CELEX: 51991PC0304
Language: nl
Date: 1991-07-30
Title: VOORSTEL VOOR EEN VERORDENING ( EEG ) VAN DE RAAD TOT VASTSTELLING VAN COMMUNAUTAIRE MAATREGELEN VOOR DE BESTRIJDING VAN AVIAIRE INFLUENZA

COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN
                                     C0M(91) 304 def.
                                     Brussel, 30 juli 1991
                        Voorstel voor een
                  VERORDENING (EEG) VAN DE RAAD
         tot vaststelling van communautaire maatregelen
            voor de bestrijding van aviaire influenza
                  (door de Commissie ingediend)
 ---pagebreak---  ---pagebreak---                                           --fUo-
                                       TQEWIÇHTlNg
   Aviaire influenza Is» in zijn sterk pathogène vorm, een besmettelijke en gevaar-
   lijke pluimveeziekte. De ziekte wordt veroorzaakt door een virus dat sterk kan
   variëren inzake pathogen!te it en Inzake klinische symptomen bij de voor deze
   ziekte vatbare diersoorten. De ziekte is over de gehele wereld verspreid en het
   virus kan worden versleept door migrerende vogels, vooral bepaalde migrerende
   watervogels.
   Krachtens artikel 19 van Richtlijn 90/539/EEG van de Raad van 15 oktober 1990 tot
   vaststelling van veterinairrechtelijke voorschriften voor het intracommunautaire
   handelsverkeer en de invoer uit derde landen van pluimvee en broedeierend)
   moeten vóór 1 Juli 1991 voorschriften voor de bestrijding van aviaire influenza
   zijn vastgesteld.
   De voorgestelde maatregelen hebben ten doel aviaire influenza uit te roeien en
   verspreiding ervan te voorkomen in geval van een uitbraak. Daartoe wordt stamping
   out toegepast, al dan niet in combinatie met vaccinatie, en worden alle verplaat-
   singen van pluimvee, pluimveeprodukten, voertuigen en alle andere stoffen waar-
   door het virus van aviaire influenza kan worden overgedragen, zorgvuldig gecon-
   troleerd. Zodra de aanwezigheid van aviaire influenza wordt vermoed, moet het
   nodige worden gedaan om onmiddellijk doeltreffende maatregelen te kunnen nemen.
   Met het oog op dergelijke maatregelen zijn in dit voorstel een aantal verplich-
   tingen vastgesteld voor de Lid-Staten; zij moeten met name :
   - ervoor zorgen dat een onderzoek wordt ingesteld om de aanwezigheid van aviaire
      influenza bij pluimvee dat ervan wordt verdacht met de ziekte te zijn besmet,
     te bevestigen of uit te sluiten;
   - bedrijven onder toezicht plaatsen en verplaatsingen uit en naar de bedrijven
     verbieden tijdens de periode waarin, in verband met de vermoedelijke besmetting
     met aviaire influenza, toezicht wordt gehouden;
   - besmette vogels doden en vernietigen wanneer de besmetting met aviaire
      i nfIuenza i s bevest igd;
   (1) PB nr. L 303 van 31.10.1990, blz.   6.
i)
 ---pagebreak---                                        -l~
- een grondig epizoötiologisch onderzoek instellen wanneer besmetting met
  aviaire influenza wordt vermoed en bevestigd;
- een beschermingsgebied (3 km) en een toezichtgebied (10 km) instellen rond de
  besmette bedrijven;
- laboratoria aanwijzen die de voor een correcte uitvoering van de bestrijdings-
  maatregelen vereiste technische assitentie moeten verlenen;
- de Commissie in kennis stellen van de vaccinatieprogramma's;
- een rampenplan opstellen.
 ---pagebreak---                                        - Zb+o ~
                                Voorstel voor een
                          Verordening (EEG) van de Raad
                                   van
                   tot vaststelling van communautaire maatregelen
                      voor de bestrijding van aviaire influenza
DE RAAD VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,
Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap,
 inzonderheid op artikel 43,
Gezien het voorstel van de Commissie,
Gezien het advies van het Europese Parlement,
Gezien het advies van het Economisch en Sociaal Comité,
Overwegende dat pluimvee is opgenomen in de lijst in bijlage II bij het Verdrag;
dat het in de handel brengen van pluimvee een aanzienlijke bron van inkomsten is
voor de landbouwbevolking;
Overwegende dat op communautair niveau moet worden bepaald welke bestrijdings-
maatregelen in geval van een uitbraak van aviaire influenza in zijn sterk patho-
gène vorm, veroorzaakt door een influenzavirus met specifieke kenmerken en hierna
"aviaire influenza" genoemd, moeten worden getroffen, ten einde de normale ont-
wikkeling van de pluimveesector te garanderen en bij te dragen tot de bescherming
van de diergezondheid in de Gemeenschap;
Overwegende dat een uitbraak van aviaire influenza zich zeer snel kan ontwik-
kelen tot een epizoötie die een zodanige sterfte veroorzaakt en een zodanig
verstorend effect heeft dat de rendabiliteit van de gehele pluimveehouderij
daardoor ernstig door kan worden geschaad;
 ---pagebreak---                                        - 2 tex
Overwegende dat, wanneer de aanwezigheid van de ziekte wordt vermoed, maat-
regelen moeten worden genomen om, zodra het vermoeden wordt bevestigd, de ziekte
onmiddellijk en doeltreffend te kunnen bestrijden;
Overwegende dat verspreiding van de ziekte van meet af aan moet worden voorkomen
door nauwlettend toezicht te houden op de verplaatsingen van dieren en op het
gebruik van mogelijk verontreinigde produkten, en, indien nodig, door inenting;
Overwegende dat diagnose van de ziekte moet plaatsvinden onder toezicht van de
bevoegde laboratoria, waarbij een communautair referent ie laboratorium voor de
coördinatie dient te zorgen;
Overwegende dat gemeenschappelijke maatregelen voor de bestrijding van aviaire
influenza de grondslag vormen voor de handhaving van een uniforme gezondheids-
status;
Overwegende dat aan de Commissie opdracht moet worden gegeven de nodige
uitvoeringsbepalingen vast te stellen,
HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD
                                    Artikel 1
1. Bij deze verordening worden de communautaire bestrijdingsmaatregelen vastge-
   steld die moeten worden toegepast wanneer aviaire influenza uitbreekt bij
   pluimvee, onverminderd de communautaire voorschriften voor het intracommunau-
   taire handelsverkeer.
2. Deze verordening is niet van toepassing wanneer aviaire influenza wordt gecon-
   stateerd bij andere vogels; in dat geval evenwel stellen de Lid-Staten de
   Commissie in kennis van de eventueel door hen getroffen maatregelen.
 ---pagebreak---                                         - 3 -
                                      Artikel 2
 1. In het kader van deze verordening zijn, voor zover nodig, de definities van
    toepassing die zijn vastgesteld in artikel 2 van Richtlijn 90/539/EEG van de
    Raad tot vaststelling van veterinairrechtelijke voorschriften voor het intra-
    communautair handelsverkeer en de uitvoer uit derde landen van pluimvee en
    broedeieren^ 1 ).
2. Voorts wordt verstaan onder :
    a) besmet pluimvee :
       - alle pluimvee waarbij de aanwezigheid van aviaire influenza als omschre-
         ven in blij age I, officieel is bevestigd door middel van een onderzoek in
         een erkend laboratorium, of
       - ingeval één of meer nieuwe uitbraken volgen, alle pluimvee waarbij kli-
         nische symptomen of, na het slachten, laesies zijn geconstateerd die op
         aviaire influenza wijzen-,
    b) van besmetting verdacht pluimvee : alle pluimvee dat klinische symptomen
       of, na het slachten, laesies vertoont van zodanige aard dat op goede gron-
       den besmetting met aviaire influenza kan worden vermoed, of pluimvee waar-
       bij de aanwezigheid van influenza-A-virus, subtype H5 of H7, is aangetoond;
    c) van verontreiniging verdacht pluimvee : alle pluimvee dat rechtstreeks of
       onrechtstreeks in contact kan zijn geweest met het virus van aviaire
       influenza of met het influenza-A-virus, subtype H5 of H7;
    d) bevoegde autoriteit : de daartoe door de nationale overheid van het betrok-
       ken land aangewezen veterinaire autoriteit, die in het kader van deze ver-
       ordening rechtstreeks onder de nationale overheid ressorteert en ook via
       die overheid verslag uitbrengt;
   e) off iciële dierenarts : de door de bevoegde autoriteit van de Lid-Staat aan-
       gewezen dierenarts.
(1) PB nr. L 303 van 31.10.1990, blz. 6.
 ---pagebreak---                                         - 4 -
                                      Artikel 3
Telkens wanneer besmetting met aviaire influenza wordt vermoed, dient daarvan on-
middellijk aangifte te worden gedaan aan de bevoegde autoriteit.
                                     Artikel 4
1. Wanneer pluimvee ervan wordt verdacht met aviaire influenza te zijn besmet of
   verontreinigd, stelt de officiële dierenarts onverwijld een onderzoek in om na
   te gaan of de ziekte al dan niet aanwezig is, waarbij hij er met name voor
   moet zorgen dat de nodige monsters voor laboratoriumonderzoek worden genomen.
2. Zodra van het vermoeden van besmetting aangifte is gedaan, laat de bevoegde
   autoriteit het bedrijf onder officieel toezicht plaatsen en eist zij met name
   dat :
   a) voor alle categorieën pluimvee op het bedrijf per categorie wordt opgete-
      kend hoeveel dieren zijn gestorven, hoeveel dieren klinische symptomen
       vertonen en hoeveel dieren geen symptomen vertonen. Deze gegevens moeten
      worden bijgewerkt en desgevraagd worden overgelegd en ziJ kunnen bij elk
       inspectiebezoek worden gecontroleerd;
   b) alle pluimvee op het bedrijf wordt geïsoleerd in de lokalen waarin het is
      gehuisvest of op een andere daarvoor geschikte plaats, en geen contact
      heeft met andere vogels;
   c) geen pluimvee op het bedrijf wordt binnengebracht of van het bedrijf wordt
      afgevoerd;
   d) behoudens toestemming van de officiële dierenarts,
      - elke verplaatsing van personen, van andere dieren en van voertuigen van
         en naar het bedrijf wordt verboden,
      - het afvoeren uit het bedrijf van vlees of kadavers van pluimvee, van
         diervoeders, van materiaal, van afvallen, van strooisel of van andere
        objecten waardoor het virus van aviaire influenza kan worden overgedra-
         gen, wordt verboden;
 ---pagebreak---                                               - 5 -
   e) geen eieren van het bedrijf worden afgevoerd, met uitzondering van voor
       consumptie bestemde eieren die ten genoegen van de officiële dierenarts
       zi Jn ontsmet;
   f) wordt gezorgd voor de nodige ontsmettingsvoorzieningen bij de in- en uit-
       gangen van de gebouwen waar het pluimvee is gehuisvest, en van het bedrijf
       zelf;
   g) een epizoötiologisch onderzoek wordt verricht overeenkomstig artikel 7.
3. Totdat de in lid 2 genoemde officiële maatregelen zijn vastgesteld, doet de
   eigenaar of houder van pluimvee waarbij de aanwezigheid van de ziekte wordt
   vermoed, alles wat redelijkerwijze mogelijk is om aan het bepaalde in lid 2,
   sub    b ) , c ) , d) en e ) , te voldoen.
4. De bevoegde autoriteit kan alle in lid 2 genoemde maatregelen ook doen gelden
   voor andere bedrijven, wanneer         in verband met de ligging ervan, de plaatse-
   lijke situatie of de contacten met het bedrijf waar de ziekte vermoedelijk
   aanwezig is, verontreiniging moet worden gevreesd.
5. De in de leden 2, 3 en 4 bedoelde maatregelen worden pas opgeheven wanneer de
   officiële dierenarts de vermoedelijke aanwezigheid van aviaire influenza heeft
   weerlegd.
                                            Artikel 5
1. Zodra de aanwezigheid van aviaire influenza op een bedrijf officieel is
   bevestigd, eist de bevoegde autoriteit dat behalve de in artikel 4, lid 2,
   genoemde maatregelen, ook de volgende maatregelen worden getroffen :
   a) alle op het bedrijf aanwezige pluimvee moet onmiddellijk ter plaatse worden
       afgemaakt. Alle gestorven dieren, alle afgemaakte dieren en alle eieren op
       het bedrijf moeten worden vernietigd. Bij het afmaken en vernietigen moet
       verspreiding van de ziekte zoveel mogelijk worden voorkomen;
 ---pagebreak---                                        - 6 -
   b) alle stoffen of afvallen, met name voeder, strooisel en mest, die mogelijk
       zijn verontreinigd, moeten worden vernietigd of worden behandeld; deze
       behandeling, die moet worden uitgevoerd overeenkomstig de instructies van
       de officiële dierenarts, moet garanderen dat het eventueel aanwezige virus
       van aviaire influenza wordt vernietigd;
   c) wanneer pluimvee tijdens de vermoedelijke incubatieperiode van de ziekte is
      geslacht, moet het vlees daarvan zoveel mogelijk worden opgespoord en ver-
      niet igd;
   d) broedeieren die gedurende de vermoedelijke incubatieperiode van de ziekte
      van het bedrijf zijn afgevoerd, moeten worden opgespoord en vernietigd; als
      die eieren reeds zijn uitgekomen, moet het betrokken pluimvee onder offi-
      cieel toezicht worden geplaatst; consumptie-eieren die gedurende de vermoe-
      delijke incubatieperiode van de ziekte zijn gelegd en die reeds van het
      bedrijf zijn afgevoerd, moeten in de mate van het mogelijke worden opge-
      spoord en vernietigd;
   e) na uitvoering van de sub a) genoemde werkzaamheden moeten de gebouwen waar
      het betrokken pluimvee is gehuisvest, alsmede de omgeving daarvan, de ge-
      bruikte vervoermiddelen en alle ander materieel dat kan zijn verontreinigd,
      worden schoongemaakt en ontsmet overeenkomstig artikel 11;
   f) na uitvoering van de sub e) genoemde werkzaamheden, moet een leegstand van
      ten minste 21 dagen in acht worden genomen voordat weer pluimvee op het
      bedrijf wordt binnengebracht;
   g) er moet een epizoötiologisch onderzoek worden verricht overeenkomstig
      artikel 7.
2. De bevoegde autoriteit kan de in lid 1 genoemde maatregelen ook doen gelden
   voor andere bedrijven wanneer in verband met de ligging daarvan, de
   plaatselijke situatie of de contacten met het bedrijf waar de aanwezigheid van
   de ziekte is bevestigd, mogelijke verontreiniging moet worden gevreesd.
 ---pagebreak---                                            - 7 -
                                         Artikel 6
   1. Indien er op een besmet bedrijf twee of meer afzonderlijke koppels zijn, kan
      de bevoegde autoriteit voor de gezonde koppels een uitzondering op het be-
      paalde in artikel 5, lid 1, a ) , toestaan, voor zover door de officiële dieren-
      arts is bevestigd dat de op het bedrijf verrichte werkzaamheden van zodanige
      aard zijn dat de koppels op het vlak van huisvesting, verzorging en voedering
      volledig zijn gescheiden, zodat het virus zich niet van het ene maar het
      andere koppel kan verspreiden.
   2. De Commissie stelt volgens de procedure van artikel 21 de criteria vast voor
      het toestaan van een uitzondering als bedoeld in lid 1.
                                         Artikel 7
   1. Het epizoötiologisch onderzoek heeft betrekking op :
        -  de duur van de periode waarin aviaire influenza op het bedrijf aanwezig
           kan zijn geweest ;
        -  de mogelijke oorsprong van aviaire influenza op het bedrijf en de opspo-
           ring van de andere bedrijven waar zich pluimvee bevindt dat uit dezelfde
           bron kan zijn besmet of verontreinigd;
        -  de verplaatsingen van personen, pluimvee of andere dieren, voertuigen,
           eieren, vlees en kadavers en alle materieel of alle stoffen, waardoor het
           virus van aviaire influenza van en naar het betrokken bedrijf kan zijn
           gebracht.
   2. Met het oog op een volledige coördinatie van alle maatregelen om aviaire
      influenza zo snel mogelijk uit te roeien en voor het uitvoeren van het epizoö-
      tiologisch onderzoek, wordt een erisiseenheid opgericht.
3)
 ---pagebreak---                                        - 8 -
   De algemene voorschriften inzake de Nationale erisiseenheden en de
   Communautaire erisiseenheden zijn vastgesteld bij Verordening (EEG) ... van de
   Raad.
                                     Artikel 8
1. Wanneer de officiële dierenarts redenen heeft om aan te nemen dat pluimvee op
   een bedrijf kan zijn verontreinigd ten gevolge van verplaatsingen van per-
   sonen, dieren of voertuigen, of anderszins, wordt dat bedrijf onder officiële
   controle geplaatst overeenkomstig lid 2.
2. De officiële controle heeft ten doel om elke mogelijke aanwijzing van aviaire
   influenza onmiddellijk te ontdekken, de nodige tellingen te verrichten, de
   verplaatsingen van het pluimvee te controleren en zo nodig de in lid 3 vast-
   gestelde maatregelen toe te passen.
3. Wanneer een bedrijf onder officiële controle is geplaatst als bedoeld in
   lid 2, verbiedt de bevoegde autoriteit dat pluimvee van het bedrijf wordt
   afgevoerd, tenzij om onder officieel toezicht rechtstreeks naar een slachterij
   te worden gebracht en daar onmiddellijk te worden geslacht. Voordat daartoe
   toestemming wordt gegeven moet de officiële dierenarts alle pluimvee klinisch
   hebben onderzocht om de aanwezigheid van aviaire influenza op dat bedrijf uit
   te sluiten. De bovengenoemde beperkingen op verplaatsingen zijn van toepassing
   gedurende 21 dagen, te rekenen vanaf de laatste dag waarop verontreiniging kan
   hebben plaatsgevonden. De beperkingen zijn in elk geval van toepassing
   gedurende ten minste zeven dagen.
4. Wanneer de bevoegde autoriteit van oordeel  is dat de omstandigheden het
   toelaten, kan zij de in dit artikel bedoelde maatregelen beperken tot een
   gedeelte van het bedrijf en tot het pluimvee dat zich in dat gedeelte bevindt,
   voor zover de dieren er volledig afzonderlijk worden gehuisvest, verzorgd en
   gevoederd, en het daarbij betrokken personeel alleen daar werkzaam is.
 ---pagebreak---                                         - 9 -
                                      Artikel 9
1. Zodra de diagnose van aviaire influenza officieel is bevestigd, stelt de be-
   voegde autoriteit rond het besmette bedrijf een besmet gebied in, bestaande
   uit een beschermingsgebied met een straal van ten minste 3 km en een toezicht-
   gebied met een straal van ten minste 10 km. Bij de instelling van deze gebie-
   den moet rekening worden gehouden met de natuurlijke barrières en de epi-
   zoöt i o logische kenmerken van de uitbraak.
2. In het beschermingsgebied gelden met name de volgende maatregelen :
   a) alle bedrijven in het gebied waar pluimvee wordt gehouden, worden geïden-
      t if iceerd,
   b) alle bedrijven waar pluimvee wordt gehouden, worden op gezette tijden
      bezocht, waarbij het pluimvee klinisch wordt onderzocht en, voor zover
      nodig, monsters voor laboratoriumonderzoek worden genomen; de gegevens en
      de resultaten van die bezoeken moeten worden geregistreerd;
   c) het pluimvee moet in de lokalen blijven waarin het is gehuisvest, of op een
      andere plaats waar het kan worden geïsoleerd;
   d) bij de in- en uitgangen van de bedrijven dienen adequate ontsmettingsvoor-
      zieningen beschikbaar te zijn;
   e) verplaatsingen van personen die in contact komen met pluimvee, pluimvee-
      kadavers en eieren, en van voertuigen waarmee pluimvee, pluimveekadavers en
      eieren binnen het gebied worden vervoerd, worden gecontroleerd; in het al-
      gemeen wordt alle vervoer van pluimvee verboden, met uitzondering van door-
      voer via de hoofdwegen of hoofdlijnen van het spoorwegnet;
   f) pluimvee en broedeieren mogen niet van de bedrijven waar ze zich bevinden,
      worden afgevoerd, tenzij de bevoegde autoriteit toestemming heeft verleend
      voor het vervoer van :
 ---pagebreak---                                        - 10 -
       i)   pluimvee naar een slachting die bij voorkeur gelegen is binnen het
            besmette gebied of, indien dit niet mogelijk is, naar een door de
            bevoegde autoriteit aangewezen slachterij buiten dat gebied, om daar
            onmiddellijk te worden geslacht. Het vlees van dit pluimvee wordt
            voorzien van het bijzondere merk als bedoeld in artikel 6, lid 1, van
            Verordening (EEG) nr. ... van de Raad tot vaststelling van veterinair-
            rechtelijke voorschriften voor het intracommunautaire handelsverkeer
            in en de invoer uit derde landen van vers vlees van pluimvee en
            gekweekt vederwild(1>;
       ii)  eendagskuikens en legrijpe kippen naar een bedrijf binnen het besmette
            gebied waar geen ander pluimvee aanwezig is. Het betrokken bedrijf
            wordt onder officieel toezicht geplaatst als bedoeld in artikel 8,
            I id 2 .
       iii) broedeieren naar een broeder ij binnen het besmette gebied of naar een
            door de bevoegde autoriteit aangewezen broederij buiten dat gebied;
            vóór verzending moeten de eieren en de verpakkingen worden ontsmet.
      Het sub i), ii) en iii), bedoelde vervoer moet rechtsreeks en onder offi-
      cieel toezicht geschieden. Het vervoer mag slechts worden toegestaan nadat
      de officiële dierenarts op het bedrijf een gezondheidsinspectie heeft ver-
      richt. De gebruikte vervoermiddelen moeten vóór en na gebruik worden
      gereinigd en ontsmet.
   g) strooisel en pluimveemest mogen niet zonder toestemming worden afgevoerd en
      verspreid;
   h) jaarbeurzen, markten, tentoonstellingen en andere evenementen waarbij
      pluimvee of andere vogels worden bijeengebracht, worden verboden;
3. De maatregelen in het beschermingsgebied mogen ten vroegste worden opgeheven
   21 dagen nadat op het besmette bedrijf de reinigings- en ontsmettingswerkzaam-
   heden zijn uitgevoerd overeenkomstig artikel 11. Het beschermingsgebied maakt
   vanaf dat ogenblik deel uit van het toezichtgebied.
(1) COM (89) 507 def.
 ---pagebreak---                                        - 11 -
4. In het toezichtgebied gelden met name de volgende maatregelen :
   a) alle bedrijven in het gebied, waar pluimvee wordt gehouden, worden geTden-
       t ificeerd;
   b) verplaatsingen van pluimvee en broedeieren binnen het gebied worden gecon-
       troleerd;
   c) het pluimvee mag de eerste 15 dagen het gebied niet verlaten, tenzij om
       rechtstreeks te worden vervoerd naar een door de bevoegde autoriteit aange-
      wezen slachterij buiten het toezichtgebied. Het vlees van dit pluimvee
      wordt voorzien van het bijzondere merk als bedoeld in artikel 6, lid 1, van
      Verordening (EEG) nr. .../      van de Raad tot vaststelling van veterinair-
       rechtelijke voorschriften voor het intracommunautaire handelsverkeer in en
      de invoer uit derde landen van vers vlees van pluimvee en gekweekt veder-
      wi ld;
   d) broedeieren mogen het toezichtgebied niet verlaten, tenzij om naar een door
      de bevoegde autoriteit aangewezen inrichting te worden gebracht.    Vóór
      verzending moeten de eieren en de verpakkingen worden ontsmet;
   e) strooisel en pluimveemest mogen niet uit het gebied worden afgevoerd;
   f) jaarbeurzen, markten, tentoonstellingen en andere evenementen waarbij
      pluimvee of andere vogels worden bijeengebracht, worden verboden;
   g) onverminderd het bepaalde sub b) en c ) , wordt het vervoer van pluimvee
      binnen het gebied verboden, met uitzondering van doorvoer via de hoofdwegen
      of de hoofdlijnen van het spoorwegnet.
5. De maatregeien in het toezichtgebied worden ten vroegste opgeheven 30 dagen
   nadat op het besmette bedrijf de reinigings- en ontsmettingswerkzaamheden zijn
   uitgevoerd overeenkomstig artikel 11.
 ---pagebreak---                                        - 12 -
                                     Artikel 10
1. De bevoegde autoriteit treft de nodige regelingen om de verplaatsingen van
   eieren en pluimvee te kunnen traceren.
2. De pluimvee-eigenaar of -houder dient de bevoegde autoriteit desgevraagd de
   nodige inlichtingen te verstrekken over het pluimvee en de eieren die op zijn
   bedrijf zijn binnengebracht of ervan zijn afgevoerd.
3. Een ieder die betrokken is bij het vervoer of het in de handel brengen van
   pluimvee en eieren, moet de bevoegde autoriteit de nodige inlichtingen kunnen
   verstrekken omtrent de verplaatsingen van het pluimvee en de eieren die zij
   hebben vervoerd of in de handel gebracht, en moet alle desbetreffende bewijs-
   stukken kunnen overleggen.
                                     Artikel 11
1. De te gebruiken ontsmettingsmiddelen en de concentraties daarvan moeten door
   de bevoegde autoriteit worden goedgekeurd.
2. De reinigings- en ontsmettingswerkzaamheden moeten onder officieel toezicht en
   volgens de instructies van de officiële dierenarts worden verricht.
                                     Artikel 12
Bemonstering en laboratoriumonderzoek met het oog op de opsporing van het virus
van aviaire influenza worden verricht overeenkomstig bijlage I.
                                     Artikel 13
1. In elke Lid-Staat worden aangewezen :
   a) één of meer nationale laboratoria met de nodige voorzieningen en het nodige
      gespecia Iiseerd personeel om de pathogeniteit van influenzavirusiso laten te
      bepalen (Hoofdstuk 7 van bijlage I) en om influenza-A-virussen, subtypes H5
      of H7, te identificeren;
 ---pagebreak---                                        - 13 -
   b) één of meer nationale laboratoria die worden belast met het testen van de
      reagentia die door de regionale laboratoria worden gebruikt;
   c) één of meer nationale instituten of laboratoria, waar geautoriseerde
      vaccins kunnen worden getest, teneinde hun conformiteit te verifiëren met
      de specificaties zoals die zijn weerlegd in "The marketing authorisation".
2. De in bijlage II genoemde nationale laboratoria worden belast met de coördi-
   natie van de voor de diagnose geldende normen en methoden, van het gebruik van
   de reagentia en van de tests van de vaccins.
3. In iedere Lid-Staat zijn de in I id 2 bedoelde nationale laboratoria voor
   aviaire influenza verantwoordelijk voor de coördinatie van de normen en diag-
   nosemethoden die in elk diagnose laboratorium voor aviaire influenza worden
   gebruikt. Daartoe :
   a) mogen zij de bij het stellen van de diagnose te gebruiken reagentia leveren
      aan de regionale laboratoria;
   b) controleren zij de kwaliteit van alle diagnosereagentia die in de Lid-Staat
      worden gebruikt ;
   c) organiseren zij geregeld vergelijkende tests;
   d) bewaren zij iso laten van het virus van aviaire influenza, afkomstig van in
      die Lid-Staat bevestigde gevallen;
   e) zien zij erop toe dat de in de regionale diagnose laborator ia verkregen
      positieve resultaten worden bevestigd.
4. De in bijlage II genoemde nationale laboratoria houden nauw contact met het in
   artikel 14 bedoelde communautaire referent ie laboratorium.
                                     Artikel 14
Het communautair referent ie laboratorium voor aviaire influenza is vermeld in
bijlage lil. De taken en bevoegdheden van het laboratorium worden vastgesteld
volgens de procedure van artikel 21, voor zover dat nog niet is gebeurd op grond
van artikel 28 van Beschikking 90/424/EEG van de Raad betreffende bepaalde uit-
gaven op veterinair gebied (1) .
(1) PB nr. L 224 van 18.08.1990, blz. 29.
 ---pagebreak---                                       - 14 -
                                    Artikel 15
1. Tegen aviaire influenza mag met behulp van een door de bevoegde autoriteiten
   goedgekeurd vaccin alleen worden ingeënt ter aanvulling van de bestrijdings-
   maatregelen die bij het uitbreken van de ziekte zijn getroffen.
2. Het besluit om in te enten ter aanvulling van de bestaande bestrijdingsmaat-
   regelen wordt genomen door de Commissie in samenwerking met de betrokken
   Lid-Staat, volgens de procedure van artikel 21. BIJ dat besluit dient met name
   rekening te worden gehouden met :
   - de pluimveedichtheid in het betrokken gebied;
   - de kenmerken en de samenstelling van het te gebruiken vaccin;
   - de procedures die worden gevolgd bij het toezicht op de distributie, de op-
     slag en het gebruik van het vaccin;
   - de soorten en categorieën pluimvee die worden gevaccineerd;
   - de gebieden waar wordt gevaccineerd.
3. Wanneer een Lid-Staat overeenkomstig het bepaalde in lid 2 toestemming krijgt
   om in een beperkt deel van zijn grondgebied noodvaccinatie toe te passen,
   heeft dat geen effect op de status van de rest van het grondgebied, op voor-
   waarde dat de ingeente dieren niet worden verplaatst gedurende drie maanden na
   het einde van de vaccinâtiewerkzaamheden.
                                    Artikel 16
1. Wanneer in een bepaald gebied een besmetting met aviaire influenza buitenge-
   woon ernstige vormen aanneemt en de epizoötie zich bovendien dreigt te ver-
   spreiden, neemt de betrokken Lid-Staat de volgende maatregelen :
   - een geografisch afgebakend gebied dat ten minste alle beschermingsgebieden
     en toezichtgebleden omvat, wordt uitgeroepen tot "gebied met groot besmet-
     tingsgevaar";
 ---pagebreak---                                       - 15 -
   - in het "gebied met groot besmettingsgevaar" worden de in artikel 9, lid 3,
     vastgestelde maatregelen toegepast;
   - levend pluimvee en broedeieren mogen het "gebied met groot besmettings-
     gevaar" niet verlaten;
   - de Commissie en de andere Lid-Staten worden in het kader van het Permanent
     Veterinair Comité op de hoogte gebracht van de ziektesituatie en de toege-
     paste bestrijdingsmaatregelen.
2. De grenzen van het "gebied met groot besmettingsgevaar" kunnen worden aange-
   past naarmate toezichtgebieden worden opgeheven. Het bepaalde in lid 1 is niet
   langer van toepassing wanneer het laatste toezichtgebied is opgeheven.
3. Indien de buitengewoon ernstige situatie aanhoudt, moet elk besluit ten aan-
   zien van de door de betrokken Lid-Staat te nemen maatregelen, met name het
   uitroepen van het gebied tot "gebied met groot besmettingsgevaar" en de toe-
   passing van artikel 15, worden genomen volgens de procedure van artikel 21.
                                    Artikel 17
1. Elke Lid-Staat stelt een rampenplan op, waarin wordt aangegeven welke natio-
   nale maatregelen moeten worden uitgevoerd in geval van een uitbraak van
   aviaire influenza.
   Dat plan moet voorzien in de beschikbaarstelling van adequate voorzieningen,
   apparatuur, personeel en materiaal, nodig voor de snelle en doeltreffende
   uitroeiing van de uitbraak.  In het plan dient elke betrokken Lid-Staat een
   nauwkeurige raming te maken van de behoeften aan vaccin voor het geval dat
   noodvaccinatie nodig zou blijken.
 ---pagebreak---                                        - 16 -
2. Voor het opstellen van de rampenplannen gelden mutatis mutandis de criteria
   die zijn vastgesteld bij Beschikking 91/42/EEG van de Commissie van
   8 januari 1991 houdende vaststelling, overeenkomstig artikel 5 van Richtlijn
   90/423/EEG van de Raad, van de cri tri a die moeten worden toegepast bij het
   opstellen van de rampenplannen voor de bestrijding van mond- en klauwzeer^).
   De Commissie kan, volgens de procedure van artikel 21, deze criteria wijzigen
   of aanvullen in verband met de specifieke aard van aviaire influenza.
3. De overeenkomstig de in lid 2 bedoelde criteria vastgestelde plannen worden
   uiterlijk twaalf maanden na de inwerkingtreding van deze verordening ingediend
   bij de Comm i ssI e.
4. De Commissie onderzoekt de plannen ten einde na te gaan of zij toereikend zijn
   om het gestelde doel te bereiken en stelt de betrokken Lid-Staat eventueel
   voor de nodige wijzigingen aan te brengen, .met name om te garanderen dat de
   plannen verenigbaar zijn met die van de andere Lid-Staten.
   De Commissie keurt de, eventueel gewijzigde, plannen goed volgens de procedure
   van art ikel 21.
   De plannen kunnen nadien nog volgens dezelfde procedure worden gewijzigd of
   aangevuld in verband met de ontwikkeling van de situatie.
                                     Artikel 18
Veterinaire deskundigen van de Commissie kunnen, in samenwerking met de autori-
teiten van de betrokken Lid-Staat en voor zover dat nodig is om een uniforme
toepassing van deze verordening te garanderen, controles ter plaatse verrichten;
de Commissie stelt de Lid-Staten in kennis van de resultaten van deze controles.
(1) PB nr. L   23 van 29.01.1991, blz. 29.
 ---pagebreak---                                        - 17 -
De Lid-Staat op het grondgebied waarvan een controle wordt verricht, verleent de
deskundigen de nodige assistentie om hun taak te vervullen.
De algemene bepalingen ter uitvoering van dit artikel worden vastgesteld volgens
de procedure van artikel 21.
                                     Artikel 19
De voorschriften met betrekking tot de financiële deelneming van de Gemeenschap
 in de uit deze verordening voortvloeiende maatregelen zijn vastgesteld in
Beschikking 90/424/EEG van de Raad betreffende bepaalde uitgaven op veterinair
gebied.
                                     Artikel 20
De bijlagen bij deze verordening kunnen door de Commissie volgens de procedure
van artikel 21 worden gewijzigd in verband met de ontwikkeling op het gebied van
de diagnostische procedures.
                                     Artikel 21
1. De Commissie wordt bijgestaan door het bij Besluit 68/361/EEG<1> ingestelde
    Permanent Veterinair Comité, hierna het "Comité" genoemd.
2. In de gevallen waarin wordt verwezen naar de in dit artikel omschreven proce-
    dure, gelden de onderstaande bepalingen.
    De vertegenwoordiger van de Commissie dient bij het Comité een ontwerp in van
    de te nemen maatregelen.  Het Comité brengt over dat ontwerp advies uit bin-
    nen een termijn die de voorzitter kan vaststellen naargelang van de urgentie
    van de aangelegenheid, eventueel door middel van een stemming.
Het advies wordt opgenomen in de notulen; voorts heeft elke Lid-Staat het recht
te verzoeken dat zijn standpunt in de notulen wordt opgenomen.
(1) PB nr. L 255 van 18.10.1968, blz. 23
 ---pagebreak---                                        - 18 -
De Commissie houdt zoveel mogelijk rekening met het door het Comité uitgebrachte
advies.   Zij brengt het Comité op de hoogte van de wijze waarop zij met dat
advies rekening heeft gehouden.
                                    Artikel 22
Deze verordening treedt in werking op 1 juli 1991.
Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepas-
se I ijk in elke Lid-Staat.
Gedaan te Brussel,                                          Voor de Raad,
 ---pagebreak---                                        -4Î-
                                     BULAGE I
                     METHODE VOOR DIFFERENTIËLE DIAGNOSTIEK EN
                 BEVESTIGING VAN DE DIAGNOSE VAN AVIAIRE INFLUENZA
De onderstaande voorschriften voor het isoleren en karakteriseren van virussen
van aviaire influenza moeten worden beschouwd als richtsnoeren en minimumeisen
die bij het stellen van de diagnose van de ziekte in acht moeten worden genomen.
Voor de differentiële diagnostiek en de bevestiging van de diagnose van aviaire
influenza geldt de volgende definitie :
"Aviaire influenza is een pluimveeziekte die wordt veroorzaakt door een
influenza-A-virus met een intraveneuze pathogenite lts index bij zes weken oude
kuikens van meer dan 1,2, of door een influenza-A-virus, subtype H5 of H7; door
middel van "sequencing" (bepaling van de basenvolgorde) van de nucleotiden is
aangetoond dat bij deze subtypes verschillende basische aminozuren aanwezig zijn
aan de breukzijde van het hemagglutinine.
             HOOFDSTUK 1 : Bemonstering en behandeling van de monsters
1. Monsters
   Cloaca-swabs (of faeces) en trachea-swabs van zieke dieren ; faeces of inhoud
   van het spijsverteringskanaal, hersenweefsel, trachea,    longen, lever, milt en
   andere duidelijk aangetaste organen van pas gestorven dieren.
2. Behandeling van de monsters
   Bovengenoemde organen en weefsels mogen worden samengevoegd, met uitzondering
   van het faecal e materiaal, dat apart moet worden behandeld. De swabs moeten
   volledig worden ondergedompeld in een voldoende hoeveelheid antibiotisch
   medium. Monsters van faeces en organen moeten worden gehomogeniseerd (in een
    laboratoriummixer of met stamper en vijzel en steriel zand) in een antibio-
   tisch medium zodat een 10-20%-1ge m/v suspensie in het medium ontstaat. De
   suspensies worden gedurende ongeveer twee uur bij omgevingstemperatuur (of
   gedurende een langere tijd bij 4'C) gehouden en daarna door middel van centri-
   fugeren (bv. 800 tot 1000 g gedurende 10 minuten) geclarifieerd.
 ---pagebreak---                                          - 20-
 3. Ant ibiot isch medium
    Met diverse formuleringen van antibiotische media zijn in verschillende
     laboratoria goede resultaten verkregen en de nationale laboratoria kunnen voor
    een bepaald land advies geven. Monsters van faeces vereisen hoge antibiotica-
    concentratles; een typische formulering daarvoor is : 10.000 eenheden/ml peni-
    cilline, 10 mg/ml streptomycine, 0,25 mg/ml gentamycine en 5.000 eenheden/ml
    mycostatine in PBS. Een vijfvoudige verdunning van deze concentraties volstaat
    voor weefsels en trachea-swabs. Voor ChIamydia-oroanIsmen mag 50 mg/ml oxyte-
    tracycline worden toegevoegd. Voor het bereiden van het medium is het van
    essentieel belang dat na toevoeging van de antibiotica de pH wordt gecontro-
     leerd en op 7,0-7,4 wordt gebracht.
                             HOOFDSTUK 2 : Virus isolât ie
Virusiso lat Ie met behulp van bebroede kippeëleren
Bij ten minste vier geëmbryoneerde kippeëieren die gedurende acht tot tien dagen
zijn bebroed, wordt telkens 0,1-0,2 ml van het geclarifieerde en vloeibare super-
natant in de allantoTsholte geënt. Deze eieren zijn bij voorkeur afkomstig van
een specifiek pathogeenvriJ koppel (SPF-koppel), maar wanneer dit niet mogelijk
 is, mogen eieren worden gebruikt van een koppel waarvan is aangetoond dat het
vrij is van antistoffen tegen het virus van aviaire influenza. De geënte eieren
worden bij 37'C bewaard en dagelijks geschouwd. Eieren waarin bij het schouwen
dode of stervende embryo's worden opgemerkt en alle eieren die op de zesde dag na
enten nog overblijven, worden gekoeld tot 4'C en het allantoïs- of amnionvocht
daarvan wordt getest op hemagglutinatie. Als geen hemagglutinatie wordt gecon-
stateerd, wordt de hierboven beschreven procedure herhaald met onverdund allan-
toïs- of amnionvocht als inoculum.
Wanneer hemagglutinatie wordt geconstateerd, moet de aanwezigheid van bacteriën
door middel van kweek worden uitgesloten. Als bacteriën aanwezig zijn, kan het
vocht op een membraanfiIter van 450 nm worden gefiltreerd ; vervolgens worden
opnieuw antibiotica toegevoegd en worden bebroede eieren met de aldus verkregen
vloeistof geënt volgens de hierboven beschreven methode.
 ---pagebreak---                        HOOFDSTUK 3 : Differentiële diagnose
1- Voorlopige differentiatie
   Aangezien het van belang is dat bestrijdingsmaatregelen om verspreiding van
   het virus tegen te gaan zo spoedig mogelijk worden toegepast, dient elk
   regionaal laboratorium in staat te zijn om niet alleen NCD-virus, maar ook elk
   ander geïsoleerd hemagglutinerend virus, bijvoorbeeld influenza-A-virus,
   subtypes H5 of H7, te identificeren. Met alle vloeistoffen die hemagglutinatie
   teweegbrengen, moet derhalve een hemagglutinatieremmingstest als beschreven in
   de hoofdstukken 5 en 6 worden opgezet. Een positieve remming, d.i. 2 4 of
   hoger, met het specifieke polyklonale anti serum voor subtype H5 of H7 van het
   influenza-A-virus met een titer van ten minste 2 9 , wordt beschouwd als een
   voorlopige identificatie op grond waarvan tijdelijke bestrijdingsmaatregelen
   kunnen worden ingesteld.
2. Bevestiging van de identificatie
   Aangezien bij elk influenzavirus 13 subtypes van hemagglutinine en 9 subtypes
   van neuraminiotase voorkomen, telkens met varianten, is het praktisch niet
   realiseerbaar en uit een oogpunt van de kosten niet verantwoord dat elk
   nationaal laboratorium de nodige antisera bewaart voor een volledige
   karakterisering van de in influenzavirusiso laten aanwezige anti genen. Elk
   nationaal laboratorium dient :
   i)   te bevestigen dat het iso laat een influenza-A-virus is, aan de hand van
        een dubbele immunodiffusietest voor de opsporing van het gemeenschap-
        pelijk anti geen, als beschreven in hoofdstuk 9 van deze bijlage (indien
        het nationale laboratorium daaraan de voorkeur geeft, mag voor de
        opsporing van de gemeenschappelijke antigenen ook gebruik worden gemaakt
        van de immunofluorescentietest of de EL ISA);
   ii)  bepalen of het I so laat al dan niet van het subtype HS of H7 is;
 ---pagebreak---                                              -11-
   iii) bij zes weken oude kuikens een intraveneuze pathogeniteitsindextest te
         verrichten als beschreven in hoofdstuk 7 van deze bijlage. Een
         intraveneuze pathogenite its index van meer dan 1,2 wijst op de aanwezig-
         heid van virus; in dat geval moeten de bestrijdingsmaatregelen volledig
         worden toegepast (het zou nuttig zijn indien de nationale laboratoria ook
         test zouden uitvoeren om te bepalen in welke mate een iso laat bij machte
         is om in cel cultures plaques te vormen, overeenkomstig het bepaalde in
         hoofdstuk 8 ) .
   De nationale laboratoria dienen alle iso laten van het virus van aviaire
   influenza en van de subtypes H5 en H7 onmiddellijk naar het communautair
   referentielaboratorium te zenden voor een volledige karakterisering.
3. Nadere typering en karakterisering van isolaten
   De nationale laboratoria dienen alle hemagglutinerende virussen aan het com-
   munautaire referent ie laboratorium toe te zenden voor verder onderzoek op hun
   anti gene en genetische eigenschappen, ten einde de epizoötiologische kennis
   van de ziekte(n) in de Europese Gemeenschap te ontwikkelen en het referentie-
   laboratorium de mogelijkheid te bieden om zijn taak beter te vervullen.
   Bovendien dient het communautaire referent ie laboratorium voor alle ontvangen
   infIuenzavirussen een volledige antigeentypering te verrichten. Voor virussen
   van het subtype H5 en H7 met een intraveneuze pathogenite its index van ten
   hoogste 1,2 is ook sequencing van de nucleotiden van het hemagglutininegeen
   vereist om te bepalen of zich al dan niet multiple basische aminozuren bevin-
   den op de breukzijde van het hemagglutinine-eiwit.
 ---pagebreak---                                                -£3-      •
     HOOFDSTUK 4 : Serolooische tests voor de opsporing van antistoffen tegen
                          het virus van aviaire influenza
1. In het kader van uitroeiingsprogramma's, waarbij reeds geweten is welk subtype
   H van het virus verantwoordelijk is voor de ziekte of waarbij het homologe
   virus als antigeen wordt gebruikt, kan als serologische test voor de opsporing
   van de besmetting gebruik worden gemaakt van de hemagglutinatieremmingstest
   als beschreven In de hoofdstukken 5 en 6.
   Indien het subtype van het hemagglutin Ine niet gekend is, kan, om besmetting
   met influenza-A-virussen aan te tonen, worden gezocht naar tegen de groepspe-
   cifieke anti genen gerichte ant11Ichamen. Daartoe kan gebruik worden gemaakt
   van de dubbele immunodiffusietest (als beschreven in hoofdstuk 9 van deze
   bijlage) of van een EL ISA (een probleem bij de EL ISA is evenwel de gastheer-
   specificiteit van de test, aangezien de test gebaseerd is op de opsporing van
   als gastheer fungerende immunogiobulinen). Watervogels geven zelden positieve
   resultaten te zien bij de dubbele immunodiffusietest en in de praktijk is het
   bijgevolg aangewezen om, tenzij het subtype bekend is, dergelijke vogels
   alleen te onderzoeken op de aanwezigheid van antistoffen tegen de subtypes H5
   en H7.
2. a) Monsters
      Bloedmonsters worden genomen van alle dieren als het koppel kleiner is dan
       20 dieren, en van 20 dieren als het koppel groter is (Dit geeft ongeacht de
      grootte van het koppel een waarschijnlijkheid van meer dan 99 % dat ten
      minste één positief serum worden gevonden als 25 % of meer van het koppel
      positief is). Men laat het bloed stollen en het serum wordt verzameld voor
      onderzoek.
   b) Onderzoek O P antistoffen
      De individuele serummonsters worden onderzocht op hun capaciteit om het
      hemagglutinerende antigeen van het influenzavirus te remmen in een gestan-
      daardiseerde hemagglutinatieremmingstest (HAR) zoals beschreven in
      hoofdstuk 6-,
 ---pagebreak---                                                -Ik-
      Er bestaat enige discussie over het feit of 4 dan wel 8 hemagglutinine-een-
      heden moeten worden gebruikt bij de HAR-test. Beide opties lijken mogelijk
      en de keuze wordt overgelaten aan de nationale laboratoria. Het gebruikte
      antigeen bepaalt echter wel bij welk niveau een serum als positief wordt
      beschouwd : bij gebruik van 4 HAE is een serum positief als het een titer
      heeft van 2 4 of hoger, bij gebruik van 8 HAE is een serum positief als
      het een titer heeft van 2 3 of hoger.
                    HOOFDSTUK 5 : Hemagglutinatietest (HA-test)
Reagent ia
1. Isotonische zoutoplossing die met fosfaat (0,05 M) is gebufferd op een pH van
   7.0-7.4.
2. Rode bloedcellen (RBC) van minimaal drie specifiek pathogeenvriJe kippen (of
   als die niet beschikbaar zijn van vogels die regelmatig zijn gecontroleerd en
   vrij zijn gebleken van antistoffen tegen aviaire-influenza-virussen) worden
   samengevoegd en in eenzelfde volume Alsever-oplossing gebracht. Vóór gebruik
   worden de cellen drie keer in PBS gewassen. Voor de test wordt een 1 %-ige
   suspensie (packed cells v/v) in PBS aanbevolen.
3. Het communautair referent ie laboratorium levert laagvirulente virussen van de
   subtypes H5 en H7 voor gebruik als standaardantigeen, of beveelt het gebruik
   daarvan aan.
Werkwijze
                                          «
1. Breng in ieder putje van een plastic microtiterplaat (met V-vormige putjes)
   0,025 ml PBS.
2. Breng 0,025 ml virussuspensie (d.w.z. allantoïsvocht) in het eerste putje.
3. Leg een tweevoudige verdunningsreeks aan van het virus over de gehele plaat
   (1:2 tot en met 1:4096) met behulp van een microtitratiediluter.
4. Voeg in ieder putje 0,025 ml PBS toe.
5. Voeg in ieder putje 0,025 ml van de 1 %-ige suspensie van rode bloedcellen
   toe.
 ---pagebreak---                                                -19-
6. Meng door zachtjes te tikken en laat de plaat staan bij 4'C.
7. De platen worden 30-40 minuten daarna afgelezen wanneer de RBC-controles tot
   rust zijn gekomen. Bij het aflezen worden de platen lichtjes schuin gehouden
   en wordt nagegaan of in de RBC al dan niet een traanvormige stroming optreedt,
    In putjes waarin geen HA optreedt, moet de stroming tegen dezelfde snelheid
   geschieden als in de controleputjes met de virusvrije controles.
8. De HA-titer is de hoogste verdunning waarin agglutinât ie van RBC optreedt.
   Deze verdunning mag worden beschouwd als bevattende 1 HA-eenheid (HAE). De HA-
   titer kan nauwkeuriger worden bepaald als in het kader van de HA-test verdun-
   ningsreeksen worden aangelegd met een aantal dicht bij elkaar gelegen uit-
   gangsverdunningen van het virus, b.v. 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, enz. Deze methode
   wordt aanbevolen voor de accurate bereiding van anti geen voor de hemaggluti-
   natieremmingstests (Hoofdstuk 6 ) .
                HOOFDSTUK 6 : Hemagglutinatieremmingstest (HAR-test)
Reagent ia
1. PBS.
2. Allantoïsvocht dat virus bevat en met PBS is verdund tot het 4 of 8 HAE per
   0,025 ml bevat.
3. 1 %-ige suspensie van RBC van kippen.
4. Negatief controleserum van kippen.
5. Positief controleserum.
WerkwlJze
1. Breng in ieder putje van een plastic microtiterplaat (met V-vormige putjes)
   0,025 ml PBS.
2. Breng 0,025 ml serum in het eerste putje van de plaat.
 ---pagebreak---                                                   - l b -
 3. Leg een tweevoudige verdunningsreeks aan van het serum over de gehele plaat
    met behulp van een microtitratiediluter.
 4. Voeg 0,025 ml verdund allantoïsvocht dat 4 of 8 HAE bevat, toe.
5. Meng door zachtjes te tikken en laat de plaat staan bij 4'C gedurende ten
    minste 60 minuten of bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten.
6. Voeg aan ieder putje 0,025 ml van de 1 %-ige suspensie van RBC toe.
7. Meng door zachtjes te tikken en laat de plaat staan bij 4'C.
8. De platen worden 30-40 minuten daarna afgelezen wanneer de RBC-controles tot
    rust zijn gekomen. BIJ het aflezen worden de platen lichtjes schuin gehouden
    en wordt nagegaan of in de putjes al dan niet een traanvormige stroming
    optreedt met dezelfde snelheid ais in de controleputjes die uitsluitend RBC
    (0,025 ml) en PBS (0,05 ml) bevatten.
9. De HAR-titer is de hoogste verdunning van het anti serum die nog in staat is de
    hemagglutinatie van 4 of 8 eenheden virus volledig te remmen (Een HA-titratie
    om de aanwezigheid van de vereiste HAE te bevestigen, maakt deel uit van
     iedere test).
10.De resultaten zijn alleen geldig als met het negatieve controleserum, een
    titer wordt verkregen die lager is dan 2 3 voor 4 HAE of lager dan 2 2 voor
    8 HAE en als de titer die met het positieve controleserum, wordt verkregen,
    maximaal 1 verdunning afwijkt van de gekende titer van dat serum.
                HOOFDSTUK 7 : Intraveneuze pathogen I te its index (IVPl)
1. Besmettelijk allantoïsvocht van de laagste passage die beschikbaar is, bij
    voorkeur van de oorspronkelijke isolatie zonder dat enige selectie heeft
    plaatsgevonden, wordt tot op 10-1 verdund in een steriele isotonische zoutop-
    lossing.
2. Bij 10 weken oude kuikens (het gebruik van specifiek pathogeenvrI Je kuikens is
    verplicht) wordt telkens 0,1 ml verdunde virusoplossing intraveneus
    ingespoten.
3. De dieren worden gedurende tien dagen om de 24 uur onderzocht.
 ---pagebreak---                                                  ~n-
4. Bij iedere waarneming wordt voor elk dier een van de volgende aantekeningen
   gemaakt : normaal (0), ziek (1), ernstig ziek (2) of dood (3).
5. Het registreren van de resultaten en het berekenen van de index vindt plaats
   overeenkomstig het volgende voorbeeld :
    Klinische              Dagen na inoculât ie             Totale score
    symptomen
                    1   2   3  4   5   6   7   8   9     10
  Normaal          10   2   0    0   0   0   0   0   0    0 1 2 x 0 -    0
  Ziek              0  4   2   0   0   0   0   0   0   0       6 x   1 - 6
  Ernstig ziek*     0   2   2  2   0   0   0   0   0   0     6 x 2  -   12
  Dood              0   2   6    8 10 10 10 10 10 10        76 x 3   - 228
                                                            TOTAAL - 246
  De index is het gemiddelde van het totale aantal punten per dier en per
  waarneming - 246 : 100 « 2,46.
* Dit is uiteraard een subjectief klinisch oordeel maar normaal betreft het
  hier dieren die meer dan één van de volgende symptomen vertonen : ademha-
  lingsstoornissen, depressie, diarree, cyanose van onbeschermde huid of
  lellen, oedeem in het gezicht en/of op het hoofd, zenuwsymptomen.
         HOOFDSTUK 8 : Bepaling van de capaciteit tot vorming van plagues
1. Doorgaans kan het best een verdunningsreeks van het virus worden aangelegd om
   ervoor te zorgen dat in de schaal een optimaal aantal plaques wordt verkregen,
   Een tienvoudige verdunningsreeks tot en met 10~ 7 in PBS zal normaliter vol-
   doende zijn.
2. In petrischalen (met een diameter van 5 cm) worden confluente vettapijten van
   kippeëmbryocellen of een andere geschikte cellijn (bijvoorbeeld Mad in-Darby
   bovine kidney) aangebracht.
3. Van elke virusverdunning wordt 0,2 ml overgebracht in twee petrischalen en
   vervolgens laat men het virus gedurende 30 minuten adsorberen.
4. Na driemaal wassen met PBS worden de geïnfecteerde cellen bedekt met een
   geschikt medium dat 1% m/v agar en 0,01 mg/ml trypsine bevat of agar alleen
   zonder trypsine; het dekmedium mag geen serum bevatten.
 ---pagebreak---                                                 -?«p-
 5. Na 72 uur incuberen bij 37'C zouden de plaques voldoende groot moeten zijn.
    Zij zijn het gemakkelijkst waar te nemen als de agardeklaag wordt verwijderd
    en als het celtapijt wordt gekleurd met in 25%-ige v/v ethanol opgelost
    crystal violet (0,5% m/v).
6. Alle virussen die met een trypsine bevattende deklaag zijn geïncubeerd, moeten
    heldere plaques geven. Wanneer de deklaag geen trypsine bevat worden alleen
    plaques gevormd door de voor kippen virulente virussen.
                        HOOFDSTUK 9 : Dubbele immunodiffusie
Om uit te maken of influenza-A-virus aanwezig is, wordt bij voorkeur de aanwezig-
heid aangetoond van de nucleocapside- of matrix-antigenen die gemeenschappelijk
zijn aan alle influenza-A-virussen. Daartoe wordt meestal gebruik gemaakt van de
dubbele immunodiffusietest met geconcentreerde viruspreparaten of met extracten
van geïnfecteerde chorion-allantoïsmembranen.
Geconcentreerde viruspreparaten kunnen worden aangemaakt door eenvoudige hyper-
centrifugatie van besmet allantoïsvocht en disrupt ie van het virus ten einde de
 inwendige nucleocapside- en matrix-antigenen vrij te maken door behandeling met
het detergent natriumlauriolsarcosInaat. Ook kan gebruik worden gemaakt van
zuurprecipitatie, door aan besmet allantoïsvocht 1N HCL toe te voegen waardoor de
PH op 3,5-4,0 wordt gebracht, gedurende ten minste 1 uur te koelen bij 0 'C en
vervolgens bij geringe snelheid te centrifugeren (1.000 g gedurende 10 minuten).
Het supernatant kan worden verwijderd en het precipitaat dat het virus bevat weer
gesuspendeerd in een minimumhoeveelheid glycine-sarkosylbuffer (1 % natriumlauri-
olsarcosinaat dat met 0,5 M glycine is gebufferd tot een PH van 9,0). Deze prepa-
raten bezitten zowel de nucleocapside- als de matrix-antigenen.
Beard (1970) beschrijft de bereiding van nucleocapsideriJk antigeen uit chorion-
al lantoïsmembranen afkomstig van besmette eieren. Deze methode bestaat uit : ver-
wijdering van de chorion-allantoïsmembranen van besmette eieren die
hemagglutin Ine bevatten, vermaling of homogenisering van de membranen, bevriezing
en ontdooiing (driemaal) gevolgd door centrifugatie bij 1.000 g gedurende
10 minuten. Het vaste gedeelte wordt verwijderd en het supernatant wordt met
0,1 % formaline behandeld om vervolgens als antigeen te worden gebruikt.
 ---pagebreak---                                               -IS-     •
Deze twee antigenen kunnen zonder onderscheid worden gebruikt bij de dubbele
immunodiffusietest, met gebruikmaking van 1 % agarose (of agar), een gel die
8,0 % natriumchloride bevat waarvan de PH op 7,2 is gebracht met 0,1 M
fosfaatbuffer. Influenza-A-virus is aanwezig wanneer het te onderzoeken antigeen
en het positief controle-antigeen tegenover het positieve anti serum een fuserende
précipitât iel ijk vormen.
 ---pagebreak---                                       BULAGE II
              Lijst van de nationale laboratoria voor aviaire influenza
België                       Institut national de Recherches Vétérinaires,
                            Groeselenberg 99,
                            B 1180 Bruxelles
Denemarken                  National Veterinary Laboratory, Poultry Disease
                            Division, HangdveJ 2,
                            DK 8200 Aarhus N.
Bondsrepubllek               Institut fUr KIe intierzucht der Bundesforschungs-
Duitsland                   anstalt für Landwirtschaft, Braunschweig-Völkenrode,
                            Postfach 280, D 3100 Celle
Frankr i Jk                 Centre National d'Etudes Vétérinaires et Alimentation
                            - Laboratoire Centrale de Recherches Agricoles et
                            Porcine, B.P. 53, F 22440 Ploufragan
Gr ieken land
 1er land                   Veterinary Research Laboratory,
                            Abbotstown, Castleknock, Dublin 15
 Italië                      Istituto Patologie Aviaire, Facolta di Medicina
                            Veter inaria, Universita di Napoli,
                            Via Aniezzo Falcone 394,
                             I 80127 Napoli F Delpino 1
Luxemburg                    Institut National de Recherches Vétérinaires
                            Groeselenberg 99,
                            B 1180 Bruxelles
Neder land                  Centraal Diergeneeskundig Instituut,
                            Vestiging Virologie, Hourtibweg 39,
                            NL 8221 RA Lelystad
Portugal                    Laboratorio Nacional de Investigaçao
                            Veterinaria (LNIV), Estrada de Benfica 701,
                            1500 Lisboa
Spanje
Verenigd Koninkrijk         Central Veterinary Laboratory, New Haw,
                            Weybridge, GB-Surrey KT15 3 NB
 ---pagebreak---                                    PIAAQE III
     Naam van het communautair referent ialaboratorium voor aviaire Influenza
Central Veterinary Laboratory
New Haw
Weybridge
Surrey KT15  3NB
United Kingdom
 ---pagebreak---                                                                     ISSN 0254-1513
                                                              COM(91)304def.
                                                  DOCUMENTEN
NL                                                                             03
                                Catalogusnummer : CB-CO-91-344-NL-C
                                                            ISBN 92-77-74820-6
Bureau voor officiële publikaties der Europese Gemeenschappen
L-2985 Luxemburg