CELEX: 32008R0440
Language: mt
Date: 2008-05-30 00:00:00
Title: Regolament tal-Kummissjoni (KE) nru 440/2008 tat- 30 ta' Mejju 2008 li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skond ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH) (Test b'rilevanza għaż-ŻEE)

31.5.2008   
               
               
                  MT
               
               
                  Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea
               
               
                  L 142/1
               
            REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (KE) Nru 440/2008
      tat-30 ta' Mejju 2008
      li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skond ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH)
      (Test b'rilevanza għaż-ŻEE)
      IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ,
      Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komuità Ewropea,
      Wara li kkunsidrat ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-18 ta' Diċembru 2006 dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH), li jistabbilixxi Aġenzija Ewropea għas-Sustanzi Kimiċi, li jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li jħassar ir-Regolament tal-Kunsill (KEE) Nru 793/93 u r-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 1488/94 kif ukoll id-Direttiva tal-Kunsill 76/769/KEE u d-Direttivi tal-Kummissjoni 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE (1), u b'mod partikolari l-Artikolu 13(3) tiegħu,
      Billi:
      
                  (1)
               
               
                  Skond ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006, metodi ta' ttestjar għandhom jiġu adottati fuq il-livell tal-Komunità għall-finijiet ta' testijiet fuq sustanzi fejn tali testijiet huma meħtieġa biex jiġġeneraw l-informazzjoni dwar il-karatteristiċi intrinsiċi ta' sustanzi.
               
            
                  (2)
               
               
                  Id-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE tas-27 ta' Ġunju 1967 rigward l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-dispożizzjonijiet amministrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l-imballaġġ u l-ittikkettjar ta' sustanzi perikolużi (2) stipulat, fl-Anness V, metodi għad-determinazzjoni tal-proprjetajiet fiżikokimiċi, it-tossiċità u l-ekotossiċità ta' sustanzi u preparati. L-Anness V għad-Direttiva 67/548/KEE tħassret bid-Direttiva 2006/121/KE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill, b'effett mill-1 ta' Ġunju 2008.
               
            
                  (3)
               
               
                  Il-metodi ta' ttestjar li hemm fl-Anness V għad-Direttiva 67/548/KEE għandhom jiġu inkorporati f'dan ir-Regolament.
               
            
                  (4)
               
               
                  Dan ir-Regolament ma jeskludix l-użu ta' metodi oħra ta' l-ittestjar, sakemm l-użu tagħhom ikun kompatibbli ma' l-Artikolu 13(3) tar-Regolament 1907/2006.
               
            
                  (5)
               
               
                  Il-prinċipji tas-sostituzzjoni, it-tnaqqis u l-irfinar ta' l-użu ta' l-annimali fi proċeduri għandhom jiġu kkunsidrati bis-sħiħ fid-disinn tal-metodi ta' ttestjar, partikolarment meta metodi f'lokhom u validati jsiru disponibbli biex jissostitwixxu, inaqqsu jew jirfinaw l-ittestjar fuq l-annimali.
               
            
                  (6)
               
               
                  Id-dispożizzjonijiet ta' dan ir-Regolament huma konformi ma' l-opinjoni tal-Kumitat stabbilit skond l-Artikolu 133 tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006,
               
            ADOTTAT DAN IR-REGOLAMENT:
      Artikolu 1
      Il-metodi ta' ttestjar li għandhom jiġu applikati għall-finijiet tar-Regolament 1907/2006/KE huma stipulati fl-Anness għal dan ir-Regolament.
      Artikolu 2
      Il-Kummissjoni għandha teżamina mill-ġdid, meta dan ikun f'loku, il-metodi ta' ttestjar li fih dan ir-Regolament, bil-għan li tissostitwixxi, tnaqqas jew tirfina l-ittestjar fuq l-annimali vertebrati.
      Artikolu 3
      Ir-referenzi kollha għall-Anness V għad-Direttiva 67/548/KEE għandhom jinftiehmu bħala referenzi għal dan ir-Regolament.
      Artikolu 4
      Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fl-għoxrin jum wara dak tal-pubblikazzjoni tiegħu fil-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea.
      
         Għandu japplika mill-1 ta' Ġunju 2008.
         Magħmul fi Brussell, 30 ta' Mejju 2008.
         
            
               Għall-Kummissjoni
            
            Stavros DIMAS
            
               Membru tal-Kummissjoni
            
         
      
      
         (1)  ĠU L 396, 30.12.2006, p. 1. kif ikkoreġut bil-ĠU L 136, 29.5.2007, p. 3.
      
         (2)  ĠU 196, 16.8.1967, p. 1. Id-Direttiva kif emendata l-aħħar bid-Direttiva 2006/121/KE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill (ĠU L 396, 30.12.2006, p. 850) – għandha tiġi aġġornata bir-referenzi rilevanti mal-pubblikazzjoni tat-30 ATP.
      
      
         ANNESS
         PARTI A: METODI GĦAD-DETERMINAZZJONI TAL-PROPRJETAJIET FIŻIKO-KIMIĊI
         WERREJ
         
                     A.1.
                  
                  TEMPERATURA TA' TIDWIB/IFFRIŻAR
                  4
               
                     A.2.
                  
                  TEMPERATURA TAT-TGĦOLIJA
                  14
               
                     A.3
                  
                  DENSITÀ RELATTIVA
                  21
               
                     A.4.
                  
                  PRESSJONI TAL-FWAR
                  26
               
                     A.5.
                  
                  TENSJONI TAS-SUPERFIĊJE
                  50
               
                     A.6.
                  
                  SOLUBILITÀ TA' L-ILMA
                  57
               
                     A.8.
                  
                  KOEFFIĊJENT TAL-QSIM
                  67
               
                     A.9.
                  
                  IL-PUNT TA' fjammabilità
                  80
               
                     A.10.
                  
                  FJAMMABILITÀ (SOLIDI)
                  82
               
                     A.11.
                  
                  FJAMMABILITÀ (GASSIJIET)
                  85
               
                     A.12.
                  
                  FJAMMABILITÀ (KUNTATT MA' L-ILMA)
                  87
               
                     A.13.
                  
                  PROPRJETAJIET PIROFORIĊI TA' SOLIDI U LIKWIDI
                  91
               
                     A.14.
                  
                  PROPRJETAJIET ESPLOŻIVI
                  93
               
                     A.15.
                  
                  TEMPERATURA TA' AWTO-FJAMMABILITÀ -(LIKWIDI U GASSIJIET)
                  104
               
                     A.16.
                  
                  TEMPERATURA TA' AWTO-FJAMMABILITÀ RELATTIVA GĦAL SOLIDI
                  106
               
                     A.17.
                  
                  PROPRJETAJIET OSSIDANTI (SOLIDI)
                  109
               
                     A.18.
                  
                  IL-MEDJA TAL-PIŻ MOLEKULARI TAN-NUMRU U D-DISTRIBUZZJONI TAL-PIŻ MOLEKULARI TAL-POLIMERI
                  114
               
                     A.19.
                  
                  KONTENUT TA' POLIMERI TA' PIŻ MOLEKULARI BAXX
                  123
               
                     A.20.
                  
                  L-IMĠIBA TAS-SOLUZZJONI/TA' L-ESTRAZZJONI TA' POLIMERI FL-ILMA
                  131
               
                     A.21.
                  
                  PROPRJETAJIET OSSIDIZZANTI (LIKWIDI)
                  135
               A.1.   TEMPERATURA TA' TIDWIB/IFFRIŻAR
         1.   METODU
         Il-maġġoranza tal-metodi mfissra huma bbażati fuq il-linja gwida ta' l-OECD Test (1). Il-prinċipji fundamentali huma mogħtija fir-referenzi (2) u (3).
         1.1.   DAĦLA
         Il-metodi u l-apparati mfissra għandhom ikunu applikati għad-determinazzjoni tat-temperatura ta' tidwib ta' sustanzi, mingħajr ebda restrizzjoni fir-rigward tal-grad ta' purità tagħhom.
         L-għażla tal-metodu hija dipendenti fuq in-natura tas-sustanza li se tiġi ttestjata. Bħala konsegwenza l-fattur ta' limitazzjoni jkun skond, jekk is-sustanza tistax tiġi mfarrka malajr jew le, b'diffikultà, jew xejn affattu.
         Għal xi sustanzi, id-determinazzjoni tat-temperatura ta' l-iffriżar jew solidifikazzjoni hija aktar xierqa u l-istandards għal dawn id-determinazzjonijiet ġew inklużi wkoll f'dan il-metodu.
         Fejn, minħabba il-proprjetajiet partikulari tas-sustanza, ebda wieħed mill-parametri t'hawn fuq ma jista' jkun mkejjel b'mod konvenjenti, punt ta' tferriegħ jista' jkun xieraq.
         1.2.   TIFSIRIET U UNITAJIET
         It-temperatura tat-tidwib hija mfissra bħala t-temperatura li fiha t-transizzjoni f’fażi minn stat solidu għal dak likwidu ssir fi pressjoni atmosferika u din it-temperatura tikkorrispondi idealment mat-temperatura ta' l-iffriżar.
         Peress li t-transizzjoni f’fażi ta' bosta sustanzi titwettaq fuq skala ta' temperatura, ta' spiss hija mfissra bħala l-iskala tat-tidwib.
         Konverżjoni ta' unitajiet (K għal oC)
         t = T - 273,15
         
                     t
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Temperatura Celsius, grad Celsius ( oC)
                  
               
                     T
                  
                  
                     :
                  
                  
                     temperatura termodinamika, kelvin (K)
                  
               1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Sustanzi ta' referenza mhumiex meħtieġa li jintużaw fil-każijiet kollha meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma għandhom iservu primarjament biex jiċċekkjaw ir-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' riżultati minn metodi oħra.
         Xi sustanzi ta' kalibrazzjoni huma mniżżla fir-referenzi (4).
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TA' TTESTJAR
         It-temperatura (l-iskala tat-temperatura) tat-transizzjoni f’fażi mill-istat solidu għal dak likwidu jew mill-istat likwidu għal dak solidu hija determinata. Fil-prattika waqt it-tisħin/tkessiħ ta' kampjun tas-sustanza għall-ittestjar fi pressjoni atmosferika t-temperaturi ta' tidwib/iffriżar inizjali u l-istadju finali tat-tidwib/iffriżar jiġu determinati. Ħames tipi ta' metodi huma mfissra, jiġifieri metodu kapillari, metodi ta' uċuh ta'sħana, determinazzjonijiet ta' temperatura ta' ffriżar, metodi ta' analiżi termika, u determinazzjoni ta' punt ta' tferriegħ (kif żviluppat għaż-żjut tal-pitrolju).
         F’ċerti każijiet, jista' jkun konvenjenti li titkejjel it-temperatura ta' l-iffriżar flok it-temperatura ta' tidwib.
         1.4.1.   Metodu kapillari
         1.4.1.1.   Apparati li jiffissaw it-temperatura tat- tidwib b'banju ta' likwidu
         Ammont żgħir tas-sustanza mfarrka sewwa jitpoġġa f’tubu kapillari u jiġi ppakkjat sewwa. It-tubu jissaħħan, flimkien ma' termometru, u ż-żieda fit-temperatura tiġi aġġustata għal inqas minn madwar l K/min matul it-tidwib innifsu. It-temperaturi tat-tidwib inizjali u finali jiġu determinati.
         1.4.1.2.   Apparati li jiffissaw it-temperatura tat-tidwib bi blokka tal-metall
         Kif imfisser taħt 1.4.1.1., ħlief li t-tubu kapillari u t-termometru jitpoġġew fi blokka msaħħna tal-metall, u jistgħu jkunu osservati minn ġo toqob fil-blokka.
         1.4.1.3.   Determinazzjoni permezz ta' fotoċellula
         Il-kampjun fit-tubu kapillari huwa msaħħan awtomatikament f'ċilindru tal-metall. Raġġ ta' dawl huwa dirett minn ġos-sustanza, permezz ta' toqba fiċ-ċilindru, sa fotoċellula kalibrata b'mod preċiż. Il-proprjetajiet ottiċi ta' ħafna sustanzi jinbidlu minn opak għal trasparenti meta jkunu qed jiddewbu. L-intensità tad-dawl li tilħaq lill-fotoċellula tiżdied u tibgħat sinjal ta' waqfien lill-indikatur diġitali li jkun qed jaqra t-temperatura tat-termometru ta' reżistenza tal-platinu li jkun jinsab fil-kompartiment tat-tisħin. Dan il-metodu mhuwiex adattat għal xi sustanzi b'kuluri qawwija.
         1.4.2.   Uċuh ta' Sħana
         1.4.2.1.   Il-bank sħun Kofler
         Il-bank sħun Kofler juża biċċtejn tal-metall ta' konduttività termika differenti, imsaħħna b'mod elettriku, bil-bank iddisinjat sabiex il-gradjent tat-temperatura huwa kwazi lineari matul it-tul tiegħu. It-temperatura tal-bank sħun tista' tinfirex minn 283 sa 573 K b'apparat speċjali li jaqra t-temperatura li jinkludi runner b'indiċi u marka ta' identifikazzjoni maħsubin għall-bank speċifiku. Bil-għan li tkun determinata temperatura tat-tidwib, is-sustanza titqiegħed, f’saff irqiq, direttament fuq il-wiċċ tal-bank sħun. Fi ftit sekondi tiżviluppa linja ta' separazzjoni netta bejn il-fażi fluwida u dik solida. It-temperatura fil-linja ta' separazzjoni tinqara bl-aġġustament ta' l-indiċi mal-bqija tal-linja.
         1.4.2.2.   Mikroskopju tat-tidwib
         Bosta uċuh sħan tal-mikroskopju jintużaw għad-determinazzjoni tat-temperaturi tat-tidwib bi kwantitajiet żgħar ferm ta' materjal. F'ħafna minn dawn l-uċuh sħan it-temperatura titkejjel b'termokoppja sensittiva iżda xi drabi jintużaw termometri tal-merkurju. Apparat tipiku għad-determinazzjoni tal-punt tat-tidwib fi stadju sħun għandu kompartiment ta' sħana li fiha pjanċa metallika li fuqha jitqiegħed il-kampjun fuq slide. Iċ-ċentru tal-pjanċa metallika għandu toqba li tippermetti d-dħul tad-dawl mill-mera illuminanti tal-mikroskopju. Meta tkun qed tintuża, il-kompartiment tingħalaq bi pjanċa tal-ħġieġ biex teskludi l-arja miż-żona tal-kampjun.
         It-tisħin tal-kampjun huwa regolat minn reostat. Għal kejl preċiż ħafna fuq sustanzi ottikament anisotropiċi, jista' jintuża dawl polarizzat.
         1.4.2.3.   Metodu tal-menisku
         Dan il-metodu jintuża b'mod speċifiku għal poliamidi
         It-temperatura li fiha l-ispostament tal-menisku taż-żejt tas-silikone, maqbud bejn il-wiċċ sħun u għatu tal-ħġieġ sostnut mill-kampjun tal-poliamide li jkun qed jigi ttestjat.
         1.4.3.   Metodu biex tkun determinata t-temperatura ta' l-iffriżar
         Il-kampjun jitpoġġa f’tubu tat-testijiet speċjali u jitpoġġa f’apparat għad-determinazzjoni tat-temperatura ta' l-iffriżar. Il-kampjun jiġi mħawwad b'ġentilezza u kontinwament matul it-tkessiħ u t-temperatura tiġi mkejla f’intervalli adattati. Hekk kif it-temperatura tibqa' kostanti għal qari din it-temperatura (korretta għall-iżball tat-termometru) tiġi reġistrata bħala t-temperatura ta' l-iffriżar.
         Għandu jkun evitat is-supercooling billi jinżamm l-ekwilibriju bejn il-fażijiet solidi u likwidi.
         1.4.4.   Analiżi termika
         1.4.4.1   Analiżi termika differenzjali (ATD)
         Din it-teknika tirreġistra d-differenza fit-temperaturi bejn is-sustanza u l-materjal ta' referenza bħala funzjoni tat-temperatura, waqt li s-sustanza u l-materjal ta' referenza huma suġġetti għall-istess programm ta' temperatura kontrollata. Meta l-kampjun jgħaddi minn transizzjoni li tinvolvi bidla ta' entalpija, dik il-bidla hija indikata b'devjazzjoni endotermika (tidwib) jew eżotermika (iffriżar) mil-linja tal-bażi tar-reġistru tat-temperatura.
         1.4.4.2   Kalorimetrija differenzjali ta'l-iskennjar (KDS)
         Din it-teknika tirreġistra d-differenza fl-enerġija introdotta f’sustanza u dik introdotta f'materjal ta' referenza, bħala funzjoni tat-temperatura, waqt li s-sustanza u l-materjal ta' referenza huma suġġetti għall-istess programm ta' temperatura kontrollata. Din l-enerġija hija l-enerġija meħtieġa biex tinżamm żero d-differenza tat-temperatura bejn is-sustanza u l-materjal ta' referenza. Meta l-kampjun jgħaddi minn transizzjoni li tinvolvi bidla ta' entalpija, dik il-bidla hija indikata b'devjazzjoni endotermika (tidwib) jew eżotermika (iffriżar) mil-linja ta' bażi tar-reġistru tal-fluss tas-sħana.
         1.4.5.   Punt ta' tferriegħ
         Dan il-metodu kien żviluppat biex jintużaw maż-żjut tal-pitrolju u huwa adattat għal użu ma' sustanzi żejtnin b'temperaturi baxxi ta' l-iffriżar.
         Wara tisħin preliminari, il-kampjun jitkessaħ b'rata speċifika u eżaminat f’intervalli ta' 3 K għall-karatteristiċi tat-tferriegħ. L-inqas temperatura li fiha jiġi osservat moviment tas-sustanza tiġi reġistrata bħala l-punt ta' tferrigħ.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         L-applikabilità u l-eżattezza tal-metodi differenti użati għad-determinazzjoni tat-temperatura tat-tidwib/skala tat-tidwib huma mniżżla fit-tabella li ġejja:
         TABELLA: APPLIKABILITÀ TAL-METODI
         A.   Metodi kapillari
         
         
                     Metodu ta' kejl
                  
                  
                     Sustanzi li jistgħu jitfarrku
                  
                  
                     Sustanzi li ma jintaħnux malajr
                  
                  
                     Skala ta' temperatura
                  
                  
                     Kalkolu ta' l-eżattezza (1)
                     
                  
                  
                     Standards eżistenti
                  
               
                     Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib b'banju ta' likwidu
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     għal ftit biss
                  
                  
                     273 sa 573 K
                  
                  
                     ±0,3  K
                  
                  
                     JIS K 0064
                  
               
                     Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib bi blokka tal-metall
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     għal ftit biss
                  
                  
                     293 sa >573 K
                  
                  
                     ±0,5  K
                  
                  
                     ISO 1218(E)
                  
               
                     Determinazzjoni permezz ta' fotoċellula
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     Bosta b'apparati ta' tagħmir
                  
                  
                     253 sa 573 K
                  
                  
                     ±0,5  K
                  
                  
                      
                  
               
            
         B.   Uċuh sħan u metodi ta' ffriżar
         
         
                     Metodu ta' kejl
                  
                  
                     Sustanzi li jistgħu jitfarrku
                  
                  
                     Sustanzi li ma jitfarrkux malajr
                  
                  
                     Skala ta' temperatura
                  
                  
                     Kalkolu ta' l-eżattezza (2)
                     
                  
                  
                     Standards eżistenti
                  
               
                     Il-bank sħun Kofler
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     le
                  
                  
                     283 sa >573 K
                  
                  
                     ± 1K
                  
                  
                     ANSI/ASTM D 3451-76
                  
               
                     Mikroskopju tat-tidwib
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     għal ftit biss
                  
                  
                     273 sa >573 K
                  
                  
                     ±0,5  K
                  
                  
                     DIN 53736
                  
               
                     Metodu tal-menisku
                  
                  
                     le
                  
                  
                     Speċifikament għal poliamidi
                  
                  
                     293 sa >573 K
                  
                  
                     ±0,5  K
                  
                  
                     ISO 1218(E)
                  
               
                     Temperatura ta' l-iffriżar
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     223 sa 573 K
                  
                  
                     ±0,5  K
                  
                  
                     eż. BS 4695
                  
               
            
         C.   Analiżi termika
         
         
                     Metodu ta' kejl
                  
                  
                     Sustanzi li jistgħu jitfarrku
                  
                  
                     Sustanzi li ma jitfarrkux malajr
                  
                  
                     Skala ta' temperatura
                  
                  
                     Kalkolu ta' l-eżattezza (3)
                     
                  
                  
                     Standards eżistenti
                  
               
                     Analiżi termika differenzjali
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     Iva
                  
                  
                     173 sa 1 273  K
                  
                  
                     sa 600 K ±0,5  K sa 1 273  K ±2,0 K
                  
                  
                     ASTM E 537-76
                  
               
                     Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     173 sa 1 273  K
                  
                  
                     sa 600 K ±0,5 K sa 1 273  K ±2,0  K
                  
                  
                     ASTM E 537-76
                  
               
            
         D.   Punt ta' tferrigħ
         
         
                     Metodu ta' kejl
                  
                  
                     Sustanzi li jistgħu jitfarrku
                  
                  
                     Sustanzi li ma jitfarrkux malajr
                  
                  
                     Skala ta' temperatura
                  
                  
                     Kalkolu ta' l-eżattezza (4)
                     
                  
                  
                     Standards eżistenti
                  
               
                     Punt ta' tferrigħ
                  
                  
                     għal żjut tal-pitrolju u sustanzi żejtnin
                  
                  
                     għal żjut tal-pitrolju u sustanzi żejtnin
                  
                  
                     223 sa 323 K
                  
                  
                     ±0,3  K
                  
                  
                     ASTM D 97-66
                  
               1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODI
         Il-proċeduri għal kważi l-metodi ta' ttestjar kollha tfissru fi standards internazzjonali u nazzjonali (Ara Appendiċi 1)
         1.6.1.   Metodi permezz ta' tubu kapillari
         Meta jkunu suġġetti għal żieda bil-mod tat-temperatura, sustanzi mfarrka f’mod fin is-soltu juru l-istadji ta' tidwib murija fil-figura 1.
         Figura 1
         Matul id-determinazzjoni tat-temperatura tat-tidwib, it-temperaturi jiġu reġistrati fil-bidu ta' l-istadju tat-tidwib u b'dak finali.
         1.6.1.1.   Tagħmir li jiffissa t-temperatura ta' tidwib b'apparat ta' banju ta' likwidu
         Il-Figura 2 turi tip ta' apparat standardizzat tat-temperatura ta' tidwib magħmul mill-ħġieġ (JIS K 0064); l-ispeċifikazzjonijiet kollha huma b'millimetri.
         Figura 2
         Banju ta' likwidu:
         Għandu jingħażel likwidu adattat. L-għażla tal-likwidu tiddependi fuq it-temperatura tat-tidwib li għandha tiġi determinata, eż. paraffin likwidu għal temperaturi tad-tidwib mhux ogħla minn 473 K, żejt tas-silikone għal temperaturi tat-tidwib mhux ogħla minn 573 K
         Għal temperaturi tat-tidwib fuq il-523 K, tista' tintuża taħlita li tikkonsisti minn tliet partijiet aċidu sulfuriku u żewġ partijiet sulfat tal-potassju (fi proporzjon tal-piż). Għandhom jittieħdu prekawzjonijiet xierqa jekk tintuża taħlita bħal din.
         Termometru:
         Għandhom jintużaw biss dawk it-termometri li jissodisfaw ir-rekwiżiti ta' l-istandards li ġejjin jew l-ekwivalenti tagħhom:
         ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.
         Proċedura:
         Is-sustanza niexfa titfarrak b'mod fin ħafna fi trab u titpoġġa f’tubu kapillari, magħluq f’tarf minnhom, bil-għan li l-livell tal-mili jkun approssimattivament 3 mm wara li jkun ippakkjat sewwa. Biex jinkiseb kampjun ippakkjat uniformi, it-tubu kapillari għandha jitwaqqa' minn għoli approssimattiv ta' 700 mm minn tubu tal-ħġieġ b'mod vertikali fuq watchg.
         It-tubu kapillari mimli jitpoġġa fil-banju sabiex il-parti tan-nofs tal-bozza tal-merkurju tat-termometru tmiss it-tubu kapillari fil-parti fejn hemm il-kampjun. Is-soltu t-tubu kapillari jiġi introdott fl-apparat madwar 10 K taħt it-temperatura tat-tidwib.
         Il-banju ta' likwidu jissaħħan sabiex it-temperatura ogħla sa approssimattivament 3 K/min. Il-likwidu għandu jitħawwad. F’madwar 10 K taħt it-temperatura tat-tidwib mistennija r-rata taż-żieda fit-temperatura tiġi aġġustata għal massimu ta' 1 K/min.
         Kalkolu:
         Il-kalkolu tat-temperatura tat-tidwib hija kif ġej:
         T = TD+0,00016 (TD -TE) n
         fejn:
         
                     T
                  
                  
                     =
                  
                  
                     it-temperatura tat-tidwib korretta f’K
                  
               
                     TD
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     qari tat-temperatura mit-termometru D f’K
                  
               
                     TE
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     qari tat-temperatura mit-termometru E f’K
                  
               
                     n
                  
                  
                     =
                  
                  
                     numru ta' gradazzjonijiet tal-ħajta tal-merkurju fuq termometru D fil-parti li qiegħda fil-wiċċ ta' l-ilma
                  
               1.6.1.2   Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib bi blokka tal-metall
         Apparat:
         
            Dan jikkonsist fi:
         
         
                     —
                  
                  
                     blokka ċilindrika tal-metall, li l-parti ta' fuq tagħha hija konkava u tifforma kompartiment (ara figura 3),
                  
               
                     —
                  
                  
                     tapp tal-metall, b'żewġ toqob jew aktar, li jippermetti li tubi jiġu mmuntati fil-blokka tal-metall,
                  
               
                     —
                  
                  
                     sistema ta' tisħin, għall-blokka tal-metall, provduta, eż., minn reżistenza elettrika inkorporata fil-blokka,
                  
               
                     —
                  
                  
                     reostat għar-regolazzjoni tal-qawwa applikata, jekk jintuża tisħin elettriku.
                  
               
                     —
                  
                  
                     erba' twieqi ta' ħġieġ li jiflaħ għas-sħana fuq il-ġnub laterali tal-kompartiment, imqiegħda dijametrikalment f’anglu rett ma' xulxin. Quddiem waħda minnhom tkun immuntata lenti għall-osservazzjoni tat-tubu kapillari. It-tliet twieqi l-oħra jintużaw biex jinxtegħel l-intern permezz ta' lampi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     tubu kapillari ta' ħġieġ li jirreżisti s-sħana magħluq minn naħa waħda (ara 1.6.1.1).
                  
               Ara l-istandards imsemmija f’ 1.6.1.1. Jistgħu jintużaw ukoll apparati tal-kejl termoelettriċi b'eżattezza komparabbli.
         Figura 3
         1.6.1.3.   Determinazzjoni permezz ta' fotoċellula
         
            Apparat u proċedura:
         
         L-apparat jikkonsisti f’ kompartiment tal-metall b'sistema awtomatizzata ta' tisħin. Tliet kapillari jimtlew skond il-1.6.1.1. u jitpoġġew fil-forn.
         Huma disponibbli bosta żidiet lineari biex ikun kalibrat l-apparat u ż-żieda adattata fit-temperatura hija aġġustata bl-elettriku b'rata kostanti u lineari magħżula minn qabel. Reġistri juru t-temperatura attwali fil-forn u t-temperatura tas-sustanza fit-tubi kapillari.
         1.6.2.   Uċuh sħan
         1.6.2.1.   Il-bank sħun Kofler
         Ara l-Appendiċi
         1.6.2.2.   Mikroskopju tat-tidwib
         Ara l-Appendiċi
         1.6.2.3.   Metodu tal-menisku (poliamidi)
         Ara l-Appendiċi
         Ir-rata tat-tisħin mit-temperatura tat-tidwib għandha tkun inqas minn 1 K/min.
         1.6.3.   Metodi għad-determinazzjoni tat-temperatura ta' l-iffriżar
         Ara l-Appendiċi
         1.6.4.   Analiżi termika
         1.6.4.1.   Analiżi termika differenzjali
         Ara l-Appendiċi
         1.6.4.2.   Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar
         Ara l-Appendiċi
         1.6.5.   Determinazzjoni tal-punt tat-tferrigħ
         Ara l-Appendiċi
         2.   DATA
         Korrezzjoni tat-termometru hija neċessarja f’ xi każijiet.
         3.   RAPPURTAR
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     metodu użat
                  
               
                     —
                  
                  
                     speċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet) u l-pass preliminari ta' purifikazzjoni, jekk ikun hemm,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kalkolu ta' l-eżattezza
                  
               Il-medja talanqas żewġ kejlijiet li huma fl-iskala ta' l-eżattezza kalkulata (ara t-tabelli) hija reġistrata bħala t-temperatura tat-tidwib.
         Jekk id-differenza bejn it-temperatura fil-bidu u fl-istadju finali tat-tidwib hija fil-limiti ta' l-eżattezza tal-metodu, it-temperatura fl-istadju finali tat-tidwib tittieħed bħala t-temperatura tat-tidwib; inkella ż-żewġ temperaturi għandhom ikunu rapportati.
         Jekk is-sustanza tiddekomponi jew tissaffa bis-sublimazzjoni qabel ma tintlaħaq it-temperatura, it-temperatura li fiha jiġi osservat l-effett għandha tkun rapportata.
         L-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rapportati, b'mod speċjali fir-rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.
         4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803–834.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505–515.
                  
               
            Appendiċi
            Għal dettalji tekniċi addizzjonali, l-istandards li ġejjin jistgħu jkunu kkonsultati bħala eżempju.
            1.   Metodi kapillari
            1.1.   Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib b'banju ta' likwidu
            
                        ASTM E 324-69
                     
                     
                        Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals
                     
                  
                        BS 4634
                     
                     
                        Method for the determination of melting point and/or melting range
                     
                  
                        DIN 53181
                     
                     
                        Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapilarverfarehn
                     
                  
                        JIS K 00-64
                     
                     
                        Testing methods for melting point of chemical products.
                     
                  1.2   Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib bi blokka tal-metall
            
                        DIN 53736
                     
                     
                        Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
                     
                  
                        ISO 1218 (E)
                     
                     
                        Plastics- polyamides -determination of “melting point”
                     
                  2.   Elementi Imsaħħnin
            2.1.   Il-bank sħun Kofler
            
                        ANSI/ASTM D 3451-76
                     
                     
                        Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings
                     
                  2.2.   Mikroskopju tat-tidwib
            
                        DIN 53736
                     
                     
                        Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen.
                     
                  2.3.   Metodu tal-menisku (poliamidi)
            
                        ISO 1218 (E)
                     
                     
                        Plastics -poly ami des -determination of “melting point”
                     
                  
                        ANSI/ASTM D 2133-66
                     
                     
                        Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials
                     
                  
                        NF T 51-050
                     
                     
                        Resines de polyamides. Determination du “point de fusion” methode du menisque
                     
                  3.   Metodi għad-determinazzjoni tat-temperatura ta' l-iffriżar
            
                        BS 4633
                     
                     
                        Method for the determination of crystallizing point
                     
                  
                        BS 4695
                     
                     
                        Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve)
                     
                  
                        DIN 51421
                     
                     
                        Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen
                     
                  
                        ISO 2207
                     
                     
                        Cires de petrole: determination de la temperature de figeage
                     
                  
                        DIN 53175
                     
                     
                        Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsiiuren
                     
                  
                        NF T 60-114
                     
                     
                        Point de fusion des paraffines
                     
                  
                        NF T 20-051
                     
                     
                        Methode de determination du point de cristallisation (point de Congelation
                     
                  
                        ISO 1392
                     
                     
                        Method for the determination of the freezing point
                     
                  4.   Analiżi termika
            4.1.   Analiżi termika differenzjali
            
                        ASTM E 537-76
                     
                     
                        Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
                     
                  
                        ASTM E 473-85
                     
                     
                        Standard definitions of terms relating to thermal analysis
                     
                  
                        ASTM E 472-86
                     
                     
                        Standard practice for reporting thermoanalytical DATA
                     
                  
                        DIN 51005
                     
                     
                        Thermische Analyse, Begriffe
                     
                  4.2.   Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar
            
                        ASTM E 537-76
                     
                     
                        Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
                     
                  
                        ASTM E 473-85
                     
                     
                        Standard definitions of terms relating to thermal analysis
                     
                  
                        ASTM E 472-86
                     
                     
                        Standard practice for reporting thermoanalytical DATA
                     
                  
                        DIN 51005
                     
                     
                        Thermische Analyse, Begriffe
                     
                  5.   Determinazzjoni tal-punt tat-tferriegħ
            
                        NBN 52014
                     
                     
                        Echantillonnage et analyse des produits du petrole: Point de trouble et point d'ecoulement limite -Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt
                     
                  
                        ASTM D 97-66
                     
                     
                        Standard test method for pour point of petroleum oils
                     
                  
                        ISO 3016
                     
                     
                        Petroleum oils –Determination of pour point
                     
                  
         A.2.   TEMPERATURA TAT-TGĦOLIJA
         1.   METODU
         Il-maġġoranza tal-metodi mfissra huma bbażati fuq il-linjagwida tat-Test OECD (1). Il-prinċipji fundamentali huma mogħtija fir-referenzi (2) u (3).
         1.1.   DAĦLA
         Il-metodi u l-apparati mfissra hawnhekk jistgħu jiġu applikati għal likwidu u għal sustanzi li jiddewbu bil-mod f’ temperatura baxxa, bil-kondizzjoni li dawn ma jkollhomx xi reazzjoni kimika taħt it-temperatura tat-tgħolija (eż.: awto-ossidazzjoni, traspożizzjoni, degradazzjoni, eċċ.). Il-metodi jistgħu jiġu applikati għal sustanzi likwidi puri u impuri.
         Issir enfasi fuq il-metodi li jużaw osservazzjoni permezz ta' fotoċellula u analiżi termika, għaliex dawn il-metodi jippermettu d-determinazzjoni tat-temperaturi tat-tidwib kif ukoll dawk tat-tgħolija. Barra dan, il-kejlijiet jistgħu jsiru b'mod awtomatiku.
         Il-“metodu dinamiku” għandu l-vantaġġ li jista' jiġi applikat ukoll għad-determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar u mhuwiex neċessarju li t-temperatura tat-tgħolija tkun korretta sal-pressjoni normali (101,325 kPa) għaliex il-pressjoni normali tista' tiġi aġġustata matul il-kejl minn manostat.
         
            Rimarki:
         
         L-influwenza ta' impuritajiet fuq id-determinazzjoni tat-temperatura tat-tgħolija tiddependi l-aktar fuq in-natura ta' l-impurità. Meta fil-kampjun ikun hemm impuritajiet volatili, li jistgħu jaffetwaw ir-riżultati, is-sustanza tista' tiġi ppurifikata.
         1.2.   TIFSIRIET U UNITAJIET
         It-temperatura normali tat-tgħolija hija mfissra bħala t-temperatura li fiha l-pressjoni tal-fwar tal-likwidu hija 101,325 kPa.
         Jekk it-temperatura tat-tgħolija ma titkejjilx fi pressjoni atmosferika normali, id-dependenza tat-temperatura fuq il-pressjoni tal-fwar tista' tiġi deskritta bl-ekwazzjoni Clausius-Clapeyron:
         
            
         fejn:
         
                     P
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-pressjoni tal-fwar tas-sustanza f’ pascals
                  
               
                     ΔHv
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     is-sħana ta' evaporizzazzjoni tiegħu f’ J mol-1
                     
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-kostanti universali molari tal-gass = 8,314 mol-1 K-1
                     
                  
               
                     T
                  
                  
                     =
                  
                  
                     it-temperatura termodinamika, f’ K
                  
               It-temperatura tat-tgħolija hija murija skond il-pressjoni ta' l-ambjent matul il-kejl.
         
            Bdil
         
         Pressjoni (unitajiet: kPa)
         
                     100 kPa
                  
                  
                     =
                  
                  
                     1 bar = 0,1 MPa
                     (“bar” għadha permessa iżda mhux rakkomandata)
                  
               
                     133 Pa
                  
                  
                     =
                  
                  
                     1 mm Hg = 1 Torr
                     (l-unitajiet “mm Hg” u “Tor” mhumiex permessi).
                  
               
                     1 atm
                  
                  
                     =
                  
                  
                     atmosfera standard = 101 325 Pa
                     (l-unità “atm” mhix permessa).
                  
               Temperatura (unitajiet: K)
         t = T - 273,15 K
         
                     t
                  
                  
                     :
                  
                  
                     temperatura Celsius, grad Celsius ( oC)
                  
               
                     T
                  
                  
                     :
                  
                  
                     temperatura termodinamika, kelvin (K)
                  
               1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         M'hemmx bżonn li jintużaw sustanzi ta' referenza fil-każijietjiet kollha kull meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma primarjament qegħdin biex ikun iċċekkjat ir-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu paragun ma' riżultati minn metodi oħra.
         Xi sustanzi ta' kalibrazzjoni jinsabu fil-metodi elenkati fl-Appendiċi.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TA' L-ITTESTJAR
         Ħames metodi għad-determinazzjoni tat-temperatura tat-tgħolija (skala tat-temperatura tat-tgħolija) huma bbażati fuq il-kejl tat-temperatura tat-tgħolija, tnejn oħra huma bbażati fuq analiżi termika.
         1.4.1.   Determinazzjoni bl-użu ta' l-ebulliometer
         L-ebulliometers kienu żviluppati oriġinarjament għad-determinazzjoni tal-piż molekulari permezz taż-żieda fit-temperatura tat-tgħolija, iżda huma adattati wkoll għal kejl eżatt tat-temperatura tat-tgħolija. Apparat sempliċi ħafna huwa mfisser fl-ASTM D 1120-72 (ara l-Appendiċi). Il-likwidu jissaħħan f’ dan l-apparat taħt kondizzjonijiet ta' ekwilibriju fi pressjoni atmosferika sakemm jiftaħ jagħli.
         1.4.2.   Metodu dinamiku
         Dan il-metodu jinvolvi il-kejl tat-temperatura tar-rikondensazzjoni tal-fwar permezz ta' termometru adattat fir-rifluss waqt it-tgħolija. B'dan il-metodu l-pressjoni tista' tiġi varjata.
         1.4.3.   Metodu ta' distillazzjoni għat-temperatura tat-tgħolija
         Dan il-metodu jinvolvi d-distillazzjoni tal-likwidu u l-kejl tat-temperatura tar-rikondensazzjoni tal-fwar u d-determinazzjoni ta' l-ammont ta' l-iddistillat.
         1.4.4.   Metodu skond Siwoloboff
         Kampjun jissaħħan f’ tubu għall-kampjun, li jkun mgħaddas f’ likwidu ġo banju sħun. Kapillari mgħaqqda, li fiha bużżieqa ta' l-arja fil-parti t'isfel, tiġi mgħaddsa fit-tubu bil-kampjun.
         1.4.5.   Determinazzjoni permezz ta' fotoċellula
         Skond il-prinċipju Siwoloboff, kejl foto-elettriku awtomatiku jsir bit-tlugħ tal-bżieżaq.
         1.4.6.   Analiżi termika differenzjali
         Din it-teknika tirreġistra d-differenza fit-temperaturi bejn is-sustanza u l-materjal ta' referenza bħala funzjoni tat-temperatura, waqt li s-sustanza u l-materjal ta' referenza huma suġġetti għall-istess programm kontrollat ta' temperatura. Meta l-kampjun jgħaddi minn transizzjoni li tinvolvi bidla ta' entalpija, dik il-bidla hija indikata b'devjazzjoni endotermika (tidwib) jew eżotermika (iffriżar) mil-linja ta' bażi tar-reġistru tat-temperatura.
         1.4.7.   Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar
         Din it-teknika tirreġistra d-differenza fl-enerġija introdotta f’ sustanza u dik introdotta f'materjal ta' referenza, bħala funzjoni tat-temperatura, waqt li s-sustanza u l-materjal ta' referenza huma suġġetti għall-istess programm kontrollat ta' temperatura. Din l-enerġija hija l-enerġija meħtieġa biex id-differenza tat-temperatura bejn is-sustanza u l-materjal ta' referenza tinżamm żero. Meta l-kampjun jgħaddi minn transizzjoni li tinvolvi bidla ta' entalpija, dik il-bidla hija indikata b'devjazzjoni endotermika (tgħolija) mil-linja ta' bażi tar-reġistru tal-fluss tas-sħana.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         L-applikabbiltà u l-eżattezza tal-metodi differenti użati għad-determinazzjoni tat-temperatura tat-tgħolija/ta' l-iskala tat-tgħolija huma mniżżla fit-tabella 1:
         Tabella 1
         Paragun tal-metodi
         
                     Metodu ta' kejl
                  
                  
                     Kalkolu ta' l-eżattezza
                  
                  
                     Standard eżistenti
                  
               
                     L-ebulliometer
                  
                  
                     ±1,4  K (sa 373 K) (5)
                         (6)
                     
                     ±2,5  K (sa 600 K) (5)
                         (6)
                     
                  
                  
                     ASTM D 1120-72 (5)
                     
                  
               
                     Il-metodu dinamiku
                  
                  
                     ±0,5  K (sa 600 K) (6)
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Il-proċess ta' distillazzjoni (skala ta'tgħolija)
                  
                  
                     ±0,5  K (sa 600 K)
                  
                  
                     ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71
                  
               
                     Il-metodu skond Siwoloboff
                  
                  
                     ± 2 K (sa 600 K) (6)
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Osservazzjoni permezz ta' fotoċellula
                  
                  
                     ±0,3  K (sa 373 K) (6)
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Il-kalorimetrija termika differenzjali
                  
                  
                     ±0,5  K (sa 600 K)
                     ±2,0  K (sa 1 273  K)
                  
                  
                     ASTM E 537-76
                  
               
                     Il-kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar
                  
                  
                     ±0,5  K (sa 600 K)
                     ±2,0  K (sa 1 273  K)
                  
                  
                     ASTM E 537-76
                  
               1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODI
         Kważi l-proċeduri għall-metodi ta' ttestjar kollhatfissru fi standards internazzjonali u nazzjonali (Ara l-Appendiċi).
         1.6.1.   L-ebulliometer
         Ara l-Appendiċi.
         1.6.2.   Il-metodu dinamiku
         Ara l-metodu ta' ttestjar A.4. għad-determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar.
         It-temperatura tat-tgħolija osservata bi pressjoni applikata ta' 101,325 kPa hija reġistrata.
         1.6.3.   Il-proċess ta' distillazzjoni (skala tat-tgħolija)
         Ara l-Appendiċi.
         1.6.4.   Il-metodu skond Siwoloboff
         Il-kampjun jissaħħan f'apparat ta' temperatura tat-tidwib f'tubu għall-kampjun, b'dijametru ta' approssimattivament 5 mm (figura 1).
         Il-figura 1 turi tip ta' apparat standardizzat ta' temperatura tat-tidwib u tat-tgħolija (JIS K 0064) (magħmul mill-ħġieġ, l-ispeċifikazzjonijiet kollha f’ millimetri).
         Figura 1
         Tubu kapillari (kapillari tat-tgħolija) li huwa magħluq madwar 1 cm ’il fuq mill-parti t’isfel tat-tubu jitpoġġa fit-tubu għall-kampjun. Is-sustanza tat-test tiżdied sa livell tali li l-parti mgħaqqda tal-kapillari tkun taħt il-wiċċ tal-likwidu. It-tubu għall-kampjun li fih il-kapillari tat-tgħolija huwa marbut mat-termometru permezz ta' lastiku jew huwa mwaħħal b'irfid mal-ġenb (ara figura 2).
         
                     
                        Figura 2
                     
                     
                        Il-prinċipju skond Siwoloboff
                     
                  
                  
                     
                        Figura 3
                     
                     
                        Il-prinċipju mmodifikat
                     
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     
                        
                  
               Il-banju ta' likwidu jintgħażel skond it-temperatura tat-tgħolija. F’ temperaturi ta' 573 K, jista' jintuża żejt tas-silikone. Il-paraffina likwida tista' tintuża biss sa 473 K. Għall-bidu t-tisħin tal-banju ta'likwidu għandu jkun aġġustat sa żieda fit-temperatura ta' 3 K/min. Il-banju ta' likwidu jrid jitħawwad. F’ madwar 10 K taħt it-temperatura tat-tgħolija mistennija, it-tisħin jitnaqqas sabiex ir-rata fiż-żieda tat-temperatura tkun anqas minn 1 K/min. Meta tkun se tintlaħaq it-temperatura tat-tgħolija, jibdew jitfaċċaw b'mod rapidu bżieżaq fil-kapillari li tkun qed tagħli.
         It-temperatura tat-tgħolija hija dik it-temperatura li, fil-waqt ta' tkessiħ momentarju, is-serje ta' bżieżaq tieqaf u l-fluwidu f’ daqqa waħda jerġa' jibda tiegħla fil-kapillari. Il-qari korrispondenti tat-termometru huwa t-temperatura tat-tgħolija tas-sustanza.
         Fil-prinċipju mmodifikat (figura 3) t-temperatura tat-tgħolija hija ddeterminata f’kapillari ta' temperatura tat-tidwib. Hija tiġġebbed sa punt fin ta' madwar 2 cm fit-tul (a) u ammont żgħir tal-kampjun jinġibed ’il fuq. Il-parti l-miftuħa tal-kapillari fin tingħalaq billi tiddewweb, b'mod li jkun hemm buieqa ta' l-arja fit-tarf. Waqt it-tisħin fl-apparat tat-temperatura tat-tidwib (b) l-bużżieqa ta' l-arja tespandi. It-temperatura tat-tgħolija tikkorrispondi mat-temperatura li fiha t-tapp tas-sustanza jilħaq il-livell tas-superfiċje tal-banju ta' likwidu (ċ).
         1.6.5.   Osservazzjoni permezz ta' fotoċellula
         Il-kampjun jissaħħan f-tubu kapillari ġo blokka tal-metall imsaħħna.
         Raġġ ta' dawl jiġi dirett, f’toqob adattati fil-blokka, minn ġo s-sustanza għal fuq fotoċellula kkalibrata b'mod preċiż.
         Waqt iż-żieda fit-temperatura tal-kampjun, bżieżaq ta' l-arja singoli jitfaċċaw mill-kapillari li tkun qed tagħli. Meta tintlaħaq it-temperatura tat-tgħolija n-numru ta' bżieżaq jiżdied ħafna. Dan jikkawża bidla fl-intensità tad-dawl, irreġistrata minn fotoċellula, u jagħti sinjal ta' waqfien lill-indikatur li jkun qed jaqra t-temperatura tat-termometru tal-platinu ta' reżistenza li jkun fil-blokka.
         Dan il-metodu huwa speċjalment utli għaliex jippermetti determinazzjonijiet taħt it-temperatura ambjentali sa 253,15 K (-20 oC) mingħajr ebda bidliet fl-apparat. Kemm jitpoġġa l-istrument f'banju li jkessaħ.
         1.6.6.   Analiżi termika
         1.6.6.1.   Analiżi termika differenzjali
         Ara l-Appendiċi.
         1.6.6.2.   Kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar
         Ara l-Appendiċi.
         2.   DATA
         B'devjazzjonijiet żgħar mill-pressjoni normali (max. ± 5 kPa) it-temperaturi tat-tgħolija huma normalizzati sa Tn permezz ta' l-ekwazzjoni numru-valur minn Sidney Young li ġejja:
         Tn = T + (fT x Δp)
         fejn:
         
                     Δp
                  
                  
                     =
                  
                  
                     (101,325 – p) [nnota s-sinjal]
                  
               
                     P
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-kejl tal-pressjoni f’kPa
                  
               
                     fT
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     ir-rata ta' bidla fit-temperatura tat-tgħolija bi pressjoni f’K/kPa
                  
               
                     T
                  
                  
                     =
                  
                  
                     it-temperatura tat-tgħolija mkejla f’K
                  
               
                     Tn
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     it-temperatura tat-tgħolija korretta sal-pressjoni normali f’K
                  
               Għal ħafna sustanzi l-fatturi tal-korrezzjoni tat-temperatura, fT, u l-ekwazzjonijiet għall-approssimazzjoni tagħhom huma inklużi fl-istandards internazzjonali u nazzjonali msemmija hawn fuq.
         Eż, il-metodu tad-DIN 53171 isemmi l-korrezzjonijiet mhux bilfors eżatti li ġejjin għal solventi inklużi fiż-żebgħa:
         Tabella 2
         Temperatura – il-fatturi ta' korrezzjonijiet ft
         
         
                     Temperatura T (K)
                  
                  
                     Fattur ta' korrezzjoni fT (K/kPa)
                  
               
                     323,15 
                  
                  
                     0,26 
                  
               
                     348,15 
                  
                  
                     0,28 
                  
               
                     373,15 
                  
                  
                     0,31 
                  
               
                     398,15 
                  
                  
                     0,33 
                  
               
                     423,15 
                  
                  
                     0,35 
                  
               
                     448,15 
                  
                  
                     0,37 
                  
               
                     473,15 
                  
                  
                     0,39 
                  
               
                     498,15 
                  
                  
                     0,41 
                  
               
                     523,15 
                  
                  
                     0,4 
                  
               
                     548,15 
                  
                  
                     0,45 
                  
               
                     573,15 
                  
                  
                     0,47 
                  
               3.   RAPPURTAR
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     il-metodu użat
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet) u l-istadju preliminarju ta' purifikazzjoni, jekk hemm,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kalkolu ta' l-eżattezza.
                  
               Il-medja ta' mill-inqas żewġ temperaturi li huma fl-iskala tal-kalkolu ta' l-eżattezza (ara t-Tabella 1) hija rrapurtata bħala t-temperatura tat-tgħolija.
         It-temperaturi tat-tgħolija mkejla u l-medji tagħhom għandhom ikunu ddikjarati u l-pressjoni (jiet) li fihom saru l-kejlijiet għandhom ikunu rrapurtati f’kPa. Il-pressjoni għandha tkun preferibbilment qrib il-pressjoni atmosferika normali.
         L-informazzjoni kollha u r-rimarki relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rrapurtati, b'mod speċjali rigward l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.
         4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, volume II.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.
                  
               
            Appendiċi
            Għal dettalji tekniċi addizzjonali, l-istandards li ġejjin jistgħu jkunu kkonsultati bħala eżempju.
            1.   L-ebulliometer
            
                     
                        1.1
                     
                     
                        Apparati li jiffissaw it-temperatura ta' tidwib b'banju ta' likwidu
                     
                  
                        ASTM D 1120-72
                     
                     
                        Standard test method for boiling point of engine anti-freezes
                     
                  2.   Il-proċess ta' distillazzjoni (l-iskala tat-tgħolija)
            
                        ISO 918:1989:
                     
                     
                        Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)
                     
                  
                        BS 4349/68
                     
                     
                        Method for determination of distillation of petroleum products
                     
                  
                        BS 4591/71
                     
                     
                        Method for the determination of distillation characteristics
                     
                  
                        DIN 53171
                     
                     
                        Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes
                     
                  
                        NF T 20-608
                     
                     
                        Distillation:determination du rendement et de l'intervalle de distillation
                     
                  3.   L-analiżi termika differenzjali u l-kalorimetrija differenzjali ta' l-iskennjar
            
                        ASTM E 537-76
                     
                     
                        Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
                     
                  
                        ASTM E 473-85
                     
                     
                        Standard definitions of terms relating to thermal analysis
                     
                  
                        ASTM E 472-86
                     
                     
                        Standard practice for reporting thermoanalytical data
                     
                  
                        DIN 51005
                     
                     
                        Thermische Analyse, Begriffe
                     
                  
         A.3.   DENSITÀ RELATTIVA
         1.   METODU
         Il-maġġoranza tal-metodi mfissra huma bbażati fuq il-linja gwida tat-Test OECD (1). Il-prinċipji fundamentali huma mogħtija fir-referenzi (2) u (3).
         1.1.   DAĦLA
         Il-metodi għad-determinazzjoni tad-densità relattiva mfissra hawn huma applikabbli għal sustanzi solidi u likwidi, mingħajr restrizzjoni fir-rigward tal-grad ta' purità tagħhom. Id-diversi metodi li għandhom jintużaw huma mniżżla fit-tabella 1.
         1.2.   TIFSIRIET U UNITAJIET
         Id-densità relattiva D20
            4 ta' solidi jew likwidi hija l-proporzjoni bejn il-piż ta' volum tas-sustanza li trid tiġi eżaminata, iddeterminata f’temperatura ta' 20 oC, u l-piż ta' l-istess volum ta' ilma, iddeterminata f’temperatura ta' 4 oC. Id-densità relattiva ma għandhiex dimensjoni.
         Id-densità, P, ta' sustanza hija l-kwozjent tal-piż, m, u l-volum tagħha, v.
         Id-densità, P, tingħata f’unitajiet SI, f’kg/m3.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA (1) (3)
         M'hemmx bżonn li jintużaw sustanzi ta' referenza kull meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma primarjament qegħdin biex ikun iċċekkjat ir-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu paragun ma' riżultati minn metodi oħra.
         1.4.   TQABBIL TAL-METODI
         Jintużaw erba' klassijiet ta' metodi
         1.4.1.   Il-metodi taż-żamma fil-wiċċ
         1.4.1.1.   Idrometru (għal sustanzi likwidi)
         
         Jistgħu jinkisbu determinazzjonijiet tad-densità rapidi u eżatti biżżejjed permezz ta' idrometri li jżommu fil-wiċċ, li jippermettu li d-densità ta' likwidu titqies mill-fond ta' l-immersjoni bil-qari ta' skala bi gradazzjoni.
         1.4.1.2.   Miżien idrostatiku (għal sustanzi likwidi u solidi)
         
         Id-differenza bejn il-piż tal-kampjun għat-test imkejjel fl-ajru u f'likwidu adattat (eż. l-ilma) tista' tintuża biex tiddetermina d-densità tiegħu.
         Għal solidi, id-densità mkejla hija kkunsidrata valida biss għal kampjun partikolari li jkun qed jiġi eżaminat. Għad-determinazzjoni tad-densità tal-likwidi, oġġett ta' volum magħruf, v, jintiżen l-ewwel fl-arja u imbagħad fil-likwidu.
         1.4.1.3.   Il-metodu ta' l-oġġett mgħaddas (għal sustanzi likwidi) (4)
         
         F’dan il-metodu, id-densità ta' likwidu hija ddeterminata mid-differenza bejn ir-riżultati ta' kejl tal-likwidu qabel u wara l-immersjoni ta' oġġett ta' volum magħruf fil-likwidu tat-test.
         1.4.2.   Metodi piknometriċi
         Għal solidi jew likwidi, jistgħu jintużaw piknometri ta' diversi forom u ta' volumi magħrufa. Id-densità hija kkalkulata mid-differenza fil-piż bejn il-piknometru mimli u vojt u l-volum magħruf tiegħu.
         1.4.3.   Piknometru għal paragun fl-arja (għal solidi)
         
         Id-densità ta' solidu fi kwalunkwe forma tista' titkejjel f’temperatura ambjentali b'piknometru għal paragun bil-gass. Il-volum tas-sustanza jitkejjel fl-arja jew f’gass inert f’ċilindru ta' volum varjabbli ikkalibrat. Għal kalkolu tad-densità jittieħed kejl wieħed tal-piż wara li jsir il-kejl tal-volum.
         1.4.4.   Densitometru li joxxilla (5) (6) (7)
         
         Id-densità ta' likwidu tista' titkejjel f’densitometru li joxxilla. Oxxillatur mekkaniku mibni fil-forma ta' tubu-U jiġi vvibrat bil-frekwenza ta' reżonanza ta' l-oxxilatur li tiddependi fuq il-piż tiegħu. L-introduzzjoni ta' kampjun tbiddel il-frekwenza ta' reżonanza ta' l-oxxillatur. L-apparat għandu jiġi kkalibrat b'żewġ sustanzi likwidi ta' densitajiet magħrufa. Dawn is-sustanzi għandhom ikunu preferibbilment magħżula b'tali mod li d-densitajiet tagħhom ikopru l-iskala kollha li se titkejjel.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         L-applikabilità tal-metodi differenti użati għad-determinazzjoni tad-densità relattiva hija mniżżla fit-tabella.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODI
         L-istandards mogħtija bħala eżempji, li għandhom ikunu kkonsultati għal dettalji tekniċi addizzjonali, huma mehmuża fl-Appendiċi.
         Il-testijiet għandhom isiru f’temperatura ta' 20 oC, u għandhom isiru għall-inqas żewġ kejlijiet.
         2.   DATA
         Ara l-istandards.
         3.   RAPPURTAR
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     il-metodu użat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet) u l-istadju preliminarju ta' purifikazzjoni, jekk hemm,
                  
               Id-densità relattiva, , għandha tkun irrappurtata kif imfisser f’1.2, flimkien ma' l-istat fiżiku tas-sustanza mkejla.
         L-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rrapportati, b'mod speċjali fir-rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.
         Tabella
         Applikabilità tal-metodi
         
                     Metodu ta' kejl
                  
                  
                     Densità
                  
                  
                     Viskożità dinamika massima possibbli
                  
                  
                     Standards eżistenti
                  
               
                     solidu
                  
                  
                     likwidu
                  
               
                     
                                 1.4.1.1.
                              
                              
                                 Idrometru
                              
                           
                  
                      
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     5 Pa s
                  
                  
                     ISO 387,
                     ISO 649-2,
                     NF T 20-050
                  
               
                     
                                 1.4.1.2.
                              
                              
                                 Miżien Idrostatiku
                              
                           
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 solidsi
                              
                           
                  
                     iva
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     ISO 1183 (A)
                  
               
                     
                                 (b)
                              
                              
                                 likwidi
                              
                           
                  
                      
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     5 Pa s
                  
                  
                     ISO 90 u 758
                  
               
                     
                                 1.4.1.3.
                              
                              
                                 Il-metodu ta' l-oġġett mgħaddas
                              
                           
                  
                      
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     20 Pa s
                  
                  
                     DIN 53217
                  
               
                     
                                 1.4.2.
                              
                              
                                 Piknometru
                              
                           
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     ISO 3507
                  
               
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 solidi
                              
                           
                  
                     iva
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     ISO 1183(B),
                     NF T 20-053
                  
               
                     
                                 (b)
                              
                              
                                 likwidi
                              
                           
                  
                      
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     500 Pa s
                  
                  
                     ISO 758
                  
               
                     
                                 1.4.3
                              
                              
                                 Piknometru għal paragun fl-arja
                              
                           
                  
                     iva
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     DIN 55590 Teil 3,
                     DIN53243
                  
               
                     
                                 1.4.4.
                              
                              
                                 Densitometru li joxxilla
                              
                           
                  
                      
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     5 Pa s
                  
                  
                      
                  
               M4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ. , New York, 1959, vol. I, Part 1.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.ll, 427–430.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297–302.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen -Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717–726.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253–255.
                  
               
            Appendiċi
            Għal dettalji tekniċi addizzjonali, l-istandards li ġejjin jistgħu jkunu kkonsultati bħala eżempju.
            1.   Il-metodi taż-żamma fil-wiċċ
            1.1   Idrometru
            
                        DIN 12790, ISO 387
                     
                     
                        Hydrometer; general instructions
                     
                  
                        DIN 12791
                     
                     
                        Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use
                        Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation
                        Part III: Use and test
                     
                  
                        ISO 649-2
                     
                     
                        Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose
                     
                  
                        NF T 20-050
                     
                     
                        Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method
                     
                  
                        DIN 12793
                     
                     
                        Laboratory glassware: range find hydrometers
                     
                  1.2   Miżien idrostatiku
            Għal sustanzi solidi
            
                        ISO 1183
                     
                     
                        Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics
                     
                  
                        NF T 20-049
                     
                     
                        Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method
                     
                  
                        ASTM-D-792
                     
                     
                        Specific gravity and density of plastics by displacement
                     
                  
                        DIN 53479
                     
                     
                        Testing of plastics and elastomers; determination of density
                     
                  Għal sustanzi likwidi
            
                        ISO 901
                     
                     
                        ISO 758
                     
                  
                        DIN 51757
                     
                     
                        Testing of mineral oils and related materials; determination of density
                     
                  
                        ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 and ASTM D 1481-62
                     
                  
                        ASTM D 1298
                     
                     
                        Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
                     
                  
                        BS 4714
                     
                     
                        Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
                     
                  1.3   Metodu tat-tagħdis ta' l-oġġett
            
                        DIN 53217
                     
                     
                        Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method
                     
                  2.   Metodi piknometriċi
            2.1.   Għal sustanzi likwidi
            
                        ISO 3507
                     
                     
                        Pycnometers
                     
                  
                        ISO 758
                     
                     
                        Liquid chemical products; determination of density at 20 oC
                     
                  
                        DIN 12797
                     
                     
                        Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous)
                     
                  
                        DIN 12798
                     
                     
                        Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00 . 10-6 m2 s-1 at 15 oC)
                     
                  
                        DIN 12800
                     
                     
                        Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798)
                     
                  
                        DIN 12801
                     
                     
                        Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than l00 . 10-6 m2 s-1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC)
                     
                  
                        DIN 12806
                     
                     
                        Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen)
                     
                  
                        DIN 12807
                     
                     
                        Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801)
                     
                  
                        DIN 12808
                     
                     
                        Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture)
                     
                  
                        DIN 12809
                     
                     
                        Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous)
                     
                  
                        DIN 53217
                     
                     
                        Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer
                     
                  
                        DIN 51757
                     
                     
                        Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density
                     
                  
                        ASTM D 297
                     
                     
                        Section 15: Rubber products – chemical analysis
                     
                  
                        ASTM D 2111
                     
                     
                        Method C: Halogenated organic compounds
                     
                  
                        BS 4699
                     
                     
                        Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)
                     
                  
                        BS 5903
                     
                     
                        Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary- stoppered pycnometer method
                     
                  
                        NF T 20-053
                     
                     
                        Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method
                     
                  2.2.   Għal sustanzi solidi
            
                        ISO 1183
                     
                     
                        Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics
                     
                  
                        NF T 20-053
                     
                     
                        Chemical products for industrial use -Determination of density of solids in powder and liquids -Pyknometric method
                     
                  
                        DIN 19683
                     
                     
                        Determination of the density of soils
                     
                  3.   Piknometru għat-tqabbil ma' l-arja
            
                        DIN 55990
                     
                     
                        Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte
                     
                  
                        DIN 53243
                     
                     
                        Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prüfung
                     
                  
         A.4.   PRESSJONI TAL-FWAR
         1.   METODU
         Il-maġġoranza tal-metodi mfissra huma bbażati fuq il-linja gwida tat-Test OECD (1). Il-prinċipji fundamentali huma mogħtija fir-referenzi (2) u (3).
         1.1.   DAĦLA
         Biex isir it-test huwa utli li jkollok informazzjoni preliminari dwar l-istruttura, it-temperatura tat-tidwib u t-temperatura tat-tgħolija tas-sustanza.
         Ma hemmx proċedura waħda ta' kejl applikabbli għall-iskala kollha tal-pressjonijiet tal-fwar. Għalhekk, huma rakkomandati bosta metodi għal kejl tal-pressjoni tal-fwar minn < 10-4 sa 105 Pa.
         L-impuritajiet is-soltu jaffettwaw il-pressjoni tal-fwar, u dan sa limitu li jiddependi ħafna fuq ix-xorta ta' impurità.
         Fejn ikun hemm impuritajiet volatili fil-kampjun, li jistgħu jaffettwaw ir-riżultat, is-sustanza tista' tiġi ppurifikata. Jista' jkun ukoll xieraq li tkun ikkwotata l-pressjoni tal-fwar għall-materjal tekniku.
         Uħud mill-metodi mfissra hawnhekk jużaw apparat b'partijiet metalliċi; għalhekk dan għandu jkunu kkunsidrat meta jsir test fuq sustanzi korrużivi.
         1.2.   TIFSIRIET U UNITAJIET
         Il-pressjoni tal-fwar ta' sustanzi hija mfissra bħala l-pressjoni ta' saturazzjoni 'il fuq mis-sustanza solida jew likwida. Fl-ekwilibriju termodinamiku, il-pressjoni tal-fwar ta' sustanza pura hija l-funzjoni tat-temperatura biss.
         L-unità tal-pressjoni SI li għandha tintuża hija l-pascal (Pa).
         L-unitajiet li storikament ġew użati, flimkien mal-fatturi tal-konverżjoni tagħhom, huma:
         
                     1 Torr (≡1 mm Hg)
                  
                  
                     = 1,333 x102 Pa
                  
               
                     1 atmosfera
                  
                  
                     = 1,013  x 105 Pa
                  
               
                     1 bar
                  
                  
                     = 105 Pa
                  
               L-unità SI tat-temperatura hija l-kelvin (K).
         Il-kostanti universali molari tal-gass R huwa 8,314 mol-1 K-1
         
         Id-dipendenza tat-temperatura tal-pressjoni tal-fwar hija mfissra mill-ekwazzjoni Clausius-Clapeyron:
         
            
         fejn:
         
                     p
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-pressjoni tal-fwar tas-sustanza f’pascals
                  
               
                     ΔHv
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     is-sħana ta' evaporizzazzjoni tagħha f’J mol-1
                     
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-kostanti universali tal-gass molari f’J mol-1 K-1
                     
                  
               
                     T
                  
                  
                     =
                  
                  
                     it-temperatura termodinamika f’K
                  
               1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Sustanzi ta' referenza mhumiex meħtieġa li jintużaw fil-każijietjiet kollha meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma għandhom iservu primarjament biex jiċċekkjaw r-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' riżultati minn metodi oħra.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODI TA' TTESTJAR
         Għad-determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar, huma proposti seba' metodi li jistgħu jiġu applikati fi skali differenti tal-pressjoni tal-fwar. Għal kull metodu, il-pressjoni tal-fwar hija ddeterminata f’temperaturi diversi. Fi skala limitata ta' temperatura, il-logaritmu tal-pressjoni tal-fwar ta' sustanza pura huwa l-funzjoni lineari ta' l-invers tat-temperatura.
         1.4.1.   Metodu dinamiku
         Fil-metodu dinamiku, titkejjel it-temperatura tat-tgħolija li tirrigwarda l-pressjoni speċifikata.
         Skala rakkomandata
         103 sa 105 Pa.
         Dan il-metodu huwa rakkomandat ukoll għad-determinazzjoni tat-temperatura tat-tgħolija normali u jintuża għal dan il-għan sa 600 K.
         1.4.2.   Metodu statiku
         Fil-proċess statiku, f’ekwilibriju termodinamiku, il-pressjoni tal-fwar stabbilita f’sistema magħluqa hija ddeterminata f’temperatura speċifikata. Dan il-metodu huwa adattat għall-komponent wieħed u solidi u likwidi multikomponenti.
         Skala rakkomandata:
         10 sa 105 Pa.
         Dan il-metodu jista' jintuża wkoll fl-iskala 1 sa 10 Pa, kemm-il darba tingħata attenzjoni xierqa.
         1.4.3.   Isoteniskopju
         Dan il-metodu standardizzat huwa wkoll metodu statiku iżda s-soltu mhuwiex adattat għal sistemi multikomponenti. Informazzjoni addizzjonali hija disponibbli fil-metodu ASTM D-2879-86.
         Skala rakkomandata:
         Minn 100 sa 105 Pa.
         1.4.4.   Metodu bl-effużjoni: Miżien bi pressjoni tal-fwar
         Il-kwantità ta' sustanza li tħalli ċellula għal kull unità ta' ħin minn ġo fetħa ta' daqs magħruf hija ddeterminata taħt kondizzjonijiet ta' vakwu b'tali mod li r-ritorn tas-sustanza fiċ-ċellula jkun insinifikanti (eż. bil-kejl ta' tektika ġġenerata fuq miżien sensittiv minn merżuq fwar jew bil-kejl tat-telf fil-piż).
         Skala rakkomandata:
         10-3 sa 1 Pa.
         1.4.5.   Metodu bl-effużjoni: Bit-telf fil-piż jew bil-qbid tat-tifwir
         Il-metodu huwa bbażat fuq l-estimu tal-piż tas-sustanza għat-test li tkun qed toħroġ ma' kull unità ta' ċellula Knudsen (4) fil-forma ta' fwar, permezz ta' fetħa ta' daqs mikro taħt kondizzjonijiet ta' ultravakwu. Il-piż ta' fwar effuż jista' jinkiseb jew bid-determinazzjoni tat-telf ta' piż taċ-ċellula jew bl-ikkondensar tal-fwar f’temperatura baxxa u bid-determinazzjoni ta' l-ammont ta' sustanza volatilizzata bl-użu ta' analiżi kromografika. Il-pressjoni tal-fwar hija kkalkulata bl-applikazzjoni tar-relazzjoni Kertz-Knudsen.
         Skala rakkomandata:
         10-3 sa 1 Pa.
         1.4.6.   Metodu bis-saturazzjoni tal-gass
         Fluss ta' gass trasportatur inert jiġi mgħoddi fuq is-sustanza b'tali mod li hija ssir saturata bil-fwar tagħha. L-ammont ta' materjal trasportat minn ammont magħruf ta' gass trasportatur jitqies jew bil-kollezzjoni f’kumpartiment għall-ġbir adattat jew b'teknika analitika intrain. Dan imbagħad jintuża biex tkun ikkalkulata l-pressjoni f’temperatura stabbilita.
         Skala rakkomandata:
         10-4 sa 1 Pa.
         Dan il-metodu jista' jintuża wkoll fl-iskala 1 sa 10 Pa, kemm-il darba tingħata attenzjoni xierqa.
         1.4.7.   Skrun li jdur
         Fil-gejġ ta' l-iskrun li jdur, l-element tal-kejl attwali huwa ballun żgħir ta' l-azzar li huwa sospiż f’kamp manjetiku u li jdur b'veloċità kbira. Il-pressjoni tal-gass tiġi dedotta mit-tnaqqis fid-dawran tal-ballun ta' l-azzar li jiddependi mill-pressjoni.
         Skala rakkomandata:
         10-4 sa 0,5 Pa.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         Id-diversi metodi ta' determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar huma mqabbla ma' dak li għandu x'jaqsam ma' l-applikazzjoni, ir-ripetibilità, ir-riproduċibilità, l-iskala ta' kejl u l-istandard eżistenti. Dan isir fit-tabella li ġejja.
         
                     Metodu ta' kejl
                  
                  
                     Sustanzi
                  
                  
                     Ripetibilità stmata (7)
                     
                  
                  
                     Riproduċibilità stmata (7)
                     
                  
                  
                     Skala rakkomandata
                  
                  
                     Standard Eżistenti
                  
               
                     solidi
                  
                  
                     likwidi
                  
               
                     
                                 1.4.1.
                              
                              
                                 Metodu dinamiku
                              
                           
                  
                     Tidwib baxx
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     Sa 25 %
                  
                  
                     sa 25 %
                  
                  
                     103 Pa sa 2x103 Pa
                  
                  
                     —
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1 sa 5 %
                  
                  
                     1 sa 5 %
                  
                  
                     2 x 103 Pa sa 105 Pa
                  
                  
                     —
                  
               
                     
                                 1.4.2.
                              
                              
                                 Metodu statiku
                              
                           
                  
                     iva
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     5 sa 10 %
                  
                  
                     5 sa 10 %
                  
                  
                     10Pa sa 105 Pa
                  
                  
                     NFT 20-048 (S)
                  
               
                     
                                 1.4.3.
                              
                              
                                 Iżoteniskopju
                              
                           
                  
                     iva
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     5 sa 20 %
                  
                  
                     5 sa 10 %
                  
                  
                     10-3 Pa sa 1 Pa
                  
                  
                     ASTM-D
                     2879-86
                  
               
                     
                                 1.4.4.
                              
                              
                                 Metodu ta' efużjoni
                              
                           Miżien tal-pressjoni tal-fwar
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     5 sa 20 %
                  
                  
                     sa 50 %
                  
                  
                     10-3 Pa sa 1 Pa
                  
                  
                     NFT
                     20-047(6)
                  
               
                     
                                 1.4.5.
                              
                              
                                 Metodu ta efużjoni
                              
                           Telf ta' piż
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     10 sa 30 %
                  
                  
                     —
                  
                  
                     10-3 Pa sa 1 Pa
                  
                  
                     —
                  
               
                     
                                 1.4.6.
                              
                              
                                 Metodu ta' saturazzjoni tal-gass
                              
                           
                  
                     iva
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     10 sa 30 %
                  
                  
                     sa 50 %
                  
                  
                     10-4 Pa sa 1 Pa (8)
                     
                  
                  
                     —
                  
               
                     
                                 1.4.7.
                              
                              
                                 Metodu ta' skrun li jdawwar
                              
                           
                  
                     iva
                  
                  
                     iva
                  
                  
                     10 sa 20 %
                  
                  
                     —
                  
                  
                     10-4 Pa sa 0,5  Pa
                  
                  
                     —
                  
               1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODI
         1.6.1.   Kejl dinamiku
         1.6.1.1.   Apparat
         L-apparat tal-kejl jikkonsisti tipikament f'reċipjent għat-tgħolija b'apparat li jżomm il-kesħa mqabbad miegħu li huwa magħmul mill-ħġieġ jew mill-metall (figura 1), tagħmir għall-kejl tat-temperatura, u tagħmir għar-regolazzjoni u l-kejl tal-pressjoni. Apparat tal-kejl tipiku muri fid-disinn huwa magħmul minn ħġieġ reżistenti għas-sħana u jikkonsisti minn ħames partijiet:
         It-tubu l-kbir b'superfiċje parzjalment doppja jikkonsisti f’ġonta li torbot mal-qiegħ, apparat li jkessaħ, reċipjent għat-tkessiħ u fetħa għad-dħul.
         Iċ-ċilindru tal-gass, b'pompa Cottrel, huwa mmuntat fit-taqsima tat-tgħolija tat-tubu u għandu superfiċje ħarxa ta' ħġieġ imfarrak biex jevita “ħbit” matul il-proċess tat-tgħolija.
         It-temperatura titkejjel b' senser tat-temperatura adattat (eż. termometru ta' reżistenza jew b' jacket thermocouple) imdaħħal fl-apparat sal-punt tal-kejl (Nru 5, figura 1) permezz ta' dħul adattat (eż. ġonta male li torbot mal-qiegħ).
         Il-konnessjonijiet neċessarji jsiru għar-regolazzjoni tal-pressjoni u tat-tagħmir tal-kejl.
         Il-bozza, li sservi bħala volum ta' protezzjoni, hija mgħaqqda ma' l-apparat tal-kejl permezz ta' tubu kapillari.
         Ir-reċipjent tat-tgħolija jissaħħan b'element tat-tisħin (eż. ħiter bil-cartridge) imdaħħal fl-apparat tal-ħġieġ minn taħt. Il-kurrent tat-tisħin meħtieġ huwa stabbilit u rregolat permezz ta' termokoppja.
         Il-vakwu neċessarju ta' bejn 102 Pa u approssimattivament 105 Pa jiġi prodott b'pompa tal-vakwu.
         Jintuża valv adattat biex ikejjel l-arja jew in-nitroġenu għar-regolazzjoni tal-pressjoni (skala ta' kejl approssimattivament 102 sa 105 Pa) u l-ventilazzjoni.
         Il-pressjoni titkejjel permezz ta' manometru.
         1.6.1.2.   Proċedura tal-kejl
         Il-pressjoni tal-fwar titkejjel bid-determinazzjoni tat-temperatura tat-tgħolija tal-kampjun b'diversi pressjonijiet speċifikati bejn wieħed u ieħor bejn 103 u 105 Pa. Temperatura stabbli taħt pressjoni kostanti tindika li t-temperatura tat-tgħolija tkun intlaħqet. Sustanzi bir-ragħwa ma jistgħux jitkejlu bl-użu ta' dan il-metodu.
         Is-sustanza titqiegħed f’reċipjent li jkun fih il-kampjun nadif u niexef. Jistgħu jinqalgħu problemi b'solidi mhux imfarrka iżda dawk kultant jistgħu jinħallu bit-tisħin tal-cooling jacket. Ladarba r-reċipjent jimtela’ l-apparat jiġi ssiġġillat fil-flanġ u jitneħħa l-gass mis-sustanza. L-inqas pressjoni mixtieqa imbagħad tiġi stabbilita u jinxtegħel l-apparat għat-tisħin. Fl-istess ħin, is-senser tat-temperatura jiġi kkonnettjat mar-rekorder.
         L-ekwilibriju jinkiseb meta temperatura tat-tgħolija kostanti tiġi rreġistrata fi pressjoni kostanti. Għandha tingħata attenzjoni partikulari biex ikun evitat ħbit matul t-tgħolija. Barra dan, trid issir kondensazzjoni kompleta fuq l-apparat li jżomm il-kesħa. Meta tkun qed tiġi ddeterminata l-pressjoni tal-fwar ta' solidi li jinħallu bil-mod, għandu tinghata attenzjoni sabiex il-kondensatur ma jiġix imblukkat.
         Wara li jkun irreġistrat dan il-punt ta' ekwilibriju, għandha tiġi stabbilita pressjoni ogħla. Il-proċess jitkompla b'dan il-mod sakemm jintlaħqu l-105 Pa (approssimattivament minn 5 sa 10 punti ta' kejl b'kollox). Bħala ċċekkjar, il-punti ta' ekwilibriju għandhom ikunu ripetuti taħt pressjonijiet dixxendentali.
         1.6.2.   Kejl statiku
         1.6.2.1.   Apparat
         L-apparat jinkludi kontenitur għall-kampjun, sistema ta' tisħin u ta' tkessiħ biex tirregola t-temperatura tal-kampjun u tkejjel it-temperatura. L-apparat jinkludi wkoll strumenti biex jiffissaw u jkejlu l-pressjoni. Il-figura 2a u 2b jillustraw il-prinċipji bażiċi involuti.
         Il-kompartiment għall-kampjun (figura 2a) hija marbuta fuq naħa waħda minn valv ta' vakwu għoli adattat. Tubu-U li jinkludi fluwidu tal-manometru adattat huwa mehmuż man-naħa l-oħra. Naħa mit-tubu-U toħroġ 'il barra mill-pompa tal-vakwu, miċ-ċilindru tan-nitroġenu jew mill-valv ta' ventilazzjoni, u minn manometru.
         Gejġ tal-pressjoni b'indikatur tal-pressjoni jista' jintuża flok tubu-U (Figura 2b).
         Bil-għan li tkun irregolata t-temperatura tal-kampjun, ir-reċipjent bil-kampjun flimkien mal-valv u t-tubu-U jew il-gejġ tal-pressjoni jitqiegħed f‘banju li jinżamm f’temperatura kostanti ta' 0,2 K. Il-kejl tat-temperatura jittieħed fuq in-naħa ta' barra tar-reċipjent bil-kampjun jew fir-reċipjent innifsu.
         Pompa tal-vakwu b'nassa li tkessaħ il-fluss tiela' 'l fuq tintuża biex tbattal l-apparat.
         Fil-metodu 2a l-pressjoni tal-fwar tas-sustanza titkejjel b'mod indirett bl-użu ta' indikatur żero. Dan jikkunsidra l-fatt li d-densità tal-fluwidu fit-tubu-U tinbidel jekk it-temperatura tinbidel ħafna.
         Il-fluwidi li ġejjin huma adattati għall-użu bħala indikaturi żero għat-tubu-U, skond l-iskala tal-pressjoni u l-proprjetajiet kimiċi tas-sustanza għat-test: fluwidi tas-silikone, ftalati. Is-sustanzi għat-test m'għandhomx jinħallu b'mod notevoli jew jirreaġixxu mal-fluwidu fit-tubu-U.
         Għall-manometru, jista' jintuża l-merkurju fl-iskala tal-pressjoni normali ta' l-arja sa 102 Pa, waqt li fluwidi tas-silikone u ftalati huma adattati għall-użu taħt l-102 Pa sa 10 Pa. Manometri ta' kapaċità b'membrana li jissaħħnu jistgħu jintużaw anke taħt l-10-1 Pa. Hemm ukoll gejġis tal-pressjoni oħra li jistgħu jintużaw taħt l-102 Pa.
         1.6.2.2.   Proċedura tal-kejl
         Qabel ma jsir il-kejl, il-komponenti kollha ta' l-apparat murija fil-figura 2 iridu jitnaddfu u jitnixxfu għal kollox.
         Għall-metodu 2a, it-tubu-U għandu jimtela’ bil-likwidu magħżul, li jrid jitneħħilu l-gass f’temperatura elevata qabel ma jittieħed il-qari.
         Is-sustanza għat-test titqiegħed fl-apparat, li mbagħad jingħalaq u t-temperatura titnaqqas b'mod suffiċjenti biex jitneħħa l-gass. It-temperatura trid tkun baxxa biżżejjed biex tiżgura li l-arja tinġibed 'il barra, iżda – fil-każ ta' sistema b'komponenti multipli – ma tridx tibdel il-kompożizzjoni tal-materjal. Jekk ikun meħtieġ, l-ekwilibriju jista' jiġi stabbilit aktar malajr permezz ta' tħawwid.
         Il-kampjun jista' jiġi mkessaħ ħafna eż. bin-nitroġenu likwidu (trid tingħata attenzjoni biex tkun evitata l-kondensazzjoni ta' l-arja jew il-pompa fluwida) jew b'taħlita ta' etanol u silġ niexef. Għal kejl f’temperatura baxxa għandu jintuża banju rregolat bit-temperatura kkonnettjat ma' ultra-cryomat.
         Bil-valv fuq ir-reċipjent tal-kampjun miftuħ, jiġi applikat ġbid għal diversi minuti biex titneħħa l-arja. Il-valv imbagħad jingħalaq u t-temperatura tal-kampjun titnaqqas għall-iktar livell baxx mixtieq. Jekk neċessarju, l-operazzjoni tat-tneħħija tal-gass trid tiġi ripetuta diversi drabi.
         Meta l-kampjun jissaħħan il-pressjoni tal-fwar togħla. Dan ibiddel l-ekwilibriju tal-fluwidu fit-tubu-U. Biex ikun hemm kumpens għal dan, jiddaħħal nitroġenu jew tiddaħħal arja fl-apparat permezz ta' valv sakemm il-fluwidu ta' l-indikatur tal-pressjoni jerġa' jinżel għal żero. Il-pressjoni meħtieġa għal dan tista' tinqara permezz ta' manometru ta' preċiżjoni f’temperatura ambjentali. Din il-pressjoni tikkorrispondi għall-pressjoni tal-fwar tas-sustanza f’dik it-temperatura partikulari tal-kejl.
         Il-metodu 2b huwa simili iżda l-pressjoni tal-fwar tinqara direttament.
         Id-dipendenza fuq it-temperatura tal-pressjoni tal-fwar hija ddeterminata b'intervalli żgħar adattati (approssimattivament minn 5 sa 10 punti ta' kejl b'kollox) sal-massimu mixtieq. Qari ta' temperatura baxxa jrid jiġi ripetut bħala kontroll.
         Jekk il-valuri miksuba minn qari ripetut ma jaqblux mal-kurva miksuba għat-temperatura li tkun qed tiżdied, dan jista' jkun minħabba waħda mir-raġunijiet li ġejjin:
         
                     1.
                  
                  
                     Il-kampjun għad fih l-arja (eż. materjali b'viskożità għolja) jew sustanzi li jagħlu bil-mod, li tinħareġ/jinħarġu matul it-tisħin u jistgħu jitneħħew bil-ġbid wara aktar supercooling.
                  
               
                     2.
                  
                  
                     It-temperatura tat-tkessiħ mhijiex baxxa biżżejjed. F’dan il-każ in-nitroġenu likwidu jintuża bħala aġent ta' tkessiħ.
                     Jekk raġuni 1 jew raġuni 2 tapplika, il-kejl irid jiġi ripetut.
                  
               
                     3.
                  
                  
                     Is-sustanza jkollha reazzjoni kimika fl-iskala ta' temperatura rreġistrata (eż. dekompożizzjoni, polimerizzazzjoni).
                  
               1.6.3.   Isoteniskopju
         Deskrizzjoni kompluta ta' dan il-metodu tista' tinsab fir-referenza 7. Il-prinċipju ta' l-apparat tal-kejl jidher fil-figura 3. L-istess bħall-metodu statiku mfisser f'1.6.2, l-isoteniskopju huwa adattat għall-investigazzjoni ta' solidi jew likwidi.
         Fil-każ ta' likwidi, is-sustanza nnifisha sservi bħala l-fluwidu fil-manometru awżiljarju. Kwantità ta' likwidu, suffiċjenti biex timtela' l-bozza jew is-sieq il-qasira tat-taqsima tal-manometru titqiegħed fl-isoteniskopju. L-isoteniskopju jitwaħħal mas-sistema tal-vakwu u jiġi evakwat, imbagħad jimtela’ bin-nitroġenu. L-evakwazzjoni u t-tindif tas-sistema huma ripetuti darbtejn biex jitneħħa l-ossiġenu residwu. L-isoteniskopju mimli jitpoġġa f’pożizzjoni orizzontali sabiex il-kampjun jinfirex fuq saff irqiq fil-bozza bil-kampjun u t-taqsima tal-manometru (parti-U). Il-pressjoni tas-sistema titnaqqas għal 133 Pa u l-kampjun jissaħħan bil-mod sakemm jiftaħ jagħli (tneħħija ta' gassijiet fissi maħlula). L-isoteniskopju mbagħad jitpoġġa b'tali mod li l-kampjun jerġa' lura fil-bozza u s-sieq l-qasira tal-manometru, sabiex it-tnejn li huma jintlew għal kollox bil-likwidu. Il-pressjoni tinżamm bħal meta jitneħħa l-gass; il-parti tal-bozza bil-kampjun miġbuda 'l barra tissaħħan bi fjamma żgħira sakemm il-fwar tal-kampjun rilaxxat jespandi b'mod suffiċjenti biex jieħu post parti mill-kampjun mill-parti ta' fuq tal-bozza u mid-driegħ tal-manometru fit-taqsima tal-manometru ta' l-isoteniskopju, u b'hekk jinħoloq spazju mimli bil-fwar mingħajr nitroġenu.
         L-isoteniskopju mbagħad jitpoġġa f’banju b'temperatura kostanti, u l-pressjoni tan-nitroġenu tiġi aġġustata sakemm il-pressjoni tiegħu tkun ugwali għal dik tal-kampjun. Il-bilanċ tal-pressjoni huwa indikat mit-taqsima tal-manometru ta' l-isoteniskopju. Fl-ekwilibriju, il-pressjoni tal-fwar tan-nitroġenu tkun ugwali għall-pressjoni tal-fwar tas-sustanza.
         Fil-każ ta' solidi, dipendenti fuq il-pressjoni u l-iskala tat-temperatura, jintużaw il-likwidi tal-manometru mniżżla f’1.6.2.1. Il-likwidu tal-manometru li jitneħħilu l-gass jintefa’ fin-nefħa tad-driegħ it-twil ta' l-isoteniskopju. Imbaghad is-solidu biex ikun investigat jitqiegħed fil-bozza u jitneħħilu l-gass f'temperatura elevata. Wara dan l-isoteniskopju jiġi inklinat sabiex il-likwidu tal-manometru jista' joħroġ fit-tubu-U. Il-kejl tal-pressjoni tal-fwar bħala funzjoni tat-temperatura jsir skond 1.6.2.
         1.6.4.   Metodu bl-effużjoni: Miżien bi pressjoni tal-fwar
         1.6.4.1.   Apparat
         Verżjonijiet diversi ta' l-apparat huma mfissra fil-letteratura (1). L-apparat imfisser hawnhekk juri l-prinċipji ġenerali involuti (figura 4). Il-Figura 4 turi l-komponenti ewlenin ta' l-apparat, li jinkludu kontenitur ta' l-azzar li ma jsaddadx jew tal-ħġieġ b'vakwu għoli, tagħmir li jipproduċi u jkejjel il-vakwu u komponenti mibnija fih stess biex ikejlu l-pressjoni tal-fwar fuq il-miżien. Dawn il-komponenti mibnija fl-apparat stess li ġejjin huma inklużi fl-apparat:
         
                     —
                  
                  
                     forn evaporatur bi flanġ u dħul li jdur. Il-forn evaporatur huwa reċipjent ċilindriku, magħmul minn eż. ramm jew minn liega kimikament reżistenti b'konduttività termika tajba. Reċipjent tal-ħġieġ bil-ġnub tar-ram. Il-forn għandu dijametru ta' madwar 3 sa 5 cm u huwa minn 2 sa 5 cm għoli. Hemm minn waħda sa tliet fetħiet ta' qisien differenti għall-fluss tal-fwar. Il-forn jissaħħan bi spiral li jsaħħan mdawwar mal-forn minn barra. Biex is-sħana ma tgħaddix lejn pjanċa tal-qiegħ, il-ħiter huwa marbut mal-pjanċa tal-qiegħ b'metall ta' konduttività termika baxxa (azzar magħmul minn nikil u fidda jew kromju u nikil), eż. pajp tan-nikil u fidda mwaħħal ma' fetħa għad-dħul li ddur jekk ikun qed jintuża forn b'diversi fetħiet. Dan l-arranġament għandu l-vantaġġ li jippermetti l-introduzzjoni ta' faxxa tar-ram. Dan jippermetti tkessiħ minn barra bl-użu ta' banju tat-tkessiħ.
                  
               
                     —
                  
                  
                     jekk l-għatu tal-forn tar-ram għandu tliet fetħiet ta' dijametri differenti f’angolu ta' 90o waħda ma' l-oħra, diversi skali tal-pressjoni tal-fwar fil-kamp tal-varjazzjoni tal-kejl kollu jistgħu jiġu koperti (fetħiet b'dijametru approssimattivament bejn 0,30 u 4,50 mm). Fetħiet kbar jintużaw għall-pressjoni tal-fwar baxxa u viċi versa. Il-fetħa mixtieqa jew il-pożizzjoni intermedjarja fil-fluss tal-fwar (il-fetħa tal-forn – it-tarka – il-platt tal-miżien), tista' tkun issettjata billi jiddawwar il-forn u l-fluss tal-molekuli jinħeles jew jitwassal mill-fetħa tal-forn għal fuq il-platt tal-miżien. Sabiex titkejjel it-temperatura tas-sustanza, termokoppja jew termometru ta' reżistenza titqiegħed/jitqiegħed f’punt adattat.
                  
               
                     —
                  
                  
                     'il fuq mit-tarka hemm il-platt tal-miżien li jagħmel parti minn miżien mikro b'sensittività għolja (ara hawn taħt). Il-platt tal-miżien għandu dijametru ta' approssimattivament 30 mm. Aluminju maħsul bid-deheb huwa materjal adattat.
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-platt tal-miżien huwa mdawwar b'kaxxa ċilindrika tar-ram isfar jew b'kaxxa ta' tkessiħ tar-ram. Ikun hemm fetħiet għal ġot-travu tal-miżien u fetħa fit-tarka għall-fluss tal-molekuli, skond it-tip tal-miżien, u għandhom jiggarantixxu kondensazzjoni kompleta tal-fwar fuq il-platt tal-miżien. It-tixrid ‘il barra tas-sħana huwa żgurat eż. permezz ta' strixxa tar-ram ikkonnettjata mal-kaxxa tat-tkessiħ. L-istrixxa tgħaddi mill-pjanċa tal-qiegħ u hija iżolata minnha termikament, eż. permezz ta' tubu ta' l-azzar magħmul minn kromju u nikil. L-istrixxa hija mgħaddsa fi flixkun Dewar li fih nitroġenu likwidu taħt il-pjanċa tal-qiegħ jew nitroġenu likwidu jiġi ċċirkolat minn ġo l-istrixxa. Għalhekk, il-kaxxa tat-tkessiħ tinżamm approssimattivament f’-120 oC. Il-platt tal-miżien jitkessaħ esklussivament bir-radjazzjoni u huwa sodisfaċenti għall-skala tal-pressjoni li qed jiġi investigat (tkessiħ ta' approssimattivament siegħa qabel jibda l-kejl),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-miżien jitqiegħed fuq il-kaxxa tat-tkessiħ. Imwieżen, eż miżien elettroniku mikro sensittiv b'żewġt dirgħajn (8) jew strument b'bobina li tiċċaqlaq ta' sensittività għolja ħafna (ara l-Linjagwida tat-Test OECD, l-Edizzjoni ta' 12.05.81).
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-pjanċa tal-qiegħ tinkorpora wkoll konnessjonijiet elettriċi għal termokoppji (jew termometri ta' reżistenza) u bobina tas-sħana,
                  
               
                     —
                  
                  
                     fir-reċipjent jiġi prodott vakwu permezz ta' pompa ta' vakwu parzjali jew pompa ta' vakwu qawwi (il-vakwu meħtieġ huwa ta' approssimattivament minn 1 sa 1 x10-3 Pa, li jinkiseb wara ippompjar għal sagħtejn). Il-pressjoni hija rregolata b'manometru ta' jonizzazzjoni adattata.
                  
               1.6.4.2.   Proċedura tal-kejl
         Ir-reċipjent jimtela’ bis-sustanza għat-test u l-għatu jingħalaq. It-tarka u l-kaxxa tat-tkessiħ tiġi mżerżqa fuq il-forn. L-apparat jingħalaq u l-pompi tal-vakwu jinxtegħlu. Il-pressjoni finali qabel il-bidu tat-teħid tal-kejl għandha tkun ta' approssimattivament 10-4 Pa. It-tkessiħ tal-kaxxa tat-kessiħ jibda f’10-2 Pa.
         Ladarba jinkiseb l-vakwu meħtieġ, ibda s-sensiela ta' kalibrazzjoni fl-inqas temperatura meħtieġa. Il-fetħa korrispondenti fl-għatu tiġi ffissata, il-fluss tal-fwar jgħaddi mit-tarka direttament fuq il-fetħa u jolqot il-platt tal-miżien imkessaħ. Il-platt tal-miżien irid ikun kbir biżżejjed biex jiżgura li jintalaqt mill-fluss kollu mgħoddi minn ġot-tarka. Il-momentum tal-fluss tal-fwar jaġixxi bħala qawwa kontra l-platt tal-miżien u l-molekuli jikkondensaw fuq is-superfiċje kiesħa tiegħu.
         Il-momentum u l-kondensazzjoni simultanja jipproduċu sinjal fuq ir-rekorder. VALUTAZZJONI tas-sinjali tipprovdi biċċtejn informazzjoni:
         
                     1.
                  
                  
                     Fl-apparat imfisser hawnhekk il-pressjoni tal-fwar hija ddeterminata direttament mill-momentum fuq il-platt tal-miżien (mhuwiex neċessarju li jkun magħruf il-piż molekulari għal dan (2)). Fatturi ġeometriċi bħal ma huma l-fetħa tal-forn u l-angolu tal-fluss molekulari jridu jiġu kkunsidratu meta jkun evalwat il-qari li jsir.
                  
               
                     2.
                  
                  
                     Il-piż tal-kondensat jista' jitkejjel fl-istess ħin u r-rata ta' evaporazzjoni tista' tkun ikkalkulata minn dan. Il-pressjoni tal-fwar tista' tkun ikkalkulata wkoll mir-rata ta' evaporazzjoni u mill-piż molekulari bl-użu tal-ekwazzjoni Hertz (2).
                  
               
            
         fejn:
         
                     G
                  
                  
                     =
                  
                  
                     ir-rata ta' evaporazzjoni (kgs-l m-2)
                  
               
                     M
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-piż molari (g mol-l)
                  
               
                     T
                  
                  
                     =
                  
                  
                     it-temperatura T (K)
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-kostanti universali tal-gass molari (Jmol-1 K-1)
                  
               
                     p
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-pressjoni tal-fwar (Pa)
                  
               Meta jintlaħaq il-vakwu neċessarju, is-serje ta' kejl tibda ma' l-inqas temperatura tal-kejl mixtieqa.
         Għal aktar kejl, it-temperatura hija miżjuda b'intervalli żgħar sakemm jintlaħaq il-valur tat-temperatura massima mixtieqa. Il-kampjun imbagħad jitkessaħ għal darb'oħra u t-tieni kurva tal-pressjoni tal-fwar tiġi rreġistrata. Jekk it-tieni test ma jikkonfermax ir-riżultati ta' l-ewwel test, allura huwa possibli li s-sustanza qed tiddekomponi fl-iskala tat-temperatura li qed titkejjel.
         1.6.5.   Metodu b'effużjoni – bit-telf ta' piż
         1.6.5.1.   Apparat
         L-apparat ta' effużjoni jikkonsisti mill-partijiet bażiċi li ġejjin:
         
                     —
                  
                  
                     it-tank li jista' jiġi ttermostat u evakwat u li fih hemm iċ-ċelluli ta' effużjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-pompa ta' vakwu għoli (eż. pompa ta' tixrid jew pompa turbomolekulari) b'gejġ ta' vakwu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     nassa, bl-użu ta' nitroġenu likwifikat jew silġ mnixxef.
                  
               Tank tal-vakwu ta' l-aluminju msaħħan bl-elettriku b'erba' ċelluli ta' effużjoni ta' azzar li ma jsaddadx huwa muri fil-figura 5 bħala eżempju. Folja ta' azzar li ma jsaddadx ta' madwar 0,3 mm ħxuna għandha fetħa ta' effużjoni ta' dijametru minn 0,2 sa 1,0 mm u hija mwaħħla maċ-ċellula ta' effużjoni permezz ta' għatu bil-viti.
         1.6.5.2.   Proċedura tal-kejl
         Is-sustanza ta' referenza u s-sustanza għat-test jiġu mimlija f’kull ċellula ta' effużjoni, id-dijaframma tal-metall bil-ftuħ hija mwaħħla permezz ta' l-għatu bil-viti, u kull ċellula tintiżen sa eżattezza ta' 0,1 mg. Iċ-ċellula titpoġġa f’apparat termostatiku, li mbagħad jitbattal sa taħt waħda mill-għaxar pressjonijiet previsti. F’intervalli ta' ħin iffissati li jvarjaw minn 5 sa 30 siegħa, l-arja tiddaħħal fl-apparat, u t-telf fil-piż taċ-ċellula ta' effużjoni jiġi ddeterminat billi tintiżen mill-ġdid.
         Bil-għan li jkun żgurat li r-riżultati ma jkunux influwenzati minn impuritajiet volatili, iċ-ċellula terġa' tintiżen f’intervalli ta' ħin iffissati biex ikun ikkontrollat li r-rata ta' evaporazzjoni tkun kostanti fuq ta' l-inqas tnejn minn dawn l-intervalli ta' ħin.
         Il-pressjoni tal-fwar p fiċ-ċellula ta' effużjoni tingħata minn:
         
            
         fejn:
         
                     p
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-pressjoni tal-fwar (Pa)
                  
               
                     m
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-piż tas-sustanza li toħroġ miċ-ċellula matul il-ħin t (kg)
                  
               
                     t
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-ħin (s)
                  
               
                     A
                  
                  
                     =
                  
                  
                     l-erja tat-toqba (m2)
                  
               
                     K
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-fattur ta' korrezzjoni
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-kostanti universali tal-gass (Jmol-1 K-1)
                  
               
                     T
                  
                  
                     =
                  
                  
                     it-temperatura (K)
                  
               
                     M
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-piż molekulari (kg mol-l)
                  
               Il-fattur ta' korrezzjoni K jiddependi fuq il-proporzjon tat-tul mar-raġġ tat-toqba ċilindrika.
         
                     proporzjon
                  
                  
                     0,1 
                  
                  
                     0,2 
                  
                  
                     0,6 
                  
                  
                     1,0 
                  
                  
                     2,0 
                  
               
                     K
                  
                  
                     0,952 
                  
                  
                     0,909 
                  
                  
                     0,771 
                  
                  
                     0,672 
                  
                  
                     0,514 
                  
               L-ekwazzjoni t’hawn taħt tista' tinkiteb:
         
            
         Fejn  u hija l-kostanti taċ-ċellula ta' effużjoni.
         Din il-kostanti E taċ-ċellula ta' effużjoni tista' tiġi ddeterminata b'sustanzi ta' referenza (2,9), bl-użu ta' l-ekwazzjoni li ġejja:
         
            
         fejn:
         
                     p(r)
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-pressjoni tal-fwar tas-sustanza ta' referenza (Pa)
                  
               
                     M(r)
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-piż molekulari tas-sustanza ta' referenza (kg x mol-l)
                  
               1.6.6.   Metodu bis-saturazzjoni tal-gass
         1.6.6.1.   Apparat
         Apparat tipiku użat biex jitwettaq dan it-test jinkludi numru ta' komponenti mogħtija fil-figura 6a u mfissra taħt (1).
         Gass inert:
         Il-gass trasportatur ma jridx jirreaġixxi kimikament mas-sustanza tat-test. In-nitroġenu s-soltu huwa suffiċjenti għal dan il-għan iżda f’xi okkażżjonijiet gassijiet oħra jistgħu jkunu meħtieġa (10). Il-gass użat irid ikun niexef (ara figura 6a, tifsira 4: senser ta' l-umdità relattiva).
         Kontroll tal-fluss:
         Sistema adattata għall-kontroll tal-gass hija meħtieġa biex tiżgura fluss kostanti u magħżul mill-kolonna tas-saturatur.
         Kumpartimenti li jiġbru l-fwar:
         Dawn huma dipendenti fuq il-karatteristiċi partikulari tal-kampjun u l-metodu ta' analiżi magħżul. Il-fwar irid jinqabad fi kwantità u f’forma li tippermetti analiżi sussegwenti. Għal xi sustanzi għat-test, kondensaturi li fihom likwidi bħal hexane u glikol etilene huma adattati. Għall-oħrajn, jistgħu japplikaw assorbenti solidi.
         Bħala alternattiva għall-kondensazzjoni tal-fwar u l-analiżi sussegwenti, jistgħu jintużaw tekniki analitiċi in-train, bħall-kromatografija, biex jiddeterminaw b'mod kwantitattiv l-ammont ta' materjal trasportat minn ammont magħruf ta' gass trasportatur. Barra dan, jista' jitkejjel it-telf tal-piż tal-kampjun.
         Apparat li jibdel is-sħana:
         Għal kejl f’temperaturi differenti jista' jkunu neċessarju li fl-apparat ikun inkluż apparat li jibdel is-sħana.
         Kolonna ta' saturazzjoni:
         Is-sustanza għat-test tiġi ddepożitata minn soluzzjoni fuq irfid inert adattat. L-irfid miksi jiġi introdott fil-kolonna ta' saturazzjoni, li d-dimensjoni u r-rata tal-fluss tagħha għandhom ikunu tali li tiġi assigurata saturazzjoni kompleta tal-gass trasportatur. Il-kolonna ta' saturazzjoni għandha tkun bit-termostat. Għal kejl ogħla mit-temperatura ambjentali, iż-żona bejn il-kolonna ta' saturazzjoni u l-kumpartimenti għall-ġbir għandha tissaħħan biex tevita l-kondensazzjoni tas-sustanza għat-test.
         Bil-għan li tnaqqas it-trasport tal-piż b'diffużjoni, jista' jitqiegħed kapillari wara l-kolonna ta' saturazzjoni (figura 6b).
         1.6.6.2.   Proċedura tal-kejl
         Preparazzjoni tal-kolonna ta' saturazzjoni:
         Soluzzjoni tas-sustanza għat-test f’solvent volatili ħafna tiżdied ma' ammont adattat ta' rfid. Kwantità suffiċjenti mis-sustanza għat-test għandha tiżdied biex tinżamm is-saturazzjoni għaż-żmien tat-test. Is-solvent jiġi evaporat totalment fl-arja jew f’evaportatur li jdur, u l-materjal imħawwad tajjeb jiġi miżjud mal-kolonna ta' saturazzjoni. Wara li jkun irregolat il-kampjun bit-termostat, nitroġenu niexef jiġi mgħoddi mill-apparat.
         Kejl:
         Il-kompartimenti għall-ġbir jew id-ditekters in-train jiġu kkonnettjati mal-linja effluwenti tal-kolonna u l-ħin jiġi rreġistrat. Ir-rata tal-fluss tiġi kkontrollata fil-bidu u f’intervalli regolari matul l-esperiment, bl-użu ta' miter tal-bużżieqa (jew kontinwament b'miter tal-fluss tal-piż).
         Il-pressjoni fil-fetħa tal-ħruġ għandha titkejjel. Dan jista' jsir jew:
         
                     (a)
                  
                  
                     bl-inklużjoni ta' gejġ tal-pressjoni bejn is-saturatur u l-kumpartimenti għall-ġbir (dan jista' ma jkunx sodisfaċenti għax iżid l-ispazju mejjet u s-superfiċje li tassorbixxi); jew
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     bid-determinazzjoni ta' l-inżul tal-pressjoni f’sistema partikulari ta' kumpartimenti għall-ġbir użata bħala funzjoni tar-rata tal-fluss f’esperiment separat (dan jista' ma jkunx sodisfaċenti ħafna għall-kondensaturi tal-likwidu).
                  
               Iż-żmien meħtieġ għall-kollezzjoni ta' kwantità ta' sustanza għat-test li hija neċessarja għal metodi differenti ta' analiżi huwa ddeterminat b'testijiet preliminari jew bi stimi. Bħala alternattiva għall-ġbir tas-sustanza għal aktar analiżi, tista' tintuża teknika analitika kwantitattiva bil-fluss (eż. kromatografija). Qabel il-kalkolu tal-pressjoni tal-fwar f’temperatura mogħtija, iridu jsiru testijiet preliminari biex tkun iddeterminata r-rata ta' fluss massima li tissatura kompletament il-gass trasportatur mal-fwar tas-sustanza. Din hija garantita jekk il-gass trasportatur jiġi mgħoddi mill-kolonna ta' saturazzjoni suffiċjentement bil-mod sabiex rata baxxa ma tagħtix kalkolu tal-pressjoni tal-fwar akbar.
         Il-metodu analitiku speċifiku jkun determinat min-natura tas-sustanza għat-test (eż. kromatografija tal-gass jew gravimetrija).
         Il-kwantità ta' sustanza ttrasportata minn volum magħruf ta' gass trasportatur hija ddeterminata.
         1.6.6.3.   Kalkolu tal-pressjoni tal-fwar
         Il-pressjoni tal-fwar hija kkalkulata mid-densità tal-fwar, W/V, permezz ta' l-ekwazzjoni:
         
            
         fejn:
         
                     P
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-pressjoni tal-fwar (Pa)
                  
               
                     W
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-piż ta' sustanza għat-test evaporata (g)
                  
               
                     V
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-volum ta' gass saturat (m3)
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-kostanti universali molari tal-gass (J mol-1 K-1)
                  
               
                     T
                  
                  
                     =
                  
                  
                     it-temperatura (K)
                  
               
                     M
                  
                  
                     =
                  
                  
                     piż molari tas-sustanza għat-test (g mol-l)
                  
               Volumi mkejla jridu jkunu korretti għad-differenzi fil-pressjoni u fit-temperatura bejn il-miter tal-fluss u s-saturatur b'termostat. Jekk il-miter tal-fluss qiegħed ‘l isfel mill-kompartiment għall-ġbir tal-fwar, jistgħu jkunu neċessarji korrezzjonijiet biex tingħata kunsiderazzjoni għal xi ingredjenti vaporizzati fil-kompartiment għall-ġbir (1).
         1.6.7.   Skrun li jdur (8, 11, 13)
         1.6.7.1.   Apparat
         It-teknika ta' l-iskrun li jdur tista' titwettaq bl-użu ta' gejġ tal-visżkożità ta' l-iskrun li jdur kif murija fil-figura 8. Disinn skematiku ta' l-esperiment jidher fil-figura 7.
         L-apparat tal-kejl jikkonsisti tipikament minn skrun li jdawwar li l-parti ta' fuq tiegħu tintuża għall-kejl, impoġġija fi spazju magħluq b'termostat (irregolat sa 0,1 oC). Il-kontenitur għall-kampjun jitpoġġa fi spazju magħluq b'termostat (irregolat sa 0,1 oC), u l-partijiet l-oħra kollha ta' l-apparat jinżammu f’temperatura ogħla biex tiġi evitata l-kondensazzjoni. Apparat ta' pompa b'vakwu għoli huwa kkonnettjat mas-sistema permezz ta' valvijiet b'vakwu għoli.
         Il-parti ta' fuq ta' l-iskrun li jdur li tintuża għall-kejl tikkonsisti minn ballun ta' l-azzar (minn 4 sa 5 mm dijametru) f’tubu. Il-ballun huwa sospiż u stabbilizzat f’kamp manjetiku, ġeneralment bl-użu ta' kombinazzjoni ta' kalamiti permanenti u bobini ta' kontroll.
         Il-ballun jiddawwar mill-kampijiet li jduru prodotti mill-bobini. Bobini pick-up, li jkejlu l-manjetizzazzjoni baxxa laterali dejjem preżenti tal-ballun, jippermettu li r-rata ta' dawran tkun imkejla.
         1.6.7.2   Proċedura tal-kejl
         Meta l-ballun ikun laħaq veloċità determinata ta' rotazzjoni v(o) (is-soltu madwar 400 revoluzzjoni kull sekonda), tieqaf il-fornitura ta' l-enerġija u titnaqqas il-veloċità, minħabba l-frizzjoni mal-gass.
         It-tnaqqis fil-veloċità tar-rotazzjoni titkejjel bħala funzjoni tal-ħin. Peress li l-frizzjoni kkawżata mis-sospensjoni manjetika hija insinifikanti meta mqabbla mal-frizzjoni tal-gass, il-pressjoni tal-gass p tinsab minn:
         
            
         fejn
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-veloċità medja tal-molekuli tal-gass
                  
               
                     r
                  
                  
                     =
                  
                  
                     ir-raġġ tal-ballun
                  
               
                     ρ
                  
                  
                     =
                  
                  
                     id-densità tal-piż tal-ballun
                  
               
                     σ
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-koeffiċjent tat-trasferiment tanġenzjali tal-momentum (ε = għal superfiċje sferikali ideali tal-ballun)
                  
               
                     t
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-ħin
                  
               
                     v(t)
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-veloċità tar-rotazzjoni wara l-ħin t
                  
               
                     v(o)
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-veloċità tar-rotazzjoni inizjali
                  
               L-ekwazzjoni tista' tinkiteb ukoll:
         
            
         fejn tn, tn - 1 huma l-ħinijiet meħtieġa għal numru determinat N ta' revoluzzjonijiet. Dawn l-intervalli ta' ħin tn u tn-1 jiġu wara xulxin, u tn > t n - 1.
         Il-veloċità medja tal-molekula tal-gass  hija mogħtija bi:
         
            
         fejn:
         
                     T
                  
                  
                     =
                  
                  
                     it-temperatura
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-kostanti molari universali tal-gass
                  
               
                     M
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-piż molari
                  
               2.   DATA
         Il-pressjoni tal-fwar minn kwalunkwe metodu preċedenti għandha tkun iddeterminata għal ta' l-inqas żewġ temperaturi. Tlieta jew aktar huma preferuti fl-iskala minn 0 sa 50 oC, bil-għan li tkun ikkontrollata l-linearità tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar.
         3.   RAPPURTAR
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     il-metodu użat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet) u l-istadju preliminarju ta' purifikazzjoni, jekk hemm,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ta' l-inqas żewġ valuri tal-pressjoni tal-fwar u tat-temperatura, preferibbilment fl-iskala minn 0 sa 50 oC,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-DATA kollha mhux maħduma,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kurva log p versus 1/T,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-istima tal-pressjoni tal-fwar f’20 jew 25 oC.
                  
               Jekk tkun osservata xi transizzjoni (bdil fl-istat, dekompożizzjoni), l-informazzjoni li ġejja għandha tkun innotata:
         
                     —
                  
                  
                     in-natura tal-bidla,
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-temperatura li fiha saret il-bidla fi pressjoni atmosferika,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-pressjoni tal-fwar f’10 u 20 oC taħt it-temperatura ta' transizzjoni u 10 u 20 oC fuq din it-temperatura (kemm-il darba it-transizzjoni ma tkunx minn solidu għall-gass).
                  
               L-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rrapportati, b'mod speċjali fir-rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.
         4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol II.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa -Static method.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa -Vapour pressure balance method.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure- temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987,'VoI. 5 (4),2440.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, Vol. 17 (2),642.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, voI. 20 (4),1148.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, Vol. 3 (3),1715.
                  
               
            Appendiċi 1
            Metodu ta' stima
            DAĦLA
            Il-valuri kkalkulati tal-pressjoni tal-fwar jistgħu jintużaw:
            
                        —
                     
                     
                        biex ikun deċiż liema mill-metodi sperimentali huwa adattat,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        biex tkun provduta stima jew valur ta' limitu f'każijiet fejn il-metodu sperimentali ma jistax jiġi applikat minħabba raġunijiet tekniċi (anke fejn il-pressjoni tal-fwar hija baxxa ħafna),
                     
                  
                        —
                     
                     
                        biex jgħinu l-identifikazzjoni ta' dawk il-każijietjiet fejn huwa ġġustifikat li jitħalla barra l-kejl sperimentali għax il-pressjoni tal-fwar hija mistennija li tkun < 10 -5 Pa f'temperatura ambjentali.
                     
                  METODU TA' STIMA
            Il-pressjoni tal-fwar tal-likwidi u solidi tista' tkun stmata bl-użu tal-Watson Correlation (a) immodifikata. L-unika DATA sperimentali meħtieġa hija t-temperatura normali tat-tgħolija. Il-metodu japplika fuq l-iskala tal-pressjoni minn 105 Pa to 10-5 Pa.
            Informazzjoni dettaljata dwar il-metodu hija mogħtija fil-“Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (b).
            PROĊEDURA TA' KALKOLU
            Skond (b) il-pressjoni tal-fwar hija kkalkulata kif ġej:
            
               
            fejn:
            
                        T
                     
                     
                        = it-temperatura ta' interess
                     
                  
                        Tb
                        
                     
                     
                        = it-temperatura normali bit-tgħolija
                     
                  
                        Pvp
                        
                     
                     
                        = il-pressjoni tal-fwar f'temperatura T
                     
                  
                        ΔHvb
                        
                     
                     
                        = is-sħana ta' l-evaporazzjoni
                     
                  
                        ΔZb
                        
                     
                     
                        = il-fattur ta' kompressibilità (stmata f’0,97)
                     
                  
                        m
                     
                     
                        = il-fattur empiriku li jiddependi fuq l-istat fiżiku fit-temperatura ta' interess
                     
                  Ma' dan
            
               
            fejn Kf huwa l-fattur empiriku meta tkun ikkunsidrata l-polarità tas-sustanza. Għal diversi tipi ta' komposti, fatturi Kf huma mniżżla fir-referenza (b).
            Spiss mhux ħażin, ikun hemm disponibbli d-DATA li tingħata meta t-temperatura tat-tgħolija tkun fi pressjoni mnaqqsa. F'każ bħal dan, skond (b), il-pressjoni tal-fwar hija kkalkulata kif ġej:
            
               
            fejn T1 hija t-temperatura tat-tgħolija fi pressjoni mnaqqsa P1.
            RAPPORT
            Fejn jintuża l-metodu ta' stima, ir-rapport għandu jinkludi dokumentazzjoni komprensiva tal-kalkolu.
            LETTERATURA
            
                        (a)
                     
                     
                        K.M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, vol. 35, 398.
                     
                  
                        (b)
                     
                     
                        W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.
                     
                  
         
            Appendiċi 2
            Figura 1
            Apparat għad-determinazzjoni tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar skond il-metodu dinamiku
            Figura 2a
            Apparat għad-determinazzjoni tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar skond il-metodu statiku (bl-użu ta' manometru b'tubu-U)
            Figura 2b
            Apparat għad-determinazzjoni tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar skond il-metodu statiku (bl-użu ta' indikatur tal-pressjoni)
            Figura 3
            Isoteniskopju (ara ir-referenza 7)
            Figura 4
            Apparat għad-determinazzjoni tal-kurva tal-pressjoni tal-fwar skond il-metodu bil-miżien tal-pressjoni tal-fwar
            Figura 5
            Eżempju ta' apparat għall-evaporazzjoni fi pressjoni baxxa bil-metodu ta' effużjoni, b'volum ta' ċellula ta' effużjoni ta 8 cm3
            
            Figura 6a
            Eżempju ta' sistema ta' fluss għad-determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar bil-metodu ta' saturazzjoni bil-gass
            Figura 6 b
            Eżempju ta' sistema għad-determinazzjoni tal-pressjoni tal-fwar bil-metodu ta' saturazzjoni tal-gass, b'kapillari mqiegħed wara l-kopartiment ta' saturazzjoni.
            Figura 7
            Eżempju ta' apparat sperimentali armat għall-metodu ta' l-iskrun li jdur
            Figura 8
            Eżempju tal-parti ta' fuq li tintuża għall-kejl ta'skrun li jdur
            
         A.5.   TENSJONI TAS-SUPERFIĊJE
         1.   METODU
         Il-metodi mfissra huma bbażati fuq il-linja gwida tat-Test OECD (1). Il-prinċipji fundamentali huma mogħtija fir-referenzi (2).
         1.1.   DAĦLA
         Il-metodi mfissra għandhom jiġu applikati għall-kejl tat-tensjoni fuq is-superfiċje ta' soluzzjonijiet ta' l-ilma.
         Qabel ma jsiru dawn it-testijiet huwa utli li jkollok informazzjoni preliminari dwar is-solubilità ta' l-ilma, l-istruttura, il-proprjetajiet ta' l-idrolisi u l-konċentrazzjoni għall-formazzjoni ta' micelles mis-sustanza.
         Il-metodi li ġejjin japplikaw għall-parti l-kbira tas-sustanzi kimiċi, mingħajr ebda restrizzjoni fir-rigward tal-grad tal-purità tagħhom.
         Il-kejl tat-tensjoni tas-superfiċje bil-metodu tat-tensiometer bil-ħolqa huwa ristrett għal soluzzjonijiet fl-ilma b’viskożità dinamika ta' inqas minn approssimattivament 200 mPa s.
         1.2.   TIFSIRIET U UNITAJIET
         L-entalpija ħielsa tas-superfiċje għal kull unità ta' l-erja tas-superfiċje hija msejħa t-tensjoni tas-superfiċje.
         It-tensjoni tas-superfiċje tingħata bħala:
         N/m (unità SI) jew
         mN/m (sub-unità SI)
         1 N/m = 103 dini/cm
         1 mN/m = 1 dina/cm fis-sistema cgs li m'għadhiex tintuża
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Sustanzi ta' referenza mhumiex meħtieġa li jintużaw fil-każijiet kollha meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma għandhom iservu primarjament biex minn żmien għal żmien jiċċekkjaw ir-rendiment tal-metodu u sabiex jippermettu tqabbil ma' riżultati minn metodi oħra.
         Sustanzi ta' referenza li jkopru firxa kbira ta' tensjoni tas-superfiċje jingħataw fir-referenzi 1 u 3.
         1.4.   PRINĊIPJI TAL-METODI
         Il-metodi huma bbażati fuq il-kejl tal-qawwa massima li hemm bżonn li tkun eżerċitata b'mod vertikali, fuq staffa jew ħolqa f’kuntatt mas-superfiċje tal-likwidu li jkun qed jiġi eżaminat imqiegħed f’reċipjent tal-kejl, bil-għan li jkun separat minn din is-superfiċje, jew fuq pjanċa, bit-tarf f’kuntatt mas-superfiċje, bil-għan li tinġibed ir-rita li tkun ffurmat.
         Sustanzi li jinħallu fl-ilma f’millinqas konċentrazzjoni ta' 1 mg/l jiġu ttestjati f’soluzzjoni fl-ilma f’konċentrazzjoni waħda.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         Dawn il-metodi kapaċi jagħtu preċiżjoni akbar milli mistennija li tkun meħtieġa għall-valutazzjoni ambjentali.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODI
         Soluzzjoni tas-sustanza titħejja f’ilma distillat. Il-konċentrazzjoni ta' din is-soluzzjoni għandha tkun 90 % tas-solubilità tas-saturazzjoni tas-sustanza fl-ilma, meta din il-konċentrazzjoni taqbeż 1 g/l, konċentrazzjoni ta' 1 g/l tiġi użata għat-test. Mhux meħtieġ li jkunu ttestjati sustanzi b'solubilità fl-ilma ta' inqas minn 1 mg/l.
         1.6.1.   Il-metodu tal-pjanċa
         Ara ISO 304 u NF T 73-060 (Aġenti attivi fis-superfiċje – determinazzjoni tat-tensjoni tas-superfiċje bil-ġbid tar-rita tal-likwidu).
         1.6.2.   Metodu ta' l-istaffa
         Ara ISO 304 u NF T 73-060 (Aġenti attivi fis-superfiċje – determinazzjoni tat-tensjoni tas-superfiċje bil-ġbid tar-rita tal-likwidu).
         1.6.3.   Metodu tal-ħolqa
         Ara ISO 304 u NF T 73-060 (Aġenti attivi fis-superfiċje – determinazzjoni tat-tensjoni tas-superfiċje bil-ġbid tar-rita tal-likwidu).
         1.6.4.   Il-metodu armonizzat tal-ħolqa ta' l-OECD
         1.6.4.1.   Apparat
         
            Tensiometers disponibbli kummerċjalment huma adegwati għal dan il-kejl. Huma jikkonsistu minn dawn l-elementi:
         
                     —
                  
                  
                     il-mejda mobbli għall-kampjun,
                  
               
                     —
                  
                  
                     is-sistema ta' kejl tal-qawwa,
                  
               
                     —
                  
                  
                     korp tal-kejl,
                  
               
                     —
                  
                  
                     reċipjent tal-kejl.
                  
               1.6.4.1.1.   Mejda mobbli għall-kampjun
         
         Il-mejda mobbli għall-kampjun tintuża bħala rfid għar-reċipjent ta' kejl kontrollat tat-temperatura li jżomm il-likwidu għat-test. Flimkien mas-sistema ta' kejl tal-qawwa, hija mmuntata fuq struttura wieqfa.
         1.6.4.1.2.   Sistema ta' kejl tal-qawwa
         
         Is-sistema ta' kejl tal-qawwa (ara l-figura) tinsab fuq il-mejda li żżomm il-kampjun. L-iżball ta' kejl tal-qawwa m'għandux jaqbeż ± 10-6 N, li jikkorrispondi mal-limitu ta' żball ta' ±0,1 mg f’kejl ta' piż. F’bosta każijietjiet, l-iskala tal-kejl ta' tensiometers disponibbli kummerċjalment hija kkalibrata fi mN/m sabiex it-tensjoni tas-superfiċje tista' tinqara direttament f’mN/m b'eżattezza ta' 0,1 mN/m.
         1.6.4.1.3.   Korp ta' kejl (ħolqa)
         
         Il-ħolqa hija magħmula normalment minn wajer ta' platinu-iridju ta' madwar 0,4 mm ħxuna u ċirkumferenza medja ta' 60 mm. Il-ħolqa tal-wajer hija sospiża orizzontalment minn pinn tal-metall u brazz tal-wajer għall-immuntar biex tkun stabbilita l-konnessjoni mas-sistema tal-kejl tal-forza (ara l-figura).
         Figura
         Korp tal-kejl
         (Id-dimensjonijiet kollha f’millimetri)
         1.6.4.1.4.   Reċipjent tal-kejl
         
         Ir-reċipjent tal-kejl li fih is-sustanza tat-test li se tiġi mkejla għandu jkun tal-ħġieġ b'temperatura kkontrollata. Huwa għandu jkun iddisinjat b'tali mod li matul il-kejl it-temperatura tal-likwidu tas-soluzzjoni għat-test u l-fażi tal-gass “il fuq mis-superfiċje tibqa” kostanti u li l-kampjun ma jistax jevapora. Huma aċċettabbli reċipjenti ċilindriċi tal-ħġieġ li jkollhom dijametru intern ta' mhux inqas minn 45 mm.
         1.6.4.2.   Preparazzjoni ta' l-apparat
         1.6.4.2.1.   Tindif
         
         Reċipjenti tal-ħġieġ għandhom jitnaddfu bl-attenzjoni. Jekk neċessarju huma għandhom jinħaslu b'aċidu kromo-sulfuriku, imbagħad b'aċidu fosforiku bħall-ġulepp (minn 83 % sa 98 % mill-piż H3PO4), imlaħlaħ sewwa fl-ilma tal-vit u fl-aħħar maħsul b'ilma distillat għal darbtejn sakemm tinkiseb reazzjoni newtrali u sussegwentement imnixffa jew imlaħalħa b'parti mil-likwidu tal-kampjun li se jitkejjel.
         Il-ħolqa trid l-ewwel titlaħlaħ sewwa fl-ilma biex jitneħħew xi sustanzi li jinħallu fl-ilma, titgħaddaa għal ftit fl-aċidu kromo-sulfuriku, tinħasel f’ilma distillat għal darbtejn sakemm tinkiseb reazzjoni newtrali u finalment tissaħħan ftit fuq fjamma tal-metanol.
         
            Nota:
         
         Il-kontaminazzjoni minn sustanzi li ma jinħallux jew li jinqerdu minn aċidu kromo-sulfuriku jew aċidu fosforiku, bħas-silikone, għandha titneħħa permezz ta' solvent organiku adattat.
         1.6.4.2.2.   Kalibrazzjoni ta' l-apparat
         
         Il-validazzjoni ta' l-apparat tikkonsisti mill-verifika tal-punt żero u minn aġġustament sabiex l-indikazzjoni ta' l-istrument tippermetti determinazzjonali affidabbli f’mN/m.
         Immuntar:
         L-apparat għandu jkun invellat, eżempju permezz ta' livell ta' l-ispirtu fuq il-bażi tat-tensiometer, billi jiġu aġġustati l-viti fil-bażi.
         Aġġustament tal-punt żero:
         Wara l-immuntar tal-ħolqa fuq l-apparat u qabel ma tkun mgħaddsa fil-likwidu, l-indikazzjoni tat-tensiometer għandha tkun aġġustata għal żero u l-ħolqa ċċekkjata għall-parallelliżmu mal-likwidu tas-superfiċje. Għal dan il-għan, il-likwidu tas-superfiċje jista' jintuża bħala mera.
         Kalibrazzjonijiet:
         Il-kalibrazzjoni tat-test attwali tista' ssir permezz ta' waħda minn dawn iż-żewġ proċeduri:
         
                     (a)
                  
                  
                     Bl-użu ta' piż: proċedura bl-użu ta' rikkieba ta' piż magħruf bejn 0,1 u 1,0 g mqiegħdin fuq il-ħolqa. Il-fattur ta' kalibrazzjoni, Φa li miegħu jrid jiġi mmultiplikat il-qari kollu ta' l-istrumenti, għandu jkun ddeterminat skond l-ekwazzjoni (1).
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (1)
                              
                           fejn:
                     
                         (mN/m)
                     
                                 m
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 il-piż tar-rikkieb (g)
                              
                           
                                 g
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 l-aċċellerazzjoni tal-gravità (981 cm s-2 fil-livell tal-baħar)
                              
                           
                                 b
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 iċ-ċirkumferenza medja tal-ħolqa (cm)
                              
                           
                                 σa
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 il-qari tat-tensiometer wara li jitpoġġa r-rikkieb fuq il-ħolqa (mN/m).
                              
                           
               
                     (b)
                  
                  
                     Bl-użu ta' l-ilma: proċedura li tuża ilma pur li t-tensjoni tas-superfiċje tiegħu f’eżempju 23 oC hija ugwali għal 72,3 mN/m. Din il-proċedura titwettaq b'aktar ħeffa mill-kalibrazzjoni tal-piż iżda dejjem hemm il-periklu li t-tensjoni tas-superfiċje ta' l-ilma tkun iffalsifikata minn traċċi ta' kontaminazzjoni mis-surfattanti.
                     Il-fattur ta' kalibrazzjoni, Φa li miegħu jrid jiġi mmultiplikat il-qari kollu ta' l-istrument, għandu jkunu ddeterminat skond l-ekwazzjoni (2).
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (2)
                              
                           fejn:
                     
                                 σo
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 il-valur ċitat fil-letteratura għat-tensjoni tas-superfiċje ta' l-ilma (mN/m)
                              
                           
                                 σg
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 il-valur mkejjel tat-tensjoni tas-superfiċje ta' l-ilma (mN/m) it-tnejn fl-istess temperatura.
                              
                           
               1.6.4.3.   Preparazzjoni tal-kampjuni
         Soluzzjonijiet fl-ilma għandhom jitħejjew mis-sustanzi li se jkunu ttestjati, bl-użu tal-konċentrazzjonijiet meħtieġa fl-ilma, u m'għandhomx jinkludu xi sustanzi li ma nħallux.
         Is-soluzzjoni trid tinżamm f’temperatura kostanti (±0,5 oC). Ladarba t-tensjoni tas-superficje tas-soluzzjoni fir-reċipjent tal-kejl tinbidel fuq perjodu ta' żmien, diversi kejlijiet għandhom isiru f’ħinijiet differenti u ssir kurva li turi t-tensjoni tas-superfiċje bħala funzjoni taż-żmien. Meta ma ssir ebda bidla oħra, ikun intlaħaq stat ta' ekwilibriju.
         Kontaminazzjoni ta' trab jew ta' gassijiet minn sustanzi oħra tinterferixxi mal-kejl. Ix-xogħol għalhekk għandu jitwettaq taħt għata ta' protezzjoni.
         1.6.5.   Kondizzjonijiet tat-test
         Il-kejl għandu jsir f’approssimattivament 20 oC u għandu jkun ikkontrollat sa ±0,5 oC,
         1.6.6.   L-eżekuzzjoni tat-test
         Is-soluzzjonijiet biex jiġu mkejla għandhom ikunu trasferiti fir-reċipjent tal-kejl imnaddaf sewwa, bl-attenzjoni biex ma jkunx hemm ragħwa, u sussegwentement ir-reċipjent tal-kejl għandu jitpoġġa fuq il-mejda ta' l-apparat tat-test. Il-wiċċ tal-mejda bir-reċipjent tal-kejl għandu jittella’ sakemm il-ħolqa titgħaddas taħt il-wiċċ tas-soluzzjoni li se titkejjel. Sussegwentement, il-wiċċ tal-mejda jitbaxxa gradwalment u b'mod ibbalanċjat b'rata ta' approssimattivament 0,5 cm/min) biex tinqala’ l-ħolqa mill-wiċċ sakemm tintlaħaq il-forza massima. Is-saff likwidu mwaħħal mal-ħolqa ma jridx jissepara mill-ħolqa. Wara li jintemmu l-kejlijiet, il-ħolqa għandha titbaxxa għal darb'oħra taħt il-wiċċ u l-kejl jiġi ripetut sakemm jintlaħaq valur ta' tensjoni tas-superfiċje kostanti. Il-ħin tat-trasferiment tas-soluzzjoni għar-reċipjent tal-kejl għandu jkun irreġistrat għal kull determinazzjoni. Il-qari għandu jittieħed fil-forza massima meħtieġa biex il-ħolqa tinqala’ mill-wiċċ tal-likwidu.
         2.   DATA
         Bil-għan li tkun ikkalkulata t-tensjoni tas-superfiċje, il-valur moqri f’mN/m fuq l-apparat għandu l-ewwel jiġi mmultiplikat bil-fattur tal-kalibrazzjoni Φa u Φb (jiddependi fuq il-proċedura ta' kalibrazzjoni użata). Dan jagħti valur li japplika biss approssimattivament u għalhekk jeħtieġ korrezzjoni.
         Harkins u Jordan (4) iddeterminaw b'mod empiriku fatturi ta' korrezzjoni għall-valuri tat-tensjoni tas-superfiċje mkejla bil-metodu tal-ħolqa li huma dipendenti fuq id-dimensjonijiet tal-ħolqa, id-densità tal-likwidu u t-tensjoni tas-superfiċje tiegħu.
         Peress li d-determinazzjoni tal-fattur ta' korrezzjoni għal kull kejl individwali mit-tabelli Harkins and Jordan teħtieġ ħafna xogħol, sabiex tkun ikkalkulata t-tensjoni tas-superfiċje għal soluzzjonijiet fl-ilma tista’ tintuża l-proċedura simplifikata tal-qari tal-valuri kkorreġuti tat-tensjoni tas-superfiċje direttament mit-tabella. (Għandha tintuża l-interpolazzjoni għall-qari fl-iskala bejn il-valuri tabulari).
         Tabella
         Korrezzjoni tat-tensjoni tas-superfiċje mkejla
         
            Għal soluzzjonijiet fl-ilma biss, ρ = 1 g/cm3
            
         
         
                     r
                  
                  
                     = 9,55  mm (raġġ medju tal-ħolqa)
                  
               
                     r
                  
                  
                     = 0,185  mm (raġġ medju tal-ħolqa)
                  
               
            
         
                     Valur Sperimentali (mN/m)
                  
                  
                     Valur Ikkoreġut (mN/m)
                  
               
                     Kalibrazzjoni tal-piż (ara 1.6.4.2.2(a))
                  
                  
                     Kalibrazzjoni ta' l-ilma (ara 1.6.4.2.2(b))
                  
               
                     20
                  
                  
                     16,9 
                  
                  
                     18,1 
                  
               
                     22
                  
                  
                     18,7 
                  
                  
                     20,1 
                  
               
                     24
                  
                  
                     20,6 
                  
                  
                     22,1 
                  
               
                     26
                  
                  
                     22,4 
                  
                  
                     24,1 
                  
               
                     28
                  
                  
                     24,3 
                  
                  
                     26,1 
                  
               
                     30
                  
                  
                     26,2 
                  
                  
                     28,1 
                  
               
                     32
                  
                  
                     28,1 
                  
                  
                     30,1 
                  
               
                     34
                  
                  
                     29,9 
                  
                  
                     32,1 
                  
               
                     36
                  
                  
                     31,8 
                  
                  
                     34,1 
                  
               
                     38
                  
                  
                     33,7 
                  
                  
                     36,1 
                  
               
                     40
                  
                  
                     35,6 
                  
                  
                     38,2 
                  
               
                     42
                  
                  
                     37,6 
                  
                  
                     40,3 
                  
               
                     44
                  
                  
                     39,5 
                  
                  
                     42,3 
                  
               
                     46
                  
                  
                     41,4 
                  
                  
                     44,4 
                  
               
                     48
                  
                  
                     43,4 
                  
                  
                     46,5 
                  
               
                     50
                  
                  
                     45,3 
                  
                  
                     48,6 
                  
               
                     52
                  
                  
                     47,3 
                  
                  
                     50,7 
                  
               
                     54
                  
                  
                     49,3 
                  
                  
                     52,8 
                  
               
                     56
                  
                  
                     51,2 
                  
                  
                     54,9 
                  
               
                     58
                  
                  
                     53,2 
                  
                  
                     57,0 
                  
               
                     60
                  
                  
                     55,2 
                  
                  
                     59,1 
                  
               
                     62
                  
                  
                     57,2 
                  
                  
                     61,3 
                  
               
                     64
                  
                  
                     59,2 
                  
                  
                     63,4 
                  
               
                     66
                  
                  
                     61,2 
                  
                  
                     65,5 
                  
               
                     68
                  
                  
                     63,2 
                  
                  
                     67,7 
                  
               
                     70
                  
                  
                     65,2 
                  
                  
                     69,9 
                  
               
                     72
                  
                  
                     67,2 
                  
                  
                     72,0 
                  
               
                     74
                  
                  
                     69,2 
                  
                  
                     —
                  
               
                     76
                  
                  
                     71,2 
                  
                  
                     —
                  
               
                     78
                  
                  
                     73,2 
                  
                  
                     —
                  
               Din it-tabella ġiet kompilata abbażi tal-korrezzjoni Harkins-Jordan. Hija simili għal dik fid-DIN Standard (DIN 53914) għall-ilma u soluzzjonijiet fl-ilma(densità ρ = 1 g/cm3) u hija għall-ħolqa disponibbli kummerċjalment li għandha d-dimensjonijiet R = 9,55 mm (raġġ medju tal-ħolqa) u r = 0,185 mm (raġġ tal-wajer tal-ħolqa). It-tabella tipprovdi valuri kkorreġuti għall-kejl tat-tensjoni tas-superfiċje meħuda wara l-kalibrazzjoni bil-piżijiet jew il-kalibrazzjoni bl-ilma.
         Alternattivament, mingħajr il-kalibrazzjoni preċedenti, it-tensjoni tas-superfiċje tista' tkun ikkalkulata skond il-formula li ġejja:
         
            
         fejn:
         
                     F
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-forza mkejla fuq id-dinamometru fil-punt tal-ksur tar-rita
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     ir-raġġ tal-ħolqa
                  
               
                     f
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-fattur ta' korrezzjoni (1)
                  
               3.   RAPPURTAR
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     il-metodu użat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-tip ta' ilma jew is-soluzzjoni użat/a.
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet),
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati tal-kejl: it-tensjoni tas-superfiċje (qari) li juri kemm il-qari individwali u l-medja aritmetika tagħhom kif ukoll il-medja kkorreġuta (jikkunsidraw il-fattur tat-tagħmir u t-tabella ta' korezzjoni),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-temperatura tat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-età tas-soluzzjoni użata; b'mod partikulari l-ħin bejn it-Preparazzjoni u l-kejl tas-soluzzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-deskrizzjoni tad-dipendenza fuq il-ħin tat-tensjoni tas-superfiċje wara t-trasferiment tas-soluzzjoni fir-reċipjent tal-kejl.
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rrapportati, b'mod speċjali fir-rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.
                  
               3.2.   INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Meta jkun ikkunsidrat il-fatt li l-ilma distillat għandu tensjoni tas-superfiċje ta' 72,75 mN/m f’20 C, sustanzi li juru tensjoni tas-superfiċje inqas minn 60 mN/m taħt il-kondizzjonijiet ta' dan il-metodu għandhom jitqiesu bħala materjali attivi fis-superfiċje.
         4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751.
                  
               A.6.   SOLUBILITÀ TA' L-ILMA
         1.   METODU
         Il-metodi mfissra huma bbażati fuq il-linja gwida tat-Test OECD (1).
         1.1   DAĦLA
         Biex isir it-test huwa utli li jkollok informazzjoni preliminari dwar il-formula strutturali, il-pressjoni tal-fwar, il-kostanti ta' dissoċjazzjoni u l-idrolisi (bħala funzjoni ta' pH) tas-sustanza.
         Ebda metodu singolu m'huwa disponibbli biex ikopri l-firxa kollha ta' solubilitajiet fl-ilma.
         Iż-żewġ metodi ta' test mfissra hawn taħt ikopru l-firxa kollha tas-solubilitajiet iżda m'humiex applikabbli għal sustanzi volatili:
         
                     —
                  
                  
                     wieħed japplika għal sustanzi essenzjalment puri b'solubilitajiet baxxi, (< 10-2 grammi kull litru), u li huma stabbli fl-ilma, imfisser bħala “l-metodu ta' elużjoni tal-kolonna”,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-ieħor japplika għal sustanzi essenzjalment puri b'solubilitajiet ogħla, (< 10-2 grammi kull litru), u li huma stabbli fl-ilma, imfisser bħala “l-metodu tal-flixkun”.
                  
               Is-solubiltà ta' l-ilma tas-sustanza għat-test tista’ tkun affettwata b’mod konsiderevoli bil-preżenza ta' impuritajiet.
         1.2.   TIFSIRA U UNITAJIET
         Is-solubiltà fl-ilma tas-sustanza hija speċifikata bis-saturazzjoni tal-piż ta' konċentrazzjoni tas-sustanza fl-ilma f’temperatura mogħtija. Is-solubilità fl-ilma hija speċifikata f’unitajiet ta' piż għal kull volum ta' soluzzjoni. L-unità SI hija kg/m3 (grammi għal kull litru tista' tintuża wkoll).
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Sustanzi ta' referenza mhumiex meħtieġa li jintużaw fil-każijiet kollha meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma għandhom iservu primarjament biex jiċċekkjaw r-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' riżultati minn metodi oħra.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         L-ammont approssimattiv tal-kampjun u l-ħin neċessarju biex tintlaħaq il-konċentrazzjoni tas-saturazzjoni tal-piż għandu jkun ddeterminat f’test preliminari sempliċi.
         1.4.1.   Il-metodu ta' elużjoni tal-kolonna
         Dan il-metodu huwa bbażat fuq l-elużjoni tas-sustanza għat-test bl-ilma minn mikro-kolonna li hija mimlija b'materjal ta' appoġġ inert, bħal boċċi tal-ħġieġ jew ramel, miksija b'eċċess ta' sustanza għat-test. Is-solubiltà ta' l-ilma tigi ddeterminata meta l-konċentazzjoni tal-piż tas-sustanza li titneħħa bl-elużjoni tkun kostanti. Din tintwera bil-konċentrazzjoni bħala funzjoni tal-ħin.
         1.4.2.   Il-metodu tal-flixkun
         F’dan il-metodu, is-sustanza (is-solidi jridu jitfarrku) tinħall fl-ilma f’temperatura ftit ogħla mit-temperatura tat-test. Meta tinkiseb is-saturazzjoni t-taħlita titkessaħ u tinżamm fit-temperatura tat-test, bi tħawwid sakemm neċessarju biex jintlaħaq l-ekwilibriju. Alternattivament, il-kejl jista' jitwettaq direttament fit-temperatura tat-test, jekk ikun assigurat bit-teħid adattat ta' kampjuni li ntlaħaq l-ekwilibriju tas-saturazzjoni. Sussegwentement, il-konċentrazzjoni tal-piż tas-sustanza fis-soluzzjoni fl-ilma, li ma tridx tinkludi xi partikoli mhux maħlula, hija determinata b'metodu analitiku adattat.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         1.5.1.   Ripetibiltà
         Għall-metodu ta' elużjoni tal-kolonna, jista' jinkiseb < 30 % ; għall-metodu tal-flixkun, għandu jkun osservat < 15 %.
         1.5.2.   Sensittività
         Din tiddependi fuq il-metodu ta' analiżi, iżda determinazzjonijiet tal-konċentrazzjoni tal-piż sa 10-6 grammi għal kull litru jistgħu jkunu determinati.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.6.1.   Kondizzjonijiet tat-test
         It-test isir preferibbilment f’20 ±0,5 oC. Jekk ikun hemm suspett ta' dipendenza fuq it-temperatura fis-solubiltà (> 3 % għal kull oC), għandhom jintużaw żewġ temperaturi oħra ta' mill-inqas 10 oC fuq u taħt it-temperatura magħżula inizjalment. F’dan il-każ, il-kontroll tat-temperatura għandu jkun ±0,1 oC. It-temperatura magħżula għandha tinżamm kostanti fil-parti relevanti kollha tat-tagħmir.
         1.6.2.   Test preliminari
         Ma' approssimattivament 0,1 g ta' kampjun (is-sustanzi solidi għandhom jintaħnu) f’ċilindru bi gradazzjoni ta' 10ml magħluq b'tapp tal-ħġieġ, volumi ta' ilma distillat għandhom jiżdiedu f’temperatura ambjentali skond l-indikazzjonijiet murija fit-tabella hawn taħt:
         
                     0,1  g solubbli f’ “x” ml ta' ilma
                  
                  
                     0,1 
                  
                  
                     0,5 
                  
                  
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     10
                  
                  
                     100
                  
                  
                     >100
                  
               
                     Solubilità approssimattiva (grammi għal kull litru)
                  
                  
                     >1 000 
                  
                  
                     1 000  sa 200
                  
                  
                     200 sa 1 000 
                  
                  
                     100 sa 50
                  
                  
                     50 sa 10
                  
                  
                     10 sa 1
                  
                  
                     <1
                  
               Wara kull żieda ta' l-ammont indikat ta' ilma, it-taħlita titħawwad bis-saħħa għal 10 minuti u hija kkontrollata viżwalment għal xi partijiet tal-kampjun mhux maħlula. Jekk, wara ż-żieda ta' 10 ml ta' ilma, il-kampjun jew partijiet minnu jibqgħu mhux maħlula, l-esperiment għandu jiġi ripetut b'ċilindru tal-kejl ta' 100 ml b'volumi akbar ta' ilma. F’solubilitajiet aktar baxxi l-ħin meħtieġ biex tinħall sustanza jista' jkun iktar b'mod konsiderevoli (ta’ l-inqas għandhom jingħataw 24 siegħa). Is-solubiltà approssimattiva hija mogħtija fit-tabella taħt dak il-volum ta' ilma miżjud li fih iseħħ it-taħlil komplet tal-kampjun. Jekk is-sustanza apparentement tkun għadha mhux maħlula, għandhom jingħataw aktar minn 24 siegħa (massimu ta' 96 siegħa), jew għandha ssir aktar dilwazzjoni biex ikun aċċertat jekk għandhiex tintuża l-elużjoni tal-kolonna jew il-solubilità fil-flixkun.
         1.6.3.   Il-metodu ta' elużjoni tal-kolonna
         1.6.3.1.   Materjal ta' appoġġ, solvent u fluwidu li jintuża għall-elużjoni
         Il-materjal ta' appoġġ għall-metodu ta' elużjoni tal-kolonna għandu jkun inert. Boċċi tal-ħġieġ u ramel huma materjali li jistgħu possibbilment jintużaw. Solvent volatili adattat ta' kwalità ta' reaġenti analitiku għandu jintuża biex tkun applikata s-sustanza għat-test mal-materjal ta' appoġġ. Ilma li kien distillat għal darbtejn f’apparat tal-ħġieġ jew kwarz għandu jintuża bħala l-eluwent.
         Nota:
         M'għandux jintuża ilma direttament minn apparat li jbiddel jone organiku.
         1.6.3.2.   Preparazzjoni ta' l-appoġġ
         Madwar 600 mg ta' materjal ta' appoġġ jintiżen u jiġi trasferit fi flixkun ta' 50 ml b'qiegħ tond.
         Ammont adattat miżun ta' sustanza għat-test jiġi maħlul fis-solvent magħżul. Ammont adattat ta' din is-soluzzjoni tiġi miżjuda mal-materjal ta' appoġġ. Is-solvent irid ikun evaporat kompletament, eż. f’evaporatur li jdur, inkella s-saturazzjoni ta' l-ilma ta' l-appoġġ ma tinkisibx minħabba l-effetti ta' partizzjoni fuq is-superfiċje tal-materjal ta' appoġġ.
         It-Preparazzjoni tal-materjal ta' appoġġ jista' jikkawża problemi (riżultati żbaljati) jekk is-sustanza għat-test tiddepożita bħala żejt jew bħala fażi kristallina differenti. Il-problema għandha tiġi eżaminata b'mod sperimentali u d-dettalji rrapurtati.
         Huwa permess li l-materjal ta' appoġġ imħejji jixxarrab għal madwar sagħtejn f’approssimattivament 5 ml ta' ilma, u imbagħad is-sospensjoni tiġi miżjuda mal-mikrokolonna. Alternattivament, materjal ta' appoġġ niexef imħejji jista' jitferra' fil-mikrokolonna, li imtliet bl-ilma, u mbagħad ekwilibrata għal madwar sagħtejn.
         Proċedura tat-test:
         L-elużjoni tas-sustanza mill-materjal ta' appoġġ tista' titwettaq b'wieħed minn żewġ modi differenti:
         
                     —
                  
                  
                     il-pompa ta' ċirkolazzjoni mill-ġdid (ara l-figura 1),
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-reċipjent ta' livellar (ara l-figura 4).
                  
               1.6.3.3.   Metodu ta' elużjoni tal-kolonna bil-pompa li tiċ ċirkola mill-ġdid
         Apparat
         Arranġament skematiku ta' sistema tipika huwa rrappreżentat fil-figura 1. Mikrokolonna adattata hija murija fil-figura 2, għalkemm kwalunkwe qies huwa aċċettabbli, bil-kondizzjoni li jissodisfa l-kriterji ta' riproduċibilità u sensittività. Il-kolonna għandha tipprovdi għal spazju ta' fuq li jesa' ta' l-inqas ħames volumi ta' ilma tal-qiegħ u tkun kapaċi żżomm minimu ta' ħames kampjuni. Alternattivament, id-daqs jista' jitnaqqas jekk is-solvent għall-mili jintuża biex jieħu post il-ħames volumi tal-qiegħ inizjali mneħħija ma' l-impuritajiet.
         Il-kolonna għandha tiġi kkonnettjata ma' pompa li tiċċirkola mill-ġdid kapaċi tikkontrolla flussi ta' madwar 25 ml/h. Il-pompa hija kkonnettjata b'politetetrafluworoetilene (P.T.F.E.) u/jew konnessjonijiet tal-ħġieġ. Il-kolonna u l-pompa, meta mmuntati, għandu jkollhom provvediment għat-teħid tal-kampjuni mill-effluwent u għall-ekwilibrazzjoni ta' l-ispazju ta' fuq fi pressjoni atmosferika. Il-materjal tal-kolonna huwa appoġġat minn tapp żgħir (5 mm) glass wool, li jservi wkoll biex jiffiltra l-partikoli. Il-pompa li tiċċirkola mill-ġdid tista' tkun, eż. pompa peristaltika jew pompa bil-membrana (għandha tingħata attenzjoni sabiex ma jsir ebda kontaminazzjoni ma' u/jew assorbiment fil-materjal tat-tubu).
         Proċedura tal-kejl
         Jibda l-fluss mill-kolonna. Huwa rrakkomandat li tintuża r-rata tal-fluss ta' madwar 25 ml/hr (din tikkorrispondi għal 10 volumi tal-qiegħ/siegħa għal kolonna msemmija). L-ewwel ħames volumi tal-qiegħ (minimu) jkunu skartati sabiex jitneħħew impuritajiet li jinħallu fl-ilma. Wara dan, il-pompa li tiċċirkola mill-ġdid titħalla taħdem sakemm jiġi stabbilit ekwilibriju, kif definit minn ħames kampjuni suċċessivi li l-konċentrazzjonijiet tagħhom ma jiddifferenzjawx b'aktar minn ± 30 % b'għażla bbażata bl-inzertaturi. Dawn il-kampjuni għandhom ikunu separati wieħed mill-ieħor b'intervalli ta' ħin li jikkorrispondu għall-passaġġ ta' mill-inqas 10 volumi tal-qiegħ ta' l-eluwent.
         1.6.3.4.   Metodu ta' elużjoni b'reċipjent ta' livellar
         Apparat (ara figuri 4 u 3)
         
         Reċipjent ta' livellar: Il-konnessjoni mar-reċipjent ta' livellar ssir bl-użu ta' ġonta tal-qiegħ tal-ħġieġ li hija kkonnettjata b'tubu PTFE. Huwa rakkomandat li tkun użata rata ta' fluss ta' approssimattivament 25 ml/hr. Frazzjonijiet suċċessivi ta' materjal ta' elużjoni għandhom jinġabru u jiġu analizzati bil-metodu magħżul.
         Proċedura tal-kejl
         Dawk il-frazzjonijiet mill-iskala tan-nofs ta' materjal ta' elużjoni fejn il-konċentrazzjonijiet huma kostanti (± 30 %) f’mill-inqas ħames frazzjonijiet konsekuttivi jintużaw biex tkun iddeterminata s-solubiltà fl-ilma.
         Fiż-żewġ każijiet (l-użu ta' pompa li tiċċirkola mill-ġdid jew reċipjent ta' livellar), it-tieni test għandu jitwettaq b'nofs ir-rata ta' fluss ta' l-ewwel. Jekk ir-riżultati taż-żewġ testijiet jaqblu, it-test huwa sodisfaċenti; jekk hemm solubilità ogħla apparenti mar-rata ta' fluss aktar baxxa, imbagħad it-tnaqqis tar-rata ta' fluss bin-nofs għandu jkompli sakemm żewġ testijiet konsekuttivi jagħtu l-istess solubiltà.
         Fiż-żewġ każijiet (bl-użu tal-pompa li tiċċirkola mill-ġdid jew b'reċipjent ta' livellar) il-frazzjonijiet għandhom jiġu kkontrollati għall-preżenza ta' materja li twaħħal permezz ta' eżami bl-effett Tyndall (diffużjoni tad-dawl). Preżenza ta' partikoli bħal dawn tinvalida r-riżultati, u t-test għandu jkun ripetut b'titjib fl-azzjoni filtranti tal-kolonna.
         Il-pH ta' kull kampjun għandu jkun reġistrat. Għandu jitwettaq test ieħor bl-istess temperatura.
         1.6.4.   Metodu tal-flixkun
         1.6.4.1.   Apparat
         Għall-metodu tal-flixkun hemm bżonn il-materjal li ġej:
         
                     —
                  
                  
                     l-apparat tal-ħġieġ u strumentazzjoni normali ta' laboratorju,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-apparat adattat għall-aġitazzjoni tas-soluzzjonijiet ta' temperaturi kostanti kontrollati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-magna ċentifruga (preferibbilment bit-termostat), jekk ikun meħtieġ b'emulsjonijiet, u
                  
               
                     —
                  
                  
                     t-tagħmir għal determinazzjoni analitika.
                  
               1.6.4.2.   Proċedura tal-kejl
         Il-kwantità ta' materjal neċessarju biex jiġi saturat il-volum mixtieq ta' ilma hija stmata mit-test preliminari. Il-volum ta' l-ilma meħtieġ ikun jiddependi fuq l-metodu analitiku u l-iskala ta' solubilità. Jintiżen madwar ħames darbiet il-kwantità ta' materjal ddeterminat hawn fuq f’kull wieħed mit-tliet reċipjenti tal-ħġieġ mgħammra b'tappijiet tal-ħġieġ (eż. tubi ċentrifugi, fliexken). Il-volum magħżul ta' ilma jiżdied f’kull reċipjent, u r-reċipjenti jingħalqu sewwa. Ir-reċipjenti magħluqa imbagħad jiġu mċaqalqa fi 30 oC. (Għandu jintuża apparat li jċaqlaq jew iħawwad kapaċi li jaħdem f’temperatura kostanti, eż. taħwid manjetiku b'banju ta' l-ilma kkontrollat termostatikament). Wara ġurnata, wieħed mir-reċipjenti jitneħħa u jiġi ekwilibrat mill-ġdid għal 24 siegħa fit-temperatura tat-test b'ċaqliq okkażjonali. Il-kontenuti tar-reċipjent imbagħad jiġu ċċentrifugati fit-temperatura tat-test, u l-konċentrazzjoni tas-sustanza għat-test f’fażi ċara fl-ilma hija ddeterminata b'metodu analitiku adattat. Iż-żewġt iflixken l-oħra jiġu ttrattati bl-istess mod wara ekwilibrazzjoni inizjali f’30 oC għal jumejn u tlitt ijiem, rispettivament. Jekk ir-riżultati tal-konċentrazzjoni f’mill-anqas l-aħħar żewġ reċipjenti jaqblu mar-riproduċibbiltà, it-test huwa sodisfaċenti. It-test kollu għandu jkun ripetut, bl-użu ta' ħinijiet ta' ekwilibrazzjoni itwal, jekk ir-riżultati mir-reċipjenti 1, 2 u 3 juru tendenza ta' valuri li jiżdiedu.
         Il-proċedura ta' kejl tista' titwettaq ukoll mingħajr pre-inkubazzjoni fi 30 oC. Bil-għan li tkun stmata r-rata li biha jkun stabbilit l-ekwilibriju tas-saturazzjoni, jittieħdu kampjuni sakemm il-ħin tat-tħawwid ma jinfluwenzax aktar il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni għat-test.
         Il-pH ta' kull kampjun għandu jkun reġistrat.
         1.6.5.   Analiżi
         Metodu analitiku speċifiku għas-sustanza huwa preferut għal dawn id-determinazzjonijiet, ladarba ammont żgħar ta' impuritajiet li jinħallu jistgħu jikkawżaw żbalji kbar fis-solubiltà mkejla. Eżempji ta' metodi bħal dawn huma: Kromatografija tal-gass jew likwidu, metodi ta' titrazzjoni, metodi fotometriċi, metodi voltametriċi.
         2.   DATA
         2.1.   IL-METODU TA' ELUŻJONI TAL-KOLONNA
         Il-valur medju ta' mill-inqas ħames kampjuni konsekuttivi meħuda mill-fażi ta' saturazzjoni kostanti għandu jkun ikkalkulat għal kull test, kif ukoll id-devjazzjoni standard. Ir-riżultati għandhom jingħataw f’unitajiet ta' piż għal kull volum ta' soluzzjoni.
         Il-medji kkalkulati fuq żewġ testijiet bl-użu ta' flussi differenti jiġu mqabbla u għandhom jkollhom ripetibilità ta' anqas minn 30 %.
         2.2.   METODU TAL-FLIXKUN
         Ir-riżultati individwali għandhom jingħataw għal kull wieħed mit-tlitt iflixken u dawk ir-riżultati meqjusa kostanti (ripetibilità ta' anqas minn 15 %) għandha titteħdilhom il-medja u jingħataw f’unitajiet ta' piż għal kull volum ta' soluzzjoni. Dan jista' jeħtieġ il-konverżjoni mill-ġdid ta' l-unitajiet ta' piż għall-unitajiet ta' volum, bl-użu tad-densità meta s-solubilità hija għolja ħafna (> 100 gramma għal kull litru).
         3.   RAPPURTAR
         3.1.   IL-METODU TA' ELUŻJONI TAL-KOLONNA
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati tat-test preliminari,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjonijiet individwali, rati ta' fluss u l-pH ta' kull kampjun,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-devjazzjonijiet medji u standard ta' mill-anqas ħames kampjuni mil-livell kostanti ta' saturazzjoni ta' kull test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-medja ta' żewġ testijiet aċċettabbli, suċċessivi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-temperatura ta' l-ilma matul il-proċess ta' saturazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-metodu ta' analiżi użat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     in-natura ta' materjal ta' appoġġ użat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-preparazzjoni tal-materjal ta' appoġġ.
                  
               
                     —
                  
                  
                     is-solventi użati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ix-xhieda ta' kwalunkwe instabbiltà kimika tas-sustanza matul it-test u l-metodu użat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-informazzjoni kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati, b'mod speċjali fir-rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.
                  
               3.2.   METODU TAL-FLIXKUN
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati tat-test preliminari,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet),
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-determinazzjonijiet analitiċi individwali u l-medja fejn aktar minn valur wieħed kien determinat għal kull flixkun.
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-pH ta' kull kampjun,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-medja tal-valur għall-fliexken differenti li kienu jaqblu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-temperatura tat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-metodu analitiku użat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ix-xhieda ta' kwalunkwe instabbiltà kimika tas-sustanza matul it-test u l-metodu użat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-informazzjoni kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati, b'mod speċjali fir- rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility -Column elution method
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility -Flask method
                  
               
            Appendiċi
            Figura 1
            Metodu ta' elużjoni ta' kolonna bil-pompa li tiċċirkola mill-ġdid
            Figura 2
            Mikro-kolonna tipika
            
               (Id-dimensjonijiet kollha f'millimetri)
            
            Figura 3
            Mikro-kolonna tipika
            
               (Id-dimensjonijiet kollha f'millimetri)
            
            Figura 4
            Metodu ta' elużjoni tal-kolonna b'reċipjent ta' invellar
            
         A.8.   KOEFFIĊJENT TAL-QSIM
         1.   METODU
         Il-metodu “taċ-ċaqliq tal-flixkun” imfisser huwa bbażat fuq il-linja gwida tat-Test OECD (1).
         1.1.   DAĦLA
         Biex isir it-test huwa utli li jkollok informazzjoni preliminari dwar il-formula strutturali, il-kostanti ta' dissoċjazzjoni, is-solubiltà ta' l-ilma, l-idrolisi, is-solubiltà ta' l-n-oktanol, it-tensjoni tas-superfiċje tas-sustanza.
         Il-kejlijiet għandhom jittieħdu fuq sustanzi jonizzabbli biss fil-forma mhux jonizzata tagħhom (aċidu ħieles jew bażi ħielsa) prodotti bl-użu ta' sustanza adattata b'pH ta' mill-anqas unità pH taħt (aċidu ħieles) jew fuq (bazi ħielsa) il-pK.
         Dan il-metodu tat-test jinkludi żewġ proċeduri separati: il-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun u l-kromatografija likwida ta' rendiment għoli (HPLC). Ta' l-ewwel hija applikabbli meta l-valur tal-log Pow (ara isfel għad-definizzjonijiet) jaqa' fl-iskala minn - 2 sa 4 u ta' l-aħħar fl-iskala minn 0 sa 6. Qabel ma titwettaq xi waħda mill-proċeduri sperimentali għandha l-ewwel tinkiseb stima preliminari tal-koeffiċjent tal-qsim.
         Il-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun japplika biss għal sustanzi essenzjalment puri li jinħallu fl-ilma u fl-n-oktanol. Ma japplikax għall-materjali attivi fuq is-superfiċje (li għalihom għandu jkun provdut valur ikkalkulat jew stima bbażata fuq is-solubilitajiet individwali fl-n-oktanol u l-ilma).
         Il-metodu HPLC ma japplikax għall-aċidi u l-bażijiet qawwija, komplessi metalliċi, materjali attivi fuq is-superficje jew sustanzi li jirreaġġixxu ma' l-eluwent. Għal dawn il-materjali, għandu jkun provdut valur ikkalkulat jew stima bbażata fuq is-solubilitajiet individwali fl-n-oktanol u l-ilma.
         Il-metodu HPLC huwa inqas sensittiv għall-preżenza ta' impuritajiet fil-kompost għat-test milli huwa l-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun. Madankollu, f’xi każijietjiet impuritajiet jistgħu jagħmlu l-interpretazzjoni tar-riżultati diffiċli minħabba li l-assenjazzjoni tal-quċċata ssir inċerta. Għal taħlitiet li jagħtu faxxa mhux riżolta, għandhom ikunu ddikjarati l-ogħla u l-inqas limiti tal-log P.
         1.2.   TIFSIRIET U UNITAJIET
         Il-koeffiċjent tal-qsim (P) huwa mfisser bħala l-proporzjon tal-konċentrazzjonijiet ta' l-ekwilibriju (ci) tas-sustanza maħlula f’sistema ta' żewġ fażijiet li tikkonsisti f’żewġ solventi li ma jistgħux jitħalltu. Fil-każ ta' l-n-oktanol u l-ilma:
         
            
         Il-koeffiċjent tal-qsim (P) għalhekk huwa l-kwozjent taż-żewġ konċentrazzjonijiet u normalment jingħata fil-forma tal-logaritmu tiegħu sa bażi 10 (log P).
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun
         Sustanzi ta' referenza mhumiex meħtieġa li jintużaw fil-każijiet kollha meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma għandhom iservu primarjament biex jiċċekkjaw r-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' riżultati minn metodi oħra.
         Metodu HPLC
         Bil-għan li d-DATA mkejla għall-HPLC tal-kompost tkun relatata mal-valur P tiegħu, għandu jkun stabbilit graff tal-log P vs DATA kromatografika bl-użu ta' mill-inqas 6 punti ta' referenza. Huwa f’idejn dak li qed juża l-apparat li jagħżel is-sustanzi ta' referenza adattati. Fejn huwa possibli, ta' l-inqas żewġ komposti ta' referenza għandu jkollhom Pow akbar minn dak tas-sustanza għat-test, u Pow ieħor taħt dak tas-sustanza għat-test. Għall-valuri ta' log P inqas minn 4, il-kalibrazzjoni tista' tkun ibbażata fuq DATA miksuba bil-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun. Għall-valuri ta' log P inqas minn 4, il-kalibrazzjoni tista' tkun ibbażata fuq il-valuri validati tal-letteratura jekk dawn jaqblu mal-valuri kkalkulati. Għal aktar eżattezza, huwa preferibbli li jintgħażlu komposti ta' referenza li huma strutturalment relatati mas-sustanza għat-test.
         Listi estensivi ta' log Pow għal bosta gruppi ta' kimiċi huma disponibbli (2)(3). Jekk m'hemmx disponibbli DATA dwar il-koeffiċjenti tal-qsim ta' komposti relatati strutturalment, imbagħad tista' tintuża kalibrazzjoni aktar ġenerali, stabbilita ma' komposti ta' referenza oħra.
         Lista ta' sustanzi ta' referenza rakkomandati u l-valuri Pow huma mogħtija fl-Appendiċi 2.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODI
         1.4.1.   Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun
         Biex ikun iddeterminat il-koeffiċjent tal-qsim, irid jinkiseb ekwilibriju bejn il-komponenti kollha li jagħmlu interazzjoni fis-sistema, u l-konċentrazzjonijiet tas-sustanzi maħlula fiż-żewġ fażijiet jridu jkunu ddeterminati. Studju tal-letteratura fuq dan is-suġġett jindika li jistgħu jintużaw bosta tekniki differenti biex tiġi solvuta din il-problema, i.e. it-taħlit sewwa taż-żewġ fażijiet segwit bis-separazzoni tagħhom bil-għan li tkun iddeterminata l-konċentrazzjoni ta' l-ekwilibriju għas-sustanza li tkun qed tiġi eżaminata.
         1.4.2.   Metodu HPLC
         L-HPLC jitwettaq fuq kolonni analitiċi ppakkjati b'fażi solida disponibbli kummerċjalment li fihom idrokarburi b'katina twila (eż. C8, C18) kimikament mgħaqqda fuq is-silika. Kimiċi injettati f’kolonna bħal din jimxu magħha b'rati differenti minħabba l-gradi differenti tal-qsim bejn il-fażi mobbli u l-fażi stazzjonarja idrokarbonika. Taħlitiet ta' kimiċi jitneħħewlhom is-sustanzi fl-ordni ta' l-idrofobiċità tagħhom, l-ewwel il-kimiċi li jinħallu fl-ilma u t-tieni l-kimiċi li jinħallu fiż-żejt, fi proporzjon mal-koeffiċjent tal-qsim idrokarburi-ilma tagħhom. Dan jippermetti li tkun stabbilita r-relazzjoni bejn il-ħin ta' retenzjoni fuq kolonna bħal din (fażi bil-kontra) u l-koeffiċjent ta' l-n-oktanol/ilma. Il-koeffiċjent tal-qsim jiġi dedott mill-fattur ta' kapaċità k, mogħti bl-espressjoni:
         
            
         li fiha, tr = huwa l-ħin ta' retenzjoni tas-sustanza għat-test, u to = il-ħin medju li teħtieġ molekula solventi biex tgħaddi mill-kolonna (ħin mejjet).
         Mhumiex meħtieġa metodi analitiċi kwantitattivi u hija neċessarja biss id-determinazzjoni tal-ħin ta' elużjoni.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         1.5.1.   Ripetibilità
         Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun
         Bil-għan li tkun assigurata l-eżattezza tal-koeffiċjent tal-qsim, determinazzjonijiet duplikati jridu jsiru taħt tliet kondizzjonijiet ta' test differenti, fejn il-kwantità tas-sustanza speċifikata kif ukoll il-proporzjon tal-volumi tas-solvent jistgħu jvarjaw. Il-valuri ddeterminati tal-koeffiċjent tal-qsim espressi bħala l-logaritmi komuni tagħhom għandhom jidħlu fil-kamp ta' varjabbiltà ta' ±0,3 unitajiet logaritmiċi.
         Metodu HPLC
         Bil-għan li tikber il-fiduċja fil-kejl, jridu jsiru determinazzjonijiet duplikati. Il-valuri ta' log P meħuda minn kejl individwali għandhom jaqgħu fil-kamp ta' varjabbiltà ta' ±0,1 unitajiet logaritmiċi.
         1.5.2.   Sensittività
         Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun
         L-iskala ta' kejl tal-metodu hija ddeterminata bil-limitu ta' tfittxija tal-proċedura analitika. Dan għandu jippermetti l-valutazzjoni tal-valuri ta' log Pow fil-kamp ta' varjabbiltà ta' - 2 sa 4 (f’okkażżjonijiet meta kondizzjonijiet japplikaw, dan il-kamp ta' varjabbiltà jista' jitkabbar għall-log Pow sa 5) meta l-konċentrazzjoni ta' sustanza maħlula f’xi waħda mill-fażijiet mhijiex aktar minn 0,01 mol għal kull litru.
         Metodu HPLC
         Il-metodu HPLC jippermetti koeffiċjenti tal-qsim li jkun stmat fil-log Pow fil-kamp ta' varjabbiltà minn 0 sa 6.
         Normalment, il-koeffiċjent tal-qsim ta' kompost jista' jkun stmat sa ± 1 unità logaritmika tal-valur taċ-ċaqliq tal-flixkun. Korrelazzjonijiet tipiċi jistgħu jinstabu fil-letteratura (4)(5)(6)(7)(8). Eżattezza ogħla s-soltu tista' tinkiseb meta grafiċi ta' korrelazzjoni huma bbażati fuq komposti ta' referenza ta' struttura simili (9).
         1.5.3.   Speċifiċità
         Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun
         Il-Liġi tal-Qsim ta' Nernst tapplika biss għal soluzzjonijiet dilwiti f’temperatura, pressjoni u pH kostanti. Hija tapplika strettament għal sustanza pura mxerrda bejn żewġ solventi puri. Jekk bosta sustanzi differenti maħlula jseħħu f’fażi waħda miż-żewġ fażijiet jew fiż-żewġ fażijiet fl-istess ħin, ir-riżultati jistgħu jiġu affettwati.
         Dissoċjazzjoni jew assoċjazzjoni tal-molekuli maħlula tirriżulta f’devjazzjonijiet mill-Liġi tal-Qsim ta' Nernst. Devjazzjonijiet bħal dawn huma indikati mill-fatt li l-koeffiċjent tal-qsim isir dipendenti fuq il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni.
         Minħabba l-ekwilibriji multipli li huma mdaħħla, dan il-metodu ta' test m'għandux ikun applikat għal komposti jonizzati mingħajr ma tkun applikata korrezzjoni. L-użu ta' sustanza ta' protezzjoni flok l-ilma għandu jkun ikkunsidrat għal komposti bħal dawn; il-pH ta' protezzjoni għandu jkun ta' l-inqas unità ta' 1 pH mill-pKa tas-sustanza u tingħata attenzjoni għar-relevanza ta' dan il-pH għall-ambjent.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.6.1.   Stima preliminari tal-koeffiċjent tal-qsim
         Il-koeffiċjent tal-qsim jiġi stmat preferibbilment bl-użu ta' metodu ta' kalkolu (ara Appendiċi 1), jew fejn adattat, mill-proporzjon tas-solubilitajiet tas-sustanza għat-test fis-solventi puri (10).
         1.6.2.   Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun
         1.6.2.1.   Preparazzjoni
         n-Oktanol: Id-determinazzjoni tal-koeffiċjent tal-qsim għandha ssir b'rijaġent ta' analiżi ta' purità għolja.
         Ilma: ilma distillat jew li kien distillat għal darbtejn f’apparat tal-ħġieġ jew kwarz għandu jintuża. Għal komposti jonizzati, soluzzjonijiet ta' protezzjoni flok l-ilma għandhom jintużaw jekk possibbli.
         
            Nota:
         
         M'għandux jintuża ilma direttament minn apparat li jbiddel il-jone.
         1.6.2.1.1.   Pre-saturazzjoni tas-solventi
         
         Qabel ma koeffiċjent tal-qsim jiġi ddeterminat, il-fażijiet tas-sistema tas-solvent jiġu reċiprokament saturati biċ-ċaqliq fit-temperatura ta' l-esperiment. Biex isir dan, hija ħaġa prattika li ċċaqlaq żewġt ifliexken kbar bl-n-oktanol jew bl-ilma t-tnejn ta' purezza għolja bi kwantità suffiċjenti tas-solvent l-ieħor fuq xejker mekkaniku għal 24 siegħa u mbagħad jitħallew joqgħodu għal ħin twil biżżejjed li jippermetti li l-fażijiet jisseparaw u jiksbu stat ta' saturazzjoni.
         1.6.2.1.2.   Preparazzjoni għat-test
         
         Il-volum sħiħ tas-sistema b'żewġ fażijiet kważi jimla' r-reċipjent tat-test. Dan jgħin biex jevita telf ta' materjali minħabba volatilizzazzjoni. Il-proporzjon tal-volum u l-kwantitajiet tas-sustanza li għandha tintuża huma stabbiliti f’dawn li ġejjin:
         
                     —
                  
                  
                     il-valutazzjoni preliminari tal-koeffiċjent tal-qsim (ara hawn fuq),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kwantità minima tas-sustanza għat-test meħtieġa għall-proċedura analitika, u
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-limitazzjoni tal-konċentrazzjoni massima għal kull fażi ta' 0,01 mol għal kull litru.
                  
               Isiru t-tliet testijiet. F’ ta’ l-ewwel, tintuża l-proporzjon ta' volum ikkalkulata ta' n-oktanol għall-ilma; fit-tieni, din il-proporzjon tinqasam fi tnejn; u fit-tielet, din il-proporzjon tiġi mmultiplikat bi tnejn (eż. 1:1, 1:2, 2:1).
         1.6.2.1.3.   Is-sustanza għat-test
         
         Titħejja soluzzjoni ta' riżerva f’n-oktanol pre-saturat fl-ilma. Il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni ta' riżerva għandha tkun iddeterminata bi preċiżjoni qabel ma tintuża fid-determinazzjoni tal-koeffiċjent tal-qsim. Is-soluzzjoni għandha tinħażen taħt kondizzjonijiet li jiżguraw l-istabbiltà tagħha.
         1.6.2.2.   Kondizzjonijiet tat-test
         It-temperatura tat-test għandha tinżamm kostanti (± 1 oC) u fil-kamp ta' varjabbiltà ta' 20 sa 25 oC.
         1.6.2.3.   Proċedura tal-kejl
         1.6.2.3.1.   Kisba ta' l-ekwilibriju tal-qsim
         
         Għal kull kondizzjoni tat-test għandhom jitħejjew reċipjenti tat-test doppji li jkun fihom l-ammonti meħtieġa, taż-żewġ solventi flimkien imkejla b'eżattezza bil-kwantità neċessarja ta' soluzzjoni ta' riżerva.
         Il-fażijiet ta' l-n-oktanol għandhom jitkejlu bil-volum. Ir-reċipjenti tat-test għandhom jew jitpoġġew f’xejker adattat jew jiċċaqalqu manwalment. Fejn jintuża tubu ċentrifugu, metodu rakkomandat huwa li t-tubu jiddawwar malajr 180o madwar l-assi trasversali tiegħu sabiex kwalunkwe arja maqbuda titla’ miż-żewġ fażijiet. L-esperjenza wriet li 50 dawra bħal din is-soltu huma suffiċjenti għall-kisba ta' l-ekwilibriju tal-qsim. Għaċ-ċertezza, huma rakkomandati 100 dawra f'ħames minuti.
         1.6.2.3.2.   Separazzjoni tal-fażi
         
         Meta huwa neċessarju, bil-għan li jkunu separati l-fażijiet, għandha titwettaq ċentrifugazzjoni tat-taħlita. Dan għandu jsir fiċ-ċentrifugu tal-laboratorju miżmum f'temperatura ambjentali, jew, jekk jintuża ċentrifugu mhux kontrollat permezz tat-temperatura, it-tubi taċ-ċentrifugu għandhom jinżammu għall-ekwilibrazzjoni fit-temperatura tat-test għall-millanqas siegħa qabel l-analiżi.
         1.6.2.4.   Analiżi
         Għad-determinazzjon tal-koeffiċjent tal-qsim, huwa neċessarju li jkunu determinati l-konċentrazzjonijiet tas-sustanza għat-test fiż-żewġ fażijiet. Dan jista' jsir billi tittieħed alikwota ta' kull wieħed miż-żewġ fażijiet minn kull tubu għal kull kondizzjoni ta' test u tiġi analizzata bil-proċedura magħżula. Il-kwantità totali ta' sustanza preżenti fiż-żewġ fażijiet għandha tkun ikkalkulata u mqabbla mal-kwantità tas-sustanza introdotta oriġinarjament.
         Għandu jittieħed kampjun tal-fażi fl-ilma bi proċedura li timminimizza r-riskju li jkunu introdotti traċċi ta' n-oktanol. Tista' tintuża siringa tal-ħġieġ b'labbra li tista' tintrema biex jittieħed kampjun tal-fażi ta' l-ilma. Inizjalment is-siringa għandha tkun parzjalment mimlija bl-arja. L-ajra għandha titneħħa bil-mod waqt li tkun qed tiddaħħal is-siringa fis-saff ta' l-n-oktanol. Volum adattat tal-fażi fl-ilma jinġibed fis-siringa. Is-siringa titneħħa malajr mis-soluzzjoni u l-labbra maqlugħa. Il-kontenut tas-siringa jista' mbagħad jintuża bħala kampjun fl-ilma. Il-konċentrazzjoni fiż-żewġ fażijiet separati għandha preferibbilment tkun iddeterminata minn metodu speċifiku għas-sustanza. Eżempji ta' metodi analitiċi li jistgħu jkunu adattati huma:
         
                     —
                  
                  
                     il-metodi fotometriċi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kromatografija tal-gass,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kromatogrfija likwida ta' rendiment għoli.
                  
               1.6.3.   Metodu HPLC
         1.6.3.1.   Preparazzjoni
         Apparat
         Huwa meħtieġ kromatografu likwidu, mgħammar b'pompa mingħajr vibrazzjoni u apparat ta' osservazzjoni adattat. Huwa rakkomandat li jintuża valv ta' injezzjoni b'ċirku ta' injezzjoni. Il-preżenza ta' gruppi polari fil-fażi stazzjonarja tista' tfixkel serjament il-prestazzjoni tal-kolonna HPLC. Għalhekk, fażijiet stazzjonarji għandhom ikollhom il-perċentwali minima tal-gruppi polari (11). Jista' jintuża ppakkjar kummerċjali ta' mikropartikulati b'fażi b'lura jew kolonni diġà ppakkjati. Kolonna ta' protezzjoni tista' titpoġġa bejn is-sistema ta' injezzjoni u l-kolonna analitika.
         Fażi mobbli
         Biex jitħejja s-solvent ta' elużjoni jintużaw metanol iggradat għall-HPLC jew ilma ggradat għall-HPLC u s-solvent jitneħħilu l-gass qabel l-użu. Għandha tintuża elużjoni isokratika. Għandhom jintużaw proporzjonijiet ta' metanol/ilma b'kontenut minimu ta' ilma ta' 25 %. Tipikament taħlita ta' 3:1 (v/v) metanol-ilma hija sodisfaċenti għall-elużjoni ta' komposti ta' log P 6 fi żmien siegħa, b'rata ta' fluss ta' 1 ml/min. Għal komposti ta' log P għoli jista' jkun neċessarju li jitqassrilhom iż-żmien ta' l-elużjoni (u dak tal-komposti ta' referenza) billi titnaqqas il-polarità tal-fażi mobbli jew it-tul tal-kolonna.
         Sustanzi b'solubiltà baxxa ħafna f’n-oktanol għandhom tendenza li jagħtu valuri ta' log Pow baxxi u mhux normali bil-metodu HPLC; il-quċċata ta' komposti bħal dawn xi drabi takkumpanja l-front tas-solvent. Dan probabbilment huwa minħabba l-fatt li l-proċess tal-qsim huwa bilmod wisq biex jintlaħaq ekwilibriju fiż–żmien normalment meħtieġ għal separazzjoni HPLC. It-tnaqqis tar-rata tal-fluss u/jew it-tbaxxija tal-proporzjon metanol/ilma tista’/jistgħu mbagħad tkun/ikunu effettivi biex jinkiseb valur affidabbli.
         Il-komposti għat-test u ta' referenza għandhom ikunu solubbli fil-fażi mobbli f’konċentrazzjonijiet suffiċjenti li jippermettu l-osservazzjoni tagħhom. F’każijiet eċċezzjonali biss jistgħu jintużaw additivi mat-taħlita metanol/ilma, għaliex l-additivi jibdlu l-proprjetajiet tal-kolonna. Għal kromatogrammi b'additivi huwa obbligatorju li tintuża kolonna separata ta' l-istess tip. Jekk il-metanol/ilma mhuwiex adattat, taħlitiet oħra ta' solvent organiku-ilma jistgħu jintużaw, eż. etanol-ilma jew acetonitrile-ilma.
         Il-pH ta' l-eluwent huwa kritiku għal komposti jonizzabbli. Huwa għandu jkun fl-iskala operattiva tal-pH tal-kolonna, li s-soltu hija bejn 2 u 8. Hija rakkomandata protezzjoni. Għandha tingħata attenzjoni biex ikun evitat il-preċipitazzjoni tal-melħ u t-taħsir tal-kolonna li jseħħu b'xi taħlitiet ta' fażi organika/ta, protezzjoni. Kejl HPLC b'fażijiet stazzjonarji bbażati fuq is-silika 'l fuq minn pH8 mhuwiex rakkomandat għaliex l-użu ta' fażi alkalina, mobbli tista' tikkawża nuqqas rapidu ta' prestazzjoni tal-kolonna.
         Sustanzi maħlula
         Il-komposti ta' referenza għandhom ikunu fil-forma l-aktar pura disponibbli. Komposti li se jiġu użati għal skopijiet ta' test jew ta' kalibrazzjoni jiġu maħlula jekk huwa possibli fil-fażi mobbli.
         Kondizzjonijiet tat-test
         It-temperatura matul il-kejl m‘għandhiex tvarja b’aktar minn ± 2 K.
         1.6.3.2.   Kejl
         
         Kalkolu tal-ħin mejjet to
         
         Il-ħin mejjet to jista' jkun iddeterminat bl-użu jew ta' serje omologa (eż. n-alkyl methyl ketones) jew mill-komposti organiċi mhux miżmuma (eż. thiourea jew formamide). Għal kalkolu tal-ħin mejjet to bl-użu tas-serje omologa, sett ta' mill-anqas seba' membri tas-serje omologa jiġi injettat u ż-żmien ta' retenzjoni rispettivament jiġi ddeterminat. Il-ħinijiet ta' retenzjoni mhux analizzati tr (n c + 1) jiġu pplottjati bħala funzjoni ta' tr(n c) u l-linja bejn żewġ punti ta' interċezzjoni a u l-anglu b ta' l-ekwazzjoni ta' regressjoni:
         tr(nc + 1) = a + b tr(nc)
         
         jiġu ddeterminati (nc = n-numru ta' l-atomi tal-karbonju). Il-ħin mejjet to mbagħad huwa mogħti bi:
         to = a/(1-b)
         Graff ta' kalibrazzjoni
         Il-pass li jmiss huwa li tinbena plott ta' korrelazzjoni tal-valuri log k kontra log p għall-komposti ta' referenza adattati. Fil-prattika, sett ta' bejn 5 u 10 komposti ta' referenza standard li l-log p tagħhom hija madwar l-iskala mistennija jiġu injettati flimkien u jiġu ddeterminati l-ħinijiet ta' retenzjoni, preferibbilment fuq integratur ta' l-irrekordjar mgħaqqad mas-sistema tat-tiftix. Il-logaritmi korrispondenti tal-fatturi ta' kapaċità, log k, huma kkalkulati u pplottjati bħala funzjoni tal-log p ddeterminat bil-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun. Il-kalibrazzjoni titwettaq f’intervalli regolari, għall-inqas darba kuljum, sabiex ikunu jistgħu jiġu kkunsidrati l-bidliet possibbli fil-prestazzjoni tal-kolonna.
         Determinazzjoni tal-fattur tal-kapaċità tas-sustanza għat-test
         Is-sustanza għat-test tiġi injettata fi kwantità żgħira kemm jista' jkun ta' fażi mobbli. Il-ħin ta' retenzjoni jiġi ddeterminat (għal darbtejn), u b'hekk jippermetti l-kalkolu tal-fattur ta' kapaċità k. Mill-graff tal-korrelazzjoni tal-komposti ta' referenza, il-koeffiċjent tas-sustanza għat-test jista' jiġi interpolat. Għal koeffiċjenti baxxi ħafna u għolja ħafna, hija neċessarja l-estrapolazzjoni. F’dawk il-każijiet trid tingħata attenzjoni partikulari għal-limiti ta' validità tal-linja ta' rigressjoni.
         2.   DATA
         Metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun
         L-affidabbiltà tal-valuri ddeterminati ta' P jistgħu jkunu ppruvati bi tqabbil mal-mezzi tad-determinazzjonijiet dupplikati mal-medja globali.
         3.   RAPPURTAR
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet),
                  
               
                     —
                  
                  
                     meta l-metodi ma japplikawx (eż. materjal attiv fuq is-superfiċje), għandhom ikun pprovdut valur ikkalkulat jew stima bbażat/a fuq is-solubilitajiet individwali fl-n-oktanol u fl-ilma,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rrapportati, b'mod speċjali fir-rigward ta' l-impuritajiet u l-istat fiżiku tas-sustanza.
                  
               Għall-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun:
         
                     —
                  
                  
                     ir-riżultat ta' l-istima preliminari, jekk ikun hemm,
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-temperatura tad-determinazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-DATA dwar il-proċeduri analitiċi użati fid-determinazzjoni tal-konċentrazzjonijiet,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin u l-veloċità taċ-ċentrifugazzjoni, jekk użata,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjonijiet imkejla biż-żewġ fażijiet għal kull determinazzjoni (dan ifisser li total ta' 12-il konċentrazzjoni jiġu rrappurtati),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-piż tas-sustanza għat-test, il-volum ta' kull fażi użata f’kull reċipjent tat-test u l-ammont totali kkalkulat ta' sustanza għat-test preżenti f’kull fażi wara l-ekwilibrazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-valuri kkalkulati tal-koeffiċjent tal-qsim (P) u l-medja għandhom ikunu rrapurtati għal kull sett ta' kondizzjonijiet tat-test kif għandu jsir ukoll għall-medja tad-determinazzjonijiet kollha. Jekk hemm suspett ta' dipendenza tal-konċentrazzjoni fuq il-koeffiċjent tal-qsim, dan għandu jkun imniżżel fir-rapport,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-devjazzjoni standard tal-valuri individwali P madwar il-medja tagħhom għandha tkun rrapurtata,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-valur medju P tad-determinazzjonijiet kollha għandu jkun espress ukoll bħala logartimu tiegħu stess (bażi 10),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-Pow teoretiku kkalkulat meta dan il-valur ġie ddeterminat jew meta l-valur imkejjel huwa > 104,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-pH ta' l-ilma użat u tal-fażi fl-ilma matul l-esperiment,
                  
               
                     —
                  
                  
                     jekk jintużaw protezzjonijiet, ġustifikazzjoni għall-użu tal-protezzjonijiet flok l-ilma, il-kompożizzjoni, il-konċentrazzjoni u l-pH tal-protezzjonijiet, il-pH tal-fażi fl-ilma qabel u wara l-esperiment.
                  
               Metodu HPLC:
         
                     —
                  
                  
                     ir-riżultat ta' l-istima preliminari, jekk ikun hemm,
                  
               
                     —
                  
                  
                     is-sustanza għat-test u ta' referenza u l-purità tagħhom,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-iskala tat-temperatura tad-determinazzjonijiet,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-pH li fih isiru d-determinazzjonijiet,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-dettalji tal-kolonna analitika u ta' protezzjoni, tal-fażi mobbli u tal-mezzi tat-tiftix,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-DATA ta' retenzjoni u l-valuri tal-log P fil-letteratura għall-komposti ta' referenza użati fil-kalibrazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-dettalji tal-linja ta' rigressjoni riżultanti (log K kontra log P),
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-DATA ta' retenzjoni medja u l-valur interpolat ta' log P għall-kompost għat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-deskrizzjoni tat-tagħmir u l-kondizzjonijiet operattivi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-profili ta' l-elużjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kwantitajiet ta' sustanzi għat-test u ta' referenza mdaħħla fil-kolonna,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin mejjet u kif tkejjel.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) -Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219 (1981).
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223–339.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial use -Determination of partition coefficient -Flask shaking method.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10 ,382
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984,
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Base11978.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.
                  
               
            Appendiċi 1
            Metodi ta' stima/kalkolu
            DAĦLA
            Daħla ġenerali għall-metodi ta' kalkolu, DATA u eżempji huma pprovduti fil-Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a).
            Il-valuri kkalkulati tal-Pow jistgħu jintużaw:
            
                        —
                     
                     
                        biex ikun deċiż liema mill-metodi sperimentali huma adattati (skala taċ-ċaqliq tal-flixkun: log Pow: minn - 2 sa 4, skala HPLC: log Pow: minn 0 sa 6),
                     
                  
                        —
                     
                     
                        għall-għażla tal-kondizzjonijiet għat-test adattati (eż. sustanzi ta' referenza għal proċeduri HPLC, proporzjon tal-volum n-oktanol/ilma għall-metodu taċ-ċaqliq tal-flixkun),
                     
                  
                        —
                     
                     
                        bħala verifika interna tal-laboratorju ta' żbalji sperimentali possibli,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        għall-għoti ta' stima ta' Pow- f'każijiet fejn il-metodi sperimentali ma jistgħux jiġu applikati għal raġunijiet tekniċi.
                     
                  METODU TA' STIMA
            
               Stima preliminari tal-koeffiċjent tal-qsim
            
            Il-valur tal-koeffiċjent tal-qsim jista' jkun stmat bl-użu tas-solubilitajiet tas-sustanza tat-test f'solventi puri: Għal din:
            
               
            METODI TA' KALKOLU
            
               Prinċipju tal-Metodi ta' Kalkolu
            
            Il-metodi kollha ta' kalkolu huma bbażati fuq il-frammentazzjoni formali tal-molekula b'sub-strutturi adattati li għalihom huma magħrufa żidiet affidabbli tal-log Pow. Il-log Pow tal-molekula kollha huwa mbagħad ikkalkulat bħala s-somma tal-valur tal-framment korrispondenti tiegħu flimkien mas-somma tat-termini ta' korrezzjoni għal interazzjonijiet intramolekulari.
            Lista ta' kostanti ta' frammenti u termini ta' korrezzjoni huma disponibbli (b)(c)(d)(e);. Uħud huma regolarment aġġornati (b).
            Kriterji ta' kwalità
            B'mod ġenerali, l-affidabbiltà tal-metodu ta' kalkolu tonqos jekk tiżdied il-komplessità tal-kompost taħt studju. Fil-każ ta' molekuli sempliċi b'piż molekulari baxx u grupp funzjonali jew tnejn, tista' tkun mistennija devjazzjoni ta' 0,1 sa 0,3 unitajiet ta' log Pow bejn ir-riżultati tal-metodi ta' frammentazzjoni differenti u l-valur mkejjel. Fil-każ ta' molekuli aktar komplessi l-marġni ta' l-iżball jista' jkun akbar. Dan se jiddependi fuq l-affidabbiltà u d-disponibbiltà ta' kostanti ta' framment, kif ukoll fuq l-abbiltà biex jintgħarfu l-interazzjonijeit intramolekulari (eż.. ir-rabtiet ta' l-idroġenu) u l-użu korrett tat-termini ta' korrezzjoni (inqas ta' problema bis-software tal-kompjuter CLOGP-3) (b). Fil-każ ta' komposti jonizzanti l-konsiderazzjoni korretta taċ-ċarġ u l-grad ta' jonizzazzjoni hija importanti.
            Proċedura ta' kalkolu
            Il-metodu Hansch π-
            Il-kostanti tas-sostitwent idrofobiku oriġinali, π, introdott minn Fujira et al. (f) huwa mfisser bħala:
            πx = log Pow (PhX) -log Pow (PhH)
            fejn Pow (PhX) huwa l-koeffiċjent tal-qsim ta' derivattiv aromatiku u Pow (PhH) dak tal-kompost ewlieni
            (eż.. πCl = log Pow (C6H5Cl) -log Pow (C6H6) = 2,84 – 2,13 = 0,71).
            Skond id-definizzjoni tiegħu l-metodu π japplika b'mod predominanti għal sostituzzjoni aromatika. Valuri π għal għadd kbir ta' sostitwenti ngħataw f'tabelli (b)(c)(d). Huma użati għall-kalkolu ta' log Pow għall-molekuli jew substrutturi aromatiċi.
            Metodu Rekker
            Skond Rekker (g) il-valur tal-log Pow huwa kkalkulat kif ġej:
            
               
            fejn fi jirrappreżenta l-kostanti tal-frammenti molekulari differenti u ai il-frekwenza ta' l-okkorrenza fil-molekula taħt eżami. It-termini ta' korrezzjoni jistgħu jiġu espressi bħala multiplu integrali ta' kostanti wieħed Cm (l-hekk imsejjaħ “kostanti maġiku”). Il-kostanti tal-frammenti fi u Cm kienu ddeterminati minn lista ta' 1,054 valur sperimentali ta' Pow (825 kompost) bl-użu ta' l-analiżi ta' rigressjoni multipla (c)(h). Id-determinazzjoni tat-termini ta' interazzjoni titwettaq skond regoli fissi mfissra fil-letteratura (e)(h)(i).
            Il-metodu Hansch-Leo
            Skond Hansch u Leo (c) il-valur tal-log Pow huwa kkalkulat kif ġej:
            
               
            fejn fi jirrapreżenta l-kostanti tal-frammenti molekulari differenti, Fj it-termini ta' korrezzjoni u ai il-frekwenzi korrispondenti ta' l-okkorrenza. Lista ta' valuri atomiċi u ta' gruppi frammentali u lista ta' termini ta' korrezzjoni Fj (l-hekk imsejħa “fatturi”) iddeterminati bl-approssimazzjoni, inkisbet mill-valuri sperimentali Pow. It-termini ta' korrezzjoni kienu ordnati f'diversi klassijiet differenti (a)(c). Huwa relattivament komplikat u jitteħed wisq ħin biex ikunu kkunsidrati r-regoli u t-termini ta' korrezzjoni kollha. Pakketti tas-software ġew żviluppati (b).
            Metodu Kombinat
            Il-kalkolu tal-log Pow tal-molekuli komplessi tista' titjieb konsiderevolment, jekk il-molekula tiġi tinqasam f'substrutturi akbar li għalihom hemm disponibbli valuri affidabbli tal-log Pow jew mit-tabelli (b)(c) jew mill-kejl li wieħed jagħmel. Frammenti bħal dawn (eż.. eteroċikli, antrakinone, ażobenżin) jistgħu mbagħad jiġu kkombinati mal-valuri Hansch π jew mal-kostanti tal-frammenti Rekker jew Leo.
            Rimarki
            
                        i)
                     
                     
                        Il-metodi ta' kalkolu jistgħu jkunu applikati biss għal komposti jonizzati parzjalment jew sħaħ meta huwa possibli li jiġu kkunsidrati l-fatturi ta' korrezzjoni neċessarji.
                     
                  
                        ii)
                     
                     
                        Jekk wieħed jassumi li hemm rabtiet idroġeni intramolekulari, it-termini ta' korrezzjoni korrispondenti (approssimattivament unitajiet +0,6 to +1,0 log Pow) jridu jiġu miżjuda (a). Indikazzjoni tal-preżenza ta' rabtiet bħal dawn jistgħu jinkisbu mill-mudelli tridimensjonali jew mid-DATA spettroskopika tal-molekula.
                     
                  
                        iii)
                     
                     
                        Jekk huma possibli bosta forom tawtomeriċi, l-aktar forma probabbli għandha tintuża bħala bażi għall-kalkolu.
                     
                  
                        iv)
                     
                     
                        Ir-reviżjonijiet tal-listi tal-kostanti tal-frammenti għandhom jkunu segwiti bl-attenzjoni kollha.
                     
                  Rapport
            Meta jkunu qed jintużaw metodi ta' kalkolu/stima, ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
            
                        —
                     
                     
                        id-deskrizzjoni tas-sustanza (identità, impuritajiet, eċċ.),
                     
                  
                        —
                     
                     
                        l-indikazzjoni ta' kwalunkwe rabta idroġena intramolekulari possibli, dissoċjazzjoni, taċ-ċarġ u kwalunkwe effett mhux tas-soltu ieħor (eż.. tawtomeriżmu) ,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        id-deskrizzjoni tal-metodu ta' kalkolu,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        l-identifikazzjoni jew il-provvista ta' database,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        il-pekularitajiet fil-għażla tal-frammenti,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        id-dokumentazzjoni komprensiva tal-kalkolu.
                     
                  LETTERATURA
            
                        (a)
                     
                     
                        W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.
                     
                  
                        (b)
                     
                     
                        Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).
                     
                  
                        (ċ)
                     
                     
                        C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
                     
                  
                        (d)
                     
                     
                        A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71,525.
                     
                  
                        (e)
                     
                     
                        R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. -Chill. Ther. 1979, vol. 14,479.
                     
                  
                        (f)
                     
                     
                        T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86,5175.
                     
                  
                        (g)
                     
                     
                        R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977,vol.1.
                     
                  
                        (h)
                     
                     
                        C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,1459.
                     
                  
                        (i)
                     
                     
                        R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.
                     
                  
         
            Appendici 2
            Sustanzi ta' Referenza Rakkomandati għal Metodu HPLC
            
                        No.
                     
                     
                        Reference Substance
                     
                     
                        log Pow
                        
                     
                     
                        pKa
                     
                  
                        1
                     
                     
                        2-Butanone
                     
                     
                        0,3 
                     
                     
                         
                     
                  
                        2
                     
                     
                        4-Acetylpyridine
                     
                     
                        0,5 
                     
                     
                         
                     
                  
                        3
                     
                     
                        Aniline
                     
                     
                        0,9 
                     
                     
                         
                     
                  
                        4
                     
                     
                        Acetanilide
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                         
                     
                  
                        5
                     
                     
                        Benzylalcohol
                     
                     
                        1,1 
                     
                     
                         
                     
                  
                        6
                     
                     
                        p-Methoxyphenol
                     
                     
                        1,3 
                     
                     
                        pKa = 10,26 
                     
                  
                        7
                     
                     
                        Phenoxy acetic acid
                     
                     
                        1,4 
                     
                     
                        pKa = 3,12 
                     
                  
                        8
                     
                     
                        Phenol
                     
                     
                        1,5 
                     
                     
                        pKa = 9,92 
                     
                  
                        9
                     
                     
                        2,4-Dinitrophenol
                     
                     
                        1,5 
                     
                     
                        pKa = 3,96 
                     
                  
                        10
                     
                     
                        Benzonitrile
                     
                     
                        1,6 
                     
                     
                         
                     
                  
                        11
                     
                     
                        Phenylacetonitrile
                     
                     
                        1,6 
                     
                     
                         
                     
                  
                        12
                     
                     
                        4-Methylbenzyl alcohol
                     
                     
                        1,6 
                     
                     
                         
                     
                  
                        13
                     
                     
                        Acetophenone
                     
                     
                        1,7 
                     
                     
                         
                     
                  
                        14
                     
                     
                        2-Nitrophenol
                     
                     
                        1,8 
                     
                     
                        pKa = 7,17 
                     
                  
                        15
                     
                     
                        3-Nitrobenzoic acid
                     
                     
                        1,8 
                     
                     
                        pKa = 3,47 
                     
                  
                        16
                     
                     
                        4-Chloraniline
                     
                     
                        1,8 
                     
                     
                        pKa = 4,15 
                     
                  
                        17
                     
                     
                        Nitrobenzene
                     
                     
                        1,9 
                     
                     
                         
                     
                  
                        18
                     
                     
                        Cinnamic alcohol
                     
                     
                        1,9 
                     
                     
                         
                     
                  
                        19
                     
                     
                        Benzoic acid
                     
                     
                        1,9 
                     
                     
                        pKa = 4,19 
                     
                  
                        20
                     
                     
                        p-Cresol
                     
                     
                        1,9 
                     
                     
                        pKa = 10,17 
                     
                  
                        21
                     
                     
                        Cinnamic acid
                     
                     
                        2,1 
                     
                     
                        pKa = 3,89  cis 4,44  trans
                     
                  
                        22
                     
                     
                        Anisole
                     
                     
                        2,1 
                     
                     
                         
                     
                  
                        23
                     
                     
                        Methylbenzoate
                     
                     
                        2,1 
                     
                     
                         
                     
                  
                        24
                     
                     
                        Benzene
                     
                     
                        2,1 
                     
                     
                         
                     
                  
                        25
                     
                     
                        3-Methylbenzoic acid
                     
                     
                        2,4 
                     
                     
                        pKa = 4,27 
                     
                  
                        26
                     
                     
                        4-Chlorophenol
                     
                     
                        2,4 
                     
                     
                        pKa = 9,1 
                     
                  
                        27
                     
                     
                        Trichloroethylene
                     
                     
                        2,4 
                     
                     
                         
                     
                  
                        28
                     
                     
                        Atrazine
                     
                     
                        2,6 
                     
                     
                         
                     
                  
                        29
                     
                     
                        Ethylbenzoate
                     
                     
                        2,6 
                     
                     
                         
                     
                  
                        30
                     
                     
                        2,6-Dichlorobenzonitrile
                     
                     
                        2,6 
                     
                     
                         
                     
                  
                        31
                     
                     
                        3-Chlorobenzoic acid
                     
                     
                        2,7 
                     
                     
                        pKa = 3,82 
                     
                  
                        32
                     
                     
                        Toluene
                     
                     
                        2,7 
                     
                     
                         
                     
                  
                        33
                     
                     
                        1-Naphthol
                     
                     
                        2,7 
                     
                     
                        pKa = 9,34 
                     
                  
                        34
                     
                     
                        2,3-Dichloroaniline
                     
                     
                        2,8 
                     
                     
                         
                     
                  
                        35
                     
                     
                        Chlorobenzene
                     
                     
                        2,8 
                     
                     
                         
                     
                  
                        36
                     
                     
                        Allyl-phenylether
                     
                     
                        2,9 
                     
                     
                         
                     
                  
                        37
                     
                     
                        Bromobenzene
                     
                     
                        3,0 
                     
                     
                         
                     
                  
                        38
                     
                     
                        Ethylbenzene
                     
                     
                        3,2 
                     
                     
                         
                     
                  
                        39
                     
                     
                        Benzophenone
                     
                     
                        3,2 
                     
                     
                         
                     
                  
                        40
                     
                     
                        4-Phenylphenol
                     
                     
                        3,2 
                     
                     
                        pKa = 9,54 
                     
                  
                        41
                     
                     
                        Thymol
                     
                     
                        3,3 
                     
                     
                         
                     
                  
                        42
                     
                     
                        1,4-Dichlorobenzene
                     
                     
                        3,4 
                     
                     
                         
                     
                  
                        43
                     
                     
                        Diphenylamine
                     
                     
                        3,4 
                     
                     
                        pKa = 0,79 
                     
                  
                        44
                     
                     
                        Naphthalene
                     
                     
                        3,6 
                     
                     
                         
                     
                  
                        45
                     
                     
                        Phenylbenzoate
                     
                     
                        3,6 
                     
                     
                         
                     
                  
                        46
                     
                     
                        Isopropylbenzene
                     
                     
                        3,7 
                     
                     
                         
                     
                  
                        47
                     
                     
                        2,4,6-Trichlorophenol
                     
                     
                        3,7 
                     
                     
                        pKa = 6
                     
                  
                        48
                     
                     
                        Biphenyl
                     
                     
                        4,0 
                     
                     
                         
                     
                  
                        49
                     
                     
                        Benzylbenzoate
                     
                     
                        4,0 
                     
                     
                         
                     
                  
                        50
                     
                     
                        2,4-Dinitro-6 sec. butyophenol
                     
                     
                        4,1 
                     
                     
                         
                     
                  
                        51
                     
                     
                        1,2,4-Trichlorobenzene
                     
                     
                        4,2 
                     
                     
                         
                     
                  
                        52
                     
                     
                        Dodecanoic acid
                     
                     
                        4,2 
                     
                     
                         
                     
                  
                        53
                     
                     
                        Diphenylether
                     
                     
                        4,2 
                     
                     
                         
                     
                  
                        54
                     
                     
                        n-Butylbenzene
                     
                     
                        4,5 
                     
                     
                         
                     
                  
                        55
                     
                     
                        Phenanthrene
                     
                     
                        4,5 
                     
                     
                         
                     
                  
                        56
                     
                     
                        Fluoranthene
                     
                     
                        4,7 
                     
                     
                         
                     
                  
                        57
                     
                     
                        Dibenzyl
                     
                     
                        4,8 
                     
                     
                         
                     
                  
                        58
                     
                     
                        2,6-Diphenylpyridine
                     
                     
                        4,9 
                     
                     
                         
                     
                  
                        59
                     
                     
                        Triphenylamine
                     
                     
                        5,7 
                     
                     
                         
                     
                  
                        60
                     
                     
                        DDT
                     
                     
                        6,2 
                     
                     
                         
                     
                  
                        Other reference substances of low log Pow
                        
                     
                  
                        1
                     
                     
                        Nicotinic acid
                     
                     
                        -0,07 
                     
                     
                         
                     
                  
         A.9.   IL-PUNT TA' FJAMMABILITÀ
         1.   METODU
         1.1.   DAĦLA
         Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminari dwar il-fjammabilità tas-sustanza qabel jitwettaq dan it-test. Il-proċedura tat-test hija applikabbli għas-sustanzi likwidi fejn il-fwar jista' jitqabbad permezz ta' għejun ta' fjammabilità tan-nar. Il-metodi tat-test mniżżla f’dan it-test huma biss affidabbli għall-iskala ta' punti ta' fjammabilità li huma speċifikati fil-metodi individwali.
         Il-possibiltà ta' reazzjonijiet kimiċi bejn is-sustanza u fejn jinżamm il-kampjun għandha tkun ikkunsidrata meta jintgħażel il-metodu li se jintuża.
         1.2.   TIFSIRIET U UNITAJIET
         Il-punt ta' infjammabilità huwa l-inqas temperatura, korretta għal pressjoni ta' 101,325 kPa, li fiha likwidu jevolvi l-fwar, taħt kondizzjonijiet imfissra fil-metodu tat-test, f’dak l-ammont li l-fwar fjammabbli/t-taħlita ta' arja huwa/hija prodott/a fir-reċipjent tat-test.
         Unitajiet: °C
         t = T - 273,15
         (t f’ oC u T f’K)
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Sustanzi ta' referenza mhumiex meħtieġa li jintużaw fil-każijiet kollha meta tkun qed tiġi investigata sustanza ġdida. Huma għandhom iservu primarjament biex jiċċekkjaw ir-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' riżultati minn metodi oħra.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODI
         Is-sustanza titpoġġa fir-reċipjent tat-test u tissaħħan jew titkessaħ sat-temperatura tat-test skond il-proċedura mfissra fil-metodu tat-test individwali. Testijiet dwar il-fjammabilità jitwettqu bil-għan li jkun aċċertat jekk il-kampjun qabadx jew le fit-temperatura tat-test.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         1.5.1.   Ripetibbilità
         Ir-ripetibbilità tvarja skond l-iskala tal-fjammabilità u l-metodu tat-test użat; sa massimu ta' 2 oC.
         1.5.2.   Sensittività
         Is-sensittività tiddependi fuq il-metodu tat-test użat.
         1.5.3.   Speċifiċità
         L-ispeċifiċità ta' wħud mill-metodi tat-test hija limitata għal ċerti skali ta' punti ta' fjammabilità u suġġetti għal DATA relatata mas-sustanza (eż. viskożità għolja).
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.6.1.   Preparazzjonijiet
         Kampjun tas-sustanza għat-test jitpoġġa f’apparat għat-test skond 1.6.3.1 u/jew 1.6.3.2.
         Għas-sikurezza, huwa rakkomandat li metodu li jutilizza daqs żgħir ta' kampjun, circa 2 cm3, jintuża għal sustanzi enerġetiċi jew tossiċi.
         1.6.2.   Kondizzjonijiet tat-test
         L-apparat, għandu, sakemm ikun konsistenti mas-sikurezza, jitpoġġa f’pożizzjoni 'l-bogħod mill-kurrent ta' l-arja.
         1.6.3.   L-eżekuzzjoni tat-test
         1.6.3.1.   Metodu ta' l-ekwilibriju
         Ara ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.
         1.6.3.2.   Metodu ta' non-ekwilibriju
         Apparat Abel:
         Ara BS 2000 parti 170, NF M07-011, NF T66-009.
         Apparat Abel-Pensky:
         Ara EN 57, DIN 51755 parti 1 (għal temperaturi minn 5 sa 65 oC), DIN 51755 parti 2 (għal temperaturi taħt il-5 C), NF M07-036.
         Apparat Tag:
         Ara ASTM D 56.
         Apparat Pensky-Martens:
         Ara ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.
         Rimarki:
         Meta l-punt ta' fjammabilità, iddeterminat permezz ta' metodu ta' non-ekwlibriju f’1.6.3.2., jinstab li huwa 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC jew 55 ± 2 oC, għandu jkun ikkonfermat b'metodu ta' ekwilibriju bl-użu ta' l-istess apparat.
         Il-metodi li jagħtu t-temperatura tal-punt ta' fjammabilità biss jistgħu jintużaw għal notifikazzjoni.
         Biex ikun iddeterminat il-punt ta' fjammabilità ta' likwidi viskożi (żebgħa, gomom u simili) li fihom solventi, jista' jintuża biss apparat u jintużaw biss metodi tat-test adattati għad-determinazzjoni tal-punt ta' fjammabilità ta' likwidi viskożi.
         Ara ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 parti 1.
         
                  
                     2.
                  
                  
                     DATA
                  
               3.   RAPPURTAR
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identità u impuritajiet),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-metodu użat għandu jkun dikjarat kif ukoll xi devjazzjonijiet possibbli,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati u xi rimarki addizzjonali relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               4.   REFERENZI
         Xejn.
         A.10.   FJAMMABILITÀ (SOLIDI)
         1.   METODU
         1.1.   DAĦLA
         Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminari dwar proprjetajiet splussivi potenzjali tas-sustanza qabel jitwettaq dan it-test.
         Dan it-test għandu jkun applikat biss għal sustanzi tat-trab, mrammla jew qishom kolla.
         Bil-għan li ma jiġux inklużi s-sustanzi kollha li jistgħu jinxtegħlu imma dawk biss li jinħarqu malajr jew dawk li l-imġiba tal-ħruq tagħhom hija fi kwalunkwe mod speċjalment perikoluża, sustanzi li l-veloċità tal-ħruq tagħhom taqbeż ċertu valur ta' limitu biss huma kkunsidrati bħala fjammabbli ħafna.
         B'mod speċjali jista' jkun perikoluż li inkandexxenza timxi permezz ta' trab metalliku minħabba d-diffikultajiet fit-tifi ta' nar. Trabijiet metalliċi għandhom ikunu kkunsidrati bħala fjammabli ħafna jekk huma jgħinu t-tixrid ta' l-inkandexxenza fil-piż fi żmien speċifikat.
         1.2.   TIFSIRA U UNITAJIET
         Il-ħin tal-ħruq huwa muri f’sekondi.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Mhux speċifikati
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METOD
         Is-sustanza tiġi ffurmata fi strixxa mhix maqtugħa jew miċċa tat-trab ta' madwar 250 mm tul u test preliminari ta' orjentazzjoni jiġi esegwit biex ikun iddeterminat jekk, mal-fjammabilità ta' fjamma tal-gass, issirx propagazzjoni bil-ħruq tal-fjamma jew bi ħruq bati mingħajr fjamma. Jekk isseħħ propagazzjoni fuq 200 mm tal-miċċa f’ħin speċifikat allura jitwettaq programm ta' test sħiħ biex tkun iddeterminata r-rata ta' ħruq.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         Mhux definiti.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.6.1.   Test preliminari ta' orjentazzjoni
         Is-sustanza tiġi ffurmata fi strixxa mhux miksura jew miċċa tat-trab madwar 250 mm tul u 20 mm wiesa’ b’10 mm għoli fuq pjanċa tal-bażi mhux kombustibbli, mhux poruża u b'konduċibilità ta' sħana baxxa. Fjamma b’temperatura għolja minn berner tal-gass (dijametru minimu ta' 5 mm) tiġi applikata fuq tarf tal-miċċa tat-trab sakemm it-trab jaqbad jew għal massimu ta' 2 minuti (5 minuti għal trab tal-metall jew għal liegi metalliċi). Għandu jkun innotat jekk il-kombustjoni timxix matul 200 mm tal-miċċa fil-perjodu ta' test ta' 4 minuti (jew 40 minuta għal trabijiet tal-metall). Jekk is-sustanza ma taqbadx u ma tmexxix il-kombustjoni permezz tal-fjammabilità bil-fjamma jew bin-nati bati bla fjamma matul 200 mm tal-miċċa tat-trab fil-perjodu ta' test ta’4 minuti (jew 40 minuta), allura s-sustanza m'għandhiex titqies bħala fjammabbli ħafna u mhuwa meħtieġ ebda test ieħor. Jekk is-sustanza tmexxi l-fjammabilità fuq 200 mm tal-miċċa tat-trab f’inqas minn 4 minuti, jew inqas minn 40 minuta għal trabijiet metalliċi, għandha titwettaq il-proċedura mfissra hawn taħt (punt 1.6.2 u ta' wara).
         1.6.2.   It-test tar-rata ta' fjammabilità
         1.6.2.1.   Preparazzjoni
         Sustanzi f'forma ta' trab jew mrammla jiġu mimlija sfużi f’forma ta' 250 mm tul b'taqsima trasversali trijangulari ta' għoli intern ta' 10 mm u wisa' ta' 20 mm. Żewġ pjanċi tal-metall jiġu mmuntati fuq iż-żewġ naħat tal-forma bħala limitazzjonijiet laterali li joħorġu 2 mm ’il barra mit-tarf l-għoli tat-taqsima trasversali trijangulari (figura). Il-forma mbagħad titwaddab tliet darbiet minn għoli ta' 2 cm fuq superfiċje solida. Jekk ikun neċessarju l-forma terġa’ tiġi mimlija. Il-limitazzjonijiet laterali mbagħad jitneħħew u s-sustanza żejda titneħħa. Pjanċa tal-bażi mhux kombustibbli, mhux poruża u b’konduċibilità ta' sħana baxxa titpoġġa fuq il-forma, l-apparat jinqaleb u l-forma titneħħa.
         Sustanzi bħall-pejst jiġu mdellka fuq pjanċa tal-bażi mhux kombustibbli, mhux poruża u b’konduċibilità ta' sħana baxxa fil-forma ta' ħabel 250 mm fit-tul b'sezzjoni trasversali ta' madwar 1 cm2.
         1.6.2.2.   Kondizzjonijiet tat-test
         Fil-każ ta' sustanza sensittiva għall-umdità, it-test għandu jitwettaq malajr kemm jista' jkun wara li jitneħħa mill-kontenitur.
         1.6.2.3.   L-eżekuzzjoni tat-test
         Irranġa l-gozz f’kurrent ta' arja f’armarju li jiġbed id-duħħan.
         Il-veloċità ta' l-arja trid tkun suffiċjenti biex tevita li d-duħħan joħroġ fil-laboratorju u m'għandhiex tkun varjata matul it-test. L-apparat irid ikun protett mill-kurrent ta' l-arja.
         Fjamma taħraq minn berner tal-gass (dijametru minimu ta' 5mm) jintuża biex ikun mixgħul il-gozz minn naħa waħda. Meta l-gozz ikun inħaraq sa distanza ta' 80 mm, titkejjel ir-rata ta' ħruq fuq il-100 mm li jmiss.
         It-test jitwettaq sitt darbiet, bl-użu ta' pjanċa nadifa u kiesħa kull darba, kemm-il darba ma jkunx osservat riżultat pożittiv qabel.
         2.   DATA
         Il-ħin tal-ħruq mit-test ta' orjentazzjoni preliminari (1.6.1.) u l-inqas ħin ta' ħruq sa sitt testijiet (1.6.2.3.) huma relevanti għall-valutazzjoni.
         3.   RAPPURTAR
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identifikazzjoni u impuritajiet),
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-deskrizzjoni tas-sustanza għat-test, l-istat fiżiku tagħha inkluż il-kontenut ta' l-umdità,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati mit-testijiet ta' orjentazzjoni preliminari u mit-test tar-rata ta' ħruq jekk ikunu saru,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Sustanzi f'forma ta' trab, imrammla jew bħall-pejst għandhom jiġu kkunsidrati bħala fjammabbli ħafna meta l-ħin tal-ħruq fi kwalunkwe test skond il-proċedura tat-test mfisser f'1.6.2 huwa inqas minn 45 sekonda. Trabijiet tal-metall u liegi tal-metall huma kkunsidrati bħala fjammabbli ħafna meta huma jistgħu jitqabbdu u l-fjamma jew iż-żona ta' reazzjoni tinfirex fuq il-kampjun kollu f’10 minuti jew inqas.
         4.   REFERENZI
         NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.
         
            Appendiċi
            Figura
            Forom u aċċessorji għall-preparazzjoni tal-gozz
            (Id-dimensjonijiet kollha f'millimetri)
            
         A.11.   FJAMMABILITÀ (GASSIJIET)
         1.   METODU
         1.1.   DAĦLA
         Dan il-metodu jippermetti d-determinazzjoni ta' jekk gassijiet imħallta ma' l-arja f’temperatura ambjentali (circa 20 oC) u l-pressjoni atmosferika humiex fjammabbli u, jekk huma hekk, fuq liema skala ta' konċentrazzjonijiet. Taħlitiet ta' konċentrazzjonijiet li jiżdiedu tal-gass għat-test ma' l-arja jiġu esposti għal spark elettriku u jiġi osservat jekk jaqbdux.
         1.2.   TIFSIRA U UNITAJIET
         L-iskala ta' fjammabilità hija l-iskala ta' konċentrazzjoni bejn l-inqas u l-ogħla limiti ta' splużjoni. L-inqas u l-ogħla limiti ta' splużjoni huma dawk il-limiti ta' konċentrazzjoni ta' gass fjammabbli mħallat ma' l-arja li fih ma sseħħx propagazzjoni tal-fjamma.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Mhux speċifikati
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU
         Il-konċentrazzjoni tal-gass fl-arja tiżdied pass pass u t-taħlita hija esposta f’kull stadju għal spark elettriku.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         Mhux definiti.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.6.1.   Apparat
         Ir-reċipjent għat-test huwa ċilindru tal-ħġieġ vertikali li għandu dijametru intern ta' 50 mm u għoli minimu ta' 300 mm. L-elettrodi għall-fjammabilità huma separati b'distanza ta' 3 sa 5 mm u huma mpoġġija 600 mm fuq il-qiegħ taċ-ċilindru. Iċ-ċilindru huwa mgħammar bi ftuħ għar-rilaxx tal-pressjoni. L-apparat għandu jkollu protezzjoni biex inaqqas kwalunkwe ħsara minn splużjoni.
         Bħala sors ta' fjammabilità jintuża spark ta' induzzjoni permanenti ta' dewmien ta' 0,5 s, li huwa ġġenerat minn transformer ta' vultaġġ għoli b'vultaġġ ta' ħruġ minn 10 sa 15 kV (massimu ta' enerġija ta' dħul 300 W). Eżempju ta' apparat adattat huwa mfisser fir-referenza (2).
         1.6.2.   Kondizzjonijiet tat-test
         It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20 oC).
         1.6.3.   L-eżekuzzjoni tat-test
         Konċentrazzjoni magħrufa ta' gass fl-arja tiġi mdaħħla fiċ-ċilindru tal-gass, permezz ta' pompi li jippompjaw proporzjon tad-doża. Spark jiġi mgħoddi mit-taħlita u jiġi osservat jekk il-fjamma tinqatax waħedha jew mill-għajn tal-fjammabilità u tinfirix b'mod indipendenti. Il-konċentrazzjoni tal-gass tvarja fi stadji ta' 1 % vol. sakemm isseħħ il-fjammabilità kif imfisser hawn fuq.
         Jekk l-istruttura kimika tal-gass tindika li ma tkunx fjammabbli u tista' tiġi kkalkulata l-kompożizzjoni tat-taħlita stojkjometrika bl-arja, imbagħad taħlitiet fl-iskala minn 10 % anqas mill-kompożizzjoni stojkjometrika sa 10 % aktar minn din il-kompożizzjoni biss jeħtieġ li jkunu ttestjati fi stadji ta' 1 %.
         2.   DATA
         L-okkorrenza tat-tixrid tal-fjamma hija l-unika DATA ta' informazzjoni relevanti għad-determinazzjoni ta' din il-proprjetà.
         3.   RAPPURTAR
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identifikazzjoni u impuritajiet),
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni, bid-dimensjonijiet, ta' l-apparat użat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-temperatura li fiha twettaq it-test ,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjonijiet ippruvati u r-riżultati miksuba,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultat tat-test: gass mhux fjammabbli jew gass fjammabbli ħafna,
                  
               
                     —
                  
                  
                     jekk ikun konkluż li l-gass mhuwiex fjammabbli allura l-iskala ta' konċentrazzjoni li fuqha kien ippruvat fi stadji ta' 1 % għandha tkun iddikjarata,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu rrapurtati.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse- einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen'. Chem.-Ing.- Tech. 1984, vo156, 2, 126-127.Wortmann, T.Redeker und H.Schacke. 'Entwicklung
                  
               A.12.   FJAMMABILITÀ (KUNTATT MA' L-ILMA)
         1.   METODU
         1.1.   DAĦLA
         Dan il-metodu ta' test jista' jintuża biex ikun iddeterminat jekk ir-reazzjoni ta' sustanza ma' l-ilma jew l-arja umda twassalx għall-iżvilupp ta' ammonti perikolużi ta' gass jew gassijiet li jistgħu jkunu fjammabbli ħafna.
         Il-metodu jista' jiġi applikat għal sustanzi likwidi kif ukoll solidi. Dan il-metodu mhux applikabbli għal sustanzi li jitqabbdu spontanjament meta jiġu f’kuntatt ma' l-arja.
         1.2.   TIFSIRIET U UNITAJIET
         Fjammabbli ħafna: sustanzi li, f’kuntatt ma' l-ilma jew l-arja umda, jevolvu gassijiet fjammabbli ħafna fi kwantitajiet perikolużi b'rata minima ta' 1 litru/kg għal kull siegħa.
         1.3.   PRINĊIPJU TAL-METODU
         Is-sustanza hija ttestjata skond is-sekwenza pass wara pass imfissra hawn taħt; jekk il-fjammabilità isseħħ fi kwalunkwe pass, ebda test ieħor mhuwa meħtieġ. Jekk ikun magħruf li s-sustanza ma tirreaġixxix b'mod vjolenti ma' l-ilma allura jsir pass 4 (1.3.4).
         1.3.1.   Pass 1
         Is-sustanza għat-test titpoġġa f’reċipjent bl-ilma distillat f’20 oC u jiġi nnotat jekk il-gass li evolva jaqbadx jew le.
         1.3.2.   Pass 2
         Is-sustanza għat-test titpoġġa fuq karta filtru fuq il-wiċċ ta' dixx li fih ilma distillat f’20 oC u jiġi nnotat jekk il-gass li evolva jaqbadx jew le. Il-karta filtru tintuża biss biex iżżomm lis-sustanza f’post wieħed biex jikbru ċ-ċansijiet tal-fjammabilità.
         1.3.2.   Pass 3
         Is-sustanza għat-test hija magħmula f’gozz approssimattivament 2 cm għoli u 3 cm dijametru. Ftit qtar ta' ilma jiżdiedu mal-gozz u jiġi nnotat jekk il-gass evolut jaqbadx jew le.
         1.3.4.   Pass 4
         Is-sustanza għat-test tiġi miżjuda ma' ilma distillat f’20 C u r-rata ta' evoluzzjoni tal-gass titkejjel fuq perjodu ta' seba' sigħat, f’intervalli ta' siegħa. Jekk ir-rata ta' evoluzzjoni mhijiex kostanti, jew qed tiżdied wara seba’ sigħat, il-ħin tal-kejl għandu jittawwal għal massimu ta' ħamest ijiem. It-test jista' jitwaqqaf jekk ir-rata fi kwalunkwe ħin taqbeż il-1 litru/kg għal kull siegħa.
         1.4.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Mhux speċifikati
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         Mhux definiti.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.6.1.   Pass 1
         1.6.1.1.   Kondizzjonijiet tat-test
         It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20 C).
         1.6.1.2.   L-eżekuzzjoni tat-test
         Kwantità żgħira (approssimattivament 2 mm dijametru) tas-sustanza għat-test għandha titpoġġa f'reċipjent li fih ilma distillat. Għandu jkun innotat jekk (i) evolviex xi gass u (ii) jekk seħħitx il-fjammabbiltà tal-gass. Jekk isseħħ il-fjammabbiltà tal-gass mhuwa meħtieġ l-ebda test ieħor tas-sustanza għaliex is-sustanza hija meqjusa bħala perikoluża.
         1.6.2.   Pass 2
         1.6.2.1.   Apparat
         Karta filtru titpoġġa tgħum fil-wiċċ ta' l-ilma distillat fi kwalunkwe reċipjent adattat, eż. dixx għall-evaporazzjoni b'dijametru ta' 100 mm.
         1.6.2.2.   Kondizzjonijiet tat-test
         It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20 oC).
         1.6.2.3.   L-eżekuzzjoni tat-test
         Kwantità żgħira tas-sustanza għat-test (approssimattivament 2 mm dijametru) għandha titpoġġa fin-nofs tal-karta filtru. Għandu jkun innotat jekk (i) evolviex xi gass u (ii) jekk seħħitx il-fjammabilità tal-gass. Jekk isseħħ it-tqabbid tal-gass mhuwa meħtieġ l-ebda test ieħor tas-sustanza għaliex is-sustanza hija meqjusa bħala perikoluża.
         1.6.3.   Pass 3
         1.6.3.1.   Kondizzjonijiet tat-test
         It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20 oC).
         1.6.3.2.   L-eżekuzzjoni tat-test
         Is-sustanza għat-test hija magħmula f’gozz approssimattivament 2 cm għoli u 3 cm dijametru bi ftit fond fil-quċċata. Jiżdiedu ftit qtar ta' ilma fil-post fond u għandu jkun innotat jekk (i) evolviex xi gass u (ii) jekk seħħitx il-fjammabilità tal-gass. Jekk isseħħ il-fjammabbiltà tal-gass mhuwa meħtieġ l-ebda test ieħor tas-sustanza għaliex is-sustanza hija meqjusa bħala perikoluża.
         1.6.4.   Pass 4
         1.6.4.1.   Apparat
         L-apparat jiġi mmuntat kif jidher fil-figura.
         1.6.4.2.   Kondizzjonijiet tat-test
         Spezzjona l-kontenitur tas-sustanza għat-test għal xi trab < 500 μm (daqs tal-partikula). Jekk it-trab jikkostitwixxi aktar minn 1 % w/w tat-total, jew jekk il-kampjun jista' jitfarrak malajr, allura l-ammont kollu tas-sustanza għandu jitfarrak fi trab qabel it-test sabiex jippermetti tnaqqis fid-daqs tal-partikula matul il-ħażna u l-immaniġġar; inkella s-sustanza għandha tkun ittestjata kif tkun irċevuta. It-test irid isir f’temperatura ambjentali (circa 20 oC) u pressjoni atmosferika.
         1.6.4.3.   L-eżekuzzjoni tat-test
         Minn 10 sa 20 ml ta' ilma jitpoġġew fil-lembut tal-qtar ta' l-apparat u 10 g tas-sustanza jitpoġġew fi flixkun koniku. Il-volum tal-gass li jevolvi jista' jitkejjel bi kwalunkwe mezz adattat. It-tapp tal-lembut tal-qtar jiġi miftuħ biex iħalli l-ilma jidħol fil-flixkun koniku u l-arloġġ tal-ħin jibda jitħaddem. L-evoluzjoni tal-gass titkejjel kull siegħa matul perjodu ta' seba’ sigħat. Jekk, matul dan il-perjodu, l-evoluzzjoni tal-gass hija irregolari, jew jekk, fi tmiem dan il-perjodu, ir-rata ta' l-evoluzzjoni tal-gass qed tiżdied, allura l-kejl għandu jitkompla sa ħamest ijiem. Jekk, fi kwalunkwe ħin tal-kejl ir-rata tal-gass taqbeż il-1 litru/kg għal kull siegħa, it-test għandu jieqaf. It-test għandu jsir għal tliet darbiet.
         Jekk l-identità kimika tal-gass ma tkunx magħrufa, il-gass għandu jkun analizzat. Meta l-gass jinkludi komponenti fjammabbli ħafna u mhux magħruf jekk it-taħlita kollha hijiex fjammabbli ħafna, taħlita ta' l-istess kompożizzjoni għandha titħejja u tkun ppruvata skond il-metodu A.11.
         2.   DATA
         Is-sustanza titqies li hija perikoluża jekk:
         
                     —
                  
                  
                     isseħħ fjammabilità spontanja f’kull stadju tal-proċedura tat-test,
                     jew
                  
               
                     —
                  
                  
                     hemm evoluzzjoni ta' gass fjammabbli b'rata akbar minn 1 litru/kg tas-sustanza għal kull siegħa.
                  
               3.   RAPPURTAR
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identifikazzjoni u impuritajiet),
                  
               
                     —
                  
                  
                     dettalji ta' kwalunkwe Preparazzjoni inizjali tas-sustanza għat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati tat-testijiet (passi 1, 2, 3 u 4),
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-identità kimika tal-gass evolut,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-rata ta' evoluzzjoni ta' gass jekk pass 4 (1.6.4) jitwettaq,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwalunkwe rimarki relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
                  
               
            Appendiċi
            Figura
            Apparat
            
         A.13.   PROPRJETAJIET PIROFORIĊI TA' SOLIDI U LIKWIDI
         1.   METODU
         1.1.   DAĦLA
         Il-proċedura tat-test hija applikabbli għal sustanzi solidi jew likwidi, li, f’ammonti żgħar, jaqbdu spontanjament f’ħin qasir wara li jagħmlu kuntatt ma' l-arja f’temperatura ambjentali (circa 20 oC).
         Sustanzi li jeħtieġ li jkunu esposti għall-arja għal sigħat jew ġranet f’temperatura ambjentali jew f’temperaturi elevati qabel ma sseħħ il-fjammabilità mhumiex koperti b'dan il-metodu ta' test.
         1.2   TIFSIRIET U UNITAJIET
         Sustanzi huma kkunsidrati li għandhom proprjetajiet piroforiċi jekk huma jaqbdu jew jikkawżaw ħruq sakemm l-oġġett isir faħam skond il-kondizzjonijiet mfissra f’1.6.
         L-awto-fjammabilità ta' likwidi tista' tkun ittestjata bl-użu tal-metodu A.15 Temperatura ta' awto-fjammabilità (likwidi u gassijiet).
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Mhux speċifikati.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU
         Is-sustanza, kemm jekk solida kif ukoll likwida, tiżdied ma' carrier inert u titqiegħed f’kuntatt ma' l-arja f’temperatura ambjentali għal perjodu ta' ħames minuti. Jekk is-sustanzi likwidi ma jaqbdux allura huma assorbiti f’karta filtru u esposti għall-arja f’temperatura ambjentali (circa 20 oC) għal ħames minuti. Jekk solidu jew likwidu jaqbad, jew likwidu jaqbad jew jagħmel ifaħħam karta filtru, allura s-sustanza hija meqjusa bħala piroforika.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         Ripetibbilità: minħabba l-importanza fir-rigward tas-ikurezza, riżultat pożittiv wieħed huwa suffiċjenti biex is-sustanza tiġi kkunsidrata bħala piroforika.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' TEST
         1.6.1.   Apparat
         Kapsula tal-porċellana ta' dijametru circa 10 cm tiġi mimlija bi trab diatomaceous sa għoli ta' madwar 5 mm f’temperatura ambjentali (circa 20 oC).
         Nota:
         It-trab diatomaceous jew kwalunkwe sustanza inerta komparabbli oħra li hija disponibbli b'mod ġenerali għandha titqies bħala rappreżentattiva ta' ħamrija li fiha s-sustanza għat-test tista' tintefa' f'każ ta' inċident.
         Karta filtru niexfa hija meħtieġa biex ikunu ttestjati likwidi li ma jaqbdux f'kuntatt ma' l-arja meta jkunu f'kuntatt ma' carrier inert.
         1.6.2.   L-eżekuzzjoni tat-test
         a)   Solidi trab
         Minn 1 sa 2 cm3 mis-sustanza għat-test jitferraw minn għoli ta' circa 1 m fuq superfiċje mhux kombustibbli u jiġi osservat jekk is-sustanza taqbadx matul it-tferrigħ jew fi żmien ħames minuti wara li toqgħod.
         It-test jitwettaq sitt darbiet kemm-il darba ma sseħħx il-fjammabilità.
         b)   Likwidi
         Madwar 5 cm3 mil-likwidu għat-test jitferra’ f’kapsula tal-porċellana mħejjija u jiġi osservat jekk is-sustanza taqbadx fi żmien ħames minuti.
         Jekk ma sseħħ l-ebda fjammabilità f’sitt testijiet, għandhom jitwettqu dawn it-testijiet:
         Kampjun ta' 0,5 mm jintefa' permezz ta' siringa fuq karta filtru bit-tarf f’forma ta' serrieq u jiġi osservat jekk isseħħx fjammabilità jew ħruq sakemm titfaħħam il-karta filtru fi żmien ħames minuti li jiżdied il-likwidu. It-test jitwettaq tliet darbiet kemm-il darba ma sseħħx il-fjammabbiltà u t-tfaħħim.
         2.   DATA
         2.1.   INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         It-test jista' jitwaqqaf hekk kif iseħħ riżultat pożittiv f’xi wieħed mit-testijiet.
         2.2.   VALUTAZZJONI
         Jekk is-sustanza taqbad fi żmien ħames minuti meta tiżdied ma' courier inert u tkun esposta għall-arja, jew jekk sustanza likwida tinħaraq sakemm issir faħam jew tqabbad karta filtru fi żmien ħames minuti meta miżjuda jew esposta għall-arja, hija kkkunsidrata bħala piroforika.
         3.   RAPPURTAR
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identifikazzjoni u impuritajiet),
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultat tat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwalunkwe rimarka relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.
                  
               A.14.   PROPRJETAJIET ESPLOŻIVI
         1.   METODU
         1.1.   DAĦLA
         Il-metodu jipprovdi skema ta' testijiet biex jiġi ddeterminat jekk sustanza solida jew f’forma ta' pejst tippreżentax perikolu ta' splużjoni meta tkun sottomessa għall-effett ta' fjamma (sensittività termika), jew għal xokk jew frizzjoni (sensittività għal stimuli mekkaniċi), u jekk sustanza likwida tippreżentax periklu ta' splużjoni meta sottomessa għall-effett ta' fjamma jew xokk.
         Il-metodu fih tliet partijiet:
         
                     (a)
                  
                  
                     test ta' sensittività termika (1);
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     test ta' sensittività mekkanika fir-rigward ta' xokk (1);
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     test ta' sensittività mekkanika fir-rigward ta' frizzjoni (1).
                  
               Il-metodu jforni DATA biex tkun evalwata l-probabbiltà li tinbeda splużjoni permezz ta' ċerti stimuli komuni. Il-metodu mhuwiex maħsub biex jaċċerta jekk sustanza hijiex kapaċi li tesplodi taħt kwalunkwe kondizzjonijiet.
         Il-metodu huwa adattat biex ikun iddeterminat jekk sustanza tippreżentax periklu ta' splużjoni (termika jew sensittività mekkanika) taħt kondizzjonijiet partikulari speċifikati fid-Direttiva. Huwa bbażat fuq numru ta' tipi ta'apparati li huma użati ħafna internazzjonalment (1) u li s-soltu jagħtu riżultati sinifikattivi. Huwa rikonoxxut li l-metodu mhuwiex definittiv. Apparat alternattiv għal dak speċifikat jista' jintuża kemm-il darba huwa rikonoxxut internazzjonalment u li r-riżultati jistgħu jkunu korrelatati adegwatament ma' dawk minn apparat speċifikat.
         M'hemmx għalfejn jitwettqu t-testijiet meta informazzjoni termodinamika hija disponibbli (eż. is-sħana tal-formazzjoni, is-sħana tad-dekompożizzjoni) u/jew l-assenza ta' ċerti gruppi reattivi (2) fil-formula strutturali tistabbilixxi mingħajr dubju raġjonevoli li s-sustanza mhijiex kapaċi li tiddekomponi malajr bl-evoluzzjoni tal-gassijiet jew bir-rilaxx ta' sħana (i.e. il-materjal ma jippreżenta l-ebda riskju ta' splużjoni). Test ta' sensittività mekkanika fir-rigward ta' frizzjoni mhuwiex meħtieġ għal-likwidi.
         1.2.   TIFSIRIET U UNITAJIET
         Esplożiv:
         Sustanzi li jistgħu jisplodu taħt l-effett ta' fjamma jew li huma sensittivi għal xokk jew frizzjoni fl-apparat speċifikat (jew li huma sensittivi mekkanikament aktar minn 1,3 dinitrobenzene f’apparat alternattiv).
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         1,3-dinitrobenzene, prodott ta' kristallina teknika mgħarbul biex jgħaddi minn 0,5 mm, għall-metodi ta' frizzjoni u ta' xokk.
         
            Perhydro-1.3.5-trinitro-1.3.5-triazine (RDX, hexogen, ċiklonite-CAS 121-82-4), rikristallizzat minn cyclohexogen fl-ilma, mgħarbel fl-ilma minn 250 μm u miżmum fuq għarbiel ta' 150 μm u mnixxef f’103 ± 2 oC (għal erba' sigħat) għat-tieni serje ta' frizzjoni u testijiet ta' xokk.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU
         Testijiet preliminari huma neċessarji biex ikunu stabbiliti kondizzjonijiet bla periklu għall-eżekuzzjoni tat-tliet testijiet ta' sensittività.
         1.4.1.   Testijiet ta' sikurezza fl-immaniġġjar (3)
         Għal raġunijiet ta' sikurezza, qabel jitwettqu t-testijiet ewlenin, kampjuni żgħar ħafna (madwar 10 mg) tas-sustanza jiġu soġġetti għas-sħana mingħajr għeluq fi fjamma tal-gass, għal xokk fi kwalunkwe forma konvenjenti ta' apparat u għal frizzjoni bl-użu ta' martell b'ras ta' l-injam kontra inkwina jew kwalunkwe forma ta' magna għall-frizzjoni. L-għan huwa li jkun assigurat jekk is-sustanza hijiex daqshekk sensittiva u esplożiva li t-testijiet ta' sensittività preskritti, b'mod partikolari dak tas-sensittività termika, għandhomx jitwettqu bi prekawzjonijiet speċjali sabiex jiġi evitat korriment ta' l-operatur.
         1.4.2.   Sensittività termika
         Il-metodu jinvolvi t-tisħin tas-sustanza f’tubu ta' l-azzar, magħluq bi pjanċi miftuħa b'dijametri ta' toqob differenti, biex ikun iddeterminat jekk is-sustanza għandhiex tendenza li tisplodi taħt kondizzjonijiet ta' sħana intensa u għeluq definit.
         1.4.3.   Sensittività mekkanika (xokk)
         Il-metodu jinvolvi li s-sustanza tkun soġġetta għal xokk minn piż speċifikat mwaqqa’ minn għoli speċifikat.
         1.4.4.   Sensittività mekkanika (frizzjoni)
         Il-metodu jinvoli li sustanza solida jew f’forma ta' pejst tkun soġġetta għal frizzjoni bejn spuperfiċje standard taħt kondizzjonijiet speċifiċi ta' tagħbija u moviment relattiv.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         Mhux definiti.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.6.1.   Sensittività termika (effett ta' fjamma)
         1.6.1.1.   Apparat
         L-apparat jikkonsisti f’tubu ta' l-azzar li ma jerġax jintuża bi strument li jagħlaq u li jerġa' jintuża (figura 1) installat fi strument ta' sħana u ta' protezzjoni. Kull tubu huwa miġbud minn pjanċa ta' l-azzar (ara l-Appendiċi) u li għandu dijametru intern ta' 24 mm, tul ta' 75 mm u ħxuna tal-qoxra ta' 0,5 mm. It-tubu għandu flanġ fil-ġenb tal-ftuħ biex ikun jista' jingħalaq bl-immuntar tal-pjanċa miftuħa. Dan jikkonsisti fi pjanċa miftuħa li tirreżisti l-pressjoni, b'toqba ċentrali, marbuta sewwa ma' tubu bl-użu ta' vit f’żewġ partijiet (vit u skorfina bil-kamin). Il-vit u l-iskorfina bil-kamin huma magħmulin minn azzar tal-kromju-manganiż (ara l-Appendiċi) li ma jisparkjax sa 800 oC. Il-pjanċi miftuħin huma 6 mm ħoxnin, magħmula minn azzar reżistenti għas-sħana, u huma disponibbli b'firxa ta' dijametri fil-ftuħ.
         1.6.1.2.   Kondizzjonijiet tat-test
         Normalment is-sustanza tiġi ttestjata kif tkun riċevuta għalkemm f’ċerti każijiet, eż. jekk ippressata, magħmula f’forma jew ikkondensata b'xi mod ieħor, ikun neċessarju li s-sustanza tiġi ttestjata wara it-tifrik.
         Għal solidi, il-piż tal-materjal għall-użu f’kull test huwa ddeterminata bl-użu ta' testijiet f’żewġ stadji f’forma niexfa. Tubu miksi bil-qatran jimtela b“9 cm3 ta' sustanza u s-sustanza tiġi kompatta b'forza ta' 80 N applikata fuq it-trasversali totali tat-tubu. Għal raġunijiet ta' sikurezza jew f’każijiet fejn il-forma fiżika tal-kampjun tista' tinbidel b'kompressjoni jistgħu jintużaw proċeduri ta' mili oħrajn, eż. jekk is-sustanza hija sensittiva ħafna għal frizzjoni allura l-ikkompattjar mhuwiex adattat. Jekk il-materjal huwa kompressibbli jiżdied aktar materjal u jiġi kkompattjat sakemm it-tubu jimtela” sa 55 mm minn fuq. Il-piż totali użat biex jimtela’ t-tubu sal-livell ta' 55 mm huwa ddeterminat u jsiru żewġ żidiet oħra, kull waħda kkompattjata b'forza ta' 80N. Imbagħad jiżdied il-materjal jew bl-ikkompattjar, jew billi jinħareġ barra, kif ikun meħtieġ, sabiex it-tubu jitħalla mimli sa livell ta' 15 mm minn fuq. Jitwettaq test ieħor niexef, fil-bidu bi kwantità kkompattjata ta' terz mill-piż totali misjuba fl-ewwel test niexef. Żewġ żidiet oħra minn dawn isiru flimkien ma' ikkompattjar ta' 80 N u l-livell tas-sustanza fit-tubu jiġi aġġustat sa 15 mm minn fuq biż-żieda jew bit-tnaqqis tal-materjal kif meħtieġ. L-ammont ta' solidu ddeterminat fit-tieni test niexef jintuża f’kull test; billi l-mili jitwettaq fi tliet ammonti ugwali, kull wieħed kompressat sa 9 cm3 b'kull mod ta' forza neċessarju. (Dan jista' jkun iffaċilitat bl-użu ta' ħoloq li joħolqu spazju).
         Likwidi u ġels jintefgħu fit-tubu sa għoli ta' 60 mm b'attenzjoni partikulari fejn jidħlu l-ġels biex tkun evitata l-formazzjoni ta' spazju vojt. L-iskorfina bil-kamin tiddaħħal madwar it-tubu mill-qiegħ, tiddaħħal il-pjanċa mtaqqba u l-vit jiġi ssikkat wara l-applikazzjoni ta' ftit lubrikant bbażat fuq disulphide tal-molibdenu. Huwa essenzjali li jiġi ċċekkjat li xejn mis-sustanza ma jinqabad bejn il-flanġ u l-pjanċa, jew fil-ħjut.
         Is-sħana tiġi pprovduta mill-propan meħud minn ċilindru industrijali, mgħammar b'regolatur tal-pressjoni (60 sa 70 mbar), permezz ta' arloġġ u distribwit ugwalment (kif indikat b'osservazzjoni viżwali tal-fjammi mill-berners) minn manifold għal erba' berners. Il-berners huma lokalizzati madwar il-kompartiment tat-test kif jidher f’figura 1. L-erba' berners flimkien għandhom konsum ta' madwar 3,2 litri ta' propan għal kull minuta. Jistgħu jintuża gassijiet kombustibbli u berners alternattivi iżda r-rata tat-tisħin trid tkun kif speċifikata fil-figura 3. Għall-apparati kollha, ir-rata tat-tisħin trid tkun iċċekkjata perjodikament bl-użu ta' tubi mimlija b’
            dibutyl phthalate kif indikat fil-figura 3.
         1.6.1.3.   L-eżekuzzjoni tat-testijiet
         Kull test jitwettaq sakemm jew it-tubu jitfarrak jew it-tubu jkun issaħħan għal ħames minuti. Test li jirriżulta fil-frammentazzjoni tat-tubu fi tliet biċċiet jew aktar, li f’xi każijiet jistgħu jkunu kkonnettjati ma' xulxin bi strixxi dojoq tal-metall kif muri fil-figura 2, huwa evalwat bħala wieħed li jagħti splużjoni. Test li jirriżulta f’biċċiet inqas jew ebda frammentazzjoni jiġi meqjus bħala wieħed li ma tax splużjoni.
         L-ewwel titwettaq serje ta' tliet testijiet bi pjanċa mtaqqba b'dijametru ta' 6,0 mm u, jekk ma tinkiseb ebda splużjoni, titwettaq serje oħra ta' tliet testijiet bi pjanċa mtaqqba b'dijametru ta' 2,0 mm. Jekk isseħħ splużjoni matul xi waħda mis-serje ta' testijiet allura mhumiex meħtieġa aktar testijiet.
         1.6.1.4.   Valutazzjoni
         Ir-riżultat tat-test jiġi kkunsidrat bħala pożittiv jekk isseħħ splużjoni f’xi waħda mis-serje ta' testijiet t'hawn fuq.
         1.6.2.   Sensittività mekkanika (xokk)
         1.6.2.1.   Apparat (figura 4)
         Il-partijiet essenzjali ta' apparat bil-martell li jaqa' tipiku huma blokka ta' l-azzar fondut bil-bażi, inkwina, kolonna, gwidi, piżijiet li jaqgħu, apparat għar-rilaxx u reċipjent għall-kampjun. L-inkwina ta' l-azzar 100 mm (dijametru) x 70 mm (għoli) tiġi invitata mal-wiċċ tal-blokka ta' l-azzar 230 mm (twila) x 250 mm (wiesa’) x 200 mm (għolja) b'bażi fonduta 450 mm (twila) x 450 mm (wiesa’) x 60 mm (għolja). Kolonna magħmula minn tubu ta' l-azzar mingħajr saldatura, tintrabat mar-reċipjent invitat ma' wara tal-blokka ta' l-azzar. Erba' viti jorbtu lill-apparat ma' blokka tal-konkrit solida 60 x 60 x 60 cm b'tali mod li l-gwidi huma assolutament vertikali u l-piżijiet li jaqgħu jistgħu jaqgħu liberament. Piżijiet ta' 5 u 10 kg, magħmula minn azzar solidu, huma disponibbli għall-użu. Il-parti ta' fuq li tagħmel impatt għal kull piż hija ta' azzar imwebbes, HRC 60 sa 63, u għandha dijametru minimu ta' 25 mm.
         Il-kampjun għat-test jingħalaq f’apparat għax-xokk li jikkonsistit f’żewġ ċilindri ta' l-azzar solidu koassjali, wieħed fuq l-ieħor, f'ħolqa gwida ċilindrika mħaffra. Iċ-ċilindri ta' l-azzar solidu għandhom ikunu ta' 10 (-0,003, -0,005) mm dijamtru u 10 mm għoli u jkollhom uċuħ ippolixxjati, ġnub fit-tond (raġġ tal-kurvatura ta' 0,5 mm) u l-għebusija ta' HRC minn 58 sa 65. Iċ-ċilindru mħaffer irid ikollu dijametru estern ta' 16 mm, toqba ppolixxjata ta' 10 (+0,005, +0,010) mm u għoli ta' 13 mm. L-apparat għax-xokk jiġi mmuntat fuq inkwina intermedjarja (26 mm dijametru u 26 mm għoli) magħmula minn azzar u ċċentrata b'ħolqa b'perforazzjonijiet biex tippermetti l-ħruġ ta' dħaħen.
         1.6.2.2.   Kondizzjonijiet tat-test
         Il-volum tal-kampjun irid ikun 40 mm3, jew volum li huwa adattat ma' kwalunkwe apparat alternattiv. Sustanzi solidi għandhom ikunu ppruvati fi stat niexef u mħejjija kif ġej:
         
                     (a)
                  
                  
                     sustanzi mfarrka jiġu mgħarbula (daqs tat-toqba ta' l-għarbiel 0,5 mm); dak kollu li jgħaddi mill-għarbiel jintuża għat-test;
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     sustanzi ppressati, fonduti jew altrimenti kondensati jiġu mkissra fi bċejjeċ żgħar u mgħarbula; il-frazzjoni mgħarbula minn 0,5 sa 1 mm dijametru tintuża għat-test u għandha tkun rappreżentattiva tas-sustanza oriġinali.
                  
               Sustanzi pprovduti normalment bħala pejst għandhom ikunu ppruvati fi stat niexef fejn possibbli jew, wara t-tneħħija ta' l-ammont massimu possibbli ta' dilwent. Sustanzi likwidi jiġu ppruvati bi spazju ta' 1 mm bejn iċ-ċilindri ta' l-azzar ta' fuq u t’isfel.
         1.6.2.3.   L-eżekuzzjoni tat-testijiet
         Jitwettqu serje ta' sitt testijiet bit-twaqqigħ tal-piż ta' 10 kg minn 0,40 m (40 J). Jekk tinkiseb splużjoni matul is-sitt testijiet f’40 J, trid titwettaq serje oħra ta' sitt testijiet, bit-twaqqigħ ta' piż ta' 5 kg minn 0,15 m (7,5 J). F’apparati oħrajn, il-kampjun jitqabbel mas-sustanza ta' referenza magħżula bl-użu ta' proċedura stabbilita (eż. bit-teknika ta' 'l fuq u 'l isfel eċċ.).
         1.6.2.4.   Valutazzjoni
         Ir-riżultat tat-test jiġi kkunsidrat pożittiv jekk splużjoni (il-bidu ta' fjamma u/jew ta' rapport huma ekwivalenti għal splużjoni) isseħħ ta' l-inqas darba f'xi wieħed mit-testijiet bl-apparat għax-xokk speċifikat jew il-kampjun huwa aktar sensittiv minn 1, 3–dinitrobenzene jew RDX f’test tax-xokk alternattiv.
         1.6.3.   Sensittività mekkanika (frizzjoni)
         1.6.3.1.   Apparat (figura 5)
         L-apparat tal-frizzjoni jikkonsisti fi pjanċa tal-bażi magħmula minn azzar fondut li fuqha jiġi mmuntat l-apparat ta' frizzjoni. Dan jikkonsisti f’ċilindru fiss tal-porċellana u pjanċa mobbli tal-porċellana. Il-pjanċa tal-porċellana tinżamm fuq keriġ li tiġri fuq żewġ gwidi. Il-keriġ tiġi kkonnettjata ma' mutur ta' l-elettriku permezz ta' virga li tikkonnettja, kamm eċċentriku u apparat ta' trażmissjoni adattat biex il-pjanċa tal-porċellana titmexxa, darba waħda, lura u'l quddiem taħt iċ-ċilindru tal-porċellana għal distanza ta' 10 mm. Iċ-ċilindru jista' jitgħabba b'eż. 120 jew 360 newtons.
         Il-pjanċi ċatti tal-porċellana huma magħmula minn porċellana teknika bajda (ħruxija minn 9 sa 32 μm) u għandhom dimensjonijiet 25 mm (tul) x 25 mm (wisa') × 5 mm (għoli). Iċ-ċilindru tal-porċellana huwa magħmul ukoll minn porċellana teknika bajda u huwa twil 15 m, għandu dijametru ta' 10 mm u wċuħ tal-ġnub sferikali ħorox b'raġġ ta' kurvatura ta' 10 mm.
         1.6.3.2.   Kondizzjonijiet tat-test
         Il-volum tal-kampjun irid ikun ta' 10 mm3, jew volum li huwa adattat għal kwalunkwe apparat alternattiv.
         Sustanzi solidi għandhom ikunu ttestjati fi stat niexef u mħejjija kif ġej:
         
                     (a)
                  
                  
                     sustanzi mfarrka jiġu mgħarbula (daqs tat-toqba ta' l-għarbiel 0,5 mm); dak kollu li jgħaddi mill-għarbiel jintuża għat-test;
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     sustanzi ppressati, fonduti jew altrimenti kkondensati jiġu mkissra fi bċejjeċ żgħar u mgħarbula; il-frazzjoni mgħarbula ta' < 0,5 mm dijametru tintuża għat-test.
                  
               Sustanzi forniti normalment bħala pejsts għandhom ikunu ppruvati fi stat niexef fejn huwa possibbli. Jekk is-sustanza ma tistax titħejja fi stat niexef, il-pejst (wara t-tneħħija ta' l-ammont massimu possibbli ta' dilwent) jiġi ppruvat bħala liega 0,5 mm ħoxna, 2 mm wiesa’, 10 mm twila, ippreparata ma' ta' qabel.
         1.6.3.3.   L-eżekuzzjoni tat-testijiet
         Iċ-ċilindru tal-porċellana jiddaħħal fil-kampjun għat-test u tiġi applikata l-forza. Meta jkun qed jitwettaq it-test, il-marki ta' l-isponża tal-pjanċa tal-porċellana jridu jkunu b'mod trasversali mad-direzzjoni tal-moviment. Trid tingħata attenzjoni li ċ-ċilindru jistrieħ fuq il-kampjun, li jkun hemm materjal tat-test suffiċjenti taħt iċ-ċilindru u anke li l-pjanċa timxi b'mod korrett taħt iċ-ċilindru. Għal sustanzi f’forma ta' pejst, gejġ bi ħxuna ta' 0,5 mm b'xaqq ta' 2 x 10 mm jintuża biex tkun applikata s-sustanza mal-pjanċa. Il-pjanċa tal-porċellana trid timxi 10 mm “il quddiem u lura taħt iċ-ċilindru tal-porċellana f’ħin ta' 0,44 sekondi. Kull parti tas-superfiċje tal-pjanċa trid tintuża darba biss; iż-żewġt itruf ta' kull ċilindru jservu għal żewġ provi u kull waħda miż-żewġ superfiċji tal-pjanċa sservi għal tliet provi.
         Jitwettqu serje ta'sitt testijiet b'tagħbija ta' 360 N. Jekk riżultat pożittiv jinkiseb matul dawn is-sitt testijiet, serje oħra ta' sitt testijiet trid titwettaq b'tagħbija ta' 120 N. F’apparati oħra, il-kampjun huwa mqabbel ma' sustanza ta' referenza magħżula bl-użu ta' proċedura stabbilita (eż. teknika ta' ‘l fuq u ‘l isfel, eċċ.).
         1.6.3.4.   Valutazzjoni
         Ir-riżultat tat-test jiġi kkunsidrat pożittiv jekk splużjoni (tifqigħ u/jew rapport jew kombustibilità fi fjamma huma ekwivalenti għal splużjoni) titwettaq għall-inqas darba f'xi wieħed mit-testijiet bl-apparat speċifiku ta' frizzjoni jew il-kriterji ekwivalenti f'test ta' frizzjoni alternattiv ikunu ssodisfati.
         2.   DATA
         Fil-prinċipju, sustanza hija kkunsidrata li tippreżenta periklu ta' splużjoni fis-sens tad-Direttiva jekk riżultat pożittiv jinkiseb fit-test termiku, bix-xokk jew bis-sensittività tal-frizzjoni.
         3.   RAPPURTAR
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     identità, kompożizzjoni, purità, kontenut ta' umdità eċċ. tas-sustanza ttestjata.
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-forma fiżika tal-kampjun u jekk kienx imfarrak, miksur u/jew mgħarbul,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-osservjazzjonijiet matul it-testijiet għas-sensittività termika (eż. piż b'kampjun, numru ta' frammenti eċċ.),
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-osservjazzjonijiet matul it-testijiet għas-sensittività mekkanika (eż. il-formazzjoni ta' ammonti konsiderevoli ta' duħħan jew dekompożizzjoni kompleta mingħajr rapport, fjammi, sparks, rapport, tifqigħ eċċ.),
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati ta' kull test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     jekk intuża apparat alternattiv, trid tingħata ġustifikazzjoni alternattiva kif ukoll xhieda ta' korelazzjoni bejn riżultati miksuba b'apparat speċifiku u dawk miksuba b'apparat ekwivalenti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwalunkwe kummenti utli bħal referenza għal testijiet bi prodotti simili li jistgħu jkunu relevanti għall-interpretazzjoni proprja tar-riżultati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   INTERPRETAZZJONI U VALUTAZZJONI TA' RIŻULTATI
         Ir-rapport tat-test irid isemmi kwalunkwe riżultati li huma kkunsidrati foloz, anomali jew mhux rappreżentattivi. Jekk xi wieħed mir-riżultati għandu jitwarrab, għandha tingħata spjegazzjoni u r-riżultati ta' l-ittestjar supplimentari. Sakemm riżultat anomalu ma jkunx spjegat, irid ikun aċċettat skond l-apparenza u użat biex tkun ikklassifikata s-sustanza skond il-każ.
         4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol.3, 6-13 and 30-42.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use -Determination of explosion risk.
                  
               
            Appendiċi
            Eżempju ta' speċifikazzjoni ta' materjal għal test ta' sensittività termika (ara DIN 1623)
            
                     
                        (1)
                     
                     
                        Tubu: Speċifikazzjoni tal-materjal Nru 1.0336.505 g
                     
                  
                     
                        (2)
                     
                     
                        Pjanċa mħaffra: Speċifikazzjoni tal-materjal Nru 1.4873
                     
                  
                     
                        (3)
                     
                     
                        Il-vit fil-kamin u l-iskorfina: Speċifikazzjoni tal-materjal Nru 1.3817
                     
                  Figura 1
            Apparat għat-test tas-sensittività termika
            (d-dimensjonijiet kollha f'millimetri)
            Figura 2
            Test tas-sensittività termika
            (eżempju ta' frammentazzjoni)
            Figura 3
            Il-kalibrazzjoni tar-rata ta' tisħin għat-test tas-sensittività termika
            Il-kurvatura tat-temperatura/ħin miksuba bit-tisħin ta' dibutyl phtalate (27 cm3) f'tubu magħluq (1,5 mm pjanċa mħaffra) bl-użu ta' rata ta' fluss tal-propan ta' 3,2 litru/minuta. It-temperatura tiġi mkejla b'termokoppja ta' azzar li ma jissaddadx miksi b’chromel/alumel ta' 1mm dijametru, impoġġija fiċ-ċentru 43 mm taħt ix-xifer tat-tubu. Ir-rata tat-tisħin bejn 135 oC u 285 oC għandha tkun bejn 185 u 215 K/minuta.
            Figura 4
            Apparat għat-test bix-xokk
            
               (i-dimensjonijiet huma kollha f'millimetri)
            
            Figura 4
            Kontinwazzjoni
            Figura 5
            Apparat għas-sensittività tal-frizzjoni.
            
         A.15.   TEMPERATURA TA' AWTO-FJAMMABILITÀ (LIKWIDI U GASSIJIET)
         1.   METODU
         1.1.   DAĦLA
         Sustanzi esplożivi u sustanzi li jaqbdu spontanjament f’kuntatt ma' l-arja f’temperatura ambjentali m‘għandhomx ikunu sottomessi għal dan it-test. Il-proċedura tat-test hija applikabbli għal gassijiet, likwidi u fwawar li, fil-preżenza ta' l-arja, jistgħu jitqabbdu b'superfiċje sħuna.
         It-temperatura ta' l-awto-fjammabilità tista' titqies imnaqqsa b'mod konsiderevoli bil-preżenza ta' impuritajiet katalitiċi, b'materjal tas-superfiċje u b'volum akbar tar-reċipjent tat-test.
         1.2.   TIFSIRIET U UNITAJIET
         Il-grad ta' l-awto-fjammabilità huwa espress f’termini ta' temperatura ta' awto-fjammabilità. It-temperatura ta' l-awto-fjammabilità hija l-inqas temperatura li fiha s-sustanza għat-test taqbad meta mħallta ma' l-arja taħt kondizzjonijiet imfissra fil-metodu tat-test.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Sustanzi ta' referenza huma ċitati fl-istandards (ara 1.6.3.). Huma għandhom iservu primarjament biex jiċċekkjaw ir-rendiment tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu tqabbil ma' riżultati minn metodi oħra.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU
         Il-metodu jiddetermina t-temperatura minima tal-qoxra ta' ġewwa ta' reċipjent magħluq li tirriżulta fil-fjammabilità ta' gass, fwar jew likwidu injettat fir-reċipjent.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         Ir-ripetibbilità tvarja skond l-iskala ta' l-awto-fjammabilità u l-metodu tat-test użat.
         Is-sensittività u l-ispeċifiċità jiddependu fuq il-metodu tat-test użat.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.6.1.   Apparat
         L-apparat huwa mfisser fil-metodu riferut f’1.6.3.
         1.6.2.   Kondizzjonijiet tat-test
         Kampjun tas-sustanza tat-test jiġi ttestjat skond il-metodu msemmi f’1.6.3.
         1.6.3.   L-eżekuzzjoni tat-test
         Ara IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.
         2.   DATA
         Irreġistra t-temperatura tat-test, il-pressjoni atmosferika, il-kwantità użata mill-kampjun u l-intervall ta' ħin sakemm issir il-fjammabilità.
         3.   RAPPURTAR
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     l-ispeċifikazzjoni preċiża tas-sustanza (identifikazzjoni u impuritajiet),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kwantità ta' kampjun użata, il-pressjoni atmosferika,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-apparat użat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultat tal-kejl (temperaturi tat-test, riżultati li jirrigwardaw il-fjammabilità, u l-intervalli ta' ħin korrispondenti),
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               4.   REFERENZI
         Xejn.
         A.16.   TEMPERATURA TA' AWTO-FJAMMABILITÀ RELATTIVA GĦAL SOLIDI
         1.   METODU
         1.1   DAĦLA
         Sustanzi esplożivi u sustanzi li jaqbdu spontanjament f’kuntatt ma' l-arja f’temperatura ambjentali m'għandhomx ikunu sottomessi għal dan it-test.
         L-għan ta' dan it-test huwa li jipprovdi informazzjoni preliminari dwar l-awto-fjammabilità ta' sustanzi solidi f’temperaturi elevati.
         Jekk is-sħana li tiżviluppa jew b'reazzjoni tas-sustanza ma' l-ossiġenu jew b’dekompożizzjoni eżotermika ma tintilifx malajr biżżejjed fil-madwar, iseħħ awto-tisħin li jwassal għall-awto-fjammabilità. Awto-fjammabilità għalhekk isseħħ meta r-rata ta' produzzjoni tas-sħana taqbeż ir-rata tat-telf tas-sħana.
         Il-proċedura tat-test hija utli bħala test ta' skrinjar preliminari għal sustanzi solidi. Minħabba n-natura komplessa tal-fjammabilità u l-kombustjoni ta' solidi, it-temperatura ta' l-awto-fjammabilità ddeterminata skond dan il-metodu ta' test għandha tintuża għal għanijiet ta' tqabbil biss.
         1.2.   TIFSIRIET U UNITAJIET
         It-temperatura ta' awto-fjammabilità kif miksuba b'dan il-metodu hija t-temperatura ambjentali minima espressa f’ oC li fiha ċertu volum ta' sustanza jaqbad taħt kondizzjonijiet definiti.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU
         Ċertu volum tas-sustanza għat-test jitpoġġa f’forn f’temperatura ambjentali; il-kurva tat-temperatura/ħin relatata mal-kondizzjonijiet f’nofs il-kampjun tiġi rreġistrata waqt li t-temperatura tal-forn tiżdied sa 400 oC, jew sal-punt tat-tidwib jekk dan huwa iżgħar, b'rata ta' 0,5 oC/min. Għall-għan ta' dan it-test, it-temperatura tal-forn li fiha t-temperatura tal-kampjun tilħaq 400 C b'awto-tisħin tissejjaħ it-temperatura ta' l-awto-fjammabilità.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         Xejn.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.6.1.   Apparat
         1.6.1.1.   Forn
         Forn tal-laboratorju pprogrammat b'temperatura (volum ta' madwar 2 litri) mgħammar b'ċirkolazzjoni ta' l-arja naturali u bi sfog għal splużjoni. Bil-għan li jkun evitat ir-riskju ta' splużjoni potenzjali, kwalunkwe gassijiet ta' dekompożizzjoni m‘għandhomx jitħallew jagħmlu kuntatt ma' l-elementi elettriċi tat-tisħin.
         1.6.1.2.   Kubu b'xibka tal-wajer irqiq
         Biċċa xibka tal-wajer irqiqa ta' l-azzar li ma jissaddadx b'fetħiet ta' 0,045 mm għandha tinqata' skond id-disinn f'figura 1. Ix-xibka għandha tintewa u tintrabat b'wajer f'forma ta' kubu bil-parti ta' fuq miftuħa.
         1.6.1.3.   Termokoppji
         Termokoppji adattati.
         1.6.1.4.   Rekorder
         Kwalunkwe rekorder b'żewġ kanali kkalibrati minn 0 sa 600 oC jew vultaġġ korrispondenti.
         1.6.2.   Kondizzjonijiet tat-test
         Is-sustanzi jiġu ttestjati kif riċevuti.
         1.6.3.   L-eżekuzzjoni tat-test
         Il-kubu jimtela bis-sustanza għat-test u jittaptap bil-mod, u tiżdied aktar sustanza sakemm il-kubu jkun mimli kompletament. Il-kubu mbagħad jiġi sospiż fiċ-ċentru tal-forn f’temperatura ambjentali. Termokoppja titpoġġa fiċ-ċentru tal-kubu u oħra bejn il-kubu u l-ġenb tal-forn biex tirreġistra t-temperatura tal-forn.
         It-temperaturi tal-forn u tal-kampjun jiġu rreġistrati kontinwament waqt li t-temperatura tal-forn tiġi miżjuda għal 400 C, jew għat-temperatura tat-tidwib jekk din tkun iżgħar, bir-rata ta' 0,5 oC/min.
         Meta s-sustanza tqabbad it-termokoppja kampjun turi żieda qawwija fit-temperatura ogħla mit-temperatura tal-forn.
         2.   DATA
         It-temperatura tal-forn li fiha t-temperatura kampjun tilħaq l-400 oC b'awto-tisħin hija relevanti għal valutazzjoni (ara figura 2).
         3.   RAPPURTAR
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni tas-sustanza għat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati tal-kejl inkluża l-kurva tat-temperatura/ħin,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-rimarki addizzjonali kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               4.   REFERENZI
         NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.
         Figura 1
         Disinn ta' kubu tat-test ta' 20 mm
         Figura 2
         Kurva tipika tat-temperatura/ħin
         A.17.   PROPRJETAJIET OSSIDANTI (SOLIDI)
         1.   METODU
         1.1.   DAĦLA
         Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminari dwar proprjetajiet esplożivi potenzjali tas-sustanza qabel jitwettaq dan it-test.
         Dan it-test mhuwiex applikabbli għal likwidi, gassijiet, sustanza fjammabbli jew esplożivi ħafna, jew perrossidi organiċi.
         Dan it-test jista' ma jsirx meta eżami tal-formula strutturali jistabbilixxi mingħajr ebda dubju raġjonevoli li s-sustanza mhijiex kapaċi li tirreaġixxi eżotermikament ma' materjal kombustibbli.
         Bil-għan li jkun żgurat jekk it-test għandux jitwettaq bi prekawzjonijiet speċjali, għandu jitwettaq test preliminari.
         1.2.   TIFSIRIET U UNITAJIET
         Ħin tal-kombustjoni: żmien ta' reazzjoni, f’sekondi, meħud għaż-żona ta' reazzjoni biex timxi mal-gozz, wara l-proċedura mfissra f’1.6.
         Rata ta' kombustjoni: espressa f’millimetri għal kull sekonda.
         Rata massima ta' kombustjoni: l-ogħla valur ta' rati ta' kombustjoni miksuba b'taħlitiet li jinkludu minn 10 sa 90 % bil-piż ta' ossidant.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Nitrat tal-barju (grad analitiku) huwa użat bħala sustanza ta' referenza għat-test u t-test preliminari.
         It-taħlita ta' referenza hija dik it-taħlita ta' nitrat tal-barju b'ċelluloża f’forma ta' trab, ippreparat skond 1.6, li għandu rata ta' kombustjoni massima (is-soltu taħlita b’60 % nitrat tal-barju bil-piż).
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU
         Test preliminari jitwettaq fl-interess tas-sikurezza. Ma jkunx meħtieġ aktar ittestjar meta t-test preliminari jindika b'mod ċar li s-sustanza għat-test għandha proprjetajiet ossidanti. Meta dan mhuwiex il-każ, is-sustanza mbagħad għandha tkun soġġetta għat-test sħiħ.
         Fit-test sħiħ, is-sustanza għat-test u sustanza kombustibbli definita tiġi mħallta fi proporzjonijiet diversi. Kull taħlita mbagħad tiġi ffurmata f’gozz u l-gozz jitqabbad f’tarf minnu. Ir-rata ta' kombustjoni massima ddeterminata titqabbel mar-rata ta' kombustjoni massima tat-taħlita ta' referenza.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         Jekk ikun meħtieġ, kwalunkwe metodu ta' tħin u taħlit huwa validu bil-kondizzjoni li d-differenza fir-rata ta' kombustjoni massima fis-sitt testijiet separati tarja mill-valur medju aritmetiku b'mhux aktar minn 10 %.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.6.1.   Preparazzjoni
         1.6.1.1.   Is-sustanza għat-test
         Naqqas il-kampjun għat-test għal daqs ta' partikula < 0,125 mm bl-użu tal-proċedura li ġejja: għarbel is-sustanza għat-test, itħan il-frazzjoni li jkun baqa', irrepeti l-proċedura sakemm il-porzjon kollha għat-test tkun għaddiet mill-għarbiel.
         Jista' jintuża kwalunkwe metodu ta' tħin jew ta' tgħarbil li jissodisfa l-kriterji ta' kwalità.
         Qabel titħejja t-taħlita s-sustanza titnixxef f’105 oC, sakemm jinkiseb il-piż kostanti. Jekk it-temperatura ta' dekompożizzjoni tas-sustanza għat-test hija taħt il-105 oC, is-sustanza għandha titnixxef b'temperatura adattata iktar baxxa.
         1.6.1.2.   Sustanza kombustibbli
         Ċelluloża f’forma ta' trab hija użata bħala sustanza kombustibbli. Iċ-ċelluloża għandha tkun tat-tip użata għal kromatografija ta' saff irqiq jew għal kromatograija tal-kolonna. Waħda tat-tip b'fibri ta' tul ta' aktar minn 85 % bejn 0,020 u 0,075 mm instabu li kienu adattati. It-trab taċ-ċelluloża jiġi mgħoddi minn għarbiel b'toqob ta' daqs ta' 0,125 mm. L-istess lott ta' ċelluloża għandu jintuża matul it-test.
         Qabel titħejja t-taħlita, iċ-ċelluloża f’forma ta' trab titnixxef f’105 oC, sakemm jinkiseb piż kostanti.
         Jekk tintuża ċ-ċana ta' l-injam fit-test preliminari, allura pprepara ċ-ċana ta' l-injam artab billi tiġbor il-porzjon li tgħaddi minn għarbiel b'toqob ta' 1,6 mm, ħallat sewwa, imbagħad nixxef f’105 oC għal erba' sigħat f’saff ta' mhux oħxon aktar minn 25 mm. Kessaħ u aħżen f’kontenitur li fih ma jidħolx arja mimli kemm sa kemm huwa prattiku u sakemm ikun meħtieġ, preferibbilment fi żmien 24 siegħa mit-tnixxif.
         1.6.1.3.   Għajn ta' fjammabiltà
         Fjamma taħraq minn berner tal-gass (dijametru minimu ta' 5 mm) għandha tintuża bħala l-għajn ta' fjammabilità. Jekk tintuża għajn ta' fjammabbiltà oħra (eż. meta jsir it-test f’atmosfera inerta), id-deskrizzjoni u l-ġustifikazzjoni għandhom ikunu rrapurtati.
         1.6.2.   L-eżekuzzjoni tat-test
         
            Nota:
         
         Taħlitiet ta' ossidaturi ma' ċelluloża jew ċana ta' l-injam iridu jkunu ttrattati bħala potenzjalment splussivi u mmaniġġjati b'attenzjoni xierqa.
         1.6.2.1.   Test preliminari
         Is-sustanza mnixxfa hija mħallta sewwa ma' ċelluloża mnixxfa jew ċana ta' l-injam fil-proporzjonijiet ta' 2 ta' sustanza għat-test għal 1 ta' ċelluloża jew ċana ta' l-injam bil-piż u t-taħlita tiġi ffurmata f’gozz żgħir forma ta' kon ta' dimensjonijiet 3,5 cm (dijametru tal-bażi) x 2,5 cm (għoli) pemezz tal-mili, mingħajr rass, ta' oġġett li jifforma kon (eż. lembut tal-ħġieġ tal-laboratorju biż-żennuna magħluqa).
         Il-gozz jitpoġġa fuq pjanċa tal-bażi li mhijiex kombustibbli, mhux poruża u b'konduttività baxxa ta' sħana. It-test għandu jitwettaq f’armarju tad-duħħan bħal f’1.6.2.2.
         L-għajn tal-fjammabbiltà jitressaq f’kuntatt mal-kon. Is-saħħa u d-dewmien tar-reazzjoni riżultanti għandhom ikunu osservati u rreġistrati.
         Is-sustanza għandha tkun ikkunsidrata bħala ossidanti jekk ir-reazzjoni hija qawwija.
         Fi kwalunkwe każ fejn ir-riżultat huwa dubjuż, imbagħad ikun neċessarju li jsir it-test kollu mfisser hawn taħt.
         1.6.2.2.   It-test tas-serje
         Ipprepara taħlitiet ta' ossidatur ċelluloża li jkun fihom minn 10 sa 90 % piż ta' ossidatur f’żidiet ta' 10 %. F'każijiet li kważi qegħdin fl-istess limiti, taħlitiet ta' ossidatur ċelluloża intermedji għandhom jintużaw biex tinkiseb ir-rata ta' fjammabbiltà massima b'aktar preċiżjoni.
         Il-gozz ikun iffurmat permezz ta' forma. Din il-forma magħmula mill-metall, għandha tul ta' 250 mm b'taqsima trasversali trijangulari ta' għoli intern ta' 10 mm u wisa' interna ta' 20 mm. Żewġ pjanċi tal-metall jiġu mmuntati fuq iż-żewġ naħat tal-forma f’direzzjoni lonġitudinali bħala limitazzjonijiet laterali li joħorġu 2 mm ‘il barra mit-tarf l-għoli tat-taqsima trasversali trijangulari (figura). Dan l-arranġament jimtela liberament bi ftit taħlita żejda. Wara li l-forma tintefa’ għal darba waħda minn għoli ta' 2 cm fuq superfiċje solida, is-sustanza żejda li tibqa’ titneħħa b’karta milwija. Il-limitazzjonijiet laterali jitneħħew u t-trab li jibqa' jiħi ċċattjat, permezz ta' romblu. Pjanċa ta' bażi mhux kombustibbli, mhux poruża u b’konduttività ta' sħana baxxa mbagħad titpoġġa fuq il-forma, l-apparat jinqaleb u l-forma titneħħa.
         Irranġa l-gozz fil-kurrent ta' l-arja f’armarju li jiġbed id-duħħan.
         Il-veloċità ta' l-arja trid tkun suffiċjenti biex tevita li d-duħħan joħroġ fil-laboratorju u m'għandhiex tkun varjata matul it-test. L-apparat irid ikun protett mill-kurrent ta' l-arja.
         Minħabba l-igroskopiċità taċ-ċelluloża u ta' wħud mis-sustanzi għat-test, it-test għandu jitwettaq malajr kemm jista' jkun.
         Qabbad ġenb wieħed tal-gozz billi tressqu mal-fjamma.
         Kejjel il-ħin tar-reazzjoni fuq distanza ta' 200 mm wara li ż-żona ta' reazzjoni tinfirex sa distanza inizjali ta' 30 mm.
         It-test jitwettaq bis-sustanza ta' referenza u ta' l-inqas darba b'kull waħda mill-firxa ta' taħlitiet tas-sustanza għat-test maċ-ċelluloża.
         Jekk ir-rata ta' fjammabilità massima tinsab li hija akbar b'mod sinifikanti minn dik tat-taħlita ta' referenza, it-test jista' jitwaqqaf; inkella t-test għandu jkun ripetut għal ħames darbiet għal kull waħda mit-tliet taħlitiet li jagħtu l-aktar rata veloċi ta' fjammabilità.
         Jekk hemm suspett li r-riżultat huwa pożittiv falz, allura t-test għandu jkun ripetut bl-użu ta' sustanza inerta bl-istess daqs ta' partikula, bħall-kieselguhr, flok iċ-ċelluloża. Alternattivament, it-taħlita tas-sustanza għat-test maċ-ċelluloża, li għandha l-aktar rata veloċi ta' fjammabilità, għandha tkun ittestjata mill-ġdid f’atmosfera inerta (< 2 % v/v kontenut ta' ossiġnu).
         2.   DATA
         Għal raġunijiet ta' sikurezza r-rata ta' fjammabilità massima – mhux il-valur medju – għandha tkun ikkunsidrata bħala l-proprjetà ossidanti karatteristika tas-sustanza għat-test.
         L-ogħla valur tar-rata tal-fjammabilità f’serje ta' sitt testijiet ta' taħlita definita huwa relevanti għall-valutazzjoni.
         Pinġi graff ta' l-ogħla valur tar-rata tal-fjammabilità għal kull taħlita kontra l-konċentrazzjoni ta' l-ossidatur. Mill-graff ħu r-rata tal-fjammabilità massima.
         Is-sitt valuri mkejla tar-rata tal-fjammabilità f’serje miksuba mit-taħlita mar-rata ta' fjammabilità massima ma tridx tiddiferenzja mill-valur medju aritmetiku b'aktar minn 10 %; inkella l-metodi tat-tħin u t-taħlit jridu jittejbu.
         Qabbel ir-rata ta' fjammabilità massima miksuba mar-rata ta' fjammabilità massima tat-taħlita ta' referenza (ara 1.3).
         Jekk it-testijiet jitwettqu f’atmosfera inerta, ir-rata ta' reazzjoni massima titqabbel ma' dik tat-taħlita ta' referenza f’atmosfera inerta.
         3.   RAPPURTAR
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk huwa possibli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     l-identità, il-kompożizzjoni, il-purità, il-kontenut ta' umdità eċċ. tas-sustanza ttestjata;
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwalunkwe trattament tal-kampjun għat-test (eż. tħin, tnixxif);
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-għajn tal-fjammabbiltà użata fit-testijiet;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati tal-kejl;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-mod ta' reazzjoni (eż. fjammabilità lelliexa fuq is-superfiċje, fjammabilità tul il-massa kollha, kwalunkwe informazzjoni li tirrgwarda l-prodotti ta' kombustjoni, ...);
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-rimarki rilevanti kollha għall-interpretazzjoni tar-riżultati, inkluża deskrizzjoni ta' l-enerġija fiżika (fjamma, spark, duħħan, ħruq bil-mod sakemm isir faħam, eċċ.) u t-tul ta' żmien approssimattiv prodott fit-test preliminari tas-sikurezza/skrinjar kemm għas-sustanza għat-test kif ukoll għal dik ta' referenza;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati minn testijiet b'sustanza inerta, jekk hemm;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati minn testijiet f’atmosfera inerta, jekk hemm.
                  
               3.2.   INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Sustanza titqies li hija sustanza ossidanti meta:
         
                     (a)
                  
                  
                     fit-test preliminari, hemm reazzjoni vigoruża;
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     fit-test sħiħ, ir-rata ta' fjammabilità massima tat-taħlitiet ittestjati hija ogħla minn jew ugwali għar-rata ta' fjammabilità massima tat-taħlita ta' referenza taċ-ċelluloża u n-nitrat tal-barju.
                  
               Bil-għan li jkun evitat pożittiv falz, ir-riżultati miksuba meta s-sustanza għat-test titħallat ma' materjal inert u/jew meta jsir l-ittestjar taħt atmosfera inerta, għandhom jiġu kkunsidrati wkoll fl-interpretazzjoni tar-riżultati.
         4.   REFERENZI
         NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.
         
            Appendiċi
            Figura
            Forma u aċċessorji għall-preparazzjoni tal-gozz
            (Id-dimensjonijiet kollha f'millimetri)
            
         A.18.   IL-MEDJA TAL-PIŻ MOLEKULARI TAN-NUMRU U D-DISTRIBUZZJONI TAL-PIŻ MOLEKULARI TAL-POLIMERI
         1.   METODU
         Dan il-metodu Kromotografiku bil-Permeazzjoni tal-Ġel huwa replika tal-OECD TG 118 (1996). Il-prinċipji fundamentali u aktar informazzjoni teknika jinsabu fir-referenza 1.
         1.1.   DAĦLA
         Ladarba l-proprjetajiet tal-polimeri huma daqshekk differenti, huwa impossibbli li jiġi deskritt metodu wieħed li jagħti l-kondizzjonijiet preċiżi għas-separazzjoni u l-valutazzjoni li japplikaw għal kull sitwazzjoni u għal kull ħaġa li tiġri waqt is-separazzjoni tal-polimeri. Partikolarment u ta' spiss, sistemi ta' polimeri komplessi mhumiex soġġetti għall-kromatografija bil-permeazzjoni tal-ġel (GPC). Meta l-GPC mhuwiex prattikabbli, l-piż molekulari jista' jiġi deċiż b'metodi oħrajn (ara l-Anness). F'dawn il-każijiet, għandhom jingħataw id-dettalji u l-ġustifikazzjonijiet kollha għall-metodu użat.
         Il-metodu deskritt huwa bbażat fuq l-istandard DIN 55671 (1). F'dan l-istandard DIN tinsab informazzjoni dettaljata fuq kif għandhom jitmexxew dawn l-esperimenti u kif għandha tiġi vvalutata d-DATA. F'każ illi hemm bżonn li l-kondizzjonijiet ta' l-esperiment jinbidlu, dawn il-bidliet iridu jiġu ġustifikati. Jistgħu jintużaw standards oħrajn jekk ikun hemm ir-referenzi kollha. Il-metodu deskritt juża kampjuni tal-polisterin ta' politixrid magħruf għall-kalibrazzjoni, u jista' jagħti l-każ li jrid jiġi modifikat biex jaqbel ma' ċerti polimeri, eż. polimeri li jinħallu fl-ilma u polimeri long-chain branched.
         
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET
         Il-medja tal-piż molekulari tan-numru Mn u l-medja tal-piż molekulari tal-piż Mw huma ddeterminati skond l-ekwazzjonijiet li ġejjin:
         
                     
                        
                  
                  
                     
                        
                  
               fejn,
         Hi huwa l-livell tas-sinjal ta' osservazzjoni mil-linja ta' bażi għall-volum ta' retenzjoni Vi,
         Mi huwa l-piż molekulari tal-frazzjoni tal-polimeri fil-volum ta' retenzjoni Vi, u
         n huwa n-numru tal-punti ta' DATA.
         Il-wisa' tad-distribuzzjoni tal-piż molekulari, li hija miżura tat-tixrid tas-sistema, tingħata bil-proporzjon Mw/Mn.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Ladarba l-GPC huwa metodu relattiv, hemm bżonn ta' kalibrazzjoni. Normalment jintużaw standards tal-polistiren b'distribuzzjoni limitata u mibnija linearment u li għandhom piż molekulari medju Mn u Mw u distribuzzjoni ta' piż molekolari magħrufa. Il-kurva tal-kalibrazzjoni tista' tintuża biss fid-determinazzjoni tal-piż molekulari tal-kampjun mhux magħruf jekk il-kondizzjonijiet għas-separazzjoni tal-kampjun u l-istandards intgħażlu b'mod preċiżament l-istess.
         Ir-relazzjoni ddeterminata bejn il-piż molekulari u l-volum ta' elużjoni huwa validu biss taħt il-kondizzjonijiet speċifiċi ta' l-esperiment partikolari. Il-kondizzjonijiet fuq kollox jinkludu t-temperatura, s-solvent (jew taħlita tas-solventi), il-kondizzjonijiet tal-kromatografija u l-kolonna tas-separazzjoni jew is-sistemi tal-kolonni.
         Il-piż molekulari tal-kampjuni ddeterminati b'dan il-mod huma valuri relattivi u huma deskritti bħala ‘piżijiet molekulari ekwivalenti għall-polistiren’. Dan ifisser illi skond id-differenzi strutturali u kimiċi bejn il-kampjun u l-istandards, il-piżijiet molekulari jistgħu jiddevjaw mill-valuri assoluti sa grad iktar jew inqas. Jekk jintużaw standards oħrajn, eż. il-glikol tal-polietilin, l-ossidu tal-politin, il-metakrilat tal-polimetil, aċidu poliakriliku, għandha titniżżel ir-raġuni.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TA' L-EŻAMI
         Kemm id-distribuzzjoni tal-piż molekulari tal-kampjun kif ukoll il-piżijiet molekulari medji (Mn, Mw) jistgħu jiġu ddeterminati billi jintuża l-GPC. Il-GPC huwa metodu speċjali ta' kromatografija likwida fejn il-kampjun jiġi separat skond il-valuri idrodinamiċi tal-kostitwenti individwali (2).
         Is-separazzjoni ssir kif il-kampjun jgħaddi minn ġo kolonna mimlija b'materjal poruż, tipikament ġel organiku. Molekoli żgħar jistgħu jippenetraw il-pori filwaqt li l-molekoli kbar ma jistgħux. Il-passaġġ tal-molekoli kbar huwa, għalhekk, iqsar u għalhekk huma jippenetraw l-ewwel. Il-molekoli ta'daqs medju jippenetraw minn uħud mill-pori u jgħaddu iktar tard. L-iżgħar molekoli, b'raġġ idrodinamiku medju iżghar mill-pori tal-ġel jistgħu jippenetraw il-pori kollha. Dawn ikun elużi l-aħħar.
         Idealment, is-separazzjoni hija ddeterminata biss skond id-daqs ta' l-ispeċi tal-molekoli, imma fil-prattika huwa diffiċli li wieħed jevita xi interferenza mill-assorbiment L-ippakkjar mhux ugwali tal-kolonni u volumi mejtin jistgħu jaggravaw is-sitwazzjoni (2).
         L-osservazzjoni hija effetwata minn, eż. l-indiċi refrattiv jew l-assorbiment tal-UV u tagħti kurva tad-distribuzzjoni sempliċi. Madankollu, biex il-kurva tingħata valuri attwali tal-piż molekulari, huwa neċessarju li l-kolonna tiġi kkalibrata billi polimeri ta' piż molekulari magħruf u, idealment, ta' struttura simili ħafna, jitniżżlu ‘l isfel, eż. standards tal-polistiren varji. B'mod tipiku, għandha tirriżulta kurva Gaussian, xi drabi mgħawwġa minħabba denb fuq in-naħa baxxa tal-piż molekulari, fejn il-fus vertikali jindika l-kwantità, skond il-piż, ta' l-ispeċi tal-piż molekulari varji, u l-fus orizzontali l-piż molekulari rreġistrat.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         Ir-ripetibilità (Devjazzjoni ta' Livell Stabbilit: RSD) tal-volum ta' l-elużjoni għandha tkun aħjar minn 0,3 %. Ir-ripetibilità mixtieqa ta' l-analiżi għandha tiġi żgurata permezz ta' korrezzjoni skond standard intern jekk kromatogram huwa evalwat b'mod li huwa dipendenti fuq il-ħin u ma jaqbilx mal-kriterju msemmi hawn fuq (1). Il-politixrid jiddependi fuq il-piżijiet molekulari ta' l-istandards. Fil-każ ta' standards tal-polistirene, valuri tipiċi huma:
         
                     Mp < 2 000 
                  
                  
                     Mw/Mn < 1,20 
                  
               
                     2 000  ≤ Mp ≤ 106
                     
                  
                  
                     Mw/Mn < 1,05 
                  
               
                     Mp > 106
                     
                  
                  
                     Mw/Mn < 1,20 
                  
               (Mp huwa l-piż molekulari ta' l-istandard fil-quċċata tal-massimu)
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' L-EŻAMI
         1.6.1.   Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet standard tal-polistiren
         L-istandards tal-polistiren għandhom jinħallu billi jitħalltu b'attenzjoni fl-eluwent magħżul. Ir-rakkomandazzjonijiet tal-fabbrikant għandhom jiġu kkunsidrati waqt il-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet.
         Il-konċentrazzjonijiet ta' l-istandards magħżula jiddependu fuq diversi fatturi: eż. il-volum ta' l-injezjoni, il-viskożità tas-soluzzjoni u s-sensittività tad-ditekter analitiku. Il-volum massimu ta' l-injezzjoni għandu jiġi adattat għat-tul tal-kolonna biex tiġi evitata tagħbija żejda. Volumi ta' injezzjoni tipiċi għas-separazzjonijiet analitiċi bl-użu tal-GPC b'kolonna ta' 30 cm × 7,8 mm huma normalment bejn 40 u 100 μl. Volumi ogħla huma possibbli, imma m'għandhomx jaqbu 250 μl. L-aħjar proporzjon ta' bejn il-volum ta' l-injezzjoni u l-konċentrazzjoni għandha tiġi ddeterminata qabel ma tiġi kkalibrata l-kolonna.
         1.6.2.   Preparazzjoni tal-kampjun tas-soluzzjoni
         Fil-prinċipju, l-istess ħtiġijiet japplikaw għall-preparazzjoni tal-kampjuni tas-soluzzjonijiet. Il-kampjun għandu jinħall f’solvent xieraq, eż. it-tetraidrofuran (THF), billi jitħawwad bil-galbu. Taħt l-ebda ċirkostanza m'għandu jinħall permezz ta' banju ultrasoniku. Fejn huwa neċessarju, il-kampjun tas-soluzzjoni għandu jiġi ppurifikat permezz ta' filtru tal-membrana b'pori ta' daqs bejn 0,2 u 2 μm.
         Il-preżenza ta' partikoli li ma nħallux għanda titniżżel fir-rapport finali għar-raġuni li dawn jistgħu jirriżultaw minn speċi ta' piż molekulari għoli. Għandu jintuza metodu xieraq biex jiġi ddeterminat il-perċentaġġ skond il-piż tal-partikoli li nħallu. Is-soluzzjonijiet għandhom jintużaw fi-żmien 24 siegħa.
         1.6.3.   L-apparat
         
                     —
                  
                  
                     ġibjuni tas-solventi:
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        degasser (fejn xieraq),
                  
               
                     —
                  
                  
                     pompa
                  
               
                     —
                  
                  
                     apparat biex inaqqas l-impuls (fejn hemm bżonn)
                  
               
                     —
                  
                  
                     sistema ta' injezzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kolonni tal-kromatografija,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ditekter
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        flowmeter (fejn hemm bżonn),
                  
               
                     —
                  
                  
                     proċessur li jirrekordja d-DATA,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kontenitur għall-iskart
                  
               Għandu jiġi żgurat li s-sistema GPC hija inerta fir-rigward tas-solventi użati (eż. bl-użu ta' kapillari ta' l-azzar għas-solvent THF).
         1.6.4.   L-injezzjoni u s-sistema li twassal s-solventi
         Volum definit tal-kampjun tas-soluzzjoni jitgħabba fuq il-kolonna bl-użu ta' auto-sampler jew manwalment f'żona definita preċiżament. L-irtirar jew l-għafis tal-plunger tas-siringa b'mod mgħaġġel, jekk isir manwalment, jista' jikkawża bidliet fid-distribuzzjoni tal-piż molekulari osservata. Is-sistema tat-twassil tas-solvent għandha, safejn huwa possibbli, tkun ħielsa mill-impulsi u idealment għandha tinkludi apparat li jnaqqas l-impulsi. Il-flowrate tkun madwar 1 ml/min.
         1.6.5.   Il-kolonna
         Skond il-kampjun, il-polimer ikun karatterizzat mill-użu ta' kolonna sempliċi jew minn numru ta' kolonni konnessi f’sekwenza. Għadd ta' materjali porużi tal-kolonni bi proprjetajiet definiti (eż. daqs tal-pori, limiti ta' esklużjoni) huma disponibbli kummerċjalment. L-għażla tal-ġel ta' separazzjoni jew tat-tul tal-kolonna jiddependi fuq il-proprjetajiet tal-kampjun (volumi idrodinamiċi, distribuzzjoni tal-piż molekulari) u l-kondizzjonijiet speċifiċi għas-separazzjoni bħas-solventi, t-temperatura u l-flowrate (1) (2) (3).
         1.6.6.   Il-pjanċi teoretiċi
         Il-kolonna jew il-kombinazzjoni tal-kolonni użati għas-separazzjoni għandhom jiġu karatterizzati skond in-numru ta' pjanċi teoretiċi. Dan jinvolvi, f’każ meta t-THF huwa s- solvent eluwent, it-tagħbija ta' soluzzjoni ta' etile benżin jew ta' sustanza maħlula mhux b'polarità xierqa fuq kolonna ta' tul magħruf. In-numru ta' pjanċi teoretiċi huwa mogħti skond l-ekwazzjoni li ġejja:
         
                     
                        
                  
                  
                     or
                  
                  
                     
                        
                  
               fejn,
         
                     N
                  
                  
                     =
                  
                  
                     in-numru tal-pjanċi teoretiċi
                  
               
                     Ve
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-volum ta' elużjoni fil-quċċata tal-massimu
                  
               
                     W
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-quċċata tal-wisa' tal-linja bażi
                  
               
                     W1/2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-quċċata tal-wisa' fin-nofs ta' l-għoli
                  
               1.6.7.   L-effiċjenza tas-separazzjoni
         Flimkien ma' l-ammont tal-pjanċi teoretiċi, li hija kwantità li tistabbilixxi il-bandwidth, l-effiċjenza tas-separazzjoni għandha sehem ukoll, u din hija stabbilita skond kemm hi wieqfa l-kurva tal-kalibrazzjoni. L-effiċjenza tas-separazzjoni ta' kolonna tinkisebskond ir-relazzjoni li ġejja:
         
            
         fejn,
         
                     Ve, Mx
                        
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-volum ta' elużjoni għall-polistiren b'piż molekulari Mx
                     
                  
               
                     Ve,(10.Mx)
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-volum ta' elużjoni għall-polistiren b'piż molekulari ta' għaxar darbiet iktar
                  
               Ir-riżoluzzjoni tas-sistema hija normalment definita kif ġej:
         
            
         fejn,
         
                     Ve1, Ve2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-volumi ta' elużjoni taż-żewġ standards tal-polistiren fil-quċċata tal-massimu
                  
               
                     W1, W2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-quċċata tal-wisat tal-linji ta' bażi
                  
               
                     M1, M2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-piżijiet molekulari fil-quċċata tal-massimu (għandu jkun hemm differenza b' fattur ta' 10)
                  
               Il-valur R għas-sistema tal-kolonni għandu jkun ikbar minn 1.7 (4).
         1.6.8.   Solventi
         Is-solventi kollha għandhom ikollhom purità għolja (għat-THF tintuża purità ta' 99,5 %). Id-depożitu tas-solventi (f'atmosfera ta' gass inert, jekk huwa neċessarju) għandu jkun kbir biżżejjed għall-kalibrazzjoni tal-kolonna u għal diversi analiżijiet tal-kampjuni. Il-gass għandu jitneħħa mis-solvent qabel ma jgħaddi għall-kolonna minn ġo pompa.
         1.6.9.   Kontroll tat-temperatura
         It-temperatura tal-komponenti kruċjali interni (iċ-ċirku ta' injezzjoni (injection loop), il-kolonni, id-ditekter, u t-tubi) għandha tkun kostanti u konsistenti skond l-għażla tas-solvent.
         1.6.10.   Ditekter
         Il-funzjoni tad-ditekter hija li jirreġistra b'mod kwantitattiv il-konċentrazzjoni tal-kampjun li ġie elwat mill-kolonna. Biex jiġi evitat li l-quċċati jitwessgħu, il-volum tal-cuvette taċ-ċellula tad-ditekter għandu jinżamm żgħir kemm jista' jkun. M'għandux ikun akbar minn 10 μl ħlief għal ditekters li jxerrdu d-dawl u għal ditekters tal-viskożità. Normalment tintuża rifrattometrija differenzjali għall-osservazzjoni. Madankollu, jekk meħtieġ mill-proprjetajiet speċifiċi tal-kampjun jew tas-solvent ta' elużjoni, jistgħu jintużaw ditekters oħrajn, eż. UV/VIS, IR, ditekters tal-viskożità, eċċ.
         2.   DATA U RAPPURTAR
         2.1.   DATA
         L-istandard DIN (1) għandu jiġi kkonsultat għall-kriterji ta' valutazzjoni dettaljata kif ukoll għall-kondizzjonijiet għall-ġbir u għall-proċessar ta' DATA.
         Għal kull kampjun għandhom isiru żewġ esperimenti indipendenti. Għandhom jiġu analizzati individwalment.
         Mn, Mw, Mw/Mn u Mp għandhom jiġu pprovduti għal kull kejl. Huwa neċessarju li jiġi espliċitament indikat li l-valuri mkejla huma valuri relattivi ekwivalenti għall-piżijiet molekulari ta' l-istandard użat.
         Wara li jiġu ddeterminati il-volumi ta' ritenzjoni jew il-ħinijiet ta' ritenzjoni (possibbilment irranġati permezz ta' standard intern), valuri log Mp (fejn Mp huwa l-massimu tal-quċċata ta' l-istandard tal-kalibrazzjoni) għandhom jitniżżlu ma' wieħed minn dawk il-kwantitajiet. Mill-inqas żewġ punti ta' kalibrazzjoni huma neċessarji għal kull sett ta' għaxar piżijiet molekulari, u mill-inqas ħames punti ta' kejl huma meħtieġa għall-kurva totali, u dan għandu jkopri l-piż molekulari stmat tal-kampjun. It-tarf baxx tal-kurva tal-kalibrazzjoni tal-piż molekulari huwa definit permezz ta' benżin n-hexyl jew sustanza maħlula mhux polari oħra.xierqa Il-medja tan-numru u l-medja tal-piż molekulari huma ġeneralment iddeterminati permezz ta' proċessar tad-DATA elettronika bbażata fuq il-formuli tas-sezzjoni 1.2. F'każ li tintuża d-diġitazzjoni manwali, ASTM D 3536-91 jista' jiġi kkonsultat (3).
         Il-kurva tad-distribuzzjoni għandha tiġi pprovduta f'forma ta' tabella jew figura (frekwenza differenzjali jew persentaġġi tas-somom ma' log M). Fir-rappreżentazzjoni grafika, sett wieħed ta' għaxar piżijiet molekulari huwa normalment wiesa’ 4 cm u l-massimu tal-quċċata għandu jkun twil xi 8 cm. F'każ ta' kurvi tad-distribuzzjoni integrali, d-differenza fil-koordinat bejn 0 u 100 % għandha tkun ta' xi 10 cm.
         2.2.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         2.2.1.   Sustanza tat-test
         
                     —
                  
                  
                     informazzjoni disponibbli dwar is-sustanza tat-test (identità, addittivi, impuritajiet),
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni tat-trattament tal-kampjun, osservazzjonijiet, problemi.
                  
               2.2.2.   Strumentazzjoni
         
                     —
                  
                  
                     kontenitur ta' l-eluwent, gass inert, tneħħija ta' gass żejjed ta' l-eluwent, kompożizzjoni ta' l-eluwent, impuritajiet,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pompa, apparat li jnaqqas il-polz, sistema ta' injezzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kolonni tas-separazzjoni (il-fabbrikant, l-informazzjoni kollha dwar il-karatteristiċi tal-kolonni bħad-daqs tal-pori, it-tip ta' materjal ta' separazzjoni eċċ., in-numru, it-tul u l-ordni tal-kolonni użati),
                  
               
                     —
                  
                  
                     numru ta' pjanċi teoretiċi tal-kolonni (jew kombinazzjoni), effiċjenza tas-separazzjoni (riżoluzzjoni tas-sistema).
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar is-simetrija tal-quċċati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     temperatura tal-kolonni, tip ta' kontroll tat-temperatura,
                  
               
                     —
                  
                  
                     indikatur (prinċipju tal-kejl, tip, cuvette, volum),
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        flowmeter jekk użat (il-fabbrikant, il-prinċipju tal-kejl),
                  
               
                     —
                  
                  
                     sistema għar-reġistrazzjoni u proċessar tad-DATA (hardware u software)
                  
               2.2.3.   Kalibrazzjoni tas-sistema
         
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni dettaljata tal-metodu użat biex tinbena l-kurva tal-kalibrazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar il-kriterji ta' kwalità ta' dan il-metodu (eż. koeffiċjent tal-korrelazzjoni, error sum of squares eċċ.),
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar l-estrapolazzjonijiet, l-assunzjonijiet u l-approssimazzjonijiet li saru waqt il-proċedura esperimentali u l-valutazzjoni u l-proċessar tad-DATA,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kejl kollu użat għall-kostruzzjoni tal-kurva ta' kalibrazzjoni għandu jiġi dokumentat f'tabella li tinkludi l-informazzjoni li ġejja għal kull punt ta' kalibrazzjoni:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-isem tal-kampjun,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-fabbrikant tal-kampjun,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-valuri karatteristiċi ta' l-istandards Mp, Mn, Mw u Mw/Mn, kif ipprovduti mill-fabbrikant jew kif miġjuba minn kejl sussegwenti, flimkien ma' dettalji dwar il-metodu ta' determinazzjoni,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-volum ta' l-injezzjoni u l-konċentrazzjoni ta' l-injezzjoni,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-valur Mp użat għall-kalibrazzjoni,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-valur ta' l-elużjoni jew il-ħin taż-żamma kkoreġut imkejjel fl-ogħla punt massimu,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-Mp kkalkulat fl-ogħla punt massimu,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-persentaġġ ta' żball ta' l-Mp kkalkulat u l-valur tal-kalibrazzjoni.
                              
                           
               2.2.4.   Valutazzjoni:
         
                     —
                  
                  
                     valutazzjoni fuq bażi ta' ħin: il-metodi użati biex tkun żgurata r-riproduzzjoni meħtieġa (metodu ta' korrezzjoni, standard intern, eċċ.),
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar jekk l-istima ġietx affettwata fuq il-bażi tal-volum ta' l-elużjoni jew il-ħin taż-żamma,
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar il-limiti tal-valutazzjoni jekk quċċata mhijiex analizzata kompletament,
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni ta' metodi li jneħħu x-xkiel, jekk użati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     proċeduri ta' preparazzjoni u trattament minn qabel tal-kampjun,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-preżenza ta' partikoli mhux maħlulin, jekk hemm,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-volum ta' l-injezzjoni (μl) u l-konċentrazzjoni ta' l-injezzjoni (mg/ml),
                  
               
                     —
                  
                  
                     osservazzjonijiet li jindikaw effetti li jwasslu għal devjazzjonijiet mill-profil GPC ideali,
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni dettaljata tal-modifikazzjonijiet kollha fil-proċeduri ta' l-ittestjar,
                  
               
                     —
                  
                  
                     dettalji ta' l-iskali ta' żbalji,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwalunkwe informazzjoni oħra u osservazzjonijiet rilevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati,
                  
               3.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Yau, W. W., Kirkland, J. J., u Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
                  
               
            Appendiċi
            Eżempji ta' metodi oħra għad-determinazzjoni tal-piż numru medju molekulari (mn) għall-polimeri
            Il-kromatografija bil-permeazzjoni tal-ġel (GPC) hija l-metodu preferut għad-determinazzjoni ta' Mn, speċjalment meta huwa disponibbli sett ta' standards, li l-istruttura tagħhom hija komparabbli ma' l-istruttura tal-polimer. Madankollu, fejn hemm diffikultajiet prattiċi fl-użu tal-GPC jew fejn diġà mistenni li s-sustanza ma tgħaddix mill-kriterju regolatorju Mn (u li jeħtieġ konferma), metodi alternattivi oħra huma disponibbli, bħal:
            1.   Użu ta' Proprjetajiet Kolligativi
            
                     
                        1.1
                     
                     
                        Ebulljoskopija/Krijoskopija
                        tinvolvi l-kejl ta' l-elevazzjoni tat-temperatura tat-tgħolija (ebulljoskopija) jew id-depressjoni tat-temperatura ta' l-iffriżar (krijoskopija) ta' solvent, meta jiżdied il-polimer. Il-metodu huwa bbażat fuq il-fatt li l-effett tal-polimer maħlul fuq it-temperatura tat-tgħolija/ta' l-iffriżar tal-likwidu jiddependi fuq il-piż molekulari tal-polimer (1)(2).
                        Applikabilità, Mn < 20 000.
                     
                  
                     
                        1.2
                     
                     
                        Tbaxxija tal-Pressjoni tal-Fwar
                        tinvolvi l-kejl tal-pressjoni tal-fwar minn likwidu ta' referenza magħżul qabel u wara ż-żieda ta' kwantitajiet magħrufa ta' polimer (1)(2).
                        Applikabilità, Mn < 20 000 (teoretikament; iżda fil-prattika ta' valur limitat).
                     
                  
                     
                        1.3
                     
                     
                        L-Ożmometrija tal-Membrana
                        hija bbażata fuq il-prinċipju ta' l-ożmosi, i.e. it-tendenza naturali ta' molekuli solventi li jgħaddu minn membrana semi-permeabbli minn soluzzjoni dilwita għal soluzzjoni konċentrata biex jinkiseb l-ekwilibriju. Fit-test, is-soluzzjoni dilwita hija f'konċentrazzjoni żero, waqt li s-soluzzjoni konċentrata fiha l-polimer. L-effett tal-ġbid tas-solvent mill-membrana jikkawża differenzjal tal-pressjoni li huwa dipendenti fuq il-konċentrazzjoni u l-piż molekulari tal-polimer (1)(3)(4).
                        Applikabilità, Mn < 20 000 – 200 000.
                     
                  
                     
                        1.4
                     
                     
                        Ożmometrija tal-Fażi tal-Fwar.
                        tinvolvi l-paragun tar-rata ta' evaporazzjoni ta' aerosol tas-solvent pur ma' mill-anqas tliet aerosols li fihom il-polimer f'konċentrazzjonijiet varji (1)(5)(6) Applikabbiltà Mn < 20 000.
                        Analiżi tal-Grupp Terminali Mn < 20 000.
                     
                  2.   Analiżi tal-Grupp Terminali
            Biex jintuża dan il-metodu, huwa meħtieġ għarfien kemm ta' l-istruttura komplessiva tal-polimer kif ukoll in-natura tal-gruppi terminali tal-katina (li jridu jkunu distinti mill-iskeletru ewlieni b'eż.. NMR jew titrazzjoni/derivatizzazzjoni). Id-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni molekulari tal-gruppi terminali preżenti fuq il-polimer tista' twassal għal valur għall-piż molekulari (7) (8) (9).
            Applikabbiltà, Mn sa 50 000 (b'affidabilità li tonqos).
            3.   Referenzi
            
                     
                        (1)
                     
                     
                        Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York.
                     
                  
                     
                        (2)
                     
                     
                        Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.
                     
                  
                     
                        (3)
                     
                     
                        ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
                     
                  
                     
                        (4)
                     
                     
                        Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52.
                     
                  
                     
                        (5)
                     
                     
                        ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
                     
                  
                     
                        (6)
                     
                     
                        Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
                     
                  
                     
                        (7)
                     
                     
                        Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.
                     
                  
                     
                        (8)
                     
                     
                        Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
                     
                  
                     
                        (9)
                     
                     
                        Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.
                     
                  
         A.19.   KONTENUT TA' POLIMERI TA' PIŻ MOLEKULARI BAXX
         1.   METODU
         Dan il-metodu ta' kromatografija bil-permeazzjoni tal-ġel hu ripetizzjoni ta' l-OECD TG 119 (1996). Il-prinċipji fundamentali u iktar informazzjoni teknika jinsabu bħala riferenzi.
         1.1.   DAĦLA
         Ladarba l-proprjetajiet tal-polimeri huma daqshekk varji, huwa impossibbli li jiġi deskritt metodu wieħed li jagħti l-kondizzjonijiet preċiżi għas-separazzjoni u l-valutazzjoni li japplikaw għal kull sitwazzjoni u għal kull ħaġa li tiġri waqt is-separazzjoni tal-polimeri. Ta' spiss u b'mod partikolari, sistemi ta' polimeri kumplessi mhumiex soġġetti għall-kromatografija bil-permeazzjoni tal-ġel (GPC). Meta il-GPC mhuwiex prattikabbli, il-piż molekulari jista' jiġi deċiż b'metodi oħrajn (ara l-Anness). F'dawn il-każijiet, għandhom jingħataw id-dettalji u l-ġustifikazzjonijiet kollha għall-użu ta' dak il-metodu.
         Il-metodu deskritt huwa bbażat fuq l-istandard DIN 55671 (1). F'dan l-istandard DIN tinsab informazzjoni dettaljata fuq kif għandhom jitmexxew dawn l-esperimenti u kif għandha tiġi vvalutata d-DATA. F'każ illi hemm bżonn li l-kondizzjonijiet ta' l-esperiment jinbidlu, dawn il-bidliet iridu jiġu ġġustifikati. Jistgħu jintużaw standards oħrajn jekk ikun hemm ir-referenzi kollha. Il-metodu deskritt juża kampjuni tal-polisterin ta' politixrid magħruf għall-kalibrazzjoni, u jista' jagħti l-każ li jrid jiġi modifikat biex jaqbel ma' ċerti polimeri, eż. polimeri li jinħallu fl-ilma u polimeri long-chain branched.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET
         Piż molekulari baxx huwa deskritt arbitrarjament bħala piż molekulari ta' inqas minn 1 000 dalton.
         Il-medja tal-piż molekulari tan-numru Mn u l-medja tal-piż molekulari tal-piż Mw huma ddeterminati skond l-ekwazzjonijiet li ġejjin:
         
                     
                        
                  
                  
                     
                        
                  
               fejn,
         
                     HI
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-livell tas-sinjal tad-ditekter mil-linji bażi għall-volum ta' retenzjoni Vi,
                  
               
                     Mi
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     Mi huwa t-toqol molekulari tal-frazzjoni tal-polimeri fil-volum ta' retenzjoni Vi, u n huwa n-numru tal-punti tad-DATA.
                  
               Il-wisa' tad-distribuzzjoni tat-toqol molekulari, li hija miżura tat-tixrid tas-sistema, huwa mogħti bil-proporzjon Mw/Mn.
         1.3.   SUSTANZI TA' RIFERENZA
         Ladarba l-GPC huwa metodu relattiv, hemm bżonn ta' kalibrazzjoni. Normalment jintużaw standards tal-polistiren b'distribuzzjoni limitata u mibnija linearment u li għandhom piż molekulari medju Mn u Mw u distribuzzjoni ta' piż molekolari magħrufa. Il-kurva tal-kalibrazzjoni tista' tintuża biss fid-determinazzjoni tal-piż molekulari tal-kampjun mhux magħruf jekk il-kondizzjonijiet għas-separazzjoni tal-kampjun u l-istandards intgħażlu b'mod preċiżament l-istess.
         Ir-relazzjoni ddeterminata bejn il-piż molekulari u l-volum ta' elużjoni huwa validu biss taħt il-kondizzjonijiet speċifiċi ta' l-esperiment partikolari. Il-kondizzjonijiet fuq kollox jinkludu t-temperatura, s-solvent (jew taħlita tas-solventi), il-kondizzjonijiet tal-kromatografija u l-kolonna tas-separazzjoni jew is-sistemi tal-kolonni.
         Il-piż molekulari tal-kampjuni ddeterminati b'dan il-mod huma valuri relattivi u huma deskritti bħala “piżijiet molekulari ekwivalenti għall-polistiren”. Dan ifisser illi skond id-differenzi strutturali u kimiċi bejn il-kampjun u l-istandards, il-piżijiet molekulari jistgħu jiddevjaw mill-valuri assoluti sa grad iktar jew inqas. Jekk jintużaw standards oħrajn, eż. il-glikol tal-polietilin, l-ossidu tal-politin, il-metakrilat tal-polimetil, aċidu poliakriliku, għandha titniżżel ir-raġuni.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TA' L-EŻAMINAZZJONI
         Kemm id-distribuzzjoni tal-piż molekulari tal-kampjun kif ukoll il-piżijiet molekulari medji (Mn, Mw) jistgħu jiġu ddeterminati billi jintuża l-GPC. Il-GPC huwa metodu speċjali ta' kromatografija likwida fejn il-kampjun jiġi separat skond il-valuri idrodinamiċi tal-kostitwenti individwali (2).
         Is-separazzjoni ssir kif il-kampjun jgħaddi minn ġo kolonna mimlija b'materjal poruż, tipikament ġel organiku. Molekoli żgħar jistgħu jippenetraw il-pori filwaqt li l-molekoli kbar ma jistgħux. Il-passaġġ tal-molekoli kbar huwa, għalhekk, iqsar u għalhekk huma jippenetraw l-ewwel. Il-molekoli ta'daqs medju jippenetraw minn uħud mill-pori u jgħaddu iktar tard. L-iżgħar molekoli, b'raġġ idrodinamiku medju iżgħar mill-pori tal-ġel jistgħu jippenetraw il-pori kollha. Dawn ikun elużi l-aħħar.
         Idealment, is-separazzjoni hija ddeterminata biss skond id-daqs ta' l-ispeċi tal-molekoli, imma fil-prattika huwa diffiċli li wieħed jevita xi interferenza mill-assorbiment L-ippakkjar mhux ugwali tal-kolonni u volumi mejtin jistgħu jaggravaw is-sitwazzjoni (2).
         L-osservazzjoni hija effetwata minn, eż. l-indiċi refrattiv jew l-assorbiment tal-UV u tagħti kurva tad-distribuzzjoni sempliċi. Madankollu, biex il-kurva tingħata valuri attwali tal-piż molekulari, huwa neċessarju li l-kolonna tiġi kkalibrata billi polimeri ta' piż molekulari magħruf u, idealment, ta' struttura simili ħafna, jitniżżlu ‘l isfel, eż. standards tal-polistiren varji. B'mod tipiku, għandha tirriżulta kurva Gaussian, xi drabi mgħawwġa minħabba denb fuq in-naħa baxxa tal-piż molekulari, fejn il-fus vertikali jindika l-kwantità, skond il-piż, ta' l-ispeċi tal-piż molekulari varji, u l-fus orizzontali l-piż molekulari rreġistrat.
         Il-kontenut tal-piż molekulari baxx huwa derivat minn din il-kurva. Il-kalkolu jista' jkun eżatt biss jekk l-ispeċi ta' piż molekulari baxx iġibu ruħhom bl-istess mod fuq bażi ta' piż għall-polimer sħiħ.
         1.5.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         Ir-ripetibilità (Devjazzjoni ta' Standard Relattiv: RSD) tal-volum ta' l-elużjoni għandha tkun aħjar minn 0,3 %. Ir-ripetibilità mixtieqa ta' l-analiżi għandha tiġi żgurata permezz ta' korrezzjoni skond standard intern jekk kromatogram huwa evalwat b'mod li huwa dipendenti fuq il-ħin u ma jaqbilx mal-kriterju msemmi hawn fuq (1). Il-politixrid jiddependi fuq il-piżijiet molekulari ta' l-istandards. Fil-każ ta' standards tal-polisterin, valuri tipiċi huma:
         
                     Mp < 2 000 
                  
                  
                     Mw/Mn < 1,20 
                  
               
                     2 000  ≤ Mp ≤ 106
                     
                  
                  
                     Mw/Mn < 1,05 
                  
               
                     Mp > 106
                     
                  
                  
                     Mw/Mn < 1,20 
                  
               (Mp huwa l-piż molekulari ta' l-istandard fil-quċċata tal-massimu)
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' L-EŻAMINAZZJONI
         1.6.1.   Preparazzjoni tas-soluzzjonijiet standard tal-polistirene
         L-istandards tal-polisterin huma maħlula permezz ta' taħlit bil-galbu fl-eluwent magħżul. Ir-rakkomandazzjonijiet tal-fabbrikant għandhom jiġu kkunsidrati waqt il-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet.
         Il-konċentrazzjonijiet ta' l-istandards li ntagħżlu huma dipendenti fuq fatturi varji, eż. il-volum ta' injezzjoni, il-viskożità tas-soluzzjoni u s-sensittività ta' l-indikatur analitiku. Il-volum massimu ta' injezzjoni għandu jiġi adattat għat-tul tal-kolonna, sabiex tiġi evitata t-tagħbija żejda. Il-volumi tipiċi ta' injezzjoni għal separazzjonijiet analitiċi bl-użu ta' GPC b'kolonna ta' 30 cm × 7,8 mm huma normalment bejn 40 u 100 μl. Volumi ogħla huma possibbli, imma m'għandhomx ikunu aktar minn 250 μl. L-aħjar proporzjon ta' volum ta' injezzjoni ma' konċentrazzjoni għandha tiġi ddeterminata qabel il-kalibrazzjoni attwali tal-kolonna.
         1.6.2.   Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun
         Bħala prinċipju, l-istess ħtiġijiet japplikaw għall-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tal-kampjun. Il-kampjun hu maħlul f'solvent xieraq, e.g. tetraidrofuran (THF), billi jitħawwad bil-galbu. Taħt l-ebda ċirkustanzi m'għandu jiġi maħlul permezz ta' banju ultrasoniku. Meta meħtieġ, is-soluzzjoni tal-kampjun hija ppurifikata permezz ta' filtru tal-membrana b'daqs tal-pori ta' bejn 0,2 u 2 μm.
         Il-preżenza ta' partikoli mhux maħlula għandha tiġi rreġistrata fir-rapport finali peress li dawn jistgħu jkunu minħabba speċi ta' piż molekulari għoli. Metodu xieraq għandu jintuża' biex jiġi ddeterminat il-persentaġġ f’piż tal-partikoli mhux maħlula. Is-soluzzjonijiet għandhom jintużaw fi żmien 24 siegħa.
         1.6.3.   Korrezzjoni għal kontenut ta' impuritajiet u addittivi
         Korrezzjoni tal-kontenut ta' speċi ta' M < 1 000 għall-kontribuzzjoni minn komponenti speċifiċi mhux polimeri preżenti (eż. impuritajiet u/jew addittivi) hija ġeneralment meħtieġa, sakemm il-kontenut imkejjel mhux diġà <1 %. Dan jinkiseb permezz ta' analiżi diretta tas-soluzzjoni polimera jew l-elużjoni GPC.
         F'każijiet fejn l-elużjoni, wara passaġġ mill-kolonna, hija wisq dilwita għal analiżi ulterjuri, din għandha tiġi kkonċentrata. Jista' jkun hemm il-ħtieġa li l-elużjoni tiġi evaporata san-nixfa u maħlula mill-ġdid. Konċentrazzjoni ta' l-elużjoni għandha tiġi miksuba taħt kondizzjonijiet li jassiguraw li l-ebda bidliet ma jseħħu fl-elużjoni. It-trattament ta' l-elużjoni wara l-pass tal-GPC hu dipendenti fuq il-metodu analitiku użat għad-determinazzjoni kwantitattiva.
         1.6.4.   Apparat
         L-apparat GPC jinkludi l-komponenti li ġejjin:
         
                     —
                  
                  
                     reservoir tas-solventi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        degasser (fejn hemm bżonn),
                  
               
                     —
                  
                  
                     pompa,
                  
               
                     —
                  
                  
                     apparat li jnaqqas l-impuls (fejn hemm bżonn),
                  
               
                     —
                  
                  
                     sistema ta' injezzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kolonni tal-kromatografija,
                  
               
                     —
                  
                  
                     indikatur,
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        flowmeter (fejn hemm bżonn)
                  
               
                     —
                  
                  
                     reġistratur-proċessur tad-data,
                  
               
                     —
                  
                  
                     reċipjent għall-iskart.
                  
               Għandu jiġi żgurat li s-sistema GPC hija inerta fir-rigward tas-solventi użati (eż. bl-użu ta' kapillari ta' l-azzar għas-solvent THF).
         1.6.5.   L-injezzjoni u s-sistema li twassal s-solventi
         Volum definit tal-kampjun tas-soluzzjoni jitgħabba fuq il-kolonna bl-użu ta' auto-sampler jew manwalment f'żona definita preċiżament. L-irtirar jew l-għafis tal-plunger tas-siringa b'mod mgħaġġel, jekk isir manwalment, jista' jikkawża bidliet fid-distribuzzjoni tal-piż molekulari osservata. Is-sistema tat-twassil tas-solvent għandha, safejn huwa possibbli, tkun ħielsa mill-impulsi u idealment għandha tinkludi apparat li jnaqqas l-impulsi. Il-flowrate tkun madwar 1 ml/min.
         1.6.6.   Il-kolonna
         Skond il-kampjun, il-polimer ikun karatterizzat mill-użu ta' kolonna sempliċi jew minn numru ta' kolonni konnessi f’sekwenza. Għadd ta' materjali porużi tal-kolonni bi proprjetajiet definiti (eż. daqs tal-pori, limiti ta' esklużjoni) huma disponibbli kummerċjalment. L-għażla tal-ġel ta' separazzjoni jew tat-tul tal-kolonna jiddependi fuq il-proprjetajiet tal-kampjun (volumi idrodinamiċi, distribuzzjoni tal-piż molekulari) u l-kondizzjonijiet speċifiċi għas-separazzjoni bħas-solventi, t-temperatura u l-flowrate (1) (2) (3).
         1.6.7.   Il-pjanċi teoretiċi
         Il-kolonna jew il-kombinazzjoni tal-kolonni użati għas-separazzjoni għandhom jiġu karatterizzati skond in-numru ta' pjanċi teoretiċi. Dan jinvolvi, f’każ meta t-THF huwa s- solvent eluwent, it-tagħbija ta' soluzzjoni ta' etile benżin jew ta' sustanza maħlula mhux b'polarità xierqa fuq kolonna ta' tul magħruf. In-numru ta' pjanċi teoretiċi huwa mogħti skond l-ekwazzjoni li ġejja:
         
                     
                        
                  
                  
                     or
                  
                  
                     
                        
                  
               fejn,
         
                     N
                  
                  
                     =
                  
                  
                     in-numru tal-pjanċi teoretiċi
                  
               
                     Ve
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-volum ta' elużjoni fil-quċċata tal-massimu
                  
               
                     W
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-quċċata tal-wisa' tal-linja bażi
                  
               
                     W1/2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-quċċata tal-wisa' fin-nofs ta' l-għoli
                  
               1.6.8.   L-effiċjenza tas-separazzjoni
         Flimkien ma' l-ammont tal-pjanċi teoretiċi, li hija kwantità li tistabbilixxi il-bandwidth, l-effiċjenza tas-separazzjoni għandha sehem ukoll, u din hija stabbilita skond kemm hi wieqfa l-kurva tal-kalibrazzjoni. L-effiċjenza tas-separazzjoni ta' kolonna tinkisebskond ir-relazzjoni li ġejja:
         
            
         fejn,
         
                     Ve, Mx
                        
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-volum ta' elużjoni għall-polistiren b'piż molekulari Mx
                     
                  
               
                     Ve,(10.Mx)
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-volum ta' elużjoni għall-polistiren b'piż molekulari ta' għaxar darbiet iktar
                  
               Ir-riżoluzzjoni tas-sistema hija normalment definita kif ġej:
         
            
         fejn,
         
                     Ve1, Ve2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-volumi ta' elużjoni taż-żewġ standards tal-polistiren fil-quċċata tal-massimu
                  
               
                     W1, W2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-quċċata tal-wisat tal-linji ta' bażi
                  
               
                     M1, M2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-piżijiet molekulari fil-quċċata tal-massimu (għandu jkun hemm differenza b' fattur ta' 10)
                  
               Il-valur R għas-sistema tal-kolonni għandu jkun ikbar minn 1,7 (4).
         1.6.9.   Solventi
         Is-solventi kollha għandhom ikollhom purità għolja (għat-THF tintuża purità ta' 99,5 %). Id-depożitu tas-solventi (f'atmosfera ta' gass inert, jekk huwa neċessarju) għandu jkun kbir biżżejjed għall-kalibrazzjoni tal-kolonna u għal diversi analiżijiet tal-kampjuni. Il-gass għandu jitneħħa mis-solvent qabel ma jgħaddi għall-kolonna minn ġo pompa.
         1.6.10.   Kontroll tat-temperatura
         It-temperatura tal-komponenti kruċjali interni (iċ-ċirku ta' injezzjoni (injection loop), il-kolonni, id-ditekter, u t-tubi) għandha tkun kostanti u konsistenti skond l-għażla tas-solvent.
         1.6.11.   Ditekter
         Il-funzjoni tad-ditekter hija li jirreġistra b'mod kwantitattiv il-konċentrazzjoni tal-kampjun li ġie elwat mill-kolonna. Biex jiġi evitat li l-quċċati jitwessgħu, il-volum tal-cuvette taċ-ċellula tad-ditekter għandu jinżamm żgħir kemm jista' jkun. M'għandux ikun akbar minn 10 μl ħlief għal ditekters li jxerrdu d-dawl u għal ditekters tal-viskożità. Normalment tintuża rifrattometrija differenzjali għall-osservazzjoni. Madankollu, jekk meħtieġ mill-proprjetajiet speċifiċi tal-kampjun jew tas-solvent ta' elużjoni, jistgħu jintużaw ditekters oħrajn, eż. UV/VIS, IR, ditekters tal-viskożità, eċċ.
         2.   DATA U RAPPURTAR
         2.1.   DATA
         L-istandard DIN (1) għandu jiġi kkonsultat għall-kriterji ta' valutazzjoni dettaljata kif ukoll għall-kondizzjonijiet għall-ġbir u għall-proċessar ta' DATA.
         Għal kull kampjun għandhom isiru żewġ esperimenti indipendenti. Għandhom jiġu analizzati individwalment. Fil-każijietjiet kollha hu essenjzali li tiġi ddeterminata wkoll DATA minn blanks, ittrattati taħt l-istess kondizzjonijiet tal-kampjun.
         Huwa meħtieġ li jiġi indikat b'mod espliċitu li l-valuri mkejla huma valuri relattivi ekwivalenti għall-piż molekulari ta' l-istandard użat.
         Wara determinazzjoni tal-volumi taż-żamma jew tal-ħinijiet taż-żamma (possibilment ikkoreġuti bl-użu ta' standard intern), valuri log Mp (Mp meqjus bħala l-ogħla quċċata ta' l-istandard tal-kalibrazzjoni) jitniżżlu ħdejn waħda minn dawn il-kwantitajiet. Mill-inqas żewġ punti ta' kalibrazzjoni huma meħtieġa għal kull sett ta' għaxaa piżijiet molekulari, u mill-inqas ħames punti ta' kejl huma meħtieġa għall-kurva totali, li għandha tkopri l-piż molekulari stmat għall-kampjun. Il-punt ta' tmiem baxx tal-piż molekulari tal-kurva ta' kalibrazzjoni huwa mfisser minn n-hexyl benżin jew minn soluzzjonimaħlula mhux polari oħra xierqa. Il-porzjon tal-kurva li jikkorrispondi għall-piż molekulari taħt 1 000 huwa ddeterminat u kkoreġut kif meħtieġ għall-impuritajiet u l-addittivi. Il-kurvi ta' l-elużjoni huma ġeneralment stmati permezz ta' l-ipproċessar elettroniku tad-DATA. Fil-każ li tintuża diġitazzjoni manwali, ASTM D 3536-91 jista' jiġi kkonsultat (3).
         Jekk kwalunkwe polimer li ma jinħallx jinżamm fil-kolonna, il-piż molekulari tiegħu x'aktarx li jkun ogħla minn dak tal-frazzjoni li tinħall, u jekk ma jiġix ikkunsidrat jista' jirriżulta fi stima eċċessiva tal-kontenut tal-piż molekulari baxx. Gwida għall-korrezzjoni tal-kontenut tal-piż molekulari baxx għall-polimer li ma jinħallx hija prevista fl-Anness.
         Il-kurva tad-distribuzzjoni għandha tiġi pprovduta f'forma ta' tabella jew figura (frekwenza differenzjali jew persentaġġi tas-somom ma' log M). Fir-rappreżentazzjoni grafika, sett wieħed ta' għaxar piżijiet molekulari huwa normalment wiesa’ 4 cm u l-massimu tal-quċċata għandu jkun twil xi 8 cm. F'każ ta' kurvi tad-distribuzzjoni integrali, d-differenza fil-koordinat bejn 0 u 100 % għandha tkun ta' xi 10 cm.
         2.2.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         2.2.1.   Sustanza tat-test
         
                     —
                  
                  
                     informazzjoni disponibbli dwar is-sustanza tat-test (identità, addittivi, impuritajiet),
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni tat-trattament tal-kampjun, osservazzjonijiet, problemi.
                  
               2.2.2.   Strumentazzjoni
         
                     —
                  
                  
                     kontenitur ta' l-eluwent, gass inert, tneħħija ta' gass żejjed ta' l-eluwent, kompożizzjoni ta' l-eluwent, impuritajiet,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pompa, apparat li jnaqqas il-polz, sistema ta' injezzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kolonni tas-separazzjoni (il-fabbrikant, l-informazzjoni kollha dwar il-karatteristiċi tal-kolonni bħad-daqs tal-pori, it-tip ta' materjal ta' separazzjoni eċċ., in-numru, it-tul u l-ordni tal-kolonni użati),
                  
               
                     —
                  
                  
                     numru ta' pjanċi teoretiċi tal-kolonni (jew kombinazzjoni), effiċjenza tas-separazzjoni (riżoluzzjoni tas-sistema).
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar is-simetrija tal-quċċati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     temperatura tal-kolonni, tip ta' kontroll tat-temperatura,
                  
               
                     —
                  
                  
                     indikatur (prinċipju tal-kejl, tip, cuvette, volum),
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        flowmeter jekk użat (il-fabbrikant, il-prinċipju tal-kejl),
                  
               
                     —
                  
                  
                     sistema għar-reġistrazzjoni u proċessar tad-DATA (hardware u software)
                  
               2.2.3.   Kalibrazzjoni tas-sistema
         
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni dettaljata tal-metodu użat biex tinbena l-kurva tal-kalibrazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar il-kriterji ta' kwalità ta' dan il-metodu (eż. koeffiċjent tal-korrelazzjoni, error sum of squares eċċ.),
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar l-estrapolazzjonijiet, l-assunzjonijiet u l-approssimazzjonijiet li saru waqt il-proċedura esperimentali u l-valutazzjoni u l-proċessar tad-DATA,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kejl kollu użat għall-kostruzzjoni tal-kurva ta' kalibrazzjoni għandu jiġi dokumentat f'tabella li tinkludi l-informazzjoni li ġejja għal kull punt ta' kalibrazzjoni:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-isem tal-kampjun,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-fabbrikant tal-kampjun,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-valuri karatteristiċi ta' l-istandards Mp, Mn, Mw u Mw/Mn, kif ipprovduti mill-fabbrikant jew kif miġjuba minn kejl sussegwenti, flimkien ma' dettalji dwar il-metodu ta' determinazzjoni,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-volum ta' l-injezzjoni u l-konċentrazzjoni ta' l-injezzjoni,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-valur Mp użat għall-kalibrazzjoni,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-valur ta' l-elużjoni jew il-ħin taż-żamma kkoreġut imkejjel fl-ogħla punt massimu,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-Mp kkalkulat fl-ogħla punt massimu,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-persentaġġ ta' żball ta' l-Mp kkalkulat u l-valur tal-kalibrazzjoni.
                              
                           
               2.2.4.   Informazzjoni dwar il-kontenut polimeru ta' piż molekulari baxx
         
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni tal-metodi użati fl-analiżi u l-mod li bih twettqu l-esperimenti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar il-persentaġġ ta' kontenut ta' speċi ta' piż molekulari baxx (w/w) relatat mal-kampjun totali,
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar impuritajiet, addittivi u speċi oħra mhux polimeri f'persentaġġ f’piż relatat mal-kampjun totali.
                  
               2.2.5.   Valutazzjoni:
         
                     —
                  
                  
                     valutazzjoni fuq bażi ta' ħin: il-metodi użati biex tkun żgurata r-riproduzzjoni meħtieġa (metodu ta' korrezzjoni, standard intern, eċċ.),
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar jekk l-istima ġietx affettwata fuq il-bażi tal-volum ta' l-elużjoni jew il-ħin taż-żamma,
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar il-limiti tal-valutazzjoni jekk quċċata mhijiex analizzata kompletament,
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni ta' metodi li jneħħu x-xkiel, jekk użati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     proċeduri ta' preparazzjoni u trattament minn qabel tal-kampjun,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-preżenza ta' partikoli mhux maħlulin, jekk hemm,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-volum ta' l-injezzjoni (μl) u l-konċentrazzjoni ta' l-injezzjoni (mg/ml),
                  
               
                     —
                  
                  
                     osservazzjonijiet li jindikaw effetti li jwasslu għal devjazzjonijiet mill-profil GPC ideali,
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni dettaljata tal-modifikazzjonijiet kollha fil-proċeduri ta' l-ittestjar,
                  
               
                     —
                  
                  
                     dettalji ta' l-iskali ta' żbalji,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwalunkwe informazzjoni oħra u osservazzjonijiet rilevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati,
                  
               3.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
                  
               
            Appendiċi
            Gwida għall-korrezzjoni tal-kontenut molekulari baxx għall-preżenza ta' polimeri insolubbli
            Meta hemm polimer insolubbli f'kampjun, dan jirriżulta f'telf tal-piż matul l-analiżi GPC. Il-polimer insolubbli jinżamm b'mod irriversibbli fuq il-kolonna jew il-filtru tal-kampjun waqt li l-porzjon solubbli tgħaddi mill-kolonna. Fil-każ fejn iż-żieda fl-indiċi rifrattiva (dn/dc) tal-polimer tista' tkun stmata jew imkejla, wieħed jista' jistma’ l-piż tal-kampjun mitluf fuq il-kolonna. F'dak il-każ, wieħed jagħmel korrezzjoni bl-użu ta' kalibrazzjoni esterna b'materjali standard ta' konċentrazzjoni magħrufa u dn/dc magħruf sabiex ikun ikkalibrat ir-reazzjoni tar-rifrattometru. Fl-eżempju hawn taħt jintuża standard poly(methyl methacrylate) (pMMA).
            Fil-kalibrazzjoni esterna għall-analiżi ta' polimeri akriliċi, standard pMMA ta' konċentrazzjoni magħrufa fit-tetraidrofuran, jiġi analizzat bil-GPC u d-data li tirriżulta tintuża biex jinsab il-kostanti tar-rifrattometru skond l-ekwazzjoni:
            K = R/(C x V x dn/dc)
            fejn :
            
                        K
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-kostanti tar-rifrattometru (f'microvolt second/ml),
                     
                  
                        R
                     
                     
                        =
                     
                     
                        it-tweġiba ta' l-istandard pMMA (f'microvolt/second),
                     
                  
                        C
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-konċentrazzjoni ta' l-istandard pMMA (f'mg/ml),
                     
                  
                        V
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-volum ta' l-injezzjoni (f'ml) u
                     
                  
                        dn/dc
                     
                     
                        =
                     
                     
                        iż-żieda fl-indiċi rifrattiv għall-pMMA f'tetraidrofuran (f'ml/mg).
                     
                  The following data are typical for a pMMA standard:
            
                        R
                     
                     
                        =
                     
                     
                        2 937 891
                     
                  
                        C
                     
                     
                        =
                     
                     
                        1,07 mg/ml
                     
                  
                        V
                     
                     
                        =
                     
                     
                        0,1 ml
                     
                  
                        dn/dc
                     
                     
                        =
                     
                     
                        9 x 10-5 ml/mg
                     
                  Il-valur K li jirriżulta, 3,05 x 1011 imbagħad jintuża biex tkun ikkalkulata r-reazzjoni teoretika tad-ditekter jekk 100 % tal-polimer injettat kien elwat permezz tad-ditekter.
         
         A.20.   L-IMĠIBA TAS-SOLUZZJONI/TA' L-ESTRAZZJONI TA' POLIMERI FL-ILMA
         1.   METODU
         Il-metodu deskritt huwa repetizzjoni tal-verżjoni reveduta ta' l-OECD TG 120 (1997). Aktar informazzjoni teknika tingħata bħala referenza (1).
         1.1.   DAĦLA
         Għal ċerti polimeri, bħall-polimeri ta' emulsjoni, xogħol ta' preparazzjoni inizjali jista' jkun meħtieġ qabel ma jista' jintuża' l-metodu stabbilit minn hawn 'il quddiem. Il-metodu mhuwiex applikabbli għal polimeri likwidi u għal polimeri li jirreaġixxu ma' l-ilma taħt il-kondizzjonijiet ta' l-ittestjar.
         Meta l-metodu mhuwiex prattiku jew mhuwiex possibbli, l-imġiba tas-soluzzjoni/ta’ l-estrazzjoni tista' tiġi investigata permezz ta' metodi oħrajn. F'każijiet bħal dawn, dettalji sħaħ u ġustifikazzjoni sħiħa għandhom jingħataw għall-metodu użat.
         1.2.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Xejn.
         1.3.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TA' TTESTJAR
         L-imġiba tas-soluzzjoni/ta’ l-estrazzjoni ta' polimeri f'sustanza ta' l-ilma hija ddeterminata bl-użu tal-metodu tal-flixkun (ara A.6 is-solubilità fl-ilma, metodu tal-flixkun) bil-modifikazzjonijiet deskritti hawn taħt.
         1.4.   KRITERJI TA' KWALITÀ
         Xejn.
         1.5.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' TTESTJAR
         1.5.1.   Apparat
         L-apparat li ġej hu meħtieġ għall-metodu:
         
                     —
                  
                  
                     mezz ta' tifrik, eż. mola għall-produzzjoni ta' partikoli ta' daqs magħruf,
                  
               
                     —
                  
                  
                     apparat għat-tħawwid bil-possibiltà ta' kontroll tat-temperatura,
                  
               
                     —
                  
                  
                     sistema ta' l-iffiltrar tal-membrana,
                  
               
                     —
                  
                  
                     apparat analitiku xieraq,
                  
               
                     —
                  
                  
                     għarbiela standardizzati.
                  
               1.5.2.   Preparazzjoni tal-kampjun
         Kampjun rappreżentattiv għandu l-ewwel jitnaqqas sa daqs ta' partikolu bejn 0,125 u 0,25 mm bl-użu ta' għarbiela xierqa. Jista' jkun meħtieġ tkessiħ għall-istabbilità tal-kampjun jew għall-proċess tad-tħin. Materjali ta' natura li tixbah il-lastiku jistgħu jitfarrku fit-temperatura tan-nitroġenu likwidu (1).
         Jekk il-frazzjon tad-daqs tal-partikolu meħtieġ ma jistax jinkiseb, għandha tittieħed azzjoni biex kemm jista' jkun jitnaqqas id-daqs tal-partikoli u r-riżultat jiġi rrappurtat. Fir-rapport, huwa meħtieġ li jiġi indikat il-mod li bih il-kampjun imfarrak kien maħżun qabel it-test.
         1.5.3.   Proċedura
         Tliet kampjuni ta' 10g tas-sustanza tat-test jintiżnu f'kull wieħed minn tliet kontenituri li għandhom stopper tal-ħġieġ u jiżdiedu 1 000 ml ta' ilma f’kull kontenitur. Jekk it-trattament ta' ammont ta' polimeru ta' 10 g jidher li mhuwiex prattikabbli, l-ogħla ammont li jmiss li jista' jiġi ttrattat għandu jintuża' u l-volum ta' ilma jiġi aġġustat skond dan.
         
            Stoppers jitqiegħdu fuq il-kontenituri u jiġu ssikkati u mbgħad jitħawdu f'temperatura ta' 20 oC. Għandu jintuża apparat ta' ċaqliq jew tħawwid li kapaċi jaħdem f'temperatura kostanti. Wara perjodu ta' 24 siegħa, il-kontenut ta' kull kontenitur huwa ċċentrifugat u ffiltrat u l-konċentrazzjoni ta' polimer fil-fażi ċara ta' l-ilma hija ddeterminata permezz ta' metodu analitiku xieraq. Jekk metodi analitiċi xierqa għall-fażi ta' l-ilma mhumiex disponibbli, is-solubilità/l-estrattività totali tista' tiġi stmata mill-piż niexef tar-residwu tal-filtru jew tal-preċipitat iċċentrifugat.
         Is-soltu ikun hemm il-ħtieġa li jkun hemm differenza kwantitattiva bejn l-impuritajiet u l-addittivi min-naħa l-waħda u l-ispeċi ta' piż molekulari baxx min-naħa l-oħra. Fil-każ ta' determinazzjoni gravimetrika, huwa importanti wkoll li titwettaq prova blank mingħajr sustanza għat-test sabiex jinkiseb għarfien dwar residwi li ġejjin mill-proċedura esperimentali.
         L-imġiba tas-soluzzjoni/ta’ l-estrazzjoni ta' polimeri fl-ilma f’temperatura ta' 37 oC f’pH 2 u pH 9 tista' tiġi ddeterminata bl-istess mod kif deskritt fit-twettiq ta' l-esperiment f‘temperatura ta' 20 oC. Il-valuri tal-pH jistgħu jinkisbu biż-żieda jew sustanzi ta' protezzjoni xierqa jew ta' aċidi jew ta' bażi xierqa bħal aċidu idrokloriku, aċidu aċetiku, sodju ta' grad analitiku jew idrossidu tal-potassju jew NH3.
         Skond il-metodu ta' analiżi użat, għandhom jitwettqu test wieħed jew żewġ testijiet. Meta metodi speċifiċi biżżejjed ikunu disponibbli għall-analiżi diretta tal-fażi ta' l-ilma għall-komponent tal-polimer, test wieħed kif deskritt hawn fuq għandu jkun biżżejjed. Madankollu, meta dawn il-metodi mhumiex disponibbli u d-determinazzjoni ta' l-imġiba tas-soluzzjoni/ta’ l-estrazzjoni tal-polimer hija limitata għall-analiżi indiretta billi jiġi iddeterminat biss il-kontenut totali ta' karbonju organiku (TOC) ta' l-estratt ta' l-ilma, test addizzjonali għandu jitwettaq. Dan it-test addizzjonali għandu wkoll jsir tliet darbiet, bl-użu ta' kampjuni ta' polimeri li huma 10 darbiet iżgħar u bl-istess ammonti ta' ilma użati fl-ewwel test.
         1.5.4.   Analiżi
         1.5.4.1.   Test imwettaq b'daqs wieħed ta' kampjun
         Jista' jkun hemm metodi disposnibbli għall-analiżi diretta ta' komponenti polimeri fil-fażi ta' l-ilma. Inkella, analiżi indiretta ta' komponenti polimeri maħlula/estratti, permezz tad-determinazzjoni tal-kontenut totali ta' partijiet li jinħallu u l-korrezzjoni għal komponenti polimeri mhux speċifiċi, tista' wkoll tiġi kkunsidrata.
         Analiżi tal-fażi ta' l-ilma għall-ispeċi polimerika totali hija possibbli:
         jew permezz ta' metodu sensittiv biżżejjed, eż.
         
                     —
                  
                  
                     TOC li tuża diġestjoni ta' persulfat jew dikromata biex tagħti CO2 segwita bi stima permezz ta' IR jew ta' analiżi kimika,
                  
               
                     —
                  
                  
                     spettrometrija atomika ta' l-assorbiment (AAS) jew l-emissjoni tal-plasma tagħha magħquda b'mod induttiv (ICP) ekwivalenti għal silikone jew polimer li jkun fih il-metall,
                  
               
                     —
                  
                  
                     assorbiment ta' l-UV jew spettrofluworimetrija għall-polimeri aryl,
                  
               
                     —
                  
                  
                     LC-MS għal kampjuni ta' piż molekulari baxx.
                  
               jew permezz ta' evaporazzjoni b'vakwu san-nixfa ta' l-estratt ta' l-ilma u analiżi spettroskopika (IR, UV, eċċ.) jew AAS/ICP tar-residwu.
         Jekk analiżi tal-fażi ta' l-ilma fiha nnifisha mhijiex prattikabbli, l-estratt ta' l-ilma għandu jiġi estratt b'solvent organiku li ma jistax jitħallat ma' l-ilma, eż. idrokarbonju klorinat. Is-solvent huwa mbagħad evaporat u r-residwu huwa analizzat kif imsemmi hawn fuq għall-kontenut polimeru notifikat. Kwalunkwe komponenti f'dan ir-residwu li huma identifikati bħala impuritajiet jew addittivi għandhom jitnaqqsu għall-iskop tad-determinazzjoni tal-grad ta' soluzzjoni/ta” l-estrazzjoni tal-polimer nnifsu.
         Meta kwantitajiet relattivament kbar ta' dawn il-materjali huma preżenti, jista' jkun meħtieġ li r-residwu jiġi soġġett għal, eż. analiżi HPLC jew GC biex jiġu differenzjati l-impuritajiet preżenti li ġejjin mill-ispeċi monomeri jew li ġejjin mill-monomeri sabiex il-kontenut veru ta' dawn ta' l-aħħar jista' jiġi ddeterminat.
         F'xi każijiet, jista' jkun suffiċjenti li ssir evaporazzjoni sempliċi tas-solvent organiku san-nixfa u li jintiżen ir-residwu niexef.
         1.5.4.2.   Test imwettaq b'żewġ daqsijiet differenti ta' kampjun
         L-estratti ta' l-ilma kollha huma analizzati għat-TOC.
         Determinazzjoni gravimetrika titwettaq fuq il-parti mhux maħlula/mhux estratta tal-kampjun. Jekk, wara ċ-ċentrifugazzjoni jew l-iffiltrar tal-kontenut ta' kull kontenitur, residwi polimeri jibqgħu mwahħlin mal-ħajt tal-kontenitur, il-kontenitur għandu jitlaħlaħ bil-filtrat sa kemm il-kontenitur jitnaddaf mir-residwi viżibbli kollha. Wara dan, il-filtrat huwa ċċentrifugat jew iffiltrat għal darb'oħra. Ir-residwi li jibqgħu fuq il-filtru jew fit-tubu taċ-ċentrifugu jitnixxfu f’temperatura ta' 40 oC taħt vakwu u jintiżnu. It-tnixxif jitkompla sakemm jintlaħaq piż kostanti.
         2.   DATA
         2.1.   TEST IMWETTAQ B'DAQS WIEĦED TAL-KAMPJUN
         Ir-riżultati individwali għal kull wieħed mit-tliet fliexken u l-valuri medji għandhom jingħataw u għandhom ikunu espressi f'unitajiet ta' piż għal kull volum tas-soluzzjoni (tipikament mg/l) jew piż għal kull piż ta' kampjun tal-polimeru (tipikament mg/g). Barra dan, it-telf ta' piż tal-kampjun (ikkalkulat bħala l-piż tas-sustanza maħlula mnaqqsa mill-piż tal-kampjun inizjali) għandu wkoll jingħata. Id-devjazzjonijiet relattivi standard (RSD) għandhom jiġu kkalkulati. Figuri individwali għandhom jingħataw għas-sustanza totali (polimer + addittivi essenzjali, eċċ.) u għall-polimer biss (jiġifieri wara t-tnaqqis tal-kontribuzzjoni minn dawn l-addittivi).
         2.2.   TEST IMWETTAQ B'ŻEWĠ DAQSIJIET DIFFERENTI TAL-KAMPJUN
         Il-valuri TOC individwali ta' l-estratt ta' l-ilma taż-żewġ esperimenti ripetuti għal tliet darbiet u l-valur medju għal kull esperiment għandu jingħata espress bħala unità ta' piż għal kull volum ta' soluzzjoni (tipikament mgC/1), kif ukoll f'unità ta' piż għal kull piż tal-kampjun inizjali (tipikament mgC/g).
         Jekk m'hemm l-ebda differenza bejn ir-riżultati fil-proporzjonijiet għolja u baxxi tal-kampjun/ilma, dan jista' jindika li l-komponenti li setgħu jiġu estratti kienu fil-fatt estratti kollha. F'dan il-każ, analiżi diretta m'għandhiex normalment tkun meħtieġa.
         Il-piżijiet individwali tar-residwi għandhom jingħataw u jiġu espressi f'persentaġġ tal-piżijiet inizjali tal-kampjuni. Il-medji għandhom jiġu kkalkulati għal kull esperiment. Id-differenzi bejn 100 u l-persentaġġi li nstabu jirrappreżentaw il-persentaġġi ta' materjal li jinħall u li jista' jiġi estratt fil-kampjun oriġinali.
         3.   RAPPURTAR
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         3.1.1.   Is-sustanza għat-test
         
                     —
                  
                  
                     informazzjoni disponibbli dwar is-sustanza għat-test (identità, addittivi, impuritajiet, kontenut ta' speċi ta' piż molekulari baxx).
                  
               3.1.2.   Kondizzjonijiet esperimentali
         
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni tal-proċeduri użati u kondizzjonijiet esperimentali,
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni tal-metodi analitiċi u ta' osservazzjoni.
                  
               3.1.3.   Riżultati
         
                     —
                  
                  
                     riżultati tal-kapaċità li jinħall/jiġi estratt f’mg/l; valuri medji u individwali għat-testijiet ta' l-estrazzjoni fis-soluzzjonijiet varji, imqassmin f'kontenut polimeru u impuritajiet, addittivi, eċċ.,
                  
               
                     —
                  
                  
                     riżultati tal-kapaċità li jinħall/jiġi estratt f’mg/g ta' polimer,
                  
               
                     —
                  
                  
                     valuri TOC ta' estratti ta' l-ilma, piż tas-sustanza li tinħall u l-persentaġġi kkalkulati, jekk imkejlin,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-pH ta' kull kampjun,
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar il-valuri vojta,
                  
               
                     —
                  
                  
                     fejn meħtieġ, referenzi għall-instabilità kimika tas-sustanza tat-test, kemm matul il-proċess ta' l-ittestjar kif ukoll il-proċess analitiku,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-informazzjoni kollha li hija importanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.
                  
               A.21.   PROPRJETAJIET OSSIDIZZANTI (LIKWIDI)
         1.   METODU
         1.1   INTRODUZZJONI
         Dan il-metodu tat-test huwa ddisinjat sabiex ikejjel il-potenzjal ta' sustanza likwida li żżid ir-rata tal-ħruq jew l-intensità tal-ħruq ta' sustanza kombustibbli, jew li tifforma taħlita ma' sustanza kombustibbli li tieħu n-nar b'mod spontanju, meta it-tnejn ikunu kompletament imħallta. Dan huwa bbażat fuq it-test tan-NU dwar likwidi ossidizzanti (1) u huwa ekwivalenti għalih. B'danakollu, minħabba li dan il-metodu A.21 huwa primarjament iddisinjat biex jissodisfa l-ħtiġijiet tar-Regolament 1907/2006, huwa meħtieg il-paragun ma' sustanza ta' referenza waħda. It-testijiet u l-paragun ma' sustanzi addizzjonali ta' referenza jistgħu jkunu meħtieġa meta jkun mistenni li r-riżultati tat-test se jintużaw għal skopijiet oħrajn. (9)
         
         Dan it-test mhux bil-fors li jitwettaq meta l-eżami tal-formula struttrali jistabbilixxi lil hinn minn kull dubbju raġjonevoli li s-sustanza ma jistax ikollha reazzjoni eżotermika ma' materjal kombustibbli.
         Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminarja dwar il-potenzjal tal-proprjetajiet esplożivi tas-sustanza qabel ma jitwettaq it-test.
         Dan it-test mhux applikabbli għal solidi, gassijiet, sustanzi li huma ferm fjammabbli jew splussivi, jew perossidi organiċi.
         Dan it-test jista' ma jsirx meta r-riżultati tas-sustanza għat-test fit-test tan-NU għal likwidi ossidanti (1) ikunu diġà disponibbli.
         1.2   DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET
         Iż-żieda fil-ħin tal-pressjoni medja hija l-medja tal-ħinijiet imkejla għal taħlita li tkun għat-test sabiex tipproduċi żieda fil-pressjoni minn 690 kPa sa 2 070 kPa aktar minn dik atmosferika.
         1.3   SUSTANZA TA' REFERENZA
         65 % (w/w) aċidu nitriku fl-ilma (grad analitiku) huwa meħtieġ bħala sustanza ta' referenza (10).
         L-aħjar, jekk l-esperiment jipprevedi li r-riżultati ta' dan it-test jistgħu eventwalment ikunu użati għal skopijiet oħrajn (9), l-ittestjar ta' sustanzi ta' referenza addizzjonali jista' jkun xieraq ukoll (11).
         1.4   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Il-likwidu għat-test jitħawwad fi proporzjon ta' 1: 1, bil-piż, ma' ċellulożi fibruża u jiġi introdott f’reċipjent ta' pressjoni. Jekk waqt it-taħlit jew waqt il-mili jaqbad b'mod spontanju, l-ebda test ieħor ma jkun meħtieġ.
         Jekk ma jaqbadx b'mod spontanju it-test kollu għandu jitwettaq. It-taħlita tisaħħan f'reċipjent ta' pressjoni u l-ħin medju jkun irreġistrat għall-pressjoni li titla’ minn 690 kPa sa 2 070 kPa aktar mill-pressjoni atmosferika. Dan jitqabbel maż-żieda fil ħin tal-pressjoni medja għat-taħlita 1: 1 tas-sustanza(i) ta' referenza u ċ-ċellulożi.
         1.5   KRITERJA TA' KWALITÁ
         F'serje ta' ħames provi fuq sustanza waħda l-ebda riżultat m'għandu jiddiferixxi b'aktar minn 30 % mill-medja aritmetika. Ir-riżultati li jiddiferixxu b'aktar minn 30 % minn dik il-medja għandhom jitwarrbu, il-proċedura tat-taħlit jew tal-mili tittejjeb u t-test jiġi ripetut.
         1.6   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.6.1   Preparazzjoni
         1.6.1.1   Sustanza kombustibbli
         Sustanza xotta, fibruża, biċ-ċellulożi b'fibra b'tul ta' bejn 50 u 250 μm u dijametru medju ta' 25 μm, (12) tintuża bħala l-materjal kombustibbli. Din titnixxef għal piż kostanti f'saff ta' mhux aktar minn 25 mm ħxuna f’105 oC għal 4 sigħat u tinżamm f'dessikatur, bid-dessikant, sakemm tibred u tkun meħtieġa għall-użu. Il-kontenut ta' l-ilma taċ-ċellulożi xotta għandu jkun anqas minn 0,5 % f’piż xott (13). Jekk meħtieġ, il-ħin tat-tnixxif għandu jittawwal sabiex jintlaħaq dan il-livell (14). L-istess lott ta' ċellulożi għandu jintuża matul it-test kollu.
         1.6.1.2   Apparat
         1.6.1.2.1   Reċipjent ta' pressjoni
         
         Reċipjent ta‘ pressjoni huwa meħtieġ. Ir-reċipjent jikkonsisti minn reċipjent ċilindriku ta' pressjoni ta' l-azzar 89 mm tul u 60 mm dijametru estern (ara l-figura 1). Żewġ pjanċi huma msawwra b'magna fuq in-naħat opposti (il-cross section tar-reċipjent b'hekk tonqos għal 50 mm) sabiex ikun iffaċilitat it-twaħħil tal-plagg li jqabbad u tat-tapp tal-vent. Ir-reċipjent, b'ċirkonfernza interna ta' 20 mm u ribattut f'kull tarf għall-fond ta' 19 mm u b'kamin li jaċċetta 1” British Standard Pipe (BSP) jew l-ekwivalenti metriku. It-take-off tal-pressjoni, fl-għamla ta' driegħ laterali, tiġi invitata fuq il-wiċċ tal-kurva tar-reċipjent ta' pressjoni, 35 mm minn tarf wieħed u 90o mill-pjanċi msawwra b'magna. Il-plagg għal dan jitħaffer għal fond ta' 12 mm u jingħata l-kamin sabiex jaċċetta 1/2” BSP (jew metriku ekwivalenti) fit-tarf l-ieħor tad-driegħ. Jekk meħtieġ, siġill inert jitwaħħal sabiex jassigura siġill li ma jgħaddix gass minnu. Id-driegħ tal-ġenb jestendi għall-55 mm lil hinn mil-qafas tar-reċipjent ta' pressjoni u jkollu ħofra interna ta' 6 mm. It-tarf tad-driegħ tal-ġenb ikun ribattut u jkollu kamin sabiex jaċċetta transducer tal-pressjoni tat-tip bid-dijaframma. Kwalunkwe apparat li jkejjel il-pressjoni jista' jintuża basta dan ma jkunx effettwat minn gassijiet sħan jew minn dikompożizzjoni ta' prodotti u jkun kapaċi jirrispondi għal rati ta' żieda fil-pressjoni ta' 690-2 070 kPa f'mhux aktar minn 5ms.
         It-tarf l-aktar 'il bogħod mid-driegħ tal-ġenb tar-reċipjent ta‘ pressjoni jingħalaq bi plagg li jqabbad u li jkun mgħammar b'żewg elettrodi, waħda insulata minn ġewwa, u l-oħra mwaħħla ma' l-earth, mal-plagg taċ-ċilindru. It-tarf l-ieħor tar-reċipjent ta‘ pressjoni jingħaluq b'disk li tinfaqa' (pressjoni tat-tifqigħ ta' madwar 2 200 kPa) miżmuma fil-post b'plagg li jżomm li jkollu ħofra ta' 20 mm. Jekk meħtieġ, siġill inert jintuża mal-plagg li jqabbad sabiex jiżgura rabta tajba li ma jgħaddix gass minnha. Stend ta' frid (il-figura 2) iservi sabiex iżomm l-immuntar fil-pożizzjoni t-tajba matul l-użu. Dan normalment ikun jinkludi pjanċa ta' l-azzar artab b'kejl ta' 235 mm × 184 mm × 6 mm u 185 mm tul b'sezzjoni kwadra mħaffra (S.H.S.) 70 mm × 70 mm × 4 mm.
         Sezzjoni tkun maqtugħa minn kull wieħed mill-ġnub opposti fit-tarf ta' l-S.H.S. hekk li tirriżulta struttura b'żewġ saqajn bil-ġenb ċatt li fuqha tistrieħ box section intatta b'tul ta' 86 mm. It-truf ta' dawn il-ġnub ċatti huma maqtugħa għal angolu ta' 60o mal-lat orizzontali u iwweldjati mal-pjanċa tal-qiegħ. Qasma bil-kejl ta' 22 mm wisa' x 46 mm fond tinqata’ b'mod mekkaniku fuq naħa waħda fit-tarf ta' fuq tas-sezzjoni tal-qiegħ hekk li l-immuntar tar-reċipjent ta' pressjoni jitniżżel, it-tarf tal-plagg li jqabbad jiddaħħal l-ewwel, fil-box section ta' l-irfid tas-sezzjoni, bid-driegħ tal-ġenb akkomodat f'dik il-qasma. Biċċa azzar 30 mm wisa' u 6 mm ħxuna tkun iwweldjata mal-wiċċ intern l-aktar baxx tas-sezzjoni tal-box section sabiex taġixxa bħala spacer. Żewġ skorfini butterfly, bil-kamin fuq il-wiċċ oppost, iservu sabiex iżommu r-reċipjent ta' pressjoni f'pożizzjoni soda. Żewġ strippi 12 mm wiesa' magħmulin minn azzar ta' 6 mm ħxuna, iwweldjati mal-biċċiet tal-ġenb li joħorġu mill-bażi tal-box section, jirfdu r-reċipjent tal-pressjoni minn taħt.
         1.6.1.2.2   Sistema li tagħti n-nar
         
         Is-sistema li tagħti n-nar tikkonsisti minn wajer ta' Ni/Cr twil 25 cm b'dijametru ta' 0,6 mm u b’reżistenza ta' 3,85 ohm/m. Il-wajer jinbaram, bl-użu ta' virga b'dijametru ta' 5 mm, f'għamla ta' romblu u jintrabat ma' l-elettrodi tal-plagg li jqabbad. Ir-romblu għandu jkollu waħda mill-konfigurazzjonijiet murija fil-figura 3. Id-distanza bejn il-qiegħ tar-reċipjent u l-parti t'isfel tar-romblu li jqabbad għandha tkun 20 mm. Jekk l-elettrodi ma jkunux aġġustabbli, it-trufijiet tal-wajer li jqabbad bejn ir-romblu u l-qiegħ tar-reċipjent għandhom ikunu insulati b'kisja taċ-ċeramika. Il-fil jissaħħan b'kurrent kostanti ta' l-elettriku li jista' jforni mill-anqas 10 A.
         1.6.2   It-twettiq tat-test
                (15)
            
         
         L-apparat, immuntat kollu kemm hu bit-transducer tal-pressjoni u s-sistema tas-sħana imma mingħajr il-plattina li tinfaqa', huwa mirfud bit-tarf tal-plagg li jqabbad fin-naħa t'isfel. 2,5 g mill-likwidu tat-test jitħallat ma' 2,5 g taċ-ċelluloża mnixxfa f'beaker tal-ħġieġ bl-użu ta' virga tal-ħġieġ għat-tħawwid (16). Bħala prekawzjoni kontra l-periklu, it-tħawwid għandu jitwettaq wara tarka tas-sikurezza bejn l-operatur u t-taħlita. Jekk it-taħlita taqbad matul it-tħawwid jew waqt il-mili, il-kumplament tat-test mhux meħtieġ. It-taħlita tiżdied, fi porzjonijiet żgħar u bit-taptip, fir-reċipjent tal-pressjoni waqt li jkun żgurat li t-taħlita tkun ippakkjata madwar il-bobina li tqabbad u li tkun f'kuntatt tajjeb magħha. Huwa importanti li l-bobina ma titgħaffiġx waqt il-proċess ta' l-ippakkjar minħabba li dan jista' jwassal għal riżultati ħżiena (17). Il-plattina ti tinfaqa' titqiegħed f'postha u l-plagg li jżomm jiġi invitat sewwa. Ir-reċipjent kif hekk imħejji jkun trasferit għal fuq l-istand ta' rfid ta' tqabbid, bil-plattina li tinfaqa' fuq in-naħa ta' fuq, u r-reċipjent għandu jkun lokalizzat f'armarju ventilat xieraq jew inkella f'ċellula li tqabbad. L-għejun ta' l-elettriku jintrabat mat-trufijiet esterni tal-plagg li jqabbad u jiġu applikati 10 A. Il-ħin minn meta jibda t-taħlit u jinxtegħel l-elettriku m'għandux jeċċedi l-10 minuti.
         Is-sinjal prodott mit-transducer tal-pressjoni jkun irreġistrat fuq sistema xierqa li tippermetti kemm il-valutazzjoni u kif ukoll il-ġenerazzjoni ta' reġistrazzjoni permanenti tal-profil tal-ħin mal-pressjoni (eż. reġistratur b'kurrent qasir ma' reġistratur chart). It-taħlita tissaħħan sakem il-plattina li tinfaqa' tinkiser jew sakemm mill-anqas ikunu għaddew 60 s. Jekk il-plattina li tinfaqa' ma tinkisirx, it-taħlita għandha titħalla tibdred qabel ma, b'galbu kbir, l-apparat jiżżarma, billi jittieħdu l-prekawzjonijiet għal xi forza ta' pressjoni li jista jkun hemm. Għandhom jitwettqu ħames provi bis-sustanza tat-test u bis-sustanza(i) tar-referenza. Il-ħin meħtieġ sabiex il-pressjoni titla’ minn 690 kPa sa 2 070 kPa aktar mill-pressjoni atmosferika għandu jkun innotat. Il-ħin taż-żieda medja fil-pressjoni tkun ikkalkulata.
         F'ċerti każijiet, is-sustanzi jistgħu jiġġeneraw żieda fil-pressjoni (għolja wisq jew baxxa wisq), minħabba r-reazzjonijiet kimiċi li ma jkunux jikkaratterizzaw il-proprjetajiet ossidanti tas-sustanza. F'dawn il-każijiet, jista' jkun hemm il-ħtieġa li jkun ripetut it-test b'sustanza inerta, eż. diatomit (kieselguhr), minflok iċ-ċelluloża, sabiex tkun iċċarata n-natura tar-reazzjoni.
         2.   DATA
         Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni kemm għas-sustanza tat-test u wkoll għas-sustanza(i) ta' referenza. Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni għat-testijiet b'sustanza inerta, jekk imwettqa.
         2.1   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni kemm għas-sustanza tat-test u wkoll għas-sustanza(i) ta' referenza jkunu ikkalkulati.
         Il-ħinijiet taż-żieda fil-pressjoni għat-testijiet b'sustanza inerta, (jekk imwettqa) jkunu ikkalkulati.
         Uħud mill-eżempji tar-riżultati huma murija fit-Tabella 1
         Tabella 1
         Eżempji tar-riżultati
                (1)
            
         
         
                     Sustanza (2)
                     
                  
                  
                     Il-ħin taż-żieda medja fil-pressjoni ta' taħlita ta' 1:1 maċ-ċelluloża
                     (ms)
                  
               
                     Dikromat ta' l-ammonju, taħlita saturata fl-ilma
                  
                  
                     20 800 
                  
               
                     Nitrat tal-kalċju, taħlita saturata fl-ilma
                  
                  
                     6 700 
                  
               
                     Nitrat ferriku, taħlita saturata fl-ilma
                  
                  
                     4 133 
                  
               
                     Perklorat tal-litjum, taħlita saturata fl-ilma
                  
                  
                     1 686 
                  
               
                     Perklorat tal-magneżju, taħlita saturata fl-ilma
                  
                  
                     777
                  
               
                     Nitrat tan-nikil, taħlita saturata fl-ilma
                  
                  
                     6 250 
                  
               
                     Aċidu nitriku, 65 %
                  
                  
                     4 767  (3)
                     
                  
               
                     Aċidu perkoriku, 50 %
                  
                  
                     121 (3)
                     
                  
               
                     Aċidu perkoriku, 55 %
                  
                  
                     59
                  
               
                     Nitrat tal-potassju, 30 % taħlita fl-ilma
                  
                  
                     26 690 
                  
               
                     Nitrat tal-fidda, taħlita saturata fl-ilma
                  
                  
                     — (4)
                     
                  
               
                     Klorat tas-sodju, 40 % taħlita fl-ilma
                  
                  
                     2 555  (3)
                     
                  
               
                     Nitrat tas-sodju, 45 % taħlita fl-ilma
                  
                  
                     4 133 
                  
               
                     
                        Sustanza inerta
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Ilma:Ċelluloża
                  
                  
                     — (4)
                     
                  
               3.   RAPPORT
         3.1   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     l-identità, il-kompożizzjoni, il-purità, eċċ. tas-sustanza għat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjoni tas-sustanza għat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-proċedura użata għat-tnixxif taċ-ċelluloża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kontenut ta' l-ilma użat fiċ-ċelluloża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati tal-kejl;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati mit-testijiet b'sustanza inerta, jekk ikun hemm;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħinijiet medji taż-żieda fil-pressjoni kkalkulati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     xi devjazzjonijiet minn dan il-metodu u r-raġunijiet ta' dawn;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-informazzjoni addizzjonali kollha, jew ir-rimarki, dwar l-interpretazzjoni tar-riżultati;
                  
               3.2   INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI (18)
         
         Ir-riżultati tat-test huma vvalutati fuq il-bażi ta':
         
                     a)
                  
                  
                     jekk it-taħlita tas-sustanza għat-test u ċ-ċelluloża jaqbdux b'mod spontanju; u
                  
               
                     b)
                  
                  
                     il-paragun fil-ħin medju meħtieġ sabiex il-pressjoni titla’ minn 690 kPa għal 2 070 kPa, mas-sustanza(i) ta' referenza.
                  
               Sustanza likwida għandha titqies ossidanti, meta:
         
                     a)
                  
                  
                     taħlita 1:1, fil-piż, tas-sustanza u ċ-ċelluloża taqbad b'mod spontanju; jew
                  
               
                     b)
                  
                  
                     taħlita 1:1, fil-piż, tas-sustanza u ċ-ċelluloża turi żieda fil-ħin tal-medja tal-pressjoni li tkun anqas minn jew ugwali għal, żieda fil-ħin għal taħlita 1:1 fil-piż, ta' 65 % (w/w) aċidu nitriku fl-ilma u ċelluloża.
                  
               Sabiex ikunu evitati riżultati pożittivi foloz, ir-riżultati mogħtija meta tiġi ttestjata s-sustanza għat-test ma' materjal inert, għandhom jitqiesu wkoll fl-interpretazzjoni tar-riżultati.
         4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. It-tielet edizjoni riveduta. Pubblikazzjoni tal-NU, Nru.: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, paġna 342. Test O.2: Test għall-likwidu ossidanti
                  
               Figura 1
         Reċipjent tal-Pressjoni
         Figura 2
         Stend għall-irfid
         Figura 3
         Sistema li tqabbad
         Nota: tista' tintuża kwalunkwe konfigurazzjoni minn dawn.
         
            (1)  Dipendenti fuq it-tip ta' strument u fuq il-grad ta' purità tas-sustanza
         
            (2)  Dipendenti fuq it-tip ta' strument u fuq il-grad ta' purità tas-sustanza.
         
            (3)  Dipendenti fuq it-tip ta' strument u fuq il-grad ta' purità tas-sustanza.
         
            (4)  Dipendenti fuq it-tip ta' strument u fuq il-grad ta' purità tas-sustanza.
         
            (5)  Din l-eżattezza hija valida biss għall-apparat sempliċi kif eż. mfisser f‘ ASTM D 1120-72; tista’ tkun imtejba b’ apparati ebulliometer aktar sofistikati.
         
            (6)  Validi biss għal sustanzi puri. L-użu f’ ċirkustanzi oħra għandu jkun ġustifikat.
         
            (7)  Dipendenti fuq il-grad tal-purità.
         
            (8)  Dawn il-metodi jistgħu jintużaw ukoll fil-firxa 1 sa 10 Pa kemm-il darba tittieħed l-attenzjoni.
         
            (9)  Kif, per eżempju, muri fil-kwadru tar-regolamenti ta' trasport tan-NU.
         
            (10)  L-aċidu għandu jiġi ttitrat qabel it-test sabiex tiġi kkonfermata l-konċentrazzjoni tiegħu.
         
            (11)  Eż.: 50 % (w/w) aċidu perkloriku u 40 % (w/w) klorat tas-sodju jintużaw f’referenza 1.
         
            (12)  eż. Trab taċ-Ċelluloża għal — Kolonni tal-Kromatografija Whatman CF11, nru tal-katalgu 4021050.
         
            (13)  Konfermat minn (eż.) titrazzjoni Karl-Fisher.
         
            (14)  Alternattivament, dan il-kontenut ta' ilma jista' jintlaħaq (eż.) b'tisħin f’105 oC taħt vakwu għal 24 h.
         
            (15)  Taħlitiet ta' ossidanti maċ-ċelluloża għandhom jitqiesu bħala potenzjalment esplożiv u għandhom jintużaw bil-galbu xieraq.
         
            (16)  Fil-prattika dan jista' jsir bil-preparament ta' taħlita ta' 1:1 ta' likwidu għat-test u ċelluloża f’ammont akbar milli meħtieġ għat-test u bit-trasferiment ta' 5 ±0,1 g fir-reċipjent tal-pressjoni. It-taħlita għandha tiġi ppreparata friska għal kull esperiment.
         
            (17)  B'mod partikolari, il-kuntatt bejn it-tidwiriet ta' ħdejn xulxin tal-bobina għandu jiġi evitat.
         
            (1)  ara r-referenza (1) għall-klassifika skond l-iskema tat-trasport tan-NU.
         
            (2)  Is-soluzzjonijiet saturati għandhom jitħejjew f’20 oC.
         
            (3)  Valur medju minn esperimenti komparattivi minn laboratorji differenti.
         
            (4)  Il-pressjoni massima ta' 2 070 kPA ma ntlaħqitx.
         
            (18)  Ara r-referenza 1 għall-interpretazzjoni tar-riżultati skond ir-regolamenti għat-trasport tan-NU bl-użu ta' bosta sustanzi ta' referenza.
      
      
         PARTI B: METODI GĦAD-DETERMINAZZJONI TAT-TOSSIĊITÀ U EFFETTI OĦRA TAS-SAĦĦA
         WERREJ
         DAĦLA ĠENERALI
                  143
               
                     B.1.bis.
                  
                  TOSSIĊITÀ ORALI AKUTA – PROĊEDURA GĦAL DOŻA FISSA
                  145
               
                     B.1.tris.
                  
                  TOSSIĊITÀ ORALI AKUTA – METODU TAL-KLASSIFIKA TOSSIKA AKUTA
                  158
               
                     B.2.
                  
                  TOSSIĊITÀ AKUTA (TEĦID MAN-NIFS)
                  174
               
                     B.3.
                  
                  TOSSIĊITÀ AKUTA (DERMALI)
                  178
               
                     B.4.
                  
                  TOSSIĊITÀ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRUŻJONI TAL-ĠILDA
                  182
               
                     B.5.
                  
                  TOSSIĊITÀ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRUŻJONI TA' L-GĦAJNEJN
                  191
               
                     B.6.
                  
                  SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA
                  202
               
                     B.7.
                  
                  DOŻA REPETUTA (28 jum) TOSSIĊITÀ (ORALI)
                  210
               
                     B.8.
                  
                  DOŻI REPETUTI (28 jum) TOSSIĊITÀ (TEĦID MAN-NIFS)
                  216
               
                     B.9.
                  
                  DOŻI REPETUTI (28 jum) TOSSIĊITÀ (DERMALI)
                  221
               
                     B.10.
                  
                  MUTAĠENIĊITÀ – TEST IN VITRO DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMI TAL-MAMMIFERI
                  225
               
                     B.11.
                  
                  MUTAĠENIĊITÀ – TEST IN VIVO DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMI TAL-MUDULLUN TAL-MAMMIFERI
                  233
               
                     B.12.
                  
                  MUTAĠENIĊITÀ – TEST MIKRONUKLEU IN VIVO GĦAL ERITROĊITE FIL-MAMMIFERI
                  240
               
                     B.13/14.
                  
                  MUTAĠENIĊITÀ – TEST TA' MUTAZZJONI RIVERSIVA TA' BATTERJI
                  248
               
                     B.15.
                  
                  IT-TIBDIL TAL-ĠENE – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
                  
                  256
               
                     B.16.
                  
                  IR-RIKOMBINAZZJONI MITOTISTA – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
                  
                  259
               
                     B.17.
                  
                  MUTAĠENEĊITÀ – TEST TAL-MUTAZZJONI TAL-ĠENE TAĊ-ĊELLULA TAL-MAMMIFERI IN VITRO
                  
                  262
               
                     B.18.
                  
                  DANNI U RIMEDJI TAD-DNA – SINTESI MHUX FL-ISKEDA TAD-DNA – ĊELLULI MAMMIFERI IN VITRO
                  
                  271
               
                     B.19.
                  
                  ANALIŻI IN VITRO TA’ L-ISKAMBJU TA’ KROMATID OĦT
                  275
               
                     B.20.
                  
                  TEST REESSIV LI JIKKAĠUNA L-MEWT U LI HUWA SKOND IS-SESS F’DROSOPHILA MELANOGASTER
                  
                  279
               
                     B.21.
                  
                  TEST TAT-TIBDIL TAL-ĠENI F’ĊELLULI MAMMIFERI IN VITRO
                  
                  282
               
                     B.22.
                  
                  TEST LETALI DOMINANTI TAL-MAMMALI ĠERRIERA
                  285
               
                     B.23.
                  
                  TEST DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMI SPERMATOGONI TAL-MAMMIFERI
                  288
               
                     B.24.
                  
                  TEST TAT-TIKEK FIL-PIL TAL-ĠRIEDEN
                  295
               
                     B.25.
                  
                  IT-TRASLOKAZZJONI TAL-ĠRIEDEN LI TITTIEĦED
                  298
               
                     B.26.
                  
                  EŻAMI TA’ TOSSIĊITA ORALI SUB-KRONIKU ESPERIMENT BIS-SOMMINISTRAZZJONI ORALI RIPETUTA TA’ DOŻA GĦAL 90 ĠURNATA BL-UŻU TA’ SPEĊJI TA’ ANNIMALI GERRIEMA
                  302
               
                     B.27.
                  
                  EŻAMI TA’ TOSSIĊITÀ ORALI SUB-KRONIKU ESPERIMENT BIS-SOMMINISTRAZZJONI ORALI RIPETUTA TA’ DOŻI GĦAL 90 ĠURNATA BL-UŻU TA’ SPEĊI TA’ ANNIMALI MHUX GERRIEMA
                  308
               
                     B.28.
                  
                  STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ DERMALI SUB-KRONIKA STUDJU DERMALI TAD- DOŻA RIPETUT GĦAL 90 ĠURNATA LI JUŻA SPEĊI TA’ MAMMALI GERRIEMA
                  314
               
                     B.29.
                  
                  STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ TA’ ĠBID GĦAL ĠOL-PULMUN SUB-KRONIKU STUDJU TAD-DOŻA TA’ ĠBID GĦAL ĠOL-PULMUN RIPETUT GĦAL 90 ĠURNATA LI JUŻA SPEĊI TA’ MAMMALI GERRIEMA
                  318
               
                     B.30.
                  
                  STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ KRONIKA
                  323
               
                     B.31.
                  
                  STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ FL-IŻVILUPP PRENATALI
                  329
               
                     B.32.
                  
                  TEST TAL-KARĊINOĠENIĊITÀ
                  338
               
                     B.33.
                  
                  TEST MAGĦQUD TA’ TOSSIĊITÀ KRONIKA/KARĊINOĠENITÁ
                  344
               
                     B.34.
                  
                  TEST TA’ TOSSIĊITÀ FUQ IR-RIPRODUZZJONI FUQ ĠENERAZZJONI WAĦDA
                  351
               
                     B.35.
                  
                  STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ REPRODUTTIVA FUQ ŻEWĠ ĠENERAZZJONIJIET
                  355
               
                     B.36.
                  
                  TOSSIKOKINETISTA’
                  365
               
                     B.37.
                  
                  ID-DEWMIEN FIN-NEWROTOSSIĊITÀ TAS-SUSTANZI ORGANOPHOSPHORUS WARA L-ESPOŻIZZJONI AKUTA
                  369
               
                     B.38.
                  
                  ID-DEWMIEN FIN-NEWROTOSSIĊITÀ TAS-SUSTANZI ORGANOPHOSPHORUS STUDJU TA' DOŻA RIPETUTTA GĦAL 28 ĠURNATA
                  374
               
                     B.39.
                  
                  TEST IN VIVO TA' SINTESI MHUX PROGRAMMATA TA' DNA (UDS) FUQ ĊELLULI TAL-FWIED TAL-MAMMIFERI
                  378
               
                     B.40.
                  
                  IL-KORROŻJONI TAL-ĠILDA IN VITRO: IT-TEST TAR-REŻISTENZA ELETTRIKA TRANSKUTANJA (TER – TRANSCUTANEAL ELECTRICAL RESISTANCE)
                  384
               
                     B.40.BIS.
                  
                  IL-KORROŻJONI TAL-ĠILDA IN VITRO: IT-TEST TAL-MUDELL TAL-ĠILDA UMANA
                  394
               
                     B.41.
                  
                  IT-TEST TAL-FOTOTOSSIĊITÀ IN VITRO 3T3 NRU
                  400
               
                     B.42.
                  
                  SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA: ASSAĠĠ LOKALI TAN-NODULA TAL-LIMFA
                  414
               
                     B.43.
                  
                  STUDJU DWAR IN-NEWROTOSSIĊITÁ FL-ANNIMALI GERRIEMA
                  420
               
                     B.44.
                  
                  L-ASSORBIMENT TAL-ĠILDA: IL-METODU IN VIVO
                  
                  432
               
                     B.45.
                  
                  L-ASSORBIMENT TAL-ĠILDA: IL-METODU IN VITRO
                  
                  438
               DAĦLA ĠENERALI
         A.   KARATTERIZZAZZJONI TAS-SUSTANZA GĦAT-TEST
         Il-kompożizzjoni tas-sustanza għat-test, inklużi l-impuritajiet l-iktar importanti, u l-proprjetajiet fiżiko-kimiċi relevanti tagħha inkluża l-istabilità, għandha tkun magħrufa qabel il-bidu ta’ kwalunkwe studju għat-tossiċità.
         Il-proprjetajiet fiżiko-kimiċi tas-sustanza għat-test jagħtu informazzjoni importanti fl-għażla election of the route of administration, the design of each particular study and the handling and storage of the test substance.
         L-iżvilupp ta’ metodu analitiku għad-determinazzjoni tas-sustanza għat-test (inklużi l-impuritajiet prinċipali meta hu possibbli) fil-midjum tad-dożaġġ u l-materjal bijoloġiku għandu jiġi qabel il-bidu ta’ l-istudju.
         L-informazzjoni kollha li għandha x’taqsam ma’ l-identifikazzjoni, il-proprjetajiet fiżiko-kimiċi, il-purità, u l-imġiba tas-sustanza għat-test għandhom jiġu inklużi fir-rapport tat-test.
         B.   KURA TA’ L-ANNIMALI
         Il-kontroll strett tal-kundizzjonijiet ambjentali u l-kura b’sengħa ta’ l-annimali huma essenzjali fl-ittestjar tat-tossiċità
         (i)   Il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpoġġew l-annimali
         Il-kundizzjonijiet ambjentali fil-kmamar sperimentali jew l-ispazji magħluqa ta’ l-annimali għandhom ikunu xierqa għall-ispeċi li se jiġu ttestjati. Għall-firien, ġrieden u fniek ta’ l-indi, il-kundizzjonijiet xierqa huma temperatura tal-kamra ta’ 22 oC ± 3 oC b’umdità relattiva minn 30 sa 70 %; għall-fniek it-temperatura għandha tkun ta’ 20 oC ± 3 oC b’umdità relattiva minn 30 sa 70 %.
         Ċerti tekniki sperimentali huma partikularment sensittivi għall-effetti tat-temperatura u, f’dawn il-każijiet, id-dettalji tal-kundizzjonijiet xierqa huma inklużi fid-deskrizzjoni tal-metodu tat-test. Fl-investigazzjonijiet kollha ta’ l-effetti tossiċi, it-temperatura u l-umdità għandhom jiġu mmoniterjati, irrekordjati, u inklużi fir-raport finali ta’ l-istudju.
         Id-dwal għandhom ikunu artifiċjali, is-sekwenza għandha tkun ta’ 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Id-dettalji tas-sekwenza tad-dwal għandhom jiġu rrekordjati u inklużi fir-rapport finali ta’ l-istudju.
         Sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor fil-metodu, l-annimali jistgħu jitpoġġew individwalment, jew jinqaflu fi gruppi żgħar ta’ l-istess sess; biex jinqaflu fi grupp, m’għandux ikun hemm iktar minn ħames annimali f’kull gaġġa.
         Fir-rapporti ta’ l-esperimenti fuq l-annimali, huwa importanti li jidher ċar kif qed jiġu maqfula l-annimali u n-numru ta’ annimali mpoġġija f’kull gaġġa kemm waqt l-espożizzjoni għall-kimika u kemm waqt kwalunkwe perjodu ta' osservazzjoni li jiġi wara.
         (ii)   Kundizzjonijiet ta’ l-għalf
         Id-dieti għandhom jissodisfaw il-ħtiġiet nutrizzjonali kollha ta’ l-ispeċi li qed jiġu ttestjati. Fejn jiġu amministrati s-sustanzi għat-test fid-dieta ta' l-annimali il-valur nutrizzjonali jista’ jonqos permezz ta' l-effett li s-sustanza u l-kostitwent tad-dieta jagħmlu fuq xulxin. Il-possibbiltà ta’ reazzjoni bħal din għandha tiġi meqjusa meta jiġu interpretati ir-riżultati tat-testijiet. Id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu jintużaw b'forniment illimitat ta' ilma għax-xorb. L-għażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata mil-ħtieġa li tiġi żgurata taħlita xierqa tas-sustanza għat-test meta tiġi somministrata b'dan il-metodu.
         Il-kontaminanti tad-dieta li jinfluwenzaw it-tossiċità m’għandhomx ikunu preżenti f’konċentrazzjonijiet li jinterferixxu.
         C.   ITTESTJAR ALTERNATTIV
         L-Unjoni Ewropea għandha l-impenn li tippromwovi l-iżvilupp u l-validazzjoni ta’ tekniki alternattivi li jistgħu jipprovdu l-istess livell ta’ informazzjoni bħala testijiet kurrenti għall-annimali, iżda li jużaw inqas annimali, jikkawżaw inqas tbatija jew jevitaw kompletament l-użu ta' annimali.
         Metodi bħal dawn, meta jsiru disponibbli, għandhom jiġu kkunsidrati fejn hu possibbli għall-karatterizzazzjoni tal-periklu u l-klassifikazzjoni u l-ittikettjar konsegwenti għall-perikli intrinsiċi u l-valutazzjoni għas-sigurtà tal-kimika.
         D.   EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI
         Meta t-testijiet jiġu evalwati u interpretati, il-limitazzjonijiet safejn ir-riżultati ta' l-istudji ta' l-annimali u ta' l-in vitro jistgħu jkunu estrapolati direttament lill-bniedem iridu jiġu kkunsidrati u għalhekk, l-evidenza ta’ effetti avversi fil-bnedmin, fejn huma disponibbli, jistgħu jintużaw għall-konfermazzjoni tar-riżultati ta’ l-ittestjar.
         E.   REFERENZI TA’ LETTERATURA
         Bosta minn dawn il-metodi huma żviluppati fi ħdan l-istruttura tal-programm OECD Testing Guidelines, u għandhom isiru skond il-prinċipji tal-Good Laboratory Practice, sabiex jiżguraw ‘l-aċċettazzjoni reċiproka tad-data’ kemm jista’ jkun.
         Informazzjoni addizzjonali tinsab fir-referenzi msemmija fil-linji gwida ta' l-OECD u l-etteratura relevanti ppubblikata x’imkien ieħor.
         B.1 BIS.   TOSSIĊITÀ ORALI AKUTA – PROĊEDURA GĦAL DOŻA FISSA
         1.   METODU
         Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalenti għal OECD TG 420 (2001)
         1.1.   DAĦLA
         Il-metodi tradizzjonali għall-istudju tat-tossiċità akuta bl-użu tal-mewt ta' l-annimali bħala l-għan ewlieni. Fil-1984, resqien ġdid dwar it-testijiet tat-tossiċità akuta kien ġie suġġerit mill-British Toxocology Society li huwa ibbażat fuq l-amministrazzjoni f'serje ta' livelli ta' dożi fissi (1). Ir-resqien evita l-użu tal-mewt ta' l-annimali bħala l-għan ewlieni, u minflok straħ fuq l-osservazzjonijiet ta' sinjali ċari tat-tossiċità f'wieħed mis-serje ta' livelli ta' dożi fissi. Bsegwiment ta' studji in vivo tal-validazzjoni fil-UK (2) u f'medda internazzjonali (3), il-proċedura kienet adottata bħala metodu tat-test fil-1992. Sussegwentament, il-propjetajiet statistiċi tal-Proċedura ta' Doża Fissa kienu ġew evalwati bl-użu ta' mudelli matematiċi f'serje ta' studji (4) (5) (6). Flimkien, l-istudji in vivo u l-mudellar kienu were li l-proċedura hija riproduċibbli, bl-użu anqas ta' annimali u tikkawża anqas tbagħtija mill-metodi tradizzjonali u hija kapaċi li tiggrada s-sustanzi f'manjera simili mal-metodi l-oħrajn tat-testijiet tat-tossiċità akuta.
         Gwida dwar l-għażla tal-metodu tat-test l-aktar xieraq għal skop partikolari tista’ tinstab fid-Dokument ta' Gwida dwar it-Testijiet tat-Tossiċità Akuta Orali (7). Dan id-Dokument ta' Gwida fih ukoll informazzjoni addizzjonali dwar it-twettieq u l-interpretazzjoni tal-Metodu tat-test B.1 bis.
         Huwa prinċipju tal-metodu li fl-istudju ewlieni dożi tossiċi moderati biss ikunu użati, u li l-amministrazzjoni tad-dożi li jkunu mistenna bħala letali għandhom ikunu evitati. Ukoll, id-dożi li huma magħrufa bħala li jikkawżaw uġiegħ u tqallib żejjed, minħabba l-azzjonijiet korrossivi jew ta' irritazzjoni qawwija, ma jkunx hemm ħtieġa li jkunu amministrati. Annimali moridondi, jew annimali li ovvjament ikunu bl-uġiegħ jew li juru sinjali ta' tqallib sever u dewwiemi għandhom ikunu maqtula b'mod uman, u huma meqjusa fl-interpretazzjoni tar-riżultati tat-test bl-istess mezz bħal dawk l-annimali li jkunu mietu waqt it-test. Il-kriterja ta' kif tittieħed id-deċiżjoni sabiex ikunu maqtula l-annimali moribondi jew dawk li jkunu fi tbagħtija kbira, u l-gwida għar-rikonoxximent ta' mewt prevista jew mistennija, huma s-suġġett ta' Dokument ta' Gwida separat (8).
         Il-metodu jipprovdi informazzjoni dwar il-propjetajiet perikolużi u jippermetti li s-sustanza tkun iggradata u ikklassifikata skond il-Globally Harmonised System (GHS) (Sistema Armonizzata Globali) għall-klassifika ta' kimika li toħloq tossiċità akuta (9).
         Il-laboratorju tat-test għandu jikkonsidra l-informazzjoni disponibbli kollha dwar is-sustanza tat-test qabel ma jwettaq l-istudju. Tali informazzjoni għandha tinkludi l-identifikaazzjoni u l-istruttura kimika tas-sustanza; il-propjetajiet fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultati ta' xi testijiet oħrajn In vitro jew in vivo dwar is-sustanza' id-dettalji tossikoloġiċi dwar sustanzi struttalment relatati; u l-użu(i) antiċipati tas-sustanza. Din l-informazzjoni hija meħtieġa sabiex tissodisfa lil dawk kollha ikkonċernati li t-test huwa relevanti għall-protezzjoni tas-saħħa umana, u li jkun jgħin fil-għażla ta' doża xierqa għal-bidu.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Tossiċita akuta orali: Tirreferi għall-effetti ħżiena li jseħħu wara l-amministrazzjoni orali ta' doża waħda ta' sustanza jew dożi multipli, matul 24 siegħa.
         
            Mewt imdewma: Tfisser li l-annimal ma jkunx u ma jidhirx moribond fi żmien 48 siegħa, imma li jmut aktar tard matul il-perjodu ta' osservazzjoni ta' 14-il jum.
         
            Doża: Hija l-ammont tas-sustanza tat-test li tkun somministrata. Id-doża hija espressa bħala l-piż tas-susatanza tat-test għal kull unità tal-piż ta' l-annimal tat-test (eż. mg/kg).
         
            Tossiċità evidenti: Hija terminoloġija ġenerali li tiddeskrivi sinjali ċari tat-tossiċita bħala segwiment ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test (ara (3) għall-eżempji) bħal ma hija d-doża fissa segwenti aktar għolja li toħloq uġiegħ waqqi jew sinjali dewwiema ta' tbagħtija qawwija, l-istatus ta' moribond (il-kriterja hija ippreżentatha fil-Humane Endpoints Guidance Document (8) (Dokument ta' Gwida dwar l-Għanijiet Umani)), jew li l-probabbiltà ta' mortalità f'bosta annimali tista’ tkun mistennija.
         
            GHS:
            Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures. (Sistema tal-Klassifikazzjoni Armonizzata Globali dwar Sustanzi u Taħlitiet Kimiċi.) Attività konġunta tal-OECD (is-saħħa umana u l-ambjent), il-Kumitat tan-NU ta' l-Esperti dwar it-Trasport ta' Oġġetti Perikolużi (il-propjetajiet fiżiċi/kimiċi) u l-ILO (kommunikazzjoni ta' periklu) u kordinata mill-Programm Interorganizzazzjonali għal Amministrazzjoni Soda tal-Kimika (IOMC).
         
            Mewt iminenti: Meta l-istat ta' moribond jew mewt ikun mistenni qabel il-ħin ta' l-osservazzjoni segwenti ippjanata. Sinjali indikattivi ta' dan l-istat f'annimali gerriema jistgħu jinkludu konvulżjonijiet, posizzjoni laterali, mimduda, u roda. (Ara d-Dokument ta' Gwida dwar l-Umanita Immirata (8) għal aktar dettalji).
         
            LD50 (doża letali medja): Hija akkwistata b'mod statistiku minn doża waħda ta' sustanza li tista’ tkun mistennija li tikkaġuna mewt f'50 fil-mija ta' l-annimali meta amministrati permezz tar-rotta orali. Il-valur LD50 huwa espress f'termini ta' piż tas-sustanza tat-test għal kull unità tal-piż ta' l-annimal tat-test (mg/kg).
         
            Limitu tad-doża: Tirreferi għal doża fil-litu l-aktar għoli tagħha waqt it-testijiet (2 000 jew 5 000 mg/kg).
         
            L-istat moribondi: Huwa l-istat ta' qabel il-mewt jew ta' l-inabbiltà tas-sopravivenza, anki jekk ikun hemm trattament. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (8) dwar aktar dettalji).
         
            Mewt mistennija: Il-preżenza ta' sinjali kliniċi indikattivi tal-mewt fi żmien mistenni jew inkella fil-ġejjieni imma qabel it-tmiem ippjanat ta' l-esperiment, per eżempju: l-inabbiltà li jersaq lejn l-ilma u lejn l-ikel. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (8) dwar aktar dettalji).
         1.3.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Gruppi ta' annimali ta' sess wieħed huma mogħtija doża fi proċedura mtarrġa bl-użu ta' dożi fissi ta' 5, 50, 300 u 2 000 mg/kg (eċċezzjonalment għal doża fissa addizzjonali ta' 5 000 mg/kg li tista’ tkun ikkonsidrata, ara s-sezzjoni 1.6.2.). Il-livell inizjali tad-doża huwa magħżul fuq il-bażi ta' l-istudju tas-sejbien bħala d-doża mistennija li tipproduċi xi sinjali ta' tassiċità mingħajr ma toħloq l-effetti ta' tossiċità severa jew tal-mortalità. Is-sinjali kliniċi u l- kundizzjonijiet assoċjati ma l-uġiegħ, sofferenza, u mewt iminenti, huma deskritti fid-dettall fi Gwida OECD separata, id-Dokument (8). L-annimali jistgħu jingħataw doża aktar għolja jew aktar baxxa, jiddependi mill-preżenza jew in-nuqqas ta' sinjali ta' tossiċità jew mortalità. Din il-proċedura tinżamm sakemm id-doża li toħloq tossiċità evidenti jew ta' mewt waħda jew aktar, ikunu identifikati, jew meta l-ebda effetti ma jkunu jidhru fid-doża l-aktar għolja jew meta l-imwiet iseħħu fid-doża l-aktar baxxa.
         1.4.   ID–DESKRIZZJONI TAL–METODU TAT–TEST
         1.4.1.   L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali
         L-ispeċi preferuta ta' l-annimali gerriema huwa l-far, għalkemm speċi oħrajn ta' annimali gerriema tista’ tkun użata. Normalment ikunu wżata il-femminili (7). Dan huwa minħabba li listħarriġ letterarju tat-testijiet konvenzjonali LD50 juru li normalment ikun hemm ftit differenza fis-sensittività bejn is-sessi, imma li f'dawk il-każi meta d-differenzi jkunu osservati, in-nisa ikunu ġeneralment kemm xejn aktar sensittivi (10). B'dana kollu, jekk tagħrif dwar il-propjetajiet tossikoloġiċi jew tossikinetiċi ta' kimiċi strutturament relatati jindika li l-irġiel aktarx li jkunu aktar sensittivi, allura dak is-sess għandu jkun użat. Meta t-test ikun imwettaq fuq maskili, ġustifikazzjoni adekwata għandha tkun ipprovduta.
         Annimali żgħażagħ adulti u b'saħħithom tas-siltiet normalment użati fil-laboratorju għandhom ikunu utilizzati. Il-femminili għandhom ikunu tali li qatt ma jkunu weldu u ma jkunux tqal. Kull annimal, fil-bidu ta' meta jkun sejjer jingħata doża, għandu jkun f'età ta' bejn 8 u 12 il-ġimgħa u l-piż tiegħu għandu jkun fil-medda ta' ± 20 % tal-piż medju ta' dawk l-annimali li preċedentament ikun u ntużaw għad-dożi.
         1.4.2.   Il-kundizzjonijiet tal-gaġeġ u ta' l-għalf
         It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 22 oC (± 3 oC). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu użati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L-annimali jistgħu ikunu miġbura flimkien bħala grupp skond id-doża, imma n-numru ta' l-annimali f'kull gaġġa m'għandux ifixkel l-osservazzjonijiet ċari ta' kull annimal.
         1.4.3.   Preparazzjoni ta' l-annimali
         L-animmali għandhom ikunu magħżula kif jinzerta, immarkati sabiex jippermettu identifikazzjoni individwali, u miżmuma fil-gaġġeġ tagħhom għal mill-anqas 5 tijiem qabel il-bidu tad-dożi sabiex jippermettu li jkunu akklamattiżati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju.
         1.4.4.   Preparazzjoni tad-dożi
         Ġeneralment, is-sustanzi tat-test għandhom ikunu amministrati f'volum kostanti matul medda ta' dożi tat-testijiet bil-varjazzjoni tal-konċentrazzjoni fil-preparazzjoni tad-dożi. Meta, b'dana kollu, likwidu jew taħlita ikunu l-prodott finali, l-użu ta' sustanza tat-test mingħajr trattib, i.e. konċentrazzjoni kostanti, tista’ tkun aktar relevanti għall-istudju sussegwenti tar-riskju ta' dik is-sustanza, u hija ħtieġa għal uħud mill-awtoritajiet regolatorji. Fi kwalunkwe każ, il-volum massimu tad-doża għall-amminsitrazzjoni m'għandux ikunu misbuq. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jkun amministrat f'waqt wieħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Fl-annimali gerriema, il-volum m'għandux normalment jeċċedi 1ml/100g tal-piż tal-ġisem: b'dana kollu fil-każ ta' taħlitiet akweji, 2 ml/100g tal-piż tal-ġisem jista’ jkun ikkonsidrat. Fir- rigward tal-formulazzjoni tal-preparazzjoni tad-doża, l-użu ta' taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni akweja hija rakkommandata kull meta possibbli, segwita f'ordni ta' preferenza bit-taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħ-ir- rum) u mbagħad il-possibbiltà ta' likwidi oħrajn. Għal likwidi oħrajn apparti milli l-ilma, il- karatteristiċi tossikoloġiċi tal-likwidu għandhom ikunu magħrufa. Id-dożi għandhom ikunu ippreparati ftit qabel l-amministrazzjoni, sakemm l-istabbilità tal-preparazzjoni matul il- perjodu ta' l-użu tkun magħruha u turi li tkun aċċettabbli.
         1.5.   PROĊEDURA
         1.5.1.   Amministrazzjoni tad-dożi
         Is-sustanza tat-tes hija somministrata f'doża waħda b'mod sfurzat bl-użu ta' tubu sa l-istonku jew b'xi intubazzjoni canula xierqa. F'ċirkostanzi mhux tas-soltu li fihom doża waħda ma tkunx possibbli, id-doża tista’ tingħata fi frazzjonijiet iżgħar matul perjodu li ma jeċċedix l-24 siegħa.
         L-annimali għandhom ikunu msajma qabel ma jingħataw id-doża (eż. għall-firien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul il-lejl sal-ħin ta' l-esperiment; fil-każ ta' ġurdien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul 3-4 siegħat). Wara l-perjodu tas-sawma, l-annimali għandhom ikunu miżuna u s-sustanza tat-test tkun somministrata. Wara li s-sustanza tat-test tkun somministrata, l-ikel jista’ jkun imċaħħad għal 3-4 siegħat oħra fil-każ tal-firien jew 1-2 siegħat fil-każ tal-ġrieden. Meta d-doża tkun somministrata fi frazzjonijiet matul perjodu ta' żmien, jista’ jkun meħtieġ li l-annimali jkunu ipprovduti b'ikel u ilma, jiddependi mit-tul tal-perjodu.
         1.5.2.   Studju ta' l-osservazzjoni
         L-iskop ta' l-istudju ta' l-osservazzjoni huwa li jippermetti l-għażla xierqa tad-doża tal-bidu li tintuża fl-istudju ewlieni. Is-sustanza tat-test hija somministrata lill-annimali singoli b'manjera sekwenzali skond il-karti tan-nixxija fl-Anness 1. L-istudju ta' l-osservazzjoni ikunu komplut meta d-deċiżjoni dwar il-bidu tad-doża għall-istudju ewlieni tkun tista’ tittieħed (jew jekk il-mewt tkun apparenti fid-doża l-baxxa kif stabbilita).
         Id-doża tal-bidu għall-istudju ta' l-oisservazzjoni hija magħżulha minn livelli fissi ta' dożi ta' 5, 50, 300 u 2 000 mg/kg bħala doża mistennija li tipproduċi tossiċità evidenti ibbażata, meta possibbli, fuq evidenza mid-dettalji In vivo u In vitro mill-istess kimika jew il-kimiċi ta' struttura relatata. Fin-nuqqas ta' tali informazzjoni, id-doża tal-bidu għandha tkun 3000 mg/kg.
         Perijodu ta' mill-anqas 24 siegħa għandu jkun imħolli bejn l-għoti tad-doża lil kull annimal. L-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal mil anqas 14-il jum.
         B'mod eċċezzjonali, u biss meta iġġustifikat bi ħtiġiet regolatorji speċifiċi, l-użu ta' doża addizzjonali iffissata fil-livel għoli ta' 5 000 mg/kg tista’ tkun ikkonsidrata (ara l-Anness 3). Għal raġunijiet li jikkonċernaw il-ġid ta' l-annimali, it-testijiet ta' l-annimali skond GHS, il-Kategorija 5, il-meded (2 000-5 000 mg/kg huma ferm skorraġiti u għandhom biss ikunu ikkonsidrati meta jkun hemm possibbiltà qawwija li r-riżultati minn tali test ikollu relevanza diretta għall-rotezzjoni umana jew tas-saħħa ta' l-annimali jew dik ambjentali.
         Fil-każi meta annimal ikun ittestjat fil-livell l-aktar baxx ta' doża fissa (5 mg/kg) fl-istudju ta' l-osservazzjoni imut, il-proċeduira normali hija li jkun terminat l-istudju u li s-sustanza tkun assanjata għal-GHS, Kategorija 1 (kif muri fl-Anness 1). B'dana kollu, jekk aktar konferma tal-klassifika tkun meħtieġa, proċedura supplementari voluntarja tista’ tkun imwettqa, kif ġej: It-tieni annimal ikunu mogħti d-doża f’5 mg/kg. Jekk dan it-tieni annimal imut, allura il-Kategorija 1 GHS tkun ikkonfermata u l-istudju jkun terminat immedjetament. Jekk it-tieni annimali jibqa ħaj, allura massimu ta' tlett annimali addizjnonali ikunu mogtoja d-doża ta' 5 mg/kg. Minħabba li jkun hemm riskju kbir ta' mortalità, dawn l-annimali għandhom ikunu mogjħtija d-doża b'mod sekwenzali sabiex ikun imħares il-ġid ta' l-annimali. Fl-intervall ta' ħin bejn kull doża għal kull annimal għandu jkun suffiċjenti sabiex ikun stabbilit jekk l-annimal preċedenti jkunx sejjer jibqa ħaj. Jekk isseħħ it-tieni mewt, is-sekwenza tad-doża għandha tkun terminata immedjetament u l-ebda annimali oħrajn ma jingħataw id-doża. Minħabba l-okkorrenza tat-tieni mewt (irrispettivemanet min-numru ta' l-annimali ittestjati fil-waqt tat-terminazzjoni) tidħol fl-eżitu A (2 jew aktar imwiet), ir-regola tal-klassifika ta' l-Anness 2 fi 5 mg/kg doża fissa tkun segwita (il-Kategorija 1 jew ikun hemm 2 jew aktar imwiet, jew il-Kategorija 2 jekk ikun hemm mhux aktar minn mewt waħda). B'żieda, l-Anness 4 jagħti gwida dwar il-klassifika fis-sistema UE sakemm GHS ġdida tkun implementata.
         1.5.3.   Studju ewlieni
         1.5.3.1.   Numru ta' l-annimali u l-livelli tad-dożi
         L-azzjoni li għandha tittieħed b'segwiment tat-testijiet fid-doża tal-livell tal-bidu hija indikata fil-karti nixxija fl-Anness 2. Waħda mit-tlett azzjonijiet tkun meħtieġa; jew li jieqfu t-testijiet u li tkun assenjata l-klassifikazzjoni tal-klassi tal-periklu xierqa, it-test f'doża ta' livell għola jew test f'doża f'livell aktar baxx. B'dana kollu, għall-protezzjoni ta' l-annimali, livell ta' doża li jikkaġuna l-mewt fl-istudju ta' l-osservazzjoni m'għandhiex tkun użata mill-ġdid fl-istudju ewlieni (ara l-Anness 2). L-esperjenza wriet li r-riżultat probabbli fil-livell tad-doża tal-bidu ikun dak li s-sustanza tista’ tkun klassifikata u li l-ebda aktar testijiet ma jkunu meħtieġa.
         Total ta' ħames annimali ta' sess wieħes ikun normalment użat għal kull livell ta' doża investigata. Il-ħames annimali għandhom ikunu magħmula minn annimal wieħed mill-istudju ta' l-osservazzjoni li jkun ħa doża fil-livell magħżul flimkien ma erba annimali addizzjonali oħrajn (apparti, ħaġa mhux tas-soltu, jekk il-livell tad-doża użat ma kienx inkluż fl-istudju ta' l-osservazzjoni).
         L-intervall tal-ħin bejn id-dożi f'kull wieħed mill-livelli huwa determinat bl-iskoppjar, it-tul, u s-severità, tas-sinjali tossiċi. It-trattament ta' l-annimali fid-doża segwenti għandu jkun imdewwem sakemm wieħed ikun żgur bis-sopravivenza ta' l-annimali li jkunu ireċevew id-doża preċedentament. Perijodu ta' minn 3 sa 4 ijiem bejn id-dożi f'kull livell huma rakkommandabbli, jekk maħtieġ, sabiex jippermetti għall-osservazzjoni tat-tossiċità mdewma. L-intervall tal-ħin jista’ jkun aġġustat kif xieraq, eż. fil-każ ta' reazzjoni mhux konklussiva.
         Meta l-użu tad-doża l-aktar għolja ta' 5 000 mg/kg ikun ikkonsidrat, il-proċedura kif elenkata fl-Appendiċi 3 għandha tkun segwita (ara wkoll is-sezzjoni 1.6.2.).
         1.5.3.2.   Test tal-limitu
         It-test tal-limitu huwa primarjament użat f'sitwazzjonijiet meta dak li jwettaq l-esperiment ikollu informazzjoni li tindika li l-materjal tat-test ma jkunx tossiku, i.e. li jkollu tossiċita biss aktar mil-limitu regolatorju tad-dożi. L-informazzjoni dwar it-tossiċità tal-materjal tat-test tista’ tkun akkwistat mit-tagħrif dwar komposti simili li kienu ġew ittestjati jew minn taħlitiet jew prodotti simili li kienu ġew ittestjati, billi tkun meqjusa l-identità u l-persentaġġ tal-komponenti magħrufa li huma ta' sinifikanza tossikoloġika. F'dawk is-sitwazzjonijiet meta ftit jew l-ebda informazzjoni ma tkun disponibbli dwar it-tossiċità tagħha, jew meta l-materjal tat-test ikun mistenni li huwa tossiku, it-test ewlieni għandu jkun imwettaq.
         Bl-użu tal-proċedura normali, studju ta' l-osservazzjoni li jibda b'doża ta' 2 000 mg/kg (jew b'mod eċċezzjonali 5 000 mg/kg) segwit b'doża fuq erba’ annimali oħrajn f'dan il-livell iservi bħala test tal-limitu għal din il-linja ta' gwida.
         1.6.   OSSERVAZZJONIJIET
         L-annimali osservati individwalment wara l-ewwel doża mill-anqas darba matul l-ewwel 30 minuta, perdodikament matul l-ewwel 24 siegħa, b'attenzjoni speċjali mogħtija matul l-ewwel 4 siegħat, u ta' kull minn hemm il-quddiem, għal total ta' 14-il jum, apparti minn meta jkun meħtieġ li dawn jitneħħew mill-istudju u li jkunu maqtula b'mod umanesk għal raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali jew inkella li jinsabu mejta. B'dana kollu, it-tul ta' l-osservazzjoni m'għandhux ikun iffissat b'mod rigoruż. Għandu jkun determinat bir-reazzjoni tossika, il-ħin ta' l-iskoppjar u t-tul tal-perjodu ta' l-irkupru, u jista’ b'hekk ikun estiż meta ikkonsidrat bħala meħtieġ. Il-ħinijiet ta' meta jidhru jew jisparixxu s-sinjali tat-tossiċità huma importanti, speċjalment jekk ikun hemm tendenza li s-sinjali tossiċi jkunu mdewwma (11). L-osservazzjonijiet kollha huma sistematista’ment irreġistrati, b'dettalji individwali jkunu jinżammu għal kull annimal.
         Osservazzjonijiet addizzjonali jkunu meħtieġa jekk l-annimali jkomplu juru sinjali ta' tossiċità. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu xi tibdil fil-ġilda u s-suf, l-għajnejn, fil-membrani mukaneji, u wkoll fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tan-nervituri ċentrali, u l-attività somatomuturali u t-tip ta' l-imġieba. Attenzjoni għandha tkun diretta għall-osservazzjonijiet ta' roda, konvulżjonijiet, rieq, dijarrea, letarġija, irqad u koma. Il-prinċipji u l-kriterja kif aggruppati fid-Dokument ta' Gwida dwar il-Miri Umanitarji għandhom ikunu ikkonsidrati (8). L-annimali misjuba f'kundizzjoni moribonda u l-annimali li juru sinjali ta' uġieħ qawwi jew li jgħaddu minn sinjali ta' tbgħatija, għandhom ikunu maqtula b'mod umanitarju. Meta l-annimali jkunu maqtula għal raġunijiet umanitarji jew jekk jinstabu mejta, il-ħin tal-mewt għandu jkun reġistrat bi preċiżjoni kemm jista’ jkun possibbli.
         1.6.1.   Piż tal-Ġisem
         Il-piżijiet ta' l-annimali individwali għandhom ikunu determinati kemxejn qabel ma s-sustanza tat-test tkun somministrata u mill-anqas darba fil-ġimgħa wara dan. Tibdiliet fil-piż għandhom ikunu ikkalkolati u rreġistrati. Fit-tmiem tat-test, l-annimali li jibqgħu ħajjin għandhom ikunu miżuna w imbagħas maqtula b'mod umanitarju.
         1.6.2.   Patoloġija
         L-annimali kolha tat-test (inklużi dawk li jmutu matul it-test jew li jkunu mneħħija mill-istudju minħabba raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali) għandhom ikunu suġġetti għal nekropsija ġenerali. It-tibdiliet patoloġiċi ġenerali għandhom ikunu irreġistrati għal kull annimal. Eżaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi li juri evidenza patoloġika ġenerali fl- annimali li jibqgħu ħajjin għa 24 siegħa jew aktar wara li jkunu rċevew id-doża inizjali għandha wkoll tkun ikkunsidrata minħabba li din tista’ tforni informazzjoni utili.
         2.   DATA
         Data ta' l-annimal individwali għandha tkun ipprovduta. B'żieda ma dan, id-dettalji kollha għandhom ikunu miġbura f'sommarju, li juru għal kull grupp tat-test, in-numru ta' l-annimali użati, in-numru ta' annimali ji jkollhom sinjali ta' tossiċità, in-numru ta' annimali li jinstabu mejta matul it-test jew li jkunu maqtula għal raġunijiet umanitarji, il-ħin tal-mewt ta' l-annimali individwali, deskrizzjoni u l-korsa tal-ħin ta' l-effetti tossiċi, u r-riversabbiltà ta' dawn, u s-sejbiet tan-nekropsija.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, skond kif xieraq:
         
                      
                  
                  
                     Is-sustanza tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 in-natura fiżika, il-purità, u meta relevanti, il-propjetajiet fiżiko-kimiċi (inkluża l- iżomerizzazzjoni);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-identifikazzjoni, inkluż in-numru CAS.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Mezz (jekk applikabbli):
                     
                                 —
                              
                              
                                 ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz, jekk mhux sempliċement ilma.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Annimali tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 speċi/tipi użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-istatus mikrobioloġiku ta' l-annimali, meta magħruf;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali (inklużi, meta xieraq, raġornament dwar l-użu ta' maskili minflok femminili);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kondizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi dettalji dwar l-għamla fiżika tal-materjal amministrat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar l-amminstrazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi l-volumi tad-dożi u l-ħin ta' meta tkun ingħata id-doża;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u ta' l-ilma (inklużi t-tip/sorsi tad-dieta, is-sorsi ta' l-ilma);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ir-raġjonar għall-għażla tad-doża tal-bidu.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 tabulazzjoni tad-dettalji tar-reazzjoni u tal-livell tad-doża għal kull animal (i.e. l-annimali li juru sinjali ta' tossiċità, inklużi l-effetti tal-mortalità, in-natura, is-severanza u t-tul ta' l-effetti);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tabulazzjoni tal-piż tal-ġisem u tat-tibdiliet fil-piż tal-ġisem;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piżijiet ta' l-annimali individwali fil-jum ma meta jirċievi d-doża, u wara dan matul intervalli ta' darba fil-ġimgħa, u il-ħin tal-mewt jew ta' meta jkunu maqtula;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-data u l-ħin tal-mewt jekk qabel il-qtil previst;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-korsa tal-ħin ta' kif jiskoppjaw is-sinjali tat-tossiċità u jekk dawn kienux riversibbli għal kull animal individwali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sejbiet tan-nekropsija u s-sejbiet ħispatoloġiċi għal kull animal, jekk disponibbli.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni u interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 19.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 ġhttp://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.htmlħ.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.
                  
               
            ANNESS 1
            FLOW CHART DWAR L-ISTUDJU TA' OSSERVAZZJONI
            
         
            ANNESS 2:
            FLOW CHART DWAR L-ISTUDJU EWLIENI
            
         
            ANNESS 3
            KRITERJI GĦALL-KLASSIFIKA TAS-SUSTANZI TAT-TEST B'VALURI MISTENNIJA TA’ LD50 LI JEĊĊEDU 2 000 MG/KG MINGĦAJR IL-ĦTIEĠA TA’ TESTIJIET
            Il-kriterji dwar il-periklu tal-Kategorija 5 hija ntiża sabiex tiffaċilita l-identifikazzjoni tas-sustanzi tat-test li huma relattivament f'periklu ta’ tossiċità akuta baxxa imma li, skond ċerti ċirkustanzi jistgħu jippreżentaw periklu għall-populazzjonijiet vulnerabbli. dawn is-sustanzi huma antiċipati li jkollhom LD50 orali jew tal-ġilda fil-medda ta’ 2 000-5 000 mg/kg jew b'dożi ekwivalenti għal rotot oħra. Is-sustanzi tat-test jistgħu jkunu kklassifikati fil-kategorija tal-periklu definita bi: 2 000 mg/kg <LD50< 5 000 MG/KG (Kategorija 5 fil-GHS) f'dawn il-każi li ġejjin:
            
                        a)
                     
                     
                        jekk ikunu miġjuba f'din il-kategorija minn kwalunkwe skemi tat-testijiet ta’ l-Anness 2, ibbażati fuq l-inċidenti tal-mortalità;
                     
                  
                        b)
                     
                     
                        jekk evidenza affidabbli diġà tkun disponibbli li tindika li l-LD50 tkun fil-medda tal-valuri tal-Kategorija 5 jew li studji oħrajn dwar l-annimali jew ta’ l-effetti tossiċi fil-bnedmin umani jindikaw tħassib għas-saħħa umana ta’ natura akuta;
                     
                  
                        ċ)
                     
                     
                        permezz ta’ estrapolazzjoni, estimi jew kejl tad-dettalji jekk assenjati għal klassi aktar perikoluża milli mistħoqq u
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    informazzjoni affidabbli kif disponibbli tindika effetti tossiċi sinifikanti fil-bnedmin, jew
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    xi mortalità tkun osservata meta t-test isir sal-valuri tal-Kategorija 4 bir-rotta orali, jew
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    meta ġudizzju minn esperti jikkonferma sinjali kliniċi sinifikanti ta’ tossiċità, meta t-test isir sal-valuri tal-Kategorija 4, apparti milli għal dijarrea, piloerezzjoni jew dehra żmattata, jew
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    meta ġudizzju minn esperti jikkonferma li l-informazzjoni affidabli tindika il-potenzjal għal effetti sinifikament akuti minn studji oħrajn fuq l-annimali.
                                 
                              
                  TESTIJIET F'DOŻI OGĦLA MINN 2 000 MG/KG
            B'mod eċċezzjonali u biss meta ġġustifikat bi ħtiġiet regolatorji speċifiċi, l-użu ta’ doża addizzjonali ffissata fil-livell l-għoli ta’ 5 000 mg/kg tista’ tkun ikkunsidrata. Bir-rikonoxximent tal-ħtieġa li jkun mħares il-ġid ta’ l-annimali, testijiet fi 5 000 mg/kg huma skuraġġiti u għandhom biss ikunu kunsidrati meta jkun hemm possibiltà qawwija li r-riżultati minn tali test ikollu relevanza diretta għall-ħarsien tas-saħħa ta’ l-annimali jew dik umana (9).
            Studju ta’ l-osservazzjoni
            Ir-regoli tad-deċiżjoni li jirregolaw il-proċedura sekwenzjali ppreżentata fl-Anness 1 huma estiżi sabiex jinkludu l-livell ta’ doża 5 000mg/kg. Għalhekk, meta l-istudju ta’ l-osservazzjoni li jibda b'doża ta’ 5 000 mg/kg ikun użat, ir-riżultat A (mewt) ikun jeħtieġ it-tieni annimal li jkun ittestjat fi 2 000 mg/kg; ir-riżultat B u C (tossiċità evidenti jew l-ebda tossiċità) ikunu jippermettu l-għażla ta’ 5 000 mg/kg bħala d-doża tal-bidu fl-istudju ewlieni. Bl-istess mod, jekk id-doża tal-bidu apparti milli ta’ 5 000 mg/kg tkun użata, allura t-test għandu jippreċedi għal 5 000 mg/kg fil-każ tar-riżultati B jew C fi 2 000 mg/kg; ir-riżultat A sussegwenti ta’ 5 000 mg/kg ikun jimponi studju ewlieni li jibda b'doża ta’ 2 000 mg/kg u r-riżultati B u C ikunu jimponu studju ewlieni li jibda b'doża ta’ 5 000 mg/kg.
            Studju Ewlieni
            Ir-regoli tad-deċiżjoni li jirregolaw il-proċedura sekwenzjali ppreżentata fl-Anness 2 huma estiżi sabiex jinkludu l-livell ta’ doża 5 000 mg/kg. Għalhekk, meta d-doża ta’ l-istudju ewlieni li tibda bi 5 000 mg/kg tkun użata, ir-riżultat A (≥ 2 imwiet) ikun jeħtieġ it-testijiet tat-tieni grupp fi 2 000 mg/kg; ir-riżultat B (tossiċità evidenti u/jew ≤ mewt 1)jew C (l-ebda tossiċità) ikun jirriżulta filli s-sustanza ma tkunx ikklassifikata skond il-GHS. L-istess, jekk id-doża tal-bidu apparti milli ta’ 5 000 mg/kg tkun użata, allura t-test ikun jiproċedi lejn il-5 000 mg/kg fil-każ tar-riżultat C fi 2 000 mg/kg; ir-riżultat A sussegwenti ta’ 5 000 mg/kg ikun jirriżulta filli s-sustanza tkun assenjata għal GHS Kategorija 5 u r-riżultati B jew C ikunu jwasslu li s-sustanza ma tkunx ikklassifikata.
         
         
            ANNESS 4
            METODU TAT-TEST B.1.
            bis Gwida dwar il-klassifika skond l-iskema UE li tkopri l-perjodu tranżitorju sat-tmiem sħiħ ta' l-implimentazzjoni kollha tas-Sistema Armonizzata tal-Klassifika Globali (GHS) (meħud mir-referenza (8))
            
         B.1TRIS.   TOSSIĊITÀ ORALI AKUTA – METODU TAL-KLASSIFIKA TOSSIKA AKUTA
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa ekwivalnti għal OECD TG 423 (2001)
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Il-metodu tal-klassi tat-tossiċità akuta (1) kif stabbilit f'dan it-test huwa l-proċedura sussegwenti ma l-użu ta' 3 annimali ta' sess wieħed għal kull pass. Jiddependi mill-mortalità u/jew l-istat ta' modibondi li jkunu fih l-annimali, bħala medja 2-3 passi jkunu meħtieġa sabiex jippermeti li jsir ġudizju dwar it-tossiċità akuta tas-sustanza tat-test. Din il-proċedura hija riproduċibbli, tuża ftit annimali u hija kapaċi li tiggrada sustanzi b'manjera simili għall-metodi l-oħrajn tat-testijiet dwar it-tossiċità akuta. Il-metodu tal-klassi tat-tossiċità akuta huwa bbażat fuq evalwazzjonijiet biometriċi (2) (3) (4) (5) b'dożi fissi, separati b'mod adekwat sabiex jippermettu li sustanza tkun iggradata għall-iskopijiet tal-klassifika u ta' l-assessjar tal-periklu. Il-metodu kif adottat fil-1996 kien ġie validat b'mod estensiv in vivo bi tqabbil mad-dettalji JD50 akkwistati mil-letteratura, kemm nazzjonali (6) u dik internazzjonali (7).
         Gwida dwar l-għażla tal-metodu tat-test l-aktar xieraq għal skop partikolari tista’ tinstab fid-Dokument ta' Gwida dwat it-Testijiet tat-Tossiċità Orali Akuta (8). Dan id-Dokument ta' Gwida fih ukoll informazzjoni addizzjonali dwar it-twettieq u l-interpretazzjoni tal-metodu tat-test B. 1 tris.
         Is-sustanzi tat-test, fid-dożi li huma magħrufa li jikkaġunaw uġiegħ qawwi u tbatija minħabba l-azzjonijiet korrossivi jew severament irritanti, ma jistgħux ikunu amministrati. Annimali fl-għafja tal-mewt, jew annimali avvjament bl-uġiegħ jew li juru sinjali ta' tbagħtija qawwija għandhom ikun u maqtula b'mod umanitarju, u huma meqjusa fl-interpretazzjoni tar-riżultati tat-test bl-istess mod bħal dawk l-annimali li jmutu matul it-test. Il-kriterja sabiex tittieħed id-deċiżjoni li jkunu maqtula l-annimali fl-għafja tal-mewt jew dawk li jkunu jbagħtu ħafna, u l-gwida dwar ir-rikonoxximent ta' mewt mistennija jew prevista, huma s-suġġett ta' Dokument ta' Gwida separat (9).
         Dan il-metodu jutilizza dożi definiti bil-quddiem u r-riżultati jippermettu li sustanza tkun gradata u klassifikata skond is-Sistema Globali Armonizzata għall-klassifika ta' kimiċi li jikkaġunaw tossiċità akuta (10).
         Bħala prinċipju, il-metodu mhux intiż li jippermetti l-kalkolu ta' LD50 preċiża, imma fil-fatt jipperemetti għad-determinazzjoni ta' medded ta' esposizzjoni definita meta l-letalità tkun mistennija minħabba li l-mewt ta' proporzjoni ta' l-annimali tkun xorta waħda l-għan finali ewlieni ta' dan it-test. Il-metodu jippermetti għad-determinazzjoni tal-valur LD50 biss meta mill-anqas żewġ dożi jirriżultaw f'mortalità għola minn 0 % u anqas minn 100 %. L-użu ta' għażla ta' dożi definiti bil-quddiem, independentament mis-sustanza tat-test, bil-klassifika espliċitament marbuta man-numri ta' l-annimali osservati f'diversi sitwazzjonijiet ittejjeb l-opportunità għar-rapurtaġġ ta' bejn laboratorju u laboratorju, b'konsistenza u repatabbilità.
         Il-laboratorju tat-test għandu jikkonsidra l-informazzjoni disponibbli kollha dwar is-sustanza tat-test qabel ma jwettaq l-istudju. Tali informazzjoni għandha tinkludi l-identità u l-istruttura kimika tas-sustanza, il-propjetajiet fiżikokimiċi tagħha; ir-riżultat ta' xi testijiet oħrajn In vivo jew in vitro dwar is-sustanza; id-dettalji tossikoloġiċi dwar is-sustanzi strutturament relatati; u l-użu antiċipat tas-sustanza. Din l-informazzjhoni hija meħtieġa sabiex tissodisfa lil dawk kollha ikkonċernati li t-test huwa relevanti għall-protezzjoni tas-saħħa umana u li jkun ta' għajnuna fl-għażla tad-doża tal-bidu l-aktar xierqa.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Tossiċità akuta orali: Tirreferi għal dawk l-effetti ħżiena li jseħħu wara l-amministrazzjoni orali ta' doża singola ta' sustanza jew ta' dożi multipli mogħtija matul 24 siegħa.
         
            Mewt imdewma: Tfisser li annimal ma jmutx u ma jkunx jidher f'għafja tal-mewt fi żmien 48 siegħa imma li jmut aktar tard matul il-perjodu ta' l-osservazzjoni ta' 14-il jum.
         
            Doża: Hija l-ammont tas-sustanza tat-test kif somministrata. Id-doża hija espressa bħala piż tas-sustanza tat-test għal kull unità tal-piż ta' l-annimal ittestjat (eż. mg/kg).
         
            GHS: Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures. Is-Sistema tal-Klassifika Globali Armonizzata għal Sustanzi u Taħlitiet Kimiċi. Attività konġunta tal-OECD (is-saħħa umana u l-ambjent), Il-Kumitat ta' Esperti tal-NU dwar it-Trasport ta' Oġġetti Perikolużi (il-propjetajiet fiżiċi/kimiċi) u l-ILO (kommunikazzjoni perikoluża) u l-kordinazzjoni mill-Programm Interorganizzazzjonali għal Amministrazzjoni Soda tal-Kimika (IOMC).
         
            Imwiet imminenti: Meta l-istat fl-għafja tal-mewt jew il-mewt ikunu mistennija qabel il-ħin ippjanat segwenti ta' l-osservazzjoni. Sinjali indikattivi għal dan l-istat f'annimali gerriema jistgħu jinkludu konvulżjonijiet, posizzjoni ta' serħan fuq il-ġemb, mitluqa fuq darhom, u tregħid (Ara d-Dokument ta' Gwida ta' l-Għan Finali b'mod Umanitarju (9) għal aktar dettalji).
         
            LD50 (doża orali medja ta' l-mwiet): Hija doża akkwistata b'mod statistiku ta' sustanza li tista’ tkun mistennija li tikkaġuna l-mewt fi 50 fil-mija ta' l-annimali meta amminsitrata bir-rotta orali. Il-valur LD50 huwa espress f'termini ta' piż tas-sustanza tat-test għal kull unità piż ta' l-annimal tat-test (mg/kg).
         
            Doża b'limitu: Tirreferi għad-doża fil-limitu l-aktar għoli tat-testijiet (2 000 jew 5 000 mg/kg).
         
            Stat moribund (fl-għafja tal-mewt): Huwa l-istat li jwassal għall-mewt jew ta' nuqqas ta' kapaċità għal ħajja, anki jekk ittrattat (ara d-Dokument ta' Gwida dwar it-Tmiem Finali b'mod Umanitarju (9) dwar aktar dettalji).
         
            Mewt mistennija: Il-preżenza ta' sinjali kliniċi indikattivi tal-mewt fi żmien mistenni jew inkella fil-ġejjieni imma qabel it-tmiem ippjanat ta' l-esperiment, per eżempju: l-inabbiltà li jersaq lejn l-ilma u lejn l-ikel. (Ara d-Dokmunet ta' Gwida tat-Tmiem Umanitarju (9) dwar aktar dettalji).
         1.3.   IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
         Huwa l-prinċipju tat-test li, ibbażat fuq il-proċedura ta' pass b'pass, bl-użu ta' numru minimu ta' annimali kull pass, informazzjoni suffiċjenti tkun akkwista dwar it-tossiċità akuta tas- sustanza tat-test sabiex tiffaċilita l-klassifika tagħha. Is-sustanza hija ammenistrata b'mod orali fuq grupp ta' annimali esperimentali b'waħda mid-dożi definiti. Is-sustanza hija ittestjata bl-użu tal-proċedura tal-pass b'pass, kull pass jutilizza tlett annimali ta' sess wieħed (normalment nisa). In-nuqqas jew il-preżenza ta' mortalità relatata mal-kompost ta' l-anniamli bid-doża. Ta' l-ewwel pass tkun tiddetermina l-pass segwenti, i.e.:
         
                     —
                  
                  
                     l-ebda aktar testijiet ma jkunu meħtieġa,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-doża fuq tlett annimali, bl-istess doża,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-doża fuq tlett annimali addizzjonali fil-livell aktar għoli segwenti jew fil-livell aktar baxx preċedenti.
                  
               Id-dettalji tal-proċedura tat-test huma deskritti fl-Anness I. Il-metodu ikun jiffaċilita ġudizju fir-rigward tal-klassifika ta' sustanza tat-test lejn waħda mis-serje tal-klassijiet ta' tossiċità definiti bil-valuri fissi LD-50 bħala waqfien.
         1.4.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.4.1.   L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali
         L-ispeċi preferuta ta' l-annimali gerriema huwa l-far, għalkemm speċi oħrajn ta' annimali gerriema tista’ tkun użata. Normalment ikunu wżata il-femminili (9). Dan huwa minħabba li listħarriġ letterarju tat-testijiet konvenzjonali LD-50 juru li normalment ikun hemm ftit differenza fis-sensittività bejn is-sessi, imma li f'dawk il-każi meta d-differenzi jkunu osservati, in-nisa ikunu ġeneralment kemm xejn aktar sensittivi (11). B'dana kollu, jekk tagħrif dwar il-propjetajiet tossikoloġiċi jew tossikinetiċi ta' kimiċi strutturament relatati jindika li l-irġiel aktarx li jkunu aktar sensittivi, allura dak is-sess għandu jkun użat. Meta t-test ikun imwettaq fuq maskili, ġustifikazzjoni adekwata għandha tkun ipprovduta.
         Annimali żgħażagħ adulti u b'saħħithom tas-siltiet normalment użati fil-laboratorju għandhom ikunu utilizzati. Il-femminili għandhom ikunu tali li qatt ma jkunu weldu u ma jkunux tqal. Kull annimal, fil-bidu ta' meta jkun sejjer jingħata doża, għandu jkun f'età ta' bejn 8 u 12 il-ġimgħa u l-piż tiegħu għandu jkun fil-medda ta' ± 20 % tal-piż medju ta' dawk l-annimali li preċedentament ikun u ntużaw għad-dożi.
         1.4.2.   Il-kundizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf
         It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 22 oC (± 3 oC). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu użati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L-annimali jistgħu ikunu miġbura flimkien bħala grupp skond id-doża, imma n-numru ta' l-annimali f'kull gaġġa m'għandux ifixkel l-osservazzjonijiet ċari ta' kull annimal.
         1.4.3.   Preparazzjoni ta' l-annimali
         L-annimali għandhom ikunu magħżula kif jinzerta, immarkati sabiex jippermettu identifikazzjoni individwali, u miżmuma fil-gaġġeġ tagħhom għal mil anqas 5 tijiem qabel il-bidu tad-dożi sabiex jippermettu li jkunu akklamattiżati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju.
         1.4.4.   Preparazzjoni tad-dożi
         Ġeneralment, is-sustanzi tat-test għandhom ikunu amministrati f'volum kostanti matul medda ta' dożi tat-testijiet bil-varjazzjoni tal-konċentrazzjoni fil-preparazzjoni tad-dożi. Meta, b'dana kollu, likwidu jew taħlita ikunu l-prodott finali, l-użu ta' sustanza tat-test mingħajr trattib, i.e. konċentrazzjoni kostanti, tista’ tkun aktar relevanti għall-istudju sussegwenti tar-riskju ta' dik is-sustanza, u hija ħtieġa għal uħud mill-awtoritajiet regolatorji. Fi kwalunkwe każ, il-volum massimu tad-doża għall-amminsitrazzjoni m'għandux ikunu misbuq. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jkun amministrat f'waqt wieħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Fl-annimali gerriema, il-volum m'għandux normalment jeċċedi 1ml/100g tal-piż tal-ġisem: b'dana kollu fil-każ ta' taħlitiet akweji, 2 ml/100g tal-piż tal-ġisem jista’ jkun ikkonsidrat. Fir- rigward tal-formulazzjoni tal-preparazzjoni tad-doża, l-użu ta' taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni akweja hija rakkommandata kull meta possibbli, segwita f'ordni ta' preferenza bit-taħlita/sospenzjoni/emulsifikazzjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħ-ir- rum) u mbagħad il-possibbiltà ta' likwidi oħrajn. Għal likwidi oħrajn apparti milli l-ilma, il- karatteristiċi tossikoloġiċi tal-likwidu għandhom ikunu magħrufa. Id-dożi għandhom ikunu ppreparati ftit qabel l-amministrazzjoni, sakemm l-istabbiltà tal-preparazzjoni matul il- perjodu ta' l-użu tkun magħrufa u turi li tkun aċċettabbli.
         1.5.   PROĊEDURA
         1.5.1.   Amministrazzjoni tad-dożi
         Is-sustanza tat-test hija somministrata f'doża waħda b'mod sfurzat bl-użu ta' tubu sa l-istonku jew b'xi intubazzjoni canula xierqa. F'ċirkostanzi mhux tas-soltu li fihom doża waħda ma tkunx possibbli, id-doża tista’ tingħata fi frazzjonijiet iżgħar matul perjodu li ma jeċċedix l-24 siegħa.
         L-annimali għandhom ikunu msajma qabel ma jingħataw id-doża (eż. għall-firien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul il-lejl sal-ħin ta' l-esperiment; fil-każ ta' ġurdien, l-ikel imma mhux ilma għandu jkun imċaħħad għal ma tul 3-4 siegħat). Wara l-perjodu tas-sawma, l-annimali għandhom ikunu miżuna u s-sustanza tat-test tkun somministrata. Wara li s-sustanza tat-test tkun somministrata, l-ikel jista’ jkun imċaħħad għal 3-4 siegħat oħra fil-każ tal-firien jew 1-2 siegħat fil-każ tal-ġrieden. Meta d-doża tkun somministrata fi frazzjonijiet matul perjodu ta' żmien, jista’ jkun meħtieġ li l-annimali jkunu ipprovduti b'ikel u ilma, jiddependi mit-tul tal-perjodu.
         1.5.2.   Numru ta' l-annimali u l-livelli tad-dożi
         Tlett annimali huma użati għal kull pass. Il-livell tad-doża li għandu jkun użat bħala d-doża tal-bidu jkun magħżul minn wieħed minn erba’ livelli fissi, 5, 50, 300 u 2 000 mg/kg piż tal-ġisem. Il-livell tad-doża tal-bidu għandu jkun dak li jkun l-aktar probabbli li jipproduċi mortalità f'uħud mill-animali li jkunu reċevew id-doża. Il-karti tan-nixxija ta' l-Anness 1 jiddeskrivu l-proċedura li għandha tkun segwita għal kull waħda mid-dożi tal-bidu. B'żieda, l-Anness 4 jagħti gwida dwar il-klassifika fis-sistema UE sakemm GHS ġdida tkun implementata.
         Meta l-informazzjoni disponibbli tissuġġerixxi li l-lortalità pjuttost li ma sseħħx fl-għola livell tal-bidu (2 000 mg/kg piż tal-ġisem), allura test tal-limitu għandu jkun imwettaq. Meta ma jkunx hemm informazzjoni dwar xi sustanza li għandha tkun ittestjata, għal raġunijiet tal-ġid ta' l-annimali, huwa rakkommandabbli li jsir użu minn doża tal-bidu ta' 300 mg/kg piż tal-ġisem.
         L-intervall tal-ħin bejn id-dożi f'kull wieħed mill-livelli huwa determinat bl-iskoppjar, it-tul, u s-severità, tas-sinjali tossiċi. It-trattament ta' l-annimali fid-doża segwenti għandu jkun imdewwem sakemm wieħed ikun żgur bis-sopravivenza ta' l-annimali li jkunu ireċevew id-doża preċedentament.
         B'mod eċċezzjonali, u biss meta iġġustifikat bi ħtiġiet regolatorji speċifiċi, l-użu ta' doża addizzjonali iffissata fil-livel għoli ta' 5 000 mg/kg tista’ tkun ikkonsidrata (ara l-Anness 2). Għal raġunijiet li jikkonċernaw il-ġid ta' l-annimali, it-testijiet ta' l-annimali skond GHS, il-Kategorija 5, il-meded (2 000-5 000 mg/kg huma ferm skorraġiti u għandhom biss ikunu ikkonsidrati meta jkun hemm possibbiltà qawwija li r-riżultati minn tali test ikollu relevanza diretta għall-rotezzjoni umana jew tas-saħħa ta' l-annimali jew dik ambjentali.
         1.5.3.   Test tal-limitu
         It-test tal-limitu huwa primarjament użat f'sitwazzjonijiet meta dak li jwettaq l-esperiment ikollu informazzjoni li tindika li l-materjal tat-test ma jkunx tossiku, i.e. li jkollu tossiċita biss aktar mil-limitu regolatorju tad-dożi. L-informazzjoni dwar it-tossiċità tal-materjal tat-test tista’ tkun akkwistat mit-tagħrif dwar komposti simili li kienu ġew ittestjati jew minn taħlitiet jew prodotti simili li kienu ġew ittestjati, billi tkun meqjusa l-identità u l-persentaġġ tal-komponenti magħrufa li huma ta' sinifikanza tossikoloġika. F'dawk is-sitwazzjonijiet meta jkun ftit jew l-ebda informazzjoni dwar. It-tossiċità tagħha, jew li fiha l-materjal tat-test ikun mistenni li jirriżulta tossiku, it-test ewlieni għandu jkun imwettaq.
         Test tal-limitu f'doża waħda fil-livell ta' 2 000 mg/kg piż tal-ġisem jista’ jitwettaq fuq sitt annimali (tlett annimali kull pass). B'mod eċċezzjonali, test tal-limitu b'doża waħda fil-livell ta' 5 000 mg/kg jista’ jkun imwettaq fuq tlett annimali (ara l-Anness 2). Jekk il-mortalità tat-test relatata mas-sustanza tirriżulta, aktar testijiet fil-livell preċedenti aktar baxx jista’ jkun hemm il-ħtieġa li jitwettqu.
         1.6.   OSSERVAZZJONIJIET
         L-annimali osservati individwalment wara l-ewwel doża mill-anqas darba matul l-ewwel 30 minuta, perjodikament matul l-ewwel 24 siegħa, b'attenzjoni speċjali mogħtija matul l-ewwel 4 siegħat, u ta' kull minn hemm il-quddiem, għal total ta' 14-il jum, apparti minn meta jkun meħtieġ li dawn jitneħħew mill-istudju u li jkunu maqtula b'mod umanesk għal raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali jew inkella li jinsabu mejta. B'dana kollu, it-tul ta' l-osservazzjoni m'għandhux ikun iffissat b'mod rigoruż. Għandu jkun determinat bir-reazzjoni tossika, il-ħilata' l-iskoppjar u t-tul tal-perjodu ta' l-irkupru, u jista’ b'hekk ikun estiż meta ikkonsidrat bħala meħtieġ. Il-ħinijiet li fihom is-sinjali tat-tassiċità) jkunu apparaenti jew li jisparixxu huma. Importanti, speċjalment meta jkun hemm tendenza li s-sinjali tossiċi jkunu mdewma (12). L-osservazzjonijiet kollha huma sistematista’ment irreġistrati, b'dettalji individwali jkunu jinżammu għal kull annimal.
         Osservazzjonijiet addizzjonali jkunu meħtieġa jekk l-annimali jkomplu juru sinjali ta' tossiċità. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu xi tibdil fil-ġilda u s-suf, l-għajnejn, fil-membrani mukaneji, u wkoll fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tan-nervituri ċentrali, u l-attività somatomuturali u t-tip ta' l-imġieba. Attenzjoni għandha tkun diretta għall-osservazzjonijiet ta' roda, konvulżjonijiet, rieq, dijarrea, letarġija, irqad u koma. Il-prinċipji u l-kriterja kif aggruppati fid-Dokument ta' Gwida dwar il-Miri Umanitarji għandhom ikunu ikkonsidrati (9). L-annimali misjuba f'kundizzjoni moribonda u l-annimali li juru sinjali ta' uġieħ qawwi jew li jgħaddu minn sinjali ta' tbgħatija, għandhom ikunu maqtula b'mod umanitarju. Meta l-annimali jkunu maqtula għal raġunijiet umanitarji jew jekk jinstabu mejta, il-ħin tal-mewt għandu jkun reġistrat bi preċiżjoni kemm jista’ jkun possibbli.
         1.6.1.   Piż tal-ġisem
         Il-piżijiet ta' l-annimali individwali għandhom ikunu determinati kemxejn qabel ma s-sustanza tat-test tkun somministrata u mill-anqas darba fil-ġimgħa wara dan. Tibdiliet fil-piż għandhom ikunu ikkalkolati u rreġistrati. Fit-tmiem tat-test, l-annimali li jibqgħu ħajjin għandhom ikunu miżuna w imbagħas maqtula b'mod umanitarju.
         1.6.2.   Patoloġija
         L-annimali kolha tat-test (inklużi dawk li jmutu matul it-test jew li jkunu mneħħija mill-istudju minħabba raġunijiet tal-benesseri ta' l-annimali għandhom ikunu suġġetti għal nekropsija ġenerali. It-tibdiliet patoloġiċi ġenerali għandhom ikunu irreġistrati għal kull annimal. Eżaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi li juri evidenza patoloġika ġenerali fl-annimali li jibqgħu ħajjin għa 24 siegħa jew aktar wara li jkunu rċevew id-doża inizjali għandha wkoll tkun ikkunsidrata minħabba li din tista’ tforni informazzjoni utili.
         2.   DATA
         Data ta' l-annimal individwali għandha tkun ipprovduta. B'żieda ma dan, id-dettalji kollha għandhom ikunu miġbura f'sommarju, li juru għal kull grupp tat-test, in-numru ta' l-annimali użati, in-numru ta' annimali ji jkollhom sinjali ta' tossiċità, in-numru ta' annimali li jinstabu mejta matul it-test jew li jkunu maqtula għal raġunijiet umanitarji, il-ħin tal-mewt ta' l-annimali individwali, deskrizzjoni u l-korsa tal-ħin ta' l-effetti tossiċi, u r-riversabbiltà ta' dawn, u s-sejbiet tan-nekropsija.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   Rapport tat-test
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, skond kif xieraq:
         
                      
                  
                  
                     Is-sustanza tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 in-natura fiżika, il-purità, u, meta relevanti, il-propjetajiet fiżiko-kimiċi (inkluża l- iżomerizzazzjoni);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-identifikazzjoni, inkluż in-numru CAS.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Mezz (jekk applikabbli):
                     
                                 —
                              
                              
                                 ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz, jekk mhux sempliċement ilma.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Annimali tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 speċi/tipi użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-istatus mikrobioloġiku ta' l-annimali, meta magħruf;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali (inklużi, meta xieraq, raġornament dwar l-użu ta' maskili minflok femminili);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kondizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-formulazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi dettalji dwar l-għamla fiżika tal-materjal amministrat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar l-amminstrazzjoni tas-sustanza tat-test, inklużi l-volumi tad-dożi u l-ħin ta' meta tkun ingħata d-doża;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u ta' l-ilma (inklużi t-tip/sorsi tad-dieta, is-sorsi ta' l-ilma);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ir-raġjonar għall-għażla tad-doża tal-bidu.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 tabulazzjoni tad-dettalji tar-reazzjoni u tal-livell tad-doża għal kull animal (i.e. l-annimali li juru sinjali ta' tossiċità, inklużi l-effetti tal-mortalità, in-natura, is-severanza u t-tul ta' l-effetti);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tabulazzjoni tal-piż tal-ġisem u tat-tibdiliet fil-piż tal-ġisem;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piżijiet ta' l-annimali individwali fil-jum ma meta jirċievi d-doża, u wara dan matul intervalli ta' darba fil-ġimgħa, u l-ħin tal-mewt jew ta' meta jkunu maqtula;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-data u l-ħin tal-mewt jekk qabel il-qtil previst;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-korsa tal-ħin ta' kif jiskoppjaw is-sinjali tat-tossiċità u jekk dawn kienux riversibbli għal kull animal individwali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sejbiet tan-nekropsija u s-sejbiet ħispatoloġiċi għal kull animal, jekk disponibbli.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni u interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Konklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 (http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html).
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
                  
               
            ANNESS 1
            PROĊEDURA LI GĦANDHA TKUN SEGWITA GĦAL KULL WAĦDA MID-DOŻI TAL-BIDU
            RIMARKI ĠENERALI
            Għal kull doża tal-bidu, l-iskemi rispettivi tat-testijiet, kif inklużi f'dan l-Anness, jelenkaw il-proċedura li għandha tkun segwita.
            
                        —
                     
                     
                        Anness 1 a: Id-doża tal-bidu hija: 5 mg/kg piż tal-ġisem
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Anness 1 b: Id-doża tal-bidu hija: 50 mg/kg piż tal-ġisem
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Anness 1 c: Id-doża tal-bidu hija: 300 mg/kg piż tal-ġisem
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Anness 1 d: Id-doża tal-bidu hija: 2 000 mg/kg piż tal-ġisem
                     
                  Jiddependi min-numru ta' annimali maqtula b'mod umanitarju jew ta' l-annimali mejta, il-proċedura tat-test għandha ssegwi il-vleġeġ indikati.
            
               ANNESS 1A
               PROĊEDURA TAT-TEST B'DOŻA TAL-BIDU TA' 5 MG/KG PIŻ TAL-ĠISEM
               
            
               ANNESS 1B
               PROĊEDURA TAT-TEST B'DOŻA TAL-BIDU TA' 50 MG/KG PIŻ TAL-ĠISEM
               
            
               ANNESS 1C
               PROĊEDURA TAT-TEST B'DOŻA TAL-BIDU TA' 300 MG/KG PIŻ TAL-ĠISEM
               
            
               ANNESS ID
               PROĊEDURA TAT-TEST B'DOŻA TAL-BIDU TA' 2 000 MG/KG PIŻ TAL-ĠISEM
               
         
         
            ANNESS 2
            KRITERJA GĦALL-KLASSIFIKA TAS-SUSTANZI TAT-TEST B'VALURI MISTENNIJA TA' LD50 LI JEĊĊEDU 2 000 MG/KG MINGĦAJR IL-ĦTIEĠA TA'TESTIJIET
            Il-kriterji dwar il-periklu tal-Kategorija 5 hija ntiża sabiex tiffaċilita l-identifikazzjoni tas-sustanzi tat-test li huma relattivament f'periklu ta' tossiċità akuta baxxa imma li, skond ċerti ċirkostanzi jistgħu jippreżentaw periklu għall-populazzjonijiet vulnerabbli. Dawn is-sustanzi huma antiċipati li jkollhom LD50 orali jew tal-ġilda fil-medda ta' 2 000-5 000 mg/kg jew b'dożi ekwivalenti għal rotot oħrajn. Is-sustanzi tat-test jistgħu ikunu klassifikati fil-kategorija tal-periklu definita bi: 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (Kategorija 5 fil-GHS) f'dawn il-każi li ġejjin:
            
                        a)
                     
                     
                        jekk ikunu miġjuba f'din il-kategorija minn kwalunkwe skemi tat-testijiet ta' l-Anness 2, ibbażati fuq l-inċidenti tal-mortalità;
                     
                  
                        b)
                     
                     
                        jekk evidenza affidabbli diġà tkun disponibbli li tindika li l-LD50 tkun fil-medda tal-valuri tal-Kategorija 5; jew li studji oħrajn dwar l-annimali jew ta' l-effetti tossiċi fil-bnedmin umani jindikaw tħassib għas-saħħa umana ta' natura akuta;
                     
                  
                        c)
                     
                     
                        permezz ta' extrapolazzjoni, estimi jew kejl tad-dettalji jekk assenjati għal klassi aktar perikoluża milli mistħoqq; u
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    informazzjoni affidabbli kif disponibbli tindika effetti tossiċi sinifikati fil-bnedmin, jew
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    xi mortalità tkun osservata meta t-test isir sal-valuri tal-Kategorija 4 bir-rotta orali, jew
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    meta ġudizzju minn esperti jikkonferma sinjali kliniċi sinifikanti ta' tossiċità, meta t-test isir sal-valuri tal-Kategorija 4, apparti milli għal dijarrea, piloerezzjoni jew dehra żmattata, jew
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    meta ġudizzju minn esperti jikkonferma li l-informazzjoni affidabbli tindika l-potenzjal għal effetti sinifikament akuti minn studji oħrajn fuq l-annimali.
                                 
                              
                  TESTIJIET F'DOŻI OGĦLA MINN 2 000 MG/KG
            Bir-rikonoxximent tal-ħtieġa li jkun imħares il-ġid ta' l-annimali, testijiet fi 5 000 mg/kg huma skurraġiti u għandhom biss ikunu kkunsidrati meta jkun hemm possibbiltà qawwija li r-riżultati minn test bħal dan ikollu relevanza diretta għall protezzjoni tas-saħħa ta' l-annimali jew dik umana (10). L-ebda aktar testijiet m'għandhom ikunu mwettqa fil-livelli tad-dożi aktar għoljin.
            Meta t-testijiet ikunu jeħtieġu doża ta' 5 000 mg/kg, il-pass wieħed biss (i.e. tliet annimali) huwa meħtieġ. Jekk l-ewwel annimal li jkun ingħata d-doża, imut, allura l-għoti tad-dożi għandu jipproċedi fi 2 000 mg/kg skond il-flow chart fl-Anness 1. Jekk l-ewwel annimal jibqa' ħaj, żewġ annimali oħrajn għandhom jingħataw id-doża. Jekk wieħed biss mit-tliet annimali jmut, il-valur LD50 huwa mistenni li jeċċedi 5 000 mg/kg. Jekk żewġ annimali jmut, allura d-doża tipproċedi fi 2 000 mg/kg.
         
         
            ANNESS 3
            B1c. METODU TAT-TEST Gwida dwar il-klassifika skond l-iskema UE li tkopri l-perjodu transitorju sakemm ikun hemm l-implementazzjoni sħiħa tas-Sistema ta' Klassifika Armonizzata Globali (GHS) (meħuda minn referenza (8))
            
         B.2.   TOSSIĊITÀ AKUTA (TEĦID MAN-NIFS)
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Huwa utli li jkun hemm informazzjoni preliminarja dwar id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli, l-pressjoni tal-fwar, il-punt tat-taħlil, il-punt tat-togħlija, il-punt tal-leħħa jew ta’ l-isplussività (jekk applikabbli) tas-sustanza.
         Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (A).
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (B).
         1.3.   SUSTANZI TA’ REFERENZA
         Xejn
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Diversi gruppi ta’ annimali sperimentali huma esposti għal perjodu definittiv lejn is-sustanza tat-test f’konċentrazzjonini bi gradwazzjonijiet, b’konċentrazzjoni waħda tkun użata għal kull grupp. Sussegwentement l-effetti u l-imwiet jiġu osservati. Annimali li jmutu matul it-test ikollhom awtopsija tal-mewt u l-konklużjoni tat-test li l-annimali li jibqgħu ħajjin ikollhom ukoll l-awtopsija ta’ wara l-mewt
         Jista’ jagħti l-każ li l-annimali li juru sinjali qawwija u li jtulu ta’ tbatija u uġigħ jinqatlu b’mod uman. Sustanzi f’dożaġġi għat-test li huma magħrufa li jikkawżaw it-tbatija u l-uġigħ minħabba proprjetajiet korrużivi jew ta’ irritazzjoni qawwija jistgħu ma jintużawx.
         1.5.   KRITERJI TA’ KWALITÀ
         Xejn.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.6.1.   Preparazzjonijiet
         L-annimali huma miżmuma b’fondi sperimentali u f’kundizzjonijiet ta’ l-għalf għal mill-anqas ħamest ijiem qabel l-esperiment. Qabel it-test, annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma magħżula b’mod kif jinzerta u assenjati lejn in-numru meħtieġ ta’ gruppi. M’hemmx bżonn ikunu suġġetti għal espożizzjoni simulata sakemm dan ma jkunx indikat mit-tip ta’ apparat t’espożizzjoni li qed jintuża.
         Sustanzi għat-test solidi jistgħu jkunu mikronizzati sabiex jinkisbu l-partiċelli ta’ daqs xieraq.
         Meta meħtieġ, materjal adattat jista’ jkun miżjud mas-sustanza tat-test sabiex jgħin fil-ġenerazzjoni ta’ konċentrazzjoni xierqa tas-sustanza tat-test fl-atmosfera. Jekk xi materjal jew addittivi oħrajn ikunu użati għall-faċilizzazzjoni tad-doża, dawn għandhom ikunu magħrufa li ma jipproduċu l-ebda effetti tossiċi. Data storika tista’ tkun użata, jekk xieraq.
         1.6.2.   Il-kundizzjonijiet tat-test
         1.6.2.1.   Annimali sperimentali
         Sakemm ma jkunx hemm indikazzjonijiet mod ieħor, il-far huwa l-ispeċi preferita. Is-siltiet normalment użati fil-laboratorju ta’ l-annimali żgħażagħ b’saħħithom għandhom ikunu użati. Fil-bidu ta’ kull test, il-medda tal-varjazzjoni fil-piż ta’ l-annimali użati m’għandhiex teċċedi ± 20 % tal-valur medju kif xieraq.
         1.6.2.2.   Numru u sess.
         Mill-anqas 10 gerriema (ħamsa femminili u ħamsa maskili) għandhom ikunu użati f’kull livell ta’ doża. Jekk ikunu użati femminili, dawn għandhom ikunu femminili li qatt ma welldu u li ma humiex tqal.
         
            Nota: F’testijiet ta’ tossoċità akuta b’annimali ta’ ordni ogħla mill-gerriema għandhom jintużaw numri iżgħar. Id-dożi għandhom jingħażlu bl-attenzjoni u għandu jsir kull sforz sabiex ma jinqabżux id-dożi li huma xi ftit tossiċi. F’testijiet bħal dawn għandha tiġi evitata l-amministrazzjoni ta’ dożi letali tas-sustanza għat-test.
         1.6.2.3.   Konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni
         Dawn għandhom ikunu biżżejjed fin-numru, mill-inqas tlieta, u spazjati b’mod xieraq biex jipproduċu gruppi ta’ test b’medda ta’ effetti tossiċi u rati ta’ mortalità. Id-data għandha tkun biżżejjed biex tipproduċi kurva ta’ konċentrazzjoni ta’ mortalità u, fejn hu possibbli, tippermetti determinazzjoni aċċettabbli ta’ test tal-limitu LC50 1.6.2.4.
         1.6.2.4.   Test tal-limitu
         Jekk ħames annimali għat-test maskili u ħamsa femminili jiġu esposti għal erba’ sigħat għal 20 mg għal kull litru ta’ gass jew 5 rug għal kull litru ta’ aerosol jew ta’ partiċella (jew fejn dan mhuwiex possibbli minħabba xi proprjetajiet tas-sustanza għat-test li huma fiżiċi jew kimiċi u inklużi dawk splussivi, il-massimu ta’ konċentrazzjoni li tista’ tintlaħaq) u ma tirriżulta l-ebda mortalità compound-related fi żmien 14-il jum iktar ittestjar jista’ ma jkunx meħtieġ. (18th ATP, dir. 93/21/KEE, Ll10/93)
         1.6.2.5   Ħin ta’ l-espożizzjoni
         It-tul ta’ l-espożizzjoni għandu jkun ta’ erba’ sigħat.
         1.6.2.6.   Apparat:
         L-annimali għandhom ikunu ttestjati bl-apparat tan-nifs iddisinjat għas-sostenn ta’ nixxija ta’ arja dinamika ta’ mill-anqas 12-il kambjamenti ta’ l-arja fis-siegħa, sabiex ikun assigurat kontenut adekwat ta’ l-ossiġenu u espożizzjoni ta’ l-atmosfera mqassma b’mod egwali. Meta kabina tkun użata, d-disinn tagħha għandu jimminimizza l-iffullar ta’ l-annimali tat-test u jimminimizzaw l-espożizzjoni tagħhom man-nifs tas-sustanza tat-test. Bħala regola ġenerali sabiex tkun assigurata l-istabbilità ta’ l-atmosfera fil-kabina il-“volum” totali ta’ l-annimali tat-test m’għandux jeċċedi 5 % tal-volum tal-kabina tat-test. Ħalq-nażali, ir-ras biss, jew l-ispazji tal-kabina ta’ l-espożizzjoni jista’ jkun użat; bl-ewwel tnejn għandhom jgħinu li jimminimizzaw l-ammont tas-sustanza tat-test b’meżżi oħrajn.
         1.6.2.7.   Perijodu ta’ l-Osservazzjoni
         Il-perjodu ta’ osservazzjoni għandu jkun mill-inqas ta’ 14-il jum. Madankollu, id-dewmien ta’ l-osservazzjonijiet m’għandux ikun strettament fiss. Għandu jkun determinat mir-reazzjonijiet tossiċi, ir-rata tagħhom ta’ onset u t-tul ta’ żmien ta’ rkupru, għalhekk meta hu meħtieġ jista’ jiġi estiż. Il-ħin li fih is-sinjali ta’ tossiċità jidhru u jisparixxu u l-ħin tal-mewt huma importanti, speċjalment jekk hemm it-tendenza li l-imwiet itulu.
         1.6.3.   Il-proċedura
         Ftit qabel l-espożizzjoni, l-annimali jintiżnu, imbagħad jiġu esposti għall-konċentrazzjoni tat-test fl-apparat magħżul għal erba’ sigħat, wara l-ekwilibrazzjoni tal-konċentrazzjoni tal-kabina. It-temperatura li fiha t-test ikun imwettaq għandha tinżamm fi 22 ± 3 oC. Idealment, l-umdità relattiva għandha tinżamm bejn 30 u 70 %, imma f’ċerti kazi (eż. it-testijiet ta’ uħud mill-aerosols) dan jista’ ma jkunx prattikabbli. Iż-żamma ta’ pressjoni kemxejn negattiva ġewwa l-kabina (≥ 5 mm ta’ ilma) tkun tipprevjeni l-ħruġ tas-sustanza tat-test fiż-żona tal-madwar. L-ikel u l-ilma għandhom ikunu miċħuda matul l-espożizzjoni. Sistemi xierqa għandhom jintużaw għall-ġenerazzjoni u l-monitoraġġ ta’ l-atmosfera tat-test. Is-sistema għandha tassigura li kundizzjonijiet stabbli ta’ l-espożizzjoni jintlaħqu malajr kemm jista’ jkun. Il-kurrent ta’ l-arja għandu jkun aġġustat sabiex jassigura li l-kundizzjonijiet matul il-kabina ta’ l-espożizzjoni jkunu omoġenji.
         Il-kejl jew l-moniteraġġ għandu jsir:
         
                     (a)
                  
                  
                     tar-rata tal-kurrent ta’ l-arja (b’mod kontinwu).
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     il-konċentrazzjoni attwali tas-sustanza tat-test imkejla fiż-żona ta’ fejn jittieħed in-nifs mill-inqas tliet darbiet waqt l-espożizzjoni (x’uħud mill-atmosferi, eż. L-aerosols f’konċentrazzjonijiet għoljin jistgħu jeħtieġu monitoraġġ iktar frekwenti). Il-konċentrazzjonijiet m’għandhomx ivarjaw b’aktar minn ± 15 % tal-medja tal-valur. B’danakollu, fil-każ ta’ uħud mill-aerosols, dan il-livell ta’ kontroll ma jistax ikun milħuq u medda aktar wiesa tkun għalhekk aċċettabbli. Għall-aerosols għandhom isiru analiżi għad-daqs tal-partiċelli kemm hemm bżonn (mill-inqas darba kull grupp ta’ test).
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     tat-temperatura u l-umdità, kontinwament jekk possibbli.
                  
               Matul u wara l-espożizzjoni, osservazzjoni hija mwettqa u reġistrata b’mod sistematiku; dettalji individwali għandhom jinżammu għal kull annimal. L-osservazzjonijiet għandhom isiru ta’ spiss fl-ewwel jum. Mill-inqas darba kuljum għandha ssir eżaminazzjoni klinika tajba, osservazzjonijiet oħra għandhom isiru kuljum b’azzjonijiet xierqa li jittieħdu sabiex jimminimizzaw it-telf ta’ l-annimali mill-istudju, eż. In-nekropsija jew refriġerazzjoni ta’ dawk l-annimali li jinstabu mejta u l-iżolament jew il-qtil ta’ annimali dgħajfa jew qed imutu.
         L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u l-pil, fl-għajnejn u membrani mukożji, u anki s-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tas-sistema ċentrali tan-nervituri, l-attività somatomotori u l-istil ta’ l-imġiba. Attenzjoni partikulari għandha tingħata għall-osservazzjoni ta’ l-imġiba respiratorja, it-tkexkix, il-konvulżjonijiet, ir-rieq, id-dijareja, il-letarġija, l-irqad u l-koma. Il-ħin tal-mewt għandu jittieħed kemm jista’ jkun bl-eżatt. Il-piżijiet individwali ta’ l-annimali għandhom jiġu determinati fil-ġimgħa wara l-espożizzjoni u mal-mewt.
         L-annimali li jmutu waqt it-test u dawk li jibqgħu ħajjin fl-aħħar tat-test huma suġġetti għan-nekropsija b’referenza partikulari għal kwalunkwe bidliet fil-parti respiratorja ta’ fuq u t’isfel. It-tibdil patoloġiku kbir għandu jiġi rrekordjat. Fejn hu indikat, għandhom jittieħdu t-tessuti għall-eżaminazzjoni ħispatoloġika.
         2.   DATA
         Id-data għandha tkun miġbura u mqassra f’għamla tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, il-ħin tal-mewt ta’ l-annimali, in-numru ta’ l-annimali li għandhom sinjali oħra ta’ tossiċità, id-deskrizzjoni ta’ l-effetti tossiċi u s-sejbiet ta’ nekropsija It-tibdiliet fil-piż iridu jiġu kkalkulati u rrekordjati meta l-annimali jgħixu iktar minn jum wieħed. Dawk l-annimali li jmutu b’mod uman minħabba tbatija li compound-related u minħabba l-uġigħ jiġu rrekordjati bħala mwiet compound-related. L- LC50 għandu jiġi determinat permezz ta’ metodu rikonoxxut. L-evalwazzjoni tad-data għandha tinkludi r-relazzjoni, jekk ikun hemm, bejn l-espożizzjoni ta’ l-annimal għas-sustanza tat-test u l-okkorrenza u l-gravità ta’ l-anormalitajiet kollha nklużi l-anormalitajiet kliniċi u fl-imġiba, feriti, tibdil fil-piż tal-ġisem, mortalità u effetti tossiċi oħra.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     l-ispeċi, is-silta, is-sorsi, il-kundizzjonijiet ambjentali, id-dieta, eċċ.,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kundizzjonijiet tat-test: Deskrizzjoni ta’ l-apparat ta’ l-espożizzjoni, inkluż id-disinn, it-tip, il-qisien, is-sorsi ta’ l-arja, is-sistema għall-ġenerazzjoni ta’ l-aerosols, metodu għall-kondizzjonar ta’ l-arja u l-metodu taż-żamma ta’ lannimali fil-kabina tat-test, meta din tkun użata. L-apparat għall-kejl tat-temperatura, l-umdità, il-koncentrazzjonijiet ta’ l-aerosol u d-distrubuzzjoni tad-daqs tal-particelli, għandhom ikunu deskritti.
                  
               Data ta’ l-espożizzjoni:
         Dawn għandhom ikunu tabulati u preżentati mal-valuri medji u l-kejl tal-varjabbiltà (eż. devjazzjoni normali) u għandhom, meta possibbli, jinkludu:
         
                     (a)
                  
                  
                     ir-rati tal-kurrent ta’ l-arja matul l-apparat tat-teħid man-nifs;
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     it-temperatura u l-umdità ta’ l-arja;
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     il-konċentrazzjonijiet nominali (l-ammont totali tas-sustanza ta’ kif infuża fl-apparat tat-teħid man-nifs, diviża bil-volum ta’ l-arja);
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     in-natura tal-mezz, jekk użat;
                  
               
                     (e)
                  
                  
                     il-konċentrazzjonijiet attwali fiż-żona tat-teħid tan-nifs waqt it-test;
                  
               
                     (f)
                  
                  
                     Il-massa tad-dijametru erodinamiku medjan (MMAD) u d-devjazzjoni ġeometrika normali (GSD);
                  
               
                     (g)
                  
                  
                     Il-perjodu ta’ l-ekwilibrazzjoni;
                  
               
                     (h)
                  
                  
                     Il-perjodu ta’ l-espożizzjoni;
                     
                                 —
                              
                              
                                 it-tabulazzjoni tad-data ta’ rispons bil-livell tas-sess u espożizzjoni (i.e. in-numru ta’ annimali li mietu jew inqatlu waqt it-test, in-numru ta’ annimali li juru sinjali ta’ tossiċità; in- numru ta’ annimali esposti);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-ħin tal-mewt matul jew wara l-espożizzjoni, ir-raġunijiet u l-kriterji użati għall-qtil uman ta’ l-annimali,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-osservazzjonijiet kollha;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-valur LC50 għal kull sess determinat fi tmiem il-perjodu t’osservazzjoni; (bil-metodu tal-kalkulazzjoni speċifikat);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 95 % ta’ l-intervall ta’ kunfidenza għall- LC50 (fejn dan jista’ jiġi provdut);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-kurva tad-doża/mortalità (fejn hu permess bil-metodu tad-determinazzjoni);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 sejbiet tan-nekropsija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kwalunkwe sejbiet hispatoloġiċi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-diskussjoni tar-riżultati (għandha tingħata attenzjoni partikulari lill-effett li l-qtil uman ta’ l-annimali waqt it-test jista’ jkollu fuq il-valur LC50 kalkulat);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatoloġiċi kollha;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-interpretazzjoni tar-riżultati.
                              
                           
               3.2.   L-EVALWAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (D).
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (E).
         B.3.   TOSSIĊITÀ AKUTA (DERMALI)
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (A).
         1.2.   DEFINIZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (B).
         1.3.   SUSTANZI TA’ REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza tat-test tiġi applikata fuq il-ġilda f’dożi ggradwati lil bosta gruppi ta’ annimali sperimentali, doża waħda użata għal kull grupp. Sussegwentement, isiru l-osservazzjonijiet ta’ l-effetti u ta’ l-imwiet. L-annimali, li jmutu waqt it-test issirilhom in-nekropsija u fl-aħħar tat-test din issir fuq dawk l-annimali li baqgħu ħajjin.
         Jista’ jagħti l-każ li l-annimali li juru sinjali gravi u li jtulu ta’ tbatija u uġigħ jinqatlu b’mod uman. Is-sustanzi għat-test f’dożaġġi magħrufa li jikkawżaw l-uġigħ u t-tbatija minħabba proprjetajiet korrużivi jew ta’ irritazzjoni m’għandhomx għalfejn jitwettqu.
         1.5.   KRITERJI TAL-KWALITÀ
         Xejn
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.6.1.   Preparazzjonijiet
         L-annimali huma miżmuma f’fondi sperimentali u f’kundizzjonijiet ta’ l-għalf għal mill-anqas ħamest ijiem qabel l-esperiment. Qabel it-test, annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma magħżula b’mod kif jinzerta u assenjati lejn gruppi għat-trattament. Xi ftit qabel it-testijiet, il-pil huwa maqtugħ miż-żona dorsali tad-dahar ta’ l-annimali tat-test. It-tqaxxir jista’ jkun użat imma għandu jkun imwettaq madwar 24 siegħa qabel it-test. Meta jsir il-qtugħ jew it-tqaxxir tal-pil, kura għandha tittieħed sabiex ikun evitat xi grif fil-ġilda li jkunu jistgħu jibdlu l-permeabbiltà tagħha. Mhux anqas minn 10 % tal-wiċċ tal-ġisem għandu jkun imnaddaf għall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Meta jsiru testijiet tas-solidi, li jistgħu ikunu pulverizzati jekk xieraq, is-sustanza tat-test għandha tkun b’umidità suffiċjenti bl-ilma, jew, meta meħtieġ, apparat adattat sabiex jassigura kuntatt tajjeb mal-ġilda. Meta jiġi użat xi mezz, għandha tiġi kkunsidrata l-influwenza tiegħu fuq il-penetrazzjoni tal-ġilda bis-sustanza għat-test. Is-sustanzi għat-test likwidi ġeneralment jintużaw mhux maħlula.
         1.6.2.   Kundizzjonijiet tat-test
         1.6.2.1.   Annimali sperimentali
         Firien jew fniek, jew fniek ta’ l-indi adulti jistgħu jintużaw. Speċje oħrajn jistgħu jiġu użati imma l-użu tagħhom ikun jeħtieġ ġustifikazzjoni. Għandhom jintużaw karatteristiċi tal-laboratorju użati b’mod komuni. Fil-bidu ta’ kull test, il-medda tal-varjazzjoni fil-piż ta’ l-annimali użati m’għandhiex teċċedi ± 20 % tal-valur medju kif xieraq.
         1.6.2.2.   Numru u sess.
         Mill-anqas 5 annimali huma użati f’kull livell tad-doża. Iridu jkunu ta’ l-istess sess. Jekk jintużaw dawk femminili, dawn qatt ma jkunu welldu u mhumiex tqal. Fejn l-informazzjoni hija disponibbli li turi li s-sess partikulari huwa iktar sensittiv, l-annimali ta’ dan is-sess għandhom jingħataw id-doża.
         
            Nota: F’testijiet ta’ tossiċità akuta b’annimali t’ordni ogħla minn tal-gerriema, l-użu ta’ numri iżgħar għandu jiġi kkunsidrat. Id-dożi għandhom jingħażlu bl-attenzjoni, u għandu jsir kull sforz sabiex id-dożi li huma xi ftit tossiċi ma jinqabżux. F’testijiet bħal dawn, l-amministrazzjoni tad-dożi letali tas-sustanza għat-test għandha tiġi evitata.
         1.6.2.3.   Livelli tad-doża
         Dawn għandhom ikunu biżżejjed bħala numru, mill-inqas tlieta, u spazjati b’mod xieraq sabiex jipproduċu gruppi ta’ test b’medda ta’ effetti tossiċi u rati ta’ mortalità. Kwalunkwe effetti korrużivi jew ta’ irritazzjoni għandhom jiġu kkunsidrati meta jiġu deċiżi l-livelli tad-doża. Id-data għandha tkun biżżejjed biex tipproduċi kurva li turi d-doża/ir-rispons u, fejn hu possibbli, tippermetti determinazzjoni aċċettabbli ta’ l- LD50
         
         1.6.2.4.   Test ta’ limitazzjoni
         Test ta’ limitu f’livell wieħed ta’ doża ta’ mill-inqas 2 000 mg/kg ta’ piż tal-ġisem jista’ jitwettaq fi gruppi ta’ 5 annimali maskili u 5 femminili, bl-użu tal-proċeduri deskritti hawn fuq. Jekk ikun hemm mortalità compound-related jista’ jiġi kkunsidrat studju sħiħ.
         1.6.2.5.   Perijodu ta’ l-Osservazzjoni
         Il-perjodu ta’ osservazzjoni għandu jkun ta’ mill-inqas 14-il jum. Madankollu, it-tul ta’ l-osservazzjoni m’għandux ikun issettjat strettament. Għandu jkun determinat mir-reazzjonijiet tossiċi, ir-rata ta’ onset tagħhom u t-tul tal-perjodu ta’ rkupru, u għalhekk jista’ jiġi estiż jekk ikun meħtieġ. Il-ħin li fih is-sinjali tat-tossiċità jidhru u jisparixxu, iż-żmien li jieħdu u l-ħin tal-mewt huma importanti, speċjalment jekk ikun hemm it-tendenza li jtulu l-imwiet.
         1.6.3.   Il-proċedura
         L-annimali għandhom jinżammu f’gaġeġ individwali. Is-sustanza għat-test għandha tiġi applikata b’mod uniformi fuq żona, li hija bejn wieħed u ieħor 10 % taż-żona totali tal-wiċċ tal-ġisem B’sustanzi ferm tossiċi, iż-żona tal-wiċċ koperta tista’ tkun anqas imma kemm jista’ jkun miż-żona għandha tkun koperta b’saff irqieq u uniformi kemm jista’ jkun possibbli
         Matul l-24 siegħa tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni s-sustanza tat-test tinżamm f’kuntatt mal-ġilda b’garża poruża u faxxa mhux irritanti.Is-sit tat-test għandu jkun aktar kopert b’mod xieraq sabiex iżomm il-faxxex bil-garża u s-sustanza tat-test u jassiguraw li l-annimali ma jkunux jistgħu jilgħaqu u jieklu s-sustanza tat-test. Restrizzjonijiet jistgħu jintużaw sabiex jipprevjenu l-inġestjoni tas-sustanza tat-test, imma l-immobilizzazzjoni kompleta mhix metodu rakkommandat.
         Fi tmiem il-perjodu ta’ l-espożizzjoni, għandhom jitneħħew ir-residwi tas-sustanza għat-test, fejn hu prattikabbli, permezz ta’ l-ilma jew xi metodu xieraq ieħor ta’ tindif tal-ġilda.
         L-osservazzjonijiet għandhom jiġu rrekordjati sistematikament kif isiru. Ir-rekords individwali għandhom jinżammu għal kull animal. L-osservazzjonijiet għandhom isiru ta’ spiss fl-ewwel jum. Eżaminazzjoni klinika bil-galbu għandha ssir mill-inqas darba kull ġurnata ta’ xogħol, l-osservazzjonijiet l-oħra għandhom isiru kuljum b’azzjonijiet xierqa sabiex jiġi minimizzat it-telf ta’ annimali mill-istudju eż. In-nekropsija jew ir-refriġerazzjoni ta’ dawk l-annimali li jinstabu mejta u l-iżolament jew il-qtil ta’ annimali dgħajfa jew li qed imutu.
         L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u l-pil, fl-għajnejn u membrani mukożji, u anki fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tas-sistema ċentrali tan-nervituri; l-attività somatomotori u l-istil ta’ l-imġiba. Għandha tingħata attenzjoni partikulari għall-osservazzjoni ta’ tkexkix, konvulżjonijiet, ir-rieq, dijareja, il-letarġija, l-irqad u l-koma. Il-ħin tal-mewt għandu jiġi rrekordjat kemm jista’ jkun bl-eżatt. L-annimali li jmutu waqt it-test u dawk li jibqgħu ħajjin fi tmiem it-test huma suġġetti għan-nekropsija. It-tibdil kollu patoloġiku kbir għandu jiġi rrekordjat. Fejn hu indikat, it-tessuti għandhom jittieħdu għall-eżaminazzjoni ħispatoloġika.
         Valutazzjoni tat-tossiċità fis-sess l-ieħor.
         Wara tmiem l-istudju ta’ sess wieħed, mill-inqas grupp wieħed ta’ 5 annimali tas-sess l-ieħor jingħata d-doża biex jiġi stabbilit li l-annimali ta’ dan is-sess mhumiex iktar sensittivi għas-sustanza tat-test. L-użu ta’ inqas annimali jista’ jkun ġustifikat f’ċirkostanzi individwali. Fejn hemm informazzjoni xierqa disponibbli li turi li l-annimali tas-sess li qed jiġi ttestjat huma iktar sensittivi, l-ittestjar fuq l-annimali tas-sess l-ieħor jista’ ma jsirx.
         2.   DATA
         Id-data għandha tkun riassunta f’għamla tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, il-ħin tal-mewt ta’ l-annimali individwali, in-numru ta’ l-annimali li juru sinjali oħra ta’ tossiċità, id-deskrizzjoni ta’ l-effetti tossiċi u s-sejbiet ta’ nekropsija. Il-piżijiet individwali ta’ l-annimali għandhom jiġu determinati u rrekordjati ftit qabel is-sustanza għat-test tiġi applikata. Wara, dan isir kull ġimgħa u mal-mewt it-tibdiliet fil-piż għandhom jiġu kkalkulati u rrekordjati meta l-annimali jibqgħu ħajjin sa ġurnata wara. L-annimali li jiġu maqtula b’mod uman minħabba t-tbatija u l-uġigħ li huma compound related huma rrekordjati bħala mwiet compound-related. L-LD50 għandu jiġi determinat minn metodu rikonoxxut.
         Il-valutazzjoni tad-data għandha tinkludi l-valutazzjoni tar-relazzjonijiet, jekk ikun hemm, bejn l-espoħizzjoni ta’ l-annimali għas-sustanza tat-test u l-okkorrenza u l-gravità ta’ l-anormalitajiet kollha, inklużi dawk ta’ imġiba u dawk kliniċi, feriti kbar, tibdil fil-piż tal-ġisem, il-mortalità u kwalunkwe effetti tossiċi oħra.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk inhu possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     l-ispeċje, is-silta, is-sors, il-kundizzjonijiet ambjentali, dieta, eċċ.;
                  
               
                     —
                  
                  
                     kundizzjonijiet tat-test (inklużu t-tip ta’ faxex: okklussivi jew mhux okklussivi);
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-livelli tad-doża (inkluż il-mezz, jekk użat, u l-konċentrazzjoninijiet);
                  
               
                     —
                  
                  
                     is-sess ta’ l-annimal li qed jingħata d-doża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-tabulazzjoni tad-data ta’ rispons tas-sess u l-livell tad-doża (i.e. in-numru ta’ l-annimali li mietu jew inqatlu waqt it-test; in-numru ta’ annimali li juru sinjali ta’ tossiċità; in-numru ta’ annimali esposti);
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin tal-mewt wara d-dożaġġ, ir-raġunijiet u l-kriterji użati għall-qtil b’mod uman ta’ l-annimali;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-osservazzjonijiet kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-valur LD50 għas-sess suġġett għal studju komplet, determinat f’14-il jum bil-metodu ta’ determinazzjoni speċifikat;
                  
               
                     —
                  
                  
                     95 % ta’ l-intervall ta’ kunfidenza għall- LD50 (fejn dan huwa provdut);
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-kurva li turi id-doża/il-mortalità fejn hu permess bil-metodu tad-determinazzjoni
                  
               
                     —
                  
                  
                     Is-sejbiet tan-nekropsija;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Kwalunkwe sejbiet ħispatoloġiċi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Ir-riżultati ta’ kwalunkwe test fuq is-sess l-ieħor;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-diskussjoni tar-riżultati (b’attenzjoni partikulari għall-effett li l-qtil b’mod uman ta’ l-annimali jista’ jkollu fuq il-valur kalkulat LD50);
                  
               
                     —
                  
                  
                     L-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (D).
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (E).
         B.4.   TOSSIĊITÀ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRUŻJONITAL-ĠILDA
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa ekwivalnti għal OECD TG 404 (2002)
         1.1   INTRODUZZJONI
         Fil-preparazzjoni ta' dan il-metodu aġġornat, attenzjoni speċjali kienet mogħtija għat-titjib possibbli b'relazzjoni ma dak li jikkonċerna l-ġid ta' l-annimali u ta' l-evalwazzjoni ta' l-informazzjoni eżistenti kollha dwar is-sustanza tat-test sabiex ikunu evitati testijiet mingħajr ħtieġa ta' l-annimali fil-laboratorju. Dan il-metodu jinkludi r-rakkommandazzjonijiet li qabel ma jibda l-impenn deskritt għat-test in vivo dwar il-korrużjoni/irrirtazzjoni tas-sustanza, l-analiżi ta' l-evidenza peżata għandu jkun imwettaq skond id-dettalji relevanti eżistenti. Meta d-disponabbiltà ta' dettalji mhux suffiċċjenti, dawn jistgħu ikunu żviluppati permezz ta' l-applikazzjoni ta' testijiet sekwenzali (1). L-istrateġija tat-testijiet tinkludi t-twettieq ta' testijiet validati u aċċettabbli ta' in vitro u kemm provvediment dwarha bħala Anness ta' dan il-metodu. B'żieda, meta xieraq, l-applikazzjoni suċċessiva, minflok simultanja, tat-tlett impjastri tat-test fuq l-annimal, fit-test inizjali in vivo, hija rakkommandata.
         Fl-interess kemm ta' xjenza għaqlija u tal-ġid ta' l-annimali, testijiet in vivo m'għandhomx iseħħu qabel ma d-dettalji relevanti disponibbli kollha dwar il-potenzal ta' korrossività/irritazzjoni tal-ġilda mis-sustanza jkunu ġew evalwati b'analiżi tal-peżar bl-evidenza. Tali dettalji għandhom jinkludu evidenza minn studju eżistenti kemm fuq il-bnedmin u/jew l-annimali tal-laboratorju, l-evidenza ta' korrossività/irritazzjoni ta' sustanza waħda struttarament relatati u it-taħlitiet ta' tali sustanzi, id-dettalji li juru aċidità jew alkalinità qawwija tas-sustanza (2) (3), u r-riżultati minn testijiet validati u aċċettati kemm in vitro jew ex vivo (4) (5) (5a). Din l-analiżi għandha tnaqqas il-ħtieġa ta' testijiet in vivo dwar is-sustanzi b'korrossività/irritazzjoni tal-ġilda li dwarha evidenza suffiċjenti tkun diġa eżistenti minn studju oħrajn rigward iż-żewġ għanijiet aħħarija.
         Strateġija preferuta sekwenzali ta' testijiet, li tinkludi t-twettieq ta testijiet validati u aċċettabbli, in vitro jew ex vivo, dwar il-korrożjoni/irritazzjoni, hija inkluża bħala Anness għal dan il-metodu. L-istrateġija kienet żviluppata fi, u rakkommandata b'mod unanimu, mill-parteċipanti ta' laqgħa ta' studju ta' l-OECD (6), u kienet ġiet adottata bħala l-istrateġija rakkommandata tat-testijiet fis-Sistema Armonizzata Globali għall-Klassifika ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) (7). Huwa rakkommandabbli li din l-istrateġija tat-testijiet tkun segwita qabel ma jindew xi testijiet in vivo. Għal sustanzi ġodda huwa rakkommandabbli r-resqien ta' testijiet pass b'pass għall-iżvilupp ta' informazzjoni xjentifikament soda dwar il-korrosività/irritazzjoni mis-sustanza. Għal sustanzi eżistenti b'informazzjoni mhux suffiċjenti dwar il-korrożjoni/irritazzjoni tal-ġilda, l-istrateġija għanha tkun użata sabiex timla l-vojt fin-nuqqas tad-dettalji. L-użu ta' strateġija jew proċedura differenti tat-testijiet, jew ta' deċiżjoni li ma jkunx utilizzat it-test ta' pass b'pass, għandha tkun ġustifikata.
         Jekk determinazzjoni tal-korrossività jew irritazzjoni ma tkuns tista’ ssir bl-użu ta' l-analiżi tal-peżar ta' l-evidenza, konsistenti mal-istrateġija sekwenzali tat-testijiet, test in vivo għandu jkun ikkonsidrat (ara l-Anness).
         1.2   DEFINIZZJONIJIET
         
            Irritazzjoni dermali (tal-ġilda): Hija l-produzzjoni ta' ħsara riversibbli tal-ġilda bħala segwiment ta' l-applikazzjoni ta' sustanza tat-test għal 4 siegħat.
         
            Korrożjoni dermali (tal-ġilda): Hija l-produzzjoni ta' ħsara irrevirsibbli tal-ġilda nekrożi viżibbli mill-epidermis u sa ġewwa d-dermis, bħala segwiment ta' l-applikazzjoni ta' sustanza tat-test għal sa 4 siegħat. Ir-reazzjonijiet korrossivi huma tipifikati b'ulċeri, nixxija ta' demm, qoxra bid-demm, u, fit-tmiem ta' l-osservazzjoni matul 14-il jum, b'tibdil tal-kulur minħabba l-bjudija tal-ġilda, żoni sħaħ bi alopecia u farretti. Il-ħispatoloġija għandha tkun ikkonsidrata sabiex tevalwa feriti dubbjużi.
         1.3   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza li għandha tkun ittestjata hija applikata f'doża singola mal-ġilda ta' annimal sperimentli; żoni tal-ġilda mhux trattati ta' l-annimal tat-test iservu għall-kontroll. Il-grad tal-korrożjoni/irritazzjoni ikun moqri u rreġistrat matul intervalli speċifiċi u jkun aktar deskritt sabiex jipprovdi evalwazzjoni sħiħa ta' l-effetti. It-tul ta' żmien ta' l-istudju għandu jkun suffiċjenti sabiex tkun evalwata r-riversabbilità jew in-nuqqas ta' riversabbilità ta' l-effetti osservati.
         L-annimali li juru sinjali kontinwi ta' dwejjaq u/jew uġiegħ severi, fi kwalunkwe waqt tat-test, għandhom ikunu maqtula b'mod umanitarju, u s-sustanza tkun assessjata kif xieraq. Il-kriterja sabiex tittieħed id-deċiżjoni li jkunu maqtula b'mod umanitarju l-annimali moribondi jew li jkunu jsofru ħafna tista’ tinstgħab fir-referenza (8).
         1.4   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.4.1   Preparazzjoni tat-test in vivo
         
         1.4.1.1   L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali
         Il-fenek albino huwa l-annimal preferut tal-laboratorju, u fniek żgħażagħ adulti huma użati. Ir-raġuni għall-użu ta' speċje oħrajn għandha tkun mogħtija.
         1.4.1.2   Preparazzjoni ta' l-annimali
         Madwar 24 siegħa qabel it-test, is-suf għandu jkun imneħħi bi tqaxxir taż-żona dorsali minn fuq id-dhar ta' l-annimali. Kura għandha tingħata li jkunu evitati xi brix tal-ġilda, u biss l-anniamli li huma b'saħħithom, b'ġilda ntatta, għandhom ikunu użati.
         Uħud mit-tip tal-fniek għandhom irqajja folti ta' suf li huma aktar prominenti f'ċerti żminijiet tas-sena. Tali żoni ta' tkabbir ta' suf folt m'għandhomx ikunu użati bħala s-siti tat-testijiet.
         1.4.1.3   Il-kundizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf
         L-annimali għandhom jinzammi f'gaġġeġ individwali. It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 20 oC (± 3 oC), għall-fniek. Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu użati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb.
         1.4.2   Proċedura tat-test
         1.4.2.1   L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test
         Is-sustanza tat-test għandha tkun applikata fuq żona żgħira (madwar 6 cm2) tal-ġilda u miksija b'biċċa garża, li tinżamm fil-post bi stikk mhux irritanti. Fil-każi meta l-applikazzjoni diretta ma tkunx possibbli (eż. likwidi u ċerti dlik), is-sustanza tat-test għandha l-ewwel tkun applikata fuq biċċa garża, li imbagħad tkun applikata mal-ġilda. Il-biċċa għandha tinżamm f'kuntatt ħafif mal-ġilda permezz ta' faxxa adattata semi-okklussiva, għal matul il-perjodu ta' l-espożizzjoni. Jekk is-sustanza tat-test tkun applikata fuq biċċa, din għandha tkun imwaħħla mal-ġilda b'tali mod li jkun hemm kuntatt tajjeb u distribuzzjoni uniformi tas-sustanza mal-ġilda. Aċċess mill-annimal lejn il-biċċa, jew l-inġestjoni li t-teħid man-nifs tas-sustanza tat-test m'għandux jitħalla li jseħħ.
         Is-sustanzi likwidi huwa ġeneralment użati mingħajr ma jkunu mrattba. Meta jsiru t-testijiet ta' solidi (li jistgħu ikunu pulverizzati, jekk hekk ikun meqjus bħala meħtieġ), is-sustanza tat-test għandha tkun niedja b'ammont żgħir ilma (jew, meta meħtieġ, b'xi likwidu adattat ieħor) li jkun suffiċjenti sabiex jassigura kuntatt tajjeb mal-ġilda. Meta likwidi oħrajn apparti milli l-ilma jkunu użati, l-influwenza potenzali tal-likwidu fuq l-irritazzjoni tal-ġilda mis-sustanza tat-test għand tkun ferm minima, jekk ikun hemm.
         Fit-tmiem tal-perjodu ta' l-espożizzjoni, li normalment ikun ta' 4 siegħat, is-sustanza residwa tat-test għandha tkun imneħħija, meta prattikabbli, bl-użu ta' ilma jew b'xi solvent xieraq mingħajr ma jbiddel ir-reazzjoni eżistenti jew l-integrità ta' l-epidermis.
         1.4.2.2   Livell tad-doża
         Doża ta' 0,5 ml likwidu jew 0,5 g solidu jew dlik hija applikata maż-żona tat-test.
         1.4.2.3   It-test inizjali (It-test in vivo bl-irritazzjoni/korrożjoni dermali bl-użu ta' annimal wieħed)
         Huwa ferm rakkommandabbli li t-test in vivo jkun imwettaq inizjalment bl-użu ta' annimal wieħed, speċjalment meta s-sustanza tkun issusspetata li jkollha potenzal korrossiv. Dan huwa skond l-istrateġija tat-testijiet sekwenzali (ara l-Anness 1).
         Meta sustanza tkun ġiet iġġudikata bħala korrossiva fuq il-bażi ta' l-analiżi ta' l-evidenza peżata, l-ebda aktar testijiet fuq l-annimali ma jkunu meħtieġa. Għal bosta mis-sustanzi li huma issusspettati bħala korrossivi, aktar testijiet in vivo ma jkunux normalment meħtieġa. B'dana kollu, f'dawk il-każi meta informazzjoni addizzjonali tinħass li tkun meħtieġa minħabba l-evidenza mhux suffiċjenti, testijiet limitati ta' l-annimali jistgħu jitwettqu bl-użu ta' dan il-metodu: Sa tlett biċċiet tat-test huma applikati b'mod sekwenzali fuq l-annimal. L-ewwel biċċa tkun imneħħija wara tlett minuti. Jekk l-ebda reazzjoni tal-ġilda ma tkun osservata, it-tieni biċċa tkun applikata u mneħħija wara siegħa. Jekk l-osservazzjonijiet f'dan l-istadju jindikaw li l-espożizzjoni tista’ titħalla b'mod umanitarju, allura t-test ikun estiż għal erba' siegħat, it-tielet biċċa tkun applikata u mneħħija wara erba' siegħat, u r-reazzjoni tkun gradata.
         Jekk effett korrossiv ikun osservat wara kwalunkwe mit-tlett espżizzjonijiet sekwenzali, it-test ikun immedjetament terminat. Jekk effett korrossiv ma jkunx osservat wara li l-aħħar biċċa tkun imneħħija, l-annimal ikun osservat għal 14-il jum, sakemm il-korrożjoni ma tkunx żviluppat f'xi punt aktar kmieni.
         F'dawk il-każi li fihom is-sustanza tat-test ma tkunx mistennija li tipproduċi korrożjoni imma li tista’ tkun irritanti, biċċa waħda għandha tkun applikata ma annimal wieħed għal erba' siegħat.
         1.4.2.4   Test konfermatorju (It-test in vivo ta' l-irritazzjoni tal-ġilda b'annimali addizzjonali)
         Jekk effett korrossiv ma jkunx osservat fit-test inizjali, l-irritant jew ir-reazzjoni negattiva għandhom ikunu ikkonfermati bl-użu ta' żewġ annimali oħrajn, kull wieħed b'biċċa waħda, għal perjodu ta' espożizzjoni ta' erba' siegħat. Jekk effett irritanti jkun osservat fit-test inizjali, it-test konfermatorju jista’ jitwettaq b'mod sekwenzali, jew bl-espożizzjoni ta' żewġ annimali simultanjament. Fil-każ eċċezzjoni, li fih it-test inizjali ma jkunx imwettaq, tnejn jew tlett annimali jistgħu ikunu ittrattati b'biċċa waħda, li tkun imneħħija wara erba' siegħat. Meta żewġ annimali huma użati, jekk it-tnejn li huma juru l-istess reazzjoni, l-ebda testijiet oħrajn ma huma meħtieġa. Inkella, it-tielet annimal ikun ukoll ittestjat. Reazzjonijiet ekwoviċi ikunu jeħtieġu avalwazzjoni bl-użu ta' annimali addizzjonali.
         1.4.2.5   Perijodu ta' osservazzjoni
         It-tul ta' żmien ta' l-istudju gġandu jkun suffiċjenti sabiex tkun evalwata r-riversabbiltà jew in-nuqqas ta' riversabbiltà ta' l-effetti osservati. B'dana kollu l-esperiment għandu jkun terminat fi kwalunkwe ħin jekk dak l-annimal ikollu sinjali kontinwi ta' uġiegħ jew tbagħtija qawwija. Sabiex ikunu determinati l-effetti tar-riversabbilità, l-annimali għandhom ikunu osservati sa 14-il jum wara t-tneħħija tal-biċċiet. Jekk l-irriversibbiltà tkun osservata qabel l-14-il jum, l-esperiment għandu jkun imwaqqaf f'dak il-waqt.
         1.4.2.6   Osservazzjonijiet kliniċi u l-iggradar tar-reazzjonijiet tal-ġilda
         L-annimali kollha għandhom ikunu eżaminati għal sinjali ta' eritema u odema, u r-reazzjoni rreġistrati wara 60 minuta, u imbagħad fi 24, 48 u 72 siegħa, wara t-tneħħija tal-biċċa. Għattest inizjali fuq annimal wieħed, is-sit tat-test ikun ukoll eżaminat immedjetament wara li l-biċċ tkun imneħħija. Ir-reazzjoni dermali huma ggradati u rreġistrati skond il-gradi fit-tabella ta' hawn taħt. Jekk ikun hemm ħsara għall-ġilda li ma tistgħax tkunidentifikata bħala irritazzjoni jew korrożjoni wara 72 siegħa, l-osservazzjonijiet jistgħu ikunu meħtieġa sal-jum 14 sabiex tkun determinata r-riversibbiltà ta' l-effetti. B'żieda ma l-osservazzjonijiet ta' l-irritazzjoni, l-effetti tossiċi kollha, bħal ma huma n-nuqqas ta' xaħam min taħt il-ġilda, u xi effett kuntrarji sistematiċi (eż. l-effetti fuq sinjali kliniċi ta' tossiċità u l-piż tal-ġisem), għandhom ikunu deskritti bis-sħiħ u rreġistrati. L-eżaminazzjoni ħistoġatoloġika għandha tkun ikkonsidrata sabiex tikklarifika r-reazzjonijiet b'mod ekwivoku.
         Il-gradar tar-reazzjonijiet tal-ġilda hija neċċessarjament suġġestiva. Sabiex tkun imħġeġġa l-armonizzazzjoni fil-gradar tar-reazzjoni tal-ġilda u sabiex ikunu mgħejjuna l-laboratorji tat-testijiet u dawk involuti fiż-żamma ta' l-osservazzjonijiet u ta' l-interpretazzjoni tagħhom, il-persunal li jwettaq l-osservazzjonijiet jeħtieġu li jkunu adekwatament imħarrġa fis-sistema ta' l-iggradat kif użata (ara t-Tabella ta' hawn taħt). Gwida illustrata dwar l-iggradar ta' l-irritazzjoni tal-ġilda u feriti oħrajn tista’ tkun ta' għajnuna (9).
         2.   DATA
         2.1   PREŻENTAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Ir-riżultati ta' l-istudju għandhom ikunu miġbura f'sommarju f'għamla tabulari fir-rapport finali tat-test u għandhom ikopru l-punti kollha elenkati fis-sezzjoni 3.1.
         2.2   EVALWAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Il-marki ta' l-irritazzjoni dermali għandhom ikunu evalwati b'konnessjoni man-natura u s-severità tal-feriti, u r-riversibbilità tagħhom, jew tan-nuqqas ta' riversibbilità. Il-marki individwali ma jkunux jirrapreżentaw norma assoluta għall-propjetajiet irritanti ta' xi materjaa, minħabba li effetti oħrajn tal-materjal taat-test huma wkoll evalwati. Minflok, marki individwali għandhom ikunu meqjusa bħala valuri ta' referenza, li jeħtieġu li jkunu evalwati flimkien ma l-osservazzjonijiet l-oħrajn kolha li jirriżultaaw mill-istudju.
         Ir-riversibbilità tal-feriti dermali għandha wkoll tkun ikkunsidrata fl-evalwazzjoni tar-reazzjoni irritanti. Meta r-reazzjonijiet bħal ma huma l-alopeċja (żoma limitat), iperkeratożi, iperplażja u qxur, jippersistu fit-tmiem talk-perjodu ta' 14-il jum osservazzjoni, is-sustanza tat-test għandha tkun meqjusha bħala irritanti.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Raġġunar dwar it-test in vivo: Analiżi ta' l-evidenza mal-piż ra' informazzjoni pre-eżistenti qabel it-test, inklużi r-riżultati minn strateġija ta' testijiet sekwenzali:
                     
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni tad-dettalji relevanti disponibbli minn testijiet preċedenti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni akkwistat f’kull stadju ta’ l-istrateġija ta’ l-ittestjar;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni tat-testijiet in vitro kif imwettqa, inklużi d-dettalji tal-proċeduri, ir-riżultati akkwistati bis-sustanza tat-test/referenza;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 analiżi ta’ l-evidenza peżata għat-twettieq ta’ l-istudju in vivo.
                                 
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Is-sustanza tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta’ l-identifikazzjoni (eż. numru CAS; sorsi; purità; impuritajiet magħrufa; n-numru tal-lot);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-natura fiżika u l-propjetajiet fiżikokimiċi (eż. pH, volatilità, solubilità, stabbilità);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 jekk taħlita, il-komposizzjoni u l-persentaġġi relattivi tal-komponenti.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Mezz:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-identifikazzjoni, il-konċentrazzjoni (meta xieraq), il-volum użat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-ġustifikazzjoni tal-mezz użat.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Annimali tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-ispeċji/tipi użati, ir-raġjunar għall-użu ta’ l-annimali apparti milli fniek albino;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru ta’ l-annimaali għal kull sess;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piżijiet ta’ l-annimali individwali, kemm fil-bidu u wkoll fil-konklużjoni tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-età fil-bidu ta’ l-istudju;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, eċċ.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 it-teknika taal-preparazzjoni tas-sit tal-biċċa;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tal-materjali użat fil-biċċa u t-teknika tat-twaħħil tal-biċċa;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-preparazzjoni, l-applikazzjoni u t-tneħħija tas-susstanza tat-test.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 tabulazzjoni tal-marki tar-reazzjoni/korrożjoni għal kull annimal fil-punti kollha tal-ħin tal-kejl;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjonijiet tal-feriti kollha, kif osservati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni narrattiva tan-natura u l-grad ta’ l-irritazzjoni jew tal-korrożjoni osservati, u xi sejbiet ħistopatoloġiċi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-deskrizzjoni ta’ xi Danni lokali oħrajn (eż. tneħħija tax-xaħam minn taħt il-ġilda) u l-effetti sistematiċi b’żieda ma l-irritazzjoni jew il-korrożjoni dermali.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Diskussjoni tar-riżultati.
                              
                           
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In vitro, 2, 19-26.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     ECETOC (1990) Monograph No. 15, “Skin Irritation”, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). 1. L-istudju ECVAM tal-validazzjoni internazzjonali dwar testijiet in vitro għall-korrossività tal-ġilda. 2. Ir-riżultati u l-evalwazzjoni mill-Grupp Amministrattiv Toxicology in vitro 12, pp. 483-524.
                  
               
                  
                     (5a)
                  
                  
                     Metodu tat-test B.40, Korrożjoni tal-Ġilda
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Programm ta’ Linji ta’ Gwida għat-Test OECD (1996): Rapport Finali tal-Grupp ta’ Studju OECD dwar l-Armonizzazzjoni tal-Validazzjoni u l-Aċċettazzjoni tal-Kriterja dwar Metodi Alternattivi għal-Testijiet Tossikoloġiċi. Li kien inżamm fi Solna, l-Isvezjam fit-22 – 24 ta’ Jannar 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     OECD (1998), Is-Sistema tal-Klassifika Integrata Armonizzata tal-Perikoli għas-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kumiċi, kif approvat mit-28 Laqgħa Konġunta tal-Kumitat tal-Kimika u tal-Grupp ta’ Ħidma dwart il-Kimika, Novembru 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     OECD (2000). Dokument ta’ Gwida dwar ir-Rikonoxximent, l-Assessjar u l-Użu ta’ Sinjali Kliniċi bħala għanijiet finali umanitarji għall-annimali Sperimenti Użati fl-Evalwazzjoni tas-Sigurtà. OECD, Pubblikazzjonijiet dwar is-Saħħa u s-Sigurtà Ambjentali. Serje dwar it-Testijiet u l-Assessjar Nru. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     EPA (1990). Atlas tal-Feriti Dermali, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. ;
                     (Disponibbli ma talba minn għand is-Segretarjat ta’ l-OECD).
                  
               Tabella I
         IGGRADAR TAR-REAZZJONIJIET TAL-ĠILDA
         
            Il-Formazzjoni ta’ l-Eritema u l-Eskar
         
         
                     L-ebda eritema …
                  
                  
                     0
                  
               
                     Eritema ferm ħafifa (bill-kemm tidher) …
                  
                  
                     1
                  
               
                     Eritema definita sewwa …
                  
                  
                     2
                  
               
                     Eritima moderata jew severa …
                  
                  
                     3
                  
               
                     Eritema severa (ħmura ta’ laħam nej) għall-formazzjoni ta’ l-eskar għall-prevenzjoni ta’ l-eritema gradata …
                  
                  
                     4
                  
               Massimu possibli: 4
         
            Formazzjoni ta’ l-odema
         
         
                     L-ebda oredma …
                  
                  
                     0
                  
               
                     Odema ferm ħafifa (bill-kemm tidher) …
                  
                  
                     1
                  
               
                     Odema ħafifa (it-trufijiet taż-żona definiti sewwa b’ħanek definit) …
                  
                  
                     2
                  
               
                     Odema moderata (imqabbża b’madwar 1 mm) …
                  
                  
                     3
                  
               
                     Odema severa (imqabbża b’aktar minn 1 mm u testendi lil hinn miż-żona esposta) …
                  
                  
                     4
                  
               Massimu possibli: 4
         L-eżaminazzjoni ħistoġatoloġika għandha titwettaq sabiex tikklarifika r-reazzjonijiet b’mod ekwoviku.
         
            ANNESS
            Strateġija ta' testijiet Sekwenzali dwar l-Irritazzjoni u l-Korrożjoni ta' l-Għajnejn
            KONSIDERAZZJONIJIET ĠENERALI
            Fl-imnteressi ta' xjenza soda u l-ġid ta' l-annimali, huwa importanti li jkun evitat l-użu bla bżonn ta' l-annimali, u jkun imnaqqas it-testjar li aktar jipproduċi reazzjonijiet serveri fl-annimali. L-informazzjoni kollha dwar sustanza relatata mal-potenzal tagħha ta' l-irritazzjoni/korrożjoni okulari għandha tkun evalwata bil-quddiem qabel ma jkunu ikkonsidrati t-testijiet in vivo. Evidenza suffiċjenti tista' tkun diġa teżisti sabiex tikklassifika sustanza tat-test dwar l-irritazzjoni ta' l-għajnejn jew tal-potenzal tal-korrożjoni mingħajr il-ħtieġa li jkunu mwettqa testijiet fuq l-annimali tal-laboratorju. Għalhekk, l-utiliżżażżjoni ta' l-analiżi peżata bl-evidenza u l-istrateġija sussegwenti tat-testijiet għandha tnaqqas il-ħtieġa ta' testijiet in vivo, speċjalemnt jekk is-sustanza aktarx li tipproduċi reazzjonijiet severi.
            Huwa rakkommandabbli li l-analiżi ta' l-evidenza peżata tkun użata għall-evalwazzjoni ta' l-informazzjoni eżistenti li tappartieni għas-sustanzi ta' l-irritazzjoni u l-korrożjoni ta' l-għajnejn u sabiex tiddetermina jekk studju addizzjonali, apparti milli l-istudji in vivo fuq l-għajnejn, għandhom ikun u mwettqa sabiex jgħinu dwar il-karatteristiċi ta' tali potenzal. Meta aktar studji huma meħtieġa, huwa rakkommandabbli li l-istrateġija ta' testijiet sekwenzali tkun utilizzata sabie tiżviluppa d-dettalji sperimentali relevanti. Għal sustanzi li ma jkollhom l-ebda storja ta' testijiet, l-istrateġija tat-testijiet sekwenzali għandha tkun utilizzata sabiex jiżviluppa l-informazzjoni meħtieġa għall-evalwazzjoni tal-korrożjoni/irritazzjoni tagħha fuq l-għajnejn. L-istrateġija tat-testijiet deskritta f'dan l-Anness kienet ġiet żviluppata minn grupp ta' ħidma tal-OECD (1). Kienet sussegwentament ikkonfermata u mkabbra fis-sistema tal-Klassifa Armonizzata Integrata dwar is-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kimiċi, kif ikkonfermata bit-28 Laqgħa Konġunta tal-Kumitat tal-Kimiċi u tal-Grupp ta' Ħidma dwar il-Kimiċi, f'Novembru 1998 (2).
            Għalkemm din l-istrateġija tat-testijiet mhix parti integrali tal-metodu tat-testijiet B.5, din tesprimi r-resqien rakkommandat għad-determinazzjoni tal-propjetajiet ta' l-irritazzjoni/korrożjoni ta' l-għajnejn. Dan ir-resqien jirrapreżenta kemm l-aħjar prassi u l-mira etika dwar testijiet in vivo ta' l-irritazzjoni korrożjoni ta' l-għajnejn. Il-metodu tat-testijiet jipprovdi gwida għat-twettieq tat-test in vivo u sommarji u fatturi li għandhom ikunu ndirizzati qabel ma jkun ikkonsidrat tali test. L-istrateġija tat-testijiet sekwenzali tipprovdi r-resqien ta' l-evidenza peżata għall-evalwazzjoni ta' informazzjoni eżistenti dwar il-propjetajiet ta' l-irritazzjoni/kjorrożjoni ta' l-għajnejn, ta'sustanza, u tar-resqien imtarraġ għall-ġenerazzjoni ta' l-informazzjoni relevanti dwar sustanzi li dwarhom studju addizzjonali huma meħtieġa jew li dwarhom l-ebda studji ma kienu twettqu. L-istrateġija tinkludi it-twettieq, l-ewwel ta' testijiet tal-validazzjoni u l-aċċettazzjoni in vitro jew ex vivo, u imbagħad il-metodu tat-test B.4 ta' studji dwar l-irritazzjoni/korrożjoni tal-ġilda skond iċ-ċirkostanzi speċifiċi (3) (4).
            DESKRIZZJONI TA' L-ISTRATEĠIJA GĦAL TESTIJIET PASS B'PASS
            Qabel ma jitwettqu t-testijiet bħala parti mill-istrateġija tat-testijiet sekwenżjali (il-Figura), l-informazzjoni disponibbli kollha għandha tkun evalutata għad-determinazzjoni tal-ħtieġa tat-testijiet in vivo fuq l-għajnejn. Għalkemm informazzjoni sinifikanti tista' tkun akkwistata mill-evalwazzjoni ta' parametri singoli (eż. pH estrema), it-totalità ta' l-informazzjoni eżistenti għandha tkun assessjata. L-informazzjoni relevanti kollha dwar l-effetti tas-sustanza f'dak il-każ, u ta' l-analogi strutturali tagħha, għandhom ikunu evalutati fit-teħid tad-deċiżjoni ta' l-evidenza peżata, u r-raġjunar għad-deċiżjoni għandu jkun ippreżentat. L-emfasi primarja għandha tkun fuq l-informazzjoni jmana u ta' l-annimali eżistenti risward is-sustanza, segwita bl-eżitu tat-testijiet in vitro jew ex vivo. L-istudji in vivo ta' sustanzi korrosivi għandhom ikunu evitati, kull meta jkun possibbli. Il-fatturi meqjusa għall-istrateġija tat-testijiet, jinkludu:
            
               Evalwazzjoni ta' l-informazzjoni eżistenti, umana u ta' l-annimali (il-Pass 1). Informazzjoni eżistenti umana, eż. studji kliniċi u okkupazzjonali, u rapporti dwar il-każ, u/jew informazzjoni minn testijiet fuq l-annimali minn studji okulari għandhom ikun ikkunsidrata bħala l-ewwel ħaġa, minħabba li dawn jipprovdu informazzjoni relatata direttament ma l-effetti fuq l-għajnejn. Wara dan, l-informazzjoni disponibbli mill-istudji umani u/jew ta' l-annimali, li jinvestigaw korrożjoni/irritazzjoni dermali, għandhom ikunu evalutati. Sustanzi b'korrossività magħrufa jew ta' irritazzjoni severa, fuq l-għajnejn, m'għandhomx ikunu imdeffsa fuq l-għajnejn ta' l-annimali, u l-anqas m'għandhom is-sustanzi li juru effetti korrossivi jew irritanti fuq il-ġilda; tali sustanzi għandhom ikunu meqjusa bħala korrossivi u/jew irritanti għall-għajnejn, ukoll. Sustanzi b'evidenza suffiċjenti ta' non-korrossività u non-irritazzjoni, minn studji okulari preċedenti diġa mwettqa, għandhom ukoll ma jkunux ittestjati fi studji in vivo fuq l-għajnejn.
            
               Analiżi tar-relazzjonijietta’ l-attività strutturali (SAR) (il-Pass 2). Ir-riżultati tat-testijiet ta' kimika strutturalment relatata għandhom ikunu ikkunsidrati, jekk disponibbli. Meta informazzjoni, umana u/jew ta' l-annimali, suffiċjenti, tkun disponibbli dwar sustanzi jew taħlitiet strutturalment relatati ta' tali sustanzi li jindikaw il-potenzal tal-korrożjoni/irristazzjoni ta' l-għajnejn, dan għandu jkun present li s-sustanza tat-test tkun sejra tipproduċi l-istess reazzjonijiet. F'dawk il-każi, is-sustanza ma jkunx hemm ħtieġa tat-test tagħha. Informazzjoni negattiva mill-istudji tas-sustanzi strutturalment relatati jew minn taħlitiet ta' tali sustanzi ma tkunx tikkostitwixxi evidenża suffiċjenti tan-non-korrosività/non-irrittabbilità ta' sustanza permezz ta' l-istrateġija tat-testijiet sekwenzali. Ir-resqien SAR validat u aċċettat għandu jkun użat sabiex jidentifika l-korrożjoni u l-irrirtazzjoni potenzali kemm ta' l-effett dermali u wkoll okulari.
            
               Propjetajiet fiżikokimiċi u r-reattivazzjoni kimika (il-Passa 3). Is-sustanzi li jesebixxu pH estremi bħal ma huma ≤ 2,0 jew ≥ 11,5 jistgħu ikollhom effetti lokali ferm qawwija. Jekk il-pH estrema hija l-bażi għall-identifikazzjoni ta' sustanza bħala korrossiva jew irritanti għall-għajnejn, allura ir-riserva aċida/alkalina tagħha (il-kapaċità mewwieta) tista' wkoll tkun ikkunsidrata (5) (6). Jekk il-kapaċità mewwieta tissuġġerixxi lki sustanza ma tistgħax tkun korrossiva għall-għajnejn, allura aktar testijiet għandhom ikunu mwettqa sabiex jikkonfermaw dan, preferibbilment bl-użu ta' test in vitro jew ex vivo validat u aċċettat (ara s-sezzjoni, il-pass 5 u 6).
            
               Konsiderazzjoni ta' informazzjoni eżistenti oħra (il-Pass 4). L-informazzjoni disponibbli kollha dwar it-tossiċità sistematika permezz tar-rotta dermali għandha tkun evalutata f'dan l-istadju. It-tossiċità dermali akuta tas-sustanza tat-test għandha wkoll tkun ikkonsidrata. Jekk is-susrtanza tat-test tkun uriet li hija ferm tossika bir-rotta dermali, din ma tkunx teħtieġ li tkun ittestjata fl-għajnejn. Għalkemm mhux bilfors li neċessarjament hemm relazzjoni bejn it-tossiċità akuta dermali u l-irritazzjoni/korrożjonu ta' l-għajnejn, dan jista' jkun preżent jekk aġent li huwa ferm tossiku via ir-rotta dermali, dan ikun ukoll jesebixxi tossiċità għolja meta jkun imqiegħed fuq l-għajnejn. Tali informazzjoni tista' wkoll tkun ikkonsidrata bejn il-Passi 2 u 3.
            
               Ir-riżultati mit-testijiet in vitro jew ex vivo (il-Passi 5 u 6). Is-sustanzi li jkunu wrew propjetajiet severi korrossivi jew irritanti f'test in vitro jew ex vivo (7) (8) li jkunu ġew validati u aċċettati għall-istudju speċifikament dwar il-kossossività/irritazzjoni ta' l-għajnejn jew tal-ġilda, ma jeħtieġx li jkunu ittestjati fuq l-annimali. Jista' jkun preżent li tali sustanzi jkunu jipproduċu l-istess effetti severi in vivo. Jekk it-testijiet in vitro/ex vivo validati u aċċettati ma jkunux disponibbli, wieħed għandu jevita il-Passi 5 u 6 u jipproċiedi direttament għall-Pass 7.
            
               Assessjar ta' l-irritazzjoni jew tal-korrożjoni dermali in vivo tas-sustanza (il-Pass 7). Meta evidenza mhux suffiċjenti tkun teżisti li permezz tagħha tista' titwettaq analiżi konklussiva ta' l-evidenza peżata tal-potenzal ta' l-irritazzjoni/korrossività ta' l-għajnejn minn sustanza, li tkun ibbażata fuq inforazzjoni mill-istudji elenkati hawn fuq, il-potenzal ta' l-irritazzjoni/korrożjoni in vivo għandha l-ewwel tkun evalutata, bl-użu tal-metodu B.4 (4) u ta' l-Anness li hemm miegħu (9). Jekk is-sustanza turi li tipproduċi korrożjoni jew irritazzjoni severa tal-ġilda, din għandha tkun ikkunsidrata bħala li hija irritant korrossiv għall-għajnejn sakemm infomazzjoni oħra tkun tappoġġja konklużjoni alternattiva. B'hekk, it-test in vivo fuq l-għajnejn ma jkunx hemm ħtieġa li jitwettaq. Jekk is-sustanza ma tkunx korrossiva jew severament irritanti għall-ġilda, it-test in vivo fuq l-għajnejn jenħtieġ li jkun imwettaq.
            
               Test in vivo fuq il-fniek (il-Passi 8 u 9): Testijiet okulari in vivo għandhom ikunu mibdija b'test inizjali li juża annimali wieħed. Jekk ir-riżultati ta' dan it-test jindikaw li s-sustanza tkun severament irritanti jew korrosiva għall-għajnejn, aktar testiet ma jkunx meħtieġa. Jekk dak it-test ma jiżvelax xi effetti korrossivi jew severi, test konfermatorju ikun imwettaq b'żewġ annimali oħrajn.
            REFERENZI
            
                     
                        (1)
                     
                     
                        Programm ta' Linji ta' Gwida għat-Test OECD (1996): Rapport Finali tal-Grupp ta' Studju OECD dwar l-Armonizzazzjoni tal-Validazzjoni u l-Aċċettazzjoni tal-Kriterja dwar Metodi Alternattivi għal-Testijiet Tossikoloġiċi. Li inżamm fi Solna, l-Isvezja, 22-24 ta' Jannar 1996. (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                     
                  
                     
                        (2)
                     
                     
                        OECD (1998), Is-Sistema tal-Klassifika Integrata Armonizzata tal-Perikoli għas-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kumiċi, kif approvat mit-28 Laqgħa Konġunta tal-Kumitat tal-Kimika u tal-Grupp ta' Ħidma dwart il-Kimika, Novembru 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                     
                  
                     
                        (3)
                     
                     
                        Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.
                     
                  
                     
                        (4)
                     
                     
                        Metodu tat-testijiet B.4. Tossiċità akuta: Irritazzjoni/korrużjoni dermali.
                     
                  
                     
                        (5)
                     
                     
                        Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In vitro, 2, 19-26.
                     
                  
                     
                        (6)
                     
                     
                        Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231.
                     
                  
                     
                        (7)
                     
                     
                        Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) L-istudju ta' validazzjoni internazzjonali ECVAM dwar it-testijiet in vitro għall-korrossività tal-ġilda. 2. Ir-riżultati u l-evalwazzjoni mill-Grupp Amministrattiv Toxicology in vitro 12, pp. 483–524.
                     
                  Figura
            STRATEĠIJA GĦAT-TESTIJIET U L-EVELWAZZJONL LA' L-LRRL LAZZJONI/KORROŻJONI DERM ALL
            
         B.5.   TOSSIĊITÀ AKUTA: IRRITAZZJONI/KORRUŻJONI TA' L-GĦAJNEJN
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa ekwivalnti għal OECD TG 405 (2002)
         1.1   INTRODUZZJONI
         Fil-preparazzjoni ta' dan il-metodu aġġornat, attenzjoni speċjali kienet mogħtija għat-titjib possibbli b'relazzjoni ma dak li jikkonċerna l-ġid ta' l-annimali u ta' l-evalwazzjoni ta' l-informazzjoni eżistenti kollha dwar is-sustanza tat-test sabiex ikunu evitati testijiet mingħajr ħtieġa ta' l-annimali fil-laboratorju. Dan il-metodu jinkludi r-rakkommandazzjonijiet li qabel ma jibda l-impenn deskritt għat-est in vivo dwar il-korrużjoni/irrirtazzjoni tas-sustanza, l-analiżi ta' l-evidenza peżata għandu jkun imwettaq (1) skond id-dettalji relevanti eżistenti. Meta d-disponabbiltà ta' dettalji mhux suffiċċjenti, dawn jistgħu ikunu żviluppati permezz ta' l-applikazzjoni ta' testijiet sekwenzali (2)(3). L-istrateġija tat-testijiet tinkludi it-twettieq ta' testijiet validati u aċċettabbli ta' in vitro u kemm provvediment dwarha bħala Anness ta' dan il-metodu. B'żieda, l-użu tat-test in vivo ta' l-irritazzjoni/korrużjoni dermali, sabiex ikun hemm tbassir tal-korrużjoni ta' l-għajnejn qabel il–kunsiderazzjoni tat-test in vivo ta' l-għajnejn, huwa rakkommandabbli.
         Fl-interess kemm ta' xjenza għaqlija u tal-ġid ta' l-annimali, testijiet in vivo m'għandhomx iseħħu qabel ma d-dettalji relevanti disponibbli kollha dwar il-potenzal ta' korrossività/irritazzjoni tal-ġilda mis-sustanza jkunu ġew evalwati b'analiżi tal-peżar bl-evidenza. Tali dettalji għandhom jinkludu evidenza minn studju eżistenti kemm fuq il-bnedmin u/jew l-annimali tal-laboratorju, l-evidenza ta' korrossività/irritazzjoni ta' sustanza waħda struttarament relatati u it-taħlitiet ta' tali sustanzi, id-dettalji li juru aċidità jew alkalinità qawwija tas-sustanza (4) (5), u r-riżultati minn testijiet validati u aċċettati kemm in vitro jew ex vivo (6) (6a). L-istudji setgħu kienu ġew imwettqa preċedentament għal, jew bħala riżultat ta', l-analiżi ta' l-evidenza peżata.
         Għal-ċerti sustanzi, tali analiżi tista’ tindika l-ħtieġa għal studji in vivo dwar il-potenzal tas-sustanza għal korrożjoni/irritazzjoni okulari. F'tali każi, qabel ma jkun ikkunsidrat l-użu tat-test in vivo fuq l-għajnejn, studju preferibbilemt in vivo ta' l-effetti dermali mis-sustanza għandu jkun l-ewwel nett imwettaq u evalwat bi qbil mal-metodu tat-testijiet B.4 (7). L-applikazzjoni ta' l-analiżi ta' l-evidenża peżata u ta' l-istrateġija sekwenzali tat-testijiet għandhom inaqqsu l-ħtieġa tat-testijiet in vivo dwar il-korrossività/irritazzjoni ta' l-għajnejn mis-sustanza li dwarha evidenza suffiċjenti tkun diġa teżisti minn studju oħrajn. Jekk id-determinazzjoni tal-potenzal tal-korrożjoni jew l-irritazzjoni ta' l-għajnejn ma tistgħax issir bl-istrateġija tat-testijier sekwenzali, anki wara t-twettieq ta' studju in vivo tal-korrożjoni u l-irritazzjoni dermali, test in vivo tal-korrożjoni/irritazzjoni ta' l-għajnejn jista’ jkun imwettaq.
         Strateġija preferuta sekwenzali ta' testijiet, li tinkludi t-twettieq ta' testijiet validati u aċċettabbli, in vitro jew ex vivo, dwar il-korrożjoni/irritazzjoni, hija inkluża bħala Anness għal dan il-metodu. L-istrateġija kienet żviluppata fi, u rakkommandata b'mod unanimu, mill-parteċipanti ta' laqgħa ta' studju ta' l-OECD (8), u kienet ġiet adottata bħala l-istrateġija rakkommandata tat-testijiet fis-Sistema Armonizzata Globali għall-Klassifika ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) (9). Huwa rakkommandabbli li din l-istrateġija tat-testijiet tkun segwita qabel ma jindew xi testijiet in vivo. Għal sustanzi ġodda huwa rakkommandabbli r-resqien ta' testijiet pass b'pass għall-iżvilupp ta' informazzjoni xjentifikament soda dwar il-korrosività/irritazzjoni mis-sustanza. Għal sustanzi eżistenti b'informazzjoni mhux suffiċjenti dwar il-korrożjoni/irritazzjoni tal-ġilda, l-istrateġija għanha tkun użata sabiex timla l-vojt fin-nuqqas tad-dettalji. L-użu ta' strateġija jew proċedura differenti tat-testijiet, jew ta' deċiżjoni li ma jkunx utilizzat it-test ta' pass b'pass, għandha tkun ġustifikata.
         1.2   DEFINIZZJONIJIET
         
            Irritazzjoni għal għajnejn: Hija l-produzzjoni ta' tibdiliet fil-għajnejn b'segwiment ta' l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test mal-part esterna ta' l-għajn, li huma kompletament riversibbli xi żmien 21 jum mill-applikazzjoni.
         
            Korrożjoni ta' l-għajnejn: Hija l-produzzjoni ta' tibdiliet fil-għajnejn b'segwiment ta' l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test mal-part esterna ta' l-għajn, li huma kompletament riversibbli xi żmien 21 jum mill-applikazzjoni.
         1.3   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza tat-test hija applikata f'doża singola ma waħda mill-għajnejn ta' l-annimal tal-prova; l-għajn mhux trattata isservi bħala kontroll. Il-grad ta' l-irritazzjoni/korrożjoni ta' l-għajn huwa evalwat billi jkunu immarkati l-feriti ta' konġunktiva, l-kornea, u l-iris, matul intervalli speċifiċi. Effetti oħrajn fil-għajn u l-effetti kuntrarji sistematiċi huma wkoll deskritti sabiex jipprovdu evalwazzjoni sħiħa ta' l-effetti. It-tul ta' żmien ta' l-istudju għandu jkun suffiċjenti sabiex tkun evalwata r-riversabbilità jew in-nuqqas ta' riversabbilità ta' l-effetti osservati.
         L-annimali li juru sinjali kontinwi ta' dwejjaq u/jew uġiegħ severi, fi kwalunkwe waqt tat-test, għandhom ikunu maqtula b'mod umanitarju, u s-sustanza tkun assessjata kif xieraq. Il-kriterja sabiex tittieħed id-deċiżjoni li jkunu maqtula b'mod umanitarju l-annimali moribondi jew li jkunu jsofru ħafna tista’ tinstgħab fir-referenza (10).
         1.4   ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.4.1   Preparazzjoni tat-test in vivo
         
         1.4.1.1   L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali
         Il-fenek albino huwa l-annimal preferut tal-laboratorju, u fniek żgħażagħ adulti huma użati. Ir-raġuni għall-użu ta' speċje oħrajn għandha tkun mogħtija.
         1.4.1.2   Preparazzjoni ta' l-annimali
         Iż-żewġ għajnejn ta' kull annumal sperimentali proviżjonalment magħżul għat-testijiet għandu jkun eżaminat fi żmien 24 siegħa qabel ma jibda t-test. L-annimali li juru irritazzjoni fl-għajnejn, difetti okulari, jew li ħsara korneali pre-eżistenti m'għandhomx ikunu użati.
         1.4.1.3   Il-kundizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf
         L-annimali għandhom jinzammi f'gaġġeġ individwali. It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 20 oC (± 3 oC), għall-fniek. Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu użati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb.
         1.4.2   Proċedura tat-test
         1.4.2.1   L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test
         Is-sustanza tat-test għandha tkun imqiegħda fuq il-ħofra konġunktivali ta' waħda mill-għajnejn ta' kull annimal wara li l-għatu tan-naħa t'isfel ta' l-għajn ikun inġibed lil himm mill-boċċa ta' l-għajn. Il-għotjien jkunu imbagħad b'ġentilezza miżmuma flimkien għal madwar sekonda sabiex ikun prevenut it-telf tal-materjal. L-għajn l-oħra, li tibqa mingħajr trattament, isservi bħala kontroll.
         1.4.2.2   Irrigazzjoni
         L-għajnejn ta' l-annimali tat-test m'għandhomx ikunu maħsula għal mill-anqas 24 siegħa wara li tkun saret l-istallazzjoni tas-sustanza tat-test, apparti milli fil-każ ta' solidi (ara s-sezzjoni 1.4.2.3.2), u fil-każ ta' effetti korrossivi jew irritanti immedjati. Wara 24 siegħa, hasla sewwa tista’ ssir jekk dan ikun meqjus bħala xieraq.
         L-użu ta' grupp satellit ta' annimali għall-inverigazzjoni ta' l-infuwenza tal-ħasil mhux rakkommandabbi, sakemm ma jkunx xjetifikament ġustifikat. Jekk grupp satellit ikun meħtieġ, għandhom ikunu użati żewġt ifniek. Il-kundizzjonijiet tal-ħasil gġandhom ikunu dokumentati bir-reqqa, eż. il-ħiun tal-ħasil; il-komposizzjoni u t-temperatura tat-taħlita tal-ħasil; it-tul ta' żmien, il-volum, u l-veloċità ta' l-applikazzjoni.
         1.4.2.3   Livell tad-doża
         1.4.2.3.1   It-testijiet tal-likwidi
         
         Għat-testijiet tal-likwidi, doża ta' 0,1 ml hija użata. Tbexxix bil-pompa m'għandux ikunu użat għall-istallazzjoni diretta ġewwa il-għajn. It-tbexxix tal-likwidu għandu jkun imneħħi u miġbur f'kontenitur qabel ma jkun installat 0,1 ml ġewwa l-għajn.
         1.4.2.3.2   Testijiet tas-solidi
         
         Meta jsiru t-testijiet ta' solidi, dlik, u sustanzi partikolati, l-ammont użat għandu jkollu volum ta' 0,1 ml jew ġiż ta' mhux aktar minn 100 mg. Il-materjal tat-test għandu jkun mitħun fi trab fin. Il-volum tal-materjal solidu għandu jkun imkejjel wara li jkun kumpatt b'ġentilezza, eż. bit-tektik tal-kontenitur tal-kejl. Jekk is-sustanza solida tat-test ma tkun ġiet imneħħija mill-għajn ta' l-annimal tat-tesr b'mekkaniżmi fiżjoloġiċi waqt l-ewwel punt fil-ħin ta' l-osserazzjoni ta' siegħa wara t-trattament, il-għajn tista’ tkun imlaħalħa b'ilma bil-melħ jew distillat.
         1.4.2.3.3   Testijiet ta' aerosols
         
         Huwa rakkommandat li t-tbexxix kollu bil-pompa u l-aerosols ikun miġbur qabel l-istallazzjoni ġewwa l-għajn. L-eċċezzjoni waħda hija għas-sustanzi f'kontenituri aerosol taħt pressjoni, li ma jistgħux ikunu miġbura minħabba l-vaporizzazzjoni. F'tali każi, l-għajn għandha tinżamm miftuħha, u s-sustanza tat-test somministrata fuq l-għajn bi spunt wieħed għal madwar sekonda, minn distanza ta' 10 cm, direttament minn quddiem il-għajn. Din id-distanza tista’ tvarja jiddependi mill-pressa tat-tbexxix u l-kontenuti. Kura għandha tittieħed li ma ssirx ħsara lill-għajn mill-pressa tat-tbexxix. F'każi xierqa, jista’ jkun hemm il-ħtieġa li jkun evalutat il-potenzal dwar ħsara “mekkaanika” ta' l-għajn mill-qawwa tat-tbexxix.
         Estimi tad-doża minn aerosol jistgħu isiru bit-test tas-simulazzjoni kif ġej: Is-sustanza hija mbexxa fuq karta ta' l-użin minn fetħa d-daqs ta' għajn ta' fenek imqiegħda direttament qabel il-karta. Iż-żieda fil-piż tal-karta hija użata sabiex ikun ikkalkolat l-ammont imbexxex fuq il-għajn. Għal sustanzi volatili, id-doża tista’ tkun ikkalkolata bl-użin ta' kontenitur riċevitur qabel u wara t-tneħħija tal-matyerjal tat-test.
         1.4.2.4   It-test inizjali (It-test in vivo bl-irritazzjoni/korrożjoni ta' l-għajn bl-użu ta' annimal wieħed)
         Kif spjegat fl-istrateġija sekwenzali tat-testijiet (ara l-Anness 1), huwa ferm rakkommandabbli li t-test in vivo ikun imwettaq inizjalment bl-użu ta' annimal wieħed.
         Jekk ir-riżultati ta' dan it-test jindikaw li s-sustanza tkun severament irritanti jew korrosiva għall-għajnejn bl-użu tal-proċedura deskritta, aktar testiet dwar l-irritazzjoni okulari ma jkunx meħtieġa.
         1.4.2.5   Anastesija lokali
         L-anastesija lokali tista’ tkun użata fuq il-bażi ta' każ b'każ. Jekk l-analiżi ta' l-evidenza peżata jindika li s-sustanza jkollha l-potenzal li tikkaġuna l-uġiegħ, jew jekk test inizzjali juri li reazzjoni ta' uġiegħ tkun tirriżulta, anastesija lokali tista’ tkun użata qabel l-istallazzjoni tas-sustanza tat-test. It-tip, il-konċentrazzjoni, u d-doża ta' l-anastesija lokali għandhom ikunu magħżula bir-reqqa sabiex jassiguraw li d-differenzi fir-reazzjoni għas-sustanza tat-test ma jkunux jirriżultaw mill-użu tiegħu. Il-għajn tal-kontrol għandha bl-istess mod tkun anastetizzata.
         1.4.2.6   Test konfermatorju (It-test in vivo ta' l-irritazzjoni ta' l-għajn b'annimali addizzjonali)
         Jekk effett korrossic ma jkunx osservat fit-test inizjali, ir-reazzjoni irritanti jew negattiva għandha tkun ikkonfermata bl-użu ta' sa żewġ annimali addizzjonali. Jekk effett irritanti sever ikun osservat fit-test inizjali li jindika l-possibbiltà ta' effett qawwi (mhux riversibbli) fit-testijiet konformatorji, huwa rakkommandat li t-test konformatorju jkun imwettaq b'manjera sekwenzali fuq annimal wieħed kull darba, pjuttost milli l-espożizzjoni ta' żewġ annimali b'mod simultanju. Jekk it-tieni annimal jiżvela effetti severi korrossivi jew irritanti, it-test m'gġandux jitkompla. Annimali addizzjonali jistgħu ikunu meħtieġa sabiex jikkonfermaw ir-reazzjonijiet ħfief jew moderati ta' l-irritant.
         1.4.2.7   Perijodu ta' osservazzjoni
         It-tul ta' żmien ta' l-istudju għandu jkun suffiċjenti sabiex tkun evalwata r-riversabbilità jew in-nuqqas ta' riversabbilità ta' l-effetti osservati. B'dana kollum l-esperiment għandu jkun terminat fi kwalunkwe ħin jekk dak l-annimal ikollu sinjali kontinwi ta' uġiegħ jew tbagħtija qawwija. Sabiex ikunu determinati l-effetti riversibbli, l-annimali għandhom ikunu osservati normalment għal 21 jum wara l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test. Jekk l-irriversibbiltà tkun osservata qabel l-21 jum, l-esperiment għandu jkun imwaqqaf f'dak il-waqt.
         1.4.2.7.1   Osservazzjonijiet kliniċi u l-iggradar tar-reazzjonijiet ta' l-għajn
         
         L-għajnejn għandhom ikunu eżaminati fi 1, 24, 48 u 72 siegħa wara l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. L-annimali għandhom jinżammu fit-test mhux aktar milli meħtieġ la darba informazzjoni definita tkun ġiet akkwistata. L-annimali li juru kon tinwament uġiegħ u tbagħtija severa għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk, mingħajt dewmien, u s-sustana tkun assessjata kif applikabbli. L-annimali b'dawn il-feriti ta' l-għajnejn wara li jkun kellhom l-istallazzjoni għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk: Xi toqba fil-kornea jew ulċera sinifikanti tal-kornea, inkluża s-stafiloma; demm fil-parti anterjuri ta' l-għajn; opaċità grad 4 tal-kornea li tippersisti għal 48 siegha; nuqqas ta' reazzjoni għad-dawl (nuqqas ta' reazzjoni radiali grad 2) li tippersisti għal 72 siegha; ulċera fil-membrana konjunktivali; nekrożi tal-membrana konjunktivali jew niktitanti; jew qoxra mejta. Dan huwa minħabba l-fatt li tali feriti, ġeneralment, ma humiex riversibbli.
         L-annimali li ma jiżviluppawx feriti okulari jistgħu ikunu mneħħija mhux aktar kmieni minn 3 ijiem wara l-istallazzjoni. L-annimali b'feriti ħfief jew moderati għandhom ikunu osservati sakemm il-ferita tkun fieqet, jew għal 21 jum, f'liema waqt l-istudju jkun terminat. L-osservazzjonijiet għandhom ikunu mwettqa fi 7, 14, u 21 jum sabiex ikun determinat l-istat tal-feriti, u r-riversabbiltà jew in-non-riversabbiltà tagħhom.
         Il-gradi tar-reazzjoni okkulati (konġunktiva, kornea u iris) għandhom ikunu irreġistrati wara kull eżami (Tabella I). Xi feriti oħrajn ta' l-għajnejn (eż. imtappna, imtebba) jew effetti ħżiena sistematiċi għandhom ukoll ikunu rrapurtati.
         L-eżami tar-reazzjonijiet jistgħu ikunu faċilitati bl-użu tal-loupe binokulari, lampa-maqsuma ta' l-idejn, biomikroskopju, jew xi apparat ieħor xieraq. Wara r-reġistrazzjoni ta' l-osservazzjoni fi 24 siegħa, il-għajnejn jistgħu wkoll ikunu eżaminati bil-għajnuna tal-florixxin.
         Il-gradar tar-reazzjonijiet okulari hija neċċessarjament suġġestiva. Sabiex tkun imħġeġġa l-armonizzazzjoni fil-gradar tar-reazzjoni okulari u sabiex ikunu mgħejjuna l-laboratorji tat-testijiet u dawk involuti fiż-żamma ta' l-osservazzjonijiet u ta' l-interpretazzjoni tagħhom, il-persunall li jwettaq l-osservazzjonijiet jeħtieġu li jkunu adekwatament imħarrġa fis-sistema ta' l-iggradat kif użata ara t-Tabella ta' hawn taħt).
         2.   DATA
         2.2   EVALWAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Il-marki ta' l-irritazzjoni dermali għandhom ikunu evalwati b'konnessjoni man-natura u s-severità tal-feriti, u r-riversibbilità tagħhom, jew tan-nuqqas ta' riversibbilità. Il-marki individwali ma jkunux jirrapreżentaw norma assoluta għall-propjetajiet irritanti ta' xi materja, minħabba li effetti oħrajn tal-materjal tat-test huma wkoll evalwati. Minflok, il-marki individwali għandhom ikunu riveduti bħala valuri ta' referenza u jagħmlu sens biss meta jkunu sostnuti b'deskrizzjoni sħiħa u l-evalwazzjoni ta' l-osservazzjonijiet kollha.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Raġunar dwar it-test in vivo: Analiżi ta' l-evidenza peżata ta' informazzjoni pre-eżistenti qabel it-test, inklużi r-riżultati minn strateġija ta' testijiet sekwenzali:
                     
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni tad-dettalji relevanti disponibbli minn testijiet preċedenti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni akkwistat f'kull stadju ta' l-istrateġija ta' l-ittestjar;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni tat-testijiet in vitro kif imwettqa, inklużi d-dettalji tal-proċeduri, ir-riżultati akkwistati bis-sustanza tat-test/referenza;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni ta' l-istudju in vivo dwar l-irritazzjoni/korrożjoni dermali li jkun ġie mwettaq, inklużi r-riżultati akkwistati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 analiżi ta' l-evidenza peżata għat-twettieq ta' l-istudju in vivo
                                 
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Is-sustanza tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-identifikazzjoni (eż. numru CAS; sorsi; purità; impuritajiet magħrufa; n-numru tal-lot);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-natura fiżika u l-propjetajiet fiżikokimiċi (eż. pH, volatilità, solubilità, stabbilità, reattività fl-ilma);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 jekk taħlita, il-komposizzjoni u l-persentaġġi relattivi tal-komponenti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 jekk anastesija lokali tkun ġiet użata, l-identifikazzjoni, il-purità, it-tip, id-doża, u l-potenzal ta' interazzjoni mas-sustanza tat-test.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Mezz:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-identifikazzjoni, il-konċentrazzjoni (meta xieraq), il-volum użat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-ġustifikazzjoni tal-mezz użat.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Annimali tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-ispeċji/tipi użati, ir-raġjunar għall-użu ta' l-annimali apparti milli fniek albino;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-età ta' kull annimal fil-bidu ta' l-istudju;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru ta' l-annimali ta' kull sess użati fit-test u fil-grupp ta' kontroll (jekk meħtieġ);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piżijiet ta' l-annimali individwali, kemm fil-bidu u wkoll fil-konklużjoni tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, eċċ.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni tal-metodu użat biex tkun immarkata l-irritazzjoni f'kull ħil ta' l-osservazzjoni (eż. lampa maqsuma ta' l-idejn, bimikroskopju, florexxin);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tabulazzjoni tad-dettalji tar-reazzjoni dwar l-irritamnt/korrosiv għal kull annimali f'kull ħin ta' l-osservazzjoni jew sa kemm kull animal ikun tneħħa mit-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni narrattiva tal-grad u n-natura ta' l-irritazzjoni jew tal-korrożjoni osservata;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni ta' xi ferita oħra osservata fil-għajn (eż. vaskularizzazzjoni, formazzjoni imtappna, waħħalija, tgħagħjja);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni ta' effetti ħżiena mhux okulari, lokali u sistematiċi, u s-sejbiet ħistopatoloġiċi, jekk ikun hemm.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni tar-riżultati.
                  
               3.2   INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         L-estrapolazzjoni tar-rżultati ta' l-istudji dwar l-irritazzjoni ta' l-għajn li jkun twettqu fuq l-annimali tal-laboratorju lejn bnedmin umani hija valida biss sa grad limitat. F'ħafna każi, il-fenek albimo huwa iktar sensittiv mill-bnedmin dwar l-irritanti okulari jew għall-korrossivi.
         Attenzjoni għandha tingħata fl-interpretazzjoni tad-dettalji sabiex tkun eskluża xi irritazzjoni li tirriżulta minn infezzjoni sekondarja.
         4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In vitro, 2, 19-26.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) L-istudju ta' validazzjoni internazzjonali ECVAM dwar it-testijiet in vitro għall-korrossività tal-ġilda. 2. Ir-riżultati u l-evalwazzjoni mill-Grupp Amministrattiv Toxicology in vitro 12, pp. 483–524.
                  
               
                  
                     (6a)
                  
                  
                     Metodu tat-test B.40, Korrożjoni tal-Ġilda
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Metodu tat-testijiet B.4. Tossiċità akuta Irritazzjoni/korrużjoni dermali.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Programm ta' Linji ta' Gwida għat-Test OECD (1996): Rapport Finali tal-Grupp ta' Studju OECD dwar l-Armonizzazzjoni tal-Validazzjoni u l-Aċċettazzjoni tal-Kriterja dwar Metodi Alternattivi għal-Testijiet Tossikoloġiċi. Li inżamm fi Solna, l-Isvezja, 22-24 ta' Jannar 1996. (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     OECD (1998), Is-Sistema tal-Klassifika Integrata Armonizzata tal-Perikoli għas-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kumiċi, kif approvat mit-28 Laqgħa Konġunta tal- Kumitat tal-Kimika u tal-Grupp ta' Ħidma dwart il-Kimika, Novembru 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Dokument ta' Gwida dwar ir-Rikonoxximent, l-Assessjar u l-Użu ta' Sinjali Kliniċi bħala għanijiet finali umanitarji għall-annimali Sperimenti Użati fl-Evalwazzjoni tas-Sigurtà. OECD, Pubblikazzjonijiet dwar is-Saħħa u s-Sigurtà Ambjentali. Serje dwar it-Testijiet u l-Istudju Nru. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
                  
               Tabella I
         L-IGGRADAR TAL-FERITI OKULARI
         Il-kornea
         L-opaċità: il-grad ta’ densità (il-qari għandu jsittieħed mill-iktar żona densa) (*)
         
         
                     L-ebda ulċerazzjoni jew opaċità …
                  
                  
                     0
                  
               
                     Żoni mferrxa jew diffużi ta’ opaċità (minnbarra l-oskurità ħafifa jew il-leqqa normali); id-dettaliji ta’ l-iris huma viżibbli sew …
                  
                  
                     1
                  
               
                     Żona transluscent li tidher faċilment; id-dettalji ta’ l-iris kemmxejn imdallma …
                  
                  
                     2
                  
               
                     Żona nacrous; l-ebda dettal ta’ l-iris ma jidher; id-daqs tal-pupill bilkemm jidher …
                  
                  
                     3
                  
               
                     Kornea opaka; l-iris ma tidhirx mill-opaċità …
                  
                  
                     4
                  
               Il-massimu possibbli: 4
         NOTI
         L-iris
         
                     Normali …
                  
                  
                     0
                  
               
                     Tikmix fond, konġestjoni, infiħ, circumcorneal hyperaemia ħafifa; Jew l-injezzjoni; l-iris li tirreaġixxi għad-dawl (reazzjoni għajjiena hija meqjusa bħala effetts) …
                  
                  
                     1
                  
               
                     Emoraġġija, ħsara grossa, jew l-ebda reazzjoni għad-dawl …
                  
                  
                     2
                  
               Il-massimu possibbli: 2
         Conjunctivae
         Il-ħmura (tirreferi għall- conjunctivae palpebrali u bulbari; il-kornea u l-iris huma esklużi)
         
                     Normali …
                  
                  
                     0
                  
               
                     Xi vini tad-demm hyperaemic (injettati) …
                  
                  
                     1
                  
               
                     Diffuż, kulur aħmar skur; il-vini individwali ma jidhrux faċilment …
                  
                  
                     2
                  
               
                     Diffuż aħmar mimli …
                  
                  
                     3
                  
               Il-massimu possibbli: 3
         Chemosis
         l-infiħ (jirreferi għall-kpiepel u/jew il-membrani li jiċċaqalqu)
         
                     Normali …
                  
                  
                     0
                  
               
                     Xi nfiħ iktar min-normal …
                  
                  
                     1
                  
               
                     Infiħ ovvju, b’averżjoni parzjali tal-kpiepel …
                  
                  
                     2
                  
               
                     L-infiħ, bil-kpiepel kważi nofshom magħluqin …
                  
                  
                     3
                  
               
                     L-infiħ, bil-kpiepel iktar minn nofshom magħluqin …
                  
                  
                     4
                  
               Il-massimu possibbli: 4
         
            ANNESS
            Strateġija ta' testijiet Sekwenzali dwar l-Irritazzjoni u l-Korrożjoni ta' l-Għajnejn
            KONSIDERAZZJONIJIET ĠENERALI
            Fl-imnteressi ta' xjenza soda u l-ġid ta' l-annimali, huwa importanti li jkun evitat l-użu bla bżonn ta' l-annimali, u jkun imnaqqas it-testjar li aktar jipproduċi reazzjonijiet serveri fl-annimali. L-informazzjoni kollha dwar sustanza relatata mal-potenzal tagħha ta' l-irritazzjoni/korrożjoni okulari għandha tkun evalwata bil-quddiem qabel ma jkunu ikkonsidrati t-testijiet in vivo. Evidenza suffiċjenti tista' tkun diġa teżisti sabiex tikklassifika sustanza tat-test dwar l-irritazzjoni ta' l-għajnejn jew tal-potenzal tal-korrożjoni mingħajr il-ħtieġa li jkunu mwettqa testijiet fuq l-annimali tal-laboratorju. Għalhekk, l-utilizzsazzjoni ta' l-analiżi peżata bl-evidenza u l-istrateġija sussegwenti tat-testijiet għandha tnaqqas il-ħtieġa ta' testijiet in vivo, speċjalemnt jekk is-sustanza aktarx li tipproduċi reazzjonijiet severi.
            Huwa rakkommandabbli li l-analiżi ta' l-evidenza peżata tkun użata għall-evalwazzjoni ta' l-informazzjoni eżistenti li tappartieni għas-sustanzi ta' l-irritazzjoni u l-korrożjoni ta' l-għajnejn u sabiex tiddetermina jekk studju addizzjonali, apparti milli l-istudji in vivo fuq l-għajnejn, għandhom ikun u mwettqa sabiex jgħinu dwar il-karatteristiċi ta' tali potenzal. Meta aktar studji huma meħtieġa, huwa rakkommandabbli li l-istrateġija ta' testijiet sekwenzali tkun utilizzata sabie tiżviluppa d-dettalji sperimentali relevanti. Għal sustanzi li ma jkollhom l-ebda storja ta' testijiet, l-istrateġija tat-testijiet sekwenzali għandha tkun utilizzata sabiex jiżviluppa l-informazzjoni meħtieġa għall-evalwazzjoni tal-korrożjoni/irritazzjoni tagħha fuq l-għajnejn. L-istrateġija tat-testijiet deskritta f'dan l-Anness kienet ġiet żviluppata minn grupp ta' ħidma tal-OECD (1). Kienet sussegwentament ikkonfermata u mkabbra fis-sistema tal-Klassifa Armonizzata Integrata dwar is-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kimiċi, kif ikkonfermata bit-28 Laqgħa Konġunta tal-Kumitat tal-Kimiċi u tal-Grupp ta' Ħidma dwar il-Kimiċi, f'Novembru 1998 (2).
            Għalkemm din l-istrateġija tat-testijiet mhix parti integrali tal-metodu tat-testijiet B.5, din tesprimi r-resqien rakkommandat għad-determinazzjoni tal-propjetajiet ta' l-irritazzjoni/korrożjoni ta' l-għajnejn. Dan ir-resqien jirrapreżenta kemm l-aħjar prassi u l-mira etika dwar testijiet in vivo ta' l-irritazzjoni korrożjoni ta' l-għajnejn. Il-metodu tat-testijiet jipprovdi gwida għat-twettieq tat-test in vivo u sommarji u fatturi li għandhom ikunu ndirizzati qabel ma jkun ikkonsidrat tali test. L-istrateġija tat-testijiet sekwenzali tipprovdi r-resqien ta' l-evidenza peżata għall-evalwazzjoni ta' informazzjoni eżistenti dwar il-propjetajiet ta' l-irritazzjoni/kjorrożjoni ta' l-għajnejn, ta'sustanza, u tar-resqien imtarraġ għall-ġenerazzjoni ta' l-informazzjoni relevanti dwar sustanzi li dwarhom studju addizzjonali huma meħtieġa jew li dwarhom l-ebda studji ma kienu twettqu. L-istrateġija tinkludi it-twettieq, l-ewwel ta' testijiet tal-validazzjoni u l-aċċettazzjoni in vitro jew ex vivo, u imbagħad il-metodu tat-test B.4 ta' studji dwar l-irritazzjoni/korrożjoni tal-ġilda skond iċ-ċirkostanzi speċifiċi (3) (4).
            DESKRIZZJONI TA' L-ISTRATEĠIJA GĦAL TESTIJIET PASS B'PASS
            Qamel ma jitqettqu t-testijiet bħala parti mill-istrateġija tat-testijiet sekwenżjali (il-Figura), l-informazzjoni disponibbli kollha għandha tkun evalutata għad-determinazzjoni tal-ħtieġa tat-testijiet in vivo fuq l-għajnejn. Għalkemm informazzjoni sinifikanti tista' tkun akkwistata mill-evalwazzjoni ta' parametri singoli (eż. pH estrema), it-totalità ta' l-informazzjoni eżistenti għandha tkun assessjata. L-informazzjoni relevanti kollha dwar l-effetti tas-sustanza f'dak il-każ, u ta' l-analogi strutturali tagħha, għandhom ikunu evalutati fit-teħid tad-deċiżjoni ta' l-evidenza peżata, u r-raġjunar għad-deċiżjoni għandu jkun ippreżentat. L-emfasi primarja għandha tkun fuq l-informazzjoni jmana u ta' l-annimali eżistenti risward is-sustanza, segwita bl-eżitu tat-testijiet in vitro jew ex vivo. L-istudji in vivo ta' sustanzi korrosivi għandhom ikunu evitati, kull meta jkun possibbli. Il-fatturi meqjusa għall-istrateġija tat-testijiet, jinkludu:
            
               Evalwazzjoni ta' l-informazzjoni eżistenti, umana u ta' l-annimali (il-Pass 1). Informazzjoni eżistenti umana, eż. studji kliniċi u okkupazzjonali, u rapporti dwar il-każ, u/jew informazzjoni minn testijiet fuq l-annimali minn studji okulari għandhom ikun ikkunsidrata bħala l-ewwel ħaġa, minħabba li dawn jipprovdu informazzjoni relatata direttament ma l-effetti fuq l-għajnejn. Wara dan, l-informazzjoni disponibbli mill-istudji umani u/jew ta' l-annimali, li jinvestigaw korrożjoni/irritazzjoni dermali, għandhom ikunu evalutati. Sustanzi b'korrossività magħrufa jew ta' irritazzjoni severa, fuq l-għajnejn, m'għandhomx ikunu imdeffsa fuq l-għajnejn ta' l-annimali, u l-anqas m'għandhom is-sustanzi li juru effetti korrossivi jew irritanti fuq il-ġilda; tali sustanzi għandhom ikunu meqjusa bħala korrossivi u/jew irritanti għall-għajnejn, ukoll. Sustanzi b'evidenza suffiċjenti ta' non-korrossività u non-irritazzjoni, minn studji okulari preċedenti diġa mwettqa, għandhom ukoll ma jkunux ittestjati fi studji in vivo fuq l-għajnejn.
            
               Analiżi tar-relazzjonijietta’ l-attività strutturali (SAR) (il-Pass 2). Ir-riżultati tat-testijiet ta' kimika strutturalment relatata għandhom ikunu ikkunsidrati, jekk disponibbli. Meta informazzjoni, umana u/jew ta' l-annimali, suffiċjenti, tkun disponibbli dwar sustanzi jew taħlitiet strutturalment relatati ta' tali sustanzi li jindikaw il-potenzal tal-korrożjoni/irristazzjoni ta' l-għajnejn, dan għandu jkun present li s-sustanza tat-test tkun sejra tipproduċi l-istess reazzjonijiet. F'dawk il-każi, is-sustanza ma jkunx hemm ħtieġa tat-test tagħha. Informazzjoni negattiva mill-istudji tas-sustanzi strutturalment relatati jew minn taħlitiet ta' tali sustanzi ma tkunx tikkostitwixxi evidenża suffiċjenti tan-non-korrosività/non-irrittabbilità ta' sustanza permezz ta' l-istrateġija tat-testijiet sekwenzali. Ir-resqien SAR validat u aċċettat għandu jkun użat sabiex jidentifika l-korrożjoni u l-irrirtazzjoni potenzali kemm ta' l-effett dermali u wkoll okulari.
            
               Propjetajiet fiżikokimiċi u r-reattivazzjoni kimika (il-Passa 3). Is-sustanzi li jesebixxu pH estremi bħal ma huma ≤2.0 jew ≥11.5 jistgħu ikollhom effetti lokali ferm qawwija. Jekk il-pH estrema hija l-bażi għall-identifikazzjoni ta' sustanza bħala korrossiva jew irritanti għall-għajnejn, allura ir-riserva aċida/alkalina tagħha (il-kapaċità mewwitea) tista' wkoll tkun ikkunsidrata (5) (6). Jekk il-kapaċità mewwieta tissuġġerixxi lki sustanza ma tistgħax tkun korrossiva għall-għajnejn, allura aktar testijiet għandhom ikunu mwettqa sabiex jikkonfermaw dan, preferibbilment bl-użu ta' test in vitro jew ex vivo validat u aċċettat (ara s-sezzjoni, il-pass 5 u 6).
            
               Konsiderazzjoni ta' informazzjoni eżistenti oħra (il-Pass 4). L-informazzjoni disponibbli kollha dwar it-tossiċità sistematika permezz tar-rotta dermali għandha tkun evalutata f'dan l- istadju. It-tossiċità dermali akuta tas-sustanza tat-test għandha wkoll tkun ikkonsidrata. Jekk is-susrtanza tat-test tkun uriet li hija ferm tossika bir-rotta dermali, din ma tkunx teħtieġ li tkun ittestjata fl-għajnejn. Għalkemm mhux bilfors li neċessarjament hemm relazzjoni bejn it-tossiċità akuta dermali u l-irritazzjoni/korrożjonu ta' l-għajnejn, dan jista' jkun preżent jekk aġent li huwa ferm tossiku via ir-rotta dermali, dan ikun ukoll jesebixxi tossiċità għolja meta jkun imqiegħed fuq l-għajnejn. Tali informazzjoni tista' wkoll tkun ikkonsidrata bejn il-Passi 2 u 3.
            
               Ir-riżultati mit-testijiet in vitro jew ex vivo (il-Passi 5 u 6). Is-sustanzi li jkunu wrew propjetajiet severi korrossivi jew irritanti f'test in vitro jew ex vivo (7) (8) li jkunu ġew validati u aċċettati għall-istudju speċifikament dwar il-kossossività/irritazzjoni ta' l-għajnejn jew tal-ġilda, ma jeħtieġx li jkunu ittestjati fuq l-annimali. Jista' jkun preżent li tali sustanzi jkunu jipproduċu l-istess effetti severi in vivo. Jekk it-testijiet in vitro/ex vivo validati u aċċettati ma jkunux disponibbli, wieħed għandu jevita il-Passi 5 u 6 u jipproċiedi direttament għall-Pass 7.
            
               Assessjar ta' l-irritazzjoni jew tal-korrożjoni dermali in vivo tas-sustanza (il-Pass 7). Meta evidenza mhux suffiċjenti tkun teżisti li permezz tagħha tista' titwettaq analiżi konklussiva ta' l-evidenza peżata tal-potenzal ta' l-irritazzjoni/korrossività ta' l-għajnejn minn sustanza, li tkun ibbażata fuq inforazzjoni mill-istudji elenkati hawn fuq, il-potenzal ta' l-irritazzjoni/korrożjoni in vivo għandha l-ewwel tkun evalutata, bl-użu tal-metodu B.4 (4) u ta' l-Anness li hemm miegħu (9). Jekk is-sustanza turi li tipproduċi korrożjoni jew irritazzjoni severa tal-ġilda, din għandha tkun ikkunsidrata bħala li hija irritant korrossiv għall-għajnejn sakemm infomazzjoni oħra tkun tappoġġja konklużjoni alternattiva. B'hekk, it-test in vivo fuq l-għajnejn ma jkunx hemm ħtieġa li jitwettaq. Jekk is-sustanza ma tkunx korrossiva jew severament irritanti għall-ġilda, it-test in vivo fuq l-għajnejn jenħtieġ li jkun imwettaq.
            
               Test in vivo fuq il-fniek (il-Passi 8 u 9): Testijiet okulari in vivo għandhom ikunu mibdija b'test inizjali li juża annimali wieħed. Jekk ir-riżultati ta' dan it-test jindikaw li s-sustanza tkun severament irritanti jew korrosiva għall-għajnejn, aktar testiet ma jkunx meħtieġa. Jekk dak it-test ma jiżvelax xi effetti korrossivi jew severi, test konfermatorju ikun imwettaq b'żewġ annimali oħrajn.
            REFERENZI
            
                     
                        (1)
                     
                     
                        Programm ta' Linji ta' Gwida għat-Test OECD (1996): Rapport Finali tal-Grupp ta' Studju OECD dwar l-Armonizzazzjoni tal-Validazzjoni u l-Aċċettazzjoni tal-Kriterja dwar Metodi Alternattivi għal-Testijiet Tossikoloġiċi. Li inżamm fi Solna, l-Isvezja, 22-24 ta' Jannar 1996. (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                     
                  
                     
                        (2)
                     
                     
                        OECD (1998), Is-Sistema tal-Klassifika Integrata Armonizzata tal-Perikoli għas-Saħħa Umana u l-Effetti Ambjentali tas-Sustanzi Kumiċi, kif approvat mit-28 Laqgħa Konġunta tal-Kumitat tal-Kimika u tal-Grupp ta' Ħidma dwart il-Kimika, Novembru 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                     
                  
                     
                        (3)
                     
                     
                        Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.
                     
                  
                     
                        (4)
                     
                     
                        Metodu tat-testijiet B.4. Tossiċità akuta: Irritazzjoni/korrużjoni dermali.
                     
                  
                     
                        (5)
                     
                     
                        Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In vitro, 2, 19-26.
                     
                  
                     
                        (6)
                     
                     
                        Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231.
                     
                  
                     
                        (7)
                     
                     
                        Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) L-istudju ta' validazzjoni internazzjonali ECVAM dwar it-testijiet in vitro għall-korrossività tal-ġilda. 2. Ir-riżultati u l-evalwazzjoni mill-Grupp Amministrattiv Toxicology in vitro 12, pp. 483–524.
                     
                  
                     
                        (8)
                     
                     
                        Metodu tat-test B.40, Korrożjoni tal-Ġilda
                     
                  
                     
                        (9)
                     
                     
                        Anness tal-Metodu tat-Test B.4: Strateġija ta' testijiet Sekwenzali dwar l-Irritazzjoni u l-Korrożjoni tal-ġilda.
                     
                  Figura
            Strateġija għat-testijiet u l-evelwazzjom ta' L-Irritazzjoni/korrożjoni dermali
            
         B.6.   SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         
            Rimarki:
         
         Is-sensittività u l-abbiltà tat-testijiet li jintebħu b’sensitizzaturu potenzali għall-ġilda umana huma meqjusa bħala importanti fis-sistema tal-klassifikazzjoni dwar it-tossiċità relevanti għas-saħħa pubblika.
         M’hemm l-ebda metodu wieħed ta’ test li b’mod adegwat jidentifika s-sustanzi kollha bil-potenzjal għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda umana u li huwa relevanti għas-sustanzi kollha.
         Fatturi bħalma huma l-karatteristċi fiżiċi ta’ sustanza, inkluża l-abbiltà tagħha li tippenetra l-ġilda, għandhom ikunu meqjusa fil-għażla tat-test.
         Żewġ tipi ta’ testijiet bl-użu tal-fniek ta’ l-indi ġew żviluppati: testijiet tat-tip adġuvanti, li fihom l-istat ellerġiku jkun ippotenzjat bit-taħlil jew bis-sospensjoni tas-sustanza tat-test fi Freunds Complete Adjuvant (FCA), u f’testijiet mhux adġuvanti.
         Testijiet tat-tip adġuvanti pjuttost li jkunu aktar eżatti fit-tbassir ta’ effett sensitizzanti probabbli tal-ġilda ta’ sustanza fuq il-bniedem milli dawk il-metodi li ma jutilizzawx il-Freunds Complete Adjuvant u huma għalhekk il-metodi preferiti.
         It-test tal-Massimizzazzjoni tal-Fenek ta’ l-Indi (GPMT) huwa test tat-tip adġuvanti ferm użat. Għalkemm diversi metodi oħrajn jistgħu jkunu użati għas-sejbien tal-potenzjal ta’ sustanza li tikkaġuna reazzjoni ta’ sensitizzazzjoni tal-ġilda, il-GPMT huwa meqjusa bħala li huma t-teknika adġuvinanti preferuta.
         B’ħafna mill-klassijiet kimiċi, testijiet mhux-adġuvinanti (dak preferut huwa t-test Buehler) huma meqjusa bħala li huma anqas sensittivi.
         F’ċerti każi jista’ jkun hemm raġunijiet tajbin għall-għażla tat-test Buehler li jinvolvi applikazzjoni topika pjuttost milli l-injezzjoni intradermali użata fit-Test tal-Massimizzazzjoni tal-Fenek ta’ l-Indi. Ġustifikazzjoni xjentifika għandha tkun mogħtija meta t-test Buehler ikun użat.
         It-Test tal-Massimizzazzjoni tal-fenek ta’ l-Indi (GPMT) u t-test Buehler huma deskritti f’dan il-metodu. Metodi oħrajn jistgħu ikunu użati basta li dawn ikunu validati tajjeb u l-ġustifikazzjoni xjentifika tkun mogħtija.
         Jekk ikun jidher riżultat pożittiv f’test ta’ screening rikonoxxut, sustanza tat-test jista’ jiġi ddisinjat bħala sensitizzatur potenzjali, u jista’ ma jkunx meħtieġ test ieħor fuq il-fniek ta’ l-Indi. Madankollu, jekk ikun hemm riżultat negattiv f’test bħal dan, it-test fuq il-fniek ta’ l-Indi jrid isir bil-proċedura deskritta f’dan il-metodu tat-test.
         Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         Is-sensitizzazzjoni tal-ġilda: (kuntatt allerġiku dermatitis) hija reazzjoni immunoloġikament cutaneous għas-sustanza. Fil-bniedem, ir-rispons jista’ jkun karatterizzat minn pruritis, erythema, oedema, papules, vesicles, bullae jew kombinazzjoni ta’ dawn. Fi speċje oħra ir-reazzjonijiet jistgħu ivarjaw u l-erythemau l- oedema biss jistgħu jidhru.
         Espożizzjoni ta’ induzzjoni: espożizzjoni sperimentali ta’ suġġett għal sustanza tat-test bil-ħsieb li joħloq stat ipersensittiv.
         Il-perjodu ta’ induzzjoni: perjodu ta’ mill-inqas ġimgħa wara l-espożizzjoni ta’ induzzjoni li matulu jista’ jiżviluppa stat ipersensittiv.
         Espożizzjoni ta’ tħaqqieq: espożizzjoni sperimentali ta’ suġġett li jkun ġie trattat qabel għas-sustanza tat-test wara l-perjodu ta’ induzzjoni, sabiex jiġi determinat jekk is-suġġett jirreaġixxix b’mod ipersensittiv.
         1.3.   SUSTANZI TA’ REFERENZA
         Is-sensittività u l-kredibilità tat-teknika sperimentali għandha tiġi valutata kull sitt xhur bl-użu tas-sustanzi, li huma magħrufa li jkollhom proprjetajiet ta’ sensitizzazzjoni għall-ġilda ħfief għal moderati.
         F’test magħmul sew, huwa mistenni li għal sesitizzaturi ħfief għal moderati jkun hemm rispons ta’ mill-inqas 30 % f’test adġuvinanti u mill-inqas 15 % f’test li mhux adġuvinanti.
         Is-sustanzi li ġejjin huma preferuti.
         
                     Numri CAS
                  
                  
                     Numri EINECS
                  
                  
                     Ismijiet EINECS
                  
                  
                     Ismijiet komuni
                  
               
                     101-86-0
                  
                  
                     202-983-3
                  
                  
                     α-hexylcinnamaldehyde
                  
                  
                     α-hexylcinnamaldehyde
                  
               
                     149-30-4
                  
                  
                     205-736-8
                  
                  
                     Benzothiazole-2-thiol (mercaptobenzothiazole)
                  
                  
                     kaptax
                  
               
                     94-09-7
                  
                  
                     202-303-5
                  
                  
                     Benzocaine
                  
                  
                     norcaine
                  
               Jista’ jkun hemm ċirkustanzi fejn, b’ġustifikazzjoni adegwata mogħtija jistgħu jintużaw sustanzi ta’ kontroll oħra li jissodisfaw il-kriterji t’hawn fuq.
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         L-annimali għat-test huma esposti fil-bidu għas-sustanza tat-test permezz ta’ injezzjonijiet intradermali u/jew applikazzjoni epidermali espożizzjoni ta’ induzzjoni). Wara perjodu ta’ waqfa ta’ minn 10 sa 14-il jum (perjodu ta’ induzzjoni), li matulu jista’ jiżviluppa rispons ta’ immunità, l-annimali jiġu esposti għal doża ta’ tħaqqieq. Il-grad u l-firxa tar-reazzjoni tal-ġilda għall-espożizzjoni ta’ tħaqqieq fl-annimali għat-test huma mqabbla ma’ dak li ntwera fl-annimali ta’ kontroll li jġarrbu l-istess trattament waqt l-induzzjoni u jirċievu l-espożizzjoni ta’ tħaqqieq.
         1.5.   DESKRIZZJONI TAL-METODI TAT-TEST
         Jekk it-tneħħija tas-sustanza tat-test hija meħtieġa, dan għandu jinkiseb bl-użu ta’ l-ilma jew solvent xieraq mingħajr bidla fir-rispons li jkun hemm jew fl-integrità ta’ l-epidermi.
         1.5.1.   Test ta’ Massimizzazzjoni tal-Fniek ta’ l-Indi (TMFI)
         
         1.5.1.1.   Preparazzjonijiet
         
         Fniek ta’ l-indi albino, żgħażagħ u b’saħħithom jadattaw għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju mill-inqas 5 ijiem qabel it-test. Qabel it-test, l-annimali jingħażlu bl-addoċċ fi gruppi ta’ trattament. It-tneħħija tax-xagħar isir permezz ta’ l-ikklippjar, tqaxxir jew possibilment depolazzjoni kemikali, skond il-metodu tat-test użat. Għandha tingħata attenzjoni sabiex il-ġilda ma tiġix migrufa. L-annimali jintiżnu qabel jibda t-test u fi tmiemu.
         1.5.1.2.   Kundizzjonijiet tat-test
         
         1.5.1.2.1.   Annimali għat-test
         Razzez tal-fniek ta’ l-indi albino normalment użati fil-laboratorju huma utilizzati
         1.5.1.2.2.   In-numru u s-sess
         Annimali maskili u/jew femminili jistgħu ikunu użati. Jekk ikunu użati femminili, dawn għandhom ikunu femminili li qatt ma welldu u li mhumiex tqal.
         Minimu ta’ 10 annimali huma użati fil-grupp ittrattat u mill-anqas 5 fil-grupp tal-kontroll. Meta inqas minn 20 test u 10 fniek ta’ l-Indi jkunu ntużaw, u mhux possibbli tikkonkludi li s-sustanza għat-test hija sensitizzatur, huwa rakkomandat ħafna li jiġu ttestjati iktar annimali sabiex ikun hemm mill-inqas total ta’ 20 test u 10 annimali tal-kontroll.
         1.5.1.2.3.   Livelli tad-dożi
         Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija aġġustata lejn livell li jipproduċi xi ftit ta’ l-evidenza ta’ l-irritazzjoni tal-ġilda, imma li tkun tollerata tajjeb mill-annimali matul kull stadju ta’ l-induzzjoni. Il-konċentrazzjoni użata għandha tkun il-massimu li ma jipproduċi l-ebda evidenza ta’ l-irritazzjoni tal-ġilda f’annimali li mhumiex sensitizzati. Dawn il-konċentrazzjoninijiet jistgħu jkunu determinati fi skala żgħira b’żewġ jew tliet annimali waqt l-istudju pilota ladarba informazzjoni oħra ma tkunx disponibbli. L-annimali trattati bl-FCA għandhom jiġu kkunsidrati għal dan il-għan.
         1.5.1.3.   Il-Proċedura
         
         1.5.1.3.1.   L-induzzjoni
         Jum 0 – il-grupp ittrattat
         Il-pari segwenti ta’ injezzjonijiet intradermali, kull waħda ta’ 0,1 ml, huma mogħtija fiż-żona ta’ l-ispalla li ma jkollhiex suf hekk li kull wieħed mill-pari jkun fuq kull naħa taċ-ċentru ta’ l-annimal.
         Injezzjoni 1: it-taħlita ta’ (v/v) FCA/l-ilma jew salin fiżjoloġiku 1:1
         Injezzjoni 2: is-sustanza tat-test, bil-mezz xieraq u bil-konċentrazzjoni magħżula
         Injezzjoni 3:is-sustanza tat-test bil-konċentrazzjoni magħżula fformulata f’taħlita 1:1 (v/v) FCA/ilma jew salin fiżjoloġiku
         Fl-injezzjoni 3, is-sustanzi li jinħallu fl-ilma huma mdewba fil-fażi akweja qabel it-taħlit ma’ l-FCA. Is-sustanzi liposolubbli jew insolubbli huma mdendla fl-FCA qabel il-kombinazzjoni mal-fażi akweja. Il-konċentrazzjoni finali tas-sustanza għat-test għandha tkun ugwali għal dik użata fit-2 injezzjoni.
         L-injezzjonijiet 1 u 2 jingħataw waħda wara l-oħra u qrib ir-ras kemm jista’ jkun, waqt illi l-injezzjoni 3 tkun lejn il-parti kawdjali taż-żona tat-test.
         Jum 0 – il-grupp tal-kontroll
         It-tliet pari ta’ injezzjonijiet intradermali ta’ 0,1 ml f’volum il-waħda jingħataw fl-istess żoni bħal fl-annimali trattati.
         Injezzjoni 1: it-taħlita (v/v) FCA/ilma jew salin fiżjoliġiku 1:1
         Injezzjoni 2: il-mezz mhux maħlul fl-ilma
         Injezzjoni 3: formulazzjoni ta’ 50 % w/v tal-mezz f’taħlita (v/v) FCA/ilma jew salin fiżjoloġiku 1:1
         5-7 jum – gruppi ta’ kontroll trattati
         Bejn wieħed u ieħor erbgħa u għoxrin siegħa qabel l-applikazzjoni ta’ l-induzzjoni topikali, jekk is-sustanza mhix irritanti għall-ġilda, iż-żona tat-test, wara l-ikklippjar u/jew it-tqaxxir tiġi trattata b’0,5 ml ta’ 10 % mis- sulfat lawrju tas-sodju fil-vażelina, sabiex tinħoloq irritazzjoni lokali.
         Jum 6-8 tal-grupp trattat
         Iż-żona tat-test terġa’ titnaddaf mis-suf. Filter paper (2 x 4 ċm) titgħabba kollha bis-sustanza għat-test f’mezz xieraq u applikata fuq iż-żona tat-test u miżmuma f’kuntatt permezz ta’ faxxa okklussiva għal 48 siegħa. L-għażla tal-mezz għandha tkun ġustifikata. Is-solidi jiġu pulverizzati b’mod fin u inkorporati f’mezz xieraq. Il-likwidi jistgħu jiġu applikati mingħajr taħlit bl-ilma jekk inhu xieraq.
         Jum 6-8 grupp ta’ kontroll
         Iż-żona tat-test terġa’ titnaddaf mis-suf. Il-mezz biss huwa applikat b’mod simili liż-żona tat-test u miżmum f’kuntatt permezz ta’ faxxa okklussiva għal 48 siegħa.
         1.5.1.3.2.   It-tħaqqieq
         Jum 20-22 gruppi ta’ kontroll trattati
         Il-ġenbejn huma trattati u l-annimali tal-kontroll huma mnaddfa mix-xagħar. Biċċa jew kapsula li jkun fiha s-sustanza tat-test hija applikata ma’ wieħed mill-ġnub ta’ l-annimali ittratati u l-biċċa jew il-kapsula mil-mezz biss mal-ġemb l-ieħor. Il-biċċiet huma miżmuma b’faxxa okklussiva għal 24 siegħa.
         L-osservazzjoni u l-iggradar: gruppi ta’ kontroll trattati
         
                     —
                  
                  
                     Bejn wieħed u ieħor 21 siegħa wara t-tneħħija tal-biċċa, iż-żona mħaqqa hija mnaddfa u kklippjata u/jew imqaxxra u depilata jekk ikun meħtieġ,
                  
               
                     —
                  
                  
                     Bejn wieħed u ieħor 3 sigħat wara (bejn wieħed u ieħor 48 siegħa mill-bidu ta’ l-applikazzjoni tat-tħaqqieq) ir-reazzjoni tal-ġilda hija osservata u rrekordjata skond il-gradi li jidhru fl-appendiċi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Bejn wieħed u ieħor 24 siegħa wara din l-osservazzjoni, it-tieni osservazzjoni (72 siegħa) hija mwettqa u rrekordjata għal darb’oħra.
                  
               Il-qari bl-addoċċ ta’ l-annimali ta’ kontroll u tat-test huwa nkuraġġit.
         Sabiex ikunu kjarifikati r-riżultati miksuba fl-ewwel tħaqqieqa, t-tieni tħaqqieqa, fejn hu xieraq mal-grupp tal-kontroll ġdid, għandha tkun meqjusa madwar ġimgha minn wara l-ewwel waħda. Tħaqqieq għat-tieni darba jista’ jsir ukoll fuq il-grupp ta’ kontroll oriġinali.
         Ir-reazzjoni kollha tal-ġilda f’xi sejbiet mhux tas-soltu inklużi r-reazzjonijiet sistematiċi li jirriżultaw mill-proċeduri ta’ l-induzzjoni u tat-tħaqqieq ghandhom ikunu osservati u rrekordjati skond l-iskala ta’ gradazzjoni ta’ Magnusson/Kligman (Ara l-appendiċi). Proċeduri oħra, eż. L-eżaminazzjoni ħispatoloġika, il-kejl tal-ħxuna tat-tinja tal-ġilda, tista’ titwettaq sabiex jiġu ċċarati ir-reazzjonijiet dubbjużi.
         1.5.2.   It-test Buehler
         
         1.5.2.1.   Preparazzjonijiet
         
         Fniek ta’ l-indi albino, żgħażagħ u b’saħħithom jadattaw għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju 5 ijiem qabel it-test. Qabel it-test, l-annimali jinġabru kif jinzerta u assenjati għall-gruppi ta’ trattament. Il-pil jitneħħa billi jiġi kklippjat, imqaxxar jew possibilment depilat kimikament skond il-metodu tat-test użat. Għandha tingħata attenzjoni sabiex tkun evitata li ssir xi ħsara lill-ġilda. L-annimali jintiżnu qabel ma jibda t-test u fi tmiemu.
         1.5.2.2.   Il-kundizzjonijiet tat-test
         
         1.5.2.2.1.   L-annimali għat-test
         Razez tal-fniek ta’ l-indi albino normalment użati fil-labortatorju huma utlizzati.
         1.5.2.2.2.   Numru u sess.
         Annimali maskili u/jew femminili jistgħu jintużaw. Jekk ikunu użati femminili, dawn għandhom ikunu femminili li qatt ma welldu u li mhumiex tqal.
         Minimu ta’ 20 annimal huma użati fil-grupp ittrattat u mill-anqas 10 fil-grupp tal-kontroll.
         1.5.2.2.3.   Il-livelli tad-dożi
         Għal kull stadju ta’ l-induzzjoni, il-konċentrazzjonini tas-sustanza tat-test hija aġġustata għal-ogħla livell possibbli biex tipproduċi irritazzjoni ħafifa imma mhux eċċessiva. Il-konċentrazzjoni mħaqqa għandha tkun il-massimu tad-doża mhux irritanti. Jekk ikun meħtieġ il-konċentrazzjonini xierqa tista’ tiġi determinata minn studju pilota bl-użu ta’ żewġ jew tliet annimali.
         Għall-materjali tat-test li jinħallu fl-ilma, huwa xieraq li jintuża l-ilma jew soluzzjoni mħallta bl-ilma li ma tikkawżax irritazzjoni ta’ surfactant bħala l-mezz. Għal materjali tat-test oħra 80 % ta’ l-etanol/l-ilma huwa preferut għall-induzzjoni u t-tħaqqieq ta’ l- acetone.
         
         1.5.2.3.   Il-proċedura
         
         1.5.2.3.1.   L-induzzjoni
         Jum 0 – il-grupp trattat
         Ġenb wieħed huwa mnaddaf mill-pil (ikklippjat). Is-sistema tal-biċċa għat-test għandha titgħabba tajjeb bis-sustanza għat-test f’mezz xieraq (l-għażla tal-mezz għandha tkun ġustifikata; is-sustanzi għat-test likwidi jistgħu jiġu applikati mingħajr ma jitħalltu bl-ilma, jekk ikun xieraq).
         Is-sistema tal-biċċa għat-test hija applikata fuq iż-żona tat-test u miżmuma f’kuntatt permezz ta’ biċċa okklussiva jew kapsula u faxxa xierqa għal 6 sigħat.
         Is-sistema tal-biċċa għat-test trid tkun okklussiva. Biċċa tal-qoton hija adattata u tista’ tkun tonda jew kwadra, iżda għandha tkun bejn wieħed u ieħor minn 4-6 cm2. Iż-żamma permezz ta’ żamma xierqa hija preferuta sabiex tiżgura l-okklużjoni. Jekk jiġi użat it-tqarwis, espożizzjonijiet addizzjonali jistgħu jkunu meħtieġa.
         Jum 0 – il-grupp tal-kontroll
         Ġenb wieħed huwa mnaddaf mill-pil (bl-ikklippjar). Il-mezz biss huwa applikat b’manjera simili bħal dik għall-grupp trattat. Is-sistema tal-biċċa għat-test tinżamm f’kuntatt mal-ġilda b’biċċa jew kapsula oklussiva u faxxa xierqa għal 6 sigħat. Jekk jista’ jintwera li grupp ta’ kontroll falz mhux meħtieġ, jista’ jintuża grupp ta’ kontroll naive.
         Jiem 6-8 u 13-15 – il-grupp ta’ kontroll trattat
         Titwettaq l-istess applikazzjoni bħal fil-jum 0 fuq l-istess żona għat-test (nadifa mill-pil jekk ikun meħtieġ) tal-ġenb fil-jum 6-8, u għal darb’oħra fil-jum 13-15.
         1.5.2.3.2.   It-tħaqqieq
         Il-jum 27-29 – il-grupp ta’ kontroll trattat
         Il-ġenb li ma ġiex trattat ta’ l-annimali ta’ kontroll u trattati jitnaddaf mill-pil (bl-ikklippjar). Biċċa okklussiva jew kabina li jkun fiha l-ammont xieraq tas-sustanza għat-test tiġi applikata fil-massimu tal-konċentrazzjoni li mhix irritanti fuq il-ġenb mhux trattat ta’ wara ta’ l-annimali ta’ kontroll u trattati.
         Fejn jgħodd, biċċa okklussiva jew kabina bil-mezz biss tiġi applikata fuq il-ġenb mhux trattat ta’ quddiem ta’ l-annimali li huma kemm kontrollati u kemm trattati. Il-biċċiet jew kabini huma miżmuma f’kuntatt permezz ta’ faxex xierqa għal 6 sigħat.
         1.5.2.3.3.   L-osservazzjoni u l-iggradar
         
                     —
                  
                  
                     Bejn wieħed u ieħor 21 siegħa wara t-tneħħija tal-biċċa, ż-żona mħaqqa hija mnaddfa mill-pil;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Bejn wieħed u ieħor tliet sigħat aktar tard (bejn wieħed u ieħor 30 siegħa mill-bidu ta’ l-applikazzjoni tal-biċċa tat-tħaqqieq) ir-reazzjoni tal-ġilda hija osservata u rrekordjata skond il-gradi murija fl-appendiċi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Bejn wieħed u ieħor 24 siegħa wara l-osservazzjoni ta’ 30 siegħa, (bejn wieħed u ieħor 54 siegħa wara l-applikazzjoni tal-biċċa tat-tħaqqieq) ir-reazzjonijiet tal-ġilda huma għal darb’oħra osservati u rrekordjati.
                  
               Il-qari bl-addoċċ ta’ l-annimali ta’ kontroll u għat-test huwa nkuraġġit.
         Sabiex ikunu kjarifikati r-riżultati miksuba fl-ewwel tħaqqieqa, t-tieni tħaqqieqa, fejn hu xieraq mal-grupp tal-kontroll ġdid, għandha tkun meqjusa madwar ġimgha minn wara l-ewwel waħda. Tħaqqieq għat-tieni darba jista’ jsir ukoll fuq il-grupp ta’ kontroll oriġinali.
         Ir-reazzjoni kollha tal-ġilda f’xi sejbiet mhux tas-soltu inklużi r-reazzjonijiet sistematiċi li jirriżultaw mill-proċeduri ta’ l-induzzjoni u tat-tħaqqieq ghandhom ikunu osservati u rrekordjati skond l-iskala ta’ gradazzjoni ta’ Magnusson/Kligman (Ara l-appendiċi). Proċeduri oħra, eż. L-eżaminazzjoni ħispatoloġika, il-kejl tal-ħxuna tat-tinja tal-ġilda, tista’ titwettaq sabiex jiġu ċċarati ir-reazzjonijiet dubbjużi
         2.   DATA (GPMT u t-test buehler)
         Id-data għandha tkun riassunta f’għamla tabulari, li turi għal kull annimal individwali r-reazzjonijiet tal-ġilda għal kull perjodu ta’ l-osservazzjoni.
         3.   RAPPURTAĠĠ (GPMT u t-test Buehler)
         Jekk l-iscreening isir qabel it-test fuq il-fenek ta’ l-Indi, id-deskrizzjoni jew ir-referenza tat-test (eż. It-Test ta’ l-Infiħ tal-Widnejn tal-Ġurdien (TIWĠ), inklużi d-dettalji tal-proċedura, iridu jingħataw flimkien mar-riżultati miksuba mas-sustanzi tat-test u tar-referenza.
         Rapport tat-test (GPMT u t-test Buehler)
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk inhu possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Annimali għat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ir-razza tal-fniek ta’ l-indi użata;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru, l-età u s-sess ta’ l-annimali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sors. Il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpoġġew. Id-dieta eċċ.;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test u fi tmiemu.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Il-kundizzjonijiet tat-test
                     
                                 —
                              
                              
                                 it-teknika tal-preparazzjoni taż-żona tal-biċċa;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tal-materjali tal-biċċa użati u t-teknika tal-biċċa;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ir-riżultat ta’ l-istudju pilota bil-konklużjoni fuq l-induzzjoni u l-konċentrazzjonijiet tat-tħaqqieq li jridu jintużaw fit-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tal-preparazzjoni tas-sustanza għat-test, l-applikazzjoni u t-tneħħija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-mezz;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-mezz u l-konċentrazzjonijiet tas-sustanza għat-test użati għall-induzzjoni u l-espożizzjonijiet tat-tħaqqieq u l-ammont totali tas-sustanza applikata għall-induzzjoni u għattħaqqieq.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Ir-riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 taqsira tar-riżultati ta’ l-aħħar ċekkjatura għas-sensittività u għall-kredibilità (ara 1.3) inkluża l-informazzjoni fuq is-sustanza, il-konċentrazzjoni u l-mezz użat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ta’ kull annimal inkluża s-sistema ta’ gradazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni narrativa ta’ l-effetti tan-natura u tal-gradi osservati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kwalunkwe sejbiet hispatoloġiċi.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Id-diskussjoni tar-riżultati
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         Dan il-metodu huwa analogu għal OECD TG 406
         
            Appendiċi
            TABELLA
            L-iskala ta' gradazzjoni ta' Magnusson/Kligman għall-evalwazzjoni tat-test għar-reazzjonijiet tal-biċċa tat-tħaqqieq
            0 = l-ebda bidla ċara
            1 = erythema moderata jew fi dbabar
            2 = erythema moderata u konfluwenti
            3 = erythema intensa u nefħa
         
         B.7.   DOŻA REPETUTA (28 JUM) TOSSIĊITÀ (ORALI)
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.3.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza tat-test hija somministrata b’mod orali, ta’ kuljum, b’dożi meqjusa lil diversi gruppi ta’ annimali sperimentali, b’doża waħda tkun użata ma’ kull grupp matul perjodu ta’ 28 jum. Matul il-perjodu ta’ l-amministrazzjoni, l-annimali huma osservati kuljum sabiex ikunu skoperti sinjali tat-tossiċità. Annimali li jmutu jew jinqatlu matul it-test ikollhom awtopsija tal-mewt u l-konklużjoni tat-test li l-annimali li jibqgħu ħajjin jinqatlu u jkollhom ukoll l-awtopsija ta’ wara l-mewt.
         Dan il-metodu jenfasizza ħafna iktar fuq l-effetti newroloġiċi bħala endpoint, u fuq il-ħtieġa ta’ osservazzjonijiet kliniċi u tal-galbu ta’ l-annimali, sabiex tinkiseb kemm jista’ jkun informazzjoni. Il-metodu għandu jidentifika il-kimiċi li għandhom potenzjal newrotossiku, li jista’ jwassal għal iktar investigazzjoni bir-reqqa fuq dan l-aspett. Barra minn hekk, il-metodu jista’ jagħti indikazzjoni ta’ l-effetti immunoloġiċi u tat-tossiċità ta’ l-organu riproduttiv.
         1.4.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.4.1.   It-tħejjija
         L-annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma magħżula b’mod kif jinzerta u assenjati lejn gruppi ta’ kontroll u ta’ trattament. Il-gaġeġ għandhom jitqiegħdu b’tali mod li l-effetti possibbli jiġu minimizzati minħabba kif ikunu mqiegħda l-gaġeġ. L-annimali huma identifikati wieħed wieħed u miżmuma fil-gaġeġ tagħhom għal mill-inqas ħamest ijiem qabel il-bidu ta’ l-istudju sabiex l-annimali jidraw il-kundizzjonijiet tal-laboratorju.
         Is-sustanza tat-test tista’ tiġi somministrata ma’ l-ikel, bl-għalf sfurzat, jew fl-ilma tax-xorb. Il-metodu ta’ l-amministrazzjoni orali jiddependi fuq l-iskop ta’ l-istudju, u l-propjetajiet fiżiko/kimiċi tas-sustanza.
         Fejn hu meħtieġ, is-sustanza għat-test tinħall jew tipi sospiża f’mezz xieraq. Huwa rakkomandat li, kull fejn hu possibbli, l-użu ta’ soluzzjoni/sospensjoni akwea tiġi kkunsidrata l-ewwel, u wara tiġi kkunsidrata is-soluzzjoni/emulsjoni fiż-żejt (eż. Żejt tal-qamħ) u mbagħad permezz ta’ soluzzjoni possibbli f’mezzi oħra. Għal mezzi li mhumiex l-ilma l-karatteristiċi tossiċi tal-mezz iridu jkunu magħrufa. L-istabilità tas-sustanza għat-test fil-mezz għandha tiġi determinata.
         1.4.2.   Il-kundizzjonijiet tat-test
         1.4.2.1.   L-annimali għat-test
         Il-far huwa l-ispeċi preferita fir-razza tal-gerriema għalkemm speċji oħra ta’ gerriema jistgħu jintużaw. Razez komuni użati fil-laboratorju ta’ annimali żgħażagħ b’saħħithom għandhom ikunu użati. In-nisa iridu jkunu qatt ma welldu qabel u mhumiex tqal. Id-dożaġġ għandu jibda malajr kemm jista’ jkun wara l-fatma u qabel ma l-annimali jkollhom disa’ ġimgħat.
         Fil-bidu ta’ l-istudju l-medda tal-varjazzjoni fil-piż ta’ l-annimali użati m’għandhiex teċċedi ± 20 % tal-valur medju ta’ kull sess.
         Fejn ikun hemm studju tad-doża ripetuta orali bħala studju preliminari għal ieħor fit-tul, preferebbilment għandhom jintużaw annimali mill-istess razza u sors fiż-żewġ studji.
         1.4.2.2.   Numru u sess
         Mill-anqas 10 annimali gerriema (ħamsa femminili u ħamsa maskili) għandhom ikunu użati f’kull livell ta’ doża. Jekk sagrifikar interim huwa ppjanat, in-numru ta’ l-annimali għandu jkun miżjud bin-numru ta’ l-annimali skedati li jkunu sagrifikati qabel it-tkomplija ta’ l-istudju.
         Barra minn hekk, grupp satellita ta’ 10 annimali (ħames annimali kull sess) jista’ jiġi trattat bil-livell għoli ta’ doża għal 28 jum u osservat għar-riversibbiltà, għall-persistenza, jew għad-dewmien fl-okkorrenza ta’ l-effetti tossiċi għal 14-il jum ta’ wara t-trattament. Grupp satellita ta’ 10 annimali ta’ kontroll (ħames annimali kull sess) huwa użat ukoll.
         1.4.2.3.   Livelli tad-dożi
         Ġeneralment, mill-anqas tliet gruppi għat-test u grupp ta’ kontroll għandhom ikunu użati. Appart milli t-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom ikunu trattati b’mod identiku bħal dawk suġġetti għat-test. Meta mezz ikun użat sabiex tiġi somministrata s-sustanza għat-test, il-grupp ta’ kontroll għandu jilqa’ l-mezz fl-ogħla volum użat.
         Jekk mill-valutazzjoni ta’ data oħra, ma jkunu mistennija l-ebda effetti fid-doża ta’ 1 000 mg/kg bw/d, test ta’ limitu jista’ jitwettaq. Jekk m’hemm l-ebda data xierqa disponibbli, studju għat-tiftix tal-medda jista’ jsir biex jgħin id-determinazzjoni tad-dożi li se jintużaw.
         Livelli ta’ dożi għandhom jingħażlu billi titqies kwalunkwe tossiċità u data (tossiku-) kinetika disponibbli għas-sustanza tat-test jew materjai relatati. L-ogħla livell tad-doża għandu jingħażel bl-għan li jwassal għal effetti tossiċi iżda mhux għal mewt jew tbatija qawwija. Wara, sekwenza li tinżel ta’ livelli tad-dożi għandha tingħażel bil-ħsieb li turi kwalunkwe rispons li għandu x’jaqsam mad-dożaġġ u l-ebda effetti avversi osservati fl-inqas livell tad-doża. Minn tnejn sa erba’ fold intervals huma ta’ spiss ottimali għall-issettjar ta’ l-inżul tal-livelli tad-dożi u ż-żieda tar-raba’ grupp għat-test huwa ta’ spiss iktar preferut milli l-intervalli kbar ħafna (eż. Iżjed minn fattur ta’ 10) bejn id-dożaġġi.
         Għas-sustanzi amministrati bid-dieta jew bl-ilma għax-xorb huwa importanti li jiġi żgurat li l-kwantitajiet tas-sustanza għat-test involuti ma jfixklux in-nutrizzjoni normali jew il-bilanċ ta’ l-ilma. Meta is-sustanza għat-test tiġi somministrata fid-dieta jista’ jintuża jew konċentrazzjoni ta’ dieta kostanti (ppm) jew livell ta’ dożi kostanti f’termini tal-piż tal-ġisem ta’ l-annimali. L-użu alternattiv irid jiġi speċifikat. Għal sustanza somministrata bil-fors id-doża trid tingħata f’ħinijiet simili kuljum, u aġġustati kif ikun meħtieġ sabiex jinżamm livell kostanti tad-doża f’termini tal-piż tal-ġisem ta’ l-annimal.
         Fejn jintuża studju ta’ doża repetuta bħala studju preliminarju għal ieħor twil, dieta simili għandha tintuża fiż-żewġ studji.
         1.4.2.4.   Test tal-limitazzjoni
         Jekk test ta’ livell ta’ doża waħda ta’ mill-inqas 1 000 mk/kg tal-piż tal-ġisem/kuljum jew, għall-amministrazzjoni ta’ l-ikel jew ilma għax-xorb, persentaġġ ekwivalenti fid-dieta jew fl-ilma għax-xorb (ibbażat fuq id-determinazzjonijiet tal-piż tal-ġisem), bl-użu tal-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, ma jipproduċi l-ebda effetti tossiċi li jistgħu jiġu osservati u jekk it-tossiċità ma tkunx mistennija bbażata fuq id-data minn sustanzi relatati, mela studju komplut bl-użu ta’ tliet livelli ta’ dożi jista’ ma jkunx meħtieġ. It-test tal-limitu japplika ħlief meta l-espożizzjoni umana tindika l-ħtieġa ta’ l-użu ta’ livell ta’ doża ogħla
         1.4.2.5   Perijodu ta’ l-osservazzjoni
         Il-perjodu ta’ osservazzjoni għandu jkun ta’ 28 jum. L-annimali fi grupp satellita skedat għall-osservazzjoni b’segwiment għandhom jinżammu għal mill-inqas 14-il jum mingħajr trattament sabiex jidher id-dewmien fl-okkorrenza, jew il-persistenza ta’ jew l-irkupru minn effetti tossiċi.
         1.4.3.   Il-proċedura
         L-annimali jirċievu d-doża bis-sustanza tat-test kuljum sebat ijiem fil-ġimgħa għal perjodu ta’ 28 jum; l-użu ta’ dieta ta’ żamest ijiem fil-ġimgħa jrid jiġi ġustifikat. Meta s-sustanza tat-test tiġi somministrata bil-fors, dan għandu jsir f’doża waħda lill-annimali bl-użu ta’ tubu fl-istonku jew intubazzjoni cannula xierqa. Il-volum massimu tal-likwidu li jista’ jiġi amministrat f’darba jiddependi mid-daqs ta’ l-annimal għat-test. Il-volum m’għandux jaqbeż .il-1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem, ħlief fil-każ ta’ soluzzjonijiet akwei fejn 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem jista’ jintuża. Ħlief għal sustanzi korrużivi jew li jikkawżaw irritazzjoni, li normalment jiżvelaw effetti agħar b’konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandha tkun minimizzata bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti fil-livelli tad-dożi kollha.
         1.4.3.1   Osservazzjonijiet ġenerali
         L-osservazzjonijiet kliniċi ġenerali għandhom isiru mill-inqas darba kuljum, preferibbilment fl-istess ħin (ħinijiet) kuljum u jiġi kkunsidrat il-perjodu peak ta’ l-effetti antiċipati wara d-dożaġġ. Il-kundizzjonijiet tas-saħħa ta’ l-annimali għandha tiġi rrekordjata. Mill-inqas darbtejn kuljum, l-annimali kollha jiġu osservati għall-morbidità u għall-mortalità. L-annimali li qed imutu u dawk li qegħdin fi tbatija jew uġigħ qawwija għandhom jitneħħew, jinqatlu b’mod uman u ssir fuqhom in-nekropsija.
         Darba qabel l-ewwel espożizzjoni (biex tippermetti l-paraguni fi ħdan is-suġġett), u mill-inqas darba fil-ġimgħa wara dan, osservazzjonijiet kliniċi u dettaljati għandhom isiru fl-annimali kollha. Dawn l-osservazzjonijiet għandhom isiru barra l-gaġġa f’arena standard u preferebbilment fl-istess ħin kull darba. Għandhom ikunu rrekordjati b’attenzjoni, preferebbilment bl-użu ta’ sistemi ta’ mmarkar, definiti espliċitament mil-laboratorju ta’ l-ittestjar. Għandu jsir sforz sabiex jiġi żgurat li l-varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet tat-test huma minimali u li l-osservazzjonijiet isiru preferebbilment minn osservaturi li ma jafux bit-trattament. Is-sinjali nnotati għandhom jinkludu, iżda mhux ikunu limitati għal, tibdiliet fil-ġilda, fil-pil, fl-għajnejn, fil-membrani mukożji, l-okkorrenza ta’ taqtir u eskrezzjonijiet u attività awtonomika (eż. lacrimation, piloerection, id-daqs tal-pupill, disinn respiratorju mhux tas-soltu). It-tibdiliet fil-gait, fil-pożizzjoni u rispons għall-immaniġġjar kif ukoll il-preżenza ta’ ċaqliq kloniku jew toniku, sterjotipi (eż. Grooming eċċessiv, tidwir f’ċirku repetittiv) jew imġiba stramba (eż. Awto-mutilazzjoni, mixi b’lura) għandhom jiġu rrekordjati wkoll.
         Fir-raba’ ġimgħa ta’ espożizzjoni għandhom isiru reattività sensorja għal tipi differenti ta’ stimuli (eż. Stimuli awditorjali, viżwali u proprioceptive), il-valutazzjoni tas-saħħa fil-qabda ta’ l-id u fil-motor activity. Iktar dettalji tal-proċeduri li jistgħu jiġu wara jinsabu fil-letteratura (ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B).
         Osservazzjonijiet funzjonali li jitwettqu fir-raba’ ġimgħa ta’ espożizzjoni jistgħu jitħallew barra meta l-istudju jsir bħala studju preliminarju għal studju subkroniku sussegwenti (90 jum). F’dak il-każ, l-osservazzjonijiet funzjonali għandhom jiġu inklużi f’dan l-istudju. Minnaħa l-oħra, id-disponibbiltà tad-data fuq l-osservazzjonijiet funzjonali mid-doża repetuta tista’ żżid l-abbiltà għall-għażla tal-livelli tad-doża għal studju subkroniku sussegwenti.
         B’eċċezzjoni, l-osservazzjonijiet funzjonali jistgħu jitħallew barra għal gruppi li juru sinjali ta’ tossiċità tant li jinterferixxu b’mod sinifikanti fil-prestazzjoni funzjonali tat-test.
         1.4.3.2.   Il-piż tal-ġisem u l-konsum ta’ l-ikel/xorb
         L-annimali kollha għandhom jintiżnu mill-inqas darba fil-ġimgħa. Il-konsum ta’ l-ikel u tax-xorb għandu jitkejjel għallinqas kull ġimgħa. Jekk is-sustanza għat-test hija somministrata permezz ta’ l-ilma għax-xorb, il-konsum ta’ l-ilma għandu jitkejjel għallinqas fil-ġimgħa wkoll.
         1.4.3.3.   Ħematoloġija
         L-eżaminazzjonijiet ħematoloġiċi li ġejjin għandhom isiru fl-aħħar tal-perjodu għat-test: Haematocrit, konċentrazzjoni ta’ haemoglobin, l-għadd ta’ l- erythrocyte, l-għadd totali u differenzjali tal-leucocyte , l-għadd tal- platelet u l-kejl tal-ħin/potenzjali tal-boċċi fid-demm.
         Il-kampjuni tad-demm għandhom jittieħdu minn site imsemmija eżatti qabel jew bħala parti mill-proċedura tal-qtil ta’ l-annimali, u maħżuna f’kundizzjonijiet xierqa.
         1.4.3.4.   Il-bijokemistrija klinika
         Id-determinazzjonijiet tal-bijokemistrija klinika biex jinvestigaw effetti prinċipali tossiċi fit-tessuti u, speċifikament, l-effetti fuq il-kliewi u fuq il-fwied, għandhom isiru fuq il-kampjuni tad-demm miksuba mill-annimali kollha eżatti qabel jew bħala parti mill-proċedura tal-qtil ta’ l-annimali (apparti ta’ dawk li jinstabu qed imutu u/jew jinqatlu). Huwa rakkomandat is-sawm mal-lejl ta’ l-annimali qabel it-teħid tal-kampjuni tad-demm (1). L-investigazzjonijiet tal-plasma jew serum għandhom jinkludu is-sodju, il-putassa, il-glokożju, il-kolestorol totali, l-urea, il-creatinine, il-proteini u l-albumin totali, mill-inqas żewġ enzimi indikattivi ta’ effetti epatoċellulari (bħalma huma l-alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, alkaline phosphatase, gamma glutamyl transpeptidase, u sorbitol dehydrogenase). Il-kejl ta’ enzimi addizzjonali (ta’ oriġini epatika jew oħra) u aċidi tal-bile jista’ jipprovdi informazzjoni utli taħt ċerti ċirkostanzi.
         B’għażla, id-determinazzjonijiet ta’ l-analiżi ta’ l-urina li ġejjin jistgħu jsiru waqt l-aħħar ġimgħa ta’ l-istudju bl-użu tal-ġbir bil-ħin tal-volum ta’ l-urina; l-apparenza, il-volum, l-osmolality jew gravità speċifika, pH, il-proteini, il-glukożju u d-demm/iċ-ċelloli tad-demm.
         Barra minn hekk, studji biex jinvestigaw l-immarkar tas-serum ta’ ħsara ġenerali għat-tessuti għandhom jiġu kkunsidrati. Determinazzjonijiet oħra li għandhom jitwettqu jekk il-proprjetajiet magħrufa tas-sustanza għat-test jistgħu, jew huma suspettati li jaffettwaw il-profili metaboliċi relatati jinkludu il-kalċju, il-fasting triglycerides, l-ormoni speċifiċi, il-methaemoglobin u l-cholinesterase. Dawn iridu jiġu identifikati għas-sustanzi f’ċerti klassijiet jew fuq bażi ta’ kull każ.
         Fuq kollox, hemm il-bżonn ta’ attitudni flessibbli skond l-ispeċje u l-effett osservat u/jew mistenni mas-sustanza mogħtija.
         Jekk id-data storika mhix adegwata, għandha tingħata kunsiderazzjoni lid-determinazzjoni tal-varjabbli tal-bijokemistrija klinika u ematoloġika qabel ma jibda d-dożaġġ.
         1.4.3.5.   Nekropsija Grossa
         L-annimali kollha fl-istudju għandhom ikunu suġġetti għall-awtopsja sħiħa grossa ta’ wara l-mewt li tinkludi eżaminazzjoni bir-reqqa tal-wiċċ tal-ġisem, l-orifiċi kollha, u l-kavitajiet tal-kranju, tat-toraċi u dawk addominali u l-kontenut tagħhom. Il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, it-testi, l-epididymides, it-thymus, il-milsa, il-moħħ u l-qalb ta’ l-annimali kollha għandhom jiġu trimmjati minn kwalunkwe tessut aderenti, kif xieraq, u għandhom ikunu mwieżna niedja malajr kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni sabiex ma jinxfux.
         It-tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati fl-iktar medium xieraq għal kemm it-tip ta’ tessut u kemm għall-eżaminazzjoni ħispatoloġika maħsuba sussegwenti: il-feriti kbar kollha, il-moħħ (partijiet rappreżentattivi inklużi iċ-ċerebrum, iċ-ċerebellum u l-pons), il-korda spinali, l-istonku, l-intestini żgħar u kbar (inklużi l-Peyer's patches), il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, il-milsa, il-qalb, it-thymus, it-tajrojd, it-trakea u l-pulmuni (ippreservati bl-inflazzjoni bil-fixative imbagħad bl-immersjoni), il-gonads, l-organi sesswali aċċessorili (eż. L-utru, il-prostata), il-bużżieqa ta’ l-urina, in-noduli limfatiċi (preferibbilment nodulu limfatiku wieħed li jkopri r-rotta ta’ l-amministrazzjoni u oħra distanti mir-rotta ta’ l-amministrazzjoni biex tkopri l-effetti sistematiċi), in-nerv periferali (sciatic jew tibial) preferebbilment viċin il-muskolu, u biċċa mill-mudullun (jew, a fresh mounted bone marrow aspirate). Is-sejbiet klinikali u oħrajn jista’ jkollhom bżonn li jeżaminaw tessuti addizzjonali. Kwalunkwe organi li jistgħu jkunu organi-mira bbażati fuq il-proprjetajiet magħrufa tas-sustanza tat-test għandhom jiġu preservati.
         1.4.3.6.   Eżaminazzjoni ħistopatoloġika
         Il-ħispatoloġija kompluta għandha titwettaq fuq l-organi u t-tessuti ppreservati ta’ l-annimali kollha fil-gruppi ta’ kontroll u ta’ doża għolja. Dawn l-eżaminazzjonijiet għandhom jiġu estiżi għall-annimali tal-gruppi ta’ dożaġġ l-oħrajn ukoll, jekk it-tibdil relatat mat-trattament jiġi osservat fil-grupp ta’ doża għolja.
         Il-feriti grossi kollha għandhom jiġu eżaminati.
         Meta jintuża grupp satellita il-ħistopatoloġija għandha ssir fuq it-tessuti u l-organi identifikati bħala li qed juru l-effetti fil-gruppi trattati.
         DATA
         Id-data individwali għandha tiġi provduta. Barra minn hekk, id-data kollha għandha tkun riassunta f’għamla tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta’ l-annimali nstabu maqtula waqt it-test jew li nqatlu għal raġunijiet umani u l-ħin ta’ kwalunkwe mewt jew qtil umanm in-numru li juri sinjali ta’ tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta’ tossiċità osservati, inkluż il-ħin ta’ l-onset, it-tul, il-qawwa ta’ kwalunkwe effetti tossiċi, in-numru ta’ l-annimali li għandhom il-feriti, it-tip ta’ feriti u l-perċentwal ta’ l-annimali li juri kull tip ta’ ferita.
         Fejn hu possibbli ir-riżultati numeriċi għandhom ikunu evalwati b’metodu statistiku ġeneralment aċċettat xieraq. Il-metodi statistiċi għandhom jingħażlu waqt id-disinn ta’ l-istudju.
         3.   IR-RAPPURTAĠĠ
         IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     L-annimali tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-ispeċi/is-silta użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru, l-età u s-sess ta’ l-annimali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sors, il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpoġġew, id-dieta eċċ.;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, wara dan f’intervalli ta’ ġimgħa u fi tmiem it-test Il-kundizzjonijiet tat-test:
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     il-ġustifikazzjoni għall-aħażla tal-mezz, jekk mhuwiex l-ilma;
                     
                                 —
                              
                              
                                 ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tat-tħejjija tal-formulazzjoni/dieta tas-sustanza għat-test, il-konċentrazzjoni
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 miksuba u l-omoġeneità tat-tħejjija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji ta’ l-amministrazzjoni tas-sustanza għat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-konverżjoni mill-konċentrazzjoni tat-test għas-sustanza tad-dieta/l-ilma għax-xorb (ppm) għad-doża propja (mg/kg piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tal-kwalità ta’ l-ikel u ta’ l-ilma.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Ir-riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Il-piż tal-ġisem/it-tibdil fil-piż tal-ġisem;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Il-konsum ta’ l-ikel u ta’ l-ilma jekk applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Id-data tar-rispons tossiku bis-sess u bil-livell tad-doża, inklużi s-sinjali tat-tossiċità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 In-natura, il-qawwa u t-tul ta’ l-osservazzjonijiet kliniċi (jekk humiex riversibbli jew le);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-attività sensorjali, is-saħħa tal-qabda ta’ l-id u l-valutazzjonijiet motor activity;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 it-testijiet ematoloġiċi bil-baluri base-line relevanti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 it-testijiet tal-bijokemistrija kemikali bil-valuri base-line relevanti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-data tal-piż tal-ġisem fil-qtil u ta’ l-organi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sejbiet tan-nekropsija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatoloġiċi kollha;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Id-data ta’ l-assorbiment jekk hi disponibbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 trattament statistiku tar-riżultati, fejn hu xieraq.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Id-diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         Dan il-metodu huwa analogu għall-OECD TG 407
         B.8.   DOŻI REPETUTI (28 JUM) TOSSIĊITÀ (TEĦID MAN-NIFS)
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Huwa utili li jkun hemm informazzjoni preliminarja dwar id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli, l-pressjoni tal-fwar, il-punt tat-taħlil, il-punt tat-togħlija, il-punt tal-leħħa jew tal-isplussività (jekk applikabbli) tas-sustanza.
         Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (A).
         1.2.   DEFINIZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (B).
         1.3.   SUSTANZI TA’ REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Diversi gruppi ta’ annimali sperimentali huma esposti għal perjodu definittiv lejn is-sustanza tat-test f’konċentrazzjonini bi gradwazzjonijiet, b’konċentrazzjoni waħda tkun użata għal kull grupp, għall-perjodu ta’ 28 jum. Meta mezz ikun użat sabiex jgħin fil-ġenerazzjoni b’konċentrazzjoni xierqa tas-sustanzi tat-test fl-atmosfera, mezz ta’ grupp ta’ kontroll għandu jkun użat. Matul il-perjodu ta’ l-amministrazzjoni, l-annimali huma osservati kuljum sabiex ikunu skoperti sinjali tat-tossiċità. Annimali li jmutu matul it-test ikollhom awtopsija tal-mewt u l-konklużjoni tat-test li l-annimali li jibqgħu ħajjin ikollhom ukoll l-awtopsija ta’ wara l-mewt.
         1.5.   KRITERJA TAL-KWALITÀ
         Xejn.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.6.1.   Preparazzjonijiet
         L-annimali huma miżmuma b’fondi sperimentali u f’kundizzjonijiet tal-għalf għal mill-anqas ħamest ijiem qabel l-esperiment. Qabel it-test, annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma magħżula b’mod kif jinzerta u assenjati lejn in-numru meħtieġ ta’ gruppi. Meta meħtieġ, materjal adattat jista’ jkun miżjud mas-sustanza tat-test sabiex jgħin fil-ġenerazzjoni ta’ konċentrazzjonini xierqa tas-sustanza tat-test fl-atmosfera. Jekk xi materjal jew addittivi oħrajn ikunu użati għall-faċilizzazzjoni tad-doża, dawn għandhom ikunu magħrufa li ma jipproduċu l-ebda effetti tossiċi. Data storika tista’ tkun użata, jekk xieraq.
         1.6.2.   Il-kundizzjonijiet tat-test
         1.6.2.1.   Annimali sperimentali
         Sakemm ma jkunx hemm indikazzjonijiet mod ieħor, il-far huwa l-ispeċi preferita. Is-siltiet normalment użati fil-laboratorju ta’ l-annimali żgħażagħ b’saħħithom għandhom ikunu użati.
         Fil-bidu ta’ kull test, il-medda tal-varjazzjoni fil-piż ta’ l-annimali użati m’għandhiex teċċedi ± 20 % tal-valur medju kif xieraq.
         1.6.2.2.   Numru u sess.
         Mill-anqas 10 annimali (ħamsa femminili u ħamsa maskili) għandhom ikunu użati f’kull livell ta’ doża. Jekk ikunu użati femminili, dawn għandhom ikunu femminili li qatt ma welldu u li ma humiex tqal. Jekk sagrifikar interim huwa pjanat, in-numru ta’ l-annimali għandu jkun miżjud bin-numru ta’ l-annimali skedati li jkunu sagrifikati qabel it-tkomplija ta’ l-istudju. B’żieda, grupp satellita ta’ 10 annimali (ħames annimali kull sess) jistgħu jkunu trattati b’doża ta’ livell għoli għal 28 jum u osservati għar-riversabbiltà, l-persistenza, jekk l-okkurenza mdewma ta’ l-effetti tossiċi tkun għal 14-il jum wara t-trattament. Grupp satellita ta’ 10 annimali ta’ kontroll (ħames annimali kull sess) huwa wkoll użat.
         1.6.2.3.   Konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni
         Mill-anqas tlett konċentrazzjoninijiet huma meħtieġa, b’kontroll jew mezz ta’ kontroll (korrespondenti għall-konċentrazzjoni tal-mezz fil-livell l-aktar għoli) tal-mezz jekk użat. Appart milli t-trattament tas-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom ikunu trattati b’mod identiku bħal dawk suġġetti għat-test. Il-livell ta’ l-ogħla doża għandu jirriżulta f’effetti tossiċi imma ma jipproduċi l-ebda, jew ftit, imwiet. Il-livell tad-doża l-aktar baxxa m’għandux jipproduċi xi evidenza ta’ tossiċità. Meta jkun hemm estimi użabbli ta’ l-espożizzjoni umana, il-livell l-aktar baxx għandu jeċċedi dan. Idealment, il-livell medju tad-doża għandu jipproduċi effetti tossiċi minimi osservabbli. Jekk aktar minn doża intermedja waħda tkun użata, l-livelli tad-doża għandhom ikunu spazjati bi gradjazzjoni ta’ l-effetti tossiċi. Fil-gruppi baxxi jew intermedji u f’dawk tal-kontroll, l-inċidenza ta’ xi fatalitajiet għandha tkun baxxa sabiex tippermetti ewalwazzjoni sensibbli tar-riżultati.
         1.6.2.4.   Ħin ta’ l-espożizzjoni
         It-tul ta’ l-espożizzjoni ta’ kuljum għandu jkun ta’ sitt siegħat imma perijodi oħrajn jistgħu ikunu meħtieġa sabiex jilħqu l-ħtiġiet speċifiċi.
         1.6.2.5.   Apparat
         L-annimali għandhom ikunu testjati bl-apparat tan-nifs iddisinjat għas-sostenn ta’ nixxija ta’ arja dinamika ta’ mill-anqas 12-il kambjamenti ta’ l-arja fis-siegħa, sabiex ikun assigurat kontenut adekwat ta’ l-ossiġenu u espożizzjoni ta’ l-atmosfera mqassma b’mod egwali. Meta kabina tkun użata, d-disinn tagħha għandu jimminimizza l-iffullar ta’ l-annimali tat-test u jimminimizzaw l-espożizzjoni tagħhom man-nifs tas-sustanza tat-test. Bħala regola ġenerali sabiex tkun assigurata l-istabbilità ta’ l-atmosfera fil-kabina il-“volum” totali ta’ l-annimali tat-test m’għandux jeċċedi 5 % tal-volum tal-kabina tat-test. Ħalq-nażali, ir-ras biss, jew l-ispazji tal-kabina ta’ l-espożizzjoni jista’ jkun użat; bl-ewwel tnejn għandhom jgħinu li jimminimizzaw l-ammont tas-sustanza tat-test b’meżżi oħrajn.
         1.6.2.6.   Perijodu ta’ l-Osservazzjoni
         L-annimali sperimentali għandhom ikunu osservati ta’ kuljum għal sinjali ta’ tossiċità matul il-perjodu kollu tat-trattament u ta’ l-irkupru. Il-ħin tal-mewt u ż-żmien li fih tidher jew tisparixxi t-tossiċità għandhom ukoll ikunu reġistrati.
         1.6.3.   Il-proċedura
         L-annimali jirċievu d-doża bis-sustanza tat-test idealment fis-sebat ijiem tal-ġimgħa għal perjodu ta’ 28 jum. L-annimali f’xi grupp satellita skedat għall-osservazzjoni b’segwiment għandhom jinżammu għal 14-il jum ieħor mingħajr trattament sabiex tkun żvelata xi rkupru minn, jew il-persistenza ta’, l-effetti tossiċi. It-temperatura li fiha t-test ikun imwettaq għandha tinżamm fi 22 ± 3 oC.
         Idealment, l-umdità relattiva għandha tinżamm bejn 30 u 70 %, imma f’ċerti kazi (eż. it-testijiet ta’ uħud mill-aerosols) dan jista’ ma jkunx prattikabbli. Il-manteniment ta’ pressjoni kemxejn negattiva ġewwa l-kabina (= 5 mm ta’ ilma) tkun tipprevjeni l-ħruġ tas-sustanza tat-test fiż-żona tal-madwar. L-ikel u l-ilma għandhom ikunu miċħuda matul l-espożizzjoni.
         Sistema ta’ inħalazzjoni dinamika b’konċentrazzjoni analitika xierqa tas-sistema tal-kontroll għandha tkun użata. Sabiex tkun stabbilita espożizzjoni xierqa tal-konċentrazzjoni, test bi prova huwa rakkomandat. Il-kurrent ta’ l-arja għandu jkun aġġustat sabiex jassigura li l-kundizzjonijiet matul il-kabina ta’ l-espożizzjoni jkunu omoġenji. Is-sistema għandha tassigura li kundizzjonijiet stabbli ta’ l-espożizzjoni jintlaħqu malajr kemm jista’ jkun possibbli.
         Il-kejl u l-moniteraġġ għandu jsir:
         
                     (a)
                  
                  
                     tar-rata tal-kurrent ta’ l-arja (b’mod kontinwu).
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     il-konċentrazzjoni attwali tas-sustanza tat-test imkejla fiż-żona ta’ fejn jittieħed in-nifs. Matul il-perjodu ta’ l-espożizzjoni, l-konċentrazzjonijiet m’għandhomx ivarjaw b’aktar minn ± 15 % tal-medja tal-valur. B’danakollu, fil-każ ta’ uħud mill-aerosols, dan il-livell ta’ kontroll ma jistax ikun milħuq u medda aktar wiesgħa tkun għalhekk aċċettabbli. Matul iż-żmien totali ta’ l-istudju, l-konċentrazzjonijiet minn jum għal jum għandhom jinżammu kostanti kemm jista’ jkun possibbli. Għall-aerosols, mill-anqas analiżi ta’ partikola waħda għandha tkun imwettqa darba fil-ġimgha għal kull grupp;
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     tat-temperatura u l-umidità, kontinwament jekk possibbli.
                  
               Matul u wara l-espożizzjoni, osservazzjoni hija mwettqa u reġistrata b’mod sistematiku; dettalji individwali għandhom jinżammu għal kull annimal. L-annimali kollha għandhom ikunu osservati kuljum u s-sinjali tossiċi reġistrati jkunu inklużi, meta jsir it-tfaqqiegħ, il-grad u t-tul ta’ żmien tagħhom. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u l-pil, fl-għajnejn u membrani mukożji, u anki s-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tas-sistema ċentrali tan-nervaturi, l-attività somatomotori u l-istil ta’ l-imġieba. Il-kejl għandu jsir ta’ kull ġimgħa dwar il-piż ta’ l-annimali. Huwa wkoll rakkomandat li l-konsum ta’ l-ikel ikun imkejjel ta’ kull ġimgħa. Osservazzjonijiet regolari ta’ l-annimali huma meħtieġa sabiex jassiguraw li l-annimali jkunu, sakemm ikun possibbli, m’humiex mitlufa mill-istudju minħabba kawżi oħrajn bħalma huma kannibaliżmu, awtolożi tan-nisġa jew mitlufa. Fit-tmiem tal-perjodu ta’ l-istudju, dawk kollha li jkunu għadhom ħajjin fil-gruppi tat-trattament mhux-satellita, jkunu maqtula u awtopsija tkun imwettqa immedjatament. Annimali moribondi u annimali f’uġiegħ jew li ghaddejjin minn strapazz sever għandhom ikunu mneħħija meta dan ikun innutat, u maqtula sabiex tkun evitata l-moħqrija, waqt li titwettaq awtopsija ta’ wara l-mewt.
         L-eżami li ġejja għandha sseħħ fit-tmiem tal-perjodu tat-test għall-annimali kollha, inklużi dawk tal-kontrolli:
         
                     (i)
                  
                  
                     ħematoloġija, inkluża mill-anqas il-ħematokrità, l-konċentrazzjonini tal-ħemaglobulini, l-għadd ta’ l-eritroċiti, l-għadd totali u differenzali tal-lewtoċiti, u l-kejl tal-potenzal ta’ boċċi fid-demm;
                  
               
                     (ii)
                  
                  
                     biokemistrija klinika tad-demm, inkluż mill-anqas parametru wieħed tal-fwied u tal-funzjoni tal-kliewi: aminotransferażi ta’ l-alanina (qabel kienet magħrufa bħala t-transaminażi piruvika glutamika), l-aminotransferażi aspartata tas-serum (qabel kienet magħrufa bħala t-transaminażi ossalo-aċetika glutamika), in-nitroġenu ta’ l-urea, l-albumina, l-kreatinin tad-demm, il-bilirubin totali u l-protein totali tas-serun.
                  
               Determinazzjonijiet oħrajn li jistgħu jinħtieġu għal evalwazzjoni tossikoloċika adekwata, inkluż il-kalċju, l-fosfru, l-klorid, is-sodju, l-putassa, l-glokożju tas-sawm, l-analiżi tal-lipidi, l-ormoni, l-bilanċ tal-aċidu/bażi, il-metaemoglobina, l-attività kolinesterażi.
         Biokemistrija klinika addizzjonali tista’ tkun użata, meta meħtieġ, sabiex tkun estiża l-investigazzjoni ta’ l-effetti osservati.
         1.6.3.1.   Nekropsija Grossa (awtopsija ta’ wara l-mewt)
         L-annimali kollha fl-istudju għandhom ikunu suġġetti għall-awtopsija sħiħa grossa ta’ wara l-mewt. Mill-anqas il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, u t-testi għandhom ikunu mwieżna niedja malajr kemm jista’ jkun poissibbli wara d-dissikazzjoni sabiex ikun evitat li jinxfu. Organi u ċerti nsiġ tal-ġisem (fwied, kliewi, il-milsa (l-marrara), t-testi, l-adrenali, l-qalb, u xi organi oħrajn li juru feriti kbar jew tibdil fid-daqs) għandhom ikunu preservati f’medja xierqa għall-possibbiltà ta’ eżami fuut ħistopatoloġiku. Il-pulmuni għandhom jinqalgħu intatti, miżuna u ittrattati b;’fissattiv xieraq sabiex ikun assigurat li l-istruttura tal-pulmun tkun miżmumha.
         1.6.3.2.   Eżaminazzjoni ħistopatoloġika
         Fil-grupp ta’ doża għolja u fil-grupp ta’ kontroll, l-eżaminazzjoni ħistoloġika għandha tkun imwettqa fuq l-organi u l-insiġ ippreservati. Organi u nsiġ li juru difetti attribwibbli għas-sustanza tat-test fil-livell ta’ l-għola doża għandhom ikunu eżaminati fil-gruppi kollha tad-doża l-baxxa. L-annimali f’xi grupp satellita għandhom ikunu eżaminati ħistoloġikalment b’enfasi partikolari fuq l-organi u nsiġ identifikati bħala li juru effetti fil-gruppi l-oħrajn ittrattati.
         2.   DATA
         Id-data għandha tkun riassunta f’għamla tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test u n-numru ta’ l-annimali li jiżvelaw kull tip ta’ ferita.
         Ir-riżultati osservati kollha għabdhom ikunu evalwati b’metodu statistiku xieraq. Kwalunkwe metodu statistiku rikonoxxut jista’ jkun użat.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     l-ispeċi, s-silta, s-sorsi, l-kundizzjonijiet ambjentali, id-dieta, eċċ.;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kundizzjoni tat-test.
                     Deskrizzjoni ta’ l-apparat ta’ l-espożizzjoni, inkluż id-disinn, it-tip, il-qisien, is-sorsi ta’ l-arja, is-sistema għall-ġenerazzjoni ta’ l-aerosols, metodu għall-kondizzjonar ta’ l-arja u l-metodu taż-żamma ta’ l-annimali fil-kabina tat-test, meta din tkun użata. L-apparat għall-kejl tat-temperatura, l-umidità, il-koncentrazzjonijiet ta’ l-aerosol u d-distrubuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli, għandhom ikunu deskritti.
                     Data ta’ l-espożizzjoni:
                     Dawn għandhom ikunu tabulati u preżentati mal-valuri medji u l-kejl tal-varjabbiltà (eż. devjazzjoni normali) u għandhom, meta possibbli, jinkludu:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 ir-rati tal-kurrent ta’ l-arja matul l-apparat tat-teħid man-nifs;
                              
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 it-temperatura u l-umidità ta’ l-arja;
                              
                           
                                 (ċ)
                              
                              
                                 konċentrazzjonijiet nominali (ammont totali tas-sustanza ta’ kif infuża fl-apparat tat-teħid man-nifs, diviża bil-volum ta’ l-arja);
                              
                           
                                 (d)
                              
                              
                                 in-natura tal-mezz, jekk użat;
                              
                           
                                 (e)
                              
                              
                                 il-konċentrazzjonijiet attwali fiż-żona tat-teħid tan-nifs waqt it-test;
                              
                           
                                 (f)
                              
                              
                                 Il-massa tad-dijametru erodinamiku medjan (MMAD) u d-devjazzjoni ġeometrika normali (GSD);
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     dettalji dwar ir-reazzjoni tossika bis-sess u d-doża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin tal-mewt matul l-istudju jew meta l-annimali jkunu baqgħu ħajjin fit-terminazzjoni tat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni ta’ l-effetti tossiċi u oħrajn; il-livell ta’ l-ebda effett;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin ta’ l-osservazzjoni u kull sinjal annormali u l-korsa sussegwenti tiegħu;
                  
               
                     —
                  
                  
                     dettalji dwar l-ikel u piż tal-ġisem;
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet ħematoloġiċi użati u r-riżultati kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet ħematoloġiċi kliniċi użati u r-riżultati kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     is-sejbiet ta’ l-awtopsja ta’ wara l-mewt;
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatoloġiċi kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     trattament statistiku tar-riżultati, meta xieraq;
                  
               
                     —
                  
                  
                     diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (D).
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (E).
         B.9.   DOŻI REPETUTI (28 JUM) TOSSIĊITÀ (DERMALI)
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (A).
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (B).
         1.3.   SUSTANZI TA’ REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   PRINCIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza tat-test hija somministrata b’mod orali, ta’ kuljum, b’dożi meqjusa lil diversi gruppi ta’ annimali sperimentali, b’doża waħda tkun użata ma kull grupp matul perjodu ta’ 28 jum. Matul il-perjodu ta’ l-amministrazzjoni, l-annimali huma osservati ta’ kuljum sabiex ikunu skoperti sinjali tat-tossiċità. Annimali li jmutu matul it-test ikollhom awtopsija tal-mewt u l-konklużjoni tat-test li l-annimali li jibqgħu ħajjin ikollhom ukoll l-awtopsija ta’ wara l-mewt.
         1.5.   KRITERJA TAL-KWALITÀ
         Xejn.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.6.1.   Preparazzjonijiet
         L-annimali huma miżmuma f’fondi sperimentali u f’kundizzjonijiet tal-għalf għal mill-anqas ħamest ijiem. Qabel it-test, annimali adulti żgħażagħ b’saħħithom huma magħżula b’mod kif jinzerta u assenjati lejn gruppi għat-trattament. Xi ftit qabel it-testijiet, il-pil huwa maqtugħ miż-żona dorsali tad-dahar ta’ l-annimali tat-test. It-tqaxxir jista’ jkun użat imma għandu jkun imwettaq madwar 24 siegħa qabel it-test. Ir-repetizzjoni tal-qtugħ jew tat-tqaxxir normalment ikun meħtieġ f’intervalli ta’ madwar darba fil-ġimgħa. Meta jsir il-qtugħ jew it-tqaxxir tal-pil, kura għandha tittieħed sabiex ikun evitat xi grif fil-ġilda li jkunu jistgħu jibdlu l-permeabbiltà tagħha. Mhux anqas minn 10 % tal-wiċċ tal-ġisem għandu jkun imnaddaf għall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Il-piż ta’ l-annimali għandu jkun meqjus meta tkun deċiża ż-żona li għandha tkun imnaddfa u l-qisien kollha tal-koperta. Meta jsiru testijiet tas-solidi, li jistgħu ikunu pulverizzati jekk xieraq, is-sustanza tat-test għandha tkun b’umidità suffiċjenti bl-ilma, jew, meta meħtieġ, apparat adattat sabiex jassigura kuntatt tajjeb mal-ġilda. Sustanzi likwidi tat-test huma ġeneralment użati mingħajr ma jkunu mrattba. Applikazzjoni odjerna bħala bażi ta’ minn ħamsa sa sebat ijiem fil-ġimgħa hija użata.
         1.6.2.   Kundizzjonijiet tat-test
         1.6.2.1.   Annimali sperimentali
         Firien jew fniek, jew fniek ta’ l-indi adulti jistgħu ikunu użati. Speċje oħrajn jistgħu ikunu użati imma l-użu tagħhom ikun jeħtieġ ġustifikazzjoni.
         Fil-bidu ta’ kull test, il-medda tal-varjazzjoni fil-piż ta’ l-annimali użati m’għandhiex teċċedi ± 20 % tal-valur medju kif xieraq.
         1.6.2.2.   Numru u sess.
         Mill-anqas 10 annimali gerriema (ħamsa femminili u ħamsa maskili) għandhom ikunu użati f’kull livell ta’ doża. Jekk ikunu użati femminili, dawn għandhom ikunu femminili li qatt ma weldu u li ma humiex tqal. Jekk sagrifikar interim huwa ippjanat, in-numru ta’ l-annimali għandu jkun miżjud bin-numru ta’ l-annimali skedati li jkunu sagrifikati qabel it-tkomplija ta’ l-istudju. B’żieda, grupp satellita ta’ 10 annimali (ħames annimali kull sess) jistgħu ikunu ittrattati b’doża ta’ livell għoli għal 28 jum u osservati għar-riversabbiltà, persistenza, jew ghal okkurrenza mdewma ta’ l-effetti tossiċi għal 14-il jum ta’ wara t-trattament. Grupp satellita ta’ 10 annimali ta’ kontroll (ħames annimali kull sess) huwa wkoll użat.
         1.6.2.3.   Livell tad-doża
         Mill-anqas tlett livelli ta’ dożi huma meħtieġa bil-kontroll u mezz ta’ kontroll, jekk mezz ikun użat. Il-perjodu ta’ l-osservazzjoni għandu jkun ta’ mill-anqas ta’ sitt siegħat kuljum. Għal sustanzi amministrati bi tmiegħ sfurzat, id-doża għandha tkun mogħtija f’ħinijiet simili f’kull jum u l-livelli tad-doża għandhom ikunu aġġustati matul l-intervalli (ta’ kull ġimgha jew ta’ darbtejn fil-gimgħa) sabiex jinżamm livell ta’ doża kostanti f’termini tal-piż ta’ l-annimal. Apparti milli t-trattament tas-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom ikunu trattati b’mod identiku bħal dawk suġġetti għat-test. Meta mezz ikun użat sabiex jiffaċilita l-għoti tad-doża, l-kontrolli għandhom ikollhom doża bil-mezz bl-istess mod bħal gruppi ittrattati, u jirċievu l-istess ammont ta’ mezz bħal dak li jkunu irċevew il-grupp bil-livell ta’ l-ogħla doża. Il-livell ta’ l-ogħla doża għandu jirriżulta f’effetti tossiċi imma ma jipproduċi l-ebda, jew ftit, imwiet. Il-livell tad-doża l-aktar baxxa m’għandux jipproduċi xi evidenza ta’ tossiċità. Meta jkun hemm estimi użabbli ta’ l-espożizzjoni umana, il-livell l-aktar baxx għandu jeċċedi dan. Idealment, il-livell medju tad-doża għandu jipproduċi effetti tossiċi minimi osservabbli. Jekk aktar minn doża intermedja waħda tkun użata, l-livelli tad-doża għandhom ikunu spazzjati bi gradjazzjoni ta’ l-effetti tossiċi. Fil-gruppi baxxi jew intermedji u f’dawk tal-kontroll, l-inċidenza ta’ xi fatalitajiet għandha tkun baxxa sabiex tippermetti ewalwazzjoni sensibbli tar-riżultati.
         Jekk l-applikazzjoni tas-sustanzi tat-test tipproduċi irritazzjoni severa tal-ġilda, l-konċentrazzjonijiet għandhom ikunu mnaqqsa u dan jista’ jirriżulta fi tnaqqis fil, jew fl-assenza ta’, l-effetti tossiċi l-oħrajn, fil-livell għoli tad-doża. Aktar minn hekk, jekk il-ġilda tkon sofriet ħsara qawwija, jista’ jkun meġtieġ li jkun imwaqqaf l-istudju u li jinbeda studju ġdid b’konċentrazzjoni aktar baxxa.
         1.6.2.4.   Test ta’ limitazzjoni
         Jekk studju preliminari fil-livell ta’ doża ta’ 1 000 mg/kg, jew livell ta’ doża ogħla relattat ma l-espożizzjoni umana possibbli meta dan ikunu magħruf, ma jipproduċi l-ebda effetti tossiċi, aktar testijiet ma jkunu aktar meqjusa bħala meħtieġa.
         1.6.2.5.   Perijodu ta’ l-Osservazzjoni
         L-annimali sperimentali għandhom ikunu osservati ta’ kuljum għal sinjali tat-tossiċità. Il-ħin tal-mewt u ż-żmien li fih tidher jew tisparixxi t-tossiċità għandhom ukoll ikunu irreġistrati.
         1.6.3.   Il-proċedura
         L-annimali għandhom jinżammu f’gaġġeġ individwali. L-annimali jirċievu d-doża bis-sustanza tat-test idealment fis-sebat ijiem tal-ġimgħa għal perjodu ta’ 28 jum. L-annimali f’xi grupp satellita skedat għall-osservazzjoni b’segwiment għandhom jinżammu għal 14-il jum ieħor mingħajr trattament sabiex tkun żvelata xi irkupru minn, jew il-persistenza ta’, l-effetti tossiċi. Il-perjodu ta’ l-osservazzjoni għandu jkun ta’ mill-anqas ta’ sitt siegħat kuljum.
         Is-sustanza tat-test għandha tkun applikata b’mod uniformi fuq żona li hija madwar 10 % taż-żona totali tal-wiċċ tal-ġisem. B’sustanzi ferm tossiċi, iż-żona tal-wiċċ koperta tista’ tkun anqas imma kemm jista’ jkun miż-żona għandha tkun koperta b’saff irqieq u uniformi kemm jista’ jkun possibbli.
         Matul l-espożizzjoni s-sustanza tat-test tinżamm f’kuntatt mal-ġilda b’garża poruża u faxxa mhux irritanti. Is-sit tat-test għandu jkun aktar kopert b’mod xieraq sabiex iżomm il-faxxex bil-garża u s-sustanza tat-test u jassiguraw li l-annimali ma jkunux jistgħu jilgħaqu u jieklu s-sustanza tat-test. Restrizzjonijiet jistgħu jintużaw sabiex jipprevjenu l-inġestjoni tas-sustanza tat-test, imma immobilizzazzjoni kompleta mhix metodu rakkommandat. Bħala alternattiva, “apparat b’għonq protettiv” jista’ jkun użat.
         Fit-tmiem tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni, ir-residwu tas-sustanza tat-test għandu jkun imneħħi, meta prattikabbli, bl-użu ta’ ilma jew xi metodu xieraq ieħor tat-tindif tal-ġilda.
         L-annimali kollha għandhom ikunu osservati ta’ kuljum u s-sinjali tossiċi irreġistrati jkunu inklużi, meta jsir it-tfaqqiegħ, il-grad u t-tul ta’ żmien tagħhom. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u l-pil, fl-għajnejn u membrani mukożji, u anki fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċi u tas-sistema ċentrali tan-nervituri; l-attività somatomotori u l-istil ta’ l-imġieba. Il-kejl għandu jsir ta’ kull ġimgħa dwar il-piż ta’ l-annimali. Huwa wkoll rakkommandat li l-konsum ta’ l-ikel ikun imkejjel ta’ kull ġimgħa. Osservazzjonijiet regolari ta’ l-annimali huma meħtieġa sabiex jassiguraw li l-annimali jkunu, sakemm ikun possibbli, mhux mitlufa mill-istudju minħabba kawżi oħrajn bħalma huma kannibaliżmu, awtolożi tan-nisġa jew mitlufa. Fit-tmiem tal-perjodu ta’ l-istudju, dawk kollha li jkunu għadhom ħajjin fil-gruppi tat-trattament mhux-satellita, jkunu maqtula u awtopsija tkun imwettqa immedjatament. Annimali moribondi u annimali f’uġiegħ jew strapazz sever għandhom ikunu mneħħija meta dan ikun innutat, u maqtula sabiex tkun evitata l-moħqrija u titwettaq awtopsja ta’ wara l-mewt.
         L-eżami li ġejja għandha sseħħ fit-tmiem tal-perjodu tat-test għall-annimali kollha, inklużi dawk tal-kontrolli:
         
                     1)
                  
                  
                     ħematoloġija, inkluża mill-anqas il-ħematokrità, l-konċentrazzjoni tal-ħemaglobulini, l-għadd ta’ l-eritroċiti, l-għadd totali u differenzali tal-lewtoċiti, u l-kejl tal-potenzal ta’ boċċi fid-demm;
                  
               
                     2)
                  
                  
                     biokemistrija klinika tad-demm, inkluż mill-anqas parametru wieħed tal-fwied u tal-funzjoni tal-kliewi: aminotransferażi ta’ l-alanina tas-serum (qabel kienet magħrufa bħala t-transaminażi piruvika glutamika), il-aminotransferażi aspartata tas-serum (qabel kienet magħrufa bħala t-transaminażi ossalo-aċetika glutamika), in-nitroġenu ta’ l-urea, l-albumina, il-kreatinin tad-demm, il-bilirubin totali u l-protein totali tas-serun.
                  
               Determinazzjonijiet oħrajn li jistgħu jkunu meħtieġa għal evalwazzjoni tossikologika adekwata, inkluż il-kalċju, l-fosfru, l-klorid, is-sodju, il-putassa, l-glokożju tas-sawm, l-analiżi tal-lipidi, l-ormoni, l-bilanċ tal-aċidu/bażi, l-metaemoglobina, l-attività kolinesterażi.
         Biokemistrija klinika addizzjonali tista’ tkun użata, meta meħtieġ, sabiex tkun estiża l-investigazzjoni ta’ l-effetti osservati.
         1.6.4.   Nekopsija Grossa (awtopsija ta’ wara l-mewt)
         L-annimali kollha fl-istudju għandhom ikunu suġġetti għall-awtopsja sħiħa grossa ta’ wara l-mewt. Mill-anqas il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, u t-testi għandhom ikunu miżuna niedja malajr kemm jista’ jkun poissibbli wara d-dissikazzjoni sabiex ikun evitat li jinxfu. Organi u ċerti nsiġ tal-ġisem (fwied, kliewi, il-milsa (l-marrara), it-testi, l-adrenali, l-qalb, u xi organi oħrajn li juru feriti kbar jew tibdil fid-daqs) għandhom ikunu ippreservati f’medja xierqa għall-possibbiltà ta’ eżami futura ħistopatoloġika.
         1.6.5.   Eżaminazzjoni ħistopatoloġika
         Fil-grupp ta’ doża għolja u fil-grupp ta’ kontroll, l-eżaminazzjoni ħistoloġika għandha tkun imwettqa fuq l-organi u l-insiġ ippreservati. Organi u nsiġ li juru difetti attribwibbli għas-sustanza tat-test fil-livell ta’ l-ogħla doża għandhom ikunu eżaminati fil-gruppi kollha tad-doża l-baxxa. L-annimali f’xi grupp satellita għandhom ikunu eżaminati ħistoloġikalment b’enfasi partikolari fuq l-organi u nsiġ identifikati bħala li juru effetti fil-gruppi l-oħrajn ittrattati.
         2.   DATA
         Id-data għandha tkun riassunta f’għamla tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test u n-numru ta’ l-annimali li jiżvelaw kull tip ta’ ferita.
         Ir-riżultati osservati kollha għabdhom ikunu evalwati b’metodu statistiku xieraq. Kwalunkwe metodu statistikali rikonoxxut jista’ jkun użat.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     id-dettalji dwar l-annimal (l-ispeċje, silta, sorsi, il-kundizzjonijiet ambjentali, dieta, eċċ.);
                  
               
                     —
                  
                  
                     kundizzjonijiet tat-test (inklużu t-tip ta’ faxex: okklussivi jew mhux okklussivi);
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-livelli tad-doża (inkluż il-mess, jekk użat), u l-konċentrazzjonijiet;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-livell ta’ l-ebda effett, meta possibbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     dettalji dwar ir-reazzjoni tossika bis-sess u d-doża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin tal-mewt matul l-istudju jew meta l-annimali jkunu baqgħu ħajjin fit-terminazzjoni tat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-effetti tossiċi jew oħrajn;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin ta’ l-osservazzjoni u kull sinjal annormali u l-korsa sussegwenti tiegħu;
                  
               
                     —
                  
                  
                     dettalji dwar l-ikel u piż tal-ġisem;
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet ħematoloġiċi użati u r-riżultati kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet ħematoloġiċi kliniċi użati u r-riżultati kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     is-sejbiet ta’ l-awtopsja ta’ wara l-mewt;
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatoloġiċi kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     trattament statistiku tar-riżultati, meta xieraq;
                  
               
                     —
                  
                  
                     diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (D).
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B (E).
         B.10.   MUTAĠENIĊITÀ – TEST IN VITRO DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMITAL-MAMMIFERI
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 473, Test in vitro dwar Anormalità fil-Kromożomi tal-Mammiferi (1997).
         1.1.   INTRODUZZJONI
         L-għan tat-test in vitro dwar anormalità fil-kromożomi huwa biex jiġu identifikati aġenti li jikkawżaw anormalitajiet strutturali fil-kromożomi f'kulturi ta' Ċelloli tal-mammiferi (1) (2) (3). Anormalitajiet strutturali jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomi jew kromatidi. Fil-maġġoranza ta' mutaġeni kimiċi, anormalitajiet imġiegħela huma tat-tip kromatidu, iżda jirrikorru wkoll anormalitajiet tat-tip ta' kromożomi. Żieda fil-poliplojdi tista’ tindika li kimika għandha l-potenzal li ġġib magħha anormalitajiet numeriċi. Madankollu, dan il-metodu mhux maħsub biex iqis anormalitajiet numeriċi u ma jintużax normalment għal dak il-għan. Mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem u hemm xhieda sostanzjali li mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati li jikkawżaw alterazzjonijiet f'onkoġeni u f'ġeni ta' Ċelloli somatiċi li jrażżnu t-tumuri huma involuti fil-ħolqien tal-kanċer fil-bniedem u annimali sperimentali.
         It-test in vitro ta' anormalità fil-kromożomi jista’ jagħmel użu minn kulturi ta' linji ta' Ċelloli stabbiliti, tipi ta' Ċelloli, jew kulturi ta' Ċelloli primarji. Iċ-ċelluli jingħażlu fuq bażi ta' kemm jistgħu jikbru fil-kultura, l-istabbilità tal-karjotip, għadd ta' kromożomi, diversità ta' kromożomi u frekwenza spontanea ta' anormalitajiet fil-kromożomi.
         Testijiet magħmula in vitro ġeneralment jeħtieġu l-użu ta' għejun essoġenu ta' attivazzjoni metabolika. Din is-sistema ta' attivazzjoni metabolika ma tista’x kompletament tkun bħall-kundizzjonijiet in vivo tal-mammiferi. Għandha tingħata attenzjoni biex jiġu evitati kundizzjonijiet li jwasslu għal riżultati pożittivi li ma jirriflettux mutaġeneċità intrinsika u jistgħu jinħolqu minn bidliet fil-pH, osmolalità jew livelli għoljin ta' ċitotossiċità (4) (5).
         It-test jintuża biex jiġi kontrollat hemmx mutaġeni jew karċinoġeni fil-mammiferi. Ħafna komposti li huma pożittivi f'dan it-test huma karċinoġeni fil-mammiferi; madankollu ma hemmx korrelazzjoni perfetta bejn dan it-test u l-karċinoġeniċità. Il-korrelazzjoni tiddependi fuq il-klassi kimika u hemm xiedha dejjem tikber li jeżistu karċinoġeni li ma jiġux żvelati b'dan it-test għax jidher li jaġixxu permezz ta' mekkaniżmi li huma differenti minn ħsara diretta fid-DNA.
         Ara ukoll l-Introduzzjoni Ġenerali Taqsima B.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Anormalità tat-tip kromatidu : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u għaqda mill-ġdid bejn kromatidi.
         
            Anormalità tat-tip tal-kromożomi: ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur, jew ksur u għaqda mill-ġdid, taż-żewġ kromatidi f'sit identiku.
         
            Endoreduplikazzjoni: proċess li fih wara perjodu S ta' replikazzjoni ta' DNA, in-nukleu ma jispiċċax f'mitożi iżda jerġa' jibda perjodu ieħor S. Ir-riżultat hu kromożomi bi 4, 8, 16,… kromatidi.
         
            Vojt: leżjoni akromatika iżgħar mill-wisgħa ta' kromatid wieħed, u b'misallinjament minimu tal-kromatidi.
         
            Indiċi mitotiku: il-paragun ta' Ċelloli fil-metafażi diviżi min-numru totali ta' Ċelloli osservati f'popolazzjoni ta' Ċelloli; indikazzjoni tal-livell ta' profilerazzjoni ta' dik il-popolazzjoni.
         
            Anormalità numerika: bidla fin-numru ta' kromożomi min-numru karatteristku normali ta' Ċelloli utilizzati.
         
            Poliplojdi: multiplu tan-numru aplojdu ta' kromożomi (n) minbarra n-numru diplojdu (jiġifieri 3n, 4n, eċċetera).
         
            Anormalità strutturali: bidla fl-istruttura tal-kromożomi li wieħed jinduna biha bl-eżami mikroskopiku ta' l-istadju metafażiku tad-diviżjoni ta' ċelluli, osservati bħala tħassir u biċċiet, bidliet minn ġewwa u bidliet bejniethom.
         1.3.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Kulturi ta' Ċelloli huma esposti għas-sustanza tat-test kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. F'intervalli predeterminati wara l-espożizzjoni ta' kulturi ta' Ċelloli għas-sustanza tat-test, jiġu ttrattati b'sustanza li twaqqaf il-metafażi (eż. Colcemid® jew kolċiċina), Ċelloli maħsudin, mtebbgħin u matafażiċi jiġu analizzati taħt mikroskopju għall-preżenza ta' anormalitajiet fil-kromożomi.
         1.4.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.4.1.   Preparazzjonijiet
         1.4.1.1.   Ċelloli
         Jistgħu jintużaw varjetà ta' linji ta' Ċelloli, tipi ta' Ċelloli jew kulturi primarji ta' Ċelloli, inklużi Ċelloli umani (eż. fibroblasti ta' Chinese hamster, limfoċiti tad-demm umani jew periferali mal-mammiferi oħrajn).
         1.4.1.2.   Il-kundizzjonijiet tal-medjum u tal-kulturi
         Għandhom jintużaw medjum xieraq ta' kulturi, u kundizzjonijiet ta' inkubazzjoni (kontenituri għall-kulturi, konċentrazzjoni CO2, temperatura u umdità) sabiex jinżammu l-kulturi. Linji u tipi ta' ċelluli stabbiliti għandhom jiġu kontrollati kull tant żmien għall-istabbilità fl-għadd ta' kromożomi modali u għan-nuqqas ta' kontaminazzjoni minn mikoplasma u m'għandhomx jintużaw jekk ikunu kontaminati. Għandu jkun magħruf ukoll il-perjodu normali ta' ċiklu ta' ċellula għaċ-ċelluli u għall-kundizzjonijiet tal-kulturi.
         1.4.1.3.   Preparazzjoni tal-kulturi
         Linji u tipi ta' Ċelloli stabbiliti: iċ-ċelluli huma mnisslin minn ħażniet ta' kulturi, miżrugħa f'medjum ta' kulturi f'dik id-densità li tiżgura li l-kulturi ma jilħqux konfluwenza qabel il-ħsad, u inkubati f'teperatura ta' 37 oC.
         Limfoċiti: demm sħiħ trattat b'antikoagulant (eż. heparin) jew limfoċiti separati miksubin minn suġġetti b'saħħithom jiżdiedu mal-madju tal-kulturi li jkun fih mitoġenu (eż. fitohaemagglutinin) u inkubati f'temperatura ta' 37 oC.
         1.4.1.4.   Attivazzjoni metabolika
         Iċ-ċelluli għandhom jiġu esposti għas-sustanza tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fin-nuqqas ta' sistema xierqa ta' attivazzjoni metabolika. Is-sistema li l-aktar tintuża huja dik tal-cofactor-supplemented post-mitochondrial fraction (S9) preparata mill-fwied ta' annimali gerriema trattat b'aġenti li jġibu l-enżimi bħal ma huma l-Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9), jew taħlita ta' fenobarbitone u β-naftoflavone (10) (11) (12).
         Il-frazzjon post-mitochondrial tintuża ġeneralment f'konċentrazzjonijiet fil-medda minn 1-10 % v/v fil-medju finali tat-test. Is-sistema ta' attivazzjoni metabolika tista’ tiddependi fuq il-klassi tal-kimika li qed tiġi ttestjata. F'ċerti każijiet jista’ jkun xieraq li tintuża aktar minn konċentrazzjoni waħda għall-frazzjon post-mitochondrial.
         Numru ta' żviluppi, inkluż il-ħolqien ta' linji ta' Ċelloli ġenetikament iġġenerati li jesprimu enżimi attivanti speċifiċi, jistgħu jkunu ta' potenzal għal attivazzjoni endoġenea. L-għażla tal-linji ta' Ċelloli użati għandha tkun ġustifikata xjentifikament (eż. bir-rilevanza tal-ċitikromu P450 isoenzim għall-metaboliżmu tas-sustanza tat-test).
         1.4.1.5.   Sustanza tat-test/Preparazzjoni
         Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewwbin jew sospiżi f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament taċ-Ċelloli. Jistgħu jiżdiedu sustanzi likwidi tat-test direttament mas-sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix l-aċċettabbilità tal-ħażna.
         1.4.2.   Kundizzjonijiet tat-test
         1.4.2.1.   Solvent/mezz
         Ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika bejn is-solvent/mezz u s-sustanza tat-test, u s-solvent/mezz għandu jkun kompatibbli mas-sopravivenza taċ-Ċelloli u l-attività S9. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra minflok dawk l-aktar magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Hu rakkomandat li kemm jista’ jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akwuż. Meta jiġu ttestjati sustanzi li mhumiex stabbli fl-ilma, is-solventi organiċi li jintużaw għandhom jkunu mingħajr ilma. L-ilma jista’ jitneħħa billi jintuża passatur molekulari.
         1.4.2.2.   Konċentrazzjonijiet ta' espożizzjoni
         Fost il-kriterji li għandhom jitqiesu biex tiġi stabbilita l-ogħla konċentrazzjoni hemm iċ-ċitotossiċità, is-solubbilità fis-sistema tat-test u bidliet fil-pH jew osmolalità.
         Iċ-ċitossiċità għandha tiġi stabbilita kemm b'attivazzjoni metabolika, kif ukoll mingħajrha, fl-esperiment prinċipali billi tintuża indikazzjoni xierqa ta' l-integrità u tkabbir taċ-Ċelloli, bħal ma huma gradi ta' konfluwenza, għadd ta' Ċelloli vijabbli, jew indiċi mitotiku. Jista’ jkun utli li jiġu stabbiliti ċ-ċitossiċità u s-solubbilità f'esperiment preliminari.
         Għandhom jintużaw għall-inqas tliet konċentrazzjonijiet analizzabbli. Fejn ikun hemm iċ-ċitossiċità, dawn il-konċentrazzjonijiet għandhom ikopru medda mill-massimu għal ftit tossiċità jew xejn; ġeneralment dan ifisser li l-konċentrazzjonijiet għandhom jiġu separati b'xejn aktar minn fattur bejn 2 u√10. Fiż-żmien tal-ħsad, l-ogħla konċentrazzjoni għandha turi riduzzjoni sinjifikanti fil-livell ta' konfluwenza, fgħadd ta' Ċelloli jew indiċi mitotiku (kollha ogħla minn 50 %). L-indiċi mitotiku huwa biss miżura indiretta ta' l-effetti ċitotossiċi/ċitostatiċi u jiddependi fuq il-ħin wara t-trattament. Madankollu, l-indiċi mitotiku huwa aċċettabbli għal kulturi ta' sospensjoni li fihom qisien tossiċi oħra jistgħu jkunu diffiċli u mhux prattiċi. Bħala informazzjoni supplimentari tista’ tintuża informazzjoni dwar kinetika taċ-ċiklu taċ-Ċelloli, bħal ma huwa ż-żmien medju ta' ġenerazzjoni (AGT). Iżda l-AGT huwa medja totali li mhux dejjem tiżvela l-eżistenza ta' subpopolazzjonijiet li għadhom ma jidhrux, u żidiet minimi wkoll fiż-żmien medju ta' ġenerazzjoni jistgħu jiġu assoċjati ma' dewmien sostanzjali fil-ħin ta' l-aħjar riżultati dwar anormalitajiet.
         Għal sustanzi li relativament mhumiex ċitotossiċi, l-konċentrazzjoni massima tat-test għandha tkun 5μl/ml, 5 mg/ml jew 0,01 M, liema minnhom ikun l-anqas.
         Għal sustanzi li relativament mhumiex solubbli li mhumiex tossiċi f'konċentrazzjonijiet anqas mill-konċentrazzjoni li mhix solubbli, l-ogħla doża li tintuża għandha tkun konċentrazzjoni ogħla mil-limitu ta' solubbilità fil-medjum finali tal-kultura fl-aħħar tal-perjodu ta' trattament. F'ċerti każijiet (eż. meta t-tossiċità tirrikorri biss fuq livell ogħla mill-anqas konċentrazzjoni li mhix solubbli), hu tajjeb li jsir test b'aktar minn konċentrazzjoni waħda bi preċipitazzjoni viżibbli. Jista’ jkun utli li ssir stima tas-solubbilità fil-bidu u fl-aħħar tat-trattament, għax is-solubbilità tista’ tinbidel waqt l-espożizzjoni fis-sistema tat-test minħabba fil-preżenza ta' Ċelloli, serum S9, eċċ. L-insolubbilità tista’ tintnebah bil-vista mingħajr ebda għajnuna. Dak li jippreċipita m'għandux ifixkel l-għadd.
         1.4.2.3.   Kontrolli negattivi u pożittivi
         Għandhom jiġu inklużi f'kull esperiment kontrolli pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent jew mezz), kemm b'attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. Meta tintuża l-attivazzjoni metabolika, l-kimika ta' kontroll pożittiv għandha tkun dik li teħtieġ l-attivazzjoni biex tagħti riżultati mutaġeniċi.
         Il-kontrolli pożittivi għandhom jagħmlu użu minn elastoġen magħruf f'livelli ta' espożizzjoni li huma mistennija li jagħtu żieda riproduċibbli u li tingħaraf fuq l-isfond li juri s-sensitività tas-sistema tat-test.
         Għandhom jingħażlu konċentrazzjonijiet ta' kontrolli pożittivi sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tad-dijappożittivi kodifikati għal min jaqrahom. Eżempji ta' sustanzi pożittivi ta' kontroll jinkludu:
         
                     Kondizzjoni ta' attivazzjoni metabolika
                  
                  
                     Sustanza
                  
                  
                     Nru SAK
                  
                  
                     Nru Einecs
                  
               
                     Nuqqas ta' attivazzjoni essoġenea metabolika Activation
                  
                  
                     Metil metanesulfonat
                  
                  
                     66-27-3
                  
                  
                     200-625-0
                  
               
                     Etil metanesulfonat
                  
                  
                     62-50-0
                  
                  
                     200-536-7
                  
               
                     Etil nitrosourea
                  
                  
                     759-73-9
                  
                  
                     212-072-2
                  
               
                     Mitomiċina
                  
                  
                     50-07-7
                  
                  
                     200-008-6
                  
               
                     4-Nitrokwinolina-N-ossidu
                  
                  
                     56-57-5
                  
                  
                     200-281-1
                  
               
                     Preżenza ta' attivazzjoni essoġenea metabolika Activation
                  
                  
                     Benżo(a)pirene
                  
                  
                     50-32-8
                  
                  
                     200-028-5
                  
               
                     Ċiklofosfamid
                     Ċiklofosfamide monojdrat
                  
                  
                     50-18-0
                     6055-19-2
                  
                  
                     200-015-4
                  
               Jistgħu jintużaw sustanzi oħra ta' kontroll pożittiv xieraq. Għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittiv li huma relatati mal-klassi tal-kimika, meta dan hu disponibbli.
         F'kull żmien ta' ħsad għandhom jiġu inklużi kontrolli negattivi, li jikkonsistu f'soilvent jew mezz biss fil-medjum tat-trattament, u ttrattati bl-istess mod bħal kulturi ta' trattament. Barra minn dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm ikun hemm informazzjoni storika ta' kontrolli li turi li ma jkunx hemm effetti ta' ħsara jew mutaġeniċi mill-użu tas-solvent magħżul.
         1.4.3.   Proċedura
         1.4.3.1.   Trattament bis-sustanza tat-test
         Celluli li jipproliferaw huma ttrattati bis-sustanza tat-test fil-preżenza u fin-nuqqas ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika. It-trattament ta' limfoċiti għandu jibda madwar 487 siegħa wara l-istimulazzjoni mitoġenika.
         
                  
                     1.4.3.2.
                  
                  
                     Normalment jintużaw kulturi duplikati f'kull konċentrazzjoni, u dan huwa rakkomandat bil-qawwi għal kulturi ta' kontroll negattiv/solvent. Billi varjazzjoni minima bejn kulturi duplikati tista’ tidher (13) (14), mill-informazzjoni storika, jista’ jkun aċċettabbli li jintużaw kulturi singoli f'kull konċentrazzjoni.
                     Sustanzi gassużi jew volatili għandhom jiġu ttestjati b'metodi xierqa, bħal ma huma mezzi ta' kulturi magħluqin (15) (16).
                  
               1.4.3.3.   Żmien tal-ħsad tal-kulturi
         Fl-ewwel esperiment, iċ-Ċelloli għandhom jiġu esposti għas-sustanza tat-test, kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha, għal 3-6 siegħat, u jittieħed kampjun f'ħin ekwivalenti għal madwar 1,5 it-tul taċ-ċiklu ta' ċellula normali wara li jkun beda t-trattament (12). Jekk dan il-protokoll jagħti riżultati negattivi kemm bl-attivazzjoni kif ukoll mingħajrha, għandu jsir esperiment addizzjonali mingħajr attivazzjoni, bi trattament kontinwu sakemm jittieħed kampjun f'ħin ekwivalenti għal 1,5 it-tul taċ-ċiklu ta' ċellula normali. Ċerti kimiċi jistgħu jintnebħu aktar faċilment b'ħinijiet ta' trattament/teħid ta' kampjuni itwal minn 1,5 it-tul taċ-ċiklu. Riżultati negattivi b'attivazzjoni metabolika għandhom jiġu konfermati għal kull każ partikolari. F'dawk il-każijiet fejn mhux meqjus neċessarju li jkun hemm konferma tar-riżultati negattivi, għandha tingħata ġustifikazzjoni.
         1.4.3.4.   Preparazzjoni tal-kromożomi
         Il-kulturi taċ-Ċelloli jiġu ttrattati bi Colcemid® jew kolċiċina normalment għal 1-3 siegħat qabel il-ħsad. Kull kultura ta' ċellula tinħasad u tiġi proċessata separatament għall-preparazzjoni tal-kromożomi. Il-preparazzjoni tal-kromożomi tinvolvi t-trattament ipotoniku ta' Ċelloli, il-fissazzjoni u li jingħataw kulur.
         1.4.3.5.   Analiżi
         Id-dijapożittivi kollha, inklużi dawk ta' kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati indipendentement qabel l-analiżi mikroskopika. Peress li l-proċeduri ta' fissazzjoni ta' spiss jirriżultaw fil-ksur ta' għadd ta' Ċelloli metafażiċi bit-telf ta' kromożomi, iċ-Ċelloli li jingħaddu għandu għalhekk ikollhom numru ta' ċentromeri ekwivalenti għan-numru modali ≠ 2 għat-tipi kollha ta' Ċelloli. Għandhom jingħaddu għall-inqas 200 metafażi mifruxa sew għal kull konċentrazzjoni u kontroll, maqsumin b'mod ugwali bejn id-duplikati, jekk ikun applikabbli. Dan in-numru jista’ jitnaqqas meta jiġi osservat numru akbar ta' anormalitajiet.
         Għalkemm l-għan tat-test huwa biex jinkixfu anormalitajiet strutturali fil-kromożomi, u importanti li wieħed jirreġistra poliplojdi u endoreduplikazzjoni meta wieħed jinduna b'dawn.
         2.   DATA
         2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         L-unità sperimentali hija ċ-ċellula, u għalhekk għandha ssir valutazzjoni tal-perċentwali ta' Ċelloli b'anormalità (jiet) strutturali fil-kromożomi. Għandhom jiġu elenkati t-tipi differenti ta' anormalitajiet strutturali fil-kromożomi bl-għadd u l-frekwenzi tagħhom għal kulturi ta' esperimenti u ta' kontroll. Il-vojt jiġi reġistrat separatament u jsir rapport dwaru iżda ġeneralment ma jiġix inkluż fil-frekwenza totali ta' l-anormalità.
         Għandhom jiġu reġistrati ukoll miżuri ta' ċitotossiċità li jittieħdu fl-istess ħin għall-kulturi kollha ta' kontroll trattati u negattivi fl-esperimenti prinċipali dwar l-anormalitajiet.
         Għandha tingħata l-informazzjoni dwar kultura individwali. Barra minn dan, l-informazzjoni għandha tingħata sommarjament f'forma ta' tabella.
         Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' riżultat pożittiv ċar. Riżultati ekwivoċi għandhom jiġu ċċarati b'testijiet oħra preferibbilment billi jkun hemm modifika tal-kundizzjonijiet sperimentali. Il-ħtieġa li riżultati negattivi jiġu konfermati ġiet diskussa fi 1.4.3.3. Il-modifika ta' parametri ta' studju biex tiġi estiża l-medda tal-kundizzjonijiet stmati għandha tiġi kkunsidrata f'esperimenti li jsiru wara. Il-parametri ta' studju li jistgħu jiġu modifikati jinkludu l-ispazju tal-konċentrazzjoni u l-kundizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika.
         2.2.   VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit riżultat pożittiv, bħal ma hi żieda relatata mal-konċentrazzjoni jew żieda riproduċibbli f'għadd ta' Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromożomi. L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet (3) (13), jistgħu jintużaw metodi ta' statistika.
         L-importanza ta' l-istatistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal riżultat pożittiv. Żieda fin-numru ta' Ċelloli poliplojdi tista’ tindika li s-sustanza tat-test għandha l-potenzal li twaqqaf il-proċessi mitotiċi u li twassal għal anormalitajiet numeriċi fil-kromożomi. Żieda fl-għadd ta' ċelluli bi kromożomi endoreduplikati tista’ tindika li s-sustanza tat-test għandha l-potenzal li twaqqaf il-progressjoni taċ-ċiklu taċ-Ċelloli (17) (18).
         Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma jilħqux il-kriterji fuq imsemmija titqies bħala mhux mutaġenika f'din is-sistema.
         Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ekwivoċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ruħu l-esperiment.
         Ir-riżultati pożittivi minn test in vitro ta' anormalitajiet fil-kromożomi jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq anormalitajiet strutturali fil-kromożomi f'Ċelloli somatiċi ta' kulturi ta' mammiferi. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, taħt il-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx anormalitajiet fil-kromożomi f'Ċelloli somatiċi ta' kulturi ta' mammiferi.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Solvent/mezz:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Ċelloli:
                     
                                 —
                              
                              
                                 tip u għejun taċ-Ċelloli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 karatteristiċi karjotipiċi u adattibilità tat-tip ta' ċellula użata;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 nuqqas ta' mikoplasma, jekk ikun applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar it-tul taċ-ċiklu taċ-ċellula;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 sess ta' min jagħti d-demm, demm sħiħ jew limfoċiti separati, nitroġenu użat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru ta' passaġġi, jekk ikun applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi għall-manutenzjoni tal-kulturi taċ-Ċelloli, jekk jkun applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 għadd modali ta' kromożomi.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 identità tas-sustanza li twaqqaf il-metafażi, il-konċentrazzjoni tagħha u kemm iddum l-espożizzjoni taċ-ċellula;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 raġuni prinċipali għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet u għadd ta' kulturi inklużi, eż. informazzjoni dwar ċitotossiċità u limitazzjonijiet dwar solubbilità, jekk ikunu disponibbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 komposizzjoni tal-medja, konċentrazzjoni CO2 jekk tkun applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 volum tal-mezz u sustanza tat-test miżjuda;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 temperatura ta' l-inkubazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 perjodu ta' inkubazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kemm idum it-trattament;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 densità taċ-ċellula fiż-żriegħ, jekk ikun xieraq;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tip u komposizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika, inklużi krierji ta' aċċettabilità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kontrolli pożittivi u negattivi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi ta' preparazzjoni ta' dijapożitivi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kriterji għall-għadd ta' anormalitajiet;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru ta' metafażijiet analizzati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi biex titqies it-tossiċità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 sinjali ta' tossiċità, eż. grad ta' konfluwenza, informazzjoni dwar iċ-ċiklu taċ-ċellula, għadd ta' Ċelloli, indiċi mitotiku;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 sinjali ta' preċipitazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar pH u l-osmolalità tal-medjum tat-trattament, jekk ikun stabbilit;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 definizzjoni għall-anormalitajiet, inkluż il-vojt;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru ta' Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromożomi u tip ta' anormalitajiet fil-kromożomi mogħtija separatament għal kull kultura trattata u ta' kontroll;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 bidliet fil-plojdi, jekk jidhru;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv (solvent/mezz) u pożittiv;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, bil-meded, mezzi u devjazzjonijiet standard.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni dwar ir-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (1985), The In vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1-175.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, pp. 297-305.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83-90.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In vitro, Mutation Res., 66, pp. 277-290.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In vitroMetabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994), Report from Working Group on in In vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241-261.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139-149.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.
                  
               B.11.   MUTAĠENIĊITÀ -TEST IN VIVO DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMITAL-MUDULLUN TAL-MAMMIFERI
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 475, Test dwar Anormalità fil-Kromożomi tal-Mudullun tal-Mammiferi (1997).
         1.1.   INTRODUZZJONI
         It-test in vivo dwar anormalitajiet fil-kromożomi tal-mammiferi jintuża biex jinstabu anormalitajiet strutturali fil-kromożomi miġjuba mis-sustanza tat-test fiċ-Ċelloli tal-mudullun ta' annimali, normalment annimali gerriema (1) (2) (3)(4). Anormalitajiet strutturali fil-kromożomi jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomi jew kromatidi. Żieda fil-poliplojdi tista’ tindika li kimika għandha l-potenzal li ġġib magħha anormalitajiet numeriċi. Fil-maġġoranza ta' mutaġeni kimiċi, anormalitajiet imġiegħela huma tat-tip kromatidu, iżda jirrikorru wkoll anormalitajiet tat-tip ta' kromożomi. Mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem u hemm xhieda sostanzjali li mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati li jikkawżaw alterazzjonijiet f'onkoġeni u f'ġeni li jrażżnu t-tumuri huma involuti fil-ħolqien tal-kanċer fil-bniedem u sistemi sperimentali.
         Annimali gerriema jintużaw ġeneralment f'dan it-test. Il-mudullun huwa t-tessut immirat f'dan it-test, għax huwa tessut vaskularizzat immense, u fih popolazzjoni ta' ċelluli li jiċċiklaw rapidament li jistgħu jkunu faċilment iżolati u proċessati. Speċi oħra u tessuti mmirati mhumiex is-suġġett ta' dan il-metodu.
         Dan it-test ta' anormalitajiet fil-kromożomi huwa rilevanti speċjalment fil-valutazzjoni ta' perikli mutaġeniċi għax jippermetti l-kunsiderazzjoni ta' fatturi ta' metaboliżmu in vivo, farmakokinetika u proċessi ta' tiswija ta' DNA għalkemm dawn jistgħu jvarjaw fost l-ispeċi u fost it-tessuti. Test in vivo huwa utli ukoll għal investigazzjoni ulterjuri ta' effett mutaġeniku żvelat minn test in vitro.
         Jekk hemm xiedha li s-sustanza tat-test, jew metabolit reattiv, ma jwasslux għat-tessut immirat, mhux xieraq li jintuża dan it-test.
         Ara ukoll Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Anormalità tat-tip kromatidu: ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u għaqda mill-ġdid bejn kromatidi.
         
            Anormalità tat-tip tal-kromożomi: ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur, jew ksur u għaqda mill-ġdid, taż-żewġ kromatidi f'sit identiku.
         
            Endoreduplikazzjoni: proċess li fih wara perjodu S ta' replikazzjoni ta' DNA, in-nukleu ma jispiċċax f'mitożi iżda jerġa' jibda perjodu ieħor S. Ir-riżultat hu kromożomi bi 4, 8, 16,… kromatidi.
         
            Vojt: leżjoni akromatika iżgħar mill-wisgħa ta' kromatid wieħed, u b'misallinjament minimu tal-kromatidi.
         
            Anormalità numerika: bidla fin-numru ta' kromożomi min-numru karatteristku normali ta' Ċelloli utilizzati.
         
            Poliplojdi: multiplu tan-numru aplojdu ta' kromożomi (n) minbarra n-numru diplojdu (jiġifieri 3n, 4n, eċċetera).
         
            Anormalità strutturali: bidla fl-istruttura tal-kromożomi li wieħed jinduna biha bl-eżami mikroskopiku ta' l-istadju metafażiku tad-diviżjoni ta' ċelluli, osservati bħala tħassir u biċċiet, bidliet minn ġewwa u bidliet bejniethom.
         1.3.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Annimali huma esposti għas-sustanza tat-test b'rotta xierqa ta' espożizzjoni u huma sakrifikati f'ħinijiet xierqa wara t-trattament. Qabel ma jiġu sakrifikati, l-annimali huma ttrattati b'aġent li jwaqqaf l-metafażi (eż. kolċiċina jew Colcemid®). Imbagħad isiru preparazzjonijiet ta' kromożomi miċ-Ċelloli tal-mudullun u jiġu mtebbgħin, u ċ-ċelluli metafażiċi jiġu analizzati għal anormalitajiet fil-kromożomi.
         1.4.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.4.1.   Preparazzjonijiet
         1.4.1.1.   Selezzjoni ta' l-ispeċi ta' l-annimali
         Normalment jintużaw far, ġrieden u Ħamsters ċiniżi, iżda jista’ jintuża kull annimal xieraq ta' l-ispeci tal-mammiferi. Għandhom jintużaw razez, li komunement jintużaw fil-laboratorji, ta' annimali adulti b'saħħithom u żgħar. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali għandha tkun minima u ma teċċedix ± 20 % tal-medja tal-piż ta' kull sess.
         1.4.1.2.   Kundizzjonijiet ta' fejn jinżammu u x'jieklu
         Għandhom japplikaw il-kundizzjonijiet ġenerali msemmija fl-Introduzzjoni ġenerali għat-Taqsima B iżda l-mira dwar l-umdità għandha tkun 50-60 %.
         1.4.1.3.   Preparazzjoni ta' l-annimali
         Annimali adulti żgħar u b'saħħithom jiġu assenjati mingħajr skema għall-gruppi ta' kontroll u trattament. Il-gaġeġ għandhom jitqiegħdu b'tali mod li jiġu minimizzati effetti possibbli li jirriżultaw minn kif jitqiegħdu l-gaġeġ. L-annimali jiġu identifikati wieħed wieħed. L-annimali jiġu akklimatizzati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju għall-inqas għal ħamest ijiem.
         1.4.1.4.   Preparazzjoni tad-dożi
         Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewwbin jew sospiżi f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta' l-annimali. Sustanzi likwidi tat-test jistgħu jiġu ttrattati direttament jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix laċċettabbilità tal-ħażna.
         1.4.2.   Kundizzjonijiet tat-test
         1.4.2.1.   Solvent/mezz
         Is-solvent/mezz ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli ta' doża użata, u ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika mas-sustanza tat-test. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra minflok dawk l-aktar magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Hu rakkomandat li kemm jista’ jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akwuż.
         1.4.2.2.   Kontrolli
         Għandhom jiġu inklużi għal kull wieħed mis-sessi f'kull test kontrolli pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom jiġu trattati bl-istess mod bħall-annimali fil-grupp ta' trattament.
         Il-kontrolli pożittivi għandhom jipproduċu anormalitajiet strutturali in vivo f'livelli ta' espożizzjoni li huma mistennija li jagħtu żieda li tkun tidher fuq l-isfond. Trattamenti ta' kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx l-identità tad-dijapożitivi kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettat li l-kontroll pożittiv jiġi somministrat minn rotta differenti minn dik tas-sustanza tat-test u jittieħed kampjun darba waħda biss. Jista’ jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittivi relatati mal-klassi ta' kimiċi, meta dawn ikunu disponibbli. Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll pożittivi jinkludu:
         
                     Sustanza
                  
                  
                     Nru SAK
                  
                  
                     Nru EINECS
                  
               
                     Etil metansulfonat
                  
                  
                     62-50-0
                  
                  
                     200-536-7
                  
               
                     Etil nitrosourea
                  
                  
                     759-73-9
                  
                  
                     212-072-2
                  
               
                     Mitomiċina C
                  
                  
                     50-07-7
                  
                  
                     200-008-6
                  
               
                     Ciklofosfamide
                     Ciklofosfamide monojdrat
                  
                  
                     50-18-0
                     6055-19-2
                  
                  
                     200-015-4
                  
               
                     Trijetilenemelamina
                  
                  
                     51-18-3
                  
                  
                     200-083-5
                  
               Il-kontrolli negattivi, trattati biss bis-solvent jew bil-mezz, u mod ieħor trattati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, għandhom jiġu inklużi għal kull perjodu ta' teħid ta' kampjuni, sakemm ma jkunux disponibbli varjabbilità aċċettabbli bejn l-annimali u frekwenżi ta' Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromożomi mill-informazzjoni storika tal-kontroll. Jekk jiġi applikat it-teħid ta' kampjun singolu, l-aktar żmien xieraq huwa l-ewwel darba li jittieħed il-kampjun. Barra minn dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm ma jkunx hemm informazzjoni ta' kontroll pubblikata u storika li turi li jkun hemm effetti ta' ħsara u mutaġeniċi bl-uzu tas-solvent/mezz magħżul.
         1.5.   PROĊEDURA
         1.5.1.   Numru u sess ta' l-annimali
         Kull grupp ta' trattament u ta' kontroll għandu jinkludi fih għall-inqas ħames annimali analizzabbli għal kull sess. Jekk fiż-żmien ta' l-istudju jkun hemm informazzjoni disponibbli minn studji fl-istess speċi u bl-użu ta' l-istess rotta ta' espożizzjoni li juru li ma hemm l-ebda differenzi sostanzjali fit-tossiċità bejn is-sessi, allura jkun suffiċjenti li l-ittestjar isir fuq sess wieħed. Fejn l-espożizzjoni umana għall-kimiċi tista’ tiddependi fuq is-sess, bħal per eżempju b'ċerti aġenti farmaċewtiċi, it-test għandu jitwettaq b'annimali tas-sess xieraq.
         1.5.2.   Skeda tat-trattament
         Is-sustanzi tat-test huma preferibbilment somministrati bħala trattament singolu. Is-sustanzi tat-test jistgħu wkoll jiġu somministrati bħala doża maqsuma, jiġifieri żewġ trattamenti fl-istess ġurnata separati b'mhux aktar minn ftit sigħat, biex tiġi faċilitata s-somministrazzjoni ta' volum qawwi ta' materjal. Reġimi ta' dożi oħra għandhom ikunu ġustifikati xjentifikament.
         Il-kampjuni għandhom jittieħdu f'żewġ ħinijiet separati wara t-trattament f'ġurnata waħda. Għal annimali ġerriema l-ewwel intervall bejn it-teħid ta' kampjuni huwa ta' tul ta' 1,5 iċ-ċiklu normali ta' ċellula (dan ta' l-aħħar huwa normalment ta' 12-18-il siegħa) wara t-trattament. Ladarba l-ħin meħtieġ għall-bidu u l-metaboliżmu tas-sustanza tat-test kif ukoll l-effetti tiegħu fuq il-kinetika taċ-ċikli taċ-Ċelloli jistgħu jaffettwaw iż-żmien ottimali biex wieħed jintnebaħ bl-anormalitajiet fil-kromożomi, huwa rakkomandat li jittieħed kampjun ieħor 24 siegħa wara li jkun ttieħed l-ewwel kampjun. Jekk jintużaw metodi ta' dożi ta' aktar minn ġurnata waħda, għandu jkun hemm ħin ta' teħid ta' kampjun wieħed f'tulijiet ta' 1,5 iċ-ċikli normali ta' ċellula wara l-aħħar trattament.
         Qabel is-sagrifiċċju, l-annimali huma injettati intraperitonalment b'doża xierqa ta' aġent li jwaqqaf l-metafażi (eż. Colcemid® jew kolċiċina). Wara dan, jittieħed kampjun mill-annimali f'intervalli xierqa. Għall-ġrieden dan l-intervall huwa ta' madwar 3-5 siegħat; għal Ħamsters ċiniżi dan l-intervall huwa ta' madwar 4-5 siegħat. Iċ-Ċelloli jinħasdu mill-mudullun u jiġu analizzati għal anormalitajiet fil-kromożomi.
         1.5.3.   Livelli ta' doża
         Jekk jitwettaq studju biex tiġi skoperta l-medda għax ma jkunx hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, jintużaw l-istess speċi, razza, sess u metodu ta' trattament li għandhom jintużaw fl-istudju prinċipali (5). Jekk ikun hemm tossiċità, jintużaw tliet livelli ta' doża għall-ewwel perjodu ta' teħid ta' kampjuni. Dawn il-livelli ta' doża għandhom jkopru medda mill-massimu għal ftit jew l-ebda tossiċità. L-ogħla doża hija mfissra bħala s-sinjali ta' tossiċità li jipproduċu d-dożi hekk li livelli ogħla tad-doża, bbażati fuq l-istess reġim ta' dożaġġ, huma mistennija li jikkawżaw il-mewt. Is-sustanzi b'attivitajiet bijoloġiċi speċifiċi f'dożi baxxi mhux tossiċi (bħal ma huma ormoni u nitroġeni) jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' l-issettjar tad-dożi u għandhom jiġu valutati fuq bażi ta' każ b'każ. L-ogħla doża tista’ ukoll tfisser id-doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossiċità fil-mudullun (eż. ogħla minn riduzzjoni ta' 50 % fl-indiċi mitotiku).
         1.5.4.   Test tal-limitu
         Jekk test ta' doża waħda ta' livell ta' għall-inqas 2 000 mg/kg piż tal-ġisem meta jitwettaq trattament wieħed, jew bħala żewġ trattamenti fl-istess ġurnata, ma jipproduċix effetti tossiċi li wieħed jinduna bihom, u jekk ma tkun mistennija l-ġenotossiċità fuq il-bażi ta' l-informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx li jkun neċessarju li jsir studju komplet bl-użu ta' tliet livelli ta' dożaġġ. Għal studji li jdumu aktar, il-limitu tad-doża huwa 2 000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum għal trattament sa 14-il ġurnata, u 1 000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum għal trattament ta' aktar minn 14-il ġurnata. L-espożizzjoni umana mistennija tista’ tindika l-ħtieġa ta' livell ogħla ta' doża li għandu jintuża fit-test tal-limitu.
         1.5.5.   Somministrazzjoni ta' dożi
         Normalment is-sustanza tat-test tiġi somministrata b'gavage billi jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni, jew bl-injezzjoni intraperitonali. Fejn ikunu ġustifikati, jistgħu jiġu aċċettati rotot oħra ta' espożizzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jiġi somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f'ħin wieħed jiddependi fuq il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux ikun aktar minn 2 ml/100g piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ogħla minn dawn għandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-każ ta' sustanzi li jirritaw jew korrożivi li normalment juru effetti aggravati b'konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbilita fil-volum tat-test għandha titnaqqas bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti fuq il-livelli kollha tad-doża.
         1.5.6.   Preparazzjoni tal-kromożomi
         Minnufih wara s-sagrifiċċju, il-mudullun jiġi miksub, espost għal soluzzjoni ipotonika u ffissat. Iċ-Ċelloli imbagħad jinfirxu fuq dijapożitivi u jingħataw kulur.
         1.5.7.   Analiżi
         L-indiċi mitotiku għandu jiġi stabbilit bħala miżura ta' ċitotossiċita f'għall-inqas 1 000 ċellula għal kull annimal għal kull annimal trattat (inklużi kontrolli pożittivi) u annimali kontrollati negativament mhux trattati.
         Għandhom jiġu analizzati għall-inqas 100 ċellula għal kull annimal. Dan in-numru jista’ jitnaqqas meta jiġi nnotat għadd kbir ta' anormalitajiet. Id-dijapożitivi kollha, inklużi dawk ta' kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati indipendentement qabel l-analiżi mikroskopika. Billi l-proċeduri tal-preparazzjoni ta' dijapożitivi jirriżultaw ħafna drabi fil-ksur ta' għadd ta' metafażi bit-telf ta' kromożomi, iċ-Ċelloli li jingħaddu għandu għalhekk ikun fihom numru ta' ċentromeri ugwali għan-numru 2n ± 2.
         2.   DATA
         2.1.   TRATTAMENT TAR- RIŻULTATI
         L-informazzjoni dwar annimali individwali għandha tingħata f'forma ta' tabella. L-unità sperimentali hija l-annimal. Għal kull annimal għandhom jiġu valutati n-numru ta' Ċelloli li jingħaddu, in-numru ta' anormalitajiet f'kull ċellula u l-perċentwali ta' Ċelloli b'anormalità (jiet) strutturali fil-kromożomi. Għandhom jiġu elenkati t-tipi differenti ta' anormalitajiet strutturali fil-kromożomi bl-għadd u l-frekwenzi tagħhom għal gruppi ta' trattament u ta' kontroll. Il-vojt jiġi reġistrat separatament u jsir rapport dwaru iżda ġeneralment ma jiġix inkluż fil-frekwenza totali ta' l-anormalità. Jekk ma hemmx xiehda ta' differenza fir-riżultat bejn iż-żewġ sessi, l-informazzjoni dwar iż-żewġ sessi tista’ tingħaqad għall-analiżi statistika.
         2.2.   VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit riżultat pożittiv, bħal ma hi żieda relatata mad-doża fl-għadd relattiv ta' Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromożomi jew żieda ċara fin-numru ta' Ċelloli b'anormalitajiet fi grupp singolu ta' trattament fi żmien singolu ta' teħid ta' kampjuni. L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet (6), jistgħu jintużaw metodi ta' statistika. L-importanza ta' l-istatistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal riżultat pożittiv. Riżultati ekwivoċi għandhom jiġu ċċarati b'testijiet ulterjuri preferibilment billi tintuża modifika tal-kundizzjonijiet ta' l-esperiment.
         Żieda fil-poliplojdi tista’ tindika li s-sustanza tat-test għandha l-potenzal li twassal għal anormalitajiet numeriċi fil-kromożomi. Żieda fl-endoreduplikazzjoni tista’ tindika li s-sustanza tat-test għandha l-potenzal li twaqqaf il-progressjoni taċ-ċiklu taċ-Ċelloli (7) (8).
         Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma jilħqux il-kriterji fuq imsemmija titqies bħala mhux mutaġenika f'dan it-test.
         Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ekwivoċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ruħu l-esperiment.
         Ir-riżultati pożittivi minn test in vivo ta' anormalitajiet fil-kromożomi jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq anormalitajiet strutturali fil-kromożomi fil-mudullun ta' l-ispeċi ttestjata. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, taħt il-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx anormalitajiet fil-mudullun ta' l-ispeċi ttestjata.
         Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test jew il-metaboliti tagħha jilħqu ċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew speċifikatament it-tessut immirat (eż. tossiċità sistemika).
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Solvent/mezz:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Annimali ttestjati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 speċi/razza użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru, età u sess ta' l-annimali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 għejun, kundizzjonijiet dwar fejn jinżammu, dieta, eċċ.;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inkluża l-medda ta' piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard għal kull grupp.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 kontrolli pożittivi u negattivi (mezz/solvent);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 raġuni prinċipali għall-għażla tad-doża;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi biex jiġi verifikat li s-sustanza tat-test waslet għaċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew it-tessut immirat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 konverżjoni mill-konċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test dieta/ilma għax-xorb għad doża attwali (mg/kg piż tal-ġisem/jum) jekk tkun applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u teħid ta' kampjuni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi biex titqies it-tossiċità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 identità tas-sustanza li twaqqaf il-metafażi, il-konċentrazzjoni tagħha u kemm idum it-trattament;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi tal-preparazzjoni tad-dijapożitivi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kriterji għall-għadd ta' anormalitajiet;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru ta' Ċelloli analizzati kull annimal;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 sinjali ta' tossiċità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 indiċi mitotiku;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tip u numru ta' anormalitajiet, mogħtija separatament għal kull annimal;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru totali ta' anormalitajiet għal kull grupp bil-mezzi u devjazzjonijiet standard;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru ta' Ċelloli b'anormalitajiet f'kull grupp bil-mezzi u devjazzjonijiet standard;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 bidliet fil-plojdi, jekk jidhru;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz), bil-meded, mezzi u devjazzjonijiet standard;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin pożittiv.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni dwar ir-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D.C., pp. 275-306.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157-165.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha- radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.
                  
               
            “B.12.   MUTAĠENIĊITÀ-TEST MIKRONUKLEUIN VIVO GĦAL ERITROĊITE FIL-MAMMIFERI
            1.   METODU
            Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 474, Test Mikronukleu għal Eritroċite fil-Mammiferi (1997).
            1.1.   INTRODUZZJONI
            It-test mikronukleu in vivo fil-mammiferi jintuża biex jinstab jekk hemmx ħsara li tinġieb mis-sustanza tat-test lill-kromożomi jew l-apparat mitotiku ta' eritroblasti bl-analiżi ta' eritroċiti meħuda bħala kampjuni fil-mudullun u/jew Ċelloli periferali tad-demm ta' annimali, ġeneralment annimali gerriema.
            L-għan tat-test mikronukleu huwa biex jiġu identifikati sustanzi li jikkawżaw ħsara ċitoġenetika li tirriżulta fil-formazzjoni ta' mikronukleji li jkun fihom biċċiet ta' residwi ta' kromożomi jew kromożomi sħaħ.
            Meta eritroblast tal-mudullun jiżviluppa f'eritroċite polikromatika, joħroġ in-nukleu prinċipali; kull mikronukleu li jkun ġie ffurmat jista’ jibqa' lura fiċ-ċitoplasma mod ieħor anukleat. Il-viżwalizzazzjoni tal-mikronukleji hija faċilitata f'dawn iċ-Ċelloli għax ma għandhomx nukleu prinċipali. Żieda fil-frekwenza ta' eritroċiti polikromatiċi mikronukleati fl-annimali trattati hija indikazzjoni ta' ħsara miġjuba fil-kromożomi.
            Ġeneralment f'dan it-test jiġi użat il-mudullun ta' annimali gerriema għax l-eritroċiti polikromatiċi huma prodotti f'dak it-tessut. Il-qisien ta' eritroċiti mikronukleati immaturi (polikromatiċi) fid-demm periferali huwa ugwalment aċċettat f'kull speċi li fiha ġiet murija l-inabbiltà tal-milsa li tneħħi eritroċiti mikronukleati, jew li tkun uriet sensittività adegwata biex tiskopri aġenti li jikkawżaw anormalitajiet fil-kromożomi strutturali jew numeriċi. Il-mikronukleji jistgħu differenzati b'għadd ta' kriterji. Dawn jinkludu l-identifikazzjoni tal-preżenza jew nuqqas ta' DNA kinetoċoru jew ċentromeriku fil-mikronukleji. Il-frekwenza ta' eritroċiti mikronukleati immaturi (polikromatiċi) hija l-punt prinċipali ta' konklużjoni. L-għadd ta' eritroċiti maturi (normokromatiċi) fid-demm periferali li jkun fihom mikronukleji fost numru stabbilit ta' eritroċiti maturi jista’ jintuża ukoll bħala l-punt ta' konklużjoni tal-valutazzjoni meta l-annimali jiġu ttrattati għal erba' ġimgħat jew aktar.
            Dan it-test mikronukleu in vivo fil-mammiferi huwa speċjalment rilevanti fil-valutazzjoni ta' perikli mutaġeniċi għax jippermetti l-kunsiderazzjoni ta' fatturi ta' metaboliżmu in vivo, farmakokinetika u proċessi ta' tiswija tad-DNA għalkemm dawn jistgħu jvarjaw fost l-ispeċi, fost it-tessuti u fost il-punti ġenetiċi ta' konklużjoni. Eżami in vivo huwa utli ukoll għal investigazz ulterjuri ta' effett mutaġeniku żvelat b'sistema in vitro.
            Jekk ikun hemm xiedha li s-sustanza tat-test, jew metabolit reattiv, ma jilħaqx it-tessut immirat, mhux xieraq li jintuża dan it-test.
            Ara ukoll l-Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.
            1.2.   DEFINIZZJONIJIET
            
               Ċentromeru (Kinetoċoru): reġjun(i) ta' kromożomu li magħha huma assoċjati fibri irqaq waqt d-diviżjoni taċ-ċellula, li jippermettu l-moviment b'ċertu ordni ta' kromożomi sekondarji għat-truf ta' Ċelloli sekondarji.
            
               Mikronukleji: nukleji żgħar, separate minn u addizzjonali għan-nukleji prinċipali ta' Ċelloli, prodotti waqt it-telofażi ta' mitożi (mejożi) permezz ta' biċċiet ta' residwi ta' kromożomi jew kromożomi sħaħ.
            
               Eritroċite normokromatika: eritroċite matura li ma għandhiex ribosomi u li tista’ tiġi differenzata minn eritroċiti polikromatiċi immaturi bit-tebgħat selettivi għal ribosomi.
            
               Entroċite polikromatika: eritroċite immatura, fi stadju intermedju ta' żvilupp, li xorta waħda fiha ribosomi u għalhekk tista’ tiġi differenzata minn eritroċiti normokromatiċi maturi bit-tebgħat selettivi għal ribosomi.
            1.3.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
            L-annimali huma esposti għas-sustanza tat-test permezz ta' rotta xierqa. Jekk jintuża l-mudullun, l-annimali jiġu sakrifikati fi żminijiet xierqa wara t-trattament, jitneħħa l-mudullun, u l-preparazzjonijiet jsiru u jingħataw il-kulur (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Meta jintuża demm periferali, id-demm jinġabar f'ħinijiet xierqa wara t-trattament u wara li jsiru l-preparazzjonijiet u jingħataw il-kulur (4) (8) (9) (10). Għal studji b'demm periferali, għandu jgħaddi perjodu kemm jista’ jkun żgħir bejn l-aħħar espożizzjoni u l-ħsad taċ-ċellula. Il-preparazzjonijiet jiġu analizzati għall-preżenza ta' mikronukleji.
            1.4.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
            1.4.1.   Preparazzjonijiet
            1.4.1.1.   Għażla ta' l-ispeċi ta' l-annimali
            Hu rakkomandat li jintużaw ġrieden jew far, jekk jintuża l-mudullun, iżda jista’ jintuża kull annimal xieraq ta' l-ispeci tal-mammiferi. Meta jintuża demm periferali, hu rakkomandat li jintużaw ġrieden. Iżda kull speċi xierqa ta' mammiferi tista’ tintuża sakemm tkun speċi li fiha l-milsa ma tneħħix eritroċiti mikronukleati, jew speċi li tkun uriet sensittività adegwata biex tiskopri aġenti li jikkawżaw anormalitajiet fil-kromożomi strutturali jew numeriċi. Għandhom jintużaw razez, li komunement jintużaw fil-laboratorji, ta' annimali adulti b'saħħithom u żgħar. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali għandha tkun minima u ma teċċedix ± 20 % tal-medja tal-piż ta' kull sess.
            1.4.1.2.   Kundizzjonijiet ta' fejn jinżammu u x'jieklu
            Għandhom japplikaw il-kundizzjonijiet ġenerali msemmija fl-Introduzzjoni ġenerali għat-Taqsima B iżda l-mira dwar l-umdità għandha tkun 50-60 %.
            1.4.1.3.   Preparazzjoni ta' l-annimali
            Annimali adulti żgħar u b'saħħithom jiġu assenjati mingħajr skema għall-gruppi ta' kontroll u trattament. L-annimali jiġu identifikati wieħed wieħed. L-annimali jiġu akklimatizzati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju għall-inqas għal ħamest ijiem.. Il-gaġeġ għandhom jitqiegħdu b'tali mod li jiġu minimizzati effetti possibbli li jirriżultaw minn kif jitqiegħdu l-gaġeġ.
            1.4.1.4.   Preparazzjoni tad-dożi
            Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewwbin jew sospiżi f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta' l-annimali. Sustanzi likwidi tat-test jistgħu jiġu ttrattati direttament jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix laċċettabbilità tal-ħażna.
            1.4.2.   Kundizzjonijiet tat-test
            1.4.2.1.   Solvent/mezz
            Is-solvent/mezz ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli ta' doża użata, u ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika mas-sustanza tat-test. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra minflok dawk l-aktar magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Hu rakkomandat li kemm jista’ jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akwuż.
            1.4.2.2.   Kontrolli
            Għandhom jiġu inklużi għal kull wieħed mis-sessi f'kull test kontrolli pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom jiġu trattati bl-istess mod bħall-annimali fil-gripp ta' trattament.
            Il-kontrolli pożittivi għandhom jipproduċu mikronukleji in vivo f'livelli ta' espożizzjoni li huma mistennija li jagħtu żieda li tkun tidher fuq l-isfond. Trattamenti ta' kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx l-identità tad-dijapożitivi kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettat li l-kontroll pożittiv jiġi somministrat minn rotta differenti minn dik tas-sustanza tat-test u jittieħed kampjun darba waħda biss. Barra minn dan, jista’ jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittivi relatati mal-klassi ta' kimiċi, meta dawn ikunu disponibbli. Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll pożittivi jinkludu:
            
                        Sustanza
                     
                     
                        Nru SAK
                     
                     
                        Nru Einecs
                     
                  
                        Etil metansulfonat
                     
                     
                        62-50-0
                     
                     
                        200-536-7
                     
                  
                        N-etil-N-nitrosourea
                     
                     
                        759-73-9
                     
                     
                        212-072-2
                     
                  
                        Mitomiċina C
                     
                     
                        50-07-7
                     
                     
                        200-008-6
                     
                  
                        Ciklofosfamide
                        ciklofosfamide monojdrat
                     
                     
                        50-18-0
                        6055-19-2
                     
                     
                        200-015-4
                     
                  
                        Trijetilenemelamina
                     
                     
                        51-18-3
                     
                     
                        200-083-5
                     
                  Il-kontrolli negattivi, trattati biss bis-solvent jew bil-mezz, u mod ieħor trattati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, għandhom jiġu inklużi għal kull perjodu ta' teħid ta' kampjuni, sakemm ma jkunux disponibbli varjabbilità aċċettabbli bejn l-annimali u frekwenżi ta' Ċelloli b'mikronuleji mill-informazzjoni storika tal-kontroll. Jekk jiġi applikat it-teħid ta' kampjun singolu, l-aktar żmien xieraq huwa l-ewwel darba li jittieħed il-kampjun. Barra minn dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm ma jkunx hemm informazzjoni ta' kontroll pubblikata u storika li turi li jkun hemm effetti ta' ħsara u mutaġeniċi bl-uzu tas-solvent/mezz magħżul.
            Jekk jintuża demm periferali, ħampjun ta' qabel it-trattament jista’ jkun aċċettabbli bħala kontroll negattiv fl-istess ħin, iżda fi studji qosra ta' demm periferali biss (eż. 1-3 trattament(i)) meta l-informazzjoni li tirriżulta tkun fil-medda mistennija għall-kontroll storiku.
            1.5.   PROĊEDURA
            1.5.1.   Numru u sess ta' l-annimali
            Kull grupp ta' trattament u ta' kontroll għandu jinkludi fih għall-inqas ħames annimali analizzabbli għal kull sess (11). Jekk fiż-żmien ta' l-istudju jkun hemm informazzjoni disponibbli minn studji fl-istess speċi u bl-użu ta' l-istess rotta ta' espożizzjoni li juru li ma hemm l-ebda differenzi sostanzjali fit-tossiċità bejn is-sessi, allura jkun suffiċjenti li l-ittestjar isir fuq sess wieħed. Fejn l-espożizzjoni umana għall-kimiċi tista’ tiddependi fuq is-sess, bħal per eżempju b'ċerti aġenti farmaċewtiċi, it-test għandu jitwettaq b'annimali tas-sess xieraq.
            1.5.2.   Skeda tat-trattament
            Ma jista’ jiġi rakkomandat l-ebda trattament standard (jiġifieri trattament wieħed, żewġ trattament jew aktar b'intervalli ta' 24 siegħa). Il-kampjuni minn reġimi ta' dożi estiżi huma aċċettabbli sakemm ikun ġie muri effett pożittiv għal dan l-istudju jew, għal studju negattiv, sakemm tkun ġiet murija tossiċità sakemm tintuża d-doża sal-limitu, u tingħata doża sal-ħin tat-teħid ta' kampjuni. Is-sustanzi tat-test jistgħu ukoll jiġu somministrati bħala doża maqsuma, jiġifieri żewġ trattament fl-istess ġurnata separati b'mhux aktar minn ftit sigħat, biex tiġi faċilitata s-somministrazzjoni ta' volum kbir ta' materjal.
            It-test jista’ jsir f'żewġ modi:
            
                        (a)
                     
                     
                        l-annimali jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test darba. Il-kampjuni tal-mudullun jittieħdu għall-inqas darbtejn, l-ewwel wieħed mhux qabel 24 siegħa wara t-trattament, iżda mhux aktar minn 48 siegħa wara t-trattament b'intervalli xierqa bejn it-teħid ta' kampjuni. It-teħid ta' kampjuni qabel 24 siegħa wara t-trattament għandu jkun ġustifikat. Il-kampjuni ta' demm periferali jittieħdu għall-inqas darbtejn, l-ewwel wieħed mhux qabel 36 siegħa wara t-trattament, b'intervalli xierqa wara t-teħid ta' l-ewwel kampjun, iżda mhux aktar minn 72 siegħa. Meta jiġi rikonoxxut riżultat pożittiv wara t-teħid wieħed ta' kampjuni, ma jkunx meħtieġ aktar teħid ta' kampjuni;
                     
                  
                        (b)
                     
                     
                        Jekk jintużaw żewġ trattament jew aktar kuljum (eż. żewġ trattamenti jew aktar f'intervalli ta' 24 siegħa), għandhom jinġabru kampjuni darba bejn 18 u 24 siegħa wara l-aħħar trattament riward il-mudullun u darba bejn 36 u 48 siegħa wara l-aħħar trattament rigward demm periferali (12).
                     
                  Jistgħu jintużaw metodi oħra ta' teħid ta' kampjuni, fejn dawn ikunu rilevanti.
            1.5.3.   Livelli ta' doża
            Jekk jitwettaq studju biex tiġi skoperta l-medda għax ma jkunx hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, jintużaw l-istess speċi, razza, sess u metodu ta' trattament li għandhom jintużaw fl-istudju prinċipali (13). Jekk ikun hemm tossiċità, jintużaw tliet livelli ta' doża għall-ewwel perjodu ta' teħid ta' kampjuni. Dawn il-livelli ta' doża għandhom jkopru medda mill-massimu għal ftit jew l-ebda tossiċità. Fil-ħin ta' l-aħħat teħid ta' kampjuni, l-ogħla doża biss hi meħtieġa li tintuża. L-ogħla doża hija mfissra bħala d-doża li tipproduċi sinjali ta' tossiċità hekk li livelli ogħla tad-doża, bbażati fuq l-istess reġim ta' dożaġġ, huma mistennija li jikkawżaw il-mewt. Is-sustanzi b'attivitajiet bijoloġiċi speċifiċi f'dożi baxxi mhux tossiċi (bħal ma huma ormoni u nitroġeni) jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' l-issettjar tad-dożi u għandhom jiġu valutati fuq bażi ta' każ b'każ. L-ogħla doża tista’ ukoll tfisser id-doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossiċità fil-mudullun (eż. tnaqqqis fil-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali fil-mudullun jew demm periferali).
            1.5.4.   Test tal-limitu
            Jekk test ta' doża waħda ta' livell ta' għall-inqas 2 000 mg/kg piż tal-ġisem meta jitwettaq trattament wieħed, jew bħala żewġ trattamenti fl-istess ġurnata, ma jipproduċix effetti tossiċi li wieħed jinduna bihom, u jekk ma tkunx mistennija l-ġenotossiċità fuq il-bażi ta' l-informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx li jkun neċessarju li jsir studju komplet bl-użu ta' tliet livelli ta' dożaġġ. Għal studji li jdumu aktar, il-limitu tad-doża huwa 2 000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum għal trattament sa 14-il ġurnata, u 1 000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum għal trattament ta' aktar minn 14-il ġurnata. L-espożizzjoni umana mistennija tista’ tindika l-ħtieġa ta' livell ogħla ta' doża li għandu jintuża fit-test tal-limitu.
            1.5.5.   Somministrazzjoni ta' dożi
            Normalment is-sustanza tat-test tiġi somministrata b'gavage billi jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni, jew bl-injezzjoni intraperitonali. Fejn ikunu ġustifikati, jistgħu jiġu aċċettati rotot oħra ta' espożizzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jiġi somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f'ħin wieħed jiddependi fuq il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux ikun aktar minn 2 ml/100g piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ogħla minn dawn għandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-każ ta' sustanzi li jirritaw jew korrożivi li normalment juru effetti aggravati b'konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbilità fil-volum tat-test għandha titnaqqas bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti fuq il-livelli kollha tad-doża.
            1.5.6.   Preparazzjoni tal-mudullun/demm
            Iċ-Ċelloli tal-mudullun ġeneralment jinkisbu mill-wirk jew mill-qasba tas-sieq minnufih wara s-sagrifiċċju. Komunement, iċ-ċelluli jitneħħew mill-wirk jew mit-qasba tas-sieq, preparati u mogħtija kulur permezz ta' metodi stabbiliti. Demm periferali jinkiseb mill-vina tad-denb jew arterja/vina oħra xierqa. Iċ-Ċelloli tad-demm huma minnufih mogħtija kulur supravitalment (8) (9) (10) jew isiru preparazzjonijiet biex jingħataw il-kulur. L-użu ta' kulur speċifiku ta' DNA (eż. oranġjo akridin (14) jew Hoechst 33258 plus pyronin-Y (15)) jista’ jelimina xi uħud mill-prodotti assoċjati ma' l-użu ta' kulur mhux speċifiku DNA. Dan il-vantaġġ ma jipprekludix l-użu ta' kuluri konvenzjonali (eż. Giemsa). Jistgħu jintużaw ukoll sistemi addizzjonali (eż. kolonni ta' ċelluloża biex jitneħħu Ċelloli nukleati (16)) iżda dawn is-sistemi intwerew li jaħdmu adegwatament għall-preparazzjoni ta' mikronukleji fil-laboratorju.
            1.5.7.   Analiżi
            Il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali (immaturi + maturi) tiġi stabbilita għal kull annimal billi jingħaddu għall-inqas 200 eritroċiti għall-mudullun u 1 000 eritroċiti għad-demm periferali (17). Id-dijapożitivi kollha, inklużi dawk ta' kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati indipendentement qabel l-analiżi mikroskopika. Jingħaddu għall-inqas 2 000 eritroċiti immaturi għall-inċidenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati. Tista’ tinkiseb iktar informazzjoni billi jingħaddu eritroċiti maturi għal mikronukleji. Meta jiġu analizzati d-dijapożitivi, il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali ma għandhiex tkun inqas minn 20 % tal-valur ta' kontroll. Meta l-annimali jiġu ttrattati kontinwament għal erba' ġimgħat jew aktar, jistgħu jingħaddu ukoll għall-inqas 2 000 eritroċiti maturi għal kull annimal għall-inċidenza ta' mikronukleji. Is-sistemi ta' analiżi awtomatizzata (analiżi ta' l-immaġini u analiżi tal-fluss ċitometriku ta' sospensjonijiet ta' Ċelloli) huma aċċettabbli bħala alternattivi għall-valutazzjoni manwali jekk ikunu ġustifikati u validati kif xieraq.
            2.   DATA
            2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
            L-informazzjoni dwar annimali individwali għandha tingħata f'forma ta' tabella. L-unità sperimentali hija l-annimal. Għal kull annimal li jiġi analizzat għandhom jiġu elenkati separatament in-numru ta' eritroċiti immaturi li jingħaddu, in-numru ta' eritroċiti immaturi mikronukleati, u n-numru ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali. Meta l-annimali jiġu ttrattati kontinwament għal erba' ġimgħat jew aktar, għandha tingħata wkoll l-informazzjoni dwar l-eritroċiti maturi jekk din tinġabar. Għal kull annimal tingħata l-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali u, jekk jitqies applikabbli, il-perċentwali ta' eritroċiti mikronukleati. Jekk ma hemmx xiehda ta' differenza fir-riżultat bejn iż-żewġ sessi, l-informazzjoni dwar iż-żewġ sessi tista’ tingħaqad għall-analiżi statistika.
            2.2.   EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
            Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit riżultat pożittiv, bħal ma hi żieda relatata mad-doża fl-għadd relattiv ta' Ċelloli mikronukleati jew żieda ċara fin-numru ta' Ċelloli mikronukleati fi grupp singolu ta' trattament fi żmien singolu ta' teħid ta' kampjuni. L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet (18) (19), jistgħu jintużaw metodi ta' statistika. L-importanza ta' l-istatistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal riżultat pożittiv. Riżultati ekwivoċi għandhom jiġu ċċarati b'testijiet ulterjuri preferibilment billi tintuża modifika tal-kundizzjonijiet ta' l-esperiment.
            Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma jilħqux il-kriterji fuq imsemmija titqies bħala mhux mutaġenika f'dan it-test.
            Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta'
            sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ekwivoċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ruħu l-esperiment. Ir-riżultati pożittivi minn test mikronukleu jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq mikronukleji li huma r-riżultat ta' ħsara fil-kromożomi jew ħsara lill-apparat mitotiku fl-eritroblasti ta' l-ispeċi ttestjata. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, taħt il-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx mikronukleji fl-eritroċiti immaturi ta' l-ispeċi ttestjata.
            Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test jew il-metaboliti tagħha jilħqu ċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew speċifikatament it-tessut immirat (eż. tossiċità sistemika).
            3.   RAPPORTAĠĠ
            3.1.   RAPPORT TAT-TEST
            Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
            
                         
                     
                     
                        Solvent/mezz:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.
                                 
                              
                  
                         
                     
                     
                        Annimali ttestjati:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    speċi/razza użati,
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    numru, età u sess ta' l-annimali;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    għejun, kundizzjonijiet dwar fejn jinżammu, dieta, eċċ.;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inkluża l-medda ta' piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard għal kull grupp.
                                 
                              
                  
                         
                     
                     
                        Kundizzjonijiet tat-test:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    kontrolli pożittivi u negattivi (mezz/solvent);
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    raġuni prinċipali għall-għażla ta' livell tad-doża;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    metodi biex jiġi verifikat li s-sustanza tat-test waslet għaċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew it-tessut immirat, jekk tkun applikabbli;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    konverżjoni mill-konċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test dieta/ilma għax-xorb għad doża attwali (mg/kg piż tal-ġisem/jum) jekk tkun applikabbli;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u teħid ta' kampjuni;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    metodi tal-preparazzjoni tad-dijapożitivi;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    metodi biex titqies it-tossiċità;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    kriterji għall-għadd ta' eritroċiti immaturi mikronukleati;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    numru ta' ċelluli analizzati kull annimal;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi.
                                 
                              
                  
                         
                     
                     
                        Riżultati:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    sinjali ta' tossiċità;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    numru ta' eritroċiti immaturi mikronukleati, mogħtija separatament għal kull annimal;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    devjazzjoni standard medja ± ta' eritroċiti immaturi mikronukleati għal kull grupp;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    analiżi statistiċi u metodi applikati;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    informazzjoni negattiva kurrenti u storika;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin pożittiv.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Diskussjoni dwar ir-riżultati.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Kunklużjonijiet.
                                 
                              
                  4.   REFERENZI
            
                     
                        (1)
                     
                     
                        Heddle, J. A. (1973), A Rapid In vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190.
                     
                  
                     
                        (2)
                     
                     
                        Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15.
                     
                  
                     
                        (3)
                     
                     
                        Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61-118.
                     
                  
                     
                        (4)
                     
                     
                        Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80.
                     
                  
                     
                        (5)
                     
                     
                        MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.
                     
                  
                     
                        (6)
                     
                     
                        MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C., Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112.
                     
                  
                     
                        (7)
                     
                     
                        MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522.
                     
                  
                     
                        (8)
                     
                     
                        Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245-249.
                     
                  
                     
                        (9)
                     
                     
                        The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98.
                     
                  
                     
                        (10)
                     
                     
                        The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 53-159.
                     
                  
                     
                        (11)
                     
                     
                        Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. (1994), in vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293-304.
                     
                  
                     
                        (12)
                     
                     
                        Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313-319.
                     
                  
                     
                        (13)
                     
                     
                        Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
                     
                  
                     
                        (14)
                     
                     
                        Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247.
                     
                  
                     
                        (15)
                     
                     
                        MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, pp. 269-275.
                     
                  
                     
                        (16)
                     
                     
                        Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104.
                     
                  
                     
                        (17)
                     
                     
                        Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97-99.
                     
                  
                     
                        (18)
                     
                     
                        Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part 1, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
                     
                  
                     
                        (19)
                     
                     
                        Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Staticical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.”
                     
                  
         B.13/14.   MUTAĠENIĊITÀ -TEST TA' MUTAZZJONI RIVERSIVA TA' BATTERJI
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 471, Test ta' Mutazzjoni Riversiva ta' Batterji (1997).
         1.1.   INTRODUZZJONI
         It-test ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji juża aċidu amino li jeħtieġ kundizzjonijiet ta' Salmonella typhimurium u Escherichia coli biex jiġu żvelati mutazzjonijiet f'punti, li jinvolvu sostituzzjoni, żjieda jew tħassir ta' par wieħed jew aktar ta' bażijiet DNA (1) (2) (3). Il-prinċipju tat-test ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji huwa li jiskopri mutazzjonijiet li jirrivertu mutazzjonijiet preżenti fil-kundizzjonijiet tat-test u jirrestitwixxu l-kapaċità funzjonali tal-batterja biex tissintesizza aċidu amino essenzali. Il-batterji li jiġu lura jiġu skoperti mill-kapaċità tagħhom li jikbru fl-assenza ta' l-aċidu amino meħtieġ mill-kundizzjonijiet tal-ġenitur tat-test.
         Mutazzjonijiet f'punti huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem u hemm xiehda sostanzjali li mutazzjonijiet f'punt f'onkoġeni u fil-ġeni ta' ċelluli somatiċi li jrażżnu t-tumuri huma involuti fil-formazzjoni ta' tumuri fil-bniedem u f'annimali ta' esperimenti. It-test ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji huwa rapidu, mhux għali u relattivament faċli biex jitwettaq. Ħafna mill-kundizzjonijiet tat-test għandhom diversi karatteristiċi li jagħmuluhom aktar sensittivi għall-iskoperta ta' mutazzjonijiet inklużi sekwenzi DNA responsivi fis-siti ta' reversjoni, permeabilità miżjuda ta' Ċelloli għal molekuli kbar u l-eliminazzjoni ta' sistemi ta' riparazzjoni ta' DNA jew titjib ta' proċessi ta' riparazzjoni ta' DNA li huma suxxettibbli għall-iżbalji. L-ispeċifiċità tal-kundizzjonijiet tat-test jistgħu jipprovdu informazzjoni utli dwar it-tipi ta' mutazzjonijiet li huma kkaużati mill-aġenti ġenotossiċi. Bażi ta' informazzjoni kbira ħafna ta' riżultati għal varjetà wiesgħa ta' strutturi hija disponibbli għal testijiet ta' mutazzjoni riversiva ta' batterji u ġew żviluppati metodoloġiji stabbiliti sew biex jittestjaw il-kimiċi b'karatteristiċi diversi fiżiko kimiċi, inklużi komposti li jiżvintaw.
         Ara wkoll l-Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Test ta' mutazzjoni riversiva jew fi Salmonella typhimurium jew f'Escherichia coli jiżvela mutazzjoni f'amino aċidu li jeħtieġ karatteristika (histidine jew tryptophan, rispettivament) biex jipproduċi karatteristika indipendenti minn fornitura minn barra ta' aċidu amino.
         
            Mutaġeni li jġibu s-sostituzzjoni ta' koppji ta' bażijiet huma aġenti li jikkawżaw bidla fil-bażi tad-DNA. F'test reversiv din il-bidla tista’ tirrikorri fil-lok tal-mutazzjoni oriġinali, jew f'xi tieni lok fil-genome batteriku.
         
            Mutaġeni li jġibu l-mutazzjoni tal-fażi tal-qari huma aġenti li jikkawżaw iż-żieda jew ittħassir ta' pari ta' bażi waħda jew aktar fid-DNA, u b'hekk jibdlu l-fażi tal-qari tar-RNA.
         1.3.   KONSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU
         It-test tal-mutazzjoni batterika reversiva jutilizza Ċelloli prokarijotiċi, li huma differenti minn Ċelloli tal-mammiferi fil-karatteristiċi bħal ma huma l-assorbiment, il-metaboliżmu, l-istruttura tal-kromożomi u l-proċessi ta' riparazzjoni tad-DNA. It-testijiet li jitwettqu in vitro ġeneralment jeħtieġu l-użu ta' għejun esoġenu għall-attivazzjoni metabolika. Sistemi ta' attivazzjoni metabolika in vitro ma jistgħux jissimulaw kompletament il-kundizzjonijiet in vivo fil-mammiferi. Għalhekk it-test ma jagħtix informazzjoni diretta fuq il-qawwa mutaġenika u karċinoġenika ta' sustanza fil-mammiferi.
         It-test tal-mutazzjoni riversiva batterika normalment jintuża bħala l-ewwel pass għall-attività ġenolossika u, b'mod partikolari, għall-attività li toħloq mutazzjoni puntiformi. Informazzjoni estensiva wriet li ħafna kimiċi li huma posittivi f'dan it-test juru wkoll attività mutaġenika f'testijiet oħra. Hemm eżempji ta' aġenti mutaġeniċi li ma jiġux żvelati b'dan it-test; ir-raġunijiet għal dawn in-nuqqasijiet jistgħu jkunu attribwiti għan-natura speċifika tal-punt ta' laħħar żvelat, differenzi fl-attivazzjoni metabolika, jew differenzi fil-bijodisponibbilità. Minnaħa l-oħra, l-fatturi li jsaħħu s-sensitività tat-test tal-mutazzjoni riversiva batterika jistgħu jwasslu għal sopravalutazzjoni ta' l-attivita mutaġenika.
         It-test tal-mutazzjoni riversiva batterika jista’ ma jkunx xieraq għall-valutazzjoni ta' ċerti klassijiet ta' kimiċi, per eżempju komposti b'qawwa kbira batteriċida (eż. ċerti antibijotiċi) li dawk li huma maħsuba (jew huma magħrufa) li jiddisturbaw speċifikatament is-sitema ta' replika ta' Ċelloli fil-mammiferi (eż. inibituri tat-topojsomerasi u ċerti analogi nukleosidi). F'dawn il-każijiet jistgħu jkunu aktar xierqa testijiet fuq mutazzjoni fil-mammiferi.
         Minkejja li ħafna mill-komposti li huma posittivi f'dan it-test huna karċinoġeni tal-mammiferi, il-korrelazzjoni mhijiex assoluta. Tiddependi fuq il-klassi tal-kimika u hemm karċinoġeni li ma jiġux żvelati b'dan it-test għax jaġixxu permezz ta' mekkaniżmi oħra li mhumiex ġenotossiċi jew mekkaniżmi li ma jeżistux f'ċelluli batteriċi.
         1.4.   PRINĊIPJI TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sospensjonijiet taċ-Ċelloli batteriċi jiġu esposti għas-sustanza tat-test fil-presenza u fl-assenza ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika esoġenea. Fil-metodu ta' inkorporazzjonmi fuq bażi, dawn is-sospensjonijiet jitħalltu ma' agar ta' kopertura u jitqiegħdu fuq il-bażi minnufih fuq medjum minimu. Fil-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni, it-taħlita tat-trattament tiġi inkubata u imbagħad imħallta ma' agar ta' kopertura qabel titqiegħed fuq bażi fuq medjum minimu. Għaż-żewġ metodi ta' teknika, wara jumejn ta' inkubazzjoni jew tlieta, jingħaddu l-kolonji revertanti u jiġu mqabbla man-numru ta' kolonji revertanti spontanji fuq il-bażijiet ta' kontroll tas-solvent.
         Ġew deskritti ħafna proċeduri għat-twettiq tat-test tal-mutazzjoni riversiva batterika. Fost dawk li ġeneralment jintużaw hemm il-metodu ta' inkorporazzjoni fuq bażi (1) (2) (3) (4), il-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni (2) (3) (5) (6) (7) (8), il-metodu ta' fluttwazzjoni (9) (10), u l-metodu tas-sospensjoni (11). Ġew deskritti modifiki għall-ittestjar ta' gassijiet jew fwar (12).
         Il-proċeduri deskritti fil-metodu jappartjenu primarjament għall-metodi ta' l-inkorporazzjoni fuq bażi u ta' qabel l-inkubazzjoni. Kull wieħed minnhom huwa aċċettabbli biex isiru esperimenti kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. Ċerti sustanzi jistgħu jiġu żvelati b'mod aktar effiċjenti meta jintuża l-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni. Dawn is-sustanzi jappartjenu għal klassijiet kimiċi li jinkludu nitrosamini alifatiċi short chain, metalli divalenti, aldejidi, komposti ta' koloranti ażo u dijażo, alkalojdi pirolliżidini, komposti allil u nitro komposti (3). Hu rikonoxxut ukoll li ċerti klassijiet ta' mutaġeni mhux dejjem jiġu żvelati meta jintużaw proċeduri standard bħal ma huma l-metodu ta' inkorporazzjoni fuq bażi u l-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni. Dawn għandhom jitqiesu bħala “każijiet speċjali” hu huwa bil-qawwa rakkomandat li jintużaw proċeduri alternattivi biex jiġu żvelati. Il-“każijiet speċjali” li ġejjin jistgħu jiġu identifikati (flimkien ma' eżempji ta' proċeduri li jistgħu jintuiżaw biex jiġu żvelati): komposti ta' koloranti ażo u dijażo (3) (5) (6) (13), kimiċI ta' gasssijiet u fwar (12) (14) (15) (16) u glikosidi (17) (18). Kull devjazzjoni mill-proċedura standard teħtieġ li tkun ġustifikata xjentifikament.
         1.5.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.5.1.   Preparazzjonijiet
         1.5.1.1.   Batterja
         Kulturi friski ta' batterja għandhom jitħallew jiżviluppaw sal-fażi esponenzali tardiva jew il-fażi bikrija stazzjonarja ta' l-Iżvilupp (madwar 109 Ċelloli kull ml). Ma għandhomx jintużaw kulturi fil-fażi stazzjonarja tardiva. Huwa essenzali li l-kulturi li jintużaw fl-esperiment ikun fihom titolu għoli ta' batterja vijabbli. It-titolu jista’ jintwera jew mill-informazzjoni storika ta' kontroll fuq il-fażijiet ta' żvilupp, jew minn kull analiżi permezz tad-determinazzjoni ta' l-għadd ta' Ċelloli vijabbli bl-esperiment tal-bażi.
         It-temperatuta rakkomandata għall-inkubazzjoni hi ta' 37 oĊ.
         Għandhom jintużaw għallinqas ħames karatteristiċi ta' batterji. Dawn għandhom jinkludu erba' karatteristiċi ta' S. typhimurium (TA 1535; TA 1537 jew TA97a jew TA97; TA98; u TA100) li ġew pruvati li huma ta' min wieħed jorbot fuqhom u responsivi għar-riproduzzjoni bejn laboratorji. Dawn l-erba' karatteristiċi S. typhimurium għandhom pari bażiċi GC fuq il-lok ta' reversjoni primarja u huwa magħruf li jistgħu ma jiżvelawx ċerti mutaġeni ossidanti, aġenti li jipprovokaw il-cross-linking u idrażini. Dawn is-sustanzi jistgħu jiġu żvelati bil-karatteristiċi ta' E. coli WP2 jew S. typhimurium TA102 (19) li jkollhom par ta' bażi AT fil-lok primarju ta' reversjoni. Għalhekk it-tagħqid rakkomandat ta' karatteristiċi huwa:
         
                     —
                  
                  
                     
                        S. typhimurium TA1535, u
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        S. typhimurium TA1537 jew TA97 jew TA97a, u
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        S. typhimurium TA98, u
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        S. typhimurium TA100, u
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        E. coli WP2 uvrA, jew E. coli WP2 uvrA (pKM101), jew S. typhimurium TA102.
                  
               Biex jiġu żvelati mutaġeni cross-linking jista’ jkun preferibbli li wieħed jinkludi TA102 jew li tiżdied karatteristika ta' riparazzjoni tad-DNA ta' E. coli (eż. E. coli WP2 jew E. coli WP2 (pKM101)).
         Għandhom jintużaw proċeduri stabbiliti għall-preparazzjoni ta' kulturi primarji, verifika ta' l-immarkar u l-ħażna. Għandha tintwera l-ħtieġa ta' l-amino aċidu għall-Iżvilupp għal kull kultura primarja ffriżata (istidina għal karatteristiċi ta' S. typhimurium, u triptofan għal karatteristiċi ta' E. coli). Karatteristiċi oħra fenotipiċi għandhom jiġu verifikati bl-istess mod, jiġfieri: il-presenza jew l-assenza ta' plasmidi tal-fattur R fejn ikun xieraq (jiġifieri r-resistenza għall-ampiċillina fil-karatteristiċi ta' TA98, TA100, u TA97a jew TA97, WP2 uvrA u WP2 uvrA (pKM101), u resistenza għall-ampiċillina + tetraċiklina fil-karatteristika TA 102); il-presenza ta' mutazzjonijiet karatteristiċi (jiġifieri mutazzjoni rfa mutation fi S. typhimurium permezz ta' senmsitività għal kristalvjola, u mutazzjoni uvrA fi E. coli jew mutazzjoni uvrB mutation fi S. typhimurium, permezz ta' sensitività għal dawl ultravjola) (2) (3). Il-karatteristiċi għandhom ukoll jipproduċu numru ta' bażijiet ta' kolonji revertanti spontanji fi ħdan il-meddiet ta' frekwenza mistennija mill-informazzjoni storika ta' kontroll tal-laboratorji u preferibbilment fil-medda msemmija fil-letteratura.
         1.5.1.2.   Medjum
         Jintuża agar minimu xieraq (eż. li jkun fih medjum E minimu ta' Vogel-Bonner u glukożju), u agar ta' kopertura li jkun fih istidina u bijotin jew triptofan biex jippermetti ftit diviżjonijiet ta' Ċelloli (1) (2) (9).
         1.5.1.3.   Attivazzjoni metabolika
         Il-batterja għandha tiġi esposta għas-sustanza tat-test kemm fil-presenza kif ukoll fl-assenza ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika xierqa. Is-sistema li normalment l-aktar tintuża hija frazzjoni post mitokondrijali integrata ta' kofattur (S9) ippreparata mill-fwied ta' annimali gerriema trattata b'aġenti li jipprokuraw l-enżimi bħal ma huma l-Aroclor 1254 (1) (2) jew komposizzjoni ta' phenobarbitone u β-naphthoflavone (18) (20) (21). Il-frazzjoni post mitokondrijali normalment tintuża f'konċentrazzjonijiet fil-medda minn 5 sa 30 % v/v fit-taħlita S9. L-għażla u l-kundizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika tista’ tiddependi fuq il-klassi tal-kimika li tintuża. F'ċerti każijiet, jista’ jkun xieraq li jintużaw aktar minn konċentrazzjoni waħda ta' frazzjon post mitokondrijali. Għal komposti ta' koloranti ażo u dijażo, jista’ jkun aktar xieraq li tintuża sistema ta' attivazzjoni metabolika (6) (13).
         1.5.1.4.   Sustanza/preparazzjoni tat-test
         Sustanzi solidi tat-test għandhom jiddewbu jew jiġu sospiżi f'solventi jew mezzi xierqa u dilwiti kif ikun xieraq qabel ma tiġi ttrattata l-batterja. Sustanzi likwidi tat-test jistgħu jiżdiedu direttament mas-sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda sakemm l-informazzjoni ta' l-istabbilità ma turix li jistgħu jinħażnu.
         Ma għandhux jkun hemm suspett ta' reazzjoni kimika tas-solvent/mezz mas-sustanza tat-test u dan is-solvent/mezz għandu jkun kompatibbli mas-sopravvivenza tal-batterja u ma' l-attività S9 (22). Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompattibilità tagħhom. Huwa rakkomandat li kull fejn ikun possibbli għandu l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akkwuż. Meta jiġu ttestjati sustanzi li mhumiex stabbli fl-ilma, is-solventi organiċi li jintużaw ma għandux ikollhom ilma.
         1.5.2.   Kundizzjonijiet tat-test
         1.5.2.1.   Karatteristiċi tat-test (Ara 1.5.1.1)
         1.5.2.2.   Konċentrazzjoni ta' l-espożizzjoni
         Fost il-kriterji li għandhom jitqiesu meta jiġi determinat l-ogħla ammont tas-sustanza tat-test li għandha tintuża hemm il-ċitotossiċità u s-solubbilità fit-taħlita ta' trattament finali.
         Jista’ jkun utli li jiġu stabbiliti t-tossiċità u l-insolubbilità f'esperiment preliminari. Iċ-ċitossiċità tista’ tiġi żvelata b'riduzzjoni fl-għadd ta' konolonji revertanti, bid-dehra ta' żvilupp a normali tal-fond, jew bil-grad ta' sopravivenza tal-kulturi ttratati. Iċ-ċitossiċità ta' sustanza tista’ tinbidel fil-preżenza ta' sistemi ta' attivazzjoni metabolika. L-insolubbilità għandha tiġi stmata bħala preċipitazzjoni fit-taħlita finali taħt il-kundizzjonijiet attwali tat-test u tkun evidenti għall-għajn mingħajr għanjuna.
         Il-konċentrazzjoni massima rakkomandata għat-test għal sustanzi solubbli li mhumiex ċitotossiċi hija 5mg/bażi jew 5μl/bażi. Għal sustanzi li mhumiex ċitotossiċi u li ma jinħallux fuq 5mg/bażi jew 5 μl/bażi u waħda mill-konċentrazzjonijiet ittestjati jew aktar għandha tkun mhux solubbli fit-taħlita finali tat-trattament. Sustanzi tat-test li huma diġà ċitotossiċi taħt il-5mg/bażi jew 5 μl/bażi għandhom jiġu ttestjati sa konċentrazzjoni ċitotossika. Dak li jippreċipita ma għandux jiddisturba l-għadd.
         Għandhom jintużaw għallinqas ħames konċentrazzjonijiet differenti analizzabbli tas-sustanza tat-test b'madwar intervalli ta' semi logarittmi (jiġifieri √10) bejn punti tat-test għal esperiment inizjali. Jistgħu ikunu xierqa intervalli iqsar meta jkun qed jiġi investigat rispons ta' konċentrazzjoni. Testjar għola mill-ċonċentrazzjoni ta' 5mg/bażi jew 5 μl/bażi jista’ jiġi kkunsidrat meta ssir il-valutazzjoni ta' sustanzi li jkollhom ammonti sostanzjali ta' impuritajiet potenzalment mutaġeniċi.
         1.5.2.3.   Kontrolli negattivi u pożittivi
         Kontrolli (solvent jew mezz) pożittivi u negattivi konkurrenti speċifiċi għall-kwalitajiet, kemm b'attivazzjoni metabolika jew mingħajr, għandhom jiġu inklużi f'kull eżami. Għandhom jintgħażlu konċentrazzjonijiet ta' kontrolli pożittivi li juru l-prestazzjoni effettiva ta' kull eżami.
         Għal eżamijiet li jagħmlu użu minn sistema ta' attivazzjoni metabolika, is-sustanza (i) ta' referenza ta' kontoll pożittiv għandha(hom) tingħażel fuq bażi tat-tip tal-kwalitajiet ta' batterja użati.
         Is-sustanzi li ġejjin huma eżemmpji ta' kontrolli pożittivi xierqa għal eżamijiet ta' attivazzjoni metabolika:
         
                     Nri CA
                  
                  
                     NRI EINECS
                  
                  
                     Ismijiet
                  
               
                     781-43-1
                  
                  
                     212-308-4
                  
                  
                     9,10- Dimetil-antraċena
                  
               
                     57-97-6
                  
                  
                     200-359-5
                  
                  
                     7,12- Dimetilbenż(a)antraċena
                  
               
                     50-32-8
                  
                  
                     200-028-5
                  
                  
                     Benzo(a)pirena
                  
               
                     613-13-8
                  
                  
                     210-330-9
                  
                  
                     2-Amino-antraċena
                  
               
                     50-18-0
                  
                  
                      
                  
                  
                     Ċiklofosfamida
                  
               
                     6055-19-2
                  
                  
                     200-015-4
                  
                  
                     Monoidrat taċ-ċiklofosfamida
                  
               Is-sustanza li ġejja hija kontroll pożittiv xieraq għall-metodu ta' attivazzjoni metabolika riduttiva:
         
                     Nri CA
                  
                  
                     NRI EINECS
                  
                  
                     Ismijiet
                  
               
                     573-58-0
                  
                  
                     209-358-4
                  
                  
                     Congo Red
                  
               It-2-Aminoantraċena ma għandhiex tintuża bħala l-uniku indikatur ta' l-effikaċja tat-taħlita S9. Jekk tintuża t-2-aminoantraċena, kull lott ta' S9 għandu jkun karatteriżat b'mutaġen li jeħtieġ l-attivazzjoni metabolika b'enżimi mikrosomali, eż. benzo(a)pirena, dimetilbenzantraċena.
         Is-sustanzi li ġejjin huma eżempji ta' kontrolli pożittivi skond karatteristiċi speċifiċi għal eżamijiet imwettqa mingħajr is-sistema ta' attivazzjoni metabolika essoġena:
         
                     NRI CAS
                  
                  
                     NRI EINECS
                  
                  
                     ISMIJIET
                  
                  
                     Strain
                  
               
                     26628-22-8
                  
                  
                     247-852-1
                  
                  
                     Ażidu tas-sodju
                  
                  
                     TA 1535 u TA 100
                  
               
                     607-57-8
                  
                  
                     210-138-5
                  
                  
                     2 Mikro-fluworena
                  
                  
                     TA 98
                  
               
                     90-45-9
                  
                  
                     201-995-6
                  
                  
                     9 Amino-akridina
                  
                  
                     TA 1537, TA 97 u TA 97a
                  
               
                     17070-45-0
                  
                  
                     241-129-4
                  
                  
                     ICR 191
                  
                  
                     TA 1537, TA 97 u TA 97a
                  
               
                     80-15-9
                  
                  
                     201-254-7
                  
                  
                     Iperossidu tal-Kumena
                  
                  
                     TA 102
                  
               
                     50-07-7
                  
                  
                     200-008-6
                  
                  
                     Mitomycin C
                  
                  
                     WP2 uvrA u TA102
                  
               
                     70-25-7
                  
                  
                     200-730-1
                  
                  
                     N-etil-N-nitro-3-nitro-N-nitrosogwanidina
                  
                  
                     WP2, WP2uvrA u WP2uvrA (pK M101)
                  
               
                     56-57-5
                  
                  
                     200-281-1
                  
                  
                     4-Nitrokwinolina-1-ossidu
                  
                  
                     WP2, WP2uvrA u WP2uvrA(pK M101)
                  
               
                     3688-53-7
                  
                  
                      
                  
                  
                     Furilfuramida (AF2)
                  
                  
                     Karatteristiċi li fihom il-plasmid
                  
               Jistgħu jintużaw sustanzi ta' referenza ta' kontroll pożittiv xierqa oħra. Għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittiv li huma relatati ma' klassijiet ta' kimiċi, meta dan ikun possibbli.
         Għandhom jiġu inklużi kontrolli negattivi, li jikkonsistu biss f'solvent jew mezz, mingħajr sustanza tat-test, u mod ieħor ittrattati bl-istess mod bħal gruppi ta' trattament. B'żieda ma dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakamm ma jkunx hemm informazzjoni storika ta' kontroll li turi li s-solvent magħżul ma jġibx effetti ta' ħsara jew mutaġeniċi.
         1.5.3.   Proċedura
         Għall-metodu ta' inkorporazzjoni fuq bażi (1) (2) (3) (4), mingħajr l-attivazzjoni metabolika, normalment 0,05 jew 0,1 ml tas-soluzzjonijiet tat-test, 0,1 ml ta' kulturi friski ta' batterja (li jkun fihom madwar 108 ċelloli vijabbli u 0,5 ml ta' tarka sterili jitħalltu ma' 2,0 ml ta' agar ta' kopertura. Għall-eżami bl-attivazzjoni metabolika, normalment 0,5 ml tat-taħlita ta' l-attivazzjoni metabolika li jkun fiha ammont adegwat ta' frazzjoni post mitokondrijali (fil-medda ta' 5 sa 30 % v/v fit-taħlita ta' l-attivazzjoni metabolika) jitħalltu ma' agar ta' kopertura (2,0 ml) flimkien mal-batterja u mas-sustanza tat-test/soluzzjoni tat-test. Il-kontenut ta' kull tubu jiġi mħallat u jitferra fuq superfiċi ta' bażi b'agar minimu. L-agar ta' kopertura jitħalla jsir solidu qabel l-inkubazzjoni.
         Għall-metodu ta' qabel l-inkubazzjoni (2) (3) (5) (6), is-sutanza tat-test/soluzzjoni tat-test tiġi inkubata minn qabel mal-karatteristika tat-test (li jkun fiha madwar 108 Ċelloli vijabbli u t-tarka sterili jew is-sistema ta' attivazzjoni metabolika, 0,5ml) ġeneralment għal 20 minuta jew aktar f'temperatura ta' 30- 37Ċ qabel ma titħallat ma' l-agar ta' kopertura u titferra fuq superfiċi ta' bażi ta' agar minimu. Ġeneralment 0,05 jew 0,1 ml tas-sustanza tat-test/soluzzjoni tat-test, 0,1 ml ta' batterja u 0,5ml ta' taħlita S9 jew tarka sterili jitħalltu ma' 2,0 ml ta' agar ta' kopertura. It-tubi għandhom jitħallew li tidħol l-arja fihom fl-istadju ta' qabel l-inkubazzjoni billi jintuża aġitatur.
         Biex issir stima xierqa tal-varjazzjoni, għandhom jintużaw tarki ittriplikati għal kull livell ta' doża. L-użu ta' tarka duplikata hija aċċettabbli meta xjentement ġustifikata. It-telfa ta' kull tant ta' bażi ma tinvalidax it-test neċessarjament.
         Sustanzi gassużi jew volatili għandhom jiġu ttestjati b'metodi xierqa, bħalma huma mezzi magħluqa (12) (14) (15) (16).
         1.5.4.   Inkubazzjoni
         Il-bażijiet kollha f'eżami partikolari għandhom jiġu inkubati ta' 37 oC għal 48-72 siegħa. Wara l-perjodu ta' inkubazzjoni, għandu jingħadd in-numru ta' kolonji revertanti kull bażi.
         2.   DATA
         2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         Informazzjoni għandha tiġi preżentata bħala numru ta' kolonji revertanti kull bażi. Għandu jingħata wkoll in-numru ta' kolonji revertanti kemm dwar bażijiet ta' kontroll negattivi (kontroll tas-solvent, u kontroll mhux trattat, jekk ikun ġie użat) kif ukoll bażijiet ta' kontroll pożittivi. L-għadd ta' bażijiet individwali, in-numru medju ta' kolonji revertanti kull bażi u d-devjazzjoni standard għandhom jiġu preżentati għas-sustanza tat-test u għall-kontrolli pożittivi u negattivi (mhux trattati u/jew tas-solvent).
         Ma hemmx ħtieġa ta' verifika għal rispons pożittiv ċar. Riżultati ambigwi għandhom jiġu ċċarati b'permezz ta' aktar testijiet preferibbilment billi jkun hemm modifika fil-kundizzjonijiet ta' l-esperiment. Riżultati negattivi għandhom jiġu konfermati fuq il-bażi ta' każ b'każ. F'dawk il-każijiet fejn il-konferma ta' riżultati negattivi mhiex ikkunsidrata bħala negattiva, trid tingħata ġustifikazzjoni. Modifikazzjonijiet ta' parametri ta' studju sabiex tiġi estiża l-medda tal-kundizzjonijiet stmati għandha tiġi kkonsidrata f'esperimenti ta' wara. Parametri ta' studju li jisgħu jiġu modifikati jinkludu l-ispazjar tal-konċentrazzjoni, il-metodu ta' trattament (inkorporazzjoni mal-bażi jew qabel l-inkubazzjoni fil-likwidu), u kundizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika.
         2.2.   VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TA' RIŻULTATI
         Hemm diversi kriterji sabiex jiġi determinat riżultat pożittiv, bħal żieda ta' relata mal-konċentrazzjoni matul il-medda ttestjata u/jew żieda riproduċibbli f'konċentrazzjoni waħda jew aktar fin-numru ta' kolonji revertanti kull bażi f'mill-inqas karatteristika waħda b'sistema ta' attivazzjoni metabolika jew mingħajrha (23). Għandha tiġi kunsidrata l-ewwel ir-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Jistgħu jintużaw metodi ta' statistika bħala għanjuna għal valutazzjoni tar-riżultati tat-test (24). Madankollu, is-sinjifikanza statistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal rispons pożittiv.
         Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma josservawx il-kriterji fuq imsemmija hija kkunsidrata bħala mhux mutaġenika f'dan it-test.
         Minkejja li ħafna esperimenti jagħtu riżultati ċari, pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni mogħtija ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività tas-sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ambigwi jew dubbjużi rrispettivament min-numru ta' drabi li jiġi ripetut l-esperiment.
         Riżultati pożittivi mit-test ta' mutazzjoni reversibbli batterika jindikaw li s-sustanza tiġġenera mutazzjonijiet mal-punt permezz ta' sostituzzjonijiet fuq il-bażi jew tibdiliet fil-parametri tal-ġenomu ta' jew Salmonella typhimurium u/jew Escherichia coli. Riżultati negattivi jindikaw li taħt il-kundizzjonijiet tat-test is-sustanza tat-test mhix mutaġenika fl-ispeċi ttestjati.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Solvent/mezz:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent/mezz;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Karatteristiċi:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Karatteristiċi użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru ta' ċelluli kull kultura;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji tal-karatteristiċi.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kundizzjonijiet tat-Test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ammont tas-sustanza tat-test kull bażi (mg/bażi jew μl/bażi) flimkien mar-raġuni bażija għall-għażla tad-doża u n-numru ta' bażijiet kull konċentrazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 medja użata;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tip u komposizzjoni ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika, inklużi l-kriterji ta' aċċettazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 proċeduri tat-trattament.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 sinjali ta' tossiċità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 sinjali ta' preċipitazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 għadd ta' bażijiet individwali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru medju ta' kolonji rivertanti kull bażi u devjazzjoni standard;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ir-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, fl-istess ħin, bil-meded, mezzi, u devjazzjonjiet standard;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, storiċi, bil-meded, mezzi, u devjazzjonjiet standard.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni tar-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Konklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69-240.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, pp. 91-96.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273-285.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, pp. 167-177.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, pp. 33-42.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453-465.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335-344.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33-47.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2-141.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421-441.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780-3782.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285-291.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343-350.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83-91.
                  
               
                  
                     (24)
                  
                  
                     Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, pp. 28-65.
                  
               B.15.   IT-TIBDIL TAL-ĠENE – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
         
         1.   IL-METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   TIFSIRA
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.3   SUSTANZI GĦAR-REFERENZA
         Xejn.
         1.4   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU GĦAT-TEST
         Hemm varjetà ta’ razez ta’ l-aplojde u tad-diplojde tal-ħmira Saccharomyces cerevisiae li jistgħu jintużaw biex tkun ikkalkulata il-produzzjoni ta’ tibdil tal-ġene li huwa kkaġunat minn aġenti kimiċi bl-attivazzjoni metabolika u mingħajr dik l-attivazzjoni.
         Kienu użati sistemi ta’ tibdil ‘il-quddiem f’razez ta’ l-aplojde, bħall-kalkolu tat-tibdil minn mutanti (ade-1, ade-2) ħomor li jeħtieġu l-adenina, għal mutanti bojod doppji li jeħtieġu l-adenina u sistemi selettivi bħall-ikkaġunar ta’ reżistenza għall-canavnaine u għaċ-ċiklohessimida.
         Is-sistema ta’ tibdil b’lura li hija validata bil-mod l-iktar estensiv tinvolvi l-użu tar-razza ta’ l-aplojde XV 185-14C li ġġorr il-bidliet nonsense ta’ l-okra ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 u trp 5-48, li jistgħu jinqalbu lura b’mutaġeni li jissostitwixxu l-bażi u li jikkaġunaw tibdil speċifiku għas-sit jew tibdil li jrażżnu l-okra. XV 185-14C iġorr ukoll is-sinjal his 1-7, li huwa bidla missense li tista’ tinqaleb lura prinċipalment b’tibdil tat-tieni sit, u s-sinjal hom 3-10 li jista’ jinqaleb lura permezz ta’ mutaġeni frameshift..
         F’razez diplojdiċI ta’ l-S. cerevisiae l-unika razza li tintuża b’mod estensiv hija D7 li hija omozigota għal ilv 1-92.
         1.5.   KRITERJI GĦALL-KWALITÀ
         Xejn.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         Preparazzjonijiet
         Is-soluzzjonijiet tal-kimiċi tat-test u l-kontroll għandhom ikunu ppreparati eżatt qabel l-ittestjar, bl-użu ta’ vettura xierqa. Fil-każ ta’ komposti organiċi li ma jinħallux fl-ilma, m’għandhiex tintuża iktar minn taħlita ta’ 2 % v/v ta’ solventi organiċi bħall-etanol, l-aċetun jew id-dimetilsulfossidu (DMSO). Il-konċentrazzjoni finali tal-vettura m’għandhiex taffettwa b’mod sinifikanti il-vijabilità taċ-ċelluli u l-karatteristiċi tat-tkabbir.
         
            L-attivazzjoni metabolika
         
         Iċ-ċelluli għandhom ikunu esposti għall-kimiċi tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema ta’ l-attivazzjoni metabolika esoġena xierqa. Is-sistema li tintuża l-iktar spiss hija frazzjoni post-mitokondrijali supplimentata minn ko-fattur mill-fwied ta’ mammali gerriema trattati minn qabel b’aġenti li jikkaġunaw l-enzimi.
         L-użu ta’ speċi, tessuti, frazzjonijiet post-mitokondrijali, jew proċeduri oħrajn jistgħu ukoll ikunu xierqa għall-attivazzjoni metabolika.
         Kundizzjonijiet għat-test
         
            Razez użati għat-test
         
         Ir-razza aplojdika XV 185-14C u r-razza diplojdika D7 huma dawk li jintużaw l-iktar fl-istudji dwar it-tibdil fil-ġeni. Razez oħrajn jistgħu ikunu xierqa ukoll.
         
            Mezzi
         
         Mezzi xierqa tal-kultura huma użati għad-determinazzjoni tan-numri tas-sopravivenza u tat-tibdil.
         
            L-użu ta’ kontrolli pożittivi u negattivi
         
         Kontrolli tas-solventi, posittivi, li m’humiex trattati għandhom isiru fl-istess ħin. Kimiċi xierqa għall-kontroll posittiv għandhom jintużaw għal kull tarf speċifiku ta’ tibdil.
         
            Il-konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni
         
         Għall-inqas ħames konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test mqassmin b’mod adegwat għandhom jintużaw. Għal sustanzi tossiċi, l-ogħla konċentrazzjoni ttestjata m’għandhiex tnaqqas is-sopravivenza għal inqas minn 5 % sa 10 %. Sustanzi li relattivament ma jinħallux fl-ilma għandhom ikunu ttestjati sal-limitu tas-solubilità tagħhom, bl-użu ta’ proċeduri xierqa. Għal sustanzi li jinħallu b’mod faċli fl-ilma u li m’humiex tossiċi, l-ogħla konċentrazzjoni għandha tkun determinata skond il-każ.
         
            Kundizzjonijiet għall-inkubazzjoni
         
         Il-platti huma inkubati għal erba’ sa sebat ijiem f’28 sa 30 oC fid-dlam.
         
            Frekwenzi ta’ tibil spontanju
         
         Għandhom jintużaw sub-kulturi b’frekwenzi ta’ tibdil spontanju ġewwa l-medda normali aċċettata.
         
            Numru ta’ repliki
         
         Għandhom jintużaw għall-inqas tliet repliki tal-platti għal kull konċentrazzjoni għall-analiżi tal-prototrophs li jinħalqu bit-tibdil tal-ġeni u għall-vijabilità taċ-ċelluli. Fil-każ ta’ esperimenti li jużaw sinjali bħal hom 3-10 b’rata baxxa ta’ tibdil, in-numru ta’ platti li jintużaw għandu jkun ikbar biex tinkiseb data rilevanti fis-sens statistiku.
         Il-Proċedura
         It-trattament tar-razez S. cerevisiae isir normalment bil-proċedura ta’ test likwidu li jinvolvi Ċelloli wieqfin jew li qed jikbru. Esperimenti inizjali għandhom isiru fuq Ċelloli li qed jikbru: 1-5 x 10 Ċelloli/ml huma esposti għall-kimika tat-test għal perjodu ta’ ħin sa 18-il siegħa f’temperatura ta’ 28-37 oC biċ-ċaqliq; ammont adegwat tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika huwa miżjud waqt it-trattament meta xieraq. Fl-aħħar tat-trattament, iċ-Ċelloli huma ċentrifugati, maħsulin u miżrugħin f’mezz ta’ kultura xieraq. Wara l-inkubazzjoni, il-platti jiġu eżaminati għas-sopravivenza u għall-ikkaġunar tat-tibdil tal-ġeni. Jekk l-ewwel esperiment ikun negattiv, għandu jsir esperiment ieħor bl-użu ta’ Ċelloli fil-fażi wieqfa. Jekk l-ewwel esperiment huwa pożittiv irid ikun ikkonfermat f’esperiment indipendenti xieraq.
         2.   ID-DATA
         Id-data għandha tkun ippreżentata fil-forma ta’ tabelli li jindikaw in-numru ta’ kolonji mgħadda, in-numru ta’ mutanti, is-sopravivenza u l-frekwenza tal-mutanti. Ir-riżultati kollha għandhom ikunu kkonfermati f’esperiment indipendenti. Id-data għandha tkun evalwata bl-użu ta’ metodi statistiċi xierqa.
         3.   IR-RAPPURTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandhu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni il ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     ir-razza użata;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kundizzjonijiet tat-test: Ċelloli f’fażi wieqfa jew Ċelloli li qed jikbru, komposizzjoniiet tal-mezzi, it-temperatura u t-tul ta’ l-inkubazzjoni, is-sistema għall-attivazzjoni metabolika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kundizzjonijiet tat-trattament: il-livelli ta’ l-espożizzjoni, il-proċedura u t-tul tat-trattament, it-temperatura tat-trattament, kontrolli pożittivi u negattivi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     in-numru ta’ kolonji mgħadda, in-numru ta’ mutanti, is-sopravivenza u l-frekenza tal-mutanti, ir-relazzjoni doża/risposta fejn tapplika, il-valutazzjoni statistika ta-data;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzjoni Ġenerali Parti B.
         B.16.   IR-RIKOMBINAZZJONI MITOTIKA- SACCHAROMYCES CEREVISIAE
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   TIFSIRA
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.3.   SUSTANZI TAR-REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Ir-rikombinazzjoni mitotika fis-Saccharomyces cerevisiae tistà tkun osservata bejn il-ġeni (jew b’mod iktar ġenerali bejn ġene u ċ-ċentromeru tagħha) u ġewwa l-ġeni. L-ewwel każ jissejjaħ il-qsim mitotiku u jiġġenera prodotti reċiproki filwat li t-tieni każ iktar spiss ma jkunx reċiproku u jissejjaħ il-konversjoni tal-ġeni. Il-qsim huwa ġeneralment analizzat permezz tal-produzzjoni ta’ kolonji jew setturi omozigoti reċessivi prodotti f’razza eterozigota, filwaq li l-konversjoni tal-ġeni hija analizzata permezz tal-produzzjoni ta’ revertants protorofiċi prodotti f’razza eteroallelika auxotrophic li tkun qed iġġorr żewġ alleli difettivi differenti ta’ l-istess ġene. Ir-razez li jintużaw l-iktar spiss għall-iskoperta tal-konversjoni mitotika tal-ġeni huma D4 (eteroalleliku f’ade 2 u trp 5) D7 (eteroalleliku f’trp 5) BZ34 (eteroalleliku f’arg 4) u JD1 (eteroalleliku f’his 4 u trp 5). Il-qsim mitotiku li jipproduċi setturi omozigoti ħomor u roża jistgħu ikunu analizzati f’D5 jew D7 (li jikkalkula ukoll il-konversjoni mitotika tal-ġeni u t-tibdil b’lura f’ilv 1-92) fejn iż-żewġ razez huma eteroalleliċi għax jikkumplimentaw alleli ta’ ade 2.
         1.5.   KRITERJI TAL-KWALITÀ
         Xejn.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         Preparazzjonijiet
         It-taħlitiet tal-kimiċi tat-test u l-komposti għal-kontroll u għar-referenza għandhom ikunu ppreparati eżatt qabel l-ittestjar, bl-użu ta’ vettura xierqa. Fil-każ ta’ komposti organiċi li ma jinħallux fl-ilma, m’għandhiex tintuża iktar minn taħlita ta’ 2 % v/v ta’ solventi organiċi bħall-etanol, l-aċetun jew id-dimetilsulfossidu (DMSO). Il-konċentrazzjoni finali tal-vettura m’għandhiex taffettwa b’mod sinifikanti il-vijabilità taċ-ċelluli u l-karatteristiċi tat-tkabbir.
         
            Attivazzjoni Metabolika
         
         Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti għall-kimiċi tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema ta’ l-attivazzjoni metabolika esoġena xierqa. Is-sistema li tintuża l-iktar spiss hija frazzjoni post-mitokondrijali supplimentata minn ko-fattur mill-fwied ta’ mammali gerriema trattati minn qabel b’aġenti li jikkaġunaw l-enzimi. L-użu ta’ speċi, tessuti, frazzjonijiet post-mitokondrijali, jew proċeduri oħrajn jistgħu ukoll ikunu xierqa għall-attivazzjoni metabolika.
         Kundizzjonijiet għat-test
         
            Razez użati għat-test
         
         Ir-razez użati l-iktar spiss huma d-diplojdi D4, D5, D7 u JD1. L-użu ta’ razez oħrajn jista’ jkun xieraq.
         
            Mezzi
         
         Mezzi xierqa tal-kultura huma użati għad-determinazzjoni tas-sopravivenza u tal-frekwenza tar-rikombinazzjoni mitotika.
         
            L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi
         
         Kontrolli tas-solventi, pożittivi, li m’humiex trattati għandhom isiru fl-istess ħin. Kimiċi xierqa għall-kontroll pożittiv għandhom jintużaw għal kull tarf speċifiku tar-rikombinazzjoni.
         
            Il-konċentrazzjonijiet ta’ l-espożizzjoni
         
         Għall-inqas ħames konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test mqassmin b’mod adegwat għandhom jintużaw. Fost il-fatturi li għandu jittieħed qies tagħhom hemm iċ-ċitotossiċità u s-solubilità. Il-konċentrazzjoni l-iktar baxxa m’għandha jkollha l-ebda effett fuq il-vijabilità taċ-ċelluli. Għal kimiċi tossiċi, l-ogħla konċentrazzjoni ttestjata m’għandhiex tnaqqas is-sopravivenza għal inqas minn 5 % sa 10 %. Kimiċi li relattivament ma jinħallux fl-ilma għandhom ikunu ttestjati sal-limitu tas-solubilità tagħhom, bl-użu ta’ proċeduri xierqa. Għal sustanzi li jinħallu b’mod faċli fl-ilma u li m’humiex tossiċi, l-ogħla konċentrazzjoni għandha tkun determinata skond il-każ.
         Iċ-Ċelloli jistgħu ikunu esposti għall-kimiċi tat-test jew fil-fażi wieqfa tagħhom jew waqt li jkunu qed jikbru għal perjodi ta’ ħin sa 18-il siegħa. Madankollu, għal ħinijiet twal ta’ trattament il-kulturi għandhom ikunu spezzjonati b’mikroskopju għal formazzjonijiet ta’ spori, li l-preżenza tagħhom twassal għall-invalidità tat-test.
         
            Kundizzjonijiet għall-inkubazzjoni
         
         Il-platti huma inkubati fid-dlam għal erba’ sa sebat ijiem f’28 sa 30 oC. Il-platti użati għal setturi omożigoti ħomor u roża li huma prodotti permezz tal-qsim mitotiku għandhom jinżammu f’refriġerejter (madwar 4 oC) għal ġurnata jew tnejn iktar qabel ma jiġu eżaminati jitħallew jiżviluppaw il-kolonji ippigmentati adegwati.
         
            Frekwenzi ta’ rikombinazzjoni mitotika spontanja
         
         Għandhom jintużaw sub-kulturi b’frekwenzi ta’ tibdil ta’ rikombinazzjonijiet mitotiċi spontanji ġewwa l-medda normali aċċettata.
         
            Numru ta’ repliki
         
         Għandhom jintużaw għall-inqas tliet repliki tal-platti għal kull konċentrazzjoni għall-analiżi tal-prototrophs li jinħalqu bil-konversjoni tal-ġeni mitotiċi u għall-vijabilità. Fil-każ ta’ l-analiżi ta’ l-omozigosi reċessiva prodotta bil-qsim mitotiku, in-numru ta’ platti għandu jiżdied biex ikun provvdut numru adegwat ta’ kolonji
         Il-Proċeduri
         It-trattament tar-razez S. cerevisiae isir normalment bil-proċedura ta’ test likwidu li jinvolvi Ċelloli wieqfin jew li qed jikbru. Esperimenti inizjali għandhom isiru fuq Ċelloli li qed jikbru: 1-5 × 107 Ċelloli/ml huma esposti għall-kimika tat-test għal perjodu ta’ ħin sa 18-il siegħa f’temperatura ta’ 28-37 oC biċ-ċaqliq; ammont adegwat tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika huwa miżjud waqt it-trattament meta xieraq.
         Fl-aħħar tat-trattament, iċ-ċelluli huma ċentrifugati, maħsulin u miżrugħin f’mezz ta’ kultura xieraq. Wara l-inkubazzjoni, il-platti jiġu eżaminati għas-sopravivenza u għall-ikkaġunar tar-rikombinazzjoni mitotika.
         Jekk l-ewwel esperiment ikun negattiv, għandu jsir esperiment ieħor bl-użu ta’ Ċelloli fil-fażi wieqfa. Jekk l-ewwel esperiment huwa pożittiv irid ikun ikkonfermat f’esperiment indipendenti.
         2.   ID-DATA
         Id-data għandha tkun ippreżentata fil-forma ta’ tabelli li jindikaw in-numru ta’ kolonji mgħadda, in-numru ta’ rikombinanti, is-sopravivenza u l-frekwenza tar-rikombinanti.
         Ir-riżultati għandhom ikunu kkonfermati f’esperiment indipendenti.
         Id-data għandha tkun evalwata bl-użu ta’ metodi statistiċi xierqa.
         3.   IR-RAPPURTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     ir-razza użata;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kundizzjonijiet tat-test: Ċelloli f’fażi wieqfa jew Ċelloli li qed jikbru, komposizzjoni tal-mezzi, it-temperatura u t-tul ta’ l-inkubazzjoni, is-sistema għall-attivazzjoni metabolika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kundizzjonijiet tat-trattament: il-konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni, il-proċedura u t-tul tat-trattament, it-temperatura tat-trattament, kontrolli pożittivi u negattivi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     in-numru ta’ kolonji mgħadda, in-numru ta’ rikombinanti, is-sopravivenza u l-frekwenza tal-mutanti, ir-relazzjoni doża/risposta fejn tapplika, il-valutazzjoni statistika ta-data;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzjoni Ġenerali Parti B.
         B.17.   MUTAĠENEĊITÀ –TEST TAL-MUTAZZJONI TAL-ĠENETAĊ-ĊELLULA TAL-MAMMIFERI IN VITRO
         
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa replika tal-OECD TG 476, Test tal-Mutazzjoni tal-Ġene taċ-Ċellula tal-Mammiferi In vitro (1997).
         1.1.   INTRODUZZJONI
         It-test tal-mutazzjoni tal-ġene taċ-ċellula tal-mammiferi in vitro jista’ jintuża biex jiġu żvelati mutazzjonijiet tal-ġene miġjuba minn sustanzi kimiċi. Il-linji ta' Ċelloli xierqa jinkludu L5178Y Ċelloli mouse lymphoma, il-linji CHO, CHO-AS52 u V79 ta' ċelluli ta' Chinese hamster, u ċ-Ċelloli umani lymphoblastoid TK6 (1). F'dawn il-linji ta' Ċelloli l-punti tat-truf ġenetiċi li l-aktar jintużaw ikejlu l-mutazzjoni fi thymidine kinase (TK) u hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT), u transġene ta' xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (XPRT). It-testijiet ta' mutazzjoni TK, HPRT u XPRT jiżvelaw dehriet differenti ta' ġrajjiet ġenetiċi. Il-lok awtosomali ta' l-TK u l-XPRT jista’ jippermetti l-iżvelar ta' ċerti ġrajjiet ġenetiċi (eż. ħafna tħassir) li mhumiex żvelati fil-locus HPRT locus fuq kromożomi X (2)(3)(4)(5)(6).
         Fit-test tal-mutazzjoni tal-ġene taċ-ċellula tal-mammiferi in vitro, jistgħu jintużaw kulturi ta' linji ta' Ċelloli jew karatteristiċi ta' Ċelloli. Iċ-Ċelloli li jintużaw jingħażlu fuq il-bażi tal-kapaċità tagħhom li jiżviluppaw f'kultura u l-istabbilità fil-frekwenza ta' mutazzjoni spontanea.
         Ġeneralment it-testijiet imwettqa in vitro jeħtieġu l-użu ta' għejun esoġeneu ta' attivazzjoni metabolika. Din is-sistema ta' attivazzjoni metabolika ma tista’x tikkopja kompletament il-kundizzjonijiet in vivo fil-mammiferi. Wieħed għandu jevita kundizzjonijiet li jistgħu jwasslu għal riżultati li ma jirriflettux mutaġeneċità intrinsika. Jista’ jkun hemm riżultati posittivi li ma jirriflettux mutaġeneċità intrinsika minn bidliet fil-pH, osmolalità jew livelli għolja ta' ċitotossiċità (7).
         Dan it-test jintuża biex tiġi individwata l-possibbiltà ta' mutaġeni u karċinoġeni fil-mammiferi. Ħafna komposti li huma posittivi f'dan it-test huma karċinoġeni fil-mammiferi; madankollu, m'hemmx korrelazzjoni perfetta bejn dan it-test u l-karċinoġeniċità. Il-korrelazzjoni tiddependi fuq il-klassi kimika u hemm evidenza dejjem tiżdied li jeżistu karċinoġeni li ma jiġux żvelati b'dan it-test għax jidhru li jaġixxu permezz ta' mekkaniżmi oħra mhux ġenotossiċi jew mekkaniżmi li ma jeżistux f'Ċelloli batteriċi (6).
         Ara ukoll l-Introduzzjoni Ġenerali Taqsima B:
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Mutazzjoni 'l quddiem: mutazzjoni tal-ġene mit-tip parental ital-forma mutanti li toħloq alterazzjoni jew telf ta' l-attività enżimatika tal-funzjoni tal-proteina kodifikata.
         
            Mutaġeni li jġibu s-sostituzzjoni tal-koppji tal-bażi: sustanzi li jikkawżaw is-sostituzzjoni ta' koppji tal-bażi waħda jew aktar fid-DNA.
         
            Mutaġeni li jġibu l-mutazzjoni tal-fażi tal-qari: sustanzi li jikkawżaw iż-żieda jew ittħassir ta' pari ta' bażi waħda jew multipli fil-molekula tad-DNA.
         
            Ħin ta' espressjoni fenotipika: perjodu li fih prodotti ta' ġene mhux mibdula jitneħħew mill-għadd ta' Ċelloli vijabbli.
         
            Frekwenza mutanti: l-għadd ta' Ċelloli mutanti osservati diviżi bl-għadd ta' Ċelloli vijabbli.
         
            Żvilupp totali relattiv: żieda fl-għadd taċ-Ċelloli tul iż-żmien komparata ma' popolazzjoni ta' Ċelloli ta' kontroll; kalkolat bħala l-prodott ta' l-iżvilupp tas-sospensjoni relattiv għaż-żminijiet ta' kontroll negattiv għall-effiċjenza tal-klonazzjoni relattiva għall-kontroll negattiv.
         
            Żvilupp tas-sospensjoni relattiv: żieda fl-għadd taċ-Ċelloli tul il-perjodu ta' espressjoni relattiv għall-kontroll negattiv.
         
            Vijabilità: l-effiċjenza tal-klonazzjoni taċ-ċelluli trattati fil-ħin ta' meta jitqiegħdu fuq bażi f'kundizzjonijiet selettivi wara l-perjodu ta' espressjoni.
         
            Sopravivenza: l-effiċjenza tal-klonazzjoni taċ-Ċelloli trattati meta jitqiegħdu fuq bażi wara li jintemm il-perjodu ta' trattament; ġeneralment is-sopravivenza hija espresso paragunata mas-sopravivenza tal-popolazzjoni taċ-Ċelloli ta' kontroll.
         1.3.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Iċ-Ċelloli li għandhom nuqqas ta' thymidine kinase (TK) minħabba fil-mutazzjoni TK+/- > TK-/- huma reżistenti għall-effetti ċitotossiċi tal-pyrimidine analogue trifluorothymidine (TFT). Iċ-ċelluli profiċenti tat-Thymidine kinase huma sensittivi għat-TFT, li joħloq l-inibizzjoni tal-metaboliżmu ċellulari u jwaqqaf aktar diviżjoni fiċ-Ċelloli. B'hekk Ċelloli mutanti jistgħu jipproliferaw fil-presenza tat-TFT, waqt li Ċelloli normali, li jkun fihom it-thymidine kinase, ma jistgħux. Bl-istess mod, Ċelloli li għandhom nuqqas ta' HPRT jew XPRT jingħażlu skond ir-reżistenza għal 6-thioguanine (TG) jew 8-azaguanine (AG). Il-karatteristiċi tas-sustanza tat-test għandhom jiġu meqjusa sew jekk jiġi ttestjat analogu tal-bażi jew compost relatat ma' l-aġent selettiv f'xi wieħed mit-testijiet tal-mutazzjoni tal-ġene taċ-ċellula fil-mammiferi. Bħala eżempju, għandha tiġi investigata kull tossiċità selettiva suspettata bis-sustanza tat-test għal ċelluli mutanti u mhux mutanti. Għalhekk, il-prestazzjoni tas-sistema/aġent tas-selezzjoni għandha tiġi konfermata meta jiġu ttestjati kimiċi li huma strutturalment relatati ma' l-aġent selettiv (8).
         Iċ-Ċelloli f'sospensjoni jew kultura monostrata huma esposti għas-sustanza tat-test, kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha, gġal perjodu ta' żmien xieraq u subkulturati biex jippermettu l-espressjoni fenotipika qwabel is-selezzjoni mutanti (9) (10) (11) (12) (13). Normalment iċ-ċitossiċità tiġi stabbilita billi titkejjel l-effiċjenza ta' klonazzjoni relattiva (sopravivenza) jew l-iżvilupp totali relattiv tal-kulturi wara l-perjodu ta' trattament. Il-kulturi ttrattati jinżammu f'medjum ta' żvilupp għal perjodu ta' żmien suffiċjenti, karatteristiku ta' kull locus magħżul u tip ta' ċellula, biex jippermetti l-espressjoni fenotipika kważi ottimali tal-mutazzjonijiet magħmula. Il-frekwenza mutanti tiġi stabbilita bl-inseminazzjoni ta; għadd magħruf ta' Ċelloli f'medjum li jkun fih l-aġent selettiv biex jiġu żvelati Ċelloli mutanti u f'medjum mingħajr aġent selettiv biex tiġi żvelata l-effiċjenza tal-klonazzjoni (vijabilità). Wara perjodu xieraq ta' inkubazzjoni, jingħaddu l-kolonji. Il-frekwenza mutanti hi derivate mill-għadd ta' kolonji mutanti f'medjum selettiv u l-għadd ta' kolonji f'medjum mhux selettiv.
         1.4.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.4.1.   Preparazzjonijiet
         1.4.1.1.   Ċelloli
         Hemm varjetà ta' Ċelloli disponibbli għall-użu għal dan it-test inklużi subkloni ta' Ċelloli ta' L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 jew TK6. It-tipi ta' Ċelloli użati f'dan it-test għandhom ikunu ddimostraw sensitività għal mutaġeni kimiċi, effiċjenza għolja ta' klonazzjoni u frekwenza mutanti spontanea stabbli. Iċ-Ċelloli għandhom jiġu kontrollati għal kontaminazzjoni mill-mikoplasma u m'għandhomx jintużaw jekk ikunu kontaminati.
         It-test għandu jkun iddisinjat biex ikollu sensitività u qawwa prederterminata. L-għadd ta' ċelluli, kulturi u konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test użati għandhom jirriflettu dawn il-parametri definiti (14). L-għadd minimu ta' Ċelloli vijabbli li jinqgħu ħajjin wara it-trattament u li jintużaw f'kull stadju tat-test għandu jkun msejjes fuq il-frekwenza tal-mutazzjoni spontanea. Gwida ġenerali hija li jintuża għadd ta' Ċelloli li hu għall-inqas 10 darbiet l-invers tal-frekwenza tal-mutazzjoni spontanea. Madankollu, huwa rakkomandat li jiġu utilizzati għall-inqas 106 Ċelloli. Informazzjoni storika xierqa dwar is-sistema taċ-ċellula użata għandha tkun disponibbli biex tindika l-prestazzjoni konsistenti tat-test.
         1.4.1.2.   Postijiet u kundizzjonijiet tal-kulturi
         Għandhom jintużaw postijiet tal-kulturi xierqa, u kundizzjonijiet ta' inkubazzjoni (kontenituri tal-kulturi, temperatura, konċentrazzjoni ta' CO2 u umdità). Il-postijiet għandhom jingħażlu skond is-sistemi selettivi u t-tip ta' ċellula użati f'dan it-test. Huwa partikolarment importanti li l-kundizzjonijiet tal-kulturi jingħażlu hekk li jiżguraw l-iżvilupp ottimali taċ-Ċelloli waqt il-perjodu ta' espressjoni u l-kapaċità tal-formazzjoni ta' kolonji ta' kemm iċ-ċelluli mutanti kif ukoll dawk mhux mutanti.
         1.4.1.3.   Preparazzjoni tal-kulturi
         Iċ-Ċelloli huma propagati minn ħażniet ta' kulturi, inseminati f'medjum ta' kultura u inkubati f'temperatura ta' 37 oC. Qabel ma jintużaw f'dan it-test, il-kulturi għandhom jitnaddfu minn Ċelloli mutanti pre-eżistenti.
         1.4.1.4.   Attivazzjoni metabolika
         Iċ-ċelluli għandhom jiġu esposti għas-sustanza tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika xierqa. Is-sistema l-aktar użata hija frazzjoni post mitokondrijali supplimentata b'kofattur (S9) preparata mill-fwied ta' annimali gerriema trattat b'aġenti li jġibu l-enżimi bħal ma huma l-Aroklor 1254 (15) (16) (17) (18) jew taħlita ta' phenobarbitone u β-naphthoflavone (19) (20).
         Normalment il-frazzjon post mitokondrijali tintuża f'konċentrazzjonijiet fil-medda minn 1-10 % v/v fil-medjum finali tat-test. L-għażla u l-kundizzjoni ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika tista’ tiddependi fuq il-klassi tal-kimika li tkun qed tiġi ttestjata. F'ċerti każijiet jista’ jkun xieraq li tiġi utilizzata iktar minn konċentrazzjoni waħda tal-frazzjon post mitokondrijali.
         Numru ta' żviluppi, inkluża l-kostruzzjoni ta' linji ta' Ċelloli ta' inġinerija ġenetika li jesprimu enżimi ta' attivazzjoni speċifika, jistgħu jipprovdu l-potenzal għall-attivazzjoni endoġenea. L-għażla tal-linji taċ-Ċelloli użati għandha tkun ġustifikata xjentifikament (eż. bir-rilevanza ta' l-isoenżim ċitokromu P450 għall-metaboliżmu tas-sustanza tat-test).
         1.4.1.5.   Preparazzjoni tas-sustanza tat-test
         Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewba jew sospiżi f'solventi jew mezzi xierqa u dilwiti jekk ikun xieraq qabel it-trattament taċ-Ċelloli. Sustanzi tat-test likwidi jistgġu jiżdiedu direttament mas-sistemi tat-test u/jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda tas-sustanza tat-test sakemm l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix l-aċċettabbilità tal-ħażna.
         1.4.2.   Kundizzjonijiet tat-test
         1.4.2.1.   Solvent/mezz
         Ma għandux jkun hemm suspett ta' reazzjoni kimika tas-solvent/mezz mas-sustanza tat-test u s-solvent/mezz għandu jkun kompatibbli mas-sopravivenza taċ-Ċelloli u l-attività S9. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Huwa rakkomandat li kull fejn ikun possibbli l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akkwuż. Meta jiġu testjati sustanzi li mhumiex stabbli fl-ilma, is-solventi organiċi li jintużaw ma għandhux ikollhom ilma. L-ilma jista’ jitneħħa billi jiżdied passatur molekulari.
         1.4.2.2.   Konċentrazzjonijiet ta' espożizzjoni
         Fost il-kriterji li għandhom jitqiesu biex tiġi stabbilita l-ogħla konċentrazzjoni hemm iċ-ċitossiċità, is-solubbilità fis-sistema tat-test u bidliet fil-pH jew osmolalità.
         Iċ-ċitossiċita għandha tiġi stabbilita bl-attività metabolika jew mingħajrha fl-esperiment prinċipali bl-użu ta' indikazzjoni xierqa ta' integrità u żvilupp taċ-Ċelloli, bħal ma huma l-effiċjenza tal-klonazzjoni relattiva (sopravivenza) jew l-iżvilupp totali relattiv. Jista’ jkun utli li jiġu determinati ċ-ċitossiċità u s-solubbilità f'esperiment preliminari.
         Għandhom jintużaw għall-inqas erba' konċentrazzjonijiet analizzabbli. Fejn ikun hemm iċ-ċitossiċità, dawn il-konċentrazzjonijiet għandhom ikopru medda mill-massimu għal ftit jew l-ebda ċitossiċità. Dan normalment ifisser li l-livelli ta' ċitossiċità għandhom jiġu separati b'mhux iżjed minn fattur bejn 2 u √10. Jekk il-konċentrazzjoni massima hi msejsa fuq iċ-ċitossiċità allura għandha tirriżulta f'madwar 10-20 % (iżda mhux inqas minn 10 %) sopravivenza relattiva (effiċjenza ta' klonazzjoni relattiva) jew żvilupp totali relattiv. Għal sustanzi relattivament mhux tossiċi, il-konċentrazzjoni massima tat-test għandha tkun 5 mg/ml, 5 μl/ml, jew 1,01 M, liema minnhom ikun l-anqas.
         Sustanzi relattivament mhux solubbli għandhom jiġu ttestjati sa jew lil hinn mil-limitu tagħhom ta' solubilità taħt kundizzjonijiet ta' kulturi. Il-prova tas-solubbilità għandha tiġi stabbilita fil-medjum tat-trattament finali li għalih huma esposti ċ-Ċelloli. Jista’ jkun utli li tiġi valutata s-solubilità fil-bidu u fl-aħħar tat-trattament, għax is-solubilità tista’ tinbidel waqt il-kors ta' l-espożizzjoni fis-sistema tat-test minħabba fil-preżenza ta' Ċelloli, S9, serum eċċ. L-insolublità tista’ tiġi żvelata mingħajr għajnuna lill-għajn. Il-preċipitat m'għandux jostakola l-għadd.
         1.4.2.3.   Kontrolli
         Għandhom jiġu inklużi f'kull esperiment kontrolli posittivi u negattivi fl-istess ħin (solvent jew mezz), kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. Meta tintuża l-attivazzjoni metabolika, il-kimika ta' kontroll posittiva għandha tkun dik li-teħtieġ li l-attivazzjoni tagħti rispons mutaġeniku.
         Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll posittiv jinkludu:
         
                     Kondizzjoni ta' attivazzjoni metabolika
                  
                  
                     Post
                  
                  
                     Sustanza
                  
                  
                     Nru CAS
                  
                  
                     Nru EINECS
                  
               
                     Assenza ta' attivazzjoni metabolika essoġenea
                  
                  
                     HPRT
                  
                  
                     Metansulfonat ta' l-etil
                  
                  
                     62-50-0
                  
                  
                     200-536-7
                  
               
                     Ethyl nitrosourea
                  
                  
                     759-73-9
                  
                  
                     212-072-2
                  
               
                     TK (kolonji żgħar u kbar)
                  
                  
                     Methyl methanesulphonate
                  
                  
                     66-27-3
                  
                  
                     200-625-0
                  
               
                     XPRT
                  
                  
                     Etil methanesulphonate
                  
                  
                     62-50-0
                  
                  
                     200-536-7
                  
               
                     Nitrosourea ta' l-etil
                  
                  
                     759-73-9
                  
                  
                     212-072-2
                  
               
                     Preżenza ta' attivazzjoni metabolika essoġenea
                  
                  
                     HPRT
                  
                  
                     3-Methylcholanthrene
                  
                  
                     56-49-5
                  
                  
                     200-276-4
                  
               
                     N-Nitrosodimethylamine
                  
                  
                     62-75-9
                  
                  
                     200-549-8
                  
               
                     7,12-Dimethylbenzanthracen e
                  
                  
                     57-97-6
                  
                  
                     200-359-5
                  
               
                     TK (kolonji żgħar u kbar)
                  
                  
                     Cyclophosphamide
                  
                  
                     50-18-0
                  
                  
                     200-015-4
                  
               
                     Cyclophosphamide monohydrate
                  
                  
                     6055-19-2
                  
                  
                      
                  
               
                     Benżo(a)pirena
                  
                  
                     50-32-8
                  
                  
                     200-028-5
                  
               
                     3-Metilkolantrena
                  
                  
                     56-49-5
                  
                  
                     200-276-5
                  
               
                     XPRT
                  
                  
                     N-Nitrosodimethylamine (għal livelli għoljin ta' S-9)
                  
                  
                     62-75-9
                  
                  
                     200-549-8
                  
               
                     Benżo(a)pirena
                  
                  
                     50-32-8
                  
                  
                     200-028-5
                  
               Jistgħu jintużaw sustanzi ta' referenza ta' kontroll posittiv oħra xierqa, eż. jekk laboratorju jkollu bażi ta' informazzjoni storika fuq 5-bromo 2'-deoxyuridine (Nru CAS 59-14-3, Nru EINECS 200-415-9), tista’ tintuża ukoll din is-sustanza ta' referenza. Meta jkunu disponibbli, għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll posittiv relatat ma' klassi ta' kimika.
         Għandhom jiġu inklużi kontrolli negattivi, li jikkonsistu biss f'solvent jew mezz fil-medjum ta' trattament, u trattati bl-istess mod bħall-gruppi ta' trattament. B'żieda ma' dan għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm l-informazzjoni storika ta' kontroll turi li ma jkunx hemm effetti dannużi jew mutaġeniċi kkaużati mis-solvent magħżul.
         1.4.3.   Proċedura
         1.4.3.1.   Trattament bis-sustanza tat-test
         Iċ-Ċelloli li jipproliferaw għandhom jiġu esposti għas-sustanza tat-test kemm bl-attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajrha. L-espożizzjoni għandha tkun għal perjodu xieraq ta' żmien (normalment 3-6 sigħat hu effettiv). Il-ħin ta' l-espożizzjoni jista’ jittawwal fuq ċiklu ta' Ċelloli wieħed jew aktar.
         Jistgħu jintużaw kulturi ttrattati duplikati jew singoli ma' kull konċentrazzjoni ttestjata. Meta jintużaw kulturi singoli, l-għadd ta' konċentrazzjonijiet għandu jiżdied biex jiġi żgurat li jkun hemm numru adegwat ta' kulturi għall-analiżi (eż. għall-inqas tmien konċentrazzjonijiet analizzabbli). Għandhom jintużaw kulturi ta' kontroll negattivi duplikati (solvent).
         Sustanzi gassużi jew volatili għandhom jiġu ttestjati b'metodi xierqa, bħal ma huma f'kontenituri magħluqa ta' kulturi (21) (22).
         1.4.3.2.   Tkejjil ta' sopravivanza, vijabbilità u frekwenza tal-mutazzjonijiet
         Fl-aħħar tal-perjodu ta' espożizzjoni, iċ-ċelluli jinħaslu u jitqiegħdu f'kulturi biex tiġi determinata s-sopravivenza u biex jippermettu l-espressjoni tal-fenotip mutanti. It-tkejjil taċ-ċitossiċità billi tiġi determinata l-effiċjenza tal-klonazzjoni relattiva (sopravivenza) jew l-iżvilupp totali relattiv tal-kulturi normalment jinbeda wara l-perjodu ta' trattament.
         Kull locus għandu ħtieġa ta' żmien minimu definit biex jippermetti l-espressjoni fenotipika kważi ottimali tal-mutanti ġodda li jkunu nħolqu (HPRT u XPRT jeħtieġu għall-inqas 6-8 ijiem, u TK għall-inqas jumejn). Iċ-Ċelloli jitkabbru f'medjum b'aġent(i) selettiv(i) jew mingħajru(hom) għad-determinazzjoni ta' l-għadd ta' mutanti u l-effiċjenza tal-klonazzjoni, rispettivament. It-tkejjil tal-vijabilità (li jintuża biex tiġi kalkolata l-frekenza tal-mutazzjonijiet) jinbeda fl-aħħar tal-perjodu ta' espressjoni billi jitqiegħdu fuq bażi fil-medjum mhux selettiv.
         Jekk is-sustanza tat-test tkun posittiva fit-test tal-L5178Y TK+/-, il-qies tal-kolonji għandu jiġi rilevat fuq għall-inqas waħda mill-kulturi tat-test (l-ogħla konċentrazzjoni posittiva) u fuq il-kontrolli negattivi u posittivi. Jekk is-sustanza tat-test hi negattiva fit-test L5178Y TK+/-, il-qies tal-kolonji għandu jiġi rilevat fuq il-kontrolli negattivi u posittivi. Fi studji li jużaw il-TK6TK+/-, għandu jitwettaq ukoll il-qies tal-kolonji.
         2.   DATA
         2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         L-informazzjoni għandha tinkludi d-determinazzjoni taċ-ċitossiċità u l-vijabilità, l-għadd ta' kolonji, u l-frekwenzi ta' mutazzjonijiet għall-kulturi ta' trattament u ta' kontroll. Fil-każ ta' rispons posittiv fit-test tal-L5178Y TK+/-, il-kolonji jingħaddu billi jintuża l-kriterju ta' kolonji żgħar u kbar f'għall-inqas konċentrazzjoni waħda tas-sustanza tat-test (l-ogħla konċentrazzjoni posittiva) u fuq il-kontroll negattiv u posittiv. In-natura molekulari u ċitoġenetika ta' kolonji ta' mutazzjonijiet kemm kbar kif ukoll żgħar ġiet esplorata fid-dettall (23) (24). Fit-test tat-TK+/-, il-kolonji jingħaddu billi jintuża l-kriterju ta' tkabbir normali (kbar) u tkabbir bil-mod (żgħar) ta' kolonji. (25). Iċ-Ċelloli ta' mutazzjoni li jkunu sofrew l-aktar ħsara ġenetika estensiva għandhom żminijiet ta' duplikazzjoni aktar prolongati u għalhekk jiffurmaw kolonji żgħar. Din il-ħsara tipikament tinfirex fl-iskala mit-telf tal-ġene intier għal devjazzjonijiet viżibbli karjotipikament tal-kromożomi. Il-presenza ta' kolonji żgħar mutanti ġiet assoċjata ma' kimiċi li jipproduċu alterazzjonijiet kbar fil-kromożomi (26). Ċelloli mutanti li jkunu ġew affettwati anqas serjament jikbru b'rati simili għal dawk ta' Ċelloli parentali u jifformaw kolonji kbar.
         Għandu jingħata l-ammont ta' sopravivenza (effiċjenzi ta' klonazzjoni relattivi) jew l-iżvilupp totali relattiv. Il-frekwenza tal-mutazzjoni għandha tiġi espressa bħala n-numru ta' ċelluli mutanti paragunat man-numru ta' Ċelloli li jibqgħu ħajjin.
         Għandha tingħata l-informazzjoni dwar il-kulturi differenti. B'żieda ma' dan, għandu jingħata sommarju ta' l-informazzjoni kollha fil-forma ta' tabella.
         Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' rispons posittiv ċar. Ir-riżultati dubbjużi għandhom jiġu ċċarati bżaktar testijiet preferibbilment billi jkun hemm modifika fil-kundizzjonijiet ta' l-esperiment. Riżultati negattivi għandhom jiġu konfermati fuq bażi ta' każ b'każ. F'dawk ilkażijiet fejn il-konferma ta' riżultati negattivi mhijiex kkunsidrata bħala meħtieġa, għandha tingħata ġustifikazzjoni. Għandha tiġi kkunsidrata l-modifika tal-parametri ta' studju biex tkabbar il-medda tal-kundizzjonijiet valutati f'esperimenti li jsiru wara minħabba f'riżultati dubbjużi jew negattivi. Parametri ta' studju li jistgħu jiġu modifikati jinkludu l-intervall bejn id-dożi valutati u l-kundizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika.
         2.2.   VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit risultat posittiv, bħal żieda relatata mal-konċentrazzjoni jew żieda riproduċibbli fil-frekwenza ta' mutazzjonijiet. L-ewwel għandha titqies ir-rilevanza bijoloġika tar-risultati. Jistgħu jintużaw metodi ta' statistika bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-risultati tat-test. Is-sinjifikanza statistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal rispons posittiv.
         Sustanza ta' test li dwarha ir-risultati ma jilħqux l-kriterji fuq imsemmija hija meqjusa bħala mhux mutaġenika f'din is-sistema.
         Għalkemm il-biċċa l-kbira ta' l-istudji jagħtu risultati ċari posittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni mogħtija ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività tas-sustanza tat-test. Ir-risultati jistgħu jibqgħu dubbjużi jew mhux ċari minkejja n-numru ta' drabi li jiġi ripetut l-esperiment.
         Risultati posittivi mit-test tal-mutazzjoni tal-ġene taċ-ċellula tal-mammiferi in vitro jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq mutazzjonijiet tal-ġene fiċ-Ċelloli ta' kulturi ta' mammiferi użati. Rispons popsittiv dwar il-konċentrazzjoni li huwa riproduċibbli huwa ta' valur kbir. Risultati negattivi jindikaw li, taħt il-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx mutazzjonijiet tal-ġene fiċ-Ċelloli ta' kulturi ta' mammiferi użati.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Solvent/mezz:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Ċelloli:
                     
                                 —
                              
                              
                                 tip u għejun taċ-Ċelloli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru ta' kulturi taċ-Ċelloli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru ta' passaġġi, jekk ikun applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi għall-manutenzjoni tal-kulturi taċ-Ċelloli, jekk jkun applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 assenza tal-mikoplasma.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 raġuni prinċipali għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet u għadd ta' kulturi inklużi, eż. informazzjoni dwar ċitotossiċità u limitazzjonijiet dwar solubbilità, jekk ikunu disponibbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 komposizzjoni tal-medja, konċentrazzjoni CO2;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 volum tal-mezz u sustanza tat-test miżjuda;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 temperatura ta' l-inkubazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 perjodu ta' inkubazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kemm idum it-trattament;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 densità taċ-ċellula waqt it-trattament;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tip u komposizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika, inklużi krierji ta' aċċettabilità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kontrolli pożittivi u negattivi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tul tal-perjodu ta' espressjoni (inkluż in-numru ta' ċelluli fiż-żriegħ, u skedi ta' subkulturi u alimentazzjoni, jekk ikun xieraq);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 aġenti selettivi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kriterji biex it-testijiet jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi użati biex jingħadd in-numru ta' Ċelloli viabbli u mutanti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 definizzjoni ta' kolonji li dwarhom jitqiesu l-qies u t-tip (inklużi kriterji għal kolonji “żgħar” u “kbar”, kif xieraq).
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 sinjali ta' tossiċità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 sinjali ta' preċipitazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar pH u l-osmolalità waqt l-espożizzjoni għas-sustanza tat-test, jekk ikun stabbilit;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 qies tal-kolonja jekk reġistrat għall-inqas għall-kontrolli negattivi u posittivi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 adegwatezza tal-laboratorju biex jiġu żvelati mutazzjonijiet f'kolonji żgħar bis sistema L5178Y TK+/-, fejn ikun xieraq;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv (solvent/mezz) u pożittiv;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz) u pożittiv, bil-meded, mezzi u devjazzjonijiet standard;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 frekwenza ta' mutazzjonijiet.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni dwar ir-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindal, K.R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Chu, E.H.Y. and Malling H.V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306-1312.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res. 94, pp. 467-485.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394-403.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Aaron, C.S., and Stankowski, Jr. L.F., (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res. 223, pp. 121-128.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312, pp. 235-239.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, pp. 147-204.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225-251.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17-36.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135-141.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9-17.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Stankowski, L. F. Jr., Tindal,, K. R., and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191 Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, pp. 133-147.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure for the L5178Y/TK+/- -TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, pp. 66-101.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome- Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res. 46, pp. 365-373.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, pp. 347-364.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/- – Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res. 59, pp. 61-108.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, pp. 173-215.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis 7, pp. 175-177.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51-55.
                  
               
                  
                     (24)
                  
                  
                     Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C., Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluoronthymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK+/- – Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161-174.
                  
               
                  
                     (25)
                  
                  
                     Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res. 229, pp. 89-102.
                  
               
                  
                     (26)
                  
                  
                     Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- – 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, pp. 609-614.
                  
               B.18.   DANNI URIMEDJITAD-DNA -SINTESI MHUX FL-ISKEDATAD-DNA-ĊELLULI MAMMIFERI IN VITRO
         
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   TIFSIRA
         Ara l-Introduzzjonii Ġenerali Parti B.
         1.3.   SUSTANZI GĦAR-REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU GĦAT-TEST
         It-test tas-Sintesi tad-DNA li mhux fl-iskeda (UDS) ikejjel is-sintesi tar-rimedju tad-DNA wara l-qtugħ u t-tneħħija ta’ ġibda ta’ DNA li jkun fiha r-reġjun ta’ dannu kkaġunat minn aġenti kimiċi u fiżiċi. It-test huwa bbażat fuq l-inkorporazzjoni ta’ tritju mmarkat thymidine 3H-TdR) fid-DNA ta’ Ċelloli mammiferi li m’humhiex fil-fażi S taċ-ċiklu taċ-ċellula. It-teħid ta’ 3H-TdR jista’ jkun determinat bl-awtoradjografija jew bix-xintillar likwidu bl-għadd (LSC) tad-DNA miċ-Ċelloli trattati. Ċelluli mammiferi fil-koltura, jekk ma jintużawx hepatocytes primarji tal-ġrieden huma trattati bl-aġent tat-test bis-sistema u migħajr is-sistema esoġena għall-attivazzjoni metabolika. UDS jista’ jitkejjel ukoll f’sistemi in vivo.
         1.5.   KRITERJI TAL-KWALITÀ
         Xejn.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU GĦAT-TEST
         Preparazzjonijiet
         Il-kimiċi tat-test u s-sustanzi għall-kontoll u għar-referenzi għandhom ikunu ppreparati f’mezz tat-tkabbir jew maħlula jew sospiżi f’vetturi xierqa u mbagħad dilwit f’mezz għat-tkabbir għall-użu fl-analiżi. Il-konċentrazzjoni finali tal-vettura m’għandhiex taffettwa l-vijabilità taċ-Ċelloli.
         Kulturi primarji ta’ hepatocytes tal-ġrieden, limfoċite tal-bnedmin u razez taċ-Ċelloli stabbiliti (eż. fibroblast tad-diplojde tal-bnedmin) jistgħu jintużaw fl-analiżi.
         Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti għall-kimika tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema għall-attivazzjoni metabolika xierqa.
         Kundizzjonijiet tat-test
         
            Numru ta’ kulturi
         
         Għall-inqas żewġ kulturi ta’ Ċelloli għall-awtoradjografija u sitt kulturi (jew inqas jekk iġġustifikat b’mod xjentifiku) għad-determinazzjonijiet LSC UDS huma meħtieġa għal kull punt sperimentali.
         
            L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi
         
         Għandhom ikunu inklużi fl-esperiment kontrolli pożittivi u negattivi (mhux trattati u/jew vettura) fl-istess ħin bl-attivazzjoni metabolika u mingħajr l-attivazzjoni metabolika.
         Eżempji ta’ kontrolli pożittivi għall-analiżi tal-hepatocytes tal-ġrieden jinkludu 7,12-dimetilbenżatraċene (7,12-DMBA) jew 2-aċetilamminofluworin (2-AAF). Fil-każ ta’ razez ta’ Ċelloli stabbiliti 4-nitrokwinolina-N-ossidu (4-NQO) huwa eżempju ta’ kontroll pożittiv kemm għall-analiżi awtoradjografika kif ukoll l-analiżi LSC mingħajr attivazzjoni metabolika; N-dimetilnitosammina huwa eżempju ta’ kontroll pożittiv kompost meta jintużaw sistemi għall-attivazzjoi metabolika.
         
            Konċentrazzjonijiet ta’ l-espożizzjoni
         
         Għandhom jintużaw numru ta’ konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test fuq medda adegwata biex tkun definita r-risposta. L-ogħla konċentrazzjoni għandha jkollha xi effetti ċitotossiċi. Komposti li relattivament ma jinħallux fl-ilma għandhom ikunu ttestjati sal-limiti ta’ l-insolubilità tagħhom. Għal kimiċi li jinħallu faċilment fl-ilma u li m’humhiex tossiċi, l-ogħla konċentrazzjoni tal-kimika tat-test għandha tkun determinata skond il-każ.
         
            Ċelloli
         
         Mezzi għat-tkabbir xierqa, il-konċentrazzjoni CO2, it-temperatura u l-umdità għandhom ikunu użati fil-manteniment tal-kulturi. Razez taċ-Ċelloli stabbiliti għandhom ikunu kkontrollati b’mod perjodiku għal kontaminazzjoni tal-Mycoplasma.
         
            L-attivazzjoni Metabolika
         
         Mal-kulturi primarji hepatocyte ma tintużax sistema għall-attivazzjoni metabolika. Razez taċ-Ċelloli stabbiliti u l-limfoċiti huma esposti għas-sustanza tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema xierqa għall-attivazzjoni metabolika.
         Proċedura
         
            Preparazzjoni tal-kulturi
         
         Razez taċ-Ċelloli stabbiliti huma ġġenerati minn kulturi ta’ l-istokk (eż. bit-tripsinizzazzjoni jew bit-tneħħija), miżrugħin f’vetturi għall-kultura f’densità xierqa, u inkubati f’37 oC.
         Kulturi għal żmien qasir ta’ hepatocytes tal-ġrieden huma stabbiliti billi l-hepatocytes dissoċjati reċentement jitħallew f’mezz xieraq biex jeħlu mal-wiċċ li jkun qed jikber.
         Kulturi tal-limfoċite tal-bnedmin jitwaqqfu bl-użu ta’ tekniċi xierqa.
         
            Trattament tal-kulturi bis-sustanza tat-test
         
         Hepatocytes primarji tal-ġrieden
         Hepatocytes tal-ġrieden iżolati reċentement huma trattati bis-sustanza tat-test f’mezz li fih 3H-TdR għal tul ta’ żmien xieraq. Fl-aħħar tal-perjodu tat-trattament, il-mezz għandu jitneħħa minn maċ-Ċelloli, li mbagħad għandhom ikunu mlaħalħin, imwaħħlin u mnixxfin. L-islajds għandhom ikunu mgħaddsa f’emulsjoni awtoradjografika (jista’ jintuża film alternattiv li jqaxxar), esposti, żviluppati, mlewwnin u mgħadda.
         Razez taċ-Ċelloli stabbiliti u limfoċiti
         Tekniċi awtoradjografiċi: Il-kulturi taċ-Ċelloli huma esposti għas-sustanza tat-test għal-tul ta’ żmien xieraq u wara jkunu trattati b’ 3H-TdR. Il-ħiniiet għandhom ikunu gvernati min-natura tas-sustanza, l-attività ta’ sistemi metaboliċi u t-tip ta’ Ċelloli. Biex tkun skoperta l-quċċata ta’ UDS, 3H-TdR għandu jkun miżjud jew fl-istess ħin mas-sustanza tat-test jew wara ftit minuti wara l-espożizzjoni għas-sustanza tat-test. L-għażla bejn dawn iż-żewġ proċeduri għandha tkun influwenzata mill-interazzjonijiet possibbli bejn is-sustanza tat-test u 3H-TdR. Sabiex issir differenza bejn UDS u replika ta’ DNA semi-konservattiva, din ta’ l-aħħar tista’ tkun inibita, per eżempju, bl-użu ta’ mezz nieqes mill-arginina, kontenut baxx ta’ serum jew bl-idrossiurea fil-mezz tal-kultura.
         Kejl LSC tal-UDS: Qabel it-trattament bis-sustanza tat-test, id-dħul taċ-Ċelloli fil fażi S għandu jkun imwaqqaf kif deskritt hawn fuq; iċ-Ċelloli mbagħad għandhom ikunu esposti għall-kimika tat-test kif deskritt għall-awtoradjografija. Fl-aħħar tal-perjodu ta’ l-inkubazzjoni, id-DNA għandu jinħareġ miċ-Ċelloli u l-kontenut totali ta’ DNA, u l-miżura ta’ inkorporazzjoni ta’ 3H-TdR għandhom ikunu determinati.
         Għandu jkun innotat li, fejn jintużaw il-limfoċiti tal-bnedmin fit-tekniċI msemmija hawn fuq, it-trażżin tar-replika tad-DNA semi-konservattiva m’huwiex meħtieġ f’kulturi li m’humhiex stimolati.
         Analiżi
         
            
               Determinazzjonijiet awtoradjografiċi
            
         
         Fid-determinazzjoni ta’ UDS fiċ-Ċelloli fil-kultura, in-nuklei fil-fażi S ma jingħaddux. Għall-inqas 50 ċellula għal kull konċentrazzjoni għandha tingħad. L-islajds għandhom jingħataw kodiċI qabel ma jingħaddu. Għandhom jingħaddu bosta oqsma kif jinzertaw separati sew fuq kull slajd. L-ammont ta’ 3H-TdR inkorporat fiċ-ċitoplasma għandu jkun determinat billi jingħaddu tlett partijiet b’daqs ta’ nukleu fiċ-ċitoplasma ta’ kull ċellula li tingħadd.
         
            Determinazzjonijiet LSC
         
         Għandu jintuża numru adegwat ta’ kulturi f’kull konċentrazzjoni u fil-kontrolli fid-determinazzjonijiet LSC UDS.
         Ir-riżultati kollha għandhom ikunu kkonfermati f’esperiment indipendenti.
         2.   ID-DATA
         Id-data għandha tkun ippreżentata f’forma ta’ tabelli.
         2.1.   DETERMINAZZJONIJIET AWTORADJOGRAFIĊI
         L-ammont ta’ 3H-TdR inkorporat fiċ-ċitoplasma u n-numru ta’ frak li jinstabu fuq in-nukleu taċ-ċellula għandhom ikunu miktubin separati.
         Il-medja, il-medjan u l-mode jistgħu jintużaw biex jiddeskrivu d-distribuzzjoni tal-miżura ta’ 3H-TdR inkorporat fiċ-ċitoplasma u n-numru ta’ frak għal kull nukleu.
         2.2.   DETERMINAZZJONIJIET LSC
         Għal determinazzjonijiet LSC, l-inkorporazzjoni ta’ 3H-TdR għandha tkun irrapportata bħala dpm/μg DNA. Il-medja dpm/μg DNA b’devjazzjoni standard tista’ tintuża biex tiddeskrivi d-distribuzzjoni ta’ l-inkorporazzjoni.
         Id-data għandha tkun evalwata bl-użu ta’ metodi statistiċi xierqa.
         3.   IR-RAPPURTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     iċ-Ċelloli użati, id-densità u n-numru tal-passaġġ waqt it-trattament, in-numru ta’ kulturi ta’ Ċelloli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-metodi użati biex jinżammu l-kulturi taċ-Ċelloli inklużi l-mezzi, it-temperatura u l-konċentrazzjoni ta’ CO2;
                  
               
                     —
                  
                  
                     is-sustanza tat-test, il-vettura, il-konċentrazzjonijiet u r-raġuni għas-selezzjoni tal- konċentrazzjonijiet użati fl-analiżi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-dettalji tas-sistemi għall-attivazzjoni metabolika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-iskeda għat-trattament;
                  
               
                     —
                  
                  
                     kontrolli pożittivi u negattivi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     teknika awtoradjografika użata;
                  
               
                     —
                  
                  
                     proċeduri użati biex jitwaqqaf id-dħul ta’ Ċelloli fil-fażi S;
                  
               
                     —
                  
                  
                     proċeduri użati għall-ħruġ ta’ DNA u d-determinazzjoni tal-kontenut totali ta’ DNA fid-determinazzjoni LSC;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-relazzjoni bejn id-doża u r-risposta, fejn possibbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-valutazzjoni statistika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B
         B.19.   ANALIŻI IN VITRO TA’ L-ISKAMBJU TA’ KROMATID OĦT
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   TIFSIRA
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.3.   SUSTANZI GĦAR-REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU GĦAT-TEST
         L-analiżi ta’ l-Iskambju ta’ Kromatid Oħt (SCE) huwa test fuq żmien qasir għall-iskoperta ta’ skambji reċiproki ta’ NA bejn żewġ kromatidi aħwa ta’ kromosoma li tirdoppja. L-SCE’s jirrappreżentaw l-interkambju ta’ prodotti tar-replika tad-DNA f’postijiet li jidhru li huma omologi. Il-proċess ta’ l-iskambju preżumibbilment jinvolvi l-ksur u tgħaqqid mill-ġdid tad-DNA, għalkemm ftit huwa magħruf dwar il-bażi molekulari tiegħu. L-iskoperta ta’ SCE’s teħtieġ xi mod ta’ tikkettjar differenti tal-kromatidi aħwa u dan jista’ jinkiseb bl-inkorporazzjoni ta’ bromodeossiuridina (BrdU) fid-DNA kromosomali għal żewġ ċikli taċ-Ċelloli.
         Ċelloli mammiferi in vitro huma esposti għall-kimika tat-test b’s-sitema għall-attivazzjoni metabolika esoġena mammifera kif ukoll mingħajrha, jekk xieraq, u kkulturati għal żewġ dawriet ta’ repliki f’mezz li fih il-BrdU. Wara t-trattament b’inibitur tal-magħżel (eż. il-kolkiċina) biex ikunu akkumulati ċ-Ċelloli fi stat ta’ mitosi simili għall-metafasi (c-metafasi), iċ-Ċelloli huma maħsuda u jsiru l-preparazzjonijiet tal-kromosomi.
         1.5.   KRITERJI GĦALL-KWALITÀ
         Xejn.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.6.1.   Preparazzjonijiet
         
         
                     —
                  
                  
                     Fl-analiżi jistgħu jintużaw kulturi primarji, (limfoċiti tal-bnedmin) jew razez taċ Ċelloli stabbiliti (eż. Ċelloli ovarji tal-ħamsters ċiniżi). Ir-razez taċ-Ċelloli għandhom ikunu kkontrollati għall-kontaminazzjoni tal-Mycoplasma.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Għandhom jintużaw mezzi tal-kultura u kundizzjonijiet ta’ l-inkubazzjoni xierqa (eż. temperatura, reċipjenti għall-kultura, CO2, konċentrazzjoni u umdità),
                  
               
                     —
                  
                  
                     Sustanzi tat-test jistgħu ikunu ppreparati fil-mezzi għall-kultura jew maħlula jew sospiżi f’vetturi xierqa qabel it-trattament taċ-Ċelloli. Il-konċentrazzjoni finali ta’ vettura fis-sistema tal-kultura m’għandhiex taffettwa b’mod sinifikattiv il-vijabilità jew ir-rata ta’ tkabbir taċ-Ċelloli u l-effetti fuq il-frekwenza SCE għandhom ikunu kontrollati b’solvent ta’ kontroll,
                  
               
                     —
                  
                  
                     Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti għas-sustanza tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema għall-attivazzjoni metabolika mammifera esoġena. B’mod alternattiv, meta jintużaw ċelluli b’attività metabolika intrinsika, ir-rata u n-natura ta’ l-attività għandhom ikunu xierqa għall-klassi tal-kimika li tkun qed tiġi ttestjata.
                  
               1.6.2.   Kundizzjonijiet għat-test
         
         
            1.6.2.1.   Numru ta’ kulturi
         
         Għandhom jintużaw għall-inqas kulturi doppji għal kull punt sperimentali.
         
            1.6.2.2.   L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi
         
         Kontrolli pożittivi, li jużaw kemm kompost attiv dirett kif ukoll kompost li jeħtieġ attivazzjoni metabolika, għandhom ikunu inklużi f’kull esperiment; kontroll tal-vettura għandu jintuża ukoll.
         Dawn li ġejjin huma eżempji ta’ sustanzi li jistgħu jintużaw bħala kontrolli posittivi:
         
                     —
                  
                  
                     komposti attivi diretti:
                     
                                 —
                              
                              
                                 etilmetansulfonat,
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     komposti attivi indiretti:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ċiklofosfamida.
                              
                           
               Meta xieraq, kontroll pożittiv addizzjonali ta’ l-istess klassi kimika bħall-kimika fit-test jista’ jkun inkluż.
         
            1.6.2.3.   Konċentrazzjonijiet ta’ l-espożizzjoni
         
         Għandhom jintużaw għall-inqas tlett konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test mqassma b’mod adegwat. L-ogħla konċentrazzjoni għandha toħloq effett tossiku sinifikanti iżda xorta għandha tippermetti r-replika adegwata taċ-Ċelloli. Sustanzi li relattivament ma jinħallux fl-ilma għandhom ikunu ttestjati sal-limitu tas-solubilità bl-użu ta’ proċeduri xierqa. Għal sustanzi li m’humhiex tossiċi u li jinħallu faċilment fl-ilma, l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza għattest għandha tkun determinata skond il-każ.
         1.6.3.   Proċedura
         
         
            1.6.3.1.   Preparazzjoni tal-kulturi
         
         Ir-razez taċ-Ċelloli stabbiliti huma ġenerati minn kulturi ta’ l-istokk (eż. bit-tripsinizzazzjoni jew bit-tneħħija), miżrugħin f’reċipjenti tal-kultura f’densità xierqa u inkubati f’37 oC. Għal kulturi b’saff wieħed, in-numru ta’ ċelluli għal kull reċipjent tal-kultura għandu jkun aġġustat sabiex il-kulturi ma jkunux ħafna iktar minn 50 % konfluwenti fiż-żmien tal-ħsad. Alternattivament, iċ-ċelluli jistgħu jintużaw f’kultra ta’ sospensjoni. Il-kulturi tal-limfoċita tal-bnedmin huma mwaqqfa minn demm eparinizzat, bl-użu ta’ tekniċi xierqa, u inkubati f’37 oC.
         
            1.6.3.2.   It-trattament
         
         Iċ-Ċelloli li qegħdin fl-istadju ta’ tkabbir esponenzali huma esposti għas-sustanza tat-test għal perjodi ta’ ħin adegwat; fil-biċċa l-kbira tal-każijiet siegħa jew sagħtejn jistgħu ikunu effettivi, iżda l-ħin tat-trattament jista’ jkun estiż sa żewġ ċikli taċ-Ċelloli f’ċerti każijiet. Ċelluli li m’għandhomx attività metabolika intrinsika suffiċjenti għandhom ikunu esposti għall-kimika tat-test fil-preżenza u fl-assenza ta’ sistema għall-attivazzjoni metabolika xierqa. Fl-aħħar tal-perjodu għall-espożizzjoni, iċ-Ċelloli jinħaslu mis-sustanza tat-test u jiġu kulturati għal żewġ dawriet ta’ replika fil-preżenza ta’ BrdU għall-ħin sħiħ tal-kultura ta’ żewġ ċikli ta’ Ċelloli.
         Kulturi tal-limfoċita tal-bnedmin huma trattati waqt li jkunu f’kundizzjoni semisinkronika.
         Iċ-Ċelloli huma analizzati fit-tieni diviżjoni tagħhom wara t-trattament, bl-assigurazzjoni li l-istadji taċ-ċikli taċ-Ċelloli li huma l-iktar sensittivi kienu esposti għall-kimika. Il-kulturi kollha li huma miżjuda bil-BrdU għandhom ikunu ttrattati fid-dlam jew f’dawl baxx minn lampi inkandexxenti sal-ħsad taċ-Ċelloli sabiex titnaqqas sal-minimu il-fotolisi ta’ DNA li fiha l-BrdU.
         
            1.6.3.3.   Il-ħsad taċ-Ċelloli
         
         Il-kulturi taċ-Ċelloli huma trattati b’inibitur tal-magħżel (eż. l-kolkiċina) bejn siegħa u erba’ siegħat qabel il-ħsad. Kull kultura hija maħsuda u proċessata b’mod separat għall-preparazzjoni tal-kromosomi.
         
            1.6.3.4.   Il-preparazzjoni u t-tilwin tal-kromosomi
         
         Il-preparazzjonijiet tal-kromosomi isiru permezz ta’ tekniċi ċitoġenetiċi standard. It-tilwin ta’ l-islajds biex juru l-SCEs jista’ jsir b’bosta tekniċi, (eż. il-metodu tal-fluworexxenza flimkien ma’ Giemsa).
         
            1.6.3.5.   L-Analiżi
         
         In-numru ta’ Ċelloli analizzati għandu jkun ibbażat fuq il-frekwenza tal-kontroll spontanju ta’ SCE. Is-soltu, għall-inqas 25 metafasi mqassmin sew għal kull kultura huma analizzati għal SCEs. L-islajds jingħataw kodiċi qabel l-analiżi. Fil-limfoċiti tal-bnedmin huma analizzati biss dawk il-metafasijiet li fihom 46 centromeres. F’razez ta’ Ċelloli stabbiliti huma analizzati biss il-metafasijiet li fihom ±2 ċentromeri tan-numru modali. Għandu jkun indikat jekk it-tibdil ċentromeriku tat-tikketta huwa mmarkat bħala SCE. Ir-riżultati għandhom ikunu konfermati f’esperiment indipendenti.
         2.   ID-DATA
         Id-data għandha tkun ippreżentata f’forma ta’ tabelli. In-numru ta’ SCEs għal kull metafasi u n-numru ta’ SCE’s għal kull kromosoma għal kull metafasi għandhom jitniżżlu b’mod separat għall-kulturi kollha trattati u kontrollati.
         Id-data għandha tkun evalwata bl-użu ta’ metodi staitistiċi xierqa.
         3.   IR-RAPPURTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni il ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     Iċ-Ċelloli użati, il-metodi użati biex jinżammu l-kulturi taċ-Ċelloli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-kundizzjonijiet tat-test: il-komposizzjoni tal-mezzi, il-konċentrazzjoni ta’ CO2 il- konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test, il-vettura użata, it-temperatura ta’ l-inkubazzjoni, il-ħin tat-trattament, l-inibitur tal-magħżel użat, il-konċentrazzjoni tiegħu u t-tul tat-trattament bih, it-tip ta’ sistema għall-attivazzjoni mammifera użata, kontrolli pożittivi u negattivi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     In-numru ta’ kulturi ta’ Ċelloli għal kull punt sperimentali;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-dettalji tat-teknika użata għall-preparazzjoni ta’ l-islajds;
                  
               
                     —
                  
                  
                     in-numru ta’ metafasijiet analizzati (id-data għandha tingħata separata għal kull kultura);
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-medja tan-numru ta’ SCE għal kull ċellula u għal kull kromosoma (id-data għandha tingħata separata għal kull kultura);
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kriterji biex jingħad SCE;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-raġuni għall-għażla tad-doża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-relazzjoni bejn id-doża u r-risposta, jekk tapplika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-valutazzjoni statistika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B
         B.20.   TEST REĊESSIV LI JIKKAĠUNA L-MEWT U LI HUWA SKOND IS-SESS F’DROSOPHILA MELANOGASTER
         
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   TIFSIRA
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.3.   SUSTANZI GĦAR-REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU GĦAT-TEST
         It-test reċessiv li jikkaġuna l-mewt u li huwa skond is-sess (SLRL) li juża d- Drosophila melanogaster josserva t-tibdil li jsir, kemm tibdil tal-punt kif ukoll tħassir żgħir, fir-razza tal-mikrobu ta’ l-insett. Dan it-test huwa analiżi tat-tibdil ‘il-quddiem u huwa kapaċi isib tibdil f’madwar 800 post fuq il-kromosoma-X; Dawn jirrappreżentaw madwar 80 % tal-postijiet tal-kromosoma-X. Il-kromosoma-X tirrappreżenta madwar wieħed minn ħamsa tal-ġenomu ta’ l-aplojde kollu.
         Tibdiliet fil-kromosoma-X tad-Drosophila melanogaster huma fenotipikament espressi fl-irġiel li jġorru l-ġene mutanti. Meta t-tibdil jikkaġuna l-mewt fil-kundizzjoni emizigota, il-preżenza tiegħu hija deduċibbli mill-assenza ta’ waħda mill-klassijiet ta’ frieħ tas-sess maskili miż-żewġ klassijiet li s-soltu jkunu prodotti minn mara eterożigota. It-test SLRL jieħu vantaġġ minn dawn il-fatti permezz ta’ kromosomi mmarkati u rranġati b’mod speċjail.
         1.5.   KRITERJI GĦALL-KWALITÀ
         Xejn.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         Preparazzjonijiet
         
            Stokk
         
         Annimali tas-sess maskili ta’ stokk tat-tip salvaġġ definit sew u annimali tas-sess femminili ta’ l-istokk Muller-5 jistgħu jintużaw. Stokk femminili ieħor immarkat b’mod xieraq b’kromosomi multipli maqlubin jistgħu jintużaw ukoll.
         
            Sustanza tat-test
         
         Is-sustanzi tat-test għandhom ikunu maħlulin fl-ilma. Sustanzi li ma jinħallux fl-ilma jistgħu ikunu maħlula jew sospiżi f’vetturi xierqa (eż. taħlita ta’ etanol u Tween-60 jew 80), u mbagħad jinħallu fl-ilma jew fl-ilma bil-melħ qabel ma jkunu amministrati. Id-Dimetilsulfossidu (DMSO) għandu jkun evitat bħala vettura.
         
            In-numru ta’ annimali
         
         It-test għandu jkun iddiżinjat b’sensitività u saħħa predeterminata. Il-frekwenza ta’ tibdil spontanju osservata fil-kontroll xieraq jinfluwenza b’mod qawwi in-numru ta’ kromosomi trattati li għandhom ikunu analizzati.
         
            Ir-rotta ta’ l-amministrazzjoni
         
         L-espożizzjoni tistà tkun orali, b’injezzjoni, jew bl-espożizzjoni għal gassijiet jew fwar. Meta s-sustanza tat-test tittiekel dan jista’ jsir f’soluzzjoni taz-zokkor.
         
            L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi
         
         Kontrolli negattivi (tal-vettura) u pożittivi għandhom ikunu inklużi. Madankollu, jekk tkun disponibbli data xierqa tal-laboratorju dwar kontroll storiku, m’humhiex meħtieġa kontrolli fl-istess ħin.
         
            Livelli ta’ espożizzjoni
         
         Għandhom jintużaw tlett livelli ta’ espożizzjoni. Għal stima preliminary jista’ jintuża livell wieħed ta’ espożizzjoni tas-sustanza tat-test, b’dak il-livell ta’ espożizzjoni li jkun jew il-konċentrazzjoni massima tollerata jew dak li jipproduċi xi indikazzjoni ta’ tossiċità. Għal sustanzi li m’humhiex tossiċi għandha tintuża espożizzjoni għall-ogħla konċentrazzjoni prattikabbli.
         
            Proċedura
         
         L-annimali tas-sess maskili tat-tip salvaġġ (li jkollhom bejn tlieta u ħamest ijiem) huma trattati bis-sustanza u mgħammrin individwalment ma’ eċċess ta’ annimali femminili verġni mill-istokk Muller-5 jew minn stokk ieħor immarkat b’mod xieraq (b’kromosomi X multipli maqlubin). L-annimali femminili ikunu mibdula b’verġni ġodda kull jumejn jew tlett ijiem biex ikun kopert iċ-ċiklu kollu taċ-ċellula tal-mikrobu. Il-frieħ ta’ dawn l-annimali femminili jiġu eżaminati għal effetti li jikkaġunaw il-mewt li jikkorrispondu ma’ l-effetti fuq l-isperma matura, l-ispermatidi fi stadju medju jew tard, l-ispermatidi fi stadju kmieni, spermatoċiti u spermatogonji waqt it-trattament.
         Annimali tas-sess femminili eterozigoti F7 mill-qasmiet msemmija hawn fuq jitħallew jgħammru individwalment (jiġifieri, femminili waħda f’kull kunjett) ma’ l-aħwa tagħhom. Fil-ġenerazzjoni F7, kull kultura tiġi eżaminata għall-assenza ta’ maskili tat-tip salvaġġ. Jekk ikun hemm kultura li tidher li telgħet minn femminili F1 li kienet qed iġġorr letali fil-kromosoma X parentali (jiġifieri ma jkunux osservati maskili bil-kromosoma trattata) il-frieħ femminili ta’ dak l-annimal femminili li għandhom l-istess ġenotip għandhom ikunu ttestjati biex ikun assigurat jekk dik il-possibilità li tikkaġuna l-mewt hijhiex ripetuta fil-ġenerazzjoni ta’ wara.
         2.   ID-DATA
         Id-data għandha tkun fil-forma ta’ tabelli li juru n-numru ta’ kromosomi-X ittestjati, in-numru ta’ annimali maskili li m’humhiex fertili u n-numru ta’ kromosomi li jikkaġunaw il-mewt f’kull konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni u għal kull perjodu ta’ tgħammir għal kull maskil trattat. Għandhom ikunu rrappurtati numri ta’ ġemgħat ta’ daqsijiet differenti għal kull maskil. Dawn ir-riżultati għandhom ikunu kkonfermati f’esperiment separat.
         Għandhom ikunu użati metodi statistiċi xierqa fil-valutazzjoni ta’ testijiet reċessivi li jikkaġunaw il-mewt u li huma skond is-sess. It-tgħaqqid ta’ letali reċessivi li joriġinaw minn maskil wieħed għandhom jitqiesu u jkunu evalwati b’mod statistiku xieraq.
         3.   IR-RAPPURTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni il ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     Stokk: l-istokk jew ir-razez ta’ Drosophilia użati, iż-żmien ta’ l-insetti, in-numru ta’ annimali maskili trattati, in-numru ta’ annimali maskili sterili, in-numru ta’ kulturi F2 stabbiliti, in-numru ta’ kulturi F2 mingħajr prodotti, in-numru ta’ kromosomi li jġorru letali f’kull stadju taċ-ċellula tal-mikrobu;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-kriterji biex ikun stabbilit id-daqs tal-gruppi trattati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-kundizzjonijiet tat-test: deskrizzjoni dettaljata ta’ l-iskeda tat-trattament u tat-teħid tal-kampjuni, il-livelli ta’ l-espożizzjoni, data dwar it-tossiċità, kontrolli negattivi (tas-solvent) u pożittivi, jekk xierqa;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-kriterji biex jingħadd it-tibdil letali;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-relazzjoni bejn l-espożizzjoni u l-effett fejn possibbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     valutazzjoni tad-data;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B
         B.21   TEST TAT-TIBDILTAL-ĠENI F’ĊELLULIMAMMIFERI IN VITRO
         
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   TIFSIRA
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.3.   SUSTANZI TA’ REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Sistemi tal-kultura taċ-Ċelloli mammiferi jistgħu jintużaw għall-iskoperta ta’ tibdil ikkaġunat minn sustanzi kimiċi. Linji taċ-Ċelloli li jintużaw ħafna jinkludu L5178Y ċelluli tal-limfoma tal-ġrieden u l-linji CHO u V-79 taċ-Ċelloli ta’ ħamsters iniżi. F’dawn il-linji taċ-ċelluli is-sistemi li jintużaw l-iktar jikkalkulaw it-tibdil f’thymidine kinase (TK), hypoxanthine guanine phosphorybosyl transferase (HPRT) [21] u NA/K ATPase loci. Is-sistemi ta’ tibdil TK u HPRT isibu t-tibdil ta’ bażi ta’ pari, tibdil frameshift u tħassir żgħir; is-sistema NA/K issib biss it-tibdil ta’ bażi ta’ pari. Ċelloli nieqsin minn thymidine kinase (TK), minħabba t-tibdil ‘l-quddiem TK – T K, huma reżistenti għall-bromodeossiuridina (BrdU), il-fluworodeossiuridina (FdU)jew it-trifluworotimidina (TFT) billi dawn l-antimetaboliti m’humiex inkorporati f’nukleotidi taċ-Ċelloli permezz tas-sistema ta’ l-enzimi tas-‘salvataġġ‘ thymidine kinase; in-nukleotidi meħtieġa għall-metaboliżmu taċ-ċelluli jinkisbu biss minn sintesi de novo. Madankollu, fil-presenza ta’ thymidine kinase BrdU, FdU jew TFT huma inkorporati fin-nukleotidi, bir-riżultat ta’ l-inibizzjoni tal-metaboliżmu taċ-Ċelloli u ċ-ċitotossiċità. B’hekk iċ-Ċelloli mutanti jistgħu jipproliferaw fil-preżenza ta’ BrdU, FdU jew TFT filwaqt li ċ-Ċelloli normali, li fihom it-thymidine kinase, ma jistgħux. B’mod simili, iċ-Ċelloli nieqsin mill-HPRT jintgħażlu skond ir-reżistenza għal 8-ażagwanina (AG) jew 6-tiogwanina (TG). elluli b’ NA/K ATPase alterati jintgħażlu skond ir-reżistenza għall-ouabain. Iċ-ċitotossiċità hija determinata billi jitkejjel l-effett tal-materjal tat-test fuq il-kapaċitajiet għall-formazzjoni tal-kolonji (l-effiċjenza ta’ l-ikklonjar) jew ir-rati tat-tkabbir tal-kulturi. Il-frekwenza tal-mutanti hija determinata billi jinżergħu numri magħrufa ta’ Ċelloli f’mezz li fih l-aġent selettiv għall-iskoperta ta’ Ċelloli mutanti, u f’mezz mingħajr l-aġent selettiv biex ikunu determinati ċ-Ċelloli sopraviventi. Wara perjodu ta’ l-inkubazzjoni xieraq, il-kolonji jingħaddu. Il-frekwenzi tal-mutanti huma mkejjla min-numru ta’ kolonji ta’ mutanti kkoreġuti għas-sopravivenza taċ-Ċelloli.
         1.5.   KRITERJI GĦALL-KWALITÀ
         Xejn
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         Preparazzjonijiet
         
            Ċelloli
         
         Hemm varjetà ta’ linji ta’ Ċelloli disponibbli għall-użu f’din l-analiżi. Dawn jinkludu subkloni ta’ L5178Y, Ċelloli CHO jew Ċelloli V-79 b’sensitività murija għall-mutaġeni kimiċi, effiċjenza għolja ta’ l-ikklonjar u frekwenza baxxa ta’ tibdil spontanju. Iċ-Ċelloli jistgħu ikunu kkontrollati b’mod perjodiku għall-istabilità tal-karjotip u għandhom ikunu kkontrollati għall-kontaminazzjoni tal-Mycoplasma. Jistgħu jintużaw tipi oħra ta’ Ċelloli jekk il-validità tagħhom bħala analiżi tat-tibdil tal-ġeni kkaġunat mill-kimiċi tista’ tkun kompletament dokumentata.
         
            Mezz
         
         Mezzi ta’ kultura u kundizzjonijiet ta’ l-inkubazzjoni xierqa (eż. temperatura, vettura għall-kultura, konċentrazzjonijiet ta’ CO2 u umdità) għandhom jintużaw. Mezzi u sera għandhom jintgħażlu skond is-sistemi selettivi u t-tipi ta’ Ċelloli użati fl-analiżi.
         
            Sustanza tat-test
         
         Sustanzi tat-test jistgħu ikunu ppreparati f’mezzi għall-kultura jew maħlula jew sospiżi f’vetturi xierqa qabel it-trattament taċ-Ċelloli. Il-konċentrazzjoni finali tal-vettura fis-sistema tal-kultura m’għandhiex taffettwa il-vijabilità tar-rata tat-tkabbir.
         
            L-attivazzjoni metabolika
         
         Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti għas-sustanza tat-test kemm fil-preżenza kif ukoll fl-assenza ta’ sistema ta’ l-attivazzjoni tal-metaboliżmu mammiferu esoġenu xierqa. B’mod alternattiv, meta jintużaw tipi ta’ Ċelloli b’attività metabolika intrinsika ir-rata u n-natura ta’ l-attività għandhom ikunu magħrufa li huma xierqa għall-klassi kimika li qed tkun ittestjata.
         Kundizzjonijiet tat-test
         
            L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi
         
         Kontrolli pożittivi, li jużaw kemm kompost attiv dirett kif ukoll kompost li jeħtieġ attivazzjoni metabolika, għandhom ikunu inklużi f’kull esperiment; kontroll negattiv (tal-vettura) għandu jintuża ukoll.
         Dawn li ġejjin huma eżempji ta’ sustanzi li jistgħu jintużaw bħala kontrolli posittivi:
         
                     —
                  
                  
                     komposti attivi diretti:
                     
                                 —
                              
                              
                                 etilmetansulfonat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 hycanthone;
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     komposti attivi indiretti:
                     
                                 —
                              
                              
                                 2-aċetilamminofluworin;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 7,12-dimetilbenżantraċene;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 N-nitrosodimetilammina.
                              
                           
               Meta xieraq, kontroll pożittiv addizzjonali ta’ l-istess klassi kimika bħall-klassi kimika fit-test jista’ jkun inkluż.
         
            Konċentrazzjonijiet ta’ l-espożizzjoni
         
         Għandhom jintużaw bosta konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test. Dawn il-konċentrazzjonijiet għandhom joħolqu effett tossiku skond il-konċentrazzjoni, bl-ogħla konċentrazzjoni li toħloq livell baxx ta’ sopravivenza u bis-sopravivenza fil-konċentrazzjoni l-iktar baxxa li tkun kważi l-istess daqs dik fil-kontroll negattiv. Sustanzi li relattivament ma jinħallux fl-ilma għandhom ikunu ttestjati sal-limitu tas-solubilità bl-użu ta’ proċeduri xierqa. Għal sustanzi li m’humhiex tossiċi u li jinħallu faċilment fl-ilma, l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza għat-test għandha tkun determinata skond il-każ.
         Proċedura
         In-numru ta’ ċelluli użati għal kull kultura għandu jkun skond il-frekwenza ta’ tibdil spontanju; gwida ġenerali hija l-użu ta’ numru ta’ ċelluli vijabbli li huwa għaxar darbiet l-invers tal-frekwenza tat-tibdil spontanju. Iċ-Ċelloli għandhom ikunu esposti għal perjodu ta’ ħin xieraq, fil-biċċa l-kbira tal-każijiet bejn sagħtejn u ħames siegħat huwa effettiv. Ċelluli mingħajr attività metabolika intrinsika suffiċjenti għandhom ikunu esposti għas-sustanza tat-test fil-preżenza u fl-assenza ta’ sistema ta’ attivazzjoni metabolika xierqa. Fl-aħħar tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni, iċ-Ċelloli jinħaslu u jinħelsu mis-sustanza tat-test u jiġu kkultivati biex tkun determinata l-vijabilità u biex tkun tistà sseħħ l-espressjoni tal-fenotip tal-mutant. Fl-aħħar tal-perjodu ta’ l-espressjoni, li għandu jkun biżżejjed biex jippermetti espressjoni fenotipika kważi ottima, iċ-Ċelloli jitkabbru fil-mezz b’aġenti selettivi kif ukoll mingħajr aġenti selettivi għad-determinazzjoni tan-numri ta’ mutanti u l-vijabilità. Ir-riżultati kollha jiġu ikkonfermati f’esperiment indipendenti.
         2.   ID-DATA
         Id-data għandha tkun ippreżentata fil-forma ta’ tabelli. Għandhom ikunu ppreżentati għadd u kontrolli individwali tal-platti għas-sustanza tat-test kemm għall-ikkaġunar tat-tibdil kif ukoll għas-sopravivenza. In-numru medju ta’ kolonji għal kull platt u d-devjazzjoni standard għandhom jingħataw ukoll. Il-frekwenza tat-tibdil għandha tkun espressa bħala n-numru ta’ mutanti skond in-numru ta’ Ċelloli sopraviventi. L-effiċjenzi tas-sopravivenza u ta’ l-ikklonjar huma espressi bħala perċentwali tal-livell tal-kontroll. Id-data għandha tkun evalwata bl-użu ta’ metodi xierqa ta’ l-istatistika.
         3.   IR-RAPPURTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     ir-razza użata, in-numru ta’ kulturi ta’ Ċelloli, il-metodi biex jinżammu l-kulturi taċ-Ċelloli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kundizzjonijiet tat-test: il-komposizzjoni tal-mezzi, il-konċentrazzjoni ta’ CO2, il- konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test, il-vettura użata, it-temperatura ta’ l-inkubazzjoni, it-tul ta’ l-inkubazzjoni, it-tul tal-perjodu għall-espressjoni (inkluż in-numru ta’ Ċelloli miżrugħin u subkulturi u skedi ta’ l-ikel, jekk xierqa), it-tul tat-trattament, id-densità taċ-ċelluli waqt it-trattament is-sistema għall-attivazzjoni metabolika, il-kundizzjonijiet tat-trattament: il-konċentrazzjoni ta’ l-espożizzjoni, il-proċedura u t-tul tat-trattament, it-tip ta’ sistema għall-attivazzjoni metabolika mammifera użata, kontrolli pożittivi u negattivi, l-aġent selettiv użat; ir-raġuni għall-għażla tad-doża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-metodu użat biex ikunu enumerati n-numri ta’ Ċelloli vijabbli u mutanti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     valutazzjoni statistika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B
         B.22.   TEST LETALI DOMINANTI TAL-MAMMALI GERRIEMA
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   TIFSIRA
         Ara l-Introduzzjonii Ġenerali Parti B.
         1.3.   SUSTANZI GĦAR-REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU GĦAT-TEST
         Effetti letali dominanti jikkawżaw il-mewt embrijonika jew tal-fetu. L-induzzjoni ta’ letali dominanti bl-espożizzjoni għal sustanza kimika tindika li s-sustanza affetwat it-tessut ġerminali ta’ l-ispeċi tat-test. Huwa aċċettat b’mod ġenerali li l-letali dominanti huma dovuti għad-dannu kromosomali (anomaliji strutturali u numeriċi). Il-mewt embrijonika jekk ikunu trattati l-annimali femminili tista’ tkun ukoll riżultat ta’ l-effetti tossiċi.
         Ġeneralment, l-annimali tas-sess maskil huma esposti għall-kompost tat-test u mgħammra ma’ annimali tas-sess femminili li huma verġni u li m’humhiex trattati. Id-diversi stadji taċ-ċellula tal-mikrobu jistgħu ikunu ttestjati b’mod separat bl-użu ta’ intervalli sekwenzali fit-tgħammir. Iż-żieda fl-impjanti mejtin f’kull waħda tas-sess femminil fil-grupp trattat diviż bin-numru ta’ impjanti mejtin f’kull waħda tas-sess femminil fil-grupp tal-kontroll turi t-telfa ta’ wara l-impjantazzjoni. It-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni tista’ tkun stimata fuq il-bażi ta’ l-għadd corpora lutea jew billi jitqabblu l-impjanti totali f’kull waħda tas-sess femminili fil-gruppi trattati u tal-kontroll. L-effett letali dominanti totali huwa t-total tat-telf ta’ qabel u ta’ wara l-impjantazzjoni. Il-kalkolu ta’ l-effett letali dominanti totali huwa bbażat fuq it-tqabbil ta’ impjanti ħajjin f’kull waħda mis-sess femminili fil-grupp tat-test ma’ l-impjanti ħajjin f’kull waħda mis-sess femminili fil-grupp tal-kontroll. Tnaqqis fin-numru ta’ impjanti f’ċerti intervalli jista’ jkun ir-riżultat tal-qtil ta’ Ċelloli (jiġifieri spermatoċiti u/jew spermatogonji).
         1.5.   KRITERJI TAL-KWALITÀ
         Xejn
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU GĦAT-TEST
         Preparazzjonijiet
         Meta possibbli, is-sustanzi tat-test għandhom ikunu maħlula jew sospiżi f’soluzzjoni mielħa isotonika. Kimiċi li ma’ jinħallux fl-ilma jistgħu ikunu maħlula jew sospiżi f’vetturi xierqa. Il-vettura użata m’għandhiex tfixkel il-kimika tat-test u lanqas m’ghandha tipproduċi effetti tossiċi. Preparazzjonijiet ġodda tal-kimika tat-test għandhom ikunu użati.
         Kundizzjonijiet tat-test
         
            Rotta ta’ l-amministrazzjoni
         
         Ġeneralment il-kompost tat-test għandu jkun amministrat darba biss. Tista’ tkun użata skeda ta’ trattament ripetuta bbażata fuq informazzjoni tossikoloġika. Ir-rotot normali għall-amministrazzjoni huma l-intubazzjoni orali jew l-injezzjoni fil-peritonew. Rotot oħrajn għall-amministrazzjoni jistgħu ikunu xierqa.
         
            Annimali sperimentali
         
         Ġrieden u firien huma rrakkommandati bħala speċi tat-test. Annimali kompletament maturi fis-sens sesswali u b’saħħithom huma magħżulin bl-addoċċ u assenjati f’gruppi għat-trattament u gruppi tal-kontroll.
         
            In-numru u s-sess
         
         Għandu jintuża numru adegwat mis-sess maskili li huma trattati, u għandu jittieħed qies tal-varjazzjoni spontanja tal-karattru bijoloġiku li jkun qiegħed jiġi evalwat. In-numru magħżul għandu jkun ibbażat fuq is-sensitività pre-determinata ta’ l-osservazzjoni u l-qawwa tas-sinifikazzjoni. Per eżempju f’test tipiku, in-numru ta’ annimali tas-sess maskili f’kull grupp ta’ doża għandu jkun biżżejjed biex jipprovdu bejn 30 u 50 annimali nisa tqal f’kull intervall ta’ tgħammir
         
            L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi
         
         Ġeneralment għandhom ikunu inklużi f’kull esperiment kontrolli pożittivi u negattivi (vettura). Meta jkunu disponibbli riżultati ta’ kontrolli pożittivi minn esperimenti li saru reċentement fl-istess laboratorju dawn ir-riżultati jistgħu jintużaw minflok kontroll pożittiv fl-istess ħin. Sustanzi ta’ kontroll pożittiv għandhom jintużaw f’doża baxxa xierqa (eż. MMS, fil-peritonew, f’10 mg/kilogramma) biex tkun murija s-sensitività tat-test.
         
            Livell tad-doża
         
         Normalment, għandhom jintużaw tliet livelli ta’ doża. Id-doża l-għolja għandha tipproduċi sinjali ta’ tossiċità jew fertilità mnaqqsa f’annimali trattati. F’ċerti każijiet doża waħda ta’ livell għoli tistà tkun suffiċjenti.
         
            Test tal-limitu
         
         Sustanzi li m’humhiex tossiċi għandhom ikunu ttestjati b’5 g/kilogramma b’amministrazzjoni waħda jew b’1 g/kilogramma/jum b’amministrazzjoni ripetuta.
         Proċedura
         Bosta skedi ta’ trattament huma disponibbli. L-iktar użata hija l-amministrazzjoni waħda tas-sustanza tat-test. Jistgħu jintużaw skedi oħrajn tat-trattament.
         Annimali individwali tas-sess maskil huma mgħammrin sekwenzalment ma’ waħda jew żewġ annimali tas-sess femminili li huma verġni u li m’humhiex trattati, f’intervalli xierqa wara t-trattament. Annimali femminili għandhom jitħallew ma’ dawk maskili għall-inqas għat-tul ta’ ciklu estrus wieħed jew sakemm iseħħ it-tgħammir kif determinat bil-preżenza ta’ l-isperma fil-vaġina jew bil-preżenza ta’ tapp vaġinali.
         In-numru ta’ tgħammir wara t-trattament huwa ggvernat bl-iskeda tat-trattament u għandu jassigura li jkun hemm kampjun ta’ l-istadji kollha taċ-Ċelloli tal-mikrobu wara t-trattament.
         L-annimali femminili huma sagrifikati fit-tieni parti tat-tqala u l-kontenut ta’ l-utru huwa eżaminat biex ikun determinat in-numru ta’ impjanti mejtin u ħajjin. L-ovarji jistgħu ikunu eżaminati biex ikun determinat in-numru ta’ corpora lutea.
         2.   ID-DATA
         Id-data għandha tkun f’forma ta’ tabelli biex turi n-numru ta’ annimali maskili, in-numru ta’ femminili tqal, u n-numru ta’ annimali femminili li m’humhiex tqal. Ir-riżultati ta’ kull tgħammir, inkluża l-identità ta’ kull animal maskil u feminili. Għandhom ikunu rrappurtati b’mod individwali. Għal kull animal femminili, il-ġimgħa tat-tgħammir, il-livell tad-doża li ngħatat lill-annimal maskil, il-frekwenza ta’ impjanti ħajjin u ta’ impjanti mejtin għanhom ikunu imniżżla.
         Il-kalkolu ta’ l-effett letali dominanti totali huwa bbażat fuq it-tqabbil ta’ l-impjanti ħajjin għal kull annimal femminili fil-grupp tat-test ma’ l-impjanti ħajjin għal kull animal femminili fil-grupp ta’ kontroll. Il-proporzjon ta’ l-impjanti mejtin għal dawk ħajjin mill-grupp tat-trattament mqabbel ma’ l-istess proporzjon mill-grupp tal-kontroll huwa analizzat biex juri t-telf ta’ wara l-impjantazzjoni.
         Jekk id-data tkun imniżżla bħala mewt kmieni jew tard, it-tabelli għandhom jagħmluha ċara. Jekk it-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni ikun stimat, għandu jkun irrappurtat. It-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni jista’ jkun ikkalkulat bħala diskrepanza bejn in-numru ta’ corpora lutea u n-numru ta’ impjanti jew bħala tnaqqis in-numru medju ta’ impjanti għal kull uteru meta mqabbel ma’ tgħammir ta’ kontroll.
         Id-data għandha tkun evalwata bl-użu ta’ metodi statistiċi xierqa.
         3.   IR-RAPPURTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     l-ispeċi, ir-razza, iż-żmien u l-piż ta’ l-annimali użati, in-numru ta’ annimali ta’ kull sess fil-gruppi ta’ sperimentazzjoni u kontroll;
                  
               
                     —
                  
                  
                     is-sustanza tat-test, il-vettura, il-livelli tad-doża ttestjati u r-raġuni għall-għażla tad-doża, kontrolli pożittivi u negattivi, data dwar it-tossiċità;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-rotta u l-iskeda tat-trattament;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-iskeda tat-tgħammir;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-metodu użat biex ikun determinat li sar it-tgħammir;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin tas-sagrifiċċju;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kriterji biex jingħaddu letali dominanti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-relazzjoni bejn id-doża u r-risposta, jekk tapplika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     valutazzjoni statistika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B
         B.23.   TEST DWAR ANORMALITÀ FIL-KROMOŻOMI SPERMATOGONI TAL-MAMMIFERI
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 483, Test dwar Anormalità fil-Kromożomi Spermatogoni tal-Mammiferi (1997).
         1.1.   INTRODUZZJONI
         L-għan tat-test in vivo dwar anormalitajiet fil-kromożomi spermatogoni tal-mammiferi huwa biex jiġu identifikati sustanzi li jikkawżaw anormalitajiet strutturali fil-kromożomi fiċ-Ċelloli spermatogoni tal-mammiferi (1) (2) (3) (4) (5). Anormalitajiet strutturali jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomi jew kromatidi. Fil-maġġoranza ta' mutaġeni kimiċi, anormalitajiet imġiegħela huma tat-tip kromatidu, iżda jirrikorru wkoll anormalitajiet tat-tip ta' kromożomi. Dan il-metodu mhux intiż biex jitkejlu l-anormalitajiet numeriċi u ma jintużax bħala rutina għal dak il-għan. Mutazzjonijiet fil-kromożomi u ġrajjiet relatati huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem.
         Dan it-test ikejjel l-ġrajjiet tal-kromożomi fiċ-Ċelloli spermatogoni u, għalhekk, hu maħsub li jipprevedi l-mutazzjonijiet ġenetiċi fiċ-ċelluli ġerminali.
         Annimali gerriema jintużaw generalment f'dan it-test. Dan it-test ċitoġenetiku jiżvela anormalitajiet fil-kromożomi f'mitosi spermatogoni. Ċelloli oħra mmirati mhumix l-oġġett ta' dan il-metodu.
         Sabiex jiġu żvelati anormalitajiet tat-tip kromatid f'Ċelloli spermatogoni, għandha tiġi eżaminata l-ewwel diviżjoni taċ-ċellula mitotika qabel ma jintilfu dawn il-leżjonijiet f'diviżjonijiet sussegwenti taċ-Ċelloli. Tista’ tinkiseb informazzjoni addizzjonali minn Ċelloli spermatogoni trattati bl-analisi tal-kromożomi mejotiċi għal anormalitajiet tat-tip tal-kromożomi fil-metafażi tad-dijakinesis I meta ċ-Ċelloli ttrattati jsiru spermatoċiti.
         Dan it-test in vivo huwa intiż biex jinvestiga jekk mutaġeni ta' Ċelloli somatiċi jkunux attivi f'Ċelloli ġerminali. B'żieda ma' dan, it-test spermatogonu huwa rilevanti fil-valutazzjoni ta' perikli mutaġeniċi għax jippermetti l-kunsiderazzjoni ta' fatturi ta' metaboliżmu in vivo, farmakokinetika u proċessi ta' tiswija ta' DNA.
         Jeżisti numru ta' ġenerazzjonijiet ta' spermatogoni fit-testikoli bi spettru ta' sensitività għat-trattament kimiku. Għalhekk, l-anormalitajiet żvelati jirrappreżentaw rispons medju ta' popolazzjonijiet ta' Ċelloli spermatogoni ttrattati, bi predominanza ta' Ċelloli spermatogoni differenzati li jkunu aktar numerużi. Skond il-posizzjoni tagħhom fit-testikoli, ġenerazzjonijiet differenti ta' spermatogoni jistgħu jew ma jistgħux ikunu esposti għal ċirkolazzjoni ġenerali, minħabba fil-barriera fiżika u fiżjoloġika ta' ċelluli Sertoli u l-barriera ematotestikolari.
         Jekk hemm xiedha li s-sustanza tat-test, jew metabolit reattiv, ma jwasslux għat-tessut immirat, mhux xieraq li jintuża dan it-test.
         Ara ukoll Introduzzjoni ġenerali Taqsima B.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Anormalità tat-tip kromatidu: ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u għaqda mill-ġdid bejn kromatidi.
         
            Anormalità tat-tip tal-kromożomi: ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur, jew ksur u għaqda mill-ġdid, taż-żewġ kromatidi f'sit identiku.
         
            Vojt: leżjoni akromatika iżgħar mill-wisgħa ta' kromatid wieħed, u b'misallinjament minimu tal-kromatidi.
         
            Anormalità numerika: bidla fin-numru ta' kromożomi min-numru karatteristku normali ta' Ċelloli utilizzati.
         
            Poliplojdi: multiplu tan-numru aplojdu ta' kromożomi (n) minbarra n-numru diplojdu (jiġifieri 3n, 4n, eċċetera).
         
            Anormalità strutturali: bidla fl-istruttura tal-kromożomi li wieħed jinduna biha bl-eżami mikroskopiku ta' l-istadju metafażiku tad-diviżjoni ta' ċelluli, osservati bħala tħassir u biċċiet, bidliet minn ġewwa u bidliet bejniethom.
         1.3.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Annimali huma esposti għas-sustanza tat-test b'rotta xierqa ta' espożizzjoni u huma sakrifikati f'ħinijiet xierqa wara t-trattament. Qabel ma jiġu sakrifikati, l-annimali huma ttrattati b'sustanza li twaqqaf il-metafażi (eż. kolċiċina jew Colcemid®). Imbagħad isiru preparazzjonijiet ta' kromożomi miċ-Ċelloli ġerminali u jiġu mtebbgħin, u ċ-Ċelloli metafażiċi jiġu analizzati għal anormalitajiet fil-kromożomi.
         1.4.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.4.1.   Preparazzjonijiet
         1.4.1.1.   Selezzjoni ta' l-ispeċi ta' l-annimali
         Normalment jintużaw ħamsters ċiniżi u ġrieden. Madankollu, jistgħu jintużaw l-annimali maskili ta' speċi oħra ta' mammiferi xierqa. Għandhom jintużaw razez, li komunement jintużaw fil-laboratorji, ta' annimali adulti b'saħħithom u żgħar. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali għandha tkun minima u ma teċċedix ± 20 % tal-medja tal-piż.
         1.4.1.2.   Kundizzjonijiet ta' fejn jinżammu u x'jieklu
         Għandhom japplikaw il-kundizzjonijiet ġenerali msemmija fl-Introduzzjoni ġenerali għat-Taqsima B iżda l-mira dwar l-umdità għandha tkun 50-60 %.
         1.4.1.3.   Preparazzjoni ta' l-annimali
         Annimali adulti żgħar u b'saħħithom jiġu assenjati mingħajr skema għall-gruppi ta' kontroll u trattament. Il-gaġeġ għandhom jitqiegħdu b'tali mod li jiġu minimizzati effetti possibbli li jirriżultaw minn kif jitqiegħdu l-gaġeġ. L-annimali jiġu identifikati wieħed wieħed. L-annimali jiġu akklimatizzati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju għall-inqas għal ħamest ijiem qabel ma jibda l-istudju.
         1.4.1.4.   Preparazzjoni tad-dożi
         Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewwbin jew sospiżi f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta' l-annimali. Sustanzi likwidi tat-test jistgħu jiġu ttrattati direttament jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix laċċettabbilità tal-ħażna.
         1.4.2.   Kundizzjonijiet tat-test
         1.4.2.1.   Solvent/mezz
         Is-solvent/mezz ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli ta' doża użata, u ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika mas-sustanza tat-test. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra minflok dawk l-aktar magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Hu rakkomandat li kemm jista’ jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akkwuż.
         1.4.2.2.   Kontrolli
         Għandhom jiġu inklużi f'kull test kontrolli pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom jiġu trattati bl-istess mod bħall-annimali fil-grupp ta' trattament.
         Il-kontrolli pożittivi għandhom jipproduċu anormalitajiet strutturali fil-kromożomi in vivo fiċ-Ċelloli spermatogoni meta jiġu somministrati f'livelli ta' espożizzjoni li huma mistennija li jagħtu żieda li tkun tidher fuq l-isfond.
         Dożi ta' kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tad-dijapożitivi kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettat li l-kontroll pożittiv jiġi somministrat minn rotta differenti minn dik tas-sustanza tat-test u jittieħed kampjun darba waħda biss. Barra minn dan, jista’ jiġi kkunsidrat l-użu ta' kimiċi ta' kontroll pożittivi relatati mal-klassi ta' kimiċi, meta dawn ikunu disponibbli. Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll pożittivi jinkludu:
         
                     Sustanza
                  
                  
                     Nru CAS
                  
                  
                     Nru EINECS
                  
               
                     Ċiklofosfamid
                     Monojdrat taċ-ċiklofosfamid
                  
                  
                     50-18-0
                     6055-19-2
                  
                  
                     200-015-4
                  
               
                     Ċiklohessilamina
                  
                  
                     108-91-8
                  
                  
                     203-629-0
                  
               
                     Mitomiċin-C
                  
                  
                     50-07-7
                  
                  
                     200-008-6
                  
               
                     Akrilamid monomeriku
                  
                  
                     79-06-1
                  
                  
                     201-173-7
                  
               
                     Trietilenemelamina
                  
                  
                     51-18-3
                  
                  
                     200-083-5
                  
               Il-kontrolli negattivi, trattati biss bis-solvent jew bil-mezz, u mod ieħor trattati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, għandhom jiġu inklużi għal kull perjodu ta' teħid ta' kampjuni, sakemm ma jkunux disponibbli varjabbilità aċċettabbli bejn l-annimali u frekwenżi ta' Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromożomi mill-informazzjoni storika tal-kontroll. Barra minn dan, għandhom jintużaw ukoll kontrolli mhux trattati sakemm ma jkunx hemm informazzjoni ta' kontroll pubblikata u storika li turi li jkun hemm effetti ta' ħsara u mutaġeniċi bl-uzu tas-solvent/mezz magħżul.
         1.5.   PROĊEDURA
         1.5.1.   Numru ta' l-annimali
         Kull grupp ta' trattament u ta' kontroll għandu jinkludi fih għall-inqas ħames annimali maskili analizzabbli
         1.5.2.   Skeda tat-trattament
         Is-sustanzi tat-test huma preferibbilment somministrati darba jew tnejn (jiġifieri bħala trattament singolu jew żewġ trattamenti). Is-sustanzi tat-test jistgħu wkoll jiġu somministrati bħala doża maqsuma, jiġifieri żewġ trattamenti fl-istess ġurnata separati b'mhux aktar minn ftit sigħat, biex tiġi faċilitata s-somministrazzjoni ta' volum qawwi ta' materjal. Reġimi ta' dożi oħra għandhom ikunu ġustifikati xjentifikament.
         Fil-grupp ta' l-ogħla doża jittieħdu żewġ kampjuni wara t-trattament. Ladarba l-kinetika taċ-ċikli taċ-Ċelloli tista’ tiġi influwenzata bis-sustanza tat-test, jintużaw ħinijiet għat-teħid ta' kampjuni wieħed bikri u l-ieħor tard madwar 24 u 48 siegħa wara t-trattament. Għal dożi ogħla mill-l-ogħla doża għandu jittieħed żin ta' teħid ta' kampjun ta' 24 siegħa jew ta' 1,5 it-tul taċ-ċiklu ta' ċellula wara t-trattament, sakemm ma jkunx magħruf li jkun hemm ħin ta' teħid ta' kampjun ieħor aktar xieraq għall-iżvelar ta' l-effetti.
         B'żieda ma' dan, jistgħu jintużaw ħinijiet ta' teħid ta' kampjun oħra. Per eżempju fil-każ ta' kimiċi li jistgħu jikkawżaw telf ta' kromożomi, jew jistgħu jkollhom effetti indipendenti mill-fażi S, kull wieħed mill-ħinijiet ta' teħid ta' kampjuni huwa xieraq.
         Il-konvenjenza ta' skeda ta' trattament ripetut għandha tiġi identifikata fuq bażi ta' każ b'każ. Wara skeda ta' trattament ripetut l-annimali għandhom imbagħad jiġu sakrifikati 24 siegħa (1,5 tul ta' ċiklu ta' ċellula) wara l-aħħar trattament. Jistgħu jintużaw ħinijiet ta' teħid ta' kampjun addizzjonali meta jkun xieraq.
         Qabel is-sagrifiċċju, l-annimali huma injettati intraperitonalment b'doża xierqa ta' sustanza li twaqqaf l-metafażi (eż. Colcemid® jew kolċiċina). Wara dan, jittieħed kampjun mill-annimali f'intervalli xierqa. Għall-ġrieden dan l-intervall huwa ta' madwar 3-5 siegħat; għal Ħamsters ċiniżi dan l-intervall huwa ta' madwar 4-5 siegħat.
         1.5.3.   Livelli ta' doża
         Jekk jitwettaq studju biex tiġi skoperta l-medda għax ma jkunx hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, jintużaw l-istess speċi, razza, sess u metodu ta' trattament li għandhom jintużaw fl-istudju prinċipali (7). Jekk ikun hemm tossiċità, jintużaw tliet livelli ta' doża għall-ewwel perjodu ta' teħid ta' kampjuni. Dawn il-livelli ta' doża għandhom jkopru medda mill-massimu għal ftit jew l-ebda tossiċità. L-ogħla doża hija mfissra bħala s-sinjali ta' tossiċità li jipproduċu d-dożi hekk li livelli ogħla tad-doża, bbażati fuq l-istess reġim ta' dożaġġ, huma mistennija li jikkawżaw il-mewt.
         Is-sustanzi b'attivitajiet bijoloġiċi speċifiċi f'dożi baxxi mhux tossiċi (bħal ma huma ormoni u nitroġeni) jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' l-issettjar tad-dożi u għandhom jiġu valutati fuq bażi ta' każ b'każ. L-ogħla doża tista’ ukoll tfisser id-doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossiċità fiċ-Ċelloli spermatogoni (eż. riduzzjoni fil-paragun bejn mitosi spermatogoni u l-ewwel jew it-tieni metafasi mejotika; din ir-riduzzjoni ma għandhiex teċċedi 50 %).
         1.5.4.   Test tal-limitu
         Jekk test ta' doża waħda ta' livell ta' għall-inqas 2 000 mg/kg piż tal-ġisem/ġurnata meta jitwettaq trattament wieħed, jew bħala żewġ trattamenti fl-istess ġurnata, ma jipproduċix effetti tossiċi li wieħed jinduna bihom, u jekk ma tkun mistennija l-ġenotossiċità fuq il-bażi ta' l-informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx li jkun neċessarju li jsir studju komplet bl-użu ta' tliet livelli ta' dożaġġ. L-espożizzjoni umana mistennija tista’ tindika l-ħtieġa ta' livell ogħla ta' doża li għandu jintuża fit-test tal-limitu.
         1.5.5.   Somministrazzjoni ta' dożi
         Normalment is-sustanza tat-test tiġi somministrata b'gavage billi jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni, jew bl-injezzjoni intraperitonali. Fejn ikunu ġustifikati, jistgħu jiġu aċċettati rotot oħra ta' espożizzjoni. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jiġi somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f'ħin wieħed jiddependi fuq il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux ikun aktar minn 2 ml/100g piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ogħla minn dawn għandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-każ ta' sustanzi li jirritaw jew korrożivi li normalment juru effetti aggravati b'konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbilita fil-volum tat-test għandha titnaqqas bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti fuq il-livelli kollha tad-doża.
         1.5.6.   Preparazzjoni tal-kromożomi
         Minnufih wara s-sagrifiċċju, jinkisbu s-sospensjonijiet taċ-Ċelloli minn test wieħed jew miż-żewġ testijiet, esposti għal soluzzjoni ipotonika u ffissati. Iċ-Ċelloli imbagħad jinfirxu fuq dijapożitivi u jingħataw kulur.
         1.5.7.   Analiżi
         Għandhom jiġu analizzati għall-inqas 100 metafażi mferxin sew għal kull annimal (jiġifieri minimu ta' 500 metafażi kull grupp). Dan in-numru jista’ jitnaqqas meta jiġi nnotat għadd kbir ta' anormalitajiet. Id-dijapożitivi kollha, inklużi dawk ta' kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati indipendentement qabel l-analiżi mikroskopika. Billi l-proċeduri ta' fissazzjoni jirriżultaw ħafna drabi fil-ksur ta' għadd ta' metafażi bit-telf ta' kromożomi, iċ-Ċelloli li jingħaddu għandu għalhekk ikun fihom numru ta' ċentromeri ugwali għan-numru 2n ± 2.
         2.   DATA
         2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         L-informazzjoni dwar annimali individwali għandha tingħata f'forma ta' tabella. L-unità sperimentali hija l-annimal. Għal kull annimal għandhom jiġu valutati n-numru ta' Ċelloli b'anormalitajiet strutturali tal-kromożomi u in-numru ta' anormalitajiet fil-kromożomi f'kull ċellula. Għandhom jiġu elenkati t-tipi differenti ta' anormalitajiet strutturali fil-kromożomi bl-għadd u l-frekwenzi tagħhom għal gruppi ta' trattament u ta' kontroll. Il-vojt jiġi reġistrat separatament u jsir rapport dwaru iżda ġeneralment ma jiġix inkluż fil-frekwenza totali ta' l-anormalità.
         Jekk tiġi osservata l-mitosi kif ukoll il-mejosi, il-paragun bejn mitosi spermatogoni u l-ewwel u t-tieni metafażi mejotiċi għandu jiġi determinat bħala misura ta' ċitossiċità għall-annimali kollha trattati u ta' kontroll negattiv f'kampjun totali ta' 100 ċellula divisibbli għal kull annimal biex jiġi stabbilit l-effett ċitotossiku possibbli. Jekk tiġi osservata mitosi biss, l-indiċi tal-mitosi għandu jiġi determinat f'għall-inqas 1 000 ċellula għal kull annimal.
         2.2.   VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Hemm ħafna kriterji biex jiġi stabbilit riżultat pożittiv, bħal ma hi żieda relatata mad-doża fl-għadd relattiv ta' Ċelloli b'anormalitajiet fil-kromożomi jew żieda ċara fin-numru ta' Ċelloli b'anormalitajiet fi grupp singolu ta' trattament fi żmien singolu ta' teħid ta' kampjuni. L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika tar-riżultati. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet (8), jistgħu jintużaw metodi ta' statistika. L-importanza ta' l-istatistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur determinanti għal riżultat pożittiv. Riżultati ekwivoċi għandhom jiġu ċċarati b'testijiet ulterjuri preferibilment billi tintuża modifika tal-kundizzjonijiet ta' l-esperiment.
         Sustanza ta' test li dwarha r-riżultati ma jilħqux il-kriterji fuq imsemmija titqies bħala mhux mutaġenika f'dan it-test.
         Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ekwivoċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ruħu l-esperiment.
         Ir-riżultati pożittivi minn test in vivo ta' anormalitajiet fil-kromożomi spermatogoni jindikaw li s-sustanza tat-test toħloq anormalitajiet strutturali fiċ-Ċelloli ġerminali ta' l-ispeċi ttestjata. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, taħt il-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx anormalitajiet fiċ-Ċelloli ġerminali ta' l-ispeċi ttestjata.
         Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test jew il-metaboliti tagħha jilħqu t-tessut immirat.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Solvent/mezz:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Annimali ttestjati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 speċi/razza użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru u età ta' l-annimali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 għejun, kundizzjonijiet dwar fejn jinżammu, dieta, eċċ.;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inkluża l-medda ta' piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard għal kull grupp.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 raġuni prinċipali għall-għażla ta' livell tad-doża;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 raġjuni prinċipali għall-ħinijiet tas-sagrifiċċju;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 konverżjoni mill-konċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test dieta/ilma għax-xorb għad doża attwali (mg/kg piż tal-ġisem/jum) jekk tkun applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u teħid ta' kampjuni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi biex titqies it-tossiċità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 identità tas-sustanza li twaqqaf il-metafażi, il-konċentrazzjoni tagħha u kemm idum it-trattament;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi tal-preparazzjoni tad-dijapożitivi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kriterji għall-għadd ta' anormalitajiet;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru ta' Ċelloli analizzati kull annimal;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 sinjali ta' tossiċità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 indiċi mitotiku;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 paragun bejn mitosi spermnatogoni u l-ewwel u t-tieni metafasi mejotiċi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tip u numru ta' anormalitajiet, mogħtija separatament għal kull annimal;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru totali ta' anormalitajiet għal kull grupp;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn ikun possibbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 analiżi statistiċi, jekk ikun hemm;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin negattiv;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni storika dwar kontroll negattiv (solvent/mezz), bil-meded, mezzi u devjazzjonijiet standard;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar kontroll fl-istess ħin pożittiv;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 bidliet fil-plojdi, jekk jidhru.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni dwar ir-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Adler, I. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, pp. 477-484.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Adler, I. D., (1984), Cytogenetic tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, (ed.) S. Venitt and J. M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air-drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cytogenetics and Cell Genetics, 3, pp. 289-294.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, Mutation Res., 52, pp. 207-209.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Adler, I. D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994), International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res., 312, pp. 313-318.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clarc, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
                  
               B.24.   TEST TAT-TIKEK FIL-PIL TAL-ĠRIEDEN
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   TIFSIRA
         Ara l-Introduzzjonii Ġenerali Parti B.
         1.3.   SUSTANZI GĦAR-REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU GĦAT-TEST
         Dan huwa test in vivo tal-ġrieden li fih l-embriju li jkun qed jiżviluppa jkun espost għall-kimika. Iċ-Ċelloli li għalihom huwa mmirat it-test fl-embrija li jkun ċed jiżviluppa huma l-melanoblasts, u l-ġeni mmirati huma dawk li jikkontrollaw il-pigmentazzjoni tal-pil. L-embriji li jkunu qed jiżviluppaw huma eterozigoti għal numru ta’ dawn il-ġeni tal-kulur tal-pil. Tibdil fil-, jew telf ta’ (b’varjetà ta’ eventi ġenetiċi), l-allel dominanti ta’ din il-ġene f’melanoblast jirriżulta fl-espressjoni tal-fenotip reċessiv fiċ-Ċelloli dixxendenti, li tikkostitwixxi tikka ta’ kulur mibdul fil-pil tal-ġurdien li jirriżulta. In-numru ta’ frieħ b’dawn it-tikek, tibdil, jingħadd u l-frekwenza tagħhom hija mqabbla ma’ dik fost il-frieħ li jirriżultaw minn embriji trattati bis-solvent biss. It-test tal-ġrieden għat-tikek josserva tibdil somatiku preżunt fiċ-ċelloli tal-fetu.
         1.5.   KRITERJI TAL-KWALITÀ
         Xejn
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU GĦAT-TEST
         Preparazzjonijiet
         Meta possibbli, il-kimiċi tat-test għandhom ikunu maħlula jew sospiżi f’soluzzjoni mielħa isotonika. Kimiċi li ma jinħallux fl-ilma jiġu maħlula jew sospiżi f’vetturi xierqa. Il-vettura użata m’għandhiex tfixkel il-kimika tat-test jew tipproduċi effetti tossiċi. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda tal-kimika tat-test.
         
            Annimali sperimentali
         
         Il-ġrieden tar-razza T (nonagouti, a/a; ċinċilla, ta’ l-għajn roża, cchp/cchp; kannella, b/b; dilwiti, ta’ widnejhom qosra, d se/d se; animal b’tikek fil-pil ta’ żewġ ilwien, s/s) huma mgħammra jew mar-razza HT (pallidi, nonagouti, brakjopodi, pa a bp/pa a bp; tentuxi griż, ln fz/ln fz; perla pe/pe) jew ma’ C57 BL (nonagouti, a/a). Qasmiet xierqa oħrajn bħal bejn NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) u DBA (nonagouti, a/a; kannella, b/b; dilwiti d/d) jistgħu jintużaw jekk jipproduċu frieħ nonagouti.
         
            In-numru u s-sess
         
         Għandhom ikunu trattati biżżejjed annimali femminili tqal biex jipprovdu numru xieraq ta’ frieħ li jgħixu għal kull livell tad-doża użata. Id-daqs xieraq tal-kampjuni huwa skond in-numru ta’ tikek osservat fil-ġrieden trattati u l-iskala ta’ data ta’ kontroll. Riżultat negattiv huwa aċċettabbli biss meta jingħaddu għall-inqas 300 ferħ minn annimali tas-sess femminili trattati bl-ogħla doża.
         
            L-użu ta’ kontrolli negattivi u pożittivi
         
         Għandha tkun disponibbli data ta’ kontroll fl-istess ħin minn ġrieden trattati bil-vettura biss (kontrolli negattivi). Data storika ta’ kontroll mill-istess laboratorju jista’ jintuża biex tiżdied is-sensitività tat-test jekk ikunu omoġenji. Data ta’ kontroll pożittiv miksuba reċentement fl-istess laboratorju għal trattament b’kimika magħrufa li turi l-mutaġeniċità b’dan it-test għandha tkun disponibbli jekk l-ebda mutaġeniċità tal-kimika tat-test ma tkunx osservata.
         
            Rotta ta’ l-amministrazzjoni
         
         Ir-rotot normali ta’ l-amministrazzjoni huma l-intubazzjoni orali jew l-injezzjoni fil-peritonew ta’ l-annimali tas-sess femminili li huma tqal. It-trattament permezz tat-teħid bin-nifs jew rotot oħra ta’ l-amministrazzjoni huma użati meta xierqa.
         
            Livelli tad-doża
         
         Huma użati għall-inqas żewġ livelli tad-doża inkluża waħda li turi sinjali ta’ tossiċità jew daqs iżgħar tal-boton. Għal kimiċi li m’humhiex tossiċi għandha tkun użata espożizzjoni għall-ogħla doża prattikabbli.
         Proċedura
         Ġeneralment jingħata trattament wieħed fil-ġurnata 8, 9 jew 10 tat-tqala, u l-ġurnata meta kien osservat it-tapp vaġinali għall-ewwel darba tingħadd bħala ġurnata waħda. Dawn il-ġranet jikkorrispondu ma’ 7,25, 8,25, u 9,25 ġurnata wara l-konċepiment. Jistgħu jintużaw trattamenti suċċessivi f’dawn il-ġranet.
         
            Analiżi
         
         Il-frieħ jingħataw kodiċi u jiġu eżaminati għat-tikek bejn tlieta u erba’ ġimgħat wara t-twelid. Hemm tlett klassijiet ta’ tikek li jingħażlu:
         
                     (a)
                  
                  
                     tikek bojod sa 5 mm mil-linja f’nofs iż-żaqq li huma preżunti li jirriżultaw mill-qtil taċ-Ċelloli (WMVS);
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     tikek sofor, li jixbħu lill-agouti, assoċjati mal-mammae, l-organi ġenitali, il-griżmejn, mal-partijiet ta’ l-abt u ingwinali u f’nofs il-moħħ, li huma preżunti li jirriżultaw mill-middivrenzar (MDS); u
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     tikek pigmentati u bojod mqassmin bl-addoċċ fuq il-pil li huma preżunti li jirriżultaw minn tibdil somatiku (RS).
                  
               It-tlett klassijiet huma eżaminati kollha imma l-aħħar klassi biss, RS, hija ta’ rilevanza ġenetika. Problemi ta’ distinzjoni bejn MDS u RS jistgħu ikunu solvuti permezz ta’ mikroskopija fluworixxenti ta’ kampjuni tax-xagħar tal-pil.
         Anormalitajiet morfoloġiċi kbar li huma ovvji tal-frieħ għandhom ikunu nnotati.
         2.   ID-DATA
         Id-data għandha tkun ippreżentata bħala numru totali ta’ frieħ eżaminati u n-numru ta’ dawk li għandhom tikka waħda jew iżjed li huma preżunti li huma tikek tat-tibdil somatiku. Data tat-trattament u tal-kontroll negattiv huma mqabbla permezz ta’ metodi xierqa. Id-data hija ppreżentata ukoll fuaq bażi skond il-boton.
         3.   IR-RAPPURTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandhu jkollu, fejn huwa possibbli, l-informazzjoni il ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     ir-razez ta’ l-annimali użati fil-qsim;
                  
               
                     —
                  
                  
                     in-numru ta’ annimali femminili tqal fil-grupp ta’ sperimentazzjoni u ta’ kontroll;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-daqs medju tal-boton tal-frieħ fil-gruppi ta’ sperimentazzjoni u ta’ kontroll fil-ħin tat-twelid u fil-ħin tal-ftim;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-livell/livelli tad-doża tal-kimika tat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Is-solvent użat;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-ġurnata tat-tqala li fiha ngħata t-trattament;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Ir-rotta tat-trattament;
                  
               
                     —
                  
                  
                     In-numru totali ta’ frieħ eżaminat, u n-numru li għandhom WMVS, MDS u RS fil-gruppi ta’ sperimentazzjoni u ta’ kontroll;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Anormalitajiet morfoloġIċI kbar;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Ir-relazzjoni bejn id-doża u r-risposta ta’ l-RS meta possibbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     valutazzjoni statistika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B
         B.25.   IT-TRASLOKAZZJONI TAL-ĠRIEDEN LI TITTIEĦED
         1.   METODU
         1.1   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2   DEFINIZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.3   IS-SOSTANZI TAR-REFERENZA
         Xejn.
         1.4   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         It-test tat-traslokazzjoni tal-ġrieden li tittieħed jiskopri it-tibdiliet strutturali u numeriċi fil-kromożomi fiċ-ċelloli mammarji tal-mikrob kif rkuprati fil-wild ta’ l-annimali ta’ l-ewwel ġenerazzjoni. It-tipi ta’ tibdiliet fil-kromożomi skoperti huma traslokazzjonijiet reċiproċi u, jekk il-wild femminili jkunu inklużi, it-telf tal-kromożom-X. Dawk li jġorru t-traslokazzjonijiet u il-femminili-XO juru fertilità mnaqqsa li hija użata biex jintgħażel il-wild ta’ l-annimali F1 għall-analiżi ċitoġenetika. L-isterilità kompleta hija kkawżata minn ċerti tipi ta’ traslokazzjonijiet (X-autosome u tat-tip c-t). It-traslokazzjonijiet huma osservati ċitoġenetikament fiċ-ċelloli mejotiċi fil-metafażi tad-dijakinesi I ta’ l-individwi maskili, jew irġiel F1jew il-wild irġiel tan-nisa F1. In-nisa-XO huma ċitoġenetikament identifikati mill-presenza ta’ 39 kromożomi biss fil-mitosi tal-mudullun ta’ l-għadma.
         1.5   IL-KRITERJU TAL-KWALITÀ
         Xejn.
         1.6   ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         Il-preparazzjonijiet
         Il-kimiċi tat-testijiet huma maħlulin fl-ilma tal-melħ isotoniku. Jekk ikunu insolubbli dawn jiġu maħlula jew sospiżi fil-vetturi adattati. Is-soluzzjonijiet ippreparati friski tal-kompost tat-test jiġu użati. Jekk vettura hija użata biex ikun faċilitat id-dosaġġ, dan m’għandu ifixkel il-kompost tat-test jew jipproduċi effetti tossiċi.
         
            Il-mod ta’ l-amministrazzjoni
         
         Il-modi ta’ l-amministrazzjoni huma normalment intubazzjoni orali jew injezzjoni fil-peritonew. Il-modi l-oħra ta’ l-amministrazzjoni jistgħu jkunu adattati.
         
            L-annimali ta’ l-esperimentazzjoni
         
         Biex ikunu faċilitat it-tagħmir u l-verifikazzjonijiet ċitoloġika dawn l-esperimenti huma magħmula fuq il-ġrieden. L-ebda razza ta’ ġurdin m’hija meħtieġa. Madanakollu, il-medja tad-daqs tal-boton tar-razza għandu jkun aktar minn tmienja u għandu jkun relattivament kostanti.
         Annimali b’saħħithom u maturi sesswalment huma użati.
         
            In-numru ta’ l-annimali
         
         In-numru ta’ l-annimali neċessarju jiddependi fuq il-frekwenza spontanja tat-traslokazzjoni u r-rata minima ta’ induzzjoni meħtieġa għal riżultati pożittivi.
         It-test huwa normalment magħmul permezz ta’ analiżi tal-wild irġiel F1. Minn ta’ l-anqas 500 wild irġiel F1 għandhom ikunu ttestjati għal kull grupp ta’ doża. Jekk il-wild nisa F1 ikunu nklużi, 300 raġel u 300 mara huma meħtieġa.
         
            L-użu tal-kontrolli negattivi u pożittivi
         
         Id-data adattata tal-kontroll, miksuba mill-kontroll konkorrenti u storiku għandha tkun disponibbli. Meta’ r-riżultati pożittivi aċċettabbli tal-kontroll huma disponibbli mill-esperimenti magħmula riċentement fl-istess laboratorju dawn ir-riżultati jistgħu jkunu użati minflok il-kontroll konkorrenti pożittiv.
         
            Il-livelli tad-doża
         
         Il-livell wieħed tad-doża huwa ttestjat, normalment l-għola doża assoċċjata mal-produzzjoni ta’ l-effetti tossiċi minimi, iżda mingħajr ma’ taffettwa l-aġir riproduttiv jew is-soppravivenza. Biex tkun stabbilita relazzjoni doża/rispons żewġ dożi addizzjonali aktar baxxi huma meħtieġa. Għall-kimiċi li mhumiex tossiċi l-espożizzjoni għad-doża massima prattikabbli għandhu tkun użata.
         Il-proċedura
         
            It-trattament u t-tgħammir
         
         Żewġ ċedoli ta’ trattament huma disponibbli. L-amministrazzjoni waħda tas-sostanzi tat-test hija dik l-aktar użata. L-amministrazzjoniji tas-sostanza tat-test fuq sebat ijiem fil-ġimgħa għal 35 ġurnata tista’ wkoll tkun użata. In-numri ta’ tgħammiriet wara t-trattament huma kontrollati miċ-ċedola tat-trattament u għandu jiżgura li kull stadju taċ-ċellola tal-mikrobu trattata jkun meħud kampjun minnu. Fl-aħħar tal-perjodu tat-tgħammir in-nisa jiġu msakkra f’gaġeġ separati. Meta’ n-nisa jwelldu, id-data, id-daqs tal-boton u s-sess tal-wild għandhom ikunu rekordjati. L-ulied irġiel kollha jinfatmu u l-ulied nisa huma mormija sakemm dawn ma jkunux inklużi fl-esperiment.
         
            L-ittestjar għat-traslokazzjoniji eterożigożita’
         
         Wieħed miż-żewġ metodi possibli huwa użat:
         
                     —
                  
                  
                     L-ittestjar tal-fertilità ta’ l-ulied F1 u l-verifikazzjoni sussegwenti ta’ dawk li possibilment iġorru t-traslokazzjoni bl-analiżi ċitoġenetika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     L-analiżi ċitoġenetika ta’ l-ulied irġiel F1 kollha mingħajr għażla minn qabel bl-ittestjar tal-fertilità.
                  
               
                     (a)
                  
                  
                     L-ittestjar tal-fertilità
                     Il-fertilità mnaqqsa ta’l-individwu F1 tista’ tkun stabbilita bl-osservazzjoni tad-daqs tal-boton u/jew l-analiżi tal-kontenut ta’ l-utru tas-sieħba nisa.
                     Il-kriterji biex tkun determinata l-fertilità normali u mnaqqsa għandhom ikunu stabbiliti għar-razza tal-ġrieden użata.
                     L-osservazzjoni tad-daqs tal-boton: L-irġiel F1 li għandhom ikunu ttestjati għandhom ikunu maqfula ġo gaġeġ individwalment man-nisa jew mill-istess esperiment jew mill-kolonja. Il-gaġeġ huma spezzjonati kuljum mit-18 il-ġurnata wara t-tgħammir. Id-daqs tal-boton u s-sess ta’ l-ulied F2 huma rrekordjati mal-wild u l-botnijiet huma mormija minn dak in-nhar ‘l hemm. Jekk l-ulied nisa F1 ikunu ttestjati l-ulied F2 tal-botnijiet iż-żgħar huma miżmuma għall-aktar testijiet. Dawk li jġorru t-traslokazzjoni u huma nisa huma verifikati bl-analiżi ċitoġenetika għal traslokazzjoni fi kwalunkwe mill-ulied irġiel tagħhom. In-nisa-XO huma magħrufa mill-bidla fir-rata mqabbla tas-sess fost l-ulied tagħhom minn 1:1 sa 1:2 irġiel vs. nisa. Fil-proċedura sekwenzali, l-annimali normali F1 huma eliminati minn aktar testijiet jekk l-ewwel boton F2 jilħaq jew jaqbeż il-valur normali predeterminat, altrimenti boton it-tieni jew it-tielet boton F2 huwa osservat.
                     L-annimali F1 li ma jistgħux ikunu klassifikati bħala normali wara l-osservazzjoni ta’ sa tlett botnijiet F2 jiġu jew ittestjati aktar bl-analiżi tal-kontenut ta’ l-utru tas-sieħba nisa jew direttament soġġetti għall-analiżi ċitoġenetika.
                     L-analiżi tal-kontenut ta’ l-utru: It-tnaqqis fid-daqs tal-boton ta’ dawk li jġorru t-traslokazzjoni huwa minħabba għall-mewt embrijonika u għalhekk numru kbir ta’ impjanti mejta huwa indikattiv tal-preżenza tat-traslokazzjoni fl-annimal li qed jiġi ttestjat. L-irġiel F1 li għandhom ikunu ttestjati għandhom ikunu mgħammra ma’ tnejn jew tlett nisa kull wieħed. Il-konċepiment huwa stabbilit bl-ispezzjoni ta’ kuljum għall-plakek tal-vaġina kull filgħodu. In-nisa huma sakrifikati minn 14 sa 16 il-jum wara u l-impjanti ħajjin u mejtin fl-utri tagħhom huma rekordjati.
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     L-analiżi ċitoġenetika
                     Il-preparazzjonijiet tat-test huma magħmula bit-teknika tat-tnixxif bl-arja. Dawk li jġorru t-traslokazzjoni huma identifikati bil-presenza ta’ konfigurazzjonijiet multivalenti fil-metfażi dijakinesi I fl-ispermatoċiti primarji. L-osservazzjoni ta’ mill-anqas żewġ ċelloli bl-assoċjazzjoni multivalenti tikkostitwixxi l-evidenza meħtieġa li l-annimal ittestjat huwa dak li jġorr it-traslokazzjoni.
                     Jekk l-ebda selezzjoni ta’ tgħammir ma tkun saret l-irġiel F1 kollha huma spezzjonati ċitoġenetikament. Il-minimu ta’ 25 ċellola tal-metafażi dijakineżi I għal kull raġel għandu jkun milħuq mikroskopikament. L-eżaminazzjoni tal-metafażi mitotika, fl-ispermatogonia jew l-għadma tal-mudullun, hija meħtieġa fl-irġiel F1 bit-testikoli żgħar u t-tnaqqis mejotiku qabel id-dijakineżi jew mis-sospetti tan-nisa F1. Il-presenza ta’ kromożoma twila u/jew qasira b’mod abnormali f’kull waħda mill-10 ċelloli hija evidenza għat-traslokazzjoni partikolari ta’ l-irġiel sterili (tip c-t). Xi ftit traslokazzjonijiet X-awtosomatiċi li jikkawżaw l-isterilità fl-irġiel jistgħu biss ikunu identifikati bl-analiżi tal-gruppi tal-kromożomi mitotiċi. Il-presenza ta’ 39 kromożomi fl-10 mitożi kollha hija evidenza għall-kundizzjoni XO f’mara.
                  
               2.   ID-DATA
         Id-data hija preżentata fil-forma ta’ tabelli.
         Il-medja tad-daqs tal-boton u r-rata tas-sess mit-tagħmir tal-ġenituri fit-twelid u l-ftiem huma rappurtati għal kull intervall ta’ tgħammir.
         Għall-assessjar tal-fertilità ta’ l-annimali F1, il-medja tad-daqs tal-boton ta’ tgħammiriet kollha normali u d-daqsijiet tal-botnijiet individwali ta’ dawk li jġorru t-traslokazzjoni F1 huma preżentati. Għall-analiżi tal-kontenut ta’ l-utru, il-medja tan-numru ta’ l-impjanti ħajjin u mejtin ta’ tgħammiriet normali u n-numri individwali ta’ l-impjanti ħajjin u mejtin għal kull tgħammira ta’ dawk li jġorru t-traslokazzjoni F1 huma rappurtati.
         Għall-analiżi ċitoġenetika tal-metafażi-dijakineżi I, in-numri tat-tipi tal-konfigurazzjonijiet multivalenti u n-numru totali taċ-ċelloli huma mniżżla għal kull wieħed li jġorr it-traslokazzjoni.
         Għall-individwi F1 sterili, in-numru totali tat-tgħammiriet u t-tul tal-perjodu tat-tgħammir huma rappurtati. Il-piż tat-testikoli u d-dettalji ta’ l-analiżi ċitoġenetika huma mogħtija.
         Għan-nisa XO, il-medja tad-daqs tal-boton, ir-rata tas-sess ta’ l-ulied F2 u r-riżultati ta’ l-analiżi ċitoġenetika huma rappurtati.
         Fejn ikunu possibli dawk li jġorru t-traslokazzjoni F1 huma magħżula minn qabel bit-testijiet tal-fertilità, it-tabelli għandhom jinkludi l-informazzjoni fuq kemm minn dawn kienu konfermati eterożigoti tat-traslokazzjoni.
         Id-data mill-kontrolli negattivi u l-esperimenti pożittivi tal-kontroll huma rappurtati.
         3.   IR-RAPPORTAĠĠ
         3.1   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandhu, jekk possibbli, jkun fih l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     ir-razza tal-ġrieden, iż-żmien ta’ l-annimali, il-piż ta’ l-annimali trattati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     in-numri ta’ l-annimali ġenituri ta’ kull sess fil-gruppi esperimentali jew kontrollati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kundizzjonijiet ta’ l-ittestjar, id-deskrizzjoni dettaljata tat-trattament, il-livelli tad-doża, is-solventi, iċ-ċedola tat-tgħammir;
                  
               
                     —
                  
                  
                     in-numru u s-sess ta’ l-ulied għal kull mara, in-numru u s-sess ta’ l-ulied miżjud għall-analiżi tat-traslokazzjoni;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin u l-kriterji għall-analiżi tat-traslokazzjoni;
                  
               
                     —
                  
                  
                     in-numru u d-deskrizzjoni dettaljata ta’ dawk li jġorru t-traslokazzjoni, inkluża d-data tat-tgħammir u d-data tal-kontenut ta’ l-utru, jekk applikabbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-proċeduri ċitoġenetiċI u d-detallji ta’ l-analiżi mikroskopika, preferibbilment bl-istampi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-valutazzjoni statistika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2   IL-VALUTAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         4.   IR-REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         B.26.   EŻAMI TA’ TOSSIĊITA ORALI SUB-KRONIKU ESPERIMENT BIS-SOMMINISTRAZZJONI ORALI RIPETUTA TA’ DOŻA GĦAL 90 ĠURNATA BL-UŻU TA’ SPEĊJI TA’ ANNIMALI GERRIEMA
         1.   METODU
         Il-metodu għat-test tat-tossiċità orali sub-kronika huwa replika ta’ l- OECD TG 408 (1998)
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Fil-valutazzjoni u fl-evalwazzjoni tal-karatteristiċi tossiċi ta’ kemikali, id-determinazzjoni tat-tossiċità orali sub-kronika bl-użu ta’ dożi repetuti tista’ ssir wara li l-informazzjoni tal-bidu fuq it-tossiċità tinkiseb mit-testijiet għat-tossiċità b’doża akuta jew repetuta għal 28 jum. L-istudju ta’ 90 jum jipprovdi informazzjoni fuq il-perikli għas-saħħa possibbli li faċilment jista’ jkun hemm minħabba espożizzjoni repetuta fuq perjodu imtawwal ta’ żmien li jkopri l-maturazzjoni u t-tkabbir minn wara l-ftim sal-fażi adulta. L-istudju se jipprovdi informazzjoni fuq l-effetti tossiċi prinċipali, jindika l-organi bħala mira u l-possibiltà ta’ akkumulazzjoni, u jista’ jipprovdi kalkolu ta’ livell ta’ espożizzjoni bl-ebda effett avvers osservat li jista’ jintuża fl-għażla tal-livelli ta’ doża għal studji kroniċi u biex jiġu stabbiliti kriterji ta’ sigurtà għall-espożizzjoni umana.
         Il-metodu jkompli jenfasizza l-endpoints newroloġiċi u jagħti indikazzjoni ta’ effetti immunoloġiċi u riproduttivi. Tingħata importanza wkoll għall-ħtieġa ta’ osservazzjonijiet kliniċi bil-galbu ta’ l-annimali, sabiex tinkiseb kemm jista’ jkun informazzjoni. Dan l-istudju għandu jippermetti l-identifikazzjoni tal-kemikali bil-potenzjal li jikkawżaw effetti newrotossiċi, immunoloġiċi jew organi riproduttivi, li jistgħu jwasslu għal iktar investigazzjoni bir-reqqa.
         Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B
         1.2   DEFINIZZJONIJIET
         
            Id-doża: huwa l-ammont tas-sustanza tat-test somministrat. Id-doża tissarraf f’piż (g, mg) jew f’piż tas-sustanza tat-test per unit tal-piż ta’ l-annimal għat-test (eż. Mg/kg), jew f’konċentrazzjonijiet dietetiċi kostanti (ppm).
         
            Id-dożaġġ: huwa terminu ġenerali li jikkomprendi d-doża, il-frekwenza tagħha u t-tul taż-żmien tad-dożaġġ.
         
            NOAEL: hija l-abbrevjazzjoni għal no-observed-adverse-effect level (livell bl-ebda effett avvers osservat) u huwa l-ogħla livel ta’ doża fejn l-ebda sejbiet relatati ma’ trattament avers ma ġew osservati.
         1.3   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza sperimentali għanda tkun somministrata kuljum, b’mod orali, f’dożi gradwali lil diversi gruppi ta’ annimali sperimentali, doża waħda għal kull grupp għall-perjodu ta’ 90 jum. Matul il-perjodu ta’ somministrazzjoni, l-annimali huma osservati mill-qrib għal sinjali ta’ tossiċità. Annimali li jmutu jew jinqatlu matul l-istudju huma sottoposti għall-nekroskopija, u fi tmiem it-test dawk l-annimali li jsalvaw jiġu maqtula wkoll u sottoposti għan-nekroskopija.
         1.4   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.4.1.   It-tħejjija ta’ l-annimali
         Għandhom jiġu użati annimali b’saħħithom li jkunu adattaw ruħhom għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal mill-inqas 5 ijiem u li ma kienux suġġetti għal preoċeduri sperimentali qabel. L-annimali għat-test għandhom ikunu karatterizzati skond l-ispeċje, ir-razza, is-sors, is-sess, il-piż u/jew l-età. L-annimali għandhom jiġu assenjati għall-gruppi tat-trattament u tal-kontroll. Il-gaġeġ għandhom jitqiegħdu b’tali mod li l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġġa jiġu minimizzati. Kull annimal għandu jkollu numru ta’ identifikazzjoni.
         1.4.2.   It-tħejjija tad-dożi
         Is-sustanza għat-test tiġi somministrata bil-fors jew fid-dieta jew fl-ilma għax-xorb. Il-metodu tas-somministrazzjoni orali jiddependi mill-għan ta’ l-istudju, u mill-proprjetatjiet fiżiko/kimiċi tal-materjal għat-test.
         Fejn hu meħtieġ, is-sustanza għat-test tinħall jew tiġi sospiża f’mezz xieraq. Huwa rakkomandabbli li, kull fejn hu possibbli, jiġi kkunsidrat l-ewwel l-użu ta’ soluzzjoni/sospensjoni akwea, u wara tiġi kkunsidrata soluzzjoni/emulsjoni fiż-żejt (eż. Iż-żejt tal-qamħ) imbagħad bis-soluzzjoni possibbli f’mezzi oħra. Għall-mezzi li mhumiex ilma l-karatteristiċi tossiċi tal-mezz iridu jkunu magħrufa. L-istabilità tas-sustanza għat-test taħt il-kundizzjonijiet ta’ somministrazzjoni għandha tiġi determinata.
         1.4.3.   Il-Kundizzjonijiet tat-test
         1.4.3.1.   L-annimali sperimentali
         L-ispeċi l-aktar preferit huwa l-far għalkemm jisgħu jintużaw speċi gerriema oħra, eż. Il-ġurdien. Għandhom jintużaw razez li huma komunement utilizzati fil-laboratorju ta’ annimali żgħar u b’saħħithom. In-nisa qatt ma jkunu welldu u mhmiex tqal. Id-dożaġġ għandu jibda kemm jista’ jkun malajr wara l-ftim u qabel ma l-annimali jkollhom disa’ ġimghat. Fil-bidu ta’ l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta’ l-annimali użati m’għandux jaqbeż + 20 % tal-valur medju ta’ kull sess. Fejn isir studju preliminari għal studju fit-tul fuq it-tossiċità kronika, annimali mill-istess razza u speċi għandhom jintużaw fiż-żewġ studji.
         1.4.3.2.   In-numru u s-sess
         Mill-inqas 20 annimal (10 nisa u 10 rġiel) għandhom jintużaw f’kull livell tad-doża. Jekk il-qtil interim ikun pjanat, in-numru għandu jiżdied bin-numru ta’ annimali ppjanati li jinqatlu qabel tmiem l-istudju. Skond l-għarfien ta’ qabel dwar l-analogu kemikali jew magħluq, għandu jiġi kkunsidrat li jiżdied grupp satellita ta’ għaxar annimali (ħamsa għal kull sess) fil-grupp ta’ kontroll u ta’ l-ogħla doża għall-osservazzjoni tar-riversibbiltà jew tal-persistenza ta’ kwalunkwe effetti tossiċi, wara l-perjodu ta’ trattament. It-tul ta’ żmien ta’ dan il-perjodu post-trattament għandu jiġi determinat b’mod xieraq skond l-effetti li ġew osservati.
         1.4.3.3.   Il-livelli tad-doża
         Ghandhom jintużaw mill-inqas tlett livelli ta’ doża u kontroll wieħed, ħlief fejn hemm test ta’ limitu (ara 1.4.3.4.). Il-livelli tad-doża jistgħu jkunu bbażati fuq ir-riżultati tad-doża repetuta jew ta’ l-istudju tas-sejbiet tal-meddda u għandhom jikkunsidraw kwalunkwe data tossikoloġika u tossikokinetika disponibbli li teżisti għas-sustanza tat-test jew l-annimali relatati. Sakemm ma tkunx limitata min-natura fiżiko-kemikali jew l-effetti bijoloġiċi tas-sustanza għat-test, l-ogħla livell ta’ doża għandu jiġi magħżul bl-għan li jġib it-tossiċità iżda mhux il-mewt jew it-tbatija qawwija. Sekwenza nieżla tal-livell ta’ doża għandha tingħażel bl-għan li turi kwalunkwe rispons relata mad-dożaġġ u l-livell b’ebda effett avvers osservat (NOAEL) fl-iktar livell baxx tad-doża. Intervalli two to four fold huma ta’ spiss ottimali biex jiġu ssettjati il-livelli neżlin tad-doża u ż-żieda tar-raba’ grupp għat-test huwa ppreferut ta’ spiss iktar mill-intervalli kbar (eż. iktar minn fattur ta’ bejn wieħed u ieħor 6-10) bejn id-dożaġġi.
         Il-grupp ta’ kontroll għandu jkun grupp mhux trattat jew grupp ta’ kontroll b’mezz jekk il-mezz jintuża fis-somministrazzjoni tas-sustanza għat-test. Ħlief għat-trattament bis-sustanza għat-test, l-annimali fil-grupp ta’ kontroll għandhom jiġu trattati bl-istess mod ta’ dawk fil-gruppi għat-test. Jekk jintuża l-mezz, il-grupp ta’ kontroll għandu jirċievi l-mezz fl-ogħla volum użat. Jekk sustanza għat-test tiġi somministrata fid-dieta u tikkawża dħul dietetiku mnaqqas, imbagħad grupp ta’ kontroll li jkun ġie magħluf jista’ jgħin jiddistingwu bejn tnaqqis minħabba l-palatabilità jew minħabba l-alterazzjonijiet tossikoloġiċi fil-mudell għattest.
         Il-karatteristiċi tal-mezz u additivi oħra li ġejjin għandhom jiġu kkunsidrati kif xieraq: l-effetti fuq l-assorbiment, id-distribuzzjoni, il-metaboliżmu, jew ir-retenzjoni tas-sustanza għat-test; u l-effetti fuq il-konsum ta’ l-ikel u x-xorb jew fuq l-istatus nutrizzjonali ta’ l-annimali.
         1.4.3.4.   It-test tal-limitu
         Jekk test f’livell wieħed ta’ doża ekwivalenti għal mill-inqas 1 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem/ġurnata, bl-użu tal-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, jipproduċi in-no-observed-adverse-effects (l-ebda effetti b’avvers mhux osservat) u jekk it-tossiċità ma tkunx mistennija bbażata fuq id-data minn sustanzi relatati strutturalment, allura studju komplut bl-użu ta’ tliet livelli ta’ doża ma jkunx meħtieġ. It-test tal-limitu japplika ħlief meta l-espożizzjoni umana tindika il-ħtieġa li jiġi użat livell ogħla ta’ doża.
         1.5.   PROĊEDURA
         1.5.1.   Is-somministrazzjoni tad-dożi
         L-annimali jingħataw id-dożaġġ bis-sustanza għat-test sebat ijiem kull ġimgħa għal perjodu ta’ 90 jum. Kwalunkwe regime ta’ dożaġġ ieħor, eż. Ħamest ijiem fil-ġimgħa, irid ikun ġustifikat. Meta s-sustanza għat-test tiġi somministrata bil-fors, dan għandu jsir f’doża waħda bl-użu ta’ tubu għall-istonku jew intubazzjoni cannula xierqa. Il-volum massimu tal-likwidu li jista’ jiġi somministrat f’darba jiddependi mid-daqs ta’ l-annimal. Il-volum m’għandux ikun iktar minn 1 ml/100g tal-piż tal-ġisem, ħlief fil-każ ta’ soluzzjonijiet akwei fejn 2 ml/100g tal-piż tal-ġisem jista’ jintuża. Ħlief għal sustanzi korrużivi jew ta’ irritazzjoni, li normalment jiżvelaw effetti agħar b’konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandha tipi minimizzata billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni sabiex tiħgura volum kostanti fil-livelli kollha tad-doża.
         Għal dawk is-sustanzi somministrati permezz tad-dieta jew l-ilma għax-xorb huwa importanti li jiġi żgurat li l-kwantitajiet tas-sustanza għat-test involuta ma jfixklux in-nutrizzjoni normali jew il-bilanċ ta’ l-ilma. Meta s-sustanza għat-test hija somministrata fid-dieta jew konċentrazzjoni dietetika kostanti (ppm) jew livell ta’ doża kostanti f’termini tal-piż tal-ġisem ta’ l-annimal jistgħu jintużaw. L-użu alternattiv irid jiġi speċifikat. Għas-sustanza li tiġi somministrata bil-fors, id-doża għandha tingħata f’ħinijiet simili kuljum, u aġġustata kif ikun meħtieġ sabiex jinżamm livell ta’ doża kostanti f’termini tal-piż tal-ġisem ta’ l-annimal. Fejn qed jintuża studju ta’ 90 jum bħala studju preliminarju għal dak li jtul dwar it-tossiċità kronika, għandha tintuża dieta simili fiż-żewġ studji.
         1.5.2.   L-osservazzjonijiet
         Il-perjodu ta’ osservazzjoni għandu jkun mill-inqas ta’ 90 jum. L-annimali fi grupp satellita li huma skedati għal follow-up ta’ l-osservazzjonijiet għandhom jinżammu għal perjodu xieraq mingħajr trattament sabiex tidher il-persistenza ta’, jew l-irkupru mill-effetti tossiċi.
         L-osservazzjonijiet kliniċi ġenereali għandhom isiru mill-inqas darba kuljum, preferibbilment fl-istess ħin (ħinijiet) kuljum, waqt illi jiġi meqjus il-perjodu peak ta’ l-effetti antiċipati wara d-dożaġġ. Il-kundizzjoni klinika ta’ l-annimali għandha tiġi rrekordjata. Mill-inqas darbtejn kuljum, normalment fil-bidu u fi tmiem il-jum, l-annimali kollha jiġu spezzjonati għal sinjali ta’ morbidità jew ta’ mortalità.
         Ta’ l-inqas darba qabel l-ewwel espożizzjoni (sabiex ikun hemm lok għall-paraguni fi ħdan is-suġġett), u darba fil-ġimgħa wara dan, l-osservazzjonijiet kliniċi dettaljati għandhom isiru għall-annimali kollha. Dawn l-osservazzjonijiet għandhom isiru barra l-gaġġa fejn jitpoġġew, preferebbilment f’arena standard u f’ħinijiet simili kull darba. Għandhom jiġu rrekordjati tajjeb, preferebbilment bl-użu ta’ sistemi ta’ mmarkar, definiti b’mod ċar mil-laboratorju għall-ittestjar. Għandu jsir sforz sabiex jiġi żgurat li l-varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet ta’ l-osservazzjoni huma minimali. Is-sinjali nnutati għandhom jinkludu, iżda mhux ikunu limitati għalihom, it-tibdil fil-ġilda, fil-pil, fl-għajnejn, fil-membrani mukużi, l-okkorrenza ta’ tnixxija u ta’ l-eskrementi u ta’ l-attività awtonomika (eż. il-lakrimazzjoni, il- pilo-erection , id-daqs tal-pupill, is-sistema respiratorja mhux normali). It-tibdil fil-mixja, fil-pożizzjoni u r-rispons għall-imaniġġjar kif ukoll il-preżenza ta’ ċaqliq kloniku jew toniku, l-isterjotipi (eż. grooming eċċessiv, tidwir tond repetittiv) jew imġiba stramba (eż. Awto-mutilazzjoni, il-mixi b’lura) għandhom jiġu rrekordjati wkoll (1).
         Lejn tmiem il-perjodu ta’ l-espożizzjoni u mhux qabel il-11-il ġimgħa, għandha ssir reattività sensorjali għal stimuli ta’ tipi differenti (1) (eż. awditorjali, stimuli viżwali u proprioceptive) (2), (3), (4), il-valutazzjoni tas-saħħa tal-qabda (5) u l-valutazzjoni motor activity (6). Dettalji oħra fuq il-proċeduri li jistgħu jsegwu qegħdin fir-referenzi rispettivi. Madankollu, il-proċeduri alternattivi apparti dawk referenzjati jistgħu jintużaw ukoll.
         L-osservazzjonijiet funzjonali magħmula lejn tmiem l-istudju jistgħu jitħallew barra meta d-data fuq l-osservazzjonijiet funzjonali tista’ tittieħed minn studji oħra u l-osservazzjonijiet kliniċi ta’ kuljum ma wrew l-ebda deficits funzjonali.
         Ħlief f’eċċezzjoni, l-osservazzjonijiet funzjonali jistgħu jitħallew barra wkoll għal gruppi li juru sinjali ta’ tossiċità b’tali mod li jfixklu b’mod sinifikanti l-prestazzjoni funzjonali tat-test.
         1.5.2.1.   Il-piż tal-ġisem u l-konsum ta’ l-ikel/xorb
         L-annimali kollha għandhom jintiżnu mill-inqas darba fil-ġimgħa. Il-konsum ta’ l-ikel u tax-xorb għandu jitkejjel għallinqas kull ġimgħa. Jekk is-sustanza għat-test hija somministrata permezz ta’ l-ilma għax-xorb, il-konsum ta’ l-ilma għandu jitkejjel għallinqas kull ġimgħa wkoll. Il-konsum ta’ l-ilma jista’ jitqies ukoll għal studji dietetiċi jew ta’ ikel mogħti bil-fors li matulu l-attività tax-xorb tista’ tiġi tinbidel.
         1.5.2.2.   Il-ħematoloġija u l-Bijokemistrija Klinika
         Il-kampjuni tad-demm għandhom jittieħdu minn site imsemmija u maħżuna, jekk applikabbli, f’kundizzjonijiet xierqa. Fi tmiem il-perjodu għat-test, il-kampjuni jinġabru eżatti qabel jew bħala parti mill-proċedura tal-qtil ta’ l-annimali, u maħżuna f’kundizzjonijiet xierqa
         L-eżaminazzjonijiet ħematoloġiċi li ġejjin għandhom isiru fi tmiem il-perjodu għat-test u meta kwalunkwe kampjuni tad-demm interim ikunu nġabru:Haematocrit, konċentrazzjoni ta’ haemoglobin, l-għadd ta’ l- erythrocyte, l-għadd totali u differenzjali tal-leucocyte , l-għadd tal- platelet u l-kejl tal-ħin/potenzjal tal-boċċi fid-demm.
         Id-determinazzjonijiet tal-bijokemistrija klinika biex jinvestigaw effetti prinċipali tossiċi fit-tessuti u, speċifikament, l-effetti fuq il-kliewi u fuq il-fwied, għandhom isiru fuq il-kampjuni tad-demm miksuba mill-annimali kollha eżatti qabel jew bħala parti mill-proċedura tal-qtil ta’ l-annimali (apparti ta’ dawk li jinstabu qed imutu u/jew jinqatlu). B’mod simili għall-investigazzjonijiet ħematoloġiċi, jista’ jsir it-teħid tal-kampjuni interim għat-testijiet bijokemikali kliniċi. Huwa rakkomandat is-sawm mal-lejl ta’ l-annimali qabel it-teħid tal-kampjuni tad-demm (2). Id-determinazzjonijiet tal-plasma jew serum għandhom jinkludu is-sodju, il-putassa, il-glokożju, il-kolestorol totali, l-urea, in-nitroġenu fid-demm mill-urea, il-creatinine, il-proteini u l-albumin totali, u iktar minn żewġ enzimi li juru l-effetti hepatoċellulari (bħalma huma l-alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, alkaline phosphatase, gamma glutamyl transpeptidase, u sorbitol dehydrogenase). Il-kejl ta’ enzimi addizzjonali (ta’ oriġini epatika jew oħra) u aċidi tal-bile li jistgħu jipprovdu informazzjoni utli taħt ċerti ċirkostanzi, jista’ jiġi nkluż ukoll.
         B’għażla, id-determinazzjonijiet ta’ l-analiżi ta’ l-urina li ġejjin jistgħu jsiru waqt l-aħħar ġimgħa ta’ l-istudju bl-użu tal-ġbir bil-ħin tal-volum ta’ l-urina; l-apparenza, il-volum, l-osmolality jew gravità speċifika, pH, il-proteini, il-glukożju u d-demm/iċ-ċelloli tad-demm.
         Barra minn hekk, l-istudji biex jinvestigaw l-immarkar tas-serum ta’ ħsara ġenerali għat-tessuti għandhom jiġu kkunsidrati. Determinazzjonijiet oħra li għandhom jitwettqu jekk il-proprjetajiet magħrufa tas-sustanza għat-test jistgħu, jew huma suspettati li jaffettwaw il-profili metaboliċi relatati jinkludu il-kalċju, il-fosforu, il-fasting triglycerides, l-ormoni speċifiċi, il-methaemoglobin u l-cholinesterase. Dawn iridu jiġu identifikati għall-kimiċi f’ċerti klassijiet jew fuq bażi ta’ kull każ.
         Fuq kollox, hemm il-bżonn ta’ attitudni flessibbli skond l-ispeċi u l-effett osservat u/jew mistenni mis-sustanza mogħtija.
         Jekk id-data storika mhix adegwata, għandu jiġi kkunsidrat jekk il-varjabbli ematoloġiċi u tal-bijokemistrija kliniċi għandhomx bżonn jiġu determinati qabel ma jibda d-dożaġġ u ġeneralment mhuwiex rakkomandabbli li din id-data tiġi ġġenerata qabel it-trattament (7).
         1.5.2.3   Nekropsija Grossa
         L-annimali kollha fl-istudju għandhom ikunu suġġetti għall-awtopsja sħiħa grossa ta’ wara l-mewt li tinkludi eżaminazzjoni bir-reqqa tal-wiċċ tal-ġisem, l-orifiċi kollha, u l-kavitajiet tal-kranju, tat-toraċi u dawk addominali u l-kontenut tagħhom. Il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, it-testi, l-epididymides, it-thymus, il-milsa, il-moħħ u l-qalb ta’ l-annimali kollha (ħlief ta’ dawk li jkunu qed imutu u/jew jiġu maqtula) għandhom jiġu trimmjati minn kwalunkwe tessut aderenti, kif xieraq, u għandhom ikunu mwieżna niedja malajr kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni sabiex ma jinxfux.
         It-tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati fl-iktar medium xieraq kemm għat-tip ta’ tessut u kemm għall-eżaminazzjoni ħispatoloġika maħsuba sussegwenti: il-feriti kbar kollha, il-moħħ (partijiet rappreżentattivi inklużi iċ-ċerebrum, iċ-ċerebelllum u l-medulla/pons), il-korda spinali (fi tliet livelli: ċevikali, mid-thoracic u lumbar) il-glandoli pituitary, thyroid, parathyroid, thymus, oesophagus, salivary, l-istonku, l-intestini żgħar u kbar (inklużi l-Peyer's patches), il-fwied, il-frixa, kliewi, l-adrenali, il-milsa, il-qalb, it-trakea u l-pulmuni (ippreservati bl-inflazzjoni bil-fixative imbagħad bl-immersjoni), l-aorta, il-gonads, l-utru, l-organi sesswali aċċessorili, il-glandola mammarja femminili, il-prostata, il-bużżieqa ta’ l-urina, il-gall bladder (il-ġurdien), in-noduli limfatiċi (preferibbilment nodulu limfatiku wieħed li jkopri r-rotta ta’ l-amministrazzjoni u oħra distanti mir-rotta ta’ l-amministrazzjoni biex tkopri l-effetti sistematiċi), in-nerv periferali (sciatic jew tibial) preferebbilment viċin il-muskolu, u biċċa mill-mudullun (jew, a fresh bone marrow aspirate), il-ġilda u l-għajnejn (jekk ġew osservati xi tibdiliet waqt l-eżaminazzjonijiet oftalmoloġiċi). Is-sejbiet klinikali u oħrajn jistgħu jissuġġerixxu li hemm bżonn jiġu eżaminati tessuti addizzjonali. Kwalunkwe organi li jistgħu jkunu organi-mira bbażati fuq il-proprjetajiet magħrufa tas-sustanza tat-test għandhom jiġu ppreservati.
         1.5.2.4.   Il-ħispatoloġija
         Il-ħispatoloġija kompluta għandha titwettaq fuq l-organi u t-tessuti ppreservati ta’ l-annimali kollha fil-gruppi ta’ kontroll u ta’ doża għolja. Dawn l-eżaminazzjonijiet għandhom jiġu estiżi għall-annimali tal-gruppi ta’ dożaġġ l-oħrajn ukoll, jekk it-tibdil relatat mat-trattament jiġi osservat fil-grupp ta’ doża għolja.
         1.5.2.5. Il-feriti grossi kollha għandhom jiġu eżaminati.
         Meta jintuża grupp satellita il-ħistopatoloġija għandha ssir fuq it-tessuti u l-organi identifikati bħala li qed juru l-effetti fil-gruppi trattati.
         DATA U RAPPORTAĠĠ
         2.1.   DATA
         Id-data individwali għandha tiġi provduta. Barra minn hekk, id-data kollha għandha tkun riassunta f’għamla tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta’ l-annimali nstabu mejta waqt it-test jew li nqatlu għal raġunijiet umani u l-ħin ta’ kwalunkwe mewt jew qtil uman, in-numru li juri sinjali ta’ tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta’ tossiċità osservati, inkluż il-ħin ta’ l-onset, it-tul, il-qawwa ta’ kwalunkwe effetti tossiċi, in-numru ta’ l-annimali li għandhom il-feriti, it-tip ta’ feriti u l-perċentwal ta’ l-annimali li għandhom kull tip ta’ ferita.
         2.2.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         2.2.1.   Is-sustanza għat-test:
         
                     —
                  
                  
                     In-natura fiżika, il-purità u il-proprjetajiet fiżiko-kemikali;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-data ta’ identifikazzjoni;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-mezz (jekk inhu xieraq): il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-mezz, jekk mhuwiex l-ilma.
                  
               2.2.2.   L-ispeċi għat-test:
         
                     —
                  
                  
                     l-ispeċi/is-silta użati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     In-numru, l-età u s-sess ta’ l-annimali;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Is-sors, il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpoġġew, id-dieta eċċ.;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test
                  
               2.2.3.   Il-kundizzjonijiet għat-test:
         
                     —
                  
                  
                     Ir-rationale għall-għażla tal-livell tad-doża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-dettalji tat-tħejjija tal-formulazzjoni/dieta tas-sustanza għat-test, il-konċentrazzjoni miksuba u l-omoġeneità tat-tħejjija;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-dettalji tas-somministrazzjoni tas-sustanza għat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-dożi kif inhuma tabilħaqq (mg/kg piż tal-ġisem/jum), u l-fattur tal-konverżjoni mill-konċentrazzjoni tat-test għas-sustanza tad-dieta/l-ilma għax-xorb (ppm) għad-doża kif inhi tabilħaqq, jekk applikabbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-dettalji tal-kwalità ta’ l-ikel u ta’ l-ilma
                  
               2.2.4.   Ir-riżultati:
         
                     —
                  
                  
                     Il-piż tal-ġisem/it-tibdil fil-piż tal-ġisem;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-konsum ta’ l-ikel u ta’ l-ilma jekk applikabbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-data tar-rispons tossiku bis-sess u bil-livell tad-doża, inklużi s-sinjali tat-tossiċità;
                  
               
                     —
                  
                  
                     In-natura, il-qawwa u t-tul ta’ l-osservazzjonijiet kliniċi (jekk humiex riversibbli jew le);
                  
               
                     —
                  
                  
                     Ir-riżultati ta’ l-eżaminazzjoni oftalmoloġika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-attività sensorjali, is-saħħa tal-qabda ta’ l-id u l-valutazzjonijiet motor activity;
                     
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-testijiet ematoloġiċi bil-valuri base-line relevanti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-testijiet tal-bijokemistrija klinika bil-valuri base-line relevanti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-piż tal-ġisem terminali, il-piżijiet ta’ l-organi u r-ratios tal-piż ta’ l-organi u tal-ġisem;
                  
               
                     —
                  
                  
                     is-sejbiet tan-nekropsija;
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatoloġiċi kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-data ta’ l-assorbiment jekk hi disponibbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     trattament statistiku tar-riżultati, fejn hu xieraq;
                  
               Id-diskussjoni tar-riżultati;
         Konklużjonijiet.
         3.1.   REFERENZI
         IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
         Tupper, D.E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003.
         Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J.Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.
         Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, 267-283.
         Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assesment of Fore- and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, 233-236.
         Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599-609.
         Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). “Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies”, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, 198-201.
         B.27.   EŻAMI TA’ TOSSIĊITÀ ORALI SUB-KRONIKU ESPERIMENT BIS-SOMMINISTRAZZJONI ORALI RIPETUTA TA’ DOŻI GĦAL 90 ĠURNATA BL-UŻU TA’ SPEĊI TA’ ANNIMALI MHUX GERRIEMA
         1.   METODU
         Il-metodu għat-test tat-tossiċità orali sub-kronika huwa replika ta’ l-OECD TG 409 (1998)
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Fil-valutazzjoni u fl-evalwazzjoni tal-karatteristiċi tossiċi ta’ kemikali, id-determinazzjoni tat-tossiċità orali sub-kronika bl-użu ta’ dożi repetuti tista’ ssir wara li l-informazzjoni tal-bidu fuq it-tossiċità tinkiseb mit-testijiet għat-tossiċità b’doża akuta jew repetuta għal 28 jum. L-istudju ta’ 90 jum jipprovdi informazzjoni fuq il-perikli għas-saħħa possibbli li faċilment jista’ jkun hemm minħabba espożizzjoni repetuta għal perjodu ta’ tkabbir mgħaġġel sal-fażi adulta. L-istudju se jipprovdi informazzjoni fuq l-effetti tossiċi prinċipali, jindika l-organi bħala mira u l-possibiltà ta’ akkumulazzjoni, u jista’ jipprovdi kalkolu ta’ livell ta’ espożizzjoni bl-ebda effett avvers osservat li jista’ jintuża fl-għażla tal-livelli ta’ doża għal studji kroniċi u biex jiġu stabbiliti kriterji ta’ sigurtà għall-espożizzjoni umana
         Dan il-metodu għat-test għandu jippermetti l-identifikazzjoni ta’ l-effetti avversi minħabba l-espożizzjoni kemikali fl-ispeċi li mhumiex gerriema u għandu jintuża biss:
         
                     —
                  
                  
                     fejn l-effetti osservati fi studji oħra jindikaw il-ħtieġa għal klarifikazzjoni/karatterizzazzjoni fit-tieni speċi, li mhix gerriema, jew
                  
               
                     —
                  
                  
                     fejn l-istudji tossikokinetiċi jindikaw li l-użu ta’ speċi mhux gerriema speċifika hija l-iktar għażla relevanti għall-annimal tal-laboratorju, jew
                  
               
                     —
                  
                  
                     fejn raġunijiet speċifiċi oħra jiġġustifikaw l-użu ta’ speċi li mhix gerriema.
                  
               Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Id-doża: huwa l-ammont tas-sustanza tat-test somministrat. Id-doża tissarraf f’piż (g, mg) jew f’piż tas-sustanza tat-test per unit tal-piż ta’ l-annimal għat-test (eż. Mg/kg), jew f’konċentrazzjonijiet dietetiċi kostanti (ppm).
         
            Id-dożaġġ: huwa terminu ġenerali li jikkomprendi d-doża, il-frekwenza tagħha u t-tul taż-żmien tad-dożaġġ.
         
            NOAEL: hija l-abbrevjazzjoni għal no-observed-adverse-effect level (livell bl-ebda effett avvers osservat) u huwa l-ogħla livell ta’ doża fejn l-ebda sejbiet relatati ma’ trattament avvers ma ġew osservati.
         1.3.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza għat-test għandha tiġi somministrata kuljum, b’mod orali, f’dożi gradwali lil diversi gruppi ta’ annimali sperimentali, doża waħda għal kull grupp għall-perjodu ta’ 90 jum. Matul il-perjodu ta’ somministrazzjoni, l-annimali huma osservati mill-qrib għal sinjali ta’ tossiċità. Annimali li jmutu jew jinqatlu matul l-istudju huma sottoposti għall-nekroskopija, u fi tmiem it-test dawk l-annimali li jsalvaw jiġu maqtula wkoll u sottoposti għan-nekroskopija.
         1.4.   ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.4.1.   L-għażla ta’ l-ispeċi ta’ l-annimali
         L-ispeċi li mhumiex gerriema l-aktar użat huwa l-kelb, li għandu jkun ta’ razza definita. Il-beagle (kelb żgħir tal-kaċċa) jintuża ta’ spiss. Jistgħu jintużaw ukoll speċi oħra, eż. ħanżir, u ħnieżer żgħar. Il-primati mhumiex rakkomandabbli u l-użu tagħhom għandu jkun ġustifikat. Għandhom jintużaw annimali żgħażagħ u b’saħħithom, u fil-każ tal-kelb, id-dożaġġ għandu jibda idealment mill-età ta’ erba’ sa sitt xhur u mhux aktar tard minn disa’ xhur. Meta jsir studju preliminari għal dak iktar fit-tul dwar it-tossiċità kronika, l-istess speċi/razza għandha tintuża fiż-żewġ studji.
         1.4.2.   It-tħejjija ta’ l-annimali
         Għandhom jiġu użati annimali b’saħħithom li jkunu adattaw ruħhom għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju u li ma kinux suġġetti għal proċeduri sperimentali qabel. It-tul ta’ żmien ta’ l-adattament jiddependi fuq l-ispeċi magħżula u s-sors tagħhom. Huma rakkomandati mill-inqas 5 ijiem għall-klieb jew ħanżir tar-razza li ġejjin minn kolonja residenti u mill-inqas ħmistax għal dawk l-annimali li ġejjin minn sorsi esterni. L-annimali għat-test għandhom ikunu karatterizzati skond l-ispeċje, ir-razza, is-sors, is-sess, il-piż u/jew l-età. L-annimali għandhom jiġu assenjati bl-addoċċ għall-gruppi tat-trattament u tal-kontroll. Il-gaġeġ għandhom jitqiegħdu b’tali mod li l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġġa jiġu minimizzati. Kull annimal għandu jkollu numru ta’ identifikazzjoni
         1.4.3.   It-tħejjija tad-dożi
         Is-sustanza għat-test tiġi somministrata fid-dieta jew fl-ilma għax-xorb, permezz ta’ l-għalf mogħti bil-fors jew fil-kapsuli. Il-metodu tas-somministrazzjoni orali jiddependi mill-għan ta’ l-istudju, u mill-proprjetatjiet fiżiko/kimiċi tal-materjal għat-test.
         Fejn hu meħtieġ, is-sustanza għat-test tinħall jew tiġi sospiża f’mezz xieraq. Huwa rakkomandabbli li, kull fejn hu possibbli, jiġi kkunsidrat l-ewwel l-użu ta’ soluzzjoni/sospensjoni akwea, u wara tiġi kkunsidrata soluzzjoni/emulsjoni fiż-żejt (eż. Iż-żejt tal-qamħ) imbagħad bis-soluzzjoni possibbli f’mezzi oħra. Għall-mezzi li mhumiex ilma l-karatteristiċi tossiċi tal-mezz iridu jkunu magħrufa. L-istabilità tas-sustanza għat-test taħt il-kundizzjonijiet ta’ somministrazzjoni għandha tiġi determinata
         1.5.   IL-PROĊEDURA
         1.5.1.   In-numru u s-sess ta’ l-annimali
         Mill-inqas 8 annimali (erba’ nisa u erba’ rġiel) għandhom jintużaw f’kull livell tad-doża. Jekk il-qtil interim ikun pjanat, in-numru għandu jiżdied bin-numru ta’ annimali ppjanati li jinqatlu qabel tmiem l-istudju. Skond l-għarfien ta’ qabel dwar is-sustanza jew l-analogu magħluq, għandu jiġi kkunsidrat li jiżdied grupp satellita ta’ 8 annimali (erbgħa għal kull sess) fil-grupp ta’ kontroll u ta’ l-ogħla doża għall-osservazzjoni tar-riversibbiltà jew tal-persistenza ta’ kwalunkwe effetti tossiċi, wara l-perjodu ta’ trattament. It-tul ta’ żmien ta’ dan il-perjodu post-trattament għandu jiġi determinat b’mod xieraq skond l-effetti li ġew osservati.
         1.5.2.   Id-dożaġġ
         Ghandhom jintużaw mill-inqas tlett livelli ta’ doża u kontroll wieħed, ħlief fejn hemm test ta’ limitu (ara 1.5.3.). Il-livelli tad-doża jistgħu jkunu bbażati fuq ir-riżultati tad-doża repetuta jew ta’ l-istudju tas-sejbiet tal-meddda u għandhom jikkunsidraw kwalunkwe data tossikoloġika u tossikokinetika disponibbli li teżisti għall-compound tat-test jew il-materjali relatati. Sakemm ma tkunx limitata min-natura fiżiko-kemikali jew l-effetti bijoloġiċi tas-sustanza għat-test, l-ogħla livell ta’ doża għandu jiġi magħżul bl-għan li jġib it-tossiċità iżda mhux il-mewt jew it-tbatija qawwija. Sekwenza nieżla tal-livell ta’ doża għandha tingħażel bl-għan li turi kwalunkwe rispons relata mad-dożaġġ u l-livell b’ebda effett avvers osservat (NOAEL) fl-iktar livell baxx tad-doża. Intervalli two to four fold huma ta’ spiss ottimali biex jiġu ssettjati il-livelli neżlin tad-doża u ż-żieda tar-raba’ grupp għat-test huwa ppreferut ta’ spiss iktar mill-intervalli kbar (eż. iktar minn fattur ta’ bejn wieħed u ieħor 6-10) bejn id-dożaġġi.
         Il-grupp ta’ kontroll għandu jkun grupp mhux trattat jew grupp ta’ kontroll b’mezz jekk il-mezz jintuża fis-somministrazzjoni tas-sustanza għat-test. Ħlief għat-trattament bis-sustanza għat-test, l-annimali fil-grupp ta’ kontroll għandhom jiġu trattati bl-istess mod ta’ dawk fil-gruppi għat-test. Jekk jintuża l-mezz, il-grupp ta’ kontroll għandu jirċievi l-mezz fl-ogħla volum użat. Jekk sustanza għat-test tiġi somministrata fid-dieta u tikkawża dħul dietetiku mnaqqas, imbagħad grupp ta’ kontroll li jkun ġie magħluf jista’ jgħin biex jiddistingwu bejn tnaqqis minħabba l-palatabilità jew minħabba l-alterazzjonijiet tossikoloġiċi fil-mudell għattest.
         Il-karatteristiċi tal-mezz u additivi oħra li ġejjin għandhom jiġu kkunsidrati kif xieraq: l-effetti fuq l-assorbiment, id-distribuzzjoni, il-metaboliżmu, jew ir-retenzjoni tas-sustanza għat-test; l-effetti fuq il-proprjetajiet kemikali tas-sustanza għat-test u l-effetti fuq il-konsum ta’ l-ikel u x-xorb jew fuq l-istatus nutrizzjonali ta’ l-annimali.
         1.5.3.   It-test tal-limitu
         Jekk test f’livell wieħed ta’ doża ekwivalenti għal mill-inqas 1 000mg/kg tal-piż tal-ġisem/ġurnata, bl-użu tal-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, jipproduċi in-no-observed-adverse-effects (l-ebda effetti avversi mhux osservati) u jekk it-tossiċità ma tkunx mistennija bbażata fuq id-data minn sustanzi strutturalment relatati, allura studju komplut bl-użu ta’ tliet livelli ta’ doża ma jkunx meħtieġ. It-test tal-limitu japplika ħlief meta l-espożizzjoni umana tindika il-ħtieġa li jiġi użat livell ogħla ta’ doża.
         1.5.4.   Is-somministrazzjoni tad-dożi
         L-annimali jingħataw id-dożaġġ bis-sustanza għat-test sebat ijiem kull ġimgħa għal perjodu ta’ 90 jum. Kwalunkwe regime ta’ dożaġġ ieħor, eż. Ħamest ijiem fil-ġimgħa, irid ikun ġustifikat. Meta s-sustanza għat-test tiġi somministrata bil-fors, dan għandu jsir f’doża waħda bl-użu ta’ tubu għall-istonku jew intubazzjoni cannula xierqa. Il-volum massimu tal-likwidu li jista’ jiġi somministrat f’darba jiddependi mid-daqs ta’ l-annimal. Normalment il-volum għandu jinżamm baxx kemm jista’ jkun. Ħlief għal sustanzi korrużivi jew ta’ irritazzjoni, li normalment jiżvelaw effetti agħar b’konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandha tiġi minimizzata billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni sabiex tiżgura volum kostanti fil-livelli kollha tad-doża.
         Għal dawk is-sustanzi somministrati permezz tad-dieta jew l-ilma għax-xorb huwa importanti li jiġi żgurat li l-kwantitajiet tas-sustanza għat-test involuta ma jfixklux in-nutrizzjoni normali jew il-bilanċ ta’ l-ilma. Meta s-sustanza għat-test hija somministrata fid-dieta jew konċentrazzjoni dietetika kostanti (ppm) jew livell ta’ doża kostanti f’termini tal-piż tal-ġisem ta’ l-annimal jistgħu jintużaw. L-użu alternattiv irid jiġi speċifikat. Għas-sustanza li tiġi somministrata bil-fors, id-doża għandha tingħata f’ħinijiet simili kuljum, u aġġustata kif ikun meħtieġ sabiex jinżamm livell ta’ doża kostanti f’termini tal-piż tal-ġisem ta’ l-annimal. Fejn qed jintuża studju ta’ 90 jum bħala studju preliminarju għal dak li jtul dwar it-tossiċità kronika, għandha tintuża dieta simili fiż-żewġ studji.
         1.5.5.   L-osservazzjonijiet
         Il-perjodu ta’ osservazzjoni għandu jkun mill-inqas ta’ 90 jum. L-annimali fi grupp satellita li huma skedati għal follow-up ta’ l-osservazzjonijiet għandhom jinżammu għal perjodu xieraq mingħajr trattament sabiex tidher il-persistenza ta’, jew l-irkupru mill-effetti tossiċi.
         L-osservazzjonijiet kliniċi ġenereali għandhom isiru mill-inqas darba kuljum, preferibbilment fl-istess ħin (ħinijiet) kuljum, waqt illi jiġi meqjus il-perjodu peak ta’ l-effetti antiċipati wara d-dożaġġ. Il-kundizzjoni klinika ta’ l-annimali għandha tiġi rrekordjata. Mill-inqas darbtejn kuljum, normalment fil-bidu u fi tmiem il-jum, l-annimali kollha għandhom jiġu spezzjonati għal sinjali ta’ morbidità jew ta’ mortalità.
         Ta’ l-inqas darba qabel l-ewwel espożizzjoni (sabiex ikun hemm lok għall-paraguni fi ħdan is-suġġett), u darba fil-ġimgħa wara dan, l-osservazzjonijiet kliniċi dettaljati għandhom isiru għall-annimali kollha. Dawn l-osservazzjonijiet għandhom isiru barra l-gaġġa fejn jitpoġġew, preferebbilment f’arena standard u f’ħinijiet simili kull darba. Għandu jsir sforz sabiex jiġi żgurat li l-varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet ta’ l-osservazzjoni huma minimali. Is-sinjali tat-tossiċità għandhom jiġu rrekordjati tajjeb, inklużi l-ħin ta’ l-onset, il-grad u t-tul ta’ żmien. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu, iżda mhux ikunu limitati għalihom, it-tibdil fil-ġilda, fil-pil, fl-għajnejn, fil-membrani mukużi, l-okkorrenza ta’ tnixxija u ta’ l-eskrementi u ta’ l-attività awtonomika (eż. il-lakrimazzjoni, il- pilo-erection , id-daqs tal-pupill, attività respiratorja mhux normali). Bidliet fil-mixja, fil-pożizzjoni u r-rispons għall-imaniġġjar kif ukoll il-preżenza ta’ ċaqliq kloniku jew toniku, l-isterjotipi (eż. grooming eċċessiv, tidwir tond repetittiv) jew imġiba stramba għandhom jiġu rrekordjati.
         L-eżaminazzjoni oftalmoloġika, bl-użu ta’ oftalmoskopju jew tagħmir xieraq ekwivalenti, Għandha ssir qabel is-somministrazzjoni tas-sustanza għat-test u fi tmiem l-istudju, preferibbilment fl-annimali kollha iżda għallinqas fil-gruppi ta’ doża għolja u ta’ kontroll. Jekk ikun hemm tibdil fl-għajnejn relatat mat-trattament l-annimali kollha għandhom jiġu eżaminati.
         1.5.5.1.   Il-piż tal-ġisem u l-konsum ta’ l-ikel/xorb
         L-annimali kollha għandhom jintiżnu mill-inqas darba fil-ġimgħa. Il-konsum ta’ l-ikel u tax-xorb għandu jitkejjel għallinqas kull ġimgħa. Jekk is-sustanza għat-test hija somministrata permezz ta’ l-ilma għax-xorb, il-konsum ta’ l-ilma għandu jitkejjel għallinqas kull ġimgħa wkoll. Il-konsum ta’ l-ilma jista’ jitqies ukoll għal studji dietetiċi jew ta’ ikel mogħti bil-fors li matulu l-attività tax-xorb tista’ tinbidel.
         1.6.5.2.   Il-ħematoloġija u l-Bijokemistrija Klinika
         Il-kampjuni tad-demm għandhom jittieħdu minn site imsemmija u maħżuna, jekk applikabbli, f’kundizzjonijiet xierqa. Fi tmiem il-perjodu għat-test, il-kampjuni jinġabru eżatti qabel jew bħala parti mill-proċedura tal-qtil ta’ l-annimali.
         Il-ħematoloġija, inklużi l-haematocrit, il-konċentrazzjoni ta’ haemoglobin, l-għadd ta’ l-erythrocyte, l-għadd totali u differenzjali tal-leukocyte, l-għadd tal-platelet u l-kejl ta’ potenzjal għall-boċċi (clotting) bħalma hu l-ħin ta’ l-iffurmar tal-boċċi, il-ħin tal-prothrombin, jew il-ħin tat-thromboplastin għandhom jiġu investigati fil-bidu ta’ l-istudju, imbagħad jew f’intervalli ta’ xhur jew f’nofs triq tal-perjodu tat-test u fl-aħħarnett fi tmiemu.
         Id-determinazzjonijiet tal-bijokemistrija klinika biex jinvestigaw effetti prinċipali tossiċi fit-tessuti u, speċifikament, l-effetti fuq il-kliewi u fuq il-fwied, għandhom isiru fuq il-kampjuni tad-demm miksuba mill-annimali fil-bidu, imbagħad f’intervalli ta’ xhur jew f’nofs it-test u fl-aħħarnett fi tmiem il-perjodu tat-test. Iż-żoni tat-test li għandhom jiġu kkunsidrati huma l-bilanċ electrolyte, il-metaboliżmu tal- carbohydrate, u l-funzjoni tal-fwied u l-kliewi. L-għażla tat-testijiet speċifiċi tkun influwenzata mill-osservazzjonijiet ta’ l-azzjoni tas-sustanza għattest. L-annimali għandhom ikunu sajmin għal perjodu xieraq għall-ispeċi u qabel it-teħid tal-kampjuni tad-demm. Id-determinazzjonijiet suġġeriti jinkludu l-kalċju, il-fosfru, il-klorur, is-sodju, il-potassju, il-glukosju swami, l-alanine, l-aminotransferase, l-aspartate aminotransferase, l-ornithine decarboxylase, il- gamma glutamyl transpeptidase, l-urea nitrogen, l-albumin, il-blood creatinine, it-total tal-bilirubin u t-total tal-kejl tas-serum protein.
         Id-determinazzjonijiet ta’ l-analiżi ta’ l-urina għandhom isiru għallinqas fil-bidu, imbagħad fin-nofs u fl-aħħarnett fi tmiem l-istudjubl-użu tal-ġbir bil-ħin tal-volum ta’ l-urina. Id-determinazzjonijiet ta’ l-analiżi ta’ l-urina jinkludu l-apparenza, il-volum, l- osmolality jew il-gravità speċifika, il-pH, il-proteini, il-glukożju u d-demm/iċ-ċelloli tad-demm. Parametri addizzjonali jistgħu jintużaw fejn hu meħtieġ biex l-investigazzjoni ta’ l-effett(i) osservat(i) tiġi estiża.
         Barra minn hekk, l-istudji biex jinvestigaw l-immarkar ta’ ħsara ġenerali għat-tessuti għandhom jiġu kkunsidrati. Determinazzjonijiet oħra li jistgħu jkunu meħtieġa għal evalwazzjoni tossikoloġika adegwata jinkludu l-analiżi tal-lipidi, ta’ l-ormoni, tal-bilanċ aċdu/bażi, tal- methaemoglobin, u ta’ l-inibizzjoni tal- cholinesterase. Il-bijokemistrija klinika addizzjonali tista’ tintuża fejn hu meħtieġ sabiex l-investigazzjoni ta’ l-effetti osservati tiġi estiża. Dawn iridu jiġu identifikati għall-kimiċi f’ċerti klassijiet jew fuq bażi ta’ kull każ.
         Fuq kollox, hemm il-bżonn ta’ attitudni flessibbli skond l-ispeċi u l-effett osservat u/jew mistenni mis-sustanza mogħtija.
         1.5.5.3.   Nekropsija Grossa
         L-annimali kollha fl-istudju għandhom ikunu suġġetti għall-awtopsja sħiħa grossa ta’ wara l-mewt li tinkludi eżaminazzjoni bir-reqqa tal-wiċċ tal-ġisem, l-orifiċi kollha, u l-kavitajiet tal-kranju, tat-toraċi u dawk addominali u l-kontenut tagħhom. Il-fwied bil-gall bladder, il-kliewi, l-adrenali, it-testi, l-epididymides, l-ovaries, l-utru, it-thyroid (bil- parathyroids) it-thymus, il-milsa, il-moħħ u l-qalb ta’ l-annimali kollha (ħlief ta’ dawk li jkunu qed imutu u/jew jiġu maqtula) għandhom jiġu trimmjati minn kwalunkwe tessut aderenti, kif xieraq, u għandhom ikunu mwieżna niedja malajr kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni sabiex ma jinxfux.
         It-tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati fl-iktar medium xieraq kemm għat-tip ta’ tessut u kemm għall-eżaminazzjoni ħispatoloġika maħsuba sussegwenti: il-feriti kbar kollha, il-moħħ (partijiet rappreżentattivi inklużi iċ-ċerebrum, iċ-ċerebelllum u l-medulla/pons), il-korda spinali (fi tliet livelli: ċervikali, mid-thoracic u lumbar) il-glandoli tal-pituitary, l-għajnejn, il-glandoli tat-thyroid, tal-parathyroid, tat-thymus, ta l-oesophagus, u dawk salivary, l-istonku, l-intestini żgħar u kbar (inklużi l- Peyer's patches), il-fwied, il-gall bladder, il-frixa, kliewi, l-adrenali, il-milsa, il-qalb, it-trakea u l-pulmuni, l-aorta, il-gonads, l-utru, l-organi sesswali aċċessorili, il-glandola mammarja femminili, il-prostata, il-bużżieqa ta’ l-urina, in-noduli limfatiċi (preferibbilment nodulu limfatiku wieħed li jkopri r-rotta ta’ l-amministrazzjoni u oħra distanti mir-rotta ta’ l-amministrazzjoni biex tkopri l-effetti sistematiċi), in-nerv periferali (sciatic jew tibial) preferebbilment viċin il-muskolu, u biċċa mill-mudullun (u/jew, a fresh bone marrow aspirate) u l-ġilda. Is-sejbiet klinikali u oħrajn jistgħu jissuġġerixxu li hemm bżonn jiġu eżaminati tessuti addizzjonali. Kwalunkwe organi li jistgħu jkunu organi-mira bbażati fuq il-proprjetajiet magħrufa tas-sustanza tat-test għandhom jiġu ppreservati.
         1.5.5.4.   Il-ħispatoloġija
         Il-ħispatoloġija kompluta għandha titwettaq fuq l-organi u t-tessuti ppreservati ta’għallinqas l-annimali kollha fil-gruppi ta’ kontroll u ta’ doża għolja. L-eżaminazzjoni għandha tiġi estiża għall-annimali tal-gruppi ta’ dożaġġ l-oħra, jekk it-tibdil relatat mat-trattament jiġi osservat fil-grupp ta’ doża għolja.
         Il-feriti grossi kollha għandhom jiġu eżaminati
         Meta jintuża grupp satellita il-ħistopatoloġija għandha ssir fuq it-tessuti u l-organi identifikati bħala li qed juru l-effetti fil-gruppi trattati.
         2.   DATA U RAPPORTAĠĠ
         2.1.   DATA
         Id-data individwali għandha tiġi provduta. Barra minn hekk, id-data kollha għandha tkun riassunta f’għamla tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta’ l-annimali li nstabu mejta waqt it-test jew li nqatlu għal raġunijiet umani u l-ħin ta’ kwalunkwe mewt jew qtil uman, in-numru li juri sinjali ta’ tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta’ tossiċità osservati, inkluż il-ħin ta’ l-onset, it-tul, il-qawwa ta’ kwalunkwe effetti tossiċi, in-numru ta’ l-annimali li għandhom il-feriti, it-tip ta’ feriti u l-perċentwal ta’ l-annimali li għandhom kull tip ta’ ferita.
         Meta huwa applikabbli, ir-riżultati numeriċi għandhom jiġu evalwati b’metodu ta’ statistika xieraq u ġeneralment aċċettat. Il-metodi statistiċi u d-data li trid tiġi analizzata għandha tingħażel waqt id-disinn ta’ l-istudju.
         2.2.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         2.2.1.   Is-sustanza għat-test:
         
                     —
                  
                  
                     In-natura fiżika, il-purità u il-proprjetajiet fiżiko-kemikali;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-data ta’ identifikazzjoni;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-mezz (jekk inhu xieraq): il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-mezz, jekk mhuwiex l-ilma.
                  
               2.2.2.   L-ispeċi għat-test:
         
                     —
                  
                  
                     l-ispeċi/is-silta użati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     In-numru, l-età u s-sess ta’ l-annimali;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Is-sors, il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpoġġew, id-dieta eċċ.;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test.
                  
               2.2.3.   Il-kundizzjonijiet għat-test:
         
                     —
                  
                  
                     Ir-rationale għall-għażla tal-livell tad-doża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-dettalji tat-tħejjija tal-formulazzjoni/dieta tas-sustanza għat-test, il-konċentrazzjoni; miksuba u l-omoġeneità tat-tħejjija;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-dettalji tas-somministrazzjoni tas-sustanza għat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-dożi kif inhuma tabilħaqq (mg/kg piż tal-ġisem/jum), u l-fattur tal-konverżjoni mill-konċentrazzjoni tat-test għas-sustanza tad-dieta/l-ilma għax-xorb (ppm) għad-doża kif inhi tabilħaqq, jekk applikabbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-dettalji tal-kwalità ta’ l-ikel u ta’ l-ilma.
                  
               2.2.4.   Ir-riżultati:
         
                     —
                  
                  
                     Il-piż tal-ġisem/it-tibdil fil-piż tal-ġisem;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-konsum ta’ l-ikel u ta’ l-ilma jekk applikabbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-data tar-rispons tossiku bis-sess u bil-livell tad-doża, inklużi s-sinjali tat-tossiċità;
                  
               
                     —
                  
                  
                     In-natura, il-qawwa u t-tul ta’ l-osservazzjonijiet kliniċi (jekk humiex riversibbli jew le);
                  
               
                     —
                  
                  
                     L-eżaminazzjoni oftalmoloġika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-testijiet ematoloġiċi bil-valuri base-line relevanti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-testijiet tal-bijokemistrija klinika bil-valuri base-line relevanti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-piż tal-ġisem terminali, il-piżijiet ta’ l-organi u r-ratios tal-piż ta’ l-organi u tal-ġisem;
                  
               
                     —
                  
                  
                     is-sejbiet tan-nekropsija;
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatoloġiċi kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Id-data ta’ l-assorbiment jekk hi disponibbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     trattament statistiku tar-riżultati, fejn hu xieraq;
                  
               Id-diskussjoni tar-riżultati
         Konklużjonijiet.
         B.28.   STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ DERMALI SUB-KRONIKA STUDJU DERMALI TAD-DOŻA RIPETUT GĦAL 90 ĠURNATA LI JUŻA SPEĊI TA’ MAMMALI GERRIEMA
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.3.   SUSTANZI TA’ REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza tat-test hija applikata ta’ kuljum fuq il-ġilda f’dożi ggradati fuq għadd ta’ gruppi t’annimali esperimentali, doża waħda għal kull grupp għal perjodu ta’ 90 ġurnata. Matul dan il-perjodu t’applikazzjoni l-annimali huma osservati ta’ kuljum sabiex jiġu skoperti sinjali ta’ tossiċità. Annimali li jmutu waqt it-test issirilhom nekroskopija, u fit-tmiem tat-test l-annimali li jissopravivu ssirilhom nekroskopija.
         1.5.   KRITERJI TAL-KWALITÀ
         Xejn.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         
            Preparazzjonijiet
         
         L-annimali huma miżmumin taħt kundizzjonijiet ta’ sistemazzjoni u għalf esperimentali għal mill-inqas ħamest ijiem qabel it-test. Qabel it-test annimali żgħar u b’saħħithom huma magħżulin u assenjati lil gruppi ttrattati u gruppi tal-kontroll. Ftit qabel it-testijiet il-fur huwa imqasqas miż-żona dorsali tat-tronk ta’ l-annimali tat-test. Taqxir jista’ jiġi użat iżda jista’ biss jiġi magħmul bejn wieħed u ieħor 24 siegħa qabel it-test. Tqasqis jew taqxir ripetut huwa s-soltu meħtieġ bejn wieħed u ieħor f’intervalli ta’ ġimgħa. Meta jitqasqas jew jitqaxxar il-fur wieħed irid joqgħod attent li jevita li jobrox il-ġilda. Mhux inqas minn 10 % tal-piż ta’ l-erja tas-superfiċje tal-ġisem għandha tkun imnaddfa għall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Il-piż ta’ l-annimal irid jittieħed in kunsiderazzjoni meta jkun irid jiġi deċiż liema żona trid tkun imnaddfa u d-dimensjonijiet tal-kisi. Meta jiġu ttestjati s-solidi, li jistgħu jiġu magħmula fi trab jekk dan ikun xieraq, is-sustanza tat-test trid tkun imrattba bl-ilma jew, fejn meħtieġ, b’sustanza oħra xierqa biex tiżgura kuntatt tajjeb mal-ġilda. Sustanzi likwidi tat-test huma ġeneralment użati mhux iddilwiti. Applikazzjoni ta’ kuljum fuq bażi ta’ ħamest ijiem fil-ġimgħa jew ta’ sebat ijiem fil-ġimgħa hija użata.
         Kundizzjonijiet tat-test
         
            Annimali esperimentali
         
         Il-far adult, il-fenek jew il-fenek ta’ l-Indi jista’ jkun użat. Speċi oħrajn jistgħu ikunu użati iżda l-użu tagħhom ikun jeħtieġ ġustifkazzjoni. Fil-bidu tat-test il-limitu tal-varjazzjoniji tal-piżijiet għandha tkun ± 20 % tal-piż intermedju. Fejn ikun amministrat test sub-kroniku dermali bħala minn studju preliminarju sa studju għal tul ta’ żmien, l-istess speċi u razza għandha tintuża fiż-żewġ studji.
         
            Numru u sess
         
         Mill-inqas 20 annimal (10 ta’ sess femminili u 10 ta’ sess maskili) b’ġilda f’saħħitha għandhom ikunu użati f’kull livell tad-doża. L-annimali tas-sess femminili għandhom ikunu annimali li qatt ma welldu jew li m’humiex inċinta. Jekk hu ppjanat li xi annimali se jkunu ssagrifikati fl-intervall in-numru tagħhom għandu jkun miżjud skond in-numru t’annimali skedat biex jiġi ssagrifikat qabel it-terminu ta’ l-istudju. B’addizzjoni ma’ dan, grupp subordinat ta’ 20 annimal (10 annimali għal kull sess) jistgħu jkunu ttrattati b’doża ta’ livell qawwi għal 90 ġurnata u osservati għal riversibilità, persistenza jew okkorrenza ttardjata ta’ effetti tossiċi għal 28 ġurnata wara t-trattament.
         
            Livelli tad-doża
         
         Mill-inqas tliet livelli tad-doża huma meħtieġa b’kontroll jew b’sustanza ta’ kontroll jekk xi sustanza bħal din hija użata. Il-perjodu t’espożizzjoni għandu jkun mill-inqas ta’ sitt siegħat kuljum. L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test għandha tkun magħmula f’ħinijiet simili kuljum, u l-ammont tas-sustanza applikata għandu jiġi aġġustat f’intervalli (ta’ kull ġimgħa jew ta’ kull ġimgħatejn) sabiex il-livell tad-doża, f’termini ta’ piż tal-ġisem ta’ l-annimali, jinżamm kostanti. Għajr għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom jiġu ttrattati b’manjiera identika ta’ dawk is-soġġetti tal-grupp tat-test. Fejn sustanza tkun użata sabiex jiġi ffaċilitat id-dożaġġ, il-grupp tal-kontroll għandu jkun mogħti doża bħal dik tal-gruppi ttrattati, u jirċievi l-istess ammont bħal dak li jkun riċevut mill-grupp ta’ l-iktar livell qawwi ta’ doża. L-iktar livell qawwi ta’ doża għandu jirriżulta f’effetti tossiċi iżda ma jipproduċi l-ebda, jew ftit, fatalitajiet. L-inqas livell ta’ doża m’għandux jipproduċi xi evidenza ta’ tossiċità. Fejn hemm estimazzjoni użabbli ta’ espożizzjoni umana l-inqas livell ta’ doża jrid jaqbeż lil din l-estimazzjoni. Idealment, il-livell ta’ doża intermedju għandu jipproduċi effetti tossiċi osservabbli minimi. Jekk iktar minn doża waħda intermedja hija użata, il-livelli tad-doża għandhom ikunu spazjati sabiex tiġi prodotta gradazzjoni ta’ effetti tossiċi. Fil-gruppi baxxi u intermedji, u fil-gruppi tal-kontroll, l-inċidenza tal-fatalitajiet għandha tkun baxxa, biex tippermetti valutazzjoni sinjifiknti tar-riżultati.
         Jekk l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test tipproduċi irritazzjoni severa tal-ġilda il-konċentrazzjonijiet għandhom jiġu mnaqqsin u dan jista’ jirriżulta fi tnaqqis jew f’assenza ta’ effetti tossiċi oħrajn fil-livell qawwi tad-doża. Jekk lill-ġilda saritilha ħsara jista’ jkun neċessarju li l-istudju jiġi terminat u jsir studju ieħor b’konċentrazzjonijiet iktar baxxi.
         
            Test ta’ limitu
         
         Jekk studju preliminarju b’livell ta’ doża ta’ 1 000 mg/kilogramma, jew doża ogħla, relatata ma’ espożizzjoni umana possibbli, fejn hija magħrufa, ma jipproduċix l-ebda effetti tossiċi, testijiet iktar minn hekk jistgħu ma jkunux konsiderati neċessarji.
         
            Perijodu t’osservazzjoni
         
         L-annimali esperimentali għandhom ikunu osservati ta’ kuljum għal sinjali ta’ tossiċità. Il-ħin tal-mewt u l-ħin li fih jidhru s-sinjali tat-tossiċità għandhom ikunu miżmumin.
         
            Proċedura
         
         L-annimali għandhom jiġu magħluqin ġo gaġġa individwalment. L-annimali għandhom jiġu ttrattati bis-sustanza tat-test, idealment fuq bażi ta’ sebat ijiem fil-ġimgħa, għal perjodu ta’ 90 ġurnata.
         L-annimali fi gruppi subordinati skedati għal osservazzjonijiet ta’ wara għandhom jiġu miżmuma għal 28 ġurnata iktar mingħajr trattament sabiex jiġi osservat l-irkupru mill-jew il-persistenza ta’ l-effetti tossiċi. Il-ħin ta’ l-espożizzjoni għandu jkun ta’ sitt siegħat kuljum.
         Is-sustanza tat-test għandha tkun applikata uniformement fuq żona li hija bejn wieħed u ieħor 10 % tas-superfiċje totali tal-ġisem. Fejn is-sustanzi huma tossiċi ħafna, l-erja tas-superfiċje miksija tista’ tkun inqas iżda l-istess ammont ta’ l-erja għandu jiġi miksi b’rita rqieqa u uniformi daqs kemm hu possibbli.
         Matul l-espożizzjoni is-sustanza tat-test hija miżmuma f’kuntatt mal-ġilda permezz garża poruża u b’tejp li ma jirritax. Is-sît tat-test għandu jkun miksi iktar minn hekk b’mod xieraq biex iżomm il-garża u s-sustanza tat-test u jiżgura li l-annimali ma jkunux jistgħu jibilgħu is-sustanza tat-test. Rażżâna jistgħu jiġu użati sabiex jipprevejenu l-inġestjoni tas-sustanza tat-test iżda l-immobilizzazzjoni kompleta tas-sustanza tat-test m’huwiex metodu rakkomandat.
         Fit-terminu tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni, xi sustanza residwa tat-test għandha tiġi mneħħija fejn huwa prattiku permezz ta’ l-ilma jew b’metodu ieħor xieraq li jnaddaf il-ġilda.
         L-annimali kollha għandhom jiġu osservati ta’ kuljum u sinjali ta’ tossiċità għandhom ikunu miżmuma, inkluż il-ħin ta’ l-ewwel attakk tagħhom, il-grad tagħhom u d-dewmien tagħhom. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u fil-fur, fl-għajnejn u fil-membrani mukużi, kif ukoll fis-sistemi respiratorji, ċirkulatorji, awtonomiċi u nervużi ċentrali, fl-attività somatomotorja u fil-mudell ta’ komportament. Qjisien tal-konsum ta’ l-ikel għandhom jittieħdu ta’ kull ġimgħa. Osservazzjonijiet regolari ta’ l-annimali huma neċessarju sabiex l-annimali ma jiġux mitlufin mill-istudju minħabba kawżi bħal kannibaliżmu, awtolisi tat-tessuti jew minħabba li jiġu mqiegħdin f’post ieħor. Fit-terminu tal-perjodu ta’ l-istudju s-sopravissuti fil-gruppi tat-trattament mhux subordinati issirilhom nekroskopija. Annimali moribondi għandhom jiġu mneħħija u għandha ssirilhom nekroskopija meta jkun avżat.
         Dawn l-eżamijiet huma s-soltu magħmulin fuq l-annimali kollha inklużi dawk tal-kontroll:
         
                     (a)
                  
                  
                     Eżami oftalmoloġiku, bl-użu ta’ oftalmoskopju jew tagħmir addattat ekwivalenti, għandu jiġi magħmul qabel l-espożizzjoni għas-sustanza tat-test u fit-terminu ta’ l-istudju, preferibbilment fuq kull animal iżda mill-inqas fuq l-annimali tad-doża qawwija u fuq dawk tal-kontroll. Jekk tibdiliet fl-għajnejn huma skoperti l-annimali kollha għandhom jiġu eżaminati.
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     Ematoloġija, inklużi l-ematokrit, il-konċentrazzjoni ta’ l-emoglobina, il-kwantità ta’ l-eritroċit, it-total u d-differenzali tal-kwantità ta’ l-eritroċit, u l-qjies tal-potenzal tat-tagħqid tad-demm, bħall-ħin tat-tagħqid, il-ħin tal-protrombin, il-ħin tat-tromboplastin, jew il-kwantità tad-diski ż-żgħar fid-demm, għandhom ikunu nvestigati fit-terminu tal-perjodu tat-test.
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     Determinazzjoni tal-bijokimika tal-klinika fuq id-demm għandha tkun magħmula fit-terminu tal-perjodu tat-test. Iż-żoni tat-test li huma konsiderati xierqa għall-istudji kollha huma l-bilanċ elettrolit, il-metaboliżmu tal-karboidrati, il-funzjoni tal-fwied u tal-kliewi. Is-selezzjoni ta’ testijiet speċifiċi jiġu nfluwenzati b’osservazzhonijiet fuq il-mod t’azzjoni tas-sustanza. Determinazzjonijiet suġġeriti huma l-kalċju, l-fosfru, l-kloru, s-sodju, l-potassju, il-glukosju tas-sawm (b’perjodu ta’ sawm addattat għall-ispeċi), transaminat tas-serkum glutamiku pirviku [6], transaminat tas-serum glutamiku ożaloċetiku [7], dekarbonat ta’ l-ornitin, transpeptidu tal-gamma glutamiku, nitroġenu ta’ l-urea, albumina, kreatina tad-demm, u t-total tal-qjies tal-proteini tal-bilirubin u tas-serum. Determinazzjonijiet oħrajn li jistgħu jkunu neċessarji għal valutazzjoni xierqa tossikoloġika jinkludu analiżi tal-lipidi, ormoni, bilanċ ta’ l-aċidu/alkali, attività metemoglobina u kolìnestera. Bijokimika tal-klinika addizzjonali tista’ tkun użata fejn ikun neċessarju sabiex tiġi estiża l-investigazzjoni ta’ l-effetti osservati.
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     Analiżi kimika ta’ l-awrina m’hijiex meħtieġa fuq bażi ta’ rutina iżda hija biss meħtieġa meta hemm indikazzjoni bbażata fuq tossiċità mistennija jew osservata.
                  
               Jekk id-data storika tal-linja bażi m’hijiex adegwata, għandha tingħata kunsiderazzjoni lid-determinazzjoni tal-parametri tal-bijokimika ematoloġika u klinika qabel ma jibda d-dożaġġ.
         
            Nekroskopija totali
         
         L-annimali kollha għandhom ikunu soġġetti għal nekroskopija totali u sħiħa li tinkludi eżami tas-superfiċje esterna tal-ġisem, ta’ kull fetħa tal-ġisem, u tal-ħofor kranjali, toraċiċi u addominali u l-kontenut tagħhom. Il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, it-tirojde (bil-paratirojde), u t-testikoli għandhom ikunu peżati friski malajr kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni sabiex jiġi evitat li jixxottaw. L-organi u t-tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati għal xi eżamijiet istopatoloġiċi futuri possibbli: il-ħsarat kbar fil-ġisem, il-moħħ – inklużi sezzjonijiet tal-medulla/parti ta’ l-għerq tal-moħħ li tgħaqqad il-medulla oblongata mat-talamu, il-kortiċi taċ-ċervellett u l-kortiċi celebrali, it-tessut pitwitarju, it-tessut tat-tirojde jew tal-paratirojde, it-tessut tat-timu, (it-trakea), il-pulmuni, il-qalb, l-aorta, il-glandoli tar-rieq, il-fwied, il-milsa, il-kliewi, l-adrenali, il-frixa, il-gonadi, l-utru (l-organi ġenitali aċċessorji), (il-ġilda), il-bużżieqa tal-marrara, l-esofagu, l-istonku, id-duwodenu, il-parti ta’ bejn id-duwodenu u l-ilju, l-ilju, il-musrana l-għamja, il-musrana l-ħoxna, ir-rektum, il-bużżieqa ta’ l-awrina, il-glandola limfatika rappreżentattiva, (il-glandola tal-ħalib tas-sess femminil), (il-muskolatura tal-koxxa), in-nerv periferali, (l-għajnejn), l-isternu bl-għadam tal-mudullun, (il-wirk, inkluża s-superfiċje artikulari), u (n-nerv li jgħaddi minn ġos-sinsla fuq tliet livelli – ċervikali, toraċiku tan-nofs u tal-ġenbejn). It-tessuti msemmijin fil-parentesi għandhom jiġu eżaminati biss jekk jiġu indikati permezz ta’ sinjali ta’ tossiċità, jew permezz ta’ involviment ta’ l-organu li huwa t-targit.
         
            Eżami istopatoloġiku
         
         
                     (a)
                  
                  
                     Istopatoloġija sħiħa għandha tiġi magħmula fuq ġilda normali u ttrattata u fuq l-organi u t-tessuti ta’ l-annimali fil-gruppi tal-kontroll u tad-doża qawwija.
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     Kull ħsara serja għandha tiġi eżaminata.
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     Organi tat-targit fi gruppi ta’ doża oħrajn għandhom jiġu eżaminati.
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     Fejn il-firien huma użati, il-pulmuni ta’ l-annimali fil-gruppi ta’ doża baxxa u imtermedja għandhom jiġu soġġetti għal eżami istopatoloġiku għal evidenza ta’ infezzjoni, billi dan jipprovdi valutazzjoni konvenjenti ta’ l-istat ta’ saħħa ta’ l-annimali. Eżami istopatoloġiku iktar fil-fond jista’ ma jkunx meħtieġ bħala rutina fuq l-annimali f’dawn il-gruppi, iżda għandu dejjem isir fl-organi li juru evidenza ta’ ħsara fil-gruppi ta’ doża qawwija.
                  
               
                     (e)
                  
                  
                     Meta grupp subordinat huwa użat, l-istopatoloġija għandha tkun magħmula fuq it-tessuti u fuq l-organi identifikati bħala li juru effetti fil-gruppi l-oħrajn ittrattati.
                  
               2.   DATA
         Id-data għandha tiġi miġbura fil-qosor f’forma tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali li kien hemm fil-bidu tat-test, in-numru ta’ l-annimali li juru ħsara f’ġisimhom, it-tip ta’ ħsara f’ġisimhom u l-persentaġġ ta’ l-annimali li juru iż-żewġ tipi ta’ ħsara. Ir-riżultati għandhom jiġu evalwati b’metodu ta’ l-istatistika xieraq. Kwalunkwe metodu ta’ l-istatistika rikonoxxut jista’ jintuża.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja, jekk possibbli:
         
                     —
                  
                  
                     in-nisel ta’ l-ispeċi jew ir-razza, minn fejn ġejja l-ispeċi, il-kundizzjonijiet ta’ l-ambjent, dieta;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kundizzjonijiet tat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-livelli tad-doża (inkluża xi sustanza, jekk użata) u konċentrazzjonijiet;
                  
               
                     —
                  
                  
                     data tar-rispons tossiku, bis-sess u d-doża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-livell fejn m’hemmx effett, meta possibbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin tal-mewt waqt l-istudju jew jekk l-annimali ssopravivewx sat-tmiem;
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni ta’ effetti tossiċi jew effetti oħrajn (b’attenzjoni partikolari għal skoperti tal-klinika);
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin ta’ l-osservazzjoni ta’ kull sinjal anormali u ż-żmien sussegwenti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     data ta’ l-għalf u tal-piż tal-ġisem;
                  
               
                     —
                  
                  
                     skoperti oftalmoloġiċi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet ematoloġiċi użati u r-riżultati kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet tal-bijokimika tal-klinika użati u r-riżultati kollha (inklużi r-riżultati ta’ xi analiżi kimika ta’ l-awrina);
                  
               
                     —
                  
                  
                     skoperti tan-nekroskopija;
                  
               
                     —
                  
                  
                     dekrizzjoni dettaljata ta’ l-iskoperti istopatoloġiċi kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     trattament ta’ l-istatistika tar-riżultati fejn huwa xieraq;
                  
               
                     —
                  
                  
                     diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         B.29.   STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ TA’ ĠBID GĦAL ĠOL-PULMUN SUB-KRONIKU STUDJU TAD-DOŻA TA’ ĠBID GĦAL ĠOL-PULMUN RIPETUT GĦAL 90 ĠURNATA LI JUŻA SPEĊI TA’ MAMMALI GERRIEMA
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.3.   SUSTANZI TA’ REFERENZA
         Xejn
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Għadd ta’ gruppi t’annimali esperimentali huma esposti ta’ kuljum għal perjodu definit għas-sustanza tat-test f’konċentrazzjonijiet gradati, b’konċentrazzjoni waħda użata għal kull grupp, għal perjodu ta’ 90 ġurnata. Fejn hemm sustanza użata biex tgħin il-ġenerazzjoni ta’ konċentrazzjonijiet xierqa tas-sustanza tat-test fl-atmosfera, grupp ta’ kontroll ta’ din is-sustanza għandu jiġi użat. Matul dan il-perjodu t’applikazzjoni l-annimali huma osservati ta’ kuljum sabiex jiġu skoperti sinjali ta’ tossiċità. Annimali li jmutu waqt it-test issirilhom nekroskopija, u fit-tmiem tat-test l-annimali li jissopravivu ssirilhom nekroskopija.
         1.5.   KRITERJI TAL-KWALITÀ
         Xejn.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         
            Preparazzjonijiet
         
         L-annimali huma miżmumin taħt kundizzjonijiet ta’ sistemazzjoni u għalf esperimentali għal mill-inqas ħamest ijiem qabel it-test. Qabel it-test annimali żgħar u b’saħħithom huma magħżulin u assenjati lil gruppi ttrattati u gruppi tal-kontroll. Fejn ikun neċessarju, sustanza xierqa tista’ tiġi miżjuda mas-sustanza tat-test biex tgħin il-ġenerazzjoni ta’ konċentrazzjonijiet xierqa tas-sustanza tat-test fl-atmosfera. Jekk din is-sustanza jew addittivi oħrajn huma użati sAbiex jiffaċilitaw id-dożaġġ, dawn iridu jkunu magħrufa bħala li ma jipproduċux effett tossiku. Data storika tista’ tkun użata fejn huwa xieraq.
         
            Kundizzjonijiet tat-test
         
         
            Annimali esperimentali
         
         Għajr fejn ikun hemm kontra-indikazzjonijiet, il-far huwa l-ispeċ i preferuta. Razez t’annimali żgħar b’saħħithom komunement użati għal-laboratorju għandhom jiġu użati. Fil-bidu tat-test il-limitu tal-varjazzjoniji tal-piżijiet għandha tkun ta’ ± 20 % tal-piż intermedju. Fejn ikun amministrat test sub-kroniku tal-ġbid fil-pulmun bħala minn studju preliminarju sa studju għal tul ta’ żmien, l-istess speċi u razza għandha tintuża fiż-żewġ studji.
         
            Numru u sess
         
         Mill-inqas 20 annimal (10 ta’ sess femminili u 10 ta’ sess maskili) b’ġilda f’saħħitha għandhom ikunu użati f’kull livell tad-doża. L-annimali tas-sess femminili għandhom ikunu annimali li qatt ma welldu jew li m’humiex inċinta. Jekk hu ppjanat li xi annimali se jkunu ssagrifikati fl-intervall in-numru tagħhom għandu jkun miżjud skond in-numru t’annimali skedat sabiex jiġi ssagrifikat qabel it-terminu ta’ l-istudju. B’addizzjoni ma’ dan, grupp subordinat ta’ 20 annimal (10 annimali għal kull sess) jistgħu jkunu ttrattati b’doża ta’ livell qawwi għal 90 ġurnata u osservati għal riversibilità, persistenza jew okkorrenza ttardjata ta’ effetti tossiċi għal 28 ġurnata wara t-trattament.
         
            Konċentrazzjonijiet ta’ l-espożizzjoni
         
         Mill-inqas tliet konċentrazzjonijiet huma meħtieġa, b’kontroll jew sustanza ta’ kontroll (li tikkorrispondi mal-konċentrazzjoni tas-sustanza fl-ogħla livell tagħha) jekk sustanza bħal din hija użata. Għajr għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom jiġu ttrattati b’manjiera identika ta’ dawk is-soġġetti tal-grupp tat-test. L-iktar konċentrazzjoni qawwija għandha tirriżulta f’effetti tossiċi iżda ma tipproduċi l-ebda, jew ftit, fatalitajiet. Fejn jemm estimazzjoni użabbli ta’ espożizzjoni umana l-inqas livell ta’ jrid jaqbżu. Idealment, il-konċentrazzjoni intermedja għandha tipproduċi effetti tossiċi osservabbli minimi. Jekk iktar minn konċentrazzjoni waħda intermedja hija użata, il-konċentrazzjonijiet għandhom ikunu spazjati sabiex tiġi prodotta gradazzjoni ta’ effetti tossiċi. Fil-gruppi baxxi u intermedji, u fil-gruppi tal-kontroll, l-inċidenza tal-fatalitajiet għandha tkun baxxa, biex tippermetti valutazzjoni sinjifikanti tar-riżultati.
         
            Ħin ta’ l-espożizzjoni
         
         Id-dewmien ta’ l-espożizzjoni ta’ kuljum għandha tkun ta’ sitt siegħat wara l-ekwilibrazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tal-kompartiment. Dewmien ieħor jista’ jiġi użat sabiex jilħaq ħtiġijiet speċifiċi.
         
            Tagħmir
         
         L-annimali għandhom jiġu ttestjati f’tagħmir ta’ ġbid fil-pulmun magħmul biex iżomm fluss ta’ arja dinamiku ta’ mill-inqas 12-il tibdila ta’ l-arja għal kull siegħa sabiex jiġi żgurat kontenut t’ossiġenu adegwat u atmosfera ta’ l-espożizzjoni distribwita fl-istess kwalità. Meta kompartiment jiġi użat, irid ikun disinjat b’mod li jnaqqas l-iffullar ta’ l-annimali tat-test u jżid l-espożizzjoni tagħhom sal-massimu għall-ġbid tas-sustanza tat-test fil-pulmun. Kompartimenti individwali għal espożizzjoni oro-nażali, għal espożizzjoni tar-ras biss, jew għal espożizzjoni tal-ġisem kollu jistgħu jiġu użati; l-ewwel tnejn inaqsu l-ammont li jinġibed permezz ta’ rotot oħrajn.
         
            Perijodu t’osservazzjoni
         
         L-annimali esperimentali għandhom ikunu osservati ta’ kuljum għal sinjali ta’ tossiċità. Il-ħin tal-mewt u l-ħin li fih jidhru s-sinjali tat-tossiċità għandhom ikunu miżmumin.
         
            Proċedura
         
         L-annimali huma esposti għas-sustanza tat-test ta’ kuljum, minn ħames sa’ sebat ijiem fil-ġimgħa, għal perjodu ta’ 90 ġurnata. Annimali f’xi gruppi subordinati skedati għall-osservazzjonijiet ta’ wara għandhom jinżammu għal 28 ġurnata oħra mingħajr trattament sabiex jiġi skopert l-irkupru minn jew il-persistenza ta’ l-effetti tossiċi. It-temperatura li fiha t-test huwa magħmul għandha tkun miżmuma għal 22 ± 3 oC. Idealment, l-umdità relattiva għandha tkun miżmuma bejn it-30 % u s-70 %, iżda f’ċerti sitwazzjonijiet (pereżempju t-test ta’ l-ajrusol) dan jista’ ma jkunx prattiku. Ikel u xorb għandu jinżamm milli jingħata waqt l-espożizzjoni.
         Sistema dinamika ta’ ġbid fil-pulmun b’sistema xierqa ta’ konċentrazzjoni analitika għandha tiġi użata. Sabiex jiġu stabbiliti l-konċentrazzjonijiet xierqa ta’ l-espożizzjoni, test ta’ prova huwa rakkomandat. Il-fluss ta’ l-arja għandu jkun aġġustat biex jiżgura li l-kundizzjonijiet matul il-kompartiment ta’ l-espożizzjoni huwa omoġenu. Is-sistema għandha tiżgura li kundizzjonijiet t’espożizzjoni stabbli huma milħuqa malajr kemm jista’ jkun.
         Għandhom jiġu magħmulin qisien jew osservar:
         
                     (a)
                  
                  
                     tar-rata tal-fluss ta’ l-arja (kontinwament);
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     tal-konċentrazzjoni attwali tas-sustanza tat-test imkejjla fiż-żona tan-nifs. Matul il-perjodu ta’ l-espożizzjoni ta’ kuljum il-konċentrazzjoni m’għandhiex tvarja b’iktar minn ± 15 % tal-valur intermedju. Iżda fil-każ tat-trabijiet u ta’ l-ajrusol, dan il-livell ta’ kontroll ma jistax jiġi miksub u marġini usa’ jiġu aċċettabbli. Matul id-dewmien totali ta’ l-istudju, il-konċentrazzjonijiet minn jum għall-ieħor għandhom jinżammu kostanti daqs kemm huwa prattiku. Matul l-iżvilupp tas-sistema li tiġġenera, analiżi tad-daqs tal-partikoli għandha tkun magħmula biex jiġu stabbiliti l-konċetrazzjonijiet ta’ l-ajrusol. Matul l-espożizzjoni, analiżi għandha tiġi magħmula kemm ikun neċessarju sabiex tiġi determinata l-konsistenza tad-distribuzzjoni tad-daqs tal-partikoli;
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     it-temperatura u l-umdità
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     matul u wara l-esposizzzjoni, osservazzjonijiet għandhom isiru u jiġu mniżżlin sistematikament; informazzjoni individwali għandha tinżamm għal kull annimal. L-annimali kollha għandhom jiġu osservati ta’ kuljum u sinjali ta’ tossiċità għandhom ikunu miżmuma, inkluż il-ħin ta’ l-ewwel attakk, il-grad tagħhom u d-dewmien tagħhom. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu tibdil fil-ġilda u fil-fur, fl-għajnejn u fil-membrani mukużi, kif ukoll fis- sistemi respiratorji, ċirkulatorji, awtonomiċi u nervużi ċentrali, fl-attività somatomotorja u fil- mudell ta’ komportament. Qjisien tal-konsum ta’ l-ikel għandhom jittieħdu ta’ kull ġimgħa. osservazzjonijiet regolari ta’ l-annimali hwa neċessarju sabiex l-annimali ma jiġux mitlufin mill-istudju minħabba kawżi bħal kannibaliżmu, awtolisi tat-tessuti jew minħabba li jiġu mqegħdin f’post ieħor. Fit-terminu tal-perjodu ta’ l-istudju s-sopravissuti fil-gruppi tat- trattament mhux subordinati ssirilhom nekroskopija. Annimali moribondi għandhom jiġu mneħħija u għandha ssirilhom nekroskopija meta jkun avżat.
                  
               Dawn l-eżamijiet huma s-soltu magħmulin fuq l-annimali kollha inklużi dawk tal-kontroll:
         
                     (a)
                  
                  
                     Eżami oftalmoloġiku, bl-użu ta’ oftalmoskopju jew tagħmir addattat ekwivalenti, għandu jiġi magħmul qabel l-espożizzjoni għas-sustanza tat-test u fit-terminu ta’ l-istudju, preferibbilment fuq kull animal iżda mill-inqas fuq l-annimali tad-doża qawwija u fuq dawk tal-kontroll. Jekk tibdiliet fl-għajnejn huma skoperti l-annimali kollha għandhom jiġu eżaminati.
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     Ematoloġija, inklużi l-ematokrit, il-konċentrazzjoni ta’ l-emoglobina, il-kwantità ta’ l-eritroċit, it-total u d-differenzali tal-kwantità ta’ l-eritroċit, u l-qjies tal-potenzal tat-tagħqid tad-demm, bħall-ħin tat-tagħqid, il-ħin tal-protrombin, il-ħin tat-tromboplastin, jew il-kwantità tad-diski ż-żgħar fid-demm, għandhom ikunu nvestigati fit-terminu tal-perjodu tat-test.
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     Determinazzjoni tal-bijokimika klinika fuq id-demm għandha tkun magħmula fit-terminu tal-perjodu tat-test. Iż-żoni tat-test li huma konsiderati xierqa għall-istudji kollha huma l-bilanċ elettrolit, il-metaboliżmu tal-karboidrati, il-funzjoni tal-fwied u tal-kliewi. Is-selezzjoni ta’ testijiet speċifiċi jiġu nfluwenzati b’osservazzhonijiet fuq il-mod t’azzjoni tas-sustanza. Determinazzjonijiet suġġeriti huma l-kalċju, l-fosfru, l-kloru, s-sodj, l-potassju, il-glukosju tas-sawm (b’perjodu ta’ sawm addattat għall-ispeċi), transaminat tas-serkum glutamiku pirviku [8], transaminat tas-serum glutamiku ożaloċetiku [9], dekarbonat ta’ l-ornitin, transpeptidu tal-gamma glutamiku, nitroġenu ta’ l-urea, albumina, kreatina tad-demm, u t-total tal-qjies tal-proteini tal-bilirubin u tas-serum. Determinazzjonijiet oħrajn li jistgħu jkunu neċessarji għal valutazzjoni xierqa tossikoloġika jinkludu analiżi tal-lipidi, ormoni, bilanċ ta’ l-aċidu/alkali, attività metemoglobina u kolìnestera. Bijokimika klinika addizzjonali tista’ tkun użata fejn neċessarju biex tiġi estiża l-investigazzjoni ta’ l-effetti osservati.
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     Analiżi kimika ta’ l-awrina m’hijiex meħtieġa fuq bażi ta’ rutina iżda hija biss meħtieġa meta hemm indikazzjoni bbażata fuq tossiċità mistennija jew osservata.
                  
               Jekk id-data storika tal-linja bażi m’hijiex adegwata, għandha tingħata kunsiderazzjoni lid-determinazzjoni tal-parametri tal-bijokimika ematoloġika u klinika qabel ma jibda d-dożaġġ.
         
            Nekroskopija totali
         
         L-annimali kollha għandhom ikunu soġġetti għal nekroskopija totali u sħiħa li tinkludi eżami tas-superfiċje esterna tal-ġisem, ta’ kull fetħa tal-ġisem, u tal-ħofor kranjali, toraċiċi u addominali u l-kontenut tagħhom. Il-fwied, il-kliewi, l-adrenali, it-tirojde (bil-paratirojde), u t-testikoli għandhom ikunu peżati friski malajr kemm jista’ jkun wara d-dissezzjoni sabiex jiġi evitat li jixxottaw. L-organi u t-tessuti li ġejjin għandhom ikunu preservati għal xi eżamijiet istopatoloġiċi futuri possibbli: il-ħsarat kbar fil-ġisem, il-moħħ – inklużi sezzjonijiet tal-medulla/parti ta’ l-għerq tal-moħħ li tgħaqqad il-medulla oblongata mat-talamu, il-kortiċi taċ-ċervellett u l-kortiċi celebrali, it-tessut pitwitarju, it-tessut tat-tirojde jew tal-paratirojde, it-tessut tat-timu, (it-trakea), il-pulmuni, il-qalb, l-aorta, il-glandoli tar-rieq, il-fwied, il-milsa, il-kliewi, l-adrenali, il-frixa, il-gonadi, l-utru (l-organi ġenitali aċċessorji), (il-ġilda), il-bużżieqa tal-marrara, l-esofagu, l-istonku, id-duwodenu, il-parti ta’ bejn id-duwodenu u l-ilju, l-ilju, il-musrana l-għamja, il-musrana l-ħoxna, ir-rektum, il-bużżieqa ta’ l-awrina, il-glandola limfatika rappreżentattiva, (il-glandola tal-ħalib tas-sess femminil), (il-muskolatura tal-koxxa), in-nerv periferali, (l-għajnejn), l-isternu bl-għadam tal-mudullun, (il-wirk, inkluża s-superfiċje artikulari), u (n-nerv li jgħaddi minn ġos-sinsla fuq tliet livelli – ċervikali, toraċiku tan-nofs u tal-ġenbejn). It-tessuti msemmijin fil-parentesi għandhom jiġu eżaminati biss jekk jiġu indikati permezz ta’ sinjali ta’ tossiċità, jew permezz ta’ involviment ta’ l-organu li huwa t-targit.
         
            Eżami istopatoloġiku
         
         
                     (a)
                  
                  
                     Istopatoloġija sħiħa għandha tiġi magħmula fuq ġilda normali u ttrattata u fuq l-organi u t-tessuti ta’ l-annimali fil-gruppi tal-kontroll u tad-doża qawwija.
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     Kull ħsara serja għandha tiġi eżaminata.
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     Organi tat-targit fi gruppi ta’ doża oħrajn għandhom jiġu eżaminati.
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     Il-pulmuni ta’ l-annimali fil-gruppi tad-doża baxxi u imtermedji għandhom ukoll ikunu soġġetti għal eżami istopatoloġiku; billi dan jipprovdi valutazzjoni konvenjenti ta’ l-istat ta’ saħħa ta’ l-annimali. Eżami istopatoloġiku iktar fil-fond jita’ ma jkunx meħtieġ bħala rutina fuq l-annimali f’dawn il-gruppi, iżda għandu dejjem isir fl-organi li juru evidenza ta’ ħsara fil-gruppi ta’ doża qawwija.
                  
               
                     (e)
                  
                  
                     Meta grupp subordinat huwa użat, l-istopatoloġija għandha tkun magħmula fuq it-tessuti u fuq l-organi identifikati bħala li juru effetti fil-gruppi l-oħrajn ittrattati.
                  
               2.   DATA
         Id-data għandha tiġi miġbura fil-qosor f’forma tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali li kien hemm fil-bidu tat-test, in-numru ta’ l-annimali li juru ħsara f’ġisimhom, it-tip ta’ ħsara f’ġisimhom u l-persentaġġ ta’ l-annimali li juru iż-żewġ tipi ta’ ħsara. Ir-riżultati għandhom jiġu evalwati b’metodu ta’ l-istatistika xieraq. Kwalunkwe metodu ta’ l-istatistika rikonoxxut jista’ jintuża.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja, jekk possibbli:
         
                     —
                  
                  
                     in-nisel ta’ l-ispeċi jew ir-razza, minn fejn ġejja l-ispeċi, il-kundizzjonijiet ta’ l-ambjent, dieta;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kundizzjonijiet tat-test:
                     Deskrizzjoni ta’ l-apparat ta’ l-espożizzjoni: inkluż id-disinn, tip, dimensjonijiet, minn fejn tidħol l-arja, is-sistema tal-ġenerazzjoni ta’ partikoli separati u ajrusol, il-metodu tal-kondizzjonar ta’ l-arja, it-trattament ta’ l-egżost ta’ l-arja u l-metodu ta’ l-akkomodazzjoni ta’ l-annimali f’kompartimenti tat-tesst meta dawn huma użati. It-tagħmir għat-tkejjil tat-temperatura, umdità u, fejn xieraq, ta’ l-istabilità tal-konċentrazzjonijiet ta’ l-ajrusol jew id-daqs tal-paartikuli, għandhom jiġu deskritti.
                     Data ta’ l-espożizzjoni: din għandha tkun imqiegħda f’lista u ppreżentata b’valuri intermedji u b’miżura ta’ varjabilità (per eżempju d-devjazzjoni ta’ l-istandard) u għandha tinkludi:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 rati tal-fluss ta’ l-arja mit-tagħmir tal-ġbid fin-nifs;
                              
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 temperatura u umdità ta’ l-arja;
                              
                           
                                 (ċ)
                              
                              
                                 konċentrazzjonijiet nominali (l-ammont totali tas-sustanza tat-test imqiegħda fit-tagħmir tal-ġbid tan-nifs diviż bil-volum ta’ l-arja);
                              
                           
                                 (d)
                              
                              
                                 in-natura ta’ sustanza oħra, jekk użata;
                              
                           
                                 (e)
                              
                              
                                 konċentrazzjonijiet attwali fiż-żona tan-nifs ittestjata;
                              
                           
                                 (f)
                              
                              
                                 daqsijiet medjani tal-partikoli (fejn xierqa),
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     data tar-rispons tossiku, bis-sess u d-doża,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-livell fejn m’hemmx effett, meta possibbli,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin tal-mewt waqt l-istudju jew jekk l-annimali ssopravivewx sat-tmiem,
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni ta’ effetti tossiċi jew effetti oħrajn (b’attenzjoni partikolari għal skoperti tal-klinika),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin ta’ l-osservazzjoni ta’ kull sinjal anormali u ż-żmien sussegwenti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     data ta’ l-għalf u tal-piż tal-ġisem,
                  
               
                     —
                  
                  
                     skoperti oftalmoloġiċi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet ematoloġiċi użati u r-riżultati kollha,
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet tal-bijokimika tal-klinika użati u r-riżultati kollha (inklużi r-riżultati ta’ xi analiżi kimika ta’ l-awrina),
                  
               
                     —
                  
                  
                     skoperti tan-nekroskopija,
                  
               
                     —
                  
                  
                     dekrizzjoni dettaljata ta’ l-iskoperti istopatoloġiċi kollha,
                  
               
                     —
                  
                  
                     trattament ta’ l-istatistika tar-riżultati fejn huwa xieraq,
                  
               
                     —
                  
                  
                     diskussjoni tar-riżultati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         B.30.   STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ KRONIKA
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.3.   SUSTANZI TA’ REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza tat-test hija somministrata normali, sebat ijiem fil-ġimgħa, permezz ta’ rotta xierqa, lil għadd ta’ gruppi t’annimali esperimentali, doża waħda għal kull grupp, għal porzjon prinċipali tat-tul tal-ħajja tagħhom. Matul u wara l-espożizzjoni, l-annimali esperimentali huma osservati ta’ kuljum sabiex jiġu skoperti sinjali ta’ tossiċità.
         1.5.   KRITERJI TA’ KWALITÀ
         Xejn.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         Preparazzjonijiet
         L-annimali huma miżmuma taħt kundizzjonijiet t’ akkomodazzjoni u għalf esperimentali għal mill-inqas ħamest ijiem qabel it-test. Qabel it-test, annimali żgħar u b’saħħithom huma magħżulin u assenjati lil gruppi ttrattati u lill-gruppi tal-kontroll.
         Kundizzjonijiet tat-test
         
            Annimali esperimentali
         
         L-ispeċi preferuta hija l-far.
         Jekk ikun hemm bażi ta’ riżultati ta’ studji magħmulin qabel, speċi oħrajn (mammali gerriema jew dawk mhux gerriema) jistgħu jiġu użati. Razez t’annimali żgħar u b’saħħithom komunement użati fil-laboratorju għandhom ikunu użati u d-dożaġġ għandu jibda malajr kemm jista’ jkun wara l-ftim.
         Fil-bidu ta’ l-istudju il-varjazzjoni tal-piż fl-annimali m’għandhiex taqbeż l-± 20 % tal-valur intermedju. Fejn jiġi magħmul test sub-kroniku orali bħala minn studju preliminarju sa studju fit-tul, l-istess speċi/nisel u razza għandhom jiġu użati fiż-żewġ studji.
         
            Numru u sess
         
         Għall-mammali gerriema mill-inqas 40 annimal (20 tas-sess femminil u 20 tas-sess maskil) għandhom jiġu użati f’kull livell ta’ doża u fil-grup tal-kontroll konkorrenti. L-annimali tas-sess femminili għandhom ikunu dawk li qatt ma welldu jew li ma jkunux inċinta. Jekk huma ppjanati sagrifiċċji fl-intervall, in-numru għandu jiżdied bin-numru t’annimali skedati sabiex jiġu ssagrifikati qabel ma jkun lest l-istudju.
         Għall-mammali mhux gerriema numru iżgħar t’annimali, iżda mill-inqas erba’ għal kull sess għal kull grupp, huwa aċċettabbli.
         
            Livelli tad-doża u frekwenza ta’ l-espożizzjoni
         
         Mill-inqas tliet livelli għandhom jiġu użati b’żieda mal-grupp tal-kontroll konkorrenti. Logħla livell tad-doża għandu jislet sinjali definittivi ta’ tossiċità li tikkawża l-mewt eċċessiva.
         Il-livell baxx tad-doża m’għandux jipproduċi evidenza ta’ tossiċità.
         Id-doża intermedja għandha tiġi stabbilita fil-marġini tan-nofs bejn id-dożi l-għoljin u d-dożi l-baxxi.
         Is-selezzjoni tal-livelli tad-doża għandha tieħu in kunsiderazzjoni d-data minn testijiet u studji ta’ tossiċità preċedenti.
         Il-frekwenza ta’ l-espożizzjoni hija normalment ta’ kuljum. Jekk il-kimika hija somministrata fl-ilma tax-xorb jew imħallta fid-dieta din għandha tkun ipprovduta kontinwament.
         
            Kontrolli
         
         Grupp ta’ kontroll konkorrenti li huwa identiku f’kull aspett għall-gruppi ttrattati, għajr għall-espożizzjoni għas-sustanza tat-test, għandu jiġi użat.
         F’ċirkostanzi speċjali, bħal fi studji ta’ ġbid fin-nifs li jinvolvu l-ajrusol jew l-użu t’emulsjonant t’attività bijoloġika mhux karatterizzata fi studji orali, grupp ta’ kontroll negattiv konkorrenti għandu wkoll jiġi użat. Il-grupp ta’ kontroll negattiv huwa ttrattat fl-istess manjiera bħal dik tal-gruppi tat-test għajr li l-annimali mhumiex esposti għas-sustanza tat-test jew għal xi sustanza oħra.
         
            Rotta ta’ l-amministrazzjoni
         
         Iż-żewġ rotot t’amministrazzjoni ewlenin huma l-ħalq u n-nifs. L-għażla tar-rotta t’amministrazzjoni tiddependi mill-karatteristiċi fiżiċi u kimiċi tas-sustanza tat-test u mir-rotta lit kun t’espożizzjoni fl-umani.
         L-użu tar-rotta dermali tipperżenta problemi prattiċi konsiderevoli. Tossiċità sistemika kronika li tirriżulta mill-assorbiment minn ġol-ġilda tista’ tkun normalment dedotta mir-riżultati ta’ test orali ieħor u mit-tagħrif ta’ kemm ikun hemm assorbiment minn ġol-ġilda derivati minn testijiet għat-tossiċità ġol-ġilda preċedenti.
         
            Studji orali
         
         Meta s-sustanza tat-test hija assorbita mill-apparat gastrointestinali, u jekk ir-rotta ta’ linġestjoni hija waħda li biha l-umani jistgħu jiġu esposti, ir-rotta orali ta’ l-amministrazzjoni hija preferuta jekk m’hemmx kontra-indikazzjonijiet. Annimali jistgħu jirċievu s-sustanza tat-test fid-dieta, imdewwba fl-ilma tax-xorb jew mogħtija permezz ta’ kapsula. Idealment id-dożaġġ ta’ kuljum fuq bażi ta’ sebat ijiem fil-ġimgħa għandu jiġi użat minħabba li dożaġġ fuq bażi ta’ ħamest ijiem fil-ġimgħa jista’ jippermetti rkupru jew irtirar tat-tossiċità fil-perjodu li ma tkunx qed tiġi somministrata d-doża u b’hekk jiġi affettwat ir-riżultat u il-valutazzjoni sussegwenti. iżda, dożaġġ fuq bażi ta’ ħamest ijiem fil-ġimgħa huwa kkunsidrat bħala aċċettabbli jekk wieħed jibbaża fuq kunsiderazzjonijiet prattiċi.
         
            Studji ta’ ġbid fin-nifs
         
         Peress li l-istudji tal-ġbid fin-nifs jippreżentaw problemi tekniċi ta’ komplessità ikbar mir-rotot t’amministrazzjoni l-oħrajn, direzzjoni iktar dettaljata fuq dan il-mod t’amministrazzjoni hija mogħtija hawnhekk. Wieħed għandu wkoll jinnota li istillazzjoni intratrakeali tista’ tikkostitwixxi alternattiva valida f’sitwazzjonijiet speċifiċi.
         Espżizzjonijiet għal tul ta’ żmien huma s-soltu mmudellati fuq espżizzjonijiet umani pproġettati, u l-annimali jingħataw jew espożizzjoni ta’ kuljum ta’ sitt siegħat wara l-ekwilibrazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tal-kompartimenti, għal ħamest ijiem fil-ġimgħa (espożizzjoni intermittenti), jew, relevanti għal espożizzjoni possibbli ta’ l-ambjent, 22 sa 24 siegħat t’espożizzjoni għal kull jum għal sebat ijiem fil-ġimgħa (espożizzjoni kontinwa), b’bejn wieħed u ieħor siegħa biex jingħata l-għalf lill-annimali kuljum f’ħin simili u manteniment tal-kompartiment.
         Fiż-żewġ każijiet, l-annimali huma s-soltu esposti għal konċentrazzjonijiet fissi tas-sustanza tat-test. Differenza prinċipali bejn l-espożizzjoni intermittenti u l-espożizzjoni kontinwa hija dik li f’ta’ l-ewwel hemm perjodu ta’ 17 sa 18-il siegħa li fih l-annimali jistgħu jirkupraw mill-effetti ta’ l-espożizzjoni ta’ kuljum, b’perijodi iktar twal ta’ rkupru matul tmiem il-ġimgħa.
         L-għażla t’ espożizzjoni intermittenti jew kontinwa tiddependi fuq l-objettivi ta’ l-istudju u fuq l-espożizzjoni umana li tiġi simulata. Iżda, ċerti diffikultajiet tekniċi għandhom jiġu kkunsidrati. Per eżempju, il-vantaġġi t’espożizzjoni kontinwa għas-simulazzjoni ta’ kundizzjonijiet ambjentali tista’ tiġi bbilanċjata bin-neċessità għall-ilma u l-għalf waqt l-espożizzjoni, u bil-bżonn għal iktar ġenerazzjoni kkumplikata (iżda li tkun iktar ta’ min jafdaha) t’ajrusol u ta’ fwar u ta’ tekniċi ta’ sorveljar.
         
            Kompartimenti ta’ l-espożizzjoni
         
         L-annimali għandhom jiġu ttestjati f’kompartimenti għall-ġbid fin-nifs disinnati sabiex iżommu fluss dinamiku ta’ mill inqas 12-il bidla fl-arja għal kull siegħa biex b’hekk jiġi żgurat kontenut adegwat t’ossiġenu u atmosfera t’espożizzjoni li tkun distribwita fl-istess ammont. Il-kompartimenti tal-kontroll u ta’ l-espożizzjoni għandhom ikunu identiċi fil-kostruzzjoni u disinnati biex jiżguraw kundizzjonijiet t’espożizzjoni komparabbli f’kull rispett għajr fl-espożizzjoni għas-sustanza tat-test. Presssjoni ftit negattiva ġewwa l-kompartiment hija ġeneralment miżmuma biex tipprevjeni telf tas-sustanza tat-test fiż-żona tal-madwar. Il-kompartimenti għandhom inaqqsu l-iffullar ta’ l-annimali tat-test. Bħala regola ġenerali, sabiex tiġi żgurata l-istabilità ta’ l-atmosfera tal-kompartiment, il-volum totali ta’ l-annimali tat-test m’għandhiex taqbeż il-5 % tal-volum tal-kompartiment.
         
            Għandhom jiġu magħmulin qisien jew osservar:
         
         
                     (i)
                  
                  
                     tal-fluss ta’ l-arja: ir-rata tal-fluss ta’ l-arja mill-kompartiment għandha tkun preferibbilment sorveljata kontinwament.
                  
               
                     (ii)
                  
                  
                     tal-konċentrazzjoni: Matul il-perjodu ta’ l-espożizzjoni ta’ kuljum il-konċentrazzjoni m’għandhiex tvarja b’iktar minn ± 15 % tal-valur intermedju.
                  
               
                     (iii)
                  
                  
                     tat-temperatura u l-umdità: għall-mammali gerriema, it-temperatura għandha tinżamm fi 22 ± 2 oC, u l-umdità fil-kompartiment fi 30 sa 70 %, għajr fejn l-ilma huwa użat fis-sustanza tat-test fl-atmosfera tal-kompartiment. Preferibbilment dawn it-tnejn għandhom jiġu ssorveljati kontinwament;
                  
               
                     (iv)
                  
                  
                     tal-qjisien tad-daqs tal-partikoli: id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partikoli għandha tiġi ddeterminata fl-atmosferi tal-kompartimenti li tinvolvi ajrusol likwidu jew solidu. Il-partikoli ta’ l-ajrusol għandhom ikunu ta’ daqs respirabbli għad-daqs ta’ l-annimali użati. Kampjuni ta’ l-atmosferi tal-kompaartimenti għandhom jiġu meħuda fiż-żona tan-nifs ta’ l-annimali. Il-kampjun ta’ l-arja għandu jkun rappreżentattiv tad-distribuzzjoni taal-paartikuli li għalihom l-annimali huma esposti u għandhom jagħmlu tajjeb, fuq bażi gravimetrika, għall-ajrusol anke fejn ħafna mill-ajrusol ma kienx respirabbli. Analiżi tad-daqs tal-partikoli għandha tiġi magħmula frekwentement matul l-iżvilupp tas-sistema ġenerarja biex tiżgura l-istabilità ta’ l-ajrusol u minn hemm ’il quddiem, daqs kemm ikun neċessarju matul l-espżizzjonijiet biex tiġi determinate adegwatament il-konsistenza tad-distribuzzjoni tal-partikoli li għalihom l-annimali kienu ġew esposti.
                  
               
            Dewmien ta’ l-istudju
         
         Id-dewmien tal-perjodu ta’ l-amministrazzjoni għandu jkun mill-inqas 12-il xahar.
         Proċedura
         
            Osservazzjonijiet
         
         Eżaminazzjoni tal-klinika bir-reqqa għandha tiġi magħmula mill-inqas darba kuljum. Osservazzjonijiet addizzjonali għandhom jiġu magħmulin ta’ kuljum b’azzjonijiet xierqa meħuda sabiex inaqqsu t-telf ta’ l-annimali mill-istudju, per eżempju, nekroskopija jew tkessiħ ta’ dawk l-annimali li nstabu mejtin u iżolazzjoni jew sagrifikazzjoni ta’ l-annimali debboli jew moribondi. Osservazzjonijiet bir-reqqa għandhom jiġu magħmulin sabiex jiġu osservati l-ewwel attakki ta’ l-effetti tat-tossiċità u l-progressjoni tagħhom kif ukoll sabiex jitnaqqaas it-telf minħabba mard, awtolożi jew kannibaliżmu.
         Sinjali kliniċi, inklużi tibdiliet newroloġiċi u okulari kif ukoll il-mewt, għandhom jiġu mniżżlin għal kull animal. Il-ħin ta’ l-ewwel attak u l-progressjoni tal-kundizzjonijiet tossiċi, inklużu tumuri suspettati, għandhom jiġu mniżżlin.
         Il-piż tal-ġisem għandu jiġi mniżżel individwalment għal kull animal darba f’ġimgħa matul l-ewwel 13-il ġimgħa tal-perjodu tat-test u mill-inqas darba kull erba’ ġimgħat minn hemm ’il quddiem. Il-konsum ta’ l-ikel għandu jiġi determina darba f’ġimgħa matul l-ewwel 13-il ġimgħa ta’ l-istudju, u wara f’intervalli ta’ tliet xhur jekk l-istat ta’ saħħa jew it-tibdiliet fil-piż ma jiddettawx mod ieħor.
         
            Eżami ematoloġiku
         
         Eżami ematoloġiku (per eżempju l-kontenut ta’ l-emoglobina, il-volum taċ-ċelloli, it-total taċ-ċelloli ħomor tad-demm, it-total taċ-ċelloli bojod tad-demm, id-diski żgħar tad-demm u l-miżuri l-oħrajn tal-potenzal tat-tgħaqqid tad-demm) għandu jiġi magħmul f’intervalli ta’ tliet xhur, sitt xhur u minn hemm ‘il quddiem f’bejn wieħed u ieħor sitt xhur interval u fit-terminu fuq kampjuni tad-demm miġburin mill-mammali mhux gerriema u minn 10 firien/sess ta’ kull grupp.
         Jekk ikun possibbli, il-kapjuni għandhom ikunu mill-istess firien f’kull interval. B’addizzjoni ma’ dan, kampjun ta’ qabel it-test għandu jiġi meħud mill-mammali mhux gerriema.
         Jekk l-osservazzjonijiet kliniċI juru deterjorament fis-saħħa ta’ l-annimali matul l-istudju, kwantità differenzali ta’ demm hija magħmula għall-gruppi iktar baxxi li jkun imiss biss jekk hemm diskrepanza kbira bejn l-ogħla grupp u l-gruppi tal-kontroll, jew jekk dan huwa ndikat bi skoperti patoloġiċi.
         
            Analiżi kimika ta’ l-awrina
         
         Kampjuni ta’ l-awrina minn kull mammalu mhux gerriemi u minn 10 firien/sess mill-gruppi kollha, jekk possibbli minn dawk l-istess firien fl-istess interval bħal fl-eżami ematoloġiku, għandhom jiġu miġbura għall-analiżi. dawn id-determinazzjonijiet li ġejjin għandhom jiġu magħmula jew minn annimali individwali jew fuq kampjun ta’ mammali gerriema ta’ l-istess sess u grupp:
         
                     —
                  
                  
                     apparenza: volum u densità għall-annimali individwali;
                  
               
                     —
                  
                  
                     proteini, glukosju, ketoni, demm (semi-kwantitattivi);
                  
               
                     —
                  
                  
                     mikroskopija tas-sediment (semi-kwantitattiva).
                  
               
            Kimika tal-klinika
         
         F’intervalli ta’ bejn wieħed u ieħor sitt xhur u fit-terminu, kampjuni tad-demm huma meħuda għall-qjisien tal-kimika tal-klinika minn kull mammalu mhux gerriem u minn 10 firien/sess minn kull grupp, jekk possibbli, mill-istess firien f’kull interval. B’addizzjoni ma’ dan, kampjun ta’ qabel it-test għandu jiġi miġbur mill-mammali mhux gerriema. Il-plażma hija ppreparata minn dawn il-kampjuni u d-determinazzjonijiet li ġejjin għandhom jiġu magħmulin:
         
                     —
                  
                  
                     it-total tal-konċentrazzjoni tal-proteini;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjoni ta’ l-albumina;
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet tal-funzjoni tal-fwied (bħal l-attività tal-fosfat ta’ l-alkalina, l-attività tat-transaminat piruviku glutamiku [10] u l-attività tat-transaminat tas-serum glutamiku ożaloċetiku [11] ), transpeptidu tal-gamma glutamiku, dekarbonat ta’ l-ornitin;
                  
               
                     —
                  
                  
                     metaboliżmu tal-karboidrat bħal dak tal-glukosju tas-sawm;
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet tal-funzjoni tal-kliewi bħad-demm tan-nitroġenu ta’ l-urea.
                  
               
            Nekroskopija totali
         
         Nekroskopija totali u sħiħa għandha tiġi magħmula fuq l-annimali kollha, inklużi fuq dawk li mietu matul l-esperiment jew dawk li ġew maqtula meta ġew misjuba f’kundizzjoni moribonda. Qabel is-sagrifikazzjoni, kampjuni tad-demm għandhom jiġu miġbura mill-annimali kollha, għall-kwantitajiet differenzali tad-demm. Il-ħsarat kollha visibbli, it-tumuri jew il-ħsarat suspettati li jkunu tumuri għandhom jiġu ppreservati. Wieħed għandu jipprova jirrelata l-osservazzjonijiet ma’ l-iskoperti mikroskopiċi.
         L-organi u t-tessuti kollha għandhom jiġu ppreservati għal eżami istopatoloġiku. Dan is-soltu jikkonċerna l-organi u t-tessuti li ġejjin: il-moħħ [12] (sezzjonijiet tal-medulla/parti ta’ l-għerq tal-moħħ li tgħaqqad il-medulla oblongata mat-talamu, il-kortiċi taċ-ċervellett u l-kortiċi celebrali), it-tessut pitwitarju, it-tessut tat-tirojde (inkluż tal-paratirojde), it-tessut tat-timu, il-pulmuni (inkluża t-trakea), il-qalb, l-aorta, il-glandoli tar-rieq, il-fwied [13] , il-milsa, il-kliewi [14], l-adrenali [15], l-esofagu, l-istonku, id-duwodenu, il-parti ta’ bejn id-duwodenu u l-ilju, l-ilju, il-musrana l-għamja, il-musrana l-ħoxna, ir-rektum, il-frixa, il-gonadi [16], l-utru, l-organi ġenitali aċċessorji, il-glandola tal-ħalib tas-sess femminil, il-ġilda, il-muskolatura, in-nerv periferali, in-nerv li jgħaddi minn ġos-sinsla fuq tliet livelli – ċervikali, toraċiku tan-nofs u tal-ġenbejn, l-isternu bl-għadam tal-mudullun u l-għajnejn. In-nefħa tal-pulmuni u tal-bużżieqa ta’ l-awrina b’fissattiv huwa l-mezz ottimali li jippreserva dawn it-tessuti; in-nefħa tal-pulmuni fi studji tal-ġbid fin-nifs hija essenzali għal eżami istopatoloġiku xieraq. Fi studji speċjali bħal dawk tal-ġbid fin-nifs, l-apparat respiratorju kollu għandu jiġi studjat, inkluż l-imnieħer, il-farinġI u l-larinġi.
         Jekk eżamijiet kliniċi oħrajn huma magħmula, l-informazzjoni ottenuta minn dawn il-proċeduri għandha tkun għad-disposizzjoni qabel l-eżami mikroskopiku, minħabba li din tista’ tagħti direzzjoni sinjifikanti lill-patoloġista.
         
            Istopatoloġija
         
         It-tibdiliet kollha visibbli, partikolarment it-tumuri u ħsarat oħrajn li jseħħu fi kwalunkwe organu għandhom jiġu eżaminati mikroskopikament. B’żieda ma’ dan, dawn il-proċeduri li ġejjin huma rakkomandati:
         
                     (a)
                  
                  
                     Eżami mikroskopiku ta’ kull organu u tessut ippreservat b’deskrizzjoni kompleta tal-ħsarat li nstabu:
                     
                                 1.
                              
                              
                                 fl-annimali kollha li mietu jew ġew maqtula matul l-istudju;
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 fl-annimali kollha tal-grupp tad-doża għolja u tal-gruppi tal-kontroll;
                              
                           
               
                     (b)
                  
                  
                     Organi u tessuti li juru anormalitajiet ikkaużati, jew possibilment ikkaużati, bis-sustanza tat-test huma wkoll eżaminati fil-gruppi tad-doża baxxa;
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     Fejn ir-riżultat tat-test jagħti evidenza ta’ tnaqqis sostanzjali fit-tul ta’ ħajja normali ta’ l-annimal jew ta’ l-induzzjoni ta’ l-effetti li jistgħu jaffettwaw reazzjoni tossika, id-doża baxxa li jkun imiss għandha tiġi eżaminata kif deskritt hawn fuq;
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     Informazzjoni dwar l-inċidenza ta’ ħsara li sseħħ normalment fir-razza ta’ l-annimali użati, taħt l-istess kundizzjonijiet tal-laboratorju, jiġifieri data tal-kontroll storika, hija indispensabbli għall-istima korretta tas-sinjifikanza tat-tibdil osservat fl-annimali ttrattati.
                  
               2.   DATA
         Id-data għandha tiġi miġbura fil-qosor f’forma tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali li kien hemm fil-bidu tat-test, in-numru ta’ l-annimali li juru ħsara f’ġisimhom, it-tip ta’ ħsara f’ġisimhom u l-persentaġġ ta’ l-annimali li juru iż-żewġ tipi ta’ ħsara. Ir-riżultati għandhom jiġu evalwati b’metodu ta’ l-istatistika xieraq. Kwalunkwe metodu ta’ l-istatistika rikonoxxut jista’ jintuża.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja, jekk possibbli:
         
                     —
                  
                  
                     in-nisel ta’ l-ispeċi jew ir-razza, minn fejn ġejja l-ispeċi, il-kundizzjonijiet ta’ l-ambjent, dieta;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kundizzjonijiet tat-test:
                     Deskrizzjoni ta’ l-apparat ta’ l-espożizzjoni:
                     Inkluż id-disinn, tip, dimensjonijiet, minn fejn tidħol l-arja, is-sistema tal-ġenerazzjoni ta’ partikoli separati u ajrusol, il-metodu tal-kondizzjonar ta’ l-arja, it-trattament ta’ l-egżost ta’ l-arja u l-metodu ta’ l-akkomodazzjoni ta’ l-annimali f’kompartimenti tat-test meta dawn huma użati. It-tagħmir għat-tkejjil tat-temperatura, umdità u, fejn xieraq, ta’ l-istabilità tal-konċentrazzjonijiet ta’ l-ajrusol jew id-daqs tal-paartikuli, għandhom jiġu deskritti.
                     Data ta’ l-espożizzjoni:
                     Din għandha tkun imqiegħda f’lista u ppreżentata b’valuri intermedji u b’miżura ta’ varjabilità (per eżempju d-devjazzjoni ta’ l-istandard) u għandha tinkludi:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 rati tal-fluss ta’ l-arja mit-tagħmir tal-ġbid fin-nifs;
                              
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 temperatura u umdità ta’ l-arja;
                              
                           
                                 (ċ)
                              
                              
                                 konċentrazzjonijiet nominali (l-ammont totali tas-sustanza tat-test imqiegħda fit-tagħmir tal-ġbid tan-nifs diviż bil-volum ta’ l-arja);
                              
                           
                                 (d)
                              
                              
                                 in-natura ta’ sustanza oħra, jekk użata;
                              
                           
                                 (e)
                              
                              
                                 konċentrazzjonijiet attwali fiż-żona tan-nifs ittestjata;
                              
                           
                                 (f)
                              
                              
                                 daqsijiet medjani tal-partikoli (fejn xierqa),
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     il-livelli tad-doża (inkluża xi sustanza, jekk użata) u konċentrazzjonijiet;
                  
               
                     —
                  
                  
                     data tar-rispons tossiku, bis-sess u d-doża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-livell fejn m’hemmx effett;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin tal-mewt waqt l-istudju jew jekk l-annimali ssopravivewx sat-tmiem;
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni ta’ effetti tossiċi jew effetti oħrajn;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin ta’ l-osservazzjoni ta’ kull sinjal anormali u ż-żmien sussegwenti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     data ta’ l-għalf u tal-piż tal-ġisem;
                  
               
                     —
                  
                  
                     skoperti oftalmoloġiċi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet ematoloġiċi użati u r-riżultati kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet tal-bijokimika tal-klinika użati u r-riżultati kollha (inklużi r-riżultati ta’ xi analiżi kimika ta’ l-awrina);
                  
               
                     —
                  
                  
                     skoperti tan-nekroskopija;
                  
               
                     —
                  
                  
                     dekrizzjoni dettaljata ta’ l-iskoperti istopatoloġiċi kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     trattament ta’ l-istatistika tar-riżultati fejn huwa possibbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         B.31.   STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ FL-IŻVILUPP PRENATALI
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa dupplikazzjoni għal OECD TG 414 (2001).
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Dan il-metodu ta' l-ittestjar żviluppanti tat-tossiċità huwa iddisinjat li jipprovdi informazzjoni ġenerali li tikkonċerna l-effetti ta' l-espożizzjoni prenatalifuq annimal tqil waqt it-test u fuq l-organiżmu żviluppanti in utero; dan jista’ jinkludi l-assessjar ta' l-effetti maternali kif ukoll il-mewt, anormalitjiet strutturali, jew it-tkabbir mibdul tal-fetu. Id-difetti funzjonali, għalkemm parti importanti fl-iżvilupp, ma humiex parti integrali ta' dan il-metodu tat-test. Dawn jistgħu ikunu ittestjati għal studju separat jew bħala żieda ma dan l-istudju bl-użu tal-metodu tat-test għal newrotossiċità ta' l-iżvilupp. Għall-informazzjoni dwar it-testijiet għal defiċjenzi funzjonali u l-effetti l-oħrajm ta' wara t-twelid, il-Metodu tat-Test għal studju tat-tossiċità riproduttiva ta' żewġ ġenerazzjonijiet u l-istudju għal newrotossiċità ta' l-iżvilupp għandu jkun ikkonsultat skond kif xieraq.
         Dan il-metodu tat-test jista’ jeħtieġ adattazzjoni speċifika f'każi individwali fuq il-bażi ta' tagħrif speċifiku fuq, eż. il-propjetajiet fiżikokimiċi jew tossikoloġiċi tas-sustanza tat-test. Tali adattazzjoni hija aċċettabbli, meta evidenza xjentifika konvinċenti tissuġġerixxi li l-adattazzjoni tkun twassal għal test aktar informattiv. F'tali każ, din l-evidenza xjentifika għandha tkun dokumentata bir-teqqa fir-rapport ta' l-istudju.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Tossikoloġijata' l-iżvilupp: l-istudju ta' l-effetti ħżiena fuq l-organiżmi ta' l-iżvilupp li jistgħu jirriżultaw mill-espożizzjoni qabel il-konċepiment, matul żvilupp ta qabel it-twelid, jew ta' wara t-twelid għaż-żmien mal-maturutà sesswali. Il-manifestazzjonijiet maġġuri tat-tossiċità ta' l-iżvilupp jinkludu, 1) il-mewt ta' l-organiżmu, 2) l-annormalità strutturali, 3) tibdil fit-tkabbir, u 4) defiċjenza funzjonali. It-tossikoloċija ta' l-iżvilupp kienet preċedentament ta' spiss referuta bħala teratolġija.
         
            Effett ħażin: Kwalunkwe alterazzjoni relatata mat-trattament minn linja bażi li tnaqqas l-abbiltà ta' l-organiżmu li jibqa ħaj, li jirripriduċi jew li jadatta għall-ambjent. Fir-rigward tat-tossoloġija ta' l-iżvilupp, meqjusha fis-sens l-aktar wiesa, din tinkludi kwalunkwe effett li jinterferixxi mal-iżvilupp normali tal-conceptus, kemm qabel u wara t-twelid.
         
            Tkabbir mibdul: Tibdil fl-organu naxxenti jew fil-piż tal-ġisem jew fid-daqs.
         
            Alterazzjonijiet (annormalitajiet): Alterazzjonijiet strutturali fl-iżvilupp li jinkludu kemm il-malformazzjonijiet u wkoll varjazzjonijiet (28).
         
            Malformazzjoni/Annormalità Maġġuri: Tibdil strutturali ikkunsidrat bħala detrimentali għall-annimal (jista’ wkoll ikunu letali) u hija normalment rari.
         
            Varjazzjoni/Annormalità Minuri: Tibdil strutturali meqjus bħala li jkollu ftit jew l-ebda effett strutturali fuq l-annimal; jista’ jkun temporanju jew jista’ jseħħ relattivament ta' spiss fil-popolozzjoni tal-kontroll.
         
            Konċepiment: Is-summa tad-derivattivi ta' ovum fertilizzat fi kwalunkwe stadju ta' l-iżvilupp mill-fertilizzazzjoni sat-twelid, inklużi l-membrani extra-embrijoniċi kif ukoll l-embriju jew il-fetu.
         
            Implantazzjoni (nidazzjoni): It-twaħħil tal-blastoċista ma l-inforra epiteljali ta' l-uteru, inkluż il-penetrazzjoni tagħha mill-epiteljum uterin, u t-twaħħil tagħha fil-endometrrijum.
         
            Embriju: l-istadju kmieni jew żviluppanti ta' kwalunkwe organiżmu, speċjalment l-iżvilupp tal-prodott tal-fertilizzazzjoni tal-bajda wara l-assi t-twila tkun tidher u sakemm l-istrutturi maġġuri kollha jkunu preżenti.
         
            Embijotossiċità: Detrimentali għall-istruttura normali, l-iżvilupp, it-tkabbir, u/jew il-viabbilità ta' embrijun.
         
            Fetu: Il-wild mhux imwieled fil-perjodu post-embrijoniku.
         
            Fetutossiċità: Detrimentali għall-istruttura normali, l-iżvilupp, it-tkabbir, u/jew il-viabbilità tal-fetu.
         
            Abort: It-twarrib ta' qabel il-waqt mill-uteru tal-prodotti tal-konċepiment: ta' l-embrijun jew ta' fetu mhux-viabbli/
         
            Reżorpzjoni: Konċepiment li, wara li jkun ġie impjantant fl-uteru, sussegwentament imut u jkun, jew kien, assorbit mill-ġdid.
         
            Reżorpzjoni kmieni: Evidenza ta' l-implant mingħajr embrijun/fetu rikonoxxibbli.
         
            Reżorpzjoni tard: Embrijun jew fetu mejjet b; tibdiliet esterni deġenerattivi.
         
            NOAEL: Abbrevjazzjoni għal-livell ta' l-ebda effett avvers ma huwa osservabbli (no-observed-adverse-effect level) u hija l-għola doża jew livell ta' espożizzjoni meta l-ebda sejbiet avversi realatati mat-trattament ma jkunu osservati.
         1.3.   SUSTANZA TA' REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Normalment, is-sustanzaa tat-test hija somministrata fuq annimali tqal għal mill-anqas mill-impjantazzjoni sa jum wieħed qabel il-jum skedat tal-qatla, li għandu jkun qrib kemm jista’ jkun possibbli għall-jum normali tal-ħlas mingħajr ir-riskju ta' informazzjoni li tirriżulta minn ħlas kmieni. Il-metodu tat-test mhux intiż li jeżamina biss il-perjodu ta' lorganoġenesi, (eż. il-jiem 5-15 fl-annimal gerriema, u l-jiem 6-18 fil-fenek) imma wkoll l-effettu mill-pre-impjantazzjoni, meta xieraq, mutul il-perjodu kollu tal-ġestjoni sal-jum ta' qabel is-sezzjoni ċesarja. Ftit qabel is-sezzjoni ċesarjaa, il-femminili jkunu maqtula, il-kontenuti ta l-utru jkunu eżaminati, u l-fetu huma evalwati għan anomalitajiet esterni viżibbli u għal nisġiet rotob u tibdiliet skeletali.
         1.5.   ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.5.1.   L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali
         Huwa rrakkommandat li t-testijiet ikunu mwettqa fuq l-ispeċje l-aktar relevanti, u li l-ispeċje u r-razzez tal-laboratorju li huma normalment użati fit-testijiet dwar it-tossiċità fl-iżvilupp prenatali, jkunu użati. L-ispeċje ta' l-anniamli gerriema preferuta huja l-far u l-ispeċje ta' annimali mhux ġeggiema huwa l-fenek. Ġustifikazzjoni għandha tkun ipprovduta jekk ikun użat xi speċje ieħor.
         1.5.2.   Il-kundizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf
         It-temperatura tal-kamra ta' fejn jinżammu l-annimali ta' l-esperiment għandha tkun 22 oC (± 3o) għall-annimali gerriema u 18 oC (± 3o) għall-fniek. Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu użati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb.
         Il-proċeduri ta' l-akkompanjament għandhom jitwettqu f'gaġġeg adatti għal dak l-iskop. Meta gaġġeg separati għall-annimali fl-akkompanjament huma preferuti, iż-żamma ta' numru żgħt f'ġagga waħda huwa wkoll aċċettabbli.
         1.5.3.   Preparazzjoni ta' l-annimali
         Annimali b'saħħithom. Li jkunu ġew akklamatizzati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal mil anqas 5 ijiem u li ma jkunux ġew suġġetti għal proċeduri preċedenti sperimentali, għandhom ikunu użati. L-annimali tat-test għandhom ikunu karatterizzati bħala speċje, razza, sorsi, seww, piż u/jew l-età. L-annimali tal-gruppi kollha tat-test għandhom, kemm jista’ jkun prattikabbli, ikunu ta' piż u età uniformi. Femmini adulti żgħażagħ li jkunu għadu ma weldux għandhom ikunu użati f'kull livell ta' doża. Il-femminili għandhom ikunu mgħammra ma maskili ta' l-istess speċje u razza, u t-tgħammir ma l-ulied għandu jkun evitat. Għall-annimali gerriema, il-jum 0 tal-gestazzjoni huwa l-jum li fih il-buq vaġinali u/jew l-isperma huma osservati; għall-fniek il-jum 0 huwa normalment il-jum tal-coitus jew ta' l-inseminazzjoni artifiċjali, jekk tkun użata dik it-teknika. In-nisa mgħammra għandhom ikunu aassenjati b'mod mingħajr preġudizju lejn gruppi tal-kontroll u t-trattament. Il-gaġġeġ għandhom ikunu irrangati b'tali mod li l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid fil-gaġġeġ ikunu minimizzat. Kull annimal għandu jkun assenjat numru uniku ta' l-identifikazzjoni. In-nisa mgħammra għandhom ikunu assenjati b'manjera mingħajr preġudizzju lejn il-gruppi ta' kontroll u tat-trattament, u jekk in-nisa jkunu mgħammra f'lottijiet, l-annimali ta' kull lott għandhom ikunu imqassma b'mod egwali matul il-gruppi. Bl-istess mod, in-nisa seminati mill-istess raġel għandhom ikunu mqassma b'mod egwali matul il-gruppi.
         1.6.   PROĊEDURA
         1.6.1.   In-numru u s-sess ta' l-annimali
         Kull grupp tat-test u tal-kontroll għandu jinkludi numru suffiċjenti ta' femminili li jirriżulta f'madwar 20 annimal femmini bis-sita ta' l-implantazzjoni fin-nekropsija. Gruppi ta' anqas minn 16 il-annimal bis-sita ta' l-implantazzjoni jista’ ma jkunx xieraq. Il-mortalià materna mhux neċessarjament tinvalida l-istudju, basta li din ma tkunx teċċedi madwar 10 %.
         1.6.2.   Preparazzjoni tad-dożi
         Jekk il-mezz jew l-adittiv l-ieħor ikun użat sabiex jiffaċilita d-doża, kunsiderazzjoni għandha tkun mogħtija għal dawn il-karatteristiċi li ġejjin: l-effetti fuq l-assorbazzjoni, id-distribuzzjoni, il-metaboliżmu, u ż-żamma jew it-twarrib tas-sustanza tat-test; l-effetti tal-propjetajiet kimiċi tas-sustanza tat-test li jistgħu joħolqu bidla fil-karatteristiċi tossiċi tagħha; u l-effetti fuq il-konsum ta' l-ikel u l-ima jew ta' l-istat nutrizzjonali ta' l-annimali. Il-mezza la għandu jkun żviluppatament tossiku u l-anqas li jkollu effetti fuq ir-riproduzzjoni.
         1.6.3.   Id-Doża
         Normalment, is-sustanza tat-test għandha tkun somministrata ta' kull jum mill-impjantazzjoni (eż. il-jum 5 minn wara t-tgħammir) sal jum ta' qabel is-sezzjoni neċessarju kif skedata. Jekk l-istudji preliminarji, meta disponibbli, ma jkunux jindikaw potenzjal għoli dwar it-telf pre-impjantazzjoni, it-trattament jista’ jkun estiż li jinkludi l-perjodu intier tal-ġestjoni, mit-tgħamir sal-jum ta' qabel il-qatla skedata. Huwa ben magħruf li tqandil mhux sewwa jew xi taħbit matul it-tqala jista’ jirriżulta f'telf prenatali. Sabiex ikun hemm ħarsien kontra t-telf prenatali minn fatturi li ma humiex relatati mat-trattament, tqandil bla ħtieġa ta' annimali tqal kif ukoll taħbit minn fatturi barranija bħal ma huma l-ħsejjes għandhom ikunu evitati.
         Mill-anqas tlett livelli ta' dożi u l-kontroll simultanju għandhom ikunu użati. Annimali b'saħħithom għandhom ikunu aassenjati b'mod mingħajr preġudizju lejn gruppi tal-kontroll u t-trattament. Il-livelli tad-doża għandhom ikunu mqassma sabiex jipproduċu l-effetti tossiċi tal-grad tat-tossiċità. Sakemm ma jkunx hemm limitazzjoni tal-propjetajiet tan-natura fiżika/limika jew bioloġika tas-sustanza tat-test, l-għola doża għandha tkun magħżula bil-għan li jkunu introdotti xi tossiċità ta' l-iżvilupp u/jew materna (sinjali kliniċi jew tnaqqis fil-piż tal-ġisem) imma mhux mewt jew sofferenza akuta. Mill-anqas livell ta' doża waħda intermedja għandu jipproduċi effetti tossiċi minimi osservati. Il-livell l-aktyar baxx m'għandux jipproduċi xi evidenza la ta' tossiċità materna u l-anqas ta' l-iżvilupp. Sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-doża għandha tkun magħżulha bil-għan li turi kwalunkwe reazzjoni relatata mad-doża u l-livell ta' l-ebda effett ħażin mhu osservat (NOAEL). Tnejn- sa erba intervalli huma ta' spiss ottimi sabiex ikunu stabbiliti l-livelli tad-doża dixxendenti, u ż-żieda tar-raba' grupp tat-test hija ta' spiss preferibbli mill-użu ta' intervalli ferm twal (eż. aktar minn fattur ta' 10) bejn id-dożi. Għalkemm l-istebbeliment tal-NOAEL materni huwa l-għan, l-istudji li ma jista’bbilixxux tali livell jistgħu wkoll ikunu aċċettabbli 91).
         Livelli ta' dożi għandhom ikunu magħżula billi tkun meqjusa xi informazzjoni eżistenti kif ukoll l-informazzjoni addizzjonali dwar il-metaboliżmu u t-tossikukinetiċi tas-sustanza tat-test jew tal-materjali relatati. Din l-infomazzjoni għandha wkoll tgħin fid-demostrazzjoni ta' l-adekwatezza ta' l-amministrazzjoni tad-dożar.
         Grupp ta' kontroll konkorrenti għandu jkun użat. Dan il-grupp għandu jkun grupp ta' kontroll ittrattat taparsi jew mezz ta' grupp ta' kontroll jekk mezz ikun użat fl-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test. Il-gruppi kollha għandhom ikunu amministrati l-istess volum jew tas-sustanza tat-test jew tal-mezz. L-annimali fil-grupp(i) tal-kontroll għandhom ikunu mqandla bl-istess manjiera bħal l-annimali fil-grupp tat-test. Il-gruppi bil-mezz ta' kontroll għandhom jirċievu l-mezz fl-għola ammont użat (bħal fil-gruppi ta' l-anqas trattament).
         1.6.4.   Test tal-limitu
         Jekk test f'doża ta' livell wieħed ta' mill-anqas 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum b'amministrazzjoni orali. Li jutilizza l-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, ma tipproduċi leba tossiċità osservabbli la fl-annimali tqal u l-anqas fil-proġenji tagħhom u jekk effett ma jkunx mistenni kif ibbażat fuq l-informazzjoni eżistenti (eż. minn taħlitiet strutturament u/jew metabilakament relatati), allura studju sħiħ bl-użu ta' dożi fi tlett livelli għandu mnejn ikunu ikkonsidrat bħala mhux meħtieġ. L-isposizzjoni umana mistennija tista’ tindika il-ħtieġa għal-livell ta' doża orali għola li tkun użata fit-test tal-limitu. Għal tipi oħrajn ta' l-amministrazzjoni, bħal ma huwa t-teħid man-nifs jew l-applikazzjoni dermali, il-propjetajiet fiżikukimiċi tas-sustanza tat-test ta' spiss jistgħu jindikaw u jillimtaw il-massimu tal-livell attenibbli għall-espożizzjoni (per eżempju, l-applikazzjoni dermali m'għandhiex toħloq tossiċità lokali severa).
         1.6.5.   Amministrazzjoni tad-dożi
         Is-sustanza tat-test jew il-mezz normalment huwa amministrat bi intubazzjoni orali. Jekk tkun użata rotta oħra ta' l-amministrazzjoni, min jagħmel it-test għandu jipprovdi ġustifikazzjoni u raġjonar għal dik l-għażla, u modifiki xierqa jistgħu li jkunu meħtieġa (2) (3) (4). Is-sustanza tat-test għandha tkun somministrata bejn wieħed u ieħor fl-istess ħin ta' kull jum.
         Id-doża lil annimali individwali għandha normalment tkun ibbażata fuq id-determinazzjoni tal-piż tal-ġisem kif l-aktar riċenti disponibbli. B'dana kollu, attenzjoni għandha tkun eżerċitata meta tkun aġġustata d-doża ma tul l-aħħar parti tremestra tat-tqala. Informazzjoni eżistenti għandha tkun użata għall-għażla tad-doża sabiex tipprevjeni eċċess tat-tossiċità materna. B'dana kollu, jekk eċċess ta' tissiċità jkun innutat fin-nisa ittrattati, dawk l-annimali għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk. Jekk diveri annimali tqal juru sinjali ta' tossiċità eċċessiva, kunsiderazzjoni għandha tingħata għat-terminazzjoni ta' dak il-grupp fid-doża. Jekk is-sustanza tkun somministrata b'ikel sfurzat, dan għandu preferibbilment ikun mogħti bħala doża waħda lill-annimali bl-użu ta' tubu lejn l-istinku jew xi canula ta' l-intubazzjoni xierqa. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jkun amministrat f'waqt wieħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux jeċċedi 1 ml/100 g piż tal-ġisem, apparti fil-każ ta' taħlitiet akweji meta 2 ml/100 g piż tal-ġisem jista’ jkun użat. Meta jkun użat iż-żejt tal-qamħ-ir-rum, il-volum m'għandux jeċċedi 0,4 ml.100 g piż tal-ġisem. Varjabbilità fil-volum tat-test għandha tkun minimizzata bl-aġġustament tal-konċentrazzjonijiet sabiex ikun assigurat volum kostanti matul il-livelli kollha tad-dożi.
         1.6.6.   Osservazzjoni tan-nisa
         Osservazzjonijiet kliniċi għandhom jitwettqu u jkunu rreġistrati mill-anqas darba kull jum, preferibbilment fl-istess ħin(ijiet) billi jkun ikkonsidrat il-perjodu l-aktar probabbli ta' l-effetti antiċipati ta' wara d-doża. Il-kundizzjoni ta' l-annimali għandha tkun irreġistrata, inkluża l-mortalità, l-għafja tal-mewt, tibdil pertinenti fl-imġieba, u s-sinjali kollha ta' tossiċita barranija.
         1.6.7.   Il-piż tal-ġisem u l-konsum ta' l-ikel
         L-annimali għandhom ikunu miżuna fil-jum 0 tal-ġestazzjoni jew mhux aktar tard mill-jum 3 tal-ġestazzjoni jekk annimali mgħammra skond iż-żmien huma fornuti min fekundament barrani, fl-ewwel jum tad-dpża, mill-anqas kull 3 ijiem matul il-perjodu tad-doża u fil-jum tal-mewt kif skedata.
         Il-konsum ta' l-ikel għandu jkun irreġistrat f'intervalli ta' tlett ijiem u għandu jkun jikkonċidi mal-jiem tad-determinazzjoni tal-piż tal-ġisem.
         1.6.8.   Eżaminazzjoni ta' wara l-mewt
         In-nisa għandhom ikunu maqtula jum qabel il-jum mistenni tal-ħlas. Femminili li juri sinjali ta' abort jew ħlas prematur għall-iskeda tal-qatla għandhom ikunu maqtula u suġġetti għal eżaminazzjoni makroskopika bir-reqqa.
         Filwaqt tat-terminazzjoni jew tal-mewt matul l-istudju, il-mara tqila għandha tkun eżaminata b'makroskopiki għal xi annormalitajiet strutturali jew tibdilied patoloġiċi. L-evalwazzjoni tan-nisa matul is-sezzjon ċesarja u l-analiżi sussegwenti tal-fetu għandha tkun imwettqa, preferibbilment, mingħajr tagħrif dwar il-grupp tat-trattament, sabiex jitnaqqas il-preġudizzju.
         1.6.9.   L-eżami tal-kontenuti uterini
         Immedjetament wara t-terminazzjoni jew malli jkun possibbli wara l-mewt, l-uteri għandhom ikunu mneħħija u l-istat tat-tqala ta' l-annimal aċċertat. L-uteri li jidhru mhux bit-tqala għandhom ikunu aktar eżaminati (eż. bit-tiċpis bis-sulfid ta' l-ammonju għall-annimali gerriema u t-tiċpis Salewski jew b'metodu alternattiv xieraq għall-fniek) sabiex ikun konfermat l-istatus mhux tat-tqala (5).
         Uteri tqal jinkludu l-għonq ta' l-uteri għandhom ikunu miżuna. Il-piżijiet ta' l-uteri tqal m'għandhomx ikunu akkwistati minn annimali misjuba mejta waqt l-istudju.
         In-numru ta' corpora lutea għandu jkun determinat għall-annimali tqal.
         Il-kontenuti ta' l-uteri għandhom ikunu eżaminati għan-numru ta' embrijuni jew imwiet tal-feti jew feti viabbli. Il-grad ta' riassorbazzjoni għandu jkun deskritt sabiex ikun ikkalkolat il-ġin relattiv tal-mewt tal-conceptus (ara s-sezzjoni 1.2).
         1.6.10.   L-eżami tal-feti
         Is-sess u l-piż tal-ġisem ta' kull fetu għandhom ikunu determinati.
         Kull fetu għandu jkun eżaminat għal tibdiliet esterni (6).
         Il-feti għandhom ikunu eżaminati għal tibdiliet skeletali u tal-partijiet rotob (eż. varjazzjonijiet u maformazzjonijiet jew anomaliji) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). Kategorizzazzjoni ta' l-alterazzjonijiet tal-feti hija preferibbli imma mhux meħtieġa. Meta ssir il-kategorizzazzjoni, il-kriterja għad-definizzjoni ta' kull kategorija għandha tkun kjarament mistqarra. Attenzjoni partikolari għandha tingħata għall-passaġġ riproduttiv li għandu jkun eżaminat għal sinjali ta' żvilupp mibdul.
         Għall-annimali gerriema, madwar nofs kull lott tal-feti għandu jkun ippreparat u eżaminat għal tibdil skeletali. Il-kumplament għandu jkun preparat u eżaminat għal tibdil fil-partijiet rotob, bl-użu ta' metodi aċċettati u xierqa b'sezzjonament serjali jew b'teknina bil-għaqal ta' dissessjoni grossa.
         Għall-annimali mhux gerriema, eż. fniek, il-feti kollha għandhom ikunu eżaminati kemm għall-partijiet rotob u wkoll għal alterazzjonijiet skeletali. L-iġsma ta' dawn il-feti huma evalwati b'dissessjoni galbata għal tibdil fil-partijiet rotob, li jistgħu jinkludu proċeduri għal aktar evalwazzjoni ta' l-istruttura kardijaka interna (25). Ir-rjus ta' nofs il-heti eżaminati b'dan il-mod għandhom ikunu mneħħija u ipproċessati għal evalwazzjoni ta' alterazzjonijiet fil-partijiet rotob (inklużi l-għajnejn, il-moħħ, il-passaġġi nażali u l-ilsien), l-użu ta' metodi normali ta' sezzjonar serjali (26) jew metodu egwalment sensittiv. L-iġsma ta' dawn il-feti u l-kumplament tal-feti intatti għandhom ikunu ipproċessati u eżaminati għal tibdil skeletali, bl-utilizzazzjoni ta' l-istess metodi kif deskritti għall-annimali gerriema.
         2.   DATA
         2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         Id-dettalji għandhom ikunu irrapurati individwalment għan-nisa kif ukoll għall-wild tagħhom u miġbura b'sommarju f'għamla tabulari, li juru għal kull grupp tat-test u għal kull ġenerazzjoni, in-numru ta' l-annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta' l-annimali misjuba mejta matul it-test jew maqtula għal raġunijiet umanitarji, il-ħin ta' xi mewt jew qtil umanitarju, in-numru ta' nisa tqal, in-numru ta' l-annimali li juru sinjali ta' tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta' tossiċità kif osservati, inkluż il-ħin ta' meta tkun skoppjat, it-tul ta' żmien, u s-severità ta' xi effetti tossiċi, it-tiġ ta' l-osservazzjonijiet ta' l-embrijuni/feti, u l-informazzjoni l-oħra kollha dwar it-traabi l-oħrajn.
         Riżultati numeriċi għandhom ikun evalwati b'metodu statistiku xieraq bl-użu tal-grupp ta' wild bħala unità tad-dettalji għall-analiżi. Metodu statistiku ġeneralment aċċettabbli għandu jkun użat, il-metodi statistiċi għandhom ikunu magħżula bħala parti mid-disinn għall-istudju u għandhom ikunu ġġustifikati. L-informazzjoni mill-annimali li jmutu qabel il-qtil skedat għandha wkol tkun irrapurtata. Dik l-informazzjoni tista’ tkun inkluża fil-mezzi tal-grupp meta relevanti. Relevanza mid-dettalji akkwistati minn tali annimali, u għalhekk l-inklużjoni jew l-esklużjoni minn xi mess ta' grupp(i), għandha tkun iġġustifikata u iġġudikata fuq bażi individwali.
         2.2.   EVALWAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Is-sejbiet ta' l-istudju tat-Tossiċità fl-Iżvilupp Prenatali għandhom ikunu evalwati f'termini ta' l-effetti osservati. L-evalwazzjoni għandha tinkludi din l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     riżultati tat-test materni u tal-embriju/fetu, inkluża l-avalwazzjoni tar-relazzjoni, jew tan-nuqqas tagħha, bejn l-espożizzjoni ta' l-annimali għas-sustanza tat-test u l-inċidenza u s-severità tas-sejbiet kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ktiterja użata għall-kategorizzazzjoni esterna tal-fetu, il-partijiet rotob, u l-alterazzjonijiet skeletali, jekk il-kategorizzazzjoni tkun seħħet;
                  
               
                     —
                  
                  
                     meta xieraq, id-dettalji stpriċi tal-kontroll sabiex iqawwu l-interpretazzjoni tar-riżultati ta' l-istidju;
                  
               
                     —
                  
                  
                     in-numri użati fil-kalkolu tal-persentaġġi kollha jew ta' l-indiċi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     analiżi statistika adekwata tas-sejbiet ta' l-istudju, meta xieraq, li għandha tinkludi informazzjoni suffiċjenti dwar il-metodu ta' l-analiżi, sabiex riveditur/statistiku independenti jkun jista’ jevalwa mill-ġdid jew jerġa jibni l-analiżi.
                  
               Fi kwalunkwe studju li juri n-nuqqas ta' xi effetti tossiċi, aktar investigazzjonijiet sabiex tkun stabbilita l-assorbazzjoni u l-biodisponabbiltà tas-sustanza tat-test għandhom ikunu meqjusa.
         2.3   INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Studju tat-tossiċità fl-iżvilupp prenatali jkun jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti ta' espożizzjoni repetuta lejn sustanza matul it-tqala, fuq in-nisa, u l-iżvilupp intra-utru tal-wild tagħhom. Ir-riżultati ta' l-istudju għandhom ikunu interpretatai b'konnessjoni mas-sejbier mill-istudji subkroniku, riproduttivi, tossikokinetiċi u studji oħrajn. La darba l-enfasi tkun kemm fuq it-tossiċita enerali f'termini ta' tossiċita materna u wkoll fuq it-tossiċità fl-iżvilupp fil-għan finali, ir-riżultati ta' l-istudju jkunu jippermettu sa ċertu limitu għal diskriminazzjoni bejn l-effetti ta' l-iżvilupp li jseħħu fin-nuqqas ta' tossiċità ġenerali u dawk li huma imdaħħla biss f'livelli li huma wkoll tossiċi għall-annimal matern (27).
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni speċifika li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Is-sustanza tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 in-natura fiżika u, meta relevanti, il-propjetajiet fiżikokimiċi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-identifikazzjoni, inklud in-numru CAS jekk magħruf/stabbilit;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 purità.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Mezz (jekk applikabbli):
                     
                                 —
                              
                              
                                 ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz, jekk mhux sempliċement ilma.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Annimali tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 speċje u t-tipi użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru u l-età ta' l-annimali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piżijiet individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ir-raġjonar għal-livell tad-doża magħżula;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar is-sustanza tat-test, fomulazzjoni/preparazzjoni tad-dieta, Il-konċentrazzjoni akkwistata, l-istabbilità u l-omoġenità tal-preparazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 skambju mis-sustanza tat-test minn dieta/ilma tax-xorb bil-konċentrazzjoni (ppm) lejn doża attwali 9mg/kg il-piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kundizzjonijiet ambjentali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                  
               
                      
                  
                  
                     Dettalji tar-reazzjoni tossika materna bid-doża, li tinkludi, imma mhux limitata għal-:
                     
                                 —
                              
                              
                                 in-numru ta' l-annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta' l-annimali li jkunu baqgħu ħajjin, in-numru ta' nisa tqal, u n-numru ta' aborti, in-numru ta' annimali li jweldu kmieni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-jum tal-mewt matul l-istudju jew jekk l-annimali jkunux baqgħu ħajjin sakem maqtula;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji mill-annimali li ma jkunux baqgħu ħajjin tal-qtil skedat għandu jkun irrapurtat imam mhux inkluż fil-paraguni statisticċi inter-grupp;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-jum ta' l-osservazzjoni ta' kull sinjal annormali kliniku u l-korsa sussegwenti tiegħu;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piż tal-ġisem, tibdil fil-piż tal-ġisem u l-piż ta' l-utru bil-ħobla, inkluż, b'mod voluntarju, it-tibdil fil-piż tal-ġiesm korreġut għall-piż ta' l-utru bil-ħobla;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-konsum ta' l-ikel u, jekk imkejjel, il-konsum ta' l-ilma;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sejbiet tan-nekopsija, inkluż il-piż ta' l-utru;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 NOAEL valuri għall-effetti materni u ta' l-iżvilupp għandhom ikunu irraportati.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     L-għanijiet finali ta' l-iżvilupp bid-doża għal grupp ta' frieħ bl-impjanti, inklużi:
                     
                                 —
                              
                              
                                 in-numru ta' corpora lutea;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru ta' implantazzjonijiet, in-numru u l-persentaġġ ta' feti ħajjin u mejta u r- reassorbazzjonijiet;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru l-persentaġġ ta' telf pre- u post-implantazzjoni.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     L-għanijiet finali ta' l-iżvilupp bid-doża għal grupp ta' frieħ b'feti ħajjin, inklużi:
                     
                                 —
                              
                              
                                 in-numru u l-persentaġġ ta' frieħ ħajjin;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 relattività tas-sess;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piż tal-ġisem tal-fetu, preferibbilment bis-sess u bis-sessi flimkien;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 alterazzjonijiet esterni, partijiet rotob, u malformazzjoni skeletali u alterazzjoni relevanti oħrajn;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kriterja għall-kategorizzazzjoni jekk xierqa;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru totali u l-persentaġġ ta' feti u frieħ b'xi alterazzjoni esterna, partijiet rotob jew skeletali, kif ukoll it-tipi u l-inċidenzi ta' anomaliji individwali u alterazzjonijiet oħrajn relevanti.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni tar-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; 399-410.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied Toxicology 14; 386-398.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CIIT Activities 17; 1-8.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte. Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experimentelle Pathologie 247:367.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D.H.M. Woolam (ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. Congenital Anomalies 16; 171-173.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techniquefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenital Anomalies 32; 381-391.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following Heat Exposure in the Rat. Teratology 47:229-242.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morphology 127:291-306.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of Foetal Maturity. Teratology 11; 313-320.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity Studies. Toxicology and Applied Pharmacology 9;:398-408.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in Rats: Malformations or Variations? Teratology 8; 309-316.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD (Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to Ethylene Glycol. Teratology 46; 169-181.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, pp. 163-173.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible Influence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy 41; 411-445.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone. Stain Technology 39; 61-63.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton. American Journal of Anatomy 36; 313-355.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 4; 181-188.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957) The Genesis of the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Teratology. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J.G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251-277.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977) Handbook of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY.
                  
               
                  
                     (24)
                  
                  
                     Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techniques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28; 233-239.
                  
               
                  
                     (25)
                  
                  
                     Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mammalian Foetuses. Teratology 9; 37-38.
                  
               
                  
                     (26)
                  
                  
                     Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, Chicago, IL, pp. 126-144.
                  
               
                  
                     (27)
                  
                  
                     US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for Developmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register 56; 63798-63826.
                  
               
                  
                     (28)
                  
                  
                     Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Teratology 55; 249-292.'
                  
               B.32.   TEST TAL-KARĊINOĠENIĊITÀ
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.3.   SUSTANZI TA’ REFERENZA
         Xejn.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza tat-test hija somministrata normali, sebat ijiem fil-ġimgħa, permezz ta’ rotta xierqa, lil għadd ta’ gruppi t’annimali esperimentali, doża waħda għal kull grupp, għal porzjon prinċipali tat-tul tal-ħajja tagħhom. Matul u wara l-espożizzjoni, l-annimali esperimentali huma osservati ta’ kuljum sabiex jiġu skoperti sinjali ta’ tossiċità.
         1.5.   KRITERJI TA’ KWALITÀ
         Xejn.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         L-annimali huma miżmuma taħt kundizzjonijiet t’ akkomodazzjoni u għalf esperimentali għal mill-inqas ħamest ijiem qabel it-test. Qabel it-test, annimali żgħar u b’saħħithom huma magħżulin u assenjati lil gruppi ttrattati u lill-gruppi tal-kontroll.
         
            Annimali esperimentali
         
         Jekk ikun hemm bażi ta’ riżultati ta’ studji magħmulin qabel, speċi oħrajn (mammali gerriema jew dawk mhux gerriema) jistgħu jiġu użati. Razez annimali żgħar u b’saħħithom komunement użati fil-laboratorju għandhom ikunu użati u d-dożaġġ għandu jibda malajr kemm jista’ jkun wara l-ftim.
         Fil-bidu tat-test il-limitu tal-varjazzjoniji tal-piżijiet għandha tkun ta’ ± 20 % tal-piż intermedju. Fejn ikun amministrat test sub-kroniku tal-ġbid fil-pulmun bħala minn studju preliminarju sa studju għal tul ta’ żmien, l-istess speċi u razza għandha tintuża fiż-żewġ studji.
         
            Numru u sess
         
         L-annimali tas-sess femminili għandhom ikunu dawk li qatt ma welldu jew li ma jkunux inċinta. Jekk huma ppjanati sagrifiċċji fl-intervall, in-numru għandu jiżdied bin-numru t’annimali skedati sabiex jiġu ssagrifikati qabel ma jkun lest l-istudju.
         
            Livelli tad-doża u frekwenza ta’ l-espożizzjoni
         
         Mill-inqas tliet livelli għandhom jiġu użati b’żieda mal-grupp tal-kontroll konkorrenti. Logħla livell tad-doża għandu jislet sinjali minimi ta’ tossiċità, bħal tnaqqis fil-piż tal-ġisem (ta’ inqas minn 10 %), mingħajr ma jbiddlu sostanzjalment it-tul tal-ħajja minħabba xi efffetti għajr it-tumuri.
         L-iktar livell baxx tad-doża m’għandux jinterferixxi mal-kobor normali, ma’ l-żvilupp u ma’ l-għomor ta’ l-annimal jew jipproduċI x’indikazzjonijiet ta’ tossiċità. Ġeneralment, dan m’għandux ikun iktar baxx minn 10 % tad-doża l-għolja.
         Id-doża intermedja għandha tiġi stabbilita fil-marġini tan-nofs bejn id-dożi l-għoljin u d-dożi l-baxxi.
         Is-selezzjoni tal-livelli tad-doża għandha tieħu in kunsiderazzjoni d-data minn testijiet u studji ta’ tossiċità preċedenti.
         Il-frekwenza ta’ l-espożizzjoni hija normalment ta’ kuljum.
         Jekk il-kimika hija somministrata fl-ilma tax-xorb jew imħallta fid-dieta din għandha tkun ipprovduta kontinwament.
         
            Kontrolli
         
         Grupp ta’ kontroll konkorrwnti li huwa identiku f’kull aspett għall-gruppi ttrattati, għajr għall-espożizzjoni għas-sustanza tat-test, għandu jiġi użat.
         F’ċirkostanzi speċjali, bħal fi studji ta’ ġbis fin-nifs li jinvilvu l-ajrusol jew l-użu t’emulsjonant t’attività bijoloġika mhux karatterizzata fi studji orali, grupp ta’ kontroll negattiv konkorrenti għandu wkoll jiġi użat. Il-grupp ta’ kontroll negattiv huwa ttrattat fl-istess manjiera bħal dik tal-gruppi tat-test għajr li l-annimali mhumiex esposti għas-sustanza tat-test jew għal xi sustanza oħra.
         
            Rotta ta’ l-amministrazzjoni
         
         It-tliet rotot ewlenin t’amministrazzjoni huma l-ħalq, il-ġilda u n-nifs. L-għażla tar-rotta t’amministrazzjoni tiddependi mill-karatteristiċI fiżiċI u kimiċI tas-sustanza tat-test u mir-rotta lit kun t’espożizzjoni fl-umani. The use of the dermal route presents considerable practical problems. Chronic systemic toxicity resulting from percutaneous absorption can normally be inferred form the results of another oral test and a knowledge of the extent of percutaneous absorption derived from preceding percutaneous toxicity tests.
         Studji orali
         Meta s-sustanza tat-test hija assorbita mill-apparat gastrointestinali, u jekk ir-rotta ta’ linġestjoni hija waħda li biha l-umani jistgħu jiġu esposti, ir-rotta orali ta’ l-amministrazzjoni hija preferuta jekk m’hemmx kontra-indikazzjonijiet. L-annimali jistgħu jirċievu s-sustanza tat-test fid-dieta, imdewwba fl-ilma tax-xorb jew mogħtija permezz ta’ kapsula.
         Idealment id-dożaġġ ta’ kuljum fuq bażi ta’ sebat ijiem fil-ġimgħa għandu jiġi użat minħabba li dożaġġ fuq bażi ta’ ħamest ijiem fil-ġimgħa jista’ jippermetti rkupru jew irtirar tat-tossiċità fil-perjodu li ma tkunx qed tiġi somministrata d-doża u b’hekk jiġi affettwat ir-riżultat u il-valutazzjoni sussegwenti. iżda, dożaġġ fuq bażi ta’ ħamest ijiem fil-ġimgħa huwa kkunsidrat bħala aċċettabbli jekk wieħed jibbaża fuq kunsiderazzjonijiet prattiċi.
         Studji dermali
         Espożizzjoni tal-ġilda tista’ tiġi magħżula sabiex tiġi simulata rotta ewlenija t’espożizzjoni umana u bħala sistema mudell għal iżolazzjoni ta’ ħsarat fil-ġilda.
         Studji ta’ ġbid fin-nifs
         Peress li l-istudji tal-ġbid fin-nifs jippreżentaw problemi tekniċi ta’ komplessità ikbar mir-rotot t’amministrazzjoni l-oħrajn, direzzjoni iktar dettaljata fuq dan il-mod t’amministrazzjoni hija mogħtija hawnhekk. Wieħed għandu wkoll jinnota li istillazzjoni intratrakeali tista’ tikkostitwixxi alternattiva valida f’sitwazzjonijiet speċifiċi.
         Espżizzjonijiet għal tul ta’ żmien huma s-soltu mmudellati fuq espżizzjonijiet umani pproġettati, u l-annimali jingħataw jew espożizzjoni ta’ kuljum ta’ sitt siegħat wara l-ekwilibrazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tal-kompartimenti, għal ħamest ijiem fil-ġimgħa (espożizzjoni intermittenti), jew, relevanti għal espożizzjoni possibbli ta’ l-ambjent, 22 sa 24 siegħat t’espożizzjoni għal kull jum għal sebat ijiem fil-ġimgħa (espożizzjoni kontinwa), b’bejn wieħed u ieħor siegħa biex jingħata l-għalf lill-annimali kuljum f’ħin simili u manteniment tal-kompartiment. Fiż-żewġ każijiet, l-annimali huma s-soltu esposti għal konċentrazzjonijiet fissi tas-sustanza tat-test. Differenza prinċipali bejn l-espisizzjoni intermittenti u l-espożizzjoni kontinwa hija dik li f’ta’ l-ewwel hemm perjodu ta’ 17 sa 18-il siegħa li fih l-annimali jistgħu jirkupraw mill-effetti ta’ l-espożizzjoni ta’ kuljum, b’perijodi iktar twal ta’ rkupru matul tmiem il-ġimgħa.
         L-għażla ta’ espożizzjoni intermittenti jew kontinwa tiddependi fuq l-objettivi ta’ l-istudju u fuq l-espożizzjoni umana li tiġi simulate. iżda, ċerti diffikultajiet tekniċI għandhom jiġu kkunsidrati. Per eżempju, il-vantaġġi t’espożizzjoni kontinwa għas-simulazzjoni ta’ kundizzjonijiet ambjentali tista’ tiġi bbilanċjata bin-neċessità għall-ilma u l-għalf waqt l-espożizzjoni, u bil-bżonn għal iktar ġenerazzjoni kkumplikata (iżda li tkun iktar ta’ min jafdaha) t’ajrusol u ta’ fwar u ta’ tekniċi ta’ sorveljar.
         
            Kompartimenti ta’ l-espożizzjoni
         
         L-annimali għandhom jiġu ttestjati f’kompartimenti għall-ġbid fin-nifs disinnati sabiex iżommu fluss dinamiku ta’ mill inqas 12-il bidla fl-arja għal kull siegħa biex b’hekk jiġi żgurat kontenut adegwat t’ossiġenu u atmosfera t’espożizzjoni lit kun distribwita fl-istess ammont. Il-kompartimenti tal-kontroll u ta’ l-espożizzjoni għandhom ikunu identiċI fil-kostruzzjoni u disinnjati biex jiżguraw kundizzjonijiet t’espożizzjoni komparabbli f’kull rispett għajr fl-espożizzjoni għas-sustanza tat-test. Pressjoni ftit negattiva ġewwa l-kompartiment hija ġeneralment miżmuma biex tipprevjeni telf tas-sustanza tat-test fiż-żona tal-madwar. Il-kompartimenti għandhom inaqqsu l-iffulla ta’ l-annimali tat-test. Bħala regola ġenerali, sabiex tiġi żgurata l-istabilità ta’ l-atmosfera tal-kompartiment, il-volum totali ta’ l-annimali tat-test m’għandhiex taqbeż il-5 % tal-volum tal-kompartiment.
         Għandhom jiġu magħmulin qjisien jew osservar:
         
                     (i)
                  
                  
                     tal-fluss ta’ l-arja: ir-rata tal-fluss ta’ l-arja mill-kompartiment għandha tkun preferibbilment sorveljata kontinwament.
                  
               
                     (ii)
                  
                  
                     tal-konċentrazzjoni: Matul il-perjodu ta’ l-espożizzjoni ta’ kuljum il-konċentrazzjoni m’għandhiex tvarja b’iktar minn ± 15 % tal-valur intermedju.
                  
               
                     (iii)
                  
                  
                     tat-temperatura u l-umdità: għall-mammali gerriema, it-temperatura għandha tinżamm fi 22 ± 2 oC, u l-umdità fil-kompartiment fi 30 sa 70 %, għajr fejn l-ilma huwa użat fis-sustanza tat-test fl-atmosfera tal-kompartiment. Preferibbilment dawn it-tnejn għandhom jiġu ssorveljati kontinwament;
                  
               
                     (iv)
                  
                  
                     tal-qjisien tad-daqs tal-partikoli: id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partikoli għandha tiġi ddeterminata fl-atmosferi tal-kompartimenti li tinvolvi ajrusol likwidu jew solidu. Il-partikoli ta’ l-ajrusol għandhom ikunu ta’ daqs respirabbli għad-daqs ta’ l-annimali użati. Kampjuni ta’ l-atmosferi tal-kompaartimenti għandhom jiġu meħuda fiż-żona tan-nifs ta’ l-annimali. Il-kampjun ta’ l-aarja għandu jkun rappreżentattiv tad-distribuzzjoni taal-paartikuli li għalihom l-annimali huma esposti u għandhom jagħmlu tajjeb, fuq bażi gravimetrika, għall-ajrusol anke fejn ħafna mill-ajrusol ma kienx respirabbli. Analiżi tad-daqs tal-partikoli għandha tiġi magħmula frekwentement matul l-iżvilupp tas-sistema ġenerarja biex tiżgura l-istabilità ta’ l-ajrusol u minn hemm ’il quddiem, daqs kemm ikun neċessarju matul l-espżizzjonijiet biex tiġi determinate adegwatament il-konsistenza tad-distribuzzjoni tal-partikoli li għalihom l-annimali kienu ġew esposti.
                  
               
            Dewmien ta’ l-istudju
         
         Id-dewmien tat-test tal-karċinoġeniċità jiġbor fih il-porzjoni ewlenija tat-tul ta’ ħajja normali ta’ l-annimali tat-test. It-terminu tat-test għandu jkun fi 18-il xahar għall-ġrieden u l-ħamsters u 24 xahar għall-firien; iżda, għal ċertu razez t’annimali b’għomor ikbar/jew rata ta’ tumor taħt il-ġilda baxxa, it-terminu għandu jkun fl-24 xahar għall-ġrieden u l-ħamsters u fi 30 xahar għall-firien. Bħala alternattiva, it-terminu ta’ dan l-isstudju estiżhuwa aċċettabbli meta n-numru ta’ sopravissuti fl-iktar livell baxx tad-doża jew fil-grupp tal-kontroll jilħaq il-25 %. Meta jintemm test li fih ikun hemm reazzjoni differenti apparenti minħabba s-sess, iż-żewġ sessi għandhom jiġu konsiderati separatament. Meta l-grupp tad-doża l-għolja biss imut qabel iż-żmien għal raġunijiet ovvji ta’ tossiċità, dan m’għandux jagħti lok għat-terminazzjoni jekk manifestazzjonijiet tossiċI mhumiex jikkawżaw problemi fil-gruppi l-ożrajn. Sabiex ikun aċċettabbli studju negattiv, mhux iktar minn 10 % ta’ kwalunkwe grupp jistgħu jintilfu mill-esperiment minħabba awtoliżi, kannibaliżmu jew problemi ta’ maniġment u s-sopravissuti ta’ kull grupp ikun ta’ mhux inqas minn 50 % fi 18-il xahar għall-ġrieden u l-ħamsters u f’24 xahar għall-firien.
         Proċedura
         
            Osservazzjonijiet
         
         Osservazzjonijiet ta’ kuljum għandhom jinkludu xi tibdil fil-ġilda jew fil-fur, fl-għajnejn, fil-membrani mukużi kif ukoll fis-sistemi respiratorji, ċirkolatorji, awtonomiċI u nervużi ċentrali, fl-attività somatomotorja u fil-mudell ta’ mġieba.
         Osservazzjonijiet regolari ta’ l-annimali human eċessarji biex jiżguraw li, sakemm ikun possibbli, l-annimali mhumiex mitlufin mill-istudju minħabba kawżi ta’ kannibaliżmu, awtoliżi tat-tessuti jew minħabba li jitqiegħdu f’xi post ieħor. Annimali moribondi għandhom jitneħħew u għandha ssirilhom nekroskopija meta avżati.
         Is-sinjali kliniċi u l-mortalità għandhom jiġu mniżżlin għal kull annimal. Attenzjoni speċjali għandha tingħata lill-iżvilupp tat-tumuri: il-ħin ta’ l-ewwel attakk, il-lokazzjoni, id-dimensjonijiet, id-dehra u l-progressjoni ta’ kull tumur palpabbli li jkun visibbli għandhom jiġu mniżżlin.
         Qjisien għandhom jittieħdu tal-konsum ta’ l-ikel (u tal-konsum ta’ l-ilma meta s-sustanza tat-test hija somministrata fl-ilma tax-xorb) ta’ kull ġimgħa matul l-ewwel 13-il ġimgħa ta’ l-istudju u wara f’intervalli ta’ bejn wieħed u ieħor tliet xhur jekk l-istat ta’ saħħa jew it-tibdil fil-piż ta’ l-annimali ma jiddettawx mod ieħor.
         Il-piż tal-ġisem għandu jiġi mniżżel individwalment għall-annimali kollha matul l-ewwel 13 - il ġimgħa tal-perjodu tat-test u mill-inqas darba kull erba’ ġimgħat minn hemm ‘il quddiem.
         Eżaminazzjonijiet tal-klinika
         
            Ematoloġija
         
         Jekk l-osservazzjonijiet juru deterjorament fis-saħħa ta’ l-annimali matul l-istudju, kwantità differenzali ta’ demm hija magħmula fuq l-annimali li jiġu affettwati.
         Fit-12-il xahar, fit-18-il xahar, u qabel ma jiġu ssagrifikati, kampjun tad-demm huwa ottenut mill-annimali u mqiegħed fuq slajd. Kwantità differenzali ta’ demm hija magħmula fuq l-annimali tal-gruppi ta’ doża għolja u tal-gruppi tal-kontroll. Jekk din id-data, partikolarment dik ottenuta minn eżami patoloġiku tindika l-ħtieġa, kwantità differenzali ta’ demm għandha tiġi magħmula fuq l-annimali tal-livell li jkun imiss ukoll.
         
            Nekroskopija totali
         
         Nekroskopija totali u sħiħa għandha tiġi magħmula fuq l-annimali kollha, inklużi fuq dawk li mietu matul l-esperiment jew dawk li ġew maqtula meta ġew misjuba f’kundizzjoni moribonda. Il-ħsarat kollha visibbli, it-tumuri jew il-ħsarat suspettati li jkunu tumuri għandhom jiġu ppreservati.
         L-organi u t-tessuti li ġejjin għandhom jiġu ppreservati f’mezzi addattati għal xi eżami istopatoloġiku futur: il-moħħ (sezzjonijiet tal-medulla/parti ta’ l-għerq tal-moħħ li tgħaqqad il-medulla oblongata mat-talamu, il-kortiċi taċ-ċervellett u l-kortiċi celebrali), it-tessut pitwitarju, it-tessut tat-tirojde/tal-paratirojde, it-tessut tat-timu, il-pulmuni u t-trakea, il-qalb, l-aorta, il-glandoli tar-rieq, il-fwied, il-milsa, il-kliewi, l-adrenali, l-esofagu, l-istonku, id-duwodenu, il-parti ta’ bejn id-duwodenu u l-ilju, l-ilju, il-musrana l-għamja, il-musrana l-ħoxna, ir-rektum, il-frixa, il-gonadi, l-utru, l-organi ġenitali aċċessorji, il-glandola tal-ħalib tas-sess femminil, il-ġilda, il-muskolatura, in-nerv periferali, in-nerv li jgħaddi minn ġos-sinsla fuq tliet livelli – ċervikali, toraċiku tan-nofs u tal-ġenbejn, l-isternu bl-għadam tal-mudullun u l-għajnejn.
         In-nefħa tal-pulmuni u tal-bużżieqa ta’ l-awrina b’fissattiv huwa l-mezz ottimali li jippreserva dawn it-tessuti; in-nefħa tal-pulmuni fi studji tal-ġbid fin-nifs hija essenzali għal eżami istopatoloġiku xieraq. Fi studji speċjali bħal dawk tal-ġbid fin-nifs, l-apparat respiratorju kollu għandu jiġi studjat, inkluż l-imnieħer, il-farinġi u l-larinġi.
         
            Istopatoloġija
         
         
                     (a)
                  
                  
                     Istopatoloġija sħiħa għandha tiġi magħmula fuq l-organi u t-tessuti ta’ kull animal li miet jew li ġie ssagrifikat matul it-test u fuq l-annimali kollha fil-gruppi tad-doża qawwija u fil-gruppi tal-kontroll.
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     It-tumuri kollha li jkunu visibbli jew il-ħsara li tkun suspettata li-tkun tumor għandhom jiġu eżaminati mikroskopikament fil-gruppi kollha.
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     Jekk ikun hemm differenzi sinjifikanti fl-inċidenza tal-ħsara neoplastika fil-gruppi tad-doża qawwija u fil-gruppi tal-kontroll, istopatoloġija għandha tiġi magħmula fuq dak l-organu jew tessut partikolari fil-gruppi l-oħrajn.
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     Jekk is-sopravivenza fil-gruppi tad-doża għoljin hija sostanzjalment inqas minn dik fil-gruppi tal-kontroll, il-grupp tad-doża li jkun fil-livell iktar baxx li jmiss għandu jiġi eżaminat bir-reqqa.
                  
               2.   DATA
         Id-data għandha tiġi miġbura fil-qosor f’forma tabulari, li turi għal kull grupp tat-test, in-numru ta’ l-annimali li kien hemm fil-bidu tat-test, in-numru ta’ l-annimali li juru tumuri skoperti waqt it-test, il-ħin ta’ l-iskoperta u n-numru ta’ l-annimali li nstabu li kellhom tumur wara li ġew sagrifikati. Ir-riżultati għandhom jiġu evalwati b’metodu ta’ l-istatistika xieraq. Kwalunkwe metodu ta’ l-istatistika rikonoxxut jista’ jintuża.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkun fih l-informazzjoni li ġejja, jekk possibbli:
         
                     —
                  
                  
                     in-nisel ta’ l-ispeċi jew ir-razza, minn fejn ġejja l-ispeċi, il-kundizzjonijiet ta’ l-ambjent, dieta,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Deskrizzjoni ta’ l-apparat ta’ l-espożizzjoni:
                                 inkluż id-disinn, tip, dimensjonijiet, minn fejn tidħol l-arja, is-sistema tal-ġenerazzjoni ta’ partikoli separati u ajrusol, il-metodu tal-kondizzjonar ta’ l-arja, it-trattament ta’ l-egżost ta’ l-arja u l-metodu ta’ l-akkomodazzjoni ta’ l-annimali f’kompartimenti tat-test meta dawn huma użati. It-tagħmir għat-tkejjil tat-temperatura, umdità u, fejn xieraq, ta’ l-istabilità tal-konċentrazzjonijiet ta’ l-ajrusol jew id-daqs tal-paartikuli, għandhom jiġu deskritti.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Data ta’ l-espożizzjoni:
                                 din għandha tkun imqiegħda f’lista u ppreżentata b’valuri intermedji u b’miżura ta’ varjabilità (per eżempju d-devjazzjoni ta’ l-istandard) u għandha tinkludi:
                                 
                                             (a)
                                          
                                          
                                             rati tal-fluss ta’ l-arja mit-tagħmir tal-ġbid fin-nifs;
                                          
                                       
                                             (b)
                                          
                                          
                                             temperatura u umdità ta’ l-arja;
                                          
                                       
                                             (ċ)
                                          
                                          
                                             konċentrazzjonijiet nominali (l-ammont totali tas-sustanza tat-test imqiegħda fit-tagħmir tal-ġbid tan-nifs diviż bil-volum ta’ l-arja);
                                          
                                       
                                             (d)
                                          
                                          
                                             in-natura ta’ sustanza oħra, jekk użata;
                                          
                                       
                                             (e)
                                          
                                          
                                             konċentrazzjonijiet attwali fiż-żona tan-nifs ittestjata;
                                          
                                       
                                             (f)
                                          
                                          
                                             daqsijiet medjani tal-partikoli (fejn xierqa),
                                          
                                       
                           
               
                     —
                  
                  
                     il-livelli tad-doża (inkluża xi sustanza, jekk użata) u konċentrazzjonijiet;
                  
               
                     —
                  
                  
                     data ta’ l-inċidenza tat-tumur, bis-sess, bid-doża, u bit-tip ta’ tumur;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin tal-mewt waqt l-istudju jew jekk l-annimali ssopravivewx sat-tmiem;
                  
               
                     —
                  
                  
                     data tar-reazzjoni tossika bis-sess u d-doża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni ta’ l-effetti tossiċI u ta’ effetti oħrajn;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin ta’ l-osservazzjoni ta’ kull sinjal anormali u ż-żmien sussegwenti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     data ta’ l-għalf u tal-piż tal-ġisem;
                  
               
                     —
                  
                  
                     skoperti oftalmoloġiċi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     skoperti tan-nekroskopija;
                  
               
                     —
                  
                  
                     dekrizzjoni dettaljata ta’ l-iskoperti istopatoloġiċi kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     trattament ta’ l-istatistika tar-riżultati fejn huwa possibbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2.   VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         4.   REFERENZI
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         B.33.   TEST MAGĦQUD TA’ TOSSIĊITÀ KRONIKA/KARĊINOĠENITÀ
         1.   METODU
         1.1   INTRODUZZJONI
         Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.
         1.2   DEFINIZZJONIJIET
         Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.
         1.3   SUSTANZI GĦAR-REFERENZA
         Xejn
         1.4   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         L-għan ta’ dan it-test magħqud ta’ tossiċità/carcinogenity hu li jiddetermina l-effetti kroniċi u karċinoġeniċi ta’ sustanza fi speċi mammifera wara li tkun esposta għal tul ta’ żmien
         Għal dan il-għan, test karċinoġeniku hu integrat almenu ma’ grupp satellitari trattat u ma’ grupp satellitari ta’ kontroll. Id-doża użata għall-grupp satellitari b’doża għolja tista’ tkun għola minn dik użata mill-grupp ta’ doża għolja fit-test karċinoġeniku. L-annimali fit-test karċinoġeniku huma eżaminati għal tossiċità ġenerali kif ukoll għar-rispons karċinoġeniku. L-annimali fil-grupp satellita trattat huma eżaminati għal tossiċità ġenerali.
         Is-sustanza ittestjata hi normalment somministrata sebat ijiem fil-ġimgħa, skond mod adattat, lil diversi gruppi ta’ annimali esperimentali, doża waħda kull grupp, għal parti kbira mill-ħajja tagħhom. Waqt u wara li jkunu esposti għas-sustanza ittestjata, l-annimali esperimentali huma osservati kuljum sabiex jiġu innutati is-sinjali ta’ tossiċità u l-iżvilupp ta’ tumuri.
         1.5   KRITERJI TAL-KWALITÀ
         Xejn.
         1.6   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         L-annimali huma miżmuma taħt kundizzjonijiet sperimentali ta’ akkomodazzjoni u ikel almenu għal ħamest ijiem qabel it-test. Qabel it-test, annimali żgħar b’saħħithom huma mqiegħedha kif ġie ġie fil-gruppi.
         
            Annimali Sperimentali
         
         L-ispeċi preferut huwa l-ġurdien. Speċijiet oħrajn (gerriem jew mhux) jistgħu jkunu użati skond ir-riżultati ta’ testijiet oħra kondotti qabel. Razez ta’ annimali normalment użati fil-laboratorju għandhom jiġu utilizzati u l-għoti tad-doża għandu jibda kemm jista’ jkun malajr wara l-ftim.
         Wara li jkun beda t-test, il-varjazzjoni ta’ piż f’l-annimali m’għandhiex tkun aktar minn ± 20 % tal-valur medju. Meta jkun kondott test sub-kroniku orali bħala test preliminari sa test b’terminu twil, l-istess speċi u razza għandhom ikunu użati fiż-żewġ studji.
         
            Numru u sess
         
         Għall-gerriema, almenu 100 annimal (50 mara u 50 raġel) għandhom ikunu użati f’kull livell ta’ dożi u f’kull grupp ta’ kontroll parallel. In-nisa ma jridu jkunu qatt welldu tarbija u mhux tqal. Jekk huma previsti sagrifiċċji fil-frattemp, in-numru għandu jiżdied bin-numru ta’ annimali li huma skedati għas-sagrifiċċju qbel ma jkun tlesta t-test.
         Il-grupp(i) satellitari trattat(i) għall-valutazzjoni patoloġika aparti tumuri, għandhom jinkludu 20 annimal minn kull sess, mentri il-grupp satellita ta’ kontroll għndu jinkludi 10 annimali minn kull sess.
         
            Livelli ta’ doża u frekwenza ta’ espożizzjoni
         
         Għal skopijiet ta’ testijiet karċinoġeniċi, almenu tliet livelli ta’ doża għandhom ikunu użati barra mill-grupp ta’ kontroll. L-għola livell ta’ doża għandu jagħti sinjali ta’ tossiċità minima, bħal nuqqas fiż-żieda ta’ piż (inqas minn 10 %), mingħajr ma tinbidel il-ħajja normali minħabba effetti oħra aparti tumuri.
         L-inqas livell ta’ doża m’għandhiex tinterfjeri mat-tkabbir, żvilupp u tul normali ta’ l-annimal kif ukoll m’għandhiex tipproduċi abda indikazzjoni ta’ tossiċità. In ġenerali, dan m’għandux ikun inqas minn 10 % tad-doża l-għolja.
         Id-doża(i) intermedjarji għandhom ikunu stabbiliti f'intervall medju bejn id-dożi l-għoljin u l-baxxi.
         Is-selezzjoni ta’ livelli ta’ dożi għandhom jieħdu in kunsiderazzjoni id-data minn testijiet u studji preċedenti ta’ tossiċità.
         Għal skopijiet ta’ ittestjar għat-tossiċità kronika, gruppi ittrattati u grupp parallel ta’ kontroll satellitari addizjonali huma inklużi fit-test. Id-doża qawwija għal trattament ta’ annimali tal-grupp satellitari għandha tkun tali li tipproduċi sinjali evidenti ta’ tossiċità.
         Normalment il-frekwenza ta’ l-espożizzjoni hi ta’ kuljum.
         Jekk il-kimika hi somministrata fl-ilma għax-xorb jew imħallta mad-dieta, din għandha tkun disponibbli kontinwament.
         
            Kontrolli
         
         Għandu jintuża grupp parallel, li jkun identiku f’kull aspett għall-gruppi trattati, bl-eċċezzjoni għall-espożizzjoni għall-bqija tas-sustanza.
         F’ċirkostanzi speċjali, bħal fil-każ ta’ studji permezz ta’ ġbid għal ġol-pulmuni li jinvolvu aerosols jew l-użu ta’ emulsjonant b’attivitá bijoloġika mhux karatterizzata fi studji orali, għandu jintuża grupp addizjonali ta’ kontroll li mhux espost għas-sutanza li magħha jitħalltu xi mediċini.
         
            Modi ta’ amministrazzjoni
         
         It-tliet modi prinċipali ta’ amministrazzjoni huma: orali, permezz tal-ġilda, u ġbid għal ġol-pulmuni. L-għazla ta’ dan il-mod tiddependi fuq il-karatteristiċi fiżiċi u kimiċi tas-sustanza ittestjata u għar-rotta ta’ espożizzjoni fil-bnedmin.
         Testijiet orali
         Meta s-sustanza ittestjata tkun assorbita mill-apparat gastro-intestinali u r-rotta inġestiva tkun waħda ta’ espożizzjoni għall-bnedmin, il-metodu ta’ amministrazzjoni orali hu preferut, sakemm ma jkunx hemm kontra-indikazzjonijiet. L-annimali jistgħu jirċievu is-sustanza ittesjat fid-dieta tagħhom jew dissolta fl-ilma għax-xorb jew permezz ta’ kapsula.
         Idealment, dożi ta’ kuljum fuq bażi ta’ sebat ijiem fil-ġimgħa għandhom jiġu użati peress li dożi fuq bażi ta’ ħamest ijiem fil-ġimgħa jistgħu jippermettu fejqan jew irtirar tossiku fil-perjodu meta ma jingħatawx dożi u b’hekk jiġi affettwat ir-riżultat jew il-valutazzjoni suċċessiva tiegħu. Madankollu, fuq il-bażi ta’ kunsiderazzjonijiet prattiċi, dożi fuq bażi ta’ ħamest ijiem fil-ġimgħa huma konsidrati bħala aċċettabbli.
         Testijiet tal-ġilda
         L-espożizzjoni tal-ġilda permezz ta’ tpinġija tista’ tkun magħżula biex tistimola ir-rotta ewlenija ta’ espożizzjoni umana u bħala mudell ta’ sistema għal bidu ta’ feriti fil-ġilda.
         Testijiet permezz ta’ ġbid għal ġol-pulmuni
         Peress li dawn it-testijiet għandhom problemi tekniċi aktar kumplessi mir-rottot l-oħra ta’ amministrazzjoni, qed tingħata hawnhekk gwida aktar dettaljata fuq dan il-mod ta’ amministrazzjoni. Ta’ min jinnota li t-tiswib tal-pajp tan-nifs jista’ jikkostitwixxi alternattiva valida f’sitwazzjonijiet speċifiċi.
         Espożizzjonijiet għal żmien twil normalment huma mfassla fuq espożizzjoni umana prevista, fejn l-annimali jingħataw jew espożizzjoni ta sitt sigħat kuljum wara l-ekwilibrazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tal-kamra, għal ħamest ijiem fil-ġimgħa (espożizzjoni intermittenti), jew, relevanti għal espożizzjoni ambjentali possibbli, 22 sa 24 siegħa ta’ espożizzjoni kuljum għal sebat ijiem fil-ġimgħa (espożizzjoni kontinwa). B’madwar siegħa għal tmigħ kuljum ta’ l-annimali fl-istess ħin u għaż-żamma tal-kmamar. Fiż-żewġ każijiet, l-annimali huma normalment esposti gżal konċentrazzjonijiet fissi tas-sustanza ittestjata. Differenza kbira bejn espożizzjoni intemittenti u kontinwa hi li b’ta’ l-ewwel hemm ġerjodu ta 17 sa 18-il siegħa fejn l-annimali jistgħu jirkupraw mill-effetti ta’ kull espożizzjoni ta’ kuljum, b’perjodu ta’ rikoverazzjoni iktar twil fi tmiem il-ġimgħa.
         L-għażla bejn espożizzjoni intermittenti jew kontinwa tiddependi fuq l-oġġettivi tat-test u fuq l-espożizzjoni umana lit rid tiġi simulata. Madankollu, ċerti diffikultajiet tekniċi għandhom ikunu kunsidrati. Per eżempju, il-vantaġġi ta’ espożizzjoni kontinwa għal simulazzjoni ta’ kundizzjonijiet ambjentali jistgħu jkunu kumpensati bin-neċessitá għal tisqija u tmigħ waqt l-espożizzjoni u bil-bżonn għal aerosol u ġenerazzjoni ta’ fwar u tekniki ta’ osservazzjoni iktar ikkomplikati (u ta’ min jafdahom).
         
            Kmamar ta’ l-espożizzjoni
         
         L-annimali għandhom ikunu ittestjati fi kmamar ta’ ġbid għal ġol-pulmuni, iddisinjati biex isostnu fluss dinamiku ta’ almenu 12-il bdil ta’ arja kull siegħa biex ikun assigurat kontenut ta’ u ossiġnu adekwat u atmosfera ta’ l-espożizzjoni ibbilanċjata. il-kmamar tal-kontroll u ta' l-espożizzjoni għandhom ikunu identiċi f'dik li hija kostruzzjoni u disinn sabiex jiġu żgurati il-kundizzjonijiet ta' l-espożizzjoni imqabbla f'kull rispe’t b’eċċezzjoni ta’ l-espożizzjoni għas-sustanzi ittestjati. Ftit pressjoni negattiva fil-kamra hi ġeneralment miżmuma sabiex tipprevjeni milli jkun hemm ħruġ tas-sustanza ittestjata fl-erja tal-madwar. Il-kmamar għandhom jimminimizzaw l-iffullar ta’ annimali ittestjati. Bħala regola ġeneralim biex tiġi żgurata l-istabilità ta’ l-atmosfera tal-kamra, il-volum totali ta’ annimali ittestjati m’għandux jaqbeż il-5 % tal-volum tal-kamra.
         Il-Qisien jew kontrolli iridu jkunu magħmula minn:
         
                     (i)
                  
                  
                     Fluss ta’ l-arja: ir-rata tal-fluss ta’ l-arja fil-kamra għandu jkun ikkontrollat kontinwament;
                  
               
                     (ii)
                  
                  
                     Konċentrazzjoni: waqt il-perjodu ta’ espożizzjoni ta’ kuljum, il-konċentrazzjoni m’għandhiex tvarja b’iktar minn ±15 % tal-valur medju. Tul il-ħin kollu ta’ dan l-istudju, il-konċentrazzjonijiet ta’ kuljum għandhom jinżammu kostanti daqs kemm prattikabbli;
                  
               
                     (iii)
                  
                  
                     Temperatura u Umditá: għal annimali gerriema, it-temperatura għandha tinżamm 22 ± 2 oC, u l-umdita’ fi ħdan il-kamra 30 sa 70 %, bl-eċċezzjoni meta l-ilma jkun użat biex jissospendi is-sustanza ittestjata fl-atmosfera tal-kamra. Preferibilment it-tnejn għandhim ikunu kontrollati kontinwament;
                  
               
                     (iv)
                  
                  
                     Qisien tad-daqs tal-partikola: id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partikola għandha tkun determinate fl-atmosferi tal-kamrali jinvolvu likwidu jew aerosols solidi. Il-partikoli ta’ l-aerosols għandhom ikunu ta’ daqs respiratorju għall-annimaali użati fit-test. Kampjuni ta’ l-atmosferi tal-kamra għandhom jittieħdu fiż-żona fejn jieħdu n-nifs l-annimali. Il-kampjun ta’ l-arja għandu jirrappreżenta id-distribuzzjoni tal-partikoli għal liema huma esposti l-annimali, u għandu jirrappreżenta fuq bażi gravimetrika, għall-aerosol sospiż kollu anke jekk ħafna minnu ma jkunx respirabbli. Analiżi tal-qies tal-partikola għandhom isiru frekwentement waqt l-iżvilupp tas-sistema ġenerattiva biex tiġi żgurata l-istabilità ta’ l-aerosol u minn hemm ‘il quddiem ta’ spiss skond il-bżonn waqt l-espożizzjonijiet biex tiġi determinata adekwatatment, il-konsistenza tad-distribuzzjoni tal-partikola għal liema ġew esposti l-annimali.
                  
               
            Tul tat-Test
         
         It-tul tal-parti karċinoġenika tat-test tinkludi il-parti l-kbira tal-ħajja normali ta’ l-annimali tat-test. It-tmiem tat-test għandu jkun 18-il xahar għal ġrieden u ħamsters u 24 xahar għal firien; madankollu, għal certi razez ta’ annimali b’ għomor twil u/jew spontanjetá baxxa ta’ rata ta’ tumor, it-tmiem għandu jkun 24 xahar għal ġrieden u ħamstersu 30 xahar għal firien. Alternattivament, it-tmiem ta’ tests estiż bħal dan hu aċċettabbli meta n-numru ta’ sopraviventi fid-doża l-iktar baxxa jew grupp ta’ kontroll tilħaq 25 %. Meta se jintemm tets fejn hemm evidenza ta’ differenza sesswali fir-rispons, kull sess għandu jkun ikkunsidrat separatament. Meta jmut qabel iż-żmien il-grupp ta’ doża għolja biss, għal raġunijiet ovvji ta’ tossiċità, dan m’għandux jikkawża tmiem sakemm manifestazzjonijiet tossiċi ma jkunux qed jikkawżaw problemi fil-gruppi l-oħra. Biex riżultat negattiv tat-test ikun aċċettabbli, mhux iktar minn 10 % ta’ kull grupp jista’ jintilef mill-esperiment kawża ta’ awtolisi, kannibaliżmu, jew problemi ta’ maniġment, u s-sopravivenza tal-gruppi kollha ma tkunx inqas minn 50 % fi 18-il xahar għal ġrieden u ħamsters u f'24 xahar għall-firien.
         Il-gruppi satelliti ta' 20 annimal (skond is-sess) dożat, u 10 (skond is-sess) ta' kontroll assoċjat użati għal ittestjar ta' tossiċità kronika għanhom jinżammu fit-test almenu għal 12-il xahar. Dawn l-annimali għandhom ikunu destinati għal sagrifiċċju għal eżami tal-patoloġija konnessa mas-sustanza sperimentali mhux kumplikata b'tibdiliet ġerontoloġiċi.
         Proċedura
         
            Osservazzjonijiet
         
         Għandhom isiru osservazzjonijiet ta’ kuljum u dawn għandhom jinkludu osservazzjonijiet tal-kambjament fil-ġilda u fil-pil, għajnejn u membrane mukuża kif ukoll kampjament respiratorju, ċirkolatorju, is-sistemi nervużi ċentrali awtonomiċi, attivitá ta’ ċaqliq tal-ġisem u mod ta’ mġieba.
         Eżaminazzjoni klinika għanha ssir f’intervalli adekwati fuq annimali fil-grupp(i) satellite trattati.
         Osservazzjonijiet regolari fuq l-annimali huma neċessarji sabiex jiżguraw, sa fejn hu possibbli, li ma jintilfux annimali mit-test kawża ta’ kannibaliżmu, awtolisi jew tqegħid mhux f’postu tat-tessuti. Annimali moribondi għandhom jitneħħew u ssirilhom awtopsja.
         Sinjali kliniċi, inkluż kambjamenti newroloġiċi u fl-għajnejn kif ukoll il-mortalitá għandhom jiġu reġistrati għall-annimali kollha. Attenzjoni speċjali għandha tingħata għall-żvilupp tat’ tumor: il-ħin li jfeġġ, il-post fejn qiegħed, dimensjonijiet, apparenza u progress ta’ kull tumur kbir u viżibbli jew tumur paplpabbli għandhom jiġu rreġistrat; il-ħin li jfeġġ u l-progress ta’ kundizzjonijiet tossiċi għandhom ikunu reġistrati.
         Il-qisien ta’ konsum ta’ ikel (u konsum ta’ ilma meta s-sustanza ittestjata tkun somministrata fl-ilma għax-xorb) għandhom jittieħdu kull ġimgħa matul l-ewwel 13-il ġimgħa ta’ l-istudju u imbagħad bejn wieħed u ieħor f’intervalli ta’ tliet xhur sakemm l-istat ta’ saħħa u piż tal-ġisem ma jiddettawx mod ieħor.
         Il-piżijiet ta’ l-iġsma għandhom ikunu reġistrati individwalment għall-annimali kollha matul l-ewwel 13-il ġimgħa tal-perjodu tat-test u ta’ l-inqas darba kull erba’ ġimgħat minn hemm ‘il quddiem.
         Eżaminazzjonijiet kliniċi
         
            Ematoloġija
         
         L-eżaminazzjoni ematoloġika (eż. Kontenut emoglobina, volum taċ-ċellola, it-total ta’ Ċelloli ħomor tad-demm, it-total ta’ Ċelloli bojod tad-demm, diski żgħar numerużi fid-demm, jew miżuri oħra li potenzalment iwasslu għal demm magħqud) għandu jsir wara tliet xhur, sitt xhur u bejn wieħed u ieħor f’intervalli ta’ sitt xhur minn hemm ‘il quddiem, u fit-tmiem, fuq kampjuni ta’ demm miġbura minn 10 firien/skond is-sess ta’ kull grupp. Jekk hu possibbli. Il-kampjuni għandhom ikunu mill-istess firien f’kull intervall.
         Jekk l-osservazzjonijiet kliniċi jissuġġerixxu deterjorazzjoni fis-saħħa ta’ l-annimali waqt l-istudj, għandu jiġi esegwit għadd differenzali ta’ demm ta’ la-annimali milquta. L-għadd differenzali ta’ demm issir fuq kampjuni ta’ dawk l-annimali mill-grupp ta’ doża qawwija u l-kontrolli. L-għadd differenzali ta’ demm isiru fuq il-grupp(i) ta’ doża inferjuri li jmiss, biss jekk ikun hemm diskrepanza kbira bejn l-għola grupp u l-kontrolli, jew jekk ikun indikat mis-sejbiet patoloġiċi.
         
            Analiżi kimika ta’ l-awrina
         
         Kampjuni ta’ l-urina minn 10 firien/skond is-sess tal-gruppi kollha, jekk possibbli mill-istess firien fl-istess intrvalli bħall-eżaminazzjoni ematoloġika, għandhom jinġabru għall-analiżi. Id-determinazzjonijiet li ġejjin għandhom jiġu determinati jew minn annimali individwali jew fuq kampjun/sess/grupp ta’ gerriema.
         
                     —
                  
                  
                     apparenza: volum u densitá għal annimali individwali;
                  
               
                     —
                  
                  
                     proteïni, glukosju, ketoni, demm moħbi (semi-kwantitattiv);
                  
               
                     —
                  
                  
                     microskopija tas-sediment (semi-kwantitattiv).
                  
               
            Kimika klinika
         
         F’intervalli ta’ bejn wieħed u ieħor sitt xhur, u fit-tmiem, kampjuni ta’ demm huma meħuda għal qisien ta’ kimika klinika mill-annimali mhux gerriema kollha u minn 10 firien/sess tal-gruppi kollha u jekk possibbli mill-istess firien f’kull interval. Ma’ dan għandu jinġabar kampjun qabel it-test mill-annimali mhux gerriema. Il-plasma hi preparata minn dawn il-kampjuni u jsiru dawn id-determinazzjonijiet li ġejjin:
         
                     —
                  
                  
                     konċentrazzjoni totali ta’ proteini;
                  
               
                     —
                  
                  
                     konċentrazzjoni ta’ albumina;
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet fuq il-funzjoni tal-fwied (bħal attivitá alkalina ta’ kull enzim li jikkatalizza s-sintesi jew l-idrolisi ta’ fosfat organiku, glutamic pyruvic transaminase [17] activity u glutamic oxaloacetic transaminase [18] ), gamma glutamyl transpeptidase, ornithine decarboxylase;
                  
               
                     —
                  
                  
                     metaboliżmu karboidratiku bħal glukows tad-demm sajjem;
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet fuq il-funzjoni tal-kliewi bħal nitroġenu urea tad-demm.
                  
               
            Awtopsja sħiħa
         
         Għandha ssir awtopsja kompluta fuq l-annimali kollha, inkluż dawk li mietu waqt l-esepriment jew kienu sagrifikati billi nstabu li kienu f’kundizzjoni moribonda. Qabel is-sagrifiċċju, kampjuni ta’ demm għandhom jittieħdu mill-annimali kollha għall-għadd ta’ demm differenzat. Kull tumur kbir viżibbli u feriti suspettati li huma tumuri għandhom ikunu preservati. Għandu jisir attentat sabiex jiġu korrelati l-osservazzjonijiet kbar ma’ dawk mikroskopiċi.
         L-organi u t-tessuti kollha għandhom ikunu preservati għal eżaminazzjoni istopatoloġiku. Dan ġeneralment jikkonċerna l-organi u t-tessuti li ġejjin: il-moħħ [19] (mudullun/sħiħ, il-kortiċi taċ-ċervellett, il-kortiċi ċerebrali), il-glandola pitwitarja, it-tirojde (inkluża il-paratirojde), it-timu, il-pulmuni (inkluż it-trakea) il-qalb, l-aorta, il-glandoli tal-bżieq, il-fwied, il-milsa, il-kliewi l-adrenali, l-esofagu, l-istonku, id-duwodenu, il-parti tal-musrana ż-żgħira bejn id-dwodenu u l-ilju, l-ileu, il-musrana l-għamja, kolon, rektum, bużżieqa ta’ l-awrina, limfa magħquda, il-frixa, il-gonadil-organi ġenitali aċċessorji, glandola tal-ħalib fin-nisa, ġilda, muskulatura, nervitura periferali, is-sinsla tad-dahar (ċervikali, toraċiku, fil-ġenbejn) sternu bil-mudullun u l-wirk (inkluż il-ġog) u l-għajnejn.
         Għalkemm li l-inflazzjoni tal-pulmuni u l-borża ta’ l-urina b’sustanza li twaħħal hi l-mod opzjonali sabiex jiġu preservati dawn it-tessuti, l-inflazzjoni u l-istudju permezz ta’ ġbid għal ġol-pulmuni hu rekwiżita neċessarju għal eżaminazzjon histopatolġika kif suppost. Fi studji speċjali bħalma huma l-istudji permezz ta’ ġbid għal ġol-pulmuni, it-toroq respiratorji kollha għandhom ikunu studjati, inkluż l-imnieħer, il-farinġi u l-larinġi.
         Jekk jiġu kondotti eżaminazzjonijiet kliniċi oħrajn, l-informazzjoni miksuba minn dawn il-proċeduri għandha tkun magħrufa qabel l-eżaminazzjoni mikroskopika, għax din tista’ tagħti gwida sgnnifikanti lill-patologu.
         
            Istopatoloġija
         
         Għall-parti tat-test li tirrigwarda t-tossiċità kronika:
         Għandu jsir eżaminazzjoni dettaljat għall-organi preservati kollha ta’ l-annimali kollha fil-gruppi satelliti b’doża għolja u fil-gruppi ta’ kontroll. Fejn tinstab patoloġija relatata mas-sustanza ittestjata fil-grupp grupp satellite b’doża għolja, l-organi bersaljati ta’ l-annimali l-oħra kollha f'kull grupp satellita trattat ieħor għandhom ikunu suġġetti għal eżaminazzjoni istoloġiku sħiħ u dettaljat kif ukoll dawk tal-grupp trattat fil-parti karċinoġenika tat-test fit-tmiem tiegħu.
         Għall-parti karċinoġenika tat-test:
         
                     (a)
                  
                  
                     Għandha ssir istopatoloġija sħiħa fuq l-organi u t-tessuti ta' l-annimali kollha li mietu jew ġew sagrifikati matul it-test, u ta' l-annimali kollha fil-gruppi ta' kontroll u ta' doża għolja;
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     It-tumuri jew il-feriti kollha li hemm suspett li huma tumuri li jidhru fi kwalunkwe organu fil-gruppi kollha għandhom jiġu eżaminati mikroskopikament;
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     Jekk hemm differenza signifikanti fl-inċidenza ta’ feriti neoplastiċi fil- gruppi b’doża għolja u gruppi ta’ kontroll, l-istopatoloġija għandha ssir fuq dak l-organu partikolari jew tessut, fil-gruppi l-oħra;
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     Jekk is-sopravivenza fil-grupp b’doża għolja hi sostanzjalment inqas minn dik fil-grupp ta’kontroll, allura il-grupp sussegwenti b’doża inqas għolja għandu jkun eżaminat kompletament;
                  
               
                     (e)
                  
                  
                     Jekk hemm evidenza fil-grupp b’doża għolja ta’ l-induzzjoni ta’ tossiku jew effetti oħra li jistgħu jaffettwaw rispons neoplastiku, il-grupp sussegwenti b’doża inqas għolja għandu jkun eżaminat kompletament.
                  
               2.   DATA
         Id-data għandha tkun miġbura fil-qosor f’forma tabulari, fejn għandhom jiġu murija in-numru ta’ annimali fil-bidu tat-test f’kull grupp, in-numru ta' annimali li qed juru tumuri jew effetti tossiċi osservati waqt it-test, il-ħin li fih ġew osservati u n-numru ta' annimali li rriżulta li għandhom tumuri wara s-sagrifiċċju. Ir-riżultati għandhom jiġu evalwati b’metodu statistiku adattat. Kwalunkwe metodu rikonoxxut ta’ statistika jista’ jiġi użat.
         3.   RAPPURTAĠĠ
         3.1   RAPPORT TAT-TEST
         Jekk possibbli, ir-rapport tat-test għandu jkollu l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     speċijiet, sors ta’ razza, kundizzjonijiet ambjentali, dieta,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Deskrizzjoni ta’ l-apparat ta’ l-espożizzjoni:
                                 Inkluż id-disinn, tip, qisien, sors ta’ arja, sistema biex tiġġenera partikoli separate u aerosols, metodu ta’ kondizzjonar ta’ arja, trattament ta’ egżost u l-metodu ta’ akkomodazzjoni ta’ annimali f’kamra tat-test meta din tkun użata. L-apparat użat biex titkejjel it-temperatura, umditá u fejn hu xieraq, l-istabilità tal-konċentrazzjoni ta’ l-aerosol jew daqs tal-partikola, għandhom ikunu deskritti.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Data ta’ l-espożizzjoni:
                                 Dawn għandhom ikunu tabulate u preżentati bil-valuri medji u miżura ta’ varjabilitá (eż. kwantitá kalkulata biex turi l-ammont ta’ devjazzjoni ta’ grupp meħud kollu kemm hu), u għandha tinkludi:
                                 
                                             (a)
                                          
                                          
                                             rati ta’ fluss ta’ arja mill-apparat ta’ ġbid għal ġol-pulmuni;
                                          
                                       
                                             (b)
                                          
                                          
                                             temperatura u umditá ta’ l-arja;
                                          
                                       
                                             (ċ)
                                          
                                          
                                             konċentrazzjonijiet nominali (ammont totali tas-sustanza ittestjata li ntefgħet fl-apparat ta’ ġbid għal ġol-pulmuni diviż bil-volum ta’ l-arja);
                                          
                                       
                                             (d)
                                          
                                          
                                             sustanza għat-taħlit, jekk użata;
                                          
                                       
                                             (e)
                                          
                                          
                                             konċentrazzjonijiet attwali fiz-zona respiratorja tat-test;
                                          
                                       
                                             (f)
                                          
                                          
                                             qisien medjani tal-partikoli (fejn japplikaw),
                                          
                                       
                           
               
                     —
                  
                  
                     livelli ta’ doża (inkluż is-sustanza li titħallat magħha, jekk użata) u l-konċentrazzjonijiet,
                  
               
                     —
                  
                  
                     data ta’ inċidenza ta’ tumor skond is-sess, id-doża u t-tip ta’ tumour,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ħin tal-mewt waqt l-istudju jew jekk l-annimali li għexu sat-tmiem, inkluż il-grupp satellite,
                  
               
                     —
                  
                  
                     data ta’ rispons tossiku skond is-sess u d-doża,
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni ta’ l-effetti tossiċi jew effetti oħrajn,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin ta’ osservazzjoni ta’ kull sinjal anormali u l-imġieba sussegwenti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     sejbiet oftalmoloġiċi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ikel u piż tal-ġisem,
                  
               
                     —
                  
                  
                     testijiet ematoloġiċi użati u r-riżultati kollha,
                  
               
                     —
                  
                  
                     test ta’ bijokimika klinika użat u r-riżultati kollha (inkluż kull analiżi kimika ta’ l-awrina),
                  
               
                     —
                  
                  
                     sejbiet nekroskopiċi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni dettaljat tas-sejbiet istopatoloġiċi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     trattament statistiku tar-riżultati b’deskrizzjoni tal-metodi użati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     diskussjoni tar-riżultati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2   VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI
         Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.
         4.   REFERENZI
         Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.
         B.34.   TEST TA’ TOSSIĊITÀ FUQ IR-RIPRODUZZJONI FUQ ĠENERAZZJONI WAĦDA
         1.   METODU
         1.1   INTRODUZZJONI
         Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.
         1.2   DEFINIZZJONIJIET
         Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.
         1.3   SUSTANZI GĦAR-REFERENZA
         Xejn.
         1.4   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza ittestjata hi somministrata f’dożi gradwati lil diversi gruppi ta’ nisa u rġiel. L-irġiel għandhom ikunu iddożati waqt li jkunu qed jikbru u għallinqas għal ċiklu spermatoġenetiku wieħed (bejn wieħed u ieħor 56 ġurnata għall-ġurdien u 70 ġurnata għall-far) sabiex joħroġ kwalunkwe effetti negattiv tas-sustanza ittestjata fuq l-ispermatoġenesi.
         Nisa tal-ġenerazzjoni parentali (P) għandhom ikunu iddożati għallinqas għal żewġ ċikli totali ta’ saħna sesswali sabiex joħroġ kwalunkwe effett negattiv tas-sustanza ittestjata fuq din is-saħna sesswali. Imbagħad l-annimali jiġu mgħammra. Is-sustanza ittestjata tiġi somministrata liż-żewġ sessi waqt il-perjodu ta’ tgħammir u minn hemm ’il quddiem lin-nisa waqt it-tqala u għall-perjodu ta’ meta jkunu qed ireddgħu mill-ħalib ta’ sidirhom. Għall-amministrazzjoni permezz ta’ ġbid minn ġol-pulmuni, il-metodu jirrikjedi modifikazzjoni.
         1.5   KRITERJI KWALITATTIVI
         Xejn.
         1.6   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         Preparazzjonijiet
         Qabel it-test, annimali zgħazagħ u b’saħħithom huma assenjati kif ġie ġie fil-gruppi trattati u fil-gruppi ta’ kontroll. L-annimali huma miżmuma taħt kundizzjonijiet ta’ akkomodazzjoni u ikel għallinqas għal ħamest ijiem qabel it-test. Huwa rakkomandat li s-sustanza ittestjata tkun somministrata fid-dieta jew fl-ilma tax-xorb. Tipi oħra ta’ amministrazzjoni huma aċċettabbli wkoll. L-annimali kollha għandhom ikunu iddożati bl-istess metodu waqt il-perjodu sperimentali xieraq. Jekk jintużaw xi sustanzi jew addittivi oħrajn li jiffaċilitaw l-għoti tad-doża, dawn għandhom ikunu magħrufa li ma jipproduċux effetti tossiċi. L-għoti tad-doża għandu jkun fuq bażi ta’ sebat ijiem fil-ġimgħa.
         
            Annimali sperimentali
         
         Selection of species
         Il-far jew ġurdien huma l-ispeċi preferuta. Għandhom ikunu użati annimali b’saħħithom li ma kienux suġġetti għal proċeduri sperimentali preċedenti. Razez b’fertilitá baxxa m’għandhomx ikunu użati. L-annimali ittestjati għandhom ikunu karatterizzati skond l-ispeċi, ir-razza, sess, piż u/jew etá.
         Għal valutazzjoni adegwata tal-fertilitá, kemm l-irġiel kif ukoll in-nisa għandhom ikunu studjati. Kull annimal għat-test u għall-kontroll għandu jkun fatmat qabel tibda tingħata d-doża.
         Numru u sess
         Kull grupp trattat u ta’ kontroll għandu jkollu numru biżżejjed ta’ annimali sabiex ikun hemm 20 mara tqila kważi lesta biex tixtri jew qrib.
         L-għan hu li hu li jkun hemm biżżejjed tqala u frieħ biex tkun assigurata valutazzjoni sinifikanti tal-potenzal li għandha s-sustanza biex taffettwa l-fertilitá, it-tqala u l-imġieba maternali fl-annimali tal-ġenerazzjoni P u fl-annimali mhux miftumin, fl-iżvilupp u t-tkabbir ta’ frieħ ta’ l-F1 mill-konċepiment sal-ftim.
         
            Kundizzjonijiet tat-test
         
         Ilma u ikel għandhom ikunu provdut ad libitum. Meta jkunu viċin li jwelldu, in-nisa tqal għandhom ikunu magħluqa separatament f’gaġeġ għall-ħlas u jistgħu jiġu provduti b’materjal biex jibnu il-bejta tagħhom.
         
            Livelli ta’ doża
         
         Għandhom jiġu użati għallinqas tliet gruppi trattati u wieħed ta’ kontroll. Jekk tintuża sustanza oħra biex tkun somministrata s-sutsanza ittestjata, il-grupp ta’ kontroll għandu jirċievi din is-sustanza fl-għola volum użata. Jekk sustanza ittestjata tikkawża tnaqqis fil-konsum tad-dieta, allura jista’ jkun neċessarju l-użu ta’ grupp ta’ kontroll parallel. Idealment, sakemm mhux limitat bin-natura kimika/fiżika jew bl-effetti bijoloġiċi tas-sustanza ittestjata, l-għola doża għandha tikkaġuna tossiċità imma mhux mortalitá fl-annimali parentali (P). Id-doża(i) intermedjarja(i) għandha tikkaġuna effetti tossiċi minimi li jistgħu jkunu attribwiti lis-sustanza ittestjata, u id-doża l-baxxa m’għandhiex tikkaġuna effetti negattivi osservabbli fuq il-ġenituri jew il-frieħ. Meta somministrata permezz ta’ gavage jew kapsula, id-doża mogħtija lil kull animal għandha tkun ibbażata fuq il-piż tal-ġisem ta’ l-annimal individwali u għandha tkun aġġustata kull ġimgħa minħabba tibdil fil-piż. Jekk mixtieq, fil-każ tan-nisa tqal, id-dożaġġi jistgħu jkunu ibbażati fuq il-piż tal-ġisem fil-ġurnata 0 jew 6 tat-tqala.
         
            Test limitu
         
         Fil-każ ta’ sustanzi b'tossiċità baxxa, jekk il-livell ta' doża ta’ għallinqas 1 000 mg/kilogramm ma jipproduċix evidenza ta’ interferenza ma' l-imġieba riproduttiv, studji tad-doża f'livelli oħrajn jistgħu ma jiġux ikkunsidrati bżonnjużi. Jekk studju preliminari f’livell ta’ doża qawwija, b’evidenza definite ta’ tossiċità maternali, ma jurix effetti negattivi fuq il-fertilitá, studji tad-doża f’livelli oħra jistgħu ma jiġux ikkunsidrati bżonnjużi.
         Eżekuzzjoni tat-test
         
            Skedi sperimentali
         
         L-għoti tad-doża ta' kuljum lill-irġiel parentali (P) għandu jibda meta jkollhom etá ta’ madwar ħames sa disa ġimgħat, war li jkunu infatmu u akklimatizzati ta’ l-iqas għal ħamest ijiem. Għall-firien, l-għoti tad-doża ikompli għal għaxar ġimgħat qabel il-perjodu ta’ tgħammir (tmien ġimgħat għal ġrieden). L-irġiel għandhom jinqatlu u eżaminati jew fit-tmiem tal-perjodu ta’ tgħammir jew inkella dawn jinżammu fuq id-dieta tat-test għall-produzzjoni possibbli tat-tieni wild u għandhom jinqatlu u eżaminati ftit qabel it-tmiem ta' l-istudju. Għal nisa parentali (P) l-għoti tad-doża għandu jibda għallinqas wara ħamest ijiem ta’ akklimatizzazzjoni u jibqa’ sejjer almenu għal ġimgħatejn qabel it-tgħammir. L-għoti ta’ kuljum tad-doża lin-nisa P għandu jibqa' sejjer matul it-tliet ġimgħat ta' tgħammir, it-tqala sal-ftim tal-frieħ F1. Il-modifikazzjoni ta' l-iskeda ta' l-għoti tad-doża fuq il-bażi ta’ informazzjoni oħra fuq is-sustanza ittestjat, bħal induzzjoni tal-metaboliżmu jew bijo-akkumulazzjoni.
         
            Proċedura ta’ tgħammir
         
         Fl-istudju ta’ l-effetti tossiċi fuq ir-riproduzzjoni jistgħu jintużaw żewġ tipi ta’ tgħammir, jew tgħammir 1:1 (raġel wieħed għal mara waħda) jew 1:2 (raġel wieħed għal żewġ nisa).
         Ibbażat fuq tgħammir 1:1, mara waħda għandha titpoġġa ma’ l-istess raġel sakemm ma sseħħ riproduzzjoni jew ikunu għaddew tliet ġimgħat. Kull filgħodu in-nisa għandhom ikunu eżaminati għall-preżenza ta’ sperma jew ta’ tappijiet vaġinali. Il-ġurnata 0 tat-tqala hi definita bħala l-ġurnata meta jinstab tapp vaġinali jew tinstab l-isperma.
         Dawk il-pari li ma jitgħammrux għandhom ikunu evalwati sabiex tiġi definita l-kawża tan-nuqqas ta’ fertilitá apparenti.
         Jista’ jkun li din il-valutazzjoni tinvolvi proċeduri bħal li jiġu provduti opportunitajiet oħra sabiex jitgħammru ma' nisa jew irġiel oħra, eżaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi riproduttivi, u eżaminazzjoni taċ-ċiklu ta' saħna sesswali jew ta’ spermatoġenesi.
         
            Daqsijiet tal-gruppi ta’ ulied/frieħ
         
         Annimali li ingħatatilhom id-doża waqt l-istudju tal-fertilitá huma permessi li jwelldu normalment u jrabbu l-frieħ tagħhom sa l-istadju tal-ftim mingħajr standardizzazzjoni tal-gruppi ta’ ulied/frieħ.
         Fejn issir standardizzazzjoni, il-proċedura sussegwenti hi rakkomandata. Bejn l-1 u r-4 ġurnata wara t-twelid, id-daqs ta' kull grupp ta’ ulied/frieħ jista’ jkun irranġat billi jkunu eliminati iż-żgħar żejda b'tali mod li jkun hemm sa fejn hu possibbli, erba' subien u erbgħat
         ibniet kull grupp ta' ulied/frieħ. Fejn in-numru ta' frieħ subien jew bniet jipprevenu milli jkun hemm erba' minn kull sess għal kull grupp ta' ulied, hu aċċettabbli arranġament parzjali (per eżempju, ħames subien u tlett ibniet). L-arranġamenti m'humiex applikabbli għall-gruppi ta' ulied/frieħ ta' inqas minn tmien frieħ.
         
            Osservazzjonijiet
         
         Matul dan il-perjodu tat-test, kull animal għandu jkun osservat għallinqas darba kuljum. Tibdil relevanti fl-imġieba, sinjali ta’ diffikultá jew titwil tal-proċess tat-twelid u kull sinjal ta’ tossiċità, inkluż il-mortalitá għandhom ikunu irreġistrati. Waqt il-perjodi ta’ qabel it-tgħammir u tat-tgħammir, il-konsum ta’ l-ikel jista’ jkun imkejjel kuljum. Wara t-twelid u waqt it-treddigħ, il-kejl tal-konsum ta’ l-ikel (u ta’ l-ilma meta s-sustanza ittestjata hi somministrata permezz ta’ l-ilma tax-xorb) għandu jittieħed fl-istess ġurnata meta jintiżnu it-trabi l-ġodda. Irġiel u nisa P għandhom jintiżnu fl-ewwel ġurnata ta’ l-għoti tad-doża u minn hemm ‘il quddiem kull ġimgħa. Dawn l-osservazzjonijiet għandhom jiġu rreġistrati individwalment għal kull animal adult.
         It-tul tat-tqala għandu jkun ikkalkulat mill-ġurnata 0 tat-tqala. Kull grupp ta’ ulied/frieħ għandu jkun eżaminat kemm jista’ jkun malajr wara l-ħlas sabiex jiġi stabbilit in-numru u s-sess tal-frieħ, il-frieħ li twieldu mejta u dawk li twieldu ħajjin, u l-preżenza ta’ anomaliji kbar.
         Il-frieħ mejta u dawk sagrifikati għandhom ikunu preservati u studjati għal xi difetti possibbli. Frieħ ħajjin għandhom jingħaddu u jintiżnu il-gruppi ta’ frieħ fl-għodwa ta’ wara t-twelid, fir-4 u s-7 ġurnata kif ukoll kull ġimgħa minn hemm ‘il quddiem sat-tmiem ta’ l-istudju, meta l-annimali għandhom jintiżnu individwalment.
         Anormalitajiet fiżiċi kif ukoll fl-imġieba osservati fl-ommijiet jew fil-frieħ għandhom jiġu rreġistrati.
         
            Patoloġija
         
         
            Awtopsja
         
         Fil-ħin tas-sagrifiċċju jew tal-mewt waqt l-istudju, l-annimali tal-ġenerazzjoni P għandhom jiġu eżaminati makroskopikament għal kwalunkwe anormalitajiet strutturali jew kambjamenti patoloġiċi, b’attenzjoni speċjali tingħata lill-organi tas-sitema riproduttiva. Frieħ mejta jew moribondi għandhom jiġu eżaminati għad-difetti.
         
            Istopatoloġija
         
         L-ovarji, l-utru, iċ-ċerviċi, il-vaġina, it-testikoli, il-kanali twal ta’ wara l-bajd minn fejn tgħaddi l-isperma, il-bżieżaq seminali, il-prostata, il-glandola li tagħqqad, glandola pitwitarja u l-organu(i) immirati ta’ l-annimali P kollha għandhom ikunu preservati għal eżaminazzjoni mikroskopika. Fl-eventwalitá li dawn l-organi ma kinux eżaminati fi studji oħrajn b’doża multipla, dawn, fejn hu possibbli, għandhom ikunu eżaminati mikroskopikament fl-annimali kollha fil-gruppi trattati b’doża għolja u fil-gruppi ta’ kontroll u f’annimali li jmutu waqt l-istudju.
         Organi, f’dawn l-annimali, li juru anormalitajiet, imbagħad, għandhom ikunu eżaminati fl-annimali P l-oħra kollha. F’dawn il-każijiet, għandha ssir eżaminazzjoni mikroskopika tat-tessuti kollha li juru kambjamenti patoloġiċi kbar. Kif suġġerit fil-proċeduri ta’ tgħammir, l-organi riproduttivi ta’ l-annimali suspettati b’infertilitá jistgħu jkunu suġġetti għal eżaminazzjoni mikroskopika.
         2.   DATA
         Id-data tista’ tkun miġbura fil-qosor f’forma tabulari, fejn għandhom jiġu murija in-numru ta’ annimali fil-bidu tat-test f’kull grupp, in-numru ta’ rġiel fertili, in-numru ta’ nisa tqal, it-tipi ta’ kambjamenti u l-persentaġġ ta’ annimali li juru kull tip ta’ kambjament.
         Fejn hu possibbli, ir-riżultati numeriċi għandhom jiġu evalwati b'metodu ta' statistika xieraq. kwalunkwe metodu ta' statistika aċċettat jista’ jintuża
         3.   RAPPURTAĠĠ
         3.1   RAPPORT TAT-TEST
         Jekk possibbli, ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni sussegwenti:
         
                     —
                  
                  
                     speċi/razza użata;
                  
               
                     —
                  
                  
                     data tar-rispons tossiku skond is-sess u d-doża, inkluż il-fertilitá, it-tqala u l- vijabilità;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ħin tal-mewt waqt l-istudju jew jekk l-annimali għex sal-ħin tas-sagrifiċċju skedat jew sat-tmiem ta’ l-istudju;
                  
               
                     —
                  
                  
                     tabella li turi il-piż ta’ kull grupp ta’ wlied, il-ferż medju u l-piżijiet individwali tal-frieħ fit-tmiem l-istudju;
                  
               
                     —
                  
                  
                     effetti tossiċi fuq ir-riproduzzjoni, fuq il-frieħ u l-iżvilupp wara t-twelid;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-ġurnata ta’ meta ġie osservat kull sinjal anormali u l-imġieba sussegwenti tiegħu;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-data ta’ piż tal-ġisem għall-annimali P;
                  
               
                     —
                  
                  
                     sejbiet nekroskopiċi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet mikroskopiċi kollha;
                  
               
                     —
                  
                  
                     trattament statistiku tar-riżultati, fejn xieraq;
                  
               
                     —
                  
                  
                     diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2   VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI
         Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.
         4.   REFERENZI
         Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.
         B.35.   STUDJU TAT-TOSSIĊITÀ REPRODUTTIVA FUQ ŻEWĠ ĠENERAZZJONIJIET
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa replika għal OECD TG 416 (2001)
         1.1   INTRODUZZJONI
         Dan il-metodu għal testijiet riproduttivi fuq żewġ ġenerazzjonijiet huwa iddisinjat li jipprovdi informazzjomni ġenerali li tikkonċerna l-effetti tas-sustanza tat-test fuq l-integrità u l-imġieba tas-sistemi riproduttivi ta' l-irġiel u n-nisa, inkluża l-funzjoni gonadali, iċ-ċiklu ta' l-estru, l-imġieba tat-tgħammir, il-konċepiment, il-ġestazzjoni, il-parturazzjoni, il-lattazzjoni, u l-ftim, u it-rtkabbir u l-iżvilupp tal-wild. L-istudju jista’ wkoll jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti tas-sustanza tat-test fuq il-morbidità ta' frieħ għadhom jitwieldu, il-mortalità, u d-dettalji preliminarji fuq l-iżvilupp tossiku ta' qabel it-twelid u ta' wara t-twelid u jservi bħala gwida għal testijiet sussegwenti. B'żieda ma l-istudju tat-tkabbir u l-iżvilupp tal-ġenerazzjoni F1, dan il-metodu tat-test huwa wkoll intiż li jassessja l-integrità u l-imġieba tas-sistemi riproduttivi maskili u femminili kif ukoll it-tkabbir u l-iżvilupp tal-ġenerazzjoni F2. Għal aktar informazzjoni dwar l-iżvilupp tossiku u d-defiċjenzi funzjonali, jew partijiet addizzjonali ta' l-istudju jistgħu inkorporati f'dan il-protokoll, b'konsulta mal-metodi tat-tossiċità ta' l-iżvilupp u/jew in-newrotassiċità ta' l-iżvilupp kif xieraq, jew inkella dawk il-miri finali jistgħu ikunu studjati fi studji separati, bl-użu ta' metodi xierqa tat-test.
         1.2   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza tat-test hija somministrata f'dożi gradwali lil diversi gruppi maskili u femminili. L-irġiel tal-ġenerazzjoni P għandhom ikollhom id-doża waqt li jkunu jikbru u għal mill-anqas ċiklu speratoġenetiku sħiħ wieħed (madwar 56 jum fil-ġrieden u 70 jum fil-firien) sabiex ikunu misjuba l-effetti ħżiena fuq l-ispermatoġeneżi. L-effetti fuq l-isperma huma determinati bin-numru ta' parametri ta' l-isperma (eż. mortfoloġija u l-motilità ta' l-isperma) u l-preparazzjoni tan-nisġiet u ħistopatoloġija dettaljata. Jekk dettalji dwar l-ispermatoġeneżi jkunu disponibbli minn studju preċedenti dwar doża repetuta ta' tul ta' żmien suffuiċjenti, eż. studju ta' 90 jum, l-irġiel tal-ġenerazzjoni P m'humiex meħtieġa li jkunu nklużi fl-evalwazzjoni. Huwa rakkommandabbli, b'dana kollu, li l-kampjuni jew ir-reġistrazzjoni diġitali ta' l-isperma tal-ġeberazzjoni P jkunu maħżuna, sabiex jiffaċlitaw evalwazzjoni fil-quddiem. Femminili tal-ġenerazzjoni P għandhom ikollhom id-doża matul it-tkabbir u għal diversi ċikli sħaħ ta' l-estru sabiex ikunu żvelati xi effetti ħżiena fuq in-normalità taċ-ċiklu ta' l-estru mis-sustanza tat-test. Is-sustanza tat-test hija somministrata lill-annimali parenti (P) matul it-tgħammir, matul it-tqala riżultanti, u matul il-ftim tal-wild tagħhom F1. Fil-ftim, l-amministrazzjoni tas-sustanza jitkompla lejn il-wild F1 matul it-tkabbir tagħhom lejn il-maturità, it-tgħammir u l-produzzjoni tal-ġenerazzjoni F2, sakemm il-ġenerazzjoni F2 tkun imfattma.
         Osservazzjonijiet kliniċi u l-eżaminazzjonijiet patoloġiċi huma mwettqa fuq l-annimali kollha għal sinjali tat-tossiċità b'emfasi speċjali dwar l-effetti fuq l-integrità u l-imġieba tas-sistemi riproduttivi maskili u femminili u dwar it-tkabbir u l-iżvilupp tal-wild tagħhom.
         1.3   ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.3.1   L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali
         Il-far huwa l-ispeċje preferut għat-testijiet. Jekk ikunu użati speċje oħrajn, ġustifikazzjoni għandha tkun mogħtija u l-modifika xierqa ikunu meħtieġa. Tipi b'fekundità baxxa jew li huma sew magħrufa li għandhom inċidenza għolja ta' difetti fl-iżvilupp m'għandhomx ikunu użati. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali użati għandha tkun minima u ma teċċedix 20 % tal-piż medju ta' kull sess.
         1.3.2   Il-kundizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf
         It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 22 oC (± 3 oC). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu użati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata bil-ħtieġa li tkun assigurata inter-taħlita xierqa tas-sustanza tat-test meta somministrata b'dan il-metodu.
         L-annimali jistgħu jinżammu individwalment jew li jkunu f'gaġġa bħala grupp żgħir ta' l-istess sess. Il-proċeduri ta' l-akkompanjament għandhom jitwettqu f'gaġġeg adatti għal dak l-iskop. Wara l-evidenza tal-kopulazzjoni, in-nisa mgħammra għandhom jinzammu waħda kull gaġġa fil-gaġġeg tal-maternità sa kemm iwelldu. Firien mgħammra jistgħu wkoll jinżammu fi gruppiu żgħat u imbagħad ikunu separati minn jum sa tnejn qabel il-parturazzjoni. L-annimali mgħammra għandhom ikunu ipprovduti bil-materjali xierqa u definiti sabiex ikunu jistgħu jippreparaw il-bejta, meta l-parturazzjoni tkun fil-qrib.
         1.3.3   Preparazzjoni ta' l-annimali
         Annimali b'saħħithom, li jkunu ġew akklamatizzati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal mil anqas 5 ijiem u li ma jkunux ġew suġġetti għal proċeduri preċedenti sperimentali, għandhom ikunu użati. L-annimali tat-test għandhom ikunu karatterizzati bħala speċje, razza, sorsi, seww, piż u/jew l-età. Kwalunkwe relazzjonijiet bejn l-aħwa fost l-annimali għandha tkun magħrufa sabiex it-tgħammir bejn l-aħwa jkun evitat. L-annimali għandhom ikunu assenjati kif jinzerta lejn il-grupp tal-kuntroll u tat-trattament (stratifikazzjoni bil-piż tal-ġisem hija rakkommandabbli). Il-gaġġeġ għandhom ikunu irrangati b'tali mod li l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid fil-gaġġeġ ikunu minimizzat. Kull annimal għandu jkun assenjat numru uniku ta' l-identifikazzjoni. Għall-ġenerazzjoni P, dan għandu jsir qabel ma tibda d-doża. Għall-ġenertazzjoni F1, dan għandu jsir mat-ftim ta' dawk l-annimali li jkunu magħżula għat-tgħammir. Reġistri li jindikaw l-origini tal-botom għandhom jinżammu għall-annimali F1 kollha magħżula. B'żieda, identifikazzjoni individwali tal-frieħ malajr kemm jista’ jkun possibbli malli jitwieldu hija rakkommandabbli, meta l-użin tal-frieħ individwali jew tat-testijiet funzjonali jkunu ikkonsidrati.
         L-annimali parenti (p) għandhom ikunu f'età ta' madwar 5 sa 9 ġimgħat qabel il-bidu tad-doża. L-annimali tal-gruppi kollha tat-test għandhom, kemm jista’ jkun prattikabbli, ikunu ta' piż u età uniformi.
         1.4   PROĊEDURA
         1.4.1   In-numru u s-sess ta' l-annimali
         Kull grupp tat-test u tal-kontroll għandu jinkludi numru suffiċjenti ta' annimali sabiex iforni, preferibbilment mhux anqas minn 20 mara tqila, jew qrib tal-parturazzjoni. Għal sustanzi li jikkaġunaw effetti mhux mixtieqa kif relatati mat-trattament (eż. sterilità, tossiċità eċċessiva f'doża għolja), dan jista’ ma jkunx possibbli. L-għan huwa li jipproduċi tqalat biż-żejjed sabiex jassiguraw evalwazzjoni li tagħmel sens dwar il-potenzal tas-sustanza li taffettwa l-fertilità, it-tqala jew l-imġieba materna u wkoll l-irdiegħ, it-tkabbir u l-iżvilupp tal-wild F1 mill-konċepiment sal-maturità, u l-iżvilupp tal-botom tagħhom (F2) sa kemm ikunu mfattma. Għalhekk, nuqqas li jkun milħuq in-numru mixtieq ta' annimali tqal (i.e. 20) mhux neċessarjament jiżvalida l-istudju u għandu jkun evalwat fuq il-bażi ta' każ b'każ.
         1.4.2   Preparazzjoni tad-dożi
         Huwa rakkommandat li s-sustanza tat-test tkun somministrata oralment (ma l-ikel, ma l-ilma tax-xorb, jew b'ikel sfurzat) sakemm rotta oħra ta' l-amministrazzjoni (eż. dermali jew man-nifs) tkun ikkonsidrata aktar xierqa.
         Meta meħtieġ, is-sustanza tat-test tkun imdewwba jew sospiża f'mezz xieraq. Huwa rakkommandat li, kull meta possibbli, l-użu ta' taħlita/sospenzjoni akwea tkun meqjusa bħala l-ewwel għażla, sewgeita bil-kunsiderazzjoni ta' taħlita/emulsjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħirrum) w imbagħad b'xi taħlita oħra f'mezzi oħrajn. Għal likwidi oħrajn apparti milli l-ilma, il-karatteristiċi tossikoloġiċi tal-likwidu għandhom ikunu magħrufa. L-istabbilità tas-sustanza tat-test fil-mezz għandha tkun determinata.
         1.4.3   Id-Doża
         Mill-anqas tlett livelli ta' dożi u l-kontroll simultanju għandhom ikunu użati. Sakemm ma tkunx limitata bin-natura fiżiko-kimika jew fl-effetti bioloġiċi tas-sustanza tat-test, l-għola livell ta' doża għandu jkun magħżul bil-għan li jinduċi tossiċità imma mhux il-mewt jew xi sofferenza qawwija. Fil-każ ta' mewt mhux mistennija, l-istudji b'rata ta' mortalità ta' anqas minn madwar 10 fil-mijja fl-annimali parentali (P) tkun normalment xorta waħda aċċettabbli. Sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-doża għandha tkun magħżulha bil-għan li turi kwalunkwe reazzjoni relatata mad-doża u l-livell ta' l-ebda effett ħażin mhu osservat (NOAEL). Tnejn- sa erba intervalli huma ta' spiss ottimi sabiex ikunu stabbiliti l-livelli tad-doża dixxendenti, u ż-żieda tar-raba' grupp tat-test hija ta' spiss preferibbli mill-użu ta' intervalli ferm twal (eż. aktar minn fattur ta' 10) bejn id-dożi. Għal-studju djetarji, l-ibtervall tad-doża m'għanduk ikun ta' aktar minn tlett darbiet. Il-livelli tad-doża għandhom ikunu magħżula billi tkun meqjusa l-informazzjoni eżistenti tat-tossiċità, speċjalment ir-riżultati minn studji repetuti tad-doża. Kwalunkwe informazzjoni disponibbli dwar il-mataboliżmu u l-kinetiki tal-kompost tat-test jew tal-materjali relatati għandhom ukoll ikunu ikkunsidrati. Din l-infomazzjoni għandha wkoll tgħin fid-demostrazzjoni ta' l-adekwatezza ta' L-amministrazzjoni tad-dożar.
         Dan il-grupp għandu jkun grupp ta' kontroll ittrattat taparsi jew mezz ta' grupp ta' kontroll jekk mezz ikun użat fl-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test. Apparti milli għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom ukoll ikunu mqandla b'manjera identika għas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk ikun użat mezz, il-grupp tal-kontroll għandu jirċievi il-mezz fl-għola volum użat. Jek sustanza tat-test hija somministrata ma l-ikel, u toħloq tnaqqis ta' l-ammont djetarju jew ta' l-utilizzazzjoni, allura l-użu ta' grupp ta' kontroll mitmugħa bħala par jista’ jkun ikkunsidrat bħala meħtieġ. L-informazzjoni alternattiv minn studji tal-kontroll iddisinjati għall-evalwazzjoni ta' l-effetti ta' konsum imnaqqas ta' l-ikel fuq il-parametri riproduttivi tista’ tkun użata minflok il-grupp konkorrenti li jkunu mitmugħa bħala par.
         Konsiderazzjoni għandha tkun mogħtija lil dawn il-karatteristiċi li ġejjin dwar il-mezz jew xi addittivi oħrajn: l-effetti fuq l-assorbazzjoni, id-distribuzzjoni, il-metaboliżmu, u ż-żamma jew it-twarrib tas-sustanza tat-test; l-effetti tal-propjetajiet kimiċi tas-sustanza tat-test li jistgħu joħolqu bidla fil-karatteristiċi tossiċi tagħha; u l-effetti fuq il-konsum ta' l-ikel u l-ilma jew ta' l-istat nutrizzjonali ta' l-annimali.
         1.4.4   Test tal-limitu
         Jekk studju orali f'livell ta' doża waħda ta' mill-anqas 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/kull jum jew, għall-amministrazzjoni ta' l-ikel jew ilma tax-xorb, persentaġġ ekwivalenti fid-dieta jew fl-ima tax-xorb bl-użu tal-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, ma jipproduċu l-ebda effetti tossiċi osservabbli la fl-annimali parentali u l-anqas fil-wild tagħhom u jekk it-tossiċità ma tkunx mistennija kif ibbażata fuq informazzjoni minn komposti strutturament u/jew metabolikament relatati, allura studju sħiħ bl-użu ta' diversi livelli tad-doża jistgħu ikunu meqjusa bħala mhux meħtieġa. It-test tal-limitu huwa applikabbli apparti minn meta l-eposizzjoni umana tindika il-ħtieġa għal doża orali għola fil-livell użat. Għal tipi oħrajn ta' l-amministrazzjoni, bħal ma hija l-applikazzjoni man-nifs jew dermali, il-propjetajiet fiżiko-kimiċi tas-sustanza tat-test, bħal kemm tinħall, ta' spiss tista’ tindika u tillimita l-livell massimu attenibbli ta' l-espożizzjoni.
         1.4.5   Amministrazzjoni tad-dożi
         L-annimali għandhom jingħataw id-doża bis-sustanza tat-test fuq il-bażi ta' 7-ijiem-fil-ġimgħa. Ir-rotta orali ta' l-amministrazzjoni (ma l-ikel, fl-ilma tax-xorb, jew bi tmiegħ sfurżat) hija preferuta. Jekk rotta oħra ta' l-amministrazzjoni hija użata, ġustifikazzjoni għandha tkun ipprovduta, u l-modifika xierqa jistgħu ikunu meħtieġa. L-annimali kollha għandhom jingħataw id-doża bl-istess metodu matul il-perjodu sperimentali kif xieraq. Meta s-sustanza tat-test tkun somministrata bi tmiegħ sfurzat, dan għandu jsir bl-użu ta' tubu ta' l-istonku. Il-volum ta' likwidu amministrat f'darba waħda m'għandux jeċċedi 1 ml.100 g piż tal-ġisem (4,4 ml/100 g piż tal-ġisem huwa l-massimu għaż-żejt tal-qamħ-ir-rum), apparti milli fil-każ ta' taħlitiet akweji meta 2 ml/100 g piż tal-ġisem jista’ jkun użat. Apparti milli għal sustanzi irritanti jew korrossivi, li normalment ikununjiżvelaw effetti eżasperanti b'konċentrazzjonijiet għola, varjabbilità fil-volum tat-test għandha tkun minimizzata bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni sabiex tassigura volum kostanti fil-livelli kollha tad-doża. Fl-istudju bit-tmiegħ sfurzat, il-frieħ ikunu normalment jirċievu biss is-sustanza tat-test b'mod inderett minn meta jkunu jerdgħu, sakemm id-doża diretta tkun tibda għalihom meta jkunu miftuma. Fl-istudji tat-dieta jew ta' l-ilma tax-xorb, il-frieħ ikunu addizzjonalment jirċievu s-sustanza tat-test direttament meta huma jibdew jieklu waħedhom matul l-aħħar ġimgha tal-perjodu tal-lattazzjoni.Għal sustanzi amministrati permezz ta' l-ikel jew ta' l-ilma tax-xorb, huwa importanti li jkun assigurat li l-kwantitajiet tas-sustanza tat-test kif involuti ma jkunux jinterferixxu nat-nutriment normali jew mal-bilanċ ta' l-ilma. Meta s-sustanza tat-test tkun somministrata fid-dieta, konċentrazzjoni djetarja kostanti (ppm) jew livell ta' doża kostanti f'termini tal-piż tal-ġisem ta' l-annimal, jista’ jkun użat; il-mod alternattiv użat għandu jkun speċifikat. Għal sustanza somministrata bi tmiegħ sfurzat, id-doża għandha tkun mogħtija
         f'ħinijiet simili ta' kull jum, u aġġustata mill-anqas darba fil-ġimgħa sabiex jinżamm livell kostanti ta' doża f'termini tal-piż tal-ġisem ta' l-annimal. Informazzjoni rigward id-distribuzzjoni plaċentali għandha tkun ikkonsidrata meta tkun aġġustata d-doża fi tmiegħ sfurzat ibbażżata fuq il-piż.
         1.4.6   Skedi sperimentali
         Id-doża ta' kull jum ta' l-irġiel u n-nisa parentali (P) għandha tibda meta dawn ikollhom età ta' 5 sa 9 ġimghat. Id-doża ta' kull jum fl-irġiel u n-nisa F1 għandha tibda meta jkunu miftuma; din għandha tkun imfakkra fil-każi ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test permezz ta' l-ikel jew ta' l-ilma tax-xorb, espożizzjoni diretta tal-frieħ F1 għas-sustanza tat-test tista’ diġa tkun seħħet matul il-perjodu tal-lattazzjoni. Għaż-żewġ sessi (P u F1), id-doża għandha tibqa għal mill-anqas 10 ġimghat qabel il-perjodu tat-tgħammir. Id-doża tinżamm kontinwa għaż-żewġ sessi matul il-perjodu ta' ġimgħatejn waqt it-tgħammir. L-irgiel għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk u eżaminati meta ma jkunux aktar meħtieġa għall-assessjar ta' l-effetti riproduttivi.
         Rigward in-nisa parentali (P), id-doża għandha tinżamm kostanti matul it-tqala u sal-ftim tal-frieħ F1. Konsiderazzjoni għandha tingħata għall-modifiki fl-iskeda tad-doża ibbażati fuq l-informazzjoni disponibbli dwar is-sustanza tat-test, inklużi d-dettalji eżistenti tat-tossiċità, l-induzzjoni tal-metaboliżmu jew tal-bio-akkumulazzjoni. Id-doża lil annimali individwali għandha normalment tkun ibbażata fuq id-determinazzjoni tal-piż tal-ġisem kif l-aktar riċenti disponibbli. B'dana kollu, attenzjoni għandha tkun eżerċitata meta tkun aġġustata d-doża matul l-aħħar parti tremestra tat-tqala. It-trattament ta' l-irġiel u n-nisa P u F1 għandha tibqa sat-terminu.L-irġiel u n-nisa P u F1 adulti kollha għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk meta ma jkunux aktar meħtieġa dwar l-assessjar ta' l-effetti riproduttivi. Il-frieħ F1 mhux magħżula għat-tgħammir u l-frieħ kollha F2 għandhom ikunu maqtula b'mod umanesk wara li jkunu nfatmu.
         1.4.7   Priċedura tat-tgħammir
         1.4.7.1   It-tgħammir parentali (P)
         Għal kull tgħammir, kull mara għandha tkun imqiegħda ma raġel wieħed mill-istess livell ta' doża (tgħammir 1: 1) sakemm iseħħ il-kopulazzjoni jew wara li jkunu skadew 2 ġimghat. Ta' kull jum, in-nisa għandhom ikunu eżaminati għall-preżenza ta' sperma jew ta' buq vaġinali. Il-jum 0 tat-tqala huwa definit bħala l-jum ta' meta tapp vaġinali jew sperma jkunu misjuba. Fil-każ li l-par ma jirnexxix, it-tgħammir mill-ġdid ta' nisa ma rġiel diġa ippruvari ta' l-istess grupp jista’ jkun ikkunsidrat. Pari mgħammra għandhom ikunu kjarament identifikati f'dik id-data. It-tgħammir ta' aħwa għandu jkun evitat.
         1.4.7.2   Tgħammir F1
         Għat-tgħammir ta' l-ulied F1, mill-anqas raġel wieħed u mara waħda għandhom ikunu magħżula mal-ftiem minn kull boton għal tgħammir ma frieħ oħrajn ta' l-istess livell ta' doża imma minn boton differenti, sabiex jipproduċu l-ġenerazzjoni F2. L-għażla tal-frieħ minn kull boton għandha tkun kif jinzerta meta l-ebda differrenzi sinifikanti ma jkunu osservati fil-piż tal-ġisem jew fid-dehra, bejn is-sieħba fl-istess botom. Fil-każ li differrenzi jkunu osservati, laħjar rapreżentattivi minn kull botom għandhom ikunu magħżula. B'mod pragmatiku, dan laħjar isir fuq il-bażi tal-piż tal-ġisem imma jista’ jkun aktar xieraq fuq il-bażi ta' l-apparenza. Il-wild F1 m'għandux ikun mgħammar sakemm ikunu laħqu l-maturità sesswali kollha. Pari mingħajr proġenità għandhom ikunu evalwati sabiex tkun determinata l-kawża apparenti ta' l- infertilità. Dan jista’ jinvolvi tali proċeduri bħala opportunitajiet addizzjonali saniex jitgħammru ma nisa jew irġiel oħrajn li diġa kienu taw provam b'eżaminazzjoni mikroskopika ta' l-organi riproduttivi, u l-eżaminazzjoni ċikli ta' l-eteru jew ta' l-ispermatoġeneżi.
         1.4.7.3   It-tieni tgħammir
         F'ċerti okkażżjonijiet, bħala ma huma aterazzjoni relatati mat-trattament fid-daqs tal-botom jew fl-osservazzjoni ta' effett ekwivoku fl-ewwel tgħamir, huwa rakkommandabbli li l-adulti P jew F1 ikunu mgħammra mill-ġdid sabiex jipproduċu it-tieni botom. Huwa rakkommandabbli li jkunu mgħammra mill-ġdid in-nisa u l-irġiel, li ma jkunux ipproduċew botom meta mgħammra ma oħrajn diġa bi prova mis-sess oppost. Jekk il-produzzjoni tat-tieni botom tkun meqjusha bħala meħtieġa f'waħda mill-ġenerazzjonijiet, l-annimali għandhom ikunu m, għammra mill-ġdid fi żmien madwar ġimgħa wara l-ftim ta' l-aħħar botom.
         1.4.7.4   Id-daqs tal-botom
         L-annimali għandhom jitħallew li jipproduċu l-botom b'mod normali u li jkabbru t-tfal tagħhom sal-ftim. Standardizzazzjoni tad-daqs tal-botom hija volontarja. Meta ssir l-istandardizzazzjoni, il-metodu użat għandu jkun deskritt fid-dettall.
         1.5   OSSERVAZZJONIJIET
         1.5.1   Osservazzjonijiet kliniċi
         Ossevazzjoni klinika ġenerali għandha ssir ta' kull jum u, fil-każ ta' tmiegħ tad-doża b'mod sfurzat, il-ħin tiegħu għandu jkun meqjus fl-għola perjodu antiċipat ta' l-effetti ta' wara d-doża. Tibdiliet fl-imġieba, sinjali ta' parturazzjoni diffiċli jew imtawwla u s-sinjali kollha ta' tossiċità għandhom ikunu irreġistrati. B'żieda, eżaminazzjoni aktar dettaljata ta' kull annimal għandha tkun imwettqa fuq bażi ta' mill-anqas darba fil-ġimgħa u tista’ tkun imwettqa b'mod konvenjenti fl-okkażżjoni ta' meta l-annimal ikun miżun. Darbtejn kull jum, matul tmiem il-ġimgħa darba kull jum, meta xieraq, l-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal morbidità u l-mortalità.
         1.5.2   Il-piż tal-ġisem u l-konsum ta' l-ikel/ilma fl-annimali parenti
         L-annimali parentali (P u F1) għandhom ikunu miżuna fl-ewwel jum tad-doża u mill-anqas darba fil-ġimgħa minn hemm il-quddiem. Nisa parentali (P u F1) għandhom ikunu miżuna bħala minimu fil-jiem tal-gestjoni 0, 7, 14, u 20 jew 21, u matul il-jiem meta jreddgħu jew fl-istess jiem bħal meta jsir l-użin tal-botom u fil-jum ta' meta l-annimali jkunu maqtula. Dawn l-osserbazzjonijiet għandhom ikunu irrapurtati individwalment għal kull annimal adult. Matul il-pperijodi ta' qabel it-tgħammir u tal-ġestjoni, il-konsum ta' l-ikel għandu jkun imkejjel mill-anqas darba fil-ġimgħa. Il-konsum ta' l-ilma għandu jkun imkejjel bħala minimu jekk is-sustanza tat-test tkun somministrata fl-ilma.
         1.5.3   Iċ-ċikli esteru
         It-tul taċ-ċiklu esteru u n-normalità huma evalwati fin-nisa P u F1 b'ti1pisa vaġinali qabel ma jsir it-tgħammir, u l-aħjar waqt it-tgħammir, sakemm tkun instabet evidenza tat-tgħammir. Meta jkunu akkwistati ċ-ċelloli vaġinali ċervikali, attenzjoni għandha tingħata sabiex ikun evitat li ċaqlieq tal-mukuża u sussegwentament, l-induzzjoni ta' psewdo-tqala (1).
         1.5.4   Parametri ta' l-isperma
         L-irġiel P u F1 kollha, waqt it-teminazzjoni, il-piż tat-testis u ta' l-epididimi għandu jkun irreġistrat u kull wieħed mill-organi preservati għal eżaminazzjoni ħistopatoloġika (ara s-sezzjoni 1.5.7, 1.5.8.1). Minn subset ta' mill-anqas għaxart irġiel ta' kull grupp P u F1, il-kumplament tat-testes u l-epididimidi għandhom ikunu użati għall-ennumerazzjoni ta' l-ispermatidi omoġenizzazzjoni-reżistenti u tar-riservi ta' l-isperma tal-cauda epididimali, rispettivament. Għall-istess subset ta' rġile, l-isperma mill-cauda epididymides jew vas deferens għandhom ikunu miġbura għall-evalwazzjoni tal-motilità ta' l-isperma u l-morfoloġija ta' l-isperma. Jekk l-effetti relatati mat-trattament huma osservati jew meta jkun hemm evidenza minn studji oħrajn ta' effetti possibbli fuq l-ispermatoġeneżi, l-evalwazzjoni ta' l-isperma tista’ tkun imwettqa fuq l-irġiel kollha f'kull grupp ta' doża; altrimenti l-enumerazzjoni tista’ tkun ristretta fuq l-irġiel P u F1 tal-kontroll u dawk ta' doża għolja.
         In-numru totali ta' spermatidi testikulari reżistenti-omogenizzazzjoni u l-isperma cauda epididimali għandhom ikunu innumerati (2) (3). Ir-riservi ta' l-isperma cauda jistgħu ikunu derivati mill-konċentrazzjoni u l-volum ta' l-isperma f'sospenzjoni użata sabiex ikunu mwettqa kompletament l-evalwazzjonijiet kwalitattivi, u n-numru ta' sperma rkuprat minn tgħaffiġ u/jew omoġenizzazzjoni sussegwenti tal-kumplament tal-materja cauda. L-enumerazzjoni għandha tkun imwettqa fuq subset magħżul ta' rġiel tal-gruppi ta' dożi kollha immedjetament wara l-qtil ta' l-annimali sakemm ma jkunx hemm ir-rekordings bil-video jew diġitali, jew sakemm il-kampjuni jkunu ffriżati għal analiżi aktar tard. F'dawn il-każi, il-grupp tal-kontrolli u tad-doża għolja għandhom ikunu analiżżati l-ewwel. Jekk l-ebda effetti reletatati mat-trattament (eż. effetti fuq l-għadd ta' l-isperma, il-motilità, jew il-morfoloġija) jkunu jidhru, il-gruppi tad-dożi l-oħrajn ma jkunx hemm ħtieġa li jkunu analizzati. Meta l-effetti relatati mat-trattament ikunu innotati fil-grupp ta' doża għolja, allura l-gruppi fid-doża aktar baxxa għandhom ukoll ikunu evalwati.
         Il-motilità epididimala (jew ductus deferens) għandha tkun evalwata jew irreġistrata fuq video immedjetament wara s-sagrifiċju. L-isperma għandha tkun irkuprata waqt li tkun minimiżżata l-ħsaram u mrattba għall-analiżi tal-motilità bl-użu ta' metodi accettabbli (4). Il-persentaġġ ta' sperma motilment progressiva għandu jkun determinat jew suġġettivament jew inkella oġġettivament. Meta l-analiżi ta' moviment mgħajjun mill-computer hija mwettqa (5) (6) (7) (8) (9) (10) id-derivazzjoni tal-motilità progressive tkun tistrieħ fuq il-għatbiet definiti bl-użu għal passaġġ ta' veloċità medja u l-linja dritta jew l-indiċi lineari. Jekk il-kampjunu jkun ġew fotografi fuq videotape (11) jew l-immapini ikunu b'mod ieħor reġistrati fil-waqt tan-nekropsija, analiżi sussegwenti biss ta' l-irġiel P u F1 tal-kontroll u ta' doża għolja tista’ tkun imwettqa, sakemm ma jkunx osdservati l-effetti relatati mat-trattament; f'dak il-każ, il-gruppi tad-doża l-baxxa għandhom ukoll ikunu evalwati. Fin-nuqqas ta' imaġġini video jew diġitali, il-kampjuni kollha fil-gruppi tat-trattament għandhom ikunu analiżżati man-nekropsija.
         Evalwazzjoni morfoloġika tal-kampjun ta' l-isperma epididimali (jew van deferens) għandha tkun imwettqa. L-isperma (jew mill-anqas 200 kull kampjun) għandha tkun eżaminata kif stabbilita, preparazzjonijiet niedja (12) u klassifikata bħala jew normali in annormali. L-eżempji ta' l-annormalitajiet ta' l-isperma morfoloġika jkunu jindikaw fużjoni, irjus iżolati, u rjus u/jew denb mingħajr forma. L-evalwazzjoni għandha tkun imwettqa fuq subjet ta' rġile magħżula fil-gruppi tad-dożi kollha jew immedkjetament wara l-qtil ta' l-annimali, jew, ibbażati fuq ir-rekordings tal-video jew diġitali, f'ħin aktar tard. It-tiċpis, la darna stabbilit, jista’ wkoll ikun moqri aktar tard. F'dawn il-każi, il-grupp tal-kontrolli u tad-doża għolja għandhom ikunu analiżżati l-ewwel. Jekk l-ebda effetti reletatati mat-trattament (eż. effetti fuq l-għadd ta' l-isperma, il-motilità, jew il-morfoloġija) jkunu jidhru, il-gruppi tad-dożi l-oħrajn ma jkunx hemm ħtieġa li jkunu analizzati. Meta l-effetti relatati mat-trattament ikunu innotati fil-grupp ta' doża għolja, allura l-gruppi fid-doża aktar baxxa għandhom ukoll ikunu evalwati.
         Jekk uħud mill-parametri ta' hawn fuq dwar l-evalwazzjoni ta' l-isperma jkunu diġa ġew eżaminati bħala parti minn studju sistematiku tat-tossiċità ta' mill-anqas 90 jum, dawn ma jkunu neċċessarjament jeħtieġu li jkunu repetuti fl-istidju ta' żewġ ġenerazzjonijiet. l-kampjuni jew ir-reġistrazzjoni diġitali ta' l-isperma tal-ġeberazzjoni P jkunu maħżuna, sabiex jiffaċlitaw evalwazzjoni fil-quddiem.
         1.5.5   Il-wild
         Kull botom għandu jkun eżaminat malajr kemm jista’ jkun possibbli wara l-ħlas (jum tal-attazzjoni 0) sabiex ikun stabbilit in-numru u s-sess tal-frieħ, imweldin mejta, imweldin ħajjin, u il-preżenza ta' annomalitajiet kbar. Frieħ misjuba mejta fil-jum), jekk mhux maċerati, għandhom preferibbilment ikunu eżaminati għal difetti possibbli u l-kawża tal-mewt, u għandhom ikunu preservati. Frieħ ħajjin għandhom ikunu magħduda u miżuna individwalment mat-twelid (jum 0 tal-lattazzjoni) jew fil-jum 1, u fil-jiem regolati ta' l-użin minn hemm il-quddiem, eż. fil-jiem 4, 7, 14, u 21 tal-lattazzjoni. Annormalitajiet fiżiċi jew ta' l-imġieba osservati fl-ommijiet jew fil-frieħ għandhom ikunu reġistrati.
         L-iżvilupp fiżiku tal-frieħ għandu jkun irreġistrat l-aktar biż-żieda fil-piż tal-ġisem. Parametri fiżiċi oħrajn (eż. il-fetħa ta' l-għajnejn u l-widnejn, il-ħruġ tas-snien, it-tkabbir tax-xagħar) jista’ jformi informazzjoni supplementari, imma dawn id-dettalji għandhom preferibbilment ikunu evalwati fil-kuntest tad-dettalji tal-maturità sesswali (eż. l-età u l-piż tal-ġisem jew il-fetħa vaġinali jew is-separazzjoni balano-preputial) (14). Investigazzjonijiet funzjonali (eż. attivita motorili, funzjoni sensitorja, ontoġenija relfettiva) tal-ferħ F1 qabel u/jew wara l-ftim, partikolarment dawk relatati mal-maturità sesswali, huma rakkommandati jekk tali investigazzjonijiet ma jkunux inklużi fi studju separati. L-età tal-ftuħ vaġinali u s-separazzjoni prepuzjali għandha tkun determinata għal dawk imfatma F1 magħżula għat-tgħammir, Distanza anoġenitali għandha tkun imkejla fil-jum 0 ta' wara t-twelid fil-frieħ F2 jekk istigata b'alterazzjonijiet fir-relattività tas-sess F1 jew bil-kalkolu tal-maturità sesswali.
         Osservazzjonijiet funzjonali jistgħu ikunu mħollija barra fi gruppi li altrimentri jiżvelaw sinjali ċari ta' effetti ħżiena (eż. tnaqqis sinifikanti fl-akkwist tal-piż, eċċ.). Jekk l-investigazzjonijiet funzjonali jkunu mwettqa, dawn m'għandhomx isiru fuq il-frieħ magħżula għat-tgħammir.
         1.5.6   Nekropsija maġġuri
         Fil-waqt tat-terminazzjoni jew tal-mewt matul l-istudji, l-annimali parentali kollha (P u F1), il-frieħ kollha b'annormalitajiet esterni jew sinjali kliniċi, kif ukoll wieħed magħżul b'mod kif jinzerta, ferħ/sess/botom, miż-żewġ ġenerazzjonijiet F1 u F2, għandu jkun eżaminat b'mod makroskopiku għal xi annormlitajiet structurali jew tibdil patiloġiku. Attenzjoni speċjali għandha tingħata lill-organi tas-sistema riproduttiva. Il-frieħ li jinqatlu b'mod umanesk f'kundizzjoni morbonda u l-frieħ mejta, meta ma jkunux maċerati, għandhom ikunu eżaminati għal difetti possibbli u/jew il-kawża tal-mewt, u ippreservati.
         L-uteri tan-nisa li jkun għadhom mhux mgħammra għandhom ikunu eżaminati, f'tali manjera li ma tikkompromettix l-evalwazzjoni ħistopatoloġika, għall-preżenza u n-numru ta' siti ta' l-implantazzjoni.
         1.5.7   Il-piż ta' l-organi
         Fil-waqt tat-terminazzjoni, il-piż tal-ġisem u l-piż ta' dawn l-organi li ġejjin fl-annimali P u F1 parentali kollha għandu jkun determinat (l-organi bħala pari għandhom ikunu miżuna individwalment):
         
                     —
                  
                  
                     l-utru, l-ovarji;
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-testi, l-epididimidi (total u cauda);
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-prostata';
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-bużżieqa seminali bil-glandoli koaġjulanti u l-fluwidi tagħhom u l-prostata (bħala unità waħda);
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-moħħ, il-fwied, il-kliewi, il-milsa, il-glandola pitwarja, it-tirojde u l-glandoli adrenali u dawk l-organi fil-mira kif maagħrufa.
                  
               Il-piżijiet ta' l-iġsma fit-terminazzjoni għandhom ikunu determinati għall-frieħ Fċ u F2 li huma magħżula għan-nekropsija. Dawn l-organi li ġejjin minn ferħ/sess/botom magħżula kif jinzerta (ara s-sezzjoni 1.5.6) għandhom ikuinu miżuna.
         Il-moħħ, il-milsa u t-timu. Ir-riżultati tan-nekropsija ġenerali u l-piż ta' l-organi għandhom ikunu assessjati fil-kuntest ma l-osservazzjonijiet magħmula fi studji oħrajn ta' dożi repetuti, meta prattikabbli.
         1.5.8   Ħistopatoloġija
         1.5.8.1   Annimali parentali
         L-organi u l-biċċiet li ġejjin ta' l-annimali parentali (P u F1), jew il-kampjuni rapreżentattivi tagħhom, għandhom ikun stabbiliti u maħżuna f'medja xierqa għall-eżaminazzjoni ħistopatoloġika.
         
                     —
                  
                  
                     il-vaġina, l-utru bil-għonq, u l-ovarji (ippreservati ġo fissant xieraq);
                  
               
                     —
                  
                  
                     waħda mit-testi (ippreservata fil-fissattiv Bouis jew komparabbli), waħda minn ħaġa: epididima, l-borża seminali, l-prostata, u l-glandola koaġjulanti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     oragnu(i) tal-mira preċedentament identifikati mill-annimali kollha P u F1 li huma magħżula għat-tgħammir.
                  
               Ħistopatoloġija sħiħa tal-organi u l-biċċiet presevati elenkati hawn fuq għandha tkun imwettqa għad-dożi l-għoljin kollha u l-annimali P u F1 magħżula għat-tgħammir. L-eżaminazzjoni ta' l-ovarji fl-annimali P hija voluntarja. L-organi li juru tibdiliet relatati mat-trattament għandhom ukoll ikunu eżaminati fil-gruppi tad-doża l-baxxa u l-medja sabiex jgħinu fl-eluċidazzjoni tal-NOAEL. B'żieda, l-organi riproduttivi fl-annimali tad-doża baxxa u medja li huma issusspettati b'fertilità mnaqqsa, eż. dawk li ma jirnexxilhomx jitgħammru, li jkunu tqal, l-irgiel li ma jimpregnawx, jew li jwelldu frieħ b'saħħithom, jew dawk li ċ-ċikliċità estera jew in-numru ta' l-isperma, l-motilità, jew il-mofoloġija tagħhom kienet affettwata, għandhom ikunu suġġetti għal evalwazzjoni ħistopatoloġika. Il-ferita kbar kollha bħal ma huma l-atrofija jew it-tumuri għandhom ikunu eżaminati.
         Eżaminazzjoni ħistopatoloġika testikulati dettaljata (e.g, bl-użu tal-fissattiv Bouin, it-twaħħil bill-paraaffin u s-sezzonijiet transervsjali ta' 4-5 μm ħxuna) għandhom ikunu mwettqa sabiex ikunu identifikati l-effetti relatati mat-trattament bħal ma huma l-ispermatidi miżmuma, is-saffi jew it-tipi nieqsa mil-ġermi taċ-ċelloli, iċ-ċelloli kbar multinukleati jew it-tgħaffiġ taċ-ċelloli spermatoġeniċi fil-lumen (14). L-eżami ta' l-epididimi intatta għandu jinkludi il-kaput, il-korp u l-kaanula, li jista’ jkun imwettaq bl-evalwazzjoni tas-sezzjoni lonġitudinali. L-epididimi għandha tkun evalutata għall-infiltrazzjoni lewkoċita, tibdil fil-prevalenza tat-tipi taċ-ċelloli, it-tipi ta' ċelloli aberrenti, u l-isperma patoġikitożi. Il-PAS u t-tbgħajja ħematossilini jistgħu ikunu użati għall-eżaminazzjoni ta' l-organi riproduttivi maskili.
         L-ovarju postlaktatjonali għandu jkollu l-folliki primordjali u tat-tkabbir kif ukoll il-corpora lutea l-kbira tal-lattazzjoni. L-eżaminazzjoni ħistopatoloġika għandha tiżvela t-tnaqqis kwalitattiv tal-popolazzjoni tal-follika primordjali. Evalwazzjoni kwantitattiva tal-folliki primordjali għandha tkun imwettqa għall-femminili F1; in-numru ta' l-annimali, l-għażla tas-sezzjoni ovarja, u s-sezzjoni tad-daqs tal-kampjun għandha tkun statistikament xierqa għall-proċedura ta' l-evalwazzjoni użata. L-eżaminazzjoni għandha tinkludi l-ennumerazzjoni tan-numru tal-folliki primordjali, li jistgħu ikunu aggrupparti mal-filliki ż-żgħar tat-tkabbir, għal paragun ta' l-ovarji ittrattati u tal-kontrol (15) (16) (17) (18) (19).
         1.5.8.2   Frieħ mhux miftuma
         Il-partijiet ferm annormali u l-organi tal-mira mill-frieħ kollha b'annormallitajiet esterni jew sinjali kliniċi, kif ukoll minn wieħed mill-grupp ferħ/sess/botom magħżul kif jinzerta miż-żewġ ġenerazzjonijiet F1 u F2 li ma jkunux ġew magħżula għat-tgħammir, għandhom ikunu iffissati u maħġżuna f'medja xierqa għall-eżaminazzjoni ħistopatoloġika. Il-karatteristika sħiħa ħistopatoloġika tal-partijiet ippreservati għandha tkun imwettqa b'enfasi speċjali dwar l-organi tas-sistema reproduttiva.
         2.   DATA
         2.1   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         Id-dettalji għandhom ikunu irrapurati individwalment għan-nisa kif ukoll għall-wild tagħhom u miġbura b'sommarju f'għamla tabulari, li juru għal kull grupp tat-test u għal kull ġenerazzjoni, in-numru ta' l-annimali fil-bidu tat-test, in-numru ta' l-annimali misjuba mejta matul it-test jew maqtula għal raġunijiet umanitarji, il-ħin ta' xi mewt jew qtil umanitarju, in-numru ta' nisa tqal, in-numru ta' l-annimali li juru sinjali ta' tossiċità, deskrizzjoni tas-sinjali ta' tossiċità kif osservati, inkluż il-ħin ta' meta tkun skoppjat, it-tul ta' żmien, u s-severità ta' xi effetti tossiċi, it-tiġ ta' l-osservazzjonijiet ta' l-embrijuni/feti, u l-informazzjoni l-oħra kollha dwar it-trabi l-oħrajn.
         Metodu statistiku ġeneralment aċċettabbli għandu jkun użat' il-metodi statistiċi għandhom ikunu magħżula bħala parti mid-disinn għall-istudju u għandhom ikunu iġġustifikati. Il-mudelli statistiċi bir-reazzjoni tad-doża jistgħu ikunu utili għad-data ta' l-analiżi. Ir-rapport għandu jinkludi informazzjoni suffiċjenti dwar il-metodu ta' l-analiżi u l-programm tal-kompjuter użat, hekk li riveditur/statistiku independenti jkun jista’ jevalwa mill-ġdid u jikkostitwixxi mill-ġdid l-analiżi.
         2.2   EVALWAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Is-sejbiet ta' dan l-istudju tat-tossiċità riproduttiva fuq żewġ ġenerazzjhonijiet għandu jkun evalutat f'termini ta' l-effetti osservati, inklużi s-sejbiet tan-nekropsija u mikroskopiċi. L-evalwazzjoni għandha tinkludi r-relazzjoni, jew in-nuqqas tagħha, bejn id-doża u s-sustanza tat-test u l-preżenza jew l-assenza, l-inċidenza jew is-sevirità ta' l-annormalitajiet, inklużi l-feriti kbar, l-organi tal-mira identifikati, il-fertilità affettwata, l-annormalitajiet kliniċi, l-imġieba tar-riproduzzjoni u l-botom affettwati, it-tibdiliet fil-piż tal-ġisem, l-effetti fuq il-mortalità u xi effetti tossiċi oħrajn. Il-propjetajiet fiżiko-kimiċi tas-sustanza tat-test, u meta disponibbli, id-dettalji tossikokinetiċi għandhom ikunu meqjusa fil-kunsiderazzjoni meta jkunu evalutati r-riżultati tat-test.
         Test tat-tossiċità riproduttiva imwettqa kif suppost għandu jipprovdi estimi sodisfaċenti tal-livbell bla ebda effett u rikonoxximent ta' l-effeti ħżiena fuq ir-riproduzzjoni, l-parturizzjoni, il-lattazzjoni, l-iżvilupp postnatli inkluż it-tbakkir u l-iżvilupp sesswali.
         2.3   INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Studju tat-tossiċita riproduttiva fuq żewġ ġenerazzjonijiet għandu jipprovdi informazzjoni dwar l-effetti ta' l-espożizzjoni ripetuta ta' sustanza matul il-fażijiet kollha taċ-ċiklu riproduttiv. Partikolarment, l-istudju jipprovdi informazzjoni dwar il-parametri riproduttivi, u dwar l-iżvilupp, it-tlabbir, il-maturità u s-sopravvivenza tal-frieħ. Ir-riżultati ta' l-istudju għandhom ikunu interpretatai b'konnessjoni mas-sejbier mill-istudji subkroniku, riproduttivi, tossikokinetiċi u studji oħrajn. Ir-riżultati ta' dan l-istudju jistgħu ikunu użati fl-assessjar tal-ħtieġa ta' aktar testijiet tal-kimika. L-estrapolazzjoni tar-riżultati ta' l-istudju mal-bniedem hija valida sa grad limitat. Dawn huma l-aħjar użati sabiex jipprovdu informazzjoni dwar il-livelli-mingħajr-effett u l-espożizzjoni umana (20) (21) (22) (23).
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Is-sustanza tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 in-natura fiżika u, meta relevanti, il-propjetajiet fiżikokimiċi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-identifikazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 purità.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Mezz (jekk applikabbli):
                     
                                 —
                              
                              
                                 ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz, jekk mhux sempliċement ilma.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Annimali tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 speċje/tipi użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, eċċ.;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piżijiet individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ir-raġjonar għal-livell tad-doża magħżula;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji tat-test tal-preparazzjoni tal-formulazzjoni/dieta tas-sustanza, il-konċentazzjonijiet;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-istabbilità u l-omoġenità tal-preparazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 skambju mis-sustanza tat-test minn dieta/ilma tax-xorb bil-konċentrazzjoni (ppm) lejn doża attwali 9 mg/kg il-piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 il-konsum ta' l-ikel. Il-konsum ta' l-ilma, jekk disponibbli, l-effikaċja ta' l-ikel (iż-żieda fil-piż tal-ġisem għal kull gramma ikel ikkunsmat), u l-konsum tal-materjal tat-test għall-annimali P u F1, apparti milli għall-perjodu tal-koabitazzjoni u għal mill-anqas l-aħħar terz tal-lattazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji ta' l-assorbazzjoni (jekk disponibbli);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tal-piż tal-ġisem dwar l-annimali P u Fċ magħżula għat-tgħammir;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tal-piż tal-botom u l-frieħ individwali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piż tal-ġsem fil-waqt li jkunu sagrifikati u l-piż assolut u rtelattiv ta' l-organi għall-annimali parentali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-natura, s-severità u t-tul ta' l-osservazzjonijiet kliniċi (sew jekk reversibbli u anki jekk le);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-jum tal-mewt matul l-istudju jew jekk l-annimali jkunux baqgħu ħajjin sakem maqtula;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji tar-reazzjoni tossika bis-sess u d-doża, inklużi l-indiċi tat-tgammir, il-fertilità, il-ġestazzjoni, it-twelid, il-vijabbilità, u l-lattazzjoni; ir-rapport għandu jindika n-numri użati fil-kalkoli ta' dawn l-indiċi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-effetti tossiċi jew oħrajn fuq ir-riproduzzjoni, il-frieħ, it-tbabbir ta' wara t-twelid, eċċ.;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sejbiet tan-nekropsija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet ħistopatoloġiċi kollha;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru ta' nisa P u F1 fiċ-ċiklu normali u t-tul taċ-ċiklu;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 it-total tan-numru ta' l-isperma cauda epididimali, il-persentaġġ progressive tal-motilità ta' l-isperma, il-persentaġġ morfoloġikament normali, u l-persentaġġ ta' l-ispetma b'kull annormalità identifikata;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 iż-żmien satotgħammir, inklużi n-numru ta' jiem sakem isir it-tgħammir;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 it-tul tal-ġestjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numri ta' l-impjantazzjonijiet, corpora lutea, id-daqs tal-botom;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru ta' twelid ħajjin u t-telf tal-post-impjantazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru ta' frieħ b'annormalitajiet ferm viżibbli, jekk determinati bin-numru tal-botom, għandu jkun irraportat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar l-aċċenni fiżiċi fil-frieħ u l-informazzjoni l-oħra ta' l-iżvilupp post natali; laċċenni fiżiċi evalwati għandhom ikunu ġustifikati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar l-osservazzjonijiet funzjonali fil-frieħ u l-adulti, kif applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 trattamentv statistiku tar-riżultati, meta xieraq.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni tar-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet, inklużi l-valuri NOAEL għall-effetti materni u fuq il-frieħ.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology 12:92-108.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility 54:103-107.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology 5:39 44.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3):237- 244.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Chapin, R.E. et al., (1992).Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology 6:267-273.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In vitro Demonstration. Journal of Andrology 13:409-421.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology 5:449-458.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401-415.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andrology 8:330-337.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17:298303.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, pp. 421-426.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Assessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven, New York.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive Toxicology 5:379-383.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.
                  
               B.36.   TOSSIKOKINETIKA
         1.   METODU
         1.1   INTRODUZZJONI
         Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.
         1.2   DEFINIZZJONIJIET
         Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.
         1.3   SUSTANZI GĦAR-REFERENZA
         Xejn.
         1.4   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza ittestjata hi somministrata permezz ta’ rotta adattata. Is-sustanza tista’ tkun somministrata f’dożi singoli jew ripetuti fuq perjodi definiti lil wieħed jew diversi gruppi ta’ annimali sperimantali skond l-iskop ta’ l-istudju. Sussegwentement, skond it-tip ta’ studju, is-sustanza u/jew is-sustanzi meħtieġa għall-metaboliżmu huma determinati f’likwidi tal-ġisem, tessuti u/jew ekskreta.
         L-istudji jistgħu jsiru b’sustanza ittestjata ‘bit-tikketta’ jew ‘bla tikketta’. Meta tintuża tikketta din għandha tkun imqieghda fis-sustanza b’tali mod li tipprovdi kemm jista’ jkun informazzjoni fuq id-destin tat-taħlita.
         1.5   KRITERJI TAL-KWALITÀ
         Xejn.
         1.6   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         
            Preparazzjonijiet
         
         Annimali zgħar u b’saħħithom huma akklimatizzati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju għallinqas għal ħamestijiem qabel it-test. Qabel it-test, l-annimali huma assenjati bl-addoċċ fil-gruppi tat-trattament. F’sitwazzjonijiet speċjali, annimali zgħar ħafna tqal jew pre-trattati jistgħu jintużaw.
         
            Kundizzjonijiet tat-test
         
         Annimali sperimentali
         Studji tossikokinetiċi jistgħu jsiru f’wieħed jew aktar speċi xierqa ta’ annimali u għandhom jieħdu akkont ta’ l-ispeċijiet użati jew li hem mil-ħsieb li jintużaw fi studji tossikoloġiċi oħra fuq l-istess sustanza ittestjata. Meta f’test jintużaw gerriema, il-varjazzjoni fil-piż m’għandhiex tkun iktar minn ±20 % tal-piż medju.
         Numru u sess
         Għal studji ta’ assorbiment u ta ekskreta, inizjalment għandu jkun hemm erba’ annimali f’kull grupp ta’ doża. Preferenza ta’ sess m’hix mandatorja, imma taħt xi ċirkostanzi jista’ jkun li jkollhom jiġu studjati iż-żewġ sessi. Jekk ikun hemm diferenzi ta’ sess fir-rispons, allura erba’ annimali ta’ kull sess għandhom jiġu ittestjati. Fil-każ ta’ studji b’annimali li mhux gerriema, jistgħu jintużaw inqas annimali. Meta tkun studjata id-distribuzzjoni tat-tessuti, id-daqs tal-grupp inizjali għandu jieħu in kunsiderazzjoni kemm in-numru ta’ annimali li jridu jiġu sagrifikati f’kull fażi kif ukoll tal-fażijiet li ser ikunu eżaminati.
         Meta qed ikun studjat il-metaboliżmu, id-daqs tal-grupp hu relatat mal-bżonnijiet ta’ l-istudju. Għall-studji b’doża multipla u b’fażijiet multipli, id-daqs tal-grupp għandu jieħu in kunsiderazzjoni in-numru ta’ fażijiet u s-sagrifiċċji pjanati, iżda ma jistgħux ikunu inqas minn żewġ annimali. Id-daqs tal-grupp għandu jkun biżżejjed li jipprovdi karatterizzazzjoni aċċettabbli ta’ l-ammont, tal-plateau u tat-tnaqqis (kif xieraq) tas-sustanza ittestjata u/jew tas-sustanzi meħtieġa għall-metaboliżmu.
         
            Livelli ta’ doża
         
         Fil-każ ta’ amministrazzjoni ta’ doża unika, ta’ l-inqas żewġ livelli ta’ doża għandhom jintużaw. Għandu jkun hemm doża baxxa f’liema ma jkunux osservati ebda effetti tossiċi u doża għolja f’liema jista’ jkun hemm xi kambjamenti fil-parametri tossikokinetiċi jew fejn iseħħu effetti tossiċi.
         Fil-każ ta’ amministrazzjoni ta’ doża ripetuta, id-doża l-baxxa hi normalment biżżejjed iżda f’ċerti ċirkostanzi jista’ jkun hemm bżonn ta’ doża għolja.
         
            Rotta ta’ amministrazzjoni
         
         Studji tossikokinetiċi għandhom isiru billi tintuża l-istess rotta, u fejn hu xieraq, l-istess mezz bħal dak użat jew hemm l-intenzjoni li jkun użat fi studji tossiċi oħrajn. Is-sustanza ittestjata hi ġeneralmet somministrata mill-ħalq permezz ta’ gavage jew fid-dieta, applikata lill-ġilda jew somministrata permezz ta’ ġbid għal ġol-pulmuni għall-perjodi definiti lill-gruppi ta’ annimali sperimentali. Amministrazzjoni minn ġol-vini tas-sutanza ittestjata tista’ tkun ta’ għajnuna sabiex jiġi determinat l-assorbiment relattiv permezz ta’ rotot oħra. Informazzjoni utli tista’ tkun provduta fuq it-tfassil ta’ distribuzzjoni kemm jista’ jkun malajr wara l-amministrazzjoni ta’ sustanza minn ġol-vini.
         Il-possibiltá ta’ interferenza tal-mezz mas-sustanza ittestjata għandu jittieħed in kunsiderazzjoni. Għandha tingħata attenzjoni għad-differenzi fl-assorbiment bejn l-amministrazzjoni tas-sustanza ittestjat permezz ta’ gavage u fid-dieta u l-bżonn li jkun hemm determinazzjoni eżatta tad-doża partikolarment meta is-sustanza ittestjata hi mogħtija fid-dieta.
         
            Perjodu ta’ osservazzjoni
         
         l-annimali kollha għandhom ikunu osservati kuljum u għandhom jiġu irreġistrati is-sinjali ta’ tossiċità kif ukoll l-elementi kimiċi relevanti, inkluż il-ħin tal-bidu qalil, il-grad u t-tul ta’ ħin.
         
            Proċedura
         
         Wara li jintiżnu l-annimali ittestjati, is-sustanza ittestjata hi somministrata permezz ta’ rotta xierqa. Jekk relevanti, l-annimali għandhom jinżammu sajjmin qabel ma tkun somministrata is-sustanza ittestjat.
         Assorbiment
         Ir-rata u l-entitá ta assorbiment tas-sustanza somministrata jistgħu jkunu evelwati billi jintużaw diversi metodi, bil-gruppi ta’ referenza jew mingħajrhom [20], per eżempju:
         
                     —
                  
                  
                     billi jiġi determinat l-ammont tas-sustanza ittestjata u/jew is-sustanzi li jwasslu għall-metaboliżmu fl-ekskreta, bħall-urina, ħmieġ, bili, nifs mormi ‘l barra u dak li jibqa fil-karkassa;
                  
               
                     —
                  
                  
                     billi jsir tqabbil tar-rispons bijoloġiku (eż. studji ta’ tossiċità akuta) bejn test u l- gruppi ta’ kontroll u/jew gruppi ta’ referenza;
                  
               
                     —
                  
                  
                     permezz tat-tqabbil ta’ l-ammont ta’ sustanza u/jew tas-sustanzi li jwasslu għall- metaboliżmu mneħħija mil-ġisem renalment u tqabbil mad-data minn grupp ta’ referenza;
                  
               
                     —
                  
                  
                     billi tiġi determinate l-arja taħt il-livell ta’ plażma/kurva ta’ ħin tas-sustanza ittestjata u/jew sustanzi li jwasslu għall-metaboliżmu u tqabbil mad-data minn grupp ta’ referenza.
                  
               Ditribuzzjoni
         Fil-preżent jeżistu żewġ proċeduri, wieħed jew it-tnejn li huma jistgħu jintużaw għall-analiżi tal-mudelli ta’ distribuzzjoni:
         
                     —
                  
                  
                     informazzjoni kwalitattiva utli hi akkwistata billi jintużaw tekniċi awtoradjografiċi tal-ġisem kollu;
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni kwantitattiva hi akkwistata billi jiġu sagrifikati annimali f’ħinijiet differenti wara l-espożizzjoni u billi jiġu determinati il-konċentrazzjoni u l-ammont tas-sustanza ittestjata u/jew tas-sustanza li twassal għall-metaboliżmu fit-tessuti u l-organi.
                  
               Tkeċċija ta’ ħmieġ il-ġisem
         Fl-istudji ta’ tkeċċija ta’ ħmieġ il-ġisem, ħmieġ u arja maqtugħa u f’ċertu ċirkostanzi, bili, huma miġbura. L-ammont ta’ sustanza ittestjata u/jew sustanzi li jwasslu għall-metaboliżmu f’dawn l-ekskreta għandhom jiġu mkejjla ħafna drabi wara l-espożizzjoni, jew sakemm tkun imkeċċija 95 % tad-doża somministrata jew għal sebat ijiem, skond liema tiġi l-ewwel.
         F’każijiet speċjali, it-tkeċċija tas-sustanza ittestjata fil-ħalib ta’ annimali li jreddgħu, jista’ jkun li tkun ikkonsidrata.
         Metaboliżmu
         Biex tiġi determinata l-entitá u l-mod ta’ metaboliżmu, kampjuni bijoloġiċi għandhom ikunu analizzati b’tekniċi adattati. Strutturi ta’ sustanzi li jwasslu għall-metaboliżmu għandhom ikunu eluċidati u proposti toroq metaboliċi adattati fejn ikun hemm bżonn li jiġu risposti xi mistoqsijiet li joħorġu minn studji tossikoloġiċi preċedenti. Studji in vitro jistgħu jkunu ta’ għajnuna biex tinkiseb informazzjoni fuq passaġġi metaboliċi.
         Aktar informazzjoni fuq ir-relazzjoni tal-metaboliżmu mat-tossiċità tista’ tinkiseb minn studji bijokemikali bħad-determinazzjoni ta’ l-effetti fuq sistemi ta’ enzimi metabolizzanti, tbattil ta’ kompożizzjonijiet sulfidriliċi endoġeni li mhux proteini u fuq l-unjoni tas-sostanza makromolekuli.
         2.   DATA
         Id-data, jiddependi mit-tip ta’ studju magħmul, għandha tkun miġbura fil-qosor f’forma tabulari bl-assistenza ta’ preżentazzjoni grafika fejn hu xieraq. Għal kull grupp tat-test, varjazzjonijiet medji u statistiċi tal-qisien f’relazzjoni mal-ħin, dożaġġ, tessuti u organi għandhom jintwerew fejn xieraq. L-entitá ta’ l-assorbiment u l-ammont u r-rata ta’ tkeċċija ta’ ħmieġ għandhom jiġu determinati b’metodi xierqa. Fejn isiru studji metaboliżmu, l-istruttura identifikata tas-sustanzi li jwassli għall-metaboliżmu, għandha tingħata kif ukoll jiġu preżentati il-passaġġi metaboliċi.
         3.   RAPPURTAĠĠ
         3.1   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja skond it- tip ta’ studju magħmul:
         
                     —
                  
                  
                     speċijiet, razza, sors, kundizzjonijiet ambjentali, dieta;
                  
               
                     —
                  
                  
                     karatterizzazzjoni ta’ materjal bit-tikketta, meta użati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     livelli ta’ dożaġġ u intervalli użati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     rotta/rotot ta’ amministrazzjoni u kull mezz użat;
                  
               
                     —
                  
                  
                     effetti tossiċi u effetti oħrajn innotati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     metodi ta’ determinazzjoni tas-sustanza ittestjata u/jew sustanzi li jwasslu għall- metaboliżmu f’kampjunu bijoloġiċi, inkluż l-arja maqtugħa;
                  
               
                     —
                  
                  
                     tabella tal-qisien skond is-sess, doża, reġim, ħin, tessuti u organi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     preżentazzjoni ta’ l-entitá ta’ assorbiment u tkeċċija ta’ ħmieġ mill-ġisem biż-żmien;
                  
               
                     —
                  
                  
                     metodi għall-karatterizzazzjoni u identifikazzjoni tas-sustanzi li jwasslu għall- metaboliżmu f’kampjuni bijoloġiċi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     metodi għall-qisien bijokemikali relatati mal-metaboliżmu;
                  
               
                     —
                  
                  
                     passaġġi proposti għall-metaboliżmu;
                  
               
                     —
                  
                  
                     diskussjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     interpretazzjoni tar-riżultati.
                  
               3.2   VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI
         Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.
         4.   REFERENZI
         Ara Parti B ta’ l-Introduzzjoni Ġenerali.
         B.37.   ID-DEWMIEN FIN-NEWROTOSSIĊITÀ TAS-SUSTANZI ORGANOPHOSPHORUS WARA L-ESPOŻIZZJONI AKUTA
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Fil-valutazzjoni u fl-evalwazzjoni ta’ l-effetti tossiċi tas-sustanzi, huwa importanti li jiġi ikkonsidrat il-potenzjal ta’ ċerti klassijiet ta’ sustanzi biex jikkawża tipi speċifiċi ta’ newrotossiċità li jistgħu ma jidrux fi studji tossiċi oħra. Ċerti sustanzi organophosphorus jidru li jikkawżaw dewmien tan-newrotossiċità u għandhom jitqisu kandidati għall-evalwazzjoni.
         Testijiet ta’ screening in vitro jistgħu jitħaddmu biex jiddentifikaw dawk is-sustanzi, jistgħu jikkawżaw dewmien fil-polyneuropathy; madankollu, sejbiet negattivi fl-istudji in vitro ma jipprovdux evidenza li s-sustanza tat-test mhiex newrotossikant.
         
         Ara l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         Is-sustanzi organophosphorus jinkludu l- organophosphorus esters, it-thioesters uncharged jew l-anhydrides ta’ l-aċdi organophosphoric, organophosphonic jew organophosphoramidic jew ta’ l-aċdi phosphorothioic, phosphonothioic jew phosphorothioamidic relatati, jew sustanzi oħra li jistgħu jikkawżaw dewmien ta' newrotossiċità li xi drabi tidher f'din il-klassi ta' sustanzi.
         Id-dewmien tan-newrotossiċità huwa sindromu assoċjat ma’ l-onset tad-dewmien prolungat ta’ l-ataxia, id-distal axonopathies fil-korda spinali u n-nerv periferali, u l-inibizzjoni u x-xjuħija tan-neuropathy target esterase (NTE) fit-tessut newrali.
         1.3.   SUSTANZI TA’ REFERENZA
         Sustanza ta’ referenza tista’ tiġi ttestjata bi grupp ta’ kontroll pożittiv li juri li taħt il-kundizzjonijiet tat-test tal-laboratorju, , ir-rispons ta’ l-ispeċi ittestjati ma nbidilx b’mod sinifikanti.
         Eżempju ta’ newrotossikant użat f’irxa wisgħa huwa il-fosfat tri–o–tolyl phosphate (Cas 78-30-8, Einecs 201-103-5, Cas nomenkaltura: l-aċdu fosforiku, tris(2–methylphenyl)ester), magħruf ukoll bħala tris–o–cresylphosphate.
         
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza tat-test tiġi somministrata oralment lit-tiġieġ domestiku f’doża waħda. Meta huwa xieraq, it-tiġieġ huwa mħares mill-effetti cholinergic akuti. . L-annimali jiġu osservati għal 21 jum għal imġieba anormali, ataxia u paraliżi.. Il-kejl bijokemikali, b’mod partikolari l-inibizzjoni tan-neuropathy target esterase (NTE), isir fuq it-tiġieġ li jingħażel bl-addoċċ minn kull grupp. Dan normalment isir 24 u 48 siegħa wara d-dożaġġ.Wieħed u għoxrin jum wara l-espożżizzjoni l-bqija tat-tiġieġ jiġi maqtul u ssir l-eżaminazzjoni ħispatoloġika ta’ tessuti newrali magħżula.
         1.5.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.5.1.   Tħejjija
         Tiġieġ b’saħħtu u adult żagħżugħ li huwa ħieles minn mard virali u l-medikazzjoni li jfixxklu u li m’għandux anormalitajiet fil-mixja għandu jingħażel bl-adoċċ u assenjati għall-gruppi ta’ kontroll u ta’ trattament.Għandu wkoll jadatta għall kundizzjonijiet tal-laboratorju għal mill-inqas 5 jiem qabel il-bidu ta’ l-istudju.
         Gaġeġ jew spazji magħluqa li huma kbar biżżejjed biex jippermettu ċ-ċaqliq ħieles tat-tiġieġ, u għandu jkun faċli biex tiġi osservata l-mixja tiegħu.
         Id-dożaġġ bis-sustanza tat-test għandha normalment tingħata oralment bl-għalf li jingħata bilfors, kapsuli tal-ġelatina, jew metodu li jitqabbel magħhom. Il-likwidi jistgħu jingħataw mhux imħallta bl-ilma jew maħlula f’mezz xieraq bħal ma huwa ż-żejt tal-qamħ; jekk hu possibbli s-solidi għandhom jinħallu la darba dożi kbar tas-solidi fil-kapsuli tal-ġelatina jistgħu ma jiġux assorbiti sew. Għall-mezzi li mhumiex akwei il-karatteristiċi tossiċi tal-mezz iridu jkunu magħrufa, u jekk le għandhom jiġu determinati qabel it-test.
         1.5.2.   Kundizzjonijiet tat-test
         1.5.2.1.   Annimali għat test
         It-tiġieġ żagħżugħ adult domestiku u li jbid (Gallus gallus domesticus), li għandu minn 8 sa 12-il xahar huwa rakkomandat. Għandhom jintużaw daqsijiet u razez standard. Normalment it-tiġieġ għandu jitrabba f’kundizzjonijiet li jippermettu ċ-ċaqliq ħieles.
         1.5.2.2.   In-numru u s-sess
         Barra l-grupp tat-trattament, għandhom jintużaw kemm il-grupp ta’ mezz ta’ control u kemm dak ta’ kontroll pożittiv. Il-grupp tal-mezz ta’ kontroll għandu jiġi trattat bl-istess mod tal-grupp għat-trattament, ħlief li s-somministrazzjoni tas-sustanza għat-test titneħħa.
         Għandu jintużaw numru biżżejjed ta’ tiġieġ f’kull grupp ta’ għasafar sabiex mill-inqas sitt għasafar jistgħu jinqatlu għad-determinazzjoni bijokemikali (tlieta f’kull żewġ punti) u sitta jistgħu jibqgħu jgħixu tul il-perjodu ta’ osservazzjoni għall-patoloġija ta’ 21 jum.
         Il-grupp ta’ kontroll pożittiv jista’ jseħħ fl-istess ħin jew ikun grupp ta’ kontroll riċenti storiku. Għandu mill-inqas ikollu sitt tiġiġiet, trattati b’newrotossikant b’dewmien magħruf, tliet tiġiġiet għall-bijokemistrija u tliet tiġiġiet għall-patoloġija. Huwa rakkomandat laġġornament perjodiku tad-data storika. Data ġdida ta’ kontroll pożittiv għandha tiġi żviluppata meta xi element essenzjali (eż. ir-razza, l-għalf u l-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpoġġew) ta kif isir it-test jinbidel mil-laboratorju attiv.
         1.5.2.3.   Il-livelli tad-doża
         Għandu jsir studju preliminary bl-użu ta’ numru xieraq ta’ tiġieġ u ta’ gruppi ta’ livelli tad-doża sabiex jiġi stabbilit il-livell li se jintuża fl-istudju prinċipali. Il-mewt hija tipikament meħtieġa f’dan l-istudju preliminari sabiex tiġi stabbilita doża adegwata ta’ l-istudju prinċipali. Madankollu, sabiex tiġi evitata il-mewt minħabba l-effetti cholinergic akuti, jista’ jintuża l-atropine jew aġent protettiv ieħor magħruf li ma jfixkilx ir-rispons tad-dewmien fin-newrotossiċità. Varjetà ta’ metodi għat-test jistgħu jintużaw biex tiġi kkalkulata d-doża massima mhux letali tas-sustanzi għat-test (Ara l-metodu B.1bis). Id-data storika fit-tiġieġa jew informazzjoni tossikoloġika oħra tista’ tkun ta’ għajnuna fl-għażla tad-doża.
         Il-livell tad-doża tas-sustanza għat-test fl-istudju prinċipali għandu jkun għoli kemm jista’ jkun waqt li jitqiesu ir-riżultati ta’ l-istudju preliminari għall-għażla tad-doża u l-limitu fuqani tad-doża tal-piż tal-ġisem ta’ 2 000 mg/kg. F’21 jum, kwalunkwe mortalità li tista’ sseħħ m’għandhiex tfixkel is-sopravivenza ta’ biżżejjed annimali għall-bijokemistrija (sitta) u għall-istoloġija (sitta). L-atropine jew aġent protettiv ieħor, magħruf li ma jfixkilx ir-rispons tad-dewmien fin-newrotossiċità, għandu jintuża sabiex tiġi evitata l-mewt minħabba effetti cholinergic akuti.
         1.5.2.4.   It-test tal-limitu
         Jekk test f’livell wieħed ta’ doża ekwivalenti għal mill-inqas 2 000mg/kg tal-piż tal-ġisem/ġurnata, bl-użu tal-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, jipproduċi in-no-observed-adverse-effects (l-ebda effetti avversi osservati) u jekk it-tossiċità ma tkunx mistennija bbażata fuq id-data minn sustanzi strutturalment relatati, allura studju komplut bl-użu ta’ tliet livelli ta’ doża ma jkunx meħtieġ. It-test tal-limitu japplika ħlief meta l-espożizzjoni umana tindika il-ħtieġa li jiġi użat livell ogħla ta’ doża.
         1.5.3.   Il-perjodu ta’ l-Osservazzjoni
         
         Il-perjodu ta’ osservazzjoni għandu jkun ta’ 21 jum.
         1.5.4.   Il-proċedura
         Wara s-somministrazzjoni ta’ aġent protettiv sabiex jevita l-mewt minħabba l-effett cholinergic akut, is-sustanza għat-test tiġi somministrata f’doża waħda.
         
            Osservazzjoni ġenerali
         
         L-Osservazzjonijiet għandhom jibdew mill-ewwel wara l-espożizzjoni. It-tiġieġ kollu għandu jiġi osservat bosta drabi waqt l-ewwel jumejn imbagħad mill-inqas darba kuljum għall-perjodu ta’ 21 jum jew sal-qtil skedat. Għandhom jiġu rrekordjati s-sinjali kollha tat-tossiċità, inklużi l-ħin ta’ l-onset, it-tip, il-qawwa u d-dewmien ta’ l-anormalitajiet fl-imġiba. L-ataxia għandha titkejjel fuq skala ordinali ta’ gradazzjoni li tikkonsisti f’erba’ livelli u l-paraliżi għandha tiġi nnutata. Mill-inqas darbtejn fil-ġimgħa t-tiġieġ magħżul għall-patoloġija għandu jinħareġ mill-gaġeġ u jiġi suġett għal perjodu ta’ attività forced motor, bħal ngħidu aħna t-tlugħ mas-sellun, sabiex tiġi faċilitata l-osservazzjoni ta’ l-effetti tossiċi minimali. L-annimali li qed imutu u dawk fi tbattija jew uġigħ għandhom jitneħħew, jinqatlu b’mod uman u sottomessi għan-nekropsija.
         
            Il-piż tal-ġisem
         
         It-tiġieġ kollu għandu jintizen eżatt qabel is-somministrazzjoni tas-sustanza għat-test u mill-inqas darba fil-ġimgħa wara dan.
         
            Bijokemistrija
         
         Sitt tiġiġiet jingħażlu bl-adoċċ minn kull grupp tal-mezz ta’ kontroll u ta’ trattament, u tliet tiġiġiet mill-grupp ta’ kontroll pożittiv (meta dan il-grupp iseħħ fl-istess żmien), għandhom jinqatlu fi żmien ftit jiem wara d-dożaġġ. Il-moħħ u l-korda spinali lumbar jiġu mħejjija u analizzati għall-attività ta’ l-inibizzjoni tan-neuropath target esterase. Barra minn hekk, ittħejjija u l-analiżi tat-tessut tan-nerv xjatiku jistgħu jkunu ta’ għajnuna għall-attività ta’ l-inibizzjoni tan-neuropath target esterase. Normalment, tlett għasafar tal-grupp ta’ kontroll u ta’ kull trattament jinqatlu wara 24 siegħa u tlieta jinqatlu wara 48 siegħa. It-tlett tiġiġiet tal-kontrolli pożittivi għandhom jinqatlu f’24 siegħa. Jekk l-osservazzjoni ta’ sinjali kliniċi ta’ intossikazzjoni (dan jista’ jiġi evalwat permezz ta’ l-osservazzjoni tal-ħin ta’ l-onset tas-sinjali cholinergic) juru li l-aġent tossiku jista’ jitwarrab bil-mod allura huwa preferibbli li jittieħed kampjun tat-tessut għal darbtejn minn kull wieħed mit-tlett għasafar bejn 24 sa 72 siegħa wara d-dożaġġ.
         L-analiżi ta’ l-acetylcholinesterase (AChE) tista’ ssir ukoll fuq dawn il-kampjuni jekk ikun xieraq. Madankollu, ir-reattivazzjoni spontanja ta’ l- AChE tista’ sseħħ in vivo, u b’hekk twassal għal nuqqas ta’ valutazzjoni dwar l-effikaċja tas-sustanza bħala inibitur AChE .
         
            Nekropsija Grossa
         
         In-nekropsija grossa ta’ l-annimali kollha (skedati li jinqatlu u jinqatlu meta jkunu moribondi) għandha tinkludi l-osservazzjoni tad-dehra tal-moħħ u tal-korda spinali.
         
            L-eżaminazzjoni Ispatologika
         
         It-tessut newrali mill-annimali li jibqgħu ħajjin fil-perjodu ta’ l-osservazzjoni u li ma jintużawx għal studji bijokemikali għandhom ikunu suġġetti għall-eżaminazzjoni mikroskopika. It-tessuti għandhom jiġu ffissati in situ, bl-użu ta’ tekniki ta’ perfużjoni. Is-sezzjonijiet għandhom jinkludu ċ-ċerebellum (il-livell mid-lonġitudinali), il-medulla oblongata, il-korda spinali, u n-nervituri periferali. Is-sezzjonijiet tal-korda spinali għandhom jittieħdu mill-parti ċervikali ta’ fuq, miż-żoni mid-thoracic u lumbo-sacral. Għandhom jittieħdu sezzjonijiet miż-żona distal tan-nerv tibjali u l-friegħi tiegħu sal-muskolu gastrocnemial u tan-nerv xjatiku. Is-sezzjonijiet għandhom jittebbgħu bi tbajja speċifiċi xierqa ta’ myelin u ta’ l-axon.
         
         2.   DATA
         Normalment ir-riżultati negattivi fuq l-endpoints magħżula f’dan il-metodu (l-osservazzjoni tal-bijokemistrija, ta’ l-ispatoloġija u ta’ l-imġiba) ma jitolbux iktar ittestjar għad-dewmien tan-newrotossiċità. Riżultati żbaljati jew inkonklussivi għal dawn l-endpoints jistgħu jitolbu evalwazzjoni addizjonali.
         Id-data individwali għandha tiġi provduta. Barra minn hekk, id-data kollha għandha tkun imqassra f’għamla tabulari, li turi n-numru ta’ l-annimali għal kull grupp tat-test fil-bidu tiegħu, in-numru ta’ l-annimali li għandhom il-feriti, l-effetti ta’ l-imġiba jew dawk bijokemikali, it-tip u l-gravità ta’ dawn il-feriti jew effetti, u l-perċentwal ta’ l-annimali li għandhom kull tip u gravità tal-feriti jew ta’ l-effett.
         Is-sejbiet ta’ dan l-istudju għandhom jiġu elvawati f’termini ta’ l-inċidenza, tal-gravità, u tal-korrelazzjoni tal-effetti ta’ l-imġiba, ta’ dawk bijokemikali u dawk ispatoloġiċi u kwalunkwe effetti oħra osservati fil-gruppi ta’ kontroll u dawk trattati.
         Ir-riżultati numeriċi għandhom jiġu evalwati permezz ta’ metodi ta’ statistika xierqa u ġeneralment aċċettabbli. Il-metodi ta’ statistika użati għandhom jiġu magħżula waqt id-disinn ta’ l-istudju.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         IR-RAPPORTTAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk inhu possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     3.1.
                  
                  
                     Annimali għat-test
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-ispeċi użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru u l-età ta’ l-annimali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sors, il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpoġġew, eċċ,;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test.
                              
                           
               
                  
                     Kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tat-tħejjija tas-sustanza għat-test, l-istabilità u l-omoġeneità fejn hu xieraq;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-mezz;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tas-somministrazzjoni tas-sustanza għat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tal-kwalità ta’ l-ikel u ta’ l-ilma;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Ir-rationale għall-għażla tad-doża;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 L-ispeċifikazzjoni tad-dożi somministrati, inklużi d-dettalji tal-mezz, tal-volum u tal-forma fiżika tal-materjal somministrat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 L-identità u d-dettalji tas-somministrazzjoni ta’ kwalunkwe aġent protettiv.
                              
                           
               
                  
                     Riżultati:
                  
               
                  
                     
                                 —
                              
                              
                                 id-data tal-piż tal-ġisem;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-data tar-rispons tossiku fi grupp, inkluża l-mortalità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-natura, l-gravità u d-dewmien taż-żmien ta’ l-osservazzjonijiet kliniċi (kemm jekk huma riversibbli jew le);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni dettaljata tal-metodi u s-sejbiet bijokemikali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sejbiet tan-nekropsija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet kollha ispatoloġiċi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 fejn hu xieraq, it-trattament statistiku tar-riżultati.
                              
                           
               
                  
                     Id-diskussjoni tar-riżultati
                  
               
                  
                     Konklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         Dan il-metodu huwa analogu għal OECD TG 418.
         B.38.   ID-DEWMIEN FIN-NEWROTOSSIĊITÀ TAS-SUSTANZI ORGANOPHOSPHORUS STUDJU TA' DOŻA RIPETUTTA GĦAL 28 ĠURNATA
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Fil-valutazzjoni u fl-evalwazzjoni ta’ l-effetti tossiċi tas-sustanzi, huwa importanti li jiġi ikkonsidrat il-potenzjal ta’ ċerti klassijiet ta’ sustanzi biex jikkawża tipi speċifiċi ta’ newrotossiċità li jistgħu ma jidrux fi studji tossiċi oħra. Ċerti sustanzi organophosphorus jidru li jikkawżaw dewmien tan-newrotossiċità u għandhom jitqisu kandidati għall-evalwazzjoni.
         Testijiet ta’ screening in vitro jistgħu jitħaddmu biex jiddentifikaw dawk is-sustanzi jistgħu jikkawżaw dewmien fil-polyneuropathy; madankollu, sejbiet negattivi fl-istudji in vitro ma jipprovdux evidenza li s-sustanza tat-test mhiex newrotossikant.
         Dan it-test ta’ 28 jum tad-dewmien tan-newrotossiċità jipprovdi l-informazzjoni fuq il-perikli għas-saħħa possibli li jista’ jkun hemm minħabba espożizzjonijiet repetuti f’perjodu limitat ta’ żmien. Jipprovdi informazzjoni fuq ir-rispons tad-doża u jista’ jipprovdi kalkolu ta’ no-observed-adverse-effects (l-ebda effetti avversi osservati), li jista’ jkun utli sabiex jiġu stabbiliti l-kriterji ta’ sigurtà għall-espożizzjoni.
         Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali Parti B
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         Is-sustanzi organophosphorus jinkludu l- organophosphorus esters, it-thioesters uncharged jew l-anhydrides ta' l-aċdi organophosphoric, organophosphonic jew organophosphoramidic jew ta' l-aċdi phosphorothioic, phosphonothioic jew phosphorothioamidic relatati, jew sustanzi oħra li jistgħu jikkawżaw dewmien ta' newrotossiċità li xi drabi tidher f'din il-klassi ta' sustanzi.
         Id-dewmien tan-newrotossiċità huwa sindromu assoċjat ma’ l-onset tad-dewmien prolungat ta’ l-ataxia, id-distal axonopathies fil-korda spinali u n-nerv periferali, u l-inibizzjoni u x-xjuħija tan-neuropathy target esterase (NTE) fit-tessut newrali.
         1.3.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Id-dożi ta’ kuljum tas-sustanza għat-test huma somministrati oralment lit-tiġieġ domestiku għal 28 jum. L-annimali jiġu osservati għallinqas kuljum għal anormalitajiet fl-imġiba, għall-ataxia u għall-paraliżi sa 14-il jum wara l-aħħar doża. Il-kejl bijokemikali, b’mod partikolari l-inibizzjoni tan-neuropathy target esterase (NTE), isir fuq it-tiġieġ li jingħażel bl-addoċċ minn kull grupp. Dan normalment isir 24 u 48 siegħa wara d-dożaġġ. Ħmistax wara l-aħħar doża il-bqija tat-tiġieġ jiġi maqtul u ssir eżaminazzjoni ispatoloġika tat-tessuti newrali magħżula.
         1.4.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.4.1.   Preparazzjonijiet
         Tiġieġ b’saħħtu u adult żagħżugħ li huwa ħieles minn mard virali u l-medikazzjoni li jfixxklu u li m’għandux anormalitajiet fil-mixja għandu jingħażel bl-adoċċ u assenjati għall-gruppi ta’ kontroll u ta’ trattament.Għandu wkoll jadatta għall kundizzjonijiet tal-laboratorju għal mill-inqas 5 jiem qabel il-bidu ta’ l-istudju.
         Gaġeġ jew spazji magħluqa li huma kbar biżżejjed biex jippermettu ċ-ċaqliq ħieles tat-tiġieġ, u għandu jkun faċli biex tiġi osservata l-mixja tiegħu.
         Id-dożaġġ orali kuljum, 7 ijiem fil-ġimgħa, għandu jitwettaq preferibbilment permezz ta’ l-għalf mogħti bil-fors jew bis-sommistrazzjoni tal-kapsuli tal-ġelatina. Il-likwidi jistgħu jingħataw mhux imħallta bl-ilma jew maħlula f’mezz xieraq bħal ma huwa ż-żejt tal-qamħ; jekk hu possibbli s-solidi għandhom jinħallu la darba dożi kbar tas-solidi fil-kapsuli tal-ġelatina jistgħu ma jiġux assorbiti sew. Għall-mezzi li mhumiex akwei il-karatteristiċi tossiċi tal-mezz iridu jkunu magħrufa, u jekk le għandhom jiġu determinati qabel it-test.
         1.4.2.   Kundizzjonijiet tat-test
         Annimali għat-test
         It-tiġieġ żagħżugħ adult domestiku u li jbid (Gallus gallus domesticus), li għandu minn 8 sa 12-il xahar huwa rakkomandat. Għandhom jintużaw daqsijiet u razez standard. Normalment it-tiġieġ għandu jitrabba f’kundizzjonijiet li jippermettu ċ-ċaqliq ħieles.
         In-numru u s-sess
         Ġeneralment għandhom jintużaw mill-inqas tlett gruppi ta’ trattament u grupp ta’ kontroll tal-mezz. Il-grupp ta’ kontroll tal-mezz għandu jiġi trattat bl-istess mod bħal dak ta’ trattament ħlief li s-somministrazzjoni tas-sustanza għat-test hija mneħħija.
         Għandu jintużaw numru biżżejjed ta’ tiġieġ f’kull grupp ta’ għasafar sabiex mill-inqas sitt għasafar jistgħu jinqatlu għad-determinazzjoni bijokemikali (tlieta f’kull żewġ punti) u sitt għasafar jistgħu jgħixu waqt l-14-il jum tal-perjodu ta’ osservazzjoni wara t-trattament għall-patoloġija.
         Livelli tad-doża
         Il-livelli tad-doża għandhom jingħażlu waqt li jitqiesu r-riżultati tat-test akut fuq id-dewmien tan-newrotossiċità u kwalunkwe tossiċità oħra li teżisti jew id-data kinetika disponibbli għall-compound tat-test. L-ogħla livell tad-doża għandu jingħażel bl-għan li jkun hemm żieda ta’ effetti tossiċi, preferibbilment tan-newrotossiċità b’dewmien, iżda mhux ta’ mewt jew tbatija ovvja. Wara, sekwenza nieżla tal-livelli tad-doża għandha tingħażel bl-għan li jidher kwalunkwe rispons relatat mad-doża u no-observed-adverse-effects (l-ebda effetti avversi osservati), fl-iktar livell ta’ doża baxx.
         Test ta’ limitazzjoni
         Jekk test f’livell wieħed ta’ doża ekwivalenti għal mill-inqas 1 000mg/kg tal-piż tal-ġisem/ġurnata, bl-użu tal-proċeduri deskritti għal dan l-istudju, jipproduċi in-no-observed-adverse-effects (l-ebda effetti avversi osservati) u jekk it-tossiċità ma tkunx mistennija bbażata fuq id-data minn sustanzi strutturalment relatati, allura studju komplut bl-użu ta’ tliet livelli ta’ doża ma jkunx meħtieġ. It-test tal-limitu japplika ħlief meta l-espożizzjoni umana tindika il-ħtieġa li jiġi użat livell ogħla ta’ doża.
         Perjodu ta’ l-Osservazzjoni
         L-annimali kollha għandhom jiġu osservati mill-inqas kuljum waqt il-perjodu ta’ l-espożizzjoni u 14-il jum wara, sakemm ma jkunx hemm nekropsija skedata.
         1.4.3.   Proċedura
         Animals are dosed with the test substance on seven days per week for a period of 28 days.
         Osservazzjoni ġenerali
         L-osservazzjonijiet għandhom jibdew mill-ewwel wara li jibda t-trattament. It-tiġieġ kollu għandu jiġi osservat mill-inqas darba kuljum f’kull wieħed mit-28 jum ta’ trattament, u għal 14-il jum wara d-dożaġġ jew sal-qtil skedat. Għandhom jiġu rrekordjati is-sinjali kollha ta’ tossiċità inklużi il-ħin ta’ l-onset tagħhom, it-tip, il-gravità u d-dewmien ta’ żmien. L-osservazzjonijiet għandhom jinkludu, iżda mhux limitati għal, l-anormalitajiet ta’ fl-imġiba. L-ataxia għandha titkejjel fuq skala ordinali ta’ gradazzjoni li tikkonsisti f’erba’ livelli, u għandha tiġi nnutata l-paraliżi. Mill-inqas darbtejn fil-ġimgħa it-tiġieġ għandu jittieħed barra l-gaġeġ u suġġett għal perjodu ta’ attività forced motor, bħal ngħidu aħna t-tlugħ mas-sellum, sabiex tiġi faċilitata l-osservazzjoni ta’ l-effetti tossiċi minimali. L-annimali moribondi li qed ibatu ħafna jew li huma muġugħa għandhom jitneħħew, jinqatlu b’mod uman u sottoposti għan-nekropsija.
         Il-piż tal-ġisem
         It-tiġieġ kollu għandu jintizen eżatt qabel is-somministrazzjoni tas-sustanza għat-test u mill-inqas darba fil-ġimgħa wara dan.
         Bijokemistrija
         Sitt tiġiġiet magħżula bl-addoċċ minn kull grupp ta’ trattament u ta’ kontroll tal-mezz, għandhom jinqatlu fi ftit jiem wara l-aħħar doża. Il-moħħ u l-korda spinali lumbar jiġu mħejjija u analizzati għall-attività ta’ l-inibizzjoni tan-neuropath target esterase (NTE). Barra minn hekk, it-tħejjija u l-analiżi tat-tessut tan-nerv xjatiku jistgħu jkunu ta’ għajnuna għall-attività ta’ l-inibizzjoni tan-neuropath target esterase (NTE). Normalment, tlett għasafar tal-grupp ta’ kontroll u ta’ kull trattament jinqatlu wara 24 siegħa u tlieta jinqatlu wara 48 siegħa wara l-aħħar doża. Jekk id-data mill-istudju akut jew studju ieħor (eż. it-tossikokinetiċi) turi li ħinijiet oħra tal-qtil wara d-dożaġġ finali huma preferibbli, mela għandhom jintużaw dawn il-ħinijiet u r-rationale tiġi dokumentata.
         L-analiżi ta’ l-acetylcholinesterase (AChE) tista’ ssir ukoll fuq dawn il-kampjuni jekk ikun xieraq. Madankollu, ir-reattivazzjoni spontanja ta’ l- AChE tista’ sseħħ in vivo, u b’hekk twassal għal nuqqas ta’ valutazzjoni dwar l-effikaċja tas-sustanza bħala inibitur AChE .
         Nekropsija Grossa
         In-nekropsija grossa ta’ l-annimali kollha (skedati li jinqatlu u jinqatlu meta jkunu moribondi) għandha tinkludi l-osservazzjoni tad-dehra tal-moħħ u tal-korda spinali.
         L-eżaminazzjoni Ispatologika
         It-tessut newrali mill-annimali li jibqgħu ħajjin fil-perjodu ta’ l-osservazzjoni u li ma jintużawx għal studji bijokemikali għandhom ikunu suġġetti għall-eżaminazzjoni mikroskopika. It-tessuti għandhom jiġu ffissati in situ, bl-użu ta’ tekniki ta’ perfużjoni. Is-sezzjonijiet għandhom jinkludu ċ-ċerebellum (il-livell mid-lonġitudinali), il-medulla oblongata, il-korda spinali, u n-nervituri periferali. Is-sezzjonijiet tal-korda spinali għandhom jittieħdu mill-parti ċervikali ta’ fuq, miż-żoni mid-thoracic u lumbo-sacral. Għandhom jittieħdu sezzjonijiet miż-żona distal tan-nerv tibjali u l-friegħi tiegħu sal-muskolu gastrocnemial u tan-nerv xjatiku. Is-sezzjonijiet għandhom jittebbgħu bi tbajja speċifiċi xierqa ta’ myelin u ta
            ’
            l-axon. Fil-bidu l-eżaminazzjoni mikroskopika għandha titwettaq fuq it-tessuti priservati tal-annimali kollha fil grupp ta’ kontroll u f’dak ta’ doża għolja. Fejn hemm evidenza ta’ l-effetti fil-grupp ta’ doża għolja, l-eżaminazzjoni mikroskopika għandha titwettaq ukoll fuq it-tiġieġ li qedgħin fil-gruppi ta’ doża intermedjarja u baxxa.
         2.   DATA
         Normalment ir-riżultati negattivi fuq l-endpoints magħżula f’dan il-metodu (l-osservazzjoni tal-bijokemistrija, ta’ l-ispatoloġija u ta’ l-imġiba) ma jitolbux iktar ittestjar għad-dewmien tan-newrotossiċità. Riżultati żbaljati jew inkonklussivi għal dawn l-endpoints jistgħu jitolbu evalwazzjoni addizjonali.
         Id-data individwali għandha tiġi provduta. Barra minn hekk, id-data kollha għandha tkun imqassra f’għamla tabulari, li turi n-numru ta’ l-annimali għal kull grupp tat-test fil-bidu tiegħu, in-numru ta’ l-annimali li għandhom il-feriti, l-effetti ta’ l-imġiba jew dawk bijokemikali, it-tip u l-gravità ta’ dawn il-feriti jew effetti, u l-perċentwal ta’ l-annimali li għandhom kull tip u gravità tal-feriti jew ta’ l-effett.
         Is-sejbiet ta’ dan l-istudju għandhom jiġu elvawati f’termini ta’ l-inċidenza, tal-gravità, u tal-korrelazzjoni tal-effetti ta’ l-imġiba, ta’ dawk bijokemikali u dawk ispatoloġiċi u kwalunkwe effetti oħra osservati fil-gruppi ta’ kontroll u dawk trattati.
         Ir-riżultati numeriċi għandhom jiġu evalwati permezz ta’ metodi ta’ statistika xierqa u ġeneralment aċċettabbli. Il-metodi ta’ statistika użati għandhom jiġu magħżula waqt id-disinn ta’ l-istudju.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk inhu possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     3.1.
                  
                  
                     Annimali għat-test
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-ispeċi użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru u l-età ta’ l-annimali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sors, il-kundizzjonijiet ta’ fejn jitpoġġew, eċċ,;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test.
                              
                           
               
                     3.2.
                  
                  
                     Kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tat-tħejjija tas-sustanza għat-test, l-istabilità u l-omoġeneità fejn hu xieraq;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-mezz;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tas-somministrazzjoni tas-sustanza għat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tal-kwalità ta’ l-ikel u ta’ l-ilma;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 
                                    Ir-rationale għall-għażla tad-doża;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 L-ispeċifikazzjoni tad-dożi somministrati, inklużi d-dettalji tal-mezz, tal-volum u tal-forma fiżika tal-materjal somministrat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 
                                    Ir-rationale għall-għażla ta’ ħinijiet oħra għad-determinazzjoni bijokemikali jekk mhux 24 u 48 siegħa.
                              
                           
               
                     3.3.
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 id-data tal-piż tal-ġisem;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-data ta r-rispons tossiku permezz tal-livell tad-doża, inkluża l-mortalità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-ebda livell ta’ effett avvers osservat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-natura, l-gravità u d-dewmien taż-żmien ta’ l-osservazzjonijiet kliniċi (kemm jekk huma riversibbli jew le);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni dettaljata tal-metodi u s-sejbiet bijokemikali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sejbiet tan-nekropsija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet kollha ispatoloġiċi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 fejn hu xieraq, it-trattament statistiku tar-riżultati.
                              
                           
               
                  
                     Id-diskussjoni tar-riżultati
                  
               
                  
                     Konklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         Dan il-metodu huwa analogu għal OECD TG 419.
         B.39.   TEST IN VIVO TA' SINTESI MHUX PROGRAMMATA TA' DNA (UDS) FUQ ĊELLULI TAL-FWIED TAL-MAMMIFERI
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa replika tat-Test OECD TG 486 In vivo ta' Sintesi Mhux Programmata ta' DNA (UDS) fuq Ċelloli tal-Fwied tal-Mammiferi (1997).
         1.1.   INTRODUZZJONI
         L-għan tat-test in vivo ta' sintesi mhux programmata ta' DNA (UDS) fuq Ċelloli tal-fwied tal-mammiferi huwa biex jiġu identifikati sustanzi tat-test li joħolqu t-tiswija tad-DNA f'Ċelloli tal-fwied ta' annimali ttrattati (1), (2), (3), (4).
         Dan it-testr in vivo jipprovdi metodu għall-investigazzjoni ta' l-effetti ġenotossiċi ta' kimiċi fil-fwied. Il-punt ta' l-aħħar imkejjel jagħti indikazzjoni tal-ħsara fid-DNA u t-tiswija sussegwenti fiċ-Ċelloli tal-fwied. Il-fwied ġeneralment huwa l-lok maġġuri tal-metabolismu ta' komposti assorbiti. Għalhekk huwa l-lok xieraq biex titkejjel il-ħsara fid-DNA in vivo.
         Jekk ikun hemm prova li s-sustanza tat-test mhix ser tilħaq it-tessut immirat, mhuwiex xieraq li jintuża dan it-test.
         L-aħħar punt ta' sintesi DNA (UDS) mhux programmata jitkejjel billi jiġi stabbilit l-assorbiment ta' nukleosidi mmarkati f'Ċelloli li ma jkunux għaddejin minn sintesi tad-DNA programmata (fasi S). Il-metodu ta' teknika l-aktar użat huwa d-determinazzjoni ta' l-assorbiment ta' tritium thymidine immarkat (3H-TdR) bl-awtoradjografija. Preferibbilment jintużaw il-fwied tal-far għat-testijiet in vivo. Jistgħu jintużaw tessuti oħra minklok il-fwied, iżda mhumiex is-suġġett ta' dan il-metodu.
         L-iżvelar ta' rispons UDS jiddependi fuq in-numru ta' bażi DNA exxissi u mibdula fuq il-lok tal-ħsara. Għalhell, it-test UDS huwa partikolarment ta' valur biex tiġi żvelata r-riparazzjoni ta' segwenzi twal li jiġu mis-sustanza (20 sa 30 bażijiet). Bħala kuntrast, ir-riparazzjoni ta' segwenzi qosra (minn bażi waħda sa tlieta) tiġi żvelata b'sensitività anqas qawwija. Barra minn dan, jistgħu jirriżultaw ġrajjiet mutaġeniċi minħabba fin-nuqqas ta' riparazzjoni, riparazzjoni ħażina jew replikazzjoni ħażina tal-leżjonijiet fid-DNA. L-estensjoni tar-rispons tal-UDS ma tagħtix indikazzjoni dwar il-fedeltà tal-proċess ta' riparazzjoni. B'żieda ma' dan, huwa possibbli li li mutaġen jirreaġixxi mad-DNA iżda l-ħsara fid-DNA ma tissewwix permezz ta' proċess ta' riparazzjoni exissa. In-nuqqas ta' informazzjoni speċifika dwar l-attività mutaġenika mogħtija mit-test tal-UDS huwa kompensat bis-sensitività potenzali ta' dan il-punt aħħari għax jiġi mkejjel fil-ġenomu sħiħ.
         Ara ukoll l-Introduzzjoni Ġenerali Taqsima B.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Ċelloli li qed jissewwew: Ċelloli li l-numru ta' grani nukleari netti tagħhom (NNG) huwa ogħla minn valur determinat minn qabel, li għandu jiġi ġustifikat fil-laboratorju li fih jitwettaq it-test.
         
            Grani nukleari netti (NNG): miżura kwantitattiva għall-attività UDS taċ-Ċelloli f'testijiet UDS awtoradjografiċi, kalkolati billi jitnaqqas in-numru medju ta' grani ċitoplasmiċi f'arei ċitoplasmiċi nukei ekwivalenti (CG) min-numru ta' grani nukleari (NG): NNG = NG - CG. L-għadd ta' NNG huma kalkolati għal Ċelloli individwali u imbagħad addizzjonati ma' Ċelloli f'kultura, f'kulturi paralleli, eċċ.
         
            Sintesi DNA mhux skedata (UDS): sintesi ta' riparazzjoni DNA wara l-exissjoni u t-tneħħija ta' biċċa mid-DNA li jkun fiha reġjun ta' ħsara miġjuba minn sustanzi kimiċi jew aġenti fiżiċi.
         1.3.   PRINĊIPJI TA' DAN IL-METODU TA' TEST
         It-test tal-UDS b'Ċelloli tal-fwied ta' mammiferi in vivo jindika sintesi ta' riparazzjoni DNA wara l-exissjoni u t-tneħħija ta' biċċa mid-DNA li jkun fiha reġjun ta' ħsara miġjuba minn sustanzi kimiċi njew aġenti fiżiċi. It-test hu normalment msejjes fuq l-inkorporazzjoni ta' 3H-TdR fiċ-ċelluli DNA tal-fwied li għandhom frekwenza baxxa ta' Ċelloli fil-fasi S taċ-ċiklu taċ-Ċelloli. It-teħid ta' 3H-TdR jiġi normalment stabbilit bl-awdjoradjografija, għax dan il-metodu ta' teknika mhuwiex suxxettibbli għal indħil minn Ċelloli fil-fasi S bħal, per eżempju, konteġġ ta' xintillazzjoni fil-fasi likwida.
         1.4.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.4.1.   Preparazzjonijiet
         1.4.1.1.   Selezzjonijiet ta' l-ispeċi ta' annimali
         Normalment jintuża l-far, minkejja li tista’ tintuża kull speċi xierqa ta' mammiferi. Għandhom jintużaw partijiet ġeneralment użati fil-laboratorju ta' annimali żgħar b'saħħithom adulti. Fil-bidu ta' l-istudju l-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali għandha tkun minima u ma tkunx iżjed minn ± 20 % tal-piż medju għal kull wieħed mis-sessi.
         1.4.1.2.   Kondizzjoinijiet ta' fejn jinżammu u x'jieklu
         Jiġu applikati l-kundizzjonijiet ġenerali msemmija fl-Introduzzjoni ġenerali għat-Taqsima B għalhemm il-mira għall-umdità għandha tkun ta' 50 sa 60 %.
         1.4.1.3.   Preparazzjoni ta' l-annimali
         Annimali b'saħħithom żgħar adulti jiġu assenjati mingħajr ordni għall-gruppi ta' kontroll u ta' trattament. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b'tali mod li jitnaqqsu l-effetti possibbli mil-fatt li jitqiegħdu f'gaġeġ. L-annimali jiġu identifikati wieħed wieħed u jinżammu fil-gaġeġ tagħhom għallinqas għal ħamest ijiem qabel ma jibda l-istudju biex jippermetti żmien biex jidraw il-kundizzjonijiet fil-laboratorju.
         1.4.1.4.   Sustanza tat-test/preparazzjoni
         Sustanzi tat-test solidi għandhom jiġu mdewwbin jew sospiżi f'solventi jew kontenituri xierqa u dilwiti, jekk ikun xieraq, qabel it-trattament ta' l-annimali. Sustanzi likwidi tat-test jistgħu jiġu ttrattati direttament jew dilwiti qabel it-trattament. Għandhom jintużaw preparazzjonijiet ġodda għas-sustanza tat-test kemm-il darba l-informazzjoni dwar l-istabbilità ma turix laċċettabbilità tal-ħażna.
         1.4.2.   Kundizzjonijiet tat-test
         1.4.2.1.   Solvent/mezz
         Is-solvent/mezz ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli ta' doża użata, u ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika mas-sustanza tat-test. Jekk jintużaw solventi/mezzi oħra minflok dawk l-aktar magħrufa, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun appoġġata b'informazzjoni li tindika l-kompatibilità tagħhom. Hu rakkomandat li kemm jista’ jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/mezz akkwuż.
         1.4.2.2.   Kontrolli
         Għandhom jiġu inklużi f'kull parti indipendenti ta' l-esperiment kontrolli pożittivi u negattivi fl-isterss ħin (solvent/mezz). Ħlief għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom jiġu trattati bl-istess mod bħall-annimali fil-grupp ta' trattament.
         Il-kontrolli pożittivi għandhom ikunu sustanzi magħrufa li jipproduċu UDS meta somministrati f'livelli ta' espożizzjoni li huma meqjusa li jagħtu żieda li wieħed jista’ jinnota fuq l-isfond. Kontrolli pożittivi li jeħtieġu attivazzjoni metabolika għandhom jintużaw f'dożi li joħolqu rispons moderat (4). Id-dożi jistgħu jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tad-dijapożitivi kodifikati lil min jaqrahom. Eżempji ta' sustanzi ta' kontroll pożittivi jinkludu:
         
                     Ħinijiet ta' teħid ta' kampjuni
                  
                  
                     Sustanza
                  
                  
                     Nru CAS
                  
                  
                     Nru EINECS
                  
               
                     Teħid ta' kampjuni kmieni (2 sa 4 sigħat)
                  
                  
                     N-nitrosodimetilamina
                  
                  
                     62-75-9
                  
                  
                     200-249-8
                  
               
                     Teħid ta' kampjuni tard (12 sa 16-il siegħa)
                  
                  
                     N-2-fluworenilaċetamide (2-AAF)
                  
                  
                     53-96-3
                  
                  
                     200-188-6
                  
               Jistgħu jintużaw kontrolli pożittivi oħra xierqa. Huwa aċċettabbli li l-kontroll pożittiv għandu jiġi somministrat minn rotta differenti mis-sustanza tat-test.
         1.5.   PROĊEDURA
         1.5.1.   Numru u sess ta' l-annimali
         Għandu jintuża numru adegwat ta' annimali biex titqies il-varjazzjoni bijoloġika naturali f'rispons ta' test. In-numru ta' annimali għandu jkun għall-inqas tliet annimali analizzabbli kull grupp. Fejn ikun ġie akkumulat database storiku sinjifikattiv, annimal wieħed jew tnejn biss jkunu meħtieġa għall-gruppi ta' kontroll pożittivi u negattivi fl-istess ħin.
         Jekk fil-ħin li jsir l-istudju jkun hemm informazzjoni disponibbli minn studji fl-istess speċje u li jużaw l-istess rotta ta' espożizzjoni li juru li ma hemms differenzi sostanzjali fit-tossiċità bejn is-sessi, allura jkun biżżejjed li t-test isir fuq sess wieħed, preferibbilment dak maskil. Fejn l-espożizzjoni umana għall-kimiċi tista’ tkun speċifika skond is-sess, bħal ma hu per eżempju għal ċerti aġenti farmaċewtiċi, it-test għandu jsir b'annimali tas-sess xieraq.
         1.5.2.   Skeda tat-trattament
         Is-sustanzi tat-test ġeneralment jiġu somministrati fi trattament singolu.
         1.5.3.   Livelli tad-doża
         Normalment, jintużaw għall-inqas żewġ livelli ta' doża. L-ogħla doża hija mfissra bħala d-doża li tipproduċi sinjali ta' tossiċità hekk li livelli ogħla tad-doża, bbażati fuq l-istess reġim ta' dożaġġ, huma mistennija li jikkawżaw il-mewt. Ġeneralment, l-inqas doża għandha tkun minn 50 % sa 25 % ta' l-ogħla doża.
         Is-sustanzi b'attivitajiet bijoloġiċi speċifiċi f'dożi baxxi mhux tossiċi (bħal ma huma ormoni u nitroġeni) jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' l-issettjar tad-dożi u għandhom jiġu valutati fuq bażi ta' każ b'każ. Jekk isir studju biex tinstab il-medda għax ma jkunx hemm disponibbli informazzjoni xierqa, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, billi jintużaw l-istess speċji, karatteristiċi, sess u dożaġġ ta' trattament li jintuża fl-istudju prinċipali.
         L-ogħla doża tista’ ukoll tfisser id-doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossiċità fil-fwied (eż. nukleji piknotiċi).
         1.5.4.   Test tal-limitu
         Jekk test ta' doża waħda ta' livell ta' għall-inqas 2 000 mg/kg piż tal-ġisem, meta jitwettaq trattament wieħed, jew bħala żewġ trattamenti fl-istess ġurnata, ma jipproduċix effetti tossiċi li wieħed jinduna bihom, u jekk ma tkunx mistennija l-ġenotossiċità fuq il-bażi ta' l-informazzjoni minn sustanzi strutturalment relatati, allura ma jitqiesx li jkun neċessarju li jsir studju komplet. L-espożizzjoni umana mistennija tista’ tindika l-ħtieġa ta' livell ogħla ta' doża li għandu jintuża fit-test tal-limitu.
         1.5.5.   Somministrazzjoni ta' dożi
         Normalment is-sustanza tat-test tiġi somministrata b'gavage billi jintuża tubu għall-istonku jew cannula xierqa ta' intubazzjoni. Fejn ikunu ġustifikati, jistgħu jiġu aċċettati rotot oħra ta' espożizzjoni. Madankollu r-rotta intraperitonali mhix rakkomandata għax tista’ tesponi l-fwied direttament għas-sustanza tat-test minflok permezz tas-sistema ċirkolatorja. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jiġi somministrat b'gavage jew b'injezzjoni f'ħin wieħed jiddependi fuq il-qies ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux ikun aktar minn 2 ml/100g piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ogħla minn dawn għandu jkun ġustifikat. Ħlief fil-każ ta' sustanzi li jirritaw jew korrożivi li normalment juru effetti aggravati b'konċentrazzjonijiet ogħla, il-varjabbilità fil-volum tat-test għandha titnaqqas bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti fuq il-livelli kollha tad-doża.
         1.5.6.   Preparazzjoni taċ-Ċelloli tal-fwied
         Iċ-Ċelloli tal-fwied huma ppreparati minn annimali ttrattati normalment 12 sa 16-il siegħa wara t-teħid tad-doża. Ġeneralment ikun meħtieġ teħid ta' kampjuni ieħor addizzjonali u aktar kmieni (normalmeny sagħtejn sa erba' sigħat wara t-trattament) kemm-il darba ma jkunx hemm rispons pożittiv ċar fi 12 sa 16-il siegħa. Madankollu t-teħid ta' kampjuni jista’ jsir f'ħinijiet oħra meta jkun ġustifikat fuq il-bażi ta' informazzjoni tossikokinetika.
         Normalment il-kulturi ta' perjodu qasir ta' Ċelloli ta' manniferi jiġu stabbiliti billi l-fwied jitgħatta fil-post bil-kollaġenas u billi Ċelloli tal-fwied dissoċjati ġodda jitħallew jingħaqdu ma' superfiċji xierqa. Ċelloli tal-fwied minn annimali ta' kontroll negattiv għandu jkollhom vijabilità ta' għall-inqas 50 %.
         1.5.7.   Determinazzjoni ta' UDS
         Iċ-Ċelloli tal-fwied iżolati ġodda tal-mammiferi huma inkubati normalment b'medjum li jkun fih 3H-TdR għal tul ta' żmien xieraq, eż. tliet sigħat sa tmienja. Fl-aħħar tal-perjodu ta' inkubazzjoni, il-medjum għandu jitneħħa miċ-Ċelloli, li imbagħad jistgħu jiġu inkubati b'medjum li jkun fih eċċess ta' timidina mhux ittikkettjata biex tnaqqas r-radjuattività mhux inkorporata ('cold chase'). Imbagħad iċ-Ċelloli jiġu mlaħalħa, ffissati u mnixxfin. Għal ħinijiet ta' inkubazzjoni itwal, il-cold chase jista’ ma jkunx neċessarju. Id-dijapożittivi jixxarbu b'emulsjoni awtoradjografika, jiġu esposti fid-dlam (eż. imkessħin għal sebat ijiem sa erbatax-il ġurnata), żviluppati, mogħtika l-kulur, u jingħaddu il-grani tal-fidda esposti. Jiġu ppreparati żewġ jew tliet dijapożittivi minn kull annimal.
         1.5.8.   Analiżi
         Il-preparazzjonijiet tad-dijapożittivi għandu jkollhom biżżejjed Ċelloli ta' morfoloġija normali li jippermettu valutazzjoni xierqa tal-UDS. Il-preparazzjonijiet jiġu eżaminati mikroskopikament għal sinjali ta' tossiċita qawwija (eż. piknożi, livelli ridotti ta' radjutikkettjar).
         Id-dijapożittivi għandhom jiġu kodifikati qabel ma jibda l-għadd tal-grani. Normalment jingħaddu 100 ċellula minn kull annimal minn għall-inqas żewġ dijapożittivi; l-għadd ta' inqas minn 100 ċellula/annimal għandu jkun ġustifikat. In-numru ta' grani ma jingħaddx għan-nuklei tal-fasi S, iżda tista’ tiġi reġistrata l-proporzjon ta' Ċelloli tal-fasi S.
         L-ammont ta' inkorporazzjoni ta' 3H-TdR fin-nuklei u ċ-ċitoplasma ta' Ċelloli morfoloġikament normali, kif ppruvat bid-deposizzjoni ta' grani tal-fidda, għandu jiġi stabbilit b'metodi xierqa.
         2.   DATA
         2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         Għandha tingħata informazzjoni individwali dwar dijapożittivi u annimali. Barra minn dan. L-informazzjoni kollha għandha titqassar f'forma ta' tabella. L-għadd ta' g rani nukleari netti (NNG) għandu jiġi kalkolat għal kull ċellula, għal kull annimal u għal kull doża u ħin billi jitnaqqsu l-għadd ta' CG mill-għadd ta' NG. Jekk jingħaddu “iċ-Ċelloli li qed jissewwew”, il-kriterji għaċ-Ċelloli li qed jissewwew għandhom ikunu ġustifikati u msejsa fuq informazzjoni storika u ta' kontroll negattiv fl-istess ħin. Riżultati numeriċi jistgħu jiġu valutati b'metodi statistiċi. Jekk jintużaw, it-testijiet statistiċi għandhom jingħażlu u jkunu ġustifikati qabel ma jitwettaq l-istudju.
         2.2.   VALUTAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Eżempji ta' kriterji għal rispons pożittiv/negattiv jinkludu:
         
                     pożittiv
                  
                  
                     (i)
                  
                  
                     il-valuri NNG ogħla minn limitu determinat minn qabel li hu ġustifikat fuq il-bażi ta' informazzjoni storika tal-laboratorju; jew
                  
               
                      
                  
                  
                     (ii)
                  
                  
                     il-valuri NNG sinjifikatament ogħla minn kontroll fl-istess ħin;
                  
               
                     negattiv
                  
                  
                     (i)
                  
                  
                     il-valuri NNG fil-limitu/taħt il-limitu ta' kontroll storiku jew
                  
               
                      
                  
                  
                     (ii)
                  
                  
                     il-valuri NNG mhux sinjifikatament ogħla minn kontroll fl-istess ħin
                  
               Għandha tiġi kkunsidrata r-rilevanza bijoloġika ta' l-informazzjoni: jiġifieri għandhom jitqiesu l-parametri bħal ma huma l-varjazzjoni bejn l-annimali, r-relazzjoni għar-rispons għad-doża u ċ-ċitossiċità. Bħala għajnuna fil-valutazzjoni tar-riżultati tat-testijiet, jistgħu jintużaw metodi ta' statistika. Madankollu, s-sinjifikanza statistika ma għandhiex tkun l-uniku fattur għal rispons pożittiv.
         Għalkemm kważi l-esperimenti kollha jagħtu riżultati ċari pożittivi jew negattivi, f'każijiet rari l-informazzjoni ssettjata ma tippermettix li jsir ġudizzju definittiv dwar l-attività ta' sustanza tat-test. Ir-riżultati jistgħu jibqgħu ekwivoċi u inċerti irrispettivament min-numru ta' drabi li jirrepeti ruħu l-esperiment.
         Riżultat pożittiv minn test UDS b'Ċelloli tal-fwied tal-mammiferi in vivo jindika li s-sustanza tat-test toħloq ħsara fid-DNA taċ-Ċelloli tal-fwied tal-mammiferi in vivo li tista’ tissewwa b'sintesi tad-DNA mhux skedata in vitro. Riżultat negattiv jindika li, taħt il-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza tat-test ma toħloqx ħsara fid-DNA li tiġi żvelata b'dan it-test.
         Għandha tiġi diskussa l-probabilità li s-sustanza tat-test tilħaq iċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew speċifikatament it-tessut immirat (eż. tossiċità sistemika).
         3.   RAPPORTAĠĠ
         RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Solvent/mezz:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ġustifikazzjoni dwar l-għażla tal-mezz,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 solubbilità u stabbilità tas-sustanza tat-test fis-solvent/mezz, jekk magħrufa.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Annimali ttestjati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 speċi/razza użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru, età u sess ta' l-annimali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 għejun, kundizzjonijiet dwar fejn jinżammu, dieta, eċċ.;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 piż individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test, inkluża l-medda ta' piż tal-ġisem, mezzi u devjazzjoni standard għal kull grupp.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 kontrolli pożittivi u negattivi (mezz/solvent);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni mill-istudju dwar il-medda, jekk ikun sar;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 raġuni prinċipali għall-għażla ta' livell tad-doża;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar is-somministrazzjoni tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 raġuni prinċipali dwar ir-rotta ta' somministrazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi biex jiġi verifikat li s-sustanza tat-test waslet għaċ-ċirkolazzjoni ġenerali jew it-tessut immirat, jekk tkun applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 konverżjoni mill-konċentrazzjoni (ppm) tas-sustanza tat-test dieta/ilma għax-xorb għad doża attwali (mg/kg piż tal-ġisem/jum) jekk tkun applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni dettaljata dwar l-iskedi ta' trattament u teħid ta' kampjuni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi biex titqies it-tossiċità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodu tal-preparazzjoni u kultura taċ-Ċelloli tal-fwied;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 teknika awtoradjografika użata;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru ta' dijapożitivi ppreparati u numru ta' Ċelloli li jingħaddu;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kriterji ta' valutazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 valuri medji individwali tad-dijapożittivi, ta' l-annimali u ta' gruppi għal grani nuklei, grani ċitoplasmiċi, u grani nukleari netti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, jekk tkun disponibbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 valutazzjoni statistika, jekk ikun hemm;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 sinjali ta' tossiċità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar kontroll pożittiv u negattiv (solvent/mezz) fl-istess ħin;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar kontroll pożittiv u negattiv (solvent/mezz) storika bil-medda, mezzi u devjazzjonijiet standard;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru ta' Ċelloli li qed jissewwew, jekk magħruf;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numru ta' Ċelloli tal-fasi S, jekk magħruf;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 vijabilità taċ-ċelluli.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni dwar ir-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Ashby, J. Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. (1985), An Assessment of the In vivo Rat. Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1-18.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987), A Protocol and Guide for the In vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 189, pp. 123-133.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Kennelly, J. C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell, I. de G. (1993), In vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M., (eds), Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 52-77.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Madle, S., Dean, S. W., Andrac, U., Brambilla. G., Burlinson, B., Doolittle, D. J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C. A. and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests In vitro and In vivo, Mutation Res., 312, pp. 263-285.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl. C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the In vivo/In vitro DNA Repair Assay (UDS), Mutation Res., 291, pp. 21-27.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Mirsalis, J. C., Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), Detection of Genotoxic Carcinogens in the In vivo/In vitro Hepalocyte DNA Repair Assay, Environ. Mutagen, 4, pp. 553-562.
                  
               B.40.   IL-KORROŻJONI TAL-ĠILDA IN VITRO: IT-TEST TAR-REŻISTENZA ELETTRIKA TRANSKUTANJA (TER – TRANSCUTANEAL ELECTRICAL RESISTANCE)
         1.   IL-METODU
         Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalent għall-OECD TG 430 (2004).
         1.1.   DAĦLA
         Il-korrożjoni tal-ġilda tirreferi għall-produzzjoni ta’ dannu irriversibbli fit-tessut tal-ġilda wara l-applikazzjoni ta’ materjal tat-test [kif definit mis-Sistema Globali Armonizzata għall-Klassifika u t-Tikkettjar ta’ Sustanzi u Komposti Kimiċi (GHS – Globally Harmonised System)] (1). Dan il-metodu jipprovdi proċedura li biha l-istima tal-korrożività ma ssirx f’annimali ħajjin.
         L-istima tal-korrożività tal-ġilda involviet tipikament l-użu ta’ annimali tal-laboratorju (2). Ittħassib għall-uġigħ u t-tbatija ta’ l-annimali involuti f’din il-proċedura ġie indirizzat fir-reviżjoni tal-Metodu tat-Test B.4 li jippermetti d-determinazzjoni tal-korrożività tal-ġilda bl-użu ta’ metodi alternattivi, in vitro, li jevitaw l-uġigħ u t-tbatija.
         L-ewwel pass biex jiġu definiti testijiet alternattivi li jistgħu jintużaw għall-ittestjar tal-korrożività tal-ġilda kien it-twettiq ta’ studji tal-validazzjoni minn qabel (3). Wara dan, studju ta’ validazzjoni formali ta’ metodi in vitro biex tiġi stmata l-korrożjoni tal-ġilda (4)(5) ġie mwettaq (6)(7)(8). Ir-riżultat ta’ dawn l-istudji u letteratura oħra ppubblikata wasslu għar-rakkomandazzjoni li jistgħu jintużaw dawn it-testijiet għall-istima tal-korrożività tal-ġilda in vivo (9)(10)(11): it-test tal-mudell tal-ġilda umana (ara l-Metodu tat-Test B.40bis) u t-test tar-reżistenza elettrika transkutanja (dan il-Metodu).
         Studji ta’ validazzjoni u studji oħrajn validati rrapportaw li l-figura tar-reżistenza elettrika transkutanja (TER) l-ġilda tal-firien (12)(13) tista’ tiddiskrimina fis-sod bejn il-korrożivi tal-ġilda magħrufin u sustanzi mhux korrożivi (5)(9).
         It-test deskritt f’dan il-Metodu jippermetti l-identifikazzjoni ta’ sustanzi u komposti kimiċi korrożivi. Jippermetti wkoll l-identifikazzjoni ta’ sustanzi u komposti mhux korrożivi meta tkun sostnuta mill-piż ta’ determinazzjoni tal-provi bl-użu ta’ informazzjoni oħra eżistenti (eż. pH, struttura-attività-relazzjonijiet, data dwar l-umani u/jew l-annimali) (1)(2)(11)(14). Ma jagħtix informazzjoni dwar l-irritazzjoni tal-ġilda, u lanqas ma jippermetti s-subkategorizzazzjoni ta’ sustanzi korrożivi kif permess fis-Sistema tal-Klassifika Globali Armonizzata (GHS) (1).
         Għal evalwazzjoni sħiħa ta’ l-effetti lokali fuq il-ġilda wara espożizzjoni dermali unika, huwa rakkomandat li tiġi segwita l-istrateġija ta’ l-ittesttjar sekwenzjali kif mehmuża mal-Metodu tat-Test B.4 (2) u provduta fis-Sistema tal-Klassifika Globali Armonizzata (1). Din l-istrateġija ta’ l-ittestjar tinkludi t-twettiq ta’ testijiet in vitro għall-korrożjoni tal-ġilda (kif deskritt f’dan il-metodu) u l-irritazzjoni tal-ġilda qabel ma jitqies l-ittestjar fl-annimali ħajjin.
         1.2.   DEFINIZZJONI
         
            Il-korrożjoni tal-ġilda in vivo: hija l-produzzjoni ta’ dannu irriversibbli tal-ġilda: jiġifieri nekrożi viżibbli mill-epidermis u ġewwa d-dermis, wara l-applikazzjoni ta’ sustanza tat-test għal mhux aktar minn erba’ sigħat. Ir-reazzjonijiet korrożivi hima tipifikati minn ulċeri, ħruġ ta’ demm, qxur bid-demm, u sa l-aħħar ta’ l-osservazzjoni ta’ 14-il jum, tnaqqis ta’ kulur minħabba li tibjad il-ġilda, żoni sħaħ ta’ alopecia, u ċikatriċi. Il-ħistopatoliġija għandha titqies biex jiġu evalwati leżjonijiet li dwarhom hemm dubju.
         
            Ir-Reżistenza Elettrika Transkutanja (TER): hija kejl ta’ l-impendenza tal-ġilda, bħala valur ta’ reżistenza f’kilo Ohms. Metodu sempliċi u robust biex tiġi stmata l-funzjoni ta’ barrjera bir-rekordjar tal-passaġġ tal-joni mill-ġilda bl-użu ta’ apparat Wheatstone bridge.
         IS-SUSTANZI TA’ RIFERENZA
         Tabella 1
         Il-Kimiċi ta’ Riferenza
         
                     Isem
                  
                  
                     Nru EINECS
                  
                  
                     Nru CAS
                  
                  
                      
                  
               
                     1,2-Diaminopropane
                  
                  
                     201-155-9
                  
                  
                     78-90-0
                  
                  
                     Korrożiv Ħafna
                  
               
                     Aċidu Akriliku
                  
                  
                     201-177-9
                  
                  
                     79-10-7
                  
                  
                     Korrożiv Ħafna
                  
               
                     2-tert. Butylphenol
                  
                  
                     201-807-2
                  
                  
                     88-18-6
                  
                  
                     Korrożiv
                  
               
                     Idrossidu tal-potassju (10 %)
                  
                  
                     215-181-3
                  
                  
                     1310-58-3
                  
                  
                     Korrożiv
                  
               
                     Aċidu sulfuriku (10 %)
                  
                  
                     231-639-5
                  
                  
                     7664-93-9
                  
                  
                     Korrożiv
                  
               
                     Aċidu Oktanoiku (aċidu kapriliku)
                  
                  
                     204-677-5
                  
                  
                     124-07-02
                  
                  
                     Korrożiv
                  
               
                     4-Amino-1,2,4-triazole
                  
                  
                     209-533-5
                  
                  
                     584-13-4
                  
                  
                     Mhux Korrożiv
                  
               
                     Eugenol
                  
                  
                     202-589-1
                  
                  
                     97-53-0
                  
                  
                     Mhux Korrożiv
                  
               
                     Phenethyl bromide
                  
                  
                     203-130-8
                  
                  
                     103-63-9
                  
                  
                     Mhux Korrożiv
                  
               
                     Tetrachloroethylene
                  
                  
                     204-825-9
                  
                  
                     27-18-4
                  
                  
                     Mhux Korrożiv
                  
               
                     Aċidu iżosteariku
                  
                  
                     250-178-0
                  
                  
                     30399-84-9
                  
                  
                     Mhux Korrożiv
                  
               
                     4-(Methylthio)-benzaldehyde
                  
                  
                     222-365-7
                  
                  
                     3446-89-7
                  
                  
                     Mhux Korrożiv
                  
               Il-parti l-kbira tal-kimiċi elenkati huma meħuda mil-lista ta’ kimiċi magħżula għall-istudju internazzjonali ta’ validazzjoni ECVAM (4). L-għażla tagħhom hija bbażata fuq dawn il-kriterji li ġejjin:
         
                     i)
                  
                  
                     għaddu indaqs ta’ sustanzi korrożivi u mhux korrożivi;
                  
               
                     ii)
                  
                  
                     sustanzi disponibbli kummerċjalment li jkopru l-parti l-kbira tal-klassijiet ta’ kimiċi rilevanti;
                  
               
                     iii)
                  
                  
                     l-inklużjoni ta’ sustanzi korrożivi ħafna kif ukoll dawk inqas korrożivi sabiex tkun possibbli d-diskriminazjoni bbażata fuq il-potenza korrożiva;
                  
               
                     iv)
                  
                  
                     l-għażla tal-kimiċi li jistgħu jiġu mmaniġġjati f laboratorju mingħajr periklu serju minbarra l-korrożività.
                  
               IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Il-materjal tat-test huwa applikat għal mhux aktar minn 24 siegħa fuq l-uċuħ epidermali ta’ ċrieki ta’ ġilda f sistema ta’ test b’żewġ kompartimenti fejn iċ-ċrieki ta’ ġilda jaħdmu bħala s-separazzjoni bejn il-kompartimenti. Iċ-ċrieki tal-ġilda jittieħdu minn firien maqtula b’mod uman ta’ età ta’ 28-30 jum. Il-materjali korriżivi huma identifikati mill-abilità tagħhom li jipproduċu telf ta’ integrita normali ta’ stratum corneum u tal-funzjoni ta’ barrjera, li jitkejjel bħala tnaqqis fit-TER ’l isfel minn livell ta’ limitu (12). Għat-TER tal-firien, intgħażel valur ta’ limitu ta’ 5 k Ώ ibbażat fuq data estensiva għal varjetà kbira ta’ kimiċi fejn il-maġġoranza l-kbira ta’ valuri kienu jew sew aktar ’il fuq (spiss > 10 kΩ), jew sew aktar ’l isfel (spiss < 3 kΩ) minn dan il-valur (12). B’mod ġenerali, il-materjali li mhumiex korrożivi fl-annimali iżda li huma irritanti jew mhux irritanti ma jnaqqsux it-TER inqas minn dan il-valur ta’ limitu. Barra minn hekk, l-użu ta’ preparazzjonijiet ta’ ġilda oħrajn jew tagħmir ieħor jista’ jibdel il-valur ta’ limitu, li jeħtieġ aktar validazzjoni.
         Huwa inkorporat fil-proċedura tat-test pass li jorbot iż-żebgħa sabiex isir it-test ta’ konferma tar-riżultati pożittivi fit-TER inklużi valuri madwar 5 kΩ. Il-pass li jorbot iż-żebgħa jiddetermina jekk iż-żjieda fil permeabilità ionika hijiex minħabba qirda fiżika tal-istratum corneum. Il-metodu tat-TER bl-użu tal-ġilda tal-firien wera li jista’ jbassar il-korrożività in vivo fil-fenek evalwat taħt il-Metodu tat-Test B.4 (2). Għandu jiġi nnutat li t-test tal-fenek in vivo huwa konservattiv ħafna fir-rigward tal-korrożività tal-ġilda u l-irritazzjoni tal-ġilda meta mqabbel mat-test tal-parti tal-ġilda umana (15).
         DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         
            L-Annimali
         
         Il-firien huma l-ispeċi ta’ għażla minħabba li s-sensittività tal-ġilda tagħhom għall-kimiċi f dan it-test diġa ntweriet qabel (10). L-età (meta tinġabar il-ġilda) u l-ispeċi tal-far huma partikolarment importanti biex jiġi żgurat li l-follikoli tax-xahar fil-fażi dormanti qabel ma jibda t-tkabbir tax-xahar adult.
         Ix-xahar dorsali u tal-ġenb minn firien żgħar, ta’ età ta’ madwar 22 jum (derivati minn Wistar jew fergħa komparabbli), jitneħħa bir-reqqa b’qattiegħ ix-xahar żgħir. Imbagħad l-annimali jiġu maħsula billi jintmesħu bl-attenzjoni, filwaqt li l-parti bix-xagħar maqtugħ tiġi mgħarrqa ftaħlita antibijotika (li per eżempju, fuha streptomycin, penisilin, chloramphenicol, u amphotericin, f konċentrazzjonijiet li huma effettivi biex jinibixxu t-tkabbir tal-batterji). L-annimali jerġgħu jiġu maħsula bl-anitibjotiċi fit-tielet jew ir-raba’ jum wara l-ewwel ħasla u jintużaw fi żmien 3 ijiem wara t-tieni ħasla, meta l-istratum corneum ikun irkupra mit-tneħħija tax-xahar.
         
            Il-preparazzjoni taċ-ċrieki tal-ġilda
         
         L-annimali jiġu maqtula b’mod uman meta jkollhom 28-30 jum; l-età hija kritika Il-ġilda dorso-laterali ta’ kull annimal imbagħad titneħħa u jitneħħielha x-xaħam subkutanju eċċessiv billi jitqaxxar bl-attenzjoni minn mal-ġilda Iċ-ċrieki tal-ġilda, ta’ djametru ta’ madwar 20 mm kull wieħed, jitneħħew. Il-ġilda tista’ tiġi maħżuna qabel ma jintużaw iċ-ċrieki fejn jidher li d-data tal-kontroll pożittiva u negattiva hija ekwivalenti għal dik miksuba b’ġilda friska.
         Kull ċirku tal-ġilda jitqiegħed fuq wieħed mit-truf ta’ tubu PTFE (polytetrafluoroethylene), li jiżgura li l-wiċċ epidermali huwa f kuntatt mat-tubu. Ċirku “O” tal-gomma huwa mwaħħal billi jingħafas mat-tarf tat-tubu biex il-ġilda tinżamm f postha u t-tessut żejjed jiġi maqtugħ. Id-dimensjonijiet tat-tubu u taċ-ċirku “O” jintwerew fil-Figura 2. Iċ-ċirku “O” tal-ġilda imbagħad jiġi ssiġġillat bir-reqqa mat-tarf tat-tubu PTFE bl-ingwent. It-tubu huwa appoġġjat minn molla ġewwa parti reċettorja li fiha taħlita ta’ MgSO4 (154 mM) (Figura 1). Iċ-ċirku tal-ġilda għandha tiġi għal kollhox meqruda fit-taħlita ta’ MgSO4. Minn ġilda ta’ far wieħed jistgħu jinkisbu daqs 10 – 15 ċirku tal-ġilda.
         Qabel ma jibdew it-testijiet, ir-reżistenza elettrika ta’ żewġ ċrieki tal-ġilda tiġi mkejla bħala proċedura tal-kontroll tal-kwalità għal kull ġilda ta’ l-annimali. Iż-żewġ ċrieki għandhom jagħtu valuri ta’ reżistenza akbar minn 10 kΩ biex jintużaw il-bqija taċ-ċrieki għat-test. Jekk il-valur tar-reżistenza huwa inqas minn 10 kΩ, il-bqija taċ-ċrieki minn dik il-ġilda għandha tintrema.
         
            L-applikazzjoni tat-test u s-sustanzi tal-kontroll
         
         Għandhom jintużaw kontrolli konkurrenti pożittivi u negattivi biex kull studju jiżgura ħidma tajba tal-mudell esperimentali. Għandhom jintużaw ċ-ċrieki tal-ġilda minn animal wieħed. Is-sustanzi tal-kontroll pożittivi jew negattivi suġġeriti huma 10 M aċidu idrokloriku u ilma ddistillat, rispettivament.
         Is-sustanzi tat-test likwidi (150 μL) huma applikati b’mod uniformi mal-wiċċ eipdermali ġewwa t-tubu. Meta jiġu ttestjati materjali solidi, huwa applikat ammont biżżejjed ta’ solidu b’mod livell fuq iċ-ċirku sabiex jiġi żgurat li l-wiċċ kollu ta’ l-epidermis huwa kopert. Jiżdied l-ilma deioniżżat (150 μL) fuq is-solidu u t-tubu jiġi aġitat bil-mod. Sabiex jinkiseb il-kuntatt massimu mal-ġilda, is-solidi jistgħu jkunu jridu jissaħħnu sa 30 oC biex tinħall jew tiġi mrattba s-sustanza tat-test, jew mitħuna sabiex jipproduċu materjal granurali jew terra.
         Jintużaw tliet ċrieki tal-ġilda għal kull sustanza tat-test u tal-kontroll. Is-sustanzi tat-test huma aplikati għal 24 siegħa f temperatura ta’ 20-23 C. Is-sustanza tat-test titneħħa bil-ħasil b’merżuq ta’ ilma tal-vit sa 30 C sakemm ma jista’ jitneħħa ebda materjal ieħor.
         
            Il-kejl tat-TER
         
         L-impedenza tal-ġilda titkejjel bħala TER u titkejjel bl-użu ta’ kurrent alternat, ta’ vultaġġ baxx ta’ Wheatstone databridge (13). L-ispeċifikazzjonijiet ġenerali tal-bridge huma vultaġġ operattiv ta’ 1-3 Volt, kurrent sinus jew rettangulari alternat ta’ 50 - 1 000 Hz, u firxa tal-kejl ta’ mhux inqas minn 0,1 – 30 kΩ. Id-databridge użat fl-istudju tal-validazzjoni jkejjel l-induttanza, l-kapaċitanza u r-reżistenza sa valuri ta’ 2 000 H, 2 000 μF, u 2 MΩ, rispettivament bi frekwenzi ta’ 100 Hz jew 1 kHz, bl-użu ta’ valuri serje jew paralleli. Għal-għanijiet tal-korrożività tat-TER il-kejl tal-figura huwa rrekordjat f reżistenza, bi frekwenzi ta’ 100 Hz u bl-użu ta’ valuri serje. Qabel ma titkejjel ir-reżistenza elettrika, it-tensjoni tal-wiċċ tal-ġilda titnaqqas billi jiżdied volum suffiċ jenti ta’ etanol 70 % biex ikopri l-epidermis. Wara ftit sekondi, l-ethanol jitneħħa mit-tubu u mbagħad t-tessut jiġi idratat billi tiżdied taħlita ta’ 3 mL MgSO4 (154 mM). L-elettrodi tad-databridge jitqiegħdu fuq kull naħa taċ-ċirku tal-ġilda biex titkejjel ir-reżistenza f kΩ/ċirku tal-ġilda (Figura 1). Id-dimensjonijiet ta’ l-elettrodi u t-tul ta’ l-elettrodu espost taħt il-crocodile clips jintwerew fil-Figura 2. Il-molla mwaħħla ma’ l-elettrodu ta’ ġewwa tistrieħ fuq il-parti ta’ fuq tat-tubu PTFE matul il-kejl tar-reżistenza sabiex jiġi żgurat tul konsistenti ta’ l-elettrodu huwa meqrud fit-taħlita MgSO4. l-elettrodu ta’ barra jitqiegħed ġewwa l-parti reċettorja sabiex jistrieħ fuq il-qiegħ ta’ dik il-parti. Id-distanza bejn il-molla u l-qiegħ tat-tubu PTFE tinżamm kostanti (Figura 2), għaliex din id-distanza taffettwa l-valur ta’ reżistenza miksub. Għalhekk, id-distanza bejn l-elettrodu ta’ ġewwa u ċ-ċirku tal-ġilda għandha tkun kostanti u minimali (1-2 mm).
         Jekk il-valur tar-reżistenza mkejjel huwa akbar minn 20 kΩ, dan jista’ jkun minħabba li l-fdalijiet tas-sustanza tat-test jiksu l-wiċċ eipdermali taċ-ċirku tal-ġilda. Wieħed jista’ jipprova jkompli jneħħi din il-kisja, per eżempju, billi jissiġilla t-tubu PTFE bis-seba’ l-kbir bl-ingwanta u mbagħad iħawdu għal madwar 10 sekondi; it-taħlita ta’ MgSO4 tintrema u jerġa’ jsir il-kejl tar-reżistenza b’ MgSO4 ġdid.
         Il-karatteristiċi u d-dimensjonijiet ta’ l-apparat tat-test u l-proċedura ta’ l-esperiment użati jistgħu jinfluwenzaw il-valuri tat-TER miksuba. Il-limitu korrożiv ta’ 5 kΩ ġie żviluppat mid-data miksuba fl-apparat u l-proċdura speċifiċ i użati f dan il-Metodu. Jistgħu jgħoddu valuri differenti tal-limitu u tal-kontroll jekk jinbidlu l-kundizzjonijiet tat-test jew jintuża apparat differenti. Għalhekk, huwa meħtieġ li jiġu kkalibrati l-metodoloġija u l-valuri tal-limiti tar-reżistenza bl-ittestjar ta’ serje ta’ standards ta’ riferenza magħżula mill-kimiċi fl-istudju tal-validazzjoni (4) (5), jew minn klassijiet tal-kimiċi li huma simili għal dawk li qed jiġu investigati. Sett ta’ kimiċi ta’ riferenza xierqa jintwera fit-Tabella 1.
         
            Il-Metodi ta’ l-Irbit taż-Żebgħa
         
         L-espożizzjoni ta’ xi materjali mhux korrożivi tista’ tirriżulta fi tnaqqis ta’ reżistenza ’l isfel mil-limitu ta’ 5 kΩ li jippermetti l-mogħdija ta’ joni mi ll-istratum corneum, u b’hekk titnaqqas ir-reżistenza elettrika (5). Per eżempju, l-organiċi newtri u l-kimiċi li għandhom karatteristiċi attivi fil-wiċċ (inklużi deterġenti, emulsifikanti u surfattanti oħrajn) jistgħu jneħħu l-lipidi tal-ġilda li l-barrjera jagħmluha aktar permeabbli għall-joni. Għalhekk, jekk il-valuri tat-TER huma inqas minn jew madwar 5 kΩ fin-nuqqas ta’ dannu viżwali, tista’ ssir stima tal-penetrazzjoni taż-żebgħa fuq iċ-ċelloli tal-kontroll u dawk ittrattati sabiex jiġi determinat jekk il-valuri tat-TER miksuba kinux ir-riżultat tal-permeabilità akbar tal-ġilda, jew tal-korrożjoni tal-ġilda (3)(5). Fil-każ ta’ l-aħħar fejn jinqasam l-istratum corneum, iż-żebgħa sulforhodamine B, meta applikata mal-wiċċ tal-ġilda tippenetra malajr u ttebba’ t-tessut ta’ taħt. Din iż-żebgħa partikolari hija stabbli għal varjetà kbira ta’ kimiċi u mhijiex affettwata mill-proċedura ta’ l-estrazzjoni deskritta hawn taħt.
         L-applikazzjoni u t-tneħħija taż-żebgħa Sulforhodamine B
         Wara l-istima tat-TER, is-sulfat tal-manjeżju jintrema mit-tubu u l-ġilda tiġi eżaminata bir-retta għal dannu ovvju. Jekk ma hemm ebda dannu kbir ovvju, iż-żebħa Sulforhodamine B dye (Aċidu Aħmar 52; C.I. 45100; EINECS Numru 222-529-8; CAS numru 3520-42-1), 150 μL ta’ taħ lita ta’ 10 % (w/v) fl-ilma distillat tiġi applikata fuq il-wiċċ epidermali ta’ kull ċirku tal-ġilda għal sagħtejn. Dawn iċ-ċrieki tal-ġilda mbagħad jinħaslu bl-ilma tal-vit sa temperatura ambjentali għal madwar 10 sekonda biex titneħħa ż-żebgħa eċċessiva/mhux użata. Kull ċirku tal-ġilda mbagħad jitneħħa bl-attenzjoni mit-tubu tal-PTFE u jitqiegħed fi flixkun (eż. flixkun tal-ħġieġ tax-xintillazzjoni ta’ 20 mL) li fih ilma deionizzat (8 mL). Il-fliexken jiġu aġitati bil-mod għal 5 minuti sabiex titneħħa żebgħa żejda mhux użata. Din il-proċedura ta’ tlaħliħ imbagħad hija ripetuta, u wara dan jitneħħew iċ-ċrieki tal-ġilda u jitqiegħdu fi fliexken li fihom 5 ml ta’ 30 % (w/v) sodium dodecyl sulphate (SDS) fl-ilma distillat u huma inkubati mal-lejl f’temperatura ta’ 60 oC.
         Wara l-inkubazzjoni, iċ-ċirku tal-ġilda jitneħħa u jintrema u l-bqija tat-taħlita tiġi ċċentrifugata għal 8 minuti f’temperatura ta’ 21 oC (forza relattiva ċentrifugali ~175 x g). Kampjun ta’ 1 ml ta’ supernatant huwa mħallat 1 f’5 (v/v) [i.e. 1 mL + 4 mL] ma’ 30 % (w/v) SDS fl-ilma ddistillat. Id-densità ottika (OD) tat-taħlita titkejjel f’565 nm.
         Il-kalkolu tal-kontenut taż-żebgħa
         Il-kontenut ta’ żebgħa sulforhodamine B għal kull ċirku huwa kkalkolat mill-valur ta’ l-OD (5) (il-koeffiċjenti taż-żebgħa sulforhodamine B ta’ 565 nm = 8,7 x l04; piż molekulari = 580). Il-kontenut taż-żebgħa huwa ddeterminat għal kull ċirku tal-ġilda bl-użu ta’ kurva xierqa tal-kalibrazzjoni u l-kontenut medju taż-żebgħa mbagħad jiġi kkalkolati għad-doppji.
         2.   ID-DATA
         Il-valuri tar-reżistenza (kΩ) u l-valuri tal-kontenut medju taż-żebgħa (μg/ċirku), fejn xieraq, għall-materjal tat-test, kif ukoll għall-kontrolli pożittivi u negattivi għandhom jiġu rrapportati f’forma ta’ tabella (data individwali tal-prova u medji ± S.D.), inkluża d-data għall-esperimenti doppji/ripetuti, valuri medji u dawk individwali.
         L-INTERPRETAZZJONI TAR-RIZULTATI
         Ir-riżultati medji tat-TER huma aċċettati jekk il-valuri tal-kontroll pożittivi u negattivi konkorrenti jaqgħu fl-iskali aċċettabbli għall-metodi fil-laboratorju tat-test. L-iskali aċċettabli tar-reżistenza għall-metodoloġija u l-apparat deskritti hawn fuq jingħataw f’din it-tabella li ġejja:
         
                     Kontroll
                  
                  
                     Sustanza
                  
                  
                     Skala tar-reżistenza (kΩ)
                  
               
                     Pożittiv
                  
                  
                     Aċidu idrokloriku 10M
                  
                  
                     0,5  – 1,0 
                  
               
                     Negattiv
                  
                  
                     Ilma ddistillat
                  
                  
                     10 – 25
                  
               Ir-riżultati medji ta’ l-irbit taż-żebgħa huma aċċettati b’kundizzjoni li l-valuri konkurrenti tal-kontroll jaqgħu fl-iskali aċċettabbli għall-metodu. Skali aċċettabbli ssuġġeriti tal-kontenut taż-żebgħa għas-sustanzi tal-kontroll għall-metodoloġija u l-apparat deskritt hawn fuq jingħataw hawn isfel:
         
                     Kontroll
                  
                  
                     Sustanza
                  
                  
                     Firxa tal-kontenut taż-żebgħa (μg/ċirku)
                  
               
                     Pożittiv
                  
                  
                     Aċidu idrokloriku 10M
                  
                  
                     40 – 100
                  
               
                     Negattiv
                  
                  
                     Ilma ddistillat
                  
                  
                     15 – 35
                  
               Is-sustanza tat-test jitqies mhux korrożiv għall-ġilda:
         
                     i)
                  
                  
                     jekk il-valur medju tat-TER miksub għas-sustanza tat-test huwa akbar minn 5 kΩ, jew
                  
               
                     ii)
                  
                  
                     il-valur medju tat-TER huwa inqas minn jew daqs 5 kΩ, u
                     
                                 —
                              
                              
                                 iċ-ċirku tal-ġilda ma juri ebda dannu ovvju, u
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-kontenut medju ta’ żebgħa fiċ-ċirku huwa ferm inqas mill-kontenut medju ta’ żebgħa fiċ-ċirku tal-kontroll pożittiv ta’ l-10M HCl miksuba fl-istess ħin.
                              
                           
               Is-sustanza tat-test titqies li hija korrożiva għall-ġilda:
         
                     i)
                  
                  
                     jekk il-valur medju tat-TER miksub għas-sustanza tat-test huwa inqas minn jew daqs 5 kΩ u ċ-ċirku tal-ġilda huwa ovvjament iddanneġġjat, jew
                  
               
                     ii)
                  
                  
                     il-valur medju tat-TER huwa mean TER inqas minn jew daqs 5 kΩ, u
                     
                                 —
                              
                              
                                 iċ-ċirku tal-ġilda ma juri ebda dannu ovvju, iżda
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-kontenut medju ta’ żebgħa fiċ-ċirku huwa akbar minn jew daqs il-kontenut medju ta’ żebgħa fiċ-ċirku tal-kontroll pożittiv ta’ l-10M HCl miksuba fl-istess ħin.
                              
                           
               3.   IR-RAPPORTAĠĠ
         3.1.   Ir-RAPPORTAĠĠ TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi din l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Is-Sustanzi tat-Test u tal-Kontroll:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-isem/ismijiet tal-Kimika bħall-isem IUPAC jew l-isem CAS u n-numru CAS, jekk magħruf;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-safa u l-kompożizzjoni tas-sustanza jew preparazzjoni (f perċentwali skond il-piż) u n-natura fiżika;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-karatteristiċi fiżiko-kimiċi bħall-istat fiżiku, pH, stabilità, solubbiltà fl-ilma, _ elevanti għat-twettiq ta’ l-istudju;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 it-trattament tas-sustanzi tat-test/tal-kontroll qabel l-ittestjar, jekk jgħodd (eż. tisħin, tħin);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-istabilità, jekk magħrufa.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     L-annimali tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 varjetà u sess użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-età ta’ l-annimali meta użati bħala annimali donaturi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-għajn, il-kundizzjoni fejn jinżammu, dieta, eċċ.;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tal-preparazzjoni tal-ġilda.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Il-Kundizzjonijiet tat-Test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 il-kurvi tal-kalibrazzjoni għall-apparat tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-kurvi tal-kalibrazzjoni għat-twettiq tat-test għar-rabta taż-żebgħa;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tal-proċedura tat-test użata biex jitkejjel it-TER;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tal-proċedura tat-test użata għall-istima ta’ l-irbit taż-żebgħa; jekk xieraq;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni ta’ kwalunkwe modifika tal-proċeduri tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni tal-kriterji ta’ l-evalwazzjoni użati.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 tabulazzjoni tad-data mit-TER u mill-valur ta’ l-irbit taż-żebgħa (jekk xieraq) għall-annimali indivdiwali u għal kampjuni tal-ġilda individwali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni ta’ kwalunkwe effett osservat.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni tar-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     1.
                  
                  
                     OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
                  
               
                  
                     2.
                  
                  
                     Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corrosion.
                  
               
                  
                     3.
                  
                  
                     Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219-255.
                  
               
                  
                     4.
                  
                  
                     Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. in vitro 12, 471-482.
                  
               
                  
                     5.
                  
                  
                     Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxic. in vitro 12, 483- 524.
                  
               
                  
                     6.
                  
                  
                     OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, 62pp.
                  
               
                  
                     7.
                  
                  
                     Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. The report and recommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
                  
               
                  
                     8.
                  
                  
                     ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
                  
               
                  
                     9.
                  
                  
                     ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.
                  
               
                  
                     10.
                  
                  
                     ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf .
                  
               
                  
                     11.
                  
                  
                     OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st –2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27 ta’ Marzu 2002, OECD ENV/EHS, disponibbli fuq talba mis-Segretarjat
                  
               
                  
                     12.
                  
                  
                     Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An in vitro skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.
                  
               
                  
                     13.
                  
                  
                     Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, J. (1992). The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial. Toxic. in vitro 6, 191-194.
                  
               
                  
                     14.
                  
                  
                     Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709-720.
                  
               
                  
                     15.
                  
                  
                     Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, M., Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845-852.
                  
               
                  
                     16.
                  
                  
                     Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An In vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial Validation. Toxic. in vitro. 2, 7-17.
                  
               Figura 1
         Apparat għall-figura tat-TER tal-ġilda tal-firien
         Figura 2
         Dimensjonijiet tat-tubu tal-polytetrafluoroethylene (PFTE) u t-tubi reċettorji u l-elettrodi użati
         
            Il-fatturi kritiċi ta’ l-apparat muri fuq:
         
         
                     —
                  
                  
                     id-djametru ġewwieni tat-tubu tal-PTFE;
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-tul ta’ l-elettrodi relattivi għat-tubu tal-PTFE u t-tubu reċettorju, b’tali mod li ċ-ċirku tal-ġilda ma jintmessx mill-elettrodi u li tul standard ta’ l-elettrodu huwa f’kuntatt mat-taħlita ta’ l-MgSO4;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-ammont tat-taħlita ta’ l-MgSO4 fit-tubu reċettorju għandu jagħti fond ta’ likwidu, relattiv għal-livell fit-tubu tal-PFTE, kif muri fil-Figura 1;
                  
               
                     —
                  
                  
                     iċ-ċirku tal-ġilda għandu jitwaħħal tajjeb biżżejjed mat-tubu tal-PFTE, b’tali mod li r-reżistenza elettrika hija kejl beru tal-karatteristiċi tal-ġilda.
                  
               B.40.BIS.   IL-KORROŻJONI TAL-ĠILDA IN VITRO: IT-TEST TAL-MUDELL TAL-ĠILDA UMANA
         1.   IL-METODU
         Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalent għall-OECD TG 431 (2004).
         1.1   DAĦLA
         Il-korrożjoni tal-ġilda tirreferi għall-produzzjoni ta’ dannu irriversibbli fit-tessut tal-ġilda wara l-applikazzjoni ta’ materjal tat-test [kif definit mis-Sistema Globali Armonizzata għall-Klassifika u t-Tikkettjar ta’ Sustanzi u Komposti Kimiċi (GHS – Globally Harmonised System)] (1). Dan il-metodu tat-test ma jeħtieġx l-użu ta’ annimali ħajjin jew tessut ta’ l-annimali għall-evalwazzjoni tal-korrożività tal-ġilda.
         L-istima tal-korrożività tal-ġilda involviet tipikament l-użu ta’ annimali tal-laboratorju (2). Ittħassib għall-uġigħ u t-tbatija involuti f’din il-proċedura ġie indirizzat fir-reviżjoni tal-Metodu tat-Test B.4 li jippermetti d-determinazzjoni tal-korrożività tal-ġilda bl-użu ta’ metodi alternattivi, in vitro, li jevitaw l-uġigħ u t-tbatija ta’ l-annimali.
         L-ewwel pass biex jiġu definiti testijiet alternattivi li jistgħu jintużaw għall-ittestjar tal-korrożività tal-ġilda kien it-twettiq ta’ studji tal-validazzjoni minn qabel (3). Wara dan, studju ta’ validazzjoni formali ta’ metodi in vitro biex tiġi stmata l-korrożjoni tal-ġilda (4)(5) ġie mwettaq (6)(7)(8). Ir-riżultat ta’ dawn l-istudji u letteratura oħra ppubblikata wasslu għar-rakkomandazzjoni li jistgħu jintużaw dawn it-testijiet għall-istima tal-korrożività tal-ġilda in vivo (10)(11)12)(13): it-test tal-mudell tal-ġilda umana (dan il-Metodu) u t-test tar-reżistenza elettrika transkutanja (ara l-Metodu tat-Test B.40).
         Studji ta’ validazzjoni u studji oħrajn validati rrapportaw li t-testijiet li jużaw mudelli tal-ġilda umana (3)(4)(5)(9) jsitgħu jiddiskriminaw b’mod dipendibbli bejn il-korrożivi tal-ġilda u sustanzi mhux korrożivi fuq il-ġilda. Il-protokoll tat-test jista’ wkoll jipprovdi indikazzjoni tad-distinzjoni bejn korrożivi tal-ġilda severi u dawk inqas severi.
         It-test deskritt f’dan il-Metodu jippermetti l-identifikazzjoni ta’ sostanzi u taħlitiet kimiċi korrożivi. Jippermetti wkoll l-identifikazzjoni ta’ sustanzi u taħlitiet mhux korrożivi meta tkun sostnuta mill-piż ta’ determinazzjoni tal-provi bl-użu ta’ informazzjoni oħra eżistenti (eż. pH, struttura-attività-relazzjonijiet, data dwar l-umani u/jew l-annimali) (1)(2)(13)(14). Normalment ma jagħtix informazzjoni xierqa dwar l-irritazzjoni tal-ġilda, u lanqas ma jippermetti s-subkategorizzazzjoni ta’ sustanzi korrożivi kif permess fis-Sistema tal-Klassifika Globali Armonizzata (GHS) (1).
         Għal evalwazzjoni sħiħa ta’ l-effetti lokali fuq il-ġilda wara espożizzjoni dermali unika, huwa rakkomandat li tiġi segwita l-istrateġija tat-test sekwenzjali kif mehmuża mal-Metodu tat-Test B.4 (2) u provduta fis-Sistema tal-Klassifika Globali Armonizzata (GHS) (1). Din l-istrateġija tat-test tinkludi t-twettiq ta’ testijiet in vitro għall-korrożjoni tal-ġilda (kif deskritt f’dan il-metodu) u l-irritazzjoni tal-ġilda qabel ma jitqies l-ittestjar fl-annimali ħajjin.
         1.2   DEFINIZZJONIJIET
         
            Il-Korrożjoni tal-ġilda in vivo: hija l-produzzjoni ta’ dannu irriversibbli tal-ġilda: jiġifieri nekrożi viżibbli mill-epidermis u ġewwa d-dermis, wara l-applikazzjoni ta’ sustanza tat-test għal mhux aktar minn erba’ sigħat. Ir-reazzjonijiet korrożivi hima tipifikati minn ulċeri, ħruġ ta’ demm, qxur bid-demm, u sa l-aħħar ta’ l-osservazzjoni ta’ 14-il jum, tnaqqis ta’ kulur minħabba li tibjad il-ġilda, żoni sħaħ ta’ alopecia, u ċikatriċi. Il-ħistopatoloġija għandha titqies biex jiġu evalwati leżjonijiet li dwarhom hemm dubju.
         
            Il-vijabilità taċ-ċelloli: parametru li jkejjel l-attività totali ta’ popolazzjoni ta’ ċelloli (eż. l-abilità ta’ mitochondrial dehidrogenases ċellolari li jnaqqsu ż-żebgħa vitali MTT), li, skond il-punt tat-tmiem imkejjel u d-diżinn tat-test użat, tikkorrelata ma’ l-għadd totali u/jew il-vitalità taċ-ċelloli.
         1.3   IS-SUSTANZI TA’ RIFERENZA
         Tabella 1
         Il-Kimiċi ta’ Riferenza
         
                     Isem
                  
                  
                     Nru EINECS
                  
                  
                     Nru CAS
                  
                  
                      
                  
               
                     1,2-Diaminopropane
                  
                  
                     201-155-9
                  
                  
                     78-90-0
                  
                  
                     Korrożiv Ħafna
                  
               
                     Aċidu Akriliku
                  
                  
                     201-177-9
                  
                  
                     79-10-7
                  
                  
                     Korrożiv Ħafna
                  
               
                     2-tert. Butylphenol
                  
                  
                     201-807-2
                  
                  
                     88-18-6
                  
                  
                     Korrożiv
                  
               
                     Potassium hydroxide (10 %)
                  
                  
                     215-181-3
                  
                  
                     1310-58-3
                  
                  
                     Korrożiv
                  
               
                     Aċidu sulfuriku (10 %)
                  
                  
                     231-639-5
                  
                  
                     7664-93-9
                  
                  
                     Korrożiv
                  
               
                     Aċidu Oktanoiku (aċidu kapriliku)
                  
                  
                     204-677-5
                  
                  
                     124-07-02
                  
                  
                     Korrożiv
                  
               
                     4-Amino-1,2,4-triazole
                  
                  
                     209-533-5
                  
                  
                     584-13-4
                  
                  
                     Mhux Korrożiv
                  
               
                     Eugenol
                  
                  
                     202-589-1
                  
                  
                     97-53-0
                  
                  
                     Mhux Korrożiv
                  
               
                     Phenethyl bromide
                  
                  
                     203-130-8
                  
                  
                     103-63-9
                  
                  
                     Mhux Korrożiv
                  
               
                     Tetrachloroethylene
                  
                  
                     204-825-9
                  
                  
                     27-18-4
                  
                  
                     Mhux Korrożiv
                  
               
                     Aċidu iżosteariku
                  
                  
                     250-178-0
                  
                  
                     30399-84-9
                  
                  
                     Mhux Korrożiv
                  
               
                     4-(Methylthio)-benzaldehyde
                  
                  
                     222-365-7
                  
                  
                     3446-89-7
                  
                  
                     Mhux Korrożiv
                  
               Il-parti l-kbira tal-kimiċi elenkati huma meħuda mil-lista ta’ kimiċi magħżula għall-istudju internazzjonali ta’ validazzjoni ECVAM (4). L-għażla tagħhom hija bbażata fuq dawn il-kriterji li ġejjin:
         
                     (i)
                  
                  
                     numru indaqs ta’ sustanzi korrożivi u mhux korrożivi;
                  
               
                     (ii)
                  
                  
                     sustanzi disponibbli kummerċjalment li jkopru l-parti l-kbira tal-klassijiet ta’ kimiċi rilevanti;
                  
               
                     (iii)
                  
                  
                     l-inklużjoni ta’ sustanzi korrożivi ħafna kif ukoll dawk inqas korrożivi sabiex tkun possibbli d-diskriminazzjoni bbażata fuq il-potenza korrożiva;
                  
               
                     (iv)
                  
                  
                     l-għażla tal-kimiċi li jistgħu jiġu mmaniġġjati f’laboratorju mingħajr ażżard serju minbarra l-korrożività.
                  
               IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Il-materjal tat-test huwa applikat topikament fuq mudell ta’ ġilda umana tri-dimensjonali li fih għall-inqas epidermis rikostruwit bi stratum corneum funzjonali. Il-materjali korriżivi huma identifikati mill-abilità tagħhom li jipproduċu tnaqqis fil-vijabbiltà taċ-ċelloli [kif iddeterminat, per eżempju, bl-użu tal-figura tat-tnaqqis ta’ l-MTT (15)] ’l isfel minn livell ta’ limitu definiti matul perjodi speċifikati ta’ espożizzjoni. Il-prinċipju tal-figura tal-mudell tal-ġilda umana hija bbażata fuq il-bażi ta’ l-ipoteżi li l-kimiċi korrożivi jistgħu jippenetraw l-istratum corneum bid-diffużjoni jew l-erożjoni, u huma ċitotossiċi fuq is-saffi ta’ ċelloli ta’ taħt.
         
            Proċedura
         
         Il-Mudelli tal-ġilda umana
         Il-Mudelli tal-ġilda umana jistgħu jinbnew jew jinkisbu kummerċjalment (eż. il-mudelli EpiDermTM u EPISKINTM) (16)(17)(18)(19) jew jistgħu jiġu żviluppati jew mibnija fil-laboratorju tat-test (20)(21). Huwa rikonoxxut li l-użu tal-ġilda umana huwa soġġett għal kunsiderazzjonijiet u kundizzjonijiet etiċi nazzjonali u internazzjonali. Kwalunkwe mudell ġdid għandu jiġi vvalidat (għall-inqas sal-grad deskritt taħt 1.4.1.1.2). Il-Mudelli tal-ġilda umana użati għal dan it-test għandhom ikunu konformi ma’ dawn li ġejjin:
         1.4.1.1.1   Il-Kundizzjonijiet tal-Mudelli Ġenerali:
         
         Għandhom jintużaw keratinocytes umani biex jinbena l-epithelium. Għandhom ikunu preżenti bosta saffi ta’ ċelloli epiteljali vjabbli taħt stratum corneum funzjonali. Il-mudell tal-ġilda jista’ wkoll ikollu saff ta’ komponenti stromali. L-istratum corneum għandu jkollu bosta saffi bil-profil meħtieġ ta’ lipidi biex jipproduċi barrjera funzjonali bir-robustezza biex tirreżisti l-penetrazzjoni rapida tal-li jimmarkaw ċitotossiċi. Il-karatteristiċi tal-konteniment tal-mudell għandhom jipprevjenu l-passaġġ tal-materjal madwar l-istratum corneum fit-tessut vjabbli. Il-mogħdija tal-kimiċi tat-test madwar l-istratum corneum twassal għall-immudellar fqir ta’ l-espożizzjoni għall-ġilda. Il-mudell tal-ġilda għandu jkun ħieles mill-kontaminazzjoni bil-batterji (inkluż mikoplażma) jew fungi.
         1.4.1.1.2   Il-Kundizzjonijiet tal-Mudelli Funzjonali:
         
         Id-daqs tal-vijabbiltà normalment hija kkwantifikata bl-użu ta’ MTT jew iż-żebgħat vitali oħrajn ikkonvertiti metabolikament. F’dawn il-każijiet id-densità ottika (OD – optical density) taż-żebgħa estratta (solubilizzata) mit-tessut tal-kontroll negattiv għandha tkun għall-inqas 20 drabi akbar mill-OD tas-solvent ta’ l-estrazzjoni waħdu [għal perspettiva ġenerali ara (22)]. It-tessut tal-kontroll negattiv għandu jkun stabbli fil-kultura (jipprovdi kejl simili ta’ vijabbiltà) għal kemm idum il-perjodu ta’ l-espożizzjoni tat-test. L-istratum corneum għandu jkun robust biżżejjed biex jirreżisti l-penetrazzjoni mgħaġġla ta’ xi kimiċi li jimmarkaw ċitotossiċi (eż. 1 % Triton X-100). Din il-karatteristika tista’ tiġi stmata bil-ħin ta’ l-espożizzjoni meħtieġ biex il-viajbbiltà taċ-ċelloli tonqos b’50 % (ET50) (eż. għall-mudelli EpiDermTM u EPISKINTM dan huwa > sagħtejn). It-tessut għandu juri r-reproduttività maż-żmien u preferibbilment bejn il-laboratorji. Barra minn dan għandhom ikunu jistgħu jipprevedu l-potenzjal korrożiv tal-kimiċi ta’ riferenza (ara t-Tabella 1) meta użati fil-protokoll tat-test magħżul.
         L-applikazzjoni tat-test u s-sustanzi tal-kontroll
         Żewġ replikati tat-tessut jintużaw għal kull trattament (ħin ta’ l-espożizzjoni), inklużi l-kontrolli. Għall-materjali likwidi, għandha tkun applikata biżżejjed sustanza tat-test biex tkopri l-wiċċ tat-test b’mod uniformi: għadu jintuża mhux inqas minn 25 μL/cm2. Għall-materjali solidi, għandha tiġi applikata biżżejjed sustanza tat-test biex tkopri l-ġilda b’mod indaqs, u għandha tiġi umdata b’ilma deonizzat jew distillat biex jiġi żgurat kuntatt tajjeb mal-ġilda. Fejn xieraq, is-solidi għandhom jiġu mitħuna għal terra qabel l-applikazzjoni. Il-metodu ta’ l-applikazzjoni għandu jkun xieraq għas-sustanza tat-test (ara eż. r-referenza 5). Fl-aħħar tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni, il-materjal tat-test għandu jiġi maħsul bir-reqqa mill-wiċċ tal-ġilda b’buffer xieraq, jew 0,9 % NaCl.
         Għandhom jintużaw kontrolli konkurrenti pożittivi u negattivi għal kull studju biex tiġi żgurata l-ħidma xierqa tal-mudell esperimentali. Is-sustanzi tal-kontroll ppożittiv suġġeriti huma l-aċidu aċetiku glaċjali jew 8N KOH. Il-kontrolli negattivi suġġeriti huma 0,9 % NaCl jew ilma.
         Il-kejl tal-vijabbiltà taċ-ċelloli
         Jistgħu jintużaw biss mudelli kwantitattivi, validati biex titkejjel il-vijabbiltà taċ-ċelloli. Barra minn dan, il-miżura tal-vijabbiltà għandha tkun kompatibbli ma’ l-użu f’kostruzzjoni ta’ tessut tri-dimensjonali. L-irbit taż-żebgħa mhux speċifiku m’għandux jinterferixxi mal-kejl tal-vijabbiltà. Iż-żebgħa ta’ l-irbit tal-proteini u dawk li ma jgħaddux minn konverżjoni metabolika (eż. l-aħmar newtrali) għalhekk mhumiex xierqa. Il-figura li tintuża l-aktar spiss hija t-tnaqqis MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Thiazolyl blue: EINECS numru 206-069-5, CAS numru 298-93-1)], li ntwera li jagħti riżultati preċiżi u riproduċibbli (5) iżda jistgħu jintużaw oħrajn. Il-kampjun tal-ġilda jitqiegħed f’taħlita ta’ MTT ta’ konċentrazzjoni (eż. 0,3-1 mg/mL) f’temperatura ta’ inkubazzjoni xierqa għal 3 sigħat. Il-prodott blu preċipitat ta’ formazan imbagħad huwa estratt bl-użu ta’ solvent (isopropanol), u l-konċentrazzjoni tal-formazan hija mkejla b’determinazzjoni ta’ l-OD f’wavelength bejn 540 u 595 nm.
         L-azzjoni kimika bil-materjal tat-test fuq iż-żebgħa vitali tista’ timita dik tal-metaboliżmu ċellolari li jwassal għal stima falza tal-vijabbiltà. Dan intwera li jsir meta dan il-materjal tat-test mhuwiex imneħħi għal kollox mill-ġilda bit-tlaħliħ (9). Jekk il-materjal tat-test jaġixxi direttament fuq iż-żebgħa vitali, għandhom jintużaw kontrolli addizzjonali biex issir skoperta u korrezzjoni għall-interferenza tas-sustanzi tat-test mal-kejl tal-vijabbiltà (9)(23).
         2.   DATA
         Għal kull tessut, il-valuri OD u d-data dwar il-perċentwali kkalkolati tal-vjabbiltà taċ-ċelloli għall-materjal tat-test, il-kontrolli pożittivi u dawk negattivi għandhom ikunu rrapportati f’tabella, inkluża d-data minn esperimenti ripetuti tar-repliċi kif xieraq, valuri medji u individwali.
         L-INTERPRETAZZJONI TAR-RIZULTATI
         Il-valuri ta’ l-OD miksuba għal kull kampjun tat-test jistgħu jintużaw biex jiġi kkalkolat il-perċentwal tal-vijabbiltà relattiva għall-kontroll negattiv, li hija stabbilita arbitrarjament bħala 100 %. Il-limitu tal-perċentwal tal-vjabbiltà taċ-ċelloli li jiddistingwi l-materjali tat-test korrożivi u dawk mhux korrożivi (jew li jiddiskriminaw bejn il-klassijiet differenti, korrożivi), jew il-proċedura/i statistikali għall-evalwazzjoni tar-riżultati u l-identifikazzjoni tal-materjali korrożivi, għandhom jiġu definiti b’mod ċar u ddokumentati, u għandhom jintwerew li huma xierqa. B’mod ġenerali dawn il-valuri limiti huma stabbiliti waqt l-ottimizzazzjoni tat-test, ittestjati waqt fażi ta’ validazzjoni qabel, u kkonfermati fi studju ta’ validazzjoni. Bħala eżempju, it-tbassir tal-Korrożività assoċjata mal-mudell EpiDermTM huwa (9):
         Is-sustanza tat-test titqies li hija korrożiva għall-ġilda:
         
                     (i)
                  
                  
                     jekk il-vijabbiltà wara espożizzjoni ta’ 3 minuti hija inqas minn 50 %, jew
                  
               
                     (ii)
                  
                  
                     jekk il-vijabbiltà wara espożizzjoni ta’ 3 minuti hija akbar minn jew daqs 50 % u l-vjabbiltà wara espożizzjoni ta’ siegħa hija inqas minn 15 %.
                  
               Is-sustanza tat-test titqies li hija mhux korrożiva għall-ġilda:
         
                     (i)
                  
                  
                     jekk il-vijabbiltà wara espożizzjoni ta’ 3 minuti hija akbar minn jew daqs 50 % u l-vjabbiltà wara espożizzjoni ta’ siegħa hija akbar minn jew daqs 15 %.
                  
               3.   IR-RAPPORTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORTAĠĠ TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi din l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Is-Sustanzi tat-Test u tal-Kontroll:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-isem/ismijiet tal-Kimika bħall-isem IUPAC jew l-isem CAS u l-CAS numru, jekk magħruf;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-safa u l-kompożizzjoni tas-sustanza jew preparazzjoni (f’perċentwali skond il-piż);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-karatteristiċi fiżiko-kimiċi bħall-istat fiżiku, pH, stabilità, solubbiltà fl-ilma, relevanti għat-twettiq ta’ l-istudju;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 it-trattament tas-sustanzi tat-test/tal-kontroll qabel l-ittestjar, jekk jgħodd (eż. tisħin, tħin);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-istabilità, jekk magħrufa;
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Il-ġustifikazzjoni tal-mudell tal-ġilda u l-protokoll użati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Il-kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 is-sistema taċ-ċelloli użata;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-informazzjoni tal-kalibrazzjoni għall-apparat tal-kejl użat biex titkejjel il-vjabbiltà taċ-ċelloli (eż. Spettrofotometru);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni sħiħa ta’ appoġġ għall-mudell speċifiku tal-ġilda użata inkluż il-validità taghħa;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tal-proċedura tat-test użata;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dożi tat-test użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni ta’ kwalunkwe modifika tal-proċeduri tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 referenza għad-data storika tal-mudell;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni tal-kriterji ta’ l-evalwazzjoni użati.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 tabulazzjoni tad-data mill-kampjuni individwali tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni ta’ kwalunkwe effett osservat.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni tar-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjoni.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     1.
                  
                  
                     OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
                  
               
                  
                     2.
                  
                  
                     Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corrosion.
                  
               
                  
                     3.
                  
                  
                     Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23,219-255.
                  
               
                  
                     4.
                  
                  
                     Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. In vitro 12, 471-482.
                  
               
                  
                     5.
                  
                  
                     Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxic. In vitro 12, 483-524.
                  
               
                  
                     6.
                  
                  
                     OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, 62pp.
                  
               
                  
                     7.
                  
                  
                     Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. Test report and recommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
                  
               
                  
                     8.
                  
                  
                     ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
                  
               
                  
                     9.
                  
                  
                     Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, P., Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C., Kaufmann, T., Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp.371-401.
                  
               
                  
                     10.
                  
                  
                     ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.
                  
               
                  
                     11.
                  
                  
                     ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365-67.
                  
               
                  
                     12.
                  
                  
                     ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
                  
               
                  
                     13.
                  
                  
                     OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st –2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March 2002, OECD ENV/EHS, disponibbli fuq talba mis-Segretarjat
                  
               
                  
                     14.
                  
                  
                     Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709-720.
                  
               
                  
                     15.
                  
                  
                     Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity asssays. J.Immunol. Meth. 65, 55-63.
                  
               
                  
                     16.
                  
                  
                     Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klausner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxic. In vitro 8, 889-891.
                  
               
                  
                     17.
                  
                  
                     Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural characterization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, 211-225.
                  
               
                  
                     18.
                  
                  
                     Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Pouradier DX (1994). The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxicology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 133-140
                  
               
                  
                     19.
                  
                  
                     Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, Thivolet J (1991). In vitro and post –transplantation differentiation of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental Cell Research 193: 310-319
                  
               
                  
                     20.
                  
                  
                     Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and Rosenberg, H. (1992). The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology 9, 163-171.
                  
               
                  
                     21.
                  
                  
                     Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., Parentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengineering 43/8, 747-756.
                  
               
                  
                     22.
                  
                  
                     Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical assessment of the use of microculture tetrazolium assays to measure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69-84.
                  
               
                  
                     23.
                  
                  
                     Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne’, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation: results and evaluation by the Management Team. Toxic. InVItro 15, 57-93.
                  
               B.41.   IT-TEST TAL-FOTOTOSSIĊITÀ IN VITRO 3T3 NRU
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa ekwivalenti għall-OECD TG 432 (2004).
         1.1.   DAĦLA
         Il-fototossiċità hija definita bħala reazzjoni tossika minn sustanza applikata fuq il-ġisem li hija miġbuda jew miżjuda (apparenti f’livelli ta’ dożi aktar baxxi) wara l-espożizzjoni sussegwenti għad-dawl, jew li hija indotta mill-irradjazzjoni tal-ġilda wara amministrazzjoni sistemika ta’ sustanza.
         It-test tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU jintuża biex jiġi identifikat il-potenzjal fototossiku ta’ sustanza tat-test indotta mill-kimika eċċitata wara l-espożizzjoni għad-dawl. It-test jevalwa l-foto-ċitotossiċità bit-tnaqqis relattiv fil-vijabbiltà taċ-ċelloli esposti għall-kimika fil-preżenza kontra n-nuqqas tad-dawl. Is-sustanzi identifikati minn dan it-test x’aktarx ikunu fototossiċi in vivo wara applikazzjoni sistemika u tixrid mal-ġilda, jew wara applikazzjoni topikali.
         Bosta tipi ta’ kimiċi ġew irrapportati li jinduċu l-effetti fototossiċi (1)(2)(3)(4). Il-karatteristika komuni tagħhom hija l-abilità tagħhom li jassorbu l-enerġija tad-dawl fil-firxa tad-dawl tax-xemx. Skond l-ewwel liġi tal-fotokimika (il-Liġi ta’ Grotthaus-Draper), il-fotoreazzjoni teħtieġ assorbiment suffiċjenti ta’ ammonti ta’ dawl. Għalhekk qabel ma jitqies l-ittestjar bioloġiku, spettru ta’ l-assorbiment UV/vis tal-kimika tat-test għandu jiġi ddeterminat skond il-Linja Gwida tat-Test 101 ta’ l-OECD. Ġie ssuġġerit li jekk il-koeffiċjent ta’ l-estinzjoni/assorbiment molari huwa inqas minn 10 litru x mol-1 x cm-1 x’aktarx li l-kimika mhijiex fotoreattiva. Din il-kimika tista’ ma teħtieġx li tiġi ttestjata fit-test in vitro 3T3 NRU tal-fototossiċità jew kwalunkwe test ieħor bioloġiku għall-effetti avversi fotokimiċi (1)(5). Ara wkoll l-Anness 1.
         L-affidabbiltà u r-rilevanza tat-test tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU ġew evalwati dan laħħar (6)(7)(8) (9). It-test tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU intwera li jbassar l-effetti ta’ fototossiċità akuta fl-annimali u fl-umani in vivo. It-test mhuwiex diżinjat li jbassar effetti avversi oħrajn li jistgħu jirriżultaw minn azzjoni kkombinata ta’ kimika u d-dawl, eż. ma jindirizzax il-fotoġenotossiċtà, il-fotoallerġija, jew il-fotokarċinoġeniċità, u lanqas ma jippermetti stima tas-saħħa tal-fototossiċità. Barra minn dan, it-test ma ġiex diżinjat li jindirizza l-mekkaniżmi indiretti tal-fototossiċità, l-effetti tal-metaboliti tas-sustanza tat-test, jew l-effetti tat-taħlitiet.
         Billi l-użu tas-sistemi metabolizzanti huwa rekwiżit ġenerali għat-testijiet kollha in vitro għall-basra ta’ potenzjal ġenotossiku jew karċinoġeniku, s’issa, fil-każ tal-fototossikoloġija, hemm biss eżempji rari fejn it-trasformazzjoni metabolika hija meħtieġa biex il-kimika taġixxi bħala fototissinu in vivo jew in vitro. Għalhekk, la jitqies meħtieġ u lanqas xjentifikament ġustifikat li dan it-test isir b’sistema ta’ attivazzjoni metabolika.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Irradjanza: fl-intensità ta’ inċident tad-dawl ultravjola (UV) jew ta’ dawl viżibbli fuq wiċċ, imkejjel f’W/m2 or mW/cm2.
         
            Doża ta’ dawl: il-kwantità (= intensità × ħin) ta’ radjazzjoni ultravjola (UV) jew viżibbli fuq wiċċ, espresso f’Joules (= W × s) għal kull arja tal-wiċċ, eż. J/m2 jew J/cm2.
         
            Wavebands tad-Dawl UV: l-indikazzjonijiet rakkomandati mis-CIE (Commission Internationale de L’Eclairage) huma: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) u UVC (100-280 nm). Indikazzjonijiet oħrajn jintużaw ukoll; id-diviżjoni bejn UVB u UVA spiss titqiegħed bħala 320 nm, u l-UVA tista’ tinqasam f’UV-A1 u UV-A2 u jsir qsim f’madwar 340 nm.
         
            Il-vijabilità taċ-ċelloli: parametru li jkejjel l-attività totali ta’ popolazzjoni ta’ ċelloli (eż. l-użu taż-żebħa vitali Aħmar Newtrali fil-liżożomi ċellulari), li, skond il-punt tat-tmiem imkejjel u d-diżinn tat-test użat, tikkorrelata ma’ l-għadd totali u/jew il-vitalità taċ-ċelloli.
         
            Il-vijabilità taċ-ċelloli relattiva: il-vijabilità taċ-ċelloli espressa b’relazzjoni mal-kontrolli solventi (negattivi) li ntużaw fil-proċedura sħiħa tat-test (jew +Irr jew -Irr) iżda mhux ittrattati bil-kimika tat-test.
         
            PIF (Photo-Irritation-Factor – Fattur tal-Foto-Irritazzjoni): fattur iġġenerat bit-tqabbil ta’ żewġ konċentrazzjonijiet effettivi ndaqs (IC50) tal-kimika tat-test miksuba fin-nuqqas (-Irr) u fil-preżenza (+Irr) ta’ irradjazzjoni mhux ċitotossika b’dawl UVA/vis.
         
            IC50: il-konċentrazzjoni tal-kimika tat-test li biha l-vijabilità taċ-ċelloli titnaqqas b’50 %.
         
            MPE (Mean-Photo-Effect – Foto-Effett-Medju): kejl derivat mill-analiżi matematika tal-kurvi tar-reazzjoni tal-konċentrazzjoni miksuba fin-nuqqas (-Irr) u fil-preżenza (+Irr) ta’ irradjazzjoni mhux ċitotossika bid-dawk UVA/vis.
         
            Fototossiċità: reazzjoni tossika akuta li hija eliċitata wara l-ewwel espożizzjoni tal-ġilda ma’ xi kimika u l-espożizzjoni sussegwenti għad-dawl, jew li hija indotta b’mod simili mill-irradjazzjoni tal-ġilda wara l-amministrazzjoni sistemika ta’ kimika.
         1.3.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         It-test tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU huwa bbażat fuq paragun taċ-ċitotossiċità ta’ kimika meta tiġi ttestjata fil-preżenza u fin-nuqqas ta’ espożizzjoni għal doża mhux ċitotossika ta’ dawl tax-xemx simulata. Iċ-ċitotossiċità f’dan it-test hija espressa bħal tnaqqis dipendenti fuq il-konċentrazzjoni ta’ l-użu taż-żebgħa vitali Aħmar Newtrali meta mkejjel 24 siegħa wara t-trattament bil-kimika tat-test u l-irradjazzjoni (10). L-Aħmar Newtrali huwa żebgħa katjonika dgħajfa li tippenetra t-tessut taċ-ċelloli malajr bin-nuqqas ta’ diffiżjoni, u takkumula b’mod interċellolari fil-liżożomi. L-alterazzjonijiet tal-wiċċ tat-tessut sensittiv liżożomali jwasslu għall-fraġilità liżożomali u tibdil ieħor li gradwalment isiru irriversibbli. Dan it-tibdil ikkaġunat mill-azzjoni tax-xenobjotiċi jirriżulta f’użu u rbit mnaqqsa ta’ l-Aħmar Newtrali. Għalhekk huwa possibbli li ssir distinzjoni bejn iċ-ċelloli vijabbli, dawk danneġġjati u dawk mejtin, li huwa l-bażi ta’ dan it-test.
         Iċ-ċelloli Balb/c 3T3 jinżammu f’kultura għal 24 siegħa għall-formazzjoni ta’ monosaffi. Imbagħad żewġ plattini 96-well għal kull kimika tat-test jiġi pre-inkubati bi tmien konċentrazzjonijiet differenti tas-sustanza tat-test għal siegħa. Wara dan, waħda miż-żewġ plattini hija esposta għall-ogħla doża ta’ irradjazzjoni mhux ċitotossika filwaqt li l-plattina l-oħra tinżamm fid-dlam. Fiż-żewġ plattini il-mezz tat-trattament huwa sostitwit mill-mezz tal-kultura u wara 24 siegħa oħra ta’ inkubazzjoni, il-vijabilità taċ-ċelloli hija ddeterminata bl-użu ta’ l-Aħmar Newtrali. Il-vijabilità taċ-ċelloli hija espressa bħala persentaġġ tal-kontrolli tas-solvent mhux ittrattati u hija kkalkolata għal kull konċentrazzjoni tat-test. Biex jitbassar il-potenzjal fototossiku, ir-reazzjonijiet tal-konċentrazzjoni miksuba fil-preżenza u fin-nuqqas ta’ l-irradjazzjoni huma mqabbla, normalment fil-livell ta’ l-IC50, jiġifieri l-konċentrazzjoni li tnaqqas il-vijabilità taċ-ċelloli għal 50 % meta mqabbel mal-kontrolli mhux ittrattati.
         1.4.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.4.1   Il-preparazzjonijiet
         1.4.1.1.   Iċ-ċelloli
         Linja permanenti tal-fibroblast taċ-ċelloli tal-ġrieden, Balb/c 3T3, klonu 31, jew mill-American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, Stati Uniti, jew mill-European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Renju Unit, intużat fl-istudju tal-validazzjoni, u għalhekk huwa rakkomandat il-ksib minn depożitarju taċ-ċelloli kkwalifikat sew. Ċelloli jew linji taċ-ċelloli oħrajn jistgħu jintużaw bl-istess proċedura tat-test jekk il-kundizzjonijiet tal-kultura huma adattati għall-bżonnijiet speċifiċi taċ-ċelloli, iżda l-ekwivalenza għandha tintwera.
         Iċ-ċelloli għandhom jiġu ċċekkjati b’mod regolari għan-nuqqas tal-kontaminazzjoni tal-mikoplażma u jintużaw biss jekk ma tinstabx kontaminazzjoni (11).
         Huwa importanti li s-sensittività għall-UV taċ-ċelloli hija vverifikata b’mod regolari skond il-proċedura tal-kontroll tal-kwalità deskritta f’dan il-metodu. Minħabba li s-sensittività taċ-ċelloli għall-UVA tista’ tiżdied bin-numru ta’ passaġġi, għandhom jintużaw ċelloli Balb/c 3T3 tan-numru l-aktar baxx ta’ passaġġi possibbli li jista’ jinkiseb, preferibbilment inqas minn 100 (ara t-taqsima 1.4.2.2.2 u l-Anness 2).
         1.4.1.2.   Il-kundizzjonijiet tal-mezzi u tal-kultura
         Għandhom jintużaw mezzi tal-kultura u kundizzjonijiet ta’ l-inkubazzjoni xierqa għall-passaġġ rutin taċ-ċelloli u matul il-proċedura tat-test, eż. għaċ-ċelloli Balb/c 3T3 dawn huma DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) supplimentati b’10 % seru ta’ l-għoġol għadu jitwieled, 4 mM glutamina, peniċillina (100 IU), u streptomycin (100 μg/mL), u inkubazzjoni umidifikata f’temperatura ta’ 37 oC, 5-7,5 % CO2 skond il-buffer (ara t-taqsima 1.4.1.4, tieni paragrafu.). Huwa ta’ importanza partikolari li l-kundizzjonijiet tal-kultura taċ-ċelloli jiżguraw ħin taċ-ċiklu taċ-ċelloli fil-firxa normali storika taċ-ċelloli jew tal-linja taċ-ċelloli użati.
         1.4.1.3.   Il-preparazzjoni tal-kulturi
         Iċ-ċelloli minn kulturi ta’ ħażniet iffriżati huma miżrugħa f’mezz tal-kultura ta’ densità approssimata u subkulturati għall-inqas darba qabel ma jintużaw fit-test tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU.
         Iċ-ċelloli użati għat-test tal-fototossiċità jinżergħu fid-densitàż xierqa sabiex il-kulturi ma jilħqux konfluwenza sa l-aħħar tat-test, jiġifieri meta l-vijabilità hija ddeterminata 48 siegħa wara ż-żriegħ taċ-ċelloli. Għaċ-ċelloli Balb/c 3T3 imkabbra fi plattini 96-well, id-densità rrakkomandata taż-żriegħ taċ-ċelloli hija ta’ 1 x 104 ċelloli għal kull well.
         Għal kull test iċ-ċelloli kimiċi jiġu miżrugħa b’mod identiku f’żewġ plattini separati 96-well, li mbagħad jitgħaddew b’mod konkorrenti mill-proċedura sħiħa tat-test taħt kundizzjonijiet ta’ kultura identitċi ħlief għat-terminu sħiħ meta waħda mill-plattini tiġi irradjata (+Irr) u l-oħra tinżamm fid-dlam (-Irr).
         1.4.1.4.   Il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test
         Is-sustanzi tat-test għandhom jiġu ppreparati friski, immedjatament qabel l-użu kemm-il darba d-data ma turix l-istabilità tagħhom meta huma maħżuna. Huwa rrakkomandat li l-immaniġġjar kimiku kollu u t-trattament inizzjali taċ-ċelloli jsiru taħt kundizzjonijiet tad-dawl li jevitaw il-fotoattivazzjoni jew id-degradazzjoni tas-sustanza tat-test qabel l-irradjazzjoni.
         Il-kimiċi tat-test għandhom jinħallu f’taħlitiet ta’ mluħ buffered, eż. Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS), jew taħlitiet buffer oħrajn fiżjoloġikament ibbilanċjati, li għandhom ikunu ħelsin minn komponenti ta’ proteini, komponenti li jassorbu d-dawl (eż. kuluri li jindikaw il-pH u vitamini) sabiex tiġi evitata l-interferenza matul l-irradjazzjoni. Ladarba matul l-irradjazzjoni ċ-ċelloli jinżammu għal madwar 50 minuta barra mill-inkubatur ta’ CO2, għandu jkun hemm attenzjoni li tiġi evitata l-alkalizzazzjoni. Jekk jintużaw buffers dgħajfin bħall-EBSS dan jista’ jinkiseb billi ċ- ċelloli jiġu inkubati f’7,5 % CO2. Jekk iċ-ċelloli jiġu inkubati f’5 % CO2 biss, għandu jingħażel buffer aktar qawwi.
         Il-kimiċi tat-test ta’ solubbiltà limitata fl-ilma għandhom jinħallu f’solvent xieraq. Jekk jintuża solvent, dan għandu jkun preżenti f’volum kostanti fil-kulturi kollha, jiġifieri fil-kontrolli negattivi (solventi) kif ukoll fil-konċentrazzjonijiet tal-kimika tat-test, u għandhom ikunu mhux ċitotossiċi f’dik il-konċentrazzjoni. Il-konċentrazzjonijiet tal-kimika tat-test għandhom jingħażlu sabiex jiġu evitati taħlitiet preċipitati jew imsaħħbin.
         Dimethylsulphoxide (DMSO) u l-etanol (ETOH) huma s-solventi rrakkomandati. Jistgħu jkunu xierqa solventi oħrajn ta’ ċitotossiċità baxxa. Qabel ma jintużaw, is-solventi kollha għandhom jiġu stmati għal karatteristiċi xierqa, eż. reazzjoni mal-kimika tat-test, tnaqqis ta’ l-effett fototossiku, proprjetajiet scavenging radikali u/jew stabilità kimika fis-solvent.
         It-taħlit fil-vortiċi u/jew is-sonikazzjoni u/jew it-tisħin sa temperatura xierqa jistgħu jintużaw biex tiġu mgħejuna s-solubilazzjoni kemm-il darba dan ma jaffettwax l-istabilità tal-kimika tat-test.
         1.4.1.5.   Il-Kundizzjonijiet ta’ l-Irradjazzjoni
         1.4.1.5.1.   L-għajn tad-dawl
         
         L-għażla ta’ għajn xieraq u ta’ filtri tad-dawl huwa fattur kruċjali fl-ittestjar tal-fototossiċità. Id-dawl ta’ l-UVA u tar-reġjuni viżibbli normalment huwa normalment assoċjat mar-reazzjonijiet fototossiċi in vivo (3)(12), filwaqt li ġeneralment il-UVB huwa inqas rilevanti iżda huwa ċitotossiku ħafna; iċ-ċitotossiċità tiżdied 1 000-darba għaliex il-wavelength jinbidel minn 313 għal 280 nm (13). Il-kriterji għall-għażla ta’ l-għajn tad-dawl xieraq għandhom jinklużu r-rekwiżit li l-għajd tad-dawl jagħti wavelengths assorbiti mill-kimika tat-test (spettru ta’ l-assorbiment) u li d-doża tad-dawl (li tista’ tinkiseb f’ħin ta’ espożizzjoni raġonevoli) għandha tkun suffiċjenti biex jinżammu l-kimiċi magħrufin li huma fotoċitotossiċi. Barra minn dan, il-wavelengths u d-dożi m’għandhomx ikunu ta’ ħsara żejda għas-sistema tat-test, eż. l-emissjoni tas-sħana (ir-reġjun ta’ l-infra-aħmar).
         Is-simulazzjoni tad-dawl tax-xemx bis-simulaturi tax-xemx titqies li hija l-għajn ta’ dawl artifiċjali ottimali. Id-distribuzzjoni ta’ l-enerġija ta’ l-irradjazzjoni tas-simulatur tax-xemx iffiltrat għandha tkun qrib dik tad-dawl tal-ġurnata barra mogħtija f’(14). Kemm l-arki ta’ Xenon u arki ta’ alid ta’ merkurju-metall (doped) jintużaw bħala simulaturi tax-xemx (15). Ta’ l-aħħar għandu l-vantaġġ li jagħti inqas sħana u huwa irħas, iżda kemm jaqbel mad-dawl tax-xemx huwa inqas perfett meta mqabbel ma’ dak ta’ l-arki tax-xenon. Minħabba li s-simulaturi kollha tax-xemx jagħtu kwantitajiet ta’ UVB sinjifikanti għandhom ikunu ffiltrati biex inaqqasu l- wavelengths ta l-UVB li huma ċitotossiċi ħafna. Minħabba li l-materjali tal-plastik tal-kultura taċ-ċelloli fihom stabbilizzanti tal-UV l-ispettru għandu jiġi mkejjel bl-istess tip ta’ għatu tal-plattina ta’ 96-well li se jintuża fl-analiżi. Irrispettivament mill-miżuri meħuda biex partijiet mill-ispettru jiġu mnaqqsa bl-iffiltrar jew b’effetti inevitabbli ta’ filtru tat-tagħmir, l-ispettru rrekordjat ’l isfel minn dawn il-filtri m’għandhomx jiddevjaw mid-dawl tal-ġurnata barra standardizzat (14). Eżempju tad-distribuzzjoni ta’ l-irradjanza spettrali tas-simulatur tax-xemx iffiltrat użat fl-istudju tal-validazzjoni tat-test tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU jingħata f’(8)(16). Ara wkoll l-Anness 2 Figura 1.
         1.4.1.5.2   Id-Dożimetrija
         
         L-intensità tad-dawl (irradjanza) għandha tiġi ċċekkjata b’mod regolari qabel kull test tal-fototossiċità bl-użu ta’ miter ta’ l-UV xieraq tal-broadband. L-intensità għandha titkejjel bl-istess tip ta’ għatu tal-plattina ta’ 96-well li se jintuża fl-analiżi. Il-miter ta’ l-UV għandu jkun ġie kkalibrat għall-għajn. Il-ħidma tal-miter ta’ l-UV għandha tiġi ċċekkjata, u għal dan l-għan l-użu ta’ miter ta’ l-UV ieħor, ta’ riferenza, ta’ l-istess tip u ta’ kalibrazzjoni identika huwa rrakkomandat. Idealment, f’intervalli akbar, għandu jintuża spettroradjometru biex titkejjel l-irradjanza spettrali ta’ l-għajn tad-dawl iffiltrat u biex tiġi ċċekkjata l-kalibrazzjoni tal-miter ta’ l-UV tal-broadband.
         Doża ta’ 5 J/cm2 (kif imkejjel fil-firxa ta’ l-UVA) ġiet determinata li mhijiex ċitotossika għaċ-ċelloli Balb/c 3T3 u li hija qawwija biżżejjet biex teċċita lill-kimiċi biex jeliċitaw reazzjonijiet fototossiċi, (6) (17) eż. biex jinkiseb 5 J/cm2 f’perjodu ta’ żmien ta’ 50 min, l-irradjanza ġiet aġġustata għal 1,7 mW/cm2. Ara l-Anness 2 Figura 2. Jekk tintuża linja oħra ta’ ċelloli jew għajn ta’ dawl differenti, id-doża ta’ l-irradjazzjoni tista’ tkun trid tiġi kkalibrata sabiex jista’ jingħażel reġimen tad-doża li ma jagħmilx ħsara liċ-ċelloli iżda li hija biżżejjed biex teċċita fototossini standard. Il-ħin ta’ l-espożizzjoni għad-dawk huwa kkalkolat b’dan il-mod:
         
                     
                        
                  
                  
                     (1J = 1 Wsec)
                  
               1.4.2   Il-kundizzjonijiet tat-test
         1.4.2.1   Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test
         Il-firxiet tal-konċentrazzjonijiet ta’ kimika ttestjata fil-preżenza (+Irr) u fin-nuqqas (-Irr) tad-dawl għandhom jiġu ddeterminati b’mod xieraq f’analiżijiet tas-sejba tal-firxa tad-dożi. Jista’ jkun utli li s-solubbiltà tiġi smtata fil-bidu u fis-60 min (jew kwalunkwe ħin ta’ trattament huwa meħtieġ), għaliex is-solubbiltà tista’ tinbidel maż-żmien jew matul l-espożizzjoni. Biex tiġi evitata t-tossiċità indotta minn kundizzjonijiet ta’ kultura mhux xierqa jew minn kimiċi ta’ aċidità jew alkalinità għolja, il-pH tal-kulturi taċ-ċelloli biż-żjieda tal-kimika tat-test għandu jkun fil-firxa 6,5 – 7,8.
         L-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test għandha tkun ġewwa l-kundizzjonijiet fiżjoloġiċi tat-test, eż. għandhom jiġu evitati l-istress ożmotiku u dak tal-pH. Skond il-kimika tat-test, jista’ jkun meħtieġ li jitqiesu karatteristiċi oħrajn fiżiċi-kimiċi bħala fatturi li jillimitaw logħla konċentrazzjoni tat-test. Għal sustanzi relattivament insolubbli li mhumiex tossiċi f’konċentrazzjonijiet sal-punt tas-saturazzjoni, l-ogħla konċentrazzjoni li tista’ tinkiseb għandha tiġi ttestjata. B’mod ġenerali, il-preċipitazzjoni tal-kimika tat-test fi kwalunkwe mill-konċentrazzjonijiet tat-test għandha tiġi evitata. Il-konċentrazzjoni massima ta’ sustanza tat-test m’għandhiex teċċedi 1 000 μg/mL; l-ożmolarità m’għandhiex teċċedi 10 mmolar. Għandu jintuża serje ta’ taħlit ġeometriku ta’ 8 konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test b’fattur kostanti tat-taħlit (ara t-taqsima 2.1, tieni paragrafu).
         Jekk hemm informazzjoni (minn esperiment għas-sejba tal-firxiet) li l-kimika tat-test mhijiex ċitotossika sal-konċentrazzjoni tal-limitu fl-esperiment fid-dlam (-Irr), iżda hija ċitotossika ħafna meta tiġi irradjata (+Irr), il-firxiet tal-konċentrazzjoni li għandhom jingħażlu għall-esperiment jistgħu jkunu differenti minn dawk magħżula għall-esperiment (–Irr) biex jintlaħaq ir-rekwiżit tal-kwalità xierqa tad-data.
         1.4.2.2   Il-Kontrolli
         1.4.2.2.1   Is-sensittività għar-radjazzjoni taċ-ċelloli, l-istabbiliment tad-data storika:
         
         Iċ-ċelloli għandhom jiġu ċċekkjati regolarment (madwar kull ħames passaġġ) għal sensittività għall-għajn tad-dawl billi tiġi stmata l-vijabbiltà tagħhom wara espożizzjoni għal dożi akbar ta’ l-irradjazzjoni. Bosta dożi ta’ irradjazzjoni, inklużi livelli sostanzjalment ogħla minn dawk użati għat-test tal-Fototossiċità 3T3 NRU għandhom jintużaw f’din l-istima. Dawn id-dożi huma kkwantitati bil-mod l-aktar faċli bil-kejl tal-partijiet UV ta’ l-għajn tad-dawl. Iċ-ċelloli jiġu miżrugħa bid-densità użata fit-test tal-fototissiċità in vitro 3T3 NRU u irradjati l-għada. Il-vijabbiltà taċ-ċelloli mbagħad tiġi ddeterminata jum wara permezz ta’ l-użu ta’ l-Aħmar Newtrali. Għandu jintwera li l-ogħla doża riżultanti li mhijiex ċitotossika (eż. fl-istudju tal-validazzjoni: 5 J/cm2 [UVA]) kienet biżżejjed biex il-materjali ta’ riferenza (Tabella 1) jiġu kklassifikati tajjeb.
         1.4.2.2.2   Is-sensittività għar-radjazzjoni, l-iċċekkjar tat-test kurrenti:
         
         It-test jilħaq il-kriterji ta’ kwalità jekk il-kontrolli irradjati negattivi/solventi juru vijabbiltà ta’ aktar minn 80 % meta mqabbel ma negattivi/solventi mhux irradjati.
         1.4.2.2.3   Il-vijabbiltà tal-kontrolli solventi
         
         Id-densità ottika assoluta (OD540 NRU) ta’ l-Aħmar Newtrali estratt mill-kontrolli tas-solventi jindika jekk il-1 × 104 ċelloli miżrugħa f’kull well kibrux b’ħin ta’ l-irduppjar normali matul il-jumejn ta’ l-analiżi. Test jilħaq il-kriterji ta’ l-aċċettazzjoni jekk l-OD540 NRU medju tal-kontrolli mhux ittrattati huwa ≥ 0,4 (jiġifieri madwar għoxrin darba daqs l-assorbenza tas-solvent fl-isfond).
         1.4.2.2.4   Il-kontroll pożittiv:
         
         Kimika fototossika magħrufa għandha tiġi ttestjata fl-istess ħin ma’ kull test tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU. Huwa rakkomandat il-chlorpromazine (CPZ). Għal CPZ ittestjat bil-protokoll standard fit-test tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU, ġew definiti dawn il-kriterji li ġejjin ta’ l-aċċettazzjoni tat-test: CPZ irradjat (+Irr): IC50 = 0,1 sa 2,0 μg/ml, CPZ mhux irradjat (-Irr): IC50 = 7,0 sa 90,0 μg/mL. l-Fattur tal-Foto Irritazzjoni (PIF), għandu jkun > 6. Il-ħidma storika tal-kontroll pożittiv għandha tiġi mmonitorjata.
         Kimiċi oħrajn fototossiċi, xierqa għall-klassi tal-kimika jew il-karatteristiċi tas-solubbiltà tal-kimika li qed tiġi evalwata, jistgħu jintużaw bħala l-kontrolli pożittivi konkurrenti minflok chlorpromazine.
         1.4.3   Il-proċedura tat-test (6)(7)(8)(16)(17):
         1.4.3.1   L-1 jum:
         Ferra’ 100 μL materjal tal-kultura fil-kontenituri periferali fi plattina tal-mikrotitru tal-kultura tat-tessut b’96-well (= vojta). F’dawj li jifdal, ferra’ 100 μL sospensjoni ta’ ċelloli ta’ 1 × 105 ċelloli/mL fil-mezz tal-kultura (= 1 × 104 ċelloli/well). Għandhom jiġu ppreparati żewġ plattini għal kull serje ta’ konċentrazzjonijiet individwali tas-sustanza tat-test, u għall-kontrolli tas-solventi u dawk pożittivi.
         Inkuba ċ-ċelloli għal 24 siegħa (ara t-taqsima 1.4.1.2) sakemm jiffurmaw nofs monosaff konfluwenti. Dan il-perjodu ta’ inkubazzjoni jippermetti l-irkupru taċ-ċelloli, l-aderenza u t-tkabbir esponenzjali.
         1.4.3.2   It-2 jum:
         Wara l-inkubazzjoni, ferra’ l-mezz tal-kultura miċ-ċelloli u aħsel bl-attenzjoni b’150 μL tat-taħlita buffered użata għall-inkubazzjoni. Żid 100 μL tal-buffer li jkun fih il-konċentrazzjoni xierqa tal-kimika jew tas-solvent tat-test (kontroll tas-solvent). Applika 8 konċentrazzjonijiet differenti tal-kimika tat-test. Inkuba ċ-ċelloli bis-sustanza tat-test fid-dlam għal 60 minuta (ara t-taqsima 1.4.1.2 u 1.4.1.4 tieni paragrafu).
         Miż-żewġ plattini ppreparati għal kull serje ta’ konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test u l-kontrolli, tingħażel waħda, ġeneralment bl-addoċċ, għad-determinazzjoni taċ-ċitotossiċità (-Irr) (jiġifieri l-plattina tal-kontroll), u waħda (il-plattina tat-trattament) għad-determinazzjoni tal-fototossiċità (+Irr).
         Biex issir l-espożizzjoni +Irr, irradja ċ-ċelloli f’temperatura ambjentali għal 50 minuta mill-għatu tal-plattina 96-well bl-ogħla doża ta’ radjazzjoni li mhijiex ċitotossika (ara wkoll l-Anness 2). Żomm il-plattini mhux irradjati (-Irr) f’temperatura tal-kamra f’kaxxa mudlama 50 min (= ħin ta’ l-espożizzjoni għad-dawl).
         Ferra’ t-taħlita tat-test u aħsel bir-reqqa bl-attenzjoni b’150 μL tat-taħlita buffered użata għall-inkubazzjoni, iżda li ma fihiex il-materjal tat-test. Issostitwixxi l-buffer bil-mezz tal-kultura u inkuba (ara t-taqsima 1.4.1.2.) għal lejl sħiħ (18-22 h).
         1.4.3.3   It-3 jum:
         1.4.3.3.1   L-evalwazzjoni mikroskopika
         
         Iċ-ċelloli għandhom jiġu eżaminati għat-tkabbir, għall-morfoloġija, u għall-integrità tal-monosaff bl-użu ta’ mikroskopu b’fażi tal-kuntrast. It-tibdil fil-morfoloġija taċ-ċelloli u l-effetti fuq it-tkabbir taċ-ċelloli għandu jiġi rrekordjat.
         1.4.3.3.2   It-test ta’ l-użu ta’ l-Aħmar Newtrali
         
         Aħsel iċ-ċelloli b’150 μL buffer imsaħħan minn qabel. Neħħi t-taħlita tal-ħasil billi ttektek bil-mod. Żid 100 μL ta’ 50 μg/mL Aħmar Newtrali (NR) (3-amino-7-dimethylamino-2-methylphenazine hydrochloride, numru EINECS 209-035-8; numru CAS 553-24-2; C.I. 50040) f’mezz mingħajr serum (16) u inkuba kif deskritt fil-paragrafu 1.4.1.2., għal 3 h.
         Wara l-inkubazzjoni neħħi l-mezz ta’ NR, u aħsel iċ-ċelloli b’150 μL mill-buffer. Ferra’ u neħħi l-żejjed bl-ixxugar jew biċ-ċentrifugazzjoni.
         Żid preċiżament 150 μL taħlita NR desorb (ippreparata friska 49 partijiet ilma + 50 partijiet etanol + 1 parti aċidu aċetiku).
         Ħawwad il-plattina tal-mikrotitru bil-mnod fuq oġġett li jħawwad il-plattina tal-mikrotitru għal 10 minuti sakemm l-NR ikun ġie estratt miċ-ċelloli u jkun iffurma taħlita omoġena. Kejjel id-densità ottika ta’ l-estratt ta’ l-NR f’540 nm fi spettrofotometru, bl-użu tal-vojt bħala referenza. Issejvja d-data f’format xieraq ta’ fajl elettroniku għall-analiżi wara.
         2.   ID-DATA
         IL-KWALITÀ U L-KWANTITÀ TAD-DATA
         Id-data tat-test tippermetti analiżi sinjifikanti tar-reazzjoni tal-konċentrazzjoni miksuba fil-preżenza fin-nuqqas ta’ l-irradjazzjoni, u jekk possibbli l-konċentrazzjoni tal-kimika tat-test li biha l-vijabilità hija mnaqqsa għal 50 % (IC50). Jekk tinsab iċ-ċitotossiċità, kemm il-firxa tal-konċentrazzjoni kif ukoll l-interċett tal-konċentrazzjonijiet individwali għandhom jiġu stabbiliti b’tali mod li tkun possibbli li toqgħod kurva għad-data esperimentali.
         Għar-riżultati kemm ċarament pożittivi kif ukoll dawk ċarament negattivi (ara t-taqsima 2.3, l-ewwel paragrafu), l-esperiment primarju, sostnut minn esperiment(i) wieħed jew aktar preliminary tas-sejba tad-dożi, jista’ jkun biżżejjed.
         Ir-riżultati ekwivoċi, li huma fil-limitu, jew mhux ċari għandhom jiġu ċċarati bl-użu ta’ aktar ittestjar (ara wkoll it-taqsima 2.4, tieni paragrafu). F’dawn il-każijiet, il-modifika tal-kundizzjonijiet esperimentali għandha tiġi kkunsidrata. Il-kundizzjonijiet esperimentali li jistgħu jiġu mmodifikati jinkludu l-firxa jew l-ispazjar tal-konċentrazzjoni, il-ħin ta’ qabel l-inkubazzjoni, u l-ħin ta’ l-espożizzjoni għall-irradjazzjoni. Ħin iqsar ta’ espożizzjoni jista’ jkun xieraq għall-kimiċi li mhumiex stabbli fl-ilma.
         L-EVALWAZZJONI TAR-RIZULTATI
         Biex tkun possibbli l-evalwazzjoni tad-data, jista’ jiġi kkalkolat Fattur tal-Foto-Irritazzjoni (PIF) jew Foto Effett Medju (MPE – mean photo effect).
         Għall-kalkolu tal-miżuri tal-fotoċitossiċità (ara taħt), is-sett ta’ valuri diskreti tar-reazzjoni tal-konċentrazzjoni għandu jiġi approssimat b’kurva xierqa kontinwa tar-reazzjoni tal-konċentrazzjoni (mudell). It-tqegħid tal-kurva għad-data spiss isir b’metodu ta’ regressjoni mhux lineari (18). Biex tiġi stmata l-influwenza tal-varjabbiltà tad-data fuq il-kurva mqiegħda hija rrakkomandata proċedura bootstrap.
         Fattur tal-Foto-Irritazzjoni (PIF) jiġi kkalkolat bl-użu ta’ din il-formula:
         
            
         Jekk ma jistax jiġi kkalkolat l-IC50 fil-preżenza jew fin-nuqqas tad-dawl, PIF ma jistax jiġi ddeterminat għall-materjal tat-test. Il-foto effett medju (MPE) huwa bbażat fuq it-tqabbil tal-kurvi sħaħ tar-reazzjoni tal-konċentrazzjoni (19). Huwa ddefinit bħala l-medju bil-piż tul sett rappreżentattiv ta’ valuri tal-foto effett
         
            
         Il-foto-effett PEc fi kwalunkwe konċentrazzjoni C huwa definit bħala l-prodott ta’ l-effett tar-reazzjoni REc u l-effett tad-doża DEc i.e. PEc = REc x DEc. L-effett tar-reazzjoni REc huwa d-differenza bejn ir-reazzjonijiet osservati fin-nuqqas u fil-preżenza tad-dawl, jiġifieri. REc = Rc (-Irr) – Rc (+Irr). L-effett tad-doża jingħata b’:
         
            
         fejn C* tirrappreżenta l-konċentrazzjoni ta’ l-ekwivalenza, jiġifieri l-konċentrazzjoni li fiha r-reazzjoni ta’ +Irr hija daqs ir-reazzjoni ta’ –Irr fil-konċentrazzjoni C. Jekk C* ma tista’x tiġi determinata minħabba li l-valuri tar-reazzjoni tal-kurva +Irr huma sistematikament ogħla jew aktar baxxi minn RC(-Irr) l-effett tad-doża huwa stabbilit bħala 1. Il-fatturi tal-piżijiet wi jingħataw bl-ogħla valur ta’ reazzjoni, jiġifieri wi = MAX {Ri (+Irr), Ri (-Irr) }. Ix-xibka tal-kaxxi tal-konċentrazzjoni Ci tingħażel b’tali mod li l-istess għadd ta’ punti jaqa’ taħt kull wieħed mill-intervalli tal-konċentrazzjoni definiti mill-valuri tal-konċentrazzjoni użati fl-esperiment. Il-kalkolu ta’ l-MPE huwa ristrett għall-valur massimu ta’ konċentrazzjoni li fiha għall-inqas waħda miż-żewġ kurvi għadha turi valur ta’ reazzjoni ta’ mhux inqas minn 10 %. Jekk din il-konċentrazzjoni massima hija ogħla mill-ogħla konċentrazzjoni użata fl-esperiment +Irr il-parti residwali tal-kurva +Irr hija stabbilita bħala l-valur ta’ reazzjoni “0”. Skond jekk il-valur ta’ l-MPE huwiex akbar minn valur ta’ limitu magħżul tajjeb (MPEc = 0,15), il-kimika hija kklassifikata bħala fototossika.
         Pakkett ta’ softwer għall-kalkolu tal-PIF u tal-MPE huwa disponibbli minn (20).
         L-INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Fuq bażi ta’ l-istudju tal-validazzjoni (8), sustanza tat-test b’PIF < 2 jew MPE < 0,1 tbassar: “ebda fototossiċità”. PIF > 2 u < 5 jew MPE > 0,1 u < 0,15 tbassar: “fototossiċità probabbli”; u PIF > 5 jew MPE > 0,15 tbassar: “fototossiċità”.
         Għal kwalunkwe laboratorju li jista’bbilixxi din l-analiżi għall-ewwel darba, il-materjali ta’ riferenza elenkati fit-Tabella 1 għandhom jiġu ttestjati qabel ma jiġu ttestjati s-sustanzi tat-test għall-istima fototossika. Il-valuri tal-PIF jew ta’ l-MPE għandhom ikunu qrib il-valuri msemmija fit-Tabella 1.
         
            Tabella 1
         
         
                     Isem il-kimika
                  
                  
                     Nru EINECS
                  
                  
                     Nru CAS
                  
                  
                     PIF
                  
                  
                     MPE
                  
                  
                     L-ogħla punt ta’ l-assorbim ent
                  
                  
                     Solvent (3)
                     
                  
               
                     Amiodarone HCL
                  
                  
                     243-293-2
                  
                  
                     [19774-82-4]
                  
                  
                     >3,25 
                  
                  
                     0,27 -0,54 
                  
                  
                     242 nm
                     300 nm
                     (fl-ispalla)
                  
                  
                     ehanol
                  
               
                     Choloropromazi ne HCL
                  
                  
                     200-701-3
                  
                  
                     [69-09-0]
                  
                  
                     >14,4 
                  
                  
                     0,33 -0,63 
                  
                  
                     309 nm
                  
                  
                     etanol
                  
               
                     Norfloxacin
                  
                  
                     274-614-4
                  
                  
                     [70458-96-7]
                  
                  
                     >71,6 
                  
                  
                     0,34 -0,90 
                  
                  
                     316 nm
                  
                  
                     acetonitrile
                  
               
                     Anthracene
                  
                  
                     204-371-1
                  
                  
                     [120-12-7]
                  
                  
                     >18,5 
                  
                  
                     0,19 -0,81 
                  
                  
                     356 nm
                  
                  
                     acetonitrile
                  
               
                     Protoporphyrin IX, Disodium
                  
                  
                     256-815-9
                  
                  
                     [50865-01-5]
                  
                  
                     >45,3 
                  
                  
                     0,54 -0,74 
                  
                  
                     402 nm
                  
                  
                     etanol
                  
               
                     L-Histidine
                  
                  
                      
                  
                  
                     [7006-35-1]
                  
                  
                     no PIF
                  
                  
                     0,05 -0,10 
                  
                  
                     211 nm
                  
                  
                     Ilma
                  
               
                     Hexacholorophe ne
                  
                  
                     200-733-8
                  
                  
                     [70-30-4]
                  
                  
                     1,1 -1,7 
                  
                  
                     0,00 -0,05 
                  
                  
                     299 nm
                     317 nm
                     (fl-ispalla)
                  
                  
                     etanol
                  
               
                     Sodium lauryl sulphate
                  
                  
                     205-788-1
                  
                  
                     [151-21-3]
                  
                  
                     1,0 -1,9 
                  
                  
                     0,00 -0,05 
                  
                  
                     l-ebda assorbim ent
                  
                  
                     Ilma
                  
               L-INTERPRETAZZJONI TAD-DATA
         Jekk l-effetti fototossiċi huma osservati biss fl-ogħla test tal-konċentrazzjoni (speċjalment għall-kimiċi tat-test li jinħallu fl-ilma) jistgħu jkunu meħtieġa kunsiderazzjonijiet addizzjonali għall-istima ta’ l-azzard. Dawn jistgħu jinkludu d-data dwar l-assorbiment mill-ġilda, u l-akkumulazzjoni tal-kimika fil-ġilda u/jew data minn testijiet oħrajn, eż. l-ittestjar tal-kimika fil-ġilda ta’ l-annimali jew umana in vitro, jew mudelli tal-ġilda.
         Jekk ma tintwera ebda tossiċità (+Irr u -Irr), u jekk is-solubilità llimitat il-konċentrazzjonijiet li setgħu jiġu ttestjati, il-kompatibilità tas-sustanza tat-test ma’ l-analiżi tista’ tiġi fid-dubju u t-testjar konfermatorju għandu jiġi kkonsidrat bl-użu, eż. ta’ mudell ieħor.
         3.   IR-RAPPORTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi għall-inqas din l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Is-Sustanza tat-Test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 id-data ta’ l-identifikazzjoni, ismijiet ġeneriċi komuni u n-numri IUPAC u CAS, jekk magħrufin;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-natura fiżika u safa;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-karatteristiċi fiżikokimiċi jekk inhuma rilevanti għat-twettiq ta’ l-istudju;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-ispettru ta’ l-assorbiment UV/vis;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-istabilità, u l-fotostabilità jekk magħrufin.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Solvent:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 solubilita tal-kimika tat-test fis-solvent;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 persentaġġ tas-solvent preżenti fil-mezz tat-trattament.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Iċ-ċelloli
                     
                                 —
                              
                              
                                 tip u għajn taċ-ċelloli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 nuqqas ta’ mycoplasma;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-għadd tal-mogħdija taċ-ċelloli, jekk magħruf;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Is-sensittività taċ-ċelloli għar-radjazzjoni, ddeterminata bit-tagħmir ta’ l-irradjazzjoni użat fit-test tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU;
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Il-kundizzjonijiet tat-test (1); inkubazzjoni qabel u wara t-trattament:
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 tip u kompożizzjoni tal-mezz tal-kultura;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kundizzjonijiet ta’ l-inkubazzjoni (konċentrazzjoni ta’ CO2; temperatura; umdità);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kemm iddum l-inkubazzjoni (qabel it-trattament; wara t-trattament).
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Il-kundizzjonijiet tat-test (2); trattament bil-kimika:
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 ir-raġuni għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet tal-kimika tat-test użati fil-preżenza u fin-nuqqas ta’ l-irradjazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 fil-każ ta’ solubilità limitata tal-kimika tat-test u ta’ nuqqas ta’ ċitotossiċità: ir-raġuni għall-ogħla konċentrazzjoni ttestjata;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tip u kompożizzjoni tal-mezz tat-trattament (taħlita ta’ melħ buffered);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kemm idum it-trattament kimiku.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Il-kundizzjonijiet tat-test (3); l-irradjazzjoni:
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 ir-raġuni għall-għażla ta’ l-għajn tad-dawl użat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 manifattur u tip ta’ għajn tad-dawl u radjometru;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 karatteristiċi ta’ l-irradjanza spettrali ta’ l-għajn tad-dawl;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 karatteristiċi ta’ trażmissjoni u assorbiment tal-fitru/i użat(i);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 karatteristiċi tar-radjometru u d-dettalji dwar il-kalibrazzjoni tiegħu;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 distanza ta’ l-għajn tad-dawl mis-sistema tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-irradjanza tal-UVA f’din id-distanza, espresso f’mW/cm2;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kemm iddum l-espożizzjoni tad-dawl UV/vis;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 doża ta’ l-UVA (irradjanza x ħin), espressa f’J/cm2;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 temperatura tal-kulturi taċ-ċelloli matul l-irradjazzjoni u l-kulturi taċ-ċelloli li jinżammu fid-dlam konkorrentement.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Il-kundizzjonijiet tat-test (4); test tal-vijabilità ta’ l-Aħmar Newtrali:
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 kompożizzjoni tal-mezz tat-trattament ta’ l-Aħmar Newtrali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kemm iddum l-inkubazzjoni ta’ l-Aħmar Newtrali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kundizzjonijiet ta’ l-inkubazzjoni (konċentrazzjoni ta’ CO2; temperatura; umdità);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kundizzjonijiet ta’ l-estrazzjoni ta’ l-Aħmar Newtrali (estrattant; kemm idum);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 
                                    wavelength użata għall-qari spettrofotometriku tad-densità ottika ta’ l-Aħmar Newtrali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tieni wavelength (referenza), jekk tintuża;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kontenut ta’ vojt ta’ l-ispettrofotometru, jekk użat.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 il-vijabilità taċ-ċelloli miksuba f’kull konċentrazzjoni tal-kimika tat-test, espressa f’persentaġġ ta’ vijabilità ta’ kontrolli solventi medji u konkorrenti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kurvi tar-reazzjonijiet tal-konċentrazzjoni (konċentrazzjoni tal-kimika tat-test vs. vijabilità relattiva taċ-ċelloli) miksuba f’esperimenti konkorrenti +Irr u -Irr;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 analiżi tal-kurvi tar-reazzjoni tal-konċentrazzjoni: jekk possibbli, il-komputazzjoni/kalkolu ta’ l-IC50 (+Irr) u IC50 (-Irr);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tqabbil ta’ żewġ kurvi tar-reazzjonijiet tal-konċentrazzjoni miksuba fil-preżenza u fin-nuqqas ta’ l-irradjazzjoni, bil-kalkolu tal-Fattur tal-Foto-Irritazzjoni (PIF), jew bil-kalkolu tal-Foto Effett Medju (MPE);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-kriterji ta’ l-aċċettazzjoni tat-test; il-kontroll konkurrenti tas-solvent:
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-vijabilità assoluta (densità ottika ta’ l-estratt ta’ l-Aħmar Newtrali) ta’ ċelloli irradjati u mhux irradjati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-data storika tal-kontrolli negattivi u dawk solventi; devjazzjonijiet medji u dawk standard;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kriterji ta’ l-aċċettazzjoni tat-test; kontroll pożittiv konkurrenti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 IC50(+Irr) u IC50(-Irr) u PIF/MPE tal-kimika tal-kontroll pożittiv;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-data storika tal-kontrolli pożittivi kimiċi: IC50(+Irr) u IC50(-Irr) u PIF/MPE; devjazzjonijiet medji u dawk standard.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni tar-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     1.
                  
                  
                     Lovell W.W. (1993). A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential. Toxic. In vitro 7: 95-102.
                  
               
                  
                     2.
                  
                  
                     Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic substances. In “Research Progress in Organic, Biological and Medicinal Chemistry” Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam. p XI-V.
                  
               
                  
                     3.
                  
                  
                     Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sladowski, D. (1994). In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 314-348.
                  
               
                  
                     4.
                  
                  
                     Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In “The science of Photobiology” Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New York. Tieni edizzjoni, p 79-110.
                  
               
                  
                     5.
                  
                  
                     OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.7 “Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water” Environment Directorate, OECD, Pariġi.
                  
               
                  
                     6.
                  
                  
                     Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., Kalweit, S., Klecak, G., L’Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. Toxic. In vitro 8, 793-796.
                  
               
                  
                     7.
                  
                  
                     Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 ta’ Novembru 1997, ATLA, 26, 7-8.
                  
               
                  
                     8.
                  
                  
                     Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EU/COLIPA In vitro phototoxicity validation study: results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In vitro 12, 305-327.
                  
               
                  
                     9.
                  
                  
                     OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 30th-31th October 2001, Secretariat’s Final Summary Report, 15 ta’ Marzu 2002, OECD ENV/EHS, disponibbli fuq talba mis-Segretarjat.
                  
               
                  
                     10.
                  
                  
                     Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Lett., 24, 119-124.
                  
               
                  
                     11.
                  
                  
                     Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control for cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225-237.
                  
               
                  
                     12.
                  
                  
                     Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal models for phototoxicity testing. In “Dermatotoxicology”, edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. Ħames edizzjoni, p 515-530.
                  
               
                  
                     13.
                  
                  
                     Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825-1829.
                  
               
                  
                     14.
                  
                  
                     ISO 10977. (1993). Photography – Processed photographic colour films and paper prints – Methods for measuring image stability.
                  
               
                  
                     15.
                  
                  
                     Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, International Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275
                  
               
                  
                     16.
                  
                  
                     ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure: In vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 ta’ Settembru, 1998. 18 paġni.
                  
               
                  
                     17.
                  
                  
                     Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals from Annex VII of the European Union Directive 76/768/EEC, in the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 679-708.
                  
               
                  
                     18.
                  
                  
                     Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical modeling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, 127-138.
                  
               
                  
                     19.
                  
                  
                     Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 445-462.
                  
               
                  
                     20.
                  
                  
                     http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_2349687_1_1_1_1,00.html
                  
               
            L-ANNESS 1
            Ir-rwol tat-3T3 NRU PT fi strateġija sekwenzjali għall-ittestjar tal-fototossiċità tal-kimiċi
            
         
            L-ANNESS 2
            Figura 1
            Distribuzzjoni ta' poter spettrali tas-simulatur tax-xemx iffiltrat
            (ara t-taqsima 1.4.1.5, tieni paragrafu)
            Il-Figura 1 tagħti eżempju ta' distribuzzjoni ta' irradjanza spettrali aċċettabbli ta' simulatur tax-xemx iffiltrat. Huwa mill-għajn ta' alid tal-metall doped fil-prova tal-validazzjoni tat-3T3 NRU PT (6)(8)(17). L-effett ta' żewġ filtri differenti użati u l-effett addizzjoni ta' filtri ta' l-għatu ta' plattina 96-well tal-kultura huma murija. Il-filtru H2 intuża biss ma' sistemi tat-test li jistgħu jittolleraw ammont ogħla ta' UVB (test tal-mudell tal-ġilda u ttest tal-fotoħemoliżi taċ-ċelloli ħomor tad-demm). Fit-3T3 NRU-PT intuża l-filtru H1. Il-figura turi li l-effett addizzjonali ta' filtru ta' l-għatu tal-plattina huwa l-aktar osservat fil-firxa ta' l-UVB, u xorta jħallu biżżejjed UVB fl-ispettru ta' l-irradjazzjoni biex jiġu eċċitati l-kimiċi li tipikament jassorbu l-firxa ta' l-UVB, bħall-Amiodarone (ara t-Tabella 1).
            Figura 2
            Is-sensittività ta' l-irradjazzjoni taċ-ċelloli Balb/c 3T3 (kif imkejla fil-firxa UVA)
            Il-vijabilità taċ-ċelloli ( % użu ta' l-Aħmar Newtrali tal-kontrolli skuri)
            (ara t-taqsimiet 1.4.1.5.2 tieni paragrafu; 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2)
            Is-sensittività taċ-ċelloli Balb/c 3T3 għall-irradjazzjoni mas-simulatur tax-xemx użat fil-prova tal-validazzjoni tat-Test tal-Fototossiċità 3T3NRU, kif imkejla fil-firxa ta' l-UVA. Il-figura turi r-riżultati miksuba f’7 laboratorji differenti fl-istudju tal-pre-validazzjoni (1). Filwaqt li ż-żewġ kurvi b'simboli miftuħa nkisbu b'ċelloli li saru anzjani (numru għoli ta' passaġġi), li kellhom jiġu sostitwiti b'ħażniet ta' ċelloli ġodda il-kurvi bis-simboli li jispikkaw juru ċ-ċelloli b'tolleranza ta' irradjazzjoni aċċettabbli.
            Minn din id-data ġiet derivata l-ogħla irradjazzjoni mhux ċitotossika ta' 5 J/cm2 (linja ttikkjata vertikali). Il-linja ttikkjata orizzontali turi barra minn dan l-effett massimu aċċettabli ta' l-irradjazzjoni mogħti fil-paragrafu 1.4.2.2.
         
         B.42.   SENSITIZZAZZJONI TAL-ĠILDA: ASSAĠĠ LOKALI TAN-NODULA TAL-LIMFA
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa ekwivalnti għal OECD TG 429 (2002)
         1.1   INTRODUZZJONI
         L-Assaġġ Lokali tan-Nodula tal-Limfa (LLNA) kien ġie validat b'mod suffiċjenti u aċċettat sabiex jiġġustifika l-adozzjoni tiegħu bħal Metodu ġdid (1) (2) (3). Dan huwa t-tieni metodu għall-assaġġ tas-sensitizzazzjoni potenzali tal-ġilda minn kimika fl-annimali. Il-metodu lieħor (B.6) jutilizza t-testijiet tal-fniek ta' l-indi, notevolment it-test tal-massimizzazzjoni tal-fenek ta' l-indi u t-test Buehles (4).
         Il-LLNA tipprovdi metodu alternattiv għall-identifikazzjoni tal-kimika sensitizzanti tal-ġilda u għall-konferma li l-kimika ma jkollhiex potenzal sinifikanti li toħloq sensitizzazzjoni tal-ġilda. Dan mhux neċċessarjament jimplika li fil-każi kollha l-LLNA għandha tkun użata minflok it-test tal-fenek ta' l-indi, imma pjuttost li l-assaġġ huwa ta' meritu egwali u li jista’ jkun użat bħala alternattiva li fiha r-riżultati pożittivu u negattivi, ġeneralment, ma jkunux jeħtieġu aktar konferma.
         Il-LLNA tipprovdi ċerti vantaġġi f'dak li jirrigwardja kemm il-progress xjentifiku u wkoll il-ġid ta' l-annimali. Din tistudja l-pażjio ta' l-induzzjoni tas-sensitizzazzjoni tal-ġilda u tipprovdi dettalji kwantitattivi xierqa għall-assaġġ tar-reazzjoni tad-doża. Id-dettalji tal-validazzjoni tal-LLMA u r-reviżjoni tax-xogħol assoċċjat magħha kienu ġew ippubblikati (5) (6) (7) (8). B'żieda, għandu jkun innutat li s-sensitizzaturi ħfief/moderati, li huma rakkommandati bħala sustanzi adatti ta' kontroll pożittiv għall-metodi tat-test fuq il-fenek ta' l-indi, huma wkoll xierqa għall-użu mal-LLNA (6) (8) (9).
         Il-LLNA hija metodu in vivo u, bħala konsegwenza, ma teliminax l-użu ta' l-annimali fl-assaġġ ta' l-attività tal-kuntatt sensitizzanti. Din għandha, b'dana kollu, l-potenzal li tnaqqas in-numru ta' l-annimali meħtieġa għal dan l-iskop. Aktar minn hekk, l-LLNA toffri raffinar sostanzjali tal-mod ta' kif l-annimali huma użati għat-testijiet sensitizzanti tal-kuntatt. L-LLNA hija ibbażata fuq il-kunsiderazzjoni ta' l-avvenimenti immunoloġiċi stimulati bil-kimika matul il-fażi induttiva tas-sensitizzazzjoni. Kontra t-testijiet l-fenek ta' l-indi, l-LLNA ma teħtieġx li r-reazzjonijiet ta' l-ipesensittività dermali indotti bi sfida jkunu eluċidati. Aktar minn hekk, l-LLNA ma teħtieġx l-użu ta' aġġuvant, bħal fil-każ tat-test tal-massimizzazzjoni tal-fenek ta' l-indi. Għalhekk, l-LLNA tnaqqas it-tbagħtija ta' l-annimali. Minkejja l-vantaġġi tal-LLNA fuq it-testijiet tradizjonali tal-fenek ta' l-indi, għandu jkun rikonoxxut li hemm ċerti limitazzjonijiet li jistgħu ikunu jeħtieġu l-użu tat-testijiet tradizzjonali tal-fenek ta' l-indi (eż. sejbiet negattivi foloz fil-LLNA ma ċerti metalli, sejbiet pożittivi foloz ma ċerti irritanti tal-ġilda (10).
         Ara wkoll l-Introduzzjoni Parti B.
         1.2   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Il-prinċipju bażiku li jaċċenna l-LLNA huwa li s-sensitizzaturi jinduċu proliferazzjoni primarja tal-limfokiti fin-nodula lumfika li s-saffi s-sit ta' l-applikazzjoni kimika. Din il-prolifikazzjoni hija proporzjonali għad-doża applikata (u għall-qawwa ta' l-allerġeni) u tipprovdi mezz sempliċi għall-akkwist ta' sensitizzazzjoni oġġettiva, u kejl kwantitattiv. L-LLNA tagħmel l-assaġġ ta' din il-proliferazzjoni b'relazzjoni mar-reazzjoni tad-doża li fiha l-gruppi tat-test tal-proliferazzjoni huma ipparagunati ma dawk fil-mezzi tal-kontroll ittrattati. Ir-relattività tal-proliferazzjoni fil-gruppi ittrattati ma dik tal-kontrol bil-mezzi, imsemmija l-Indiċi Stimulanti, hija determinata, u għandha tkun mill-anqas tlieta qabel ma test ta' sustanza jista’ jkun aktar evalwat bħala sensitizzatur potenzali tal-ġilda. Il-metodi deskritti hawn huma ibbażati fuq l-użu tat-tikkettjar raduattiv sabiex ikejjel il-proliferazzjoni taċ-ċelloli. B'dana kollu, għanijiet finali oħrajn dwar l-assaġġ tal-proliferazzjoni jistgħu ikunu wżatu basta li jkun hemm ġustifikazzjoni u sosstenn xjentifiku xieraq, inklużi l-kwotazzjonijiet kollha u d-deskrizzjoni tal-metodoloġija.
         1.3   ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.3.1   Preparazzjonijiet
         1.3.1.1   Il-kundizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf
         L-annimali għandhom jinzammi f'gaġġeġ individwali. It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 22 oC (± 3 oC). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għand għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu użati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb.
         1.3.1.2   Preparazzjoni ta' l-annimali
         L-animmali għandhom ikunu magħżula kif jinzerta, immarkati sabiex jippermettu identifikazzjoni individwali, u miżmuma fil-gaġġeġ tagħhom għal mil anqas 5 ijiem qabel il-bidu tad-dożi sabiex jippermettu li jkunu akklamattiżati għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju. Qabel il-bidu at-trattament, l-annimali kollha huma eżaaminati sabiex ikun assigurat li huma ma jkollhom l-ebda feriti osservabbli fuq il-ġilda.
         1.3.2   Kundizzjonijiet tat-test
         1.3.2.1   Annimali sperimentali
         Il-ġurdien huwa l-ispeċje ta' l-għażla għal dan it-test. Ġrieden femminili adulti żgħażagħ tat-tip CBA/Ca jew CBA/J, li jkunu għadhom mhux mgħammra u mhux tqal, huma użati. Fil-bidu ta' l-istudju, l-annimali għandhom ikollhom età ta' 8-12 ġimghat, u l-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali għandha tkun minima u li ma teċċedix 20 % tal-piż medju. Tipi oħrajn u rġiel jistgħu ikunu użati meta dettalji suffiċjenti jkunu ġenerati sabiex juru li d-differenti sinifikanti ta' tip u/jew speċifiku għas-sess fir-reazzjonijiet LLNA ma jkunux jeżistu.
         1.3.2.2   Verifika ta' l-affidabbilità
         Kontrolli pożittivi huma użati sabiex juru l-imġieba xierqa ta' l-assaġġ u l-kompetenza tal-laboratorju li jwettaq l-assaġġ b'suċċess. Il-kontroll pożittiv għandu jipproduċi reazzjoni LLNA pożittiva fil-livell ta' l-espożizzjoni mistenni li jagħti żieda fl-indiċi stimulanti (SI) >3 matul il-grupp ta' komntroll negattiv. Id-doża tal-kontroll pożittiv għandha tkun magħżulha hekk li l-induzzjoni tkun ċara imma mhux eċċessiva. Is-sustanzi preferuti huma hexyl cinnamic aldehyde (CAS Nru 101-86-0, EINECS Nru 202-983- 3) u mercaptobenzothiazole (CAS Nru 149-30-4, EINECS Nru 205-736-8). Jista’ jkun hemm ċirkostanzi li fihom, meqjusa ġustifikazzjoni adekwata, sustannzi oħrajn ta' kontroll, li jilħqu l-kriterja ta' hawn fuq, jistgħu ikunu użati. Waqt li normalment grupp ta' kontroll pożittiv jista’ jkun meħtieġ f'kull assaġġ, jista’ jkun hemm sitwazzjonijiet li fihom il-laboratorji tat-test irid ikollhom dettalji disponibbli dwar il-kontroll pożittiv storiku sabiex juru konsistenza ta' reazzjoni sodisfaċenti matul perjodu ta' sitt xhur jew ta' aktar żmien fit-tul. F'dawk is-sitwazzjonijiet, testjar anqas ta' spiss b'kontrolli pożittivi jista’ jkun xieraq f'intervalli ta' mhux aktar minn 6 xhur. Għalkemm is-sustanza tal-kontroll pożittiv għandha tkun ittestjata f'mezz li huwa magħruf li jeliċita reazzjoni konsistenti (eż. l-aċetun: żejt taż-żebbuġa), jista’ jkun hemm ċerti sitwazzjonijiet regolatorji li fihom it-testijiet b'mezz mhux regolari (formulazzjoni klinika/kemikament relevanti) tkun ukoll meħtieġa. F'tali sitwazzjoni l-interazzjoni possibbli ta' kontroll pożittiv b'dan il-mezz mhux-konvenzjonali għandha tkun ittestjata.
         1.3.2.3   In-Numru ta' annimali, il-livelli tad-doża u l-għażla tal-mezz.
         Minimu ta' erba annimali huwa użat għal kull grupp ta' doża, b'minimu ta' tlett konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test, flimkien ma grupp ta' kontroll negattiv, ittrattat biss bil-mezz tas-sustanza tat-test, u, kif xieraq, kontroll pożittiv. F'dawk il-każi li fihom dettalji individwali ta' l-annimali għandhom ikunu miġbura, minimu ta' ħames annimali għal kull doża huma użati. Apparti filli fl-assenza ta' trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-gruppi ta' kontroll għandhom ikunu mqandla u ittrattati b'manjera identika bħal l-annimali fil-gruppi tat-trattament.
         L-għażla tad-doża u l-mezz għandha tkun ibbażata fuq ir-rakkommandazzjonijiet mogħtija fir-referenza (1). Id-dożi huma magħżula mis-serje ta' konċentrazzjoni 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % eċċ. Dettalji eżistenti dwar it-tossiċità akuta u l-irritazzjoni dermali għandhom ikunu ikkunsidrati, meta disponibbli, fil-għażla ta' tlett konċentrazzjonijiet konsekuttivi sabiex l-għola konċemntrazzjoni tkabbar l-espożizzjoni waqt li tevita tossiċità sistematika u irrittazzjoni lokali eċċessiva tal-ġilda (2) (11).
         Il-mezz għandu jkun magħżul fuq il-bażi tal-massimizzazzjoni tal-konċentazzjonijiet tat-test u ta' kemm jinħall f'likwidu, waqt li jipproduċi taħlita/sospenzjoni xierqa għall-applikazzjoni tasd-sustanza tat-test. Fl-ordni ta' preferenza, il-mezzi rakkommandati huma l-aċetun.żejt taż-żebbuġa (4:1 v/v), dimethylformamide, methyl ethyl ketone, propylene glycol u dimethyl sulphoxide (2) (10), imam oħrajn jistgħu ikunu użati jekk raġġjonar xjentifiku suffiċjenti jkunipprovdut. F'ċerti sitwazzjonijiet, jista’ jkun meħtieġ li jsir użu minn solvent kemikament relevanti jew il-formulazzjoni kummerċjali li fiha s-sustanza tat-test hija marketed bħala kontroll addizzjonali. Kura partikolari għandha tingħata sabiex ikun assigurat li l-materjali idrofiliċi jkunu inkorporati fis-sistema tal-mezz, li xxarrab il-ġilda u ma ċċarċarx immdjetament. Għalhekk, il-mezzi kompletament akweji għandhom ikunu evitati.
         1.3.3   Proċedura tat-test
         1.3.3.1   Skeda sperimentali
         L-iskeda sperimentali ta' l-assaġġ hija kif ġej:
         
                      
                  
                  
                     
                        Jum 1:
                     
                     Identifika individwalment u rreġistra l-piż ta' kull annimal. Iftaħ applikazzjoni ta' 25μl tat-trattib xieraq tas-sustanza tat-test, il-mezz waħdu, jew il-kontroll pożittiv (kif xieraq), tal-warrani ta' kull widna.
                  
               
                      
                  
                  
                     
                        Jiem 2 u 3:
                     
                     Irrepeti l-proċedura ta' l-applikazzjoni mwettqa fil-jum 1.
                  
               
                      
                  
                  
                     
                        Jiem 4 u 5:
                     
                     L-ebda trattament.
                  
               
                      
                  
                  
                     
                        Jum 6:
                     
                     Irreġistra l-piż ta' kull annimal. Injetta 250μl (PBS) salin-fosfat-mewwieti li jkun fiha 20 μCi (7.4e + 8 Bq) ta' 3H-methyl thymidine fil-ġriedem kollha tat-test u tal-kontroll via il-vina tad-demb. B'mod alternattiv innjetta 250 μL PBS li jkun fiha 2 μCi (7.4e + 7 Bq) ta' 125I-iododeoxyuridine u 10-5 M fluorodeoxyuridine fil-ġrieden kollha via il-vina tad-demb
                     Ħames siegħat wara l-annimali jkunu maqtula. It-tisfija tan-nodoli limpiċi awrikulati minn kull widna hija mposta u miġbura fil-PBS għal kull grupp sperimentali (ir-resqien tal-grupp miġbur tat-trattament); b'mod alternattiv, il-pari tan-nodulti tal-limpi mill-annimali individwali jistgħu ikunu imposti u miġbura fil-PBS għal kull annimal (ir-resqien ta' l-annimal individwali). Dettalji u disinji ta' l-identifikazzjoni tad-nodula u tad-dissezzjoni jistgħu jinstabu fl-Anness I tar-referenza 10.
                  
               1.3.3.2   Il-preparazzjoni tas-sospenzjonijiet taċ-ċelloli
         Sospenzjoni ta' ċellola waħda taċ-ċelloli tan-noduli limpiċi (LNC) jew mill-gruppi tat-trattament miġbur jew b'mod bilaterali minn annimali individwali, hija ippreparat b'mekkaniżamu ġentili ta' disaggreggazzjoni minn 200 μm-mesh garża ta' l-azzar inossidabbli. Iċ-ċelloli tan-nodoli limpiċi huma maħsula darbtejn b'eċċess ta' PBS u preċipitati bi 5 % aċidu trikloraċetiku (TCA) fi 4 oC għal 18il-siegħa (2). Gerbubi ikunu jew ri-sospiżi fi 1 ml TCA u trasferiti lejn fjali xintillanti li jkun fihom 10 ml ta' likwidu xintillanti għall-għadd ta' 3H, jew trasferiti direttament lejn tubi ta' l-għadd tal-gamma għal għadd ta' 125I.
         1.3.3.3   Determinazzjoni tal-proliferazzjoni taċ-Ċelloli (radjoattività inkorporata)
         L-inkorporazzjoni ta' 3H-methyl thymidine hija mkejjla bil ß-għadd tax-xintillazzjoni bħala disintegrazzjonijiet kull minuta (DPM). L-inkorporazzjoni ta' 125I-iododeoxyuridine hija mkejjla bil-għadd 125I u wkoll hija espressa bħala DPM. Jiddependi mir-resqien użat, l-inkorporazzjoni għandha tkun espressa bħala DPM/grupp tat-trattament (ir-resqien aggruppat) jew il-DPM/annimal (ir-resqien individwali).
         1.3.3.4   Osservazzjonijiet
         1.3.3.4.1   Osservazzjonijiet kliniċi
         
         L-annimali għandhom ikunu osservati bir-reqqa darba kull jum għal xi sinjali kliniċi, jew ta' l-irritazzjoni lokali fis-sit ta' l-applikazzjoni jew tat-tossiċità sistematika. L-osservazzjonijiet kollha huma sistematikament irreġistrati, b'dettalji individwali jkunu jinżammu għal kull annimal.
         1.3.3.4.2   Il-piż ta' l-iġsma
         
         Kif mistqarr fis-sezzjoni 1.3.3.1, il-piżijiet ta' l-annimali individwali għandhom ikunu mkejjla fil-bidu tat-test u fil-qtil skedat ta' l-annimali.
         1.3.4   Kalkolu tar-riżultati
         Ir-riżultati huma espressi fl-Indiċi tas-Stimulazzjoni (SI). Meta jsir użu mir-resqien ta' l-aggruppament, il-SI huwa akkwistat bid-diviżjoni ta' l-inkorporazzjoni radjoarriba aggruppata għal kull grupp ta' trattament tal-grupp bl-inkorporazzjoni tal-mezz ta' kontroll aggruppat; dan jirrendi il-medja SI. Meta jisr użu mir-resqien individwali, l-SI hija akkwistata bid-diviżjoni tal-medja DPM/annimal fi ħdan kull grupp tas-sustanza tat-test u l-grupp ta' kontroll pożittiv bil-medja tad-DPM/annimal għas-solvent/mezz tal-grupp ta' kontroll. Il-medja SI għal kontrolli tal-mezzi ittrattati hija mbagħad 1.
         L-użu tar-resqien individwali għall-kalkolu tal-SI ikun jiffaċilita l-imġieba ta' l-analiżi statistika tad-dettalji. Fl-għażla tal-metodu xieraq ta' l-analiżi statistika, l-investigatur għandu jżomm f'moħħu l-possibbiltà ta' inegwalitajiet ta' varjanzi u l-problemi relati l-oħtajn li jistgħu jenħtieġu t-trasformazzjoni tad-dettalji jew l-analiżi statistika mhux-parametrika. Resqien adekwat għall-interpretazzjoni tad-dettalji huwa li tkun evalwata l-informazzjoni individwali tal-kontrolli ittratti u tal-mezz, u li takkwista dawn mill-aħjar doża xierqa fil-kurva tar-reazzjoni, billi jkunu meqjusa l-limiti tar-reabbilità (8) (12) (13).
         B'dana kollu, l-investigatur għandu jkun ferm attent għall-possibbiltà ta' “reazzjonijiet” barranija għall-annimali individwali fi ħdan grupp li jkunu jeħtieġu l-kejl aalternattiv tar-reazzjoni (eż. il-medjan pjuttost milli l-medja) jew l-eliminazzjoni ta' l-effetti barranija. Il-proċess tad-deċiżjoni fir-rigward ta' reazzjoni pożittiva jinkludi l-indiċi stimulanti ≥ 3 flimkien mal-kunsiderazzjoni tar-reazzjoni mad-doża u, meta xieraq, is-sinifikanza statistika (3) (6) (8) (12) (14).
         Jekk ikun meħtieġ li jkunu kjarifikati r-riżultati akkwistati, kunsiderazzjoni għandha tun mogħtija għad-diversi propjetajiet tas-sustanza tat-test, inkluż jekk din ikollhiex relazzjoni strutturali ma sensitizzaturi magħrufa tal-ġilda, sew jekk toħloq irritazzjoni eċċessiva tal-ġilda u n-natura tar-reazzjoni tad-doza kif tidher. Dawn u kunsiderazzjonijiet oħrajn huma diskussi fid-dettal x'imkien ieħor f'dan id-dokument (7).
         2.   DATA
         Id-data għandha titħabbar f'sommarju f'għamla tabulari li juri l-medja tal-valuri DPM individwali u l-indiċi stimulanti għal kull doża (inkluż il-kontroll tal-mezz) tal-grupp.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Is-sustanza tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-identifikazzjoni (eż. numru CAS; sorsi; purità; impuritajiet magħrufa; n-numru tal-lot purity);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-natura fiżika u l-propjetajiet fiżikokimiċi (eż. pH, volatilità, solubilità, stabbilità);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 jekk taħlita, il-komposizzjoni u l-persentaġġi relattivi tal-komponenti.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Mezz:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-identifikazzjoni, il-konċentrazzjoni (meta xieraq), il-volum użat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-ġustifikazzjoni tal-mezz użat.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Annimali tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 it-tip ta' ġrieden użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-istatus mikrobioloġiku ta' l-annimali, meta magħruf;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, eċċ.;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali;
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji tal-preparazzjoni tas-sustanza tat-test u l-applikazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ġustifikazzjoni ta' l-għażla tad-doża, inklużi r-riżultati minn studju ta' medda ta' sejbiet, jekk imwettaq; il-konċentrazzjonijiet tal-mess u s-sustanza tat-test u l-ammont totali tas-sustanza applikata;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u ta' l-ilma (inklużi t-tip/sorsi tad-dieta, is-sorsi ta' l-ilma);
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Verifika ta' l-affidabbilità:
                     
                                 —
                              
                              
                                 sommarju tar-riżultati ta' l-aħħar verifika affidabbli, inkluża l-informazzjoni dwar is- sustanza, il-konċentrazzjoni u l-mezz użat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kontroll pożittiv u negattiv konkorrenti u/jew storiku ta' l-indormazzjoni dwar il-laboratorju tat-testijiet
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 piżijiet individwali ta' l-annimali fil-bidu tad-doża u fil-qtil skedat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tabella tal-medja (resqien aggruppat) u individwali (resqien individwali) tal-valuri DPM kif ukoll il-medda tal-valuri għaż-żewġ resqien u l-indiċi tas-stimulazzjoni għal kull doża (inkluż il-kontroll tal-mezz) tal-grupp;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 analiżi statistika meta xieraq;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-ħin tal-korsa ma meta jiskoppja u s-sinjali tat-tossiċità, inkluża l-irritazzjoni dermali fil-post ta' l-amministrazzjoni, jekk ikun hemm, għal kull annimal.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni tar-riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Kommentarju qasir tar-riżultati, l-analiżi tar-reazzjoni tad-doża, l-analiżi statistika, meta xieraq, bil-konklużjoni dwar jekk is-sustanza tat-test għandhiex tkun meqjusha bħala sensitizzanti għall-ġilda.
                              
                           
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology 30, 165-169.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Kimber, I, Derman, R.J., Scholes E.W, and Basketter, D.A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, 13-31.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, 563-79.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Metodu tat-testijiet B,6.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food and Chemical Toxicology, 34, 999-1002.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E (1996). The local lymph node assay- A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, 985-997.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, 327-33.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Van Och, F.M.M, Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49-59.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281-4.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99- 4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Metodu tat-testijiet B.4.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W. Lees, D. Kimber, I. and Botham, P.A. (1993) Results with OECD recommended positive control sensitisers in the maximisation, Buehler and local lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63-67.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Basketter D.A., Lea L.J., Dickens A., Briggs D., Pate I., Dearman R.J., Kimber I. (1999). A comparison of statistical approaches to the derivation of EC3 values from local lymph node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, 261-266.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Basketter DA, Blaikie L, Derman RJ, Kimber I, Ryan CA, Gerberick GF, Harvey P, Evans P, White IR and Rycroft RTG (2000). Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis 42, 344-48.
                  
               B.43.   STUDJU DWAR IN-NEWROTOSSIĊITÀ FL-ANNIMALI GERRIEMA
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa ekwivalenti għal OECD TG 424 (1997)
         Dan il-Metodu tat-test kien ġie ddisinjat sabiex jakkwista l-informazzjoni meħtieġa ħalli jikkonferma jew aktar jikkaratterizza l-potenzal tan-newrotossiċità ta' kimika f'annimali adulti. Jista’ jkun jew imwettaq flimkien mal-Metodi tat-Test eżistenti dwar l-istudji tat-tossiċità għal doża repetuta jew li jkun imwettaq bħala studju separat. Huwa rakkommandat li il-OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Methods (1) jkun ikkonsultat sabiex jgħin fid-disinn ta' l-istudji bbażati fuq dan il-metodu ta' Test. Dan huwa partikolarment importanti meta modifiki ta' l-osservazzjonijiet u tal-proċeduri tat-test kif rakkommandat għall-użu b'rutina ta' dan il-metodu jkunu kkonsidrati. Id-Dokument ta' Gwida kien ġie ippreparat sabiex jiffaċilita l-għażla ta' proċeduri oħrajn tat-test għall-użu f'ċirkostanzi speċifiċi.
         L-assess ta' l-iżvilupp newrotossiku mhux is-suġġett ta' dan il-Metodu.
         1.1   INTRODUZZJONI
         Fl-assess u l-evalwazzjoni tal-karatteristiċi tossiċi tal-kimika, huwa importanti li jkun ikkonsidrat il-potenzal ta' l-effetti newrotossiċi. Diġa fil-Metodu tat-test dwar tossiċità sistematika għal doża repetuta, jinkludi osservazzjonijiet li jħarsu dwar in-newrotossiċità potenzali. Dan il-Metodu ta' Test jista’ jkun użat dabiex jiddisinja studju ħalli jakkwista aktar informazzjoni dwar, jew jikkonferma, l-effetti newrotossiċi, osservati fl-istudji tat-tossiċità sistematika f'doża repetuta. B'dana kollu, kunsiderazzjoni dwar in-newrotossiċità potenzali ta' klassijiet ta' kimika jistgħu jissuġġerixxu li dawn jistgħu ikunu evalwati aħjar bl-użu ta' dan il-metodu mingħajr indikazzjonijiet preċedenti tan-newrotossiċità potenzali minn studji tat-tossiċità sistematika minn doża repetuta. Uħud mill-kunsiderazzjonijiet jinklu, per eżempju:
         
                     —
                  
                  
                     l-osservazzjoni ta' sinjali newroloġiċi jew feriti newropatoloġiċi fl-istudji tossiċi apparti milli l-istudji tat-tossiċità sustematika f'doża repetura, jew
                  
               
                     —
                  
                  
                     relazzjoni strutturali jew informazzjoni oħra li torbothom ma newrotossikanti magħrufa.
                  
               B'żieda jista’ jkun hemm okkażżjonijiet oħrajn meta l-użu ta' dan il-metodu ta' test jista’ jkun xieraq; għal aktar dettalji ara (1).
         Dan il-Metodu kien ġie żviluppat sabiex ikun jista’ jiġi mfassal ħalli jilħaq il-ħtiġiet partikolari sabiex jikkonferma l-ħistopatoloġija speċifika u n-newrotossiċità ta' l-imġieba ta' kimika kif ukoll jipprovdi karatterizzazzjoni u kwantifikazzjoni tar-reazzjonijiet newrotossiċi.
         Fil-passat, in-newrotossiċità kienet imqabbla man-newropatija li tinvolvi feriti newropatoloġiċi jew disfunzjonijiet newroloġiċi, bħala ma huma attakk ta' puplesija, paraliżi jew roda. Għalkemm in-newropatija hija manifestazzjoni importanti tan-newrotossiċità, issa huwa ċar li hemm ħafna sinjali oħrajn tat-tossiċità tas-sistema nervuża (eż. it-telf tal-kordinament muturili, it-tnaqqis sensitorju, id-disfunzjonijiet fil-tgħallim u l-memorja) li jistgħu ma jkunux riflessi fl-istudji newropatiċi jew ta' tipi oħrajn.
         Dan il-Metodu ta' Test newrotossiku huwa iddisinjat sabiex jiżvela newro-imġieba maġġuri u l-effetti newropatholoġiċi f'annimali gerriema adulti. Waqt l-effetti ta' l-imġieba, anki fin-nuqqas ta' tibdiliet morfoloġiċi, jistgħu jirreflettu fuq l-impatt ħażin ta' l-organiżmi, mhux it-tibdiliet ta' l-imġieba kollha huma speċifiċi għas-sistema nervuża. Għalhekk, xi tibdiliet osservati għandhom ikunu evalwati b'konnessjoni mad-dettalji ħistopatoloġiċi, ħematoloġiċi jew biokemikali korrelattivi kif ukoll l-informazzjoni dwar tipi oħrajn tat-tossiċità sistematika. It-testijiet meħtieġa b'dan il-metodu sabiex jipprovdu karatterizzazzjoni u kwantifikazzjoni tar-reazzjonijiet newrotossiċi jinkludu proċeduri ħistopatoloġiċi jew ta' l-imġieba speċifiċi li jitgħu aktar ikunu appoġġjati minn investigazzjonijiet elettrofiżjoloġiċi u/jew biokimiċi (1) (2) (3) (4).
         In-newrotossikanti jistgħu jaġixxu fuq numru ta' miri fi ħdan is-sistema nervuża u b'varjetà ta' mekkaniżmi. La darba l-ebda medda ta' testijiet ma hija kapaċi li tassessja fil-profond il-potenzal newrotossiku tas-sustanzi kollha, jista’ jkun meħtieġ li jkunu utilizzati testijiet in vivo jew in vitro oħrajn speċifiċi għat-tip tan-bewrotossiċità osservata jew antiċipata.
         Dan il-Metodu tat-Test jista’ jkun użat ukoll, b'konnessjoni mal-gwida stabbilita fid-Dokument ta' Gwida OECD dwar l-Istrateġiji u l-Metodi tat-testijiet Newrotossiċi (1) li huma iddisinjati bħala intiżi li aktar jikkaratterizzaw jew iżidu s-sensittività tal-kwantifikazzjoni tar-reazzjoni tad-doża sabiex ikun hemm estimi aħjar tal-livell ta' l-effet mhux-osservat-ħażin jew li jissustanzja perikoli magġrufa jew issusspetati tal-kimika. Per eżempju, l-istudji jistgħu ikunu iddisinjati li jidentifikaw u jevaljaw il-mekkaniżmi newrotossiċi jew li jissupplementaw l-informazzjoni diġa disponibbli mill-użu tal-proċeduri bażiċi fl-osservazzjoni newro-imġieba u newropatoloġiċi. Tali studji mhux bilfors li jiddupplikaw l-informazzjoni li tkun ġiet ġenerata mill-użu tal-proċeduri normali rakkommandati f'dan il-metodu jekk tali dettalji jkunu diġa disponibbli u li ma humiex meqjusa bħala meħtieġa għall-interpretazzjoni tar-riżultati ta' l-istudju.
         Dan l-istudju newrotossiku, meta użat waħdu jew flimkien ma oħrajn, jipprovdi informazzjoni li tista’:
         
                     —
                  
                  
                     tidentifika jekk is-sistema nervuża tkun affettwata b'mod permanenti jew riversibbli mill-kimika ittestjata;
                  
               
                     —
                  
                  
                     tikkontiribwixxi l-karatterizzazzjoni tat-tibdiliet fis-sistema nervuża assoċċjati ma l-espożizzjoni lejn il-kimika, u dwar ir-rikonoxximent tal-mekkaniżmu bażiku;
                  
               
                     —
                  
                  
                     tiddetermina ir-relazzjoni tad-doża u tar-reazzjoni tal-ħin sabiex ikun ikkalkolat il-livell ta' l-effett ħażin mhux-osservat (li jista’ jkun użat sabiex jista’bbilixxi kriterja b'sigurtà għall-kimika).
                  
               Dan il-Metodu ta' Test juża amministrazzjoni orali tas-sustanza tat-test. Rotot oħrajn ta' l-amministrazzjoni (eż. dermali jew man-nifs) jistgħu ikunu aktar xierqa, u jistgħu jeħtieġu modifika għall-proċessi rakkommandati. Konsiderazzjonijiet ta' l-għażla tar-rotta ta' l-amministrazzjoni jkunu jiddependu mill-profil ta' l-espożizzjoni umana u l-informazzjoni disponibbli, tossikoloġika jew kinetika.
         1.2   DEFINIZZJONIJIET
         
            Effett ħażin: Kwalunkwe alterazzjoni relatata mat-trattament minn linja bażi li tnaqqas l-abbiltà ta' l-organiżmu li jibqa ħaj, li jirripriduċi jew li jadatta għall-ambjent.
         
            Doża: Hija l-ammont tas-sustanza tat-test kif somministrata. Id-doża hija espressa bħala piż (g. Mg) jew bħala piż tas-sustanza tat-test għal kul unità tal-piż ta' l-annimal tat-test (eż. mg/Kg), jew bħala konċentrazzjonijiet dietarju kostanti 9ppm).
         
            Dożaġġ: Huwa terminu ġenerali li jinklużi d-doża, il-frekwenza tagħha u t-tul taż-żmien tad-dożaġġ.
         
            Newrotossiċità: Hija it-tibdil ħażin fl-istruttura jew fil-funzjoni tas-sistema nervuża li tirriżulta minn espożizzjoni lejn aġent kimiku, bioloġiku jew fiżiku.
         
            Newrotassikant: Huwa l-aġent kimiku, bioloġiku jew fiżiku li jkollu l-potenzal li joħloq in-newrotossiċità.
         
            NOAEL: Hija l-abbrevjazzjoni għall-livell ta' l-ebda effett avvers ma huwa osservabbli (no-observed-adverse-effect level) u hija l-għola doża jew livell ta' espożizzjoni meta l-ebda sejbiet avversi realatati mat-trattament ma jkunu osservati.
         1.3   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Il-kimika tat-test hija somministrata bir-rotta orali matul medda ta' dożi lil diversi gruppi ta' annimali gerriema tal-laboratorju. Dożi repetuti huma normalment maħtieġa, u r-regola tad-dożaġġ tista’ tkun 18 jum, subkronika (90 jum) jew kronika (sena jew aktar). Il-proċeduri stabbilitu f'dan il-Metodu ta' test jistgħu wkoll ikunu użati għall-istudju tan-newrotossiċità akuta. L-annimali huma ittestjati sabiex jippermettu s-sejbien jew il-karatterizzazzjoni ta' l-imġieba u/jew l-annormalitajiet newroloġiċi. Medda ta' mġieba li tista’ tkun affettwata bin-newrotossikanti hija assessjata matul kull perjodu ta' l-osservazzjoni. Fl-aħħar tat-test, subset ta' annimali ta' kull sess minn kull grupp huma mxerrda in situ u s-sezzjonijiet tal-moħħ, l-ispina dorsaali, u n-nervi periferali huma ippreparati u eżaminati.
         Meta l-istudju jkun imwettaq bħala studju independenti sabiex jevalwa n-newrotossiċità jew li jikkaratterizza l-effetti newrotossiċi, l-annimali f'kull grupp ma li jkunux użati għat-tixrid u l-ħistopatoloġija sussegwenti 9 ara t-Tabella 1) jista’ jkun użat għall-proċeduri newro-imġieba speċifika, n-newropatoloġija, in-newrokimika jew elettrofiżjoloġiċi li jistgħu jissuplementaw l-informazzjoni akkwistat mill-eżaminazzjonijiet normali meħtieġa b'daan il-Metodu (1). Dawn il-proċeduri supplementaji jistgħu ikunu partikolarment utili meta l-osservazzjonijiet empiriċi jew l-effetti mistennija jindikaw tip jew mira speċifika tan-newrotossiċità ta' kimika. B'mod alternattiv, il-kumplament ta' l-annimaali jistgħu ikunu użati għal evalwazzjonijiet bħal dawk mitluba fil-Metodi tat-testijiet għal studji tat-tossiċità f'doża repetuta fl-annimali gerriema.
         Meta l-proċeduri ta' dan il-Metodu ta' Test huma miġbura ma dawk tal-metodi ta' testijiet oħrajn, numru suffiċċjenti ta' annimali huwa meħtieġ sabiex jissodisfa l-ħtiġiet għall-osservazzjonijiet taż-żewġ studji.
         1.4   ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.4.1   L-għażla ta' l-ispeċje ta' l-annimali
         L-ispeċje preferuta ta' l-annimali gerriema huwa l-far, għalkemm speċje oħrajn ta' annimali gerriema tista’ tkun użata. Annimali żgħażagħ adulti u b'saħħithom tas-siltiet normalment użati fil-laboratorju għandhom ikunu utilizzati. Il-femminili għandhom ikunu tali li qatt ma jkunu weldu u ma jkunux tqal. Id-dożaġġ għandu normalment jibda malajr kemm jista’ jkun possibbli wara l-ftim, preferibbilemnt mhux aktar tard minn meta l-annimali jkollhom sitt ġimghat, u, fi kwalunkwe każ, qabel ma l-annimali jkunu għalqu d-disa' ġimghat. B'dana kollu, meta dan l-istudju jseħħ flimkien ma studji oħrajn, din il-ħtieġa ta' l-età tista’ tkun teħtieġ aġġustament. Fil-bidu ta' l-istudju, il-varjazzjoni fil-piż ta' l-annimali użati għandha tkun minima u ma teċċedix 20 % tal-piż medju ta' kull sess. Meta studju ta' doża repetita ftul qasir ta' żmien ikun imwettaq bħala preliminarju għal studju f'terminu fit-tul, l-annimali mill-istess tiġ u sorsi għandhom ikunu użati fiż-żewġ studji.
         1.4.2   Il-kundizzjonijiet tal-gaġġeġ u ta' l-għalf
         It-temperatura tal-kamra ta' l-annimali esperimentali għandha tkun 22 oC (± 3 oC). Għalkemm l-umidità relattiva għandha tkun mill-anqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % apparti milli waqt it-tindif tal-kamra, l-għan għandu jkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, is-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Ħsejjes għoljin intermittenti għandhom jinżammu għall-anqas possibbli. Għall-għalf, id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju jistgħu ikunu użati b'forniment mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata bil-ħtieġa li tkun assigurata inter-taħlita xierqa tas-sustanza tat-test meta somministrata b'dan il-metodu. L-annimali jistgħu jinżammu individwalment jew li jkunu f'gaġġa bħala grupp żgħir ta' l-istess sess.
         1.4.3   Preparazzjoni ta' l-annimali
         Annimali żgħażagħ b'saħħithom ikunu assenjati kif jinzerta għal gruppi ta' trattament u tal-kontroll. Il-gaġġeġ għandhom ikunu irrangati b'tali mod li l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid fil-gaġġeġ ikunu minimizzat. L-annimali huma identifikati b'mod uniku u miżmuma fil-gaġġeġ tagħhom għal mill-anqas (5) ħamest ijiem qabel il-bidu ta' l-istudju sabiex jippermetti għall-akklamitizzazzjoni lejn il-kundizzjonijiet tal-laboratorju.
         1.4.4   Rotta ta' l-amministrazzjoni u l-preparazzjoni tad-dożi
         Dan il-Metodu ta' Test juża amministrazzjoni orali tas-sustanza tat-test. L-amminstrazzjoni orali tista’ tkun bi tmiegħ sfurzat, ma l-ikel, jew fl-ilma tax-xorb, jew b'kapsuli. Rotot oħrajn ta' l-amministrazzjoni (eż. dermali jew man-nifs) jistgħu ikunu aktar xierqa, u jistgħu jeħtieġu modifika għall-proċessi rakkommandati. Konsiderazzjonijiet ta' l-għażla tar-rotta ta' l-amministrazzjoni jkunu jiddependu mill-profil ta' l-espożizzjoni umana u l-informazzjoni disponibbli, tossikoloġika jew kinetika. Ir-raġġjunar għall-għażla tar-rotta ta' l-aamministrazzjoni kif ukoll il-modifiki li jirriżultaw għall-proċeduri ta' dan il-metodu ta' test għandhom ikun indikati.
         Meta meħtieġ, is-sustanza tat-test tkun imdewwba jew sospiża f'mezz xieraq. Huwa rakkommandat li, kull meta possibbli, l-użu ta' taħlita/sospenzjoni akwea tkun meqjusa bħala l-ewwel għażla, sewgeita bil-kunsiderazzjoni ta' taħlita/emulsjoni fiż-żejt (eż. żejt tal-qamħirrum) w imbagħad b'xi taħlita oħra f'mezzi oħrajn. Il-karatteristiċi tossiċi tal-mezz għandhom ikun u magħrufa. B'żieda, kunsiderazzjoni għandha tingħata għal dawn il-karatteristiċi li ġejjin dwar il-mezz: l-effetti fuq l-assorbazzjoni, id-distribuzzjoni, il-metaboliżmu, u ż-żamma jew it-twarrib tas-sustanza tat-test; l-effetti tal-propjetajiet kimiċi tas-sustanza tat-test li jistgħu joħolqu bidla fil-karatteristiċi tossiċi tagħha; u l-effetti fuq il-konsum ta' l-ikel u l-ima jew ta' l-istat nutrizzjonali ta' l-annimali.
         1.5   PROĊEDURI
         1.5.1   Numru u sess ta' l-annimali
         Meta l-istudju jkun imwettaq bħala studju separat, mill-anqas 20 annimal (10 nisa u 10 irġiel) għandhom ikunu użati għal kull grupp tad-doża u tal-kontroll għall-evalwazzjoni ta' l-osservazzjonijiet dettaljarti kliniċi u funzjonali. Mill-anqas ħamest irġiel u ħames nisa, magħżula minn dawk l-10 tirġiel u l-għaxar nisa, għandhom ikunu mxerrda in situ u użati għall-newroħistopatoloġija dettaljata fit-tmiem ta' l-istudju. Fil-każi meta numru limitat biss ta' annimali jkunu mogħti d-doża fil-grupp osservat għas-sinjal ta' l-effetti newrotossiċi, kunsiderazzjoni għandha tkun mogħtija għall-inklużjoni ta' dawn l-annimali f'dawk magħżula għat-tixrid. Meta l-istudju jkun imwettaq flimien ma l-istudju tat-tossiċità ta' doża repetuta, numru adekwat ta' annimali għandu jkun użat sabiex jilħaq l-għanijiet taż-żewġ studju. In-numru minimu ta' annimali f'kull grupp għad-diversi ġemgħat ta' studji huwa mogħti fit-tabella 1. Jekk sa dan it-tant ikun hemm qtil jew gruppi ta' rkupru għall-osservazzjoni tar-riversabbiltà, l-persistenza jew l-okkorrenza mdewma ta' l-effetti tossiċi ta' wara t-trattament, ikunu ippjanati jew meta osservazzjonijiet supplementarji jkunu ikkonsidrati, allura n-numru ta' l-annimali għandu jkun miżjud sabiex jassigura li n-numru ta' l-anniamli meħtieġa għall-osservazzjoni u l-ħistopatoloġija jkunu disponibbli.
         1.5.2   Grupp ta' trattament u tal-kontroll
         Mill-anqas tlett gruppi ta' doża u grupp tal-kontroll għandhom ġeneralment ikunu użati, imma jekk mill-assessjar ta' informazzjoni oħra, l-ebda effetti ma jkunu mistennija fid-doża repetuta ta' 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum, tast ta' limitu jkunu jkun imwettaq. Jekk ma jkun hemm l-ebda informazzjoni disponibbli, medda ta' studju tas-sejbien tista’ tkun imwettqa sabiex tgħin fid-determinazzjoni tad-dożi li għandhom ikunu użati. Apparti milli għat-trattament bis-sustanza tat-test, l-annimali fil-grupp tal-kontroll għandhom ukoll ikunu mqandla b'manjera identika għas-suġġetti tal-grupp tat-test. Jekk ikun użat mezz, il-grupp tal-kontroll għandu jirċievi il-mezz fl-għola volum użat.
         1.5.3   Verifika ta' l-affidabbiltà
         Il-laboratorju li jwettaq l-istudju għandu jippreżenta informazzjoni li turi il-kapaċità tiegħu li jwettaq l-istudju u s-sensittività tal-proċeduri użati. Tali informazzjoni għandha tipprovdi evidenza ta' l-abbiltà li jiżvela u jikkwantifika, kif xieraq, tibdiliet fl-għanijiet finali differenti kif rakkommandati għall-osservazzjoni, bħal ma huma sinjali awtomatiki, reattività sensorja, is-saħħa tal-qabda fid-dirgħajn u s-saqajn u l-attività motorili. L-informazzjoni dwar il-kimika li tikkawża tipi differenti ta' reazzjonijiet newrotossiċi u jistgħu ikunu użati bħala kontroll pożittiv tas-sustanzi jista’ jinstgħab fir-referenzi 2 sa 9. L-informazzjoni storika tista’ tkun użata jekk l-aspetti essenzali tal-proċeduri. Sperimentali jibqgħu l-istess. Aġġornament perjodiku ta' l-informazzjoni storika huwa rakkommandat. Informazzjoni ġdida li turi s-sensittività kontinwa tal-proċeduri għandha tkun żviluppata meta uħud mill-elementi essenzali ta' l-imġieba tat-test jew tal-proċeduri tkun ġiet mibdula mill-laboratorju li jwettaq l-istudji.
         1.5.4   L-għażla tad-doża
         Il-livelli tad-doża għandhom ikunu magħżula billi tkun meqjusa xi informazzjoni preċedentament osservata tat-tossiċità u l-kinetika disponibbli għall-kompost tat-test jew tal-materjali relatati. L-għola livell tad-doża għandu jkun magħżul bil-għan li jinduċi effetti newrotossiċi jew effetti ċari sistematikament tossiċi. Sekwenza dixxendenti tal-livelli tad-doża għandha tkun magħżulha bil-għan li turi kwalunkwe reazzjoni relatata mad-doża u l-livell ta' l-ebda effett ħażin mhu osservat (NOAEL). Bħala prinċipju, il-livelli tad-doża għandhom ikunu hekk stabbiliti sabiex primarjament l-effetti tossiċi fuq is-sistema nervuża jistgħu ikunu distingwiti mill-effetti relatati mat-tossiċità sistematika. Tnejn sa erba' intervalli huma ta' spiss ottimi sabiex ikunu stabbiliti l-livelli tad-doża dixxendenti, u ż-żieda tar-raba' grupp tat-test hija ta' spiss preferibbli mill-użu ta' intervalli ferm twal (eż. aktar minn fattur ta' 10) bejn id-dożi. Meta jkun hemm estimi raġjonevili ta' espożizzjoni umana, dan għandu jkun meqjus.
         1.5.5   Test tal-limitu
         Jekk l-istudju fl-livell ta' doża ta' mill-anqas 1 000 mg/kg piż tal-ġisem.kull jum, li juża l-proċeduri deskritti, ma jipproduċi l-ebda effetti newrotossiċi u jekk it-tossiċità ma tkunx mistennija meta ibbażata fuq l-informazzjoni mill-komposti strutturament relatati, allura studju sħiħ li juża tlett livelli ta' dożi jista’ li ma jkunx meqjus bħala meħtieġ. L-isposizzjoni umana mistennija tista’ tindika il-ħtieġa għal-livell ta' doża orali għola li tkun użata fit-test tal-limitu. Għal tipi oħrajn ta' l-amministrazzjoni, bħal ma hija l-applikazzjoni man-nifs jew dermali, il-propjetajiet fiżiko-kimiċi tas-sustanza tat-test, bħal kemm tinħall, ta' spiss tista’ tindika u tillimita l-livell massimu attenibbli ta' l-espożizzjoni. Għat-twettieq ta' studju akut orali, id-doża tat-test tal-limitu għandha tkun ma mill-anqas 2 000 mg/kg.
         1.5.6   Amministrazzjoni tad-dożi
         L-annimali huma mogħtija d-doża bis-sustanza tat-test, ta' kull jum, sebat ijiet kull ġimgħa, għal perjodu ta' mill-anqas 28 jum; l-użu tar-regola tad-doża ta' ħamest ijiem jew perjodu ta' espożizzjoni aqsar, jeħtieġ li jkunu ġustifikati. Is-sustanza tat-test hija somministrata f'doża waħda b'mod sfurzat bl-użu ta' tubu sa l-istonku jew b'xi inubazzjoni canula xierqa. Il-volum massimu ta' likwidu li jista’ jkun amministrat f'waqt wieħed ikun jiddependi mid-daqs ta' l-annimal tat-test. Il-volum m'għandux jeċċedi 1 ml/100 g piż tal-ġisem. b'dana kollu fil-każ ta' taħlitiet akweji, 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem jista’ jkun ikkonsidrat. Apparti milli għal sustanzi irritanti jew korrossivi, li normalment ikununjiżvelaw effetti eżasperanti b'konċentrazzjonijiet għola, varjabbilità fil-volum tat-test għandha tkun minimizzata bl-aġġustament tal-konċentrazzjoni sabiex tassigura volum kostanti fil-livelli kollha tad-doża.
         Għal sustanzi amministrati permezz ta' l-ikel jew ta' l-ilma tax-xorb, huwa importanti li jkun assigurat li l-kwantitajiet tas-sustanza tat-test kif involuti ma jkunux jinterferixxu man-nutriment normali jew mal-bilanċ ta' l-ilma. Meta s-sustanza tat-test tkun somministrata fid-dieta, konċentrazzjoni djetarja kostanti (ppm) jew livell ta' doża kostanti f'termini tal-piż tal-ġisem ta' l-annimal, jista’ jkun użat; il-mod alternattiv użat għandu jkun speċifikat. Għal sustanza somministrata bi tmiegħ sfurzat, id-doża għandha tkun mogħtija f'ħinijiet simili ta' kull jum, u aġġustata mill-anqas darba fil-ġimgħa sabiex jinżamm livell kostanti ta' doża f'termini tal-piż tal-ġisem ta' l-annimal. Meta l-istudju tad-doża repetuta ikun użat bħala preliminarju għal studju f'terminu fit-tul, dieta simili għandha tkun użata fiż-żewġ studji. F'ċirkostanzi mhuix tas-solti li fihom doża waħda ma tkunx possibbli, id-doża tista’ tingħata fi frazzjonijiet iżgħar matul perjodu li ma jeċċedix l-24 siegħa.
         1.6   OSSERVAZZJONIJIET
         1.6.1   Frekwenza ta' l-osservazzjonijiet u t-testijiet
         Fi studji ta' doża repetuta, il-perjodu ta' l-osservazzjoni għandu jkopri l-perjodu tad-dożaġġ. Fi studju akuti, perjodu ta' 14-il jum post-trattament, għandu jkun osservat. Għall-annimali fi gruppi satteliti li huma miżmuma mingħajr espożizzjoni matul perjodu tal-post-trattament, l-osservazzjonijiet għandhom ikopru wkoll dan il-perjodu.
         L-osservazzjonijiet għandhom isiru fi frekwenza suffiċjenti sabiex iqawwu l-probabbilità tas-sejbien ta' xi annormalitajiet fl-imġieba u/jew fin-newroloġija. L-osservazzjonijiet għandhom, preferibbilment, isiru fl-istess ħinijiet ta' kull jum b'kunsiderazzjoni mogħtija għall-perjodu l-aktar qawwi ta' l-effetti antiċipati wara d-dożaġġ. Il-frekwenza ta' l-osservazzjonijiet kliniċi u tat-testijiet funzjonali huma miġbura f'sommarju fit-Tabella 2. Jekk informazzjoni kinetika jew informazzjoni oħra minn studji preċedenti tindika il-ħtieġa ta' l-użu ta' punti differenti tal-ħon, it-testijiet jew il-perjodu post-osservazzjoni, skeda alternattiva għandha tkun adotta sabiex tkun akkwistata l-informazzjoni massima. Ir-raġunar għal tibdil ta' l-iskeda għandu jkun ipprovdut.
         1.6.1.1   Osservazzjonijiet dwar il-kundizzjonijiet ġenerali tas-saħħa u tal- mortalità/morbidità
         L-annimali kollha għandhom ikunu osservati bir-reqqa mill-anqas darba kull jum fir-rigward tal-kundizzjoni tas-saħħa tagħhom kif ukoll mill-anqas darbtejn kull jum dwar il-morbidità u l-moralità.
         1.6.1.2   Osservazzjonijiet kliniċi dettaljati
         Osservazzjonijiet kliniċi dettaljati għandhom isiru fuq l-annimali kollha magħżula għal dan l-iskop (ara t-Tabella 1), darba qabel l-ewwel espożizzjoni (sabiex jippermetti għal paraguni fi ħdan is-suġġett), u f'ħinijiet differenti minn hemm il-quddiem, jiddependi mit-tul ta' l-istudju (ara t-Tabella 2). Osservazzjoni kliniċi dettaljati fuq gruppi satellita ta' l-irkupru għandhom isiru fit-tmiem tal-perjodu ta' l-irkupru. Osservazzjoni kliniċi dettaljati għandhom isiru il-barra mill-gaġġa ta' fejn jinżammu f'arena normali. Dawn għandhom ikunu reġistrati bir-reqqa bl-użu ta' sistemi tal-marki li jinkludi kriterja jew skali tal-marki għal kull kejl fl-osservazzjonijiet. Il-kriterja jew l-iskali użati għandhom ikunu spliċitament definiti mil-laboratorju tat-test. Sforz għandu jsir sabiex jassigura li l-varjazzjonijiet fil-kundizzjonijiet tat-test ikunu minimi (mhux sistematikament relatati mat-trattament) u li l-osservazzjonijiet ikunu mwettqa minn osservaturi mħarrġa li ma jkunux konxi bit-trattament attwali.
         Huwa rakkommandat li l-osservazzjonijiet ikunu mwettqa f'għamla strutturali li fiha kriterja ben definita (inkluża d-definizzjoni tal-“medda” normali) ikunu sistematikament applikati ma kull annimal fuq waqt ta' l-osservazzjon. Il-“medda normali” għandha tkun adekwatament dokumentata. Is-sinjali osservati kollha għandhom ikunu reġistrati. Kull meta prattikabbli, il-magnitudini tas-sinjali osservati għandhom ukoll ikunu rekordjati. L-osservazzjonijiet kliniċi għandhom jinkludu, imma ma jkunx limitati għall-ambjament fil-ġilda, fis-suf, fl-għajnejn, fil-membrani mukożi, fl-okkorrenza tas-sekrazzjonijiet u tal-ħmieġ u l-attività awtomatika
         (eż. lakrimazzjoni, piloerezzjoni, id-daqs tal-pupilla, għamla repiratorja mhux normali u/jew in-nifs mill-ħalq, xi sinjali mhux tas-soltu ta' l-urina jew tal-qlalet, u urina b'kulur stramb). Xi reazzjonijiet mhux tas-soltu fir-rigward tal-pożissjoni tal-ġisem, il-livell ta' l-attività (eż. tnaqqis jew żieda fl-esplorazzjoni fl-arena normali) u l-kordinament tal-moviment, għandhom ukoll ikunu innotati. Tibdil fil-mixi (eż. xengil, atassja), il-posizzjoni (eż. b'darhom mgħawweġ) u r-reattività għat-tqandil, it-tqegħid jew stimulu ambjentali oħraajn, kif ukoll il-preżenta ta' movimenti kloniċi jew toniċi, konvulżjonijiet jew rogħda, stereotipi (eż. kura żejda, movimenti mhux normali tar-ras, dawrien repetittiv) jew imġieba stramba (eż. gdim jew li jilgħaqu b'mod eċċessiv, mutilazzjoni tagħhom stess, mixi lura, vokalizzazzjoni) jew aggressjoni għandhom ikunu rekordjati.
         1.6.1.3   Testijiet funzjonali
         L-istess bħall-osservazzjonijiet kliniċi dettaljati, it-testijiet funzjonali għandhom ukoll ikunu mwettqa qabel l-espożizzjoni preċedenti u ta' spiss minn hemm il-quddiem fuq l-annimali kollha magħżula għal dan l-iskop (ara t-Tabella 1) Il-frekwenza tat-testijiet funzjonali hija wkoll dipendenti fuq it-tul ta' l-istudju (ara t-Tabella 2). B'żieda mal-perijodi ta' l-osservazzjoni kif elenkati fit-Tabella 2, l-osservazzjonijiet funzjonali fuq gruppi satellita ta' l-irkupru għandhom ukoll isiru malajr kemm jista’ jkun possibbli lejn il-qtil tat-terminazzjoni. It-testijiet funzjonali għandhom jinkludu ir-reattività sensitorja għall-istimu ta' diversi modalitajiet, eż. l-istimuli awditorji, viżwali u proprjoseptivi (5)(6)(7)), bl-assaġġ tal-forza tad-dirgħajn u s-saqajn (8) u l-assaġġ ta' l-attività motorili (9). L-attività motorili għandha tkun imkejjla b'apparat awtomatiku li jkun kapaċi jiżvela kemm it-tnaqqis u wkoll iż-żidiet fl-attività. Jekk tkun użata sistema definita oħra, din għandha tkun kwantitattiva u s-sensittività u l-affiddabbilità tagħha għandhom ikunu demonstrati. Kull apparat għandu jkun ittestjat sabiex jassigura affiddabbilità matul iż-żmien u li jkun konsistenti bejn l-apparati. Aktar dettalji tal-proċeduri li jistgħu ikunu segwiti huma mogħtija fir-referenzi rispettivi. Jekk ma jkun hemm l-ebda informazzjoni (eż. attività strutturali, dettalji epidemjoloġiċim studju tossikoloġiċi oħrajn(sabiex jindikaw l-effetti newrotossiċi potenzali, l-inklużjoni ta' aktar testijiet speċjalizzati tal-funzjoni sensitorja u motorili jew tat-tgħallim u tal-memorja, sabiex jeżaminaw dawn l-effetti possibbli f'aktar dettall, għandhom ikunu ikkonsidrati. Aktar informazzjoni dwar testijiet speċjalizzati u l-użu tagħhom hija disponibbli fi (1).
         B'mod eċċezzjonali, l-annimali li jiżvelaw sinjali ta' tossiċità sal-limitu li din tkun sinifikament tfixkel it-test funzjonali, dawn jistgħu jitħallew barra mit-test. Ġustifikazzjoni għall-eliminazzjoni ta' l-annimali minn test funzjonali għandha tkun ipprovduta.
         1.6.2   Il-piż tal-ġisem u l-konsum ta' l-ikel/ilma
         Għal studju ta' sa 90 jum, l-annimali kollha għandhom ikunu miżuna mill-anqas darba fil-ġimgħa u l-kejl għandu jittieħed tal-konsum ta' l-ikel (konsum ta' l-ilma, meta s-sustanza tat-test hija somministrata b'dik il-medja) mill-anqas darba fil-ġimgħa. Għal studji fit-tul, l-annimali kollha għandhom ikunu miżuna mill-anqas darba fil-ġimgħa għall-ewwel 13-il ġimgħa u mill-anqas kull 4 ġimgħat minn hemm il-quddiem. Il-kejl għandu jsir fuq il-konsum ta' l-ikel (il-konsum ta' l-ilma, meta s-sustanza tat-test hija somministrata b'dik il-medja) mill-anqas darba fil-ġimgħa għall-ewwel 13 il-ġimgħa u imbagħad f'madwar intervalli ta' tlett-xhur, sakemm l-istat tas-saħħa jew tat-tibdiliet fil-piż tal-ġisem jiddettaw mod ieħor.
         1.6.3   Optalmoloġija
         Għal studji itwal minn 28 jum, l-eżaminazzjoni optalmoloġika, bl-użu ta' optalmoskopju jew strument ekwivalenti addattat, għandha ssir qabel l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test u fit-terminazzjoni ta' l-istudju, preferibbilment fuq l-annimali kollha, imma mill-anqas fuq l-annimali f'doża għolja u l-gruppi ta' kontroll. Jekk tibdiliet fl-għajnejn ikunu żvelati, jew, jekk sinjali kliniċi jindikaw il-ħtieġa, l-annimali kollha għandhom ikunu ezaminati. Għal studji fit-tul, eżaminazzjoni optalmoloġika għandha titwettaq mat-13-il ġimgħa. L-eżaminazzjonijiet optalmoloġiċi ma humiex meħtieġa jekk din l-informazzjoni tkun diġa disponibbli minn studji oħrajn ta' tul simili u f'livelli ta' doża simili.
         1.6.4   Ħematoloġija u l-biokemistrija klinika
         Meta l-istudju newrtossiku jkun imwettaq flimkien ma studju tossiku sistematiku b'doża repetuta, l-eżaminazzjonijiet ħematoloġiċi u d-determinazzjoni tal-biokemistrija klinika għandhom jitwattqu kif elenkat fil-Metodu rispettiv ta' l-istudju tossiku sistematiku. Il-ġbir tal-kampjuni għandu jkun imwettaq b'tali mod li xi effetti potenzali fuq in-newro-imġieba jkunu minimizzati.
         1.6.5   Ħistopatoloġija
         L-eżaminazzjoni newropatoloġika għandha tkun iddisinjata sabiex tikkumplementa u testendi l-opsservazzjonijiet magħmula matul il-fażi in vivo ta' l-istudju. Siltiet minn mill-anqas 5 annimali/sess/grupp (ara t-Tabella 1 u l-paragrafu li ġej) għandhom jitwettqu in situ, bl-użu ta' perfużjoni ġenerali rikonoxxuta u t-teknika tal-fissazzjoni (ara r-refernza 3, il-kapitolu 5 u r-referenza 4, il-kapitolu 50). Kwalunkwe tibdiliet kbar osservabbli għandhom ikunu irreġistrati. Meta l-istudju jkun imwettaq bħala aspett ta' l-istudju waħdu dwar in-newrotossiċità hew sabiex jikkaratterizza l-effetti newrotossiċi, il-kumplament ta' l-anniamli jistgħu ikunu użati jew għal newro-imġieba speċifika (10) (11), newropatoloġija (10) (11) (12) (13), mewrokimika (10) (11) (14) (15) jew elettropsikoloġija (10) (11) (16) (17), proċeduri li jistgħu jissupplementaw il-proċeduri u l-eżaminazzjonijiet deskritti hemmhekk, jew sabiex iżidu in-numru ta' suġġetti eżaminati għall-ħistopatoloġija. Dawn il-proċeduri supplementaji jistgħu ikunu partikolarment utili meta l-osservazzjonijiet empiriċi jew l-effetti mistennija jindikaw tip jew mira speċifika tan-newrotossiċità ta' kimika. B'mod alternattiv, il-kumplament ta' l-annimali jistgħu wkoll ikunu użati għal evalwazzjoni patoloġiċi ta' rutina kif deskritt fil-Metodu għal studju ta' doża repetuta.
         Proċedura ta' tbgħajja ġenerali, bħal ma hija l-ħematossilin u l-eosin (H&E), għandha tkun imwettqa fuq il-kampjuni tal-biċċiet kollha mgħaddsa fil-paraffin, u eżaminazzjoni mikroiskopika għandha tkun imwettqa. Jekk ikunu osservati sinjali ta' newropatija periferali, jew jekk dawn ikunu issusspetati, kampjuni mgħaddsa fil-plastika tan-nisġa tal-nervu periferali, għandha tkun eżaminata. Sinjali kliniċi jistgħu wkoll jissuġġerixxi siti addizzjonali għall-eżaminazzjoni jew l-użu ta' proċeduri speċjali tat-tbgħajja. Gwida dwar siti addizzjonali tista’ tinsab fi (3) (4). Tbgħajja speċjali xierqa sabiex jurutipi speċifiċi tat-tibdil patoloġiku jistgħu wkoll ikunu ta' għajnuna (18).
         Sezzjonijiet rapreżentattivi tas-sistema nervuża ċentrali u periferali għandhom ikunu eżaminati b'mod ġistoloġiku (ara r-referenza 3, il-kapitolu 5 u r-referenza 4, il-kapitolu 50). Iż-żoni eżaminati għandhom normalment jinkludu: Il-parti ta' quddiem tal-moħħ, iċ-ċentru tal-cerebrum, inkluża sezzjoni matul il-hippocampus, il-moħħ fin-nofs, il-cerebellum, il-pons, il-medulla oblongata, l-għajnejn bin-nerv ottiku u r-retina, l-ispina dorsali u t-tinfieħ ċervikali u lumbari, il-ganġilja ta' l-għerq dorsali, il-fibri dorsali u vetrali, in-nerv xjatiku prossimali, innerv tibjali prossimati (fl-irkoppa) u n-nerv tibjali fil-friegħi tal-musolu tal-pexxun. L-ispina dorsali u s-sezzjonijiet tan-nervi periferali għandhom jinkludu s-sezzjonijiet laterali jew transversjali u lonġitudinali. Attenzjoni għandha tkun mogħtija għas-sistema vaskulaturali u nervuża. Kampjun tal-muskolu skeletali, partikolarment il-muskolu tal-pexxun, għandu wkoll ikun eżaminat. Attenzjoni speċjali għandha tingħata lis-siti bi struttura ċellullari u fibruża u d-disinn fil-CNS u il-PNS magħrufa li huma partikolarment affettwati bin-newrotossikanti,
         Gwida dwar l-alterazzjonijiet newropatologikali li tipikament jirriżultaw minn espożizzjoni tossika jistgħu jinstabu fir-referenzi (3) (4). Eżmai ta' pass b'pass tal-kampjuni tal-biċċiet huwa rakkommandat li fih is-sezzjonijiet minn grupp ta' doża għolja jkunu l-ewwel paragunati ma dawk tal-grupp ta' kontroll. Jekk l-ebda tibdiliet newropatoloġikali ma jkunu osservati fil-kampjuni minn dawn il-gruppi, analiżi sussegwenti ma tkunx meħtieġa. Jekk alterazzjonijiet newropatoloġiċi jkunu osservati fil-grupp ta' doża għolja, il-kampjun minn kull nisġiet potenzalment affettwati, mill-gruppi tad-doża medja jew baxxa, għandhom imbagħad ikunu kodifiklati u sekwenzalment eżaminati.
         Jekk xi evidenza ta' alterazzjonijiet newropatoloġikali tkun misjuba fl-eżaminazzjoni kwalitattiva, allura it-tieni eżaminazzjoni għandha tkun imwettqa fuq ir-reġjuni kollha tas-sistema nervuża li turi dawn l-alterazzjonijiet. Sezzjonijiet mill-gruppi tad-dożi kollha minn kull reġjun potenzalment affettwat għandhom ikunu kodifikati u eżaminati kif jinzerta mingħajr ma tkun magħrufa l-kodiċi. Il-frekwenza u s-severità ta' kull ferita għandha tkun reġistrata. Wara li r-reġjuni kollha mill-gruppi tad-dożi kollha jkunu ġew iggradati, il-kodiċi tista’ tkun żvelata ul-analiżi statistika mwettqa sabiex tevalwa r-relazzjonijiet doża-reazzjoni. Eżempji tal-gradi differenti tas-severità ta' kull ferita għandhom ikunu deskritti.
         Is-sejbiet newroġatoloġiċi għandhom ikunu evalwati fil-kuntest ta' l-osservazzjoni u l-kejl ta' l-imġieba, kif ukoll xi informazzjoni oħra mill-istudji preċedenti u konkorrenti tat-tossiċità sistematika dwar is-sustanza tat-test.
         2.   DATA
         2.1   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         Data ta' l-annimal individwali għandha tkun ipprovduta. B'żieda, l-informazzjoni kollha għandha tkun miġbura f'sommarju, f'għamla tubulati, li turi għal kull test jew għal kull grupp, in-numru ta' l-annimali fil-bisu tat-test, in-numru ta' l-annimali misjuba mejta waqt it-test jew dawk maqtula għal raġunijiet umanitarji, u l-ħin tal-mewt jew tal-qtil umanitarju, in-numru li juru sinjali ta' tassiċità, deskrizzjoni tas-sinjali tat-tossiċità osservati, inkluż il-ħin ta' meta jiskoppjaw, it-tul tal-ħin, it-tip u s-sevirità ta' effetti tossiċi, in-numru ta' l-annimali li jkollhom feriti, inklużi t-tipi u s-severità tal-feriti.
         2.2   EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Is-sejbiet ta' l-istudju għandhom ikunu evalwati f'termini ta' l-inċidenza, severità u korrelazzjoni ta' l-effetti newro-imġieba u newropatoloġiċi (l-effetti bewrokimiċi jew elettrofiżjoloġiċi kif ukoll jekk l-eżaminazzjonijiet supplementari huma nklużi) u xi effetti ħżiena oħrajn li jkunu osservati. Meta possibbli, r-riżultati numeriċi għandhom ikunu evalwati bil-metodu xieraq u ġeneralment statistikament aċċettabbli. Il-motodi statistiċi għandhom ikunu magħżula matul id-disinn ta' l-istudju.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Is-sustanza tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 in-natura fiżika (inklużi l-propjetajiet iżomeriċi, l-purità u fiżikokimiċi);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-identifikazzjoni.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Mezz (jekk applikabbli):
                     
                                 —
                              
                              
                                 il-ġustifikazzjoni tal-mezz użat.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Annimali tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 speċje/tipi użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru, l-età u s-sess ta' l-annimali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sorsi, il-kundizzjonijiet tal-gaġġeg, id-dieta, etc;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piżijiet individwali ta' l-annimali fil-bidu tat-test.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar is-sustanza tat-test, fomulazzjoni/preparazzjoni tad-dieta, Il-konċentrazzjoni akkwistata, l-istabbilità u l-omoġenità tal-preparazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 speċifikazzjonijiet tad-dożi amministrati, inklużi d-dettalji tal-mezz, il-volum u l-għamla fiżika tal-materjal amministrat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-amministrazzjoni tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ir-raġjonar għal-livell tad-doża magħżula;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ir-raġġjonar tar-rotta u t-tul ta' żmien ta' l-espożizzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 skambju mis-sustanza tat-test minn dieta/ilma tax-xorb bil-konċentrazzjoni (ppm) lejn doża attwali (mg/kg il-piż tal-ġisem/jum), jekk applikabbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar il-kwalità ta' l-ikel u l-ilma.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Osservazzjoni u proċedura tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-assenjar ta' l-annimali lejn kull grupp u tat-tixrid tas-sub-gruppi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji tas-sistemi tal-marki, inkluża l-kriterja għall-iskali tal-marki dwar kull kejl fl-osservazzjonijiet kliniċi dettaljati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji dwar it-testijiet funzjonali għar-reattività sensitorja lejn l-istimuli ta' modalitajiet differenti (eż. awditorji, viżwali u proprjoċettivi); għall-assessjar tal-forza tal-qabda tad-driegħ jew tas-sieq; għall-assessjar ta' l-attività motorili (inklużi dettalji ta' apparat awtomatiku sabiex jiżvela l-attività); u l-proċeduri l-oħrajn kif użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-eżaminazzjonijiet optalmoloġiċi u, jekk xieraq, l-eżaminazzjonijiet ħematoloġiċi u t-testijiet kliniċi tal-biokemistrija bil-valuri relavanti tal-bidu;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji għall-proċeduri newroimġieba, newropatoloġija, newrokimika jew elettrofiżjoloġiċi speċifiċi.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 il-piż tal-ġisem/tibdiliet fil-piż tal-ġisem, inklużi l-piż tal-ġisem mal-qatla;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-konsum ta' l-ikel u l-konsum ta' l-ilma, kif xieraq;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji tar-reazzjoni tossika bis-sess u l-livell tad-doża, inklużi sinjali ta' tossiċità jew mortalità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-natura, is-severità u t-tul ta' żmien (il-waqt ta' meta jiskoppja u l-korsa sussegwenti) ta' l-osservazzjonijiet kliniċi (sew jekk riversibbli u anki jekk le);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni dettaljata tar-riżultati kollha tat-test funzjonali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sejbiet tan-nekropsija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni dettaljata tas-sejbiet kollha, newroimġieba, newropatoloġikali, u newrokimiċi jew elettrofiżjoloġiċi, jekk disponibbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dettalji ta' l-assorbazzjoni u l-metaboliżmu, (jekk disponibbli);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 trattament statistiku tar-riżultati, meta xieraq.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni tar-riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar ir-reazzjoni mad-doża;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 relazzjoni ma xi effetti tossiċi oħrajn lejn konklużjoni dwar il-potenzal newrotossiku tal-kimika tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-livell ta' l-ebda effett ħazin ma jkun osservat.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet:
                     
                                 —
                              
                              
                                 stqarrija speċifika dwar il-globalità newrotossika tal-kimika tat-test hija nkorraġġita.
                              
                           
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, 267-283.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599-609.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. (1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343-352.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp 299-335.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co., Baltimore/London, pp. 726-742.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.
                  
               Tabella 1
         Numru minimu ta' annimali meħtieġa għal kull grupp meta l-istudju newrotossiku ikun imwettaq separatament jew flimkien ma studji oħrajn
         
                      
                  
                  
                     STUDJU NEWROTOSSIKU IMWETTAQ BĦALA:
                  
               
                     Studju separate
                  
                  
                     Studju flimkien mal-istudju ta’ 28 jum
                  
                  
                     Studju flimkien mal-istudju ta 90 jum
                  
                  
                     Studju flimkien mal-istudju dwar it-tossiċità kronika
                  
               
                     Numru totali ta' l-annimali kull grupp
                  
                  
                     10 maskili u 10 femminili
                  
                  
                     10 maskili u 10 femminili
                  
                  
                     15 maskili u 15 femminili
                  
                  
                     25 maskili u 25 femminili
                  
               
                     Numru ta' annimali magħżula għal testijiet funzjonali, inklużi l-osservazzjonijiet kliniċi dettaljati
                  
                  
                     10 maskili u 10 femminili
                  
                  
                     10 maskili u 10 femminili
                  
                  
                     10 maskili u 10 femminili
                  
                  
                     10 maskili u 10 femminili
                  
               
                     Numru ta' annimali magħżula għal kull tixrid in situ u n-newroħispatoloġija
                  
                  
                     5 maskili u 5 femminili
                  
                  
                     5 maskili u 5 femminili
                  
                  
                     5 maskili u 5 femminili
                  
                  
                     5 maskili u 5 femminili
                  
               
                     Numru ta' annimali magħżula għall-osservazzjonijiet ta' dożi tossiċi repetuti/subkroniċi/koron iċi, il-ħematoloġija, il-biokemistrija klinika, il-ħispatoloġija, eċċ., kif indikat fil-Linji ta' Gwida rispettivi.
                  
                  
                      
                  
                  
                     5 maskili u 5 femminili
                  
                  
                     10 maskili u 10 femminili (1)
                     
                  
                  
                     20 maskili (1) u 20 femminili (1)
                     
                  
               
                     Osservazzjoni supplementarja, kif xieraq
                  
                  
                     5 maskili u 5 femminili
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
            
         Tabella 2
         Frekwenza ta' l-osservazzjonijiet kliniċi u tat-testijiet funzjonali
         
                     Tip ta' l-osservazzjoni
                  
                  
                     It-tul ta' l-istudju
                  
               
                     Akut
                  
                  
                     28-jum
                  
                  
                     90-jum
                  
                  
                     Kroniku
                  
               
                     L-annimali kollha
                  
                  
                     Kondizzjoni ġenerali tas-saħħa
                  
                  
                     Kull jum
                  
                  
                     Kull jum
                  
                  
                     Kull jum
                  
                  
                     Kull jum
                  
               
                     Mortalià/morbidità
                  
                  
                     Darbtejn kull jum
                  
                  
                     Darbtejn kull jum
                  
                  
                     Darbtejn kull jum
                  
                  
                     Darbtejn kull jum
                  
               
                     Fl-annimali magħżula għall-osservazzjonij iet funzjonali
                  
                  
                     Osservazzjonij iet kliniċi dettaljati
                  
                  
                     
                                 —
                              
                              
                                 Qabel l-ewwel espożizzjoni
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Fi żmien 8 siegħat mid-doża fl-estimi tal-ħin l-aktar effettiv
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Fil-jum 7 u 14 ta' wara d-doża
                              
                           
                  
                     
                                 —
                              
                              
                                 Qabel l-ewwel espożizzjoni
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Darba fil-ġimgħa minn hem mil-quddiem
                              
                           
                  
                     
                                 —
                              
                              
                                 Qabel l-ewwel espożizzjoni
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Darba matul l-ewwel u t-tieni ġimgħa ta' l-espożizzjoni
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Darba fix-xahar minn hemm il-quddiem
                              
                           
                  
                     
                                 —
                              
                              
                                 Qabel l-ewwel espożizzjoni
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Darba fit-tmiem ta' l-ewwel xahar ta' l-espożizzjoni
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Darba kull tlett xhur, minn hemm il-quddiem
                              
                           
               
                     Testijiet Funzjonali
                  
                  
                     
                                 —
                              
                              
                                 Qabel l-ewwel espożizzjoni
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Fi żmien 8 siegħat mid-doża fl-estimi tal-ħin l-aktar effettiv
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Fil-jum 7 u 14 ta' wara d-doża
                              
                           
                  
                     
                                 —
                              
                              
                                 Qabel l-ewwel espożizzjoni
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Matul ir-raba' ġimgha tat-trattament, kemm jista’ jkun qrib possibbli lejn it-tmiem tal-perjodu ta' l-espożizzjoni
                              
                           
                  
                     
                                 —
                              
                              
                                 Qabel l-ewwel espożizzjoni
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Darba matul l-ewwel u t-tieni ġimgħa ta' l-espożizzjoni
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Darba fix-xahar minn hemm il-quddiem
                              
                           
                  
                     
                                 —
                              
                              
                                 Qabel l-ewwel espożizzjoni
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Darba fit-tmiem ta' l-ewwel xahar ta' l-espożizzjoni
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Darba kull tlett xhur, minn hemm il-quddiem
                              
                           
               B.44.   L-ASSORBIMENT TAL-ĠILDA: IL-METODU IN VIVO
         
         1.   IL-METODU
         Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalent għall-OECD TG 427 (2004).
         1.1   DAĦLA
         L-espożizzjoni għal ħafna kimiċi ssir l-aktar permezz tal-ġilda filwaqt li l-parti l-kbira ta’ l-istudji tossikoloġi mwettqa fuq l-annimali tal-laboratorju jużaw ir-rotta orali ta’ l-amministrazzjoni. L-istudju ta’ l-assorbiment perkutanju in vivo stabbilit f’din il-linja gwida jipprovdi l-kollegament meħtieġ biex jiġi estrapolat mill-istudji orali meta jsiru l-valutazzjonijiet tas-sigurtà wara l-espożizzjoni dermali.
         Sustanza trid bilfors taqsam għadd kbir ta’ saffi ta’ ċelloli tal-ġilda qabel ma tilħaq iċ-ċirkolazzjoni. Il-pass li jiddetermina r-rata għall-parti l-kbira tas-sustanzi huwa l-istratum corneum li jikkonsisti f’ċelloli mejtin. Il-permeabbiltà mill-ġilda tiddependi kemm fuq il-lopofiliċità tal-kimika kif ukoll fuq il-ħxuna tas-saff barrani ta’ l-epidermis, ukoll fuq fatturi bħall-piż molekulari u l-konċentrazzjoni tas-sustanza. B’mod ġenerali, il-ġilda tal-firien u tal-fniek hija aktar permeabbli minn dik tal-bnedmin, filwaqt li l-permeabilità tal-ġilda tal-fniek ta’ l-indi u tax-xadini hija aktar simili għal dik ta’ l-umani.
         Il-metodi biex jitkejjel l-assorbiment perkutanju jistgħu jitqassmu f’żewġ kategoriji; in vivo u in vitro. Il-metodu in vivo huwa kapaċi li jipprovdi informazzjoni tajba, f’bosta speċi tal-laboratorju, dwar l-assorbiment mill-ġilda. Aktar reċenti, ġew żviluppati l-metodi in vitro. Dawn jużaw it-trasport minn ġilda ta’ ħxuna sħiħa jew parzjali ta’ l-annimali jew umana lejn kontenitur ta’ l-ilma. Il-metodu in vitro huwa deskritt f’Metodu tat-Test separat (1). Huwa rrakkomandat li d-Dokument ta’ Gwida ta’ l-OECD għat-Twettiq ta’ l-Istudji dwar l-Assorbiment mill-Ġilda (2) jiġi kkonsultat għall-għajnuna fl-għażla tal-metodu tal-aktar xieraq fis-sitwazzjoni, għaliex jipprovdi aktar dettalji dwar kemm huma xierqa l-metodi in vivo u in vitro.
         Il-metodu in vivo, deskritt f’dan il-metodu, jippermetti d-determinazzjoni tal-penetrazzjoni tas-sustanza tat-test mill-ġilda għal ġewwa l-kompartiment sistemiku. It-teknika intużat b’mod mifrux għal ħafna snin (3)(4)(5)(6)(7). Għalkemm l-istudji in vitro dwar l-assorbiment perkutanju jistgħu jkunu xierqa f’ħafna każijiet, jista’ jkun hemm sitwazzjonijiet fejn studju in vivo biss jista’ jipprovdi d-data meħtieġa.
         Il-vantaġġi tal-metodu in vivo huma li juża sistema li hija fiżjoloġikament u metabolikament intatta, juża speċi li hija komuni għal bosta studji dwar it-tossiċità u jista’ jiġi mmodifikat għall-użu ma’ speċi oħrajn. L-iżvantaġġ huma li jintużaw annimali ħajjin, il-bżonn ta’ materjal li huwa radjotikkettjat biex jiġu ffaċilitati r-riżultati dipendibbli, u d-diffikultajiet fid-determinazzjoni tal-fażi ta’ l-assorbiment bikri u d-differenzi fil-permeabilità tal-ġilda ta’ l-ispeċi preferita (firien) u tal-bniedem. Il-ġilda ta’ l-annimali normalment hija aktar permeabbli u għalhekk tista’ toħloq stima kbira wisq dwar l-assorbiment perkutanju tal-bniedem (6)(8)(9). Is-sustanzi kawstiċi/korrożivi m’għandhomx jiġu ttestjati fl-annimali ħajjin.
         1.2   DEFINIZZJONIJIET
         
            Doża mhux assorbita: tirrappreżenta dik maħsula mill-wiċċ tal-ġilida wara l-espożizzjoni u kwalunkwe doża preżenti fuq il-kopertura mhux poruża, inkluża kwalunkwe doża murija li tiżvinta minn fuq il-ġilda matul l-espożizzjoni.
         
            Doża assorbita (in vivo): tinkludi dik preżenti fl-urina, fil-ħasil tal-gaggi, fil-feċi, fl-arja skaduta (jekk tiġi mkejla), fid-demm, fiċ-ċelloli (jekk jinġabru) u fil-karkass li jifdal, wara t-tneħħija tal-ġilda tas-sit ta’ l-applikazzjoni.
         
            Doża li tista’ tiġi assorbita: tirrappreżenta d-doża preżenti fuq jew ġewwa l-ġilda wara l-ħasil.
         1.3   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza tat-test, preferibbilment radjotikkettjata, hija applikata fuq il-ġilda mqaxxra ta’ annimali f’livell wieħed jew aktar ta’ doża xierqa fil-forma ta’ preparazzjoni fl-użu rappreżentattiva. Il-preparazzjoni tat-test hija permessa li tibqa’ fil-kuntatt mal-ġilda għal perjodu ta’ żmien fiss taħt kopertura xierqa (mhux poruża, semi-poruża, jew poruża) biex tiġi mrażżna l-inġestjoni tal-preparazzjoni tat-test. Fl-aħħar tal-ħin ta’ l-espożizzjoni l-kopertura titneħħa u l-ġilda titnaddaf b’aġent xieraq tat-tindif, il-kopertura u l-materjali tat-tindif jinżammu għall-analiżi u tiġi provduta kopertura oħra. L-annimali jinżammu qabel, matul u wara l-perjodu ta’ l-espożizzjoni f’gaġġi tal-metaboliżmu individwali, u l-ħmieġ u l-arja minfuħa ‘l barra f’dawn il-perjodi jinġabru għall-analiżi. Il-ġbir ta’ l-arja minfuħa ‘l barra jista’ jitħalla barra meta hemm biżżejjed informazzjoni li ftit jew xejn metabolit radjoattiv ma jiġi ffurmat. Normalment kull studju jinvolvi bosta gruppi ta’ annimali li se jiġu esposti għall-preparazzjoni tat-test. Grupp wieħed jinqatel fl-aħħar tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni. Gruppi oħrajn jinqatlu f’intervalli ta’ ħin skedati wara dan (2). Fl-aħħar tal-ħin tat-teħid tal-kampjuni l-annimali li jifdal jinqatlu, jinġabar id-demm għall-analiżi, jitneħħa s-sit ta’ l-applikazjoni għall-analiżi u l-karkass huwa analiżżat għal materjal li ma ġiex ekskretat. Il-kampjuni huma mogħdija mill-esperiment b’mezzi xierqa u l-livell ta’ l-assorbiment perkutanju jiġi stmat (6)(8)(9).
         1.4   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.4.1   L-għażla ta’ l-ispeċi ta’ l-annimali
         Il-far huwa l-ispeċi użata l-aktar spiss, iżda fergħat u speċi mingħajr suf li għandhom rati ta’ l-assorbiment tal-ġilda aktar simili għal dawk tal-bnedmin, jistgħu jintużaw ukoll (3)(6)(7)(8)(9). Għandhom jintużaw annimali adulti żgħażagħ u b’saħħithom ta’ sess uniku (is-sess normali huwa maskili) ta’ fergħat użati ħafna fil-laboratorji. Fil-bidu ta’ l-istudju, il-varjazzjoni tal-piż ta’ l-annimali użati m’għandhiex teċċedi ± 20 % tal-piż medju. Bħala eżempju, il-firien maskili ta’ 200 g – 250 g huma xierqa, b’mod partikolari fl-ogħla nofs ta’ din il-firxa.
         1.4.2   L-għadd u s-sess ta’ l-annimali
         Għandu jintuża għal kull preparazzjoni tat-test u għal kull ħin ta’ tmiem skedat, grupp ta’ mhux inqas minn erba’ . annimali ta’ sess uniku. Kull grupp ta’ annimali jinqatel wara intervalli ta’ żmien differenti, per eżempju fl-aħħar tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni (tipikament 6 sigħat jew 24 siegħa) u fuq okkorrenzi sussegwenti (eż. 48 u 72 siegħa). Jekk hemm data disponibbli li juru differenzi sustanzjali fit-tossiċità dermali bejn il-maskili u l-femminili, għandu jintgħażel is-sess l-aktar sensittiv. Jekk ma hemmx data minn din, jista’ jintuża kwalunkwe sess.
         1.4.3   Il-kundizzjonijiet taż-żamma u l-għalf
         It-temperatura fil-kamra ta’ l-esperimenti ta’ l-annimali għandha tkun ta’ 22 oC (± 3 oC). Għalkemm l-umdità relattiva għandha tkun għall-inqas 30 % u preferibbilment ma teċċedix 70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra, wieħed għandu jimmira lejn 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, u s-sekwenza tkun 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għall-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju u għandhom ikunu liberament disponibbli flimken ma’ provvista mingħajr limitu ta’ ilma għax-xorb. Matul l-istudju, u preferibbilment ukoll matul l-akklimatizzazzjoni, l-annimali jinżammu individwalment f’gaġeġ tal-metaboliżmu. Ladarba t-twaqqigħ ta’ l-ikel u ta’ l-ilma jista’ jikkomprometti r-riżultati, il-probabbiltà ta’ dawn l-okkorrenzi għandha tiġi minimizzata.
         1.4.4   Il-preparazzjoni ta’ l-annimali
         L-annimali huma mmarkati biex tkun possibbli l-identifikazzjoni individwali u jinżammu fil-gaġeġ tagħhom għall-inqas għal ħamest ijiet qabel ma jinbeda l-istudju biex tkun possibbli l-akklimatizzazzjoni għall-kundizzjonijiet tal-laboratorju.
         Wara l-perjodu ta’ l-akklimatizzazzjoni, u madwar 24 siegħa qabel ma tingħata d-doża, kull animal ikollu parti ta’ ġilda fir-reġjun ta’ l-ispallejn u d-dar imqaxxra. Il-karatteristiċi ta’ permeazzjoni ta’ ġilda danneġġjata huma differenti mill-ġilda intatta u għandu jkun hemm attenzjoni li l-ġilda ma tinbaraxx. Wara t-tqaxxir u madwar 24 siegħa qabel ma tiġi applikata s-sustanza tat-test, (ara t-tqsima 1.4.7) il-wiċċ tal-ġilda għandu jintmesaħ bl-aċeton biex jitneħħa s-sebum. Mhijiex rakkomandata ħasla addizzjonali bis-sapun u bl-ilma għaliex ir-residwu tas-sapun jista’ jippromwovi l-assorbument tas-sustanza tat-test. Iż-żona għandha tkun kbira biżżejjed biex tippermetti kalkolu dipendibbli ta’ l-ammont tal-kimika tat-test asssorbit, preferibbilment għall-inqas 10 ċm2. Din iż-żona hija prattikabbli bil-firien ta’ piż tal-ġisem ta’ 200-250 g. Wara l-preparazzjoni, l-annimali jiġu ritornati għal-gaġeġ tal-metaboliżmu.
         1.4.5   Is-sustanza tat-test
         Is-sustanza tat-test hija l-entità li l-karatteristiċi tal-permeazzjoni tagħha għandhom jiġu studjati. Idealment, is-sustanza tat-test għandha tiġi radjotikkettjata.
         1.4.6   Il-preparazzjoni tat-test
         Il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test (eż. materjal mhux imħallat, imħallat jew ifformulat li fih il-kimika tat-test li hija applikata għall-ġilda(għandha tkun l-istess (jew surrogat realistiku) bħal dik li għalihom jistgħu jkunu esposti l-umani jew speċi oħrajn potenzjali mmirati. Kwalunkwe varjazzjoni mill-preparazzjoni “fl-użu” għandha tkun iġġustifikata. Fejn meħtieġ, is-sustanza tat-test hija maħlula jew sospiża f’kontenitur xieraq. Għal kontenituri minbarra l-ilma, il-karatteristiċi ta’ l-assorbiment u l-interazzjoni potenzjali mas-sustanza tat-test għandhom ikunu magħrufa.
         1.4.7   L-applikazzjoni tal-ġilda
         Sit ta’ applikazzjoni ta’ arja tal-wiċċ speċifika hija ddefinita fuq wiċċ il-ġilda. Ammont magħruf tal-preparazzjoni tat-test huwa mbagħad applikat b’mod uniformi fuq is-sit. Dan l-ammont għandu normalment jimita l-espożizzjoni potenzjali umana, tipikament 1-5 mg/ċm2 għal solidu jew sa 10 μl/ċm2 għal-likwidi. Kwantitajiet oħrajn għandhom ikunu ġġustifikati bil-kundizzjonijiet ta’ l-użu mistenni, l-għanijiet ta’ l-istudju jew il-karatteristiċi fiżiċi tal-preparazzjoni tat-test. Wara l-applikazzjoni, is-sit ittrattat għandu jiġi protett milli jintmess. Eżempju ta’ tagħmir tipiku jintwera fil-Figura 1. Normalment, is-sit ta’ l-applikazzjoni jiġi protett b’kopertura mhux poruża (eż. għata tal-garża tan-nylon permeabbli). Iżda, għal applikazzonijiet infiniti, is-sit ta’ l-applikazzjoni għandu jiġi okkluż. Fil-każ li l-evaporazzjoni ta’ sustanzi tat-test semi-volatili jnaqqas ir-rata ta’ l-irkupru tas-sustanza tat-test sa livell mhux aċċettabbli (ara wkoll it-taqsima 1.4.1.0, l-ewwel paragrafu), huwa neċessarju li s-sustanza li żvintat tiġi evaporata f’filtru tal-faħam li jkopri t-tagħmir ta’ l-applikazzjoni (ara l-Figura 1). Huwa importanti li t-tagħmir ma jagħmilx ħsara lill-ġilda, u lanqas ma jassorbi jew jirreaġixxi mal-preparazzjoni tat-test. L-annimali huma ritornati fil-gaġeġ tal-metaboliżmu individwali sabiex jinġabar il-ħmieġ tagħhom.
         1.4.8   Kemm iddum l-espożizzjoni u t-teħid tal-kampjuni
         Id-dewmien ta’ l-espożizzjoni huwa l-intervall bejn l-applikazzjoni u t-tneħħija ta’ preparazzjoni bil-ħasil tal-ġilda. Għandu jintuża perjodu rilevanti ta’ l-espożizzjoni (tipikament 6 sigħat jew 24 siegħa) fuq bażi tad-dewmien ta’ l-espożizzjoni mistennija umana. Wara l-perjodu ta’ l-espożizzjoni, l-annimali jinżammu fil-gaġeġ tal-metaboliżmu sat-terminazzjoni kif ippjanat. L-annimali għandhom jiġu osservati għal sinjali ta’ tossiċità/reazzjonijiet mhux normali f’intervalli regolari għal kemm idum l-istudju kollu. Flaħħar tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni, il-ġilda ttrattata għandha tiġi osservata għal sinjali viżibbli ta’ irritazzjoni.
         Il-gaġeġ tal-metaboliżmu għandhom jippermettu l-ġbir separat ta’ l-urina u l-feċi matul l-istudju kollu. Għandhom jippermettu l-ġbir ta’ diossidu tal-karbonju 14C u komposti volatili ta’ karbonju 14C, li għandhom jiġu analizzati meta prodotti f’kwantitajiet kbar (> 5 %). L-urina, il-feċi u l-fluwidi intrappolati (eż. diossidu tal-karbonju 14C u komposti volatili ta’ 14C) għandhom jinġabru individwalment minn kull gripp fil-ħin tat-teħid tal-kampjuni. Jekk hemm biżżejjed informazzjoni li ftit metabolit radojattiv li jiżvinta, jew xejn, ma jiġi ffurmat, jistgħu jintużaw gaġeġ miftuħin.
         Matul il-perjodu ta’ l-espożizzjoni, jinġabru l-excreta, sa 24 siegħa wara l-ewwel kuntatt tal-ġilda u mbagħad kuljum sa l-aħħar ta’ l-esperiment. Filwaqt li normalment ikunu biżżejjed tliet intervalli tal-ġbir ta’ l-excreta, l-għan ippjanat tal-preparazzjoni tat-test jew id-data kinetika eżistenti jistgħu jissuġġerixxu punti ta’ żmien addizzjonali għall-istudju.
         Fl-aħħar tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni it-tagħmir protettiv jitneħħa minn kull annimal u jitneħħa minn kull annimal u jinżamm separat għall-analiżi. Jekk il-ġilda ttrattata ta’ l-annimali kollha għandha tinħasel għall-inqas 3 darbiet bl-aġent tat-tindif bl-użu ta’ tajjar xieraq. Għandu jkun hemm attenzjoni biex jiġi evitat il-kontaminazzjoni ta’ partijiet oħrajn tal-ġisem. L-aġent tat-tindif għandu jirrappreżenta l-prattika normali ta’ l-iġjene, eż. taħlita tas-sapun bl-ilma. Fl-aħħar, il-ġilda għandha tiġi xxuttata. It-tajjar kollu u l-ħasil kollu għandhom jinżammu għall-analiżi. Għandha tiġi provduta kopertura friska biex is-sit ittrattat ta’ dawk l-annimali li jiffurmaw il-gruppi tal-punti ta’ ħin ta’ wara jiġi protett, qabel ma jittieħdu lura fil-gaġeġ individwali.
         1.4.9   Il-proċeduri terminali
         Għal kull grupp, l-annimali individwali għandhom jinqatlu fil-ħin ippjanat u d-demm jinġabar għall-analiżi. It-tagħmir jew kopertura protettivi għandhom jitneħħew għall-analiżi. Il-ġilda mis-sit ta’ l-applikazzjoni u minn żona simili ta’ ġilda mhux iddożata u mqaxxra għandhom jitneħħew minn kull annimali għal analiżi separata. Is-sit ta’ l-applikazzjoni jista’ jkun frazzjonat biex jiġi sseparat l-istratum corneum mill-epidermis ta’ taħt biex tingħata aktar informazzjoni dwar id-dispożizzjoni tal-kimika tat-test. Id-determinazzjoni ta’ din id-dispożizzjoni wara l-mogħdija ta’ żmien ta’ l-espożizzjoni għandha tipprovdi xi indikazzjoni tad-destin ta’ kwalunkwe kimika tat-test fl-istratum corneum. Biex tkun faċli l-frazzjonazzjoni tal-ġilda (wara l-aħħar ħasla tal-ġilda u l-qtil ta’ l-annimal) kull kopertura protettiva titneħħa. Il-ġilda tas-sit ta’ l-applikazzjoni, biċ-ċirku anulari tal-ġilda madwarha, tinqata’ minn mal-far u tiġi mwaħħla b’labra fuq biċċa njama. Strixxa ta’ tejp tiġi mwaħħla mal-wiċċ tal-ġilda bl-użu ta’ pressjoni bil-mod u t-tejp jitneħħa flimkien ma’ parti mill-istratum corneum. Jiġu applikati strixxi ta’ tejp oħrajn sakemm it-tejp ma jibqax jeħel mal-wiċċ tal-ġilda, meta l-istratum corneum kollu jkun tneħħa. Għal kull animal, l-istrixxi kollha tat-tejp jistgħu jiġu kkombinati f’kontenitur wieħed li mbagħad jiżdied miegħu diġestant tat-tessut biex jissolubilizza l-istratum corneum. Jistgħu jitneħħew tessuti potenzjalment immirati għal kejl separat qabel ma jiġi analiżżat il-karkass residwali għad-doża assorbita tal-karkass. Il-karkassi ta’ l-annimali individwali għandhom jinżammu għall-analiżi. Normalment l-organi mmirati jitneħħew għall-analiżi separata (jekk indikat minn studji oħrajn). L-urina preżenti fil-marrara fil-qtil ippjanat għandha tiżdied mal-ġabra ta’ l-urina ta’ qabel. Wara li jinġabar il-ħmieġ mil-gaġeġ tal-metaboliżmu wara l-qtil fil-ħin ippjanat, il-gaġeġ u l-bibien tagħhom għandhom jinħaslu b’solvent xieraq. Għandu wkoll jiġi analizzat tagħmir ieħor potenzjalment ikkontaminat.
         1.4.10   Analiżi
         Fl-istudji kollha għandu jinkiseb l-irkupru xieraq (jiġifieri medja ta’ 100 ± 10 % tar-radjoattività). L-irkupru barra minn din il-firxa għandu jiġi ġġustifikat. L-ammont tad-doża somministrata f’kull kampjun għandu jiġi analizzat fi proċeduri validati kif xieraq.
         Il-kunsiderazzjonijiet statistiċi għandhom jinkludu miżura ta’ varjanza għar-replikati għal kull applikazzjoni.
         2.   DATA
         Dan il-kejl għandu jsir għal kull annimal, f’kull ħin tat-teħid tal-kampjuni għall-kimika tat-test u/jew metabolite. Minbarra d-data individwali, id-data miġbura skond il-ħinijiet tat-teħid tal-kampjuni għandha tiġi rrapportata bħala medja.
         
                     —
                  
                  
                     kwantità assoċjata ma’ l-applikazzjonijiet protettivi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwantità li tista’ tinqala’ minn mal-ġilda;
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwantità fi/fuq il-ġilda li ma tista’x tinħasel minn mal-ġilda;
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwantità fid-demm li ttieħed bħala kampjun;
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwantità fl-excreta u fl-arja skaduta (jekk xieraq);
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwantità li jifdal fil-karkass u kwalunkwe organi mneħħi għall-analiżi separata.
                  
               Il-kwantità tas-sustanza tat-test u/jew metabolit fil-ħmieġ, fl-arja skaduta, fid-demm u fil-karkass tippermetti d-determinazzjoni ta’ l-ammont totali assorbit f’kull punt ta’ ħin. Jista’ jinkiseb ukoll kalkolu ta’ l-ammont ta’ kimika tat-test assorbit għal kull ċm2 ta’ ġilda esposta għas-sustanza tat-test fil-perjodu ta’ l-espożizzjoni.
         3.   IR-RAPPORTAĠĠ
         3.1   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport għandu jinkludi r-rekwiżiti stipulati fil-protokoll, inkluża ġustifikazzjoni tas-sistema tat-test użata u għandu tinkludi dawn li ġejjin:
         
                      
                  
                  
                     Is-Sustanza tat-Test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 id-data ta’ l-identifikazzjoni [eż. CAS numru, jekk disponibbli; għajn; safa (safa radjokimika); impuritajiet magħrufin; numru tal-lott]
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-natura fiżika, il-karatteristiċi fiżikokimiċi (eż. pH, volatilità, solubilità, stabilità, piż molekulari u Pow).
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Il-preparazzjoni tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 formulazzjoni u ġustifikazzjoni ta’ l-użu;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji tal-preparazzjoni tat-test, l-ammont applikat, il-konċentrazzjoni miksuba, il-mezz, l-istabilità u l-omoġeneità.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     L-annimal tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 speċi/fergħa użata;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 numbru, età u sess ta’ l-annimali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 għajn ta’ l-annimali, kundizzjonijiet taż-żamma, dieti, eċċ.;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 piżijiet individwali ta’ l-annimali fil-bidu tat-test.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Il-kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta’ l-amministrazzjoni tal-preparazzjoni tat-test (sit ta’ l-applikazzjoni, metodi ta’ l-esperiment, porożità/nuqqas ta’ porożità, volum, estrazzjoni, skoperta);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji tal-kwalità ta’ l-ikel u l-ilma.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 sinjali ta’ tossiċità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 data tabulata dwa l-assorbiment (espresso bħala rata, ammont jew persentaġġ);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 irkupri totali ta’ l-esperiment;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 interpretazzjoni tar-riżultati, tqabbil ma’ data disponibbli jew assorbiment perkutanju tal-kompost tat-test.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni tar-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     1.
                  
                  
                     Metodu tat-Test B.45. L-Assorbiment tal-Ġilda: Metodu In vitro
                     
                  
               
                  
                     2.
                  
                  
                     OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.
                  
               
                  
                     3.
                  
                  
                     ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20.
                  
               
                  
                     4.
                  
                  
                     Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for Environmental Protection Agency Requirements. J. Am. Coll. Toxicol. 8(5), 829-835.
                  
               
                  
                     5.
                  
                  
                     Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.
                  
               
                  
                     6.
                  
                  
                     EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Applications. Exposure Assessment Group, Office of Health and Environmental Assessment.
                  
               
                  
                     7.
                  
                  
                     EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic Substances.
                  
               
                  
                     8.
                  
                  
                     Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R (1990) In vivo percutaneous absorption of fragrance ingredients in reshus monkeys and humans. Fd. Chem. Toxic. 28, 369-373.
                  
               
                  
                     9.
                  
                  
                     Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic compounds through the skin in man. J. Invest Dermatol. 54, 399-404.
                  
               Figura 1
         Eżempju ta’ Diżinn ta’ Tagħmir Tipiku użat biex jiġi Definit u Protett Sit ta’ l-Applikazzjoni Dermali matul Studji in vivo ta’ l-Assorbiment Perkutanju
         B.45.   L-ASSORBIMENT TAL-ĠILDA: IL-METODU IN VITRO
         
         1.   IL-METODU
         Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalent għall-OECD TG 428 (2004).
         1.1   DAĦLA
         Dan il-Metodu ġie ddiżinjat biex jipprovdi informazzjoni dwar l-assorbiment ta’ sustanza tat-test applikata għall-ġilda maqtugħa barra. Jista’ jiġi kkombinat mal-Metodu għall-Assorbiment tal-Ġilda: Il-Metodu In vivo (1), jew isir separatament. Huwa rrakkomandat li d-Dokument ta’ Gwida ta’ l-OECD għat-Twettiq ta’ l-Istudji dwar l-Assorbiment mill-Ġilda (2) jiġi kkonsultat għall-għajnuna fid-disinn ta’ l-istudji bbażati fuq dan il-Metodu. Id-Dokument ta’ Gwida ġie ppreparat biex jiffaċilita l-għażla ta’ proċeduri in vitro xierqa għall-użu f’ċirkostanzi speċifiċi, biex tiġi żgurata d-dependibbiltà tar-riżultati miksuba b’dan il-metodu.
         Il-metodi biex jitkejjel l-assorbiment perkutanju jistgħu jitqassmu f’żewġ kategoriji; in vivo u in vitro. Il-metodi in vivo dwar l-assorbiment tal-ġilda huma stabbiliti sew u jipprovdu informazzjoni farmakokinetika f’firxa ta’ speċje ta’ l-annimali. Il-metodu in vivo huwa deskritt separatament f’Metodu tat-Test ieħor (1). Il-metodi in vitro ukoll intużaw għal bosta snin biex jitkejjel l-assorbiment tal-ġilda. Għalkemm l-istudji tal-validazzjoni formali tal-metodi in vitro koperti b’dan il-Metodu tat-Test ma sarux, l-esperti ta’ l-OECD qablu fl-1999 li kien hemm biżżejjed data evalwata biex issostni l-metodu in vitro (3). Aktar dettalji li jissostanzjaw dan is-sostenn, inkluż għadd sinjifikanti ta’ paraguni diretti tal-metodi in vitro u in vivo, jingħataw mad-Dokument ta’ Gwida (2). Hemm għadd ta’ monografi li jeżaminaw dan is-suġġett u jagħtu sfond dettaljat dwar l-użu ta’ metodu in vitro (4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12). Il-metodi in vitro jkejlu d-diffużjoni tal-kimika fi u minn ġo l-ġilda lejn kontenitur tal-fluwidu u jistgħu jużaw ġilda mhux vijabbli biex ikejlu d-diffużjoni biss, jew ġilda attiva, metabolikament attiva, biex fl-istess ħin ikejlu d-diffużjoni u l-metaboliżmu tal-ġilda. Dawn il-metodi nstabu partikolarment utli bħala skrin għat-tqabbil tat-twassil tal-kimika fi u minn ġo l-ġilda minn formolazzjonijiet differenti u jistgħu wkoll jipprovdu mudelli utli għall-istima ta’ l-assorbiment perkutanju mill-ġilda.
         Il-metodu in vitro jista’ ma jgħoddx għas-sitazzjonijiet kollha jew għall-klassijiet kollha tal-kimiċi. Jista’ jkun possibbli li jintuża l-metodu tat-test in vitro għall-evalwazzjoni kwalitattiva inizzjali tal-penetrazzjoni tal-ġilda. F’xi każijiet jista’ jkun meħtieġ li mbagħad ikun hemm id-data in vivo. Id-dokument ta’ gwida (2) għandu jiġi kkonsultat għal aktar elaborazzjoni ta’ sitwazzjonijiet fejn ikun xieraq il-metodu in vitro. Informazzjoni addizzjonali dettaljata biex tiġi sostnuta d-deċiżjoni tingħata f’(3).
         Dan il-metodu jippreżenta l-prinċipji ġenerali biex jitkejjel l-assorbiment dermali u t-twassil tas-sustanza tat-test bl-użu tal-ġilda maqtugħa barra. Tista’ tintuża l-ġilda minn bosta speċje mammiferi, inklużi l-bnedmin. Il-karatteristiċi tal-permeabilità tal-ġilda jinżammu wara li tinqata’ minn mal-ġilda għaljiex l-ostakolu prinċipali tad-diffużjoni huwa l-istratum corneum mhux vijabbli; it-trasport attiv tal-kimika mill-ġilda ma ġiex identifikat. Il-ġilda ntweriet li għandha l-kapaċità li timmetabolizza xi kimika matul l-assorbiment perkutanju (6), iżda dan il-proċess ma jillimitax ir-rata f’termini ta’ doża attwalment assorbita, għalkemm jista’ jaffettwa n-natura ta’ materjal li daħlet fis-sistema tad-demm.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Doża mhux assorbita: tirrappreżenta dik maħsula mill-wiċċ tal-ġilida wara l-espożizzjoni u kwalunkwe doża preżenti fuq il-kopertura mhux poruza, inkluża kwalunkwe doża murija li tiżvinta minn fuq il-ġilda matul l-espożizzjoni.
         
            Doża assorbita (in vitro): massa tas-sustanza tat-test li tilħaq il-fluwidu reċettur jew iċ-ċirkolazzjoni sistemika f’ħin speċifikat.
         
            Doża li tista’ tiġi assorbita (in vitro): tirrappreżenta d-doża preżenti fuq jew ġewwa l-ġilda wara l-ħasil.
         1.3.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Is-sustanza tat-test, li tista’ tkun radjotikkettjata, hija applikata fuq il-wiċċ ta’ kampjun tal-ġilda li jissepara żewġ kompartimenti ta’ ċellola tad-diffużjoni. Il-kimika tibqa’ fuq il-ġilda għal żmien speċifikat taħt kundizzjonijiet speċifikati, qabel ma titneħħa bi proċedura xierqa tat-tindif. Jittieħed kampjun tal-fluwidu reċettorju f’punti matul l-esperiment u jiġi analizzat għall-kimika tat-test u/jew metaboliti.
         Meta jintużaw sistemi metabolikament attivi, il-metaboliti tal-kimika tat-test jistgħu jiġu analizzati b’metodi xierqa. Fl-aħħar ta’ l-esperiment, id-distribuzzjoni tal-kimika tat-test u l-metaboliti tagħha jiġu kkwantifikat, meta jkun xieraq.
         Bl-użu ta’ kundizzjonijiet xierqa, li huma deskritti f’dan il-metodu u fid-dokument ta’ gwida (2), l-assorbiment ta’ sustanza tat-test matul terminu definit jitkejjel bl-analiżi tal-fluwidu reċettorju u tal-ġilda ttrattata. Is-sustanza tat-test li jifdal fil-ġilda għandha titqies bħala assorbita mill-valuri tal-fluwidu reċettorji waħdu. L-analiżi tal-komponenti oħrajn (materjal maħsul minn mal-ġilda u li jifdal fis-saffi tal-ġilda) tippermetti evalwazzjoni ulterjuri tad-data, inkluża d-dispożizzjoni totali tas-sustanza tat-test u l-perċentwal ta’ l-irkupru.
         Biex jintwera l-operat u d-dipendibbiltà tas-sistema tat-test fil-laboratorju tal-ħidma, ir-riżultati għall-kimiċi rilevanti ta’ referenza għandhom ikunu disponibbli u bi qbil mal-letteratura pubblikata għall-metodu użat. Dan ir-rekwiżit jista’ jintlaħaq billi tiġi ttestjata sustanza xierqa ta’ riferenza (preferibbilment ta’ lipofiliċità qrib is-sustanza tat-test) b’mod konkurrenti mas-sustanza tat-test jew bil-proviżon ta’ data storika xierqa għal għadd ta’ sustanzi ta’ riferenza ta’ lipofiliċità differenti (eż. il-kaffeina, l-aċidu benżoiku, u t-testosterone).
         1.4.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.4.1   Iċ-ċellola tad-diffużjoni
         Ċellola tad-diffużjoni tikkonsisti f’kompartiment donatur u kompartiment reċettorju li bejniethom titqiegħed il-ġilda (eżempju ta’ diżinn tipiku huwa provdut fil-Figura 1). Iċ-ċellola għandha tipprovdi siġill tajjeb madwar il-ġilda, tippermetti t-teħid faċli tal-kampjuni u taħlit tajjeb tat-taħlita reċettorja f’kuntatt mal-parti ta’ taħt tal-ġilda, u l-kontroll tajjeb tat-temperatura taċ-ċellola u l-kontenut tagħha. Iċ-ċelloli statiċi u li jippermettu d-diffużjoni bit-tnixxija huma t-tnejn aċċettabbli. Normalment, il-kompartimenti donaturi jitħallew mhux porużi matul l-espożizzjoni għal doża tal-preparazzjoni tat-test. Madankollu, għal applikazzjonijiet infiniti u għal xi xenarji għal dożi finite, il-kompartimenti donaturi jistgħu jkunu porużi.
         1.4.2.   Il-fluwidu reċettorju
         L-użu ta’ fluwidu reċettorju fiżjoloġikament konduċiv huwa preferit għalkemm jistgħu jintużaw kemm-il darba huma ġġustifikati. Il-kompożizzjoni preċiża tal-fluwidu reċettorju għandha tkun provduta. Is-solubilità xierqa tal-kimika tat-test fil-fluwidu reċettorju għandha tintwera sabiex ma taġixxix bħala ostakolu għall-assorbiment. Barra minn hekk, il-fluwidu reċettorju m’għandux jaffettwa l-integrità tal-preparazzjoni tal-ġilda. F’sistema tat-tnixxija, ir-rata tat-tnixxija m’għandhiex tostakola d-diffużjoni ta’ sostanza tat-test fil-fluwidu reċettorju. F’sistema ta’ ċelloli statiċi, il-fluwidu għandu jiġi mħawwad kontinwament u jittieħdu l-kampjuni regolarment. Jekk il-metaboliżmu qed jiġi studjat, il-fluwidu reċettorju għandu jsostni l-vijabilità tal-ġilda tul l-esperiment kollu.
         1.4.3   Il-preparazzjonijiet tal-ġilda
         Tista’ tintuża ġilda minn għejun umani jew ta’ l-annimali. Huwa rikonoxxut li l-użu tal-ġilda umana huwa soġġett għal kunsiderazzjonijiet u kundizzjonijiet etiċi nazzjonali u internazzjonali. Għalkemm hija preferuta ġilda vijabbli, tista’ tinuża wkoll ġilda mhux vijabbli kemm-il darba l-integrità tal-ġilda tista’ tintwera. Huma aċċettabbli membrani epidermali (separati enżimikament, bis-sħana jew kimikament) jew ġilda ta’ ħxuna maqsuma (tipikament ħoxna daqs 200-400 μm) ippreparati b’dermatome. Tista’ tintuża ġilda ta’ ħxuna sħiħa iżda l-ħxuna eċċessiva (ca. > 1 mm) għandha tiġi evitata kemm-il darba mhijiex speċifikament meħtieġa għad-determinazzjoni tal-kimika tat-test fis-saffi tal-ġilda. L-għażla ta’ l-ispeċje, tas-sit anatomiku u tat-teknika preparattiva għandhom ikunu ġġustifikati. Id-data aċċettabbli minn minimu ta’ erba’ replikati għal kull preparazzjoni tat-test hija meħtieġa.
         1.4.4   L-integrità tal-Preparazzjoni tal-Ġilda
         Huwa essenzjali li l-ġilda hija ppreparata sew. L-immaniġġjar mhux xieraq jista’ jirriżulta f’dannu lill-istratum corneum, u għalhekk l-integrità tal-ġilda ppreparata għandha tiġi ċċekkjata. Meta jiġi investigat il-metaboliżmu tal-ġilda, il-ġilda maqtugħa barra friska għandha tintuża mill-aktar fis possibbli, u taħt kundizzjonijiet magħrufa li jsostnu l-attività metabolika. Bħala gwida ġenerali, il-ġilda maqtugħa barra friska għandha tintuża fi żmien 24 siegħa, iżda l-perjodu aċċettabbli tal-ħażna jista’ jvarja skond is-sistema ta’ l-enżimi involuti fil-metabolizzazzjoni u t-temperaturi tal-ħażna (13). Meta l-preparazzjonijiet tal-ġilda jkunu nħażnu qabel ma jintużaw, għandha tingħata prova biex turi li l-funzjoni ta’ ostakolu nżammet.
         1.4.5   Is-sustanza tat-test
         Is-sustanza tat-test hija l-entità li l-karatteristiċi tal-permeazzjoni tagħha għandhom jiġu studjati. Idealment, is-sustanza tat-test għandha tiġi radjotikkettjata.
         1.4.6   Il-preparazzjoni tat-test
         Il-preparazzjoni tas-sustanza tat-test (eż. materjal mhux imħallat, imħallat jew ifformulat li fih il-kimika tat-test li hija applikata għall-ġilda għandha tkun l-istess (jew surrogat realistiku) bħal dik li għalihom jistgħu jkunu esposti l-umani jew speċje oħrajn potenzjali mmirati. Kwalunkwe varjazzjoni mill-preparazzjoni “fl-użu” għandha tkun iġġustifikata.
         1.4.7   Il-Konċentrazzjonijiet u l-Formulazzjonijiet tas-Sustanzi tat-Test
         Normalment tintuża aktar minn konċentrazzjoni waħda li hija mifruxa fuq l-ogħla espożizzjonijiet potenzjali umani. Bl-istess mod, għandu jitqies l-ittestjar ta’ firxa ta’ formulazzjonijiet tipiċi.
         1.4.8   L-applikazzjoni tal-ġilda
         Taħt kundizzjonijiet normali ta’ espożizzjoni umana għall-kimika, normalment ikun hemm dożi finiti. Għalhekk, għandha titntuża applikazzjoni li timita l-espożizzjoni umana, normalment 1-5 mg/cm2 ġilda għal solidu u sa 10 μl/cm2 għal-likwidi. Il-kwantità għandha tkun ġustifikata mill-kundizzjonijiet ta’ l-użu mistenni, mill-għanijiet ta’ l-istudju jew mill-karatteristiċi tal-preparazzjoni tat-test. Per eżempju, l-applikazzjonijiet għall-wiċċ tal-ġilda jistgħu jkunu infiniti, fejn huma applikati volumi kbar għal kull żona ta’ unità.
         1.4.9   Temperatura
         Id-diffużjoni passiva tal-kimiċi (u għalhekk l-assorbiment tagħhom mill-ġilda) hija affettwata mit-temperatura. Il-kompartiment tad-diffużjoni u l-ġilda għandhom jinżammu f’temperatura kostanti qrib dik normali tal-ġilda ta’ 32+/-1 oC. Diżinji differenti taċ-ċelloli jeħtieġu temperaturi differenti tal-banju ta’ l-ilma jew tal-blokka msaħħna sabiex jiġi żgurat li r-reċettur/ġilda ikun/tkun fin-norma fiżjoloġika. L-umdità għandha preferibbilment tkun bejn it-30 u s-70 %.
         1.4.10   Kemm iddum l-espożizzjoni u t-teħid tal-kampjuni
         L-espożizzjoni tal-ġilda għall-preparazzjoni tat-test tista’ tkun għal kemm idum l-esperiment jew għal termini iqsar (jiġifieri, biex tiġi imitata espożizzjoni umana ta’ tip speċifiku). Il-ġilda għandha tinħasel mill-preparazzjoni tat-test żejda b’aġent tat-tindif rilevanti, u t-tlaħliħ jinġabar għall-analiżi. Il-proċedura tat-tneħħija tal-preparazzjoni tat-test tiddependi fuq il-kundizzjoni ta’ l-użu mistenni, u għandha tiġi ġustifikata. Normalment huwa meħtieġ perjodu tat-teħid tal-kampjuni ta’ 24 siegħa biex tkun possibbli l-karatterizzazzjoni xierqa tal-profil ta’ l-assorbiment. Ladarba l-integrità tal-ġilda tista’ tibda tiddeterjora wara 24 siegħa, il-ħinijiet tat-teħid tal-kampjuni normalment m’għandhomx jeċċedu 24 siegħa. Għas-sustanzi tat-test li jippenetraw il-ġilda malajr, dan jista’ ma jkunx meħtieġ, iżda, għas-sustanzi tat-test li jippenetraw bil-mod, jistgħu jkunu meħtieġa perjodi itwal. Il-frekwenza tat-teħid tal-kampjuni tal-fluwidu reċettorju għandha tippermetti lill-profil ta' l-assorbiment tas-sustanza tat-test jiġi ppreżentat grafikament.
         1.4.11   Il-proċeduri terminali
         Il-komponenti kollha tas-sistema tat-test għandhom jiġu analizzati u l-irkupru għandu jiġi determinat. Dan jikludi l-kompartiment donator, it-tlaħliħ tal-wiċċ tal-ġilda, il-preparazzjoni tal-ġilda u l-fluwidu/kompartiment reċettorju. F’xi każijiet, il-ġilda tista’ tiġi frazzjonata fil-parti esposta tal-ġilda u l-parti tal-ġilda taħt il-flanġa tal-ġilda, u fl-istratum corneum, l-epidermis u l-frazzjonijiet tad-dermis, għall-analiżi separata.
         1.4.12   L-analiżi
         Fl-istudji kollha għandu jinkiseb l-irkupru xieraq (il-mira għandha tkun medja ta’ 100+/-10 % tar-radjoattività u kwalunkwe devjazzjoni għandha tkun iġġustifikata). L-ammont tas-sustanza tat-test fil-fluwidu reċettorju, fil-preparazzjoni tal-ġilda, fil-ħasil tal-wiċċ tal-ġilda u fit-tlaħliħ ta’ l-apparat għandu jiġi analizzat, bl-użu ta’ teknika xierqa.
         ID-DATA
         L-analiżi tal-fluwidu reċettorju, id-distribuzzjoni tal-kimika tas-sustanza tat-test fis-sistema tat-test u l-profil ta’ l-assorbiment mal-ħin, għandhom jiġu ppreżentati. Meta jintużaw kundizzjonijiet ta’ l-espożizzjoni għal dożi finita, il-kwantità maħsula mill-ġilda, il-kwantità assoċjataa mal-ġilda (u f’saffi differenti tal-ġilda jekk analizzata) u l-ammont preżenti fil-fluwidu reċettorju (rata, u l-ammont jew perċentwal tad-doża applikata) għandhom jiġu kkalkolati. L-assorbiment mill-ġilda jista’ kultant jiġi espress bl-użu tad-data tal-fluwidu reċettorju biss. Madankollu meta s-sustanza tat-test tibqa’ fil-ġilda fl-aħħar ta’ l-istudju, jista’ jkun meħtieġ li tiġi inkluża fl-ammont totali assorbit (ara l-paragafu 66 fir-referenza (3)). Meta jintużaw kundizzjonijiet ta’ dożi infiniti ta’ espożizzjoni id-data tista’ tippermetti l-kalkolu ta’ kostant tal-permeabilità (Kp). Taħt dawn il-kundizzjonijiet ta’ l-aħħar, il-perċentwal assorbit mhuwiex rilevanti.
         3.   IR-RAPPORTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport għandu jinkludi r-rekwiżiti stipulati fil-protokoll, inkluża ġustifikazzjoni tas-sistema tat-test użata u għandu tinkludi dawn li ġejjin:
         
                      
                  
                  
                     Is-Sustanza tat-Test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 in-natura fiżika, il-karatteristiċi fiżikokimiċi (għall-inqas il-piż molekulari u log Pow
                                    ), safa (safa radjokimika);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni ta’ l-identifikazzjoni (eż. lott numru);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 solubilità fi fluwidu reċettorju.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Il-preparazzjoni tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 formulazzjoni u ġustifikazzjoni ta’l-użu;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 omoġeneità.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Il-kundizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 għejun u s-sit tal-ġilda, il-metodu tal-preparazzjoni, il-kundizzjonijiet tal-ħażna qabel l-użu, kwalunkwe trattament qabel (tindif, trattament antibjotiku, eċċ), kejl ta’ l-integrità tal-ġilda, stat metaboliku, ġustifikazzjoni ta’ l-użu;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 diżinn taċ-ċelloli, kompożizzjoni tal-fluwidu reċettorju, rata tat-tnixxija tal-fluwidu jew ħinijiet u proċeduri tat-teħid tal-kampjuni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta’ l-applikazzjoni f test tal-preparazzjoni tat-test u l-kwantifikazzjoni tad-doża applikata;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kemm iddum l-espożizzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji tat-tneħħija tal-preparazzjonijiet mill-ġilda, eż. tlaħliħ tal-ġilda;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta’ l-analiżi tal-ġilda u kwalunkwe teknika tal-frazzjonazzjoni użata biex tintwera d-distribuzzjoni tal-ġilda;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 proċeduri tal-ħasil taċ-ċelloli u tat-tagħmir;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi ta’ l-esperimenti, tekniċi ta’ l-estrazzjoni, limiti ta’ l-iskoperta u validazzjoni analitika tal-metodu.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 irkupru totali ta’ l-esperiment (Doża applikata ≡ Ħasil tal-ġilda + Ġilda + Fluwidu reċettur + Ħasil taċ-Ċelloli);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tabulazzjoni ta’ l-irkupru individwali taċ-ċelloli f’kull kompartiment;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 profil ta’ l-assorbiment;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 data tabulata dwar l-assorbiment (espressa bħala rata, ammont jew perċentwal).
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Diskussjoni tar-riżultati.
                  
               
                      
                  
                  
                     Kunklużjonijiet.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     1.
                  
                  
                     Metodu tat-Test B.44. L-Assorbiment tal-Ġilda: Metodu In vivo.
                  
               
                  
                     2.
                  
                  
                     OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.
                  
               
                  
                     3.
                  
                  
                     OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, Annex 1 to ENV/JM/TG(2 000)5. OECD, Paris.
                  
               
                  
                     4.
                  
                  
                     Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for skin absorption. CRC Press, Boca Raton.
                  
               
                  
                     5.
                  
                  
                     Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Studies, in In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications, RL Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pp. 237-241.
                  
               
                  
                     6.
                  
                  
                     Bronaugh RL and Maibach HI. (1991). In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications. CRC Press, Boca Raton.
                  
               
                  
                     7.
                  
                  
                     European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussel.
                  
               
                  
                     8.
                  
                  
                     Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, Dupuis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). Test Guidelines for In vitro Assessment of Dermal Absorption and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191-205.
                  
               
                  
                     9.
                  
                  
                     Recommended Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.
                  
               
                  
                     10.
                  
                  
                     Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR et al. (1996). Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM Workshop Report ATLA 24, 81 R10.
                  
               
                  
                     11.
                  
                  
                     Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles of percutaneous absorption. Karger, Basel.
                  
               
                  
                     12.
                  
                  
                     Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.
                  
               
                  
                     13.
                  
                  
                     Jewell, C., Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. (2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356-365.
                  
               Figura 1
         Eżempju ta’ Diżinn Tipiku ta’ Ċellola tad-Diffużjoni Statika għall-Istudji in vitro ta’ l-Assorbiment Perkutanju
         
            (*)  Iż-żona ta’ l-opaċità tal-kornea trid tiġi nnutata
         
            (1)  Għal numru ta' kejl fis-serum u fil-plasma, l-iktar għall-glukożju, is-sawm mal-lejl ikun iktar preferut. Ir-raġuni prinċipali għal din il-preferenza hi li l-varjabbiltà li qed tiżdied u li bla dubju se tirriżulta min-nuqqas ta' sawm, tgħatti l-effetti l-iktar moħbija u l-interpretazzjoni tkun iktar diffiċli. Min-naħa l-oħra, madankollu, is-sawm mal-lejl jista’ jfixkel il-metaboliżmu ġenerali ta' l-annimali u, b'mod partikulari fl-istudji ta' l-għalf. Jista’ jfixkel ukoll l-espożizzjoni ta' kuljum għas-sustanza tat-test. Jekk jiġi adottat is-sawm mal-lejl, id-determinazzjonijiet bijokemikali u kliniċi għandhom jitwettqu wara t-twettieq ta' l-osservazzjonijiet funzjonali fir-4 ġimgħa ta' l-istudju.
         
            (2)  Għal numru ta' kejl fis-serum u fil-plasma, l-iktar għall-glukożju, is-sawm mal-lejl ikun iktar preferut. Ir-raġuni prinċipali għal din il-preferenza hi li l-varjabbiltà li qed tiżdied u li bla dubju se tirriżulta min-nuqqas ta' sawm, tgħatti l-effetti l-iktar moħbija u l-interpretazzjoni tkun iktar diffiċli. Min-naħa l-oħra, madankollu, is-sawm mal-lejl jista’ jfixkel il-metaboliżmu ġenerali ta' l-annimali u, b'mod partikulari fl-istudji ta' l-għalf. Jista’ jfixkel ukoll l-espożizzjoni ta' kuljum għas-sustanza tat-test. Jekk jiġi adottat is-sawm mal-lejl, id-determinazzjonijiet bijokemikali u kliniċi għandhom jitwettqu wara t-twettieq ta' l-osservazzjonijiet funzjonali ta' l-istudju.
         
            (3)  Solvent użat biex jitkejjel l-assorbiment.
         
            (1)  
         
                     †
                  
                  
                     tinkludi ħames annimali magħżula għall-ittestjar funzjonali u osservazzjonijiet kliniċi bħala parti mill-istudju tan-newrotossiċita
                  
               
      
         PARTI Ċ: IL-METODI GĦAD-DETERMINAZZJONI TA' L-EKOTOSSIĊITÀ
         WERREJ
         
                     C.1.
                  
                  TOSSIĊITÀ AKUTA GĦALL ĦUT
                  446
               
                     C.2.
                  
                  IT-TEST TA' L-IMMOBBILIZZAZZJONI AKUTA DAPHNIA SP.
                  
                  456
               
                     C.3.
                  
                  TEST TA' L-INIBIZZJONI
                  464
               
                     C.4.
                  
                  DETERMINAZZJONI TAL-BIJODEGRADABBILITÀ LESTA
                  473
               
                     PARTI I.
                  
                  KONSIDERAZZJONIJIET ĠENERALI
                  473
               
                     PARTI II.
                  
                  DOC TEST TAT-TNEĦĦIJA TAL-KULUR (Metodu C.4-A)
                  480
               
                     PARTI III.
                  
                  TEST TA' L-GĦAŻLA OECD MODIFIKATA (Metodu oC.4-B)
                  484
               
                     PARTI IV.
                  
                  TEST TA' L-EVOLUZZJONI CO2 (Metodu oC.4-C)
                  488
               
                     PARTI V.
                  
                  TEST TAR-RESPIROMETRIJA MANJOMETRIKA (Metodu C.4-D)
                  493
               
                     PARTI VI.
                  
                  TEST TAL-FLIXKUN MAGĦLUQ (Metodu oC.4-E)
                  497
               
                     PARTI VII.
                  
                  TEST M.I.T.I. (Metodu oC.4-F)
                  502
               
                     C.5.
                  
                  DEGRADAZZJONI – TALBA TA' L-OSSIĠENU BIOKEMIKALI
                  514
               
                     C.6.
                  
                  DEGRADAZZJONI – TALBA TA' L-OSSIĠENU KEMIKALI
                  516
               
                     C.7.
                  
                  ID-DEGRADAZZJONI – ID-DEGRADAZZJONI ANTIBIJOTIKA: L-IDROLISI BĦALA FUNZJONI TAL-PH
                  518
               
                     C.8.
                  
                  IT-TOSSIĊITÀ TAL-ĦNIEX
                  533
               
                     C.9.
                  
                  ID-DEGREDAZZJONI BIJOLOĠIKA
                  538
               
                     C.10.
                  
                  BIODEGRADAZZJONI TESTIJIET ATTIVATI TA' SIMULAZZJONI TA' TAJN
                  545
               
                     C.11.
                  
                  BIODEGRADAZZJONI
                  559
               
                     C.12.
                  
                  BIODEGRADAZZJONI
                  564
               
                     C.13.
                  
                  BIJOKONĊENTRAZZJONI: FLOW-THROUGH FISH TEST
                  
                  571
               
                     Ċ.14.
                  
                  PROVA TA' L-IŻVILUPP FIŻ-ŻGĦOŻIJA TAL-ĦUT
                  590
               
                     C.15.
                  
                  PROVA TA' TOSSIĊITÀ B'TERMINU QASIR FUQ EMBRIJONI U STADJI TA' SAC- FRY TAL-ĦUT
                  603
               
                     C.16.
                  
                  NAĦAL – PROVA TA' TOSSIĊITÀ ORALI AKUTA
                  618
               
                     C.17.
                  
                  NAĦAL – PROVA TA' TOSSIĊITÀ AKUTA MILL-KUNTATT
                  623
               
                     C.18.
                  
                  ADSORBIMENT/DESORBIMENT BL-UŻU TAL-METODU TA' L-EKWILIBRIJU TA' GRUPPI
                  627
               
                     C.19.
                  
                  ESTIMAZZJONI TAL-KOEFFIĊJENT TA' ADSORPTION (K
                        OC
                     ) FUQ IL-ĦAMRIJA U FUQ ĦAMA TAD-DRENAĠĠ BL-UŻU TA' KROMATOGRAFIJA TA' LIKWIDU LI JIPPERFORMA GĦOLI (HPLC)
                  666
               
                     C.20.
                  
                  
                     DAPHNIA MAGNA REPRODUCTION TEST
                  674
               
                     C.21.
                  
                  MIKROORGANIŻMI TAL-ĦAMRIJA: TEST TAT-TRASFORMAZZJONI TAN- NITROĠENU
                  693
               
                     C.22.
                  
                  MIKROORGANIŻMI TAL-ĦAMRIJA: TEST TAT-TRASFORMAZZJONI TAL- KARBONJU
                  701
               
                     C.23.
                  
                  TRASFORMAZZJONI EROBIKA U ANEROBIKA FIL-ĦAMRIJA
                  709
               
                     C.24.
                  
                  TRASFORMAZZJONI EROBIKA U ANEROBIKA FIS-SEDIMENT TAS-SISTEMI AKWATIĊI
                  724
               C.1.   TOSSIĊITÀ AKUTA GĦALL ĦUT
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         L-iskop ta' dan it-test huwa sabiex jiddetermina t-tossiċita letali akuta ta' sustanza għall-ħut fl-ilma ħelu. Huwa mixtieq li jkun hemm, sa kemm ikun possibbli, informazzjoni dwar is-solubbiltà fl-ilma, il-pressjoni tal-fwar, l-istabbilità kimika, ilpkostanti tad-disassoċjazzjoni u tal-biodegrabbilità tas-sustanza sabiex tgħin fil-għażla tal-metodu tat-test l-aktar xieraq (statiku, semi-statiku jew ta' kurrent kontinwu) sabiex ikunu assigurati l-konċentrazzjoninijiet kostanti sodisfaċenti tas-sustanza tat-test matul il-perijodu tat-test.
         Informazzjoni addizzjonali (per eżempju l-formula strutturali, il-grad tal-purità, n-natura u l-persentaġġ ta' impuritajiet sinifikanti, l-preżenza u l-ammonti ta' addittivi, u l-koeffiċjent tal-qasma n-oktonal/ilma) għandhom ikunu meqjusa kemm fl-ippjanar tat-test u fl-interpretazzjoni tar-riżultati.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET
         Tossiċità akuta hija l-effett ħażin apparenti intiż f'organiżmu matul perijodu qasir (jiem) ta' l-espożizzjoni tiegħu għal sustanza. Fit-test preżenti, tossiċità akuta hija espressa bħala l-konċentrazzjonini medjana letali (LC50), jiġifieri l-konċentrazzjoni fl-ima li toqtol 50 % f'lott ta' prova ta' ġut matul perijodu kontinwu ta' l-espożizzjoni li għandu jkun mistqarr.
         Il-konċentrazzjoninijiet kollha tas-sustanza fit-test huma mogħtija bil-piż/volum (milligrammi kull litru). Dawn jistgħu ikunu espressi wkoll bħala piż bil-piż (mg.kg-1).
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Sustanza ta' referenza tista tkun ittestjata bħala mezz sabiex turi li l-kondizzjonijiet waqt it-test fil-laboratorju, ir-reazzjoni tal-ispeċi ittestjati ma jkunux inbidlu b'mod sinifikanti.
         L-ebda sustanzi ta' referenza ma huma speċifikati f'din il-kitba.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Test limitat jista' jkun imwettaq fi 100 mg kull litru sabiex tkun determinata li il-LC50 tkun akbar minn din il-konċentrazzjoni.
         Il-ħut hu espost għas-sustanza tat-test miżjuda ma' l-ilma fil-medda tal-konċentrazzjonijiet għal perijodu ta' 96 siegħa. Il-mortalitajiet huma irreġistrati fi mill-anqas intervalli ta' 24 siegħa, u l-konċentrazzjoninijiet li joqtlu 50 % tal-ħut (LC50) f'kull żmien ta' l-osservazzjoni huma ikkalkolati, meta dan ikun possibbli
         1.5.   KRITERJA TAL-KWALITÀ
         Il-kriterja tal-kwalità għandha tkun applikabbli għal-limitu tat-test kif ukoll għall-metodu tat-test kollu.
         Il-mortalità fil-kontrolli m'għandhiex teċċedi 10 % (jew ħuta waħda jekk anqas minn għaxa jkunu wżati) sat-tmiem tat-test.
         Il-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu mdewweb għandha tkun ta' aktar monn 60 % tal-valur tas-saturazzjoni ta' l-arja matul iż-żmien kollu.
         Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test għandhom jinżammu sa fil-limitu ta' 80 % tal-konċentrazzjoninijiet inizjali matul iż-żmien kollu tat-test.
         Għal sustanzi li jdubu faċilment fil-medja tat-test, b'hekk ifornu taħlitiet stabbli, i.e. dawk li ma jkollhomx reazzjoni volatili sinifikanti, jkollhom degradazzjoni, ikunu idrolizzati jew adsorbiti, l-konċentrazzjoni inizjali tista tkun meqjusa bħala ekwivalenti tal-konċentrazzjoni nominali. Evidenza għandha tkun ippreżentata li l-livelli tal-konċentrazzjonijiet ikunu nżammu matul it-test u li l-kriterja tal-kwalità kienet ġiet milħuqa.
         Għal sustanzi li huma:
         
                     (i)
                  
                  
                     ftit li xejn jinħallu fil-medja tat-test, jew
                  
               
                     (ii)
                  
                  
                     kapaċi li jiffurmaw emulsjonijiet jew dispersjonijiet stabbli, inkella
                  
               
                     (iii)
                  
                  
                     ma humiex stabbli f'taħlitiet akweji,
                  
               l-konċentrazzjonini inizjali għandha tkun meqjusa bħala l-konċentrazzjoni mkejla fit-taħlita (jew, jekk teknikament dan ma jkunx possibbli, imkejla f'kolonna ta' l-ilma) fil-bidu tat-test. Il-konċentrazzjoni għandha tkun determinata wara perijodu ta' ekwilibriju imma qabel l-introduzzjoni tal-ħut tat-test.
         Fi kwalunkwe minn dawn il-każi, aktar kejl għandu jsir matul it-test sabiex jikkonferma l-konċentrazzjoni attwali ta' l-espożizzjoni jew li l-kriterja tal-kwalità tkun ġiet milħuqha.
         Il-pH m'għandux ivarja b'aktar minn unità waħda.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         Tlett tipi ta' proċedura jistgħu ikunu wżati:
         
            Test statiku:
         
         Test tat-tossiċità li fih l-ebda ċaqlieq ma jseħħ tat-taħlita tat-test. (It-taħlitiet jinqgħu mingħajr tibdil matul iż-żmien kollu tat-test.)
         
            Test semi-statiku:
         
         Test mingħajr ċaqlieq tat-taħlita tat-test, imma bit-tiġdid regolari tal-lottijiet tat-taħlitiet tat-test eara perijodi mtawwla (eż. 24 siegħa).
         
            Test biċ-ċaqlieq kontinwu:
         
         Test tat-tossiċità li fih l-ilma jkun imġedded regolarment fil-kabini tat-test, il-kimika li tkun ittestjata tiġi trasportata ma l-ilma użat għat-tiġdid tal-medja tat-test.
         1.6.1.   Reaġenti
         1.6.1.1.   Taħlitiet tas-sustanzi tat-test
         Taħlitiet diġa lesti tas-saħħa meħtieġa huma preparati bit-tidwib tas-sustanza f'ilma de-jonizzat jew f'ilma skond 1.6.1.2.
         Il-konċentrazzjoni tat-test kif magħżula huma ippreparati bit-tidwib tat-taħlita diġà lest. Jekk konċentrazzjoninijiet għoljin huma ttestjati, is-sustanza tista' tkun imdewba direttament mat-trattib ta' l-ilma.
         Is-sustanza għandha normalment tkun ittestjata biss sal-limitu tas-solubbilità tagħha. Għal uħud mis-sustanzi (eż. sustanzi li jkollhom solubbilità baxxa fl-ilma, jew Pow9 għoli, jew dawk li jiffurmaw tixriq stabbli pjuttost milli taħlita vera fl-ilma), huwa aċċettabbli li tintuża l-konċentrazzjonini tat-test aktar għolja mil-limitu tal-solubbilità tas-sustanza sabiex ikun assigurat li s-solubbilità massima/stabbilità tal-konċentrazzjoni tkun intlaħqet. Huwa mportanti, b'danakollu, li din il-konċentrazzjoni ma tkunx b'mod ieħor tħawwad is-sistema tat-test (eż. li jkun hemm rita tas-sustanza fil-wiċċ ta' l-ilma li ma tħallix li jseħħ l-ossiġinazzjoni ta' l-ilma, eċċ.).
         Tixrid ultrasoniku, solventi organiċi, emulsifikaturi jew dispersanti jistgħu jintużaw bħala għajnuna għat-tħejjija tat-taħlitiet bil-lest ta' sustanzi b'solubbilità baxxa fl-ilma jew sabiex jgħinu fit-tixrid ta' dawn is-sustanzi fil-medja tat-test. Meta tali sustanzi awżiljarji huma wżati, il-konċentrazzjoninijiet kollha tat-test għandhom jinkludu l-istess ammont tas-sustanza awżiljarja, u ħut addizzjonali tal-kontroll għandhom ikunu esposti għall-istess konċentrazzjoni tas-sustanza awżiljarja bħal dik użata fis-serje tat-test. Il-konċentrazzjoni ta' tali awżiljarji għandha tkun minimizzata, imma fl-ebda każ m'għandha teċċedi 100 mg kull litru fil-medja tat-test.
         It-test għandu jkun imwettaq mingħajr l-aġġustament tal-pH. Jekk ikun hemm evidenza ta' tibdil qawwi fil-pH, huwa rakkomandat li t-test għandu jkun repetut bi pH aġġustat u r-riżultati inklużu fir-rapport. F'dak il-każ, il-valur tal-pH tat-taħlita bil-lest għandu jkun aġġustat għall-valur tal-pH ta' l-ilma tat-taħlit, sakemm ma jkunx hekk raġunijiet speċifiċi il-għala dan m'għandux isir. HCI u NaOH huma preferuti għal dan l-iskop. Dan l-aġġustament tal-pH għandu jsir b'tali mod hekk li l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fit-taħlita bil-lest ma tkunx mibdula sa xi medda sinifikanti. Jekk ikun hemm xi reazzjoni kimika jew preċipitazzjoni fiżika tal-kompost tat-test ikkaġunata bl-aġġustament, dan għandu jkun mistqarr.
         1.6.1.2.   Ilma taż-żamma u tat-trattib
         Forniment ta' ilma tax-xorb (mhux kontaminat b'konċentrazzjonijiet potenzalment ta' ħsara mill-klorin, metalli tqal jew sustanzi oħrajn), ilma naturali ta kwalità tajba jew ilma rikostitwita (ara l-Appendiċi I) jista jkun użat. Ilmijiet b'ebusija totali ta' bejn 10 u 250 mg kull litru (bħala CaCO3) u bi pH minn 6,0 sa 8,5 huma preferuti.
         1.6.2.   Apparat
         L-apparat kollu għandu jkun magħmul minn materjal kemikalment inert.
         
                     —
                  
                  
                     sistema ta' taħlil awtomatiku (għal test b'ċaqlieq kontinwu),
                  
               
                     —
                  
                  
                     arloġġ ta' l-ossiġenu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     apparat għad-determinazzjoni ta' l-ebusija ta' l-ilma,
                  
               
                     —
                  
                  
                     apparat adekwat għall-kontroll tat-temperatura,
                  
               
                     —
                  
                  
                     arloġġ pH.
                  
               1.6.3.   Ħut tat-test
         Il-ħut għandu jkun f'kondizzjoni tajba tas-saħħa u ħieles minn xi malformazzjoni apparenti.
         L-ispeċi użati għandhom ikunu magħżula fuq il-bażi ta' kriterja prattika, bħalma hija d-disponibbiltà faċli tagħhom matul is-sena, l-faċilità tal-manutenzjoni, l-konvenjenza għat-testijiet, is-sensittività relattiva għall-kimika u xi fatturi ekonomiċi, bioloġiċi u ekoloġiċi li jistgħu jaffettwaw ir-riżultati. Il-ħtieġa tal-kompattibbiltà tad-data akkwistat u l-armonizzazzjoni internazzjonali eżistenti (referenza 1) għandha wkoll tkun imfakkra meta ssir l-għażla tal-ispeċi tal-ħut.
         Lista tal-ispeċi tal-ħut li huma rakkommandati għat-twettieq ta' dan it-test hija mogħtija fl-Appendiċi 2; il-ħut irrigat (taż-żebra) u t-trotta ikkulurita huma l-ispeċi preferuti.
         1.6.3.1.   Iż-zamma
         Il-ħut tat-test preferibbilment jiġu minn lott wieħed ta' l-istess tul u età. Il-ħut għandu jinżamm għal mill-anqas 12-il jum, fil-kondizzjonijiet kif ġejjin:
         
            tagħbija:
         
         xierqa għas-sistema (riċirkolazzjoni jew kurrent kontinwu) u l-ispeċi tal-ħut,
         
            l-ilma:
         
         ara 1.6.1.2,
         
            dawl:
         
         12 sa 16-il siegħa ta' dawl kuljum,
         
            konċentrazzjoni ta' ossiġenu mdewweb:
         
         mill-anqas 80 % tal-valur tas-saturazzjoni ta' l-arja,
         
            ikel:
         
         tlett darbiet fil-ġimgħa jew kull jum, jieqaf 24 siegħa qabel il-bidu tat-test.
         1.6.3.2.   Mortalità
         B'segwiment tal-perijodu ta' 48 siegħa sakem joqgħodu, il-mortalitajiet huma reġistrati u din il-kriterja li ġejja għandha tkun applikata:
         
                     —
                  
                  
                     aktar minn 10 % tal-popolazzjoni matul sebat ijiem:
                     ċaħda tal-lott kollu kemm hu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     bejn 5 u 15 % tal-popolazzjoni:
                     perijodu taż-żamma ikompli għal sebat ijiem addizzjonali.
                     Jekk l-ebda mortalità ma sseħħ, il-lott huwa aċċettabbli, altrimentri għandu jkun miċħud,
                  
               
                     —
                  
                  
                     anqas minn 5 % tal-popolazzjoni:
                     aċċettazzjoni tal-lott.
                  
               1.6.4.   Adattazzjoni
         Il-ħut kollu għandu jkun espost għall-ilma tal-kwalità u tat-temperatura li jkunu wżati fit-test għal mill-anqas sebat ijiem qabel ma jintużaw.
         1.6.5.   Proċedura tat-test
         Test tas-sejba tal-medda jista jippreċedi t-test definittiv, sabiex tkun akkwistata l-informazzjoni dwar il-medda tal-konċentrazzjonijiet li għandhom ikunu wżati fit-test ewlieni.
         Kontroll wieħed mingħajr is-sustanza tat-test għandu jkun magħmul u, jekk relevanti, kontroll wieħed li jkun fih sustanza awżiljarja għandu wkoll ikun magħmul, b'żieda mas-serje tat-testijiet.
         Jiddependi mill-proprjetajiet fiżiċi u kimiċi tal-kompost tat-test, test statiku, semi-statiku jew biċ-ċaqlieq kontinwu għandu jkun magħżul skond kif xieraq, sabiex iwettaq il-kriterja tal-kwalità.
         Il-ħut huwa espost għas-sustanza kif deskritt hawn taħt:
         
                     —
                  
                  
                     tul ta' żmien: 96 siegħa
                  
               
                     —
                  
                  
                     numru ta' l-annimali: mill-anqas 7 kull konċentrazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     tankijiet: ta' daqs adattat b'relazzjoni mat-tagħbija rakkommandata,
                  
               
                     —
                  
                  
                     tagħbija: tagħbija massima ta' 1 g kull litru għal testijiet statiċi u semi-statiċi hija rakkommandata; għal sistemi ta' ċaqlieq kontinwu, tagħbija għola hija aċċettabbli
                  
               
                     —
                  
                  
                     konċentrazzjoni tat-test: Mill-anqas ħames konċentrazzjoninijiet li jiddifferixxu b'fattur kostanti li ma jeċċedix 2,2 u kemm jista jkun possibbli li jkopri l-medda ta' 0 sa 100 % mortalità.
                  
               
                     —
                  
                  
                     ilma: ara 1.6.1.2,
                  
               
                     —
                  
                  
                     dawl: 12 sa 16-il siegħa ta' dawl kuljum,
                  
               
                     —
                  
                  
                     temperatura: xierqa għall-ispeċi (l-Appendiċi 2) imma fi ħdan ± 1 oC skond it-test partikolari,
                  
               
                     —
                  
                  
                     konċentrazzjoni ta' ossiġenu mdewweb: mhux anqas minn 60 % tal-valur tas-saturazzjoni ta' l-arja fit-temperatura magħżula,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ikel: xejn.
                  
               Il-ħut ikunu spezzjonati wara l-ewwel 2 sa 4 siegħat u mill-anqas matul intervalli ta' 24 siegħa. Il-ħut huma meqjusa bħala mejta jekk meta jkunu minsusa fil-pedunkula kawdjali ma jipproduċu l-ebda reazzjoni u l-ebda movimenti tan-nifs ma jkunu viżibbli. Il-ħut mejta jkunu mneħħija malli dan ikun osservat u l-mortalitajiet huma reġistrati. Reġistri jinżammu ta' annormalitajiet viżibbli (eż. talf ta' l-ekwilibriju, tibdil fl-imġieba ta' l-għawm, funzjoni respiratorja, pigmentazzjoni, eċċ.).
         Il-kejl tal-pH, l-ossiġenu mdewweb u tat-temperatura għandhom jitwettqu ta' kuljum.
         Test ta' limitazzjoni
         Bl-użu tal-proċeduri deskritti f'dan il-metodu tat-test, test tal-limitazzjoni jista jkun imwettaq fi 100 mg kull litru sabiex ikun muri li l-LC50 ikun akbar minn din il-konċentrazzjoni.
         Jekk in-natura tas-sustanza tkun tali li konċentrazzjoni ta' 100 mg kull litru fl-ima tat-test ma tistax tkun milħuqha, it-test tal-limitazzjoni għandu jkun imwettaq f'konċentrazzjoni egwali għas-solubbilità tas-sustanza (jew tal-konċentrazzjoni massima li tifforma tixrid stabbli) fil-medja użata (ara wkoll il-punt 1.6.1.1).
         It-test tal-limitazzjoni għandu jkun imwettaq bl-użu ta' minn 7 sa 10 ħutiet, bl-istess numru ta' kontroll(i). (It-teorija binominali tiddetta li meta 10 ħutiet huma wżati b'mortalità żero, ikun hemm 99,9 % affidabbilità li l-LC50 huwa akbar mill-konċentrazzjonini użata f'dak it-test tal-limitazzjoni. Bi 7, 8 jew 8 ħutiet, l-assenza tal-mortalità tipprovdi mill-anqas 99 % affidabbilità li l-LC50 huwa akbar mill-konċentrazzjoni użata.)
         Jekk ikun hemm mortalijiet, studju sħiħ għandu jkun imwettaq. Jekk effetti sub-letali huma osservati, dawn għandhom ikunu reġistrati.
         2.   DATA U EVALWAZZJONI
         Għal kull perijodu ta' meta l-osservazzjonijiet kienu reġistrati (24, 48, 72 u 96 siegħa), pinġi l-persentaġġ tal-mortalità għal kull perijodu ta' l-espożizzjoni kif rakkommandat kontra l-konċentrazzjoni fuq karta tal-probabbiltà logaritmika,
         Meta possibbli u għal ħin ta' l-osservazzjoni, l-LC50 u l-limiti tal-kunfidenza (p = 0,05) għandhom ikunu ikkalkolati bl-użu tal-proċeduri normali; dawn il-valuri għandhom ikunu mqarrba lejn wieħed, l-aktar lejn tnejn, figuri sinifikanti (eżempji tat-tqarrib lejn żewġ figuri: 170 għal 173,5; 0,13 għal 0,127; 1,2 għal 1,21).
         F'dawk il-każi meta l-linja magħwġa bil-kurva tal-konċentrazzjoni/persentaġġ tar-reazzjoni tkun wieqfa wisq sabiex tippermetti l-kalkolazzjoni tal-LC50, estimi grafiċi ta' dan il-valur huma suffiċjenti.
         Meta żewġ konċentrazzjonijiet konsekuttivi, b'relattività ta' 2,2 jagħtu biss 0 u 100 % mortalità, dawn iż-żewġ valuri huma suffiċjenti sabiex jindikaw il-medda li fiha jkun jidħol il-LC50.
         Jekk ikun osservat li l-istabbilità jew l-omoġenità tas-sustanza tat-test ma jistghux jinzammu dan għandu jkun irrapportat u qies għandu jittieħed fl-interpretazzjoni tar-riżultati.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dwar il-ħut tat-test (isem xjentifiku, razza, fornitur, xi pre-trattament, daqs u numru użat f'kull konċentrazzjoni tat-test);
                  
               
                     —
                  
                  
                     is-sorsi tat-trattib – ilma u l-karatteristiċi kimiċi maġġuri (pH, ebusija, temperatura);
                  
               
                     —
                  
                  
                     fil-każ ta' sustanza b'solubilità akwea baxxa, l-metodu tal-preparazzjoni tat-taħlitiet kemm dawk imħejjija lesti u tat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     konċentrazzjoni ta' xi sustanzi awżiljarji;
                  
               
                     —
                  
                  
                     lista tal-konċentrazzjonijiet użati u xi informazzjoni disponibbli dwar l-istabbilità tal-konċentrazzjonijiet tal-kimika ittestjata fit-taħlita tat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     jekk analiżi kimika titwettaq, metodi wżati u r-riżultati akkwistati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     r-riżultati tat-test tal-limitazzjoni, jew imwettaq;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-raġunijiet tal-għażla u d-dettalji tal-proċedura tat-test kif użata (eż. statiku, semi-statiku, rata tad-dożar, rata taċ-ċaqlieq kontinwu, jekk huma mogħti l-arja, t-tagħbija tal-ħut, eċċ.);
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni ta' l-apparat tat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-organizzazzjoni tad-dawl;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjonijiet ta' l-ossiġenu mdewweb, il-valuri pH u t-temperaturi tat-taħlitiet tat-test kull 24 siegħa;
                  
               
                     —
                  
                  
                     evidenza tal-kriterja tal-kwalità li tkun ġiet imwettqa;
                  
               
                     —
                  
                  
                     tabella li turi il-mortalità kumulattiva ta' kull konċentrazzjoni u l-kontroll (u l-kontroll bis-sustanza awżiljarja, jekk meħtieġ) f'kull wieħed mill-ħinijiet rakkommandati ta' l-osservazzjoni;
                  
               
                     —
                  
                  
                     grafika tal-konċentrazzjoni/persentaġġ tal-kurva tar-reazzjoni fit-tmiem ta' kull test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     jekk possibbli, l-valuri LC50 f'kull wieħed mill-hinijiet rakkommandati ta' l-osservazzjoni (bi 95 % tal-limiti ta' l-affidibbiltà);
                  
               
                     —
                  
                  
                     proċedura statistiċi wżati għad-determinazzjoni tal-valuri LC50;
                  
               
                     —
                  
                  
                     jekk tkun użata sustanza ta' referenza, r-riżultati akkwistati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-ogħla konċentrazzjoni tat-test li ma toħloq l-ebda mortalità matul il-perijodu tat- test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-anqas konċentrazzjoni tat-test li toħloq 100 % mortalità matul il-perijodu tat-test.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD, Pariġi, 1981, Linji ta' Gwida tat-Testijiet 203, Deċiżjoni tal-Kunsill C(81) 30 finali u aġġornamenti.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     AFNOR – Determinazzjoni tat-tossiċità akuta ta' sustanza mal-Brachydanio rerio -Metodi Statiċi u ta' Caqlieq Kontinwu – NFT 90-303 Ġunju 1985.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     AFNOR – Determinazzjoni tat-tossiċità akuta ta' sustanza mal-Salmo gairdneri -Metodu Statiku – ta' Caqlieq Kontinwu – NFT 90-305 Ġunju 1985
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     ISO 7346/1,/2 u/3 – Kwalità ta' l-ilma – Determinazzjoni tat-tossiċità letali akuta ta' sustanzi għall-ħut ta' l-ilma frisk (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan -Teleostei, Cyprinidae). Parti 1: Metodu statiku. Parti 2: Metodu semi-statiku. Parti 3: Metodu biċ-ċaqlieq kontinwu.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden – Part II 1974.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15).
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     JIS K 0102, Test tat-tossiċità akuta għall-ħut.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     NEN 6506 – Ilma – Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Aġenzija tal-Ħarsien Ambjentali, Metodi għal testijiet tat-tossiċità akuta mal-ħut, makroinvertebrati u amfibji. Il-Kumitat dwar il-Metodi għat-Testijiet tat-Tossiċità ma l-Organiżmi Akwatiċi, Serje tar-Riċerka Ekoloġika EPA-660-75-009, 1975.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Aġenzija tal-Ħarsien Ambjentali, Laboratorju tal-moniteraġġ u sostenn ambjentali, Uffiċju tar-Riċerka u Żvilupp, EPA-600/4-78-012, Jannar 1978.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Aġenzija tal-Ħarsien Ambjentali, Kontroll tas-Sustanza Tossika, Parti IV, 16 ta' Marzu 1979.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Metodi normali għall-eżaminazzjoni ta' l-ilma u l-ilma skartat, l-erbatax edizjoni, APHA-AWWA-WPCF, 1975.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Kummissjoni tal-Komunitajiet Ewropej, Programm tat-test Inter-Laboratorju li jikkonċerna l- istudju ta' l-ekotossiċità ta' sustanza kimika fir-rigward tal-ħut. Studju KEE D.8368, 22 Marzu 1979.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grundlagen für die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Litchfield, J.T. u Wilcoxon, F., Metodu simplifikat għall-evalwazzjoni ta' l-esperimenti ta' l-effetti tad-doża, J. Pharm, Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Finney, D.J. Metodi Statistiċi fl-Assaġġ Bioloġiku. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Sprague, J.B. Kejl tat-tossiċità tat-tniġġis għall-ħut. Metodi tal-Bioassaġġ għal tossiċità akuta. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Sprague, J.B. Kejl tat-tossiċità tat-tniġġis għall-ħut. II L-utilizzazzjoni u l-applikar tar-riżultati tal-bioaassaġġ. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Stephan, C.E. Metodi għal kalkolazzjoni ta' LC50. Fl-Evalwazzjoni tat-Tossikoloġija u l-Periklu Akwatiku (bl-edizjoni ta' F.I. Mayer u J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Stephan, oC.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. u Andrews, R.W. Programm tal-computer għal kalkolazzjoni ta' LC50. US EPA.
                  
               
            Appendiċi 1
            Ilma rikostitwit
            Eżempju ta' trattib xieraq ta' l-ilma
            Il-kimiċi kollha għandhom ikunu ta' grad analitiku.
            L-ilma għandu jkun distillat ta' kwalità tajba, jew ilma dejonizzat b'konduttività ta' anqas minn 5 μScm-1.
            Apparat għad-distillazzjoni ta' l-ilma m'għandux ikun fih xi partijiet magħmula mir-ramm.
            Taħlitiet bil-lest
            
                        CaCI2. (Diħidrat tal-klorid tal-kalċju):
                        Dewweb fi, u wassal għal litru bl-ilma.
                     
                     
                        11,76  g
                     
                  
                        MgSO4. (ħeptaidrat tas-sulfat tal-magneżju):
                        Dewweb fi, u wassal għal litru bl-ilma.
                     
                     
                        4,93  g
                     
                  
                        NaHCO3 NaHCO3 (karbonat ta' l-idroġenu tas-sodju):
                        Dewweb fi, fl-ilma u wassal għal litru bl-ilma.
                     
                     
                        2,59  g
                     
                  
                        KC1 (klorid tal-putassa):
                        Dewweb fi, u wassal għal litru bl-ilma.
                     
                     
                        0,23  g
                     
                  Ilma rikostitwit għat-tidwib
            Ħawwad 25 ml ta' kull wieħed ta' l-erba taħlitiet bil-lest u wassal sa litru bl-ilma.
            Qawwi bl-arja sakemm il-konċentrazzjonini ta' l-ossiġenu mdewweb tkun egwali għall-valur tas-saturizzazzjoni ta' l-arja.
            Il-pH għandu jkun 7,8 ± 0,2.
            Jekk meħtieġ, aġġusta il-pH bi NaOH (idrossidu tas-sodju) jew HCI (aċidu idrokloriku).
            L-ilma tat-trattib hekk ippreparat huwa mwarrab għal madwar 12-il siegħa u l-ebda arja aktar ma tkun miżjuda.
            Is-somma tal-jonji Ca u Mg f'din it-taħlita hija ta' 2,5 mmol kull litru. Ir-relattività tal-jonji Ca:Mg hija 4:1 u tal-joni Na:K hija 10:1. L-alkalinità totali ta' din it-taħlita hija 0,8 mmol kull litru.
            Kwalunkwe devjazzjoni fil-preparazzjoni ta' l-ilma tat-trattib m'għandhiex tibdel il-komposizzjoni jew il-proprjetajiet ta' l-ilma.
         
         
            Appendiċi 2:
            Speċi ta' ħut rakkommandat għat–testijiet
            
                        Speċje rakkommandati
                     
                     
                        Medda rakkommandata tat-Temperatura tat-Test ( oC)
                     
                     
                        Tul total rakkommandat ta' l-annimal tat-test (cm)
                     
                  
                        
                           Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) Ħut-Zebrab
                     
                     
                        20 sa 24
                     
                     
                        3,0  ± 0,5 
                     
                  
                        
                           Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Fathead minnow (ħut ta' l-ilma ħelu)
                     
                     
                        20 sa 24
                     
                     
                        5,0  ± 2,5 
                     
                  
                        
                           Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758) Karpjun komuni
                     
                     
                        20 sa 24
                     
                     
                        6,0  ± 2,0 
                     
                  
                        
                           Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) Cyprinodontidae (Tomminck and Schlege 1850) Killifish ħamrani
                     
                     
                        20 sa 24
                     
                     
                        3,0  ± 1,0 
                     
                  
                        
                           Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters 1859) Guppy
                     
                     
                        20 sa 24
                     
                     
                        3,0  ± 1,0 
                     
                  
                        
                           Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque Linneaus 1758) Bluegill
                     
                     
                        20 sa 24
                     
                     
                        5,0  ± 2,0 
                     
                  
                        
                           Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum 1988) Trota kulurita
                     
                     
                        12 sa 17
                     
                     
                        6,0  ± 2,0 
                     
                  
                        
                           Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758) Orfe dehbi
                     
                     
                        20 sa 24
                     
                     
                        6,0  ± 2,0 
                     
                  Ġabra
            Il-ħut elenkat hawn fuq huma faċli sabiex jitkabbru u/jew faċilment disponibbli matul is-sena kollha. Dawn jistgħu ikunu mkabbra u ikkultivati jew fl-irzizet tal-ħut jew fil-laboratorju, f'kondizzjonijiet ikkontrollati dwar il-mard u l-parassiti, hekk li l-annimal tat-test ikunu b'saħħtu u ta' nisel magħruf. Dan il-ħut huwa disponibbli f'ħafna partijiet tad-dinja.
         
         
            Appendiċi 3
            Eżempju tal-konċentrazzjonini: persentaġġ tal-mortalità
            Eżempju tad-determinazzjoni ta' LC50 bl-użu tal-karta log-probit
            
            
         C.2.   IT-TEST TA' L-IMMOBBILIZZAZZJONI AKUTA DAPHNIA SP.
         
         1.   METODU
         Dan il-metodu tat-test ta' immobbilizzazzjoni akuta huwa ekwivalenti għall-OECD TG 202 (2004).
         1.1.   DAĦLA
         Dan il-metodu jiddeskrivi test ta' tossiċità akuta biex jiġu stmati l-effetti tal-kimiċi lejn id-dafnidi. Intużaw metodi tat-test eżistenti safejn possibbli (1)(2)(3).
         1.2   DEFINIZZJONIJIET
         Fil-kuntest ta' dan il-metodu, jintużaw dawn id-definizzjonijiet li ġejjin:
         
                      
                  
                  
                     
                        EC
                        
                           5O
                         : hija l-konċentrazzjoni stmata li timmobbilizza 50 % tad-dafnidi f'perjodu ta' espożizzjoni dikjarat. Jekk tintuża definizzjoni oħra, din għandha tiġi rrapportata, flimkien mar-riferenzi tagħha.
                  
               
                      
                  
                  
                     
                        Immobilizzazzjoni: Dawk l-annimali li huma li ma jistgħux jgħumu fi żmien 15-il sekonda, wara aġitazzjoni bil-mod tal-kontenitur tat-test jitqiesu li huma immobbilizzati (ukoll jekk għadhom jistgħu jċaqalqu l-antenni tagħhom).
                  
               1.3.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Dafnidi żgħar, ta' eta' ta' inqas minn 24 siegħa fil-bidu tat-test, huma esposti għas-sustanza tat-test f'varjetà ta' konċentrazzjonijiet għal perjodu ta' 48 siegħa. L-immobbilizzazzjoni hija rrekordjata ma' l-24 siegħa u mat-48 siegħa u mqabbla mal-valuri tal-kontroll. Ir-riżultati huma analizzati sabiex jiġi kkalkolat l-EC5O fit-48 siegħa (ara t-taqsima 1,2 għad-definizzjonijiet). Id-determinazzjoni ta' l-EC5O fl-24 siegħa mhijiex obbligatorja.
         1.4   L-INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAT-TEST
         Is-solubbiltà fl-imla u l-pressa tal-fwar tas-sustanza tat-test għandhom ikunu magħrufa u għandu jkunu disponibbli metodu analitiku affidabbli għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza fit-taħlitiet tat-test b'effiċjenza ta' l-irkupru rrapportata, u limitu tad-determinazzjoni. Informazzjoni utli tinkludi l-formula strutturali, il-purità tas-sustanza, l-istabilità fl-ilma jew fid-dawl, Pow u r-riżultati ta' test għall-bijodegradibbiltà lesta (ara l-metodu C.4).
         Nota: Il-gwida għall-ittestjar ta' sustanzi bil-kwalitajiet fiżiċi kimiċi li għamluhom diffiċli li jiġu ttestjati hija pprovduta f' (4).
         1.5   IS–SUSTANZI TA' RIFERENZA
         Sustanza ta' riferenza tista' tiġi ttestjata għal EC5O bħala mezz biex jiġi żgurat li l-kondizzjonijiet tat-test huma affidabbli. It-tossikanti użati fit-testijiet-ċirku internazzjonali (1)(5) huma rrakkomandati għal dan l-għan (1). It-test(ijiet) b'sustanza ta' riferenza għandhom preferibbilment isiru kull xahar u għall-inqas darbtejn fis-sena.
         1.6   IL–KRITERJI TAL–KWALITÀ
         Biex test ikun validu, jgħoddu dawn il-kriterji operattivi:
         
                     —
                  
                  
                     Fil-kontrolli, inkluż il-kontroll li fih l-aġent li jħoll, mhux aktar minn 10 % tad-dafnidi għandhom ikunu ġew immobilizzati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu maħlul fl-aħħar tat-test għandha tkun ≥ 3 mg/l fil-kontenituri tal-kontroll u tat-test.
                  
               Nota: Għall-ewwel kriterju, mhux aktar minn 10 % tad-dafnidi tal-kontroll għandhom juru immobilizzazzjoni jew sinjali oħra ta' mard jew stress, per eżempju, diskolorazzjoni, mġiba mhux normali bħal li jinqabdu f'wiċċ l-ilma.
         1.7   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.7.1.   L-Apparat
         Il-kontenitur tat-test u apparat ieħor li se jiġi f'kuntatt mat-taħlitiet tat-test għandhom ikunu magħmula għal kollox mill-ħġieġ jew minn materjal ieħor li huwa kimikament inert. Il-kontenituri tat-test normalment ikunu tubi tat-test tal-ħġieġ jew tazzi biż-żennuna; għandhom jitnaddfu qabel kull użu bl-użu ta' proċeduri standard tal-laboratorju. Il-kontenituri tat-test għandhom ikunu koperti ħafif biex jitnaqqas it-telf ta' l-ilma minħabba evaporazzjoni u biex jiġi evitat id-dħul tat-trab fit-taħlitiet. Is-sustanzi volatili għandhom l-ewwel jiġu ttestjati f'kontenituri magħluqin li huma mimlijin sa fuq, u li huma kbar biżżejjed biex jiġi prevenut li l-ossiġnu jibda jillimita jew ikun baxx wisq (ara t-taqsima 1.6 u l-ewwel paragrafu tat-taqsima 1.8.3).
         Barra minn dan, jintuża xi ftit mit-tagħmir li ġej jew kollu: miter ta' l-ossiġnu (b'mikroelettrodu jew tagħmir ieħor xieraq biex jitkejjel l-ossiġnu f'kampjuni b'volumi baxxi); miter tal-pH; apparat xieraq għall-kontroll tat-temperatura; tagħmir għad-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni totali tal-karbonu organiku (TOC – total organic carbon concentration); tagħmir għad- determinazzjoni tat-talba ta' l-ossiġnu kimiku (COD – chemical oxygen demand); tagħmir għad-determinazzjoni ta' l-ebusija, eċċ.
         1.7.2   L-organiżmu tat-test
         
            Daphnia magna Straus hija l-ispeċje preferuta tat-test għalkemm speċje oħrajn Daphnia xierqa jistgħu jintużaw f'dan it-test (eż. Daphnia pulex). Fil-bidu tat-test, l-annimali għandu jkollhom inqas minn 24 siegħa u biex titnaqqas il-varjabbiltà, huwa rakkomandat bis-saħħa li ma jkunux l-ewwel friegħ tat-tifqisa. Għandhom ikunu derivati minn tifqisa b'saħħitha (jiġifieri ma juru l-ebda sinjali ta' stress bħall-mortalità għolja, il-preżenza ta' maskili u ephippia, dewmien fil-produzzjoni ta' l-ewwel tifqisa, annimali li jmurilhom il-kulur, eċċ.). L-organiżmu kollha użati għal test partikolari għandhom ikunu oriġinaw mill-istess tifqisa ta' dafnidi. L-annimali tat-tifqisa għandhom jinżammu fil-kondizzjonijiet tal-kultura (dawl, temperatura, medju) simili għal dawk li għandhom jintużaw fit-test. Jekk il-mezz tal-kultura tad-dafnidi li għandu jintuża fit-test huwa differenti minn dak użat għall-kultura rutina tad-dafnidi, hija prattika tajba li jiġi inkluż test ta' l-akklimatizzazzjoni ta' qabel it-test. Għal dak, id-dafnidi tat-tifqisa għandhom jinżammu fl-ilma tat-taħlit fit-temperatura tat-test għal mhux inqas minn 48 siegħa qabel il-bidu tat-test.
         1.7.3.   L-ilma taż-żamma u tat-taħlit
         L-ilma naturali (l-ilma tal-wiċċ u ta' l-art), l-ilma rikostitwit jew ilma tal-vit deklorinat huma aċċettabbli bħala ilma taż-żamma u tat-taħlit jekk id-dafnidi jissopravivu fihom għal kemm idum il-kulturazzjoni, l-akklimatizzazzjoni jew l-ittestjar mingħajr ma jintwerew sinjal ta' stress. Kwalunkwe ilma li jikkonforma mal-karatteristiċi kimiċi ta' ilma tat-taħlit aċċettabbli kif elenkat fl-Anness 1 huwa xieraq bħala ilma tat-test. Għandu jkun ta' kwalità kostanti matul il-perjodu tat-test. L-ilma rikostitwit jista' jsir biż-żjieda ta' ammonti speċifiċi ta' reaġenti ta' grad analitiku magħruf għal ilma deonizzat jew distillat. Eżempji ta' ilma rikostitwit jingħataw f'(1) (6) u fl-Anness 2. Innota li l-medja li fihom aġenti li jikkombinaw jonu tal-metall ma' kompost kimiku (chelating agent), bħall-medji M4 u M7 fl-Anness 2, għandhom jiġu evitati sustanzi tat-test li fihom il-metalli. Il-pH għandu jkun fil-firxa ta' 6 sa 9. Hija rrakkomandata l-ebusija bejn 140 u 250 mg/l (bħala CaCO3) għal Daphnia Magna, filwaqt li tista' wkoll tkun xierqa ebusija inqas għal speċje oħrajn ta' Daphnia. L-ilma tat-taħlit jista' jiġi arjat qabel ma jintuża għat-test sabiex il-konċentrazzjoni ta' l-ossiġnu mħallat tkun laqħet is-saturazzjoni.
         Jekk jintuża l-ilma naturali, il-parametri tal-kwalità għandhom jitkejlu għall-inqas darbtejn fis-sena jew kull meta huwa ssuspettat li dawn il-karatteristuċi setgħu nbidlu b'mod sinjifikanti (ara l-paragrafu ta' qabel u l-Anness 1). Il-kejl tal-metalli tqal (eż. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) għandu jsir ukoll. Jekk jintuża ilma tal-vit deklorinat, l-analiżi kuljum tal-klorin hija mixtieqa. JEkk l-ilma tat-taħlit huwa minn għajn ta' l-ilma fil-wiċċ jew fl-art, għandhom jitkejlu l-konduttività u l-karbonu organiku totali (TOC) jew it-talba għall-ossiġnu kimiku (COD).
         1.7.4   It-taħlitiet tat-test
         It-taħlitiet tat-test tal-konċentrazzjonijiet magħżula normalment huma ppreparati bid-dilwizzjoni ta' soluzzjoni ta' stokk. Is-soluzzjonijiet ta' stokk preferibbilment għandhom jiġu ppreparati billi s-sustanza tat-test tinħall fl-ilma tat-taħlit. Sa fejn huwa possibbli, l-użu tas-solventi, l-emulsifikanti jew id-dispersanti għandu jiġi evitat. Madankollu, dawn il-komposti jistgħu jkunu meħtieġa f'xi każijiet sabiex tiġi prodotta soluzzjoni ta' stokk li hija kkonċentrata kif xieraq. Il-gwida dwar solventi, emulsifikanti u d-dispersanti xierqa tingħata f' (4). Fi kwalunkwe każ is-sustanza tat-test fit-taħlitiet tat-test m'għandhiex teċċedi l-limitu ta' solubbiltà fl-ilma tat-taħlita.
         It-test għandu jsir mingħajr l-aġġustament tal-pH. Jekk il-pH ma jibqax fil-firxa 6 – 9, imbagħad jista' jsir test ieħor, bl-aġġustament tal-pH tas-soluzzjoni ta' stokk skond dak ta' l-ilma tat-taħlit qabel ma tiżdied is-sustanza tat-test. L-aġġustament tal-pH għandu jsir b'tali mod li l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni ta' stokk ma tinbidilx sa livell sinjifikanti u li ma tiġi kkaużata ebda reazzjoni kimika jew preċipitazzjoni tas-sustanza tat-test. Huma ppreferuti HCl u NaOH.
         1.8   IL-PROĊEDURA
         1.8.1.   Il-kondizzjonijiet ta' l-espożizzjoni
         1.8.1.1.   Il-gruppi tat-test u l-kontrolli
         Il-kontenituri tat-test jimtlew bil-volumi xierqa ta' l-ilma tat-taħlit u t-taħlitiet tas-sustanza tat-test. Il-proporzjon tal-volum ta' arja/ilma għandha tkun identika għall-grupp tat-test u tal-kontroll. Imbagħad id-dafnidi jitqiegħdu fil-kontenituri tat-test. Għall-inqas 20 annimal, preferibbilment maqsuma f'erba' gruppi ta' ħames annimali kull wieħed, għandhom jintużaw għal kull konċentrazzjoni tat-test (jiġifieri volum ta' 10 ml għal ħames dafnidi għal kull vettura tat-test). It-test jista' jsir bl-użu ta' tiġdid semi-statiku jew sistema ta' flow-through meta l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test mhijiex stabbli.
         Serje ta' kontroll waħda ta' l-ilma ta' dilwizzjoni kif wkoll, jekk rilevanti, serje ta' kontroll waħda li fiha l-aġent solubilizzanti għandhom isiru flimkien mas-serje tat-trattament.
         1.8.1.2   Il-konċentrazzjonijiet tat-test
         Jista' jsir test biex tinsab il-firxa sabiex tiġi ddeterminata l-firxa ta' konċentrazzjonijiet għat-test definittiv kemm-il darba ma tkunx disponibbli l-informazzjoni dwar it-tossiċità tas-sustanza tat-test. Għal dan l-għan, id-dafnidi huma esposti għal serje ta' konċentrazzjonijiet spazjati ħafna tas-sustanza tat-test. Ħames dafnidi għandhom jiġu esposti għal kull konċentrazzjoni tat-test għal 48 siegħa jew inqas, u ma huma neċessarji ebda replikati. Il-perjodu ta' espożizzjoni jista' jitqassar (eż. 24 siegħa jew inqas) jekk id-data xierqa għall-għan tat-test biex tinsab il-firxa tista' tinkiseb f'inqas żmien.
         Għandhom jintużaw għall-inqas ħames konċentrazzjonijiet tat-test. Għandhom jiġu rranġati f'serje ġeometriċi b'fattur ta' separazzjoni li preferibbilment ma jeċċedix 2,2. Għandha tingħata ġustifikazzjoni jekk jintużaw inqas minn ħames konċentrazzjonijiet. L-ogħla konċentrazzjoni ttestjata għandha preferibbilment tirriżulta fl-immobbilizzazzjoni ta' 100 fil-mija, u l-konċentrazzjoni l-aktar baxxa ttestjata għandha preferibbilment ma tagħti ebda effett osservabbli.
         1.8.1.3.   Il-kondizzjonijiet ta' l-inkubazzjoni
         It-temperatura għandha tkun bejn 18 oC u 22 oC, u għal kull test uniku għandha tkun kostanti sa ± 1 oC. Huwa rakkomandat ċiklu ta' 16-il siegħa dawl u 8 sigħat dlam. Huwa aċċettabbli wkoll id-dlam totali, speċjalment għas-sustanzi tat-test li mhumiex stabbli fid-dawl. Il-kontenituri tat-test m'għandhomx jiġu arjati matul it-test.
         It-test isir mingħajr aġġustament tal-pH. Id-dafnidi m'għandhomx jiġu mitmugħa matul it-test.
         1.8.1.4   Kemm idum it-test
         It-test idum 48 siegħa.
         1.8.2   Osservazzjonijiet
         Kull kontenitur tat-test għandu jiġi vverifikat għal dafnidi immobilizzati fl-24 u fit-24 siegħa wara l-bidu tat-test. (ara t-taqsima 1,2 għad-definizzjonijiet). Minbarra l-immobilità, kwalunkwe mġieba jew dehra mhux normali għandha tiġi rrapportata.
         1.8.3.   Kejl analitiku
         L-ossiġnu imħallat u l-pH jiġu mkejla fil-bidu u fl-aħħar tat-test fil-kontroll(i) u fl-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza. Il-konċentrazzjoni ta' l-ossiġnu maħlul fil-kontrolli għandha tkun skond il-kriterji tal-validità (ara t-taqsima 1.6). Il-pH normalment m'għandux ivarja b'aktar minn 1.5 unitajiet fi kwalunkwe test. Normalment it-temperatura tiġi mkejla fil-kontenituri tal-kontroll jew fl-arja ta' l-ambjent u preferibbilment għandha tiġi rreġistrata kontinwament matul it-test, jew, bħala minimu, fil-bidu u fl-aħħar tat-test.
         Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test għandha tiġi mkejla mhux inqas minn fl-ogħla konċentrazzjoni tat-test u f'dik l-aktar baxxa, fil-bidu u fl-aħħar tat-test (4). Huwa rakkomandat li r-riżultati jkunu bbażati fuq konċentrazzjonijiet imkejla. Iżda, jekk hemm provi li juru li l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test inżammet b'mod sodisfaċenti bejn ± 20 % tal-konċentrazzjoni nominali jew tal-bidu matul it-test kollu, ir-riżultati jistgħu jkunu bbażati fuq valuri mkejla nominali jew tal-bidu.
         1.9   IT-TEST TAL-LIMITU
         Bl-użu tal-proċeduri deskritti f'dan il-Metodu, jista' jsir test tal-limitu b'100 mg/l sustanza tat-test jew sa l-limitu ta' solubbiltà tagħha fil-mezz tat-test (dak li huwa l-aktar baxx fosthom) sabiex jintwera li l-EC5O huwa akbar minn din il-konċentrazzjoni. It-test tal-limitu għandu jsir bl-użu ta' 20 dafnida (preferibbilment maqsuma f'erba' gruppi ta' ħamsa), bl-istess numru fil- kontroll(i). Jekk isseħħ immobilizzazzjoni, għandu jsir studju sħiħ. Għandha tiġi rrekordjata kwalunkwe mġieba osservata li mhijiex normali.
         2.   DATA
         Id-data għandha tiġi mqassra f'forma tabulari, li turi għal kull grupp ta' trattament u l-kontroll, l-għadd ta' dafnidi użati, l-immobilizzazzjoni f'kull osservazzjoni. Il-persentaġġ immobbilizzati fl-24 siegħa u fit-48 siegħa huma mpinġija fuq djagramma kontra l-konċentrazzjonijiet tat-test. Id-data hija analizzata permezz ta' metodi statistiċi xierqa. (eż. analiżi probit, eċċ.) biex jiġu kkalkolati l-gradjenti tal-kurvi ta' l-EC5O b'limiti ta' kunfidenza ta' 95 % (p = 0,05) (7) (8).
         Fejn il-metodi standard biex jinħadem l- EC5O , ma jgħoddux għad-data miksuba, l-ogħla konċentrazzjoni li ma tikkaġuna ebda immobilità u l-konċentrazzjoni l-aktar baxxa li tipproduċi immobilità ta' 100 % għandhom jintużaw bħala approssimazzjoni għall- EC5O (għaliex dan huwa l-medju ġeometriku ta' dawn iż-żewġ konċentrazzjonijiet).
         3.   L-IRRAPPORTAR
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi għall-inqas din l-informazzjoni li ġejja:
         Is-sustanza tat-test:
         
                     —
                  
                  
                     in-natura fiżika u l-karatteristiċi fiżiċi-kimiċi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     data ta' l-identifikazzjoni kimika, inkluża l-purità.
                  
               L-ispeċje tat-test:
         
                     —
                  
                  
                     l-għajn u l-ispeċje tad-Daphnia, min jipprovdi l-għajn (jekk magħruf) u l- kondizzjonijiet tal-kultura użati (inkluża l-għajn, it-tip u l-ammont ta' l-ikel, il-frekwenza ta' l-għalf).
                  
               Il-kondizzjonijiet tat-test:
         
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni tal-kontenituri tat-test: tip ta' kontenituri, volum tat-taħlita, għadd ta' dafnidi għal kull kontenitur tat-test, għadd ta' kontenituri tat-test (replikati) għal kull konċentrazzjoni;
                  
               
                     —
                  
                  
                     metodi ta' preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta' stokk u tat-test inkluż l-użu ta' kwalunkwe solvent jew dispersanti, il-konċentrazzjonijiet użati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     dettalji ta' l-ilma tat-taħlit: il-karatteristiċi tal-kwaliità ta' l-għajn u ta' l-ilma (pH, ebusija, proporzjon Ca/Mg, proporzjon Na/K, alkalinità, konduttività, eċċ.);
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kompożizzjoni ta' l-ilma kkostitwit mill-ġdid jekk jintuża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kondizzjonijiet ta' l-inkubazzjoni: it-temperatura, l-intensità u l-perjodiċità tad- dawl, l- ossiġnu maħlul, il-pH, eċċ.
                  
               Riżultati:
         
                     —
                  
                  
                     l-għadd u l-persentaġġ ta' dafnidi li ġew immobilizzati jew li wrew xi effetti avversi (inkluża mġieba mhux normali) fil-kontrolli u f'kull grupp ta' trattament, f'kull ħin ta' osservazzjoni u deskrizzjoni tan-natura ta' l-effetti osservati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati u d-data tat-test imwettaq bis-sustanza ta' riferenza, jekk disponibbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjonijiet nominali tat-test u r-riżultat ta' l-analiżi kollha biex tiġi ddeterminata s-sustanza tat-test fil-kontenituri tat-test; l-effiċjenza ta' l-irkupru u l-limitu tad-determinazzjoni għandhom ukoll jiġu rrapportati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kejl kollu fiżiku-kimiku tat-temperatura, tal-pH u ta' l-ossiġenu maħlul li sar matul it-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-EC5O fl-48 siegħa għall-immobbilizzazzjoni b'intervalli ta' kunfidenza u graffs tal-mudell użat għall-kalkolu tagħhom, l-angolatura tal-kurvi tad-dożi ta' rispons u l-iżball standard tagħhom; il-proċeduri statistiċi użati għad-determinazzjoni ta' l- EC5O ; (dawn l-elementi ta' data għall-immobbilizzazzjoni fl-24 siegħa għandhom jiġu rrapurtati wkoll meta jkunu tkejlu)
                  
               
                     —
                  
                  
                     spjegazzjoni ta' kwalunkwe devjazzjoni mill-Metodu tat-Test u jekk id-devjazzjoni affetwatx ir-riżultati tat-test.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     1.
                  
                  
                     ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) – Acute toxicity test. Third edition, 1996.
                  
               
                  
                     2.
                  
                  
                     EPA OPPTS 850,1010. (1996). Ecological Effects Test Guidelines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater Daphnids.
                  
               
                  
                     3.
                  
                  
                     Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute Lethality Test Using Daphnia spp. EPS 1/RM/11. Environment Canada, Ottawa, Ontario, Canada.
                  
               
                  
                     4.
                  
                  
                     Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris 2000.
                  
               
                  
                     5.
                  
                  
                     Commission of the European Communities. Study D8369. (1979). Inter- laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to Daphnia
                     
                  
               
                  
                     6.
                  
                  
                     OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211: Daphnia magna Reproduction Test, adopted September 1998.
                  
               
                  
                     7.
                  
                  
                     Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 -American Society for Testing and Materials. Pp65-84
                  
               
                  
                     8.
                  
                  
                     Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3rd ed. London. Griffin, Weycombe, UK.
                  
               
            L-ANNESS 1
            XI KARATTERISTIĊI KIMIĊI TA' ILMA TAT-TAĦLIT AĊĊETTABBLI
            
                        Sustanza
                     
                     
                        Konċentrazzjoni
                     
                  
                        Materja f'partiċelli
                     
                     
                        < 20 mg/l
                     
                  
                        Karbonu organiku totali
                     
                     
                        < 2 mg/l
                     
                  
                        Ammonja mingħajr ioni
                     
                     
                        < 1 μg/l
                     
                  
                        Klorin residwali
                     
                     
                        < 10 μg/l
                     
                  
                        Il-pestiċidji organofosfori totali
                     
                     
                        < 50 ng/l
                     
                  
                        Il-pestiċidji organofosfori totali flimkien ma' polychlorinated biphenyls
                        
                     
                     
                        < 50 ng/l
                     
                  
                        Il-klorin organiku totali
                     
                     
                        < 25 ng/l
                     
                  
         
            L-ANNESS 2
            EŻEMPJI TA' IL-A TAT-TEST KOSTITWIT MILL-ĠDID XIERAQ
            Ilma tat-test ISO (1)
            
                        Soluzzjonijiet ta’ stokk (sustanza waħda)
                     
                     
                        Biex tipprepara l-ilma kkostitwit mill-ġdid, żid dawn il-volumi li ġejjin ta’ taħlitiet tat-tifqisiet ma’ litru ilma (*)
                        
                     
                  
                        Susstanza
                     
                     
                        Ammont miżjud ma’ litru ilma (*)
                        
                     
                  
                        Calcium chloride
                        CaCl2 , 2H2O
                     
                     
                        11,76  g
                     
                     
                        25 ml
                     
                  
                        Sulfat tal-manjeżju
                        MgSO4 , 7H2O
                     
                     
                        4,93  g
                     
                     
                        25 ml
                     
                  
                        Bikarnobat tas-sodju
                        NaHCO3
                        
                     
                     
                        2,59  g
                     
                     
                        25 ml
                     
                  
                        Kloridu tal-potassju
                        KCl
                     
                     
                        0,23  g
                     
                     
                        25 ml
                     
                  Il-mezz Elendt M7 u M4
            L-Akklimazzjoni għall-mezz Elendt M4 u M7
            Xi laboratorji esperjenzaw diffikoltà biex jittrasferixxu direttament id-Daphnia għall-mezz M4 u M7. Madankollu, inkiseb xi suċċess bl-akklimazzjoni gradwali, jiġifieri li jiċċaqalqu mill-mezz tagħhom għal 30 % Elendt, u mbagħad għal 60 % Elendt u mbagħad għal 100 % Elendt. Jista’ jkun li l-perjodi ta’ akklimazzjoni jkunu jeħtieġu li jkunu twal daqs xahar.
            Il-preparazzjoni
            Element traċċa
            Soluzzjonijiet ta’ stokk separati (I) ta’ elementi traċċi individwali huma l-ewwel ippreparati f’ilma ta’ safa xierqa, eż. deonizzat, distillat jew reverse osmosis. Minn dawn it-taħlitiet tat-tifqisiet differenti (I) taħlita tat-tifqisiet oħra (II) tiġi ppreparata, li jkun fiha l-elementi traċċi kollha (soluzzjoni kkombinata), jiġifieri:
            
                        Taħlita/i tat-tifqisa I (sustanza waħda)
                     
                     
                        Ammont miżjud ma’ lima (mg/l)
                     
                     
                        Konċentrazzjoni (relatata mal-mezz M4)
                     
                     
                        Biex tipprepara s-soluzzjoni ta’ stokk kkombinata II, żid dan l-ammont li ġej ta’ soluzzjoni ta’ stokk I ma’ l-ilma (ml/l)
                     
                  
                        M4
                     
                     
                        M7
                     
                  
                        H3 BO3
                        
                     
                     
                        57 190 
                     
                     
                        20 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        MnCl2.4H2O
                     
                     
                        7 210 
                     
                     
                        20 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        LiCl
                     
                     
                        6 120 
                     
                     
                        20 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        RbCl
                     
                     
                        1 420 
                     
                     
                        20 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        SrCl2.6H2O
                     
                     
                        3 040 
                     
                     
                        20 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        NaBr
                     
                     
                        320
                     
                     
                        20 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        Na2 MoO4.2H2O
                     
                     
                        1 230 
                     
                     
                        20 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        CuCl2.2H2O
                     
                     
                        335
                     
                     
                        20 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        ZnCl2
                        
                     
                     
                        260
                     
                     
                        20 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        CoCl2.6H2O
                     
                     
                        200
                     
                     
                        20 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        KI
                     
                     
                        65
                     
                     
                        20 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        Na2 SeO3
                        
                     
                     
                        43,8 
                     
                     
                        20 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        NH4 VO3
                        
                     
                     
                        11,5 
                     
                     
                        20 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        Na2 EDTA.2H2O
                     
                     
                        5 000 
                     
                     
                        2 000 - darba
                     
                     
                        —
                     
                     
                        —
                     
                  
                        FeSO4.7H2O
                     
                     
                        1 991 
                     
                     
                        2 000 - darba
                     
                     
                        —
                     
                     
                        —
                     
                  
                        Kemm it-taħlitiet Na 2 EDTA u FeSO4 huma ppreparati waħdehom, imferrgħin flimkien u awtoklavati mill-ewwel.
                     
                  
                        Dan jagħti:
                     
                  
                        Taħlita 2 l EDTA
                     
                     
                         
                     
                     
                        1 000 - darba
                     
                     
                        20,0 
                     
                     
                        5,0 
                     
                  Mezzi M4 u M7
            Il-mezzi M4 u M7 huma ppreparati bl-użu tas-soluzzjoni ta’ stokk II, il-makro-nutrienti u l-vitamini kif ġej:
            
                         
                     
                     
                        Ammont miżjud ma’ l-ima (mg/l)
                     
                     
                        Konċentrazzjoni (relatata mal- mezz M4)
                     
                     
                        Ammont ta’ soluzzjoni ta’ stokk II miżjuda mal-mezz ippreparat (ml/l)
                     
                  
                        M4
                     
                     
                        M7
                     
                  
                        Soluzzjoni ta’ stokk II (elementi traċċi kkombinati)
                     
                     
                         
                     
                     
                        20-darba
                     
                     
                        50
                     
                     
                        50
                     
                  
                        Taħlitiet tat- tifqisa makro nutrienti (sustanza waħda)
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        CaCl2 · 2H20
                     
                     
                        293 800 
                     
                     
                        1 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        MgSO4 · 7H2O
                     
                     
                        246 600 
                     
                     
                        2 000 - darba
                     
                     
                        0,5 
                     
                     
                        0,5 
                     
                  
                        KCl
                     
                     
                        58 000 
                     
                     
                        10 000 - darba
                     
                     
                        0,1 
                     
                     
                        0,1 
                     
                  
                        NaHCO3
                        
                     
                     
                        64 800 
                     
                     
                        1 000 - darba
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        Na2 SiO3 · 9H2O
                     
                     
                        50 000 
                     
                     
                        5 000 - darba
                     
                     
                        0,2 
                     
                     
                        0,2 
                     
                  
                        NaNO3
                        
                     
                     
                        2 740 
                     
                     
                        10 000 - darba
                     
                     
                        0,1 
                     
                     
                        0,1 
                     
                  
                        KH2 PO4
                        
                     
                     
                        1 430 
                     
                     
                        10 000 - darba
                     
                     
                        0,1 
                     
                     
                        0,1 
                     
                  
                        K2HPO4
                        
                     
                     
                        1 840 
                     
                     
                        10 000 - darba
                     
                     
                        0,1 
                     
                     
                        0,1 
                     
                  
                        Taħlita ta’ vitamini kkombinati
                     
                     
                        —
                     
                     
                        10 000 - darba
                     
                     
                        0,1 
                     
                     
                        0,1 
                     
                  
                        It-taħlita ta’ vitamini kkombinati hija ppreparata biż- żjieda tat-3 vitamini ma’ litru ta’ ilma, kif jidher hawn taħt:
                     
                  
                        Thiamine hydrochloride
                     
                     
                        750
                     
                     
                        10 000 - darba
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Cyanocobalamine (B12)
                     
                     
                        10
                     
                     
                        10 000 - darba
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Biotine
                     
                     
                        7,5 
                     
                     
                        10 000 - darba
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  It-taħlita tal-vitamini kkombinati tiġi maħżuna ffriżata f’alikwoti żgħar. Il-vitamini jiżdiedu mal-mezz ftit qabel l-użu.
            
                        N.B
                     
                     
                        :
                     
                     
                        Biex tiġi evitata l-preċipitazzjoni ta’ l-imluħ meta jiġu ppreparati il-mezzi kollha, żid l-aliquots tat-taħlitiet tat-tifqisiet sa madwar 500 – 800 ml ilma deonizzat u mbagħad imla sa litru.
                     
                  
                        N.B
                     
                     
                        :
                     
                     
                        L-ewwel pubblikazzjoni tal-mezz M4 tista’ tinsab f’Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructual approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
                     
                  
         C.3.   TEST TA' L-INIBIZZJONI ALGAL
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         L-iskop ta' dan it-test huwa sabiex jiddetermina l-effetti ta' sustanza fit-tkabbir ta' speċi algali ħodor uniċllulari. Testijiet relattivament qosra (72 siegħa) jistgħu jassessjaw l-effetti matul diversi ġenerazzjonijiet. Dan il-metodu jista jkun adattat għall-użu ma diversi speċi ta' l-algar uniċellulari, f'liema każ deskrizzjoni tal-metodu użat għandha tkun ipprovduta mar-rapport tat-test.
         Dan il-metodu huwa l-aktar faċli li jkun applikat ma sustanzi li jinħallu fl-ilma, skond il-kondizzjonijiet tat-test, li pjuttost jibqgħu fl-ilma.
         Dan il-metodu jista jkun użat għal sustanzi li ma jfixklux direttament il-kejl tat-tkabbir ta' l-algal.
         Huwa mixtieq li jkun hemm, sakemm ikun possibbli, informazzjoni dwar is-solubbilità, pressjoni tal-fwar, stabbilità kimika, limitazzjonijiet tad-disassoċjażżjoni u l-biodegradabbiltà tas-sustanzi qabel ma jibda t-test.
         Informazzjoni addizzjonali (per eżempju l-formula strutturali, il-grad tal-purità, in-natura u l-persentaġġ ta' impuritajiet sinifikanti, il-preżenza u l-ammonti ta' addittivi, u l-ko-effiċjent tal-qasma n-oktonal/ilma) għandhom ikunu meqjusa kemm fl-ippjanar tat-test u fl-interpretazzjoni tar-riżultati.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET
         Densità taċ-ċellola: in-numru ta' ċelloli kull millilitru;
         Tkabbir: iż-żieda fid-densità tal-ċelloli matul il-perijodu tat-test;
         Rata tat-tkabbir: iż-żieda fid-densità tal-ċelloli matul l-unità taż-żmien;
         EC50 : f'dan il-metodu, il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test li tirriżulta fi 50 % tnaqqis jew fit-tkabbir (EbC50) jew fir-rata tat-tkabbir (ErC50) relattiva mal-kontroll;
         NOEC (no observed effect concentration) (l-ebda effett ta' konċentrazzjoni m'hu osservat): f'dan il-metodu, l-għola konċentrazzjoni testjata li fiha inobizzjoni sinifikati tat-tkabbir hija osservata b'relattività mal-kontroll.
         Il-konċentrazzjonijiet kollha tas-sustanza fit-test huma mogħtija bil-piż/volum (milligrammi kull litru). Dawn jistgħu jkunu espressi wkoll bħala piż bil-piż (mg.kg-1).
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Sustanza ta' referenza tista' tkun ittestjata bħala mezz sabiex turi li l-kondizzjonijiet waqt it-test fil-laboratorju, r-reazzjoni tal-ispeċje ittestjati ma jkunux inbidlu b'mod sinifikanti.
         Jekk test aktar qasir ikun użat, ġustifikazzjoni għandha tkun mogħtija fir-rapport tat-test. Dikromat tal-putassa jista' jkun użat bħala sustanza ta' referenza, imma l-kulur tiegħu jista jaffettwa l-kwalità u l-intensità tad-dawl disponibbli għaċ-ċelloli u wkoll id-determinazzjonijiet spektrofotometriċi, jekk użati. Id-dokromat tal-putassa kien ġie użat fit-test inter-laboratorju internazzjonali (ara ref. (3) u Appendiċi 2).
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Test limitat jista' jkun imwettaq fi 100 mg kull litru sabiex tkun determinata li il- EC50 tkun akbar minn din il-konċentrazzjoni.
         Il-kulturi tat-tkabbir-expotenzali ta' l-algar ħodor magħżula huma esposti għal diversi konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test matul diversi ġenerazzjonijiet taħt kondizzjonijiet definiti.
         It-taħlitiet tat-test huma inkunati għal perijodu ta' 72 siegħa, li matulhom id-densità taċ-ċelloli f'kull taħlita hija mkejla mill anqas kull 24 siegħa. L-inibizzjoni tat-tkabbir b'relazzjoni mal-kultura tal-kontroll hija determinata.
         1.5.   KRITERJATAL-KWALITÀ
         Il-kriterja tal-kwalità għandha tkun applikabbli għal-limitu tat-test kif ukoll għall-metodu tat-test kollu.
         Id-densità taċ-ċellola fil-kulturi tal-kontroll għandha li tkun żdiedet b'fattur ta' mill-anqas 16 matul tlett ijiem.
         Il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test għandhom jinżammu sa fil-limitu ta' 80 % tal-konċentrazzjonijiet inizjali matul iż-żmien kollu tat-test.
         Għal sustanzi li jdubu faċilment fil-medja tat-test, b'hekk ifornu taħlitiet stabbli, i.e. dawk li ma jkollhomx reazzjoni volatili sinifikanti, jkollhom degradazzjoni, ikunu idrolizzati jew adsorbiti, l-konċentrazzjonini inizjali tista tkun meqjusa bħala li hija l-ekwivalenti tal-konċentrazzjoni nominali. Evidenza għandha tkun ippreżentata li l-livelli tal-konċentrazzjonijiet ikunu nżammu matul it-test u li l-kriterja tal-kwalità kienet ġiet milħuqa.
         Għal sustanzi li huma:
         
                     (i)
                  
                  
                     ftit li xejn jinħallu fil-medja tat-test, jew
                  
               
                     (ii)
                  
                  
                     kapaċi li jiffurmaw emulsjonijiet jew dispersjonijiet stabbli, inkella
                  
               
                     (iii)
                  
                  
                     mhux stabbli f'taħlitiet akweji,
                  
               il-konċentrazzjoni inizjali għandha tkun meqjusa bħala l-konċentrazzjoni mkejla fil-bidu tat-test. Il-konċentrazzjoni għandha tkun determinata wara perijodu ta ekwilibrazzjoni.
         Fi kwalunkwe minn dawn il-każi, aktar kejl għandu jsir matul it-test sabiex jikkonferma l-konċentrazzjoni attwali ta' l-esposiżżjoni jew li l-kriterja tal-kwalità tkun ġiet milħuqha.
         Huwa rikonoxxut li ammonti sinifikanti tas-sustanza tat-test jistgħu jkunu inkorporati bil-biomassa ta' l-algal matul il-perijodu tat-test. Għalhekk, għall-iskop li tkun murija l-konformità mal-kriterja tal-kwalità ta' hawn fuq, kemm l-ammont tas-sustanza inkorporata fil-biomassa ta' l-algal u wkoll tas-sustanza fit-taħlita (jew, jekk mhux teknikament possibbli, imkejla fil-kolonna ta' l-ilma) għandhom ikunu meqjusa. B'danakollu, minħabba li d-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni tas-sustanza fil-biomassa ta' l-algal tista toħloq problemi tekniċi sinifikanti, konformità mal-kriterja tal-kwalità tista tkun murija billi reċipjent taat-test ikun suġġett għall-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza mingħajr l-algal u l-kejl tal-konċentrazzjonijiet fit-taħlita (jew, jekk mhux teknikament possibbli, imkejla fil-kolonna ta' l-ilma) fil-bidu u fit-tmiem tal-perijodu tat-test.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL–PROCEDURA TAT-TEST
         1.6.1.   Reaġenti
         1.6.1.1.   Taħlitiet tas-sustanzi tat-test
         Taħlitiet diġa lesti tas-saħħa meħtieġa huma preparati bit-tidwib tas-sustanza f'ilma de-jonizzat jew f'ilma skond 1.6.1.2.
         Il-konċentrazzjonijiet tat-test kif magħżula huma ippreparati biż-żieda ta' alikwota xierqa mal-pre-kulturi ta' l-algal (ara Appendiċi 1).
         Is-sustanza għandha normalment tkun ittestjata biss sal-limitu tas-solubbilità tagħha. Għal uħud mis-sustanzi (eż. sustanzi li jkollhom solubbilità baxxa fl-ilma, jew Pow għoli, jew dawk li jiffurmaw tixriq stabbli pjuttost milli taħlita vera fl-ilma), huwa aċċettabbli li tintuża l-konċentrazzjoni tat-test aktar għolja mil-limitu tal-solubbilità tas-sustanza sabiex ikun assigurat li s-solubbilità massima/stabbilità tal-konċentrazzjoni tkun intlaħqet. Huwa importanti, b'danakollu, li din il-konċentrazzjoni ma tkunx b'mod ieħor tħawwad is-sistema tat-test (eż. li jkun hemm rita tas-sustanza fil-wiċċ ta' l-ilma li ma tħallix li jseħħ l-ossiġinazzjoni ta' l-ilma, eċċ.).
         Tixrid ultrasoniku, solventi organiċi, emulsifikaturi jew dispersanti jistgħu jintużaw bħala għajnuna għat-tħejjija tat-taħlitiet bil-lest ta' sustanzi b'solubbilità baxxa fl-ilma jew sabiex jgħinu fit-tixrid ta' dawn is-sustanzi fil-medja tat-test. Meta tali sustanzi awżiljarji huma wżati, il-konċentrazzjonijiet kollha tat-test għandhom jinkludu l-istess ammont tas-sustanza awżiljarja, u ħut addizzjonali tal-kontroll għandhom ikunu esposti għall-istess konċentrazzjoni tas-sustanza awżiljarja bħal dik użata fis-serje tat-test. Il-konċentrazzjoni ta' tali awżiljarji għandha tkun minimizzata, imma fl-ebda każ m'għandha teċċedi 100 mg kull litru fil-medja tat-test.
         It-test għandu jkun imwettaq mingħajr l-aġġustament tal-pH. Jekk ikun hemm evidenza ta' tibdil qawwi fil-pH, huwa rakkomandat li t-test għandu jkun repetut bi pH aġġustat u r-riżultati inklużi fir-rapport. F'dak il-każ, il-valur tal-pH tat-taħlita bil-lest għandu jkun aġġustat għall-valur tal-pH ta' l-ilma tat-taħlit, sakemm ma jkunx hekk raġunijiet speċifiċi il-għala dan m'għandux isir. HCI u NaOH huma preferuti għal dan l-iskop. Dan l-aġġustament tal-pH għandu jsir b'tali mod hekk li l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fit-taħlita bil-lest ma tkunx mibdula sa xi medda sinifikanti. Jekk ikun hemm reazzjoni kimika jew preċipitazzjoni fiżika tal-kompost tat-test ikkaġunata bl-aġġustament, dan għandu jkun mistqarr.
         1.6.1.2.   Medja tat-test
         L-ilma għandu jkun distillat ta' kwalità tajba, jew ilma dejonizzat b'konduttività ta' anqas minn 5 μS.cm-1. Apparat għad-distillazzjoni ta' l-ilma m'għandux ikun fih xi partijiet magħmula mir-ramm.
         Il-medja li ġejja hija rakommandata.
         Erba' taħlitiet bil-lest huma preparati, skond it-tabella li ġejja. It-taħlitiet bil-lest huma sterilizzati b'filtrazzjoni tal-membrana jew bl-awtoklavar, u maħżuna fid-dlam fi 4 oC. It-taħlita bil-lest Nru 4 għandha tkun sterilizzata biss bil-filtrazzjoni tal-membrana. Dawn it-taħlitiet bil-lest huma mdewwba sabiex ikunu milħuqa l-konċentrazzjonijiet finali tan-nutrijent fit-taħlitiet tat-test.
         
                      
                  
                  
                     taħlita bil-lest
                  
                  
                     fit-taħlita tat-test
                  
               
                     
                        Taħlita bil-lest 1: makro-nutrienti
                  
               
                     NH4Cl
                  
                  
                     1,5  g/l
                  
                  
                     15 mg/l
                  
               
                     MgCl2.6H2O
                  
                  
                     1,2  g/l
                  
                  
                     12mg/l
                  
               
                     CaCl2.2H2O
                  
                  
                     1,8  g/l
                  
                  
                     18 mg/l
                  
               
                     MgSO4.7H2O
                  
                  
                     1,5  g/l
                  
                  
                     15 mg/l
                  
               
                     KH2PO4
                     
                  
                  
                     0,16  g/l
                  
                  
                     1,6  mg/l
                  
               
                     
                        Taħlita bil-lest 2:Fe-EDTA
                     
                  
               
                     FeCl3.6H2O
                  
                  
                     80 mg/l
                  
                  
                     0,08  mg/l
                  
               
                     Na2EDTA.2H2O
                  
                  
                     100 mg/l
                  
                  
                     0,1  mg/l
                  
               
                     
                        Taħlita bil-lest 3: elementi traċċa
                     
                  
               
                     H3BO3
                     
                  
                  
                     185 mg/l
                  
                  
                     0,185  mg/l
                  
               
                     MnCl2.4H2O
                  
                  
                     415 mg/l
                  
                  
                     0,415  mg/l
                  
               
                     ZnCl2
                     
                  
                  
                     3 mg/l
                  
                  
                     3 x 10-3 mg/l
                  
               
                     CoCl2.6H2O
                  
                  
                     1,5  mg/l
                  
                  
                     1,5  x 10-3 mg/l
                  
               
                     CuCl2.2H2O
                  
                  
                     0,01  mg/l
                  
                  
                     10-5 mg/l
                  
               
                     Na2MoO4.2H2O
                  
                  
                     7 mg/l
                  
                  
                     7 x 10-3mg/l
                  
               
                     
                        Taħlita bil-lest 4: NaHCO3
                     
                  
               
                     NaHCO3
                     
                  
                  
                     50 g/l
                  
                  
                     50 mg/l
                  
               Il-pH tal-medja wara l-ekwilibrazzjoni bl-arja huwa ta' madwar 8.
         1.6.2.   Apparat
         
                     —
                  
                  
                     Apparat normali tal-laboratorju,
                  
               
                     —
                  
                  
                     Garafini tat-test ta' volum xieraq (eż. garafini koniċi 250 ml huma adatti meta l-volum tat-taħlita tat-test huwa 100 ml). Il-garafini tat-test għandhom ikunu kollha identiċi f'dak li jirrigwardja l-materjal u l-qisien.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Apparat tal-kultura: armarju jew kabina li fiha it-temperatura fil-medda ta' 21 oC to 25 oC tkun tista tinżamm fi ± 2 C, u illuminazzjoni kontinwa uniformi ipprovduta fil-medda spettrali 400 sa 700 nm. Jekk l-algae fil-kultru tal-kontrol ikunu laħqu r-rati tat-tkabbir rakommandat, jista jkun assumit li kondizzjonijiet tat-tkabbir, inkluża l-intensità tad-dawl, kienu adekwati.
                     Huwa rakkomandat li jsir użu. Fil-livell medju tat-taħlitiet tat-test, ta' intensità tad-dawl fil-medda ta' 60 sa 120 μE.m-2.s-1 μE.m- 2.s-1 (35 sa 70 x 1018 photons.m- 2.s-1) meta mkejla fil-medda 400 sa 700 nm bl-użu tar-riċevitur xieraq. Għall- istrumenti tal-kejl tad-daawl kalibrati fi lux, medda ekwivalenti ta' 6 000 sa 10 000 lx hija aċċettabbli.
                     L-intensità tad-dawl tista tkun akkwistata bl-użu ta' minn erba' sa seba lampi florixxenti ta' 30 W tat-tip abjad universali (it-temperatura tal-kulur ta' madwar 4 300 K), f'distanza ta' 0,35 m mill-kultura ta' l-algal.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Il-kejl tat-densità taċ-ċellola għandu jsir bl-użu tal-metodu ta' l-għadd dirett taċ-ċelloli ħajjin, eż. mikroskopju bil-qsim ta' l-għadd. B'danakollu, proċeduri oħrajn (fotometrija, turbidimetria,…) jistgħu ikunu wżati jekk ta' sensittività suffiċjenti u jekk ikun muri li jkunu sew korrelati b'mod sodisfaċenti mad-densità taċ-ċellola.
                  
               1.6.3.   Organiżmi tat-test
         Huwa suġġerit li l-ispeċje ta' l-algal ħodor użati jkunu tal-ispeċi li jikbru malajr li huma konvenjenti għall-preparatazzjoni tal-kultura u tat-testijiet. L-ispeċi li ġejjin huma preferuti:
         
                     —
                  
                  
                     
                        Selenastrum capricornutum, eż. ATCC 22662 jew CCAP 278/4,
                  
               
                     —
                  
                  
                     Scenedesmus subspicatus, eż. 86.81 SAG,
                  
               
            Nota:
         
         
                     ATCC
                  
                  
                     =
                  
                  
                     American Type Culture Collection (U.S.A.)
                  
               
                     CCAP
                  
                  
                     =
                  
                  
                     Culture Centre of Algae and Protozoa (U.K.)
                  
               
                     SAG
                  
                  
                     =
                  
                  
                     Ġbir tal-kultura ta' l-algal (Göttingen, F.R.G.)
                  
               Jekk speċi oħrajn huma wżati, is-silta għandha tkun inkluża fir-rapport.
         1.6.4.   Proċedura tat-test
         Il-medda tal-konċentrazzjoni li fiha l-effetti pjuttost li jseħħu hija determinata fuq il-bażi tar-riżultati mit-testijiet tas-sejbin tal-medda.
         Iż-żewġ kejl tat-tkabbir (biomassa u r-rata tat-tkabbir) jistgħu jirriżultaw minn kejl ferm differenti ta' l-inibizzjoni tat-tkabbir, it-tnejn għandhom ikunu wżati fit-test tas-sejbien tal-medda sabiex jassiguraw li l-progressjoni ġeometrika tal-konċentrazzjoninijiet tkun tippermetti l-estimi kemm tal- EbC50 u wkoll tal- ErC50.
         Densità taċ-ċellola inizjali
         Huwa rakommandat li d-densità tal-ċellola inizjali fil-kultru tat-test għandha tkun madwar 104 ċelloli/ml għal Selenastrum capricornutum u Scenedesmus subspicatus. Jekk speċje oħrajn huma wżati, il-biomassa għandha tkun komparabbli.
         Konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test
         Għat-test, mill-anqas ħames konċentrazzjoninijiet huma magħmula minn serje ġeometrika, fir-relattività tal-konċentrazzjonini li ma teċċedix 2,2. Il-konċentrazzjoni l-aktar baxxa kif ittestjata m'għandha jkollha l-ebda effett fuq it-tkabbir ta' l-algae. L-ogħla konċentrazzjoni ittestjata għandha tnaqqas it-tkabbir b'mill-anqas 50 % b'relattività mal-kontroll u, preferibbilment, twaqqaf it-tkabbir kompletament.
         Repliki u kontrolli
         Id-disinn tat-test għandu jinkludi tlett replikati għal kull konċentrazzjoni tat-test. It-tlett kontrolli mingħajr is-sustanza tat-test huma esegwiti u, jekk relevanti, tlett kontrolli li jkun fihom is-sustanza awżiljarja huma wkoll esegwiti. Jekk ġustifikat, id-disinn tat-test jista jkun mibdul sabiex jiżdiedu n-numru ta' konċentrazzjonijiet u jitnaqqsu n-numru ta' repliki f'kull konċentrazzjoni.
         L-imġieba tat-test
         Il-kulturi tat-test li jkun fihom il-konċentrazzjonijiet mixtieqa tas-sustanza tat-test u l-kwantità mixtieqa ta' l-algal inoculum huma preparati biż-żieda ta alikwoti ta' taħlitiet bil-lest tas-sustanza tat-test sa ammonti xierqa tal-pre-kulturi ta' l-algal (ara Appendiċi 1).
         Il-garfina tal-kultura huma mċekċka u mqiegħda fl-apparat tal-kulturar. Iċ-ċelloli algar huma miżmuma f'sospenzjoni biċ-ċekċik, taħwid jew tbaqbieq bl-arja, sabiex jittejjeb l-iskambju tal-gass u titnaqqas il-varjazzjoni pH fit-taħlitiet tat-test. Il-kulturi ghandhom ikunu miżmuma f'temperatura fil-medda ta' 21 sa 25 oC, ikkontrollata fi ± 2 oC.
         Id-densità taċ-ċellola f'kull garafina hija determinata fi mill-anqas 24, 48 u 72 siegħa wara l-bidu tat-test. Medja ta' l-algal iffiltrata li jkun fiha il-konċentrazzjoni xierqa tal-kimika tat-test hija użata sabiex tiddetermina l-isfond meta jkunu wżati kejl tad-densità taċ-ċellola apparti mill-metodi ta' l-għadd dirett.
         Il-pH huwa mkejjel fil-bidu tat-test u wara 72 siegħa.
         Il-pH tal-kontrolli m'għandux normalment jiddevja b'aktar minn 1,5 unitajiet matul it-test.
         L-ittestjar ta' sustanza volatili
         Sa issa ma hemm l-ebda mod ġeneralment aċċettabbli għat-testijiet ta' sustanzi volatili. Meta sustanza tkun magħrufha bħala li għandha tendenzi għall-vaporizzazzjoni, garafini magħluqa tat-test bi spazju miżjud fil-wiċċ jistgħu ikunu wżati. Il-possibbiltà ta' nuqqas ta' CO2 għandha tkun meqjusa meta jkun ikkalkolat l-ispazju fil-wiċċ tal-garafini magħluqa. Varjazzjonijiet ta' dan il-metodu huma proponuti (ara referenza (4))
         Tentattivi għandhom isiru għad-determinazzjoni ta' l-ammont tas-sustanza li tibqa' fit-taħlita, u attenzjoni estrema hija rakkomandata meta jkunu interpretati r-riżultati tat-testijiet b'kimiċi volatili bl-użu ta' sistemi magħluqa.
         Test ta' limitazzjoni
         Test limitat jista' jkun imwettaq fi 100 mg kull litru sabiex tkun determinata li il-EC5O tkun akbar minn din il-konċentrazzjoni.
         Jekk in-natura tas-sustanza tkun tali li konċentrazzjonini ta' 100 mg kull litru fl-ima tat-test ma tistax tkun milħuqha, t-test tal-limitazzjoni għandu jkun imwettaq f'konċentrazzjoni egwali għas-solubbilità tas-sustanza (jew tal-konċentrazzjoni massima li tifforma tixrid stabbli) fil-medja użata (ara wkoll il-punt 1.6.1.1).
         It-test tal-limitazzjoni għandu jkun imwettaq mill-anqas fi tlett darbiet, bl-istess numru ta' kontrolli. Iż-żewġ kejl tat-tbabbir (biomassa u r-rata tat-tkabbir) għandhom ikunu wżati għattest tal-limitazzjoni.
         Jekk, fit-test tal-limitazzjoni, medja ta' tnaqqis ta' 25 % jew aktar tkun misjuba jew bil-biomassa inkella fir-rata tat-tkabbir bejn it-test tal-limitazzjoni u tal-kontroll, test sħiħ għandu jkun imwettaq.
         2.   DATA U EVALWAZZJONI
         Id-densità mkejla taċ-ċelloli fil-kulturi tat-test u tal-kontrolli huma tabulati flimkien mal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test u l-ħinijiet tal-kejl. Il-valur medju tad-densità taċ-ċellola għal kull konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test u għall-kontrolli huwa mpinġi kontra l-ħin (0-72 siegħa) sabiex jipproduċu l-kurva tat-tkabbir.
         Sabiex tkun determinata r-relazzjoni tal-konċentrazzjonini/effett, iż-żewġ resqien li ġejjin għandhom ikunu wżati. Uħud mis-sustanzi jistgħu jistimulaw it-tkabbit f'konċentrazzjoninijiet baxxi. Dawk il-punti biss tad-data li jindikaw l-inibizzjoni bejn 0 u 100 % għandhom ikunu meqjusa.
         2.1.   TQABBIL TAŻ-ŻONI PERMEZZ TAL-KURVI TAT-TKABBIR
         Iż-żona bejn il-kurvi tat-tkabbir u l-linja orizzonataali N = N0 tistatkun ikkalkolata skond din il-formula:
         
            
         meta
         
                     A
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-medda taż-żona,
                  
               
                     No
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     in-numru ta' ċelloli/ml fil-ħin ta' t0 (il-bidu tat-test),0,
                  
               
                     N1
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     in-numru mkejjel ta' ċelloli/ml fi t1,
                  
               
                     Nn
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     in-numru mkejjal ta' ċelloli/ml fil-ħin tn,
                  
               
                     tl
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-ħin ta' l-ewwel kejl wara l-bidu tat-test,
                  
               
                     tn
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-ħin tal-kejl applikabbli wara l-bidu tat-test,
                  
               
                     n
                  
                  
                     =
                  
                  
                     in-numru ta' kejl meħuda wara l-bidu tat-test.
                  
               Il-persentaġġ ta' l-inibizzjoni tat-tkabbir taċ-ċellola f'kull konċentrazzjonini tas-sustanza (IA) huwa ikkalkolat skond din il-formula:
         
            
         Meta
         
                     Ac
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-medda taż-żona bejn il-kurva tal-kontroll tat-tkabbir u l-linja orizzontali N = No.
                  
               
                     At
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-medda taż-żona bejn il-kurva tat-tkabbir fil-konċentrazzjoni t u l-linja orizzontali N = No.
                  
               
                     IA
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     Il-valuri IA huma mpinġija fuq karta semilogaritmika jew fuq karta probit semilogaritmika kontra l-konċentrazzjonijiet korrespondenti. Jekk pinġuti fuq karta probit, il-punti huma mdaħħla b'linja dritta, jew bl-għajnejn inkella b'regressjoni komputata.
                  
               Il-EC5O hija ikkalkolata bil-linja tar-regressjoni bil-qari mill-konċentrazzjoni li hija ekwivalenti għall-inibizzjoni ta' 50 % (IA = 50 %). Sabiex ikun muri dan il-valur mingħajr ebda ambigwità b'relazzjoni ma dan il-metodu tal-kalkolazzjoni, huwa proponut li jsir użu mis-simbolu EbC50. Huwa essenzali li l- EbC50 ikun ikkwotat mal-perijodu xieraq ta' l-espożizzjoni, eż. EbC50 (0-72h).
         2.2.   TQABBIL TAR-RATI TAT-TKABBIR
         Il-medja tar-rata speċifika tat-tkabbir (μ) għall-kulturi li jikbru b'mod esponenzali tista tkun ikkalkolata bħala
         
            
         meta to hija il-ħin fil-bidu tat-test.
         B'mod alternattiv, il-medja tar-rata speċifika tat-tkabbir tista tkun akkwistata mil-linja mżerzqa tar-regressjoni fit-tpinġija ta' 1n N versus il-ħin.
         Il-persentaġġ ta' l-inibizzjoni speċifika tat-tkabbir f'kull konċentrazzjoni tas-sustanza (Iμt) huwa ikkalkolat skond din il-formula:
         
            
         meta
         
                     μc
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     medja tal-kontroll speċifiku tat-tkabbir
                  
               
                     μt
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     medja tar-rata speċifika tat-tkabbir għall-konċentrazzjoni tat-test t
                  
               It-tnaqqis perċentwali fil-medja speċifika tat-tkabbir f'kull konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test imqabbel mal-valur tal-kontroll huwa mpinġi kontra l-logaritmu tal-konċentrazzjoni. Il- EC50 jista jkun moqri mill-grafika riżultanti. Sabiex tkun murija n-nuqqas ta' ambigwità, il- EC50 akkwistat b'dan il-metodu, huwa proponut li jsir użu mis-simbolu ErC50. Il-ħinijiet tal-kejl għandhom ikunu indikati, eż. jekk il-valuri jirrigwardjaw il-ħinijiet 0 u 21 siegħa, is-simbolu isir ErC50 (0-72h).
         Nota: rata speċifika tat-tkabbir hija t-terminu logaritmiku, u tibdiliet żgħar fir-rata tat-tkabbir tista' twassal għal tibdiliet kbar fil-biomassa. Il-valuri EbC u ErC huma għalhekk mhux numerikament komparabbli.
         2.3.   KALKOLU TAL-NOEC
         Il-Konċentrazzjoni ta' l-Effett Osservat N hija determinata bi proċedura statistikali xierqa għat-tqabbil tal-multi-kampjun (eż. analaiżi tal-varjanza u t-test Dunnett), bl-użu tal-valur ta' repliki individwali taż-żoni fil-kurvi tat-tkabbir A (ara l-unt 2.1) jew fir-rati tat-tkabbir μ (ara l-punt 2.2).
         3.   RAPPORTAĠĠ
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     sustanza tat-test: data ta' l-identifikazzjoni tal-kimika;
                  
               
                     —
                  
                  
                     organiżmi tat-test: oriġini, kultura tal-laboratorju, numru tas-silta, metodu tal-kultivazzjoni;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kondizzjoni tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 il-jum tal-bidu u tat-tmiem tat-test u t-tul taż-żmien tiegħu,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 temperatura,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-komposizzjoni tal-medja,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-apparat tal-kultura,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-pH tat-taħlitiet fil-bidu u fit-tmiem tat-test (bħala spjegazzjoni għandhom ikunu ipprovduti jekk id-devjazzjonijiet tal-pH ikunu aktar minn 1,5 unità ta' kif osservati),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-mezz u l-metodu użat għat-taħlil tas-sustanza tat-test u l-konċentrazzjoni tal-mezz fit-taħlitiet tat-test,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-intensità u l-kwalità tad-dawl,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-konċentrazzjonijiet ittestjati (imkejla jew minimi)
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 id-densita) taċ-ċellola għal kull garafina f'kull punt tal-kejl u l-metodu għall-kejl tad-densità taċ-ċellola,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 valuri medji tad-densità taċ-ċellola,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kurvi tat-tkabbir,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 preżentazzjoni grafika tal-konċentrazzjoninijiet li jaffetwaw il-relattività,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-valuri KE u l-metodu tal-kalkolazzjoni,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 NOEC,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 effetti oħrajn osservati.
                              
                           
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD, Pariġi, 1981, Linji ta' Gwida tat-Testijiet 201, Deċiżjoni tal-Kunsill C(81) 30 Finali.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag 'Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatusċ, in: Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     ISO 8692 – Kwalità ta' l-ilma – Test ta' l-inibizzjoni tat-tkabbir ta' l-algal fl-ilma frisk bil Scenedesmus subspicatus u Selenastrum capricornutum.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     S.Galassi and M.Vighi – Chemosphere, 1981, vol.10, 1123-1126.
                  
               
            Appendiċi 1
            Eżempju tal-proċedura għall-kultura ta' l-algae
            Oservazzjonijiet ġenerali
            L-iskop tal-kultura fuq il-bażi tal-proċedura li ġejja huwa li jkunu akkwistati kulturi ta' l-algal għat-testijiet tat-tossiċità.
            Metodi xierqa għandhom ikunu wżati sabiex jassiguraw li l-kulturi ta' l-algal ma jkunux infettati bil-bakterja (ISO 4833). Kulturi asseniċi jistgħu jkunu mixtieqa imma kulturi unjagali huma essenzali.
            L-operazzjonijiet kollha għandhom jitwettqu f'kondizzjonijiet sterili sabiex tkun evitata l-kontaminazzjoni mal-bakterja minn algae oħrajn. Kulturi kontaminati għandhom ikunu miċħuda.
            Proċeduri għall-akkwista tal-kulturi algal
            Preparazzjoni tat-taħlitiet tan-nutrient (medja):
            Il-medja tista tkun ippreparata bit-trattib tat-taħlitiet konċentrati bil-lest tan-nutrijenti. Għal medja solida, 0,8 % agar huwa miżjud. Il-medja użata għandha tkun sterili. Sterlizzazzjoni bl-awtoklavar tista twassal għat-telf ta' NH3.
            Kultura bil-lest:
            Il-kulturi bil-lest huma kulturi algali żgħar li huma regolarment trasferiti lejn medja friska sabiex jaġixxu bħala l-materjal tat-test inizjali. Jekk il-kulturi ma jkunux użati regolarment, dawn għandhom ikunu mferrgħin bilmod mit-tubi agar. Dawn huma trasferiti lejn medja friska mill-anqas darba kull xahrejn.
            Il-kulturi bil-lest huma mkabbra f'garafini koniċi li jkun fihom il-medja xierqa (volum ta' madwar 100 ml). Meta l-algae huma inkubati fi 20 oC b'illuminazzjoni kontinwa, trasferiment ta' kull ġimgħa huwa meħtieġ.
            Matul it-trasferiment, ammont tal-kultura “qadima” huwa trasferit b'pipetti sterili għal ġewwa garafina bilmedja friska, hekk li l-ispeċi li jikbru bil-ħeffa, l-konċentrazzjoni inizjali tkun ma madwar 100 darba iżgħar minn dik tal-kultura l-qadima.
            Ir-rata tat-tkabbir ta' speċje tista tkun determinata mill-kurva tat-tkabbir. Jekk dan ikun magħruf, ikun possibbli li tkun ikkalkolata d-densità li fiha l-kultura għandha tkun trasferita lejn medja ġdida. Dan għandu jseħħ qabel il-kultura tilħaq il-fażi tal-mewt.
            Pre-kultura:
            Il-pre-kultura hija ntiża li tagħti ammont ta' algae adatti għall-innokulazzjoni fil-kulturi tat-test. Il-prekultura hija inkubata fl-istess kondizzjonijiet bħal tat-test u użata meta tkun għadha esponenzalment tikber, normalment wara perijodu ta' inkubazzjoni ta' madwar tlett ijiem. Meta l-kulturi ta' l-algal ikun fihom ċelloli deformati jew annormali, dawn għandhom ikunu mwarrba.
         
         
            Appendiċi 2
            L-ISO 8692 – Kwalità ta' l-ilma – Test ta' l-inibizzjoni tat-tkabbir ta' l-algar f'ilma frisk bi Scenedesmussubspicatus u Selenastrum capricornutum, jirraportaw ir-riżultati li ġejjin għal test inter-laboratorju fost 16 laboratorju, testijiet bid-dikromat tal-putassa:
            
                         
                     
                     
                        Mezzi (mg/I)
                     
                     
                        Medda (mg/I)
                     
                  
                        ErC50 (0 – 72h)
                     
                     
                        0,84 
                     
                     
                        0,60  to 1,03 
                     
                  
                        EbC50 (0 – 72 h)
                     
                     
                        0,53 
                     
                     
                        0,20  to 0,75 
                     
                  
         C.4.   DETERMINAZZJONI TAL-BIODEGRADABBILITÀ “LESTA”
         PARTI I.   KONSIDERAZZJONIJIET ĠENERALI
         I.1.   INTRODUZZJONI
         Sitt metodi tat-ġtestijiet huma deskritti li jippermettu l-għażla tal-kimiċi għal biodegradabbilità lesta f; medja akwea arobika:
         
                     (a)
                  
                  
                     Karbonju Organiku Mdewweb (DOC) Bit-Tneħħija tal-Kulur (Metodu oC.4-A)
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     Għażla Modifikata OECD – DOC Bit-Tneħħija tal-Kulur (Metodu oC.4-B)
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     Evoluzzjoni tad-diossidu tal-karbonju (CO2) (Test Sturm modifikat (Metodu oC.4-C)
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     Respirometrija Manjometrika (Metodu oC.4-D)
                  
               
                     (e)
                  
                  
                     Flixkun magħluq (Metodu oC.4-E)
                  
               
                     (f)
                  
                  
                     MITI (Ministeru tal-Kummerċ Internazzjonali u l-Industrija – Ġappun) (Metodu oC.4-F)
                  
               Konsiderazzjonijiet ġenerali u komuni għas-sitt testijiet kollha huma mogħtija fil-Parti I tal-metodu. Punti speċifiċi għal metodi individwali huma mogħtija fil-Partijiet II sa VII. L-annessi fihom definizzjonijiet, formuli u materjal ta' gwida.
         Eżerċizzju ta' tqabbil inter-laboratorju OECD, magħmul fil-1988, kien wera li l-metodi jagħtu riżultati konsistenti. B'danakollu, jiddependi mill-karatteristiċi fiżiċi tal-sustanza tat-test, wieħed jew ieħor mill-metodi jista jkun preferut.
         I.2.   SELEZZJONI TAL-METODU XIERAQ
         Sabiex ikun magħżul il-metodu l-aktar xieraq, informazzjoni dwar is-solubbiltà tal-kimika, pressa tal-fwar u l-karatteristiċi ta' l-assorbazzjoni huma essenzali. L-istruttura jew il-formula tal-kimika għandhom ikunu magħrufa sabiex ikun ikkalkolati l-valuri teoretiċi u/jew il-verifika tal-valuri mkejla tal-parametri, eż. ThOD, ThCO2, DOC, TOC, COD (ara l-Annessi I u II).
         Kimiki tat-test li jinħallu fl-ilma għal mill-anqas 100 mg/l jistgħu ikunu assessjati bil-metodi kollha, basta li dawn ma jkunux volatili u mhux-assorbanti. Għal dawk il-kimiki li jinħallu bilmod fl-ilma, li huma volatili jew assorbanti, metodi xierqa huma indikati fit-Tabella 1. Il-manjera li biha l-kimiċi li jinħallu bilmod fl-ilma u kimiki volatili jistgħu ikunu ittratti kif deskritt fl-Anness III. Kimiki moderatament volatili jistgħu ikunu ittestjati bil-metodu DOC tat-Tneħħija tal-Kulur jekk ikun hemm spazzju biż-żejjed tal-gass fir-reċipjenti tat-test (li għandhom ikunu magħluqa sewwa). F'dan il-każ, kontrol abjotiku jista jkun stabbilit sabiex jippermetti għal xi telf fiżiku.
         Tabella 1
         Applikabbiltà tal-metodi tat-test
         
                     Test
                  
                  
                     Metodu analitiku
                  
                  
                     Adattabbilità għal taħlitiet li huma:
                  
               
                     Jinħallu ftit
                  
                  
                     volatili
                  
                  
                     assorbenti
                  
               
                     DOC Tneħħija tal-kulur
                  
                  
                     Karbonju organiku mdewweb
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     +/–
                  
               
                     Mod. OECD Tneħħija tal-kulur
                  
                  
                     Karbonju organiku mdewweb
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     +/–
                  
               
                     Evoluzzjoni CO2
                     
                  
                  
                     Respirometrija: Evoluzzjoni CO2
                     
                  
                  
                     +
                  
                  
                     —
                  
                  
                     +
                  
               
                     Respirometrija manometrika
                  
                  
                     Respirometrija manometrika: konsum ta' l-ossiġenu
                  
                  
                     +
                  
                  
                     +/–
                  
                  
                     +
                  
               
                     Flixkun magħluq
                  
                  
                     Respirometrija: ossiġenu mdewweb
                  
                  
                     +/–
                  
                  
                     +
                  
                  
                     +
                  
               
                     MITI
                  
                  
                     Respirometrija: konsum ta' l-ossiġenu
                  
                  
                     +
                  
                  
                     +/–
                  
                  
                     +
                  
               Informazzjoni dwar il-purità jew il-proporzjonijiet relattivi ta' komponenti maġġuri tal-materjal tat-test hija meħtieġa għall-interpretazzjoni tar-riżultati akkwistati, speċjalment meta r-riżultati huma baxxi jew marġinali.
         Informazzjoni dwar it-tossiċità tal-kimika tat-test mal-bakterja (l-Anness IV) tista tkun ferm utili għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet xierqa tat-test u tista tkun essenzjali għall-interpretazzjoni tajba tal-valuri tal-biodegradazzjoni baxxa.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Sabiex tkun verifikata l-proċedura, kimiċi ta' referenza li jilħqu l-kriterja għal biodegradabbilità faċli huma ittestjati billi jkun hemm garafina xierqa b'mod parallel mal-provi nomali tat-test.
         Kimiċi xierqa huma l-anilin (iddistillat frisk), l-aċetat tas-sodju u l-benżoat tas-sodju. Dawn il-kimiċi ta' referenza kollhom jkollhom degradazzjoni b'dawn il-metodi meta l-ebda inoculum ma jkun deliberatament miżjud.
         Huwa suġġerit li kika ta' referenza għandha tkun imfittxija li jkollha biodegradabbilità faċli imma meħtieġa b'żieda ma l-inoculum. Il-ftalat ta' l-idroġenu tal-putassa kien proponut imma aktar evidenza jeħtieġ li tkun akkwistata b'din is-sustanza qabel ma tista tkun aċċettata bħal sustanza ta' referenza.
         Fit-testijiet respirometriċi, il-komposti li jkun fihom in-nitroġenu jistgħu jaffettwaw l-akkwist ta' l-ossiġenu minħabba n-nitrifikazzjoni (ara l-Annessi II u V).
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODI TAT-TEST
         Taħlita, jew sospenzjoni, tas-sustanza tat-test f'medja minerali, hija innokulata u inkubata permezz tal-kondizzjonijiet erobiċi, fid-dlam jew f'dawl baxx hafna. L-ammont ta' DOC fit-taħlita tat-test minħabba l-inoculum għandu jinżamm baxx kemm jista jkun possibbli imqabbel ma l-ammont ta' DOC minħabba s-sustanza tat-test. Ghandu jkun hemm marġini għall-attività endoġenea ta' l-inoculum billi jkunu mwettqa testijiet parallelli fl-imbjank bl-inoculum imma mingħajr is-sustanza tat-test, għalkemm l-attività endoġenea taċ-ċelloli fil-preżenta tas-sustanza ma tkunx eżattament taqbel ma dik fil-kontroll endoġeneu. Sustanza ta' referenza tkun utilizzata b'mod parallel għall-verifika ta' l-operazzjoni tal-proċeduri.
         Ġeneralment, degradazzjoni hija segwita bid-determinazzjoni tal-parametri, bħalma huma DOC, produzzjoni CO2 bl-akkwist ta' l-ossiġenu, u l-kejl ikun meħud f'intervalli ta' spiss suffiċjenti sabiex jippermettu l-identifikazzjoni tal-bidu u tat-tmiem tal-biodegradazzjoni. B'respirometri awtomatiċi, il-kejl ikun kontinwu. DOC ta' kultant huwa mkejjel b'żieda ma parametru ieħor, imma dan normalment iseħħ biss fil-bidu u fit-tmiem tat-test. Analiżi kimika speċifika tista wkoll tkun użata għall-assessjar tad-degradazzjoni primarja tas-sustanza tat-test, u sabiex tkun determinata l-konċentrazzjoni ta' xi sustanzi intermedji iffurmati (obligatorja fit-test MITI).
         Normalment, it-test idum 28 jum. B'danakollu, t-testijiet jistgħu jieqfu qabel it-28 jum, i.e. malli l-kurva tal-bijodegredazzjoni tkun laħqet il-quċċata lixxa għal mill-anqas 3 determinazzjonijiet. It-testijiet jistgħu wkoll ikunu mtawla lill hinn minn 28 jum meta l-kurva turi li l-biodegradazzjoni tkun bdiet imma l-quċċata lixxa ma tkunx intlaħqet fil-jum 28.
         I.5.   KRITERJA TAL-KWALITÀ
         1.5.1.   Reproduċibbiltà
         Minħabba n-natura tal-biodegradazzjoni u tal-popolazzjoni mħallta tal-bakterja użata bħala inocula, determinazzjonijiet għandhom jitwettqu mill-anqas b'mod doppju.
         Hija esperjenza komuni li akbar ma tkun il-konċentrazzjoni tal-mikro-organiżmi inizjalment miżjuda mal-medja tat-test, aktar tkun żgħira l-varjazzjoni bejn ir-repetizzjonijiet. Testijiet biċ-ċrieki kienu wkoll urew li kien hemm varjazzjonijiet kbar bejn ir-riżultati akkwistati minn laboratorji differenti, imma ftehim tajjeb huwa normalment akkwistat b'komposti faċilment biodegradabbli.
         1.5.2.   Validità tat-test
         Test huwa meqjus bħala validu jekk id-differenza ta' l-estremi fil-valuri tar-repetizzjoni tat-tneħħija tal-kimika tat-test fil-quċċata lixxa, fit-tmiem tat-test jew fit-tmiem tas-sessjoni ta' 10 ijiem, kif xieraq, hija anqas minn 20 % u jekk il-perċentwal tad-degradazzjoni tas-sustanza ta' referenza jkun laħaq il-livell għal biodegradabbiltà faċli sa 14-il jum. Jekk waħda minn dawk il-kondizzjonijiet ma tkunx milħuqha, it-test għandu jkun repetut. Minħabba l-limitazzjoni stretta tal-metodi, valuri baxxi mhux neċessarjament ifissru li s-sustanza tat-test ma tkun biodegradabbli permezz tal-kondizzjonijiet ambjentali, imma tindika li aktar xogħol għandu jsir sabiex tkun stabbilita l-biodegradabbiltà.
         Fit-test tat-tossiċità, li jkun fih kemm it-test tas-sustanza u kimika ta' referenza, anqas minn 35 % degradazzjoni (ibbażat fuq DOC) jew anqas minn 25 % (ibbażata fuq ThOD jew ThCO2) li tkun seħħet matul l-14-il jum, il-kimika tat-test tista tkun meqjusa bħala inibitriċi (ara wkoll l-Anness IV). Is-serje ta' testijiet għandu jkun repetut, jekk possibbli bl-użu ta' konċentrazzjoni aktar baxxa tal-kimika tat-test u/jew ta' konċentrazzjoni aktar għolja ta' l-inoculum, imma mhux aktar minn 30 mg solidi/litru.
         I.6.   PROCEDURA ĠENERALI UPREPARAZZJONIJIET
         Il-kondizzjonijiet ġenerali applikabbli għat-testijiet huma riassunti fit-Tabella 2. Apparat u l-kondizzjonijiet sperimentali tal-kondizzjonijiet li jappartieni speċifikament għal test individwali huma deskritti aktar tard taħi l-intestatura għall-dak it-test.
         Tabella 2
         Kundizzjonijiet tat-test
         
                     Test
                  
                  
                     DOC Tneħħija tal-kulur
                  
                  
                     Evoluzzjoni CO2
                     
                  
                  
                     Respirometrija manometrika
                  
                  
                     Għażla modifikati
                  
                  
                     Flixkun magħluq OECD
                  
                  
                     MITI (1)
                  
               
                     Konċentrazzjoni tas-Sustanza tat-test hija bħ
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     ala mg/l
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     100
                  
                  
                      
                  
                  
                     2-10
                  
                  
                     100
                  
               
                     mg DOC/l
                  
                  
                     10-40
                  
                  
                     10-20
                  
                  
                     10-40
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     mg ThOD/l
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     50-100
                  
                  
                      
                  
                  
                     5-10
                  
                  
                      
                  
               
                     Konċentrazzjoni ta' l-Inoculum (f'ċelloli/I, b'mod approssimattiv)
                  
                  
                     ≤ 30 mg/1 SS
                     jew ≤ 100 ml effluwent/1
                     (107- 108)
                  
                  
                     0,5  ml
                     affluwent sekondarju/l (105)
                  
                  
                     ≤ 5 ml ta' l-effluwent/1
                     (104 - 106)
                  
                  
                     30 mg/l SS
                     (107 - 108)
                  
               
                     Konċentrazzjoni ta' l-elementi fil-medja minerali (fi mg/l)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     P
                  
                  
                     116
                  
                  
                     11,6 
                  
                  
                     29
                  
               
                     N
                  
                  
                     1,3 
                  
                  
                     0,13 
                  
                  
                     1,3 
                  
               
                     Na
                  
                  
                     86
                  
                  
                     8,6 
                  
                  
                     17,2 
                  
               
                     K
                  
                  
                     122
                  
                  
                     12,2 
                  
                  
                     36,5 
                  
               
                     Mg
                  
                  
                     2,2 
                  
                  
                     2,2 
                  
                  
                     6,6 
                  
               
                     Ca
                  
                  
                     9,9 
                  
                  
                     9,9 
                  
                  
                     29,7 
                  
               
                     Fe
                  
                  
                     0,05 -0,1 
                  
                  
                     0,05 -0,1 
                  
                  
                     0,15 
                  
               
                     pH
                  
                  
                     7,4 ±0,2 
                  
                  
                     preferibbilment 7,0 
                  
               
                     Temperatura
                  
                  
                     22 ± 2 oC
                  
                  
                     25 + 1 oC
                  
               
                     
                                 DOC
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 Dissolved Organic Carbon (Karbonju organiku mdewweb)
                              
                           
                  
                     
                                 ThOD
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 Theoretical Oxygen Demand (Talba teoretika ta' l-ossiġenu)
                              
                           
                  
                     
                                 SS
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 Solidi sospiżi
                              
                           
               I.6.1.   Ilma tat-trattib
         Ilma deonizzat jew distillat, ħieles minn konċentrazzjonijiet inibitorji ta' sustanzi tossiċi (eż. Cu++ jonji) huwa wżat. Dan għandu jkun fih mhux aktar minn 10 % tal-kontenut tal-karbonju organiku introdott bil-materjal tat-test. Il-purità għolja ta' l-ilma tat-test hija meħtiega sabiex telimina l-valuri għolja fl-imbjank. Kontaminazzjoni tista tirriżulta minn impuritajiet inerenti u wkoll minn reżini ta' l-iskambju tal-jonji u l-materjal lysed mill-bakterja u l-algae. Għal kull serje ta' testijiet għandek tuża lott wieħed biss ta' ilma, ivverifikat bil-quddiem bl-analiżi DOC. Tali verifika ma tkunx meħtieġa għat-test tal-flixkun magħluq, imma l-konsum ta' l-ossiġenu ta' l-ilma għandu jkun baxx.
         I.6.2.   Taħlitiet bil-lest ta' komposti minerali
         Sabiex isiru t-taħlitiet tat-test, taħlitiet bil-lest tal-konċentrazzjonijiet xierqa jkunu magħmula minn komponenti minerali. Dawn it-taħlitiet bil-lest li ġejjin jistgħu jkunu wżati (bil-fatturi differenti tat-trattib) għall-metodu DOC Tneħħija bil-kulur, Għażla OECD Modifikata, Evoluzzjoni CO2, Respirometrija Manometrika, it-test tal-Flixkun Magħluq.
         Il-fatturi tat-trattib u, għat-test MITI, il-preparazzjoni speċifika tal-medja minerali, huma mogħtija taht l-intestaturi tat-testijiet speċifiċi.
         Taħlitiet bil-lest:
         Ipprepara t-taħlitiet bil-lest li ġejjin, bl-użu ta' reaġenti ta' grad analitiku.
         
                     a
                  
                  
                     Monopotassium dihydrogen orthophosphate, KH2PO4
                     
                  
                  
                     8,50  g
                  
               
                     Dipotassium monohydrogen orthophosphate, K2HPO4 Disodium
                  
                  
                     21,75  g
                  
               
                     monohydrogen orthophosphate dihydrate Na2HPO4. 2 H2O Klorid
                  
                  
                     33,40  g
                  
               
                     ta' l-ammonium NH4Cl
                  
                  
                     0,50  g
                  
               
                     Dewweb fl-ilma u wassal sa 1 litru. Il-pH tat-taħlita għandu jkun 7,4 .
                  
                  
                      
                  
               
                     b
                  
                  
                     Klorid tal-kalċji, anidriju, CaCl2
                     
                  
                  
                     27,50  g
                  
               
                     jew dihidrat tal-klorid tal-kalċju CaCl2, 2 H2O
                  
                  
                     36,40  g
                  
               
                     Dewweb fl-ilma u wassal sa litru
                  
                  
                      
                  
               
                     c
                  
                  
                     Eptaidrat tas-sulfat tal-magneżju, MgSO4. 7 H2O
                  
                  
                     22,50  g
                  
               
                     Dewweb fl-ilma u wassal għal-litru
                  
                  
                      
                  
               
                     d
                  
                  
                     Ħadid (III) eksaidrat tal-klorid, FeC13. 6H2O
                  
                  
                     0,25  g
                  
               
                     Dewweb fl-ilma u wassal għal-litru.
                  
                  
                      
                  
               Nota: Sabiex tkun evitata l-ħtieġa li tkun ippreparata din is-soluzzjonu immedjetament qabel l-użu, żid qatra ta' HCL ikkonċentrat, jew 0,4 g melħ disodju ta' l-aċidu ethylenediaminetetra-aċetiku (EDTA) kull litru.
         1.6.3.   Taħlitiet bil-lest ta' kimiċi
         Per eżempju, dewweb 1-10 g, kif xieraq, tal-kimika tat-test jew ta' referenza, f'ilma de-jonizzata u wassal sa litru meta s-solubbiltà teċċedi 1 g/l. Altrimenti, ipprepara t-taħlitiet bil-lest fil-medja minerali jew żid il-kimika direttament mal-medja minerali. Għat-trattament ta' kimiċi anqas solubbli, ara l-Anness III, imma fit-test MITI (il-Metodu oC.4-F), la s-solventi u l-anqas l-aġenti emulsifikanti m'għandhom ikunu wżati.
         1.6.4.   Inocula
         L-inoculum jista jkun akkwistat minn varjeta ta' sorsi: ħama' attivata, effluwenti tad-drenaġġ (mhux klorinati), ilmijiet minn wiċċ l-art u ħamrija jew minn taħlita ta' dawn. Għal testijiet tar-Repirometrija ta' l-Evoluzzjoni jew Manjometika DOC Tneħħija bil-Kulur, CO2, jekk il-ħama' attivata tkun użata, dan għandu jkun meħud minn impjant tat-trattament jew unità ta' skala ta' laboratorju li tirċieci predominantament drenaġġ domestiku. Kien instab li Inocula minn sorsi oħrajn tagħti tixrid aktar għoli tar-riżultati. Għall-għażla OECD Modifikata u t-testijiet tal-Flixkun Magħluq, inoculum mingħajr il-frak tal-ħama' aktar imdewwb huwa meħtieġ u s-sorsi preferita huwa l-effluwent sekondarju mill-impjant tat-trattament ta' l-ilma ta' l-iskart domestiku jew minn unita ta' skala ta' laboratorju. Għat-test MITI, l-inoculum huwa akkwistat minn taħlita ta' sorsi u huwa deskritt taħt l-intestatura ta' dan it-test speċifiku.
         I.6.4.1.   Inoculum minn ħama' attivita
         Iġbor kampjun minn ħama' attivata friska mit-tank ta' l-arjazzjoni ta' l-impjant tat-trattament tad-drenaġġ jew minn unit′ta' skala tal-laboratorju li predominantament jitratta d-drenaġġ domestiku. Warral il-partiċelli rozzi, jekk meħtieġ bil-filtrazzjoni minn passatur fin u wara dan zomm il-ħama f'mod erobiku.
         B'mod alternattiv, ħalli joqgħod, jew inkella għaddi miċ-ċentrufuga (eż. fi 1 100 g għal 10 min.) wara t-tneħħija ta' xi partiċelli rozzi. Warrab is-supernatant. Il-ħama tista tkun maħsula f'medja minerali. Issospendi l-ħama ikkonċentrata f'medja minerali sabiex takkwista konċentrazzjoni ta' 3-5 g solidi sospiżi kull litru u imla bl-arja sakemm meħtieġ.
         Il-ħama' għandha tkun miġbura proporzjonalment minn impjant ta' xogħol konvenzjonali. Jekk il-ħama jkun jeħtieġ li tinġabar minn impjant ta' trattament qawwi, jew ikun maħsub li jkun fiha inibituri, din għandha tkun maħsula. Ħalliha toqgħod jew għaddi l-ħama' sospiża mill-ġdid minn ċentrifugu wara li tkun imħallta sewwa, warrab is-supernatant u mill-ġdid erġa issospendi l-ħama' maħsula f'volum ieħor tal-medja minerali. Irrepeti din il-proċedura sakemm il-ħama' tkun meqjusa bħala ħielsa minn substrata jew inibitur eċċessivi.
         Wara li s-sopenzjoni sħiħa mill-ġdid tkun akkwistata, jew b'ħama' mhux trattata, warrab il-pamkun immedjetament qabel l-użu għad-determinazzjoni tal-piż xott tas-solidi sospiżi.
         Alternattiva oħra hija li tkun omoġenizzata l-ħama' attivata (3-5 g solidi sospiżi kull litru). Il-ħama' hija trattata f'ħawwadi mekkaniku għal 2 minuti f'veloċità medja. Ħalli l-ħama' tal-ħawwadi toqgħod għal 30 minuta jew aktar jekk hekk meħtieġ u ferra l-likwidu għall-użu bħala inoculum bir-rata ta' 10 ml/l tal-medja minerali.
         I.6.4.2.   Sorsi oħrajn ta' l-inoculum
         Dan jista jkun akkwistat minn effluwent sekondarju ta' l-impjant tat-trattament jew minn unità tal-iskala tal-laboratorju li jirċievi b'mod predominanti d-drenaġġ domestiku. Iġbor kampjun frisk u żommu erobiku waqt it-trasport. Ħallieh joqgħod għal siegħa jew iffiltra minn karta rozza tal-filtru u żomm l-effluwent imferra jew il-filtrat erobiku sakemm ikunu meħtieġa. Sa 100 ml ta' dan it-tip ta' inoculum jista jkun użat ma kull litru ta' medja.
         Sors ieħor għall-inoculum hija l-ilma tal-wiċċ ta' l-art. F'dan il-każ, iġbor kampjun xieraq mill-ilma tal-wiċċ, eż. xmara, għadira, u żommu erobiku sakemm ikun meħtieġ. Jekk meħtieġ, ikkonċentra l-inoculum bil-fitrazzjoni jew biċ-ċentrifugazzjoni.
         1.6.5.   Pre-kondizzjonat ta' l-inocula
         L-inocula tista tkun pre-kondizzjonata għall-kondizzjonijiet sperimentali,, imma mhux pre-afattata għall-kimika tat-test. Il-pre-kondizzonjar jikkonsisti mill-arjazzjoni tal-ħama' attvita f'medja minerali jew effluwent sekondarju għal 5-7 tijiem fit-temperatura tat-test. Il-pre-kondizzjonar ta' kull tant itejjeb il-prċiżjoni tal-metodi tat-test bit-tnaqqis tal-valuri vojta. Huma meqjus bħala mhux neċessarju il-pre-kondizzjonar ta' l-inoculum MITI.
         1.6.6.   Kontrolli abjotiċi
         Meta meħtieġ, għandek tivverifika d-degradazzjoni abjotika possibbli tas-sustanza tat-test bid-determinazzjoni tat-tneħħija ta' DOC, l-akkwist ta' l-ossiġenu jew ta' l-evoluzzjoni tad-diossidu tal-karbonju f'kontrolli sterili li ma jkun fihom l-ebda inoculum. Sterlizza bil-filtrazzjoni minn membrana (0,2-0,45 mikrometri) jew biż-żieda ta' sustanza tossika xierqa fil-konċentrazzjoni adatta. Jekk tkun użata l-membrana tal-filtrazzjoni, iġbor kampjuni b'mod axettiku għaż-żamma tal-isterilità. Sakemm l-assorbazzjoni tal-kimika tat-test ma tkunx diġa ġiet imwarrba minn qabel, testijiet li jkejlu l-biodegradazzjoni bħala t-tneħħija ta' DOC, speċjalment bl-inocula tal-ħama' attivita, għandhom jinkludu kontroll abjotiku li huwa innokulat u ivvelenat.
         I.6.7.   Numru ta' garafini
         In-numru ta' garafini fi prova tipika huwa deskritt taħt l-intestaturi ta' kull wieħed mit-testijiet.
         It-tip ta' garafina li ġej jista jkun użat:
         
                     —
                  
                  
                     Sospenzjoni tat-test: li jkun fiha s-sustanza tat-test u l-inoculum
                  
               
                     —
                  
                  
                     Inoculumi fl-imbjank: li jkun fih biss l-inoculum
                  
               
                     —
                  
                  
                     Proċedura tal-kontroll: li jkun fiha s-sustanza ta' referenza u l-inoculum
                  
               
                     —
                  
                  
                     Kontroll ta' abjotiku sterili: sterili, li jkun fiha s-sustana tat-test (ara I.6.6)
                  
               
                     —
                  
                  
                     Kontroll ta' l-adsorbazzjoni: li jkun fiha s-sustanza, l-inoculum u l-aġent sterilizzanti
                  
               
                     —
                  
                  
                     Kontroll tat-tossiċità: li jkun fiha s-sustanza tat-test, is-sustanza ta' referenza u l-inoculum
                  
               Huwa mandatorju li d-determinazzjoni tas-sospenzjoni tat-test u l-imbjank ta' l-inoculum iseħħ b'mod paralell. Huwa rakommandabbli li jsiru d-determinazzjonijiet fil-garafini l-oħrajn b'mod parallel ukoll.
         Dan jista, b'danakollu, mhux dejjem ikun possibbli. Assigura li kampjoni jew qari suffiċjenti jkunu meħuda sabiex jippermettu t-tneħħija perċentwali fl-ispażju ta' l-10 ijiem ta' l-assessjar.
         I.7.   DATA U EVALWAZZJONI
         Fil-kalkolu ta' Dt, id-degradazzjoni preċentwali, il-valuri medji tal-kejl duplikat tal-parametru fiż-żewġ reċipjenti tat-test u l-imbjank ta' l-inoculum, ikunu wżati. Dawn il-formuli huma stabbiliti fis-sezzjonijiet ta' hawn taħt fit-testijiet speċifiċi. Il-korsa tad-degradazzjoni hija murija b'mod grafiku u l-perijodu ta' 10 ijiem huwa indikat. Ikkalkola u irrapporta l-perċentwal tat-tneħħija milħuq fit-tmiem tal-perijodu ta' 10 ijiem u l-valur tal-quċċata lixxa jew fit-tmiem tat-test, liema minnhom huwa xieraq.
         Fit-testijiet respirometriċi, l-komposti li jkun fihom in-nitroġenu jistgħu jaffettwaw l-akkwist ta' l-ossiġenu minħabba n-nitrifikazzjoni (ara l-Annessi II u V).
         I.7.1.   Degradazzjoni mkjela permezz tad-determinazzjoni DOC
         Id-degredazzjoni perċentwali Dt kull darba li kampjun ikun miġbur għandha tkun ikkalkolata b'mod separat għal kull waħda mill-garafini li jkun fihom is-sustanza tat-test bl-użu tal-valuri medji tal-kejn duplikat DOC sabiex il-validità tat-test tista tkun assessjata (ara I.5.2.). Hija ikkalkolata bl-użu ta' din l-ekwazzjoni li ġejja:
         
            
         meta:
         
                     Dt
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     % degradazzjoni fil-ħin t,
                  
               
                     Co
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-medja tal-bidu tal-konċentrazzjoni ta' DOC tal-kultura inokulata fil-medju li jkun fih is-sustanza tat-test (mg DOC/l),
                  
               
                     Ct
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-medja tal-konċentrazzjoni ta' DOC tal-kultura innokulata fil-medju li jkun fih is-sustanza fil-ħin t (mg DOC/l),
                  
               
                     Cbo
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-medja tal-bidu tal-konċentrazzjonini ta' DOC fl-imbjank inokulata fil-medja minerali (mg DOC/l),
                  
               
                     Cbt
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-medja tal-konċentrazzjoni ta' DOC fl-imbjank innokulata fil-medja minerali fil-ħin t (mg DOC/l),
                  
               Il-konċentrazzjoninijiet kollha huma mkejla b'mod sperimentali.
         I.7.2.   Degradazzjoni mkjela permezz ta' analiżi speċifika
         Meta data analitika speċifika tkun disponibbli, wettaq il-kalkolazzjoni tal-biodegredazzjoni primarja minn:
         
            
         meta:
         
                     Dt
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     % degradazzjoni fil-ħin t, normalment 28 jum,
                  
               
                     Sa
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     ammont residwu tas-sustanza tat-test fil-medja inokulata fit-tmiem tat-test (mg),
                  
               
                     Sb
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     l-ammont residwu tas-sustanza tat-test fit-test fl-imbjank bl-ima/medja li magħha tkun ġiet miżjuda biss is-sustanza tat-test (mg).
                  
               I.7.3.   Degredazzjoni abjotika
         Meta jkun użat il-kontroll abjotiku sterili, wettaq il-kalkolazzjoni tal-perċentali tad-degradazzjoni abjotika bl-użu:% degradazzjoni abjotika
         
            
         Meta:
         
                     Cs(o)
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     DOC Il-konċentrazzjonini sterili tal-kontroll fil-jum 0
                  
               
                     C s(t)
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     DOC Il-konċentrazzjonini sterili tal-kontroll fil-jum t
                  
               I.8.   RAPPURTAĠĠ
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     is-sustanzi tat-test u tar-referenza, u il-purità tagħhom,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kondizzjoni tat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     inoculum: is-sit(i) tan-natura u l-kampjunar, konċentrazzjonini u xi trattament ta' pre-kondizzjonar;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-proporzjon u n-natura tal-iskart industriali preżenti fid-drenaġġ, jekk magħruf;
                  
               
                     —
                  
                  
                     iż-żmien u t-temperatura tat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     fil-każ ta' kimika tat-test li ma tantx tinħall, it-trattament mogħti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-metodu tat-test applikat; ir-raġinijiet xjentifiċi u l-ispejagazzjoni għandha tkun mogħtija għal xi tibdil tal-proċedura;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-folja tad-data;
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwalunkwe fenomena ta' l-inibizzjoni;
                  
               
                     —
                  
                  
                     xi degradazzjoni abjotika osservata;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-data speċifika kimika analitika, jekk disponibbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-data analitika dwar l-intermedjati, jekk disponibbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-grafika tad-degradazzjoni perċentwali kontra l-ħin għat-test u s-sustanzi ta' referenza; il-fażi li ddewwem il-process, il-fażi tad-degradazzjoni, il- perijodu ta' 10 ijiem u l-linja għandha kjarament tkun indikata (l-Anness I). Jekk it-test ikun konformi mal-kriterja tal-validità, l-medja tal- perċentwali tad-degradazzjoni fil-garafini li jkun fihom is-sustanza tat-test tista tkun użata għall-grafika.
                  
               
                     —
                  
                  
                     perċentwal tat-tneħħija eata l-perijodu ta' 10 ijiem, u l-linja lixxa fil-quċċata jew fit-tmiem tat-test.
                  
               PARTI II.   DOC TEST TAT-TNEĦĦIJA TAL-KULUR (Metodu C.4-A)
         
         II.1.   PRINĊIPJU TAL-METODU
         Volum imkejjel tal-medja minerali inokulata li jkun fiha konċentrazzjonini magħrufa tas-sustanza tat-test 10-40 mg DOC/l) bħala l-unika sorsi nominali ta' karbonju organiku jkun mogħti l-arja fid-dlam jew fid-dawl baxx fi 22 ± 2 oC.
         Id-degradazzjoni hija segwita bl-analiżi DOC matul intervalli frekwenti matul perijodu ta' 28 jum. Il-grad tal-biodegradazzjoni huwa ikkalkolat bl-espressjoni tal-konċentrazzjoni DOC imneħħija (ikkorreġuta għal dak fil-kontroll ta' l-inoculum fl-imbjank) bħala perċentwali tal-konċentrazzjoni inizjali preżenti. Il-grad tal-biodegradazzjoni primarja jista wkoll ikun ikkalkolat mill-analiżi kimika supplemetari mwettqa fil-bidu u fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni.
         II.2.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         11.2.1.   Apparat
         
                     (a)
                  
                  
                     Garafini koniċi, eż. 250 ml sa 2 1, jiddependi mill-volum meħtieġ għall- analiżi DOC;
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     Magna taċ-ċekċik li tista takkomoda l-garafini koniċi, jew bil-kontroll awtomatiku tat-temperatura jew użata fit-temperatura kostanti tal-kamra, u forza suffiċjenti tal-potenza għaż-żamma tal-kondizzjonijiet etobiċi fil-garafini kollha;
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     Apparat tal-filtrazzjoni, b'membrani xierqa;
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     Analiżattur DOC;
                  
               
                     (e)
                  
                  
                     Apparat għad-determinazzjoni ta' l-ossiġenu mdewweb;
                  
               
                     (f)
                  
                  
                     Ċentrifuga.
                  
               11.2.2.   Preparazzjoni tal-medja minerali
         Għall-preparazzjoni tat-taħlitiet bil-lest, ara I.6.2.
         Ħawwad 10 ml tat-taħlita (a) ma 800 ml ilma tat-trattib, żid 1 ml tat-taħlitiet (b) sa (d) u wassal sa litru bl-ilma tat-trattib.
         11.2.3.   Preparazzjoni u pre-kondizzjonar ta' l-inoculum
         L-inoculum jista jkun akkwistat minn varjeta ta' sorsi: ħama' attivata, effluwenti tad-drenaġġ (mhux klorinati), ilmijiet minn wiċċ l-art u ħamrija jew minn taħlita ta' dawn.
         Ara I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. u I.6.5.
         11.2.4.   Preparazzjoni tal-garafini
         Bħala eżempju, introduċi 800 ml porzjonijiet tal-medja minerali ġewwa garafini koniċi 2 l u żid volumi suffiċjenti tat-taħlitiet bil-lest tat-test u tas-sustanzi ta' referenza mal-garafini separati sabiex takkwista konċentrazzjoni kemikali ekwivalenti għal 10-40 mg DOC/1. Ivverifika l-valuri pH u aġġusta, jekk meħtieġ, għal 7,4. Inokula l-garafini b'ħama' attivita jew b'sorsi oħrajn ta' l-inocula (ara I.6.4.), sabiex takkwista konċentrazzjoni mhux aktar minn 30 mg solidi sospiżi fil-litru. Ipprepara wkoll il-kontrolli ta' l-inoculum fil-medja minerali imma mingħajr il-kimika tat-test jew ta' referenza.
         Jekk meħtieġ, uża reċipjent wieħed sabiex tivverifika l-possibbiltà ta' l-effett inibitorju tal-kimika tat-test bl-inokulazzjoni tat-taħlita li jkun fiha, fil-medja minerali, konċentrazzjonijiet komparabbli kemm tal-kimika tat-test u dik ta' referenza.
         Ukoll, jekk meħtieġ, organizza garafina sterili oħra sabiex tivverifika jekk il-kimika tat-test tkun degradata abjotikament bl-użu tat-taħlita mhux inokulata tal-kimika (ara I.6,6.).
         B'mod addizzjonali, jekk ikun hemm suspett li l-kimika tat-test tkun sinifikament assorbita fuq il-ħġieġ, ħama' eċċ., wettaq assessjar preliminari sabiex tkun determinata l-medda possibbli ta' l-assorbazzjoni u b'hekk l-adattabbiltà tat-test għall-kimika (ara t-Tabella 1). Organizza garafina li jkun fiha s-sustanza tat-test, l-inculum u l-aġent sterilizzanti.
         Wassal il-volumi fil-garafini kollha għal 1:1 bil-medja minerali u, wara t-taħwib, ħu kampjun minn kull garafina sabiex tiddetermina l-konċentrazzjonini inizjali ta' DOC (ara l-Anness II,4). Għatti l-ftugħ tal-garafini, eż. b'liega ta' l-aluminju, b'tali mod hekk li tippermetti l-iskambju ħieles ta' l-arja bejn il-garafina u l-atmosfera tal-madwar. Imbagħad deffes ir-reċipjenti fil-magna taċ-ċekċik għall-bidu tat-test.
         11.2.5.   Numru ta' garafini fi prova tipika
         Il-garafini 1 u 2: Sospenzjoni tat-test,
         Il-garafini 3 u 4: L-imbjank ta' l-inoculum,
         Il-garafina 5: Proċedura tal-kontroll preferibbilment
         u meta meħtieġ:
         Il-garafina 6: Kontroll ta' abjotiku sterili
         Il-garafina 7: Kontroll ta' l-adsorbazzjoni
         Il-garafina 8: Kontroll tat-tossiċità
         Ara wkoll I.6.7.
         II.2.6.   It-twettieq tat-test
         Matul it-test, iddetermina l-konċentrazzjonijiet ta' DOC f'kull garafina b'mod doppju f'intervalli tal-ħin magħruf, ta' spiss b'mod suffiċjenti sabiex tkun tista tiddetermina l-bidu tal-perijodu ta' 10 ijiem u l-persentaġġ tat-tneħħija fit-tmiem tal-perijodu ta' 10 ijiem. Ħu biss il-volum minimu tas-sospenzjoni tat-test meħtieġ għal kull determinazzjoni.
         Qabel il-kampjunar għamel tajjeb għat-telf ta' l-evaporazzjoni mill-garafini biż-żieda ta' ilma tat-trattib (I.6.1) fl-ammont meħtieġ, jekk ikun neċessarju. Ħawwad il-medja tal-kultura sewwa qabel ma tiġbed il-kampjun u assigura li l-materjal li jeħel mal-ġnub tar-reċipjenti jkun imdewweb jew sospiż qabel il-kampjunar. Immedjetament iffiltra mill-membrana jew b'ċentrifuga (ara l-Anness II.4) wara li jkun inġabar il-kampjun. Analizza l-kampjuni tal-filtrat jew taċ-ċentrifuga l-istess jum, altrimentri aħżen fi 2-4 oC għal massimu ta' 48 siegħa, jew f'anqas minn 18 oC għal perijodu twil.
         II.3.   DATA U RAPPORTAĠĠ
         II.3.1.   Trattament tar-riżultati
         Ikkalkola l-persentaġġ tad-degradazzjoni fil ħin kif mogħti taħt I.7.1. (determinazzjoni DOC) u, preferibbilment, taħt I.7.2. (analiżi speċifika).
         Irreġistra r-riżultati kollha fuq il-karti tad-data kif ipprovduta.
         11.3.2.   Validità tar-riżultati
         Ara I.5.2.
         11.3.3.   Rappurtaġġ
         Ara I.8.
         II.4.   FOLJA TAD-DATA
         Eżempju tal-folja tad-data huwa mogħti aktar il-quddiem.
         TEST DOK TAT-TNEĦĦIJA TAL-KULU R
         
                  
                     1.
                  
                  
                     LABORATORJU
                  
               
                  
                     2.
                  
                  
                     IL-JUM TAL-BIDU TAT-TEST
                  
               3.   IS-SUSTANZA TAT-TEST
         Isem:
         Il-konċentrazzjoni tat-taħlita bil-lest: mg/l bħala kimika
         Konċentrazzjoni inizjali fil-medja, għal: mg/l bħala kimika
         4.   INOCULUM
         Sorsi:
         Trattament mogħti:
         Pre-kondizzjonar, jekk ikun hemm:
         Konċentrazzjoni ta' solidi sospiżi fit-taħlita tar-reazzjoni: mg/l
         5.   DETERMINAZZJONI TAL-KARBONJU
         Analizzatur tal-karbonju:
         
                      
                  
                  
                     Garafina Nru
                  
                  
                      
                  
                  
                     DOC wara jiem n (mg/I)
                  
               
                     0
                  
                  
                     n1
                     
                  
                  
                     n2
                     
                  
                  
                     n3
                     
                  
                  
                     n4
                     
                  
               
                     Kimika tat-test flimkien ma l-inoculum
                  
                  
                     1
                  
                  
                     a1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     a2
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     a, medja
                     Ca(t)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     2
                  
                  
                     b1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     b2
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     b, medja
                     Cb(t)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Inoculum fl-imbjank mingħajr il-kimika tat-test
                  
                  
                     3
                  
                  
                     c1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     c2
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     c, medja Cc(t)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     4
                  
                  
                     d1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     d2
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     d, medja
                     Cd(t)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               6.   EVALWAZZJONI TAD-DATA MHIX ITTRATTATA
         
                     Garafina Nru
                  
                  
                      
                  
                  
                     % degradazzjoni wara n jiem
                  
               
                     0
                  
                  
                     n1
                     
                  
                  
                     n2
                     
                  
                  
                     n3
                     
                  
                  
                     nx
                     
                  
               
                     1
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     2
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Medja (**)
                     
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
            Nota: formati simili jistgħu ikunu wżati għall-kimika tar-referenza u l-kontrolli tat-tossiċità.
         7.   KONTROLLI ABJOTICI (voluntarji)
         
         
                      
                  
                  
                     Żmien (jiem)
                  
               
                     0
                  
                  
                     t
                  
               
                     Konċ. DOC (mg/l) f'kontroll sterili
                  
                  
                     Cs(o)
                     
                  
                  
                     Cs(t)
                     
                  
               
            
         8.   ANALŻI TA' KIMIKA SPECIFIKA (voluntarja)
         
         
                      
                  
                  
                     ammont residwu tal- kimika tat-test fit-tmiem (mg/l)
                  
                  
                     % degradazzjoni primarja tat-test
                  
               
                     Kontroll sterili
                  
                  
                     Sb
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Medja tat-test inokulat
                  
                  
                     Sa
                     
                  
                  
                     
                        
                  
               PARTI III.   TEST TA' L-GĦAŻLA OECD MODIFIKATA (Metodu oC.4-B)
         
         III.1.   PRINĊIPJU TAL-METODU
         Volum imkejjel tal-medja minerali inokulata li jkun fiha konċentrazzjoni magħrufa tas-sustanza tat-test (10-40 mg DOC/l) bħala l-unika sorsi nominali ta' karbonju huwa inokulat b' 0,5 ml effluwent kull litru tal-medja. It-taħlita hija mogħtija l-arja fid-dlam jew f'dawl baxx ħafna fi 22 ± 2 oC.
         Id-degradazzjoni hija segwita bl-analiżi DOC matul intervalli frekwenti matul perijodu ta' 28 jum. Il-grad tal-biodegradazzjoni huwa ikkalkolat bl-espressjoni tal-konċentrazzjonini DOC imneħħija (ikkorreġuta għal dak fil-kontroll ta' l-inoculum fl-imbjank) bħala perċentwali tal-konċentrazzjonini inizjali preżenti. Il-grad tal-biodegradazzjoni primarja jista wkoll ikun ikkalkolat mill-analiżi kimika supplemetari mwettqa fil-bidu u fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni.
         III.2.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         III.2.1.   Apparat
         
         
                     a)
                  
                  
                     Garafini koniċi, eż. 250 ml sa 2 1itri, jiddependi mill-volum meħtieġ għall-analiżi DOC;
                  
               
                     b)
                  
                  
                     Magna taċ-ċekċik – li tista takkomoda l-garafini koniċi, jew bil-kontroll awtomatiku tat-temperatura jew użata fit-temperatura kostanti tal-kamra, u forza suffiċjenti tal-potenza għaż-żamma tal-kondizzjonijiet etobiċi fil- garafini kollha;
                  
               
                     ċ)
                  
                  
                     Apparat tal-filtrazzjoni, b'membrani xierqa;
                  
               
                     d)
                  
                  
                     Analiżattur DOC;
                  
               
                     e)
                  
                  
                     Apparat għad-determinazzjoni ta' l-ossiġenu mdewweb;
                  
               
                     f)
                  
                  
                     Ċentrifuga.
                  
               III.2.2.   Preparazzjoni tal-medja minerali
         Għall-preparazzjoni tat-taħlitiet bil-lest, ara I.6.2.
         Ħawwad 10 ml tat-taħlita (a) ma 80 ml ilma tat-trattib, żid 1 ml tat-taħlitiet (b) sa (d) u wassal sa litru bl-ilma tat-trattib.
         Dan il-metodu jiża biss 0,5 ml effluwent/litru bħala inoculum u għalhekk il-medja jista jkun li tkun teħtieġ li tkun imsaħħa b'elementi traċċa u fatturi tat-tkabbir. Dan huwa magħmul biż-żieda ta' 1 ml kull wieħed mat-taħlitiet li ġejjin għal kull litru tal-medja finali:
         Taħlita ta' l-element traċċa:
         
                     Tetraidrat tas-sulfat tal-magneżja, MnSO4. 4H2O
                  
                  
                     39,9  mg
                  
               
                     Aċidu Boriku, H3BO3
                     
                  
                  
                     57,2  mg
                  
               
                     Ħepaidrat tas-sulfat taż-żingu, ZnSO4. 7H2O
                  
                  
                     42,8  mg
                  
               
                     Ammonium heptamolybdate (NH4)6 Mo7O24
                     
                  
                  
                     34,7  mg
                  
               
                     Fe-ċelat (FeCl3 aċidu ethylenediamine-tetra-aċetiku)
                  
                  
                     100,0  mg
                  
               
                     Dewweb fi, u wassal għal 1 000  ml bl-ilma tat-trattib
                  
                  
                      
                  
               
                     Taħlita tal-vitamina:
                  
                  
                      
                  
               
                     Estratt tal-ħmira
                  
                  
                     15,0  mg
                  
               Dewweb l-estratt tal-ħmira fi 100 ml ilma. Sterlizza bil-passaġġ minn membrana 0,2 mikronji, jew għamilha friska.
         III.2.3.   Preparazzjoni u pre-kondizzjonar ta' l-inoculum
         L-inoculum jkun akkwistat minn effluwent sekondarju ta' l-impjant tat-trattament jew minn unità tal-iskala tal-laboratorju li jirċievi b'mod predominanti d-drenaġġ domestiku. Ara I.6.4.2. u I.6.5.
         0,5 ml kull litru tal-medja minerali hija użata.
         III.2.4.   Preparazzjoni tal-garafini
         Bħala eżempju, introduċi 800 ml porzjonijiet tal-medja minerali ġewwa garafini koniċi 2 l u żid volumi suffiċjenti tat-taħlitiet bil-lest tat-test u tas-sustanzi ta' referenza mal-garafini separati sabiex takkwista konċentrazzjoni kemikali ekwivalenti għal 10-40 mg DOC/1. Ivverifika l-valur pH u aġġusta, jekk meħtieġ, għal 7,4. Innokula l-garafini fl-effluwent tad-drenaġġ fi 0,5 ml/litru (ara I.6.4.2.). Ippreparata wkoll il-kontrolli ta' l-inoculum fil-medja minerali mingħajr il-kimika tat-test jew ta' referenza.
         Jekk meħtieġ, uża reċipjent wieħed sabiex tivverifika l-possibbiltà ta' l-effett inibitorju tal-kimika tat-test bl-inokulazzjoni tat-taħlita li jkun fiha, fil-medja minerali, konċentrazzjonijiet komparabbli kemm tal-kimika tat-test u dik ta' referenza.
         Ukoll, jekk meħtieġ, organizza garafina sterili oħra sabiex tivverifika jekk il-kimika tat-test tkun degradat abjotikament bl-użu tat-taħlita mhix inokulata tal-kimika (ara I.6,6.).
         B'mod addizzjonali, jekk ikun hemm suspett li l-kimika tat-test tkun sinifikament adsorbita fuq il-ħġieġ, ħama' eċċ., wettaq assessjar preliminari sabiex tkun determinata l-medda possibbli ta' l-adsorbazzjoni u b'hekk l-adattabbiltà tat-test għall-kimika (ara t- Tabella 1). Organizza garafina li jkun fiha s-sustanza tat-test, l-inculum u l-aġent sterilizzanti.
         Wassal il-volumi fil-garafini kollha għal 1:1 bil-medja minerali u, wara t-taħwib, ħu kampjun minn kull garafina sabiex tiddetermina l-konċentrazzjonini inizjali ta' DOC (ara l-Anness II,4). Għatti l-ftugħ tal-garafini, eż. b'liega ta' l-aluminju, b'tali mod hekk li tippermetti l-iskambju ħieles ta' l-arja bejn il-garafina u l-atmosfera tal-madwar. Imbagħad deffes ir-reċipjenti fil-magna taċ-ċekċik għall-bidu tat-test.
         III.2.5.   Numru ta' garafini fi prova tipika
         Il-garafini 1 u 2: Sospenzjoni tat-test
         Il-garafini 3 u 4: Inoculumi fl-imbjank
         Il-garafini 5: Proċedura tal-kontroll
         Preferibbilment u meta meħtieġ:
         Il-garafini 6: Kontroll ta' abjotiku sterili
         Il-garafini 7: Kontroll ta' l-adsorbazzjoni
         Il-garafini 8: Kontroll tat-tossiċità
         Ara wkoll I.6.7.
         III.2.6.   It-twettieq tat-test
         Matul it-test, iddetermina l-konċentrazzjoninijiet ta' DOC f'kull garafina b'mod doppju f'intervalli tal-ħin magħruf, ta' spiss b'mod suffiċjenti sabiex tkun tista tiddetermina l-bidu tal-perijodu ta' 10 ijiem u l-ersentaġġ tat-tneħħija fit-tmiem tal-perijodu ta' 10 ijiem. Ħu biss il-volum minimu tas-sospenzjoni tat-test meħtieġ għal kull determinazzjoni.
         Qabel il-kampjunar għamel tajjeb għat-telf ta' l-evaporazzjoni mill-garafini biż-żieda ta' ilma tat-trattib (I.6.1) fl-ammont meħtieġ, jekk ikun neċċessarju. Ħawwad il-medja tal-kultura sewwa qabel ma tiġbed il-kampjun u assigura li l-materjal li jeħel mal-ġnub tar-reċipjenti jkun imdewweb jew sospiż qabel il-kampjunar. Immedjatament iffiltra mill-membrana jew b'ċentrifuga (ara l-Anness II.4) wara li jkun inġabar il-kampjun. Analizza l-kampjuni tal-filtrat jew taċ-ċentrifuga l-istess jum, altrimentri aħżen fi 2-4 oC għal massimu ta' 48 siegħa, jew f'anqas minn 18 oC għal perijodu twil.
         III.3.   DATA URAPPORTAĠĠ
         III.3.1.   Trattament tar-riżultati
         Ikkalkola l-persentaġġ tad-degradazzjoni fil ħin ta' kif mogħti taħt I.7.1. (determinazzjoni DOC) u, voluntarjament, taħt I.7.2. (analiżi speċifika).
         Irreġistra r-riżultati kollha fuq il-karti tad-data kif ipprovduta.
         III.3.2.   Validità tar-riżultati
         
         Ara I.5.2.
         III.3.3.   Rappurtaġġ
         
         Ara I.8.
         III.4.   FOLJA TAD-DATA
         Eżempju tal-folja tad-data huwa mogħti aktar il-quddiem.
         TEST MODIFIKAT TAL-GĦAŻLA OECD
         
                  
                     1.
                  
                  
                     LABORATORJU
                  
               
                  
                     2.
                  
                  
                     IL-JUM TAL-BIDU TAT-TEST
                  
               3.   IS-SUSTANZA TAT-TEST
         Isem:
         Il-konċentrazzjoni tat-taħlita bil-lest: mg/litru bħala kimika
         Konċentrazzjoni inizjali fil-medja, għal: mg/litru bħala kimika
         4.   INOCULUM
         Sorsi:
         Trattament mogħti:
         Pre-kondizzjonar, jekk ikun hemm:
         Konċentrazzjoni ta' solidi sospiżi fit-taħlita tar-reazzjoni: mg/l
         5.   DETERMINAZZJONI TAL-KARBONJU
         
         Analizzatur tal-karbonju:
         
                      
                  
                  
                     Garafina Nru
                  
                  
                      
                  
                  
                     DOC wara jiem n (mg/I)
                  
               
                     0
                  
                  
                     n1
                     
                  
                  
                     n2
                     
                  
                  
                     n3
                     
                  
                  
                     nx
                     
                  
               
                     Kimika tat-test flimkien ma l-inoculum
                  
                  
                     1
                  
                  
                     a1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     a2
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     a, medja
                     Ca(t)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     2
                  
                  
                     b1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     b2
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     b, medja
                     Cb(t)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Inoculum fl-imbjank mingħajr il-kimika tat-test
                  
                  
                     3
                  
                  
                     c1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     c2
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     c, medja Cc(t)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     4
                  
                  
                     d1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     d2
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     d, medja
                     Cd(t)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               6.   EVALWAZZJONI TAD-DATAMHIX ITTRATTATA
         
                     Garafina Nru
                  
                  
                      
                  
                  
                     % degradazzjoni wara n jiem
                  
               
                     0
                  
                  
                     n1
                     
                  
                  
                     n2
                     
                  
                  
                     n3
                     
                  
                  
                     nx
                     
                  
               
                     1
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     2
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Medja (***)
                     
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
            Nota: formati simili jistgħu ikunu wżati għall-kimika tar-referenza u l-kontrolli tat-tossiċità.
         7.   KONTROLLI ABJOTICI (voluntarji)
         
         
                      
                  
                  
                     Żmien (jiem)
                  
               
                     0
                  
                  
                     t
                  
               
                     Konċ. DOC (mg/l) f'kontroll sterili
                  
                  
                     Cs(o)
                     
                  
                  
                     Cs(t)
                     
                  
               
            
         8.   ANALŻI TA' KIMIKA SPECIFIKA (voluntarja)
         
         
                      
                  
                  
                     Ammont residwu tal-kimika tat-test fit-tmiem
                  
                  
                     % degradazzjoni primarja tat-test
                  
               
                     Kontroll sterili
                  
                  
                     Sb
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Medja tat-test inokulat
                  
                  
                     Sa
                     
                  
                  
                     
                        
                  
               PARTI IV.   TEST TA' L-EVOLUZZJONU CO2 (METODU oC.4-C)
         
         IV.1.   PRINĊIPJU TAL-METODU
         Volum imkejjel tal-medja minerali innokulata li jkun fiha konċentrazzjoni magħrufa tas-sustanza tat-test 10-40 mg DOC/l) bħala l-unika sorsi nominali ta' karbonju organiku jkun mogħti l-arja fid-dlam jew fid-dawl baxx. Id-degradazzjoni hija segwita matul 28 jiem bid-determinazzjoni tad-diossidu tal-karbonju prodott, li huwa marbut fil-barju jew fl-idossidu tas-sodju u li huma mkejjel bit-titrazzjoni ta' l-idrossu residwu bħala karbonju mhux organiku. L-ammont tad-diossidu tal-karbonju prodott mit-test kimiku (ikkorreġut għal dak derivat mill-inoculum fl-imbjank (huwa espress bħala persentaġġ ta ThCO2. Il-grad tal-biodegradazzjoni primarja jista wkoll ikun ikkalkolat mill-analiżi kimika supplemetari mwettqa fil-bidu u fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni.
         IV.2.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         IV.2.1.   Apparat
         
                     a)
                  
                  
                     Garafini, 2-5 litri, kull waħda mgħammra b'tubu ta' l-arjazzjoni li jwassal sa kważi il-qiegħ tar-reċipjent u bi ħruġ;
                  
               
                     b)
                  
                  
                     Ħawwada manjetiċi, għal meta jsir l-assessjar tal-kimika li ma tantx tinħall;
                  
               
                     ċ)
                  
                  
                     Flixkien ta' assorbazzjoni tal-gass;
                  
               
                     d)
                  
                  
                     Apparat għal kontroll u l-kejl tan-nixxija ta' l-arja;
                  
               
                     e)
                  
                  
                     Apparat għat-tindig tad-diossidu tal-karbonju, għall-preparazzjoni ta' l-arja li hija ħielsa mid-dossidu tal-karbonju; jew b'mod alternattiv, taħlita ta' CO2 ħieled mill-ossiġenu u CO2 ħieles min-nitroġenu, minn ċilindri tal-gass fil-proporzjonijiet korretti (20 % O2: 80 % N2) jistgħu ikunu wżati;
                  
               
                     (f)
                  
                  
                     Apparat għad-determinazzjoni tad-diossidu tal-karbonju, jew b'mod titrimetriku jew inkella f'xi għala ta' l-analizzatur tal-karbonju mhux- organiku;
                  
               
                     (g)
                  
                  
                     Apparat tal-filtrazzjoni bil-membrana (voluntarju);
                  
               
                     (h)
                  
                  
                     Analiżattur DOC (voluntarju).
                  
               IV.2.2.   Preparazzjoni tal-medja minerali
         Għall-preparazzjoni tat-taħlitiet bil-lest, ara I.6.2.
         Ħawwad 10 ml tat-taħlita (a) ma 800 ml ilma tat-trattib, żid 1 ml tat-taħlitiet (b) sa (d) u wassal sa litru bl-ilma tat-trattib.
         IV.2.3.   Preparazzjoni u pre-kondizzjonar ta' l-inoculum
         L-inoculum jista jkun akkwistat minn varjeta ta' sorsi: ħama' attivata, effluwenti tad-drenaġġ (mhux klorinati), ilmijiet minn wiċċ l-art u ħamrija jew minn taħlita ta' dawn.
         Ara I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. u I.6.5.
         IV.2.4.   Preparazzjoni tal-garafini
         Bħala eżempju, il-volumi u l-piżijiet li ġejjin jindikaw il-valuri għal garafini ta' 5-litri li jkun fihom 3 litri ta' sospensjoni. Jekk volumi iżgħar ikunu wżati, immodifika l-valuri kif meħtieġ, imma assigura li d-diossidu tal-karbonju iffurmat jista jkun imkejjel bl-eżatezza.
         Ma kull garafina ta' 5 litri żid 2 400 ml tal-medja minerali. Żid volum xieraq tal-ħama' attivata ippreparata (ara I.6.4.1 u I.6.5.) sabiex takkwista konċentrazzjoni ta' solidi sospiżi ta' mhux aktar minn 30 mg/l fit-taħlita finali 3 l ta' l-inokulat. B'mod alternattiv, l-ewwel dewweb il-ħama' ippreparata sabiex takkwista sospensjoni ta' 500-1 000 mg/l fil-medja minerali qabel ma żżid alikwott mal-kontenuti tal-garafina ta' 5-litri sabiex takkwista konċentrazzjoni ta' 30 mg/l; dan jassigura preċiżjoni akbar. Sorsi oħrajn ta' l-inoculum jistgħu ikunu wżati (ara I.6.4.2.).
         Daħħal l-arja f'dawn it-taħlitiet tal- CO2 ħieles mill-arja matul il-lejl sabiex titnaddaf is-sistema mid-diossidu tal-karbonju.
         Żid il-materjal tat-test u s-sustanza ta' referenza, separatament, bħala volum magħruf tat-taħlitiet lesti, f'garafini kopji sabiex takkwista l-konċentrazzjonijiet, kontribwiti biż-żieda tal-kimika, ta' 10 sa 20 mg DOC jew TOC/l; ħalli wħud mill-garafini mingħajr iż-żieda tal-kimika bħala kontrolli ta' l-inoculum. Żid sustanzi tat-test li jinħallu bilmod direttament fil-garafini u iżen jew ikkalkula il-bażi tal-volum u opera kif deskritt fl-Anness III.
         Jekk meħtieġ, uża garafina waħda sabiex tivverifika l-effett inibitorju possibbli tat-kimika tat-test biż-żieda kemm tal-kimika tat-test u tar-referenza fl-istess konċentrazzjonijiet kif preżenti fil-garafini l-oħrajn.
         Ukoll, jekk meħtieġ, organizza garafina sterili oħra sabiex tivverifika jekk il-kimika tat-test tkun degradat abjotikament bl-użu tat-taħlita mhux inokulata tal-kimika (ara I.6,6.). Sterilizza biż-żieda ta' sustanza tossika fil-konċentrazzjoni xierqa.
         Wassal il-volumi tas-sospenzi fil-garafina kollha għal 3 litri biż-żueda ta' medja minerali li preċedentament mogħtija l-arja bi CO2 ħieles mill-arja. B'mod operattiv, il-kampjuni jistgħu ikunu miġbura għall-analiżi DOC (ara l-Anness II.4(u/jew analiżi speċifika. Waħħal il-flixkien ta' l-assorbazzjoni mal-ħruġ tal-ġarafini.
         Jekk ikun użat l-idrossidu tal-barju, waħħal tlett fliexken ta' l-assorbazzjoni, b'kull wieħed ikun fih 100 ml ta, 0,0125 M taħlita ta' l-idrossidu tal-barju, f'serje ta' garafini ta' 5-litri 'l wieħed. It-taħlita għandha tkun ħielsa mis-sulfat u l-karbonat preċipitat u s-saħħa tagħha għandhom ikunu determinati immedjatament qabel l-użu. Jekk ikun użat l-idrossidu tas-sodju, waħħal żewġ nasses, it-tieni taġixxi bħala kontroll għad-demostrazzjoni li d-diossidu tal-karbonju kollu kien assorbit fl-ewwel wieħed. Fliexken ta' l-assorbazzjoni mgħammra b'għeluq tal-flixkun tas-serum huma adatti. Żid 200 ml 0,05 M idrossidu tas-sodju ma kull flixkun, li huwa suffiċjenti sabiex jassorbixxi l-kwantità totali tad-diossidu tal-karbonju evolut meta l-kimika tat-test tkun kompletament degradata. It-taħlita ta' l-idrossi tas-sodju, anki meta ippreparata friska, ikun fiha traċċi tal-karbonati, dan huma ikkorreġut bit-tnaqqis tal-karbonat fl-imbjank.
         IV.2.5.   Numru ta' garafini fi prova tipika
         Il-garafini 1 u 2: Sospenzjoni tat-test
         Il-garafini 3 u 4: Inoculumi fl-imbjank
         Garafina 5: Proċedura tal-kontroll u,
         preferibbilment u meta meħtieġ:
         Garafina 6: Kontroll ta' abjotiku sterili
         Garafina 7: Kontroll tat-tossiċità
         Garafina 8: Kontroll tat-tossiċità Ara wkoll I.6.7.
         IV.2.6.   It-twettieq tat-test
         Ibda t-test bit-tbaqbieq ta' CO2 ħieles mill-arja matul is-sospenzjoni bir-rata ta' 30-100 ml/min. Iġbor il-kampjuni ta' l-assorbent diossidu tal-karbonju perjodikament għall-analiżi tal-kontenut CO2. Matul l-ewwel għaxart ijiem huwa rakkomndat li l-analiżi għandha tkun imwettqa fit-tieni jew fit-tielet jum u imbagħad kull ħames jum sat-28 jum hekk li l-perijodu ta' l-10 ijiem jista jkun identifikat.
         Fit-28 jum, iġbor il-kampjuni (voluntarja) għall-analiżi DOC u/jew speċifika, kejjel il-pH tas-sospenzjoni u żid 1 ml ta' l-aċidu idrokloriku ikkonċentrar ma kull garafina; agħti l-arja lill-garafini matul il-lejn sabiex twarrab id-diossidu tal-karbonju preżenti fis-sospenzjonijiet tat-test. Fil-jum 29 agħmel l-aħħar analiżi tad-diossidu tal-karbonju evolut.
         Fil-jiem tal-kejl ta' CO2, aqla l-assorbatur ta' l-idrossidu tal-barju l-ebreb lejn il-garafina, ittitra t-taħlita ta' l-idrossidu bi HCl 0,05 M bl-użu tal-fenilftalejn bħala indikatur. Mexxi l-assorbaturi li jkun fadat post aktar qrib tal-garafina u poġġi assorbatur ġdid li jkun fih 100 ml ta' l-idrossidu tal-barju frisk 0,0125 M fit-tarf imbiegħed tas-serje. Wettaq titrazzjonijiet kif meħtieġ, per eżempju, meta l-preċipitazzjoni sostanzjali hija murija fl-ewwel nassa u qabel ma jkun evidenti fit-tieni, jew mill-anqas darba fil-ġimgħa. B'mod alternattiv, bi NaOH bħala assorbatur, iġbed b'siringa kampjun żgħir (jiddependi mill-karatteristiċi ta' l-analizzatur tal-karbonju użat) tat-taħlita ta' l-idrossidu tas-sodju fl-assorbatur l-eqreb lejn il-garafina. Injetta direttament il-kampjun fil-parti IC ta' l-anilizzatur tal-karbonju għall-analiżi tad-diossidu tal-karbonju evolut.
         Analizza l-kontenuti tat-tieni nassa biss fit-tmiem tat-test sabiex tikkorieġi għal xi ammont żejjed tad-diossidu tal-karbonju.
         IV.3.   DATA U RAPPORTAĠĠ
         IV.3.1.   Trattament tar-riżultati
         L-ammont ta' CO2 fin-nassa ta' l-assorbatur meta ittrat huwa mogħti bi:
         mgCO2 = (100 x CB-0,5 x V x CA) x 44
         meta:
         
                     V
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-volum ta' HC1 użat għat-titrazzjoni tal-100 ml fl-assorbatur (ml).
                  
               
                     CB
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-konċentrazzjoni tat-taħlita ta' l-idrossidu tal-barju (M),
                  
               
                     CA
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     l-konċentrazzjoni tat-taħlita ta' l-aċidu idrokloriku (M),
                  
               jekk CB jkun 0,0125 M u CA huwa 0,05 M, it-titrazzjoni għal 100 ml idrossidu tal-barju hija 50 ml u l-piż ta' CO2 huwa mogħti bi:
         
            
         Hekk, f'dan il-każ, sabiex il-volum ta' HC1 titrat ikun ikkopnvertit għal mg tas-CO2 prodott, il-fattur huwa 1,1.
         Ikkalkola l-piżijiet ta' CO2 prodott biss mill-inoculum u mill-iconulum flimkien mal-kimika tat-test bl-użu tal-valuri rispettivi tat-titrazzjoni u d-differenza fil-piż ta' CO2 prodott biss mill-kimika tat-test.
         Per eżempju, jekk l-inoculum biss jagħti titrazzjoni ta' 48 ml u l-inoculum flimkien mal-kimika tat-test jagħti 45 ml,
         CO2 mill-inoculum = 1,1 × (50-48) = 2,2 mg
         CO2 mill-inoculum flimkien mal-kimika tat-test = 1,1 × (50-45) = 5,5 mg
         u bhekk il-piż ta' CO2 prodott mill-kimika tat-test hija 3,3 mg.
         Il-persentaġġ tal-biodegradazzjoni huwa ikkalkolat minn:
         
            
         jew,
         
            
         3,67 ikun il-fattur tal-konverżjoni (44/12) għall-karbonju tad-diossidu tal-karbonju.
         Akkwista l-persentaġġ tad-degradazzjoni wara kwalunkwe intervall ta' ħin biż-żieda tal-persentaġġ tal-valuri ThCO2 ikkalkolat għal kull waħda mill-jiem, sa dak il-ħin, li fih ikun imkejjel.
         Għall-assorbaturi idrossidu tas-sodju, ikkalkola l-ammont tad-diossidu tal-karbonju prodott, espressa bħala IC (mg), bil-moltiplikazzjoni tal-konċentrazzjoni ta' IC fl-assorbent bil-volum ta' l-assorbent.
         Ikkalkula l-persentaġġ tad-degradazzjoni minn:
         
            
         Ikkalkola DOC imneħħija (voluntarja) kif deskritt taħt 1.7. Irreġistra dawn u r-riżultati l-oħrajn kollha fuq il-karti tad-data kif ipprovduta.
         IV.3.2.   Validità tar-riżultati
         Il-kontenut IC tas-sospenzjoni tal-kimika tat-test fil-medja minerali fil-bidu tat-test għandu jkun anqas minn 5 % tal-TC, u t-total CO2 ta' l-evoluzzjoni ta' l-inoculum fl-imbjank fit-tmiem tat-test għandu normalment jeċċedi 40 mg/l medja. Jekk valuri akbar minn 70 mg CO2/litru jkunu akkwistati, id-data u t-teknika sperimentali għandha tkun eżaminata b'mod kritiku.
         Ara wkoll I.5.2.
         IV.3.3.   Rapportaġġ
         Ara I.8.
         IV.4.   FOLJA TAD-DATA
         Eżempju tal-folja tad-data huwa mogħti aktar il-quddiem.
         TEST TA' L-EVOLUZZJONI TAD-DIOSSIDU TAL-KARBONJU
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     LABORATORJU
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     IL-JUM TAL-BIDU TAT-TEST
                  
               (3)   IS-SUSTANZA TAT-TEST
         Isem:
         Il-konċentrazzjoni tat-taħlita bil-lest: mg/litru bħala kimika
         Konċentrazzjoni inizjali fil-medja: mg/litru bħala kimika
         Total C miżjud mal-garafina: mg C
         ThCO2: mg CO2
         
         4.   INOCULUM
         Sorsi:
         Trattament mogħti:
         Pre-kondizzjonar, jekk ikun hemm:
         Konċentrazzjoni ta' solidi sospiżi fit-taħlita tar-reazzjoni: mg/litru
         
                     Ħin
                     (jum)
                  
                  
                     CO2 iffurmat
                     Test (mg)
                  
                  
                     CO2 iffurmat
                     imbjank (mg)
                  
                  
                     CO2 iffurmat Kumulattiv (mg)
                     (Il-medja ta' l-imbjank minus tat-test)
                  
                  
                     ThCO2
                     
                     Kumulattiv 
                  
               
                     1
                     2
                  
                  
                     medja
                  
                  
                     3
                     4
                  
                  
                     medja
                  
                  
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     medja
                  
               
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     n1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     n2
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     n3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     28
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Nota: formati simili jistgħu ikunu wżati għall-kimika tar-referenza u l-kontrolli tat-tossiċità
         6.   ANALIŻI TAL-KARBONJU (voluntarju)
         
         Analizzatur tal-karbonju:
         
                     Żmien (jiem)
                  
                  
                     Imbjank mg/l
                  
                  
                     Kimika tat-test mg/l
                  
               
                     0
                  
                  
                     Cb(o)
                     
                  
                  
                     Co
                     
                  
               
                     28 (****)
                     
                  
                  
                     Cb(t)
                     
                  
                  
                     Ct
                     
                  
               
            
         7.   DEGRADAZZJONI ABJOTIKA (voluntarja)
         
         
            
         PARTI V.   TEST TAR-RESPIROMETRIJA MANJOMETRIKA (Metodu C.4-D)
         
         V.1.   PRINĊIPJU TAL-METODU
         Volum imkejjel tal-medja minerali inokulata, li jkun fiha konċentrazzjoni magħrufa tal-kimika tat-test (100 mg/litru tas-sustanza tat-test, li tagħti mill-anqas 50-100 mg ThOD/litru) bħala s-sorsi unika nominali tal-karbonju organiku, hija mħawwda f'garafina magħluqa f'temperatura kostanti (± 1 oC jew eqreb) għal sa 28 jum. Il-konsum ta' l-ossiġenu huwa determinat jew bil-kejl tal-kwanità ta' ossiġenu (prodott b'mod elettolitiku) meħtieġ għaż-żamma tal-volum tal-gass fil-garafina respirimetru, jew bit-tibdil fil-volum jew fil-pressjoni (jew ġemgħa tat-tnejn) fl-apparat. Id-diossidu tal-karbonju evolu huwa assorbit fit-tahlita ta' l-idrossidu tal-putassa jew f'xi assorbent xieraq ieħor. L-ammont ta' ossiġenu akkwistat bil-kimika tat-test (ikkorreġut għall-akwista mill-inoculim fl-imbjank, imwettaq b'mod parallel) huwa espress bħala persentaġġ ta' ThOD jew COD. B'mod voluntarju, il-grad tal-biodegradazzjoni primarja jista wkoll ikun ikkalkolat mill-analiżi kimika supplemetari mwettqa fil-bidu u fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni, u fl-aħħar mill-aħħar il-biodegredazzjoni bl-analiżi DOC..
         V.2.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         V.2.1.   Apparat
         
                     a)
                  
                  
                     respirometru xieraq;
                  
               
                     b)
                  
                  
                     kontroll tat-temperatura, żamma ta' ± 1 oC jew aħjar;
                  
               
                     ċ)
                  
                  
                     Apparat tal-filtrazzjoni bil-membrana (voluntarju);
                  
               
                     d)
                  
                  
                     analizzatur tal-karbonju (voluntarju).
                  
               V.2.2.   Preparazzjoni tal-medja minerali
         Għall-preparazzjoni tat-taħlitiet bil-lest, ara I.6.2.
         Ħawwad 10 ml tat-taħlita (a) ma 800 ml ilma tat-trattib, żid 1 ml tat-taħlitiet (b) sa (d) u wassal sa litru bl-ilma tat-trattib.
         V.2.3.   Preparazzjoni u pre-kondizzjonar ta' l-inoculum
         L-inoculum jista jkun akkwistat minn varjeta ta' sorsi: ħama' attivata, effluwenti tad-drenaġġ (mhux klorinati), ilmijiet minn wiċċ l-art u ħamrija jew minn taħlita ta' dawn.
         Ara I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. u I.6.5.
         V.2.4.   Preparazzjoni tal-garafini
         Ipprepara t-taħlitiet għat-test u l-kimika tar-referenza, f'lottijiet separati, f'medja minerali ekwivalenti għal konċentrazzjoni, normalment, ta' 100 mg kimika/litru (li tagħti mill-anqas 50-100 mg ThOD/litru), bl-użu tat-taħlitiet bil-lest.
         Ikkalkola il-ThOD fuq il-bażi tal-formazzjoni ta' l-imluħa ta' l-ammonium, sakemm nitrifikazzjoni tkun antiċipata, meta l-kalkolazzjoni għandha tkun ibbażata fuq il-formazzjoni nitrika (ara l-Anness II.2.)
         Iddetermina l-valuri pH u aġġusta, jekk meħtieġ, għal 7,4. ±0,2.
         Sustanzi li ma tantx jinħallu għandhom ikunu miżjuda fi stadju aktar tard (ara hawn taħt).
         Jekk it-tossiċita tal-kimika tat-test għandha tkun determinata, ipprepara taħlita oħra fil-medja minerali li jkun fiha kemm il-kimika tat-test u tar-referenza fl-istess konċentrazzjonijiet bħal fit-taħlitiet individwali.
         Jekk il-kejl tat-teħid fiżiku-kimiku ta' l-ossiġenu huwa meħtieġ, ipprepara taħlita tal-kimika tat-test fi, mormalment, 100 mh ThOD/litru li tkun ġiet sterilizzata biż-żieda ta' sustanza tassika adatta (ara I.6,6.).
         Introduċi l-volum meħtieġ tat-taħlitiet tal-kimika tat-test u ta' referenza, rispettivament, mill-anqas fil-garafini duplikati. Żid ma garafini oħrajn il-medja minerali biss (għal kontrolli ta' l-inoculum) u, jekk meħtieġ, it-taħlita tal-kimika tat-test imħallta/ta' referenza, u t-taħlita sterili.
         Jekk il-kimika tat-test ma tantx tkun tinħall, żid sustanzi tat-test li jinħallu bil-mod direttament fil-garafini u iżen jew ikkalkula l-bażi tal-volum u opera kif deskritt fl-Anness III. Żid l-idrossidu tal-putazza, gerbubi tal-ġir tas-soda jew assorbent ieħor mal-kompartimenti assorbatur CO2.
         V.2.5.   Numru ta' garafini fi prova tipika
         Il-garafini 1 u 2: Sospenzjoni tat-test
         Il-garafini 3 u 4: Inoculumi fl-imbjank
         Il-garafini 5: Proċedura tal-kontroll preferibbilment, u meta meħtieġ:
         Il-garafini 6: Kontroll sterili
         Il-garafini 7: Kontroll tat-tossiċità
         Il-garafini 8: Kontroll tat-tossiċità
         Ara wkoll I.6.7.
         V.2.6.   It-twettieq tat-test
         Ħalli l-garafini jilħqu t-temperatura mixtieqa u inokula r-reċipjenti xierqa bil-ħama' attivata ippreparata jew b'sors ieħor ta' l-inoculum sabiex takkwista konċentrazzjoni ta' solidi sospiżi ta' mhux aktar minn 30 mg/litru. Ħejji l-apparat, qabbad il-ħawwadi u ivverifika li ma tgħaddix arja, u ibda bil-kejl tat-teħid ta' l-ossiġenu. Normalment l-ebda attenzjoni oħra m'hija meħtieġa apparti milli t-teħid tal-qari u tal-virifika odjerna sabiex tara li t-temperatura korretta u t-taħwis adekwat ikun mantenut.
         Ikkalkola t-teħid ta' l-ossiġenu mill-qari meħuda f'intervalli regolati u ta' spiss, bl-użu tal-motodi rakkomandati mill-manifattur ta' l-apparat. Fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni, normalment 28 jum, kejjel il-pH tal-kontenuti tal-garafini, speċjalment jekk it-teħid ta' l-ossiġenu jkun baxx jew aktar minn ThODNH4 (għal komposti li jkun fihom in-nitroġenu).
         Jekk meħtieġ, neħħli l-kampjuni mill-garafini respirometri, inizjalment u finalment, għall-analiżi ta' DOC jew kimika speċifika (ara l-Anness II.4). Fit-tneħħija inizjali, assigura li l-volum tas-sospensjoni tat-test li jkun baqa' fil-garafina, jkun magħruf. Meta l-ossiġenu jkun meħud mis-sustanza tat-test li jkun fiha l-N, iddetermina ż-żieda fil-konċentrazzjoni tan-nitrat u wettaq in-nitrazzjoni matul 28 jum u ikkalkola l-korrezzjoni għall-ossiġenu ikkunsmat bin-nitrifikazzjoni (l-Anness V).
         V.3.   DATA U RAPPORTAĠĠ
         V.3.1.   Trattament tar-riżultati
         Iddividi l-akkwista ta' l-ossiġenu (mg) tal-kimika tat-test wara hin pre-determina (korreġut għal dak ta' l-inoculum tal-kontroll fl-imbjank wara l-istess ħin) bil-piż tat-kimika tat-test kif użata. Dan iforni il-BOD espress bħala mg ossiġenu/mg kimika tat-test, iġiefiri
         
            
         mg O2 kull mg kimika tat-test
         ikkalkola l-persentaġġ tal-biodegradazzjoni jew minn:
         
            
         Jew inkella minn:
         
            
         Għandu jkun innotat li dawn iż-żewġ metodi mhux neċessarjament jagħtu l-istess valur, huwa preferibbli li jsir użu mill-metodu preċedenti.
         Għal sustanzi tat-test li jkun fihom in-nitroġenu, għamel użu mill-ThOD xieraq (NH4 jew NO3) skond ma jkun magħruf jew mistenni dwar l-okkorrenza tan-nitrifikazzjoni (l-Anness II.2). Jekk in-nitrifikazzjoni isseħħ imma ma tkun kompluta, ikkalkola korrezzjoni għall-ossiġenu ikkunsmat bin-nitrifikazzjoni mit-tibdil fil-konċentrazzjoni tan-nitrit u n-nitrat (l-Anness V).
         Meta determinazzjonijiet voluntarji tal-karbonju organiku u/jew ta' kimika speċifika jkun saru, ikkalkola il-persentaġġ tad-degradazzjoni, kif deskritt taħt I.7.
         Irreġistra r-riżultati kollha dwara id-data fuq il-karti tad-data kif ipprovduta.
         V.3.2.   Validità tar-riżultati
         It-teħid ta' l-ossiġenu ta' l-inoculum fl-imbjank normalment huwa 20-30 mg O2/litru u m'għandux ikun aktar minn 60 mg/litru fi 28 jum. Valuri għola minn 60 mg/litru jkunu jeħtieġu eżaminazzjoni kritika tad-data u tat-tekniki sperimentali. Jekk il-valur tal-pH huwa l-barra mill-medda 6-8, 5 u l-konsum ta' l-ossiġenu bil-kimika tat-test huwa anqas minn 60 %, it-test għandu jkun repetut b'konċentrazzjoni aktar baxxa tal-kimika tat-test.
         Ara wkoll I.5.2.
         V.3.3.   Rapportaġġ
         Ara I.8.
         V.4.   FOLJA TAD-DATA
         
         Eżempju tal-folja tad-data huwa mogħti aktar il-quddiem.
         TEST RESPIRATORJU MANOMETRIKU
         
                  
                     1.
                  
                  
                     LABORATORJU
                  
               
                  
                     2.
                  
                  
                     IL-JUM TAL-BIDU TAT-TEST
                  
               3.   IS-SUSTANZA TAT-TEST
         Isem:
         Il-konċentrazzjoni tat-taħlita bil-lest: mg/litru
         Konċentrazzjoni inizjali fil-medja, Co: mg/litru
         Volum fil-garafina tat-test (V): ml
         ThOD jew COD: mg O2/mg sustanza tat-test (NH4, NO3)
         4.   INOCULUM
         Sorsi:
         Trattament mogħti:
         Pre-kondizzjonar, jekk ikun hemm:
         Konċentrazzjoni ta' solidi sospiżi fit-taħlita tar-reazzjoni: mg/l
         5.   TEĦID TA' L-OSSIĠENU BIODEGRADABBILITÀ
         
                      
                  
                  
                     Jum
                  
               
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                     7
                  
                  
                      
                  
                  
                     14
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     21
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     28
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 upt. (mg), kimika tat-test
                  
                  
                     1
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     2
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     a, medja
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 upt. (mg) imbjank
                  
                  
                     3
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     4
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     b, medja
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     BOD(mg) ikkorreġut
                  
                  
                     (a1-bm)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     (a2-bm)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     BOD kull mg tal-kimika tat-test
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     % degradazzjoni
                     
                        
                  
                  
                     D1 (a1)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     D2 (a2)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Medja (*****)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     V = Volum tal-medja fil-garafina tat-test
                  
               N.B.: Formati simili jistgħu ikunu wżati għall-kimika tar-referenza u l-kontrolli tat-tossiċità.
         6.   KORREZZJONI GĦAN-NITRIFIKAZZJONI (ara l-Anness V)
         
         
                     Jum
                  
                  
                     0
                  
                  
                     28
                  
                  
                     Differenza
                  
               
                     
                                 (i)
                              
                              
                                 Konċentrazzjoni tan-nitrat (mg N/litru)
                              
                           
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     (N)
                  
               
                     
                                 (ii)
                              
                              
                                 Ossiġenu ekwivamenti (4,57  × N × V) (mg)
                              
                           
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                      
                  
               
                     
                                 (iii)
                              
                              
                                 Konċentrazzjoni tan-nitrat (mg N/litru)
                              
                           
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     (N)
                  
               
                     
                                 (iv)
                              
                              
                                 Ossiġenu ekwivamenti (3,43  × N × V) (mg)
                              
                           
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                      
                  
               
                     
                                 (ii + iv)
                              
                              
                                 Ossiġenu ekwivamenti totali
                              
                           
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                      
                  
               7.   ANALIŻI TAL-KARBONJU (volontarju)
         
         Analizzatur tal-karbonju:
         
                     Żmien (jiem)
                  
                  
                     mg/litru fl-imbjank
                  
                  
                     Kimika tat-test mg/litru
                  
               
                     0
                  
                  
                     (Cblo)
                  
                  
                     (Co)
                  
               
                     28 (******)
                     
                  
                  
                     (Cblt)
                  
                  
                     (Ct)
                  
               
            
         8.   KIMIKA SPECIFIKA (volontarja)
         
         
                     Sb
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni fil-fiżiko0kimika (sterili) mal-kontroll ta' 28 jum
                  
               
                     Sa
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni fil-garafina inokulta fi 28 jum.
                  
               
            
         9.   DEGRADAZZJONI ABJOTIKA (voluntarja)
         
         
                     a
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konsum ta' l-ossiġenu f'garafini sterili wara 28 jum, (mg)
                  
               
            
         (ara s-sezzjonijiet 1 u 3)
         
            
         PARTI VI.   TEST TAL-FLIXKUN MAGĦLUQ (Metodu oC.4-E)
         
         VI.1.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         It-taħlita tal-kimika tat-test f'medja minerali, normalment fi 2-5 mg/litru, hija inokulata b'relattivament numru żghir ta' mikro-organiżmi minn popolazzjoni mħallta u miżmuma fi fliexken, kompletament mimlija u magħluqa, fid-dlam u f'temperatura kostanti. Id- degradazzjoni hija segwita bl-analiżi ta' l-ossiġneu maħlul matul perijodu ta' 28 jum. L-ammont ta' ossiġenu akkwistat bil-kimika tat-test, ikkorreġut għall-akwista mill-inoculim fl-imbjank, imwettaq b'mod parallel, huwa espress bħala persentaġġ ta' ThOD jew COD.
         VI.2.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         VI.2.1.   Apparat
         
                     a)
                  
                  
                     Fliexken BOD, b'tappini tal-ħġieġ, eż. 250-300 ml;
                  
               
                     b)
                  
                  
                     Banju ta' l-ilma jew inkubatur, għaż-żamma tal-fliexken f'temperatura kostanti (± 1 oC jew aħjar) bl-esklużjoni tad-dawl;
                  
               
                     ċ)
                  
                  
                     Fliexken tal-ħġieġ kbar (2-5 litri) għall-preparazzjoni tal-medja u għall- mili tal-fliexken BOD;
                  
               
                     d)
                  
                  
                     Elettrodu u arloġġ ta' l-ossiġenu, jew apparat u reaġenti għat-titrazzjoni Winker.
                  
               VI.2.2.   Preparazzjoni tal-medja minerali
         Għall-preparazzjoni tat-taħlitiet bil-lest, ara I.6.2.
         Ħawwad 1 (wieħed) tat-taħlita (a) sa (d) u wassal sa litru bl-ilma tat-taħwid.
         VI.2.3.   Preparazzjoni ta' l-inoculum
         L-inoculum huwa normalment akkwistat minn effluwent sekondarju ta' l-impjant tat-trattament jew minn unità tal-iskala tal-laboratorju li jirċievi b'mod predominanti d-drenaġġ domestiku. Sors alternattiv ieħor għall-inoculum hija l-ilma tal-wiċċ ta' l-art. Normalment l-użu huwa ta' taqtira waħda (0,05 ml) ma 5 ml tal-filtrat għal kull litru tal-medja; il-provi jistgħu jeħtieġ li jiskopru l-aħjar volum għal effluwent partikolari (ara I.6.4.2. u I.6.5.).
         VI.2.4.   Preparazzjoni tal-garafini
         B'mod qawwi daħħal l-arja f'medja minerali għal mill-anqas 20 minuta. Wettaq kull waħda mis-serje tat-testijiet bil-medja akkwistata mill-istess lott. Ġeneralment, il-medja hija lesta għall-użu wara li tkun qagħdet għal 20 siegħa, fit-temperatura tat-test. Iddetermina l-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu mdewweb għall-iskopijiet tal-kontroll; il-valur għandu jkun madwar 0 mg/litru fi 20 oC. Wettaq l-operazzjonijiet kollha tat-trasferiment u tal-mili tal-medja saturata bl-arja imma mingħajr bżieżaq, per eżempju, bl-użu ta' sifuni.
         Ipprepara grupp paralelli ta' fliexken BOD għad-determinazzjoni tat-test u l-kimika ta' referenza f'serje sperimentali simultanji. Organizza numru suffiċjenti tal-flixkien BOD, inklużi l-inoculum fl-imbjank, sabiex tippermetti mill-anqas kejl duplikat tal-konsum ta' l-ossiġenu li jsir matul l-intervalli mixtieqa tat-test, per eżempju, wara 0, 7, 14, 21 u 28 jum. Sabiex tassigura li tkun tista tidentifika l-perijodu ta' l-10 ijiem, aktar fliexken jistgħu ikunu meħtieġa.
         Żid medja minerali mimlija kollha bl-arja ma fliexken kbar hekk li jkunu mimlija għal madwar terz. Imbagħad żid taħlitiet bil-lest suffiċjenti tal-kimika tat-test u tal-kimika ta' referenza sabiex tissepara l-flixken il-kbar hekk l-konċentrazzjoni finali tal-kimika tkun normalment mhux akbar minn 10 mg/litru. M'għandhek iżżid l-ebda kimika ma l-imbjank fil-medja tal-kontroll li tkun fi flixkun kbir ieħor.
         Sabiex tassigura li l-attività ta' l-inoculum ma tkunx limitata, il-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu mdewweb m'għandhiex tinżel aktar baxxa minn 0,5 mg/litru fil-fliexken BOD. Dawn jillimitaw il-konċentrazzjoni tal-kimika tat-test għal madwar 2 mg/litru. B'dana kollu, għal komposti b'degradibbiltà baxxa u dawk bi ThOD baxxa, 5-10 mg/litru jistgħu ikunu wżati. F'uħud mill-każi, ikun rakommandabbli li twettaq b'mod parallel serje tal-kimika tat-test f'żewġ konċentrazzjonijiet differenti, per eżempju, 2 u 5 mg/litru. Normalment, għandhek twettaq il-kalkolu tal-ThOD fuq il-bażi tal-formazzjoni tal-melħ ta' l-ammonium, imma, jekk in-nitrifikazzjoni tkun mistennija jew ikun magħruf li sseħħ, agħmel il-kalkolu fuq il-bażi tal-formazzjoni tan-nitrat (ThODNO3: ara l-Anness II.2). B'danakollu, jekk in-nitrifikazzjoni ma tkunx kompluta imma isseħħ, għamel korrezzjoni għat-tibdil fil-konċentrazzjoni tan-nitrit u n-nitrat, determinati fl-analiżi, (ara l-Anness V).
         Jekk it-tossiċità tal-kimika tat-test għandha tkun investigata (fil-każ, per eżempju, tal-valur preċedenti baxx tal-biodegradabbiltà li jkun ġie misjub), serje oħra ta' flixkien hija neċessarja.
         Ipprepara flixkun kbir ieħor li jkun fih medja minerali bl-arja (sa madwar terz tal-volum tiegħu) flimkien mal-kimika tat-test u l-kimika ta' referenza fil-konċentrazzjoni finali normalment l-istess bħal dawk fil-fliexken kbar l-oħrajn.
         Inokula t-taħlitiet fil-fliexken il-kbar b'effluwent sekondarju (qatra waħda jew madwar 0,05 ml, ma 5 ml/litru) jew b'sorsi oħra bħal ma hu l-ilma tax-xmara (ara I.6.4.2.). Finalment, wassal it-taħlitiet għall-volum b'medja minerali bl-arja bl-użu ta' manka li tilħaq sal-qiegħ tal-flixkun sabiex takkwista taħlita adekwata.
         VI.2.5.   Numru ta' garafini fi prova tipika
         Fi prova tipika, il-fliexken li ġejjin huma wżati:
         
                     —
                  
                  
                     mill-anqas 10 li jkun fihom il-kimika tat-test u ta' l-inoculum (sospenzjoni tat-test),
                  
               
                     —
                  
                  
                     mill-anqas 10 li jkun fihom biss l-inoculum (inoculum fl-imbjank),
                  
               
                     —
                  
                  
                     mill-anqas 10 li jkun fihom il-kimika ta' referenza u ta' l-inoculum (kontroll tal-proċedura),
                  
               
                     —
                  
                  
                     u, meta meħtieġ, 6 fliexken li jkun fihom il-kimika tat-test, kimika ta' referenza u l-inoculum (kontroll tat-tossiċità). B'dana kollu, sabiex tassigura li tkun tista tidentifika l-perijodu ta' l-10 ijiem, madwar id-doppju ta' fliexken jistgħu ikunu meħtieġa.
                  
               VI.2.6.   It-twettieq tat-test
         
         Forni kull taħlita ippreparata immedjetament ġewwa kull grupp rispettiv tal-fliexken BOD bil-manka mill-kwart tl-isfel (mhux mill-qiegħ) tal-flixkun kbir xieraq, hekk li l-fliexken BOD kollha jkunu kompletament mimlija. Taptap bil-ġentilizza sabiex tneħħi xi bżieżaq ta' l-arja. Analiżża il-fliexken ħin-żero immedjetament għall-ossiġenu mdewweb bil-metodi Winkles jew bl-elettrodi. Il-kontenuti tal-fliexken jistghu jkunu preservati għal analiżi aktar tard bil-metodu Winkles biż-żieda tal-manganiż (II) sulfat jew idrossidu tas-sodju (l-ewwel reaġent Winkler). Aħżen bil-galbu l-fliexken magħluqa bl-istopponi, li jkun fihom l-ossiġentu iffissat bħala manganiż kannella (III) ossidu idrat, fid-dlam fi 10-20 oC għal mhux aktar minn 24 siegħa qabel ma tipproċedi bil-kumplament tal-passi tal-metodu Winkler. Agħmel it-tappini fuq il-kumplament tal-flixkien, tassigura li l-ebda bżieżaq ta' l-arja ma jkunu magħluqa, u inkuba fi 20 oC fid-dlam. Kull serja għandha tkun akkumpanjata b'serje paralella sħiħa għad-determinazzjoni tal-medja in-bjank inokulata. Neħħi mill-anqas il-flixkien duplikati tas-serje kollha għall-abaliżi ta' l-ossiġenu mdewweb matul l-intervalli tal-ħin (mill-anqas kull ġimgħa) matul it-28 jum ta' l-inkubazzjoni.
         Kampjuni ta' kull ġimgħa għandhom jippermettu l-assessjar tat-tneħħija perċentwali fil-perijodu ta' 14-il jum, fil-waqt li l-kmpjunar ta' kull 3-4 ijiem għandu jippermetti li l-perijodu ta' 10 ijiem li jkun identifikat, li jkun jeħtieġ madwar id-doppju ta' tant fliexken.
         Għal sustanzi tat-test li jkun fihom N, korrezzjonijiet għat-teħid ta' l-ossiġenu minn xi nitrifikazzjoni li sseħħ, għandu jsir. Sabiex isir dan, uża l-metodu ta' l-elettrodi-O2 għad-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu mdewweb u imbagħad warrab il-kampjun mill-flixkun BOD għall-analiżi tan-nitrit u n-nitrat. Miż-żieda fil-konċentrazzjoni tan-nitrit u n-nitrat, wettaq il-kalkolu ta' l-ossiġenu użat (ara l-Anness V).
         VI.3.   DATA U RAPPORTAĠĠ
         VI.3.1.   Trattament tar-riżultati
         L-ewwel agħmel il-kalkolu tal-BOD eżerċitat wara kull perijodu ta' żmien billi tnaqqas l-eżawriment ta' l-ossiġenu (mg O2/litru) ta' l-inoculum fl-imbjank minn dak esibit bit-test kimiku. Iddividi dan l-eżawriment ikkorreġut bil-konċentrazzjoni (mg/litru) tal-kimika tat-test, sabiex takkwista l-BOD speċifika vġama mg ossiġenu kull mg tal-kimika tat-test. Wettaq il-kalkolu tal-persentaġġ tal-biodegradabbiltà billi tiddividi l-BOD speċifika bil-ThOD speċifika (ikkalkolata skond l-Anness II,2) jew il-COD (determinata bl-analiżi, ara l-Anness II.3),b'hekk:
         
            
         mg O2 kull mg tal-kimika tat-test
         
            
         jew
         
            
         Għandu jkun innotat li dawn iż-żewġ metodi mhux neċessarjament jagħtu l-istess valur, huwa preferibbli li jsir użu mill-metodu preċedenti.
         Għal sustanzi tat-test li jkun fihom in-nitroġenu, għamel użu mill-ThOD xieraq (NH4 jew NO3) skon ma jkun magħruf jew mistenni dwar l-okkorrenza tan-nitrifikazzjoni (l-Anness II.2). Jekk in-nitrifikazzjoni isseħħ imma ma tkun kompluta, ikkalkola korrezzjoni għall-ossiġenu ikkunsmat bin-nitrifikazzjoni mit-tibdil fil-konċentrazzjoni tan-nitrit u n-nitrat (l-Anness V).
         VI.3.2.   Validità tar-riżultati
         L-eżawriment ta' l-ossiġenu mill-imbjank ta' l-inoculum m'għandux jeċċedi 1,5 mg ossiġenu mdewwb/litru wara 28 jum. Valuri għola minn dan jeħtieġu investigazzjoni tat-tekniki sperimental. Il-konċentrazzjoni residwa ta' l-ossiġenu fil-fliexken tat-test m'għandhiex tinżel għal anqas minn 0,5 mg/litru fi kwalunkwe żmien. Livelli hekk baxxi ta' l-ossiġenu huma validi biss jekk il-metodu għad-determinazzjoni ta; l-ossiġenu mdewweb tkun tista tkejjel tali livella bl-akbar eżatezza.
         Ara wkoll I.5.2.
         VI.3.3.   Rapportaġġ
         Ara I.8.
         VI.4.   FOLJA TAD-DATA
         Eżempju tal-folja tad-data huwa mogħti aktar il-quddiem.
         TEST TAL-FLIXKUN MAGĦLUQ
         
                  
                     1.
                  
                  
                     LABORATORJU
                  
               
                  
                     2.
                  
                  
                     IL-JUM TAL-BIDU TAT-TEST
                  
               3.   IS-SUSTANZA TAT-TEST
         Isem:
         Il-konċentrazzjoni tat-taħlita bil-lest: mg/litru
         Konċentrazzjoni inizjali fil-flixkun: mg/litru
         ThOD jew COD: mg O2/mg sustanza tat-test
         4.   INOCULUM
         Sorsi:
         Trattament mogħti:
         Pre-kondizzjonar, jekk ikun hemm:
         Konċentrazzjoni fit-taħlita tar-reazzjoni: mg/litru
         5.   DETERMINAZZJONI DO
         Metodu: Winkler/elettrodu
         
            L-analiżi tal-garafini
         
         
                     Iż-żmien ta' l-inkubazzjoni (d)
                  
                  
                     DO (mg/1)
                  
               
                     0
                  
                  
                     n1
                     
                  
                  
                     n2
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Imbjank (mingħajr kimika)
                  
                  
                     1
                  
                  
                     C1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     2
                  
                  
                     C2
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Medja
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Kimika tat-test
                  
                  
                     1
                  
                  
                     a1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                     2
                  
                  
                     a2
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Medja
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Nota: Formati simili jistgħu ikunu wżati għall-kompost tar-referenza u l-kontrolli tat-tossiċità.
         6.   KORREZZJONI GĦAN-NITRIFIKAZZJONI (ara l-Anness V)
         
         
                     Iż-żmien ta' l-inkubazzjoni (d)
                  
                  
                     0
                  
                  
                     n1
                     
                  
                  
                     n2
                     
                  
                  
                     n3
                     
                  
               
                     
                                 (i)
                              
                              
                                 Konċentrazzjoni tan-nitrat (mg N/litru)
                              
                           
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                                 (ii)
                              
                              
                                 Tibdil tal-konċentrazzjoni tan-nitrat (mg N/litru)
                              
                           
                  
                     —
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                                 (iii)
                              
                              
                                 Ossiġenu ekwivalenti (mg/litru)
                              
                           
                  
                     —
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                                 (iv)
                              
                              
                                 Konċentrazzjoni tan-nitrat (mg N/litru)
                              
                           
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                                 (v)
                              
                              
                                 Tibdil tal-konċentrazzjoni tan-nitrat (mg N/litru)
                              
                           
                  
                     —
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                                 (vi)
                              
                              
                                 Ossiġenu ekwivalenti (mg/litru)
                              
                           
                  
                     —
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                                 (iii + vi)
                              
                              
                                 Ossiġenu totali ekwivalenti (mg/litru)
                              
                           
                  
                     —
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               7.   EŻAWRIMENT DO: % DEGRADAZZJONI
         
                      
                  
                  
                     Degradazzjoni wara jiem n (mg/litru)
                  
               
                     n1
                     
                  
                  
                     n2
                     
                  
                  
                     n3
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     GARAFINA 1: (mto – mtx) – (mbo – mbx)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     GARAFINA 2: (mto – mtx) – (mbo – mbx)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     GARAFINA 1:
                     
                        
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     GARAFINA 2:
                     
                        
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               % D medja (*******) = 
                        
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     mto
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     alur fil-garafina tat-test fil-ħin 0
                  
               
                     mtx
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     alur fil-garafina tat-test fil-ħin x
                  
               
                     mbo
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     l-valur medju ta' imbjank fil-ħin 0
                  
               
                     mbx
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-valur medju ta' imbjank fil-ħin x
                  
               Applika wkoll il-korrezzjoni għan-nitrifikazzjoni minn iii+vi fis-sezzjoni 6.
         8.   EŻAWRIMENT DO IMBJANK
         Konsum ta' l-ossiġenu fl-imbjank: (mbo – mb28) mg/litru Dan il-konsum huwa importanti għall-validità tat-test. Dan għandu jkun anqas minn 1,5 mg/litru.
         PARTI VII.   TEST M.I.T.I. (Metodu oC.4-F)
         
         VII.1.   PRINĊIPJUTAL-METODU
         It-teħid ta' l-ossiġenu bit-taħlita mħawda, jew bis-sospensjoni, tal-kimika tat-test f'medja minerali, inokulata b'mikro-organiżmi speċjalment imkabbra, mhux adattati, hija mkejla awtomatikament matul perijodu ta' 28 jum f'respirometri magħluq u fid-dlam fi 25 ± 1 oC. Id-disossidu tal-karbonju evolut huwa assorbit bil-ġir tas-soda. Il-biodegradabbiltà hija espressa bħala persentaġġ tat-teħid ta' l-ossiġenu (ikkorreġut għat-teħit fl-imbjank) tat-teħid teoretiku (ThOD). Il-persentaġġ tal-biodegradazzjoni primarja jista wkoll ikun ikkalkolat mill-analiżi kimika supplemetari mwettqa fil-bidu u fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni, u fl-aħħar mill-aħħar il-biodegredazzjoni bl-analiżi DOC.
         VII.2.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         VII.2.1.   Apparat
         
                     a)
                  
                  
                     Arloġġ BOD elettroliku awtomatiku jew respirometru normalment mgħammar b'6 fliexken, 300 ml il-wieħed, u mgħammar b'kikkri sabiex ikun fihom l-assorbent CO2;
                  
               
                     b)
                  
                  
                     Kamra ta' temperatura kostanti u/jew banju ta' l-ilma fi 25 oC ± 1 oC jew aħjar;
                  
               
                     ċ)
                  
                  
                     Apparat tal-filtrazzjoni bil-membrana (voluntarju);
                  
               
                     d)
                  
                  
                     analiżattur tal-karbonju (voluntarju).
                  
               VII.2.2.   Preparazzjoni tal-medja minerali
         Ipprepara t-taħlitiet bil-lest li ġejjin, bl-użu ta' reaġenti ta' grad analitiku u l-ilma (I.6.1.):
         
                     a)
                  
                  
                     Monopotassium dihydrogen ortho phosphate, KH2PO4
                     
                  
                  
                     8,50  g
                  
               
                     Dipotassium monohydrogen ortho phosphate, K2HPO4
                     
                  
                  
                     21,75  g
                  
               
                     Disodium monohydrogen ortho phosphate dodecahydrate Na2HPO4 12 H2O
                  
                  
                     44,60  g
                  
               
                     Klorid ta' l-ammonium, NH4Cl
                  
                  
                     1,70  g
                  
               
                     Dewweb fl-ilma u wassal għal-litru.
                  
                  
                      
                  
               
                     Il-valur pH tat-taħlita għandu jkun 7,2 
                  
                  
                      
                  
               
                     b)
                  
                  
                     Eptaidrat tas-sulfat tal-magneżju, MgSO4 7 H2O
                  
                  
                     22,50  g
                  
               
                     Dewweb fl-ilma u wassal għal-litru
                  
                  
                      
                  
               
                     c)
                  
                  
                     Klorid tal-kalċji, anidriju, CaCl2
                     
                  
                  
                     27,50  g
                  
               
                     Dewweb fl-ilma u wassal għal-litru.
                  
                  
                      
                  
               
                     d)
                  
                  
                     Ħadid (III) eksaidrat tal-klorid, FeCl3 6 H2O
                  
                  
                     0,25  g
                  
               
                     Dewweb fl-ilma u wassal għal-litru.
                  
                  
                      
                  
               Ħu 3 ml ta' kull taħlita (a), (b), (c) u (d) u wassal sa litru.
         VII.2.3.   Preparazzjoni ta' l-inoculum
         Iġbor kampjuni friski minn mhux anqas minn għaxar siti, l-aktar minn żoni ta' fejn varjetà ta' kimiċi huma użati u mormija. Minn siti bħalma huma l-impjanti tat-trattament tad-drenaġġ, trattament ta' l-iskart industrijali, xmajjar, għadajjer, ibħra, iġbor litru tal-kampjun u tal-ħama', ħamrija tal-wiċċ, ilma, eċċ., u ħallat sewwa flimien. Wara li tneħħi l-materja li jkun hemm fil-wiċċ u tħalli li joqgħod, aġġusta s-supernatant għal pH 7 ± 1 bl-idrossidu tas-sodju u l-aċidu fosforiku.
         Uża l-volum xieraq mas-supernayant iffiltrat sabiex timla reċipjent tal-“mili u ġbir” tal-ħama' attivata u agħti l-arja lil-likwidu għal madwar 231/2 siegħat. Tletin minuta wara li tkun waqfet l-arjazzjoni, warrab madwar terż tal-volum kollu tas-supernatant u żid volum egwali tat-taħlita (pH 7) li jkun fiha 0,1 % kull wieħed tal-glukożju, peptun, u monoputassa orto fosfat, mal-materja li tkun qagħdet u erġa ibda bl-arjazzjoni. Irrepeti din il-proċedura darba kuljum. L-unità tal-ħama' għandha tkun operata skond il-prattika tajba: l-effluwenti għandhom ikunu ċari, t-temperatura għandha tinżamm fi 25 ± 2 C, il-pH għandu jkun 7 ± 1, il-ħama' għandha tkun qagħdet sewwa, b'arjazzjoni suffiċjenti sabiex iżżomm it-taħlita erobika matul il-ħin kollu, il-protażoa għandha tkun preżenti u l-attività tal-ħama għandha tkun ittestjata kontra sustanza ta' referenza mill-anqas darba kull tlett xhur. Tutilizzax il-ħama' bħala inoculum sa mill-anqas xahar wieħed mill-operazzjoni, imma mhux aktar tard minn erba' xhur. Minn hemm 'il quddiem, iġbor kampjun minn mill-anqas 10 siti matul intervelli regolari, darba kull tlett xhur.
         Sabiex iżżomm kemm il-ħama' friska u dik antika fl-istess attività, ħawwad is-supernatant iffiltrat ta' ħama' attivata bl-użu ta' volum egwali tas-supernatant iffiltrat mat-taħlita ta' l-għaxar sorsi miġbura friski u wettaq il-kultura ta' dak il-likwir miġmugħ kif deskritt hawn fuq. Iġbor il-ħama' għall-użu bħala inoculum 18-24 siegħa wara liu l-unita tkun ġiet mimlija.
         VII.2.4.   Preparazzjoni tal-garafini
         Ipprepara dawn is-sitt garafini kif ġejjin:
         Nru. 1: kimika tat-test f'ilma mdewweb fi 100 mg/litru
         Nru. 2, 3 u 4: kimika tat-test f'minerali mdewweb fi 100 mg/litru
         Nru. 5: kimika tat-test (eż. analin) f'medja minerali mdewwba fi 100 mg/litru
         Nru. 6: medja minerali biss
         Żid il-kimika tat-test li ma tantx tinħall fuq il-bażi ta' piż jew volum jew ittratta kif deskritt fl-Anness III, apparti li la s-solventi u l-anqas l-aġenti emulsifikanti m'għandhom ikunu wżati. Żid l-assorbent tal-CO2 mal-garafini kollha fil-kikkri speċjali kif fornuti. Aġġusta l-pH fil-garafini nri. 2, 3 u 4 għal 7,0.
         VII.2.5.   It-twettieq tat-test
         Inokulta l-garafini nri. 2, 3 u 4 (sospensjoni tat-test, nru. 5 (kontroll ta' l-attività) u nru. 6 (inoculum fl-imbjank) b'volum żghir ta' l-inoculum sabiex ikun hemm konċentrazzjoni ta' 30 mg/litru ta' solidi sospiżi. Inoculum N huwa miżjud mal-garafina nru. 1 li sservi bħala kontroll abjotiku. Ħejji l-apparat, qabbad il-ħawwadi u ivverifika li ma tgħaddix arja, u ibda bil-kejl tat-teħid ta' l-ossiġenu taħt kondizzjonijiet fid-dlam. Ivverifika ta' kuljum, it-temperatura, l-ħawwadi u r-reġistratur kowlometriku tat-teħid ta' l-ossiġenu, u innota xi kambjamenti fil-kulur tal-kontenuti tal-garafini. Aqra l-akkwist ta' l-ossiġenu għas-sitt garafini direttament bil-metodu xieraq, per eżempju, mill-grafika tar-reġistrazzjoni ta' sitt punti, li tipproduċi kurva BOD. Fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni, normalment 28 jum, kejjel il-pH tal-kontenuti tal-garafini u iddetermina l-konċentrazzjoni tal-kimika tat-test residwa u xi intermedju u, fil-każ ta' sustanza li tinħall fl-ilma, il-konċentrazzjoni ta' DOC (l-Anness II.4). Agħti attenzjoni speċjali fil-każ ta' kimika volatili. Jekk nitrifikazzjoni tkun antiċipata, iddetermina l-konċentrazzjoni tan-nitrat u tan-nitrit, jekk dan ikun possibbli.
         VII.3.   DATA URAPPORTAĠĠ
         VII.3.1.   Trattament tar-riżultati
         Iddividi l-akkwista ta' l-ossiġenu (mg) tal-kimika tat-test wara hin pre-determina (korreġut għal dak ta' l-inoculum tal-kontroll fl-imbjank wara l-istess ħin) bil-piż tat-kimika tat-test kif użata. Dan iforni il-BOD espress bħala mg ossiġenu/mg kimika tat-test, jiġifieri
         
            
         mg O2 per mg tal-kimika tat-test
         Il-persentaġġ tal-biodegradazzjoni huwa imbagħad akkwistat minn:
         
            
         Għat-taħlitiet, ikkalkola il-ThOD mill-analiżi elementali, bħal fil-każ ta' kompost sempliċi. Uża il-ThOD (ThODNH4 jew ThODNO3) xierqa skond ta' jekk in-nitrifikazzjoni tkunx assenti jew kompluta (l-Anness II.2). Jekk b'danakollu, n-nitrifikazzjoni isseħħ imma ma tkunx kompluta, ikkalkola korrezzjoni għall-ossiġenu ikkunsmat bin-nitrifikazzjoni mit-tibdil fil-konċentrazzjoni tan-nitrit u n-nitrat (l-Anness V).
         Ikkalkola l-persentaġġ tal-biodegredazzjoni primarja mit-telf ta' kimika speċifika (paterna) (ara I.7,2).
         
            
         Jekk issib li kien hemm xi telf tal-kimika tat-test fil-garafina nru. 1, kejjel it-tneħħija fiżiku-kimika, agħmel rapport dwar dan u uża l-konċentrazzjoni tal-kimika tat-test (Sb) wara 28 jum f din il-garafina sabiex tikkalkola l-persentaġġ tal-biodegredazzjoni.
         Meta jsiru d-determinazzjonijiet ta' DOC (voluntarji), ikkalkola il-persentaġġ aħħari tal-biodegredazzjoni, minn:
         
            
         kif deskritt taħt il-punt I.7.1. Jekk issib li kien hemm xi telf tal-DOC fil-garafina nru. 1, kejjel it-tneħħija fiżiku-kimika, uża l-konċentrazzjoni DOC fdin il-garafina sabiex tikkalkola l-persentaġġ tal-biodegredazzjoni.
         Irreġistra r-riżultati kollha dwara id-data fuq il-karti tad-data kif ipprovduta.
         VII.3.2.   Validità tar-riżultati
         It-teħid ta' l-ossiġenu ta' l-inoculum fl-imbjank normalment huwa 20-30 mg O2/litru u m'għandux ikun aktar minn 60 mg/litru fi 28 jum. Valuri għola minn 60 mg/litru jkunu jeħtieġu eżaminazzjoni kritika tad-data u tat-tekniki sperimentali. Jekk il-valur tal-pH huwa 'l barra mill-medda 6-8,5 u l-konsum ta' l-ossiġenu bil-kimika tat-test huwa anqas minn 60 %, it-test għandu jkun repetut b'konċentrazzjoni aktar baxxa tal-kimika tat-test.
         Ara wkoll I.5.2.
         Jekk il-presentaġġ tad-degradazzjoni ta' l-anilin ikkalkolat mill-konsum ta' l-ossiġenu ma jkunx jeċċedi 40 % wara 7 tijiet u 65 % wara 14-il jum, it-test ikun meqjus bħala invalidu.
         VII.3.3.   Rapportaġġ
         Ara I.8.
         VII.4.   FOLJATAD-DATA
         Eżempju tal-folja tad-data huwa mogħti hawn taħt.
         TEST MITI (1)
         
                  
                     1.
                  
                  
                     LABORATORJU
                  
               
                  
                     2.
                  
                  
                     IL-JUM TAL-BIDU TAT-TEST
                  
               3.   IS-SUSTANZA TAT-TEST
         Isem:
         Il-konċentrazzjoni tat-taħlita bil-lest: mg/l bħala kimika
         Konċentrazzjoni inizjali fil-medja, Co: mg/l bħala kimika
         Volum tat-taħlita ta' reazzjoni, V: ml
         ThOD: mg O2/l
         4.   INOCULUM
         Siti tal-kampjunar tal-ħama':
         
                     
                                 1)
                              
                              
                                 …
                              
                           
                  
                     
                                 6)
                              
                              
                                 …
                              
                           
               
                     
                                 2)
                              
                              
                                 …
                              
                           
                  
                     
                                 7)
                              
                              
                                 …
                              
                           
               
                     
                                 3)
                              
                              
                                 …
                              
                           
                  
                     
                                 8)
                              
                              
                                 …
                              
                           
               
                     
                                 4)
                              
                              
                                 …
                              
                           
                  
                     
                                 9)
                              
                              
                                 …
                              
                           
               
                     
                                 5)
                              
                              
                                 …
                              
                           
                  
                     
                                 10)
                              
                              
                                 …
                              
                           
               Konċentrazzjonijiet ta' solidi sospiżi fil-ħama' attivata wara l-akklamitizzazzjoni bid-drenaġġ sintetiku +… mg/litru
         Volum tal-ħama' attivata kull litru tal-medja finali =… ml
         Konċentrazzjoni tal-ħama' fil-medja finali =… mg/litru
         5.   TEĦID TA' L-OSSIĠENU BIODEGRADABBILITÀ
         Tip ta' respirometru użat:
         
                      
                  
                  
                     (jum)
                  
               
                     0
                  
                  
                     7
                  
                  
                     14
                  
                  
                     21
                  
                  
                     28
                  
               
                     O2 upt. (mg), kimika tat-test
                  
                  
                     a1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     a2
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     a3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 upt. (mg), imbjank
                  
                  
                     b
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Ikkorreġut O 2 upt. (mg)
                  
                  
                     (a1 - b)
                     (a2 - b)
                     (a3 - b)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     BOD kull mg tal-kimika tat-test
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     Garafina 1.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Garafina 2.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Garafina 3.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     % degradazzjoni
                     
                        
                  
                  
                      
                  
                  
                     1
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     2
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     3
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     medja (********)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Nota: Formati simili jistgħu ikunu wżati għall-kompost ta' referenza.
         6.   ANALIŻI TAL-KARBONJU (voluntarju):
         Analizzatur tal-karbonju:
         
                     Garafina
                  
                  
                     DOC
                  
                  
                     % DOC imneħħi
                  
                  
                     Medja
                  
               
                     Imkejjel
                  
                  
                     Ikkorreġut
                  
               
                     Ilma + sustanza tat-test
                  
                  
                     a
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Ilma + sustanza tat-test
                  
                  
                     b1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                     b1 – c
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Ilma + sustanza tat-test
                  
                  
                     b2
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                     b2 – c
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Ilma + sustanza tat-test
                  
                  
                     b3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                     b3 – c
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Kontroll fl-imbjank
                  
                  
                     c
                  
                  
                      
                  
                  
                     —
                  
                  
                      
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
            
         7.   DATA SPECIFIKA KUMIKA ANALITIKA
         
                      
                  
                  
                     Ammont residwu tal-kimika tat-test fit-tmiem tat-test
                  
                  
                     % degradazzjoni
                  
               
                     Test imbjank bl-ilma
                  
                  
                     Sb
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     meda inokulata
                  
                  
                     Sa1
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Sa2
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Sa3
                     
                  
                  
                      
                  
               
            
         Ikkalkola il- % tad-degradazzjoni għall-garafini a1, a2 u a3 rispettivament
         8.   RIMARKI
         Il-kurva BOD kontra l-ħin, jekk disponibbli, għandha tkun mehmuża.
         
            ANNESS I
            ABBREVJAZZJONIJIET U DEFINIZZJONIJIET
            
                        DO
                     
                     
                        :
                     
                     
                        Ossiġenu mdewweb (mg/l) hija l-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu mdewweb f'kampjun akweju.
                     
                  
                        BOD
                     
                     
                        :
                     
                     
                        Talba biokimika ta' l-ossiġenu (g) hija l-ammont ta' l-ossiġenu ikkunsmat mill-mikro-organiżmi meta ssir il-metabolizzazzjoni tal-kompost tat-test; espress wkoll bħala g teħid ta' l-ossiġenu kull g tal-kompost tat-test. (ara l-metodu C.5).
                     
                  
                        COD
                     
                     
                        :
                     
                     
                        Talba ta' l-ossiġenu Kimiku (g) hija l-ammont ta' orriġenu ikkunsmat matul l-assidizzazzjoni ta' kompost tat-test bl-aċidu dikromatiku jaħraq; din tipprovdi għall-ammont tal-materja ossidizzabbli preżenti; ukoll espressa bħala g ossiġenu ikkunsmat kull g tal-kompost tat-test. (ara l-metodu C.6).
                     
                  
                        DOC
                     
                     
                        :
                     
                     
                        Karbonju organiku mdewweb huwa l-karbonju organiku preżenti fit-taħlita jew li jgħaddi minn filtru ta' 0,45 mikrometri jew jibqa fis-supernatant wara ċ-ċentrifigazzjoni fi 40 000 m.s-2 (±4 000 g) għal 15-il minuta.
                     
                  
                        ThOD
                     
                     
                        :
                     
                     
                        Talba teoretika ta' l-ossiġenu (mg) hija l-ammont totali ta' l-ossiġenu meħtieġ għall-ossidizzazzjoni kompleta ta'kimika; hija ikkalkolata mill-formula molekulati (ara l-Anness II.2) u hija wkoll espress bħala mg ossiġenu meħtieġ kull mg tal-kompost tat-test.
                     
                  
                        ThCO2
                        
                     
                     
                        :
                     
                     
                        Diossidu karbonju teoretiku (mg) hija l-kwantita ta' diossidu tal-karbonju ikkalkolat li jkun prodott mill-kontenut tal-karbonju magħruf jew imkejjel tal-kompost tat-test meta kompletament mineralizzat, ukoll espress bħala mg diossidu tal-karbonju kull mg tal-kompost tat-test.
                     
                  
                        TOC
                     
                     
                        :
                     
                     
                        Karbonju organiku totali ta' kampjun huwa s-somma tal-karbonju organiku fit-taħlita u fissospenzjoni.
                     
                  
                        IC
                     
                     
                        :
                     
                     
                        Karbonju inorganiku
                     
                  
                        TC
                     
                     
                        :
                     
                     
                        Karbonju totali huwa s-somma tal-karbonju organiku u inorganiku preżenti f'kampjun.
                     
                  Biodegredazzjoni primarja:
            hija t-tibdil fl-istruttura kimika ta' sustanza, imwassla bl-azzjoni bjoloġika, li tirriżulta mit-telf ta' proprjetà speċifika ta' dik is-sustanza.
            Biodegredazzjoni finalissima (erobika):
            hija l-livell tad-degradazzjoni akkwistata meta l-kompost tat-test ikun totalment utilizzat bil-mokroorganiżmi li jirriżulta fil-produzzjoni tad-diossidu tal-karbonju, ilma, melħ minerali u kostitwenti ġodda mikrobjali ċellulari (biomassa).
            Biodegrabbillità Pronta:
            klassifikazzjoni arbitrarja tal-kimika li tkun għaddiet minn ċerti testijiet speċifiċi tal-għażla għall-biodegradabbilità finalissima; dawn it-testijiet huma hekk strinġenti li huma assumiti li tali komposti jkunu malajr jew kompletament biodegradabbli f'ambjenti akweji permezz ta' kondizzjonijiet erobiċi.
            Biodegrabbillità Inerenti:
            klassifikazzjoni tal-kimika li dwarha jkun hemm evidenza mingħajr ekwivoku tal-biodegradazzjoni (primarja jew finalissima) fi kwalunkwe test rikonoxxut tal-biodegradabbilità.
            Trattabbilità:
            hija l-amenabbilità ta' komposti għat-tneħħija matul it-trattament bioloġiku ta' l-ilma ta' l-iskart mingħajr ma tkun affettwata b'mod ħażin l-operazzjoni normali tal-proċessi tat-trattament. Ġeneralment, komposti faċilment biodegradabbli jistgħu jkunu trattati, imma mhux il-komposti ineretament biodegradabbli huma hekk. Proċessi abjotiċi jistgħu ukoll ikunu operabbli.
            L-ispazju
            taż-żmien mill-innokulazzjoni, fit-test tat-tneħħija bil-kulur, sal-persentaġġ tad-degradazzjoni, jkun żdied b'mill anqas 10 %. L-ispazju taż-żmien huwa ta' spiss varjabbli u riproduċibbli ħażin ħafna.
            Il-ħin tad-degradazzjoni
            huwa l-ħin mit-tmiem ta' l-ispazju tal-ħin sal-ħin li 90 % tal-livell massimu tad-degradazzjoni tkun ġiet milħuqha.
            Il-perijodu ta' 10 ijiem
            huma l-10 jiem li immedjetament isegwu l-akkwist ta' l-10 % degradazzjoni.
         
         
            ANNESS II
            KALKOLU U DETERMINAZZJONI TA' PARAMETRI SOMMARJI XIERQA
            Jiddependi mill-metodu magħżul, ċerti parametri sommarji jkunu meħtieġa. Is-sezzjoni li ġejja tiddeskrivi dderiva ta' dawn il-valuri. L-użu ta' dawn il-parametri hija deskritta fil-metodi individwali.
            1.   Kontenut tal-Karbonju
            Il-kontenut tal-karbonju huwa ikkalkolat minn komposizzjoni elementali magħrufa jew determinata bl-analiżi elementali tas-sustanza tat-test.
            2.   ThOD = Theoretical Oxygen Demand (Talba teoretika ta' l-ossiġenu)
            It-Talba teoretika ta' l-ossiġenu (ThOD) tista tkun ikkalkolata jekk il-komposizzjoni elementali tkun magħrufa jew determinata b'analiżi elementali. Hija għal kompost:
            CcHhClclNnNanaOoPpSs
            
            mingħajr nitrifikazzjoni,
            
                mg/mg
            jew bin-nitrifikazzjoni,
            
                mg/mg
            3.   Talba ta' l-Ossiġenu Kimiku (COD)
            It-Talba ta' l-Ossiġenu Kimiku (COD) hija determinata skond il-metodu C.6.
            4.   DOC = Dissolved Organic Carbon (Karbonju organiku mdewweb)
            Il-Karbonju organiku mdewweb (DOC) huwa bid-definizzjoni l-karbonju organiku ta' kwalunkwe kimika jew taħlita fl-ilma li tgħaddi minn filtru 0,45 mikrometri.
            Kampjuni mir-reċipjenti tat-test huma miġbura u iffiltrati immedjatament minn apparat tal-filtrazzjoni blużu ta' membrana filtranti xierqa. L-ewwel 20 ml (l-ammont jista jkun imnaqqas meta jsir użu minn filtranti żgħar) tal-filtrat ikunu mwarrba. Volumi ta' 10-20 ml jew anqas, jekk injettati (il-volum jiddependi mill-ammont meħtieġ għall-analizzatur tal-karbonju) huma miżmuma għall-analizzar tal-karbonju. Il-konċentrazzjoni DOC hija determinata permezz ta' l-analizzatur tal-karbonju organiku li huwa kapaċi li jkejjel b'eżatezza l-konċentrazzjoni tal-karbonju ekwivalenti għal, jew aktar baxxa minn 10 % tal-konċentrazzjoni DOC inizjali użat fittest.
            Kampjuni iffiltrati li ma jkunux jistgħu jiġu analizzati fl-istess jum utili jistgħu ikunu preservati bil-ħażna fir-refriġeratur fi 2-4 °C għal 48 h, jew f'anqas minn 18 °C għal perijodu twil.
            Rimarki:
            Filtri tal-membra huma ta' spiss impregnati b'surfaktanti għall-idrofilizzazzjoni. B'hekk il-filtru jista jkun fih sa diversi mg ta' karbonju organiku solubbli li jkun jinterferixxi fid-determinazzjonijiet tal-biodegradabbilità. Surfaktanti u komposti organiċi solubbli oħrajn huma mneħħija mill-filtri billi jkunu mogħllija f'ilma dejonizzat għal tlett perijodi ta' siegħa kull wieħed. Il-filtri jistgħu mbagħad ikunu maħżuna fl-ilma għal ġimgħa waħda. Jekk ikunu wżati l-kartuċċi tal-filtri, kull lott għandu jkun ivverifikat dwar il-konformità li dan ma jkunx jirrilaxxa karbonju organiku li jinħall.
            Jiddependi mit-tip tal-filtri tal-membrana, l-kimika tat-test tista' tkun miżmuma bl-assorbazzjoni. Jista jkungħalhekk rakkomandabbli li jkun assigurat li l-kimika tat-test ma tkunx miżmuma bil-filtru.
            Centrifugazzjoni fi 40 000 m.sek 2 (4 000 g) għal 15-il minuta tista tkun użata għad-differenzazzjoni ta' TOC versus DOC minflok il-filtrazzjoni. Il-metodu mhux affidabbli fil-konċentrazzjoni inizjali ta' < 10 mg DOC/l ladarba jew mhux il-bakterja kollha tkun imneħħija jew inkella l-karbonju bħala parti tal-bakterja, plażma tkun imdewba mill-ġdid.
            BIBLJOGRAFIJA
            
                        —
                     
                     
                        Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat.Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, P 65.
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139.
                     
                  
                        —
                     
                     
                        DIN-Entwurf 38 409 Teil 41 – Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser-und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs-und StoffkenngroLen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschu1 Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.V.
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol 13 (1),169.
                     
                  
         
            ANNESS III
            EVALWAZZJONI TAL-BIODEGRADABBILITÀ TA' SUSTANZI LI FTIT LI XEJN JINĦALLU
            Fit-testijiet tal-biodegradabbilità b'sustanzi li ftit li xejn jinħallu, l-aspetti li ġejjin għandhom jirċievu attenzjoni speċjali.
            Waqt li l-likwidi omoġenji rari jippreżentaw problemi tal-kampjunar, huwa rakommandabbli li materjali solidi jkunu omoġenizzati bil-meżżi xierqa sabiex ikunu evitati żbalji minħabba n-nuqqa ta' omoġenità.
            Attenzjoni speċjali għandha tkun mogħtija meta kampjuni rappreżentattivi ta' ftit milligrammi huma meħtieġa minn taħlitiet ta' kimika jew sustanzi b'ammonti żgħar ta' impuritajiet. Diversi għamliet ta' aġitazzjoni matul it-testijiet tista tkun użata. Attanzjoni għandha tingħata għall-użu biss ta' aġitazzjoni suffiċjenti sabiex il-kimika tinżamm imxerda, u sabiex ikunu evitati sħana żejda, rgħawwa eċċessiva u forzi qawwija eċċessivi.
            Jista jkun użat emulsifikatur li jagħti tixrid stabbli tal-kimika. Dan m'għandux ikun tossiku għall-bakterja u m'għandux ikun biodegradabbli jew li joħloq ir-rgħawwa bil-kondizzjonijiet tat-test.
            L-istess kriterja hija applikabbli għal solventi bħalma hija applikabbli għall-emulsifikanti.
            Mhux rakkomandat li trasportaturi solidi jkunu wżati għal sustanzi solidi tat-test imma dawn jistgħu ikunu adatti għal sustanzi żejtnija.
            Meta sustanzi awżiljarji bħalma huma l-emulsifikanti, solventi u trasportaturi jkunu wżati, prova fl-imbjank li jkun fiha s-sustanza awżiljarja, għandha tkun imwettqa.
            Kwalunkwe mit-tlett testijiet respirometriċi C02, BOD, MITI jistgħu ikunu wżati fl-istudju tal-biodebradabbilità tal-komposti li ftit li xejn jinħallu.
            BIBLJOGRAFIJA
            
                        —
                     
                     
                        de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, vol. 16, 833.
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.
                     
                  
         
            ANNESS IV
            EVALWAZZJONI TAL-BIODEGRADABBILITÀ TA' KIMIKA SUSPETTATA LI TKUN TOSSIKA GĦALL-INOCULUM
            Meta kimika hija suġġetta għal testijiet ta' biodegradabbilità faċli u tidher li ma tkunx biodegradabbli, l-proċedura li ġejja hija rakommandabbli jew distinzjoni bejn l-inibizzjoni u l-inenità tkun mixtieqa (Reynolds et al., 1987).
            
               Inocula simili jew identika għandha tkun użata għat-testijiet tat-tossiċità u l-biodegredazzjoni.
            Sabiex tkun assessjata t-tossiċità tal-kimika studjata f'testijiet tal-biodegradibbiltà faċli, l-applikazzjoni ta' ġemgħa waħda ta' l-inibizzjoni tar-rata tar-Respirazzjoni tal-Ħama’ (test ta' l-inibizzjoni tar-respirazzjoni talħama attivata – Dir 88/302/EEC), BOD u/jew il-metodi ta' l-Inibizzjoni tat-Tkabbir, għandhom ikunu jidħru jidhru xierqa.
            Jekk l-inibizzjoni minħabba t-tossiċità għandha tkun evitata, huwa suġġerit li l-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test użata fit-testijiet tal-biodegradabbiltà faċli għandha tkun mhux anqas minn 1/10 tal-valuri EC50 (jew anqas mill-valuri EC20) akkwistati fit-testijiet tat-tossiċità. Komposti b'valur EC50 jew akbar minn 300 mg/l aktarx li ma jkollhomx effetti tossiċi fit-testijiet tal-biodehradabbiltà faċli.
            Il-valuri EC50 ta;’ anqas minn 20 mg/l huma aktarx li jimponu problemi serji għal testijiet sussegwenti. Konċentrazzjoni tat-test baxxi għandhom ikunu użati, li joħolqu l-ħtiega ta' l-użu tat-test strinġenti u sensittiv tal-Flixkun Magħluq jew l-użu ta' 14C – materjal bit-tikketta. B'mod alternattiv, inoculum akklamitizzat jista jippermetti li jkunu użati konċentrazzjonijiet ogħla tas-sustanza tat-test. F'dan il-każ ta' l-aħħar, b'danakollu, l-kriterja speċifika tat-test tal-biodegradabbilità faċli li tintilef.
            BIBLJOGRAFIJA
            Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.
         
         
            ANNESS V
            KORREZZJONI TAT-TEĦID TA' L-OSSIĠENU GĦALL-INTERFERENZA BIN-NITRIFIKAZZJONI
            Żbalji minħabba li ma tkunx ikkonsidrata n-nitrifikazzjoni fil-kalkolazzjoni tat-teħid ta' l-ossiġenu bilbiodegradabbilità tas-sustanzi tat-test li ma jkun fihom N huma marġinali (mhux akbar minn 5 %), anki jekk l-ossidazzjoni ta' l-ammonju-N fil-medja isseħħ b'mod erratiku bħal bejn ir-reċipjenti tat-test u l-imbjank. B'danakollu, għal sustanzi tat-test li jkun fihom N, żbalji serji jistgħu iseħħu.
            Jekk in-nitrifikazzjoni tkun seħħet imma ma tkunx kompluta, t-teħid osservat ta' l-ossiġenu bit-taħlita tarreazzjoni jista' jkun ikkoerruġut għall-ammont ta' l-ossiġenu użat fl-ammonju ossidizzanti għan-nitrit u nnitrat, jekk il-bidliet fil-konċentrazzjoni matul l-inkubazzjoni tan-nitrit u n-nitrat huma determinati bilkonsiderazzjoni ta' dawn l-ekwazzjonijiet li ġejjin:
            
                        2 NH4Cl + 3O2 = 2 HN O2 + 2 HCI + 2 H2O
                     
                     
                        (1)
                     
                  
                        2 HNO2 + O2 = 2 HNO3
                        
                     
                     
                        (2)
                     
                  
                        Globalment:
                     
                     
                         
                     
                  
                        2 NH4Cl + 4 O2 = 2 HNO3 + 2 HCl + 2 H2O
                     
                     
                        (3)
                     
                  Mill-ekwazzjoni (1), l-akkwist ta' l-ossiġenu bit-28 g ta' nitroġenu li jkun jinsab fil-klorid ta' l-ammonium (BH4C1) li jkun ossidizzat għan-nitrit huwa 96 g, i.e. fattur ta' 3,43 (96/28). Bl-istess mod, mill-ekwazzjoni (3), l-akkwist ta' l-ossiġenu bit-28 g ta' nitroġenu li jkun ossidizzat għan-nitrit huwa 128 g, i.e. fattur ta' 4,57 (128/28).
            Ladarba r-reazzjonijiet huma sekwenzali, li jkunu esegwiti minn speċje ta' bakterja distinta u differenti, huwa possibbli għall-konċentrazzjoni tan-nitrit li tiżdied jew tonqos; f'dan il-każ ta' laħħar, konċentrazzjoni ekwivalenti tan-nitrat ikun iffurmat. Għalhekk, l-ossiġenu ikkunsmat fil-formazzjoni ta' ornitrat hija 4,75 multiplikata biż-żieda fil-konċentrazzjoni tan-nitrat, filwaqt li l-ossiġenu assoċjaat mal-formazzjoni tan-nitri hija 3,43 multiplikata biż-żieda fil-konċentrazzjoni tan-nitrit jew bit-tnaqqis fil-konċentrazzjoni tagħha, ittelf ta' l-ossiġenu huwa -3,43 moltiplikat bit-tnaqqis fil-konċentrazzjoni.
            Dan ifisser:
            
                        02 ikkunsmat fil-formazzjoni tan-nitrat = 4,57  × iż-żieda fil-konċentrazzjoni tan-nitrat
                     
                     
                        (4)
                     
                  
                        u
                     
                     
                         
                     
                  
                        02 ikkunsmat fil-formazzjoni tan-nitrit = 3,43  × iż-żieda fil-konċentrazzjoni tan-nitrit
                     
                     
                        (5)
                     
                  
                        u
                     
                     
                         
                     
                  
                        02 mitluf fl-għebien tan-nitrit = -3,43  × it-tnaqqis fil-konċentrazzjoni tan-nitrat
                     
                     
                        (6)
                     
                  
                        Sabiex
                     
                     
                         
                     
                  
                        02 akkwistat minħabba n-nitrifikazzjoni = ±3,43  × il-kambjament fin-nitrit ikkonċentrat + 4,57  ×i żida fin-nitrat ikkonċentrat.
                     
                     
                        (7)
                     
                  
                        u għalhekk
                     
                     
                         
                     
                  
                        02 akkwistat minħabba l-ossidizzazzjoni C = l-akkwist totali osservat – l-akkwist minħabba nnitrifikazzjoni
                     
                     
                        (8)
                     
                  B'mod alternattiv, jekk it-total biss ta' l-N ossidizzat huwa determinat, l-akkwista ta' l-ossiġenu minħabba nnitrifikazzjonijista' jkun meqjus bħala, fl-ewwel approssimazzjoni, 4,57 × iż-żieda fl-N ossidizzat.
            Il-valur ikkorreġut għall-konsum ta' l-ossiġenu minħabba l-ossidizzazzjoni ta' C huwa mbagħad imqabbel mal- ThOD NH3, kif ikkalkolat fl-Anness II.
         
         C.5   DEGRADAZZJONI – TALBA TA' L-OSSIĠENU BIOKEMIKALI
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         L-iskop tal-metodu huwa l-kejl tat-talba ta' l-ossiġenu biokemikali (BOD) ta' sustanzi organiċi solidi u likwidi.
         L-informazzjoni elaborata b'dan it-test tappartjeni għal komposti li jinħallu fl-ilmal b'dana kollu, komposti volatili u dawk b'solubbiltà baxxa fl-ilma jistgħu wkoll, għall-anqas fil-prinċipju, jkunu ittestjati.
         Il-metodu huwa applikabbli biss għal dawk il-materja organiċi tat-test li ma humiex inibitorji għall-bakterja fil-konċentrazzjoni użata fit-test. Jekk il-materjal tat-test ma jkunx jinħall fil-konċentrazzjoni tat-test, miżuri speċjali, bħalma hu l-użu ta' dispersjoni ultrasonika, jistgħu jkunu wżati sabiex tkun akkwistata dispersjoni tajba tal-materjal tat-test.
         Informazzjoni dwar it-tossiċità tal-kimika tista tkun utili għall-interpretazzjoni ta' riżultati baxxi u fil-għażla tal-konċentrazzjonijiet xierqa tat-test.
         1.2.   DEFINIZZJONI U UNITAJIET
         Il-BOD huwa definit bħala l-massa ta' ossiġenu mdewweb meħtieġ minn volum speċifikat tat-taħlita tas-sustanza għall-proċess ta' l-ossidizzazzjoni biokimika skond il-kondizzjonijiet preskritti.
         Dawn ir-riżultati huma espressi bħala grammi tal-BOD f'kull gramma tas-sustanza ittestjata.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         L-użu ta' sustanza ta' referenza xierqa għall-verifika ta' l-attività ta' l-inoculum hija mixtieqa.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Ammont predominanti tas-sustanza, mdewweb jew imxerred b'medja adatta sew-arjata, huwa innokulat mal-mikro-organiżmi u inkubat f'temperatura kostanti ambjenti definita, f'post fid-dlam.
         Il-BOD huwa determinat bid-differenza tal-kontenut ta' l-ossiġenu mdewweb fil-bidu u fit-tmien tat-test. It-tul ta' żmien tat-test għandu jkun mill-anqas ħamest ijiem u mhux aktaar minn 28 jum.
         Imbjank għandu jkun determinat f'assaġġ parallel li ma jkun fih l-ebda sustanza tat-test.
         1.5.   KRITERJA TAL-KWALITÀ
         Id-determinazzjoni BOD ma tistgħax tkun meqjusa bħala determinazzjoni valida tal-biodegradabbiltà ta' sustanza. Dan it-test jista biss ikun meqjus bħala test ta' prova.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         Taħlita jew tixrid preliminari tas-sustanza huwa ippreparat sabiex tkun akkwista l-konċentrazzjoni BOD kompatibbli mal-metodu użat. Il-BOD huwa mbagħad determinat skond kwalunkwe metodu standardizzat nazzjonali jew internazzjonali.
         2.   DATA U EVALWAZZJONI
         Il-BOD li jkun jinsab fit-taħlita preliminari huwa kalkolat skond il-metodu normalizzat magħżul, u konvertit fi grammi ta' BOD kull gramma tas-sustanza tat-test.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         Il-metodu użat għandu jkun mistqarr.
         It-talba għall-ossiġenu biokemikali għandha tkun il-medja ta' mill-anqas tlett kejl validi.
         L-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu irrappurtati, speċjalment f'dak li jirrigwardja l-impuritajiet, l-istat fiżiku, l-effetti tossiċi u l-komposizzjoni inerenti tas-sustanza.li jkunu jaffettwaw ir-riżultati.
         L-użu ta' addittiv għall-inibizzjoni tan-nitrifikazzjoni bioloġika għandu jkun irrappurtat.
         4.   REFERENZI
         
         Lista ta' metodi standardizzati, per eżempju:
         
                      
                  
                  
                     NF T 90-103: Determinazzjoni tat-talba ta' l-ossiġenu biokemikali.
                  
               
                      
                  
                  
                     NBN 407: Talba ta' l-ossiġenu biokemikali.
                  
               
                      
                  
                  
                     NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV).
                  
               
                      
                  
                  
                     Id-determinazzjoni tat-talba ta' l-ossiġenu biokemikali, il-Metodu S għall-eżaminazzjoni ta' l-ilma u l-materjali assoċjati, HMSO, Londra.
                  
               
                      
                  
                  
                     ISO 5815: Determinazzjoni tat-talba ta' l-ossiġenu biokemikali wara n jiem.
                  
               C.6.   DEGRADAZZJONI — TALBA TA' L-OSSIĠENU KEMIKALI
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         L-iskop tal-metodu huwa l-kejl tat-talba ta' l-ossiġenu kemikali (COD) ta' sustanzi organiċi solidi u likwidi f'manjera normali, arbitrarja, skond kondizzjonijiet fissi tal-laboratorju.
         Informazzjoni dwar il-formula tas-sustanza tkun utili għat-twettieq tat-test u l-interpretazzjoni tar-riżultat akkwistat (eż. imluħa aloġenizzati, imluħa ferrużi ta' komposti organiċi, komposti organoklorini).
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET U U NITAJIET
         It-talba ta' l-ossiġenu kemikali hija l-kejl ta' l-ossidabbilità ta' sustanza, espressa fl-ammont ekwivalenti ta' ossiġenu ta' reaġent ossidizzanti ikkunsmat mis-sustanza skond kondizzjonijiet fiss-tal-laboratorju.
         Ir-riżultat huwa espress bħala grammi tal-COD kull gramma tas-sustanza ittestjata.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Sustanzi ta' referenza ma jeħtieġux li jkunu wżati fil-każi kollha meta tkun investigata sustanza ġdida. Dawn għandhom primarjament iservu għall-kalibrazzjoni tal-metodu minn żmien għal żmien u sabiex jippermettu l-paragun mar-riżultati tal-metodu applikat.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Ammont predeterminat tas-sustanza, imdewba jew imxerda fl-ilma, huwa ossidizzat bid-dikromat tal-putass f'medja qawwija ta' l-aċidu sulfuriku bis-sulfat tal-fidda bħala katalist, taħt reflus għal sagħtejn. Id-dikromat residwu huwa determinat bit-titrazzjoni mas-sulfat ta' l-ammonium ferruż standardizzat.
         Fil-każ ta' sustanzi li jkun fihom il-klorin (2), sulfat tal-merkurju huwa miżjud sabiex titnaqqas l-interferenza tal-klorid.
         1.5.   KRITERJA TAL-KWALITÀ
         Minħabba l-manjiera arbitrarja tad-determinazzjoni, il-COD huwa “indikatur ossidizzabbli” u bhala tali użat bħala metodu prattiku fil-kejl tal-materja organika.
         Il-klorid jista jinterferixxi f'dan it-test, aġenti inorganiċi tat-tnaqqis jew ta' l-ossidizzazzjoni jistgħu ukoll jinterferixxu mad-determinazzjoni tal-COD.
         Uħud mill-kompost ċikliċi u ħafna mis-sustanzi volaiti (eż. aċidi xaħmija baxxi) ma humiex kompletament ossidizzati b'dan it-test.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         Taħlita jew tixrid preliminarji tas-sustanza huma ippreparati sabiex ikun akkwistat COD bejn 250 u 600 mg kull litru.
         
            Rimarki:
         
         Fil-każ ta' sustanza li ma tantx tinħall u mhux-dispersibbli, ammont ta' sustanza miġjuba trab fin jew sustanza likwida korrespondenti għal madwar S mg ta' COD tista tkun miżuna u poġġuta fl-apparat esperimentali bl-ilma.
         It-talba ta' l-ossiġeni kemikali (COD) hija ta' spiss u speċjalment fil-każ ta' sustanzi li ma tantx jinħallu, determinata b'mod vantaġġuż ġewwa varjant tal-metodu, i.e., f'sistema magħluqa bl-ekwalizzatur tal-pressjoni (H. Kelkenberg, 1975). F'din il-modifika, l-komposti huma determinati biss b'diffikulta bil-metodu konvenzjonali. – eż. aċidu aċetiku – jista ta' spiss ikun kwantifikat b'suċċess. Il-metodu wkoll jonqos, b'dana kollu, fil-każ tal-pridin Jekk il-konċentrazzjoni tad-dikromat tal-putassa, kif preskritt fir-ref. (1), huma mtella għal 0,25 N (0,0416 M), l-użin dirett ta' 5-10 mg tas-sustanza huwa faċilitat, li huwa essenzali għad-determinazzjoni tal-COD ta' sustanzi li ma tantx jinħallu fl-ilma (ref. (2)).
         Altrimenti l-BOD huwa mbagħad determinat skond kwalunkwe metodu xieraq standardizzat nazzjonali jew internazzjonali.
         2.   DATA U EVALWAZZJONI
         Il-COD li jkun jinsab fil-garafina sperimentali huwa ikkalkolat skond il-metodu normalizzat magħżul, u ikkonvertit fi grammi ta' COD kull gramma tas-sustanza tat-test.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         Il-metodu użat għandu jkun mistqarr.
         It-talba għall-ossiġenu kemikali għandha tkun il-medja ta' mill-anqas tlett kejl validi. L-informazzjoni u r-rimarki kollha relevanti għall-interpretazzjoni tar-riżultati għandhom ikunu irrappurtati, speċjalment f'dak li jirrigwardja l-impuritajiet, l-istat fiżiku, l-effetti tossiċi u l-komposizzjoni inerenti tas-sustanza.li jkunu jaffetwaw ir-riżultati.
         L-użu tas-sulfat tal-merkurju għal minimizzar ta' l-interferenza tal-klorid għandu jkun rapportat.
         4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Kelkenberg, H.,Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, vol. 8, 146
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.
                     Lista ta' metodi standardizzati, per eżempju:
                     
                                  
                              
                              
                                 NBN T 91-201 Id-determinazzjoni tad-domanda kemikali ta' l-ossiġnu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 ISBN 0 11 7512494 Id-domanda kemikali ta' l-ossiġnu (il-valur tad-dichromate) ta' l-ilmijiet imniġġsa u waste waters.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 NFT 90-101 Id-determinazzjoni tad-domanda kemikali ta' l-ossiġnu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 DS 217 = L-analiżi ta' l-ilma Id-determinazzjoni tad-domanda kemikali ta' l-ossiġnu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 DIN 38409-H-41 Id-determinazzjoni tad-domanda kemikali ta' l-ossiġnu (COD) fil-medda li tasal iktar minn 15 mg kull litru.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 ISO 6060 Kwalità ta' l-ilma: talba ta' l-ossiġenu kemikali metodi dikromati.
                              
                           
               C.7.   ID-DEGRADAZZJONI – ID-DEGRADAZZJONI ANTIBIJOTIKA: L-IDROLISI BĦALA FUNZJONI TAL-PH
         1.   METODU
         Dan il-metodu tat-test huwa ekwivalenti għall-OECD TG 111 (2004).
         1.1.   DAĦLA
         Il-kimiċi jistgħu jidħlu fl-ilmijiet tal-wiċċ b'tali metodi bħall-applikazzjoni diretta, l-irxiex, l-ilma li jiskula, id-drenaġġ, ir-rimi ta' l-iskart, l-effluwent industrijali, domestiku jew agrikolu u d-depożizzjoni atmosferika u jistgħu jiġu ttrasformati f'dawk l-ilmijiet minn proċessi kimiċi (eż. l-idrolisi, l-ossidazzjoni), fotokimiċi u/jew mikrobjali. Din il-Linja Gwida tiddeskrivi metodu tat-test fil-laboratorju biex jiġu stmati trasformazzjonijiet idrolitiċi abjotiċi tal-kimiċi f'sistemi akkwatiċi ta' valuri pH normalment misjuba fl-ambjent (pH 4 – 9) u hija bbażati fuq Linji Gwidi eżistenti (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).
         L-esperimenti huma mwettqa sabiex jiġu ddeterminati (i) ir-rata ta' l-idrolisi tas-sustanza tat-test bħala funzjoni tal-pH u (ii) l-identità jew in-natura u r-rati tal-formazzjoni u t-tnaqqis tal-prodotti ta' l-idrolisi li għalihom jistgħu jiġu esposti l-organiżmi. Dawn l-istudji jistgħu jkunu meħtieġa għall-kimiċi li huma direttament applikati għall-ilma jew li x'aktarx jilħqu l-ambjent b'meżżi oħrajn deskritti hawn fuq.
         1.2.   DEFINIZJONIJIET U UNITAJIET
         Ara l-Anness 2
         1.3.   L-APPLIKABILITÀ TAL-METODU
         Il-metodu ġeneralment jgħodd għal sustanzi kimiċi (mingħajr tikketta jew bit-tikketta) li għalihom huwa disponibbli metodu analitiku bi preċiżjoni u sensittività biżżejjed. Jgħodd għall-komposti ftit volatili u mhux volatili ta' solubbiltà suffiċjenti fl-ilma. It-test ma għandux jgħodd għall-kimiċi li huma volatili ħafna mill-ilma (eż. fumiganti, solventi organiċi) u għalhekk ma jistax jinżamm fit-taħlita taħt il-kondizzjonijiet esperimentali ta' dan it-test. It-test jista' jkun diffiċli li jitwettaq b'sustanzi ta' solubbiltà minima fl-ilma (8).
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Taħlitiet buffer solubbli bl-ilma ta' valuri pH differenti (pH 4, 7 u 9) huma trattati bis-sustanza tat-test u inkubati fid-dlam taħt kondizzjonijiet tal-laboratorju kkontrollati (b'temperaturi kostanti). Wara intervalli xierqa ta' żmien, it-taħlitiet buffer huma analizzati għas-sustanza tat-test u għall-prodotti ta' l-idrolisi. Bis-sustanza tat-test ittikkettjat (eż. 14C), jista' jiġi stabbilit bilanċ tal-massa b'mod aktar faċli.
         Dan il-metodu tat-test huwa diżinjat bħala strateġija f'saffi li tintwera u hija spjegata fl-Anness 1, Kull saff huwa mibdi mir-riżultati tas-saff ta' qablu.
         1.5.   L-INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAT-TEST
         Is-sustanza tat-test mingħajr tikketta jew bit-tikketta tista' tintuża biex titkejjel ir-rata ta' l-idrolisi. Il-materjal ittikkettjat ġeneralment huwa preferut għall-istudju tar-rotta ta' l-idrolisi u biex jitwaqqaf il-bilanċ tal-massa; iżda, f'każijiet speċjali, l-ittikkettjar jista' ma jkunx assolutament neċessarju. L-ittikkettjar ta' 14C huwa rrakkomandat iżda l-użu ta' iżotopi oħrajn bħal 13C, 15N, 3H, jista' jkun utli wkoll. Sa fejn possibbli, it-tikketta għandha tkun pożizzjonata fil-parti(jiet) l-aktar stabbli tal-molekula. Per eżempju, jekk is-sustanza tat-test fiha ċirku wieħed, it-tikkettjar fuq dan iċ-ċirku huwa meħtieġ; jekk is-sustanza tat-test fiha żewġ ċrieki jew aktar, jistgħu jkunu meħtieġa studji separati biex jiġi evalwat id-destin ta' kull ċirku ttikkettjat u biex jinkiseb l-informazzjoni xierqa dwar il-formazzjoni tal-prodotti ta' l-idrolisi. Is-safa tas-sustanza tat-test għandha tkun mhux inqas minn 95 %.
         Qabel ma jsir it-test ta' l-idrolisi, għandha tkun disponibbli din l-informazzjoni li ġejja dwar is-sustanza tat-test:
         
                     a)
                  
                  
                     is-solubbiltà fl-ilma [Il-Metodu tat-Test A.6];
                  
               
                     b)
                  
                  
                     is-solubbiltà fis-solventi organiċi;
                  
               
                     ċ)
                  
                  
                     il-pressa tal-fwar [Metodu tat-Test A.4] u/jew il-kostant tal-Liġi ta' Henry;
                  
               
                     d)
                  
                  
                     il-koeffiċjenti tal-qsim n-octanol/ilma [Il-Metodu tat-Test A.8];
                  
               
                     e)
                  
                  
                     il-kostant tad-dissoċjazzjoni (pKa) [Linja Gwida 112 ta' l-OECD] (9);
                  
               
                     f)
                  
                  
                     rata ta' fototrasformazzjoni diretta u indiretta fl-ilma fejn xieraq.
                  
               Il-metodi analitiċi għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza tat-test u, jekk huwa rilevanti, għall-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni tal-prodotti ta' l-idrolisi f'taħlitiet bl-ilma għandhom ikunu disponibbli (ara wkoll it-taqsima 1.7.2).
         1.6.   IS-SUSTANZI TA' RIFERENZA
         Fejn possibbli, is-sustanzi ta' riferenza għandhom jintużaw għall-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni tal-prodotti ta' l-idrolisi bil-metodi spettroskopiċi u kromatografiċi jew metodi oħrajn sensittivi b'mod xieraq.
         1.7.   IL-KRITERJI TAL-KWALITÀ
         1.7.1.   L-irkupru
         L-analiżi ta', għall-inqas, soluzzjonijiet buffer doppji jew ta' l-estratti tagħhom immedjatament wara ż-żjieda tas-sustanza tat-test tagħti l-ewwel indikazzjoni tar-repetibbiltà tal-metodu analitiku u ta' l-uniformità tal-proċedura ta' l-applikazzjoni għas-sustanza tat-test. L-irkupru għal stadji aktar tard ta' l-esperimenti jingħata bil-bilanċi tal-massa rispettivi (meta jintuża materjal ittikkettjat). L-irkupru għandu jvarja minn 90 % sa 110 % għal kimiċi ttikkettjati u mhux ittikkettjati (7). Fil-każ li huwa teknikament diffiċli li tintlaħaq din l-iskala, irkupru ta' 70 % għall-kimiċi mhux ittikkettjati, iżda għandha tingħata ġustifikazzjoni.
         1.7.2.   Ir-repetibbiltà u s-sensittività tal-metodu analitiku
         Ir-repetibbiltà tal-metodu/i analitiku/iċi biex tiġi kkwantifikata s-sustanza tat-test u l-prodotti ta' l-idrolisi f'ħinijiet aktar tard tista' tiġi vverifikata bl-analiżi doppja ta' l-istess taħlitiet buffer (jew ta' l-estratti tagħhom) wara li biżżejjed kwantitajiet ta' prodotti ta' l-idroliġi jkunu ffurmaw għall-kwantifikazzjoni .
         Il-metodu analitiku għandu jkun sensittiv biżżejjed biex il-konċentrazzjonijiet tas-sustanzi tat-test jiġu kkwalifikati sa 10 % jew inqas mill-konċentrazzjonijiet inizjali. Jekk huwa rilevanti, il-metodi analitiċi għandhom ukoll ikunu sensittivi biżżejjed biex jiġi kkwantifikat kwalunkwe prodott ta' l-idrolisi li jirrappreżenta 10 % jew aktar mill-applikat (fi kwalunkwe ħin matul l-istudju) sa 25 % jew inqas mill-konċentrazzjoni l-aktar għolja tagħha.
         1.7.3.   L-intervalli ta' kunfidenza għad-data kinetika ta' l-idrolisi
         L-intervalli ta' kunfidenza għandhom jinħadmu u jiġu ppreżentati għall-koeffiċjenti kollha tar-rigressjoni, il-kostanti tar-rati, il-half-lives, u kwalunkwe parametri kinetiċi oħrajn (eż. DT50).
         1.8.   ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.8.1.   It-tagħmir u l-apparat
         L-istudju għandu jsir f'kontenituri tal-ħġieġ (eż. tubi tat-testijiet, fliexken żgħar) taħt kundizzjonijiet mudlama u sterili, jekk meħtieġ, kemm-il darba l-informazzjoni preliminiari (bħall-koeffiċjenti tal-qsim ta' l-n-octanol-ilma) ma tindikax li s-sustanza tat-test tista' teħel mal-ħġieġ. F'dawn il-każijiet, jistgħu jkunu jridu jitqiesu materjali alternattivi (bħal Teflon). Jista' wkoll ikun possibbli li tittaffa l-problema ta' twaħħil mal-ħġieġ bl-użu ta' wieħed jew aktar minn dawn il-metodi:
         
                     —
                  
                  
                     id-determinazzjoni tal-massa tas-sustanza tat-test u tal-prodotti ta' l-idrolisi sorbiti mal-kontenitur tat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-użu ta' banju ultrasoniku;
                  
               
                     —
                  
                  
                     tiġi żgurata ħasla bis-solventi ta' l-oġġetti kollha tal-ħġieġ f'kull intervall tat-teħid tal-kampjuni;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-użu ta' prodotti formulati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-użu ta' ammont akbar ta' kosolvent għaż-żjieda tas-sustanza tat-test mas-sistema; jekk jintuża kosolvent għandu jkun kosolvent li ma jidrolizzax is-sustanza tat-test.
                  
               Normalment huma meħtieġa oġġetti li jaġitaw il-banju ta' l-ilma u kkontrollati mit-temperatura jew inkubaturi kkontrollati termostatikament għall-inkubazzjoni tat-taħlitiet differenti tat-test.
         Huwa meħtieġ tagħmir standard tal-laboratorju, inkluż b'mod partikolari, dawn li ġejjin
         
                     —
                  
                  
                     miter tal-pH;
                  
               
                     —
                  
                  
                     strumenti analitiċi bħal tagħmir GC, HPLC, TLC, inklużi s-sistemi xierqa ta' l-iskoperta biex jiġu analizzati sustanzi radiotikkettjati u mhux tikkettjati jew il-metodu tat-taħlit ta' l-iżotopi inversi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-istrumenti għall-iskopijiet ta' l-identifikazzjoni (eż. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR, eċċ.);
                  
               
                     —
                  
                  
                     kalkulatur tal-fluworexxenza tal-likwidu;
                  
               
                     —
                  
                  
                     lembub li jisseparaw għall-estrazzjoni ta' likwidi-likwidi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     strumentazzjoni biex jiġu kkonċentrati t-taħlitiet u l-estratti (eż. evaporator li jdur);
                  
               
                     —
                  
                  
                     tagħmir li jikkontrolla t-temperatura (eż. banju ta' l-ilma).
                  
               Ir-reaġenti kimiċi jinkludu, per eżempju:
         
                     —
                  
                  
                     solventi organiċi, grad analitiku, bħal hexane, dichloromethane, eċċ.;
                  
               
                     —
                  
                  
                     likwidu tal-fluworexxenza;
                  
               
                     —
                  
                  
                     taħlitiet buffer (għad-dettalji ara t-taqsima 1.8.3).
                  
               L-oġġetti kollha tal-ħġieġ, l-ilma tal-grad ta' reaġent u t-taħlitiet buffer użati fit-testijiet ta' l-idrolisi għandhom jiġu sterilizzati.
         1.8.2.   L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test
         Is-sustanza tat-test għandha tiġi applikata bħala taħlita ilmija fit-taħlitiet buffer differenti (ara l-Anness 3). Jekk huwa meħtieġ għat-taħlit xieraq, l-użu ta' ammonti żgħar ta' solventi li jitħalltu fl-ilma (bħall-acetonitrile, acetone, etanol) huwa permess għall-applikazzjoni u d-distribuzzjoni tas-sustanza tat-test iżda dan ma għandux normalment jeċċedi 1 % v/v. Fil-każ li titqies konċentrazzjoni ogħla ta' solventi (eż. fil-każ ta' sustanzi tat-test li ma tantx jinħallu), dan jista' jkun permess biss meta jista' jintwera li s-solvent ma għandu ebda effett fuq l-idrolisi tas-sustanzi tat-test.
         L-użu ta' prodott formulat mhuwiex rakkomandat bħala rutina, għaliex ma jistax jiġi eskluż li l-ingredjenti tal-formulazzjoni jistgħu jinfluwenzaw il-proċess ta' l-idrolisi. Madankollu, għas-sustanzi tat-test li ma tantx jinħallu fl-ilma jew għal sustanzi li jeħlu mal-ħġieġ (ara t-taqsima 1.8.1), l-użu ta' materjal formulat jista' jkun alternattiv xieraq. Għandha tintuża konċentrazzjoni waħda tas-sustanza tat-test;
         ma għandhiex teċċedi 0,01 M jew nofs il-konċentrazzjoni tas-saturazzjoni (ara l-Anness 1).
         1.8.3.   It-taħlitiet buffer
         It-test ta' l-idrolisi għandu jitwettaq f'valuri pH ta' 4, 7 u 9. Għal dan l-iskop, it-taħlitiet buffer għandhom jiġu ppreparati bl-użu ta' kimiċi tal-grad ta' reaġenti u ilma. Xi sistemi utli buffer huma ppreżentati fl-Anness 3. Għandu jiġi nnutat li s-sistema buffer użata tista' tinfluwenza r-rata ta' l-idrolisi u fejn dan huwa osservat għandha tintuża sistema alternata ta' buffer
             (3).
         Il-pH ta' kull taħlita buffer għandu jiġi vverifikat b' pH meter ikkalibrat sa preċiżjoni sa għall-inqas 0,1 fit-temperatura meħtieġa.
         1.8.4.   Il-kondizzjonijiet tat-test
         1.8.4.1.   It-temperatura tat-test
         L-esperimenti ta' l-idrolisi għandhom isiru f'temperaturi kostanti. Għall-iskopijiet ta' l-estrapolazzjoni, huwa importanti li tinżamm it-temperatura sa għall-inqas ±0,5 oC.
         Test preliminari (Livell 1) għandu jitwettaq f'temperatura ta' 50 oC jekk l-imġieba idrolitika tas-sustanza tat-test mhijiex magħrufa. It-testijiet kinetiċi ta' Livell Ogħla għandhom isiru f'mhux inqas minn tliet temperaturi (inkluż it-test ta' 50 oC) sakemm is-sustanza tat-test hija stabbli għall-idrolisi kif determinat mill-ittestjar tal-Livell 1. Skala suġġerita tat-temperatura hija 10-70 oC (preferibbilment f'għall-inqas temperatura waħda inqas minn 25 oC użat), li jinkludi t-temperatura tar-rapportar ta' 25 oC u l-parti l-kbira tat-temperaturi misjuba fil-qasam.
         1.8.4.2.   Dawl u ossiġenu
         It-testijiet ta' l-idrolisi għandhom isiru bl-użu ta' kwalunkwe metodu xieraq biex jiġu evitati effetti fotolitiċi. Il-miżuri kollha xierqa għandhom jittieħdu biex jiġi evitat l-ossiġenu (eż. bit-tbaqbiq tal-helium, nitroġenu jew argon għal 5 minuti qabel il-preparazzjoni tat-taħlita).
         1.8.4.3.   Kemm idum it-test
         It-test preliminari għandu jsir għal 5 ijiem filwaqt li t-testijiet tal-Livell Ogħla għandhom isiru sad-90 % idrolisi tas-sustanza tat-test jew għal 30 jum, skond x'jiġi l-ewwel.
         1.8.5.   It-twettiq tat-test
         1.8.5.1.   It-test preliminari (Livell 1)
         It-test preliminari jsir f'temperatura ta' 50 ± 0,5 oC u pH 4,0, 7,0 u 9,0. Jekk inqas minn 10 fil-mija ta' l-idrolisi jiġi osservat wara 5 ijiem (t0,5 f'temperatura ta' 25 oC > 1 sena) is-sustanza tat-test titqies idrolitikament stabbli u, normalment, ma hu meħtieġ ebda ttestjar addizzjonali. Jekk is-sustanza hija magħrufa li hija instabbli f'temperaturi ambjentalment rilevanti (4), it-test preliminari mhuwiex meħtieġ. Il-metodu analitiku għandu jkun preċiż u sensittiv biżżejjed biex jiġi skopert tnaqqis ta' 10 fil-mija fil-konċentrazzjoni inizjali.
         1.8.5.2.   L-idrolisi ta' sustanzi mhux stabbli (Livell 2)
         It-test tal-Livell Ogħla (avvanzat) għandu jsir fil-valuri pH li fihom is-sustanza tat-test tinstab instabbli kif definit mit-test preliminari hawn fuq. It-taħlitiet buffered tas-sustanza tat-test għandhom ikunu termostatati fit-temperaturi magħżula. Biex isir it-test għall-imġieba ta' l-ewwel ordni, kull reazzjoni tat-taħlita għandha tiġi analizzata f'intervalli ta' żmien li jipprovdu minimu ta' sitt punti ta' data spazjati bejn 10 % u 90 % ta' l-idrolisi tas-sustanza tat-test. Il-kampjuni replikati tat-test individwali (minimu ta' kampjuni duplikati li jinsabu f'kontenituri separati tar-reazzjoni) għandhom jitneħħew u l-kontenuti jiġu analizzati f'kull wieħed mis-sitt drabi tat-teħid tal-kampjuni (għal mhux inqas minn tnax-il punt tad-data doppja). L-użu ta' kampjun kbir wieħed li minnhom jitneħħew l-aliquots individwali tat-taħlita tat-test f'kull intervall tat-teħid tal-kampjuni jitqies li mhux xieraq, għaliex ma jippermettix l-analiżi tal-varjabbiltà tad-data u jista' jwassal għal problemi bil-kontaminazzjoni tat-taħlita tat-test. It-testijiet tal-konferma ta' l-isterilità għandhom isiru fl-aħħar tat-test tal-Livell ogħla (jiġifieri f'90 % idrolisi jew 30 jum). Iżda, jekk ma tiġi osservata ebda degradazzjoni (jiġifier t-trasformazzjoni), it-testijiet ta' l-isterilità ma jitqisux meħtieġa.
         1.8.5.3.   L-identifikazzjoni tal-prodotti ta' l-idrolisi (Livell 3)
         Kwalunkwe prodott ewlieni ta' l-idrolisi għall-inqas dawk li jirrappreżentaw > 10 % tad-doża applikata għandu jiġi identifikat b'metodi xierqa analitika.
         1.8.5.4.   Testijiet mhux obbligatorji
         It-testijiet addizzjonali f'valuri pH minbarra 4, 7 u 9 jistgħu jkunu meħtieġa għal sustanza tat-test idrolitikament instabbli. Per eżempju, għall-iskopijiet fiżjoloġiċi jista' jkun meħtieġ test taħt kondizzjonijiet aktar aċidużi (eż. pH 1.2) bl-użu ta' temperatura unika fiżjoloġikament rilevanti (37 oC).
         2.   DATA
         L-ammonti tas-sustanza tat-test u tal-prodotti ta' l-idrolisi, jekk rilevanti, għandhom jingħataw bħala perċentwal tal-konċentrazzjoni inizjali applikata u, fejn xieraq, bħala mg/L għal kull interval tat-teħid tal-kampjuni u għal kull pH u temperatura tat-test. Barra minn dan, għandu jingħata bilanċ tal-massa f perċentwali tal-konċentrazzjoni inizjali applikata meta ntużat sustanza tat-test ittikkettjata.
         Preżentazzjoni grafika tad-data ta' logs trasformati tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test maż-żmien għandha tiġi rrapportata. Kwalunkwe prodott ewlieni ta' l-idrolisi għall-inqas dawk li jirrappreżentaw ≥ 10 % tad-doża applikata li għandu jiġi identifikat bil-konċentrazzjonijiet tal-logs trasformati għandu wkoll jista' jiġi ppjanat bl-istess mod bħas-sustanza ewlenija biex jidhru r-rati tal-formazzjoni u tat-tnaqqis tagħhom.
         2.1.   IT-TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         Determinazzjonijiet aktar preċiżi ta' half-lives jew ta' valuri DT50 għandha tinkiseb bl-applikazzjoni ta' kalkoli xierqa tal-mudelli kinetiċi il-valuri tal-half-life u/jew DT50 (inklużi l-limiti tal-kunfidenza) għandhom jiġu rrapportati għal kull pH u kull temperatura flimkien ma' deskrizzjoni tal-mudell użat, l-ordni tal-kinetika u l-koeffiċjenti tad-determinazzjoni (r2). Jekk xieraq, il-kalkoli għandhom ukoll jiġu applikati għall-prodotti ta' l-idrolisi.
         Fil-każ ta' studju ta' rati mwettqa f temperaturi differenti, il-kostanti ta' l-idrolisi tal-psewdo-ewwel ordni (kobs) għandhom jiġu deskritti bħala funzjoni tat-temperatura. Il-kalkolu għandu jiġi bbażat fuq kemm is-separazzjoni tal-kobs f kostanti tar-rati għall-idrolisi katalizzata bl-aċidu, newtrali u kkatalizzati bil-bażi (kH, kneutral, u kOH rispettivament) u l-ekwazzjoni ta' Arrhenius:
         
            
         fejn Ai u Bi huma kostanti tar-rigressjoni mill-interċett u l-gradjent, rispettivament, tal-linji li joqogħdu l-aħjar iġġenerati mir-rigress lineari ln ki kontra r-reċiproku tat-temperatura assoluta f Kelvin (T). Bl-użu tar-relazzjonijiet ta' Arrhenius għall-idrolisi kkatalizzata aċida, newtrali u bażi, il-kostanti tar-rata psewdo l-ewwel ordni, u għalhekk half-lives jistgħu jiġu kkalkolati għal temperaturi oħrajn li għalihom id-determinazzjoni diretta esperimentali tal-kostant tar-rata mhijiex prattikabbli (10).
         2.2.   L-EVALWAZZJONI U L-INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Il-parti l-kbira tar-reazzjonijiet ta' l-idrolisi jsegwu r-rati apparenti tar-reazzjonijiet ta' l-ewwel ordni u, għalhekk, il-half-lives huma indipendenti mill-konċentrazzjoni (ara l-ekwazzjoni 4 fl-Anness 2). Dan normalment jippermetti l-applikazzjoni tar-riżultati tal-laboratorju determinati bħala 10-2 sa 10-3 M għal kondizzjonijiet ambjentali (≤ 10-6 M) (10). Bosta eżempji ta' ftehim tajjeb bejn ir-rati ta' l-idrolisi mkejla f'ilmijiet kemm puri kif ukoll naturali għal varjetà ta' kimiċi ġew irrapportati minn Mabey u Mill (11), kemm-il darba kemm il-pH kif ukoll it-temperatura kienu tkejlu.
         3.   IR-RAPPORTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi għall-inqas din l-informazzjoni li ġejja:
         Is-sustanza tat-test:
         
                     —
                  
                  
                     isem komuni, isem tal-kimika, CAS numru, formula strutturali (li tindika l- pożizzjoni tat-tikketta meta jintuża materjal radjotikkettjat) u karatteristiċi rilevanti fiżiċi-kimiċi (ara t-taqsima 1.5);
                  
               
                     —
                  
                  
                     purità (impuritajiet) tas-sustanza tat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     purità tat-tikketta ta' kimika ttikkettjata u attività molari (fejn xieraq).
                  
               
                     —
                  
                  
                     taħlitiet buffer:
                  
               
                     —
                  
                  
                     dati u dettalji tal-preparazzjoni
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        buffers u ilmijiet użati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     molarità u pH tat-taħlitiet buffer.
                  
               Il-kondizzjonijiet tat-test:
         
                     —
                  
                  
                     id-dati tat-twettiq ta' l-istudji;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-ammont tas-sustanza tat-test applikati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-metodu u s-solventi (tip u ammont) użati għall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-volum tat-taħlitiet buffered tas-sustanza tat-test inkubati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni tas-sistema ta' inkubazzjoni użata;
                  
               
                     —
                  
                  
                     pH u temperatura matul l-istudju;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ħinijiet tat-teħid tal-kampjuni;
                  
               
                     —
                  
                  
                     metodu/i ta' l-estrazzjoni;
                  
               
                     —
                  
                  
                     metodi biex jiġu kkwantifikati u identifikati s-sustanza tat-test u l-prodotti ta'l- idrolisi tagħha fit-taħlitiet buffer;
                  
               
                     —
                  
                  
                     għadd ta' replikati.
                  
               Riżultati:
         
                     —
                  
                  
                     repetibbiltà u sensittività tal-metodi analitiċi użati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     rkupru (valuri % għal studju validu jingħataw fit-taqsima 1.7.1);
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        data replikata u mezzi f'forom tabulari;
                  
               
                     —
                  
                  
                     bilanċ tal-massa matul u fl-aħħar ta' l-istudji (meta tintuża sustanza tat-test ittikkettjata);
                  
               
                     —
                  
                  
                     riżultati tat-test preliminari;
                  
               
                     —
                  
                  
                     diskussjoni u interpretazzjoni tar-riżultati;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-data u l-figuri kollha oriġinali.
                  
               Din l-informazzjoni li ġejja hija meħtieġa biss meta hija ddeterminata r-rata ta' l- idrolisi:
         
                     —
                  
                  
                     ippjanar fuq dijagramma ta' konċentrazzjonijiet kontra ħin għas-sustanzi tat-testu, fejn xieraq, għall-prodotti ta' l-idrolisi għal kull valur ta' pH u temperatura;
                  
               
                     —
                  
                  
                     tabelli tar-riżultati ta' l-ekwazzjoni Arrhenius għat-temperatura 20 oC/25 oC, bil-pH, kostant tar-rata [h-1 jew jum-1], half-life jew DT50, temperaturi [ oC] inklużi limiti tal-kunfidenza u l-koeffiċjenti tal-korrelazzjoni (r2) jew informazzjoni komparabbli;
                  
               
                     —
                  
                  
                     rotta proposta ta' l-idrolisi.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guideline for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25 oC. Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate Guidelines for registration of pesticides in Canada.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex V: Fate and Behaviour in the Environment.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (October 1980).
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment Nr.23.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994 – 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14th Annual Meeting of the Society of Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, November 1993).
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis of organic compounds in water under environmental conditions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.
                  
               
            ANNESS 1
            Tiered Hydrolysis Test Scheme
            
         
            ANNESS 2
            Definizjonijiet u Unitajiet
            
               L-Unitajiet In d Inte w fi kwalunkwe każ.
            
               Sustanza tat-Test: kwalunkwe sustanza, kemm jekk il-kompost ewlieni kif ukoll prodotti rilevanti tat-trasformazzjoni.
            
               Prodotti tat-trasformazzjoni: is-sustanzi kollha li jirriżultaw minn reazzjonijiet biotiċi jew abiotiċi tat-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test.
            
               Prodotti ta' l-idrolisi: is-sustanzi kollha li jirriżultaw mir-reazzjonijiet tat-trasformazzjoni idrolitika tas-sustanza tat-test.
            
               Idrolisi tirreferi għal reazzjoni ta' sustanza tat-test RX ma' l-ilma, bl-iskambju nett tal-grupp X ma' l-OH fiċ-ċentru tar-reazzjoni:
            
                        RX + HOH → ROH + HX
                     
                     
                        [1]
                     
                  Ir-rata li biha l-konċentrazzjoni ta' RX tonqos f'dan il-proċess simplifikat tingħata b'
            
                        rata = k [H2O] [RX]
                     
                     
                        reazzjoni tat-tieni ordni
                     
                  
                        jew
                     
                  
                        rata = k [RX]
                     
                     
                        reazzjoni ta' l-ewwel ordni
                     
                  skond il-pass li jiddetermina r-rata. Minħabba li l-ilma huwa preżenti f'eċċess kbir meta mqabbel mas-sustanza tat-test, dan it-tip ta' reazzjoni normalment huwa deskritt bhala reazzjoni tal-psewdo-ewwel ordni fejn il-kostant tar-rata osservat jingħata bir-relazzjoni
            
                        kobs = k [H2O]
                     
                     
                        [2]
                     
                  u jista' jiġi ddeterminat mill-espressjoni (*********)
            
            
                        
                            ln 
                           
                     
                     
                        [3]
                     
                  fejn
            
               t= ħin
            
               u Co, Ct
               = konċentrazzjonijiet ta' RX fil-ħinijiet 0 u t.
            L-unitajiet ta' dan il-konstant għandhom id-dimensjonijiet ta' (ħin)-1 u l-half-life tar-reazzjoni (ħin biex 50 % ta' RX jirreaġixxi) jingħata b'
            
                        
                           
                     
                     
                        [4]
                     
                  
               
                  Half-life
               : (t0,5) huwa l-ħin meħud għal 50 % idrolisi ta' sustanza tat-test meta r-reazzjoni tista' tiġi deskritta b'kinetiċi ta' l-ewwel ordni; huwa indipendenti mill-konċentrazzjoni.
            
               DT
               
                  50
                (
                  Disappearance Time
               
               (ħin biex jisparixxi) 50): huwa l-ħin li fih il-konċentrazzjoni tat-test titnaqqas b'50 %; huwa different mill-half-life t0,5 meta r-reazzjoni ma ssegwix kinetiċi ta' l-ewwel ordni.
            
               Stima ta' k f'temperatura differenti
            
            Meta l-konstanti tar-rata huma magħrufa għal żewġ temperaturi, il-kostanti tar-rata f'temperaturi oħrajn jistgħu jiġu kkalkolati bl-użu ta' l-ekwazzjoni ta' Arrhenius:
            
                jew 
            Tpinġija fid-djagramma ta' ln k versus 1/T tagħti linja dritta bi gradjent ta'–E/R
            Fejn
            
                        k
                     
                     
                        =
                     
                     
                        kostant tar-rata, imkejjel b'temperaturi differenti
                     
                  
                        E
                     
                     
                        =
                     
                     
                        enerġija ta' l-attivazzjoni [kJ/mol]
                     
                  
                        T
                     
                     
                        =
                     
                     
                        temperatura assoluta [K]
                     
                  
                        R
                     
                     
                        =
                     
                     
                        kostant tal-gass [8,314 J/mol.K]
                     
                  L-enerġija ta' l-attivazzjoni ġiet ikkalkolata bl-analiżi tar-rigressjoni jew l-ekwazzjoni li ġejja:
            
               
            fejn: T2 > T1.
         
         
            L-ANNESS 3
            Sistemi Buffer
            
            A.   CLARK U LUBS:
            Taħlitiet Buffer ta’ CLARK u LUBS
                   (**********)
               
            
            
                        Kompożizzjoni
                     
                     
                        pH
                     
                  
                        
                           0,2  N HCl U 0,2  N KCl AT 20 oC
                        
                     
                  
                        47,5  ml. HCl + 25 ml. KCl mħal. sa 100 ml
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        32,25  ml. HCl + 25 ml. KCl mħal. sa 100 ml
                     
                     
                        1,2 
                     
                  
                        20,75  ml. HCl + 25 ml. KCl mħal. sa 100 ml
                     
                     
                        1,4 
                     
                  
                        13,15  ml. HCl + 25 ml. KCl mħal. sa 100 ml
                     
                     
                        1,6 
                     
                  
                        8,3  ml. HCl + 25 ml. KCl mħal. sa 100 ml
                     
                     
                        1,8 
                     
                  
                        5,3  ml. HCl + 25 ml. KCl mħal. sa 100 ml
                     
                     
                        2,0 
                     
                  
                        3,35  ml. HCl + 25 ml. KCl mħal. sa 100 ml
                     
                     
                        2,2 
                     
                  
                        
                           0,1  M potassium biphthalate + 0,1  N HCl f'temperatura ta’ 20 oC
                        
                     
                  
                        46,70  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        2,2 
                     
                  
                        39,60  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        2,4 
                     
                  
                        32,95  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        2,6 
                     
                  
                        26,42  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        2,8 
                     
                  
                        20,32  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        3,0 
                     
                  
                        14,70  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        3,2 
                     
                  
                        9,90  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        3,4 
                     
                  
                        5,97  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        3,6 
                     
                  
                        2,63  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. biphthalate to 100 ml
                     
                     
                        3,8 
                     
                  
                        
                           0,1  M potassium biphthalate + 0,1  N NaOH f'temperatura ta’ 20 oC
                        
                     
                  
                        0,40  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        4,0 
                     
                  
                        3,70  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        4,2 
                     
                  
                        7,50  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        4,4 
                     
                  
                        12,15  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        4,6 
                     
                  
                        17,70  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        4,8 
                     
                  
                        23,85  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. biphthalate to 100 ml
                     
                     
                        5,0 
                     
                  
                        29,95  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        5,2 
                     
                  
                        35,45  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. biphthalate to 100 ml
                     
                     
                        5,4 
                     
                  
                        39,85  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. biphthalate to 100 ml
                     
                     
                        5,6 
                     
                  
                        43,00  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        5,8 
                     
                  
                        45,45  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. biphthalate sa 100 ml
                     
                     
                        6,0 
                     
                  Taħlitiet Buffer ta’ CLARK u LUBS (Ikompli)
            
                        
                           0,1  M monopotassium phosphate + 0,1  N NaOH f'temperatura ta’ 20 oC
                        
                     
                  
                        5,70  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml
                     
                     
                        6,0 
                     
                  
                        8,60  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml
                     
                     
                        6,2 
                     
                  
                        12,60  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml
                     
                     
                        6,4 
                     
                  
                        17,80  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml
                     
                     
                        6,6 
                     
                  
                        23,45  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml
                     
                     
                        6,8 
                     
                  
                        29,63  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml
                     
                     
                        7,0 
                     
                  
                        35,00  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml
                     
                     
                        7,2 
                     
                  
                        39,50  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml
                     
                     
                        7,4 
                     
                  
                        42,80  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml
                     
                     
                        7,6 
                     
                  
                        45,20  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml
                     
                     
                        7,8 
                     
                  
                        46,80  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. fosfat sa 100 ml
                     
                     
                        8,0 
                     
                  
                        
                           0,1  M H3B03 in 0,1  M KCl + 0,1  N NaOH f'temperatura ta’ 20 oC
                        
                     
                  
                        2,61  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. aċidu boriku sa 100 ml
                     
                     
                        7,8 
                     
                  
                        3,97  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. aċidu boriku sa 100 ml
                     
                     
                        8,0 
                     
                  
                        5,90  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. aċidu boriku sa 100 ml
                     
                     
                        8,2 
                     
                  
                        8,50  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. aċidu boriku sa 100 ml
                     
                     
                        8,4 
                     
                  
                        12,00  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. aċidu boriku sa 100 ml
                     
                     
                        8,6 
                     
                  
                        16,30  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. aċidu boriku sa 100 ml
                     
                     
                        8,8 
                     
                  
                        21,30  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. aċidu boriku sa 100 ml
                     
                     
                        9,0 
                     
                  
                        26,70  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. aċidu boriku sa 100 ml
                     
                     
                        9,2 
                     
                  
                        32,00  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. aċidu boriku sa 100 ml
                     
                     
                        9,4 
                     
                  
                        36,85  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. aċidu boriku sa 100 ml
                     
                     
                        9,6 
                     
                  
                        40,80  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. aċidu boriku sa 100 ml
                     
                     
                        9,8 
                     
                  
                        43,90  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. aċidu boriku sa 100 ml
                     
                     
                        10,0 
                     
                  B.   KOLTHOFF U VLEESCHHOUWER:
            
               Buffers taċ-ċitrat ta’ KOLTHOFF u VLEESCHHOUWER
            
                        Kompożizzjoni
                     
                     
                        pH
                     
                  
                        
                           0,1  M ċitrat tal-monopotassju u 0,1  N HCl f'temperatura ta’ 18 oC
                            (***********)
                        
                     
                  
                        49,7  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        2,2 
                     
                  
                        43,4  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        2,4 
                     
                  
                        36,8  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        2,6 
                     
                  
                        30,2  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        2,8 
                     
                  
                        23,6  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        3,0 
                     
                  
                        17,2  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        3,2 
                     
                  
                        10,7  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        3,4 
                     
                  
                        4,2  ml. 0,1  N HCl + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        3,6 
                     
                  
                        
                           0,1  M ċitrat tal-monopotassju u 0,1  N NaOH f'temperatura ta’ 18 oC
                            (***********)
                        
                     
                  
                        2,0  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        3,8 
                     
                  
                        9,0  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        4,0 
                     
                  
                        16,3  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        4,2 
                     
                  
                        23,7  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        4,4 
                     
                  
                        31,5  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        4,6 
                     
                  
                        39,2  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        4,8 
                     
                  
                        46,7  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        5,0 
                     
                  
                        54,2  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        5,2 
                     
                  
                        61,0  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        5,4 
                     
                  
                        68,0  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        5,6 
                     
                  
                        74,4  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        5,8 
                     
                  
                        81,2  ml. 0,1  N NaOH + 50 ml. ċitrat sa 100 ml
                     
                     
                        6,0 
                     
                  C.   SÖRENSEN:
            Taħlitiet Borate ta’ SÖRENSEN
            
                        Kompożizzjoni
                     
                     
                        Sörensen
                        18 oC
                     
                     
                        Walbum, pH f'temperatura ta’
                     
                  
                        ml. Borax
                     
                     
                        ml. HCl/NaOH
                     
                     
                        10 oC
                     
                     
                        40 oC
                     
                     
                        70 oC
                     
                  
                        
                           0,05  M borax + 0,1  N HCl
                        
                     
                  
                        5,25 
                     
                     
                        4,75 
                     
                     
                        7,62 
                     
                     
                        7,64 
                     
                     
                        7,55 
                     
                     
                        7,47 
                     
                  
                        5,50 
                     
                     
                        4,50 
                     
                     
                        7,94 
                     
                     
                        7,98 
                     
                     
                        7,86 
                     
                     
                        7,76 
                     
                  
                        5,75 
                     
                     
                        4,25 
                     
                     
                        8,14 
                     
                     
                        8,17 
                     
                     
                        8,06 
                     
                     
                        7,95 
                     
                  
                        6,00 
                     
                     
                        4,00 
                     
                     
                        8,29 
                     
                     
                        8,32 
                     
                     
                        8,19 
                     
                     
                        8,08 
                     
                  
                        6,50 
                     
                     
                        3,50 
                     
                     
                        8,51 
                     
                     
                        8,54 
                     
                     
                        8,40 
                     
                     
                        8,28 
                     
                  
                        7,00 
                     
                     
                        3,00 
                     
                     
                        8,08 
                     
                     
                        8,72 
                     
                     
                        8,56 
                     
                     
                        8,40 
                     
                  
                        7,50 
                     
                     
                        2,50 
                     
                     
                        8,80 
                     
                     
                        8,84 
                     
                     
                        8,67 
                     
                     
                        8,50 
                     
                  
                        8,00 
                     
                     
                        2,00 
                     
                     
                        8,91 
                     
                     
                        8,96 
                     
                     
                        8,77 
                     
                     
                        8,59 
                     
                  
                        8,50 
                     
                     
                        1,50 
                     
                     
                        9,01 
                     
                     
                        9,06 
                     
                     
                        8,86 
                     
                     
                        8,67 
                     
                  
                        9,00 
                     
                     
                        1,00 
                     
                     
                        9,09 
                     
                     
                        9,14 
                     
                     
                        8,94 
                     
                     
                        8,74 
                     
                  
                        9,50 
                     
                     
                        0,50 
                     
                     
                        9,17 
                     
                     
                        9,22 
                     
                     
                        9,01 
                     
                     
                        8,80 
                     
                  
                        10,00 
                     
                     
                        0,00 
                     
                     
                        9,24 
                     
                     
                        9,30 
                     
                     
                        9,08 
                     
                     
                        8,86 
                     
                  
                        
                           0,05  M borax + 0,1  N NaOH
                        
                     
                  
                        10,0 
                     
                     
                        0,0 
                     
                     
                        9,24 
                     
                     
                        9,30 
                     
                     
                        9,08 
                     
                     
                        8,86 
                     
                  
                        9,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        9,36 
                     
                     
                        9,42 
                     
                     
                        9,18 
                     
                     
                        8,94 
                     
                  
                        8,0 
                     
                     
                        2,0 
                     
                     
                        9,50 
                     
                     
                        9,57 
                     
                     
                        9,30 
                     
                     
                        9,02 
                     
                  
                        7,0 
                     
                     
                        3,0 
                     
                     
                        9,68 
                     
                     
                        9,76 
                     
                     
                        9,44 
                     
                     
                        9,12 
                     
                  
                        6,0 
                     
                     
                        4,0 
                     
                     
                        9,97 
                     
                     
                        10,06 
                     
                     
                        9,67 
                     
                     
                        9,28 
                     
                  Taħlitiet tal-fosfat ta’ SÖRENSEN
            
                        Kompożizzjoni
                     
                     
                        pH
                     
                  
                        
                           0,0667  M Monopotassium phosphate + 0,0667  M Disodium phosphate f'temperatura ta’ 20 oC
                        
                     
                  
                        99,2  ml. KH2PO4 + 0,8  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        5,0 
                     
                  
                        98,4  ml. KH2PO4 + 1,6  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        5,2 
                     
                  
                        97,3  ml. KH2PO4 + 2,7  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        5,4 
                     
                  
                        95,5  ml. KH2PO4 + 4,5  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        5,6 
                     
                  
                        92,8  ml. KH2PO4 + 7,2  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        5,8 
                     
                  
                        88,9  ml. KH2PO4 + 11,1  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        6,0 
                     
                  
                        83,0  ml. KH2PO4 + 17,0  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        6,2 
                     
                  
                        75,4  ml. KH2PO4 + 24,6  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        6,4 
                     
                  
                        65,3  ml. KH2PO4 + 34,7  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        6,6 
                     
                  
                        53,4  ml. KH2PO4 + 46,6  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        6,8 
                     
                  
                        41,3  ml. KH2PO4 + 58,7  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        7,0 
                     
                  
                        29,6  ml. KH2PO4 + 70,4  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        7,2 
                     
                  
                        19,7  ml. KH2PO4 + 80,3  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        7,4 
                     
                  
                        12,8  ml. KH2PO4 + 87,2  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        7,6 
                     
                  
                        7,4  ml. KH2PO4 + 92,6  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        7,8 
                     
                  
                        3,7  ml. KH2PO4 + 96,3  ml Na2HPO4
                        
                     
                     
                        8,0 
                     
                  
         C.8.   IT-TOSSIĊITÀ TAL-ĦNIEX
         IT-TEST TAL-ĦAMRIJA ARTIFIĊJALI
         1.   IL-METODU
         1.1.   L-INTRODUZZJONI
         F'dan it-test tal-laboratorju, is-sostanza tat-test hija miżjuda mal-ħamrija artifiċjali li l-ħniex ikunu mpoġġija fiha għal 14-il ġurnata. Wara dan il-perjodu (u b'għażla wara sebat'ijiem) l-effett letali tas-sostanza fuq il-ħniex hija eżaminata. It-test jipprovdi metodu għal superviżjoni relativvament għall-perjodu qasir ta' l-effett tal-kimiċi fuq il-ħniex, bit-teħid tal-ġilda jew alimentari.
         1.2.   ID-DEFINIZZJONI U L-UNITÀ
         LC50: Il-konċentrazzjoni tas-sostanza stmata bħala li toqtol 50 % ta' l-annimali ttestjati waqt il-perjodu tat-test.
         1.3.   IS-SOSTANZA TAR-REFERENZA
         Is-sostanza tar-referenza hija użata perjodikament bħala mezz ta' dimostrazzjoni li s-sensitività tas-sistema tat-test ma nbidlitx b'mod sinifikattiv.
         Il-chloroacetamide analitiku tal-grad huwa rakkomandat bħala s-sostanza referenza.
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAT-TEST
         Il-ħamrija hija mezz varjabbli, u għalhekk għal dan it-test il-ħamrija artifiċjali tal-lom definita hija użata. Il-ħniex adulti ta' l-ispeċi Eisenia foetida (ara n-nota fl-Appendiċi) huma miżmuma f'ħamrija artifiċjali definita trattata b'konċentrazzjonijiet differenti tas-sostanzi tat-test. Il-kontenut tal-kontenituri huwa mifrux fuq gabarre 14-il ġurnata (u b'għażla sebat'ijiem) wara l-bidu tat-test, u l-ħniex li jibqgħu ħajjin f'kull konċentrazzjoni jkunu magħduda.
         1.5.   IL-KRITERJI TAL-KWALITÀ
         It-test huwa disinnjat biex ikun riproduċibbli kemm jista' jkun fir-rigward tas-substrat u l-organiżmu tat-test. Il-mortalità fil-kontrolli m'għandhix taqbeż l-10 % fl-aħħar tat-test, jew inkella it-test ikun invalidu.
         1.6.   ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.6.1.   Il-materjali
         
         1.6.1.1.   Is-substrata tat-test
         
         Il-ħamrija artifiċjali definita hija użata bħala substrat bażiku għat-test.
         
                     (a)
                  
                  
                     Is-substrata bażika (il-persentaġġi huma fit-termini tal-piż niexef)
                     
                                 —
                              
                              
                                 10 % pit Sphagnum (kemm jista' jkun l-aktar qrib għall-pH 5,5 sa 6,0 bl- ebda fdalijiet tal-pjanti li jidhru u mitħun fin),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 20 % tafal tal-kawlina bi preferibbilment aktar minn 50 % kawlina,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Madwar 69 % ramel tal-kwarz industrijali (ramel fin dominanti b'aktar minn 50 % tal-qies tal-partiċelli ta' 0,05 sa 0,2mm). Jekk is-sostanza m'hijiex suffiċjentament abbli li tinfirex fl-ilma, 10g għal kull kontenitur tat-test għandhom jinżammu disponibbli biex jitħalltu mas-sostanza tat-test aktar tard, miż
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Madwar 1 % karbonat tal-kalċju (CaCO3), fi trab, kimikament pur, żjud biex il-pH jinġieb sa 6,0±0,5.
                              
                           
               
                     (b)
                  
                  
                     Is-substrata tat-test
                     Is-substrata tat-test ikun fiha is-substrata bażika, is-sostanza tat-test u l-ilma detonizzat.
                     Il-kontenut ta' l-ilma huwa ta' madwar 25 sa 42 % tal-piż niexef tas-substrata bażika. Il-kontenut ta' l-ilma tas-substrata huwa determinat billi jkun imnixxef kampjun għall-piż kostanti ta' 105 oC. Il-kriterju prinċipali huwa li l-ħamrija artifiċjali għandha tkun imxarrba sal-punt fejn m'hemm l-ebda ilma qiegħed. Għandu jkun hemm attenzjoni meta' jkun qed isir it-taħlit biex tkun miksuba distribuzzjoni ugwali tas-sostanza tat-test u tas-substrata. Il-mod ta' kif tkun introdotta is-sostanza tat-test mas-substarata għandu jkun rappurtat.
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     Is-substrata tal-kontroll
                     Is-substrata tal-kontoll fiha is-substrata bażika u l-ilma. Jekk aġent adittiv ikun użat, il-kontroll addizzjonali għandu jkun fih l-istess kwantità ta' l-aġent addittiv.
                  
               1.6.1.2.   Il-kontenituri ta' l-ittestjar
         
         Il-kontenituri tal-ħġieġ ta' madwar litru kapaċità (adegwatament miksija bl-għatien tal-plastik, id-dixxijiet jew l-film tal-plastic bit-toqob għall-ventilazzjoni) mimlija b'ammont tas-substrata mxarrba tat-test jew tal-kontroll ekwivalenti għall-500g tal-piż niexef tas-substrata.
         1.6.2.   Il-kondizzjonijiet tat-test
         
         Il-kontenituri għandhom jinżammu fi kmamar klimatiċi f'temperatura ta' 20 ± 2 oC bid-dawl kontinwu. L-intensità tad-dawl għandha tkun ta' 400 sa 800 lux.
         Il-perjodu tat-test huwa ta' 14-il ġurnata, iżda l-mortalità tista' tkun stmata b'għażla ta' sebat'ijiem wara li jibda t-test
         1.6.3.   Il-proċedura tat-test
         
         
            Il-konċentrazzjonijiet tat-test
         
         Il-konċentrazzjonijiet tas-sostanza tat-test huma espresse bħala piż tas-sostanza għall-piż niexef tas-substrata bażika (mg/kg).
         
            It-test biex jinstabu l-limiti
         
         Il-limiti tal-konċentrazzjonijiet li jikkawża mortalità ta' 0 sa 100 % biss jistgħu jkunu determinati f'test biex jinstabu l-limiti biex tkun provvduta l-informazzjoni fuq il-limiti tal-konċentrazzjonijiet li għandhom jintużaw fit-test definittiv.
         Is-sostanza għandha tkun ittestjata fil-konċentrazzjonijiet li ġejjin: 1 000; 100; 10; 1; 0,1mg tas-sostanza/kilogramma tas-substrata tat-test (il-piż niexef).
         Jekk it-test sħiħ definittiv għandu jkun magħmul, grupp wieħed għal kull konċentrazzjoni u wieħed għall-kontroll mhux trattat, kull wieħed b'għaxar ħniex, għandu jkun suffiċjenti għat-test biex jinstabu l-limiti.
         
            It-test definittiv
         
         Ir-riżultati għat-test biex jinstabu l-limiti huma wżati biex jintgħażlu minn ta' l-anqas ħames konċentrazzjonijiet f'serje ġeometrika li tilħaq eżatt il-limiti ta' bejn 0 sa 100 % tal-mortalità u li tinbidel b'fattur kostanti li ma jaqbiżx il-1,8.
         It-testijiet li jużaw din is-serje ta' konċentrazzjoni għandhom iħallu l-valur LC50 u l-limiti tiegħu ta' kunfidenza biex ikunu stmati kemm jista' jkun b'mod preċiż.
         Fit-test definittiv minn ta' l-anqas erba' gruppi tat-testijiet għal kull konċentrazzjoni u erba' kontrolli mhux trattati, kull wieħed b'10 ħniex, huma wżati. Ir-riżultati ta' dawn il-gruppi repliki huma mogħtija bħala devjazzjoni medja u standard.
         Meta' żewġ konċentrazzjonijiet konsekuttivi, b'rata ta' 1,8, jagħtu biss 0 u 100 % mortalità, dawn iż-żewġ valuri huma suffiċjenti biex jindikaw il-limiti li fihom jaqa' l- LC50.
         
            It-taħlita tas-substrata bażika tat-test u s-sostanza tat-test
         
         Is-substrata tat-test għandha, kull meta' jkun possibbli, tkun magħmula mingħajr ebda aġenti addizzjonali minbarra l-ilma. Immedjatament qabel il-bidu tat-test, l-emulsjoni jew it-tixrid tas-sostanza tat-test f'ilma mingħajr jonji jew f'xi solvent ieħor tiġi mħallta mas-substrata bażika tat-test, jew sprejjat b'mod ugwali fuqha bi sprej fin kromotagrafiku jew ieħor simili.
         Jekk ma tkunx tinħall fl-ilma, is-sostanza tat-test tista' tkun maħlula f'volum żgħir kemm jista' jkun ta' solvent organiku adattat (eż. hexane (idrokarbon likwidu), aċeton jew kloroform).
         Dawk l-aġenti biss li jtiru malajr jistgħu jkunu wżati biex ikunu iħollu, jferrxu jew jemulsifaw is-sostanza tat-test. Is-substrata tat-test għandha tkun ventilata qabel l-użu. L-ammont ta' ilma evaporat għandu jkun sostitwit. Il-kontroll għandu jkollu l-istess kwantità ta' kwalunkwe aġenti addittiv.
         Jekk is-sostanza tat-test ma tkunx solubbli, li tista' tinfirex jew li tista' tkun emulsifata fis-solventi organiċi, 10g tat-taħlita tar-ramel mitħun fin tal-kwarz u kwantità tas-sostanza tat-test neċessarja biex titratta 500g piż niexef tal-ħamrija artifiċjali huma mħallta ma 490g tal-piż niexef tas-substrata tat-test.
         Għall kull grupp tat-test, ammont tas-substrata tat-test imxarrba ekwivalenti għal 500g piż niexef tiġi mpoġġija f'kull kontenitur tal-ħġieġ u 10 ħniex, li kienu kkondizzjonati għal 24 siegħa f'substrata simili mxarrba u mbagħad maħsula malajr u l-ilma żejjed mixrub fuq karta li tiffiltra qabel l-użu, huma mpoġġija fuq il-wiċċ tas-substrata tat-test.
         Il-kontenituri huma mgħottija bl-għatien tal-plastic imtaqqba, bid-dixxijiet jew bil-film biex ikun evitat li s-substrata tinxef u dawn huma miżmumin taħt il-kondizzjonijiet tat-test għal 14-il ġurnata.
         L-istimi għandhom ikunu magħmula 14-il-ġurnata (u b'għażla seba' t'ijiem) wara li jkun magħmul it-test. Is-substrata tiġi mifruxa fuq platt magħmul mill-ħġieġ jew ta' l-azzar li ma jissaddadx. Il-ħniex jiġu eżaminati u n-numru tal-ħniex li għexu għandu jkun determinat. Il-ħniex huma kkonsidrati mejta jekk dawn ma jirrispondux għal stimulu ġentili u mekkaniku mat-tarf ta' quddiem.
         Meta' l-eżaminazzjoni tkun magħmula fis-seba' ġurnata, il-kontenitur għandu jerġa' jimtela bis-substrata u l-ħniex li għex għandu jkun sostitwit fuq l-istess wiċċ tas-substrata tat-test.
         1.6.4.   L-organiżmi tat-test
         
         L-organiżmi tat-test għandhom ikunu adulti ta' l-Eisenia foetida (ara n-nota fl-Appendiċi) (minn ta' l-anqas ta' żmien xahrejn bil-clitellum) tal-piż imxarrab ta' 300 sa 600 mg. (Għall-metodu tat-tgħammir ara l-Appendiċi).
         2.   ID-DATA
         2.1.   IT-TRATTAMENT U L-VALUTAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Il-konċentrazzjonijiet tas-sostanza ttestjata huma rappurtati bir-referenza għall-persentaġġi korrispondenti tal-ħniex mejta.
         Meta' d-data tkun adegwata il-valur ta' l- LC50 u l-limiti tal-kunfidenza (p = 0,05) għandhom ikunu determinati billi jintużaw il-metodi standard (Litchfield u Wilcoxon, 1949, għall-metodu ekwivalenti). L- LC50 għandu jkun mogħti bħala mg tas-sostanza tat-test għal kull kilogramma tas-substrata tat-test (piż niexef).
         F'dawk il-każijiet meta' it-tidwira tal-kurva tal-konċentrazzjoni hija wisq wieqfa biex tippermetti l-kalkulazzjoni ta' l- LC50, stima grafika ta' dan il-valur hija suffiċjenti.
         Meta' żewġ konċentrazzjonijiet bħala rata ta' 1,8 jagħtu biss 0 % u 100 % mortalità, iż-żewġ valuri huma suffiċjenti biex jindikaw il-limiti li fihom jaqa' l-LC50.
         3.   IR-RAPPORTAĠĠ
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test jekk possibbli, għandu, jkun fih dan li ġej:
         
                     —
                  
                  
                     id-dikjarazzjoni li t-test kien magħmul skond il-kriterji tal-kwalità msemmija aktar 'il fuq,
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-test magħmul (it-test li jsib il-limiti u/jew it-test definittiv),
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-deskrizzjoni eżatta tal-kondizzjonijiet tat-test jew id-dikjarazzjoni li t-test kien magħmul skond il-metodu; kwalunkwe devjazzjonijiet għandhom ikunu rappurtati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-deskrizzjoni eżatta ta' kif is-sostanza tat-test tiġi mħallta mas-subtrata bażika tat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-informazzjoni dwar l-organiżmi tat-test (l-ispeċi, iż-żmien, il-medja u l-limiti tal-piż, il-kondizzjonijiet taż-żamma u n-nifs, il-fornitur),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-metodu użat għad-determinazzjoni ta' l- LC50,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati tat-test inkluża d-data kollha użata,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-deskrizzjoni tas-sintomi jew il-bidliet osservati fl-aġir ta' l-organismi tat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-mortalità fil-kontrolli,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l- LC50 jew il-konċentrazzjoni l-aktar għolja ttestjata mingħajr il-mortalità u l-konċetnrazzjoni l-aktar baxxa b'mortalità ta' 100 %, 14-il ġurnata (u b'għażla ta' seba' t'ijiem) wara li jkun mibdi t-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-tpinġija tal-kurva tal-konċentrazzjoni/respons,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-riżultati miksuba bis-sustanza tar-referenza, kemm jekk bl-assoċjazzjoni mat-test preżenti jew mill-eżerċizzji ta' qabel tal-kontroll tal-kwalità.
                  
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD, Pariġi, 1981, Test Guideline 207, id-Deċiżjoni tal-Kunsill C(81) 30 finali.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Edwards, C.A. and Lofty, J.R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and Hall, Londra, 331pp.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Bouche, M.B., 1972, Lombriciens de France, Ècologie et Systèmatique, Institut National de la Recherche Agronomique, 671 pp.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. J.Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Il-Kummissjoni tal-Kommunitajiet Ewropej, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Rapport EUR 8714 EN, 1983.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur Land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag “Toxiżitatstest am Regenwurm Eisenia foetidia in kunstlichem Boden”, f': Rudolph/Boje, Okotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
                  
               
            Appendiċi
            It-tgħammir u ż-żamma tal-ħniex qabel l-ittestjar
            Biex jitgħammru l-annimali, 30 sa 50 ħanex adult, jitpoġġew f'kaxxa tat-tgħammir bis-substrata friska u mneħħija wara 14-il ġurnata. Dawn l-annimali jistgħu jkunu wżati għal gruppi oħra tat-tgħammir. Il-ħniex imfaqqsa mill-fosdqa huma wżati għall-ittestjar meta’ jkunu maturi (taħt il-kondizzjonijiet preskritti wara xahrejn jew tlett xhur).
            Il-kondizzjonijiet taż-żamma u tat-tgħammir
            
                        Il-kamra klimatika
                     
                     
                        :
                     
                     
                        it-temperatura ta' 20 ± 2 oC preferibilment bid-dawl kontinwu (intensita’ ta' 400 sa 800 lux).
                     
                  
                        Il-kaxxa tat-tgħammir
                     
                     
                        :
                     
                     
                        il-kontenituri baxxi adattati tal-volum ta' 10 sa 20 l.
                     
                  
                        Is-substrata
                     
                     
                        :
                     
                     
                        L-Eisenia foetida tista' titrabba fl-eskrimenti ta' annimali varji. Huwa rakkomandat li bħala mezz tat-tgħammir tintuża taħlita ta' 50 % mill-volum pit u 50 % demel tal-baqar jew taż-żwiemel. Il-mezz għandu jkollu valur tal-pH ta' madwar 6 sa 7 (refolat bil-karbonju tal-kalċju) u konduttività tal-jonje baxxa (anqas minn 6 mmhos jew 0,5 % konċentrazzjoni tal-melħ).
                        Is-substrata għandha tkun niedja iżda mhux imxarrba żżejjed.
                        Il-proċeduri l-oħra ta' suċċess jistgħu jkunu wżati minbarra l-metodu mogħti hawn fuq.
                     
                  
               Nota: L-Eisenia foetida teżisti f'żewġ razez li ċerti tassonomi sseparaw fi speċi (Bouche, 1972). Dawn huma morfoloġikament simili minnbarra waħda, Eisenia foetida foetida, li għandha strixxi tipikament transversi jew faxxi fuq is-segmenti u l-oħra, Eisenia foetida andrei, li m'għandix dan u għandha kulur aħmar varjegat. Fejn hu possibbli l-Eisenia foetida andrei għandha tintuża. L-ispeċi l-oħra jistgħu jkunu wżati jekk il-metodoloġija neċessarja hija disponibbli.
         
         C.9.   ID-DEGREDAZZJONI BIJOLOĠIKA
         IT TEST TA' WELLENS –ZAHN
         1.   IL-METODU
         1.1.   L-INTRODUZZJONI
         Ir-raġuni tal-metodu hija l-valutazzjoni ta' bijodegradabilità potenzali u aħħarija tas-sostanzi li jinħallu fl-ilma, li mhumiex volatili u organiċi meta' dawn ikunu esposti għall-konċentrazzjonijiet relattivament għoljin ta' mikroorganiżmi f'test statiku.
         L-assorbiment fiżikukimiku fuq is-solidi sospiżi jista' jsir u dan għandu jittieħed in konsiderazzjoni meta' jkunu qegħdin jiġu interpretati r-riżultati (ara 3.2).
         Is-sostanzi li għandhom ikunu studjati huma wżati f'konċentrazzjonijiet li jikkorrispondu għall-valuri DOC fil-limiti ta' 50 sa 400 mg/litru jew il-valuri COD fil-limiti ta' 100 sa 1 000 mg/litru (DOC = il-karbonju organiku maħlul; COD = id-domanda għall-ossiġnu kimiku). Dawn il-konċentrazzjonijiet relattivament għoljin għandhom il-vantaġġ li huma affidabbli b'mod analitiku. Il-komposti bil-proprjetajiet tossiċI jistgħu itawwlu jew iwaqqfu il-proċess ta' degradazzjoni.
         F'dan il-metodu, il-kejl tal-konċentrazzjoni tal-karboju organiku maħlul jew id-domanda għall-ossiġnu kimiku huwa wżat biex jistima il-bijodegradabilità aħħarija tas-sostanza tat-test.
         L-użu simultanju tal-metodu speċifiku analitiku jista' jippermetti l-istimar tal-bijodegradazzjoni primarja tas-sostanza (it-tneħħija ta' l-istruttura kimika maġġuri).
         Il-metodu huwa applikabbli biss għal dawk is-sostanzi organiċi tat-test li, fil-konċentrazzjoni użata fit-test:
         
                     —
                  
                  
                     huma solubbli fl-ilma taħt il-kondizzjonijiet tat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     għandhom pressjoni tal-fwar insinjifikanti taħt il-kondizzjonijiet tat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     li mhumiex inibitorji għall-batterji,
                  
               
                     —
                  
                  
                     li huma mixruba fis-sistema tat-test biss sa' ċertu limitu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     li mhumiex mitlufa fir-rawha mis-soluzzjoni tat-test.
                  
               L-informazzjoni fuq il-proporzjoni relattivi tal-komponenti maġġuri tal-materjal tat-test għandu jkun utli biex ikunu interpretati r-riżultati miksuba, partikolarment f dawk il-każijiet fejn ir-riżultati huma baxxi jew marġinali.
         L-informazzjoni fuq it-toxiċità tas-sostanza għall-mikro-organiżmi hija mixtieqa għall-interpretazzjoni tar-riżultati baxxi u fl-għażla tal-konċentrazzjoni adattati tat-test.
         1.2.   ID-DEFINIZZJONIJIET U L-UNITAJIET
         L-ammont ta' degradazzjoni miksuba fl-aħħar tat-test hija rappurtata bħala “Il-bijodegradabilità fiz-Zahn – it-test ta' Wellens”:
         
            
         fejn:
         
                     DT
                  
                  
                     =
                  
                  
                     id-degradazzjoni bijoloġika ( %) fil-ħin T,
                  
               
                     CA
                  
                  
                     =
                  
                  
                     DOC (jew COD) valuri fit-taħlita tat-test imkejla tlett siegħat wara l-bidu tat-test (mg/l) (DOC = Il-Karbonju Organiku Maħlul, COD = Id-domanda għall-Ossiġnu Kimiku),
                  
               
                     CT
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-valuri DOC jew COD fit-taħlita tat-test fil-ħin tat-teħid tal-kampjun (mg/l),
                  
               
                     CB
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-valuri DOC jew COD tal-vojt fil-ħin tat-teħid tal-kampjun (mg/l),
                  
               
                     CBA
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-valuri DOC jew COD tal-vojt, mkejla tlett siegħat wara l-bidu tat-test (mg/l).
                  
               Il-limitu tad-degradazzjoni huwa miżjud għall-eqreb persentaġġ sħiħ.
         Il-persentaġġ tad-degradazzjoni huwa dikjarat bħala l-persentaġġ DOC (jew COD) ta' tneħħija tas-sostanza ttestjata.
         Id-differenza bejn il-valur imkejjel wara tlett siegħat u l-valur inizjali kkalkulat jew preferibbilment imkejjel jista' jipprovdi informazzjoni utli fuq l-eliminazzjoni tas-sostanza (ara 3.2, L-interpretazzjoni tar-riżultati).
         1.3.   IS-SOSTANZI TAR-REFERENZA
         F'ċerti każijiet meta' jkunu qegħdin jiġu investigati sostanzi ġodda s-sostanzi tar-referenza jistgħu jkunu utli; madanakollu, s-sostanzi speċifiċI tar-referenza ma jistgħux ikunu rakkomandati.
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         It-tajn oħxon attivat, in-nutrijenti minerali u l-materjali ta' l-ittestjar bħala l-unika sors tal-karbonju f'soluzzjoni mimlija ilma huma mpoġġija flimkien f'reċipjent tal-ħġieġ li jieħu minn litru sa erba' litri mgħammar b'aġitatur u b'apparat li jagħti l-arja. It-taħlita tiġi aġitata u mogħtija l-arja f 20 to 25 oC taħt l-illuminazzjoni mferrxa jew f'kamra mudlama sa 28 ġurnata. Il-proċess ta' degradazzjoni jiġi kkontrollat bid-determinazzjoni tal-valuri tad-DOC (jew is-COD) fis-soluzzjoni ffiltrata f'intervalli ta' kuljum jew f'intervalli oħra tal-ħin adattati. Ir-rata tad-DOC (jew COD) eliminati wara kull intervall għall-valur tlett siegħat wara l-bidu hija espressa bħala persentaġġ ta' bijodegradazzjoni u sservi bħala kejl tal-limitu ta' degradazzjoni f'dan il-ħin. Ir-riżultat ikun impinġi versus il-ħin biex jagħti l-kurva tal-bijodegradazzjoni.
         Meta' l-metodu speċifiku analitiku jkun użat, it-tibdiliet fil-konċentrazzjoni tal-molekula maġġuri minħabba d-degradazzjoni tista' tkun imkejla (bijodegradabilità primarja).
         1.5.   IL-KRITERJI TAL-KWALITÀ
         Ir-riproduċibilità ta' dan it-test ġie pruvat li hi sodisfaċenti f'test ċirku.
         Is-sensittività tal-metodu hija determinata l-aktar mill-varjabilità tal-vojt u, anqas, mill-preċiżjoni tad-determinazzjoni tal-karbonju organiku maħlul u l-livell tal-kompost tal-likur tat-test.
         1.6.   ID-DESKRIZZJONI TAL-PROĊEDURA TAT-TEST
         1.6.1.   Il-preparazzjonijiet
         
         1.6.1.1.   Ir-reaġenti
         
         L-ilma tat-test: l-ilma tax-xorb bil-kontenut tal-karbonju organiku < 5mg/litru. Il-konċentrazzjoni tal-jonji tal-kalċju u tal-manjesju flimkien ma jistgħux jaqbżu il-2,7 mmole/litru; jew inkella it-taħlit adegwat ma' l-ilma dejonizzat jew distillat huwa meħtieġ.
         
                     L-aċidu sulfuriku, ir-reaġent analitiku (A.R.):
                  
                  
                     50 g/l
                  
               
                     Is-soluzzjoni ta' l-idrossidu tas-sodju A.R.:
                  
                  
                     40 g/l
                  
               
                     Is-soluzzjoni nutrijenti tal-minerali: ħoll f'litru ilma dejonizzat:
                  
                  
                      
                  
               
                     Il-klorit ta' l-ammonja, NH4Cl, A.R.:
                  
                  
                     38,5  g
                  
               
                     Dihydrogenphosphate tas-sodju, NaH2PO4.2H2O, A.R.:
                  
                  
                     33,4  g
                  
               
                     Dihydrogenphosphate tal-potassju, KH2PO4, A.R.:
                  
                  
                     8,5  g
                  
               
                     di-potassium mono-hydrogenphosphate, K2HPO4, A.R.:
                  
                  
                     21,75  g.
                  
               It-taħlita sservi kemm bħala nutrijent u kemm bħala sistema ta' buffering.
         
         1.6.1.2.   L-apparat
         
         Ir-reċipjenti tal-ħġieġ b'volum ta' litru sa erba' litri (e.ż. ir-reċipjenti ċilindriċi).
         L-aġitatur bi strument li jħallat tal-ħġieġ jew tal-metall fuq maqbad adattat (l-istrument li jħallat għandu jdur madwar 5 sa 10 cm fuq il-qiegħ tar-reċipjent). L-istrument li jħallat u li hu manjetiku b' lasta twila minn 7 sa 10 cm tista' tkun użata minflok.
         It-tubu tal-ħġieġ ta' 2 sa 4 mm fid-dijametru ta' ġewwa biex tkun introdotta l-arja. Il-ftuħ tat-tubu għandu jkun ta' madwar 1 cm fuq il-qiegħ tar-reċipjent.
         ċentrifugu (madwar 3 550 g).
         Il-metru tal-pH.
         Il-metru ta' l-ossiġnu maħlul.
         Il-filtri tal-karta.
         L-apparat tal-filtrazzjoni tal-membran.
         Il-filtri tal-membra, il-qies tal-pora ta' 0,45 nm. Il-filtri tal-membran huma adattati jekk huwa żgurat li huma la jerħu l-karbonju u lanqas jassorbu s-sostanza fl-istadju tal-filtrazzjoni.
         It-tagħmir analitiku għad-determinazzjoni tal-kontenut tal-karbonju u tad-domanda ta' l-ossiġnu kimiku.
         1.6.1.3.   Il-preparazzjoni tas-sostanza tat-tilqim
         
         It-tajn oħxon attivat minn pjanta tat-trattament bijoloġiku jiġi maħsul minn (b'mod repettitiv) ċentrifugazzjoni jew tqegħed bl-ilma tat-test (fuq).
         It-tajn oħxon attivat għandu jkun f'kondizzjoni adattata. Dan it-tajn huwa disponibbli minn pjanta tat-trattament ta' l-ilma li huwa skart li taħdem tajjeb. Biex jinġabu kemm jista' jkun speċji u razzez differenti ta' batterji, jista' jkun aħjar li titħallat is-sostanza tat-tilqim minn sorsi differenti (e.ż. il-pjanti tat-trattament differenti, l-estratti tal-ħamrija, l-ilma tax-xmara, eċċ.). It-taħlita għandha tkun trattata kif deskritt hawn fuq.
         Biex tkun iċċekkjata l-attività tat-tajn oħxon attivat ara “Il-kontroll funzjonali”, taħt.
         1.6.1.4.   Il-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tat-test
         
         Żied mar-reċipjent tat-test 500ml ta' l-ilma tat-test, 2,5 ml/litru tas-soluzzjoni nutrijenti u t-tajn oħxon attivat f'ammont li jikkorrispondi għal 0,2 sa 1,0 g/litru ta' materjal niexef fit-taħlita finali. Żied soluzzjoni ta' l-istokk suffiċjenti tas-sostanza li għandha tkun ittestjata biex b'hekk il-konċentrazzjoni DOC ta' 50 sa 400mg/litru tirriżulta fit-taħlita finali. Il-valuri tas-COD korrispondenti huma 100 sa 1 000 mg/litru. Għamel bl-ilma tat-test għall-volum totali ta' litru sa erba' litri. Il-volum totali li għandu jintgħażel huwa dipendenti fuq in-numru ta' kampjuni li għandhom jittieħdu għad-determinazzjoni tad-DOC jew tas-COD u l-volumi neċessarji għall-proċedura analitika.
         Normalment il-volum ta' żewġ litri jista' jitqies bħala sodisfaċenti. Minn ta' l-anqas reċipjent wieħed tal-kontroll (vojt) huwa magħmul biex jimxi parallel ma' kull serje tat-test; huwa fih biss tajn oħxon attivat u s-soluzzjoni tan-nutrijenti minerali magħmul bl-ilma tat-test għall-istess volum totali bħal fir-reċipjenti tat-test.
         1.6.2.   L-andament tat-test
         
         Ir-reċipjenti tat-test jiġu aġitati bl-istrumenti li jħalltu li huma manjetiċi jew skrejjen li jinbuttaw taħt illuminazzjoni mxerrda jew f'kamra mdallma f'20 sa 25 oC . L-għoti ta' l-arja huwa miksub bl-arja kompressata mnaddfa b'passatur tas-suf tal-qoton u bi flixkun tal-ħasil jekk ikun neċessarju. Għandu jkun żgurat li t-tajn oħxon ma joqgħodx u l-konċentrazzjoni ta' l-ossiġnu ma taqax taħt iż-2mg/litru.
         Il-valur pH għandu jkun iċċekkjat f'intervalli regolari (e.ż. kuljum) u irranġat għal pH 7 sa 8, jekk ikun neċessarju.
         It-telf mill-evaporazzjoni huwa magħmul eżatt qabel kull teħid tal-kampjun bl-ilma dejonizzat jew distillat fl-ammonti meħtieġa. Il-proċedura tajba għandha timmarka l-livell tal-likwidu fuq ir-reċipjent qabel ma jibda t-test. Il-marki l-ġodda huma magħmula wara kull teħid ta' kampjun (mingħajr l-għoti ta' l-arja u t-taħwid). L-ewwel kampjuni huma dejjem meħuda tlett siegħat wara l-bidu tat-test biex b'hekk ikun skopert l-assorbiment tal-materjali tat-test bit-tajn oħxon attivat.
         L-eliminazzjoni tal-materjal tat-test huwa segwit bid-determinazzjoni tad-DOC jew tas-COD magħmula kuljum jew f'intervall ieħor regolari. Il-kampjuni mir-reċipjenti tat-test u l-vojt huma ffiltrati minn ġo filtru tal-karti maħsul sew. L-ewwel 5ml tas-soluzzjoni ffiltrata tat-test huma mormija. It-tajn oħxon li huwa diffiċli li tiffiltrah jista' jkun imneħħi qabel biċ-ċentrifugazzjoni għal 10 minuti. Id-determinazzjonijiet tad-DOC u s-COD huma magħmul doppji. It-test huwa magħmul sa 28 ġurnata.
         
            Nota: Il-kampjuni li jibqgħu turpid jiġu ffiltrati minn ġo filtri tal-membran. Il-filtri tal-membran m'għandhom jerħu jew jassorbu xi materjal organiku.
         
            Il-kontroll funzjonali tat-tajn oħxon attivat
         
         Ir-reċipjent li fih sostanza magħrufa għandu jkun magħmul parallel ma' kull serje ta' testijiet biex b'hekk tkun iċċekkjata l-kapaċità funzjonali tat-tajn oħxon attivat. Id-diethyleneglycol kien misjub utli għal dan il-għan.
         
            L-adattament
         
         Jekk l-analiżi huma magħmula f'intervalli relattivament qosra (e.ż. kuljum), l-adattament għandu jkun rikonoxxut b'mod ċar mill-kurva tad-degradazzjoni (ara l-Figura 2). It-test għalhekk m'għandux jibda immedjatament qabel il-weekend.
         Jekk l-adattament iseħħ fl-aħħar tal-perjodu, it-test jista' jittawwal sakemm id-degradazzjoni tkun kompleta.
         
            Nota: Jekk tagħrif aktar vast fuq l-aġir tat-tajn oħxon huwa meħtieġ, l-istess tajn oħxon attivat huwa espost darba oħra għall-istess materjal tat-test skond il-proċedura li ġejja:
         Itfi l-aġitatur u l-apparat li jagħti l-arja u ħalli t-tajn oħxon attivat joqgħod. Neħħi s-sustanza li tgħum f'wiċċ il-likwidu, imla sa żewġ litri bl-ilma tat-test, ħawwad għal 15-il minuta u ħalliħ jerġa joqgħod. Wara li s-sostanza li tgħum f'wiċċ il-likwidu tkun imneħħija, uża t-tajn oħxon li jibqa biex tirrepeti t-test bl-istess materjal skond 1.6.1.4 u 1.6.2, fuq. It-tajn oħxon attivat jista' wkoll ikun iżolat biċ-ċentrifugazzjoni minfloq bit-tqegħid.
         It-tajn oħxon attivat jista' jkun imħallat mat-tajn oħxon frisk għal konċentrazzjoni ta' 0,2 sa 1 g piż niexef/litru.
         
            Il-mezzi analitiċi
         
         Normalment il-kampjuni jiġu ffiltrati minn ġo passatur tal-karti maħsul sew (għal ħasil uża l-ilma deonizzat).
         Il-kampjuni li jibqgħu mdardra jiġu ffiltrati minn ġo filtri tal-membran (0,45 μm).
         Il-konċentrazzjoni DOC hija determinata darbtejn fil-filtrati tal-kampjuni (l-ewwel 5ml jiġu mormija) permezz ta' l-istrument tat-TOC. Jekk il-filtrat ma jistax ikun analizzat fl-istess ġurnata, għandu jkun merfugħ fir-refriġeratur sal-ġurnata ta' wara. Irfigħ għal aktar tul ta' żmien ma jistax ikun rakkomandat.
         Il-konċentrazzjoni COD hija determinata fil-filtrati tal-kampjuni b'arranġatura analitika tas-COD bil-proċedura deskritta fir-referenza (2), hawn taħt.
         2.   ID-DATA UL-VALUTAZZJONI
         Il-konċentrazzjoni tad-DOC u/jew tas-COD huma determinati minn ta' l-anqas darbtejn fil-kampjuni skond 1.6.2 hawn fuq. Id-degradazzjoni fil-ħin T hija kkalkulata skond il-formula (bid-definizzjonijiet) mogħtija taħt 1.2 hawn fuq.
         Il-limitu tad-degradazzjoni jiġi mnaqqas jew miżjud għall persentaġġ sħiħ l-aktar qrib. L-ammont tad-degradazzjoni miksub fl-aħħar tat-test huwa rappurtat bħala il-“Biodegradabilità fiz-Zahn – it-test ta' Wellens”.
         
            Nota: Jekk id-degredazzjoni kompleta hija miksuba qabel il-ħin tat-test jispiċċa u dan ir-riżultat huwa konfermat b'analiżi oħra fil-ġurnata ta' wara, it-test jista' jkun konkluż.
         3.   IR-RAPPORTAGG
         3.1.   IR-RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, ikun fih dan li ġej:
         
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjoni inizjali tas-sustanza,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-informazzjoni l-oħra kollha u r-riżultati sperimentali rigward is-sustanza ttestjata, is-sostanza referenza jekk kienet użata, u l-vojt,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjoni wara tlett siegħat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kurva tal-biodegradazzjoni bid-deskrizzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-data u l-post fejn l-organiżmi tat-test kienu meħuda, l-istatus ta' l-adattament, il-konċentrazzjoni użata, eċċ.,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ir-raġunijiet xjentifiċi għal kwalunkwe tibdiliet fil-proċedura tat-test.
                  
               3.2.   L-INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         It-tneħħija tad-DOC (COD) li ssir gradwalment fuq medda ta' ġranet jew ġimgħat tindika li s-sustanza tat-test qiegħda tiġi biodegradata.
         Madanakollu, l-assorbiment fiżiko-kimiku jista', f'ċerti każijiet, jilgħab rwol u dan huwa indikat fejn hemm it-tneħħija kompleta jew parzjali mill-bidu nett, fl-ewwel tlett siegħat, u d-differenza bejn il-likuri tal-kontroll u dawk li jgħumu f'wiċċ l-ilma tibqa f'livell baxx li ma jkunx mistenni.
         Aktar testijiet huma neċessarji jekk għandu jkun hemm distinzjoni bejn il-biodegradazzjoni (jew il-biodegradazzjoni parzjali) u l-assorbiment.
         Dan jista' jkun magħmul f'numru ta' modi, iżda dak l-aktar konvinċenti għandu jkun li tkun użata is-sustanza li tgħum f'wiċċ l-ilma jew it-tajn oħxon bħala sustanza użata għat-tilqim f'test tas-sett bażiku (preferibbilment f'test respirometriku).
         Is-sustanzi tat-test li jagħtu tneħħija għolja u li ma tassorbix ta' DOC (COD) fittest għandhom ikunu meqjusa bħala potenzalment biodegradabbli. It-tneħħija parzjali li ma tassorbix tindika li l-kimika hija minn ta' l-anqas soġġetta għal ċerta biodegradazzjoni. It-tneħħija baxxa jew l-ebda tneħħija tad-DOC (COD) tista' tkun kawża ta' l-inibizzjoni tal-mikroorganiżmi mis-sostanza tat-test u dan jista' wkoll ikun mikxuf bil-lisi u t-telf tat-tajn oħxon, li jagħti sostanzi li jgħumu fuq l-ilma li jkunu mdardra. Dan it-test għandu jkun ripetut billi tintuża konċentrazzjoi aktar baxxa tas-sostanza tat-test.
         L-użu tal-metodu speċifiku għall-komposti jew tas-sostanza tat-test bit-tikketta 14 C tista' tħalli sensittività aktar għolja. Fil-każ tal-kompost tas-14C tat-test, l-irkuprar tal-14 CO2 għandu jikkonferma li l-biodegradazzjoni seħħet.
         Meta r-riżultati jingħataw fit-termini tal-bijodegradazzjoni primarja, għandha tingħata spjegazzjoni jekk ikun possibbli fuq il-bidla ta' l-istruttura kimika li twassal għal telf fir-rispons tas-sustanza tat-test primarja.
         The validation of the analytical method must be given together with the response found on the blank test medium.
         4.   IR-REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD, Pariġi, 1981, Test Guideline 302 B, Id-Deċiżjoni tal-Kunsill C (81) 30 finali.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     L-Anness V C.9 Id-Degradazzjoni: Id-Domanda għall-Ossiġnu Kimiku, id-Direttiva tal-Kummissjoni 84/449/KEE, Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Kommunitajiet Ewropej, Nru L 251, 19.9.1984.
                  
               
            L-Appendiċi:
            L-EŻEMPJU TAL-VALUTAZZJONI
            
                        Il-kompost organiku:
                     
                     
                        L-aċidu 4-Ethoxybenzoic
                     
                  
                        Il-konċentrazzjoni teoretika tat-test:
                     
                     
                        600 mg/1
                     
                  
                        Id-DOC teoretiku:
                     
                     
                        390 mg/l
                     
                  
                        Is-sostanza tat-tilqim
                     
                     
                        L-impjant tat-trattament tal-ħmieġ tad-drenaġġ ta'
                     
                  
                        Il-konċentrazzjoni:
                     
                     
                        gramma waħda tal-materjal niexef/litru
                     
                  
                        L-istatus ta' l-adattament:
                     
                     
                        mhux adattat
                     
                  
                        L-analiżi:
                     
                     
                        Id-determinazzjoni tad-DOC
                     
                  
                        L-ammont tal-kampjuni:
                     
                     
                        3 ml
                     
                  
                        Is-sostanza tal-kontroll:
                     
                     
                        Diethyleneglycol
                     
                  
                        Il-kompost tat-tossiċità:
                     
                     
                        L-ebda effetti toxiċi taħt l-1 000  mg
                        It-test użat: Il-fermentazzjoni tat-tubi tat- test
                     
                  
               
            
                        Il-ħin tat-test
                     
                     
                        Is-sustanza tal-kontroll
                     
                     
                        Is-sustanza tat-test
                     
                  
                        Id-DOC
                        vojt
                        mg/1
                     
                     
                        Id-DOC
                        mg/l
                     
                     
                        Id-DOC nett
                        mg/l
                     
                     
                        Id-degradazzjoni
                        %
                     
                     
                        Id-DOC
                        mg/l
                     
                     
                        Id-DOC nett
                        mg/l
                     
                     
                        Id-degradazzjoni
                        %
                     
                  
                        0
                     
                     
                        —
                     
                     
                        —
                     
                     
                        300,0 
                     
                     
                        —
                     
                     
                        —
                     
                     
                        390,0 
                     
                     
                        —
                     
                  
                        3 siegħat
                     
                     
                        4,0 
                     
                     
                        298,0 
                     
                     
                        294,0 
                     
                     
                        2
                     
                     
                        371,6 
                     
                     
                        367,6 
                     
                     
                        6
                     
                  
                        1 ġurnata
                     
                     
                        6,1 
                     
                     
                        288,3 
                     
                     
                        282,2 
                     
                     
                        6
                     
                     
                        373,3 
                     
                     
                        367,2 
                     
                     
                        6
                     
                  
                        2 ġranet
                     
                     
                        5,0 
                     
                     
                        281,2 
                     
                     
                        276,2 
                     
                     
                        8
                     
                     
                        360,0 
                     
                     
                        355,0 
                     
                     
                        9
                     
                  
                        5 ġranet
                     
                     
                        6,3 
                     
                     
                        270,5 
                     
                     
                        264,2 
                     
                     
                        12
                     
                     
                        193,8 
                     
                     
                        187,5 
                     
                     
                        52
                     
                  
                        6 ġranet
                     
                     
                        7,4 
                     
                     
                        253,3 
                     
                     
                        245,9 
                     
                     
                        18
                     
                     
                        143,9 
                     
                     
                        136,5 
                     
                     
                        65
                     
                  
                        7 ġranet
                     
                     
                        11,3 
                     
                     
                        212,5 
                     
                     
                        201,2 
                     
                     
                        33
                     
                     
                        104,5 
                     
                     
                        93,2 
                     
                     
                        76
                     
                  
                        8 ġranet
                     
                     
                        7,8 
                     
                     
                        142,5 
                     
                     
                        134,7 
                     
                     
                        55
                     
                     
                        58,9 
                     
                     
                        51,1 
                     
                     
                        87
                     
                  
                        9 ġranet
                     
                     
                        7,0 
                     
                     
                        35,0 
                     
                     
                        28,0 
                     
                     
                        91
                     
                     
                        18,1 
                     
                     
                        11,1 
                     
                     
                        97
                     
                  
                        10 ġranet
                     
                     
                        18,0 
                     
                     
                        37,0 
                     
                     
                        19,0 
                     
                     
                        94
                     
                     
                        20,0 
                     
                     
                        2,0 
                     
                     
                        99
                     
                  Figura 1
            Eżempji tal-kurvi tal-bijodegradazzjoni
            Figura 2
            Eżempji ta' l-adattazzjoni tat-tajn oħxon
            
         C.10.   BIJODEGRADAZZJONI
         TESTIJIET ATTIVATI TA' SIMULAZZJONI TA' TAJN
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         1.1.1.   Rimarki Ġenerali
         
         Il-metodu huwa applikabbli biss għall-dawk is-sostanzi organiċi li, fil-konċentrazzjoni użata fit-testijiet:
         
                     —
                  
                  
                     jinħallu fl-ilma sal-punt neċessarju għall-preparazzjoni tat-taħlita għat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     għandhom pressjoni tal-fwar negliġibbli fil-kondizzjonijiet tat-testijiet,
                  
               
                     —
                  
                  
                     huma inibittorji għall-batteri.
                  
               Informazzjoni fuq il-proporzjonijiet relattivi tal-komponenti l-iktar importanti tal-materjal tat-test hija importanti sabiex jiġu interpretati r-riżultati miksuba, b'mod partikolari f'dawk il-każijiet fejn ir-riżultati huma baxxi jew marġinali.
         Informazzjoni fuq it-tossiċità tas-sostanza għall-micro-organiżmi hija mixtieqa għall-interpretazzjoni tar-riżultati baxxi u fl-għażla tal-konċentrazzjonijiet xierqa għat-test.
         1.1.2.   Stabbiliment tal-bijodegrabilità aħħarija (analiżi DOC/COD)
         
         L-għan ta' dan il-metodu huwa li jistabbilixxi l-bijodegrabilità aħħarija billi jitkejjel ir-rimi tas-sostanza u xi metaboliti f'impjant mudell attivat tat-tajn u b'konċentrazzjoni li tikkorrispondi għal >12 mg DOC/litru (jew madwar 40 mg COD/litru); 20 mg DOC/litru jidher illi huwa l-aħjar. (DOC = Karbon Organiku Maħlul; COD = Bżonn ta' l-ossiġinu kimikali).
         Il-kontenut tal-karbon organiku (jew il-bżonn ta' l-ossiġinu kimikali) tal-materjal użat fit-test għandu jiġI stabbilit.
         1.1.3.   Stabbiliment tal-bijodegrabilità primarja (analiżi speċifika)
         
         L-għan tal-metodu huwa li tiġi stabbilita il-bijodegrabilità primarja tas-sostanza f'impjant mudell attivat tat-tajn, f'konċentrazzjoni ta' madwar 20mg/litru, bl-użu ta' metodu analitiku speċifiku (tista' tintuża konċentrazzjoni ogħla jew iktar baxxa jekk il-metodu analitiku u l-konsiderazzjoni tossika tippermetti). Dan jippermetti li ssir stima tal-bijodegrabilità primarja ta' sostanza (skompariment ta' l-istruttura kimikali oriġinali).
         L-għan ta' dan il-metodu m'huwiex li jiġi stabbilit il-mineralizzazzjoni tas-sostanza ttestjata.
         Metodu analitiku adegwat għall-istabbiliment tas-sostanza ttestajata għandu jkun għad-disposizzjoni.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET
         1.2.1.   Analiżi DOC/COD
         
         Il-livell ta' rimi tas-sostanza huwa mogħti:
         
                     
                        
                  
                  
                     [1(a)]
                  
               fejn
         
                     DR
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-grad ta' tneħħija f perċentwal DOC (jew COD) fil-medja tal-ħin ta' ritenzjoni mogħtija fir-rigward tal-materjal tat-test,
                  
               
                     T
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-konċentrazzjoni tal-materjal għat-test fl-influwenf f mg DOC/litru (jew mg COD/litru),
                  
               
                     E
                  
                  
                     =
                  
                  
                     DOC (jew COD) il-konċentrazzjoni fl-effluwent ta' l-unità tat-test f mg DOC/litru (jew mg COD/litru),
                  
               
                     Eo
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     DOC (jew COD il-konċentrazzjoni fl-effluwent ta' l-unità imbjank f mg DOC/litru (jew mg COD/litru).
                  
               Id-degradazzjoni tingħad bħala l-perċentwal tat-tneħħija DOC (jew COD) fil-ħin ta' retenzjoni mogħti fir-rigward tal-materjal għat-test.
         1.2.2.   Analiżi speċifika
         
         Il-perċentwali ta' eliminazzjoni tas-sostanza ttestjata mill-fażi akwea (Rw) fil-ħin medju taż-żamma huwa mogħti permezz ta':
         
                     
                        
                  
                  
                     [1(b)]
                  
               fejn:
         
                     CI
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni tas-sostanza fl-iffluwenti ta' l-unità ta' l-ittestjar (mg sostanza/litru, stabbilita minn analiżi speċifika),
                  
               
                     Co
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni tas-sostanza fl-effluwneti ta' l-unità ta' l-ittestjar (mg sostanza/litru, stabbilita minn analiżi speċifika)
                  
               1.3.   SOSTANZI TA' REFERENZA
         F'ċerti każijiet fl-investigazzjoni ta' sostanza ġdida, sostanzi ta' referenza jistgħu jkunu ta' użu, sostanzi ta' referenza speċifiċi, pero', għadhom ma jistgħux jiġu rakkomandati.
         1.4.   PRINĊIPJU TA' METODI TA' TTESTJAR
         Sabiex tiġi stabbilita il-bijodegrabilità aħħarija, żewġ unitajiet piloti attivati tat-tajn (testijiet konfermatorji OECD jew unitajiet ta' kontenituri porużi) għandhom isiru b'mod parallel. Is-sotanza ttestjata għandha tiġi miżjuda ma' l-iffluwent (drenaġġ sintetiku jew domestiku) ta' wieħed mill-unitajiet, filwaqt li l-ieħor jirċievi d-drenaġġ biss. Għall-istabbiliment tal-biodegradazzjoni primarja b'analiżi speċifika fl-iffluwent jew l-affluwent, tiġI użata unita' waħda biss.
         Il-konċentrazzjonijiet DOC (jew COD) huma kkalkolati fl-effluwenti, jew il-konċentrazzjonijiet tas-sostanza huma determinati b'analiżi speċifika.
         Id-DOC meħtieġ sabiex ikun ittestjat il-materjal m'huwiex imkejjel imma sempliċiment mogħti.
         Meta l-kejl ta' DOC (jew COD) huwa miksub, id-differenza fil-medja tal-konċentrazzjonijiet bejn it-testijiet u l-effluwenti kkontrollati hija assunta li tkun materjal ta' l-ittestjar iggradad inqas.
         Meta jsiru l-analiżi speċifiċi, il-bidla fil-konċentrazzjoni tal-molekula oriġinali tista' tiġi mkejla (bijodegradazzjoni primarja)
         L-unitajiet jistgħu jitħaddmu bil-“mod ta' unitajiet kkopjati”, bi proċedura transinolkulari.
         1.5.   KRITERJI TAL–KWALITÀ
         Il-konċentrazzjoni tal-bidu tas-sostanza tiddependi fuq it-tip ta' analiżi magħmula u l-limitazzjoni tagħha.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' TTESTJAR
         1.6.1.   Preparazzjoni
         
         1.6.1.1.   Apparat
         
         Hemm bżonn par unitajiet ta' l-istess tip b'eċċezzjoni ta' meta jsiru analiżijiet speċifiċi. Jistgħu jiġu użati żewġ tipi ta' apparat:
         Test ta' konferma ta' l-OECD
         L-apparat (appendiċi 1) jikkonsisti f'kontenitur (A) li jżomm id-drenaġġ sintetiku, pompa dożatriċi (B), kontenitur ta' aerjazzjoni (C), separatur (D), pompa ta' l-arja (E), sabiex tirriċikla t-tajn attivat, u kontenitur (F) li jilqa' fih l-effluwent ittrattat.
         Il-kontenituri (A) u (F) għandhom ikunu tal-ħġieġ jew plastik xieraq u li jżommu ta' l-anqas 24 litru. Il-pompa (B) għandha tipprovdi fluss kostanti ta' drenaġġ sintetiku għall-kontenitur ta' aerjazzjoni; tista' tiġi użata kwalunkwe sistema xierqa, sakemm il-fluss li dieħel u l-konċentrazzjoni jkunu assigurati. Waqt l-operat normali l-għoli tas-separatur (D) għandu jkun b'mod li l-volum li jinsab fil-kontenitur ta' aerjazzjoni huwa ta' taħlita ta' tlett litri. Kubu ta' aerjazzjoni li fih jgħaqad il-materjal (G) għandu jkun sospiż fil-kontenitur (C) fil-vertiċi tal-kon. Il-kwantità ta' arja li tgħaddi mill-kontenitur ta' aerjazzjoni tista' tiġi kkontrollata permezz ta' arloġġ li jaqra l-fluss.
         Il-pompa ta' l-arja (E) għandha tiġi magħmula b'mod li t-tajn attivat mis-separatur huwa kontinwament u regolament irriċiklat għall-kontenitur ta' aerjazzjoni (C).
         “Kontenitur poruż”
         Il-kontenitur poruż huwa magħmul minn pjanċi ta' polietilene poruż (2mm oħxon, d-daqs massimu tal-pori 95 μm), maħdum f'erba' ċilindri b'dijametru ta' 14 cm u b'bażi f'forma ta' 45o (Tabelli 1 u 2 ta' l-Appendiċi 2). Il-kontenitur poruż huwa mqiegħed f'kontenitur ieħor li ma jgħaddix likwidu minnu tal-plasitk adegwat b'dijametru ta' 15 cm, b'tobqa minn fejn joħroġ il-likwidu f'għoli ta' 17,2 cm fuq il-parti ċilindrika, li tiddetermina l-volum (3 litri) fil-kontenitur poruż. Għandu jkun hemm ukoll ċirku iebes li jservi ta' support magħmul minn plastik adegwat fil-quċċata tal-kontenitur ta' ġewwa, sabiex ikun hemm spazju effluwenti ta' 0,5 cm bejn il-kontenitur ta' ġewwa u dak ta' barra.
         Il-kontenituri porużi jistgħu jkunu mqiegħda fil-bażi ta' banju ta' l-ilma termostatikament ikkontrollat. Għandu jkun hemm fornitura ta' l-arja għall-bażi tal-kontenitur ta' ġewwa li fuqu jitqiegħdu diffużaturi adegwati.
         Il-kontenituri (A) u (E) għandhom ikunu tal-ħġieġ jew plastik adegwat u li jżommu ta' l-inqas 24 litru. Il-pompa (B) għandha tipprovdi fluss kostanti ta' drenaġġ sintetiku għall-kontenitur ta' l-aerjazzjoni; tista' tiġi użata kwalunkwe sistema xierqa, sakemm il-fluss tad-dħul u l-konċentrazzjoni huma assigurati.
         Kontenituri porużi żejda huma bżonnjużi sabiex jirrimpjazzaw oħrajn li jistgħu jiġu miżduda waqt l-użu; il-kontenituri miżduda huma mnaddfa permezz ta' immersjoni ta' 24 siegħa f'taħlita ipokolritika imbagħad b'ħassla sħiħa fl-ilma tal-vit.
         1.6.1.2.   Filtrazzjoni
         
         Apparat ta' filtrazzjoni bil-membrena, u filtri tal-membrena bid-daqs tal-pori ta' 0,45 μm. Il-filtri tal-membrena huma xierqa jekk huwa assigurat li dawn ma jirilaxxawx il-karbon u li ma jixrobux mit-taħlita waqt l-istadju tal-filtrazzjoni.
         1.6.1.3.   Drenaġġ
         
         Jista' jiġi użat dak sintetiku jew dak domestiku.
         Eżempju ta' drenaġġ sintetiku
         Ħallat f'litru ta' ilma tal-vit:
         
                     Pepton:
                  
                  
                     160 mg,
                  
               
                     Estratti mil-laħam:
                  
                  
                     10 mg,
                  
               
                     Urea:
                  
                  
                     30 mg,
                  
               
                     NaCl:
                  
                  
                     7 mg,
                  
               
                     CaCl2 .2H2O:
                  
                  
                     4 mg,
                  
               
                     MgSO4 .7H2O:
                  
                  
                     2 mg,
                  
               
                     K2HPO4:
                  
                  
                     28 mg.
                  
               Drenaġġ domestiku
         Dan għandu jkun miġbur kuljum miż-żejjed tat-tank primarju fejn id-drenaġġ joqgħod ta' impjant għat-trattament li predominament jitratta drenaġġ domestiku.
         1.6.1.4.   Stokk tat-taħlita tal-materjal għall-ittestjar.
         
         Għandha tiġi ppreparata taħlita ta' materjal għall-ittestjar, eż. 1 % biex tiżdied ma' l-untità ta' l-ittestjar. Il-konċentrazzjoni tal-materjal għandha tiġi stabbilita, sabiex il-volum adegwat li jiżdied mad-drenaġġ jew direttament ma' l-unità permezz ta' pompa oħra sabiex tagħti l-konċentrazzjoni tat-test.
         1.6.1.5.   Inoculum
         
         
            Kumment: Meta jiġi użat drenaġġ domestiku, ma jkunx hemm għalfejn li jintuża inoculum ta' konċentrazzjoni baxxa ta' batteri, imma jista' jiġi użat tajn attivat.
         Jistgħu jiġu użati varjetà ta' inocula.
         Qed jingħataw tliet eżempji ta' inculum adegwat:
         
                     (a)
                  
                  
                     Inoculum minn effluwent sekondarju
                     L-inoculum għandu jkun miksub minn effluwent sekondarju ta' kwalità tajba miksub minn impjant ta' trattament li jipproċessa predominalment drenaġġ domestiku. L-effluwent għandu jinżamm taħt kondizzjonijiet aerjużi fil-perjodu ta' bejn meta jittieħed il-kampjun u l-użu. Sabiex ikun preparat l-inoculum, il-kampjun huwa ffiltrat permezz ta' filtru oħxon, bl-ewwel 200 ml jintremew. Il-filtrat għandu jinżamm aerjat sakemm jintuża. L-inoculum għandu jintuża fil- ġurnata li fiha dan jiġi miġbur. Għandhom ta' l-anqas jintużaw 3 ml għall-inokulazzjoni.
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     Inoculum compost
                     Inoculum minn effluwent sekondarju:
                     Ara d-deskrizzjoni hawn fuq.
                     Inoculum mill-ħamrija:
                     100 g ta' ħamrija tal-ġnien (fertili u mhux sterili) huma sospiżi f'1 000 ml ta' ilma tax-xorb ħieles mill-kloru. (Ħamrija b'parti kbira ta' tafal, ramel jew ħumus m'humiex adegwati.) Wara li dawn jitħalltu, s-sospensjoni għandha titħalla toqgħod għall-30 minuta. It-taħlita hija ffiltrata permezz ta' karta ħarxa tal-filtru, bl-ewwel 200 ml jkunu mormija. Il-filtrat għandu jinżamm aerjat immedjatament sakemm dan jintuża. L-inoculum għandu jintuża fl-istess ġurnata li dan ikun inġabar.
                     Inoclum mill-ilma tal-wiċċ:
                     Inoculum ieħor għandu jkun miġbur mill-ilma tal-wiċċ mesosaprobiku. Il-kampjun huwa filtrat permezz ta' karta ħarxa tal-filtru bl-ewwel 200 ml jkunu mormija. Il-filtrat għandu jinżamm aerjat immedjatament sakemm dan jintuża. L-inoculum għandu jintuża fl-istess ġurnata li dan ikun inġabar.
                     Volumi ugwali tat-tlett inocula huma mħallta flimkien, u b'hekk jinġabar inoculum finali minn din it-taħlita. Ta' l-anqas 3 ml għandhom jintużaw għal din l-inokulazzjoni.
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     Inoculum minn tajn attivat
                     Volum (ta' mhux aktar minn 3 litri) ta' tajn attivat (solidi sospiżi f'kontenut sa 2,5 g/litru) meħud mit-tank ta' l-aerjazzjoni ta' l-impjant li predominament jitratta drenaġġ domestiku jista' jintuża bħala inoculum.
                  
               1.6.2.   Proċedura
         
         It-test isir fit-temperatura tal-kamra; dan għandu jinżamm f'temperatura ta' bejn 18 u 25o C.
         Jekk huwa xieraq, it-test jista' jsir f'temperatura iktar baxxa (sa' 10o C); jekk is-sostanza ddegradat, m'hemmx bżonn ta' aktar xogħol. Jekk, madankollu, is-sotanza ma ddegradatx, it-test għandu jsir b'temperatura stabbli ta' bejn 18 u 25o C.
         1.6.2.1.   Perjodu ta' running-in: Formazzjoni tat-tajn/stabilizazzjoni ta' l-unitajiet
         
         Il-perjodu tat-tkabbir/stabilizazzjoni tat-tajn huwa l-perjodu li fiħ il-konċentrazzjoni tas-solidi sospiżi tat-tajn attivat u l-effiċċjenza tal-progress ta' l-unitajiet lejn stat stabbli taħt il-kondizzjonijiet ta' l-operat użat.
         Il-perjodu tar-running-in li jdum minn meta s-sostanza tat-test hija l-ewwel miżjuda saż-żmien meta t-tneħħija tagħha tlaħħaq ċertu punt (valur relattivament kostanti). Dan il-perjodu m'għandux jaqbeż is-sitt ġimgħat.
         Il-perjodu evalwattiv huwa ta' tlett ġimgħat minn meta t-tneħħija tas-sostanza ta' l-ittestjar tlaħħaq valur relattivament kostanti u normalment għoli. Għal dawk is-sostanzi li juru ftit jew xejn degradazzjoni fl-ewwel sitt ġimgħat, il-perjodu evalwattiv ikun dak tat-tlett ġimgħat li fadal.
         Inizjalment, għandhom jimtlew l-unitajiet, jew l-unità, bżonnjużi għal test wieħed bl-inoculum imħallat ma' l-effluwent.
         L-aerjatur (u l-pompa ta' l-arja (E) fil-każ ta' unitajiet ta' testijiet konfermatorji OECD) u l-pompa dożattriċi (B) għandhom jinxtgħelu.
         L-iffluwent mingħajr is-sostanza li għandu jiġi ttestjat għandu jgħaddi minn kontenitur ta' aerjazzjoni (C) jew bir-rata ta' litru fis-siegħa jew bir-rata ta' nofs litru fis-siegħa; dan jagħti l-ħin medju ta' ritensjoni ta' tliet jew sitt siegħat.
         Ir-rata ta' aerjazzjoni għandha tkun irregolata sabiex il-kontenut tal-kontenitur (C) jinżamm kostanti f'sospenzjoni filwaqt li l-kontenut ta' l-ossiġinu mħallat jkun ta' l-anqas ta' 2 mg/litru.
         Għandu jiġi evitat li jsir “foaming” b'mezzi adegwati. M'għandhomx jintużaw prodotti kontra l-“foaming” li jdgħajfu t-tajn attivat.
         It-tajn li jkun akkumula madwar il-quċċata tal-kontenitur ta' aerjazzjoni (C) (u, fil-każ ta' l-unitajiet tat-test konfermatorju OECD, fil-bażi tal-kontenitur li fiħ is-sospensjoni toqgħod (D), u fiċ-ċirkwit ta' ċirkolazzjoni) għandu jingħata lura lit-taħlita ta' l-anqas darba kuljum billi jinkines jew permezz ta' xi mod ieħor adegwat.
         Meta t-tajn ma joqgħodx, id-densità tiegħu tista' tiżdied permezz ta' porzjonijiet ta' 2 ml ta' taħlita ta' 5 % kloru tal-ħadid, u ripetut kif xieraq.
         L-effluwent huwa miġbur f'kontenitur (E jew F) għal 20 jew 40 siegħa, u jittiħed kampjun wara li jkun imħallat sew. Il-kontenitur (E jew F) għandu jiġi mnaddaf bil-għaqal.
         Sabiex tkun kontrollata l-effiċjenza tal-proċess, il-bżonn ta' l-ossiġinu kemkali (COD) jew il-karbon organiku mħallat (DOC) tal-filtrat tal-effluwenti akkumulat għandu jiġi mkejjel ta' l-anqas darbtejn fil-ġimgħa, kif ukoll dak ta' l-iffluwent iffiltrat (bl-użu ta' membrana bid-daqs tal-pori ta' 0,45 μm, l-ewwel 20 ml (bejn wieħed u ieħor) tal-filtrat jintremew)
         It-tnaqqis fil-COD jew DOC għandhom jikkompensaw “l xulxin meta tintlaħaq degradazzjoni regolari kuljum”.
         Il-kontenut ta' materja niexfa tat-tajn attivat fit-tank ta' aerjazzjoni għandu jkun stabbilit darbtejn fil-ġimgħa (fi g/litru). L-unitajiet jistgħu jkunu operati f'wieħed minn żewġ modi: il-kontenut tal-materja niexfa fit-tajn attivat jkun stabbilit darbetjn fil-ġimgħa, u, jekk hu aktar minn 2,5 g/litru, it-tajn attivat żejjed għandu jintrema, jew inkella 500 ml tat-taħlita huwa mormi minn kull kontenitur kuljum sabiex jingħata perjodu ta' ritenzjoni medju tat-tajn ta' sitt ijiem.
         Meta il-parametri mkejla u stmati (effiċjenza tal-proċess (fit-tneħħija COD jew DOC). Il-konċentrazzjoni tat-tajn, il-kapaċità li t-tajn għandu biex joqgħod, it-taħlit tal-iffluwenti, eċċ.) taż-żewġ unitajiet huma suffiċjentement stabbli, s-sostanza tat-test tista' tkun introdotta fl-iffluwent ta' wieħed mill-unitajiet, skond 1.6.2.2.
         Alternattivament, is-sostanza tat-test tista' tkun miżjuda fil-bidu tal-perjodu li fiħ jitabbar it-tajn (1.6.2.1), speċjalment meta t-tajn huwa miżjud bħala l-inoculum.
         1.6.2.2.   Proċedura tat-test
         
         Il-kondizzjonijiet ta' l-operat tal-perjodu tar-running-in għandhom ikunu miżmuma u għandha tiżdied biżżejjed taħlita (madwar 1 %) tal-materjal tat-test ma' l-iffluwent ta' l-unità tat-test sabiex il-konċentrazzjoni mixtieqa tal-materjal tat-test (madwar 10 sa 20 mg DOC/litru jew 40 mg COD/litru) fid-drenaġġ tkun miksuba. Dan jista' jsir billi titħallat it-taħlita tad-drenaġġ kuljum permezz ta' sistema ta' ppumpjar. Il-konċentrazzjoni tista' tintlaħaq progressivament. Jekk ma jkunx hemm effetti tossiċi għas-sostanza ttestjata fuq it-tajn attivat, jistgħu jkunu ttestjati konċentrazzjonijiet ogħla.
         L-unità vojta hija mogħtija l-iffluwent, mingħajr sostanzi oħrajn miżjuda, volumi xierqa ta' l-effluwenti għandhom jkunu analiżżati u ffiltrati permezz ta' filtri tal-membrena (0,45 μm) bl-ewwel 20 ml (jew madwar) tal-materjal ffiltrat jkun mormi.
         Il-kampjuni ffiltrati għandhom jkunu analiżżati fl-istess jum, inkella għandhom jiġu ppreżervati bi kwalunkwe metodu xieraq, per eżempju bl-użu ta' 0,05 ml ta' 1 % kloru tal-merkurju (HgCl2) għal kull 10 ml ta' taħlita ffiltrata jew billi jiġu miżmuma f'temperatura minn 2 sas 4 oC sa 24 siegħa, jew inqas minn - 18 oC għall-perjodi itwal.
         Il-perjodu tar-running-in biż-żieda tas-sostanza ttestjata, m'għandu jeċċedi sitt ġimgħat u l-perjodu ta' valutazzjoni m'għandux ikun iqas minn tlett ġimgħat, i.e. għandu jkun hemm madwar 14 sa 20 determinazzjoni għall-kalkolazzjonijiet tar-riżultat finali.
         Mod ta' unitajiet akkoppjati
         L-akkoppjament ta' l-unitajiet jinkiseb billi jitħalltu 1,5 litri tat-taħlita (inkluż t-tajn) mit-tankijiet ta' aerjazzjoni tat-tajn attivat bejn iż-żewġ unitajiet darba kuljum. Fil-każ ta' materjali ta' l-ittestjar li jassorbu ħafna, 1,5 litri ta' likwidu supernatant huma miġbuda mil-kontenituri fejn toqgħod it-taħlita u mferra fil-kontenitur tat-tajn attivat ta' l-unità l-oħra.
         1.6.2.3.   Analiżi
         
         Jistgħu jsiru żewġ tipi ta' analiżi sabiex tiġi segwita n-natura tas-sostanza:
         DOC u COD
         Il-konċentrazzjonijiet DOC għandhom isiru b'mod doppju ma' l-analiżi tal-karbonju u/jew il-valuri COD skond il-punt (2).
         Analiżi speċifika
         Il-konċentrazzjonijiet tas-sostanzi ttestjati jinstabu b'metodu analitiku xieraq. Fejn possibbli, għandha ssir seterminazzjoni speċifika tas-sostanza mixruba fuq it-tajn.
         2.   DATA U VALUTAZZJONI
         2.1.   MOD TA' UNITAJIET AKKOPPJATI
         Meta jkun qed jintuża l-“mod ta' unitajiet akkoppjati”, il-gradi ta' kuljum tat-tneħħija DR huma kkalkolati skond 1.2.1.
         Il-gradi ta' kuljum tat-tneħħija DR huma kkoreġuti għall-DRc għat-trasferiment tal-materjal minħabba l-proċedura ta' transinokulazzjoni bil-formula [2] għall-perjodu ta' retenzjoni ta' tlett siegħat jew formula [3] għall-dak ta' sitt siegħat.
         
                     
                        
                  
                  
                     [2]
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     [3]
                  
               Il-medja ta' serje ta' valuri DRc hija kkalkolata u għandha tiżdied id-derivazzjoni standard skond il-formula [4]
         
                     
                        
                  
                  
                     [4]
                  
               fejn:
         
                     SDRc
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     devjazzjoni standard tas-serje ta' valuri DRc,
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     meda tal-valur DRc,
                  
               
                     n
                  
                  
                     =
                  
                  
                     numru ta' determinazzjonijiet.
                  
               Valuri li huma 'l bogħod mill-medja tas-serje DRc għandhom jiġu mneħħija skond proċedura statistikali xierqa, eż. Nalimov (6), fil-livell ta' probabbilità ta' 95 % u l-medja ta' d-devjazzjoni standard tad-data outlier free DRc mingħajr valuri li huma 'l bogħod mill-medja hija kkalkolata.
         Ir-riżultat finali huwa kkalkolat bil-formula [5] bħala
         
                     
                        
                  
                  
                     [5]
                  
               fejn:
         
                     tn-1; α
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-valur tat-tabella ta' t għall-valur n ta' koppji ta' E u EO u konfidenza statistika P (P = 1 – α) fejn P huwa 95 % (1).
                  
               Ir-riżultat huwa mogħti bħala l-medja bil-limitu ta' tolleranza fil-livell tal-probabilità ta' 95 %, id-devjazzoni standard rispettiva u n-numru ta' l-informazzjoni DRc mingħajr valuri li huma 'l bogħod mill-medja, u n-numru ta' dawn l-istess valuri, eż.
         
                     DRc
                  
                  
                     =
                  
                  
                     98,6±2,3 % tneħħija DOC
                  
               
                     s
                  
                  
                     =
                  
                  
                     4,65 % tneħħija DOC
                  
               
                     n
                  
                  
                     =
                  
                  
                     18,
                  
               
                     x
                  
                  
                     =
                  
                  
                     numru ta' riżultati li huma 'l bogħod mill-medja.
                  
               2.2.   MOD TA' UNITAJIET MHUX AKKOPPJATI
         L-effiċjenza ta' dawn l-unitajiet jistgħu jkunu kkontrollati kif ġej:
         
            
         Dawn it-tneħħijiet ta' kuljum jistgħu jitpinġew grafikament sabiex jikxfu kwalunkwe imġieba, eż. akklimatizzazzjoni.
         2.2.1.   Użu ta' determinazzjonijiet COD/DOC
         
         Il-grad ta' tneħħija ta' kuljum ta' DR huwa kkalkolat skond il-punt 1.2.1.
         Il-medja tas-serje ta' valuri DR hija kkalkolata; aktar minn dan, id-devjazzjoni standard hija kkalkolata skond:
         
                     
                        
                  
                  
                     [6]
                  
               fejn:
         
                     sDR
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     devjazzjoni standard ta' serje ta' valuri DRi,
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     medja ta' valuri DRi,
                  
               
                     n
                  
                  
                     =
                  
                  
                     numru ta' determinazzjonijiet.
                  
               Valuri li huma 'l bogħod mill-medja tas-serje DR jiġu mneħħija skond proċedura statistikali adegwata, eż. Nalimov (6) fil-livell ta' probabilità ta' 95 %, u l-medja tad-devjazzjoni standard tal-valuri DR mingħajr valuri li huma 'l bogħod mill-mejda hija ikkalkolata.
         Ir-riżultat finali huwa kkalkolat permezz tal-formula [7]:
         
                     
                        
                  
                  
                     [7]
                  
               fejn:
         
                     tn-1; α
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-valur tat-tabella ta' t għall-valur n ta' koppji ta' E u EO u konfidenza statistika P (P = 1 – α) fejn P huwa 95 % (1). tn-1; α table value of t for n value pairs of E and Eo and statistical confidence P (P = 1-α) whereby P is set at 95 % (1).
                  
               Ir-riżultat jingħata bħala il-medja b'limiti ta' tolleranza fil-livell ta' probabilità 95Ž %, id-devjazzjoni standard rispettiva u n-numru tad-data ta' l-outlier-free DRc data set, u n-numru ta'l-outliers, eż.:
         
                     DRc
                  
                  
                     =
                  
                  
                     98,6±2,3 % DOC it-tneħħija,
                  
               
                     s
                  
                  
                     =
                  
                  
                     4,65 % DOC it-tneħħija,
                  
               
                     n
                  
                  
                     =
                  
                  
                     18,
                  
               
                     x
                  
                  
                     =
                  
                  
                     in-numru ta' l-outliers.
                     
                  
               2.2.2.   L-użu ta' analiżi speċifika
         
         Il-perċentwal ta' l-eliminazzjoni tas-sustanza għat-test mil-fażi akwea (Rw) huwa kkalkulat skond 1.2.2.
         3.   RAPPORTI
         3.1.   RAPPORTI TAT-TESTIJIET
         Ir-rapport tat-testijiet għandu jkollu, jekk hu possibbli, dan li ġej:
         
                     —
                  
                  
                     il-formula mogħtija fl-Appendiċi 3, li turi l-kondizzjonijiet ta' l-operat tat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     liema apparat kien qed jintuża (test konfermatorju OECD jew tal-kontenitur poruż),
                  
               
                     —
                  
                  
                     liema mod ta' l-operat intuża, dak akkoppjat jew dak li m'huwiex,
                  
               
                     —
                  
                  
                     liema tip ta' drenaġġ: sintetiku jew domestiku – fil-każ ta' drenaġġ domestiku, d-data u l-post tal-kampun,
                  
               
                     —
                  
                  
                     liema inoculum, bid-data u l-post tal-kampun,
                  
               
                     —
                  
                  
                     dikjarazzjoni bid-deskrizzjoni tal-metodu analitiku ta' l-analiżi speċifiċi li saru,
                  
               
                     —
                  
                  
                     tabella grafika tat-tneħħija COD jew DOC mal-ħin, inklużi il-perjodi tar-running-in u l-perjodu ta' valutazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     rekupru analitiku tas-sostanza ttestjata bħala COD jew DOC fit-taħlita,
                  
               
                     —
                  
                  
                     jekk saru l-analiżi speċifiċi, tabella grafika tal-perċentwali ta' tneħħija tas-sostanza ttestjata mal-fażi akwea u l-ħin (perjodi ta' running-in u ta' valutazzjoni),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-medja tat-tneħħija tas-sostanzi ttestjati DOC jew COD u d-devjazzjoni standard huma kkalkolati mir-riżultati tal-perjodu ta' valutazzjoni, i.e. fejn ikun hemm tneħħija standard tal-materjal tat-test jew perjodu stabbli ta' l-operat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     tabella grafika tat-tajn attivat mal-ħin,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwalunkwe kumment fir-rigward tat-tajn attivat (rimi ta' tajn eċċessiv, preżenza ta' bulking, FeCl3, eċċ.),
                  
               
                     —
                  
                  
                     konċentrazzjoni tas-sostanza użata fit-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwalunkwe riżultati li jirrigwardjaw l-analiżi magħmula fuq it-tajn,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-informazzjoni kollha u r-riżultati ta' l-esperimenti magħmula fuq is-sostanza tat-test u tas-sostanza ta' referenza jekk intużat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     raġunijiet xjentifiċi għal xi tibdil tal-poċediment.
                  
               3.2.   INTERPRETAZZJONI TAR–RIŻULTATI
         Tneħħija baxxa tal-materjal ttestjat mill-fażi akewa jista' jiġri minħabba l-inibizzjoni tal-mikrorganiżmi mis-sostanza ttestjata. Dan jista' jidher ukoll mill-leża u mit-telf tat-taħlita, li tagħti supernatant turbidu, minn nuqqas ta' tneħħija ta' l-effiċjenza COD (jew DOC) mill-impjant pilota.
         L-assorbiment fiżikukemikali jista' jkollu effett. Differenzi bejn l-azzjoni bioloġika fuq il-molekula u l-assorbiment fiżiku-kemikali jista' jidher minn analiżi magħmula mit-tajn wara desorzjoni adegwata.
         Testijiet oħrajn huma neċessarji jekk trid issir distinzjoni bejn il-bijodegradazzjoni (jew bijodegradazzjoni parzjali) u assorbiment.
         Dan jista' jseħħ f'numru ta' modi, imma l-iktar wieħed konvinċenti huwa l-użu ta' supernatant bħala inoculum fuq test bażi (preferibbilment test respirometriku).
         Jekk tiġi osservata tneħħija għolja ta' DOC jew COD, dan ikun minħabba l-biodegradazzjoni filwaqt, bi tneħħija baxxa, il-biodegradazzjoni ma tingħarafx mill-eliminazzjoni. Per eżempju, jekk kompost solubbli juri kostant ta' assorbiment għoli ta' 98 % u r-rata ta' r-rimi tat-tajn żejjed hija ta' 10 % kull jum, hija possibli eliminazzjoni sa' 40 %; b'rata ta' rimi tat-tajn żejjed ta' 30 % minħabba l-assorbiment fuq it-tneħħija bit-tajn żejjed li jista' jammonta għall-65 % (4).
         Meta tkun qed tintuża analiżi speċifika, għandha tingħata attenzjoni lejn ir-rabta bejn l-istruttura tas-sostanza u l-analiżi speċifika użata. F'dan il-każ, il-fenomenu osservat ma jistgħax jiġi interpretat bħala mineralizzazzjoni tas-sostanza.
         4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD, Pariġi, 1981, Linjigwida dwar it-testijiet 303 A, Deċiżjoni tal-Kunsill C(81) 30 finali.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Anness V C9 Test ta' Degradazzjoni – Ossiġinu Kimiku Meħtieġ. Direttiva tal-Kummissjoni 84/449/KEE, Ġurnal Uffiċjali tal-Komunitajiet Ewropej, Nru L 251, 19.9.1984.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Painter, H. A., King, E. F., WRC Metodu tal-Kontenitur Poruż għall-istima tal-biodegradibilità, Rapport Tekniku TR70, Ġunju 1978, Ċentru tar-Riċerka fuq l-Ilma, r-Renju Unit.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Wierich, P., Gerike, P., L-andantament tal-komposti solubbli, rekalċitranti u assorbenti fl-impjanti tat-tajn attivat, Sigurtà Ecotossikali Ambjentali, vol. 5, Nru 1, Ġunju 1981, pp. 161 sa 171.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Direttivi tal-Kunsill nru. 82/242/KEE u 82/243/KEE, Ġurnal Uffiċjali tal-Komunitajiet Ewropej, Nru. L 109, 22.4.1982, li jemenda d-Direttivi tal-Kunsill Nru. 73/404/KEE u 73/405/KEE dwar il-bijodegrabilità tad-deterġenti, Ġurnali Uffiċjali tal-Komunitajiet Ewropej. Nru. L 347, 17.12.1973.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreißetests, insbesondere bei Ringversuchen zur Überprüfung analytisch-chemischer Untersuchungsmetoden, Fresenius-Zeitschrift fur Analytiche Chemie, 303 (1980), pp. 406 to 408.
                  
               
            Appendiċi 1
            Tabella 1
            Tabella 2
            
         
            Appendiċi 2
            Tabella 1
            Apparat użat sabiex jistabbilixxi l-bijodegrabilità
            Tabella 2
            Dettalji tal-kontenitur poruż ta' aerjazzjoni ta' tlett litri
            
         
            Appendix 3
            Operating conditions for the Activated Sludge Simulation Test
            Check in each group
            Apparatus
            
                        OECD confirmatory
                     
                     
                         
                     
                  
                        Porous pot
                     
                     
                         
                     
                  Mode of operation
            
                        Single unit
                     
                     
                         
                     
                  
                        Coupled units
                     
                     
                         
                     
                  
                        Non-coupled units
                     
                     
                         
                     
                  Transinoculation
            
                        None
                     
                     
                         
                     
                  
                        Activated sludge
                     
                     
                         
                     
                  
                        Supernatant
                     
                     
                         
                     
                  Mean retention time
            
                        Three hours
                     
                     
                         
                     
                  
                        Six hours
                     
                     
                         
                     
                  Base nutrient
            
                        Domestic sewage
                     
                     
                         
                     
                  
                        Synthetic sewage
                     
                     
                         
                     
                  Inoculum
            
                        Secondary effluent
                     
                     
                         
                     
                  
                        Composite
                     
                     
                         
                     
                  
                        Activated sludge
                     
                     
                         
                     
                  Test material addition
            
                        Form the start
                     
                     
                         
                     
                  
                        Stepwise increase
                     
                     
                         
                     
                  
                        After sludge has formed
                     
                     
                         
                     
                  Analysis
            
                        Specific
                     
                     
                         
                     
                  
                        COD
                     
                     
                         
                     
                  
                        DOC
                     
                     
                         
                     
                  
         C.11.   BIJODEGRADAZZJONI
         TEST TA' L-INIBIZZJONI TAR-RESPIRAZZJONI TAT-TAJN ATTIVAT
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Il-metodu deskritt jistima l-effett ta' sostanza tat-test fuq il-mikrorganiżmi billi jkejjel ir-rata ta' respirazzjoni f'kondizzjonijiet definiti fil-preżenza ta' konċentrazzjonijiet tas-sostanza tat-test.
         L-għan ta' dan il-metodu huwa li jgħati metodu ta' screening li biħ is-sostanzi li jistgħu jaffettwaw ħażin l-impjanti tat-trattament aerobiċi tal-mikrobi jiġu individwati, u li jindika konċentrazzjonijiet xierqa li mhux inibitorji tas-sostanza tat-test li għandha tintuża fit-testijiet tal-bijodegrabilità.
         Jista' jsir test li jiddefinixxi l-varjetà qabel it-test definittiv. Dan jipprovdi informazzjoni dwar il-varjetà ta' konċentrazzjonijiet li għandhom jintużaw fit-test.
         Huma inklużi ukoll żewġ testijiet mingħajr is-sostanza tat-test, wieħed fil-bidu u lieħor fl-aħħar tas-serje tat-testijiet. Kull ammont ta' tajn attivat għandu jiġi kkontrollat ukoll bl-użu ta' sostanza ta' referenza.
         Dan il-metodu huwa l-aktar applikat għall-sostanzi li, minħabba li dawn jinħallu fl-ilma u li ma evaporawx, x'aktarx li jibqgħu fl-ilma.
         Għal sostanzi li ma tantx jinħallu fl-ilma fis-sostanza tat-test, x'aktarx li ma jkunx possibbli li jiġi ddeterminat l- EC50 .
         Riżultati bbażati fuq il-bżonn ta' ossiġinu jista' jwassal għal konklużjonijiet ħżiena meta s-sostanza tat-test jkolla l-propensità li tneħħi l-fosforilazzjoni ossidattiva akkopjata.
         Din l-informazzjoni waqt li jkun qed isir it-test hija bżonnjuża:
         
                     —
                  
                  
                     is-solubilità ta' l-ilma
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-pressjoni tal-fwar
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-forma strutturali
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-purità tas-sostanza tat-test.
                  
               Rakkomandazzjoni
         It-tajn attivat jista' jkollu organiżmi potenzalment patoġeniċi u għandu jiġi mmanovrat b'attenzjoni.
         1.2.   DEFINIZZJONI U UNITAJIET
         Ir-rata ta' respirazzjoni hija l-konsum ta' ossiġinu tal-mikrorganiżmi fl-ilma maħmuġ f tajn aerobiku, espressa ġeneralment bħala mg O2 ta' tajn għal kull siegħa.
         Sabiex jiġi kkalkolat l-effett inibitorju tas-sostanza tat-test, f'konċentrazzjoni partikolari, ir-rata ta' respirazzjoni hija espressa bħala perċentwali tal-medja ta' żewġ rati ta' kontroll respiratorju:
         
            
         Fejn:
         
                     Rs
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     rata ta' konsum ta' ossiġinu f'konċentrazzjoni ttestjata ta' sostanza tat-test,
                  
               
                     Rc1
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     rata ta' konsum ta' l-ossiġinu, kontroll 1,
                  
               
                     Rc2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     rata ta' konsum ta' l-ossiġinu, kontroll 2.
                  
               EC50 f'dan il-metodu huwa l-konċentrazzjoni tas-sostanza tat-test li fiha r-rata ta' respirazzjoni hija ta' 50 % ta' dik murija mill-kontroll taħt il-kondizzjonijiet deskritti f dan il-metodu.
         1.3.   SOSTANZI TA' REFERENZA
         Huwa rrakkomandat li 3,5-diklorofenol, bħala inibitur magħruf ta' respirazzjoni, jintuża bħala sostanza ta' referenza u ttestjat għall-EC50 fuq kull ammont ta' tajn attivat bħala mod ta' kontroll li s-sensittività tat-tajn ma tkunx anormali.
         1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Ir-rata ta' respirazzjoni ta' tajn ativat mogħti ammont standard ta' drenaġġ sintetiku huwa mkejjel wara ħin ta' kuntatt ta' 30 minuta jew tlett siegħat, jew it-tnejn li huma. Ir-rata ta' respirazzjoni ta' l-istess tajn attivat fil-preżenza ta' varji konċentrazzjonijiet tas-sostanza tat-test taħt kondizzjonijiet identiċi hija kkalkolata ukoll. L-effett inibitorju tas-sostanza tat-test f'konċentrazzjoni partikolari hija espressa bħala perċentwali tar-rati medji ta' respirazzjoni ta' żewġ kontrolli. Valur EC50 huwa kkalkolat mid-determinazzjonijiet ta' konċentrazzjonijiet differenti.
         1.5.   KRITERJI TAL–KWALITÀ
         Ir-riżultati tat-testijiet huma validi jekk:
         
                     —
                  
                  
                     iż-żewġ rati ta' kontroll ta' respirazzjoni m'humiex ta' iktar minn 15 % minn xulxin,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l- EC50 (30 minuta u/jew tliet siegħat) ta' 3,5-diklorofenol huwa fl-ambitu aċċettat ta' 5 sa 30 mg/litru.
                  
               1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.6.1.   Reaġenti
         
         1.6.1.1.   Taħlita tas-sostanza tat-test
         
         Taħlit tas-sostanza tat-test huma ppreparati fil-bidu ta' l-istudju bl-użu ta' taħlita ta' l-istokk. Konċentrazzjoni ta' taħlita ta' l-istokk ta' 0,5 g/litru hija adegwata jekk il-proċedura rrakkomandata hawn isfel hija segwita.
         1.6.1.2.   Taħlita tas-sostanza ta' kontroll
         
         Taħlita ta' 5,5-diklorofenol tista', per eżempju, tkun ippreparata billi jinħallu 0,5 g 3,5-dikolorofenol f'10 ml ta' 1M NaOH, maħlula f'madwar 30 ml ta' ilma distillat, biż-żieda ta' 0,5 M H2SO4 sal-punt ta' preċipitazzjoni inċipjenti – madwar 8ml ta' 0,5 M H2SO4 għandu jkun meħtieġ – u fl-aħħar billi t-taħlita tkun maħlula f'litru ta' ilma distillat. Il-pH għandu jkun ta' bejn 7 sa 8.
         1.6.1.3.   Drenaġġ Sintetiku
         
         Taħlita ta' drenaġġ sintetika issir billi jitħalltu flimkien l-ammonti ta' sostanzi li ġejjin f'litru ilma:
         
                     —
                  
                  
                     16 g Pepton
                  
               
                     —
                  
                  
                     11 g Estratti mil-laħam
                  
               
                     —
                  
                  
                     3 g urea,
                  
               
                     —
                  
                  
                     0,7 g NaCl,
                  
               
                     —
                  
                  
                     0,4 g CaCl2.2H2O,
                  
               
                     —
                  
                  
                     0,2 g MgSO4.7H2O,
                  
               
                     —
                  
                  
                     2,8 g K2HPO4.
                  
               
            Nota 1: Dan id-drenaġġ sintetiku huwa 100 darba iktar konċentrat minn dak deskritt fir-Rapport Tekniku OECD Metodu propost sabiex tiġi stabbilita l-bijodegrabilità ta' surfactants użati fid-deterġenti sintetiċi (Ġunju 11, 1976), biż-żieda tal-fosfat tad-dipotassju ta' l-idroġenu.
         
            Nota 2: Jekk it-taħlita preparata m'hijiex użata immedjatament, din għandha tinżamm fid-dlam f'temperatura ta' bejn 0o sa 4o C, għal mhux aktar minn ġimgħa, f'kondizzjonijiet li ma jikkawżaw l-ebda biddla fil-kompożizzjoni tagħha. It-taħlita tiġi ukoll sterilizzata qabel ma tintrefa, jew il-pepton u l-estratt tal-laħam jista' jiżdied ftit qabel ma jsiru t-testijiet. Qabel l-użu, dan għandu jkun imħallat kompletament u l-pH aġġustat.
         1.6.2.   Apparat
         
         Apparat li jkejjel id-disinn preċiż m'huwiex kritiku. Madankollu, għandu jkun hemm spazju fil-parti l-għolja u l-parti 'l barra għandha teħel tajjeb bl-għonq tal-flixkun tal-kejl.
         Apparat nomali tal-laboratorju, u b'mod partikolari dan l-apparat li ġej huwa neċessarju:
         
                     —
                  
                  
                     apparat li jkejjel,
                  
               
                     —
                  
                  
                     apparat li jippermetti l-aerjazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     elettrod li jkejjel il-pH u apparat li jkejjel,
                  
               
                     —
                  
                  
                     eletrod ta' l- O2.
                  
               1.6.3.   Preparazzjoni ta' l-inoculum
         
         It-tajn attivat minn impjant tat-trattament tad-drenaġġ predominament domestiku huwa użat bħala l-inoculum micobiku għat-test.
         Jekk huwa neċessarju, meta jittieħed lura fil-laboratorju, jistgħu jitenħħew l-biċċiet il-kbar li jkunu qagħdu għal perjodu qasir, eż. 15-il minuta, u billi jinġibdu biċċiet fini mill-wiċċ ta' l-ilma għall-użu. Alternattivament, it-tajn jista' jkun imħallat bl-użu ta' blender għall-ftit sekondi.
         Aktar minn dan, jekk huwa maħsub li jeżisti materjal inibittorju, it-tajn jista' jiġii maħsul bl-ilma tal-vit jew taħlita isotonika. Wara ċ-ċentrifugazzjoni, is-supernatant huwa ddekantat, (din il-proċedura hija ripetuta għal tlett darbiet)
         Ammont żgħir ta' tajn huwa mkejjel mill-piż u mnixxef. Minn dan ir-riżultat, l-ammont ta' tajn mxarrab jista' jiġi kkalkolat li għandu jiġi sospendut fl-ilma sabiex jkun ottenut tajn attivat minn taħlita ta' biċċiet solidi sospiżi ta' bejn 2 u 4 g/litru. Dan il-livell jagħti konċentrazzjoni ta' bejn 0,8 u 1,6 g/litru f'taħlita tat-test jekk il-proċedura rrakkomandata hawn isfel hija segwita.
         Jekk it-tajn ma jistgħax jintuża fil-ġurnata ta' meta dan jkun inġabar, 50 ml ta' drenaġġ sintetiku huwa miżjud ma' kull litru ta' tajn attivat li jkun ippreparat kif hawn fuq deskritt; dan għandu imbagħad jiġi aerjat matul il-lejl f'temperatura ta' bejn 20 ± 2o C. Dan jinżamm aerjat għall-użu matul il-jum. Qabel ma jintuża, il-pH għandu jitkejjel u aġġustat, jekk hemm bżonn, għall-pH 6 sa 8. It-taħlita bil-biċċiet sospiżi għandha tiġi ddeterminata kif deskritt fil-paragrafu preċedenti.
         Jekk l-istess ammont ta' tajn huwa meħtieġ sabiex jiġi użat fil-ġranet sussegwenti (massimu ta' erbat ijiem), għandu jiżdied 50 ml ta' drenaġġ sintetiku għal kull litru ta' tajn l-aħħar ta' kull ġurnata xogħol.
         1.6.4.   Kif għandu jsir it-test
         
         
                     Ħin li għandu jieħu/ta' kuntatt:
                  
                  
                     30 minuta u/jew tlett siegħat, li fihom issir l-aerjazzjoni
                  
               
                     Ilma:
                  
                  
                     Ilma tax-xorb (deklorinat jekk meħtieġ)
                  
               
                     Arloġġ ta' l-ossiġinu
                  
                  
                     Nadifa, mingħajr żejt. Fluss ta' arja ta' 0,5  sa 1 litru/minuta
                  
               
                     Fornitura ta' l-arja:
                  
                  
                     Flixkun bil-qiegħ ċatt, bħall-flixkun tat-tip BOD
                  
               
                     Apparat li jkejjel:
                  
                  
                     Elettrod ta' ossiġinu xieraq bil-faċilita' li jkejjel
                  
               
                     Taħlita ta' nutrijenti:
                  
                  
                     Drenaġġ sintetiku (ara hawn fuq)
                  
               
                     Sostanza tat-test:
                  
                  
                     Is-sostanza tat-test hija ppreparata fil-bidu tat-test
                  
               
                     Sostanza ta' referenza
                  
                  
                     eż. 3,5 -diklorofenol (ta' l-anqas tlett konċentrazzjonijiet)
                  
               
                     Kontrolli:
                  
                  
                     Kampjun inokulat mingħajr s-sostanza tat-test
                  
               
                     Temperatura:
                  
                  
                     20 ± 2o C.
                  
               Proċedura esperimentali ssuġġerita li tista' tiġi segwita kemm għat-test u kemm għas-sostanza tar-referenza għall-perjodu ta'
         kuntatt ta' tlett siegħat hija mogħtija hawn isfel:
         Ta' l-anqas ħames konċentrazzjonijiet, spazjati b'fattur kostanti preferibbilment li ma taqbiżx 3,2 għadha tkun użata.
         Fil-ħin 0, 16 ml tad-drenaġġ sintetiku għandu jsir sa' 300 ml bl-ilma. 200 ml ta' inoculum mikrobiku huma miżjuda u t-taħlita totali (500ml) huma mferra' fl-ewwel kontenitur (l-ewwel kontroll C1).
         Il-kontenituri tat-test għandhom jiġu aerjati kontinwament sabiex jassiguraw li l-O2maħlul fl-ilma ma jaqgħax taħt 2,3 mg/litru u li, immeddjatament qabel ma tiġI mkejla r-rata ta' respirazzjoni, il-konċentrazzjoni ta' l- O2 tkun ta' madwar 6,5 mg/litru.
         Wara 15-il minuta (il-15-il minuta huwa ħin arbitrarju imam konvenjenti bħala interval) dan t'hawn fuq għandu jiġi ripetut, bl-eċċezzjoni li 100 ml tas-sostanza tat-test huma miżjuda mas-16 ml ta' drenaġġ sintetiku u qabel jiżdied l-ilma sa 300 ml u inoculum mikobiku sabiex flimkien jagħmlu volum ta' 500 ml. Din it-taħlita hija imbagħad imferra' f'kontenitur ieħor u aerjat kif imsemmi hawn fuq. Dan il-proċess huwa ripetut f'intervalli ta' 15-il minuta b'volumi differenti tas-sostanza tat-test sabiex tagħti serje ta' kontenituri li fihom konċentrazzjonijiet differenti tas-sostanza tat-test. Fl-aħħar, għandi jiġi ppreparat t-tieni kontroll (C2).
         Wara tlett siegħat il-pH huwa mkejjel, u kampjun imħallat sew tal-kontenuti ta' l-ewwel ħames kontenituri huwa mferra' fl-apparat li jkejjel u r-rata ta' respirazzjoni hija mkejla fuq perjodu sa' 10 minuti.
         Din id-determinazzjoni hija ripetuta fuq il-kontenut ta' kull kontenitur f'intervalli ta' 15-il minuta, b'mod li l-ħin tal-kuntatt f'kull kontenitur huwa ta' tlett siegħat.
         Is-sostanza ta' referenza huwa ttestjat f'kull kampjun ta' incolumu mikrobiku bl-istess mod.
         Reġim differenti (eż. b'aktar minn arloġġ ta' l-ossiġinu wieħed) huwa neċessarju meta l-kejl għandu jsir wara 30 minuta ta' kuntatt.
         Jekk il-kejl ta' l-konsum ta' l-ossiġinu kimikali huwa meħtieġ, kontenituri oħrajn huma ppreparati li fihom s-sostanza tat-test, drenaġġ sintetiku u ilma, imma mingħajr tajn attivat. Il-konsum ta' l-ossiġinu jitkejjel u rrekordjat wara perjodu ta' aerjazzjoni ta' 30 minuta u/jew tlett siegħat (ħin ta' kuntatt).
         2.   DATA U VALUTAZZJONI
         Ir-rata ta' respirazzjoni hija kkalkolata mit-traċċi rrekordjati bejn madwar 6,5 mg O2/litru u 2,5 mg O2/litru, jew fuq perjodu ta' 10 minuti meta r-rata ta' respirazzjoni tkun waħda baxxa. Il-porzjon tal-kurva tar-respirazzjoni li fuqha hija mkejla r-rata ta' respirazzjoni għandha tkun lineari.
         Jekk ir-rati ta' respirazzjoni taż-żewġ kontrolli m'humiex fi 15 % 'l bogħod minn xulxin, jew l- EC50 (30 minuta u/jew tlett siegħat) tas-sostanza ta' referenza ma tkunx f'mejda aċċettata (5 sa 30 mg/litru għal 3,5 diklorofenol), it-test huwa invalidu u għandu jerġa' jsir.
         Il-perċentwali ta' l-inibizzjoni hija kkalkolata fuq kull test ta' konċentrazzjoni (ara 1.2.). Il-perċentwal ta' l-inibizzjoni hija mpinġijja mal-konċentrazzjoni fuq karta log-normal (jew log-probability), u b'hekk għandu jkun ottenut valur EC50 .
         Limiti ta' konfidenza ta' 95 % għall-valuri EC50 jistgħu jkunu stabbiliti mill-proċeduri standard.
         3.   RAPPURTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jkollu, sa fejn hu possibbli, dan li ġej:
         
                     —
                  
                  
                     is-sostanza tat-test: data li tidentifika l-kemikali
                  
               
                     —
                  
                  
                     is-sistema tat-test: s-sors, konċentrazzjoni u kwalunkwe pre-trattament tat-tajn ativat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kondizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 pH tar-reazzjoni tat-taħlita qabel ma tiġi mkejla r-respirazzjoni,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 it-temperatura tat-test,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-dewmien tat-test
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sostanza ta' referenza u l-EC50 tagħha mkejjel,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-bżonn ta' l-ossiġinu abijotiku (jekk hemm).
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 d-data kollha mkejla
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-kurva ta' l-inibizzjoni u l-metodu għall-kalkolazzjoni ta' l-EC50 ,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-EC50 u, jekk possibbli, l-limiti ta' konfidenza ta' 95 %, EC20 u EC80
                                 
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-osservazzjonijiet kollha u kwalunkwe derivazzjonijiet minn dan il-metodu ta' ttestjar u li seta' influenza r-riżultat.
                              
                           
               3.2.   INTERPRETAZZJONI TAD–DATA
         
         Il-valur EC50 għandu jiġi meqjus bħala gwida għat-tossiċita probabbli tas-sostanza tat-test għat-trattament tajn attivat tad-drenaġġ jew għall-mikrorganiżmi ta' l-ilma tar-rimi, minħabba li l-interazzjonijiet kumplessi li jseħħu fl-ambjent ma jistgħux ikunu akkuratament simulati t-testijiet tal-laboratorju. Aktar minn dan, is-sostanzi tat-test li jista' jkollhom effett inibitorju fuq l-ossidazzjoni ta' l-ammonja jistgħu jipproduċu wkoll kurvi atipikali ta' inibizzjoni. B'hekk, dawn il-kurvi għandhom jiġu interpretati b'attenzjoni.
         4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Standard Internazzjonali ISO 8192-1986.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Broecker, B., Zahn, R., r-Riċerka dwar l-ilma 11, 1977, p. 165.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L., Kemosfera 10, 1981, p. 245.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     ETAD (Assoċċjazzjoni Ekoloġika u Tossolġika ta' l-Industrija tal-Prodotti li Jagħtu l-Kulur), Metodu Rrakkomandat Nru.103, deskritt ukoll minn:
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, p. 80.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, p. 247.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     OECD, Paris, 1981, Gwida tat-Test 209, Deċiżjoni tal-Kunsill nru. C(81) 30 finali.
                  
               C.12.   BIJODEGRADAZZJONI
         TEST SCAS MODIFIKAT
         1.   METODU
         1.1.   INTRODUZZJONI
         L-għan tal-metodu huwa l-valutazzjoni tal-bijodegrabilità aħħarija potenzali tas-sostanzi organiċi li jinħallu fl-ilma u li ma jinxfux malajr meta esposti għall-konċentrazzjonijiet relattivament għoljin ta' mikrorganiżmi fuq perjodu ta' żmien twil. Il-vijabbilità tal-mikrorganiżmi hija mantenuta fuq dan il-perjodu biż-żieda ta' kuljum ta' dħul ta' drenaġġ. (Għar-rekwiżiti fi tmiem il-ġimgħa, id-drenaġġ jista' jinżamm f'temperatura ta' 4o C. Alternattivament, id-drenaġġ sintetiku tat-test konfermatorju OECD jista' jintuża.)
         L-assorbiment fiżiko-kemikali tal-biċċiet sospiżi jista' jseħħ, u dan għandu jitqies meta jiġu interpretati r-riżultati (ara 3.2.).
         Minħabba l-perjodu twil ta' detenzjoni tal-fażi likwida (36 siegħa), u ż-żieda intermittenti tan-nutrijenti, t-test ma jistimulax il-kondizzjonijeit esperjenzati fl-impjant tat-trattament tad-drenaġġ. Ir-riżultati miksuba mill-varji sostanzi tat-test jindikaw li t-test għandu potenzal għoli ta' biodegradazzjoni.
         Il-kondizzjonijiet provduti mit-test huma favorevoli ħafna għall-għażla u/jew l-adattazzjoni ta' mikrorganiżmi kapaċi jiddegradaw il-kompost tat-test. (Il-proċedura tista' tkun użata wkoll sabiex tipproduċi inocula akkliatizzati għall-użu tagħhom f'testijiet oħrajn.)
         F'dan il-metodu, l-kejl tal-konċentrazzjoni tal-karbon organiku maħlul huwa użat sabiex jistima l-bijodegrabilità aħħarija tas-sostanzi tat-test. Huwa preferibbli li jiġi ddeterminat id-DOC wara l-aċidifikazzjoni u l-tindif milli bħala d-differenza Ctotali – Cinorganika
         L-użu simultaneju ta' metodu speċifiku analitiku jista' jippermetti l-istima tad-degradazzjoni primarja tas-sostanza (ma jibqax tidher l-istruttura tal-kimika oriġinali).
         Il-metodu huwa applikabbli biss għal dawk is-sostanzi organiċi tat-test li, bil-konċentrazzjoni użata fit-test:
         
                     —
                  
                  
                     jinħallu fl-ilma (ta' l-anqas 20mg organiku maħlul karbon/litru),
                  
               
                     —
                  
                  
                     għandhom pressjoni ta' l-istijm negliġibbli,
                  
               
                     —
                  
                  
                     m'humiex inibittorji għall-batteri,
                  
               
                     —
                  
                  
                     m'humiex assobiti b'mod sinifikattiv fis-sistema tat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     m'humiex mitlufa b'fowming mit-taħlita tat-test.
                  
               Il-kontentut tal-karbon organiku tal-materjal tat-test għandu jiġi stabbilit.
         Informazzjoni fuq il-porzjonijiet relattivi tal-komponenti l-maġġuri tal-materjal tat-test tkun bżonnjuża sabiex jiġu interpretati r-riżultati miksuba, partikolarment f'dawk il-każijiet fejn ir-riżultati huma baxxi jew marġinali.
         Informazzjoni fuq it-tossiċità għall-mikrorganiżmi tas-sostanza tista' tkun bżonnjuża sabiex tinterpreta r-riżultati baxxi u fl-għażla ta' konċentrazzjoni xierqa tat-test.
         1.2.   DEFINIZZJONJIET U UNITAJIET
         
                     CT
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni tal-kompost tat-test bħala karbon organiku kif jinstab jew miżjud mad-drenaġġ li jkun qagħad fil-bidu tal-perjodu ta' aerjazzjoni (mg/litru),
                  
               
                     Ct
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni ta' karbon organiku maħlul li jinstab fit-taħlita supernatanta tat-test fit-tmien tal-perjodu ta' aerjazzjoni (mg/litru),
                  
               
                     Cc
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni ta' karbon organiku maħlul li jinstab fit-taħlita supernatanta tal-kontroll fit-tmien tal-perjodu ta' aerjazzjoni (mg/litru).
                  
               Il-biodegradazzjoni hija definita b'dan il-metodu bħala l-iskopariment tal-karbon organiku. Il-biodegradazzjoni tista' tiġi espressa bħala:
         
                     1.
                  
                  
                     Il-perċentwal tat-tneħħija ta' Dda ta' l-ammont tas-sostanza miżjuda kuljum:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [1]
                              
                           fejn
                     
                                 Dda
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 degradazzjoni/żieda ta' kuljum.
                              
                           
               
                     2.
                  
                  
                     Il-perċentwali tat-tneħħija Dssd ta' l-ammont tas-sostanza fil-bidu ta' kull jum:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [2 (a)]
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 [2 (b)]
                              
                           fejn
                     
                                 Dssd
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 degradazzjoni/bidu ta' sostanza tal-ġurnata;
                              
                           l-indiċi i u (i + 1) jirreferu għall-ġurnata li fiha sar il-kejl.
                     Il-formula 2(a) hija rrakkomandata jekk l-effluwent DOC ivarja minn jum għal jum, filwaqt li l-formula 2(b) tista' tkun użata meta l-effluwent DOC jibqa' relattivament kostanti minn ġurnata għall-oħra.
                  
               1.3.   SOSTANZI TA' REFERENZA
         Fċerti każijiet, meta xi sostanza ġdida tkun qed tiġi investigata, s-sostanzi ta' referenza jistgħu jkunu ta' benefiċċju, però, m'hi rakkomandata l-ebda sostanza ta' referenza hawnhekk.
         Id-data fuq bosta komposti evalwati fit-testijiet ring huma provduti (ara l-Appendiċi 1) primarjament sabiex il-kalibrazzjoni tal-metodu tkun tista' ssir minn żmien għall-ieħor u sabiex tippermetti tqabbil tar-riżultati meta jkun applikat metodu ieħor.
         1.4.   METODU PRINĊIPALI TAT-TEST
         Tajn attivat minn impjant tat-trattament tad-drenaġġ huwa mpoġġi f'unità ta' tajn attivat semikontinwu (SCAS). Il-kompost tat-test u d-drenaġġ li jkun qagħad huma miżjuda, u t-taħlita hija aerjata għall-23 siegħa. L-aerjazzjoni hija imbagħad imwaqqfa, it-tajn joqgħod u t-taħlita supernatanta hija mneħħija.
         It-tajn li jkun baqa' fil-kontenitur ta' aerjazzjoni huwa imbagħad imħallat ma' alikwot ieħor tal-kompost tat-test u d-drenaġġ, u ċ-ċiklu huwa imbagħad ripetut.
         Il-bijodegradazzjoni hija stabbilita bid-determinazzjoni tal-kontenut tal-karbon organiku maħlul fit-taħlita supernatanta. Il-valur huwa imbagħad imqabbel ma dak misjub għat-taħlita miksuba mit-tubu ta' kontroll bid-doża tad-drenaġġ li qagħad.
         Meta huwa użat metodu speċifiku analitiku, t-tibdil fil-konċentrazzjoni tal-molekula oriġinali minħabba l-biodegradazzjoni tista' tiġi mkejla (bijodegrabilità primarja).
         1.5.   KRITERJI TAL–KWALITÀ
         Ir-reproduċibilità ta' dan il-metodu bbażata fuq it-tneħħija tal-karbon organiku maħlul għada ma ġietx stabilita. (Meta tiġi kkonsidrata l-bijodegradazzjoni primarja, hija miksuba data preċiża ħafna għall-materjali li huma degradati estensivament.)
         Is-sensittività tal-metodu hija ddeterminata ħafna mill-varjabbilità tal-blank u, xi ftit inqas, mill-preċiżjoni tad-determinazzjoni tal-karbon organiku maħlul u l-livell tal-kompost tat-test fit-taħlita fil-bidu ta' kull ċiklu.
         1.6.   DESKRIZZJONI TAL–PROĊEDRA TAT-TEST
         1.6.1.   Preparazzjonijiet
         
         Nurmu suffiċjenti ta' unitajiet ta' aerjazzjoni nodfa, tista' tiġi użata. l-unità SCAS ta' 1,5 litru oriġinali u tubi li jdaħħlu l-arja (Figura 1) għall-kull sostanza tat-test u l-kontrolli huma mibnijin. Arja kkompressata fornita lill-unitajiet tat-test, mnaddfa b'tajjara, għandhom ikunu nodfa mill-karbon organiku u presaturati bl-ilma sabiex jiġu mnaqqas t-telf minħabba l-evaporazzjoni.
         Kampjun ta' taħlita, li fiha 1 sa 4 gr solidi/litru sospensjoni, hija miksuba mill-impjant tat-tajn attivat li jitratta predominament d-drenaġġ domestiku. Madwar 150 ml tat-taħlita huma meħtieġa għall-kull unità ta' aerjazzjoni.
         Taħlit ta' l-istokk tas-sostanza tat-test hija ppreparata fl-ilma distillate; il-konċentrazzjoni normalment meħtieġa hija ta' 400 mg/litru bħala karbon organiku li tagħti konċentrazzjoni tal-kompost tat-test ta' 20 mg/litru fil-bidu ta' kull ċiklu ta' aerjazzjoni jekk ma sseħħ l-ebda bijodegradazzjoni.
         Konċentrazzjonijiet ogħla huma permessi jekk it-tossiċità tal-mikroganiżmi tippermettiha.
         Il-kontenut tal-karbon organiku tat-taħlita ta' l-istokk hija mkejla.
         1.6.2.   Kondizzjonijiet tat-test
         
         It-test għandu jsir f'temperatura ta' bejn 20 sa 25 oC.
         Għandha tintuża konċentrazzjoni għolja tal-mikorganiżmi (minn 1 sa 4 g/litru ta' solidi sospiżi), u l-perjodu effettiv ta'detenzjoni huwa ta' 36 siegħa. Il-materjal karbonaċeju fid-drenaġġ huwa estensivament ossidizzat, normalment fi tmien siegħat wara li jkun inbeda ċ-ċiklu ta' aerjazzjoni. Wara dan, it-tajn jirrespira endoġenament għall-bqijja tal-perjodu ta' aerjazzjoni, waqt dan il-perjodu l-uniku sostratt għad-disposizzjoni huwa l-kompost tat-test sakemm dan ma jkunx diġa metabolizzat. Dawn il-fatturi, kkombinati mar-reinokulazzjoni ta' kuljum tat-test meta d-drenaġġ domestiku huwa użat bħala l-materjal, jagħti kondizzjonijiet favorevoli kemm għall-akklimatizzazzjoni u l-livelli għoljin ta' biodegradazzjoni.
         1.6.3.   Kif isir it-test
         
         Kampjun ta' taħlita minn impjant xieraq li jittratta predominalment tajn attivat jew unità tal-laboratorju huwa miksub u miżmum aerobiku sakemm dan ikun użat fil-laboratorju. Kull unità ta' aerjazzjoni kif ukoll l-unità ta' kontroll huma mimlijin b' 150ml tat-taħlita (jekk l-unita' oriġinali SCAS hija użata, immoltiplika l-volumi mogħtija b' 10 darbiet) u l-aerjazzjoni b'hekk tkun bdiet. Wara 23 siegħa, l-aerjazzjoni hija mwaqqfa u t-tajn jitħalla joqgħod għall-45 minuta. It-tapp ta' kull kontenitur jinfetaħ, u għandhom jittieħdu porzjonijiet ta' 100 ml tat-taħlita supernatanta. Kampjun ta' drenaġġ domestiku huma miksuba immedjatament qabel l-użu, u 100 ml għandhom jiġu miżjuda mat-tajn rimanenti f'kull unità ta' aerjazzjoni. L-aerjazzjoni għandha terġa tinbeda. F'dan l-istadju m'għandhom jiġu miżjuda l-ebda materjali tat-test, u l-unitajiet huma mitmuma kuljum bid-drenaġġ domestiku biss sakemm it-taħlita supernatanta hija miksuba wara li jkun tħalla jitqiegħed. Dan normalment jieħu sa ġimgħatejn, li sa dak iż-żmien il-karbon organiku maħlul fit-taħlita supernatanta fl-aħħar taċ-ċiklu ta' aerjazzjoni twassal għal valur kostanti.
         Fit-tmiem ta' dan il-perjodu, it-tajn individwali li jkun qagħad huma mħallta, u għandu jiżdied 50 ml tat-tajn kompost li jirriżulta ma kull unità.
         95 ml tad-drenaġġ li jirriżulta u 5 ml ta' ilma huma miżjuda ma' l-unitajiet ta' kontroll, u 95 ml tad-drenaġġ trattat u 5 ml tal-kompost xieraq tat-taħlita ta' l-istokk (400 mg/litru) huma miżjuda ma' l-unitajiet tat-test. L-aerjazzjoni għandha terġa tinbeda u tkompli għal 23 siegħa. It-Tajn imbagħad għandu jitħalla joqgħod għal 45 minuta u s-supernatant jittieħed u annalizzat għall-kontenut ta' karbon organiku.
         Il-proċedura ta' mili u tneħħija hija ripetuta regoalrment kuljum.
         Qabel ma jitħalla joqgħod, jaf ikun neċessarju li l-unitajiet jinaddfu sabiex jipprevjenu l-akkumulazzjoni ta' solidi 'l fuq mil-livell tal-likwidu. Barraxa differenti għandha tintuża għal kull unità sabiex tiġi evitat l-kontaminazzjoni.
         Idejalment, il-karbonju organiku maħlul fit-taħlita supernatanta hija determinata kuljum, għalkemm analiżi inqas frekwenti tista' ssir ukoll. Qabel l-analiżi, it-taħlit huma ffiltrati permezz ta' filtri tal-membrena maħsula ta' 0,45 μm jew ċċentrifugati. Il-filtri tal-membrena huma xierqa jekk huwa assigurat li dawn ma jirrilaxxawx il-karbonju jew li ma jixorbux is-sostanza fil-fażi tal-filtrazzjoni. It-temperatura tal-kampjun ma tistgħax taqbeż l-40 oC waqt li tkun qegħdha fiċ-ċentrifugu.
         It-tul tat-test tal-komposti li juru ftit jew xejn biodegradazzjoni hija indeterminata, imma l-esperjenza tissuġġerixxi li din għandha tkun ta' l-anqas ta' 12-il ġimgħa, imma ta' mhux aktar minn 26 ġimgħa.
         2.   DATA U VALUTAZZJONI
         Il-valuri tal-karbon organiku maħlul fit-taħlit supernatant ta' l-unitajiet tat-test u l-unitajiet ta' kontrol huma mpinġija mal-ħin.
         Kif tkun qed iseħħ il-biodegradazzjoni, il-livell misjub fit-test għandu jersaq lejn misjub għall-kontroll. La darba d-differenza bejn iż-żewġ livelli hija misjuba bħala waħda kostanti fuq it-tlett kejliet konsekutivi, in-numru meħtieġ ta' iktar kejl kif hemm bżonn sabiex ikun jista' jsir trattament statistikali tad-data u l-perċentwali tal-biodegradazzjoni tal-kompost tat-test huwa kkalkolat (Dda jew Dssd, ara 1.2).
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu, jekk possibbli, jkollu dan li ġej:
         
                     —
                  
                  
                     l-informazzjoni kollha fuq it-tip ta' drenaġġ, t-tip ta' unitajiet użati u r-riżultati esperimentali dwar is-sostanza ttestjata, is-sostanza ta' referenza jekk użata, u l-blank,
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-temperatura,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kurva ta' tneħħija bid-deskrizzjoni, mod ta' kalkolazzjoni (ara 1.2.),
                  
               
                     —
                  
                  
                     d-data u l-lokazzjoni fejn, ittieħed il-kampjun tat-tajn attivat u d-drenaġġ, status ta' adattazzjoni, konċentrazzjoni, eċċ..,
                  
               
                     —
                  
                  
                     raġunijiet xjentifiċi għall-xi tibdil fil-proċedura tat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     firma u data.
                  
               3.2.   INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Minħabba li s-sostanza li għandha tiġi ttestjata b'dan il-metodu mhux ser tkun biodegradabbli minn qabel, kwalunkwe tneħħija ta' DOC minħabba l-biodegradazzjoni għandha tkun normalment gradwali fuq xi jiem jew ġimgħat, ħlief f'każijiet fejn l-akklimatizazzjoni seħħ malajr kif indikat minn skompariment f'daqqa waħda li jseħħ wara ftit ġimgħat.
         Madankollu, l-assorbiment fiżikokemikali jista' xi kultant jkollu rwol importanti; dan huwa indikat meta jkun hemm tneħħija kompleta jew parzjali tad-DOC miżjud. Dak kollu li jiġri sussegwentement jiddependi minn fatturi bħall-gradi ta' assorbiment u l-konċentrazzjoni ta' biċċiet sospiżi fl-effluwenti mormi. Ġeneralment id-differenza bejn il-konċentrazzjoni ta' DOC fil-kontroll u t-test tat-taħlit supernatant jiżdied bil-mod minn valur inizjali baxx u din id-differenza tibqa' fil-valur ġdid għall-bqija ta' l-esperiment, sakemm ma sseħħx l-akklimatizazzjoni.
         Jekk għandha ssir distinzjoni bejn il-biodegradazzjoni (jew bijodegradazzjoni parzjali) u l-assorbiment, huma neċessarji li jsiru aktar testijiet. Dan jista' jseħħ f'numru ta' modi, imma l-iktar wieħed konvinċenti huwa l-użu ta' taħlita supernatanta, jew tajn, bħala inoculum f'test bażi (preferibbilment test respiromatiku).
         Is-sostanzi tat-test li jagħtu rimi mhux assobiv għoli ta' DOC għandhom jitqiesu bħala potenzalment biodegradabbli. Rimi parzjali, mhux assorbiv jindika li ta' l-anqas il-kemikali huwa soġġett għal xi biodegradazzjoni.
         Rimi baxx, jew xejn, ta' DOC jista' jseħħ minħabba l-inibizzjoni ta' mikrorganiżmi mis-sostanza tat-test u dan jista' jidher ukoll mill-leża u t-telf tat-tajn, bir-rimi ta' supernatanti turbidi. Dan it-test għandu jiġI ripetut bl-użu ta' konċentrazzjoni iktar baxxa tas-sostanza tat-test.
         L-użu tal-metodu analitiku speċifiku jew ta' 14C-labelled sostanza tat-test tista' tippermetti aktar sensittività. Fil-każ ta' compost tat-test 14C, ir-rekupru tal-14CO2 għandu jikkonferma li l-biodegradazzjoni tkun seħħet.
         Meta jingħataw ukoll ir-riżultati f'termini ta; biodegradazzjoni primarja, għandha tingħata, sa fejn hu possibbli, spjegazzjoni dwar it-tibdil fl-istruttura kemikali li twassal għat-telf tar-ripons mis-sostanza oriġinali tat-test.
         Il-validazzjoni tal-metodu analitiku għandha tingħata flimkien mar-rispons li jinstab mill-materja tat-test blank.
         4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD, Pariġi, 1981, Linji Gwida għat-Testijet, 302 A, Deċiżjoni tal-Kunsill C(81) 30 finali.
                  
               
            Appendiċi 1
            Test SCAS: eżempju tar-riżultati
            
                        Sostanza
                     
                     
                        CT
                        
                        (mg/1)
                     
                     
                        Ct – Cc
                        
                        (mg/l)
                     
                     
                        Perċentwali tal-biodegradazzjoni
                        Dda
                        
                     
                     
                        Dewmien tat-Test
                        (ġranet)
                     
                  
                        4-acetyl sulfonat tal-aminobenzene
                     
                     
                        17,2 
                     
                     
                        2,0 
                     
                     
                        85
                     
                     
                        40
                     
                  
                        Sulfonat tat-tetra propylene benzene
                     
                     
                        17,3 
                     
                     
                        8,4 
                     
                     
                        51,4 
                     
                     
                        40
                     
                  
                        4-nitrofenol
                     
                     
                        16,9 
                     
                     
                        0,8 
                     
                     
                        95,3 
                     
                     
                        40
                     
                  
                        Diethylene tal-glikol
                     
                     
                        16,5 
                     
                     
                        0,2 
                     
                     
                        98,8 
                     
                     
                        40
                     
                  
                        Aniline
                     
                     
                        16,9 
                     
                     
                        1,7 
                     
                     
                        95,9 
                     
                     
                        40
                     
                  
                        Cyclopentane tetra Karbossilat
                     
                     
                        17,9 
                     
                     
                        3,2 
                     
                     
                        81,1 
                     
                     
                        120
                     
                  
         
            Appendiċi 2
            Eżempju ta' l-apparatus tat-test
            
         C.13.   BIJOKONĊENTRAZZJONI: FLOW-THROUGH FISH TEST
         
         1.   METODU
         Dan il-metodu ta' bijokonċentrazzjoni hu repetizzjoni ta' l-OECD TG 305 (1996).
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Dan il-metodu jiddiskrivi proċedura sabiex jiġi karatterizzat il-potenzal tal-bijokonċentrazzjoni ta' sustanzi fil-ħut taħt kondizzjonijiet li jgħaddi minnhom. Għalkemm ittestjar tar-reġimi li jgħaddi minnu għandhom bil-wisq jiġu preferuti, reġimi semistatiċi huma permessi, ladarba l-kriterja tal-validità huma sodisfatti.
         Il-metodu jagħti dettalji suffiċjenti sabiex l-ittestjar jiġi maħdum filwaqt li jippermetti libertà adegwata sabiex jiġi xieraq id-disinn sperimentali għall-kondizzjonijiet f'laboratorji partikolari u sabiex jiġu varjati l-karatteristiċi tat-test tas-sustanzi. Huwa aktar validament applikat għall-kimiċi organiċi stabbli b'valuri log tal-Pow bejn il-1,5 u s-6,0 (1), iżda għadu jista' jiġi applikat għall-sustanzi superlipholic (li jkollhom il-log tal-Pow baxx > 6,0). L-istima li saret qabel tal-fattur tal-biokonċentrazzjoni (BCF), xi kultant tiddenota bħala KB, ladarba t-tali sustanzi superlipophilic għandhom ikunu presumibbilment ogħla mill-fattur tal-stat stabbli (BCFSS) il-valur mistenni li jiġi miksub mill-esperimenti tal-laboratorju. Stimi li saru qabel tal-fattur tal-biokonċentrazzjoni għall-kimiċi organiċi b'valuri log tal-Pow sa bejn wieħed u ieħor 9,0 jistgħu jiġu miksuba billi tkun użata l-ekwazzjoni tal-Bintein et al (2). Il-parametri li jikkaratterizzaw il-potenzal tal-biokonċentrazzjoni jinkludu r-rata kostanti tad-dħul (k1), it-tisfija tar-rata kostanti (k2) u l-BCFSS.
         Sustanzi ta' l-ittestjar ittikettati tar-radjazzjoni jistgħu jiffaċilitaw l-analiżi ta' l-ilma u tal-kampjuni tal-ħut u jistgħu jintużaw sabiex jiġi ddeterminat/sabiex jiddetermina jekk l-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni degradanti għandhomx jiġu magħmula jew le. Jekk residwi totali radjuattivi jkunu mkejla (per eżempju permezz ta' kombustjoni jew tessut solubbli), il-BCF huwa bbażat fuq kompost tal-ġenitur, kull metabolite miżmuma u wkoll karbonju assimilat. Il-BCFs bbażati fuq residwi totali radjuattivi ma jistgħux, għalhekk, jkunu direttament imqabbla ma' BCF derivati minn analiżi kimika speċifika tal-kompost tal-ġenitur biss.
         Proċeduri ta' tindifa sewwa jistgħu jiġu mpjegati fl-istudji ttikettati tar-radjazzjoni sabiex jiġi determinat il-BCF ibbażat fuq il-kompost tal-ġenitur, u l-metabolite maġġuri tistà tiġi karatterizzata jekk ikun maħsub li jkun neċessarju. Huwa wkoll possibbli li tgħaqqad l-istudju tal-metaboliżmu tal-ħut ma' l-istudju tal-biokonċentrazzjoni bl'analiżi u l-identifikazzjoni tar-residwi fit-tessuti.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET
         Biokonċentrazzjoni/bioakkumulazzjoni hija ż-żieda fil-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar ġo jew fuq organiżmu (tessuti speċifiċi tiegħu) relattiv mal-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar fil-mezz li jiċċirkundah.
         Il-fattur tal-bijokonċentrazzjoni (BCF jew KB) f'kull ħin matul il-fażi tad-dħul ta' dan l-ittestjar ta' l-akkumulazzjoni hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar ġo/fuq il-ħut jew it-tessuti speċifiċi tagħha (Cf bħala μg/g (ppm)) diviżi mill-konċentrazzjoni tal-kimika fil-mezz li jdawru(Cw bħala μg/ml (ppm)).
         Il-fattur ta' l-istat stabbli tal-bijokonċentrazzjoni (BCFSS jew KB) ma jinbidilx b'mod sinifikattiv fuq perjodu mġedded ta' żmien, il-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar tal-mezz li jdawru matul dan il-perjodu ta' ħin.
         Kondizzjoni jew stat stabbli hija milħuqa fl-għemil tas-sustanza ta' l-ittestjar bil-ħut (Cf) kontra l-ħin meta l-kurva ssir parallela ma' l-assi tal-ħin u tlett analiżi taċ-Cf magħmula fuq kampjuni meħuda waqt l-intervalli ta' mill-inqas jumejn huma ma' l-± 20 % ta' xulxin, u ma hemmx differenzi sinifikattivi bejn it-tliet perjodi tat-teħid tal-kampjuni. Meta l-kampjuni miġbura flimkien ikunu analizzati huma meħtieġ mill-inqas erba' analiżi suċċessivi. Għas-sustanzi ta' l-ittestjar li huma meħuda bil-mod jkun aktar xieraq li l-intervalli jkunu ta' sebat ijiem.
         Fatturi tal-bijokonċentrazzjoni kalkulati direttament mir-rata kostanti kinetika (k1/k2) huma msejħa fattur tal-konċentrazzjoni kinetika, il- BCFK.
         Il-qsim tal-koeffiċjent ta' l-octanol-water (Pow) huwa l-proporzjon tas-solublità tal-kimika f'n-octanol u l-ilma fil-bilanċ (metodu A.8) imfisser ukoll bħala Kow. Il-logaritmu tal-Pow huwa wżat bħala indikazzjoni tal-potenzal tal-kimika għall-biokonċentrazzjoni ta' l-organiżmi akwatiċi.
         Il-fażi tal-ħruġ jew tad-dħul huwa ż-żmien li matulu il-ħut jiġu esposti għall-ittestjar kimiku.
         Ir-rata kostanti tad-dhul (k1) hija l-valur numeriku li jiddefinixxi r-rata taz-zieda fil-koncentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar ġo/fuq l-ittestjar tal-ħut (jew tessuti speċifiċi tagħhom) meta l-ħut jkun espost għal dik il-kimika (k1 huwa msejjaħ fl-ewwel ġurnata).
         Il-fażi ta' wara l-ħruġ jew tat-tisfija ta' l-impuritajiet (telf) huwa l-ħin, wara t-trasferiment ta' l-ittestjar tal-ħut mill-mezz li jiġbor fih is-sustanza ta' l-ittestjar għal mezz liberu ta' dik is-sustanza, li matulu t-tisfija (jew it-telf nett) tas-sustanza mill-ħut ta' l-ittestjar (jew it-tessut speċifiku tiegħu) jiġi studjat.
         Ir-rata tat-tisfija (telf) kostanti (k2) huwa l-valur numeriku li jiddefinixxi r-rata tat-tnaqqis fil-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar tal-ħut ta' l-ittestjar (jew it-tessuti speċifiċi tiegħu) wara t-trasferiment tal-ħut ta' l-ittestjar mill-mezz liberli jiġbor fih is-sustanza ta' l-ittestjar (k2 huwa msejjaħ fl-ewwel ġurnata).
         1.3.   PRINĊIPJU TAL-METODU TA' L-ITTESTJAR
         L-ittestjar jikkonsisti f'żewġ fażijiet: il-fażijiet tal-kxif (uptake) u ta' wara l-kxif (it-tisfija). Matul il-fażi tad-dħul, gruppi separati ta' ħut ta' speċi waħda huma murija mill-inqas għal żewġ konċentrazzjonijiet tas-sustanza ta' l-ittestjar. Imbagħad jiġu trasferiti għall-mezz liberu tas-sustanza ta' l-ittestjar għall-fażi tat-tisfija. Il-fażi tat-tisfija hija dejjem neċessarja sakemm id-dħul tas-sustanza matul il-fażi tad-dħul kienet insinifikanti (eż. il-BCF huwa inqas minn 10). Il-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar ġo/fuq il-ħut (jew it-tessut speċifiku tieghu) jiġi segwit miż-żewġ fażijiet ta' l-ittestjar. Biż-żieda taż-żewġ konċentrazzjonijiet ta' l-ittestjar, grupp ta' kontroll tal-ħut huwa miżmum taħt kondizzjonijiet identiċi ħlief għall-assenza tas-sustanza ta' l-ittestjar, sabiex jiġu konnessi effetti avversi possibbli osservati fl-ittestjar tal-bijokonċentrazzjoni għall-grupp ta' kontroll li jaqbel u sabiex jiġu miksuba konċentrazzjonijiet ta' l-isfond tas-sustanza ta' l-ittestjar.
         Il-fażi tad-dħul titħaddem għal 28-il ġurnata sakemm jintwera li l-bilanċ intlaħaq qabel. Predizzjoni tat-tul tal-fażi tad-dħul u l-ħin għall-istat stabbli tista' tiġi magħmula mill-ekwazzjoni fl-Anness 3. Il-perjodu tat-tisfija jiġi mibdi mbagħad billi l-ħut jiġi trasferit lill-istess mezz iżda mingħajr is-sustanza ta' l-ittestjar ġo reċipjent nadif ieħor. Fejn hu possibbli l-fattur tal-biokonċentrazzjoni huwa kalkulat preferibbilment kemm bħala l-proporzjon (BCFSS) tal-konċentrament tal-ħut (Cf) u fl-ilma (Cw) għal dik li tidher stat stabbli u bħala fattur kinetiku tal-bijokonċentrazzjoni (BCFk) bħala l-proporzjon tar-rati kostanti tad-dħul (k1) u t-tisfija (k2) li jassumu l-kinetiċi ta' l-ewwel ordni. Jekk kinetiċi ta' l-ewwel ordni mhumiex ovvjament obduti, mudelli aktar kumplessi għandhom jiġu mpjegati. (Anness 5).
         Jekk stat stabbli ma sseħħx fi 28-il ġurnata, il-fażi ta' l-uptake għandha tiġi estiża sakemm il-stat stabbli tintlaħaq, jew 60 jum, tiġi liema tiġi l-ewwel; il-fażi tat-tisfija tkun imbagħad mibdija.
         Il-kostant tar-rata tad-dħul, it-tisfija (telf) il-kostant tar-rata (jew il-kostanti, fejn mudelli aktar komplessi huma nvoluti), il-fattur tal-biokonċentrazzjoni, u fejn huwa possibbli, l-limiti tal-kunfidenza ta' kull wieħed minn dawn il-parametri huma kalkulati mill-mudell li jiddeskrivi bl-aħjar mod il-konċentrazzjonijiet mkejla tas-sustanza ta' l-ittestjar tal-ħut u l-ilma.
         Il-BCF hija msejħa bħala funzjoni ta' l-użien imxarrab totali tal-ħut. Madankollu, għall-għanijiet speċjali, tessuti jew organi speċifiċi (eż. muskolu, fwied), jistghu jintużaw jekk il-ħut huwa kbir biżżejjed jew jekk il-ħut jista' jinqasam fi frazzjonijiet li jittieklu (maqtugħ fi strixxi) u li ma jittieklux (vixxri). Ladarba, għal ħafna sustanzi organiċi, hemm relazzjoni ċara bejn il-potenzal għall-biokonċentrazzjoni u l-lipophilicity, hemm ukoll relazzjoni korrispondenti bejn il-kontenut tal-lipidu tal-ħut ta' l-ittestjar u l-biokonċentrazzjoni osservata tat-tali ħut. Għalhekk, sabiex dan is-sors ta' varjabilità jiġi mnaqqas fir-riżultati ta' l-ittestjar għal dawk is-sustanzi b'lipophilicity għolja (jiġifieri b'log tal-Pow > 3), il-biokonċentrazzjoni għandha tiġi espressa skond il-kontenut tal-lipidu miżjud mal-piż tal-ġisem kollu.
         Il-kontenut tal-lipidu għandu jiġi determinat fuq l-istess materjal bijoloġiku ladarba huwa wżat sabiex jiddetermina l-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar, meta possibbli.
         1.4.   INFORMAZZJONI DWAR IS–SUSTANZA TA' L-ITTESTJAR
         Qabel ma jsir l-ittestjar għall-biokonċentrazzjoini, din l-informazzjoni li ġejja għas-sustanza ta' l-ittestjar għandha tkun magħrufa:
         
                     —
                  
                  
                     solubilità fl-ilma;
                  
               
                     —
                  
                  
                     koeffiċjenti tal-qsim ta' l-octanol-water Pow (indikat ukoll bħala Kow, determinat minn metodu ta' l-HPLC A.8);
                  
               
                     —
                  
                  
                     idrolisi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     fototrasformazzjoni ġo l-ilma determinata taħt illuminazzjoni solari jew illuminazzjoni solari simulata u taħt il-kondizzjonijiet ta' l-illuminazzjoni ta' l-ittestjar għall-bijokonċentrazzjoni (3);
                  
               
                     —
                  
                  
                     tensjoni tal-wiċċ (jiġifieri għall-sustanzi fejn il-logaritmu tal-Pow ma jistax jiġi determinat);
                  
               
                     —
                  
                  
                     pressjoni tal-fwar;
                  
               
                     —
                  
                  
                     bijodegradibilità lesta (fejn xieraq).
                  
               Informazzjoni oħra meħtieġa hija t-tossiċità għall-ispeċi tal-ħut li għandha tintuża fl-ittestjar, preferibbilment l-asintot LC50 (jiġifieri indipendenti mill-hin). Metodu analitiku xieraq, ta' reqqa magħrufa, preċiżjoni u sensittività, għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar fis-soluzzjonijiet ta' l-ittestjar u f'materjal bioloġiku għandu jkun disponibbli, flimkien mad-dettalji tal-preparazzjoni tal-kampjun u tal-ħażna. Il-limitu ta' l-iskoperta analitika tas-sustanza ta' l-ittestjar kemm ta' l-ilma kif ukoll tat-tessuti tal-ħut għandhom ukoll jiġu magħrufa. Meta sustanza ta' l-ittestjar bit-tikketta 14C hija użata, il-persentaġġ tar-radjuattività assoċjat ma' l-impuritajiet għandu jiġi magħruf.
         1.5.   VALIDITÀ TA' L-ITTESTJAR
         Il-kondizzjonijiet li jsegwu għandhom japplikaw sabiex l-ittestjar ikun validu:
         
                     —
                  
                  
                     il-varjazzjoni tat-temperatura hija inqas minn ± 2 oC,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu maħlul ma jaqax taħt is-60 % tas-saturazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar fil-kmamar hija miżmuma sa l-± 20 % tal-medja tal-valuri mkejla matul il-fażi tad-dħul,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-mortalità jew effetti avversi oħra/marda kemm fil-kontroll u fil-kura tal-ħut hija inqas minn 10 % fl-aħħar ta' l-ittestjar; fejn l-ittestjar huwa mġedded fuq ħafna ġimgħat jew xhur, mewt jew effetti avversi fiż-żewġ settijiet tal-ħut għandha tkun inqas minn 5 % kull xahar u ma taqbiżx it-30 % b'kollox.
                  
               1.6.   KOMPOŻIZZJONIJIET TA' REFERENZA
         L-użu ta' kompożizzjonijiet ta' referenza ta' potenzal tal-bijokonċentrazzjoni magħruf ikun bżonnjuż sabiex il-proċedura sperimentali tiġi ċekkjata, meta huwa meħtieġ. Madankollu, sustanzi speċifiċi għadhom ma jistgħux jiġu rakkomandati.
         1.7   DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' L-ITTESTJAR
         1.7.1.   Apparat
         
         Għandha tingħata kura sabiex ikun jista' jiġi evitat l-użu tal-materjali, għall-partijiet kollha tat-tagħmir, li jistgħu jħollu, jaqbdu ma' jew ikollhom effett avvers fuq il-ħut. Tankijiet standard rettangulari jew ċilindriċi, magħmula minn materjal kimiku inerti u ta' kapaċità adatta b'konformità mar-rata tal-karga jistgħu jiġu wżati. L-użu ta' tubi tal-plastik artab għandu jiġi mnaqqas. Teflon (R), stainless steel u/jew tubi tal-ħġieġ huma preferibbilment użati. L-esperjenza wriet li s-sustanzi b'koeffiċjenti ta' l-assorbiment għolja, bħall-pyrethroids sintetiċi, ħġieġ silanised jista' jkun meħtieġ. F'dawn is-sitwazzjonijiet it-tagħmir għandu jiġi mormi wara l-użu.
         1.7.2.   Ilma
         
         L-ilma naturali huwa ġeneralment użat fl-ittestjar u għandu jiġi miksub minn sors mhux ikkontaminat u ta' kwalità uniformi. L-ilma li jitħallat għandu jkun ta' kwalità li għandha tippermetti s-sopravivenza ta' l-ispeċi ta' ħut magħżula għad-dewmien ta' l-akklimazzjoniu perjodi ta' l-ittestjar mingħajr kull apparenza jew imġieba anormali. Idealment, għandu jiġi muri li l-ispeċi għall-ittestjar jistgħu jgħixu, jikbru u jirriproduċu fl-ilma li jitħallat (eż. fil-kultura tal-laboratorju jew l-ittestjar tat-tossità taċ-ċiklu tal-ħajja). L-ilma għandu jkun karatterizzat mill-inqas minn pH, twebbis, solidi totali, karbonju organiku totali u, preferibbilment ammonju wkoll, nitrit u alkalinità u, għall-ispeċi marini, s-salinita. Il-parametri li huma importanti għall-aħjar benesseri tal-ħut huma magħrufa kollha, iżda l-Anness 1 jagħti konċentrazzjonijiet massimi rakkomandati ta' numru ta' parametri għal ilmijiet friski u marini ta' l-ittestjar.
         L-ilma għandu jkun ta' kwalità kostanti matul il-perjodu ta' l-ittestjar. Il-valur tal-pH għandu jkun ta' bejn il-limiti ta' 6,0 sa 8,5, iżda matul l-ittestjar speċifiku għandu jkun bejn il-limiti ta' unitajiet ±0,5 tal-pH. Sabiex ikun assigurat illi t-taħlit ta' l-ilma ma jinfluwenzax b'mod inkorrett ir-riżultat ta' l-ittestjar (per eżempju, bit-tifsira tas-sustanza ta' l-ittestjar) jew avversament jaffettwa l-eżekuzzjoni ta' l-istokk tal-ħut, kampjuni għandhom jiġu mogħtija kull ftit żmien għall-analiżi. Id-determinazzjoni ta' metalli tqal (eż.. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), anjoni u cations (eż. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pestiċidi (eż. pestiċidi organophosphorous totali u organochlorine totali), karbonju organiku totali u solidi sospiżi għandhom jintagħmlu, per eżempju, kull tlett xhur fejn ilma mħallat huwa magħruf li l-kwalità hija relativament kostanti. Jekk il-kwalità ta' l-ilma ġiet murija bħala kostanti mill-inqas fi żmien sena, id-determinazzjonijiet jistgħu jkunu inqas frekwenti u l-intervalli miżjuda (eż. kull sitt xhur).
         Il-kontenut naturali tal-partikola wkoll il-karbonju organiku totali (TOC) ta' l-ilma tat-taħlit għandu jkun baxx kemm jista' jkun sabiex jiġi evitat l-assorbiment tas-sustanza ta' l-ittestjar għall-oġġett organiku li jista' jnaqqas il-biodisponibilità tiegħu (4). Il-valur massimu aċċettabbli huwa ta' 5 mg/l għall-oġġett partikolari (oġġett niexef/xott, li ma jagħddix il-filtru ta' 0,45 μm) u 2 mg/l għall-karbonju totali organiku (ara Anness 1). Jekk hemm bżonn, l-ilma għandu jiġi filtrat qabel l-użu. Il-kontribuzzjoni għall-kontenut organiku tal-karbonju fl-ilma mill-ħut ta' l-ittestjar (eskreta) u mir-residwi ta' l-ikel għandha tkun baxxa kemm jista' jkun. Matul l-ittestjar, il-konċentrazzjoni tal-karbonju organiku fir-reċipjent ta' l-ittestjar ma għandux jaqbeż il-konċentrazzjoni tal-karbonju organiku li joriġina mis-sustanza ta' l-ittestjar u, jekk ikun użat, l-aġent li jitħallat b'iktar minn 10 mg/l (± 20 %).
         1.7.3.   Soluzzjonijiet ta' l-ittestjar
         
         Soluzzjoni ta' l-istokk tas-sustanza ta' l-ittestjar hija preparata f'konċentrazzjoni adattata. Is-soluzzjoni ta' l-istokk għandha preferibbilment tiġi preparata billi sempliċiment tkun imħallta u mċaqalqa s-sustanza ta' l-ittestjar fl-ilma li jitħallat. L-użu ta' solventi jew jew li jixterdu (aġenti li jitħalltu) ma huwiex rakkomandat; madankollu dan jista' jseħħ f'xi okkażjonijiet sabiex tkun prodotta soluzzjoni ta' l-istokk ikkonċentrata xierqa. Solventi li jistgħu jintużaw huma ethanol, methanol, eteru ethylene glikol monomethyl, eteru etheylene glikol dimethyl, dimethylformamide u glikol triethylene. Sustanzi li jixterdu li jistgħu jintużaw huma Cremophor RH40, Tween 80, methylcellulose 0,01 % u HCO-40. Kura għandha tingħata meta jintużaw aġenti lesti bijodigradabbli ladarba dawn jistgħu jikkawżaw problemi bit-tkabbir batteriku fl-ittestjar li jagħaddi minnu. Is-sustanza ta' l-ittestjar jista' tiġi tikettata bir-radjazzjoni u għandha tkun ta' l-akbar purità (eż. preferibbilment > 98 %).
         Għat-testijiet li jgħaddi minnhom, sistema li kontinwament tiddispensa u tħallat soluzzjoni ta' l-istokk tas-sustanza ta' l-ittestjar (eż. pompa tal-miter, taħlit proporzjonali, sistema li tissatura) hija meħtieġa sabiex tikkunsinna l-konċentrazzjonijiet ta' l-ittestjar tal-kmamar ta' l-ittestjar. Mill-inqas ħames sostituzzjonijiet tal-volum minn kull kamra ta' l-ittestjar kull ġurnata huma permessi. Il-mod li jgħaddi minnu għandu jkun preferut, iżda fejn dan m'huwiex possibbli (eż. fejn l-organiżmi ta' l-ittestjar huma avversament affettwati) teknika semistatika tista' tintuża ladarba l-kriterji tal-validità jkunu sodisfatti. Ir-rati li jimxu/jgħaddu tas-soluzzjonijiet ta' l-istokk u l-ilma tat-taħlit għandhom it-tnejn ikunu kontrollati 48-il siegħa qabel u mbagħad mill-inqas kuljum matul l-ittestjar. F'dan il-kontroll tad-determinazzjoni tar-rata li tgħaddi ta' kull kamra ta' l-ittestjar hija inkluża u assigurata li ma tvarjax b'aktar minn 20 % jew ġo inkella bejn il-kmamar.
         1.7.4.   Selezzjoni ta' speċi
         
         Kriterji importanti fis-selezzjoni ta' l-ispeċi huma li huma dejjem lesti disponibbli, jistgħu jitkisbu f'daqsijiet konvenjenti u jistgħu jkunu b'mod sodisfaċenti mantenuti fil-laboratorju. Kriterji oħra sabiex jiġu selezjonati l-ispeċi tal-ħut jinkludu importanza rekreazzjonali, kummerċjali, ekoloġika wkoll sensittività komparattiva, l-użu li rnexxa qabel, eċċ.
         Speċi rakkomandati għall-ittestjar huma stabbiliti fl-Anness 2. Speċi oħrajn jistgħu jintużaw iżda il-proċedura ta' l-ittestjar jista' jkollha tiġi xierqa sabiex jingħataw kondizzjonijiet xierqa ta' l-ittestjar. Ir-razzjonal għas-selezzjoni ta' l-ispeċi u l-metodu sperimentali għandu jkun irrapportat f'dan il-każ.
         1.7.5.   Is-sehem tal-ħut
         
         Akklimatizza il-popolazzjoni ta' l-istokk tal-ħut mill-inqas għal ħmistax fl-ilma fit-temperatura ta' l-ittestjar u għalef fuq dieta suffiċjenti u ta' l-istess tip li jintuża waqt l-ittestjar.
         Wara perjodu ta' 48-il siegħa jissetiljaw, l-imwiet huma rreġistrati u l-kriterji li ġejjin huma applikati:
         
                     —
                  
                  
                     imwiet ta' aktar minn 10 % tal-popolazzjoni f'sebat ijiem: jintrema n-numru sħiħ tal-ħut,
                  
               
                     —
                  
                  
                     imwiet ta' bejn il-5 u l-10 % tal-popolazzjoni f'sebat-ijiem: aklimatizza għal sebat ijiem oħra,
                  
               
                     —
                  
                  
                     imwiet ta' inqas minn 5 % tal-popolazzjoni f'sebat-ijiem: taċċetta l-grupp/numru ta' ħut – jekk ikun hemm aktar minn 5 % imwiet matul it-tieni sebat-ijiem tarmi il-grupp kollu.
                  
               Tassigura li l-ħut użat fl-ittestjar huma liberi minn mard u a anormalitajiet osservabbli. Skarta kull ħut infettat/marid. Il-ħut ma għandux jirċievi trattament għall-mard fil-ħmistax ta' qabel l-ittestjar, jew matul l-ittestjar.
         1.8.   EŻEKUZZJONI TA' L-ITTESTJAR
         1.8.1.   Ittestjar preliminari
         
         Jista' jkun utli li jitmexxa speriment preliminari sabiex jittejbu l-kondizzjonijiet ta' l-ittestjar ta' l-ittestjar definittiv, eż. selezzjoni tal-konċentrazzjoni(ijiet) tas-sustanza ta' l-ittestjar, dewmien tad-dħul u fażijiet tat-tisfija.
         1.8.2.   Kondizzjonijiet ta' l-espożizzjoni
         
         1.8.2.1.   Dewmien tal-fażi tad-dħul
         
         Tbassir tad-dewmien tad-dħul jista' jinkiseb minn esperjenza prattika (eż. minn studju li sar qabel jew minn kimika dwar l-akkumulazzjoni) jew minn ċerti relazzjonijiet empiriċi li jużaw it-tagħrif jew tas-solubilità ta' l-ilma jew il-koeffiċjent tal-qsim ta' l-octanol/l-ilma tas-sustanza ta' l-ittestjar (ara Anness 3).
         Il-fażi ta' l-uptake għandha sseħħ għall-28-il ġurnata sakemm jista' jintwera li l-bilanċ ġie milħuq qabel. Jekk l-istat stabbli ma ntlaħaqx sa 28-il ġurnata, il-fażi ta' l-uptake għandha tiġi estiża, tistabbilixxi aktar miżuri, sakemm l-istat stabbli jiġi milħuq jew 60-il ġurnata, ikun liema jkun l-iqsar.
         1.8.2.2.   Dewmien tal-fażi tat-tisfija
         
         Perjodu ta' nofs id-dewmien tal-fażi ta' l-uptake hija s-soltu suffiċjentement għal-riduzzjoni xierqa fil-piż tal-ġisem (eż. 95 %) tas-sustanza biex isseħħ (ara Anness 3 għall-ispjegazzjoni ta' l-istima). Jekk il-ħin meħtieġ biex jintlaħaq 95 % tat-telf mhux prattikament twil, li jaqbeż per eżempju darbtejn id-dewmien normali tal-fażi tad-dħul (jiġifieri aktar minn 56-il ġurnata) perjodu iqsar jista' jkun użat (jiġifieri sakemm il-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar hija inqas minn 10 % tal-konċentrazzjoni tal-stat stabbli). Madankollu, għall-sustanzi li għandhom mudelli aktar kumplessi tad-dħul u t-tisfija milli huma rappreżentati minn mudell tal-ħut ta' kumpartiment wieħed, ipprovdi kinetiċi ta' l-ewwel ordni, ippermetti fażijiet tat-tisfija itwal għad-determinazzjoni tal-kostanti tar-rata tat-telf. Il-perjodu jista', madankollu, jkun immexxi mill-perjodu li fuqu l-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar fil-fdal tal-ħut fuq il-limitu ta' l-iskoperta analitika.
         1.8.2.3.   Numri ta' ħut ta' l-ittestjar
         
         Għażel in-numri ta' ħut għal kull konċentrazzjoni ta' l-ittestjar b'mod li l-minimu ta' erbgħa ħutiet għal kull kampjun huma/huwa disponibbli f'kull kampjun. Jekk poter statistiku ikbar huwa meħtieġ, aktar ħut għal kull kampjun għandu jkun neċessarju.
         Jekk ħut adult jintuża, irraporta jekk humiex irġiel jew nisa, jew it-tnejn li jintużaw fl-esperiment. Jekk iż-żewġ sessi huma użati, differenzi fil-kontenut tal-lipidu bejn is-sessi għandu jkun dokumentat li ma għandux sinifikat qabel il-bidu ta' l-espożizzjoni; iġbor flimkien l-ħut irġiel u nisa kollha jista' jkun neċessarju.
         F'xi wieħed mill-ittestjar, il-ħut ta' l-istess piż huwa magħżul, b'mod li l-iżgħar mhumiex iżgħar minn tnejn minn tlieta tal-piż ta' l-ikbar ħut. Kollha għandhom ikunu ta' l-istess sena-klassi u jiġu mill-istess sors. Ladarba l-piż u l-età/ż-żmien ta' ħut jidhru xi kultant li għandhom xi effett sinifikanti fuq il-valuri tal-BCF (1) dawn id-dettalji huma rraportati b'reqqa. Huwa rakkomandat li sub-kampjun ta' l-istokk tal-ħut huma ppeżati qabel l-ittestjar sabiex jiġi stimat il-piż medju.
         1.8.2.4.   Tagħbija
         
         Proporzjoni għolja ta' l-ilma mal-ħut jintużaw sabiex tonqos ir-riduzzjoni fis-Cw ikkawżat miż-żieda ta' ħut fil-bidu ta' l-ittestjar u sabiex jiġi evitat it-tnaqqis fil-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu mħallat. Huwa mportanti li r-rata tat-tagħbija tkun xierqa għall-ispeċi ta' l-ittestjar użat. F'kull każ, rata tat-tagħbija ta' 0,1 sa 1,0 g ta' ħut (wet weight) għal kull litru fil-ġurnata hija normalment rakkomandata. Rati għolja tat-tagħbija jistgħu jkunu użati jekk ikun muri li l-konċentrazzjonijiet meħtieġa tas-sustanza ta' l-ittestjar jistgħu jkunu mantnuti/miżmuma f'limiti ta' ± 20 %, u li l-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu mħallat ma jaqax taħt saturazzjoni ta'60 %.
         Fl-għażla tar-reġimi xierqa tat-tagħbija, reġistrazzjoni/account ta' l-abitat normali ta' l-ispeċi tal-ħut huwa meħud. Per eżempju, ħut li jgħix fil-qiegħ jista' jirrikjedi qiegħ ta' l-akwarjum ikbar għall-istess volum ta' ilma minn speċi ta' ħut pelaġiku.
         1.8.2.5.   Għalf
         
         Matul l-akklimazzjoni u l-perjodi ta' l-ittestjar, il-ħut jkunu magħllfa b'dieta xierqa ta' lipidi magħrufa u kontenut totali tal-proteini total protein content, f'ammont suffiċjenti li jżommhom f'kondizzjoni sanitarja u li jmantni l-piż tal-ġisem. Il-ħut huma magħlufa kuljum mill-/permezz tal-perjodi ta' l-akklimazzjoni u l-perjodi ta' l-ittestjar f'livell ta' bejn wieħed u ieħor ta' piż tal-ġisem ta' 1 sa 2 % kull ġurnata; din iżżomm il- konċentrazzjoni tal-lipidu f'ħafna speċi ta' ħut f'livell relattivament kostanti matul l-ittestjar. L-ammont ta' għalf għandu jerġa' jiġi kkalkulat, per eżempju, darba f'ġimgħa, sabiex jiġu mantnuti piż tal-ġisem konsistenti u kontenut tal-lipidu. Għal din il-kalkulazzjoni, il-piż tal-ħut f'kull kamra ta' l-ittestjar jista' jkun estimat mill-piż tal-ħut miġbura l-iktar reċenti f'dik il-kamra. Tiżinx il-ħut li jibqa' fil-kamra.
         Ikel mhux mittiekel u l-ħmieġ huma mogħddija minn sifun siphoned kuljum mill-kamri ta' l-ittestjar eżatt wara l-għalf (30-il minuta sa siegħa). Il-kmamar huma miżmuma ndaf kemm jista' jkun matul l-ittestjar sabiex il-konċentrazzjoni tas-sitwazzjoni organika tinzamm baxxa kemm jista' jkun, ladarba l-preżenza tal-karbonju organiku jista' jillimita l-biodisponibilità tas-sustanza ta' l-ittestjar (1).
         Ladarba ħafna għalf ġej mill-ikel tal-ħut, l-għalf għandu jiġi analizzat għas-sustanza ta' l-ittestjar. Huwa ukoll mixtieq li l-għalf jiġi analizzat għall-pestiċidi u l-metalli tqal.
         1.8.2.6.   Dawl u temperatura
         
         Il-fotoperjodu huwa ġeneralment 12 sa 16-il siegħa u t-temperatura (± 2 oC) għandha tkun xierqa għall-ispeċi ta' l-ittestjar (ara l-Anness 2). It-tip u l-karatteristiċi ta' l-illuminazzjoni għandhom ikunu magħrufa. Kawtiela għandha tkun mogħtija lill-possibbli fototransformazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar taħt kondizzjonijiet ta' l-irradjazzjoni ta' l-istudju. Illuminazzjoni xierqa għandha tintuża tevita espożizzjoni tal-ħut għal fotoprodotti mhux naturali. F'xi każijiet jista' jkun xieraq li jintuża filtru sabiex tiġi eżaminata/screen out l-irradjazzjoni tal-UV anqas minn 290 nm.
         1.8.2.7.   Konċentrazzjonijiet ta' l-ittestjar
         
         Il-ħut huwa espost taħt kondizzjonijiet li jagħddi minnhom għal mill-inqas żewġ konċentrazzjonijiet tas-sustanza ta' l-ittestjar fl-ilma. Normalment, l-għola (jew l-għola) konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar hija magħżula li tkun ta' madwar 1 % ta' l-asintot intens tiegħu LC50, u sabiex ikunu mill-inqas ten-fold għola mill-limitu ta' l-iskoperta tagħhom fl-ilma bil-metodu analitiku użat.
         L-ogħla konċentrazzjoni ta' l-ittestjar tista' tkun determinata billi tiddividi l-akut 96h LC50 bi proporzjon xieraq akut/kroniku (proporzjonijiet xierqa għal xi wħud mill-kimiċi jistgħu ikunu bejn wieħed u ieħor tlieta sa 100). Jekk ikun possibbli, għażel il-konċentrazzjoni(jiet) l-oħra b'mod li jiddistingwi ruħu minn dak ta' fuq bil-fattur ta' għaxra 10. Jekk dan mhuwiex possibbli minħabba fil-1 % tal-kriterja ta' l-LC50 u l-limitu analitiku, fattur aktar baxx minn 10 jista' jkun użat jew l-użu ta' sustanza ta' l-ittestjar ittikettata 14C għandu jkun ikkunsidrat. L-ebda konċentrazzjoni użata ma għandha tkun għola mis-solubilità tas-sustanza ta' l-ittestjar.
         Fejn aġent solubbli huwa użat il-konċentrazzjoni tiegħu ma għandiex tkun ikbar minn 0,1 ml/l u għandha tkun l-istess fir-reċipjenti kollha ta' l-ittestjar. Il-kontribuzzjoni tiegħu, flimkien mas-sustanza ta' l-ittestjar, il-kontenut kollu tal-karbonju organiku fl-ilma ta' l-ittestjar għandu jkun magħruf. Madankollu, kull sforz għandu jiġi magħmul sabiex jiġi evitat l-użu tat-tali materjali.
         1.8.2.8.   Kontrolli
         
         Kontroll ta' l-ilma tat-taħlit jew jekk relevanti, kontroll li jiġbor ġo fih l-aġent li titħallat should be run miżjud mas-serje ta' l-ittestjar, ladarba kien stabbilit li l-aġent ma għandu l-ebda effett fuq il-ħut. Jekk le, iż-żewġ kontrolli għandhom jitwaqqfu/jiġu stabbiliti.
         1.8.3.   Frekwenza tal-miżuri tal-kwalità ta' l-ilma
         
         Matul l-ittestjar, l-ossiġenu maħlul, TOC, pH u t-temperatura għandhom jitwieżnu fil-kontenuti kollha. Twebbis totali u salinità, jekk relevanti, għandhom ikunu miżurati fil-kontrollijiet u reċipjent fl-għola (l-għola) konċentrazzjoni. Bħala minimu, l-ossiġenu mħallat u s-salinità, jekk relevanti, għandhom ikunu miżurati tlett darbiet fil-bidu, għan-nofs u għall-aħħar tal-perjodu ta' l-uptake– u darba f'ġimgħa fil-perjodu tat-tisfija. TOC għandu jkun miżurat fil-bidu ta' l-ittestjar (24 siegħa u 48 siegħa qabel l-inizjazzjoni ta' l-ittestjar tal-fażi ta' l-uptake) qabel iż-żieda tal-ħut u mill-inqas darba f'ġimgħa, kemm matul il-fażi ta' l-uptake kif ukoll dik tat-tisfija. It-temperatura għandha tkun miżurara kuljum, il-pH fil-bidu u fl-aħħar ta' kull perjodu u t-twebbis darba f'kull ittestjar. It-temperatura għandha preferibbilment tiġi kkontrollata kontinwament mill-inqas f'reċipjent wieħed.
         1.8.4.   Il-kontroll u l-analiżi tal-ħut u l-ilma
         
         1.8.4.1.   Skeda tal-kontroll tal-ħut u l-ilma
         
         L-ilma mill-kmamar ta' l-ittestjar għad-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar tittieħed għall-kampjun qabel iż-żieda tal-ħut kemm matul il-fażijiet tad-dħul kif ukoll dik tat-tisfija. Bħala minimu, l-ilma fl-istess ħin tal-ħut u qabel l-għalf. Matul il-fażi tad-dħul, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza ta' l-ittestjar huma ddeterminati sabiex tiġi kkontrollata l-konformità bil-kriterja tal-validità.
         Il-ħut huwa kkontrollat fuq mill-inqas ħames okkażjonijiet matul il-fażi ta' l-uptake u mill-inqas erbgħa okkażjonijiet matul il-fażi tat-tisfija. Ladarba fuq xi okkażjonijiet għandu tkun diffiċli li tiġi kkalkulata stima preċiża raġonevoli tal-valur tal-BCF ibbażat fuq dan in-numru ta' kampjuni, speċjalment meta minbarra t-tisfija tal-kinetiċi ta' l-ewwel ordni huma ndikati, jista' jkun rakkomandat li jittieħdu kampjuni bi frekwenza għola fiż-żewġ perjodi (ara Anness 4). Il-kampjuni ż-żejda huma miżmuma u analizzati biss jekk ir-riżultati ta' l-ewwel fażi ta' l-analiżi turi li mhijiex adegwata għall-kalkulazzjoni tal-BCF bil-preċiżjoni mixtieqa.
         Eżempju ta' skeda aċċettabbli tal-kontrolli huwa mogħti fl-Anness 4. Skedi oħrajn jistgħu jiġu kkalkulati mill-ewwel jużaw valuri oħra assunti tal-Pow sabiex jiġi kkalkulat il-ħin ta' l-espożizzjoni għall-95 % tad-dħul.
         It-teħid tal-kampjuni jitkompla matul il-fażi ta' l-uptake sakemm kondizzjoni li ma tinbidilx tiġi stabbilita jew 28-il jum, ikun liema jkun l-iqsar. Jekk l-istat stabbli ma jkunx intlaħaq f'28-il jum kontroll ikompli sakemm stat stabbli jkun intlaħaq jew għal 60 jum, ikun liema jkun l-iqsar. Qabel ma tinbeda l-fażi tat-tisfija l-ħut jiġi trasferit f'tankijiet nodfa.
         1.8.4.2.   Kontroll u preparazzjoni tal-kampjun
         
         Kampjuni ta' l-ilma għall-analiżi huma miksuba, per eżempju, jmexxi minn ġo sifun minn punt ċentrali fil-kamra ta' l-ittestjar billi tagħddi minn sifun minn tubi inerti minn punt ċentrali. Ladarba la l-filtrazzjoni lanqas billi jinfired il-likwidu mis-solidu ma jidher dejjem jissepara l-frazzjoni mhux bijodisponibbli (speċjalment għall-kimiċi superlipophilic, jiġifieri, dawk il-kimiċi b'log tal-Pow baxxa > 5) (1) (5), il-kampjuni jistgħu ma jkunux suġġetti għal dawk it-tratttamenti.
         Minflok, il-miżuri għandhom jittieħdu sabiex it-tankijiet jinżammu nodfa kemm jista' jkun u l-kontenut tal-karbonju organiku totali għandu jiġi kkontrollat kemm matul il-fażijiet ta' l-uptake kif ukoll dik tat-tisfija.
         Numru xieraq ta' ħut (normalment minimu ta' erbgħa) jiġu mneħħija mill-kmamar ta' l-ittestjar f'kull ħin tal-kampjuni. Il-ħut kkontrollati huma mlaħalħa malajr mill-ilma, blot “dry”, maqtula istantanjament billi jintuża l-metodu l-iktar xieraq u uman, u mbagħad ppeżati.
         Huwa preferibbli li jiġu analizzati il-ħut u l-ilma immedjatament wara kontroll sabiex tkun evitata degradazzjoni jew aktar telf u sabiex jiġi kkalkulata l-uptake approssimativ u r-rati tat-tisfija filwaqt li l-ittestjar jitkompla. Analiżi mmedjata tevita ukoll dewmien biex tiddetermina meta plateau jkun intlaħaq.
         Fin-nuqqas ta' analiżi immedjata, il-kampjuni huma maħżuna b'metodu xieraq. Qabel il-bidu ta' l-istudju, l-informazzjoni fuq il-metodu propju tal-ħażna tas-sustanza ta' l- ittestjar partikolari – per eżempju, il-kesħa qawwija, li tinżamm f 4 oC, id-dewmien tal-ħażna, il-qliegħ, eċċ. huma miksuba.
         1.8.4.3.   Kwalità ta' metodu analitiku
         
         Ladarba l-proċedura kollha tkun immexxija essenzalment bl-eżattezza, preċiżjoni u sensittività tal-metodu analitiku użat għas-sustanza ta' l-ittestjar, ikkontrolla permezz ta' esperiment li l-preċiżjoni u r-riproduċibilità ta' l-analiżi kemikali, kif ukoll l-irkupru tas-sustanza ta' l-ittestjar kemm mill-ilma kif ukoll mill-ħut huma sodisfaċenti għall-metodu partikolari. Ukoll, ikkontrolla li s-sustanza ta' l-ittestjar mhijiex investigata fl-ilma tat-taħlit użat.
         Jekk neċessarju, il-valuri ta' Cw u Cf miksuba mill-ittestjar huma kkoreġuti għall-irkupri u l-valuri ta' l-isfond tal-kontrolli. Il-kampjuni tal-ħut u l-ilma huma mmexxija b'mod li tiġi mnaqqsa l-kontaminazzjoni u t-telf (eż. li jirriżultaw mill-assorbiment mill-proġett/l-għodda tat-teħid tal-kampjuni).
         1.8.4.4.   Analizi tal-kampjuni tal-ħut
         
         Jekk il-materjali radiolabeled huma użati fl-ittestjar, huwa possibbli li tanalizza għal radio label totali (jiġifieri ġenitur u metaboliti) jew, il-kampjuni jistgħu jitnaddfu sabiex il-kompost tal-ġenitur jista' jiġi analizzat separatament. Ukoll, l-akbar metaboliti jistgħu jkunu karatterizzati f stat stabbli jew fl-aħħar tal-fażi ta' l-uptake, tkun meta tkun l-iktar kmieni. Jekk il-BCF skond residwi radiolabeled totali hija ≥ 1 000 %, tista' tiġi rakkomandata, u ċertament għal ċerti kategoriji ta' kimiċi bħal ma huma il-pestiċidi rakkomandati ħafna, sabiex jidentifikaw u jikkwantifikaw degradati li jirrappreżentaw ≥ 10 % tar-residwi totali fit-tessuti tal-ħut f stat stabbli. Jekk degradati li jirrappreżentaw ≥ 10 % tar-residwi radiolabeled totali fit-tessut tal-ħut huma identifikati u kwantifikati, imbagħad huwa rakkomandat ukoll li jiddentifikaw u jikkwantifikaw id-degradati fl-ilma ta' l-ittestjar.
         Il-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar għandha s-soltu tkun determinata għal kull ħuta ndividwali mwieżna. Jekk dan mhux possibbli, il-ġbir tal-kampjuni fkull okkażjoni tat-teħid tal-kampjuni tista' tiġi magħmula iżda l-pooling ma jirrestrinġix il-proċeduri statistiċi li jistgħu jiġu appplikati mad/lid-data. Jekk proċedura statistika speċifika u l-poter huma konsiderazzjonijiet importanti, imbagħad numru adegwat ta' ħut sabiex jalloġġa il-proċedura tal-pooling mixtieqa u l-poter għandhom jiġu nklużi fl-ittestjar (6) (7).
         Il-BCF għandu jiġi msemmi kemm bħala funzjoni ta-piż mxarrab totali u, għal sustanzi lipholic għolja, bħala funzjoni tal-kontenut tal-lipidu. Il-kontenut tal-lipidu tal-ħut huwa ddeterminat fuq kull okkażjoni tal-kontroll jekk possibbli. Metodi għandhom jintużaw għad-determinazzjoni tal-kontenut tal-lipidu (referenzi 8 u 2 ta' Anness 3). It-teknika ta' l-estrazzjoni tal-Chloroform/methanol tista' tkun rakkomandata bħala metodu standard (9). Il-metodi varji ma jagħtux valuri identiċi (10), għalhekk huwa mportanti li jingħataw id-dettalji tal-metodu użat. Meta possibbli, l-analiżi għal-lipidu għandu jkun magħmul fuq l-istess estrazzjoni bħal dik prodotta għas-sustanza ta' l-ittestjar, ladarba l-lipidi spiss għandhom ikunu mneħħija mill-estrazzjoni qabel ma jkun analizzat kromotografikament. Il-kontenut tal-lipidu tal-ħut (bħal mg/kg użien imxarrab) fl-aħħar ta' l-esperiment ma għandux ivarja minn dak tal-bidu minn iktar minn ± 25 %. Is-solidi perċentwali tat-tessut għandhom ukoll ikunu rrappurtatati sabiex jippermettu l-konversjoni tal-konċentrazzjoni tal-lipidu minn bażi mxarrba għal waħda xotta.
         2.   DATA
         2.1.   TRATTAMENT TAR–RIŻULTATI
         Il-kurva tad-dħul tas-sustanza ta' l-ittestjar hija miksuba billi tgħaqqad il-ponot tal-konċentrazzjoni tagħha ġo/fuq il-ħut (jew tessuti speċifiċi) fil-fażi tad-dħul kontra l-ħin fuq skali aritmetiċi. Jekk il-kurva laħqet kondizzjoni, jiċifieri, ssir bejn wieħed u ieħor asintotika ma' l-assi tal-ħin, il-kondizzjoni statika tal-BCFSS hija kkalkulata minn:
         
            
         Meta l-ebda stat stabbli ma jkun intlaħaq, jista' jkun possibbli tikkalkula BCFSS ta' preċiżjoni suffiċjenti għal assessjar riskjuż minn ‘steady-state’ bi 80 % (1,6/k2) jew 95 % (3,0/k2) ta' bilanċ.
         Ukoll il-fattur tal-konċentrazzjoni (BCFk) huwa ddeterminat, bħala l-proporzjon tal-k1/k2, l-ewwel żewġ kostanti kinetiċi ta' l-ewwel ordni. Il-kostant tar-rata tat-tisfija (k2) hija s-soltu determinata mill-kurva tat-tisfija (jiġifieri il-proġett tat-tnaqqis tal-konċentrazzjoni tas-sustanza ta' l-ittestjar fil-ħut mal-ħin). Il-kostant tar-rata tad-dħul (k1) huwa mbagħad kkalkulat mogħti k2 u l-valur ta' Cf li ġej mill-kurva tad-dħul (ara wkoll Anness 5). Il-metodu preferut sabiex tikseb il-BCFk u l-kostanti tar-rati, il- k1 u l-k2, huwa li jintużaw metodi ta' l-istima tal-parametru mhux lineari fuq komputer (11). Inkella, metodi grafiċi jistgħu jintużaw sabiex jikkalkulaw k1 u k2. Jekk il-kurva tat-tisfija hija ovvjament mhux l-ewwel ordni, imbagħad mudelli iktar kumplessi għandhom jintużaw (ara referenzi fl-Anness 3) u parir minn espert tal-bijostatistika mfittex.
         2.2   INTERPRETAZZJONI TAR–RIŻULTATI
         Ir-riżultati għandhom jiġu nterpretati b'kawtela fejn konċentrazzjonijiet miżurati/mkejla tas-soluzzjonijiet ta' l-ittestjar iseħħu f'livelli qrib il-limitu ta' l-iskoperta tal-metodu analitiku.
         Dħul definit b'mod ċar u kurvi tat-telf huma indikazzjoni ta' data tal-biokonċentrazzjoni ta' kwalità tajba. Il-varjazzjoni fil-kostanti tad-dħul/t-tisfija bejn iż-żewġ konċentrazzjonijiet ta' l-ittestjar għandha tkun inqas minn 20 %. Differenzi sinifikattivi osservati fir-rati tad-dħul/it-tisfija bejn iż-żewġ konċentrazzjonijiet applikati ta' l-ittestjar għandhom ikunu rreġistrati u spjegazzjonijiet possibbli mogħtija. Ġeneralment il-limitu tal-kunfidenza tal-BCFs minn approċi ta' studji ddisinjati sew ± 20 %.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         Ir-rapport ta' l-ittestjar għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         3.1.   SUSTANZA TA' L-ITTESTJAR
         
                     —
                  
                  
                     natura fiżika u, fejn relevanti, propertajiet fisiokemikali,
                  
               
                     —
                  
                  
                     data ta' l-identifikazzjoni kemikali (li jinkludu il-kontenut tal-karbonju organiku, jekk huwa xieraq),
                  
               
                     —
                  
                  
                     jekk ittikettata tar-radjazzjoni, il-posizzjoni preċiża ta' l-atomu(i) u l-persentaġġ tar-radjuattività assoċjata ma' l-impuritajiet.
                  
               3.2.   SPEĊI TA' L-ITTESTJAR
         
                     —
                  
                  
                     ismijiet xjentifiċi, sforz, sors, xi trattament li sar qabel, akklimazzjoni, żmien, limitu ta' daqs, eċċ.
                  
               3.3.   IL–KONDIZZJONIJIET TA' L-ITTESTJAR
         
                     —
                  
                  
                     ittestja l-proċedura użata (e.ż. li jgħaddi minnha jew semistatika),
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-tip u l-karatteristiċi ta' l-illuminazzjoni użata u l-fotoperijodu(i),
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-disinn bi prova (e.ż. in-numru u l-kobor tal-kmamar ta' l-ittestjar, ir-rata tal-bdil tal-volum ta' l-ilma, in-numru tar-repliki, in-numru tal-ħut għal kull replika, in-numru tal-konċentrazzjonijiet ta' l-ittestjar, it-tul tal-ħin biex jiddaħħal il-materjal li jintuża u l-fażijiet tat-tisfija, il-frekwenza tat-teħid tal-kampjuni għall-kampjuni tal-ħut u ta' l-ilma),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-metodu tal-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet ta' l-iskorti u l-frekwenza tar-rinnovament (l-aġent li jagħmel xi ħaġa solubbli, il-konċentrazzjoni tiegħu u l-kontribuzzjoni tiegħu għall-kontenut organiku tal-karbonju ta' l-ilma ta' l-ittestjar għandu jingħata, meta' jiġi wżat),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjonijiet nominali ta' l-ittestjar, il-mezzi tal-valuri mkejla u d-devjazzjonijiet standard tagħhom fil-bastimenti ta' l-ittestjar u l-metodu li bih dawn ġew miksuba,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-egħjun ta' l-ilma dilwit, id-deskrizzjoni ta' xi trattament li jsir qabel, ir-riżultati ta' xi dimostrazzjoni ta' l-abbilità tal-ħut ta' l-ittestjar li jgħixu fl-ilma, u l-karatteristiċi ta' l-ilma: il-pH, l-ebusija, it-temperatura, il-konċentrazzjoni ta' l-ossiġnu maħlul, il-livelli tal-kloru residwu (jekk mkejla), il-karbonju organiku totali, is-solidi mdendla, is-salinità tal-mezz ta' l-ittestjar (jekk xieraq) u xi kejl ieħor magħmul,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kwalità ta' l-ilma fil-bastimenti ta' l-ittestjar, il-pH, l-ebusija, it-TOC, it-temperatura u l-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu maħlul,
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni ddetaljata fuq l-għalf (per eżempju, it-tip ta' l-ikel, l-egħjun, il-komposizzjoni – għall-anqas tal-kontenut tal-lipidi u tal-proteini jekk possibli, l-ammont mogħti u l-frekwenza),
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni fuq it-trattament tal-kampjuni tal-ħut u ta' l-ilma, inklużi d-dettalji tal-preparazzjoni, il-ħażna, il-qligħ u l-proċeduri analitiċi (u l-preċiżjoni) għas-sostanza ta' l-ittestjar u l-kontenut lipidu (jekk mkejla).
                  
               3.4.   IR–RIŻULTATI:
         
                     —
                  
                  
                     ir-riżulatati minn kwalunkwe studji preliminari magħmula,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-mortalità tal-ħut ikkontrollat u l-ħut f'kull kamra ta' l-espożizzjoni u kull aġir li mhux normali li jkun osservat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kontenut lipidu tal-ħut (jekk id-determinazzjoni fuq l-okkażjoni ta' l-ittestjar),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kurva (inkluża l-informazzjoni mkejla kollha) li turi d-dħul u it-tisfija tal-kimika ta' l-ittestjar fil-ħut, il-ħin għall-istat stabbli,
                  
               
                     —
                  
                  
                     Cf u Cw (b'devjazzjoni u l-marġni standard, jekk xieraq) għall-ħinijiet kollha tat-teħid tal-kampjuni (Cf espressi fi μg/g piż mxarrab (ppm) tal-ġisem kollu jew tat-tessuti speċifikati tagħhom, e.ż. lipidu, u is-Cw fi μg/ml (ppm). Valuri tas-Cw għas-serje tal-kontroll (l-isfond għandu wkoll jiġi rrappurtat),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-fattur tal-bijo-konċentrazzjoni ta' l-istat stabbli (BCFSS) u/jew il-fattur tal-konċentrazzjoni kinetika (BCFK) u jekk applikabbli, 95 % limiti tal-fiduċja għall-kwantitajiet li ma jvarjawx tar-rati (telf) għad-dħul jew għat-tisfija (kollha espressi in relazzjoni mal-ġisem sħiħ u l-kontenut lipidu totali, jekk mkejjel, tat-tessut ta' l-annimal jew tat-tessut speċifikat tiegħu), il-limiti tal-fiduċja u d-devjazzjoni standard (kif disponibbli) u l-metodi ta' l-analiżi tal-komputazzjoni/ta' l-informazzjoni għal kull konċentrazzjoni ta' sostanza ta' l-ittestjar użata,
                  
               
                     —
                  
                  
                     fejn sostanzi bit-tikketta tar-radjazzjoni huma wżati, u jekk tkun meħtieġa, l-akkumulazzjoni ta' xi sostanzi ffurmati fil-metaboliżmu skoperti tista' tiġi ppreżentata,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwalunkwe ħaġa li mhix tas-soltu dwar it-test, kwalunkwe devjazzjoni minn dawn il-proċeduri, u kwalunkwe informazzjoni relevanti oħra.
                  
               imminimizza r-riżultati bħala 'mhux skoperti fil-limitu ta' l-iskoperta bl-iżvilupp tal-metodu ta' qabel it-test u d-disinn sperimentali', peress li dawn ir-riżultati ma jistgħux jiġu wżati għal-kalkulazzjonijiet tal-kwantitajiet li ma jvarjawx tar-rati.
         4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human jew animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Compaan H. (1980) in ‘The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulationċ’, Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Randall R. C., Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431-1436.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method- Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
                  
               
            ANNESS 1
            Il-karatteristiċi kemikali ta' l-ilma dilwit aċċettabli
            
                         
                     
                     
                        Sostanza
                     
                     
                        Il-limitu talkonċentrazzjoni
                     
                  
                        1
                     
                     
                        Materja f'sura ta' partikolari separati
                     
                     
                        5 mg/l
                     
                  
                        2
                     
                     
                        Karbonju organiku totali
                     
                     
                        2 mg/l
                     
                  
                        3
                     
                     
                        Ammonja mhux jonizzata
                     
                     
                        1 μg/l
                     
                  
                        4
                     
                     
                        Kloru residwu
                     
                     
                        10 μg/l
                     
                  
                        5
                     
                     
                        Pestiċidi tal-fosfru organiku totali
                     
                     
                        50 ng/l
                     
                  
                        6
                     
                     
                        Pestiċidi tal-kloru organiku totali u bi-fenili polychlorinated
                        
                     
                     
                        50 ng/l
                     
                  
                        7
                     
                     
                        Kloru organiku totali
                     
                     
                        25 ng/l
                     
                  
                        8
                     
                     
                        Aluminju
                     
                     
                        1 μg/l
                     
                  
                        9
                     
                     
                        Arseniku
                     
                     
                        1 μg/l
                     
                  
                        10
                     
                     
                        Kromju
                     
                     
                        1 μg/l
                     
                  
                        11
                     
                     
                        Kobalt
                     
                     
                        1 μg/l
                     
                  
                        12
                     
                     
                        Ram
                     
                     
                        1 μg/l
                     
                  
                        13
                     
                     
                        Ħadid
                     
                     
                        1 μg/l
                     
                  
                        14
                     
                     
                        Ċomb
                     
                     
                        1 μg/l
                     
                  
                        15
                     
                     
                        Nikil
                     
                     
                        1 μg/l
                     
                  
                        16
                     
                     
                        Żingu
                     
                     
                        1 μg/l
                     
                  
                        17
                     
                     
                        Kadmju
                     
                     
                        100 ng/l
                     
                  
                        18
                     
                     
                        Merkurju
                     
                     
                        100 ng/l
                     
                  
                        19
                     
                     
                        Fidda
                     
                     
                        100 ng/l
                     
                  
         
            ANNESS 2
            L-ispeċi tal-ħut irrakkomandati għall-ittestjar
            
                         
                     
                     
                        Speċi rakkomandati
                     
                     
                        Il-marġni rakkomandata Tat-temperatura ta’ l-ittestjar (oC)
                     
                     
                        It-tul totali rakkomandat ta’ l-annimal għall-ittestjar (cm)
                     
                  
                        (1)
                     
                     
                        Danio rerio (5) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) ħut-żebra
                     
                     
                        20 - 25
                     
                     
                        3,0 ±0,5 
                     
                  
                        (2)
                     
                     
                        Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Fathead minnow
                     
                     
                        20 - 25
                     
                     
                        5,0 ±2,0 
                     
                  
                        (3)
                     
                     
                        Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) Karpjun Komuni
                     
                     
                        20 - 25
                     
                     
                        5,0 ±3,0 
                     
                  
                        (4)
                     
                     
                        Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck and Schlegel) Ricefish
                        
                     
                     
                        20 - 25
                     
                     
                        4,0 ±1,0 
                     
                  
                        (5)
                     
                     
                        Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Guppy
                        
                     
                     
                        20 - 25
                     
                     
                        3,0 ±1,0 
                     
                  
                        (6)
                     
                     
                        Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque) Bluegill
                        
                     
                     
                        20 - 25
                     
                     
                        5,0 ±2,0 
                     
                  
                        (7)
                     
                     
                        Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) salamun tal-kulur
                     
                     
                        13 - 17
                     
                     
                        8,0 ±4,0 
                     
                  
                        (8)
                     
                     
                        
                           Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus) Three-spined stickleback
                        
                     
                     
                        18 - 20
                     
                     
                        3,0 ±1,0 
                     
                  Diversi speċi ta’ l-estwarju u tal-baħar ġew użati f'pajjiżi differenti, per eżempju:
            
                        Spot
                     
                     
                        
                           Leiostomus xanthurus
                        
                     
                  
                        Sheepshead minnow
                     
                     
                        
                           Cyprinodon variegatus
                        
                     
                  
                        Silverside
                     
                     
                        
                           Menidia beryllina
                        
                     
                  
                        Shiner perch
                     
                     
                        
                           Cymatogaster aggregata
                        
                     
                  
                        English sole
                     
                     
                        
                           Parophrys vetulus
                        
                     
                  
                        Staghorn sculpin
                     
                     
                        
                           Leptocottus armatus
                        
                     
                  
                        Three-spined stikleback
                     
                     
                        
                           Gasterosteus aculeatus
                        
                     
                  
                        Spnotta
                     
                     
                        
                           Dicentracus labrax
                        
                     
                  
                        Arġentina
                     
                     
                        
                           Alburnus alburnus
                        
                     
                  Il-ġbir
            Il-ħut ta’ l-ilma ħelu mniżżel fit-tabella huwa faċli biex jittrabba u/jew huwa disponibbli b'mod vast matul is-sena, filwaqt li d-disponibbilità ta’ l-ispeċi tal-baħar u ta’ l-estwarju huwa parzjalment limitat għall-pajjiżi rispettivi. Huma kapaċi li jiġi mrobbi u kkultivat jew fil-farms tal-ħut jew fil-laboratorju, taħt kondizzjonijiet ta’ kontroll tal-mard u tal-parassiti, sabiex l-annimal ta’ l-ittestjar ikun b'saħħtu u ta’ nisel magħruf. Dawn il-ħut huma disponibbli f'ħafna partijiet tad-dinja.
         
         
            ANNESS 3
            It-tbassir tad-dewmien tal-fażjijiet tad-dħul u tat-tisfija
            1.   It-tbassir tad-dewmien tal-fażi tad-dħul
            Qabel jiġi magħmul it-test, l-istima tal- k2 u għalhekk xi ftit mill-persentaġġ tal-ħin meħtieġ biex jintlaħaq l-istat stabbli jista' jkun miksub mir-relazzjonijiet empiriċi bejn il-k2u l-koeffiċjenti tal-qsim ta' l-n-octanol/ta' l-ilma (Pow) jew k2 u s-solubilità milwiema (s).
            L-istima tal-k2 (ġurnata-1) tista' tkun miksuba, per eżempju mir-relazzjonijiet empiriċi li ġejjin (1):
            
                        log10k2 = 0,414  log10(Pow) + 1,47  (r2 = 0,95 )
                     
                     
                        [ekwazzjoni 1]
                     
                  Għal relazzjonijiet oħra ara r-referenza 2.
            Jekk il-koeffiċjenti tal-qsim (Pow) mhuwiex magħruf, l-istima tista' tkun magħmula (3) mill-għarfien tas-solubilità milwiema (s) tas-sostanza billi tkun użata:
            
                        log10(Pow) = 0,862  log10(s) + 0,710  (r2 = 0,994 )
                     
                     
                        [ekwazzjoni 2]
                     
                  fejn
            s = solubilità (moles/l): (n = 36).
            Dawn ir-relazzjonijiet japplikaw biss għall-kimiċi bil-valuri tal-logaritmu Pow bejn 2 u 6,5 (4).
            Il-ħin biex jintlaħaq xi persentaġġ ta' l-istat stabbli jista' jkun miksub, billi tiġi applikata l-istima tal-k2, millekwazzjoni ġenerika kinetika li tiddeskrivi d-dħul u t-tisfija (il-kinetiċi ta' l-ewwel ordni):
            
               
            Il-ħin biex jintlaħaq xi persentaġġ ta' l-istat stabbli jista' jkun miksub, billi tiġi applikata
            
                        
                           
                     
                     
                        [ekwazzjoni 3]
                     
                  Meta' l-istat stabbli jiġi avviċinat (t->∞), l-ekwazzjoni 3 tista' tiġi mnaqqsa (5) (6) sa:
            
                or Cf/Cw = k1/k2
                = BCF
            Għalhekk k1/k2.Cw huwa approċċ għall-konċentrazzjoni fil-ħut bħala stat stabbli (Cf, s).
            L-ekwazzjoni 3 tista' tkun transkritta għal:
            
                        
                            or 
                           
                     
                     
                        [ekwazzjoni 4]
                     
                  Meta' tiġi applikata l-ekwazzjoni 4, il-ħin biex jintlaħaq xi persentaġġ ta' l-istat stabbli jista' jkun imbassar meta' l-k2 huwa stimat minn qabel billi tiġi użata l-ekwazzjoni 1 jew 2.
            Bħala linja ta' gwida, l-aħjar tul statistiku tal-fażi tad-dħul għall-produzzjoni ta' l-informazzjoni statistikament aċċettabbli (BCFk) huwa dak il-perjodu li huwa meħtieġ għall-kurva tal-logaritmu tal-konċentrazzjoni tassostanza ta' l-ittestjar fil-ħut immarkata kontra l-ħin lineari biex jintlaħaq il-punt tan-nofs tiegħu, jew 1,6/k2, jew 80 % ta' l-istat stabbli imma mhux aktar minn 3,0/k2 jew 95 % ta' l-istat stabbli (7).
            Il-ħin biex jintlaħqu it-80 % ta' l-istat stabbli huwa (ekwazzjoni 4):
            
                        
                            or 
                           
                     
                     
                        [ekwazzjoni 5]
                     
                  Bl-istess mod il-95 % ta' l-istat stabbli huma:
            
                        
                           
                     
                     
                        [ekwazzjoni 6]
                     
                  Per eżempju, it-tul tal-fażi tad-dħul (‘il fuq) għas-sostanza ta' l-ittestjar bil-logaritmu Pow = 4 jkun (meta' jiġu wżati l-ekwazzjonijiet 1, 5 u 6)
            
                        log10k2 = -0,414 .(4) + 1,47 
                     
                     
                        k2 = 0,652  jiem-1
                        
                     
                  jew fuq (80 %) = 1,6/0,652, i.e. 2,45 jiem (59 sigħat)
            Fuq (95 %) = 3,0/0,652, i.e. 4,60 jiem (110 sigħat)
            Bl-istess mod, għas-sostanza ta' l-ittestjar b' s = 10-5 mol/l (logaritmu(i) = 5,0), it-tul 'il fuq jkun (meta' jiġu wżati l-ekwazzjonijiet 1, 2, 5 u 6):
            log10 (Pow) = 0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02
            log10 K2 = 0,414 (5,02) + 1,47
            k2 =0,246 jiem -1
            
            Fuq (80 %) = 1,6/0,246, i.e. 6,5 jiem (156 sigħat)
            jew fuq (95 %) = 3,0/0,246, i.e. 12,2 jiem (293 sigħat)
            B'mod alternattiv, l-espressjoni:
            teq = 6,54 × 103 Pow + 55,31 (sigħat)
            tista' tiġi użata biex jiġi kkalkolat il-ħin biex jintlaħaq l-istat stabbli effettiv (4).
            2.   It-tbassir tat-tul tal-fażi tat-tisfija
            It-tbassira tal-ħin meħtieġ biex jiġi mnaqqas il-piż tal-ġisem għal xi persentaġġ tal-konċentrazzjoni inizjali tista' wkoll tiġi miksuba mill-ekwazzjoni ġenerali li tiddeskrivi d-dħul u t-tisfija (il-kinetiċi ta' l-ewwel ordni) (1) (8).
            Għall-fażi tat-tisfija, Cw huwa assumat li huwa żero. L-ekwazzjoni tista' tkun ridotta għal:
            
                jew 
            fejn Cf, o hija l-konċentrazzjoni fil-bidu tal-perjodu tat-tisfija. 50 % tisfija tkun imbagħad milħuqa fil-ħin (t50):
            
               jew
            B'mod simili 95 % tisfija għandha tintlaħaq fi:
            
               
            Jekk 80 % tad-dħul huma wżati għall-ewwel perjodu (1,6/k2) u 95 % telf fil-fażi tat-tisfija (3,0/k2), għalhekk il-fażi tat-tisfija huwa approssimattivament darbtejn it-tul tal-fażi tad-dħul.
            Huwa importanti li jkun innotat, madankolllu, li l-istimi huma bbażati fuq is-supposizzjoni li l-iskemi tad-dħul u tat-tisfija ser isegwu l-kinetiċi ta' l-ewwel ordni. Jekk il-kinetiċi ta' l-ewwel ordni huma ovvjament mhux osservati, mudelli aktar kumplessi għandhom jkunu użati (eż. referenza (1)).
            Letteratura (ta' l-Anness 3)
            
            
                     
                        (1)
                     
                     
                        Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp 309-320.
                     
                  
                     
                        (2)
                     
                     
                        Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.
                     
                  
                     
                        (3)
                     
                     
                        Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982) Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp 4-10.
                     
                  
                     
                        (4)
                     
                     
                        Hawker D.W. and Connell D.W. (1988) Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp 701-707.
                     
                  
                     
                        (5)
                     
                     
                        Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975) Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp 785-792.
                     
                  
                     
                        (6)
                     
                     
                        Ernst W. (1985) Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4 pp 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N.Y.
                     
                  
                     
                        (7)
                     
                     
                        Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. (1977) Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp 614-622.
                     
                  
                     
                        (8)
                     
                     
                        Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980) Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp 3-19.
                     
                  
         
            ANNESS 4
            Eżempju teoretiku ta' L–Iskeda tat–Teħid tal–Kampjuni għat–Tests tal–Biokonċentrazzjoni tas–Sostanzi bil–Logaritmu pOw = 4
            
                        It-teħid tal-kampjuni tal-ħut
                     
                     
                        Skeda tal-ħin tal-kampjun
                     
                     
                        Numru tal-kampjuni ta' l-ilma
                     
                     
                        Numru tal-ħut għal kull kampjun
                     
                  
                        Il-frekwenza minima meħtieġa (ġranet)
                     
                     
                        Teħid tal-kampjuni addizzjonal i
                     
                  
                        Il-fażi tad-dħul
                     
                     
                        -1
                        0
                     
                     
                         
                     
                     
                        2 (************)
                        
                        2
                     
                     
                        Iż-żieda ta' 45 sa 80 ħuta
                     
                  
                        L-ewwel
                     
                     
                        0,3 
                     
                     
                        0,4 
                     
                     
                        2
                        (2)
                     
                     
                        4
                        (4)
                     
                  
                        It-tieni
                     
                     
                        0,6 
                     
                     
                        0,9 
                     
                     
                        2
                        (2)
                     
                     
                        4
                        (4)
                     
                  
                        It-tielet
                     
                     
                        1,2 
                     
                     
                        1,7 
                     
                     
                        2
                        (2)
                     
                     
                        4
                        (4)
                     
                  
                        Ir-raba'
                     
                     
                        2,4 
                     
                     
                        3,3 
                     
                     
                        2
                        (2)
                     
                     
                        4
                        (4)
                     
                  
                        Il-ħames
                     
                     
                        4,7 
                     
                     
                         
                     
                     
                        2
                     
                     
                        6
                     
                  
                        Il-fażi tat-tisfija
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        It-trasferime nt talħut għall-ilma mingħajr kimika ta' l-ittestjar
                     
                  
                        Is-sitt
                     
                     
                        5,0 
                     
                     
                        5,3 
                     
                     
                         
                     
                     
                        4
                        (4)
                     
                  
                        Is-seba'
                     
                     
                        5,9 
                     
                     
                        7,0 
                     
                     
                         
                     
                     
                        4
                        (4)
                     
                  
                        It-tmien
                     
                     
                        9,3 
                     
                     
                        11,2 
                     
                     
                         
                     
                     
                        4
                        (4)
                     
                  
                        Id-disa'
                     
                     
                        14,0 
                     
                     
                        17,5 
                     
                     
                         
                     
                     
                        6
                        (4)
                     
                  
                  
         
            ANNESS 5
            Mudell ta’ diskriminazzjoni
            Il-maġġoranza ta' l-informazzjoni tal-biokonċentrazzjoni ġiet assumita li hija “raġonevolment” deskritta tajjeb b'mudell sempliċi ta' żewġ kompartamenti/żewġ parametri, kif indikati mill-kurva rettilineari li toqrob għall-punti talkonċentrazzjonijiet fil-ħut, waqt il-fażi tat-tisfija, meta’ dawn jiġu mmarkati fuq karta tas-semi-log. (Fejn dawn il-punti ma jistgħux jiġu deskritti b'kurva rettilineari allura mudelli aktar kumplessi għandhom ikunu użati, ara, per eżempju, Spacie u Hamelink, referenza 1 fl-Anness 3).
            Il–metodu grafikali għad–determinazzjoni tal–kwantitajiet li ma jvarjawx tar–rata tat–tisfija (telf) K2
            
            Immarka l-konċentrazzjoni tas-sostanza tat-test misjuba f'kull kampjun tal-ħut kontra l-ħin tat-teħid tal-kampjuni fuq karta semi-log. Iż-żerżieqa ta' dik il-linja hija il-k2.
            
               
            Innota li d-devjazzjonijiet mil-linja d-dritta jistgħu jindikaw skema ta' tisfija aktar kumplessa mill-kinetiċi ta' l-ewwelordni. Il-metodu grafiku jista' jiġi applikat biex ikunu riżolti tipi ta' tisfija li jiddevjaw mill-kinetiċi ta' l-ewwel ordni.
            Il–Metodu grafiku għad–Determinazzjoni tal–Kwantitajiet li ma jvarjawx tar–Rata tad–Dħul k1
            
            Mogħtija l-k2, ikkalkula l-k1 kif ġej:
            
                        
                           
                     
                     
                        [ekwazzjoni 1]
                     
                  Il-valur tas-Cf jinqara mill-punt tan-nofs tal-kurva lixxa tad-dħul prodotta mill-informazzjoni meta’ l-konċentrazzjoni tal-logaritmu tiġi mmarkata kontra l-ħin (fuq skala aritmetika).
            Il–metodu tal–kompjuter għal–kalkulazzjoni tal–kwantitajiet li ma jvarjawx tar–rati tad–dħul u tat–tisfija (telf)
            Il-mezz preferut biex jiġi miksub il-fattur tal-biokonċentrazzjoni u l-kwantitajiet li ma jvarjawx tar-rata l-k1 u l-k2 huwa li jiġu wżati metodi ta' parametri ta' stimar mhux lineari fuq kompjuter. Dawn il-programmi jsibu l-valuri għall- k1 u l-k2 meta’ jkunu mogħtija sett ta' informazzjoni tal-konċentrazzjoni tal-ħin sekwenzali u l-mudell:
            
                        
                            0 < t < tc
                     
                     
                        [ekwazzjoni 2]
                     
                  
                        
                            t > tc
                     
                     
                        [ekwazzjoni 3]
                     
                  fejn tc= il-ħin fl-aħħar tal-fażi tad-dħul.
            Dan l-approċċ jipprovdi stimi tad-devjazzjonijiet standard l-k1 u l-k2.
            Peress illi l-k2 fil-maġġoranza tal-każijiet jista' jiġi stimat mill-kurva tat-tisfija bi preċiżjoni relattivament għolja, u peress illi korrelazzjoni qawwija teżisti bejn iż-żewġ parametri l-k1 u l-k2 jekk stimati simultanjament, jista' jkun irrikkmandat li l-ewwel jiġi kkalkolat il-k2 mill-informazzjoni tat-tisfija biss, u sussegwentement jiġi kkalkolat il-k1 mill-informazzjoni tad-dħul billi tiġi użata r-rigressjoni non-lineari.
         
         C.14.   PROVATA' L-IŻVILUPP FIŻ-ŻGĦOŻIJA TAL-ĦUT
         1.   METODU
         Dan il-metodu tal-prova tat-tossiċità fl-iżvilupp huwa replika ta' l-OECD TG 215 (2000).
         1.1.   DAĦLA
         Din il-prova hija ddisinjata biex isir stima ta' l-effetti ta' espożizzjoni fit-tul għall-kimiċi fuq l-iżvilupp ta' hut żagħżugħ. Hija bbażata fuq metodu, żviluppat u ppruvat permezz ta' programm komparattiv bejn il-laboratorji (ring test) (1)(2) fl-Unjoni Ewropea, biex issir stima ta' l-effetti tal-kimiċi fuq l-iżvilupp tal-ħut żagħżugħ ta' l-ispeċi fil-ġeneru ta' Salamun (Oncorynchus mykiss – rainbow trout) taħt kondizzjonijiet flow-through. Speċi oħra li huma ddokumentati tajjeb jistgħu jintużaw. Per eżempju, inkisbet esperjenza minn provi ta' l-iżvilupp biż-zebrafish (Danio rerio) (6) (3)(4) u bir-ricefish (medaka, Oryzias latipes) (5)(6)(7).
         Ara wkoll id-Daħla Ġenerali l-Parti Ċ.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Konċentrazzjoni l-aktar baxxa li tagħti effett osservat (LOEC): hija l-iktar konċentrazzjoni baxxa ta' sustanza tal-prova li ġiet ippruvata li fiha s-sustanza hija osservata li għandha effett sinifikattiv (fi p < 0,05) meta mqabbla mal-kontroll. Madankollu, il-konċentrazzjonijiet tal-prova kollha li huma aktar għoljin mil-LOEC għandu jkollhom effett perikoluż daqs jew aktar minn dawk osservati fil-LOEC.
         
            Konċentrazzjoni li ma tagħti l-ebda effett osservat (NOEC): hija l-konċentrazzjoni tal-prova immedjatament taħt il-LOEC.
         
            EC
            
               x
            : f'dan il-metodu tal-prova hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza tal-prova li tikkaġuna varjazzjoni fir-rata ta' żvilupp tal-ħut ta' x % meta mqabbla mal-kontrolli.
         
            Rata tat-tagħbija: hija l-piż imxarrab ta' ħut f'volum ta' ilma.
         
            Densità tal-ħżin: hija n-numru ta' ħut f'volum ta' ilma.
         
            Rata ta' żvilupp speċifika għall-ħuta individwali: tesprimi r-rata ta' żvilupp ta' ħuta individwali bbażata fuq il-piż inizjali tagħha.
         
            Rata ta' żvilupp medja speċifika għat-tank: tesprimi r-rata ta' żvilupp medja ta' popolazzjoni ġo tank għal konċentrazzjoni waħda.
         
            Rata ta' żvilupp psewdo speċifika: tesprimi r-rata ta' żvilupp individwali mqabbla mal-piż inizjali medju tal-popolazzjoni tat-tank.
         1.3.   PRINĊIPJUTAL-METODU TAL-PROVA
         Ħut żagħżugħ f'fażi ta' żvilupp esponenzali huwa mqiegħed, wara li jintiżen, f'kompartimenti tal-prova u huwa espost għal firxa ta' konċentrazzjonijiet sotto-letali tas-sustanza tal-prova maħlula fl-ilma preferibbilment taħt kondizzjonijiet flow-through, jew, jekk dan mhux possibbli, taħt kondizzjonijiet semistatiċi (ta' tiġdid statiku) xierqa. It-tul ta' żmien tal-prova huwa ta' 28 jum. Il-ħut huwa mitmugħ kuljum. Ir-razzjon ta' l-ikel huwa bbażat fuq il-piżijiet inizjali tal-ħut u jista' jerġa' jiġi kkalkolat wara 14-il jum. Fit-tmiem tal-prova, il-ħut jerġa' jintiżen. L-effetti fuq ir-rati ta' żvilupp huma analizzati bl-użu ta' mudell tar-rigressjoni sabiex issir stima tal-konċentrazzjoni li tikkaġuna varjazzjoni fir-rata ta' żvilupp ta' x %, i.e. ECx (eż. EC10, EC20, jew EC30). Alternattivament, id-data tista' titqabbel mal-valuri tal-kontroll sabiex tiġi stabbilita l-konċentrazzjoni l-aktar baxxa li tagħti effett osservat (LOEC) u għalhekk il-konċentrazzjoni li ma tagħti l-ebda effett osservat (NOEC).
         1.5.   INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAL-PROVA
         Ir-riżultati tal-prova ta' tossiċċità akuta (ara l-metodu tal-prova Ċ1). Dan jimplika li s-solubilità fl-ilma u l-pressjoni tal-fwar tas-sustanza tal-prova huma magħrufa u li metodu analitiku u ta' min joqgħod fuqu għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza fis- soluzzjonijiet tal-prova bi preċiżjoni u b'limitu ta' osservazzjoni magħrufa u rraportati huwa disponibbli.
         Informazzjoni utli tinkludi l-formula strutturali, purità tas-sustanza, stabbiltà fl-ilma u fid-dawl, pKa, Pow u riżultati tal-prova għal bijodigradibilità fil-pront (ara l-metodu tal-prova Ċ.4).
         1.5.   VALIDITÀTAL–PROVA
         Sabiex il-prova tkun valida għandhom japplikaw il-kondizzjonijiet li ġejjin:
         
                     —
                  
                  
                     il-mortalità fil-kontroll(i) ma jistax jeċċedi l-10 % fit-tmiem tal-prova,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-piż medju tal-ħut fil-kontroll(i) għandu jkun żdied biżżejjed biex jippermetti l-osservazzjoni tal-varjazzjoni minima tar-rata ta' żvilupp li hi meqjusa bħala sinifikattiva. Prova permezz ta' programm komparattiv bejn il-laboratorji (ring test) (2) uriet li għal ħut ta' l-ispeċi fil-ġeneru ta' Salamun (rainbow trout) il-piż medju ta' ħut fil-kontrolli żdied mill-inqas bin-nofs (i.e. 50 %) tal-piż inizjali medju tagħhom fmedda ta' 28 jum, eż. piż inizjali: 1 g/ħut (= 100 %), piż finali wara 28 jum: > 1,5 g/ħut (≥ 150 %),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjoni ta' ossiġnu maħlul kienet mill-inqas 60 % tal-valur ta' saturazzjoni ta' l-arja (ASV) matul il-prova,
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-temperatura ta' l-ilma m'għandhiex tvarja b'aktar minn ± 1 oC bejn il-kompartimenti tal-prova fxi ħin partikolari matul il-prova u għandha tinżamm f firxa ta' 2 oC fil-firxiet ta' temperatura speċifikati għall-ispeċi tal-prova (l-Appendiċi 1).
                  
               1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAL–PROVA
         1.6.1.   Apparat
         Tagħmir normali tal-laboratorju u speċjalment dan li ġej:
         
                     —
                  
                  
                     metri ta' l-ossiġnu u tal-pH;
                  
               
                     —
                  
                  
                     tagħmir għad-determinazzjoni ta' l-ebusija u l-alkalinità ta' l-ilma;
                  
               
                     —
                  
                  
                     tagħmir adegwat għall-kontroll tat-temperatura u preferibbilment moniturjar kontinwu;
                  
               
                     —
                  
                  
                     tankijiet magħmula minn materjal li huwa inert għall-kimika u ta' kapaċità adattata skond it-tagħbija u d-densità tal-ħżin rakkomandati (ara it-taqsima 1.8.5 u l-Appendiċi 1);
                  
               
                     —
                  
                  
                     bilanċ preċiż kif xieraq (i.e. preċiż sa ±0,5 %).
                  
               1.6.2.   Ilma
         Kull ilma li fih l-ispeċi tal-prova turi sopravivenza fit-tul u żvilupp adattat jista' jintuża bħala ilma tal-prova. Għandu jkun ta' kwalità kostanti matul il-perjodu tal-prova. Il-pH ta' l-ilma għandu jkun fil-firxa ta' 6,5 sa 8,5, imma matul prova partikolari għandu jkun f'firxa ta' ±0,5 unitajiet tal-pH. Ebusija ogħla minn 140 mg/l (bħala CaCO3) hija rakkomandata. Sabiex jiġi żgurat li l-ilma għat-taħlit ma jaffettwax ir-riżultati tal-prova b'mod eċessiv (per eżempju billi jbiddel il-karattru ġenerali tas-sustanza tal-prova), għandhom jittieħdu kampjuni f'intervalli għall-analiżi. Tiqjis ta' metalli tqal (eż. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd u Ni), anjoni u katjoni maġġuri (eż. Ca, Mg, Na, K, Cl u SO4), pestiċidi (eż. pestiċidi ta' l-organofosforu totali u ta' l-organoklorin totali), karbonju organiku totali u solidi f'forma ta' suspensjoni għandu jsir, per eżempju, kull tliet xhur fejn l-ilma għat-taħlit huwa magħruf li hu ta' kwalità relattivament kostanti. Jekk il-kwalità ta' l-ilma intweriet li kienet konstanti matul ta' l-inqas sena, id-determinazzjonijiet jistgħu jsiru inqas spiss u l-intervalli jiġu estiżi (eż. kull sitt xhur). Xi karatteristiċi kimiċi ta' ilma għat-taħlit li huwa aċċettabbli huma elenkati fl-Appendiċi 2.
         1.6.3.   Soluzzjonijiet tal-prova
         Soluzzjonijiet tal-prova tal-konċentrazzjonijiet magħżula huma preparati billi soluzzjoni tal-ħżin tiġi mħallta ma' l-ilma.
         Is-soluzzjoni tal-ħżin għandha preferibbilment tkun preparata sempliċiment billi s-sustanza tal-prova tiġi mħallta jew aġitata fl-ilma għat-taħlit bl-użu ta' mezzi mekkaniċi (eż. tħawwid jew ultrasonikazzjoni). Kolonni ta' saturazzjoni (kolonni ta' solubilità) jistgħu jintużaw biex tinkiseb soluzzjoni konċentrata tal-ħżin adattata.
         L-użu ta' solventi jew ta' aġenti li jiffaċilitaw is-solubbilità (dispersants) jista' jkun meħtieġ f'xi każijiet biex tkun magħmula soluzzjoni tal-ħżin ta' konċentrazzjoni adattata. Eżempji ta' solventi adattati huma aċeton, etanol, metanol, dimethylsulfoxide, dimethylformamide u triethyleneglycol. Eżempji ta' aġenti li jiffaċilitaw is-solubbilità (dispersants) adattati huma Cremophor RH40, Tween 80, Methylcellulose 0,01 % u HCO-40. Attenzjoni għandha tittieħed meta jkunu qed jintużaw aġenti li huma faċilment bijodigradabbli (eż. aċeton) u/jew komposti li huma volatili ħafna għax dawn jistgħu jikkaġunaw problemi bit-tkattir ta' batterja fil-provi flow-through. Meta jintuża aġent li jiffaċiltà s-solubbilità dan m'għandux jkollu effetti sinifikattivi fuq l-iżvilupp tal-ħut u l-inqas effetti negattivi viżibbli fuq il-ħut żagħżugħ kif svelat b'kontroll li juża s-solvent biss.
         Għal provi flow-through, hija meħtieġa sistema li kontinwament tqassam u tħallat bl-ilma s-soluzzjoni tal-ħżin tas-sustanza tal-prova (eż. pompa li tkejjel u tqassam bil-miter, tagħmir li jħallat is-sustanza ma' l-ilma b'mod proporzjonali, sistema ta' saturazzjoni) biex twassal serje ta' konċentrazzjonijiet lill-kompartimenti tal-prova. Ir-rati ta' ċaqliq tas-soluzzjonijiet tal-ħżin u ta' l-ilma għat-taħlit għandhom jiġu kkontrollati f'intervalli, preferibbilment ta' kuljum, matul il-prova u m'għandhomx ivarjaw b'aktar minn 10 % matul il-prova. Prova permezz ta' programm komparattiv bejn il-laboratorji (ring test) (2) uriet li, għal ħut ta' l-ispeċi fil-ġeneru ta' Salamun (rainbow trout), frekwenza tat-tneħħija ta' l-ilma matul il-prova ta' 6 litri/g ta' ħut/jum hija aċċettabbli (ara it-taqsima 1.8.2.2).
         Għal provi semi-statiċi (ta' tiġdid), il-frekwenza ta' tiġdid tal-likwidu tiddependi fuq l-istabbiltà tas-sustanza tal-prova, imma tiġdid ta' kuljum ta' l-ilma huwa rakkomandat. Jekk, minn provi ta' stabbiltà preliminarji (ara t-taqsima 1.4), il-konċentrazzjoni tas-sustanza tal-prova ma tkunx stabbli (i.e. barra mill-firxa ta' 80-120 % tal konċentrazzjoni nominali jew taqa' inqas minn 80 % tal-konċentrazzjoni inizjali meqjusa) matul il-perjodu ta' tiġdid, għandha tingħata konsiderazzjoni għall-użu ta' prova flow-through.
         1.6.4.   Għażla ta' l-ispeċi
         L-ispeċi fil-ġeneru ta' Salamun (Oncorhynchus mykiss – rainbow trout) huwa l-ispeċi rakkomandat għal din il-prova peress li ħafna mill-esperjenza kienet akkwistata minn prova permezz ta' programm komparattiv bejn il-laboratorji (ring test) b'dan l-ispeċi (1) (2). Madankollu, speċi oħra li huma ddokumentati tajjeb jistgħu jintużaw imma l-proċedura tal-prova għandha mnejn ikollha tiġi adattata biex tipprovdi kondizzjonijiet tal-prova adattati. Per eżempju, esperjenza hija wkoll disponibbli biż-zebrafish (Danio rerio) (3) (4) u r-ricefish (medaka, Oryzias latipes) (5) (6) (7). Ir-raġuni fundamentali għall-għażla ta' l-ispeċi u tal-metodu esperimentali għandhom jiġu rraportati f'dan il-każ.
         1.6.5.   Żamma tal-ħut
         Il-ħut tal-prova għandu jiġi magħżul minn popolazzjoni ta' stokk wieħed, preferibbilment mill-istess wild, li tkun ilha miżmuma għal mill-inqas ġimagħtejn qabel il-prova taħt kondizzjonijiet ta' kwalità ta' l-ilma u ta' illuminazzjoni simili għal dawk użati fil-prova. Għandhom jingħataw razzjon minimu ta' ikel ta' 2 % tal-piż tal-ġisem kuljum u preferibbilment ta' 4 % tal-piż tal-ġisem kuljum matul il-perjodu taż-żamma u matul il-prova.
         Wara perjodu ta' stabbilizzazzjoni ta' 48 siegħa, l-imwiet jiġu reġistrati u jiġu applikati l-kriterji li ġejjin:
         
                     —
                  
                  
                     imwiet ta' aktar minn 10 % tal-popolazzjoni f'sebat ijiem: il-grupp intier jiġi mwarrab,
                  
               
                     —
                  
                  
                     imwiet ta' bejn il-5 % u l-10 % tal-popolazzjoni: akklimatizzazzjoni għal sebat ijiem addizjonali, jekk aktar minn 5 % mortalità matul it-tieni sebat ijiem, il-grupp intier jiġi mwarrab,
                  
               
                     —
                  
                  
                     imwiet ta' inqas minn 5 % tal-popolazzjoni f'sebat ijiem: aċċetta l-grupp.
                  
               Il-ħut m'għandux jirċievi trattament għall-mard fil-gimagħtejn ta' qabel il-prova, jew matul il-prova.
         1.7.   DISINN TAL-PROVA
         L-“ippjanar tal-prova” huwa relatat ma' l-għażla tan-numru u ta' l-ispazjar tal-konċentrazzjonijiet tal-prova, in-numru ta' rankijiet għal kull livell ta' konċentrazzjoni u n-numru ta' ħut f'kull tank. Idealment, id-disinn tal-prova għandu jkun magħżul skond:
         
                     —
                  
                  
                     l-għan ta' l-istudju;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-metodu ta' analiżi ta' l-istatistika li ser jintuża;
                  
               
                     —
                  
                  
                     id-disponibbiltà u l-ispiża tar-riżorsi esperimentali.
                  
               Il-prospett ta' l-għan għandu, jekk hu possibbli, jispeċifika l-qawwa ta' l-istatistika li fiha ammont partikolari ta' differenza fid-daqs (eż. fir-rata ta' żvilupp) huwa meħtieġ biex jiġi osservat jew, alternattivament, il-preċiżjoni li biha l-ECx (eż. fejn x = 10, 20, jew 30, u preferibbilment mhux inqas minn 10) hija meħtieġa biex tkun stmata. Mingħajr dan, ma tistax tingħata preskrizzjoni ferma tad-daqs ta' l-istudju.
         Huwa importanti li jingħaraf li d-disinn li huwa l-aħjar (jagħmel l-aħjar użu mir-riżorsi) għall-użu ma' metodu wieħed ta' analiżi ta' l-istatistika mhuwiex neċessarjament l-ottimu għall-użu ma' ieħor. Id-disinn rakkomandat għall-istima ta' LOEC/NOEC għalhekk ma jkunx l-istess bħal dak rakkomandat għal analiżi bir-rigressjoni.
         F'għadd kbir ta' każijiet, analiżi bir-rigressjoni hija preferibbli minn analiżi tal-varjanza, għal raġunijiet iddiskutati minn Stephan u Rogers (8). Madankollu, meta ma jinstab l-ebda mudell tar-rigressjoni adattat (r2 < 0,9) in-NOEC/LOEC għandhom jintużaw.
         1.7.1.   Disinn għal analiżi bir-rigressjoni
         Il-konsiderazzjonijiet importanti fid-disinn tal-prova li ser tiġi analizzata bir-rigressjoni huma:
         
                     —
                  
                  
                     Huwa meħtieġ li l-konċentrazzjoni li tagħti effett (eż. EC10, 20, 30) u l-firxa ta' konċentrazzjonijiet li fiha l-effett tas-sustanza tal-prova huwa ta' interess, ikunu koperti mill-konċentrazzjonijiet inklużi fil-prova. Il-preċiżjoni li biha jistgħu jsiru l-istimi tal-konċentrazzjonijiet li jagħtu effett, tkun l-aqwa meta l-konċentrazzjoni li tagħti effett tkun fin-nofs tal-firxa ta' konċentrazzjonijiet ppruvati. Prova preliminarja biex tinstab il-firxa tista' tkun ta' għajnuna biex jintgħażlu l-konċentrazzjonijiet tal-prova xierqa.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Biex ikun possibbli li jsir mudellar sodisfaċenti ta' l-istatistika, il-prova għandha tinkludi mill-inqas tank tal-kontroll wieħed u ħames tankijiet addizjonali b'konċentrazzjonijiet differenti. Fejn xieraq, meta jintuża aġent li jiffaċilità s-solubbilità, barra mis-serje tal-prova għandu jsir kontroll wieħed li jkun jinstab fih dan l-aġent fl-iktar konċentrazzjoni għolja li ġiet ppruvata (ara t-taqsimiet 1.8.3 u 1.8.4).
                  
               
                     —
                  
                  
                     Serje ġeometrika jew logaritmika xierqa (9) (ara l-Appendiċi 3) tista' tintuża. L-ispazjar logaritmiku tal-konċentrazzjoni tal-prova għandha tkun preferuta.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Jekk aktar minn sitt tankijiet huma disponibbli, it-tankijiet addizjonali għandhom jew jintużaw biex jipprovdu replikazzjoni jew ikunu distribwiti mal-firxa tal-konċentrazzjonijiet sabiex jiffaċilitaw spazjar eqreb tal-livelli. Kemm il-waħda kif ukoll l-oħra minn dawn il-miżuri huma ugwalment mixtieqa.
                  
               1.7.2.   Disinn għall-istima ta' NOEC/LOEC bl-użu ta' l-analiżi tal-varjanza (ANOVA)
         Preferibbilment għandu jkun hemm tankijiet replikati f'kull konċentrazzjoni, u l-analiżi ta' l-istatistika għandha tkun fil-livell tat-tank (10). Mingħajr tankijiet replikati, ma tista' ssir l-ebda konċessjoni għall-varjabilità bejn it-tankijiet aktar minn dik dovuta għall-ħut individwali. Madankollu, l-esperjenza uriet (11) li l-varjabilità bejn it-tankijiet kienet żgħira ħafna meta mqabbla mal-varjabilità ġot-tank (i.e. bejn il-ħut) fil-każ eżaminat. Għalhekk alternattiva li hi relattivament aċċettabbli hi li ssir analiżi ta' l-istatistika fil-livell tal-ħut individwali.
         Konvenzjonalment, jintużaw mill-inqas ħames konċentrazzjonijiet tal-prova f'serje ġeometrika b'fattur li preferibbilment ma jeċċedix it-3,2.
         Ġeneralment, meta jsiru provi b'tankijiet replikati, in-numru ta' tankijiet tal-kontroll replikati u għalhekk in-numru ta' ħut għandu jkun id-doppju tan-numru f'kull waħda mill-konċentrazzjonijiet tal-prova, li għandhom ikunu ta' daqs ugwali (12) (13) (14). Min naħa l-oħra, fin-nuqqas ta' tankijiet replikati, in-numru ta' ħut fil-grupp tal-kontroll għandu jkun l-istess bħan-numru f'kull waħda mill-konċentrazzjonijiet tal-prova.
         Jekk l-ANOVA għandha tkun bbażata fuq it-tankijiet minflok fuq il-ħut individwali (li jkun jinvolvi jew l-immarkar individwali tal-ħut jew l-użu ta' rati ta' żvilupp ‘psewdo’ speċifiċi (ara t-taqsima 2.1.2)), hemm il-ħtieġa li jkun hemm biżżejjed replikazzjoni ta' tankijiet biex id-devjazzjoni standard ta' ‘tankijiet fil-konċentrazzjonijiet’ tkun tista' tiġi determinata. Dan ifisser li l-gradi ta' ħelsien għall-iżbalji fl-analiżi tal-varjanza għandhom ikunu mill-inqas 5 (10). Jekk il-kontrolli biss huma replikati, hemm il-periklu li l-varjabilità fl-iżbalji tkun preġudikata għax għandha mnejn tiżdied skond il-valur medju tar-rata ta' żvilupp li ssemmiet. Peress li r-rata ta' żvilupp x'aktarx tonqos meta l-konċentrazzjoni tiżdied, dan ikollu tendenza li jwassal għal stima ogħla tal-varjabilità.
         1.8.   PROĊEDURA
         1.8.1.   Għażla u użin tal-ħut tal-prova
         Huwa importanti li l-varjazzjoni fil-piż tal-ħut fil-bidu tal-prova tiġi mnaqqsa kemm jista' jkun. Firxiet ta' daqs adattati għall-ispeċi differenti li huma rakkomandati għall-użu f'din il-prova jingħataw fl-Appendiċi 1. Għall-grupp kollu ta' ħut użat fil-prova, il-firxa ta' piżijiet individwali fil-bidu tal-prova għandha idealment tinżamm fil-± 10 % tal-piż medju aritmetiku u, f'kull każ, m'għandux jeċċedi l-25 %. Huwa rak komandat li sottokampjun ta' ħut jiġi peżat qabel il-prova sabiex issir stima tal-piż medju.
         L-ikel għandu jinżamm mill-popolazzjoni tal-ħżin għal 24 siegħa qabel ma tibda l-prova. Il-ħut għandu imbagħad jintgħażel saltwarjament. Bl-użu ta' anestetiku ġenerali (eż. soluzzjoni fl-ilma ta' 100 mg/l tricaine methane sulphonate (MS 222) newtralizzata biż-żieda ta' żewġ partijiet bikarbonat tas-sodju għal kull parti ta' MS 222), il-ħut għandu jintiżen individwalment bħala piż imxarrab (ixxugat) bil-preċiżjoni mniżżla fl-Appendiċi 1. Dawk il-ħut li l-piż tagħhom ikun fil-firxa maħsuba għandhom jinżammu u għandhom imbagħad jiġu mqassma b'mod saltwarju bejn il-reċipjenti tal-prova. Il-piż imxarrab totali tal-ħut f'kull reċipjent tal-prova għandu jiġi reġistrat. L-użu ta' anestetiċi u bl-istess mod l-immaniġġjar tal-ħut (inkluż l-ixxugar u l-użin) jista' jikkaġuna tensjoni u ħsara lill-ħut żagħżugħ, b'mod partikolari lil dawk l-ispeċi ta' daqs żgħir. Għalhekk l-immaniġġjar ta' ħut żagħżugħ għandu jsir bl-akbar attenzjoni biex jiġi evitat li l-annimali tal-prova tinħolqilhom tensjoni u ħsara.
         Il-ħut jerġgħu jintiżnu fil-jum 28 tal-prova (ara t-taqsima 1.8.6). Madankollu, jekk ikun meqjus li hu meħtieġ li jerġa' jiġi kkalkolat ir-razzjon ta' l-ikel, il-ħut jista' jerġa' jintiżen fil-jum 14 tal-prova (ara t-taqsima 1.8.2.3). Metodu ieħor bħall-metodu fotografiku jista' jintuża biex jiġi stabbilit it-tibdil fid-daqs tal-ħut li fuq il-bażi tiegħu r-razzjonijiet ta' l-ikel jistgħu jiġu aġġustati.
         1.8.2.   Kondizzjonijiet ta' l-espożizzjoni
         1.8.2.1.   Tul ta' żmien
         It-tul ta' żmien tal-prova hi ≥ 28 jum.
         1.8.2.2.   Rati tat-tagħbija u densitjiet tal-ħżin
         Huwa importanti li r-rata tat-tagħbija u d-densità tal-ħżin huma xierqa għall-ispeċi tal-prova użati (ara l-Appendiċi 1). Jekk id-densità tal-ħżin tkun għolja wisq, allura jkun hemm tensjoni minħabba fl-iffullar esaġerat li jirriżulta f'rati ta' żvilupp imnaqqsa u possibbilment fil-mard. Jekk tkun baxxa wisq, tista' tikkaġuna mġieba territorjali li tista' wkoll taffettwa l-iżvilupp. F'kull każ, ir-rata tat-tagħbija għandha tkun baxxa biżżejjed sabiex konċentrazzjoni ta' ossiġnu maħlul ta' mill-inqas 60 % ASV tista' tinżamm mingħajr arjazzjoni. Programm komparattiv bejn il-laboratorji (ring test) (3) wera li, għall-ħut ta' l-ispeċi fil-ġeneru ta' Salamun (rainbow trout), rata tat-tagħbija ta' 16 il-ħuta ta' dan l-ispeċi ta' 3-5 g f'volum ta' 40-litru hija aċċettabbli. Il-frekwenza rakkomandata għat-tneħħija ta l-ilma matul il-prova hija ta' 6 litri/g ta' ħut/jum.
         1.8.2.3.   Tmigħ
         Il-ħut għandhom jiġu mitmugħa b'ikel xieraq (l-Appendiċi 1) b'rata suffiċjenti li tikkaġuna rata ta' żvilupp aċċettabbli. Għandha tittieħed attenzjoni biex jiġi evitat l-iżvilupp ta' mikrobi u d-dardir ta' l-ilma. Għall-ħut ta' l-ispeċi fil-ġeneru ta' Salamun (rainbow trout), rata ta' 4 % tal-piż tagħom tal-ġisem kuljum għandha x'aktarx tissodisfa dawn il-kondizzjonijiet (2)(15)(16)(17). Ir-razzjon ta' kuljum jista' jitqassam f'żewġ porzjonijiet indaqs u jingħata lill-ħut f'żewġ ikliet kuljum, imbegħdin b'ta' l-inqas ħames sigħat. Ir-razzjon huwa bbażat fuq il-piż totali inizjali tal-ħut f'kull reċipjent tal-prova. Jekk il-ħut jerġgħu jintiżen fil-jum 14, ir-razzjon jerġa' jiġi kkalkolat. L-ikel għandu jinżamm mill-ħut 24 siegħa qabel l-użin.
         L-ikel li ma jittiekilx u l-materjal tal-ħmieġ ta' l-imsaren għandu jitneħħa kuljum mir-reċipjenti tal-prova permezz ta' tindif bl-attenzjoni tal-qiegħ ta' kull tank bl-irdigħ.
         1.8.2.4.   Dawl u temperatura
         Il-fotoperjodu u t-temperatura ta' l-ilma għandhom ikunu xierqa għall-ispeċi tal-prova (l-Appendiċi 1).
         1.8.3.   Konċentrazzjonijiet tal-prova
         Normalment ħames konċentrazzjonijiet tas-sustanza tal-prova huma meħtieġa, ikun xi jkun d-disinn tal-prova (ara t-taqsima 1.7.2). Tagħrif minn qabel tat- tossiċità tas-sustanza tal-prova (eż. minn prova akuta u/jew minn studji biex tinstab il-firxa) għandhom ikunu ta' għajnuna biex jintgħażlu l-konċentrazzjonijiet tal-prova xierqa. Għandha tingħata ġustifikazzjoni jekk inqas minn ħames konċentrazzjonijiet huma użati. L-ogħla konċentrazzjoni ppruvata m'għandhiex teċċedi l-limitu tas-solubilità tas-sustanza fl-ilma.
         Fejn jintuża aġent li jiffaċilità s-solubbilità biex igħin fil-preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-ħżin, il-konċentrazzjoni finali tiegħu m'għanduz ikun aktar minn 0,1 ml/l u għandu preferibbilment ikun l-istess fir-reċipjenti kollha tal-prova (ara t-taqsima 1.6.3). Madankollu, għandu jsir kull sforz biex jiġi evitat l-użu ta' materjali bħal dawn.
         1.8.4.   Kontrolli
         In-numru ta' kontrolli bl-ilma tat-taħlit jiddependi fuq id-disinn tal-prova (ara t-taqsimiet 1.7-1.7.2). Jekk jintuża aġent li jiffaċilità s-solubbilità, allura l-istess numru ta' kontrolli bl-aġenti li jiffaċilitaw s-solubbilità daqs kontrolli bl-ilma tat-taħlit għandhom jiġu inklużi wkoll.
         1.8.5.   Frekwenza ta' determinazzjonijiet analitiċi u tiqjis
         Matul il-prova, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tal-prova huma determinati f'intervalli regolari (ara hawn taħt).
         Fil-provi flow-through, ir-rati ta' ċaqliq tas-soluzzjoni ta' ħżin dilwenti u tossikanti għandhom jiġu kkontrollati f'intervalli, preferibbilment kuljum, u m'għandhomx ivarjaw b'aktar minn 10 % matul il-prova. Fejn il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tal-prova huma mistennija li jkunu bejn il-± 20 % tal-valuri nominali (i.e. fil-firxa ta' 80-120 %; ara t-taqsimiet 1.6.2 u 1.6.3), huwa rakkomandat li, bħala minimu, il-konċentrazzjonijiet l-aktar għoljin u dawk l-aktar baxxi jiġu analizzati fil-bidu tal-prova u f'intervalli ta' kull ġimgħa wara dan. Għall-prova fejn il-konċentrazzjoni tas-sustanza tal-prova mhix mistennija li tibqa' bejn il-± 20 % tal-valuri nominali (fuq il-bażi ta' data dwar l-istabbiltà tas-sustanza tal-prova), huwa meħtieġ li jiġu analizzati l-konċentrazzjonijiet tal-prova kollha, imma bl-użu ta' l-istess reġim.
         Fil-provi semi-statiċi (ta' tiġdid) fejn il-konċentrazzjoni tas-sustanza tal-prova hija mistennija li tibqa' bejn il-± 20 % tal-valuri nominali, huwa rakkomandat li, bħala minimu, il-konċentrazzjonijiet tal-prova l-aktar għoljin u dawk l-aktar baxxi jiġu analizzati meta ppreparati friski u immedjatament qabel it-tiġdid fil-bidu ta' l-istudju u ta' kull ġimgħa wara dan. Għall-provi fejn il-konċentrazzjoni tas-sustanza tal-prova mhix mistennija li tibqa' bejn il-± 20 % tal-valuri nominali, il-konċentrazzjonijiet kollha tal-prova iridu jiġu analizzati bl-użu ta' l-istess reġim bħal dak użat għal sustanzi aktar stabbli.
         Huwa rakkomandat li r-riżultati jkunu bbażati fuq il-konċentrazzjonijiet meqjusa. Madankollu, jekk ikun hemm evidenza disponibbli biex turi li l-konċentrazzjoni ta' soluzzjoni tas-sustanza tal-prova inżammet b'mod sodisfaċenti bejn il-± 20 % tal-konċentrazzjoni nominali jew tal-konċentrazzjoni inizjali meqjusa matul il-prova, allura r-riżultati jistgħu jkunu bbażati fuq valuri nominali jew meqjusa.
         Il-kampjuni jistgħu jeħtieġu li jiġu ffiltrati (eż. bl-użu ta' daqs tal-pori ta' 0,45 μm) jew soġġetti għal azzjoni ċentrifuga. Iċ-ċentrifugazzjoni hija l-proċedura rakkomandata. Madankollu, jekk il-materjal tal-prova ma jiġix assorbit mill-filtri, il-filtrazzjoni tista' tkun aċċettabbli wkoll.
         Matul il-prova, għandhom jitqiesu l-ossiġnu maħlul, il-pH u t-temperatura fir-reċipjenti tal-prova kollha. L-ebusija totali, l-alkalinità u s-salinità (jekk relevanti) għandhom jitqiesu fil-kontrolli u f'reċipjent wieħed ta' l-ogħla konċentrazzjoni. Bħala minimu, l-ossiġnu maħlul u s-salinità (jekk relevanti) għandhom jitqiesu tliet darbiet (fil-bidu, fin-nofs u fit-tmiem tal-prova). Fi provi semi-statiċi, huwa rakkomandat li l-ossiġnu maħlul jitqies aktar spiss, preferibbilment qabel u wara kull tiġdid ta' l-ilma jew mill-inqas darba fil-ġimgħa. Il-pH għandha titqies fil-bidu u fit-tmiem ta' kull tiġdid ta' l-ilma fi prova tat-tiġdid statiku u ta' l-inqas darba fil-ġimgħa fi provi flow-through. L-ebusija u l-alkalinità għandhom jitqiesu darba f'kull prova. It-temperatura preferibbilment għandha tkun ikkontrollata kontinwament f'mill-inqas reċipjent wieħed tal-prova.
         1.8.6.   Osservazzjonijiet
         Piż: Fit-tmiem tal-prova l-ħut kolha li jibqgħu ħajjin għandhom jintiżnu bħala piż imxarrab (ixxugat) jew fi gruppi skond ir-reċipjent tal-prova jew individwalment. L-użin ta' l-annimali bir-reċipjent tal-prova huwa preferibbli mill-użin individwali li jeħtieġ li l-ħut ikun immarkat individwalment. Fil-każ ta' tiqjis tal-piżijiet individwali għad-determinazzjoni tar-rata ta' żvilupp speċifika għall-ħuta individwali, il-metodu ta' teknika ta' l-immarkjar magħżula għandha tevita li toħloq tensjoni fl-annimali (alternattivi għall-immarkjar bl-iffriżar jistgħu jkunu xierqa, eż. l-użu ta' xlief fin ikkulurit).
         Il-ħut għandu jkun eżaminat kuljum matul il-perjodu tal-prova u kull anormalità esterna (bħal emorraġija, telf tal-kulur) u mġieba anormali nnotata. Kull mewt għandu jiġi rreġistrat u l-ħut mejjet jitneħħa malajr kemm jista' jkun. Il-ħut mejjet ma jiġix sostitwit, ir-rata tat-tagħbija u d-densità tal-ħżin huma biżżejjed biex jiġu evitati effetti fuq l-iżvilupp minħabba bdil fin-numru ta' ħut f'kull tank. Madankollu, ir-rata ta' tmigħ tkun teħtieġ li tiġi aġġustata.
         2.   DATA U RAPURTAĠĠ
         2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         Huwa rakkomandat li espert ta' l-istatistika jkun involut kemm fid-disinn kif ukoll fl-analiżi tal-prova peress li dan il-metodu tal-prova jippermetti varjazzjoni konsiderevoli fid-disinn esperimentali bħal per eżempju, fin-numru ta' kompartamenti tal-prova, numru ta' konċentrazzjonijiet tal-prova, numru ta' ħut, eċċ. Minħabba l-għażliet li huma disponibbli fid-disinn tal-prova, gwida speċifika dwar il-proċedura ta' l-istatistika ma tingħatax hawn.
         Ir-rati ta' żvilupp m'għandhomx jiġu kkalkolati għar-reċipjenti tal-prova fejn il-mortalità teċċedi l-10 %. Madankollu, ir-rata tal-mortalità għandha tkun indikata għall-konċentrazzjonijiet tal-prova kollha.
         Ikun liema metodu li jintuża biex tiġi analizzata d-data, il-kunċett ċentrali huwa r-rata ta' żvilupp speċifika r bejn il-ħin t1 u l-ħin t2. Din tista' tiġi definita f'ħafna modi skond jekk il-ħut hux immarkat individwalment jew le jew skond jekk hix meħtieġa l-medja għat-tank.
         
            
         
            
         
            
         fejn:
         
                     r1
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     rata ta' żvilupp speċifika għall-ħuta individwali
                  
               
                     r2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     rata ta' żvilupp medja speċifika għat-tank
                  
               
                     r3
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     rata ta' żvilupp ‘psewdo’ speċifika
                  
               
                     w1, w2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     rata ta' żvilupp medja speċifika għat-tank loge
                     
                  
               
                     w1
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     logaritmu tal-piż ta' ħuta individwali fil-bidu tal-perjodu ta' studju
                  
               
                     loge w2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     l logaritmu tal-piż ta' ħuta individwali fit-tmiem tal-perjodu ta' studju
                  
               
                     loge W1
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     medja tal-logaritmi tal-valuri w1 għall-ħut fit-tank fil-bidu tal-perjodu ta' studju
                  
               
                     loge W2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     medja tal-logaritmi tal-valuri w2 għall-ħut fit-tank fil-tmiem tal-perjodu ta' studju
                  
               
                     t1, t2
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     ħin (jiem) fil-bidu u fit-tmiem tal-perjodu ta' studju
                  
               r1, r2, r3 jistgħu jiġu kkalkolati għall-perjodu ta' minn 0-28 jum u, fejn xieraq (i.e. meta t-tiqis fil-jum 14 ikun sar) għall-perjodi ta' minn 0-14 u minn 14-28 jum.
         2.1.1.   Analiżi tar-riżultati bir-riġressjoni (mudellar tar-rispons għall-konċentrazzjoni)
         Dan il-metodu ta' analiżi jaqbel ma' relazzjoni tal-matematika adattata bejn ir-rata ta' żvilupp speċifika u l-konċentrazzjoni, u għalhekk jagħmel possibbli l-istima ta' l-“ECx” i.e. kull valur ta' l-EC meħtieġ. Bl-użu ta' dan il-metodu l-kalkolu ta' r għall-ħut individwali (r1) mhux meħtieġ u minflok, l-analiżi tista' tkun ibbażata fuq il-valur medju għat-tank ta' r (r2). Dan il-metodu ta' l-aħħar huwa preferut. Huwa wkoll aktar xieraq fil-każ li jintuża l-iżgħar speċi.
         Ir-rati ta' żvilupp medji speċifiċi għat-tank (r2) għandhom jiġu mmarkati fuq graff kontra l-konċentrazzjoni, sabiex tiġi spezzjonata r-relazzjoni tar-rispons mal-konċentrazzjoni.
         Sabiex tiġi mfissra r-relazzjoni bejn r2 u l-konċentrazzjoni, għandu jintgħażel mudell xieraq u l-għażla tiegħu għandha tkun sostnuta b'raġunar xieraq.
         Jekk in-numri ta' ħut li jibqgħu ħajjin f'kull tank ma jkunux l-istess, allura l-proċess ta' tqabbil tal-mudell, kemm jekk sempliċi jew jekk mhux lineari, għandu jiġi peżat biex jippermetti għal gruppi ta' daqsijiet differenti.
         Il-metodu ta' tqabbil tal-mudell għandu jagħmel possibbli l-istima ta', per eżempju, l-EC20 u tad-dispersjoni tiegħu (jew l-iżball standard jew l-intervall ta' fiduċja). Il-graff tal-mudell imqabbel għandu jintwera fir-rigward tad-data sabiex s-suffiċjenza tat-tqabbil tal-mudell tista' tidher (8)(18)(19)(20).
         2.1.2.   Analiżi tar-riżultati għall-istima tal-LOEC
         Jekk il-prova tkun inkludiet ir-replikazzjoni tat-tankijiet fil-livelli kollha tal-konċentrazzjoni, l-istima tal-LOEC tista' tkun ibbażata fuq analiżi tal-varjanza (ANOVA) tar-rata ta' żvilupp medja speċifika għat-tank (ara t-taqsima 2.1), segwita minn metodu adattat (eż. il-prova ta' Dunnett jew ta' Williams (12) (13) (14) (21)) għat-tqabbil tal-medja r għal kull konċentrazzjoni mal-medja r għall-kontrolli biex tiġi identifikata l-aktar konċentrazzjoni baxxa li għaliha din id-differenza hija sinifikattiva f'livell ta' probabbiltà ta' 0,05. Jekk is-supposizzjonijiet meħtieġa għall-metodi parametricċi ma jintlaħqux – distribuzzjoni mhux normali (eż. il-prova ta' Shapiro-Wilk) jew varjanza eteroġena (il-prova ta' Bartlett), għandha tingħata konsiderazzjoni għat-trasformazzjoni tad-data biex jiġu omoġenizzati l-varjanzi qabel ma ssir l-ANOVA, jew biex issir l-ANOVA miżuna.
         Jekk il-prova ma tkunx inkludiet ir-replikazzjoni tat-tankijiet f'kull konċentrazzjoni, ANOVA bbażata fuq it-tankijiet ma tkunx sensittiva jew tkun impossibbli. F'din is-sitwazzjoni, kompromess aċċettabbli hu li l-ANOVA tkun ibbażata fuq ir-rata ta' żvilupp ‘psewdo’ speċifika r3 għall-ħut individwali.
         Il-medja ta' l-r3 għal kull konċentrazzjoni tal-prova tista' imbagħad tiġi mqabbla mal-medja ta' l-r3 għall-kontrolli. Il-LOEC tista' imbagħad tiġi identifikata bħal qabel. Għandu jiġi konoxxut li dan il-metodu ma jipprovdi l-ebda konċessjoni għal, l-anqas protezzjoni kontra, il-varjabilità bejn it-tankijiet, aktar minn dik li hi ġġustifikata mill-varjabilità ta' bejn il-ħut individwali. Madankollu, l-esperjenza uriet (8) li l-varjabilità bejn it-tankijiet kienet żgħira ħafna meta mqabbla mal-arjabilità ġot-tank (i.e. bejn il-ħut). Jekk il-ħut individwali ma jkunx inkluż fl-analiżi, il-metodu ta' identifikazzjoni ta' data anomala (outlier) u l-ġustifikazzjoni għall-użu tagħha għandhom ikunu provduti.
         2.2.   INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Ir-riżultati għandhom ikunu interpretati bl-attenzjoni fejn il-konċentrazzjonijiet meqjusa ta' tossikant fis-soluzzjonijiet tal-prova jseħħu f'livelli qrib tal-limitu ta' osservazzjoni tal-metodu analitiku jew, fi provi semistatiċi, meta l- konċentrazzjoni tas-sustanza tal-prova tonqos minn soluzzjoni ppreparata friska għal qabel ma tiġġedded.
         2.3.   RAPPORT TAL-PROVA
         Ir-rapport tal-prova għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         2.3.1.   Sustanza tal-prova:
         
                     —
                  
                  
                     natura fiżika u proprjetajiet fiżiċikimiċi relevanti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        data dwar l-identifikazzjoni kimika inkluż il-purità u l-metodu analitiku għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza tal-prova fejn xieraq.
                  
               2.3.2.   Speċi tal-prova:
         
                     —
                  
                  
                     possibbilment, l-isem xjentifku,
                  
               
                     —
                  
                  
                     razza, daqs, fornitur, kull trattament li jkun sar minn qabel, eċċ.
                  
               2.3.3.   Kondizzjonijiet tal-prova:
         
                     —
                  
                  
                     proċedura tal-prova użata (eż. semi-statiku/ta' tiġdid, flow-through, tagħbija, densità tal-ħżin, eċċ),
                  
               
                     —
                  
                  
                     disinn tal-prova (eż. numru ta' reċipjenti tal-prova, konċentrazzjonijiet u repliki tal-prova, numru ta' ħut f'kull reċipjent),
                  
               
                     —
                  
                  
                     metodu ta' preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tal-ħżin u frekwenza tat-tiġdid (l-aġent li jiffaċiltà s-solubbilità u l-konċentrazzjoni tiegħu għandhom jingħataw, meta użati),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjonijiet nominali tal-prova, il-medji tal-valuri meqjusa u d-devjazzjonijiet mill-istandard tagħhom fir-reċipjenti tal-prova u l-metodu li bih dawn intlaħqu u evidenza li t-tiqjis jirreferi għall-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tal-prova f'soluzzjoni vera,
                  
               
                     —
                  
                  
                     karatterisitiċi ta' l-ilma għat-taħlit: pH, ebusija, alkalinità, temperatura, konċentrazzjoni ta' ossiġnu maħlul, livelli residwali ta' klorin (jekk meqjusa), karbonju organiku totali, solidi f'forma ta' suspensjoni, salinità tal-likwidu tal-prova (jekk meqjus) u kull tiqjis ieħor li jsir,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwalità ta' l-ilma fir-reċipjenti tal-prova: pH, ebusija, temperatura u konċentrazzjoni ta' ossiġnu maħlul,
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dettaljata dwar it-tmigħ (eż. tip ta' ikel, għajn, ammont mogħti u frekwenza).
                  
               2.3.4.   Riżultati:
         
                     —
                  
                  
                     evidenza li l-kontrolli laħqu l-kriterju ta' validità għas-sopravivenza, u data dwar l-imwiet li jseħħu f'kull waħda mill-konċentrazzjonijiet tal-prova,
                  
               
                     —
                  
                  
                     metodi ta' teknika ta l-istatistika analitika użati, statistika bbażata fuq ir-repliki jew il-ħut, trattament tad-data u ġustifikazzjoni tal-metodi ta' teknika użati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     data mqassma f'forma tabulari dwar il-piż ta' ħut individwali u l-piċ medju fil-jiem 0, 14 (jekk meqjusa) u 28, valuri tar-rati ta' żvilupp medji speċifiċi għat-tank jew psewdo speċifiċi (kif xieraq) għall-perjodi 0-28 jum jew possibbilment 0-14 u 14-28,
                  
               
                     —
                  
                  
                     riżultati ta' l-analiżi ta' l-istatistika (i.e. analiżi tar-rigressjoni jew ANOVA) preferibbilment f'forma tabulari u grafika u l-LOEC (p = 0,05) u n- NOEC jew l-ECx ma', meta possibbli, l-iżbalji standard, kif xieraq,
                  
               
                     —
                  
                  
                     inċidenza ta' kull reazzjoni mhux tas-soltu mill-ħut u kull effett viżibbli ikkaġunat mis-sustanza tal-prova.
                  
               3.   REFERENZI
         
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Ir-Rapport tal-WRc Nru PRD 1388-M/2.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Ashley S., Mallett M. J and Grandy N. J. (1990). EEC: Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Ir-Rapport Finali Lill-Kummissjoni tal-Komunitajiet Ewropej. Ir-Rapport tal-WRc Nru KEE: 2600-M.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, pġ. 1855-1870.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N. and Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, pġ. 157-164.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Econ. Conta. Toxicol. 28, pġ. 287-297.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner u D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, pġ. 328-338.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, jew atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Ir-Rapport EPS 1/RM/28, 81 pp. Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10-12 ta' Diċembru 1991.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, pġ. 1096-1121.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, pġ. 482-491.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, pġ. 103-117.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, pġ. 123-133.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, pġ. 33-41.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Il-Kapitolu IX fit-Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 pp.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, pġ. 1485-1494.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Ir-Rapport EA-6189 (American Petroleum Institute
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Publication, Nru 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Ir-Rapport Tekniku Nru 05-88 tan-National Effluent Toxicity Assessment Center. Settembru 1988. 12-il pp.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, pġ. 510-531.
                  
               
            ANNESS 1
            SPEĊI TA' ĦUT RAKKOMANDAT GĦALL-PROVA U KONDIZZJONIJIET TAL-PROVA ADATTATI
            
                        Speċi
                     
                     
                        Firxa rakkomandata tat-temperatura tal-prova
                        (oC)
                     
                     
                        Fotoperjodu
                        (sigħat)
                     
                     
                        Firxa rakkomandata għall-piż inizjali tal-ħut
                        (g)
                     
                     
                        Preċiżjoni meħtieġa fit-tiqjis
                     
                     
                        Rata tat-tagħbija
                        (g/l)
                     
                     
                        Densità tal-ħżin
                        (kull litru)
                     
                     
                        Ikel
                     
                     
                        Tul tal-prova
                        (jiem)
                     
                  
                        
                           Speċi rakkomandati
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        
                           Oncorhynchu s mykiss L-ispeċi fil-ġeneru ta' Salamun
                        (rainbow trout)
                     
                     
                        12,5  - 16,0 
                     
                     
                        12 – 16
                     
                     
                        1 – 5
                     
                     
                        Sa l-eqreb 100 mg
                     
                     
                        1,2  - 2,0 
                     
                     
                        4
                     
                     
                        Ikel proprjetarju niexef magħmul minn ħut żgħir tas-salmonid
                     
                     
                        ≥ 28
                     
                  
                        
                           Speċi oħra li huma ddokumentati tajjeb:
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        
                           Danio rerio
                        
                        zebrafish
                     
                     
                        21 – 25
                     
                     
                        12 – 16
                     
                     
                        0,050  - 0,100 
                     
                     
                        Sa l-eqreb 1 mg
                     
                     
                        0,2  - 1,0 
                     
                     
                        5 – 10
                     
                     
                        Ikel ħaj (Brachionus Artemia)
                     
                     
                        ≥ 28
                     
                  
                        
                           Oryzias latipes
                        
                        ricefish (Medaka)
                     
                     
                        21 – 25
                     
                     
                        12 – 16
                     
                     
                        0,050  - 0,100 
                     
                     
                        Sa l-eqreb 1 mg
                     
                     
                        0,2  - 1,0 
                     
                     
                        5 – 20
                     
                     
                        Ikel ħaj (Brachionus Artemia)
                     
                     
                        ≥ 28
                     
                  
         
            ANNESS 2
            XI KARATTERISTIĊI KIMIĊI TA' ILMA GĦAT-TAĦLIT AĊĊETTABBLI
            
                        Sustanza
                     
                     
                        Konċentrazzjonijiet
                     
                  
                        Materja f'partikoli
                     
                     
                        < 20 mg/l
                     
                  
                        Karbonju organiku totali
                     
                     
                        < 2 mg/l
                     
                  
                        Ammonja mhix jonizzata
                     
                     
                        < 1 μg/l
                     
                  
                        Klorin residwali
                     
                     
                        < 10 μg/l
                     
                  
                        Pestiċidi ta' l-organofosforu totali
                     
                     
                        < 50 ng/l
                     
                  
                        Pestiċidi ta' l-organoklorin totali biż-żjieda ta' bifenili poliklorinati
                     
                     
                        < 50 ng/l
                     
                  
                        Klorin organiku totali
                     
                     
                        < 25 ng/l
                     
                  
         
            ANNESS 3
            Serje logaritmika ta' konċentrazzjonijiet tajbin għat-test ta' tossiċità (9)
            
                        Kolonna (numru ta' konċentrazzjonijiet bejn 100 u 10, jew bejn 10 u 1) (*************)
                        
                     
                  
                        1
                     
                     
                        2
                     
                     
                        3
                     
                     
                        4
                     
                     
                        5
                     
                     
                        6
                     
                     
                        7
                     
                  
                        100
                     
                     
                        100
                     
                     
                        100
                     
                     
                        100
                     
                     
                        100
                     
                     
                        100
                     
                     
                        100
                     
                  
                        32
                     
                     
                        46
                     
                     
                        56
                     
                     
                        63
                     
                     
                        68
                     
                     
                        72
                     
                     
                        75
                     
                  
                        10
                     
                     
                        22
                     
                     
                        32
                     
                     
                        40
                     
                     
                        46
                     
                     
                        52
                     
                     
                        56
                     
                  
                        3,2 
                     
                     
                        10
                     
                     
                        18
                     
                     
                        25
                     
                     
                        32
                     
                     
                        37
                     
                     
                        42
                     
                  
                        1,0 
                     
                     
                        4,6 
                     
                     
                        10
                     
                     
                        16
                     
                     
                        22
                     
                     
                        27
                     
                     
                        32
                     
                  
                         
                     
                     
                        2,2 
                     
                     
                        5,6 
                     
                     
                        10
                     
                     
                        15
                     
                     
                        19
                     
                     
                        24
                     
                  
                         
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        3,2 
                     
                     
                        6,3 
                     
                     
                        10
                     
                     
                        14
                     
                     
                        18
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        1,8 
                     
                     
                        4,0 
                     
                     
                        6,8 
                     
                     
                        10
                     
                     
                        13
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        2,5 
                     
                     
                        4,6 
                     
                     
                        7,2 
                     
                     
                        10
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        1,6 
                     
                     
                        3,2 
                     
                     
                        5,2 
                     
                     
                        7,5 
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        2,2 
                     
                     
                        3,7 
                     
                     
                        5,6 
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        1,5 
                     
                     
                        2,7 
                     
                     
                        4,2 
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,9 
                     
                     
                        3,2 
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        1,4 
                     
                     
                        2,4 
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,8 
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        1,3 
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
         C.15.   PROVA TA' TOSSIĊITÀ B'TERMINU QASIR FUQ EMBRIJONI U STADJI TA' SAC-FRY TAL-ĦUT
         1.   METODU
         Dan il-metodu ta' ittestjar għal tossiċità b'terminu qasir huwa replika tal-OECD TG 212 (1998).
         1.1.   DAĦLA
         Dan it-test ta' tossiċità b'terminu qasir fuq embrijoni u stadji ta' sac-fry tal-ħut huwa prova b'terminu qasir fejn jiġu esposti l-istadji tal-ħajja minn meta bajda ġdida tiġi fertilizzata sa l-istadju ta' sac-fry. Ebda ikel ma huwa provdut fit-test ta' l-embrijon u sac-fry, u t-test għandu jiġi terminat waqt li s-sac-fry għadhom jiġu nutriti mill-membrana li tagħlaq ġo fiha l-isfar tal-bajda.
         L-għan ta' dan it-test huwa sabiex jiddefinixxi effetti letali, u sa ċertu punt effeti sub-letali ta' kimiċi fuq l-istadji speċifiki u fuq l-ispeċi ittestjati. Dan it-test jipprovdi informazzjoni utli b'tali mod li jista' (a) jifforma pont bejn testijiet letali u dawk sub-letali (b) jintuża bħala test ta' screening għal test komplut fuq l-istadji kollha tal-bidu tal-ħajja jew għal test ta' tossiċità kronika u (c) jista' jintuża biex jiġu ittestjati speċi li it-tkabbir tagħhom m'huwiex avvanzat biex ikopri biżżejjed il-perjodu ta' transizzjoni minn nutriment endoġenu għal dak esoġenu.
         Ta' min jiftakar li testijiet li jinkorporaw il-fażijiet kollha tal-ħajja tal-ħuta huma ġeneralment suġġetti li jagħtu stima eżatta tat-tossiċità kronika tal-kimiċi għall-ħut, u kwalunkwe tnaqqis fl-espożizzjoni fir-rigward ta' stadji tal-ħajja jistgħu inaqqsu is-sensittività ta' dan it-test u għalhekk jissottovalutaw it-tossiċità kronika. Għalhekk hu mistenni li t-test ta' l-embrijun u ta' l-istadji ta' sac-fry ikun inqas sensittiv minn dak ta' test komplut fuq l-istadji kollha tal-bidu tal-ħajja, partikolarment fejn jidħlu kimiċi li għandhom lipofilità għolja (log Pow > 4) u kimiċi b'mod ta' azzjoni tossika speċifika. Madankollu differenzi zgħar bejn iż-żewġ testijiet huma mistennija għal kimiċi li m'għandhomx mod ta' azzjoni narkotika speċifika (1).
         Qabel ma' ġie ppublikat, dan it-test ta' l-embrijun u ta' sac-fry ġie ppruvat l-aktar fuq ħut ta' l-ilma ħelu Danio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – magħruf aktar bħala zebrafish). Għaldaqstant l-appendiċi 1 jagħti gwida aktar dettaljata ta' l-eżekuzzjoni ta' dan it-test fuq din l-ispeċi. Dan ma jeskludix l-użu ta' speċi oħra għal liema diġà hemm xi prova disponibbli (Tabella 1).
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         Konċentrazzjoni minima b'effett sinjifikanti (LOEC) : hija l-aktar konċentrazzjoni baxxa ttestjata mis-sustanza tat-test fejn is-sustanza ikollha effett sinifikattiv (f'p < 0,05) meta mqabbla mal-kontroll. Madankollu, kull konċentrazzjoni 'l fuq mill-LOEC għandu jkollha effett ta' ħsara daqs jew aktar minn dawk osservati fl-LOEC.
         Konċentrazzjoni massima mingħajr effetti sinifikanti (NOEC): hija l-prova ta' konċentrazzjoni eżatt taħt l-LOEC.
         1.3.   PRINĊIPJU TAT-TEST
         L-istadji ta' l-embrijon u tas-sac-fry tal-ħut huma esposti għal sensiela ta' konċentrazzjonijiet tas-sustanza għall-prova dissolta fl-ilma. Il-protokoll jippermetti għażla bejn proċedura semi-statika jew proċedura b'ċirkolazzjoni kontinwa. Din l-għażla tiddependi fuq in-natura tas-sustanza li ser tiġi ittestjata. Dan it-test jibda billi jitpoġġew bajd fertilizzat fil-kontenituri u jintemm eżatt qabel ma l-membrana li tagħlaq ġo fiha l-isfar tal-bajd ta' xi waħda mil-larva f'xi kontenitur tkun assorbita kompletament jew qabel ma l-kontrolli jibdew imutu tal-ġuħ. Effetti letali u sub-letali huma evalwati u mqabbla mal-valuri relattivi għall-kontrolli bl-iskop li tiġi determinata l-konċentrazzjoni minima b'effetti sinifikanti. L-alternattiva hi li jiġu analizzati billi jintuza mudell rigressiv sabiex tkun stmata il-konċentrazzjoni li tista' tikkawża effett perċentwali (i.e. LC/ECx, fejn x hija effett % definit).
         1.4.   INFORMAZZJONI FUQ IS-SUSTANZA TAT-TEST
         Ir-riżultati ta' test ta' tossiċità qawwija (ara metodu C.1) preferibilment ma' l-ispeċi magħżula għal dan it-test, għanhom ikunu disponibbli. Ir-riżultati jistgħu jkunu utli biex tintgħażel sensiela ta' konċentrazzjonijiet tat-test mill-istadji tal-bidu tal-ħajja. Is-solubilità ta' l-ilma (inkluż is-solubilità fl-ilma tat-test) u l-pressa tal-fwar għandhom ikunu magħrufa. Għandu jkun hemm metodu ta' min jorbot fuqu disponibbli, għal kwantifikazzjoni tas-sustanza fis-soluzzjonijiet tat-test, b'eżattezza magħrufa u rappurtata kif ukoll il-limitu ta' rivelazzjoni.
         L-informazzjoni utli fuq is-sustanza tat-test sabiex jiġu definiti il-kondizzjonijiet għall-eżekuzzjoni tat-test tinkludi il-formola strutturali, il-purità tas-sustanza, dawl stabbli, stabilità fil-kondizzjonijiet ta' l-eżekuzzjoni tat-test, pKa, Pow u r-riżultati ta' test ta' bijodegradibiltà immedjata (ara metodu C.4).
         1.5.   VALIDITÀ TAT-TEST
         Biex test ikun validu dawn il-kondizzjonijiet li ġejjin għandhom japplikaw:
         
                     —
                  
                  
                     is-sopravivenza komplessiva tal-bajd fertilizzat fil-kontrolli, u fejn hu relevanti, fil-kontenituri ta' solvent biss, għandha tkun aktar jew daqs il-limiti definiti fl-Annessi 2 u 3,
                  
               
                     —
                  
                  
                     matul it-test, il-konċentrazzjoni ta' l-ossiġnu dissolt għandha tkun bejn 60 u 100 % tal-valur ta' l-arja saturata (ASV),
                  
               
                     —
                  
                  
                     it-temperatura ta' l-ilma m'għandhiex tvarja b'iktar minn ±1,5 oC bejn il-kompartamenti divesri jew bejn ġranet suċċessivi waqt il-ħin tat-test u għandha tkun fil-limitu tas-sensiliet speċifikati ta' temperaturi għall-ispeċi użati fit-test (Annessi 2 u 3).
                  
               1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.6.1.   Il-Kompartamenti tat-test
         Jista' jintuża kull tip ta' reċipjent tal-ħġieġ jew kimikament inerti. Id-dimensjonijiet tar-reċipjenti għandhom ikunu kbar biżżejjed sabiex ikunu konformi mar-rata ta' tagħbija (ara taqsima 1.7.1.2). Hu rakkomandat li l-kompartamenti tat-test ikunu pożizzjonati kif ġie ġie fil-post fejn ser isir it-test. Jekk fil-laboratorju jeżistu effetti sistematiċi kontrollabbli permezz ta' separazzjoni bi blokki, preferibilment għandu jintuża disinn sperimentali bi blokki ta' daqs irregolari fejn kull trattament ikun preżenti f'kull blokka, monflok ma jintuża disinn kompletament irregolari. Jekk jintuża il-metodu ta' għeluq, dan għandu jittieħed in konsiderazzjoni fl-analiżi sussegwenti ta' data. Il-kompartamenti tat-test għandhom ikunu imħarsa minn kwalunkwe interferenza.
         1.6.2.   Selezzjoni ta' speċi ta' ħut
         Speċi ta' ħut rakkomandat huma mniżżla f'tabella 1A. Din ma tippermettix l-użu ta' speċi oħrajn (eżempji huma mogħtija f'tabella 1B), iżda il-proċedura tat-test tista tkun adattata sabiex tipprovdi kondizzjonijiet adattati għat-test. F'dan il-każ, ir-raġuni li tiġġustifika l-għażla ta' l-ispeċi u l-metodu esperimentali għandhom ikunu magħrufa.
         1.6.3.   Trobbija tal-ħut riptoduttiv
         Dettalji fuq iż-żamma tal-ħut riproduttiv f'kondizjonijiet sodisfaċenti jinstabu f'OECD TG 210 (7) u f'referenzi (2) (3) (4) (5) (6).
         1.6.4.   Immaniġġjar ta' embrijoni u larva
         Embrijoni u larva jistgħu ikunu esposti, fil-kontenitur ewlieni, f'kontenituri iżgħar bil-ġnub jew bit-truf miksija b'xibka sabiex jippermettu ċ-ċirkolazzjoni tas-sustanza tat-test madwar il-kontenitur. Wieħed jista jasal għal ċirkolazzjoni non turbolenti f'dawn il-kontenituri iżgħar billi jdendilhom ma' brazz b'tali mod li jkunu jistgħu jiċċaqalqu 'l fuq u 'l isfel iżda xorta waħda l-organi jibqgħu mgħarrqa; tista' tiġi użata wkoll sistema bis-sufun. Bajd iffertilizzat ta' ħut salmonidu jista' jiġi sistemati fuq xkafef jew xbieki b'fetħiet kbar biżżejjed li jippermettu il-bajd jgħaddu wara it-tfaqqis. Il-pipetti tat-tip pasteur huma l-aktar adattati għat-tneħħija ta' l-embrijoni u tal-larva fit-testijiet semistatiċi b'tiġdid kuljum ta' l-ilma (ara paragrafu 1.6.6).
         Il-kontenituri, il-gradilji jew ix-xbieki li ntużaw biex iżommu l-bajd ġol-kontenitur ewlieni tat-test, għandhom jitneħħew wara li jfaqqsu l-larva (7), bl-eċċezzjoni li x-xbieki għandhom jitħallew sabiex iwaqqfu l-ħut milli jaħarbu. Jekk ikun hemmm il-bżonn li jiġu mċaqalqa il-larva, dawn m'għandhomx ikunu esposti għall-arja u m'għandhomx jintużaw xbiek biex jiġu mħarrba ħut mill-kontenituri tal-bajd (prekawzjoni bhal din tista ma tkunx neċessarja għal speċ inqas delikat bħal per eżempju il-carp). Il-ħin tat-trasferiment ivarja skond l-ispeċi u mhux dejjem ikun hemm bżonn ta' dan it-trasferiment. Għat-teknika semistatika jistgħu jintużaw buqari jew kontenituri baxxi, u jekk ikun hemm bżonn dawn ikunu armati b'xibka bħala paraventu kemm kemm 'il fuq mill-qigħ tal-buqar. Jekk il-volum ta' dawn il-kontenituri huwa biżżejjed sabiex jaqbel mal-bżonn tat-tagħbija, (ara 1.7.1.2) ma jkunx hemm bżonn ta' trasferiment ta' embrijoni u larva.
         1.6.5.   Ilma
         Kull ilma li jkun konformi mal-karatteristiċi kimiċi ta' ilma dilwit kif imniżżel f'Appendiċi 4 u ġo liema ilma l-ispeċi użata fit-test turi kapaċità ta' sopravivenza almenu daqs dik deskritta f'Appendiċi 2 u 3, huwa ilma tajjeb biex ikun użat fittest. L-ilma għandu jkun ta' kwalità kostanti matul il-perjodu tat-tets. Il-pH għandha tjinżamm fil-limitu ta' ±0,5 unità pH. Sabiex jiġi żgurat li l-ilma dilwit ma jħallix effetti mhux mixtieqa fuq ir-riżultat tat-test (per eżempju taħwid tas-sustanza), jew kuntrarjament jaffettwa il-ħut riproduttiv, għandhom jittieħdu kampjuni biex jiġu analizzati regolarment. Qisien ta' metalli tqal (per eżempju. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd u Ni), anjoni u katjoni maġġuri (eż. Ca, Mg, Na, K, Cl u SO4), pestiċidji (per eżempju pestiċidji b'organofosforu totali u organoklorin totali), karbon totalment organiku u solidi sopiżi għandhom ikunu magħmula kull tliet xhur, meta ilma tat-taħlit ikollu kwalità relattivament kostanti. Jekk il-kwalità ta' l-ilma tkun kostanti almenu għal sena, qatgħat deciżivi jistgħu jkunu anqas frekwenti u l-intervalli jistgħu jkunu anqas frekwenti (per eżempju kull sitt xhur).
         1.6.6.   Soluzzjonijiet tat-test
         Soluzzjonijet tat-test fuq il-konċentrazzjonijiet magħżula, huma preparati b'taħlit ta' soluzzjoni ewlenija.
         Din is-soluzzjoni għall-ħażna għandha tkun preparata preferibilment billi is-sustanza tat-test titħallat u titħawwad ma' l-ilma b'mezzi mekkaniċi (per eżempju tqanqil u ultrasonikazzjoni). Sabiex tiġi milħuqa soluzzjoni konċentrata ewlenija, jistgħu jintużaw kolonni saturati (kolonni solubili). Sa fejn hu possibbli għandu jiġi evitat l-użu ta' solvents jew dipersants (aġenti solubilizzanti); madankollu, ċertu komposizzjonijiet jistgħu jiġu bżonnjużi f'ċerti każi sabiex tiġi prodotta soluzzjoni konċentrata xierqa. Eżempji ta' solvents adattati huma aċetun, ethanol, metanol, dimethylformamide u triethyleneglycol. Eżempji ta' dispersants adattati huma Cremophor RH40, Tween 80, methylcellulose 0,01 % and HCO-40. Meta jintużaw aġenti li jkollhom bijo-degradibbiltà mgħaġġla (per eżempju: aċetun) jew li jevaporaw malajr, wieħed irid juża kawtela peress li dawn jistgħu jikkawżaw problemi fil-kreazzjoni ta' batterja f'testijiet b'ċirkolazzjoni kontinwa. Meta jkun użat aġent solubbli, dan m'għandux iħalli l-ebda effett sinifikanti fuq is-sopravivenza u l-anqas xi effett negattiv fuq l-istadji inizjali ta' ħajja kif juri il-kontroll li jkun solvent biss. Madankollu, għandu jsir kull sforz biex jiġi evitat l-użu ta' materjal bħal dan.
         Għat-teknika semi-statika jistgħu jintużaw żewġ proċeduri ta' tiġdid differenti; jew (i) li jiġu preparati soluzzjonijiet ġodda f'kontenituri nodfa u il-bajd ħaj u il-larva jiġu trasferiti delikatament fil-kontenituri ġodda li jkollhom fihom volum żgħir mis-soluzzjoni il-qadima, kif ukoll jiġi evitat li jiġu esposti għall-arja, jew (ii) l-oganiżmi tat-test jinżammu fil-kontenituri filwaqt li proporzjon (almenu tliet kwarti) mill-ilma tat-test jinbidel. Il-frekwenza ta' tiġdid ta' dan il-mezz ikun jiddependi fuq l-istabilità tas-sustanza ittestejata, iżda tiġdid kuljum ta' l-ilma huwa rakkomandat. Jekk minn testijiet preliminari ta' stabilità (ara sezzjoni 1.4) jirriżulta li l-konċentrazzjoni tas-sustanza ittestjata m'hijiex stabbli (jiġifieri barra mill-parametri 80-120 %, tal-konċentrazzjoni nominali jew inqas minn 80 % ta' tal-konċentrazzjoni imkejla inizjalment) waqt il-perjodu ta' tiġdid, jeħtieġ li jittieħed in-konsiderazzjoni l-użu ta' test b'ċirkolazzjoni kontinwa. Fi kwalunkwé każ jeħtieġ li jiġi evitat kull li jiġu stressjati il-larvae waqt li l-ilma jkun qed jiġġedded.
         Testijiet b'ċirkolazzjoni kontinwa jirrikjedu sistema li kontinwament tiddispensa u tħallat is-soluzzjoni inizjali (per eżempju metering pump, proportional diluter, saturator system) biex ikunu jistgħu jipprovdi serje ta' konċentrazzjonijiet fil-kompartamenti tat-test. T Ir-rati ta' ċirkolazzjoni tas-soluzzjonijiet ewlenin u ta'l-ilma għat-taħlit m'għandhomx ivarjaw b'iktar minn 10 % matul it-test. Rata ta' ċirkolazzjoni ekwivalenti almenu għall-volum ta' ħames kompartamenti tat-test għal 24 siegħa hija adattata (2).
         1.7.   PROĊEDURA
         Fil-letteratura wieħed isib infornazzjoni utli fuq il-prestazzjoni ta' testijiet fuq l-embrijuni tal-ħut kif ukoll fuq it-testijiet ta' tossiċità ta' sac-fry, b'xi eżempji jinstabu wkoll fil-biblijografija inkluża ma' dan it-test (7) (8) (9).
         1.7.1.   Kondizzjonijiet ta' l-espożizzjoni
         1.7.1.1.   Tul ta' Żmien
         Dan it-test għandu jibda preferibilment fi żmien 30 minuta wara li jkunu ġew iffertilizzati l-bajd. L-embrijoni għandhom jiġu mgħarrqa fis-soluzjoni tal-prova qabel jew eżatt wara li jkun beda l-istadju tal-qsim tal-blastodisc, imma dejjem qabel ma jkun beda l-istadju tal-gastrula. It-test ma jistax jinbeda immedjatament wara l-fertlizzazzjoni jekk il-bajd ikun ġej mingħand sorsi kummerċjali. Billi kull dewmien jista jinfluwenza serjament is-sensittività tat-test, it-test għandu jibda fi żmien tmien sigħat wara il-fertilizzazzjoni. Billi il-larva ma jingħatawx ikel waqt il-perjodu ta' espożizzjoni, it-test għandu jintemm eżatt qabel ma tkun inxtorbot il-membrana li tagħlaq ġo fiha l-isfar tal-bajd fi kwalunkwe mill-kompartamenti li qed isiru t-testijiet fihom jew qabel ma jkunu jew imutu minħabba nuqqas ta' ikel. Id-dewmien jiddependi fuq l-ispeċi li qed tkun użata. F'l-Appendiċi 2 u 3 wieħed isib xi rakkomandazzjonijiet f'dan ir-rigward.
         1.7.1.2.   Tagħbija
         In-numru ta' bajd fertilizzat għandu jkun biżżejjed sabiex jissodisfaw it-talbiet ta' l-istatistika. Dawn għandhom ikunu distribwiti kif ġie ġie fost it-trattamenti, u ghal kull konċentrazzjoni għandhom jintużaw almenu 30 bajda fertilizzata imqassmin indaqs, (jew almenu ndaqs kemm jista' jkun billi jista' jkun diffiċli li jkollok gruppi ndaqs meta tkun qed tuża ċertu speċi) bejn almenu tliet kompartamenti replika. Ir-rata ta' tagħbija (bijomassa skond il-volum tas-soluzzjoni ittestjata) għandha tkun baxxa biżżejjed b'tali mod li tippermetti li tinżamm konċentrazzjoni ta' ossiġnu dissolt ta' almenu 60 % ASV mingħajr arjazzjoni. Huwa rakkomandat li għal testijiet b'ċirkolazzjoni kontinwa, ir-rata ta' tagħbija ma taqbiżx 0,5 g/l għal 24 siegħa u ma taqbiżx 5 g/l ta' soluzzjoni fi kwalunkwé ħin (2).
         1.7.1.3.   Dawl u temperatura
         It-temperatura tal-fotoperjodu u ta' l-ilma għandha tkun waħda xierqa għall-ispeċi li qed ikunu ttestjati (Appendiċi 2 u 3). Biex tkun ikkontrollata it-temperatura ikun opportun li jintuża reċipjent tat-test miżjud.
         1.7.2.   Konċentrazzjonijiet tat-test
         Normalment huma rikjesti ħames konċentrazzjonijiet tat-test li għandhom fattur ta' differenza kostanti u li ma jaqbiżx it-3,2. Fl-għażla tas-sensiela ta' konċentrazzjonijiet tat-test wieħed għandu jieħu in-konsiderazzjoni il-kurva li tirrelata l-LC50 mal-perjodu ta' espożizzjoni fl-istudju ta' tossiċità qawwija. F'xi ċirkostanzi, bħal per eżempju f'testijiet tal-limitu, ikun aktar adattat li jintużaw inqas minn ħames konċentrazzjonijiet kif ukoll l-intervall ta' konċentrazzjonijiet ikun aktar ristrett. Trid tingħata spjegazzjoni jekk jintużaw anqas minn ħames konċentrazzjonijiet. Konċentrazzjonijiet b'sustanza għola minn LC50 f'69 siegħa jew 100mg/1, bl-ebda differneza ghal liema hija l-aktar baxxa, m'għandhomx għalfejn jiġu ttestjati. Is-sustanzi m'għandhomx ikunu ittestjati fl-ilma tat-test 'il fuq mil-limitu ta' solubilità tagħhom.
         Meta aġent solubilizzanti ikun użat biex jgħin fil-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet għat-test (ara sezzjoni 1.6.6), il-koċentrazzjoni finali fir-reċipjenti tat-test m'għandhomx ikunu aktar minn 0,1 ml/l u għandu jkun l-istess fir-reċipjenti kollha.
         1.7.3.   Kontrolli
         Aparti il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza ittestjata, irid jiġi ippreparat ukoll kontroll bl-ilma għat-taħlit (ripetuta skond il-bżonn) u eventwalment kontroll ukoll bl-ilma li fih l-aġent solubilizzanti (ripetut skond il-bżonn).
         1.7.4.   Frekwenza tad-determinazzjonijiet u qisien analitiċi
         Waqt it-test, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza huma determinati f'intervalli regolari.
         Huwa rakkomandat li f'testijiet semi-statiċi, il-konċentrazzjoni tat-test, li mistennija tibqa' fl-iskala ta' ± 20 % tal-valur nominali, (i.e. bejn 80-120 %; ara sezzjoni 1.4 u 1.6.6), l-għola u l-inqas konċentrazzjonijiet tat-test, ikunu analizzati meta jkunu għadhom kif ġew preparati u immedjatament qabel it-tibdil ta' l-ilma almenu tliet darbiet imqassmin tul il-perjodu tat-test (i.e. l-analiżi għandhom jiġu effettwati fuq kampjun ta' l-istess soluzzjoni li tkun għadha kemm ġiet ippreparata u wara fil-mument li ser tkun ħa tinbidel).
         Huwa neċessarju li fil-każi ta' testijiet fejn il-konċentrazzjoni tas-sustanza li qed tiġi ittestjata m'hix mistennija li tibqa fil-limitu ta' ± 20 % tal-valur nominali (fuq il-bażi ta' data fuq l-iatbilità tas-sustanza) jiġu analizzati il-konċentrazzjonijiet kollha tat-test, eżatt meta jkunu għadhom kif ġew preparati u kif ikunu qed jinbidlu, iżda tinżamm l-istess skema (i.e. fi tliet okkażjonijiet imqassma mat-test kollu). Id-determinazzjoni tas-sustanza ittestjata qabel it-tiġdid tas-soluzzjoni, għandha ssir fuq replika tar-reċipjent għal kull konċentrazzjoni tat-test. L-intervalli ta' bejn id-determinazzjonijiet ma jridux ikunu aktar minn sebat ijiem. Huwa rakkomandat li ir-riżultati ikunu ibbażati fuq konċentrazzjonijiet imkejla. Madankollu, jekk ikun hemm evidenza li turi li l-konċentrazzjoni tas-sustanza ittestjata fis-soluzzjoni hi fil-limitu ta' ± 20 % tal-konċentrazzjoni nominali jew tal-konċentrazzjoni mkejla inizjalment matul it-test, allura ir-riżultati jistgħu ikunu bażati fuq valuri nominali jew fuq valuri imkejla inizjalment.
         Għal testijiet b'ċirkolazzjoni kontinwa, l-użu ta' reġim ta' kampjuni simili għal dak deskritt għal testijiet semistatiċi hu adattat (iżda f'dan il-każ, il-qisien ta' soluzzjonijiet antiki ma japplikawx). Madankollu, jekk it-test idum aktar minn sebat ijiem, huwa rakkomandat li jiżdiedu l-okkażjonijiet meta jittieħdu kampjuni (eż. tliet settijiet ta' qisien) biex tkun żgurata l-istabilità tal-konċentrazzjonijiet ittestjati.
         Jista' jagħti l-każ li il-kampjuni jkollhom bżonn li jiġu separati jew iffiltrati (Eż. billi jintużaw pori ta' daqs 0,45 im). Madankollu, billi la s-separazzjoni u l-anqas il-filtrazzjoni ma jidher li dejjem jisseparaw il-frazzjoni non bijodisponibbli tat-test minn dik bijodisponibbli, il-kampjuni jistgħu ma jiġux suġġetti għal dawk it-trattamenti.
         Waqt it-test, l-ossiġnu dissolt, il-pH u it-temperatura, għandhom jiġu mkejla f'kull reċipjent tat-test. L-ebusija kif ukoll is-salinità (jekk relevanti) totali, għandhom jitkejlu fil-kontrolli u f'reċipjent wieħed li jkollu l-ogħla konċentrazzjoni. L-ossiġnu u is-salinità (jekk relevanti), għandhom jitkejlu minimament tliet darbiet (fil-bidu, fin-nofs u fl-aħħar tat-test). Huwa rakkomandat, li f'testijiet semi-statiċi, l-ossiġnu dissolt jiġi mkejjel aktar spiss, preferibiliment qabel u wara kull tiġdid ta' l-ilma, jew almenu darba fil-ġimgħa. Il-pH, f'testijiet semi-statiċi, għandha tiġi mkejla fil-bidu u fl-aħħar ta' kull tiġdid ta' l-ilma u ta' l-inqas darba fil-ġimgħa fil-każ ta' testijiet b'ċirkolazzjoni kontinwa. L-ebusija għandha tkun imkejla darba f'kull test. It-temperatura għandha titkejjel kuljum u preferibilment għandha tkun osservata kontinwament almenu f'kompartament wieħed tat-test.
         1.7.5.   Osservazzjonijiet
         1.7.5.1.   Stadju ta' żvilupp embrijoniku
         L-istadju embrijoniku (i.e. embriju fl-ewwel stadju ta' żvilupp) fil-bidu ta' l-espożizzjoni tas-sustanza ittestjata, għandu jkun verifikat kemm jista' jkun bi preċiżjoni. Dan jista' jsir billi jintuża kampjun rappreżentattiv tal-bajd li jkun preżervat u separat kif jixraq. Għal deskrizzjoni u xbiehat ta' l-istadji embrijoniċi wieħed jista' jirreferi għall-letteratura (2) (5) (10) (11).
         1.7.5.2.   Tfaqqis u sopravvivenza.
         Ta' l-inqas darba kuljum, għandhom isiru oservazzjonijiet, kif ukoll jiġu dokumentati ċ-ċifri tat-tfaqqis u tas-sopravivenza. Jista' jagħti l-każ li jkunu jridu jsiru osservazzjonijiet aktar frekwenti fil-bidu tat-test (eż. kull 30 minuta matul l-ewwel tliet sigħat) billi f'ċerti każi dawn jista' jkollom aktar relevanza milli n-numru ta' mwiet biss (eż. meta hemm effetti tossiċi qawwijin). Embirijoni u larva mejta għandhom jitneħħew hekk kif jiġu innutati billi dawn jitħassru malajr. Wieħed għandu joqgħod ferm attent meta jkunu qed jitneħħew individwi mejta li ma jitlaqqgħux jew issir xi ħsara lill-bajd/larva ta' ħdejhom billi dawn huma delikati ħafna. Ir-raġunijiet tal-mewt ivarjaw skond f'liema stadju ta' ħajja jkunu:
         
                     —
                  
                  
                     għal bajd: partikolarment fl-istadji tal-bidu, nuqqas notevoli ta' trasluċidità u bidla fil-kulur, kawża ta' koagulazzjoni li twassal għal dehra bajda mċajpra,
                  
               
                     —
                  
                  
                     għal embrijoni: nuqqas ta' ċaqliq tal-ġisem u/jew nuqqas ta' taħbit tal-qalb u/jew tidnis imċajpar tal-kulur fi speċi li l-embrijoni tagħhom huma normalment trasparenti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     għal larva: immobilità u/jew nuqqas ta' movement respiratorju u/jew nuqqas ta' taħbit tal-qalb u/jew is-sistema ta' nervituri ċentrali ssir ta' kulur abjad imċajpar u/jew nuqqas ta' reazzjoni fl-istimolu mekkaniku.
                  
               1.7.5.3.   Aspett anormali
         In-numru ta' larva li juru anormalitajiet fil-forom tal-ġisem u/jew pigmentazzjoni, u l-istadju ta' assorbiment tal-membrana li tagħlaq ġo fiha l-isfar ta' bajda, għandhom ikunu dokumentati f'inetrvalli adekwati skond it-tul tat-test kif ukoll in-natura ta' l-anormalità deskritta. Ta' min jinnota li embrijoni u larva anormali huma fenomenu naturali u fil-kontroll(i) ta' xi speċi jsitgħu jlaħħqu ħafna punti perċentwali. Annimali anormali għandhom jitneħħew mir-reċipjenti tat-test, meta jmutu biss.
         1.7.5.4.   Imġieba anormali
         Anormalitajiet, bħal per eżempju teħid tan-nifs mgħaġġel ħafna, għawm mhux koordinat, u inattività atipiku għandhom jiġu dokumentati f'intervalli adekwati skond it-tul tat-test. Dwan l-effetti, għalkemm diffiċli biex jiġu kwanitifikati, meta jkun osservati, jistgħu jgħinu fl-interpretazzjoni ta' l-informazzjoni fuq l-imwiet, jiġifieri, jipprovdu informazzjoni fuq il-mod ta' azzjoni tossika tas-sustanza.
         1.7.5.5.   Tul
         Fi tmiem it-test, huwa rakkomandat li jitkejlu it-tulijiet ta' kull individwu u jistgħu jintużaw qisien standard, mifrudin jew tat-tul totali. Madankollu, jekk il-ġewnaħ tad-denb titħassar jew titħaffer, għandhom jintużaw qisien standard. Ġeneralment, f'testijiet immexxija tajjeb, il-koeffiċjent tal-varjazzjoni fit-tul fost ir-repliki fil-kontrolli għandu jkun ≤ 20 %.
         1.7.5.6.   Piż
         Fl-aħħar tat-test, jistgħu jitkejlu il-piżijiet individwali; il-piżijiet xotti (24 siegħa f60 oC) huma preferuti minn dawk umdużi (wara li jkunu ġew ixxuttati). Ġeneralment, ftestijiet immexxija tajjeb, il-ko-effiċjent tal-varjazzjoni fil-piż fost ir-repliki fil-kontrolli għandu jkun ≤ 20 %.
         Dawn l-osservazzjonijiet iwasslu sabiex l-informazzjoni mogħtija hawn tkun għad-dispożizzjoni ta' statistika analitika:
         
                     —
                  
                  
                     mwiet kumulattiv,
                  
               
                     —
                  
                  
                     numru ta' larva b'saħħita fl-aħħar tat-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ħin biex jibda u jispiċċa it-tfaqqis (i.e. 90 % ta' tfaqqis fir-repliki),
                  
               
                     —
                  
                  
                     numru ta' larva li jfaqqsu kuljum,
                  
               
                     —
                  
                  
                     tul (u qies) ta' annimali li baqgħu ħajjin fi tmiem it-test,
                  
               
                     —
                  
                  
                     numru ta' larva li huma deformati jew b'apparenza anormali,
                  
               
                     —
                  
                  
                     numru ta' larva li qed juru imġieba anormali.
                  
               2.   DATA U RAPPURTAĠĠ
         2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         Huwa rakkomandat li l-istatistiku jkun involut kemm fid-disinn kif ukoll fl-analiżi tat-test billi il-metodu jħalli lok għal varjazzjoni konsiderevoli fl-esperiment fid-disinn, per eżempju fin-numru ta' kompartamenti tat-test, fin-numru ta' konċentrazzjonijiet tat-test, in-numru ta' bajd fertilizzat li ser jibda bih u fil-parametri mkejla. Fid-dawl ta' dawn l-alternativi fid-disinn tat-test, gwisda speċifika fuq il-proċeduri statistiċ i m'humiex mogħtija hawn.
         Jekk ser jiġu kalkolati l-LOEC/NOEC allura jkun hemm bżonn li l-varjazzjonijiet jiġu analizzati f'kull sett ta' repliki billi tintuża l-analiżi tal-varjazzjoni (ANOVA) jew proċeduri ta' tabelli kontinġenti. Il-metodu ta' Dunnett jista' jkun utli (12) (13) sabiex isir tqabbil bejn ir-riżultati f'konċentrazzjonijiet individwali u r-riżultati fil-kontrolli. Huma wkoll disponibbli eżempji oħra utli (14) (15). Id-daqs ta' l-effett li jiġi identifikat meta jintuża l-metodu u proċeduri oħra, (i.e. il-qawwa tat-test) għandu jkun kalkolat u dokumentat. Għandu jkun innutat li mhux kull osservazzjoni mniżżla f'taqsima 1.7.5.6 hija adattata għal analiżi ta' statsitika bil-metodu ANOVA. Per eżempju, mwiet kumulattiv u n-numru ta' larva b'saħħitha fit-tmiem tat-test, jistgħu jiġu analizzati b'metodi ta' probit.
         Jekk se jkunu kalkolati LC/ECxs, iridu jkunu mdaħħla fid-data kurva(i) adattata(i) bħall-kurva loġistika, billi jintuża metodu statistiku bħal kaxxi minimi jew kaxxi minimi li mhux linejari. Il-kurva(i) għandha(hom) tkun(u) mqieghda f'parametri sabiex l-LC/ECx interessata u l-iżball standard tagħha jista' jkun kalkolat direttament. Dan iħaffef ħafn aktar il-kalkoli tal-limiti ta' kunfidenza madwar l-LC/ECx. Sakemm ma jkunx hemm motivi sabiex jiġu preferiti livelli affidabbli differenti, għandha tiġi kwotata 95 % ta' kunfidenza b'żewġ livelli. Preferibilmet, il-proċedura ta' adattament għandha tipprovdi mezz biex jiġi valutat is-sinifikat tan-nuqqas ta' addattament. Jistgħu jintużaw metodi grafiċi għal kurvi xierqa. Analiżi rigressiva hi adattata għall-osservazzjonijiet kollha mniżżla f'taqsima 1.7.5.6.
         2.2.   INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Ir-riżultati għandhom ikunu trattati b'kawtela fil-każijiet ta' meta fis-soluzzjonijiet tat-test jitkejlu konċentrazzjonijiet ta' sustanzi tossiċi fil-limitu ta' osservazzjoni tal-metodu analitiku. L-interpretazzjoni tar-riżultati ta' koċentrazzjonijiet 'il fuq mil-livell ta' solubilità tas-sustanza, għandha ssir b'kawtela wkoll.
         2.3.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi din l-informazzjoni:
         2.3.1.   Sustanza tat-test:
         
                     —
                  
                  
                     in-natura fiżika u l-karatteristiċi fiżiċi relevant ital-kimika,
                  
               
                     —
                  
                  
                     fejn relevanti, l-identifikazzjoni kimika tad-data, inklużi l-purità u l- metodu analitiku għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza ttestjata.
                  
               2.3.2.   Speċi ittestjati:
         
                     —
                  
                  
                     l-isem xjentifiku, il-purità, in-numru ta' ħut riproduttiv (jiġifieri kemm intużaw speċi femminili biex ġew prodotti in-numru ta' bajd fertilizzat li ġie użat fit-test), minn fejn oriġinaw u l-metodu ta' kollezzjoni tal-bajd fertilizzat u manipulazzjoni suċċessiva.
                  
               2.3.3.   Kondizzjonijiet tat-test:
         
                     —
                  
                  
                     proċedura użata fit-test (eż. semistatika jew b'ċirkolazzjoni kontinwa, perjodu ta' ħin mill-fertilizzazzjoni sal-bidu tat-test, manipulazzjoni, eċċ),
                  
               
                     —
                  
                  
                     fotoperjodu(i),
                  
               
                     —
                  
                  
                     disinn tat-test (eż. numru ta' kompartamenti tat-test u repliki tagħhom, numru ta' embrijoni replikati),
                  
               
                     —
                  
                  
                     metodu ta' preparazzjoni ta' soluzzjonijiet ta' ħażna u l-frekwenza ta' tiġdid (l-aġent solubilizzanti u l-konċentrazzjonijiet tiegħu għandhom jingħataw meta jiġu użati),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjonijiet nominali tat-test, il-valuri mkejla kif ukoll il-medja u d-devjazzjonijiet standard tagħhom fir-reċipjenti tat-test u l-metodu ta' kif dawn jintlaħqu u jekk is-sustanza ttestjata tinħallx fl-ilma b'konċentrazzjonijiet inqas minn dawk ittsetjati, għandhom jiġu provduti sabiex il-qisien jirreferu għall-konċentrazzjonijiet tas-sustanza ttestjata fis-soluzzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     karatteristiċi ta' l-ilma mħallat: p pH, solidità, temperatura, konċentrazzjoni ta' ossiġnu dissolt, livelli ta' klorin residwu (jekk ġie mkejjel) karbon organiku totali, suspended solids, salinità tal-mezz ittestjat (jekk ġie mkejjel) u kwalunkwe qies ieħor,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwalità ta' l-ilma fil-reċipjenti tat-test: pH, solidità, temperatura u konċentrazzjoni ta' ossiġnu maħlul.
                  
               2.3.4.   Riżultati:
         
                     —
                  
                  
                     riżultati minn studji preliminary fuq l-istabilità tas-sustanza ittestjata,
                  
               
                     —
                  
                  
                     xiehda li l-kontrolli jikkorrispondu ma' l-istandard ta' sopravivenza aċċettabbli ta' l-ispeċi ittestjati (Appendiċi 2 u 3),
                  
               
                     —
                  
                  
                     data fuq mortalità/sopravivenza fl-istadju ta' embrijun u larva kif ukoll mortalità u sopravivenza komplessiva,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ġranet biex ifaqqsu u kwantità
                  
               
                     —
                  
                  
                     ġranet biex ifaqqsu u kemm faqqsu – data għal tul (u piż),
                  
               
                     —
                  
                  
                     incidenza u deskrizzjoni ta' anormalitajiet morfoloġiċi, jekk jeżistu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     incidenza u deskrizzjoni ta' effetti ta' mġieba, jekk jeżistu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     analiżi statistika u trattament tad-data,
                  
               
                     —
                  
                  
                     għal testijiet li użaw l-ANOVA, l-inqas konċentrazzjoni b'effetti sinjifikanti (LOEC) F'P=0,05 f' konċentrazzjoni massima mingħajr effetti sinjifikattivi (NOEC) għal kull risposta analizzata, inkluż deskrizzjoni tal-proċeduri statistiċi utilizzati u indikazzjoni ta' l-entità ta' l-effett li seta' ġie individwat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     għal testijiet li użaw it-teknika rigressiva, l-LC/ECx u intervalli ta' kunfidenza u deskrizzjoni grafika tal-mudell użat għall-kalkolazzjoni tiegħu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     spjegazzjoni għal kull devjazzjoni minn dan il-metodu ta' ittestjar.
                  
               3.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Comunities, 60 pp. June 1990.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 pp.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Brungs W. A. and Jones B. R. (1977). it-temperatura Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature review. J. Biol. 10, pp. 121-173.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, pp. 328-330.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemistry, 6, pp. 61-71.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp. 807-821.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986). Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, pp. 129-145.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 pp.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist.. Assoc., 50, pp. 1096-1121.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp. 321-334.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Environment Canada. (1992). Toxicity Test Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon jew Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, 81 pp.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 21, pp. 126-134.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: pp. 231-236.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F. and Roubaud P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Environmental Safety 32, pp. 19-28.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, pp. 1189-1203.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.
                  
               
                  
                     (24)
                  
                  
                     Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 pp.
                  
               
                  
                     (25)
                  
                  
                     Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, pp. 1-58.
                  
               Tabella 1A
         Speċi ta' ħut rakkomandat għat-test
         
                     Ilma Ħelu
                  
               
                     
                        Oncorhynchus mykiss
                     
                     Rainbow trout (9)(16)
                  
               
                     
                        Danio rerio
                     
                     Zebrafish (7)(17)(18)
                  
               
                     
                        Cyprinus caprio
                     
                     Karpjun komuni (8)(19)
                  
               
                     
                        Oryzias latipes
                     
                     Japanese ricefish/Medaka (20)(21)
                  
               
                     
                        Pimephales promelas
                     
                     Fathead minnow (8)(22)
                  
               
            
         Tabella 1B
         Eżempji ta' speċi oħra dokumentati tajjeb li ġew użati
         
                     Ilma Ħelu
                  
                  
                     Ilma Mielaħ
                  
               
                     
                        Carassius auratus
                     
                     Goldfish (8)
                  
                  
                     
                        Menidia peninsulae
                     
                     Tidewater silverside (23)(24)(25)
                  
               
                     
                        Lepomis macrochirus
                     
                     Bluegill (8)
                  
                  
                     
                        Clupea harengus
                     
                     Herring (24)(25)
                  
               
                     
                        Gadus morhua
                     
                     Merluzz (24)(25)
                  
               
                     
                        Cyprinodon variegatus
                     
                     Sheepshead minnow (23)(24)(25)
                  
               
            ANNESS 1
            GWIDA FUQ IL-PRESTAZZJONI TA' TEST TA' TOSSIĊITÀ FUQ EMBRIJONI U SAC-FRY TA' ZEBRAFISH (BRACHYDANIO RERIO)
            DAĦLA
            Iż-zebrafish toriġina mill-kosta ta' Coromandel fl-Indja fejn tgħix fi xmajjar b'kurrent mgħaġġel ta' ilma. Hija ħuta komuni ta' l-akwarju li tappartjeni għall-familja tal-carp, u informazzjoni dwar il-proċeduri għal ħarsien u l-kultura tagħha tista' tinstab f'kotba standard dwar ħut tropikali. Il-bijoloġija u l-użu tagħha għal riċerka ta' sajd kienu riveduti minn Laale (1).
            Il-ħuta rari tkun itwal minn 45 mm. Il-ġisem hu ta' forma ċilindrika b' 7-9 strixxi orizzontali ta' lewn blu skur arġentat. Dawn l-istrixxi jkopru l-ġwienaħ tal-ġenb u ta' wara. Id-dahar huwa ta' lewn aħdar kulur iż-żebbuġa. L-irġiel huma rqaq min-nisa. In-nisa ileqqu aktar u żaqqhom hi aktar mitluqa partikolarment qabel ma jbidu.
            Il-ħut adult hu kapaċi jittollera varjazzjonijiet kbar fit-temperatura, pH u ebusija. Madankollu, għandhom ikunu provduti kondizzjonijiet ottimali biex ikun hemm ħut f'saħħtu li jipproduċi bajd ta' kwalità.
            Waqt li l-mara tkun qed tbid, ir-raġel jiġri warajha u jtiha bir-ras, u l-bajd ikun fertilizzat hekk kif ikun ħiereġ. Il-bajd, li hu trasparenti u ma jwaħħalx, jaqgħu fil-qigħ fejn jistgħu jiġu mittiekla mill-ġenituri stess. Il-proċess ta' meta l-ħuta tbejjed jiġi influwenzat mid-dawl. Jekk id-dawl ta' filgħodu jkun adattat, il-ħut ġeneralment ibejjed fis-sigħat bikrin ta' wara s-sebħ.
            Ta' kull ġimgħa, mara tista' tipproduċi lottijiet ta' diversi mijiet ta' bajd.
            KONDIZZJONIJIET TA' ĦUT RIPRODUTTIV, RIPRODUZZJONI U STADJI TAL-BIDU TAL-ĦAJJA
            Agħżel numru adegwat ta' ħut f'saħħtu u żommhom f'ilma adattat (eż. Appendiċi 4) almenu għal ġimgħatejn qabel it-tqegħid ta' bajd proġettat. Il-grupp ta' ħut għandu jitħalla jirriproduċi ta' l-anqas darba qabel ma jipproduċu il-lott ta' bajd użat fit-test. Id-densità ta' ħut f'dan il-perjodu ma jridx ikun aktar minn gramma ta' ħut għal kull litru. Tibdil regolari ta' l-ilma jew l-użu ta' sistemi ta' purifikazzjoni jippermettu li din id-densità tkun ogħla. It-temperatura fit-tankijiet li qed jinżammu fihom għandha tinżamm sa 25 ± 2 oC. Il-ħut għandu jkollu dieta varjata, li tista' tikkonsisti minn per eżempju ikel kummerċjali niexef, Arthemia mfaqqsa friska, chironomids, Daphnia, dud abjad (Enchytraeids).
            Żewġ proċeduri li fil-prattika wasslu għal-lott suffiċjenti ta' bajd f'saħħtu u fertiliizzat sabiex ikun kondott test huma spjegati hawn taħt:
            
                         
                     
                     
                        Tmien nisa u 16-il raġel huma mitfugħa f'tank l-i fih 50 litru ta' ilma għat-taħlit, protett minn dawl dirett u mitluqa kemm jista jkun mingħajr ma jiġu disturbati għal almenu 48 siegħa. Tilar biex fih isir it-tqegħid ta' bajd huwa mqiegħed fil-qigħ ta' l-akwarju wara nofsinhar fil-ġurnata ta' qabel jibda t-test. Dan it-tilar jikkonsisti fi gwarniċ (ħġieġ plexi jekk materjal adattat ieħor), għoli 5-7 ċm u b'xibka ħarxa ta' 2-5 mm mwaħħla ma' fuq u xibka fina ta' 10-30 μm mal-qiegħ. Max-xibka l-ħarxa nsibu diversi “siġar tat-tqegħid ta' bajd”, magħmulin minn ħabel tan-najlon maħlul. Wara li l-ħut ikunu tħallew fid-dlam għal 12-il siegħa, jinxtegħel dawl baxx biex jingħata bidu għat-tqegħid ta' bajd. 2-4 sigħat wara it-tqegħid ta' bajd, it-tilar li fih ibidu jitneħħa u jinġabru l-bajd. Dan it-tilar iċaħħad il-ħut milli jieklu l-bajd u jiffaċilita wkoll il-ġbir tal-bajd. Il-grupp ta' ħut għandhom ikunu biedu ta' l-inqas darba qabel it-tqegħid ta' bajd li jintuża fit-test.
                     
                  
                         
                     
                     
                        5-10 ħutiet maskili u femminili huma mqiegħda individwalment ta' l-inqas ġimgħatejn qabel it-tqegħid ta' bajd. Wara 5-10 ijiem, iż-żaqq tan-nisa tkun tidher mitluqa u il-papillae ġenitali tagħhom ikunu viżibbli. Ħut maskili m'għandhomx papillae. It-tqegħid ta' bajd isir f'tankijiet apposta armati b'xibka falza fil-qiegħ (kif deskritt hawn fuq). It-tank hu mimli b'ilma għat-taħlit, sabiex il-fond ta' l-ilma ‘il fuq mix-xibka jkun ta' 5-10 ċm. Mara waħda u żewġt irġiel huma mqiegħda fit-tank ġurnata qabel it-tqegħid pjanat. It-temperatura ta' l-ilma tiżdied gradwalment bi grad wieħed għola mit-temperatura akklimatizzanti. Id-dawl jintefa u possibilment it-tank jitħalla mingħajr ma jkun disturbat kemm jista' jkun. Filgħodu jinxtegħel dawl baxx sabiex jinbed it-tqegħid ta' bajd. Sa 2-4 sigħat wara il-ħut jitneħħa u l-bajd jinġabar. Jekk ikun hemm bżonn ta' lottijiet ikbar ta' bajd minn dak l-ammont li tista' tipproduċi mara waħda, allura jistgħu jiġu preparati numru suffiċjenti ta' tankijiet għat-tqegħid ta' bajd fl-istess ħin. Meta is-suċċess tar-riproduzzjoni ta' nisa individwali qabel it-test (daqs tal-lott u l-kwalità)jiġi dokumentat, dawk in-nisa bl-għola rata ta' suċċess riproduttiv, jistgħu ikunu magħżula għar-riproduzzjoni.
                     
                  Il-bajd għandhom ikunu trasferiti għal ġor-reċipjenti tat-test permezz ta' tubi tal-ħġieġ (id-dijametru minn ġewwa m'għandux ikun inqas minn 4mm) fornuti bi flexible suction bulb. L-ammont ta' ilma li fih jitpoġġew il-bajd biex jiġu trasferiti għandu jkun minimu kemm jista' jkun. Il-bajd huma itqal mill-ilma u jistgħu joħorġu minn ġot-tubi. Għandha tingħata attenzjoni sabiex jiġi evitat li l-bajd (u l-larva) jiġu f'kuntatt ma' l-arja. Għandu jsir eżami mikroskopiku tal-kampjun(i) tal-lott(ijiet) sabiex jiġi żgurat li m'hemm l-ebda irregolarità fl-ewwel stadji ta' l-iżvilupp. Diżinfezzjoni tal-bajd mhux permess.
            Ir-rata ta' mwiet fost il-bajd tkun l-ogħla fl-ewwel 24 siegħa wara l-fertilizzazzjoni. Mortalità ta' 5-40 % hi normali f'dan il-perjodu. Il-bajd jiddeġenera bħala riżultat ta' falliment fil-fertilizzazzjoni jew fl-iżvilupp. Il-kwalità tal-lott jiddependi fuq il-ħut nisa billi certu nisa jipproduċu bajd ta' kwalità tajba filwaqt li oħrajn qatt ma jipproduċu bajd ta' kwalità. Anke ir-rata ta' żvilupp u r-rata ta' tfaqqis tvarja minn lott għall-ieħor. Il-bajd fertilizzat b'suċċess u l-membrana li tagħlaq ġo fiha l-isfar tal-bajd jgħixu sew, normalment ‘il fuq minn 90 %. F'25 oC il-bajd ifaqqas 3-5 ijiem wara l-fertilizzazzjoni u l-membrana li tagħlaq ġo fiha l-isfar tal-bajd tkun assorbita bejn wieħed u ieħor 13-il ġurnata wara l-fertilizzazzjoni.
            L-iżvilupp embrijoniku kien definit tajjeb minn Hisaoka u Battle (2). Minħabba it-trasparenza tal-bajd u tal-larva wara it-tfaqqis, jista' jiġri li l-iżvilupp tal-ħut ikun segwit minn preżenza ta' malformazzjonijiet. Bejn wieħed u ieħor erba' sigħat wara it-tqegħid ta' bajd, il-bajd mhux fertilizzat ikun jingħaraf minn dak fertilizzat (3). Għal dan l-eżami, il-bajd u l-larva jitpoġġew f'kompartamenti b'volum baxx u studjati taħt mikroskopju.
            Il-kondizzjonijiet tat-test, li japplikaw għall-istadji ta' bidu tal-ħajja huma mniżżla f'Appendiċi 2. Valuri ottimali tal-pH u ta' l-ebusija ta' l-ilma tat-taħlit huma 7,8 u 250 mg CaCO3/l rispettivament.
            KALKOLAZZJONIJIET U STATISTIKA
            Hu propost metodu b'żewġ stadji. L-ewwel, id-data fuq il-mortalità, żvilupp anormali u l-ħin tat-tfaqqis huma analizzati statistikament. Wara, it-tul tal-ġisem ta' dawk il-konċentrazzjonijiet f'liema ma kien hemm l-ebda effett kuntrarju fuq l-ebda minn dawn il-parametri, hu evalwat statistikament. Dan l-approċċ huwa rakkomandat billi it-tossikant jista' joqtol ħut iżgħar, itawwal il-ħin għat-tfaqqis u jwassal għal malformazzjonijiet kbar u sussegwentement jinfluwenza il-kejl ta' tul. F Barra minn dan, ser ikun hemm bejn wieħed u ieħor l-istess ammont ta' ħut biex ikunu mkejla għal kull trattament, sabiex tiġi assigurata il-validità ta' l-istatistika tat-test.
            DETERMINAZZJONIJIET TA' L-LC50 U EC50
            
            Il-persentaġġ ta' bajd u larva sopraviventi huwa kalkolat u tiġi koreġuta abbażi tal-mortalità fil-kontrolli skond il-formola ta' Abbott (4):
            
               
            billi,
            
                        P
                     
                     
                        =
                     
                     
                        % ta' sopravivenza korretta
                     
                  
                        P'
                     
                     
                        =
                     
                     
                        % ta' sopravivenza osservata fil-konċentrazzjoni tat-test
                     
                  
                        C
                     
                     
                        =
                     
                     
                        % sopravivenza fil-kontroll
                     
                  Jekk hu possibbli, l-LC50 tiġi determinata b'metodu adattat fi tmiem it-test.
            Jekk hi mixtieqa l-inklużjoni ta' anormalitajiet morfoloġiċi fl-istatistika ta' l-EC5O , wieħed jista' jsib gwida għal dan fi Stephan (5).
            STIMA TA' LOEC U NOEC
            L-għan tat-test fuq il-bajd u s-sac-fry huwa li jqabbel konċentrazzjonijiet diversi miz-zero mal-kontroll, u allura jiġi determinat l-LOEC. Għalhekk għandhom jiġu utilizzati diversi proċeduri ta' tqabbil (6) (7) (8) (9) (10).
            REFERENZI
            
                     
                        (1)
                     
                     
                        Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, pp. 121-173.
                     
                  
                     
                        (2)
                     
                     
                        Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 pp.
                     
                  
                     
                        (3)
                     
                     
                        Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 2, pp. 173-181.
                     
                  
                     
                        (4)
                     
                     
                        Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, pp. 1-333.
                     
                  
                     
                        (5)
                     
                     
                        Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, pp. 69-81.
                     
                  
                     
                        (6)
                     
                     
                        Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statis. Assoc., 50, pp. 1096-1121.
                     
                  
                     
                        (7)
                     
                     
                        Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.
                     
                  
                     
                        (8)
                     
                     
                        Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, pp. 103-117.
                     
                  
                     
                        (9)
                     
                     
                        Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519-531.
                     
                  
                     
                        (10)
                     
                     
                        Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.
                     
                  
         
            ANNESS 2
            KONDIZZJONIJIET TAT-TEST, DEWMIEN U KRITERJI TA' SOPRAVIVENZA GĦAL SPEĊI RAKKOMANDATI
            
                        Speċi
                     
                     
                        Temp
                        (oC)
                     
                     
                        Salinità
                        (0/00)
                     
                     
                        Fotoper jod
                        (sigħat) (hrs)
                     
                     
                        Dewmien fl-istadji
                        (ġranet)
                     
                     
                        Dewmien tipiku tat-test
                     
                     
                        Sopravivenza tal-Kontroll
                        ( % minimu)
                     
                  
                        embrijo
                     
                     
                        Sac-fry
                     
                     
                        Suċċess fit-tfaqqis
                     
                     
                        Perjodu ta' wara t-tfaqqis
                     
                  
                        ILMA ĦELU
                     
                  
                        
                           Brachydanio rerio
                        
                        Zebrafish
                     
                     
                        25 ± 1
                     
                     
                        —
                     
                     
                        12 – 16
                     
                     
                        3 – 5
                     
                     
                        8 – 10
                     
                     
                        Appena wara l-fertilizzazzjoni (fil-bidu ta' l-istadju tal-gastrula) sa ħamest ijiem wara it-tfaqqis (8-10 ijiem)
                     
                     
                        80
                     
                     
                        90
                     
                  
                        
                           Oncorhynchus mykiss
                        
                        Rainbow trout
                     
                     
                        10 ± 1 (8)
                        
                        12 ±1 (9)
                        
                     
                     
                        —
                     
                     
                        0 (1)
                        
                     
                     
                        30 – 35
                     
                     
                        25 – 30
                     
                     
                        Appena possibbli wara il-fertilizzazzjoni (fil-bidu ta' l-istadju tal-gastrula) sa 20 ġurnata wara t-tfaqqis (50-55 ġurnata)
                     
                     
                        66
                     
                     
                        70
                     
                  
                        
                           Cyprinus carpio
                        
                        Karpjun komuni
                     
                     
                        21 – 25
                     
                     
                        —
                     
                     
                        12 – 16
                     
                     
                        5
                     
                     
                        > 4
                     
                     
                        Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni (kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 4 ijiem wara it-tfaqqis (8-9 ġranet)
                     
                     
                        80
                     
                     
                        75
                     
                  
                        
                           Oryzias latipes
                        
                        Japanese ricefish/Medaka
                     
                     
                        24 ± 1 (8)
                        
                        23 ± 1 (9)
                        
                     
                     
                        —
                     
                     
                        12 – 16
                     
                     
                        8 – 11
                     
                     
                        4 – 8
                     
                     
                        Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni (kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 5 ijiem wara it-tfaqqis (13-16-il ġurnata)
                     
                     
                        80
                     
                     
                        80
                     
                  
                        
                           Pimephales promelas
                        
                        Fathead minnow
                     
                     
                        25 ± 2
                     
                     
                        —
                     
                     
                        16
                     
                     
                        4 – 5
                     
                     
                        5
                     
                     
                        Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni (kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 4 ijiem wara it-tfaqqis (8-9 ġranet)
                     
                     
                        60
                     
                     
                        70
                     
                  
         
            ANNESS 3
            Kondizzjonijiet tat-test, dewmien u kriterji għal sopravivenza ta' speċi oħra dokumentati tajjeb
            
                        Speċi
                     
                     
                        TEMP (0C)
                     
                     
                        Salinità (0/00)
                     
                     
                        Fotoperjod (sigħat) (hrs)
                     
                     
                        Dewmien fl-istadji (ġranet)
                     
                     
                        Dewmien tipiku tat-test
                     
                     
                        Sopravivenza tal-Kontroll ( % minimu)
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        embrijo
                     
                     
                        SAC-FRY TEST
                     
                     
                        Suċċess tat-tfaqqis
                     
                     
                        Wara t-tfaqqis
                     
                  
                        ILMA ĦELU
                     
                  
                        
                           Carassius auratus
                        
                        Goldfish
                     
                     
                        24 ± 1
                     
                     
                        —
                     
                     
                        —
                     
                     
                        3 – 4
                     
                     
                        > 4
                     
                     
                        Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni (kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 4 ijiem wara it-tfaqqis (7 ġranet)
                     
                     
                        —
                     
                     
                        80
                     
                  
                        
                           Leopomis macrochirus
                        
                        Blugill sunfish
                     
                     
                        21 ± 1
                     
                     
                        —
                     
                     
                        16
                     
                     
                        3
                     
                     
                        > 4
                     
                     
                        | Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni (kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 4 ijiem wara it-tfaqqis (7 ġranet)
                     
                     
                        —
                     
                     
                        75
                     
                  
                        ILMA MIELAĦ
                     
                  
                        
                           Menidia peninsulae
                        
                        Tidewater silverside
                     
                     
                        22 -25
                     
                     
                        15 – 22
                     
                     
                        12
                     
                     
                        1,5 
                     
                     
                        10
                     
                     
                        Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni (kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 5 ijiem wara it-tfaqqis (6-7 ġranet)
                     
                     
                        80
                     
                     
                        60
                     
                  
                        
                           Clupea harengus
                        
                        Herring
                     
                     
                        10 ± 1
                     
                     
                        8 – 15
                     
                     
                        12
                     
                     
                        20 – 25
                     
                     
                        3 – 5
                     
                     
                        Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni (kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 3 ijiem wara it-tfaqqis (23-27 ġranet)
                     
                     
                        60
                     
                     
                        80
                     
                  
                        
                           Gadus morhua
                        
                        Cod
                     
                     
                        5 ± 1
                     
                     
                        5 – 30
                     
                     
                        12
                     
                     
                        14 – 16
                     
                     
                        3 – 5
                     
                     
                        Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni (kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 3 ijiem wara it-tfaqqis (18-il ġurnata)
                     
                     
                        60
                     
                     
                        80
                     
                  
                        
                           Cyprinodon variegatus
                        
                        Sheepshead minnow
                     
                     
                        25 ± 1
                     
                     
                        15 – 30
                     
                     
                        12
                     
                     
                        —
                     
                     
                        —
                     
                     
                        Appena possibbli wara l-fertilizzazzjoni (kmieni fl-istadju tal-gastrula) sa 4/7 ijiem wara it-tfaqqis (28 ġurnata)
                     
                     
                        > 75
                     
                     
                        80
                     
                  
         
            ANNESS 4
            XI KARATTERISTIĊI KIMIĊI TA' ILMA GĦAT-TAĦLIT AĊĊETTABBLI
            
                        Sustanza
                     
                     
                        Konċentrazzjoni
                     
                  
                        Materja ta' partiċelli
                     
                     
                        < 20 mg/l
                     
                  
                        Karbonju organiku totali
                     
                     
                        < 2 mg/l
                     
                  
                        Ammonja mhix ionizzata
                     
                     
                        < 1 μg/l
                     
                  
                        Klorina residwali
                     
                     
                        < 10 μg/l
                     
                  
                        Pestiċidi organophosphorus totali
                     
                     
                        < 50 ng/l
                     
                  
                        Pestiċidi organophosphorus totali u polychlorinated biphenyls
                     
                     
                        < 50 ng/l
                     
                  
                        Klorina organika totali
                     
                     
                        < 25 ng/l
                     
                  
         C.16.   NAĦAL – PROVA TA' TOSSIĊITÀ ORALI AKUTA
         1.   METODU
         Dan il-metodu ta' prova ta' tossiċità akuta huwa replika ta' l-OECD TG 213 (1998).
         1.1.   DAĦLA
         Din il-prova ta' tossiċità hija metodu li tintuża fil-laboratorju, magħmul biex issir stima tat-tossiċità orali akuta tal-prodotti għall-protezzjoni tal-pjanti u kimiċi oħra, lin-naħal adult li jkun qiegħed jaħdem.
         Fl-istima u l-evalwazzjoni tal-karatteristiċi tossiċi ta' tas-sustanzi, d-determinazzjoni ta' tossiċità akuta orali fin-naħal tista' tukun meħtieġa, e.ż. meta jkun probabbli li n-naħal ġie espost għal xi kimika. Din il-prova ta' tossiċità orali akuta ssir sabiex tiġi determinata it-tossiċità intrinsika ta' pestiċidi u kimiċi oħra għan-naħal. Ir-riżultati ta' din il-prova għandhom jintużaw biex jiġi definit il-bżonn għal evalwazzjoni ulterjuri. B'mod partikolari, dan il-metodu jista' jintuża f'programmi mqassma f'aktar minn fażi waħda sabiex jiġu determinati il-ħsarat tal-pestiċidi għan-naħal, ibbażat fuq sekwenza ta' provi ta' tossiċità ġol-laboratorju għal-esperimenti fuq is-semi-kamp u fuq il-kamp (1). Il-pestiċidi jistgħu jiġu ittestjati bħala sustanzi attivi (s.a.) jew bħala prodotti fformulati.
         L-istandard tossiku għandu jiġi stabbilit sabiex tiġi vverifikata s-sensittività tan-naħal u l-preċiżjoni tal-prova proċedurali.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Tossiċità orali akuta: hija l-effett avvers li jseħħ f'perjodu massimu ta' 96 siegħa (s) ta' amministrazzjoni orali ta' dosa singola ta' sustanza sperimentali.
         
            Doża : hija l-ammont tas-sustanza ikkonsmata. Id-doża hija espressa bħala l-massa (μg) tas-sustanza sperimentali għal kull annimal sperimentali (μg/bee). L-ammont reali għal kull naħla ma jistax jiġi kkalkolat peress li n-naħal jintema' kollettivament, imma tista' ssir stima tad-doża medja (it-total tas-sustanza sperimentali kkonsmata/in-numru ta' naħal sperimentali f'kull gaġġa).
         
            LD
            
               50
            
            (doza letali medja) orali: hija doża singola ta' sustanza miġjuba statistikament li tista' tikkawża l-mewt f'50 % ta' l-annimali meta tiġi somministrata oralment. Il-valur ta' l-LD50 huwa espress bħala μg tas-sustanza sperimentali kull naħla. Fil-każ tal-pestiċidi, is-sustanza sperimentali tista' tkun kemm sustanza attiva (s.a.) kif ukoll prodott formulat li jkunu fih wieħed jew aktar sustanzi attivi.
         
            Mortalità: annimal huwa registrat mejjet meta ikun kompletament immobbli.
         1.3.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAL-PROVA
         Naħal ħaddiema adulti (Apis mellifera) huma esposti għal firxa ta' dożijiet tas-sustanza sperimentali imferrxa f'soluzzjoni tas-sukrosju. In-naħal imbagħad jintema' bl-istess dieta, libera mis-sustanza sperimentali. Matul mill-anqas 48 s il-mortalità tiġi reġistrata kull jum u pparagunata mal-valur tal-kontroll. Jekk ir-rata tal-mortalità tkun qed tiżdied bejn 24 s u 48 s filwaqt illi l-mortalità tal-kontrolli tibqa' f'livell aċċettabbli, i.e. < = 10 %, ikun xieraq illi l-prova tiġi estiża għal massimu ta' 96 s. Ir-riżultati jiġu analizzati sabiex jiġi kkalkulat l-LD50 fl-24 s u t-48 s u, fil-każ li l-istudju jiġi pprolongat, fit-72 s u fis-96 s.
         1.4.   VALIDITÀ TAL-PROVA
         Sabiex prova tkun valida, japplikaw l-kondizzjonijiet li ġejjin:
         
                     —
                  
                  
                     il-mortalità medja għan-numru totali ta' kontrolli m'għandiex teċċedi 10 % fl-aħħar tal-prova,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-LD50 ta' l-istandard tossiku jilħaq il-firxa speċifikata.
                  
               1.5.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAL-PROVA
         1.5.1.   Kollezzjoni ta' naħal
         Jintużaw naħal ħaddiema żagħżagħ adulti ta' l-istess razza, i.e. naħal ta' l-istess età, mitmugħa bl-istess mod, eċċ. In-naħal għandu jinkiseb minn kolonji li għandhom reġina, li huma mitmugħin tajjeb, u sakemm dan ikun possibbli, li jkunu eżenti minn mard, bi storja u stat fiżjoloġiku magħruf. Jistgħu jiġu miġbura filgħodu l-jum tal-prova jew filgħaxija ta' qabel il-prova u miżmuma fil-kondizzjonijiet tal-prova sal-ġurnata ta' wara. Jistgħu jintużaw ukoll naħal miġbura minn għamliet bla duqqajs. Għandu jiġi evitat l-ġbir fil-bidu tar-rebbiegħa jew fl-aħħar tal-ħarifa peress illi matul dan iż-żmien n-naħal ibiddel l-istat fiżjoloġiku tiegħu. Jekk il-provi ikollom jsiru fil-bidu tar-rebbiegħa jew fl-aħħar tal-ħarifa, in-naħal jistgħu jitqegħdu f'inkubatur u mrobbija għal gimgħa b'‘ħobż tan-naħal’ (pollinu miġbur mix-xehdiet) u soluzzjoni tas-sukrosju. In-naħal li jiġi trattat b'sustanzi kimiċi, bħal m'huma antibiotiċi, prodotti antivarroa, eċċ., m'għandux jintuża għal provi ta' tossiċità qabel erba' ġimgħat mit-tmiem ta' l-aħħar trattament.
         1.5.2.   Kondizzjonijiet ta' manteniment u alimentazzjoni
         Jintużaw gaġġeġ li jitnaddfu faċilment u li għandhom ventilazzjoni tajjba. Kull materjal xieraq jista' jintuża, e.ż. azzar stainless, xbieki tal-ħadid, plastik jew gaġġeġ ta' l-injam disposable, eċċ. In-numru idejali huwa ta' gruppi ta' għaxar naħliet f'kull gaġġa. Il-qies tal-gaġġeġ sperimentali għandu jkun xieraq għan numru ta' naħal, i.e. jipprovdi spazju adegwat.
         In-naħal għandu jinżamm fid-dlam ġewwa kamra sperimentali f'temperatura ta' 25 ± 2 oC. L-umdità relattiva, normalment madwar 50-70 %, għandha tiġi reġistrata matul il-prova kollha. Proċeduri ta' manipolazzjoni, inklużi t-trattamenti u l-osservazzjonijiet jistgħu jsiru fid-dawl (naturali). L-alimentazzjoni tikkonsisti f'soluzzjoni ta' sukrosju fl-ilma b'konċentrazzjoni finali ta' 500 g/l (50 % w/v). Wara li jingħataw id-dożii sperimentali, l-alimentazzjoni għandha tingħata ad libitum. Is-sistema ta' alimentazzjoni għandha tħalli ssir reġistrazzjoni ta' kemm jiġi kkonsmat ikel f'kull gaġġa (ara taqsima 1.6.3.1). Tista' tintuża pipetta tal-ħġieġ (madwar 50 mm twila u 10 mm wiesgħa bin-naħa l-miftuħa li tidjieq għal djametru ta' madwar 2 mm).
         1.5.3.   Preparazzjoni tan-naħal
         In-naħal miġbur jiġi allokat saltwarjament f'gaġġeġ sperimentali, li mbagħad jitpoġġew saltwarjament fil-kamra sperimentali.
         Qabel ma tibda l-prova in-naħal jista' jitħalla bla ikel għal ħin massimu ta' 2 s. Huwa rakkomandat li n-naħal jitħalla bla ikel qabel it-trattament sabiex fil-bidu tal-prova in-naħal kollu jirriżulta ugwali f'termini tal-kontenut intestinali. Qabel ma tinbeda l-prova jeħtieġ illi jitneħħa n-naħal li jkun qiegħed imut u li jiġi sostitwit b'naħal b'saħħtu.
         1.5.4.   Preparazzjoni tad-dożi
         Meta s-sustanza sperimentali tkun waħda li tista' titħallat ma' ilma, din tista' titħallat direttament f'50 % soluzzjoni tas-sukrosju. Għal prodotti u sustanzi oħra tekniċi li ma jinħallux daqshekk malajr fl-ilma, jistgħu jintużaw vetturi oħra bħal solventi organiċi, emulsifiers jew dispersants li għandhom livell ta' tossiċità baxxa għan-naħal (e.ż. acetone, dimethylformamide, dimethylsulfoxide). Il-konċentrazzjoni tal-vettura tiddependi fuq is- solubiltà tas-sustanza sperimentali li għandha tkun l-istess għal konċentrazzjonijiet kollha li ssirilhom il-prova. Madankollu, konċentrazzjoni tal-vettura ta' madwar 1 % hija ġeneralment xierqa u m'għandhiex tkun għola.
         Sustanzi xierqa għall-kontroll għandhom jitlestew, i.e. meta solvent jew dispersant jintuza biex iħoll is-sustanza sperimentali, għandhom jintużaw żewġ gruppi ta': soluzzjoni fl-ilma, u soluzzjoni ta' sukrosju li jkollha s-solvent/trasportatur bil-konċentrazzjoni użata fis-soluzzjonijiet dożi.
         1.6.   PROĊEDURA
         1.6.1.   Gruppi sperimentali u gruppi għall-kontroll
         In-numru ta' dożi u ta' repliċi ttestjati għandhom ikunu konformi mar-rekwiżiti statistiċi għad-determinazzjoni ta' l-LD50 mal-limiti ta' affidabilità ta' 95 %. Normalment, għal-prova jeħtieġu ħames dożi f'serie ġeometrika, b'fatturi li ma jaqbżux 2.2, u li jkopru l-firxa għall-LD50. Madankollu, għandhom jiġu determinati l-fattur tat-taħlit ma' l-ilma u n-numru ta' konżentrazzjonijiet għad-dożi b'relazzjoni ma' kemm tkun immejla l-kurva tat-tossiċità (doża kontra mortalità) u għandu jiġi ikkunsidrat il-metodu statistiku li ġie magħżul għall-analiżi tar-riżultati. Prova ta' riċerka fuq il-firxa tippermetti li jintgħażlu l-konċentrazzjonijiet appropjati għad-dożi.
         Minimu ta' tlett gruppi ta' provi repetuti, kull wieħed ta' tliet naħliet, għandu jiġi dożat b'kull konċentrazzjoni sperimentali. Oltre s-serje sperimentali hu neċessarju li jiġu analizzati minimu ta' tliet lottijiet ta' kontroll, kull waħda ta' 10 naħliet. Huma meħtieġa tliet gruppi ta' kontroll anke għal solventi/trasportaturi użati (ara taqsima 1.5.4).
         1.6.2.   Sustanza tossika standard
         Fis-serje sperimentali għandha tiġi inkluża sustanza tossika standard. Jeħtieġ li jintgħażlu mill-anqas tlett dożi li jkopru l-valur mistenni ta' LD50. Għal kull doża sperimentali jintużaw mill-inqas tlett gaġġeġ repliċi, kull waħdha fiha għaxar naħliet. Is-sustanza tossika standard preferuta hija d-dimethoate, fejn l-LD50-24 s orali rrapurtat huwa fil-firxa ta' 0,10- 0,35 μg s.a./naħla (2). Madankollu, huma ukoll aċċettabbli sustanżi tossiċi standard oħra jekk data suffiċenti tkun tista' tinġieb sabiex tiġi vverifikata r-risposta mistennija rigward id-dożi(e.ż. parathion).
         1.6.3.   Espożizzjoni
         1.6.3.1.   Somministrazzjoni tad-dożi
         Kull grupp sperimentali ta' naħal għandu jirċievi 100-200 μl soluzzjoni tas-sukrosju ġo l-ilma ta' 50 %, li jkunu jinsabu fiha s-sustanza in eżami bil-konċentrazzjoni xierqa. Għal dawk il-prodotti li jdumu ma jinħallu fl-ilma, li għandhom livell ta' tossiċità baxx jew li għandhom livell ta' konċentrazzjoni baxx fil-formulazzjoni, huwa meħtieġ volum akbar peress illi jkunu jridu jintużaw proporzjonijiet għola fis-soluzzjoni tas-sukrosju. Il-monitoraġġ tal-kwantità ta' ikel trattat li jiġi ikkonsmat minn kull grupp hu neċessarju. Ġaladarba jittiekel (normalment f'3-4 s), il-kontenitur ta' l-ikel għandu jitneħħa minn ġol-gaġġa u mibdul b'kontenitur li jkun fih biss is-soluzzjoni tas-sukrosju. Is-soluzzjonijiet tas-sukrosju huma mbagħad provduti ad libitum. Għal xi sustanzi li jkollhom konċentrazzjoni elevata hu possibbli li n-naħal jirrifjuta l-ikel trattat. Wara ħin massimu ta' 6 s, l-ikel trattat li ma jiġix ikkonsmat għandu jinbidel b'soluzzjoni ta' sukrosju biss. Stima ta' l-ikel trattat ikkonsmat hija neċessarja (e.ż. kejl tal-volum/piż ta' l-ikel trattat li jkun fadal).
         1.6.3.2.   Tul ta' żmien
         Preferibbilment, il-prova għandha ddum 48 s mill-mument meta s-soluzzjoni sperimentali tiġi sostitwita b'soluzzjoni ta' sukrosju biss. Jekk il-mortalità tkompli tgħola għal aktar minn 10 % wara l-ewwel 24 s, d-durata tal-prova għandha tiġi estiża għal massimu ta' 96 s sakemm il-mortalità matul il-kontrolli ma jaqbiżx 10 %.
         1.6.4.   Osservazzjonijiet
         L-mortalità tiġi reġistrata 4 s wara li tibda l-test u sussegwentement wara 24 s u wara 48 s (i.e. wara li tingħata d-doża). F'każ li l-perjodu ta' osservazzjoni jiġi pprolongat jeħtieġ li jkun hemm valutazzjonijiet oħra f'intervalli ta' 24 s sa ħin massimu ta' 96 s, CASemm il-mortalità matul il-kontrolli ma jaqbiżx 10 %.
         Għandu jkun hemm stima ta' l-ikel ikkonsmat minn kull grupp. Pargun bejn ir-rati ta' konsumazzjoni ta' ikel trattat u dak mhux trattat matul is-6 s imsemmija jista' jipprovdi informazzjoni dwar il-palatabiltà ta' l-ikel trattat.
         Hu neċessarju li jiġu reġistrati l-anomaliji kollha fl-imġieba osservata matul il-prova.
         1.6.5.   Prova limiti
         F'ċertu każijiet (e.ż. meta jkun mistenni illi sustanza sperimentali jkollha tossiċità baxxa) tista' ssir prova limiti bl-użu ta' 100μg s.a./naħla sabiex jintwera illi l-LD50 huwa akbar minn minn dan il-valur. L-istess proċedura għandha tintuża, inklużi t-tliet gruppi repliċi, għad-doża sperimentali, għall-kontrolli rilevanti, għall-istima ta' l-ammont ta' ikel ikkonsmat, u għall-użu ta' l-istandard tossiku. Jekk iseħħu każijiet ta' mortalità, irid isir studju komplet. Jekk jiġu osservati effetti subletali (ara taqsima 1.6.4), dawn għandhom jiġu reġistrati.
         2.   DATA U RAPURTAĠĠ
         2.1.   DATA
         Id-data għandha tiddaħħal fil-qosor f'tabella li turi n-numru ta' naħal użat kif ukoll il-mortalità f'kull osservazzjoni u n-numru ta' naħal b'imġieba anomala għal kull grupp ta' trattament, ta' kontroll u relattiv għas-sustanza tossika standard. Sabiex tiġi analizzata d-data tal-mortalità jeħtieġ li jintużaw metodi statistiċi xierqa (e.ż. analiżi probit, medja mobbli, probbabiltà binomali) (3) (4). Jeħtieġ li jiġu mpinġija kurvi doża-tweġiba għal kull żmien ta' osservazzjoni rakkomandat u li tiġi kkalkolata l-mejla tal-kurvi u d-dożi letali medji (LD50) b'limiti ta' affidabilità ta' 95 %. Il-korrezzjonijiet għall-mortalità bejn il-kontrolli jistgħu jiġu effettwati skond il-metodu ta' Abbott (4) (5). Meta l-ikel trattat ma jiġix ikkonsmat totalment, għandha tiġi determinata d-doża tas-sustanza sperimentali kkonsmata f'kull grupp. Il-LD50 għandha tiġi espressa f'ìg tas-sustanza sperimentali kull naħla.
         2.2.   RAPPORT TAL-PROVA
         Ir-rapport tal-prova irid jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         2.2.1.   Sustanza sperimentali:
         
                     —
                  
                  
                     natura fiżika u propjetà fiżjokimika rilevanti (e.ż. stabilità fl-ilma, pressjoni tal-fwar),
                  
               
                     —
                  
                  
                     data kimika ta' identifikazzjoni, inkluża formula ta' struttura, purezza (i.e. għall-pestiżidi, l-identità u l-konċentrazzjoni ta' sustanza(/i) attiva(/i).
                  
               2.2.2.   Speċi sperimentali:
         
                     —
                  
                  
                     isem xjentifiku ta' l-ispeċi, razza, età approssimattiva (f'ġimgħat), metodu u data tal-ġabra,
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni fuq kolonji użati għall-ġbir tan-naħal għall-isperimentazzjoni inkluż is-saħħa, eventwali mard ta' l-eżemplari adulti, eventwali pretrattamenti, eċċ.
                  
               2.2.3.   Kondizzjonijiet sperimentali:
         
                     —
                  
                  
                     temperatura u umdità relattiva tal-kamra sperimentali,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kondizzjonijiet tal-housing inklużi t-tip, il-qies u l-materjal tal-gaġġa,
                  
               
                     —
                  
                  
                     metodi tal-preparazzjoni tar-riżerva u tas-sustanza sperimentali (meta jintuża, is-solvent u l-konċentrazzjoni tiegħu għandha tingħata), metodu ta' preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tar-riżerva u l-frekwenza tat-tiġdid (meta jintuża, l-aġent li jħoll u l-konċentrazzjoni tiegħu għandha tingħata),
                  
               
                     —
                  
                  
                     disinn sperimentali, e.ż. numru u konċentrazzjonijiet sperimentali użati, numru ta' kontrolli; għal kull konċentrazzjoni sperimentali u kontroll, numru ta' repliċi ta' gaġġeġ u numru numru ta' naħal f'kull gaġġa,
                  
               
                     —
                  
                  
                     data tal-prova.
                  
               2.2.4.   Riżultati:
         
                     —
                  
                  
                     riżultati ta' l-istudju preliminari tar-riċerka tal-firxa, jekk magħmul,
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        data primarja: mortalità għal kull doża ttestjata f'kull ħin ta' osservazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     grafika tal-kurvi doża-tweġiba fl-aħħar tal-prova,
                  
               
                     —
                  
                  
                     valuri ta' l-LD50 b'limiti ta' affidabilità with 95 %, għal kull ħin rakkomandat għall-osservazzjoni għas-sustanza tal-prova u għas-sustanza tossika standard,
                  
               
                     —
                  
                  
                     proċeduri statistiċi użati biex jistabilixxu l-LD50,
                  
               
                     —
                  
                  
                     mortalità bejn il-kontrolli,
                  
               
                     —
                  
                  
                     effetti oħra bioloġiċi osservati jew imkejla e.ż. mġieba anomala tan-naħal (inkluż ir-rifjut tad-doża sperimentali), rata tal-konsumazzjoni ta' l-ikel f'gruppi trattati u gruppi mhux trattati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     devjazzjoni eventwali mill-proċedura tal-metodu sperimentali hawn deskritti u informazzjoni eventwali oħra rilevanti.
                  
               3.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151-165. March 1993.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal of Apicultural Research, 22, pp.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, pp. 265-267.
                  
               C.17.   NAĦAL – PROVA TA' TOSSIĊITÀ AKUTA MILL-KUNTATT
         1.   METODU
         Dan il-metodu ta' prova ta' tossiċità akuta huwa replika ta' l-OECD TG 214 (1998).
         1.1.   DAĦLA
         Din il-prova ta' tossiċità huwa metodu li jntuża fil-laboratorju, magħmul biex issir stima tat-tossiċità mill-kuntatt akuta tal-prodotti għall-protezzjoni tal-pjanti u kimiċi oħra, lin-naħal adult li jkun qiegħed jaħdem.
         Fl-istima u l-evalwazzjoni tal-karatteristiċi tossiċi ta' tas-sustanzi, d-determinazzjoni ta' tossiċità akuta mill-kuntatt fin-naħal tista' tukun meħtieġa, eż. meta jkun probabbli li n-naħal jiġi espost għal xi kimika. Din il-prova ta' tossiċità mill-kuntatt akuta jsir sabiex tiġi determinata it-tossiċità intrinsika ta' pestiċidi u kimiċi oħra għan-naħal. Ir-riżultati ta' din il-prova għandhom jintużaw biex jiġi definit il-bżonn għal evalwazzjoni ulterjuri. B'mod partikolari, dan il-metodu jista' jintuża f'programmi mqassma f'aktar minn fażi waħda sabiex jiġu determinati il-ħsarat tal-pestiċidi għan-naħal, ibbażat fuq sekwenza ta' provi ta' tossiċità ġol-laboratorju għal-esperimenti fuq is-semikamp u fuq il-kamp (1). Il-pestiċidi jistgħu jiġu ittestjati bħala sustanzi attivi (s.a.) jew bħala prodotti fformulati.
         L-istandard tossiku għandu jiġi stabbilit sabiex tiġi vverifikata s-sensittività tan-naħal u l-preċiżjoni tal-prova proċedurali.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Tossiċità orali akuta: hija l-effett avvers li jseħħ f'perjodu massimu ta' 96 siegħa ta' applikazzjoni topika ta' dosa singola ta' sustanza sperimentali.
         
            Doża: hija l-ammont tas-sustanza applikata. Id-doża hija espressa bħala l-massa (μg g) tas-sustanza sperimentali għal kull annimal sperimentali (μg/bee).
         
            LD
            
               50
            
            (doza letli medja) mill-kuntatt: hija doża singola ta' sustanza miġjuba statistikament li tista' tikkawża l-mewt f'50 % ta' l-annimali meta tiġi somministrata mill-kuntatt. Il-valur ta' l-LD50 huwa espress bħala μg) tas-sustanza sperimentali kull naħla. Fil- każ tal-pestiċidi, is-sustanza sperimentali tista' tkun kemm sustanza attiva (s.a.) kif ukoll prodott formulat li jkunu fih wieħed jew aktar sustanzi attivi.
         
            Mortalità: annimal huwa registrat mejjet meta ikun kompletament immobbli.
         1.3.   PRINĊIPJU TAL-METODU TAL-PROVA
         Naħal ħaddiema adulti (Apis mellifera) huma esposti għal firxa ta' dożijiet tas-sustanza sperimentali maħlula f'trasportaturi xierqa, b'applikazzjoni diretta mas-sider (taqtir). Il-prova ddum 48 s. Jekk ir-rata tal-mortalità tkun qed tiżdied bejn 24 s u 48 s filwaqt illi l-mortalità tal-kontrolli tibqa' f'livell aċċettabbli, i.e. ≤ 10 %, ikun xieraq illi l-prova tiġi estiża għal massimu ta' 96 s. Il-mortalità għandha tiġi reġistrata kull jum u pparagunata mal-valur tal-kontroll. Ir-riżultati jiġu analizzati sabiex jiġi kkalkulat l-LD50 fl-24 s u t-48 s u, fil-każ li l-istudju jiġi pprolongat, fit-72 s u fis-96 s.
         1.4.   VALIDITÀ TAL-PROVA
         Sabiex prova tkun valida, japplikaw l-kondizzjonijiet li ġejjin:
         
                     —
                  
                  
                     il-mortalità medja għan-numru totali ta' kontrolli m'għandux jeċċedi 10 % fl-aħħar tal-prova,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-LD50 ta' l-istandard tossiku jilħaq il-firxa speċifikata.
                  
               1.5.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TAL-PROVA
         1.5.1.   Kollezzjoni ta' naħal
         Jintużaw naħal ħaddiema żgħażagħ adulti, i.e. naħal ta' l-istess età, mitmugħa bl-istess mod, ta' l-istess razza eċċ. In-naħal għandu jinkiseb minn kolonji li għandhom reġina, li huma mitmugħin tajjeb, u sakemm dan ikun possibbli, li jkunu eżenti minn mard, b'storja u stat fiżjoloġiku magħruf. Jistgħu jiġu miġbura filgħodu l-jum tal-prova jew filgħaxija ta' qabel il-prova u miżmuma fil-kondizzjonijiet tal-prova sal-ġurnata ta' wara. Jistgħu jintużaw ukoll naħal miġbura minn għamliet bla duqqajs. Għandhu jiġi evitat l-ġbir fil-bidu tar-rebbiegħa jew fl-aħħar tal-ħarifa peress illi matul dan iż-żmien n-naħal ibiddel l-istat fiżjoloġiku tiegħu. Jekk il-provi jkollom jsiru fil-bidu tar-rebbiegħa jew fl-aħħar tal-ħarifa, in-naħal jistgħu jitpoġġew f'inkubatur u mrobbija għal ġimgħa b' ‘ħobż tan-naħal’ (pollinu miġbur mix-xehdiet) u soluzzjoni tas-sukrosju. In-naħal li jiġi trattat b'sustanzi kimiċi, bħal m'huma antibiotiċi, prodotti anti-varroa, eċċ., m'għandux jintuża għal provi ta' tossiċità qabel erba' ġimgħat mit-tmiem ta' l-aħħar trattament.
         1.5.2.   Kondizzjonijiet ta' manteniment u alimentazzjoni
         Jintużaw gaġġeġ li jitnaddfu faċilment u li għandhom ventilazzjoni tajba. Kull materjal xieraq jista' jintuża, e.ż. azzar stainless, xbieki tal-ħadid, plastik jew gaġġeġ ta' l-injam disposable, eċċ. Il-qies tal-gaġġeġ sperimentali għandu jkun xieraq għan numru ta' naħal, i.e. jipprovdi spazju adegwat. In-numru idejali huwa ta' gruppi ta' għaxar naħliet f'kull gaġġa.
         In-naħal għandu jinżamm fid-dlam ġewwa kamra sperimentali f'temperatura ta' 25 ± 2 oC. L-umdità relattiva, normalment madwar 50-70 %, għandha tiġi reġistrata matul il-prova kollha. Proċeduri ta' manipolazzjoni, inklużi t-trattamenti u l-osservazzjonijiet jistgħu jsiru fid-dawl (naturali). L-alimentazzjoni tikkonsisti f'soluzzjoni ta' sukrosju fl-ilma b'konċentrazzjoni finali ta' 500 g/l (50 % w/v) u għandha tingħata ad libitum matul iż-żmien tal-prova, permezz ta' kontenitur għall-ikel tan-naħal. Dan jista' jkun pipetta tal-ħġieġ (madwar 50 mm twila u 10 mm wiesgħa bin-naħa l-miftuħa li tidjieq għal djametru ta' madwar 2 mm).
         1.5.3.   Preparazzjoni tan-naħal
         In-naħal miġbur jista' jiġi illoppjat b'carbon dioxide jew nitrogen għall-applikazzjoni tas-sustanza sperimentali. L-ammont ta' loppju użat u l-ħin ta' espożizzjoni għandu jiġi minimizzat. Qabel ma tinbeda l-prova jeħtieġ illi jitneħħa n-naħal li jkun qiegħed imut u li jiġi sostitwit minn naħal b'saħħithom.
         1.5.4   Preparazzjoni tad-dożi
         Is-sustanza sperimentali għandha tiġi applikata bħalha soluzzjoni ġo trasportatur, i.e. solvent organiku jew soluzzjoni bl-ilma b'aġent li jxarrab, huwa preferibbli l-acetone imma jistgħu jintużaw ukoll solventi organiċi oħra li għandhom livell ta' tossiċità baxxa għan-naħal (e.ż. dimethylformamide, dimethylsulfoxide). Għal dawk il-prodotti formulati mitlufa fl-ilma u s-sostanzi organiċi altament polari li ma jinħallux f'solventi organiċi jista' jirriżulta aktar faċli biex jiġu applikati jekk preparati f'soluzzjoni debboli ta' agent li jxarrab kummerċjali (e.ż. Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).
         Sustanzi xierqa għall-kontroll għandhom jitlestew, i.e. meta solvent jew dispersant jintuza biex iħoll is-sustanza sperimentali, għandhom jintużaw żewġ gruppi ta' gruppi ta' kontroll, wieħed trattat bl-ilma, u wieħed trattat b'is-solvent/id-dispersant.
         1.6.   PROĊEDURA
         1.6.1.   Gruppi sperimentali u gruppi għall-kontroll
         In-numru ta' dożi u ta' repliċi ttestjati għandhom ikunu konformi mar-rekwiżiti statistiċi għad-determinazzjoni ta' l-LD50 mal-limiti ta' affidabilità ta' 95 %. Normalment, għall-prova jeħtieġu ħames dożi f'serie ġeometrika, b'fatturi li ma jaqbżux 2.2, u li jkopru l-firxa għall- LD50. Madankollu, għandhom jiġu determinati n-numru ta' dożi b'relazzjoni ma' kemm tkun immejla l-kurva tat-tossiċità (doża kontra mortalità) u għandu jiġi ikkunsidrat il-metodu statistiku li ġie magħżul għall-analiżi tar-riżultati. Prova ta' riċerka fuq il-firxa tippermetti li jintgħażlu d-dożi appropjati.
         Minimu ta' tlett gruppi ta' provi repetuti, kull wieħed ta' tlett naħliet, għandu jiġi dożat b'kull konċentrazzjoni sperimentali.
         Oltre s-serje sperimentali hu neċessarju li jiġu analizzati minimu ta' tlett lottijiet ta' kontroll, kull waħda ta' 10 naħliet. Jekk jintuża solvent organiku jew aġent li jxarrab tlett gruppi ta' kontroll addizzjonali ta' 10 naħliet kull wieħed iridu jiġu inklużi għas-solvent jew għall-aġent li jxarrab.
         1.6.2.   Sustanza tossika standard
         Fis-serje sperimentali għandha tiġi inkluża sustanza tossika standard. Jeħtieġ li jintgħażlu mill-anqas tlett dożi li jkopru l-valur mistenni ta' LD50. Għal kull doża sperimentali jintużaw mill-inqas tlett gaġġeġ repliċi, kull waħdha fiha 10 naħliet. Is-sustanza tossika standard preferuta hija d-dimethoate, fejn l- LD50 - 24 s mill-kuntatt rrapurtat huwa fil-firxa ta' 0,10 - 0,35 μg s.a./naħla (2). Madankollu, huma ukoll aċċettabbli sustanżi tossiċi standard oħra jekk data suffiċenti tkun tista' tinġieb sabiex tiġi vverifikata r-risposta mistennija rigward id-dożi(e.ż. parathion).
         1.6.3.   Espożizzjoni
         1.6.3.1.   Somministrazzjoni tad-dożi
         Naħal illoppjat jiġi trattat individwalment permezz ta' applikazzjoni topika. In-naħal huwa assenjat saltwarjament għad-dożi sperimentali u kontrolli differenti. Permezz ta' mikroapplikatur għandu jiġi applikat volum ta' 1 μl tas-soluzzjoni li jkun fiha s-sustanza sperimentali bil-konċentrazzjoni xierqa fin-naħa tad-dahar tas-sider ta' kull naħla. Jekk ġustifikati, volumi oħra jistgħu jintużaw. Wara l-applikazzjoni, in-naħal jiġu allokati ġol-gaġġeġ sperimentali u mitmugħa b'soluzzjonijiet tas-sukrosju.
         1.6.3.2.   Tul ta' żmien
         Preferibbilment, il-prova għandha ddum 48 s. Jekk il-mortalità tiżdied għal aktar minn 10 % bejn 24 s u 48h, d-durata tal-prova għandha tiġi estiża għal massimu ta' 96 s CASemm il-mortalità matul il-kontrolli ma jaqbiżx 10 %.
         1.6.4.   Osservazzjonijiet
         L-mortalità tiġi reġistrata 4 s wara l-applikazzjoni u sussegwentement wara 24 s u wara 48 s. F'każ li l-perjodu ta' osservazzjoni jiġi pprolongat jeħtieġ li jkun hemm valutazzjonijiet oħra f'intervalli ta' 24 s sa ħin massimu ta' 96 s, sakemm il-mortalità matul il-kontrolli ma jaqbiżx 10 %.
         Hu neċessarju li jiġu reġistrati l-anomaliji kollha ta' l-imġieba osservata matul il-prova.
         1.6.5.   Prova limiti
         F'ċertu każijiet (e.ż. meta jkun pretiż illi sustanza sperimentali jkollha tossiċità baxxa) tista' ssir prova limiti bl-użu ta' 100 μg s.a./naħla sabiex jintwera illi l-LD50 huwa akbar minn minn dan il-valur. L-istess proċedura għandha tintuża, inklużi t-tlett gruppi repliċi, għad-doża sperimentali, għall-kontrolli rilevanti, u għall-użu ta' l-istandard tossiku.If mortalities occur, a full study should be conducted. Jekk jiġu osservati effetti subletali (ara taqsima 1.6.4), dawn għandhom jiġu reġistrati.
         2.   DATA U RAPURTAĠĠ
         2.1.   DATA
         Id-data għandha tiġi mqassra ġo tabella li turi n-numru ta' naħal użat kif ukoll il-mortalità f'kull osservazzjoni u n-numru ta' naħal b'imġieba anomala għal kull grupp ta' trattament, ta' kontroll u relattiv għas-sustanza tossika standard. Sabiex tiġi analizzata d-data tal-mortalità jeħtieġ li jintużaw metodi statistiċi xierqa (e.ż. analiżi probit, medja mobbli, probbabiltà binomali) (3) (4). Il-kurvi għal plot dose-response f'kull ħin ta' osservazzjoni rakkomandat (i.e. 24 s, 48 s u, jekk inhu relevanti, 72 s, 96 s) u kkalkula l-kurvi u l-medja tad-dożi letali (LD50) b'95 % ta' limiti ta' kunfidenza. Il-korrezzjonijiet għall-mortalità bejn il-kontrolli jistgħu jiġu effetwati skond il-metodu ta' Abbott (4) (5). Il- LD50 għandha tiġi espressa f'ìg tas-sustanza sperimentali kull naħla.
         2.2.   RAPPORT TAL-PROVA
         Ir-rapport tal-prova irid jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         2.2.1.   Sustanza sperimentali:
         
                     —
                  
                  
                     natura fiżika u propjetà fiżjo-kimika rilevanti (e.ż. stabilità fl-ilma, pressjoni tal-fwar),
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        data kimika ta' identifikazzjoni, inkluża formula ta' struttura, purezza (i.e. għall-pestiżidi, l-identità u l-konċentrazzjoni ta' sustanza(/i) attiva(/i).
                  
               2.2.2.   Speċi sperimentali:
         
                     —
                  
                  
                     isem xjentifiku ta' l-ispeċi, razza, età approssimattiva (f'ġimgħat), metodu u data tal-ġabra,
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni fuq kolonnji użati għall-ġbir tan-naħal għall-esperimentazzjoni inkluż is-saħħa, mard eventwali ta' l-eżemplari adulti, eventwali pretrattamenti, eċċ.
                  
               2.2.3.   Kondizzjonijiet sperimentali:
         
                     —
                  
                  
                     temperatura u umdità relattiva tal-kamra sperimentali,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kondizzjonijiet tal-housing inklużi t-tip, il-qies u l-materjal tal-gaġġa,
                  
               
                     —
                  
                  
                     metodu ta' amministrazzjoni tas-sustanza sperimentali, e.ż. solvent trasportatur użat, volum tas-soluzzjoni sperimentali applikat, loppju użat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     disinn sperimentali, e.ż. numru ta' dożi sperimentali użati, numru ta' kontrolli; għal kull doża sperimentali u kontroll, numru ta' repliċi ta' gaġġeġ u numru ta' naħal f'kull gaġġa,
                  
               
                     —
                  
                  
                     data tal-prova.
                  
               2.2.4.   Riżultati:
         
                     —
                  
                  
                     riżultati ta' l-istudju preliminari tar-riċerka tar-range, jekk magħmul,
                  
               
                     —
                  
                  
                     data primarja: mortalità għal kull doża ttestjata f'kull ħin ta' osservazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     grafika tal-kurvi doża-tweġiba fl-aħħar tal-prova,
                  
               
                     —
                  
                  
                     valuri ta' l- LD50 b'limiti ta' affidabilità with 95 %, għal kull ħin rakkomandat għall-osservazzjoni għas-sustanza tal-prova u għas-sustanza tossika standard,
                  
               
                     —
                  
                  
                     proċeduri statistiċi użati biex jistabilixxu l- LD50,
                  
               
                     —
                  
                  
                     mortalità bejn il-kontrolli,
                  
               
                     —
                  
                  
                     effetti oħra bioloġiċi osservati jew imkejla e.ż. mġieba anomala tan-naħal,
                  
               
                     —
                  
                  
                     eventwali devjazzjoni mill-proċedura tal-metodu sperimentali hawn deskritti u eventwali informazzjoni oħra rilevanti.
                  
               3.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151-165. March 1993.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal of Apicultural Research, 22, pp. 119-125.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265-267.
                  
               C.18.   ADSORBIMENT/DESORBIMENT BL-UŻU TAL-METODU TA' L-EKWILIBRIJU TA' GRUPPI
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa replika ta' l-OECD TG 106, għad-Determinazzjoni ta' l-Assorbiment/Desorbiment tal-ħamrija, bl-użu ta' Metodu ta' Eqwilibriju ta' Gruppi (2000).
         1.1.   DAĦLA
         Fl-elaborazzjoni tal-metodu preżenti, ingħata każ tar-riżultati ta' sperimentazzjoni ċirkolari u ta' workshop għall-għażla tal-ħamrija għall-iżvilupp ta' prova ta' l-adsorbiment (1) (2) (3) (4) kif ukoll linji gwida eżistenti fuq livell nazzjonali (5) (5) (6) (7) (8) (9) (10).
         L-istudji fuq l-adsorbiment/desorbiment huma utli sabiex tinkiseb informazzjoni essenzali fuq il-mobilità tal-komposti kimiċi u d-distribuzzjoni tagħhom fil-ħamrija, fl-ilma u fl-arja tal-biosfera (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Din l-informazzjoni tista' tkun utli, pereżempju, sabiex wieħed ikun jista' jobsor jew jagħmel stima tad-disponibbiltà ta' prodott kimiku taħt aspetti varji: degredazzjoni (22) (23), trasformazzjoni u assimilazzjoni ta' l-organiżmi ħajjin (24); filtrazzjoni minn ġol-profil tal-ħamrija (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28); volatilità mill-ħamrija (21) (29) (30); passaġġ mill-wiċċ ta' l-art għall-ilmijiet naturali (18) (31) (32). Id-data fuq l-adsorbiment tistà tintuża għall-skopijiet ta' paragunar u ta' mudellar (19) (33) (34) (35).
         Id-distribuzzjoni ta' prodott kimiku bejn il-ħamrija u fażijiet li fihom l-ilma huwa proċess ikkomplikat li jiddependi fuq numru ta' fatturi differenti: in-natura kimika tas-sustanza (12) (36) (37) (38) (39) (40), il-karatteristiċi tal-ħamrija (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49), u l-fatturi klimatiċi bħal ma huma l-inżul tax-xita, it-temperatura, id-dawl tax-xemx u r-riħ. Għaldaqstant, il-fenomeni numerużi u l-mekkaniżmi involuti fil-proċess ta' l-adsorbiment tal-ħamrija ta' sustanza kimika ma jistgħux jiġu definiti kompletament permezz ta' mudell simplifikat tal-laboratorju bħal m'hu il-metodu preżenti. Madankollu, anke jekk dan l-attentat ma jkunx jista' jkopri l-każijiet ambjentali kollha possibbli, jipprovdi informazzjoni ta' valur fuq ir-rilevanza ambjentali ta' l-adsorbiment ta' sustanza kimika.
         Ara ukoll l-Introduzzjoni Ġenerali.
         1.2.   AMBITU
         L-għan ta' dan il-metodu huwa li jivvaluta l-imġieba ta' l-adsorbiment/desorbiment ta' sustanza fuq il-ħamrija. L-għan huwa li jinkiseb valur ta' sorbiment li jkun jista' jintuża biex tinbasar partizzjoni taħt varjetà ta' kondizzjonijiet ambjentali; għal dan l-għan, għal kull prodott kimiku li jiġi meqjus, jiġu ddeterminati l-koeffiċjent ta' adsorbiment għall-ekwilibriju fuq tipi ta' ħamrija differenti bħala funzjoni tal-karatteristiċi tal-ħamrija stess (e.ż. kontenut karboniku organiku, kontenut ta' tafal u struttura tal-ħamrija u pH). Tipi differenti ta' ħamrija għandhom jintużaw sabiex ikopru bl-aktar mogħod wiesgħa possibbli l-interazzjonijiet ta' sustanza magħrufa ma' ħamrija li tiġri b'mod naturali.
         F'dan il-metodu, l-adsorbiment jirrapreżenta l-proċess ta' vinkolazzjoni ta' sustanza kimika mal-wiċċ tal-ħamrija; ma tiddistingwix bejn proċessi differenti ta' adsorbiment (adsorbiment fiżiku u kimiku) u proċessi oħra bħad-degredazzjoni katalitika fil-wiċċ, l-adsorbiment bil-massa jew r-reazzjoni kimika. M'għandux jingħata każ ta' l-adsorbiment li jseħħ fuq il-partiċelli kolloidali (djametru < 0,2 μìm) ġenerati mill-ħamrija.
         Il-parametri tal-ħamrija meqjusa l-aktar importanti għall-adsorbiment huma: kontenut karboniku organiku (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) (45) (46) (47) (48); kontenut ta' tafal u struttura tal-ħamrija (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) u pH għall-kompost ionizzabbli (3) (4) (42). Parametri oħra tal-ħamrija li jista' jkollhom impatt fuq l-adsorbiment/desorbiment ta' sustanza partikolari huma l-kapaċità effettiva ta' l-iskambju katjoniku (ECEC), il-kontenut ta' ossidi amorphous tal-ħadid u tal-aluminjum, partikolarment għal ħamrija volkanika u tropikali (4), kif ukoll il-wiċċ speċifiku (49).
         Din il-prova hija magħmula biex tevalwa l-adsorbiment ta' prodotti kimiċi fuq tipi differenti ta' ħamrija differenti b'rage ta' kontenut karboniku organiku, kontenut ta' tafal u struttura tal-ħamrija, u pH li jvarja. Dan jikkonsisti f'tlett stadji:
         
                     
                        Stadju 1:
                  
                  
                     Studju preliminarju sabiex jiġi determinat:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ir-rapport ħamrija/soluzzjoni,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-ħin ta' l-ekwilibriju għall-adsorbiment u l-ammont tas-sustanza sperimentali adsorbita f'l-ekwilibriju,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-adsorbiment tas-sustanza sperimentali fl-uċuħ tar-reċipjenti u l-istabilità tas-sustanza sperimentali matul il-perjodu sperimentali.
                              
                           
               
                     
                        Stadju 2:
                  
                  
                     Screening prova: l-adsorbiment huwa studjat f'ħames tipi differenti ta' ħamrija permezz ta' kinetika ta' adsorbiment ta' konċentrazzjoni singola u determinazzjoni tal-koeffiċjenti Kd u Koc.
                  
               
                     
                        Stadju 3:
                     
                  
                  
                     Determinazzjoni ta' l-iżotermi ta' adsorbiment ta' Freundlich biex tiġi stabbilità l-influwenza tal-konċentrazzjoni fuq id-daqs ta' l-adsorbiment fuq il-ħamrija.
                     Studju tad-desorbiment permezz tal-kinetika ta' desorbiment/ta' l-iżotermi ta' adsorbiment ta' Freundlich (Anness 1).
                  
               1.3.   DEFINIZZJONIJIET U UNITAJIET
         
                     Simbolu
                  
                  
                     Definizzjonijiet
                  
                  
                     Unitajiet
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     persentaġġ ta' adsorbiment fil-ħin ti
                     
                  
                  
                     %
                  
               
                     Aeq
                     
                  
                  
                     persentaġġ ta' adsorbiment fl-ekwilibriju ta' l-adsorbiment
                  
                  
                     %
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     massa tas-sustanza sperimentali adsorbita fuq il-ħamrija fil-ħin ti
                     
                  
                  
                     μg
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     massa tas-sustanza sperimentali adsorbita fuq il-ħamrija matul l-intervall ta' ħin Δti
                     
                  
                  
                     μg
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     massa tas-sustanza sperimentali adsorbita fuq il-ħamrija f'l-equilibriju ta' l-adsorbiment
                  
                  
                     μg
                  
               
                     m0
                     
                  
                  
                     massa tas-sustanza sperimentali fil-pipetta, fil-bidu tal-prova ta' l-adsorbiment
                  
                  
                     μg
                  
               
                     
                        
                  
                  massa tas-sustanza sperimentali mkejla f'alikwota (
                        )fil-ħin ti
                  
                  
                     μg
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     massa tas-sustanza fis-soluzzjoni f'l-ekwilibriju ta' l-assorbiment
                  
                  
                     μg
                  
               
                     msoil
                     
                  
                  
                     kwantità tal-fażi ħamrija, espressa f'massa ta' ħamrija xotta
                  
                  
                     g
                  
               
                     Cst
                     
                  
                  
                     konċentrazzjoni ta' massa tas-soluzzjoni ta' riżerva tas-sustanza
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
               
                     C0
                     
                  
                  
                     konċentrazzjoni inizjali tal-massa tas-soluzzjoni sperimentali f'kuntatt mal-ħamrija
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     konċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza fil-fażi bl-ilma fil-ħin ti , meta issir l-analiżi
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     kontenut tas-sustanza adsorbità fuq il-ħamrija fl-ekwilibriju ta' l-adsorbiment
                  
                  
                     μg g-1
                     
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     konċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza fil-fażi bl-ilma fl-ekwilibriju ta' l-adsorbiment
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
               
                     V0
                     
                  
                  
                     volum inizjali tal-fażi bl-ilma f'kuntatt ma' l- ilma matul il-prova ta' adsorbiment
                  
                  
                     cm3
                     
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     volum ta' l-alikwota fejn tiġi mkejla s-sustanza sperimentali
                  
                  
                     cm3
                     
                  
               
                     Kd
                     
                  
                  
                     koeffiċjent ta' distribuzzjoni għall-adsorbiment
                  
                  
                     cm3 g-1
                     
                  
               
                     Koc
                     
                  
                  
                     koeffiċjent ta' adsorbiment normalizzat għall-karbonju organiku
                  
                  
                     cm3 g-1
                     
                  
               
                     Kom
                     
                  
                  
                     koeffiċjent ta' distribuzzjoni normalizzat għas-sustanza organika
                  
                  
                     cm3 g-1
                     
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     koeffiċjent ta' adsorbiment skond Freundlich
                  
                  
                     μg 1-1/n (cm3) 1/n g-1
                  
               
                     1/n
                  
                  
                     esponenti ta' Freundlich
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     persentaġġ ta' desorbiment fil-ħin ti
                     
                  
                  
                     %
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     persentaġġ ta' desorbiment matul l-intervall ta' ħin Δti
                     
                  
                  
                     %
                  
               
                     Kdes
                     
                  
                  
                     koeffiċjenti apparenti ta' desorbiment
                  
                  
                     cm3 g-1
                     
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     koeffiċjenti ta' desorbiment skond Freundlich
                  
                  
                     μg 1-1/n (cm3) 1/n g-1
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     massa tas-sustanza sperimentali desorbita mill-ħamrija fil-ħin ti
                     
                  
                  
                     μg
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     massa tas-sustanza sperimentali desorbita mill-ħamrija matul l-intervall ta' ħin Δti
                     
                  
                  
                     μg
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     Il-massa tas-sustanza determinata b'mod analitiku fil-fażi akwea f'ekwilibriju ta' desorption
                     
                  
                  
                     μg
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     Il-massa totali tas-sustanza għat-test li ġie desorbed f'ekwilibriju ta' desorption
                     
                  
                  
                     μg
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     massa tas-sustanza li tibqa adsorbita fuq il-ħamrija wara l-intervall ta' ħin Δti
                     
                  
                  
                     μg
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     massa tas-sustanza residwa mill-ekwilibriju ta' adsorbiment minħabba sostituzzjoni mhux kompluta tal-volum
                  
                  
                     μg
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     kontenut tas-sustanza sperimentali li tibqa' adsorbita fuq il-ħamrija fl-ekwilibriju tad-desorbiment
                  
                  
                     μg g-1
                     
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     konċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza sperimentali preżenti fil-fażi bl-ilma fl-ekwilibriju tad-desorbiment
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
               
                     VT
                     
                  
                  
                     volum totali tal-fażi bl-ilma b'kuntatt mal-ħamrija matul l-edperiment fuq il-kinetika tad-desorbiment magħmul bil-metodu serje
                  
                  
                     cm3
                     
                  
               
                     VR
                     
                  
                  
                     volum tas-supernatant mneħħi mil-pipetta wara li jintlaħaq ekwilibriju ta' adsorbiment u mibdul b'l-istess volum tas-soluzzjoni ta' 0,01  M CaCl2
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     volum ta' l-alikwota prelevata għal raġuni analitika mill-ħin (i), matul l-esperiment fuq il-kinetika tad-desorbiment magħmul bil-metodu serje
                  
                  
                     cm3
                     
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     volum tas-soluzzjoni prelevata mill-pipetta (i) biex titkejjel is-sustanza sperimentali, matul l-esperiment fuq il-kinetika tad-desorbiment (metodu paralleli)
                  
                  
                     cm3
                     
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     volum tas-soluzzjoni prelevata mill-pipetta biex titkejjel is-sustanza sperimentali, fl-ekwilibriju tad-desorbiment
                  
                  
                     cm3
                     
                  
               
                     MB
                  
                  
                     bilanċ tal-massa
                  
                  
                     %
                  
               
                     mE
                     
                  
                  
                     massa totali tas-sustanza sperimentali estratta f'żewġ stadji, mill-ħamrija u mill-ħitan tar-reċipjent
                  
                  
                     μg
                  
               
                     Vrec
                     
                  
                  
                     volum tas-supernatant miġbur wara li ntlaħaq l-fl-ekwilibriju tad-adsorbiment
                  
                  
                     cm3
                     
                  
               
                     Pow
                     
                  
                  
                     koeffiċjent tar-ripartizzjoni octanol/ilma
                  
                  
                      
                  
               
                     pKa
                  
                  
                     kostanti tad-disoċjazzjoni
                  
                  
                      
                  
               
                     Sw
                     
                  
                  
                     solubilità fl-ilma
                  
                  
                     g l-1
                     
                  
               1.4.   PRINĊIPJU TAL-METODU SPERIMENTALI
         Volumi magħrufa ta' soluzzjonijiet tas-sustanza sperimentali, mhux markata jew radjumarkata, b'konċentrazzjonijiet magħrufa 0,01 M CaCl2 huma miżjuda ma' kampjuni ta' ħamrija ta' piż xott magħruf li kienu ekwilibrati qabel f'0,01 M CaCl2 It-taħlita tiġi mħawwda għal żmien xieraq. Is-sospensjonijiet tal-ħamrija jiġu mbagħad separati permezz ta' ċentrifugazzjoni u, jekk ikun mixtieq, filtrazzjoni u tiġi analizzata l-fażi bl-ilma. L-ammont ta' sustanza sperimentali adsorbita fuq il-ħamrija tiġi kkalkolata skond id-differenza bejn l-ammont ta' sustanza sperimentali preżenti fis-soluzzjoni mill-bidu u l-ammont li jibqa fl-aħħar ta' l-esperiment (metodu indirett).
         Metodu ieħor biex tiġi determinata l-kwantità adsorbita tas-sustanza sperimentali huwa billi tiġi analizzata direttament il-ħamrija (metodu dirett). Din il-proċedura li teħtieġ estrazzjoni tal-ħamrija f'stadji suċċessivi permezz ta' solvent xieraq, hija rakkomandata f'każijiet fejn id-differenza fil-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tas-sustanza ma tistax tiġi determinata preċiżament. Eżempji ta' dawn il-każijiet huma: l-adsorbiment tas-sustanza sperimentali fil-wiċċ tar-reċipjenti fejn isir l-esperiment, instabilità tas-sustanza sperimentali matul il-ħin ta' l-esperiment, adsorbiment debboli li jagħti biss lok għal varjazzjonijiet żagħar ta' konċentrazzjoni fis-soluzzjoni; u adsorbiment qawwi li jwassal għal konċentrazzjonijiet baxxi li ma jistgħux jiġu determinati akkuratament. Jekk tintuża sustanza radjumarkata, l-estrazzjoni tal-ħamrija tista' tiġi evitata permezz ta' analiżi tal-fażi ħamrija permezz tat-teknika tal-kombustjoni u l-għadd suċċessiv tax-xintillazzjoni fil-fażi likwida. Madankollu, l-għadd tax-xintillazzjoni fil-fażi likwida huwa metodu ta' teknika mhux speċifiku li ma jagħmilx distinzjoni bejn prodotti proġenituri u dawk ta' trasformazzjoni; għaldaqstant għandu jintuża biss jekk il-prodott kimiku sperimentali jibqa stabbli matul id-dewmien kollu ta' l-istudju.
         1.5.   INFORMAZZJONI FUQ IS-SUSTANZA SPERIMENTALI
         Ir-reattivi kimiċi għandhom ikunu ta' livell analitiku. Huwa rakkomandat l-użu ta' sustanzi li ma jkunux immarkati b'komposizzjoni magħrufa u preferibbilment purezza mhux anqas minn 95 % jew ta' sustanzi sperimentali radjumarkati li għandhom komposizzjoni u radjupurezza magħrufa. Fil-każ ta' radjumarkaturi ta' nofs-ħajja qasira, għandhom jiġu applikati korrezzjonijiet adegwati.
         Qabel ma ssir prova għall-adsorbiment-desorbiment, l-informazzjoni li ġejja dwar is-sustanza sperimentali għandha tkun disponibbli:
         
                     (a)
                  
                  
                     solubilità fl-ilma (A.6);
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     tensjoni tal-fwar (A.4) u/jew il-Kostanti tal-Liġi ta' Henry;
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     degradazzjoni antibjotika: idrolisi bħalha funzjoni tal-pH (C.7);
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     koeffiċjent tar-ripartizzjoni (A.8);
                  
               
                     (e)
                  
                  
                     bijodegrabilità ta' malajr (C.4) jew trasformazzjoni aerobika u anaerobika fil-ħamrija;
                  
               
                     (f)
                  
                  
                     pKa tas-sustanzi ionizzabili;
                  
               
                     (g)
                  
                  
                     fotoliżi diretta fl-ilma (i.e. spectrum ta' adsorbiment UV-Vis fl-ilma, rendiment quantum) u fotodegradazzjoni fil-ħamrija.
                  
               1.6.   APPLIKABBILITÀ TAL-PROVA
         Din il-prova hi applikabbli għas-sustanzi kimiċi għal-liema jista' jiġi applikat metoodu analitiku suffiċjentement akkurat. L-istabbilità tas-sustanza sperimentali matul il-ħin neċessarju biex titwettaq il-prova huwa parametru importanti li jista' jinfluwenza l-affidabilità tar-riżultati, speċjalment meta jiġi applikat il-metodu indirett. Għaldaqstant, huwa neċessarju li din l-istabbilità tiġi verifikata tramiti studju preliminari; jekk tiġi osservata trasformazzjoni fil-perjodu ta' ħin tal-prova, huwa rakkomandat li l-istudju prinċipali għandu jiġi eżegwit billi jiġu analizzati kemm il-fażi ħamrija kif ukoll il-fażi ta' l-ilma.
         Jistgħu jinħolqu diffikultajiet meta din il-prova isir għal sustanzi li għandhom solubilità baxxa fl-ilma (Sw < 10-4 g l-1), kif ukoll għal sustanzi ta' karika elevata, dovut għall-fatt illi l-konċentrazzjoni fil-fażi bl-ilma ma tistax tiġi mkejla analitikament b'akkuratezza effiċjenti. F'dawn il-każijiet, iridu jittieħdu passi addizzjonali. Il-mod kif wieħed jista' jaffronta dawn il-problemi jista' jinstab fit-taqsima relevanti ta' dan il-metodu.
         Fl-isperimentazzjoni fuq sustanzi li jiżvintaw, għandhom jittieħdu prekawzjonijiet biex telf matul l-istudju jiġi evitat.
         1.7.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.7.1.   Apparat u reattivi kimiċi
         Apparat normali tal-laboratorju, speċjalment li ġej:
         
                     (a)
                  
                  
                     Pipetti jew kontenituri biex isir l-esperiment. Huwa importanti li dawn il-pipetti jew kontenituri:
                     
                                 —
                              
                              
                                 joqgħodu direttament fiċ-ċentrifuga sabiex jiġi miniminizzat telf fil- manipolazzjoni u trasferiment,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 jkunu magħmula minn materjal inert, li jimminimizza l-adsorbiment fil-wiċċ tas-sustanza sperimentali.
                              
                           
               
                     (b)
                  
                  
                     Apparat għat-taħwid: overhead shaker jew apparat ekwvilenti; l-apparat għat-taħwid għandu jżomm il-ħamrija sospiża matul it-taħwid.
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     Ċentrifuga: preferibbilment ta' veloċità għolja, e.ż. forza ċentrifuga > 3 000 g, temperatur kontrollata, kapaċi tneħħi partiċelli b'djametru akbar minn 0,2 μm minn soluzzjonijiet bl-ilma. Sabiex jiġi evitat telf dovut għal volatilità jew ta' ilma, dawn il-kontenituri għandhom jinżammu mgħottija matul iċ-ċentrifugazzjoni u t-taħwid; biex jiġi minimizzat l-adsorbiment fuq l-għotjien, dawn iridu jiġu diżattivati pereżempju għotjin mgħottija bit-teflon.
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     Fakultattiv: apparat għall-filtrazzjoni; filtri ta' porożità ta' 0,2 μm, sterili, għal użu wieħed. Kura speċjali għandha tingħata għall-għażla tal-materjal għall-filtrazzjoni sbiex telf eventwali tas-sustanza sperimentali minn dan il-materjal jiġi evitat; għal dawk is-sustanzi li ma jinħallux malajr, mhux opportun li jintuża materjal għall-filtrazzjoni organiku.
                  
               
                     (e)
                  
                  
                     Strumentazzjoni analitika, adatta biex titkejjel il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika sperimentali.
                  
               
                     (f)
                  
                  
                     Forn tal-laboratorju, kapaċi jżomm temperatura ta' 103 oC sa 110 oC.
                  
               1.7.2.   Karatterizzazzjoni u selezzjoni tal-ħamrija
         Il-ħamrija għandha tiġi karatterizzata minn tlett parametri li huma meqjusa maġġorment responsabbli għall-kapaċitaà ta' l-adsorbiment: karbonju organiku, kontenut f'tafal u struttura tal-ħamrija, u pH. Kif diġà msemmi (ara Skop) għandhom jiġu meqjusa propjetajiet fiżiko-kimiċi oħra tal-ħamrija li jista' jkollhom impatt fuq l-adsorbiment/desorbiment ta' sustanza partikolari.
         Il-metodi użati għall-karatterizzazzjoni tal-ħamrija huma importanti ħafna u jistà jkollhom influwenza sinifikattiva fuq ir-riżultati. Għaldaqstant, huwa rakkomandat illi l-pH tal-ħamrija għandha titkejjel f'soluzzjoni ta' 0,01 M CaCl2 (iġifieri fis-soluzzjoni użata għall-prova ta' l-adsorbiment/desorbiment) skond il-metodu ISO li jikkorrispondi (ISO-10390-1). Huwa rakkomandat ukoll illi jiġu determinati l-popjetajiet rilevanti l-oħra tal-ħamrija skond metodi standard (pereżempju ISO 'Manwal ta' l-Analiżi tal-Ħamrija'); dan jippermetti illi l-analiżi tad-data fuq is-sorbiment tkun ibbażata fuq parametri tal-ħamrija standardizzati globalment. Ir-refernzi (50-52) jagħtu xi indikazzjonijiet fuq il-metodi standard disponibbli għall-analiżi u għall-karatterizzazzjoni tal-ħamrija. Għall-kalibrazzjoni tal-metodi sperimentali tal-ħamrija, huwa rakkomandat l-użu ta' ħamrija ta' referenza.
         It-Tabella 1 tagħti indikazzjoni għall-għażla tal-ħamrija għall-esperimenti ta' l-adsorbiment/desorbiment. Is-seba' kwalitajiet ta' ħamrija magħżula ikopru l-kwalitajiet li jinstabu f'żoni ġeografiċi temperati. Meta s-sustanzi sperimentali ikunu ionizzabbli, il-kwalitajiet ta' ħamrija magħżula għandhom ikopru range wiesgħa ta' pH, sabiex ikun jista' jiġi evalwat l-adsorbiment tas-sustanza fil-forma ionizzata u dik mhux ionizzata. Indikazzjoni fuq kemm il-kwalità ta' ħamrija għandha tintuża fl-istadji varji tal-prova tinstab taħt 1.9. Eżekuzzjoni tal-prova.
         Jekk jiġu preferuti kwalitajiet oħra ta' ħamrija, għandhom jiġu karatterizzati permezz ta' l-istess parametri u għandu jkollhom varjazzjoni simili fil-propjetajiet għal dawk deskritti f'Tabella 1, anke jekk ma jaqblux eżattament mal-kriterji.
         Tabella 1:
         Gwida għas-selezzjoni tal-kampjuni tal-ħamrija għall-adsorbiment-desorbiment
         
                     Kwalità ta' ħamrija
                  
                  
                     Range ta' pH (f'0,01  M CaCl2)
                  
                  
                     Kontenut f'karbonju organiku ( %)
                  
                  
                     Kontenut f'tafal ( %)
                  
                  
                     Komposizzjoni tal-ħamrija (**************)
                     
                  
               
                     1
                  
                  
                     4,5 -5,5 
                  
                  
                     1,0 -2,0 
                  
                  
                     65 – 80
                  
                  
                     tafal
                  
               
                     2
                  
                  
                     > 7,5 
                  
                  
                     3,5 -5,0 
                  
                  
                     20 – 40
                  
                  
                     art taflija
                  
               
                     3
                  
                  
                     5,5 -7,0 
                  
                  
                     1,5 -3,0 
                  
                  
                     15 – 25
                  
                  
                     art imtajjna
                  
               
                     4
                  
                  
                     4,0 -5,5 
                  
                  
                     3,0 -4,0 
                  
                  
                     15 – 30
                  
                  
                     art tajba u għammiela
                  
               
                     5
                  
                  
                     < 4,0 -6,0  (1)
                     
                  
                  
                     < 0,5 -1,5  (1)
                         (2)
                     
                  
                  
                     < 10 – 15 (1)
                     
                  
                  
                     art imrammla
                  
               
                     6
                  
                  
                     > 7,0 
                  
                  
                     < 0,5 -1,0  (1)
                         (2)
                     
                  
                  
                     40 – 65
                  
                  
                     art taflija/tafal
                  
               
                     7
                  
                  
                     < 4,5 
                  
                  
                     > 10
                  
                  
                     < 10
                  
                  
                     ramel/art imrammla
                  
               1.7.3.   Kollezzjoni u ħażna tal-kampjuni tal-ħamrija
         1.7.3.1.   Kollezzjoni
         Għall-kampjunaġġ mhumiex rakkomandati tekniċi jew strumenti speċifiċi; it-teknika tal-kampjunaġġ tiddependi fuq il-finalità ta' l-istudju (53) (54) (55) (56) (57) (58).
         Għandu jitqies dan li ġej:
         
                     (a)
                  
                  
                     informazzjoni dettaljata fuq l-istorja ta' l-għalqa minn fejn sar il-kampjunaġġ hija neċessarja; dan jinkludi l-lokalità, il-medda vegetali, trattamenti bl-użu ta' pestiċidi u/jew fertilizzanti, żidiet bioloġiċi jew kontaminazzjoni aċċidentali. Rigward id-deskrizzjoni tal-lokalità fejn sar il-kampjunaġġ, għandhom jiġu osservati r-rakkomandazzjonijiet ta' l-standard ta' l-ISO fuq il-kampjunaġġ tal-ħamrija (ISO 10381-6);
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     il-lokalità fejn sar il-kampjunaġġ trid tiġi definita skond il-metodu UTM (Proġettazzjoni Universali Trażversali Merkatorja/Datum Orizzontali Ewropew) jew permezz tal-koordinati ġeografiċi tiegħu; dan jista' jippermetti rikollizzjoni ta' kwalità ta' ħamrija partikolari fil-futur jew jist' jgħin jiddefinixxi l-ħamrija taħt sistemi varji ta' klassifikazzjoni użati f'pajjiżi differenti. Ukoll, jinġabar biss l'orizzont A sa fond massimu ta' 20 ċm. Speċjalment għal-kwalità ta' ħamrija n. 7 jekk il-ħamrija tagħmel parti minn orizzont Oh, dan irid jiġi miżjud fril-kampjunaġġ.
                  
               Il-kampjuni tal-ħamrija għandhom jinġarrew permezz ta' kontenituri u taħt u f'kondizzjonijiet ta' temperatura li jiggarantixxu li l-propjetajiet oriġinali tal-ħamrija ma jiġux mibdula b'mod sinifikattiv.
         1.7.3.2.   Ħażna
         L-użu ta' ħamrija prelevata reċentement huwa preferibbli. Biss meta dan ma jkunx possibbli l-ħamrija tista' tiġi maħżuna f'temperatura ambjentali u għandha tinżamm niexfa bl-arja. Għall-ħażna mhux rakkomandat l-ebda limitu ta' ħin partikolari, imma ħamrija maħżuna għal aktar minn tliet snin għandha tiġi rianalizzata qabel l-użu biex jiġi verifikat il-kontenut karboniku organiku, pH u CEC.
         1.7.3.3.   Manipolazzjoni u preparazzjoni tal-kampjuni tal-ħamrija għall-prova
         Il-ħamrija trid tiġi mnixxfa bl-arja f'temperatura ambjentali (preferibbilment bejn 20-25 oC). Is-disgregazzjoni trid tiġi magħmula bl-anqas forza possibbli, sabiex l-istruttura oriġinali tal-ħamrija tinbidel mill-anqas possibbli. Il-ħamrija trid tintgħarbel sa qies partikolari ≤ 2 mm; skond ir-rakkomandazzjonijiet tan-norma ta' l-ISO fuq il-kampjunaġġ tal-ħamrija (ISO 10381-6). Homogenità akkurata hija rakkomandata, peress li din tkabbar ir-reprouċibilità tar-riżultati. Il-kontenut ta' umdità f'kull kwalità ta' ħamrija hu determinat fuq tlett aliquoti msaħħna sa 105 oC CASemm ma jkun hemm l-ebda tibdil sinifikattiv fil-piż (approssimament 12 s). Għall-kalkoli kollha il-massa tal-ħamrija tirreferi għall-massa xxottata fil-forn, i.e. il-piż tal-ħamrija kkoreġut għall-kontenut ta' umdità tiegħu.
         1.7.4.   Preparazzjoni tas-sustanza sperimentali għall-applikazzjoni għall-ħamrija
         Is-sustanza sperimentali tiġi maħlula f'soluzzjoni 0,01 M CaCl2 f'ilma distillat jew deionizzat; is-soluzzjoni ta' CaCl2, użata bħala l-fażi tas-solvent bl-ilma, tiswa biex titjieb iċ-ċentrifugabilità u timminimizza l-iskambjar ta' katjoniku. Il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni maħżuna preferibbilment għandha tkun tlett ordini ta' kobor għola mil-limitu tas-sejba tal-metodu analitiku użat. Dan il-parametru jissalvagwardja miżuri akkurati fil- każ tal-metodoloġija użata f'dan il-metodu; barra minn hekk, il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni maħżuna għandha tkun inferjuri għas-solubilità tas-sustanza sperimentali fl-ilma.
         Preferibbilment, is-soluzzjoni maħżuna għandha titlesta' immedjatament qabel il-ħin ta' l-applikazzjoni għall-kampjuini tal-ħamrija u għandha tinżamm magħluqa fid-dlam f'4 oC. Il-ħin tal-ħażna jiddependi fuq l-istabbilità tas-sustanza sperimentali u l-konċentrazzjoni tagħha fis-soluzzjoni.
         Sustanzi lijdumu biex jinħallu biss (Sw < 10-4 g l-1), jista' jkun neċessarju aġent xieraq għas-solubilizazzjoni meta diffiċilment tinħall is-sustanza sperimentali. Dan l-aġent għas-solubilizazzjoni: (a) irid ikun jitħallat ma l-ilma bħal methanol jew acetonitrile; (b) il-konċentrazzjoni tiegħu ma tridx taqbeż 1 % tal-volum totali tas-soluzzjoni maħżuna u trid tikkostitwixxi anqas minn dan fis-soluzzjoni tas-sustanza sperimentali li tiġi f'kuntatt mal-ħamrija (preferibilment anqas minn 0,1 %); u (ċ) m'għandux ikun surfactant jew jagħti lok għal reazzjonijiet solvolitiċi mas-sustanza kimika sperimentali. L-użu ta' aġent solubilizzani għandu jiġi msemmi u ġustifikat fir-rapurtaġġ tad-data.
         Alternattiva oħra għal sustanzi li jinħallu bil-mod tikkonsisti fiż-żieda intenzjonali tas-sustanza sperimentali mas-sistema sperimentali: is-sustanza sperimentali tiġi maħlula ġo solvent organiku, u minn dan alikwota tiġi miżjuda mas-sistema tal-ħamrija u 0,01 M soluzzjoni ta' CaCl2 f'ilma distillat jew deionizzat. Il-kontenut tas-solvent organiku fil-fażi bl-ilma għandha tinżamm l-aktar baxxa possibbli, normalment li ma taqbiżx 0,1 %. Iż-żieda intenzjonali ta' soluzzjoni organika tista' tikkomprometti r-riproduċibilità mill-aspett tal-volum. Għaldaqstant, żball addizzjonali jista' jiġi introdott bħala s-sustanza sperimentali u konċentrazzjoni tal-kosolvent ma jkunx l-istess fil-provi kollha.
         1.8.   PREREQUIŻITI GĦALL-EŻEKUZZJONI TAL-PROVA TA' L-ADSORBIMENT/DESORBIMENT
         1.8.1.   Metodu analitiku
         Fost il-paramentri ewlenin li jistgħu jinfluwenzaw l-akkuratezza tal-miżuri tas-sorbiment hemm il-preċiżjoni tal-metodu analitiku fl-analiżi kemm tal-fażi soluzzjoni, kif ukoll tal-fażi ta' l-adsorbiment, l-istabilità u l-purezza tas-sustanza sperimentali, il-kisba ta' l-ekwilibriju tas-sorbiment, l-ordni tal-kobor tal-varjazzjonijiet ta' konċentrazzjoni tas-soluzzjoni, ir-rapport ħamrija/soluzzjoni u il-varjazzjonijiet fl-istruttura tal-ħamrija matul il-proċess ta' ekwilibrazzjoni (35) (59-62). Xi eżempji, fokalizzati fuq il-preċiżjoni, jinstgħabu fl-Anness 2.
         L-attendibilità tal-metodu analitiku li jintuża trid tiġi kontrollata fir-range ta' konċentrazzjoni li x'aktarx iseħħ matul il-prova. Min jagħmel l-esperiment għandu jħossu ħieles li jiżviluppa metodu xieraq b'akkuratezza, preċiżjoni, riproduċibilità, limiti ta' rivelazzjoni u ġbir xierq. Gwida għall-eżekuzzjoni tal-prova hija mogħtija fl-esperiment li ġej.
         Volum xieraq ta' 0,01 M CaCl2, e.ż. 100 ċm3, jitħawwad għal 4 s bil-piż ta' ħamrija, e.ż. 20 g, li għandha adsorbiment għoli, i.e. b'kontenut għoli ta' karbonju organiku u ta' tafal; dawn il-piżijiet u volumi jistgħu ivarjaw skond bżonnijiet analitiċi, imma rapport ħamrija/soluzzjoni ta' 1:5 jista' jirrapreżenta punt ta' bidu konvenjenti. It-taħlita tiġi ċentrifugata u l-fażi bl-ilma tista' tiġi filtrata. Ma' din ta' l-aħħar jiġi miżjud volum determinat ta' soluzzjoni maħżuna tas-sustanza sperimentali sabiex kiseb konċentrazzjoni nominali fil-kamp tar-range ta' konċentrazzjoni li x'aktarx iseħħ matul il-prova. Dan il-volum m'għandux jaqbeż 10 % tal-volum finali tal-fażi bl-ilma, sabiex in-natura tas-soluzzjoni ta' preekwilibrazzjoni tinbidel mill-anqas possibbli. Is-soluzzjoni tiġi analizzata.
         Sabiex jitqiesu s-sustanzi artifiċjali użati fil-mod analitiku u l-effetti martiċi kkawżati mill-ħamrija irid jiġi inkluż “blank run” li jikkonsisti f'sistema ta' ħamrija + soluzzjoni ta' CaCl2 (mingħajr iż-żieda tas-sustanza sperimentali).
         Għall-miżuri ta' sorbiment jistgħu jintużaw metodi analitiċi, fosthom kromatografija gass-likwidu (GLC), kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja (HPLC), spettrometrija (e.ż. GC/spettrometrija tal-massa, HPLC/spettrometrija tal-massa) u kont tax-xintillazzjonijiet likwidi (għall-sustanzi radjumarkati). Indipendentement mill-metodu analitiku użat, huwa meqjus adegwat jekk il-ġbir ikun bejn 90 % u 110 % tal-valur nominali. Sabiex titħalla l-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni wara li ssir r-ripartizzjoni, il-limiti tar-rivelazzjoni tal-metodu analitiku trid tkun ta' l-anqas żewġ ordinjiet ta' kobor anqas mill-konċentrazzjoni nominali.
         Il-karatteristiċi u limiti ta' rivelazzjoni tal-metodu analitiku utilizzat biex isiru l-istudji fuq l-adsorbiment huma importanti biex jiġu definiti il-kondizzjonijiet sperimentali u l-eżekuzzjoni sħiħa tal-prova. Dan il-metodu jsegwi skema sperimentali ġenerali u jipprovdi rakkomandazzjonijiet u linji gwida għal soluzzjonijiet alternattivi fejn il-metodu analitiku u l-faċilitajiet tal-laboratorju jimponi limitazzjonijiet.
         1.8.2.   Għażla tar-rapporti ottimali ħamrija/soluzzjoni
         Fl-istudji tal-fenomeni fuq is-sorbiment, l-għażla tar-rapporti ħamrija/soluzzjoni tiddependi mill-koeffiċjent tad-distribuzzjoni Kd u mill-grad relattiv ta' adsorbiment mixtieq. Il-varjazzjoni tal-konċentrazzjoni tas-sustanza fis-soluzzjoni tiddetermina l-preċiżjoni statistika tal-miżura li tiddependi mill-forma ta' l-ekwazzjoni ta' l-adsorbiment u, fil-każ ta' l-iskoperta tal-konċentrazzjoni tas-sustanza kimikafis-soluzzjoni, tal-limitazzjoni tal-metodoloġija analitika applikata. Għaldaqstant, fil-prattika ġenerali, ikun utli li jiġu adottati numru limitat ta' rapporti fissi, fejn il-perċentwali ta' adsorbiment tkun aktar minn 20 %, u preferibbilment > 50 % (62), fl-istess ħin kura trid tingħata sabiex il-konċentrazzjoni tas-sustanza sperimentali fil-fażi bl-ilma tkun dejjem għolja biżżejjed li tiġi mkejla bi preċiżjoni. Dan huwa partikolarment importanti meta il-perċentwali ta' adsorbiment ikunu għolja.
         Approċċ konvenjenti biex jintgħażlu r-rapporti ħamrija/ilma xierqa, jibbaża fuq stima tal-valur Kd permezz ta' studji preliminarji jew permezz ta' metodi ta' teknika ta' valutazzjoni stabbiliti (Anness 3). Ir-rapport xieraq jista' mbagħad jintgħażel fuq il-bażi ta' grafika tar-rapport ħamrija/soluzzjoni versus Kd għal persentaġġi fissi ta' adsorbiment (Fig. 1). Tali grafika hija bbażata fuq il-preżuppost li l-ekwazzjoni ta' l-assorbiment hija lineari (10). Ir-ralazzjoni applikabbli tinkiseb billi titranġa l-ekwazzjoni (4) tal-Kd fil-forma ta' ekwazzjoni
         
                     
                        
                  
                  
                     (1)
                  
               jew fil-forma logaritmika tagħha, billi tassumi li R = msoil/V0 and Aeq %/100 = :
         
                     
                        
                  
                  
                     (2)
                  
               Fig. 1 turi rapporti ħamrija/soluzzjoni meħtieġa bħalha funzjoni Kd għal-livelli differenti ta' adsorbiment. Pe reżempju, għal rapport ħamrija/soluzzjoni ta' 1:5 u Kd ta' 20, l-adsorbiment għandu jkun ta' madwar 80 %. Biex jinkiseb 50 % adsorbiment għall-istess ammont ta' Kd, irid jintuża rapport ta' 1:25. Dan l-approċċ, biex jintagħżlu rapporti xierqa ħamrija/soluzzjoni, joffri lill-investigatur il-flessibilità neċessarja biex ilaħħaq ma' l-eżiġenzi sperimentali.
         L-akbar diffikultajiet huma dawk fejn is-sustanza kimika tiġi adsorbita b'doża għolja ħafna jew baxxa ħafna. Meta jkun hemm adsorbiment baxx, hu rakkomandabbli l-użu ta' rapport ħamrija/soluzzjoni ta' 1:1, għalkemm għal xi tipi ta' ħamrija ta' kontenut organiku għoli jistgħu jkunu neċessarji miżuri iżar sabiex tinkiseb taħlita likwida. Fil-metodoloġija analitika kura trid tingħata biex jitkejjlu bidliet żgħar fil-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni; inkella l-kejl ta' l-adsorbiment ma jkunx preċiż. Minn naħa l-oħra, għal valuri għolja ħafna ta' Kd, tista' tasal għal rapporti ħamrija/soluzzjoni ta' 1:100 biex tħalli fis-soluzzjoni kwantità sinifikattiva ta' sustanza kimika. Madankollu, kura trid tingħata sabiex taħlit sew jiġi żgurat, ħin adegwat irid jitħalla biex is-sistema tilħaq ekwilibriju. Biex issolvi dawn il-każijiet estremi meta metodoloġija analitika tkun nieqsa, possibiltà oħra hija dik li tipprevedi l-valur ta' Kd bl-użu ta' tekniċi ta' valutazzjoni bbażati, pereżempju, fuq valuri Pow (Anness 3). Dan jista' jkun utli speċjalment għal sustanzi kimiċi li għandhom adsorbiment baxx/polari b' Pow < 20 u għal dawk lipofili/altament sorbitivi b' Pow > 104.
         1.9.   EŻEKUZZJONI TAL-PROVA
         1.9.1.   Il-kondizzjonijiet tal-prova
         L-esperimenti kollha iridu jsiru f'temperatura ambjentali u, jekk possibbli, f'temperatura kostanti bejn 20 oC u 25 oC.
         Il-kondizzjonijiet għaċ-centrifugazzjoni iridu jippermettu t-tneħħija ta' partiċelli akbar minn 0,2 μm mis-soluzzjoni. Dan il-valur huwa l-iżar partiċella li hija kkunsidrata partiċella solida, u jirrapreżenta l-limitu bejn partiċelli solidi u kolloidali. Gwida biex jiġu stabbiliti l-kondizzjonijiet taċ-ċentrifugazzjoni hija mogħtija fl-Anness 4.
         Jekk il-faċilitajiet taċ-ċentrifugazzjoni ma jkunux jistgħu jiggarantixxu t-tneħħija ta' partiċelli akbar minn 0,2 μm, kombinazzjoni ta' ċentrifugazzjoni u filtrazzjoni b'filtri 0,2 μm tista' tintuża. Dawn il-filtri għandhom ikunu magħmula minn materjal inert xieraq biex jinevita telf tas-sustanza sperimentali fuqhom. F'kull każ, għandu jiġi ppruvat li ma jkun hemm l-ebda telf tas-sustanza sperimentali matul il-filtrazzjoni.
         1.9.2.   Stadju 1 – Studju preliminarju
         L-iskop ta' studju preliminarju diġà ngħata fis-sezzjoni Skop. Gwida biex issir tali prova hija mgħotija fl-esperiment suġġerit hawn taħt.
         1.9.2.1.   Selezzjoni tar-rapporti ottimali ħamrija/soluzzjoni
         Jintużaw żewġ tipi ta' ħamrija u tlett rapporti ħamrija/soluzzjoni (sitt esperimenti). Tip ta' ħamrija għandha kontenut għoli ta' karbonju organiku u kontenut baxx ta' tafal, u l-oħra għandha kontenut baxx ta' karbonju organiku u kontenut għoli ta' tafal. Ir-rapporti ħamrija/soluzzjoni huma suġġeriti:
         
                     —
                  
                  
                     50 g ħamrija u 50 ċm3 soluzzjoni bl-ilma tas-sustanza sperimentali (rapport 1/1),
                  
               
                     —
                  
                  
                     10 g ħamrija 50 ċm3 soluzzjoni bl-ilma tas-sustanza sperimentali (rapport 1/5),
                  
               
                     —
                  
                  
                     2 g ħamrija u 50 ċm3 soluzzjoni bl-ilma tas-sustanza sperimentali (rapport 1/25).
                  
               L-ammont minimu ta' ħamrija li għandha tintuża tiddependi mill-faċilitajiet tal-laboratorju u l-eżekuzzjoni tal-metodi analitiċi użati. Madankollu, biex jinkisbu riżultati affidabbli mill-prova, hu rakkomandat illi tintuża mill-anqas 1 g, u preferibbilment 2 g.
         Sabiex tiġi verifikata l-istabbilità tas-sustanza sperimentali fis-soluzzjoni ta' CaCl2 u l-adsorbiment eventwali fuq il-ħitan tal-kontenituri, irid jitlesta' kampjun ta' riferiment li ma jkunx fiħ ħamrija imma jkun fih biss is-sustanza sperimentali f'soluzzjoni ta' 0,01 M CaCl2 li jiġi sottopost eżattament għall-istess passi tas-sistemi sperimentali.
         Għal kull ħamrija jiġi preparat “blank run” bl-istess ammont ta' ħamrija u volum totali ta' soluzzjoni 50 ċm30,01 M CaCl2 (mingħajr prova sperimentali) li tiġi sottoposta għall-istess proċedura sperimentali. Dan iservi bħala kontroll bażiku matul l-analiżi biex jiġu skoperti sustanzi li jinterfeixxu jew ħamrija kontaminata.
         L-esperimenti kollha, inklużi kontrolli u “blanks”, għandhom isiru minn l-anqas darbtejn. In-numru totali ta' kampjuni li għandhom jitlestew għall-istudju għandhom jiġu kalkolati skond il-metodoloġija li tiġi segwita.
         Metodi għall-istudju preliminarju u l-istudju ewlieni huma ġeneralment l-istess, eċċezzjonijiet imsemmija fejn rilevanti.
         Il-kampjuni tal-ħamrija mnixxfin bl-arja jiġu ekwilibrati billi jitħawdu għal (12 s) lejl sħih qabel jum l-eaperiment, b'volum minimu ta' 45 ċm3 ta' 0,01 M CaCl2. Wara jiżdied ċertu volum tas-soluzzjoni riżerva tas-sustanza sperimentali sa total ta' 50 ċm3. Il-volum tas-soluzzjoni riżerva miżjud: (a) m'għandux ikun aktar minn 10 % tal-volum finali 50 ċm3 tal-fażi bl-ilma sabiex issir l-anqas bidla possibbli lin-natura tas-soluzzjoni pre-ekwilibrata; u (b) għandu jirriżulta, preferibilment, f'konċentrazzjoni inizjali tas-sustanza sperimentali f'kuntatt mal-ħamrija (C0) akbar b'żewġ ordnijiet ta' preferenza mill-anqas, ta' l-iskoperta tal-metodu analitiku, sabiex tiġi salvagwardjata l-kapaċità biex isiru mizuri eżatti ankè meta l-adsorbiment ikun qawwi (> 90 %) u biex wara jiġu stabbiliti l-iżotermi ta' l-adsorbiment. Hu rakkomandat ukoll, jekk possibbli, illi l-konċentrazzjoni inizjali tas-sustanza (C0) ma taqbiżx in-nofs tal-limitu tas-solubilità tagħha.
         L-eżempju li jmiss juri l-mod kif tikkalkula l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni riżerva (Cst). Tibda bil-ħsieb illi l-limitu ta' rivelazzjoni huwa 0,01 μg ċm-3 u l-adsorbiment huwa ta' 90 %; għaldaqstant, il-konċentrazzjoni inizjali tas-sustanza sperimentali f'kuntatt mal-ħamrija trid tkun, preferibbilment, 1 μg ċm-3 (żewġ ordnijiet ta' kobor għola mil-limitu ta' rivelazzjoni). Jekk jiżdied il-massimu rakkiomandat tal-volum tas-soluzzjoni maħżuna, i.e. 5 sa 45 ċm3 tas-soluzzjoni ta' ekwilibrazzjoni ta' CaCl20,01 M (= 10 % tas-soluzzjoni maħżuna għal volum totali ta' 50 ċm3 tal-fażi bl-ilma), il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni maħżuna għandha tkun ta' 10 μg ċm-3; jiġifieri ogħla bi tliet ordnijiet ta' kobor mil-limitu ta' rivelazzjoni tal-metodu analitiku.
         Il-pH tal-fażi bl-ilma għandu jitkejjel qabel u wara kuntatt mal-ħamrija peress li għandu rwol importanti fil-proċess kollu ta' l-adsorbiment, speċjalment għal sustanzi ionizzabbli.
         It-taħlita titħawwad CASemm jintlaħaq l-ekwilibriju ta' l-adsorbiment. Il-ħin ta' l-ewilibriju fil-ħamrija huwa varjabbli ħafna, skond is-sustanza kimika fil-ħamrija; perjodu ta' 24 s huwa biżżejjed normalment (77). Fl-istudju preliminari, kampjuni jistgħu jinġabru b'sekwenza matul perjodu ta' taħlit ta' 48 s (pereżempju f'4, 8, 24, 48 s). Madankollu, il-ħinijiet ta' l-analiżi iridu jiġu meqjusa bi flessibilità skond l-iskeda ta' xogħol tal-laboratorju.
         Hemm żewġ alternattivi għall-analiżi tas-sustanza sperimentali fis-soluzzjoni bl-ilma: (a) il-metodu paralleli (b) il-metodu f'serje. għandu jingħad illi, għalkemm il-metodu paralleli huwa aktar tedjanti fil-kamp sperimentali, it-trattament matematiku tas-soluzzjonijiet huwa aktar sempliċi (Anness 5). Madankollu, l-għażla tal-metodoloġija li għandha tintuża, hija f'idejn il-persuna li tagħmel l-esperiment li tkun trid tqis il-faċilitajiet tal-laboratorju u r-riżorsi li huma disponibbli.
         
                     (a)
                  
                  
                     Metodu paralleli: kampjuni bl-istess relazzjoni ħamrija/soluzzjoni humw ppreparati, bl-istess numru ta' intervalli ta' ħin li hu mixtieq biex isir l-istudju tal-kinetika ta' l- adsorbiment. Wara ċentrifugazzjoni u, jekk mixtieq, filtrazzjoni, il-fażi bl-ilma ta' l-ewwel pipetta tiġi miġbura bl-aktar mod komplet possibbli u titkejjel wara, pereżempju, 4 s, dik tat-tieni pipettta wara 8 s, dik tat-tielet wara 24, eċċ.
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     Metodu f'serje: għal kull rapport ħamrija/soluzzjoni jiġi preparat biss kampjun kampjun doppju wieħed. f'intervalli determinati ta' ħin it-taħlita tiġi ċentrifugata biex il- fażijiet jiġu separati. Alikwota żgħira ta' riżorsi tiġi immedjatament analizzata għas- sustanza sperimentali; imbagħad l-esperiment ikompli bit-taħlita oriġinali. Jekk l- filtrazzjoni tiġi applikata wara ċ-ċentrifugazzjoni, il-laboratorju għandu jkollu faċilitajiet biex issir l-filtrazzjoni ta' aliquoti bl-ilma żgħar. Huwa rakkomandabbli li l-volum totali ta' laliquoti meħuda, ma jkunx aktar mjinn 1 % tal-volum totali tas-soluzzjoni, sabiex ir- rapport ħamrija/soluzzjoni ma jinbidilx b'mod sinifikattiv u biex titnaqqas il-massa tas- solute disponibbli għall-adsorbiment matul il-prova.
                  
               Il-perċentwali ta' l-adsorbiment  huwa kkalkolat f'kull punt ta' ħin (ti) fuq il-bażi tal-konċentrazzjoni inizjali nominali u l-konċentrazzjoni mkejla fil-ħin tal-kampjunaġġ (ti), korrett għall-ħin tal-‘blank’. Plots ta' l-  versus l-ħin (Fig. 1 Anness 5) huma magħmula sabiex jiġi vvalutat jekk inkisbitx il-pjattaforma ta' l-ekwilibriju (11). Il-valur Kd fl-ekwilibriju jiġi kkalkolat ukoll. Ibbażat fuq dan il-valur Kd, u bl-użu tal-Fig.1 jintagħżlu rapporti xierqa ħamrija/soluzzjoni, sabiex il-perċentwali ta' l-adsorbiment taqbeż 20 % u preferibbilment > 50 % (61). L-ekwazzjonijiet u l-prinċipji tal-plotting kollha applikabbli huma mgħotija fit-taqsima fuq id-Data u rapurtaġġ u fl-Anness 5.
         1.9.2.2.   Determinazzjoni tal-ħin ta' ekwilibrazzjoni ta' l-adsorbiment u ta' l-ammont sustanza sperimentali adsorbita fl-ekwilibriju
         Kif digà msemmi, plots ta'  jew  versus il-ħin jippermettu stima tat-twettieq ta' l-ekwilibriju ta' l-adsorbiment u l-ammont ta' sustanza sperimentali adsorbita fl-ekwilibriju. Il-figuri 1 u 2 fl-Anness 5 juru eżempji ta' tali plots. Il-ħin ta' l-ekwilibriju huwa dak neċessarju biex is-sistema tilħaq pjattaforma.
         Jekk, b'ħamrija partikolari, ma tintlaħaqx pjattaforma iżda issir żieda kontinwa, din tista' tkun dovuta għal fatturi ta' komplikazzjoni bħal biodegredazzjoni jew diffużjoni bil-mod. Biodegradazzjoni tista' tintwera' billi jirrepeta l-isperiment b'kampjun sterilizzat tal-ħamrija. Jekk anke f'dan il-każ ma tintlaħaq l-ebda pjattaforma, min qed jagħmel l-esperiment għandu jfittex fenomeni oħra li jistgħu ikunu involuti fl-istudji speċifiċi tiegħu; dan jista' jsir b'modifikazzjonijiet xierqa tal-kondizzjonijiet ta' l-esperiment (temperatura, ħin tat-taħwid, rapporti ħamrija/soluzzjoni). Ukoll, min qed jagħmel l-esperiment irid jiddeċidi jekk ikomplix il-proċedura sperimentali malgrad ta' eventwali possibilità li jintlaħaq ekwilibriju.
         1.9.2.3.   L-adsorbiment fil-wiċċ tal-kontenituri u l-istabilità tas-sustanza sperimentali
         Xi informazzjoni fuq l-istabliltà tas-sustanza sperimentali u l-adsorbiment tagħha fil-wiċċ tal-kontenituri tagħha tista' tinkiseb billi ssir analiżi tal-kampjuni tal-kontroll. Jekk tiġi osservata deplezzjoni akbar minn l-iżball standard tal-metodu analitiku, tista' tkun kaużata minn degredazzjoni abiotika u/jew adsorbiment fil-wiċċ tal-kontenitur sperimentali. Distinzjoni bejn dawn iż-żewġ fenomeni tista' tintlaħaq billi jinħaslu sew il-ħitan tal-kontenitur b'volum magħruf ta' solvent xieraq u billi jiġi analizzat il-likwidu tal-ħasil għas-sustanza sperimentali. Jekk l-ebda adsorbiment ma jinstab fil-wiċċ tal-kontenituri sperimentali, il-fasda turi instabilità abiotika tas-sustanza sperimentali. Jekk jinstab adsorbiment, bdil tal-materjal tal-kontenituri sperimentali ikun neċessarju. Madankollu, data fuq l-adsorbiment tal-wiċċ tal-kontenituri sperimentali miġbura minn dan l-esperiment ma tistax tiġi estrapolata direttament lill-esperiment ħamrija/soluzzjoni. Il-preżenza ta' ħamrija taffetwa l-adsorbiment.
         Informazzjoni addizzjonali fuq l-istabilità tas-sustanza sperimentali tista' tinkiseb billi jiġi stabbilit bilanċ tal-massa proġenitriċi fiż-żmien. Dan ifisser illi l-fażi bl-ilma, estratti ta' ħamrija u ħitan ta' kontenituri sperimentali jiġu analizzati għas-sustanza sperimentali. Id-differenza bejn il-massa ta' kimika sperimentali miżjuda u s-somma tal-massi kimiċi sperimentali fil-fażi bl-ilma, fl-estratti tal-ħamrija u fil-ħitan ta' kontenituri sperimentali huwa ugwali għal massa degredata u/jew volatilizzata u/jew mhux estratta. Sabiex issir determinazzjoni tal-bilanċ tal-massa, l-ekwilibriju ta' adsorbiment trid tintlaħaq matul l-perjodu ta' l-esperiment.
         Il-bilanċ tal-massa jrid isir kemm fuq ħamrija kif ukoll fuq rapport ħamrija/soluzzjoni għal kull tip ta' ħamrija li fl-ekwilibriju tagħti lok għal fasda għola minn 20 % u preferibbilment > 50 %. Meta l-esperiment għar-riċerka tar-rapporti jintemm bl-analiżi ta' l-aħħar kampjun tal-ħażi bl-ilma wara 48 s, il-fażijiet iridu jiġu separati permezz ta' ċentrifugazzjoni u, jekk mixtieqa, filtrazzjoni. Il-fażi bl-ilma trid tinġabar fl-akbar kwantità possibbli, biż-żieda ta' solvent ta' estrazzjoni adatt (koeffiċjent ta' estradizzjoni mhux anqas minn 95 %) mal-ħamrija biex tiġi estratta s-sustanza sperimentali. Minn l-anqas żewġ estrazzjonijiet suċċessivi huma rakkomandati. L-ammont ta' sustanza sperimentali estratt mill-ħamrija u mill-kontenitur jiġi determinat u l-bilanċ tal-massa jiġi kkalkolat (ekwazzjoni 10, data u rapurtaġġ). Jekk ikun anqas minn 90 %, is-sustanza sperimentali hija meqjusa instabbli fil-perjodu ta' ħin ta' l-esperiment. Madankollu, studji xorta jistgġu jitkomplew, għalkemm l-instabilità tas-sustanza sperimentali trid tiġi meqjusa; f'dan il-każ huwa rakkomandat biex jiġu analizzati ż-żewġ fażijiet fl-istudju prinċipali.
         1.9.2.4   Stadju 2 – Kinetika ta' l-adsorbiment għal konċentrazzjoni ta' sustanza sperimentali
         Jintużaw ħames kwalitajiet ta' ħamrija, selezzjonati minn Tabella 1. Jekk dan ikun xieraq, huwa vantaġġuż jekk tintuża kull kwalità ta' ħamrija użata fl-istudju preliminari fost dawn il-ħames kwalitajiet ta' ħamrija. F'dan il-każ, Stadju 2 m'għandux jerġa' jiġi repetut għall-kwalitajiet ta' ħamrija użati fl-istudju preliminarju.
         Il-ħin ta' l-ekwilibriju, ir-rapport ħamrija/soluzzjoni, il-piż tal-kampjun tal-ħamrija, il-volum tal-fażi bl-ilma f'kuntatt mal-ħamrija u il-konċentrazzjoni tas-sustanza sperimentali fis-soluzzjoni huma magħżula fuq il-bażi tar-riżultati ta' l-istudji preliminarji. L-analiżi trid issir, bejn wieħed u ieħor, 2, 4, 6, 8 (possibliment ankè 10) u 24 s wara l-ħin tal-kuntatt; il-ħin tat-taħwid jista' jiġi estiż sa massimu ta' 48 s fil-każ illi sustanza kimika tirrikjedi ħin itwal biex jintlaħaq l-ekwilibriju fil-każ tar-riżultati tar-riċerka fil-qasam tar-rapporti. Madankollu, il-ħinijiet ta' l-analiżi jridu jiġu kkunsidrati b'flessibilità.
         Kull esperiment (ħamrija waħda u soluzzjoni waħda) isir doppju mill-inqas biex tkun tista' tiġi vvalutata l-varjanza fir-riżultati. F'kull esperiment isir wieħed “blank”. Dan jikkonsisti fil-ħamrija u fis-soluzzjoni ta' CaCl20,01 M, mingħajr iż-żieda ta' sustanza sperimentali, ta' piż u volum, rispettivament, identiku għal dak ta' l-esperiment. Sabiex ikun hemm salvagwardja għall-imprevvist, kampjun ta' kontroll bis-sustanza sperimentali fis-soluzzjoni ta' CaCl20,01 M biss (mingħajr ħamrija) jiġi soġġett għall-istess proċedura sperimentali.
         Il-persentaġġ ta' adsorbiment jiġi kkalkolat f'kull punt ta' ħin  u/jew intervall ta' ħin  (skond il-bżonn) impinġi kontra l-ħin. Jiġu ukoll ikkalkolati l-koeffiċjent ta' distribuzzjoni Kd at equilibrium, u l-koeffiċjent ta' adsorbiment normalizzat tal-karbonju organiku Koc (għall-komposti kimiċi organiċi mhux polari).
         Riżultati tal-provi fuq il-kinetika ta' l-adsorbiment
         Il-valur linjari Kd hu ġeneralment preċiż biżżejjed biex tkun jista' tiġi deskritta l-imġieba relattiva għas-sorbiment fil-ħamrija (35) (78) u jirrapreżenta espressjoni tal-mobilità intrinsika tal-prodotti kimiċi fil-ħamrija. Pereżempju, ġeneralment, kimiċi b' Kd ≤ 1 cm3 g-1 huma meqjusa kwalititivament mobblì. Simili hija l-iskema ta' klassifikazzjoni tal-mobilità bbażata fuq valuri Koc żviluppata minn MacCall et al. (16). Addizzjonalment, jeżistu skemi ta' klassifikazzjoni ta' filtrazzjoni li huma bbażati fuq ir-relażżjoni bejn Koc u DT-50 (12) (32) (79).
         Ukoll, skond studji fuq l-analiżi ta' l-iżbalji (61), valuri Kd anqas minn 0,03 cm3 g-1 ma jistgħux jiġu vvalutati akkuratament minn tnaqqis fil-konċentrazzjoni fil-fażi bl-ilma, ankè meta jintuża l-aktar rapport ħamrija/soluzzjoni favorevoli (mil-lat tal-preċiżjoni), i.e. 1:1. F'dan il-każ l-analiżi taż-żewġ fażijiet, ħamrija u soluzzjoni, hija rakkomandata.
         Rigward l-osservazzjonijiet magħmula 'l fuq, huwa rakkomandat illi jitkompla l-istudju ta' l-imġieba ta' l-adsorbiment ta' prodott kimiku fil-ħamrija u l-mobilità potenzali tiegħu billi jiġu stabbiliti l-iżotermi ta' adsorbiment skond Freundlich għal dawn is-sistemi, għal liema, id-determinazzjoni ta' Kd hija possibbli bil-protokoll sperimentali segwit f'dan il-metodu sperimentali. Determinazzjoni akkurata tkun possibbli jekk il-valur li jirriżulta billi ssir multiplikazzjoni tal- Kd mar-relazzjoni ħamrija/soluzzjoni ikun > 0,3, meta l-miżuri jkunu bbażati fuq tnaqqis fil-konċentrazzjoni fil-fażi bl-ilma (metodu indirett), jew > 0,1, meta ż-żewġ fażijiet jiġu analizzati (metodu dirett) (61).
         1.9.2.5.   Stadju 3 – Iżotermi ta' adsorbiment u kinetika ta' desorbiment/iżotermi ta' desorbiment
         1.9.2.5.1.   Iżotermi ta' adsorbiment
         
         Jintużaw ħames konċentrazzjonijiet tas-sustanza, li jkopru żewġ ordnijiet ta' kobor; fl-għażla ta' dawn il-konċentrazzjonijiet għandhom jiġu meqjusa s-solubilità fl-ilma u l-konċentrazzjoni fl-ekwilibriju bl-ilma li jirriżulta. L-istess relazzjoni ħamrija/soluzzjoni għal kull kwalità ta' ħamrija għandha tinżamm għat-tul kollu ta' l-istudju. Il-prova ta' l-adsorbiment hija magħmula kif deskritt 'il fuq, bl-uniku differenza illi l-fażi bl-ilma tiġi analizzata darba biss fil-ħin neċessarju biex jintlaħaq l-ekwilibriju kif determinat qabel fl-Istadju 2. Il-konċentrazzjonijiet ta' l-ekwilibriju fis-soluzzjoni jiġu determinati u l-ammont adsorbit jiġi kkalkolat mill-fasda tas-sustanza sperimentali fis-soluzzjoni jew bil-metodu indirett. Il-massa adsorbita għall-unità tal-massa tal-ħamrija tiġi mpinġija grafikament bħala funzjoni tal-konċentrazzjoni fl-ekwilibriju tas-sustanza sperimentali (ara Data u rapurtaġġ).
         Riżultati ta' l-esperiment għall-iżotermi ta' l-adsorbiment
         Fost il-mudelli matematiċi ta' l-adsorbiment proposti s'issa, l-iżoterma Freundlich hija dik li tintuża l-iktar biex tiddeskrivi l-proċess ta' l-adsorbiment. Informazzjoni aktar dettaljata fuq l-interpretazzjoni u l-importanza tal-mudelli ta' l-adsorbiment hija previst fir-referenzi (41) (45) (80) (81) (82).
         
            Nota: Għandu jiġi osserva illi, għal sustanzi varji, konfront bejn il-valuri ta' KF (koeffiċjent ta' l-adsorbiment ta' Freundlich) hu possibbli biss jekk dawn il-valuri K F huma espressi fl-istess unità (83).
         1.9.2.5.2.   Kinetika tad-desorbiment
         
         L-għan ta' dan l-esperiment huwa illi jiġi nvestigat jekk sustanza kimika tiġix adsorbita riversibilment jew irriversibilment mill-ħamrija. Din l-informazzjoni hija mportanti, peress illi l-proċess ta' desorbiment għandu ukoll rwol importanti fl-imġieba ta' sustanza kimika f'ħamrija ta' l-għalqa. Madankollu, id-data tad-desorbiment tikkontribwixxi utilment għall-mudellar kompjuterizzat tal-filtrazzjoni u għas-simulazzjoni tas-sustanza li tddewweb. Jekk studju ta' desorbiment ikun mixtieq, huwa rakkomandat li l-istudju rakkomandat hawn taħt isir fuq kull sistema fejn determinazzjoni akkurata ta' Kd fil-esperiment tal-kinetika ta' l-adsorbiment preċedenti tkun possibbli.
         B'mod analogu ma' l-istudju tal-kinetika ta' l-adsorbimetnt, biex tiġi studjata l-kinetika tad-desorbiment hemm żewġ metodi: (a) il-metodu paralleli u (b) il-metodu f'serje. L-għażla tal-metodoloġija li għandha tapplika titħalla f'idejn min ikun qed jagħmel l-esperiment li jkun irid jikkonsidra il-faċilitajiet disponibbli u r-riżorsi tal-laboratorju.
         
                     (a)
                  
                  
                     Metodu paralleli: għal kull ħamrija magħżula għall-istudju fuq id-desorbiment, jitlestew kampjuni bl-istess relazzjoni ħamrija/soluzzjoni, daqs kemm hemm intervalli ta' ħin li fihom tixtieq tiġi studjata l-kinetika tad-desorbiment. Preferibilment, jiġu applikati l-istess intervalli ta' ħin utilizzati għall-kinetika ta' l-adsorbiment; madankollu, il-ħin totali jista' jiġi estiż skond in-neċessità sabiex is-sistema tkun tista' tilħaq l-ekwilibriju ta' desorbiment. F'kull esperiment (ħamrija waħda, soluzzjoni waħda) isir wieħed “blank”. Dan jikkonsisti fil-ħamrija u fis-soluzzjoni 0,01 M ta' CaCl2, mingħajr is-sustanza sperimentali, u ta' piż u valur, rispettivament, identiku għal dawk ta' l-esperiment. Bħala kampjun ta' kontroll, is-sustanza sperimentali fis-soluzzjoni 0,01 M ta' CaCl2 (mingħajr ħamrija) hija soġġetta għall-istess proċedura sperimentali. It-taħlit kollu tas-soluzzjoni mal-ħamrija jitħawwad sakemm jintlaħaq l-ekwilibriju ta' l-adsorbiment (kif determinat qabel fl-Istadju 2). Imbagħad, il-fażijiet jiġu separati permezz ta' ċentrifugazzjoni u l- fażijiet bl-ilma, kemm ikun possibbli, jitneħħew. Il-volum ta' soluzzjoni mneħħi jiġi sostitwit b'volum ugwali ta' 0,01 M CaCl2 mingħajr is-sustanza sperimentali u t-taħlit il-ġdid jiġi mħawwad mill-ġdid. Il-fażi bl-ilma ta' l-ewwel pipetta tiġi miġbura bl-aktar mod komplet possibbli u tiġi mkejla, pereżempju, wara 2 s, dik tat-tieni pipetta wara 4 s, dik tat-tielet wara 6 s, eċċ. CASemm jintlaħaq l-ekwilibriju tad-desorbiment.
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     Metodu f'serje: wara l-esperiment tal-kinetika ta' l-adsorbiment, it-taħlita tiġi ċentrifugata u l-fażi bl-ilmam, sakemm ikun possibbli, titneħħa. Il-volum tas-soluzzjoni li jitneħħa jiġi sostitwit b'volum ugwali ta' CaCl20,01 M, mingħajr is-sustanza sperimenmtali. It-taħlita l-ġdida tiġi mħawwda CASemm jintlaħaq l-ekwilibriju tad-desorbiment. Matul dan il-perjodu ta' żmien, f'intervalli definiti ta' ħin, it-taħlita tiġi ċentrifugata biex jiġu separati l-fażijiet. Alikuota żgħira tal-fażi bl-ilma tiġi immedjatament eżaminata għas-sustanza sperimentali; imbagħad, l-esperiment ikompli bit-taħlita oriġinali. Il-volum ta' kull alikwota individwali għandu jkun inqas minn 1 % tal-volum totali. Tiġi miżjuda mat-taħlita l-istess kwantità ta' soluzzjoni friska ta' CaCl20,01 M biex jinżamm l-istess rapport ħamrija/soluzzjoni, u tkompli tiġi mġawda sa l-intervall ta' ħin li jmiss.
                  
               Il-perċentwlai tad-desorbiment jiġi kkalkolatf'kull punt ta' ħin  u/jew intervall ta' ħin  (skond l-eżiġenzi ta' l-istudju) u tiġi mpinġija grafikament kontra l-ħin. Jiġi kkalkolat ukoll il-koeffiċjent tad-desorbiment Kdes fl-ekwilibriju. L-ekwazzjonijiet applikabbli kollha huma msemmija f'Data u Rapurtaġġ u Anness 5.
         Riżultati ta' l-esperiment fuq il-kinetika tad-desorbiment
         Tpinġija grafika kommuni tal-persentaġġ ta' desorbiment  u l-adsorbiment  kontra l-ħinjippermettu stima tar-riversibilità tal-proċess ta' l-adsorbiment. Jekk l-ekwilibriju tad-desorbiment jintlaħaq ankè f'darbtejn il-ħin ta' l-ekwilibriju ta' l-adsorbiment, u d-desorbiment totali ikun aktar minn 75 % ta' l-ammont adsorbit, l-adsorbiment huwa meqjus irriversibbli.
         1.9.2.5.3.   Iżotermi tad-desorbiment
         
         L-iżotermi tad-desorbiment skond Freundlich huma determinati fuq ħamrija użata fl-esperiment fuq l-iżotermi ta' l-adsorbiment. Il-prova tad-desorbiment issir kif deskritta fit-taqsima Kinetika tad-desorbiment, bl-unika differenza illi il-fażi bl-ilma tiġi analizzata darba biss, fl-ekwilibriju tad-desorbiment. Jiġi kkalkolat l-ammont ta' sustanza sperimentali desorbit. Il-kontenut tas-sustanza sperimentali li tibqa adsorbita fuq il-ħamrija fl-ekwilibriju tad-desorbiment tiġi mpinġija grafikament bħalha funzjoni tal-konċentrazzjoni ta' l-ekwilibriju tas-sustanza sperimentali fis-soluzzjoni (ara Data u rapurtaġġ u Anness 5).
         2.   DATA U RAPURTAĠĠ
         Id-data analitika tiġi preżentata f'forma ta' tabella (ara Anness 6). Jingħataw il-miżuri u l-medji individwali kalkolati. Jingħataw rappreżentazzjonijiet grafiċi ta' l-iżotermi ta' l-adsorbiment. Il-kalkoli jsiru kif deskritt hawn taħt.
         Għall-iskop tal-prova, huwa meqjus illi l-piż ta' 1 cm3 ta' soluzzjoni bl-ilma huwa 1 g. Ir-rapport ħamrija/soluzzjoni jista' jiġi espress f'unità ta' w/w jew w/vol għall-istess figura.
         2.1.   ADSORBIMENT
         L-adsorbiment ) huwa definit bħala l-persentaġġ tas-sustanza adsorbita fuq il-ħamrija relatata mal-kwantità preżenti fil-bidu tal-prova, taħt il-kondizzjonijiet sperimentali. Jekk is-sustanza sperimentali tkun stabbli u ma t'adsorbix b'mod sinifikattiv mal-ħajt tal-kontenitur , tiġi kkalkolata f'kull punt ta'ħin t1, skond l-ekwazzjoni:
         
                     
                        
                  
                  
                     (3)
                  
               meta:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     presentaġġ ta' adsorbiment fil-punt ta' ħin ti ( %);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     massa tas-sustanza sperimentali adsorbita fuq il-ħamrija fil-ħin ti (μg);
                  
               
                     m0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     massa tas-sustanza sperimentali fil-pipetta fil-bidu tal-prova (μg).
                  
               Informazzjoni dettaljata fuq kif għandu jiġi kkalkolat il-persentaġġ ta' adsorbiment  għall-metodi paralleli u f'serje hija mogħtija fl-Anness 5.
         Il-koeffiċjent ta' distribuzzjoni Kd huwa r-relazzjoni bejn il-kontenut tas-sustanza fil-fażi tal-ħamrija u l-konċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza fis-soluzzjoni bl-ilma, taħt il-kondizzjonijiet tal-prova meta jintlaħaq l-ekwilibriju ta' l-adsorbiment.
         
                     
                        (cm3 g-1)
                  
                     (4)
                  
               meta:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     kontenut tas-sustanza adsorbita fuq il-ħamrija fl-ekwilibriju ta' l-adsorbiment (μg g-1);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza fil-fażi bl-ilma fl-ekwilibriju ta' l-adsorbiment (μg cm-3). Din il-konċentrazzjoni tiġi analitikament determinata billi jitqiesu il-valuri mogħtija mill-“blanks”
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     massa tas-sustanza adsorbita fuq il-ħamrija fl-ekwilibriju ta' l-adsorbiment (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     massa tas-sustanza fis-soluzzjoni fl-ekwilibriju ta' l-adsorbiment (μg);
                  
               
                     msoil
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     kwantità tal-fażi ħamrija, espressa f'massa xotta tal-ħamrija (g);
                  
               
                     V0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     volum inizjali tal-fażi bl-ilma f'kuntatt mal-ħamrija (cm3).
                  
               Ir-relazzjoni bejn Aeq u Kd hija mogħtija minn:
         
                     
                        (cm3 g-1)
                  
                     (5)
                  
               meta:
         
                     Aeq
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     persentaġġ ta' adsorbiment fl-ekwilibriju ta' l-adsorbiment, %.
                  
               Il-koeffiċjent normalizzat ta' l-adsorbiment tal-karbonju organiku Koc jirrelata l-koeffiċjent ta' distribuzzjni Kd mal-kontenut ta' karbonju organiku tal-kampjun tal-ħamrija:
         
                     
                        (cm3 g-1)
                  
                     (6)
                  
               :meta
         
                     %OC
                  
                  
                     =
                  
                  
                     persentaġġ tal-karbonju organiku fil-kampjun tal-ħamrija (g g-1).
                  
               Il-koeffiċjent Koc jirrapreżenta valur singolu li jikkaratterizza l-partizzjoni tas-sustanzi kimiċi organiċi li mhumiex polari bejn il-karbonju organiku li jinstab fil-ħamrija jew fis-sediment u l-ilma. L-adsorbiment ta' dawn il-kimiċi huwa korrelatat mal-kontenut organika tas-solidu sorbeni (7); għalhekk, valuri Koc jiddependu fuq karatteristiċi speċifiċi tal-frazzjonijiet umiċi li jvarjaw konsiderevolment fil-kapaċità tas-sorbiment, dovut għad-differenzi fl-oriġini, ġenesi, eċċ.
         2.1.1.   Iżotermi ta' l-adsorbiment
         L-ekwazzjoni ta' l-iżotermi ta' adsorbiment ta' Freundlich trirrelata l-ammont tal-prova sperimentali adsorbita mal-konċentrazzjoni tas-sustanza sperimentali fis-soluzzjoni fl-ekwilibriju (ekwazzjoni 8).
         Id-data tiġi trattata kif deskritt f Adsorbiment' u, għal kull pipetta jiġi kkalkolat il-kontenut tas-sustanza sperimentali adsorbit fuq il-ħamrija wara l-prova ta' l-adsorbiment ( banda oħra indikat bħal x/m). Jitlaq bl-idea illi l-ekwilibriju ntlaħaq u illi jirrapreżenta l-valur ta' l-ekwilibriju:
         
                     
                        (μg g-1)
                  
                     (7)
                  
               L-ekwazzjoni ta' l-adsorbiment ta' Freundlich hija murija f (8):
         
                     
                        (μg g-1)
                  
                     (8)
                  
               jew fil-forma linjari
         
                     
                        
                  
                  
                     (9)
                  
               meta:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     Freundlich il-koeffiċċjent ta' l-adsorbiment; id-dimensjoni tiegħu huwa ta' ċm3 g-1 biss jekk 1/n = 1; fil-każi l-oħra kollha, is-slope 1/n huwa introdott fid-dimensjoni ta'  1-1/n 3 1/n - 1 (μg (ċm) g);
                  
               
                     n
                  
                  
                     =
                  
                  
                     kostanti tar-regressjoni; 1/n ġeneralment ivarja bejn 0,7-1,0, li jindika illi d-data ta' sorbiment frekwentement tvarja ftit mil-linearità.
                  
               Ekwazzjonijiet (8) u (9) huma mpinġija grafikament u jiġi kkalkolati l-valuri ta'  u 1/n permezz ta' analiżi ta' rigressjoni bl-applikazzjoni ta' -ekwazzjoni 9. Jiġi kkalkolat il- koeffiċjent tal-korrelazzjoni r2 ta' l-ekwazzjoni logartimika is also calculated. Eżempju ta' tali grafika hia mogħtija f'Fig. 2.
         2.1.2.   Bilanċ tal-massa
         Il-bilanċ tal-massa (MB) huwa definit bħalha l-persentaġġ tas-sustanza li tista' tiġi analitikament miġbura wara prova ta' adsorbiment konta l-ammont nominali tas-sustanza fil-bidu tal-prova.
         It-trattament tad-data ma jkunx l-istess jekk is-solvent ikun jista' jitħallat kompletament ma' l-ilma. Fil-każ ta' solvent li jista' jitħallat ma' l-ilma, it-trattament ta' data deskritta taħt ”Desorbiment“ jista' jiġi applikat biex jiġi stabbilit l-ammont ta' sustanza miġbura mill-estrazzjoni tas-solvent. Jekk is-solvent jitħallat inqas faċilment ma' l-ilma, trid issir determinazzjoni ta' l-ammont miġbur.
         Il-bilanċ tal-massa MB għall-adsorbiment jiġi kkalkolat kif ġej; huwa preżunt illi (mE) jikkorrispondi għas-somma tal-massa tal-prodotti kimiċi estratti mill-ħamrija u mill-wiċċ tal-kontenitur permezz ta' solvent organiku:
         
                     
                        
                  
                  
                     (10)
                  
               meta:
         
                     MB
                  
                  
                     =
                  
                  
                     bilanċ tal-massa( %)
                  
               
                     mE
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     massa totali tal-prova sperimentali estratta mill-ħamrija u mill-ħitan tal-kontenitur sperimentali f'żewġ stadji (μg);
                  
               
                     C0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni inizjali tal-massa tas-soluzzjoni sperimentali f'kuntatt mal-ħamrija (μg cm-3);
                  
               
                     Vrec
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     volum tas-supernatant miġbur wara l-ekwilibriju ta' l- adsorbiment (cm-3).
                  
               2.2.   DESORBIMENT
         Id-desorbiment (D) huwa definit bħala l-persentaġġ tas-sustanza sperimentali li tiġi desorbita, b'referenza għall-kwantità tas-sustanza preċedentement adsorbita, fil- kondizzjonijiet sperimentali:
         
                     
                        
                  
                  
                     (11)
                  
               meta:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     persentaġġ ta' desorbiment f'punt ta' ħin ti( %);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     massa tas-sustanza sperimentali desorbita mill-ħamrija f'punt ta' ħin (μg)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     massa tas-sustanza sperimentali adsorbita fuq il-ħamrija fl-ekwilibriju ta' -adsorbiment (μg).
                  
               Informazzjoni dettaljata fuq kif għandu jiġi kkalkolat il-persentaġġ ta' desorbiment  għall-metodi paralleli u f'serje hu mgħoti fl-Anness 5.
         Il-koeffiċjent tad-desorbiment apparenti (Kdes), taħt il-kondizzjonijiet sperimentali, huwa r-rapport bejn il-kontenut tas-sustanza li tibqa fil-fażi ħamrija u l-konċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza desorbita fis-soluzzjoni bl-ilma, meta jintlaħaq l-ekwilibriju tad-desorbiment:
         
                     
                        (cm3 g-1)
                  
                     (12)
                  
               meta:
         
                     Kdes
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-koeffiċjent tad-desorbiments (cm3 g-1);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     massa totali tas-sustanza sperimentali desorbita mill-ħamrija fl-ekwilibriju tad- desorbiment (µg)
                  
               
                     VT
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     volum totali tal-fażi bl-ilma f'kuntatt mal-ħamrija matul il-prova tal-kinetika tad-desorbiment (cm3).
                  
               Gwida biex jiġi kkalkolat  hija mogħtija fl-Anness 5 taħt l-intestatura “Desorbiment”.
         Rimarka:
         Jekk il-preċedenti prova ta' adsorbiment, issir bil-metodu paralleli, il-volum VT fl-ekwazzjoni 12 huwa meqjus ugwali għal V0.
         2.2.1.   Iżotermi tad-desorbiment
         L-ekwazzjoni ta' l-iżotermi tad-desorbiment ta' Freundlich jikkollegaw il-kontenut tas-sustanza sperimentali li tibqa adsorbita fuq il-ħamrija mal-konċentrazzjoni tas-sustanza sperimentali fis-soluzzjoni fl-ekwilibriju tad-desorbiment (ekwazzjoni 16).
         Għal kull pipetta, il-kontenut tas-sustanza li jibqa adsorbit fuq il-ħamrija fl-ekwilibriju tad-desorbiment jiġi kkalkolat kif ġej:
         
                     
                         (µg g-1)
                  
                     (13)
                  
               
             jiġi definit bħalha:
         
                     
                        (μg)
                  
                     (14)
                  
               fejn:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     kontenut tas-sustanza sperimentali li jibqa' adsorbit fuq il-ħamrija fl-s ekwilibriju tad-desorbiment (μg g-1);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-massa tas-sustanza determinata b'mod analitiku fil-fażi akwea fl-ekwilibriju tad-desorbiment (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-massa tas-sustanza għat-test imħolli mill-ekwilibriju minħabba r-rimpjazzar inkomplet tal-volum (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-massa tas-sustanza fis-soluzzjoni fl-ekwilibriju ta' l-adsorbiment (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     (15)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     volum tas-soluzzjoni meħud mill-pipetta għall-kejl tas-sustanza sperimentali (cm3);
                  
               
                     VR
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     volum tas-supernatant mneħħi mill-pipetta wara li jkun intlaħaq l-ekwilibriju ta' l-adsorbiment u sostitwit bl-istess volum ta' soluzzjoni 0,01 M CaCl2 solution (cm3);
                  
               L-ekwazzjoni ta' desorbiment skond Freundlich hija mogħtija f (16):
         
                     
                        (μg g-1)
                  
                     (16)
                  
               jew fil-forma lineari
         
                     
                        
                  
                  
                     (17)
                  
               meta:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     koeffiċjent ta' desorbiment skond Freundlich;
                  
               
                     n
                  
                  
                     =
                  
                  
                     kostanti ta' rigressjoni;
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza fil-fażi bl-ilma fl-ekwilibriju tad-desorbiment (ug cm-3).
                  
               L-ekwazzjonijiet 16 u 17 jistgħu jitpinġew grafikament u il-valur ta'  u 1/n jiġu kkalkolati bl-analiżi tar-rigressjoni bl-użu ta' l-ekwazzjoni 17.
         Rimarka:
         Jekk l-esponenti 1/n ta' adsorbiment jew desorbiment, skond Freundlich, huwa ugwali għal 1, il-vinkoli kostanti ta' l-adsorbiment jew tad-desorbiment skond Freundlich (KF u KF) ikunu ugwali, rispettivament, għal kostanti ta' l-ekwilibriju fl-adsorbiment jew fid-desorbiment ( u ), u it-tpinġija grafika ta' Cs vs Caq tkun lineari. Jekk l-esponenti ikunu differenti minn 1, it-tpinġija grafika ta' Cs vs Caq ma tkunx lineari u l-kostanti ta' l-adsorbiment u d-desorbiment ivarjaw matul l-iżotermi.
         2.2.2.   Rapport tal-prova
         Ir-rapport tal-prova għandu jindika l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     Identifikazzjoni kompleta tal-kampjuni tal-ħamrija użat inkluż:
                  
               
                     —
                  
                  
                     referenza ġeografika tal-lokalità (latitudni, lonġitudni),
                  
               
                     —
                  
                  
                     data meta jittieħed il-kampjun,
                  
               
                     —
                  
                  
                     skema ta' impieg (e.ż. ħamrija agrikola, foresta, eċċ.),
                  
               
                     —
                  
                  
                     fond ta' fejn jittieħed il-kampjun,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kontenut f'ramel/torba/tafal,
                  
               
                     —
                  
                  
                     valuri tal-pH (bħal CaCl2 0,01 M),
                  
               
                     —
                  
                  
                     kontenut f'karbonju organiku,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kontenut f'sustanza organika,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kontenut f'nitroġenu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     rapport C/N,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kapaċità ta' skambjar katjoniku (mmol/kg),
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-informazzjoni kollha dwar il-kollezzjoni u l-ħażna tal-kampjun tal-ħamrija,
                  
               
                     —
                  
                  
                     meta approprjat, l-informazzjoni kollha rilevanti għall-interpretazzjoni ta' l-adsorbiment desorbiment tas-sustanza sperimentali,
                  
               
                     —
                  
                  
                     referenza għall-metodi użati għad-determinazzjoni ta' kull parametru,
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni fuq is-sustanza sperimentali, kif xieraq,
                  
               
                     —
                  
                  
                     temperatura ta' l-esperimenti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kondizzjonijiet taċ-ċentrifugazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     proċedura analitika użata biex tiġi analizzata s-sustanza sperimentali,
                  
               
                     —
                  
                  
                     justifikazzjoni għall-użu ta' kwalsiasi aġent solubilizzanti għat-tlestija tas-soluzzjoni maħżuna tas-sustanza sperimentali,
                  
               
                     —
                  
                  
                     spjegazzjonijiet tal-korrezzjonijiet magħmula fil-kalkoli, jekk rilevanti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     data skond il-formularju (Anness 6) u preżentazzjonijiet grafiċi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-informazzjoni u l-osservazzjonijiet kollha li jistgħu ikunu utli għall-interpretazzjoni tar-riżultati tal-provi.
                  
               3.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02045, Part II.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Fränzle O., Kuhnt G. AND Vetter L., (1987). Selection of Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02045, Part I.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995 (June 1995).
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, 0PPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Determining a Sorption Constant (Koc) for an Organic Chemical in Soil and Sediments.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Application for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Danish National Agency of Environmental Protection (October 1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health jew especially harmful to the environment.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Calvet R., (1989), ‘Evaluation of adsorption coefficients and the prediction of the mobilities of pesticides in soils’, in Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Calvet R., (1980), ‘Adsorption-Desorption Phenomena’ in Interactions between herbicides and the soil. (R. J. Hance ed.), Academic Press, London, pp. 83-122.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Hasset J. J., and Banwart W.L., (1989), ‘The sorption of nonpolar organics by soils and sediments’ in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, pp. 31-44.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     van Genuchten M. Th., Davidson J. M., and Wierenga P. J., (1974), ‘An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media’. Soil Sci. Soc. Am. Proc., Vol. 38(1), pp. 29-35.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., and Dishburger H. J., (1981), ‘Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis’, in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Lambert S. M., Porter P. E., and Schieferrstein R. H., (1965), ‘Movement and sorption of chemicals applied to the soil’. Weeds, 13, pp. 185-190.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Rhodes R. C., Belasco I. J., and Pease H. L., (1970) ‘Determination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils’. J.Agric.Food Chem., 18, pp. 524-528.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Russell M. H., (1995), ‘Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil’ in Environmental Behavior of Agrochemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley & Sons Ltd.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. W. and Holland P. T., (1988), ‘Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides’, IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, pp. 901-932.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     Guth J. A., Burkhard N., and D. O. Eberle, (1976), ‘Experimental models for studying the persistence of pesticides in soils’. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp. 137-157, BCPC, Surrey, UK.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     Furminge C. G. L., and Osgerby J. M., (1967), ‘Persistence of herbicides in soil’. J. Sci. Fd Agric., 18, pp. 269-273.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     Burkhard N., and Guth J. A., (1981), ‘Chemical hydrolysis of 2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption’. Pestic. Sci. 12, pp. 45-52.
                  
               
                  
                     (24)
                  
                  
                     Guth J. A., Gerber H. R., and Schlaepfer T., (1977), ‘Effect of adsorption, movement and persistence on the biological availability of soil-applied pesticides’. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, pp. 961-971.
                  
               
                  
                     (25)
                  
                  
                     Osgerby J. M., (1973), ‘Process affecting herbicide action in soil’. Pestic. Sci., 4, pp. 247-258.
                  
               
                  
                     (26)
                  
                  
                     Guth J. A., (1972), ‘Adsorptions-und Einwascheverhalten von Pflanzenschutzmitteln in Böden’. Schr. Reihe Ver. Wass. -Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, pp. 143-154.
                  
               
                  
                     (27)
                  
                  
                     Hamaker J. W., (1975), ‘The interpretation of soil leaching experiments’, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), pp. 135-172, Plenum Press, NY.
                  
               
                  
                     (28)
                  
                  
                     Helling C. S., (1971), ‘Pesticide mobility in soils’. Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 35, pp. 732-210.
                  
               
                  
                     (29)
                  
                  
                     Hamaker J. W., (1972), ‘Diffusion and volatilization’ in Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J. W. Hamaker eds), Vol. I, pp. 49-143.
                  
               
                  
                     (30)
                  
                  
                     Burkhard N. and Guth J. A., (1981), ‘Rate of volatilisation of pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results with those determined in a laboratory model system’. Pestic. Sci. 12, pp. 37-44.
                  
               
                  
                     (31)
                  
                  
                     Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F., and Enfield C.G., (1984), ‘Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses’, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
                  
               
                  
                     (32)
                  
                  
                     Gustafson D. I., (1989), ‘Groundwater ubiquity score: a simple method for assessing pesticide leachability’. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), pp. 339-357.
                  
               
                  
                     (33)
                  
                  
                     Leistra M., and Dekkers W. A., (1976). ‘Computed effects of adsorption kinetics on pesticide movement in soils’. J. of Soil Sci., 28, pp. 340-350.
                  
               
                  
                     (34)
                  
                  
                     Bromilov R. H., and Leistra M., (1980), ‘Measured and simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils’. Pest. Sci., 11, pp. 389-395.
                  
               
                  
                     (35)
                  
                  
                     Green R. E., and Karickoff S. W., (1990), ‘Sorption estimates for modeling’, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., Book Series no. 2, pp. 80-101,
                  
               
                  
                     (36)
                  
                  
                     Lambert S. M., (1967), ‘Functional relationship between sorption in soil and chemical structure’. J. Agri. Food Chem., 15, pp. 572-576.
                  
               
                  
                     (37)
                  
                  
                     Hance R. J., (1969), ‘An empirical relationship between chemical structure and the sorption of some herbicides by soils’. J. Agri. Food Chem., 17, pp. 667-668.
                  
               
                  
                     (38)
                  
                  
                     Briggs G. G. (1969), ‘Molecular structure of herbicides and their sorption by soils’. Nature, 223, 1288.
                  
               
                  
                     (39)
                  
                  
                     Briggs G. G. (1981). ‘Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor’. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.
                  
               
                  
                     (40)
                  
                  
                     Sabljic A., (1984), ‘Predictions of the nature and strength of soil sorption of organic polutance by molecular topology’. J. Agric. Food Chem., 32, pp. 243-246.
                  
               
                  
                     (41)
                  
                  
                     Bailey G. W., and White J. L., (1970), ‘Factors influencing the adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil’. Residue Rev., 32, pp. 29-92.
                  
               
                  
                     (42)
                  
                  
                     Bailey G. W., J. L. White and Y. Rothberg., (1968), ‘Adsorption of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate’. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 32: pp. 222-234.
                  
               
                  
                     (43)
                  
                  
                     Karickhoff S. W., (1981), ‘Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils’. Chemosphere 10, pp. 833-846.
                  
               
                  
                     (44)
                  
                  
                     Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), ‘Soil Sorption of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners’. Environ. Toxicol. Safety 21, pp. 1-17.
                  
               
                  
                     (45)
                  
                  
                     Hamaker J. W., and Thompson J. M., (1972), ‘Adsorption in organic chemicals’ in Organic Chemicals in the Soil Environment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, pp. 49-143.
                  
               
                  
                     (46)
                  
                  
                     Deli J., and Warren G. F., 1971, ‘Adsorption, desorption and leaching of diphenamid in soils’. Weed Sci. 19: pp. 67-69.
                  
               
                  
                     (47)
                  
                  
                     Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, (1975), ‘Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils’. Weed Science, Vol. 23, pp. 454-457.
                  
               
                  
                     (48)
                  
                  
                     Haues M. H. B., Stacey M., and Thompson J. M., (1968), ‘Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations’ in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p. 75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
                  
               
                  
                     (49)
                  
                  
                     Pionke H. B., and Deangelis R. J., (1980), ‘Methods for distributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase’, CREAMS, in A Field Scale Model for Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.
                  
               
                  
                     (50)
                  
                  
                     ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition (1994).
                  
               
                  
                     (51)
                  
                  
                     Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.
                  
               
                  
                     (52)
                  
                  
                     Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L. E., and Clark F. E., eds. ‘Methods of Soil Analysis’, Vol 1 and 2, American Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.
                  
               
                  
                     (53)
                  
                  
                     ISO/DIS 10381-1 Soil Quality – Sampling – Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.
                  
               
                  
                     (54)
                  
                  
                     ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance on sampling techniques.
                  
               
                  
                     (55)
                  
                  
                     ISO/DIS 10381-3 Soil Quality – Sampling – Part 3: Guidance on safety of sampling.
                  
               
                  
                     (56)
                  
                  
                     ISO/DIS 10381-4 Soil Quality – Sampling – Part 4: Guidance on the investigation of natural and cultivated soils.
                  
               
                  
                     (57)
                  
                  
                     ISO/DIS 10381-5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.
                  
               
                  
                     (58)
                  
                  
                     ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
                  
               
                  
                     (59)
                  
                  
                     Green R. E., and Yamane V. K., (1970), ‘Precision in pesticide adsorption measurements’. Soil Sci. Am. Proc., 34, pp. 353-354.
                  
               
                  
                     (60)
                  
                  
                     Grover R., and Hance R. J. (1970), ‘Effect of ratio of soil to water on adsorption of linuron and atrazine’. Soil Sci., pp. 109-138.
                  
               
                  
                     (61)
                  
                  
                     Boesten, J. J. T. I, ‘Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system’. Pest. Sci. 1990, 30, pp. 31-41.
                  
               
                  
                     (62)
                  
                  
                     Boesten, J. J. T. I. ‘Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106’. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.
                  
               
                  
                     (63)
                  
                  
                     Bastide J., Cantier J. M., et Coste C., (1980), ‘Comportement de substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique’. Weed Res. 21, pp. 227-231.
                  
               
                  
                     (64)
                  
                  
                     Brown D. S., and Flagg E. W., (1981), ‘Empirical prediction of organic pollutants sorption in natural sediments’. J. Environ.Qual., 10(3), pp. 382-386.
                  
               
                  
                     (65)
                  
                  
                     Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W., (1983), ‘Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water’. Environ. Sci. Technol., 17(4), pp. 227-231.
                  
               
                  
                     (66)
                  
                  
                     Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), ‘Sorption of organic substances by soils and sediments’. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), pp. 297-312.
                  
               
                  
                     (67)
                  
                  
                     Vowles P. D., and Mantoura R. F. C., (1987), ‘Sediment-water partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons’. Chemosphere, 16(1), pp. 109-116.
                  
               
                  
                     (68)
                  
                  
                     Lyman W. J., Reehl W. F.and Rosenblatt D. H. (1990). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
                  
               
                  
                     (69)
                  
                  
                     Keniga E. E., and Goring, C. A. I. (1980). ‘Relationship between water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota’ in Aquatic Toxicology (eds J.G. Eaton, et al.), pp.78-115, ASTM STP 707, Philadelphia.
                  
               
                  
                     (70)
                  
                  
                     Chiou C. T., Peters L. J., and Freed V. H., (1979), ‘A physical concept of soil-water equilibria for non-ionic organic compounds’. Science, Vol. 206, pp. 831-832.
                  
               
                  
                     (71)
                  
                  
                     Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G., and Means J. C., (1981), ‘Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption’. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, pp. 38-42.
                  
               
                  
                     (72)
                  
                  
                     Karickhoff S. W., (1981), ‘Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils’. Chemosphere, Vol. 10(8), pp. 833-846.
                  
               
                  
                     (73)
                  
                  
                     Moreale A., van Bladel R., (1981), ‘Adsorption de 13 herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilité-reactivité’. Revue de l'Agric., 34 (4), pp. 319-322.
                  
               
                  
                     (74)
                  
                  
                     Müller M., Kördel W. (1996), ‘Comparison of screening methods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil’. Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.
                  
               
                  
                     (75)
                  
                  
                     Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), ‘HPLC – screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil – results of a ring test’. Chemosphere 30 (7), pp. 1373-1384.
                  
               
                  
                     (76)
                  
                  
                     Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), ‘HPLC – screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil – comparison of different stationary phases’. Chemosphere 27 (12), pp. 2341-2352.
                  
               
                  
                     (77)
                  
                  
                     Hance, R. J., (1967), ‘The Speed of Attainment of Sorption Equilibria in Some Systems Involving Herbicides’. Weed Research, Vol. 7, pp. 29-36.
                  
               
                  
                     (78)
                  
                  
                     Koskinen W. C., and Harper S. S., (1990), ‘The retention processes: mechanisms’ in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
                  
               
                  
                     (79)
                  
                  
                     Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield C. G. (1984), ‘Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses’, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp.297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
                  
               
                  
                     (80)
                  
                  
                     Giles C. H., (1970), ‘Interpretation and use of sorption isotherms’ in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, pp. 14-32.
                  
               
                  
                     (81)
                  
                  
                     Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, (1960), ‘Studies in adsorption: XI A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils’. J. Chem. Soc., pp. 3973-93.
                  
               
                  
                     (82)
                  
                  
                     Calvet R., Tercé M., and Arvien J. C., (1980), ‘Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques générales de l'adsorption’. Ann. Agron. 31: pp. 239-251.
                  
               
                  
                     (83)
                  
                  
                     Bedbur E., (1996), ‘Anomalies in the Freundlich equation’, Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.
                  
               
                  
                     (84)
                  
                  
                     Guth, J. A., (1985), ‘Adsorption/desorption’, in Joint International Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.
                  
               
                  
                     (85)
                  
                  
                     Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
                  
               
            ANNESS 1
            Skema tal-prova
            
         
            ANNESS 2
            INFLUENZA TA' PREĊIŻJONI TA' METODU ANALITIKU U BIDLA FIL-KONĊENTRAZZJONI FUQ PREĊIŻJONI TA' RIŻULTATI TA' L-ASSORBIMENT
            Mit-tabella li ġejja (84) jidher ċar li meta d-differenza bejn il-massa inizjali (m0=110 μg) u lads massa ta' l-ekwilibriju (=100 μg) tas-sustanza għat-test fis-soluzzjoni hi ċkejkna ħafna, żball ta' 5 % fil-kejl tar-riżultati tal-konċentrażżjoni ta' l-ekwilibriju fi żball ta' 50 % fil-kalkolu tal-massa tas-sustanza adsorbita fil-ħamrija () u ta' 52,4 % fil-kalkolu ta' Kd.
            
                        Lammont ta'ħamrija
                     
                     
                        msoil
                        
                     
                     
                        = 10 g
                     
                  
                        Il-volum tas-soluzzjoni
                     
                     
                        V0
                        
                     
                     
                        = 100 cm3
                        
                     
                  
               
            
                         
                     
                     FOR-L_2008142MT.01044401.notes.0187.xml.jpg(μg)
                     
                     FOR-L_2008142MT.01044401.notes.0188.xml.jpg(μg cm-3)
                     
                     
                        R
                     
                     FOR-L_2008142MT.01044401.notes.0189.xml.jpg(μg)
                     
                     FOR-L_2008142MT.01044401.notes.0190.xml.jpg(μg g-1)
                     
                     
                        R‡
                     
                     
                        Kd*
                     
                     
                        R‡
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           GĦAL A = 9 %
                        
                     
                  
                        m0 = 110 μg jew C0=1,100 μg/cm3
                        
                     
                     
                        100
                     
                     
                        1,000 
                     
                     
                        true value
                     
                     
                        10
                     
                     
                        1,00 
                     
                     
                        true value
                     
                     
                        1
                     
                     
                         
                     
                  
                        101
                     
                     
                        1,010 
                     
                     
                        1 %
                     
                     
                        9
                     
                     
                        0,90 
                     
                     
                        10 %
                     
                     
                        0,891 
                     
                     
                        10,9  %
                     
                  
                        105
                     
                     
                        1,050 
                     
                     
                        5 %
                     
                     
                        5
                     
                     
                        0,50 
                     
                     
                        50 %
                     
                     
                        0,476 
                     
                     
                        52,4  %
                     
                  
                        109
                     
                     
                        1,090 
                     
                     
                        9 %
                     
                     
                        1
                     
                     
                        0,10 
                     
                     
                        90 %
                     
                     
                        0,092 
                     
                     
                        90,8  %
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           GĦAL A = 55 %
                        
                     
                  
                        m0 = 110 μg jew C0=1,100 μg/cm3
                        
                     
                     
                        50,0 
                     
                     
                        0,500 
                     
                     
                        Valur aawtentiku
                     
                     
                        60,0 
                     
                     
                        6,00 
                     
                     
                        Valur awtentiku
                     
                     
                        12,00 
                     
                     
                         
                     
                  
                        50,5 
                     
                     
                        0,505 
                     
                     
                        1 %
                     
                     
                        59,5 
                     
                     
                        5,95 
                     
                     
                        0,8  %
                     
                     
                        11,78 
                     
                     
                        1,8  %
                     
                  
                        52,5 
                     
                     
                        0,525 
                     
                     
                        5 %
                     
                     
                        57,5 
                     
                     
                        5,75 
                     
                     
                        4,0  %
                     
                     
                        10,95 
                     
                     
                        8,8  %
                     
                  
                        55,0 
                     
                     
                        0,550 
                     
                     
                        10 %
                     
                     
                        55,0 
                     
                     
                        5,50 
                     
                     
                        8,3  %
                     
                     
                        10,00 
                     
                     
                        16,7  %
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           FOR A = 99 %
                        
                     
                  
                        m0 = 110 μg jew C0=1,100 μg/cm3
                        
                     
                     
                        1,100 
                     
                     
                        0,011 
                     
                     
                        true value
                     
                     
                        108,9 
                     
                     
                        10,89 
                     
                     
                        true value
                     
                     
                        990
                     
                     
                         
                     
                  
                        1,111 
                     
                     
                        0,01111 
                     
                     
                        1 %
                     
                     
                        108,889 
                     
                     
                        10,8889 
                     
                     
                        0,01  %
                     
                     
                        980
                     
                     
                        1,0  %
                     
                  
                        1,155 
                     
                     
                        0,01155 
                     
                     
                        5 %
                     
                     
                        108,845 
                     
                     
                        10,8845 
                     
                     
                        0,05  %
                     
                     
                        942
                     
                     
                        4,8  %
                     
                  
                        1,21 
                     
                     
                        0,0121 
                     
                     
                        10 %
                     
                     
                        108,790 
                     
                     
                        10,8790 
                     
                     
                        0,10  %
                     
                     
                        899
                     
                     
                        9,2  %
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        
                           
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-massa tas-sustanza għat-test fil-fażi tal-ħamrija f'ekwilibriju, µg;
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-massa tas-sustanza għat-test fil-fażi tal-ħamrija f'ekwilibriju, μg;
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-kontenut tas-sustanza għat-test fil-fażi tal-ħamrija f'ekwilibriju, μg g-1;
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        konċentrazzjoni ta' massa tas-sustanza għat-test fil-fażi akwea f'ekwilibriju, μg cm-3;
                     
                  
                        R
                     
                     
                        =
                     
                     
                        żball analitiku fid-determinazzjoni tal-  ;
                     
                  
                        R‡
                     
                     
                        =
                     
                     
                        żball kalkkulat minħabba l-iżball analitiku R.
                     
                  
         
            ANNESS 3
            METODI TA' TEKNIKA TA' STIMA GĦAL KD
            
            
                        1.
                     
                     
                        Tekniki ta' kalkolu jippermettu t-tbassir ta' Kd ibbażata fuq il-korrelazzjoni ma', pre eżempju, Pow valuri (12)(39)(63-68), id-data tas-solubilità ta' l-ilma (12)(19)(21)(39)(68-73), jew id-data tal-polarità derivata bl-applikazzjoni ta' HPLC fuq il-fażi reversed (74-76). Kif jidher fit-Tabelli 1 u 2, huwa Koc jew Kom li huma kkalkulati minn dawn l-ekwazzjonijiet imbagħad, indirettament, il-Kd mill-ekwazzjonijiet:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    
                                       
                                 
                              
                  
                        2.
                     
                     
                        Il-kunċett ta' dawn il-korrelazzjonijiet huwa bbażat fuq żewġ suppożizzjonijiet: (1) hija l-materja organika tal-ħamrija li prinċiparjament tinfluenza l-assorbiment ta' sustanza; u (2) l-interactions involuti huma prinċiparjament non-polari. B'riżultat ta' dan, dawn il-korrelazzjonijiet: (1) m'humiex, jew huma biss sa ċertu punt, applikabbli għal sustanzi polari, u (2) m'humiex applikabbli f'każijiet fejn il-kontenut tal-materja organika tal-ħamrija hija żgħira ħafna (12). Barra dan, għalkemm instabu korrelazzjonijiet sodisfaċenti bejn Pow u assorbiment (19), ma jistax jingħad l-istess għar-relazzjoni bejn is-solubilità ta'l-ilma u miżura ta' assorbiment (19) (21); s'issa l-istudji huma kontradittorji ħafna.
                     
                  
                        3.
                     
                     
                        Xi eżempji ta' korrelazzjonijiet bejn il-koeffiċjent ta' l-assorbiment u l-ko-effiċjent tat-taqsima ta' ilma-ottan, kif ukoll is-solubilità ta' l-ilma huma mogħtija f'Tabelli 1 u 2, ripettivament.
                        Tabella 1.
                        Eżempji ta' korrelazzjonijiet bejn il-ko-effiċjent tad-distribuzzjoni ta' assorbiment u l-ko-effiċjent tat-taqsima ta' ilma-ottan; għal iktar eżempji (12) (68)
                        
                                    Sustanzi
                                 
                                 
                                    Korrelazzjonijiet
                                 
                                 
                                    Awturi:
                                 
                              
                                    Ureas sostituti
                                 
                                 
                                    log Kom = 0,69  + 0,52  log Pow
                                    
                                 
                                 
                                    Briggs (1981) (39)
                                 
                              
                                    Fihom il-kloru aromatiku
                                 
                                 
                                    log Koc = -0,779  + 0,904  log Pow
                                    
                                 
                                 
                                    Chiou et al. (1983) (65)
                                 
                              
                                    Diversi pestiċidi
                                 
                                 
                                    log Kom = 4,4  + 0,72  log Pow
                                    
                                 
                                 
                                    Gerstl and Mingelgrin (1984) (66)
                                 
                              
                                    Idrokarbon aromatiku
                                 
                                 
                                    log Koc = -2,53  + 1,15  log Pow
                                    
                                 
                                 
                                    Vowles and Mantoura (1987) (67)
                                 
                              
                           
                        Tabella 2.
                        Eżempji ta' korrelazzjonijiet bejn il-ko-effiċjent tad-distribuzzjoni ta' assorbiment u solubilità ta' l-ilma; għal iktar eżempji ara (68) (69)
                        
                                    Kompost
                                 
                                 
                                    Korrelazzjonijiet
                                 
                                 
                                    Awturi
                                 
                              
                                    Diversi pestiċidi
                                 
                                 
                                    log Kom = 3,8  - 0,561  log Sw
                                    
                                 
                                 
                                    Gerstl and Mingelgrin (1984) (66)
                                 
                              
                                    Sustanzi li fihom il-kloru, alifatiċi, u aromatiċi
                                 
                                 
                                    log Kom = (4,040  +/- 0,038 ) – (0,557  +/- 0,012 ) log Sw
                                    
                                 
                                 
                                    Chiou et al. (1979) (70)
                                 
                              
                                    α- naftal
                                 
                                 
                                    logKoc = 4,273  – 0,686  log Sw
                                    
                                 
                                 
                                    Hasset et al. (1981) (71)
                                 
                              
                                    Sustanzi aromatiċi, alifatiċi u ċikliċi
                                 
                                 
                                    logKoc = -1,405  – 0,921  log Sw-0,00953  (mp-25)
                                 
                                 
                                    Karickhoff (1981) (72)
                                 
                              
                                    Diversi komposti
                                 
                                 
                                    log Kom = 2,75  – 0,45  log Sw
                                    
                                 
                                 
                                    Moreale van Blade (1982) (73)
                                 
                              
                  
         
            ANNESS 4
            KALKOLI BIEX JIĠU DEFINITI L-KONDIZZJONIJIET TA' L-AZZJONI ĊENTRIFUGA
            
                        1.
                     
                     
                        Il-ħin ta' azzjoni ċentrifuga jingħata bil-formula li ġejja, jekk nassumu li hemm partiċelli sferikali:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    (1)
                                 
                              Għal skopijiet ta' simplifikazzjoni, il-parametri kollha huma deskritti f'unitajiet non-SI (g, cm).
                        fejn:
                        
                                    ω
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    veloċità tar-rotazzjoni (=2 p rpm/60), rad s-1;
                                 
                              
                                    rpm
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    dawriet sħaħ għal kull minuta
                                 
                              
                                    η
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    viskożità tas-soluzzjoni, g s-1 cm-1;
                                 
                              
                                    rp
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    radju tal-partiċella, cm
                                 
                              
                                    ps
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    densità tal-ħamrija, g cm-3;
                                 
                              
                                    paq
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    densità tas-soluzzjoni, g cm-3;
                                 
                              
                                    
                                       Rt
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    distanza miċ-ċentru ta' rotor ċentrifugu sal-wiċċ tas- soluzzjoni fit-tubu ċentrifugu, cm;
                                 
                              
                                    Rb
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    distanza miċ-ċentru tar-rotor ċentrifuga sal-qiegħ tat- tubu ċentrifugu, cm;
                                 
                              
                                    Rb-Rt
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    l-għoli tal-ħamrija/taħlita tas-soluzzjoni fit-tubu ċentrifugu, cm.
                                 
                              Fil-prattika ġenerali, jiġu użati d-doppju tal-ħinijiet ikkalkulati biex tiġi assigurata separazzjoni kompleta.
                     
                  
                        2.
                     
                     
                        L-ekwazzjoni (1) tista' tiġi ssimplifikata iktar jekk nikkunisdraw il-viskożità (η) u d- densità (ρaq) tas-soluzzjoni bħala daqs il-viskożità u d-densità ta' ilma f 25 oC; għalhekk, n = 8,95 × 10-3g 1cm-1 upaq = 1,0 g.cm-3.
                        Imbagħad, il-ħin ta' l-azzjoni ċentrifuga jiġi mogħti bl-ekwazzjoni (2):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                              
                  
                        3.
                     
                     
                        Mill-ekwazzjoni 2 jidher ċar li ż-żewġ parametri huma importanti biex tiġi definita l-kondizzjoni ta' l-azzjoni ċentrifuga, i.e. ħin (t) u velocità (rpm), sabiex tinkiseb is-separazzjoni tal-partiċelli ta' daqs speċifiku (fil-każ tagħna radju ta' μm): (1) id-densità tal-ħamrija u (2) it-tul tat-taħlita fit-tubu ċentrifugu (Rb-Rt), i.e. id-distanza li partiċella tal-ħamrija tiksi mill-wiċċ tas-soluzzjoni sal-qiegħ tat-tubu; ovvjament, għal volum fiss it-tul tat-taħlita fit-tubu sejjer jiddependi fuq ir-radiċi kwadrata tar-radju tat-tubu.
                     
                  
                        4.
                     
                     
                        Fig. 1 jippreżenta varjazzjonijiet fil-ħin ta' l-azzjoni ċentrifuga (t) versu veloċità ta' l-azzjoni ċentrifuga (rpm) għal densitajiet ta' ħamrija differenti (ρs) (Fig. 1a) u tulijiet differenti tat-taħlita fit-tubi ċentrifugi(ps) (Fig. 1b). Minn Fig. 1a l-influenza tad-densità tal-ħamrija tidher ovvja; per eżempju, għall-azzjoni ċentrifuga klassika ta' 3000 rpm il-ħin ta l-azzjoni ċentrifuga huwa bejn wieħed u ieħor 240 min. għal 1,2 g cm3 densità tal-ħamrija, waqt li huwa 50 min. biss għal 2,0 g cm 3 Bl-istess mod, minn Fig. 1b, għal azzjoni ċentrifuga klassika ta' 3000 rpm il-ħin ta' l-azzjoni ċentrifuga huwa bejn wieħed u ieħor 50 min. għal tul tat-taħlita ta' 10 cm u huwa ta' 7 min. biss għal tul ta' 1 cm. Madankollu, huwa importanti li tinstab l-aħjar relazzjoni bejn l-azzjoni ċentrifuga li teħtieġ l-inqas tul possibbli u handling faċli għall-esperimentatur biex jissepera l-phases wara l-azzjoni ċentrifuga.
                     
                  
                        5.
                     
                     
                        Barra dan, meta jiġu definiti l-kondizzjonijiet esperimentali għas-separazzjoni ta' phases tal-ħamrija/soluzzjoni, huwa importanti li tiġi kkunsidrata l-possibiltà ta' l-eżistenza tat-tielet “pseudo-phase”, il-kollojde. Dawn il-partiċelli, ta' daqs inqas minn 0,2 μm, jista' jkollhom impatt importanti fuq il-mekkaniżmu ta' l-assorbiment sħiħ ta' sustanza f suspension tal-ħamrija. Meta l-azzjoni ċentrifuga tiġi esekwita kif spjegat hawn fuq, kollojde jibqgħu fl-aqueous phase u huma suġġetti għal analiżi flimkien m' l-aqueous phase. Għalhekk, l-informazzjoni dwar l-impatt tagħhom tintilef
                        Jekk il-laboratorju amministrattiv ikollu faċilitajiet ta' azzjoni ultra-ċentrifuga jew ultrafiltrazzjoni, l-assorbiment/desorption ta' sustanza fil-ħamrija tista' tiġi studjata fiktar dettall, inkluża informazzjoni dwar l-assorbiment tas-sustanza fuq il-kollojde. F'dan il-każ, azzjoni ultra-ċentrifuga b'60 000 rpm/min. jew ultrafiltrazzjoni b'porożità tal-filtru ta' 100 000 Daltons għandha tiġi applikata sabiex jiġu sseparati it-tliet phases, ħamrija, kollojde, soluzzjoni. Il-protokoll ittestjat għandu jiġi wkoll modifikat skond il-bżonn, sabiex it-tliet phases kollha jkunu suġġetti għal analiżi tas-sustanza.
                     
                  Fig. 1a.
            Fig. 1b.
            
         
            ANNESS 5
            KALKOLU TA' ASSORBIMENT A ( %) U DESORPTION D ( %)
            L-iskema tal-ħin tal-proċedura hija:
            Għall-kalkoli kollha huwa meqjus li s-sustanza tat-test hija stabbli u ma tassorbix b'mod sinifikanti mal-ġnub tal-kontenitur.
            ASSORBIMENT A (A %)
            (a)   Metodu parallel
            L-assorbiment perċentwali huwa kkalkulat għal kull tubu tat-testijiet (i) f'kull punt ta' ħin (ti), skond l-ekwazzjoni:
            
                        
                            (%)
                     
                        (1)
                     
                  It-termini ta' din l-ekwazzjoni jistgħu jiġu kkalkulati kif ġej:
            
                        m0 = C0 · V0 (μg)
                     
                     
                        (2)
                     
                  
                        
                            (μg)
                     
                        (3)
                     
                  fejn:
            
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-perċentwal ta' l-assorbiment ( %) f'dan il-punt tal-ħin ti;
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        massa tas-sustanza ttestjata fuq il-ħamrija fil-ħin ti li l-analiżi ġiet esekwita (μg)
                     
                  
                        m0
                        
                     
                     
                        =
                     
                     
                        massa tas-sustanza tat-test fit-tubu tat-testijiet, fil-bidu tat-test (μg)
                     
                  
                        C0
                        
                     
                     
                        =
                     
                     
                        konċentrazzjoni tal-massa inizjali tas-soluzzjoni tat-test f'kuntatt mal- ħamrija (μg cm-3);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        konċentrazzjoni tal-massa tas-sustanza fl-aqueous phase fil-ħin ti li fih ġiet esekwita l-analiżi (μg cm-3); din il-konċentrazzjoni hija ffissata analitikament meta jitqiesu l-valuri mogħtija mill-
                     
                  
                        V0
                        
                     
                     
                        =
                     
                     
                        volum inizjali tas-soluzzjoni ttestjata mal-ħamrija (cm3).
                     
                  Il-valuri tal-persentaġġ ta' l-assorbiment  jew  huma pplottjati versu ħin u huwa ddeterminat il-ħin li jittieħed biex jintlaħaq l-ekwilibriju tas-sorption. Eżempji ta' plots bħal dawn huma mogħtija f'Fig. 1 u Fig. 2 rispettivament.
            (b)   Metodu serial
            L-ekwazzjonijiet li ġejjin jieħdu qies li l-proċedura ta' l-assorbiment hija mwettqa permezz ta' kejl tas-sustanza tat-test f'alikwoti żgħar ta' l-aqueous phase f'intervalli ta' ħin speċifiċi.
            
                        —
                     
                     
                        Matul kull intervall ta' ħin l-ammont tas-sustanza assorbita fuq il-ħamrija hija kkalkulata kif ġej:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    għall-ewwel intervall ta' ħin Δt1 = t1- t0
                                    
                                    
                                                
                                                   
                                             
                                             
                                                (4)
                                             
                                          
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    għat-tieni intervall ta' ħin Δt2 = t2- t1
                                    
                                                
                                                   
                                             
                                             
                                                (5)
                                             
                                          
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    għat-tielet intervall ta' ħin Δt3 = t3- t2
                                    
                                                
                                                   
                                             
                                             
                                                (6)
                                             
                                          
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    għall-nth intervall ta' ħin Δtn = tn – tn – 1
                                    
                                                
                                                   
                                             
                                             
                                                (7)
                                             
                                          
                              
                  
                        —
                     
                     
                        Il-persentaġġ ta' assorbiment għal kull intervall ta' ħin, , huwa kkalkulat permezz ta' l-ekwazzjoni li ġejja:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    (8)
                                 
                              waqt li l-persentaġġ ta' assorbiment f' punt tal-ħin ti jingħata b'din l-ekwazzjoni:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    (9)
                                 
                              Il-valuri ta' l-assorbiment  jew  (dwar il-bżonnijiet ta' l-istudju) huma pplottjati versu ħin u huwa ddeterminat il-ħin li jittieħed biex jintlaħaq l-ekwilibriju tas-sorption.
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Fil-ħin ta' l-ekwilibriju teq:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    il-massa tas-sustanza tat-test assorbita fuq il-ħamrija hija:
                                    
                                                
                                                   
                                             
                                             
                                                (10)
                                             
                                          
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    il-massa tas-sustanza ttestjata fis-soluzzjoni hija:
                                    
                                                
                                                   
                                             
                                             
                                                (11)
                                             
                                          
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    u l-persentaġġ ta' assorbiment waqt ekwilibriju huwa:
                                    
                                                
                                                   
                                             
                                             
                                                (12)
                                             
                                          
                              
                  Il-parametri użati hawn fuq huma definiti bħala:
            
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        massa tas-sustanza assorbita fuq il-ħamrija matul l-intervalli tal-ħin Δt1, Δt2,..., Δtn rispettivament (μg);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        mass of the substance measured in an aliquot  at thetime points t1, t2,tn respectively (μg);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        massa tas-sustanza assorbita fuq il-ħamrija waqt ekwilibriju ta' l-assorbiment (μg);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        massa tas-sustanza fis-soluzzjoni waqt ekwilibriju ta' l-assorbiment (μg);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        volum ta' l-alikwot li fih tiġi mkejla s-sustanza ttestjata (cm3);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        persentaġġ ta' assorbiment li jikkorrispondi f'intervall ta' ħin Δti ( %);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        persentaġġ ta' assorbiment waqt ekwilibriju ta' l-assorbiment ( %).
                     
                  DESORPTION D ( %)
            Il-ħin t0 li fih jibda l-esperiment tal-kinetika tad-desorption, huwa kkunsidrat bħala l-mument li l-ikbar ammont ta' volum akkwistat tas-soluzzjoni tas-sustanza tat-test (wara dan jintlaħaq l-assorbiment ta' ekwilibriju) huwa mibdul b'volum ugwali ta' soluzzjoni 0,01 M CaCl2.
            (a)   Metodu parallel
            Fil-punt tal-ħin ti, il-massa tas-sustanza tat-test hija mkejla fl-aqueous phase meħuda mit-tubu i (), u l-massa desorbed hija kkalkulata skond din l-ekwazzjoni:
            
                        
                           
                     
                     
                        (13)
                     
                  Waqt l-ekwilibriju tad-desorption ti = teq, u għalhekk  = 
            Il-massa tas-sustanza tat-test desorbed matul intervall ta' ħin (Ati) tingħata permezz ta' din l-ekwazzjoni:
            
                        
                           
                     
                     
                        (14)
                     
                  Il-persentaġġ ta' desorption huwa kkalkulat:
            fil-punt tal-ħin ti mill-ekwazzjoni:
            
                        
                           
                     
                     
                        (15)
                     
                  u matul intervall ta' ħin (Δti) mill-ekwazzjoni:
            
                        
                           
                     
                     
                        (16)
                     
                  fejn:
            
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-persentaġġ ta' desorption f punt ta' ħin ti ( %);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-persentaġġ ta' desorption li jikkorrispondi ma' intervall ta' ħin Ati ( %);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-massa tas-sustanza tat-test desorbed f punt tal-ħin ti, (μg);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-massa tas-sustanza tat-test desorbed matul intervall ta' ħin Ati (μg);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-massa tas-sustanza tat-test mkejla analitikament fħin ti fvolum tas-soluzzjoni , li jittieħed għall-analiżi (ug);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-massa tas-sustanza tat-test li tibqa' mill-ekwilibriju ta' assorbiment dovut għall-bdil tal-volum inkomplet (ug);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        (17)
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-massa tas-sustanza tat-test fis-soluzzjoni waqt ekwilibriju ta' assorbiment (μg)
                     
                  
                        VR
                        
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-volum tas-supernatant imneħħi mit-tubu wara li jintlaħaq ekwilibriju ta' assorbiment u mibdul bl-istess volum ta' soluzzjoni 0,01 M CaCl2 solution (cm3);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-volum tas-soluzzjoni meħuda mit-tubu (i) għall-kejl tas-sustanza tat-test, fl-esperiment tal-kinetika tad-desorption (cm3).
                     
                  Il-valuri ta' desorption  jew  (skond il-ħtiġijiet ta' l-istudju) huma pplottjati versu ħin u huwa ddeterminat il-ħin li jittieħed biex jintlaħaq l-ekwilibriju tad-desorption.
            (b)   Metodu serial
            L-ekwazzjonijiet li ġejjin jieħdu qies li l-proċedura ta' assorbiment, li kienet ippreċeduta, kienet imwettqa permezz tal-kejl tas-sustanza tat-test f alikwoti żgħar  ta' l-acqueous phase (metodu serial f1.9. Andament tat-test). Huwa meqjus li: (a) il-volum tas-supernatant imneħħi mit-tubu wara l-esperiment ta' l-kinetika ta' l-assorbiment kien mibdul bl-istess volum ta' soluzzjoni 0,01 M CaCl2 solution (VR) u (b) u l-volum totali ta' l-aqueous phase fkuntatt mal-ħamrija (VT)) matul l-esperiment tal-kinetika tad-desorption jibqa' kostanti u jingħata b'din l-ekwazzjoni:
            
                        
                           
                     
                     
                        (18)
                     
                  Fpunt tal-ħin ti:
            
                        —
                     
                     
                        il-massa tas-sustanza tat-test hija mkejla falikwot żgħir  u l-massa desorbed hija kkalkulata, skond l-ekwazzjoni:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    (19)
                                 
                              
                  
                        —
                     
                     
                        waqt ekwilibriju ta' desorption ti = teq u għalhekk  = 
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Il-persentaġġ ta' desorption  huwa kkalkulat, mill-ekwazzjoni li ġejja:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    (20)
                                 
                              
                  F'intervall ta' ħin (Δti):
            Matul kull intervall ta' ħin l-ammont tas-sustanza desorbed huwa kkalkulat kif ġej:
            
                        —
                     
                     
                        għall-ewwel intervall ta' ħin Δt1 = t1-t0
                        
                        
                                    
                                        and 
                                       
                                 
                                 
                                    (21)
                                 
                              
                  
                        —
                     
                     
                        għat-tieni intervall ta’ ħin Δt2 = t2-t1
                        
                        
                                    
                                        u
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    (22)
                                 
                              
                  
                        —
                     
                     
                        għall-nth intervall Δtn = tn-tn-1
                        
                        
                                    
                                        u
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    (23)
                                 
                              
                  Finalment, il-persentaġġ ta' desorption għal kull interval ta' ħin, , huwa kkalkulat permezz ta' l-ekwazzjoni li ġejja:
            
                        
                           
                     
                     
                        (24)
                     
                  waqt li l-persentaġġ ta' desorption  f'punt tal-ħin ti jingħata permezz ta' l-ekwazzjoni:
            
                        
                           
                     
                     
                        (25)
                     
                  fejn il-parametri użati hawn fuq huma definiti bħala:
            
                        
                           , 
                           ,... , 
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-massa tas-sustanza li tibqa' assorbita fuq il-ħamrija wara lintervalli tal-ħin Δt1, Δt2,..., Δtnrispettivament (μg);
                     
                  
                        
                           , 
                           ,... , 
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-massa tas-sustanza tat-test matul l-intervalli tal-ħin rispettivament (μg);
                     
                  
                        
                           , 
                           ,... , 
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        Il-massa tas-sustanza mkejla f’aliquot
                            f'punti tal-ħin t1,t2,..., tn, rispettivament (μg)
                     
                  
                        VT
                        
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-volum totali ta' l-aqueous phase f'kuntatt mal-ħamrija matul l-esperiment tal-kinetika tad-desorptionesekwit bilmetodu serial (cm3);
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-massa tas-sustanza tat-test li jibqa' mill-ekwilibriju ta' lassorbiment dovut għall-bdil tal-volum inkomplet (μg)
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    (26)
                                 
                              
                  
                        VR
                        
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-volum tas-supernatant mneħħi mit-tubu wara li jintlaħaq ekwilibriju ta' assorbiment u jinbidel bl-istess volum ta' soluzzjoni 0,01 M CaCl2(cm3)
                     
                  
                        
                           
                     
                     
                        =
                     
                     
                        il-volum ta' l-alikwot meħuda bħala kampjun għal skop analitiku mit-tubu (i), matul l-esperiment tal-kinetika tad-desorption mwettaq bil-metodu serial(cm3);
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    (27)
                                 
                              
                  
         
            ANNESS 6
            ASSORBIMENT-DESORPTION FIL-ĦAMRIJA: KARTI GĦAR-RAPPORT TAD-DATA
            Is-sustanza ttestjata:
            Il-ħamrija ttestjata:
            Il-kontenut ta' dry mass tal-ħamrija (105 oC,12h):………………………………………………..%
            it-temperatura: … oC
            L-adattament tal-metodu analitiku
            
                        Il-ħamrija miżunal
                     
                     
                        g
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-ħamrija: dry mass
                        
                     
                     
                        g
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum CaCl2 sol.
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                  
                        konk.nominali sol.finali
                     
                     
                        μg cm-3
                        
                     
                     
                         
                     
                  
                        Konk. analitiku sol.finali
                     
                     
                        μg cm-3
                        
                     
                     
                         
                     
                  Il-prinċipju tal-metodu analitiku wżat:
            Il-kalibrazzjoni tal-metodu analitiku:
            Is-suststanza ttestjata:
            Il-ħamrija ttestjata
            Il-kontenut dry mass tal-ħamrija (105 oC, 12 h): … %
            it-temperatura: … oC
            
                        Il-metodoloġija analitika ta' wara:
                     
                     
                        Indirett
                     
                     
                        
                     
                     
                        Parallel
                     
                     
                        
                     
                     
                        Serjali
                     
                     
                        
                     
                  
                         
                     
                     
                        Dirett
                     
                     
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  It-test ta' adżorbzjoni: il-kamjuni għat-test
            
                         
                     
                     
                        Simbolu
                     
                     
                        Unitajiet
                     
                     
                        Il-ħint'ekwilibrazzjoni
                     
                     
                        Il-ħint'ekwilibrazzjoni
                     
                     
                        Il-ħint'ekwilibrazzjoni
                     
                     
                        Il-ħint'ekwilibrazzjoni
                     
                  
                        In-nru tat-tubu
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-ħamrija miżuna
                     
                     
                        —
                     
                     
                        g
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-ħamrija: dry mass
                        
                     
                     
                        msoil
                        
                     
                     
                        g
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum ta' l-ilma fil-ħamrija miżuna (kalkulat)
                     
                     
                        VWS
                        
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum 0,01  M CaCl2 sol. Biex jekwilibrizza l-ħamrija
                     
                     
                         
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum ta' stock solution
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum totali tal-fażi akwea. F'kuntatt mal-ħamrija
                     
                     
                        V0
                        
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Is-soluzzjoni ta' konċentrazzjoni għat-test inizjali
                     
                     
                        C0
                        
                     
                     
                        μg cm-3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Is-sustanza tal-massa għat-test fil-bidu tat-test
                     
                     
                        m
                              0
                           
                        
                     
                     
                        μg
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Wara l-aġitazzjoni u ċ-ċentrifugazzjoni
                     
                  
                        IL-METODU INDIRETT
                     
                  
                        Il-metodu parallel
                     
                  
                        Il-korrezzjoni tal-fażi akwea imbjank tas-sustanza għat-test ta' konċentrazzjoni inkludiet
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        μg cm-3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-metodu serjali
                     
                  
                        Il-massa tas-sustanzi għat-test imkejla f'aliquot
                           vaA
                        
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        μg
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        IL-METODU DIRETT
                     
                  
                        Il-massa tas-sustanza għat-test adsorbita fil-ħamrija
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        μg
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-kalkolu ta' l-adżorbzjoni
                     
                  
                        L-adżorbzjoni
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        %
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        %
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-medji
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-koeffiċjent ta' l-adżorbzjoni
                     
                     
                        Kd
                        
                     
                     
                        cm3 g-1
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-medji
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-koeffiċjent ta' l-adżorbzjoni
                     
                     
                        Koc
                        
                     
                     
                        cm3 g-1
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-medji
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  Is-sustanza ttestjata:
            Il-ħamrija ttestjata:
            Il-kontenut ta' dry mass tal-ħamrija (105 oC, 12)
            it-temperatura:……………………………………………….………………………………… oC
            It-test ta' adżorbzjoni: l-imbjanki u l-kontroll
            
                         
                     
                     
                        Simb olu
                     
                     
                        Unita jiet
                     
                     
                        Imbjank
                     
                     
                        Imbjank
                     
                     
                        l-kontroll
                     
                  
                        In-nru tat-tubu
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-ħamrija miżuna
                     
                     
                         
                     
                     
                        g
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        0
                     
                     
                        0
                     
                  
                        L-ammont ta' l-ilma fil-ħamrija miżuna (ikkalkulata)
                     
                     
                         
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        —
                     
                     
                        —
                     
                  
                        Il-volum ta' 0,01  M CaCl2 is-soluzzjoni miżjuda
                     
                     
                         
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum ta' l-istock solution tas-sustanza tat-test miżjuda
                     
                     
                         
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                        0
                     
                     
                        0
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        It-total tal-volum tal-fażi akwea (ikkalkulata)
                     
                     
                         
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        —
                     
                     
                        —
                     
                  
                        Il-konċentrazzjoni inizjali tas-sustanza għat-test fil-fażi akwea
                     
                     
                         
                     
                     
                        μg cm-3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Wara l-aġitazzjoni u ċ-ċentrifugazzjoni
                     
                  
                        Il-konċentrazzjoni fil-fażi akwea
                     
                     
                         
                     
                     
                        μg cm-3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  Rimarka: Żid il-kolonni jekk inhumeħtieġ
            Is-sustanza ttestjata:
            Il-ħamrija ttestjata:
            Il-kontenut dry mass tal-ħamrija (105 oC 12 s):………………………………………………… %
            it-temperatura: … …… ………. oC
            Il-bilanċ tal-massa
            
                         
                     
                     
                        simbolu
                     
                     
                        unitajiet
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Nru tat-tubu
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        il-ħamrija miżuna
                     
                     
                        —
                     
                     
                        g
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-ħamrija: dry mass
                        
                     
                     
                        msoil
                        
                     
                     
                        g
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        il-volum ta' l-ilma fil-ħamrija miżuna (kkalkulat)
                     
                     
                        VWS
                        
                     
                     
                        ml
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        il-volum 0,01  M CaCl2 sol, biex tiġi ekwilibrizzata l-ħamrija
                     
                     
                         
                     
                     
                        ml
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum ta' stock solution
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum totali tal-fażi akwea f'kuntatt mal-ħamrija
                     
                     
                        V0
                        
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        is-soluzzjoni inizjali tat-test tal-konċentrazzjoni
                     
                     
                        C0
                        
                     
                     
                        μg cm-3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        il-ħin ta' ekwilibrazzjoni
                     
                     
                        —
                     
                     
                        h
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        wara l-aġitazzjoni u ċ-ċentrifugazzjoni
                     
                  
                        Il-korrezzjoni tal-fażi akwea imbjank tas-sustanza għat-test ta' konċentrazzjoni inkludiet
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        μg cm-3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        il-ħin ta' ekwilibrazzjoni t
                     
                     
                        teq
                        
                     
                     
                        h
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        l-ewwel dilution bis-solvent
                     
                  
                        Il-volum imneħħi tal-fażi akwea
                     
                     
                        Vrec
                        
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum miżjud tas-solvent
                     
                     
                        ΔV
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        l-ewwel estrazzjoni bis-solvent
                     
                  
                        Is-sinjal analizzat fis-solvent
                     
                     
                        SE1
                        
                     
                     
                        var.
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        konk. Sust. Għat-test. fis-solvent
                     
                     
                        CE1
                        
                     
                     
                        μg cm-3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-massa tas-sustanza meħuda mill-ħamrija u minn mal-ġnub tar-reċipjent
                     
                     
                        mE1
                        
                     
                     
                        μg
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        It-tieni dilution bis-solvent
                     
                  
                        Il-volum imneħħi tas-solvent
                     
                     
                        ΔVs
                        
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum miżjud tas-solvent
                     
                     
                        ΔV'
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        It-tieni estrazzjoni bis-solvent
                     
                  
                        is-sinjal analizzat fil-fażi tas-solvent
                     
                     
                        SE2
                        
                     
                     
                        var.
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        konk. test subst. in solvent
                     
                     
                        CE2
                        
                     
                     
                        μg cm-3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        il-massa tas-sustanza meħuda mill-ħamrija u minn mar-reċipjent
                     
                     
                        mE2
                        
                     
                     
                        μg
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-massa totali tas-sust. għat-test. meħuda f'żewġ fażijiet
                     
                     
                        mE
                        
                     
                     
                        μg
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        il-bilanċ tal-massa
                     
                     
                        MB
                     
                     
                        %
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  Is-sustanza ttestjata:
            Il-ħamrija ttestjata:
            il-kontenut dry mass tal-ħamrija(105 oC, 12h):……………………………….………………… %
            it-temperatura:………………………………………………………………..……………….. oC
            L-adżorbzjoni ta' l-isotermi
            
                         
                     
                     
                        simbolu
                     
                     
                        unitajiet
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Nru tat-tubu
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        il-ħamrija miżuna
                     
                     
                        —
                     
                     
                        g
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-ħamrija: dry mass
                        
                     
                     
                        E
                     
                     
                        g
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        il-volum ta' l-ilma fil-ħamrija miżuna (kkalkulat)
                     
                     
                        VWS
                        
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum 0,01  M CaCl2 sol. Biex tiġi ekwlibrizzata l-ħamrija
                     
                     
                         
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum ta' l-istock solution miżjud
                     
                     
                         
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum totali tal-fażi akwea f'kuntatt mal-ħamrija (calculated)
                     
                     
                        V0
                        
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Soluzzjoni ta' konċentrazzjoni
                     
                     
                        C0
                        
                     
                     
                        μg cm-3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        il-ħin ta' ekwilibrazzjoni
                     
                     
                        —
                     
                     
                        h
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        wara l-aġitazzjoni u ċ-ċentrifugazzjoni
                     
                  
                        Il-korrezzjoni tal-fażi akwea imbjank tas-sustanza għat-test ta' konċentrazzjoni inkludiet
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        μg cm-3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        it-temperatura
                     
                     
                         
                     
                     
                        
                           oC
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-massa ta' ladżorbzjoni kull unità ta' ħamrija
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        μg g-1
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  L-analiżi ta' rigressjoni:
            valur ta' KF
               ads:
            valur ta' l/n:
            il-koeffiċjent tar-rigressjoni r2:
            Is-sustanza ttestjata:
            Il-ħamrija ttestjata:
            il-kontenut dry mass tal-ħamrija(105 oC, 12 s):…………………………………………………..%
            it-temperatura:… oC
            
                        Il-metodoloġija analitika ta' wara:
                     
                     
                        Indirett
                     
                     
                        
                     
                     
                        Parallel
                     
                     
                        
                     
                     
                        Serjali
                     
                     
                        
                     
                  It-test ta' deżorbzjoni
            
                         
                     
                     
                        simbolu
                     
                     
                        unitajiet
                     
                     
                        Il-ħint'ekwilibrazzjoni
                     
                     
                        Il-ħint'ekwilibrazzjoni
                     
                     
                        Il-ħint'ekwilibrazzjoni
                     
                     
                        Il-ħint'ekwilibrazzjoni
                     
                  
                        Nru tat-tubu ġej mill-fażi ta' adżorbzjoni
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-massa tas-sustanza assorbita fuq il-ħamrija f'ekwilibriju ta' adżorbzjoni
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        μg
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum tal-fażi akwea mneħħija, rimpjazzat minn 0,01  M CaCl2
                        
                     
                     
                        VR
                        
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum totali tal-fażi akwea F'kuntatt mal-ħamrija
                     
                     
                        PM
                     
                     
                        V0
                        
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        SM
                     
                     
                        VT
                        
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-massa tas-sustanza għattest imħollija fl-ekwilibriju ta' l-adżorbzjoni minħabba ir-rimpjazzament tal-volum inkomplut
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        μg
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-kinetiċi tad-deżorbzjoni
                     
                  
                        Il-massa mkejla tas-sustanza disorbita mill ħamrija fil-ħin ti
                        
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        μg
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-volum tas-soluzzjoni meħud mit-tubu (i) għal Il-kejl tas-sustanza għat-test
                     
                     
                        PM
                     
                     
                        Vf
                           i
                        
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        SM
                     
                     
                        va
                           D
                        
                     
                     
                        cm3
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-massa tas-sustanza disorbita mill-ħamrija fil-ħin ti (ikkalkulat)
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        μg
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-massa tas-sustanza disorbita mill-ħamrija il-ħin ta' l-intervall Δti (ikkalkulat)
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        μg
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-perċentwal tad-deżorbzjoni
                     
                  
                        Id-deżorbzjoni fil-ħin ti
                        
                     
                     
                        Dti
                           
                        
                     
                     
                        %
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Id-deżorbzjoni fl-intervall Δti
                        
                     
                     
                        
                           
                     
                     
                        %
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Il-koeffiċjent tad-deżorbzjoni apparenti
                     
                     
                        Kdes
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  MP: Il-metodu parallel
            MS: Il-metodu serjali
         
         C.19.   ESTIMAZZJONI TAL-KOEFFIĊJENT TA' ADSORPTION (K
               OC
            ) FUQ IL-ĦAMRIJA U FUQ ĦAMA TAD-DRENAĠĠ BL-UŻU TA' KROMATOGRAFIJA TA' LIKWIDU LI JIPPERFORMA GĦOLI (HPLC)
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa replika tal-OECD TG121 (2001).
         1.1.   DAĦLA
         L-aġir ta' sorpzjoni tas-sustanzi fil-ħamrija u fil-ħama tad-drenaġġ jista' jkun deskritt permezz ta' parametri li jkunu determinati b'esperimentar permess tal-metodu tat-testjar C.18. Parametru importanti huwa l-koeffiżjent tal-assorbiment li huwa mfisser bħala r-ratio bejn il-konċentrazzjoni tas-sustanza fil-ħamrija/ħama u l-konċentrazzjoni tas-sustanza fil-fażi akwatika fuq l-ekwilibriju tal-assorbiment. Il-koeffiċjent tal-assorbiment normalizzat għall-kontenut karboniku organiku fil-ħamrija Koc huwa indikatur utili għall-kapaċita vinkolanti ta' kimika fuq materja organika tal-ħamrija jew ħama tad-drenaġġ u jippermetti li wieħed jikkompara bejn kimiċi differenti. Dan il-parametru jista' jkun estimat minn korrelazzjonijiet mas-solubilita fl-ilma u in- n-octanol/koeffiċjenta' diviżjoni ta' l-ilma (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
         Il-metodu ta' esperimentar deskritt f'dan it-test juża' l-HPLC għall-estimu tal-koeffiċjent tal-assorbiment Koc fil-ħamrija u fil-ħama tad-drenaġġ (8). L-estimi huma aktar ta' min wieħed jafdahom minn dawk tal-kalkolazzjoni QSAR (9). Bħala metodu ta' stima ma tistax tieħu post kompletament il-lott ta' esperimenti ta' ekwilibriju użati fil-metodu ta' test C18. Madankollu, il-Koc estimata tista' tkun utili meta tiġI biex tagħżel paramentri ta' testijiet xierqa għal studji ta' assorbiment/desorpzjoni skond il-metodu ta' test C.18 billi tikkalkula l-Kd (koeffiċjent ta' distribuzzjoni) jew Kf (Koeffiċjent ta' assorbiment ta' Freundlich) skond l-equation 3 (ara taqsima 1.2).
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            K
            
               d
            : Il-koeffiċjenti ta' distribuzzjoni huwa deskritt bħala r-ratio tal-konċentrazzjonijiet ta' ekwilibriju C ta' test fuq sustanza li kien imdewweb permezz ta' sistema ta' żewġ fażijiet li tikkonsisti f'sorbent (ħamrija jew ħama tad-drenaġġ) u fażi akwatika; hija valur mingħajr dimensjoni fejn konċentrazzjonijiet fiż-żewġ fażi huma espressi skond bażi ta' piż/piż. Fil-każ illi l-konċentrazzjoni fil-fażi akwatika hija mogħtija bħala bażi ta' piż/volum, hemmhekk il-units huma ml· g-1. Kd tista' tvarja skond il-kwalitajiet ta' sorbent u tista' tkun dipendenti fuq is-solubilità.
         
                     
                        
                  
                  
                     (1)
                  
               meta:
         
                     Csoil
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni ta' sustanza taħt prova fil-ħamrija f ekwilibriju (μg· g1)
                  
               
                     Cslud
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni ta' sustanza taħt prova fil-ħama f ekwilibriju (μg· g1)
                  
               
                     Caq
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni ta' sustanza taħt prova fil-fażi akwatika fekwilibriju (μg· g-1, μg· ml-1).
                  
               
            K
            
               f
            : Il-Koeffiċjent ta' assorbiment ta' Freundlich konċentrazzjoni ta' sustanza taħt prova fil-ħamrija jew ħama tad-drenaġġ (x/m) meta l-konċentrazzjoni tal-ekwilibriju Caq fil-fażi akwatika hija ugwali għall-wieħed; units huma ng.g1 sorbent. Il-valur jista' jvarja skond il-kwalitajiet tas-sorbent.
         
                     
                        
                  
                  
                     (2)
                  
               fejn:
         
                     x/m
                  
                  
                     =
                  
                  
                     ammont ta' sustanza taħt prova x (μg) assorbiti f ammont ta' sorbent m (g) f'ekwilibriju
                  
               
                     1/n
                  
                  
                     =
                  
                  
                     niżla ta' isoterm ta' assorbiment ta' Freundlich
                  
               
                     Caq
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     konċentrazzjoni ta' sustanza taħt prova fil-fażi akwatika f 'ekwilibriju (μg · ml-1)
                  
               At
         
            K
            
               oc
            : Distribution coefficient (Kd) jew Koeffiċjent ta' assorbiment ta' Freundlich (Kf) normalizzat għall-kontenut ta' carbon organiku (foc) ta' sorbent; partikolarment għall-kimiċi li mhumiex ionizzata, huwa indikazzjoni approssimattiva għall-estent ta' assorbiment bejn is-sustanza u s-sorbent u jaċċetta li wieħed ikun jista' jikkompara bejn kimiċi different. Skond id-dimensjoni ta' Kd u Kf, Koc tista' tkun mingħajr dimensjoni jew ikollha l-units ml · g1 jew μg.g1 materja organika.
         
                     
                        
                  
                  
                     (3)
                  
               Ir-relazzjoni bejn Koc u Kd mhijiex dejjem lineari u għalhekk valuri ta' Koc jistgħu jvarjaw minn ħamrija għall-ħamrija imma l-varjabilita' tista' tkun ridotta drastikament meta kkomparata ma' valuri Kd jew Kf.
         Il-Koeffiċjent ta' assorbiment (Koc) huwa mnaqqas mill-fattur ta' kapacita' (k') bl-użu ta' plot ta' kalibrazzjoni ta' log k' kontra log Koc tat-taħlita magħżula bħala riferenza.
         
                     
                        
                  
                  
                     (4)
                  
               fejn:
         
                     tR
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     HPLC ħin ta' ritenzjoni tat-test u sustanza ta' riferenza (minuti)
                  
               
                     t0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     HPLC ħin mejjet (minuti) (ara taqsima 1.8.2).
                  
               
            P
            
               OW
            : Il-koeffiċjenti tad-diviżjoni ta' octanol-ilma huwa deskritt bżala r-ratio tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza mdewba f'n-octanol u ilma; huwa valur mingħajr dimensjoni.
         
                     
                        
                  
                  
                     (5)
                  
               1.3.   SUSTANZI TA' RIFERENZA
         Il-formula ta' struttura, il-purita' u l-konstant tad-dissoċjazzjoni (jekk mixtieqa) għandha tkun magħrufa qabel jintuża dan il-metodu. Informazzjoni dwar is-solubilita' fl-ilma u f'solventi organiċi, f'diviżjoni ta' koeffiċjenza ta' octanol-ilma u l-karatteristiċi ta' hydrolysis huma utili.
         Sabiex tirrelata d-data ta' retezjoni tal-HPLC kif imkejla ta' sustanza taħt test bil-koeffiċjenti tal-assorbiment tagħha, graff ta' kalibrazzjoni ta' log Koc kontra log k' għandha tkun stabbilita. Minimu ta' sitt punti ta' riferenza, mill-inqas wieħed 'il fuq u wieħed l-isfel mill-valur pretiż tas-sustanza taħt prova għandhom ikunu użati. Ir-reqqa tal-metodu jkun aktar mtejjeb sinjifikament jekk ikunu wżati sustanzi ta' riferenza li huma relatati strutturalment mas-sustanza taħt prova. Jekk din id-data mhijiex disponibbli, sta għall-utent illi jagħżel s-sustanzi ta' kalibrazzjoni xierqa. Sett aktar ġenerali ta' sustanzi strutturalment eteroġeniċi għandhom ikunu mgħażula f'dan il-każ. Sustanzi u valuri ta' Koc li jistgħu jkunu użati huma mniżżla fl-Anness f'Tabella 1 għall-ħama ta' drenaġġ u f'Tabella 3 għall-ħamrija. L-għażla ta' sustanzi oħra ta' kalibrazzjoni għandha tkunu ġustifikati.
         1.4.   PRINĊIPJITAL-METODU TA' PROVA
         HPLC huwa magħmul fuq kolonni analitiċI ippakkjati b'fażi solida ta' cyanopropyl disponibbli kummerċjalment li fih jinstabu biċċiet ta' ipofiliċi u polari. Fażi stazzjonarja li hi moderalment polari bbażata fuq matrix ta' silica hija użata:
         
                     – O – Si
                  
                  
                     – CH2 – CH2 – CH2
                     
                  
                  
                     – CN
                  
               
                     silica
                  
                  
                     non-polar spacer
                  
                  
                     polar moiety
                  
               Il-prinċipju tal-metodu ta' prova huwa simili għall-metodu ta' testjar A.8 (koeffiċjent ta' diviżjoni, metodu HPLC). Waqt li tgħaddi mill-kolonna flimkien mall-fażi mobbli, is-sustanza taħt prova għandha effett mall-fażi stazzjonarja. Bħala riżultat diviżjoni o bejn fażijiet mobbli u stazzjonarjiu s-sustanza taħt prova hija mdewwma. Iż-żewġ komposizzjonijiet tal-fażi stazzjonarja li għandhom sites polari u mhux polari jaċċettaw effett ma' gruppi polari u mhux polari ta' molekuli simili bħal fil-każ ta' materji organiċi f'matrices fil-ħamrija jew fi ħama tad-drenaġġ. Dan jagħmel possibbli r-relazzjoni bejn il-ħin ta' ritenzjoni fil-kolonna u l-koeffiċjent ta' assorbiment f'materji organiċi li jista' jkun stabbilit.
         pH għandu influwenza sinjifikattiva fuq l-atteġġjament ta' sorpzjoni partikolarment f'sustanzi polari. Għall-ħamrija agrikola jew tankijiet ta' impjanti ta' trattament ta' drenaġġ il-pH normalment tvarja bejn pH 5,5 u 7,5. Għal sustanzi ionizzabbli, żewġ testijiet għandhom ikunu magħmula b' formi kemm ionizzati u kemm mhux ionizzati f'soluzzjonijiet ta' buffer xierqa, imma dan biss f'każijiet fejn mill-inqas 10 % tal-kompost taħt prova jkun dissoċjati bejn pH 5,5 u s-7,5.
         Billi r-relazzjoni biss bejn ir-ritenzjoni fuq il-kolonna ta' HPLC u l-koeffiċjent ta' adżorbzjoni huwa użat għall-evalwazzjoni, mhux rikjest li jkun hemm il-metodu ta' analizzar kwantitattiv u jkun biss neċessarju d-determinazzjoni tal-ħin ta' retention. Jekk ikun disponibbli sett ta' sustanzi ta' riferenza u jkunu jistgħu jiġu wżati kondizzjonijiet standard ta' esperimentar, il-metodu jipprovdi mezz aktar mgħaġġla u effiċjenti sabiex ikun hemm estimu tal-koeffiċjent Koc ta' assorbiment.
         1.5.   APPLIKABBILITÀ TAT-TEST
         Il-metodu HPLC huwa applikabbli għal sustanzi kimiċi (kemm jekk mingħajr tikketta u jekk bit-tikketta) għal xhiex sistema ta' skoperta xierqa (eż. spectrofotometer, ta' radjoattività) hija disponibbli u li huma suffiċjentament stabbli waqt il-lant tal-esperiment. Jista' jkun partikolarment bżonnjuż għall-kimiċi li huma diffiċli illi jkunu studjati f'sistemi oħra ta' esperimentar (i.e. sustanzi volatili; substanzi li ma jinħallux fl-ilma f'konċentrazzjoni illi tista' tiġi mkejla analitikament; substanzi li għandhom affinita qawwija għas-surface tas-sistemi ta' inkubazzjoni). Il-metodu jista' jkun użat għat-taħlit illi jagħtu elution bands mhux risolti. F'każijiet bħal dawn, limiti 'l fuq u 'l isfel tal-valuri tal-log Koc tal-kompost tat-taħlit taħt prova għandhom ikunu magħrufa.
         Xi kultant impuritajiet jistgħu jikkawżaw problemi fl-interpretazzjoni tar-riżultati tal-HPLC, imma dawn huma ta' imprtanza minuri kemm-il darba s-sustanza taħt prova tista' analitikament tkun identifikabbli kjarament u sseparata mill-impuritajiet.
         Il-metodu huwa validat għal sustanzi mniżżla f'Tabella 1 fl-Anness u kien ukoll applikat għal varjeta ta' kimiċi oħra li jagħmlu parti mill-klassijiet ta' kimiċi kif ġejjin:
         
                     —
                  
                  
                     amines aromatiċi (eż trifluralin, 4-chloroaniline, 3,5-dinitroaniline, 4-methylaniline, N-methylaniline, 1-naphthylamine),
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        carboxilic acid esters aromatic (eżbenzoic acid methylester, 3,5-dinitrobenzoic acid ethylester),
                  
               
                     —
                  
                  
                     hydrocarbons aromatiċi (eż toluene, xylene, ethylbenzene, nitrobenzene),
                  
               
                     —
                  
                  
                     aryloxyphenoxypropionic acid esters (eż diclofop-methyl, fenoxaprop-ethyl, fenoxaprop-P-ethyl),
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        benzimidazole u imidazole fungicides (eż carbendazim, fuberidazole, triazoxide),
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        carboxilic acid amides (eż 2-chlorobenzamide, N,N-dimethylbenzamide, 3,5-dinitrobenzamide, N-methylbenzamide, 2-nitrobenzamide, 3-nitrobenzamide),
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        chlorinated hydrocarbons (eż endosulfan, DDT, hexachlorobenzene, quintozene, 1,2,3-trichlorobenzene),
                     
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        organophosphorus insecticides (eż azinphos-methyl, disulfoton, fenamiphos, isofenphos, pyrazophos, sulprofos, triazophos),
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        phenols (eż phenol, 2-nitrophenol, 4-nitrophenol, pentachlorophenol, 2,4,6-trichlorophenol, 1-naphthol),
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        phenylurea derivatives (eż. isoproturon, monolinuron, pencycuron),
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        pigment dyestuffs (eż acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 81),
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        polyaromatic hydrocarbons (eż acenaphthene, naphthalene),
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        1,3,5-triazine herbicides (eż prometryn, propazine, simazine, terbutryn),
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        triazole derivatives (eż tebuconazole, triadimefon, tradimenol, triapenthenol).
                  
               Il-metodu mhuwiex applikabbli għal sustanzi li jagħmlu reazzjoni jew mall-eluent jew mall-fażi stazzjonarja. Mhuwiex applikabbli wkoll għal sustanzi illi jagħmlu reazzjoni b'mod speċifiku ma' taħlit inorganiku (eż formażżjoni ta' gzuz kumplessi ma' minerali taċ-ċaqquf). Il-metodu jista' ma jaħdimx għal sustanzi attivi li jitilgħu fil-wiċċ, kompost inorganiku u aċidi jew bażijiet moderati jew b'saħħithom. Valuri ta' Log Koc bejn il-1,5 sal-5,0 jistgħu jiġu ddeterminati. Sustanzi inonissabbli għandhom ikunu mkejla permezz ta' l-użu ta' fażi mmobbli buffered, imma wie'ed għandu jieħu ħsieb illi jevita l-preċipitazzjoni ta' komponimenti ta' buffer jew sustanza taħt prova.
         1.6.   KRITERJA TA' KWALITÀ'
         1.6.1.   Akkuratezza
         Normalment, il-koeffiċjent ta' assorbiment ta' sustanza taħt prova jkun estimat bejn il-± 0,5 unit ta' log tal-valur determinat bil-metodu tal-ekwilibrju tal-grupp (ara Tabella 1 fl-Anness). Akkuratezza ogħla tista' tiġi milħuqa jekk is-sustanza ta' riferenza użata hija strutturalment relatata mas-sustanza taħt prova.
         1.6.2.   Ir-rata tar-repetizzjoni
         Determinazzjonijiet għandhom isiru mill-inqas f'darbtejn. Il-valuri ta' log Koc meħuda mill-kejl individwali għandu jkun bejn il-unit ta' 0,25 log.
         1.6.3.   Riproduċibbilità
         Esperjenza milħuqa sa issa fl-applikazzjoni tal-metodu hija ta' sosten għall-validita' tagħha. Investigazzjoni tal-metodu ta' HPLC, bl-użu ta' 48 sustanza (l-aktar minnhom pestiċidi) għal liema kien hemm diġa disponibbli data dwar Koc ta' min wieħed joqgħod fuqha tal-koeffiċjent ta' korrelazzjoni ta' R = 0,95 (10) (11).
         Test ta' komparazzjoni magħmul f'laboratorju bil-parteċipazzjoni ta' 11-il laboratorju ġie magħmul sabiex jirranġa u jivvalida il-metodu (12). Ir-riżultati huma mogħtija f'Tabella 2 fl-Anness.
         1.7.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' PROVA
         1.7.1.   Estimazzjoni preliminari tal-koeffiċjent ta' assorbiment
         Il-koeffiċjent Pow (= Kow) ta' diviżjoni ta' octanol-ilma u sa ċertu punt, is-solubilita fl-ilma jistgħu jintużaw bħala indikaturi ai fini tal-assorbiment, partikolarment għal sustanzi li mhumiex ionizzati, u għalhekk jistgħu jintużaw sabiex jinstab il-limitu preliminari. Varjeta' ta korrelazzjonijiet bżonnjużi ġew ippubblikati għall-diversi gruppi ta' kimiċi (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
         1.7.2.   Apparat
         Kromatograf likwidu, li miegħu ġie mwaħħal pompa pulse-free u mekkaniżmu xieraq ta' detection huwa meħtieġ. L-użu ta' valv ta' injezzjoni b'loop ta' injezzjoni huwa rikkmandat. Resins magħmula minn kimiċu ta' cyanopropyl magħquda kommerċjalment fuq bażi ta' silica għandhom ikunu użati (eż Hypersil u Zorbax CN). Kolonna ta' gwida ta' l-istess materjal tista' tkun impoġġija bejn is-sistema ta' injezzjoni u l-kolonna analitika. Kolonni minn fornituri differenti jistgħu jvarjaw konsiderevolment fl-effiċjenza tas-separazzjoni tagħhom. Bħala gwida, il-fatturi ta' kapaċita k' li ġejjin għandhom ikunu milħuqa: log k' > 0,0 għal log Koc = 3,0 u log k' > 0,4 għal log Koc = 2,0 meta tuza methanol/ilma 55/45 % bħala fażi mobbli.
         1.7.3.   Fażijiet mobbli
         Diversi ġew ittestjati, u it-tnejn li ġejjin huma rrikmandati:
         
                     —
                  
                  
                     methanol/ilma (55/45 % v/v),
                  
               
                     —
                  
                  
                     methanol/0,01M citrate-buffer pH 6,0 (55/45 % v/v).
                  
               HPLC grade methanol u ilma distillat jew citrate buffer huma użati sabiex jiġi ppreparat is-solvent ta' elutar. It-taħlita hija iddigassjata qabel ma tiġi użata. Eluzzjoni isokratika għandha tkun użata. Jekk taħlit ta' methanol/ilma mhuwiex ritenut xieraq, taħlit organiku ieħor ta' other solvent/ilma jista' jiġi ppruvat, eż. ethanol/ilma jew taħlita ta' acetonitrile/ilma. Għal kompost ionizzabbli, l-użu ta' soluzzjoni ta' buffer hija rrikmandata sabiex tkun stabilizzata l-pH. Wieħed għandu jieħu ħsieb illi tkun evitata preċipitazzjoni ta' melħ u deterjorazzjoni ta' kolonni, li jista' jiġri waqt it-taħlit ta' xi phase/buffer organiċi.
         L-ebda addittiv bħal reagents ta' ion pair jistgħu jiġu użati minħabba li dawn jistgħu jaffetwaw il-kwalifiki ta' sorpzjoni tal-fażi stazzjonarja. Dawn il-kambjamenti fil-fażi stazzjonarja jistgħu jkunu irriversibbli Għal din ir-raġuni, huwa obbligatorju illi esperimenti li fihom jintużaw addittivi għandhom isiru f'kolonni separati.
         1.7.4.   Solutes
         Sustanzi taħt prova u ta' riferenza għandhom ikunu maħlulin fil-fażi mobbli.
         1.8.   PRESTAZZJONI TAT-TEST
         1.8.1.   Il-kondizzjoni tat-test
         Waqt il-kejl it-temperatura għandha tkun irrekordjata. L-użu ta' kompartament ta' kolonna hija rrikmandata ħafna sabiex tiggarantixxi kondizzjonijiet stabbli waqt il-kalibrazzjoni u r-runs ta' estimi u kejl tas-sustanza taħt prova.
         1.8.2.   Determinazzjoni dead time to
         Għad-determinazzjoni tal-dead time għaż-żewġ metodi differenti jistgħu jiġu użati (ara wkoll taqsima 1.2).
         1.8.2.1.   Determinazzjoni ta' ħin mejjet permezz ta' serje omologi
         Din il-proċedura wriet illi tagħti valuri ta' min wieħed joqgħod fuqhom u li huma standard. Għad-detallji ara l-metodu tat-testjar A.8: koeffiċjent ta' diviżjoni (n-octanol/ilma), metodu HPLC.
         1.8.2.2.   Determinazzjoni ta' ħin mejjet permezz ta' sustanzi inert li mhumiex miżmuma mill-kolonna
         Dan il-metodu ta' teknika huwa bbażat fuq injezzjoni ta' soluzzjonijiet ta' formamide, urea u nitrat tal-kubrit. Il-kejl irid ikun magħmul mill-inqas darbtejn.
         1.8.3.   Determinazzjoni tad-drabi tar-ritenzjoni tR
         Sustanzi ta' riferenza għandhom ikunu magħżula kif deskritt f'taqsima 1.3. Jistgħu jkunu injettati bħala taħlita standard sabiex ikun stabbilit id-drabi tagħhom tar-ritenzjoni, kemm-il darba jkun ikkonfermat illi l-ħin ta' ritenzjoni ta' kull standard ta' riferenza ma jkunx affetwat bil-preżenza ta; standards oħra ta' riferenza. Il-kalibrazzjoni għandha tkun magħmula f'intervalli regolari mill-inqas darbtejn kuljum sabiex jieħdu konsiderazzjoni ta' xi kambjamenti mhux maħsuba fil-kolonna tal-prestazzjoni. Għall-aħjar prattika, l-injezzjonijiet ta' kalibrazzjoni għandhom ikunu magħmula qabel u wara l-injezzjonijiet tas-sustanza taħt prova sabiex ikun ikkonfermat illi l-ħin ta' ritenzjoni ma kienx injorat. Is-sustanzi taħt prova huma injettati separatament fi kwantitajiet kemm jista' jkun żgħar (sabiex jevitaw overload ta' kolonni) u l-ħinijiet tagħhom ta' ritenzjoni jkunu determinati.
         Sabiex tiżdied il-kunfidenza fil-kejl, mill-inqas żewġ determinazzjonijiet għandhom ikunu magħmula. Il-valuri ta' log Koc miġjuba mill-kejl individwali għandhom ikunu bejn il-0,25 log unit.
         1.8.4.   Evalwazzjoni
         Il-fatturi ta' kapaċita' k' huma kkalkolati mill-ħin mejjet to u sal-ħinijiet ta' ritenzjoni tR tas-sustanzi tar-referenza kif magħżula skond l-equation 4 (ara taqsima 1.2). Id-data tal-log k' tas-sustanzi ta' referenza huma mbagħad ipplottjati kontra il-valuri tal-log Koc tagħhom mill-esperimenti ta' ekwilibriju fil-gruppi mogħtija f'Tabelli 1 u 3 tal-Anness. Bl-użu ta' dan il-plot, il-valur ta' log k' tas-sustanza taħt prova hija mbagħad użata sabiex ikun jista' jiġi stabbilit il-valur ta' log Koc tagħha. Jekk ir-riżultati attwali juru illi l-log Koc tas-sustanzi taħt prova hija barra l-limitu ta' kalibrazzjoni, it-test għandhu jerġa jiġi magħmul bl-użu ta' sustanzi differenti, aktar xierqa.
         2.   DATA U RRAPURTAR
         Ir-rapport għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                     —
                  
                  
                     identita' tas-sustanzi taħt prova u bħala riferenza u l-purita tagħhom, u l-valuri pKa jekk rilevanti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     deskrizzjoni ta' apparat u kondizzjonijiet tal-operat eż. tip u dimensjoni tal-kolonna analitika (u gwida), il-metodu ta' identifikar, fażi mobbli (ratio ta' komponimenti u pH), il-limiti ta' temperatura waqt il-kejl,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ħin mejjet u l-metodu użat sabiex ikun determinat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kwantitajiet ta' sustanzi taħt prova u bħala riferenza introdotti fil-kolonna,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ħinijiet ta' ritenzjoni tal-kompost ta' riferenza użat għall-kalibrazzjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     dettalji tal-linja ta' rigressjoni kif mdaħħla (log k' vs log Koc) u l-graff tal-linja ta' rigressjoni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     medja tad-data ta' ritenzjoni u l-valur ta' d log Koc estimat għall-kompost taħt prova.
                  
               
                     —
                  
                  
                     chromatograms.
                  
               3.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). Handbook of property estimation methods, Chap. 4, McGraw-Hill, New York.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adżorbzjoni coefficient (Koc) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adżorbzjoni, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, pġ. 1050-1059.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic between soil organic matter and water. . Sci. Technol., 17, pġ. 227-231.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. . Sci. Health, B19, pp. 297-312.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic, Science, 106, pġ. 831-832.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, pġ. 833-846.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adżorbzjoni coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pġ. 121-128.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adżorbzjoni coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), pġ. 2493-2504.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adżorbzjoni coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), pġ. 2341-2352.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, pġ. 285-304.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adżorbzjoni coefficient on soil-results of a ring . Chemosphere, 30(7), pġ. 1373-1384.
                  
               
            ANNESS
            Tabella 1
            Komparazzjoni ta' valuri ta' Koc għall-ħamrija u ħama tad-drenaġġ, u valuri ikkalkolati bil-metodu tal-iscreening tal-HPLC (13), (14)
            
            
                        Sustanza
                     
                     
                        CAS Nr.
                     
                     
                        Log Koc drenaġ ġ ħama
                     
                     
                        log Koc HPL C
                     
                     
                        Δ
                     
                     
                        log Koc ħamri ja
                     
                     
                        log Koc HPL C
                     
                     
                        Δ
                     
                  
                        Atrazine
                     
                     
                        1912-24-9
                     
                     
                        1,66 
                     
                     
                        2,14 
                     
                     
                        0,48 
                     
                     
                        1,81 
                     
                     
                        2,20 
                     
                     
                        0,39 
                     
                  
                        Linuron
                     
                     
                        330-55-2
                     
                     
                        2,43 
                     
                     
                        2,96 
                     
                     
                        0,53 
                     
                     
                        2,59 
                     
                     
                        2,89 
                     
                     
                        0,30 
                     
                  
                        Fenthion
                     
                     
                        55-38-9
                     
                     
                        3,75 
                     
                     
                        3,58 
                     
                     
                        0,17 
                     
                     
                        3,31 
                     
                     
                        3,40 
                     
                     
                        0,09 
                     
                  
                        Monuron
                     
                     
                        150-68-5
                     
                     
                        1,46 
                     
                     
                        2,21 
                     
                     
                        0,75 
                     
                     
                        1,99 
                     
                     
                        2,26 
                     
                     
                        0,27 
                     
                  
                        Phenanthrene
                     
                     
                        85-01-8
                     
                     
                        4,35 
                     
                     
                        3,72 
                     
                     
                        0,63 
                     
                     
                        4,09 
                     
                     
                        3,52 
                     
                     
                        0,57 
                     
                  
                        Benzoic acid phenylester
                     
                     
                        93-99-2
                     
                     
                        3,26 
                     
                     
                        3,03 
                     
                     
                        0,23 
                     
                     
                        2,87 
                     
                     
                        2,94 
                     
                     
                        0,07 
                     
                  
                        Benzamide
                     
                     
                        55-21-0
                     
                     
                        1,60 
                     
                     
                        1,00 
                     
                     
                        0,60 
                     
                     
                        1,26 
                     
                     
                        1,25 
                     
                     
                        0,01 
                     
                  
                        4-Nitrobenzamide
                     
                     
                        619-80-7
                     
                     
                        1,52 
                     
                     
                        1,49 
                     
                     
                        0,03 
                     
                     
                        1,93 
                     
                     
                        1,66 
                     
                     
                        0,27 
                     
                  
                        Acetanilide
                     
                     
                        103-84-4
                     
                     
                        1,52 
                     
                     
                        1,53 
                     
                     
                        0,01 
                     
                     
                        1,26 
                     
                     
                        1,69 
                     
                     
                        0,08 
                     
                  
                        Aniline
                     
                     
                        62-53-3
                     
                     
                        1,74 
                     
                     
                        1,47 
                     
                     
                        0,27 
                     
                     
                        2,07 
                     
                     
                        1,64 
                     
                     
                        0,43 
                     
                  
                        2,5-Dichloroaniline
                     
                     
                        95-82-9
                     
                     
                        2,45 
                     
                     
                        2,59 
                     
                     
                        0,14 
                     
                     
                        2,55 
                     
                     
                        2,58 
                     
                     
                        0,03 
                     
                  
               
            Tabella 2
            Riżultati ta' testijiet inter-komparabbli f'laboratorji (11 –il laboratorju parteċipanti) magħmula sabiex jagħmlu aħjar u jivvalidaw il-metodu ta' HPLC (15)
            
            
                        Sustanza
                     
                     
                        CAS Nr.
                     
                     
                        log Koc
                        
                     
                     
                        Koc log
                        
                     
                     
                        Koc
                        
                     
                  
                        [OECD 106]
                     
                     
                        [Metodu HPLC]
                     
                  
                        Atrazine
                     
                     
                        1912-24-9
                     
                     
                        1,81 
                     
                     
                        78 ± 16
                     
                     
                        1,89 
                     
                  
                        Monuron
                     
                     
                        150-68-5
                     
                     
                        1,99 
                     
                     
                        100 ± 8
                     
                     
                        2,00 
                     
                  
                        Triapenthenol
                     
                     
                        77608-88-3
                     
                     
                        2,37 
                     
                     
                        292 ± 58
                     
                     
                        2,47 
                     
                  
                        Linuron
                     
                     
                        330-55-2
                     
                     
                        2,59 
                     
                     
                        465 ± 62
                     
                     
                        2,67 
                     
                  
                        Fenthion
                     
                     
                        55-38-9
                     
                     
                        3,31 
                     
                     
                        2062 ± 648
                     
                     
                        3,31 
                     
                  
               
            Tabella 3
            Sustanzi ta' riferenza rrikomandati għall-metodu tal-iscreening tal-HPLC ibbażat fuq id-data ta' assorbiment tal-ħamrija
            
                        Sustanza ta' riferenza
                     
                     
                        CAS Nr.
                     
                     
                        Log Koc mean valuri minn grupp ekwilibriju
                     
                     
                        Numru ta' data ta' Koc
                        
                     
                     
                        log S.D.
                     
                     
                        Ejgħun
                     
                  
                        Acetanilide
                     
                     
                        103-84-4
                     
                     
                        1,25 
                     
                     
                        4
                     
                     
                        0,48 
                     
                     
                        
                            (2)
                        
                     
                  
                        Phenol
                     
                     
                        108-95-2
                     
                     
                        1,32 
                     
                     
                        4
                     
                     
                        0,70 
                     
                     
                        
                            (2)
                        
                     
                  
                        2-Nitrobenzamide
                     
                     
                        610-15-1
                     
                     
                        1,45 
                     
                     
                        3
                     
                     
                        0,90 
                     
                     
                        
                            (3)
                        
                     
                  
                        N.N-dimethylbenzamide
                     
                     
                        611-74-5
                     
                     
                        1,52 
                     
                     
                        2
                     
                     
                        0,45 
                     
                     
                        
                            (2)
                        
                     
                  
                        4-Methylbenzamide
                     
                     
                        619-55-6
                     
                     
                        1,78 
                     
                     
                        3
                     
                     
                        1,76 
                     
                     
                        
                            (2)
                        
                     
                  
                        Methylbenzoate
                     
                     
                        93-58-3
                     
                     
                        1,80 
                     
                     
                        4
                     
                     
                        1,08 
                     
                     
                        
                            (2)
                        
                     
                  
                        Atrazine
                     
                     
                        1912-24-9
                     
                     
                        1,81 
                     
                     
                        3
                     
                     
                        1,08 
                     
                     
                        
                            (4)
                        
                     
                  
                        Isoproturon
                     
                     
                        34123-59-6
                     
                     
                        1,86 
                     
                     
                        5
                     
                     
                        1,53 
                     
                     
                        
                            (4)
                        
                     
                  
                        3-Nitrobenzamide
                     
                     
                        645-09-0
                     
                     
                        1,95 
                     
                     
                        3
                     
                     
                        1,31 
                     
                     
                        
                            (3)
                        
                     
                  
                        Aniline
                     
                     
                        62-53-3
                     
                     
                        2,07 
                     
                     
                        4
                     
                     
                        1,73 
                     
                     
                        
                            (2)
                        
                     
                  
                        3,5-Dinitrobenzamide
                     
                     
                        121-81-3
                     
                     
                        2,31 
                     
                     
                        3
                     
                     
                        1,27 
                     
                     
                        
                            (3)
                        
                     
                  
                        Carbendazim
                     
                     
                        10605-21-7
                     
                     
                        2,35 
                     
                     
                        3
                     
                     
                        1,37 
                     
                     
                        
                            (4)
                        
                     
                  
                        Triadimenol
                     
                     
                        55219-65-3
                     
                     
                        2,40 
                     
                     
                        3
                     
                     
                        1,85 
                     
                     
                        
                            (4)
                        
                     
                  
                        Triazoxide
                     
                     
                        72459-58-6
                     
                     
                        2,44 
                     
                     
                        3
                     
                     
                        1,66 
                     
                     
                        
                            (4)
                        
                     
                  
                        Triazophos
                     
                     
                        24017-47-8
                     
                     
                        2,55 
                     
                     
                        3
                     
                     
                        1,78 
                     
                     
                        
                            (4)
                        
                     
                  
                        Linuron
                     
                     
                        330-55-2
                     
                     
                        2,59 
                     
                     
                        3
                     
                     
                        1,97 
                     
                     
                        
                            (4)
                        
                     
                  
                        Naphthalene
                     
                     
                        91-20-3
                     
                     
                        2,75 
                     
                     
                        4
                     
                     
                        2,20 
                     
                     
                        
                            (2)
                        
                     
                  
                        Endosulfan-diol
                     
                     
                        2157-19-9
                     
                     
                        3,02 
                     
                     
                        5
                     
                     
                        2,29 
                     
                     
                        
                            (4)
                        
                     
                  
                        Methiocarb
                     
                     
                        2032-65-7
                     
                     
                        3,10 
                     
                     
                        4
                     
                     
                        2,39 
                     
                     
                        
                            (4)
                        
                     
                  
                        Acid Yellow 219
                     
                     
                        63405-85-6
                     
                     
                        3,16 
                     
                     
                        4
                     
                     
                        2,83 
                     
                     
                        
                            (2)
                        
                     
                  
                        1,2,3-Trichlorobenzene
                     
                     
                        87-61-6
                     
                     
                        3,16 
                     
                     
                        4
                     
                     
                        1,40 
                     
                     
                        
                            (2)
                        
                     
                  
                        γ-HCH
                     
                     
                        58-89-9
                     
                     
                        3,23 
                     
                     
                        5
                     
                     
                        2,94 
                     
                     
                        
                            (2)
                        
                     
                  
                        Fenthion
                     
                     
                        55-38-9
                     
                     
                        3,31 
                     
                     
                        3
                     
                     
                        2,49 
                     
                     
                        
                            (4)
                        
                     
                  
                        Direct Red 81
                     
                     
                        2610-11-9
                     
                     
                        3,43 
                     
                     
                        4
                     
                     
                        2,68 
                     
                     
                        
                            (2)
                        
                     
                  
                        Pyrazophos
                     
                     
                        13457-18-6
                     
                     
                        3,65 
                     
                     
                        3
                     
                     
                        2,70 
                     
                     
                        
                            (4)
                        
                     
                  
                        α-Endosulfan
                     
                     
                        959-98-8
                     
                     
                        4,09 
                     
                     
                        5
                     
                     
                        3,74 
                     
                     
                        
                            (4)
                        
                     
                  
                        Diclofop-methyl
                     
                     
                        51338-27-3
                     
                     
                        4,20 
                     
                     
                        3
                     
                     
                        3,77 
                     
                     
                        
                            (4)
                        
                     
                  
                        Phenanthrene
                     
                     
                        85-01-8
                     
                     
                        4,09 
                     
                     
                        4
                     
                     
                        3,83 
                     
                     
                        
                            (2)
                        
                     
                  
                        Basic Blue 41 (mix)
                     
                     
                        26850-47-5
                        12270-13-2
                     
                     
                        4,89 
                     
                     
                        4
                     
                     
                        4,46 
                     
                     
                        
                            (2)
                        
                     
                  
                        DDT
                     
                     
                        50-29-3
                     
                     
                        5,63 
                     
                     
                        1
                     
                     
                        —
                     
                     
                        
                            (3)
                        
                     
                  
         C.20.   DAPHNIA MAGNA REPRODUCTION TEST
         1.   METODU
         Dan il-metodu ta' test tossiku tar-riproduċibilità huwa replika tal-OECD TG 211 (1998).
         1.1.   DAĦLA
         L-għan primarju tat-test huwa li jkun hemm stima tal-effetti tal-kimiċi fuq il-prodott riproduttiva tal-Daphnia magna.
         1.2.   TIFSIR U UNITS
         
            Annimali ġenituri : huma dawk id-Daphnia femminili illi huma preżenti fil-bidu tat-test u illi l-prodott riproduttiva tagħhom huwa l-oġġettiv ta' l-istudju.
         
            Wild : huma d-Daphnia żġħar prodotti mill-annimali ġenituri waqt it-test.
         
            L-inqas effett ta' konċentrazzjoni osservata (LOEC): hija l-inqas konċentrazzjoni pprovata meta s-sustanza hija osservata illi kellha effett statistikalment sinifikanti fuq ir-riproduzzjoni u mhux il-mortalita tal-ġenituri (fejn p < 0,05) meta komparata mall-kontroll, fi żmien espost stabbilit. Madankollu, il-konċentrazzjonijiet kollha taħt prova 'il fuq mill-LOEC għandhom ikollhom effett daneġġuż ugwali jew aktar minn dak osservat fil-LOEC. Meta dawn iż-żewġ kondizzjonijiet ma jkunux jistgħu jiġu sodisfatti, trid tingħata spjegazzjoni kompluta ta' kif ġiet magħżula l-LOEC (u b'hekk in-NOEC).
         
            L-ebda effett osservat tal-konċentrazzjoni (NOEC): huwa t-test tal-konċentrazzjoni eżatt l-isfel mill-LOEC, li meta kkomparat mall-kontroll, m'għandu l-ebda effett statistikament sinjifikanti (p < 0,05), fi żmien espost stabbilit.
         
            EC
            
               x
            : hija il-konċentrazzjoni tas-sustanza taħt prova illi dagħbet fl-ilma b'riżultat f'riduzzjoni ta' x % f'riproduttiva tal-Daphnia magna fi żmien espost stabbilit.
         
            Rata intrinsika ta' żieda: hija l-kejl fit-tkabbir tal-popolazzjoni li tintegra mall-prodott riproduttiva u mal-mortalità skond kif speċifikat skond l-età (20) (21) (22). F'popolazzjonijiet ta' pajjiżi standard din tkun żero. Għall-popolazzjonijiet illi qegħdin jikbru din tkun posittiva u għall-popolazzjonijiet li qegħdin jonqsu din tkun negattiva. Kjarament, tal-aħħar mhux sostitwibbli u fl-aħħar mill-aħhar dan jiġi estint.
         
            Limitu tal-għarfien: huwa l-inqas konċentrazzjoni illi jista' jkun nstabu iżda mhux ikkwantifikat.
         
            Limitu ta' determinazzjoni: huwa l-inqas konċentrazzjoni illi jista' jkun imkejjel kwantittivament.
         
            Moralità: annimali huwa reġistrat bħala mejjet meta jkun immobbli, i.e. meta ma jkunx aktar kapaci illi jgħum, jew jekk ma jkunx osservat ebda moviment tal-appendiċi jew post-abdomen, fi żmien 15-il sekonda minn meta jkun hemm aġitazzjoni ġentili tal-kontenitur tat-test. (Jekk tintuża definizzjoni oħra, din għandha tkun irraportata flimkien mar-riferenza tagħha)
         1.3.   PRINĊIPJUTAL-METODU TA' PROVA
         
            Daphnia femminili żagħżugħa (l-annimal ġenitur), li għandhom eta' ta' inqas minn 24 siegħa fil-bidu tal-prova, huma esposti għas-sustanza taħt prova kif miżjuda ma' l-ilma f'limitu ta' konċentrazzjonijiet. It-tul tal-prova huwa ta' 21 ġurnata. Fl-aħħar tal-prova, in-numru totali ta' wild ħajj pprodott minn kull annimal ħajj ikun assessjat. Dan ifisser illi l-prodotti ġovanili mill-adulti li jmutu waqt il-prova huma esklużi mill-kalkulazzjonijiet. Il-prodott tar-riproduzzjoni tal-annimali ġenituri tista' tkun espressa permezz ta' mogħdi oħra (eż. numru ta' wild ħajj prodott minn kull annimal kull ġurnata mill-ewwel ġurnata minn meta l-wild ikun osservat) imma dawn għandhom ikunu rrapurtati flimkien man-numru totali tal-prodotti ġovanili minn kull ġenitur ħajj fl-aħħar tal-prova. Il-prodott tar-riproduzzjoni tal-annimali esposti għas-sustanza taħt prova hija kkomparata ma' dak tal-kontroll (i) sabiex ikun jistaż jiġi stabbilit l-inqas effett ta' konċentrazzjoni osservat (LOEC) u wara stabbilit ukoll dik il-konċentrazzjoni illi li ma kinitx osservata (NOEC). Flimkien ma' dan, u kemm jista' jkun possibbli, id-data hija analizzata bl-użu tal-mudell ta' rigressjoni sabiex tkun tista' tkun stmata l-konċentrazzjoni li tikkawża riduzzjoni ta' x % fil-prodott riproduttiv (i.e. the EC50, EC20, jew EC10).
         Is-sovravivenza tal-annimali ġenituri u l-ħin sal-produzzjoni tal-ewwel grupp għandhu jkun irrapurtat. Effetti oħra rrelatati mas-sustanza fuq il-parametri bħall-kobor (eż. it-tul) u possibilment ir-rata intrinsika tat-tkabbir, tista' wkoll tkun eżaminata.
         1.4.   INFORMAZZJONI DWAR IS-SUSTANZA TAĦ TPROVA
         Riżultati tat-test ta' tossiċita akuta (ara metodu C.2, Parti I) magħmula minn Daphnia magna għandha tkun disponibbli. Ir-riżultat jista' jkun ta' użu fis-selezzjoni ta' limiti xierqa ta' konċentrazzjonijiet taħt prova fit-test tar-riproduzzjoni. Is-solubilita fl-ilma u l-pressjoni tal-fwar tas-sustanza taħt prova għandhom ikunu magħrufa u metodu analitiku ta' min wieħed joqgħod fuqu għall-kwantifikazzjoni tas-sustanza fis-soluzzjonijiet taħt prova b'effiċjenza ta' rkuprament rrapurtat u l-limiti ta' determinazzjoni għandhom ikunu disponibbli.
         Informazzjoni dwar is-sustanza taħt prova li tista' tkun ta' użu sabiex ikunu stabbiliti l-kondizzjonijiet tat-test tinkludi l-formula ta' struttura, il-purita' tas-sustanza, stabbilità fid-dawl, stabbilità taħt il-kondizzjonijiet tat-test, pKa, Pow u riżultati tat-test għall-biodegradabilità li diħa kien hemm (ara metodu C.4).
         1.5.   VALIDITÀ TAL-PROVA
         Sabiex il-prova tkun valida dawn il-kriterji ta' esekuzzjoni li ġejjin, għandhom ikunu milħuqa fil-kontroll(i):
         
                     —
                  
                  
                     il-mortalità tal-annimal ġenitur (Daphnia femminili) ma taqbiżx l-20 % fl-aħħar tal-prova,
                  
               
                     —
                  
                  
                     in-numru medju ta' wild ħaj prodott għal kull ġenitur li jissupera l-prova huwa ≥ 60.
                  
               1.6.   DESKRIZZJONI TAL-METODU TA' PROVA
         1.6.1.   Apparat
         Vessili ta' prova u apparat ieħor li jkun se jiġi f'kuntatt mas-soluzzjonijiet taħt prova għandhom ikunu magħmula interament mill-ħġieġ u kimiċi oħra magħmula minn materjal inert. Il-vessili tal-prova normalment ikunu beakers tal-ħġieġ.
         Flimkien ma' dan, xi wħud jew l-apparat kollu li ġej se huwa bżonnjuż:
         
                     —
                  
                  
                     meter tal-ossiġenu (b'microelectrode jew apparat aktar xieraq gġall-kejl ta' ossiġenu li kien maħlul f'kampjun ta' volum baxx),
                  
               
                     —
                  
                  
                     apparatat adekwat għall-kontroll tat-temperatura,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pH meter,
                  
               
                     —
                  
                  
                     apparat għad-determinazzjoni tat-toqol ta' l-ilma,
                  
               
                     —
                  
                  
                     apparat għad-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni tal-karbon organiku totali (TOC) ta' l-ilma jew apparat għad-determinazzjoni tad-domanda tal-ossiġenu kemikali (COD),
                  
               
                     —
                  
                  
                     pparat adegwat għall-kontroll fuq utenti tar-reġim tad-dawl u l-kejl tal-intesita' tad-dawl.
                  
               1.6.2.   Organismu taħt prova
         L-ispeċi li għandhom ikunu użati fil-prova huma id-Daphnia magna Straus. Speċi ta' Daphnia oħra jistgħu jkunu użati sakemm dawn jilħqu l-kriterji ta' validita' kif xieraq (il-kriterju tal-validita' relatat mall-prodott tar-riproduzzjoni fil-kontrolli għandu jkun rilevanti għall-ispeċi ta' Daphnia). Jekk speċi oħra ta' Daphnia jkunu użati huma għandhom ikunu identifikati kjaramant u jkun ġustifikat l-użu tagħhom.
         Preferibillment, il-klon għandu jkun ġie identifikat mill-ġenotipu. Riċerka (1) uriet illi l-prestazzjoni tar-riproduzzjoni ta' Klon A (li oriġina minn IRCHA fi Franza) (3) konsistentament laħaq il-kriterju tal-validita' tal-medju of ≥ 60 wild ħal kull ġenitur annimal li jkun baqa' ħajj meta ġie mkabbar taħt il-kondizzjonijiet deskritti f'dan il-metodu. Madankollu, kloni oħra huma aċċettabbli jekk il-kultura tad-Daphnia turi illi laħqet il-kriterju tal-validita' għall-prova.
         Fil-bidu tal-prova, l-annimali għandhom ikollhom inqas minn 24 siegħ u ma għandhomx ikunu proġeni tal-ewwel brood. Għandhom ikunu meħuda minn ħażna b'saħħitha (i.e. li ma juru l-ebda sinjal ta' stress bħal mortalitaż għolja, preżenza ta' rġiel u ephippia, ritardjar fil-produzzjoni ta' l-ewwel grupp, annimali diskoloriti eċċ.). L-annimali li jkunu maħżuna għandhom ikunu miżmuma f'kondizzjonijiet ta' kulturi (dawl, temperatura, medium, għalf u annimali għall-kull unit ta' volum) simili għal dawk użati fil-prova. Jekk il-medium tal-kultura ta' Daphnia li tkun se tintuża fil-prova hija differenti minn dik użata għall-kultura normali ta' Daphnia, hija prattika tajba illi tinkludi pretest ta' perjodu ta' akklimazzjoni li normalment tieħu tliet ġimgħat (i.e. ġenerazzjoni waħda) sabiex jkun evitat illi jikkawża stress fuq l-annimali ġenituri.
         1.6.3.   Medium taħt prova
         Huwa rrikmandat illi medium li huwa kompletament definit huwa użat għall-prova. B'hekk ikun qiegħed jiġi evitat l-użu ta' addittivi (eż. alġi, estratt tal-ħamrija, eċċ.), li huma diffikultużi biex jiġu kkaratterizzati, u għalhekk jirranġa l-opportunitajiet gġall-istandarizzar bejn il-laboratoji. Elendt ta' media M4 (4) u M7 (ara l-Anness 1) instabu illi huma adegwati għal dan il-għan. Madankollu, media oħra (eż. (5) (6)) huma aċċettabbli kemm-il darba l-prestazzjoni tal-kultura ta' Daphnia turi illi tilħaq il-kriteju tal-validita' għall-prova.
         Jekk media huma użati li jinkludu addittivi li mhumiex definiti, dawn l-addittivi għandhom ikunu speċifikati kjarament u l-informazzjoni għandha tkun ipprovduta fir-rapport tat-test dwar il-komposizzjoni, partikolarment fejn tikkonċerna l-kontenut ta' karbon għaliex dan jista' jikkontribwixxi għad-dieta kif previst. Huwa rikomandit illi il-carbon organiku totali (TOC) u/jew id-domanda ta' ossiġenu kemikali (COD) tal-preparazzjoni tal-ħażna tal-addittiv organiku huwa determinat u jkun magħmul estimu tal-kontribuzzjoni distributorja tal-TOC/COD fil-medium taħt prova. Huwa rikomandit illi l-livelli ta' TOC fil-medium (i.e. qabel l-addizzjoni tal-algi) jkunu taħt il-2 mg/l (7).
         Meta jkunu qegħdin jiġu ttestjati sustanzi illi fihom hemm il-metalli, huwa importanti illi wieħed jirrikonoxxi illi l-kwalitajiet tal-medium taħt prova (eż. toqol, kapaċita' ta' kilatar) jistgħu jkollhom impatt fuq it-tossiċita tas-sustanza taħt prova. Għal din ir-raġuni, huwa meħtieġ medium illi huwa kompletament definit. Madankollu, fil-preżent, l-unika medium illi huwa definit kompletament li huwa magħruf illi huwa adegwat għall-kultura ta' Daphne fuq medda twila ta' żmien huma l-Elendt M4 u M7. Iż-żewġ media fihom s-sustanza kilata EDTA. Ix-xogħol wera (2) illi t-‘tossiċita apparenti’ tal-cadmium hija ġeneralment inqas meta t-test tar-riproduzzjoni kien magħmul f'media ta' M4 u M7 milli meta kienu f'media li ma kienx fihom EDTA. M4 u M7 mhumiex, għalhekk, irrikmandati għat-testjar ta' sustanzi illi fihom il-metalli, u media oħra illi hu magħruf illi fihom sustanzi kilati għandhom ikunu evitati. Wieħed jista' jkun ta' parir ilii gġal sustanzi li fihom il-metall ikun użat medium alternattiv bhal, per eżempju, ASTM rikonstitwit f'ilma frisk aħrax (7), li fihom ma jkunx hemm EDTA, u li jkollhom magħhom estratti ta' alġi (8). Din il-kombinazzjoni ta' ASTM rikonstitwit f'ilma frisk aħrax u estratt ta' alġi huwa wkoll adegwat għal kulturi għal żmien twil u ttestjar ta' magna ta' Daphne (2), għalkemm xorta joħroġ azzjoni kilanti medja dovuta minħabba l-komponent organiku tal-estratt ta' alġi li ġew mgħaduda.
         Fil-bidu u waqt il-prova, l-l-konċentrazzjoni ta' ossiġenu li ġie maħlul għandu jkun 'il fuq minn 3 mg/l. Il-pH għandha tkun bejn 6-9, u normalment m'għandhiex tvarja aktar minn 1,5 units f'test wieħed. Ħruxija 'il fuq minn 140 mg/l (bħal CaCO3) huwa rikomandat. Testijiet f'dan il-livell u 'il fuq minnhom urew prestazzjoni ripproduttiva flimkien mall-kriteju ta' validita' (9) (10).
         1.6.4.   Soluzzjonijiet taħt prova
         Soluzzjonijiet taħt prova ta' konċentrazzjonijiet magħżula huma ġeneralment ippreparati billi jkun hemm taħlita ta' ilma mas-soluzzjoni maħżuna. Soluzzjonijiet maħżuna huma preferibilment ippreparati billi jkun hemm taħlita ta' ilma mas-soluzzjoni fil-medium taħt prova.
         L-użu ta' solventi organiċi jew dispersanti jistgħu jkunu meħtieġa f'ċerti każijiet sabiex ikun hemm produzzjoni ta' ħażna ta' soluzzjoni konċentrata xierqa, imma għandu jsir hemm kwalsiasi sforz meħtieġ sabiex jiġi evitat l-użu ta' dawn il-materjali. Eżempji ta' solventi xierqa huma acetone, ethanol, methanol, dimethylformamide u triethylene glycol. Eżempji ta' dispersanti xierqa huma Cremophor RH40, methylcellulose 0,01 % u HCO-40. Fi kwalsiasi każ, is-sustanzi taħt prova għandhom ma jaqbżux il-limiti ta' solubilità tal-medium taħt prova.
         Is-solventi huma użati sabiex jipproduċu ħażna ta' soluzzjoni li tista' tkun mħallta preċiżament mal-ilma. Fil-medium taħt prova finali, il-konċentrazzjoni tas-solvent rikomandita (i.e. ≤ 0,1 ml/l), is-solventi imniżżlin hawn fuq m'għandhomx ikunu tossiċi u m'għandhomx iżidu is-solubilita' ta' sustanza.
         Dispersanti jistgħu jassistu f'taħlit preċiż u disperzjoni. Fil-medium taħt prova finali, il-konċentrazzjoni tas-solvent rikomandita (≤ 0,1 ml/l), id-dispersanti imniżżlin hawn fuq m'għandhomx ikunu tossiċi u m'għandhomx iżidu is-solubilita' ta' sustanza.
         1.7.   DISINN TAĦ TPROVA
         It-trattamenti għandhom ikunu allokati għall-vessili tat-test u kull immaneġġjar sussegwenti tal-vessili tat-test għandhu jkun magħmul f'mod każwali. Fin-nuqqas li jsir dan jista' jirriżulta fi żbilanċ illi jista' jittieħed bħala effett ta' konċentrazzjoni. Partikolarment, jekk units esperimentali huma immaniġjati f'ordni ta' trattament jew taż konċentrazzjoni, jiġri illi xi effett relatat mall-ħin, bhħal għeja tal-operatur jew xi żball ieħor, jista' jwassal għall-effetti akbar f'konċentrazzjonijiet akbar. Barra minnhekk, jekk ir-riżultati tat-test probabbli illi jkunu affettwati b'ambjent li jkun fih inizjalment jew bil-kondizzjoni ambjentali tal-prova, bħal posizzjoni fil-laboratorju, hemmhekk mela għandu jittieħed in konsiderazzjoni sabiex il-prova tkun imblukkata.
         1.8.   PROĊEDURA
         1.8.1.   Kondizzjonijiet ta' espożizzjoni
         1.8.1.1.   Tul ta' żmien
         Id-durazzjoni tat-test hija ta' 21 ġurnata.
         1.8.1.2.   Tgħabija
         Annimali ġenituri huma mantenuti individwalment, wieħed għal kull vessilu ta' prova, b'50-100 ml ta' medium f'kull vessilu.
         Volumi akbar jistgħu xi kultant ikun neċessarji sabiex jilħqu ir-rekwiżiti tal-proċedura analitika użata sabiex tkun determinata l-konċentrazzjoni tas-sustanza taħt prova, għalkemm il-pooling ta' repliki għall-analiżi kemikali hija wkoll aċċettabbli. Jekk jintużaw volumi akbar minn 100 ml, ir-ratio mogħti lid-Daphnia jista' jkollu bżonn illi jiżdied sabiex ikun assigurat illi jkun hemm provista adegwata ta' ikel u konformita mall-kriterju tal-validita'. Għal testijiet ta' flow-through, disinji alternattivi jistgħu jiġu kkunsidrati għal raġunijiet ta' teknika, (e.ż. erba' gruppi ta' 10 annimali f'volum akbar ta' prova), imma kwalsiasi kambjament għandu jkun irrapurtat.
         1.8.1.3.   Numru ta' annimali
         Għall-testijiet semi-statiċi, mill-inqas 10 annimali miżmuma individwalment f'kull konċentrazzjoni ta' prova u mill-inqas 10 annimali miżmuma individwalment f'serje ta' kontrolli.
         Għal testijiet ta' flow-through, 40 annimal maqsuma f'erba gruppi ta' għaxar annimali għal kull konċentrazzjoni taħt prova ġie muri li jkunu adegwati (1). Numru iżgħar ta' organiżmi taħt prova jistgħu jkunu użati u minimu ta' 20 annimali għal kull konċentrazzjoni maqsuma f'żewg repliki jew aktar b'numru indaqs ta' annimali (e.ż. erba' repliki kull wieħed b' ħames daphnids) huma rakomandati. Għandu jkun innutat illi għall-testijiet fejn l-annimali huma miżmuma fi gruppi, mhux se jkun possibbli illi jiġi espress r-riżultat ripproduttiv bħala numru totali ta' wild ħajjin prodotti għal kull annimal ġenitur ħajj fl-aħħar tal-prova, jekk l-annimal ġenitur imut. F'dawn il-każijiet il-produzzjoni ripproduttiva għandha tkun espressa bħala “in-numru totali ta' offspring ħajjin prodotti għal kull ġenitur prezenti fil-bidu tal-prova”.
         1.8.1.4.   Għalf
         Għal testijiet semi statiċi, l-għalf għandu preferibbilment ikun magħmul kulljum, iżda mill-inqas tlett darbiet fil-ġimgħa (i.e. li jikkorrispondi mal-kambjamenti fil-media). Devjazzjonijiet minn dan (e.ż. għat-testijiet ta' flow-through) għandu jkun irrapurtat.
         Waqt il-prova, id-dieta tal-annimal ġenitur għandha preferibbilment tkun ċelloli ta' algi ħajjin ta' wieħed jew aktar minn dawn li ġejjin: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (issa Pseudokirchneriella subcapitata (11)) u Scenedesmus subspicatus. Id-dieta mogħtija għandha tkun ibbażata fuq l-ammont ta' karbon organiku (C) previst f'kull annimal ġenitur. Riċerka (12) write illi, għall-Daphnia magna, livelli ta' razzjon bejn 0,1 u 0,2 mg C/Daphnia/kull ġurnata huma biżżejjed sabiex jintlaħaq in-numru rikjest ta' wild sabiex jintlaħaq il-kriteju tal-validita'. Ir-razzjoni jista' jkun mogħti jew f'rata konsistenti matul il-perjodu ta' prova, jew, jekk mixtieq, rata aktar baxxa tista' tkun użata fil-bidu u mbagħad tkun miżjuda waqt il-prova sabiex jittieħed in konsiderazzjoni l-kobor tal-annimal ġenitur. F'dan il-każ, ir-razzjon għandu xorta jibqa' fil-limitu rakomandit ta' 0,1 - 0,2 mg C/Daphnia/kuljum fi kwalsiasi ħin.
         Jekk miżuri surrogati, bħan-numru ta' ċelloli ta' algi jew l-assorbiment tad-dawl, huma użati sabiex jiġu mitmugħa il-livelli rikjesti tar-razzjon (i.e. għall-konvenjenza minħabba il-kejl tal-kontenut ta' karbon jieħu l-ħin), kull laboratorju għandu jipproduċi n-nomograff propju relatat mal-miżura ta' surroga tal-kontenut ta' karbon fil-kulturi ta' algi (ara l-anness 2 għal pariri dwar il-produzzjoni ta' nomograff). Nomograffs għandhom ikunu iċċekkjati mill-inqas kull sena jew aktar jekk il-kondizzjonijiet tal-kultura ta' l-algi jinbidlu. Ġie misjub illi l-assorbiment tad-dawl huwa surroga aħjar għall-kontenut ta' karbon minn numru ta' ċelloli (13).
         Suspension ikkonċentrata ta' algi għandhom ikunu mitmugħa lid-Daphnia sabiex jitnaqqas il-volum ta' medium ta' kultura ta' algi trasferita fil-vessili ta' prova. Konċentrazzjoni ta' algi tista' tkun milħuqa b'centrifugazzjoni u wara b' resuspension f'ilma ddistillat, ilma deionizzat medium ta' kultura ta' Daphnia.
         
         1.8.1.5.   Dawl
         16–il siegħa dawl f'intensità li ma taqbiżx il-15-20 μE· m-2·s-1.
         1.8.1.6.   Temperatura
         It-temperatura tal-media taħt prova għandha tkun fir-range ta' 18-22 oC. Madankollu, għal kull prova, it-temperatura m'għandhiex tvarja, kemm jista' jkun possibbli, b'aktar minn 2 oC bejn dawn il-limiti (e.ż. 18-20, 19-21 jew 20-22 oC). Jista' ikun xieraq illi jintuża vesseli ta' prova ieħor sabiex it-temperatura tkun tista' tiġi kkontrollata.
         1.8.1.7.   Aeration
         Il-vessili ta' prova m'għandhomx ikunu aerated waqt il-prova.
         1.8.2.   Konċentrazzjoni tal-prova
         Normalment, għandu jkun hemm mill-inqas ħames konċentrazzjonijiet tal-prova impoġġijja f'serje ġeometrika b'fattur ta' separazzjoni preferibilment li ma jeċċedix 3.2, u n-numru xieraq tar-repliki għal kull konċentrazzjoni tal-prova għandhom ikunu użati (ara taqsima 1.8.1.3). Ġustifikazzjoni għandha tkun ipprovduta jekk inqas minn ħames konċentrazzjonijiet ikunu użati. Is-sustanzi m'għandhomx ikunu ittestjati 'il fuq mill-limitu tas-solubilita' tagħhom fil-medium tat-test.
         Sabiex ikun stabbilit limitu tal-konċentrazzjonijiet, wieħed ma jridx jinsa dawn li ġejjin:
         
                     (i)
                  
                  
                     Jekk l-għan ikun illi jinkiseb LOEC/NOEC, l-inqas konċentrazzjoni ta' prova għandha tkun baxxa biżżejjed sabiex il-fekundita f'dik il-konċentrazzjoni mhijiex konsiderevolment aktar baxxa minn dik tal-kontroll. Jekk dan mhuwiex il-każ, it-test għandu jkun ripetut b'inqas konċentrazzjoni mnaqqsa;
                  
               
                     (ii)
                  
                  
                     Jekk l-għan ikun illi jinkiseb LOEC/NOEC, l-ogħla konċentrazzjoni ta' prova għandha tkun għolja biżżejjed sabiex il-fekundita f'dik il-konċentrazzjoni hija konsiderevolment aktar baxxa minn dik tal-kontroll. Jekk dan mhuwiex il-każ, it-test għandu jkun ripetut bl-ogħla konċentrazzjoni miżjuda;
                  
               
                     (iii)
                  
                  
                     Jekk il-ECX għall-effetti fuq ir-riproduzzjoni hija estimata, wieħed huwa ta' parir illi jkunu użati konċentrazzjonijiet biżżejjed sabiex jagħtu definizzjoni lill-ECX b'livell xieraq ta' kunfidenza. Jekk il-EC50 għall-effetti fuq ir-riproduzzjoni hija estimata, wieħed huwa ta' parir illi l-ogħla konċentrazzjoni taħt prova tkun akbar minn din il-EC50 . Inkella, għalkemm wieħed xorta jkun jista' jagħti estimu għall-EC5O, l-interval ta' kunfidenza għall-EC50 tkun wiesgħa ħafna u jista' ma jkunx possibbli illi ikun stima sodifaċenti jekk il-mudell kif magħmul kienx xieraq;
                  
               
                     (iv)
                  
                  
                     Il-limitu tal-konċentrazzjoni tat-test għandu preferibilment ma jinkludix xi konċentrazzjonijiet illi għandhom effett statistikament sinjifikattiv fuq is-sovravivenza tal-adult billi dan ibiddel in-natura tat-test minn sempliċiment test ta' riproduzzjoni għall-riproduzzjoni kkombinata u test tal-mortalita li jirrikjedu aktar analizzar kumpless statistikament.
                  
               Informazzjoni minn qabel tat-tossiċita' tas-sustanza taħt prova (e.ż. minn prova akuta u/jew studji sabiex jinstabu il-limiti) għandhom jgħinu fl-għażla tal-konċentrazzjonijiet l-aktar xierqa għall-prova.
         Fejn solvent jew dispersant huwa użat sabiex jgħin fil-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tal-prova (ara taqsima 1.6.4), il-konċentrazzjoni finali tagħha fil-vessili tal-prova għandhom ikunu akbar minn 0,1 ml/l u għandhom ikunu l-istess bħal tal-vessili tal-prova.
         1.8.3.   Kontrolli
         Serje ta' medium ta' prova wieħed u jekk rilevanti serje ta' kontroll wieħed li fih solvent jew dispersant għandu jiġi magħmul ukoll ukoll għas-serje tat-test. Meta użat, il-konċentrazzjoni tas-solvent jew tad-dispersant għandha tkun l-istess bħal dik użata fil-vessili illi fihom ikunu jinsabu is-sustanzi taħt prova. In-numru xieraq ta' repliki għandhom jkun użat (ara taqsima 1.8.1.3).
         Ġeneralment, fi prova magħmula tajba, il-koeffiċjent tal-varjazzjoni madwar in-numru medju tal-wild ħajjin prodotti għal kull annimal ġenitur fil-kontroll(i) għandu jkun ta' < 25 %, u dan għandu jkun irrapurtat għad-disinni tat-test bl-użu tal-annimali użati individwalment.
         1.8.4.   Rinovazzjoni tal-medium tat-test
         Il-frekwenza tar-rinovazzjoni tal-medium jiddependi fuq l-istabbilita tas-sustanza taħt prova, imma għandha tkun mill-inqas ta' tlett darbiet fil-ġimgħa. Jekk, mill-prova preliminarja sabiex tkun tista' tiġi stabbilita, (ara taqsima 1.4) il-konċentrazzjoni tas-sustanza taħt prova mhijiex stabbli (i.e. barra l-limitu 80-120 % tan-nominali jew li taqa' taħt it-80 % tal-konċentrazzjoni kif imkejla fil-bidu) fuq perjodu ta' rinovazzjoni massimu (i.e. tlett ijiem), wieħed għandu jieħu in konsiderazzjoni ir-rinovazzjoni aktar frekwenti, jew għall-użu ta' test flow-through.
         Meta il-medium huwa rinovat fi prova semi-statika, it-tieni serje ta' vessili tal-prova għandhom ikunu ppreparati u l-annimali ġenitur jiġu ttrasferiti fihom, b'pipetta tal-ħġieġ per eżempju li jkollha diametru xieraq. Il-volum ta' medium trasferit bid-Daphnia għandu jkun minimizzat.
         1.8.5.   Osservazzjonijiet
         Ir-riżultati tal-osservazzjonijiet magħmula waqt il-prova għandhom ikunu rreġistrati fuq data sheets (ara eżempji fl-Appendiċi 3 u 4). Jekk miżuri oħra huma bżonnjużi (ara 1.3 u 1.8.8) osservazzjonijiet addizzjonali jistgħu jkunu meħtieġa.
         1.8.6.   Wild
         Il-wild li huma prodotti minn kull annimal ġenitur għandu preferibilment ikun imneħħi u jingħadd kuljum sad-dehra ta' l-ewwel grupp, sabiex tipprevenihom milli jikkunsmaw ikel li jkun intiż għall-adulti. Għal dan il-metodu huwa biss in-numru ta' wild ħajj li hemm bżonn illi jiġu mgħaduda, iżda l-preżenza ta' bajd abbortit u ta' wild mejjet għandu jkun irrekordjat.
         1.8.7.   Mortalità
         Mortalità fl-annimali ġenituri għandha tkun irrekordjata preferibilment kuljum, mill-inqas fl-istess ħinijiet illi l-wild huma magħduda.
         1.8.8.   Parametri oħra
         Għalkemm dan il-metodu huwa intiż prinċiparjament sabiex ikun hemm stima fuq ir-riproduzzjoni, huwa possibbli illi effetti oħra jistgħu jkunu kkwantifikati biżżejjed li jippermettu analiżi statika. Kejl ta' kobor huwa desiderevoli ħafna minħabba illi jipprovdi informazzjoni fuq effetti li possibilment jistgħu jkunu subletali, li jistgħu jkunu aktar ta' użu mill-kejl tar-riproduzzjoni waħedha; il-kejl tat-tul tal-annimali ġenituri (i.e. it-tul tal-ġisem minbarra l-ispina anali) fl-aħħar tal-prova huwa rrakomandit. Parametri oħra li jistgħu jiġu mkejla jew ikkalkolati jinkludu ż-żmien illi jieħdu sabiex jipproduċu l-ewwel grupp (u gruppi oħra), numbru u miżura tal-gruppi għal kull annimal, numru ta' gruppi abbortiti, preżenza ta' rġiel jew ephippia u r-rata intrinsika taż-żieda fil-popolazzjoni
         1.8.9.   Il-frekwenza tad-determinazzjonijiet analitiċi u l-kejl
         Konċentrazzjoni ta' ossiġenu, temperatura, ħruxija u l-valuri tal-pH għandhom ikunu mkejla mill-inqas darba fil-ġimgħa, fil-kontroll(i) u fl-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza taħt prova.
         Waqt il-prova, il-konċentrazzjonijiet tas-sustanza taħt prova huma ddeterminati f'intervalli regolari.
         F'testijiet semi-statiċi fejn il-konċentrazzjoni tas-sustanza taħt prova hija maġsuba illi tibqa' bejn ± 20 % tan-nominali (i.e. fil-limitu 80-120 % – ara 1.4 u 1.8.4), huwa rrakomandit illi, bħala minimu, l-ogħla u l-inqas konċentrazzjonijiet tat-testijiet huma analiżżati meta jkunu ppreparati ġodda u fil-ħin tar-rinovazzjoni f'okkażjoni ta' darba waqt l-ewwel ġimgħa tal-prova (i.e. l-analiżi għandhom ikunu magħmula fuq kampjun ta' l-istess soluzzjoni – meta tkun għadha kemm ġiet ippreparata u meta rrinovata). Dawn id-determinazzjonijiet għandhom ikunu irripetuti mill-inqas f'intervalli ta' ġimgħa u ta' ġimgħa wara ġimgħa wara dan.
         Għal provi fejn il-konċentrazzjoni tas-sustanza taħt prova mhijiiex maħsuba illi tibqa' fil-limiti ± 20 % tan-nominali, huwa neċessarju illi ssir analiżi tal-konċentrazzjonijiet tal-prova, meta ppreparata mill-bidu jew meta rrinovatai. Madankollu, għal dawk it-testijiet fejn il-konċentrazzjoni inizjali mkejla tas-sustanza taħt prova mhijiex fil-± 20 % tan-nominali imma jista' jkun hemm evidenza biżżejjed illi turi illi l-konċentrazzjonijiet tal-bidu huma repetibbli u stabbli (i.e. fil-limitu ta' 80-120 % tal-konċentrazzjonijiet tal-bidu), id-determinazzjonijiet kimiċi jistgħu jkunu mnaqqsa b' 2 ġimgħat u 3 tat-test sa l-ogħla u l-inqas konċentrazzjonijiet tal-prova. Fil-każijiet kollha, id-determinazzjoni tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza taħt prova qabel ikunu rrinovati tista' tiġi magħmula f'vessilu wieħed ta' replika f'kull konċentrazzjoni taħt prova.
         Jekk prova ta' flow-through hija użata, reġim ta' teħid ta' kampjuni simili għal dak deskritt fil-prova semi statika huwa xieraq (iżda l-kejl tas-soluzzjonijeit ‘qodma’ mhuwiex applikabbli f'dan il-każ). Madankollu, wieħed jista' jkun ta' parir illi jiżdiedu n-numri ta' okkażżjonijiet ta' teħid ta' kampjuni waqt l-ewwel ġimgħa (e.ż. tlett gruppi ta' kejl) sabiex ikun assigurat illi l-konċentrazzjonijiet tal-prova għadhom stabbli. F'dawn it-tipi ta' testijiet, ir-rata tal-flow tad-diluent u s-sustanza taħt prova huma iċċejkati kuljum.
         Jekk ikun hemm evidenza illi l-konċentrazzjoni tas-sustanza li tkun qegħda tiġi ttestjata kienet ikkontrollata kif xieraq fl-± 20 % tan-nominali jew fil-konċentrazzjoni imkejla fil-bidu baqghet l-istess waqt it-test, mela r-riżultati jistgħu jkunu ibbażati fuq in-nominali u fuq il-valuri tal-bidu kif imkejla. Jekk id-devjazzjoni minn nominali jew mill-valuri tal-bidu kif imkejla hija akbar minn ± 20 %, ir-riżultati għandhom ikunu espressi ai termini tal-medju kif imkejjel skond il-ġin.(ara l-anness 5).
         2.   DATA U RAPURTAĠĠ
         2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         L-għan ta' din il-prova huwa illi jkun stabbilit l-effett tas-sustanza taħt prova fuq in-numru totali ta' wild ħaj prodott għal kull annimal ġenitur li huwa ħajj fl-aħħar tal-prova. In-numru totali tal-wild għal kull annimal ġenitur għandu jkun ikkalkolat għall-kull vessilu ta' prova (i.e. repliki). Jekk, fi kwalsiasi replika l-annimal ġenitur imut waqt il-prova jew jiġri illi jkun maskili, mela r-replika hija eskluża mill-analiżi. L-analiżi mbagħad tkun ibbażata fuq in-numru ridott ta' repliki.
         Sabiex tkun stmata l-LOEC, u wara l-NOEC, għall-effetti tal-kimiċi fuq il-prodott tar-riproduzzjoni, huwa neċessarju illi jkun ikkalkolat l-prodott mean tar-riproduzzjoni tul repliki għal kull konċentrazzjoni u d-devjazzjoni standard residwali kif miġmuha, u din tista' tkun magħmula bl-użu tal-analiżi tal-varjant (ANOVA). Il-medju għal kull konċentrazzjoni għandu mbagħad ikun ikkomparat mall-medju ta' kontroll bl-użu ta' metodu ta' ikkomparar multipliku kif ikun xieraq. It-test ta' Dunnett jew ta' Williams jista' jkun ta' użu (14) (15) (16) (17). Huwa neċessarju illi wieħed jiċċekkja jekk l-assumazzjoni ANOVA tal-homogeneity tal-varjant huwiex validu. Huwa rrikomandit illi dan huwa magħmul graffikament, iktar milli bl-użu ta' prova sinjifikattivi formali (18); alternattiv xieraq sabiex jiġi magħmul it-test ta' Bartlett. Jekk din l-assumazzjoni ma treġix, hemmhekk wieħed għandu jikkonsidra illi d-data tkun ittrasformata sabiex tkun omoġinezzata il-varjanza qabel issir l-ANOVA, jew qabel issir ANOVA ta' ċertu saħħa. Il-kobor tal-effett kif dedott bl-użu tal-ANOVA (i.e. id-differenza l-inqas sinjifikanti) għandu jkun ikkalkolat u rrapurtat.
         Għall-estimu tal-konċentrazzjoni illi jista' jikkawża riduzzjoni ta' 50 % fil-prodott riproduttiv (i.e. l- EC50), kurvatura xierqa, bħall-kurvatura loġistika, għandha tkun xierqa għad-data bl-użu ta' metodu ta' statistika bħal l-inqas kwadri. Il-kurvatura tista' tkun parametrizzata sabiex il- EC50 u l-iżbalji standard tagħha jistgħu jiġu estimati direttament. Dan jgħin ħafna fil-kalkulazzjoni tal-limiti ta' kunfidenza tal-EC5O . Kemm-il darba ikun hemm raġuni validi għal xiex jintużaw livelli ta' kunfidenza differenti, 95 % tal-limiti ta' kunfidenza ta' żewġ naħat għandhom ikunu kkwotati. Il-proċedura xierqa għandha preferibbilment tipprovdi mezz ta' kif wieħed jagħmel stima tal-mankanza xierqa. Dan jista' jkun magħmul graffikament jew bid-diviżjoni tas-somma li tibqa' ta' kwadri fil-‘lack of fit’ u ‘pure error components’ u li jagħmlu test sinjifikattiv tal-mankanza xierqa. Billi trattamenti illi jagħtu fekundita' għolja aktarx li għandhom varjanza għola fin-numru ta' prodotti ġovanili aktar mit-trattamenti li jaħtu fekundita' baxxa, wieħed għandu jagħti konsiderazzjoni lill-valuri osservati sabiex jirreflettu l-varjanzi differenti fi gruppi ta' trattament differeneti (ara bħala riferenza l-informazzjoni fl-isfond (18).
         Fl-analiżi tad-data mill-aħħar dawra ta' prova (2), kurvatura loġistika kienet magħmula permezz taż l-użu tal-mudell kif ġejj, għalkemm mudelli oħra kkonsidrati bħala xierqa jistgħu jkunu użati:
         
            
         fejn:
         
                     Y
                  
                  
                     =
                  
                  
                     in-numru totali ta' ġovanili għal kull annimal ġenitur ħajj fl-aħħar tal-prova (ikkalkolat għal kull vessilu)
                  
               
                     x
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-konċentrazzjoni tas-sustanza
                  
               
                     c
                  
                  
                     =
                  
                  
                     in-numru pretiż ta' ġovanili meta x = 0
                  
               
                     x0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il EC50 fil-popolazzjoni
                  
               
                     b
                  
                  
                     =
                  
                  
                     il-parametru tan-niżla.
                  
               Dan il-mudell huwa x'aktarx adegwat f'numru kbir ta' sitwazzjonijiet, imma jista' jkun hemm provi fejn mhuwiex adegwat. Għandu jkun hemm ispezzjoni dwar il-validita' tal-mudell kif issuġġerit hawn fuq. F'xi każijiet, mudell ta' hormesis li jagħti konċentrazzjonijiet baxxi jista' jkun xieraq (19).
         Konċentrazzjonijiet oħra ta' effett, bħal EC10 jew EC20 jistgħu wkoll ikunu stmati, għalkemm ikun aktar preferibbli illi tintuża parametrizzazzjoni differenti tal-mudell minn dak uzat sabiex tkun stmata l-EC50 .
         2.2.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi dan li ġej:
         2.2.1.   Sustanza taħt prova:
         
                     —
                  
                  
                     natura fiżika u kwalitajiet psikokemikali,
                  
               
                     —
                  
                  
                     
                        data ta' identifikazzjoni ta' kimiċi, inkluż il-purita'.
                  
               2.2.2.   Speċi tal-prova:
         
                     —
                  
                  
                     il-klon (jekk kienx tipati ġenetikament, il-fornitur jew l-egħjun (jekk hu magħruf) u l-kondizzjonijiet tal-kultura użati. Jekk speċi differenti ta' Daphnia magna hija użata, din għandha tkun irrapurtata u ġġustifikata.
                  
               2.2.3.   Kondizzjonijiet ta' prova:
         
                     —
                  
                  
                     Proċedura ta' prova użata (e.ż. semi-statika jew flow-through, volum, tgħabija fin-numru ta' Daphnia għal kull litru),
                  
               
                     —
                  
                  
                     photoperiod u intensita' ta' dawl,
                  
               
                     —
                  
                  
                     disinn tal-prova (e.ż. numru ta' repliki, numru ta' ġenituri għal kull replika),
                  
               
                     —
                  
                  
                     dettalji tal-medium tal-kultura użat,
                  
               
                     —
                  
                  
                     jekk użati, addizzjonijiet ta' materjali organiċi inkluż il-komposizzjoni, egħjun, metodu tal-preparazzjoni, TOC/COD tal-preparazzjonijiet tal-ħażniet, estimu tal-TOC/COD kif riżultanti fil-medium tal-prova,
                  
               
                     —
                  
                  
                     informazzjoni dettaljata dwar għalf, inkluż ammont (f'mg C/Daphnia/kull ġurnata) u skeda (e.ż. tip ta' ikel, inkluż għall-algi b'ismijiet speċifiċi (speċi) u, jekk magħruf, it-tensjoni, il-kondizzjonijiet tal-kultura),
                  
               
                     —
                  
                  
                     metodu tal-preparazzjoni tas-soluzzjonijiet tal-ħażna u l-frekwenza tar-rinovar (is-solvent jew dispersant u l-konċentrazzjoni tagħha għandhom jingħataw, meta użati).
                  
               2.2.4.   Riżultati:
         
                     —
                  
                  
                     riżultati minn xi studji preliminari dwar l-istabilita' tas-sustanza taħt prova;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-konċentrazzjonijiet tat-test nominali u r-riżultati tal-analiżi kollha sabiex ikun stabbilit il-konċentrazzjoni tas-sustanza taħt prova fil-vessili tal-prova (ara id- data sheets tal-eżempju fl-anness 4); l-effiċjenza tal-irkuprar tal-metodu u l- limiti tad-determinazzjoni għandhom ikunu irrapurtati wkoll,
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-kwalità tal-ilma fil-vessili tal-prova (i.e. pH, temperatura u l-konċnetrazzjoni tal-ossiġenu kif inħall, u TOC u/jew COD u ħruxija fejn applikabbli ara id-data sheets tal-eżempju fl-anness 3),
                  
               
                     —
                  
                  
                     ekord komplet tal-offspring ħajj minn kull annimal ġenitur (ara d-data sheets tal-eżempju fl-anness 3),
                  
               
                     —
                  
                  
                     in-numru ta' mejtin fl-annimali ġenituri u d-data meta tiġri (ara d-data sheets tal-eżempju fl-anness 3),
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-koeffiċjent tal-varjazzjoni fuq il-fekundita' tal-kontroll (ibbażata fuq in-numru totali tal-wild ħajj għal kull annimal ġenitur ħajj fl-aħħar tal-prova),
                  
               
                     —
                  
                  
                     plot tan-numru totali tal-wild ħaj għal kull annimal ġenitur (għal kull replika) fl-aħħar tal-prova vs konċentrazzjoni tas-sustanza taħt prova,
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-inqas konċentrazzjoni ta' effett osservat (LOEC) għar-riproduzzjoni, inkluż deskrizzjoni tal-proċeduri statistiċi użati u indikazzjoni ta' x' kobor jista' jkollu l-effett u l-konċentrazzjoni mhux osservata ta' effett (NOEC) għar-riproduzzjoni; meta approprjat, l-LOEC/NOEC għall-mortalita' tal-annimal ġenitur għandha wkoll tiġi rrapurtata,
                  
               
                     —
                  
                  
                     meta approprjat, l-ECx għar-riproduzzjoni u l-intervalli ta' kunfidenza u graff tal-mudell kif xieraq użat għall-kalkolazzjoni tagħha, in-niżla tal-kurvitura tad-dose-response u l-Iżball standard tagħha,
                  
               
                     —
                  
                  
                     effetti oħra bijoloġiċi osservati jew imkejla: jkun irrapurtat effetti oħra biloloġiċi li kienu ossevati jew mkejla (e.ż. kobor tal-annimali ġenituri) inkluż kwalsiasi ġustifikazzjoni meħtieġa,
                  
               
                     —
                  
                  
                     spjegazzjoni ta' xi devjazzjoni mill-metodu tal-prova.
                  
               3.   RIFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20-21 March 1993.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No.6. Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Baird D.J., Barber J., Bradley M.C., Soares A.M.V.M. and Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, 257-265.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Elendt B.P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol. ,47, 775-782.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 pp.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley M.C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.) pp 144-148.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Parkhurst B.R., Forte J.L. and Wright G.P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, 1-8.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Cowgill U.M. and Milazzo D.P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), 185-196.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, 209.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Sims I.R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 2053-2058.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459-466.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Dunnett C.W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Dunnett C.W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, 510-531.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Draper N.R. and Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Wilson E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     Poole R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, p 532.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     Meyer J.S., Ingersoll C.G., McDonald L.L. and Boyce M.S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs boo
                  
               
            ANNESS
            PREPARAZZJONI TA' ELENDT M7 U M4 MEDIA IMFISSRA KOMPLETAMENT
            Akklimazzjoni għal Elendt M7 u M4 media
            Xi laboratorji sabu xi diffikultajiet meta trasferixxew direttament id-Daphnia għal M4 (1) u M7 media. Madankollu, kien hemm xi suċċess b'akklimazzjoni gradwali, i.e. bilmixi mill-użu tal-medium rikjest għal 30 % Elendt, wara għal 60 % Elendt u mbagħad għal 100 % Elendt. Il-perjodu ta' akklimazzjoni jistgħu jieħdu sa sena.
            PREPARAZZJONI
            Elementi ta' traċċi
            Soluzzjonijiet separati ta' 1–istokk (I) ta' elementi individwali huwa 1–ewwel mitfugħa f'ilma safi, eż. dejonizzat, distillat jew mir-rivers ożmożis. Minn dawn 1–istokkijiet diffrenti (I) soluzzjoni waħdanija (II) tiġi ppreparata, li jkun fiha 1–elementi traċċabbli kollha (is-soluzzjoni kombinata). i.e.
            
                        Soluzzjonijiet ta' ħażna I
                        (sustanzi singoli)
                     
                     
                        Ammont miżjud ma' l-ilma
                        (mg/l)
                     
                     
                        Konċentr azzjoni (vis-a-vis il-medium M4)
                        (fold)
                     
                     
                        Sabiex tiġi ppreparata ħażna ta' soluzzjoni II kkombinata żid l-ammont li ġej ta' soluzzjoni I ta' ħażna mal-ilma
                        (ml/l)
                     
                  
                        M 4
                     
                     
                        M 7
                     
                  
                        H3BO3
                        
                     
                     
                        57 190 
                     
                     
                        20 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        MnCl2 * 4 H2O
                     
                     
                        7 210 
                     
                     
                        20 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        LiCl
                     
                     
                        6 120 
                     
                     
                        20 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        RbCl
                     
                     
                        1 420 
                     
                     
                        20 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        SrCl2 * 6 H2O
                     
                     
                        3 040 
                     
                     
                        20 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        NaBr
                     
                     
                        320
                     
                     
                        20 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        Na2MoO4 * 2 H2O
                     
                     
                        1 260 
                     
                     
                        20 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        CuCl2 * 2 H2O
                     
                     
                        335
                     
                     
                        20 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        0,25 
                     
                  
                        ZnCl2
                        
                     
                     
                        260
                     
                     
                        20 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        CoCl2 * 6 H2O
                     
                     
                        200
                     
                     
                        20 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        KI
                     
                     
                        65
                     
                     
                        20 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        Na2SeO3
                        
                     
                     
                        43,8 
                     
                     
                        20 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        NH4VO3
                        
                     
                     
                        11,5 
                     
                     
                        20 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        Na2EDT * 2 H2O A
                     
                     
                        5 000 
                     
                     
                        2 000 
                     
                     
                        —
                     
                     
                        —
                     
                  
                        FeSO4 * 7 H2O
                     
                     
                        1 991 
                     
                     
                        2 000 
                     
                     
                        —
                     
                     
                        —
                     
                  
                        Kemm is-soluzzjonijiet ta' Na2EDTA u ta' FeSO4 huma ppreparati singolarment, mferrgħin flimkien u autoklavjata immedjatament. Dan jagħti:
                     
                  
                        Soluzzjoni ta' 21 Fe-EDTA
                     
                     
                         
                     
                     
                        1 000 -fold
                     
                     
                        20,0 
                     
                     
                        5,0 
                     
                  M4 u M7 media
            M4 u M7 media huma ppreparati bl-użu ta' soluzzjoni ta' ħażna II, il-macro-nutrijenti u l-vitamini li ġejjin:
            
                         
                     
                     
                        Ammont miżjud ma' l-ilma
                        (mg/l)
                     
                     
                        Konċentraz zjoni (visa-vis il-medium M4)
                        (fold)
                     
                     
                        Ammont ta' soluzzjoni ta' ħażna miżjud sabiex ikun ippreparat medium
                        (ml/l)
                     
                  
                        M 4
                     
                     
                        M 7
                     
                  
                        Soluzzjoni ta' ħażna II kkombinata ma' oligoelementi
                     
                     
                         
                     
                     
                        20
                     
                     
                        50
                     
                     
                        50
                     
                  
                        Soluzzjonijiet macro-nutrient stock (sustanza waħda)
                     
                  
                        CaCl2 * 2 H2O
                     
                     
                        293 800 
                     
                     
                        1 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        MgSO4 * 7 H2O
                     
                     
                        246 600 
                     
                     
                        2 000 
                     
                     
                        0,5 
                     
                     
                        0,5 
                     
                  
                        KCl
                     
                     
                        58 000 
                     
                     
                        10 000 
                     
                     
                        0,1 
                     
                     
                        0,1 
                     
                  
                        NaHCO3
                        
                     
                     
                        64 800 
                     
                     
                        1 000 
                     
                     
                        1,0 
                     
                     
                        1,0 
                     
                  
                        Na2SiO * 9 3 H2O
                     
                     
                        50 000 
                     
                     
                        5 000 
                     
                     
                        0,2 
                     
                     
                        0,2 
                     
                  
                        NaNO3
                        
                     
                     
                        2 740 
                     
                     
                        10 000 
                     
                     
                        0,1 
                     
                     
                        0,1 
                     
                  
                        KH2PO4
                        
                     
                     
                        1 430 
                     
                     
                        10 000 
                     
                     
                        0,1 
                     
                     
                        0,1 
                     
                  
                        K2HPO4
                        
                     
                     
                        1 840 
                     
                     
                        10 000 
                     
                     
                        0,1 
                     
                     
                        0,1 
                     
                  
                        
                           Combined Vitamin stock
                        
                     
                     
                        —
                     
                     
                        10 000 
                     
                     
                        0,1 
                     
                     
                        0,1 
                     
                  
                        Is-soluzzjoni ta' ħażna ta' vitamini kombinati hija ppreprata billi jiżdiedu 3 vitamini ma' 1 litra ilma kif muri hawn taħt:
                     
                  
                        Thiamine hydrochloride
                     
                     
                        750
                     
                     
                        10 000 
                     
                     
                        —
                     
                     
                        —
                     
                  
                        Cyanocobalamine (B12)
                     
                     
                        10
                     
                     
                        10 000 
                     
                     
                        —
                     
                     
                        —
                     
                  
                        Biotine
                     
                     
                        7,5 
                     
                     
                        10 000 
                     
                     
                        —
                     
                     
                        —
                     
                  
                        Il-ħażna ta' vitamini kombinati hija maħżuna ffriżata f'aliquots żgħar. Vitamini huma miżjuda ftit qabel l-użu.
                        
                                    
                                       N.B.
                                    
                                 
                                 
                                    Sabiex tkun evitata l-preċipitazzjoni ta' mluħa meta tkun qed tiġi ppreparat l-media kompleta, żid l-aliquots tas-soluzzjonijiet ta' ħażna ma' daqs 500-800 ml ilma dionizzat u wara mlieh sa litru.
                                 
                              
                                    
                                       N.N.B.
                                    
                                 
                                 
                                    L-ewwel pubblikazzjoni ta' M4 medium tista' tinstab f' Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
                                 
                              
                  
         
            ANNESS 2
            ANALIŻI TA' KARBON ORGANIKU (TOC) U TAL-PRODUZZJONI TA' NOMOGRAFF GĦAL KONTENUT TA'TOC FL-IKEL TAL-ALGI
            Huwa rikonoxxut illi l-kontenut ta' karbon fl-ikel tal-algi mhuwiex normalment imkejjel direttament iżda minn korrelazzjonijiet (i.e. nomograffi) b'kejl surrogat bġal numru ta' ċelloli ta' algi u assorbiment ta' dawl).
            TOC għandu jkun imkejjel b'ossidazzjoni f'temperatura għolja aktar milli bil-UV jew metodi ta' persulphate. (Ara: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
            Għal produzzjoni ta' nomograff, l-algi għandhom ikumu isseparati mill-medium ta' kobor b'centrifugation u wara b'resuspension f'ilma ddistillat. Kejjel il-parametru ta' surrogate u l-konċentrazzjoni ta' TOC f'kull kampjun tliet darbiet. Blanks ta' ilma ddistillat għandu jkun analizzat u l-konċnetrazzjoni ta' TOC mnaqqas minn dak tal-TOC tal-kampjun tal-algi.
            Nomograffi għandu jkun lineari madwar limitu ta' konċetrazzjonijiet ta' karbon. Eżempji huma mhurija hawn isfel.
            NB: Dawn ma għandhomx ikunu użati għall-konverżjonijiet; huwa essenzali illi l-laboratorji jippreparaw in-nomografi tagħhom.
            
         
            ANNESS 3
            EŻEMPJU TA' DATA SHEET LI TIRREĠISTRA RINOVAR TA' MEDIUM, KONTROLL TA' DATA FIŻIKALI/KEMIKALI, IKEL, RIPRODUZZJONI TA' DAPHNIA U MORTALITA FL-ADULTI
            
                        Esperiment Nru°:
                     
                     
                        Data starded:
                     
                     
                        Clone:
                     
                     
                        Medium:
                     
                     
                        Tip ta' ikel:
                     
                     
                        Sustanza tat-test:
                     
                     
                        Konk. nominali:
                     
                  
                        Day
                     
                     
                        0
                     
                     
                        1
                     
                     
                        2
                     
                     
                        3
                     
                     
                        4
                     
                     
                        5
                     
                     
                        6
                     
                     
                        7
                     
                     
                        8
                     
                     
                        9
                     
                     
                        10
                     
                     
                        11
                     
                     
                        12
                     
                     
                        13
                     
                     
                        14
                     
                     
                        15
                     
                     
                        16
                     
                     
                        17
                     
                     
                        18
                     
                     
                        19
                     
                     
                        20
                     
                     
                        21
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Tiġdid tal-medium (ittikkja)
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        PH (16)
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        ġdid
                     
                     
                         
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        qadim
                     
                     
                         
                     
                  
                        O2 mg/l (16)
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        ġdid
                     
                     
                         
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        qadim
                     
                     
                         
                     
                  
                        Temp ( oC) (16)
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        ġdid
                     
                     
                         
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        qadim
                     
                     
                         
                     
                  
                        Ikel provdut (ittikkja)
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        In-nru ta' wild ħaj (17)
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        T o t a l
                     
                  
                        Reċipjent 1
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        2
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        3
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        4
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        5
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        6
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        7
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        8
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        9
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        10
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        Total
                     
                     
                         
                     
                  
                        Mortalità kumulattiva ta' l-adulti (18)
                        
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
         
            ANNESS 4
            EŻEMPJU TA' DATA SHEET GĦAR-REĠISTRAZZJONI TA' RIŻULTATI TA' ANALIŻI KIMIĊI
            (a)   Il-konċentrazzjonijiet imkejla
            
                        Konk. nominali
                     
                     
                        Ġimgħa 1 kampjun
                     
                     
                        Ġimgħa 2 kampjun
                     
                     
                        Ġimgħa 3 kampjun
                     
                  
                        Ġdid
                     
                     
                        Qadim
                     
                     
                        Ġdid
                     
                     
                        Qadim
                     
                     
                        Ġdid
                     
                     
                        Qadim
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  (b)   Il-konċentrazzjonijiet imkejla bħala perċentwali tan-nominali
            
                        Konk. nominali
                     
                     
                        Ġimgħa 1 kampjun
                     
                     
                        Ġimgħa 2 kampjun
                     
                     
                        Ġimgħa 3 kampjun
                     
                  
                        Ġdid
                     
                     
                        Qadim
                     
                     
                        Ġdid
                     
                     
                        Qadim
                     
                     
                        Ġdid
                     
                     
                        Qadim
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
         
            ANNESS 5
            KALKOLU TA' L-INTERMEDJU KKALKULAT MAŻ-ŻMIEN
            L-intermedju kkalkulat maż-żmien
            Meta wieħed iqis li l-konċentrażżjoni tas-sustanza li qiegħda tiġi eżaminata tista' tonqos tul il-perjodu bejn it-tiġdidiet medji, huwa neċessarju li jiġi kkunsidrat liema konċentrazzjoni għandha tingħażel biex tirrapreżenta s-sensiela ta' konċentrazzjonijiet esperjenzati mill-għajn Daphnia. L-għażla għandha tkun ibbażata fuq konsiderazzjonijiet bioloġiċi kif ukoll fuq dawk statistiċi. Per eżempju, jekk huwa maħsub li r-riproduzzjoni hija l-aktar milquta mill-ogħla konċentrażżjoni esperjenzata, allura għandha tintuża l-ogħla konċentrazzjoni. Madankollu, jekk l-effett akkumulat jew l-effett fil-futur aktar imbiegħed tas-sustanża tossika huwa kkunsidrat bħala aktar importanti, allura l-konċentrazzjoni medja hija aktar relevanti. F'dan il-każ, ikun approprjat li tintuża l-medja tal-konċentrazzjoni tal-intermedju kkalkulat maż-żmien, peress illi din tikkonsidra l-varjazzjoni fil-konċentrazzjoni instantanja fuq medda ta' żmien.
            Figura 1:
            Eżempju tal-medja time-weighted
            
            Il-figura 1 turi eżempju ta' eżami (semplifikat) li jdum sebat ijiem b'tiġdid medju fil-ġranet 0, 2 u 4.
            
                         
                     
                     
                        Il-linja rqiqa f'forma ta' żigżag tirrappreżenta l-konċentrazzjoni waqt kwalunkwe ħin. Wieħed għandu jassumi li l-waqgħa fil-konċentrazzjoni issegwi l-proċess ta' tħassir esponenzali.
                     
                  
                         
                     
                     
                        Is-sitt punti mmarkati jirrappreżentaw il-konċentrazzjonijiet li ġew osservati imkejla fil-bidu u fit-tmien ta' kull perjodu ta' tiġdid.
                     
                  
                         
                     
                     
                        Il-linja solida u ħoxna tindika l-posizzjoni ta' l-intermedju kkalkulat maż-żmien.
                     
                  L-intermedju kkalkulat maż-żmien huwa kkalkulat b'mod li l-erja taħt l-intermedju kkalkulat maż-żmien ikun daqs l-erja taħt il-kurva tal-konċentrazzjoni. Il-kalkolu għall-eżempju fuq imsemmi huwa muri fit-Tabella 1.
            Tabella 1
            Kalkolu ta' l-intermedju kkalkulat maż-żmien
            
                        Tiġdid Nru
                     
                     
                        Ġranet
                     
                     
                        Konċ0
                     
                     
                        Konċ1
                     
                     
                        Ln (Konċ0)
                     
                     
                        Ln (Konċ1)
                     
                     
                        Erja
                     
                  
                        1
                     
                     
                        2
                     
                     
                        10,000 
                     
                     
                        4,493 
                     
                     
                        2,303 
                     
                     
                        1,503 
                     
                     
                        13,767 
                     
                  
                        2
                     
                     
                        2
                     
                     
                        11,000 
                     
                     
                        6,037 
                     
                     
                        2,398 
                     
                     
                        1,798 
                     
                     
                        16,544 
                     
                  
                        3
                     
                     
                        3
                     
                     
                        10,000 
                     
                     
                        4,066 
                     
                     
                        2,303 
                     
                     
                        1,403 
                     
                     
                        19,781 
                     
                  
                        Total ta' ġranet: 7
                     
                     
                        Erja totali
                     
                     
                        50,091 
                     
                  
                        Intermedj u TW
                     
                     
                        7,156 
                     
                  
                        
                           Ġranet huwa n-numru ta' ġranet fil-perjodu ta' tiġdid.
                        
                           Konċ0 hija l-konċentrazzjoni imkejla fil-bidu ta' kull perjodu ta' tiġdid.
                        
                           Konċ1 hija l-konċentrazzjoni imkejla fit-tmiem ta' kull perjodu ta' tiġdid.
                        
                           Ln(Konċ0) huwa l-logaritmu naturali tal-Konċ0.
                        
                           Ln(Konċ1) huwa l-logaritmu naturali tal-Konċ1.
                        L-intermedju kkalkulat maż-żmien (“intermedju TW”) huwa l-“Erja totali” diviża mit-“Total ta' ġranet”.
                        
                           
                     
                  
               Erja hija l-erja taħt il-kurva esponenzali għal kull perjodu ta' tiġdid. Hija kkalkulata hekk:
            Naturalment, għall-eżami ta' riproduzzjoni tad-Daphnia it-tabella ikollha tiġi estiża biex tkopri 21 ġurnata.
            Huwa ċar li meta jsiru osservazzjonijiet biss fil-bidu u fit-tmiem ta' kull perjodu ta' tiġdid, m'huwiex possibbli li jiġi kkonfermat li l-proċess ta' tħassir huwa, fil-fatt, esponenzali. F'kalkolu differenti għall-“Erja” tirriżulta kurva differenti. Madankollu, il-proċess tat-tħassir esponenzali huwa plawsibbli u probabilment huwa l-aħjar kurva li tista' tintuża fl-assenza ta' aktar informazzjoni.
            Madankollu, hemm bżonn li jsir xogħol b'kawzjoni jekk l-analiżi kimika tonqos milli ssib xi sustanza fl-aħħar tal-perjodu ta' tiġdid. Kemm-il darba ma jkunx possibbli li ssir valutazzjoni ta' kemm is-sustanza tisparixxi malajr mit-taħlila, inkun impossibbli li tinkiseb erja realistika taħt il-kurva u għalhekk ikun impossibbli li jinkiseb intermedju raġonevoli kkalkulat maż-żmien.
         
         C.21.   MIKROORGANIŻMI TAL-ĦAMRIJA: TEST TAT-TRASFORMAZZJONI TAN-NITROĠENU
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa dupplikazzjoni għal OECD TG 216 (2000)
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Dan il-Metodu tat-Testijiet jiddiskrivi metodu tal-laboratorju iddisinjat sabiex jinvestiga l-effetti fit-tul ta' kimiċi, wara espożizzjoni waħda, dwar l-attività tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu fil-mikroorganiżmi tal-ħamrija It-test huwa prinċipalment ibbażat fuq ir-rakkommandazzjonijiet ta' l-Organizzazzjoni għall-Protezzjoni tal-Pjanti Ewropej u tal-Mediterran (1). B'dana kollu, Linji ta' Gwida oħrajn, inklużi dawk tal-Biologische Bundesanstalt tal-Ġermanja (2), il-US Environmental Protection Agency (3) il-SETAC (4) u International Organization for Standardization (ISO) (5), kienu wkoll meqjusa. Laqgħa ta' ħidma tal-OECD dwar is-Selezzjoni tal-ħamrija/sediment li kienet inżammet fi Belgirate, l-Italja, fil-1995 (6) qabel dwar in-numru u t-tipi tal-ħamrija għall-użu f'dan it-test. Rakkommandazzjonijiet dwar il-ġbir, it-tqandil u l-ħażna tal-kampjun tal-ħamrija huma ibbażati fus id-Dokument ta' Gwida ISO (7) u r-rakkommandazzjonijiet mil-Laqgħa ta' Ħidma ta' Beligrate. Fl-assaġġ u l-evalwazzjoni tal-karatteristiċi tossiċi tas-sustanzi tat-test, determinazzjoni ta' l-effetti fuq l-attività mikrobjali tal-ħamrija tista tkun meħtieġa, eż., meta l-informazzjoni dwar l-effetti potenzali min-naħa tal-protezzjoni tal-prodotti ta' l-uċuħ fuq il-mikroflora tal-ħamrija huma meħtieġa jew meta l-espożixxjoni ta' mikroorganiżmi tal-ħamrija lejn kimiċi apparti milli l-prodotti tal-protezzjoni tal-ħamrija, jkunu mistennija. It-test tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu huwa mwettaq sabiex jiddetermina l-effetti ta' tali kimiċi fuq il-mikroflora tal-ħamrija. Jekk l-agrikimiċi (eż., il-prodotti talk-protezzjoni tal-ħamrija, l-fertilizzanti, u l-kimiċi tal-foresterija) huma ittestjati, kemm it-trasformazzjoni tan-nitroġenu u wkoll it-testijiet tat-trasformazzjoni tal-karbonu, huma mwettqa. Jekk dawk li ma humiex l-agrokimiċi huma ittestjati, it-test tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu huwa suffiċjenti. B'dana kollu, jekk il-valuri EC5O tat-test tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu għal tali kimiċi jidħol fi ħdan il-medda miosjuba għal inibituri tan-nitrifikazzjoni kummerċjalment disponibbli (eż. nitrapyrin), test tat-trasformazzjoni tal-karbondu jista jkun imwettaq sabiex tkun akkwistata aktar informazzjoni.
         Il-ħamrija tikkonsisti minn komponenti ħajjin u mhux-ħajjin li jeżistu f'taħlitiet kumplessi u eteroġenji. Il-mikroorganiżmi għandhom parti ta' rwol impoprtanti fit-tfarrik u t-traformazzjoni tal-meterja organika f'ħamrija fertili b'ħafna speċje jikkontribwixxu għal diversi aspetti tal-fertilià tal-ħamrija. Kwalunkwe interferenza fit-tul ma dawn il-proċessi biokimiċi jista jkollha l-potenzal li tinterferixxi maċ-ċiklu tan-nutrient u dan jista jibdel il-fertilità tal-ħamrija. It-trasformazzjoni tal-karbonju u n-nitroġenu isseħħ fil-ħamrija fertili kollha. Għalkemm il-kommunitajiet mikrobjali responsabbli għal dawn il-proċessi jiddifferixxu bejn ħamrija u oħra, il-mezzi tat-trasformazzjoni huma essenzalment l-istess.
         Dan il-Metodu ta' Testijiet kif deskritt huwa iddisinjat sabiex jiżvela l-effetti ħżiena ta' terminu fit-tul ta' sustanza dwar il-proċess tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu f'ħamrija erobika tal-wiċċ. Dan il-Metodu tat-test jippermetti wkoll l-estimi ta' l-effetti tas-sustanzi fuq it-trasformazzjoni tal-karbonju mill-mikroflora tal-ħamrija. Il-formazzjoni tan-nitrat isseħħ sussegwentament għad-deġenerazzjoni tar-rabtiet karbonju-nitroġenu. Għalhekk, jekk rati egwali tal-produzzjoni tan-nitroġenu jkunu misjuba f'ħamrija ittrattata u tal-kontroll, dan huma ferm probabbli minħabba li l-passaġġi tad-degradazzjoni maġġura tal-karbonju huma intatti u funzjonali. Is-substrata magħżulha għat-test (tagħsida luċerna fi trab) għandha telattività favorevoli ta' karbonju u nitroġenu (normalment bejn 12/1 u 16/1). Minħabba dan, in-nuqqas ta' karbonju huma aġevolat matul it-test u jekk il-kommunitajiet mikrobjali huma bil = ħsara kinn xi kimika, dawn jistgħu jirkupraw fi żmien 100 jum.
         It-testijiet li minnhoma dn il-metodu ta' testijiet kien ġie żviluppat kienu primarjament iddisinjati għal sustanzi li dwarhom l-ammont li jilħaq il-ħamrija setgħa jkun antiċipat. Dan hu l-każ, per eżempju, għall-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ li dwarhom ir-rata ta' l-applikazzjoni fl-għelieqi hija magħrufa. Għall-agrokimiki, it-testijiet ta' żewġ dożi relevanti għar-rata antiċipata jew imbassra ta' l-applikazzjoni huma suffiċjenti. L-agrokimiċi jistgħu ikunu ittestjati bħala ingredjenti attivi (a.i.) jew prodotti formulati. B'dana kollu, it-test mhux limitat għall-agrokimiċi. Bit-tibdil kemm ta' l-ammonti tas-sustamnza tat-test applikata fil-ħamrija, u il-mod ta' kif l-informazzjoni hija evalwata, it-test jista wkoll ikunu użat għal kimiċi li dwarhom l-ammont mistenni li jilħaq il-ħamrija ma jkunx maghruf. Għalhekk, bil-kimiċi apparti milli l-agrokimiċi, l-effetti ta' serje ta' konċentrazzjonijiet dwar it-trasformazzjoni tan-nitroġenu, huma determinati. L-informazzjoni minn dawn it-testijiet hija użata sabiex tipprepara il-kurva tad-doża-reazzjoni u tikkalkola il-valuri Ecx, meta x hija definita bħala % effett.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Trasformazzjoni tan-nitroġenu: Hija d-deghradazzjoni aħħarija mill-mikroorganiżmi tal-materja organika li jkun fiha n-nitroġenu, via l-proċess ta' l-ammonifikazzjoni u n-nitrifikazzjoni, lejn in-nitrat inorganiku tal-prodott finali rispettivament.
         
            Ec
            
               x
            
            (Konċentrazzjoni Effettiva): Hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħamrija li tirriżulta f'xi persentaġġ inibizzjoni tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu lejn nitrat.
         
            EC
            
               5O
            
            (Konċentrazzjoni Effettiva Medjana): Hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħamrija li tirriżulta fi 50 persentaġġ (50 %) inibizzjoni tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu lejn nitrat.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Xejn
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Ħamrija mgħarbla hija emendata ma tgħasida tal-pjanti li ssir trab u jew ittrattata bis-sustanza tat-test jew imħollija mhux ittrattata (kontroll). Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, minimu ta' żewġ konċentrazzjonijiet tat-test huma rakkommandati u dawn għandhom ikunu magħżula b'reazzjoni ma l-għola konċentrazzjoni antiċipata fl-għalqa. Wara 0, 7, 14-il jum u 28 jum ta' l-inkubazzjoni, kampjuni ta' ħamrija ittrattata u tal-kontroll huma estratti bis-solvent xieraq, u l-kwantitajiet ta' nitrat fl-estratti huma determinati. Ir-rata tal-formazzjoni tan-nitrat fil-kampjuni ittratti huwa paragunata mar-rata fil-Kontrolli, u d-fevjazzjoni perċentwali ta' dik ittrattata mill-kontrol hija ikkalkolata. It-testijiet kollha jkunu mill-anqas ta' 28 jum. Jekk, fit-28 jum, id-differenzi bejn il-ħamrija ittrattata u dik mhux ittrattata huma egwali jew akbar minn 25 %, il-kejl jitkompla sa massimu ta' 100 jum. Jekk agrokimiċi huma ittestjati, serje ta' konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test huma miżjuda mal-kampjuni tal-ħamrija, u l-kwantitajiet tan-nitrat iffurmat fil-kampjuni ittrattati u tal-kontroll huma mkejla wara 28 jum ta' inkubazzjoni. Ir-riżultati mit-testijiet b'konċentrazzjonijiet multipli huma analizzati bl-użu ta' mudell regressiv, u l-valuri Ecx huma ikkalkolati (i.e. . EC50, EC25 u/jew EC10). Ara definizzjonijiet.
         1.5.   IL-VALIDITÀ TAT-TEST
         L-evalwazzjonijiet tar-riżultati tat-test ma l-agrokimiċi huma bbażati fuq relattivament differenzi żgħar (i.e. medja ta' valur ± 25 %) bejn il-konċentrazzjonijiet nitriċi fil-ħamrija tal-kontroll u f'dik ittrattata, għalhekk varjazzjonijiet kbar fil-kontrolli jistgħu jwasslu għal riżultati foloz. Għalhekk, il-varjazzjoni bejn kampjunu mġedda tal-kontroll għandha tkun ta' anqas minn ± 15 %.
         1.6.   ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.6.1.   Apparat
         Il-kontenituri tat-test użati huma magħmula minn materjal kemikament inert. Dawn għandhom ikunu ta' daqs xieraq b'konformità mal-proċedura użata għall-inkubazzjoni tal-ħamrija. i.e. l-inkubazzjoni fil-massa jew bħala serje individwai ta' kampjuni tal-ħamrija (ara s-sezzjoni 1.7.1.2). Attenzjoni qawwija għandha tingħata sabiex ikun minimizzat it-telf ta' l-ilma u li jkun imħolli l-iskambju tal-gass matul it-test (eż. il-kontenituri tat-test jistgħu ikunu mogħttija b'folja tal-polyethylene mtaqqba). Meta jkunu ittestjati sustanzi volatili, kontenituri li jistgħu ikunu ssiġġilati u li ma jgħaddix gass minnhom għandhom ikunu wżati. Dawn għandhom ikunu ta' daqs li madwar kwart tal-volum tagħhom ikun mimli bil-kampjun tal-ħamrija.
         Apparat normali tal-laboratorju, inkluż dan li ġej, huwa wżat:
         
                     —
                  
                  
                     apparat ta' l-aġitazzjoni:: ċelċieka mekkanika jew apparat ekwivalenti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     ċentrifuga (3 000 g) jew apparat tal-filtrazzjoni (bl-użu tal-karta tal-filtru ħielsa min-nitrat);
                  
               
                     —
                  
                  
                     strument ta' sensittivit adekwata u tar-riproduċċibbiltà għall-analiżi tan-nitrat.
                  
               1.6.2.   L-għażla u n-numu ta' ħamrija
         Ħamrija waħda hija użata. Il-karatteristiċi rakkommandati tal-ħamrija huma kif ġej:
         
                     —
                  
                  
                     kontenut tar-ramel: Mhux inqas minn 50 % imma mhux iktar minn 75 %;
                  
               
                     —
                  
                  
                     pH: 5,5 - 7,5;
                  
               
                     —
                  
                  
                     kontenut tal-karbonju organiku: 0,5 – 1,5 %;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-biomassa mikrobjali għandha tkun imkejla (8)(9) u l-pkontenut tal-karbonju tagħha għandu jkun ta' mill-anqas 1 % tal-karbonju organiku totali tal-ħamrija.
                  
               F'bosta każi, ħamrija b'dawn il-karatteristiċi tirrapreżenta l-għar każ ta' sitwazzjoni, la darba l-adsorbazzjoni tal-kimika tat-test hija l-minimu u d-disponnabbiltà tagħha lejn il-mikroflora hija l-massimu. B'konsegwenza, it-testijiet b'ħamrija oħra huma, ġeneralemnt, mhux meħtieġa. B'dana kollu, f'ċerti ċirkostanzi, eż. meta l-użu maġġuri antiċipat tas-sustanza tat-test f'ħamrija partikolari, bħal ma huma l-ħamrija aċiduża tal-foresti, jew għal kimiċi ikkargati elettrostatikament, jista jkun meħtieġ li tintuża ħamrija addizzjonali.
         1.6.3.   Il-ġbir u l-ħażna tal-kampjunu tal-ħamrija
         1.6.3.1.   Il-ġbir
         L-informazzjoni dettaljata dwar l-istorja tas-sit fl-għalqa minn fejn il-ħamrija tat-test hija miġburha għandha tkun disponibbli. Id-dettalji jinkludu l-lokalità eżatta, il-kisi veġitali, id-dati tat-trattament bil-prodotti tal-protezzjoni tal-pjanti, it-trattamenti b'fertilizzanti organiċi u mhux-organiċi, żidiet ta' materjali bioloġiċi jew kontaminazzjonijiet aċċidentali. Is-sit magħżul għall-ġbir tal-ħamrija għandu jkun wieħed li jippermetti użu f'terminu twil. Mergħat permanenti, għelieqi b'uċuħ annwali taċ-ċereali (apparti mill-qamħ-ir-rum) jew dawk moghtija d-demel b'żergħat iffullata, huma tajbin. Il-għażla tas-sit tal-kampjunar m'għandhiex tkun ġiet trattata bil-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ għam mill-anqas sena qabel il-kampjunar. Ukoll, l-ebda fertilizzant organiku ma jkun ġie applikat għal mill-anqas sitt xhur. L-użu ta' fertilizzant minerali huwa aċċettabbli biss meta, b'konformità mal-ħtiġiet tal-kampjuni ta' l-uċuħ u tal-ħamrija, m'għandhomx ikunu miġbura għal mill-anqas tlett xhur wara l-applikazzjoni tal-fertilizzant. L-użu ta' ħamrija trattata bil-fertilizzanti li għandhom effetti bijoċidali magħrufa (eż. is-sijanamid tal-kalċju) għandu jkun evitat.
         Il-kampjunar għandu jkun evitat matul, jew immedjetament wara, perijodi twal (itwal minn 30 jum) ta' nixfa jew ta' stgħadir bl-ilma. Għal ħamrija maħruta, il-kampjuni għandhom jinġabru minn fond ta' 1 sa 20 cm l-isfel. Għall art tal-mergħa (art fil-ħaxix) jew ħamrija oħra meta l-ħrit ma jseħħx matul perijodi twal (f'mill-anqas staġun wieħed tat-tkabbir), il-fond massimu tal-kampjunar jista jkun kemm xejn aktar minn 20 cm (eż. sa 25 cm).
         Il-kampjuni tal-ħamrija għandhom ikunu trasportati bl-użu ta' kontenituri u skond kondizzjonijiet tat-temperatura li jiggarantixxu li l-propjetajiet inizjali tal-ħamrija ma jkunux sinifikament mibdula.
         1.6.3.2.   Ħażna
         L-użu ta' ħamrija miġbura friska mill-għelieqi huwa ippreferut. Jekk ħażna fil-laboratorju ma tistgħax tkun evitata, il-ħamrija tista tkun maħżuna fid-dlam 4 ± 2 oC għal massimu ta' tlett xhur. Matul il-ħażna tal-ħamrija, il-kondizzjonijiet erobiċi għandhom ikunu assigurati. Jekk il-ħamrija tkun miġbura minn żoni ta' fejn din tkun iffriżata għal mill-anqas tlett xhur tas-sena, il-ħażna għal sitt xhur fi – 18 oC sa – 22 oC tista tkun ikkonsidrata. Il-biomassa mikrobjali tal-ħamrija maħżuna hija mkejla qabel kull esperiment u l-karbonju fil-biomassa għandu jkun mill-anqas 1 % tal-kontenut totali tal-karbonju organiku fil-ħamrija (ara s-sezzjoni 1.6.2).
         1.6.4.   Tqandil u l-Preparazzjoni tal-ĦAmrija għat-Test
         1.6.4.1.   Preinkubazzjoni
         Jekk il-ħamrija kienet maħżunha (ara s-sezzjoni 1.6.3.2), preinkubazzjoni hija rakkommandata għal perijodu ta' bejn 2 u 28 jum. It-temperatura u l-umidità tal-kontenut tal-ħamrija matul il-preinkubazzjoni għandhom ikunu simili għal dik użata fit-test (ara s-sezzjonijiet 1.6.4.2 u 1.7.1.3).
         1.6.4.2.   Karatteristiċi fiżiko-kimiċi
         Il-ħamrija hija manwalment imnaddfa minn oġġeti kbar (eż. ġebel, partijiet ta' pjanti, eċċ.) u imbagħad magħrbla fin-nieda mingħajt tnixxif eċċessiv lejn daqs ta' partiċelli ta' anqas minn jew egwali għal 2 mm. Il-kontenut ta' l-umidità tal-kampjun tal-ħamrija għandu jkun aġġustat b'ilma distillat jew dejonizzat lejn valur ta' bejn 40 % u 60 % tal-kapaċità massima taż-żamma ta' l-ilma.
         1.6.4.3   Amendi b'substrata organika
         Il-ħamrija għandha tkun emendata b'substrata organika xierqa, eż. tgħasida mrammla luċerna-ħaxix-ħadranija (il-komponent ewlieni: Medicago sativa) b'relattività C/N ta' bejn 12/1 u 16/1. Ir-relattività rakkommandata tal-ħamrija luċerna hija ta' 5 g luċern kull kilogramma ta' ħamrija (piz xott).
         1.6.5.   Preparazzjoni tas-sustanza tat-test għall-applikazzjoni mal-ħamrija
         Is-sustanza tat-test hija normalment applikata bl-użu ta' trasportatur. It-trasportatur jista jkun ilma (għal sustanzi li jinħallu fl-ilma) jew solidu inert bħal ma huwa ramel fin tal-kwartz (daqs tal-partiċella: 0,1 - 0,5 mm). Trasportaturi likwidi apparti mill-ilma (eż. solventi organiċi bħal ma huma l-aċetun, il-kloroforma) għandhom ikunu evitati la darba dawn jistgħu joħolqu ħsara għall-mikroflora. Jekk ir-ramel ikunu użat bħala trasportatur, dan jista jkun m iksi bis-sustanza tat-test imdewba jew sospiża f'solvent xieraq. F'tali każi, is-solvent għandu jkun imneħħi bl-evaporazzjoni qabel it-taħlit mal-ħamrija. Għall-aħjar distribuzzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħamrija, relattività ta' 10 g ramel ma kull kilogramma ta' ħamrija (piż xott) huwa rakkommandabbli. Kampjuni tal-kontroll huma ittrattati b'ammont ekwivalenti ta' ilmaa u/jew ramel kwartz biss.
         Meta jkunu ittestjati kemikali volatili, it-telf matul it-trattament għandu jkun evitat sa kemm dan ikun possibbli u tentattiv għandu jsir sabiex tkun assigurata distribuzzjoni omoġenja fil-ħamrija (eż. is-sustanza tat-test għandha tkun injettata fil-ħamrija minn diversi postijiet).
         1.6.6.   Konċentrazzjonijiet tat-test
         Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, mill-anqas żewġ konċentrazzjonijiet għandhom ikunu wżati. Il-konċentrazzjoni l-baxxa għandha tirrifletti mill-anqas l-ammont massimu mistenni li jilħaq il-ħamrija waqt kondizzjonijiet prattiċi, fil-waqt li l-konċentrazzjoni l-għolja għandha tkun mutiplu tal-konċentrazzjoni l-baxxa. Il-konċentrazzjonijiet ta' sustanza tat-test miżjuda mal-ħamrija huma kkalkolati billi tkun preżunta inkorporazzjoni uniformi sa fond ta' 5 cm u l-massa tal-ħamrija f'densità ta' 1.5. Għall-agrokimiċi li huma applikati direttament mal-ħamrija, jew għal kimiċi li dwarhom il-kwantità li tilħaq il-ħamrija tista tkun prevista, il-konċentrazzjonijiet tat-test irrakkommandati huma l-massimu Predicted Environmental Concentration (PEC) (Konċentrazzjoni Ambjentali Mbassra) u ħames darbiet dik il-konċentrazzjoni. Is-sustanzi li huma mistennija li jkunu applikati diversi drabi mal-ħamrija fi staġun wieħed għandhom ikunu ittestjati fil-konċemntrazzjonijiet derivati mill-multiplikazzjoni tal-PEC bin-numru massimu antiċipat ta' l-applikazzjonijiet. L-għoila konċentrazzjoni ittestjata, b'dana kollu, m'għandhiex teċċedi għaxar darbiet il-massimu tar-rata ta' applikazzjoni waħda. Jekk dawk li ma humiex agrokimiċi huma ittestjati, serje ġeometrikuta' mill-anqas ħames konċentrazzjonijiet għandu jkun użat. Il-konċentrazzjonijiet ittestjati għandhom ikopru l-medda meħtieġa tal-valuri ECx.
         1.7.   L-IMĠIEBA TAT-TEST
         1.7.1.   Il-kondizzjonijiet ta' l-espożizzjoni
         1.7.1.1.   It-trattament u l-kontrol
         Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, il-ħamrija hija diviża fi tlett porzjonijiet ta' piż egwali. Żewġ porzjonijiet huma mħallta mat-trasportatur li jkun fih il-prodott, u l-ieħor huwa mħallat mat-trasportatur mingħajr il-prodott (kontroll). Minimu ta' tliet repliki kemm għall-ħamrija ittrattata u wkol mhux ittrattata huma rakkommandati. Jekk dawk li ma humiex agrokimiċi huma ittestjati, il-ħamrija hija diviża f'sitt porzjonijiet ta' piż egwali. Ħamsa mill-kampjunu huma mħallta mat-trasportatur li jkun fih is-sustanza tat-test, u s-sitt kampjun huwa mħallat mat-trasportatur mingħajr il-kimika. Tlett replikati taż-żewġ trattamenti u tal-kontroll huma rakkommandati. Attenzjoni għandha tingħata sabiex tkun assigurata distribuzzjoni omoġenja tas-sustanza tat-test fil-kampjunu tal-ħamrija ittrattata. Matul it-taħlit, l-ikkumpattjar jew gerbubi mgħaqqda għandhom ikunu evitati.
         1.7.1.2.   L-inkubazzjoni tal-kampjuni tal-ħamrija
         L-inkubazzjoni tal-kampjuni tal-ħamrija tista titwettaq b'żewġ modi: Bħala kampjuni fil-massa ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata jew f'serje ta' sub-kampjuni individwali u ta' daqs egwali ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata. B'dana kollu, meta sustanzi volatili huma ittestjati, it-test għandu jkun imwettaq biss b'serje ta' sub-kampjuni individwali. Meta l-ħamrija tkun inkubata fil-massa, kwantitajiet kbar ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata huma ippreparati u s-sub-kampjuni għall-analiżi huma miġbura kif meħtieġ matul it-test. L-ammont inizjalment ippreparat għal kull trattament u kontroll jiddependi mid-daqs tas-sub-kampjuni, in-numru ta' repliki użati għall-analiżi u n-numru massimu antiċipat tad-drabi tal-kampjunar. Il-ħamrija inkubata fil-massa għamndha tkun imħallta sewwa qabel is-sub-kampjuni. Meta l-ħamrija hija inkubata f'serje individwali ta' ħamrija, kull ħamrija ittrattata jew mhux trattata fil-massa hija diviża fin-numru meħtieġ ta' sub-kampjuni, u dawn huma utilizzati kif meħtieġ. Fl-esperimenti ta' meta tnejn jew aktar ħinijiet tal-kampjunar jistgħu ikunu antiċipati, sub-kampjuni biż-żejjed għandhom ikunu ippreparati sabiex ikun hemm abbastanza għar-replikati kollha u d-drabi tal-kampjunar kollu. Mill-anqas tlett kampjuni tar-replikati tal-ħamrija tat-test għandhom ikunu inkubati permezz tal-kondizzjonijiet erobiċi (ara s-sezzjoni 1.7.1.1). Matul it-testijiet kollha, kontenituri xierqa, bi spazju fil-wiċċ suffiċjenti, għandhom ikunu użati sabiex ikunu evitati l-kondizzjonijiet anerobiċi. Meta sustanzi volatili huma ittestjati, it-test għandu jkun imwettaq biss b'serje ta' sub-kampjuni individwali.
         1.7.1.3.   Il-kondizzjonijiet u t-tul tat-testijiet
         It-test huwa mwettaq fid-dlam f'temepratura tal-kamra ta' 20 ± 2 oC. Il-kontenut ta' l-umidità tal-kamjuni tal-ħamrija għandu jkun miżmum matul it-test għal bejn 40 % u 60 % tal-kapaċità massima taż-żamma ta' l-ilma fil-ħamrija (ara s-sezzjoni 1.6.4.2) b'medda ta' ± 5 %. Ilma distillat jew deonizzat jista jkun miżjud kif meħtieġ.
         It-tul minimu tat-testijiet huwa 28 jum. Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, ir-rati tal-formazzjoni tan-nitrat fil-kampjuni ittrattati u tal-kontroll huma mqabbla. Jekk dawn ikunu differenti b'aktar minn 25 % fil-jum 28, it-test jitkompla sakemm differenza egwali għal, jew anqas minn 25 % tkun akkwistata, jew għal massimu ta' 100 jum, liema minnhom ikun l-aqsar. Għal dawk li ma humiex agrokimiċi, it-test ikun terminat wara 28 jum. Fil-jum 28, il-kwantitajiet tan-nitrat fil-kampjuni tal-ħamrija ittrattata jew tal-kontroll huma determinati u l-valuri ECx ikunu ikkalkolati.
         1.7.2.   Kampġjunaar u analiżi tal-ħamrija
         1.7.2.1.   Kampjunar skedat tal-ħamrija
         Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, il-kampjuni tal-ħamrija huma analiżżati għan-nitrat fil-jiem 0, 7, 14 u 28. jekk test imtawwal ikun meħtieġ, aktar kejl għandu jseħħ f'intervalli ta' 14-il jum, wara l-jum 28.
         Jekk dawk li ma humiex agrokimiċi huma ittestjati, mill-anqas ħames konċentrazzjonijiet tat-test huma wżati u l-kampjuni tal-ħamrija huma analiżżati għan-nitrat fil-bidu (jum 0) u fit-tmiem tal-perijodu ta' l-espożizzjoni (28 jum). Kejl intermedju, eż. fil-jum 7, jista jkun miżjud jekk dan ikun meqjus bħala meħtieġ. L-informazzjoni akkwistata fil-jum 28 hija użata għad-determinazzjoni tal-valux ECx dwar il-kimika. Jekk mixtieq, l-informazzjoni mill-jum 0 tal-kampjuni tal-kontroll jistgħu ikunu wżati sabiex jirraportaw il-kwanitità inizjali tan-nitrat fil-ħamrija.
         1.7.2.2.   L-analiżi tal-kampjuni tal-ħamrija
         L-ammont ta' nitrat iffurmat f'kull replika trattata jew tal-kontroll huwa determinat f'kull waqt tal-kampjunar. In-nitrat huwa estratt mill-ħamrija biċ-ċekċik tal-kampjun b'solvent xieraq ta' l-estrazzjoni, eż. taħlita ta' 0,1 M klorid tal-putassa. Relattività ta' 5 ml tat-taħlita KC1 kull gramma piż xott ekwivalenti tal-ħamrija huwa rakkommandat. Sabiex tkun imtejba l-estrazzjoni, il-kontenituri li jkunu bil-ħamrija u t-taħlita ta' l-estrazzjoni m'għandhomx ikunu aktar minn nofshom mimlija. It-taħlitiet huma mċekċka fi 150 rpm għal 60 minuta. It-taħlitiet ikunu ċentrifugati jew filtrati u l-fażijiet likwidi huma analiżżati għan-nitrat. Estratti likwisi ħielsa minn partiċelli jistgħu ikunu maħżuna qabel l-analiżi fi - 20 ± 5 oC sa sitt xhur.
         2.   DATA
         2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         Jekk it-testijiet huma mwettqa b'agrokimiċi, il-kwalità yan-nitrat iffurmat f'kull replika tal-kampjun tal-ħamrija għandha tkun irreġistrata, u l-valuri medji tar-replikati kollha għandhom ikunu ipprovduti f'għamla tabulari. Ir-rati tat-trasformazzjoni tan-nbitroġenu għandhom ikunu evalwati b'metodi xierqa u ġeneralment aċċettabbli (eż. Test-F, 5 % livell sinifikanti). Il-kwantitajiet ta' nitrat iffurmat huma espressi fi mg nitrat/kg piż xott tal-ħamrija/kull jum. Ir-rata tal-formazzjoni tan-nitrat f'kull trattament hija mqabbla ma dik tal-kontroll, u l-persentaġġ tad-devjazzjoni mill-kontroll hija ikkaalkolata.
         Jekk it-testijiet huma mwettqa b'dawk li ma humiex agrokimiċi, il-kantità ta' nitrat iffurmat f'kull replika huwa determinat, u l-kurva doża-reazzjoni hija ippreparata għall-estimi tal-valuri ECx. Il-kwantitajiet ta' nitrat (i.e. mg nitrat.kg piż xottv tal-ħamrija) misjuba fil-kampjuni ittrattati wara 28 jum huma mqabbla ma' dak misjun fil-kontroll. Minn din l-informazzjoni, il- % tal-valuri ta' l-inibizzjoni għal kull konċentrazzjoni tat-test huma ikkalkolati.Dawn il-persentaġġi huma mpinġija kontra l-konċentrazzjoni, u l-proċeduri statistiċi huma mbagħad użati għall-kalkolu tal-valuri ECx. Limiti ta' l-affidabbilità (p = 0,95) għal ECx ikkalkolati huma wkoll determinati bl-użu tal-proċeduri normali (10) (11) (12).
         Is-sustanzi tat-test li jkollhom kwantitajiet għoljin ta' nitroġenu jistgħu jikkontribwixxu għall-kwantitajiet ta' nitrat iffurmat matul it-test. Jekk dawn is-sustanzi huma ttestjati f'konċentrazzjoni għolja (eż. kimika li hija mistennija li tkun użata f'applikazzjonijiet repetuti) kontrolli xierqa għandhom ikunu inklużi fit-test (i.e. il-ħamrija flimkien mas-sustanza tat-test imma mingħajr it-tgħasida tal-pjanti). Dettalji minn dawn il-kontrolli għandhom ikunu nklużi fil-kalkoli tal- ECx.
         2.2.   INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Meta r-riżultati mit-testijiet bl-agrokimiċi huma evalwati, u d-differenza fir-rati tal-formazzjoni tan-nitrat bejn it-trattament baxx (i.e. il-massimu tal-konċentrazzjoni prevista) u l-kontroll tkun egwali għal, jew anqas minn 25 % fi kwalunkwe kampjun fil-waqt wara l-jum 28, il-prodott jista jkun evalwat bħala li jkollu infuwenza f'terminu fit-tul fuq it-trasformazzjoni tan-nitroġenu fil-ħamrija. Meta r-riżultati mit-testijiet bil-kimiċi apparti milli l-agrokimiċi huma evalwatim il-valuri EC50, EC25 u/jew EC10 huma wżati.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Identifikazzjoni sġiġa tal-ġamrija użata, inkluż:
                     
                                 —
                              
                              
                                 refernza ġeografika tas-sit (latitudini, lonġitudini);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar l-istorja tas-sit (i.e. il-koperta veġittiva, it-trattamenti bil-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ, trattamenti bil-fertilizzanti, kontaminazzjoni aċċidentali, eċċ.);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sekwenza ta' l-użu (eż. ħamrija agrikola, foresta, eċċ.);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-fond tal-kampjunar (cm);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-kontenut ramel/ħama'/tafal ( % tal-piż);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pH (fl-ilma);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kontenut tal-karbonju organiku ( % piż xott);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kontenut tan-nitroġenu organiku ( % piż xott);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-konċentrazzjoni inizjali tan-nitrat (mg nitrat kg piż xott);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kapaċità ta' l-iskambju tal-jonju (mmol/kg);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 biomassa mikrobjali f'termini ta' persentaġġ tal-karbonju organiku totali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 referenza għall-metodi użati għad-determinazzjoni ta' kull parametru;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-informazzjoni li tirrigwardja il-ġbir u l-ħażna tal-kampjuni tal-ħamrija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Is-sustanza tat-test:
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     dettalji tal-pri-inkubazzjoni tal-ħamrija, jekk ikun hemm.
                     
                                 —
                              
                              
                                 in-natura fiżika u, meta relevanti, il-propjetajiet fiżikokimiċi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-informazzjoni ta' l-identifikazzjoni kimika, meta relevanti, inkluża l-formula strutturali, il-purità (i.e. għall-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ il-persentaġġ ta' l-ingredjent attiv), il-kontenut tan-nitroġenu.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     
                        Substrata:
                     
                                 —
                              
                              
                                 is-sorsi tas-substrata
                                 
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-komposizzjoni (i.e. tgħasida luċerna, it-tgħasida luċerna-ħaxix-ħdura);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kontenut tal-karbonju u tan-nitroġenu ( % piż xott);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-daqs ta' l-imgħarbel (mm).
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kondizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-emenda tal-ħamrija b'substrata organika;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru tal-konċentrazzjonijiet fil-kimika tat-test użata u, meta xieraq, ġustifikazzjoni tal-konċentrazzjonijiet magħżula;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-applikazzjoni tas-substrata tat-test fil-ħamrija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 temperatura ta' l-inkubazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-kontenut ta' l-umidità fil-bidu u matul it-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-metodu użat ta' l-inkubazzjoni tal-ħamrija (i.e. bħala massa jew bħala serje ta' subkampjuni individwali);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru ta' replikati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-drabi tal-kampjuna;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Riżultati:
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     il-metodu użat għall-estrazzjoni tan-nitrat mill-ħamrija.
                     
                                 —
                              
                              
                                 proċedura analitika u l-apparat użat fl-analiżi tan-nitrat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji tabulati, inklużi il-valuri individwali u medji għall-kejl tan-nitrat;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-varjazzjoni bejn ir-replikati fil-kampjuni ittrattati u tal-kontroll;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 spjegazzjonijiet tal-korrezzjonijiet imwettqa fil-kalkoli, jekk relevanti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-varjazzjoni perċentwali fir-rati tal-formazzjoni tan-nitrat f'kull waqt tal- kampjunar, jekk xieraq, il-limitu ta' l-affidibbilità tal-valur EC50 b'95 fil-mijja affidibbilità, ECx oħrajn (i.e. EC25 jew EC10) b'intervalli ta' l-affidibbilità, u grafika tal-kurva doża-reazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 riżultati statitiċi tat-trattament;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-informazzjoni u l-osservazzjonijiet kollha li jkunu ta' għajnuna fl- interpretazzjoni tar-riżultati.
                              
                           
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Bruxelles.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality – Biological Methods.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18-20 janvier 1995.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass -Part 1: Substrateinduced respiration method.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass -Part 2: Fumigationextraction method.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New - York.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.
                  
               C.22.   MIKROORGANIŻMI TAL-ĦAMRIJA: TEST TAT-TRASFORMAZZJONI TAL-KARBONJU
         1.   METODU
         Dan il-metodu huwa dupplikazzjoni għal OECD TG 217 (2000)
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Dan il-Metodu tat-testijiet jiddeskrivi metodu tal-laboratorju iddisnjat sabiex jinvestiga l-effetti potenzjoni f'terminu fit-tul ta' espożizzjoni singola tal-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ u possibbilment kemikali oħrajn fuq l-attività tat-trasformazzjoni tal-karbomnju f'mikroorgaiżmi tal-ħamrija. It-test huwa prinċipalment ibbażat fuq ir-rakkommandazzjonijiet ta' l-Organizzazzjoni għall-Protezzjoni tal-Pjanti Ewropej u tal-Mediterran (1). B'dana kollu, Linji ta' Gwida oħrajn, inklużi dawk tal-Biologische Bundesanstalt tal-Ġermanja (2), il-US Environmental Protection Agency (3) il-SETAC (4), kienu wkoll meqjusa. Laqgħa ta' Ħidma tal-OECD dwar l-Għażla tal-Ħamrija/Sediment li nżammet f'Belgirate, l-Italja, fil-1955 (5) qablet dwar in-numru u t-tip ta' ħamrija għall-użu f'dan it-test. Rakkommandazzjonijiet għall-ġbir, tqandil u l-ħażna tal-kampjun tal-ħamrija huma ibbażai fuq Dokument ta' Gwida ISO (6) u r-rakkomandazzjonijiet tal-Laqgħa ta' Ħidma ta' Belgirate.
         Fl-assaġġ u l-evalwazzjoni tal-karatteristiċi tossiċi tas-sustanzi tat-test, determinazzjoni ta' l-effetti fuq l-attività mikrobjali tal-ħamrija tista tkun meħtieġa, eż., meta l-informazzjoni dwar l-effetti potenzjali min-naħa tal-protezzjoni tal-prodotti ta' l-uċuħ fuq il-mikroflora tal-ħamrija huma meħtieġa jew meta l-espożizzjoni ta' mikroorganiżmi tal-ħamrija lejn kimiċi apparti milli l-prodotti tal-protezzjoni tal-ħamrija, jkunu mistennija. It-test tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu huwa mwettaq sabiex jiddetermina l-effetti ta' tali kimiċi fuq il-mikroflora tal-ħamrija. Jekk l-agrikimiċi (eż., il-prodotti tal-protezzjoni tal-ħamrija, l-fertilizzanti, u l-kimiċi tal-foresterija) huma ittestjati, kemm it-trasformazzjoni tan-nitroġenu u wkoll it-testijiet tat-trasformazzjoni tal-karbonu, huma mwettqa. Jekk dawk li ma humiex l-agrokimiċi huma ittestjati, it-test tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu huwa suffiċjenti. B'dana kollu, jekk il-valuri EC5O tat-test tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu għal tali kimiċi jidħol fi ħdan il-medda misjuba għal inibituri tan-nitrifikazzjoni kummerċjalment disponibbli (eż. nitrapyrin), test tat-trasformazzjoni tal-karbondu jista jkun imwettaq sabiex tkun akkwistata aktar informazzjoni.
         Il-ħamrija tikkonsisti minn komponenti ħajjin u mhux-ħajjin li jeżistu f'taħlitiet kumplessi u eteroġenji. Il-mikroorganiżmi għandhom parti ta' rwol impoprtanti fit-tfarrik u t- traformazzjoni tal-meterja organika f'ħamrija fertili b'ħafna speċi jikkontribwixxu għal diversi aspetti tal-fertilità tal-ħamrija. Kwalunkwe interferenza fit-tul ma' dawn il-proċessi bijokimiċi jista' jkollha l-potenzal li tinterferixxi maċ-ċiklu tan-nutrient u dan jista jibdel il-fertilità tal-ħamrija. It-trasformazzjoni tal-karbonju u n-nitroġenu sseħħ fil-ħamrija fertili kollha. Għalkemm il-kommunitajiet mikrobjali responsabbli għal dawn il-proċessi jiddifferixxu bejn ħamrija u oħra, il-mezzi tat-trasformazzjoni huma essenzjalment l-istess.
         Dan il-Metodu ta' Testijiet kif deskritt huwa iddisinjat sabiex jiżvela l-effetti ħżiena ta' terminu fit-tul ta' sustanza dwar il-proċess tat-trasformazzjoni tan-nitroġenu f'ħamrija erobika tal-wiċċ. It-test huwa sensittiv għal kambju fid-daqs u l-attività tal-kommunitajiet mikrobjali responsabbli għat-trasformazzjoni tal-karbonju la darba jissuġġetti dawn il-kommunitajiet kemm lejn l-impenn kemikali u wkoll għal nuqqas gravi ta' karbonju. Ħamrija mramma baxxa f'materja organika hija użata. Din il-ħamrija hija ittrattata bis-sustanza tat-test u inkubata permezz tal-kondizzjonijiet li jippermettu mataboliżmu mikrobjali mħaffef. Permezz ta' dawn il-kondizzjonijiet, sorsi ta' karbonju faċilment disponibbli fil-ħamrija huma malajr eżawriti. Dan jikkaġuna skarzezza tal-karbonju li kemm jiqtol iċ-ċelloli mikrobjali u wkoll jinduċi rqad u/jew sporlazzjoni. Jekk it-test ikun imwettaq għal aktar minn 28 jum, is-somma ta' dawn ir-reazzjonijiet tista tkun imkejla bi (ħamrija mhux trattata) kontrolli bħala telf progressiv tal-biomassa mikrobjali metabolikament attiva (7). Jekk il-biomassa tal-ħammrija mċaħħda mill-karbonju, skond il-kondizzjonijiet tat-test, hija affettwata bil-preżenza ta' kimika, jista jkun il-każ li din ma terġal lura lejn l-istess livell bħal fil-kontroll. Għalhekk, disturnazi ikkaġunati bis-sustanza tat-test fi kwalunkwe hin matul it-test ta' spiss iddum sat-tmiem tat-test.
         It-testijiet li minnhom dan il-metodu ta' testijiet kien ġie żviluppat kienu primarjament iddisinjati għal sustanzi li dwarhom l-ammont li jilħaq il-ħamrija setgħa jkun antiċipat. Dan hu l-każ, per eżempju, għall-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ li dwarhom ir-rata ta' l-applikazzjoni fl-għelieqi hija magħrufa. Għall-agrokimiki, it-testijiet ta' żewġ dożi relevanti għar-rata antiċipata jew imbassra ta' l-applikazzjoni huma suffiċjenti. L-agrokimiċi jistgħu ikunu ittestjati bħala ingredjenti attivi (a.i.) jew prodotti formulati. B'dana kollu, it-test mhux limitat għall-kimiċi b'konċentrazzjonijiet ambjentali prevedibbli. Bit-tibdil kemm ta' l-ammonti tas-sustamnza tat-test applikata fil-ħamrija, u l-mod ta' kif l-informazzjoni hija evalwata, it-test jista wkoll ikunu wżat għal kimiċi li dwarhom l-ammont mistenni li jilħaq il-ħamrija ma jkunx maghruf. Għalhekk, bil-kimiċi apparti milli l-agrokimiċi, l-effetti ta' serje ta' konċentrazzjonijiet dwar it-trasformazzjoni tal-karbonju, huma determinati. L-informazzjoni minn dawn it-testijiet hija użata sabiex tipprepara l-kurva tad-doża-reazzjoni u tikkalkola l-valuri Ecx, meta hija definita bħala % effett.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Trasformazzjoni tal-karbonju: Hija d-degradazzjoni minn mikroorganiżmi ta' materja organika li tifforma il-prodott aħħari inorganiku tad-diossidu tal-karbonju.
         
            EC
            
               x
            
            (Konċentrazzjoni Effettiva): Hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħamrija li tirriżulta fi x persentaġġ inibizzjoni tat-trasformazzjoni tal-karbonju lejn diossidu tal-karbonju.
         
            EC
            
               5O
            
            (Konċentrazzjoni Effettiva Medjana): Hija l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħamrija li tirriżulta fi 50 fil-mijja inibizzjoni tat-trasformazzjoni tal-karbonju lejn diossidu tal-karbonju.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Xejn
         1.4.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Il-ħamrija magħrbla hija jew ittrattata bis-sustanza tat-test jew imħollija mhux ittrattata (kontroll). Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, minimu ta' żewġ konċentrazzjonijiet tat-test huma rakkommandati u dawn għandhom ikunu magħżula b'reazzjoni ma l-għola konċentrazzjoni antiċipata fl-għalqa. Wara 0, 7, 14 u 28 jum ta' inkubazzjoni, kampjuni ta' ħamrija ittrattata u tal-kontroll huma mħallta bil-glukożju, u r-rati tar-respirazzjoni indotti mill-glukożju huma mkejla għal 12-il siegħa konsekuttivi. Ir-rate tar-respirazzjoni huma espressi bħala diossidu tal-karbonju rilaxxat (mg diossidu tal-karbonju/kd ħamrija xotta/fis-siegħa) jew ossiġenu ikkunsmat (mg ossiġenu/kg ħamrija/siegħa). Ir-rata medja tar-respirazzjoni fil-kampjuni tal-ħamrija ittrattata hima mqabbla ma dik fil-kontroll u d-devjazzjoni perċentwali tal-ħamrija ittrattata minn dik tal-kontroll hija ikkalkolata. It-testijiet kollha jkunu mill-anqas ta' 28 jum. Jekk, fit-28 jum, id-differenzi bejn il-ħamrija ittrattata u dik mhux ittrattata huma egwali jew akbar minn 25 %, il-kejl jitkompla sa massimu ta' 100 jum. Jekk kimiċi oħrajn apparti milli l-agrokimiċi huma ittestjati, serje ta' konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test huma miżjuda mal-kampjuni tal-ħamrija, u r-rati tar-respirazzjoni indotti mill-glukożju (i.e. il-medja tal-kwantitajiet tad-diossidu tal-karbonju iffurmat jew l-ossiġenu ikkunsm, at) huma imkejja wara 28 jum. Ir-riżultati mit-testijiet b'konċentrazzjonijiet multipli huma analizzati bl-użu ta' mudell regressiv, u l-valuri Ecx huma kkalkolati (i.e. EC50, EC25 u/jew EC10). Ara definizzjonijiet.
         1.5.   IL-VALIDITÀ TAT-TEST
         L-evalwazzjonijiet tar-riżultati tat-test ma l-agrokimiċi huma bbażati fuq relattivament differenzi żgħar (i.e. medja ta' valur ± 25 %) bejn il-konċentrazzjonijiet nitriċi fil-ħamrija tal-kontroll u f'dik ittrattata, għalhekk varjazzjonijiet kbar fil-kontrolli jistgħu iwasslu għal riżultati foloz. Għalhekk, il-varjazzjoni bejn kampjuni mġedda tal-kontroll għandha tkun ta' anqas minn ± 15 %.
         1.6.   ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.6.1.   Apparat
         Il-kontenituri tat-test użati huma magħmula minn materjal kemikament inert. Dawn għandhom ikunu ta' daqs xieraq b'konformità mal-proċedura użata għall-inkubazzjoni tal-ħamrija. i.e. l-inkubazzjoni fil-massa jew bħala serje individwai ta' kampjuni tal-ħamrija (ara s-sezzjoni 1.7.1.2). Attenzjoni qawwija għandha tingħata sabiex ikun minimizzat it-telf ta' l-ilma u li jkun imħolli l-iskambu tal-gass matul it-test (eż. il-kontenituri tat-test jistgħu ikunu mogħttija b'folja tal-polyethylene mtaqqba). Meta jkunu ittestjati sustanzi volatili, kontenituri li jitgħu ikunu issiġġillati u li ma jgħaddix gass minnhom għandhom ikunu wżati. Dawn għandhom ikunu ta' daqs li madwar kwart tal-volum tagħhom ikun mimli bil-kampjun tal-ħamrija.
         Għad-determinazzjoni tar-respirazzjoni indotta mill-glukożju, sistemi ta' inkubazzjoni u strumenti għall-kejl tal-produzzjoni tad-diossidu tal-karbonju jew tal-konsum ta' l-ossiġenu huma meħtieġa. Eżempji ta' tali sistemi u strumenti huma misjuba fil-letteratura (8) (9) (10) (11).
         1.6.2.   L-għażla u n-numu ta' ħamrija
         Ħamrija waħda hija użata. Il-karatteristiċi rakkommandati tal-ħamrija huma kif ġej:
         
                     —
                  
                  
                     kontenut tar-ramel: Mhux inqas minn 50 % imma mhux iktar minn 75 %.
                  
               
                     —
                  
                  
                     pH: 5,5-7,5;
                  
               
                     —
                  
                  
                     kontenut tal-karbonju organiku: 0,5-1,5 %;
                  
               
                     —
                  
                  
                     il-biomassa mikrobjali għandha tkun imkejla (12)(13) u l-pkontenut tal- karbonju tagħha għandu jkun ta' mill-anqas 1 % tal-karbonju organiku totali tal- ħamrija.
                  
               F'bosta każi, ħamrija b'dawn il-karatteristiċi tirrapreżenta l-għar każ ta' sitwazzjoni, la darba l-adsorbazzjoni tal-kimika tat-test hija l-minimu u d-disponnabbiltà tagħha lejn il-mikroflora hija l-massimu. B'konsehwenza, it-testijiet b'ħamrija oħra huma, ġeneralemnt, mhux meħtieġa. B'dana kollu, f'ċerti ċirkostanzi, eż. meta l-użu maġġuri antiċipat tas- sustanza tat-test f'ħamrija partikolari, bħal ma huma l-ħamrija aċiduża tal-foresti, jew għal kimiċi ikkargati elettrostatikament, jista jkun meħtieġ li tintuża ħamrija addizzjonali.
         1.6.3.   Il-ġbir u l-ħażna tal-kampjunu tal-ħamrija
         1.6.3.1.   Il-ġbir
         L-informazzjoni dettaljata dwar l-istorja tas-sit fl-għalqa minn fejn il-ħamrija tat-test hija miġburha għandha tkun disponibbli. Id-dettalji jinkludu l-lokalità eżatta, il-kisi veġitali, id-dati tat-trattament bil-prodotti tal-protezzjoni tal-pjanti, it-trattamenti b'fertilizzanti organiċi u mhux-organiċi, żidiet ta' materjali bioloġiċi jew kontaminazzjonijiet aċċidentali. Is-sit magħżul għall-ġbir tal-ħamrija għandu jkun wieħed li jippermetti użu f'terminu twil. Mergħat permanenti, għelieqi b'uċuħ annwali taċ-ċereali (apparti mill-qamħ-ir-rum) jew dawk moghtija d-demel b'żergħat iffullata, huma tajbin. Il-għażla tas-sit tal-kampjunar m'għandhiex tkun ġiet trattata bil-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ għam mill-anqas sena qabel il-kampjunar. Ukoll, l-ebda fertilizzant organiku ma jkun ġie applikat għal mill-anqas sitt xhur. L-użu ta' fertilizzant minerali huwa aċċettabbli biss meta, b'konformità mal-ħtiġiet tal-kampjuni ta' l-uċuħ u tal-ħamrija, m'għandhomx ikunu miġbura għal mill-anqas tlett xhur wara l-applikazzjoni tal-fertilizzant. L-użu ta' ħamrija trattata bil-fertilizzanti li għandhom effetti bioċidali magħrufa (eż. is-sijanamid tal-kalċju) għandu jkun evitat.
         Il-kampjunar għandu jkun evitat matul, jew immedjetament wara, perijodi twal (itwal minn 30 jum) ta' nixfa jew ta' stgħadir bl-ilma. Għal ħamrija maħruta, il-kampjuni għandhom jinġabru minn fond ta' 1 sa 20 cm l-isfel. Għall art tal-mergħa (art fil-ħaxix) jew ħamrija oħra meta l-ħrit ma jseħħx, atul perijodi twal (f'mill-anqas staġun wieħed tat-tkabbir), il-fond massimu tal-kampjunar jista jkun kemm xejn aktar minn 20 cm (eż. sa 25 cm). Il-kampjuni tal-ħamrija għandhom ikunu ittrasportati bl-użu ta' kontenituri u skond kondizzjonijiet tat-temperatura li jiggarantixxu li l-propjetajiet inizjali tal-ħamrija ma jkunus sinifikament mibdula.
         1.6.3.2.   Ħażna
         L-użu ta' ħamrija miġbura friska mill-għelieqi huwa ippreferut. Jekk ħażna fil-laboratorju ma tistgħax tkun evitata, il-ħamrija tista tkun maħżuna fid-dlam 4 ± 2 oC għal massimu ta' tlett xhur. Matul il-ħażna tal-ħamrija, il-kondizzjonijiet erobiċi għandhom ikunu assigurati. Jekk il-ħamrija tkun miġbura minn żoni ta' fejn din tkun iffriżata għal mill-anqas tlett xhur tas-sena, il-ħażna għal sitt xhur fi – 18 oC tista tkun ikkonsidrata. Il-biomassa mikrobjali tal-ħamrija maħżuna hija mkejla qabel kull esperiment u l-karbonju fil-biomassa għandu jkun mill-anqas 1 % tal-kontenut totali tal-karbonju organiku fil-ħamrija (ara s-sezzjoni 1.6.2).
         1.6.4.   Tqandil u l-preparazzjoni tal-ħamrija għat-test
         1.6.4.1.   Pre-inkubazzjoni
         Jekk il-ħamrija kienet maħżunha (ara s-sezzjoni 1.6.4.2 u 1.7.1.3), pre-inkubazzjoni hija rakkommandata għal perijodu ta' bejn 2 u 28 jum. It-temperatura u l-umidità tal-kontenut tal-ħamrija matul il-pre-inkubazzjoni għandhom ikunu simili għal dik użata fit-test (ara s-sezzjonijiet 1.6.4.2 u 1.7.1.3).
         1.6.4.2.   Karatteristiċi fiżiko-kimiċi
         Il-ħamrija hija manwalment imnaddfa minn oġġeti kbar (eż. ġebel, partijiet ta' pjanti, eċċ.) u imbagħad magħrbla fin-nieda mingħajt tnixxif eċċessiv lejn daqs ta' partiċelli ta' anqas minn jew egwali għal 2 mm. Il-kontenut ta' l-umidità tal-kampjun tal-ħamrija għandu jkun aġġustat b'ila distillat jew dejonizzat lejn valur ta' bejn 40 % u 60 % tal-kapaċità massima taż-żamma ta' l-ilma.
         1.6.5.   Preparazzjoni tas-sustanza tat-test għall-applikazzjoni mal-ħamrija
         Is-sustanza tat-test hija normalment applikata bl-użu ta' trasportatur. It-trasportatur jista jkun ilma (għal sustanzi li jinħallu fl-ilma) jew solidu inert bħal ma huwa ramel fin tal-kwartz (daqs tal-partiċella: 0,1 - 0,5 mm). Trasportaturi likwidi apparti mill-ilma (eż. solventi organiċi bħal ma huma l-aċetun, il-kloroforma) għandhom ikunu evitati la darba dawn jistgħu joħolqu ħsara għall-mikroflora. Jekk ir-ramel ikunu użat bħala trasportatur, dan jista jkun m iksi bis-sustanza tat-test imdewba jew sospiża f'solvent xieraq. F'tali każi, is-solvent għandu jkun imneħħi bl-evaporazzjoni qabel it-taħlit mal-ħamrija. Għall-aħjar distribuzzjoni tas-sustanza tat-test fil-ħamrija, relattività ta' 10 g ramel ma kull kilogramma ta' ħamrija (piż xott) huwa rakkommandabbli. Kampjuni tal-kontroll huma ittrattati b'ammont ekwivalenti ta' ilmaa u/jew ramel kwartz biss.
         Meta jkunu ittestjati kemikali volatili, it-telf matul it-trattament għandu jkun evitat sa kemm dan ikun possibbli u tentattiv għandu jsir sabiex tkun assigurata distribuzzjoni omoġenja fil-ħamrija (eż. is-sustanza tat-test għandha tkun injettata fil-ħamrija minn diversi postijiet).
         1.6.6.   Konċentrazzjonijiet tat-test
         Jekk il-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ jew kimiċi oħrajn b'konċentrazzjonijiet ambjentali prevedibbli huma ittestjati, mill-anqas żewġ konċentrazzjonijiet għandhom ikunu wżati. Il-konċentrazzjoni l-baxxa għandha tirrifletti mill-anqas l-ammont massimu mistenni li jilħaq il-ħamrija waqt kondizzjonijiet prattiċi, fil-waqt li l-konċentrazzjoni l-għolja għandha tkun mutiplu tal-konċentrazzjoni l-baxxa. Il-konċentrazzjonijiet ta' sustanza tat-test miżjuda mal-ħamrija huma ikkalkolati billi tkun preżunta inkorporazzjoni uniformi sa fond ta' 5 cm u l-massa tal-ħamrija f'densità ta' 1.5. Għall-agrokimiċi li huma applikati direttament mal-ħamrija, jew għal kimiċi li dwarhom il-kwantità li tilħaq il-ħamrija tista tkun prevista, il-konċentrazzjonijiet tat-test irrakkommandati huma l-massimu Predicted Environmental Concentration (PEC) (Konċentrazzjoni Ambjentali Mbassra) u ħames darbiet dik il-konċentrazzjoni. Is-sustanzi li huma mistennija li jkunu applikati diversi drabi mal-ħamrija fi staġun wieħed għandhom ikunu ittestjati fil-konċemntrazzjonijiet derivati mill-multiplikazzjoni tal-PEC bin-numru massimu antiċipat ta' l-applikazzjonijiet. L-għoila konċentrazzjoni ittestjata, b'dana kollu, m'għandhiex teċċedi għaxar darbiet il-massimu tar-rata ta' applikazzjoni waħda.
         Jekk dawk li ma humiex agrokimiċi huma ittestjati, serje ġeometrikuta' mill-anqas ħames konċentrazzjonijiet għandu jkun użat. Il-konċentrazzjonijiet ittestjati għandhom ikopru l-medda meħtieġa tal-valuri ECx.
         1.7.   L-IMĠIEBA TAT-TEST
         1.7.1.   Il-kondizzjonijiet ta' l-espożizzjoni
         1.7.1.1.   It-trattament u l-kontrol
         Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, il-ħamrija hija diviża fi tlett porzjonijiet ta' piż egwali. Żewġ porzjonijiet huma mħallta mat-trasportatur li jkun fih il-prodott, u l-ieħor huwa mħallat mat-trasportatur mingħajr il-prodott (kontroll). Minimu ta' tlett repliki kemm għall ħamrija ittrattata u wkol mhux ittrattata huma rakkommandati. Jekk dawk li ma humiex agrokimiċi huma ittestjati, il-ħamrija hija diviża f'sitt porzjonijiet ta' piż ugwali. Ħmasa mill-kampjunu huma mħallta mat-trasportatur li jkun fih is-sustanza tat-test, u s-sitt kampjun huwa mħallat mat-trasportatur mingħajr il-kimika. Tlett replikati taż-żewġ trattamenti u tal-kontroll huma rakkommandati. Attenzjoni għandha tingħata sabiex tkun assigurata distribuzzjoni omoġenja tas-sustanza tat-test fil-kampjunu tal-ħamrija ittrattata. Matul it-taħlit, l-ikkumpattjar jew gerbubi mgħaqqda għandhom ikunu evitati.
         1.7.1.2.   L-inkubazzjoni tal-kampjuni tal-ħamrija
         L-inkubazzjoni tal-kampjuni tal-ħamrija tista titwettaq b'żewġ modi: Bħala kampjuni fil-massa ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata jew f'serje ta' subkampjuni individwali u ta' daqs egwali ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata. B'dana kollu, meta sustanzi volatili huma ittestjati, it-test għandu jkun imwettaq biss b'serje ta' sub-kampjuni individwali. Meta l-ħamrija tkun inkubata fil-massa, kwantitajiet kbar ta' kull ħamrija ittrattata u mhux trattata huma ippreparati u s-sub-kampjuni għall-analiżi huma miġbura kif meħtieġ matul it-test. L- ammont inizjalment ippreparat għal kull trattament u kontroll jiddependi mid-daqs tas-sub-kampjuni, in-numru ta' repliki użati għall-analiżi u n-numru massimu antiċipat tal-ħinijiet tal-kampjunar. Il-ħamrija inkubata fil-massa għamndha tkun imħallta sewwa qabel is-sub-kampjuni. Meta l-ħamrija hija inkubata f'serje individwali ta' ħamrija, kull ħamrija ittrattata jew mhux trattata fil-massa hija diviża fin-numru meħtieġ ta' sub-kampjuni, u dawn huma utilizzati kif meħtieġ. Fl-esperimenti meta tnejn jew aktar drabi tal-kampjunar jistgħu ikunu antiċipati, sub-kampjuni biż-żejjed għandhom ikunu ippreparati sabiex iqisu ir-replikati kollha u l-waqtiet kollha tal-kampjunar. Mill-anqas tlett kampjuni tar-replikati tal-ħamrija tat-test għandhom ikunu inkubati permezz tal-kondizzjonijiet erobiċi (ara s-sezzjoni 1.7.1.1). Matul it-testijiet kollha, kontenituri xierqa, bi spazju fil-wiċċ suffiċjenti, għandhom ikunu użati sabiex ikunu evitati l-kondizzjonijiet anerobiċi. Meta sustanzi volatili huma ittestjati, it-test għandu jkun imwettaq biss b'serje ta' sub-kampjuni individwali.
         1.7.1.3.   Il-kondizzjonijiet u t-tul tat-testijiet
         It-test huwa mwettaq fid-dlam f'temepratura tal-kamra ta' 20 ± 2 oC. Il-kontenut ta' l-umidità tal-kamjuni tal-ħamrija għandu jkun miżmum matul it-test għal bejn 40 % u 60 % tal-kapaċità massima taż-żamma ta' l-ilma fil-ħamrija (ara s-sezzjoni 1.6.4.2) b'medda ta' ± 5 %. Ilma distillat jew deonizzat jista jkun miżjud kif meħtieġ.
         It-tul minimu tat-testijiet huwa 28 jum. Jekk agrokimiċi huma ittestjati, il-kantitajiet tad-diossidu tal-karbonju rilaxxat jew ta' lk-ossiġenu ikkunsmat fil-kampjuni ittrattati u tal-kontroll huma paragunati. Jekk dawn ikunu differenti b'aktar minn 25 % fil-jum 28, it-test jitkompla sakemm differenza egwali għal, jew anqas minn 25 % tkun akkwistata, jew għal massimu ta' 100 jum, liema minnhom ikun l-aqsar. Għal dawk li ma humiex agrokimiċi, it-test ikun terminat wara 28 jum. Fil-jum 28, il-kwantitajiet tan-nitrat fil-kampjuni tal-ħamrija ittrattata jew tal-kontroll huma determinati u l-valuri ECx ikunu ikkalkolati.
         1.7.2.   Kampġjunaar u analiżi tal-ħamrija
         1.7.2.1.   Kampjunar skedat tal-ħamrija
         Jekk l-agrokimiċi huma ittestjati, il-kampjuni tal-ħamrija huma analiżżati għan-nitrat fil-jiem 0, 7, 14 u 28. jekk test imtawwal ikun meħtieġ, aktar kejl għandu jseħħ f'intervalli ta' 14-il jum, wara l-jum 28.
         Jekk dawk li ma humiex agrokimiċi huma ittestjati, mill-anqas ħames konċentrazzjonijiet tat-test huma wżati u l-kampjuni tal-ħamrija huma analiżżati għan-nitrat fil-bidu (jum 0) u fit-tmiem tal-perijodu ta' l-espożizzjoni (28 jum). Kejl intermedju, eż. fil-jum 7, jista jkun miżjud jekk dan ikun meqjus bħala meħtieġ. L-informazzjoni akkwistata fil-jum 28 hija użata għad-determinazzjoni tal-valux ECx dwar il-kimika. Jekk mixtieq, l-informazzjoni mill-jum 0 tal-kampjuni tal-kontroll jistgħu ikunu wżati sabiex jirraportaw il-kwanitità inizjali tan-nitrat fil-ħamrija (12).
         1.7.2.2.   Kejl tar-rati tar-respirazzjoni indotti mill-glukożju
         L-ammont ta' nitrat iffurmat f'kull replika trattata jew tal-kontroll huwa determinat f'kull waqt tal-kampjunar. Il-kampjuni tal-ħamrija huma mħallta ma ammint suffiċjenti ta' glukożju sabiex iħeġġeġ reazzjoni immedjata ta' respirazzjoni massima. L-ammont ta' glukożju meħtieġ sabiex iħeġġeġ ir-reazzjoni respiratorja massima minn ħamrija partikolari jista jkun determinat b'test preliminarju li jutilizza serje ta' konċentrazzjonijiet ta' glukożju (14). B'dana kollu, għal ħamrija mrammla bi 0,5-1,5 % karbonju organiku, 2 000 mg sa 2 000 mg glukożju kull kg piż tal-ħamrija xotta huwa normalment suffiċjenti. Il-glukożju jistgħa jkun mitħun fi trab mar-ramel kwarz nadif (10 gramel/kd piż tal-ħamrija xotta) u imħallta b'mod omoġeniku mal-ħamrija.
         Il-kampjuni tal-ħamrija emendata bil-glukożju hija inkubata f'apparat xieraq għall-kejl tar-rati tar-respirazzjoni, jew kontinwament, kull siegħa, jew kull sagħtejn (ara s-sezzjoni 1.6.1) fi 20 ± 2 oC. Id-diossidu tal-karbonju rilaxxat jew l-ossiġenu ikkunsmat huwa mkejjel għal 12-il siegħa konsekuttivi u l-kejl għandu jibda malajr kemm jista jkun possibbli, i.w. fi żmien 1 sa 2 siegħat wara s-supplement tal-glukożju. Il-kwantitajiet totali tad-diossidu tal-karbonju rilaxxata jew l-ossiġenu ikkunsmat matul it-12-il siegħa huma mkejla u r-rati medja tar-respirazzjoni huma determinati.
         2.   DATA
         2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         Jekk it-testijiet huma mwettqa b'agrokimiċi, il-kwalità tad-diossidu tal-karbonju rilaxxat minn, jew l-ossiġenu ikkunsmat f'kull replika tal-kampjun tal-ħamrija għandha tkun irreġistrata, u l-valuri medji tar-replikati kollha għandhom ikunu ipprovduti f'għamla tabulari. Ir-riżultati għandhom ikunu evalwatu b'metodi statistiċi xierqa u ġeneralment aċċettabbli (eż. Test-F, 5 % livell sinifikanti). Ir-rati tar-respirazzjoni indotti bil-glukożju huma espressi fi mg diossidu tal-karbonju/kd piż tal-ħamrija xotta/siegħa jew mg ossiġenu/piż tal-ħamrija xotta/siegħa. Il-medja tar-rata tal-formazzjoni tad-diossidu tal-karbonju jew il-medja tar-rata tal-konsum ta' l-ossiġenu f'kull trattament huma mqabbla ma dawk tal-kontroll, u d-devjazzjoni perċentwali mill-kontroll hija ikkalakolata.
         Jekk it-testijiet huma mwettqa b'dawk li ma humiex agrokimiċi, il-kantità ta' nitrat iffurmat f'kull replika huwa determinat, u l-kurva doża-reazzjoni hija ippreparata għall-estimi tal-valuri ECx Ir-rati tar-respirazzjoni indotta bil-glukożju (i.e. mg diossidu tal-karbonju/kg piż tal-ħamrija xotta.siegħa jew mg ossiġenu/piż tal-ħamrija xotta.siegħa) misjuba fil-kampjuni ittrattati wara 28 jum huma mqabbla ma dawk misjuba fil-kontroll. Minn din l-informazzjoni, il- % tal-valuri ta' l-inibizzjoni għal kull konċentrazzjoni tat-test huma ikkalkolati. Dawn il-persentaġġi huma mpinġija kontra l-konċentrazzjoni, u l-proċeduri statistiċi huma mbagħad użati għall-kalkolu tal-valuri ECx. Limiti ta' l-affidabbilità (p = 0,95) għal ECx ikkalkolati huma wkoll determinati bl-użu tal-proċeduri normali (15) (16) (17).
         2.2.   INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Meta r-riżultati mit-testijiet bl-agrokimiċi huma evalwati, u d-differenza fir-rati tal-formazzjoni tar-respirazzjoni bejn it-trattament baxx (i.e. il-massimu tal-konċentrazzjoni prevista) u l-kontroll tkun egwali għal, jew anqas minn 25 % fi kwalunkwe kampjun fil-waqt wara l-jum 28, il-prodott jista jkun evalwat bħala li jkollu infuwenza f'terminu fit-tul fuq it-trasformazzjoni tal-karbonju fil-ħamrija. Meta r-riżultati minn testijiet b'kimiċi apparti milli l-agrokimiċi huma evalwati, il-Valuri EC50, EC25 u/jew EC10 huma wżati.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         RAPPORTTAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Identifikazzjoni sħiħa tal-ħamrija użata, inkluż:
                     
                                 —
                              
                              
                                 refernza ġeografika tas-sit (latitudini, lonġitudini);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 informazzjoni dwar l-istorja tas-sit (i.e. il-koperta veġittiva, it-trattamenti bil-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ, trattamenti bil-fertilizzanti, kontaminazzjoni aċċidentali, eċċ.);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-sekwenza ta' l-użu (eż. ħamrija agrikola, foresta, eċċ.);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-fond tal-kampjunar (cm);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-kontenut ramel/ħama'/tafal ( % tal-piż);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pH (fl-ilma);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kontenut karbonju organiku ( % piż xott);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kontenut tan-nitroġenu organiku ( % piż xott);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kapaċità ta' l-iskambju tal-jonju (mmol/kg);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 biomassa mikrobjali f'termini ta' persentaġġ tal-karbonju organiku totali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 referenza għall-metodi użati għad-determinazzjoni ta' kull parametru;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-informazzjoni li tirrigwardja il-ġbir u l-ħażna tal-kampjuni tal-ħamrija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji tal-pri-inkubazzjoni tal-ħamrija, jekk ikun hemm.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Is-sustanza tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 in-natura fiżika u, meta relevanti, il-propjetajiet fiżikokimiċi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-informazzjoni ta' l-identifikazzjoni kimika, meta relevanti, inkluża l-formula strutturali, il-purità (i.e. għall-prodotti tal-protezzjoni ta' l-uċuħ il-persentaġġ ta' l- ingredjent attiv), il-kontenut tan-nitroġenu.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kondizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-emenda tal-ħamrija b'substrata organika;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru tal-konċentrazzjonijiet fil-kimika tat-test użata u, meta xieraq, ġustifikazzjoni tal-konċentrazzjonijiet magħżula;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ta' l-applikazzjoni tas-substrata tat-test fil-ħamrija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 temperatura ta' l-inkubazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-kontenut ta' l-umidità fil-bidu u matul it-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-metodu użat ta' l-inkubazzjoni tal-ħamrija (i.e. bħala massa jew bħala serje ta' subkampjuni individwali);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru ta' replikati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-drabi tal-kampjunar.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 metodu u apparat użat għall-kejl tar-rati tar-respirazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji tabulate, inklużi l-valuri individwali u medji għall-kwantitajiet tad- diossidu tal-karbonju jew ta' l-ossiġenu;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-varjazzjoni bejn ir-replikati fil-kampjuni ittrattati u tal-kontroll;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 spjegazzjonijiet tal-korrezzjonijiet imwettqa fil-kalkoli, jekk relevanti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-varjazzjoni perċentwali fir-rati tal-formazzjoni tan-nitrat f'kull waqt tal-kampjunar, jekk xieraq, il-limitu ta' l-affidibbilità tal-valur EC5 b'95 fil-mija affidibbilità, ECx oħrajn (i.e. EC25 jew EC10) b'intervalli ta' l-affidibbilità, u grafika tal-kurva doża-reazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 trattament statistiku tar-riżultati, meta xieraq;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-informazzjoni u l-osservazzjonijiet kollha li jkunu ta' għajnuna fl- interpretazzjoni tar-riżultati.
                              
                           
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in ‘Pesticide Effects on Soil Microflora’. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in ‘Methods of Soil Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties’. Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831- 871.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Heinemeye, r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.
                  
               C.23.   TRASFORMAZZJONIEROBIKA UANEROBIKA FIL-ĦAMRIJA
         1.   METODU
         Dan il-Metodu tat-Test huwa replika għal OECD TG 307 (2002)
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Dan il-Metodu tat-test huwa ibbażat fuq linji ta' gwida eżistenti (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Dan il-metodu deskritt f'dan il-metodu tat-test huwa iddisinjat għall-evalwazzjoni tat-trasformazzjoni erobika u anerobika tal-kimiċi fil-ħamrija. L-esperimenti huma mwettqa sabiex ikun determinat (i) ir-rata tat-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test, u (ii) in-natura u r-rata tal-formazzjoni u t-tnaqqis tat-traformazzjoni tal-prodotti li dwarhom il-pjanti u l-organiżmi fil-ħamrija jistgħu ikunu esposti. Tali studji huma meħtieġa għall-kimiċi li huma direttament applikati fil-ħamrija jew li huma pjuttost li jilħqu l-ambjent tal-ħamrija. Ir-riżultati ta' tali studji fil-laboratorju jistgħu wkoll ikunu wżati sabiex jiżviluppaw il-protokolli tal-kampjunar u ta' l-analiżi fl-oqsma ta' studju relatati.
         L-istudji erobiċi u anerobiċi ma tip wieħed ta' ħamrija huma ġeneralment suffiċjenti għall-evalwazzjoni tal-passaġġi tat-trasformazzjoni (8) (10) (11). Ir-rati tat-trasformazzjoni għandhom ikunu determinati f'mill-anqas tlett ħamrija addizzjonali (8) (10).
         Laqgħa ta' Ħidma tal-OECD dwar l-Għażla tal-Ħamrija/Sediment li nżammet f'Belgirate, l-Italja, fil-1955 (10) qablet dwar in-numru u t-tip ta' ħamrija għall-użu f'dan it-test. It-tipi tal-ħamrija ittestjati għandhom ikunu rapreżentattivi tal-kondizzjonijiet ambjentali ta' fejn l-użu jew ir-rilaxx ikun sjjer iseħħ. Per eżempju, il-kimiċili jistgħu ikunu rilaxxati fi klimi subtropikali sa tropikali għandhom ikunu ittestjati bil-Ferrasoli jew in-Nitrasoli (sistema FAO). Il-Laqgħa ta' Ħidma kienet ukoll għamlet rakkommandazzjonijiet li jirrigawrjaw il-ġbir, it-tqandil u l-ħażna tal-kampjuni tal-ħamrija, ibbażari fuq il-Linja ta' Gwida ISO (15). L-użu tal-ħamrija mistgħadra (tar-ross) hija wkoll ikkunsidrata f'dan il-metodu.
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         
            Is-sustanza tat-test: Kwalunkwe sustanza, sew jekk kompost oriġinali jew il-prodotti relevanti tat-trasformazzjoni.
         
            Prodotti tat-trasformazzjoni: Is-sustanzi kollha li jirriżultaw mir-reazzjonijiet tat-trasformazzjoni biotiċi jew abiotiċi tas-sustanza tat-test, inklużi il-CO2 u l-prodotti li huma marbuta mar-residwi.
         
            “Residwi marbuta” :‘Residwi marbuta’ tirrapreżemnta komposti fil-ħamrija, pjanti jew annimali, li jippersistu fil-matriċi fil-għamla ta' sustanza oriġinali jew tal-prodotti metaboliti/trasformazzjoni wara l-estrazzjoni. Il-metodu ta' l-estrazzjoni m'għandux sostanzjalment jibdel il-komposti nfushom jew l-istruttura tal-matriċi. In-natura tar-rabta tista tkun kjarifikata parzjalment bil-metodi ta' l-estrazzjoni tat-tibdil-tal-matriċi u b'tekniċi analitiċi sofistikati. Sal-lum, per eżempju, ir-rabtiet kovalenti joniċi u sorptivi, kif ukoll l-ingassar, kienu ġew identifikati b'dan il-mod. Ġeneralment, il-formazzjoni tar-residwi marbuta tnaqqas il-bioaċċessibbiltà u l-biodisponabbiltà sinifikament (12) (Modifikati minn IUPAC 1984 (13)).
         
            Trasformazzjoni erobika: Reazzjonijiet li jseħħu fil-preżenza ta' l-ossiġenu molekulari (14).
         
            Trasformazzjoni anerobika: Reazzjonijiet li jseħħu fl-esklużjoni ta' l-ossiġenu molekulari (14).
         
            Ħamrija: Hija taħlita ta' kostitwenti kimiċi minerali u organiċi, dawn ta' l-aħħar ikun fihom komposti ta' kontenut għoli tal-karbonju u n-nitroġenu u ta' piżijiet molekulari għoljin, animali b'organiżmi żgħat (l-aktar mikro-). Il-ħamrija tista tkun imqandla f'żewġ stati:
         
                     (a)
                  
                  
                     mhux disturbata, kif tkun żviluppat matul iż-żmien, f'saffi karatteristiċi tat-tipi tal-varjetà tal-ħamrija;
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     disturbata, kif normalment tinsab f'għelieqi ħarratija jew kif isseħħ meta l-kampjuni huma miġbura bit-tħaffir u kif użata f'dan il-metodu ta' test (14).
                  
               
            Mineralizzazzjoni: Hija d-degradazzjoni kompleta ta' kompost organiku lejn CO2 u H2O permezz tal-kondizzjonijiet erobiċi, u CH4, CO2 u H2O permezz tal-kondizzjonijiet anerobiċi. Fil-kuntest ta' dan il-metodu taa' test, meta kompost bit-tikketta-14C ikun użat, il-mineralizzazzjoni tfisser dehradazzjoni estensiva li matulha atomu tal-karbonu ttikkettjat ikun ossidizzat bil-rilaxx ta' l-ammont xieraq ta' 14CO2 (14).
         
            Nofs-ħajja: t0,5, huwa l-ħin meħtieġ għal 50 % trasformazzjoni tas-sustanza tat-test meta t-trasformazzjoni tista tkun deskritta bil-kinetiċi ta' l-ewwel ordni; din hija independenti mill-konċentrazzjoni.
         
            DT
            
               50
            
            (Għibien Ħin 50): Huwa l-ħin li fih il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 50 %; din hija differenti min-nofs-ħajja t0,5 meta t-trasformazzjoni ma tkunx issegwi il-kinetiċi ta' l-ewwel ordni.
         
            DT
            
               75
            
            (Għibien Ħin 75): Huwa l-ħin li matulu l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 75 %.
         
            DT
            
               90
            
            (Għibien Ħin 90): Huwa l-ħin li matulu l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 90 %.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Is-sustanzi ta' referenza għandhom ikunu wżati għall-karetterizzazzjoni u/jew l-identifikazzjoni tat-trasformazzjoni tal-prodotti bil-metodi spektroskopiċi u kromatografiċi.
         1.4.   L-APPLIKABBILTÀ TAT-TEST
         Il-metodu huwa applikabbli għas-sustanzi kimiċi kollha (mhux ittikkettjati jew radjotikkettjati) li dwarhom metodu analitiku b'eżattezza u sensittività suffiċjenti huma disponibbli. Dan huwa applikabbli għal komposti kemm xejn volatili, mhux volatili, li jinħallu fl-ilma jew li ma jinħallux fl-ilma. It-test m'għandux ikun applikat lejn kimiċi li huma ferm volatili minn ġewwa l-ħamrija (eż., fumiganti, solventi organiċi) u għalhekk ma jistgħux jinżammu fil-ħamrija skond il-kondizzjonijiet sperimentali ta' dan it-test.
         1.5.   INFORMAZZJONI DWARIS-SUSTANZATAT-TEST
         Sustanza tat-test mhux-ittikkettjata jew ittikkettjata tista tkun użata sabiex tkejjel ir-rata tat-trasformazzjoni. Il-materjal tikkettjat huwa meħtieġ għall-istudju tal-passaġġ tat-trasformazzjoni u sabiex ikun stabbilit il-bilanċ tal-massa. Tikkettjar-14C huwa rakkommandat imma l-użu ta' iżotopi oħrajn bħal ma huma 13C, 15N, 3H, 32P, jistgħu wkoll ikunu utili. Sa kemm huwa possibbli, it-tikketta għandha tkun imqiegħda fil-parti(jiet) l-aktar stabbli tal-molekolu (19) (10). Il-Purità tas-sustanza tat-test għandha tkun mill-anqas 95 %.
         Qabel ma jitwettaq test dwar it-trasformazzjoni eronika u amerobika fil-ħamrija, l-informazzjoni li ġejja dwar is-sustanza tat-test għandha tkun disponibbli.
         
                     (a)
                  
                  
                     solubilità fl-ilma (il-Metodu A.6);
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     solubilità f'solventi organiċi;
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     pressjoni tal-fwar (il-Metodu A.4) u l-liġi kostanti Henry;
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     il-koeffiċjent tal-qsim n–oktano/ilma (il-Metodu A.8);
                  
               
                     (e)
                  
                  
                     stabbilità kimika fid-dlam (idrolisi) (il-Metodu C.7);
                  
               
                     (f)
                  
                  
                     pKa jekk il-molekolu jkun probabbli għal protonazzjoni jew deportonazzjoni (OECD Linja ta' Gwida 112) (16).
                  
               Informazzjhoni utili oħra tista tinkludi dettalji dwar it-tossiċità tas-sustanza tat-test fuq il-mikro-organiżmi tal-ħamrija (il-Metodi tat-Testijiet C.21 u C.22) (16).
         Il-metodi analitiċi (inklużi l-metodi ta' l-estrazzjoni u tat-tindif) għall-kwantifikazzjoni u l-identifikazzjoni tas-sustanza tat-test u tat-traformazzjoni tal-prodotti tagħha, għandhom ikunu disponibbli.
         1.6.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Il-kampjuni tal-ħamrija huma ittrattati bis-sustanza tat-test u inkubati fid-dlam f'garafini tat-tip biometriċi jew f'sistemi ta' nixxija kontinwa skond il-kondizzjonijiet kontrollati tal-laboratorju (f'temepratura u l-umidità tal-ħamrija kostanti). Wara intervalli ta' ħin xieraq, il-kampjuni tal-ħamrija huma estratti u analizzati mis-sustanza oriġinali u għall-prodotti tat-trasformazzjoni. Prodotti volatili huma wkoll, miġbura għall-analiżi bl-użu ta' apparati xierqa ta' l-assorbazzjoni. Bl-użu tal-materjal ittikkettjat-14C, ir-rati varji tal-mineralizzazzjoni tas-sustanza tat-test jistgħu ikunu mkejla bin-nassa evoluta 14CO2 u l-bilanċ tal-massa, inkluża l-formazzjoni ta' residwi marbuta mal-ħamrija, jisgħu ikunu stabbiliti.
         1.7.   KRITERJI TAL-KWALITÀ
         1.7.1.   Irkupru
         L-estrazzjoni u l-analiżi ta', mill-anqas, nofs il-kampjunu duplikati tal-ħamrija, wara ż-żieda tas-sustanza tat-test, tagħti l-ewwel indikazzjoni tar-repetabbiltà tal-metodu nalitiku u ta' l-uniformità tal-proċedura ta' l-applikazzjoni għas-sustanza tat-test. L-irkupri fi stadji aktar tard ta' l-esperimenti huma mogħtija bil-bilanċi rispettivi tal-massa. L-irkupri għandhom ikunu fil-medda ta' minn 90 % sa 110 % tal-kimiċi ittikkettjati (8) u minn 70 % sa 110 % għal kimiċi mhux ittikkettjati (3).
         1.7.2.   Ir-repettabbiltà u s-sensittività tal-metodu analitiku
         Ir-repetabbilità tal-metodu analitiku (eskluża l-peffiċjenza ta' l-estrazzjoni inizjali) sabiex tkun kwantifikata s-sustanza tat-test u tat-trasformazzjoni tal-prodotti tista tkun verifikata b'analiżi dupplikata ta' l-istess estratt tal-ħamrija, inkubat għal tul ta' żmien biżżejjed għall-formazzjoni tat-trasformazzjoni tal-prodotti.
         Il-limitu ta' sejbien (limit of detection (LOD)) tal-metodu analitiku għas-sustanza tat-test u għat-trasformazzjoni tal-prodotti għandu jkun mill-anqas 0,01 mg.kg-1 ħamrija (bħala sustanza tat-test) jew 1& tad-doża applikata, liema minnhom hija l-anqas. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni (limit of quantification (LOQ)) għandu wkoll ikun speċifikat.
         1.7.3.   L-eżatezza tad-dettalji tat-trasformazzjoni
         Analiżi regressiva tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test bħala funzjoni tal-ħin, tagħti informazzjoni xierqa dwar l-affiddabbilità tal-kurva tat-trasformazzjoni u tippermetti il-kolkolu tal-limiti affidabbli ta' nofs-ħajjiet (fil-każ ta' psewdo kinetiċi ta' l-ewwel ordni) jew il-valuri DT50 u, jekk xieraq, il-valuri DT75 u DT90.
         1.8.   ID-DESKRIZZJONI TAL-METODU TAT-TEST
         1.8.1.   Apparat u reaġenti kimiċi
         Is-sistemi ta' l-inkubazzjoni jikkonsistu minn sistemi statiċi magħluqa jew sistemi xierqa ta' nixxija kontinwa (7)(17). Eżempji ta' l-apparat xieraq ta' nixxija kontinwa fil-ħamrija u l-garafina tat-tip-biometriku huma murija fil-Fihuri 1 u 2, rispettivament. Iż-żewġ tipi tas-sistemi ta' l-inkubazzjoni għandhom vantaġġi u limitazzjonijiet (7)(17).
         Apparat normali tal-laboratorju huwa meħtieġ, u speċjalment dan li ġej:
         
                     —
                  
                  
                     Strumenti analitiċi bħal ma huma l-apparat GLC, HPLC, TLC, inklużi s-sistemi xierqa ta' sejbien għall-analiżi ta' sustanzi radjo-tikketta jew mhux-tikketta jew metodu tat-trattib ta' l-iżotopi inversi;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Strumenti għall-iskopijiet ta' l-identifikazzjoni (eż. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR, eċċ.);
                  
               
                     —
                  
                  
                     Strument ta' l-għadd tal-likwidu xintillanti;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Ossidizzatur għall-kombustjoni tal-materjal radjo-attiv;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Ċentrifuga;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Apparat ta' l-estrazzjoni (per eżempju, tubi taċ-ċentrifuga għal estrazzjoni fil-kiesaħ u apparat Soxhlet għal estrazzjoni kontinwa taħt ir-refluss);
                  
               
                     —
                  
                  
                     Strumentazzjoni għall-konċentrazzjoni tat-taħlitiet u l-estratti (eż. evaporator rotanti);
                  
               
                     —
                  
                  
                     Banju ta' l-ilma;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Apparat mekkaniku tat-taħlit (eż. maagna li tagħġen, ħallati rotanti).
                  
               Ir-reaġenti kimiċi użati jinklusu, per eżempju:
         
                     —
                  
                  
                     NaOH, grad analitiku, 2 mol . dm-3, jew bażi oġra xierqa (eż. KOH, ethanolamine);
                  
               
                     —
                  
                  
                     H2SO4,, grad analitiku, 0,05 mol . dm-3;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Ethylene glycol, grad analitiku;
                  
               
                     —
                  
                  
                     aterjali solidi ta' l-assorbazzjoni bħal ma huma l-ġir tas-soder u l-buqi tal-polyurethane;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Solventi organiċi, grad analitiku, bħal ma hu l-aċetun, il-metanol, eċċ.;
                  
               
                     —
                  
                  
                     Likwidu tax-xintillazzjoni.
                  
               1.8.2.   L-applikazzjoni tas-sustanza tat-test
         Għal żieda ma, u d-distribuzzjoni fil-ħamrija, is-sustanza tat-test tista tkun imdewwba fl-ilma (deonizzat jew distillat) jew, meta meħtieġ, f'ammonti minimi ta' aċetun jew solventi organiċi oħrajn (6) li fihom is-sustanza tat-test tkun tinħall u stabbli b'mod suffiċjenti. B'dana kollu, l-ammont ta' solvent magħżul m'għandux ikollu influwenza sinifikanti fuq l-attività mikrobjali tal-ħamrija (ara s-sezzjonijiet 1.5 u 1.9.2-1.9.3) L-użu ta' solventi li jfixklu l-attività mikrobjali, bħal ma huma l-kloroform, id-diklorometanju u solventi ħaloġenizzati oħrajn, għandu jkun evitat.
         Is-sustanza tat-test tista wkoll tkun miżjuda bħala solidu, eż. mħallta mar-ramel kwatrz (6) jek f'test żgħir ta' sub-kampjun tal-ħamrija li tkun ġiet imnixxfa fl-arja u sterilizzata. Jekk is-sustanza tat-test hija miżjuda bl-użu ta' solvent, is-solvent għandu jkun imġolli li jevapora qabel ma s-sub-kampjun hekk miżjud ikun imħallat mal-kampjun oriġinali mhux-sterili tal-ħamrija.
         Għal kimiċi ġenerali, li r-rotta maġġura tad-dħul tagħhom fil-ħamrija hija matul l-applikazzjoni tal-ħama' tad-drenaġġ/mill-ħmieġ ta' l-annimali, is-sustanza tat-test għandha l-ewwel tkun miżjuda mal-ħama' li imbagħad tkun miżjuda mal-kampjun tal-ħamrija. (ara s-sezzjonijiet 1.9.2 u 1.9.3)
         L-użu ta' prodotti formulati mhux, bħala rutina, rakkommandat. B'dana kollu, eż. għal sustanzi tat-test li ma tantx jinħallu, l-użu ta' materjal; formulat jista jkun alternattiva xierqa.
         1.8.3.   Il-ħamrija
         1.8.3.1.   L-għażla tal-ħamrija
         Għad-determinazzjoni tal-passaġġ tat-trasformazzjoni, ħamrija rapreżentattiva tista tkun użata' ħamrija grassa mrammla jew ħamrija grassa bil-ħama' jew ħamrija grassa jew ramel grass (skond il-klassifikazzjoni FAO u USDA 18) bi pH ta' 5,5-8,0, kontenut karboniku organiku ta' 0,5-2,5 % u biomassa mikrobjali ta' mill-anqas 1 % tal-karbonju organiku totali hija rakkommandata (10).
         Għall-istudji tar-rata tat-trasformazzjoni mill-anqas tlett żidiet tal-ħamrija għandhom ikunu wżati li jirrapreżentaw medda ta' ħamrija relevanti. Il-ħamrija għandha tvarja fil-kontenut karboniku organiku, pH, kontenut tat-tafal u l-biomassa mikrobjali (10).
         Il-ħamrija kollha għandha tkun karatterizzata, mill-anqas, għal tiswir ( % ramel, % ħama', % tafal) (skond il-klassifikazzjoni FAO u ESDA (18)), pH, kapaċità ta' skambju tal-jonji, karbonju organiku, densità tal-massa, karatteristiċi taż-żamma ta' l-ilma [2] (20)u l-bijomassa mikrobjali (biss għal studju erobiċi). Informazzjoni addizzjonali dwar il-propjetajiet tal-ħamrija jistgħu ikunu utili fl-interpretazzjoni tar-riżultati. Għad-determinazzjoni tal-karatteristiċi tal-ħamrija, il-metodi rakkommandati fir-referenzi (19) (20) (21) (22) (23) jistgħu ikunu wżati. Il-bijomassa mikrobjali għandha tkun determinata bl-użu tar-respirazzjoni indotta-fis-sub-strata (substrate-induced respiration (SIR)) il-metodu (25) (26) jew metodi alternattivi (20).
         1.8.3.2.   Ġbir, tqandil, u l-ħażna tal-ħamrija
         L-informazzjoni dettaljata dwar l-istorja tas-sit fl-għalqa minn fejn il-ħamrija tat-test hija miġburha għandha tkun disponibbli. Id-dettalji jinkludu l-lokalità eżatta, il-kisi veġitali, id-dati tat-trattament bil-prodotti tal-protezzjoni tal-pjanti, it-trattamenti b'fertilizzanti organiċi u mhux-organiċi, żidiet ta' materjali bioloġiċi jew kontaminazzjonijiet aċċidentali. Jekk il-ħamrija tkun ġiet ittrattata bis-sustanza tat-test jew bl-analogi strutturali tagħha matul l-erba' snin preċedenti, dawn m'għandhomx ikunu użati għall-istudji tat-transformazzjoni (10) (15).
         Il-ħamrija għandha tkun miġbura friska mill-għalqa (mill-orizzont A jew mis-saff tal-wiċċ f'20 cm) b'kontenut ta' l-ilma fil-ħamrija li jiffaċilita l-għarbiel. Għal ħamrija oħra apparti milli dik mistgħadra, il-kampjunar għandu jkun evitat matul, jew immedjetament wara, perijodi twal (> 30 jum) ta' nixfa, ġlata jew mifqugħa bl-ilma (14). Il-kampjuni għandhom ikunu trasportati b'manjera li tnaqqas it-tibdiliet fil-kontenut ta' l-ilma fil-ħamrija u għandhom jinżammi fid-dlam b'aċċess liberu ta' arja, kemm jista jkun possibbli. Borża tal-plastik, kemm xejn marbuta, hija ġeneralment adekwata għal dan l-iskop.
         Il-ħamrija għandha tkun proċessata malajr kemm jista jkun possibbli wara l-kampjunar. Veġitazzjoni, fawna kbira tal-ħamrija u ġebel għandhom ikunu mneħħija qabel ma l-ħamrija tkun mogħddija minn għarbiel ta' 2 mm li jneħħli ġebel żgħar, fawna u l-frak tal-pjanti. Tnixxif estensiv u t-tisħiq tal-ħamrija, qabel l-għarbiel, għandhom ikunu evitati (15).
         Meta il-kampjunar fil-għalqa jkun diffiċli fix-xitwa (il-ħamrija iffriżta jew koperta f'saffi ta' borra), din għandha tinġabar mil-ħamrija tal-lott maħżuna f'serra b'koperta ta' pjanti (eż. ħaxix jew taħlita ta' ħaxix u silla) L-istudji bil-ħamrija miġbura friska mill-għalqa huma ferm prefereuti, imma jekk il-ħamrija miġbura u ipproċessata ikunu tiġi maħżuna qabel il-bidu ta' l-istudju, il-kondizzjonijiet tal-ħażna għandhom ikunu adekwati u biss għal-limitu ta' żmien (4 ± 2 oC għal massimu ta' tlett xhur) sabiex jinżamm l-attività mikrobjali (21) 1. Struzzjonijiet dettaljati dwar il-ġbir, it-tqandil u l-ħażna tal-ħamrija, li għandha tkun użata fl-esperimenti tal-biotrasformazzjoni, jistgħu jinstabu fi (8) (10) (15) (26) (27).
         Qabel ma l-ħamrija ipproċċessata tkun użata f'dan it-test, din għandha tkun l-ewwel inkubata sabiex tippermetti l-ġerminazzjoni u t-tneħħija taż-żrieragħ, u sabiex ikun stabbilit mill-ġdid l-ekwilibriju tal-metaboliżmu mikrobjali bħala segwiment tal-kambju mill-kampjunar jew mill-kondizzjonijiet tal-ħażna lejn il-kondizzjonijiet ta' l-inkubazzjoni. Perijodu ta' qabel l-inkubazzjoni ta' bejn 2 u 28 jum, li jqarreb it-temperatura u l-kondizzjonijiet ta' l-umidità tat-test attwali huma ġeneralment adekwati (15).Iż-żmien tal-ħażna u ta' qabel l-inkubazzjoni, flimkien, m'għandhomx jeċċedu t-tlett xhur.
         1.9.   L-IMĠIEBA TAT-TEST
         1.9.1.   Kondizzjonijiet tat-test
         1.9.1.1.   Temperatura tat-test
         Matul il-perijodu kollu tat-test, il-ħamrija għandha tkun inkubata fid-dlam f'temperatura kostanti li tirrapreżenta l-kondizzjonijiet klimatiċi ta' fejn l-użu jew ir-rilaxx ikun sejjer iseħħ. Temperatura ta' 20 ± 2 oC hija rakkommandata għas-sustanzi kollha tat-test li jistgħu jilħqu t-temperatura klimatika tal-ħamrija. It-temperatura għandha tkun sorveljata.
         Dwar il-kimiċi applikati jew rilaxxati fi klimi kesħin (eż. pajjiżi tat-tramunta, matul il-perijodi tal-ħarifa/xitwa), kampjuni addizzjonali tal-ħamrija għandhom ikunu inkubati imma f'temperatura aktar baxxa (eż. 10 ± 2 oC).
         1.9.1.2.   Il-kontenut ta' l-umidità
         Għat-testijiet tat-trasformazzjoni permezz tal-kondizzjonijiet erobiċi, il-kontenut ta' l-umidità tal-ħamrija (22) 2għandu jkun aġġustat lejn u miżmum fi pF bejn 2,0 u 2,5 (3). Il- kontenut ta' l-umidità fil-ħamrija huwa espress bħala massa ta' l-ilma għal kull massa ta' ħamrija xotta u għandu jkun ikkontrollat regolarment (eż. f'intevalli ta' ġimgħatejn) bl-użin fil-garafini ta' l-inkubazzjoni u t-talf ta' l-ilma kumpensdat biż-żieda ta' l-ilma (preferibbilment ilma tal-vit sterilizzat mill-filtru). Attenzjoni għandha tingħata sabiex ikunu prevenuti jew minimizzati t-telf tas-sustanza tat-test u/jew il-prodotti tat-trasformazzjoni bil-volatilizzazzjoni u/jew il-fotodegradazzjoni (jekk ikun hemm) matul iż-żieda ta' l-umidità.
         Għat-testijiet tat-trasformazzjoni fil-kondizzjonijiet anerobiċi u mistgħadra, il-ħamrija tkun saturata bl-ilma mfawwar.
         1.9.1.3.   Kondizzjonijiet ta' l-inkubazzjoni erobika
         Fis-sistimi tan-nixxija kontinwa, il-kondizzjonijiet erobiċi ikunu miżmuma bit-tlaħliħ intermittenti jew bil-ventilazzjoni kontinwa b'arja umidifikata. Fil-garafini biometriċi, skambju ta' l-arja jkun miżmum b'diffużjoni.
         1.9.1.4.   Kondizzjonijiet erobiċi sterili
         Sabiex tkun akkwistat l-informazzjoni dwar ir-releavanza tat-trasformazzjon abjotika tas-sustanza tat-test, kampjunu tal-ħamrija jistgħu ikunu sterilizzati (għall-metodi ta' l-isterilizzazzjoni ara r-referenzi 16 u 29), ittrattati bis-sustanza sterili tat-test (eż. żieda ta' taħlita matul filtru sterili) u mogħtija l-arja bl-użu ta' arja sterili umidifikata kif deskritt fis-sezzjoni 1.9.1.3, Għal ħamrija mistgħadra, ħamrija u ilma għandhom ikunu sterilizzati u l-inkubazzjoni għandha tkun imwettqa kif deskritt fis-sezzjoni 1.9.1.6.
         1.9.1.5.   Kondizzjonijiet ta' l-inkubazzjoni anerobika
         Sabiex ikunu stabbiliti l-kondizzjonijiet amerobiċi, il-ħamrija ittrattata mis-sustanza tat-test u unkubata fil-kondizzjonijiet erobiċi għal 30 jum jew għal ‘nofs-ħajja’ waħda jew DT50 (liema minnhom ikun l-iqsar) hija mbagħad mistgħadra fl-ilma (saff ta' 1-3 cm ilma) u s-sistema ta' l-inkubazzjoni mlaħilħa b'gass inert (eż. nitroġenu jew argonu) (23) 3. Is-sistema tat-test għandha tippermetti l-kejl bħal ma huma pH, konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu u l-potenzal redox u tinkludi l-apparati tan-nassa għal prodotti volatili. Sistema tat-tip biometrika għandha tkun magħluqha sabiex tevita id-dħul ta' l-arja bid-diffużjoni.
         1.9.1.6.   Kondizzjonijiet ta' l-ikubazzjoni fil-mistgħadar
         Sabiex tkun studjata t-trasformazzjoni tal-ħamrija fl-għelieqi mistgħadra tar-ross, il-ħamrija tkun mifquha fl-ilma b'saff ta' madwar 1-5 cm u s-sustanza tat-test tkun applikata mal-fażi ta' l-ilma (9). Ħamrija b'fond ta' mill-anqas 5 cm hija rakkomandabbli. Is-sistema hija ventilata bl-arja permezz tal-kondizzjonijiet erobiċi, il-pH, il-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu u l-potenzal tar-redox fis-saff akweju għandhom ikunu sorveljati u irraportati. Perijodu ta' pre-inkubazzjoni ta' mil anqas ġimghatejn huwa meħtieġ qabel ma jibdew l-istudji tat-trasformazzjoni (ara s-sezzjoni 1.8.3.2).
         1.9.1.7.   It-tul tat-test
         Ir-rata u l-passaġġ ta' l-istudji għandhom normalment ma jeċċedux 120 jum (24) 4(3) (6) (8), minħabba li wara dan, tnaqqis fl-attività mikrobjali tal-ħamrija mal-mogħdija taż-żmien tkun mistennija f'sistema artifiċjali tal-laboratorju li tkun iżolata mit-tiġdid naturali. Meta meħtieġ għall-karatterizzazzjoni tat-tnaqqis fis-sustanza tat-test u fil-formazzjoni u t-tnaqqis tal-prodotti tat-trasformazzjoni maġġuri, l-istudji jistgħu ikomplu għal perijodi itwal (eż. 6 jew 12 il-xahar) (8). Perijodi itwal ta' inkubazzjoni għandhom ikunu ġustifikati fir-rapport tat-test u akkumpanjati bil-kejl tal-biomassa matul u fit-tmiem ta' dawn il-perijodi.
         1.9.2.   It-twettieq tat-test
         Madwar 50 sa 200 g ħamrija (piż xott bażiku) ikun imqiegħed f'kull garafina ta' l-inkubazzjoni (ara l-Figuri 1 u 2 fl-AŻnness 3) u l-ħamrija ittrattata bis-sustanza tat-test b'wieħed mill-metodi deskritti fis-sezzjoni 1.8.2. Meta s-solventi organiċi huma wżati għall-applikazzjoni tas-sustanza tat-test, dawn għandhom ikunu mneħħija mill-ħamrija bl-evaporazzjoni. Il-ħamrija tkun kompletament imħallta bi spatula u/jew biċ-ċekċik tal-garafina. Jekk l-istudju jkun imwettaq fil-kondizzjonijiet ta' għalqa mistgħadra, il-ħamrija u l-ilma għandhom ikunu mħallta sewwa wara l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. Siltiet żgħar (eż. 1 g) tal-ħamrija ittrattata għandhom ikunu analizzati għas-sustanza tat-test sabiex tkun verifikata distribuzzjoni uniformi. Għal metodu alternattiv, ara hawn taħt.
         It-trattament għandu jkun jikorrespondi għall-għola rata ta' l-applikazzjoni tal-prodott għall-protezzjoni ta' l-uċuħ kif rakkommandat fl-istruzzjonijiet ta' l-użu u l-inkorporazzjoni uniformi sa fond xieraq fil-għalqa (eż. is-saff ta' fuq,10 cm (25) 5 tal-ħamrija). Per eżempju, għall-kimiċi tat-tħaddir jew tal-ħamrija applikati mingħajr inkorporazzjoni, il-fond xieraq għall-kalkolazzjoni ta' kemm kimika għandha tkun miżjuda ma kull garafina huwa 2,5 cm. Għal ħamrija inkorporata bil-kimiċi, il-fond xieraq huwa l-fond ta' l-inkorporazzjoni speċifikat fl-istruzzjonijiet ta' l-użu. Għal kimiċi ġenerali, ir-rata ta' l-applikazzjoni għandha tkun ikkalkolata fuq il-bażi tar-rotta l-aktar relevanti tad-dħul; per eżempju, meta r-rotta ewlenija tal-dħul fil-ħamrija hija mil-ħama' tad-drenaġġ, il-kimika għandha tkun dożata fil-ħama' f'konċentrazzjoni li tirrefletti l-konċentrazzjoni mistennija tal-ħama' u l-ammont ta' ħama' miżjud mal-ħamrija għandu jirrefletti t-tgħabija normali tal-ħama' mal-ħamrija agrikola. Jekk din il-konċentreazzjoni ma tkunx għola biżżejjed sabiex tidentifika l-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni, inkubazzjoni separata tal-kampjunu tal-ħamrija li jkun fiha rati għoljinm jista jkun ta' għajnuna, imma rati eċċessivi li jinfluwenzaw il-funzjonijiet mikrobjali għandhom ikunu evitati (ara s-sezzjonijiet 1.5 u 1.8.2).
         B'mod alternattiv, lott kbit (i.e. 1 sa 2 kg) ta' ġamrija jista jkun ittrattat bis-sustanza tat-test, imħalta bil-galbu f'magna xierqa tat-taħlit u imbagħad trasferita f'porzjonijiet żgħat ta' 50 sa 200 g fil-garafini ta' l-inkubazzjoni (per eżempju bl-użu tal-qsim tal-kampjun). Siltiet żgħar (eż. 1 g) tal-ħamrija ittrattata għandhom ikunu analizzati għas-sustanza tat-test sabiex tkun verifikata distribuzzjoni uniformi. Tali proċedura hija preferibbli la darba tippermetti għal aktar distribuzzjoni uniformi tas-sustanza tat-test fil-ħamrija.
         Ukoll, kampjuni mhux trattati huma inkubati permezz ta' l-istess kondizzjonijiet (erobiċi) bħall-kampjuni trattati bis-sustanza tat-test. Dawn il-kampjuni huma wżati għall-kejl tal-biomassa matul u fit-tmiem ta' l-istudji.
         Meta s-sustanza tat-test hija applikata mal-ħamrija mdewwba fl-solvent(i) organiċi, kampjuni tal-ħamrija ittrattat bl-istess ammont ta' solvent(i) huma inkubati bl-istess kondizzjonijiet (erobiċi) bħall-kampjuni ittrattati bis-sustanza tat-test. Dawn il-kampjuni huma wżati għall-kejl tal-biomassa, inizjalment, matul u fit-tmiem ta' l-istudji sabiex jivverifikaw l-effetti tas-solvent(i) fuq il-biomassa mikrobjali.
         Il-garafini li jkun fihom ħamrija ittratta huma jew imwaħħla mas-sistema tan-nixxija kontinwa deskritta fil-Figura 1 jew magħluqa mal-kolobba ta' l-assorbozzjoni murija fil-Figura 2 (ara l-Anness 3).
         1.9.3.   Kampjunar u kejl
         Garafini doppji ta' l-inkubazzjoni huma mneħħija fl-intervalli xierqa tal-ħin u l-kampjuni tal-ħamrija estratti bis-solventi xierqa ta' polarità differenti u analizzati għas-sustanza tatA = Ir-rata ta' applikazzjoni [kg.ha-1]; 1 = il-ħxuna tas-saff ta' ħamrija ta' l-għalqa [m]; d = dry bulk density tal-ħamrija [kg.m-3]. Bħala regola, rata ta' applikazzjoni ta' 1 kg.ha-1 tirriżulta f'konċentrazzjoni ta' ħamrija ta' bejn wieħed u ieħor 1 mg.kg-1 f'saff ta' 10 cm (jekk tassumi bulk density ta' 1 g . cm-3). test u/jew il-prodotti tat-trasformazzjoni. Studju iddisinjat sewwa jinkludi garafini suffiċjenti hekk li żewġ garafini jkunu sagrifikati f'kull darba tal-kampjunar. Ukoll, it-taħlitiet ta' l-assorbazzjoni jew il-materjali solidi ta' l-assorbazzjoni ikunu mneħħija f'intervalli varji tal-ħin (intervalli ta' sebat ijiet matul l-ewwel xhar u intervalli ta' 17 il-jum wara xhar) matul u fit-tmiem ta' l-inkubazzjoni ta' kull kampjun tal-ħamrija, u analizzati għall-prodotti volatili. Apparti mil-kampjun tal-ħamrija miġbur direttament wara l-applikazzjoni (jum 9 tal-kampjunar) mill-anqas 5 punti addizzjonali tal-kampjunar għandhom ikunu nklużi. L-intervalli taż-żmien għandhom ikunu magħżula b'tali mod li l-għamla tat-tnaqqis tas-sustanza tat-test u l-għamla tal-formazzjoni u t-tnaqqis tal-prodotti tat-trasformazzjoni jistgħu ikunu stabbiliti (eż. 0, 1, 3, 7 tijiem; 2, 3 ġimghat; 1, 3, 3 xhur, eċċ.).
         Meta jsir użu mis-sustanza tat-test tikkettjata-14C, radjoattività mhux-estrattibbli tkun kwantifikata bil-kombustjoni u l-bilanċ tal-massa tkun ikkalkolata għal kull intervall tal-kampjunar.
         Fil-każ ta' l-inkubazzjoni anerobika u mistgħadra, il-fażijiet tal-ħamrija u ta' l-ilma huma analizzati flimkien għas-sustanza tat-test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni jew separatament bil-filtrazzjoni jew biċ-ċentrifugazzjoni qabel l-estrazzjoni u l-analiżi.
         1.9.4.   Testijiet Opzjonali
         L-istudju erobiċi, mhux-sterili, f'temperaturi addizzjonali u umidità tal-ħamrija, jistgħu ikunu utili għall-kalkolu ta' l-influwenza tat-temperatura u l-umidità tal-ħamrija fuq ir-rati tat-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test u/jew il-prodotti tat-trasformazzjoni tagħha fil-ħamrija.
         Aktar karatterizzazzjoni tar-radjoattività mhux-estrattibbli tista tkun ipprovata bl-użu ta', per eżempju, estrazzjoni superfiċjali likwida.
         2.   DATA
         2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         L-ammonti tas-sustanza tat-test, tal-prodotti tat-trasformazzjoni, is-sustanżi volatili (fi % biss) u huma mhux-estrattibbli għandhom ikunu murija bħala % tal-konċentrazzjoni inizjalment applikata u, meta xieraq, bħala mg.kg-1 ħamrija (ibbażata fuq il-piż tal-ħamrija xorra) għal kull interval tal-kampjunar. Bilanċ tal-massa għandu jkun muri f'persentaġġ tal-konċentrazzjoni inizjalmeent applikata għal kull intervall tal-kampjunar. Preżentazzjoni grafika tal-konċentrazzjonijiet tas-susstanza tat-test kontra ż-żmien tkun tippermetti kalkolu tan-nofs-ħajja tat-trasformazzjoni tagħha jew DT50. Prodotti ta' trasformazzjoni maġġuri għandhom ikunu identifikati u l-konċentrazzjonijiet tagħhom għandhom ukoll ikunu pinġuti kontra ż-żmien sabiex juru r-rati tal-formazzjoni t-tnaqqis tagħhom. Prodott ta' trasformazzjoni maġġuri huwa kwalunkwe prodott li jirrapreżenta = 10 % tad-doża applikataa fi kwalunkwe waqt matul l-istudju.
         Il-prodotti volatili kin ingastati jagħtu xi indikazzjoni tal-potenzal volatili ta' sustanza tat-test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni tagħha mill-ħamrija.
         Determinazzjonijiet aktar eżatti ta' nofs-ħajja jew tal-valuri DT50 u, jekk xieraq, il-valuri DT75 u DT90 għandhom ikunu akkwistati bl-applikazzjoni xierqa tal-kalkoli bil-mudell kinetiku. Il-valuri ta' nofs-ħajja u DT50 għandhom ikunu irrappurtati flimkien mad-deskrizzjoni tal-mudell użat, l-ordni tal-kinetiċi u l-koeffiċjent tad-determinazzjoni (r2). Kinetiċi ta' l-ewwel ordni huwa preferutu, sakemm r2 < 0,7. Jekk xieraq, il-kalkoli għandhom ukoll ikunu applikati għall-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni. Eżempji ta' mudelli xierqa huma deskritti fir-referenzi 31 sa 35.
         Fil-każ ta' studji ta' rati mwettqa f diversi temperaturi, ir-rati tat-trasformazzjoni għandhom ikunu deskritti bħala funzjoni tat-temperatura fi ħdan il-medda tat-temperatura sperimentali bl-użu tar-relazzjoni Arrhenius, bil-formula:
         
             or ,
         Meta 1n A u B huma kostanti regrassivi mill-inteċessjoni u ż-żurżieqa, rispettivament, tal-linja ta' l-aħjar posizzjoni ġenerata minn regressjoni lineari 1n k kontra 1/T, k hija r-rata kostanti fit-temperatura t u T hija t-temperatura fi Kelvin. Attenzjoni għandha tingħata għall-medda limitata tat-temperatura li fiha ir-relazzjoni Arrehenius tkun valida fil-każ tat-trasformazzjoni li tkun irregolata bl-azzjoni mikrobjali.
         2.2.   EVALWAZZJONI U INTERPRETAZZJONI TAR-RIŻULTATI
         Għalkemm l-istudji huma mwettqa f'sistema artifiċjali tal-laboratorju, ir-riżultati jkunu jippermettu kalkolu tar-rata tat-traformazzjoni tas-sustanza tat-test u wkoll tar-rata tal-formazzjoni u tat-tnaqqis tal-prodotti tat-trasformazzjoni skond il-kondizzjonijiet fl-għalqa (36)(37).
         Studju tal-passaġġ tat-trasformazzjonni tas-sustanza tat-test jipprovdi informazzjoni dwar il-mezz li bih is-sustanza aapplikata hija strutturament mibdula fil-ħamrija bir-razzjoni kimika u mikrobjali.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi:
         
                      
                  
                  
                     Is-sustanza tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-isem komuni, l-isem kimiku, in-numru CAS, il-formula strutturali (bl-indikazzjoni tal-posizzjoni tat-tikketti meta materjal radjo-tikkettjat ikun użat) u l-propjetajiet fiżiċi-kemikali relevanti (ara s-sezzjoni 1.5);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-purità (l-impuritajiet) tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-purità tar-radjokimika tal-kimika tikkettjata u l-attività speċifika (meta xieraq);
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Sustanzi ta' referenza:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-isem kimiku u l-istruttura tas-sustanzi ta' referenza kif użati għall- karatterizzazzjoni u/jew l-identifikazzjoni tal-prodott tat-trasformazzjoni;
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Ħamrija tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 dettalji tas-sit tal-ġbir;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-data u l-proċedura tal-kampjunar tal-ħamrija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-proprjetajiet tal-ħamrija, bħalma huma l-pH, il-kontenut karbonju organiku, it- texture ( % ramel, % ħama, % tafal), cation exchange capacity, bulk density, il- karatteristika tar-ritenzjoni ta' l-ilma, u l-bijomass mikrobjali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 it-tul tal-ħażna tal-ħamrija u l-kondizzjonijiet tal-ħażna (jekk maħżuna);
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kondizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 id-dati tat-twettieq ta' l-istudji;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-ammont tas-sustanza tat-test applikata
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 is-solventi użati u l-metodu ta' l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-piż tal-ħamrija inizjalment ittrattata u kampjunata matul kull interval għall-analiżi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 deskrizzjoni tas-sistema użata għall-inkubazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 rati tan-nixxijiet ta' l-arja (għal sistemi biss ta' nixxija kontinwa);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 it-temperatura ta' l-apparat sperimentali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-kontenut ta' l-umidità tal-ħamrija matul l-inkubazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-biomassa mikrobjali inizjali, matul u fit-tmiem ta' l-istudji erobiċi;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pH, il-konċentazzjoni ta' l-ossiġenu u l-potenzal inizjali redox, matul u fit-tmiem ta' l-istudji erobiċi u tal-mistgħadar;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodu/i tal-estrazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 metodi għall-kwantifikazzjoni u l-identifikazzjoni tas-sustanza tat-test u tal-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni, fil-ħamrija u l-materjali ta' l- assorbazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-numru ta' replikati u n-numru ta' kontrolli.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 riżultat tad-determinazzjoni ta' l-attività mikrobjali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ir-repettabbilità u s-sensittività tal-metodi analitiċi wżati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ir-rati ta' l-irkupru ( % valuri għal studju validu huma mogħtija fis-sezzjoni 1.7.1);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ir-riżultati tat-tabelli espresssi fi % tad-doża inizjali applikata u bħala mg.kg-1 ħamrija (fuq il-bażi ta' piż xott);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-bilanċ tal-massa, matul u qrib it-tmiem ta' l-istudji;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-karatterizzazzjoni ta' radjoattivita (marbuta) mhux strattibbli jew tar-residwi fil-ħamrija;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kwantifikazzjoni tal-CO2 rilaxxat u ta' komposti volatili oħrajn;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 grafika tal-konċentrazzjonijiet tal-ħamrija versus is-sustanza tat-test u, meta xieraq, il-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-nofs-ħajja jew DT50 , DT75 u DT90 tas-sustanza tat-test u, meta xieraq, dwar il-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni li huma inklużi fil-limiti ta' l-affidibilità;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kalkolu tar-rata tad-degradazzjoni abjotika permezz ta' kondizzjonijiet sterili;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kalkolu tal-kinetiċi tat-trasformazzjoni għas-sustanza tat-test u, meta xieraq, il-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-passaġġi proponuti tat-trasformazzjoni, meta xieraq;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 diskussjoni u interpretazzjoni tar-riżultati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dettalji ġenerali (i.e. kromatogrammi tal-kampjun, kampjun tar-rati tal-kalkoli tat-trasformazzjoni u l-mezzi użati għall-identifikazzjoni tal-prodotti tat-traformazzjoni).
                              
                           
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     US-Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex II, Part A and Annex III, Part A: Fate and Behaviour in the Environment.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: Aerobic conditions.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil -Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984)
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981)
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     ISO 10381-6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Annex V to Dir. 67/548/EEC
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.
                  
               
                  
                     (24)
                  
                  
                     Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221.
                  
               
                  
                     (25)
                  
                  
                     ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of soil microbial biomass -Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.
                  
               
                  
                     (26)
                  
                  
                     Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.
                  
               
                  
                     (27)
                  
                  
                     Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105-120.
                  
               
                  
                     (28)
                  
                  
                     Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).
                  
               
                  
                     (29)
                  
                  
                     Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).
                  
               
                  
                     (30)
                  
                  
                     Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197-200.
                  
               
                  
                     (31)
                  
                  
                     Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
                  
               
                  
                     (32)
                  
                  
                     Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.
                  
               
                  
                     (33)
                  
                  
                     Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In ‘Environmental Dynamics of Pesticides’. R. Haque and V.H. Freed, Eds., 135-172.
                  
               
                  
                     (34)
                  
                  
                     Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz -Nachrichten Bayer 39, 188-204.
                  
               
                  
                     (35)
                  
                  
                     Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 47-60.
                  
               
                  
                     (36)
                  
                  
                     Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.
                  
               
                  
                     (37)
                  
                  
                     Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 83-122.
                  
               
            ANNESS I
            TENSJONI TA' L-ILMA, KAPAĊITÀ TA' L-GĦALQA (FC) U L-KAPAĊITÀ TAŻ-ŻAMMA TA' L-ILMA (WHC) (26)
            
            
                        L-għoli tal-kolonna ta' l- ilma
                        [cm]
                     
                     
                        pF (5)
                        
                     
                     
                        bar (6)
                        
                     
                     
                        Rimarki
                     
                  
                        107
                        
                     
                     
                        7
                     
                     
                        104
                        
                     
                     
                        Ħamrija xotta
                     
                  
                        1,6  · 104
                        
                     
                     
                        4,2 
                     
                     
                        16
                     
                     
                        Il-punt tal-mitbiela
                     
                  
                        104
                        
                     
                     
                        4
                     
                     
                        10
                     
                     
                         
                     
                  
                        103
                        
                     
                     
                        3
                     
                     
                        1
                     
                     
                         
                     
                  
                        6· 102
                        
                     
                     
                        2,8 
                     
                     
                        0,6 
                     
                     
                         
                     
                  
                        3,3  · 102
                        
                     
                     
                        2,5 
                     
                     
                        0,33  (7)
                        
                     
                     
                        Il-medda tal
                        kapaċità ta' l-għalqa (8)
                        
                     
                  
                        102
                        
                     
                     
                        2
                     
                     
                        0,1 
                     
                  
                        60
                     
                     
                        1,8 
                     
                     
                        0,06 
                     
                  
                        33
                     
                     
                        1,5 
                     
                     
                        0,033 
                     
                  
                        10
                     
                     
                        1
                     
                     
                        0,01 
                     
                     
                        WHC (approsimazzjoni)
                     
                  
                        1
                     
                     
                        0
                     
                     
                        0,001 
                     
                     
                        Ħamrija mistgħadra bl-ilma
                     
                  
               It-tenzjoni ta' l-ilma hija mkejla fi cm tal-kolonna ta' l-ilma jew fi bar. Minħabba il-medda kbira tat-tenzjoni tal-ġbid, din hija espressa sempliċement bħala valur pF li huwa ekwivalenti għal-logaritmu ta' cm kolonna ta' l-ilma.
            
               Il-kapaċità ta' l-għalqa hija definita bħala l-ammont ta' ilma li jista jkun maħżun kontra l-gravità minn ħamrija naturali, jumejn wara l-itwal perijodu ta' xita jew wara irrigazzjoni suffiċjenti hija determinata f'ħamrija mhux imqallba, in situ fil-għalqa. Il-kejl hu b'hekk mhux applikabbli għall-kampjuni tal-ħamrija imqallba fil-laboratorju. Il-valuri FC li jkunu determinati f'ħamrija mqallba jistgħu juru varjazzjonijiet sistematiċi kbar.
            
               Il-kapaċità taż-żamma ta' l-ilma (Water holding capacity (WHC)) hija determinata fil-laboratorju b'ħamrija mqallba u mhux imqallba bis-saturazzjoni ta' kolonna ħamrija bl-ilma bit-trasport kapillari. Huwa partikolarment utili għal ħamrija mqallba u jista jkun sa 30 % akbar mill-kapaċità ta' l-għalqa (1) Huwa wkoll, b'mod sperimentali, aktar faċli li jkunu determinati b'mod affidabbli l-valuri FC.
            Noti
         
         
            ANNESS 2
            KONTENUTI TA' L-UMIDITÀ FIL-ĦAMRIJA (g ilma kull 100 g ħamrija xotta) TAD-DIVERSI TIPI TA' ĦAMRIJA MINN PAJJIŻI VARJI
            
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        Soil
                     
                  
                        Umidità fil-ħamrija Kontenut fi Tip tal-ħamrija
                     
                     
                        skond il-pajjiż
                     
                  
                         
                     
                     
                         
                     
                     
                        WHC
                     
                     
                        pF = 1,8 
                     
                     
                        pF = 2,5 
                     
                  
                        Ramel
                     
                     
                        Ġermanja
                     
                     
                        28,7 
                     
                     
                        8,8 
                     
                     
                        3,9 
                     
                  
                        Ramel Tafli
                     
                     
                        Ġermanja
                     
                     
                        50,4 
                     
                     
                        17,9 
                     
                     
                        12,1 
                     
                  
                        Ramel Tafli
                     
                     
                        Żvizzera
                     
                     
                        44,0 
                     
                     
                        35,3 
                     
                     
                        9,2 
                     
                  
                        Ħama' taflija
                     
                     
                        Żvizzera
                     
                     
                        72,8 
                     
                     
                        56,6 
                     
                     
                        28,4 
                     
                  
                        Tafal biċ-ċappa
                     
                     
                        Brażil
                     
                     
                        69,7 
                     
                     
                        38,4 
                     
                     
                        27,3 
                     
                  
                        Tafal biċ-ċappa
                     
                     
                        Ġappun
                     
                     
                        74,4 
                     
                     
                        57,8 
                     
                     
                        31,4 
                     
                  
                        Tafal imrammel
                     
                     
                        Ġappun
                     
                     
                        82,4 
                     
                     
                        59,2 
                     
                     
                        36,0 
                     
                  
                        Ħama' taflija
                     
                     
                        USA
                     
                     
                        47,2 
                     
                     
                        33,2 
                     
                     
                        18,8 
                     
                  
                        Tafal imrammel
                     
                     
                        USA
                     
                     
                        40,4 
                     
                     
                        25,2 
                     
                     
                        13,3 
                     
                  
         
            ANNESS 3
            Figura 1
            Eżempju ta' apparat flow-through għall-istudju tat-trasformazzjoni tal-kemikali fil-ħamrija
                   (27)
                   (28)
               
            
            Figura 2
            Eżempju ta' garaffina tat-tip biometer għall-istudju tat-trasformazzjoni tal-kemikali fil-ħamrija
                   (29)
               
            
            
         C.24.   TRASFORMAZZJONI EROBIKA U ANEROBIKA FIS-SEDIMENT TAS-SISTEMI AKWATIĊI
         1.   METODU
         Dan il-Metodu tat-Test huwa replika għal OECD TG 308 (2002)
         1.1.   INTRODUZZJONI
         Il-kimiċi jistgħu jidħlu fl-ilmijiet tal-wiċċ, kemm baxxi u kemm fil-fond b'tali rotat bħala applikazzjoni diretta, skular tat-tbexxix, skular, soffija, drenaġġ, disposizzjoni ta' l-iskart, industria, effluwent domestiku jew agrikolu u d-deposizzjoni atmosferika. Dan il-Metodu ta' test jiddeskrivi l-metodu tal-laboratorju sabiex jassessja t-trasformazzjoni erobika u anerobika tal-kimiċi organiċi fis-sistema tas-sediment akwatiku. Dan il-Metodu tat-test huwa ibbażat fuq Linji ta' Gwida eżistenti (1) (2) (3) (4) (5) (6). Laqgħa ta' Ħidma tal-OECD dwar l-Għażla tal-Ħamrija/Sediment li nżammet f'Belgirate, l-Italja, fil-1955 (7) qablet dwar in-numru u t-tip ta' ħamrija għall-użu f'dan it-test. Il-Laqgħa ta' Ħidma kienet ukoll għamlet rakkommandazzjonijiet li jirrigarjaw il-ġbir, it-tqandil u l-ħażna tal-kampjuni tal-ħamrija, ibbażari fuq il-Linja ta' Gwida ISO (8). Tali studji huma meħtieġa għall-kimiċi li huma direttament applikati fil-ħamrija jew li huma pjuttost li jilħqu l-ambjent tal-ħamrija.
         Il-kondizzjonijiet fis-sistemi tas-sedeiment akwatiku naturali ta' spiss huma erobiċi fil-fażi ta' l-ilma tal-wiċċ. Is-saff tal-wiċċ tas-sediment jista jkun jew erobiku jew anerobiku, waqt li sediment aktar fond, normalment ikun anerobiku. Sabiex ikunu inklużi dawn il-possibbiltajiet kollha, iż-żewġ testijiet erobiċi u anerobiċi huma deskritti f'dan id-dokument. It-test erobiku jistimula kolonna erobika ta' l-ilma fuq saff ta' sediment erobiku li jkun fil-qiegħ b'xaqliba anerobika. It-test anerobiku jistimula sistema kompleta tas-sediment-ta'-l-ilma anerobiku. Jekk iċ-ċirkostanzi jindikaw li huwa meħtieġ li jkun hemm devjazzjoni sinifikanti minn dawn ir-rakommandazzjonijiet, per eżempju bl-użu tal-qalba tas-sediment jew tas-sedimenti li jistgħu kienu ġew esposti għas-sustanza tat-test, metodi oħrajn huma disponibbli għal dan l-iskop (9).
         1.2.   DEFINIZZJONIJIET
         Standard International (SI) units (unitajiet tan-Norma Internazzjonali) għandhom ikunu wżati fi kwalunkwe każ.
         
            Is-sustanza tat-test: Kwalunkwe sustanza, sew jekk kompost oriġinali jew il-prodotti relevanti tat-trasformazzjoni.
         
            Prodotti tat-trasformazzjoni: Is-sustanzi kollha li jirriżultaw mir-reazzjonijiet tat-trasformazzjoni biotiċi jew abiotiċi tas-sustanza tat-test, inklużi iċ-CO2 u l-prodotti li huma marbuta mar-residwi.
         
            Residwi marbuta: ‘Residwi marbuta’ tirrapreżemnta komposti fil-ħamrija, pjanti jew annimali, li jippersistu fil-matriċi fil-għamla ta' sustanza oriġinali jew tal-prodotti metaboliti/trasformazzjoni wara l-estrazzjoni. Il-metodu ta' l-estrazzjoni m'għandux sostanzjalment jibdel il-komposti nfushom jew l-istruttura tal-matriċi. In-natura tar-rabta tista tkun kjarifikata parzjalment bil-metodi ta' l-estrazzjoni tat-tibdil-tal-matriċi u b'tekniċi analitiċi sofistikati. Sal-lum, per eżempju, ir-rabtiet kovalenti joniċi u sorptivi, kif ukoll l-ingassar, kienu ġew identifikati b'dan il-mod. Ġeneralment, il-formazzjoni tar-residwi marbuta tnaqqas il-bioaċċessibbiltà u l-biodisponabbiltà sinifikament (10) (Modifikati minn IUPAC 1984 (11)).
         
            Trasformazzjoni erobika: (ossidazzjoni): Reazzjonijiet li jseħħu fil-preżenza ta' l-ossiġenu molekulari (12).
         
            Trasformazzjoni anerobika: (tnaqqis): Reazzjonijiet li jseħħu fl-esklużjoni ta' l-ossiġenu molekulari (12).
         
            Ilmijiet naturali: Huma l-ilmijiet tal-wiċċ akkwistati min għadajjar, xmajjar, nixxijat, eċċ.
         
            Sediment: Hija taħlita ta' kostitwenti kimiċi minerali u organiċi, dawn ta' l-aħħar ikun fihom komposti ta' kontenut għoli tal-karbonju u n-nitroġenu u ta' piżijiet molekulari għoljin. Dan huwa depożitat b'ilma naturali u jifforma interfażi ma dak l-ilma.
         
            Mineralizzazzjoni: Hija d-degradazzjoni kompleta ta' kompost organiku lejn CO2, H2O permezz tal-kondizzjonijiet erobiċi, u CH4, CO2 u H2O permezz tal-kondizzjonijiet anerobiċi. Fil-kuntest ta' dan il-metodu tat-test, meta kompost bit-tikketta-14C ikun użat, il-mineralizzazzjoni tfisser dehradazzjoni estensiva li matula atomu tal-karbonu tikkettjat ikun ossidizzat bil-rilaxx ta' l-ammont xieraq ta' 14CO2 jew 14CH4
         
         
            Half-life t0,5, huwa l-ħin meħtieġ għal 50 % trasformazzjoni tas-sustanza tat-test meta t-trasformazzjoni tista tkun deskritta bil-kinetiċi ta' l-ewwel ordni; din hija independenti mill-konċentrazzjoni.
         
            DT
            
               50
            
            (Għibien Ħin 50): Huwa l-ħin li matulu l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 50 %.
         
            DT
            
               75
            
            (Għibien Ħin 75): Huwa l-ħin li matulu l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 75 %.
         
            DT
            
               90
            
            (Għibien Ħin 90): Huwa l-ħin li matulu l-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test hija mnaqqsa bi 90 %.
         1.3.   SUSTANZI TA' REFERENZA
         Is-sustanzi ta' referenza għandhom ikunu wżati għall-karetterizzazzjoni u/jew l-identifikazzjoni tat-trasformazzjoni tal-prodotti bil-metodi spektroskopiċi u kromatografiċi.
         1.4.   INFORMAZZJONI DWARIS-SUSTANZATAT-TEST
         Sustanza tat-test mhux-ittikkettjata jew ittikkettjata tista tkun użata sabiex tkejjel ir-rata tat-trasformazzjoni, għalkemm materjal tikkettjat huwa preferut. Il-materjal tikkettjat huwa meħtieġ għall-istudju tal-passaġġ tat-trasformazzjoni u sabiex ikun stabbilit il-bilanċ tal-massa. Tikkettjar-14C huwa rakkomandat imma l-użu ta' iżotopi oħrajn bħal ma huma 13C, 15N, 3H, 32P, jistgħu wkoll ikunu utili. Sa kemm huwa possibbli, it-tikketta għandha tkun imqiegħda fil-parti(jiet) l-aktar stabbli tal-molekolu (30) 6. Il-Purità tal-kimika u/jew tar-radjo-kimika tas-sustanza tat-test għandha tkun mill-anqas 95 %.
         Qabel jitwettaq it-test, l-informazzjoni li ġejja, dwar is-sustanza tat-test, għandha tkun disponibbli:
         
                     (a)
                  
                  
                     solubilità fl-ilma (il-Metodu A.6);
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     solubilità f'solventi organiċi;
                  
               
                     (ċ)
                  
                  
                     pressjoni tal-fwar (il-Metodu A.4) u l-liġi kostanti Henry;
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     il-koeffiċjent tal-qsim n–oktano/ilma (il-Metodu A.8);
                  
               
                     (e)
                  
                  
                     koeffiċjent ta' l-adsorbazzjoni (Kd, Kf jew Koc, meta xieraq) (il-Metodu C.18);
                  
               
                     (f)
                  
                  
                     idrolisi 9il-Metodu C.7);
                  
               
                     (g)
                  
                  
                     kostant tad-disassoċjazzjoni (pKa) (Linja ta' Gwida OECD 112) (13);
                  
               
                     (h)
                  
                  
                     struttura kemikali tas-sustanza tat-test u l-posizzjoni tat-tikketta(i)-iżotpika, jekk applikabbli.
                  
               
            Nota: It-temperatura li fiha dawn il-kejl kienu saru għandha tkun rappurtata.
         Informazzjoni utili oħra tista tinkludi dettalji dwar it-tossiċità tas-sustanza tat-test fuq il-mikroorganiżmi, dettalji diġa disponibbli u/jew biodegradabbiltà inerenti, u dettalji dwar trasformazzjoni erobika u anerobika fil-ħamrija.
         Il-metodi analitiċi (inklużi l-metodi ta' l-estrazzjoni u tat-tindif) għall-kwantifikazzjoni u l-identifikazzjoni tas-sustanza tat-test u tat-traformazzjoni tal-prodotti tagħha, għandhom ikunu disponibbli.
         1.5.   IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TAT-TEST
         Il-metodu deskritt f'dan it-test jutilizza sistema tas-sediment akwatiku erobiku u anerobiku (ara l-Anness 1) li tippermetti:
         
                     (i)
                  
                  
                     il-kejl tar-rata tat-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test f'sistema ta' sediment ta' l-ilma,
                  
               
                     (ii)
                  
                  
                     il-kejl tar-rata tat-trasformazzjoni tas-sustanza tat-test fis-sediment,
                  
               
                     (iii)
                  
                  
                     il-kejl tar-rata tal-mineralizzazzjoni tas-suistanza tat-test u/jew il-prodotti tat-trasformazzjoni tagħha (meta tikkettjata-C14, is-sustanza tat-test hija użata),
                  
               
                     (iv)
                  
                  
                     l-identifikazzjoni u l-kwantifikazzjoni tal-prodotti tat-trasformazzjoni fil- fażijiet ta' l-ilma u tas-sediment, inkluż il-bilanċ tal-massa (meta sustanza tat-test, tikkettjata, tkun użata),
                  
               
                     (v)
                  
                  
                     il-kejl tad-distrubuzzjoni tas-sustanza tat-test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni tagħha bejn iż-żewġ fażijiet matul perijodu ta' l-inkubazzjoni fid-dlam (sabiex ikun evitat, per eżempju, it-tnibbit ta' l-alga) f'temperatur kostanti. Il-valuri nofs-ħajja, DT50, DT75 and DT90 huma determinati meta l-informazzjoni hekk teħtieġ, imma m'għandhiex tkun estrapolata wisq lura lejn perijodu sperimentali (ara s-sezzjoni 1.2).
                  
               Mill-anqas żewġ sedimenti u l-imijiet assoċċjati tagħhom huma meħtieġa għaż-żewġ studji erobiċi u anerobiċi rispettivament 97). B'dana kollu, jista jkun hemm każi meta aktar minn żewġ sedimenti għandhom ikunu wżati, per eżempju, dwar kimika li tista tkun preżenti f'ambjenti ta' l-ilma frisk u/jew marini.
         1.6.   L-APPLIKABBILTÀ TAT-TEST
         Il-metodu huwa applikabbli għas-sustanzi kimiċi kollha (mhux ittikkettjati jew radjotikkettjati) li dwarhom metodu analitiku b'eżattezza u sensittività suffiċjenti huma disponibbli. Dan huwa applikabbli għal komposti kemm xejn volatili, mhux volatili, li jinħallu fl-ilma jew li ma jinħallux fl-ilma. It-test m'għandux ikun applikat lejn kimiċi li huma ferm volatili minn ġewwa l-ħamrija (eż., fumiganti, solventi organiċi) u għalhekk ma jistgħux jinżammu fil-ħamrija skond il-kondizzjonijiet sperimentali ta' dan it-test.
         Dan il-metodu kien ġie applikat, s'issa, sabiex jistudja t-trasformazzjoni f'ilma frisk u sedimenti, imma l-prinċipju jista wkoll ikun applikat għal sistemi estwarini/marini. Dan mhux adattat biex jistimu kondizzjonijiet f'ilma mexxej (eż. xmajjar) jew fil-baħar miftuħ.
         1.7.   KRITERJA TAL-KWALITÀ
         1.7.1.   Irkupru
         L-estrazzjoni u l-analiżi ta', mill-anqas, nofs il-kampjunu duplikati ta' l-ima u tal-ħamrija, wara ż-żieda tas-sustanza tat-test, tagħti l-ewwel indikazzjoni tar-repetabbiltà tal-metodu analitiku u ta' l-uniformità tal-proċedura ta' l-applikazzjoni għas-sustanza tat-test. L-irkupri fi stadji aktar tard ta' l-esperimenti huma mogħtija bil-bilanċi rispettivi tal-massa (meta materjal tikkettjat ikunu wżat). L-irkupri għandhom ikunu fil-medda ta' minn 90 % sa 110 % tal-kimiċi ittikkettjati (6) u minn 70 % sa 110 % għal kimiċi mhux ittikkettjati.
         1.7.2.   Ir-repettabbiltà u s-sensittività tal-metodu analitiku
         Ir-repetabbilità tal-metodu analitiku (eskluża l-peffiċjenza ta' l-estrazzjoni inizjali) sabiex tkun kwantifikata s-sustanza tat-test u tat-trasformazzjoni tal-prodotti tista tkun verifikata b'analiżi dupplikata ta' l-istess estratt tal-ħamrija, inkubat għal tul ta' żmien biż-żejjed għall-formazzjoni tat-trasformazzjoni tal-prodotti.
         Il-limitu ta' sejbien (limit of detection (LOD)) tal-metodu analitiku għas-sustanza tat-test u għat-trasformazzjoni tal-prodotti għandu jkun mill-anqas 0,01 mg.kg-1ħamrija (bħala sustanza tat-test) jew 1 % tad-doża applikata, liema minnhom hija l-anqas. Il-limitu tal-kwantifikazzjoni (limit of quantification (LOQ)) għandu wkoll ikun speċifikat.
         1.7.3.   L-eżatezza tad-dettalji tat-trasformazzjoni
         Analiżi regressiva tal-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test bħala funzjoni tal-ħin, tagħti informazzjoni xierqa dwar l-affiddabbilità tal-kurva tat-trasformazzjoni u tippermetti il-kolkolu tal-limiti affidabbli ta' nofs-ħajjiet (fil-każ ta' psewdo kinetiċi ta' l-ewwel ordni) jew il-valuri DT50 u, jekk xieraq, il-valuri DT75 u DT90
         
         1.8.   DESKRIZZJONI TAL-METODU
         1.8.1.   Sistema u apparat tat-test
         L-istudju għandu jkun jkun imwettaq fl-kontenuturi tal-ħġieġ (eż. flixkien, tubi taċ-ċentrifuga), sakemm informazzjoni preliminari (bħal ma huwa l-koeffiċjent tal-qasmi n-oktanol-ilma, id-dettaltji tas-sopzjoni, eċċ.) tkun tindika li s-sustanza tat-test tista tkun teħel mal-ħġieġ, f'liema każ, materjal alternattiv (bħala ma hu t-teflon) għandu mnejn ikun ikkonsidrat. Meta s-sustanza tat-test hija magħrufa li teħel mal-ħġieġ, jista jkun possibbli li titnaqqas din il-problema bl-użu ta' wieħed jew aktar minn dawn il-metodi li ġejjin:
         
                     —
                  
                  
                     iddetermina l-massa tas-sustanza tat-test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni kif sorbiti mal-ħġieġ;
                  
               
                     —
                  
                  
                     assigura ħasla bis-solvent ta' l-oġġetti kollha tal-ħġieġ fit-tmiem tat-test;
                  
               
                     —
                  
                  
                     l-użu ta' prodotti formulati (ara wkoll is-sezzjoni 1.9.2);
                  
               
                     —
                  
                  
                     uża ammont miżjud tal-ko-solvent bħala żieda tas-sustanza tat-test mas-sistema; jekk ko-solvent ikun użat, dan għandu jkun ko-solvent li ma jkunx idewweb is-sustanza tat-test.
                  
               Eżempji ta' apparat xieraq, i.e. sistemi tal-ħġieġ b'nixxija kontinwa u tat-tip biometriku, huma murija fl-Annessi 2 u 3, rispettivament (14). Sistemi utili oħrajn ta' l-inkubazzjoni huma deskritti fir-referenza 15. Id-disinn ta' l-apparat sperimentali għandu jippermetti l-iskambju ta' l-arja jew tan-nitroġenu u tal-prodotti volatili li jkunu ġew maqbuda. Il-qisien ta' l-apparat għandu jkun tali li l-ħtiġiet tat-test ikun hemm konformità magħhom (ara s-sezzjoni 1.9.1). Il-ventilazzjoni tista tkun ipprovduta jew bi bżieżaq ġentili jew bill-passaġġ ta' l-arja jew tan-nitroġenu minn fuq wiċċ l-ilma. F'dan il-każ ta' l-aħħar, taħwid ġentili ta' l-ilma minn fuq jista jkun rakkommadabbli għal distribuzzjoni aħjar ta' l-ossiġenu jew tan- nitroġenu fl-ilma. Arja ħielsa minn CO2 m'għandhiex tkun użata minħabba li dan jirriżulta f'żidiet fil-pH ta' l-ilma. Fi kwalunkwe każ, it-tqallib tas-sediment mhux mixtieq u għandu jkun evitat, sa kemm ikun possibbli. Kimiċi kemm xejn volatili għandhom ikunu ittestjati f'sistema tip-ta'-barometru b'taħwid ġentili tal-wiċċ ta' l-ilma. Kontenituri magħluqa, bi spazju fil-wiċċ ta', jew l-arja atmosferika jew tan-nitroġenu, u fjali interni għal-qbil ta' prodotti volatili, jistgħu wkoll ikunu wżati (16). Skambju regolari tal-gass fl-ispazju huwa meħtieġ fit-test erobiku sabiex jikkumpensa għall-konsum ta' l-ossiġenu mill-biomassa.
         Nasses xierqa għall-ġbir tal-prodotti volatili tat-trasformazzjoni jinkludu, imma mhux ristertti għal, 1 mol.dm-3 taħlitiet ta' l-idrossidu tal-putassa jew ta' l-idrossidu tas-sodju, għad-diossidu tal-karbonju (31) 7u tal-glikol etiliniku, l-etanolamin jew 2 % paraffin fi xilene għal komposti organiċi. Volatili ffurmati permezz ta' kondizzjonijiet anerobiċi, bħal ma huwa l-metanju, jistgħu ikunu miġbura, per eżempju, b'għarbiel molekulari. Tali volatili jistgħu ikunu maħruqa, per eżempju, iċ-CO2 li jgħaddi mill-gass matul tubu tal-kwart mimli bi CuO f'temperatura ta' 900 oC u li jiġbor iċ- CO2 iffurmat f'assorbatur bl-alkali (17).
         Strumentazzjoni tal-laboratorju għal analiżi kimika tas-sustanza tat-test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni hija meħtieġa (i.e. kromatografija likwida tal-gass (GLC), kromatografija likwida ta' mġieba qawwija (HPLC), kromatografija tas-saff irqieq (TLC), spektroskopju tal-massa (MS), spektroskopju tal-kromatografija-tal-massa tal-gass (GC-MS), spektrometru tal-kromatografija tal-massa likwida (LC-MS), reżonanza manjetika nukleari (NMR), eyc.) inklużi s-sistemi tas-sejbien għal kimiċi radjotikkettjati jew mhux tikkettjati, kif xieraq. Meta materjal radjo-tikkettjat ikun użat bħala għadd tax-xintillazzjoni tal-likwidu u ossidizzatur tal-kombustjoni (għall-kombustjoni ta' kampjuni tas-sediment qabel l-analiżi tar-radjo-attività) ikun ukoll meħtieġ.
         Apparat normali ieħor tal-laboratorju, għal determinazzjonijiet fiżiko-kimiċi u bioloġiċi (ara s-sezzjoni Tabella 1, is-sezzjoni 1.8.2.2(l-oġġetti tal-ħġieġ, il-kimiċi u r-reaġenti huma meħtieġa, kif xieraq.
         1.8.2.   L-għażla u n-numru ta' sedimenti akwatiċi
         Is-siti tal-kampjunar għandhom ikunu magħżula skond l-iskop tat-test, f'xi sitwazzjoni partikolari. Fl-għażla tas-siti tal-kampjunar, l-istorja fl-isfond, agrikola, indistriali jew domestika dwar il-wesgħa tal-ġbir u ta' l-ilmijiet fin-naħa ta' fuq, għandhom ikunu ikkunsidrati. Is-sedimenti m'għandhomx ikunu wżati jekk ikunu ġew kontaminati bis-sustanza tat-test jew bl-istrutturi analogi tagħha matul l-4 snin preċedenti.
         1.8.2.1.   L-għażla tas-sediment
         Żewġ sedimenti huma normalment użati għall-istudju erobiċi (7). Iż-żewġ sedimenti magħżula għandhom ikunu differenti fir-rigward tal-kontenut tal-karbonju organiku u fil-formazzjoni tagħhom. Sediment wieħed għandu jkollu kontenut għoli ta' karbonju organiku (2,5-7,5 %) u ta' formazzjoni fina, is-sediment l-ieħor għandu jkollu kontut baxx tal-karbonju organiku (0,5-2,5 %) u formazzjoni rozza. Id-differenza bejn il-kontenuti tal-karbonu organiku għandha, normalment, tkun ta' mill-anqas 2 %. ‘Formnazzjoni fina’ hija definita bħala (tafal + ħama') [10] (32) 8kontenut ta > 50 % u ‘formazzjoni rozza’ hija definita bħala (tafal + ħama') kontenut ta' < 50 %. Id-differenza fil-kontenut (tafal + ħama') għaż-żewġ sedimenti għandha normalment tkun mill-anqas 20 %. Fil-każi, meta l-kimika tista wkoll tilħaq l-ilmijiet marittimi, mill-anqas waħda mis-sistemi tas-sediment ta' l-ilma għandha tkun ta' oriġini marittima.
         Għal studju strettament anerobiku, żewġ sedimenti (inklużi l-imijiet assoċjati tagħhom) għandhom ikunu miġbura minn żoni anerobiċi tal-partijiet ta' l-ilma tal-wiċċ (7). Iż-żewġ fażijiet tas-sediment u ta' l-ilma għandhom ikunu mqanda u ittrasportati bir-reqqa bl-esklużjoni ta' l-ossiġenu.
         Parametri oħrajn jistgħu ikunu importanti fil-għażla tas-sedimenti u għandhom ikunu ikkunsidrati fuq il-bażi ta' każ b'każ. Per eżempju, il-medda pH tas-sedimenti tkun importanti għall-kimiċi tat-testijiet li dwarhom trasformazzjoni u/jew sorpzjoni jistgħu ikunu pH-dipendenti. Id-dipendenza-pH tas-sorpzjoni tista tkun riflessa bil-pKa tas-sustanza tat-test.
         1.8.2.2.   Karatterizzazzjoni tal-kampjuni tas-sedimenti ta' l-ilma
         Parametri ewlenija li għandhom ikunu mkejla u inklużi fir-rapport (b'referenza għall-metodu wżat) kemm għall-ilma u għas-sediment, u l-istadju tat-test li fih dawk il-parametri għandhom ikunu determinati, huma miġbura f'sommarju fit-Tabella ta' hawn taħt. Għall-informazzjoni, il-metodi tas-sejbin għad-determinazzjoni ta' dawn il-parametri huma mogħtija fir-referenzi (18) (19) (20) (21).
         B'żieda, parametri oħrajn jistħu li jkunu metieġa li jkunu mkejla u nklużi fir-rapport fuq il-bażi ta' każ b'każ (eż. għall-ila frisk: Partiċelli, alkalinità, toqol. Kondittività, NO3/PO4 (relattività u valuri individwali); għas-sedimenti: Il-kapaċità ta' l-iskambju tal-jonji, il-kapaċità taż-żamma ta' l-ilma, Il-karbonat, in-nitroġenu u l-fosfru totali; u għas-sistemi marittimi: Salinità). L-analiżi tas-sedimenti u l-ilma għan-nitrat, is-sulfat u l-ħadid bio-disponibbli, u l-ossibbiltà ta' aċċettaturu elettroni oħrajn tista tkun utili fl-assaġġ tal-kondizzjonijiet redox, speċjalment b'relazzjoni mat-trasformazzjoni anerobika.
         
            Parametri tal-kejl għall-karatterizzazzjoni tal-kampjunu fis-sediment ta' l-ilma (7)(22)(23)
         
         
                     Parametru
                  
                  
                     Stadju tal-proċedura tat-test
                  
               
                     Kampjun ta' l-għalqa
                  
                  
                     Wara t-tqandil
                  
                  
                     Bidu ta' l-akklamit - azzjoni
                  
                  
                     Bidu tat-test
                  
                  
                     Matul it-test
                  
                  
                     Tmiem tat-test
                  
               
                     
                        Ilma
                     
                  
               
                     Oriġini/sorsi
                  
                  
                     x
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     temperatura
                  
                  
                     x
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     pH
                  
                  
                     x
                  
                  
                      
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
               
                     TOC
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                      
                  
                  
                     x
                  
               
                     O2 konċentrazzjoni (***************)
                     
                  
                  
                     x
                  
                  
                      
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
               
                     
                        Potenzal Redox
                         (***************)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
               
                     
                        Sediment
                     
                  
               
                     Oriġini/sorsi
                  
                  
                     x
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Il-fond tas-saff
                  
                  
                     x
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     pH
                  
                  
                      
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
               
                     Distribuzzjon i tad-daqs tal-partiċelli
                  
                  
                      
                  
                  
                     x
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     TOC
                  
                  
                      
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                      
                  
                  
                     x
                  
               
                     Biomassa mikrobjali (***************)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                     x
                  
                  
                      
                  
                  
                     x
                  
                  
                      
                  
                  
                     x
                  
               
                     Potenzal Redox (****************)
                     
                  
                  
                     Osservaz zjonijiet (lewn/riħ a)
                  
                  
                      
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
                  
                     x
                  
               1.8.3.   Ġbir, Tqandil u Ħażna
         1.8.3.1.   Il-ġbir
         L-abbozz tal-gwida ISO dwar il-kampjunar tas-sediment tal-qiegħ 98 għandu jkun użat għall-kampjunar tas-sediment. Kampjuni tas-sediment għandhom ikunu miġbura mis-saff intier ta' fuq, 5 sa 10 cm, tas-sediment. L-ilma assoċjat għandu jkun miġbur mill-istess sit jew lokalità u fl-istess waqt bħas-sediment. Għal studju anerobiku, il-ġbir tal-kampjuni tas-sediment u ta' l-ilma assoċjat u t-trasportazzjoni tagħhom għandu jkun bl-esklużjomni ta' l-ossiġenu (28) (ara s-sezzjoni 1.8.2.1). Uħud mill-apparati tal-kampjunar huma deskritti fil-litteratura (8) (23).
         1.8.3.2.   Tqandil
         Is-sediment huwa separat mill-ilma permezz tal-filtrazzjoni u s-sediment ikun magħrbel fl-undità minn għarbiel ta' 2 mm bl-użu ta' l-ilma eċċessiv tal-lokalita, li imbagħad ikunu mormi. Imbagħad, ammonti magħrufa ta' sedimenti u ilma huma mħallta fir-relattività mixtieqa (ara s-sezzjoni 1.9.1) f'garafini ta' l-inkubazzjoni u ippreparati għall-perijodu ta' l-akklamizzazzjoni (ara s-sezzjoni 1.8.4). Għal studju anerobiku, il-passi kollha tat-tqandil għandhom iseħħu bl-esklużjoni ta' l-ossiġenu (29) (30) (31) (32) (33).
         1.8.3.3.   Ħażna
         L-użu ta' kampjun frisk tas-sediment u l-ilma huwa ferm rakkommandabbli, imma jekk ħażna tkun meħtieġa, Is-sediment u l-ilma għandhom ikunu magħrbla kif deskritt hawn fuq u maħżuna flimkien, mifqugħa bl-ilma (6-10 cm saff ta' ilma), fid-dlam, fi 4 ± 2 oC4 għal massimu ta' [13] ġimghat (7)(8)(23). Il-kampjuni li huma ntiżi għal studji erobiċi għandhom ikunu maħżuna b'aċċess liberu ta' arja 9eż. f'kontenituri miftħa), waqt li dawk għal studji erobiċi bl-esklużjoni ta' l-ossiġenu. L-iffriżar tas-sediment u l-ilma u waqt l-inxif tas-sediment m'għandux iseħħ matul it-trasportazzjoni u l-ħażna.
         1.8.4.   Preparazzjoni tal-kampjuni sediment/ilma għat-test
         Perijodu ta' akklamitazzjoni għandu jseħħ qabel iż-żieda tas-sustanza tat-test, b'kull kampjun ta' sediment/ilma jkun miqiegħed fir-reċipjent ta' l-unkubazzjoni li għandu jkun użat għat-test ewlieni, u l-akklamizzazzjoni tkun imwettqa skond l-istess kondizzjonijiet bħal fit-test ta' l-inkubazzjoni (ara s-sezzjoni 1.9.1). Il-perijodu ta' l-akklimizzazzjoni huwa ż-żmien meħtieġ għal stabbilità raġjonevoli tas-sistema kif rifless bil-pH, il-konċentrazzjoni ta' l-ossiġenu fl-ilma, il-potenzal tar-redox tas-sediment u l-ilma, u l-fażijiet tas-separazzjoni makroskopika. Il-perijodu ta' l-akklamizzazzjoni għandu normalment idem bejn ġimgħa waħda u ġimgħatejn u m'għandux jeċċedi erba' ġimghat. Ir-riżultati tad-determinazzjonijiet imwettqa matul dan il-perijodu għandhom ikunu nlkużi fir-rapport.
         1.9.   L-IMĠIEBA TAT-TEST
         1.9.1.   Kondizzjonijiet tat-test
         It-test għandu jkun imwettaq fl-apparat ta' l-inkubazzjoni (ara s-sezzjoni ċ.8.1) b'relattività tal-volum ta' l-ilma mas-sedimet ta' bejn 3:1 u 4:1, u saff tas-sediment ta' 2,5 cm (±0,5 cm) (33) 9. Ammont minimu ta' 50 g ta' sediment (bażi ta' piż xott) kull reċipjent ta' l-inkubazzjoni huwa rakkommandat.
         It-test għandu jkun imwettaq fid-dlam, b'temperatura kostanti fil-medda ta' 1- sa 30 oC. Temperatura ta' (20 ± 2) oC hija xierqa. Meta xieraq, temperatura addizzjonali aktar baxxa (eż. 10 oC) tista tkun meqjusha fuq il-bażi ta' każ b'każ, jiddependi mill-informazzjoni meħtieġa mit-test. It-temperatura ta' l-inkubazzjoni għandha tkun sorveljata u nkluża fir-rapport.
         1.9.2.   It-trattament u l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test
         Konċentrazzjoni waħda tal-kimika tat-test hija użata (34) . Għall-kimiċi tal-protezzjoni ta' l-uċuġ applikati direttament lejn is-saffi ta' l-ilma, id-doża massima tat-tikketta għandha tkun meqjusa bħala, ir-rata massima ta' l-applikazzjoni ikkalkolata fuq il-bażi taż-żona tal-wiċċ ta' l-ilma fir-reċipjent tat-test. Fil-każi l-oħrajn kollha, il-konċemtrazzjoni li trid tkun użata għandha tkun ibbażata fuq previżjonijiet mill-emissjonijiet ambjentali. Attenzjoni għandha tingħata sabiex tkun assigurata li konċentrazzjoni adekwata tas-sustanza tat-test tkun applikata sabiex tikkaratterizza r-rotta tat-trasformazzjoni u tal-formazzjoni u t-tnaqqis tal-prodotti tat-trasformazzjoni. Jista jkun meħtieġ li jkunu applikati dożi aktar għoljin (eż. 19-il darba) f'sitwazzjonijiet meta l-konċentrazzjonijiet tas-sustanza tat-test ikunu qrib il-limitu tas-sejbien fil-bidu ta' l-istudji u/jew meta prodotti ta' trasformazzjoni maġġuri ma jkunux faċli li jkunu misjuba meta preżenti fi 10 % tar-rata ta' l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test. B'dana kollu, jekk konċentrazzjonijiet għola tat-test huma wżati, dawn m'għandhox ikollhom effett ħażin sinifikanti fuq l-attività mikrobjali tas-sistema ilma-sediment. Sabiex tkun akkwistat konċentrazzjoni kostanti tas-susstanza tat-test fir-reċipjenti ta' qisien differenti, aġġustament tal-kwantità tal-materjal applikat jista jkun meqjus bħala xieraq, ibbażat fuq il-fond tal-kolonna ta' l-ilma fir-reċipjent b'relazzjoni mal-fond ta' l-ilma fl- għalqa (li huwa preżunt li huwa 100 cm, imma fond ieġor jista jkun użat). Ara l-Anness 4 għal eżempju tal-kalkolazzjoni.
         Idealment, is-sustanza tat-test għandha tkun applikata bħala taħlita akweja ġewwa l-fażi ta' l-ilma tas-sistema tat-test. Jekk ma jkunx jista jsir mod ieħor, l-użu ta' ammonti anqas ta' solventi li jitħaltu ma l-ilma (bħal ma huma l-aċetun, l-etanol) huwa permisibbli għall-applikazzjoni u d-distribuzzjoni tas-sustanza tat-test, imma dan m'għandux jeċċedi 1 % v/v u m'għandux ikollu effeti ħżiena fuq l-attività mikrobjali tas-sistema tat-test. Attenzjoni għandha tingħata fil-ġenerazzjoni tat-taħlita akweja tas-sustanza tat-test – l-użu ta' kolonni ġenerati u t-taħlit minn qabel jista jkun xieraq sabiex tkun assigurata omoġenità kompluta. B'segwiment taż-żieda tat-taħlita akweja mas-sistema tat-test, taħvid ġentili tal-fażi ta' l-ilma huwa rakkommandat, li jqanqal is-sediment mill-anqas possibbli.
         L-użu ta' prodotti formulati mhux normalment rakkommandat minħabba li l-ingredjenti tal-formulazzjoni jistgħu jaffettwaw is-sustanza tat-test u/jew tal-prodotti tat-trasformazzjoni bejn il-fażijiet ta' l-ilma u tas-sediment. B'dana kollu, eż. għal sustanzi tat-test li ma tantx jinħallu, l-użu ta' materjal formulat jista jkun alternattiva xierqa.
         In-numru ta' reċipjenti ta' l-inkubazzjoni jiddependi min-numru ta' drabi tal-kampjunar (ara s-sezzjoni 1.9.3). Numru suffiċjenti tas-sistemi tat-test għandhom ikunu nklużi sabiex żewġ sistemi jistgħu ikunu sagrifikati f'kull waqt tal-kampjunar. Meta l-unitajiet tal-kontroll ta' kull sistema tas-sediment akwatiku jkunu wżati, dawn m'għandhomx ikunu ittrattati bis-sustanza tat-test. L-unitajiet tal-kontroll jistgħu ikunu wżati għad-determinazzjoni tal-biomassa mikrobjali tas-sediment u tal-karbonju organiku totali ta' l-ilma u tas-sediment fit-tmiem ta' l-istudju. Iż-żewġ unitajiet tal-komntroll (i.e. unità tal-kontroll waħda ta' kull sediment akwatiku) jistgħu ikunu wżati sabiex jissorveljaw il-parametri meħtieġa fis-sediment u fl-ilma matul il-perjodu ta' l-akklamitizzazzjoni (ara t-Tabella fis-sezzjoni 1.8.2.2). Żewġ unitajiet addizzjonali tal-kontroll għandhom ikunu nklużi fil-każ li sustanza tat-test tkun applikata permezz ta' solvent li jkejjel l-effetti ħżiena fuq l-attività mikrobjali tas-sistema tat-test.
         1.9.3.   It-tul taż-żmien u l-kampjunar tat-test
         It-tul ta' l-esperiment m'għandux normalment jeċċedi 100 jum (6), u għandu jkompli sa kemm il-passaġġ tal-gradazzjoni u l-għamla tad-distrubuzzjoni ta' l-ilma/sediment tkun stabbilita jew meta 90 % tas-sustanza tat-test tkun dissipata fit-trasformazzjoni u/jew il-volatilizzazzjoni. In-numru ta' waqtiet tal-kampjunar għandhom ikunu mill-anqas sitta (inkluż il-ħin żero), bi studju preliminarji voluntarju (ara s-sezzjoni 1.9.4) ikunu wżat sabiex tkun stabbilit r-regola xierqa tal-kampjunar u tat-tul tat-test, sakemm informazzjoni suffiċjenti ma tkunx diġa disponibbli dwar is-sustanza tat-test minn studju preċendenti. Għal sustanzi tat-test idrofobiċim punti addizzjonali tal-kampjunar matul il-perijodu inizjali ta' l-istudju jistgħu ikunu meħtieġa sabiex tkun determinata r-rata tad-distribuzzjoni bejn il-fażijiet ta' l-ilma u tas-sediment.
         Filwaqtiet xierqa tal-kampjunar, ir-reċipjenti kollha ta' l-inkubazzjoni (dupplikat) huma mneħħija għall-analiżi. Is-sediment u l-ilma tal-wiċċ huma analizzati separatament (35) 1. L-ilma tal-wiċċ għandu jkun imneħħi bil-galbu b'ċaqlieq mill-anqas tas-sediment. L-estrazzjoni u l-karatterizzazzjoni tas-sustanza tat-test u tal-prodotti tat-trasformazzjoni għandhom isegwu l-proċeduri analitiċi xierqa. Attenzjoni għandha tingħata għat-tneħħija tal-materjal li jkun jkun ġie assorbit mar-reċipjent ta' l-inkubazzjoni jew mat-tibi ta' l-interkonnessjoni wżati li jaqbdu l-volatili.
         1.9.4.   Test preliminarju voluntarju
         Jekk ir-regolazzjoni tat-tul u tal-kampjunar ma jistgħux ikunu ikkalkolati minn studju relevanti oħrajn dwar is-sustanza tat-test, studju preliminari voluntarju jista jkun meqjus bħala xieraq, li għandu jkun imwettaq bl-użu ta' l-istess kondizzijonijiet tat-test proponuti għall-istudju definittiv. Kondizzjonijiet sperimentali relevanti u r-riżultati mit-test preliminarju, jekk imwettaq, għandhom ikunu rraportati fil-qosor.
         1.9.5.   Kejl u analiżi
         Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test u l-prodotti tat-trasformazzjoni f'kull waqt tal-kampjunar fl-ilma u fis-sediment għandhom ikunu mkejla u rraportati (bħala konċentrazzjoni u bħala persentaġġ ta' l-applikat). Ġeneralment, il-prodotti tat-trasformazzjoni misjuba fl-≥10 % tar-radjoattività applikata fis-sistema totali ta' ilma-sediment fi kwalunkwe waqt tal-kampjunar għandhom ikunu identifikati, sakemm ma jkunx raġjonevolment ġustifikat mod ieħor. Il-prodotti tat-trasformazzjoni li dwarhom il-konċentrazzjonjiet huma kontinwament miżjuda matul l-istudju għandhom ukoll ikunu ikkonsidrati għall-identifikazzjoni, anki jekk il-konċentrazzjonijiet tagħhom ma jkunux jeċċedu l-limitu mogħti hawn fuq, minħabba li dan jista jindika persistenza. Dan ta' l-aħħar għandu jkun ikkonsidrat fuq il-bażi ta' każ b'każ, bil-ġustifikazzjoni tkun ipprovduta fir-rapport.
         Ir-riżultati mis-sistemi tal-qbid tal-gassijiet/volatili (CO2 u oħrajn, i.e. komposti organiċi volatili) għandhom ikunu rrapurtati f'kull waqt tal-kampjunat. Ir-rati tal-mineralizzazzjoni għandhom ikunu rrapurtati. Residwi mhux estrattibbli (marbuta) fis-sediment għandhom ikunu irrapurtati f'kull punt tal-kampjunar.
         2.   DATA
         2.1.   TRATTAMENT TAR-RIŻULTATI
         Il-bilanċ jew l-irkupru tal-massa totali (ara s-sezzjoni 1.7.1) tar-radjoattività miżjuda għandhom ikunu ikkalkolati f'kull waqt tal-kampjunar. Ir-riżultati għandhom ikunu irrapurtati bħala persentaġġ tar-radjoattività miżjuda. Id-distribuzzjoni tar-radjoattività bejn l-ilma u s-sediment għanda tkun irrapurtata bħala konċentrazzjonijiet u persentaġġi, f'kull waqt tal-kampjunar.
         In-nofs-ħajja, il-DT50 u, jekk xieraq, il-DT75 u il-DT90 tas-sustanza tat-test għandhom ikunu ikkalkolati flimkien mal-limiti ta' affidibbilità tagħhom (ara s-sezzjoni 1.7.3). L-informazzjoni dwar ir-rata tad-dissipazzjoni tas-sustanza tat-test fl-ilma u fis-sediment tista tkun akkwistata mill-użu ta' l-għodda xierqa ta' l-evalwazzjoni. Dawn jistgħu ivarjaw mill-applikazzjoni tal-kinetiċi ta' psewdo-l-ewwel-ordni, tat-teknika li timxi mal-kurva emprika li tapplika għal soluzzjonijiet grafiċi jew numeriċi u l-assaġġ aktar kumpless bl-użu, per eżempju, tal-mudelli ta' kompartiment singolu jew multiplu. N Aktar dettalji jistgħu ikunu akkwistati mill-letteratura relevanti kif ippubblikata (35) (36) (37).
         Ir-resqien kollu għandu s-saħħa u d-debbolizzi tiegħu u jvarja konsiderevolment fil-komplessità, Preżunzjoni tal-kinetiċi ta' l-ewwel ordni tista ssir b'simplifikazzjoni żejda tal-proċessi tad-degradazzjoni u tad-distribuzzjoni, imma meta possibbli li tagħti terminu (ir-rata kostanti jew nofs-ħajja) li faċilment ikunu jifthiemu u l-valur fil-mudellar tas-simulazzjoni u l-kalkolu tal-konċentrazzjonijiet ambjentali previsti. Resqien empiriku jew trasformazzjonijiet lineari jistgħu jirriżultaw fi dħul aħjar tal-kurvi mad-dettall u għalhekk jippermettu estimi aħjar tan-nofs-ħajja, DT50 u, jekk xieraq, il-valuri DT75 u DT90. L-użu tal-kostanti derivati, b'dana kollu huwa limitat. Mudelli kumpartimentali jistgħu jiġġeneraw numru ta' kostanti utili ta' valur fir-riskju ta' l-assaġġ li jiddeskrivi r-rata tad-degradazzjoni f'kumpartimenti differenti u d-distribuzzjoni tal-kimika. Dawn għandhom ukoll ikunu wżati għall-estimi tal-kostanti tar-rata għall-formazzjoni u d-degradazzjoni ta' prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni. Fil-każi kollha, il-metodu wżat għandu jkun ġustifikat u min jagħmel l-esperiment għandu juri b'mod grafiku u/jew l-istatistika ta' dħul aħjar.
         3.   RAPPORTAĠĠ
         3.1.   RAPPORT TAT-TEST
         Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:
         
                      
                  
                  
                     Is-sustanza tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-isem komuni, l-isem kimiku, in-numru CAS, il-formula strutturali (bl-indikazzjoni tal-posizzjoni tat-tikketti meta materjal radjo-tikkettjat ikun użat) u l-propjetajiet fiżiċi-kemikali relevanti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-purità (l-impuritajiet) tas-sustanza tat-test;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-purità tar-radjokimika tal-kimika tikkettjata u l-attività speċifika (meta xieraq);
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Sustanzi ta' referenza:
                     
                                 —
                              
                              
                                 l-isem kimiku u l-istruttura tas-sustanzi ta' referenza kif użati għall- karatterizzazzjoni u/jew l-identifikazzjoni tal-prodott tat-trasformazzjoni;
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Sedimenti u ilmijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 il-lokalità u d-deskrizzjoni tas-sit(i) tal-kampjunar tas-sediment akwatiku, inkluża, jekk possibbli, l-istorja tal-kontaminazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-informazzjoni kollha li tirrigwardja il-ġbir, il-ħażna (jekk ikun hemm) u l-akklamizzazzjoni tas-sistemi ta' l-ilma/sediment;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 karatteristiċi tal-kampjunar ilma-sediment kif elenkati fit-Tabella fis-sezzjoni 1.8.2.2.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Kondizzjonijiet tat-test:
                     
                                 —
                              
                              
                                 is-sistema tat-test użata (eż. in-nixxija kontinwa, il-biometrika, il-mezz tal- ventilazzjoni, il-metodu tat-taħwid, il-volum ta' l-ilma, il-massa tas-sediment, il-ħxuna kemm tas-saff ta' l-ilma u tas-sediment, il-qisiem tar-reċipjenti tat-test, eċċ.);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 l-applikazzjoni tas-sustanza tat-test għas-sistema tat-test: Il-konċentrazzjoni tat-test kif użata, in-numri ta' repliki u l-modula tal-kontrolli ta' l-applikazzjoni tas-sustanzaa tat-test (eż. l-użu tas-solvent jekk ikun hemm), eċċ.;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 temperatura ta' l-inkubazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 id-drabi tal-kampjuna;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-metodi ta' l-estrazzjoni u l-effiċċjenzi kif ukoll il-metodi analitiċi u l-limiti tas-sejbien;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-metodi għall-karatterizzazzjoni/identifikazzjoni tal-prodotti tat- trasformazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 devjazzjonijiet mill-protokoll tat-test jew mill-kondizzjonijiet tat-test, matul l-istudju.
                              
                           
               
                      
                  
                  
                     Riżultati:
                     
                                 —
                              
                              
                                 dettalji fi stat oriġinali tal-figuri li jirrapreżentaw analiżi (id-dettalj kollha fi stat oriġinali għandhom ikunu maħżuna fl-arkivji-GLP);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ir-repettabbilità u s-sensittività tal-metodi analitiċi użati;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ir-rati ta' l-irkupru ( % valuri għal studju validu huma mogħtija fis-sezzjoni 1.7.1);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tabelli tar-riżultati espressi bħala % tad-doza applikata u fi mg.kg-1 fl-ilma, sediment u s-sistema totali ( % biss) għas-sustanza tat-test u, jekk xieraq, għall-prodotti tat-trasformazzjoni u tar-radjoattività mhux-estrattibbli;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-bilanċ tal-massa, matul u qrib it-tmiem ta' l-istudji;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 rapreżentazzjoni grafika tat-trasformazzjoni fl-ilma u l-frazzjonijiet tas- sediment u fis-sistema totali (inkluża l-mineralizzazzjoni);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 rati tal-mineralizzazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 in-nofs-ħajja, il- DT50 u, jekk xieraq, il-valuri DT75 u DT90 tas-sustanza tat-test u, meta xieraq, il-proddotti tat-trasfirmazzjoni maġġuri inklużi fil-limiti ta' l-affidabbilità fl-ilma, fis-sediment u fis-sistema totali;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kalkolu tal-kinetiċi tat-trasformazzjoni għas-sustanza tat-test u, meta xieraq, il-prodotti maġġuri tat-trasformazzjoni;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 il-passaġġi proponuti tat-trasformazzjoni, meta xieraq;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 diskussjoni tar-riżultati.
                              
                           
               4.   REFERENZI
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Linja ta' Gwida BBA għall-eżaminazzjoni tal-protetturi tal-pjanti fil-progress tar-reġistrazzjoni. (1990). Parti IV, Sezzjoni 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Il-Ġermanja.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Kummissjoni għar-reġistrazzjoni tal-pestiċidi: L-Applikazzjoni għar-reġistrazzjoni tal-pestiċidi. (1991). Part G. Imġieba tal-prodott u l-metabiżmi tiegħu fil-ħamrija, fl-ilma u fl-arja, Sezzjoni G.2.1 (a). L-Olanda.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     MAFF Direttorat dwar is-Sigurtà tal-Pestiċidi. (1992). Linja ta' Gwida prelimari għall-imġieba tat-testijiet dwar il-biodegrabbilità tal-pestiċidi f'sistemi naturali ta' sediment/ilma. Ref No SC 9046. Renju Unit.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Agrikoltura Kanada: Environmental chemistry and fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada. pp 35-37.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality – Sampling – Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149-158.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631-637.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C-labelled model surfactants. Water Research 21, 661-667.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (17th edition). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. Longman.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chemistry 44, 1038- 1039.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop ‘A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests’, 3-4 July 1991.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
                  
               
                  
                     (24)
                  
                  
                     Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858-2868.
                  
               
                  
                     (25)
                  
                  
                     Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329-338.
                  
               
                  
                     (26)
                  
                  
                     Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203.
                  
               
                  
                     (27)
                  
                  
                     ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigationextraction method.
                  
               
                  
                     (28)
                  
                  
                     Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13-21.
                  
               
                  
                     (29)
                  
                  
                     Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857.
                  
               
                  
                     (30)
                  
                  
                     Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550.
                  
               
                  
                     (31)
                  
                  
                     Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegradation tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499-1509.
                  
               
                  
                     (32)
                  
                  
                     Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597-3603.
                  
               
                  
                     (33)
                  
                  
                     US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090.
                  
               
                  
                     (34)
                  
                  
                     Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961-968.
                  
               
                  
                     (35)
                  
                  
                     Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, 187-203.
                  
               
                  
                     (36)
                  
                  
                     Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47-60.
                  
               
                  
                     (37)
                  
                  
                     Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Diseases, pp 1349-1354.
                  
               
            ANNESS 1
            LINJA TA' GWIDA DWAR IS-SISTEMI TAS-TEST EROBIKU U ANEROBIKU
            Sistema ta' test erobiku
            Is-sistema tat-test erobiku deskritta f'dan il-metodu tat-test tikkonsisti minn saff ilma erobiku (konċentrazzjoni tipika ta' l-ossiġenu fil-medda bejn 7 u 10 mg· l-1) u saff tas-sediment, erobiku fil-wiċċ u anerobiku taħt il-wiċċ (medja tipika tal-potenzali redox (Eh) fiż-żona anerobika tas-sediment fil-medda minn –80 sa –190 mV). L-arja umida tkun mogħddiha matul il-wiċċ ta' l-ilma ta' kull unità ta' l-inkubazzjoni sabiex iżżomm ossiġenu suffiċjenti fl-ispazju ta' fuq.
            Sistema ta' test anerobiku
            Għas-sistema tat-test anerobiku, il-proċedura tat-test hija essenzalment l-istess bħal dik elenkata għas-sistema erobika bl-eċċezzjoni li nitroġenu umidu jkun mogħddi minn fuq il-wiċċ ta' l-ilma f'kull unità ta' l-inkubazzjoni sabiex jinżamm spaziu fil-wiċċ bin-nitroġenu. Is-sediment u l-ilma huma meqjusa bħala anerobiċi la darba l-potenzal tar-redox (Eh) ikun aktar baxx minn –100 mV.
            Fit-test anerobiku, l-assaġġ tal-mineralizzazzjoni jinkludi l-kejl tad-diossidu tal-karbonu u tal-metanju evoluti.
         
         
            ANNESS 2
            EŻEMPJU TA' L-APPARAT TAN-NIXXIJA KONTINWA TAL-GASS
            
         
            ANNESS 3
            EŻEMPJU TA' L-APPARAT BIOMETRIKU
            
         
            ANNESS 4
            EŻEMPJU TAL-KALKOLU GĦALL-APPLIKAZZJONI TA' DOŻA MAR-REĊIPJENTI TAT-TEST
            
                        Diametru intern taċ-ċildru:
                     
                     
                        = 8 cm
                     
                  
                        Fond tal-kolonna ta’ l-ilma li ma jinkludix is-sediment:
                     
                     
                        = 12 cm
                     
                  
                        Iż-żona tal-wiċċ 3,142  × 42
                        
                     
                     
                        = 50,3  cm2
                        
                     
                  
                        Rata ta' l-applikazzjoni: 500 g sustanza tat-test/ha tikkorrespondi għal 5 μg/cm2
                        
                     
                     
                         
                     
                  
                        Total μg: 5 × 50,3 
                     
                     
                        = 251,5  μg
                     
                  
                        Aġġusta l-kantità b’relazzjoni mal-fond ta’ 100 cm:
                        12 × 251,5  ÷ 100
                     
                     
                        = 30,18  μg
                     
                  
                        Kolonna tal-volum ta’ l-ilma: 50,3  × 12
                     
                     
                        = 603 ml
                     
                  
                        Konċentrazzjoni fl-ilma 30,18  ÷ 603
                     
                     
                        = 0,050  μg/ml jew 50 μg/l
                     
                  
         
            (1)  Ir-riżultati ta' dawn it-testijiet inter-laboratorji u Korriġendum Tekniku għall-ISO 6341 jagħtu EC50 – 24 h tad-dikromat tal-potassju (K2Cr2O7) fil-firxa bejn 0,6 mg/l u 1,7 mg/l.
         
            (*)  Ilma ta’ safa xierqa, eż. deonizzat, distillat jew reverse osmosis b’kondottività li preferibbilment ma teċċedix 10 μS.cm-1.
         
            (**)  D1 u D2 m'għandhiex tittieħed il-medja tagħhom jekk ikun hemm differenza konsiderevoli.
         
            (***)  D1 u D2 m'għandhiex tittieħed il-medja tagħhom jekk ikun hemm differenza konsiderevoli.
         
            (****)  jew fl-aħħar ta' l-inkubazzjoni.
         
            (*****)  D1 u D2 m'għandhiex tittieħed il-medja tagħhom jekk ikun hemm differenza konsiderevoli.
         
            (******)  jew fl-aħħar ta' l-inkubazzjoni.
         
            (*******)  bħala kondizzjoni stabbli(medja)
         
            (********)  bħala kondizzjoni stabbli(medja).
         
            (2)  Wara l-użu, is-soluzzjonijiet li fihom salts tal-merkurju għandhom jiġu trattati sabiex jiġi evitat it-tixrid tal- merkurju fl-ambjent.Altrimentri l-BOD huwa mbagħad determinat skond kwalunkwe metodu xieraq standardizzat nazzjonali jew internazzjonali.
         
            (3)  Mabey u Mill jirrakkomandaw l-użu ta' buffers tal-borate u ta' l-aċetat minflok il-fosfat (11).
         
            (4)  Din l-informazzjoni tista' tiġi minn għejun oħrajn bħad-data ta' l-idrolisi ta' komposti strutturalment simili mil- letteraturi jew minn testijiet oħrajn preliminarji, semi-kwantattivi bis-sustanza tat-test fi stadju aktar bikri ta' l-iżvilupp.
         
            (*********)  Jekk it-tpinġija fuq djagramma tad-data ta' logs ittrasformati ta' data vs. ħin ma tindikax funzjoni lineari (ekwata ma' rata ta' reazzjoni ta' l-ewwel ordni), allura l-użu ta' l-ekwazzjoni [3] mhuwiex xieraq biex jiġi ddeterminat il-konstant tar-rata ta' l-idrolisi tal-kompost tat-test.
         
            (**********)  Il-valur pH irrapportati f'dawn it-tabelli ġew ikkalkolati mill-kejl potenzjali bl-użu ta' ekwazzjonijiet standard ta' Sörensen (1909). Il-valuri pH korrispondenti huma 0,04 unitajiet ogħla mill-valuri tabulate.
         
            (***********)  Żid kristall żgħir ħafna ta' timol jew sustanza simili biex jitrażżan it-tkabbir tal-moffa.
         
            (5)  Meyer A, Orti G. (1993) Proc. Soċjetà Rjali ta’ Londra, Serje B, Vol. 252, pġ. 231.
         
            (************)  L-ilma kampjun wara li minimu ta' tlett kmamar b'volum huma kkunsinnati.
         Il-valuri fil-parentesi huma numri tal-kampjuni (ilma, ħut) li għandhom jittieħdu jekk kampjuni addizzjonali għandhom jiġu magħmula.
         
                     
                        NB
                     
                  
                  
                     :
                  
                  
                     L-istima ta' qabel it-test tal-k2 għal-logaritmu Pow ta' 4,0 huwa 0,652 ġranet ±1. It-tul totali ta' l-esperiment huwa stabbilit għal 3 × 'il fuq =3 × 4,6 ġranet, i.e. 14 –il ġurnata. Għall-istimar ta' l'fuq irreferi għall-Anness 3.
                  
               
            (6)  Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.
         
            (*************)  Serje ta' ħames (jew iktar) konċentrazzjonijiet suċċessivi jistgħu jingħażlu minn kolonna. Il-mid-points ta' bejn il-konċentrazzjonijiet f'kolonna (x) jinsabu f'kolonna (2x + 1). Il-valuri msemmija jistgħu jirrappreżentaw konċentrazzjonijiet li jingħadu bħala perċentwal f'volum jew piż (mg/l jew μg/l). Il-valuri jistgħu jkunu multiplikati jew diviżi bi kwalunkwe power of 10 kif inhu xieraq. Il-kolonna 1 tista' tintuża jekk ikkun hemm inċertezza konsiderevoli fil-livell ta' tossiċità.
         
            (7)  OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, “Fish, Early-life Stage Toxicity Test”.
         
            (8)  Għall-embrijoni.
         
            (9)  Għall-larvae.
         
            (1)  Dlam għall-embrijoni u għal-larvae sa ġimgħa wara t-tfaqqis ħlief meta jkunu spezzjonati. Imbagħad dawl baxxa matul it-test.
         
            (**************)  Skond il-FAO u s-sistema US (85).
         
            (1)  Il-varjabbli rispettivi għandhom juru preferebbilment il-valuri fil-medda mogħtija. Jekk, madankollu, ikun hemm diffikultajiet fis-sejba tal-materjal ta' ħamrija xieraq, il-valuri taħt il-minimu indikat huma aċċettati.
         
            (2)  Il-ħamrija b'inqas minn 0,3 % tal-karbonju organiku tista' tfixkel il-korrelazzjoni bejn il-kontenut organiku u ta' adsorbiment. Għalhekk, huwa rakkomandat l-użu tal-ħamrija li fiha kontenut minimu ta' karbonju organiku ta' 0,3 %.
         
            (10)  
         
            (11)  Plots tal-konċentrazzjoni tas-sustanza għat-test fil-fażi akwea  versus il-ħin jistgħu jintużaw ukoll għall-kalkolu tal-kisba tal-plateau ta' l-ekwilibriju (ara Fig. 2 fl-Anness 5).
         
            (12)  DT-50: il-ħin tad-degradazzjoni għal 50 % tas-sustanza għat-test.
         
            (13)  W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC screening method for the determination of the adżorbzjoni coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121 – 128.
         
            (14)  W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adżorbzjoni-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), 107 – 119.
         
            (15)  W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adżorbzjoni coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373-1384.
         
            (2)  W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D Report No. 106 01044 (1994).
         
            (3)  B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein. (1991). Chemosphere, 22, 285-304.
         
            (4)  Id-data provduta mill-industrija.
         
            (16)  Indika liema reċipjent ġie wżat għall-esperiment
         
            (17)  Ir-rekord tal-mortalità ta' kwalunkwe annimal adult bħala “M” fil-kaxxa relevanti
         
            (18)  Ir-rekord ta' aborted broods bħala “AB” fil-kaxxa relevanti
         
            (19)  Per eżempju, jekk is-sustanza għat-test ikun fiha ċirku wieħed. L-ittikkettjar fuq dan iċ-ċriku huwa meħtieġ. Jekk is-sustanza għat-test ikun fiha żewġ ċrieki jew iktar, studji separati jistgħu jkunu meħtieġa biex tiġi evalwata x-xorti ta' kull ċirku ttikkettjat u biex tinkiseb informazzjoni adattata dwar il-formazzjoni tal-prodotti ta' trasformazzjoni.
         
            (20)  Il-karatteristika tar-ritenzjoni ta' l-ilma fil-ħamrija tista' titkejjel bħala field capacity, bħala kapaċità taż-żamma ta' l-ilma jew bħala water suction tension (pF). Għall-ispjegazzjoni ara Anness 1. Għandu jiġi r-rappurtat fir-rapport ta-test jekk il-karatteristiċi tar-ritenzjoni ta' l-ilma u d-densità goffa tal-ħamrija ġew determinati fil-kampjuni ta' l-għelieqi not disturbed jew f'kampjuni disturbed (proċessati).
         
            (21)  Recent research results indicate that soils from temperate zones can also be stored at –20 oC for more than three months (28)(29) without significant losses of microbial activity.
         
            (22)  Il-ħamrija la għandha tkun imxarrba wisq u lanqas niexfa wisq sabiex tinżamm l-aeration adegwata u n-nutrizzjoni tal-ħamrija microflora. Kontenuti ta' umdità rakkomandati għall-medda tat-tkabbir mikrobbjali ottimali minn 40-60 % il-kapaċità taż-żamma ta' l-ilma (WHC) u minn 0,1-0,33 bar (6). Il-medda ta' l-aħħar hija ekwivalenti għall-medda pF-ta' 2,0 – 2,5. Il-kontenuti ta' umdità tipiċi ta' tipi varji ta' ħamrija huma mogħtija f'Anness 2.
         
            (23)  Il-kundizzjonijiet ajrobiċi huma dominanti fil-ħamrija tal-wiċċ kif ukoll fis-sub-surface tal-ħamrija kif jidher fil-proġett ta' riċerka sponsorjat mill-UE. [K. Takagi et al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, Sweden]. Il-kundizzjonijiet ajrobiċi jistgħu jseħħu biss okkażjonalment meta il-ħamrija tinfaqa' bl-ilma wara xita qawwija jew meta jkun hemm kundizzjonijiet ta' ross li għadu fil-ħliefa fl-għelieqi tar-ross.
         
            (24)  L-istudji ajrobiċi jistgħu jintemmu ħafna qabel 120 jum sakemm l-ultimate transformation pathway u l-ultimate mineralisation jintlaħqu tajjeb sa dak iż-żmien. It-terminazzjoni tat-test hija possibbli wara 120 jum, jew meta mill-inqas 90 % tas-sustanza għat-test jiġi trasformat, iżda biss jekk mill-inqas 5 % CO2 jiġi ffurmat.
         
            (25)  Il-kalkolu tal-konċentrazzjoni inizjali fuq area basis bl-użu ta' l-ekwazzjoni li ġejja:
         
            
         
                     Csoil
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     Il-konċentrazzjoni inizjali fil-ħamrija [mg.kg-1]
                  
               
                     A
                  
                  
                     =
                  
                  
                     Ir-rata ta’ applikazzjoni [kg.ha-1]; 1 = il-ħxuna tas-saff ta’ ħamrija ta’ l-għalqa [m]; d = dry bulk density tal-ħamrija [kg.m- 3].
                  
               Bħala regola, rata ta’ applikazzjoni ta’ 1 kg.ha-1 tirriżulta f’konċentrazzjoni ta’ ħamrija ta’ bejn wieħed u ieħor 1 mg.kg-1 f’saff ta’ 10 cm (jekk tassumi bulk density ta’ 1 g . cm-3).
         
            (26)  Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
         
            (5)  pF = log ta' cm kolonna ta' l-ilma.
         
            (6)  1 bar = 105 Pa.
         
            (7)  Jikkorrispondi għal kontenut ta' ilma ta' bejn wieħed u ieħor 10 % f'ramel, 35 % f' loam u 45 % f'tafal.
         
            (8)  Il-kapaċità ta' l-għalqa mhix kostanti iżda tvarja bit-tip ta' ħamrija bejn pF 1,5 u 2,5.
         
            (27)  Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.
         
            (28)  Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.
         
            (29)  Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
         
            (30)  Per eżempju, jekk is-sustanza jkun fiha ċirku wieħed, l-ittikketjar fuq dan iċ-ċirku huwa meħtieġ. Jekk is-sustanza tat-test ikun fiha żewġ ċrieki jew iktar, studji separati jistgħu jkunu meħtieġa għall-evalwazzjoni tax-xorti ta' kull ċirku ittikkettjat u sabiex tinkiseb l-informazzjoni adattata fuq il-formazzjoni tal-prodotti tat-trasformazzjoni.
         
            (31)  Bħalma dawn is-soluzzjonijiet ta' abżorpzjoni alkalini jassorbu wkoll id-dijossidju tal-karbonju mill-arja ta' ventilazzjoni u li iffurmati peremzz ta' respirazzjonni f'esperimenti ajrobiċi, għandhom jiġu mibdula f'intervali regolari sabiex tiħi evitata is-saturazzjoni tagħhom u b'hekk it-telf tal-kapaċita' ta' l-abżorpzjoni tagħhom
         
            (32)  Tafal u ħama) hija il-frazzjoni minerali tas-sediment bid-daqs tal-partiċella ta' < 50 μm.
         
            (***************)  Riżultati tar-riċerka riċenti wrew li il-kejl tal-konċentrazzjonijiet tal- water oxygen l-ossiġnu ta' l-ilma u tal-potenzjalitajiet redox m'għandhomx valur la mekkanistiku u lanqas ta' tbassir fejn għandu x'jaqsam it-tkabbir u l-iżvilupp tal-popolazzjoni mikrobjali fl-ilmijiet tal-wiċċ. (24) (25).
         
            (****************)  Id-determinazzjoni tad-domanda bijokemikali ta' l-ossiġnu (BOD, fit-teħid tal-kampjuni ta' l-għelieqi, fil-bidu u fi tmiem it-test) jistgħu jkunu għodod aħjar għall-interpretazzjoni u l-evalwazzjoni tal-bijotrasformazzjoni ajrobika tar-rati u r-rotot ajrobiċi (26), il-metodu ta' fumigazzjoni (27) jew plate count measurements (eż. il-batterja, l-actinomycetes, fungi u l-kolonji totali) għal studji ajrobiċi; ir-rata tal-methanogenesis ghal studji anajrobiċi.
         
            (33)  Studji riċenti wrew li il-ħżin f'temepratura ta' 4 oC jista' jwassal għal tnaqqis tal-kontenut tal-karbonju organiku tas- sediment li jista' jirriżulta fi tnaqqis ta' l-attivita' mikorbjali (34).
         
            (34)  Test bit-tieni konċentrazzjoni jista' jkun utili għall- kemikali li jilħqu l-ilmijiet tal-wiċċ permezz ta' entry
            routes differenti u dan jwassal għal konċentrazzjonijiet differenti b'mod sinifikattiv, sakemm l-iktar konċentrazzjoni baxxa tista' tkun analizzata b'kemm jista' jkun eżattezza.
         
            (35)  F'każijiet fein ir-re-oxidation mgħaġġla tal-prodotti tat-trasformazzjoni anajrobika tista' sseħħ, il-kondizzjonijiet anajrobiċi għandhom jinżammu waqt l-ikkampjunar u l-analiżi.