CELEX: 31990R2676
Language: nl
Date: 1990-09-17 00:00:00
Title: Verordening (EEG) nr. 2676/90 van de Commissie van 17 september 1990 tot vaststelling van de in de wijnsector toe te passen communautaire analysemethoden

Avis juridique important

|

31990R2676

Verordening (EEG) nr. 2676/90 van de Commissie van 17 september 1990 tot vaststelling van de in de wijnsector toe te passen communautaire analysemethoden  

Publicatieblad Nr. L 272 van 03/10/1990 blz. 0001 - 0192 Bijzondere uitgave in het Fins: Hoofdstuk 3 Deel 34 blz. 0005  Bijzondere uitgave in het Zweeds: Hoofdstuk 3 Deel 34 blz. 0005 

VERORDENING  (EEG)  Nr. 2676/90  VAN  DE  COMMISSIE van 17 september 1990 tot vaststelling van de in de wijnsector toe te passen communautaire analysemethoden DE  COMMISSIE  VAN  DE  EUROPESE  GEMEENSCHAPPEN,   Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap,   Gelet op Verordening (EEG) nr. 822/87 van de Raad van 16 maart 1987 houdende een gemeenschappelijke ordening van de wijnmarkt (1), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 1325/90 (2), en met name op artikel 74,   Overwegende dat volgens artikel 74, lid 1, van Verordening (EEG) nr. 822/87 het gebruik is voorgeschreven van wederzijds aanvaarde analysemethoden waarmee de samenstelling van de in artikel 1 van die verordening bedoelde produkten kan worden bepaald en  van voorschriften waardoor kan worden vastgesteld of deze produkten behandelingen hebben ondergaan die in strijd zijn met de toegelaten oenologische praktijken;   Overwegende dat, voor zover de Gemeenschap nog geen maxima en minima heeft vastgesteld voor de aanwezige bestanddelen die kenmerkend zijn voor het gebruik van bepaalde oenologische praktijken en van tabellen die een vergelijking van de analytische  gegevens mogelijk maken, het de Lid-Staten wordt toegestaan deze grenswaarden vast te stellen;   Overwegende dat in artikel 13, lid 1, van Verordening (EEG) nr. 822/87 een analytisch onderzoek wordt voorgeschreven dat ten minste betrekking heeft op de waarden van de in de bijlage van die verordening opgesomde factoren welke kenmerkend zijn voor de  betrokken wijn v.q.p.r.d.;   Overwegende dat om de gegevens op de documenten betreffende de produkten te kunnen controleren uniforme analysemethoden moeten worden vastgesteld zodat nauwkeurige en vergelijkbare gegevens worden verkregen; dat deze methoden derhalve verplicht moeten  worden gesteld voor elke handelstransactie en elke controle; dat het, gezien de beperkte mogelijkheden van de handel, dienstig is toe te staan dat een beperkt aantal vereenvoudigde werkwijzen worden gebruikt waarmee de gewenste gegevens snel en met  voldoende zekerheid kunnen worden bekomen;   Overwegende dat het dienstig is zoveel mogelijk algemeen erkende methoden te kiezen, zoals die welke zijn ontwikkeld in het kader van de Internationale Conventie voor de unificatie van de analysemethoden en de beoordeling van wijn van 1954, gepubliceerd  door het ""Office international de la vigne et du vin" (Internationaal Wijnbureau) in het ""Recueil des méthodes internationales d'analyse des vins" (Internationale analysemethoden voor Wijn);   Overwegende dat de in de wijnsector toe te passen communautaire analysemethoden zijn vastgesteld in Verordening (EEG) nr. 1108/82 van de Commissie (3); dat het, rekening houdend met de wetenschappelijke vooruitgang, noodzakelijk is gebleken bepaalde  methoden te vervangen door meer geschikte methoden of wel methoden te wijzigen en andere methoden te introduceren, met name die welke sindsdien zijn goedgekeurd door het ""Office international de la vigne et du vin"; dat het, gezien het grote aantal  aanpassingen en de ingewikkeldheid ervan, aangewezen is alle analyses te hergroeperen in een nieuwe verordening en Verordening (EEG) nr. 1108/82 in te trekken;   Overwegende dat, met het oog op een goede vergelijkbaarheid van de resultaten verkregen bij toepassing van de volgens artikel 74 van Verordening (EEG) nr. 822/87 bedoelde analysemethoden, het voor de hand ligt dat de juistheid, de herhaalbaarheid en de  reproduceerbaarheid van deze resultaten getoetst dienen te worden aan de definities vastgesteld door het""Office international de la vigne et du vin";   Overwegende dat, ten einde rekening te houden enerzijds met de wetenschappelijke vooruitgang en anderzijds met de technische uitrusting van de officiële laboratoria en om de werkzaamheden van deze laboratoria meer doeltreffend en rendabel te maken, het  toegestaan is onder bepaalde voorwaarden gebruik te maken van geautomatiseerde analysemethoden; dat onderstreept dient te worden dat bij betwistingen de geautomatiseerde analysemethoden niet de referentiemethoden noch de gebruikelijke methoden kunnen  vervangen;   Overwegende dat de meetresultaten van de geautomatiseerde dichtheidsbepaling, gebaseerd op het principe van een stemvork, wat betreft juistheid, herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid ten minste gelijk zijn aan die verkregen met de methoden beschreven  in hoofdstuk 1 van de bijlage bij deze verordening ter bepaling van de dichtheid en de relatieve dichtheid; dat deze geautomatiseerde methode derhalve, gelet op artikel 74, lid 3, van Verordening (EEG)nr. 822/87, als gelijkwaardig dient te worden  beschouwd aan de in de bijlage bij deze verordening beschreven methoden;   Overwegende dat de in hoofdstuk 25, punt 2.2.3.3.2, van de bijlage bij deze verordening beschreven methode voor de analyse van het totale zwaveldioxidegehalte van wijn en most met een vermoedelijk gehalte van minder dan 50 mg/l een betere extractie van  deze stof met zich brengt dan de in hoofdstuk 13, punt 13.4, van de bijlage bij Verordening (EEG)nr. 1108/82 beschreven methode; dat de geanalyseerde produkten daardoor een hoger gehalte aan totaal zwaveldioxide te zien geven, zodat zij in bepaalde  gevallen, met name bij een aantal druivesappen, het voorgeschreven maximum kunnen overschrijden; dat, om moeilijkheden te voorkomen bij de afzet van druivesap dat al bereid was bij de inwerkingtreding van deze verordening en in afwachting dat de  bereidingsprocédés worden aangepast met het oog op een grondiger ontzwaveling van gemuteerde druivemost, moet worden toegestaan dat de in bovengenoemde verordening beschreven methode nog enige tijd verder wordt toegepast;   Overwegende dat de in deze verordening vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Comité van beheer voor wijn,   HEEFT  DE  VOLGENDE  VERORDENING  VASTGESTELD:     Artikel 1   1. De in de wijnsector toe te passen gemeenschappelijke analysemethoden die toelaten bij handelstransacties en bij elke controle  - de samenstelling van de in artikel 1 van Verordening (EEG) nr. 822/87 bedoelde produkten te bepalen,   - vast te stellen of deze produkten behandelingen hebben ondergaan die in strijd zijn met de toegelaten oenologische praktijken,   zijn die die opgesomd zijn in de bijlage bij deze verordening.   2. Voor die bestanddelen waarvoor zowel referentiemethoden als gebruikelijke methoden zijn vastgesteld, hebben de resultaten verkregen met de referentiemethoden de overhand.   Artikel 2   Voor de toepassing van deze verordening is:   a) de herhaalbaarheid: de waarde beneden dewelke het absolute verschil tussen twee afzonderlijke uitkomsten die met dezelfde methode en onder dezelfde omstandigheden (dezelfde medewerker, hetzelfde toestel, hetzelfde laboratorium, kort tijdsbestek)  verkregen worden, met een gespecificeerde waarschijnlijkheid kan worden verwacht;   b) de reproduceerbaarheid: de waarde beneden dewelke het absolute verschil tussen twee afzonderlijke uitkomsten die onder verschillende omstandigheden (verschillende medewerkers, verschillende apparaten, verschillende laboratoria en/of verschillende  tijdstippen) verkregen worden, met een gespecificeerde waarschijnlijkheid kan worden verwacht.   Een ""afzonderlijke uitkomst" is de waarde die wordt verkregen bij eenmalige en volledige toepassing van de genormaliseerde proefmethode op één enkel monster. Wanneer niets anders aangegeven is, bedraagt deze waarschijnlijkheid 95 %.   Artikel 3   1. Geautomatiseerde analysemethoden zijn toegestaan onder de verantwoordelijkheid van de directeur van het laboratorium op voorwaarde dat de juistheid, de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid van de resultaten ten minste gelijkwaardig  zijn aan die van de resultaten verkregen met de analysemethoden zoals vermeld in de bijlage.   Bij betwistingen kunnen de methoden van de bijlage niet vervangen worden door geautomatiseerde methoden.   2. De geautomatiseerde methode voor de bepaling van de dichtheid, gebaseerd op het principe van een stemvork, dient als gelijkwaardig te worden beschouwd aan de in hoofdstuk 1 van de bijlage bij deze verordening beschreven methoden.   Artikel 4   Wanneer voor het oplossen, verdunnen of wassen water is voorgeschreven, betreft het steeds gedestilleerd water of gedemineraliseerd water met ten minste dezelfde zuiverheid. Tenzij anders is vermeld, moeten alle reagentia van  pro-analysekwaliteit zijn.   Artikel 5   Verordening (EEG) nr. 1108/82 wordt ingetrokken.   Artikel 1, lid 4, van laatstgenoemde verordening blijft evenwel van toepassing tot en met 31 december 1990.   Artikel 6   Deze verordening treedt in werking op de dag van haar bekendmaking in het Publikatieblad van de Europese Gemeenschappen.  Zij is van toepassing met ingang van 1 oktober 1990.   Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks van toepassing in elke Lid-Staat.   Gedaan te Brussel, 17 september 1990.   Voor de CommissieRay MAC SHARRYLid van de Commissie    (1)PB nr. L 84 van 27. 3. 1987,blz. 1. (2)PB nr. L 132 van 23. 5. 1990, blz. 19. (3)PB nr. L 133 van 14. 5. 1982, blz. 1.    BIJLAGE  1. DICHTHEID  BIJ  20 °C  EN  RELATIEVE  DICHTHEID  20 °C/20 °C 1. BEGRIPSBEPALINGEN   De dichtheid is de verhouding van de massa van een bepaald volume wijn of most bij 20 °C tot dit volume. De dichtheid wordt uitgedrukt in gram per milliliter.Het symbool ervoor is r 20 °C   De relatieve dichtheid bij 20 °C of de dichtheid 20 °C/20 °C is de in decimale getallen uitgedrukte verhouding van de massa van een bepaald volume wijn of most bij 20 °C tot de massa van hetzelfde volume water bij dezelfde temperatuur.Het symbool  ervoor is d20 °C20 °C2. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN   De dichtheid en de relatieve dichtheid bij 20 °C worden bepaald door middel van:    - pyknometrie: de referentiemethode;    - areometrie of densimetrie met de hydrostatische balans: de gebruikelijke methoden.    Opmerking:Voor zeer nauwkeurige bepalingen moet de dichtheid worden gecorrigeerd voor de invloed van zwaveldioxide:    r 20 °C = r 20 °C   0,0006 · Sr 20 °C = de gecorrigeerde dichtheidr 20 °C = de waargenomen dichtheidS = totaal zwaveldioxide in g/l.3. VOORBEHANDELING  VAN  HET  MONSTER   Als de wijn of most aanzienlijke hoeveelheden kooldioxide bevat, dient het grootste deel hiervan te worden verwijderd door 250 ml wijn in een Erlenmeyer van 1 000 ml om te schudden of onder afzuigen te filtreren over 2 g katoenwatten in een trechter.4.  REFERENTIEMETHODE  4.1. ApparatuurGebruikelijke laboratoriumuitrusting, onder andere:   4.1.1. Pyknometer (1) van pyrex met een inhoud van ongeveer 100 ml voorzien van een ingeslepen thermometer die van 10 °C tot 30 °C is onderverdeeld in 0,1 graad.    Deze thermometer dient te worden geijkt (figuur 1).      Figuur 1: Pyknometer en tarrafles.     Deze pyknometer is voorzien van een zijbuis van 25 mm lengte met een inwendige doorsnede van maximaal 1 mm, waarvan het uiteinde konisch is geslepen. Deze zijbuis kan worden afgesloten met een daarop passend slijpstuk waarvan het uiteinde is  uitgetrokken en dichtgesmolten. Dit slijpstuk doet dienst als dilatatieruimte.    De slijpstukken moeten uiterst nauwkeurig zijn uitgevoerd.   4.1.2. Tarrafles, met hetzelfde uitwendige volume (tot op 1 ml nauwkeurig) als de pyknometer en met een massa overeenkomend met de massa van de pyknometer gevuld met een vloeistof met een dichtheid van 1,01 (oplossing à 2 % natriumchloride).    Thermisch geïsoleerd vat, nauwkeurig aangepast aan de vorm van de pyknometer.   4.1.3. Tweearmige balans, met een capaciteit van ten minste 300 g, gevoelig tot op 0,1 mg,ofeenarmige balans, met een capaciteit van ten minste 200 g, gevoelig tot op 0,1 mg.4.2. IJking van de pyknometer   Voor de ijking van de pyknometer dienen de volgende constanten te worden bepaald:- de lege massa,- het volume bij 20 °C,- de waterwaarde bij 20 °C.4.2.1. Gebruik van een tweearmige balans   Plaats de tarrafles op de linkerschaal van de balans en de schone en droge pyknometer, voorzien van het afsluitslijpstuk, op de rechterschaal. Breng evenwicht tot stand door bij de pyknometer gewichten te plaatsen. Stel dat dit p gram is.    Vul de pyknometer zorgvuldig met gedestilleerd water van kamertemperatuur en plaats de thermometer; maak de pyknometer zorgvuldig droog en plaats deze in het geïsoleerde vat; wacht, onder af en toe omzwenken, tot de temperatuur afgelezen op de  thermometer constant is. Vul zo nodig de zijbuis, droog en breng het afsluitslijpstuk aan; lees zorgvuldig de temperatuur t °C af en corrigeer deze eventueel voor de afwijking in de schaal van de thermometer. Weeg de pyknometer gevuld met water. Stel p2  gram is nodig om evenwicht te bereiken.    Berekeningen (2)   De lege massa van de pyknometer:Lege massa = p + mm = de massa van de in de pyknometer aanwezige luchtm = 0,0012 (p   p2).    Volume bij 20 °C:V20 °C = (p + m   p2) · FtFt = factor afhankelijk van de temperatuur t °C, zie tabel IV20 °C moet tot op 0,001 ml nauwkeurig worden berekend.    Waterwaarde bij 20 °C:M20 °C = V20 °C · 0,9982030,998203 = dichtheid van water bij 20 °C.  4.2.2. Gebruik van een eenarmige balans   Bepaal:- de massa van de droge en schone pyknometer; deze zij P- de massa van de pyknometer gevuld met water van t °C; deze zij P1; volg hierbij de richtlijnen in punt 4.2.1- de massa van de tarrafles; deze zij To.    Berekeningen(3):    De lege massa van de pyknometer:Lege massa = P   mm = de massa van de in de pyknometer aanwezige luchtm = 0,0012 (P1   P).    Volume bij 20 °C:V20 °C = [P1   (P   m)] · FtFt = factor afhankelijk van de temperatuur t °C, zie tabel I.Het volume bij 20 °C moet tot op 0,001 ml nauwkeurig worden berekend.    Waterwaarde bij 20 °C:M20 °C = V20 °C · 0,9982030,998203 = dichtheid van water bij 20 °C.4.3. Meettechniek (3)  4.3.1. Gebruik van een tweearmige balans   Gebruik de pyknometer gevuld met het monster (3). Volg hierbij de richtlijnen in punt 4.2.1.    Stel p" gram is nodig om evenwicht te bereiken bij t °C.    De massa van de vloeistof in de pyknometer = p + m   p".    Schijnbare dichtheid bij t °C:   Bereken de dichtheid bij 20 °C met behulp van een van de hierna volgende correctietabellen, afhankelijk van de natuur van de onderzochte vloeistof: droge wijn (tabel II), natuurlijke of geconcentreerde most (tabel III) en zoete wijn (tabel IV).    De relatieve dichtheid 20 °C/20 °C wordt berekend door de dichtheid bij 20 °C te delen door 0,998203.4.3.2. Gebruik van een eenarmige balans (3)   Weeg de tarrafles, zij Tl de massa.Bereken dT = Tl   To.Massa van de lege pyknometer op het moment van de bepaling = P   m + dT.    Weeg de pyknometer gevuld met het monster (3); volg hierbij de richtlijnen in punt 4.2.1; zij P2 de massa bij t °C.     Massa van de vloeistof in de pyknometer bij t °C is nu = P2   (P   m + dT).    Schijnbare dichtheid bij t °C:   Bereken de dichtheid bij 20 °C van de onderzochte vloeistof: droge wijn, natuurlijke of geconcentreerde most of zoete wijn, zoals aangegeven in punt 4.3.1.    De relatieve dichtheid 20 °C/20 °C wordt berekend door de dichtheid bij 20 °C te delen door 0,998203.   4.3.3. HerhaalbaarheidVoor de dichtheid van droge en zachte wijn:r = 0,00010.    Voor de dichtheid van zoete wijn:r = 0,00018.   4.3.4. ReproduceerbaarheidVoor de dichtheid van droge en zachte wijn:R = 0,00037.Voor de dichtheid van zoete wijn:R = 0,00045.5. GEBRUIKELIJKE  METHODEN  5.1. Areometrie  5.1.1. Apparatuur  5.1.1.1. Areometer   Areometers dienen te voldoen aan de voorschriften van de ISO voor wat betreft afmetingen en schaalverdelingen.    Zij moeten bestaan uit een cilindervormig dompellichaam voorzien van een ronde steel met een doorsnede van ten minste 3 mm. Voor droge wijn moeten zij van 0,983 tot 1,003 in duizendsten en vijfden van duizendsten zijn gegradueerd. De afstand tussen de  deelstrepen die duizendsten aangeven moet ten minste 5 mm bedragen. Voor de bepaling van de dichtheid van alcoholvrij gemaakte wijn, van zoete wijn en van most dient gebruik te worden gemaakt van een serie van 5 areometers, die respectievelijk als volgt  zijn gegradueerd: 1,000   1,030; 1,030   1,060; 1,060   1,090; 1,090   1,120; 1,120   1,150. Deze areometers dienen te zijn gegradueerd in dichtheid bij 20 °C in ten minste duizendsten en vijftienduizendsten, waarbij de afstand tussen de deelstrepen die  duizendsten aangeven ten minste 3 mm bedraagt.    De schaalverdeling van deze areometers moet""op de top van de meniscus" worden afgelezen. De aanduiding van de schaalverdeling in dichtheid bij 20 °C of in relatieve dichtheid 20 °C/20 °C en de wijze van aflezing ""op de top van de meniscus" moeten  zijn vermeld op de schaal of op een strookje papier dat is gevoegd bij de areometer.    Deze areometers dienen te zijn geijkt door een overheidsorgaan.   5.1.1.2. Geijkte thermometer, ten minste onderverdeeld in 0,5 °C.   5.1.1.3. Maatcilinder met een inwendige doorsnede van 36 mm en 320 mm hoog, die met behulp van een statief loodrecht overeind wordt gehouden.5.1.2. Werkwijze  5.1.2.1. Meettechniek   Breng in de maatcilinder (5.1.1.3) 250 ml monster (3), de areometer en de thermometer. Zwenk om temperatuursevenwicht te bereiken en lees na één minuut de thermometer af. Verwijder de thermometer en lees na één minuut de schijnbare dichtheid bij t °C  af op de schaal van de areometer.     Corrigeer de schijnbare dichtheid bij t °C voor de temperatuur met behulp van tabel V voor droge wijn, tabel VI voor most en tabel VII voor zoete wijn.    De relatieve dichtheid 20 °C/20 °C wordt berekend door de dichtheid bij 20 °C te delen door 0,998203.5.2. Densimetrie met de hydrostatische balans  5.2.1. Apparatuur  5.2.1.1. Hydrostatische balans   Hydrostatische balans met een capaciteit van ten minste 100 g, gevoelig tot op 0,1 mg.    Onder elke schaal is een vlotter van pyrex bevestigd van ten minste 20 ml. Deze twee identieke vlotters hangen aan een draad met een doorsnede van maximaal 0,1 mm.    De onder de rechterschaal aangebrachte vlotter moet passen in een maatcilinder die voorzien is van een hoogtemerk. Deze maatcilinder moet een inwendige doorsnede hebben die ten minste 6 mm groter is dan die van de vlotter. De vlotter moet geheel passen  in het gedeelte van de maatcilinder dat zich onder het hoogtemerk bevindt, terwijl het oppervlak van de te meten vloeistof slechts door de ophangdraad mag worden doorsneden. De temperatuur van de vloeistof in de maatcilinder wordt gemeten met een  thermometer die in 0,2 °C is onderverdeeld.    Een eenarmige hydrostatische balans kan eveneens worden gebruikt.5.2.2. Werkwijze  5.2.2.1. IJking van de hydrostatische balans   Bepaal de evenwichtstoestand van de twee vlotters in de lucht door op de rechterschaal gewichten te plaatsen. Stel p gram is nodig om dit evenwicht te bereiken.    Vul de maatcilinder met zuiver water tot aan het hoogtemerk. Zwenk om en lees na twee à drie minuten wachten de temperatuur t °C af. Bepaal wederom de evenwichtstoestand door op de rechterschaal gewichten te plaatsen. Stel p2 gram is nodig om dit  evenwicht te breiken.    Volume van de vlotter bij 20°C:V20 °C = (p2 - p) (F + 0,0012).F = factor afhankelijk van de temperatuur t °C, zie tabel I p en V20 °C zijn de vlotterconstanten.5.2.2.2. Meettechniek   De rechter vlotter wordt ondergedompeld in de met wijn (of most) tot aan het hoogtemerk gevulde maatcilinder. Lees de temperatuur t °C van de wijn (of most) af.    Stel p" gram is nodig om weer evenwicht te bereiken.  De schijnbare dichtheid  rt °C is dan:Herleid de schijnbare dichtheid bij t °C tot de dichtheid bij 20 °C met behulp van één van de tabellen II, III of IV.  6. VOORBEELD  VAN  DE  BEREKENING  VAN  DE  DICHTHEID  BIJ  20 °C  EN  DE  RELATIEVE  DICHTHEID  20 °C/20 °C  (REFERENTIEMETHODE)  6.1. Pyknometrie met de tweearmige balans  6.1.1. Bepaling van de pyknometerconstanten   1. Weging van de pyknometerconstanten:Tarra = pyknometer + p  p = 104,9454 g.    2. Weging van de pyknometer gevuld met water van t °C:Tarra = pyknometer + water + r2r2 = 1,2396 g voor t = 20,5°C.       3. Berekening van de massa lucht in de pyknometer:m = 0,0012 (p   p2) m = 0,0012 (104,9454   1,2396) m = 0,1244 g.    4. Pyknometerconstanten:Massa van de lege pyknometer: p + m:  p + m = 104,9454 + 0,1244 p + m = 105,0698 g.     Volume bij 20 °C = (p + m   p2) · Ft °CF20,50 °C = 1,001900 V20 °C = (105,0698   1,2396)· 1,001900 V20 °C = 104,0275 ml.     Waterwaarde bij 20 °C = V20 °C · 0,998203 M20 °C = 103,8405 g.6.1.2. Bepaling van de dichtheid bij 20 °C en de relatieve dichtheid 20 °C/20 °C van een droge wijn:    p" = 1,2622 bij 17,80 °Cr 17,80 °C = 0,99788.    Met tabel II kan r 20 °C worden berekend uitgaande van r t °C met behulp van de formule:   Voor t = 17,80 °C en voor een alcoholgehalte van 11 % vol ° is c = 0,546.2. Pyknometrie met de eenarmige balans  6.2.1. Bepaling van de pyknometerconstanten   1. Weging van de schone en droge pyknometer:P = 67,7913 g.     2. Weging van de pyknometer gevuld met water van t °C:P1 = 169,2715 bij 21,65 °C.    3. Berekening van de massa lucht in de pyknometer: m = 0,0012 (P1   P) m = 0,0012 × 101,4802 m = 0,1218 g.    4. Pyknometerconstanten:Massa van de lege pyknometer: P   m P   m = 67,7913   0,1218 P   m = 67,6695 gVolume bij 20 °C = [P1   (P   m)] Ft °C F21,65 °C = 1,002140 V20 °C = (169,2715   67,6695) · 1,002140V20 °C = 101,8194 mlWaterwaarde bij 20 °C = V20 °C · 0,998203 M20 °C = 101,6364 gMassa van de tarrafles: To To = 171,9160 g.6.2.2. Bepaling van de dichtheid bij 20 °C en de relatieve dichtheid 20 °C/20 °C van een droge wijn:    T1 = 171,9178 g dT = 171,9178   171,9160 = 0,0018 g P   m + dT = 67,6695 + 0,0018 = 67,6713 g P2 = 169,2799 bij 18 °Cr 18 °C = 0,99793 g/ml.    Met tabel II kan r 20 °C worden berekend uitgaande vanr t °C met behulp van de formule:   Voor t = 18 °C en een alcoholgehalte van 11 % vol, is c = 0,49      TABEL I  Tabel van de factor Fwaarmee de massa van het water in de pyknometer van pyrex bij t °C moet worden vermenigvuldigd om het volume van de pyknometer bij 20 °C te berekenen   TABEL II  Tabel van de correctie c die moet worden toegepast om de dichtheid van droge wijn en van alcoholvrij gemaakte droge wijn, bepaald in een pyknometer van pyrex bij t °C, te herleiden naar 20 °C       TABEL III  Tabel van de correctie c die moet worden toegepast om de dichtheid van most en geconcentreerde most, bepaald in een pyknometer van pyrex bij t °C, te herleiden naar 20 °C     TABEL IV  Tabel van de correctie c die moet worden toegepast om de dichtheid van wijn met een alcoholgehalte van 13 % vol en meer, met restsuikers, bepaald in een pyknometer van pyrex bij t °C, te herleiden naar 20 °C          TABEL V  Tabel van de correctie c die moet worden toegepast om de dichtheid van droge wijn en van alcoholvrij gemaakte wijn, bepaald met behulp van een areometer of van een pyknometer van gewoon glas bij t °C, te herleiden naar 20 °C       TABEL VI  Tabel van de correctie c die moet worden teogepast om de dichtheid van most en geconcentreerde most, bepaald met behulp van een areometer of van een pyknometer van gewoon glas bij t °C, te herleiden naar 20 °C       TABEL VII  Tabel van de correctie c die moet worden toegepast om de dichtheid van wijn met een alcoholgehalte van 13 % vol en meer, met restsuikers, bepaald met behulp van een areometer of van een pyknometer van gewoon glas bij t °C, te herleiden naar  20 °C            2. REFRACTOMETRISCHE  BEPALING  VAN  HET  SUIKERGEHALTE  VAN  MOST,  GECONCENTREERDE  MOST  EN  GERECTIFICEERDE  GECONCENTREERDE  MOST 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   De brekingsindex bij 20 °C wordt gemeten met behulp van een refractometer, welke afleesbaar is in absolute eenheden of in massapercenten saccharose. Uit een tabel wordt het met de brekingsindex overeenkomende suikergehalte afgelezen, uitgedrukt in g/l  of in g/kg van most, geconcentreerde most en gerectificeerde geconcentreerde most.2. APPARATUUR  2.1. Refractometer van het Abbé-type   De te gebruiken refractometer moet een schaalindeling hebben met:- het massapercentage saccharose tot op 0,1 %;- of de brekingsindex tot op vier decimalen.    De refractometer moet zijn voorzien van een thermometer met ten minste een afleesbereik gaande van +15 °C tot +25 °C en van een thermostaatbad waardoor metingen kunnen worden verricht bij temperaturen tussen +15 °C en +25 °C.    De bedieningsvoorschriften van de refractometer dienen strikt te worden nageleefd, met name die betreffende de ijking en de lichtbron.3. VOORBEHANDELING  VAN  HET  MONSTER  3.1. Most en geconcentreerde most   Filtreer indien nodig de most eerst over een in vieren gevouwen droge rondfilter. Laat de eerste milliliter van het filtraat weglopen en neem de rest voor de bepaling.3.2. Gerectificeerde geconcentreerde most   Gebruik, afhankelijk van de concentratie, de gerectificeerde geconcentreerde most als dusdanig of de verdunning, verkregen door nauwkeurig 200 g gerectificeerde geconcentreerde most met water aan te lengen tot 500 g.4. WERKWIJZE   Breng het monster op een temperatuur van ongeveer 20 °C. Breng een klein deel van het monster op de onderste prisma van de refractometer. Zorg ervoor dat het monster, bij het tegen elkaar aanklemmen van de prisma's, het glasoppervlak uniform bedekt, en  voer de meting uit conform de bedieningsvoorschriften van het gebruikte apparaat.    Lees het massapercentage saccharose af, tot op 0,1 % nauwkeurig, of noteer de brekingsindex tot op vier decimalen.    Voer ten minste twee bepalingen uit op hetzelfde voorbehandelde monster. Noteer de temperatuur t °C.5. BEREKENINGEN  5.1. Temperatuurcorrectie  5.1.1. Toestellen met een afleesschaal in massapercenten saccharoseGebruik tabel I om te corrigeren voor de temperatuur.    5.1.2. Toestellen met een afleesschaal in brekingsindexeenhedenZoek in tabel II, kolom 1, bij de bij t °C gemeten brekingsindex het hiermee overeenkomende massapercentage saccharose bij t °C. Deze waarde wordt gecorrigeerd en uitgedrukt bij 20 °C met  behulp van tabel I.5.2. Suikergehalte van most en geconcentreerde most   Zoek in tabel II bij het bij 20 °C berekende massapercentage saccharose het hiermee overeenkomende suikergehalte in g/l en in g/kg. Het suikergehalte wordt opgegeven met één decimaal.5.3. Suikergehalte van gerectificeerde geconcentreerde most   Zoek in tabel III bij het bij 20 °C berekende massapercentage saccharose het hiermee overeenkomende suikergehalte in g/l en in g/kg. Het suikergehalte uitgedrukt als invertsuiker wordt opgegeven met één decimaal.    Als de bepaling is uitgevoerd met een verdunning van de gerectificeerde geconcentreerde most dan moet het resultaat vermenigvuldigd worden met de verdunningsfactor.5.4. Brekingsindex van most, geconcentreerde most en gerectificeerde geconcentreerde  most   Zoek in tabel II bij het bij 20 °C berekende massapercentage saccharose de hiermee overeenkomende brekingsindex bij 20 °C. De brekingsindexeenheden worden opgegeven met vijf decimalen.  TABEL I  Temperatuurcorrectie voor het geval dat het massapercentage saccharose is bepaald bij een temperatuur die afwijkt van 20 °C     De temperatuur mag ten opzichte van 20 °C niet meer dan 5 °C naar boven of naar beneden afwijken.   TABEL II  Overzicht van het suikergehalte  (4)  van most en geconcentreerde most in g/l en in g/kg, bepaald met behulp van een refractometer met een schaalverdeling of in massapercenten saccharose bij 20 °C of in brekingsindexeenheden bij 20 °C. De dichtheid bij 20 °C is eveneens vermeld     TABEL III  Overzicht van het suikergehalte  (5)  van gerectificeerde geconcentreerde most in g/l en in g/kg, bepaald met behulp van een refractometer met een schaalverdeling of in massapercenten saccharose bij 20 °C of in brekingsindexeenheden bij 20 °C. De dichtheid bij 20 °C is eveneens vermeld      3. ALCOHOLVOLUMEGEHALTE 1. BEGRIPSBEPALING   Het alcoholvolumegehalte is het aantal liters ethanol aanwezig in 100 l wijn, beide volumes gemeten bij een temperatuur van 20 °C. Het symbool hiervoor is ""% vol".    Opmerking:De ethanolhomologen en de esters van ethanol en van zijn homologen worden meegerekend, aangezien zij ook overdestilleren.2. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN  2.1. Destillatie van met een calciumhydroxidesuspensie alkalisch gemaakte wijn. Bepaling van het alcoholgehalte in het destillaat.   2.2. Referentiemethode: bepaling van de dichtheid van het destillaat met de pyknometer.2.3.Gebruikelijke methoden  2.3.1. Bepaling van het alcoholgehalte van het destillaat met de areometer  2.3.2. Bepaling van het alcoholgehalte van het destillaat door dichtheidsmeting met de hydrostatische balans  2.3.3. Bepaling van het alcoholgehalte van het destillaat met de refractometer   Opmerking:Om het alcoholgehalte uitgaande van de dichtheid van het destillaat te kunnen berekenen dient gebruik te worden gemaakt van de tabellen I, II en III, zoals vermeld in bijlage II bij dit hoofdstuk. Deze tabellen zijn berekend uit de  internationale alcoholtabellen, gepubliceerd in 1972 door de ""Organisation internationale de métrologie légale" (OIML) in haar aanbeveling nr. 22 en overgenomen door de OIV (Algemene Vergadering van 1974).    In tabel I (bijlage II) is de algemene vergelijking vermeld die het verband aangeeft tussen het alcoholvolumegehalte en de dichtheid van alcohol-water mengsels bij verschillende temperaturen.3. DESTILLATIE  3.1. Apparatuur  3.1.1. Destillatieopstelling, bestaande uit:- een kolf van 1 l met genormaliseerd slijpstuk;- een rectificeerkolom van ongeveer 20 cm lengte of elke andere voorziening bedoeld om wegspatten te voorkomen;- een warmtebron; verbranding van te extraheren  bestanddelen moet worden voorkomen door gebruik te maken van een geschikte voorziening;- een koeler, eindigend in een dunne buis die het destillaat naar de bodem van de opvangkolf (maatkolf van 200 ml) leidt welke enkele milliliters water bevat.   3.1.2. Stoomdestillatieopstelling, bestaande uit:1. een stoomgenerator,2. een monsterhouder,3. een rectificeerkolom,4. een koeler.    Elke destillatieopstelling of elke andere opstelling om stoom te genereren kan worden gebruikt mits aan de volgende voorwaarden wordt voldaan.     Destilleer vijf maal achter elkaar een alcohol-water mengsel met een alcoholgehalte van 10 % vol; het vijfde destillaat moet ten minste een alcoholgehalte hebben van 9,9 % vol, dat wil zeggen dat bij iedere destillatie niet meer dan 0,02 % vol ethanol  verloren mag gaan.3.2. Reagentia  3.2.1. Calciumhydroxidesuspensie 2 M  Giet voorzichtig 1 l warm water (60-70 °C) op 120 gram ongebluste kalk, CaO.3.3.Voorbehandeling van het monster   Uit jonge en mousserende wijn wordt eerst het meeste kooldioxide verwijderd door 250-300 ml wijn om te schudden in een kolf van 500 ml.3.4. Werkwijze  Vul een maatkolf van 200 ml met wijn. Noteer de temperatuur van de wijn.    Breng de wijn over in de destillatiekolf of in de monsterhouder van de stoomdestillatieopstelling. Spoel de maatkolf vier maal met telkens 5 ml water en breng dit over in de destillatiekolf of de monsterhouder. Voeg 10 ml calciumhydroxidesuspensie  (3.2.1) toe en ook wat kooksteentjes (bij voorbeeld puimsteen) bij gebruik van de destillatieopstelling.    Vang het destillaat op in dezelfde maatkolf van 200 ml die is gebruikt voor het afmeten van de wijn.    Indien een destillatieopstelling wordt gebruikt, moet ongeveer driekwart van het oorspronkelijke volume worden overgedestilleerd.    Indien een stoomdestillatieopstelling wordt gebruikt, moet 198-199 ml worden opgevangen.    Vul met gedestilleerd water aan tot 200 ml bij een temperatuur die niet meer dan 2 °C mag afwijken van de begintemperatuur.    Meng voorzichtig door een zwenkende beweging.    Opmerking:Bij ammoniumrijke wijnen kan het destillaat opnieuw worden gedestilleerd onder bovenstaande omstandigheden waarbij de calciumhydroxidesuspensie wordt vervangen door 1 ml zwavelzuur 10 % (v/v).4. REFERENTIEMETHODE   Bepaling van het alcoholgehalte van het destillaat met pyknometrie.4.1. Apparatuur  4.1.1. Pyknometer geijkt volgens de richtlijnen van het hoofdstuk 1. ""Dichtheid"4.2. Werkwijze   Ga te werk zoals beschreven in de punten 4.3.1 en 4.3.2 van hoofdstuk 1. ""Dichtheid" en bepaal de schijnbare dichtheid bij t °C van het destillaat (3.4); zij r t °C deze dichtheid.4.3. Weergave van de resultaten  4.3.1. Rekenwijze   Bepaal het alcoholgehalte bij 20 °C met behulp van tabel I. Zoek daartoe in de tabel die regel op die behoort bij de op gehele getallen naar beneden afgeronde temperatuur t °C, deze zij T °C en kies dan op die regel die dichtheid uit die net groter is  dan de experimenteel gevonden waarde r t. Gebruik het interpolatiegetal direct onder deze dichtheid om de dichtheid r bij T °C te berekenen.    Zoek dan op de lijn van deze temperatuur T de dichtheid r2 die net groter is dan r en bereken het verschil tussen deze twee dichtheden. Het verschil wordt gedeeld door het interpolatiegetal aan de rechterkant van de dichtheid r 2. Het quotiënt geeft  het decimale deel van het alcoholgehalte, terwijl het aantal hele graden wordt aangegeven in de kop van de kolom waarin de dichtheid r 2 staat.    Een voorbeeld van de berekening van het alcoholgehalte is opgenomen in bijlage I van dit hoofdstuk.    Opmerking:Deze temperatuurscorrectie is in een rekenprogramma verwerkt en kan eventueel automatisch worden uitgevoerd.4.3.2. Herhaalbaarheid (r)   r = 0,10 % vol.4.3.3.Reproduceerbaarheid (R)   R = 0,19 % vol.5. GEBRUIKELIJKE  METHODEN  5.1. Areometrie  5.1.1.Apparatuur  5.1.1.1. Alcoholmeter   De alcoholmeter moet voldoen aan de specificaties van klasse I of klasse II, zoals gedefinieerd in Internationale aanbeveling nr. 44 ""Alcoholmeters en areometers voor alcohol" van de OIML.   5.1.1.2. Thermometer, van 0 tot 40 °C, met een schaal verdeeld in tienden van graden en tot op 0,05 °C nauwkeurig afleesbaar  5.1.1.3. Maatcilinder met een doorsnede van 36 mm en 320 mm hoog, die met behulp van een statief loodrecht overeind wordt gehouden5.1.2. Werkwijze   Breng het destillaat (3.4) in de maatcilinder. Hou deze recht overeind. Breng de thermometer en de alcoholmeter in het destillaat. Zwenk voorzichtig om een temperatuursevenwicht te bereiken tussen de maatcilinder, de thermometer, de alcoholmeter en het  destillaat en lees na één minuut de temperatuur af. Verwijder de thermometer en lees na één minuut het schijnbare alcoholgehalte af. Verricht ten minste drie metingen met behulp van een vergrootglas. Het schijnbaar gemeten gehalte bij t °C wordt  gecorrigeerd voor de temperatuur met behulp van tabel II. Het verdient aanbeveling de temperatuur van de vloeistof niet te veel te laten afwijken van de kamertemperatuur (maximaal 5 °C verschil).5.2. Dichtheidsmeting met de hydrostatische balans  5.2.1. Apparatuur  5.2.1.1. Hydrostatische balans zoals aangegeven in hoofdstuk 1. ""Dichtheid" 5.2.2. Werkwijze  Ga te werk zoals beschreven in punt 5.2.2 van hoofdstuk 1. ""Dichtheid" en bepaal de schijnbare dichtheid van het destillaat bij t °C.5.2.3. Weergave van de resultaten  Bepaal het alcoholgehalte bij 20 °C volgens de richtlijnen beschreven in punt 4.3.1 met behulp van tabel I indien de vlotter in pyrex is of met behulp van tabel III indien de vlotter in gewoon glas is.5.3. Refractometrie  5.3.1. Apparatuur  5.3.1.1. Refractometer, waarop de brekingsindex kan worden afgelezen tussen 1,330 en 1,346   Afhankelijk van het type apparaat worden de metingen gedaan:- bij 20 °C, indien de refractometer is uitgerust met een thermostaat, of- bij kamertemperatuur t °C, gemeten met een thermometer die kan worden afgelezen op ten minste 0,05 °C nauwkeurig. Een  temperatuurscorrectietabel hoort bij een dergelijk apparaat aanwezig te zijn.5.3.2. Werkwijze   De meting van de brekingsindex wordt uitgevoerd op het wijndestillaat (3.4). Volgens de werkwijze voorgeschreven voor het gebruikte type apparaat.5.3.3. Weergave van de resultaten   Via de brekingsindex bij 20 °C wordt in tabel IV het alcoholgehalte afgelezen.    Opmerking:Tabel IV geeft de correlatie weer tussen de brekingsindex en de alcoholgehalten van zuiver alcohol-water mengsels en wijndestillaten. Bij wijndestillaten is rekening gehouden met onzuiverheden van het destillaat (voornamelijk hogere  alcoholen). De aanwezigheid van methanol veroorzaakt een verlaging van de brekingsindex en dus van het alcoholgehalte.   6. VOORBEELD  VAN  EEN  BEREKENING  VAN  HET  ALCOHOLGEHALTE  VAN  WIJN  6.1. Pyknometrie met de tweearmige balans  6.1.1. De pyknometerconstanten zijn bepaald en berekend zoals aangegeven in punt 6.1.1 van hoofdstuk 1. ""Dichtheid en relatieve dichtheid".  Getallenvoorbeeld.6.1.2. Weging van de met destillaat gevulde pyknometerTarra = pyknometer + Stel t °C = 18,90 °C destillaat  t °C gecorrigeerd = 18,70 °C  bij t °C + p"  p"= 2,8074 g p + m   p" = massa van het destillaat bij t °C 105,0698   2,8074 = 102,2624 g   Schijnbare dichtheid bij t °C: 6.1.3. Berekening van het alcoholgehalte          Zie de tabel van de schijnbare dichtheden van alcohol-water mengsels bij verschillende temperaturen, zoals boven is aangegeven Op de regel van 18 °C in de tabel van de schijnbare dichtheden is de dichtheid die net groter is dan de waargenomen dichtheid van 0,983076: 0,98398, in de kolom 11 % De dichtheid bij 18 °C is dus:  (98307,6 + 0,7 × 22) · 10 5 = 0,98323 0,98398   0,98323 = 0,00075 Het decimale gedeelte van het alcoholgehalte is 75/114 = 0,65 Het alcoholgehalte is 11,65 % vol.6.2. Pyknometrie met de eenarmige balans  6.2.1. De pyknometerconstanten zijn bepaald en berekend zoals aangegeven in punt 6.2.1 van hoofdstuk 1. ""Dichtheid en relatieve dichtheid".   6.2.2. Weging van de met destillaat gevulde pyknometer   Massa van de tarrafles op het ogenblik van de bepaling: T1 = 171,9178 gMassa van de pyknometer gevuld met destillaat bij 20,50 °C: P2 = 167,8438 gVariatie in de luchtdruk: dT = 171,9178   171,9160 = + 0,0018 gMassa van het destillaat bij 20,50 °C: Lt = 167,8438   (67,6695 + 0,0018) = 100,1725 gSchijnbare dichtheid van het destillaat:6.2.3. Berekening van het alcoholgehalte          Zie de tabel van de schijnbare dichtheden van alcohol-water mengsels bij verschillende temperaturen, zoals boven is aangegeven Op de regel van 20 °C in de tabel van de schijnbare dichtheden is de dichtheid die net groter is dan de waargenomen dichtheid van 0,983825: 0,98471, in de kolom 10 %.  De dichtheid bij 20 °C is dus: (98382,5 + 0,50 × 24)· 10 5 = 0,983945 g/ml 0,98471   0,983945 = 0,000765 Het decimale gedeelte van het alcoholgehalte is 76,5/119 = 0,64 Het alcoholgehalte is 10,64 % vol.  FORMULE  WAARMEE  DE  ALCOHOLTABELLEN  KUNNEN  WORDEN  BEREKEND  UIT  ETHYLALCOHOL-WATER  MENGSELSDe dichtheid t °C, uitgedrukt in kilogram per kubieke meter (kg/m³), van een ethylalcohol-water mengsel bij een temperatuur t, uitgedrukt in graden  Celsius, wordt door de volgende formule gegeven, waarbij:   - het gehalte p wordt uitgedrukt in een decimaal getal (6),- de temperatuur wordt uitgedrukt in °C (E. I. P. T. 68),- de coëfficiënten de hierna volgende waarden hebben.   De formule geldt voor temperaturen van   20 °C tot + 40 °C.  Coëfficiënten in de formule    TABEL  I  Internationaal alcoholgehalte bij 20 °CTabel van de schijnbare dichtheid van alcohol-water mengsels bij gebruik van een pyknometer in pyrexDichtheid bij t °C, gecorrigeerd voor de opwaartse druk van de lucht                      TABEL  II  INTERNATIONAAL  ALCOHOLGEHALTE  BIJ  20 °CTabel van de correctie die moet worden toegepast om het schijnbare alcoholgehalte, bepaald met behulp van een alcoholmeter in gewoon glas bij t °C, te herleiden naar 20 °C+ als t w 20 °C   als t W 20  °C               TABEL  III  INTERNATIONAAL  ALCOHOLGEHALTE  BIJ  20 °CTabel van de schijnbare dichtheid van alcohol-water mengsels bij gebruik van apparatuur in gewoon glasDichtheid bij t °C, gecorrigeerd voor de opwaartse druk van de lucht                     TABEL  IV  Correlatietabel tussen de brekingsindexen bij 20 °C en de alcoholgehalten bij 20 °C van zuivere alcohol-water mengsels en destillaten     4. TOTAAL  DROOG  EXTRACT   Totaal droge stof1. Begripsbepalingen   Het ""totaal droog extract" of de ""totaal droge stof" is de totale massa aan stoffen die onder bepaalde fysische omstandigheden niet vervluchtigen. Deze fysische omstandigheden moeten van dien aard zijn dat de stoffen waaruit het extract bestaat zo  min mogelijk verandering ondergaan.    Het""niet reducerend extract" is het droog extract verminderd met het totaal aan suikers.    Het""gereduceerd extract" is het totaal droog extract verminderd met het suikergehalte, voor zover dat hoger is dan 1 g/l, met het kaliumsulfaatgehalte, voor zover dit hoger is dan 1 g/l, met het gehalte aan mannitol, voor zover aanwezig, en met alle  eventueel aan de wijn toegevoegde chemische stoffen.    De""extractrest" is het niet reducerend extract verminderd met het in wijnsteenzuur uitgedrukte gehalte aan gebonden zuur.    Het extract wordt uitgedrukt in gram per liter en moet tot op 0,5 g nauwkeurig worden bepaald.2. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Enige methode: densimetrie.    Het totaal droog extract wordt indirect berekend, voor most uit de relatieve dichtheid en voor wijn uit de relatieve dichtheid van de alcoholvrij gemaakte wijn.    Dit droog extract komt overeen met de hoeveelheid saccharose die, opgelost in 1 l water, een oplossing geeft met dezelfde relatieve dichtheid als de most of de alcoholvrije wijn. Deze hoeveelheid wordt afgelezen in tabel I.3. WERKWIJZE   De relatieve dichtheid d2020 van de alcoholvrij gemaakte wijn (dr) wordt berekend met de formule:dr = dv   da + 1,000waarin dv = de relatieve dichtheid van de wijn bij 20 °C (gecorrigeerd voor het gehalte aan vluchtige zuren (7)) waarin da = de  relatieve dichtheid bij 20 °C van een alcohol-water mengsel met hetzelfde alcoholgehalte als de wijn.    De waarde van dr kan ook worden berekend door uit te gaan van de dichtheden bij 20 °C van de wijn,r v, en van het alcohol-water mengsel met hetzelfde alcoholgehalte als de wijn, r a, en wel volgens de formule:dr = 1,0018 (r v   r a) + 1,000waarin de  coëfficiënt 1,0018 praktisch gelijk gesteld kan worden aan 1 wanneer r v kleiner is dan 1,05, hetgeen meestal het geval is.4. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN   Met behulp van tabel I wordt het totaal droog extract berekend uitgaande van de relatieve dichtheid d2020 van alcoholvrij gemaakte wijn of uit de relatieve dichtheid van most.    Het totaal droog extract wordt opgegeven in gram per liter met één decimaal.   TABEL  I  voor de berekening van het gehalte aan totaal droog extract in g/l  Invoegingstabel  5. REDUCERENDE  SUIKERS 1. BEGRIPSBEPALING   Onder ""reducerende suikers" wordt verstaan het totaal aan suikers met keton- of aldehydegroepen die worden bepaald door hun reducerende werking op een basische kopersulfaatoplossing.2. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN  2.1. Klaring  2.1.1. Referentiemethode: de geneutraliseerde en alcoholvrij gemaakte wijn wordt over een anionenwisselaarskolom (acetaatvorm) geleid waarbij de anionen worden uitgewisseld voor acetaationen, vervolgens vindt klaring plaats met neutraal loodacetaat.   2.1.2. Gebruikelijke methoden: de wijn wordt behandeld met een van de volgende reagentia:   2.1.2.1. Neutraal loodacetaat  2.1.2.2. Zinkhexacyanoferraat (II)2.2. Bepaling  2.2.1. Enige methode: na de geklaarde wijn of most te hebben laten reageren met een bekende hoeveelheid basische kopersulfaatoplossing wordt de overmaat koper jodometrisch bepaald.3. KLARING   De vloeistof waarin de suikers worden bepaald moet een suikergehalte hebben tussen 0,5 en 5 g/l.    Een droge wijn hoeft tijdens de klaring niet te worden verdund; een zoete wijn wordt bij de klaring zover verdund dat het gehalte aan suikers tussen de in de onderstaande tabel aangegeven grenzen komt te liggen.                  OmschrijvingSuikergehalte in g/lDichtheidToe te passen verdunning in %Most, mistella>125>1,0381Zoete wijn, al dan niet versterkt  25-125  1,005-1,038  4Zachte wijn5-250,997-1,00520Droge wijn< 5< 0,997geen verdunning3.1. Referentiemethode  3.1.1. Reagentia  3.1.1.1. Zoutzuuroplossing (HCl), 1 M  3.1.1.2. Natriumhydroxideoplossing (NaOH), 1 M  3.1.1.3. Azijnzuuroplossing (CH3COOH), 4 M  3.1.1.4. Natriumhydroxideoplossing (NaOH), 2 M  3.1.1.5. Anionenwisselaarshars (type Dowex 3 (20-50 mesh) of gelijkwaardig)   Bereiding van de anionenwisselaarskolom.  Breng onder in een buret voorzien van een kraan een propje glaswol aan en 15 ml anionenwisselaarshars (3.1.1.5).     Alvorens de hars in gebruik te nemen moet dit twee keer volledig worden geregenereerd door een wisselende behandeling met zoutzuuroplossing (3.1.1.1) en natriumhydroxideoplossing (3.1.1.2). Breng de hars, na spoelen met 50 ml gedestilleerd water, over  in een bekerglas, voeg hier 50 ml azijnzuuroplossing (3.1.1.3) aan toe en schud gedurende vijf minuten. Vul de buret opnieuw en laat 100 ml azijnzuuroplossing (3.1.1.3) doorlopen. (Aanbevolen wordt een voorraad hars te bewaren in fles gevuld met deze 4  M azijnzuuroplossing.) Was de kolom met gedestilleerd water totdat het waswater neutraal is.    Regenerering van de hars. Laat 150 ml natriumhydroxideoplossing (3.1.1.4) doorlopen om de zuren en het grootste deel van de aan de hars gehechte kleurstoffen te verwijderen. Spoel met 100 ml water en daarna met 100 ml azijnzuuroplossing (3.1.1.3). Was  de kolom met gedestilleerd water totdat het waswater neutraal is.   3.1.1.6. Neutraal-loodacetaatoplossing (ongeveer verzadigd)Neutraal loodacetaat, Pb(CH3COO)2, 3H2O: 250 g Heet water toevoegen en aanlengen tot: 500 ml.Los op door schudden.   3.1.1.7. Calciumcarbonaat, CaCO33.1.2. Werkwijze  3.1.2.1. Droge  wijn   Breng 50 ml wijn in een bekerglas met een doorsnede van 10-12 cm, waaraan 0,5 (n   0,5) ml natriumhydroxideoplossing (3.1.1.2) is toegevoegd (n = het voor de bepaling van totaal zuur in 10 ml wijn benodigde volume 0,1 M natriumhydroxideoplossing). Damp  in op een kokend-waterbad onder begeleiding van een warme luchtstroom tot het volume is teruggebracht tot ongeveer 20 ml.    Laat deze vloeistof met een snelheid van 3 ml per twee minuten door de kolom gevuld met anionenwisselaar in acetaatvorm (3.1.1.5) lopen. Vang de uitstromende vloeistof op in een maatkolf van 100 ml. Spoel het bekerglas en de kolom zes keer met 10 ml  gedestilleerd water. Voeg onder schudden 2,5 ml verzadigde loodacetaatoplossing (3.1.1.6) en 0,5 g calciumcarbonaat (3.1.1.7) toe; schud enkele malen goed en wacht ten minste 15 minuten; vul aan met water tot de maatstreep en filtreer.    1 ml van dit filtraat komt overeen met 0,5 ml wijn.   3.1.2.2. Most,  mistella,  zoete  wijn  en  zachte  wijn   Bij wijze van voorbeeld kunnen volgende verdunningen worden gemaakt:    1) Most en mistellaVerdun 10 ml van de te analyseren vloeistof tot 100 ml, neem hiervan een monster van 10 ml.    2) Zoete wijn, al dan niet versterkt, waarvan de dichtheid ligt tussen 1,005 en 1,038 g/mlVerdun 20 ml van de te analyseren vloeistof tot 100 ml, neem hiervan een monster van 20 ml.    3) Zachte wijn, waarvan de dichtheid ligt tussen 0,997 en 1,005 g/mlNeem een monster van 20 ml niet verdunde wijn.Laat het hierboven aangegeven monster al dan niet verdunde wijn of most met een snelheid van 3 ml per twee minuten door de kolom gevuld  met anionenwisselaar in acetaatvorm lopen. Vang de uitstromende vloeistof op in een maatkolf van 100 ml, spoel de kolom na met water totdat ongeveer 90 ml vloeistof is verkregen. Voeg 0,5 g calciumcarbonaat (3.1.1.7) en 1 ml verzadigde  loodacetaatoplossing (3.1.1.6) toe; schud af en toe gedurende een periode van ten minste 15 minuten; vul aan met water tot de maatstreep en filtreer.Bij gebruik van de hierboven aangegeven hoeveelheden most, mistella, zoete wijn en zachte wijn:     1) komt 1 ml filtraat overeen met 0,01 ml most of mistella;2) komt 1 ml filtraat overeen met 0,04 ml zoete wijn;3) komt 1 ml filtraat overeen met 0,20 ml zachte wijn.  3.2. Gebruikelijke methoden  3.2.1. Klaring met neutraal loodacetaat  3.2.1.1. Reagentia   Neutraal-loodacetaatoplossing (ongeveer verzadigd) (3.1.1.6).Calciumcarbonaat, CaCO3 (3.1.1.7).3.2.1.2. Werkwijze  3.2.1.2.1. Droge wijn   Breng 50 ml wijn in een maatkolf van 100 ml; voeg hieraan 0,5 (n   0,5) ml natriumhydroxideoplossing (3.1.1.2) toe, waarin n = het voor de bepaling van totaal zuur in 10 ml wijn benodigde volume 0,1 M natriumhydroxideoplossing. Voeg onder schudden 2,5  ml verzadigde loodacetaatoplossing (3.1.1.6) en 0,5 g calciumcarbonaat (3.1.1.6) toe; schud enkele malen goed en wacht ten minste 15 minuten; vul aan tot de maatstreep met water en filtreer.1 ml van dit filtraat komt overeen met 0,5 ml wijn.3.2.1.2.2.  Most, mistella, zoete wijn en zachte wijn   Breng in een maatkolf van 100 ml een monster al dan niet verdunde wijn (of most of mistella), waarbij de hieronder aangegeven verdunningen louter richtinggevend zijn:    1) Most en mistellaVerdun 10 ml van de te analyseren vloeistof tot 100 ml; neem hiervan een monster van 10 ml.    2) Zoete wijn, al dan niet versterkt, waarvan de dichtheid ligt tussen 1,005 en 1,038 g/mlVerdun 20 ml van de te analyseren vloeistof tot 100 ml; neem hiervan een monster van 20 ml.    3) Zachte wijn, waarvan de dichtheid ligt tussen 0,997 en 1,005 g/mlNeem een monster van 20 ml van de niet verdunde wijn.Voeg 0,5 g calciumcarbonaat, ongeveer 60 ml water en 0,5, 1 of 2 ml verzadigde loodacetaatoplossing toe; schud af en toe gedurende  een periode van 15 minuten. Vul aan tot de maatstreep met water en filtreer.Bij gebruik van de hierboven aangegeven hoeveelheden most, mistella, zoete wijn en zachte wijn:1) komt 1 ml filtraat overeen met 0,01 ml most of mistella;2) komt 1 ml filtraat  overeen met 0,04 ml zoete wijn;3) komt 1 ml filtraat overeen met 0,20 ml zachte wijn.3.2.2. Klaring met zinkhexacyanoferraat (II)   Deze klaringsmethode kan slechts worden gebruikt voor witte wijn, licht gekleurde zoete wijn en most.3.2.2.1. Reagentia  3.2.2.1.1. Kaliumhexacyanoferraat (II)-oplossing   Kaliumhexacyanoferraat (II),K4Fe(CN)6,3H2O:   150 g Oplossen in water en aanlengen tot: 1 000 ml.  3.2.2.1.2. Zinksulfaatoplossing (II)Zinksulfaat, ZnSo4,7H2O:   300 g Oplossen in water en aanlengen tot: 1 000 ml.  3.2.2.2. Werkwijze   Breng in een maatkolf van 100 ml een monster al dan niet verdunde wijn (of most of mistella) waarbij de hieronder aangegeven verdunningen louter richtinggevend zijn:    1) Most en mistellaVerdun 10 ml van de te analyseren vloeistof tot 100 ml, neem hiervan een monster van 10 ml.    2) Zoete wijn, al dan niet versterkt, waarvan de dichtheid ligt tussen 1,005 en 1,038 g/mlVerdun 20 ml van de te analyseren vloeistof tot 100 ml; neem hiervan een monster van 20 ml.    3) Zachte wijn, waarvan de dichtheid ligt tussen 0,997 en 1,005 g/mlNeem een monster van 20 ml van de niet verdunde wijn.    4) Droge wijnNeem een monster van 50 ml van de niet verdunde wijn.Voeg toe 5 ml kaliumhexacyanoferraatoplossing (3.2.2.1.1) en 5 ml zinksulfaatoplossing (3.2.2.1.2). Meng. Vul aan tot de maatstreep met water. Wacht tien minuten en filtreer.Bij gebruik  van de hierboven aangegeven hoeveelheden most, mistella, zoete wijn, zachte wijn en droge wijn:     1) komt 1 ml filtraat overeen met 0,01 ml most of mistella;2) komt 1 ml filtraat overeen met 0,04 ml zoete wijn;3) komt 1 ml filtraat overeen met 0,20 ml zachte wijn;4) komt 1 ml filtraat overeen met 0,50 ml droge wijn.  4. BEPALING  VAN  HET  SUIKERGEHALTE  4.1. Reagentia  4.1.1. Basische kopersulfaatoplossingKopersulfaat p.a., CuSO4, 5H2O:   25 g Citroenzuur, C6H8O7, H2O:   50 g Natriumcarbonaat, Na2CO3, 10H2O:   388 g Gedestilleerd water tot: 1 000 ml.Los het kopersulfaat op in 100 ml water, het citroenzuur in 300 ml water en het natriumcarbonaat in 300 à 400 ml heet water. Meng de citroenzuuroplossing met de natriumcarbonaatoplossing. Voeg vervolgens de  kopersulfaatoplossing toe en vul aan tot 1 l.4.1.2. Kaliumjodideoplossing 30 % (m/m)Kaliumjodide, KI:  30 g Gedestilleerd water tot: 100 ml.Bewaar deze oplossing in een bruingekleurde fles.4.1.3. Zwavelzuuroplossing 25 % (m/m)Zwavelzuur, H2SO4, r20 = 1,84 g/ml:  25 g Gedestilleerd water tot: 100 ml.Giet het zuur in water, laat afkoelen en vul aan tot 100 ml.4.1.4. Zetmeeloplossing 5 g/l   Meng 5 g oplosbaar zetmeel met ongeveer 500 ml water. Breng al roerend aan de kook en laat tien minuten doorkoken; voeg 200 g natriumchloride (NaCl) toe. Vul na afkoelen aan tot 1 l.4.1.5. Natriumthiosulfaatoplossing, Na2S2O3, 0,1 M  4.1.6. Invertsuikeroplossing, 5 g/l   Deze oplossing wordt gebruikt om de bepalingsmethode te controleren.     Breng in een maatkolf van 200 ml:Saccharose p.a., C12H22O11: 4,75 g Gedestilleerd water, ongeveer: 100 ml Zoutzuur p.a., HCl, r20 = 1,16 1,19 g/ml:  5 ml.Dompel de maatkolf in een waterbad van 60 °C gedurende een tijd die voldoende is om de vloeistof een temperatuur van 50 °C te laten bereiken, handhaaf deze temperatuur nog 15 minuten. Neem de kolf uit het  bord en laat hem gedurende 30 minuten afkoelen; koel verder af door de kolf te dompelen in een koud-waterbad. Breng de inhoud van de kolf over in een maatkolf van 1 l. Vul aan tot 1 l. Deze oplossing is gedurende één maand houdbaar. Neutraliseer bij  gebruik de overmaat aan zuur van het genomen monster met natriumhydroxideoplossing (de oplossing is ongeveer 0,06 M zuur).4.2. Werkwijze   Pipetteer in een Erlenmeyer met slijpstuk van 300 ml: 25 ml basische kopersulfaatoplossing (4.1.1), 15 ml water en 10 ml filtraat (3.1.2 of 3.2.1.2 of 3.2.2.2). Deze hoeveelheid filtraat mag niet meer dan 60 mg invertsuiker bevatten.    Voeg enkele puimsteenkorrels toe. Bevestig een terugvloeikoeler en breng binnen twee minuten aan de kook. Laat precies tien minuten koken.    Koel direct af onder koud stromend water. Voeg na volledige afkoeling 10 ml kaliumjodideoplossing (4.1.2), 25 ml zwavelzuur (4.1.3) en 2 ml zetmeeloplossing (4.1.4) toe.    Titreer met de natriumthiosulfaatoplossing (4.1.4). Het verbruikte aantal milliliters zij n.    Voer tevens een blanco-bepaling uit, waarbij de 10 ml filtraat wordt vervangen door 10 ml gedestilleerd water. Het verbruikte aantal milliliters zij n2.4.3. Weergave van de resultaten  4.3.1. Berekening   De hoeveelheid suiker, uitgedrukt als invertsuiker, die in het monster aanwezig is, wordt afgelezen in onderstaande tabel als functie van het verbruikte aantal milliliters natriumthiosulfaatoplossing (n2   n).    Druk het gehalte aan invertsuiker in de wijn uit in g/l met één decimaal en houdt hierbij rekening met de vóór en tijdens de klaring toegepaste verdunningen.4.3.2. Herhaalbaarheid   r = 0,015 xi.xi = gehalte aan invertsuiker in g/l.4.3.3. Reproduceerbaarheid   R = 0,058 xi.xi = gehalte aan invertsuiker in g/l.          6. SACCHAROSE 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN   II. Kwalitatief onderzoek met behulp van dunne-laagchromatografieSaccharose wordt gescheiden van de andere suikers op een dunne-laagplaat met cellulose en gedecteerd door behandeling met het ureum-zoutzuur-reagens en ontwikkeling in een droogstoof bij  105 °C.    II. Kwantitatieve bepaling met behulp van hoge-druk-vloeistofchromatografieSaccharose wordt gescheiden op een alkylamine-silicum kolom en refractometrisch bepaald, met behulp van een externe standaardoplossing die onder dezelfde omstandigheden wordt  onderzocht.     Opmerking:De authenticiteit van most of wijn kan worden bepaald met behulp van deuteriumkernspinresonantie, zoals beschreven in hoofdstuk 8,""Aantonen van verrijking en aanlenging van most, geconcentreerde most, gerectificeerde geconcentreerde most en  wijn met behulp van deuteriumkernspinresonantie". Voor het bepalen van suiker kan ook gebruik worden gemaakt van de gaschromatografische methode beschreven in hoofdstuk 12. ""Speciale analysemethoden voor gerectificeerde geconcentreerde most", oder  f).2. KWALITATIEF ONDERZOEK MET BEHULP VAN DUNNE-LAAGCHROMATOGRAFIE2.1. Apparatuur  2.1.1. Platen voor dunne-laagchromatografie voorzien van een laag cellulose  2.1.2. Ontwikkeltank  2.1.3. Micrometerspuit of micropipet  2.1.4. Droogstoof, regelbaar op 105 ± 2 °C2.2. Reagentia  2.2.1. Actieve kool  2.2.2. Loopvloeistof: methyleenchloride, azijnzuur (r 20 = 1,05 g/ml), ethanol, methanol en gedestilleerd water (50 : 29 : 9 : 6 : 10).   2.2.3. OntwikkelaarUreum:  5 g Zoutzuuroplossing, 2 M:  20 ml Ethanol: 100 ml.   2.2.4. StandaardoplossingGlucose:   35   g Fructose:   35   g Saccharose:    0,5 g Gedestilleerd water tot: 1 000   ml.2.3. Werkwijze  2.3.1. Voorbehandeling van het monster   Wanneer most of wijn sterk is gekleurd dient ontkleuring plaats te vinden door behandeling met actieve kool (2.2.1).    Bij gerectificeerde geconcentreerde most dient de oplossing te worden gebruikt met een suikergehalte van 25 % (m/m) (25 ° Brix), bereid zoals aangegeven in punt 4.1.2 in hoofd stuk 20 ""Bepaling van de pH". Deze dient nog verder te worden verdund door  25 ml in een maatkolf met gedestilleerd water aan te vullen tot 100 ml.2.3.2. Chromatografie   Breng aan op 2,5 cm van de onderkant van de dunne-laagplaat:- 10 µl monsteroplossing;- 10 µl standaardoplossing.    Plaats de dunne-laagplaat in de ontwikkeltank verzadigd met de gasfase van de loopvloeistof en laat de loopvloeistof opstijgen tot op 1 cm van de bovenkant. De plaat uitnemen en drogen onder een stroom van warme lucht. Herhaal de migratie twee maal en  droog telkens. Besproei gelijkmatig de plaat met 15 ml ontwikkelaar en droog haar gedurende vijf minuten in de droogstoof op 105 °C.2.4. Resultaten   Saccharose en fructose vormen donkerblauwe vlekken; glucose geeft een minder intense groenachtige vlek.3. KWANTITATIEVE  BEPALING  MET  BEHULP  VAN  HOGE-DRUKVLOEISTOF- CHROMATOGRAFIE   De chromatografische voorwaarden zijn slechts aangegeven ter informatie.3.1. Apparatuur  3.1.1. Hoge-drukvloeistofchromatograaf   De hoge-drukvloeistofchromatograaf is voorzien van:1) een injectielus van 10 µl;2) een differentiële of een interferrometrische refractometer, als detector;3) een alkylamine-silicumkolom (25 cm lengte en 4 mm inwendige doormeter);4) een voorkolom  gevuld met dezelfde fase;5) een voorziening voor het isoleren of thermostateren (30 °C) van het geheel voorkolom-kolom;6) een schrijver, eventueel een integrator;7) snelheid van de mobiele fase: 1 ml/min.3.1.2. Membraanfilters (0,45 µm) en  toebehoren3.2.Reagentia  3.2.1. Dubbel gedestilleerd water  3.2.2. Acetonitril van HPLC-kwaliteit (CH3CN)  3.2.3. Mobiele fase: acetonitril-water (80 20, V/V), gefiltreerd, over een membraanfilter (0,45 µm).De mobiele fase moet vóór het gebruik worden ontgast.   3.2.4. Standaardoplossing: waterige saccharoseoplossing van 1,2 g/l. Deze moet over een membraanfilter (0,45 µm) worden gefiltreerd.  3.3. Werkwijze  3.3.1. Voorbehandeling van het monster   - Wijn en most:  filtreren over een membraanfilter (0,45 µm).- Gerectificeerde geconcentreerde most:  gebruik de verdunde oplossing verkregen zoals beschreven in punt 5.1.2 van hoofdstuk 11, ""Totaal zuur", verdun de gerectificeerde geconcentreerde most tot 40 % (m/v) en filtreer de aldus verkregen oplossing over een membraanfilter (0,45 µm).3.3.2.  Chromatografie   Injecteer in de vloeistofchromatograaf achtereenvolgens 10 µl referentieoplossing en 10 µl volgens 3.3.1 voorbehandeld monster. Herhaal deze injecties in dezelfde volgorde.Registreer het chromatogram.De retentietijd van saccharose is ongeveer tien  minuten.3.4. Berekening   Gebruik voor de gehaltebepaling het gemiddelde van de twee pieken, zowel voor de referentieoplossing als voor het monster.3.4.1. Wijn en most   Bereken het saccharosegehalte in g/l.3.4.2. Gerectificeerde geconcentreerde most   Het gehalte aan saccharose van de tot 40 % (m/v) verdunde most zij C g/l.    Het gehalte aan saccharose in gram per kilogram van de gerectificeerde geconcentreerde most is dan:  2,5 · C.3.5. Weergave van de resultaten   Het saccharosegehalte van wijn, most en gerectificeerde geconcentreerde most wordt opgegeven in gram per liter (voor wijn en most) en in gram per kilogram met één decimaal (voor gerectificeerde geconcentreerde most).    7. GLUCOSE  EN  FRUCTOSE 1. DEFINITIE   Glucose en fructose kunnen langs enzymatische weg afzonderlijk worden bepaald waardoor de verhouding glucose/fructose kan worden berekend.2. PRINCIPE   Glucose en fructose worden tijdens een enzymatische reactie die wordt gekatalyseerd door hexokinase (HK) met adenosine-trifosfaat (ATP) gefosforyleerd tot glucose-6-fosfaat (G6P) en fructose-6-fosfaat (F6P):    glucose + ATP  G6P + ADP   fructose + ATP  F6P + ADP   Het glucose-6-fosfaat wordt met nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide-fosfaat (NADP) in aanwezigheid van het enzym glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PDH) geoxideerd tot gluconaat-6-fosfaat. De hoeveelheid gereduceerd  nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide-fosfaat (NADPH) die hierbij ontstaat is een maat voor de hoeveelheid glucose-6-fosfaat en dus voor glucose:    G6P + NADP+  gluconaat-6-fosfaat + NADPH + H+   De bepaling van het gereduceerde nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide-fosfaat vindt plaats door meting van de absorptie bij 340 nm.    Wanneer deze reactie is beëindigd wordt het fructose-6-fosfaat door fosfoglucose-isomerase (PGI) omgezet in glucose-6-fosfaat:      Dit glucose-6-fosfaat reageert opnieuw met nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide-fosfaat waardoor weer gluconaat-6-fosfaat en gereduceerd nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide-fosfaat wordt gevormd; dit wordt weer bepaald.3. APPARATUUR  3.1. Spectrofotometer waarmee bij 340 nm, het absorbantiemaximum van NADPH, kan worden gemetenAls het om absolute metingen gaat (geen vergelijkende metingen, maar bij voorbeeld het vaststellen van de absorptiviteit van NADPH), dienen de golflengteschaal  en de absorbanties van het apparaat te worden geijkt. Indien een dergelijke spectrofotometer niet beschikbaar is, kan een spectrofotometer met een discontinu spectrum worden gebruikt, waarmee metingen kunnen worden verricht bij 334 nm of 365 nm.   3.2. Glaskuvetten met een optische weglengte van 1 cm, of wegwerpkuvetten  3.3. Enzymatische pipetten van 0,02, 0,05, 0,1 en 0,2 ml4. REAGENTIA  4.1. Oplossing 1: buffer (tri-ethanolamine 0,3 M; pH = 7,6; 4 · 10 3 M Mg2+) Los 11,2 g tri-ethanolaminechloorhydraat, (C2H5)3N · HCl, en 0,2 g MgSO4 · 7 H2O op in 150 ml dubbel gedestilleerd water, voeg ongeveer 4 ml 5 M natriumhydroxide-oplossing (NaOH) toe om een pH van 7,6 te verkrijgen en vul aan tot 200 ml.    Deze bufferoplossing is vier weken houdbaar bij + 4 °C.   4.2. Oplossing 2:nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide-fosfaat-oplossing (ongeveer 11,5 · 10 3 M) Los 50 mg van het dinatriumzout van nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide-fosfaat op in 5 ml dubbel gedestilleerd water.     Deze oplossing is vier weken houdbaar bij + 4 °C.   4.3. Oplossing 3: adenosine-52-trifosfaat-oplossing (ongeveer 81 · 10 3 M) Los 250 mg van het dinatriumzout van adenosine-52-trifosfaat en 250 mg natriumwaterstofcarbonaat NaHCO3 op in 5 ml dubbel gedestilleerd water.    Deze oplossing is vier weken houdbaar bij + 4 °C.   4.4. Oplossing 4: hexokinase-glucose-6-fosfaatdehydrogenase-suspensie Meng 0,5 ml hexokinase (2 mg eiwit per ml of 280 U/ml) en 0,5 ml glucose-6-fosfaatdehydrogenase (1 mg eiwit per milliliter).    Deze suspensie is één jaar houdbaar bij + 4 °C.   4.5.Oplossing 5: fosforglucose-isomerase-suspensie (2 mg eiwit per ml of 700 U/ml) Deze suspensie wordt onverdund gebruikt.    De suspensie is één jaar houdbaar bij + 4 °C.    Opmerking:Alle vorige reagentia worden in de handel in kitvorm aangeboden.5. WERKWIJZE  5.1. Voorbehandeling van het monster   Maak, afhankelijk van de geschatte hoeveelheden glucose + fructose per liter, de volgende verdunningen:                    Meting bij 340 nm en 334 nmMeting bij 365 nmVerdunning met waterVerdunningsfactor Ftot en met  0,4 g/l 0,8 g/l--tot en met  4,0 g/l 8,0 g/l1 +  9  10tot en met 10,0 g/l20,0 g/l1 +  24  25tot en met 20,0 g/l40,0 g/l1 +  49  50tot en met 40,0 g/l80,0  g/l1 + 99  100meer dan 40,0 g/l80,0 g/l1 + 9991 000 5.2. Bepaling   Regel de spectrofotometer (3.1) in op metingen bij 340 nm. Meet tegen lucht (geen kuvet in de lichtweg) of tegen water bij een temperatuur van 20 à 25 °C.Pipetteer in twee kuvetten (3.2) met een optische weglengte van 1 cm:     Blanco MeetoplossingOplossing 1 (4.1) (op 20 °C gebracht) 2,50 ml 2,50 ml Oplossing 2 (4.2) 0,10 ml 0,10 ml Oplossing 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml Monsteroplossing - 0,20 ml Dubbel gedestilleerd water 0,20 ml -   Meng en meet de absorbantie na ongeveer drie minuten (A1). Vervolg de reactie door toe te voegen:Oplossing 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml   Meng en wacht 15 minuten; meet de absorbantie (A2) en ga na twee minuten na of de reactie is beëindigd.    Voeg onmiddellijk toe:Oplossing 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml    Meng en meet na ongeveer tien minuten; ga na twee minuten na of de reactie is beëindigd (A3).    Bepaal de absorbantieverschillen:- A2   A1 voor het glucose- A3   A2 voor het fructosezowel voor de blanco als voor de meetoplossing.    Leid hieruit het extinctieverschil af voor de blanco (D AB) en voor de meetoplossing (D AM) en bereken:voor het glucose: D AG = D AM   D ABvoor het fructose: D AF = D AM   D AB.    Opmerking:De enzymactiviteit kan per afgeleverde partij wisselen. Het bovenstaande is slechts als indicatie te gebruiken. Aanbevolen wordt deze activiteit per afgeleverde partij te bepalen.5.3. Weergave van de resultaten  5.3.1. Berekening   De algemeen geldende formule voor de berekening van concentraties is de volgende:V = totaalvolume van de test (ml) v = volume van het in de kuvet gebrachte monster (ml) M = moleculaire massa van de te bepalen stof d = optische weglengte van de kuvet, in cm e = absorptiecoëfficiënt van NADPH; bij 340 nm: e = 6,3 (mmol 1 · l · cm 1) V = 2,92 ml voor de bepaling van glucose V = 2,94 ml voor de bepaling van fructose v = 0,20 ml M = 180 d = 1.   Na vereenvoudiging wordt verkregen:voor glucose: C (in g/l) = 0,417 · D AG voor fructose: C (in g/l) = 0,420 · D AF.  Indien het monster vooraf is verdund dient het resultaat te worden vermenigvuldigd met de factor F.    Opmerking:Indien de metingen zijn verricht bij 334 nm of bij 365 nm luidt de vereenvoudigde formule:- meting bij 334 nm: e = 6,2 (mmol 1 · l · cm 1)voor glucose: C (in g/l) = 0,425 · D AG voor fructose: C (in g/l) = 0,428 · D AF- meting bij 365 nm: e = 3,4 (mmol 1 · l · cm 1)voor glucose: C (in g/l) = 0,773 · D AG voor fructose: C (in g/l) = 0,778 · D AF5.3.2. Herhaalbaarheid (r)   r = 0,056 xi.5.3.3. Reproduceerbaarheid (R)   R = 0,12 + 0,076 xi.  xi = het gehalte aan glucose of fructose in g/l.     8. AANTONEN  VAN  VERRIJKING  VAN  MOST,  GECONCENTREERDE  MOST,  GERECTIFICEERDE  GECONCENTREERDE  MOST  EN  WIJN  MET  BEHULP  VAN  DEUTERIUMKERNSPINRESONANTIE  (NMR) 1. BEGRIPSBEPALINGEN   De deuteriumatomen, die in de suikers en het water van druivenmost aanwezig zijn, zullen na fermentatie in de wijn zijn verdeeld over de moleculen I, II, III en IV:CH2D CH2 OH CH3 CHD OH I IICH3 CH2 OD HOD IIIIV   Toevoeging van vreemde suikers (chaptalisering) vóór fermentatie van de most zal invloed hebben op de verdeling van het deuterium.    In vergelijking met de waarden van de parameters voor een natuurlijke referentiewijn uit dezelfde streek zal verrijking met vreemde suikers tot uiting komen in de volgende veranderingen:                              Parameters Wijn(D/H)I(D/H)II(D/H)QWR- natuurlijk    - verrijkt:      - met bietsuiker      - met rietsuiker      - met maïssuiker       (D/H)I is de isotopenverhouding in molecule I.(D/H)II is de isotopenverhouding in molecule II.(D/H)QW is de isotopenverhouding in de watermoleculen van de wijn.    R = 2(D/H)II/(D/H)I, dit geeft de relatieve verdeling aan van deuterium in de moleculen I en II; R wordt rechtstreeks gemeten uitgaande van de intensiteiten (h) van de signalen en derhalve is R = 3hII/hI.    (D/H)I geeft vooral uitsluitsel in welke plantensoort de suiker is gesynthetiseerd en in mindere mate op welke plaats deze is geoogst (aard van het bij de fotosynthese gebruikte water).    (D/H)II geeft aanwijzingen over de klimatologische omstandigheden op de plaats waar de druiven zijn geproduceerd (aard van het regenwater en de weerkundige omstandigheden) en in mindere mate over de suikerconcentratie in de oorspronkelijke most.    (D/H)QW geeft aanwijzingen over de klimatologische omstandigheden op de plaats van produktie en over de suikerconcentratie in de oorspronkelijke most.2. PRINCIPE   De bepaling van de hierboven gedefinieerde parameters [R, (D/H)I en (D/H)II] vindt plaats door deuterium-NMR uit te voeren op ethanol, verkregen uit wijn of uit onder vastgelegde omstandigheden verkregen fermentatieprodukten van most, geconcentreerde  most of gerectificeerde geconcentreerde most; ter aanvulling kan eventueel de isotopenverhouding in het uit de wijn geïsoleerde water worden bepaald, (D/H)QW en de isotopenverhouding 13C/12C van de ethanol.    In afwachting van de voltooiing van de Gemeenschapsdatabank dienen de staalnemingen voor de keuring:- van wijnen in het produktiegebied vergezeld te zijn van staalnemingen van natuurlijke referentienemingen (ten minste drie in aantal) van dezelfde  oorsprong (plaats en jaartal); deze staalnemingen gebeuren in drievoud;- van most, geconcentreerde most en gerectificeerde geconcentreerde most wordt de monstername ook in drievoud uitgevoerd en zijn de referentiemonsters (ten minste drie) natuurlijke  mosten van dezelfde oorsprong (plaats en jaartal).   De Lid-Staten mogen voor de controles op de in het eigen land bereide produkten en in afwachting van de oprichting van een communautaire gegevensbank, voorlopig gebruik maken van een nationale gegevensbank.3. VOORBEHANDELING  VAN  HET  MONSTER  3.1. Afscheiding van ethanol en water uit wijn   Opmerking:  Elk systeem voor de extractie van ethanol kan in aanmerking komen op voorwaarde dat het toelaat tussen 98 en 98,5 % van de totale alcohol van de wijn te recupereren in de vorm van een destillaat dat 92 tot 93 % (m/m) of 95 % (v/v) alcohol bevat.3.1.1.  Apparatuur en reagentia   - Opstelling voor de afscheiding van ethanol (figuur 1), bestaande uit:- elektrische verwarmingsmantel met spanningsregelaar,- 1-liter kolf met slijpstukken,- Cadiot-kolom met roterende spiraal (met teflon pakking),- Erlenmeyer-kolven met slijpstuk van  125 ml,- flesjes met plastic stop van 125 en 60 ml.- Voor de bepaling van water volgens Karl Fischer: Karl Fischer-reagentia (bij voorbeeld Merck 9241 en 9243).3.1.2. Werkwijze  3.1.2.1. Bepaal het alcoholgehalte van de wijn met een nauwkeurigheid van ten minste 0,05 % vol, dit gehalte zij tw.3.1.2.2. Afscheiding van ethanol   Breng het homogeen monster van 500 ml wijn met een alcoholgehalte van tw in de kolf van de destillatieopstelling (3.1.1) welke een constante refluxverhouding heeft van ongeveer 0,9. Sluit een vooraf getarreerde Erlenmeyer met slijpstuk van 125 ml  (3.1.1) aan op de destillatieopstelling om het destillaat op te vangen. Vang ongeveer 40 à 60 ml op van de vloeistof die kookt tussen 78,0 en 78,2 °C. Wanneer de temperatuur boven 78,5 °C stijgt moet het opvangen gedurende vijf minuten worden gestaakt.     Wanneer de temperatuur weer is gedaald tot 78 °C wordt het destillaat opnieuw opgevangen totdat de temperatuur weer stijgt tot 78,5 °C; deze werkwijze wordt herhaald tot de temperatuur na stopzetting van het opvangen, bij het functioneren van de  opstelling als gesloten circuit, niet meer daalt. De destillatie neemt ongeveer vijf uur in beslag. Met deze werkwijze wordt 98 tot 98,5 % afgescheiden van de totale alcohol van de wijn en een destillaat verkregen met een gehalte tussen 92 en 93 % (m/m)  (95 % v/v), een gehalte waar de omstandigheden van de NMR, zoals beschreven in punt 4, op zijn ingesteld.    De opgevangen alcohol wordt gewogen.    Een homogeen monster van 60 ml van het destillatieresidu wordt bewaard in een flesje van 60 ml en doet dienst als watermonster van de wijn. De isotopenverhouding hiervan kan eventueel worden bepaald.    Opmerking:Een homogeen wijnmonster van 300 ml is voldoende indien een spectrometer beschikbaar is voorzien van een cel van 10 mm (zie punt 4).3.1.2.3. Bepaling  van  het  alcoholgehalte  van  de  afgescheiden  alcohol   Via de methode van Karl Fischer wordt het watergehalte bepaald in een hoeveelheid alcohol van ongeveer 0,5 ml, waarvan de massa p nauwkeurig is vastgesteld. De hoeveelheid water zij p2 g.      Figuur 1- Opstelling voor de afscheiding van ethanol  Het massagehalte aan ethanol is dan:3.2. Fermentatie van most, geconcentreerde most en gerectificeerde geconcentreerde most  3.2.1. Apparatuur en reagentia   - Wijnsteenzuur.- Bacto Yeast Nitrogen Base without amino acids DIFCO.- Gedroogde actieve gist (Saccharomyces cerevisiae).     Indien de isotopenverhouding van het water van de most bekend is, kan de gist vooraf worden gereactiveerd door hem gedurende vijf minuten in een kleine hoeveelheid niet gedistilleerd lauw water te brengen, zodat de isotopenverhouding ongeveer gelijk is  aan die in het water van de most: 1 g ofwel 1010 cellen in 50 ml voor de enting van 1 l most. Wanneer de isotoptenverhouding niet bekend is, verdient het de voorkeur de gist rechtstreeks te enten.    Fermentatievat met een inhoud van 1,5 l, dat luchtdicht kan worden afgesloten en waarin de alcoholdampen kunnen condenseren, want verlies van alcohol tijdens de fermentatie kan niet worden getolereerd. De omzettingsgraad van fermenteerbare suikers in  ethanol moet boven 98 % liggen.3.2.2. Werkwijze  3.2.2.1. Most   - Verse mostBreng 1 l most, waarvan het gehalte aan fermenteerbare suikers vooraf is bepaald, in het fermentatievat. Voeg 1 g gedroogde gist toe die vooraf is gereactiveerd. Sluit het vat luchtdicht af. Voer de fermentatie uit bij een temperatuur van  ongeveer 20 °C tot alle fermenteerbare suikers verdwenen zijn. Het gefermenteerde produkt wordt, na bepaling van het alcoholmassagehalte en de berekening van de omzettingsgraad van suiker in alcohol, gecentrifugeerd en onderworpen aan een destillatie om  de alcohol volledig te verwijderen.    - Most waarvan gisting is gestuit met zwaveldioxideVerwijder het zwaveldioxide uit een volume van iets meer dan 1 l most (1,2 l) door stikstof te leiden door de most, die in een kolf met refluxkoeler op een waterbad op 70-80 °C is gebracht, totdat het  totale zwaveldioxide lager is dan 200 mg/l. Door gebruik te maken van een doeltreffende koeling kan worden voorkomen dat door verdamping van water concentratie van de most optreedt.Breng 1 l van de aldus behandelde most in het fermentatievat en voer de  voor verse most aangegeven werkwijze uit.Opmerking:Indien voor het sluiten van de gisting van de most gebruik is gemaakt van dikaliumdisulfiet moet voor het verwijderen van de zwaveldioxide aan de most zwavelzuur worden toegevoegd, en wel 0,25 ml  geconcentreerd zwavelzuur (r20 = 1,84 g/ml) per gram gebruikt disulfiet per liter most.3.2.2.2. Geconcentreerde  most   Breng een volume V (ml) geconcentreerde most met een bekend gehalte aan suikers, ongeveer 170 g, in het fermentatievat. Vul het volume aan tot 1 l met (1 000   V) ml water met dezelfde isotopenverhouding als het water voor de natuurlijke  referentiemost. Gistcellen toevoegen zoals beschreven in punt 3.2.1. Voeg 3 g Bacto Yeast Nitrogen Base without amino acids DIFCO toe. Homogeniseer en volg de eerder beschreven werkwijze.3.2.2.3. Gerectificeerde  geconcentreerde  most   Volg de in punt 3.2.2.2 beschreven werkzijze, waarbij het volume tot 1 l wordt aangevuld met (1 000   V) ml water met dezelfde isotopenverhouding als het water van de natuurlijke referentiemost waarin 3 g wijnsteenzuur is opgelost.   Opmerking:Bewaar 50 ml most of ontzwavelde most of geconcentreerde most of gerectificeerde geconcentreerde most om eventueel hieruit het water te isoleren en daarin de isotopenverhouding (D/H)QW te bepalen.Het water kan zeer eenvoudig uit de most worden  geïsoleerd door een azeotropische destillatie uit te voeren met tolueen.  3.3. Voorbehandeling van het alcoholmonster voor NMR-bepaling  3.3.1. Reagentia   N, N-tetramethylureum (TMU); gebruik een referentiemonster TMU waarvan de isotopenverhouding D/H bekend en gecontroleerd is. Dit monster kan worden verkregen bij:    - Directoraat-generaal Wetenschappen, onderzoek en ontwikkeling,  Communautair Referentiebureau (BCR) Wetstraat 200, B-1049 Brussel.3.3.2. Werkwijze   - NMR-apparaat met een cel van 15 mm diameterBreng in een van tevoren getarreerd flesje 7 ml van de volgens punt 3.1.2 verkregen alcohol en weeg dit tot op 0,1 mg nauwkeurig, MA; voeg vervolgens 3 ml interne standaard (TMU) toe en weeg opnieuw tot op  0,1 mg nauwkeurig, mst. Meng door schudden.    - NMR-apparaat met een cel van 10 mm diameterHierbij kan worden volstaan met 3,2 ml alcohol en 1,3 ml TMU. Voeg, afhankelijk van het type spectrometer en de te gebruiken cellen (zie punt 4), een voldoende hoeveelheid hexafluorbenzeen toe als  veldfrequentiestabilisator (lock).                     SpectrometerCel10 mm15 mm7,05 T150 µl200 µl9,4 T35 µl50 µl3.4. Voorbehandeling van het watermonster ten behoeve van de eventuele bepaling van de isotopenverhouding3.4.1. Reagentia   N, N-tetramethylureum (TMU): zie punt 3.3.1.   3.4.2. Werkwijze   Breng in een getarreerd flesje 3 ml volgens punt 3.1.2 of 3.2 verkregen water; weeg dit tot op 0,1 mg nauwkeurig, m2E; voeg 4 ml interne standaard (TMU) toe en weeg opnieuw tot op 0,1 mg nauwkeurig, m2st. Meng door schudden.    Opmerking:Indien het laboratorium beschikt over een massaspectrometer met isotoopverhoudingen kan deze meting op dit apparaat worden uitgevoerd om de NMR-spectrometer te ontlasten, omdat het bij elke serie wijnmonsters noodzakelijk is de verhouding TIV  (5.2) te ijken.4. METING  VAN  HET  DEUTERIUM-NMR-SPECTRUM  VAN  ALCOHOL  EN  WATER   Bepaling van de isotopenparameters4.1. Apparatuur   - NMR-spectrometer met een specifieke deuteriumcel, afgestemd op de karakteristieke frequentie, vo, van het veld Bo (bij voorbeeld voor Bo = 7,05 T: vo = 46,05 MHz en voor Bo = 9,4 T: vo = 61,4 MHz), met een kanaal voor protonontkoppeling B2 en een  kanaal voor stabilisatie van veldfrequentie (lock) op de frequentie van fluor. De gemeten resolutie van het spectrum zonder exponentiële vermenigvuldiging (dat wil zeggen LB = 0) en uitgedrukt als de grootte op halve hoogte van de signalen afkomstig van  het methyl- en methyleendeel van ethanol en het methylsignaal van TMU, moet lager zijn dan 0,5 Hz.De gevoeligheid, gemeten met een exponentiële vermenigvuldigingsfactor LB = 2 (figuur 2a), moet ten minste gelijk zijn aan 150 voor het methylsignaal van  ethanol met een gehalte van 95 % vol (93,5 % (m/m)). Onder deze omstandigheden is het vertrouwensbereik voor de meting van de signaalhoogte bij een waarschijnlijkheid van 97,5 % (eenzijdig getest) en bij tien herhalingen van het spectrum 0,35 %.-  Automatische monsterwisselaar.- Gegevensverwerkende apparatuur.- Monsterbuisjes van 15 mm of van 10 mm, afhankelijk van de karakteristieken van de spectrometer.4.2. Instelling en controle van de spectrometer  4.2.1. Instelling   Stel de homogeniteit en de gevoeligheid op de gebruikelijke manier in volgens de gebruiksvoorschriften van de fabrikant.4.2.2. Controle op de juistheid van de instelling   Gebruik referentiealcoholen, aangeduid met de letters C, V en B. Hierin staat C voor rietsuikeralcohol, V voor wijnalcohol en B voor bietsuikeralcohol. Deze bezitten een verschillend isotoopgehalte, dat echter nauwkeurig is geijkt. De  referentiealcoholen worden geleverd door het BCR vermeld in punt 3.3.1.    Bepaal volgens de in punt 4.3 beschreven werkwijze de isotoopwaarden van deze alcoholen en noteer deze waarden als Cmes, Vmes en Bmes (5.3).    Vergelijk deze waarden met de bekende corresponderende referentiewaarden, aangegeven als Cst, Vst en Bst (5.3).  Figuur 2a²H-NMR-spectrum van ethanol uit wijn met interne standaard (TMU: N,N-tetramethylureum)    Figuur 2b²H-spectrum van ethanol, opgenomen onder dezelfde omstandigheden als figuur 2a, echter zonder de exponentiële vermenigvuldiging (LB = 0)    De standaardafwijking van het gemiddelde van tien herhaalde metingen van elk spectrum moet lager zijn dan 0,01 bij de verhouding R en lager dan 0,3 ppm bij (D/H)I en (D/H)II.    De verkregen gemiddelde waarden voor de verschillende isotopenparameters [R, (D/H)I en (D/H)II] moeten liggen binnen de corresponderende standaardafwijking, die voor de parameters van de drie referentiealcoholen is gegeven door het BCR. Indien hieraan  niet wordt voldaan moet de instelling nogmaals worden uitgevoerd.4.3. Meetomstandigheden van de NMR-spectra   Breng het volgens punt 3.3 bereide alcoholmonster (of het volgens punt 3.4 bereide watermonster) in een buisje van 15 mm of van 10 mm en breng dit in de cel.    De meetomstandigheden van de NMR-spectra zijn de volgende:- De temperatuur van de cel (bij voorbeeld 302 K) moet constant zijn.- Meettijd: ten minste 6,8 s bij 1200 Hz voor een volledig spectrum (geheugenruimte 16 K), dat wil zeggen ongeveer 20 ppm bij  61,4 MHz of ongeveer 27 ppm bij 46,1 MHz.- Blokpuls: 90°.- Uittriltijd: deze dient van dezelfde orde van grootte te zijn als de monstertijd (dwell time).- Tweedimensionale detectie: stel de ""offset" 01 in tussen de referentiesignalen OD en CHD voor  ethanol en tussen de referentiesignalen van HOD en TMU voor water.- Bepaal de offset-waarde voor ontkoppeling 02 uitgaande van het protonspectrum, gemeten via de ontkoppelingsspoel bij hetzelfde buisje. Een goede ontkoppeling wordt verkregen wanneer 02  zich bevindt in het midden van het frequentie-interval tussen de CH3-groep en de CH2-groep. Gebruik de ontkoppelingsmethode voor brede banden.    Voer voor elk spectrum een aantal (NS) bepalingen uit dat voldoende is om de signaal-ruis verhouding, zoals beschreven in punt 4.1, te verkrijgen en herhaal deze serie van NS bepalingen NE = tienmaal. De waarden van NS zijn afhankelijk van het type  spectrometer en de gebruikte cellen (zie punt 4). Zie het volgende keuzeoverzicht.                SpectrometerCel10 mm15 mm7,05 T NS = 304NS = 2009,04 TNS = 200NS = 128 5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN  5.1. Ethanol   Bepaal voor elk van de tien spectra (zie het NMR-spectrum van ethanol, figuur 2a):hierbij is:- CH3CHDOH mst en mA zie punt 3.3.2- tDm zie punt 3.1.2.3- (D/H)st = isotopenverhouding van de interne standaard (TMU), zoals aangegeven op het flesje. Het TMU  kan worden verstrekt door het BCR vermeld in punt 3.3.1.5.2. Water   Wanneer de isotopenverhouding van het water, uitgaande van het water/TMU mengsel via NMR is bepaald, gebruikt men de volgende formule:hierbij is:- m2st en m2E zie punt 3.4.2- (D/H)st = isotopenverhouding van de interne standaard (TMU), zoals aangegeven  op het flesje dat door het BCR vermeld in punt 3.3.1 wordt verstrekt.   5.3. Bereken voor elk van de isotopenparameters het gemiddelde van de tien bepalingen de standaardafwijking.    Het is mogelijk programmatuur (bij voorbeeld SNIF-NMR) te installeren op de rekeneenheid van de spectrometer waarmee deze berekeningen on-line kunnen worden uitgevoerd.    Opmerking:Indien, na instelling van de spectrofotometer, de gemiddelde waarden die zijn verkregen voor de isotopenkarakteristieken van de referentiealcoholen (4.2.2) niet vallen binnen de standaardafwijking van de bekende referentiewaarden, kan de  volgende correctie worden toegepast om het ware gehalte van een willekeurig monster te vinden.    Interpolatie dient plaats te vinden waarbij de waarden van de referentiealcoholen dienen te worden betrokken die de waarden van het onbekende monster het dichtst benaderen.     Wanneer (D/H)iXmes de gemeten waarde is en (D/H)iXcorrde gecorrigeerde waarde, dan wordt de formule:(D/H)iXcorr = (D/H)iBst + a   Voorbeeld:Referentiemonster, verstrekt en geijkt door het Communautair Referentie Bureau (BCR):(D/H)IVst = 102,0 ppm (D/H)IBst = 91,95 ppmReferentiemonster, gemeten in het laboratorium:(D/H)IVmes = 102,8 ppm (D/H)IBmes = 93,0 ppmVerdacht monster, niet  gecorrigeerd:(D/H)IXmes = 100,2 ppm.Dit resulteert in a = 1,0255 en (D/H)IXcorr = 99,3 ppm.6. INTERPRETATIE  VAN  DE  RESULTATEN   Vergelijk de voor de verhouding R in de verdachte wijn verkregen waarde RX met de verkregen waarde voor de controlemonsters. Als het verschil tussen RX en de voor de controlemonsters verkregen gemiddelde waarde RT groter is dan tweemaal de  standaardafwijking van RT dan is er verdenking van vervalsing.6.1. Verrijking met bietsuiker of rietsuiker of glucose verkregen uit maïs  6.1.1. Wijn   RX > RT: vermoedelijk toevoeging van bietsuiker.  RX <  RT: vermoedelijk toevoeging van rietsuiker of maïssuiker.Controleer of (D/H)XII en (D/H)WQX verhoogd zijn.Bekijk (D/H)IX. Er is vermoeden van:- verrijking met bietsuiker, als (D/H)IX van het verdachte monster meer dan één keer de  standaardafwijking van de meting lager is dan (D/H)IT, de gemiddelde waarde bekomen voor de referentiemonsters;- verrijking met rietsuiker of maïssuiker als (D/H)IX van het verdachte monster meer dan één keer de standaardafwijking hoger is dan (D/H)IT;-  berekening van de verrijking, E, uitgedrukt in % vol ethanol:- verrijking met bietsuiker:waarin:(D/H)IB = isotopenverhouding voor plaats I van bietsuikeralcohol = (D/H)IB = 92,5 (8) tV = alcoholmassagehalte van de onderzochte wijn (X) - verrijking met rietsuiker of maïssuiker:waarin:(D/H)IC = isotopenverhouding voor plaats I van rietsuikeralcohol of van maïssuikeralcohol: (D/H)IC = 110,5 (9).tV = alcoholmassapercentage van de onderzochte wijn (X).6.1.2. Most, geconcentreerde most en  gerectificeerde geconcentreerde most   De waarden van de isotoopparameters van de volgens punt 3.1 afgescheiden ethanol van het gefermenteerde produkt (3.2) van most, geconcentreerde most en gerectificeerde geconcentreerde most worden bepaald volgens de aanwijzingen gegeven in punt 6.1.1 in  vergelijking met de alcohol onttrokken aan het fermentatieprodukt van de natuurlijke mosten.    De verrijking, E % vol, wordt uitgedrukt als het volume alcohol, toegevoegd aan het gefermenteerde produkt. Wanneer de eventueel uitgevoerde verdunning vóór de fermentatie (geconcentreerde most en gerectificeerde geconcentreerde most) bekend is, dan  is, rekening houdend met het feit dat 16,83 g suiker 1 % vol alcohol geeft, de gewichtshoeveelheid suiker, toegevoegd per liter most, geconcentreerde most of gerectificeerde geconcentreerde most, te berekenen.6.2. Verrijking met een mengsel van  bietsuiker en rietsuiker of glucose verkregen uit maïs   De isotopenverhoudingen (D/H)I en R vertonen minder afwijkingen dan in het geval van verrijking met slechts één type suiker.    (D/H)II neemt toe evenals (D/H)WQDe bevestiging van deze toevoegingen kan geschieden voor de verhouding 13C/12C van ethanol te bepalen met behulp van de massaspectrometer; in dit geval is dit verhoudingsgetal verhoogd.     9. AS 1. BEGRIPSBEPALING   De as wordt gedefinieerd als het geheel van de verassingsprodukten van het verdampingsresidu van wijn, op een zodanige wijze uitgevoerd dat alle kationen (behalve ammonium) in de vorm van carbonaten en andere minerale zouten worden verkregen.2.  PRINCIPE   Verassing van de droge stof van wijn bij een temperatur van 500-550 °C tot volledige verbranding van de koolstof.3. APPARATUUR  3.1. Kokend-waterbad  3.2. Balans, gevoelig tot op 0,1 mg  3.3. Kookplaat of infraroodverdamper  3.4. Elektrische oven met temperatuurregeling  3.5. Exsiccator  3.6. Platinaschaal met een platte bodem, met een diameter van 70 mm en een hoogte van 25 mm4. WERKWIJZE   Breng 20 ml wijn in de van tevoren gewogen platina schaal (Po g). Laat de wijn op het kokend-waterbad verdampen, verwarm het residu op de kookplaat bij 200 °C of onder de infraroodverdamper tot verkoling optreedt. Plaats de schaal, als er geen dampen  meer vrijkomen, in de elektrische oven bij 525 °C ± 25 °C. Verwijder de schaal na 15 minuten verkoling uit de oven, voeg 5 ml gedistilleerd water toe, welke vervolgens op het waterbad of onder de infraroodverdamper wordt verdampt en verhit opnieuw  gedurende een tiental minuten bij 525 °C.    Als de verbranding van de koolstofdeeltjes nog niet volledig is, herhaal dan het wassen van de koolstofdeeltjes, de verdamping van het water en de verassing.    Aan wijn met een hoog suikergehalte kunnen aan het extract, voor de eerste verassing, enkele druppels zuivere plantaardige olie worden toegevoegd om overschuimen te voorkomen.    Weeg de schaal, na afkoelen in de exsiccator. Het gewicht zij P1 g.    De gewichtsmassa van de as, overeenkomend met de in bewerking genomen hoeveelheid monster (20 ml), is: p = (P1   Po) g.5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN  5.1. Berekening   Het gehalte P van de as, uitgedrukt in gram per liter, is dus P = 50 · p. Geef het resultaat tot op twee decimalen.     10. ALKALITEIT  VAN  DE  AS 1. BEGRIPSBEPALING   Onder de alkaliteit van de as wordt verstaan het totaal van de kationen, uitgezonderd ammonium, gebonden aan de organische zuren van wijn.2. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Terugtitratie in aanwezigheid van methyloranje na oplossen van de as, onder verwarming, in een bekende overmaat zuur.3. REAGENTIA  EN  HULPMIDDELEN  3.1. Zwavelzuuroplossing 0,05 M (H2SO4)  3.2. Natriumhydroxideoplossing 0,1 M (NaOH)  3.3. Methyloranjeoplossing, 0,1 % in gedestilleerd water  3.4. Kokend-waterbad4. WERKWIJZE   Voeg aan de platina schaal (3.1), die de as van 20 ml wijn bevat, 10 ml zwavelzuuroplossing (3.1) toe. Plaats deze gedurende ongeveer 15 minuten op het kokend-waterbad, ondertussen het residu met een glasstaaf losmakend om het oplossen te  vergemakkelijken. Voeg vervolgens twee druppels methyloranjeoplossing (3.3) toe en titreer de overmaat zwavelzuur met natriumhydroxideoplossing (3.2) tot kleuromslag van de indicator naar geel.5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN  Berekening   De alkaliteit van de as, uitgedrukt in milli-equivalenten per liter tot op één decimaal, is:    A = 5 (10   n)n = het aantal milliliters natriumhydroxideoplossing 0,1 M.     11. CHLORIDEN 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Chloriden worden rechtstreeks in de wijn bepaald door potentiometrie met een Ag/AgCl-elektrode.2. APPARATUUR  2.1. pH/millivoltmeter met een schaalverdeling van ten minste 2 mV  2.2. Magneetroerder  2.3. Ag/AgCl-elektrode met een verzadigde kaliumnitraatoplossing als elektrolyt  2.4. Microburet met een verdeling van 0,01 ml  2.5. Chronometer3. REAGENTIA  3.1. IJkoplossing met chloride: 2,1027 g kaliumchloride, KCl (maximaal 0,005 °Br), voor gebruik enige dagen in een exsiccator gedroogd, wordt opgelost in gedestilleerd water en aangevuld tot 1 l: 1 ml van deze oplossing bevat 1 mg Cl .   3.2. Gestelde zilvernitraatoplossing: 4,7912 g zilvernitraat, AgNO3, pro analyse, wordt opgelost en aangevuld tot 1 l in een alcoholische oplossing van 10 % (v/v): 1 ml van deze oplossing komt overeen met 1 mg Cl .   3.3. Salpeterzuur van ten minste 65 % (r20 = 1,40 g/ml)4. WERKWIJZE  4.1. 5,0 ml van de ijkoplossing met chloride wordt in een bekerglas van 150 ml op een magneetroerder gedaan, met gedestilleerd water tot ongeveer 100 ml verdund en met 1,0 ml salpeterzuur van ten minste 65 % aangezuurd. Plaats de elektrode in de  oplossing en titreer door met de microburet de gestelde zilvernitraatoplossing toe te voegen onder matig roeren. Voeg eerst viermaal 1,00 ml toe en lees de corresponderende millivoltwaarde af. Voeg vervolgens de volgende 2 ml toe in fracties van 0,20  ml. Voeg ten slotte weer hoeveelheden van 1 ml toe tot in totaal 10 ml is toegevoegd. Wacht na iedere toevoeging ongeveer 30 seconden alvorens de bijbehorende millivoltwaarde af te lezen. Breng de verkregen waarden over op millimeterpapier als functie  van het bijbehorende aantal toegevoegde milliliters titratieoplossing en bepaal de potentiaal van het equivalentiepunt uit het buigpunt van de verkregen curve.   4.2. 5 ml van de ijkoplossing met chloride wordt in een bekerglas van 150 ml gebracht met 95 ml gedestilleerd water en 1 ml salpeterzuur van ten minste 65 %. Plaats de elektrode erin en titreer onder roeren tot de potentiaal van het equivalentiepunt is  bereikt. Deze bepaling wordt herhaald tot er een goede overeenstemming tussen de resultaten is bereikt. Deze controle moet worden uitgevoerd vóór elke serie bepalingen van chloride in de monsters.   4.3. 50 ml te onderzoeken wijn wordt in een bekerglas van 150 ml gedaan. Voeg 50 ml gedestilleerd water en 1 ml salpeterzuur van ten minste 65 % toe en titreer volgens de in punt 4.2 aangegeven werkwijze.5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN  5.1. Berekeningen   Als n het aantal milliliters van de gestelde zilvernitraatoplossing voorstelt, dan is het gehalte aan chloride van de onderzochte vloeistof:     20 × n uitgedrukt in milligram Cl  per liter,0,5633 × n uitgedrukt in milli-equivalenten per liter,32,9 × n uitgedrukt in milligram natriumchloride per liter.5.2. Herhaalbaarheid (r)   r = 1,2 mg Cl per literr = 0,03 meq/l.r = 2,0 mg NaCl per liter.5.3. Reproduceerbaarheid (R)   R = 4,1 mg Cl per liter.R = 0,12 meq/l.R = 6,8 mg NaCl per liter.6. Opmerking:Zeer nauwkeurige bepaling.    Uitgegaan wordt van de volledige titratiecurve, verkregen bij de toevoeging van de ijkoplossing met zilvernitraat aan de onderzochte vloeistof.    a) Breng 50 ml te onderzoeken wijn in een bekerglas van 150 ml. Voeg 50 ml gedestilleerd water en 1 ml salpeterzuur van ten minste 65 % toe. Titreer met de oplossing van zilvernitraat door telkens 0,5 ml toe te voegen en de daarmee overeenkomende  potentiaal in millivolts af te lezen. Leid uit deze eerste titratie af hoeveel zilvernitraatoplossing bij benadering nodig is.    b) Begin weer met de bepaling onder dezelfde omstandigheden. Voeg eerst de titratievloeistof toe met hoeveelheden van 0,5 ml tot het toegevoegde volume 1,5 tot 2 ml lager is dan het onder a) bepaalde volume. Ga nu verder met het toevoegen van 0,2 ml;  ga met toevoegen van telkens 0,2 ml door tot ongeveer even ver boven het equivalentiepunt, en daarna weer met 0,5 ml.    Het eindpunt van de bepaling en het exact verbruikte volume zilvernitraatoplossing wordt bepaald:- hetzij door het equivalentiepunt van de verkregen curve te bepalen,- hetzij uit de berekening:waarin:V = volume gestelde oplossing dat op het  equivalentiepunt is toegevoegdV2 = volume gestelde oplossing dat vóór de grootste potentiaalsprong is toegevoegdD Vi = constante volume van de toevoegingen van de titratievloeistof, dat wil zeggen 0,2 mlDD E1 = tweede potentiaalverschil vóór de grootste  potentiaalvariatieDD E2 = tweede potentiaalverschil na de grootste potentiaalvariatie.     Voorbeeld:                   Toegevoegd volume gestelde AgNO3-oplossingPotentiaal E in mVVerschil DETweede verschil DE  0204     4 0,2208  0   4 0,4212  2   6 0,6218  0   6 0,8224  0   6 1,0230  2   8 1,2238  4  12 1,4250 10  22 1,6272 22  44 1,8316 10  34 2,0350  8  26 2,2376  6  20 2,4396     In dit voorbeeld ligt het eindpunt van de titratie tussen 1,6 en 1,8 ml: in dit interval ligt namelijk de grootste potentiaalsprong (D E = 44 mV). Het volume gestelde zilvernitraatoplossing dat is verbruikt ter bepaling van chloriden in het monster  is:    12. SULFATEN 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN  1.1. Referentiemethode   Precipitatie van bariumsulfaat, gevolgd door weging. Het onder dezelfde omstandigheden neergeslagen bariumfosfaat wordt verwijderd door het precipitaat met zoutzuur te wassen.    In het geval van mosten en wijnen met veel zwaveldioxide dient vooraf sulfiet te worden verwijderd door koken buiten toetreding van lucht.1.2. Snelle testmethode   Indeling van wijnen in verscheidene categorieën door een zogenaamde grenswaardemethode, die berust op precipitatie van bariumsulfaat met behulp van een gestelde bariumoplossing.2. REFERENTIEMETHODE  2.1. Reagentia  2.1.1. 2 M zoutzuuroplossing  2.1.2. Bariumchlorideoplossing met 200 g BaCl2 · 2H2O per liter2.2. Werkwijze  2.2.1. Algemene gevallen   Breng 40 ml te onderzoeken monster in een centrifugebuis van 50 ml; voeg 2 ml 2 M zoutzuur en 2 ml van de bariumchlorideoplossing met 200 g/l toe; roer met een glasstaaf; spoel de staaf met wat gedestilleerd water af en laat de buis vijf minuten  rusten. Centrifugeer vijf minuten en schenk vervolgens voorzichtig de bovenstaande vloeistof af.    Was dan het neergeslagen bariumsulfaat op de volgende wijze: voeg 10 ml 2 M zoutzuur toe, breng het neerslag in suspensie en centrifugeer vijf minuten. Scheid voorzichtig de bovenstaande vloeistof af. Herhaal het wassen van het neerslag op dezelfde  wijze tweemaal met telkens 15 ml gedestilleerd water.    Breng het neerslag onder spoelen met gedestilleerd water kwantitatief over in een getarreerde platinaschaal en plaats deze op een waterbad van 100 °C tot het neerslag is drooggedampt. Het gedroogde neerslag wordt enkele malen kort boven een vlam  gecalcineerd tot een wit residu is verkregen. Laat het in een exsiccator afkoelen en weeg het.    De massa in milligrammen van het verkregen bariumsulfaat is m.2.2.2. Bijzonder geval: mosten met sulfiet en wijn met een hoog gehalte aan zwaveldioxide   Verwijder vooraf het zwaveldioxide.    Breng in een konische kolf van 500 ml, voorzien van een opzettrechter met kraan en van een afvoerbuis, 25 ml water en 1 ml onverdund zoutzuur (r20 = 1,15   1,18 g/ml). Laat deze oplossing koken om de lucht te verwijderen en voeg via de opzettrechter  met kraan 100 ml wijn toe onder doorkoken. Ga met koken door tot het volume van de vloeistof in de konische kolf tot ongeveer 75 ml is afgenomen en breng deze na afkoelen kwantitatief over in een maatkolf van 100 ml. Vul tot de merkstreep aan met water.  Bepaal de hoeveelheid sulfaat in een testhoeveelheid van 40 ml hieruit op de in punt 2.2.1 aangegeven wijze.  2.3. Weergave van de resultaten  2.3.1. Berekeningen   Het gehalte aan sulfaten, uitgedrukt in milligrammen kaliumsulfaat K2SO4 per liter is:18,67 × m.    Het gehalte aan sulfaten in most of wijn wordt zonder decimaal uitgedrukt in milligrammen kaliumsulfaat per liter.2.3.2. Herhaalbaarheid   Tot 1 000 mg/l: r = 27 mg/l.Ongeveer 1 500 mg/l: r = 41 mg/l.2.3.3. Reproduceerbaarheid   Tot 1 000 mg/l: R = 51 mg/l.Ongeveer 1 500 mg/l: R = 81 mg/l.3. SNELLE  TESTMETHODE  3.1. Reagentia  3.1.1. Gestelde bariumchlorideoplossing   2,804 g bariumchloride BaCl2· H2O en 10 ml zoutzuur (r20 = 1,15 à 1,18 g/ml) worden opgelost in voldoende water voor 1 l oplossing; 1 ml van deze oplossing laat een hoeveelheid sulfaationen neerslaan die overeenkomt met 2 mg kaliumsulfaat.   3.1.2. Zwavelzuur (r20 = 1,84 g/ml) in een verdunning van 1 op 10 (m/v)3.2. Werkwijze   Breng in drie reageerbuizen 10 ml most of wijn; voeg aan de eerste buis 3,5 ml, aan de tweede buis 5 ml en aan de derde buis 10 ml bariumchlorideoplossing toe. Schud en laat de inhoud koken; wacht daarna één tot twee uur. De vloeistof in elke buis  wordt afgeschonken, gefiltreerd en in tweeën verdeeld. Voeg aan één helft enkele druppels van de verdunde zwavelzuuroplossing toe, en aan de andere enkele druppels van de bariumchlorideoplossing. Bekijk elke buis en noteer hoe helder of troebel deze is.  In de volgende tabel wordt aangegeven hoe de resultaten moeten worden geïnterpreteerd.                         Wijn (ml)Barium- chloride (ml)Gefiltreerde wijn +Verdund zwavelzuurBarium- chloride- oplossingEerste buis103,5troebelhelder(minder dan 0,7 g K2SO4/l) helder  troebel (meer dan 0,7 g K2SO4/l)Tweede buis105troebelhelder(minder dan 1 g K2SO4/l) helder  troebel (meer dan 1 g K2SO4/l)Derde buis1010troebelhelder(minder dan 2 g K2SO4/l) helder  troebel (meer dan 2 g K2SO4/l)    13. TOTAAL  ZUUR 1. BEGRIPSBEPALING   Het totaal zuur van wijn is de som van de titreerbare zuren bekomen door titratie van wijn met een genormaliseerde loogoplossing tot aan pH 7. Bij het totaal zuur is kooldioxide niet inbegrepen.2. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Potentiometrische titratie of titratie in aanwezigheid van broomthymolblauw als indicator door vergelijking met een kleurmonster.3. REAGENTIA  3.1. Bufferoplossing pH 7,0Kaliumdiwaterstoffosfaat, KH2PO4, 107,3 g Natriumhydroxideoplossing, NaOH, 1 M 500 ml Water tot 1 000 ml.    Men kan ook geijkte bufferoplossingen uit de handel gebruiken.   3.2. Natriumhydroxideoplossing, NaOH, 0,1 M  3.3. Broomthymolblauwoplossing, 4 g/l      Broomthymolblauw, C27H28Br2O5S   4 gNeutrale alcohol, 96 % vol  200 mlVoeg, na oplossen, toe:Water, kooldioxidevrij  200 mlNatriumhydroxideoplossing 1 M tot blauwgroen kleuring (pH 7)   7,5 mlWater tot1 000 ml.4. APPARATUUR  4.1. Waterstraalpomp  4.2. Afzuigkolf van 500 ml  4.3. Potentiometer, afleesbaar in pH-eenheden, en elektrodenDe glaselektrode moet in gedestilleerd water worden bewaard.De calomelverzadigde kaliumchloride-elektrode moet worden bewaard in een verzadigde kaliumchlorideoplossing. Een gecombineerde  elektrode wordt het meest gebruikt, bewaar deze in gedestilleerd water.   4.4. Bekerglazen met een inhoud van 50 ml voor wijn en 100 ml voor gerectificeerde geconcentreerde most5. WERKWIJZE  5.1. Voorbehandeling van het monster  5.1.1. Wijn   Verwijdering van kooldioxide. Breng ongeveer 50 ml wijn in een afzuigkolf, sluit deze aan op de waterstraalpomp en zuig onder voortdurend schudden gedurende één à twee minuten vacuuem.  5.1.2. Gerectificeerde geconcentreerde most   Breng een nauwkeurig afgewogen hoeveelheid van 200 g gerectificeerde geconcentreerde most in een maatkolf van 500 ml. Vul aan tot de maatstreep met water en homogeniseer.5.2. Potentiometrische titratie  5.2.1. IJking van de pH-meter   De ijking van de pH-meter gebeurt bij 20 °C volgens de aanwijzingen van het gebruikte toestel met behulp van de bufferoplossing pH = 7,00 bij 20 °C.5.2.2. Meting   Breng in een bekerglas (4.4) een hoeveelheid volgens punt 5.1 voorbehandeld monster, voor wijn is dit 10 ml en voor gerectificeerde geconcentreerde most is dit 50 ml. Voeg ongeveer 10 ml gedestilleerd water toe en titreer met de buret zoveel  natriumhydroxideoplossing (3.2) tot de pH de waarde 7 aangeeft bij 20 °C. De toevoeging van de loogoplossing moet langzaam geschieden onder voortdurend schudden. Het verbruik aan milliliters natriumhydroxideoplossing 0,1 M zij n.5.3. Titratie met  indicator (broomthymolblauw)  5.3.1.Voorafgaande bereiding van het kleurmonster   Breng 25 ml uitgekookt gedestilleerd water in een bekerglas (4.4), voeg hieraan toe 1 ml broomthymolblauwoplossing (3.3) en een hoeveelheid volgens punt 5.1 voorbehandeld monster, voor wijn is dit 10 ml en voor gerectificeerde geconcentreerde most is  dit 50 ml. Titreer met natriumhydroxideoplossing (3.2) tot een blauw-groene kleur wordt verkregen. Voeg 5 ml bufferoplossing pH 7 (3.1) toe.5.3.2. Bepaling   Breng 30 ml uitgekookt gedestilleerd water in een bekerglas (4.4), voeg hieraan toe 1 ml broomthymolblauwoplossing (3.3) en een hoeveelheid volgens punt 5.1 voorbehandeld monster, voor wijn is dit 10 ml en voor gerectificeerde geconcentreerde most is  dit 50 ml. Titreer met natriumhydroxideoplossing (3.2) tot een blauw-groene kleur wordt verkregen die identiek is aan de kleur van het kleurmonster (5.3.1). Het verbruik aan milliliters natriumhydroxideoplossing 0,1 M zij n.6. WEERGAVE  VAN  DE   RESULTATEN  6.1. Berekening  6.1.1. Wijn   Het totaal zuur, uitgedrukt in milli-equivalenten per liter, is:    A = 10 · n.Het resultaat wordt met één decimaal weergegeven.Het totaal zuur, uitgedrukt in grammen wijnsteenzuur per liter, is:    A2 = 0,075 · A.Het resultaat wordt met één decimaal weergegeven.6.1.2. Gerectificeerde geconcentreerde most   - Totaal zuur, uitgedrukt in milli-equivalenten per kilogram gerectificeerde geconcentreerde most, is: a = 5 · n.  - Totaal zuur, uitgedrukt in milli-equivalenten per kilogram totale suikers, is:P = gehalte aan totale suikers in % (m/m).Het resultaat wordt opgegeven met één decimaal.6.2. Herhaalbaarheid (r) voor de titratie met indicator (5.3)   r = 0,9 me/lr = 0,07 g wijnsteenzuur/lvoor witte wijn, rosé wijn en rode wijn.6.3. Reproduceerbaarheid (R) voor de titratie met indicator (5.3)   Voor witte wijn en rosé wijn:R = 3,6 me/lR = 0,3 g wijnsteenzuur/l.    Voor rode wijn:R = 5,1 me/lR = 0,4 g wijnsteenzuur/l.     14. VLUCHTIGE  ZUREN 1. BEGRIPSBEPALING   De vluchtige zuren zijn het in de wijn aanwezige azijnzuur en zijn homologen, zowel vrij als gebonden.2. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Titratie van de via stoomdestillatie afgescheiden vluchtige zuren uit wijn.    De wijn wordt vooraf van koolstofdioxide bevrijd.    Het gehalte aan vluchtige zuren moet worden gecorrigeerd voor het vrije en gebonden zwaveligzuur dat onder deze omstandigheden mee overdestilleert.    Ook voor het eventueel toegevoegde sorbinezuur moet worden gecorrigeerd.    Opmerking:Salicylzuur, dat in sommige landen wordt toegepast om wijn voor de analyse te stabiliseren, destilleert gedeeltelijk over. Het is noodzakelijk dit te bepalen en het zuurgehalte hiervoor te corrigeren. De bepalingsmethode hiervan is in punt 7  van dit hoofdstuk weergegeven.3. REAGENTIA  3.1. Wijnsteenzuurkristallen, C4H6O6  3.2. Natriumhydroxideoplossing, NaOH, 0,1 M  3.3. Fenolftaleïneoplossing, 1 % in neutrale alcohol 96 % vol  3.4. Zoutzuuroplossing (r20 = 1,18   1,19 g/ml), verdund 1/4 (v/v)  3.5. Jodiumoplossing, I2, 0,005 M  3.6. Kaliumjodidekristallen, KI  3.7. Zetmeeloplossing 5 g/lMeng 5 g zetmeel met ongeveer 500 ml water. Breng al roerend aan de kook en laat tien minuten doorkoken. Voeg 200 g natriumchloride, NaCl, toe. Vul na afkoelen aan tot 1 l.   3.8. Verzadigde natriumboraatoplossing, Na2B4O7 · 10H2O, ongeveer 55 g/l bij 20 °C4. APPARATUUR  4.1. Stoomdestillatie-opstelling, bestaande uit:1. stoomgenerator; de te produceren stoom moet koolstofdioxidevrij zijn,2. monsterhouder,3. rectificeerkolom,4. koeler.De opstelling moet voldoen aan de volgende drie voorwaarden:a) Breng 20 ml uitgekookt  water in de monsterhouder. Destilleer 250 ml over en voeg hieraan 0,1 ml natriumhydroxideoplossing (3.2) toe en 2 druppels fenolftaleïneoplossing (3.3); de roze kleur moet ten minste tien seconden blijven bestaan (controle op het koolstofdioxidevrij  zijn van de stoom).b) Breng 20 ml 0,1 M azijnzuuroplossing in de monsterhouder. Destilleer 250 ml over. Titreer met natriumhydroxideoplossing (3.2). Het verbruik moet ten minste 19,9 ml zijn (overgekomen azijnzuur F 99,5 %).  c) Breng 20 ml 1 M melkzuuroplossing in de monsterhouder. Destilleer 250 ml over en titreer met natriumhydroxideoplossing (3.2).Het verbruik mag maximaal 1,0 ml zijn (gedestilleerd melkzuur E 0,5 %).Elke opstelling of elke techniek die aan deze  voorwaarden voldoet wordt internationaal erkend.   4.2. Waterstraalpomp  4.3. Afzuigkolf5. WERKWIJZE  5.1. Voorbehandeling van het monster: verwijdering van kooldioxide. Breng ongeveer 50 ml wijn in een afzuigkolf, sluit deze aan op de waterstraalpomp en zuig onder voortdurend schudden gedurende één à twee minuten vacuuem.5.2. Stoomdestillatie Breng 20 ml volgens punt 5.1 kooldioxidevrij gemaakte wijn in de monsterhouder. Voeg ongeveer 0,5 g wijnsteenzuur (3.1) toe. Vang ten minste 250 ml destillaat op.5.3. Titratie   Titreer met 0,1 M natriumhydroxideoplossing (3.2) in aanwezigheid van twee druppels fenolftaleïneoplossing (3.3). Het verbruik aan loog zij n ml.    Voeg hierna toe vier druppels verdund zoutzuur (3.4), 2 ml zetmeeloplossing (3.7) en enkele kaliumjodidekristallen (3.6). Titreer het vrije zwaveldioxide met 0,005 M jodiumoplossing (3.5). Het verbruik aan jodium zij n2 ml.    Voeg vervolgens zoveel verzadigde natriumboraatoplossing (3.8) toe tot de roze kleur weer optreedt. Titreer het gebonden zwaveldioxide met 0,005 M jodiumoplossing (3.5). Het verbruik aan jodium zij n" ml.6. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN  6.1. Berekening   Het gehalte aan vluchtige zuren, uitgedrukt in milli-equivalenten per liter met één decimaal, is:A = 5· (n   0,1 · n2   0,05 · n").    Het gehalte aan vluchtige zuren in gram azijnzuur per liter met twee decimalen, is:0,300 · (n   0,1 · n2   0,05 · n").6.2. Herhaalbaarheid (r)   r = 0,7 me/l.r = 0,04 g azijnzuur/l.6.3. Reproduceerbaarheid (R)   R = 1,3 me/l.R = 0,08 g azijnzuur/l.  6.4. Wijn met toegevoegd sorbinezuur   Het gehalte aan vluchtige zuren moet worden gecorrigeerd voor het sorbinezuur dat voor 96 % overkomt bij het destilleren van 250 ml. Elke 100 mg sorbinezuur komt overeen met 0,89 milli-equivalenten of 0,053 g azijnzuur. De bepaling van sorbinezuur in  milligram per liter wordt elders beschreven.7. BEPALING VAN HET MET HET DESTILLAAT OVERGEKOMEN SALICYLZUUR7.1. Principe   Na de bepaling van het vluchtige zuur en de hierop aangebrachte correctie voor het zwaveldioxide, wordt de aanwezigheid van salicylzuur aangetoond door de violette kleur die na aanzuring verschijnt bij toevoeging van een ijzer(III)zout.    De bepaling van het met het destillaat overgekomen salicylzuur vindt plaats in een opnieuw uitgevoerde destillatie met een volume dat gelijk is aan het volume waarin het vluchtige zuur is bepaald. In dit destillaat wordt salicylzuur colorimetrisch  bepaald door middel van een vergelijkende bepaling. Het gevonden gehalte moet in mindering worden gebracht op het zuurgehalte van het destillaat ter bepaling van het vluchtige zuur.7.2. Reagentia  7.2.1. Zoutzuur p. a., HCl (r20 = 1,18   1,19 g/ml)  7.2.2. Natriumthiosulfaat, Na2S2O3 · 5H2O, 0,1 M  7.2.3. IJzer(III)ammoniumsulfaat, Fe2(SO4)3 · (NH4)2SO4 · 24H2O, 10 % (m/v)  7.2.4. Natriumsalicylaatoplossing 0,01 M Oplossing die 1,60 g/l natriumsalicylaat, NaC7H5O3, bevat.7.3. Werkwijze  7.3.1. Aantonen van salicylzuur in het destillaat ter bepaling van de vluchtige zuren   Voeg, onmiddellijk na de bepaling van de vluchtige zuren en de hierop aangebrachte correctie voor het vrije en gebonden zwaveldioxide, aan deze oplossing in een Erlenmeyer toe 0,5 ml zoutzuur (7.2.1), 3 ml natriumthiosulfaatoplossing (7.2.2) en 1 ml  ijzer(III)ammoniumsulfaatoplossing (7.2.3).    Salicylzuur wordt aangetoond als een violette kleur verschijnt.7.3.2. Bepaling van salicylzuur   Geef met behulp van een streep de hoogte van het vloeistofniveau aan op de Erlenmeyer die in punt 7.3.1 is gebruikt. Ledig en reinig deze Erlenmeyer.    Onderwerp een nieuw monster van 20 ml wijn aan de stoomdestillatie en vang het destillaat op in de hierboven bedoelde Erlenmeyer totdat de aangebrachte maatstreep is bereikt. Voeg toe 0,3 ml zoutzuur (7.2.1) en 1 ml ijzer(III)ammoniumsulfaat (7.2.3).  De inhoud van de Erlenmeyer zal violet verkleuren.    Breng in een identieke Erlenmeyer zoveel gedestilleerd water dat het vloeistofniveau even hoog staat als in de Erlenmeyer met destillaat. Voeg 0,3 ml zoutzuur (7.2.1) toe en 1 ml ijzer(III)ammoniumsulfaat (7.2.3). Voeg met behulp van een buret  natriumsalicylaatoplossing 0,01 M (7.2.4) toe tot een violette kleur verschijnt met dezelfde intensiteit als die in de Erlenmeyer met het destillaat van de wijn.    Het verbruik aan natriumsalicylaat zij n4 ml.  7.4. Op het gehalte aan vluchtige zuren aan te brengen correctie   Verminder het volume natriumhydroxide, n, gebruikt voor de bepaling van het zuurgehalte van het destillaat, met 0,1 · n4, alvorens het gehalte aan vluchtige zuren te berekenen.     15. GEBONDEN  ZUREN 1. PRINCIPE   Het gehalte aan gebonden zuren wordt berekend uit het verschil tussen het totaal zuur en de vluchtige zuren.2. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN   Het gehalte aan gebonden zuren wordt uitgedrukt in:- milli-equivalenten per liter,- gram wijnsteenzuur per liter.         16. WIJNSTEENZUUR 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN  1.1. Referentiemethode   Wijnsteenzuur, neergeslagen als calciumracemaat, wordt gravimetrisch bepaald. Deze bepaling kan ter vergelijking worden aangevuld met een volumetrische bepaling. De omstandigheden waaronder de precipitatie plaatsvindt, zoals de pH, het totaal in  bewerking genomen monstervolume, de concentratie van de precipitatie-ionen, zijn zodanig dat het calciumracemaat volledig neerslaat terwijl het calcium-D(-)-tartraat in oplossing blijft.    Indien aan de wijn metawijnsteenzuur is toegevoegd, hetgeen de neerslagvorming van het calciumracemaat onvolledig doet zijn, moet dit van tevoren worden gehydrolyseerd.1.2. Gebruikelijke methode   Wijnsteenzuur, geïsoleerd met behulp van een kolom gevuld met anionenwisselaar, wordt colorimetrisch bepaald in het eluaat via de rode kleur die wordt gevormd met vanadiumzuur. Het eluaat bevat ook melkzuur en appelzuur die de bepaling niet storen.2.  REFERENTIEMETHODE  2.1. Gravimetrische methode  2.1.1. Reagentia  2.1.1.1. Calciumacetaatoplossing met 10 g calcium per liter  Calciumcarbonaat, Ca CO3   25 gAzijnzuur, CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml)   40 mlWater tot1 000 ml.   2.1.1.2. Gekristalliseerd calciumracemaat, C4H4O6Ca· 4H2OBreng in een bekerglas van 400 ml 20 ml wijnsteenzuuroplossing van 5 g/l, 20 ml ammoniumtartraat van 6,126 g/l en 6 ml calciumacetaatoplossing van 10 g/l (2.1.1.1).Laat dit mengsel twee uur staan.  Filtreer het neerslag af over een filterkroes G4, was het neerslag drie keer met ongeveer 30 ml gedestilleerd water. Droog het neerslag tot constant gewicht in een droogstoof bij 70° C. Met de in bewerking genomen hoeveelheden reagentia wordt ongeveer  340 mg gekristalliseerd calciumracemaat verkregen.    Bewaar dit in een gesloten fles.    2.1.1.3. Precipitatieoplossing, pH 4,75- D(-)-wijnsteenzuur  122   mg- Ammoniumhydroxide (r20 = 0,97 g/ml) verdund tot 25 % (v/v)   0,3 ml- Calciumacetaatoplossing met 10 g calcium per liter (2.1.1.1)   8,8 ml- Water tot1 000 ml.    Los het D(-)-wijnsteenzuur op in water, voeg het ammoniumhydroxide toe en breng het volume op ongeveer 900 ml. Voeg dan 8,8 ml calciumacetaatoplossing toe (2.1.1.1). Breng na menging de pH op 4,75 met behulp van azijnzuur. Leng aan tot 1 l.    Daar het calciumracemaat enigszins oplosbaar is in deze oplossing verdient het aanbeveling 5 mg calciumracemaat toe te voegen. Roer gedurende twaalf uur en filtreer.2.1.2. Werkwijze  2.1.2.1. Wijn  zonder  toevoeging  van  metawijnsteenzuur   Breng in een bekerglas van 600 ml 500 ml precipitatieoplossing (2.1.1.3) en 10 ml wijn. Meng onder wrijven met het uiteinde van een glasstaaf langs de wand van het bekerglas. Laat het neerslag zich gedurende twaalf uur (overnacht) vormen.    Filtreer over een tevoren gewogen filterkroes G4, die geplaatst is op een vacuuem afzuigkolf. Houd het neerslag zo lang mogelijk in het bekerglas. Was het bekerglas na met het filtraat en breng het neerslag kwantitatief over in een filterkroes.    Droog in de droogstoof bij 70 °C tot constant gewicht en weeg. De hoeveelheid calciumracemaat, C4H4O6Ca · 4H2O, zij p gram.2.1.2.2. Wijn met toegevoegd metawijnsteenzuur   Indien aan wijn metawijnsteenzuur is toegevoegd of wanneer deze toevoeging wordt vermoed, dient dit zuur op de volgende wijze te worden gehydrolyseerd.    Breng in een Erlenmeyer van 50 ml 10 ml wijn en 0,4 ml azijnzuur p.a., CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml). Sluit de Erlenmeyer af met een kurk voorzien van een overloop en laat de inhoud gedurende 30 minuten koken. Breng de inhoud van de Erlenmeyer na afkoeling  over in een bekerglas; was de Erlenmeyer twee keer na met 5 ml water en vervolg de bepaling zoals hierboven is aangegeven.    Bij de uitvoering van de bepaling wordt het metawijnsteenzuur als wijnsteenzuur bepaald.2.1.3. Weergave van de resultaten   Eén molecuul calciumracemaat komt overeen met 0,5 molecule L (+)-wijnsteenzuur in de wijn.    De hoeveelheid wijnsteenzuur per liter wijn, uitgedrukt in milli-equivalenten, is: 384,5 · p.    Het resultaat wordt opgegeven met één decimaal.    De hoeveelheid wijnsteenzuur per liter wijn, uitgedrukt in gram wijnsteenzuur, is: 28,84 · p.    Het resultaat wordt opgegeven met één decimaal.    De hoeveelheid wijnsteenzuur per liter wijn, uitgedrukt in gram kaliumwaterstoftartraat, is: 36,15 · p.     Het resultaat wordt opgegeven met één decimaal.2.2. Vergelijkende volumetrische bepaling  2.2.1. Reagentia  2.2.1.1. Zoutzuuroplossing, HCl (r20 = 1,18   1,19 g/ml), 1/5 verdund (v/v)  2.2.1.2. EDTA-oplossing 0,05 MEDTA (dinatriumzout van ethyleendiamino-tetra-azijnzuur met twee moleculen kristalwater, C10H14N2O8NA2 · 2H2O)  18,61 gGedestilleerd water tot1 000 ml.   2.2.1.3. Natriumhydroxideoplossing 40 % (m/v):Natriumhydroxide, NaOH   40  gGedestilleerd water tot  100  ml  2.2.1.4. Calconcarbonzuurindicator (1 % m/m):Calconcarbonzuur (2-hydroxy-4-sulfo-1-naftylazo-naftaleen3-carbonzuur, C21H14N2O7S · 3H2) 1 g.Natriumsulfaat watervrij, Na2SO4100 g.2.2.2. Werkwijze   Plaats de filterkroes, na weging van het aanwezige calciumracemaat, weer op de afzuigkolf en los het neerslag op in 10 ml verdund zoutzuur (2.2.1.1). Was de filterkroes na met 50 ml gedestilleerd water.    Voeg aan de oplossing 5 ml natriumhydroxideoplossing (2.2.1.3) en ongeveer 30 mg indicator (2.2.1.4) toe. Titreer met 0,05 M EDTA-oplossing (2.2.1.2). Zij n het verbruikte aantal milliliters.2.2.3 Weergave van de resultaten   De hoeveelheid wijnsteenzuur per liter wijn, uitgedrukt in milli-equivalenten, is: 5 · n.    Het resultaat wordt opgegeven met één decimaal.    De hoeveelheid wijnsteenzuur per liter wijn, uitgedrukt in gram wijnsteenzuur, is: 0,375 · n.    Het resultaat wordt opgegeven met één decimaal.    De hoeveelheid wijnsteenzuur per liter wijn, uitgedrukt in gram kaliumwaterstoftartraat, is: 0,470 · n.    Het resultaat wordt opgegeven met één decimaal.3. GEBRUIKELIJKE  METHODE  3.1. Reagentia  3.1.1. Voor de voorbehandeling van de wijn  3.1.1.1. Azijnzuur, CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml) 30 % (v/v)  3.1.1.2. Sterk basische anionenwisselaar (bij voorbeeld anionenwisselaar lll van Merck 20-50 mesh in acetaatvorm. Bereid een suspensie van anionenwisselaar (ongeveer 100 g) in 200 ml (30 %) azijnzuur (3.1.1.1). De suspensie moet minstens 24 uur met  elkaar in contact zijn    alvorens te gebruiken. Bewaar de onder azijnzuur staande anionenwisselaar voor latere bepalingen.   3.1.1.3. Azijnzuur, CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml) 0,5 % (v/v)  3.1.1.4. Natriumsulfaatoplossing 7,1 % (m/v), 0,5 M   Los 71 g natriumsulfaat watervrij, Na2SO4, op in gedestilleerd water en vul aan tot 1 000 ml met gedestilleerd water.3.1.2. Voor de bepaling van wijnsteenzuur  3.1.2.1. Natriumacetaatoplossing 27 % (m/v), CH3COONa   Los 270 g watervrij natriumacetaat, CH3COONa, op in gedestilleerd water en vul hiermee aan tot 1 000 ml.   3.1.2.2. Vanadiumreagens   Los 10 g ammoniumvanadaat, NH4VO3, op in 150 ml natriumhydroxideoplossing 1 M (3.1.2.10). Giet deze oplossing over in een maatkolf van 500 ml, voeg 200 ml natriumacetaatoplossing 27 % (3.1.2.1) toe en vul met gedestilleerd water aan tot 500 ml.   3.1.2.3. Zwavelzuuroplossing, H2SO4, 1 M  3.1.2.4. Zwavelzuuroplossing, H2SO4, 0,5 M  3.1.2.5. Zwavelzuuroplossing, H2SO4, 0,05 M  3.1.2.6. Perjoodzuuroplossing 0,05 M   Weeg 10,696 g natriumperjodaat, NaJO4, af en breng dit over in een maatkolf van 1 000 ml. Voeg hieraan toe 50 ml zwavelzuuroplossing 0,5 M (3.1.2.4) en vul met gedestilleerd water aan tot 1 000 ml.   3.1.2.7. Glyceroloplossing 10 % (m/v)   Breng 10 g glycerol, C3H8O3, in een maatkolf van 100 ml. Vul met gedestilleerd water aan tot 100 ml.   3.1.2.8. Natriumsulfaatoplossing 7,1 % (m/v) (3.1.1.4)  3.1.2.9. Wijnsteenzuuroplossing 1 g/l   Weeg 0,5 g wijnsteenzuur af en breng dit over in een maatkolf van 500 ml. Voeg hieraan toe 6,66 ml natriumhydroxideoplossing 1 M (3.1.2.10) en vul met natriumsulfaatoplossing 7,1 % (3.1.1.4) aan tot 500 ml.   3.1.2.10. Natriumhydroxideoplossing, NaOH, 1M3.2. Apparatuur  3.2.1. Glazen buis met een lengte van ongeveer 300 mm en een inwendige doorsnede van 10-11 mm, voorzien van een kraan  3.2.2. Spectrofotometer, waarmee absorptiemetingen bij een golflengte van 490 nm kunnen worden uitgevoerd, met cuvetten van 10 mm optische weglengte3.3. Werkwijze  3.3.1. Bereiding van de anionenwisselaarkolom   Breng een prop glaswol onder in de glazen buis (3.2.1) tot vlak boven de kraan. Bevochtig deze prop met gedestilleerd water. Giet 10 ml van de suspensie van ionenwisselaar in ace taatvorm (3.1.1.2) in de kolom. Laat de ionenwisselaar uitzakken. Duw een  prop glaswol op tot het oppervlak van de uitgezakte ionenwisselaar (hierdoor wordt voorkomen dat de uitgezakte ionenwisselaar later tijdens het elueren opnieuw suspendeert).  De ionenwisselaar kan slechts eenmaal worden gebruikt.3.3.2. Afzonderen van de organische zuren   Zet de kraan open en laat de azijnzuuroplossing tot ongeveer 2-3 mm boven de bovenste glaswolprop aflopen.    Voeg 10 ml azijnzuuroplossing 0,5 % (3.1.1.3) toe en laat vervolgens de vloeistof aflopen tot hetzelfde niveau als hierboven beschreven. Herhaal deze procedure van spoelen nog vier keer.    Na de laatste spoelgang wordt, bij gesloten kraan, 10 ml wijn of most op de kolom gebracht. Laat de wijn druppelsgewijs aflopen (gemiddelde snelheid één druppel per seconde) en sluit de kraan als het vloeistofniveau juist boven de bovenste glaswolprop  is gekomen. Vul de kolom weer met 10 ml azijnzuuroplossing 0, 5 % (3.1.1.3), laat de vloeistof aflopen met dezelfde snelheid als zojuist en herhaal deze procedure van spoelen zeven keer met telkens 10 ml water. Sluit de kraan zodra bij de laatste  spoelgang het vloeistofniveau zich net boven de bovenste glaswolprop bevindt.    Elueer de aan de ionenwisselaar gebonden zuren met behulp van de natriumsulfaatoplossing 7,1 % (3.1.1.4); vang het eluaat op in een maatkolf van 100 ml totdat precies 100 ml is opgevangen.3.3.3. Bepaling van wijnsteenzuur  3.3.3.1. Wijn  zonder  toevoeging  van  metawijnsteenzuur   Pipeteer 20 ml eluaat in twee Erlenmeyers a en b.    Erlenmeyer a wordt gebruikt voor de gehaltebepaling, Erlenmeyer b, waarin het wijnsteenzuur wordt gedestrueerd door perjoodzuur, dient als blanco-oplossing.    Breng in Erlenmeyer a:- 2 ml zwavelzuuroplossing 1 M (3.1.2.3),- 5 ml zwavelzuuroplossing 0,05 M (3.1.2.5),- 1 ml glyceroloplossing 10 % (3.1.2.7).    Breng in Erlenmeyer b:- 2 ml zwavelzuuroplossing 1 M (3.1.2.3),- 5 ml perjoodzuuroplossing 0,05 M (3.1.2.6),    wacht 15 minuten en voeg toe:- 1 ml glyceroloplossing 10 % (3.1.2.7) om de overmaat perjoodzuur te destrueren   en wacht twee minuten.    Voeg vervolgens onder roeren 5 ml vanadiumreagens (3.1.2.2) toe aan Erlenmeyer b en direct hierna ook aan Erlenmeyer a. Stel onmiddellijk een stopwatch in werking en vul twee cuvetten met de oplossingen uit Erlenmeyers a enb. Na 90 seconden wordt de  extinctie van de cuvet, gevuld met oplossing a (bepaling), bij 490 nm bepaald ten opzichte van de cuvet gevuld met de blanco-oplossing (Erlenmeyer b).    Indien de wijnsteenzuurconcentratie in het eluaat te hoog is, wat aanleiding geeft tot te lage absorbanties, dient men dit eluaat met een 7,1 % Na2SO4-oplossing te verdunnen. Dit kan dan wel gemeten worden.  3.3.3.2. Wijn met toegevoegd metawijnsteenzuur   Indien aan wijn metawijnsteenzuur is toegevoegd of wanneer deze toevoeging wordt vermoed, dient dit zuur te worden gehydrolyseerd op de wijze zoals aangegeven bij de referentiemethode.    Na afkoeling wordt de inhoud van de Erlenmeyer, evenals het waswater (twee keer 5 ml), bovenin de ionenwisselaar gebracht. Vervolg de bepaling zoals boven is aangegeven.    Bij de uitvoering van de bepaling wordt het metawijnsteenzuur als wijnsteenzuur meegerekend.3.3.4. Opstellen van de ijkcurve   Pipetteer 10, 20, 30, 40 en 50 ml van de wijnsteenzuuroplossing 1 g/l (3.1.2.9) in vijf maatkolven van 100 ml en vul aan tot 100 ml met natriumsulfaatoplossing 7,1 % (3.1.1.4). De aldus verkregen oplossingen komen overeen met eluaten van wijn die  respectievelijk 1, 2, 3, 4 en 5 g wijnsteenzuur per liter bevatten.    Pipetteer van elk van deze oplossingen 20 ml in twee Erlenmeyers, a en b, en vervolg zoals hiervóór voor wijneluaat is aangegeven.    Bij het uitzetten van de verkregen extincties van deze oplossingen tegen het wijnsteenzuurgehalte wordt een rechte verkregen die bij het nulpunt een lichte kromming vertoont. Leg dit deel van de curve, indien noodzakelijk, vast door oplossingen te  meten met een nauwkeurig bekend gehalte dat lager is dan 1,0 g/l.3.3.5. Weergave van de resultaten   Met behulp van de ijkcurve wordt het wijnsteenzuurgehalte in wijn, gram per liter, bepaald uit de gemeten absorbantie van het eluaat.    Dit gehalte wordt weergegeven met één decimaal.     17. CITROENZUUR 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Citroenzuur wordt tijdens een door citraatlyase (CL) gekatalyseerde reactie omgezet in oxaalacetaat en acetaat:   citraatoxaalacetaat + acetaat.    Het oxaalacetaat en zijn decarboxyleringsprodukt pyruvaat worden met gereduceerd nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide (NADH) in aanwezigheid van malaatdehydrogenase (MDH) en lactaatdehydrogenase (LDH) gereduceerd tot L-malaat en L-lactaat: oxaalacetaat + NADH + H+ L-malaat + NAD+  pyruvaat + NADH + H+ L-lactaat + NAD+.    De hoeveelheid bij deze reacties tot NAD+ geoxideerd NADH is evenredig aan het aanwezige citraat. De bepaling van het geoxideerde NADH vindt plaats door de afname in de extinctie te meten bij een golflengte van 340 nm.2. REAGENTIA  2.1. Buffer pH 7,8 (glycylglycine 0, 51 M; op pH 7,8 gebracht; Zn2+: 0,6 · 10 3 M)Los 7,13 g glycylglycine op in ongeveer 70 ml dubbel gedestilleerd water.    Breng de pH op 7,8 door ongeveer 13 ml natriumhydroxideoplossing 5 M toe te voegen; voeg 10 ml zinkchlorideoplossing (80 mg zinkchloride in 100 ml dubbel gedestilleerd water) en vul aan tot 100 ml met dubbel gedestilleerd water. Deze oplossing is ten  minste vier weken houdbaar bij + 4 °C.   2.2. Gereduceerd nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide-oplossing (NADH), ongeveer 6 · 10 3 MLos 30 mg NADH-Na2 en 60 mg NaHCO3 op in 6 ml dubbel gedestilleerd water. Deze oplossing is ten minste vier weken houdbaar bij + 4 °C.   2.3. Malaatdehydrogenase/lactaatdehydrogenase-oplossing (MDH/LDH; 0,5 mg MDH/ml en 2,5 mg LDH/ml)Meng 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml ammoniumsulfaatoplossing (3,2 M) en 0,5 ml LDH (5 mg LDH/ml). Deze oplossing is ten minste één jaar houdbaar bij + 4  °C.   2.4. Citraatlyaseoplossing (CL) (5 mg eiwit/ml)Los 168 mg lyofilisaat op in 1 ml ijskoud water. Deze oplossing is ten minste één week houdbaar bij 4 °C en ten minste vier weken in bevroren vorm.    Het verdient aanbeveling de enzymactiviteit te controleren alvorens een meting uit te voeren.   2.5. Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP)   Opmerking:Alle vorige reagentia worden in de handel in kitvorm aangeboden.3. APPARATUUR  3.1. Spectrofotometer waarmee bij 340 nm het extinctiemaximum NADH kan worden gemeten   Indien een dergelijke spectrofotometer niet beschikbaar is, kan een spectrofotometer met discontinu spectrum worden gebruikt waarmee metingen kunnen worden verricht bij 334 nm of 365 nm. Als het om absolute metingen gaat (geen vergelijkende metingen,  maar bij voorbeeld het vaststellen van de extinctiecoëfficiënt van NADH) dienen de golflengteschaal en de extincties van het apparaat te worden geijkt.   3.2. Glascuvetten met een optische weglengte van 1 cm of wegwerpcuvetten  3.3. Micropipetten waarmee volumes van 0,02 tot 2 ml kunnen worden afgemeten 4. VOORBEHANDELING  VAN  HET  MONSTER   De bepaling van citroenzuur geschiedt in het algemeen direct in de wijn zonder voorafgaande ontkleuring en zonder verdunning, mits het citroenzuurgehalte lager is dan 400 mg/l. Bij hogere gehalten moet de wijn zodanig worden verdund dat het  citraatgehalte tussen 20 en 400 mg/l komt te liggen (hoeveelheid citraat in de in bewerking genomen hoeveelheid monster tussen 5 en 80 mg).    Voor rode wijn die rijk is aan fenolische bestanddelen wordt aanbevolen deze eerst te behandelen met PVPP (polyvinylpolypyrrolidon).    Maak een suspensie van ongeveer 0,2 g PVPP in water. Laat 15 minuten bezinken. Filtreer over een vouwfilter.   Voeg aan 10 ml wijn in een Erlenmeyer van 50 ml met behulp van een spatel het vochtige PVPP toe. Schud gedurende twee à drie minuten en filtreer.5. WERKWIJZE   Regel de spectrofotometer in op metingen bij een golflengte van 340 nm, de extincties worden gemeten in cuvetten van 1 cm; de nulwaarde wordt ingesteld door een meting uit te voeren tegen lucht (geen cuvet in de lichtweg). Pipetteer in twee cuvetten  met een optische weglengte van 1 cm:     Blanco MeetoplossingOplossing in punt 2.1 1,00 ml 1,00 mlOplossing in punt 2.2 0,10 ml 0,10 mlMonsteroplossing - 0,20 mlDubbel gedestilleerd water 2,00 ml 1,80 mlOplossing in punt 2.3 0,02 ml 0,02 ml   Meng en meet de extinctie na ongeveer vijf minuten (E1).    Voeg toe:Oplossing in punt 2.4 0,02 ml 0,02 ml   Meng; wacht het einde van de reactie af (ongeveer vijf minuten) en meet de extinctie (E2).    Bepaal de extinctieverschillen van de blanco en de meetoplossing (E1   E2).Leid hieruit het extinctieverschil af voor de bepaling:DE = DEM   DEB.    Opmerking:De enzymactiviteit kan per afgeleverde partij wisselen. Het bovenstaande is slechts als indicatie aan te merken. Aanbevolen wordt deze activiteit per afgeleverde partij te bepalen.6. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN   Het gehalte aan citroenzuur wordt opgegeven in milligram per liter zonder decimalen.6.1. Berekening   Het gehalte in milligram per liter wordt berekend met de algemene formule: V = totaal cuvetvolume, in ml (is 3,14 ml)v = volume van het in bewerking genomen monster, in ml (is 0,2 ml)M = moleculaire massa van de te bepalen stof (watervrij citroenzuur = 192,1)d = optische weglengte van de cuvet, in cm (is 1 cm)e =  extinctiecoëfficiënt van NADH; bij 340 nm: e = 6,3 (mmol 1 · l · cm 1).   Dus:C = 479 · DE  Indien bij de voorbehandeling van het monster een verdunning is uitgevoerd, moet het resultaat met de verdunningsfactor worden vermenigvuldigd.    Opmerking:Meting bij 334 nm: C = 488 · DE (e  = 6,2 mmol 1 · l · cm 1).Meting bij 365 nm: C = 887 · DE (e  = 3,4 mmol 1 · l · cm 1).6.2. Herhaalbaarheid (r)   Citroenzuurgehalte lager dan 400 mg/l: r = 14 mg/l.Citroenzuurgehalte hoger dan 400 mg/l: r = 28 mg/l.6.3. Reproduceerbaarheid (R)   Citroenzuurgehalte lager dan 400 mg/l: R = 39 mg/l.Citroenzuurgehalte hoger dan 400 mg/l: R = 65 mg/l.     18. MELKZUUR 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN  1.1. Referentiemethode   Totaal melkzuur (L-lactaat en D-lactaat) wordt met nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide (NAD) in een door L-lactaatdehydrogenase (L-LDH) en D-lactaatdehydrogenase (D-LDH) gekatalyseerde reactie geoxideerd tot pyruvaat.    Het evenwicht van deze reactie ligt aan de lactaat-kant. Door pyruvaat te verwijderen wordt het evenwicht van de reactie richting pyruvaat verschoven.    Pyruvaat wordt met L-glutamaat in een door glutamaat-pyruvaat-transaminase (GPT) gekatalyseerde reactie omgezet in L-alanine.(1) L-lactaat + NAD+ pyruvaat + NADH + H+   (2) D-lactaat + NAD+ pyruvaat + NADH + H+   (3) pyruvaat + L-glutamaat L-alanine + a-ketoglutaraat  Het gevormde NADH, dat wordt bepaald door de extinctietoename te meten bij een golflengte van 340 nm, is evenredig aan de oorspronkelijk aanwezige hoeveelheid lactaat.    Opmerking:L-lactaat kan afzonderlijk worden bepaald via de reacties (1) en (3).    D-lactaat kan afzonderlijk worden bepaald via de reacties (2) en (3).1.2. Gebruikelijke methode   Het via een anionenwisselaarkolom afgescheiden melkzuur wordt tot ethanal geoxideerd en colorimetrisch bepaald via de reactie natriumnitroprusside en piperidine.2. REFERENTIEMETHODE  2.1. Reagentia  2.1.1. Bufferoplossing pH 10 (glycylglycine 0,6 M; L-glutamaat 0,1 M)   Los 4,75 g glycylglycine en 0,88 g L-glutaminezuur op in ongeveer 50 ml dubbel gedestilleerd water; breng de pH op 10 met enkele milliliters natriumhydroxideoplossing 10 M en vul aan tot 60 ml met dubbel gedestilleerd water. De oplossing is ten minste  twaalf weken houdbaar bij + 4 °C.   2.1.2. Nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide-oplossing (NAD), ongeveer 40 · 10 3 MLos 900 mg NAD op in 30 ml dubbel gedestilleerd water. De oplossing is ten minste vier weken houdbaar bij + 4 °C.   2.1.3. Suspensie van glutamaat-pyruvaat-transaminase (GPT) van 20 mg/mlDe suspensie is ten minste één jaar houdbaar bij + 4 °C.   2.1.4. Suspensie L-lactaatdehydrogenase (L-LDH) van 5 mg/mlDe suspensie is ten minste één jaar houdbaar bij + 4 °C.   2.1.5. Suspensie D-lactaatdehydrogenase (D-LDH) van 5 mg/ml   De suspensie is ten minste één jaar houdbaar bij + 4 °C.    Het verdient aanbeveling de enzymactiviteit te controleren alvorens een meting uit te voeren.     Opmerking:Alle vorige reagentia worden in de handel in kitvorm aangeboden.2.2. Apparatuur  2.2.1. Spectrofotometer waarmee bij 340 nm het extinctiemaximum van NADH kan worden gemeten   Indien een dergelijke spectrofotometer niet beschikbaar is, kan een spectrofotometer en discontinu spectrum worden gebruikt waarmee metingen kunnen worden verricht bij 334 nm of 365 nm.    Als het om absolute metingen gaat (geen vergelijkende metingen, maar bij voorbeeld het vaststellen van de extinctiecoëfficiënt van NADH), dienen de golflengteschaal en de extincties van het apparaat te worden geijkt.   2.2.2. Glascuvetten met een optische weglengte van 1 cm of wegwerpcuvetten  2.2.3. Micropipetten waarmee volumes van 0,02 tot 2 ml kunnen worden afgemeten2.3. Voorbehandeling van het monster   Vermijd die delen van het glaswerk met de vingers aan te raken die in contact komen met de reagentia omdat dit een oorzaak kan vormen voor een verhoogd L-melkzuurgehalte hetgeen het resultaat nadelig beïnvloed.    De bepaling van melkzuur geschiedt in het algemeen direct in de wijn zonder voorafgaande ontkleuring en zonder verdunning, mits het melkzuurgehalte lager is dan 100 mg/l. Bij hogere gehalten dient als volgt te worden verdund:100 mg/l   1 g/l: verdun 1  tot 10 met dubbel gedestilleerd water,1 g/l   2,5 g/l: verdun 1 tot 25 met dubbel gedestilleerd water,2,5 g/l   5 g/l: verdun 1 tot 50 met dubbel gedestilleerd water.2.4. Werkwijze  2.4.1. Bepaling van totaal melkzuur   De bufferoplossing moet voor de bepaling op 20-25 °C worden gebracht.    Regel de spectrofotometer af voor metingen bij een golflengte van 340 nm, de extincties worden gemeten in cuvetten van 1 cm optische weglengte; de nulwaarde wordt ingesteld door een meting uit te voeren ten opzichte van lucht (geen cuvet in de  lichtweg) of ten opzichte van water.    Pipetteer in twee cuvetten met een optische weglengte van 1 cm:     Blanco MeetoplossingOplossing in punt 2.1.1 1,00 ml 1,00 mlOplossing in punt 2.1.2 0,20 ml 0,20 mlDubbel gedestilleerd water 1,00 ml 0,80 mlSuspensie in punt 2.1.3 0,02 ml 0,02 mlMonsteroplossing - 0,20 ml   Meng met een roerder van glas of van afgeplat synthetisch materiaal; meet na ongeveer vijf minuten de extincties van de blanco en de meetoplossing (E1).    Voeg toe: suspensie in punt 2.1.4: 0,02 mlsuspensie in punt 2.1.5: 0,05 ml.    Homogeniseer, wacht het einde van de reactie af (ongeveer 30 minuten) en meet de extincties van de blanco en de meetoplossing (E2).    Bepaal de extinctieverschillen van de blanco en de meetoplossing (E2   E1).     Leid hieruit het extinctieverschil af voor de bepaling:    D E = D EM   D EB.2.4.2. Bepaling van L-melkzuur en van D-melkzuur   De bepaling van L-melkzuur en van D-melkzuur kan afzonderlijk worden verricht door bovenstaande werkwijze voor het totaal melkzuur toe te passen, waarbij na de meting van E1 als volgt te werk wordt gegaan.    Voeg 0,02 ml van de suspensie in punt 2.1.4 toe. Homogeniseer, wacht het einde van de reactie af (ongeveer 20 minuten) en meet de extincties van de blanco en de meetoplossing (E2).    Voeg 0,05 ml van de suspensie in punt 2.1.5 toe, homogeniseer, wacht het einde van de reactie af (ongeveer 30 minuten) en meet de extincties van de blanco en de meetoplossing (E3).    Bepaal de extinctieverschillen (E2   E1) voor het L-melkzuur en (E3   E2) voor het D-melkzuur, zowel voor de blanco als voor de meetoplossing.    Leid hieruit het extinctieverschil af voor de bepaling:    D E = D EM   D EB.    Opmerking:De enzymactiviteit kan per afgeleverde partij wisselen. Het bovenstaande is slechts als indicatie aan te merken. Aanbevolen wordt deze activiteit per afgeleverde partij te bepalen. Indien alleen L-melkzuur wordt bepaald kan de incubatietijd  na de toevoeging van het L-lactaatdehydrogenase worden teruggebracht tot tien minuten.2.5. Weergave van de resultaten   Het melkzuurgehalte wordt opgegeven in gram per liter met één decimaal.2.5.1. Berekening   Het gehalte in gram per liter wordt berekend met de algemene formule:V = totaal cuvetvolume, in ml (V = 2,24 ml voor L-melkzuur en V = 2,29 ml voor D-melkzuur en totaal melkzuur)v = volume van het in bewerking genomen monster, in ml (is 0,2 ml)MM =  moleculaire massa van de te bepalen stof (is 90,08)d = optische weglengte van de cuvet, in cm (is 1 cm)e = extinctiecoëfficiënt van NADH; bij 340 nm: e = 6,3 (mmol 1 · l · cm 1).2.5.1.1. Totaal melkzuur   C = 0,164· D E   Indien bij de voorbehandeling van het monster een verdunning is uitgevoerd, moet het resultaat met de verdunningsfactor worden vermenigvuldigd.    Opmerking: Meting bij 334 nm: C = 0,167 · D E (e = 6,2 mmol 1 · l · cm 1).Meting bij 365 nm: C = 0,303 · D E (e = 3,4 mmol 1 · l · cm 1).  2.5.1.2. L-melkzuur   C = 0,160 · D E  Indien bij de voorbehandeling van het monster een verdunning is uitgevoerd, moet het resultaat met de verdunningsfactor worden vermenigvuldigd.    Opmerking:Meting bij 334 nm: C = 0,163 · D E (e = 6,2 mmol 1 · l · cm 1).Meting bij 365 nm: C = 0,297 · D E ( e= 3,4 mmol 1 · l · cm 1).2.5.2 Herhaalbaarheid (r)   r = 0,02 + 0,07 · xi g/l.   xi = melkzuurgehalte van het monster in g/l.2.5.3. Reproduceerbaarheid (R)  R = 0,05 + 0,125 · xi g/l.xi = melkzuurgehalte van het monster in g/l.3. GEBRUIKELIJKE  METHODE  3.1.1. Voor de voorbehandeling van de wijn   Zie punt 3.1.1 van hoofdstuk 16. ""Wijnsteenzuur".3.1.2. Voor de bepaling van melkzuur  3.1.2.1. 0,1 M oplossing van cerium(IV)sulfaat in zwavelzuur 0,35 M   Los onder koeling met ijs 40,431 g cerium(IV)sulfaat, Ce(SO4)2 · 4 H2O, op in 350 ml gestelde zwavelzuuroplossing 1 M (3.1.2.4). Vul aan tot 1 000 ml met gedestilleerd water.   3.1.2.2. Natriumhydroxideoplossing, NaOH, 2,5 M  3.1.2.3.Natriumacetaatoplossing, 270 g/l (te bereiden uit watervrij natriumacetaat, CH3COONa)  3.1.2.4. Zwavelzuuroplossing, H2SO4, 1 M  3.1.2.5. Natriumnitroprussideoplossing, Na2[Fe(CN)5NO]· 2 H2O, 2 % (m/v)   Goed gesloten en in het donker bewaren. Houdbaarheid van deze oplossing: acht dagen.   3.1.2.6. Piperidineoplossing, C5H11N, 10 % (v/v)  3.1.2.7 Melkzuuroplossing M   Verdun 100 ml melkzuur, C3H6O3, met 400 ml water. Verhit deze oplossing in een schaal op een kokend-waterbad gedurende vier uur, waarbij af en toe gedestilleerd water wordt toegevoegd om het volume constant te houden. Vul na afkoeling aan tot 1 l.  Bepaal in 10 ml van deze oplossing het melkzuurgehalte met natriumhydroxideoplossing 1 M (3.1.2.8). Stel de oplossing in op 1 M melkzuur (90 g).   3.1.2.8 Natriumhydroxideoplossing, NaOH, 1 M 3.2 Apparatuur  3.2.1. Glazen buis met een lengte van ongeveer 300 mm en een inwendige doorsnede van 10-11 mm, voorzien van een kraan  3.2.2. Waterbad, gethermostateerd op 65 °C  3.2.3. Spectrofotometer, waarmee absorptiemetingen bij een golflengte van 570 nm kunnen worden uitgevoerd, met cuvetten van 1 cm optische weglengte3.3. Werkwijze  3.3.1 Bereiding van de anionenwisselaarkolom   Zie punt 3.3.1 van hoofdstuk 16. ""Wijnsteenzuur".3.3.2. Isolering van de organische zuren   Zie punt 3.3.2 van hoofdstuk 16. ""Wijnsteenzuur".3.3.3. Bepaling van melkzuur   Breng 10 ml eluaat in een reageerbuis met ingeslepen stop van 50 ml, voeg 10 ml ceriumsulfaatoplossing (3.1.2.1) toe. Schud; plaats de reageerbuis gedurende precies tien minuten in een op 65°C gethermostateerd waterbad. Til de stop op het moment van  onderdompeling gedurende enkele seconden op om op deze manier het drukverschil te compenseren ten gevolge van de verwarming en sluit de reageerbuis vervolgens zodanig dat geen verlies van het te vormen ethanal kan voorkomen. Verwijder de reageerbuis,  koel af onder stromend water zodat de temperatuur op ongeveer 20 °C komt. Voeg 5 ml natriumhydroxideoplossing 2,5 M (3.1.2.2) toe, meng en filtreer.    Breng 15 ml filtraat in een Erlenmeyer met slijpstuk van 50 ml, waarin al een homogeen mengsel aanwezig is van 5 ml natriumacetaatoplossing 27 % (3.1.2.3) en 2 ml zwavelzuuroplossing 1 M (3.1.2.4). Voeg 5 ml natriumnitroprussideoplossing (3.1.2.5) toe  en meng. Voeg vervolgens 5 ml piperidineoplossing (3.1.2.6) toe. Schud direct en breng deze oplossing onmiddellijk in een cuvet. De nu ontstane kleuring, die varieert van groen tot violet, wordt gemeten (570 nm) tegen lucht (geen cuvet in de lichtweg);  na een tijdelijke intensiteitstoename neemt de kleuring vervolgens snel af.   Volg het verloop van de extinctie en kies als definitieve waarde de maximale waarde.   Indien het eluaat te veel melkzuur bevat waardoor de extinctie te hoog is, dient het eluaat te worden verdund met de natriumsulfaatoplossing 7,1 % (3.1.1), waarna de bepaling wordt uitgevoerd met deze verdunde oplossing.3.3.4. Opstellen van de ijkcurve   Breng 10 ml melkzuuroplossing 1 M (3.1.2.7) en 10 ml gestelde natriumhydroxideoplossing 1 M (3.1.2.8) in een maatkolf van 1 000 ml en vul aan tot de streep met natriumsulfaatoplossing 7,1 %. Pipetteer hiervan 5, 10, 15, 20 en 25 ml in vijf maatkolven  van 100 ml. Vul aan tot de streep met natriumsulfaatoplossing 7,1 % (3.1.1). Neem 10 ml van elk van deze oplossingen in bewerking en bepaal voor elk hiervan de extinctie volgens de werkwijze beschreven in punt 3.3.3 voor het eluaat.    De aldus verkregen oplossingen komen overeen met eluaten van wijn die respectievelijk 0,45, 0,9, 1,35, 1,80 en 2,25 g/l melkzuur bevatten.    Bij het uitzetten van de verkregen extincties van deze oplossingen tegen het melkzuurgehalte wordt een rechte verkregen.  3.4. Weergave van de resultaten   Met behulp van de ijkcurve wordt het melkzuurgehalte in wijn, in gram per liter, bepaald uit de gemeten extinctie van het eluaat.    Dit gehalte wordt opgegeven met één decimaal.    Opmerking:Wijn, die meer dan 250 mg/l zwaveldioxide bevat, kan een verhoogd gehalte voorspiegelen; dit komt door een ethanalzwavelzuurverbinding die als melkzuur wordt meebepaald. In dit geval moet het resultaat worden gecorrigeerd door de hierna  volgende aanvullende bepaling uit te voeren.Meng 15 ml eluaat in een reageerbuis met ingeslepen stop met 5 ml natriumacetaatoplossing 27 % (3.1.2.3) en 2 ml zwavelzuuroplossing 0,775 M (77,5 ml H2SO4 1 M met gedestilleerd water aanvullen tot 100 ml).  Voeg vervolgens, zoals bij de bepaling van melkzuur, 5 ml natriumnitroprussideoplossing 2 % (3.1.2.5) en 5 ml piperidineoplossing 10 % (3.1.2.6) toe. Meet, na te hebben gemengd, de extinctie volgens de omstandigheden beschreven bij de bepaling van  melkzuur. Bepaal via de ijklijn het met deze extinctie overeenkomende schijnbare melkzuurgehalte in g/l, B. Dit gehalte wordt door het ethanalzwavelzuur veroorzaakt. Indien L2 het schijnbare melkzuurgehalte in wijn in g/l is, dan is het werkelijke  melkzuurgehalte, L, gelijk aan:    L = L2   B · 0,4 (in g/l).     19. L-APPELZUUR 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   L-appelzuur wordt tijdens een door L-malaatdehydrogenase (L-MDH) gekatalyseerde reactie door nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide (NAD) geoxideerd tot oxaalacetaat.   Het evenwicht van deze reactie ligt aan de malaat-kant. Door oxaalacetaat te verwijderen wordt het evenwicht van de reactie richting oxaalacetaat verschoven. Oxaalacetaat wordt tijdens een door glutamaat-oxaalacetaat-transaminase (GOT) gekatalyseerde  reactie omgezet in L-aspartaat.    (1) L-malaat + NAD + oxaalacetaat + NADH + H+     (2) Oxaalacetaat + L-glutamaat L-aspartaat + a-ketoglutaraat   Het gevormde NADH, dat wordt bepaald door de extinctietoename te meten bij een golflengte van 340 nm, is evenredig aan de oorspronkelijk aanwezige hoeveelheid L-malaat.2. REAGENTIA  2.1. Bufferoplossing pH 10 (glycylglycine 0,60 M, L-glutamaat 0,1 M)  Los 4,75 g glycylglycine en 0,88 g L-glutaminezuur op in ongeveer 50 ml dubbel gedestilleerd water; breng de pH op 10 met ongeveer 4,6 ml natriumhydroxideoplossing 10 M en vul aan tot 60 ml met dubbel gedestilleerd water. De oplossing is ten minste  twaalf weken houdbaar bij 4 °C.   2.2. Nicotinezuuramide-adenine-dinucleotideoplossing (NAD), ongeveer 47· 10 3 MLos 420 mg NAD op in 12 ml dubbel gedestilleerd water. De oplossing is ten minste vier weken houdbaar bij 4 °C.   2.3. Suspensie van glutamaat-oxaalacetaat-transaminase (GOT) van 2 mg/mlDe suspensie is ten minste één jaar houdbaar bij + 4 °C.   2.4. L-malaatdehydrogenaseoplossing (L-MDH) van 5 mg/mlDe oplossing is ten minste één jaar houdbaar bij + 4 °C.    Opmerking:Alle vorige reagentia worden in de handel in kitvorm aangeboden.3. APPARATUUR  3.1. Spectrofotometer waarmee bij 340 nm, het extinctiemaximum van NADH, kan worden gemetenIndien een dergelijke spectrofotometer niet beschikbaar is, kan een spectrofotometer met discontinu spectrum worden gebruikt waarmee metingen kunnen worden  verricht bij 334 nm of 365 nm.    Als het om absolute metingen gaat (geen vergelijkende metingen, maar bij voorbeeld het vaststellen van de extinctiecoëfficiënt van NADH) dienen de golflengteschaal en de extincties van het apparaat te worden geijkt.   3.2. Glascuvetten met een optische weglengte van 1 cm of wegwerpcuvetten  3.3. Micropipetten waarmee volumes van 0,01 tot 2 ml kunnen worden afgemeten4. VOORBEHANDELING  VAN  HET  MONSTER   De bepaling van L-malaat geschiedt in het algemeen direct in de wijn zonder voorafgaande ontkleuring en zonder verdunning, mits het L-appelzuurgehalte lager is dan 350    mg/l (meting bij 365 nm). Bij hogere gehalten moet de wijn met dubbel gedestilleerd water zodanig worden verdund dat het L-malaatgehalte tussen 30 en 350 mg/l, komt te liggen (hoeveelheid L-malaat in de in bewerking genomen hoeveelheid monster tussen 3  en 35 µg).    Indien het L-malaatgehalte lager is dan 30 mg/l kan de hoeveelheid monsteroplossing in de cuvet worden verhoogd tot 1 ml. In dat geval moet de hoeveelheid water zodanig worden verminderd dat het totale volume in de cuvet gelijk blijft.5. WERKWIJZE   Regel de spectrofotometer in op metingen bij een golflengte van 340 nm: de extincties worden gemeten in cuvetten van 1 cm optische weglengte; de nulwaarde wordt ingesteld door een meting uit te voeren tegen lucht (geen cuvet in de lichtweg) of tegen  water.   Pipetteer in twee cuvetten met een optische weglengte van 1 cm:     Blanco MeetoplossingOplossing in punt 2.1 1,00 ml 1,00 mlOplossing in punt 2.2 0,20 ml 0,20 mlDubbel gedestilleerd water 1,00 ml 0,90 mlSuspensie in punt 2.3 0,01 ml 0,01 mlMonsteroplossing - 0,10 ml   Meng en meet na ongeveer drie minuten de extinctie (E1).    Voeg toe:Oplossing in punt 2.40,01 ml 0,01 ml   Meng en wacht op het einde van de reactie (ongeveer vijf à tien minuten; meet de extinctie (E2).    Bepaal de extinctieverschillen (E2   E1) van de blanco en de meetoplossing.    Leid hieruit het extinctieverschil af voor de bepaling:    D E = D EM   D EB.    Opmerking:De enzymactiviteit kan per afgeleverde partij wisselen. Het bovenstaande is slechts als indicatie aan te merken. Aanbevolen wordt deze activiteit per afgeleverde partij te bepalen.6. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN   Het L-appelzuurgehalte wordt opgegeven in gram per liter (g/l) met één decimaal.6.1. Berekening   Het gehalte in gram per liter wordt berekend met de algemene formule:V = totaal cuvetvolume, in ml (is 2,22 ml)v = volume van het in bewerking genomen monster, in ml (is 0,1 ml)MM = moleculaire massa van de te bepalen stof (L-appelzuur = 134,09)d =  optische weglengte van de cuvet, in cm (is 1 cm) e  = extinctiecoëfficiënt van NADH; bij 340 nm: e = 6,3 (mmol 1 · l · cm 1).    Voor L-malaat wordt dit:C = 0,473 · D E g/l.   Indien bij de voorbehandeling van het monster een verdunning is uitgevoerd, moet het resultaat met de verdunningsfactor worden vermenigvuldigd.    Opmerking:Meting bij 334 nm: C = 0,482 · D E.  Meting bij 365 nm: C = 0,876 · D E.   6.2. Herhaalbaarheid (r)   r = 0,03 + 0,034 · xixi = het appelzuurgehalte van het monster in g/l.6.3. Reproduceerbaarheid (R)   R = 0,05 + 0,071· xixi = het appelzuurgehalte van het monster in g/l.     20. D-APPELZUUR (Enzymatische methode) COMBINATIETEST  VOOR  ONGEVEER  30  BEPALINGEN1. PRINCIPE   In aanwezigheid van D-malaatdehydrogenasedecarboxyl (D-MDH) wordt D-appelzuur door nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide (NAD) geoxideerd tot oxaalacetaat. Het gevormde oxaalacetaat wordt omgezet in pyruvaat en koolzuur.    D-malaat + NAD + ·  + pyruvaat + CO2 + NADH + H+   Het gevormde NADH, dat wordt gemeten aan de toename van de extinctie bij golflengten 334, 340 en 365 nm, is evenredig aan de aanwezige hoeveelheid D-malaat.2. REAGENTIA   a) Flesje 1 met ongeveer 30 ml Hepesbufferoplossing 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethaan-sulfonzuur, pH = 9,0 en stabilisatorenb) Flesje 2 met ongeveer 210 mg lyofilisaat-NADc) Drie flesjes 3 met het lyofilisaat van D-MDH, elk met ongeveer 8 U2.1.  Voorbehandeling van de oplossingen  2.1.1. Gebruik de inhoud van flesje 1 onverdund. Breng de oplossingen vóór het gebruik op 20-25 °C met behulp van een thermostaat.   2.1.2. Los de inhoud van flesje 2 op in 4 ml dubbel gedestilleerd water.   2.1.3. Los de inhoud van een van de flesjes 3 op in 0,6 ml dubbel gedestilleerd water. Breng de oplossing vóór het gebruik op 20-25 °C met behulp van een thermostaat.2.2. Stabiliteit van de oplossingen   De inhoud van flesje 1 is ten minste één jaar houdbaar bij + 4 °C. De oplossing in flesje 2 is ongeveer drie weken houdbaar bij + 4 °C en twee maanden bij   20 °C.De oplossing in de flesjes 3 is vijf dagen houdbaar bij + 4 °C.3. APPARATUUR  3.1. Spectrofotometer waarmee de metingen kunnen worden verricht bij golflengte 340 nm, het extinctiemaximum van NADH en van NADPHIndien geen dergelijke spectrofotometer beschikbaar is, kan een spectrofotometer met een discontinu spectrum worden  gebruikt waarmee de metingen kunnen worden verricht bij 334 nm of 365 nm.   3.2. Glascuvetten met een optische weglengte van 1 cm of wegwerpcuvetten  3.3. Micropipetten waarmee volumes van 0,01 tot 2 ml kunnen worden afgemeten4. VOORBEHANDELING  VAN  HET  MONSTER   De hoeveelheid D-malaat in de cuvet moet tussen 2 en 50 µg zijn. Verdun de monsteroplossing op zodanige wijze dat het malaatgehalte tussen 0,02 en 0,5 g/l, respectievelijk 0,02 en 0,3 g/l komt te liggen.    Indien het extinctieverschil D E <  0,100 is, kan de hoeveelheid monsteroplossing worden verhoogd met 1,80 ml door de hoeveelheid toe te voegen water zodanig te verminderen dat het totale volume in de twee cuvetten (monster- en blanco-oplossing) gelijk  is.  5. WERKWIJZE   Temperatuur: 20 à 25 °C.Totaal cuvetvolume: 2,95 ml.    Meet tegen lucht (geen cuvet in de lichtweg) of tegen water.                        Breng in de cuvettenBlancoMonsterOplossing in punt 2.1.11,00 ml1,00 mlOplossing in punt 2.1.20,10 ml0,10 mlDubbel gedestilleerd water1,80 ml1,70 mlMonsteroplossing 0,10 mlMeng, en meet na ongeveer zes minuten de extinctie van de oplossingen (E1).  Breng reactie op gang door toevoeging van:Oplossing in punt 2.1.30,05 ml0,05 mlMeng, wacht tot het einde van de reactie (ongeveer 20 minuten) en meet dan de extinctie van de oplossingen (E2).   Bepaal de extinctieverschillen (E2   E1) van de blanco en de monsteroplossing. Leid hieruit het extinctieverschil tussen de blanco-oplossing en de monsteroplossing af.D E = D En   D Eb6. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN   De concentratie D-appelzuur wordt aangegeven in gram per liter met één decimaal.6.1. Berekening   De algemene formule voor de berekening van de concentraties in gram per liter is als volgt:V = totaal cuvetvolume (ml)v = volume van het in bewerking genomen monster (ml)MG = moleculair gewicht van de te bepalen stofd = optische weglengte van de cuvet  (cm)e = extinctiecoëfficiënt van NADH:bij Hg 340 nm: = 6,3 (mmol 1 · l · cm 1),bij Hg 334 nm: = 6,18 (mmol 1 · l · cm 1),bij Hg 365 nm: = 3,4 (mmol 1 · l · cm 1).Zo verkrijgt men voor D-malaat:Indien bij de voorbehandeling van het monster een verdunning  is uitgevoerd moet dit resultaat met de verdunningsfactor F worden vermenigvuldigd.  6.2. Herhaalbaarheid (r)   r = 0,05 xi.6.3. Reproduceerbaarheid (R)   R = 0,1 × xi.  xi = D-appelzuurgehalte in gram per liter.     21. TOTAAL  APPELZUUR 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Het appelzuur, dat geïsoleerd is met behulp van een anionenwisselaar, wordt colorimetrisch bepaald in het eluaat dank zij de geelkleuring die ontstaat door de reactie van appelzuur met zwavelzuur (96 %) en chromotroopzuur. De stoffen die zich in het  eluaat bevinden, storen echter deze reactie. Deze stoffen reageren echter, in tegenstelling tot appelzuur, ook met zwavelzuur van 86 % en chromotroopzuur. Om deze storing te elimineren is het daarom voldoende om van de extinctie die is verkregen na  reactie met chromotroopzuur en zwavelzuur van 96 %, de extinctie die is verkregen na reactie met chromotroopzuur en zwavelzuur van 86 %, af te trekken.2. APPARATUUR  2.1. Glazen buis met een lengte van ongeveer 250 mm en een inwendige diameter van 35 mm, voorzien van een kraan  2.2. Glazen buis met een lengte van ongeveer 300 mm en een inwendige diameter van 10-11 mm, voorzien van een kraan  2.3. Waterbad van 100 °C  2.4. Spectrofotometer, waarmee extinctiemetingen bij een golflengte van 420 nm kunnen worden uitgevoerd, en cuvetten met een optische weglengte van 10 mm3. REAGENTIA  3.1. Sterk basische anionenwisselaar (bij voorbeeld Merck III)  3.2. Natriumhydroxide 5 % (m/v)  3.3. Azijnzuur 30 % (m/v)  3.4. Azijnzuur 0,5 % (m/v)  3.5. Natriumsulfaatoplossing (Na2SO4) 10 % (m/v)  3.6. Zwavelzuur 95-97 % (m/m)  3.7. Zwavelzuur 86 % (m/m)  3.8. Chromotroopzuuroplossing 5 % (m/v)   Bereid deze oplossing pas vlak vóór elke bepaling door 500 mg natriumchromotropaat, C10H6O8S2Na2 · 2H2O, op te lossen in 10 ml gedestilleerd water.   3.9. Appelzuuroplossing, 0,5 g/l   Los 250 mg DL-appelzuur, C4H6O5, op in 500 ml natriumsulfaatoplossing 10 % (m/v) (3.5).4. WERKWIJZE  4.1. Bereiding van de ionenwisselaar   Plaats in een glazen buis van 35 × 250 mm boven de kraan een prop glaswol die bevochtigd is met gedestilleerd water. Giet in de buis van de ionenwisselaar, die in water in suspensie is gebracht, zodat boven het oppervlak van de ionenwisselaar zich een  vrije ruimte van 50 mm bevindt. Vul de buis met de natriumhydroxideoplossing 5 % nadat de ionenwisselaar is gespoeld met 1 000 ml gedestilleerd water, en laat de vloeistof tot 2-3 mm boven het oppervlak van de ionenwisselaar aflopen. Herhaal deze  handeling nog tweemaal en laat de ionenwisselaar één uur in contact staan met de vloeistof. Spoel de kolom met 1 000 ml gedestilleerd water. Vul de kolom vervolgens met de azijnzuuroplossing 30 %, laat de vloeistof tot 2-3 mm boven het oppervlak van de  ionenwisselaar aflopen, herhaal deze handeling nog tweemaal en laat de ionenwisselaar gedurende ten minste 24 uur in contact staan met de vloeistof voordat de kolom gebruikt wordt. Bewaar vervolgens de ionenwisselaar in de azijnzuuroplossing 30 % voor  latere bepalingen.4.2. Bereiding van de ionenwisselaarkolom   Plaats een prop glaswol in de glazen buis van 11 × 300 mm boven de kraan. Giet in de buis de ionenwisselaar die is bereid zoals is voorgeschreven in punt 4.1 tot een hoogte van 10 cm. Laat azijnzuuroplossing 30 % aflopen, door de kraan open te zetten,  tot ongeveer 2-3 mm boven het oppervlak van de ionenwisselaar. Was de ionenwisselaar met 50 ml azijnzuuroplossing 0,5 %.4.3. Isolering van DL-appelzuur   Giet op de ionenwisselaar, die is bereid zoals voorgeschreven in punt 4.2, 10 ml wijn of most. Laat de wijn druppelsgewijs (gemiddelde snelheid één druppel per seconde) aflopen tot ongeveer 2-3 mm boven het oppervlak van de ionenwisselaar. Spoel de  kolom eerst met ongeveer 50 ml azijnzuuroplossing 0,5 % en vervolgens met 50 ml gedestilleerd water; laat de vloeistof aflopen met dezelfde snelheid als bij de wijn.    Elueer de zuren die aan de ionenwisselaar zijn gebonden, met behulp van de natriumsulfaatoplossing 10 % met dezelfde snelheid als bij de voorgaande handelingen (één druppel per seconde). Vang het eluaat op in een maatkolf van 100 ml totdat precies 100  ml is opgevangen.    Men kan de ionenwisselaar regenereren volgens het voorschrift van punt 4.1.4.4. Bepaling van appelzuur   Neem twee wijdmondse reageerbuizen met ingeslepen stop van 30 ml""A" en ""B". Breng in elke buis 1,0 ml eluaat en 1,0 ml van de chromotroopzuuroplossing 5 %. Voeg aan buis ""A" 10,0 ml zwavelzuur 86 % (blanco) en aan buis""B" 10,0 ml zwavelzuur 96 %.  Sluit de buizen af met de stop en schud om een volkomen homogene oplossing te verkrijgen zonder hierbij de slijpstukken te bevochtigen. Dompel de buizen gedurende precies tien minuten in een van te voren aan de kook gebracht waterbad. Laat de buizen tot  20 °C afkoelen in het donker. Meet exact 90 minuten na het begin van de afkoeling de extinctie van buis ""B" tegen de blanco (buis ""A") bij een golflengte van 420 nm in de cuvetten met een optische weglengte van 10 mm.4.5. Opstellen van de ijkcurve   Pipetteer 5, 10, 15 en 20 ml DL-appelzuuroplossing (0,5 g/l) in maatkolven van 50 ml; vul aan tot de maatstreep met natriumsulfaatoplossing (10 %).    De op deze wijze bekomen oplossingen stemmen overeen met eluaten verkregen uit wijn met respectievelijk DL-appelzuurconcentraties van 0,5, 1,0, 1,5 en 2,0 g/l.    Ga verder zoals vermeld in punt 4.4.    De extinctiewaarden die zijn verkregen met deze ijkoplossingen en die een functie zijn van de overeenkomstige gehalten appelzuur, liggen op een lijn die door de oorsprong gaat.    Aangezien de intensiteit van de kleuring sterk afhangt van de concentratie zwavelzuur, is het bij elke serie metingen noodzakelijk na te gaan of de ijkcurve bij ten minste één punt klopt, ten einde een eventuele verandering van de concentratie  zwavelzuur aan te tonen.  5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN   Met behulp van de ijkcurve wordt het gehalte DL-appelzuur in gram per liter bepaald uit de gemeten extinctie van het eluaat. Dit gehalte wordt opgegeven met één decimaal. Herhaalbaarheid   Gehalte <  2 g/l : v = 0,1 g/l.Gehalte > 2 g/l : v = 0,2 g/l.Reproduceerbaarheid   R = 0,3 g/l.      22. SORBINEZUUR 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN  1.1. Spectrofotometrische bepaling in het UV-gebied   Sorbinezuur (2,4-hexadieenzuur) wordt door middel van waterdampdestillatie afgescheiden en in het destillaat door spectrofotometrie bepaald. Integrerende bestanddelen kunnen worden verwijderd door droogdampen van de oplossingen nadat die vooraf met  Ca(OH)2 licht alkalisch gemaakt werden. Concentraties lager dan 20 mg/l dienen bevestigd te worden aan de hand van een dunne laag chromatografie (gevoeligheid: 1 mg/l).1.2. Gaschromatografische bepaling   Het via extractie met di-ethylether verkregen sorbinezuur wordt gaschromatografisch bepaald met behulp van een interne standaard.1.3. Aantonen van sporen met behulp van dunne-laagchromatografie   Het via extractie met di-ethylether verkregen sorbinezuur wordt met behulp van dunne-laagchromatografie gescheiden, waarna een schatting van het gehalte plaatsvindt.2. SPECTROFOTOMETRISCHE  BEPALING  IN  HET  ULTRAVIOLET-GEBIED  2.1. Reagentia  2.1.1. Wijnsteenzuurkristallen, C4H6O6  2.1.2. Calciumhydroxideoplossing, Ca(OH)2, ongeveer 0,02 M  2.1.3. Referentiesorbinezuuroplossing van 20 mg/l   Los 20 mg sorbinezuur, C6H8O2, op in 2 ml natriumhydroxideoplossing ongeveer 0,1 M. Giet over in een maatkolf van 1 000 ml en vul met water aan tot de streep. In plaats hiervan kan ook 26,8 mg kaliumsorbaat, C6H7O2K, worden opgelost in water, waarna  tot 1 000 ml wordt aangevuld met water.2.2. Apparatuur  2.2.1. Stoomdestillatieopstelling Zie hoofdstuk 14. ""Vluchtige zuren"  2.2.2. Kokend-waterbad (100 °C)  2.2.3. Spectrofotometer, waarmee bij een golflengte van 256 nm metingen kunnen worden uitgevoerd met kwartscuvetten van 1 cm optische weglengte2.3. Werkwijze  2.3.1. Distillatie   Breng in de monsterhouder van de stoomdestillatieopstelling 10 ml wijn en voeg 1 à 2 g wijnsteenzuur (2.1.1) toe. Vang 250 ml destillaat op.2.3.2. IJklijn   Bereid door verdunning met water van de referentieoplossing (2.1.3) vier verdunde referentieoplossingen die een sorbinezuurgehalte hebben van respectievelijk 0,5, 1,0, 2,5 en 5 mg/l; meet met behulp van de spectrofotometer de respectievelijke  extincties bij 256 nm tegen gedestilleerd water. Zet de verkregen extincties uit tegen de bijbehorende concentraties van de oplossingen. De ijklijn is een rechte.2.3.3. Bepaling   Breng 5 ml destillaat in een indampschaal met een doorsnede van 55 mm, voeg 1 ml calciumhydroxideoplossing (2.1.2) toe. Damp droog op een kokend-waterbad.    Neem het residu op in enkele milliliters gedestilleerd water en breng dit kwantitatief over in een maatkolf van 20 ml en vul aan tot de streep met waswater. Meet met de spectrofotometer de extinctie bij 256 nm tegen een blanco, verkregen door 1 ml  calciumhydroxideoplossing (2.1.2) tot 20 ml aan te vullen met water.    Met behulp van de ijklijn wordt de concentratie C van de sorbinezuuroplossing bepaald uit de gemeten waarde van de extinctie.    Opmerking:In de praktijk is droogdampen overbodig. Men kan de meting van de absorbantie direct op een met gedestilleerd water 0,25 maal verdunde oplossing uitvoeren.2.4. Weergave van de resultaten  2.4.1. Berekening   Het sorbinezuurgehalte in wijn, uitgedrukt in milligram per liter, is dan:100 · C   C = sorbinezuurconcentratie van de spectrofotometrisch onderzochte oplossing, uitgedrukt in milligram per liter.3. GASCHROMATOGRAFISCHE  METHODE  3.1.Reagentia  3.1.1. Di-ethylether, (C2H5)2O, vers gedestilleerd  3.1.2. Interne standaardoplossingOplossing van undecaanzuur, C11H22O2, in ethanol 95 % (v/v) met een sterkte van 1 g/l.   3.1.3. Zwavelzuuroplossing, H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml), verdund 1/3 (v/v)3.2. Apparatuur  3.2.1. Gaschromatograaf, voorzien van vlamionisatiedetector en een roestvast stalen kolom (4 m × 1/8 inch vooraf behandeld met dimethyldichlorosilaan en gevuld met een stationaire fase, bestaande uit een mengsel van di-ethyleenglycolsuccinaat (5 %) en  fosforzuur (1 %) (DEGS-H3PO4) of uit een mengsel van di-ethyleenglycoladipaat (7 %) en fosforzuur (1 %) (DEGA-H3PO4), gebonden aan Gaschrom Q 80 100 mesh.    Voor de behandeling met dimethyldichlorosilaan laat men een oplossing van 2 à 3 g DMDCS in tolueen door de kolom lopen. Hierna wordt onmiddellijk met methanol gespoeld en wordt N2 door de kolom geblazen, dan hexaan, en wederom N2. Daarna kan de kolom  gevuld worden.    Werkomstandigheden- Oventemperatuur: 175 °C.- Injectie- en detectietemperatuur: 230 °C.  - Draaggas: stikstof (snelheid ongeveer 20 ml/min.).   3.2.2. Injectiespuit van 10 µl, onderverdeeld in 0,1 µl   Opmerking:Andere kolomtypes, vooral een capillaire kolom (bij voorbeeld FFAP), kunnen eveneens een goede scheiding verzekeren.    De hierna beschreven werkwijze is als voorbeeld bedoeld.3.3. Werkwijze  3.3.1. Voorbehandeling van het monster   Breng 20 ml wijn in een reageerbuis met ingeslepen stop met een inhoud van ongeveer 40 ml, voeg 2 ml interne standaardoplossing (3.1.2) toe en 1 ml verdund zwavelzuur (3.1.3). Voeg, na herhaaldelijk omzwenken, 10 ml di-ethylether (3.1.1) toe. Extraheer  het sorbinezuur in de organische fase door de buis gedurende vijf minuten te schudden. Laat de fasen zich scheiden.3.3.2. Voorbehandeling van de referentieoplossing   Selecteer een wijn, waarvan het chromatogram van het etherextract geen enkele piek vertoont met de retentietijd van sorbinezuur; voeg aan deze wijn sorbinezuur toe tot een gehalte van 100 mg/l. Neem 20 ml van de aldus behandelde wijn verder in  bewerking volgens de in punt 3.3.1 beschreven werkwijze.3.3.3. Chromatografie   Injecteer met de injectiespuit achtereenvolgens 2 µl van de etherfase verkregen in punt 3.3.2 en 2 µl van de etherfase verkregen in punt 3.3.1. Registreer de respectievelijke chromatogrammen; ga na of de respectievelijke retentietijden van sorbinezuur  en de interne standaard gelijk zijn. Meet de hoogte (of het oppervlak) van elk der geregistreerde pieken.3.4. Weergave van de resultaten  3.4.1. Berekening   Het sorbinezuurgehalte van de onderzochte wijn, uitgedrukt in milligram per liter, is gelijk aan:H = piekhoogte van sorbinezuur in de referentieoplossingh = piekhoogte van sorbinezuur in het onderzochte monsterI = piekhoogte van de interne standaard in  de referentieoplossingi = piekhoogte van de interne standaard in het onderzochte monster.    Opmerking:Uitgaande van de respectievelijke piekoppervlakken kan het sorbinezuurgehalte op dezelfde wijze worden bepaald.4. AANTONEN VAN SPOREN MET BEHULP VAN DUNNE-LAAGCHROMATOGRAFIE4.1. Reagentia  4.1.1. Di-ethylether, (C2H5)2O   4.1.2. Zwavelzuuroplossing, H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml), verdund 1/3 (v/v)  4.1.3. Referentieoplossing van ongeveer 20 mg/l sorbinezuur in een ethanolwateroplossing van 10 % ethanol (v/v)  4.1.4. Loopvloeistof Hexaan, C6H14; pentaan, C5H12; azijnzuur, CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml) (20:20:3).4.2. Apparatuur  4.2.1. Gebruiksklare dunne-laagplaten, 20 × 20 cm, bedekt met polyamide (laagdikte 0,15 mm), waaraan een fluorescentie-indicator is toegevoegd.   4.2.2. Ontwikkeltank  4.2.3. Micropipet of injectiespuit, waarmee volumes van 5 µl tot op 0,1 µl nauwkeurig kunnen worden gedoseerd  4.2.4. Ultraviolet-lamp (254 nm)4.3. Werkwijze  4.3.1.Voorbehandeling van het monster   Breng 10 ml wijn in een reageerbuis met ingeslepen stop met een inhoud van ongeveer 25 ml. Voeg 1 ml verdund zwavelzuur (4.1.2) toe en 5 ml di-ethylether (4.1.1). Schud door herhaaldelijk omzwenken. Laat de fasen zich scheiden.4.3.2. Bereiding van  verdunde referentieoplossingen   Bereid door verdunning van de referentieoplossing (4.1.3) vijf verdunde referentieoplossingen met respectievelijk 2, 4, 6, 8 en 10 mg/l sorbinezuur.4.3.3. Chromatografie   Breng op 2 cm van de onderkant van de plaat met behulp van de micropipet of de injectiespuit 5 µl van de etherfase verkregen in punt 4.3.1 en 5 µl van elk van de verdunde referentieoplossingen verkregen in punt 4.3.2 aan, waarbij een onderlinge afstand  wordt aangehouden van 2 cm.    Breng zo veel loopvloeistof (4.1.4) in de ontwikkeltank dat een laag van ongeveer 0,5 cm ontstaat en laat de atmosfeer in de ontwikkeltank zich verzadigen met de damp van de loopvloeistof. Plaats een dunne-laagplaat in de ontwikkeltank. Laat de  loopvloeistof opstijgen tot een afstand van 12 à 15 cm is afgelegd (dit duurt ongeveer 30 minuten). Droog de dunne-laagplaat in een koude luchtstroom. Bekijk het chromatogram onder een ultraviolet-lamp bij 254 nm.    Sorbinezuur wordt tegen een geel-fluorescerende achtergrond van de dunne-laagplaat zichtbaar als donkerviolette vlekken.4.4. Weergave van de resultaten   Door vergelijking van de intensiteit van de vlek van het monster met de vlekken van de verdunde referentieoplossingen kan een semi-kwantitatieve schatting worden gemaakt van het sorbinezuurgehalte tussen 2 en 10 mg/l. Door 10 µl van het monster op te  brengen kan een gehalte van 1 mg/l worden bepaald. Gehalten boven 10 mg/l kunnen worden bepaald door een volume op te brengen dat lager is dan 5 µl (af te meten met behulp van een injectiespuit).     23. L-ASCORBINEZUUR 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN   Met de voorgestelde methoden kan het in wijn of most aanwezige L-ascorbinezuur en dehydroascorbinezuur worden bepaald.1.1. Referentiemethode (fluorimetrie)   L-ascorbinezuur wordt met actieve kool geoxideerd tot dehydroascorbinezuur. Deze verbinding vormt met o-fenyleendiamine (OPDA) een fluorescerende verbinding. In aanwezigheid van boorzuur kan met behulp van een blanco de nevenfluorescentie worden  bepaald (vorming van een boorzuur/dehydroascorbinezuur-complex) en hieruit kan het gehalte fluorimetrisch worden afgeleid.1.2.Gebruikelijke methode (colorimetrie)   L-ascorbinezuur wordt met jodium geoxideerd tot dehydroascorbinezuur hetgeen met 2,4-dinitrofenylhydrazine wordt neergeslagen als bis(2,4-dinitrofenylhydrazon). Na dunne-laagchromatografische scheiding en oplossing in azijnzuur wordt deze roodgekleurde  verbinding colorimetrisch bepaald bij 500 nm.2. REFERENTIEMETHODE  2.1. Reagentia  2.1.1. O-fenyleendiamine-dihydrochlorideoplossing, C6H10N2Cl2, 0,02 % (v/v), vers bereid  2.1.2. Natriumacetaat-trihydraatoplossing, CH3COONa · 3H2O, 500 g/l  2.1.3. Mengoplossing van boorzuur en natriumacetaatLos 3 g boorzuur, H3BO3, op in 100 ml natriumacetaatoplossing (2.1.2). Deze oplossing moet vers worden bereid.   2.1.4. Azijnzuuroplossing, CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml), verdund tot 56 % (v/v), op pH 1,2 gebracht  2.1.5. Referentie-oplossing van L-ascorbinezuur, 1 g/lLos vlak voor het gebruik 50 mg L-ascorbinezuur, C6H8O6, dat van tevoren in het donker is gedroogd in een exsiccator, op in 50 ml azijnzuuroplossing (2.1.4).   2.1.6. Actieve kool p. a. (10) Breng in een Erlenmeyer van 2 l 100 g actieve kool, voeg toe 500 ml zoutzuuroplossing (HCl, r20 = 1,19 g/ml) 10 % (v/v). Breng aan de kook en filtreer over een glasfilter met porositeit 3. Breng de aldus behandelde actieve  kool over in een Erlenmeyer van 2 l, voeg 1 l water toe, schud en filtreer over een glasfilter met porositeit 3. Herhaal deze wasprocedure twee keer. Breng het residu over in een op 115 ± 5 °C ingestelde droogstoof gedurende twaalf uur (bij voorbeeld  overnacht).2.2. Apparatuur  2.2.1. FluorimeterGebruik een spectrofluorimeter voorzien van een lamp met continu spectrum en zet de lamp aan op minimaal vermogen. De optimale excitatie- en emissiegolflengten voor het monster dienen van tevoren te worden bepaald. Deze zijn  afhankelijk van het gebruikte apparaat. Als indicatie kan dienen dat de excitatiegolflengte in de buurt van 350 nm ligt en de emissiegolflengte in de buurt van 430 nm. Cuvetten met een optische weglengte van 1 cm.    2.2.2. Glasfilter met porositeit 3  2.2.3. Reageerbuizen (met een diameter van ongeveer 10 mm)  2.2.4. Schudapparaat voor de reageerbuizen2.3. Werkwijze  2.3.1. Voorbehandeling van het monster wijn of most   Neem een zodanige hoeveelheid wijn of most in bewerking dat, bij aanvulling in een maatkolf van 100 ml met azijnzuuroplossing 56 % (2.1.4), een oplossing wordt verkregen waarvan het L-ascorbinezuurgehalte ligt tussen 0 en 60 mg/l. Homogeniseer de  inhoud van de maatkolf door schudden. Voeg 2 g actieve kool (2.1.6) toe en laat dit gedurende 15 minuten inwerken onder af en toe omschudden. Filtreer over een gewoon papierfilter en doe de eerste milliliters filtraat weg.    Breng in twee maatkolven van 100 ml 5 ml filtraat en respectievelijk 5 ml mengoplossing boorzuur/natriumacetaat (2.1.3) en 5 ml natriumacetaatoplossing (2.1.2). Laat gedurende 15 minuten inwerken onder af en toe omschudden en vul aan tot 100 ml met  gedestilleerd water. Neem 2 ml van de inhoud van elke kolf verder in bewerking, voeg 5 ml o-fenyleendiamineoplossing (2.1.1) toe en schud; laat gedurende 30 minuten in het donker reageren en voer vervolgens de spectrofluorimetrische bepaling uit.2.3.2.  IJklijn   Breng in 3 maatkolven van 100 ml respectievelijk 2, 4 en 6 ml van de referentieoplossing van L-ascorbinezuur (2.1.5), vul aan tot 100 ml met azijnzuuroplossing (2.1.4) en homogeniseer door schudden. De aldus bereide oplossingen bevatten respectievelijk  2, 4 en 6 mg per 100 ml L-ascorbinezuur.    Voeg aan elk van deze maatkolven 2 g actieve kool (2.1.6) toe en laat dit gedurende 15 minuten inwerken onder af en toe omschudden. Filtreer over een gewoon papierfilter en doe de eerste milliliters filtraat weg. Breng van elk van deze drie aldus  verkregen filtraten 5 ml in drie maatkolven van 100 ml (eerste serie), herhaal dit bij een tweede serie van drie maatkolven. Voeg aan elk van de maatkolven uit de eerste serie (overeenkomend met de blanco) 5 ml mengoplossing boorzuur/natriumacetaat  (2.1.3) toe en aan elk van de maatkolven uit de tweede serie 5 ml natriumacetaatoplossing (2.1.2).    Laat gedurende 15 minuten inwerken onder af en toe omschudden en vul aan tot 100 ml met gedestilleerd water. Neem 2 ml van de inhoud van elke maatkolf verder in bewerking, voeg 5 ml o-fenyleendiamineoplossing (2.1.1) toe en schud; laat gedurende 30  minuten in het donker reageren en voer vervolgens de spectrofluorimetrische bepaling uit.2.3.3. Fluorimetrische bepaling   Stel voor elke oplossing, gemaakt ten behoeve van de ijklijn, en voor de monsteroplossing het nulpunt in met behulp van de overeenkomstige blanco-oplossing. Meet vervolgens de fluorescentie-intensiteit van elke ijklijnoplossing.    Stel de ijkcurve op; deze moet lineair zijn en door het nulpunt gaan. Uit de gemeten relatieve waarde van de fluorescentie-intensiteit van het monster wordt met behulp van deze rechte de concentratie C van de onderzochte oplossing aan L-ascorbinezuur  en dehydroascorbinezuur bepaald.2.3.4. Weergave van de resultaten   Het gehalte aan L-ascorbinezuur en dehydroascorbinezuur in wijn, uitgedrukt in milligram per liter, is:C · F    F = verdunningsfactor.3. GEBRUIKELIJKE  METHODE  (COLORIMETRIE)  3.1. Reagentia  3.1.1. Metafosforzuuroplossing 30 % (m/v)Wrijf enige stukken verglaasd metafosforzuur, (HPO3)n, fijn in een vijzel en weeg hiervan 30 g af. Was het fijngewreven metafosforzuur door onder schudden snel te overgieten met gedestilleerd water. Los het  gewassen metafosforzuur onder schudden op in gedestilleerd water in een maatkolf van 100 ml en vul aan tot de streep. De verkregen oplossing bevat een bekende hoeveelheid, ongeveer 30 g, metafosforzuur per 100 ml.   3.1.2. Metafosforzuuroplossing 3 % (m/v), direct voor gebruik te bereiden door de oplossing in punt 3.1.1 1 tot 10 te verdunnen met gedestilleerd water  3.1.3. Metafosforzuuroplossing 1 % (m/v), direct voor gebruik te bereiden door de oplossing in punt 3.1.1 1 tot 30 te verdunnen met gedestilleerd water  3.1.4. PolyamidesuspensieLaat een mengsel van 10 g polyamidepoeder voor chromatografische doeleinden en 60 ml gedestilleerd water gedurende twee uur staan. Deze hoeveelheid is voldoende voor vier bepalingen.   3.1.5. Thioureum, H2NCSNH2  3.1.6. Jodiumoplossing, I2, 0,05 M  3.1.7. 2,4-dinitrofenylhydrazineoplossing 6 % (m/v)   Suspendeer 6 g 2,4-dinitrofenylhydrazine, C6H6N4O4, in 50 ml ijsazijn (r20 = 1,05 g/ml), voeg toe 50 ml zwavelzuur (r20 = 1,05 g/ml). Het 2,4-dinitrofenylhydrazine gaat bij schudden in oplossing.   3.1.8. Ethylacetaat, C4H8O2, waaraan 2 % (v/v) ijsazijn (3.1.12) is toegevoegd  3.1.9. Chloroform, CHCl3  3.1.10. Waterige oplossing van amidon van 0,5 per 100 (m/v)     3.1.11. LoopvloeistofEthylacetaat (3.1.8)50 delenChloroform (3.1.9)60 delenIJsazijn (3.1.12) 5 delen.    Bereid de loopvloeistof twaalf uur vóór gebruik.   3.1.12. IJsazijn, CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml)  3.1.13. Oplossing van 0,1 g/100 ml van L-ascorbinezuur in metafosforzuuroplossing 1 % (m/v) (3.1.3)3.2. Apparatuur  3.2.1. Laboratoriumcentrifuge met centrifugebuizen van 50 ml inhoud en voorzien van slijpstukken  3.2.2. Waterbad, gethermostateerd tussen 5 en 10 °C  3.2.3. Waterbad, gethermostateerd op 20 °C  3.2.4. Gebruiksklare dunne-laagplaten, 20 × 20 cm, bedekt met kiezelgel G (laagdikte 0,25 of 0,30 mm)   3.2.5. Ontwikkeltank  3.2.6. Micropipet waarmee volumes van 0,2 ml kunnen worden gedoseerd  3.2.7. Spectrofotometer waarmee bij een golflengte van 500 nm absorptiemetingen kunnen worden uitgevoerd met cuvetten van 1 cm optische weglengte3.3. Werkwijze  3.3.1. Oxidatie van L-ascorbinezuur tot dehydroascorbinezuur   Breng in een maatkolf van 100 ml 50 ml wijn, voeg hieraan toe 15 ml polyamidesuspensie (3.1.4) en vul aan tot de streep met metafosforzuuroplossing 3 % (3.1.2). Laat gedurende één uur onder regelmatig omschudden staan en filtreer over een vouwfilter.  Breng 20 ml filtraat in een centrifugebuis, voeg 1 ml jodiumoplossing 0,05 M (3.1.6) toe. Meng de afgesloten centrifugebuis door te schudden en neem na één minuut de overmaat jodium weg door toevoeging van ongeveer 25 mg thioureum.3.3.2. Vorming en  extractie van het bis(2,4-dinitrofenylhydrazon) van diketogulonzuur   Plaats de centrifugebuis in een waterbad tussen 5 en 10 °C en voeg 4 ml 2,4-dinitrofenylhydrazineoplossing (3.1.7) toe. Meng de inhoud van de centrifugebuis zorgvuldig en vermijd daarbij bevochtiging van het slijpstuk. Plaats vervolgens de goed  gesloten centrifugebuis gedurende 16 uur in een waterbad van 20 °C (bij voorbeeld overnacht).    Voeg aan de centrifugebuis 15 ml ethylacetaat (3.1.8) toe. Sluit de centrifugebuis af met het slijpstuk en schud krachtig gedurende 30 seconden; centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 350 à 400 g. Pipetteer 10 ml van de ethylacetaatfase af  in een Erlenmeyer met slijpstuk. Voeg 5 ml ethylacetaat (3.1.8) toe aan de centrifugebuis en sluit deze. Schud opnieuw krachtig gedurende 30 seconden en centrifugeer gedurende vijf minuten bij dezelfde snelheid. Pipetteer 5 ml van de ethylacetaatfase af  en voeg deze bij de 10 ml van de eerste extractie in de Erlenmeyer. Homogeniseer dit door te schudden.3.3.3. Dunne-laagchromatografische scheiding van het bis(2,4-dinitrofenylhydrazon) Dit moet gebeuren binnen twee uur na de extractie (3.3.2).    Breng 0,2 ml ethylacetaatextract op langs de hele startlijn van een dunne-laagplaat, waarbij aan de onderkant en de zijkanten 2 cm ruimte wordt aangehouden. Breng een laag van ongeveer 1 cm loopvloeistof (3.1.11) in de ontwikkeltank en laat de  atmosfeer in de ontwikkeltank zich verzadigen met de damp van de loopvloeistof. Plaats de dunne-laagplaat in de tank, laat de loopvloeistof tot de bovenrand van de plaat lopen. Droog de plaat gedurende één uur onder afzuiging. Schraap met een spatel,  loodrecht op de looprichting, de roodgekleurde zone af (karakteristiek voor het 2,4-dinitrofenylhydrazon). Vang het afschraapsel op op een glad stuk papier en breng dit kwantitatief over in een Erlenmeyer met slijpstuk, voeg 4 ml ijsazijn (3.1.12) toe.  Laat 30 minuten staan onder herhaaldelijk omschudden. Filtreer over een klein vouwfilter direct in een cuvet met 10 mm optische weglengte (3.2.7). Het verkregen filtraat moet helder zijn. Meet de extinctie van de oplossing tegen azijnzuur (3.1.12) als  blanco bij 500 nm.3.3.4. IJklijn   Pipetteer in drie maatkolven van 100 ml respectievelijk 5, 10 en 15 ml van de L-ascorbinezuuroplossing (3.1.12), vul aan tot de streep met metafosforzuuroplossing 1 % (3.1.3). De aldus verkregen oplossingen bevatten een L-ascorbinezuurgehalte van  respectievelijk 50, 100 en 150 mg/l.    Neem 50 ml van elk van deze oplossingen in bewerking volgens de werkwijze beschreven in de punten 3.3.1, 3.3.2 en 3.3.3. Stel de ijklijn op, deze moet lineair zijn en door het nulpunt gaan.3.3.5. Weergave van de resultaten   Het gehalte aan L-ascorbinezuur en dehydroascorbinezuur in wijn wordt uitgedrukt in milligram per liter.  3.3.5.1. Berekening   Uit de volgens punt 3.3.3 gemeten extinctiewaarde wordt met behulp van deze rechte de concentratie van de onderzochte oplossing aan L-ascorbinezuur en dehydroascorbinezuur bepaald.    Opmerking:Indien het gehalte aan L-ascorbinezuur en dehydroascorbinezuur hoger is dan 150 mg/l, dan kan de in bewerking genomen hoeveelheid wijnmonster worden verlaagd naar 25, 20 of 10 ml. Het gevonden resultaat moet dan met de verdunningsfactor F  worden vermenigvuldigd.     24. pH 1. PRINCIPE   Het potentiaalverschil wordt gemeten tussen twee elektroden die in de te onderzoeken vloeistof zijn gedompeld. Eén van deze elektroden heeft een potentiaal die een functie is van de pH van de vloeistof, de andere elektrode is de referentie-elektrode,  die een vaste en bekende potentiaal heeft.2. APPARATUUR  2.1. pH-meter, in pH-eenheden geijkt, waarmee metingen tot op 0,05 eenheden nauwkeurig kunnen worden uitgevoerd  2.2. Elektroden  2.2.1. Glaselektrode, te bewaren in gedestilleerd water  2.2.2. Calomel referentie-elektrode, verzadigd met kaliumchloride, te bewaren in een verzadigde oplossing van kaliumchloride  2.2.3. Gecombineerde elektrode, te bewaren in gedestilleerd water3. REAGENTIA  3.1. Bufferoplossingen  3.1.1. Verzadigde oplossing van kaliumwaterstoftartraatDeze oplossing bevat ten minste 5,7 g/l kaliumwaterstoftartraat, C4H5O6K, bij 20 °C. De oplossing is door toevoeging van 0,1 g thymol per 200 ml twee maanden houdbaar.   pH   3,57 bij 20 °CpH   3,56 bij 25 °CpH   3,55 bij 30 °C 3.1.2. Kaliumwaterstofftalaatoplossing 0,05 MDeze oplossing bevat 10,211 g/l kaliumwaterstofftalaat (C8H5O4K) bij 20 °C.Maximale houdbaarheid: twee maanden.pH   3,999 bij 15 °CpH  4,003 bij 20 °CpH   4,008 bij 25 °CpH   4,015 bij 30 °C  3.1.3. Oplossing bestaande uit:  Kaliumdiwaterstoffosfaat, KH2PO43,402 gDikaliumwaterstoffosfaat, K2HP44,354 gWater tot1   l Maximale houdbaarheid: twee maanden.pH   6,90 bij 15 °CpH   6,88 bij 20 °CpH   6,86 bij 25 °CpH   6,85 bij 30 °C   Opmerking:Referentiebufferoplossingen die door de handel worden geleverd kunnen eveneens worden gebruikt.  4. WERKWIJZE  4.1. Voorbehandeling van het monster  4.1.1. Most en wijn   Voer de bepaling direct op de most of de wijn uit.4.1.2. Gerectificeerde geconcentreerde most   Verdun de gerectificeerde geconcentreerde most met water om een oplossing te verkrijgen die 25 ± 0,5 % (m/m) aan totaal suikers bevat (25 °Brix).    Indien P het totale suikergehalte is in % (m/m) van de gerectificeerde geconcentreerde most, weeg dan een hoeveelheid af gelijk aanen vul aan met water tot 100 g. Het gebruikte water moet een geleidend vermogen bezitten dat lager is dan 2  microsiemens/cm.4.2. Nulpuntsinstelling van de pH-meter   De nulpuntsinstelling moet voor elke meting worden uitgevoerd volgens de bij de pH-meter behorende gebruiksaanwijzing.4.3. IJking van de pH-meter   Dompel de elektrode vervolgens in de bufferoplossing pH 6,88 en 3,57, gemeten bij 20 °C, en stel bij die temperatuur de uitlezing van de pH-meter op deze waarde in.    Gebruik de bufferoplossing pH 4,00 bij 20 °C om de uitlezing te controleren.4.4. Meting   Dompel de elektrode in het monster, dat een temperatuur dient te hebben tussen 20 en 25 °C en wel zo dicht mogelijk bij 20 °C. Lees op de schaal direct de pH-waarde af.    Verricht ten minste twee bepalingen in hetzelfde monster.    Neem als resultaat het rekenkundige gemiddelde van beide bepalingen.5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN   De pH van wijn, most of van de tot op 25 % (m/m) (25 °Brix) verdunde gerectificeerde geconcentreerde most wordt opgegeven met twee decimalen.     25. ZWAVELDIOXIDE 1. DEFINITIES   Onder zwaveldioxide wordt verstaan het in wijn of most aanwezige zwaveldioxide in de volgende vormen: H2SO3, HSO3 , waarvan het evenwicht een functie is van de pH en de temperatuur:H2SO3  H+ + HSO3 H2SO3 stelt het moleculaire zwaveldioxide voor.    Onder totaal zwaveldioxide wordt verstaan het totaal van de verschillende vormen van zwaveldioxide aanwezig in wijn in vrije of gebonden toestand.2. VRIJ  EN  TOTAAL  ZWAVELDIOXIDE  2.1. Principe van de methoden  2.1.1. Referentiemethode  2.1.1.1. Wijn en most   Het zwaveldioxide wordt met een stroom lucht of stikstof uit de wijn verwijderd; het wordt opgevangen en geoxideerd door het te laten borrelen door een verdunde en geneutraliseerde oplossing van waterstofperoxide. Het gevormde zwavelzuur wordt bepaald  met een gestelde natriumhydroxideoplossing. Het vrije zwaveldioxide wordt uit wijn geëxtraheerd in de koude (10 °C).   Het totale zwaveldioxide wordt uit wijn geëxtraheerd bij ongeveer 100 °C.2.1.1.2. Gerectificeerde geconcentreerde most   Het totale zwaveldioxide wordt uit de van tevoren verdunde gerectificeerde geconcentreerde most geëxtraheerd bij ongeveer 100 °C.2.1.2. Screeningmethode   Het vrije zwaveldioxide wordt bepaald door een directe jodometrische titratie.    Het gebonden zwaveldioxide wordt vervolgens, na een alkalische hydrolyse, bepaald door een jodometrische titratie. Het totale zwaveldioxide wordt verkregen door het vrije en het gebonden zwaveldioxide op te tellen.2.2. Referentiemethode  2.2.1. Apparatuur  2.2.1.1. De te gebruiken opstelling moet, vooral voor wat betreft de koeler, overeenkomen met de hieronder afgebeelde opstelling.      Fig. 1De afmetingen zijn opgegeven in millimeters. De inwendige doorsnede van de vier concentrische buizen van de koeler is respectievelijk 45, 34, 27 en 10 mm.     Het einde van de gasinleidbuis in het opvangvat B bestaat uit een kleine bol van 1 cm diameter die op de grootste horizontale cirkel is voorzien van 20 gaatjes van 0,2 mm doorsnede. In plaats hiervan kan ook een glasfritplaatje worden gebruikt,  waardoor een groot aantal kleine belletjes worden gevormd zodat een goed contact tussen de gasfase en de vloeibare fase wordt verwezenlijkt.    De hoeveelheid door de opstelling stromend gas moet ongeveer 40 l/uur bedragen. De gaswasfles rechts van het opvangvat moet de door de waterstraalpomp veroorzaakte onderdruk beperken tot 20 à 30 cm water. Om deze onderdruk zodanig te kunnen regelen dat  de hoeveelheid door de opstelling stromend gas zo nauwkeurig mogelijk 40 l/uur bedraagt, is het nuttig tussen het opvangvat en de gaswasfles een stromingsmeter met halfcapillaire buis te plaatsen.   2.2.1.2. Microburet2.2.2. Reagentia  2.2.2.1. Fosforzuur, H3PO4, (r20 = 1,71 g/ml) 85 % (v/v)  2.2.2.2. Waterstofperoxideoplossing, 9,1 g H2O2 per liter (""3 volume")  2.2.2.3. Indicatoroplossing  Methylrood100 mgMethyleenblauw 50 mgEthanol 50 % vol100 ml.   2.2.2.4. Natriumhydroxideoplossing, NaOH, 0,01 M  2.2.3. Werkwijze  2.2.3.1. Bepaling van vrij zwaveldioxide   De wijn moet gedurende twee dagen in een volle en afgesloten fles bij 20 °C worden bewaard vóór de bepaling plaatsvindt.Breng 2 à 3 ml waterstofperoxideoplossing (2.2.2.2) en twee druppels indicatoroplossing (2.2.2.3) in het opvangvat B en neutraliseer  de waterstofperoxide met 0,01 M natriumhydroxideoplossing (2.2.2.4). Sluit het opvangvat aan aan de opstelling.Pipetteer in kolf A van 250 ml van de opstelling 50 ml monster en verbindt de kolf met de opstelling. Voeg 15 ml fosforzuur (2.2.1.1) toe.Laat  vervolgens gedurende 15 minuten lucht of stikstof doorborrelen. Het vrije zwaveldioxide wordt opgevangen in het opvangvat B en geoxideerd tot zwavelzuur. Verwijder het opvangvat van de opstelling en titreer het gevormde zuur met 0,01 M  natriumhydroxideoplossing (2.2.2.4). Het aantal verbruikte milliliters zij n.2.2.3.2. Weergave van de resultaten   Het gehalte aan vrije zwaveldioxide wordt uitgedrukt in milligram per liter, zonder decimalen.   2.2.3.2.1. Berekening   Vrij zwaveldioxide in milligram per liter: 6,4 · n.2.2.3.3. Bepaling van totaal zwaveldioxide  2.2.3.3.1. In gerectificeerde geconcentreerde most:    Gebruik de oplossing verkregen door het monster te verdunnen tot 40 % (m/v), zoals aangegeven in punt 5.1.2 van hoofdstuk 13. ""Totaal zuur". Pipetteer in kolf A van 250 ml van de opstelling 50 ml van deze oplossing en verbindt de kolf met de  opstelling. Voeg 5 ml fosforzuur (2.2.2.1) toe.   2.2.3.3.2. In wijn en most:     Geschat gehalte aan totaal zwaveldioxide in het monster is E 50 mg/l SO2.    Pipetteer in kolf A van 250 ml van de opstelling 50 ml monster en 15 ml fosforzuur (2.2.2.1). Verbind de kolf met de opstelling.    Uiterlijk tot en met 31 december 1992 gebruikt men voor de bepaling van het zwaveldioxydegehalte van druivesap echter 5 ml fosforzuur (2.2.2.1) verdund tot 25 % (m/v).   2.2.3.3.3. Geschat gehalte aan totaal zwaveldioxide in het monster is F 50 mg/l SO2. Pipetteer in kolf A van 100 ml van de opstelling 20 ml monster en verbind de kolf met de opstelling. Voeg 5 ml fosforzuur (2.2.2.1) toe.    Breng 2 à 3 ml waterstofperoxideoplossing (2.2.2.2) in het opvangvat B, neutraliseer zoals aangegeven en breng de wijn in kolf A met een kleine vlam van 4 à 5 cm hoogte, die de bodem van de kolf moet raken, aan de kook. Plaats geen metaalgaas onder de  kolf, maar laat deze rusten op een schijf met een opening van 30 mm diameter. Hierdoor wordt overmatige verhitting van de extractiestoffen van de wijn aan de wand van de kolf voorkomen.    Houd de vloeistof aan de kook tijdens het doorleiden van lucht of stikstof. In 15 minuten is het totale zwaveldioxide meegevoerd en geoxideerd. Bepaal het gevormde zwavelzuur door titratie met 0,01 M natriumhydroxideoplossing (2.2.2.4).    Het verbruikte aantal milliliters zij n.2.2.3.4. Weergave van de resultaten   Het zwaveldioxidegehalte wordt uitgedrukt in milligram per liter respectievelijk in milligram per kilogram totaal suiker, zonder cijfers na de komma.   2.2.3.4.1. Berekening   Wijn en mostTotaal zwaveldioxide in milligram per liter:- monsters arm aan zwaveldioxide (50 ml monster,):  6,4 · n- andere monsters (20 ml monster,):  16 · n.    Gerectificeerde geconcentreerde mostZwaveldioxide in milligram per kilogram totaal suiker (50 ml volgens punt 2.2.3.3.1 voorbehandeld monster):P = totaal suikergehalte in % (m/m).   2.2.3.4.2. Herhaalbaarheid (r)Gehalte <  50 mg/l (50 ml monster), r = 1 mg/l.Gehalte > 50 mg/l (20 ml monster), r = 6 mg/l.   2.2.3.4.3. Reproduceerbaarheid (R)Gehalte <  50 mg/l (50 ml monster), R = 9 mg/l.Gehalte > 50 mg/l (20 ml monster), R = 15 mg/l.2.3. Screeningmethode  2.3.1. Reagentia  2.3.1.1. EDTA (Complexon III): dinatriumzout van ethyleendiamine-tetra-azijnzuur (C10H14O8N2Na2.2H2O)   2.3.1.2. Natriumhydroxideoplossing, NaOH, 4 M (160 g/l)  2.3.1.3. Zwavelzuuroplossing, H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml), 1 tot 10 verdund  2.3.1.4. Stijfseloplossing van 5 g/l   Meng 5 g stijfsel met ongeveer 500 ml water. Breng al roerend aan de kook en laat gedurende tien minuten doorkoken; voeg 200 g natriumchloride, NaCl, toe. Vul na afkoelen aan tot 1 l.   2.3.1.5. Jodiumoplossing, I2, 0,025 M2.3.2. Hulpmiddelen  2.3.2.1. Erlenmeyers van 500 ml  2.3.2.2. Buret  2.3.2.3. Pipetten van 1, 2, 5 en 50 ml2.3.3. Werkwijze  2.3.3.1.Vrij zwaveldioxide   Breng in een Erlenmeyer van 500 ml:- 50 ml wijn,- 5 ml stijfseloplossing (2.3.1.4),- 30 mg EDTA (2.3.1.1),- 3 ml zwavelzuuroplossing, 1 tot 10 verdund (V/V) (2.3.1.3).    Titreer direct met 0,025 M jodiumoplossing (2.3.1.5) tot de blauwkleuring gedurende 10 à 15 seconden aanhoudt. Het verbruikte aantal milliliters jodiumoplossing zij n.2.3.3.2. Zwaveldioxide   Voeg 8 ml 4 M natriumhydroxideoplossing (2.3.1.2) toe, schud om en laat vijf minuten staan. Voeg vervolgens onder krachtig omschudden in één keer uit een klein bekerglas toe 10 ml zwavelzuuroplossing, 1 tot 10 verdund (2.3.1.3). Titreer direct met  0,025 M jodiumoplossing (2.3.1.5). Het verbruikte aantal milliliters jodiumoplossing zij n2.    Voeg 20 ml 4 M natriumhydroxideoplossing (2.3.1.2) toe, laat vijf minuten staan na één keer krachtig te hebben geschud. Verdun met 200 ml zo koud mogelijk water. Voeg onder krachtig omschudden in één keer uit een reageerbuis 30 ml zwavelzuuroplossing,  1 tot 10 verdund (2.3.1.3), toe. Titreer het vrijgemaakte zwaveldioxide met 0,025 M jodiumoplossing (2.3.1.5). Het verbruikte aantal milliliters jodiumoplossing zij n".2.3.4.Weergave van de resultaten  2.3.4.1. Berekening   Vrij zwaveldioxide in milligram per liter: 32 · n.Totaal zwaveldioxide in milligram per liter: 32 · (n + n2 + n").    Opmerkingen:1. Voor rode wijn, arm aan zwaveldioxide, kan in plaats van de jodiumoplossing 0,025 M een meer verdunde oplossing worden gebruikt, bij voorbeeld 0,01 M. Vervang in dat geval de coëfficiënt 32 in bovenstaande formule door 12,8.  2. Om bij rode wijn het eindpunt van de titratie vast te stellen verdient het aanbeveling de wijn van onderen te belichten met geel licht, verkregen met een gewone elektrische lamp en een kaliumchromaatoplossing als filter of met een natriumlamp. Er  moet dan in een donkere kamer worden gewerkt. Het eindpunt van de titratie is bereikt indien de wijn in het doorschijnende licht ondoorschijnend wordt.3. Indien de gevonden hoeveelheid zwaveldioxide de wettelijke grens nadert of zelfs overschrijdt moet  de bepaling van het totale zwaveldioxide met de referentiemethode worden uitgevoerd.4. Indien bijzonder belang wordt gehecht aan de bepaling van zwaveldioxide dient de bepaling te worden uitgevoerd op een monster dat gedurende twee dagen bij een  temperatuur van 20 °C afgesloten wordt bewaard alvorens de analyse uit te voeren: deze analyse moet eveneens bij 20 °C gebeuren.5. Aangezien sommige stoffen in zuur milieu door jodium worden geoxideerd is het noodzakelijk - voor zeer nauwkeurige  bepalingen - de hiervoor gebruikte hoeveelheid jodium te bepalen. Hiertoe wordt het vrije zwaveldioxide met een overmaat ethanal of propanal gebonden, waarna de titratie met jodium plaatsvindt. Breng 50 ml wijn in een Erlenmeyer van 300 ml, voeg hieraan  toe 5 ml ethanaloplossing, C2H4O, van 7 g/l of 5 ml propanaloplossing, C3H6O, van 10 g/l.Sluit de Erlenmeyer af en laat ten minste 30 minuten staan. Voeg 3 ml zwavelzuuroplossing, 1 tot 10 verdund (2.3.1.3), toe en zo veel 0,025 M jodiumoplossing  (2.3.1.5) dat de stijfseloplossing omslaat. Het verbruik aan jodiumoplossing zij n4. Dit moet worden afgetrokken van n (vrij zwaveldioxide) en van n + n2 + n" (totaal zwaveldioxide). n4 is in het algemeen laag: 0,2 à 0,3 ml 0,025 M jodiumoplossing.  Indien aan de wijn ascorbinezuur is toegevoegd is n4 veel groter. Hiermee kan, ten minste bij benadering, de hoeveelheid van deze stof worden bepaald via de waarde van n4, waarbij bedacht dient te worden dat 1 ml 0,025 M jodiumoplossing 4,4 mg  ascorbinezuur oxideert. Door de bepaling van n4 kunnen ook zonder enige problemen wijnen worden opgespoord waaraan ascorbinezuur is toegevoegd in hoeveelheden hoger dan 20 mg/l en waarvan het ascorbinezuur nog niet is omgezet in oxidatieprodukten.3.  MOLECULAIR  ZWAVELDIOXIDE  3.1. Principe van de methode   Het percentage moleculair zwaveldioxide, H2SO3, van het vrije zwaveldioxide is een functie van de pH, het alcoholgehalte en de temperatuur. Bij een bepaalde temperatuur en een bepaald alcoholgehalte geldt:H2SO3  H+ + HSO3 I = ionensterkteA en B =  coëfficiënten die variëren met de temperatuur en het alcoholgehaltekT = thermodynamische dissociatieconstante; de waarde van pkT wordt gegeven in tabel 1 als functie van het alcoholgehalte en de temperatuurkM = gemengde dissociatieconstante.    Neemt men 0,038 als gemiddelde waarde voor de ionensterkte I, dan kan men in tabel 2 de pkM-waarden als functie van alcoholgehalte en temperatuur aflezen.    Het gehalte aan moleculair zwaveldioxide berekend met formule (1) wordt gegeven in tabel 3 als functie van de pH, de temperatuur en het alcoholgehalte.3.2. Berekening   Indien de pH van de wijn en het alcoholgehalte bekend is kan het percentage moleculair zwaveldioxide bij temperatuur t °C worden afgelezen uit tabel 3; dit zij X %.     Gehalte aan moleculair zwaveldioxide in milligram per liter:X · CC = gehalte aan vrij zwaveldioxide in milligram per liter.  TABEL 1Waarden van de thermodynamische constante pkT   TABEL 2Waarden van de gemengde constante pkM     TABEL 3Moleculair zwaveldioxide in procenten van vrij zwaveldioxide (I = 0,038)     TABEL 3 (vervolg)     26. NATRIUM 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN  1.1. Referentiemethode: atoomabsorptiespectrofotometrie   Na toevoeging van een spectrale buffer, caesiumchloride, om ionisatie van natrium te voorkomen, wordt natrium rechtstreeks in wijn bepaald met behulp van atoomabsorptiespectrofotometrie.1.2. Gebruikelijke methode: vlamfotometrie   Natrium wordt rechtstreeks in de 1 op 10 of meer verdunde wijn bepaald met behulp van vlamfotometrie.2. REFERENTIEMETHODE  2.1. Reagentia  2.1.1. Natriumoplossing van 1 g/l   Gebruik een in de handel verkrijgbare standaardoplossing van natrium van 1 g/l. Deze oplossing kan ook worden bereid door 2,542 g gedroogd natriumchloride, NaCl, op te lossen in gedestilleerd water en hiermee aan te vullen tot 1 l.    Bewaar deze oplossing in een polyethyleenfles.2.1.2. Modeloplossing      Citroenzuur, C6H8O7, H2O 3,5 gSaccharose, C12H22O11 1,5 gGlycerol, C3H8O3 5,0 gCalciumchloride watervrij, CaCl2 50  mgMagnesiumchloride watervrij, MgCl2 50  mgAbsolute ethylalcohol, C2H5OH 50  mlWater tot500  ml.2.1.3. Caesiumchlorideoplossing, 5 g  caesium per 100 ml   Los 6,330 g caesiumchloride, CsCl, op in 100 ml gedestilleerd water.2.2. Apparatuur  2.2.1. Atoomabsorptiespectrofotometer, uitgerust met een door lucht en acetyleen te voeden brander  2.2.2. Holle-kathodelamp voor natrium2.3. Werkwijze  2.3.1. Voorbehandeling van het monster   Neem 2,5 ml wijn in bewerking, breng dit in een maatkolf van 50 ml, voeg 1 ml caesiumchlorideoplossing (2.1.3) toe en vul aan tot de streep met gedestilleerd water.  2.3.2. IJklijn   Breng in een serie maatkolven van 100 ml 5,0 ml modeloplossing (2.1.2), voeg hieraan respectievelijk toe 0, 2,5, 5, 7,5 en 10 ml van de natriumoplossing van 1 g/l (2.1.1), die van tevoren 1 tot 100 is verdund. Voeg aan elke kolf 2 ml  caesiumchlorideoplossing (2.1.3) toe en vul tot 100 ml aan met gedestilleerd water.    De aldus bereide standaardoplossingen, die alle 1 g caesium per liter bevatten, hebben een natriumgehalte van respectievelijk 0, 0,25, 0,50, 0,75 en 1,00 mg/l. Deze oplossingen moeten in polyethyleenflessen worden bewaard.2.3.3. Bepaling   Kies als golflengte 589,0 nm. Stel het nulpunt in met de modeloplossing die 1 g/l caesium bevat (2.3.2). Verstuif de verdunde wijn (2.3.1) en vervolgens de standaardoplossingen (2.3.2) rechtstreeks in de brander van de spectrofotometer. Noteer de  extincties. Voer de bepaling in duplo uit.2.4. Weergave van de resultaten  2.4.1. Berekening   Stel de ijklijn op met behulp van de gemeten extincties en de daarbij behorende natriumconcentraties van de standaardoplossingen.    Bepaal met behulp van de ijklijn uit de gemeten extinctie van het verdunde monster wijn de bijbehorende natriumconcentratie C in milligram per liter.    Het natriumgehalte van de wijn in milligram per liter, zonder decimalen, is dus:20 · C.2.4.2. Herhaalbaarheid (r)   r = 1 + 0,024 xi mg/l.xi = natriumgehalte van het monster in milligram per liter.2.4.3. Reproduceerbaarheid (R)   R = 2,5 + 0,05 xi mg/l.xi = natriumgehalte van het monster in milligram per liter.3. GEBRUIKELIJKE  METHODE  3.1. Reagentia  3.1.1. Standaardoplossing met 20 mg/l natrium      Absolute ethylalcohol, C2H5OH  10  mlCitroenzuur, C6H8O7 · H2O  700  mgSaccharose, C12H22O11  300  mgGlycerol, C3H8O31 000  mgKaliumwaterstoftartraat, C4H5KO6  481,3  mgCalciumchloride watervrij, CaCl2  10  mgMagnesiumchloride watervrij, MgCl2  10   mgNatriumchloride gedroogd, NaCl  50,84 mgWater   1  l.  3.1.2. Verdunningsoplossing  Absolute ethylalcohol, C2H5OH  10  mlCitroenzuur, C6H8O7 · H2O  700  mgSaccharose, C12H22O11  300  mgGlycerol, C3H8O31 000  mgKaliumwaterstoftartraat, C4H5KO6  481,3  mgCalciumchloride watervrij, CaCl2  10  mgMagnesiumchloride watervrij, MgCl2  10   mgWater   1  l.    Voor de bereiding van de oplossingen in de punten 3.1.1 en 3.1.2, los het kaliumwaterstoftartraat op in ongeveer 500 ml zeer heet gedestilleerd water, los de andere componenten op in 400 ml gedestilleerd water, voeg de twee oplossingen bij elkaar en  vul aan tot 1 l.    Bewaar de oplossingen na toevoeging van twee druppels allylisothiocyanaat in polyethyleenflessen.3.2. Apparatuur  3.2.1. Vlamfotometer, gevoed met een lucht-butaan mengsel3.3. Werkwijze  3.3.1. IJklijn   Breng in vijf maatkolven van 100 ml respectievelijk 5, 10, 15, 20 en 25 ml standaardoplossing met 20 mg/l natrium (3.1.1) en vul aan tot 100 ml met de verdunningsoplossing (3.1.2). Het natriumgehalte van de aldus verkregen oplossingen is  respectievelijk 1, 2, 3, 4 en 5 mg/l.3.3.2. Bepaling   Voer de metingen uit bij een golflengte van 589,0 nm. Stel het nulpunt in door gedestilleerd water te verstuiven. Verstuif achtereenvolgens rechtstreeks in de brander van de fotometer de standaardoplossingen (3.3.1) gevolgd door de 1 op 10 met  gedestilleerd water verdunde wijn en noteer de emissies. Verdun zonodig de 1 op 10 verdunde wijn verder met de verdunningsoplossing (3.1.2).3.4. Weergave van de resultaten  3.4.1.Berekening   Stel de ijklijn op met behulp van de gemeten emissies en de daarbij behorende natriumconcentraties van de standaardoplossingen. Bepaal met behulp van de ijklijn uit de gemeten emissie van het verdunde monster wijn de bijbehorende natriumconcentratie C.  Het natriumgehalte van de wijn, uitgedrukt in milligram per liter, is dus:C · FF = verdunningsfactor.3.4.2. Herhaalbaarheid (r)   r = 1,4 mg/l wijn (uitgezonderd likeurwijn).r = 2,0 mg/l voor likeurwijn.3.4.3. Reproduceerbaarheid (R)   R = 4,7 + 0,08 · xi mg/l.xi = natriumgehalte van het monster in mg/l.      27. KALIUM 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN  1.1. Referentiemethode: atoomabsorptiespectrofotometrie   Na toevoeging van een spectrale buffer, caesiumchloride, om ionisatie van kalium te voorkomen, wordt kalium rechtstreeks in de verdunde wijn bepaald met behulp van atoomabsorptiespectrofotometrie.1.2. Gebruikelijke methode   Kalium wordt rechtstreeks in de 1 op 10 of meer verdunde wijn bepaald met behulp van vlamfotometrie.2. REFERENTIEMETHODE  2.1. Reagentia  2.1.1. Kaliumoplossing van 1 g/l   Gebruik een in de handel verkrijgbare standaardoplossing van kalium van 1 g/l. Deze oplossing kan ook worden bereid door 4,813 g kaliumwaterstoftartraat, C4H5KO6, op te lossen in gedestilleerd water en hiermee aan te vullen tot 1 l.2.1.2.  Modeloplossing      Citroenzuur, C6H8O7 · H2O 3,5 gSaccharose, C12H22O11 1,5 gGlycerol, C3H8O3 5,0 gCalciumchloride watervrij, CaCl2 50  mgMagnesiumchloride watervrij, MgCl2 50  mgAbsolute ethylalcohol, C2H5OH 50  mlWater tot500  ml.2.1.3. Caesiumchlorideoplossing, 5 g  caesium per 100 ml   Los 6,330 g caesiumchloride, CsCl, op in 100 ml gedestilleerd water.2.2. Apparatuur  2.2.1. Atoomabsorptiespectrofotometer, uitgerust met een door lucht en acetyleen te voeden brander  2.2.2. Holle-kathodelamp voor kalium2.3. Werkwijze  2.3.1. Voorbehandeling van het monster   Neem 2,5 ml van tevoren 1 op 10 verdunde wijn in bewerking. Breng dit in een maatkolf van 50 ml, voeg 1 ml caesiumchlorideoplossing (2.1.3) toe en vul aan tot de streep met gedestilleerd water.2.3.2. IJklijn   Breng in een serie maatkolven van 100 ml 5 ml modeloplossing (2.1.2), voeg hieraan respectievelijk toe 0, 2,0, 4,0, 6,0 en 8 ml van de kaliumoplossing 1 g/l (2.1.1), die van tevoren 1 tot 10 is verdund. Voeg aan elke kolf 2 ml caesiumchlorideoplossing  (2.1.3) toe en vul aan tot 100 ml met gedestilleerd water. De aldus bereide standaardoplossingen, die alle 1 g caesium per liter bevatten, hebben een kaliumgehalte van respectievelijk 0, 2, 4, 6 en 8 mg/l. Deze oplossingen moeten in polyethyleenflessen  worden bewaard.2.3.3. Bepaling   Kies als golflengte 769,9 nm. Stel het nulpunt in met de modeloplossing die 1 g/l caesium bevat (2.3.2). Verstuif de verdunde wijn (2.3.1) en vervolgens de standaardoplossingen (2.3.2) rechtstreeks in de brander van de spectrofotometer. Noteer de  extincties. Voer de bepaling in duplo uit.2.4. Weergave van de resultaten  2.4.1. Berekening   Stel de ijklijn op met behulp van de gemeten extincties en de daarbij behorende kaliumconcentraties van de standaardoplossingen. Bepaal met behulp van de ijklijn uit de gemeten extinctie van het verdunde monster wijn de bijbehorende kaliumconcentratie  C in milligram per liter.    Het kaliumgehalte van de wijn in milligram per liter, zonder decimalen, is dus:F · CF = verdunningsfactor (200).2.4.2. Herhaalbaarheid (r)r = 35 mg/l.  2.4.3. Reproduceerbaarheid (R)R = 66 mg/l.2.4.4. Andere wijze van weergave van de resultaten   - In milli-equivalenten per liter: 0,0256 · F · C.- In milligram kaliumwaterstoftartraat per liter: 4,813 · F · C.3. GEBRUIKELIJKE  METHODE:  VLAMFOTOMETRIE  3.1. Reagentia  3.1.1. Standaardoplossing met 100 mg/l kalium      Absolute ethylalcohol, C2H5OH  10  mlCitroenzuur, C6H8O7 · H2O  700  mgSaccharose, C12H22O11  300  mgGlycerol, C3H8O31 000  mgNatriumchloride gedroogd, NaCl  50,8 mgCalciumchloride watervrij, CaCl2  10  mgMagnesiumchloride watervrij, MgCl2  10   mgKaliumwaterstoftartraat, C4H5KO6  481,3 mgWater tot1 000  ml.    Los het kaliumwaterstoftartraat op in ongeveer 500 ml zeer heet gedestilleerd water, los de andere componenten op in 400 ml gedestilleerd water, voeg de twee oplossingen bij elkaar en vul aan tot 1 l.  3.1.2. Verdunningsoplossing  Absolute ethylalcohol, C2H5OH  10  mlCitroenzuur, C6H8O7 · H2O  700  mgSaccharose, C12H22O11  300  mgGlycerol, C3H8O31 000  mgNatriumchloride gedroogd, NaCl  50,8 mgCalciumchloride watervrij, CaCl2  10  mgMagnesiumchloride watervrij, MgCl2  10   mgWijnsteenzuur, C4H6O6  383  mgWater tot1 000  ml.    Bewaar de oplossingen na toevoeging van twee druppels allylisothiocyanaat in polyethyleen flessen.3.2. Apparatuur  3.2.1. Vlamfotometer, gevoed met een lucht-butaan mengsel3.3. Werkwijze  3.3.1. IJklijn   Breng in vier maatkolven van 100 ml respectievelijk 25, 50, 75 en 100 ml standaardoplossing met 100 mg/l kalium (3.1.1) en vul aan tot 100 ml met de verdunningsoplossing (3.1.2). Het kaliumgehalte van de aldus verkregen oplossingen is respectievelijk  25, 50, 75 en 100 mg/l.3.3.2. Bepaling   Voer de metingen uit bij een golflengte van 766 nm. Stel het nulpunt in met behulp van gedestilleerd water. Verstuif achtereenvolgens rechtstreeks in de brander van de fotometer de standaardoplossingen (3.3.1) gevolgd door de 1 op 10 met gedestilleerd  water verdunde wijn en noteer de emissies. Verdun zonodig de 1 op 10 verdunde wijn verder met verdunningsoplossing (3.1.2).3.4. Weergave van de resultaten  3.4.1. Berekening   Stel de ijklijn op met behulp van de gemeten emissies en de daarbij behorende kaliumconcentraties van de standaardoplossingen. Bepaal met behulp van de ijklijn uit de gemeten emissie van het verdunde monster wijn de bijbehorende kaliumconcentratie C.    Het kaliumgehalte van de wijn, uitgedrukt in milligram per liter, zonder decimalen, is dus:C · FF = verdunningsfactor.3.4.2. Herhaalbaarheid (r)   r = 17 mg/l.3.4.3. Reproduceerbaarheid (R)   R = 66 mg/l.  3.4.4. Andere wijze van weergave van de resultaten   - In milli-equivalenten per liter: 0,0256· F · C.- In milligram kaliumwaterstoftartraat per liter: 4,813 · F · C.     28. MAGNESIUM 1. PRINCIPE   Magnesium wordt rechtstreeks in een geschikte verdunning van de wijn bepaald met behulp van atoomabsorptiespectrofotometrie.2. REAGENTIA  2.1. Geconcentreerde magnesium-standaardoplossing van 1 g/l   Gebruik hiervoor een in de handel verkrijgbare standaardoplossing. Deze oplossing kan ook worden bereid door 8,3646 g magnesiumchloride, MgCl2.6H20, op te lossen in gedestilleerd water en hiermee aan te vullen tot 1 l.2.2. Verdunde  magnesium-standaardoplossing van 5 mg/l   Opmerking:Bewaar de standaardmagnesiumoplossingen in polyethyleenflessen.3. APPARATUUR  3.1. Atoomabsorptiespectrofotometer voorzien van een brander, die gevoed wordt met lucht en acetyleen  3.2. Holle-kathodelamp voor magnesium4. WERKWIJZE  4.1. Voorbehandeling van het monster   Verdun de wijn 1 tot 100 met gedestilleerd water.4.2. IJklijn  Breng in een serie maatkolven van 100 ml respectievelijk 5, 10, 15 en 20 ml van de verdunde magnesium-standaardoplossing (2.2) en vul aan tot 100 ml met gedestilleerd water. De aldus bereide standaardoplossingen bevatten respectievelijk 0,25, 0,50, 0,75  en 1,00 mg magnesium per liter. Deze oplossingen moeten in polyethyleenflessen worden bewaard.4.3. Bepaling   Kies als golflengte 285 nm. Stel het nulpunt in met gedestilleerd water. Verstuif de verdunde wijn rechtstreeks in de brander van de spectrofotometer, gevolgd door achtereenvolgens de standaardoplossingen (4.2). Noteer de extincties. Voer de bepaling  in duplo uit.5. WEERGAVE  VAN DE  RESULTATEN  5.1. Berekening   Stel de ijklijn op met behulp van de gemeten extincties en de daarbij behorende magnesiumconcentraties van de standaardoplossingen. Bepaal met behulp van de ijklijn uit de gemeten gemiddelde extinctie van het verdunde monster wijn de bijbehorende  magnesiumconcentratie C.     Het magnesiumgehalte van de wijn, uitgedrukt in milligram per liter, zonder decimalen, is dus:100 · C.5.2. Herhaalbaarheid (r)   r = 3 mg/l.5.3. Reproduceerbaarheid (R)   R = 8 mg/l.     29. CALCIUM 1. PRINCIPE   Onder toevoeging van een spectrale buffer wordt calcium rechtstreeks in een geschikte verdunning van de wijn bepaald met behulp van atoomabsorptiespectrofotometrie.2. REAGENTIA  2.1. Stockoplossing van calcium van 1 g/l   Gebruik hiervoor een in de handel verkrijgbare standaardoplossing. Deze oplossing kan ook worden bereid door 2,5 g calciumcarbonaat, CaCO3, in zo weinig mogelijk zoutzuuroplossing HCl 1 tot 10 verdund (v/v) op te lossen en met gedestilleerd water aan  te vullen tot 100 ml.2.2. Standaardoplossing van calcium van 50 mg/l   Opmerking:Bewaar deze standaardcalciumoplossingen in polyethyleenflessen.2.3. Lanthaanchlorideoplossing met 50 g lanthaan per liter   Los 13,369 g lanthaanchloride, LaCl3·7H2O, op in gedestilleerd water; voeg 1 ml zoutzuuroplossing 1 tot 10 verdund (v/v) toe en vul aan tot 100 ml.3. APPARATUUR  3.1. Atoomabsortiespectrofotometer voorzien van een brander, die gevoed wordt met lucht en acetyleen  3.2. Holle-kathodelamp voor calcium4. WERKWIJZE  4.1. Voorbehandeling van het monster   Breng in een maatkolf van 20 ml 1 ml wijn en 2 ml lanthaanchlorideoplossing (2.3) en vul aan tot de streep met gedestilleerd water. De 1 op 20 verdunde wijn bevat 5 g lanthaan per liter.    Opmerking:De concentratie van 5 g lanthaan per liter is voor zoete wijn voldoende mits het suikergehalte door de verdunning wordt teruggebracht tot maximaal 2,5 g/l. Bij hogere suikergehalten moet het lanthaangehalte worden verhoogd tot 10 g/l.4.2.  IJklijn   Breng in vijf maatkolven van 100 ml respectievelijk 0, 5, 10, 15 en 20 ml standaardcalciumoplossing (2.2), voeg aan elke kolf 10 ml lanthaanchlorideoplossing (2.3) toe en vul aan tot 100 ml met gedestilleerd water. De aldus bereide  standaardoplossingen, die alle 5 g lanthaan bevatten, hebben een calciumgehalte van respectievelijk 0, 2,5, 5, 7,5 en 10 mg calcium per liter. Deze oplossingen moeten in polyethyleen flessen worden bewaard.4.3. Bepaling   Kies als golflengte 422,7 nm. Stel het nulpunt in met de oplossing die 5 g lanthaan per liter bevat (4.2). Verstuif de verdunde wijn rechtstreeks in de brander van de spectrofotometer, gevolgd door achtereenvolgens de standaardoplossingen (4.2). Noteer  de extincties. Voer de bepaling in duplo uit.  5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN  5.1. Berekening   Stel de ijklijn op met behulp van de gemeten extincties en de daarbij behorende calciumconcentraties van de standaardoplossingen.    Bepaal met behulp van de ijklijn uit de gemeten gemiddelde extinctie van het verdunde monster wijn de bijbehorende calciumconcentratie C. Het calciumgehalte van de wijn, uitgedrukt in milligram per liter zonder decimalen, is dus:20 · C.5.2.  Herhaalbaarheid (r)   Gehalte <  60 mg/l: r = 2,7 mg/l.Gehalte > 60 mg/l: r = 4 mg/l.5.3.Reproduceerbaarheid (R)   R = 0,114 · xi   0,5 mg/l.xi = het calciumgehalte van het monster in mg/l.     30. IJZER 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN  1.1. Referentiemethode   Na verwijdering van de alcohol uit de wijn en het toepassen van een geschikte verdunning wordt ijzer rechtstreeks in wijn bepaald met behulp van atoomabsorptiespectrofotometrie.1.2. Gebruikelijke methode   Na mineralisatie van de wijn met waterstofperoxide wordt totaal ijzer als tweewaardig ijzer bepaald via de roodgekleurde verbinding die ontstaat met ortho-fenantroline.   2. REFERENTIEMETHODE  2.1. Reagentia  2.1.1. Geconcentreerde standaardoplossing van driewaardig ijzer van 1 g/l   Gebruik hiervoor een in de handel verkrijgbare standaardoplossing. Deze oplossing kan ook worden bereid door 8,6431 g ijzer(III)ammoniumsulfaat, FeNH4(SO4)2·12H2O op te lossen in gedestilleerd water dat licht is aangezuurd met 1 M zoutzuuroplossing en  aan te vullen tot 1 l.   2.1.2. Verdunde standaardoplossing van ijzer van 100 mg/l2.2. Apparatuur  2.2.1. Rotatieverdamper met gethermostateerd waterbad  2.2.2. Atoomabsorptiespectrofotometer voorzien van een brander die gevoed wordt met lucht en acetyleen  2.2.3. Holle-kathodelamp voor ijzer2.3. Werkwijze  2.3.1. Voorbehandeling van het monster   Verwijder de alcohol uit de wijn door met de rotatieverdamper bij 50-60 °C tot op ongeveer de helft in te dampen. Vul aan tot het oorspronkelijke volume met gedestilleerd water. Verdun indien noodzakelijk.2.3.3. IJklijn   Breng in een serie maatkolven van 100 ml respectievelijk 1, 2, 3, 4 en 5 ml van de standaardoplossing van ijzer van 100 mg/l (2.1.2) en vul aan tot 100 ml met gedestilleerd water. De aldus bereide standaardoplossingen bevatten respectievelijk 1, 2, 3,  4 en 5 mg ijzer per liter.    Deze oplossingen moeten in polyethyleenflessen worden bewaard.2.3.3. Bepaling   Kies als golflengte 248,3 nm. Stel het nulpunt in met gedestilleerd water. Verstuif de verdunde wijn rechtstreeks in de brander van de spectrofotometer, gevolgd door achtereenvolgens de standaardoplossingen (2.3.2). Noteer de extincties. Voer de  bepaling in duplo uit.2.4. Weergave van de resultaten  2.4.1. Berekening   Stel de ijklijn op met behulp van de gemeten extincties en de daarbij behorende ijzerconcentraties van de standaardoplossingen. Bepaal met behulp van de ijklijn uit de gemeten gemiddelde extinctie van het verdunde monster de bijbehorende  ijzerconcentratie C.    Het ijzergehalte van de wijn, uitgedrukt in milligram per liter met één decimaal, is dus:C · Fwaarin F = verdunningsfactor.3. GEBRUIKELIJKE  METHODE  3.1. Reagentia  3.1.1. Waterstofperoxideoplossing, H2O2, 30 % (m/v), ijzervrij  3.1.2. Zoutzuuroplossing, 1 M, ijzervrij  3.1.3 Ammoniumhydroxide, NH3 (r20 = 0,92 g/ml)  3.1.4. Kooksteentjes, met kokend 1 tot 2 verdund zoutzuur behandeld en gewassen met gedestilleerd water  3.1.5. Hydrochinonoplossing, C6H6O2, 2,5 %, aangezuurd met 1 ml zwavelzuur p.a. (r20 = 1,84 g/ml) per 100 ml oplossing   Bewaar deze oplossing in een gele fles in de koelkast en vervang haar bij de minste bruinkleuring.   3.1.6. Natriumsulfietoplossing, Na2So3, 20 %, bereid uit neutraal en watervrij sulfiet  3.1.7. Ortho-fenantrolineoplossing, C12H8N2.H2O, 0,5 % in alcohol 96 % vol  3.1.8. Ammoniumacetaatoplossing, CH3COONH4, 20 %  3.1.9. Driewaardig-ijzeroplossing van 1 g/l   Gebruik hiervoor een in de handel verkrijgbare standaardoplossing. Deze oplossing kan ook worden bereid door 8,6341 g ijzer(III)ammoniumsulfaat, FeNH4(SO4)2·12H2O, op te lossen in 100 ml 1 M zoutzuuroplossing (3.1.2) en hiermee aan te vullen tot 1 l.   3.1.10. Verdunde ijzer-standaardoplossing van 100 mg/l3.2. Apparatuur  3.2.1. Kjeldahlkolf van 100 ml  3.2.2. Spectrofotometer waarmee bij een golflengte van 508 nm kan worden gemeten3.3. Werkwijze  3.3.1. Mineralisatie  3.3.1.1. Wijn met een suikergehalte lager dan 50 g/l   Breng in een kjeldahlkolf van 100 ml 25 ml wijn, 10 ml waterstofperoxideoplossing (3.1.1) en enkele kooksteentjes (3.1.4). Damp de vloeistof in tot een volume van 2 à 3 ml.     Voeg na afkoelen aan het residu, zonder de wand van de kolf te bevochtigen, zoveel ammoniumhydroxide (3.1.3) toe dat het milieu basisch wordt en de hydroxiden worden neergeslagen.    Voeg na afkoelen aan de alkalische oplossing zoveel 1 M zoutzuuroplossing (3.1.2) toe als nodig is om de neergeslagen hydroxiden op te lossen en breng de verkregen oplossing over in een maatkolf van 100 ml. Spoel de kjeldahlkolf met 1 M  zoutzuuroplossing (3.1.2) en vul met dezelfde oplossing aan tot 100 ml.3.3.1.2. Most  en  wijn  met  een  suikergehalte  hoger  dan  50  g/l  3.3.1.2.1. Suikergehalte tussen 50 en 200 g/l25 ml wijn of most wordt behandeld met 20 ml waterstofperoxideoplossing (3.1.1). Vervolg zoals beschreven in punt 3.3.1.1.   3.3.1.2.2. Suikergehalte boven 200 g/lMost- en wijnmonsters moeten van tevoren 1 tot 2 of zelfs 1 tot 4 worden verdund en vervolgens worden behandeld volgens punt 3.3.1.2.1.3.3.2. Blanco   Verricht een blanco bepaling met gedestilleerd water onder gebruikmaking van dezelfde hoeveelheid waterstofperoxideoplossing (3.1.1) die bij de mineralisatie van het monster wordt gebruikt en volg hierbij het voorschrift beschreven in punt  3.3.1.1.3.3.3. Bepaling   Neem 20 ml van de zoutzure oplossing die bij de mineralisatie van het monster is verkregen (3.3.1.1) en 20 ml van de zoutzure oplossing van de blanco (3.3.2) in bewerking. Breng deze oplossingen in twee maatkolven van 50 ml, voeg aan elke kolf toe 2 ml  hydrochinonoplossing (3.1.5), 2 ml sulfietoplossing (3.1.6) en 1 ml ortho-fenantrolineoplossing (3.1.7). Laat gedurende 15 minuten staan om de reductie van driewaardig ijzer naar tweewaardig ijzer te laten verlopen. Voeg 10 ml ammoniumacetaatoplossing  (3.1.8) toe en vul aan tot 50 ml met gedestilleerd water. Schud. Meet de extinctie bij 508 nm waarbij het nulpunt wordt ingesteld met de blanco-oplossing.3.3.4. IJklijn   Breng in vier maatkolven van 50 ml respectievelijk 0,5, 1, 1,5 en 2 ml van de standaard ijzeroplossing van 100 mg/l (3.1.10) en voeg 20 ml gedestilleerd water toe; vervolg zoals aangegeven in punt 3.3.3. Deze oplossingen komen overeen met  respectievelijk 50, 100, 150 en 200 µg ijzer in de in bewerking genomen monsterhoeveelheid.3.4. Weergave van de resultaten  3.4.1. Berekening   Stel de ijklijn op met behulp van de gemeten extincties en de daarbij behorende ijzerconcentraties van de standaardoplossingen. Bepaal met behulp van de ijklijn uit de gemeten extinctie van het monster de bijbehorende ijzerconcentratie C, die dus  aanwezig is in 20 ml zoutzuur gemineraliseerde oplossing, of wel in 5 ml monster.    Het ijzergehalte van de wijn, uitgedrukt in milligram per liter met één decimaal, is dus:200 · C.    Indien de wijn of most is verdund is het ijzergehalte van de wijn, uitgedrukt in milligram per liter met één decimaal:200 · C · Fwaarin F = verdunningsfactor.     31. KOPER 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Koper wordt rechtstreeks in een geschikte verdunning van de wijn bepaald met behulp van atoomabsorptiespectrofotometrie.2.APPARATUUR  2.1. Platinaschaal  2.2. Atoomabsorptiespectrofotometer  2.3. Holle-kathodelamp voor koper  2.4. Brandergasmengsel: lucht/acetyleen of lachgas/acetyleen3. REAGENTIA  3.1. Metallisch koper  3.2. Geconcentreerd salpeterzuur, HNO3 (r20 = 1,38 g/ml), 65 %  3.3. Salpeterzuur, 1 tot 2 verdund (v/v)3.4. Koperoplossing van 1g/l   Gebruik hiervoor een in de handel verkrijgbare standaardoplossing van 1 g/l. Deze oplossing kan ook worden bereid door 1 000 g metallisch koper af te wegen en dit kwantitatief over te brengen in een maatkolf van 1 000 ml. Voeg zoveel 1 tot 2 verdund  salpeterzuur (3.3) toe als nodig is om het metaal op te lossen, voeg dan 10 ml geconcentreerd salpeterzuur (3.2) toe en vul aan tot de streep met dubbel gedestilleerd water.3.5. Koperoplossing van 100 mg/l   Pipetteer 10 ml koperoplossing (3.4) in een maatkolf van 100 ml en vul aan tot de streep met dubbel gedestilleerd water.4. WERKWIJZE  4.1. Voorbehandeling van het monster en de bepaling van koper   Bereid indien noodzakelijk een geschikte verdunning met dubbel gedestilleerd water.4.2. Opstellen van de ijklijn   Neem respectievelijk 0,5, 1 en 2 ml koperoplossing, die 100 mg koper per liter bevat (3.5), in bewerking en breng deze in een serie maatkolven van 100 ml; vul aan tot 100 ml met dubbel gedestilleerd water. De aldus bereide oplossingen bevatten  respectievelijk 0,5, 1 en 2 mg/l.4.3. Bepaling   Kies als golflengte 324,8 nm. Stel het nulpunt in met dubbel gedestilleerd water. Verstuif de al dan niet verdunde wijn rechtstreeks in de brander van de spectrofotometer, gevolgd door achtereenvolgens de standaardoplossingen (4.2). Noteer de  extincties. Voer de bepaling in duplo uit.  5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN  5.1. Berekening   De voor het monster gemeten extinctie kan met behulp van de ijklijn worden omgezet in de concentratie C in mg/l.    Indien een verdunning F heeft plaatsgevonden, dan is het kopergehalte van de wijn in milligram per liter dus F · C.   Het gehalte wordt opgegeven met twee decimalen.    Opmerkingen:a) De sterkte van de standaardoplossingen, gebruikt voor het opstellen van de ijklijn, en de verdunning van het monster moeten worden gekozen afhankelijk van de gevoeligheid van de te gebruiken apparatuur en het gehalte aan koper.   b) Bij erg lage kopergehalten moet de volgende werkwijze worden gevolgd: breng 100 ml monster in een platinaschaal, damp op een kokend-waterbad in tot een stroperige consistentie, voeg dan druppelsgewijs 2,5 ml geconcentreerd salpeterzuur (3.2) toe,  waarbij de bodem van de schaal geheel bedekt moet worden. Start voorzichtig de verassing van het residu op een elektrische verwarmingsplaat of liever met een kleine vlam; plaats de schaal vervolgens gedurende ongeveer een uur in een moffeloven,  ingesteld op een temperatuur van 500 ± 25 °C. Bevochtig, na afkoeling, de as met 1 ml geconcentreerd salpeterzuur (3.2), maak hierbij de as fijn met een kleine glasstaaf. Damp droog en veras opnieuw zoals hierboven beschreven. Plaats de schaal weer  gedurende 15 minuten in de oven; herhaal de salpeterzuurbehandeling minstens driemaal. Los de as op door aan de schaal 1 ml geconcentreerd salpeterzuur (3.2) en 2 ml dubbel gedestilleerd water toe te voegen; breng de inhoud over in een maatkolf van 10  ml. Was de schaal driemaal met telkens 2 ml dubbel gedestilleerd water en vul ten slotte aan tot de streep met dubbel gedestilleerd water.     32. CADMIUM 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Cadmium wordt rechtstreeks in de wijn bepaald door middel van vlamloze atoomabsorptiespectrofotometrie.2. APPARATUUR   Al het glaswerk dient vooraf te worden gereinigd met warm (70-80 °C) geconcentreerd salpeterzuur en gespoeld met tweemaal gedestilleerd water.   2.1. Atoomabsorptiespectrofotometer met grafietoven, correctiemogelijkheid voor achtergrondruis en een zelfregistrerend detectiesysteem  2.2. Holle-kathodelamp voor cadmium  2.3. Micropipetten van 5 ml met speciale tuit voor atoomabsorptiemetingen3. REAGENTIA   Het te gebruiken water dient in apparatuur van borosilicaatglas tweemaal te zijn gedestilleerd of van gelijkwaardige zuiverheid te zijn. Alle reagentia moeten van erkende analytische zuiverheid zijn en mogen in het bijzonder geen cadmium bevatten.   3.1. Fosforzuur 85 % (r20 = 1,71 g/ml)  3.2. Fosforzuuroplossing, verkregen door verdunning van 8 ml fosforzuur met water tot 100 ml  3.3. 0,02 M oplossing van dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)  3.4. Bufferoplossing met pH = 9, verkregen door in een maatkolf van 100 ml 5,4 g ammoniumchloride in enkele milliliters water op te lossen, 35 ml ammoniumhydroxideoplossing (r20 = 0,92 g/ml) verdund tot 25 % (v/v) toe te voegen en tot de merkstreep aan  te vullen met water  3.5. Eriochroom-T-zwart: als vaste stof tot 1 % (m/m) verdund met natriumchloride3.6. Cadmiumsulfaat, 3CdSO4·8H2O  Het gehalte aan cadmiumsulfaat moet op de volgende wijze worden vastgesteld:Weeg precies 102,6 mg van het monster cadmiumsulfaat af, spoel het met water kwantitatief in een bekerglas en schud totdat het is opgelost; voeg 5 ml bufferoplossing met pH = 9  toe en ongeveer 20 mg van eriochroom-T-zwart. Titreer met de EDTA-oplossing tot de indicator naar blauw omslaat.    Het toegevoegde volume EDTA moet gelijk zijn aan 20 ml. Als het volume een weinig afwijkt, moet de af te wegen hoeveelheid cadmiumsulfaat ter bereiding van de referentieoplossing overeenkomstig worden bijgesteld.3.7. Referentieoplossing met 1 g cadmium  per liter   Gebruik een standaard handelsoplossing. Deze oplossing kan verkregen worden door 2,2820 g cadmiumsulfaat in water op te lossen en aan te vullen tot 1 l. Bewaar de oplossing in een fles van borosilicaatglas met geslepen stop.4. WERKWIJZE  4.1. Bereiding van het monster   Verdun de wijn tot 1/2 (v/v) met fosforzuuroplossing.  4.2. Bereiding van de oplossingen voor de ijkreeks   Maak, uitgaande van de referentieoplossing met cadmium, door achtereenvolgende verdunningen oplossingen met een gehalte van respectievelijk 2,5, 5, 10, 15mg cadmium per liter.4.3. Bepaling  4.3.1. Ovenprogramma (indicatief)   Drogen bij 100 °C gedurende 30 seconden.Mineralisatie bij 900 °C gedurende 20 seconden.Atomisatie bij 2 250 °C gedurende twee tot drie seconden.Stikstofdebiet (spoelgas): 6 l/min.    Opmerking:Temperatuurverhoging tot 2 700 °C aan het eind van de bewerking om de oven te reinigen.4.3.2. Atoomabsorptiemetingen   Kies een golflengte van 228,8 nm. Stel het nulpunt van de extinctieschaal in met tweemaal gedestilleerd water. Breng met behulp van een micropipet in de oven driemaal 5 ml van elke oplossing van de ijkreeks en van de te onderzoeken monsteroplossing.  Leg de gemeten extincties vast. Bereken de gemiddelde extinctiewaarde uit de resultaten die voor elk van de drie injecties werden verkregen.5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN  5.1. Wijze van berekening   Teken een lijn door de verschillende extinctiewaarden als functie van de cadmiumconcentraties in de oplossingen van de ijkreeks. Dit levert een rechte lijn op. Breng de gemiddelde extinctiewaarde van de monsteroplossing over op de ijkkromme en lees de  cadmiumconcentratie C af. De cadmiumconcentratie in microgram per liter wijn is gelijk aan:2 C.     33. ZILVER 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Na verassing van de wijn wordt zilver bepaald met behulp van atoomabsorptiespectrofotometrie.2. APPARATUUR  2.1. Platinaschaal  2.2. Waterbad, gethermostateerd op 100 C  2.3. Moffeloven, ingesteld op 500-525 C  2.4. Atoomabsorptiespectrofotometer  2.5. Holle-kathodelamp voor zilver  2.6. Brandergasmengsel: lucht, acetyleen3. REAGENTIA  3.1. Zilvernitraat, AgNO3  3.2. Salpeterzuur geconcentreerd, HNO3, 65 % (r20 = 1,38 g/ml)  3.3. Salpeterzuur, 1 tot 10 verdund (v/v)3.4. Zilveroplossing van 1 g/l   Gebruik hiervoor een in de handel verkrijgbare standaardoplossing. Deze oplossing kan ook worden bereid door 1,575 g zilvernitraat (3.1) op te lossen in verdund salpeterzuur en hiermee aan te vullen tot 1 000 ml.3.5. Zilveroplossing van 10 mg/l   Pipetteer 10 ml zilveroplossing (3.4) in een maatkolf van 1 000 ml en vul aan tot de streep met verdund salpeterzuur.4. WERKWIJZE  4.1. Voorbehandeling van het monster   Pipetteer 20 ml monster in een platinaschaal en damp droog met behulp van een op 100 C gethermostateerd waterbad. Veras in een moffeloven bij 500-525 C tot een witte as is verkregen. Neem de as op in 1 ml geconcentreerd salpeterzuur (3.2), damp droog  op het waterbad, voeg nogmaals 1 ml salpeterzuur (3.2) toe en damp weer droog. Voeg 5 ml verdund salpeterzuur (3.3) toe en los het residu op onder zacht verwarmen.4.2. Opstellen van de ijklijn   Breng in een serie maatkolven van 100 ml respectievelijk 2, 4, 6, 8, 10 en 20 ml zilveroplossing van 10 mg/l (3.5) en vul aan tot de streep met verdund salpeterzuur (3.3). De aldus bereide standaardoplossingen bevatten respectievelijk 0,20, 0,40, 0,60,  0,80, 1,00 en 2,00 mg zilver per liter.4.3. Bepaling   Kies als golflengte 328,1 nm. Stel het nulpunt in met verdund salpeterzuur (3.3). Verstuif het volgens punt 4.1 voorbereide monster rechtstreeks in de brander van de spectrofotometer, gevolgd door achtereenvolgens de standaardoplossingen (4.2). Noteer  de extincties. Voer de bepaling in duplo uit.5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN  5.1. Berekening   Stel de ijklijn op met behulp van de gemeten extincties en de daarbij behorende zilverconcentraties van de standaardoplossingen.    Bepaal met behulp van de ijklijn uit de gemeten gemiddelde extinctie van het monster de bijbehorende zilverconcentratie C.    Het zilvergehalte van de wijn, uitgedrukt in milligram per liter met twee decimalen, is:0,25· C.    Opmerking:  De sterkte van de standaardoplossingen, gebruikt voor het opstellen van de ijklijn, de hoeveelheid in bewerking genomen monster en het eindvolume van de meetoplossing kunnen worden aangepast afhankelijk van de gevoeligheid van de te gebruiken  apparatuur.     34. ZINK 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Zink wordt rechtstreeks in de van alcohol bevrijde wijn bepaald met behulp van atoomabsorptiespectrofotometrie.2. REAGENTIA   Het te gebruiken water moet dubbel gedestilleerd zijn in een opstelling van boorsilicaatglas of het moet water zijn van gelijkwaardige zuiverheid.   2.1. Zinkstandaardoplossing van 1 g/l   Gebruik hiervoor een in de handel verkrijgbare standaardoplossing. Deze oplossing kan ook worden bereid door 4,3975 g zinksulfaat (ZnSO4 · 7H2O) op te lossen in water en hiermee aan te vullen tot 1 l.   2.2. Zinkstandaardoplossing, verdund, van 100 mg/l3. APPARATUUR  3.1. Rotatieverdamper met gethermostateerd waterbad  3.2. Atoomabsorptiespectrofotometer voorzien van een brander die gevoed wordt met lucht en acetyleen  3.3. Holle-kathodelamp voor zink4. WERKWIJZE  4.1. Voorbehandeling van het monster   Verwijder de alcohol uit de wijn door 100 ml wijn met de rotatieverdamper bij 50 - 60 C in te dampen tot de helft van het oorspronkelijke volume. Vul aan tot het oorspronkelijke volume met dubbel gedestilleerd water.4.2. IJklijn   Breng in vier maatkolven van 100 ml respectievelijk 0,5, 1, 1,5 en 2 ml zinkoplossing van 100 mg/l (2.2) en vul aan tot de streep met dubbel gedestilleerd water. De aldus bereide standaardoplossingen bevatten respectievelijk 0,5, 1, 1,5 en 2 mg zink  per liter.4.3. Bepaling   Kies als golflengte 213,9 nm. Stel het nulpunt in met dubbel gedestilleerd water. Verstuif de van alcohol bevrijde wijn (4.1) rechtstreeks in de brander van de spectrofotometer, gevolgd door achtereenvolgens de standaardoplossingen (4.2). Noteer de  extincties. Voer de bepaling in duplo uit.5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN  5.1. Berekening   Stel de ijklijn op met behulp van de gemeten extincties en de daarbij behorende zinkconcentraties van de standaardoplossingen. Bepaal met behulp van de ijklijn uit de gemeten gemiddelde extinctie van de wijn de bijbehorende zinkconcentratie in  milligram per liter wijn met één decimaal.     35. LOOD 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Lood wordt rechtstreeks in de wijn bepaald door vlamloze atoomabsorptiespectrofotometrie.2. APPARATUUR   Al het glaswerk dient vooraf te worden gereinigd met warm (70-80 C) geconcentreerd salpeterzuur en gespoeld met tweemaal gedestilleerd water.   2.1. Atoomabsorptiespectrofotometer met grafietoven, correctiemogelijkheid voor achtergrondruis en een zelfreinigend detectiesysteem  2.2. Holle-kathodelamp voor lood  2.3. Micropipetten van 5 µl met speciale tuit voor atoomabsorptiemetingen3. REAGENTIA   Alle reagentia moeten van erkende analytische zuiverheid zijn en mogen in het bijzonder geen lood bevatten. Het te gebruiken water dient in apparatuur van borosilicaatglas tweemaal te zijn gedestilleerd of van gelijkwaardige zuiverheid te zijn.   3.1. Fosforzuur 85 % (r20 = 1,71 g/ml).   3.2. Oplossing van fosforzuur, verkregen door verdunning van 8 ml fosforzuur met water tot 100 ml  3.3. Salpeterzuur (r20 = 1,38 g/ml).   3.4. Oplossing met 1 g lood per liter   Gebruik een standaard handelsoplossing. Deze oplossing kan worden verkregen door 1,600 g lood(II)nitraat, Pb(NO3)2, in 1 % (v/v) verdund salpeterzuur op te lossen en aan te vullen tot 1 l. Bewaar de oplossing in een fles van borosilicaatglas met  geslepen stop.4. WERKWIJZE  4.1. Bereiding van het monster   Verdun de wijn tot ½ of 1/3 met de fosforzuuroplossing, afhankelijk van de te verwachten loodconcentratie.4.2. Bereiding van de oplossingen voor de ijkreeks   Maak, uitgaande van de referentieoplossing met lood, door achtereenvolgende verdunningen met tweemaal gedestilleerd water oplossingen met een gehalte van respectievelijk 25, 50, 100 en 150 µg lood per liter.4.3. Bepaling  4.3.1. Ovenprogramma (indicatief)   Drogen bij 100 C gedurende 30 seconden.Mineralisatie bij 900 C gedurende 20 seconden.  Atomisatie bij 2 250 C gedurende twee tot drie seconden.Stikstofdebiet (spoelgas): 6 l/min.    Opmerking:  Temperatuurverhoging tot 2 700 C aan het eind van de bewerking om de oven te reinigen.4.3.2. Atoomabsorptiemetingen   Kies een golflengte van 217 nm. Stel het nulpunt van de extinctieschaal in met tweemaal gedestilleerd water. Breng met behulp van een micropipet in de oven driemaal 5 µl van elke oplossing van de ijkreeks en van de te onderzoeken monsteroplossing. Leg  de gemeten extincties vast. Bereken de gemiddelde extinctiewaarde uit de resultaten die voor elk van de drie injecties werden verkregen.5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN  5.1. Wijze van berekening   Teken een lijn door de verschillende extinctiewaarden als functie van de loodconcentraties in de oplossingen van de ijkreeks. Dit levert een rechte lijn op. Breng de gemiddelde extinctiewaarde van de monsteroplossing over op de ijkkromme en lees de  loodconcentratie C af. De loodconcentratie in microgram per liter wijn is gelijk aan:C · FF = verdunningsfactor.     36. FLUORIDEN 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Het gehalte aan fluoriden van wijn wordt na toevoeging van een bufferoplossing bepaald met een specifieke elektrode met een vast membraan. De gemeten potentiaal is evenredig aan de logaritme van de fluoride-ionenactiviteit in het onderzochte milieu  volgens de betrekking:E = Eo ± S log aFwaarinE = potentiaal van de ionspecifieke elektrode, gemeten ten opzichte van de referentie-elektrode in het onderzochte medium,Eo = standaardpotentiaal van de meetcel,S = steilheid van de ionspecifieke elektrode  (Nernst-factor). Bij 25 C is de theoretische steilheid gelijk ca. 59,2 mV,aF = activiteit van de fluoride-ionen in de onderzochte oplossing.2. APPARATUUR  2.1. Ionspecifieke fluorelektrode met kristalmembraan  2.2. Referentie-elektrode (Calomel of Ag/AgCl)  2.3. Millivoltmeter (pH-meter met een geijkte millivoltverdeling), met een precisie van 0,1 mV  2.4. Magneetroerder met een isolerende plaat om de onderzochte oplossing tegen de warmte van de motor te beschermen   Roermagneet bekleed met kunststof (polytheen of gelijkwaardig materiaal).   2.5. Kunststofbekers van 30 of 50 ml en kunststofflessen (polytheen of gelijkwaardig materiaal)  2.6. Precisiepipetten (pipetten met een microliterindeling of andere gelijkwaardige pipetten)3. REAGENTIA  3.1. Moederoplossing met 1 g fluoride per liter   Gebruik een standaard handelsoplossing met 1 g/l. Deze oplossing kan worden verkregen door 2,210 g natriumfluoride (drie tot vier uur gedroogd bij 105 C) in gedestilleerd water op te lossen. Vul tot de merkstreep aan met gedestilleerd water. De  oplossing wordt in een kunststoffles bewaard.   3.2. IJkoplossingen van fluoride met geschikte concentratie worden bereid door verdunning van de moederoplossing met gedestilleerd water en bewaard in kunststofflessen. De ijkoplossingen met een fluoridegehalte in de orde van milligram per liter moeten  direct vóór gebruik worden bereid.   3.3. Bufferoplossing pH 5,5   10 g cyclohexaan-diamine(1,2)-tetra-azijnzuur (CDTA) wordt aangevuld met water (ongeveer 50 ml); voeg een oplossing toe met 58 g natriumchloride en 29,4 g trinatriumcitraat in 700 ml gedestilleerd water. Het CDTA wordt opgelost door toevoeging van een  natriumhydroxideoplossing van 32 % (ongeveer 6 ml).    Voeg ten slotte 57 ml azijnzuur (r20 = 1,05 g/ml) toe en breng de pH op 5,5 met de natriumhydroxideoplossing van 32 % (ongeveer 45 ml). Laat afkoelen en vul met gedestilleerd water aan tot 1 l.  4. WERKWIJZE   Opmerking voorafEr dient op te worden gelet dat alle oplossingen tijdens de meting op een temperatuur van 25 ± 1 C blijven. (Een afwijking van ± 1 C veroorzaakt een verandering van ongeveer ± 0,2 mV.)4.1. Directe methode   Breng in een kunststofbeker een bepaald volume wijn en een gelijk volume bufferoplossing.    De oplossing wordt gelijkmatig en niet te sterk geroerd. Lees de waarde van de potentiaal in mV af wanneer de aanwijzing van het apparaat stabiel is geworden (dit is het geval wanneer de potentiaal niet meer dan 0,2-0,3 mV per drie minuten  varieert).4.2. Methode waarbij bekende hoeveelheden worden toegevoegd   Aan het onderzochte medium wordt onder voortdurend mengen met behulp van een precisiepipet een bekend volume toegevoegd van de ijkoplossing met fluoride. Lees de potentiaalwaarde in mV af zodra het apparaat een stabiele aanwijzing vertoont.    Kies de concentratie van de toegevoegde ijkoplossing als volgt:a) verdubbel of verdrievoudig de fluorideconcentratie in het onderzochte medium;b) het volume van het onderzochte medium moet praktisch constant blijven(volumetoename d 1 %).(Voorwaarde b)  vereenvoudigt de berekeningen, zie punt 5).    De globale concentratie van het onderzochte medium wordt afgelezen op een ijklijn die semi-logaritmisch is uitgezet met ijkoplossingen van 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 en 2,0 mg/l fluoride.    OpmerkingAls de globale concentratie van het onderzochte medium hoger is dan die van de ijkoplossing met het hoogste gehalte, moet het monster worden verdund.    VoorbeeldStel het globale gehalte van het onderzochte medium (volume 20 ml) is 0,25 mg/l F ; de concentratie moet met 0,25 mg/l worden verhoogd. Voeg daartoe aan de oplossing met een geschikte precisiepipet bij voorbeeld 0,20 ml (= 1 %) toe van een  standaardoplossing van 25 mg/l F  of 0,050 ml van een standaardoplossing van 100 mg/l F .5. BEREKENINGEN   Het fluoridegehalte in mg/l van het onderzochte medium wordt met behulp van de volgende formule verkregen:waarinCF = fluorideconcentratie van het onderzochte medium (mg/l),Ca = aan het onderzochte medium toegevoegde fluorideconcentratie (mg/l),Vo =  beginvolume van het onderzochte medium vóór extra toevoeging (ml),Va = beginvolume van de extra toegevoegde oplossing (ml),D E = verschil in potentiaalwaarden E1 en E2 die in de punten 4.1 en 4.2 zijn verkregen (mV);S = steilheid van de elektrode in de  onderzochte oplossing.    Als Va dicht bij Vo ligt (4.2) wordt de formule vereenvoudigd tot:  De verkregen waarde moet vermenigvuldigd worden met de verdunningsfactor ten gevolge van de toevoeging van de bufferoplossing.      37. KOOLSTOFDIOXIDE 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN 1.1. Referentiemethode  1.1.1.Niet-mousserende wijn (koolstofdioxideoverdruk E 0,5·105 Pa) (11)   Uit de op ongeveer 0 °C gebrachte wijn wordt een hoeveelheid monster genomen dat wordt toegevoegd aan een zodanige overmaat gestelde natronloog dat de pH 10 11 wordt. Het mengsel wordt in aanwezigheid van koolzuuranhydrase getitreerd met zuur. Het  koolstofdioxidegehalte wordt afgeleid uit het volume dat is gebruikt om van pH 8,6 (bicarbonaatvorm) naar pH 4,0 (koolzuur) te komen. Met een blanco titratie uitgevoerd op de koolzuurvrij gemaakte wijn onder dezelfde omstandigheden kan worden  gecorrigeerd voor de hoeveelheid door de overige zuren van de wijn verbruikte natronloog.1.1.2. Parelwijn en mousserende wijn   Het monster wordt genomen als de temperatuur van de wijn in de buurt van het vriespunt ligt. Na een bepaald volume ten behoeve van de blanco bepaling te hebben genomen, wordt base aan de rest van de fles toegevoegd om alle CO2 als natriumcarbonaat  Na2CO3 vast te leggen. De verkregen oplossing wordt in aanwezigheid van koolzuuranhydrase met zuur getitreerd. Het koolstofdioxidegehalte wordt afgeleid uit het volume zuur dat is gebruikt om de pH van 8,6 (bicarbonaatvorm) naar pH 4,0 (koolzuur) te  brengen. Met een blanco titratie uitgevoerd op de koolzuurvrij gemaakte wijn onder dezelfde omstandigheden kan worden gecorrigeerd voor de hoeveelheid door de overige zuren van de wijn verbruikte natronloog.1.2.Gebruikelijke methode: parelwijn en  mousserende wijn   Manometermethode: directe bepaling van de koolstofdioxideoverdruk in de fles met behulp van een overdrukmeter.2. REFERENTIEMETHODE  2.1. Niet-mousserende wijn (koolstofdioxideoverdruk E 0,5 · 105 Pa)2.1.1. Apparatuur  2.1.1.1. Magneetroerder  2.1.1.2. pH meter2.1.2. Reagentia  2.1.2.1. Natriumhydroxideoplossing, NaOH, 0,1 M  2.1.2.2. Zwavelzuuroplossing, H2SO4, 0,05 M 2.1.2.3. Koolzuuranhydraseoplossing van 1 g/l2.1.3. Werkwijze   Koel de te bemonsteren wijn alsmede de pipet van 10 ml waarmee het monster wordt genomen af tot 0 °C.    Breng in een bekerglas van 100 ml 25 ml natriumhydroxideoplossing (2.1.2.1) en voeg twee druppels van de waterige koolzuuranhydraseoplossing (2.1.2.3) toe. Pipetteer met de tot op 0 °C afgekoelde pipet 10 ml wijn bij dit mengsel.     Breng een roerstaafje in het bekerglas, plaats dit op de magneetroerder en breng de elektrode in; laat de roerder kalm draaien.    Voeg, wanneer de inhoud van het bekerglas op kamertemperatuur is gekomen, langzaam zwavelzuuroplossing (2.1.2.2) toe totdat de pH de waarde 8,6 bereikt.  Druppel dan verder zwavelzuuroplossing (2.1.2.2) toe tot pH 4,0. Het verbruik aan zwavelzuur tussen pH 8,6 en 4,0 zij n ml.    Verwijder tevens het CO2 uit ongeveer 50 ml wijn door gedurende drie minuten onder vacuuem en onder verwarming van de kolf op een waterbad van ongeveer 25 °C te schudden.    Pas de hierboven beschreven werkwijze toe op 10 ml koolzuurvrij gemaakte wijn: het verbruik aan zwavelzuur zij n2 ml.2.1.4. Weergave van de resultaten   1 ml zwavelzuuroplossing 0,1 M komt overeen met 4,4 mg CO2.    De hoeveelheid CO2 in gram per liter wijn is dus:0,44 · (n   n2).Het gehalte wordt opgegeven met twee decimalen.    Opmerking:Bij wijnen met een laag CO2-gehalte (<  1 g/l) kan de toevoeging van koolzuuranhydrase om de hydratatie van CO2 te katalyseren achterwege blijven.2.2. Parelwijn en mousserende wijn  2.2.1. Apparatuur  2.2.1.1. Magneetroerder  2.2.1.2. pH-meter2.2.2. Reagentia  2.2.2.1. Natriumhydroxideoplossing, NaOH, 50 % (m/m)  2.2.2.2. Zwavelzuuroplossing, H2SO4, 0,05 M  2.2.2.3. Koolzuuranhydraseoplossing van 1 g/l2.2.3. Werkwijze   Zet op de fles met de te analyseren wijn een streepje op de hoogte van het vloeistofniveau en koel de fles af totdat de wijn begint te stollen.    Laat onder schudden de fles weer langzaam opwarmen totdat de ijskristallen zijn verdwenen.    Ontkurk de fles dan snel en giet 45 50 ml wijn in een maatcilinder. Deze hoeveelheid is bestemd voor de blanco bepaling. Het exacte volume wordt pas afgelezen nadat de wijn weer op kamertemperatuur is gekomen.    Breng, zodra dit blanco monster is genomen, 20 ml natriumhydroxideoplossing (2.2.2.1) in de fles, uitgaande van een totale inhoud van de fles van 750 ml.    Wacht tot de wijn op kamertemperatuur is gekomen.     Breng in een bekerglas van 100 ml 30 ml uitgekookt gedestilleerd water en twee druppels koolzuuranhydraseoplossing (2.2.2.3). Voeg hieraan toe 10 ml alkalisch gemaakte wijn.    Breng een roerstaafje in het bekerglas, plaats dit op de magneetroerder en breng de elektrode in; laat de roerder kalm draaien.    Voeg langzaam zwavelzuuroplossing (2.2.2.2) toe totdat de pH de waarde 8,6 bereikt.    Druppel dan verder zwavelzuuroplossing (2.2.2.2) toe tot pH 4,0. Het verbruik aan zwavelzuur tussen pH 8,6 en 4,0 zij n ml.    Verwijder tevens het CO2 uit de voor de blanco bepaling apart gehouden hoeveelheid wijn, v ml, door gedurende drie minuten onder vacuuem en onder verwarming van de kolf op een waterbad van ongeveer 25 °C te schudden. Breng 10 ml koolzuurvrij gemaakte  wijn in een bekerglas van 100 ml waarin al 30 ml uitgekookt gedestilleerd water aanwezig is. Voeg twee à drie druppels natriumhydroxideoplossing (2.2.2.1) toe om de pH op 10 11 te brengen. Pas vervolgens de hierboven beschreven werkwijze toe. Het  verbruik aan zwavelzuur zij n2 ml.2.2.4. Weergave van de resultaten   1 ml zwavelzuuroplossing 0,05 M komt overeen met 4,4 mg CO2.    Giet de alkalisch gemaakte wijn uit de fles en bepaal het oorspronkelijke volume tot op 1 ml nauwkeurig door de fles tot het aangebrachte streepje te vullen met water, het volume is V ml.    De hoeveelheid CO2 in gram per liter wijn is dus:Het gehalte wordt opgegeven met twee decimalen.2.3. Berekening van de overdruk   De overdruk bij 20 °C, Paph20, uitgedrukt in pascal, wordt door volgende formule gegeven:waarinQ =  CO2 gehalte (g) per liter wijn,A =  alcoholgehalte van wijn bij 20 °CS =  suikergehalte van wijn (g/l),Patm = atmosferische druk (pascal),3.  GEBRUIKELIJKE  METHODE  (PARELWIJN  EN  MOUSSERENDE  WIJN)  3.1. Apparatuur  3.1.1. Overdrukmeter   Het apparaat waarmee de overdruk in flessen parelwijn en mousserende wijn kan worden gemeten wordt een overdrukmeter genoemd. Dit apparaat bestaat, afhankelijk van de sluiting van de fles (metalen capsule, kroonkurk, kurk of plastic sluitdop, zie de  figuren 1 en 2), in verschillende vormen.    De overdrukmeters zijn afleesbaar in pascal (afkorting Pa) (12). Praktisch gezien verdient het de voorkeur als eenheid te gebruiken 105 pascal (105 Pa) of kilopascal (kPa).     Zij bestaan in verschillende nauwkeurigheidsklassen. Onder de nauwkeurigheid van zo'n manometer wordt verstaan de precisie van de aflezing ten opzichte van de volle schaal, uitgedrukt in een percentage (bij voorbeeld: een manometer 1 000 kPa klasse 1  betekent maximale gebruiksdruk 1 000 kPa, aflezing ± 10 kPa). Klasse 1 wordt aanbevolen voor nauwkeurige metingen.    De overdrukmeters dienen regelmatig te worden geijkt (ten minste eens per jaar).3.2. Werkwijze   De meting wordt uitgevoerd op flessen waarvan de temperatuur ten minste 24 uur is gestabiliseerd.    Na de capsule of de kurk te hebben doorboord, moet de fles vervolgens krachtig worden geschud totdat een constante druk is verkregen, waarna de waarde wordt afgelezen.      Figuur 1: Overdrukmeter voor capsule.Figuur 2: Overdrukmeter voor kurk. 3.3. Weergave van de resultaten   De overdruk bij 20 °C (Paph20) wordt uitgedrukt in pascal (Pa) of in kilopascal (kPa).    De aflezing moet overeenkomen met de nauwkeurigheid van de manometer (bij voorbeeld 6,3 · 105 Pa of 630 kPa en niet 6,33 · 105 Pa of 633 kPa voor een manometer 1 000 kPa volle schaal, klasse 1).    Indien de meting niet bij 20 °C is uitgevoerd dient hiervoor te worden gecorrigeerd door de gemeten druk te vermenigvuldigen met de in tabel 1 vermelde coëfficiëntwaardoor een herleiding naar 20 °C plaatsvindt.4. RELATIE  TUSSEN  DE  DRUK  EN  DE   HOEVEELHEID  KOOLSTOFDIOXIDE  IN  EEN  MOUSSERENDE  WIJN (13)   Met behulp van de overdruk bij 20 °C (Paph20) kan de absolute druk bij 20 °C (Pabs20) worden berekend volgens de formule:Pabs20 = Patm + Paph20    waarin Patm de atmosferische druk is, uitgedrukt in pascal.       De hoeveelheid koolstofdioxide in wijn wordt dan gegeven door de volgende vergelijkingen:- in liters CO2 per liter wijn:0,987 · 10 5 · Pabs20 (0,86   0,01 · A) (1 0,00144 · S)- in gram CO2 per liter wijn:1,951 · 10 5 · Pabs20 (0,86   0,01 · A) (1  0,00144 · S)waarinA = het alcoholvolumegehalte van de wijn bij 20 °C,S = het suikergehalte van de wijn, uitgedrukt in gram per liter.   TABEL 1Verhouding van de overdruk Paph20 van parelwijn of mousserende wijn bij 20 °C en de overdruk Papht bij temperatuur t     38. CYAANVERBINDINGEN 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN  1.1. Screeningmethode: onderzoek van met kaliumhexacyanoferraat(II) behandelde wijn.    Test op afwezigheid van zwevende of neergeslagen deeltjes van ijzer(III)hexacyanoferraat(II).    Test op afwezigheid van te vormen ijzer(III)hexacyanoferraat(II) bij toevoeging van een driewaardig ijzerzout aan de aangezuurde wijn.    Test op aanwezigheid van ijzerionen door toevoeging van een mengsel van kaliumhexacyanoferraat(II) en kaliumhexacyanoferraat(III) aan de aangezuurde wijn.1.2. Gebruikelijke methode   Argentometrische bepaling van totaal cyaanwaterstofzuur na zure hydrolyse en destillatie van het vrijgemaakte cyaanwaterstofzuur.2. SCREENINGMETHODE   Onderzoek van met kaliumhexacyanoferraat(II) behandelde wijn.2.1. Apparatuur   Eén van de volgende apparaten moet ter beschikking zijn:   2.1.1. Centrifuge, waarmee bij 1 200 à 1 500 g kan worden gecentrifugeerd  2.1.2. Filtratieopstelling met filterdoek (poriëndiameter 0,45 mm)2.2. Reagentia  2.2.1. Zoutzuuroplossing, 1 tot 2 verdund (v/v), te bereiden uit zoutzuur, HCl (r20 = 1,18   1,19 g/ml), ijzervrij  2.2.2. IJzer(III)ammoniumsulfaat, Fe2(SO4)3 · (NH4)2 SO4 · 24 H2O, 15 % (m/v)  2.2.3. Kaliumhexacyanoferraat(II)oplossing, K4 [Fe(CN)6] · 3H2O, 10 % (m/v)  2.2.4. Kaliumhexacyanoferraat(III)oplossing, K3 [Fe (CN)6], 10 % (m/v)Bereid deze oplossing vlak voor gebruik.2.3. Werkwijze  2.3.1. Test op zwevende deeltjes ijzer(III)hexacyanoferraat(II)   Schud het monster goed om. Breng 20 ml wijn in een konische centrifugeerbuis van 30 ml; voeg 1 ml verdund zoutzuur (2.2.1) toe en centrifugeer gedurende 15 minuten of filtreer door een filterdoek (poriënwijdte = 45 mm). Er mag geen blauw gekleurde  afzetting op de bodem van de centrifugeerbuis of op de filterdoek waarneembaar zijn.2.3.2. Test op afwezigheid van hexacyanoferraat(II)ionen   Voeg aan de bovenstaande vloeistof of aan het filtraat, verkregen bij 2.3.1, één druppel ijzer(III)ammoniumsulfaatoplossing (2.2.2) toe. Schud en laat ten minste 24 uur staan. Centrifugeer 15 minuten of filtreer over een filterdoek (poriënwijdte = 0,45  mm). Er mogen geen blauw gekleurde deeltjes ijzer(III)hexacyanoferraat(II) op de bodem van de centrifugebuis of op de filterdoek waarneembaar zijn.2.3.3. Test op aanwezigheid van ijzerionen in de wijn   Breng in een reageerbuis 20 ml wijn, 1 ml verdund zoutzuur (2.2.1), één druppel kaliumhexacyanoferraat(II) (2.2.3) en één druppel kaliumhexacyanoferraat(III) (2.2.4). Binnen 30 minuten moet in het mengsel een blauwkleuring dan wel een blauwe neerslag  zijn gevormd. Centrifugeer het mengsel of filtreer het mengsel over een filterdoek (poriënwijdte = 0,45 mm) en was de filterdoek tweemaal na met 5 ml gedestilleerd water. Er moet dan in de centrifugebuis of op de filterdoek een blauwe neerslag zichtbaar  zijn.3. GEBRUIKELIJKE  METHODE  3.1. Apparatuur  3.1.1. Destillatieopstelling, bestaande uit een rondbodemkolf van 500 ml, die via een glasbuis met slijpstukken is verbonden met de bovenkant van een koeler met een lengte van ten minste 350 mm, welke verticaal is opgesteld   De onderkant van deze koeler is voorzien van een allonge met uitgetrokken uiteinde die het destillaat naar de bodem van de opvangkolf van 50 ml leidt, welke tot de hals is gedompeld in ijswater.   3.1.2. Warm-waterbad, elektrisch gethermostatiseerd op 100 °C3.2. Reagentia  3.2.1. Zwavelzuuroplossing, 1 tot 5 verdund (v/v)   Meng voorzichtig zoveel water met 200 ml zwavelzuur, H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml), dat 1 l oplossing resulteert.   3.2.2. Koper(II)chloride gekristalliseerd, CuCl2 · 2H2O  3.2.3. Fenolroodoplossing   Los 0,05 g fenolrood op in 1,4 ml natriumhydroxideoplossing 0,1 M; vul aan tot 1 000 ml.   3.2.4. Kaliumjodideoplossing   Los 250 g kaliumjodide, KJ, op in water tot 1 l.   3.2.5. Zilvernitraatoplossing 0,001 M   Vul 10 ml zilvernitraatoplossing, AgNO3, 0,1 M onder toevoeging van 0,5 ml geconcentreerd salpeterzuur, HNO3 (r20 = 1,40 g/ml), aan tot 1 000 ml.   3.2.6. Natriumhydroxideoplossing, 1 M, ijzervrij3.3. Werkwijze   Breng in de rondbodemkolf 100 ml gefiltreerde wijn (of niet gefiltreerde wijn, als ook het gehalte aan cyaanwaterstofzuur in de eventuele neerslag moet worden bepaald), voeg ongeveer 5 mg koper(II)chloride (3.2.2) en 10 ml verdund zwavelzuur (3.2.1)  toe. Breng in de opvangkolf 5 ml natriumhydroxideoplossing (3.2.6). Destilleer tot in de opvangkolf een volume van 50 ml is bereikt.    Breng het destillaat over in een bekerglas van 400 ml en plaats dit op een kokend waterbad. Leid om het indampen te bevorderen een koude luchtstroom over het oppervlak van de alkalische oplossing. Damp in tot een volume van 5 à 7 ml, hetgeen ongeveer  30 minuten duurt (het volume mag niet beneden 5 ml komen).    Na afkoeling wordt de oplossing indien noodzakelijk gefiltreerd, waarbij het filtraat wordt opgevangen in een maatcilinder van 20 mm diameter en 180 mm hoogte. Indien filtratie niet noodzakelijk is wordt de oplossing direct in de maatcilinder  overgebracht. Was het bekerglas en eventueel het filter met enkele milliliters water en voeg dit bij de maatcilinder.    Plaats de maatcilinder tegen een zwarte achtergrond en belicht van opzij met wit licht. De vloeistof moet volkomen helder zijn (14).    Voeg twee druppels fenolroodoplossing (3.2.3) toe om de kleuromslag duidelijker te maken (15) en één druppel kaliumjodideoplossing (3.2.4). Titreer met zilvernitraatoplossing (3.2.5) tot een zwakke, maar blijvende troebeling optreedt. Het verbruikte  aantal ml zilvernitraatoplossing zij n ml.    Breng in een tweede maatcilinder 5 ml natriumhydroxideoplossing (3.2.6), twee druppels fenolroodoplossing (3.2.3) (15), één druppel kaliumjodideoplossing (3.2.4) en zoveel water dat het volume in deze maatcilinder gelijk is aan dat in de maatcilinder  met monsteroplossing. Titreer met zilvernitraatoplossing (3.2.5) totdat dezelfde troebeling optreedt als in het monster. Het verbruikte aantal ml zilvernitraatoplossing zij n2 ml (16).3.4. Weergave van de resultaten   1 ml 0,001 M zilvernitraatoplossing komt overeen met 54 mg cyaanwaterstofzuur, HCN.    Het totale cyaanwaterstofzuurgehalte van wijn, uitgedrukt in milligram per liter, is 0,54 · (n   n2). Het gehalte wordt opgegeven met twee decimalen.    Cyaanverbindingen worden geacht aanwezig te zijn als n   n2 groter is dan 0,5 ml.    Indien n   n2 groter is dan 10 ml dient de bepaling te worden herhaald met 0,01 M zilvernitraatoplossing.     39. ALLYLISOTHIOCYANAAT 1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Het eventueel in wijn aanwezige allylisothiocyanaat wordt door destillatie afgescheiden en gaschromatografisch geïdentificeerd.2. REAGENTIA  2.1. Ethylalcohol absoluut  2.2. Standaardoplossing: oplossing van 15 mg/l allylisothiocyanaat in absolute ethylalcohol  2.3. Koudmakend mengsel van ethanol en vast kooldioxide (temperatuur  60 °C)3. APPARATUUR  3.1. Destillatieopstelling onder doorleiding van stikstof (zie figuur)  3.2. Regelbare verwarmingsmantel  3.3. Zeepvliesmeter  3.4. Gaschromatograaf voorzien van een vlamfotometerdetector met zwavelfilter (l = 394 nm)  3.5. Roestvaststalen kolom, inwendige diameter 3 mm, lengte 3 m, gevuld met 10 % Carbowax 20 M op Chromosorb WHP, 80-100 mesh  3.6. Injectiespuit van 10 µl4. WERKWIJZE   Breng 2 l wijn in de destillatiekolf. Vul de twee opvangbuizen met zoveel ethylalcohol (2.1) dat het poreuze gedeelte zich volledig onder het vloeistofniveau bevindt. Koel de twee opvangbuizen met het koudmakend mengsel. Verbindt de destillatiekolf met  de opvangbuizen en leidt een stroom stikstof door met een snelheid van 3 l/uur. Verwarm de wijn tot 80 °C door de verwarmingsmantel op een daarvoor geschikte stand in te stellen en vang in totaal 45-50 ml destillaat op.    Conditioneer de gaschromatograaf waarbij de volgende instellingen als richtsnoer kunnen dienen:- injectietemperatuur: 200 °C,- kolomtemperatuur: 130 °C,- draaggassnelheid: 20 ml helium per minuut.    Injecteer met de injectiespuit een zodanige hoeveelheid standaardoplossing dat de piek afkomstig van allylisothiocyanaat gemakkelijk in het gaschromatogram kan worden geidentificeerd. Injecteer onder dezelfde omstandigheden een gelijke hoeveelheid  destillaat en controleer of in het chromatogram een piek voorkomt met dezelfde retentietijd als allylisothiocyanaat. Onder de aangegeven omstandigheden geeft geen enkele natuurlijke component van wijn een piek met de retentietijd van  allylisothiocyanaat.    Destillatieopstelling onder doorleiding van stikstof     40. KLEURKENMERKEN 1. WIJN  EN  MOST  1.1. Definities   Onder kleurkenmerken van wijn wordt verstaan de helderheid en de kleur.    De helderheid wordt bepaald door de transmissie. Deze varieert omgekeerd evenredig aan de kleurintensiteit van de wijn.    De kleur wordt bepaald door de dominante golflengte (welke de nuance aangeeft) en door de zuiverheid.    De kleurkenmerken van rode en rosé wijn worden gemakshalve en volgens afspraak uitgedrukt in de kleurintensiteit en de nuance volgens de volgende gebruikelijke methode.1.2. Principe van de methoden  1.2.1. Referentiemethode   Spectrofotometrische methode waarmee de tristimuluswaarden en de trichromatische coëfficiënten kunnen worden berekend noodzakelijk om de kleur te specificeren in door de ""Commission Internationale de l'éclairage" (CIE) gehanteerde waarden.1.2.2.  Gebruikelijke methode (toepasbaar voor rode en rosé wijn)   Spectrofotometrische methode volgens welke de kleurkenmerken volgens afspraak worden uitgedrukt zoals hieronder aangegeven:    - de intensiteit is de som van de extincties gemeten bij 1 cm optische weglengte voor de straling van de golflengtes van 420, 520 en 620 nm;- de nuance is de verhouding tussen de extincties bij 420 en 520 nm.1.3. Referentiemethode  1.3.1. Apparatuur  1.3.1.1. Spectrofotometer waarmee metingen kunnen worden uitgevoerd tussen 300 en 700 nm  1.3.1.2. Glascuvetten, gepaard, met een optische weglengte, b, van 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2 en 4 cm1.3.2.Werkwijze  1.3.2.1. Voorbehandeling van het monster.    Om troebele wijn helder te maken dient te worden gecentrifugeerd of te worden gefiltreerd over een membraanfilter.    Jonge of mousserende wijn moet van het grootste gedeelte aan koolstofdioxide worden ontdaan door schudden onder vacuuem.1.3.2.2.Bepalingen   De optische weglengte, b, van de te gebruiken cuvetten moet zodanig worden gekozen dat de extinctie tussen 0,3 en 0,7 ligt.     Hierom is het aangeraden cuvetten met een optische weglengte van 2 cm (of 4 cm) te gebruiken voor witte wijn, 1 cm voor rosé wijn en 0,1 (of 0,2 cm) voor rode wijn.    Voer de spectrofotometrische metingen uit met als blanco gedestilleerd water, in een cuvette met dezelfde optische weglengte b als deze waarmee de extincties op nul worden ingesteld bij 445, 495, 550 en 625 nm.   Noteer de voor wijn gemeten extincties bij optische weglengte b met drie cijfers achter de komma, dus E445, E495, E550 en E625.1.3.3. Berekeningen   Deze gevonden extinctiewaarden bij b mm optische weglengte kunnen met tabel 1 in de hiermee overeenkomende transmissies worden omgezet: T445, T495, T550 en T625.    - Bereken de tristumuluswaarden X, Y en Z, uitgedrukt in decimalen:X = 0,42 · T625 + 0,35 · T550 + 0,21 · T445Y = 0,20 · T625 + 0,63 · T550 + 0,17 · T495Z = 0,24 · T495 + 0,94 · T445- Bereken de kleurcooerdinaten x en y:1.3.4.Weergave van de resultaten  1.3.4.1. De relatieve helderheid is de waarde van Y, uitgedrukt in procenten (voor zwart Y % = 0, voor kleurloos Y % = 100).   1.3.4.2. De kleur wordt uitgedrukt in de dominante golflengte en in de zuiverheid.    Bij de bepalingen van deze twee grootheden wordt gebruik gemaakt van het kleurendiagram, zoals aangegeven in figuur 1. Hierin komt het punt 0 voor dat overeenkomt met wit licht; in het diagram wordt dit weergegeven door de lichtstandaard C met de  cooerdinaten xo = 0,3101 en yo = 0,3163, overeenkomend met het gemiddelde daglicht.    - Dominante golflengteZet in het diagram het punt C met de cooerdinaten x en y. Indien punt C buiten de driehoek AOB valt, trek dan de rechte die de punten O en C verbindt en verleng deze rechte tot het snijpunt S van de spectrumkromme. Dit punt S komt  overeen met de dominante golflengte.Indien punt C binnen de driehoek AOB valt, trek dan de rechte die de punten C en O verbindt; deze rechte snijdt de spectrumkromme in een punt dat overeenkomt met de complementaire kleur van de wijn. Deze golflengte  wordt aangegeven door haar waarde gevolgd door de letter C.- ZuiverheidIndien punt C buiten de driehoek AOB valt, wordt de zuiverheid in procenten aangegeven door de volgende verhouding:Indien punt C binnen de driehoek AOB valt, wordt de zuiverheid in  procenten aangegeven door de volgende verhouding: (17)  Punt P is het punt waar de rechte OC de purperkromme snijdt.De zuiverheid kan ook direct worden afgelezen uit het kleurendiagram indien x en y bekend zijn (figuren 2, 3, 4, 5 en 6).   1.3.4.3. Resultaten   De helderheid, de kleur (als dominante golflengte) en de zuiverheid definiëren de wijnkleur volledig.    Zij moeten op het analyseformulier worden vermeld samen met de waarde van de optische weglengte waarmee de metingen zijn uitgevoerd.1.4. Gebruikelijke methode  1.4.1. Apparatuur  1.4.1.1. Spectrofotometer waarmee metingen kunnen worden uitgevoerd tussen 300 en 700 nm  1.4.1.2. Glascuvetten, gepaard, met een optische weglengte, b, van 0,1, 0,2, 0,5 en 1 cm1.4.2. Voorbehandeling van het monster   Om troebele wijn helder te maken, dient te worden gecentrifugeerd.    Jonge of mousserende wijn moet van het grootste gedeelte aan koolstofdioxide worden ontdaan door schudden onder vacuuem.1.4.3. Bepalingen   De optische weglengte, b, van de te gebruiken cuvette moet zodanig worden gekozen dat de te meten extinctie E tussen 0,3 en 0,7 ligt.    Voer de spectrofotometrische metingen uit met als blanco gedestilleerd water in een cuvette met dezelfde optische weglengte b waarmee de extincties op nul worden ingesteld bij 420, 520 en 620 nm.1.4.4. Weergave van de resultaten  1.4.4.1.Berekeningen   Bereken de bij deze drie golflengten gemeten extinctie bij 1 cm optische weglengte door te delen door b, uitgedrukt in centimeter. Deze is dan E420, E520 en E620.    Volgens afspraak is de intensiteit dan:I = E420 + E520 + E620.Het resultaat wordt opgegeven met drie cijfers achter de komma.    Volgens afspraak is de nuance dan:Het resultaat wordt opgegeven met drie cijfers achter de komma.   TABEL  I   Omzetting extincties in transmissies (T %)   Gebruiksaanwijzing   Zoek het eerste cijfer achter de komma van de extinctie op in de eerste verticale kolom en het tweede cijfer achter de komma in de eerste horizontale rij. Noteer het getal op de plaats waar de verticale en de horizontale lijnen elkaar snijden. Om dit  om te zetten in transmissie-eenheden moet dit getal gedeeld worden door 10 als de extinctie lager is dan 1, door 100 als de extinctie ligt tussen 1 en 2 en door 1 000 als de extinctie ligt tussen 2 en 3.    Opmerking:Met de getallen rechtsboven in elk vakje kan worden geïnterpoleerd voor het derde cijfer achter de komma van de extinctie.      Voorbeeld:Extinctie  0,47 1,47 2,47 3,47Transmissie 33,9 % 3,4 % 0,3 % 0 %De transmissie wordt tot op 1 decimaal nauwkeurig opgegeven.     Figuur 1Kleurendiagram met de plaats van alle kleuren van het spectrum.     Figuur 2Kleurendiagram voor helrode en door veroudering oranjekleurig geworden wijnen.     Figuur 3Kleurendiagram voor helrode en door veroudering oranjekleurig geworden wijnen.     Figuur 4Kleurendiagram voor helrode en purperrode wijnen.     Figuur 5Kleurendiagram voor helrode en purperrode wijnen.     Figuur 6Kleurendiagram voor door veroudering oranjekleurig geworden wijnen en voor purperrode wijnen.  2. GERECTIFICEERDE  GECONCENTREERDE  MOST  2.1. Principe van de methoden   Meting van de extinctie bij 425 nm en 1 cm weglengte van de gerectificeerde geconcentreerde most, waarvan het suikergehalte is teruggebracht tot 25 % (m/m) (25 °Brix).2.2. Apparatuur  2.2.1. Spectrofotometer waarmee metingen kunnen worden uitgevoerd tussen 300 en 700 nm  2.2.2. Glascuvetten met een optische weglengte van 1 cm  2.2.3. Membraanfilter met poriënwijdte van 0,45 µm2.3. Werkwijze  2.3.1. Voorbehandeling van het monster   Gebruik de oplossing waarvan het suikergehalte op 25 % (m/m) (25 °Brix) is gebracht, zoals aangegeven in punt 4.1.2 van het hoofdstuk ""Bepaling van de pH". Filtreer deze oplossing over een membraanfilter met poriënwijdte van 0,45 µm.2.3.2. Bepaling  van de extinctie   Stel het nulpunt in bij een golflengte van 425 nm met een cuvette van 1 cm optische weglengte gevuld met gedestilleerd water. Meet de extinctie E bij deze golflengte van de oplossing met 25 % (m/m) (25 °Brix) suiker, zoals bij punt 2.3.1 is verkregen,  in een cuvette met 1 cm optische weglengte.2.4. Weergave van de resultaten   De extinctie bij 425 nm van de gerectificeerde geconcentreerde most, in de oplossing met 25 % (m/m) suiker (25 °Brix), wordt opgegeven met twee decimalen.     41. FOLIN-CIOCALTEU-GETAL 1. DEFINITIE   Het Folin-Ciocalteu-getal is het resultaat verkregen door toepassing van onderstaande methode.2. PRINCIPE   Het totaal aan fenolische stoffen van de wijn wordt met Folin-Ciocalteu-reagens geoxideerd. Het Folin-Ciocalteu-reagens bestaat uit een mengsel van fosfowolfraamzuur (H3PW12O40) en fosfomolybdeenzuur (H3PMo12O40) dat bij de oxidatie van fenolen wordt  gereduceerd tot een blauwgekleurd mengsel van wolfraamoxide (W8O23) en molybdeenoxide (Mo8O23).    De gevormde blauwgekleurde verbinding heeft een absorptiemaximum bij 750 nm en is evenredig aan het gehalte aan fenolische stoffen.3. REAGENTIA   De te gebruiken reagentia moeten van analysekwaliteit zijn. Water dient te zijn gedistilleerd of van een gelijkwaardige zuiverheid te zijn.3.1. Folin-Ciocalteu-Reagens   Dit reagens is kant en klaar in de handel verkrijgbaar. Het kan ook worden bereid door 100 g natriumwolframaat, Na2WO4,2H2O, en 25 g natriummolybdaat, Na2MoO4,2H2O, op te lossen in 700 ml gedestilleerd water en hieraan toe te voegen 50 ml fosforzuur 85  % (H3PO4, r20 = 1,71 g/ml) en 100 ml geconcentreerd zoutzuur (HCl,r20 = 1,19 g/ml). Breng onder reflux aan de kook gedurende tien uur, voeg vervolgens 150 g lithiumsulfaat, Li2SO4·H2O en enkele druppels broom toe en laat opnieuw gedurende 15 minuten  koken. Koel af en vul aan tot 1 l met gedistilleerd water.   3.2. Natriumcarbonaat (Na2CO3) watervrij, 20 % (m/v)4. APPARATUUR   Gebruikelijke laboratoriumuitrusting, en met name:   4.1. maatkolven van 100 ml;   4.2. Spectrofotometer waarmee bij 750 nm kan worden gemeten.5. WERKWIJZE  5.1. Rode wijn   Breng in een maatkolf van 100 ml (4.1) achtereenvolgens: 1 ml 1 op 5 verdunde wijn,50 ml gedestilleerd water, 5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (3.1),20 ml natriumcarbonaatoplossing (3.2).    Vul aan tot 100 ml met gedistilleerd water.    Homogeniseer door schudden. Wacht 30 minuten om de reactie tot een evenwichtstoestand te laten komen. Bepaal de extinctie bij 750 nm in een cuvette van 1 cm tegen een blanco waarin de wijn is vervangen door gedistilleerd water.    Indien de aflezing niet in de buurt van 0,3 ligt, dient de bepaling opnieuw te worden uitgevoerd met een gewijzigde verdunning van de wijn om een dergelijke aflezing te krijgen.  5.2. Witte wijn   Neem onder dezelfde omstandigheden 1 ml onverdunde wijn in bewerking.5.3.Gerectificeerde geconcentreerde most  5.3.1. Voorbehandeling van het monster   Gebruik de oplossing waarvan het suikergehalte op 25 % (m/m) (25 °Brix) is gebracht, zoals aangegeven in punt 4.1.2 van het hoofdstuk ""Bepaling van de pH".5.3.2. Bepaling   Ga te werk zoals aangegeven voor rode wijn (5.1) en neem hierbij 5 ml volgens punt 5.3.1 voorbehandeld monster in bewerking; voer de meting uit tegen een blanco bereid met 5 ml geïnverteerde suikeroplossing van 25 % (m/m).6. WEERGAVE  VAN  DE   RESULTATEN  6.1. Berekening   De uitkomst wordt uitgedrukt in de vorm van een getal, verkregen door de aflezing te vermenigvuldigen met 100 voor rode wijn die 1 op 5 is verdund (of met een factor die overeenkomt met de gebruikte verdunning) en met 20 voor witte wijn. Bij  gerectificeerde geconcentreerde most moet de extinctie vermenigvuldigd worden met 16.6.2. Herhaalbaarheid   Het verschil tussen de uitkomsten van een bepaling in duplo, gelijktijdig of kort na elkaar uitgevoerd door dezelfde analist, mag niet groter zijn dan 1.    Een goede herhaalbaarheid van de resultaten hangt sterk samen met het gebruik van zorgvuldig gereinigde apparatuur (maatkolven en cuvetten).     42. SPECIALE  ANALYSEMETHODEN  VOOR  GERECTIFICEERDE  GECONCENTREERDE  MOST a) TOTAAL  KATIONEN  1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Het monster wordt behandeld met een sterk zure kationenwisselaar. De kationen worden uitgewisseld tegen H+-ionen. Het kationengehalte wordt opgegeven als het getal dat het verschil aangeeft van het totale zuur in het eluaat en dat van het monster  zelf.2. APPARATUUR  2.1. Glazen buis met een lengte van ongeveer 300 mm en een inwendige doorsnede van 10-11 mm, voorzien van een kraan  2.2. pH-meter, afleesbaar in ten minste 0,1 pH-eenheden  2.3. Elektroden:- glaselektrode, te bewaren in gedistilleerd water;- Calomel-referentie-elektrode, verzadigd met kaliumchloride, te bewaren in een verzadigde kaliumchlorideoplossing; of- een gecombineerde elektrode, te bewaren in gedistilleerd water.3.  REAGENTIA  3.1. Sterk zure kationenwisselaar, in H+-vorm. Voorbehandeld door het hars gedurende 1 nacht in water te laten zwellen  3.2. Natriumhydroxideoplossing, 0,1 M  3.3. pH-indicatorpapier4. WERKWIJZE  4.1. Voorbehandeling van het monster   Gebruik de oplossing die verkregen wordt bij het tot 40 % (m/v) verdunnen van gerectificeerde geconcentreerde most, zoals aangegeven in punt 5.1.2 van het hoofdstuk ""Totaal zuur".4.2. Bereiding van de ionenwisselaar   Breng in de kolom (2.1) ongeveer 10 ml ionenwisselaar in H+-vorm; spoel de kolom met gedistilleerd water tot zuurvrij, hetgeen met pH-indicatorpapier wordt gecontroleerd.4.3. Ionenwisseling   Laat met een snelheid van één druppel per seconde 100 ml volgens punt 4.1 voorbehandelde gerectificeerde geconcentreerde mostoplossing door de kolom lopen. Vang het eluaat op in een bekerglas. Spoel de kolom met 50 ml gedistilleerd water. Titreer de  uitgewisselde H+-ionen (met inbegrip van het waswater) met 0,1 M natriumhydroxideoplossing (3.2) tot pH 7 bij 20 °C. De loogtoevoeging moet langzaam en onder voortdurend roeren geschieden. Zij het verbruikte aantal ml 0,1 M natriumhydroxideoplossing n  ml.5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN   Het totale kationengehalte wordt opgegeven in milli-equivalenten per kilogram suikers met één decimaal.  5.1. Berekening   - Zuurgraad van het eluaat, uitgedrukt in milli-equivalenten per kilogram gerectificeerde geconcentreerde most:E = 2,5 · n.- Totaal zuur van de gerectificeerde geconcentreerde most in milli-equivalenten per kilogram (zie punt 6.1.2 van ""Totaal zuur")  zij a.- Totaal kationen in milli-equivalenten per kilogram totaal suikers is dan: waarin P = totaal suikergehalte in % (m/m).b) GELEIDEND  VERMOGEN  1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Bepaling van het geleidend vermogen van de vloeistof tussen twee parallel geplaatste platinaelektroden opgenomen in een brug van Wheatstone.    Het geleidend vermogen is temperatuurafhankelijk. Het wordt opgegeven bij 20 °C.2. APPARATUUR  2.1. Geleidbaarheidsmeter waarmee metingen kunnen worden uitgevoerd in het gebied tussen 1 en 1 000 microsiemens per cm  2.2. Waterbad waarmee de temperatuur van de monsters op ongeveer 20 °C kan worden gebracht (20 ± 2 °C)3. REAGENTIA  3.1. Gedemineraliseerd water met een specifiek geleidend vermogen dat lager is dan 2 microsiemens per cm bij 20 °C  3.2. Referentie-kaliumchlorideoplossing   Los 0,581 g van tevoren tot constant gewicht bij 105 °C gedroogd kaliumchloride, KCl, op in gedemineraliseerd water (3.1). Vul aan tot 1 l met gedemineraliseerd water (3.1). Deze oplossing heeft een geleidend vermogen van 1 000 microsiemens per cm bij  20 °C. De oplossing is drie maanden houdbaar.4. WERKWIJZE  4.1. Voorbehandeling van het monster   Gebruik de oplossing waarvan het totale suikergehalte op 25 % (m/m) (25 °Brix) is gebracht, zoals aangegeven in punt 4.1.2 van het hoofdstuk ""pH".4.2. Bepaling van het geleidend vermogen   Breng het monster op 20 °C door onderdompeling in het waterbad.    Spoel de meetcel van de geleidbaarheidsmeter tweemaal met de te onderzoeken oplossing.    Bepaal het geleidend vermogen, uitgedrukt in microsiemens per cm.  5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN   Het geleidend vermogen van de gerectificeerde-geconcentreerde-mostoplossing van 25 % (m/m) (25 °Brix) wordt opgegeven in microsiemens per cm (µS · cm 1) bij 20 °C, zonder decimalen.5.1. Berekeningen   Indien de geleidbaarheidsmeter niet van een temperatuurcompensatie is voorzien, corrigeer dan het geleidend vermogen met behulp van tabel 1. Bij temperaturen lager dan 20 °C moet de aangegeven correctie worden opgeteld, bij temperaturen hoger dan 20 °C  moet de aangegeven correctie worden afgetrokken.   TABEL  1   Correcties aan te brengen op het geleidend vermogen bij van 20 °C afwijkende tempera- turen, uitgedrukt in microsiemens · cm 1                     Geleidend vermogenTemperatuur20,2 19,820,4 19,620,6 19,420,8 19,221,0 19,021,2 18,821,4 18,621,6 18,421,8 18,222,0 (¹) 18,0 (² 0000 0 0 0 0 0 0 0 50001 1 1 1 1 2 2 2100011 2 2 3 3 3 4 4150112 3 3 4 5 5 6 7200123 3 4 5 6 7 8 9250123 4 6 7 8 91011300134 5 7 8 9111213350135 6 8 911121415400235 7 91112141618450236 8101214161820500247  91113151820225502571012141719222460035811131618212426(¹) Correctie aftrekken.  (²) Correctie optellen.c) HYDROXYMETHYLFURFURAL  1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN  1.1. Colorimetrische methode   Furaanaldehyden, waarvan hydroxymethylfurfural de belangrijkste is, reageren met barbituurzuur en para-toluïdine onder vorming van een rood gekleurd complex hetgeen colorimetrisch bij 550 nm wordt bepaald.1.2. Hogedrukvloeistof-chromatografische  methode   Scheiding met een reservefasekolom en detectie bij 280 nm.2. COLORIMETRISCHE  METHODE  2.1. Apparatuur  2.1.1. Spectrofotometer waarmee metingen kunnen worden uitgevoerd tussen 300 en 700 nm  2.1.2. Glascuvetten met 1 cm optische weglengte 2.2. Reagentia  2.2.1. Barbituurzuuroplossing 0,5 % (m/v)   Los 500 mg barbituurzuur, C4H4O3N2, onder verwarming op een waterbad van 100 °C om het oplossen te vergemakkelijken, op in gedestilleerd water; vul aan tot 100 ml met gedestilleerd water. De oplossing is ongeveer één week houdbaar.2.2.2.  Para-toluïdineoplossing 10 % (m/v)   Breng 10 g para-toluïdine, CH3C6H4NH2, in een maatkolf van 100 ml, voeg 50 ml isopropanol, CH3CHOHCH3, toe en 10 ml ijsazijn, CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml); vul aan tot 100 ml met isopropanol. Deze oplossing moet dagelijks vers worden bereid.2.2.3.  Ethanaloplossing, CH3CHO, in water 1 % (m/v)   Deze oplossing dient vlak voor gebruik te worden bereid.2.2.4. Hydroxymethylfurfuraloplossing, C6H6O3, in water van 1 g/l  Bereid door verdunning een reeks standaardoplossingen die respectievelijk 5, 10, 20, 30 en 40 mg hydroxymethylfurfural per liter bevatten. De oplossing van 1 g/l en de verdunningen daarvan moeten vers worden bereid.2.3. Werkwijze  2.3.1. Voorbehandeling van het monster   Gebruik de oplossing die wordt verkregen bij het tot 40 % (m/v) verdunnen van gerectificeerde geconcentreerde most, zoals aangegeven in punt 5.1.2 van het hoofdstuk ""Totaal zuur". Neem 2 ml van deze oplossing in bewerking.2.3.2. Colorimetrische  bepaling   Breng in twee 25 ml flesjes met slijpstuk, a en b, 2 ml volgens punt 2.3.1 voorbehandeld monster. Voeg aan elk flesje 5 ml para-toluïdineoplossing (2.2.2) toe; meng. Voeg aan flesje b (blanco) 1 ml gedestilleerd water toe en aan flesje a 1 ml  barbituurzuuroplossing (2.2.1). Schud om te homogeniseren. Breng de inhoud van de flesjes over in cuvetten met 1 cm optische weglengte (2.1.2).    Stel het nulpunt bij een golflengte van 550 nm in met de cuvette die oplossing b bevat, meet vervolgens de extinctie van de cuvette die oplossing a bevat. Noteer de maximale waarde van de extinctie E welke wordt bereikt tussen twee en vijf minuten.    Monsters met een gehalte aan hydroxymethylfurfural hoger dan 30 mg/l moeten voor de analyse verder worden verdund.2.3.3. Opstellen van de ijklijn   Breng in twee 25 ml flesjes, a en b, 2 ml van elk van de verdunde standaardoplossingen van hydroxymethylfurfural (2.2.4) en behandel deze zoals aangegeven in punt 2.3.2.    De grafische weergave van de gemeten extincties en de daarbij behorende hydroxymethylfurfuralconcentraties van de standaardoplossingen is een rechte lijn die door het nulpunt gaat.2.4. Weergave van de resultaten   Het methylfurfuralgehalte van de gerectificeerde geconcentreerde wijnmost wordt uitgedrukt in milligram per kilogram totaal suiker.  2.4.1. Berekening   Uit de gemeten extinctie E van het monster kan met behulp van de ijklijn het hydroxymethylfurfuralgehalte C van het onderzochte monster worden afgeleid.    Het hydroxymethylfurfuralgehalte, uitgedrukt in milligram per kilogram totaal suiker, is:waarin P = totaal suikergehalte in % (m/m) van de gerectificeerde geconcentreerde most.   3. HOGEDRUKVLOEISTOF-CHROMATOGRAFISCHE  METHODE (HPLC)  3.1. Apparatuur  3.1.1. Hogedrukvloeistof-chromatograaf, voorzien van:    - een injectielus van 5 of 10 µl,- een spectrofotometrische detector, waarmee bij 280 nm kan worden gemeten,- een octadecyl-siliciumkolom (bij voorbeeld Bondapak C18 - Corasil, Waters As.),- een schrijver, of eventueel een integrator,Snelheid van de  mobiele fase: 1,5 ml/min.3.1.2. Membraanfiltratie-eenheid (0,45 µm)  3.2. Reagentia  3.2.1. Dubbel gedestilleerd water  3.2.2. Methanol, CH3OH, gedestilleerd of van HPLC-kwaliteit  3.2.3. Azijnzuur, CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml)  3.2.4. Mobiele fase: water-methanol (3.2.2) - azijnzuur (3.2.3), van tevoren gefiltreerd via het membraanfilter (0,45 µm), (40 - 9 - 1; v/v)   De mobiele fase moet elke dag vers worden bereid en worden ontgast vóór het gebruik.   3.2.5. Referentieoplossing van hydroxymethylfurfural van 25 mg/l (m/v)   Breng in een maatkolf van 100 ml een afgewogen hoeveelheid van precies 25 mg hydroxymethylfurfural, C6H6O3, en vul aan tot de streep met methanol (3.2.2). Verdun deze oplossing 1 op 10 met methanol (3.2.2) en filtreer over het membraanfilter (0,45 µm).     Deze oplossing is in een hermetisch afgesloten bruine fles in de koelkast twee à drie maanden houdbaar.3.3. Werkwijze  3.3.1. Gebruik de oplossing die wordt verkregen bij het tot 40 % (m/v) verdunnen van gerectificeerde geconcentreerde most, zoals aangegeven in punt 5.1.2 van het hoofdstuk ""Totaal zuur", en filtreer deze over het membraanfilter (0,45 µm).  3.3.2. Chromatografische bepaling   Injecteer 5 (of 10) µl van het volgens punt 3.3.1 voorbehandelde monster en 5 (of 10) µl van de verdunde hydroxymethylfurfural-standaardoplossing (3.2.5). Registreer het chromatogram.    De retentietijd van hydroxymethylfurfural is ongeveer zes à zeven minuten.3.4. Weergave van de resultaten   Het hydroxymethylfurfuralgehalte in gerectificeerde geconcentreerde most wordt uitgedrukt in milligram per kilogram totaal suiker.3.4.1. Berekening   Stel C is het hydroxymethylfurfuralgehalte in mg/l van de gerectificeerde geconcentreerde mostoplossing van 40 % (m/v).    Het hydroxymethylfurfuralgehalte in milligram per kilogram totaal suiker is dus:waarin P = totaal suikergehalte in % (m/m) van de gerectificeerde geconcentreerde most.d) ZWARE  METALEN  1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODEN  i) Screeningmethode voor zware metalen   Zware metalen worden aangetoond in een geschikte verdunning van de gerectificeerde geconcentreerde most door middel van de vorming van gekleurde sulfiden. De hoeveelheid ervan wordt geschat ten opzichte van een standaard-loodoplossing die overeenkomt  met het maximaal toelaatbare gehalte.   ii) Bepaling van lood met behulp van atoomabsorptiespectrofotometrie   Lood geeft met ammoniumpyrrolidinedithiocarbamaat een chelaat, dat wordt geëxtraheerd met methylisobutylketon. Dit chelaat wordt bij 283,3 nm gemeten. Het loodgehalte wordt bepaald met behulp van standaardtoevoegingen.2. SCREENINGMETHODE  VOOR  ZWARE   METALEN  2.1. Reagentia  2.1.1. Zoutzuur, verdund 70 % (m/v)   Verdun 70 g zoutzuur, HCl (r20 = 1,16 1,19 g/ml), tot 100 ml met water.2.1.2. Zoutzuur, verdund 20 % (m/v)   Verdun 20 g zoutzuur, HCl (r20 = 1,16 1,19 g/ml), tot 100 ml met water.2.1.3. Verdunde ammoniak   Verdun 14 g ammoniak, NH3 (r20 = 0,931 0,934 g/ml), tot 100 ml met water.  2.1.4. Bufferoplossing pH 3,5   Los 25 g ammoniumacetaat, CH3COONH4, op in 25 ml water en voeg 38 ml verdund zoutzuur (2.1.1) toe. Stel, indien noodzakelijk, de pH in op 3,5 met verdund zoutzuur (2.1.2) of verdunde ammoniak (2.1.3) en vul aan tot 100 ml met water.2.1.5.  Thioaceetamideoplossing, C2H5NS, van 4 % (m/v)  2.1.6. Glyceroloplossing, C3H8O3 (n20 °CD = 1,449 1,455), van 85 % (m/v)2.1.7. Thioaceetamidereagens   Voeg aan 0,2 ml thioaceetamideoplossing (2.1.5) toe 1 ml van een mengsel van 5 ml water, 15 ml natriumhydroxideoplossing 1 M en 20 ml glycerol (2.1.6). Verhit op een kokend waterbad gedurende 20 seconden. Dit reagens moet vlak voor gebruik worden  bereid.2.1.8. Standaard-loodoplossing van 2 mg/l   Maak een oplossing die 1 g lood per liter bevat door 0,400 g loodnitraat, Pb(NO3)2, op te lossen in water en aan te vullen tot 250 ml. Pipetteer 2 ml van deze oplossing in een maatkolf van 1 000 ml en vul aan tot de streep met water. Deze verdunde  standaardoplossing bevat 2 mg lood per liter.2.2. Werkwijze   Los 10 g gerectificeerde geconcentreerde most op in 10 ml water. Voeg 2 ml bufferoplossing (pH 3,5) toe en meng. Voeg 1,2 ml thioaceetamide-reagens (2.1.7) toe en meng onmiddellijk. Bereid een standaardoplossing met dezelfde toevoegingen waarbij 10 ml  verdunde loodstandaardoplossing van 2 mg/l (2.1.8) wordt gebruikt. Vergelijk na twee minuten de bruinkleuring van de oplossingen. De bruinkleuring van het monster mag niet intenser zijn dan die van de verdunde loodoplossing.2.3. Berekening   Onder de aangegeven omstandigheden komt het standaardmonster overeen met een gerectificeerde geconcentreerde most die het maximaal toegelaten gehalte aan zware metalen, uitgedrukt in lood, bevat, namelijk 2 mg/kg.3. BEPALING VAN LOOD MET  BEHULP VAN  ATOOMABSORPTIESPECTROFOTOMETRIE3.1. Apparatuur  3.1.1. Atoomabsorptiespectrofotometer, uitgerust met een door licht en acetyleen te voeden brander  3.1.2. Holle-kathodelamp voor lood3.2. Reagentia  3.2.1. Verdund azijnzuur   Verdun 12 g ijsazijn, (r20 = 1,05 g/ml), met water tot 100 ml.   3.2.2. Ammoniumpyrrolidinedithiocarbamaat, C5H12N2S2, 1 % (m/V)  3.2.3. Methylisobutylketon, (CH3)2CHCH2COCH3   3.2.4. Standaard-loodoplossing van 10 mg/l   Pipetteer 10 ml loodoplossing van 1 g/l (v/v) (2.1.8) in een maatkolf van 1 000 ml.3.3. Werkwijze  3.3.1. Monster   Los 10 g gerectificeerde geconcentreerde most op in een mengsel van gelijke volumedelen van verdund azijnzuur (3.2.1) en water en vul met dit mengsel aan tot 100 ml.    Voeg 2 ml ammoniumpyrrolidinedithiocarbamaat (3.2.2) en 10 ml methylisobutylketon (3.2.3) toe. Schud onder vermijding van blootstelling aan direct daglicht gedurende 30 seconden. Laat de twee lagen zich scheiden. Vervolg de bepaling met de  methylisobutylketonlaag.3.3.2. Monster met toevoegingen   Bereid drie oplossingen die naast de hoeveelheid van 10 g gerectificeerde geconcentreerde most respectievelijk bevatten 1, 2 en 3 ml van de loodoplossing van 10 mg/l (3.2.4). Behandel deze oplossingen zoals in punt 3.3.1 is aangegeven.3.3.3. Blanco   Bereid volgens punt 3.3.1 een blanco oplossing zonder toevoeging van de gerectificeerde geconcentreerde most.3.3.4. Bepaling   Kies als golflengte 283,3 nm.    Stel het nulpunt in door de methylisobutylketonlaag van de blanco te verstuiven. Verstuif de methylisobutylketonlaag van het bewerkte monster en vervolgens de methylisobutylketonlagen van de monsters met toevoegingen.3.4. Weergave van de resultaten   Het loodgehalte van gerectificeerde geconcentreerde most wordt opgegeven in milligram per kilogram met één decimaal.3.4.1. Berekening   Stel de ijklijn op met behulp van de gemeten extincties en de daarbij behorende loodconcentraties van de monsteroplossingen waaraan lood is toegevoegd. Het nulpunt van de concentratieas komt overeen met het monster.    Extrapoleer de rechte die deze punten verbindt tot deze de concentratieas aan de negatieve zijde snijdt. De afstand van dit snijpunt tot de oorsprong geeft het loodgehalte aan van het onderzochte monster.e) CHEMISCHE  BEPALING  VAN  ETHYLALCOHOL   Deze methode wordt gebruikt voor de bepaling van het alcoholgehalte in vloeistoffen met een laag alcoholgehalte, zoals most, geconcentreerde most en gerectificeerde geconcentreerde most.  1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Enkelvoudige destillatie gevolgd door oxidatie van ethylalcohol met kaliumbichromaat. De overmaat bichromaat wordt getitreerd met een tweewaardige ijzeroplossing.2. APPARAAT  2.1. Gebruik het in punt 3.2 van het hoofdstuk ""Alcoholvolumegehalte" beschreven destillatieapparaat.3. REAGENTIA  3.1. Kaliumbichromaatoplossing   Los 33,600 g kaliumbichromaat, K2Cr2O7, op in water en vul aan tot 1 l bij 20 °C. 1 ml van deze oplossing oxideert 7,8924 mg ethylalcohol.3.2. IJzer(II)ammoniumsulfaatoplossing   Los 135 g ijzer(II)ammoniumsulfaat, FeSO4 · (NH4)2SO4 · 6H2O, op in water, vul aan tot 1 l en voeg 20 ml geconcentreerd zwavelzuur, H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml) toe.    Indien vers bereid correspondeert deze oplossing met de helft van haar volume aan kaliumbichromaatoplossing. Na bereiding treedt langzaam oxidatie op.3.3. Kaliumpermanganaatoplossing   Los 1,088 g kaliumpermanganaat, KMnO4, op in water en vul met water aan tot 1 l.3.4. Zwavelzuuroplossing, 1 tot 2 verdund (v/v)   Voeg onder schudden voorzichtig en beetje bij beetje 500 ml zwavelzuur, H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml), toe aan 500 ml water.3.5. IJzer-ortho-fenanthroline-reagens   Los 0,695 g ijzer(II)sulfaat, FeSO4 · 7H2O, op in 100 ml water en voeg 1,485 g ortho-fenanthroline-monohydraat, C12H8N2 · H2O, toe. Verwarm om het oplossen te bespoedigen. Deze helderrode oplossing is onbeperkt houdbaar.4. WERKWIJZE  4.1. Destillatie   Breng in de destillatiekolf 100 g gerectificeerde geconcentreerde most en 100 ml water. Vang het destillaat op in een maatkolf van 100 ml en vul aan tot de streep met water.4.2. Oxidatie   Breng in een kolf met slijpstuk van 300 ml, waarvan de hals verwijd is uitgevoerd waardoor de hals zonder verlies van oplossing kan worden gespoeld, 20 ml gestelde kaliumbichromaatoplossing (3.1) en 20 ml verdunde zwavelzuuroplossing (3.4) en schud.  Voeg 20 ml destillaat toe. Sluit de kolf af met het slijpstuk, schud en wacht ten minste 30 minuten onder af en toe omschudden (monsterkolf).     Bereid met dezelfde hoeveelheid reagentia op deze wijze een blanco-oplossing, waarin de 20 ml destillaat is vervangen door 20 ml water (blancokolf).4.3. Titratie   Voeg aan de monsterkolf vier druppels ortho-fenanthroline-reagens (3.5) toe. Titreer de overmaat bichromaat met ijzer(II)ammoniumsulfaat-oplossing (3.2). Stop de toevoeging van ijzer(II)ammoniumsulfaat-oplossing als de kleur van blauw-groen omslaat  naar kastanjebruin.    Titreer, om de kleuromslag nauwkeuriger te bepalen, terug met kaliumpermanganaatoplossing (3.3) van kastanjebruin naar blauw-groen. Trek een tiende gedeelte van het verbruikte volume kaliumpermanganaatoplossing af van het verbruikte volume ijzer(II)  ammoniumsulfaatoplossing. Het verschil zij n.    Behandel de blancokolf op dezelfde wijze. Het verbruik zij n2.5. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN   Het ethylalcoholgehalte wordt opgegeven in gram per kilogram totaal suiker met één decimaal.5.1. Berekening   n2 ml ijzer(II)ammoniumsulfaatoplossing reduceren 20 ml kaliumbichromaatoplossing welke 157,85 mg ethylalcohol p. a. oxideren.    1 ml ijzer(II)ammoniumsulfaatoplossing heeft dus dezelfde reducerende werking als:(n2   n) ml ijzer(II)ammoniumsulfaatoplossing hebben dezelfde reducerende werking als:Het ethylalcoholgehalte van gerectificeerde geconcentreerde most, uitgedrukt in gram  per kilogram, is:Het ethylalcoholgehalte, uitgedrukt in gram per kilogram totaal suikers, is: waarin P = het totale suikergehalte in % (m/m).f) MESO-INOSITOL,  SCYLLO-INOSITOL  EN  SACCHAROSE  1. PRINCIPE  VAN  DE  METHODE   Meso-inositol wordt als gesilyleerd derivaat gaschromatografisch bepaald.  2. REAGENTIA  2.1. Interne standaard: xylitol (waterige oplossing van ongeveer 10 g/l waaraan een spatelpunt natriumoxide werd toegevoegd)  2.2. Bis-trimethylsilyltrifluoroacetamide (C8H18F3NOSi2)  2.3. Trimethylchloorsilaan (C3H9ClSi)  2.4. Pyridine p. a. (C5H5N)  2.5. Meso-inositol (C6H12O6)3. APPARATUUR  3.1. Gaschromatograaf, uitgerust met:   3.2. capillaire kolom (bij voorbeeld belegd met silicum OV 1 (dikte van de laag: 0,15 µm), lengte 25 m, inwendige diameter 0,3 mm)   Werkomstandigheden:- draaggas: waterstof, helium,- snelheid draaggas: 2 ml per minuut,- injectietemperatuur: 300 °C,- detectortemperatuur: 300 °C,- temperatuurprogramma: 1 min bij 160 °C, van 160 °C naar 260 °C aan 4 °C/min, vervolgens 15 min bij 260  °C,- splitverhouding: 1 à 20 ongeveer  3.3. integrator  3.4. injectiespuilt van 10 µl  3.5. micropipetten van 50, 100 en 200 µl  3.6. kolfje van 2 ml met teflonstop  3.7. oven4. WERKWIJZE   Voeg in een maatkolf eerst 5 g gerectificeerde geconcentreerde most bij 1 ml van de xylitolstandaardoplossing (2.1) en leng aan met water tot 50 ml. Na mengen wordt 100 µl van deze oplossing gedroogd in een lichte luchtstroom, na eventueel toevoegen  van 100 µl ethanol om het dragen te vergemakkelijken.    Los het residu op in 100 µl pyridine (2.4), voeg 100 µl bis-trimethylsilyltrifluoracetamide (2.2) en 10 µl trimethylchloorsilaan (2.3) toe, sluit het kolfje met de teflonstop en verwarm gedurende één uur bij 60 °C. Injecteer dan 0,5 µl van de heldere  oplossing (met warme en lege maatkolf, volgens de eerder vermelde splitverhouding).5. BEREKENING  5.1. Bereid een oplossing die:60 g/l glucose, 60 g/l fructose, 1 g/l meso-inositol en 1 g/l saccharose bevat. Weeg 5 g van deze oplossing af en vervolg zoals in punt 4. Uit het chromatogram kunnen de verdelingsfactoren coëfficiënten voor meso-inositol  en voor saccharose ten opzichte van xylitol berekend worden. Voor scyllo-inositol (dat niet commercieel verkrijgbaar is), waarvan de retentietijd begrepen is tussen de laatste piek van de aromatische vormen van glucose en die van meso-inositol (zie  figuur), kan dezelfde verdelingsfactorcoëfficiënt als voor meso-inositol gebruikt worden.6. WEERGAVE  VAN  DE  RESULTATEN  6.1. Meso-inositol en scyllo-inositol worden uitgedrukt in milligram per kilogram totaal suiker. Saccharose wordt uitgedrukt in gram per kilogram most.     Figuur: Gaschromatogram van meso-inositol, scyllo-inositol en saccharose.   (1)Elke pyknometer met gelijkwaardige kenmerken kan worden gebruikt. (2)Een getallenvoorbeeld wordt in de bijlage gegeven. (3)Een getallenvoorbeeld wordt in de bijlage gegeven. (4)Het suikergehalte is uitgedrukt als invertsuiker. (5)Het  suikergehalte is uitgedrukt als invertsuiker. (6)Voorbeeld: voor een alcoholgehalte (m/m) van 12 % is p = 0,12. (7)Alvorens deze berekening uit te voeren moet de relatieve dichtheid (of de dichtheid) van de onderzochte wijn, zoals boven is aangegeven,  worden gecorrigeerd voor de vluchtige zuren volgens de formule:  dv = d2020   0,0000086 a of r v = r 20   0,0000086 a waarin a = het gehalte aan vluchtige zuren in milli-equivalenten per liter. (8)Deze waarden worden hier medegedeeld in afwachting van het gereedkomen van de communautaire gegevensbank. (9)Deze waarden worden hier medegedeeld in afwachting van het  gereedkomen van de communautaire gegevensbank. (10)Eén van de handelsnamen is ""noriet". (11)105 pascal (Pa) = 1 bar. (12)1 pascal (Pa) = 1 N/m² = 10 5 bar. (13)Er wordt geen rekening gehouden met andere aanwezige gassen (O2, N2 en dergelijke), die in  dergelijk lage hoeveelheden aanwezig zijn dat de invloed op de overdruk te verwaarlozen is. (14)Sommige wijnen, zoals likeurwijn e.d., geven een destillaat dat ondanks filtratie niet helder is. Het destillaat moet dan in een destillatiekolf van 200 ml  worden gebracht en aangevuld met water tot 30 ml. Destilleer, terwijl de oplossing nog alkalisch is, ongeveer 15 ml over en doe dit weg. Koel de inhoud van de kolf af en zuur aan met ongeveer 5 ml verdund zwavelzuur. Hervat de destillatie en vang het  destillaat op in 5 ml natriumhydroxideoplossing 1 M. Destilleer ongeveer 5 ml over. Het destillaat is nu helder. (15)Deze toevoeging is niet noodzakelijk, doch slechts omdat sommige mensen het verschijnen van een troebeling beter waarnemen in een rose  gekleurde oplossing dan in een kleurloze oplossing. (16)Indien de hoeveelheid gebruikt water minder bedraagt dan 10 ml is n2 = 0,05   0,1 ml. Om een zo gevoelig mogelijke omslag te verkrijgen moet dit volume zo klein mogelijk gehouden worden. Vermijd  dus zo mogelijk elke verdunning tijdens de bepaling. (17)Deze afstand moet worden berekend in de richting OC.