CELEX: 32004L0073
Language: sk
Date: 2004-04-29 00:00:00
Title: Smernica Komisie 2004/73/ES z 29. apríla 2004, ktorou sa po dvadsiaty deviatykrát technickému pokroku prispôsobuje smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látokText s významom pre EHP.

Dôležité právne oznámenie

|

32004L0073

Smernica Komisie 2004/73/ES z 29. apríla 2004, ktorou sa po dvadsiaty deviatykrát technickému pokroku prispôsobuje smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látokText s významom pre EHP.  

CS.ES Kapitola 13 Zväzok 34 S. 448  - 757 ET.ES Kapitola 13 Zväzok 34 S. 448  - 757 HU.ES Kapitola 13 Zväzok 34 S. 448  - 757 LT.ES Kapitola 13 Zväzok 34 S. 448  - 757 LV.ES Kapitola 13 Zväzok 34 S. 448  - 757 MT.ES Kapitola 13 Zväzok 34 S. 448  - 757 PL.ES Kapitola 13 Zväzok 34 S. 448  - 757 SK.ES Kapitola 13 Zväzok 34 S. 448  - 757 SL.ES Kapitola 13 Zväzok 34 S. 448  - 757

		Smernica Komisie 2004/73/ESz 29. apríla 2004,ktorou sa po dvadsiaty deviatykrát technickému pokroku prispôsobuje smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok(Text s významom pre EHP)KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,so zreteľom na smernicu Rady 67/548/EHS z 27. júna 1967 o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok [1], a najmä na jej článok 28,keďže:(1) Príloha I k smernici 67/548/EHS obsahuje zoznam nebezpečných látok spolu s podrobnými údajmi o klasifikácii a označovaní každej látky. Tento zoznam je potrebné aktualizovať s cieľom zahrnúť ďalšie notifikované nové látky a ďalšie existujúce látky, ako aj prispôsobiť existujúce zápisy technickému pokroku, ako je stanovenie limitných hodnôt pre koncentrácie v životnom prostredí pre určité látky. V súlade s tým je tiež potrebné zápisy určitých látok vypustiť a niektoré zápisy rozdeliť, pretože v týchto zápisoch sa klasifikácia na všetky látky už neuplatňuje. Označenie látok, ktoré obsahujú 1,3-butadién, by sa malo zmeniť s cieľom vyjadriť, že táto smernica bude túto látku klasifikovať ako mutagén.(2) Príloha V k smernici 67/548/EHS ustanovuje metódy na stanovenie fyzikálno-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity látok a prípravkov. Uvedenú prílohu je potrebné zmeniť a doplniť, aby sa počet zvierat, používaných na experimentálne účely, znížil na minimum, v súlade so smernicou Rady 86/609/EHS z 24. novembra 1986 o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení členských štátov týkajúcich sa ochrany zvierat používaných na experimentálne a iné vedecké účely [2]. Na základe toho by sa mali revidovať metódy pre subchronickú orálnu toxicitu v kapitolách B.1, B.4, B.5, B.31 a B.35. Okrem toho kapitola B.42 by sa mala pridať k prílohe V, aby sa sprístupnila vylepšená metóda na subchronickú orálnu toxicitu. Nakoniec, mali by sa pridať kapitola A.21 o fyzikálno-chemických vlastnostiach, kapitola B.43 o subchronickej orálnej toxicite a kapitoly C.21 až C.24 o environmentálnej toxicite, aby sa umožnilo stanovenie vlastností, ktoré zatiaľ nie sú dostatočné pokryté metódami v prílohe V.(3) Opatrenia ustanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Výboru na prispôsobenie technickému pokroku smerníc na odstránenie technických prekážok obchodu s nebezpečnými látkami a prípravkami,PRIJALA TÚTO SMERNICU:Článok 1Smernica 67/548/EHS sa mení a dopĺňa takto:1. Príloha I sa mení a dopĺňa takto:a) poznámka K v predslove sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 1A;b) zápisy zodpovedajúce zápisom uvedeným v prílohe 1B k tejto smernici sa nahrádzajú znením, ktoré je uvedené v uvedenej prílohe;c) zápisy uvedené v prílohe 1C k tejto smernici sa vkladajú v súlade s poradím zápisov uvedeným v prílohe I k smernici 67/548/EHS;d) zápisy s indexovými číslami 604-050-00-X, 607-050-00-8, 607-171-00-6 a 613-130-00-3 sa vypúšťajú;e) zápis s indexovým číslom 048-002-00-0 sa nahrádza zápismi s indexovými číslami 048-002-00-0 a 048-011-00-X, ktoré sú uvedené v prílohe 1D k tejto smernici;f) zápis s indexovým číslom 609-006-00-3 sa nahrádza zápismi s indexovými číslami 609-006-00-3 a 609-065-00-5, ktoré sú uvedené v prílohe 1D k tejto smernici;g) zápis s indexovým číslom 612-039-00-6 sa nahrádza zápismi s indexovými číslami 612-039-00-6 a 612-207-00-9, ktoré sú uvedené v prílohe 1D.2. Príloha V sa mení a dopĺňa takto:a) znenie uvedene v prílohe 2A k tejto smernici sa pridáva ako kapitola A.21;c) kapitola B.1 bis sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 2B k tejto smernici;c) kapitola B.1 tris sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 2C k tejto smernici;d) kapitola B.4 sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 2D k tejto smernici;e) kapitola B.5 sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 2E k tejto smernici;f) kapitola B.31 sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 2F k tejto smernici;g) kapitola B.35 sa nahrádza znením uvedeným v prílohe 2G k tejto smernici;h) text uvedený v prílohe 2H k tejto smernici sa pridáva ako kapitola A.42 a B.43;i) text uvedený v prílohe 2I k tejto smernici sa pridáva ako kapitola C.21 a C.24.Článok 21. Členské štáty prijmú zákony, iné právne predpisy a správne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou najneskôr do 31. októbra 2005. Bezodkladne informujú Komisiu o znení týchto ustanovení a o korelačnej tabuľke medzi týmito ustanoveniami a touto smernicou. Členské štáty uvedú priamo v prijatých opatreniach alebo pri ich úradnom uverejnení odkaz na túto smernicu. Podrobnosti o odkaze upravia členské štáty.2. Členské štáty oznámia Komisii znenie základných ustanovení vnútroštátnych právnych predpisov, ktoré prijmú v oblasti pôsobnosti tejto smernice.Článok 3Táto smernica nadobúda účinnosť dvadsiatym dňom po jej zverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.Článok 4Táto smernica je určená členským štátom.V Bruseli 29. apríla 2004Za KomisiuMargot Wallströmčlenka Komisie[1] Ú. v. ES L 196, 16.8.1967, s. 1. Smernica naposledy zmenená a doplnená nariadením (ES) č. 807/2003 (Ú. v. EÚ L 122, 16.5.2003, s. 36).[2] Ú. v. ES L 358, 18.12.1986, s. 1. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou 2003/65/ES Európskeho parlamentu a Rady (Ú. v. EÚ L 230, 16.9.2003, s. 32).--------------------------------------------------PRÍLOHA 1A"Poznámka K:Klasifikácia ako karcinogén alebo mutagén sa nemusí uplatňovať, ak je možné preukázať, že látka obsahuje menej ako 0,1 % hmotnostných buta-1,3-diénu (číslo EINECS 203-450-8). Ak látka nie je klasifikovaná ako karcinogén alebo mutagén, potom je potrebné uviesť aspoň S-vety: (2-)9-16. Táto poznámka platí pre určité komplexné ropné deriváty, ktoré sú uvedené v prílohe I."--------------------------------------------------PRÍLOHA 2AA.21. OXIDAČNÉ VLASTNOSTI (KVAPALINY)1. METÓDA1.1 ÚVODTáto metóda je určená na meranie potenciálu kvapalnej látky zvýšiť rýchlosť alebo intenzitu horenia horľavej látky alebo tvoriť s horľavou látkou zmes, ktorá sa samovoľne vznieti, keď sa obe látky dôkladne zmiešajú. Zakladá sa na teste OSN pre oxidujúce kvapaliny (1) a je s ním rovnocenná. Metóda A.21 je však určená predovšetkým na splnenie požiadaviek smernice 67/548, vyžaduje sa však porovnanie iba s jednou referenčnou látkou. Ak sa očakáva, že výsledky testu sa použijú na iné účely, môže byť potrebné testovanie a porovnanie s ďalšími referenčnými látkami [1].Tento test nie je potrebné vykonať, ak sa na základe posúdenia štruktúrneho vzorca nepochybne potvrdí, že látka nie je schopná s horľavým materiálom exotermicky reagovať.Pred uskutočnením testu je užitočné mať predbežné informácie o akýchkoľvek potenciálnych výbušných vlastnostiach látky.Tento test nie je vhodný pre tuhé látky, plyny, výbušné alebo veľmi horľavé látky, alebo organické peroxidy.Ak sú pre testovanú látku už dostupné výsledky testu OSN pre oxidujúce kvapaliny, tento test sa nemusí vykonať (1).1.2 DEFINÍCIE A JEDNOTKYPriemerný čas zvýšenia tlaku je priemerná hodnota nameraných časov, počas ktorých testovaná zmes spôsobí zvýšenie tlaku od 690 kPa do 2070 kPa nad atmosférický tlak.1.3 REFERENČNÁ LÁTKAAko referenčná látka sa používa vodný roztok kyseliny dusičnej (65 hmotn. %, čistota p.a. - analyticky čistý) [2].Nepovinne, ak experimentátor predpokladá, že výsledky tejto skúšky sa môžu prípadne použiť na iné účely [3], môže sa tiež vykonať skúška ďalších referenčných látok [4].1.4 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDYKvapalina, ktorá sa má testovať, sa zmieša s vláknitou celulózou v hmotnostnom pomere 1:1 a zmes sa nadávkuje do tlakovej nádoby. Ak počas zmiešavania alebo dávkovania nastane samovoľné vznietenie, ďalšie testovanie nie je potrebné.Ak samovznietenie nenastane, vykoná sa celý test. Zmes sa v tlakovej nádobe zahrieva a stanoví sa priemerný čas zvýšenia tlaku od 690 kPa do 2070 kPa nad atmosférický tlak. Tento čas sa porovná s priemerným časom zvýšenia tlaku pre zmes referenčnej látky (referenčných látok) a celulózy (1:1).1.5 KRITÉRIÁ KVALITYV sérii piatich pokusov na jedenej látke by sa ani jeden výsledok nemal odlišovať od aritmetického priemeru o viac ako 30 %. Výsledky, ktoré sa odlišujú od priemeru o viac ako 30 %, sa vylúčia, zdokonalí sa postup zmiešavania a dávkovania a testovanie sa zopakuje.1.6 OPIS METÓDY1.6.1 Príprava1.6.1.1 Horľavá látkaAko horľavý materiál sa používa vysušená, vláknitá celulóza s dĺžkou vlákien medzi 50 a 250 μm a priemernou hodnotou priemeru 25 μm [5]. Celulóza sa suší pri 105 °C počas 4 hodín do konštantnej hmotnosti vo vrstve s hrúbkou najviac 25 mm a počas chladnutia a pred použitím sa uchováva v exsikátore so sušidlom. Obsah vody vo vysušenej celulóze by mal byť nižší ako 0,5 % suchej hmotnosti [6]. Na to, aby sa dosiahla takáto hodnota, sa v prípade potreby čas sušenia predĺži [7] Počas skúsšky je potrebné používať rovnakú šaržu celulózy.1.6.1.2 Aparatúra1.6.1.2.1 Tlaková nádobaPoužíva sa tlaková nádoba. Nádoba pozostáva z oceľovej tlakovej nádoby valcovitého tvaru s dĺžkou 89 mm a vonkajším priemerom 60 mm (pozri obrázok 1). Dve plochy na protiľahlých stranách sú opracované (zmenšujúc prierez nádoby na 50 mm), aby bolo možné namontovanie zážihového a odvzdušňovacieho nástavca. Nádoba má vnútorný priemer 20 mm a na oboch koncoch je zoslabená do hĺbky 19 mm a opatrená závitom 1 "(1 palec) podľa BSP (British Standard Pipe) alebo jeho metrickým ekvivalentom. Snímač tlaku v tvare bočného ramena je priskrutkovaný k zaoblenému povrchu tlakovej nádoby vo vzdialenosti 35 mm od jedného konca a v 90o uhle k opracovaným stranám. Príslušný otvor je vyvŕtaný do hĺbky 12 mm a na konci bočného ramena opatrený závitom na 1/2" podľa BSP (alebo jeho metrickým ekvivalentom). V prípade potreby sa na zabezpečenie plynotesného utesnenia upevní inertné tesnenie. Bočné rameno vyčnieva 55 mm z tlakovej nádoby a má 6 mm vývrt. Koniec bočného ramena je zoslabený a opatrený závitom na pripojenie membránového snímača tlaku. Môže sa použiť akékoľvek zariadenie na meranie tlaku, ktoré je odolné voči pôsobeniu horúcich plynov alebo produktov rozkladu a na rýchlosť zvýšenia tlaku v rozsahu 690 - 2070 kPa dokáže reagovať za najviac 5 ms.Koniec tlakovej nádoby, ktorý je ďalej od bočného ramena, je uzatvorený zážihovým nástavcom, ktorý je vybavený dvomi elektródami, jednou izolovanou od telesa nástavca a druhou uzemnenou k nástavcu. Druhý koniec tlakovej nádoby je uzatvorený poistným diskom (kritický tlak približne 2200 kPa), upevneným v uzatváracom nástavci s 20 mm vývrtom. V prípade potreby sa na zabezpečenie plynotesného utesnenia zážihového nástavca použije inertné tesnenie. Počas používania je zariadenie udržiavané v správnej polohe stojanom (obrázok 2). Zvyčajne sa skladá z podložky z mäkkej ocele s rozmermi 235 mm x 184 mm x 6 mm a zo 185 mm dlhého štvorcového dutého profilu (Š.D.P.) s rozmermi 70 mm x 70 mm x 4 mm.Profil je na protiľahlých stranách jedného konca Š.D.P. zrezaný tak, že vznikne konštrukcia s dvomi plochými ramenami, ktoré prečnievajú o 86 mm nad celým rámom profilu. Konce plochých ramien sú zrezané pod uhlom 60o k horizontálnej rovine a privarené k podložke. Na jednej strane vrchného konca základne profilu je vyrezaný 22 mm široký a 46 mm hlboký otvor tak, aby sa pri vložení tlakovej nádoby do rámu profilu stojana dostal prvý zážihový nástavec a aby bočné rameno zapadlo do otvoru. Kus ocele, široký 30 mm a hrubý 6 mm, ktorý má funkciu rozpery, je privarený k dolnej časti vnútornej plochy rámu profilu. Na upevnenie tlakovej nádoby slúžia dve 7 mm prítlačné skrutky, ktoré sú priskrutkované do protiľahlej strany. Zospodu podopierajú tlakovú nádobu dva 12 mm široké pásy 6 mm hrubej ocele, privarené k bočným stranám dosadajúcim na rám profilu.1.6.1.2.2 Systém zážihuSystém zážihu pozostáva z 25 cm dlhého Ni/Cr drôtu, ktorý má priemer 0,6 mm a odpor 3,85 ohm/m. Drôt má špirálovitý tvar s vnútorným priemerom 5 mm a je pripojený k elektródam zážihového nástavca. Špirála musí byť usporiadaná jedným zo spôsobov zobrazených na obrázku 3. Vzdialenosť medzi dnom nádoby a spodnou časťou zážihovej špirály je 20 mm. Ak nie sú elektródy nastaviteľné, konce zážihového drôtu medzi špirálou a dnom nádoby musia byť izolované keramickým obalom. Drôt sa rozžeravuje konštantným prúdom najmenej 10 A.1.6.2 Vykonanie testu [8]Kompletne zmontovaná aparatúra so snímačom tlaku a zážihovým systémom, ale bez vloženého poistného disku, sa pripevní na stojan tak, že zážihový nástavec bude v dolnej časti. V sklenenej kadičke sa sklenenou tyčinkou premieša 2,5 g testovanej kvapaliny s 2,5 g sušenej celulózy [9]. Z bezpečnostných dôvodov sa miešanie vykonáva s ochranným štítom, ktorý je medzi experimentátorom a zmesou. Ak sa počas miešania alebo plnenia zmes vznieti, ďalšie testovanie nie je potrebné. Zmes sa pridáva do tlakovej nádoby v malých dávkach poklepávaním do tlakovej nádoby, pričom sa musí dávať pozor na to, aby zmes dostatočne pokryla zážihovú špirálu a bola s ňou v dobrom kontakte. Je dôležité, aby sa špirála počas dávkovania nezdeformovala, pretože by to mohlo viesť k chybným výsledkom [10]. Do uzatváracieho nástavca sa vloží poistný disk a nástavec sa pevne zaskrutkuje. Naplnená nádoba sa presunie do stojanu tak, aby bol poistný disk v hornej polohe, umiestni sa vo vhodnom vystuženom digestore alebo v spaľovacej komore. Do zážihového nástavca sa pripojením na externú zásuvku pustí prúd 10 A. Čas medzi začiatkom miešania a zapnutím prúdu by nemal presiahnuť 10 minút.Signál z tlakového snímača sa zaznamenáva na vhodný systém, ktorý umožňuje meranie a vytváranie permanentného záznamu získaného časového profilu zmeny tlaku (napr. záznamník spojený so zapisovačom). Zmes sa zahrieva dovtedy, kým nepraskne poistný disk, alebo neuplynie aspoň 60 s. Ak poistný disk nepraskne, zmes sa pred opatrným rozobratím aparatúry nechá vychladnúť, pričom je potrebné dodržiavať bezpečnostné opatrenia pre prípad možného výskytu zvýšeného tlaku. Vykonáva sa päť pokusov s testovanou látkou a referenčnou látkou (referenčnými látkami). Zaznamenáva sa čas potrebný na zvýšenie tlaku zo 690 kPa na 2070 kPa nad atmosférický tlak. Vypočíta sa priemerný čas zvýšenia tlaku.V niektorých prípadoch môžu chemické reakcie látok, ktoré nesúvisia s ich oxidačnými vlastnosťami, spôsobiť (príliš vysoké alebo príliš nízke) zvýšenie tlaku. V takýchto prípadoch môže byť potrebné kvôli objasneniu povahy reakcie zopakovať test s inertnou látkou namiesto celulózy, napr. diatomit (kremelina).2. ÚDAJEČas zvýšenia tlaku pre testovanú látku a referenčnú látku (referenčné látky).Čas zvýšenia tlaku pri testoch s inertnou látkou, ak sa realizovali.2.1 SPRACOVANIE VÝSLEDKOVVypočíta sa priemerný čas zvýšenia tlaku pre testovanú látku a referenčnú látku (referenčné látky).Vypočíta sa priemerný čas zvýšenia tlaku pri testoch s inertnou látkou, ak sa realizovali.Niektoré príklady výsledkov sú uvedené v tabuľke 1.Tabuľka 1Príklady výsledkov [14]Látka [13] | Priemerný čas zvýšenia tlaku pre zmes s celulózou v pomere 1:1 (ms) |Dichróman amónny, nasýtený vodný roztok | 20800 |Dusičnan vápenatý, nasýtený vodný roztok | 6700 |Dusičnan železitý, nasýtený vodný roztok | 4133 |Chloristan lítny, nasýtený vodný roztok | 1686 |Chloristan horečnatý, nasýtený vodný roztok | 777 |Dusičnan nikelnatý, nasýtený vodný roztok | 6250 |Kyselina dusičná, 65 % | 4,767 [11] |Kyselina chloristá, 50 % | 121 [11] |Kyselina chloristá, 55 % | 59 |Dusičnan draselný, 30 % vodný roztok | 26690 |Dusičnan strieborný, nasýtený vodný roztok | — [12] |Chlorečnan sodný, 40 % vodný roztok | 2555 [11] |Dusičnan sodný, 45 % vodný roztok | 4133 |Inertná látka | |Voda:celulóza | — [12] |3. SPRÁVA3.1 SPRÁVA O TESTESpráva o teste obsahuje tieto informácie:- identifikáciu, zloženie, čistotu atď. testovanej látky;- koncentráciu testovanej látky;- postup sušenia použitej celulózy;- obsah vody v použitej celulóze;- výsledky meraní;- výsledky testov s inertnou látkou, ak existujú;- vypočítané priemerné časy zvýšenia tlaku;- všetky odchýlky od tejto metódy a ich dôvody;- všetky doplňujúce poznámky a poznámky dôležité pre interpretáciu výsledkov;3.2 INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV [15]Výsledky testov sa vyhodnotia na základe:a) toho, či sa zmes testovanej látky a celulózy samovoľne vznieti; ab) porovnania priemerného času potrebného na zvýšenie tlaku od 690 kPa do 2070 kPa s časom potrebným na zvýšenie tlaku u referenčnej látky (referenčných látok).Kvapalná látka sa pokladá za oxidačné činidlo, keď:a) zmes látky a celulózy v hmotnostnom pomere 1:1 sa samovoľne vznieti; alebob) zmes látky a celulózy v hmotnostnom pomere 1:1 má priemerný čas zvýšenia tlaku menší alebo rovnaký ako priemerný čas zvýšenia tlaku zmesi vodného roztoku kyseliny dusičnej a celulózy (65 hmotn. %).Na to, aby bol vylúčený falošný pozitívny výsledok sa v prípade potreby pri interpretácii výsledkov zoberú do úvahy aj výsledky získané pri testovaní látky s inertným materiálom.4. ODKAZY(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.+++++ TIFF +++++Tlaková nádoba(A) Telo tlakovej nádoby(B) Uzatvárací nástavec s poistným diskom(C) Zážihový nástavec(D) Podložka z mäkkého olova(E) Poistný disk(F) Bočné rameno(G) Hlava snímača tlaku(H) Tesnenie(J) Izolovaná elektróda(K) Uzemňovacia elektróda(L) Izolácia(M) Oceľový kónus(N) Deformačná drážka tesnenia+++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++(A) Zážihová špirála(B) Izolácia(C) Elektródy(D) Zážihový nástavecPoznámka:môže sa použiť ktorákoľvek z týchto zostáv.[1] Napríklad v rámci transportných predpisov OSN.[2] Kyselina sa musí titrovať pred testovaním, aby sa potvrdila jej koncentrácia.[3] Napríklad v rámci transportných predpisov OSN.[4] Napr.: 50 hmotn. % (w/w) perchlórovej kyseliny a 40 hmotn. % chlorečnanu sodného sa používa v odkaze 1.[5] t. j. celulózový prášok z Whatman stĺpcovej chromatografie CF 11, katalógové č. 4021 050.[6] Potvrdené (napr.) Karl-Fisherovou titráciou.[7] Alternatívne sa môže tento obsah vody tiež dosiahnuť (napr.) zahriatím na 105 °C vo vákuu na 24 h.[8] So zmesami oxidačných činidiel s celulózou sa musí zaobchádzať ako s potenciálne explozívnymi a manipulovať s nimi s náležitou pozornosťou.[9] V praxi sa to dá dosiahnuť prípravou zmesi testovanej kvapaliny s celulózou v pomere 1:1 vo väčšom množstve, ako je potrebné pre test, a do tlakovej nádoby sa nadávkuje 5 ± 0,1 g. Pre každý test osobitne sa pripraví čerstvá zmes.[10] Je potrebné zabrániť najmä kontaktu medzi susednými závitmi špirály.[11] Priemerná hodnota z medzilaboratórnych porovnávacích skúšok[12] Maximálny tlak 2070[13] Nasýtené roztoky sa pripravujú pri teplote 20 °C[14] Klasifikáciu podľa transportného systému OSN pozri v odkaze (1)[15] Pozri odkaz 1 na interpretáciu výsledkov podľa transportných predpisov OSN pri použití rôznych referenčných látok.--------------------------------------------------PRÍLOHA 2BB.1 bis. AKÚTNA ORÁLNA TOXICITA – METÓDA STABILNEJ DÁVKY1. METÓDATáto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 420 (2001)1.1 ÚVODTradičné metódy na hodnotenie akútnej toxicity využívajú smrť zvierat ako konečný bod. V roku 1984 Britská toxikologická spoločnosť navrhla novú koncepciu testovania akútnej toxicity založenú na podávaní série stabilných dávok (1). Koncepcia nevyužíva smrť zvierat ako konečný bod a vychádza namiesto toho z pozorovaní jasných príznakov toxicity pri jednej zo série stabilných dávok. Po validačných štúdiách in vivo v Spojenom kráľovstve (2) a aj v medzinárodných štúdiách in vivo sa tento postup prijal ako testovacia metóda v roku 1992. Následne sa štatistické vlastnosti metódy stabilnej dávky hodnotili s použitím matematických modelov v rade štúdií (4) (5) (6). Štúdie in vivo a modelové štúdie spolu názorne ukázali, že metóda je reprodukovateľná, používa sa pri nej menej zvierat a spôsobuje menej utrpenia ako tradičné metódy a umožňuje zatriediť látky podobne ako iné testovacie metódy akútnej toxicity.Usmernenie pre výber najvhodnejšej testovacej metódy na daný účel je možné nájsť v Usmerňujúcom dokumente o testovaní akútnej orálnej toxicity (Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing) (7). Tento usmerňujúci dokument obsahuje aj doplňujúce informácie o vykonávaní a interpretácii testovacej metódy B.1 bis.Princípom tejto metódy je, že sa v základnej štúdii používajú iba mierne toxické dávky a že je potrebné vyhýbať sa podávaniu dávok, pri ktorých sa očakáva, že sú smrteľné. Nie je tiež potrebné podávať dávky, o ktorých je známe, že spôsobujú silnú bolesť a utrpenie následkom leptavých alebo silne dráždivých účinkov. Moribundné zvieratá alebo zvieratá so zrejmými bolesťami alebo vykazujúcimi známky silného a pretrvávajúceho utrpenia sa humánnym spôsobom usmrtia a pri interpretácii výsledkov testu sa vyhodnotia ako zvieratá, ktoré uhynuli pri teste. Kritériá pre rozhodnutie usmrtiť moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídateľnej alebo nastávajúcej smrti je predmetom samostatného usmerňovacieho dokumentu (8).Metóda poskytuje informácie o nebezpečných vlastnostiach a umožňuje, aby sa látka mohla zatriediť a klasifikovať podľa Globálne harmonizovaného systému (GHS) pre klasifikáciu chemikálií, ktoré spôsobujú akútnu toxicitu (9).Testovacie laboratórium posúdi všetky dostupné informácie o testovanej látke pred uskutočnením štúdie. Takéto informácie budú obsahovať identitu a chemickú štruktúru látky; jej fyzikálno-chemické vlastnosti; výsledky všetkých ostatných in vitro alebo in vivo testov toxicity s látkou; toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných látkach; a predpokladané použitie(-ia) látky. Tieto informácie sú potrebné na ubezpečenie všetkých zainteresovaných, že test je relevantný pre ochranu zdravia ľudí a pomôže pri výbere vhodnej počiatočnej dávky.1.2 DEFINÍCIEAkútna orálna toxicita: sa vzťahuje na tie nepriaznivé účinky, ktoré sa vyskytnú po orálnom podaní jednorazovej dávky látky alebo viacnásobných dávok podávaných v priebehu 24 hodín.Oneskorená smrť: znamená, že zviera neuhynie, ani sa nejaví, že je moribundné v priebehu 48 hodín, ale uhynie neskôr v priebehu 14-dennej doby pozorovania.Dávka: je množstvo podanej testovanej látky. Dávka je vyjadrená ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (napr. mg/kg).Zrejmá toxicita: všeobecný termín popisujúci jasné príznaky toxicity po podaní testovanej látky (príklady pozri v (3)), ktoré sú také, že pri podaní najbližšej najvyššej stabilnej dávky sa dá očakávať buď silná bolesť a pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, moribundný stav (kritériá sú uvedené v Humane Endpoints Guidance Document (8)) alebo pravdepodobná mortalita u väčšiny zvierat.GHS: Globálne harmonizovaný klasifikačný systém pre chemické látky a zmesi. Spoločný projekt OECD (zdravie ľudí a životné prostredie ), Výboru expertov OSN pre prepravu nebezpečného tovaru (fyzikálno-chemické vlastnosti) a ILO (oznamovanie nebezpečenstva) a koordinovaný v rámci Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC).Blížiaca sa smrť: keď sa očakáva moribundný stav pred ďalšou plánovanou dobou pozorovania. Príznaky, ktoré sú príznačné pre tento stav u hlodavcov by mohli zahrnovať kŕče, polohu na boku, polohu v ľahu a triašku. (Ďalšie informácie pozri v Humane Endpoint Guidance Document (8)).LD50 (stredná smrteľná dávka): je štatistický odvodená jednorazová dávka látky, pri ktorej sa dá očakávať, že spôsobí úhyn 50 % zvierat po orálnom podaní. Hodnota LD50 je vyjadrená ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (mg/kg).Limitná dávka: sa vzťahuje na dávku nad hornou hranicou testovania (2000 alebo 5000 mg/kg).Moribundný stav: stav umierania alebo neschopnosti prežiť, dokonca aj pri liečbe. (Ďalšie informácie pozri v Humane Endpoint Guidance Document (8)).Predvídateľná smrť: prítomnosť klinických príznakov charakteristických pre smrť v známom čase v budúcnosti pred plánovaným ukončením experimentu, napríklad: neschopnosť prijímať vodu alebo jedlo. (Ďalšie informácie pozri v Humane Endpoint Guidance Document (8)).1.3 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDYSkupine zvierat rovnakého pohlavia sa postupne podávajú stabilné dávky 5, 50, 300 a 2000 mg/kg (výnimočne sa môže uvažovať o podaní ďalšej stabilnej dávky 5000 mg/kg, pozri oddiel 1.6.2). Na základe predbežnej štúdie sa zvolí počiatočná dávka, pri ktorej sa očakáva, že spôsobí určité príznaky toxicity bez toho, aby spôsobila vážne toxické účinky alebo mortalitu. Klinické príznaky a podmienky, ktoré sa spájajú s bolesťou, utrpením a blížiacou sa smrťou, sú podrobne uvedené v samostatnom usmerňovacom dokumente OECD (8). Ďalším skupinám zvierat sa môžu podávať vyššie alebo nižšie stabilné dávky v závislosti od prítomnosti alebo neprítomnosti príznakov toxicity alebo mortality. Tento postup pokračuje po dávku spôsobujúcu zrejmú toxicitu alebo po zistenie najviac jedného uhynutia, alebo keď nie sú viditeľné žiadne účinky pri najvyššej dávke, alebo keď sa vyskytnú uhynutia pri najnižšej dávke.1.4 OPIS TESTOVACEJ METÓDY1.4.1 Výber druhu zvieratSpomedzi živočíchov z druhu hlodavcov sa pokiaľ možno používa potkan, aj keď sa môže použiť aj iný druh hlodavca. Zvyčajne sa používajú samice (7). Je to preto, že prehľady bežných LD50 testov, uverejnené v odbornej literatúre, uvádzajú, že zvyčajne je malý rozdiel v citlivosti medzi pohlaviami, ale v tých prípadoch, keď sa pozorujú rozdiely, sú samice zvyčajne mierne citlivejšie (10). Ak však z poznatkov o toxikologických alebo toxikokinetických vlastnostiach štrukturálne príbuzných chemikálií vyplýva, že samce môžu byť citlivejšie, potom sa použije toto pohlavie. Ak sa test uskutočňuje na samcoch, je potrebné uviesť primerané zdôvodnenie.Používajú sa zdravé mladé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Samice majú byť panenské a negravidné. Každé zviera má byť na začiatku dávkovania vo veku medzi 8 a 12 týždňami a jeho hmotnosť má byť v intervale ± 20 % priemernej hmotnosti všetkých zvierat, ktorým sa predtým podala dávka.1.4.2 Podmienky pre umiestnenie a kŕmenieTeplota miestnosti pre pokusné zvieratá má byť 22 °C (± 3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť má byť aspoň 30 %, a nemala by prevyšovať 70 %, okrem doby počas čistenia miestnosti má dosahovať 50-60 %. Osvetlenie má byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Zvieratá môžu byť v klietkach po skupinách podľa dávok, ale počet zvierat na klietku musí umožniť zreteľné pozorovanie každého zvieraťa.1.4.3 Príprava zvieratZvieratá sú náhodne vybraté, označené tak, aby sa umožnila jednotlivá identifikácia a držia sa v klietkach aspoň 5 dní pred začiatkom podávania látky, aby sa im umožnila aklimatizácia na laboratórne podmienky.1.4.4 Príprava dávokTestované látky sa zvyčajne podávajú v stálom objeme počas celého rozsahu dávok, ktoré sa majú testovať zmenou koncentrácie dávkovaného prípravku. Ak sa však má testovať kvapalný konečný produkt alebo zmes, použitie neriedenej testovanej látky, t. j. pri konštantnej koncentrácii, môže byť vhodnejšie pre následné stanovenie rizika tejto látky a požadujú ho niektoré regulačné orgány. V každom prípade nesmie byť prevýšený maximálny objem podávanej dávky. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorázovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. U hlodavcov by objem zvyčajne nemal presiahnuť 1ml/100g telesnej hmotnosti: v prípade vodných roztokov sa však môže uvažovať o 2 ml/100g telesnej hmotnosti. Pokiaľ ide o zloženie dávkovaného prípravku, odporúča sa, pokiaľ je to možné, použitie vodného roztoku/suspenzie/emulzie, za ktorým v poradí nasleduje roztok/suspenzia/emulzia v oleji (napr. kukuričný olej) a potom prípadne roztok v iných nosičoch. Pre nosiče, ktoré sú iné ako voda, by mali byť známe toxikologické charakteristiky. Dávky musia byť pripravené tesne pred podávaním, pokiaľ nie je známa a prijateľná stabilita prípravku počas jeho používania.1.5 POSTUP1.5.1 Podávanie dávokTestovaná látka sa podáva ako jednorazová dávka cez sondu s použitím žalúdočnej sondy alebo vhodnej intubačnej kanyly. Za nezvyčajných okolností, keď nie je možná jednorazová dávka, sa dávka môže podávať v menších množstvách v priebehu maximálne 24 hodín.Zvieratá sa pred podaním dávky vyhladujú (napr. potkanom sa cez noc zadrží potrava, ale nie voda; myšiam sa na 3-4 hodiny zadrží potrava, ale nie voda). Po období hladovania sa zvieratá odvážia a podá sa im testovaná látka. Po podaní látky sa potrava môže zadržať na ďalšie 3-4 hodiny potkanom, alebo myšiam na 1-2 hodiny. Ak sa dávka podáva po častiach počas určitého obdobia, môže byť potrebné poskytnúť zvieratám potravu a vodu v závislosti od dĺžky obdobia.1.5.2 Predbežná štúdiaÚčelom predbežnej štúdie je umožniť výber vhodnej počiatočnej dávky pre základnú štúdiu. Testovaná látka sa podáva jednotlivým zvieratám postupne podľa postupového diagramu v prílohe 1. Predbežná štúdia je hotová, keď je možné vykonať rozhodnutie o počiatočnej dávke pre základnú štúdiu (alebo ak sa vyskytne uhynutie pri najnižšej stabilnej dávke).Počiatočná dávka sa v prípade predbežnej štúdie vyberie zo stabilných dávok 5, 50, 300 a 2000 mg/kg ako dávka, pri ktorej sa očakáva, že spôsobí zrejmú toxicitu, ktorá je založená pokiaľ možno na dôkaze z in vivo a in vitro údajov pre tú istú chemikáliu a pre štrukturálne príbuzné chemikálie. Ak takéto informácie chýbajú, bude počiatočná dávka 300 mg/kg.Medzi podaním jednotlivých dávok každému zvieraťu je časový interval aspoň 24 hodín. Všetky zvieratá sa pozorujú aspoň 14 dní.Výnimočne, a iba v odôvodnených prípadoch na základe osobitných regulačných potrieb, sa môže zohľadniť použitie ďalšej vyššej stabilnej dávky 5000 mg/kg (pozri prílohu 3). Z dôvodu starostlivosti o zvieratá sa pokusy na zvieratách v rozsahoch GHS kategórie 5 (2000-5000 mg/kg) neodporúčajú a uvážia sa iba v prípade veľkej pravdepodobnosti, že výsledky takéhoto testu sú bezprostredne dôležité pre ochranu zdravia ľudí a zvierat alebo ochranu životného prostredia.V prípadoch, keď zviera, testované pri najnižšej stabilnej dávke (5mg/kg) v predbežnej štúdii, uhynie, zvyčajným postupom je, že štúdia sa ukončí a látka sa zaradí do GHS kategórie 1 (ako je uvedené v prílohe 1). Ak sa však vyžaduje ďalšie potvrdenie klasifikácie, môže sa vykonať tento voliteľný doplnkový postup. Druhému zvieraťu sa podá dávka 5mg/kg. Ak toto druhé zviera uhynie, potom sa potvrdí GHS kategória 1 a štúdia sa ihneď ukončí. Ak druhé zviera prežije, potom sa maximálne trom ďalším zvieratám podá dávka 5 mg/kg. Pre výskyt veľkého rizika mortality sa týmto zvieratám z dôvodu starostlivosti o zvieratá podá dávka postupne. Časový interval medzi podaním dávky každému zvieraťu má byť dostatočný na to, aby sa stanovila pravdepodobnosť prežitia predchádzajúceho zvieraťa. Ak sa vyskytne druhé uhynutie, postupnosť podávania dávok sa ihneď ukončí a žiadnym ďalším zvieratám sa nepodajú dávky. Keďže výskyt druhého uhynutia (bez ohľadu na počet pokusných zvierat v čase ukončenia) patrí do výsledku A (2 alebo viac uhynutí), postupuje sa podľa klasifikačného pravidla prílohy 2 pri stabilnej dávke 5mg/kg (kategória 1, ak sa vyskytne 2 alebo viac uhynutí alebo kategória 2, ak sa nevyskytne viac ako 1 uhynutie). Okrem toho príloha 4 poskytuje usmernenie pre klasifikáciu v systéme EÚ až kým sa nezavedie nový GHS.1.5.3 Základná štúdia1.5.3.1 Počet zvierat a dávkyOpatrenia, ktoré sa majú prijať po testovaní s počiatočnou dávkou, sa uvádzajú v postupových diagramoch v prílohe 2. Vyžaduje sa jedno z troch opatrení; buď sa testovanie ukončí a priradí príslušná trieda klasifikácie nebezpečenstva, testuje sa pri vyššej stabilnej dávke, alebo sa testuje pri nižšej stabilnej dávke. Na ochranu zvierat sa však v základnej štúdii nezopakuje dávka, ktorá spôsobila uhynutie v predbežnej štúdii (pozri prílohu 2). Zo skúseností vyplýva, že najpravdepodobnejším výsledkom pri počiatočnej dávke bude to, že látku je možné klasifikovať a nie je potrebné ďalšie testovanie.Zvyčajne sa používa celkove päť zvierat rovnakého pohlavia pre každú skúmanú dávku. K týmto piatim zvieratám patrí jedno zviera z predbežnej štúdie, ktorému sa podala zvolená dávka, a ďalšie štyri zvieratá (okrem výnimočného prípadu, keď sa dávka, použitá v základnej štúdii, nezahrnula do predbežnej štúdie).Časový interval medzi dávkovaním s každou veľkosťou dávky je určený nástupom, trvaním a závažnosťou príznakov toxicity. Ďalšia dávka sa podá zvieratám až po ubezpečení, že zvieratá, ktorým sa predtým podala dávka, prežili. Podľa potreby sa odporúča interval 3 alebo 4 dni medzi jednotlivými dávkami, aby sa umožnilo pozorovanie oneskorenej toxicity. Časový interval sa môže nastaviť podľa potreby, napr. v prípade nepresvedčivej reakcie.Ak sa uvažuje o použití vyššej stabilnej dávky 5000 mg/kg, postupuje sa podľa postupu uvedeného v prílohe 3 (pozri tiež oddiel 1.6.2).1.5.3.2 Limitný testLimitný test sa pokiaľ možno používa v situáciách, keď experimentátor má informácie, z ktorých vyplýva, že testovaný materiál je pravdepodobne netoxický, t. j. že je toxický iba v prípade, keď prevyšuje predpismi stanovené limitné dávky. Informácie o toxicite testovaného materiálu je možné získať z poznatkov o podobných testovaných látkach alebo podobných testovaných zmesiach alebo produktoch pri zohľadnení identity a percenta zložiek, o ktorých je známe, že sú toxikologicky významné. V tých situáciách, keď je málo informácií alebo nie sú informácie o jeho toxicite, alebo v ktorých sa očakáva, že testovaný materiál bude toxický, je potrebné vykonať základný test.Pri zvyčajnom postupe sa počiatočná dávka predbežnej štúdie 2000 mg/kg (alebo výnimočne 5000 mg/kg) následne podá ďalším štyrom zvieratám, čo slúži ako limitný test v prípade tohto usmernenia.1.6 POZOROVANIAZvieratá sa vyšetrujú individuálne po podaní dávky aspoň raz počas prvých 30 minút, pravidelne počas prvých 24 hodín, osobitne pozorne počas prvých 4 hodín, a potom každý deň počas celkove 14 dní, okrem prípadu, keď je potrebné zvieratá vylúčiť zo štúdie a z dôvodu starostlivosti o zvieratá humánnym spôsobom usmrtiť, alebo keď sa zistí, že uhynuli. Dĺžka pozorovania by sa však nemala pevne určiť. Určí na základe toxických reakcií, času nástupu a dĺžky času zotavenia a malo by sa teda umožniť jej predĺženie, ak sa to pokladá za potrebné. Časy, kedy sa objavia a zmiznú príznaky toxicity sú dôležité, predovšetkým v prípade tendencie oneskorenia toxických príznakov (11). Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenajú, pričom každé zviera má individuálny záznam.Ďalšie vyšetrenia budú potrebné, ak zvieratá naďalej vykazujú príznaky toxicity. Pri vyšetreniach sa venuje pozornosť zmenám na pokožke a srsti, očiach a slizniciach a tiež respiračnému, obehovému, autonómnemu a centrálnemu nervovému systému a somatomotorickej aktivite a spôsobu správania. Pozornosť sa zameriava na pozorovanie triašky, kŕčov, slinenia, hnačky, letargie, spánku a kómy. Zohľadnia sa zásady a kritériá zosumarizované v Humane Endpoints Guidance Document (8). Zvieratá nachádzajúce sa v moribundnom stave, alebo ktoré vykazujú silné bolesti alebo pretrvávajúce príznaky veľkého utrpenia, sa humánnym spôsobom usmrtia. Keď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov, alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamenať čas uhynutia.1.6.1 Telesná hmotnosťHmotnosť jednotlivých zvierat sa stanoví krátko pred podaním testovanej látky a potom aspoň každý týždeň. Zmeny hmotnosti sa vypočítajú a zaznamenajú. Na konci testu sa zvieratá, ktoré prežili, odvážia a potom humánnym spôsobom usmrtia.1.6.2 PatológiaVšetky testované zvieratá (vrátane tých, ktoré uhynú počas testu, alebo sú vylúčené zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá), sa podrobia autopsii. Všetky makroskopické patologické zmeny u každého zvieraťa sa zaznamenajú. Môže sa uvažovať aj o mikroskopickom vyšetrení orgánov dokazujúcom makroskopické patologické nálezy u zvierat, ktoré prežili 24 alebo viac hodín po podaní počiatočnej dávky, ktoré môže poskytnúť užitočné informácie.2. ÚDAJEO jednotlivých zvieratách sa poskytujú informácie. Okrem toho sa všetky údaje zosumarizujú vo forme tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu počet použitých zvierat, počet zvierat vykazujúcich príznaky toxicity, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu, alebo boli usmrtené z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, popis časového priebehu toxických účinkov a reverzibility a pitevné nálezy.3. PODÁVANIE SPRÁV3.1 SPRÁVA O TESTESpráva o teste musí podľa potreby obsahovať tieto informácie:Testovaná látka:- fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti (vrátane izomerizácie);- identifikačné údaje vrátane čísla CAS,Nosič (v prípade potreby):- zdôvodnenie výberu nosiča, ak je iný ako voda.Pokusné zvieratá:- použitý druh/kmeň;- mikrobiologický stav zvierat, ak je známy;- počet, vek a pohlavie zvierat (v prípade potreby vrátane zdôvodnenia, prečo sa použili samce namiesto samíc);- zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.;Testovacie podmienky:- údaje o zložení testovanej látky, vrátane údajov o fyzikálnej forme podávaného materiálu;- údaje o podávaní testovanej látky, vrátane objemov dávok a čase podávania;- údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu krmiva/zdroja, zdroja vody);- zdôvodnenie výberu počiatočnej dávky.Výsledky:- tabuľkové spracovanie údajov o reakcii a veľkosti dávky pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane mortality, povahy, závažnosti a trvania účinkov);- tabuľkové spracovanie telesnej hmotnosti a zmien telesnej hmotnosti;- hmotnosti jednotlivých zvierat v deň podania dávky, potom v týždenných intervaloch a v čase uhynutia alebo usmrtenia;- dátum a čas uhynutia v prípade vopred naplánovaného usmrtenia;- časový priebeh nástupu príznakov toxicity a či tieto príznaky boli reverzibilné pre každé zviera;- pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú k dispozícii.Diskusia a interpretácia výsledkov.Závery.4. ODKAZY(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, s.11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes , Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.--------------------------------------------------PRÍLOHA 2C"B.1tris. AKÚTNA ORÁLNA TOXICITA – METÓDA TRIEDY AKÚTNEJ TOXICITY1. METÓDATáto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 423 (2001).1.1 ÚVODMetóda triedy akútnej toxicity (1), uvedená v tomto teste, je postupnou metódou, pri ktorej sa na každý krok použijú 3 zvieratá rovnakého pohlavia. V závislosti od mortality a/alebo ich moribundného stavu môžu byť potrebné priemerne 2 až 4 kroky na posúdenie akútnej toxicity testovanej látky. Táto metóda je reprodukovateľná, používa sa pri nej veľmi málo zvierat a umožňuje zatriediť látky podobne ako iné testovacie metódy akútnej toxicity. Metóda triedy akútnej toxicity je založená na biometrických hodnoteniach (2) (3) (4) (5) so stabilnými dávkami dostatočne odlíšenými, aby umožnili zatriedenie látky na klasifikačné účely a posúdenie nebezpečenstva. Metóda, ktorá bola prijatá v roku 1996, bola rozsiahlo validovaná pokusmi in vivo v porovnaní s údajmi LD50 získanými z literatúry, ako na národnej (6), tak aj na medzinárodnej úrovni (7).Usmernenie pre výber najvhodnejšej testovacej metódy na daný účel je možné nájsť v Usmerňujúcom dokumente o testovaní akútnej orálnej toxicity (Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8)). Tento usmerňujúci dokument obsahuje aj doplňujúce informácie o vykonávaní a interpretácii testovacej metódy B.1 tris.Nie je potrebné podávať testované látky pri dávkach, o ktorých je známe, že spôsobujú silnú bolesť a utrpenie následkom leptavých alebo silne dráždivých účinkov. Moribundné zvieratá alebo zvieratá s bolesťami alebo zviaratá, ktoré vykazujú príznaky silného a trvalého utrpenia, sa humánnym spôsobom usmrcujú a pri interpretácii výsledkov testu sa vyhodnocujú rovnako ako zvieratá, ktoré uhynuli pri teste. Kritériá pre rozhodnutie usmrtiť moribundné alebo silne trpiace zvieratá a usmernenie o uznaní predvídateľnej alebo nastávajúcej smrti sú predmetom samostatného usmerňovacieho dokumentu (9).Metóda využíva vopred stanovené dávky a výsledky umožňujú, aby sa látka mohla zatriediť a klasifikovať podľa Globálne harmonizovaného systému pre klasifikáciu chemikálií, ktoré spôsobujú akútnu toxicitu (10).V zásade metóda nie je určená na umožnenie výpočtu presnej hodnoty LD50, ale umožňuje stanovenie definovaných rozsahov expozície, kde sa očakáva letalita, keďže uhynutie časti zvierat je stále najdôležitejším konečným bodom tohto testu. Metóda umožňuje stanovenie hodnoty LD50 iba v prípade, keď v dôsledku podania aspoň dvoch dávok je mortalita vyššia ako 0 % a nižšia ako 100 %. Výber vopred stanovených dávok bez ohľadu na testovanú látku s klasifikáciou výlučne viazanou na počet zvierat vyšetrovaných v rôznych stavoch zlepšuje možnosti konzistencie podávania správ a reprodukovateľnosti medzi laboratóriami.Testovacie laboratórium posúdi všetky dostupné informácie o testovanej látke pred uskutočnením štúdie. Takéto informácie budú zahrnovať identitu a chemickú štruktúru látky; jej fyzikálno-chemické vlastnosti; výsledok všetkých ostatných in vivo alebo in vitro testov toxicity s látkou; toxikologické údaje o štrukturálne príbuzných látkach; a predpokladané použitie(-ia) látky. Tieto informácie sú potrebné na ubezpečenie všetkých zainteresovaných, že test je dôležitý na ochranu zdravia ľudí a pomôže pri výbere najvhodnejšej počiatočnej dávky.1.2 DEFINÍCIEAkútna orálna toxicita: sa vzťahuje na tie nepriaznivé účinky, ktoré sa vyskytnú po orálnom podaní jednorazovej dávky látky alebo viacnásobných dávok podávaných v priebehu 24 hodín.Oneskorená smrť: znamená, že zviera neuhynie, ani sa nejaví ako moribundné v priebehu 48 hodín, ale uhynie neskôr v priebehu vymedzeného 14-denného času pozorovania.Dávka: je množstvo podanej testovanej látky. Dávka je vyjadrená ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (napr. mg/kg).GHS: Globálne harmonizovaný klasifikačný systém pre chemické látky a zmesi. Spoločný projekt OECD (zdravie ľudí a životné prostredie), Výboru expertov OSN pre prepravu nebezpečného tovaru (fyzikálno-chemické vlastnosti) a ILO (oznamovanie nebezpečenstva) a koordinovaný v rámci Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC).Blížiaca sa smrť: keď sa očakáva moribundný stav pred ďalšou plánovanou dobou pozorovania. Príznaky, ktoré sú príznačné pre tento stav u hlodavcov by mohli zahrnovať kŕče, polohu na boku, polohu v ľahu a triašku. (Ďalšie informácie sa nachádzajú v Humane Endpoint Guidance Document (9)).LD50 (stredná smrteľná orálna dávka): je štatistický odvodená jednorazová dávka látky, pri ktorej sa dá očakávať, že spôsobí úhyn 50 % zvierat pri orálnom podaní. Hodnota LD50 je vyjadrená ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti pokusného zvieraťa (mg/kg).Limitná dávka: sa vzťahuje na dávku nad hornou hranicou testovania (2000 alebo 5000 mg/kg).Moribundný stav: stav umierania alebo neschopnosti prežiť, dokonca aj pri liečbe. (Ďalšie informácie sa nachádzajú v Humane Endpoint Guidance Document (9)).Predvídateľná smrť: prítomnosť klinických príznakov charakteristických pre smrť v známom čase v budúcnosti pred plánovaným ukončením experimentu; napríklad: neschopnosť prijímať vodu alebo jedlo. (Ďalšie informácie sa nachádzajú v Humane Endpoint Guidance Document (9)).1.3 PRINCÍP TESTUPrincíp testu spočíva v tom, že na základe metódy postupných krokov s použitím minimálneho počtu zvierat na krok sa získajú dostatočné informácie o akútnej toxicite testovanej látky, ktoré umožnia jej klasifikáciu. Látka sa podáva orálne skupine pokusných zvierat v jednej zo stanovených dávok. Látka sa testuje s použitím metódy postupných krokov, v každom kroku sa použijú tri zvieratá rovnakého pohlavia (zvyčajne samice). Absencia alebo výskyt mortality súvisiacej s látkou u zvierat, ktorým sa podala dávka v jednom kroku určí ďalší krok, t. j.:- nie je potrebné ďalšie testovanie,- podanie rovnakej dávky trom ďalším zvieratám,- podanie najbližšej vyššej alebo najbližšej nižšej dávky trom ďalším zvieratám.Informácie o postupe testu sú uvedené v prílohe 1. Metóda umožní posúdenie vzhľadom na klasifikáciu testovanej látky do jednej z viacerých tried toxicity definovaných pevnými hraničnými hodnotami LD50.1.4 OPIS METÓDY1.4.1 Výber druhu zvieratSpomedzi druhov hlodavcov sa prednostne používa potkan, hoci sa môže použiť aj iný druh hlodavca. Zvyčajne sa používajú samice (9). Je to preto, že prehľady konvenčných LD50 testov, uverejnené v odbornej literatúre, uvádzajú, že hoci je malý rozdiel v citlivosti medzi pohlaviami, v tých prípadoch, keď sa pozorovali rozdiely, sú samice zvyčajne mierne citlivejšie (11). Ak však z poznatkov o toxikologických alebo toxikokinetických vlastnostiach štrukturálne príbuzných chemikálií vyplýva, že samce môžu byť citlivejšie, potom sa použije toto pohlavie. Ak sa test uskutočňuje na samcoch, je potrebné uviesť primerané zdôvodnenie.Používajú sa zdravé mladé dospelé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Samice majú byť panenské a negravidné. Každé zviera na začiatku dávkovania má byť vo veku medzi 8 a 12 týždňami a jeho hmotnosť má byť v rozpätí ± 20 % priemernej hmotnosti všetkých zvierat, ktorým sa predtým podala dávka.1.4.2 Podmienky pre umiestnenie a kŕmenieTeplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala byť 22 °C (± 3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť by mala byť aspoň 30 % a nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti by mala dosahovať 50-60 %. Osvetlenie by malo byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Zvieratá môžu byť v klietkach po skupinách podľa dávok, ale počet zvierat na klietku musí umožniť zreteľné pozorovanie každého zvieraťa.1.4.3 Príprava zvieratZvieratá sú náhodne vybraté, označené tak, aby sa umožnila jednotlivá identifikácia a držia sa v klietkach aspoň 5 dní pred začiatkom podávania dávok, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky.1.4.4 Príprava dávokTestované látky sa zvyčajne podávajú v stálom objeme počas celého intervalu dávkovania, ktoré sa má testovať na základe zmeny koncentrácie dávkovaného prípravku. Ak sa však má testovať kvapalný konečný produkt alebo zmes, použitie neriedenej testovanej látky, t. j. s konštantnou koncentráciou, môže byť pre následné stanovenie rizika tejto látky vhodnejšie a požadujú ho niektoré regulačné orgány. V každom prípade sa nesmie prekročiť maximálny objem podávanej dávky. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorázovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. U hlodavcov by objem zvyčajne nemal presiahnuť 1ml/100g telesnej hmotnosti: v prípade vodných roztokov sa však môže uvažovať o 2 ml/100g telesnej hmotnosti. Pokiaľ ide o zloženie dávkovaného prípravku, odporúča sa vždy, keď je to možné, použitie vodného roztoku/suspenzie/emulzie, za ktorým v poradí nasleduje roztok/suspenzia/emulzia v oleji (napr. kukuričný olej) a potom prípadne roztok v iných nosičoch. Pre nosiče, ktoré sú iné ako voda, by mali byť známe toxikologické charakteristiky. Dávky musia byť pripravené tesne pred podávaním, pokiaľ nie je známa a prijateľná stabilita prípravku počas obdobia, kedy sa bude používať.1.5 POSTUP1.5.1 Podávanie dávokTestovaná látka sa podáva ako jednorazová dávka cez sondu s použitím žalúdočnej sondy alebo vhodnej intubačnej kanyly. Za nezvyčajných okolností, keď nie je možná jednorazová dávka, sa môže dávka podávať v menších množstvách v priebehu maximálne 24 hodín.Zvieratá sa pred podávaním dávok vyhladujú (napr. potkanom sa cez noc zadrží potrava, ale nie voda; myšiam sa na 3-4 hodiny zadrží potrava, ale nie voda). Po období hladovania sa zvieratá odvážia a podá sa im testovaná látka. Po podaní látky sa zadrží potrava na ďalšie 3-4 hodiny potkanom, alebo myšiam na 1-2 hodiny. Ak sa dávka podáva po častiach počas určitého obdobia, môže byť potrebné poskytnúť zvieratám potravu a vodu v závislosti od dĺžky obdobia.1.5.2 Počet zvierat a veľkosť dávokNa každý krok sa použijú tri zvieratá. Veľkosť dávky, ktorá sa použije ako počiatočná dávka, sa vyberie z jednej zo štyroch stabilných hodnôt 5, 50, 300 a 2000 mg/kg telesnej hmotnosti. Počiatočná dávka má byť taká, pri ktorej s najväčšou pravdepodobnosťou nastane smrť u niektorých zvierat, ktorým sa podala dávka. Postupové diagramy v prílohe 1 popisujú postup, ktorý je potrebné dodržiavať pre každú z počiatočných dávok. Popritom príloha 4 poskytuje usmernenie ku klasifikácii v schéme EÚ až kým sa nezavedie nový GHS.Keď z dostupných informácií vyplýva, že úmrtie je nepravdepodobné pri najvyššej počiatočnej dávke (2000 mg/kg telesnej hmotnosti), potom je potrebné vykonať limitný test. Ak nie sú žiadne informácie o látke, ktorá sa má testovať, z dôvodu starostlivosti o zvieratá sa odporúča použiť počiatočnú dávku 300 mg/kg telesnej hmotnosti.Časový interval medzi skupinami dávok je určený nástupom, trvaním a závažnosťou príznakov toxicity. Zvieratám sa podá ďalšia dávka až po ubezpečení, že zvieratá, ktorým sa predtým podala dávka, prežili.Výnimočne, a iba v odôvodnených prípadoch na základe osobitných regulačných potrieb, sa môže uvažovať o použití ďalšej vyššej stabilnej dávky 5000 mg/kg telesnej hmotnosti (pozri prílohu 2). Z dôvodu starostlivosti o zvieratá sa testy na zvieratách v rozsahu GHS kategórie 5 (2000-5000 mg/kg) neodporúčajú a uvažuje sa o nich iba v prípade veľkej pravdepodobnosti, že výsledky takéhoto testu by mohli byť bezprostredne dôležité pre ochranu zdravia ľudí a zvierat alebo ochranu životného prostredia.1.5.3 Limitný testLimitný test sa používa predovšetkým v situáciách, keď experimentátor má informácie, z ktorých vyplýva, že testovaný materiál je pravdepodobne netoxický, t. j. že je toxický iba v prípade, keď prevyšuje predpismi stanovené limitné dávky. Informácie o toxicite testovaného materiálu je možné získať z poznatkov o podobných testovaných látkach alebo podobne testovaných zmesiach alebo produktoch pri zohľadnení identity a percenta zložiek, o ktorých je známe, že sú toxikologicky významné. V týchto situáciách, keď existuje málo informácií, alebo neexistujú žiadne informácie, o jeho toxicite, alebo v ktorých sa očakáva, že testovaný materiál bude toxický, je potrebné vykonať základný test.Limitný test s jednou dávkou 2000 mg/kg telesnej hmotnosti sa môže vykonať so šiestimi zvieratami (tri zvieratá na každý krok). Výnimočne sa môže vykonať limitný test s jednou dávkou 5000 mg/kg s tromi zvieratami (pozri prílohu 2). Ak sa vyskytne uhynutie súvisiace s testovanou látkou, môže byť potrebné vykonať ďalšie testovanie s najbližšou nižšou dávkou.1.6 POZOROVANIAZvieratá sa pozorujú individuálne po podaní dávky aspoň raz počas prvých 30 minút, pravidelne počas prvých 24 hodín, osobitne pozorne počas prvých 4 hodín a potom každý deň počas celkove 14 dní, okrem prípadu, keď je potrebné zvieratá vylúčiť zo štúdie a z dôvodu starostlivosti o zvieratá humánnym spôsobom usmrtiť, alebo keď sa zistí, že uhynuli. Dĺžka pozorovania by sa však nemala pevne stanoviť. Stanoví na základe toxických reakcií, času nástupu a dĺžky času zotavenia a teda sa môže predĺžiť, ak sa to pokladá za potrebné. Časy, kedy sa objavia a zmiznú príznaky toxicity, sú dôležité, predovšetkým v prípade tendencie oneskorenia toxických príznakov (12). Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenávajú, pričom každé zviera má individuálny záznam.Ďalšie pozorovania budú potrebné, ak zvieratá naďalej vykazujú príznaky toxicity. Pri vyšetreniach sa venuje pozornosť zmenám na pokožke a srsti, očiach a slizniciach a tiež respiračnému, obehovému, autonómnemu a centrálnemu nervovému systému a somatomotorickej aktivite a spôsobu správania. Pozornosť sa zameriava na pozorovanie triašky, kŕčov, slinenia, hnačky, letargie, spánku a kómy. Zohľadňujú sa aj zásady a kritériá zosumarizované v Humane Endpoints Guidance Document (9). Zvieratá, ktoré sú moribundom stave, alebo vykazujú silné bolesti alebo pretrvávajúce príznaky silného utrpenia, sa humánnym spôsobom usmrtia. Keď sa zvieratá usmrtia z humánnych dôvodov, alebo sa nájdu uhynuté, je potrebné čo možno najpresnejšie zaznamenať čas uhynutia.1.6.1 Telesná hmotnosťHmotnosť jednotlivých zvierat sa stanovuje krátko pred podaním testovanej látky a potom aspoň každý týždeň. Zmeny hmotnosti sa vypočítajú a zaznamenajú. Na konci testu sa zvieratá, ktoré prežili, odvážia a humánnym spôsobom usmrtia.1.6.2 PatológiaVšetky testované zvieratá (vrátane tých, ktoré uhynú počas testu, alebo sú vylúčené zo štúdie z dôvodu starostlivosti o zvieratá), sa podrobujú autopsii. Všetky makroskopické patologické zmeny u každého zvieraťa sa zaznamenávajú. Môže sa tiež uvažovať o vykonaní mikroskopického vyšetrenia orgánov, dokazujúceho makropatologické nálezy vo zvieratách, ktoré prežili 24 alebo viac hodín, ktoré môže poskytnúť užitočné informácie.2. ÚDAJEO jednotlivých zvieratách sa uvádzajú informácie. Okrem toho sa všetky údaje zhrnú v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú skupinu počet použitých zvierat, počet zvierat vykazujúcich príznaky toxicity, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu, alebo sa usmrtili z humánnych dôvodov, čas uhynutia jednotlivých zvierat, popis a časový priebeh toxických účinkov a reverzibility a pitevné nálezy.3. PODÁVANIE SPRÁV3.1 Správa o testeSpráva o teste musí podľa potreby obsahovať tieto informácie:Testovaná látka:- fyzikálny charakter, čistota a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti (vrátane izomerizácie);- identifikačné údaje vrátane čísla CAS,Nosič (v prípade potreby)- zdôvodnenie výberu nosiča, ak je iný ako voda.Pokusné zvieratá:- použitý druh/kmeň;- mikrobiologický stav zvierat, ak je známy;- počet, vek a pohlavie zvierat (vrátane, ak je potrebné, zdôvodnenia na použitie samcov namiesto samíc);- zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.;Testovacie podmienky:- údaje o zložení testovanej látky vrátane údajov o fyzikálnej forme podávaného materiálu;- údaje o podávaní testovanej látky vrátane objemov dávok a čase podávania;- údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu krmiva/zdroja, zdroja vody);- zdôvodnenie výberu počiatočnej dávky.Výsledky:- tabuľkové spracovanie získaných údajov o reakcii a veľkosti dávky pre každé zviera (t. j. zvieratá vykazujúce príznaky toxicity vrátane mortality, charakteru, závažnosti a trvania účinkov);- tabuľkové spracovanie telesnej hmotnosti a zmien telesnej hmotnosti;- hmotnosti jednotlivých zvierat v deň podávania dávok, potom v týždňových intervaloch a v čase uhynutia alebo usmrtenia;- dátum a čas uhynutia v prípade vopred naplánovaného usmrtenia;- časový priebeh nástupu príznakov toxicity a či tieto príznaky boli reverzibilné pre každé zviera;- pitevné nálezy a histopatologické nálezy pre každé zviera, ak sú k dispozícii.Diskusia a interpretácia výsledkov.Závery.4. ODKAZY(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610.(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134.(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html](11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994 ). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA."--------------------------------------------------PRÍLOHA 2DB. 4. AKÚTNA TOXICITA: PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE KOŽE1. METÓDATáto metóda je rovnocenná s OECD TG 404 (2002).1.1 ÚVODPri príprave tejto aktualizovanej metódy sa osobitná pozornosť venovala možným zlepšeniam v súvislosti so starostlivosťou o zvieratá a posúdeniu všetkých existujúcich informácií o testovanej látke, aby sa zabránilo zbytočnému testovaniu na laboratórnych zvieratách. Táto metóda zahrnuje odporúčanie, aby sa pred uskutočnením opísaného in vivo testu na poleptanie/podráždenie látkou urobila kritická analýza existujúcich príslušných údajov. Ak dostačujúce údaje nie sú dostupné, môžu sa získať na základe postupného testovania (1). Stratégia testovania zahrnuje vykonanie validovaných a uznaných in vitro testov a je uvedená ako príloha k tejto metóde. Okrem toho sa v prípade potreby odporúča v počiatočnom in vivo teste použiť postupne, a nie súčasne, tri testovacie náplasti na zviera.V záujme vedeckej spoľahlivosti, a aj starostlivosti o zvieratá, sa in vivo testovanie nevykonáva, pokiaľ neboli všetky dostupné údaje, súvisiace s potenciálnym poleptaním/podráždením kože látkou, vyhodnotené v kritickej analýze. Takéto údaje zahrnujú dôkaz z existujúcich štúdií na ľuďoch a/alebo laboratórnych zvieratách, dôkaz o poleptaní/podráždení jednou alebo viacerými štrukturálne príbuznými látkami alebo zmesami takýchto látok, údaje dokazujúce silnú aciditu alebo alkalitu látky (2) (3) a výsledky z validovaných a uznaných in vitro alebo ex vivo testov (4) (5) (5a). Táto analýza zníži potrebu in vivo testovania na poleptanie/podráždenie kože látkami, pre ktoré už existujú dostatočné dôkazy z iných štúdií k uvedeným dvom konečným bodom.Uprednostňovaná stratégia postupného testovania, ktorá zahrnuje vykonanie validovaných a uznaných in vitro alebo ex vivo testov na poleptanie/podráždenie, je do tejto metódy zahrnutá ako príloha. Stratégia bola vypracovaná a jednomyseľne odporučená účastníkmi OECD workshopu (6) a bola prijatá ako odporúčaná stratégia testovania v Globálne harmonizovanom systéme pre klasifikáciu chemických látok (GHS) (7). Odporúča sa, aby sa táto stratégia testovania dodržiavala pred uskutočnením in vivo testovania. V prípade nových látok sa na získanie vedecky spoľahlivých údajov o poleptaní/podráždení látkou odporúča koncepcia postupného testovania. V prípade existujúcich látok s nedostačujúcimi údajmi o poleptaní/podráždení kože sa vedená stratégia použije na získanie chýbajúcich údajov. Použitie odlišnej stratégie testovania alebo testovacej metódy alebo rozhodnutie nepoužiť koncepciu postupného testovania, je potrebné zdôvodniť.Ak sa poleptanie alebo podráždenie nemôže stanoviť s použitím kritickej analýzy, ktorá je konzistentná so stratégiou postupného testovania, je potrebné uvažovať o použití in vivo testu (pozri prílohu).1.2 DEFINÍCIEPodráždenie kože: je vznik reverzibilného poškodenia kože po aplikácii testovanej látky v trvaní do 4 hodín.Poleptanie kože: je vznik ireverzibilného poškodenia kože; konkrétne ide o viditeľné nekrózy cez epidermu až do dermy po aplikácii testovanej látky v trvaní do štyroch hodín. Pre reakcie na poleptanie sú typické vredy, krvácanie, krvavé chrasty a, na konci pozorovania po 14 dňoch, strata farby následkom vyblednutia kože, kompletné partie bez srsti a jazvy. Na vyhodnotenie nejasných poškodení je potrebné uvažovať o vykonaní histopatologického vyšetrenia.1.3 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDYLátka, ktorá sa má testovať, sa aplikuje v jednorazovej dávke na kožu pokusného zvieraťa; neošetrené časti kože testovaného zvieraťa slúžia ako kontrola. V stanovených intervaloch zistí a vyhodnotí stupeň podráždenia/poleptania a následne sa popíše, aby sa zabezpečilo kompletné posúdenie účinkov. Trvanie štúdie má byť dostatočné na posúdenie reverzibility alebo ireverzibility pozorovaných účinkov.Zvieratá, ktoré vykazujú pretrvávajúce príznaky silného utrpenia a/alebo bolesti v ktoromkoľvek štádiu testu, sa humánnym spôsobom usmrtia a daná látka sa na základe toho posúdi. Kritéria pre rozhodnutie o humánnom spôsobe usmrtenia moribundných a silne trpiacich zvierat je možné nájsť v odkaze (8).1.4 OPIS TESTOVACEJ METÓDY1.4.1 Príprava na in vivo test1.4.1.1 Výber druhu zvieratAko laboratórne zviera sa prednostne používa králik - albín a použijú sa zdravé mladé dospelé králiky. Použitie iných druhov je potrebné zdôvodniť.1.4.1.2 Príprava zvieratPribližne 24 hodín pred testom sa dôkladným ostrihaním na chrbtovej časti trupu týchto zvierat odstráni srsť. Je potrebné venovať pozornosť tomu, aby sa koža neodrala a použijú sa iba zvieratá so zdravou, neporušenou kožou.Niektoré druhy králikov majú miesta s hustou srsťou, ktoré sa objavujú v určitých obdobiach roka. Takéto miesta, zarastené hustou srsťou, by sa nemali používať ako miesta na testovanie.1.4.1.3 Podmienky pre umiestnenie a kŕmenieZvieratá sa umiestnia jednotlivo. Teplota miestnosti pre králiky ako pokusné zvieratá má byť 22 °C (± 3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť má byť aspoň 30 % a nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti má dosahovať 50-60 %. Osvetlenie má byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.1.4.2 Postup testu1.4.2.1 Aplikácia testovanej látkyTestovaná látka sa aplikuje na malé plochy (približne 6 cm2) kože a zakryje náplasťou z gázy, ktorá sa prichytí leukoplastom, ktorý nespôsobuje podráždenie. V prípadoch, keď nie je možná priama aplikácia (napr. kvapaliny alebo niektoré pasty), sa testovaná látka nanesie najskôr na náplasť z gázy, ktorá sa potom aplikuje na kožu. Náplasť sa voľne prichytí, aby mala kontakt s kožou pomocou vhodného semiokluzívneho obväzu počas trvania expozície. Ak sa testovaná látka aplikuje na náplasť, pripevní sa tak, aby mala dobrý kontakt s kožou a aby látka bola na koži rovnomerne rozložená. Je potrebné zabrániť tomu, aby zviera dosiahlo na náplasť a aby požilo alebo vdýchlo testovanú látku.Kvapalné testované látky sa zvyčajne používajú neriedené. Pri testovaní tuhých látok (ktoré sa môžu v prípade potreby rozotrieť na prach) sa testovaná látka navlhčí malým množstvom vody (alebo v prípade potreby iným vhodným nosičom), ktoré bude dostatočné na to, aby zabezpečilo dobrý kontakt s kožou. Ak sa použijú iné nosiče ako voda, prípadný vplyv nosiča na podráždenie kože má byť minimálny.Po skončení expozície, ktorá trvá zvyčajne 4 hodiny, sa zvyšná testovaná látka odstráni podľa potreby s použitím vody alebo vhodného roztoku bez toho, aby sa pozmenila existujúca reakcia alebo integrita epidermy.1.4.2.2 Veľkosť dávkyNa testované miesto sa aplikuje dávka o veľkosti 0,5 ml kvapaliny alebo 0,5 g tuhej látky alebo pasty.1.4.2.3 Počiatočný test (In vivo test podráždenia/poleptania kože na jednom zvierati)Dôrazne sa odporúča, aby sa v in vivo počiatočnom teste použilo jedno zviera, najmä keď sa predpokladá, že látka môže byť žieravá. Je to v súlade so stratégiou postupného testovania (pozri prílohu 1).Keď sa na základe kritickej analýzy usúdi, že látka je žieravá, ďalšie testovanie na zvieratách nie je potrebné. Pre väčšinu látok, o ktorých sa predpokladá, že sú žieravé, ďalšie in vivo testovanie zvyčajne nie je potrebné. V tých prípadoch, kde však následkom nedostatočných dôkazov chýbajú ďalšie potvrdzujúce údaje, sa môže vykonať testovanie na zvieratách v obmedzenom rozsahu na základe tohto prístupu: Postupne sa aplikujú na zviera tri testovacie náplasti. Prvá náplasť sa odstráni po troch minútach. Ak sa nezistí závažná reakcia kože, aplikuje sa druhá náplasť a odstráni sa po jednej hodine. Ak zo zistení v tomto štádiu vyplýva, že je humánne, aby sa expozícia mohla predĺžiť na štyri hodiny, aplikuje sa tretia náplasť a odstráni sa po štyroch hodinách a reakcia sa vyhodnotí.Ak sa zistí žieravý účinok po ktorejkoľvek z troch postupných expozícií, test sa ihneď ukončí. Ak sa po odstránení poslednej náplasti nezistí žieravý účinok, zviera sa pozoruje 14 dní, pokiaľ sa poleptanie neprejaví skôr.V tých prípadoch, keď sa neočakáva, že testovaná látka spôsobí poleptanie, ale môže byť dráždivá, aplikuje sa jediná náplasť jednému zvieraťu na štyri hodiny.1.4.2.4 Potvrdzujúci test (In vivo test podráždenia kože na ďalších zvieratách)Ak sa nezistí žieravý účinok v počiatočnom teste, dráždivá alebo negatívna reakcia sa potvrdí na maximálne dvoch ďalších zvieratách, každé s jednou náplasťou s časom expozície štyri hodiny. Ak sa v počiatočnom teste zistí dráždivý účinok, môže sa vykonať potvrdzujúci test postupným spôsobom alebo expozíciou dvoch ďalších zvierat súčasne. Vo výnimočnom prípade, keď sa neuskutoční počiatočný test, dvom alebo trom zvieratám sa môže aplikovať jediná náplasť, ktorá sa odstráni po štyroch hodinách. V prípade, keď sa použijú dve zvieratá, ak obidve vykazujú rovnakú reakciu, nie je potrebné ďalšie testovanie. V opačnom prípade sa testuje aj tretie zviera. Môže byť potrebné, aby sa nejednoznačné reakcie vyhodnotili na ďalších zvieratách.1.4.2.5 Doba pozorovaniaDĺžka času pozorovania má byť dostatočná na celkové posúdenie reverzibility zistených účinkov. Pokus je však potrebné ukončiť vždy, keď zviera vykazuje pretrvávajúce príznaky silnej bolesti alebo utrpenia. Na určenie reverzibilných účinkov sa zvieratá pozorujú do 14 dní po odstránení náplastí. Ak sa pozoruje reverzibilita pred uplynutím 14 dní, pokus je potrebné v tomto čase ukončiť.1.4.2.6 Klinické pozorovania a vyhodnotenie kožných reakciíVšetky zvieratá sa vyšetria, či nemajú príznaky erytému (sčervenania kože) a edému (opuchu) a reakcie po 60 minútach sa vyhodnotia a potom po 24, 48 a 72 hodinách po odstránení náplasti. V prípade počiatočného testu na jednom zvierati sa testované miesto tiež vyšetrí bezprostredne po odstránení náplasti. Kožné reakcie sa vyhodnotia a zaznamenajú podľa stupňov v nižšie uvedenej tabuľke. Ak sa vyskytne poškodenie kože, ktoré nie je možné označiť ako podráždenie alebo poleptanie po 72 hodinách, budú potrebné pozorovania až do 14. dňa, aby sa určila reverzibilita účinkov. Okrem toho na pozorovanie podráždenia, všetky lokálne toxické účinky, ako je odmastenie pokožky a všetky systémové nepriaznivé účinky (napr. účinky na klinické príznaky toxicity a telesnú hmotnosť), sa celkove popíšu a zaznamenajú. Na objasnenie nejednoznačných reakcií je potrebné uvažovať o vykonaní histopatologického vyšetrenia.Vyhodnotenie kožných reakcií je nevyhnutne subjektívne. Na podporu zosúladenia pri vyhodnocovaní kožnej reakcie a na pomoc testovacím laboratóriám a tým, ktorí sú zainteresovaní na uskutočňovaní a interpretovaní výsledkov, zamestnanci uskutočňujúci vyšetrenia musia byť primerane vyškolení na používanie systému hodnotenia. Užitočnou by mohla byť ilustrovaná príručka na vyhodnotenie podráždenia kože a iných poškodení (9).2. ÚDAJE2.1 PREDKLADANIE VÝSLEDKOVVýsledky štúdie sa zhrnú v podobe tabuliek v záverečnej správe z testu a vzťahujú sa na všetky body uvedené v oddiele 3.1.2.2 VYHODNOTENIE VÝSLEDKOVStupne podráždenia kože sa posudzujú v súvislosti s charakterom a závažnosťou poškodení a ich reverzibilitou alebo ireverzibilitou. Jednotlivé stupne nepredstavujú pre dráždivé vlastnosti materiálu absolútnu normu, keďže sa hodnotia aj iné účinky testovaného materiálu. Skôr je potrebné na jednotlivé stupne nazerať ako na referenčné hodnoty, ktoré sa majú posudzovať v súvislosti s inými pozorovaniami zo štúdie.Pri hodnotení dráždivých reakcií je potrebné posúdiť reverzibilitu poškodení kože. Keď reakcie ako alopécia (obmedzená), hyperkeratóza, hyperplázia a šupinatosť pretrvávajú do konca 14-denného obdobia pozorovania, testovaná látka sa pokladá za dráždivú.3. PODÁVANIE SPRÁV2.1 SPRÁVA O TESTESpráva z testu musí obsahovať tieto informácie:Zdôvodnenie in vivo testovania: kritická analýza údajov z predchádzajúcich testov, vrátane výsledkov zo stratégie postupného testovania:- popis dôležitých údajov dostupných z predchádzajúceho testovania;- údaje získané v každom štádiu stratégie testovania;- popis vykonaných in vitro testov, vrátane údajov o postupoch, získaných výsledkov s testovanými/referenčnými látkami;- kritická analýza pre uskutočnenie in vivo štúdieTestovaná látka:- identifikačné údaje (napr. číslo CAS; zdroj; čistota; známe nečistoty; číslo šarže);- fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. pH, prchavosť, rozpustnosť, stabilita);- v prípade zmesi, zloženie a vzájomný percentuálny podiel zložiek.Nosič:- identifikácia, koncentrácia (v prípade potreby), použitý objem;- zdôvodnenie výberu nosiča.Pokusné zvieratá:- použitý druh/kmeň, zdôvodnenie pre použitie iných zvierat ako králik - albín;- počet zvierat každého pohlavia;- hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku a konci testu;- vek na začiatku štúdie;- zdroj zvierat, podmienky umiestnenia, krmivo atď.;Testovacie podmienky:- technika prípravy miesta pre náplasť;- údaje o použitých materiáloch na náplasť a metóda pokrytia náplasťou;- údaje o príprave testovanej látky, aplikácii a odstránení.Výsledky:- tabuľkové spracovanie stupňov reakcie podráždenia/poleptania pre každé zviera vo všetkých meraných časoch;- popisy všetkých pozorovaných poškodení;- podrobný popis charakteru a stupňa zisteného podráždenia alebo poleptania a všetky histopatologické nálezy;- popis iných nepriaznivých lokálnych (napr. odmastenie kože) a systémových účinkov okrem podráždenia kože alebo poleptania.Diskusia k výsledkom4. ODKAZY(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720.(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, "Skin Irritation", European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.(5a) Testovacia metóda B.40 Leptanie kože.(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. V Solne, Švédsko, 22. – 24. januára 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, potvrdený 28. spoločným zasadaním Výboru pre chemikálie a Pracovnej skupiny pre chemikálie, november 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm).(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Na požiadanie k dispozícii na sekretariáte OECD].TABUĽKA I: STUPNE REAKCIÍ KOŽEVytvorenie erytému alebo chrastyŽiadny erytém … | 0 |Veľmi slabý erytém (sotva pozorovateľný) … | 1 |Jasne ohraničený erytém … | 2 |Mierny až silný erytém … | 3 |Výrazný erytém (tmavočervený) až vytvorenie chrasty zabraňujúcej posúdenie erytému … | 4 |Maximálne možný: 4 |Vytvorenie edémuŽiadny edém … | 0 |Veľmi slabý edém (sotva pozorovateľný) … | 1 |Slabý edém (okraje oblasti jasne ohraničené zreteľným opuchom) … | 2 |Mierny edém (opuch približne 1 mm) … | 3 |Výrazný edém (opuch viac ako 1 mm a presahujúci za oblasť expozície) … | 4 |Maximálne možný: 4 |Na objasnenie nejednoznačných reakcií sa môže vykonať histopatologické vyšetrenie.--------------------------------------------------PRÍLOHA 2EB. 5. AKÚTNA TOXICITA: PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE OKA1. METÓDATáto metóda je rovnocenná s OECD TG 405 (2002).1.1 ÚVODPri príprave tejto aktualizovanej metódy sa osobitná pozornosť venovala možným zlepšeniam na základe vyhodnotenia všetkých existujúcich informácií o testovanej látke, aby sa zabránilo zbytočnému testovaniu na pokusných zvieratách, a tým zohľadnila ochrana zvierat. Táto metóda zahrnuje odporúčanie, aby sa pred uskutočnením opísaného in vivo testu poleptania/podráždenia oka látkou uskutočnila kritická analýza existujúcich príslušných údajov. Ak nie sú k dispozícii dostačujúce údaje, odporúča sa, aby sa získali na základe postupného testovania (2) (3). Stratégia testovania zahrnuje vykonanie validovaných a uznaných in vitro testov a je uvedená ako príloha k testovacej metóde. Okrem toho sa odporúča použiť in vivo test podráždenia/poleptania kože na predpovedanie poleptania oka pred uvážením in vivo očného testu.V záujme vedeckej spoľahlivosti a aj starostlivosti o zvieratá, nie je potrebné uvažovať o in vivo testovaní, pokiaľ neboli všetky dostupné údaje súvisiace s potenciálnym poleptaním/podráždením oka látkou vyhodnotené v kritickej analýze. Takéto údaje zahrnujú dôkaz z existujúcich štúdií na ľuďoch a/alebo laboratórnych zvieratách, dôkaz o poleptaní/podráždení jednou alebo viacerými štrukturálne príbuznými látkami alebo zmesami takýchto látok, údaje dokazujúce silnú aciditu alebo alkalitu látky (4) (5) a výsledky z validovaných a uznaných in vitro alebo ex vivo testov na poleptanie a podráždenie kože (6) (6a). Štúdie je možné vykonať pred kritickou analýzou alebo ako jej výsledok.V prípade určitých látok takáto analýza môže poukázať na potrebu in vivo štúdií potenciálu látky spôsobiť poleptanie/podráždenie oka. Vo všetkých takýchto prípadoch sa pred uvažovaním o použití in vivo očného testu pokiaľ možno uskutoční najskôr štúdia in vivo účinkov látky na kožu a vyhodnotí sa v súlade s testovacou metódou B.4 (7). Použitie kritickej analýzy a stratégie postupného testovania má znížiť potrebu in vivo testovania poleptania/podráždenia oka látkami, pre ktoré už existuje dostatok dôkazov z iných štúdií. Ak sa stanovenie poleptania alebo podráždenia oka nedá vykonať s použitím stratégie postupného testovania, ani po uskutočnení in vivo štúdie poleptania a podráždenia kože, môže sa vykonať in vivo test poleptania/podráždenia oka.Uprednostňovaná stratégia postupného testovania, ktorá zahrnuje vykonanie validovaných a uznaných in vitro alebo ex vivo testov poleptania/podráždenia, je zahrnutá v prílohe k tejto testovacej metóde. Stratégia bola vypracovaná a jednomyseľne odporučená účastníkmi OECD workshopu (8) a bola prijatá ako odporúčaná stratégia testovania v Globálne harmonizovanom systéme pre klasifikáciu chemických látok (GHS) (9). Odporúča sa, aby sa táto stratégia testovania dodržiavala pred uskutočnením in vivo testovania. V prípade nových látok sa na získanie vedecky spoľahlivých údajov o poleptaní/podráždení látkou odporúča koncepcia postupného testovania. V prípade existujúcich látok s nedostačujúcimi údajmi o poleptaní/podráždení kože a oka sa uvedená stratégia použije na získanie chýbajúcich údajov. Použitie odlišných stratégií testovania alebo testovacieho postupu alebo rozhodnutie nepoužiť koncepciu postupného testovania je potrebné zdôvodniť.1.2 DEFINÍCIEPodráždenie oka: je vytvorenie zmien na oku po aplikácii testovanej látky na vonkajší povrch oka, ktoré sú úplne reverzibilné do 21 dní po aplikácii.Poleptanie oka: je vytvorenie poškodenia tkaniva oka alebo závažné fyzické oslabenie zraku po aplikácii testovanej látky na vonkajší povrch oka, ktoré nie sú úplne reverzibilné do 21 dní po aplikácii.1.3 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDYTestovaná látka sa aplikuje v jednorazovej dávke do jedného oka pokusného zvieraťa; neošetrené oko slúži ako kontrola. Stupeň podráždenia/poleptania oka sa vyhodnotí na základe hodnotenia poškodenia spojoviek, rohovky a dúhovky v špecifických intervaloch. Iné účinky na oku a nepriaznivé systémové účinky sa tiež popíšu, aby sa uviedlo úplné vyhodnotenie účinkov. Trvanie štúdie má byť dostatočné na posúdenie reverzibility alebo ireverzibility účinkov.Zvieratá vykazujúce pretrvávajúce príznaky silného utrpenia a/alebo bolesti v ktoromkoľvek štádiu testu sa humánnym spôsobom usmrtia a daná látka sa na základe toho zatriedi. Kritéria pre rozhodnutie humánnym spôsobom usmrtiť moribundné a silne trpiace zvieratá je možné nájsť v odkaze (10).1.4 OPIS TESTOVACEJ METÓDY1.4.1 Príprava na in vivo test1.4.1.1 Výber druhovAko laboratórne zviera sa pokiaľ možno použije králik – albín a použijú sa zdravé mladé dospelé zvieratá. Je potrebné uviesť zdôvodnenie, ak sa použijú iné kmene alebo druhy.1.4.1.2 Príprava zvieratObe oči každého pokusného zvieraťa, predbežne vybratého na testovanie, sa 24 hodín pred začatím testovania vyšetria. Nepoužijú sa zvieratá vykazujúce podráždenie očí, očné poruchy alebo predchádzajúce zranenie rohovky.1.4.1.3 Podmienky pre umiestnenie a kŕmenieZvieratá majú byť umiestnené jednotlivo. Teplota miestnosti na pokusy s králikmi má byť 22 °C (± 3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť má byť aspoň 30 % a pokiaľ možno, nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti má dosahovať 50-60 %. Osvetlenie má byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.1.4.2 Postup testu1.4.2.1 Aplikácia testovanej látkyTestovaná látka sa umiestni do spojovkového vaku jedného oka každého zvieraťa po jemnom odtiahnutí spodného viečka od očnej gule. Viečka sa jemne podržia pri sebe asi jednu sekundu, aby sa zabránilo stratám materiálu. Druhé oko, ktoré nebolo ošetrené, slúži ako kontrola.1.4.2.2 VymývanieOči testovaných zvierat sa nevymývajú aspoň 24 hodín po nakvapkaní testovanej látky, okrem tuhých látok (pozri oddiel 1.4.2.3.2), a v prípade okamžitých leptavých alebo dráždivých účinkov. Po 24 hodinách sa môžu vymyť, ak sa usúdi, že je to potrebné.Použitie vedľajšej skupiny zvierat na vyšetrenie vplyvu vymytia sa neodporúča, pokiaľ to nie je vedecky odôvodnené. Ak je potrebná súbežná skupina, použijú sa dva králiky. Podmienky vymytia sa starostlivo zdokumentujú, napr. čas vymytia; zloženie a teplota vymývacieho roztoku, trvanie, objem a rýchlosť aplikácie.1.4.2.3 Veľkosť dávky1.4.2.3.1 Testovanie kvapalínPre testovanie kvapalín sa používa dávka 0,1 ml. Na nakvapkanie látky priamo do oka sa nepoužijú pumpičkové spreje. Tekutina zo spreja sa vystrieka a zozbiera v nádobke predtým, ako sa vkvapne do oka 0,1 ml.1.4.2.3.2 Testovanie tuhých látokPri testovaní tuhých látok, pást a látok, ktoré sú tvorené z častíc, použité množstvo má mať objem 0,1 ml alebo hmotnosť maximálne 100 mg. Testovaný materiál sa pomelie na jemný prášok. Objem tuhého materiálu sa zmeria po jemnom zhutnení, napr. poklepaním nádobky na meranie. Ak testovaná tuhá látka nebola fyziologicky odstránená z oka pokusného zvieraťa pri prvom zisťovaní v časovom bode 1 hodina po ošetrení, oko sa môže vymyť fyziologickým roztokom alebo destilovanou vodou.1.4.2.3.3 Testovanie aerosólovOdporúča sa, aby sa všetky látky v pumpičkových sprejoch a aerosóloch vystriekali a zozbierali pred nakvapkaním do oka. Jedinou výnimkou sú látky v tlakových aerosólových nádobách, ktoré sa nedajú vystriekať a zozbierať kvôli vyparovaniu. V takýchto prípadoch sa oko ponechá otvorené a testovaná látka sa aplikuje do oka ako jednorazové vstrieknutie približne jednu sekundu zo vzdialenosti 10 cm priamo na prednú časť oka. Táto vzdialenosť sa môže meniť v závislosti od tlaku spreja a jeho obsahu. Pozornosť je potrebné venovať tomu, aby sa tlakom zo spreja nepoškodilo oko. V určitých prípadoch môže byť potrebné posúdiť možnosť "mechanického" poškodenia oka tlakom kvapaliny zo spreja.Odhad dávky z aerosólu sa môže urobiť simulovaním testu takto: látka sa nasprejuje na navažovací papier cez otvor o veľkosti oka králika, ktoré je umiestnené tesne pred papierom. Na základe zvýšenia hmotnosti papiera sa odhadne množstvo nasprejované do oka. V prípade prchavých látok sa môže dávka odhadnúť tak, že sa nádobka s materiálom odváži pred odstránením testovaného materiálu a po ňom.1.4.2.4 Počiatočný test (In vivo test podráždenia/poleptania oka na jednom zvierati)Ako sa zdôrazňuje v stratégii postupného testovania (pozri prílohu 1), dôrazne sa odporúča, aby sa v in vivo test uskutočnil najskôr na jednom zvierati.Ak z výsledkov tohto testu vyplynie, že látka je žieravá alebo silne dráždivá pre oko s použitím uvedeného postupu, ďalšie testovanie na očnú dráždivosť nie je potrebné vykonať.1.4.2.5 Lokálne anestetikáLokálne anestetiká sa môžu použiť v jednotlivých prípadoch. Ak z kritickej analýzy vyplýva, že látka môže spôsobiť bolesť, alebo počiatočné testovanie ukáže, že sa vyskytne bolestivá reakcia, môže sa pred nakvapkaním testovanej látky použiť lokálne anestetikum. Je potrebné starostlivo zvoliť typ, koncentráciu a dávku lokálneho anestetika, aby sa zabezpečilo, že rozdiely v reakcii na testovanú látku nevzniknú na základe toho, že sa použilo. Kontrolné oko sa rovnako ošetrí anestetikom.1.4.2.6 Potvrdzujúci test (In vivo test podráždenia oka na ďalších zvieratách)Ak sa v počiatočnom teste nezistí žieravý účinok, dráždivá alebo negatívna reakcia by sa mal potvrdiť na maximálne dvoch ďalších zvieratách. Ak sa zistí silný dráždivý účinok v počiatočnom teste, z ktorého vyplýva silný (ireverzibilný) účinok v potvrdzujúcom testovaní, odporúča sa, aby sa potvrdzujúci test uskutočnil postupným spôsobom v danom čase na jednom zvierati a nie súčasnou expozíciou dvoch ďalších zvierat. Ak sa na druhom zvierati prejavia žieravé alebo silne dráždivé účinky, test sa preruší. Ďalšie zvieratá môže byť potrebné použiť na potvrdenie slabých alebo miernych dráždivých reakcií.1.4.2.7 Doba pozorovaniaDĺžka času pozorovania má byť dostatočná na celkové posúdenie miery a reverzibility zistených účinkov. Pokus je však potrebné ukončiť vždy, keď zviera vykazuje pretrvávajúce príznaky silnej bolesti alebo utrpenia (9). Na stanovenie reverzibility účinkov sa zvieratá zvyčajne pozorujú spravidla 21 dní po podaní testovanej látky. Ak sa zistí reverzibilita pred uplynutím 21 dní, pokus sa v tomto čase ukončí.1.4.2.7.1 Klinické pozorovania a vyhodnotenie reakcií okaOči sa vyšetria po 1, 24, 48 a 72 hodinách po aplikácii testovanej látky. Hneď ako sa získa konečná informácia, zvieratá už nie potrebné ďalej testovať. Zvieratá vykazujúce pretrvávajúce príznaky silného utrpenia alebo bolesti sa ihneď humánnym spôsobom usmrtia a daná látka sa na základe toho posúdi. Zvieratá, ktoré po nakvapkaní majú tieto poškodenia oka, sa humánnym spôsobom usmrtia: perforácia rohovky alebo závažná ulcerácia rohovky vrátane stafylomu; krvácanie prednej komory oka; nepriehľadnosť rohovky 4. stupňa, ktoré pretrváva 48 hodín; chýbajúca reakcia zreničiek na svetlo (reakcia dúhovky stupeň 2), ktorá pretrváva 72 hodín; ulcerácia spojovkovej membrány (conjuctivea); nekróza spojoviek alebo tretieho viečka; alebo odlupovanie. Je to kvôli tomu, že takéto poškodenia zvyčajne nie sú reverzibilné.Zvieratá, u ktorých sa nevyskytlo žiadne poškodenie oka, môžu byť usmrtené najskôr 3 dni po nakvapkaní látky.Zvieratá so slabými až miernymi poškodeniami sa pozorujú, pokiaľ poškodenia nezmiznú alebo 21 dní, keď je štúdia ukončená. Pozorovania sa uskutočnia na 7., 14. a 24. deň na stanovenie stavu poškodení a ich reverzibility alebo ireverzibility.Stupne reakcií oka (spojovky, rohovky a dúhovky) sa pri každom vyšetrení zaznamenajú (Tabuľka I). Každé ďalšie poškodenia oka (napr. panus, sfarbenie) alebo systémové nepriaznivé účinky sa tiež zaznamenajú.Na vyšetrenie reakcií sa môže použiť binokulárna lupa, ručná štrbinová lampa, alebo biomikroskop alebo iný vhodný prístroj. Po tom, ako sa zaznamenajú zistenia po 24 hodinách, sa ďalej môžu oči vyšetriť fluoresceínom.Vyhodnotenie reakcií oka je nevyhnutne subjektívne. Na podporu harmonizácie pri vyhodnotení reakcie oka a na pomoc testovacím laboratóriám a tým, ktorí sú zainteresovaní na uskutočňovaní a interpretovaní výsledkov, musia byť zamestnanci, ktorí uskutočňujú pozorovania, primerane vyškolení na používanie systému hodnotenia.2. ÚDAJE2.2 VYHODNOTENIE VÝSLEDKOVVyhodnotenie podráždenia oka sa posúdi v súvislosti s charakterom a závažnosťou poškodení a ich reverzibilitou alebo ireverzibilitou. Jednotlivé stupne nepredstavujú absolútne kritérium pre dráždivé vlastnosti materiálu, keďže sa hodnotia aj iné účinky testovaného materiálu. Skôr je potrebné na jednotlivé stupne nazerať ako na referenčné hodnoty, ktoré majú zmysel iba vtedy, keď sú doložené celkovým popisom a posúdením všetkých vyšetrení.3. PODÁVANIE SPRÁV3.1 SPRÁVA O TESTESpráva o teste musí obsahovať tieto informácie:Zdôvodnenie pre in vivo testovanie: kritická analýza údajov z predchádzajúcich testov, vrátane výsledkov zo stratégie postupného testovania:- popis dôležitých údajov dostupných z predchádzajúceho testovania;- údaje získané v každom štádiu stratégie testovania;- popis uskutočnených in vitro testov, vrátane údajov o postupoch, získaných výsledkov s testovanými/referenčnými látkami;- popis in vivo uskutočnenej štúdie podráždenia/poleptania kože, vrátane získaných výsledkov;- kritická analýza pre uskutočnenie in vivo štúdieTestovaná látka:- identifikačné údaje (napr. číslo CAS; zdroj, čistota, známe nečistoty, číslo šarže);- fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. pH, prchavosť, rozpustnosť, stabilita, reaktivita s vodou);- v prípade zmesi, zloženie a vzájomný percentuálny podiel zložiek;- ak sa použije lokálne anestetikum, identifikácia, čistota, typ, dávka a prípadná interakcia s testovanou látkou.Nosič:- identifikácia, koncentrácia (v prípade potreby), použitý objem;- zdôvodnenie výberu nosiča.Pokusné zvieratá:- použitý druh/kmeň, zdôvodnenie pre použitie iných zvierat ako králik – albín;- vek každého zvieraťa na začiatku štúdie;- počet zvierat každého pohlavia v testovaných a kontrolných skupinách (v prípade potreby);- hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku a konci testu;- zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.Výsledky:- opis použitej metódy na hodnotenie podráždenia v každom čase vyšetrenia (napr. ručná štrbinová lampa, biomikroskop, fluoresceín);- tabuľkové spracovanie údajov o dráždivých/žieravých účinkoch pre každé zviera v každom čase vyšetrenia až do vylúčenia každého zvieraťa z testu;- podrobný opis stupňa zisteného podráždenia alebo poleptania;- opis všetkých pozorovaných poškodení oka (napr. vaskularizácia, vytvorenie panusu, sfarbenie);- popis iných lokálnych a systémových nepriaznivých účinkov, ktoré sa nevyskytujú na oku, a prípadné histopatologické zistenia.Diskusia k výsledkom.3.2 INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOVExtrapolácia výsledkov štúdií podráždenia oka u laboratórnych zvierat na ľudí je možná len v obmedzenej miere. V mnohých prípadoch je králik – albín citlivejší na látky, ktoré spôsobujú podráždenie alebo poleptanie oka, ako ľudia.Pozornosť je potrebné venovať interpretácii údajov na vylúčenie podráždenia vyplývajúceho zo sekundárnej infekcie.4. ODKAZY(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410- 429.(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 - 26.(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 - 231.(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.(6a) Testovacia metóda B.40 Leptanie kože.(7) Testovacia metóda B.4. Akútna toxicita: podráždenie/poleptanie kože.(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. V Solne, Švédsko, 22.–24. januára 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, potvrdený 28. spoločným zasadaním Výboru pre chemikálie a Pracovnej skupiny pre chemikálie, november 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).(10) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).TABUĽKA I: STUPNE POŠKODENIA OKARohovkaNepriehľadnosť (opacita): stupeň zákalu (odčítava sa od najhustejšej oblasti) [1] |Žiadna ulcerácia alebo nepriehľadnosť (opacita) … | 0 |Roztrúsené alebo difúzne oblasti nepriehľadnosti (opacity) (iné ako ľahký zákal normálneho lesku); zreteľne viditeľné detaily dúhovky … | 1 |Ľahko rozoznateľná priehľadná oblasť; detaily dúhovky mierne zakalené … | 2 |Perleťová oblasť; neviditeľné detaily dúhovky, veľkosť zreničky ťažko rozoznateľná … | 3 |Nepriehľadná rohovka; dúhovka nezistiteľná cez zákal … | 4 |Maximálne možný: 4 |DúhovkaNormálna … | 0 |Nápadne privreté riasy, prekrvenie, opuch, mierne prekrvenie okolo rohovky; alebo injektácia, dúhovka reaguje na svetlo (pomalá reakcia sa pokladá za pozitívnu) … | 1 |Krvácanie, hrubé poškodenie, bez reakcie na svetlo … | 2 |Maximálne možný: 2 |SpojovkySčervenanie (týka sa palpebrálnych a bulbárnych spojoviek, bez rohovky a dúhovky) |Normálne … | 0 |Niektoré cievy prekrvené (injektované) … | 1 |Difúzne karmínové zafarbenie, jednotlivé cievy ťažko rozoznateľné … | 2 |Difúzna tmavá červeň … | 3 |Maximálne možný: 3 |ChemózaOpuch (týka sa viečok a/alebo tretieho viečka) |Normálne … | 0 |Trocha opuchnuté nad normálom … | 1 |Zreteľný opuch s čiastočným vyvrátením viečok … | 2 |Opuch s polovičným uzavretím viečok … | 3 |Opuch s väčším ako polovičným uzavretím viečok … | 4 |Maximálne možný: 4 |[1] Veľkosť nepriehľadnej oblasti rohovky sa zaznamená--------------------------------------------------PRÍLOHA 2FB.31. ŠTÚDIA PRENATÁLNEJ VÝVOJOVEJ TOXICITY1. METÓDATáto metóda zodpovedá OECD TG 414 (2001).1.1. ÚVODTáto metóda na testovanie vývojovej toxicity je určená na poskytnutie všeobecnej informácie týkajúcej sa účinkov prenatálnej expozície na gravidné pokusné zviera a na vývoj organizmu v utere; sem môže patriť hodnotenie účinkov na matku, ako aj uhynutie, štrukturálne abnormality alebo poruchy rastu plodu. Funkčné poruchy, aj keď sú dôležitou časťou vývoja, nie sú integrálnou časťou tejto testovacej metódy. Môžu byť testované na tieto účinky v oddelenej štúdii, alebo ako doplnok k tejto štúdii, s použitím testovacej metódy pre vývojovú neurotoxicitu. Informácie o testovaní funkčných porúch a iných postnatálnych účinkov sa dajú v prípade potreby získať z testovacej metódy pre dvojgeneračnú štúdiu reprodukčnej toxicity a štúdiu vývojovej neurotoxicity.Táto testovacia metóda môže vyžadovať, aby sa jednotlivé testy osobitne upravili na základe konkrétnych poznatkov napr. o fyzikálno-chemických alebo toxikologických vlastnostiach testovanej látky. Takáto úprava je prípustná, ak na základe presvedčivého vedeckého dôkazu vyplýva, že úprava vedie k spoľahlivejšiemu testu. V takomto prípade sa tento vedecký dôkaz starostlivo zdokumentuje v správe zo štúdie.1.2 DEFINÍCIEVývojová toxikológia: štúdia nepriaznivých účinkov na vyvíjajúci sa organizmus, ktoré môže zapríčiniť expozícia pred počatím, počas prenatálneho vývoja alebo postnatálne do obdobia sexuálnej zrelosti. K hlavným prejavom vývojovej toxicity patrí 1. smrť organizmu, 2. štrukturálna abnormalita, 3. poruchy rastu a 4. funkčné poruchy. Vývojová toxikológia sa predtým označovala ako teratológia.Nepriaznivý účinok: každá zmena voči normálnemu stavu v súvislosti s ošetrením, ktorá znižuje schopnosť organizmu prežiť, reprodukovať sa alebo prispôsobovať sa prostrediu. V širšom zmysle vývojová toxikológia zahrnuje každý účinok, ktorý vplýva na normálny vývoj zárodku ako pred narodením, tak aj a po narodení.Porucha rastu: zmena hmotnosti alebo veľkosti orgánov alebo tela potomstva.Zmeny (anomálie): štrukturálne zmeny vo vývoji, ktoré zahrnujú malformácie a aj odchýlky (28).Malformácia/veľká abnormalita: Štrukturálna zmena, ktorá sa pokladá za škodlivú pre zviera (môže byť tiež smrteľná) a je zvyčajne zriedkavá.Odchýlka/malá abnormalita: štrukturálna zmena, o ktorej sa usudzuje, že má malý alebo žiadny škodlivý účinok na zviera; môže byť prechodná a môže sa vyskytovať pomerne často v kontrolnej populácii.Zárodok: suma derivátov oplodneného vajíčka v každom štádiu vývoja od oplodnenia do narodenia vrátane extraembryonálnych membrán, ako aj embrya alebo plodu.Implantácia (nidácia): uchytenie blastocysty v epitelovej výstelke uteru, vrátane jej penetrácie cez epitel utera a jej zahniezdenie do endometria.Embryo: skoré štádium alebo vývojové štádium každého organizmu, najmä vyvíjajúceho sa produktu oplodnenia vajíčka po vzniku pozdĺžnej osi a pokiaľ nie sú prítomné všetky hlavné štruktúry.Embryotoxicita: škodlivé pre normálnu štruktúru, vývoj, rast a/alebo životaschopnosť embrya.Plod: nenarodené potomstvo v postembryonálnom období.Fetotoxicita: škodlivé pre normálnu štruktúru, vývoj, rast a/alebo životaschopnosť plodu.Potrat: predčasné vypudenie produktov oplodnenia z uteru: embrya alebo neživotaschopného plodu.Resorpcia: zárodok, ktorý po implantovaní do uteru, uhynul a sa vstrebáva, alebo sa vstrebal.Skorá resorpcia: dôkaz implantácie bez toho, aby sa dalo embryo/plod rozoznaťNeskorá resorpcia: mŕtve embryo alebo plod s vonkajšími degeneratívnymi zmenamiNOAEL: skratka pre hladinu bez pozorovaného nepriaznivého účinku a je to najvyššia dávka alebo úroveň expozície, pri ktorej sa nepozorujú žiadne nepriaznivé zistenia v súvislosti s ošetrením.1.3 REFERENČNÁ LÁTKAŽiadna.1.4 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDYTestovaná látka sa zvyčajne podáva gravidným zvieratám v dobe aspoň od implantácie do jedného dňa pred naplánovaným dňom usmrtenia, ktorý má byť čo možno najbližšie k zvyčajnému dňu pôrodu bez ohrozenia straty údajov následkom predčasnému pôrodu. Testovacia metóda nie je určená iba na skúmanie obdobia organogenézy (t. j. 5-15 dní u hlodavcov (myši, potkany, škrečky) a 6-18 dní u králikov), ale aj účinkov od obdobia preimplantácie, v prípade potreby, počas celého obdobia gravidity do dňa, keď sa uskutoční cisársky rez. Tesne pred uskutočnením cisárskeho rezu sa samice usmrtia, obsah uteru sa vyšetrí a posúdia sa vonkajšie viditeľné anomálie na plodoch a zmeny na mäkkých tkanivách a kostre.1.5 OPIS TESTOVACEJ METÓDY1.5.1 Výber druhu zvieratOdporúča sa, aby sa testovanie uskutočnilo na najvhodnejších druhoch a aby sa použili laboratórne druhy a kmene, ktoré sa zvyčajne používajú pri testovaní prenatálnej vývojovej toxicity. Z hlodavcov sa uprednostňuje potkan a z nehlodavcov králik. Použitie iných druhov je potrebné zdôvodniť.1.5.2 Podmienky pre umiestnenie a kŕmenieTeplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala byť 22 °C (± 3 °C) pre hlodavce a 18 °C (± 3 °C) pre králiky. Aj keď relatívna vlhkosť by mala byť aspoň 30 %, a pokiaľ možno, nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti by mala dosahovať 50-60 %. Osvetlenie by malo byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.Párenie sa uskutoční v klietkach vhodných na tento účel. Aj keď sa uprednostňuje jednotlivé umiestnenie spárených zvierat, spoločné umiestnenie v malých počtoch je tiež prípustné.1.5.3 Príprava zvieratPoužijú sa zdravé zvieratá, ktoré sa aklimatizovali na laboratórne podmienky aspoň 5 dní a ktoré sa predtým nepodrobili iným experimentom. Pokusné zvieratá sa charakterizujú na základe druhu, kmeňa, zdroja, pohlavia, hmotnosti a/alebo veku. Zvieratá vo všetkých pokusných skupinách majú mať, pokiaľ je to možné, rovnakú hmotnosť a vek. Na každú veľkosť dávky sa použijú mladé dospelé, panenské samice. Samice sa spária so samcami rovnakého druhu a kmeňa a je potrebné zabrániť páreniu medzi súrodencami. Pre hlodavce je deň 0 gravidity dňom, kedy sa zistila vaginálna zátka a/alebo sperma; pre králiky deň 0 je zvyčajne deň, kedy sa uskutočnil koitus alebo umelé oplodnenie, ak sa použila táto technika. Spárené samice sa náhodne rozdelia do kontrolnej a pokusnej skupiny. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy kvôli umiestneniu klietok. Každému zvieraťu sa priradí vlastné identifikačné číslo. Spárené samice sa náhodne rozdelia do kontrolnej a ošetrenej skupiny a ak sa samice párili v skupinách, zvieratá v každej skupine sa rovnomerne rozdelia do uvedených skupín. Podobne sa rovnomerne rozdelia do skupín samice oplodnené rovnakým samcom.1.6 POSTUP1.6.1 Počet a pohlavie zvieratKaždá pokusná a kontrolná skupina by mala obsahovať dostatočný počet samíc tak, aby bolo k dispozícii približne 20 samíc s implantačnými miestami na autopsiu. Skupiny, ktoré majú menej ako 16 zvierat s implantačnými miestami, sú nevhodné. Úmrtnosť materských zvierat nevedie nevyhnutne k tomu, že štúdia je neplatná, ak nedosahuje viac ako 10 %.1.6.2 Príprava dávokAk sa na uľahčenie dávkovania používa nosič alebo iná prídavná látka, je potrebné venovať pozornosť týmto charakteristikám: účinky na absorpciu, distribúciu, metabolizmus a retenciu alebo vylúčenie testovanej látky; vplyv na chemické vlastnosti testovanej látky, ktorý môže zmeniť jej toxické vlastnosti; a vplyv na spotrebu potravy a vody alebo nutričný stav zvierat. Nosič by nemal spôsobovať vývojovú toxicitu, ani by nemal mať vplyv na reprodukciu.1.6.3 DávkovanieTestovaná dávka sa zvyčajne podáva každý deň od implantácie (napr. 5 dní po párení) do dňa naplánovaného uskutočnenia cisárskeho rezu. Ak predbežné štúdie, ktoré sú prípadne dispozícii, neuvádzajú veľkú pravdepodobnosť preimplantačných strát, ošetrenie sa môže predĺžiť na celé obdobie gravidity, od párenia do dňa naplánovaného usmrtenia. Je dobre známe, že nevhodné zaobchádzanie alebo stres počas gravidity môžu mať za následok prenatálne straty. Na ochranu proti prenatálnym stratám zapríčineným faktormi, ktoré nesúvisia s ošetrením, je potrebné zabrániť zbytočnej manipulácii s gravidnými zvieratami, ako aj stresu spôsobenému vonkajšími faktormi, ako napríklad hluk.Použijú sa aspoň tri veľkosti dávok a uskutoční sa paralelná kontrola. Zdravé zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolnej a pokusnej skupiny. Dávky sa rozložia tak, aby sa toxické účinky zvyšovali. Pokiaľ neexistujú žiadne obmedzenia na základe fyzikálneho/chemického charakteru a biologických vlastností testovanej látky, zvolí sa najvyššia dávka s cieľom vyvolať nejakú vývojovú toxicitu a/alebo toxicitu u matiek (klinické príznaky alebo úbytok telesnej hmotnosti), ale nie uhynutie alebo silné utrpenie. Aspoň jedna zo prechodných dávok má viesť k minimálnym viditeľným toxickým účinkom. Najnižšia dávka by nemala spôsobiť žiadny prejav toxicity u materských zvierat, ani vývojovej toxicity. Klesajúca postupnosť dávok sa zvolí tak, aby sa preukázala každá reakcia v závislosti od dávkovania a hladina bez pozorovaného nepriaznivého účinku (NOAEL). Intervaly dávkovania s faktorom dva až štyri sú často optimálne na stanovenie klesajúceho dávkovania a pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie ako používanie veľmi veľkých intervalov (napr. viac ako faktor 10) medzi dávkami. Aj keď stanovenie NOAEL u matiek je cieľom, štúdie, pri ktorých sa nestanovuje táto hladina, môžu byť tiež prípustné (1).Veľkosti dávok sa zvolia tak, aby zohľadili všetky existujúce údaje o toxicite, ako aj ďalšie informácie o metabolizme a toxikokinetike testovanej látky alebo príbuzných materiálov. Tieto informácie napomôžu aj pri preukazovaní vhodnosti režimu dávkovania.Použije sa paralelná kontrolná skupina. Touto skupinou bude zdanlivo ošetrovaná kontrolná skupina alebo kontrolná skupina ošetrovaná nosičom, ak sa používa nosič na podávanie testovanej látky. Všetkým skupinám sa podáva rovnaký objem buď testovanej látky alebo nosiča. So zvieratami v kontrolnej(-ých) skupine(-ách) sa zaobchádza rovnakým spôsobom ako so zvieratami v pokusných skupinách. Kontrolné skupiny, ktorým sa podáva nosič, dostávajú nosič v najvyššej používanej dávke (ako v skupine s najnižším dávkovaním).1.6.4 Limitný testAk sa na základe testu s orálne podanou jednou dávkou minimálne 1000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň s použitím postupov uvedených pre túto štúdiu nezistí žiadna pozorovateľná toxicita buď u gravidných zvierat alebo ich potomkoch a ak sa účinok neočakáva na základe existujúcich údajov (napr. zo štrukturálne a/alebo metabolicky príbuzných látok), potom sa môže upustiť od úplnej štúdie s použitím troch dávok. Z predpokladanej expozície ľudí môže vyplývať potreba, aby sa v limitnom teste použili vyššie orálne dávky. Pri iných typoch podávania, ako napr. vdychovaním alebo aplikáciou cez kožu, fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej látky často môžu poukázať a limitovať maximálnu prípustnú úroveň expozície (napríklad aplikácia cez kožu by nemala spôsobiť silnú lokálnu toxicitu).1.6.5 Podávanie dávokTestovaná látka alebo nosič sa zvyčajne podáva orálne pomocou intubácie. Ak sa použije iná cesta podávania, je potrebné, aby experimentátor uviedol zdôvodnenie a argumenty pre túto voľbu a môžu byť potrebné príslušné úpravy (2) (3) (4). Testovaná látka sa podáva každý deň približne v rovnakom čase.Dávka pre jednotlivé zvieratá sa zvyčajne zakladá na naposledy zistenej telesnej hmotnosti. Je však potrebné venovať pozornosť pri nastavovaní dávky počas posledného trimestra gravidity. Je potrebné použiť existujúce údaje na výber dávky, aby sa zabránilo nadmernej toxicite matky. Ak sa však zaznamená nadmerná toxicita u ošetrených matiek, tieto zvieratá sa humánnym spôsobom usmrtia. Ak niektoré gravidné zvieratá vykazujú príznaky nadmernej toxicity, je potrebné zvážiť usmrtenie celej skupiny s touto dávkou. Ak sa látka podáva cez sondu, pokiaľ možno sa podá zvieratám ako jednorazová dávka s použitím žalúdkovej sondy alebo vhodnej intubačnej kanyly. Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže jednorázovo podať, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. Objem nemá byť vyšší ako 1 ml/100 g telesnej hmotnosti, okrem vodných roztokov, keď sa môže použiť 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. Ak sa použije ako nosič kukuričný olej, objem nemá byť vyšší ako 0,4 ml/100 g telesnej hmotnosti. Zmeny v aplikovanom objeme sa minimalizujú tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpečil stály objem vo všetkých dávkach.1.6.6 Pozorovanie matiekKlinické vyšetrenie sa uskutoční a zaznamená aspoň raz za deň, pokiaľ možno v rovnakom(-ých) čase(-y) každý deň pri zohľadnení obdobia, keď sa predpokladajú maximálne účinky po podaní dávky. Stav zvierat sa zaznamená, vrátane mortality, moribundného stavu, trvalých zmien v správaní a všetkých príznakov zjavnej toxicity.1.6.7 Telesná hmotnosť a spotreba potravyZvieratá sa odvážia v 0. deň gravidity alebo najneskôr na 3. deň gravidity, ak sú dodané zvieratá od externého chovateľa spárené na základe časových údajov, v prvý deň dávkovania, aspoň každé 3 dni počas obdobia dávkovania a v deň naplánovaného usmrtenia.Spotreba potravy sa zaznamená v trojdňových intervaloch a má sa zhodovať s dňami, keď sa zisťuje telesná hmotnosť.1.6.8 Post-mortem vyšetrenieSamice sa usmrtia jeden deň pred očakávaným dňom vrhu. Samice, ktoré vykazujú príznaky potratu alebo predčasného pôrodu pred naplánovaným usmrtením, sa usmrtia a podrobia dôkladnému makroskopickému vyšetreniu.V čase usmrtenia alebo uhynutia počas štúdie sa matka vyšetrí makroskopicky na všetky štrukturálne abnormality alebo patologické zmeny. Posúdenie matiek počas cisárskeho rezu a následná analýza plodov sa uskutoční podľa možnosti bez vedomosti o tom, či ide o ošetrovanú skupina, aby sa minimalizovalo ovplyvnenie.1.6.9 Vyšetrenie obsahu uteruBezprostredne po usmrtení alebo čo najskôr po uhynutí sa odoberie uterus a zistí sa stav gravidity u zvierat. Ak uterus nevykazuje graviditu, je potrebné ho ďalej vyšetriť (napr. farbením sírnikom amónnym pre hlodavce a Salewského farbením alebo vhodnou alternatívnou metódou pre králiky) na potvrdenie negravidného stavu (5).Gravidný uterus, vrátane cervixu, sa odváži. Nie je potrebné zisťovať hmotnosť gravidného uteru u zvierat, ktoré uhynuli počas štúdie.Pri gravidných zvieratách sa určí počet žltých teliesok (corpora lutea).Obsah uteru sa vyšetrí na počet mŕtvych embryí alebo plodov alebo počet životaschopných plodov. Stupeň resorpcie sa popíše, aby sa mohol odhadnúť relatívny čas uhynutia zárodku (pozri oddiel 1.2).1.6.10 Vyšetrenie plodovUrčí sa pohlavie a telesná hmotnosť každého plodu.Každý plod sa vyšetrí na vonkajšie zmeny (6).Plody sa vyšetria na zmeny na skelete a mäkkých tkanivách (napr. odchýlky a malformácie alebo anomálie) (7) (8) (9) (10) (11) (12 ) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). Kategorizácia fetálnych zmien sa odporúča, ale nevyžaduje. Keď sa uskutoční kategorizácia, jasne sa stanovia kritériá definujúce každú kategóriu. Je potrebné venovať osobitnú pozornosť reprodukčnému traktu, ktorý by sa mal vyšetriť na príznaky zmien vo vývoji.V prípade hlodavcov sa pripraví približne polovica vrhu a vyšetrí na zmeny na skelete. Zvyšok sa pripraví a vyšetrí na zmeny mäkkých tkanív s použitím uznaných alebo vhodných metód sériových rezov alebo dôkladných pitevných techník.V prípade nehlodavcov, napr. králiky, sa všetky plody vyšetria na zmeny mäkkých tkanív a aj na zmeny na skelete. Telá týchto plodov sa podrobia dôkladnej autopsii na vyšetrenie zmien mäkkých tkanív, ktoré môžu zahrnovať postupy pre ďalšie posúdenie internej štruktúry srdca (25). Hlavy jednej polovice plodov vyšetrených týmto spôsobom sa odstránia a spracujú, aby sa posúdili zmeny mäkkých tkanív (vrátane očí, mozgu, nosového priechodu a jazyka) s použitím štandardných metód sériových rezov (26) alebo rovnako citlivou metódou. Telá týchto plodov a zvyšné neporušené plody sa spracujú a vyšetria na zmeny na skelete s použitím rovnakých metód, ako boli popísané pre hlodavce.2. ÚDAJE2.1 SPRACOVANIE VÝSLEDKOVÚdaje sa zaprotokolujú jednotlivo pre matky, ako aj pre ich potomstvo a zosumarizujú vo forme tabuliek a uvedie sa pre každú pokusnú skupinu a každú generáciu počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat, ktoré uhynuli počas testu, alebo sa usmrtili z humánnych dôvodov, čas každého úmrtia alebo humánneho usmrtenia, počet gravidných samíc, počet zvierat vykazujúcich príznaky toxicity, opis zistených príznakov toxicity, vrátane času nástupu, trvania a závažnosti všetkých toxických účinkov, typy vyšetrení embrya/plodu a všetky údaje týkajúce sa vrhu.Číselné výsledky sa vyhodnotia vhodnou štatistickou metódou, pričom sa na analýzu údajov ako jednotka použije vrh. Použije sa všeobecne uznávaná štatistická metóda; štatistické metódy sa zvolia ako súčasť plánu štúdie a zdôvodnia sa. Údaje týkajúce sa zvierat, ktoré neprežili do naplánovaného usmrtenia, sa tiež zaznamenajú. Tieto údaje sa môžu zahrnúť do tej skupiny priemerov zvierat, ktorej sa týkajú. Závažnosť údajov, získaných od takýchto zvierat a teda zahrnutie alebo vylúčenie z priemeru(-ov) ktorejkoľvek skupiny, sa zdôvodní a individuálne posúdi.2.2 VYHODNOTENIE VÝSLEDKOVZistenia štúdie prenatálnej vývojovej toxicity sa vyhodnotia na základe zistených účinkov. Hodnotenie bude obsahovať tieto informácie:- výsledky testu na matkách a embryách/plodoch, vrátane posúdenia vzťahu alebo neprítomnosti vzťahu medzi expozíciou zvierat testovanou látkou a výskytom a závažnosťou všetkých zistení;- kritériá použité na kategorizáciu vonkajších zmien na plode, mäkkých tkanivách a skelete, ak sa uskutočnila kategorizácia;- v prípade potreby historické kontrolné údaje na podporu interpretácie výsledkov štúdie;- počty použité pri výpočte všetkých percent alebo indexov;- vhodnú štatistickú analýzu zistení zo štúdie, ktoré by v prípade potreby mohli zahrnovať dostatočné informácie o analytickej metóde tak, aby nezávislý kontrolór/štatistik mohol prehodnotiť a zrekonštruovať analýzu.V každej štúdii, pri ktorej sa nepreukázali žiadne toxické účinky, je potrebné zvážiť ďalšie vyšetrenia na stanovenie absorpcie a biologickej dostupnosti testovanej látky.2.3 INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOVŠtúdia prenatálnej vývojovej toxicity poskytne informácie o účinkoch opakovanej expozície látkou počas gravidity na matkách a na vnútromaternicový vývoj ich potomstva. Výsledky štúdie sa interpretujú v spojitosti so zisteniami zo subchronických, reprodukčných, toxikokinetických a iných štúdií. Aj keď sa dôraz kladie na všeobecnú toxicitu, pokiaľ ide o toxicitu u matky a aj vývojovú toxicitu, výsledky štúdie umožnia do určitej miery rozlíšenie medzi účinkami na vývoj, ktoré sa vyskytnú pri neprítomnosti všeobecnej toxicity, a tých účinkov, ktoré sú vyvolané dávkami, ktoré sú toxické aj pre materské zviera. (27).3. PODÁVANIE SPRÁV3.1 SPRÁVA O TESTESpráva o teste musí obsahovať tieto konkrétne informácie:Testovaná látka:- fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti;- identifikácia vrátane čísla CAS, ak je známe/stanovené;- čistota.Nosič (v prípade potreby):- zdôvodnenie výberu nosiča, ak je iný ako voda.Pokusné zvieratá:- použitý druh a kmeň;- počet a pohlavie zvierat;- zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.;- hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku testu.Podmienky testu:- zdôvodnenie výberu veľkosti dávok;- údaje o zložení testovanej látky/príprave krmiva, dosiahnutej koncentrácii, stabilite a homogenite prípravku;- údaje o podávaní testovanej látky;- prepočet koncentrácie testovanej látky v krmive/pitnej vode (ppm) na skutočnú dávku (mg/kg telesnej hmotnosti/deň), ak je potrebné;- podmienky prostredia;- údaje o kvalite krmiva a vody.Výsledky:Údaje toxickej reakcie matky podľa dávky okrem iného:- počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat, ktoré prežili, počet gravidných zvierat a počet zvierat, ktoré potratili, počet zvierat, ktoré predčasne porodili;- deň uhynutia počas štúdie, alebo či zvieratá prežili do usmrtenia;- údaje o zvieratách, ktoré neprežili do naplánovaného usmrtenia, sa zaprotokolujú, ale sa nezahrnú do štatistických porovnaní medzi skupinami;- deň zistenia každého nezvyčajného klinického príznaku a jeho ďalší priebeh;- telesná hmotnosť, zmena telesnej hmotnosti a hmotnosť gravidného uteru, nepovinne vrátane zmeny telesnej hmotnosti upravenej o hmotnosť gravidného uteru;- spotreba potravy a, ak sa meria, spotreba vody;- pitevné nálezy, vrátane hmotnosti uteru;- zaznamenajú sa hodnoty NOAEL pre účinky na matku a vývoj.Vývojové údaje o vrhu s implantátmi, vrátane:- počtu žltých teliesok (corpora lutea);- počtu implantácií, počet a percento živých a mŕtvych plodov a resorpcií;- počtu a percento pred a po implantačných strát.Vývojové údaje o vrhu so živými plodmi, vrátane:- počtu a percenta živého potomstva;- pomeru pohlaví;- telesnej hmotnosti plodu, pokiaľ možno podľa pohlavia a pre obe pohlavia spolu;- vonkajšie malformácie, malformácie mäkkých tkanív a skeletu a iné závažné zmeny;- kritériá pre kategorizáciu v prípade potreby;- celkový počet a percento plodov a vrhov s každou vonkajšou zmenou, zmenou mäkkých tkanív alebo skeletu, ako aj typy výskytov jednotlivých anomálií a iných závažných zmien.Diskusia k výsledkom.Závery.4. ODKAZY(1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; 399-410.(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied Toxicology 14; 386-398.(3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CIIT Activities 17; 1-8.(4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study.(5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte. Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experimentelle Pathologie 247:367.(6) Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D.H.M. Woolam (ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. Congenital Anomalies 16; 171-173.(8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techniquefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenital Anomalies 32; 381-391.(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following Heat Exposure in the Rat. Teratology 47:229-242.(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476.(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morphology 127:291-306.(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of Foetal Maturity. Teratology 11; 313-320.(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity Studies. Toxicology and Applied Pharmacology 9;:398-408.(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in Rats: Malformations or Variations? Teratology 8; 309-316.(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD (Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to Ethylene Glycol. Teratology 46; 169-181.(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, pp. 163-173.(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible Influence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy 41; 411-445.(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone. Stain Technology 39; 61-63.(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton. American Journal of Anatomy 36; 313-355.(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 4; 181-188.(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957) The Genesis of the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL.(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Teratology. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J.G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, s. 251-277.(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977) Handbook of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY.(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techniques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28; 233-239.(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mammalian Foetuses. Teratology 9; 37-38.(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, Chicago, IL, pp. 126-144.(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for Developmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register 56; 63798-63826.(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Teratology 55; 249-292.--------------------------------------------------PRÍLOHA 2GB.35. DVOJGENERAČNÁ ŠTÚDIA REPRODUKČNEJ TOXICITY1. METÓDATáto metóda zodpovedá OECD TG 416 (2001).1.1 ÚVODTáto metóda pre dvojgeneračné reprodukčné testovanie je navrhnutá tak, aby poskytla všeobecné informácie, ktoré sa týkajú účinkov testovanej látky na integritu a činnosť samčích a samičích reprodukčných systémov, vrátane funkcie pohlavných žliaz, estrálneho cyklu, rozmnožovacieho správania, počatia, gravidity, pôrodu, laktácie a odstavenia a rastu a vývoja potomstva. Štúdia môže poskytnúť informácie aj o účinkoch testovanej látky na neonatálnu morbiditu, mortalitu a predbežné údaje o prenatálnej a postnatálnej vývojovej toxicite a slúži ako usmernenie pre ďalšie testy. Okrem pozorovania rastu a vývoja F1 generácie je táto testovacia metóda určená aj na posúdenie integrity a činnosti samčích a samičích reprodukčných systémov, ako aj rastu a vývoja F2 generácie. Za účelom získania ďalších informácií o vývojovej toxicite a funkčných poruchách je možné do tohto protokolu zapracovať tiež ďalšie časti štúdie s použitím metód pre vývojovú toxicitu a/alebo v prípade potreby vývojovú neurotoxicitu, alebo by sa tieto konečné body mohli skúmať v samostatných štúdiách s použitím vhodných testovacích metód.1.2 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDYTestovaná látka sa podáva viacerým skupinám samčích a samičích pokusných zvierat v odstupňovaných dávkach. Samcom P generácie sa podáva testovaná látka počas rastu a minimálne počas jedného úplného cyklu spermatogenézy (približne 56 dní u myši a 70 dní u potkana), aby sa zistili nepriaznivé účinky na spermatogenézu. Účinky na spermie sa stanovujú na základe množstva parametrov pre spermie (napr. morfológia spermie a pohyblivosť) a v preparátoch tkanív dôkladným histopatologickým vyšetrením. Ak sú dostupné údaje o spermatogenéze z predchádzajúcej štúdie pri opakovaných dávkach s dostatočným trvaním, napr. 90-dňová štúdia, nie je potrebné do štúdie zahrnúť samce P generácie. Odporúča sa však, aby sa uchovali vzorky alebo digitálne záznamy spermy P generácie na umožnenie neskoršieho posúdenia. Samiciam P generácie sa podáva testovaná látka počas rastu a v priebehu niekoľkých úplných estrálnych cyklov, aby sa dali stanoviť všetky nepriaznivé účinky testovanej látky na normálny priebeh estrálneho cyklu. Testovaná látka sa podáva rodičom (P) počas ich párenia, počas výslednej gravidity a počas odstavenia ich F1 potomstva. Po odstavení pokračuje podávanie látky F1 potomstvu počas ich rastu do dospelosti, párenia a narodenia F2 generácie až do odstavenia F2 generácie.Klinické pozorovania a patalogické vyšetrenia sa vykonajú na všetkých zvieratách na príznaky toxicity s osobitným dôrazom na účinky na integritu a činnosť samčích a samičích reprodukčných systémov a na rast a vývoj potomstva.1.3 OPIS TESTOVACEJ METÓDY1.3.1 Výber druhu zvieratNa testovanie sa prednostne používa potkan. Je potrebné zdôvodniť použitie iných druhov a budú potrebné príslušné úpravy. Kmene s nízkou plodnosťou, alebo o ktorých je známe, že majú vysoký výskyt vývojových porúch, sa nemajú používať. Na začiatku štúdie má byť rozdiel medzi hmotnosťami použitých zvierat minimálny a nemá byť vyšší ako 20 % priemernej hmotnosti každého pohlavia.1.3.2 Podmienky pre umiestnenie a kŕmenieTeplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala byť 22 °C (± 3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť by mala byť aspoň 30 %, a pokiaľ možno, nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti by mala dosahovať 50-60 %. Osvetlenie by malo byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej látky, keď sa podáva týmto spôsobom.Zvieratá môžu byť umiestnené jednotlivo alebo v malých skupinách rovnakého pohlavia v klietkach. Párenie sa uskutoční v klietkach, ktoré sú vhodné na tento účel. Po zaznamenaní kopulácie sa spárené samice umiestnia jednotlivo do pôrodných klietok alebo do klietok pre matky. Spárené potkany sa môžu držať aj v malých skupinách a oddeliť jeden alebo dva dni pred pôrodom. Krátko pre termínom vrhu sa spáreným zvieratám poskytne vhodný a definovaný hniezdiaci materiál.1.3.3 Príprava zvieratPoužijú sa zdravé mladé zvieratá, ktoré sa aklimatizovali na laboratórne podmienky aspoň 5 dní a ktoré sa predtým nepodrobili iným pokusom. Pokusné zvieratá sa charakterizujú na základe druhu, kmeňa, zdroja, pohlavia, hmotnosti a/alebo veku. Je potrebné, aby boli známe všetky súrodenecké vzťahy medzi zvieratami, aby sa zabránilo páreniu medzi súrodencami. Zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolnej a ošetrovanej skupiny (odporúča sa rozdelenie podľa telesnej hmotnosti). Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy kvôli umiestneniu klietok. Každému zvieraťu sa priradí vlastné identifikačné číslo. V prípade P generácie sa to uskutoční pred začiatkom dávkovania. V prípade F1 generácie sa to uskutoční po odstavení zvierat vybratých na párenie. Pre všetky vybraté F1 zvieratá sa uchovajú záznamy s uvedením vrhu, z ktorého pochádzajú. Okrem toho sa odporúča individuálna identifikácia mláďat čo najskôr po narodení, keď sa posudzuje váženie jednotlivých mláďat alebo funkčné testy.Rodičia (P) majú byť na začiatku dávkovania vo veku 5 až 9 týždňov. Zvieratá vo všetkých pokusných skupinách majú mať, pokiaľ je to možné, rovnakú hmotnosť a vek.1.4 POSTUP1.4.1 Počet a pohlavie zvieratKaždá pokusná a kontrolovaná skupina by mala obsahovať dostatočný počet zvierat tak, aby bolo k dispozícii pokiaľ možno 20 gravidných samíc, ktoré rodia, alebo čoskoro budú rodiť. V prípade látok, ktoré spôsobujú neželateľné účinky v súvislosti s ošetrením (napr. sterilitu, nadmernú toxicitu pri vysokej dávke), toto nie je možné. Cieľom je dosiahnuť dostatok gravidít, aby sa zabezpečilo zmysluplné posúdenie potenciálu látky ovplyvniť fertilitu, graviditu a správanie matky a dojčenie, rast a vývoj F1 potomstva od počatia do zrelosti a vývoj ich potomstva (F2) do odstavenia. Preto prípad, keď sa nedosiahne potrebný počet gravidných zvierat (t. j. 20), nevedie nevyhnutne k neplatnosti štúdie a posudzuje sa na základe jednotlivých prípadov.1.4.2 Príprava dávokOdporúča sa, aby sa testovaná látka podávala orálne (v krmive, pitnej vode alebo sondou), pokiaľ sa iná cesta podávania (napr. dermálna alebo inhalačná) nepokladá za vhodnejšiu.V prípade potreby sa testovaná látka rozpustí alebo rozptýli vo vhodnom nosiči. Odporúča sa, aby sa vždy, keď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného roztoku/suspenzie, potom roztoku/emulzie v oleji (napr. kukuričný olej) a nakoniec prípadného roztoku v iných nosičoch. Pre nosiče, ktoré sú iné ako voda, musia byť známe toxické charakteristiky. Určí sa stabilita testovanej látky v nosiči.1.4.3 DávkovaniePoužijú sa aspoň tri veľkosti dávky a uskutoční sa paralelná kontrola. Pokiaľ to fyzikálno-chemické vlastnosti alebo biologické účinky testovanej látky pripúšťajú, zvolí sa najvyššia dávka tak, aby spôsobila toxicitu, ale nespôsobila úmrtie alebo silné utrpenie. V prípade nečakanej úmrtnosti, štúdie s mierou úmrtnosti menej ako približne 10 % u rodičov (P) sú zvyčajne ešte stále akceptovateľné. Klesajúca postupnosť veľkosti dávok sa zvolí tak, aby sa preukázala každá reakcia v závislosti od dávkovania a hladina bez pozorovaného nepriaznivého účinku (NOAEL). Intervaly dávkovania s faktorom dva až štyri sú často optimálne na stanovenie klesajúceho dávkovania a pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie ako používanie veľmi veľkých intervalov (napr. viac ako faktor 10) medzi dávkami. V prípade štúdií týkajúcich sa výživy interval medzi dávkami nemá mať vyšší faktor ako 3. Veľkosti dávok sa zvolia pri zohľadnení všetkých existujúcich údajov o toxicite, najmä výsledky zo štúdií pri opakovaných dávkach. Posúdia sa aj všetky dostupné informácie o metabolizme a kinetike testovanej látky alebo príbuzných materiáloch. Okrem toho napomôžu tieto informácie aj pri preukazovaní vhodnosti režimu dávkovania.Kontrolnou skupinou môže byť neošetrená skupina alebo skupina, ktorej sa podáva nosič, ak sa pri podávaní testovanej látky používa nosič. Okrem ošetrenia s testovanou látkou sa so zvieratami v kontrolnej skupine zaobchádza rovnakým spôsobom ako so zvieratami v pokusnej skupine. Ak sa používa nosič, kontrolná skupina dostane nosič v najvyššom používanom objeme. Ak sa testovaná látka podáva v krmive a spôsobuje znížený príjem potravy alebo jej využitia, potom sa usudzuje, že je potrebné použiť paralelne kŕmenú kontrolnú skupinu. Údaje z kontrolných štúdií, určených na posúdenie účinkov zníženej spotreby potravy na reprodukčné parametre, sa alternatívne môžu použiť namiesto paralelne kŕmenej kontrolnej skupiny.Je potrebné venovať pozornosť týmto charakteristikám nosiča a iných prídavných látok: vplyv na absorpciu, distribúciu, metabolizmus alebo retenciu testovanej látky; vplyv na chemické vlastnosti testovanej látky, ktorý môže meniť jej toxické vlastnosti; a vplyv na spotrebu potravy a vody alebo nutričný stav zvierat.1.4.4 Limitný testAk v orálnej štúdii s jednou dávkou s veľkosťou minimálne 1000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň alebo pri podávaní v krmive alebo pitnej vode rovnaký percentuálny podiel v krmive alebo pitnej vode s použitím postupov opísaných pre túto štúdiu nespôsobí žiadne pozorovateľné toxické účinky ani u rodičov, ani u ich potomstva a ak sa toxicita neočakáva na základe údajov zo štrukturálne a/alebo metabolicky príbuzných látok, potom sa môže upustiť od úplnej štúdie s použitím viacerých veľkostí dávok. Limitný test sa uplatňuje s výnimkou prípadu, keď z expozície ľudí vyplýva, že je potrebné použiť vyššiu orálnu dávku. Pre iné typy podávania, ako je napr. inhalácia alebo dermálna aplikácia z fyzikálno-chemických vlastností testovanej látky, ako je napr. rozpustnosť, často môže vyplývať a byť limitovaná maximálna prípustná úroveň expozície.1.4.5 Podávanie dávokZvieratám sa podáva testovaná dávka 7 dní v týždni. Uprednostňuje sa orálna cesta podávania (krmivo, pitná voda alebo sonda). Ak sa použije iný spôsob podávania, uvedie sa zdôvodnenie a môžu byť potrebné príslušné úpravy. Všetkým zvieratám sa podáva látka rovnakým spôsobom počas príslušného obdobia pokusu. Ak sa testovaná látka podáva sondou, je potrebné použiť žalúdočnú sondu. Objem kvapaliny podanej jednorázovo nesmie byť vyšší ako 1 ml/l00 g telesnej hmotnosti (0,4 ml/100 g telesnej hmotnosti je maximum pre kukuričný olej), s výnimkou vodných roztokov, keď sa môže použiť 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. S výnimkou dráždivých alebo žieravých látok, ktoré zvyčajne pri vyšších koncentráciách spôsobia zhoršenie účinkov, variabilita v aplikovanom objeme sa minimalizuje tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpečil stály objem vo všetkých dávkach. V štúdiách, pri ktorých sa používa sonda, mláďatá zvyčajne dostávajú testovanú látku iba nepriamo v mlieku, pokiaľ sa im po odstavení nezačne látka podávať priamo. V štúdiách, pri ktorých sa látka podáva v krmive alebo pitnej vode, mláďatá dostanú dodatočne testovanú látku priamo, keď začnú jesť samostatne počas posledného obdobia laktácie.Pre látky podávané v potrave alebo pitnej vode je dôležité zabezpečiť, aby množstvá použitej testovanej látky neinterferovalo s normálnou výživovou a vodnou bilanciou. Keď sa testovaná látka podáva v krmive môže sa použiť buď stála koncentrácia v krmive (ppm) alebo stála veľkosť dávky vzhľadom na telesnú hmotnosť zvieraťa; použitá alternatíva sa musí špecifikovať. V prípade, keď sa látka podáva sondou, látka sa podáva približne v rovnaký čas každý deň a prispôsobí sa aspoň raz za týždeň, aby sa zachovala stála veľkosť dávky vzhľadom na telesnú hmotnosť. Informácie, ktoré sa týkajú placentárnej distribúcie, sa posudzujú pri prispôsobení veľkosti dávky cez sondu založenej na hmotnosti.1.4.6 Priebeh pokusuDenné podávanie testovanej látky samčej a samičej rodičovskej generácii (P) sa začína, keď sú vo veku 5 až 9 týždňov. Denné podávanie testovanej látky F1 generácii samcov a samíc sa začína po odstavení; je potrebné pamätať na to, že v prípade, keď sa testovaná látka podáva v krmive alebo pitnej vode, priama expozícia F1 mláďat testovanou látkou sa môže vyskytnúť už počas laktačného obdobia. Pre obidve pohlavia (P a F1) pokračuje podávanie látky minimálne 10 týždňov pred obdobím párenia. Podávanie látky pokračuje u oboch pohlaví počas 2-týždňového obdobia párenia. Samce sa humánnym spôsobom usmrtia a vyšetria, ak už nie sú potrebné na hodnotenie účinkov na reprodukciu. Rodičovskej generácii samíc (P) pokračuje podávanie látky počas gravidity a až do odstavenia F1 potomstva. Je potrebné venovať pozornosť úpravám harmonogramu dávkovania založeným na dostupných informáciách o testovanej látke vrátane existujúcich údajov o toxicite, vplyve na metabolizmus alebo bioakumulácii. Dávka pre jednotlivé zviera sa zvyčajne zakladá na naposledy zistenej telesnej hmotnosti. Je však potrebné venovať pozornosť pri nastavovaní dávky počas posledného trimestra gravidity.Ošetrovanie samcov a samíc generácie P a F1 pokračuje až do ukončenia. Všetky dospelé samce a samice generácie P a F1 sa humánnym spôsobom usmrtia, ak už viac nie sú potrebné na hodnotenie účinkov na reprodukciu. Potomstvo generácie F1, ktoré sa nevyberie na párenie, a celé potomstvo generácie F2 sa po odstavení humánnym spôsobom usmrtí.1.4.7 Párenie1.4.7.1 Párenie rodičov (P)V prípade každého párenia sa umiestni každá samica s jedným samcom z rovnakej dávkovej skupiny (párenie 1:1), pokiaľ sa neuskutoční kopulácia, alebo neuplynú 2 týždne. Každý deň sa samice vyšetria na prítomnosť spermy alebo vaginálnej zátky. Za 0. deň gravidity sa určí deň, kedy sa zistil výskyt vaginálnej zátky alebo spermy. V prípade neúspešného párenia sa zváži opätovné párenie samíc so samcami z rovnakej skupiny s preukázanou plodnosťou. Vzájomne spárené páry sa v údajoch zreteľne identifikujú. Je potrebné zabrániť páreniu súrodencov.1.4.7.2 Párenie F1 generáciePre párenie F1 potomstva sa z každého vrhu po odstavení vyberie aspoň jeden samec a jedna samica na párenie s mláďatami tej istej dávkovej skupiny, ale z iného vrhu, aby sa vytvorila F2 generácia. Výber mláďat z každého vrhu je náhodný, ak sa nezistili žiadne významné odlišnosti telesnej hmotnosti alebo vzhľade zvierat z vrhu. V prípade, že sa zistia tieto odlišnosti, vyberú sa najlepší zástupcovia z každého vrhu. Prakticky je to najlepšie na základe telesnej hmotnosti, ale môže to byť vhodnejšie na základe vzhľadu. F1 potomstvo by sa nemalo páriť, pokiaľ nedosiahne úplnú pohlavnú zrelosť.Páry bez potomstva sa vyšetria, aby sa určila zjavná príčina neplodnosti. Toto môže zahrnovať také postupy, ako napr. ďalšie možnosti páriť sa s inými samcami alebo samicami s preukázanou plodnosťou, mikroskopické vyšetrenie reprodukčných orgánov a vyšetrenie estrálnych cyklov alebo spermatogenézy.1.4.7.3 Druhé párenieV určitých prípadoch, ako napr. zmeny vo veľkosti vrhu súvisiace s ošetrením alebo zistenie nejednoznačného účinku pri prvom párení, sa odporúča, aby sa dospelé zvieratá P alebo F1 generácie opätovne spárili na vytvorenie druhého vrhu. Odporúča sa opätovné spárenie samíc alebo samcov, ktoré nevytvorili vrh so zvieratami opačného pohlavia s preukázanou plodnosťou. Ak sa pokladá za potrebné, aby sa uskutočnil druhý vrh v ktorejkoľvek generácii, zvieratá sa opätovne spária jeden týždeň po odstavení posledného vrhu.1.4.7.4 Veľkosť vrhuZvieratám sa umožní, aby vrhli prirodzeným spôsobom a vychovávali svoje potomstvo až do odstavenia. Štandardizácia veľkostí vrhu je nepovinná. Ak sa uskutoční štandardizácia, použitá metóda sa detailne popíše.1.5 POZOROVANIA1.5.1 Klinické vyšetreniaVšeobecné klinické vyšetrenie sa uskutoční každý deň a v prípade podávania dávok cez sondu je potrebné, aby načasovanie zohľadnilo predpokladané maximálne účinky po podaní dávky. Zmeny v správaní, príznaky ťažkého alebo dlhotrvajúceho pôrodu a všetky príznaky toxicity sa zaznamenajú. Ďalšie podrobnejšie vyšetrenie každého zvieraťa sa uskutoční aspoň raz do týždňa a môže sa to zvyčajne urobiť počas váženia zvieraťa. Dvakrát za deň, počas víkendu raz za deň sa v prípade potreby u všetkých zvierat zisťuje morbidita a mortalita.1.5.2 Telesná hmotnosť a spotreba potravy/vody rodičovských zvieratRodičovské zvieratá (P a F1) sa odvážia v prvý deň po podaní látky a potom aspoň raz za týždeň. Rodičovské samice (P a F1) sa odvážia minimálne v dňoch gravidity 0, 7, 14 a 20 alebo 21 a počas laktácie v rovnaké dni ako sa vážia mláďatá z vrhov a v deň, keď sa zvieratá usmrtia. Tieto zistenia sa zaznamenajú jednotlivo pre každé dospelé zviera. V čase pred obdobím párenia a graviditou sa spotreba krmiva meria minimálne raz za týždeň. Spotreba vody sa meria minimálne raz do týždňa, ak sa testovaná látka podáva vo vode.1.5.3 Estrálny cyklusDĺžka estrálneho cyklu a normálny priebeh sa zisťuje u samíc P a F1 generácie vaginálnymi výtermi pred párením a nepovinne počas párenia, pokiaľ sa nepotvrdí spárenie. Pri odbere vaginálnych/cervikálnych buniek je potrebné venovať pozornosť, aby sa neporušila sliznica a následne nevyvolala pseudogravidita (1).1.5.4 Parametre spermiíPre všetky samce P a F1 generácie sa po usmrtení zaznamená hmotnosť semenníkov a nadsemenníkov a odloží sa po jednom z každého orgánu na histopatologické vyšetrenie (pozri oddiel 1.5.7, 1.5.8.1). Z časti pozostávajúcej z aspoň desiatich samcov z každej skupiny samcov generácie P a F1 sa zostávajúce semenníky a nadsemenníky použijú na zistenie počtu spermatidov homogenizačne rezistentných, prípadne zásob spermií z chvostovej časti nadsemenníkov. V prípade tejto istej časti samcov, sa spermie z chvostovej časti nadsemenníkov alebo semenovodu odoberú na vyšetrenie pohyblivosti a morfológie spermií. Ak sa zistia účinky v súvislosti s ošetrením, alebo ak existuje dôkaz z iných štúdií o možných účinkoch na spermatogenézu, hodnotenie spermií sa uskutoční u všetkých samcov v každej dávkovej skupine; v opačnom prípade sa môže výpočet obmedziť na samce P a F1 generácie z kontrolnej skupiny a skupiny s vysokými dávkami.Zistí sa celkový počet homogenizačne rezistentných spermatidov a spermií z chvostovej časti nadsemenníkov (2) (3). Zásoby spermií z chvostovej časti nadsemenníkov sa odvodia na základe koncentrácie a objemu spermií v suspenzii použitej na doplnenie kvalitatívnych hodnotení a počtu spermií získaných následným pomletím a/alebo homogenizáciou zvyšného tkaniva chvostovej časti. Počet sa zistí u vybratej podskupiny samcov všetkých dávkových skupín bezprostredne po usmrtení zvierat, pokiaľ sa neurobia video alebo digitálne záznamy, alebo pokiaľ sa vzorky nezamrazia a neanalyzujú neskôr. V týchto prípadoch sa môže ako prvá analyzovať kontrolná skupina a skupina s vysokou dávkou. Ak sa nezistia žiadne účinky v súvislosti s ošetrením (napr. účinky na počet spermií, pohyblivosť alebo morfológiu), ostatné dávkové skupiny nie je potrebné analyzovať. Ak sa zaznamenajú účinky v súvislosti s ošetrením v skupine s vysokými dávkami, potom sa skupiny s nižšími dávkami tiež posúdia.Posúdi sa pohyblivosť spermií v nadsemenníkoch (alebo semenovode), alebo sa zaznamená na video pásku bezprostredne po usmrtení. Spermie sa odoberú tak, aby sa minimalizovalo poškodenie a zriedia, aby sa mohla vykonať analýza pohyblivosti s použitím uznaných metód (4). Percento progresívne pohybujúcich sa spermií sa stanoví buď subjektívne alebo objektívne. Ak sa uskutočňuje počítačová analýza pohyblivosti (5) (6) (7) (8) (9) (10), odvodenie progresívnej pohyblivosti sa zakladá na maximálnych hodnotách definovaných užívateľom pre priemernú rýchlosť dráhy a priamosť alebo lineárny index. Ak sa vzorky nahrávajú na videopásky (11), alebo sa obrazy inak zaznamenávajú počas autopsie, môže sa vykonať následná analýza iba kontrolnej skupiny a skupiny s vysokými dávkami samcov generácie P a F1, pokiaľ sa nezistia účinky v súvislosti s ošetrením; v takomto prípade sa posúdia aj skupiny s nižšími dávkami. Pri neprítomnosti video alebo digitálnych záznamov sa všetky vzorky vo všetkých ošetrovaných skupinách analyzujú pri autopsii.Uskutoční sa morfologické vyšetrenie spermií zo vzorky z nadsemenníkov (alebo semenovodu). Spermie (minimálne 200 na vzorku) sa vyšetria ako fixné, mokré preparáty (12) a zatriedia sa ako buď normálne alebo abnomálne. Vzorky morfologických abnormalít spermií zahrnujú fúziu, oddelené hlavičky a zdeformované hlavičky a/alebo bičíky. Vyšetrenie sa vykoná na vybratej podskupine samcov všetkých dávkových skupín buď bezprostredne po usmrtení zvierat, alebo neskôr na základe video alebo digitálnych záznamov. Stery po fixovaní sa tiež môžu posúdiť neskôr. V týchto prípadoch sa môže ako prvá analyzovať kontrolná skupina a skupina s vysokou dávkou. Ak sa nepozorujú žiadne účinky v súvislosti s ošetrením (napr. účinky na morfológiu spermií), ostatné dávkové skupiny nie je potrebné analyzovať. Ak sa zaznamenajú účinky v súvislosti s ošetrením v skupine s vysokými dávkami, potom sa skupiny s nižšími dávkami tiež posúdia.Ak sa horeuvedené parametre hodnotenia spermií už preskúmali ako súčasť štúdie systémovej toxicity o dĺžke aspoň 90 dní, nie je ich potrebné zopakovať v dvojgeneračnej štúdii. Odporúča sa však, aby sa uchovali vzorky alebo digitálne záznamy spermií P generácie na umožnenie neskoršieho posúdenia v prípade potreby.1.5.5 PotomstvoKaždý vrh sa vyšetrí čo najskôr po pôrode (0. deň laktácie), aby sa zistil počet a pohlavie potomstva, mŕtvo narodené a živo narodené jedince a výskyt nápadných anomálií. Mláďatá, ktoré sa našli mŕtve v deň 0, ak nie sú macerované, sa prednostne vyšetria na možné poruchy a príčinu uhynutia a sa zakonzervujú. Živé mláďatá sa spočítajú a každé sa jednotlivo po narodení odváži (0. deň laktácie) alebo na 1. deň a potom pravidelne v deň váženia, napr. na 4., 7., 14. a 21. deň laktácie. Fyzické abnormality a poruchy správania pozorované u matiek alebo potomstva sa zaznamenajú.Fyzický vývoj potomstva sa zaznamená najmä na základe prírastku telesnej hmotnosti. Ostatné fyzické parametre (napr. otvorenie očí a uší, prerezanie zubov, rast srsti) môžu poskytnúť doplňujúce informácie, ale tieto údaje sa hodnotia prednostne v súvislosti s údajmi o sexuálnej zrelosti (napr. vek a telesná hmotnosť v čase otvorenia vagíny alebo oddelenia žaluďa a predkožky) (13). Vyšetrenia funkčnosti (napr. motorická aktivita, zmyslové funkcie, reflexná ontogenézia) F1 potomstva pred a/alebo po odstavení predovšetkým tie, ktoré sa týkajú sexuálnej zrelosti, sa odporúčajú, ak takéto vyšetrenia nie sú zahrnuté v samostatných štúdiách. Vek v čase vaginálneho otvorenia a oddelenia predkožky sa určí pre odstavené zvieratá generácie F1 vybraté pre párenie. Anogenitálna vzdialenosť sa zmeria v deň 0 po narodení u mláďat generácie F2, ak sa vyskytnú zmeny v pomere pohlaví u generácie F1 alebo v čase pohlavnej zrelosti.Vyšetrenia funkčnosti sa môžu vynechať v skupinách, v ktorých sa iným spôsobom prejavili jasné príznaky nepriaznivých účinkov (napr. významný pokles prírastku hmotnosti atď.). Ak sa uskutočňujú vyšetrenia funkčnosti, neuskutočnia sa na mláďatách vybratých na párenie.1.5.6 AutopsiaV čase usmrtenia alebo uhynutia počas štúdie sa všetky rodičovské zvieratá (P a F1 generácie), všetky mláďatá s externými abnormalitami alebo klinickými príznakmi, ako aj po jednom náhodne vybratom mláďati/pohlaví/vrhu z F1 a aj F2 generácie vyšetria makroskopicky na všetky štrukturálne abnormality alebo patologické zmeny. Osobitná pozornosť sa venuje orgánom reprodukčného systému. Moribundné mláďatá sa humánnym spôsobom usmrtia a uhynuté mláďatá, ak nie sú macerované, sa vyšetria na možné defekty a/alebo príčinu uhynutia a zakonzervujú.Maternice všetkých samíc, ktoré prvý raz rodili, sa vyšetria spôsobom, ktorý neovplyvní histopatologické vyšetrenie, na výskyt a počet implantačných miest.1.5.7 Hmotnosť orgánovV čase usmrtenia sa zistí telesná hmotnosť týchto orgánov všetkých rodičovských zvierat P a F1 generácie (párové orgány sa vážia jednotlivo):- uterus, vaječníky;- semenníky, nadsemenníky (celé a chvostová časť);- prostata;- semenné vačky s koagulačnými žľazami a ich tekutiny a prostata (ako jedna jednotka);- mozog, pečeň, obličky, slezina, hypofýza, štítna žľaza a nadobličky a známe cieľové orgány.Zistia sa konečné telesné hmotnosti mláďat generácie F1 a F2 vybratých na autopsiu. U jedného náhodne vybratého mláďaťa/pohlavia/vrhu sa odvážia tieto orgány (pozri časť 1.5.6): mozog, slezina a týmus.Výsledky autopsie a hmotnosti orgánov sa posúdia v súvislosti so zisteniami z iných štúdií pri opakovaných dávkach, ak je to možné.1.5.8 Histopatológia1.5.8.1 Rodičovské zvieratáTieto orgány a tkanivá rodičovských zvierat (P a F1) alebo ich reprezentatívne vzorky sa fixujú a uchovajú vo vhodnom médiu na histopatologické vyšetrenie.- vagína, uterus s cervixom a vaječníky (zakonzervované vo vhodnom fixačnom prostriedku);- jeden semenník (konzervovaný v Bouinovom roztoku alebo porovnateľnom fixačnom prostriedku), jeden nadsemenník, semenné vačky, prostata a koagulačná žľaza;- predtým identifikovaný cieľový orgán(-y) zo všetkých zvierat P a F1 generácie vybratých na párenie.Úplné histopatologické vyšetrenie zakonzervovaných horeuvedených orgánov a tkanív sa uskutoční u všetkých zvierat zo skupiny s vysokými dávkami a z kontrolnej skupiny generácie P a F1 vybratých na párenie. Vyšetrenie vaječníkov zvierat P generácie je nepovinné. Orgány vykazujúce zmeny v súvislosti s ošetrením sa tiež vyšetria v skupinách s nízkymi a strednými dávkami na pomoc pri stanovení NOAEL. Ďalej sa podrobia histopatologickému vyšetreniu reprodukčné orgány zvierat zo skupín s nízkymi a strednými dávkami s podozrením na zníženú fertilitu, napr. tie, ktoré zlyhali pri párení, počatí, plodení alebo vrhnutí zdravého potomstva, alebo u ktorých bol ovplyvnený estrálny cyklus alebo počet spermií, pohyblivosť alebo morfológia. Všetky makroskopické lézie ako napr. atrofia alebo tumory sa vyšetria.Semenníky sa podrobne histopatologicky vyšetria (napr. s použitím Bouinovho fixačného prostriedku, zaliatia v parafíne a transverzálnych rezov s hrúbkou 4-5 μm) na identifikáciu účinkov, ktoré boli spôsobené v súvislosti s ošetrením, ako sú napr. retencia spermatidov, chýbajúce vrstvy zárodočných buniek alebo typy, mnohojadrové obrovské bunky alebo olupovanie spermatogénnych buniek do lumenu (14). Vyšetrenie intaktných nadsemenníkov zahrnuje hlavu, telo a chvostovú časť, ktoré sa môže vykonať na základe posúdenia pozdĺžneho rezu. Nadsemenníky sa vyšetria na infiltráciu leukocytov, zmenu prevalencie typov buniek, aberantných typov buniek a fagocytózu spermií. PAS a farbenie hematoxylínom sa môže použiť na vyšetrenie samčích reprodukčných orgánov.Vaječník po odstavení má obsahovať primordiálne a rastúce folikuly, ako aj veľké žlté teliesko obdobia laktácie. Histopatologickým vyšetrením sa má zistiť kvalitatívny úbytok primordiálnych folikúl. Kvantitatívne hodnotenie primordiálnych folikúl sa uskutoční pre samice F1 generácie; počet zvierat, výber rezu vaječníkov a výber veľkosti vzoriek má byť štatisticky primeraný na posúdenie použitej metódy. Do vyšetrenia sa zahrnie stanovenie počtu primordiálnych folikúl, ktoré sa môžu kombinovať s malými rastúcimi folikulami na porovnanie ošetrených a kontrolných vaječníkov (15) (16) (17) (18) (19).1.5.8.2 Odstavené zvieratáMakroskopicky abnormálne tkanivo a cieľové orgány zo všetkých mláďat s vonkajšími abnormalitami alebo klinickými príznakmi, ako aj na jednom z náhodne vybratom mláďati/pohlaví/vrhu z oboch generácií F1 a F2, ktoré neboli vybraté na párenie, sa zafixuje a uchová vo vhodnom médiu na histopatologické vyšetrenie. Úplná histopatologická charakterizácia zakonzervovaného tkaniva sa uskutoční s osobitným dôrazom na orgány reprodukčného systému.2. ÚDAJE2.1 SPRACOVANIE VÝSLEDKOVÚdaje sa zaprotokolujú jednotlivo a zosumarizujú vo forme tabuliek a uvedie sa pre každú pokusnú skupinu a každú generáciu počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu, alebo sa usmrtili z humánnych dôvodov, čas každého úmrtia alebo humánneho usmrtenia, počet fertilných samíc, počet gravidných samíc, počet zvierat vykazujúcich príznaky toxicity, popis zistených príznakov toxicity, vrátane času nástupu, trvania a závažnosti každého toxického účinku, typy vyšetrení rodičov a potomstva, typy histopatologických zmien a všetky údaje, ktoré sa týkajú vrhu.Číselné výsledky sa vyhodnotia príslušnou všeobecne uznávanou štatistickou metódou; ako súčasť plánu štúdie by sa mali zvoliť štatistické metódy, ktoré by sa mali zdôvodniť. Na analýzu údajov môžu byť užitočné štatistické modely reakcie na podanie dávky. Správa by mala obsahovať dostatok informácií o analytickej metóde a použitom počítačovom programe, aby nezávislý kontrolór/štatistik mohol prehodnotiť a zrekonštruovať analýzu.2.2 VYHODNOTENIE VÝSLEDKOVZistenia z tejto štúdie dvojgeneračnej reprodukčnej toxicity by sa mali vyhodnotiť na základe zistených účinkov, vrátane autopsie a mikroskopických nálezov. Hodnotenie bude zahrnovať vzťah alebo jeho absenciu medzi dávkou testovanej látky a prítomnosť alebo absenciu výskytu a závažnosti abnormalít, vrátane makroskopických lézií, identifikovaných cieľových orgánov, ovplyvnenej fertility, klinických abnormalít, ovplyvnenej reprodukčnej činnosti a schopnosti vrhnúť, zmien telesnej hmotnosti, účinkov na mortalitu a iných toxických účinkov. Pri hodnotení výsledkov testu by sa mali zohľadniť fyzikálno-chemické vlastnosti testovanej látky a, ak sú dostupné, toxikokinetické údaje.Riadne vykonaný test reprodukčnej toxicity by mal poskytnúť uspokojivé stanovenie hladiny, ktorá nevyvoláva účinky, a umožniť pochopenie nepriaznivých účinkov na reprodukciu, pôrod, laktáciu, postnatálny vývoj vrátane rastu a sexuálneho vývoja.2.3 INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOVŠtúdia dvojgeneračnej reprodukčnej toxicity poskytne informácie o účinkoch opakovanej expozície látkou počas všetkých fáz reprodukčného cyklu. Štúdia poskytuje informácie predovšetkým o reprodukčných parametroch a o vývoji, raste, dozrievaní a prežívaní potomstva. Výsledky štúdie by sa mali interpretovať v spojitosti so zisteniami zo subchronických štúdií, štúdií prenatálneho vývoja, toxikokinetických a iných dostupných štúdií. Výsledky tejto štúdie sa môžu použiť pri posudzovaní potreby ďalšieho testovania chemikálie. Extrapolácia výsledkov štúdie na človeka platí len obmedzene. Najlepšie slúžia na poskytnutie informácií o NOAEL a prípustnej expozície ľudí (20) (21) (22) (23).3. PODÁVANIE SPRÁV3.1 SPRÁVA O TESTESpráva o teste musí obsahovať tieto informácie:Testovaná látka:- fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti;- identifikačné údaje;- čistota.Nosič (v prípade potreby):- zdôvodnenie výberu nosiča, ak je iný ako voda.Pokusné zvieratá:- použitý druh/kmeň;- počet, vek a pohlavie zvierat;- zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo, hniezdiaci materiál atď.;- hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku testu.Podmienky testu:- zdôvodnenie výberu veľkosti dávok;- údaje o príprave zloženia testovanej látky/krmiva, dosiahnutých koncentráciách;- stabilita a homogenita prípravku;- údaje o podávaní testovanej látky;- prepočet koncentrácie testovanej látky v krmive/pitnej vode (ppm) na dosiahnutú dávku (mg/kg telesnej hmotnosti/deň), ak je potrebné;- údaje o kvalite krmiva a vody.Výsledky:- spotreba potravy a spotreba vody, ak sú k dispozícii, účinnosť krmiva (prírastok telesnej hmotnosti na gram skonzumovanej potravy) a spotreba testovaného materiálu pre zvieratá generácie P a F1, okrem obdobia párenia a aspoň posledných troch mesiacov laktácie;- údaje o absorpcii (ak sú k dispozícii);- údaje o telesnej hmotnosti zvierat P a F1 generácie vybratých na párenie;- údaje o hmotnosti vrhu a mláďat;- telesná hmotnosť pri usmrtení a údaje o absolútnych a relatívnych hmotnostiach orgánov rodičov;- povaha, závažnosť a trvanie klinických vyšetrení (s údajmi o reverzibilite);- čas uhynutia počas štúdie, alebo či zvieratá prežili do usmrtenia;- údaje o toxickej reakcii podľa pohlavia a dávky, vrátane indexov pre párenie, fertilitu, graviditu, pôrod, životaschopnosť a laktáciu; v správe je potrebné uviesť čísla použité na výpočet týchto indexov;- toxické alebo iné účinky na reprodukciu, potomstvo, postnatálny rast atď;- nálezy z autopsie;- podrobný popis všetkých histopatologických nálezov;- počet samíc generácie P a F1 s normálnym cyklom a trvanie cyklu;- celkový počet spermií z chvostovej časti nadsemenníkov, percento progresívne sa pohybujúcich spermií, percento morfologicky normálnych spermií a percento spermií s každou identifikovanou abnormalitou;- čas do inseminácie, vrátane počtu dní do inseminácie;- dĺžka gravidity;- počet implantátov, žlté telieska (corpora lutea), veľkosť vrhu;- počet živo narodených zvierat a straty po implantácii;- počet mláďat s makroskopicky viditeľnými abnormalitami, ak je zistený počet nevyvinutých jedincov je potrebné uviesť;- údaje o fyzických medzníkoch vo vývoji mláďat a iné postnatálne údaje o vývoji; hodnotené fyzické medzníky sa zdôvodnia;- údaje o vyšetreniach funkčnosti u mláďat a dospelých, ak je možné;- štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby.Diskusia k výsledkom.Závery, vrátane hodnôt NOAEL pre matku a potomstvo.4. ODKAZY(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.(2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology 12:92-108.(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility 54:103-107.(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology 5:39-44.(5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3):237-244.(6) Chapin, R.E. et al., (1992).Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology 6:267-273.(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration. Journal of Andrology 13:409-421.(8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. ReproductiveToxicology 5:449-458.(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333.(10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401-415.(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andrology 8:330-337.(12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505.(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17:298-303.(14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, pp. 421-426.(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Assessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven, New York.(18) Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive Toxicology 5:379-383.(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.(20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.(21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.(22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.(23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.--------------------------------------------------PRÍLOHA 2HB.42. SENZIBILIZÁCIA POKOŽKY: LOKÁLNA SKÚŠKA LYMFATICKÝCH UZLÍN1. METÓDATáto testovacia metóda je rovnocenná s OECD TG 429 (2002).1.1 ÚVODLokálna skúška lymfatických uzlín [Local Lymph Node Assay (LLNA)] je dostatočne validovaná a uznávana, aby sa mohla uznať ako nová metóda (1) (2) (3). Je to druhá metóda na stanovenie potenciálu chemikálií spôsobiť senzibilizáciu kože u zvierat. Prvá metóda (B.6) využíva testy s morčatami, a to maximalizačný test morčiat a Buehlerov test (4).LLNA poskytuje alternatívnu metódu na identifikáciu chemikálií senzibilizujúcich kožu a na potvrdenie, že chemikália nemá významný potenciál spôsobiť senzibilizáciu kože. Neznamená to nevyhnutne, že vo všetkých prípadoch sa má použiť LLNA namiesto testu s morčatami, ale skôr to, že táto skúška je rovnako hodnotná a môže sa použiť ako alternatíva, v ktorej pozitívne a negatívne výsledky vo všeobecnosti nevyžadujú ďalšie potvrdenie.LLNA poskytuje určité výhody, pokiaľ ide o vedecký pokrok a aj starostlivosť o zvieratá. Skúma indukčnú fázu senzibilizácie kože a poskytuje kvantitatívne údaje vhodné na vyhodnotenie reakcie na podanie látky. Údaje o validácii LLNA a prehľad prác v tejto oblasti boli uverejnené (5) (6) (7) (8). Okrem toho je potrebné poznamenať, že ľahké/mierne senzibilizátory, ktoré sa odporúčajú ako vhodné látky na pozitívnu kontrolu pre testovacie metódy na morčatách, sú tiež vhodné na použitie s LLNA (6) (8) (9).LLNA je in vivo metóda a to znamená, že sa neeliminuje používanie zvierat pri hodnotení aktivity kontaktnej sensibilizácie. Môže však umožniť zníženie počtu zvierat potrebných na tento účel. Okrem toho LLNA ponúka značné zjemnenie spôsobu, akým sa zvieratá používajú na testy kontaktnej senzibilizácie. LLNA sa zakladá na posudzovaní imunologických reakcií vyvolaných chemikáliami počas indukčnej fázy senzibilizácie. Na rozdiel od testov s morčatami LLNA nevyžaduje, aby sa vyvolali reakcie dermálnej hypersenzitivity. Okrem toho LLNA nevyžaduje použitie adjuvansu ako v prípade maximalizačného testu morčiat. Tým LLNA znižuje utrpenie zvierat. Napriek výhodám, ktoré LLNA má pred tradičnými testami s morčatami, je potrebné uznať, že existujú určité obmedzenia, pre ktoré je potrebné používať tradičné testy s morčatami (napr. falošné negatívne zistenia v LLNA s určitými kovmi, falošné pozitívne zistenia s určitými kožnými iritantami) (10).Pozri tiež Úvodnú časť B.1.2 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDYZákladným princípom, na ktorom sa LLNA zakladá, je, že senzibilizátory vyvolávajú primárnu proliferáciu lymfocytov v lymfatickej uzline v drénovanom mieste aplikácie chemikálie. Táto proliferácia je úmerná aplikovanej dávke (a účinnosti alergénu) a poskytuje jednoduchý prostriedok na získanie objektívneho, kvantitatívneho merania senzibilizácie. LLNA hodnotí túto proliferáciu ako vzťah medzi dávkou a reakciou, keď sa proliferácia v pokusných skupinách porovnáva s kontrolnou skupinou, ktorej sa podáva nosič. Určí sa pomer proliferácie v ošetrenej skupine k proliferácii v kontrolách s nosičom, ktorý sa označuje ako stimulačný index, a musí mať hodnotu aspoň tri pred ďalším prípadným vyhodnotením testovanej látky ako potenciálneho senzibilizátora. Tu uvedené metódy sa zakladajú na používaní rádioaktívneho označenia na meranie proliferácie buniek. Môžu sa však použiť iné konečné body na hodnotenie proliferácie za predpokladu, že to bude zdôvodnené a príslušne vedecky doložené, vrátane úplných citácií a popisu metodológie.1.3 OPIS TESTOVACEJ METÓDY1.3.1 Prípravky1.3.1.1 Podmienky pre umiestnenie a kŕmenieZvieratá by sa mali umiestniť jednotlivo. Teplota miestnosti pre pokusné zvieratá by mala byť 22 °C (± 3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť by mala byť aspoň 30 %, a pokiaľ možno, nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti má dosahovať 50-60 %. Osvetlenie má byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.1.3.1.2 Príprava zvieratZvieratá sú náhodne vybraté, označené tak, aby sa umožnila jednotlivá identifikácia (ale nie formou ušných značiek) a držia sa v klietkach aspoň 5 dní pred začiatkom podávania dávok, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky. Pred začatím ošetrenia sa všetky zvieratá vyšetria, aby sa získala istota, že nemajú žiadne viditeľné kožné poranenia.1.3.2 Testovacie podmienky1.3.2.1 Experimentálne zvieratáVybratým druhom pre tento test je myš. Použijú sa mladé dospelé panenské a negravidné samice myši kmeňa CBA/Ca alebo CBA/J. Na začiatku štúdie by zvieratá mali byť vo veku 8-12 týždňov a rozdiel medzi hmotnosťami použitých zvierat má byť minimálny a nemá byť vyšší ako 20 % priemernej hmotnosti. Iné kmene a samce sa môžu použiť, ak sa na základe údajov dá uspokojivo dokázať, že neexistujú významné odlišnosti špecifické pre kmeň a/alebo pohlavie v reakcii na LLNA.1.3.2.2 Kontrola spoľahlivostiNa základe pozitívnych kontrol sa dokazuje riadne vykonanie testu a kompetencia laboratória na úspešné vykonanie testu. Pozitívna kontrola má spôsobiť pozitívnu reakciu na LLNA pri úrovni expozície, pri ktorej sa očakáva nárast stimulačného indexu (SI) >3 v porovnaní s negatívnou kontrolnou skupinou. Dávka pozitívnej kontroly sa zvolí tak, aby spôsobila zreteľnú, ale nie nadmernú indukciu. Vhodnými látkami sú 3-fenyl-2-hexylpropanál (č. CAS 101-86-0, č. EINECS 202-983-3) a benzotiazol-2-tiol (č. CAS 149-30-4, č. EINECS 205-736-8). Môžu sa vyskytnúť okolnosti, keď sa v riadne zdôvodnených prípadoch môžu použiť iné kontrolné látky, ktoré spĺňajú horeuvedené kritériá. Hoci sa zvyčajne vyžaduje v každom teste pozitívna kontrolná skupina, môžu sa vyskytnúť situácie, keď testovacie laboratóriá budú mať k dispozícii údaje z predchádzajúcich kontrol na preukázanie konzistencie uspokojivej reakcie v priebehu najmenej šiestich mesiacov alebo v dlhšom období. V týchto situáciách môže byť postačujúce menej časté testovanie s pozitívnymi kontrolami v intervaloch najviac 6 mesiacov. Hoci látka na pozitívnu kontrolu sa má testovať v nosiči, o ktorom je známe, že vyvoláva konzistentnú reakciu (napr. acetón: olivový olej), môžu sa vyskytnúť určité regulačné opatrenia, keď bude potrebné aj testovanie v neštandardnom nosiči (klinicky/chemicky zodpovedajúci prípravok). Za takýchto okolností sa otestuje možná interakcia pozitívnej kontroly s týmto nezvyčajným nosičom.1.3.2.3 Počet zvierat, veľkosť dávky a výber nosičaAspoň štyri zvieratá sa používajú na dávkovú skupinu, aspoň tri koncentrácie testovanej látky, a k tomu negatívna kontrolná skupina, ošetrovaná iba nosičom pre testovanú látku, a prípadne pozitívna kontrola. V tých prípadoch, keď sa majú získať údaje o jednotlivých zvieratách, použije sa aspoň päť zvierat na dávkovú skupinu. S výnimkou absencie ošetrenia s testovanou dávkou sa so zvieratami v kontrolných skupinách zaobchádza rovnakým spôsobom ako so zvieratami v ošetrovaných skupinách a ošetrujú sa rovnakým spôsobom ako zvieratá v ošetrovaných skupinách.Výber dávky a nosiča by mal byť založený na odporúčaniach uvedených v odkaze (1). Dávky sa vyberú z odstupňovaných koncentrácií 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % atď. Existujúce údaje o akútnej toxicite a podráždení kože, ak sú k dispozícii, sa posúdia výberom troch po sebe idúcich koncentrácií tak, aby najvyššia koncentrácia maximalizovala expozíciu, pričom by sa však zabránilo systémovej toxicite a rozsiahlemu lokálnemu podráždeniu kože (2) (11).Nosič sa vyberie tak, aby testované koncentrácie a rozpustnosť boli maximálne, pričom vznikne roztok/suspenzia vhodná na aplikáciu testovanej látky. Odporúčané nosiče, zoradené podľa vhodnosti, sú acetón/olivový olej (4:1 v/v), dimetylformamid, metyletylketón, propylénglykol a dimetylsulfoxid (2) (10), ale môžu sa použiť aj iné, ak sa uvedie uspokojivé zdôvodnenie. V určitých situáciách môže byť potrebné použiť klinicky vhodný roztok alebo komerčný prípravok, v ktorom sa testovaná látka predáva, ako ďalšiu kontrolu. Osobitnú pozornosť je potrebné venovať zabezpečeniu, aby sa hydrofilné materiály zabudovali do systému nosiča, ktorý zvlhčuje pokožku, a rýchlo neunikli. V dôsledku toho je potrebné sa vyhýbať použitiu vodných nosičov.1.3.3 Postup testu1.3.3.1 Priebeh pokusuPriebeh pokusu je takýto:Deň 1:Označte každé zviera a zaznamenajte jeho hmotnosť. Začnite s aplikáciou 25 μl z príslušného zriedenia testovanej látky, samotného nosiča alebo pozitívnej kontroly (podľa potreby) na zadnú stranu každého ucha.Dni 2 a 3:Zopakujte aplikačný postup uskutočnený v deň 1.Dni 4 a 5:Žiadne ošetrenie.Deň 6:Zaznamenajte hmotnosť každého zvieraťa. Podajte injekciou 250 μl fosfátového fyziologického roztoku (PBS) obsahujúceho 20 μCi (7,4e + 8 Bq) 3H-metyltymidínu do všetkých pokusných a kontrolných myší cez chvostovú žilu. Alebo podajte injekciou 250 μl PBS obsahujúceho 2 μCi (7,4e + 7 Bq) 125I-jódodeoxyuridínu a 10-5 M fluorodeoxyuridínu všetkým myšiam cez chvostovú žilu.O päť hodín sa zvieratá usmrtia. Drénované ušné lymfatické uzliny sa odstránia z každého ucha a pooled v PBS pre každú pokusnú skupinu (metóda pooled ošetrovanej skupiny); alebo sa môžu odobrať dvojice lymfatických uzlín z jednotlivých zvierat a pooled v PBS pre každé zviera (metóda jednotlivých zvierat). Údaje a diagramy identifikácie uzlín a disekcii je možné nájsť v prílohe I odkazu 10.1.3.3.2 Príprava bunkových suspenziíJednotlivá suspenzia buniek lymfatických uzlín (BLU) buď z pooled ošetrených skupín alebo bilaterálne z jednotlivých zvierat sa pripravuje jemným mechanickým pretlačením cez nerezové sitko s 200 μm otvormi. Bunky lymfatických uzlín sa dvakrát premyjú v nadbytku PBS a zrážajú s 5 % trichlóroctovou kyselinou (TCA) 18 hod. pri 4 °C (2). Pelety sa buď opätovne suspendujú v 1 ml TCA a prenesú do scintilačných fľaštičiek obsahujúcich 10 ml scintilačnej kvapaliny pre meranie 3H, alebo sa prenesú priamo gamma meracích túb na meranie125I.1.3.3.3 Stanovenie proliferácie buniek (naviazaná rádioaktivita)Naviazanie 3H-metyltymidínu sa meria β-scintilačným meraním ako (dezintegrácia za minútu (DPM). Naviazanie 125I-jododeoxyuridínu sa meria 125I-meraním a tiež sa vyjadruje ako DPM. V závislosti od použitej metódy sa naviazanie vyjadrí ako DPM/ošetrovanú skupinu (pooled metóda) alebo DPM/zviera (metóda jednotlivých zvierat).1.3.3.4 Pozorovania1.3.3.4.1 Klinické vyšetreniaZvieratá sa starostlivo vyšetria jedenkrát denne na všetky klinické príznaky, buď lokálneho podráždenia v mieste aplikácie, alebo systémovej toxicity. Všetky pozorovania sa systematicky zaznamenávajú, pričom každé zviera má individuálny záznam.1.3.3.4.2 Telesné hmotnostiAko je uvedené v časti 1.3.3.1, hmotnosti jednotlivých zvierat by mali zmerať na začiatku testu a pri naplánovanom usmrtení zvierat.1.3.4 Výpočet výsledkovVýsledky sa vyjadrujú ako stimulačný index (SI). Pri použití pooled metódy sa SI získa delením podávania rádioaktívneho začlenenia, pre každú ošetrovanú skupinu začlenením do pooled nosiča kontrolnej skupiny; tým sa získa priemerný SI. Pri použití metódy jednotlivých zvierat sa SI získa vydelením strednej DPM/zviera v rámci každej pokusnej skupiny, ktorej sa podávala testovaná látka, a pozitívnej kontrolnej skupiny pri obsahu DPM/zviera kontrolnej skupiny, ktorej sa podávalo rozpúšťadlo/nosič. Priemerná hodnota SI pre kontroly ošetrované nosičom je potom 1.Použitie metódy jednotlivých zvierat na výpočet SI umožní vykonať štatistickú analýzu údajov. Pri výbere vhodnej metódy štatistickej analýzy by si mal experimentátor uvedomiť možné rozdiely zmien a ostatné súvisiace problémy, ktoré môžu vyžadovať transformáciu údajov alebo neparametrickú štatistickú analýzu. Vhodnou metódou na interpretáciu údajov je vyhodnotenie jednotlivých údajov ošetrovaných a nosičových kontrol a z nich odvodiť najviac zodpovedajúcej krivky reakcie na dávku pri zohľadnení hraníc spoľahlivosti (8) (12) (13). Experimentátor si však musí dávať pozor na možné "hraničné" reakcie v prípade jednotlivých zvierat v skupine, na základe ktorých môže vzniknúť potreba použiť alternatívne meranie reakcie (napr. medián skôr ako stredná hodnota) alebo elimináciu hraníc.Rozhodovací proces, pokiaľ ide o pozitívnu reakciu, zahrnuje stimulačný index ≥ 3 spolu s posúdením reakcie na dávku a v prípade potreby štatistickú významnosť (3) (6) (8) (12) (14).Ak je potrebné vysvetliť získané výsledky, mala by sa venovať pozornosť rôznym vlastnostiam testovanej látky vrátane toho, či má štrukturálny vzťah k látkam so známymi senzibilizátormi, či spôsobuje nadmerné podráždenie kože a charakter pozorovanej reakcie na dávku. Tieto a ostatné hľadiská sa podrobne rozoberajú na inom mieste (7).2. ÚDAJEÚdaje by sa mali zhrnúť v podobe tabuliek, kde sa uvedú stredné a individuálne DMP hodnoty a stimulačné indexy pre každú dávkovú skupinu (vrátane kontrolnej skupiny, ktorej sa podával nosič).3. PODÁVANIE SPRÁV3.1 SPRÁVA O TESTESpráva o teste by mala obsahovať tieto informácie:Testovaná látka:- identifikačné údaje (napr. číslo CAS, ak je k dispozícii; zdroj; čistota; známe nečistoty; číslo šarže);- fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. prchavosť, stabilita, rozpustnosť);- v prípade zmesi, zloženie a vzájomný percentuálny podiel zložiek.Nosič:- identifikačné údaje [čistota; koncentrácia (v prípade potreby), použitý objem];- zdôvodnenie výberu nosiča.Pokusné zvieratá:- použitý kmeň myší;- mikrobiologický stav zvierat, ak je známy;- zdroj zvierat, podmienky umiestnenia, krmivo atď.;- počet, vek a pohlavie zvierat;Podmienky testu:- informácie o príprave testovanej látky a aplikácii;- zdôvodnenie výberu dávky, vrátane výsledkov zo štúdie na zistenie rozsahu dávkovania, ak sa uskutočnila; použité koncentrácie nosiča a testovanej látky a celkové množstvo aplikovanej látky;- údaje o kvalite krmiva a vody (vrátane druhu krmiva/zdroja, zdroja vody).Kontrola spoľahlivosti:- zhrnutie výsledkov poslednej kontroly spoľahlivosti vrátane informácií o použitej látke, koncentrácii a nosiči;- paralelné a/alebo predchádzajúce pozitívne a negatívne kontrolné údaje pre testovacie laboratórium.Výsledky:- hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku podávania látky a pri naplánovanom usmrtení;- tabuľka stredných (pooled metóda) a jednotlivých (metóda jednotlivých zvierat) DPM hodnôt, ako aj rozsah hodnôt pre obe metódy a stimulačné indexy pre každú dávkovú (vrátane kontrolnej skupiny, ktorej sa podával nosič) skupinu;- štatistická analýza v prípade potreby;- časový priebeh nástupu a príznakov toxicity, vrátane podráždenia kože na mieste podania, ak sa vyskytne, pre každé zviera.Diskusia k výsledkom:- Stručný komentár k výsledkom, analýza reakcie na dávku a štatistické analýzy v prípade potreby so záverom, pokiaľ ide o to, či sa testovaná látka má pokladať za senzibilizátor kože.4. ODKAZY(1) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology 30, 165-169.(2) Kimber, I, Derman, R.J., Scholes E.W, and Basketter, D.A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, 13-31.(3) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, 563-79.(4) Testovacia metóda B.6.(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food and Chemical Toxicology, 34, 999-1002.(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E (1996). The local lymph node assay- A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, 985-997.(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, 327-33.(8) Van Och, F.M.M, Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49-59.(9) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281-4.(10) National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).(11) Testovacia metóda B.4.(12) Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W. Lees, D. Kimber, I. and Botham, P.A. (1993) Results with OECD recommended positive control sensitisers in the maximisation, Buehler and local lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63-67.(13) Basketter D.A., Lea L.J., Dickens A., Briggs D., Pate I., Dearman R.J., Kimber I. (1999). A comparison of statistical approaches to the derivation of EC3 values from local lymph node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, 261-266.(14) Basketter DA, Blaikie L, Derman RJ, Kimber I, Ryan CA, Gerberick GF, Harvey P, Evans P, White IR and Rycroft RTG (2000). Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis 42, 344-48.B.43. ŠTÚDIA NEUROTOXICITY U HLODAVCOV1. METÓDATáto metóda je rovnocenná s OECD TG 424 (1997).Táto testovacia metóda bola vyvinutá na získanie informácií, ktoré sú potrebné na potvrdenie potenciálnej neurotoxicity chemikálií u dospelých zvierat alebo jej ďalšiu charakterizáciu. Môže sa buď kombinovať s existujúcimi testovacími metódami pre štúdie toxicity pri opakovanej dávke, alebo sa môže vykonať ako samostatná štúdia. Pri plánovaní štúdií, ktoré sú založené na tejto testovacej metóde, sa odporúča, aby sa na pomoc nahliadlo do OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Methods (1). Toto je dôležité najmä, keď sa zvažujú modifikácie vyšetrení a testovacích postupov odporúčaných pre bežné používanie tejto metódy. The Guidance Document bol pripravený, aby uľahčil výber iných testovacích postupov na použitie za špecifických podmienok. Posúdenie vývojovej neurotoxicity nie je predmetom tejto metódy.1.1 ÚVODPri posudzovaní a hodnotení toxických vlastností chemikálií je dôležité posúdiť potenciál vyvolať neurotoxické účinky. Práve testovacia metóda pre systémovú toxicitu pri opakovanej dávke zahrnuje vyšetrenia, ktoré skúmajú potenciálnu neurotoxicitu. Táto testovacia metóda sa môže použiť na zostavenie štúdie, ktorou sa získajú alebo potvrdia ďalšie informácie o neurotoxických účinkoch v štúdiách systémovej toxicity pri opakovanej dávke. Posúdenie potenciálnej neurotoxicity určitých tried chemikálií by však mohlo viesť k tomu, že sa môžu lepšie posudzovať s použitím tejto metódy bez predchádzajúcej indikácie potenciálnej neurotoxicity zo štúdií systémovej toxicity pri opakovanej dávke. Takéto posudzovanie zahrnuje napríklad:pozorovanie neurologických príznakov alebo neuropatologických lézií v iných štúdiách toxicity ako sú štúdie systémovej toxicity pri opakovanej dávke, aleboštrukturálnu príbuznosť alebo iné informácie, ktoré ich spájajú so známymi neurotoxikantami.Okrem toho sa môžu vyskytnúť aj iné príklady, keď je vhodné použitie tejto testovacej metódy; ďalšie informácie pozri v odkaze (1).Táto metóda bola vyvinutá tak, aby sa dala prispôsobiť osobitným potrebám na potvrdenie špecifickej histopatologickej a behaviorálnej neurotoxicity chemikálie, ako aj na umožnenie charakterizácie a kvantifikácie neurotoxických reakcií.V minulosti sa neurotoxicita stotožňovala s neuropatiou, ktorá zahrnuje neuropatologické lézie alebo neurologické dysfunkcie, ako sú záchvat, paralýza alebo triaška. Aj keď neuropatia je dôležitým prejavom neurotoxicity, teraz je zrejmé, že existuje mnoho ďalších príznakov nervovej systémovej toxicity (napr. strata motorickej koordinácie, senzorické deficity, dysfunkcie týkajúce sa schopnosti sa učiť a pamäte), ktoré sa nemôžu prejaviť v štúdiách neuropatie alebo iných typoch štúdií.Táto testovacia metóda na dôkaz neurotoxicity je vyvinutá na stanovenie hlavných neurobehaviorálnych a neuropatologických účinkov u dospelých hlodavcov. Hoci účinky na správanie, aj keď pri neprítomnosti morfologických zmien, môžu odrážať nepriaznivý vplyv na organizmus, nie všetky zmeny v správania sú špecifické pre nervový systém. Preto je potrebné všetky pozorované zmeny hodnotiť v súvislosti s korelačnými histopatologickými, hematologickými alebo biochemickými údajmi, ako aj údajmi o iných typoch systémovej toxicity. Testovanie uvádzané v tejto metóde na umožnenie charakterizácie a kvantifikácie neurotoxických reakcií zahrnuje špecifické histopatologické a behaviorálne postupy, ktoré sa môžu ďalej opierať o elektrofyziologické a/alebo biochemické vyšetrenia (1) (2) (3) (4).Neurotoxikanty môžu pôsobiť na množstvo cieľov v nervovom systéme a rozličnými mechanizmami. Keďže žiadny samostatný súbor testov nie je schopný dôkladne posúdiť neurotoxický potenciál všetkých látok, môže byť potrebné využiť iné in vivo alebo in vitro testy, ktoré sú špecifické pre zistený alebo predpokladaný typ neurotoxicity.Táto testovacia metóda sa môže tiež použiť v spojení s usmernením uvedeným v OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Methods (1) na zostavenie štúdií určených na ďalšiu charakterizáciu alebo zvýšenie citlivosti kvantifikácie reakcie na dávku, na lepšie stanovenie hladiny bez pozorovaného nepriaznivého účinku alebo na dokázanie známych alebo podozrivých rizík chemikálie. Napríklad sa môžu zostaviť štúdie na identifikáciu a posúdenie neurotoxického(-ých) mechanizmu(-ov) alebo na doplnenie údajov, ktoré sú už k dispozícii z použitých základných neurobehaviorálnych a neuropatologických vyšetrovacích postupov. Takéto štúdie nevyžadujú opakované údaje, ktoré by sa získali na základe použitia štandardných postupov odporúčaných v tejto metóde, ak sú už takéto údaje k dispozícii a nepokladajú sa za potrebné pre interpretáciu výsledkov štúdie.Táto štúdia neurotoxicity, použitá samostatne alebo v kombinácii, poskytuje informácie, ktoré môžu:identifikovať, či nervový systém je permanentne alebo reverzibilne ovplyvnený testovanou chemikáliou;prispieť ku charakterizácii zmien nervového systému spojených s vystavením sa pôsobeniu chemikálie a k pochopeniu príslušného mechanizmu.určiť vzťahy medzi dávkou a reakciou v závislosti od času na stanovenie hladiny bez pozorovaného nepriaznivého účinku (ktorá sa môže použiť na stanovenie bezpečnostných kritérií pre chemikáliu).Pri tejto metóde testovania sa testovaná látka podáva orálne. Iné cesty podávania (napr. dermálna alebo inhalačná) môžu byť vhodnejšie a môžu vyžadovať úpravu odporúčaných postupov. Rozhodnutie o tom akou cestou sa látka bude podávať závisí na profile expozície ľudí a na dostupných toxikologických alebo kinetických informáciách.1.2 DEFINÍCIENepriaznivý účinok: každá zmena v súvislosti s ošetrením od normálneho stavu, ktorá znižuje schopnosť organizmu prežiť, reprodukovať sa alebo prispôsobiť sa prostrediu.Dávka: je množstvo podanej testovanej látky. Dávka sa vyjadruje ako hmotnosť (g, mg) alebo ako hmotnosť testovanej látky na jednotku hmotnosti testovaného zvieraťa (napr. mg/kg) alebo ako konštantné koncentrácie v krmive (ppm).Dávkovanie: je všeobecný termín zahrnujúci podávanie látky, jej frekvenciu a trvanie podávania dávok.Neurotoxicita: nepriaznivá zmena v štruktúre alebo funkcii nervového systému, ktorá vzniká v dôsledku vystavenia chemickému, biologickému alebo fyzikálnemu činiteľu.Neurotoxikant: je každý chemický, biologický alebo fyzikálny činiteľ, ktorý môže spôsobiť neurotoxicitu.NOAEL: je skratka pre hladinu bez pozorovaného nepriaznivého účinku a je to najvyššia dávka, pri ktorej sa nepozorujú žiadne nepriaznivé zistenia v súvislosti s ošetrením.1.3 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDYTestovaná chemikália sa podáva orálnou cestou v rade dávok niekoľkým skupinám laboratórnych hlodavcov. Zvyčajne sa vyžadujú opakované dávky a režim podávania dávok môže byť 28 dní, pre subchronickú (90 dní) alebo chronickú toxicitu (1 rok alebo viac). Postupy uvedené v tejto testovacej metóde sa môžu použiť aj pre štúdiu akútnej neurotoxicity. Zvieratá sa testujú na umožnenie detekcie alebo charakterizácie behaviorálnych a/alebo neurologických abnormalít. V priebehu každého obdobia pozorovania sa hodnotí rozsah behaviorálnych aspektov, ktoré by mohli byť ovplyvnené neurotoxikantami. Na konci testu sa časť zvierat každého pohlavia z každej skupiny pomocou perfúzie fixuje in situ a rezy tkaniva mozgu, miechy a periferálnych nervov sa pripravia a vyšetria.Keď sa štúdia uskutočňuje ako samostatná štúdia na zistenie neurotoxicity alebo na charakterizáciu neurotoxických účinkov, zvieratá v každej skupine, ktoré sa nepoužili na perfúziu a následnú histopatológiu (pozri tabuľku 1), sa môžu použiť na špecifické neurobehaviorálne, neuropatologické, neurochemické alebo elektrofyziologické postupy, ktoré môžu doplniť údaje získané pri štandardných vyšetreniach vyžadovaných touto metódou (1). Tieto dodatočné postupy môžu byť osobitne užitočné, keď empirické pozorovania alebo očakávané účinky indikujú špecifický typ alebo cieľové tkanivo v prípade neurotoxicity spôsobenej chemikáliou. Alternatívne sa môžu zvyšné zvieratá použiť na také hodnotenie, ako sa vyžaduje v testovacích metódach pre štúdie toxicity pri opakovanej dávke u hlodavcov.Ak sa postupy tejto testovacej metódy kombinujú s postupmi iných testovacích metód, je potrebný dostatočný počet zvierat na splnenie požiadaviek pre vyšetrenia v oboch štúdiách.1.4 OPIS TESTOVACEJ METÓDY1.4.1 Výber druhu zvieratSpomedzi druhov hlodavcov sa prednostne používa potkan, aj keď je možné použiť aj iný druh hlodavca. Použijú sa mladé dospelé zdravé zvieratá bežne používaných laboratórnych kmeňov. Samice by mali byť panenské a negravidné. Dávkovanie by sa malo začať čo najskôr po odstavení, pokiaľ možno nie neskôr ako vo veku šesť týždňov, a v každom prípade pred dosiahnutím deviatich týždňov. Keď sa však táto štúdia kombinuje s inými štúdiami, môže byť potrebné túto vekovú požiadavku upraviť. Na začiatku štúdie rozdiel medzi hmotnosťami použitých zvierat nemá byť vyšší ako ± 20 % priemernej hmotnosti každého pohlavia. Keď sa uskutoční predbežná krátkodobá štúdia pri opakovaných dávkach pred uskutočnením dlhodobej štúdie, je potrebné v oboch štúdiách použiť zvieratá z rovnakého kmeňa a zdroja.1.4.2 Podmienky pre umiestnenie a kŕmenieTeplota v miestnosti pre pokusné zvieratá by mala byť 22 °C (± 3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť by mala byť aspoň 30 %, a pokiaľ možno, nemala by prevyšovať 70 %, okrem obdobia počas čistenia miestnosti by mala dosahovať 50-60 %. Osvetlenie by malo byť umelé, v rytme 12 hodín svetlo, 12 hodín tma. Je potrebné obmedziť na minimum krátkodobý silný hluk. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej látky, keď sa podáva týmto spôsobom. Zvieratá môžu byť umiestnené jednotlivo alebo v malých skupinách rovnakého pohlavia v klietkach.1.4.3 Príprava zvieratZdravé mladé zvieratá sa náhodne rozdelia do ošetrovanej a kontrolnej skupiny. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy kvôli umiestneniu klietok. Zvieratá sa jednoznačne označia a držia vo svojich klietkach aspoň (5) päť dní pred začiatkom štúdie, aby sa aklimatizovali na laboratórne podmienky.1.4.4 Cesta podávania a príprava dávokPri tejto metóde testovania sa testovaná látka podáva výlučne orálne. Orálne podávanie môže byť cez sondu, v krmive, v pitnej vode alebo kapsulami. Iné cesty podávania (napr. dermálna alebo inhalačná) sa môžu použiť, ale môže byť potrebné upraviť odporúčané postupy. Rozhodnutie o tom akou cestou sa látka bude podávať závisí na profile expozície ľudí a dostupných toxikologických alebo kinetických informáciách. Je potrebné uviesť zdôvodnenie výberu cesty podávania, ako aj výsledné modifikácie postupov tejto testovacej metódy.V prípade potreby sa testovaná látka môže rozpustiť alebo rozptýliť vo vhodnom nosiči. Odporúča sa, aby sa najskôr zvážilo použitie vodného roztoku/suspenzie, potom roztoku/suspenzie v oleji (napr. kukuričný olej) a nakoniec prípadného roztoku/suspenzie v inom nosiči. Toxické vlastnosti nosiča musia byť známe. Okrem toho je potrebné venovať pozornosť týmto charakteristikám nosiča: vplyv nosiča na absorpciu, distribúciu, metabolizmus alebo retenciu testovanej látky, ktoré môžu zmeniť jej toxické vlastnosti; a vplyv na spotrebu potravy alebo vody alebo nutričný stav zvierat.1.5 POSTUPY1.5.1 Počet a pohlavie zvieratKeď sa štúdia uskutočňuje ako samostatná štúdia, je potrebné použiť aspoň 20 zvierat (10 samíc a 10 samcov) v každej dávkovej a kontrolnej skupine na vyhodnotenie klinických a funkčných vyšetrení. Aspoň päť samcov a päť samíc, vybratých z týchto 10 samcov a 10 samíc, sa pomocou perfúzie fixuje in situ a použije na podrobnú neurohistopatológiu na konci štúdie. V prípade, keď sa iba obmedzený počet zvierat v danej dávkovej skupine vyšetrí na príznaky neurotoxických účinkov, je potrebné venovať pozornosť tomu, aby sa tieto zvieratá zahrnuli k tým, ktoré boli vybraté na perfúziu. Ak sa štúdia uskutočňuje v kombinácii so štúdiou toxicity pri opakovanej dávke, použijú sa vhodné počty zvierat, aby zodpovedali cieľom oboch štúdií. Minimálny počet zvierat na skupinu pre rôzne kombinácie štúdií je uvedený v tabuľke 1. Ak sa po ošetrení plánuje predčasné usmrtenie, alebo sa plánujú skupiny na regeneráciu, aby sa pozorovala reverzibilita, pretrvávanie alebo oneskorený výskyt toxických účinkov, alebo keď sa zvažujú dodatočné vyšetrenia, potom by sa počet zvierat mal zvýšiť, aby sa zabezpečilo, že je k dispozícii potrebný počet zvierat na vyšetrenie a histopatológiu.1.5.2 Ošetrovaná a kontrolná skupinaZvyčajne sa použijú aspoň tri dávkové skupiny a kontrolná skupina, ale ak sa na základe hodnotenia ďalších údajov neočakávajú žiadne účinky pri opakovanej dávke 1000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň, môže sa vykonať limitný test. Ak nie sú k dispozícii vhodné údaje, môže sa vykonať štúdia na zistenie rozsahu dávkovania, aby umožnila stanoviť dávky, ktoré sa majú použiť. Okrem ošetrenia s testovanou látkou sa zvieratá v kontrolnej skupine ošetria rovnakým spôsobom ako zvieratá v pokusnej skupine. Ak sa používa nosič pri podávaní testovanej látky, kontrolná skupina dostane nosič v najvyššom používanom objeme.1.5.3 Kontrola spoľahlivostiLaboratórium, ktoré vykonáva štúdiu, predloží údaje, ktoré dokazujú jeho spôsobilosť vykonať túto štúdiu a citlivosť použitých postupov. Takéto údaje poskytnú dôkaz schopnosti zisťovať a kvantifikovať podľa potreby zmeny v rozličných konečných bodoch, odporúčaných pre pozorovanie, ako napr. autonómne príznaky, senzorická reaktivita, sila uchopenia končatín a motorická aktivita. Informácie o chemikáliách, ktoré spôsobujú rôzne typy neurotoxických reakcií a ktoré by sa mohli použiť ako pozitívne kontrolné látky je možné nájsť v odkazoch 2 až 9. Môžu sa použiť predchádzajúce údaje, ak základné aspekty experimentálnych postupov zostávajú rovnaké. Odporúča sa pravidelná aktualizácia predchádzajúcich údajov. Ak vykonávacie laboratórium zmenilo určitý základný prvok pri uskutočňovaní testu alebo postupov, je potrebné zistiť nové údaje potvrdzujúce nezmenenú citlivosť postupov.1.5.4 Výber dávkyVeľkosti dávok sa zvolia na základe posúdenia každej už zistenej toxicity a dostupných kinetických údajov pre testovanú látku alebo príbuzné materiály. Najvyššia dávka sa zvolí s cieľom vyvolať neurotoxické účinky alebo jasné účinky systémovej toxicity. Potom sa klesajúca postupnosť hladín dávok zvolí tak, aby sa preukázala každá reakcia súvisiaca s dávkou a najnižšia hladina bez pozorovaného nepriaznivého účinku (NOAEL). V zásade sa hladiny dávok stanovia tak, aby sa primárne toxické účinky na nervový systém dali odlíšiť od účinkov súvisiacich so systémovou toxicitou. Intervaly dávkovania s faktorom dva až tri sú často optimálne a pridanie štvrtej pokusnej skupiny je často vhodnejšie ako používanie veľmi veľkých intervalov (napr. viac ako faktor 10) medzi dávkami. Ak existuje realistický odhad expozície ľudí, tiež sa zohľadní.1.5.5 Limitný testAk sa na základe štúdie s jednou dávkou aspoň 1000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň s použitím postupov, uvedených pre túto štúdiu, nezistia žiadne pozorovateľné neurotoxické účinky a ak sa neočakáva toxicita na základe údajov o štrukturálne príbuzných látkach, potom sa môže upustiť od úplnej štúdie s použitím troch dávok. Z očakávanej expozície ľudí môže vyplývať potreba, aby sa v limitnom teste použili vyššie orálne dávky. V prípade iných druhov podávania, ako je napr. inhalácia alebo dermálna aplikácia, fyzikálno-chemické vlastností testovanej látky často môžu určovať maximálnu prípustnú úroveň expozície. Pre uskutočnenie orálnej akútnej štúdie má byť dávka pre limitný test minimálne 2000 mg/kg.1.5.6 Podávanie dávokZvieratám sa podáva testovaná dávka každý deň, 7 dní v týždni počas obdobia minimálne 28 dní; použitie päťdňového režimu dávkovania alebo kratšiu dobu expozície je potrebné zdôvodniť. Ak sa testovaná látka podáva cez sondu, podáva sa ako jednorazová dávka s použitím žalúdočnej sondy alebo vhodnej intubačnej kanyly. Maximálny objem kvapaliny, ktorý sa môže jednorázovo podať závisí od veľkosti pokusných zvierat. Objem nebude vyšší ako 1 ml/100 g telesnej hmotnosti. V prípade vodných roztokov sa však môže uvážiť použitie do 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. S výnimkou dráždivých alebo žieravých látok, ktoré zvyčajne pri vyšších koncentráciách spôsobia zhoršenie účinkov, variabilita v aplikovanom objeme sa minimalizuje tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpečil stály objem vo všetkých dávkach.Pre látky podávané v potrave alebo pitnej vode je dôležité zabezpečiť, aby množstvá použitej testovanej látky neinterferovali s normálnou výživovou a vodnou bilanciou. Keď sa testovaná látka podáva v krmive, môže sa použiť buď stála koncentrácia v krmive (ppm) alebo stála veľkosť dávky vzhľadom na telesnú hmotnosť zvieraťa; iné možnosti sa musia špecifikovať. V prípade, keď sa látka podáva sondou, látka sa podáva približne v rovnaký čas každý deň a prispôsobí sa podľa potreby, aby sa zachovala stála veľkosť dávky vzhľadom na telesnú hmotnosť. Ak sa uskutoční predbežná štúdia pri opakovaných dávkach pred uskutočnením dlhodobej štúdie, je potrebné v oboch štúdiách použiť podobné krmivo. V prípade akútnych štúdií, keď nie je možná jednorazová dávka, sa dávka môže podávať v menších množstvách v priebehu maximálne 24 hodín.1.6 POZOROVANIE1.6.1 Frekvencia vyšetrení a testyV štúdiách pri opakovaných dávkach vymedzený čas pozorovania pokrýva obdobie dávkovania. V štúdiách akútnej toxicity sa sleduje 14-denné obdobie po ošetrení. V prípade zvierat vo vedľajších skupinách, ktoré sa držia bez expozície počas obdobia po ošetrení, vymedzený čas pozorovania pokrýva aj toto obdobie.Vyšetrenia sa uskutočnia dostatočne často, aby sa dosiahla maximálna pravdepodobnosť zistenia všetkých behaviorálnych a/alebo neurologických abnormalít. Vyšetrenia sa uskutočnia pokiaľ možno v rovnaký čas každý deň pri zohľadnení obdobia, keď sa predpokladajú maximálne účinky po dávkovaní. Frekvencia klinických vyšetrení a funkčných testov je zosumarizovaná v tabuľke 2. Ak z kinetických alebo iných údajov z predchádzajúcich štúdií vyplýva potreba použiť odlišné časové body pre vyšetrenia, testy alebo obdobia po vyšetrení, prijme sa alternatívny harmonogram, aby sa získalo maximálne množstvo informácií. Uvedie sa zdôvodnenie zmien harmonogramu.1.6.1.1 Pozorovania všeobecného zdravotného stavu a mortality/morbidityZdravotný stav všetkých zvierat sa pozorne vyšetrí aspoň raz denne, morbidita a mortalita sa zisťuje aspoň dvakrát denne.1.6.1.2 Podrobné klinické vyšetreniaVšetky zvieratá vybraté na tento účel sa podrobne klinicky vyšetria (pozri tabuľku 1), jedenkrát pred prvou expozíciou (na umožnenie porovnaní medzi pokusnými zvieratami) a potom v rôznych intervaloch v závislosti na trvaní štúdie (pozri tabuľku 2). Podrobné klinické vyšetrenia vedľajších skupín na regeneráciu sa vykonajú na konci obdobia regenerácie. Podrobné klinické vyšetrenia sa vykonajú mimo domácej klietky v zvyčajnej vyšetrovacej miestnosti. Starostlivo sa zaznamenajú s použitím systému hodnotenia, ktorý zahrnuje kritériá alebo stupnicu hodnotenia pre každé meranie pri vyšetreniach. Použité kritériá alebo stupnice explicitne definuje testovacie laboratórium. Je potrebné vynaložiť úsilie na zabezpečenie, aby zmeny testovacích podmienok boli minimálne (nie systematicky súvisiace s ošetrením) a aby pozorovania vykonávali vyškolení pracovníci, ktorí nie sú oboznámení o prebiehajúcom ošetrení.Odporúča sa, aby sa pozorovania vykonávali štruktúrovanej podobe, pri ktorej sa presne definované kritéria (vrátane definície normálneho "rozsahu") systematicky uplatňujú na každé zviera v každom čase pozorovania. "Normálny rozsah" sa príslušne zdokumentuje. Všetky pozorované príznaky sa zaznamenajú. Vždy, keď je to možné, zaznamená sa aj závažnosť pozorovaných príznakov. Klinicky sa pozorujú okrem iného zmeny na koži, srsti, očiach, slizniciach, výskyt sekrétov a exkrétov a autonómnu aktivitu (napr. slzenie, zježenie, veľkosť zreničky, nezvyčajný priebeh dýchania a/alebo dýchanie ústami, všetky nezvyčajné príznaky pri močení alebo vyprázdňovaní a bezfarebný moč).Všetky nezvyčajné reakcie, pokiaľ ide o polohu tela, stupeň aktivity (napr. zvýšený alebo znížený záujem o preskúmanie zvyčajného priestoru) a koordinácia pohybu, sa tiež zaznamenajú. Zmeny chôdze (napr. tackavá chôdza, ataxia), poloha (napr. zhrbená) a reaktivita na zaobchádzanie, premiestnenie alebo iné podnety z prostredia, ako aj výskyt klonických alebo tonických pohybov, kŕče alebo triaška, stereotypy (napr. nadmerná starostlivosť o srsť, nezvyčajné pohyby hlavou, opakovaný beh dokola) alebo zvláštne správanie (napr. hryzenie alebo nadmerné olizovanie, sebamrzačenie, chôdza dozadu, vydávanie zvukov) alebo agresia sa zaznamenajú.1.6.1.3 Funkčné testyPodobne ako pri podrobných klinických pozorovania, uskutočnia sa funkčné testy raz pred expozíciou a opakovane potom u všetkých zvierat, vybratých na tento účel (pozri tabuľku 1). Frekvencia funkčných testov závisí aj od trvania štúdie (pozri tabuľku 2). Okrem období pozorovania, ako je uvedené v tabuľke 2, sa vykonajú funkčné vyšetrenia vedľajších regenerujúcich skupín čo možno najbližšie k času konečného usmrtenia. Funkčné testy by mali zahrnovať senzorickú reaktivitu na rôznorodé podnety [napr. sluchové, vizuálne a proprioceptívne podnety (5) (6) (7)], hodnotenie sily uchopenia končatín (8) a hodnotenie motorickej aktivity (9). Motorická aktivita sa zmeria automatickým prístrojom, ktorým je možné stanoviť poklesy aj nárasty aktivity. Ak sa použije iný definovaný systém, je potrebné, aby bol kvantitatívny a jeho citlivosť a spoľahlivosť preukázaná. Každý prístroj by mal byť testovaný, aby sa zaručila dlhodobá spoľahlivosť a porovnateľnosť prístrojov. Ďalšie údaje o postupoch, ktoré je možné použiť, sú uvedené v príslušných odkazoch. Ak neexistujú žiadne údaje (napr. štrukturálna aktivita, epidemiologické údaje, iné toxikologické štúdie), z ktorých by vyplývali potenciálne neurotoxické účinky, je potrebné zvážiť zahrnutie špecializovanejších testov citlivosti a motorickej funkcie alebo schopnosti učiť sa a pamätať si na podrobnejšie preskúmanie týchto možných účinkov. Viac informácií o špecializovanejších testoch a ich používaní sa nachádza v odkaze (1).Vo výnimočných prípadoch sa zvieratá, ktoré vykazujú príznaky toxicity v miere, ktorá by mohla významne ovplyvniť funkčný test, môžu vylúčiť z takého testu. Uvedie sa zdôvodnenie v prípade vylúčenia zvierat z funkčného testu.1.6.2 Telesná hmotnosť a spotreba potravy/vodyPri štúdiách s trvaním do 90 dní by sa všetky zvieratá mali odvážiť aspoň raz za týždeň a spotreba potravy (spotreba vody, keď sa testovaná látka podáva cez toto médium) by sa mala zmerať aspoň raz za týždeň. Pri dlhodobých štúdiách by sa všetky zvieratá mali odvážiť aspoň raz za týždeň v prvých 13 týždňoch a potom aspoň raz za každé 4 týždne. Spotreba potravy (spotreba vody, keď sa testovaná látka podáva cez toto médium) by sa mala zmerať aspoň raz za týždeň v prvých 13 týždňoch a potom približne v trojmesačných intervaloch, pokiaľ sa nevyžaduje inak na základe zdravotného stavu alebo telesnej hmotnosti.1.6.3 OftalmológiaPri štúdiách, ktoré trvajú viac ako 28 dní, sa oftalmologicky vyšetria s použitím oftalmoskopu, alebo porovnateľného prístroja, pred podaním testovanej látky a pri ukončení štúdie pokiaľ možno všetky zvieratá alebo aspoň zvieratá v skupinách s vysokými dávkami a kontrolných skupinách. Ak sa zistia zmeny na očiach, alebo ak je to potrebné na základe klinických príznakov, vyšetria sa všetky zvieratá. Pri dlhodobých štúdiách sa oftalmologické vyšetrenie vykoná aj po 13 týždňoch. Oftalomologické vyšetrenia nie je potrebné vykonať, ak sú už tieto údaje dostupné z iných štúdií, ktoré majú podobné trvanie a podobné veľkosti dávok.1.6.4 Hematológia a klinická biochémiaAk sa štúdia neurotoxicity uskutočňuje v kombinácii so štúdiou systémovej toxicity pri opakovanej dávke, vykonajú sa hematologické a klinicko- biochemické vyšetrenia, ako je uvedené v príslušnej metóde štúdie systémovej toxicity. Vzorky sa získajú tak, aby sa minimalizovali akékoľvek prípadné účinky na neurologické správanie.1.6.5 HistopatológiaNeuropatologické vyšetrenie sa zameria na doplnenie a rozšírenie pozorovaní uskutočnených počas in vivo fázy štúdie. Tkanivá od aspoň 5 zvierat/pohlavie/skupinu (pozri tabuľku 1 a ďalší odsek) sa fixujú in situ s použitím všeobecne uznaných perfúznych a fixačných techník (pozri odkaz 3, kapitola 5 a odkaz 4, kapitola 50). Všetky viditeľné makroskopické zmeny sa zaznamenávajú. Keď sa štúdia uskutoční ako samostatná štúdia na zistenie neurotoxicity alebo na charakterizáciu neurotoxických účinkov, zvyšné zvieratá sa môžu použiť buď na špecifické neurobehaviorálne (10) (11), neuropatologické (10) (11) (12) (13), neurochemické (10) (11) (14) (15) alebo elektrofyziologické (10) (11) (16) (17) vyšetrenia, ktoré môžu doplniť postupy a vyšetrenia uvedené v tomto materiáli, alebo na zvýšenie počtu histopatologicky vyšetrených jedincov. Tieto dodatočné postupy môžu byť osobitne užitočné, keď empirické pozorovania alebo očakávané účinky indikujú špecifický typ alebo cieľové tkanivo v prípade neurotoxicity (2) (3). Podobe sa zvyšné zvieratá môžu použiť aj na bežné patologické hodnotenia, ako je uvedené v metóde pre štúdie pri opakovaných dávkach.Všetky vzorky tkanív zaliate v parafíne sa zafarbia zvyčajnou metódou, ako je hematoxylín a eozín (H&E), a mikroskopicky vyšetria. Ak sa zistia alebo predpokladajú príznaky periferálnej neuropatie, vyšetria sa vzorky periferálnych nervov zaliate v umelej hmote. Klinické príznaky môžu tiež poukázať na ďalšie miesta, ktoré je potrebné vyšetriť, alebo na použitie špeciálneho postupu farbenia. Usmernenie o ďalších miestach, ktoré je potrebné vyšetriť, je možné nájsť v odkazoch (3) (4). Vhodné špeciálne farbivá na dôkaz špecifických typov patologických zmien môžu byť tiež užitočné (18).Reprezentatívne rezy tkanív centrálneho a periferálneho nervového systému sa histologicky vyšetria (pozri odkaz 3, kapitola 5 a odkaz 4, kapitola 50). Zvyčajne sa vyšetria tieto oblasti: predný mozog, stred veľkého mozgu vrátane rezu cez hipokampus, stredný mozog, malý mozog, most, predĺžená miecha, oko s očným nervom a sietnica, zväčšenie miechy na krčných a bedrových častiach, chrbtové koreňové uzliny, tkanivá chrbtové a dutiny, proximálny sedací nerv, proximálny tibiálny nerv (na kolene) a tibiálne vetvy nervu lýtkového svalu. Rezy tkanív miechy a periferálnych nervov budú obsahovať ako krížové, tak aj priečne a pozdĺžne rezy. Je potrebné venovať pozornosť cievnatosti nervového systému. Vzorka kostrového svalu, predovšetkým lýtkového svalu sa tiež vyšetrí. Osobitnú pozornosť je potrebné venovať oblastiam s bunkovou a vláknitou štruktúrou a vzorke v CNS a PNS, o ktorých je známe, že sú osobitne náchylné na neurotoxikanty.Poznámky o neuropatologických zmenách, ktoré sú typické na základe expozície toxickej látky, je možné nájsť v odkazoch (3) (4). Odporúča sa postupné vyšetrenie vzoriek tkanív, pri ktorých sa rezy zo skupiny s vysokou dávkou najskôr porovnajú s rezmi z kontrolnej skupiny. Ak sa nezistia žiadne neuropatologické zmeny vo vzorkách z týchto skupín, nie je potrebná ďalšia analýza. Ak sa neuropatologické zmeny zistia v skupine s vysokou dávkou, vzorka z každého potenciálne zasiahnutého tkaniva zo skupín so strednými a nízkymi dávkami sa potom zakóduje a následne vyšetrí.Ak sa zistí akýkoľvek dôkaz neuropatologických zmien pri kvalitatívnom vyšetrení, vykoná sa druhé vyšetrenie všetkých oblastí nervového systému, kde sa tieto zmeny vyskytnú. Rezy zo všetkých dávkových skupín zo všetkých potenciálne zasiahnutých oblastí sa zakódujú a náhodne vyšetria bez informácií o kóde. Zaznamená sa frekvencia a závažnosť každého poškodenia. Po posúdení všetkých oblastí zo všetkých dávkových skupín sa môže kódovanie zrušiť a môže sa vykonať štatistická analýza na vyhodnotenie vzťahov medzi dávkou a reakciou. Je potrebné opísať príklady rôznych stupňov závažnosti každého poškodenia.Neuropatologické zistenia by sa mali vyhodnocovať v súvislosti s pozorovaniami a meraniami správania, ako aj s inými údajmi z predchádzajúcich a súčasných štúdií systémovej toxicity testovanej látky.2. ÚDAJE2.1 SPRACOVANIE VÝSLEDKOVJe potrebné uviesť jednotlivé údaje. Okrem toho by sa všetky údaje mali zhrnuť v podobe tabuliek, kde sa uvedie pre každú pokusnú a kontrolnú skupinu počet zvierat na začiatku testu, počet zvierat, ktoré sa našli uhynuté počas testu, alebo sa usmrtili z humánnych dôvodov, čas každého uhynutia alebo humánneho usmrtenia, popis príznakov zistenej toxicity, vrátane času nástupu, trvania, typu a závažnosti toxických účinkov, počet zvierat vykazujúcich poškodenia, vrátane typu a závažnosti poškodení.2.2 HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOVZistenia zo štúdie sa vyhodnocujú na základe výskytu, závažnosti a vzájomného vzťahu medzi neurobehaviorálnymi a neuropatologickými účinkami (aj neurochemické alebo elektrofyziologické účinky, ak sa vykonali aj ďalšie vyšetrenia) a všetky ostatné zistené nepriaznivé účinky. Ak je to možné číselné výsledky sa vyhodnotia vhodnou a všeobecne akceptovateľnou štatistickou metódou. Štatistické metódy by sa mali vybrať počas prípravnej fázy štúdie.3. PODÁVANIE SPRÁV3.1 SPRÁVA O TESTESpráva o teste musí obsahovať tieto informácie:Testovaná látka:- fyzikálny charakter (vrátane izomerizácie, čistoty a fyzikálno-chemických vlastností);- identifikačné údaje.Nosič (v prípade potreby):- zdôvodnenie výberu nosiča.Pokusné zvieratá:- použitý druh/kmeň;- počet, vek a pohlavie zvierat;- zdroj, podmienky umiestnenia, aklimatizácia, krmivo atď.;- hmotnosti jednotlivých zvierat na začiatku testu.Testovacie podmienky:- údaje o príprave testovanej látky/krmiva, dosiahnutých koncentráciách, stabilite a homogenite prípravku;- špecifikácia podávaných dávok, vrátane údajov o nosiči, objeme a fyzikálnej forme podávaného materiálu;- údaje o podávaní testovanej látky;- zdôvodnenie výberu veľkosti dávok;- zdôvodnenie cesty podávania a trvania expozície;- prepočet koncentrácie testovanej látky v krmive/pitnej vode (ppm) na skutočnú dávku (mg/kg telesnej hmotnosti/deň), ak je potrebné;- údaje o kvalite krmiva a vody.Pozorovania a postupy testovania:- údaje o zaradení zvierat v jednotlivých skupinách do podskupín na perfúzne fixovanie;- údaje o systémoch hodnotenia, vrátane kritérií a stupníc hodnotenia pre každé meranie v podrobných klinických vyšetreniach;- údaje o funkčných testoch na senzorickú reaktivitu na rôznorodé podnety (napr. sluchové, vizuálne a proprioceptívne podnety); na hodnotenie sily uchopenia končatín a na hodnotenie motorickej aktivity (vrátane údajov o automatických prístrojoch na zistenie aktivity) a iné použité postupy;- údaje o oftalmologických vyšetreniach a v prípade potreby hematologických vyšetreniach a klinicko-biochemických testoch s príslušnými základnými hodnotami;- údaje pre špecifické neurobehaviorálne, neuropatologické, neurochemické alebo elektrofyziologické postupy.Výsledky:- telesná hmotnosť/zmeny telesnej hmotnosti, vrátane telesnej hmotnosti v čase usmrtenia;- spotreba potravy a vody, podľa potreby;- údaje o toxickej reakcii podľa pohlavia a dávky, vrátane príznakov toxicity alebo mortality;- charakter, závažnosť a trvanie (čas nástupu a následný priebeh) podrobných klinických vyšetrení (s údajmi o reverzibilite);- podrobný popis všetkých výsledkov funkčných testov;- nálezy z autopsie;- podrobný popis všetkých neurobehaviorálnych, neuropatologických a neurochemických alebo elektrofyziologických nálezov, ak sú k dispozícii;- údaje o absorpcii a metabolizme, ak sú k dispozícii;- štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby.Diskusia k výsledkom:- informácie o reakcii na dávku;- vzťah medzi inými toxickými účinkami pre výsledné posúdenie neurotoxického potenciálu testovanej chemikálie;- hladina bez pozorovaného nepriaznivého účinku.Závery:- potrebné je konkrétne stanovisko k celkovej neurotoxicite testovanej chemikálie.4. ODKAZY(1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.(3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/ London.(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003.(6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, 267-283.(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236.(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599-609.(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.(11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York.(12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695.(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. (1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343-352.(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452.(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378.(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp 299-335.(17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co., Baltimore/London, pp. 726-742.(18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.Tabuľka 1Minimálny počet zvierat potrebných na skupinu, keď sa štúdia neurotoxicity uskutočňuje samostatne alebo v kombinácii s inými štúdiami| ŠTÚDIA NEUROTOXICITY SA USKUTOČŇUJE AKO: |Samostatná štúdia | Kombinovaná štúdia s 28-dennou štúdiou | Kombinovaná štúdia s 90-dennou štúdiou | Kombinovaná štúdia so štúdiou chronickej toxicity |Celkový počet zvierat na skupinu | 10 samcov a 10 samíc | 10 samcov a 10 samíc | 15 samcov a 15 samíc | 25 samcov a 25 samíc |Počet zvierat vybratých na funkčné testovanie, vrátane podrobných klinických vyšetrení | 10 samcov a 10 samíc | 10 samcov a 10 samíc | 10 samcov a 10 samíc | 10 samcov a 10 samíc |Počet zvierat vybratých na perfúznu fixáciu in situ a neurohistopatológiu | 5 samcov a 5 samíc | 5 samcov a 5 samíc | 5 samcov a 5 samíc | 5 samcov a 5 samíc |Počet zvierat vybratých na vyšetrenia toxicity pri opakovanej dávke/subchronickej/chronickej toxicity, hematológiu, klinickú biochémiu, histopatológiu atď., ako sa uvádza v príslušných usmerneniach (Guidelines) | | 5 samcov a 5 samíc | 10 samcov [1] a10 samíc [1] | 20 samcov [1] a 20 samíc [1] |Doplňujúce vyšetrenia, podľa potreby | 5 samcov a 5 samíc | | | |Tabuľka 2Frekvencia klinických vyšetrení a funkčné testyTyp vyšetrení | | Trvanie štúdie |Akútna | 28-denná | 90-denná | Chronická |U všetkých zvierat | Všeobecný zdravotný stav | denne | denne | denne | denne |Mortalita/morbidita | dvakrát denne | dvakrát denne | dvakrát denne | dvakrát denne |U zvierat vybratých na funkčné vyšetrenia | Podrobné klinické vyšetrenia | pred prvou expozícioupočas 8 hodín po podaní dávky v čase očakávaného maximálneho účinkuv deň 7 a 14 po podaní dávky | pred prvou expozícioupotom jedenkrát týždenne | pred prvou expozícioujedenkrát počas prvého alebo druhého týždňa expozíciepotom mesačne | pred prvou expozícioujedenkrát na konci prvého mesiaca expozíciepotom každé tri mesiace |Funkčné testy | pred prvou expozícioupočas 8 hodín po podaní dávky v čase očakávaného maximálneho účinkuv deň 7 a 14 po podaní dávky | pred prvou expozícioupočas štvrtého týždňa ošetrenia čo možno najbližšie ku koncu obdobia expozície | pred prvou expozícioujedenkrát počas prvého alebo druhého týždňa expozíciepotom mesačne | pred prvou expozícioujedenkrát na konci prvého mesiaca expozíciepotom každé tri mesiace |--------------------------------------------------PRÍLOHA 2IC.21. PÔDNE MIKROORGANIZMY: TEST TRANSFORMÁCIE DUSÍKA1. METÓDATáto metóda zodpovedá OECD TG 216 (2000).1.1 ÚVODTáto testovacia metóda opisuje laboratórnu metódu, určenú na stanovenie dlhodobých účinkov chemikálií po jednorazovej expozícii na aktivitu pôdnych mikroorganizmov transformovať dusík. Test sa v podstate zakladá odporúčaniach Organizácie na ochranu rastlín v Európe a stredomorskej oblasti (1). Zohľadnili sa však aj ďalšie usmernenia vrátane German Biologische Bundesanstalt (2), US Environmental Protection Agency (3), SETAC (4) a Medzinárodnej organizácie pre normalizáciu (5). Na OECD workshope o výbere pôd/sedimentov, ktorý sa konal v Belgirate, Taliansko, v roku 1995 (6) sa dohodlo množstvo a typy pôd používaných v tomto teste. Odporúčania pre odoberanie, manipuláciu a skladovanie vzoriek pôdy sa zakladajú na Usmerňovacom dokumente ISO (7) a odporúčaniach z workshopu v Belgirate. Pri posudzovaní a hodnotení toxických vlastností testovaných látok sa môže vyžadovať stanovenie účinkov na mikrobiálnu aktivitu pôdy, napr. keď sa vyžadujú údaje o potenciálnych vedľajších účinkoch výrobkov na ochranu rastlín na pôdnu mikroflóru, alebo keď sa predpokladá expozícia pôdnych mikroorganizmov inými chemikáliami, ako sú výrobky na ochranu rastlín. Test transformácie dusíka sa vykonáva na stanovenie účinkov takýchto chemikálií na pôdnu mikroflóru. Ak sa testujú agrochemikálie (napr. výrobky na ochranu rastlín, hnojivá, chemikálie používané v lesníctve) vykonáva sa test transformácie dusíka a aj test transformácie uhlíka. Ak sa testujú iné látky ako agrochemikálie, test transformácie dusíka je postačujúci. Ak však hodnoty EC50 testu transformácie dusíka pre takéto chemikálie ležia v rozsahu zistenom pre komerčne dostupné inhibítory nitrifikácie (napr. nitrapyrín), môže sa vykonať test transformácie uhlíka, aby sa získali ďalšie informácie.Pôdy pozostávajú zo živých a neživých zložiek, ktoré existujú v komplexných a heterogénnych zmesiach. Mikroorganizmy zohrávajú významnú úlohu pri rozkladaní a transformácii organických látok v úrodných pôdach, pričom mnohé druhy prispievajú k rôznym aspektom úrodnosti pôdy. Každý dlhodobý vplyv na tieto biochemické procesy by mohol potenciálne narušiť obeh živín a toto by mohlo ovplyvniť úrodnosť pôdy. Transformácia uhlíka a dusíka sa vyskytuje vo všetkých úrodných pôdach. Aj keď sa mikrobiálne populácie, ktoré sú zodpovedné za tieto procesy, odlišujú v prípade jednotlivých pôd, cesty transformácie sú v podstate rovnaké.Táto opísaná testovacia metóda je určená na stanovenie dlhodobých nepriaznivých účinkov látky na proces transformácie dusíka v aeróbnych povrchových pôdach. Testovacia metóda umožňuje aj stanovenie účinkov látky na transformáciu uhlíka v pôdnej mikroflóre. Tvorba dusíka sa uskutočňuje následne po degradácii väzieb medzi uhlíkom a dusíkom. Preto, ak sa rovnaké miery produkcie dusíka zistia v ošetrenej a kontrolnej pôde, je veľmi pravdepodobné, že hlavné cesty degradácie sú neporušené a funkčné. Substrát vybratý na test (prášková múka z lucerny) má vhodný pomer uhlíka a dusíka (zvyčajne medzi 12/1 a 16/1). Na základe tohto sa deficit uhlíka počas testu zníži a ak sú mikrobiálne populácie poškodené chemikáliou, môžu sa v priebehu 100 dní zotaviť.Testy, z ktorých sa táto testovacia metóda vyvinula, boli prednostne určené pre látky, pri ktorých sa dá predpokladať množstvo, ktoré sa dostane do pôdy. Toto je prípad, napríklad výrobkov na ochranu rastlín, pri ktorých je známa aplikačná dávka v teréne. V prípade agrochemikálií postačuje testovanie dvoch dávok, ktoré zodpovedajú predpokladanej alebo predpovedanej aplikačnej dávke. Agrochemikálie sa môžu testovať ako aktívne zložky (a.z.) alebo ako zložené výrobky. Test sa však neobmedzuje na agrochemikálie. Zmenením množstva testovanej látky aplikovanej na pôdu a aj spôsobu, akým sa údaje vyhodnocujú, sa môže test použiť aj na chemikálie, v prípade ktorých nie je známe predpokladané množstvo, ktoré sa dostane do pôdy. A takto sa pre iné chemikálie ako agrochemikálie stanovia účinky série koncentrácií na transformáciu dusíka. Údaje z týchto testov sa použijú na prípravu krivky reakcie na dávku a vypočítajú sa hodnoty ECx, kde x je definovaný účinok v percentuálnom vyjadrení.1.2 DEFINÍCIETransformácia dusíka: konečná degradácia organickej látky, ktorá obsahuje dusík, mikroorganizmami prostredníctvom procesu amonifikácie a nitrifikácie na príslušný anorganický konečný produkt nitrát.ECx (Efektívna koncentrácia): je koncentrácia testovanej látky v pôde, ktorá spôsobí x percentnú inhibíciu transformácie dusíka na nitrát.EC50 (Stredná efektívna koncentrácia): je koncentrácia testovanej látky v pôde, ktorá spôsobí 50 percentnú (50 %) inhibíciu transformácie dusíka na nitrát.1.3 REFERENČNÉ LÁTKYŽiadne.1.4 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDYPreosiata pôda sa doplní s práškovou rastlinnou múkou a buď sa ošetrí testovanou látkou, alebo sa ponechá bez ošetrenia (kontrola). Ak sa testujú agrochemikálie, odporúčajú sa minimálne dve testované koncentrácie a tieto koncentrácie sa vyberú vzhľadom na najvyššiu koncentráciu predpokladanú v teréne. Po 0, 7, 14 dňoch a 28 dňoch inkubácie sa vzorky ošetrených a kontrolných pôd extrahujú vo vhodnom rozpúšťadle a stanovia sa množstvá nitrátu v extraktoch. Miera tvorby nitrátu v ošetrených vzorkách sa porovná s mierou v kontrolách a vypočíta sa percentuálna odchýlka ošetrenej vzorky od kontroly. Všetky testy prebiehajú aspoň 28 dní. Ak sú na 28. deň rozdiely medzi ošetrenými a neošetrenými pôdami rovnaké alebo väčšie ako 25 %, merania pokračujú do maximálne 100 dní. Ak sa testujú iné látky ako agrochemikálie, testovaná látka sa pridá v sérii koncentrácií do vzoriek pôdy a zmerajú sa množstvá nitrátu, ktorý sa vytvorí v ošetrených a kontrolných vzorkách po 28 dňoch inkubácie. Výsledky z testov s viacerými rozdielnymi koncentráciami sa analyzujú s použitím regresného modelu a vypočítajú sa hodnoty ECx (t. j. EC50, EC25 a/alebo EC10). Pozri definície.1.5 VALIDITA TESTUHodnotenia výsledkov testu s agrochemikáliami sa zakladajú na relatívne malých rozdieloch (t. j. priemerná hodnota ± 25 %) medzi koncentráciami nitrátu v kontrolných a ošetrených vzorkách pôdy, takže veľké odchýlky v kontrolách môžu viesť k nesprávnym výsledkom. Z tohto dôvodu odchýlka medzi paralelnými kontrolnými vzorkami má byť menšia ako ± 15 %.1.6 OPIS TESTOVACEJ METÓDY1.6.1 AparatúraPoužívajú sa testovacie nádoby, vyrobené z chemicky inertného materiálu. Mali by mať vhodný objem v súlade s postupom, použitým na inkubáciu pôd, t. j. hromadná inkubácia alebo séria jednotlivých vzoriek pôdy (pozri oddiel 1.7.1.2). Je potrebné venovať pozornosť minimalizovaniu strát vody, a aj tomu, aby sa počas testu umožnila výmena plynov (napr. testovacie nádoby sa môžu zakryť perforovanou polyetylénovou fóliou). Keď sa testujú prchavé látky, použijú sa nádoby, ktoré sa dajú utesniť a plynotesné nádoby. Tieto majú mať takú veľkosť, aby mohli byť asi do jednej štvrtiny svojho objemu vyplnené vzorkou pôdy.Používa sa bežné laboratórne zariadenie vrátane:- miešacieho zariadenia: mechanická miešačka alebo rovnocenné zariadenie;- odstredivky (3000 g) alebo filtračného zariadenia (s beznitrátovým filtračným papierom);- prístroj s vhodnou citlivosťou reprodukovateľnosťou na analýzu nitrátu.1.6.2 Výber a počet pôdPoužije sa jediná pôda. Odporúčané charakteristiky pôdy sú tieto:- obsah piesku: nie menej ako 50 % a nie viac ako 75 %;- pH: 5,5–7,5;- obsah organického uhlíka: 0,5 – 1,5 %;- stanoví sa mikrobiálna biomasa (8) (9) a obsah uhlíka v nej má byť aspoň 1 % celkového organického uhlíka v pôde.Vo väčšine prípadov pôda s týmito charakteristikami predstavuje najhorší prípad, ktorý môže nastať, pretože adsorpcia testovanej chemikálie je minimálna a jej dostupnosť pre mikroflóru je maximálna. Následne nie sú vo všeobecnosti potrebné testy s inými pôdami. Za určitých okolností však, t. j. ak sa predpokladá hlavné použitie testovanej látky v konkrétnych pôdach, ako sú kyslé lesné pôdy, alebo v prípade elektrostaticky nabitých chemikálií, môže byť potrebné použiť ďalšiu pôdu.1.6.3 Odber a skladovanie vzoriek pôdy1.6.3.1 OdberPotrebné sú podrobné informácie o histórii miesta v teréne, odkiaľ sa testovaná pôda odobrala. Uvádza sa presná poloha, porast, dátumy ošetrení výrobkami na ochranu rastlín, ošetrenia organickými a anorganickými hnojivami, prídavky biologických materiálov alebo náhodné kontaminácie. Miesto, vybraté na odber pôdy, má byť také, aby umožňovalo dlhodobé použitie. Stále pasienky, polia s ročnými plodinami (okrem kukurice) alebo husto zasiate rastliny na zelené hnojivo sú vhodné. Vybraté miesto na odber sa nesmie ošetrovať výrobkami na ochranu rastlín minimálne jeden rok pred odberom. Aspoň šesť mesiacov sa nesmie použiť ani žiadne organické hnojivo. Použitie minerálneho hnojiva je prijateľné iba v prípade, ak sa v súlade s požiadavkami na vzorky plodín a vzoriek pôdy neodoberú skôr ako minimálne tri mesiace po aplikácii hnojiva. Je potrebné vyhnúť sa použitiu pôdy ošetrenej hnojivami so známymi biocídnymi účinkami (napr. kyanamid vápenatý).Vzorky by sa nemali odoberať počas alebo bezprostredne po dlhých obdobiach (viac ako 30 dní) sucha alebo nadmernej vlahy. Vzorky ornej pôdy odoberajú z hĺbky 0 až 20 cm. Pre vzorky pôdy z pastvín (lúk) alebo iných pôd, ktoré sa dlhšiu dobu neorú (aspoň jedno vegetačné obdobie), môže byť maximálna hĺbka odberu vzoriek o niečo väčšia ako 20 cm (napr. 25 cm).Vzorky pôdy sa prepravujú v nádobách a za teplotných podmienok, ktoré zaručujú, že sa pôvodné vlastnosti pôdy významne nezmenia.1.6.3.2 UchovávanieUprednostňuje sa použitie čerstvo odobratých pôd z terénu. Ak nie je možné vyhnúť sa skladovaniu v laboratóriu, pôdy sa môžu skladovať v tme pri 4 ± 2°C najviac tri mesiace. Počas uchovávania vzoriek sa musia zabezpečiť aeróbne podmienky. Ak sa pôdy odoberajú z oblastí, kde sú zamrznuté aspoň tri mesiace do roka, môže sa uvažovať o skladovaní šesť mesiacov pri mínus 18 °C až mínus 22 °C. Pred každým pokusom sa stanoví mikrobiálna biomasa skladovaných pôd a uhlík v biomase by mal tvoriť aspoň 1 % z celkového obsahu organického uhlíka v pôde (pozri oddiel 1.6.2).1.6.4 Manipulácia a príprava pôdy na test1.6.4.1 PreinkubáciaAk sa pôda skladuje (pozri oddiel 1.6.3.2), odporúča sa preinkubácia v trvaní medzi 2 a 28 dňami. Teplota a obsah vlhkosti pôdy počas preinkubácie by mali byť rovnaké, ako sú tie, ktoré sa použijú v teste (pozri oddiely 1.6.4.2 a 1.7.1.3).1.6.4.2 Fyzikálno-chemické charakteristikyPôda sa ručne zbaví veľkých predmetov (napr. kameňov, častí rastlín atď.) a potom sa vlhká preoseje tak, aby sa príliš nevysušila, na veľkosť častíc menšiu alebo rovnajúcu sa 2 mm. Obsah vlhkosti vzorky pôdy sa nastaví destilovanou alebo deionizovanou vodou na hodnotu medzi 40 % a 60 % maximálnej kapacity zadržiavania vody.1.6.4.3 Obohatenie organickým substrátomPôda sa obohatí vhodným organickým substrátom, napr. práškovou múkou z lucerny-trávy-zeleného krmiva (hlavná zložka: Medicago sativa) s pomerom C/N medzi 12/1 a 16/1. Odporúčaný pomer lucerna – pôda je 5 g lucerny na kilogram pôdy (suchá hmotnosť).1.6.5 Príprava testovanej látky na aplikáciu do pôdyTestovaná látka sa zvyčajne aplikuje s použitím nosiča. Nosičom môže byť voda (pre látky rozpustné vo vode) alebo inertná tuhá látka ako napr. jemný kremenný piesok (veľkosť častíc: 0,1 – 0,5 mm). Kvapalné nosiče, ktoré sú iné ako voda (napr. organické rozpúšťadlá ako acetón, chloroform), by sa nemali používať, lebo môžu poškodzovať mikroflóru. Ak sa ako nosič použije piesok, môže byť pokrytý testovanou látkou, ktorá je rozpustená alebo suspendovaná vo vhodnom rozpúšťadle. V takýchto prípadoch sa rozpúšťadlo pred zmiešaním s pôdou odparí. Pre optimálnu distribúciu testovanej látky v pôde sa odporúča pomer 10 g piesku na kilogram pôdy (suchá hmotnosť). Kontrolné vzorky sa ošetria iba rovnakým množstvom vody a/alebo kremenného piesku.Pri testovaní prchavých chemikálií je potrebné pokiaľ možno zabrániť stratám počas ošetrenia a pokúsiť sa o zabezpečenie homogénnej distribúcie v pôde (napr. testovaná látka sa na niekoľkých miestach vstrekne do pôdy).1.6.6 Testované koncentráciePri testovaní agrochemikálií by sa mali použiť aspoň dve koncentrácie. Nižšia koncentrácia by mala zohľadňovať prinajmenšom očakávané maximálne množstvo, ktoré sa dostane do pôdy za zvyčajných okolností v praxi, pričom vyššia koncentrácia by mala byť násobkom nižšej koncentrácie. Koncentrácie testovanej látky, pridanej do pôdy, sa vypočítajú za predpokladu jednotného zabudovania do hĺbky 5 cm a objemovej hmotnosti pôdy 1,5. V prípade agrochemikálií, ktoré sa aplikujú priamo do pôdy, alebo v prípade chemikálií, pre ktoré sa dá predpovedať množstvo, ktoré sa dostatne do pôdy, odporúčané testované koncentrácie sú maximálne predpovedané environmentálne koncentrácie [Predicted Environmental Concentration (PEC)] a päťnásobok týchto koncentrácií. Látky, pri ktorých sa očakáva, že sa budú aplikovať do pôd niekoľkokrát za sezónu, sa testujú s koncentráciami, ktoré sa stanovia vynásobením PEC maximálnym predpokladaným počtom aplikácií. Horná testovaná koncentrácia by však nemala prekročiť desaťnásobok maximálnej jednorazovej aplikačnej dávky. Ak sa testujú iné látky ako agrochemikálie, použije sa geometrický rad s aspoň piatimi koncentráciami. Testované koncentrácie by mali byť v rozsahu potrebnom na stanovenie hodnôt ECx.1.7 VYKONANIE TESTU1.7.1 Podmienky expozície1.7.1.1 Ošetrenie a kontrolaPri testovaní agrochemikálií sa pôda rozdelí do troch dávok s rovnakou hmotnosťou. Dve dávky sa zmiešajú s nosičom, ktorý obsahuje produkt, a ďalšia sa zmieša s nosičom bez produktu (kontrola). Odporúčajú sa minimálne tri paralelné vzorky pre ošetrené a aj neošetrené pôdy. Pri testovaní iných látok ako agrochemikálií sa pôda rozdelí do šiestich dávok s rovnakou hmotnosťou. Päť vzoriek sa zmieša s nosičom, ktorý obsahuje testovanú látku, a šiesta vzorka sa zmieša s nosičom bez chemikálie. Odporúčajú sa tri paralelné vzorky pre ošetrené a aj kontrolné vzorky. Je potrebné venovať pozornosť zabezpečeniu homogénnej distribúcie testovanej látky v ošetrených vzorkách pôdy. Počas zmiešavania je potrebné zabrániť, aby sa pôda ubila, alebo sa vytvorili hrudky.1.7.1.2 Inkubácia vzoriek pôdyInkubácia vzoriek pôdy sa môže vykonať dvomi spôsobmi: ako hromadné vzorky každej ošetrenej a neošetrenej pôdy alebo série jednotlivých a rovnako veľkých čiastočných vzoriek každej ošetrenej a neošetrenej pôdy. Ak sa však testujú prchavé látky, test sa uskutoční len so sériou jednotlivých čiastočných vzoriek. Ak sa pôdy inkubujú hromadne, pripravujú sa veľké množstvá ošetrenej a neošetrenej pôdy a čiastočné vzorky, ktoré sa majú analyzovať, sa odoberú podľa potreby počas testu. Množstvo pripravené na začiatku pre každé ošetrenie a kontrolu závisí od veľkosti čiastočných vzoriek, počtu paralelných vzoriek použitých na analýzu a predpokladaného maximálneho počtu odberov vzoriek. Pôdy inkubované hromadne sa dôkladne premiešajú pred odberom čiastočných vzoriek. Ak sa pôdy inkubujú ako séria jednotlivých vzoriek pôdy, každá ošetrená a neošetrená hromadne inkubovaná pôda sa rozdelí do požadovaného počtu čiastočných vzoriek a tieto vzorky sa použijú podľa potreby. V pokusoch, pri ktorých sa predpokladajú viac ako dva odbery, sa pripraví dostatočný počet čiastočných vzoriek, aby sa zohľadnili všetky paralelné vzorky a odbery. Aspoň tri paralelné vzorky testovanej pôdy by sa mali inkubovať za aeróbnych podmienok. Počas všetkých testov by sa mali použiť vhodné nádoby s dostatočnou plynnou fázou, aby sa zabránilo vytvoreniu anaeróbnych podmienok. Ak sa testujú prchavé látky, test sa uskutoční len so sériou jednotlivých čiastočných vzoriek.1.7.1.3 Podmienky testu a trvanieTest sa uskutočňuje v tme pri teplote miestnosti 20 ± 2 °C. Obsah vlhkosti vzoriek pôdy by sa mal počas testu zachovať medzi 40 % a 60 % maximálnej kapacity zadržiavania vody v pôde (pozri oddiel 1.6.4.2) s rozpätím ± 5 %. Podľa potreby sa môže pridať destilovaná, deionizovaná voda.Minimálne trvanie testu je 28 dní. Pri testovaní agrochemikálií sa porovnáva miera tvorby nitrátu v ošetrených a kontrolných vzorkách. Ak sa odlišujú o viac ako 25 % na 28. deň, test pokračuje, pokiaľ sa nedosiahne rozdiel rovný alebo menší ako 25 %, alebo maximálne 100 dní, podľa toho, čo je kratšie. V prípade iných látok ako agrochemikálie sa test ukončí po 28 dňoch. Na 28. deň sa množstvá nitrátu v ošetrených a kontrolných vzorkách pôdy stanovia a vypočítajú sa hodnoty ECx.1.7.2 Odber vzoriek a analýza pôd1.7.2.1 Harmonogram odberu vzoriekPri testovaní agrochemikálií sa vzorky pôdy analyzujú na nitrát v dni 0, 7, 14 a 28. Ak je potrebný predĺžený test, uskutočnia sa po 28. dni ďalšie merania v 14-denných intervaloch.Ak sa testujú iné látky ako agrochemikálie použije sa aspoň päť testovaných koncentrácií a vzorky pôdy sa analyzujú na nitrát na začiatku (deň 0) a na konci expozície (28 dní). Ak sa to pokladá za potrebné, môže sa pridať napr. na siedmy deň prechodné meranie. Údaje získané na 28. deň sa použijú na stanovenie hodnoty ECx pre chemikáliu. V prípade potreby sa môžu použiť v správe o počiatočnom množstve nitrátu v pôde údaje kontrolných vzoriek z dňa 0.1.7.2.2 Analýza vzoriek pôdyMnožstvo nitrátu, ktoré sa vytvorí v každej ošetrenej a kontrolnej paralelnej vzorke, sa stanoví pri každom odbere. Nitrát sa extrahuje z pôdy pretrepávaním vzoriek s vhodným extrakčným činidlom, napr. 0,1 M roztokom chloridu draselného. Odporúča sa pomer 5 ml KCl na gram suchého hmotnostného ekvivalentu pôdy. Na optimalizáciu extrakcie by mali byť nádoby, v ktorých sa nachádza pôda a extrakčné činidlo, naplnené najviac do polovice. Zmesi sa pretrepávajú 60 minút pri 150 otáčkach za minútu (rpm). Zmesi sa odstreďujú alebo prefiltrujú a kvapalné fázy sa analyzujú na nitrát. Kvapalné extrakty, ktoré neobsahujú častice, sa môžu skladovať pred analýzou pri mínus 20 ± 5 °C do šiestich mesiacov.2. ÚDAJE2.1 SPRACOVANIE VÝSLEDKOVAk sa test uskutočňuje s agrochemikáliami, množstvo nitrátu, ktoré sa vytvorí v každej paralelnej vzorke pôdy, sa zaznamená a priemerné hodnoty všetkých paralelných vzoriek sa uvedú v podobe tabuliek. Miera transformácie dusíka sa vyhodnotí vhodnými a všeobecne uznávanými štatistickými metódami (napr. F-test, 5 % úroveň významnosti). Množstvá vytvoreného nitrátu v mg nitrátu/kg suchej hmotnosti pôdy/deň. Miera tvorby nitrátu v každej ošetrenej vzorke sa porovná s kontrolnou vzorkou a vypočíta sa percentuálna odchýlka od kontrolnej vzorky.Ak sa test uskutočňuje s inými látkami ako agrochemikáliami, stanoví sa množstvo vytvoreného nitrátu v každej paralelnej vzorke a krivka reakcie na dávku na stanovenie hodnôt ECx. Množstvá nitrátu (t. j. mg nitrátu/kg suchej hmotnosti pôdy) zistené v ošetrených vzorkách po 28 dňoch sa porovná s množstvami zistenými v kontrole. Z týchto údajov sa vypočítajú hodnoty inhibície v percentuálnom vyjadrení pre každú testovanú koncentráciu. Tieto percentuálne hodnoty sa vynesú proti koncentrácii a potom sa použijú štatistické postupy na výpočet hodnôt ECx. Hranice spoľahlivosti (p = 0,95) pre vypočítané ECx sa tiež stanovia s použitím štandardných postupov (10) (11) (12).Testované látky, ktoré obsahujú veľké množstvá dusíka, môžu prispieť k množstvám nitrátu vytvoreného počas testu. Ak sa tieto látky testujú pri vysokej koncentrácii (napr. chemikálie, pri ktorých sa predpokladá opakované používanie), musia sa zahrnúť do testu príslušné kontroly (t. j. pôda plus testovaná látka, ale bez rastlinnej múky). Údaje z týchto kontrol sa musia zohľadniť vo výpočtoch ECx.2.2 INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOVAk je pri hodnotení výsledkov z testov s agrochemikáliami rozdiel v miere tvorby nitrátu medzi nižším ošetrením (t. j. maximálna očakávaná koncentrácia) a kontrolou rovný alebo menší ako 25 % pri každom odbere vzoriek po dni 28, môže sa vyhodnotiť, že produkt nemá dlhodobý vplyv na transformáciu dusíka v pôdach. Pri hodnotení výsledkov testov s inými chemikáliami ako agrochemikáliami sa používajú hodnoty EC50, EC25 a/alebo EC10.3. PODÁVANIE SPRÁVSpráva o teste musí obsahovať tieto informácie:Úplnú identifikáciu použitej pôdy, vrátane:- geografických údajov o mieste (zemepisná šírka, dĺžka);- informácie o histórii miesta (t. j. rastlinný porast, ošetrenia s výrobkami na ochranu rastlín, ošetrenia s hnojivami, náhodná kontaminácia atď.);- štruktúra využitia (napr. poľnohospodárska pôda, les atď.);- hĺbka odberu vzoriek (cm);- obsah piesku/bahna/ílu (% suchej hmotnosti);- pH (vo vode);- obsah organického uhlíka (% suchej hmotnosti);- obsah dusíka (% suchej hmotnosti);- počiatočná koncentrácia nitrátu (mg nitrátu/kg suchej hmotnosti);- kapacita výmeny katiónov (mmol/kg);- mikrobiálna biomasa v percentách celkového organického uhlíka;- údaje o metódach použitých na stanovenie každého parametra;- všetky informácie týkajúce sa odberu a skladovania vzoriek pôdy;- údaje o prípadnej preinkubácii pôdy.Testovaná látka:- fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti;- chemické identifikačné údaje, v prípade potreby vrátane štruktúrneho vzorca, čistoty (t. j. v prípade výrobkov na ochranu rastlín percento účinnej látky), obsah dusíka.Substrát:- zdroj substrátu;- zloženie (t. j. múka z lucerny, múka z lucerny-trávy-zeleného krmiva);- obsah uhlíka, dusíka (% suchej hmotnosti);- veľkosť otvorov sita (mm).Testovacie podmienky:- údaje o obohatení pôdy organickým substrátom;- počet použitých koncentrácií testovanej chemikálie a v prípade potreby zdôvodnenie vybratých koncentrácií;- údaje o aplikácii testovanej látky do pôdy;- inkubačná teplota;- obsah vlhkosti v pôde na začiatku a počas testu;- použitá metóda inkubácie pôdy (t. j. hromadná alebo ako séria jednotlivých čiastkových vzoriek);- počet paralelných vzoriek;- počet odberov;- metóda použitá na extrakciu nitrátu z pôdy;Výsledky:- analytický postup a zariadenie použité na analýzu nitrátu;- údaje vo forme tabuliek, vrátane jednotlivých a priemerných hodnôt pri stanovení nitrátu;- odchýlka medzi paralelnými a kontrolnými vzorkami;- vysvetlenie prípadných korekcií pri výpočtoch;- percentuálna odchýlka v mierach tvorby nitrátu pri každom odbere alebo v prípade potreby hodnota EC50 s 95 % hranicou spoľahlivosti, iné ECx (t. j. EC25 alebo EC10) s intervalmi spoľahlivosti a graf krivky reakcie na dávku;- štatistické spracovanie výsledkov;- všetky informácie a pozorovania umožňujúce interpretáciu výsledkov.4. ODKAZY(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Bruxelles.(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality - Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality - Biological Methods.(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18-20 janvier 1995.(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method.(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method.(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.C.22. PÔDNE MIKROORGANIZMY: TRANSFORMAČNÝ TEST UHLÍKA1. METÓDATáto metóda zodpovedá OECD TG 217 (2000).1.1 ÚVODTáto testovacia metóda opisuje laboratórnu metódu, určenú na skúmanie dlhodobých potenciálnych účinkov chemikálií jednorazovej expozície výrobkami na ochranu rastlín, a prípadne iných chemikálií, na aktivitu pôdnych mikroorganizmov transformovať uhlík. Test sa v podstate zakladá odporúčaniach Organizácie na ochranu rastlín v Európe a stredomorskej oblasti (1). Zohľadnili sa aj ďalšie usmernenia ako German Biologische Bundesanstalt (2), US Environmental Protection Agency (3) a SETAC (4). OECD workshop o výbere pôd/sedimentov, ktorý sa konal v Belgirate, Taliansko, v roku 1995 (5) sa dohodol na množstve a type pôd používaných v tomto teste. Odporúčania pre odoberanie, manipuláciu a skladovanie vzoriek pôdy sa zakladajú na Usmerňovacom dokumente ISO (6) a odporúčaniach z workshopu v Belgirate.Pri posudzovaní a hodnotení toxických vlastností testovaných látok sa môže vyžadovať stanovenie účinkov na mikrobiálnu aktivitu pôdy, napr. keď sa vyžadujú údaje o potenciálnych vedľajších účinkoch výrobkov na ochranu rastlín na pôdnu mikroflóru, alebo ak sa predpokladá expozícia pôdnych mikroorganizmov iným chemikáliám, ako sú výrobky na ochranu rastlín. Test transformácie uhlíka sa vykonáva na stanovenie účinkov takýchto chemikálií na pôdnu mikroflóru. Ak sa testujú agrochemikálie (napr. výrobky na ochranu rastlín, hnojivá, chemikálie používané v lesnom hospodárstve) vykonáva sa test transformácie uhlíka a aj test transformácie dusíka. Ak sa testujú iné látky ako agrochemikálie, test transformácie dusíka je postačujúci. Ak však hodnoty EC50 testu transformácie dusíka pre takéto chemikálie sú v rozsahu zistenom pre komerčne dostupné inhibítory nitrifikácie (napr. nitrapyrín), na získanie ďalších informácií sa môže vykonať test transformácie uhlíka.Pôdy pozostávajú zo živých a neživých zložiek, ktoré existujú v komplexných a heterogénnych zmesiach. Mikroorganizmy zohrávajú významnú úlohu pri rozkladaní a transformácii organických látok v úrodných pôdach, pričom mnohé druhy prispievajú k rôznym aspektom úrodnosti pôdy. Každý dlhodobý vplyv na tieto biochemické procesy by mohol potenciálne narušiť obeh živín a to by mohlo ovplyvniť úrodnosť pôdy. Transformácia uhlíka a dusíka sa vyskytuje vo všetkých úrodných pôdach. Aj keď sa mikrobiálne populácie, zodpovedné za tieto procesy, odlišujú v prípade jednotlivých pôd, cesty transformácie sú v podstate rovnaké.Táto testovacia metóda je určená na stanovenie dlhodobých nepriaznivých účinkov látky na proces transformácie uhlíka v aeróbnych povrchových pôdach. Tento test je citlivý na zmeny veľkosti a aktivity mikrobiálnych populácií, zodpovedných za transformáciu uhlíka, keďže vystavuje tieto populácie pôsobeniu chemikálií a nedostatku uhlíka. Používa sa piesková pôda, chudobná na organické látky. Táto pôda sa ošetrí testovanou látkou a inkubuje za podmienok, ktoré umožňujú rýchly mikrobiálny metabolizmus. Za týchto podmienok sa zdroje ľahko dostupného uhlíka v pôde rýchlo spotrebujú. Toto spôsobí nedostatok uhlíka, ktoré zabíja mikrobiálne bunky a vyvoláva latentný stav a/alebo sporuláciu. Ak test prebieha viac ako 28 dní, súhrn týchto reakcií sa môže stanoviť v kontrolách (neošetrenej pôdy) ako progresívna strata metabolicky aktívnej biomasy (7). Ak na biomasu v pôde vystavenú nedostatku uhlíka, v podmienkach testu pôsobí prítomnosť chemikálie, nemusí sa vrátiť na rovnakú úroveň ako kontrola. A preto narušenie spôsobené testovanou látkou kedykoľvek počas testu bude často pretrvávať do konca testu.Testy, z ktorých sa táto testovacia metóda vyvinula, boli prednostne určené pre látky, pri ktorých sa dá predpokladať množstvo, ktoré sa dostane do pôdy. Napríklad v prípade výrobkov na ochranu rastlín, pri ktorých je známa aplikačná dávka v teréne. V prípade agrochemikálií je testovanie dvoch dávok, ktoré zodpovedajú predpokladanej alebo predpovedanej aplikačnej dávke, dostačujúce. Agrochemikálie sa môžu testovať ako aktívne zložky (a.z.) ako zložené výrobky. Test však sa však obmedzuje na chemikálie s predvídateľnými environmentálnymi koncentráciami. Zmenením množstva testovanej látky aplikovanej na pôdu a spôsobu, akým sa údaje vyhodnocujú, sa test môže použiť aj na chemikálie, v prípade ktorých nie je známe predpokladané množstvo, ktoré sa dostane do pôdy. A tým sa pri iných chemikáliách ako agrochemikálie stanovia účinky série koncentrácií na transformáciu uhlíka. Údaje z týchto testov sa použijú na prípravu krivky vzťahu medzi dávkou a reakciou a vypočítajú sa hodnoty ECx, kde x je definované ako účinok v percentuálnom vyjadrení.1.2 DEFINÍCIETransformácia uhlíka: je degradácia organickej látky mikroorganizmami na anorganický konečný produkt oxid uhličitý.ECx (Efektívna koncentrácia): je koncentrácia testovanej látky v pôde, ktorá spôsobí x percentnú inhibíciu transformácie uhlíka na oxid uhličitý.EC50 (Stredná efektívna koncentrácia): je koncentrácia testovanej látky v pôde, ktorá spôsobí 50 percentnú inhibíciu transformácie uhlíka na oxid uhličitý.1.3 REFERENČNÉ LÁTKYŽiadne.1.4 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDYPreosiata pôda sa ošetrí testovanou látkou, alebo sa ponechá bez ošetrenia (kontrola). Ak sa testujú agrochemikálie, odporúčajú sa minimálne dve testované koncentrácie a tieto koncentrácie sa vyberú vo vzťahu k najvyššej koncentrácii predpokladanej v teréne. Po 0., 7., 14. a 28. dni inkubácie sa vzorky ošetrených a kontrolných pôd zmiešajú s glukózou a merajú sa glukózou indukované rýchlosti respirácie po sebe nasledujúcich 12 hodín. Rýchlosti respirácie sa vyjadrujú ako uvoľnený oxid uhličitý (mg oxidu uhličitého/kg suchej pôdy/h) alebo spotrebovaný kyslík (mg kyslíka/kg pôdy/h). Priemerná rýchlosť respirácie vo vzorkách s ošetrenou pôdou sa porovná s pôdou v kontrole a vypočíta sa percentuálna odchýlka ošetrenej pôdy od kontroly. Všetky testy prebiehajú aspoň 28 dní. Ak na 28. deň sa rozdiely medzi ošetrenými a neošetrenými pôdami rovnajú alebo sú väčšie ako 25 %, merania pokračujú v 14 dňových intervaloch do maximálne 100 dní. Ak sa testujú iné chemikálie ako agrochemikálie, pridáva sa séria koncentrácií testovanej látky ku vzorkám pôdy a glukózou indukované rýchlosti respirácie (t. j. priemer množstiev vzniknutého oxidu uhličitého alebo spotrebovaného kyslíka) sa stanovia po 28 hodinách. Výsledky z testov zo série koncentrácií sa analyzujú s použitím regresného modelu a vypočítajú sa hodnoty ECx (t. j. EC50, EC25 a/alebo EC10). Pozri definície.1.5 VALIDITA TESTUHodnotenia výsledkov testu s agrochemikáliami sa zakladajú na relatívne malých rozdieloch (t. j. priemerná hodnota ± 25 %) medzi uvoľneným oxidom uhličitým alebo spotrebovaným kyslíkom v (alebo prostredníctvom) kontrolných a ošetrených vzorkách pôdy, takže veľké odchýlky v kontrolách môžu viesť k nesprávnym výsledkom. Z tohto dôvodu odchýlka medzi paralelnými kontrolnými vzorkami má byť menšia ako ± 15 %.1.6 OPIS TESTOVACEJ METÓDY1.6.1 AparatúraPoužijú sa testovacie nádoby, vyrobené z chemicky inertného materiálu. Mali by mať vhodný objem v súlade s postupom použitým na inkubáciu pôd, t. j. hromadná inkubácia alebo séria jednotlivých vzoriek pôdy (pozri oddiel 1.7.1.2). Je potrebné venovať pozornosť tomu, aby sa minimalizovali straty vody, a aj tomu, aby sa počas testu umožnila výmena plynov (napr. testovacie nádoby sa môžu zakryť perforovanou polyetylénovou fóliou). Keď sa testujú prchavé látky, použijú sa nádoby, ktoré je možné utesniť a plynotesné nádoby. Tieto nádoby by mali mať takú veľkosť, aby mohli byť asi do jednej štvrtiny svojho objemu vyplnené vzorkou pôdy.Na stanovenie glukózou indukovanej respirácie sa vyžadujú inkubačné systémy a prístroje na meranie tvorby oxidu uhličitého alebo spotreby kyslíka. Príklady takýchto systémov a nástrojov sa nachádzajú v literatúre (8) (9) (10) (11).1.6.2 Výber a počet pôdPoužije sa jediná pôda. Odporúčané charakteristiky pôdy sú tieto:- obsah piesku: nie menej ako 50 % a nie viac ako 75 %;- pH: 5,5-7,5;- obsah organického uhlíka: 0,5-1,5 %;- mikrobiálna biomasa sa zmeria (12) (13) a jej obsah uhlíka by mal byť aspoň 1 % celkového organického uhlíka v pôde.Vo väčšine prípadov pôda s týmito charakteristikami predstavuje najhorší prípad, ktorý môže nastať, pretože adsorpcia testovanej chemikálie je minimálna a jej dostupnosť pre mikroflóru je maximálna. Následne nie sú vo všeobecnosti potrebné testy s inými pôdami. Za určitých okolností však, t. j. ak sa predpokladá hlavné použitie testovanej látky v konkrétnych pôdach, ako sú kyslé lesné pôdy, alebo v prípade elektrostaticky nabitých chemikálií, sa môže vyžadovať použitie ďalšej pôdy.1.6.3 Odber a skladovanie vzoriek pôdy1.6.3.1 OdberK dispozícii by mali byť podrobné informácie o histórii miesta v teréne, odkiaľ sa testovaná pôda odobrala. Uvádza sa presná poloha, porast, dátumy ošetrení výrobkami na ochranu rastlín, ošetrenia organickými a anorganickými hnojivami, prídavky biologických materiálov alebo náhodné kontaminácie. Miesto, vybraté na odber pôdy, má byť také, aby umožňovalo dlhodobé použitie. Vhodné sú stále pasienky, polia s ročnými plodinami (okrem kukurice) alebo husto zasiate rastliny na zelené hnojivo. Vybraté miesto na odber sa nesmie ošetrovať výrobkami na ochranu rastlín minimálne jeden rok pred odberom. Aspoň šesť mesiacov sa nesmie použiť ani žiadne organické hnojivo. Použitie minerálneho hnojiva je prijateľné iba v prípade, ak je potrebné pre plodiny a vzorky pôdy sa neodoberú skôr ako aspoň tri mesiace po aplikácii hnojiva. Je potrebné vyhnúť sa použitiu pôdy ošetrenej hnojivami so známymi biocídnymi účinkami (napr. kyanamid vápenatý).Vzorky sa neodoberajú počas dlhých období (viac ako 30 dní) sucha alebo nadmernej vlahy alebo bezprostredne po nich. Vzorky ornej pôdy odoberajú z hĺbky 0 až 20 cm. Pre vzorky pôdy z pastvín (lúk) alebo iných pôd, ktoré sa dlhšiu dobu neorú (aspoň jedno vegetačné obdobie), môže byť maximálna hĺbka odberu vzoriek o niečo väčšia ako 20 cm (napr. 25 cm). Vzorky pôdy sa prepravujú v nádobách a za teplotných podmienok, ktoré zaručujú, že sa pôvodné vlastnosti pôdy významne nezmenia.1.6.3.2 UchovávanieUprednostňuje sa použitie čerstvo odobratých pôd z terénu. Ak sa nedá zabrániť skladovaniu v laboratóriu, pôdy sa môžu skladovať v tme pri 4 ± 2 °C najviac tri mesiace. Počas uchovávania vzoriek sa musia zabezpečiť aeróbne podmienky. Ak sa pôdy odoberajú z oblastí, kde sú zamrznuté aspoň tri mesiace do roka, môže sa uvažovať o skladovaní šesť mesiacov pri mínus 18 °C. Pred každým pokusom sa stanoví mikrobiálna biomasa skladovaných pôd a uhlík v biomase má tvoriť aspoň 1 % celkového obsahu organického uhlíka v pôde (pozri oddiel 1.6.2).1.6.4 Manipulácia a príprava pôdy na test1.6.4.1 PreinkubáciaAk sa pôda skladuje (pozri oddiely 1.6.4.2 a 1.7.1.3), odporúča sa preinkubácia v trvaní medzi 2 a 28 dňami. Teplota a obsah vlhkosti pôdy počas preinkubácie by mali byť byť rovnaké, ako sa použije v teste (pozri oddiely 1.6.4.2 a 1.7.1.3).1.6.4.2 Fyzikálno-chemické charakteristikyPôda sa ručne zbaví veľkých predmetov (napr. kameňov, častí rastlín atď.) a potom sa vlhká preoseje tak, aby sa príliš vysušila, na veľkosť častíc menšiu alebo rovnajúcu sa 2 mm. Obsah vlhkosti vzorky pôdy sa nastaví destilovanou alebo deionizovanou vodou na hodnotu medzi 40 % a 60 % maximálnej kapacity zadržiavania vody.1.6.5 Príprava testovanej látky na aplikáciu do pôdyTestovaná látka sa zvyčajne aplikuje s použitím nosiča. Nosičom môže byť voda (pre látky rozpustné vo vode) alebo inertná tuhá látka ako napr. jemný kremenný piesok (veľkosť častíc: 0,1 – 0,5 mm). Kvapalné nosiče, ktoré sú iné ako voda (napr. organické rozpúšťadlá ako acetón, chloroform), by sa nemali používať, lebo môžu poškodzovať mikroflóru. Ak sa použije piesok ako nosič, môže byť pokrytý testovanou látkou rozpustenou alebo suspendovanou vo vhodnom rozpúšťadle. V takýchto prípadoch sa rozpúšťadlo pred zmiešaním s pôdou odparí. Pre optimálnu distribúciu testovanej látky v pôde sa odporúča pomer 10 g piesku na kilogram pôdy (suchá hmotnosť). Kontrolné vzorky sa ošetria iba rovnakým množstvom vody a/alebo kremenného piesku.Pri testovaní prchavých chemikálií je potrebné zabrániť stratám počas ošetrenia a pokúsiť sa o zabezpečenie homogénnej distribúcie v pôde (napr. testovaná látka sa na niekoľkých miestach vstriekne do pôdy).1.6.6 Testované koncentrácieAk sa testujú výrobky na ochranu rastlín alebo iné chemikálie s predvídateľnými environmentálnymi koncentráciami, použijú sa aspoň dve koncentrácie. Nižšia koncentrácia by mala zohľadňovať prinajmenšom očakávané maximálne množstvo, ktoré sa dostane do pôdy za zvyčajných okolností v praxi, pričom vyššia koncentrácia by mala byť násobkom nižšej koncentrácie. Koncentrácie testovanej látky pridanej do pôdy sa vypočítajú za predpokladu jednotného zabudovania do hĺbky 5 cm a objemovej hmotnosti pôdy 1,5. V prípade agrochemikálií, ktoré sa aplikujú priamo do pôdy, alebo v prípade chemikálií, pre ktoré sa dá predpovedať množstvo, ktoré sa dostane do pôdy, odporúčané testovacie koncentrácie sú maximálne predvídateľné environmentálne koncentrácie [Predictable Environmental Concentration (PEC)] a päťnásobok týchto koncentrácií. Látky, pri ktorých sa očakáva, že sa budú aplikovať do pôd niekoľkokrát za sezónu, sa testujú s koncentráciami, ktoré sa stanovia vynásobením PEC maximálnym predpokladaným počtom aplikácií. Horná testovaná koncentrácia by však nemala prekročiť desaťnásobok maximálnej jednorazovej aplikačnej dávky.Ak sa testujú iné látky ako agrochemikálie, použije sa geometrický rad s aspoň piatimi koncentráciami. Odporúča sa, aby testované koncentrácie boli v rozsahu potrebnom na stanovenie hodnôt ECx.1.7 VYKONANIE TESTU1.7.1 Podmienky expozície1.7.1.1 Ošetrenie a kontrolaPri testovaní agrochemikálií, sa pôda rozdelí do troch dávok s rovnakou hmotnosťou. Dve dávky sa zmiešajú s nosičom, ktorý obsahuje produkt a ďalšia sa zmieša s nosičom bez produktu (kontrola). Odporúčajú sa minimálne tri paralelné vzorky pre ošetrené a aj neošetrené pôdy. Pri testovaní iných látok ako agrochemikálií sa pôda rozdelí do šiestich dávok s rovnakou hmotnosťou. Päť vzoriek sa zmieša s nosičom obsahujúcim testovanú látku a šiesta vzorka sa zmieša s nosičom bez chemikálie. Odporúčajú sa tri paralelné vzorky pre ošetrené a aj kontrolné vzorky. Je potrebné venovať pozornosť zabezpečeniu homogénnej distribúcie testovanej látky v ošetrených vzorkách pôdy. Počas miešania je potrebné zabrániť, aby sa pôda ubila, alebo sa vytvorili hrudky.1.7.1.2 Inkubácia vzoriek pôdyInkubácia vzoriek pôdy sa môže vykonať dvomi spôsobmi: ako hromadné vzorky každej ošetrenej a neošetrenej pôdy alebo série jednotlivých a rovnako veľkých čiastočných vzoriek každej ošetrenej a neošetrenej pôdy. Ak sa však testujú prchavé látky, test by sa mal uskutočniť len so sériou jednotlivých čiastočných vzoriek. Ak sa pôdy inkubujú hromadne, pripravujú sa veľké množstvá ošetrenej a neošetrenej pôdy a čiastočné vzorky, ktoré sa majú analyzovať, sa odoberú podľa potreby počas testu. Množstvo pripravené na začiatku pre každé ošetrenie a kontrolu závisí od veľkosti čiastočných vzoriek, počtu paralelných vzoriek použitých na analýzu a predpokladaného maximálneho počtu odberov vzoriek. Pôdy, inkubované hromadne, sa dôkladne premiešajú pred odberom čiastočných vzoriek. Ak sa pôdy inkubujú ako séria jednotlivých vzoriek pôdy, každá ošetrená a neošetrená hromadne inkubovaná pôda sa rozdelí do požadovaného počtu čiastočných vzoriek a tieto vzorky sa použijú podľa potreby. V experimentoch, pri ktorých sa predpokladá viac ako dva odbery, sa pripraví dostatočný počet čiastočných vzoriek, aby sa zohľadnili všetky paralelné vzorky a odbery. Odporúča sa, aby sa aspoň tri paralelné vzorky testovanej pôdy inkubovali za aeróbnych podmienok (pozri oddiel 1.7.1.1). Počas všetkých testov sa by sa mali použiť vhodné nádoby s dostatočnou plynnou fázou, aby sa zabránilo vytvoreniu anaeróbnych podmienok. Ak sa testujú prchavé látky, test sa by sa mal vykonať len so sériou jednotlivých čiastočných vzoriek.1.7.1.3 Podmienky testu a trvanieTest sa uskutočňuje v tme pri teplote miestnosti 20 ± 2 °C. Obsah vlhkosti vzoriek pôdy sa počas testu zachová medzi 40 % a 60 % maximálnej kapacity zadržiavania vody v pôde (pozri oddiel 1.6.4.2) s rozpätím ± 5 %. Podľa potreby sa môže pridať destilovaná, deionizovaná voda.Minimálne trvanie testu je 28 dní. Pri testovaní agrochemikálií sa porovnajú množstvá uvoľneného oxidu uhličitého alebo spotrebovaného kyslíka v ošetrených a kontrolných vzorkách. Ak sa odlišujú o viac ako 25 % na 28. deň, test pokračuje, pokiaľ sa nedosiahne rozdiel, ktorý sa rovná alebo je menší ako 25 %, alebo maximálne 100 dní, podľa toho, čo je kratšie. Pri testovaní iných látok ako agrochemikálie sa test ukončí po 28 dňoch. Na 28. deň sa množstvá uvoľneného oxidu uhličitého alebo spotrebovaného kyslíka v ošetrených a kontrolných vzorkách pôdy stanovia a vypočítajú sa hodnoty ECx.1.7.2 Odber vzoriek a analýza pôd1.7.2.1 Harmonogram odberu vzoriekPri testovaní agrochemikálií sa vzorky pôdy analyzujú na glukózou indukované rýchlosti respirácie v dni 0, 7, 14 a 28. Ak je potrebný predĺžený test, uskutočnia sa po 28. dni ďalšie merania v 14-denných intervaloch.Ak sa testujú iné látky ako agrochemikálie, použije sa aspoň päť testovaných koncentrácií a vzorky pôdy sa analyzujú na glukózou indukovanú respiráciu na začiatku (deň 0) a na konci vymedzeného času expozície (28 dní). Ak sa to pokladá za potrebné, môže sa pridať napr. na 7. deň prechodné meranie. Údaje, získané na 28. deň, sa použijú na stanovenie hodnoty ECx pre chemikáliu. Podľa potreby sa môžu použiť údaje kontrolných vzoriek z dňa 0 na odhad počiatočných množstiev metabolicky aktívnej biomasy v pôde (12).1.7.2.2 Meranie glukózou indukovaných rýchlostí respirácieRýchlosť respirácie, indukovaná glukózou v každej ošetrenej a kontrolnej paralelnej vzorke, sa stanoví pri každom odbere. Vzorky pôdy sa zmiešajú s dostatočným množstvom glukózy, aby sa zistila okamžitá maximálna respiračná reakcia. Množstvo glukózy, potrebnej na zistenie maximálnej respiračnej reakcie z danej pôdy, sa môže stanoviť v predbežnom teste s použitím série koncentrácií glukózy (14). Pre pieskové pôdy s 0,5 – 1,5 % organického uhlíka, 2000 mg na 2000 mg glukózy na kg suchej hmotnosti pôdy je zvyčajne dostačujúce. Glukóza sa môže pomlieť na prášok s čistým kremenným pieskom (10 g piesku/ kg suchej hmotnosti pôdy) a homogénne sa zmieša s pôdou.Vzorky s pridanou glukózou sa inkubujú vo vhodnej aparatúre na stanovenie rýchlosti respirácie buď kontinuálne, každú hodinu, alebo každé dve hodiny (pozri oddiel 1.6.1) pri 20 ± 2 °C. Uvoľnený oxid uhličitý alebo spotrebovaný kyslík sa stanoví 12 po sebe nasledujúcich 12 hodín a merania sa začnú čo najskôr, t. j. do 1 až 2 hodín po pridaní glukózy. Celkové množstvá uvoľneného oxidu uhličitého alebo spotrebovaného kyslíka počas 12 hodín sa zmerajú a stanovia sa priemerné rýchlosti respirácie.2. ÚDAJE2.1 SPRACOVANIE VÝSLEDKOVAk sa testujú agrochemikálie, množstvo uvoľneného oxidu uhličitého alebo spotrebovaného kyslíka v každej paralelnej vzorke pôdy sa zaznamená a priemerné hodnoty všetkých paralelných vzoriek sa uvedú v podobe tabuliek. Výsledky sa vyhodnotia vhodnými a všeobecne uznávanými štatistickými metódami (napr. F-test, 5 % úroveň významnosti). Rýchlosti respirácie indukovanej glukózou sa vyjadrujú v mg oxidu uhličitého/kg suchej hmotnosti pôdy/h alebo mg kyslíka/suchú hmotnosť pôdy/h. Priemerná hodnota miery tvorby oxidu uhličitého alebo priemerná hodnota miery spotrebovaného kyslíka sa porovná s hodnotami v kontrole a vypočíta sa percentuálna odchýlka od kontroly.Ak sa test uskutočňuje s inými látkami ako agrochemikáliami, množstvá uvoľneného oxidu uhličitého a spotrebovaného kyslíka v každej paralelnej vzorke sa stanoví a vyhotoví sa krivka reakcie na dávku na stanovenie hodnôt ECx. Rýchlosti respirácie indukovanej glukózou (t. j. mg oxidu uhličitého/kg suchej hmotnosti pôdy/h alebo mg kyslíka/suchú hmotnosť pôdy/h) zistené v ošetrených vzorkách po 28 dňoch sa porovnajú s hodnotami zistenými v kontrole. Z týchto údajov sa vypočítajú hodnoty inhibície v percentuálnom vyjadrení pre každú testovanú koncentráciu. Tieto percentuálne hodnoty sa vynesú proti koncentrácii a použijú sa štatistické postupy na výpočet hodnôt ECx. Hranice spoľahlivosti (p = 0,95) pre vypočítané ECx sa stanovia tiež s použitím štandardných postupov (15) (16) (17).2.2 INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOVAk pri hodnotení výsledkov z testov s agrochemikáliami sa rozdiel v rýchlostiach respirácie medzi ošetrením s nižšími dávkami (t. j. maximálna očakávaná koncentrácia) a kontrolou rovná alebo je menší ako 25 % pri každom odbere vzoriek po dni 28, môže sa vyhodnotiť, že produkt nemá dlhodobý vplyv na transformáciu uhlíka v pôde. Pri hodnotení výsledkov testov s chemikáliami inými ako agrochemikáliami sa používajú hodnoty EC50, EC25 a/alebo EC10.3. PODÁVANIE SPRÁV3.1 SPRÁVA O TESTESpráva o teste musí obsahovať tieto informácie:Úplnú identifikáciu použitej pôdy vrátane:- geografických údajov o mieste (zemepisná šírka, dĺžka);- informácie o histórii miesta (t.j. rastlinný porast, ošetrenia s výrobkami na ochranu rastlín, ošetrenia s hnojivami, náhodná kontaminácia atď.);- štruktúra využitia (napr. poľnohospodárska pôda, les atď.);- hĺbka odberu vzoriek (cm);- obsah piesku/bahna/ílu (% suchej hmotnosti);- pH (vo vode);- obsah organického uhlíka (% suchej hmotnosti);- obsah dusíka (% suchej hmotnosti);- kapacita výmeny katiónov (mmol/kg);- počiatočná mikrobiálna biomasa v percentách celkového organického uhlíka;- údaje o metódach použitých na stanovenie každého parametra;- všetky informácie týkajúce sa odberu a skladovania vzoriek pôdy;- údaje o prípadnej preinkubácii pôdy.Testovaná látka:- fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti;- chemické identifikačné údaje, v prípade potreby vrátane štruktúrneho vzorca, čistoty (t. j. v prípade výrobkov na ochranu rastlín percento účinnej látky), obsah dusíka.Testovacie podmienky:- údaje o obohatení pôdy organickým substrátom;- počet použitých koncentrácií testovanej chemikálie a v prípade potreby zdôvodnenie vybratých koncentrácií;- údaje o aplikácii testovanej látky do pôdy;- inkubačná teplota;- obsah vlhkosti pôdy na začiatku a počas testu;- použitá metóda inkubácie pôdy (t. j. hromadná alebo ako séria jednotlivých čiastkových vzoriek);- počet paralelných vzoriek;- časy odberov.Výsledky:- metóda a zariadenie použité na meranie rýchlostí respirácie;- údaje v podobe tabuliek, vrátane jednotlivých a priemerných hodnôt množstiev oxidu uhličitého alebo kyslíka;- odchýlka medzi paralelnými a kontrolnými vzorkami;- vysvetlenie prípadných korekcií pri výpočtoch;- percentuálna odchýlka v glukózou indukovaných rýchlostiach respirácie pri každom odbere alebo v prípade potreby hodnota EC50 s 95 % hranicou spoľahlivosti, iné ECx (t. j. EC25 alebo EC10) s intervalmi spoľahlivosti a graf krivky reakcií na dávku;- štatistické spracovanie výsledkov v prípade potreby;- všetky informácie a pozorovania umožňujúce interpretáciu výsledkov.4. ODKAZY(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in "Pesticide Effects on Soil Microflora". Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in "Methods of Soil Analysis - Part 2: Chemical and Microbiological Properties". Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831- 871.(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality - Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality - Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.(11) Heinemeye,r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate induced respiration method.(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method.(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120.(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.C.23. AERÓBNA A ANAERÓBNA TRANSFORMÁCIA V PÔDE1. METÓDATáto testovacia metóda zodpovedá OECD TG 307 (2002).1.1 ÚVODTáto testovacia metóda je založená na existujúcich usmerneniach (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Metóda, opísaná v tejto testovacej metóde, je navrhnutá na hodnotenie aeróbnej a anaeróbnej transformácie chemikálií v pôde. Experimenty sa vykonávajú na stanovenie (i) miery transformácie testovanej látky a (ii) charakteru a miery tvorby a rozkladu produktov transformácie, ktorým rastliny a pôdne organizmy môžu byť vystavené. Takéto štúdie sa vyžadujú pre chemikálie, ktoré sa priamo aplikujú to pôdy, alebo ktoré sa môžu dostať do pôdneho prostredia. Výsledky takýchto laboratórnych štúdií sa môžu použiť aj na vypracovanie protokolov pre odbery a analýzy pre príslušné štúdie v teréne.Aeróbne a anaeróbne štúdie s jedným typom pôdy sú zvyčajne dostačujúce na hodnotenie ciest transformácie. (8) (10) (11). Miery transformácie sa stanovia aspoň v troch ďalších pôdach (8) (10).Na workshope OECD o výbere pôd/sedimentov, ktorý sa konal v Belgirate, Taliansko, v roku 1995 (10), sa dohodlo konkrétne množstvo a typ pôd, používaných v tomto teste. Typy testovaných pôd by mali byť reprezentatívne pre environmentálne podmienky v mieste, kde dôjde k použitiu chemikálie alebo uvoľneniu. Napríklad chemikálie, ktoré sa môžu uvoľniť v subtropickom až tropickom podnebí, sa testujú s Ferrasolmi alebo Nitosolmi (FAO systém). Workshop vydal tiež odporúčania, založené na pokynoch ISO (15), týkajúce sa odberu, manipulácie a skladovania vzoriek pôdy. Používanie ryžových pôd sa v tejto metóde tiež posudzuje.1.2 DEFINÍCIETestovaná látka: každá látka, či ide o východiskovú zlúčeninu alebo príslušné produkty transformácie.Produkty transformácie: všetky látky, ktoré vzniknú z biotických alebo abiotických transformačných reakcií testovanej látky, vrátane CO2 a produktov, ktoré sú vo viazaných rezíduách.Viazané rezíduá:"Viazané rezíduá" sú zlúčeniny v pôde, rastline alebo zvierati, ktoré pretrvávajú po extrakcii v matrici vo forme východiskovej zlúčeniny alebo jej metabolitu(ov)/produktov tranformácie. Extrakčné metódy nemusia podstatne meniť samotné zlúčeniny alebo štruktúru matrice. Charakter väzby sa čiastočne dá objasniť extrakčnými metódami, ktorými sa mení matrica a zložitými analytickými technikami. Doposiaľ sa týmto spôsobom identifikovali napríklad kovalentné iónové a sorpčné väzby, ako aj zadržiavanie. Vo všeobecnosti vznik viazaných rezíduí významne znižuje biologickú prístupnosť a dostupnosť (12) [upravené z IUPAC 1984 (13)].Aeróbna transformácia: reakcie, ktoré sa vyskytujú v prítomnosti molekulárneho kyslíka (14).Anaeróbna transformácia: reakcie, ktoré sa vyskytujú v neprítomnosti molekulárneho kyslíka (14).Pôda: je zmes minerálnych a organických chemických zložiek, pričom organické chemické zložky obsahujú zlúčeniny s vysokým obsahom uhlíka a dusíka a s vysokými molekulovými hmotnosťami a s malými (prevažne mikro-) organizmami. Pôda sa môže spracovávať v dvoch stavoch:(a) nenarušená, ako sa vytvorila v priebehu času, v charakteristických vrstvách s rozličnými typmi pôdy;(b) narušená, ako sa zvyčajne nachádza v poľnohospodársky využívaných oblastiach, alebo ako sa vyskytuje pri odbere vzoriek kopaním a použije v tejto testovacej metóde (14).Mineralizácia: je úplná degradácia organickej zlúčeniny na CO2 a H2O v aeróbnych podmienkach a na CH4, CO2 a H2O v anaeróbnych podmienkach. V súvislosti s touto testovacou metódou, ak sa používa zlúčenina označená 14C, mineralizácia znamená rozsiahlu degradáciu, počas ktorej sa označený atóm uhlíka oxiduje za uvoľnenia príslušného množstva 14CO2 (14).Polčas: t0,5 je čas, za ktorý sa transformuje 50 % testovanej látky, ak sa transformácia dá opísať kinetikou prvého rádu; je nezávislý od koncentrácie.DT50 (Doba odbúrania 50): je čas, za ktorý sa koncentrácia testovanej látky zníži o 50 %; odlišuje sa od polčasu t0,5, ak transformácia nepostupuje podľa kinetiky prvého rádu.DT75 (Doba odbúrania 75): je čas, za ktorý sa koncentrácia testovanej látky zníži o 75 %;DT90 (Doba odbúrania 90): je čas, za ktorý sa koncentrácia testovanej látky zníži o 90 %.1.3 REFERENČNÉ LÁTKYReferenčné látky sa použijú na charakterizáciu a/alebo identifikáciu produktov transformácie spektroskopickými a chromatografickými metódami.1.4 POUŽITEĽNOSŤ TESTUMetóda je použiteľná na všetky chemické látky (neoznačené alebo rádioaktívne označené), pre ktoré je k dispozícii analytická metóda s dostatočnou presnosťou a citlivosťou. Je použiteľná na mierne prchavé, neprchavé, vo vode rozpustné alebo vo vode nerozpustné zlúčeniny. Test sa nepoužíva na chemikálie, ktoré sú veľmi prchavé z pôdy (napr. fumiganty, organické rozpúšťadlá) a teda sa pri experimentálnych podmienkach testu nemôžu uchovať v pôde.1.5 INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKENa meranie miery transformácie sa môže použiť neoznačená alebo označená testovaná látka. Označený materiál sa vyžaduje pri skúmaní ciest transformácie a pri stanovení hmotnostnej bilancie. Odporúča sa označenie pomocou 14C, ale môže použiť aj označenie inými izotopami, ako napr. 13C, 15N, 3H, 32P. Značka sa umiestni pokiaľ možno v najstabilnejšej časti(-iach) molekuly [1]. Čistota testovanej látky by mala byť aspoň 95 %.Pred uskutočnením testu aeróbnej a anaeróbnej transformácie v pôde sú potrebné tieto informácie o testovanej látke:(a) rozpustnosť vo vode (Metóda A.6);(b) rozpustnosť v organických rozpúšťadlách;(c) tlak pár (Metóda A.4) a Henryho konštanta;(d) rozdeľovací koeficient n-oktanol/voda (Metóda A.8);(e) chemická stabilita v tme (hydrolýza) (Metóda C.7);(f) pKa, ak molekula podlieha protonácii alebo deprotonácii [OECD Guideline 112 ] (16).Ďalšie užitočné informácie môžu zahrnovať údaje o toxicite testovanej látky pre pôdne mikroorganizmy [Testovacie metódy C.21 a C.22] (16).Je potrebné mať k dispozícii analytické metódy (vrátane extrakčných a purifikačných metód) na kvantifikáciu a identifikáciu testovanej látky a jej produktov transformácie.1.6 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDYVzorky pôdy sa ošetria testovanou látkou a inkubujú v tme v bankách biometrického typu alebo v prietokových systémoch za kontrolovaných laboratórnych podmienok (pri konštantnej teplote a vlhkosti pôdy). Po príslušných časových intervaloch sa vzorky pôdy extrahujú a analyzujú na východziu látku a na produkty transformácie. Prchavé produkty sa tiež zhromaždia na analýzu s použitím príslušných absorčných zariadení. S použitím materiálu označeného 14C sa môžu merať rôzne miery mineralizácie testovanej látky zachytením uvoľneného 14CO2 a môže sa stanoviť hmotnostná bilancia, vrátane tvorby viazaných rezíduí v pôde.1.7 KRITÉRIÁ KVALITY1.7.1 RegeneráciaExtrakcia a analýza minimálne dvoch paralelných vzoriek pôdy ihneď po pridaní testovanej látky poskytne prvý dôkaz reprodukovateľnosti analytickej metódy a rovnomerného rozdelenia testovanej látky pri aplikácii. Regenerácie v neskorších štádiách experimentov sú dané prislušnými hmotnostnými bilanciami. Regenerácie by mali byť v rozsahu od 90 % do 110 % pre označené chemikálie (8) a od 70 % do 110 % pre neoznačené chemikálie (3).1.7.2 Reprodukovateľnosť a citlivosť analytickej metódyRepredukovateľnosť analytickej metódy (okrem účinnosti extrakcie v počiatočnom štádiu) na kvantifikovanie testovanej látky a produktov transformácie sa môže overiť paralelnou analýzou rovnakého extraktu pôdy inkubovaného dostatočne dlho, aby vznikli produkty transformácie.Detekčný limit (LOD) analytickej metódy pre testovanú látku a pre produkty transformácie má byť aspoň 0,01 mg·kg-1 pôdy (ako testovaná látka) alebo 1 % aplikovanej dávky, podľa toho ktorá hodnota je nižšia. Je potrebné stanoviť aj kvantifikačný limit (LOQ).1.7.3 Presnosť údajov o transformáciiRegresná analýza koncentrácií testovanej látky v závislosti od času poskytuje príslušné informácie o spoľahlivosti transformačnej krivky a umožňuje výpočet hraníc spoľahlivosti pre polčasy (v prípade kinetiky pseudo prvého rádu) alebo hodnôt DT50 a v prípade potreby DT75 a DT90.1.8 OPIS TESTOVACEJ METÓDY1.8.1 Prístroje a chemické reagencieInkubačné systémy pozostávajú zo statických uzatvorených systémov alebo vhodných prietokových systémov (7) (17). Príklady vhodného prietokového prístroja na inkubáciu pôdy a banky biometrického typu sú znázornené na obrázkoch 1 a 2. Obidva typy inkubačných systémov majú výhody a obmedzenia (7) (17).Sú potrebné štandardné laboratórne prístroje, a osobitne tieto:- analytické prístroje, ako napr. GLC, HPLC, TLC-zariadenie, vrátane vhodných detekčných systémov na analýzu rádioaktívne označených alebo neoznačených látok alebo inverzná izotopová zrieďovacia metóda;- identifikačné prístroje (napr. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR atď.);- kvapalný scintilačný počítač;- oxidačné činidlo na spaľovanie rádioaktívneho materiálu;- odstredivka;- extrakčný prístroj (napríklad centrifugačné kyvety na extrakciu za studena a Soxhletov extraktor na kontinuálnu refluxnú extrakciu);- prístroje na zvýšenie koncentrácie roztokov a extraktov (napr. rotačná odparka);- vodný kúpeľ;- mechanická miešačka (napr. stroj na miesenie, rotačný mixer).Použité chemické reagencie zahrnujú napríklad:- NaOH, analytická kvalita, 2 mol·dm-3 alebo iná vhodná zásada (napr. KOH, etanolamín);- H2SO4, analytická kvalita, 0.05 mol·dm-3;- etylénglykol, analytická kvalita;- tuhé absorpčné materiály ako napr. nátronové vápno a polyuretánové zátky;- organické rozpúšťadlá, analytická kvalita, ako napr. acetón, metanol atď.;- scintilačná kvapalina.1.8.2 Aplikácia testovanej látkyAby sa testovaná mohla pridať do pôdy a distribuovať v nej, môže sa rozpustiť vo vode (deionizovanej alebo destilovanej), alebo v prípade potreby v minimálnych množstvách acetónu alebo iných organických rozpúšťadlách (6), v ktorých je testovaná látka dostatočne rozpustná a stabilná. Množstvo zvoleného rozpúšťadla by nemalo mať významný vplyv na mikrobiálnu aktivitu pôdy (pozri oddiely 1.5 a 1.9.2-1.9.3). Je potrebné zabrániť, aby sa používali rozpúšťadlá inhibujúce mikrobiálnu aktivitu, ako je chloroform, dichlórmetán a iné halogenované rozpúšťadlá.Testovaná látka sa môže tiež pridať ako tuhá látka, napr. zmiešaná v kremennom piesku (6) alebo v malých čiastočných vzorkách pôdy, ktoré sa vysušia na vzduchu a sterilizujú. Ak sa testovaná látka pridá s použitím rozpúšťadla, rozpúšťadlo by sa malo odpariť predtým, ako sa čiastočná vzorka s pridanou látkou pridá k pôvodnej nesterilnej vzorke pôdy.V prípade bežných chemikálií, ktoré sa dostávajú do pôdy najmä prostredníctvom splaškového kalu/aplikácie v poľnohospodárstve, sa testovaná látka najskôr pridá do kalu, ktoré sa potom aplikuje do vzorky pôdy. (pozri oddiely 1.9.2 a 1.9.3)Použitie zložených produktov sa zvyčajne neodporúča. Použitie zloženého materiálu však môže byť vhodnou alternatívou, napríklad v prípade ťažko rozpustných testovaných látok.1.8.3 Pôdy1.8.3.1 Výber pôdyNa stanovenie transformačnej cesty sa môže použiť reprezentatívna pôda; piesočnatá hlina alebo prachovitá (bahenná) hlina alebo hlina alebo hlinitý piesok [podľa FAO a USDA klasifikácie (18)] s pH 5,5–8,0, obsah organického uhlíka 0,5–2,5 % a mikrobiálna biomasa s obsahom aspoň 1 % celkového organického uhlíka (10).Pre štúdie miery transformácie sa použijú aspoň tri ďalšie pôdy, predstavujúce rozsah relevantných pôd. Pôdy sa odlišujú v obsahu organického uhlíka, pH, obsahu ílu a mikrobiálnou biomasou (10).Všetky pôdy by mali byť charakterizované aspoň týmito vlastnosťami textúry (% piesok, % bahno, % íl) [klasifikácia podľa FAO a USDA (18)], pH, katiónová výmenná kapacita, organický uhlík, objemová hmotnosť, charakteristika retencie vody [2] a mikrobiálna biomasa (iba pre aeróbne štúdie). Ďalšie informácie o vlastnostiach pôdy môžu byť užitočné pri interpretácii výsledkov. Na stanovenie charakteristík pôdy sa môžu použiť odporúčané metódy v odkazoch (19) (20) (21) (22) (23). Mikrobiálna biomasa sa stanoví s použitím metódy substrátom indukovanej respirácie (SIR) (25) (26) alebo alternatívnymi metódami (20).1.8.3.2 Odber, manipulácia a skladovanie pôdPotrebné sú podrobné informácie o histórii miesta v teréne, odkiaľ sa testovaná pôda odobrala. Uvádza sa presná poloha, porast, ošetrenia chemikáliami, ošetrenia organickými a anorganickými hnojivami, prídavky biologických materiálov alebo iné kontaminácie. Na štúdie transformácie sa nepoužijú pôdy, ktoré boli ošetrené testovanou látkou alebo jej štrukturálnymi analógmi v priebehu ostatných štyroch rokov (10) (15).Pôda má byť čerstvo odobratá z terénu (z horizontu A alebo vrchnej 20 cm vrstvy) s obsahom vody v pôde, ktorý umožní preosiatie. V prípade iných pôd ako ryžové polia sa vzorky neodoberajú počas alebo bezprostredne po dlhých obdobiach (> 30 dní) sucha, mrazu alebo záplav (14). Vzorky sa dopravia tak, aby sa minimalizovali zmeny v obsahu vody v pôde a uchovávajú sa v tme za čo najväčšieho prístupu vzduchu. Na tento účel zvyčajne postačí voľne zaviazaný polyetylénový sáčok.Pôda by sa mala spracovať čo najskôr po odbere vzoriek. Porast, väčšie kusy pôdnych živočíchov a kamene sa odstránia pred preosiatím cez 2 mm sito, ktorým sa odstránia malé kamienky, živočíchy a zvyšky rastlín. Je potrebné zabrániť nadmernému vysušeniu a rozdrveniu pôdy pred preosiatím (15).Ak je ťažké odoberať vzorky v zime v teréne (zamrznutá pôda alebo pokrytá vrstvami snehu), môže sa odobrať zo šarže pôdy, uchovávanej v skleníku pod porastom (napr. tráva alebo zmes trávy a ďateliny). V každom prípade sa uprednostňujú štúdie s čerstvo odobratou pôdou z terénu, ale ak sa odobratá a spracovaná pôda musela skladovať pred začiatkom štúdie, musia sa dodržať vhodné skladovacie podmienky a iba na obmedzený čas (4 ± 2 °C maximálne tri mesiace), aby sa zachovala mikrobiálna aktivita [3]. Podrobné pokyny na odber, manipuláciu a skladovanie pôd, ktoré sa použijú na biotransformačné pokusy sa nachádzajú v odkazoch (8) (10) (15) (26) (27).Predtým ako sa spracovaná pôda použije v tomto teste, mala by sa podrobiť sa preinkubácii na umožnenie klíčenia a odstránenia semien a na opätovné nastolenie rovnováhy mikrobiálneho metabolizmu po následnej zmene podmienok odberu alebo skladovania na podmienky inkubácie. Vo všeobecnosti je vhodná doba preinkubácie medzi 2 a 28 dňami za teplotných podmienok a vlhkosti približujúcej sa skutočnému testu (15). Čas skladovania a preinkubácie spolu nesmie trvaŤ dlhŠie ako tri mesiace.1.9 VYKONANIE TESTU1.9.1 Testovacie podmienky1.9.1.1 Teplota pri testePočas celého obdobia testovania by sa pôdy mali inkubovať v tme pri konštantnej teplote, predstavujúcej klimatické podmienky, kde sa vyskytne použitie alebo uvoľnenie. Pre všetky testované látky, ktoré sa môžu dostať do pôdy v miernom podnebí, sa odporúča teplota 20 ± 2 °C. Teplota by sa mala sledovať.V prípade chemikálií, aplikovaných alebo uvoľnených v chladnejšom podnebí (napr. v severných krajinách počas obdobia jesene/zimy), sa inkubujú ďalšie vzorky pôdy, ale pri nižšej teplote (napr. 10 ± 2 °C).1.9.1.2 Obsah vlhkostiV prípade testov transformácie v aeróbnych podmienkach sa obsah pôdnej vlhkosti [4] nastaví a zachová na pF medzi 2,0 a 2,5 (3). Obsah pôdnej vlhkosti sa vyjadruje ako hmotnosť vody na hmotnosť suchej pôdy a pravidelne sa kontroluje (napr. v 2-týždňových intervaloch) vážením v inkubačných bankách a straty vody sa doplnia pridaním vody (pokiaľ možno sterilnej filtrovanej vody z vodovodu. Je potrebné venovať pozornosť tomu, aby sa predchádzalo a minimalizovali straty testovanej látky a/alebo produktov transformácie vyparovaním a/alebo fotodegradáciou (ak sa vyskytuje) počas pridávania vlhkosti.Pri testoch transformácie v anaeróbnych a podmienkach ryžových polí sa pôda saturuje zaplavením.1.9.1.3 Aeróbne inkubačné podmienkyV prietokových systémoch sa aeróbne podmienky zabezpečujú nekontinuálnym premývaním alebo kontinuálnou ventiláciou zvlhčeným vzduchom. V bankách biometrického typu sa vzduch zabezpečuje difúziou.1.9.1.4 Sterilné aeróbne podmienkyAby sa získali informácie o dôležitosti abiotickej transformácie testovanej látky vzorky, vzorky pôdy sa môžu sterilizovať (sterilizačné metódy pozri v odkazoch 16 a 29), ošetrené sterilnou testovanou látkou (napr. pridaním roztoku cez sterilný filter) a prevzdušniť zvlhčeným sterilným vzduchom, ako je uvedené v oddiele 1.9.1.3. V prípade ryžových pôd sa pôda a voda sterilizujú a inkubácia sa uskutoční, ako je uvedené v oddiele 1.9.1.6.1.9.1.5 Anaeróbne inkubačné podmienkyNa zistenie a zachovanie anaeróbnych podmienok sa pôda, ošetrená testovanou látkou a inkubovaná za aeróbnych podmienok 30 dní alebo jeden polčas alebo DT50 (podľa toho, ktoré je kratšie), potom zaleje vodou (1–3 cm vrstva vody) a do inkubačného systému sa vženie inertný plyn (napr. dusík alebo argón) [5]. Testovací systém musí umožňovať merania, ako napr. pH, koncentráciu kyslíka a redox potenciál a zapojenie zariadenia na zachytávanie prchavých produktov. Systém biomerického typu musí byť uzatvorený, aby nevnikol vzduch difúziou.1.9.1.6 Inkubačné podmienky ryžových políNa štúdiu transformácie v ryžových pôdach sa pôda zaplaví vrstvou vody s hrúbkou okolo 1–5 cm a testovaná látka sa aplikuje do vodnej fázy (9). Odporúča sa hĺbka pôdy aspoň 5 cm. Systém sa prevzdušňuje vzduchom ako za aeróbnych podmienok. Sleduje sa a zaznamená pH, koncentrácia kyslíka a redox potenciál vodnej vrstvy. Pred začatím tranformačných štúdií je potrebný preinkubácie aspoň dva týždne (pozri oddiel 1.8.3.2).1.9.1.7 Trvanie testuŠtúdie miery a cesty by nemali byť zvyčajne dlhšie ako 120 dní [6] (3) (6) (8), pretože potom sa dá očakávať pokles pôdnej mikrobiálnej aktivity s časom v neprirodzenom laboratórnom systéme izolovanom od prírodných revitalizačných procesov. Ak je potrebné charakterizovať rozklad testovanej látky a tvorbu a rozklad hlavných produktov transformácie, štúdie môžu pokračovať dlhšie obdobia (napr. 6 alebo 12 mesiacov) (8). Dlhšie inkubačné doby sa zdôvodnia v správach z testov a doložia sa k nim údaje z meraní biomasy počas týchto dôb a na ich konci.1.9.2 Vykonanie testuPribližne 50 až 200 g pôdy (vzťahuje sa na suchú hmotnosť) sa umiestni do každej inkubačnej banky (pozri obrázky 1 a 2 v prílohe 3) a pôda sa ošetrí testovanou látkou podľa jednej z metód uvedených v oddiele 1.8.2. Ak sa na aplikáciu testovanej látky používajú organické rozpúšťadlá, odstránia sa z pôdy odparením. Potom sa pôda dôkladne premieša tyčinkou a/alebo pretrepaním banky. Ak sa štúdia uskutočňuje v podmienkach ryžových polí, po aplikácii testovanej látky sa pôda a voda dôkladne premieša. Malé alikvótne časti (napr. 1 g) ošetrených pôd sa analyzujú na testovanú látku, aby sa overilo rovnomerné rozdelenie. Alternatívna metóda je uvedená ďalej.Miera ošetrenia by mala zodpovedať najvyššej aplikačnej dávke výrobku na ochranu rastlín, odporúčanej v návode na použite, a rovnomernému zabudovaniu v zodpovedajúcej hĺbke v teréne (napr. vrchná 10 cm vrstva [7] pôdy). Napríklad pre chemikálie, ktoré sa aplikujú na listy alebo na pôdu bez zabudovania, je zodpovedajúca hĺbka pre výpočet, koľko chemikálie sa má pridať do každej banky, 2,5 cm. Pre chemikálie, ktoré sa zabudujú do pôdy, je zodpovedajúca hĺbka presne uvedená v návode na použitie. Pre bežné chemikálie by sa aplikačná dávka mala odhadnúť na základe najvýznamnejšej cesty prieniku; napríklad, ak je hlavná cesta prieniku do pôdy cez splaškový kal, chemikália sa dávkuje do kalu pri koncentrácii, ktorá zodpovedá očakávanej koncentrácii kalu a množstvo kalu, pridaného do pôdy, by malo zodpovedať bežnej aplikácii kalu, používanej na poľnohospodárske pôdy. Ak táto koncentrácia nie je na identifikáciu hlavných produktov transformácie dostatočne vysoká, môže byť užitočná inkubácia samostatných vzoriek pôdy s vyššou mierou ošetrenia, ale je potrebné zamedziť priveľkej miere ošetrenia ovplyvňujúcej mikrobiálne funkcie pôdy (pozri oddiely 1.5 a 1.8.2).Alternatívne sa môže väčšia dávka (t. j. 1 až 2 kg) pôdy ošetriť testovanou látkou, dôkladne premiešať vo vhodnom miešacom zariadení a potom preniesť v malých dávkach 50 až 200 g do inkubačných baniek (napríklad s použitím dávkovačov vzoriek). Malé alikvótne časti (napr. 1 g) ošetrenej pôdy sa analyzujú na testovanú látku, aby sa overilo rovnomerné rozdelenie. Uprednostňuje sa takýto postup, pretože umožňuje rovnomernejšie rozdelenie testovanej látky do pôdy.Aj neošetrené vzorky pôdy sa inkubujú za rovnakých podmienok (aeróbne) ako vzorky ošetrené testovanou látkou. Tieto vzorky sa používajú na merania biomasy v priebehu štúdií a na ich konci.Ak sa testovaná látka aplikuje do pôdy rozpustená v organickom(-ých) rozpúšťadle(-ách), vzorky pôdy, ošetrené rovnakým množstvom rozpúšťadla(-iel), sa inkubujú za rovnakých podmienok (aeróbne) ako vzorky, ošetrené testovanou látkou. Tieto vzorky sa používajú na stanovenia biomasy na začiatku štúdií, počas nich a na ich konci, na overenie účinkov rozpúšťadla (-iel) na mikrobiálnu biomasu.Banky obsahujúce ošetrenú pôdu sa buď pripoja na prietokový systém popísaný na obrázku 1, alebo uzavrú absorpčnou kolónou, znázornenou na obrázku 2 (pozri prílohu 3).1.9.3 Odber vzoriek a meranieV príslušných časových intervaloch sa odoberú paralelné inkubačné banky a vzorky pôdy sa extrahujú s príslušnými rozpúšťadlami rôznej polarity a analyzujú na testovanú látku a/alebo produkty transformácie. Vhodne zostavená štúdia zahrnuje dostatočný počet baniek tak, aby sa mohli odobrať dve banky pri každom odbere. Odoberajú sa aj absorpčné roztoky alebo tuhé absorpčné materiály v rôznych časových intervaloch (7-dňové intervaly v priebehu prvého mesiaca a po jednom mesiaci 17-dňové intervaly) počas inkubácie každej vzorky pôdy a na jej konci a analyzujú sa na prchavé produkty. Okrem vzorky pôdy, odobratej priamo po aplikácii (vzorka z nultého dňa), je potrebné naplánovať aspoň 5 ďalších termínov odberu. Časové intervaly sa zvolia tak, aby sa dala stanoviť schéma rozkladu testovanej látky a schémy tvorby a rozkladu produktov transformácie (napr. 0, 1, 3, 7 dní; 2, 3 týždne; 1, 2, 3 mesiacov atď.).Ak sa použije testovaná látka, označená 14C, neextrahovateľná rádioaktivita sa kvantifikuje spaľovaním a vypočíta sa hmotnostná bilancia pre každý interval odberu.V prípade anaeróbnej inkubácie a inkubácie v podmienkach ryžových polí sa pôdne a vodné fázy analyzujú spolu pre testovanú látku a produkty transformácie, alebo sa pred extrakciou a analýzou oddelia pomocou filtrácie alebo centrifugácie.1.9.4 Nepovinné testyAeróbne, nesterilné štúdie pri ďalších teplotách a vlhkostiach pôdy môžu byť užitočné na posúdenie vplyvu teploty a vlhkosti pôdy na mieru transformácie testovanej látky a/alebo jej produktov transformácie v pôde.Ďalšiu charakterizáciu neextrahovateľnej rádioaktivity je možné skúsiť, napríklad superkritickou fluidnou extrakciou.2. ÚDAJE2.1 SPRACOVANIE VÝSLEDKOVMnožstvá testovanej látky, produktov transformácie, prchavých látok (iba v percentách) a neextrahovateľných látok sa vyjadria v percentách aplikovanej počiatočnej koncentrácie a v prípade potreby ako mg·kg-1 pôdy (vo vzťahu k suchej hmotnosti pôdy) pre každý interval odberu. Hmotnostná bilancia sa uvedie v percentách aplikovanej počiatočnej koncentrácie pre každý interval odberu. Grafické znázornenie koncentrácií testovanej látky v závislosti od času umožní stanovenie jej polčasu transformácie alebo DT50. Mali by sa identifikovať hlavné produkty transformácie a ich koncentrácie by sa tiež mali vyniesť v závislosti od času na znázornenie ich miery tvorby a rozkladu. Hlavný produkt transformácie je každý produkt, ktorý predstavuje ≥ 10 % aplikovanej dávky kedykoľvek počas štúdie.Zachytené prchavé látky poskytujú dôkazy o možnej prchavosti testovanej látky a jej produktov transformácie z pôdy.Presnejšie stanovenia polčasov alebo hodnôt DT50, prípadne hodnôt DT75 a DT90, by sa mali získať s použitím výpočtov príslušného kinetického modelu. Polčas a hodnoty DT50 by sa mali zaznamenať spolu s opisom použitého modelu, kinetického rádu a determinačného koeficientu (r2). Kinetika prvého rádu sa uprednostňuje, pokiaľ r2 < 0,7. V prípade potreby by sa výpočty mali použiť aj na hlavné produkty transformácie. Príklady príslušných modelov sú uvedené v odkazoch 31 až 35.Ak sa štúdie miery transformácie vykonávajú pri rôznych teplotách, miera transformácie sa uvedie ako funkcia teploty v rámci experimentálneho rozsahu teploty s použitím Arrheniovho vzťahu vo forme:k =alebolnk =BTkde ln A a B je regresná konštanta zo zadržania a B je regresná konštanta nábehu, najlepšieho smeru uvoľneného z lineárnej regresie ln k proti 1/T, k je množstvová konštanta pri teplote T a T je teplota v Kelvinoch. Je potrebné venovať pozornosť obmedzenému rozsahu teplôt, v ktorom platí Arrheniov vzťah v prípade, ak sa transformácia riadi mikrobiálnou aktivitou.2.2 HODNOTENIE A INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOVAj keď sa štúdie uskutočňujú v neprirodzenom laboratórnom systéme, výsledky umožnia posúdiť mieru transformácie testovanej látky a tiež mieru tvorby a rozkladu produktov transformácie v podmienkach v teréne (36) (37).Štúdia cesty transformácie testovanej látky poskytuje informácie o spôsobe, akým sa aplikovaná látka v pôde štrukturálne mení chemickými a mikrobiálnymi reakciami.3. PODÁVANIE SPRÁV3.1 SPRÁVA O TESTESpráva o teste musí obsahovať:Testovaná látka:- všeobecný názov, chemický názov, číslo CAS, štruktúrny vzorec (uvádzajúci pozíciu označenia(-í), ak sa použije rádioaktívne označený materiál) a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti (pozri oddiel 1.5);- čistota (nečistoty) testovanej látky;- rádiochemická čistota označenej chemikálie a špecifická aktivita (v prípade potreby);Referenčné látky:- chemický názov a štruktúra referenčných látok, použitých na charakterizáciu a/alebo identifikáciu produktu transformácie;Testované pôdy:- údaje o mieste odberu;- dátum a postup odberu vzoriek pôdy;- vlastnosti pôd, ako napr. pH, obsah organického uhlíka, textúra (koľko percent piesku, koľko percent bahna, koľko percent ílu), katiónová výmenná kapacita, objemová hmotnosť, charakteristika retencie vody a mikrobiálna biomasa;- dĺžka skladovania pôdy a podmienky skladovania (ak sa skladuje);Testovacie podmienky:- dátumy uskutočnenia štúdií;- množstvo použitej testovanej látky;- použité rozpúšťadlá a metóda aplikácie pre testovanú látku;- hmotnosť ošetrenej pôdy na začiatku testu a v každom intervale odberu na analýzu;- opis použitého inkubačného systému;- miera prietoku vzduchu (iba pre prietokové systémy);- teplota experimentálnej zostavy;- obsah pôdnej vlhkosti počas inkubácie;- mikrobiálna biomasa na začiatku, v priebehu a na konci aeróbnych štúdií;- pH, koncentrácia kyslíka a redox potenciál na začiatku, v priebehu a na konci anaeróbnych a štúdií v podmienkach ryžových polí;- extrakčná(-é) metóda(-y);- metódy kvantifikácie a identifikácie testovanej látky a hlavné produkty transformácie v pôde a absorpčné materiály;- počet paralelných vzoriek a počet kontrol.Výsledky:- výsledok stanovenia mikrobiálnej aktivity;- opakovateľnosť a citlivosť použitých analytických metód;- miera regenerácie percentuálne hodnoty pre platnú štúdiu sú uvedené v oddiele 1.7.1);- tabuľky s výsledkami vyjadrenými v percentách aplikovanej počiatočnej dávky a v prípade potreby ako mg·kg-1 pôdy (vzťahuje sa na suchú hmotnosť);- hmotnostná bilancia v priebehu štúdií a na ich konci;- charakterizácia neextrahovateľnej (viazanej) rádioaktivity alebo rezíduí v pôde;- kvantifikácia uvoľneného CO2 a iných prchavých látok;- grafické znázornenie pôdnych koncentrácií proti času pre testovanú látku a v prípade potreby pre hlavné produkty transformácie;- polčas alebo DT50, DT75 a DT90 pre testovanú látku a v prípade potreby pre hlavné produkty transformácie, vrátane hraníc spoľahlivosti;- posúdenie miery abiotickej degradácie v sterilných podmienkach;- vyhodnotenie kinetiky transformácie pre testovanú látku a v prípade potreby pre hlavné produkty transformácie;- údaje o cestách transformácie, v prípade potreby;- diskusia a interpretácia výsledkov;- nespracované údaje (t. j. chromatogramy vzoriek, vzorové výpočty miery transformácie a prostriedky použité na identifikáciu produktov transformácie).4. ODKAZY(1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.(3) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex II, Part A and Annex III, Part A: Fate and Behaviour in the Environment.(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.(5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden - Abbau, Umwandlung und Metabolismus.(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil - Part 1: Aerobic conditions.(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.(9) MAFF - Japan 2000 - Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).(13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.(16) Príloha V k smernici 67/548/EHS.(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality - General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221.(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and biotransformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105-120.(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197-200.(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In "Environmental Dynamics of Pesticides". R. Haque and V.H. Freed, Eds., 135-172.(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer 39, 188-204.(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer 33, 47-60.(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.(37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 83-122.PRÍLOHA 1TLAK VODY, KAPACITA POĽA (KP) A KAPACITA ZADRŽIAVANIA VODY (KZV) [1]Výška vodného stĺpca [cm] | pF [2] | bar [3] | Poznámky |107 | 7 | 104 | suchá pôda |1,6 . 104 | 4,2 | 16 | bod vädnutia |104 | 4 | 10 |103 | 3 | 1 |6 . 102 | 2,8 | 0,6 |3,3 . 102 | 2,5 | 0,33 [4] | rozsah kapacity poľa [5] KZV (aproximácia) vodou nasýtená pôda |102 | 2 | 0,1 |60 | 1,8 | 0,06 |33 | 1,5 | 0,033 |10 | 1 | 0,01 |1 | 0 | 0,001 |Tlak vody sa meria v cm vodného stĺpca alebo v baroch. Kvôli veľkému rozsahu sacieho tlaku sa vyjadruje jednoducho ako hodnota pF, ktorá je zodpovedá logaritmu cm vodného stĺpca.Kapacita poľa sa definuje ako množstvo vody, ktoré sa môže v prírodnej pôde zachovať proti gravitácii 2 dni po dlhšom období dažďov alebo po dostatočnom zavlažovaní. Stanovuje sa v nenarušenej pôde in situ v teréne. Meranie sa teda nepoužíva na narušené laboratórne vzorky pôdy. Stanovené hodnoty KP v narušených pôdach môžu vykazovať veľké systematické odchýlky.Kapacita zadržiavania vody (KZV) sa stanovuje v laboratóriu s nenarušenou a narušenou pôdou nasýtením stĺpca pôdy vodou prostredníctvom kapilárnej vzlínavosti. Je to osobitne dôležité pre narušené pôdy a môže byť až o 30 % väčšia ako kapacita poľa (1). Je tiež jednoduchšie experimentálne stanoviť spoľahlivé hodnoty KP.PRÍLOHA 2OBSAH PÔDNEJ VLHKOSTI (g vody na 100 g suchej pôdy) RÔZNYCH TYPOV PÔDY Z RÔZNYCH KRAJÍNTyp pôdy | Krajina | Pôdna vlhkosť pri || | KZV [1] | pF = 1,8 | pF = 2,5 |Piesok | Nemecko | 28,7 | 8,8 | 3,9 |Hlinitý piesok | Nemecko | 50,4 | 17,9 | 12,1 |Hlinitý piesok | Švajčiarsko | 44,0 | 35,3 | 9,2 |Prachovitá hlina | Švajčiarsko | 72,8 | 56,6 | 28,4 |Ílovitá hlina | Brazília | 69,7 | 38,4 | 27,3 |Ílovitá hlina | Japonsko | 74,4 | 57,8 | 31,4 |Piesčitá hlina | Japonsko | 82,4 | 59,2 | 36,0 |Prachovitá hlina | USA | 47,2 | 33,2 | 18,8 |Piesčitá hlina | USA | 40,4 | 25,2 | 13,3 |PRÍLOHA 31: | ihlový ventil |2: | plynová premývacia fľaša obsahujúca vodu |3: | ultramembrána (iba sterilné podmienky), veľkosť pórov 0,2 μm |4: | banka pôdneho metabolizmu (zaliata vodou iba v prípade anaeróbnych podmienok a podmienok ryžových polí) |5: | Lapač s etylén-glykolom na organické prchavé látky |6: | Lapač s kyselinou sírovou na alkalické prchavé látky |7, 8: | Lapač s hydroxidom sodným na CO2 a iné kyslé prchavé látky |9: | prietokomer. |+++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++(1) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.(2) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.(3) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.C.24. AERÓBNA A ANAERÓBNA TRANSFORMÁCIA V SYSTÉMOCH VODA/SEDIMENT1. METÓDATáto testovacia metóda zodpovedá OECD TG 308 (2002).1.1 ÚVODChemikálie sa môžu dostať do plytkých alebo hlbokých povrchových vôd takými cestami, ako je priama aplikácia, postrek, odtok, odvodnenie, zneškodňovanie odpadov, priemyselné, domáce alebo poľnohospodárske odpadové vody a atmosférické usadzovanie. Táto testovacia metóda opisuje laboratórnu metódu na hodnotenie aeróbnej a anaeróbnej transformácie organických chemikálií v systémoch voda/sediment. Táto testovacia metóda je založená na existujúcich usmerneniach (1) (2) (3) (4) (5) (6). Na OECD workshope o výbere pôd/sedimentov, ktorý sa konal v Belgirate, Taliansko, v roku 1995 (7) sa konkrétne dohodlo množstvo a typ sedimentov používaných v tomto teste. Tiež sa vydali odporúčania, týkajúce sa odberu, manipulácie a skladovania vzoriek sedimentov, ktoré sa zakladajú na pokynoch ISO (8). Takéto štúdie sa vyžadujú pre chemikálie, ktoré sa priamo aplikujú to vody, alebo ktoré sa môžu dostať do vodného prostredia horeuvedenými cestami.Podmienky v prírodných systémoch voda/sediment sú často aeróbne vo vrchnej vodnej fáze. Povrchová vrstva sedimentu môže byť buď aeróbna alebo anaeróbna, zatiaľ čo hlbšie vrstvy sedimentu sú zvyčajne anaeróbne. Aby sa zahrnuli obe tieto možnosti, v tomto dokumente sú opísané aeróbne aj aneróbne testy. Aeróbny test simuluje aeróbny vodný stĺpec nad aeróbnou vrstvou sedimentu, ktorá je podvrstvená anaeróbnym gradientom. Anaeróbny test simuluje úplný anaeróbny systém voda–sediment. Ak z okolností vyplýva, že je potrebné značne sa odkloniť od týchto odporúčaní, napríklad použiť intaktné jadrá sedimentov alebo sedimenty, ktoré môžu byť vystavené pôsobeniu testovanej látky, sú na tento účel dostupné iné metódy (9).1.2 DEFINÍCIEV každom prípade sa použijú medzinárodné jednotky (SI).Testovaná látka: každá látka, či východisková, alebo príslušné produkty transformácie.Produkty transformácie: všetky látky, ktoré vzniknú z biotických a abiotických transformačných reakcií testovanej látky, vrátane CO2 a viazaných rezíduí.Viazané rezíduá:"Viazané rezíduá" sú zlúčeniny v pôde, rastline alebo zvierati, ktoré pretrvávajú po extrakcii v matrici vo forme východzej zlúčeniny alebo jej metabolitu(-ov). Extrakčná metóda nemusí podstatne meniť samotné zlúčeniny alebo štruktúru matrice. Charakter väzby sa čiastočne dá objasniť extrakčnými metódami, ktorým sa mení matrica a zložitými analytickými technikami. Doposiaľ sa identifikovali týmto spôsobom, napríklad kovalentné iónové a sorpčné väzby, ako aj zadržiavanie. Vo všeobecnosti vznik viazaných rezíduí významne znižuje biologickú prístupnosť a biologickú dostupnosť (10) [upravené z IUPAC 1984 (11)].Aeróbna transformácia: (oxidačná): reakcie, ktoré sa vyskytujú v prítomnosti molekulárneho kyslíka (12).Anaeróbna transformácia: (redukčná): reakcie, ktoré sa vyskytujú za neprítomnosti molekulárneho kyslíka (12).Prírodné vody: sú povrchové vody získané z nádrží, riek, potokov atď.Sediment: je zmes minerálnych a organických chemických zložiek, pričom organické chemické zložky obsahujú zlúčeniny s vysokým obsahom uhlíka a dusíka a s vysokými molekulovými hmotnosťami. Ukladá sa prírodnou vodou a tvorí rozhranie s vodou.Mineralizácia: je kompletná degradácia organickej zlúčeniny na CO2, H2O v aeróbnych podmienkach a na CH4, CO2 a H2O v anaeróbnych podmienkach. V súvislosti s touto testovacou metódou, ak sa používa rádioaktívne označená zlúčenina, mineralizácia znamená rozsiahlu degradáciu molekuly, počas ktorej sa označený atóm uhlíka kvantitatívne oxiduje alebo redukuje za uvoľnenia príslušného množstva 14CO2 alebo 14CH4.Polčas, t0,5 je čas, za ktorý sa transformuje 50 % testovanej látky, ak sa transformácia dá opísať kinetikou prvého rádu; je nezávislý od koncentrácie.DT50 (Doba odbúrania 50): je čas, za ktorý sa koncentrácia testovanej látky zníži o 50 %.DT75 (Doba odbúrania 75): je čas, za ktorý sa koncentrácia testovanej látky zníži o 75 %.DT90 (Doba odbúrania 90): je čas, za ktorý sa koncentrácia testovanej látky zníži o 90 %.1.3 REFERENČNÉ LÁTKYReferenčné látky by sa mali používať na identifikáciu a kvantifikáciu produktov transformácie spektroskopickými a chromatografickými metódami.1.4 INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKENa meranie miery transformácie sa môže použiť neoznačená alebo izotopom označená testovaná látka, aj keď sa uprednostňuje označený materiál. Označený materiál sa vyžaduje pri skúmaní ciest transformácie a pri stanovení hmotnostnej bilancie. Odporúča sa označenie pomocou 14C, ale môže použiť aj označenie inými izotopami, ako napr. 13C, 15N, 3H, 32P. Značka sa umiestni pokiaľ možno v najstabilnejšej časti(-iach) molekuly [8]. Chemická a/alebo rádiochemická čistota testovanej látky by mala byť aspoň 95 %.Pred uskutočnením testu je potrebné, aby boli k dispozícii tieto informácie:(a) rozpustnosť vo vode (Metóda A.6);(b) rozpustnosť v organických rozpúšťadlách;(c) tlak pár (Metóda A.4) a Henryho konštanta;(d) rozdeľovací koeficient n-oktanol/voda (Metóda A.8);(e) adsorpčný koeficient (Kd, Kf alebo Koc, podľa potreby) (Metóda C.18);(f) hydrolýza (Metóda C.7);(g) disociačná konštanta (pKa) [OECD Guideline 112] (13);(h) chemická štruktúra testovanej látky a pozícia izotopového označenia, v prípade potreby.Poznámka:Zaznamená sa teplota, pri ktorej sa robili tieto merania.Iné užitočné informácie môžu obsahovať údaje o toxicite testovanej látky pre mikroorganizmy, údaje o rýchlej a/alebo potenciálnej biologickej rozložiteľnosti a údaje o aeróbnej a anaeróbnej transformácii v pôde.Je potrebné mať k dispozícii analytické metódy (vrátane extrakčných a purifikačných metód) na identifikáciu a kvantifikáciu testovanej látky a jej produktov transformácie vo vode a v sedimente (pozri oddiel 1.7.2).1.5 PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDYMetóda uvedená v tomto teste využíva systém aeróbnych a anaeróbnych vodných sedimentov (pozri prílohu 1), ktorý umožňuje:(i) meranie miery transformácie testovanej látky v systéme voda-sediment,(ii) meranie miery transformácie testovanej látky v sedimente,(iii) meranie miery mineralizácie testovanej látky a/alebo jej produktov transformácie (ak sa použije testovaná látka označená 14C),(iv) identifikáciu a kvantifikáciu produktov transformácie vo vodnej fáze a fáze sedimentu vrátane hmotnostnej bilancie (ak sa použije označená testovaná látka),(v) meranie distribúcie testovanej látky a jej produktov transformácie medzi dvomi fázami počas inkubačnej doby v tme (aby sa zabránilo, napríklad, rozmnoženiu rias) pri stálej teplote. Polčasy, hodnoty DT50, DT75 a DT90 sa stanovia, ak to umožňujú údaje, ale nesmú sa extrapolovať veľmi dlho od doby experimentu (pozri oddiel 1.2).Aspoň dva sedimenty a ich pridružené vody sú potrebné pre aeróbne a anaeróbne štúdie (7). Môžu sa však vyskytnúť prípady, keď je potrebné použiť viac ako dva vodné sedimenty, napríklad v prípade chemikálie, ktorá sa môže nachádzať v sladkých a/alebo morských vodách.1.6 POUŽITEĽNOSŤ TESTUMetóda je všeobecne použiteľná na všetky chemické látky (neoznačené alebo označené), pre ktoré je k dispozície analytická metóda s dostatočnou presnosťou a citlivosťou. Je použiteľná na mierne prchavé, neprchavé, vo vode rozpustné alebo vo vode zle rozpustné zlúčeniny. Test sa nepoužíva na chemikálie, ktoré sú veľmi prchavé z vody (napr. fumiganty, organické rozpúšťadlá) a teda sa pri experimentálnych podmienkach testu nemôžu uchovať vo vode.Metóda sa doteraz používala na skúmanie transformácie chemikálií v sladkých vodách a sedimentoch, ale v zásade sa dá použiť aj na systémy ústí riek a morské systémy. Nie je vhodná na simulovanie podmienok v tečúcich vodách (napr. rieky) alebo otvoreného mora.1.7 KRITÉRIÁ KVALITY1.7.1 RegeneráciaExtrakcia a analýza minimálne dvoch paralelných vzoriek vody a sedimentu ihneď po pridaní testovanej látky poskytuje prvý dôkaz reprodukovateľnosti analytickej metódy a rovnomerného rozdelenia testovanej látky pri aplikácii. Regenerácie v neskorších stupňoch experimentov sú dané príslušnými hmotnostnými bilanciami (ak sa použije označený materiál). Regenerácie by mali byť v rozsahu od 90 % do 110 % pre označené chemikálie (6) a od 70 % do 110 % pre neoznačené chemikálie.1.7.2 Reprodukovateľnosť a citlivosť analytickej metódyRepredukovateľnosť analytickej metódy (okrem počiatočnej účinnosti extrakcie) na kvantifikovanie testovanej látky a produktov transformácie sa môže overiť paralelnou analýzou rovnakého extraktu vzoriek vody alebo sedimentu, ktorý sa inkuboval dostatočne dlho, aby vznikli produkty tranformácie.Detekčný limit (LOD) analytickej metódy pre testovanú látku a pre produkty transformácie má byť aspoň 0,01 mg·kg-1 vo vode alebo sedimente (ako testovaná látka) alebo 1 % počiatočnej dávky, aplikovanej do testovaného systému, podľa toho ktorá hodnota je nižšia. Je potrebné stanoviť aj kvantifikačný limit (LOQ).1.7.3 Presnosť údajov o transformáciiRegresná analýza koncentrácií testovanej látky v závislosti od času poskytuje príslušné informácie o presnosti transformačnej krivky a umožní výpočet hraníc spoľahlivosti pre polčasy (ak platí kinetika pseudo prvého rádu) alebo hodnôt DT50 a v prípade potreby DT75 a DT90.1.8 OPIS METÓDY1.8.1 Testovaný systém a aparatúraŠtúdia by sa mala vykonať v sklenených nádobách (t. j. fľaše, centrifugačné kyvety), pokiaľ z predbežných informácií (ako napr. rozdeľovací koeficient n-oktanol-voda, sorpčné údaje atď.) nevyplýva, že testovaná látka môže priľnúť na sklo, v takomto prípade sa môže uvažovať o použití alternatívneho materiálu (ako napr. teflón). Ak je známe, že testovaná látka priľne na sklo, môže sa tento problém vyriešiť pomocou jednej alebo viacerých z týchto metód:- stanoviť hmotnosť testovanej látky a produktov transformácie zachytenej na sklo;- zabezpečiť, aby sa umyli rozpúšťadlom všetky sklenené pomôcky na konci testu;- použiť zložené výrobky (pozri tiež oddiel 1.9.2);- použiť väčšie množstvo pomocných rozpúšťadiel na pridávanie testovanej látky do systému; ak sa pomocné rozpúšťadlá používajú, musí to byť pomocné rozpúšťadlo, ktoré nespôsobí solvolýzu testovanej látky.Príklady typickej pokusnej aparatúry, t. j. plynový prietokový systém a systém biometrického typu, sú znázornené v prílohách 2 a 3 (14). Ďalšie užitočné inkubačné systémy sú uvedené v odkaze 15. Konštrukcia pokusnej aparatúry by mala umožniť výmenu vzduchu alebo dusíka a zachytenie prchavých produktov. Rozmery aparatúry musia byť také, aby boli v súlade s požiadavkami testu (pozri oddiel 1.9.1). Prevzdušnenie sa zabezpečí buď jemným prebublávaním alebo prepúšťaním vzduchu alebo dusíka nad povrchom vody. V druhom prípade pre lepšiu distribúciu kyslíka alebo dusíka vo vode sa môže odporúčať jemné miešanie vody zvrchu. Vzduch, zbavený CO2, by sa nemal používať, lebo môže spôsobiť zvýšenie pH vody. V každom prípade narušenie sedimentu nie je želateľné a pokiaľ možno je mu potrebné zabrániť. Mierne prchavé látky by sa mali testovať v systéme biometrického typu jemným premiešaním povrchu vody. Môžu sa použiť aj uzavreté nádoby s plynnou fázou tvorenou atmosférickým vzduchom alebo dusíkom a internými nádobkami na zachytávanie prchavých produktov (16). Je potrebná pravidelná výmena plynnej fázy v aeróbnom teste, aby sa kompenzovala spotreba kyslíka biomasou.Vhodné zachytávače na zachytávanie prchavých produktov transformácie obsahujú okrem iného roztoky hydroxidu draselného alebo hydroxidu sodného v koncentrácii 1 mol·dm-3 pre oxid uhličitý [9] a etylénglykol, etanolamín alebo 2 % parafín v xyléne pre organické zlúčeniny. Prchavé látky, ktoré sa tvoria za anaeróbnych podmienok, ako napr. metán, sa môžu zachytávať, napríklad molekulovými sitami. Takéto prchavé látky sa môžu spaľovať, napríklad na CO2 prepúšťaním plynu cez kremennú trubicu naplnenú CuO pri teplote 900 °C a zachytávaním vzniknutého CO2 v absorbéri s alkalickou látkou (17).Je potrebné laboratórne zariadenie na chemickú analýzu testovanej látky a produktov transformácie (t. j. plynová kvapalinová chromatografia (GLC), vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC), chromatografia na tenkej vrstve (TLC), hmotnostná spektroskopia (MS), plynová chromatografia – hmotnostná spektroskopia (GC-MS), kvapalinová chromatografia – hmotnostná spektrometria (LC-MS), jadrová magnetická rezonancia (NMR) atď.), vrátane detekčných systémov pre rádioaktívne označené a neoznačené chemikálie, podľa potreby. Ak sa používa radioaktívne označený materiál bude potrebný aj kvapalný scintilačný počítač a oxidačné činidlo na spaľovanie (na spaľovanie vzoriek sedimentu na analýzu rádioaktivity).V prípade potreby je potrebné ďalšie bežné laboratórne zariadenie na fyzikálno–chemické a biologické stanovenia (pozri oddiel tabuľka 1, oddiel 1.8.2.2), sklenené nádoby, chemikálie a reagencie.1.8.2 Výber a počet vodných sedimentovMiesta odberu sa zvolia v súlade s cieľom testu v danej situácii. Pri výbere miest odberu sa musia posúdiť predchádzajúce možné vstupy z poľnohospodárstva, priemyslu alebo domácností do spádovej oblasti a horné toky. Sedimenty sa nepoužijú, ak boli kontaminované testovanou látkou alebo jej štrukturálnymi analógmi počas predchádzajúcich 4 rokov.1.8.2.1 Výber sedimentuNa aeróbne štúdie sa zvyčajne používajú dva sedimenty (7). Vybraté dva sedimenty by sa mali odlišovať v obsahu organického uhlíka a textúrou. Jeden sediment by mal mať vysoký obsah organického uhlíka (2,5-7,5 %) a jemnú textúru, druhý sediment by mal mať nízky obsah organického uhlíka (0,5-2,5 %) a hrubú textúru. Rozdiel medzi obsahom organického uhlíka by mal byť zvyčajne aspoň 2 %. "Jemná textúra" je definovaná ako obsah [íl + bahno] [10] > 50 % a "hrubá textúra" je definovaná ako obsah [íl + bahno] < 50 %. Rozdiel v obsahu [íl + bahno] pre dva sedimenty by mal byť zvyčajne aspoň 20 %. V prípadoch keď sa chemikália môže dostať aj do morských vôd, aspoň jeden z týchto systémov voda-sediment by mal pochádzať z mora.Pre striktne anaeróbnu štúdiu sa dva sedimenty (vrátane ich pridružených vôd) odoberú z anaeróbnych zón povrchových vodných telies (7). S obidvomi fázami sediment aj voda sa opatrne manipuluje a prepravujú sa opatrne bez prítomnosti kyslíka.Ďalšie parametre môžu byť dôležité pri výbere sedimentov a je ich potrebné posudzovať podľa jednotlivých prípadov. Napríklad rozsah pH sedimentov by mohol byť dôležitý pri testovaní chemikálií, v prípade ktorých transformácia a/alebo sorpcia môže závisieť od pH. Závislosť sorpcie od pH môže vyjadrovať pKa testovanej látky.1.8.2.2 Charakterizácia vzoriek voda-sedimentKľúčové parametre, ktoré sa musia merať a uviesť v správe (s odkazom na použitú metódu) pre vodu aj sediment a štádium testu, v ktorom sa tieto parametre majú stanoviť sú zosumarizované v ďalej uvedenej tabuľke. Informácie o metódach na stanovenie týchto parametrov sú uvedené odkazoch (18) (19) (20) (21).Podľa okolností je potrebné stanoviť a uviesť v správe aj ďalšie parametre (napr. pre sladkú vodu: častice, zásaditosť, tvrdosť, konduktivitu, NO3/PO4 (pomer a jednotlivé hodnoty); pre sedimenty: katiónovú výmennú kapacitu, kapacitu zadržiavania vody, uhličitany, celkový dusík a fosfor; a pre morské systémy: soľnatosť). Analýza sedimentov a vody na nitrát, sulfát, biologicky dostupné železo a prípadne iné akceptory elektrónov môže byť tiež užitočná pri posudzovaní redoxných podmienok najmä vo vzťahu k anaeróbnej transformácii.Stanovenie parametrov na charakterizáciu vzoriek voda-sediment (7) (22) (23)Parameter | Štádium postupu testu |odber vzoriek v teréne | manipulácia | začiatok aklimatizácie | začiatok testu | v priebehu testu | koniec testu |VodaPôvod/zdroj | x | | | | | |Teplota | x | | | | | |pH | x | | x | x | x | x |TOC (celková koncentrácia organického kyslíka) | | | x | x | | x |koncentrácia O2 [11] | x | | x | x | x | x |Redox potenciál [11] | | | x | x | x | x |SedimentPôvod/zdroj | x | | | | | |Hĺbka vrstvy | x | | | | | |pH | | x | x | x | x | x |Distribúcia veľkosti častíc | | x | | | | |TOC (celková koncentrácia organického kyslíka) | | x | x | x | | x |Mikrobiálna biomasa [12] | | x | | x | | x |Redox potenciál [11] | Pozorovanie (farba/ vôňa) | | x | x | x | x |1.8.3 Odber, manipulácia a skladovanie1.8.3.1 OdberOdber vzoriek sedimentu by sa mal robiť podľa návrhu pokynov ISO pre odber vzoriek spodného sedimentu (8). Vzorky sedimentu by sa mali odobrať z celkovej vrchnej vrstvy 5 až 10 cm sedimentu. Pridružené vody by sa mali odobrať z rovnakého miesta alebo lokality a v rovnaký čas ako sediment. Pre anaeróbnu štúdiu by sa mali odobrať vzorky sedimentu a pridruženej vody a dopraviť za neprítomnosti kyslíka (28) (pozri oddiel 1.8.2.1). Niektoré zariadenia na odber vzoriek sú uvedené v literatúre (8) (23).1.8.3.2 ManipuláciaSediment sa oddelí od vody filtráciou a tento sediment sa za mokra preoseje na site s otvormi 2 mm s použitím nadbytku vody z lokality a voda z lokality sa potom odstráni. Potom sa známe množstvá sedimentov a vody zmiešajú v požadovanom pomere (pozri oddiel 1.9.1) v inkubačných bankách a pripravia na aklimatizačné obdobie (pozri oddiel 1.8.4). V prípade anaeróbnej štúdie sa všetky kroky pri manipulácii musia uskutočňovať za neprítomnosti kyslíka (29) (30) (31) (32) (33).1.8.3.3 UchovávanieDôrazne sa odporúča použiť čerstvo odobraté vzorky sedimentu a vody, ale ak je potrebné skladovanie, sediment a voda sa preoseje, ako je uvedené vyššie a skladujú spolu zaliate vodou (6-10 cm vodná vrstva), v tme, pri 4 ± 2 °C [13] maximálne 4 týždne (7) (8) (23). Vzorky na použitie v aeróbnych štúdiách sa skladujú za voľného prístupu vzduchu (napr. v otvorených nádobách), zatiaľ čo vzorky na použitie v anaeróbnych štúdiách za neprítomnosti kyslíka. Počas prepravy a skladovania nesmie sediment ani voda zamrznúť a sediment tiež nesmie vyschnúť.1.8.4 Príprava vzoriek sedimentu/vody na testPred pridaním testovanej látky by sa mala uskutočniť aklimatizácia každej vzorky sedimentu/vody, ktorá sa umiestni do inkubačnej nádoby, ktorá sa má použiť v základnom teste, a aklimatizácia sa uskutoční za presne rovnakých podmienok ako inkubácia v teste (pozri oddiel 1.9.1). Doba aklimatizácie je čas potrebný na dosiahnutie primeranej stability systému vyjadrenej hodnotou pH, koncentráciou kyslíka vo vode, redox potenciálom sedimentu a vody a makroskopickou separáciou fáz. Doba aklimatizácie by mala zvyčajne trvať medzi jedným a dvomi týždňami a nemala by presiahnuť štyri týždne. Výsledky stanovení, uskutočnené počas tohto obdobia, by sa mali zaznamenať.1.9 VYKONANIE TESTU1.9.1 Testovacie podmienkyTest by sa mal uskutočniť v inkubačnom zariadení (pozri oddiel 1.8.1) s pomerom objemu voda/sediment medzi 3:1 a 4:1 a vrstvou sedimentu 2,5 cm (± 0,5 cm) [14]. Odporúča sa minimálne množstvo 50 g sedimentu (suchá hmotnosť) na inkubačnú nádobu.Test by sa mal uskutočniť v tme pri stálej teplote v rozmedzí 10 až 30 °C. Teplota (20 ± 2) °C je primeraná. V prípade potreby sa môže v jednotlivých prípadoch dodatočne uvažovať o nižšej teplote (napr. 10 °C) v závislosti od informácií, ktoré sa na základe testu požadujú.Inkubačnú teplotu je potrebné sledovať a zaznamenávať.1.9.2 Spracovanie a aplikácia testovanej látkyPoužíva sa jedna testovacia koncentrácia chemikálie [15]. Pre chemikálie na ochranu rastlín, ktoré sa priamo aplikujú do vodných telies, maximálna dávka, uvedená na označení, je maximálna aplikačná dávka, ktorá sa vypočíta vo vzťahu na povrch vody v testovacej nádobe. Vo všetkých ostatných prípadoch by koncentrácia, ktorá sa má použiť, mala vychádzať z výpočtov environmentálnych emisií. Je potrebné venovať pozornosť na zabezpečenie toho, aby sa na charakterizáciu cesty transformácie a tvorby a rozkladu produktov transformácie použila primeraná koncentrácia testovanej látky. Môže byť potrebné použiť vyššie dávky (napr. 10-násobné) v situáciách, keď sa koncentrácie testovanej látky približujú k detekčným limitom na začiatku štúdie a/alebo sa hlavné produkty transformácie nedajú jasne stanoviť, keď ich podiel činí 10 % aplikačnej dávky testovanej látky. Ak sa však použijú vyššie testovacie koncentrácie, nemali by mať významný nepriaznivý účinok na mikrobiálnu aktivitu systému voda–sediment. Aby sa dosiahla konštantná koncentrácia testovanej látky v nádobách rôznych rozmerov, môže byť potrebné zvážiť prispôsobenie na množstvo použitého materiálu na základe hĺbky vodného stĺpca v nádobe vo vzťahu k hĺbke vody v teréne (predpokladá sa, že je 100 cm, ale môžu sa použiť iné hĺbky). Príklady výpočtu pozri v prílohe 4.V ideálnom prípade by sa mala testovaná látka aplikovať ako vodný roztok do vodnej fázy testovaného systému. Ak je to nevyhnuté, povoľuje sa použiť nízke množstvá vodou zmiešateľných rozpúšťadiel (ako napr. acetón, etanol) na aplikáciu a distribúciu testovanej látky, ale nemali by presiahnuť 1 objemových % a nemali by mať nepriaznivé účinky na mikrobiálnu aktivitu testovaného systému. Pri príprave vodného roztoku testovanej látky je potrebné dávať pozor – na zabezpečenie úplnej homogenity môže byť potrebné použiť stĺpcové usporiadanie generátora a premiešanie. Po pridaní vodného roztoku do testovaného systému sa odporúča jemné premiešanie vodnej fázy tak, aby sa čo najmenej narušil sediment.Použitie zložených prípravkov sa bežne neodporúča, pretože zložky prípravku môžu ovplyvniť distribúciu testovanej látky a/alebo produktov transformácie medzi vodnou fázou a fázou sedimentu. Použitie zloženého materiálu však môže byť vhodnou alternatívou, napríklad v prípade vo vode ťažko rozpustných testovaných látok.Počet inkubačných nádob závisí od počtu odberov (pozri oddiel 1.9.3). Je potrebné použiť dostatočný počet testovaných systémov tak, aby sa na každý odber mohli použiť dva systémy. Ak sa používajú kontrolné jednotky každého systému voda/sediment, nemali by sa ošetrovať testovanou látkou. Kontrolné jednotky sa môžu použiť na stanovenie mikrobiálnej biomasy sedimentu a celkového organického uhlíka vody a sedimentu na konci štúdie. Dve kontrolné jednotky (t. j. jedna kontrolná jednotka každého vodného sedimentu) sa môže použiť na sledovanie požadovaných parametrov v sedimente a vode počas doby aklimatizácie (pozri tabuľku v oddiele 1.8.2.2). Dve ďalšie kontrolné jednotky sa musia použiť v prípade, keď sa testovaná látka aplikuje s použitím rozpúšťadla na stanovenie nepriaznivých účinkov na mikrobiálnu aktivitu testovaného systému.1.9.3 Trvanie testu a odber vzoriekTrvanie experimentu by zvyčajne nemalo byť dlhšie ako 100 dní (6), a malo by pokračovať až do stanovenia cesty degradácie a modelu distribúcie voda/sediment, alebo kým sa transformáciou rozloží a/alebo vyprchá 90 % testovanej látky. Malo by sa vykonať aspoň šesť odberov (vrátane času nula) s nepovinnou predbežnou štúdiou (pozri oddiel 1.9.4), ktorá sa použije na stanovenie vhodného režimu odberov vzoriek a trvania testu, pokiaľ nebudú k dispozícii dostačujúce údaje o testovanej látke z predchádzajúcich štúdií. Pre hydrofóbne testované látky môžu byť potrebné ďalšie odbery v priebehu počiatočného štádia štúdie, aby sa stanovila miera distribúcie medzi vodnou fázou a fázou sedimentu.V dobe príslušných odberov sa všetky inkubačné nádoby (paralelne) odoberú na analýzu. Sediment a voda nad ním sa analyzujú samostatne [16]. Povrchová voda by sa mala opatrne odstrániť tak, aby sa čo najmenej narušil sediment. Extrakcia a charakterizácia testovanej látky a produkty transformácie by sa mali uskutočniť podľa príslušných analytických postupov. Je potrebné venovať pozornosť, aby sa odstránil materiál, ktorý sa môže naadsorbovať na inkubačnú nádobu alebo na rúrky, ktoré slúžia na prepojenie pri zachytávaní prchavých látok.1.9.4 Nepovinný predbežný testAk sa trvanie a režim odberov vzoriek nedá určiť z iných príslušných štúdií o testovanej látke, môže sa usúdiť, že je vhodné vykonať nepovinný predbežný test, ktorý by sa uskutočnil pri rovnakých testovacích podmienkach, aké sú navrhnuté pre konečnú štúdiu. Príslušné experimentálne podmienky a výsledky z predbežného testu, ak sa uskutoční, by sa mali stručne zaznamenávať.1.9.5 Merania a analýzaKoncentrácia testovanej látky a produktov transformácie pri každom odbere vo vode a sedimente by sa mala sa stanovť a zaznamenať (ako koncentrácia a ako percentuálny podiel použitého množstva). Vo všeobecnosti by sa mali identifikovať produkty transformácie stanovené pri ≥ 10 % použitej rádioaktivity v celom systéme voda-sediment pri ktoromkoľvek odbere, pokiaľ neexistuje iný riadne odôvodnený postup. Produkty transformácie, pre ktoré sa koncentrácie trvale zvyšujú počas štúdie, by sa taktiež mali posúdiť na identifikáciu, aj keď ich koncentrácie nepresahujú limity uvedené vyššie, lebo to môže byť dôkazom perzistencie. Toto je potrebné posúdiť na základe jednotlivých prípadov s odôvodneniami, ktoré sa uvedú v správe.Výsledky zo systémov na zachytávanie plynov/prchavých látok (CO2 a iné, t. j. prchavé organické látky) by sa mali zaznamenať pri každom odbere. Mala by sa zaznamenať miera mineralizácie. Neextrahovateľné (viazané) rezíduá v sedimente sa zaznamenajú pri každom odbere.2. ÚDAJE2.1 SPRACOVANIE VÝSLEDKOVCelková hmotnostná bilancia alebo regenerácia (pozri oddiel 1.7.1) pridanej rádioaktivity sa vypočíta pri každom odbere. Výsledky sa zaznamenajú ako percentuálna hodnota pridanej rádioaktivity. Distribúcia rádioaktivity medzi vodou a sedimentom sa zaznamenáva ako koncentrácie a percentuálne hodnoty pri každom odbere.Polčas, DT50 a v prípade potreby DT75 a DT90 testovanej látky sa vypočíta spolu s ich hranicami spoľahlivosti (pozri oddiel 1.7.3). Informácie o miere rozptylu testovanej látky vo vode a sedimente sa získajú na základe použitia príslušných vyhodnocovacích nástrojov. K nim môže patriť použitie kinetiky pseudo prvého rádu, empirické techniky (konštrukcia krivky bod po bode), ktoré používajú grafické alebo numerické riešenia a komplexnejšie vyhodnotenia s použitím, napríklad jednoduchých alebo niekoľkonásobných kazetových modelov. Ďalšie informácie je možné získať z príslušnej uverejnenej literatúry (35) (36) (37).Všetky prístupy majú svoje silné a slabé stránky a odlišujú sa v komplexnosti. Predpoklad kinetiky prvého rádu môže byť prílišným zjednodušením procesov degradácie a distribúcie, ale ak je možné, poskytuje hodnotu (rýchlostnú konštantu alebo polčas), ktorá je ľahko zrozumiteľná a má zmysel pre simulačné modelovanie a výpočty očakávaných environmentálnych koncentrácií. Výsledkom empirických prístupov alebo lineárnych transformácií môže byť lepšie prispôsobenie kriviek údajom a preto umožňujú lepšie stanovenie polčasov, hodnôt DT50 a v prípade potreby DT75 a DT90. Použitie odvodených konštánt je však obmedzené. Kazetové modely môžu vytvoriť množstvo užitočných konštánt, ktoré majú význam pri hodnotení rizika, ktoré popisuje mieru degradácie v rôznych kazetách a distribúciu chemikálie. Používajú sa na stanovenie rýchlostných konštánt na tvorbu a degradáciu hlavných produktov transformácie. V každom prípade sa zvolená metóda musí zdôvodniť a experimentátor demonštrovať graficky a/alebo štatisticky správnosť prispôsobenia.3. PODÁVANIE SPRÁV3.1 SPRÁVA O TESTESpráva musí obsahovať tieto informácie:Testovaná látka:- všeobecný názov, chemický názov, číslo CAS, štruktúrny vzorec (uvádzajúci pozíciu označenia(-í), ak sa použije rádioaktívne označený materiál) a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti;- čistota (nečistoty) testovanej látky;- rádiochemická čistota označenej chemikálie a molárna aktivita (v prípade potreby);Referenčné látky:- chemický názov a štruktúra referenčných látok použitých na charakterizáciu a/alebo identifikáciu produktov transformácieTestované sedimenty a vody:- umiestnenie a popis miesta (miest) odberu vzoriek vodného sedimentu vrátane, ak je to možné, predchádzajúcej kontaminácie;- všetky informácie týkajúce sa odberu, skladovania (ak sa uskutočnilo) a aklimatizácie systémov voda–sediment;- charakteristiky vzoriek voda-sediment, ako sú uvedené v tabuľke v oddiele 1.8.2.2.Testovacie podmienky:- použitý systém testovania (napr. prietokový, biometrický, spôsob ventilácie, metóda miešania, objem vody, hmotnosť sedimentu, výška vodnej vrstvy a vrstvy sedimentu, rozmer testovacích nádob atď.)- aplikácia testovanej látky na testovaný systém: použitá testovaná koncentrácia, počet paralelných a kontrolných vzoriek, spôsob aplikácie testovanej látky (napr. prípadného použitia rozpúšťadla), atď.- inkubačná teplota;- počet odberov;- extrakčné metódy a účinnosti, ako aj analytické metódy a detekčné limity;- metódy na charakterizáciu/identifikáciu produktov transformácie;- odchýlky od protokolu testu alebo testovacích podmienok počas štúdie.Výsledky:- číselné hodnoty nespracovaných údajov reprezentatívnych analýz (všetky nespracované údaje sa musia uchovávať v SLP archíve);- opakovateľnosť a citlivosť použitých analytických metód;- miera regenerácie (percentuálne hodnoty pre platnú štúdiu sú uvedené v oddiele 1.7.1);- tabuľky s výsledkami vyjadrené ako % aplikovanej dávky a v mg·kg-1 vo vode, sedimente a celkovom systéme (iba %) pre testovanú látku a v prípade potreby pre produkty transformácie a neextrahovateľnú rádioaktivitu;- hmotnostná bilancia v priebehu a na konci štúdií;- grafické znázornenie transformácie vo vodných frakciách a frakciách sedimentu a v celkovom systéme (vrátane mineralizácie);- miera mineralizácie;- polčas, hodnoty DT50 a v prípade potreby DT75 a DT90 pre testovanú látku a v prípade potreby pre hlavné produkty transformácie vrátane hraníc spoľahlivosti vo vode, sedimente a celkovom systéme;- vyhodnotenie kinetiky transformácie testovanej látky a v prípade potreby hlavných produktov transformácie;- údaje o cestách transformácie, v prípade potreby;- diskusia k výsledkom.4. ODKAZY(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.(2) Commission for registration of pesticides: Application for registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United-Kingdom.(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) - Anaerobic and aerobic. Canada. pp 35-37.(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism.(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality - Sampling - Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments.(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080.(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC - Pests and Diseases, 3B-4, 149-158.(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631-637.(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C-labelled model surfactants. Water Research 21, 661-667.(18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.(19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (17th edition). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. Longman.(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chemistry 44, 1038-1039.(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop "A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests", 3-4 July 1991.(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858-2868.(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329-338.(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203.(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation extraction method.(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13-21.(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857.(30) Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550.(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegradation tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499-1509.(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597-3603.(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090.(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961-968.(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer, 39, 187-203.(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer, 33, 47-60.(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference - Pest and Diseases, pp 1349-1354.[1] Napríklad, ak testovaná látka obsahuje jeden kruh, označenie tohto kruhu je potrebné; ak testovaná látka obsahuje dva alebo viac kruhov, môžu byť potrebné samostatné štúdie na hodnotenie osudu každého označeného kruhu a na získanie príslušných informácií o tvorbe produktov transformácie.[2] Charakteristiku retencie vody v pôde je možné merať ako kapacitu poľa, ako kapacitu zadržiavania vody alebo ako sací tlak vody (pF) Na vysvetlenie pozri prílohu 1. Je potrebné uviesť v správe z testu, či charakteristiky retencie vody a objemová hmotnosť pôd boli stanovené v nenarušených vzorkách z terénu alebo narušených (spracovaných) vzorkách.[3] Z výsledkov posledného výskumu vyplýva, že vzorky z miernych oblastí sa tiež môžu skladovať pri –20 °C viac ako tri mesiace (28) (29) bez významných strát mikrobiálnej aktivity.[4] Pôda nemá byť ani príliš mokrá, ani príliš suchá, aby sa zachovalo primerané prevzdušnenie a výživa pôdnej mikroflóry. Odporúčané vlhkosti pôdy pre optimálny mikrobiálny rast sú v rozsahu 40-60 % kapacity zadržiavania vody (WHC) a od 0,1– 0,33 bar (6). Posledne uvedený rozsah zodpovedá rozsahu pF 2,0 – 2,5. Typické obsahy vlhkostí rôznych typov pôdy sú uvedené v prílohe 2.[5] Aeróbne podmienky prevládajú v povrchových pôdach a dokonca v podpovrchových pôdach, ako je uvedené vo výskumnom projekte, ktorý sponzoruje EÚ [K. Takagi et al. (1992). Mikrobiálna rozmanitosť a aktivita v podloží: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, Sweden]. Anaeróbne podmienky sa môžu vyskytnúť iba príležitostne počas zaplavenia pôd po dlhotrvajúcich dažďoch alebo v podmienkach ryžových polí na poliach s ryžou.[6] Aeróbne štúdie by sa mohli ukončiť pred uplynutím 120 dní za predpokladu, že sa zreteľne dosiahne konečná cesta transformácie a konečná mineralizácia v tom čase. Ukončenie testu je možné po 120 dňoch, alebo keď sa aspoň 90 % testovanej látky transformuje, ale iba ak sa vytvorí aspoň 5 % CO2.[7] Výpočet počiatočnej koncentrácie v mieste s použitím tejto rovnice:Ctlamg/kgtla = Akg/ha·106mg/kg1m·104m2/ha·dkgtla/m3Cpôdy = počiatočná koncentrácia v pôde [mg.kg-1]A = aplikačná dávka [kg.ha-1]; l = hrúbka pôdnej vrstvy poľa [m]; d = suchá objemová hmotnosť pôdy [kg.m-3].Spravidla aplikačná dávka 1 kg.ha-1 vytvára koncentráciu 1 mg.kg-1 v 10 cm vrstve (pri objemovej hmotnosti 1 g.cm-3).[1] Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.[2] pF = logaritmus cm vodného stĺpca.[3] 1 bar = 105 Pa.[4] Zodpovedá približnému obsahu vody 10 % v piesku, 35 % v hline a 45 % v íle.[5] Kapacita poľa nie je konštantná, ale mení sa s typom pôdy medzi pF 1,5 a 2,5.[1] Kapacita zadržiavania vody.[8] Napríklad, ak látka obsahuje jeden kruh, označenie tohto kruhu je potrebné; ak testovaná látka obsahuje dva alebo viac kruhov, samostatné štúdie môžu byť potrebné na hodnotenie osudu každého označeného kruhu a na získanie príslušných informácií o tvorbe produktov transformácie.[9] Keďže tieto alkalické absorpčné roztoky tiež absorbujú oxid uhličitý zo vzduchu pri prevzdušňovaní a ktorý sa tvorí respiráciou pri aeróbnych pokusoch, musia sa v pravidelných intervaloch vymieňať, aby sa zabránilo ich saturácii a tým strate ich absorpčnej kapacity.[10] [íl + bahno] je minerálna frakcia sedimentu veľkosťou častíc < 50 μm[11] Z posledných výsledkov výskumu vyplýva, že merania koncentrácií kyslíka vo vode a redox potenciálov nemá mechanistickú, ani prognostickú hodnotu, pokiaľ ide o rast a vývoj mikrobiálnych populácií v povrchových vodách (24) (25). Stanovenie biochemickej spotreby kyslíka (BSK, pri odbere vzoriek v teréne, na začiatku a konci testu) a koncentrácií mikro/makro živín Ca, Mg a Mn (na začiatku a konci testu) vo vode a meranie celkového N a celkového P v sedimentoch (pri odbere vzoriek v teréne a na konci testu) môžu byť lepšími nástrojmi na vyjadrenie a posúdenie miery a ciest aeróbnej biotransformácie.[12] Metóda rýchlosti mikrobiálnej respirácie (26), fumigačná metóda (27) alebo stanovenie počtu mikroorganizmov (napr. baktérie, aktinomycéty, plesne a celkové kolónie) pre aeróbne štúdie; miera metanogenézy pre anaeróbne štúdie.[13] Posledné štúdie ukázali, že skladovanie pri 4 °C môže viesť k poklesu obsahu organického uhlíka sedimentu, ktorý môže mať prípadne za dôsledok zníženie mikrobiálnej aktivity (34).[14] Posledné štúdie ukázali, že skladovanie pri 4 °C môže viesť k poklesu obsahu organického uhlíka sedimentu, ktorý môže mať prípadne za dôsledok zníženie mikrobiálnej aktivity (34).[15] Test s druhou koncentráciou môže byť užitočný pre chemikálie, ktoré sa dostanú do povrchových vôd rôznymi cestami vstupu, výsledkom čoho sú značne rozdielne koncentrácie, pokiaľ sa nižšia koncentrácia dá analyzovať s dostatočnou presnosťou.[16] V prípadoch, keď môže ľahko dôjsť k rýchlej reoxidácii anaeróbnych produktov transformácie, je potrebné zachovať anaeróbne podmienky počas odberu vzoriek a analýzy.--------------------------------------------------