CELEX: 31992R0690
Language: nl
Date: 1992-03-19 00:00:00
Title: Verordening (EEG) nr. 690/92 van de Commissie van 19 maart 1992 tot vaststelling van een referentiemethode voor de opsporing van koemelkcaseïne in schapekaas

Avis juridique important

|

31992R0690

Verordening (EEG) nr. 690/92 van de Commissie van 19 maart 1992 tot vaststelling van een referentiemethode voor de opsporing van koemelkcaseïne in schapekaas  

Publicatieblad Nr. L 074 van 20/03/1992 blz. 0023 - 0032 Bijzondere uitgave in het Fins: Hoofdstuk 3 Deel 41 blz. 0123  Bijzondere uitgave in het Zweeds: Hoofdstuk 3 Deel 41 blz. 0123 

VERORDENING (EEG) Nr. 690/92 VAN DE COMMISSIE  van 19 maart 1992  tot vaststelling van een referentiemethode voor de opsporing van koemelkcaseïne in schapekaasDE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,  Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap,  Gelet op de Akte van Toetreding van Spanje en Portugal, in het bijzonder op artikel 67, leden 1 en 2, artikel 98, artikel 234, lid 2, en artikel 310,  Gelet op Verordening (EEG) nr. 1677/85 van de Raad van 11 juni 1985 inzake de monetaire compenserende bedragen in de landbouwsector (1), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 2205/90 (2), en met name op artikel 1, lid 1,  Gelet op Verordening (EEG) nr. 804/68 van de Raad van 27 juni 1968 houdende een gemeenschappelijke ordening der markten in de sector melk en zuivelprodukten (3), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 374/92 van de Commissie (4), en met name op  artikel 9, lid 3, artikel 14, lid 7, en artikel 17, lid 4,  Gelet op Verordening (EEG) nr. 876/68 van de Raad van 28 juni 1968 tot vaststelling van de algemene voorschriften betreffende de toekenning van de restituties bij de uitvoer en de criteria voor de vaststelling van het bedrag van de restitutie in de  sector melk en zuivelprodukten (5), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 1344/86 (6), en met name op artikel 6, lid 3,  Overwegende dat in de communautaire wetgeving voor de landbouwsector speciale bepalingen gelden voor kaas die uitsluitend is vervaardigd uit schapemelk; dat, voordat deze bepalingen worden toegepast, maatregelen moeten worden genomen om ervoor te zorgen  dat het betrokken produkt niet is vervaardigd uit koemelk;  Overwegende dat op grond van Verordening (EEG) nr. 508/71 van de Raad van 8 maart 1971 houdende vaststelling van de algemene regels voor de toekenning van steun voor de particuliere opslag van bewaarkaas (7) steun kan worden verleend voor de  particuliere opslag van schapekaas; dat op grond van Verordening (EEG) nr. 876/68 voor dezelfde produkten een bijzondere restitutie kan worden toegekend; dat op grond van Verordening (EEG) nr. 1677/85 geen monetaire compenserende bedragen worden  toegepast voor de handel in produkten die zijn vervaardigd uit schapemelk; dat op grond van Verordening (EEG) nr. 466/86 van de Raad van 25 februari 1986 houdende vaststelling van de algemene voorschriften van het stelsel van compenserende bedragen   "toetreding" in de sector melk en zuivelprodukten in verband met de toetreding van Spanje (8) en Verordening (EEG) nr. 3640/90 van de Raad van 11 december 1990 tot vaststelling van de algemene voorschriften van het stelsel van compenserende bedragen   "toetreding" in de sector melk en zuivelprodukten voor de tweede etappe van de toetreding van Portugal (9) geen compenserende bedragen  "toetreding" mogen worden toegepast bij de handel in schapekaas met Spanje;  Overwegende dat, aangezien de Commissie bovengenoemde voorschriften voor schapekaas heeft vastgesteld, door middel van adequate controles moet worden geverifieerd dat geen koemelk in de betrokken produkten is verwerkt; dat het voor de controle nodig  blijkt een communautaire referentiemethode voor de opsporing van koemelk vast te stellen, zonder dat het gebruik van routinemethodes wordt uitgesloten als die voldoen aan bepaalde criteria;  Overwegende dat het Comité van beheer voor melk en zuivelprodukten geen advies heeft uitgebracht binnen de door zijn voorzitter bepaalde termijn,  HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:  Artikel 1  De in de bijlage opgenomen referentiemethode voor analyse wordt toegepast om te waarborgen dat kaas die uitsluitend uit schapemelk mag zijn vervaardigd, geen koemelkcaseïne bevat.  Koemelkcaseïne wordt geacht aanwezig te zijn, als het gehalte aan koemelkcaseïne in het geanalyseerde monster gelijk is aan of hoger is dan het betrokken gehalte van het in de bijlage beschreven referentiemonster.  Artikel 2  Routinemethoden voor de opsporing van koemelkcaseïne in schapekaas mogen worden gebruikt op de volgende voorwaarden:  - met de methode moet een gehalte van 0,5 % of lager opgespoord kunnen worden;  - de methode mag geen vals positieve resultaten geven; als dit niet uitgesloten is, dient ieder monster dat een positieve uitslag geeft met gebruikmaking van de referentiemethode te worden geanalyseerd;  - koemelkcaseïne moet ook na lange rijpingsperiodes, zoals die onder gebruikelijke handelsomstandigheden voorkomen, met de vereiste gevoeligheid kunnen worden opgespoord. Als voor een bepaalde soort schapekaas niet aan deze eis kan worden voldaan, moet  deze kaas worden geanalyseerd met gebruikmaking van de referentiemethode.  Artikel 3  Deze verordening treedt in werking op de derde dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publikatieblad van de Europese Gemeenschappen.  Zij is van toepassing met ingang van 16 september 1992. Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke Lid-Staat.  Gedaan te Brussel, 19 maart 1992. Voor de Commissie  Ray MAC SHARRY  Lid van de Commissie   (1) PB nr. L 164 van 24. 6. 1985, blz. 6. (2) PB nr. L 201 van 31. 7. 1990, blz. 9. (3) PB nr. L 148 van 28. 6. 1968, blz. 13. (4) PB nr. L 41 van 18. 2. 1992, blz. 9. (5) PB nr. L 155 van 3. 7. 1968, blz. 1. (6) PB nr. L 119 van 8. 5. 1986,  blz. 36. (7) PB nr. L 58 van 11. 3. 1971, blz. 1. (8) PB nr. L 53 van 1. 3. 1986, blz. 23. (9) PB nr. L 362 van 27. 12. 1990, blz. 3.    g BIJLAGE  REFERENTIEMETHODE VOOR DE OPSPORING VAN KOEMELKCASEÏNE IN SCHAPEKAAS   1.  Doel   Detectie van koemelkcaseïne in schapekaas door middel van iso-elektrische focussering van g-caseïne na plasminolyse.  2.  Toepassingsgebied   De methode is bruikbaar voor een gevoelige specifieke detectie van koemelkcaseïne in verse en  gerijpte schapekaas.  3.  Principe van de methode  3.1.  Isoleren van caseïnen van kaas.  3.2.  De geïsoleerde caseïnen worden opgelost en geïncubeerd met plasmine (EC.3.4.21.7).  3.3.  De met plasmine behandelde caseïnen worden iso-elektrisch  gefocusseerd in aanwezigheid van ureum en de eiwitten worden gekleurd met Coomassie briljantblauw G 250.  3.4.  De gekleurde patronen van g2-caseïne (aanwijzing voor koemelk) worden beoordeeld door vergelijken van het met het monster verkregen patroon  met het patroon dat in dezelfde gel met standaarden met 0 % en 1 % koemelk is verkregen.  4.  Reagentia   Tenzij anders aangegeven, worden chemicaliën van analysekwaliteit gebruikt. Water is tweemaal gedestilleerd of van gelijkwaardige zuiverheid.    Opmerking: De onderstaande bijzonderheden zijn van toepassing op in eigen laboratorium vervaardigde ureum bevattende polyacrylamide-gelen van 265 × 125 × 0,25 mm. Bij gebruik van gelen van een ander type of met andere afmetingen worden de  scheidingsomstandigheden zo nodig aangepast.   Iso-elektrische focussering  4.1.  Reagentia voor de bereiding van de ureum bevattende polyacrylamide-gelen.  4.1.1.  Voorraad-geloplossing   Los op in water:   4,85 g acrylamide   0,15 g  N,N-methyleen-bis-acrylamide (BIS)   48,05 g ureum   12,22 g glycerol (87 % m/m)   en vul aan tot 100 ml. Bewaar de oplossing in een bruine glazen fles in de koelkast.   Opmerking: In plaats van de genoemde afgewogen hoeveelheden van de neurotoxische  acrylamiden kan een in de handel verkrijgbare gerede oplossing van acrylamide/BIS worden gebruikt. Indien een dergelijke oplossing 30 % m/v acrylamide en 0,8 % m/v BIS bevat, wordt een volume van 16,2 ml gebruikt in plaats van de aangegeven gewichten.  De houdbaarheid van de voorraadoplossing is maximaal 10 dagen; indien de geleidbaarheid meer dan 5 mS bedraagt wordt gedeïoniseerd door 30 minuten roeren met 2 g Amberlite MB-3, gevolgd door filtreren door een 0,45 mm membraan.  4.1.2.  Geloplossing    Een geloplossing wordt bereid door mengen van chemicaliën en amfolyten met de voorraad-geloplossing (zie 4.1.1).   9,0 ml voorraadoplossing   24 mg v-alanine   500 ml amfolyt pH 3,5-9,5 (1)   500 ml amfolyt pH 6-7 (1).   De geloplossing wordt gemengd  en 2 tot 3 minuten in een ultrasoonbad of onder verminderde druk ontgast.   Opmerking: De geloplossing wordt vlak voor het gieten van het gel (zie 6.2) bereid.  4.1.3.  Katalysatoroplossingen   40 % m/v ammoniumpersulfaat (PER): 800 mg PER wordt  opgelost in 2 ml water.   N,N,N,N-tetramethyl-ethyleendiamine (TEMED).   Opmerking: Er wordt altijd een vers bereide PER-oplossing gebruikt.  4.2.  Contactvloeistof   Petroleum of vloeibare paraffine.  4.3.  Anodeoplossing   5,77 g fosforzuur (85 % m/m)  wordt met water tot 100 ml aangevuld.  4.4.  Kathodeoplossing   2,00 g natriumhydroxide wordt in water opgelost en tot 100 ml met water verdund.   Monstervoorbereiding  4.5.  Reagentia voor eiwitisolatie   Dichloormethaan.   Verdund azijnzuur (25,0 ml  ijsazijn verdund met water tot 100 ml).   Aceton.  4.6.  Eiwitoplossende buffer   5,75 g glycerol (87 % m/m)   24,03 g ureum   250 mg dithiotreïtol   worden in gedestilleerd water opgelost en tot 50 ml aangevuld.   Opmerking: Wordt in de koelkast  bewaard; houdbaarheid 1 week.  4.7.  Reagentia voor plasminesplitsing van caseïne  4.7.1.  Ammoniumcarbonaatbuffer   Een 0,2 mol/l oplossing van ammoniumwaterstofcarbonaat (1,58 g/100 ml water) wordt tot pH 8 getitreerd met een 0,2 mol/l oplossing van  ammoniumcarbonaat (1,92 g/100 ml water).  4.7.2.  Runderplasmine (EC.3.4.21.7), activiteit ten minste 5 U/ml  4.7.3.  Enzymremmingsoplossing   2,624 g e-aminocapronzuur (6-aminonhexaanzuur) wordt opgelost in 100 ml 40 % (v/v) ethanol.  4.8.  Bereiding  van standaarden van gestremde magere schapemelk met 0 % en 1 % koemelk   Magere melk wordt bereid door 20 minuten centrifugeren van rauwe schapemelk of koemelk bij 37 °C bij 2 500 g. Nadat de buis met inhoud snel tot 6-8 °C is afgekoeld, wordt de  bovendrijvende vetlaag volledig verwijderd. Voor de bereiding van de standaard van 1 % wordt in een bekerglas van 1 liter 5,00 ml magere koemelk aan 495 ml magere schapemelk toegevoegd, waarna de pH door toevoeging van verdund melkzuur (10 % m/v) op 6,4  wordt gebracht. De temperatuur wordt op 35 °C ingesteld, waarna 100 ml kalfsstremsel (1: 10 000, circa 3 000 U/ml) wordt toegevoegd, 1 minuut wordt geroerd en de beker 1 uur afgedekt met aluminiumfolie op 35 °C wordt gehouden zodat de wrongel zich kan  vormen. Nadat de wrongel is gevormd, wordt de gestremde melk in zijn geheel gevriesdroogd, zonder voorafgaand homogeniseren of aftappen van de wei. Na het vriesdrogen wordt het produkt fijngemalen tot een homogeen poeder.   Voor bereiding van de  standaard van 0 % wordt dezelfde werkwijze gevolgd met 500 ml zuivere magere schapemelk.   Opmerking: Het verdient aanbeveling de zuiverheid van de schapemelk voorafgaande aan de bereiding van de standaarden te controleren door middel van  iso-elektrische focussering van de met plasmine behandelde caseïnen.   Reagentia voor eiwitkleuring  4.9.  Fixeeroplossing   150 ml trichloorazijnzuur wordt opgelost in water en tot 1 000 ml aangevuld.  4.10.  Ontkleuroplossing   500 ml methanol en 200  ml ijsazijn worden tot 2 000 ml met gedestilleerd water aangevuld.   Opmerking: De ontkleuroplossing wordt dagelijks vers bereid, eventueel door mengen van een voorraadoplossing (van 50 % (v/v) methanol en 20 % (v/v) ijsazijn) met een gelijk volume  water.  4.11.  Kleuroplossingen  4.11.1.  Kleuroplossing (voorraadoplossing 1)   3,0 g Coomassie briljantblauw G 250 (Color Index 42655) wordt met behulp van een magneetroerder in ongeveer 45 minuten opgelost in 100 ml 90 % (v/v) methanol, waarna wordt  afgefiltreerd door twee middelsnelle vouwfilters.  4.11.2.  Kleuroplossing (voorraadoplossing 2)   5,0 g kopersulfaat-pentahydraat wordt opgelost in 1 000 ml 20 % (v/v) azijnzuur.  4.11.3.  Kleuroplossing (werkoplossing)   125 ml van elk van de  voorraadoplossingen (4.11.1, 4.11.2) wordt vlak voor de kleurreactie gemengd.   Opmerking: De kleuroplossing dient na de dag van bereiding niet opnieuw te worden gebruikt.  5.  Apparatuur  5.1.  Glasplaten (265 × 125 × 4 mm); rubberen rol (breedte 15  cm); vlakke tafel  5.2.  Gel-dragerfolie (265 × 125 mm)  5.3.  Afdekfolie (280 × 125 mm). Langs beide lange zijden wordt een strook plakband (280 × 6 × 0,25 mm) gehecht (zie fig. 1)  5.4.  Elektrofocusseringskamer met koelplaat (b.v. 265 × 125 mm) met  geschikte spanningsbron ( 2,5 kV) of automatische elektroforese-inrichting  5.5.  Rondpompcryostaat, gethermostatifeerd op 12 ± 0,5 °C  5.6.  Centrifuge, instelbaar op 3 000 g  5.7.  Elektrodestroken ( 265 mm lang)  5.8.  Plastic druppelflessen voor  anodeoplossing en kathodeoplossing  5.9.  Monsterdragers (10 × 5 mm viscose of weinig eiwitabsorberend filtreerpapier)  5.10.  Roestvast stalen schaar, mes en pincet  5.11.  Roestvast stalen of glazen kleurings- en ontkleuringsschalen (b.v.  instrumentbakjes van 265 × 150 mm)  5.12.  Instelbare staafhomogenisator (schachtdiameter 10 mm), snelheidsregeling tussen 8 000 en 20 000 tpm  5.13.  Magneetroerder  5.14.  Ultrasoonbad  5.15.  Filmlasapparaat  5.16.  Micropipetten van 5-25 ml  5.17.   Vacuuemverdamper of vriesdroger  5.18.  Thermostatisch geregeld waterbad, instelbaar op 35 en 40 ± 1 °C, met schudinrichting  5.19.  Densitometer met aflezing bij l=634 nm  6.  Werkwijze  6.1.  Monstervoorbereiding  6.1.1.  Isoleren van caseïnen   Een  met 5 g droge massa overeenkomende hoeveelheid kaas of standaard - bij schimmelkaas zo veel mogelijk het onrijpe midden gebruiken - wordt afgewogen in een centrifugebuis van 100 ml, er wordt 60 ml water toegevoegd en gehomogeniseerd met een  staafhomogenisator (8 000-10 000 tpm) 5.12. De pH wordt met verdund azijnzuur (4.5) op 4,6 gebracht en het geheel wordt gecentrifugeerd (5 minuten, 3 000 g). Het vet en de wei worden gedecanteerd, het residu wordt in 40 ml gedestilleerd water (met  verdund azijnzuur (4.5) op pH 4-5 gebracht) gehomogeniseerd (20 000 tpm), er wordt 20 ml dichloormethaan (4.5) toegevoegd, waarna opnieuw wordt gehomogeniseerd en wordt gecentrifugeerd (5 minuten, 3 000 g). De caseïnelaag, die tussen de waterfase en de  organische fase drijft (zie fig. 2), wordt met een spatel opgetrokken en beide fasen worden afgeschonken. De caseïne wordt opnieuw gehomogeniseerd in 40 ml gedestilleerd water (zie boven) en 20 ml dichloormethaan en gecentrifugeerd. Deze bewerkingen  worden herhaald totdat de beide extractiefasen kleurloos zijn (2 tot 3 maal). Het eiwitresidu wordt gehomogeniseerd met 50 ml droge aceton (4.5) en door een middelsnel vouwfilterpapier gefiltreerd. Het residu op het filter wordt tweemaal met telkens 25  ml aceton gewassen, aan de lucht of onder een stikstofstroom gedroogd en in een mortier verpoederd.    Opmerking: Droge geïsoleerde eiwitten zijn bij kamertemperatuur onbeperkt houdbaar. Voor een snelle isolatie van eiwit wordt een hoeveelheid kaas die overeenkomt met 5 g droge massa tweemaal met telkens 100 ml aceton (4.5) bij 20 000 tpm  gehomogeniseerd, 5 minuten laten staan en vervolgens door een vouwfilter afgefiltreerd. Het eiwitresidu wordt gedroogd als hierboven beschreven, waarna het met aceton gedroogde poeder wordt verkregen. Deze snelle methode is niet toepasbaar op kaas van  het type Roquefort.  6.1.2.  Plasminesplitsing van v-caseïnen ter versterking van g-caseïnen   25 mg geïsoleerde caseïne of 50 mg van de gevriesdroogde standaards (4.8) of van het met aceton gedroogde poeder van de snelle eiwitisolatie wordt  gesuspendeerd in 0,5 ml ammoniumcarbonaat-buffer (4.7.1) en 20 minuten gehomogeniseerd, in een ultrasonic behandeling (5.14). Na verwarming tot 40 °C wordt 10 ml plasmine (4.7.2) toegevoegd, gemengd en één uur bij 40 °C onder voortdurend schudden  geïncubeerd. Hierna wordt ter remming van het enzym 20 ml e-aminocapronzuuroplossing (4.7.3) toegevoegd, waarna 200 mg vast ureum en 2 mg dithiotreïtol worden toegevoegd.   Opmerking: Ten einde meer symmetrie in de gefocusseerde caseïnebanden te  verkrijgen verdient het aanbeveling de oplossing na de toevoeging van het e-aminocapronzuur te vriesdrogen en de residuen vervolgens in 0,5 ml ureumbuffer (4.6) op te lossen.  6.2.  Bereiding van de ureum houdende acrylamidegelen   Het gel-dragerfolie  (5.2) wordt met behulp van enkele druppels water op een gasplaat (5.1) gerold, waarna eventueel overtollig water met een papieren handdoek of een tissue wordt verwijderd. Het afdekfolie (5.3) wordt op dezelfde wijze met afstandhouders (0,25 mm) op een  tweede gasplaat gerold. De plaat wordt horizontaal op een vlakke tafel gelegd.   Aan de bereide en ontluchte geloplossing (4.1.2) wordt van elk van de katalysatoroplossingen van TEMED en PER (4.1.3) 10 ml toegevoegd, waarna het geheel kort wordt gemengd  en gelijkmatig over het midden van het dekblad uitgegoten. Plaats de plaat met het gel-dragerfolie op een smalle kant en met de bladkant naar beneden op het afdekfolie en laat de plaat met het gel-dragerfolie langzaam zakken, zodat zich tussen de bladen  een gelfilm vormt die zich gelijkmatig en zonder bellen verspreidt (zie fig. 3). De plaat met het gel-dragerfolie wordt helemaal naar beneden gelaten, waarbij een dunne spatel wordt gebruikt, en bij wijze van gewicht worden nog drie gasplaten op de  plaat gelegd. Wanneer de polymerisatie is voltooid (ongeveer 60 minuten), wordt de op de plaat met het gel-dragerfolie gepolymeriseerde gel samen met het afdekfolie door tikken op de glasplaten verwijderd. De achterkant van de plaat met het  gel-dragerfolie wordt zorgvuldig van gelresten en ureum ontdaan. De  "gel-sandwich" wordt in plasticfolie gelast en bewaard in de koelkast (max. 6 weken).   Opmerking: De afdekfolie met afstandhouders kan opnieuw worden gebruikt. De polyacrylamidegel  kan in kleinere stukken worden gesneden, hetgeen aanbeveling verdient wanneer er weinig monsters zijn of wanneer een automatische elektroforese-inrichting wordt gebruikt (2 gelen, afmetingen 4,5 × 5 cm).  6.3.  Iso-elektrische focussering   De  koelthermostaat wordt op 12 °C ingesteld. De achterkant van het geldragerfolie wordt met petroleum afgeveegd, waarna midden op het koelblok enkele druppels petroleum (4.2) worden aangebracht. De gel-sandwich wordt met de dragerzijde naar beneden op het  koelblok gelegd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er geen bellen ontstaan. Eventuele overtollige petroleum wordt weggeveegd en het afdekfolie wordt verwijderd. De elektrodestroken worden in de elektrodeoplossingen (4.3, 4.4) nat gemaakt, op de lengte  van de gel afgeknipt en op de in aanmerking komende posities aangebracht (afstand tussen de elektroden 9,5 cm).   De focussering wordt uitgevoerd onder de onderstaande omstandigheden:  6.3.1.  Gelformaat 265 × 125 × 0,25 mm         Stap  Tijd (min)   Voltage (V)  Stroomsterkte (mA)  Vermogen (W)  Volt-uur (Vh)         1. Prefocussering  30  max. 2 500  max. 15  const. 4  ca. 300  2. Monsterfocussering (*)  60  max. 2 500  max. 15  const. 4  ca. 1 000  3. Eindfocussering  60  max. 2 500  max. 5   max. 20  ca. 3 000   40  max. 2 500  max. 6  max. 20  ca. 3 000   30  max. 2 500  max. 7  max. 25  ca. 2 500          (*) Opbrengen monster: Na de prefocussering (stap 1) wordt telkens 18 ml (5.9) van de monsteroplossingen op de monsterdragers  gepipetteerd en deze worden met een onderlinge tussenruimte van 1 mm en op een afstand van 5 mm in de lengterichting van de anode op de gel gelegd en zachtjes aangedrukt. De focussering wordt onder de hierboven aangegeven omstandigheden uitgevoerd en na  de 60 minuten van de focussering van de monsters worden de monsterdragers voorzichtig verwijderd.      Opmerking: Indien de dikte of de breedte van de gelen wordt veranderd, dienen de waarden voor de stroomsterkte en het vermogen te worden aangepast  (b.v. tweemaal zo hoge waarden voor de stroomsterkte en voor het vermogen bij gebruik van een gel van 265 × 125 × 0,5 mm).  6.3.2.  Voorbeeld van een voltageprogramma voor een automatische elektroforese-inrichting (2 gelen van 5,0 × 4,5 cm), elektroden  zonder stroken rechtstreeks op de gel aangebracht         Stap  Spanning  Stroomsterkte  Vermogen  Temperatuur  Volt-uur         1. Prefocussering  1 000 V  10,0 mA  3,5 W  8 °C  85 Vh  2. Monsterfocussering  250 V  5,0 mA  2,5 W  8 °C  30 Vh  3.  Focussering  1 200 V  10,0 mA  3,5 W  8 °C  80 Vh  4. Focussering  1 500 V  5,0 mA  7,0 W  8 °C  570 Vh          De monsterdrager wordt in stap 2 bij 0 Vh aangebracht.   De monsterdrager wordt in stap 2 bij 30 Vh verwijderd.  6.4.  Eiwitkleuring  6.4.1.   Eiwit-fixering   Direct na het uitschakelen van de stroom worden de elektrodestroken verwijderd en wordt de gel in een kleurings-/ontkleuringsschaal met 200 ml fixeermiddel (4.9) gebracht; 15 minuten laten staan onder af en toe schudden.  6.4.2.   Wassen en kleuren het gel   Giet het fixeermiddel volledig af en was de gelplaat tweemaal telkens 30 seconden met 100 ml ontkleuroplossing (4.10). De ontkleuroplossing wordt afgegoten en de schaal wordt met 250 ml kleuroplossing (4.11.3) gevuld; de  kleur wordt onder zachtjes schudden in 45 minuten ontwikkeld.  6.4.3.  Ontkleuren van de gelplaat   De kleuroplossing wordt afgegoten en de gelplaat wordt tweemaal telkens met 100 ml ontkleuroplossing gewassen en ten minste 2 × 15 minuten met 200 ml  ontkleuroplossing geschud, totdat de achtergrond schoon en ongekleurd is. Vervolgens wordt de gelplaat gespoeld met gedestilleerd water (2 × 2 minuten) en aan de lucht in 2 tot 3 uur of met een foehn in 10 tot 15 minuten gedroogd.   Opmerking: Het  fixeren, wassen, kleuren en ontkleuren wordt uitgevoerd bij 20 °C. Geen hogere temperaturen toepassen.  7.  Beoordeling   De beoordeling vindt plaats door vergelijking van de eiwitpatronen van het monster met die van referentiemonsters op dezelfde gel.  Detectie van koemelk in schapemelk of in de produkten daarvan geschiedt aan de hand van de g2- en g3-caseïnen die zijn versterkt door behandeling met plasmine (zie 6.1.2), waarvan het iso-elektrisch punt ligt tussen pH 6,5 en pH 7,5 (zie fig. 4 en 5).  De detectiegrens ligt beneden 0,5 %. Voor een visuele beoordeling van de hoeveelheid koemelk verdient het aanbeveling de concentraties van monsters en standaarden aan te passen zodat vergelijkbare intensiteiten van de g2-caseïnen worden verkregen (zie   "g2 S" in fig. 4 en 5). Daarna kan de hoeveelheid koemelk (minder dan, gelijk aan of meer dan 1 %) in het onbekende monster rechtstreeks worden bepaald door vergelijking van de intensiteit van de runder-g2-caseïnen (zie  "g2 C" in fig. 4 en 5). Zo  mogelijk wordt voor de bepaling van de verhouding van piekoppervlakken van runder- tot schape-g2-caseïnen densitometrie toegepast (zie fig. 5). De hiermee verkregen waarde wordt vergeleken met de verhouding van g2-caseïnen in de op dezelfde gel  geanalyseerde standaard van 1 %.   Opmerking: De methode werkt bevredigend wanneer er in de standaard van 1 % een duidelijk positief signaal voor runder-g2-caseïne is en in de standaard van 0 % niet. Is dat anders, dan dient de procedure aan de hand van  de bijzonderheden van de methode te worden verbeterd.  8.  Literatuurverwijzingen   Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of  bovine milk in ovine cheese by gel isoelectric focusing of g2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).   Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier  ampholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of g2-caseins using plasmin as signal amplifier. In: Electrophoresis-Forum '89 (B.J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, Munich (1989).   Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von  Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -kaese durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaligen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).   Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Z. Lebensm. Unters. Forsch. (in  voorbereiding).   Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 mm polyacrylamide gels on silanized glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).  Fig. 1. Schematische tekening van het dekblad  Afstandsband  Polyesterfilm  Fig. 2. Caseïnelaag die na centrifugering tussen de waterlaag en de organische laag drijft  H2O-fase  Caseïne  CH2Cl2-fase  Fig. 3. Opklapmethode voor het gieten van ultradunne polyacrylamidegelen. a = afstandsband (0,25 mm); b = dekblad (5.3); c, e = glasplaten (5.1); d = geloplossing (4.1.2); f = gel-draagblad (5.2)                   Fig. 4. Iso-elektrische focussering van met plasmine behandelde caseïnen van kaas van het type Pecorino met verschillende hoeveelheden koemelk. % CM = percentage koemelk, C = koe, S = schaap  Kaas van het type Pecorino met:  Fig. 5. Superpositie van densitogrammen van monsters kaas van het type Pecorino met 0, 1, 2, 3 en 7 % koemelk, na iso-elektrische focussering. De bovenste helft van de IEF-gel is onderzocht bij l = 634 nm. STD = standaarden met 0 en 1 % koemelk   (1) De produkten Ampholine pH 3,5-9,5 (Pharmacia-LKB) en Servalyt pH 6-7 (Serva) blijken bijzonder geschikt voor het bewerkstelligen van de gewenste scheiding van -caseïnen.