CELEX: 32002R2091
Language: cs
Date: 2002-11-26 00:00:00
Title: Nařízení Komise (ES) č. 2091/2002 ze dne 26. listopadu 2002, kterým se mění nařízení (ES) č. 2870/2000, kterým se stanoví referenční metody Společenství používané pro rozbor lihovin

Důležité právní upozornění

|

32002R2091

Nařízení Komise (ES) č. 2091/2002 ze dne 26. listopadu 2002, kterým se mění nařízení (ES) č. 2870/2000, kterým se stanoví referenční metody Společenství používané pro rozbor lihovin  

Úřední věstník L 322 , 27/11/2002 S. 0011 - 0027 CS.ES Kapitola 3 Svazek 37 S. 395  - 411 ET.ES Kapitola 3 Svazek 37 S. 395  - 411 HU.ES Kapitola 3 Svazek 37 S. 395  - 411 LT.ES Kapitola 3 Svazek 37 S. 395  - 411 LV.ES Kapitola 3 Svazek 37 S. 395  - 411 MT.ES Kapitola 3 Svazek 37 S. 395  - 411 PL.ES Kapitola 3 Svazek 37 S. 395  - 411 SK.ES Kapitola 3 Svazek 37 S. 395  - 411 SL.ES Kapitola 3 Svazek 37 S. 395  - 411

		Nařízení Komise (ES) č. 2091/2002ze dne 26. listopadu 2002,kterým se mění nařízení (ES) č. 2870/2000, kterým se stanoví referenční metody Společenství používané pro rozbor lihovinKOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství,s ohledem na nařízení Rady (EHS) č. 1576/89 ze dne 29. května 1989, kterým se stanoví obecná pravidla pro definici, označování a obchodní úpravu lihovin [1], ve znění aktu o přistoupení Rakouska, Finska a Švédska, a zejména na čl. 4 odst. 8 uvedeného nařízení,vzhledem k těmto důvodům:(1) V příloze nařízení Komise (ES) č. 2870/2000 ze dne 19. prosince 2000, kterým se stanoví referenční metody Společenství používané pro rozbor lihovin [2], jsou popsány příslušné metody.(2) Čtyři metody rozboru pro stanovení trans-anetholu v anýzových lihovinách, stanovení glycyrrhizové kyseliny a chalkonů v pastisu a vaječného žloutku ve vaječném likéru a v likéru s přídavkem vajec byly validovány podle mezinárodně uznávaných postupů v rámci výzkumného projektu podporovaného Komisí.(3) Tyto čtyři metody lze uznat za referenční metody Společenství a musí být doplněny do nařízení (ES) č. 2870/2000.(4) Opatření tohoto nařízení jsou v souladu se stanoviskem Prováděcího výboru pro lihoviny,PŘIJALA TOTO NAŘÍZENÍ:Článek 1Příloha nařízení (ES) č. 2870/2000 se mění takto:1. v obsahu přílohy se v kapitolách V, VI, VII a IX zrušují slova "(p.m.)";2. za kapitolu III se vkládají kapitoly V, VI, VII a IX uvedené v příloze tohoto nařízení.Článek 2Toto nařízení vstupuje v platnost sedmým dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství.Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.V Bruselu dne 26. listopadu 2002.Za KomisiFranz Fischlerčlen Komise[1] Úř. věst. L 160, 12.6.1989, s. 1.[2] Úř. věst. L 333, 29.12.2000, s. 20.--------------------------------------------------PŘÍLOHAV. ANETHOL. STANOVENÍ trans-ANETHOLU V LIHOVINÁCH PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ1. Oblast použitíTato metoda je vhodná pro stanovení trans-anetholu v anýzových lihovinách kapilární plynovou chromatografií.2. Odkazy na normyISO 3696: 1987, Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.3. Podstata metodyKoncentrace trans-anetholu v lihovině se stanoví plynovou chromatografií (GC). Ke zkušebnímu vzorku a k referenčnímu roztoku trans-anetholu o známé koncentraci se přidá stejné množství vnitřního standardu, např. 4-allylanisolu (estragolu), pokud vzorek neobsahuje přirozené množství estragolu; zkušební roztok i referenční roztok se zředí 45 % roztokem ethanolu a přímo se nastříknou do plynového chromatografu. U likérů, které obsahují velké množství cukrů, je nezbytné provést extrakci před přípravou vzorku a rozborem.4. Reakční činidla a materiálPři rozboru se použijí pouze reakční činidla o čistotě nejméně 98 %. Použije se voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696.Referenční materiály se skladují v chladu (při 4 °C), chráněny před světlem, v hliníkových nádobách nebo tmavých (hnědých) skleněných reagenčních láhvích. Zátky by měly být překryty nejlépe hliníkovou fólií. Před použitím musí být krystalický anethol převeden táním do kapalné fáze, teplota však při tom nesmí v žádném případě překročit 35 °C.4.1 Ethanol o 96 % objemových (CAS 64-17-5).4.2 1-methoxy-4-(prop-1-en-1-yl)benzen, (trans-anethol) (CAS 4180-23-8).4.3 4-allylanisol, (estragol) (CAS 140-67-0), doporučený vnitřní standard (IS).4.4 Ethanol o 45 % objemovýchK 378 g ethanolu o 96 % objemových se přidá 560 g destilované vody.4.5 Příprava standardních roztokůVšechny standardní roztoky se skladují při laboratorní teplotě (15 až 35 °C), chráněny před světlem, v hliníkových nádobách nebo tmavých (hnědých) skleněných reagenčních láhvích. Zátka by měla být překryta nejlépe hliníkovou fólií.trans-Anethol a 4-allylanisol jsou prakticky nerozpustné ve vodě a před přidáním ethanolu o 45 % objemových (4.4) musí být rozpuštěny v malém množství ethanolu o 96 % objemových(4.1).Zásobní roztoky musí být každý týden čerstvě připraveny.4.5.1 Standardní roztok AZásobní roztok trans-anetholu (koncentrace: 2 g/l)Do odměrné baňky na 20 ml se odváží 40 mg trans-anetholu (4.2) (nebo 400 mg do odměrné baňky na 200 ml, atd.). Přidá se malé množství ethanolu o 96 % objemových (4.1), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.4.5.2 Roztok vnitřního standardu BZásobní roztok vnitřního standardu, např. estragolu (koncentrace: 2 g/l)Do odměrné baňky na 20 ml se odváží 40 mg estragolu (4.3) (400 mg do odměrné baňky na 200 ml, atd.). Přidá se malé množství ethanolu o 96 % objemových (4.1), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.4.5.3 Roztoky pro kontrolu linearity odezvy plamenově-ionizačního detektoru (FID)Pro účely rozboru musí být kontrolována linearita odezvy FID, přičemž musí být zohledněn rozsah koncentrací trans-anetholu v lihovinách, který je 0 až 2,5 g/l. Při rozboru se neznámé vzorky lihovin, u nichž má být prováděn rozbor, ředí 10krát (8.3). Pro podmínky rozboru popsané v této metodě se následujícím způsobem připraví zásobní roztoky odpovídající těmto koncentracím trans-anetholu ve vzorku, u něhož má být prováděn rozbor: 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 a 0,25 g/l: do jednotlivých odměrných baněk na 20 ml se pipetou odměří 0,5, 1, 1,5, 2 a 2,5 ml zásobního roztoku A (4.5.1); do každé baňky se pipetou odměří 2 ml roztoku vnitřního standardu B (4.5.2), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.Jako roztok o koncentraci 0 g/l se použijí roztoky určené pro slepý pokus (8.4).4.5.4 Standardní roztok CDo odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml standardního roztoku A (4.5.1), poté se přidají 2 ml roztoku vnitřního standardu B (4.5.2), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.5. Přístroje a vybavení5.1 Kapilární plynový chromatograf vybavený plamenově-ionizačním detektorem (FID), integrátorem nebo jiným zařízením pro zpracování dat, které umožňuje měřit plochy píků nebo výšky píků, a automatickým dávkovačem nebo nezbytným zařízením pro ruční nástřik vzorku.5.2 Nástřikový systém split/splitless5.3 Kapilární kolona, například:Délka: 50 mVnitřní průměr: 0,32 mmTloušťka filmu: 0,2 μmStacionární fáze: FFAP – zesítěný porézní modifikovaný TPA polyethylenglykol.5.4 Obvyklé laboratorní vybavení: Kalibrované odměrné laboratorní sklo, analytické váhy (přesnost: ±0,1 mg).6. Chromatografické podmínkyTyp kolony, její rozměry a chromatografické podmínky se zvolí tak, aby došlo k oddělení anetholu od vnitřního standardu a od jakýchkoli rušivých látek. Typické podmínky pro kolonu uvedenou jako příklad v bodě 5.3 jsou tyto:6.1 Nosný plyn: helium p. a.6.2 Průtok: 2 ml/min6.3 Teplota nástřiku: 250 °C6.4 Teplota detektoru: 250 °C6.5 Teplotní podmínky pece: isotermní, 180 °C, doba analýzy (běhu) 10 minut6.6 Nastřikovaný objem: 1 μl, dělicí poměr 1: 40.7. VzorkyVzorky se skladují při laboratorní teplotě, chráněny před světlem a chladem.8. Postup8.1 Orientační zkouška vzorku na přítomnost estragoluPro ujištění, že vzorek neobsahuje přirozené množství estragolu, se provede rozbor vzorku bez přídavku jakéhokoli vnitřního standardu. Obsahuje-li vzorek přirozené množství estragolu, musí být zvolen jiný vnitřní standard (například menthol).Do odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml vzorku, objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.8.2 Příprava neznámých vzorkůDo odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml vzorku, poté se přidají 2 ml roztoku vnitřního standardu B (4.5.2), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.8.3 Roztok určený pro slepý pokusDo odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml roztoku vnitřního standardu B (4.5.2), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.8.4 Test linearityPřed zahájením rozboru se zkontroluje linearita odezvy FID tak, že se třikrát po sobě proměří každý ze standardních roztoků pro kontrolu linearity odezvy (4.5.3).Z hodnot ploch píků nebo výšek píků získaných z integrátoru pro každý nástřik se sestrojí graf závislosti poměru R na koncentraci jejich mateřského roztoku v g/l.R; = výška nebo plocha píku trans-anetholu dělená výškou nebo plochou píku estragolu.Měla by být získána lineární závislost.8.5 StanoveníV dále uvedeném pořadí se provede nástřik roztoku určeného pro slepý pokus (8.3), standardního roztoku C (4.5.4), jednoho ze standardních roztoků pro kontrolu linearity odezvy (4.5.3), který bude sloužit jako vzorek pro řízení jakosti (může být zvolen podle pravděpodobné koncentrace trans-anetholu v neznámém vzorku) a pěti neznámých vzorků (8.2); po každých pěti neznámých vzorcích se nastříkne standard pro kontrolu linearity odezvy (řízení jakosti), aby byla potvrzena stabilita rozboru.9. Výpočet odezvového faktoruZměří se plochy píků (integrátorem nebo jiným systémem zpracování dat) nebo (ručně) výšky píků trans-anetholu a vnitřních standardů.9.1 Výpočet odezvového faktoru (RFi)Odezvový faktor se vypočte takto:RFi = (Ci/(plochai nebo výškai))*((plochais nebo výškais)/Cis)kde:Ci  je koncentrace trans-anetholu ve standardním roztoku A (4.5.1)Cis  je koncentrace vnitřního standardu ve standardním roztoku B (4.5.2)plochai  je plocha (nebo výška) píku trans-anetholuplochais  je plocha (nebo výška) píku vnitřního standarduRFi se vypočte z pěti vzorků roztoku C (4.5.4).9.2 Rozbor roztoků pro kontrolu linearity odezvyNastříknou se roztoky pro kontrolu linearity odezvy (4.5.3).9.3 Rozbor vzorkuNastříkne se roztok neznámého vzorku (8.2).10. Výpočet výsledkůVzorec pro výpočet koncentrace trans-anetholu zní takto:ci=Cis*((plochai nebo výškai)/(plochais nebo výškais))*RFikde:ci  je neznámá koncentrace trans-anetholuCis  je koncentrace vnitřního standardu v neznámém vzorku (4.5.2)plochai nebo výškai  je plocha nebo výška píku trans-anetholuplochais nebo výškais  je plocha nebo výška píku vnitřního standarduRFi  je odezvový faktor (vypočtený podle bodu 9.1)Koncentrace trans-anetholu se vyjadřuje v gramech na litr na jedno desetinné místo.11. Zabezpečení a řízení jakostiNa chromatogramech musí být anethol oddělen od vnitřního standardu a od ostatních rušivých látek. Hodnota RFi se vypočte z výsledků pro pět po sobě jdoucích nástřiků roztoku C (4.5.4). Leží-li variační koeficient (CV % = (směrodatná odchylka/průměr)*100)) v intervalu ± 1 %, je průměrná hodnota RFi přijatelná.Výše uvedený výpočet se použije pro výpočet koncentrace trans-anetholu ve vzorku pro řízení jakosti vybraného z roztoků pro kontrolu linearity odezvy (4.5.3).Nacházejí-li se vypočtené průměrné výsledky z rozboru roztoků pro kontrolu linearity odezvy zvolených jako vzorky pro vnitřní řízení jakosti (IQC) v intervalu ± 2,5 % kolem jejich teoretické hodnoty, lze výsledky neznámých vzorků přijmout.12. Zpracování vzorků lihovin obsahujících velké množství cukru a zpracování vzorků likérů před rozborem GCExtrakce alkoholu z lihovin obsahujících velké množství cukru s cílem umožnit stanovení koncentrace trans-anetholu kapilární plynovou chromatografií.12.1 Podstata metodyK alikvotnímu množství vzorku likéru se přidá vnitřní standard v koncentraci, která je srovnatelná s koncentrací analytu (trans-anetholu) v likéru. Poté se přidá fosforečnan sodný dodekahydrát a bezvodý síran amonný. Výsledná směs se dobře protřepe a ochladí, přičemž se vytvoří dvě fáze; horní alkoholová fáze se oddělí. Z této alkoholové fáze se odebere alikvot, který se zředí ethanolem o 45 % objemových (4.4) (Poznámka: na tomto stupni se nepřidává žádný vnitřní standard, neboť již byl přidán). U výsledného roztoku se provádí rozbor plynovou chromatografií.12.2 Reakční činidla a materiálPři extrakci se používají pouze reakční činidla o čistotě vyšší než 99 %.12.2.1 Síran amonný bezvodý, (CAS 7783-20-2).12.2.2 Hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát, (CAS 10039-32-4).12.3 Přístroje a vybaveníErlenmeyerovy baňky, dělicí nálevky, lednička.12.4 Postup12.4.1 Orientační zkouška vzorku na estragolPro ujištění, že vzorek neobsahuje přirozené množství estragolu, se provede extrakce roztoku pro slepý pokus (12.6.2) a rozbor se provede bez přídavku jakéhokoli vnitřního standardu. Obsahuje-li vzorek přirozené množství estragolu, musí být zvolen jiný vnitřní standard.12.4.2 ExtrakceDo Erlenmeyerovy baňky se pipetou odměří 5 ml ethanolu o 96 % objemových (4.1), odváží se 50 mg vnitřního standardu (4.3) a přidá se 50 ml vzorku. Přidá se 12 g bezvodého síranu amonného (12.2.1) a 8,6 g hydrogenfosforečnanu sodného dodekahydrátu (12.2.2). Erlenmeyerova baňka se uzavře zátkou.Baňka se alespoň 30 minut protřepává. Může být použita mechanická třepačka, nikoli však teflonové magnetické míchadlo, neboť teflon může adsorbovat malé množství analytu. Je třeba poznamenat, že se přidaná sůl nerozpustí beze zbytku.Erlenmeyerova baňka uzavřená zátkou se umístí alespoň na dvě hodiny do ledničky (T < 5 °C).Za tuto dobu se vytvoří dvě oddělené kapalné fáze a pevný zbytek. Alkoholová fáze by měla být čirá; v opačném případě se baňka opět umístí do ledničky, dokud nebude dosaženo úplného oddělení.Poté, co se alkoholová fáze vyčeří, se opatrně odebere alikvot (např. 10 ml), aniž se poruší vodná fáze, převede se do tmavé ampulky a bezpečně se uzavře.12.4.3 Příprava extrahovaného vzorku určeného k rozboruExtrakt se nechá (12.4.2) temperovat na laboratorní teplotu.Do odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml temperované alkoholové fáze extrahovaného vzorku, objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.12.5 StanoveníPoužije se postup uvedený v bodě 8.5.12.6 Výpočet výsledkůVýsledky se vypočtou pomocí následujícího vzorce:Ci = (mis/V)*(plochai/plochais)*RFikde:mis  je hmotnost vnitřního standardu (4.3) použitého v bodě 12.4.2 (v miligramech)V  je objem neznámého vzorku (50 ml)RFi  je odezvový faktor (9.1)plochai  je plocha píku trans-anetholuplochais  je plocha píku vnitřního standarduVýsledky se vyjádří v gramech na litr na jedno desetinné místo.12.7 Zabezpečení a řízení jakostiPoužije se postup uvedený výše v bodě 11.13. Pracovní charakteristiky metody (přesnost)Statistické výsledky mezilaboratorního testu:v následujících tabulkách jsou uvedeny hodnoty pro anethol.Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem.Rok provedení mezilaboratorního testu | 1998 |Počet laboratoří | 16 |Počet vzorků | 10 |Analyt | anethol |Pastis:Vzorky | A | B | C | D | E | F |Počet zahrnutých laboratoří po vyloučení odlehlých výsledků | 15 | 15 | 15 | 13 | 16 | 16 |Počet odlehlých výsledků (laboratoří) | 1 | 1 | 1 | 3 | — | — |Počet zahrnutých výsledků | 30 | 30 | 30 | 26 | 16 | 16 |Střední hodnota g/l | 1,477 | 1,955 | 1,940 | 1,833 | 1,741 | 1,754 |Směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (Sr) g/l | 0,022 | 0,033 | 0,034 | 0,017 | — | — |Relativní směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (RSDr) (%) | 1,5 | 1,7 | 1,8 | 0,9 | — | — |Mez opakovatelnosti (r) g/l | 0,062 | 0,093 | 0,096 | 0,047 | — | — |Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) g/l | 0,034 | 0,045 | 0,063 | 0,037 | 0,058 | 0,042 |Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR) (%) | 2,3 | 2,3 | 3,2 | 2,0 | 3,3 | 2,4 |Mez reprodukovatelnosti (R) g/l | 0,094 | 0,125 | 0,176 | 0,103 | 0,163 | 0,119 |Druhy vzorků:A  pastis, neoznačené duplikátyB  pastis, neoznačené duplikátyC  pastis, neoznačené duplikátyD  pastis, neoznačené duplikátyE  pastis, jeden vzorekF  pastis, jeden vzorek.Další anýzové lihoviny:Vzorky | G | H | I | J |Počet zahrnutých laboratoří po vyloučení odlehlých výsledků | 16 | 14 | 14 | 14 |Počet odlehlých výsledků (laboratoří) | — | 2 | 1 | 1 |Počet zahrnutých výsledků | 32 | 28 | 28 | 28 |Střední hodnota g/l | 0,7780,530 (*) | 1,742 | 0,351 | 0,599 |Směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (Sr) g/l | 0,020 | 0,012 | 0,013 | 0,014 |Relativní směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (RSDr) (%) | 3,1 | 0,7 | 3,8 | 2,3 |Mez opakovatelnosti (r) g/l | 0,056 | 0,033 | 0,038 | 0,038 |Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) g/l | 0,031 | 0,029 | 0,021 | 0,030 |Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR) (%) | 4,8 | 1,6 | 5,9 | 5,0 |Mez reprodukovatelnosti (R) g/l | 0,088 | 0,080 | 0,058 | 0,084 |Druhy vzorků:G  ouzo, rozdělená úroveň (*)H  anýzová lihovina, neoznačené duplikátyI  anýzový likér, duplikátní vzorkyJ  anýzový likér, duplikátní vzorky.VI. GLYCYRRHIZOVÁ KYSELINA. STANOVENÍ GLYCYRRHIZOVÉ KYSELINY VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ1. Oblast použitíTato metoda je vhodná pro stanovení glycyrrhizové kyseliny v anýzových lihovinách vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Podle nařízení (EHS) č. 1576/89 musí lihoviny aromatizované anýzem, které jsou nazývány "pastis", obsahovat od 0,05 do 0,5 gramů glycyrrhizové kyseliny na litr.2. Odkazy na normyISO 3696: 1987, Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.3. Podstata metodyKoncentrace glycyrrhizové kyseliny se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s UV detekcí. Standardní roztok a zkušební vzorek se zfiltrují a samostatně se přímo nastříknou do systému HPLC.4. Reakční činidla a materiálPři rozboru se použijí pouze reakční činidla čistoty pro HPLC, čistý ethanol a voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696.4.1 Ethanol o 96 % objemových (CAS 64-17-5).4.2 Glycyrrhizát amonný, C42H62O16 · NH4 (amonná sůl glycyrrhizové kyseliny)(Mol. hmotnost: 839,98) (CAS 53956-04-0): čistota alespoň 90 %(Mol. hmotnost: glycyrrhizová kyselina 822,94).4.3 Ledová octová kyselina, CH3COOH, (CAS 64-19-7).4.4 Methanol, CH3OH (CAS 67-56-1).4.5 Ethanol o 50 % objemovýchPříprava 1000 ml při 20 °C:- ethanol o 96 % objemových (4.1): 521 ml- voda (2.0): 511 ml.4.6 Příprava elučních roztoků pro HPLC4.6.1 Eluční roztok A (příklad)80 (objemových) dílů vody (2.0)20 (objemových) dílů octové kyseliny (4.3).Eluční roztok se nechá pět minut odplynit.Poznámka:Pokud nebyla použitá voda filtrována přes mikrofiltr, doporučuje se zfiltrovat připravený eluční roztok přes filtr pro organická rozpouštědla s velikostí pórů 0,45 μm nebo menší.4.6.2 Eluční roztok BMethanol (4.4).4.7 Příprava standardních roztokůVšechny standardní roztoky musí být každé dva měsíce čerstvě připraveny.4.7.1 Referenční roztok CDo odměrné baňky na 100 ml se s přesností na 0,1 mg odváží 25 mg glycyrrhizátu amonného (4.2). Přidá se malé množství ethanolu o 50 % objemových (4.5) a glycyrrhizát amonný se rozpustí. Po jeho rozpuštění se objem doplní po rysku ethanolem o 50 % objemových (4.5).Roztok se zfiltruje přes filtr pro organická rozpouštědla.4.7.2 Standardní roztoky pro kontrolu linearity odezvy přístrojePro přípravu zásobního roztoku o koncentraci 1,0 g/l se do odměrné baňky na 100 ml odváží s přesností na 0,1 mg 100 mg glycyrrhizátu amonného. Přidá se malé množství ethanolu o 50 % objemových (4.5) a glycyrrhizát amonný se rozpustí. Po jeho rozpuštění se objem doplní po rysku ethanolem o 50 % objemových (4.5).Připraví se nejméně čtyři další roztoky s koncentrací glycyrrhizátu amonného 0,05, 0,1, 0,25 a 0,5 g/l: do samostatných odměrných baněk na 100 ml se pipetou odměří 5 ml, 10 ml, 25 ml a 50 ml zásobního roztoku o koncentraci 1,0 g/l. Poté se objem roztoků doplní po rysku ethanolem o 50 % objemových (4.5) a roztoky se důkladně promíchají.Všechny roztoky se zfiltrují přes filtr pro organická rozpouštědla.5. Přístroje a vybavení5.1 Separační systém5.1.1 Vysokoúčinný kapalinový chromatograf.5.1.2 Čerpadlo umožňující s velkou přesností dosáhnout a udržet konstantní nebo programovatelný průtok.5.1.3 Spektrofotometrický detekční systém s UV detekcí: nastavený na 254 nm.5.1.4 Systém pro odplynění rozpouštědla.5.2 Integrátor nebo zapisovač s výpočetním zařízením, provozně kompatibilní se zbytkem systému.5.3 Kolona (příklad):Materiál: korozivzdorná ocel nebo skloVnitřní průměr: 4 až 5 mmDélka: 100 až 250 mmStacionární fáze: zesítěný polymerně vázaný oktadecyl (C18) na silikagelu (přednostně sférickém), maximální velikost částic: 5 μm.5.4 Laboratorní vybavení5.4.1 Analytické váhy s přesností na 0,1 mg5.4.2 Odměrné sklo třídy A5.4.3 Zařízení pro membránovou mikrofiltraci malých objemů.6. Chromatografické podmínky6.1 Eluční charakteristiky: (příklad)- průtok: 1 ml/min,- eluční roztok A = 30 %,- eluční roztok B = 70 %.6.2 Detekce:- UV = 254 nm.7. Postup7.1 Příprava vzorku lihovinyPodle potřeby se zfiltruje přes filtr pro organická rozpouštědla (průměr pórů: 0,45 μm).7.2 StanoveníPo ustavení chromatografických podmínek se provede- nástřik 20 μl referenčního roztoku C (4.7.1),- nástřik 20 μl roztoku vzorku,- a oba chromatogramy se porovnají. Píky glycyrrhizové kyseliny se identifikují podle jejich retenčních časů. Změří se jejich plochy (nebo výšky) a z následující rovnice se vypočte koncentrace v g/l na dvě desetinná místa:c =c ×h × P × 823H × 100 × 840kde:c  je koncentrace glycyrrhizové kyseliny v gramech na litr analyzované lihovinyC  je koncentrace glycyrrhizátu amonného v referenčním roztoku v gramech na litrh  je plocha (nebo výška) píku glycyrrhizové kyseliny v analyzované lihoviněH  je plocha (nebo výška) píku glycyrrhizové kyseliny v referenčním roztokuP  je čistota referenčního glycyrrhizátu amonného (v %)823  je molární hmotnost glycyrrhizové kyseliny840  je molární hmotnost glycyrrhizátu amonného8. Pracovní charakteristiky metody (přesnost)Statistické výsledky mezilaboratorního testu:v následující tabulce jsou uvedeny hodnoty pro glycyrrhizovou kyselinu.Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem.Rok provedení mezilaboratorního testu | 1998 |Počet laboratoří | 16 |Počet vzorků | 5 |Analyt | glycyrrhizová kyselina |Vzorky | A | B | C | D | E |Počet zahrnutých laboratoří po vyloučení odlehlých výsledků | 13 | 14 | 15 | 16 | 16 |Počet odlehlých výsledků (laboratoří) | 3 | 2 | 1 | — | — |Počet zahrnutých výsledků | 26 | 28 | 30 | 32 | 32 |Střední hodnota g/l | 0,046 | 0,092(*) 0,099 | 0,089 | 0,249 | 0,493 |Směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (Sr) g/l | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,002 | 0,003 |Relativní směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (RSDr) (%) | 1,5 | 1,3 | 0,7 | 1,0 | 0,6 |Mez opakovatelnosti (r) g/l | 0,002 | 0,004 | 0,002 | 0,007 | 0,009 |Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) g/l | 0,004 | 0,007 | 0,004 | 0,006 | 0,013 |Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR) (%) | 8,6 | 7,2 | 4,0 | 2,5 | 2,7 |Mez reprodukovatelnosti (R) g/l | 0,011 | 0,019 | 0,010 | 0,018 | 0,037 |Druhy vzorků:A  pastis, neoznačené duplikátyB  pastis, rozdělená úroveň (*)C  pastis, neoznačené duplikátyD  pastis, neoznačené duplikátyE  pastis, neoznačené duplikáty.VII. CHALKONY. METODA PRO POTVRZENÍ PŘÍTOMNOSTI CHALKONŮ V PASTISU VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ1. Oblast použitíTouto metodou lze zjistit, zda jsou v anýzových lihovinách přítomny chalkony. Chalkony jsou přírodní barviva ze skupiny flavonoidů přítomná v kořenu lékořice lysé (Glycyrrhiza glabra).Anýzové lihoviny mohou být nazývány "pastis", pokud obsahují chalkony (podle nařízení (EHS) č. 1576/89).2. Odkazy na normyISO 3696: 1987, Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.3. Podstata metodyPřipraví se referenční výtažek lékořice. Přítomnost nebo nepřítomnost chalkonů se zjistí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s UV detekcí.4. Reakční činidla a materiálPři rozboru se použijí pouze činidla čistoty pro HPLC. Použije se ethanol o 96 % objemových. Použije se pouze voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696.4.1 Ethanol o 96 % objemových (CAS 64-17-5).4.2 Acetonitril, CH3CN, (CAS 75-05-8).4.3 Referenční látka: Lékořice lysá (Glycyrrhiza glabra): lékořice, "sladký kořen"Hrubě nadrcené kořeny lékořice lysé (Glycyrrhiza glabra). Průměrné rozměry podlouhlých částic: délka: 10 až 15 mm, tloušťka: 1 až 3 mm.4.4 Octan sodný, CH3COONa, (CAS 127-09-3).4.5 Ledová octová kyselina, CH3COOH, (CAS 64-19-7).4.6 Příprava roztoků4.6.1 Ethanol o 50 % objemových.Příprava 1000 ml při 20 °C:- ethanol o 96 % objemových (4.1): 521 ml,- Voda (2.0): 511 ml.4.6.2 Eluční roztok A: acetonitrilAcetonitril (4.2) čistoty pro HPLC.Odplynit4.6.3 Eluční roztok B: Pufr 0,1M roztok octanu sodného, pH 4,66.Do odměrné baňky se odváží 8,203 g octanu sodného (4.4), přidá se 6,005 g ledové octové kyseliny (4.5) a objem se doplní vodou (2) do 1000 ml.5. Příprava referenčního extraktu z lékořice lysé (Glycyrrhiza glabra) (4.3)5.1 Odváží se 10 g drceného kořene lékořice lysé (Glycyrrhiza glabra) (4.3) a vpraví se do destilační baňky s kulatým dnem,- přidá se 100 ml ethanolu o 50 % objemových (4.6.1),- vaří se pod zpětným chladičem jednu hodinu,- zfiltruje se,- a filtrát se uchová pro pozdější použití.5.2 Zbytek po filtraci extraktu z lékořice se oddělí z filtru- vpraví se do destilační baňky s kulatým dnem,- přidá se 100 ml ethanolu o 50 % objemových (4.6.1),- vaří se pod zpětným chladičem jednu hodinu,- zfiltruje se. Filtrát se uchová pro pozdější použití.5.3 Extrakce kořene lékořice se provede třikrát po sobě.5.4 Tři filtráty se spojí.5.5 Rozpouštědlová fáze (z filtrátu v bodě 5.4) se odpaří na rotační odparce.5.6 Zbylý extrakt (z úkonu v bodě 5.5) se rozpustí v 100 ml ethanolu o 50 % objemových (4.6.1).6. Přístroje a vybavení6.1 Separační systém.6.1.1 Vysokoúčinný kapalinový chromatograf.6.1.2 Čerpadlo umožňující dosáhnout a udržet konstantní nebo programovatelný průtok při vysokém tlaku.6.1.3 Spektrofotometrický detekční systém s UV/Vis detekcí nastavitelný na 254 a 370 nm.6.1.4 Systém pro odplynění rozpouštědla.6.1.5 Kolonový termostat nastavitelný na teplotu 40 ± 0,1 °C.6.2 Integrátor nebo zapisovač s výpočetním zařízením, provozně kompatibilní se zbytkem separačního systému.6.3 KolonaMateriál: korozivzdorná ocel nebo skloVnitřní průměr: 4 až 5 mmStacionární fáze: zesítěný polymerně vázaný oktadecyl (C18) na silikagelu, velikost částic: nejvýše 5 μm (zesítěná fáze).6.4 Obvyklé laboratorní vybavení včetně:6.4.1 analytických vah (přesnost: ± 0,1 mg);6.4.2 destilační aparatury se zpětným chladičem skládající se například:- z destilační baňky s kulatým dnem na 250 ml s normalizovaným zábrusem,- zpětného chladiče o délce 30 cm a- zdroje tepla (pyrogenní reakci destilovaného materiálu musí být zabráněno vhodným prvkem).6.4.3 Rotační odparka.6.4.4 Filtrační zařízení (např. Büchnerova nálevka).6.5 Chromatografické podmínky (příklad).6.5.1 Eluční charakteristiky rozpouštědel A (4.6.2) a B (4.6.3):- gradientová změna z 20/80 (V/V) na 50/50 (V/V) během 15 minut,- gradientová změna z 50/50 (V/V) na 75/25 (V/V) během pěti minut,- isokratická eluce při 75/25 (V/V) pět minut,- stabilizace kolony mezi nástřiky,- isokratická eluce při 20/80 (V/V) po dobu pěti minut,6.5.2 Průtok: 1 ml/min.6.5.3 Nastavení UV detektoru:detektor musí být nastaven na 370 nm pro detekci chalkonů a poté na 254 nm pro detekci glycyrrhizové kyseliny.Poznámka:změna vlnové délky (z 370 nm na 254 nm) musí být provedena 30 sekund před začátkem eluce píku odpovídajícího glycyrrhizové kyselině.7. Postup7.1 Příprava vzorku lihovinyZfiltruje se přes filtr pro organická rozpouštědla (průměr pórů: 0,45 μm).7.2 Příprava zbytkového extraktu z lékořice (5.6)Extrakt se před rozborem zředí ethanolem o 50 % objemových (4.6.1) v poměru jedna ku deseti.7.3 Stanovení7.3.1 Nastříkne se 20 μl připraveného extraktu z lékořice (7.2). Provede se rozbor za za výše uvedených chromatografických podmínek (6.5).7.3.2 Nastříkne se 20 μl vzorku (7.1) (vzorek anýzové lihoviny). Provede se rozbor za výše uvedených chromatografických podmínek (6.5).7.3.3 Oba chromatogramy se porovnají. Oba chromatogramy si musí být velmi podobné v oblasti eluce chalkonů (detekce při 370 nm za výše popsaných podmínek rozboru) (viz obrázek 1).8. Charakteristický chromatogram pastisu+++++ TIFF +++++9. Pracovní charakteristiky metody (přesnost)Výsledky mezilaboratorního testu:v následující tabulce jsou uvedeny výsledky zjišťování přítomnosti chalkonů v pastisu a v anýzových lihovinách.Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem.Rok provedení mezilaboratorního testu | 1998 |Počet laboratoří | 14 |Počet vzorků | 11 |Analyt | chalkony |Vzorky | A | B | C | D | E | F |Počet zahrnutých laboratoří po vyloučení odlehlých výsledků | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | 13 |Počet odlehlých výsledků (laboratoří) | — | — | — | — | — | 1 [1] |Počet zahrnutých výsledků | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 | 26 |Počet výsledků: chalkony nalezeny | 28 | 14 | 14 | 0 | 28 | 0 |Počet výsledků: chalkony nenalezeny | 0 | 0 | 0 | 28 | 0 | 26 |Počet správných výsledků (%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |Vzorky | G | H | I | J | K |Počet zahrnutých laboratoří po vyloučení odlehlých výsledků | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 |Počet odlehlých výsledků (laboratoří) | — | — | — | — | — |Počet zahrnutých výsledků | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 |Počet výsledků: chalkony nalezeny | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |Počet výsledků: chalkony nenalezeny | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 |Počet správných výsledků (%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |Druhy vzorků:A  pastis, neoznačené duplikátyB  pastis, jeden vzorekC  pastis, jeden vzorekD  "pastis" (neobsahující chalkony), neoznačené duplikátyE  "pastis" (neobsahující chalkony), neoznačené duplikátyF  anýzový likér (neobsahující chalkony), neoznačené duplikátyG  anýzový likér (neobsahující chalkony), neoznačené duplikátyH  ouzo (neobsahující chalkony), jeden vzorekI  ouzo (neobsahující chalkony), jeden vzorekJ  anýzová lihovina (neobsahující chalkony), neoznačené duplikátyK  "pastis" (neobsahující chalkony), neoznačené duplikáty.IX. VAJEČNÝ ŽLOUTEK. STANOVENÍ KONCENTRACE VAJEČNÉHO ŽLOUTKU V LIHOVINÁCH – FOTOMETRICKÁ METODA1. Oblast použitíTato metoda je vhodná pro stanovení koncentrace vaječného žloutku v rozsahu od 40 do 250 g/l ve vaječném likéru a v likéru s přídavkem vajec.2. Odkazy na normyISO 3696: 1987, Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.3. Podstata metodyExtrahují se sloučeniny fosforu obsažené ve vaječném žloutku, které jsou rozpustné v ethanolu, a stanoví se fotometricky jako fosfato-molybdenanový komplex.4. Reakční činidla a materiál4.1 Redestilovaná voda.4.2 Křemelina.4.3 Ethanol o 96 % objemových (CAS 64-17-5).4.4 15 % roztok octanu hořečnatého (CAS 16674-78-5).4.5 10 % kyselina sírová (CAS 7664-93-9).4.6 1N kyselina sírová.4.7 Roztok dihydrogenfosforečnanu draselného (CAS 778-77-0), KH2PO4 o koncentraci 0,16 g/l.4.8 Reakční činidla pro stanovení fosforečnanů:20 g molybdenanu amonného (CAS 12054-85-2), (NH4)6Mo7O24 · 4H2O se rozpustí ve 400 ml vody při 50 °C;v jiné nádobě se rozpustí 1 g vanadičnanu amonného (CAS 7803-55-6), NH4VO3, v 300 ml horké vody, roztok se nechá vyhladnout a poté se přidá 140 ml koncentrované kyseliny dusičné (CAS 7697-37-2). Vychladlé roztoky se spojí v odměrné baňce na 1000 ml a objem se doplní po rysku 1000 ml.5. Přístroje a vybavení5.1 Erlenmeyerova baňka na 100 ml5.2 Ultrazvuková lázeň (nebo magnetická míchačka)5.3 Odměrná baňka na 100 ml5.4 Vodní lázeň temperovaná na 20 °C5.5 Filtr (Whatman č. 4 nebo rovnocenný)5.6 Porcelánový (nebo platinový) kelímek5.7 Vroucí vodní lázeň5.8 Topná deska5.9 Muflová pec5.10 Odměrná baňka na 50 ml5.11 Odměrná baňka na 20 ml5.12 Spektrofotometr nastavený na 420 nm5.13 1cm kyveta.6. VzorkyVzorky se před rozborem uchovávají při laboratorní teplotě.7. Postup7.1 Příprava vzorku7.1.1 Do Erlenmeyerovy baňky (5.1) na 100 ml se odváží 10 g vzorku.7.1.2 Postupně po malých dávkách se přidá 70 ml ethanolu (4.3), přičemž se při každém přídavku intenzivně míchá, a roztok se umístí na 15 minut do ultrazvukové lázně (5.2) (nebo se při laboratorní teplotě míchá 10 minut na magnetické míchačce (5.2)).7.1.3 Obsah Erlenmeyerovy baňky se převede za současného vyplachování ethanolem (4.3) do odměrné baňky na 100 ml (5.3). Objem se doplní ethanolem (4.3) po rysku a baňka se umístí do vodní lázně temperované na 20 °C (5.4). Objem se doplní po rysku při 20 °C.7.1.4 Přidá se malé množství křemeliny (4.2) a roztok se zfiltruje (5.5); prvních 20 ml se odstraní.7.1.5 25 ml filtrátu se převede do porcelánového (nebo platinového) kelímku (5.6). Filtrát se poté musí za přídavku 5 ml 15 % roztoku octanu hořečnatého (4.4) zkoncentrovat opatrným odpařováním na vroucí vodní lázni (5.7).7.1.6 Kelímky se umístí na topnou desku (5.8) a zahřívají se, dokud se obsah neodpaří právě do sucha.7.1.7 Zbytek se zpopelní a žíhá v muflové peci (5.9) při 600 °C do bílého popela nejméně jednu a půl hodiny, může se však také žíhat přes noc.7.1.8 Popel se spolu s oplachovou destilovanou vodou převede pomocí 10 ml 10 % kyseliny sírové (4.5) do odměrné baňky na 50 ml (5.10) a objem se při laboratorní teplotě doplní po rysku destilovanou vodou (4.1). 5ml alikvot tohoto roztoku popela se použije k přípravě roztoku pro stanovení fosforečnanů fotometricky.7.2 Stanovení fosforečnanů fotometricky7.2.1 Srovnávací roztok7.2.1.1 Do odměrné baňky na 50 ml (5.10) se odměří 10 ml 10 % kyseliny sírové (4.5) a objem se doplní po rysku destilovanou vodou (4.1).7.2.1.2 K 5ml alikvotu tohoto roztoku (7.2.1.1) se v odměrné baňce na 20 ml (5.11) přidá 1 ml 1N kyseliny sírové (4.6) a 2 ml činidla pro stanovení fosforečnanů (4.8) a objem se doplní do 20 ml destilovanou vodou (4.1).7.2.1.3 Baňka se volně uzavře zátkou, protřepe a zahřívá se 10 minut ve vroucí vodní lázni (5.7), poté se 20 minut chladí ve vodní lázni temperované na 20 °C (5.4).7.2.1.4 Tímto srovnávacím roztokem se naplní 1cm kyveta (5.13).7.2.2 Roztok vzorku7.2.2.1 K 5ml alikvotu roztoku popela (7.1.8) se v odměrné baňce na 20 ml (5.11) přidá 1 ml 1N kyseliny sírové (4.6) a 2 ml činidla pro stanovení fosforečnanů (4.8) a objem se doplní do 20 ml destilovanou vodou (4.1).7.2.2.2 Baňka se volně uzavře zátkou, protřepe a zahřívá se 10 minut ve vroucí vodní lázni (5.7), poté se 20 minut chladí ve vodní lázni temperované na 20 °C (5.4).7.2.2.3 Vznikne žlutý roztok, který se ihned proměří spektrofotometricky (5.12) v 1cm kyvetě (5.13) při 420 nm proti srovnávacímu roztoku (7.2.1.4).7.2.3 Kalibrační křivka7.2.3.1 Za účelem sestrojení kalibrační křivky se do odměrných baněk na 20 ml (5.11) obsahujících po 1 ml 1N kyseliny sírové (4.6) a jednotlivě 0, 2, 4, 6, 8, 10 ml dihydrogenfosforečnanu draselného (4.7) přidá po 2 ml činidla pro stanovení fosforečnanů (4.8) a objem se doplní po 20ml rysku destilovanou vodou (4.1).7.2.3.2 Baňky se volně volně uzavřou zátkou, protřepou se a zahřívají se 10 minut ve vroucí vodní lázni (5.7), poté se 20 minut chladí ve vodní lázni temperované na 20 °C (5.4) a proměří se spektrofotometricky (5.12) v 1cm kyvetě (5.13) při 420 nm proti srovnávacímu roztoku (7.2.1.4).7.2.3.3 Sestrojení kalibrační křivky:roztok dihydrogenfosforečnanu (ml) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |P2O5 (mg) | 0 | 0,167 | 0,334 | 0,501 | 0,668 | 0,835 |8. Vyjádření výsledkůObsah vaječného žloutku v g/l se vypočte pomocí tohoto vzorce:g/l vaječný žloutek = mg PO×110 × hustotaE/40kde:110  přepočítávací faktor pro celkový obsah P2O5 v gramech ve 100 g vaječného žloutkumg P2O5  hodnota odečtená z kalibrační křivkyhustota  hmotnost vztažená na jednotku objemu likéru obsahujícího vaječný žloutek při 20 °C (g/ml)E  hmotnost likéru obsahujícího vaječný žloutek v g40  faktor ředění 5ml alikvotu roztoku popela.9. Pracovní charakteristiky metody (přesnost)Statistické výsledky mezilaboratorního testu:v následující tabulce jsou uvedeny hodnoty pro vaječný žloutek.Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem.Rok provedení mezilaboratorního testu | 1998 |Počet laboratoří | 24 |Počet vzorků | 5 |Analyt | vaječný žloutek |Vzorky | A | B | C | D | E |Počet zahrnutých laboratoří po vyloučení odlehlých výsledků | 19 | 20 | 22 | 20 | 22 |Počet odlehlých výsledků (laboratoří) | 3 | 4 | 2 | 4 | 2 |Počet zahrnutých výsledků | 38 | 40 | 44 | 40 | 44 |Střední hodnota g/l | 147,3 | 241,1 | 227,4 | 51,9 (*)72,8 (*) | 191,1 |Směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (Sr) g/l | 2,44 | 4,24 | 3,93 | 1,83 | 3,25 |Relativní směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (RSDr) (%) | 1,7 | 1,8 | 1,8 | 2,9 | 1,7 |Mez opakovatelnosti (r) g/l | 6,8 | 11,9 | 11,0 | 5,1 | 9,1 |Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) g/l | 5,01 | 6,06 | 6,66 | 3,42 | 6,87 |Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR) (%) | 3,4 | 2,5 | 2,9 | 5,5 | 3,6 |Mez reprodukovatelnosti (R) g/l | 14,0 | 17,0 | 18,7 | 9,6 | 19,2 |Druhy vzorkůA  Advocaat, neoznačené duplikátyB  Advocaat, neoznačené duplikátyC  Advocaat, neoznačené duplikátyD  Advocaat (zředěný), rozdělená úroveň (*)E  Advocaat, neoznačené duplikáty[1] Nekonzistentní výsledky mezi dvěma duplikátními vzorky způsobené chybou při odběru.--------------------------------------------------