CELEX: 32014R0260
Language: lt
Date: 2014-01-24 00:00:00
Title: 2014 m. sausio 24 d. Komisijos reglamentas (ES) Nr. 260/2014, kuriuo, derinant prie technikos pažangos, iš dalies keičiamas Reglamentas (EB) Nr. 440/2008, nustatantis bandymų metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH)  Tekstas svarbus EEE

19.3.2014   
            
            
               LT
            
            
               Europos Sąjungos oficialusis leidinys
            
            
               L 81/1
            
         
      KOMISIJOS REGLAMENTAS (ES) Nr. 260/2014
   2014 m. sausio 24 d.
   kuriuo, derinant prie technikos pažangos, iš dalies keičiamas Reglamentas (EB) Nr. 440/2008, nustatantis bandymų metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH)
   (Tekstas svarbus EEE)
   EUROPOS KOMISIJA,
   atsižvelgdama į Sutartį dėl Europos Sąjungos veikimo,
   atsižvelgdama į 2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH), įsteigiantį Europos cheminių medžiagų agentūrą, iš dalies keičiantį Direktyvą 1999/45/EB bei panaikinantį Tarybos reglamentą (EEB) Nr. 793/93, Komisijos reglamentą (EB) Nr. 1488/94, Tarybos direktyvą 76/769/EEB ir Komisijos direktyvas 91/155/EEB, 93/67/EEB, 93/105/EB bei 2000/21/EB (1), ypač į jo 13 straipsnio 3 dalį,
   kadangi:
   
               (1)
            
            
               Komisijos reglamente (EB) Nr. 440/2008 (2) pateikti bandymų metodai, kuriais, taikant Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006, turi būti nustatomos medžiagų fizikinės ir cheminės savybės, toksiškumas ir ekotoksiškumas;
            
         
               (2)
            
            
               Reglamentą (EB) Nr. 440/2008 būtina atnaujinti įtraukiant į jį prioritetinius naujus ir atnaujintus neseniai OECD patvirtintus alternatyvius bandymų metodus, taip siekiant sumažinti bandymams naudojamų gyvūnų skaičių, kaip nustatyta 2010 m. rugsėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyvoje 2010/63/ES dėl mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsaugos (3) ir 1986 m. lapkričio 24 d. Tarybos direktyvoje 86/609/EEB dėl valstybių narių įstatymų ir kitų teisės aktų, susijusių su eksperimentiniais ir kitais mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsauga, suderinimo (4);
            
         
               (3)
            
            
               pritaikyti du medžiagų fizikinių ir cheminių savybių nustatymo metodai – atnaujintas tirpumo vandenyje bandymo metodas ir įtrauktas naujas pasiskirstymo koeficiento nustatymo metodas, taikomas vertinant medžiagų patvarumą, biologinį kaupimąsi ir toksiškumą; įtraukti keturi nauji ekotoksiškumo ir išlikimo bei elgsenos aplinkoje nustatymo metodai ir vienas toks metodas atnaujintas; pritaikyti devyni toksiškumo ir kitokio poveikio sveikatai nustatymo metodai, tarp kurių yra keturi toksiškumo įkvėpus bandymų metodai (trys atnaujinti ir vienas naujas), kuriais siekiama sumažinti bandymams naudojamų gyvūnų skaičių ir geriau įvertinti medžiagų poveikį, atnaujintas kartotinių dozių 28 dienų toksiškumo per virškinamąjį traktą bandymo metodas į jį įtraukiant endokrininės veiklos vertinimo parametrus, atnaujintas toksikokinetikos bandymo metodas, kuris aktualus rengiant toksikologinius tyrimus bei padeda juos suprasti, taip pat atnaujinti lėtinio poveikio, kancerogeninio poveikio ir jungtinio lėtinio ir kancerogeninio poveikio bandymų metodai;
            
         
               (4)
            
            
               todėl Reglamentas (EB) Nr. 440/2008 turėtų būti atitinkamai iš dalies pakeistas;
            
         
               (5)
            
            
               šiame reglamente numatytos priemonės atitinka pagal Reglamento (EB) Nr. 1907/2006 133 straipsnį įsteigto komiteto nuomonę,
            
         PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENTĄ:
   1 straipsnis
   Reglamento (EB) Nr. 440/2008 priedas iš dalies keičiamas pagal šio reglamento priedą.
   2 straipsnis
   Šis reglamentas įsigalioja trečią dieną po jo paskelbimo Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje.
   
      Šis reglamentas yra privalomas visas ir tiesiogiai taikomas visose valstybėse narėse.
      Priimta Briuselyje 2014 m. sausio 24 d.
      
         
            Komisijos vardu
         
         
            Pirmininkas
         
         José Manuel BARROSO
         
      
   
   
      (1)  OL L 396, 2006 12 30, p. 1.
   
      (2)  OL L 142, 2008 5 31, p. 1.
   
      (3)  OL L 276, 2010 10 20, p. 33.
   
      (4)  OL L 358, 1986 12 18, p. 1.
   
      PRIEDAS
      Reglamento (EB) Nr. 440/2008 priedas iš dalies keičiamas taip:
      
                  1)
               
               
                  A.6 skyrius pakeičiamas taip:
                  „A.6.   TIRPUMAS VANDENYJE
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 105 (OECD bandymo gairės Nr. 105) (1995). Šis bandymo metodas yra atnaujinta 1981 m. patvirtinto originalaus bandymo metodo Nr. 105 redakcija. Dabartinė redakcija iš esmės nesiskiria nuo 1981 m. redakcijos. Daugiausia buvo keičiamas formatas. Atnaujinant remtasi ES bandymo metodu „Tirpumas vandenyje“ (1).
                           
                        PIRMINIAI ASPEKTAI
                  
                              2.
                           
                           
                              Cheminės medžiagos tirpumą vandenyje gali stipriai paveikti joje esančios priemaišos. Šis bandymo metodas skirtas nustatyti iš esmės grynų cheminių medžiagų, kurios yra stabilios vandenyje ir nelakios, tirpumą vandenyje. Prieš nustatant tirpumą vandenyje, naudinga gauti išankstinės informacijos apie bandomąją cheminę medžiagą, pvz., informacijos apie jos struktūrinę formulę, garų slėgį, disociacijos konstantą ir hidrolizę kaip pH funkciją.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Dėstant šį bandymo metodą aprašomi du metodai – kolonėlės eliuavimo metodas ir kolbos metodas, atitinkamai taikomi, kai tirpumas yra mažesnis kaip 10–2 g/l ir kai tirpumas yra didesnis kaip 10–2 g/l. Taip pat aprašomas paprastas išankstinis bandymas. Šiuo bandymu galima nustatyti apytikrį ėminio kiekį, naudotiną per galutinį bandymą, ir laiką, reikalingą sočiai užtikrinti.
                           
                        APIBRĖŽTYS IR VIENETAI
                  
                              4.
                           
                           
                              Cheminės medžiagos tirpumas vandenyje yra medžiagos soties masės koncentracija vandenyje esant tam tikrai temperatūrai.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Tirpumas vandenyje išreiškiamas tirpinio mase tirpalo tūryje. SI sistemos vienetas – kg/m3, bet gali būti naudojama ir g/l.
                           
                        ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS
                  
                              6.
                           
                           
                              Tiriant bandomąją cheminę medžiagą, etaloninių cheminių medžiagų naudoti nereikia.
                           
                        METODŲ APRAŠYMAS
                  
                     Bandymo sąlygos
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Bandymą geriausia atlikti 20 ± 0,5 °C temperatūroje. Pasirinktoji temperatūra turėtų būti išlaikoma pastovi visose svarbiose įrangos dalyse.
                           
                        
                     Išankstinis bandymas
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Į apytikriai 0,1 g ėminio (kietosios bandomosios cheminės medžiagos turi būti pulverizuotos), esančio stikliniu kaiščiu užkimštame 10 ml talpos matavimo cilindre, kambario temperatūroje nuosekliai pilami vis didesni vandens kiekiai. Kiekvieną kartą įpylus tam tikrą vandens kiekį, mišinys kratomas 10 minučių ir vizualiai tikrinama, ar nėra neištirpusių ėminio dalelių. Jeigu supylus 10 ml vandens ėminys arba jo dalys neištirpsta, bandymas tęsiamas 100 ml talpos matavimo cilindre. Toliau pateiktoje 1 lentelėje nurodytas apytikris tirpumas esant tokiam vandens tūriui, kuriame ėminys visiškai ištirpsta. Kai tirpumas mažas, bandomajai cheminei medžiagai ištirpinti gali reikėti daug laiko; tam turėtų būti skiriamos ne mažiau kaip 24 valandos. Jeigu per 24 valandas bandomoji cheminė medžiaga vis tiek neištirpsta, turėtų būti skiriama daugiau laiko (bet ne daugiau kaip 96 val.), arba turėtų būti mėginama dar labiau skiesti, siekiant išsiaiškinti, ar turėtų būti taikomas kolonėlės eliuavimo arba kolbos metodas.
                              
                                 1   lentelė
                              
                              
                                          Vandens tūris (ml), reikalingas ištirpinti 0,1 g tirpinio
                                       
                                       
                                          0,1
                                       
                                       
                                          0,5
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                       
                                          100
                                       
                                       
                                          > 100
                                       
                                    
                                          Apytikris tirpumas (g/l)
                                       
                                       
                                          > 1 000
                                       
                                       
                                          200–1 000
                                       
                                       
                                          100–200
                                       
                                       
                                          50–100
                                       
                                       
                                          10–50
                                       
                                       
                                          1–10
                                       
                                       
                                          < 1
                                       
                                    
                        
                     Kolonėlės eliuavimo metodas
                  
                  
                     Principas
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Šis metodas pagrįstas bandomosios cheminės medžiagos eliuavimu vandeniu iš mikrokolonėlės, į kurią įdėta inertinės pagalbinės medžiagos, pirmiau padengtos pertekliniu bandomosios medžiagos kiekiu (2). Tirpumas vandenyje nustatomas pagal eliuato masės koncentraciją, susidariusią pasiekus laiko funkcijos kreivės plokščiąją dalį.
                           
                        
                     Aparatūra
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Vienas iš prietaisų – mikrokolonėlė (1 paveikslas), kurioje išlaikoma pastovi temperatūra. Ji prijungiama prie recirkuliacinio siurblio (2 paveikslas) arba išlyginamojo indo (3 paveikslas). Į mikrokolonėlę įdedama inertinės pagalbinės medžiagos, laikomos vietoje mažu stiklo vatos kamščiu, kuris kartu atlieka dalelių filtravimo funkciją. Kaip pagalbinės medžiagos gali būti naudojami stiklo rutuliukai, diatomitas arba kitos inertinės medžiagos.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              1 paveiksle parodyta mikrokolonėlė yra tinkama prijungti prie recirkuliacinio siurblio. Kolonėlės viršutinėje dalyje yra tiek erdvės, kad joje tilptų penki sluoksniai (pradedant bandymą jie išpilami) ir penki ėminiai (atliekant bandymą jie paimami analizei). Arba šį dydį galima sumažinti, jeigu atliekant bandymą į sistemą galima įpilti vandens, kuriuo būtų pakeisti pradiniai penki su priemaišomis pašalinami sluoksniai. Kolonėlė prijungiama prie recirkuliacinio siurblio iš inertinės medžiagos pagamintais vamzdeliais, kuriais galima užtikrinti apie 25 ml/h pralaidumą. Pvz., recirkuliacinis siurblys gali būti peristaltinis arba membraninis siurblys. Reikia imtis atsargumo priemonių, kad vamzdelis neužsiterštų ir (arba) kad nevyktų adsorbcija į vamzdelio medžiagą.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              3 paveiksle pateikta montavimo naudojant išlyginamąjį indą schema. Pagal šią montavimo schemą mikrokolonėlėje įrengiamas vienšakis čiaupas. Išlyginamasis indas prijungiamas naudojant matinio stiklo jungtį ir vamzdelius, pagamintus iš inertinės medžiagos. Srauto, tekančio iš išlyginamoji indo, greitis turėtų būti apie 25 ml/h.
                              
                                 1   paveikslas
                              
                              
                                 
                              Matmenys, mm
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Matinio stiklo jungties prijungimas
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Viršerdvė
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Vidinė dalis – 5
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Išorinė dalis – 19
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Stiklinės vatos kamštis
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Uždaromasis čiaupas
                                       
                                    
                                 2   paveikslas
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Atmosferinis pusiausvirinimas
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Srautmatis
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Mikrokolonėlė
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Termostatu kontroliuojamas cirkuliacinis siurblys
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Recirkuliacinis siurblys
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Dvišakis ėminių ėmimo vožtuvas
                                       
                                    
                                 3   paveikslas
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Išlyginamasis indas (pvz., 2,5 l cheminė kolba)
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Kolonėlė
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Frakcijos rinktuvas
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Termostatas
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Tefloninis vamzdelis
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Matinio stiklo jungtis
                                       
                                    
                                          G.
                                       
                                       
                                          Vamzdelis vandeniui (tarp termostato ir kolonėlės, vidinis skersmuo – apie 8 mm)
                                       
                                    
                        
                              13.
                           
                           
                              Apie 600 mg pagalbinės medžiagos perpilama į 50 ml apvaliadugnę kolbą. Tinkamas bandomosios cheminės medžiagos kiekis ištirpinamas lakiame analizinio reagento kokybės tirpiklyje, ir reikiamas šio tirpalo kiekis užpilamas ant pagalbinės medžiagos. Tirpiklis visiškai išgarinamas, pavyzdžiui, sukamajame garintuve, nes kitaip eliuavimo etapu dėl paviršinio skaidymosi pagalbinė medžiaga nebus įsotinta vandeniu. Įkrauta pagalbinė medžiaga dvi valandas mirkoma apytikriai 5 mililitruose vandens, po to suspensija supilama į mikrokolonėlę. Arba dedama sausa pagalbinė medžiaga gali būti supilama į vandens pripildytą mikrokolonėlę ir dvi valandas paliekama nusistovėti pusiausvyrai.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Dėl pagalbinės medžiagos įkrovimo gali kilti sunkumų ir dėl to gali būti gauti klaidingi rezultatai, pvz., kai bandomoji cheminė medžiaga nusėda kaip alyva. Šios problemos turėtų būti išnagrinėtos ir apie jas turėtų būti pateikta išsami informacija ataskaitoje.
                           
                        
                     Procedūra, taikoma naudojant recirkuliacinį siurblį
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Srautas pradedamas leisti per kolonėlę. Rekomenduojamas srauto greitis – apie 25 ml/val.; aprašytos kolonėlės atveju tai atitinka 10 sluoksnių per valandą. Ne mažiau kaip penki pirmieji sluoksniai išpilami, kad būtų pašalintos vandenyje tirpios priemaišos. Tada recirkuliacinis siurblys paliekamas veikti tol, kol nusistovi pusiausvyra, kuri laikoma pasiekta tada, kai penkių paeiliui paimtų ėminių koncentracijos atsitiktine tvarka skiriasi ne daugiau kaip ± 30 %. Šie ėminiai turėtų būti imami laiko intervalais, per kuriuos pasikeičia ne mažiau kaip dešimt eliuato sluoksnių. Atsižvelgiant į taikomą analizės metodą, gali būti naudinga nubrėžti koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomybės kreivę, rodančią, ar jau pasiekta pusiausvyra.
                           
                        
                     Procedūra, taikoma naudojant išlyginamąjį indą
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Ištisinės sekos eliuato frakcijos turėtų būti surenkamos ir analizuojamos pasirinktu metodu. Intervalo vidurio eliuato frakcijos, kurių koncentracijos yra pastovios (± 30 %) ne mažiau kaip penkiose paeiliui paimtose frakcijose, yra naudojamos nustatyti tirpumą vandenyje.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Tinkamiausias eliuatas – du kartus distiliuotas vanduo. Taip pat gali būti naudojamas dejonizuotas vanduo, kurio savitoji varža didesnė kaip 10 ΜΩ/cm, o bendras organinės anglies kiekis mažesnis kaip 0,01 %.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Pagal abi procedūras atliekamas antrasis matavimas, taikant perpus mažesnį srauto greitį nei pirmąjį kartą. Jeigu abiejų matavimų rezultatai sutampa, bandymas yra patenkinamas. Jeigu esant mažesniam srauto greičiui nustatomas didesnis tirpumas, srauto greitis turi būti toliau mažinamas perpus tol, kol dviem vienas po kito einančiais matavimais bus gautas toks pat tirpumas.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Taikant abi procedūras turėtų būti patikrinama, ar frakcijose nėra koloidinių medžiagų, tiriant, ar nepasireiškia Tindalio efektas. Jeigu tokių dalelių yra, bandymo rezultatai negalioja, ir bandymas turėtų būti pakartojamas, prieš tai pagerinus kolonėlės filtruojamąsias savybes.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Turėtų būti išmatuojamas kiekvieno ėminio pH, geriausia – naudojant specialias indikacines juosteles.
                           
                        
                     Kolbos metodas
                  
                  
                     Principas
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga (kietosios medžiagos turi būti pulverizuojamos) ištirpinama vandenyje, kurio temperatūra šiek tiek aukštesnė už bandymo temperatūrą. Pasiekus sotį, mišinys ataušinamas ir laikomas bandymo temperatūroje. Matavimas gali būti atliekamas ir esant tiksliai bandymo temperatūrai, jeigu atitinkama ėminių imtimi užtikrinama, kad bus pasiekta soties pusiausvyra. Tada bandomosios cheminės medžiagos masės koncentracija vandeniniame tirpale, kuriame turi nebūti neištirpusių dalelių, yra nustatoma atitinkamu analizės metodu (3).
                           
                        
                     Aparatūra
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Reikalingos tokios medžiagos:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          įprasti laboratoriniai stikliniai indai ir prietaisai,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          prietaisas, tinkamas tirpalams suplakti kontroliuojamoje pastovioje temperatūroje,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          centrifuga (pageidautina, su reguliuojama temperatūra), jeigu ji būtina emulsijoms parengti, ir
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analizės įranga.
                                       
                                    
                        
                     Procedūra
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Išankstiniu bandymu apskaičiuojamas bandomosios cheminės medžiagos kiekis, reikalingas pageidaujamam vandens tūriui įsotinti. Apytikriai penkis kartus didesnis kiekis įdedamas į kiekvieną iš trijų stiklinių indų su stikliniais kaiščiais (pvz., centrifugos vamzdžius, kolbas). Į kiekvieną indą įpilamas vandens kiekis, parinktas atsižvelgiant į analizės metodą ir tirpumo intervalą. Indai tvirtai uždaromi ir kratomi 30 °C temperatūroje. Turėtų būti naudojamas kratytuvas arba maišytuvas, galintis dirbti pastovioje temperatūroje, pvz., gali būti taikomas magnetinis maišymas termostatu kontroliuojamoje vandens vonelėje. Po paros vienas indas išimamas ir 24 valandoms paliekamas bandymo temperatūroje, kad nusistovėtų pusiausvyra, retsykiais pakratant. Tada indo turinys centrifuguojamas bandymo temperatūroje ir atitinkamu analizės metodu nustatoma bandomosios cheminės medžiagos koncentracija skaidrioje vandeninėje fazėje. Su kitomis dviem kolbomis daroma taip pat, prieš tai atitinkamai per dvi ir tris paras užtikrinus pradinę pusiausvyrą 30 °C temperatūroje. Jeigu bent paskutiniuosiuose dviejuose induose išmatuota koncentracija nesiskiria daugiau kaip 15 %, bandymas yra patenkinamas. Jeigu 1, 2 ir 3 indų rezultatai krypsta į didesnes vertes, visas bandymas turėtų būti pakartojamas taikant ilgesnius pusiausvirinimo laikotarpius.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Bandymas gali būti atliekamas ir be išankstinio laikymo 30 °C temperatūroje. Kad būtų galima apskaičiuoti soties pusiausvirinimo greitį, ėminiai imami tol, kol maišymo laikas nebeturi įtakos išmatuotai koncentracijai.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Turėtų būti išmatuojamas kiekvieno ėminio pH, geriausia – naudojant specialias indikacines juosteles.
                           
                        
                     Analitiniai tyrimai
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Turėtų būti taikomas konkrečiai cheminei medžiagai pritaikytas metodas, kadangi nedideli priemaišų medžiagų kiekiai gali būti didelių matuojamo tirpumo paklaidų priežastis. Tokių metodų pavyzdžiai: dujų arba skysčių chromatografija, titravimo metodai, fotometriniai metodai, voltamperometriniai metodai.
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITOS
                  
                     Duomenys
                  
                  
                     Kolonėlės eliuavimo metodas
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Per kiekvieną matavimą turėtų būti apskaičiuotos ne mažiau kaip penkių iš soties kreivės plokščiosios dalies paeiliui paimtų ėminių vidutinės vertės ir standartiniai nuokrypiai. Vidutinės vertės, gautos per du bandymus taikant skirtingus srautus, turėtų skirtis ne daugiau kaip 30 %.
                           
                        
                     Kolbos metodas
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Apskaičiuojamas kiekvienoje iš trijų kolbų gautų atskirų rezultatų, kurie turėtų skirtis ne daugiau kaip 15 %, vidurkis.
                           
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                     Kolonėlės eliuavimo metodas
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          išankstinio bandymo rezultatai,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          cheminis tapatumas ir priemaišos (išankstinio gryninimo etapas, jeigu toks buvo taikomas),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kiekvieno ėminio koncentracija, srauto greitis ir pH,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          ne mažiau kaip penkių ėminių, paimtų iš kiekvieno matavimo soties kreivės plokščiosios dalies, vidutinės vertės ir standartiniai nuokrypiai,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          dviejų vienas po kito atliktų matavimų vidurkis,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          vandens temperatūra įsotinimo metu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analizės metodas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pagalbinės medžiagos pobūdis,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pagalbinės medžiagos dėjimas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          naudotas tirpiklis,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          cheminės medžiagos cheminio nestabilumo per bandymą įrodymai,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          visa informacija, svarbi rezultatų aiškinimui, ypač apie priemaišas ir bandomosios cheminės medžiagos fizinę būseną.
                                       
                                    
                        
                     Kolbos metodas
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          išankstinio bandymo rezultatai,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          cheminis tapatumas ir priemaišos (išankstinio gryninimo etapas, jeigu toks buvo taikomas),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          atskiri analitiniai tyrimai ir vidurkis, jeigu kiekvienai kolbai buvo nustatoma daugiau nei viena vertė,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kiekvieno ėminio pH,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          skirtingų kolbų, kurių duomenys sutampa, verčių vidurkis,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          bandymo temperatūra,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analizės metodas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          cheminės medžiagos cheminio nestabilumo per bandymą įrodymai,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          visa informacija, svarbi rezultatų aiškinimui, ypač apie priemaišas ir bandomosios cheminės medžiagos fizinę būseną.
                                       
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              1992 m. liepos 31 d. Komisijos direktyva 92/69/EEB, septynioliktąjį kartą su technikos pažangos derinanti Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo (OL L 383, 1992 12 29, p. 113).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              NF T 20–045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              NF T 20–046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method“.
                           
                        
            
                  2)
               
               
                  Įtraukiamas A.23 skyrius:
                  „A.23.   PASISKIRSTYMO KOEFICIENTAS (1-OKTANOLIS / VANDUO). LĖTO MAIŠYMO METODAS
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 123 (OECD bandymo gairės Nr. 123) (2006 m.). 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficiento (POW) vertės, kai log POW neviršija 8,2, tiksliai nustatytos taikant lėto maišymo metodą (1). Todėl Šis bandymo metodas yra tinkamas tiesiogiai nustatyti didelio hidrofobiškumo medžiagų POW.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Kiti 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficiento (POW) nustatymo metodai yra kratomos kolbos metodas (2) ir POW nustatymas remiantis atvirkštinės fazės HPLC sulaikymo savybėmis (3). Kratomos kolbos metodui būdingi artefaktai, susidarantys labai mažiems oktanolio lašeliams pereinant į vandeninę fazę. Didėjant POW vertėms, dėl šių lašelių buvimo vandeninėje fazėje vis labiau pervertinama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija vandenyje. Todėl šis metodas taikytinas tik toms cheminėms medžiagoms, kurių POW vertė mažesnė nei 4. Antrasis metodas grindžiamas patikimais tiesiogiai nustatytų POW verčių duomenimis, naudojamais tiksliai nustatyti HPLC sulaikymo savybių ir išmatuotų POW verčių tarpusavio priklausomybę. Buvo paskelbtas OECD gairių, skirtų nustatyti jonizuojamųjų cheminių medžiagų 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientus, projektas (4), tačiau jis nebenaudotinas.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas parengtas Nyderlanduose. Čia aprašytų metodų tikslumas patvirtintas ir pagerintas per tarplaboratorinį patvirtinamąjį tyrimą, kuriame dalyvavo 15 laboratorijų (5).
                           
                        PIRMINIAI ASPEKTAI
                  
                     Reikšmė ir taikymas
                  
                  
                              4.
                           
                           
                              Nagrinėjant inertines organines chemines medžiagas, nustatyta labai stiprių priklausomybių tarp 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientų (POW) ir tų medžiagų bioakumuliacijos žuvyse. Be to, įrodyta, kad POW susijęs su toksiškumu žuvims, taip pat su cheminių medžiagų sugertimi į kietąsias medžiagas, pvz., dirvožemius ir nuosėdas. Išsami šių priklausomybių apžvalga pateikta literatūros šaltinyje (6).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Nustatyta didelė 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficiento ir kitų cheminės medžiagos savybių, kurios yra svarbios aplinkos toksikologijai ir chemijai, tarpusavio priklausomybių įvairovė. Todėl 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientas ilgainiui tapo pagrindiniu kriterijumi vertinant cheminių medžiagų keliamą pavojų aplinkai, taip pat prognozuojant cheminių medžiagų išliekamumą aplinkoje.
                           
                        
                     Taikymo sritis
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Manoma, kad atliekant lėto maišymo bandymą sumažinamas labai mažų lašelių susidarymas iš 1-oktanolio lašelių vandeninėje fazėje. Todėl nepervertinama koncentracija vandenyje, susidaranti dėl bandomosios cheminės medžiagos molekulių, susijusių su šiais lašeliais. Dėl šios priežasties lėto maišymo metodas yra labai tinkamas nustatyti POW, susijusį su cheminėmis medžiagomis, kurių numatomos log POW vertės yra 5 arba didesnės ir kurioms taikant kratomos kolbos metodą (2) veikiausiai būtų gauti klaidingi rezultatai.
                           
                        APIBRĖŽTIS IR VIENETAI
                  
                              7.
                           
                           
                              Cheminės medžiagos pasiskirstymo tarp vandens ir lipofilinio tirpiklio (1-oktanolio) koeficientas rodo cheminės medžiagos pusiausvyros pasiskirstymą dviejose fazėse. Pasiskirstymo tarp vandens ir 1-oktanolio koeficientas (POW) apibrėžiamas kaip bandomosios cheminės medžiagos pusiausvyros koncentracijų 1-oktanolyje, įsotintame vandeniu (CO), ir vandenyje, įsotintame 1-oktanoliu (CW), santykis.
                              
                                 
                              Koncentracijų santykis yra bematis. Dažniausiai jis nurodomas kaip logaritmas pagrindu 10 (log POW). POW priklauso nuo temperatūros, todėl pateikiant duomenis turėtų būti nurodyta matavimo temperatūra.
                           
                        METODO PRINCIPAS
                  
                              8.
                           
                           
                              Norint nustatyti pasiskirstymo koeficientą, pasiekiama vandens, 1-oktanolio ir bandomosios cheminės medžiagos tarpusavio pusiausvyra esant pastoviai temperatūrai. Tada nustatomos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos abiejose fazėse.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Bandymų sunkumus, susijusius su labai mažų lašelių susidarymu atliekant kratomos kolbos bandymą, galima sumažinti atliekant čia siūlomą lėto maišymo bandymą. Atliekant lėto maišymo bandymą, 1-oktanolio ir bandomosios cheminės medžiagos pusiausvyra pasiekiama termostatu kontroliuojamame maišomame reaktoriuje. Perėjimas iš vienos fazės į kitą pagreitinamas maišant. Maišant sukuriamas nedidelis sūkuriavimas, kuriuo pagerinamas perėjimas iš 1-oktanolio į vandenį (ir atvirkščiai) be labai mažų lašelių susidarymo (1).
                           
                        BANDYMO TINKAMUMAS
                  
                              10.
                           
                           
                              Kadangi kitų cheminių medžiagų, be bandomosios, buvimas gali turėti įtakos bandomosios cheminės medžiagos aktyvumo koeficientui, bandomoji cheminė medžiaga turėtų būti bandoma kaip gryna cheminė medžiaga. Per 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo bandymą turėtų būti naudojama pati gryniausia cheminė medžiaga, kokios tik galima įsigyti rinkoje.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Šis metodas taikomas grynoms cheminėms medžiagoms, kurios nesiskaido ar nesijungia ir kurioms nebūdinga aktyvi sąveika. Jis gali būti taikomas nustatyti tokių cheminių medžiagų ir mišinių 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientą. Jeigu metodas taikomas mišiniams, nustatytieji 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientai yra sąlyginiai ir priklauso nuo cheminės bandomojo mišinio sudėties ir nuo elektrolitų, kurie naudojami kaip vandeninė fazė, sudėties. Įtraukus papildomų etapų, šis metodas taip pat gali būti taikomas besiskaidantiems arba besijungiantiems junginiams (12 skirsnis).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Dėl įvairios pusiausvyros vandenyje ir 1-oktanolyje, kurie naudojami per besiskaidančių cheminių medžiagų, pvz., organinių rūgščių ir fenolių, organinių bazių ir organometalinių cheminių medžiagų, pasiskirstymo procesą, 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientas yra sąlyginė konstanta, labai priklausoma nuo elektrolitų sudėties (7) (8). Todėl nustatant 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientą būtina bandymo metu kontroliuoti pH ir elektrolitų sudėtį ir tai nurodyti ataskaitoje. Vertinant šiuos pasiskirstymo koeficientus, būtina atsižvelgti į ekspertų nuomonę. Taikant disociacijos konstantos (-ų) vertę (-es), turi būti parinktos tinkamos pH vertės, kad pasiskirstymo koeficientas būtų nustatytas kiekvienai jonizacijos būklei. Atliekant bandymus su organometaliniais junginiais, turi būti naudojami nekompleksodariniai buferiai. Atsižvelgiant į turimas žinias apie vandens chemiją (kompleksodaros konstantas, disociacijos konstantas), Bandymo sąlygos turėtų būti parinktos taip, būtų galima įvertinti bandomosios cheminės medžiagos atmainavimą. Per visus bandymus naudojant foninį elektrolitą turėtų būti užtikrinta tokia pat joninė jėga.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Atliekant bandymą gali kilti sunkumų, kai bandymas atliekamas su cheminėmis medžiagomis, kurios prastai tirpsta vandenyje arba kurių POW yra didelis, nes koncentracijos vandenyje tampa labai mažos ir sunku jas tiksliai nustatyti. Aprašant šį bandymo metodą patariama, kaip spręsti šią problemą.
                           
                        INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
                  
                              14.
                           
                           
                              Cheminiai reagentai turėtų būti analizinio arba didesnio grynumo. Rekomenduojama naudoti žymėtąsias bandomąsias chemines medžiagas, kurių cheminė sudėtis yra žinoma ir kurių grynumas, pageidautina, ne mažesnis kaip 99 %, arba radioaktyviu izotopu žymėtąsias bandomąsias chemines medžiagas, kurių cheminė sudėtis ir radiocheminis grynumas yra žinomi. Jeigu naudojamos trumpo pusinio gyvavimo atsekamosios medžiagos, turėtų būti taikomos skilimo pataisos. Jeigu naudojamos radioaktyviu izotopu žymėtosios bandomosios cheminės medžiagos, turėtų būti taikomas cheminei medžiagai pritaikytas analizės metodas, kuriuo būtų užtikrinama, jog išmatuotasis radioaktyvumas būtų tiesiogiai susijęs su bandomąja chemine medžiaga.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Log POW įvertis gali būti gaunamas naudojant komercinę programinę įrangą, skirtą apskaičiuoti log POW, arba naudojant tirpumo abiejuose tirpikliuose santykį.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Prieš atliekant lėto maišymo bandymą, skirtą nustatyti POW, reikėtų gauti tokią informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          struktūrinė formulė;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          tinkami analizės metodai, skirti nustatyti cheminės medžiagos koncentraciją vandenyje ir 1-oktanolyje;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          jonizuojamųjų cheminių medžiagų disociacijos konstanta (-os) (OECD Guideline 112 (OECD gairės Nr. 112) (9));
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          tirpumas vandenyje (10);
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          abiotinė hidrolizė (11);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          lengvas biologinis skaidomumas (12);
                                       
                                    
                                          g)
                                       
                                       
                                          garų slėgis (13).
                                       
                                    
                        METODO APRAŠYMAS
                  
                     Įranga ir aparatūra
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Reikalinga įprasta laboratorinė įranga, pirmiausia šie dalykai:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          vandeninei fazei maišyti naudojami magnetiniai maišytuvai ir teflonu dengtos maišymo mentelės,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analizės prietaisai, tinkami nustatyti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją atsižvelgiant į numatomas koncentracijas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          maišymo indas su čiaupu apačioje; atsižvelgiant į log POW įvertį ir bandomojo mišinio aptikimo ribą (AR), turi būti apsvarstyta galimybė naudoti tokių pat geometrinių savybių reaktorių, kurio talpa būtų didesnė nei vienas litras, kad cheminės medžiagos ekstrahavimo ir analizės tikslais būtų galima paimti pakankamą kiekį vandens. Taip vandens ekstrakte susidarys didesnės koncentracijos ir analitinis tyrimas bus patikimesnis. 1 priedėlyje pateikta lentelė, kurioje nurodytas mažiausias būtinas kiekis, mišinio AR, jo apskaičiuotasis log POW ir jo tirpumas vandenyje. Lentelė sudaryta remiantis log POW priklausomybe nuo tirpumo oktanolyje ir vandenyje rodiklių santykio, kaip nurodė Pinsuwan ir kiti (14):
                                          
                                             
                                          čia:
                                          
                                              (moliais)
                                          ir Lyman (15) nustatyta priklausomybe, skirta prognozuoti tirpumą vandenyje. Tirpumo vandenyje rodikliai, apskaičiuoti naudojant 1 priedėlyje pateiktą lygtį, turi būti laikomi pirmuoju įverčiu. Reikėtų atkreipti dėmesį, kad naudotojas gali apskaičiuoti tirpumą vandenyje ir naudodamas bet kokią kitą priklausomybę, kuri, jo nuomone, geriau apibūdina hidrofobiškumo ir tirpumo sąryšį. Pvz., prognozuojant kietųjų mišinių tirpumą, rekomenduojama atsižvelgti į lydymosi temperatūrą. Jeigu naudojama pakeista lygtis, reikėtų įsitikinti, ar lygtis taip pat tinkama skaičiuoti tirpumą oktanolyje. 2 priedėlyje pateikta stiklu gaubto maišymo indo, kurio talpa apie vieną litrą, schema. Nustatyta, kad 2 priedėlyje pavaizduoto indo proporcijos yra tinkamos ir turėtų būti išsaugotos naudojant kitokio dydžio aparatą,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          būtina turėti pastovios temperatūros išlaikymo per lėto maišymo bandymą priemonę.
                                       
                                    
                        
                              18.
                           
                           
                              Indai turėtų būti pagaminti iš inertinės medžiagos, kad adsorbcija į indo paviršių būtų labai maža.
                           
                        
                     Bandomųjų tirpalų ruošimas
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              POW turėtų būti nustatomas naudojant patį gryniausią 1-oktanolį, kokio tik galima įsigyti rinkoje (ne mažesnio kaip 99 % grynumo). Rekomenduojama 1-oktanolį gryninti jį ekstrahuojant rūgštimi, baze ir vandeniu, o tada išdžiovinant. Be to, 1-oktanolis gali būti gryninamas distiliavimo būdu. Išgrynintas 1-oktanolis bus naudojamas paruošti etaloninius bandomųjų cheminių medžiagų tirpalus. Nustatant POW naudojamas vanduo turi būti distiliuotas stiklu arba kvarcu arba išgautas iš gryninimo sistemos, arba turi būti naudojamas HPLC kokybės vanduo. Distiliuotas vanduo turi būti filtruojamas per 0,22 μm filtrą; siekiant patikrinti, ar koncentruotuose ekstraktuose nėra priemaišų, kurios galėtų susimaišyti su bandomąja chemine medžiaga, taip pat turėtų būti įterpiami tuštieji ėminiai. Jeigu naudojamas stiklo pluošto filtras, jis turėtų būti išvalytas ne trumpiau kaip tris valandas kaitinant 400 °C temperatūroje.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Prieš bandymą abu tirpikliai įsotinami vienas kitu pasiekiant jų pusiausvyrą pakankamai dideliame inde. Tai atliekama dvi paras lėtai maišant dviejų fazių sistemą.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Parenkama tinkama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija ir ištirpinama 1-oktanolyje (įsotintame vandeniu). 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientas turi būti nustatytas atskiestuose tirpaluose, įpiltuose į 1-oktanolį ir vandenį. Todėl bandomosios cheminės medžiagos koncentracija neturėtų viršyti 70 % jos tirpumo, susidarant ne didesnei kaip 0,1 M koncentracijai kiekvienoje fazėje (1). Per bandymą naudojami 1-oktanolio tirpalai turi būti be suspenduotos kietosios bandomosios cheminės medžiagos.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Tinkamas bandomosios cheminės medžiagos kiekis ištirpinamas 1-oktanolyje (įsotintame vandeniu). Jeigu POW įvertis didesnis kaip penki, būtina imtis atsargumo priemonių, kad per bandymą naudojamuose 1-oktanolio tirpaluose nebūtų suspenduotos kietosios bandomosios cheminės medžiagos. Šiuo tikslu su cheminėmis medžiagomis, kurių apskaičiuotoji log POW vertė didesnė kaip 5, atliekama tokia procedūra:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          bandomoji cheminė medžiaga ištirpinama 1-oktanolyje (įsotintame vandeniu),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pakankamai ilgai palaukiama, kol nusės tirpale suspenduota kietoji cheminė medžiaga. Nusėdimo laikotarpiu stebima bandomosios cheminės medžiagos koncentracija,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kai išmatuotos koncentracijos 1-oktanolio tirpale vertės tampa pastovios, pradinis tirpalas atskiedžiamas tinkamu 1-oktanolio kiekiu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          matuojama atskiesto pradinio tirpalo koncentracija. Jeigu išmatuota koncentracija atitinka atskiedimo laipsnį, atskiestas pradinis tirpalas gali būti naudojamas per lėto maišymo bandymą.
                                       
                                    
                        
                     Ėminių ekstrahavimas ir analizė
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Bandomajai cheminei medžiagai ištirti turėtų būti taikomas patvirtintas analizės metodas. Tyrinėtojai turi pateikti įrodymų, kad koncentracijos vandeniu įsotintoje 1-oktanolio ir 1-oktanoliu įsotintoje vandeninėje fazėje per bandymą viršija metodinę taikomų analizės procedūrų kiekybinio vertinimo ribą. Tais atvejais, kai būtina taikyti ekstrahavimo metodus, prieš bandymą turi būti nustatytas analizinis bandomosios cheminės medžiagos regeneravimas iš vandeninės fazės ir iš 1-oktanolio fazės. Analizinis signalas turi būti koreguojamas atsižvelgiant į tuščiuosius ėminius, ir turėtų būti imtasi atsargumo priemonių, kad analitės nebūtų perkeltos iš vieno ėminio į kitą.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Atsižvelgiant į gana mažas hidrofobinių bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijas vandeninėje fazėje, prieš atliekant analizę veikiausiai reikės ekstrahuoti vandens fazę naudojant organinį tirpiklį ir paruošti parengtinę ekstrakto koncentraciją. Dėl tos pat priežasties būtina sumažinti atsitiktines tuščiąsias koncentracijas. Šiuo tikslu būtina naudoti didelio grynumo tirpiklius, pageidautina – likučių analizei naudojamus tirpiklius. Be to, naudojant iš anksto kruopščiai išvalytus (pvz., išplautus tirpikliais arba pakaitintus aukštoje temperatūroje) stiklinius indus, galima išvengti kryžminės taršos.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Log POW įvertį galima gauti naudojant skaičiavimo programą arba remiantis ekspertų nuomone. Jeigu vertė didesnė už šešis, būtina atidžiai stebėti su tuščiaisiais ėminiais susijusias pataisas ir analičių perkėlimą. Atitinkamai, jeigu log POW vertė didesnė už šešis, regeneravimo pataisoms privaloma taikyti pakaitinį etaloną, kad būtų galima pasiekti didelius parengtinės koncentracijos koeficientus. Rinkoje galima įsigyti įvairios programinės įrangos, skirtos apskaičiuoti log POW
                                  (1), pvz., „Clog P“ (16), „KOWWIN“ (17), „ProLogP“ (18) ir „ACD log P“ (19). Skaičiavimo principų aprašymai pateikti literatūros šaltiniuose (20–22).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Kiekybinio įvertinimo ribos (KĮR), taikytinos tiriant bandomąją cheminę medžiagą 1-oktanolyje ir vandenyje, nustatomos taikant patvirtintus metodus. Metodinė kiekybinio įvertinimo riba gali būti apytikriai nustatyta kaip koncentracija vandenyje arba 1-oktanolyje, kuriai esant gaunamas signalo ir triukšmo santykis, lygus dešimčiai. Turėtų būti parinktas tinkamas ekstrahavimo ir parengtinio koncentravimo metodas; be to, turėtų būti taikomas analizinis regeneravimas. Norint prieš analitinį tyrimą gauti reikiamo dydžio signalą, būtina parinkti tinkamą parengtinės koncentracijos koeficientą.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Remiantis analizės metodo parametrais ir numatomomis koncentracijomis, nustatomas apytikris imties dydis, reikalingas norint tiksliai nustatyti mišinio koncentraciją. Neturėtų būti naudojami vandens ėminiai, kurie yra per maži, kad būtų galima gauti pakankamą analizinį signalą. Be to, neturėtų būti naudojami pernelyg dideli vandens ėminiai, nes gali likti per mažai vandens minimaliam reikiamų analizių skaičiui (n = 5). 1 priedėlyje nurodytas mažiausias ėminio tūris, kaip indo tūrio funkcija, bandomosios cheminės medžiagos AR ir bandomosios medžiagos tirpumas.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Bandomųjų cheminių medžiagų kiekybinis įvertinimas atliekamas lyginant atitinkamo mišinio kalibravimo kreives. Koncentracija analizuojamuose ėminiuose turi būti sulyginama su etaloninėmis koncentracijomis.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Jeigu bandomosios cheminės medžiagos log POW įvertis didesnis už šešis, prieš ekstrahavimą vandens ėminiui turi būti pritaikytas pakaitinis etalonas, kad būtų galima užregistruoti nuostolius, susidarančius vandens ėminių ekstrahavimo ir parengtinio koncentravimo metu. Kad regeneravimo pataisa būtų tiksli, pakaitalų savybės turi būti labai panašios į bandomosios cheminės medžiagos savybes arba tokios pat. Pageidautina, kad šiuo tikslu būtų naudojami (stabilūs) izotopais žymėtieji dominančių cheminių medžiagų analogai (pvz., deuterizuotieji arba žymėtieji izotopu 13C). Jeigu žymėtųjų stabilių izotopų, pvz., 13C arba 2H, naudoti neįmanoma, remiantis patikimais literatūroje pateiktais duomenimis turėtų būti įrodyta, kad pakaitalo fizinės ir cheminės savybės labai panašios į bandomosios cheminės medžiagos savybes. Pagal skysčių ekstrahavimo skysčiais principą ekstrahuojant vandeninę fazę, gali susidaryti emulsijos. Jų susidarymą galima sumažinti įpilant druskos ir paliekant emulsiją nakčiai nusistovėti. Ataskaitoje turi būti nurodyti taikyti ėminių ekstrahavimo ir parengtinio koncentravimo metodai.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Iš 1-oktanolio fazės ekstrahuoti ėminiai prieš atliekant analizę prireikus gali būti atskiedžiami tinkamu tirpikliu. Be to, jeigu per cheminių medžiagų regeneravimo bandymus pastebimi dideli regeneravimo bandymų nuokrypiai (santykinis standartinis nuokrypis didesnis kaip 10 %), rekomenduojama regeneravimo pataisos tikslais naudoti pakaitinius etalonus.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Ataskaitoje būtina išsamiai aprašyti analizės metodą. Turėtų būti nurodytas ekstrahavimo metodas, parengtinės koncentracijos ir skiedimo koeficientai, kalibravimo tvarka, kalibravimo intervalas, bandomosios cheminės medžiagos analizinis regeneravimas iš vandens, pakaitinių etalonų naudojimas regeneravimo pataisos tikslais, tuščiosios vertės, aptikimo ribos ir kiekybinio įvertinimo ribos.
                           
                        
                     Bandymo eiga
                  
                  
                     Optimalūs 1-oktanolio / vandens kiekio santykiai
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Parenkant vandens ir 1-oktanolio kiekius, reikėtų atsižvelgti į kiekybinio įvertinimo ribas 1-oktanolyje ir vandenyje, vandens ėminiams taikomus parengtinės koncentracijos koeficientus, imamus 1-oktanolio ir vandens kiekius ir į numatomas koncentracijas. Bandymo sumetimais 1-oktanolio kiekis lėto maišymo sistemoje turėtų būti parinktas taip, kad 1-oktanolio sluoksnis būtų gana storas (> 0,5 cm), jog 1-oktanolio fazės ėminius būtų galima imti nesuardant šio sluoksnio.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Tipiniai fazių santykiai, taikomi tiriant mišinius, kurių log POW vertės yra 4,5 ir didesnės, yra 20–50 ml 1-oktanolio ir 950–980 ml vandens vieno litro talpos inde.
                           
                        
                     Bandymo sąlygos
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Atliekant bandymą reaktorius kontroliuojamas termostatu siekiant sumažinti temperatūros kaitą iki mažiau kaip 1 °C. Tyrimas turėtų būti atliekamas 25 °C temperatūroje.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Bandymų sistema turėtų būti apsaugota nuo dienos šviesos, bandymą atliekant tamsioje patalpoje arba reaktorių uždengiant aliuminio folija.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Bandymas turėtų būti atliekamas nedulkėtoje (kiek įmanoma) aplinkoje.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              1-oktanolio ir vandens sistema maišoma, kol pasiekiama pusiausvyra. Per bandomąjį eksperimentą, atliekant lėto maišymo eksperimentą ir periodiškai imant vandens ir 1-oktanolio ėminius, įvertinamas pusiausvirinimo laikotarpis. Minimalus ėminių ėmimo laiko intervalas – penkios valandos.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Kiekvienas POW turėtų būti nustatomas atliekant ne mažiau kaip tris atskirus lėto maišymo bandymus.
                           
                        
                     Pusiausvirinimo laikotarpio nustatymas
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Daroma prielaida, kad pusiausvyra pasiekiama tada, kai koncentracijų 1-oktanolyje ir vandenyje santykio priklausomybės nuo laiko kreivės nuolydis laikotarpiu, apimančiu keturis laiko momentus, įgyja beveik nulinę vertę, kai p reikšmė lygi 0,05. Trumpiausias pusiausvirinimo laikotarpis – viena para iki galimos ėminių ėmimo pradžios. Ėminių ėmimas iš cheminių medžiagų, kurių log POW įvertis mažesnis nei penki, apytikriai gali būti atliekamas antrąją ir trečiąją paromis. Kai tiriamos didesnio hidrofobiškumo medžiagos, pusiausvirinimo laikotarpis gali būti ilgesnis. Jeigu mišinio log POW vertė lygi 8,23 (dekachlorobifenilas), pusiausvyrai nusistovėti pakanka 144 valandų. Pusiausvyra įvertinama pakartotinai imant ėminius iš vieno indo.
                           
                        
                     Bandymo pradžia
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Pradedant bandymą reaktorius pripildomas 1-oktanoliu įsotinto vandens. Turėtų būti skiriama pakankamai laiko, kol bus pasiekta termostatu reguliuojama temperatūra.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Pageidaujamas bandomosios cheminės medžiagos kiekis (ištirpintas reikiamame vandeniu įsotinto 1-oktanolio kiekyje) atsargiai įdedamas į reaktorių. Tai labai svarbus bandymo etapas, nes būtina išvengti sūkurinio dviejų fazių maišymosi. Šiuo tikslu 1-oktanolio fazė gali būti lėtai lašinama pipete ant bandymų indo sienelės nedideliu atstumu nuo vandens paviršiaus. Tada ji nutekės stiklo sienele ir sudarys ploną sluoksnį virš vandeninės fazės. Visada reikėtų vengti tiesiogiai filtruoti 1-oktanolį į kolbą; 1-oktanolio lašeliams neturėtų būti leidžiama tiesiogiai kristi į vandenį.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Pradėjus maišyti, maišymo greitis turėtų būti pamažu didinamas. Jeigu maišymo greičio negalima tinkamai sureguliuoti, turėtų būti apsvarstyta galimybė naudoti transformatorių. Maišymo greitis turėtų būti sureguliuotas taip, kad ties vandens ir 1-oktanolio sąlyčio vieta susidarytų 0,5–2,5 cm gylio sūkurys. Sūkurio gyliui viršijus 2,5 cm, maišymo greitis turėtų būti sumažintas; kitaip iš 1-oktanolio lašelių vandeninėje fazėje gali susidaryti labai maži lašeliai, o dėl to gali būti pervertinta bandomosios cheminės medžiagos koncentracija vandenyje. Ne didesnį kaip 2,5 cm gylį atitinkantis maišymas rekomenduojamas atsižvelgiant į tarplaboratorinio patvirtinamojo tyrimo rezultatus (5). Tai greito pusiausvyros pasiekimo ir labai mažų 1-oktanolio lašelių susidarymo ribojimo kompromisas.
                           
                        
                     Ėminių ėmimas ir apdorojimas
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Prieš imant ėminius maišytuvas turėtų būti išjungtas, ir reikėtų palaukti, kol skysčiai nustos judėti. Baigus imti ėminius, maišytuvas vėl iš lėto paleidžiamas, kaip aprašyta pirmiau, ir pamažu didinamas maišymo greitis.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Vandeninės fazės ėminiai imami iš čiaupo, įrengto reaktoriaus apačioje. Visada atmeskite nenaudingą vandens kiekį, susikaupusį čiaupuose (2 priedėlyje parodytame inde – apie 5 ml). Čiaupuose susikaupęs vanduo nemaišomas, todėl nepasiekiama jo pusiausvyra su pagrindine mase. Užsirašykite vandens ėminių tūrį ir pasirūpinkite, kad nustatant masių balansą būtų atsižvelgta į bandomosios cheminės medžiagos kiekį atmestame vandenyje. Garavimo nuostoliai turėtų būti sumažinti leidžiant vandeniui inertiškai tekėti į skirstomąjį piltuvą, kad nebūtų drumsčiamas vandens ir 1-oktanolio sluoksnis.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              1-oktanolio ėminiai gaunami 100 mikrolitrų švirkštu, pagamintu tik iš stiklo ir metalo, paimant mažą (apie 100 μl) 1-oktanolio sluoksnio alikvotinę dalį. Turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad nebūtų suardyta riba. Užregistruojamas paimto skysčio tūris. Pakanka paimti mažą alikvotinę tirpalo dalį, nes 1-oktanolio ėminys bus atskiestas.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Turėtų būti vengiama nebūtinų ėminio perkėlimo veiksmų. Šiuo tikslu ėminio tūris turėtų būti nustatomas gravimetriniu būdu. Imant vandens ėminius tai galima užtikrinti vandens ėminį imant skirstomajame piltuve, kuriame jau yra reikiamas tirpiklio kiekis.
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITOS
                  
                              47.
                           
                           
                              Pagal šį bandymo metodą POW nustatomas vienodomis sąlygomis atliekant tris lėto maišymo bandymus (tris atskirus bandymus) su tiriamu mišiniu. Regresija, naudojama įrodyti pusiausvyros pasiekimą, turėtų būti grindžiama bent keturių CO/CW santykių nustatymo nuosekliais laiko momentais rezultatais. Tai suteikia galimybę apskaičiuoti dispersiją, kuria išreiškiamas per kiekvieną atskirą bandymą gautos vidutinės vertės neapibrėžtis.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              POW vertė gali būti apibūdinama duomenų, gautų per kiekvieną atskirą bandymą, dispersija. Ši informacija naudojama apskaičiuoti POW, kaip svertinį atskirų bandymų rezultatų vidurkį. Šiuo tikslu kaip svoris naudojamas atskirų bandymų rezultatų dispersijai atvirkštinis dydis. Todėl duomenys, kuriems būdingas didelis nuokrypis (išreikštas dispersija) ir atitinkamai mažesnis patikimumas, rezultatui turės mažiau įtakos nei duomenys, kuriems būdinga maža dispersija.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Lygiai taip pat apskaičiuojamas svertinis standartinis nuokrypis. Juo apibūdinamas POW matavimų pakartojamumas. Maža svertinio standartinio nuokrypio vertė reiškia, kad toje pačioje laboratorijoje gautiems POW nustatymo rezultatams būdingas labai aukštas pakartojamumas. Toliau aprašytas formalus statistinis duomenų apdorojimas.
                           
                        
                     Rezultatų apdorojimas
                  
                  
                     Pusiausvyros pasiekimo įrodymas
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Kiekvienam ėminių ėmimo laiko momentui apskaičiuojamas bandomosios cheminės medžiagos koncentracijų 1-oktanolyje ir vandenyje santykio logaritmas (log (CO/Cw)). Cheminės pusiausvyros pasiekimas įrodomas nubrėžiant šio santykio, kaip laiko funkcijos, kreivę. Šios kreivės plokščioji dalis, pagrįsta ne mažiau kaip keturiais nuosekliais laiko momentais, rodo, kad buvo pasiekta pusiausvyra ir kad mišinys iš tikrųjų ištirpo 1-oktanolyje. Priešingu atveju bandymas turi būti tęsiamas tol, kol remiantis keturiais nuosekliais laiko momentais negaunama kreivės nuolydžio, kurio vertė beveik nesiskiria nuo nulio, kai p reikšmė lygi 0,05, t. y. reiškiantis, kad log Co/Cw vertė nepriklauso nuo laiko.
                           
                        
                     Log POW apskaičiavimas
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Atskiro bandymo log POW vertė apskaičiuojama kaip svertinė vidutinė log Co/Cw vertė, pagrįsta log Co/Cw kreivės, kaip laiko funkcijos, dalimi, kurioje įrodytas pusiausvyros susidarymas. Svertinis vidurkis apskaičiuojamas duomenims taikant svorius, išreikštus dispersijai atvirkštiniu dydžiu, kad duomenų įtaka galutiniam rezultatui būtų atvirkščiai proporcinga duomenų neapibrėžčiai.
                           
                        
                     Log POW vidurkis
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Vidutinė atskirų bandymų log POW vertė apskaičiuojama kaip atskirų bandymų rezultatų, kuriems buvo pritaikyti jų atitinkamomis dispersijomis pagrįsti svoriai, vidurkis.
                              Skaičiuojama taip:
                              
                                 
                              čia:
                              
                                          log POW,i
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          atskiro bandymo i log POW vertė;
                                       
                                    
                                          log POW,Av
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          atskirų log POW įverčių svertinis vidurkis;
                                       
                                    
                                          wi
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          statistinis svoris, priskirtas atskiro bandymo i log POW vertei.
                                       
                                    Atvirkštinis log POW,i dispersijai dydis yra wi ().
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Log POW vidurkio paklaida apskaičiuojama kaip log Co/Cw, nustatyto atskirų bandymų pusiausvirinimo etapu, pakartojamumas. Jis išreiškiamas kaip log POW,Av (σlog Pow,Av) svertinis standartinis nuokrypis, kuris savo ruožtu yra log POW,Av paklaidos matas. Svertinis standartinis nuokrypis gali būti skaičiuojamas remiantis svertine dispersija (varlog Pow,Av):
                              
                                 
                              
                                 
                              Simbolis n reiškia atskirų bandymų skaičių.
                           
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikta toliau nurodyta informacija.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      įprastas pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, struktūrinė formulė (rodanti žymėtojo atomo padėtį, jeigu naudojama radioaktyviu izotopu žymėtoji cheminė medžiaga) ir atitinkamos fizinės bei cheminės savybės (žr. 17 skirsnį),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandomosios cheminės medžiagos grynumas (priemaišos),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      radiocheminis žymėtųjų cheminių medžiagų grynumas ir molinis aktyvumas (jeigu tinka),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išankstinis log Pow įvertis, taip pat vertės apskaičiavimo metodas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tyrimų datos,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandymo temperatūra,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      1-oktanolio ir vandens tūriai bandymo pradžioje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      paimtų 1-oktanolio ir vandens ėminių tūriai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandymo induose likę 1-oktanolio ir vandens tūriai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudotų bandymo indų ir taikytų maišymo sąlygų aprašas (maišymo mentelių ir bandymo indo geometrinės savybės, sūkurio gylis milimetrais, ir, jeigu žinoma, maišymo greitis),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analizės metodai, taikyti įvertinti bandomąją cheminę medžiagą ir metodinę kiekybinio įverčio ribą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ėminių ėmimo laikas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vandeninės fazės pH ir naudoti buferiai, kai pH koreguojamas atsižvelgiant į jonizuojamąsias molekules,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kartojimų skaičius.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatai:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      taikytų analizės metodų pakartojamumas ir jautris,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nustatytos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos 1-oktanolyje ir vandenyje, kaip laiko funkcija,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      masių balanso įrodymas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      temperatūra ir standartinis nuokrypis arba temperatūros intervalas bandymo metu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      koncentracijų santykio regresija, kaip laiko funkcija,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vidutinė log Pow,Av vertė ir jos standartinė paklaida,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatų aptarimas ir paaiškinimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tipinės analizės pirminių duomenų rodiklių pavyzdžiai (visi pirminiai duomenys turi būti saugomi pagal GLP reikalavimus), nurodant pakaitalų regeneravimą, kalibruojant taikytų lygių skaičių (nurodant kalibravimo kreivės koreliacijos koeficiento kriterijus) ir kokybės užtikrinimo ir (arba) kokybės kontrolės (KU/KK) rezultatus,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jeigu yra – tyrimo procedūros patvirtinimo ataskaita (turi būti nurodyta kaip literatūros šaltinis).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ’slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499–512.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Šio priedo A.8 skyrius. Pasiskirstymo koeficientas.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Šio priedo A.8 skyrius. Pasiskirstymo koeficientas.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596–2602.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Šio priedo A.6 skyrius. Tirpumas vandenyje.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Šio priedo C.7 skyrius. Skaidymas. Abiotinis skaidymas. Hidrolizė kaip pH funkcija.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Šio priedo C.4 skyrius. II–VII dalys (A–F metodai). „Lengvo“ biologinio skaidomumo matavimas.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Šio priedo A.4 skyrius. Garų slėgis.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623–626.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2–1 to 2–52.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479–488.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386–390.
                           
                        
                     1 priedėlis
                     
                        Mažiausio vandens tūrio, reikalingo aptikti bandomąsias chemines medžiagas su įvairiomis log POW vertėmis vandeninėje fazėje, skaičiuoklė
                     
                     Prielaidos:
                     
                                 —
                              
                              
                                 mažiausias atskirų alikvotinių tirpalo dalių tūris – 10 % viso tūrio, penkių alikvotinių tirpalo dalių – 50 % viso tūrio,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 
                                    . Esant mažesnėms koncentracijoms, gali reikėti didesnio tūrio,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tūris, reikalingas norint nustatyti aptikimo ribą (AR): 100 ml,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 log Pow/log Sw ir log Pow/SR (Soct/Sw) yra patikimos bandomosioms cheminėms medžiagoms taikytinų tarpusavio priklausomybių išraiškos.
                              
                           
                        Sw įvertis
                     
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Lygtis
                              
                              
                                 log Sw
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,496
                              
                              
                                 3,133E+00
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,035
                              
                              
                                 1,084E+00
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,426
                              
                              
                                 3,750E-01
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,887
                              
                              
                                 1,297E-01
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,348
                              
                              
                                 4,487E-02
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,809
                              
                              
                                 1,552E-02
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,270
                              
                              
                                 5,370E-03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,731
                              
                              
                                 1,858E-03
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –3,192
                              
                              
                                 6,427E-04
                              
                           
                        Sokt. įvertis
                     
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Lygtis
                              
                              
                                 Soct (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 3,763E+04
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 4,816E+04
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 6,165E+04
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 7,890E+04
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,010E+05
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,293E+05
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,654E+05
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,117E+05
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,710E+05
                              
                           
                        
                     
                                 Bendra bandomosios cheminės medžiagos masė
                                 (mg)
                              
                              
                                 Masėokt./Masėvand.
                                 
                              
                              
                                 MasėH2O
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 Konc.H2O
                                 
                                 (mg/l)
                              
                              
                                 Masėokt.
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 Konc.okt.
                                 
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 1 319
                              
                              
                                 526
                              
                              
                                 2,5017
                              
                              
                                 2,6333
                              
                              
                                 1 317
                              
                              
                                 26 333
                              
                           
                                 1 686
                              
                              
                                 1 664
                              
                              
                                 1,0127
                              
                              
                                 1,0660
                              
                              
                                 1 685
                              
                              
                                 33 709
                              
                           
                                 2 158
                              
                              
                                 5 263
                              
                              
                                 0,4099
                              
                              
                                 0,4315
                              
                              
                                 2 157
                              
                              
                                 43 149
                              
                           
                                 2 762
                              
                              
                                 16 644
                              
                              
                                 0,1659
                              
                              
                                 0,1747
                              
                              
                                 2 762
                              
                              
                                 55 230
                              
                           
                                 3 535
                              
                              
                                 52 632
                              
                              
                                 0,0672
                              
                              
                                 0,0707
                              
                              
                                 3 535
                              
                              
                                 70 691
                              
                           
                                 4 524
                              
                              
                                 1664 36
                              
                              
                                 0,0272
                              
                              
                                 0,0286
                              
                              
                                 4 524
                              
                              
                                 90 480
                              
                           
                                 5 790
                              
                              
                                 5263 16
                              
                              
                                 0,0110
                              
                              
                                 0,0116
                              
                              
                                 5 790
                              
                              
                                 115 807
                              
                           
                                 7 411
                              
                              
                                 1 664 357
                              
                              
                                 0,0045
                              
                              
                                 0,0047
                              
                              
                                 7 411
                              
                              
                                 148 223
                              
                           
                                 9 486
                              
                              
                                 5 263 158
                              
                              
                                 0,0018
                              
                              
                                 0,0019
                              
                              
                                 9 486
                              
                              
                                 189 713
                              
                           
                        Tūrio apskaičiavimas
                     
                     
                        Mažiausias tūris, reikalingas H2O fazei pagal kiekvieną AR koncentraciją
                     
                     
                                 log Kow
                                 
                              
                              
                                 AR (μg/l)→
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,38
                              
                              
                                 3,80
                              
                              
                                 38
                              
                              
                                 380
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,94
                              
                              
                                 9,38
                              
                              
                                 94
                              
                              
                                 938
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 232
                              
                              
                                 2 318
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,57
                              
                              
                                 5,73
                              
                              
                                 57,26
                              
                              
                                 573
                              
                              
                                 5 726
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,41
                              
                              
                                 14,15
                              
                              
                                 141
                              
                              
                                 1 415
                              
                              
                                 14 146
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 3,50
                              
                              
                                 34,95
                              
                              
                                 350
                              
                              
                                 3 495
                              
                              
                                 34 950
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 8,64
                              
                              
                                 86,35
                              
                              
                                 864
                              
                              
                                 8 635
                              
                              
                                 86 351
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 21,33
                              
                              
                                 213
                              
                              
                                 2 133
                              
                              
                                 21 335
                              
                              
                                 213 346
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 52,71
                              
                              
                                 527
                              
                              
                                 5 271
                              
                              
                                 52 711
                              
                              
                                 527 111
                              
                           
                                 Tūris, naudojamas norint nustatyti AR (I)
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                        Skaičiavimų paaiškinimai:
                     
                     Sudaro mažiau kaip 10 % viso vandeninės fazės tūrio, naudojant 1 litro talpos pusiausvirinimo indą.
                     Sudaro mažiau kaip 10 % viso vandeninės fazės tūrio, naudojant 2 litrų talpos pusiausvirinimo indą.
                     Sudaro mažiau kaip 10 % viso vandeninės fazės tūrio, naudojant 5 litrų talpos pusiausvirinimo indą.
                     Sudaro mažiau kaip 10 % viso vandeninės fazės tūrio, naudojant 10 litrų talpos pusiausvirinimo indą.
                     Daugiau kaip 10 % naudojant net 10 litrų talpos pusiausvirinimo indą.
                     
                        Reikalingų tūrių, kaip tirpumo vandenyje ir log POW funkcijos, apžvalga
                     
                     Mažiausias tūris, reikalingas H2O fazei pagal kiekvieną AR koncentraciją (ml)
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                              
                                 AR (μg/l)→
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,24
                              
                              
                                 2,38
                              
                              
                                 23,80
                              
                              
                                 237,97
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 3
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,40
                              
                              
                                 3,97
                              
                              
                                 39,66
                              
                              
                                 396,62
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                              
                                 1 189,86
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                 0,51
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,84
                              
                              
                                 508,42
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,02
                              
                              
                                 10,17
                              
                              
                                 101,68
                              
                              
                                 1 016,83
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                              
                                 2 033,67
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,87
                              
                              
                                 8,69
                              
                              
                                 86,90
                              
                              
                                 869,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,17
                              
                              
                                 1,74
                              
                              
                                 17,38
                              
                              
                                 173,80
                              
                              
                                 1 738,02
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,375
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 231,75
                              
                              
                                 2 317,53
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,43
                              
                              
                                 4,35
                              
                              
                                 43,45
                              
                              
                                 434,51
                              
                              
                                 4 345,05
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 0,4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,19
                              
                              
                                 1,86
                              
                              
                                 18,57
                              
                              
                                 185,68
                              
                              
                                 1 856,79
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,37
                              
                              
                                 3,71
                              
                              
                                 37,14
                              
                              
                                 371,36
                              
                              
                                 3 713,59
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,74
                              
                              
                                 7,43
                              
                              
                                 74,27
                              
                              
                                 742,72
                              
                              
                                 7 427,17
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,49
                              
                              
                                 14,85
                              
                              
                                 148,54
                              
                              
                                 1 485,43
                              
                              
                                 14 854,35
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,63
                              
                              
                                 6,35
                              
                              
                                 63,48
                              
                              
                                 634,80
                              
                              
                                 6 347,95
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,27
                              
                              
                                 12,70
                              
                              
                                 126,96
                              
                              
                                 1 269,59
                              
                              
                                 12 695,91
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,54
                              
                              
                                 25,39
                              
                              
                                 253,92
                              
                              
                                 2 539,18
                              
                              
                                 25 391,82
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,78
                              
                              
                                 507,84
                              
                              
                                 5 078,36
                              
                              
                                 50 783,64
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,17
                              
                              
                                 21,70
                              
                              
                                 217,02
                              
                              
                                 2 170,25
                              
                              
                                 21 702,46
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 4,34
                              
                              
                                 43,40
                              
                              
                                 434,05
                              
                              
                                 4 340,49
                              
                              
                                 43 404,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 9,04
                              
                              
                                 90,43
                              
                              
                                 904,27
                              
                              
                                 9 042,69
                              
                              
                                 90 426,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 18,09
                              
                              
                                 180,85
                              
                              
                                 1 808,54
                              
                              
                                 18 085,39
                              
                              
                                 180 853,86
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 7,73
                              
                              
                                 77,29
                              
                              
                                 772,89
                              
                              
                                 7 728,85
                              
                              
                                 77 288,50
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 15,46
                              
                              
                                 154,58
                              
                              
                                 1 545,77
                              
                              
                                 15 457,70
                              
                              
                                 154 577,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0015
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 23,19
                              
                              
                                 231,87
                              
                              
                                 2 318,66
                              
                              
                                 23 186,55
                              
                              
                                 231 865,51
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 46,37
                              
                              
                                 463,73
                              
                              
                                 4 637,31
                              
                              
                                 46 373,10
                              
                              
                                 463 731,03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 0,002
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 19,82
                              
                              
                                 198,18
                              
                              
                                 1 981,77
                              
                              
                                 19 817,73
                              
                              
                                 198 177,33
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 39,64
                              
                              
                                 396,35
                              
                              
                                 3 963,55
                              
                              
                                 39 635,47
                              
                              
                                 396 354,66
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 79,27
                              
                              
                                 792,71
                              
                              
                                 7 927,09
                              
                              
                                 79 270,93
                              
                              
                                 792 709,32
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 158,54
                              
                              
                                 1 585,42
                              
                              
                                 15 854,19
                              
                              
                                 158 541,86
                              
                              
                                 1 585 418,63
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 33,88
                              
                              
                                 338,77
                              
                              
                                 3 387,68
                              
                              
                                 33 876,77
                              
                              
                                 338 767,72
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 67,75
                              
                              
                                 677,54
                              
                              
                                 6 775,35
                              
                              
                                 67 753,54
                              
                              
                                 677 535,44
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 135,51
                              
                              
                                 1 355,07
                              
                              
                                 13 550,71
                              
                              
                                 135 507,09
                              
                              
                                 1 355 070,89
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,000125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 271,01
                              
                              
                                 2 710,14
                              
                              
                                 27 101,42
                              
                              
                                 271 014,18
                              
                              
                                 2 710 141,77
                              
                           
                                 Tūris, naudojamas norint nustatyti AR (I)
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                  
                     2 priedėlis
                     
                        Per lėto maišymo bandymą, skirtą nustatyti POW, naudojamo stiklu gaubto bandymų indo pavyzdys
                     
                     
                        
                  “
            
                  3)
               
               
                  B.2 skyrius pakeičiamas taip:
                  „B.2.   ŪMUS TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ 403 (OECD bandymo gairės Nr. 403) (2009) (1). Pirmosios ūmaus toksiškumo įkvėpus bandymų gairės |Nr. 403 (TG 403) priimtos 1981 m. Šis atnaujintas B.2 bandymo metodas (lygiavertis atnaujintoms TG 403) parengtas siekiant užtikrinti didesnį lankstumą, naudoti mažiau gyvūnų ir įgyvendinti reglamentavimo reikmes. Atnaujintasis bandymo metodas sudarytas iš dviejų rūšių tyrimų: įprasto LC50 protokolo ir protokolo „Koncentracija × laikas“ („K × l“). Pagrindinės šio bandymo metodo savybės yra galimybė nustatyti koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybę remiantis nemirtinomis ir mirtinomis pasekmėmis, siekiant nustatyti medianinę mirtiną koncentraciją (LC50), nemirtiną ribinę koncentraciją (pvz., LC01) ir kreivės nuolydį, taip pat galimą jautrumą pagal lytį. „K × l“ protokolas turėtų būti naudojamas tada, kai yra specialiųjų reglamentavimo arba mokslinių reikmių, dėl kurių būtina atlikti įvairios trukmės bandymus su gyvūnais, pvz., reagavimo į nepaprastąsias aplinkybes planavimo [pvz., ūmaus poveikio rekomendacinių lygių (ŪPRL) nustatymo, reagavimo į nepaprastąsias aplinkybes planavimo gairių (RNAPG) parengimo arba ūmaus poveikio ribinių lygių (ŪPRL) verčių nustatymo] arba žemėnaudos planavimo tikslais.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Šio bandymo metodo tyrimų atlikimo ir aiškinimo gairės pateiktos rekomendaciniame dokumente dėl ūmaus toksiškumo įkvėpus bandymo (RD Nr. 39) (2).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Aprašant šį bandymo metodą vartojamos apibrėžtys pateiktos šio skyriaus pabaigoje ir RD Nr. 39 (2).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Šiuo bandymo metodu galima nustatyti bandomosios cheminės medžiagos savybes ir atlikti kokybinį rizikos vertinimą, taip pat įvertinti ir klasifikuoti bandomąsias chemines medžiagas pagal Reglamentą (EB) Nr. 1272/2008 (3). RD Nr. 39 (2) pateikiamos rekomendacijos, kaip pasirinkti tinkamą bandymo metodą, skirtą ūmaus poveikio tyrimams. Kai reikalinga informacija tik apie klasifikavimą ir ženklinimą, paprastai rekomenduojama remtis šio priedo B.52 skyriumi (4) [žr. RD Nr. 39 (2)]. Šis (B.2) bandymo metodas nėra specialiai skirtas specialiosios paskirties medžiagų, pvz., mažo tirpumo izomerinių arba pluoštinių medžiagų arba dirbtinių nanomedžiagų, bandymams.
                           
                        PIRMINIAI ASPEKTAI
                  
                              5.
                           
                           
                              Prieš svarstydama galimybę atlikti bandymus pagal šį bandymo metodą, bandymų laboratorija, siekdama sumažinti bandymų su gyvūnais poreikį, turėtų peržiūrėti visą turimą informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą, įskaitant esamus tyrimus (pvz., šio priedo B.52 skyrius (4)), kurių duomenys leistų neatlikti papildomų bandymų. Pasirinkti tinkamiausią gyvūnų rūšį, padermę, lytį, poveikio būdą ir tinkamas bandymų koncentracijas gali padėti informacija apie bandomosios cheminės medžiagos tapatumą, cheminę struktūrą, fizines ir chemines savybes, taip pat toksiškumo bandymų in vitro arba in vivo rezultatai, numatomi panaudojimo būdai ir galimas poveikis žmogui, turimi (Q)SAR duomenys ir toksikologiniai duomenys apie panašios struktūros chemines medžiagas [žr. RD Nr. 39 (2)].
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Turėtų būti kaip įmanoma vengiama atlikti ėsdinančių ir (arba) dirginančių bandomųjų cheminių medžiagų bandymus naudojant koncentracijas, kurios, tikėtina, sukeltų didelį skausmą ir (arba) kančią. Ėsdinimo ir (arba) dirginimo galimybė turėtų būti vertinama pasitelkiant ekspertų nuomonę ir remiantis tokiais įrodymais kaip patirtis su žmonėmis ir gyvūnais (pvz., remiantis kartotinių dozių tyrimais, atliktais naudojant neėsdinančias ir (arba) nedirginančias koncentracijas), turimi in vitro duomenys (pvz., remiantis šio priedo B.40 (5) ir B.40 bis (6) skyriais arba OECD TG 435 (OECD bandymo gairės Nr. 425) (7)), pH vertės, informacija apie panašias chemines medžiagas arba kiti tinkami duomenys, pvz., norint ištirti, ar galima neatlikti papildomų bandymų. Jeigu yra specialiųjų reglamentavimo reikmių (pvz., nepaprastųjų aplinkybių planavimo tikslais), taikant šį bandymo metodą gyvūnai gali būti veikiami šiomis medžiagomis, nes pagal šį bandymo metodą tyrimo vadovas arba vyriausiasis tyrėjas turi galimybę kontroliuoti tikslinių koncentracijų pasirinkimą. Tačiau tikslinės koncentracijos neturėtų sukelti stipraus dirginimo ir (arba) ėsdinimo, bet turėtų būti pakankamos, kad būtų galima pratęsti koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivę į tokių lygių, kad būtų pasiektas reglamentavimo arba mokslinis tikslas, kurio siekiama bandymu. Šios koncentracijos turėtų būti parinktos atsižvelgiant į konkretų atvejį, ir turėtų būti pateiktas tokių koncentracijų pasirinkimo pagrindimas [žr. RD Nr. 39 (2)].
                           
                        BANDYMO PRINCIPAS
                  
                              7.
                           
                           
                              Šis atnaujintasis B.2 bandymo metodas skirtas gauti pakankamai informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos ūmų toksiškumą, kad ją būtų galima klasifikuoti ir pateikti gaištamumo duomenis (pvz., LC50, LC01 ir kreivės nuolydis), susijusius su viena arba abejomis lytimis ir reikalingus kiekybiniams rizikos vertinimams. Pagal šį bandymo metodą siūlomi du metodai. Pirmasis metodas yra įprastas protokolas, pagal kurį gyvūnų grupės veikiamos ribine koncentracija (ribinis bandymas) arba iš anksto nustatytą laiką, paprastai – keturias valandas, veikiamos įvairiomis pamažu didinamomis koncentracijomis. Atsižvelgiant į specialius reglamentavimo tikslus, gali būti taikomi ir kitokie poveikio laikotarpiai. Antrasis metodas yra („K × l“) protokolas, pagal kurį gyvūnų grupės veikiamos viena (ribine) koncentracija arba įvairiais laikotarpiais veikiamos skirtingomis koncentracijomis.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymių, turėtų būti humaniškai numarinami ir aiškinant bandymo rezultatą laikomi atliekant bandymą nugaišusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištančius arba sunkiai kenčiančius gyvūnus priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra pateikti OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 19 dėl pasekmių žmonėms (8).
                           
                        METODO APRAŠYMAS
                  
                     Gyvūnų rūšies parinkimas
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių padermių gyvūnai. Tinkamiausia rūšis yra žiurkės; jeigu naudojama kita rūšis, turėtų būti pateiktas jos naudojimo pagrindimas.
                           
                        
                     Gyvūnų paruošimas
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Patelės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos. Poveikio dieną gyvūnai turėtų būti jauni, bet suaugę, 8–12 savaičių amžiaus, o masė pagal kiekvieną lytį turėtų ± 20 % tikslumu atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę. Gyvūnai atrenkami atsitiktine tvarka ir paženklinami, kad būtų galima identifikuoti kiekvieną gyvūną. Ne mažiau kaip penkias paras iki bandymo pradžios gyvūnai laikomi savo narveliuose, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų. Prieš bandymus gyvūnai taip pat turėtų būti trumpai papratinami prie bandymų aparatūros, nes tai padės sumažinti įtampą, kylančią patekus į naują aplinką.
                           
                        
                     Gyvūnų laikymas
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Bandomųjų gyvūnų laikymo patalpos temperatūra turėtų būti 22 ± 3 °C. Tinkamiausias santykinis drėgnis – 30–70 %, bet jis gali būti nepasiekiamas, jeigu naudojamas nešiklis yra vanduo. Prieš dozės davimą ir davus dozę gyvūnai turėtų būti laikomi narveliuose suskirstyti grupėmis pagal lytį ir koncentraciją; narvelyje laikomų gyvūnų skaičius turėtų būti toks, kad būtų galima aiškiai stebėti kiekvieną gyvūną ir kad būtų patiriama kuo mažiau žalos dėl kanibalizmo ir grumtynių. Jeigu dozė gyvūnams duodama tik per nosį, gali reikėti juos pripratinti prie uždaromųjų vamzdelių. Uždaromieji vamzdeliai gyvūnams neturėtų kelti didelės fizinės, terminės arba suvaržymo įtampos. Varžymas gali turėti fiziologinių pasekmių, pvz., turėti poveikio kūno temperatūrai (hipertermija) ir (arba) per minutę įkvepiamam tūriui. Jeigu yra bendrųjų duomenų, rodančių, kad tokių pastebimų pokyčių neįvyksta, pripratinimas prie uždaromųjų vamzdelių nebūtinas. Gyvūnai, kurių visas kūnas veikiamas aerozoliu, poveikio laikotarpiu turėtų būti laikomi atskirai, kad bandomasis aerozolis nebūtų filtruojamas per kitų narvelyje esančių gyvūnų kailį. Išskyrus poveikio laikotarpį, gyvūnams šerti tinka įprastas ir sertifikuotas laboratorijose naudojamas pašaras, duodant neribotą geriamo vandens kiekį. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką.
                           
                        
                     Inhaliacinės kameros
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Parenkant inhaliacinę kamerą, turėtų būti atsižvelgiama į bandomosios cheminės medžiagos pobūdį ir bandymo tikslą. Pirmenybė teikiama dozės davimui tik per nosį (ši sąvoka apima sąvokas „tik per galvą“, „tik per nosį“ ir „tik per šnipą“). Pirmenybė dozės davimui tik per nosį paprastai teikiama tiriant skystųjų arba kietųjų dalelių aerozolius ir garus, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Specialieji tyrimo tikslai gali būti sėkmingiau pasiekti taikant poveikio per visą kūną metodą, tačiau tai turi būti pagrįsta tyrimo ataskaitoje. Siekiant užtikrinti atmosferos pastovumą naudojant poveikio per visą kūną kamerą, visa bandomųjų gyvūnų užimama erdvė turėtų neviršyti 5 % kameros tūrio. Poveikio tik per nosį ir poveikio per visą kūną metodų principai ir konkretūs šių metodų privalumai bei trūkumai aprašyti RD Nr. 39 (2).
                           
                        POVEIKIO SĄLYGOS
                  
                     Koncentracijų taikymas
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Poveikio tik per nosį trukmė atliekant bandymus su žiurkėmis gali būti bet kokia, tačiau ne ilgesnė kaip 6 valandos. Jeigu poveikis tik per nosį taikomas pelėms, poveikio trukmė paprastai neturėtų viršyti keturių valandų. Jeigu reikalingi ilgesnės trukmės tyrimai, būtinas pagrindimas [žr. RD Nr. 39 (2)]. Gyvūnai, kurie veikiami aerozoliais poveikio per visą kūną kamerose, turėtų būti laikomi atskirai, kad kiti viename narvelyje laikomi gyvūnai laižydami nenurytų bandomosios cheminės medžiagos. Poveikio metu gyvūnas neturėtų būti šeriamas. Vandens gali būti duodama per visą laikotarpį, kuriuo gyvūnas veikiamas per visą kūną.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga dujų, garų, aerozolių arba jų mišinių pavidalu. Per tyrimą naudotina fizinė būsena priklauso nuo fizinių ir cheminių bandomosios cheminės medžiagos savybių, pasirinktos koncentracijos ir (arba) fizinio pavidalo, kuris veikiausiai bus tvarkant ir naudojant bandomąją cheminę medžiagą. Higroskopinės ir chemiškai reaguojančios bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti bandomos sauso oro sąlygomis. Turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad būtų išvengta sprogių koncentracijų susidarymo.
                           
                        
                     Dalelių dydžio pasiskirstymas
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Dalelių rūšiavimas pagal dydį turėtų būti taikomas visiems aerozoliams ir garams, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Kad poveikis būtų padarytas visoms svarbioms kvėpavimo takų sritims, rekomenduojama naudoti aerozolius, kurių masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) yra 1–4 μm, o geometrinis standartinis nuokrypis (σg) – 1,5–3,0 (2) (9) (10). Nors turėtų būti imamasi pagrįstų priemonių, kad šio standarto būtų laikomasi, jeigu jo įgyvendinti neįmanoma, turėtų būti pateikta ekspertų nuomonė. Pvz., metalų garai gali būti mažesni už šį standartą, o įelektrintos dalelės, pluoštai ir higroskopinės medžiagos (kurios padidėja drėgnoje kvėpavimo takų aplinkoje) gali viršyti šį standartą.
                           
                        
                     Bandomosios cheminės medžiagos paruošimas nešiklyje
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Siekiant užtikrinti reikiamą bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją ir dalelių dydį atmosferoje, gali būti naudojamas nešiklis. Paprastai pirmenybė teikiama vandeniui. Siekiant užtikrinti reikiamą dalelių dydžio pasiskirstymą, iš dalelių sudaryta medžiaga gali būti apdorojama mechaniškai, tačiau turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad bandomoji medžiaga nebūtų suskaidyta arba nebūtų pakeistos jos savybės. Kai manoma, kad mechaniškai apdorojus bandomąją cheminę medžiagą pasikeitė jos cheminė sudėtis (pvz., dėl labai aukštų temperatūrų, susidariusių dėl trinties pernelyg stipriai malant), bandomosios cheminės medžiagos sudėtis turėtų būti patikrinta analizės būdu. Turėtų būti imamasi tinkamų atsargumo priemonių, kad bandomoji cheminė medžiaga nebūtų užteršta. Nebūtina tikrinti netrapių granulių pavidalo medžiagų, kurios specialiai paruoštos taip, kad jų nebūtų galima įkvėpti. Turėtų būti atliekamas trynimo bandymas, skirtas įrodyti, kad tvarkant granulių pavidalo medžiagą nesusidaro įkvepiamų dalelių. Jeigu atliekant trynimo bandymą susidaro įkvepiamų cheminių medžiagų, turėtų būti atliekamas toksiškumo įkvėpus bandymas.
                           
                        
                     Kontroliniai gyvūnai
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Vienalaikės neigiamos kontrolės (naudojant orą) grupė nebūtina. Jeigu bandymo atmosferos sukūrimo tikslais naudojamas nešiklis nėra vanduo, nešiklio kontrolinė grupė turėtų būti naudojama tik tuo atveju, jeigu nėra istorinių toksiškumo įkvėpus duomenų. Jeigu atlikus nešiklyje paruoštos bandomosios cheminės medžiagos toksiškumo tyrimą nustatoma, kad medžiaga nėra toksiška, vadinasi, ir nešiklis, esant ištirtai koncentracijai, nėra toksiškas; taigi nešiklio kontrolė nebūtina.
                           
                        POVEIKIO SĄLYGŲ STEBĖJIMAS
                  
                     Oro srautas kameroje
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Kiekvieno poveikio metu turėtų būti atidžiai reguliuojamas, nuolat stebimas ir ne rečiau kaip kartą per valandą registruojamas per kamerą tekantis oro srautas. Bandymo atmosferoje susidariusios koncentracijos (arba jos pastovumo) stebėjimas yra vienas iš visų dinaminių parametrų matavimų, suteikiantis galimybę netiesiogiai kontroliuoti visus svarbius dinaminius atmosferos kūrimo parametrus. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tam, kad būtų išvengta pakartotinio įkvėpimo dozės davimo tik per nosį kamerose, kai per poveikio sistemą tekantis oro srautas yra nepakankamas užtikrinti dinaminį bandomosios cheminės medžiagos atmosferos srautą. Yra nustatyti metodai, kurie gali būti taikomi norint įrodyti, kad pasirinktomis poveikio sąlygomis neįvyksta pakartotinio įkvėpimo (2) (11). Deguonies koncentracija turėtų būti ne mažesnė kaip 19 %, anglies dioksido – ne didesnė kaip 1 %. Jeigu yra pagrindo manyti, kad šių standartų įgyvendinti neįmanoma, turėtų būti matuojamos deguonies ir anglies dioksido koncentracijos.
                           
                        
                     Kameros temperatūra ir santykinis drėgnis
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Kameroje turėtų būti palaikoma 22 ± 3 °C temperatūra. Tiek dozę duodant tik per nosį, tiek veikiant visą kūną, santykinis drėgnis turėtų būti stebimas ir registruojamas ne mažiau kaip tris kartus, kai poveikio trukmė keturios valandos, ir kas valandą, kai poveikio trukmė mažesnė. Tinkamiausias santykinis drėgnis – 30–70 %, tačiau jis gali būti nepasiekiamas (pvz., bandant vandens pagrindo mišinius) arba neišmatuojamas dėl trukdžių, atsirandančių bandomajai cheminei medžiagai taikant bandymo metodą.
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga. Vardinė koncentracija
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Jeigu įmanoma, turėtų būti apskaičiuota ir užregistruota vardinė koncentracija poveikio kameroje. Vardinė koncentracija yra sukurtos bandomosios cheminės medžiagos masės ir viso oro srauto, perleisto per kamerų sistemą, tūrio santykis. Vardinė koncentracija nėra naudojama apibūdinti poveikį gyvūnui, tačiau, vardinę koncentraciją palyginus su faktine, nustatomas generavimo, kurį užtikrina bandymų sistema, efektyvumas, kuriuo remiantis galima nustatyti generavimo problemas.
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga. Faktinė koncentracija
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Faktinė koncentracija yra bandomosios cheminės medžiagos koncentracija inhaliacinės kameros gyvūno kvėpavimo zonoje. Faktines koncentracijas galima nustatyti specialiaisiais metodais (pvz., taikant tiesioginio ėminių ėmimo, adsorbcijos ar cheminių reakcijų metodus ir tada atliekant analizinį apibūdinimą) arba nespecialiaisiais metodais, pvz., atliekant gravimetrinę analizę naudojant filtrus. Gravimetrinė analizė gali būti taikoma tik vienos sudedamosios dalies miltelių aerozoliams arba mažo lakumo skystųjų dalelių aerozoliams ir turėtų būti grindžiama tinkamais prieš tyrimą atliktais bandomosios cheminės medžiagos savybių apibūdinimais. Iš daugiau kaip vienos sudedamosios dalies sudarytų miltelių aerozolių koncentracijos taip pat gali būti nustatomos atliekant gravimetrinę analizę. Tačiau tam reikalingi analitiniai duomenys, įrodantys, kad ore esančios medžiagos sudėtis panaši į pirminės medžiagos sudėtį. Jeigu tokios informacijos nėra, tyrimo metu gali reikėti vienodais intervalais atlikti pakartotinę bandomosios cheminės medžiagos (geriausia, kad ji būtų ore) analizę. Jeigu aerozolinės medžiagos gali garuoti arba sublimuoti, turėtų būti įrodyta, kad pasirinktu metodu surinktos visos fazės. Tyrimo ataskaitoje turėtų būti nurodytos siekiamos, vardinės ir faktinės koncentracijos, tačiau atliekant statistinę analizę, skirtą apskaičiuoti mirtinas koncentracijos vertes, naudojamos tik faktinės koncentracijos.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Jeigu įmanoma, turėtų būti naudojama viena bandomosios cheminės medžiagos partija, o bandomasis ėminys turėtų būti laikomas tokiomis sąlygomis, kad būtų išsaugotas jo grynumas, homogeniškumas ir stabilumas. Prieš pradedant tyrimą reikėtų apibūdinti bandomosios cheminės medžiagos savybes, įskaitant jos grynumą ir, jeigu tai techniškai įmanoma, tapatumą, taip pat nustatytų teršalų ir priemaišų kiekius. Be kitų duomenų, tai galima pagrįsti šiais duomenimis: sulaikymo trukme ir susijusia didžiausios koncentracijos sritimi, molekuline mase, nustatyta atlikus spektroskopinę arba dujų chromatografijos analizę, arba kitais įverčiais. Nors bandomojo ėminio tapatumo nustatymas nėra bandymų laboratorijos pareiga, bandymų laboratorijai gali būti naudinga patvirtinti bent kai kurias pateikėjo nurodytas savybes (pvz., spalvą, fizinę būseną ir t. t.).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Poveikio atmosfera turėtų būti kaip įmanoma pastovesnė ir turėtų būti stebima nuolat ir (arba) su pertraukomis, atsižvelgiant į analizės metodą. Jeigu ėminiai imami su pertraukomis, per keturių valandų tyrimą kameros atmosferos ėminiai turėtų būti imami ne mažiau kaip du kartus. Jeigu tai neįmanoma dėl nedidelių oro srauto greičių arba mažų koncentracijų, gali būti imamas vienas ėminys per visą poveikio laikotarpį. Jeigu ėminiai pastebimai skiriasi, tiriant kitas koncentracijas per poveikio laikotarpį turėtų būti imami keturi ėminiai. Atskiri kameroje susidariusios koncentracijos ėminiai neturėtų nukrypti nuo vidutinės koncentracijos daugiau kaip ± 10 %, kai tiriamos dujos ir garai, arba daugiau kaip ± 20 %, kai tiriami skystųjų arba kietųjų dalelių aerozoliai. Turėtų būti apskaičiuotas ir užregistruotas pusiausvyros nusistovėjimo kameroje laikotarpis (t95). Į poveikio trukmę įtraukiamas laikas, per kurį susidaro bandomoji cheminė medžiaga, ir atsižvelgiama į laiką, kurio reikia, kad būtų pasiekta t95. T95 apskaičiavimo gairės pateiktos RD Nr. 39 (2).
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Jeigu tiriami labai sudėtingi mišiniai, sudaryti iš dujų ir (arba) garų, ir aerozoliai (pvz., deginimo atmosferos ir bandomosios cheminės medžiagos, pučiamos iš specialiai varomų galutinio naudojimo produktų arba prietaisų), kiekvienos fazės veikimas inhaliacinėje kameroje gali būti skirtingas, todėl iš kiekvienos fazės (dujų ir (arba) garų ir aerozolio) turėtų būti parinkta bent viena indikacinė cheminė medžiaga (analitė); paprastai šiuo tikslu pasirenkama pagrindinė veiklioji mišinio cheminė medžiaga. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga yra mišinys, turėtų būti nurodyta mišinio, o ne tik veikliosios cheminės medžiagos arba sudedamosios dalies (analitės) analizinė koncentracija. Daugiau informacijos apie faktines koncentracijas pateikta RD Nr. 39 (2).
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga. Dalelių dydžio pasiskirstymas
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Aerozolių dalelių dydžio pasiskirstymas turėtų būti nustatomas bent kartą per kiekvieną keturių valandų trukmės poveikio laikotarpį naudojant pakopinį ėmiklį arba alternatyvų prietaisą, pvz., aerodinaminį dalelių rūšiuotuvą. Jeigu galima įrodyti, kad pakopiniu ėmikliu arba alternatyviu prietaisu gaunami lygiaverčiai rezultatai, atliekant tyrimą gali būti naudojamas alternatyvus prietaisas. Siekiant įsitikinti pagrindinio prietaiso surenkamuoju veiksmingumu, kartu su pagrindiniu prietaisu turėtų būti naudojamas antrasis prietaisas, pvz., gravimetrinis filtras, gaudyklė arba barboteris. Atlikus dalelių dydžio analizę nustatyta masės koncentracija turėtų neviršyti priimtinų filtruojamosios analizės būdu nustatytos masės koncentracijos ribų [žr. RD Nr. 39 (2)]. Jeigu lygiavertiškumą galima įrodyti pradiniame tyrimo etape, tolesnius patvirtinamuosius matavimus galima praleisti. Gyvūnų gerovės sumetimais turėtų būti imamasi priemonių, kad būtų kuo mažiau negalutinių duomenų, dėl kurių galėtų reikėti pakartoti poveikį. Garuose esančios dalelės turėtų būti rūšiuojamos tuo atveju, jeigu bent kiek tikėtina, kad susidarant aerozoliui gali kondensuotis garai, arba jeigu garų atmosferoje aptinkama dalelių, dėl kurių gali susidaryti mišrių fazių (žr. 15 skirsnį).
                           
                        PROCEDŪRA
                  
                              26.
                           
                           
                              Toliau aprašyti du tyrimų tipai: įprastas protokolas ir „K × l“ protokolas. Pagal abu protokolus gali būti atliekamas orientacinis tyrimas, pagrindinis tyrimas ir (arba) ribinis bandymas (tradicinis protokolas) arba bandymai taikant ribinę koncentraciją („K × l“ protokolas). Jeigu žinoma, kad kurios nors lyties gyvūnai yra jautresni, tyrimo vadovas gali nuspręsti atlikti šiuos tyrimus tik su jautresniąja lytimi. Jeigu naudojant kitos rūšies graužikus nei žiurkės dozė duodama tik per nosį, ilgiausia poveikio trukmė gali būti pakoreguojama siekiant sumažinti tos rūšies gyvūnų patiriamą kančią. Prieš pradedant turėtų būti atsižvelgta į visus turimus duomenis, kad būtų kuo labiau sumažintas gyvūnų naudojimo poreikis. Pvz., naudojant pagal šio priedo B.52 skyrių (4) gautus duomenis galima sumažinti orientacinio tyrimo poreikį ir įrodyti, ar kurios nors lyties gyvūnai yra jautresni [žr. RD Nr. 39 (2)].
                           
                        ĮPRASTAS PROTOKOLAS
                  
                     Bendrieji aspektai. Įprastas protokolas
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Atliekant įprastą tyrimą, gyvūnų grupės nustatytą laikotarpį (paprastai – keturias valandas) veikiamos bandomąja chemine medžiaga dozės davimo tik per nosį arba dozės davimo per visą kūną kameroje. Gyvūnai veikiami ribine koncentracija (ribinis bandymas) arba nuosekliai veikiami ne mažiau kaip trimis skirtingomis koncentracijomis (pagrindinis tyrimas). Išskyrus atvejus, kai apie bandomąją cheminę medžiagą jau turima informacijos, pvz., gautos remiantis anksčiau atliktu B.52 tyrimu, prieš pagrindinį tyrimą gali būti atliekamas orientacinis tyrimas [žr. RD Nr. 39 (2)].
                           
                        
                     Orientacinis tyrimas. Įprastas protokolas
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Orientacinis tyrimas skirtas įvertinti bandomosios cheminės medžiagos stiprumą, nustatyti lyčių jautrumo skirtumus ir padėti pasirinkti poveikio koncentracijos lygius, taikytinus per pagrindinį tyrimą arba ribinį bandymą. Parenkant per orientacinį tyrimą taikytinus koncentracijos lygius, turėtų būti naudojama visa turima informacija, įskaitant turimus (Q)SAR duomenis ir duomenis apie panašias chemines medžiagas. Taikant kiekvieną skirtingą koncentraciją, dozė turėtų būti duodama ne daugiau kaip trims patinams ir trims patelėms (trijų kiekvienos lyties gyvūnų gali reikėti lyčių skirtumams nustatyti). Per orientacinį tyrimą gali būti taikoma tik viena koncentracija, tačiau prireikus bandymas gali būti atliktas ir taikant kitokias koncentracijas. Per orientacinį tyrimą neturėtų būti naudojama tiek gyvūnų ir taikoma tiek skirtingų koncentracijų, kiek per pagrindinį tyrimą. Vietoje orientacinio tyrimo gali būti remiamasi anksčiau atliktu B.52 tyrimu [žr. RD Nr. 39 (2)].
                           
                        
                     Ribinis bandymas. Įprastas protokolas
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Ribinis bandymas atliekamas tada, kai bandomoji cheminė medžiaga yra nežinoma arba kai manoma, kad ji iš esmės netoksiška, t. y. sukelianti toksinį poveikį tik taikant didesnę nei norminę ribinę koncentraciją. Atliekant ribinį bandymą, ribine bandomosios cheminės medžiagos koncentracija veikiama tik viena trijų patinų ir trijų patelių grupė. Informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą galima gauti remiantis žiniomis apie panašias bandytas chemines medžiagas, atsižvelgiant į toksikologinės reikšmės turinčių sudedamųjų dalių tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos išvis nėra arba kai remiantis ta informacija yra tikėtina, kad bandomoji cheminė medžiaga yra toksiška, turėtų būti atliekamas pagrindinis bandymas.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Ribinės koncentracijos paprastai parenkamos atsižvelgiant į norminius reikalavimus. Jeigu taikomas Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008, dujoms, garams ir aerozoliams taikytinos ribinės koncentracijos atitinkamai yra 20 000 ppm, 20 mg/l ir 5 mg/l (arba didžiausioji pasiekiama koncentracija) (3). Pasiekti kai kurių bandomųjų cheminių medžiagų, ypač garų ir aerozolių, ribines koncentracijas, gali būti techniškai sudėtinga. Atliekant aerozolių bandymus, pirmiausia turėtų būti siekiama užtikrinti įkvepiamą dalelių dydį (MMAS – 1–4 μm). Daugelio bandomųjų cheminių medžiagų atveju tai įmanoma pasiekti, kai koncentracija yra 2 mg/l. Atlikti aerozolių bandymus taikant didesnę kaip 2 mg/l koncentraciją turėtų būti mėginama tik tuo atveju, jeigu įmanoma pasiekti įkvepiamą dalelių dydį [žr. RD Nr. 39 (2)]. Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 gyvūnų gerovės sumetimais rekomenduojama neatlikti bandymų viršijant ribinę koncentraciją (3). Galimybė taikyti ribinę koncentraciją turėtų būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu labai tikėtina, kad tokio bandymo rezultatai turės tiesioginės reikšmės žmonių sveikatos apsaugai (3); tokiu atveju tyrimo ataskaitoje pateikiamas pagrindimas. Tiriant potencialiai sprogias bandomąsias chemines medžiagas turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad nesusidarytų sprogimui palankių sąlygų. Siekiant išvengti nebūtino gyvūnų naudojimo, prieš ribinį bandymą turėtų būti atliktas atskiras bandymas be gyvūnų, siekiant įsitikinti, ar įmanoma pasiekti ribiniam bandymui reikalingas kameros sąlygas.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Jeigu taikant ribinę koncentraciją pastebimas gyvūnų gaišimas arba liguistumas, ribinio bandymo rezultatai gali būti naudojami kaip orientacinis tyrimas, kuriuo būtų remiamasi per tolesnius bandymus taikant kitokias koncentracijas (žr. apie pagrindinį tyrimą). Jeigu dėl bandomosios cheminės medžiagos fizinių arba cheminių savybių neįmanoma pasiekti ribinės koncentracijos, turėtų būti bandoma didžiausioji pasiekiama koncentracija. Jeigu esant didžiausiajai pasiekiamai koncentracijai pasireiškia mažesnis kaip 50 % gaištamumas, daugiau bandymų atlikti nereikia. Jeigu ribinės koncentracijos neįmanoma pasiekti, tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateiktas paaiškinimas ir patvirtinamieji duomenys. Jeigu didžiausioji pasiekiama koncentracija nesukelia toksiškumo, gali reikėti sukurti skystojo aerozolio pavidalo bandomąją cheminę medžiagą.
                           
                        
                     Pagrindinis tyrimas. Įprastas protokolas
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Pagrindinis tyrimas paprastai atliekamas naudojant po penkis patinus ir penkias pateles (arba penkis jautresniosios lyties, jeigu ji žinoma, gyvūnus) kiekvienam koncentracijos lygiui ir taikant bent tris koncentracijos lygius. Norint gauti patikimą statistinę analizę, turėtų būti taikomi pakankami koncentracijos lygiai. Laiko tarpas tarp dozių davimo grupėms nustatomas atsižvelgiant į toksiškumo požymių atsiradimo laiką, trukmę ir sunkumą. Kito koncentracijos lygio dozės davimas gyvūnams nukeliamas iki to laiko, kai bus pagrįstai įsitikinta, kad pirmiau bandytieji gyvūnai išgyveno. Tai tyrimo vadovui suteikia galimybę pakoreguoti tikslinę koncentraciją, taikytiną kitai grupei, kuriai duodama dozė. Atsižvelgiant į technologijų sudėtingumą, atliekant inhaliacinius tyrimus tai gali būti ne visada įgyvendinama, todėl poveikis gyvūnams taikant kitą koncentracijos lygį turėtų būti grindžiamas jau įgyta patirtimi ir mokslinu vertinimu. Bandant mišinius, turėtų būti remiamasi RD Nr. 39 (2).
                           
                        PROTOKOLAS „KONCENTRACIJA × LAIKAS“ („K × L“)
                  
                     Bendrieji aspektai. „K × l“ protokolas
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Vertinant toksiškumą įkvėpus, kaip alternatyva įprastam protokolui gali būti svarstoma galimybė atlikti nuoseklų „K × l“ protokolu pagrįstą tyrimą (12) (13) (14). Šiuo metodu suteikiama galimybė daryti poveikį gyvūnams taikant keletą koncentracijos lygių ir keletą laikotarpių. Visi bandymai atliekami tik dozės davimo tik per nosį kameroje (pagal šį protokolą netikslinga naudoti poveikio per visą kūną kameras). Šis protokolas pavaizduotas 1 priedėlyje pateiktoje struktūrinėje schemoje. Modeliuojamoji analizė parodė, kad gauti patikimas LC50 vertes galima ir pagal įprastą protokolą, ir pagal „K × l“ protokolą, tačiau „K × l“ protokolas paprastai tinkamesnis norint gauti patikimas LC01 ir LC10 vertes (15).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Modeliuojamoji analizė parodė, kad dviejų gyvūnų naudojimas (kai naudojama po vieną skirtingų lyčių gyvūną arba kai naudojami du jautresniosios lyties gyvūnai) kiekvienam koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomybės kreivės intervalui paprastai yra tinkamas, kai per pagrindinį tyrimą bandomos keturios koncentracijas ir taikomi penki poveikio laikotarpiai. Tam tikromis aplinkybėmis tyrimo vadovas gali pasirinkti kiekviename koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomybės kreivės intervale naudoti po dvi kiekvienos lyties žiurkes (15). Kiekvienam koncentracijos ir laiko momento deriniui naudojant po du kiekvienos lyties gyvūnus gali būti sumažintas įverčių poslinkis ir nuokrypis, padidintas vertinimo sėkmės koeficientas ir pagerinta pasikliautinojo intervalo aprėptis. Tačiau, jeigu nepasiekiama pakankamai tikslios atitikties skaičiuojant naudotiniems duomenims (kai naudojama po vieną skirtingų lyčių gyvūną arba kai naudojami du jautresniosios lyties gyvūnai), gali pakakti ir penktosios poveikio koncentracijos. Daugiau patarimų dėl gyvūnų skaičiaus ir koncentracijų, taikytinų atliekant „K × l“ protokolu pagrįstą tyrimą, pateikta RD Nr. 39 (2).
                           
                        
                     Orientacinis tyrimas. „K × l“ protokolas
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Orientacinis tyrimas yra skirtas įvertinti bandomosios cheminės medžiagos stiprumą ir padėti pasirinkti poveikio koncentracijos lygius, taikytinus per pagrindinį tyrimą. Siekiant parinkti tinkamą pradinę koncentraciją, taikytiną per pagrindinį tyrimą, ir sumažinti naudojamų gyvūnų skaičių, gali reikėti atlikti orientacinį tyrimą kiekvienai koncentracijai naudojant ne daugiau kaip po tris kiekvienos lyties gyvūnus [išsamesnės informacijos pateikta RD Nr. 39 (2) III priedėlyje]. Norint nustatyti lyčių skirtumus, gali reikėti naudoti po tris kiekvienos lyties gyvūnus. Šiems gyvūnams turėtų būti daromas vienkartinis poveikis, paprastai trunkantis 240 minučių. Galimybė sukurti tinkamas bandymo atmosferas turėtų būti įvertinta per išankstinius techninius bandymus, nenaudojant gyvūnų. Jeigu yra per B.52 (4) tyrimą gautų gaištamumo duomenų, orientacinis tyrimas paprastai nebūtinas. Parinkdamas pradinę B.2 tyrimo tikslinę koncentraciją, tyrimo vadovas turėtų atsižvelgti į gaištamumo pobūdį, nustatytą per B.52 tyrimus (4) pagal kiekvieną lytį ir visas bandytas koncentracijas [žr. RD Nr. 39 (2)].
                           
                        
                     Pradinė koncentracija. „K × l“ protokolas
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Pradinė koncentracija (I poveikio seansas) (I priedėlis) bus ribinė koncentracija arba koncentracija, tyrimo vadovo parinkta remiantis orientaciniu tyrimu. Šia koncentracija įvairiais laikotarpiais (pvz., 15, 30, 60, 120 arba 240 minučių) veikiamos gyvūnų grupės, sudarytos iš dviejų skirtingos lyties gyvūnų, t. y. bendras gyvūnų skaičius yra 10 (vadinamasis I poveikio seansas) (I priedėlis).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Ribinės koncentracijos paprastai parenkamos atsižvelgiant į norminius reikalavimus. Jeigu taikomas Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008, dujoms, garams ir aerozoliams taikytinos ribinės koncentracijos atitinkamai yra 20 000 ppm, 20 mg/l ir 5 mg/l (arba didžiausioji pasiekiama koncentracija) (3). Pasiekti kai kurių bandomųjų cheminių medžiagų, ypač garų ir aerozolių, ribines koncentracijas, gali būti techniškai sudėtinga. Atliekant aerozolių bandymus, turėtų būti siekiama užtikrinti įkvėpiamą dalelių dydį (MMAS – 1–4 μm), esant ribinei 2 mg/l koncentracijai. Daugelio bandomųjų cheminių medžiagų atveju tai įmanoma pasiekti. Atlikti aerozolių bandymus taikant didesnę kaip 2 mg/l koncentraciją turėtų būti mėginama tik tuo atveju, jeigu įmanoma pasiekti įkvepiamą dalelių dydį [žr. RD Nr. 39 (2)]. Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 gyvūnų gerovės sumetimais rekomenduojama neatlikti bandymų viršijant ribinę koncentraciją (3). Galimybė atlikti bandymus viršijant ribinę koncentraciją turėtų būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu labai tikėtina, kad tokio bandymo rezultatai turės tiesioginės reikšmės žmonių sveikatos apsaugai (3); tokiu atveju tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateiktas pagrindimas. Tiriant potencialiai sprogias bandomąsias chemines medžiagas turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad nesusidarytų sprogimui palankių sąlygų. Siekiant išvengti nebūtino gyvūnų naudojimo, prieš bandymą taikant pradinę koncentraciją turėtų būti atliktas atskiras bandymas be gyvūnų, siekiant įsitikinti, ar įmanoma pasiekti šiai koncentracijai reikalingas kameros sąlygas.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Jeigu taikant pradinę koncentraciją pastebimas gyvūnų gaišimas arba liguistumas, tos koncentracijos bandymo rezultatai gali būti panaudojami kaip pagrindas per tolesnius bandymus taikant kitokias koncentracijas (žr. apie pagrindinį tyrimą). Jeigu dėl bandomosios cheminės medžiagos fizinių arba cheminių savybių neįmanoma pasiekti ribinės koncentracijos, turėtų būti bandoma didžiausia pasiekiama koncentracija. Jeigu esant didžiausiai pasiekiamai koncentracijai pasireiškia mažesnis kaip 50 % gaištamumas, daugiau bandymų atlikti nereikia. Jeigu ribinės koncentracijos neįmanoma pasiekti, tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateiktas paaiškinimas ir patvirtinamieji duomenys. Jeigu didžiausia pasiekiama koncentracija nesukelia toksiškumo, gali reikėti sukurti skystojo aerozolio pavidalo bandomąją cheminę medžiagą.
                           
                        
                     Pagrindinis tyrimas. „K × l“ protokolas
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Per pagrindinį tyrimą bandoma pradinė koncentracija (I poveikio seansas) (I priedėlis) bus ribinė koncentracija arba koncentracija, tyrimo vadovo parinkta remiantis orientaciniu tyrimu. Jeigu per I poveikio seansą arba po jo pastebimas gaištamumas, II poveikio seanso koncentracija ir poveikio laikotarpiai bus nustatomi remiantis mažiausiuoju poveikiu („K × l“ protokolas), dėl kurio nugaištama. Kiekvienas tolesnis seansas priklausys nuo ankstesniojo seanso (žr. 1 priedėlį).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Norint nustatyti „K × l“ protokolu pagrįstą gaištamumo priklausomybę, daugeliui bandomųjų cheminių medžiagų pakanka rezultatų, gautų taikant pradinę koncentraciją ir per tris papildomus poveikio seansus naudojant smulkesnę laiko matricą (t. y. poveikio laikotarpių geometrinius intervalus, apibūdinamus vienas po kito einančių laikotarpių santykiu, kuris paprastai yra √2) (15), tačiau taip pat gali būti naudinga taikyti penktąją poveikio koncentraciją [žr. 1 priedėlį ir RD Nr. 39 (2)]. Matematinis pagal „K × l“ protokolą gautų rezultatų apdorojimas aprašytas 1 priedėlyje.
                           
                        STEBĖJIMAI
                  
                              41.
                           
                           
                              Poveikio laikotarpiu turėtų būti dažnai atliekami klinikiniai gyvūnų stebėjimai. Baigus duoti dozę, dozės davimo dieną klinikiniai stebėjimai turėtų būti atliekami bent du kartus arba daugiau, atsižvelgiant į gyvūnų reakciją į gautą dozę, o vėliau – bent kartą per parą, iš viso stebint 14 dienų. Tikslios stebėjimų laikotarpio trukmės nenustatoma; ji turėtų būti parenkama atsižvelgiant į klinikinių požymių atsiradimo laiką ir gyvūnų atsigavimo laikotarpio trukmę. Svarbu atkreipti dėmesį į toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo laiką, ypač jeigu toksiškumo požymiai pasireiškia tik po kurio laiko. Visi stebėjimai sistemingai registruojami, išsaugant atskirus įrašus apie kiekvieną gyvūną. Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus ir (arba) kuriems pasireiškia ilgalaikių sunkios kančios požymių, gyvūnų gerovės sumetimais turėtų būti humaniškai numarinami. Atliekant klinikinių toksiškumo požymių tyrimus, turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad prasta pradinė išvaizda ir trumpalaikiai kvėpavimo takų pakitimai, atsiradę dėl poveikio procedūros, nebūtų palaikyti bandomosios cheminės medžiagos sukelto toksiškumo požymiais, dėl kurių reikėtų pirmiau laiko numarinti gyvūnus. Turėtų būti atsižvelgta į principus ir kriterijus, apibendrintus Rekomendaciniame dokumente dėl pasekmių žmonėms (RD Nr. 19) (7). Kai gyvūnai numarinami dėl humaniškų priežasčių arba randami nugaišę, kiek įmanoma tiksliau užregistruojamas žūties laikas.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Narveliuose turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir gleivinės pakitimai, taip pat kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgsenos pakitimai. Jeigu įmanoma, turėtų būti išskirti vietinis ir sisteminis poveikiai. Ypač reikėtų stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Matuojant temperatūrą tiesiojoje žarnoje, galima gauti patvirtinamųjų sulėtėjusio kvėpavimo arba nukritusios ar pakilusios temperatūros įrodymų, susijusių su dozės davimu arba izoliavimu.
                           
                        
                     Kūno masė
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Kiekvieno gyvūno masė turėtų būti vieną kartą užregistruojama pratinimo laikotarpiu, tada poveikio dieną dar nedavus dozės (nulinė diena) ir bent pirmąją, trečiąją ir septintąją dienomis (o vėliau – kas savaitę), taip pat žūties arba numarinimo metu, jeigu tai įvyksta po pirmosios dienos. Kūno masė yra labai svarbus toksiškumo gyvūnams rodiklis, todėl gyvūnai, kurių masė, palyginti su vertėmis, gautomis prieš tyrimą, nukrenta 20 % arba daugiau, turėtų būti atidžiai stebimi. Pasibaigus poveikio pasekmių stebėjimo laikotarpiui, išgyvenę gyvūnai pasveriami ir humaniškai numarinami.
                           
                        
                     Patologija
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Visiems bandomiesiems gyvūnams, įskaitant nugaišusius atliekant bandymą arba numarintus ir pašalintus iš tyrimo gyvūnų gerovės sumetimais, daromas bendrasis skrodimas. Jeigu skrodimo negalima atlikti iš karto po to, kai aptinkamas nugaišęs gyvūnas, gyvūnas turėtų būti laikomas pakankamai šaltoje vietoje (bet neužšaldomas), siekiant kuo labiau pristabdyti autolizę. Skrodimai turėtų būti atliekamai kaip galima anksčiau, paprastai – per dieną arba dvi. Visi dideli patologiniai pakitimai turėtų būti užregistruojami pagal kiekvieną gyvūną, ypatingą dėmesį skiriant kvėpavimo takų pakitimams.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Norint padidinti tyrimo aiškinamąją reikšmę, gali būti atliekamos papildomos apžiūros, iš anksto numatytos pagal tyrimo planą, pvz., išgyvenusių žiurkių plaučių svėrimas ir (arba) dirginimo įrodymų gavimas atliekant kvėpavimo takų apžiūrą mikroskopu. Taip pat gali būti tiriami organai, turintys didelės 24 valandas arba ilgiau išgyvenusių gyvūnų patologijos požymių, arba organai, apie kuriuos žinoma arba dėl kurių manoma, kad jiems buvo pakenkta. Mikroskopu apžiūrėjus visus kvėpavimo takus, galima gauti naudingos informacijos apie bandomąsias chemines medžiagas, kurios reaguoja su vandeniu, pvz., rūgštis ir higroskopines bandomąsias chemines medžiagas.
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITOS
                  
                     Duomenys
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Turėtų būti pateikti kiekvieno gyvūno masės duomenys ir skrodimo išvados. Klinikinių stebėjimų duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, pagal kiekvieną bandomąją grupę nurodant naudotų gyvūnų skaičių, gyvūnų, kuriems pasireiškė toksiškumo požymių, skaičių, atliekant bandymą nugaišusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičių, kiekvieno gyvūno žūties laiką, taip pat pateikiant toksinio poveikio aprašymą, pasireiškimo laiką ir grįžtamumą, skrodimo išvadas.
                           
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikta tokia informacija (jeigu taikytina):
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomieji gyvūnai ir jų laikymas
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Laikymo sąlygų aprašymas, nurodant gyvūnų skaičių narvelyje (arba skaičiaus pokytį), kraiko medžiagą, aplinkos temperatūrą ir santykinį drėgnį, šviesos ir tamsos kaitą paros metu ir šėrimo režimą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudota rūšis (padermė) ir, jeigu tai ne žiurkės, kitos rūšies naudojimo pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      atsitiktinės atrankos metodas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą arba šaltinį, vandens šaltinį),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prieš bandymą sudarytų sąlygų aprašymas, nurodant šėrimo režimą, izoliavimo ir apsaugos nuo ligų būdą.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Fizinė būsena, grynumas ir, jeigu taikytina, fizinės ir cheminės savybės (įskaitant izomeriją),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikavimo duomenys ir Cheminių medžiagų santrumpų tarnybos (angl. CAS) registracijos numeris, jeigu jis žinomas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nešiklis
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nešiklio naudojimo pagrindimas ir nešiklio parinkimo pagrindimas (jeigu tai ne vanduo),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      istoriniai arba vienalaikiai duomenys, įrodantys, kad nešiklis nedaro neigiamo poveikio tyrimo rezultatams.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhaliacinė kamera
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Inhaliacinės kameros aprašas, nurodant matmenis ir tūrį,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      įrangos, naudotos darant poveikį gyvūnams ir kuriant atmosferą, šaltinis ir aprašas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      temperatūros, drėgnio, dalelių dydžio ir faktinės koncentracijos matavimo įranga,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oro šaltinis, tiekiamo ir (arba) ištraukiamo oro apdorojimas ir kondicionavimo sistema,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      įrangos kalibravimo siekiant užtikrinti homogenišką bandymo atmosferą metodai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      slėgių skirtumas (teigiamas ar neigiamas),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kameroje esančios dozės davimo angos (jeigu dozė duodama tik per nosį); gyvūnų vieta sistemoje (jeigu dozė duodama per visą kūną),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandymo atmosferos laikinas homogeniškumas ir (arba) pastovumas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      temperatūros ir drėgnio jutiklių vieta ir kameroje sukurtos bandymo atmosferos ėminių ėmimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oro srauto greičiai, per dozės davimo angą tekančio oro srauto greitis (jeigu dozė duodama tik per nosį) arba gyvūnų kiekis kameroje (jeigu dozė duodama per visą kūną),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informacija apie deguonies ir anglies dioksido kiekio matavimo įrangą, jeigu tokia naudota,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inhaliacinės kameros pusiausvyros pasiekimo laikas (t95),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tūrio pokyčių kiekis per valandą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      matavimo prietaisai (jeigu naudojami).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Poveikio duomenys
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tikslinės koncentracijos parinkimo pagrindiniam tyrimui pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vardinės koncentracijos (inhaliacinėje kameroje sukurtos bandomosios cheminės medžiagos bendrosios masės ir viso per kamerą perleisto oro srauto tūrio santykis),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      faktinės bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, nustatytos gyvūnų kvėpavimo zonoje; jeigu bandomi mišiniai, įgaunantys įvairias fizines būsenas (dujos, garai, aerozoliai), kiekviena iš šių būsenų gali būti analizuojama atskirai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      visos koncentracijos ore turėtų būti nurodomos masės vienetais (pvz., mg/l, mg/m3 ir t. t.); skliaustuose taip pat gali būti nurodoma tūrio vienetais (pvz., ppm, ppb ir t. t.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dalelių dydžio pasiskirstymas, masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) ir geometrinis standartinis nuokrypis (σg), nurodant jų apskaičiavimo metodus. Turėtų būti nurodytos atliktos atskiros dalelių dydžio analizės.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos paruošimą, nurodant procedūras, taikytas siekiant sumažinti kietųjų medžiagų dalelių dydį arba paruošti bandomosios cheminės medžiagos tirpalus. Jeigu mechaniniais procesais galėjo būti pakeista bandomosios cheminės medžiagos sudėtis, pateikite bandomosios cheminės medžiagos sudėties patikros analizių rezultatus,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      įrangos, naudotos kuriant bandymo atmosferą ir veikiant gyvūnus bandymo atmosfera, aprašas (pageidautina, pateikiant diagramą),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie taikytą cheminės analizės metodą ir metodo tinkamumo patvirtinimą (nurodant bandomosios cheminės medžiagos regeneravimo iš ėminių ėmimo terpės veiksmingumą),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandomųjų koncentracijų parinkimo pagrindimas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatai
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kameros temperatūrų, drėgnio ir oro srautų lentelės,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kameros vardinės ir faktinės koncentracijos duomenų lentelės,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dalelių dydžių lentelės, pateikiant analizinių ėminių ėmimo duomenis, dalelių dydžių pasiskirstymą ir MMAS bei σg skaičiavimus,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kiekvieno gyvūno reakcijos duomenų ir jam taikyto koncentracijos lygio lentelės (t. y. gyvūnų, kuriems pasireiškė toksiškumo požymių, nurodant gaištamumą, poveikio pobūdį, sunkumą, pasireiškimo laiką ir trukmę),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kiekvieno gyvūno masė, nustatyta atliekant tyrimą; žūties data ir laikas, jeigu gyvūnas nugaišo dar prieš numatytą numarinimą; toksiškumo požymių atsiradimo laikas ir ar šių požymių pasireiškimas kiekvieno gyvūno atveju buvo grįžtamasis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kiekvieno gyvūno skrodimo išvados ir histopatologinių tyrimų rezultatai, jeigu yra,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gaištamumo įverčiai (pvz., LC50, LD01), taikant 95 % pasikliovimo ribas, ir kreivės nuolydis (jeigu nustatytas pagal vertinimo metodą),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      statistinis ryšys, pateikiant n rodiklio įvertį („K × l“ protokolas). Turėtų būti nurodytas naudotos statistinės programinės įrangos pavadinimas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatų aptarimas ir aiškinimas
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas metodų, taikytų siekiant laikytis šio bandymo metodo kriterijų, pvz., susijusių su ribine koncentracija arba dalelių dydžiu, aprašymui,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      atsižvelgiant į bendruosius rezultatus, turėtų būti aprašyta dalelių įkvėpimo galimybė, ypač jeigu nebuvo įmanoma taikyti dalelių dydžio kriterijaus,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      atsižvelgiant į OECD rekomendaciniame dokumente dėl pasekmių žmonėms (8) nustatytus kriterijus, turėtų būti pateiktas paaiškinimas, ar kilo poreikis humaniškai numarinti gyvūnus, patiriančius skausmą arba sunkią ilgalaikę kančią,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jeigu šio priedo B.52 skyriuje (4) nustatyti bandymai buvo nutraukti atsižvelgiant šį (B.2) bandymo metodą, turėtų būti pateiktas pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pateikiant bendrąjį tyrimo vertinimą, turėtų būti nurodytas metodų, taikytų nustatyti vardines ir faktines koncentracijas, nuoseklumas ir faktinės koncentracijos santykis su vardine koncentracija,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      turėtų būti aprašyta tikėtina žūties priežastis ir vyraujantis veikimo būdas (sisteminis ar vietinis).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies keičiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006, OL L 353, 2008 12 31, p. 1.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Šio priedo B.52 skyrius. Ūmus toksiškumas įkvėpus. Ūmaus toksiškumo klasės (ŪTK) metodas.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Šio priedo B.40 skyrius. Odos ėsdinimas in vitro. Odos sluoksnio elektrinės varžos (OSEV) bandymas.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Šio priedo B.40bis skyrius. Odos ėsdinimas in vitro. Žmogaus odos modelio bandymas.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160–167.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278–290.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105–117.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65–71.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C x t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.
                           
                        APIBRĖŽTIS
                  Bandomoji cheminė medžiaga– naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga arba mišinys.
                  
                     1 priedėlis
                     
                        „K × l“ protokolas
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Vertinant toksiškumą įkvėpus, kaip alternatyva įprastam protokolui gali būti svarstoma galimybė atlikti nuoseklų „Koncentracija × laiko“ („K × l“) protokolu pagrįstą tyrimą (12) (13) (14). Jam turėtų būti teikiama pirmenybė, kai yra konkrečių reglamentavimo arba mokslinių reikmių, dėl kurių būtina atlikti įvairios trukmės bandymus su gyvūnais, pvz., reagavimo į nepaprastąsias aplinkybes planavimo arba žemėnaudos planavimo tikslais. Pagal šį metodą pirmiausia atliekami bandymai taikant ribinę koncentraciją (I poveikio seansas), per kuriuos gyvūnai veikiami chemine medžiaga penkis skirtingus laikotarpius (pvz., 15, 30, 60, 120 ir 240 minučių), siekiant per vieną poveikio seansą padaryti įvairios trukmės poveikius (žr. 1 paveikslą). Jeigu taikomas Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008, dujoms, garams ir aerozoliams taikytinos ribinės koncentracijos atitinkamai yra 20 000 ppm, 20 mg/l ir 5 mg/l. Šie lygiai gali būti viršijami tik tuo atveju, jeigu yra reglamentavimo arba mokslinių reikmių atlikti bandymus taikant kitokius lygius (žr. B.2 skyriaus pagrindinio teksto 37 skirsnį).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Tais atvejais, kai apie bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą turima mažai informacijos arba jeigu jos išvis nėra, turėtų būti atliekamas orientacinis tyrimas, per kurį gyvūnai (naudojant ne daugiau kaip tris kiekvienos lyties gyvūnus) paprastai 240 minučių veikiami tyrimo vadovo pasirinkta tiksline koncentracija.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Jeigu per I poveikio seansą bandoma ribinė koncentracija ir pastebimas mažesnis kaip 50 % gaištamumas, daugiau bandymų atlikti nereikia. Jeigu yra reglamentavimo arba mokslinių reikmių nustatyti koncentracijos, laiko ir reakcijos tarpusavio priklausomybę taikant aukštesnius lygius nei nurodytoji ribinė koncentracija, kitas poveikis turėtų būti daromas taikant aukštesnį lygį, pvz., du kartus viršijant ribinę koncentraciją (1 paveiksle tai nurodyta kaip 2L).
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Jeigu taikant ribinę koncentraciją pastebimas toksiškumas, būtina atlikti papildomus bandymus (pagrindinį tyrimą). Šie papildomi poveikiai daromi taikant mažesnes koncentracijas (1 paveiksle tai nurodyta kaip II, III ir IV poveikio seansai) arba didesnes koncentracijas, tačiau taikant trumpesnes trukmes (1 paveiksle tai nurodyta kaip IV poveikio seansas), parenkant pritaikytas trukmes ir jas išdėstant mažesniais intervalais).
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Bandymas (taikant pradinę koncentraciją ir papildomas koncentracijas) atliekamas kiekvienam koncentracijos lygio ir laiko momento deriniui naudojant po vieną skirtingos lyties gyvūną arba du jautresniosios lyties gyvūnus. Tam tikromis aplinkybėmis tyrimo vadovas gali pasirinkti kiekvienam koncentracijos lygio ir laiko momento deriniui naudoti po dvi kiekvienos lyties žiurkes (arba keturis jautresniosios lyties gyvūnus) (15). Kiekvienam koncentracijos ir laiko momento deriniui naudojant po du kiekvienos lyties gyvūnus gali būti sumažintas įverčių poslinkis ir nuokrypis, padidintas vertinimo sėkmės koeficientas ir pagerinta pasikliautinojo intervalo aprėptis, susijusi su čia aprašomu protokolu. Išsamesnės informacijos pateikta RD Nr. 39 (2).
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Geriausia, kad visi poveikio seansai būtų atlikti tą pačią dieną. Tai suteiktų galimybę atidėti kitą dozės davimą, kol bus pagrįstai įsitikinta išgyvenimu, o tyrimo vadovui būtų sudaryta galimybė pakoreguoti kito poveikio seanso tikslinę koncentraciją ir taikytinas trukmes. Rekomenduojama kiekvieną poveikio seansą pradėti nuo grupės, kuriai bus daromas ilgiausias poveikis, pvz., nuo grupės, kuri bus veikiama 240 minučių, tada pereiti prie grupės, kuri bus veikiama 120 minučių ir t. t. Pvz., jeigu grupės, kuri bus veikiama 240 minučių, gyvūnai žūna po 90 minučių arba jiems pasireiškia sunkaus toksiškumo požymių (pvz., labai pakinta kvėpavimas, pvz., kvėpavimas pasunkėja), nėra prasmės duoti dozę grupei, kurią buvo numatytą veikti 120 minučių, nes tikėtina, kad gaištamumas būtų 100 %. Taigi tyrimo vadovas šiai koncentracijai turėtų parinkti trumpesnius poveikio laikotarpius (pvz., 90, 65, 45, 33 ir 25 minučių trukmės).
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Turėtų būti dažnai matuojama kameroje susidariusi koncentracija, kad kiekvienai poveikio trukmei būtų galima nustatyti pagal laiką apskaičiuojamą vidutinę koncentraciją. Jeigu įmanoma, atliekant statistinę analizę turėtų būti naudojamas kiekvieno gyvūnų žūties laikas (o ne poveikio trukmė).
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Pirmųjų keturių poveikio seansų rezultatai turėtų būti išanalizuoti siekiant nustatyti koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomybės kreivėje susidariusias duomenų spragas (žr. 1 paveikslą). Nepakankamos atitikties atveju gali būti daromas papildomas poveikis (taikant penktąją koncentraciją). Šio penktojo poveikio koncentracija ir poveikio trukmės turėtų būti tokios, kad būtų užpildyta minėtoji spraga.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Visi poveikio seansai (įskaitant pirmąjį) bus naudojami apskaičiuoti koncentracijos, laiko ir reakcijos tarpusavio priklausomybę taikant statistinę analizę (16). Jeigu įmanoma, kiekvienam koncentracijos ir laiko priklausomybės kreivės intervalui turėtų būti taikoma pagal laiką apskaičiuota vidutinė koncentracija ir poveikio trukmė iki žūties (jei darant poveikį gyvūnas nugaišta).
                                 
                                    1   paveikslas
                                 
                                 
                                    Hipotetinis koncentracijos, laiko ir gaištamumo tarpusavio priklausomybės pavyzdys
                                 
                                 
                                    
                                 Nenuspalvinti simboliai – išgyvenę gyvūnai; nuspalvinti simboliai – nugaišę gyvūnai.
                                 Trikampiai – patelės; apskritimai – patinai.
                                 Ištisinė linija – LC50 vertės (intervalas – 7,5–240 min.), apskaičiuotos patinams, kai n = 1.
                                 Brūkšninė linija – LC50 vertės (intervalas – 7,5–240 min.), apskaičiuotos patelėms, kai n = 1.
                                 Taškinės linijos – hipotetinių LC50 verčių tiesės, nubrėžtos patinams ir patelėms, kai n = 2 (12).
                                 Žodynėlis
                                 koncentracija
                                 poveikio trukmė
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Toliau pateiktas nuoseklios procedūros pavyzdys.
                                 
                                    I poveikio seansas.   Bandymai taikant ribinę koncentraciją (žr. 1 paveikslą)
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kiekvienam koncentracijos ir laiko trukmės deriniui naudojama po vieną skirtingos lyties gyvūną; iš viso – 10 gyvūnų (2)
                                             
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Tikslinė koncentracija (3) – ribinė koncentracija.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Penkios gyvūnų grupės veikiamos šia tiksline koncentracija atitinkamai 15, 30, 60, 120 ir 240 minučių.
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    II poveikio seansas
                                     (4)
                                    .   Pagrindinis tyrimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kiekvienam koncentracijos ir laiko trukmės deriniui naudojama po vieną skirtingos lyties gyvūną; iš viso – 10 gyvūnų.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Penkios gyvūnų grupės veikiamos mažesne koncentracija (5) (1/2L), taikant šiek tiek ilgesnes poveikio trukmes (intervalai apskaičiuojami taikant koeficientą √2; žr. 1 paveikslą).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    III poveikio seansas.   Pagrindinis tyrimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kiekvienam koncentracijos ir laiko trukmės deriniui naudojama po vieną skirtingos lyties gyvūną; iš viso – 10 gyvūnų.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Penkios gyvūnų grupės veikiamos mažesne koncentracija (5) (1/4L), taikant šiek tiek ilgesnes poveikio trukmes (intervalai apskaičiuojami taikant koeficientą √2; žr. 1 paveikslą).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    IV’ poveikio seansas.   Pagrindinis tyrimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kiekvienam koncentracijos ir laiko trukmės deriniui naudojama po vieną skirtingos lyties gyvūną; iš viso – 10 gyvūnų.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Penkios gyvūnų grupės veikiamos mažesne koncentracija (5) (1/8L), taikant šiek tiek ilgesnes poveikio trukmes (intervalai apskaičiuojami taikant koeficientu √2; žr. 1 paveikslą).
                                          
                                       
                                    ↓ arba
                                 
                                 
                                    IV poveikio seansas.   Pagrindinis tyrimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kiekvienai koncentracijai ir laiko trukmei naudojama po vieną skirtingos lyties gyvūną; iš viso – 10 gyvūnų.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Penkios gyvūnų grupės veikiamos didesne koncentracija (6) (2L), taikant šiek tiek trumpesnes poveikio trukmes (intervalus apskaičiuojant remiantis koeficientu √2; žr. 1 paveikslą).
                                          
                                       
                           
                        Matematinis rezultatų apdorojimas pagal „K × l“ protokolą
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Pagal „K × l“ procedūrą taikant keturias arba penkias poveikio koncentracijas ir penkias trukmes bus atitinkamai bus gauti 20 arba 25 duomenų taškai. Naudojant šiuos duomenų taškus, koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomybė gali būti apskaičiuota atliekant statistinę analizę (16):
                                 
                                    1 lygtis:
                                 
                                 
                                    
                                 čia: C – koncentracija; t – poveikio trukmė, arba:
                                 
                                    2 lygtis:
                                 
                                 
                                    
                                 čia: 
                                 Naudojant 1 lygtį, LC50 vertė gali būti apskaičiuota tam tikram laikotarpiui (pvz., keturių valandų, vienos valandos, 30 minučių arba bet kokiam kitam laikotarpiui, patenkančiam į bandymų laikotarpių intervalą), tariant, kad P = 5 (50 % reakcija). Atkreipkite dėmesį, kad Haberio taisyklė taikoma tik tada, kai n = 1. LC01 vertė gali būti apskaičiuota tariant, kad P = 2,67.
                              
                           “
            
                  4)
               
               
                  B.7 ir B.8 skyriai pakeičiami taip:
                  „B.7.   28 DIENŲ GRAUŽIKŲ KARTOTINĖS DOZĖS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ 407 (OECD bandymo gairės Nr. 407) (2008). Originalios bandymo gairės „Test Guideline“ 407 priimtos 1981 m. Siekiant gauti papildomos informacijos remiantis per tyrimą naudotais gyvūnais, pirmiausia informacijos apie neurotoksiškumą ir imunotoksiškumą, 1995 m. priimta atnaujinta versija.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              1998 m. OECD ėmėsi prioritetinės veiklos, skirtos atnaujinti esamas bandymų gaires ir parengti naujas bandymų gaires, pagal kurias būtų atrenkamos ir bandomos medžiagos, galinčios pakenkti endokrininei sistemai (8). Viena iš veiklos krypčių buvo esamų OECD gairių, susijusių su „28 dienų kartotinės dozės toksiškumo per virškinamąjį traktą graužikams tyrimu“ (TG 407), atnaujinimas įtraukiant parametrus, tinkamus nustatyti bandomųjų cheminių medžiagų poveikį endokrininei sistemai. Rengiant šią procedūrą įgyvendinta plati tarptautinė programa, skirta patikrinti papildomų parametrų reikšmę ir praktinį naudingumą, jų veiksmingumą cheminėms medžiagoms, turinčioms (anti)estrogeninio, (anti)androgeninio ir (anti)tiroidinio poveikio, atkuriamumo vienoje laboratorijoje ir įvairiose laboratorijose galimybes ir naujųjų parametrų nesuderinamumą su parametrais, kurie buvo privalomi prieš priimant TG 407. Pagal šią programą gauti gausūs duomenys buvo surinkti ir įvertinti išsamioje OECD ataskaitoje (9). Šis atnaujintasis B.7 metodas (lygiavertis TG 407) yra įgyvendinant šią tarptautinę bandymų programą įgytos patirties ir gautų rezultatų išdava. Šis bandymo metodas suteikia galimybę tam tikrus per endokrininę sistemą daromus poveikius susieti su kitais toksikologiniais poveikiais.
                           
                        PIRMINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI
                  
                              3.
                           
                           
                              Vertinant ir nustatant cheminių medžiagų toksiškumo charakteristikas, kartotinės dozės toksiškumas per virškinamąjį traktą gali būti nustatomas po to, kai ūmaus toksiškumo bandymais gaunama pradinės informacijos. Šis bandymo metodas skirtas nustatyti poveikį, atsižvelgiant į labai didelę galimo toksinio poveikio objektų įvairovę. Taikant šį metodą gaunama informacijos apie galimus pavojus sveikatai, kurie gali grėsti dėl gana trumpą laiką trunkančio kartotinio poveikio, įskaitant poveikį nervų, imuninei ir endokrininei sistemoms. Atsižvelgiant šias konkrečias pasekmes, taikant šį metodą turėtų būti nustatytos cheminės medžiagos, galinčios turėti neurotoksinio poveikio, dėl kurio gali reikėti atlikti nuodugnesnius šio aspekto tyrimus, ir cheminės medžiagos, kenksmingos skydliaukės fiziologijai. Be to, šiuo metodu galima gauti duomenų apie chemines medžiagas, kurios kenkia jaunų, bet suaugusių patinų ir (arba) patelių lytiniams organams, ir pastebėti poveikio imuninei sistemai požymių.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Šio (B.7) bandymo metodo rezultatai turėtų būti naudojami pavojų nustatymo ir rizikos vertinimo tikslais. Rezultatai, gauti pagal endokrininei sistemai taikomus parametrus, turėtų būti vertinami atsižvelgiant į OECD konceptualią endokrininei sistemai kenksmingų cheminių medžiagų bandymų ir vertinimo sistemą (11). Šis metodas sudarytas iš pamatinio kartotinės dozės toksiškumo tyrimo, kuris gali būti taikomas cheminėms medžiagoms, dėl kurių nebūtina atlikti 90 dienų tyrimo (pvz., kai gamybos apimtis neviršija tam tikrų ribų), arba kaip išankstinis tyrimas prieš ilgalaikį tyrimą. Stebėjimų laikotarpio trukmė turėtų būti 28 dienos.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Tarptautinė programa, įgyvendinta siekiant patvirtinti parametrus, kurie būtų tinkami nustatyti galimą bandomosios cheminės medžiagos poveikį endokrininei sistemai, parodė, kad pagal šį (B.7) bandymo metodą gaunamų duomenų kokybė labai priklauso nuo bandymų laboratorijos patirties. Tai pirmiausia taikytina histopatologiniam ciklinių patelės lytinių organų pakitimų tyrimui ir mažų, nuo hormonų priklausomų organų, kuriuos sudėtinga skrosti, masės nustatymui. Parengtos histopatologinių tyrimų gairės (19). Jos skelbiamos OECD viešojoje svetainėje, skirtoje bandymų gairėms. Jos skirtos padėti patologams atlikti tyrimus ir užtikrinti didesnį analizės tikslumą. Nustatyta, kad toksiškumą endokrininei sistemai rodo labai įvairūs parametrai; šie parametrai įtraukti į šį bandymo metodą. Parametrai, dėl kurių negauta pakankamai duomenų, kad būtų galima įrodyti jų naudingumą, arba dėl kurių per patvirtinimo programą gauta silpnų įrodymų, kad jie gali padėti nustatyti endokrininei sistemai kenksmingas medžiagas, siūlomi naudoti kaip neprivalomos pasekmės (žr. 2 priedėlį).
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Remiantis per patvirtinimo procesą gautais duomenimis, būtina pabrėžti, kad šios analizės tikslumas nėra pakankamas, kad būtų galima nustatyti visas chemines medžiagas, kurių veikimo būdas yra (anti)androgeninis arba (anti)estrogeninis (9). Šis bandymo metodas netaikomas tam gyvenimo etapui, kuriuo endokrininė sistema yra pažeidžiamiausia. Visgi patvirtinimo proceso metu taikant šį bandymo metodą nustatyta cheminių medžiagų, kurios daugiau ar mažiau kenkia skydliaukės funkcijai, ir cheminių medžiagų, stipriai ir vidutiniškai stipriai veikiančių skydliaukę per estrogeninius arba androgeninius receptorius, tačiau dažniausiai nepavykdavo nustatyti endokrininę sistemą veikiančių cheminių medžiagų, kurios silpnai veikia estrogeninius arba androgeninius receptorius. Taigi jo negalima apibūdinti kaip atrankinės analizės, skirtos nustatyti poveikį endokrininei sistemai.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Todėl, nesant su šiais veikimo būdais susijusio poveikio, negalima teigti, kad nesukeliama poveikio endokrininei sistemai. Nagrinėjant per endokrininę sistemą daromus poveikius, cheminės medžiagos savybių apibūdinimas neturėtų būti grindžiamas vien tik šio bandymo metodo taikymo rezultatais, bet jis turėtų būti naudojamas taikant įrodomosios duomenų galios metodą, apimantį visus turimus cheminės medžiagos duomenis, skirtus apibūdinti galimą poveikį endokrininei sistemai. Dėl šios priežasties reglamentavimo tikslais priimami sprendimai dėl poveikio endokrininei sistemai (cheminės medžiagos savybių apibūdinimas) turėtų būti grindžiami platesnio metodo taikymu, o ne tik šio bandymo metodo taikymo rezultatais.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Pripažinta, kad visos gyvūnų naudojimu pagrįstos procedūros atitiks vietinius gyvūnų priežiūros reikalavimus; toliau išdėstyti priežiūros ir poveikio aprašymai yra minimalūs veiklos reikalavimai, kurie bus pakeičiami vietos teisės aktais, jeigu šie bus griežtesni. Daugiau rekomendacijų dėl humaniško elgesio su gyvūnais pateikia OECD (14).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Vartojamos apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                           
                        BANDYMO PRINCIPAS
                  
                              10.
                           
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga per burną 28 dienas kasdien skirtingomis dozėmis duodama kelioms bandomųjų gyvūnų grupėms – po vieno dydžio dozę vienai grupei. Kiekvieną dozės davimo laikotarpio dieną gyvūnai atidžiai stebimi toksiškumo požymiams nustatyti. Bandymo metu nugaišę arba numarinti gyvūnai skrodžiami, o baigus bandymą numarinami ir skrodžiami išgyvenę gyvūnai. Atliekant 28 dienų tyrimą gaunama informacijos apie kartotinės oralinės dozės poveikį, iš kurio gali būti matoma, ar reikia atlikti tolesnius ilgalaikius tyrimus. Be to, taip gali būti gauta informacijos dėl koncentracijų parinkimo ilgalaikiams tyrimams. Remiantis šiuo bandymo metodu gautais duomenimis turėtų būti galima apibūdinti cheminės medžiagos toksiškumą, nustatyti dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybę ir apibrėžti nepastebimo neigiamo poveikio lygį (NNPL).
                           
                        METODO APRAŠYMAS
                  
                     Gyvūnų rūšies parinkimas
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, bet galima naudoti ir kitų rūšių graužikus. Jeigu pagal šį (B.7) bandymo metodą nustatyti parametrai tiriami naudojant kitų rūšių graužikus, turėtų būti pateiktas išsamus pagrindimas. Nors biologiniu požiūriu tikėtina, kad kitos rūšis į toksines medžiagas turėtų reaguoti panašiai kaip žiurkės, naudojant smulkesnes rūšis gali atsirasti didesnių nuokrypių, susijusių su techniniais mažesnių organų skrodimo sunkumais. Vienintelė pagal tarptautinę patvirtinimo programą, skirtą nustatyti endokrininei sistemai kenksmingas medžiagas, naudota rūšis buvo žiurkės. Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių padermių gyvūnai. Patelės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos. Dozė turėtų būti pradedama duoti kaip galima anksčiau, kai tik jauniklis atjunkomas, bet ne vėliau nei gyvūnams sueina devynios savaitės. Pradedant tyrimą gyvūnų kūno masės skirtumai turi būti kuo mažesni ir nenukrypti nuo kiekvienos lyties kūno masės vidurkio daugiau kaip ± 20 %. Jeigu prieš ilgesnio laikotarpio tyrimą atliekamas išankstinis kartotinės oralinės dozės tyrimas, pageidautina, kad per abu tyrimus naudojami gyvūnai būtų tos pačios padermės ir gauti iš to paties šaltinio.
                           
                        
                     Laikymas ir šėrimas
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Visos procedūros turėtų atitikti vietinius laboratorinės gyvūnų priežiūros reikalavimus. Bandomųjų gyvūnų patalpos temperatūra turėtų būti 22 °C (± 3 °C). Nors santykinis oro drėgnis turėtų būti ne mažesnis kaip 30 % ir, pageidautina, ne didesnis kaip 70 % (išskyrus patalpos plovimo metą), turėtų būti siekiama užtikrinti 50–60 % santykinį drėgnį. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, užtikrinant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Pašaro parinkimui gali turėti įtakos poreikis tinkamai įmaišyti bandomąją cheminę medžiagą, kai ji duodama pagal šį metodą. Gyvūnai turėtų būti laikomi mažomis tos pačios lyties grupėmis; jeigu tai moksliškai pagrįsta, gyvūnai gali būti laikomi po vieną. Jeigu gyvūnai narveliuose laikomi grupelėmis, viename narvelyje turėti būti laikomi ne daugiau kaip penki gyvūnai.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Turėtų būti nuolat analizuojama, ar pašaro sudėtyje nėra teršalų. Pašaro ėminys turėtų būti saugomas, kol bus parengta ataskaita.
                           
                        
                     Gyvūnų paruošimas
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Sveiki jauni suaugę gyvūnai atsitiktinės atrankos principu suskirstomi į kontrolines ir bandomąsias grupes. Narveliai turėtų būti išdėstyti taip, kad galimas narvelių išdėstymo poveikis tyrimo rezultatams turėtų būtų kuo mažesnis. Gyvūnai paženklinami, kad kiekvieną iš jų būtų galima identifikuoti, ir ne mažiau kaip penkias paras iki poveikio tyrimo pradžios laikomi savo narveliuose, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų.
                           
                        
                     Dozių ruošimas
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga leidžiama zondu arba duodama su pašarais arba geriamuoju vandeniu. Oralinis dozės davimo būdas priklauso nuo tyrimo tikslų ir fizinių, cheminių bei (arba) toksikokinetinių bandomosios cheminės medžiagos savybių.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Prireikus bandomoji cheminė medžiaga ištirpinama arba pagaminama jos suspensija tinkamame nešiklyje. Rekomenduojama, jeigu įmanoma, pirmenybę teikti vandeniniam tirpalui arba suspensijai, tada svarstyti galimybę naudoti aliejaus (pvz., kukurūzų) tirpalą arba suspensiją ir tik po to – galimybę naudoti tirpalus kituose nešikliuose. Jeigu naudojamas nešiklis nėra vanduo, turi būti žinomos to nešiklio toksinės savybės. Turėtų būti nustatytas bandomosios cheminės medžiagos stabilumas nešiklyje.
                           
                        PROCEDŪRA
                  
                     Gyvūnų skaičius ir lytis
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Kiekvieno dydžio dozė duodama ne mažiau kaip dešimčiai gyvūnų (penkiems patinams ir penkioms patelėms). Jeigu numatoma marinti gyvūnus nebaigus bandymo, pradinis gyvūnų skaičius turėtų būti padidintas numatomu iki tyrimo pabaigos numarinti gyvūnų skaičiumi. Turėtų būti apsvarstyta galimybė į kontrolinę grupę ir didžiausiajai dozei skirtą grupę įtraukti po vieną papildomą pagalbinę dešimties gyvūnų grupę (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus), kad bent 14 dienų po dozės davimo būtų galima stebėti toksinio poveikio grįžtamumą, tvarumą arba delsą.
                           
                        
                     Dozuotė
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Paprastai turėtų būti naudojamos ne mažiau kaip trys bandomosios grupės ir viena kontrolinė grupė, tačiau jeigu įvertinus turimus duomenis nesitikima jokio 1 000 mg/kg kūno masės per parą dozės poveikio, galima atlikti ribinį bandymą. Jeigu nėra tinkamų duomenų, gali būti atliktas ribų nustatymo tyrimas (naudojant tos pačios padermės ir iš to paties šaltinio gautus gyvūnus), padėsiantis nustatyti naudotinas dozes. Kontrolinės grupės gyvūnai turėtų būti prižiūrimi lygiai taip pat kaip ir bandomieji gyvūnai, išskyrus tai, kad jiems neduodama bandomosios cheminės medžiagos. Jeigu duodant bandomąją cheminę medžiagą naudojamas nešiklis, kontrolinė grupė turėtų gauti didžiausią naudotą nešiklio kiekį.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Dozių dydžiai turėtų būti parenkami atsižvelgiant į jau turimus bandomosios arba į ją panašių cheminių medžiagų toksiškumo ir (toksiko)kinetinius duomenis. Pasirinkta didžiausioji dozė turėtų sukelti toksinį poveikį, tačiau nenužudyti gyvūno ir nesukelti sunkių kančių. Kitos, mažesnės dozės turėtų būti parenkamos taip, kad būtų galima nustatyti galimas reakcijas į dozes ir nepastebimą neigiamą poveikį (NNPL), kai duodama mažiausioji dozė. Dažnai būtų geriausia, jeigu mažėjančia tvarka parenkami dozių dydžiai vienas nuo kito skirtųsi du–keturis kartus, ir dažnai patartina ketvirtajai papildomai tiriamajai grupei taikyti labai didelius dozių dydžių skirtumus (pvz., koeficientus, didesnius kaip 10).
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Jeigu pastebimas bendras toksinis poveikis (pvz., sumažėjusi kūno masė, poveikis kepenims, širdžiai, plaučiams arba inkstams ir t. t.) arba nustatoma kitų pakitimų, kurie gali būti ne toksinės reakcijos (pvz., sumažėjęs pašaro vartojimas, kepenų padidėjimas), pastebėtas poveikis imuninio, nervinio arba endokrininio pobūdžio pasekmėms turėtų būti vertinamas atsargiai.
                           
                        
                     Ribinis bandymas
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Jeigu vieno dydžio dozės, ne mažesnės kaip 1 000 mg/kg kūno masės per parą arba atitinkama procentinė dalis pašaruose ar geriamame vandenyje (nustatant pagal kūno masę), kai dozė duodama su pašarais ar geriamu vandeniu, bandymas, atliekamas taikant tokiam tyrimui nustatytas procedūras, nesukelia pastebimo toksinio poveikio ir jeigu toksinio poveikio nesitikima remiantis turimais duomenimis apie panašios struktūros chemines medžiagas, išsamus trijų dydžių dozių tyrimas nebūtinas. Ribinis bandymas neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveikį žmogui, reikia duoti didesnes dozes.
                           
                        
                     Dozių davimas
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Bandomosios cheminės medžiagos dozė 28 dienų laikotarpiu gyvūnams duodama kasdien, septynias dienas per savaitę. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga leidžiama zondu, ji turėtų būti duodama viena doze, naudojant skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Didžiausias vienkartinis duodamo skysčio kiekis priklauso nuo bandomojo gyvūno dydžio. Šis kiekis neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti po 2 ml/100 g kūno masės. Išskyrus dirginančias arba ėsdinančias chemines medžiagas, kurios, būdamos didesnės koncentracijos, paprastai sukelia sunkesnį poveikį, bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turėtų būti kiek įmanoma sumažintas keičiant koncentraciją taip, kad visų dydžių dozių tūris būtų vienodas.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Jeigu cheminės medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, svarbu užtikrinti, kad įmaišomi bandomosios cheminės medžiagos kiekiai netrikdytų įprasto mitybos režimo arba vandens balanso. Bandomąją cheminę medžiagą duodant su pašaru, galima taikyti vienodą koncentraciją pašare (ppm) ar vienodą dozės dydį pagal gyvūno kūno masę; turi būti nurodytas pasirinktas variantas. Jeigu cheminė medžiaga leidžiama zondu, dozė kasdien turėtų būti duodama panašiu metu ir prireikus koreguojama, kad būtų palaikomas pastovus dozės dydis atsižvelgiant į gyvūno kūno masę. Jeigu prieš ilgalaikį tyrimą atliekamas išankstinis kartotinės dozės tyrimas, per abu tyrimus gyvūnams turi būti duodami panašūs pašarai.
                           
                        
                     Stebėjimai
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Stebėjimų laikotarpio trukmė turėtų būti 28 dienos. Tolesniems stebėjimams numatytos pagalbinės grupės gyvūnai turėtų būti dar bent 14 dienų laikomi neduodant jokios dozės, kad būtų galima nustatyti toksinio poveikio delsą, tvarumą arba gyvūnų atsigavimą nuo poveikio.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Bent kartą per parą turėtų būti atliekami bendrieji klinikiniai stebėjimai; geriausia, kad jie būtų atliekami tuo pačiu paros metu, atsižvelgiant į stipriausią numatomo poveikio pasireiškimą po dozės davimo. Turėtų būti registruojama gyvūnų sveikatos būklė. Bent du kartus per parą visi gyvūnai turėtų būti patikrinami, ar jie sveiki ir nenugaišę.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Kartą prieš pirmojo poveikio pradžią (kad būtų galima palyginti atskirus gyvūnus) ir bent kartą per savaitę po dozės davimo turėtų būti atliekami išsamūs visų gyvūnų klinikiniai stebėjimai. Šie stebėjimai atliekami perkėlus gyvūną iš jo narvo į tam skirtą įprastą vietą ir, pageidautina, turėtų būti atliekami tuo pačiu paros metu. Stebėjimai turėtų būti kruopščiai registruojami, pageidautina, pagal toje laboratorijoje aiškiai apibrėžtą vertinimo sistemą. Turėtų būti dedamos pastangos, kad bandymo sąlygų kaita būtų kuo mažesnė, ir pageidautina, kad šiuos stebėjimus atliktų stebėtojai, nežinantys apie dozės davimą. Be kitų dalykų, turėtų būti registruojami odos, kailio, akių, gleivinės pakitimai, išskyrų atsiradimas ir autonominis aktyvumas (pvz., ašarojimas, plaukų pašiaušimas, vyzdžio dydis, neįprasti kvėpavimo pakitimai). Taip pat turėtų būti registruojami eisenos, pozos, reakcijos į paėmimą rankomis pakitimai, traukulių arba toninių judesių atsiradimas, stereotipinis (pvz., besaikis valymasis, pasikartojantis sukimasis ratu) arba keistas elgesys (pvz., savęs luošinimas, vaikščiojimas atbulomis) (2).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Ketvirtą poveikio savaitę turėtų būti tiriamos jutiminės reakcijos į įvairaus pobūdžio dirgiklius (pvz., klausos, regos ir proprioreceptorinius) (3) (4) (5), vertinamas spaudimo (jėgos) stiprumas (6) ir judėjimo aktyvumas (7). Išsamesnės informacijos apie procedūras, kurios galėtų būti taikomos, pateikta atitinkamuose literatūros šaltiniuose. Vietoje nurodytųjų gali būti taikomos ir alternatyvios procedūros.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Jeigu kartotinės dozės tyrimas atliekamas kaip išankstinis tyrimas prieš pusiau lėtinio poveikio (90 dienų) tyrimą, funkciniai stebėjimai ketvirtąją savaitę gali būti neatliekami. Tokiu atveju funkciniai stebėjimai turėtų būti įtraukiami į šį tolesnį tyrimą. Kita vertus, tokie funkciniai stebėjimai atliekant kartotinės dozės tyrimą suteikia didesnę galimybę geriau parinkti dozių dydžius tolesniam pusiau lėtinio poveikio tyrimui.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Išimtiniais atvejais funkcinių stebėjimų galima neatlikti ir su tomis grupėmis, kurių toksiškumo požymiai tokio laipsnio, kad jie labai trukdytų atlikti funkcinius bandymus.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Atliekant skrodimą, (neprivaloma tvarka) galėtų būti nustatomas visų patelių lytinis ciklas, imant makšties tepinėlius. Šie stebėjimai suteiktų informacijos apie lytinio ciklo etapą, buvusį gyvūno numarinimo metu, ir padėtų atlikti histologinius su estrogenais susijusių audinių tyrimus [žr. histopatologinių tyrimų gaires (19)].
                           
                        
                     Kūno masė ir pašarų ir (arba) vandens suvartojimas
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Bent kartą per savaitę visi gyvūnai turėtų būti pasveriami. Ne rečiau kaip kartą per savaitę turėtų būti matuojamas pašarų suvartojimas. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, bent kartą per savaitę turėtų būti matuojamas ir vandens suvartojimas.
                           
                        
                     Hematologiniai tyrimai
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Pasibaigus bandymo laikotarpiui turėtų būti atlikti tokie hematologiniai tyrimai: hematokrito, hemoglobino koncentracijos, eritrocitų kiekio, retikolucitų, bendro leukocitų kiekio ir įvairių leukocitų kiekių, trombocitų kiekio ir kraujo krešėjimo laiko ir aktyvumo. Jeigu įtariama, kad bandomoji cheminė medžiaga arba jos numatomi metabolitai turi oksidacinių savybių, turėtų būti nustatyti ir kiti rodikliai, įskaitant methemoglogino koncentraciją ir Heinco kūnelius.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Kraujo ėminiai turėtų būti imami iš nurodytos vietos prieš pat gyvūnų numarinimą arba numarinimo procedūros metu ir saugomi tinkamomis sąlygomis. Naktį prieš numarinimą gyvūnams turėtų būti neduodama pašaro (7).
                           
                        
                     Klinikinė biochemija
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Siekiant ištirti pagrindinius toksinius poveikius audiniams, pirmiausia inkstams ir kepenims, turėtų būti atlikti visų gyvūnų kraujo ėminių, paimtų prieš pat gyvūnų numarinimą arba numarinimo procedūros metu, klinikiniai biocheminiai tyrimai (atmetus gaištančius arba nebaigus tyrimo numarintus gyvūnus). Kraujo plazmoje arba serume tiriama: natris, kalis, gliukozė, bendras cholesterolio kiekis, šlapalas, kreatininas, bendras baltymų ir albumino kiekis, mažiausiai du fermentai, rodantys poveikį kepenų ląstelėms (pvz., alaninaminotransferazė, aspartataminotransferazė, šarminė fosfatazė, gamaglutamiltranpeptidazė ir glutamato dehidrogenazė), ir tulžies rūgštys. Tam tikromis aplinkybėmis naudingos informacijos gali suteikti papildomi fermentų (kepenų arba kitokios kilmės) ir bilirubino tyrimai.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Paskutinę tyrimo savaitę (neprivaloma tvarka) gali būti atliekami šlapimo tyrimai, per nustatytą laiko tarpą surenkant tam tikrą šlapimo kiekį ir ištiriant šlapimo išvaizdą, kvapą, tūrį, osmosinį slėgį arba savitąjį svorį, pH, baltymus, gliukozę ir kraują (kraujo kūnelius).
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Be to, turėtų būti apsvarstyta galimybė atlikti plazmos arba serumo rodiklių, rodančių bendruosius audinių pažeidimus, tyrimus. Jeigu žinomos bandomosios cheminės medžiagos savybės gali arba, įtariama, gali turėti neigiamo poveikio susijusioms metabolinėms savybėms, galima atlikti kalcio, fosforo, trigliceridų, specifinių hormonų ir cholinesterazės tyrimus. Šie tyrimai turi būti paskiriami tam tikrų kategorijų medžiagoms arba atsižvelgiant į konkretų atvejį.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Nors atliekant tarptautinį su endokrinine sistema susijusių pasekmių vertinimą ir nepavyko įrodyti aiškios skydliaukės hormonų (T3, T4) ir tireotropinų (angl. TSH) tyrimų naudos, gali būti naudinga išsaugoti plazmos ir serumo ėminius, kad būtų galima įvertinti T3, T4 ir TSF (neprivaloma), kai atsiranda poveikio hipofizės-skydliaukės ašiai požymių. Saugotini ėminiai gali būti užšaldomi –20 °C temperatūroje. Hormonų tyrimų rezultatų nuokrypiams ir absoliutinėms koncentracijoms gali turėti įtakos šie veiksniai:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          numarinimo laikas – dėl hormonų koncentracijos kaitos paros metu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          numarinimo būdas, taikomas siekiant, kad gyvūnai nepatirtų pernelyg didelio streso, galinčio turėti įtakos hormonų koncentracijoms,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          hormonų tyrimų įranga, kuri gali skirtis etaloninių kreivių požiūriu.
                                       
                                    Galutinai nustatyti skydliaukę veikiančias chemines medžiagas patikimiau taikant histopatologinę analizę, o ne remiantis hormonų lygiais.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Hormonų tyrimams specialiai skirti plazmos ėminiai turėtų būti imami panašiu paros metu. Rekomenduojama apsvarstyti galimybę atlikti T3, T4 ir TSH tyrimus remiantis skydliaukės histopatologiniais pakitimais. Taikant įvairią komercinę analizės įrangą, skaitinės vertės, gautos analizuojant hormonų koncentracijas, skiriasi. Todėl gali būti neįmanoma parengti poveikio vertinimo kriterijų, pagrįstų vienodais istoriniais duomenimis. Arba laboratorijos turėtų siekti, kad kontroliniai T3 ir T4 variacijos koeficientai būtų mažesni kaip 25, o TSH – mažesni kaip 35. Visos koncentracijos registruojamos ng/ml išraiška.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Jeigu pamatiniai istoriniai duomenys yra netinkami, turėtų būti apsvarstyta galimybė nustatyti hematologinius ir klinikinius biocheminius kintamuosius prieš pradedant duoti dozes arba, pageidautina, naudojant gyvūnų grupę, neįtrauktą į bandomąsias grupes.
                           
                        PATOLOGIJA
                  
                     Bendrasis skrodimas
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Atliekamas išsamus visų bandomųjų gyvūnų bendrasis skrodimas, atidžiai ištiriant kūno paviršių ir visas jo angas, kaukolę, krūtinės ląstą, pilvo ertmes ir jų turinį. Atlikus skrodimą, visų gyvūnų (išskyrus gaištančius ir (arba) numarintus nebaigus tyrimo) kepenys, inkstai, antinksčiai, sėklidės, sėklidžių prielipai, prostata ir sėklinės pūslelės su koaguliatorių liaukomis (kaip kompleksas), užkrūčio liauka, blužnis, smegenys ir širdis turėtų būti nuvalyti, jeigu reikia, pašalinant prigludusius audinius, ir po skrodimo kuo greičiau pasverti, kol neišdžiuvo. Valant prostatos kompleksą, būtina imtis atsargumo priemonių, kad nebūtų pradurtos sėklinės pūslelės su skysčiais. Arba sėklinės pūslelės ir prostata gali būti valomos ir sveriamos atlikus fiksavimą.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Be to, kaip galima greičiau skrodimo, kol neišdžiuvo, gali būti pasveriami ir kiti du audiniai: kiaušidžių pora (drėgnų organų masė) ir gimda su gimdos kakleliu (patarimų, kaip pašalinti ir svėrimui paruošti gimdos audinius, pateikta OECD TG 440 (OECD bandymų gairės Nr. 440) (18)).
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Atlikus fiksavimą, gali būti (bet neprivaloma) nustatyti skydliaukės masę. Valyti irgi būtina labai atsargiai ir tik atlikus fiksavimą, kad nebūtų pažeistas audinys. Pažeidus audinį gali būti gauti netikslūs histopatologinės analizės rezultatai.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Atsižvelgiant į audinio tipą ir numatomą vėliau atlikti histopatologinį tyrimą, tinkamiausioje fiksavimo terpėje turėtų būti konservuoti šie audiniai (žr. 47 skirsnį): visi labai pakitę audiniai, smegenys (jų būdingiausios dalys – didžiosios smegenys, smegenėlės ir smegenų tiltas), nugaros smegenys, akis, skrandis, mažosios ir didžiosios žarnos (taip pat Peyerio plokštelės), kepenys, inkstai, antinksčiai, blužnis, širdis, užkrūčio liauka, skydliaukė, trachėja ir plaučiai (prileidžiant fiksatyvo ir tada panardinant), lytinės liaukos (sėklidės ir kiaušidės), kiti lytiniai organai (gimda, gimdos kaklelis, sėklidžių prielipai, prostata ir sėklinės pūslelės su koaguliatorių liaukomis), makštis, šlapimo pūslė, limfiniai mazgai [be artimiausio drenažinio mazgo, remiantis geriausiąja laboratorine patirtimi paimamas dar vienas mazgas (15)], periferinis nervas (sėdimasis arba blauzdikaulio), pageidautina, esantis arti raumens, skeleto raumuo ir kaulas su kaulų čiulpais (išpjova arba šviežiai paruošta kaulų čiulpų punkcija). Rekomenduojama atlikti sėklidžių fiksavimą jas panardinant į Bouino arba modifikuotąjį Davidsono fiksatyvą (16) (17). Abu tunica albuginea galai turi būti atsargiai ir negiliai pradurti adata, kad būtų galima greitai prileisti fiksatyvo. Atsižvelgiant į gautas klinikines ir kitokias išvadas, gali reikėti ištirti papildomus audinius. Be to, atsižvelgiant į žinomas bandomosios cheminės medžiagos savybes, turėtų būti konservuojami visi numanomi tiksliniai organai.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Vertingos informacijos apie poveikį endokrininei sistemai galima gauti ištiriant šiuos organus: lytines liaukas (kiaušides ir sėklides), kitus lytinius organus (gimdą su gimdos kakleliu, sėklidžių prielipus, sėklines pūsleles su koaguliatorių liaukomis, dorsolateralinę ir pilvinę prostatas), makštį, hipofizę, patinų pieno liaukas, skydliaukę ir antinksčius). Patinų pieno liaukų pakitimai nėra pakankamai išsamiai aprašyti, tačiau šis parametras gali būti labai svarbus estrogeninio poveikio turinčias chemines medžiagas. 43 skirsnyje nenurodytų organų ir (arba) audinių stebėjimai neprivalomi (žr. 2 priedėlį).
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Histopatologinių tyrimų gairėse (19) pateikta išsamios papildomos informacijos apie skrodimą, fiksavimą, pjaustymą ir endokrininių audinių histopatologiją.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Įgyvendinant tarptautinę bandymų programą gauta šiek tiek įrodymų, kad sunkiai pastebimo poveikio endokrininei sistemai turinčios cheminės medžiagos, menkai veikiančios lytinių hormonų homeostazę, gali būti nustatomos atsižvelgiant į lytinio ciklo sinchronizavimo trikdymą įvairiuose audiniuose ir iš dalies – į atvirus histopatologinius patelių lytinių organų pakitimus. Nors galutinių įrodymų dėl tokio poveikio negauta, rekomenduojama aiškinant kiaušidžių (folikulų, apvalkalų ir kiaušidžių grūdėtųjų ląstelių), gimdos, gimdos kaklelio ir makšties histopatologinių tyrimų rezultatus atsižvelgti į galimo lytinio ciklo asinchroniškumą. Jeigu vertinamas ciklo etapas, nustatomas imant makšties tepinėlius, į jį taip pat galima atsižvelgti atliekant šį palyginimą.
                           
                        
                     Histopatologinis tyrimas
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Turėtų būti atliktas išsamus histopatologinis visų kontrolinės grupės ir didžiausiąją dozę gavusios grupės gyvūnų konservuotų organų ir audinių tyrimas. Jeigu nustatoma, kad didžiausiąją dozę gavusioje grupėje atsirado su dozės davimu susijusių pakitimų, turėtų būti atlikti ir visų kitų dydžių dozes gavusių grupių gyvūnų histopatologiniai tyrimai.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Ištiriami visi labai pakitę audiniai.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Jei naudojama pagalbinė grupė, turėtų būti atliekamas histopatologinis audinių ir organų, dėl kurių, ištyrus dozę gavusias grupes, nustatyta, kad jiems buvo padarytas poveikis, tyrimas.
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITOS
                  
                     Duomenys
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Turėtų būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to, visi duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, pagal kiekvieną bandomąją grupę nurodant pradedant bandymą turėtų gyvūnų skaičių, atliekant bandymą nugaišusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičių ir kiekvienos žūties arba numarinimo dėl humaniškų priežasčių laiką, gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičių, pastebėtų toksiškumo požymių aprašymą, įskaitant kiekvieno toksinio poveikio pasireiškimo laiką, trukmę ir sunkumą, gyvūnų su audinių pakitimais skaičių, pakitimų tipą ir gyvūnų su kiekvieno tipo pakitimais procentinę dalį.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Jeigu įmanoma, skaitiniai rezultatai turėtų būti įvertinti taikant tinkamą visuotinai pripažintą statistinį metodą. Lyginant poveikį pagal dozių intervalą turėtų būti vengiama taikyti įvairius t kriterijus. Statistiniai metodai turėtų būti parenkami planuojant tyrimą.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Siekiant užtikrinti kokybės kontrolę, siūloma surinkti istorinius kontrolinius duomenis ir skaitiniams duomenims apskaičiuoti variacijos koeficientus, ypač parametrams, susijusiems su endokrininei sistemai kenksmingų medžiagų nustatymu. Šie duomenys gali būti naudojami palyginimo tikslais, kai vertinami faktiniai tyrimai.
                           
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Fizinė būsena, grynumas, fizinės ir cheminės savybės,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikavimo duomenys.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nešiklis (jeigu naudojamas)
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nešiklio, jeigu tai ne vanduo, pasirinkimo pagrindimas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomieji gyvūnai
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Naudota rūšis ir (arba) padermė,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kiekvieno gyvūno masė pradedant bandymą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rūšies, jeigu tai ne žiurkės, pasirinkimo pagrindimas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Dozės dydžio pasirinkimo pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos ir (arba) pašaro paruošimą, gautą koncentraciją, preparato stabilumą ir homogeniškumą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos davimo būdą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos (ppm) pašare arba geriamajame vandenyje perskaičiavimas į faktinę dozę (mg/kg kūno masės per parą), jeigu taikytina,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Neprivalomos tirti, bet ištirtos pasekmės
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Neprivalomų tirti, bet ištirtų pasekmių sąrašas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatai
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kūno masė ir (arba) kūno masės pokyčiai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      maisto ir, jeigu taikytina, vandens suvartojimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toksinės reakcijos duomenys pagal lytį ir dozės dydį, nurodant toksiškumo požymius,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinikinių požymių pobūdis, sunkumas ir trukmė (grįžtami ar negrįžtami),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jutiminio aktyvumo, spaudimo (jėgos) stiprumo ir judėjimo aktyvumo įvertinimai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologiniai tyrimai remiantis atitinkamomis pamatinėmis vertėmis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinikiniai biocheminiai tyrimai remiantis atitinkamomis pamatinėmis vertėmis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kūno masė numarinimo metu ir organų masė,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skrodimo išvados,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsamus visų histopatologinio tyrimo rezultatų aprašymas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sugerties duomenys, jeigu yra,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      statistinis rezultatų apdorojimas, jeigu taikytina.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatų aptarimas.
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Išvados.
                                          
                                       
                                    
                        
                     1 priedėlis
                     APIBRĖŽTYS
                     Androgeniškumas– cheminės medžiagos geba veikti žinduolio organizme kaip natūralus androgeninis hormonas (pvz., testosteronas).
                     Antiandrogeniškumas– cheminės medžiagos geba slopinti natūralaus androgeninio hormono (pvz., testosterono) veikimą žinduolio organizme.
                     Antiestrogeniškumas– cheminės medžiagos geba slopinti natūralaus estrogeninio hormono (pvz., 17-beta-estradiolio) veikimą žinduolio organizme.
                     Antitiroidinis veiklumas– cheminės medžiagos geba slopinti natūralaus skydliaukės hormono (pvz., T3) veikimą žinduolio organizme.
                     Dozuotė– bendroji sąvoka, apimanti dozę, jos davimo dažnumą ir trukmę.
                     Dozė– duodamas bandomosios cheminės medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios cheminės medžiagos mase, per parą tenkančia vienam bandomojo gyvūno kūno masės vienetui (pvz., mg/kg kūno masės per parą), arba pastovia koncentracija pašare.
                     Akivaizdus toksiškumas– bendroji sąvoka, apibūdinanti aiškius toksiškumo požymius, pastebimus davus bandomosios cheminės medžiagos. Šie požymiai turėtų būti pakankami įvertinti pavojų ir turėtų būti tokie, kad padidinus duodamą dozę būtų galima tikėtis sunkaus toksiškumo požymių ir galbūt gyvūnų gaišimo.
                     NNPL– „nepastebimo neigiamo poveikio lygio“ santrumpa. Tai didžiausioji dozė, kurią duodant nepastebima neigiamų rezultatų.
                     Estrogeniškumas– cheminės medžiagos geba veikti žinduolio organizme kaip natūralus estrogeninis hormonas (pvz., 17–beta-estradiolis).
                     Bandomoji cheminė medžiaga– pagal šį bandymo metodą bandoma cheminė medžiaga arba mišinys.
                     Tiroidinis veiklumas– cheminės medžiagos geba veikti žinduolio organizme kaip natūralus skydliaukės hormonas (pvz., T3).
                     Patikimumo patvirtinimas– mokslinis procesas, skirtas apibūdinti bandymo metodo procedūrinius reikalavimus ir apribojimus ir įrodyti bandymo metodo patikimumą bei tinkamumą tam tikram tikslui.
                  
                  
                     2 priedėlis
                     
                        Pasekmės, rekomenduojamos taikyti pagal B.7 metodą nustatant endokrininei sistemai kenksmingas medžiagas
                     
                     
                                 Privalomos pasekmės
                              
                              
                                 Neprivalomos pasekmės
                              
                           
                                 Masė
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Sėklidžių
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Sėklidžių prielipų
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Antinksčių
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Prostatos ir sėklinių pūslelių su koaguliatorių liaukomis
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kiaušidžių
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Gimdos su gimdos kakleliu
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Skydliaukės
                                          
                                       
                           
                                 Histopatologinis tyrimas
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Lytinių liaukų:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Sėklidžių
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Kiaušidžių
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Kitų lytinių organų:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Sėklidžių prielipų
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Prostatos ir sėklinių pūslelių su koaguliatorių liaukomis
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Gimdos su gimdos kakleliu
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Antinksčių
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Skydliaukės
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Makšties
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Makšties tepinėlių
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Patinų pieno liaukų
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Hipofizės
                                          
                                       
                           
                                 Hormonų matavimai
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Cirkuliaciniai T3, T4 lygiai
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Cirkuliaciniai TSH lygiai
                                          
                                       
                           
                  
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691–704.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404–407.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52–85.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524–533.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.
                           
                        B.8.   POŪMIS TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS. 28 DIENŲ TYRIMAS
                  
                  SANTRAUKA
                  Šis atnaujintasis B.8 bandymo metodas parengtas tam, kad būtų galima išsamiai apibūdinti bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą, pasireiškiantį neilgą (28 dienų) laikotarpį duodant kartotinę dozę per kvėpavimo takus, ir gauti duomenų, reikalingų kiekybiniams inhaliacinės rizikos vertinimams. Ne mažiau kaip penkių patinų ir penkių patelių grupės 28 dienų laikotarpiu šešias valandas per parą veikiamos a) bandomąja chemine medžiaga, taikant tris arba daugiau koncentracijos lygių, b) išvalytu oru (neigiama kontrolė) ir (arba) c) nešikliu (nešiklio kontrolė). Paprastai gyvūnai veikiami penkias dienas per savaitę, tačiau galima taikyti ir septynių dienų per savaitę poveikį. Bandymai visada atliekami ir su patinais, ir su patelėmis, tačiau, jeigu žinoma, kad kurios nors lyties gyvūnai yra jautresni tam tikrai bandomajai cheminei medžiagai, patinams ir patelėms gali būti taikomi skirtingi koncentracijos lygiai. Šis metodas tyrimo vadovui suteikia lanksčią galimybę įtraukti pagalbines (grįžtamumo tyrimų) grupes, taikyti bronchoalveolinį plovimą (BAP), atlikti neurologinius tyrimus ir papildomus klinikinius patologinius bei histopatologinius tyrimus, kad būtų galima geriau apibūdinti bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą.
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ 412 (OECD bandymo gairės Nr. 412) (2009). Originalios poūmio toksiškumo įkvėpus bandymo gairės „Test Guideline“ 412 (TG 412) priimtos 1981 m. (1). Šis (B.8) bandymo metodas (lygiavertis atnaujintosioms TG 412) atnaujintas siekiant jį suderinti su mokslo pasiekimais ir patenkinti dabartines ir būsimas reglamentavimo reikmes.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Šis metodas suteikia galimybę apibūdinti neigiamą poveikį, sukeltą 28 dienas kasdien per kvėpavimo takus duodant kartotinę bandomosios cheminės medžiagos dozę. Atlikus 28 dienų poūmio toksiškumo įkvėpus tyrimus gauti duomenys gali būti naudojami kokybiniams rizikos vertinimams [jeigu po to neatliekamas 90 dienų pusiau lėtinio toksiškumo įkvėpus tyrimas (šio priedo B.29 skyrius)]. Šie duomenys taip pat gali suteikti informacijos dėl koncentracijų parinkimo ilgesnio laikotarpio tyrimams, pvz., 90 dienų pusiau lėtinio toksiškumo įkvėpus tyrimui. Šis bandymo metodas nėra specialiai skirtas nanomedžiagų bandymams. Aprašant šį bandymo metodą vartojamos apibrėžtys pateiktos šio skyriaus pabaigoje ir rekomendaciniame dokumente Nr. 39 (2).
                           
                        PIRMINIAI ASPEKTAI
                  
                              3.
                           
                           
                              Siekdama užtikrinti aukštesnę tyrimo kokybę ir kaip galima labiau sumažinti gyvūnų naudojimą, bandymų laboratorija, prieš atlikdama tyrimą, turėtų įvertinti visą turimą informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą. Pasirinkti tinkamas bandymų koncentracijas gali padėti informacija apie bandomosios cheminės medžiagos tapatumą, cheminę struktūrą, fizines ir chemines savybes, taip pat toksiškumo bandymų in vitro arba in vivo rezultatai, numatomas (-i) panaudojimo būdas (-ai) ir galimas poveikis žmogui, turimi (Q)SAR duomenys ir toksikologiniai duomenys apie panašios struktūros chemines medžiagas, taip pat duomenys, gauti atlikus ūmaus toksiškumo įkvėpus bandymus. Jeigu yra tikėtinas arba jeigu atliekant tyrimą pastebimas neurotoksinis poveikis, tyrimo vadovas gali nuspręsti įtraukti atitinkamus vertinimus, pvz., funkcinių stebėjimų rinkinį (FSR) ir judėjimo aktyvumo vertinimą. Nors gali būti labai svarbu užtikrinti tinkamą su konkrečiais tyrimais susijusių dozių davimo laiką, ši papildoma veikla neturėtų trukdyti įgyvendinti pagrindinio tyrimo planą.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Ėsdinančių arba dirginančių bandomųjų cheminių medžiagų tirpalai gali būti bandomi taikant koncentracijas, kurioms esant pasiekiamas reikiamas toksiškumo lygis [žr. RD Nr. 39 (2)]. Tačiau veikiant gyvūnus šiomis medžiagomis taikytinos tikslinės koncentracijos turėtų būti gana mažos, kad nesukeltų ženklaus skausmo ir kančių, bet pakankamos, kad būtų galima pratęsti koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivę iki tokių lygių, kuriems esant būtų pasiektas reglamentavimo arba mokslinis tikslas, kurio siekiama bandymu. Šios koncentracijos turėtų būti parenkamos atsižvelgiant į konkretų atvejį ir, pageidautina, remiantis tinkamai suplanuotu ribų nustatymo tyrimu, suteikiančiu informacijos apie pavojingas pasekmes, dirginimo ribinę vertę ir poveikio pasireiškimo laiką (žr. 11–13 skirsnius). Turėtų būti pateiktas koncentracijos pasirinkimo pagrindimas.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Gaištantys gyvūnai arba skausmą ar sunkias ilgalaikes kančias akivaizdžiai patiriantys gyvūnai turėtų būti humaniškai numarinami. Gaištantys gyvūnai laikomi atliekant bandymą nugaišusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištančius arba sunkiai kenčiančius gyvūnus priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra pateikti OECD rekomendaciniame dokumente dėl pasekmių žmonėms (3).
                           
                        METODO APRAŠYMAS
                  
                     Gyvūnų rūšies parinkimas
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių padermių graužikai. Tinkamiausia rūšis yra žiurkės. Jeigu naudojama kita rūšis, turėtų būti pateiktas jos naudojimo pagrindimas.
                           
                        
                     Gyvūnų paruošimas
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Patelės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos. Atsitiktinės atrankos dieną gyvūnai turėtų būti jauni, bet suaugę, 7–9 savaičių amžiaus. Kūno masė pagal kiekvieną lytį turėtų ± 20 % tikslumu atitikti vidutinę tos lyties gyvūnų masę. Gyvūnai atrenkami atsitiktine tvarka, paženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir ne mažiau kaip penkias paras iki bandymo pradžios laikomi savo narveliuose, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų.
                           
                        
                     Gyvūnų laikymas
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Kad būtų patogiau stebėti ir kad būtų išvengta painiavos, kiekvienas gyvūnas turėtų būti išskirtinai paženklintas, jeigu įmanoma, naudojant poodinius atsakiklius. Bandomųjų gyvūnų laikymo patalpos temperatūra turėtų būti 22 ± 3 °C. Tinkamiausias santykinis drėgnis – 30–70 %, bet jis gali būti nepasiekiamas, jeigu naudojamas nešiklis nėra vanduo. Prieš dozės davimą ir davus dozę gyvūnai turėtų būti laikomi narveliuose suskirstyti grupėmis pagal lytį ir koncentraciją; narvelyje laikomų gyvūnų skaičius turėtų būti toks, kad būtų galima aiškiai stebėti kiekvieną gyvūną ir kad būtų patiriama kuo mažiau žalos dėl kanibalizmo ir grumtynių. Jeigu dozė gyvūnams duodama tik per nosį, gali reikėti juos pripratinti prie uždaromųjų vamzdelių. Uždaromieji vamzdeliai gyvūnams neturėtų kelti didelės fizinės, terminės arba suvaržymo įtampos. Varžymas gali turėti fiziologinių pasekmių, pvz., turėti poveikio kūno temperatūrai (hipertermija) ir (arba) per minutę įkvepiamam tūriui. Jeigu yra bendrųjų duomenų, rodančių, kad tokių pastebimų pokyčių neįvyksta, pripratinimas prie uždaromųjų vamzdelių nebūtinas. Gyvūnai, kurių visas kūnas veikiamas aerozoliu, poveikio laikotarpiu turėtų būti laikomi atskirai, kad bandomasis aerozolis nebūtų filtruojamas per kitų narvelyje esančių gyvūnų kailį. Išskyrus poveikio laikotarpį, gyvūnams šerti tinka įprastas ir sertifikuotas laboratorijose naudojamas pašaras, duodant neribotą geriamo vandens kiekį. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką.
                           
                        
                     Inhaliacinės kameros
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Parenkant inhaliacinę kamerą, turėtų būti atsižvelgiama į bandomosios cheminės medžiagos pobūdį ir bandymo tikslą. Pirmenybė teikiama dozės davimui tik per nosį (ši sąvoka apima sąvokas „tik per galvą“, „tik per nosį“ ir „tik per šnipą“). Pirmenybė dozės davimui tik per nosį paprastai teikiama tiriant skystųjų arba kietųjų dalelių aerozolius ir garus, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Specialieji tyrimo tikslai gali būti sėkmingiau pasiekti taikant poveikio per visą kūną metodą, tačiau tai turi būti pagrįsta tyrimo ataskaitoje. Siekiant užtikrinti atmosferos pastovumą naudojant poveikio per visą kūną kamerą, visa bandomųjų gyvūnų užimama erdvė turėtų neviršyti 5 % kameros tūrio. Poveikio tik per nosį ir poveikio per visą kūną metodų principai ir konkretūs šių metodų privalumai bei trūkumai aprašyti RD Nr. 39 (2).
                           
                        TOKSIŠKUMO TYRIMAI
                  
                     Ribinės koncentracijos
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Kitaip nei ūmaus poveikio tyrimams, 28 dienų poūmio toksiškumo įkvėpus tyrimams ribinių koncentracijų nenustatyta. Didžiausioji bandytina koncentracija turėtų būti nustatoma atsižvelgiant į šiuos dalykus: 1) didžiausiąją pasiekiamą koncentraciją, 2) „blogiausiu atveju“ taikytiną poveikio žmonėms lygį, 3) poreikį užtikrinti tinkamą deguonies tiekimą ir (arba) 4) gyvūnų gerovės aspektus. Jeigu nėra duomenimis pagrįstų ribų, gali būti taikomos Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 (13) nustatytos ūmaus poveikio ribos (t. y. neviršijant 5 mg/l koncentracijos, jeigu tai aerozoliai, 20 mg/l, jeigu tai garai, ir 20 000 ppm, jeigu tai dujos); žr. RD Nr. 39 (2). Jeigu atliekant dujų arba labai lakių bandomųjų cheminių medžiagų (pvz., šaldymo medžiagų) bandymus būtina viršyti šias ribas, turi būti pateiktas pagrindimas. Ribinė koncentracija turėtų sukelti akivaizdų toksiškumą nesukeldama pernelyg didelio streso gyvūnams ir netrumpindama jų gyvenimo trukmės (3).
                           
                        
                     Ribų nustatymo tyrimas
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Prieš pradedant pagrindinį tyrimą, gali reikėti atlikti ribų nustatymo tyrimą. Ribų nustatymo tyrimas yra išsamesnis už orientacinį tyrimą, nes jis susijęs ne tik su koncentracijų parinkimu. Per ribų nustatymo tyrimą gautos žinios gali padėti sėkmingai atlikti pagrindinį tyrimą. Pvz., ribų nustatymo tyrimas gali suteikti techninės informacijos apie analizės metodus, dalelių dydžius, toksinio poveikio mechanizmų nustatymą, klinikinės patologijos ir histopatologinių tyrimų duomenis ir apytikrius vertinimus, koks NNPL ir kokia didžiausioji leidžiama koncentracija (DLK) galėtų būti taikomi atliekant pagrindinį tyrimą. Tyrimo vadovas gali nuspręsti atlikti ribų nustatymo tyrimą, kad nustatytų kvėpavimo takų dirginimo ribinę vertę (pvz., atliekant histopatologinį kvėpavimo takų tyrimą, plaučių funkcijos tyrimus arba bronchoalveolinį plovimą), didžiausiąją koncentraciją, kuri būtų leidžiama kaip nesukelianti pernelyg didelio streso gyvūnams, ir parametrus, kuriais būtų geriausiai apibūdinamas bandomosios cheminės medžiagos toksiškumas.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Ribų nustatymo tyrimas gali būti atliekamas taikant vieną arba daugiau koncentracijos lygių. Kiekvienas koncentracijos lygis turėtų būti bandomas naudojant ne daugiau kaip tris patinus ir tris pateles. Ribų nustatymo tyrimas turėtų trukti ne mažiau kaip penkias dienas, bet paprastai – ne ilgiau kaip 14 dienų. Tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateiktas per pagrindinį tyrimą taikytinų koncentracijų parinkimo pagrindimas. Pagrindinio tyrimo tikslas – įrodyti koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybę remiantis numanoma sunkiausia pasekme. Tinkamiausia mažiausioji koncentracija – nepastebimo neigiamo poveikio lygio koncentracija, didžiausioji – akivaizdų toksiškumą sukelianti koncentracija, nesukelianti pernelyg didelio streso gyvūnams ir netrumpinanti jų gyvenimo trukmės (3).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Parenkant per ribų nustatymo tyrimą taikytinus koncentracijos lygius, turėtų būti atsižvelgiama į visą turimą informaciją, įskaitant struktūros ir savybių ryšius ir duomenis apie panašias chemines medžiagas (žr. 3 skirsnį). Ribų nustatymo tyrimu gali būti patikrintos ir (arba) atmestos pasekmės, kurios laikomos sunkiausiomis mechaniniu požiūriu vertinamomis pasekmėmis, pvz., cholinesterazės inhibavimas organiniais fosforo junginiais, methemoglobino susidarymas veikiant eritrocitotoksinėms medžiagoms, skydliaukės hormonų (T3, T4) reakcija į tirotoksines medžiagas, poveikis baltymams, laktatdehidrogenazei arba neutrofilams atliekant bronchoalveolinį plovimą, siekiant pašalinti nekenksmingas prastai tirpstančias daleles arba plaučius dirginančius aerozolius.
                           
                        
                     Pagrindinis tyrimas
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Pagrindinis poūmio toksiškumo tyrimas paprastai atliekamas taikant tris koncentracijos lygius ir prireikus taikant vienalaikę neigiamą kontrolę (naudojant orą) ir (arba) nešiklio kontrolę (žr. 17 skirsnį). Parenkant poveikio lygius turėtų būti pasitelkiami visi turimi duomenys, įskaitant sisteminio toksiškumo tyrimų rezultatus, metabolizmo ir kinetinių savybių duomenis (labai svarbu užtikrinti, kad nebūtų taikomos tokios didžiausiosios koncentracijos, kuriomis būtų įsotinti kinetiniai procesai). Kiekviena bandomoji grupė sudaroma iš ne mažiau kaip dešimties graužikų (penkių patinų ir penkių patelių), kurie keturių savaičių laikotarpiu (bendra tyrimo trukmė – 28 dienos) penkias dienas per savaitę šešias valandas per parą veikiami bandomąja chemine medžiaga. Gyvūnai gali būti veikiami ir septynias dienas per savaitę (pvz., tiriant įkvepiamus vaistus). Jeigu žinoma, kad kurios nors lyties gyvūnai yra jautresni konkrečiai bandomajai cheminei medžiagai, siekiant nustatyti kuo tikslesnę koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybę, kaip aprašyta 15 skirsnyje, skirtingų lyčių gyvūnams gali būti taikomi skirtingi koncentracijos lygiai. Jeigu naudojant kitos rūšies graužikus nei žiurkės dozė duodama tik per nosį, ilgiausia poveikio trukmė gali būti pakoreguojama siekiant sumažinti tos rūšies gyvūnų patiriamą kančią. Jeigu taikomas trumpesnis nei šešių valandų per parą poveikis arba jeigu būtina atlikti ilgalaikio (pvz., 22 valandų per parą) poveikio per visą kūną tyrimą, turėtų būti pateiktas atitinkamas pagrindimas [žr. RD Nr. 39 (2)]. Poveikio metu gyvūnas neturėtų būti šeriamas, išskyrus atvejus, kai poveikio trukmė ilgesnė kaip šešios valandos. Vandens gali būti duodama per visą poveikio per visą kūną laikotarpį.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Turėtų būti nurodyta, kokiam organui (-ams) skirtos pasirinktos tikslinės koncentracijos, ir taikant šias koncentracijas turėtų būti užtikrinta aiški koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybė:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          taikant didžiausiąją koncentraciją turėtų būti padarytas toksinis poveikis, tačiau neturėtų pasireikšti ilgalaikių požymių arba gyvūnai neturėtų nugaišti, nes tokiu atveju nebūtų galima atlikti prasmingo vertinimo,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          tarpinis (-iai) koncentracijos lygis (-iai) turėtų skirtis tiek, kad būtų galima nustatyti toksinio poveikio lygius tarp mažiausiosios ir didžiausiosios koncentracijos,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          taikant mažiausiąją koncentraciją neturėtų būti daroma toksinio poveikio ir neturėtų būti pastebima jo požymių.
                                       
                                    
                        
                     Pagalbinis (grįžtamumo) tyrimas
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Siekiant nustatyti toksinio poveikio grįžtamumą, tvarumą arba delsą, reikiamos trukmės, bet ne ilgesniu kaip 14 dienų laikotarpiu po dozės davimo gali būti atliekamas pagalbinis (grįžtamumo) tyrimas. Pagalbinės (grįžtamumo tyrimų) grupės sudaromos iš penkių patinų ir penkių patelių, kurie per pagrindinį tyrimą veikiami kartu su bandomaisiais gyvūnais. Pagalbinės (grįžtamumo) grupės turėtų būti veikiamos didžiausiąja bandomosios cheminės medžiagos koncentracija; prireikus turėtų būti taikoma vienalaikė kontrolė naudojant orą ir (arba) nešiklį (žr. 17 skirsnį).
                           
                        
                     Kontroliniai gyvūnai
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Su vienalaikės neigiamos kontrolės (naudojant orą) gyvūnais turėtų būti elgiamasi taip pat, kaip su bandomosios grupės gyvūnais, išskyrus tai, kad jie veikiami išvalytu oru, o ne bandomąja chemine medžiaga. Jeigu siekiant palengvinti bandymo atmosferos sukūrimą naudojamas vanduo arba kita cheminė medžiaga, atliekant tyrimą naudojama nešiklio kontrolės grupė, o ne neigiamos kontrolės (naudojant orą) grupė. Jeigu įmanoma, kaip nešiklis turėtų būti naudojamas vanduo. Jeigu kaip nešiklis naudojamas vanduo, kontroliniai gyvūnai turėtų būti veikiami oru, kurio drėgnis turėtų būti toks pat, koks taikomas grupėms, kurioms duodama dozė. Tinkamas nešiklis turėtų būti parenkamas remiantis tinkamai atliktu išankstiniu tyrimu arba istoriniais duomenimis. Jeigu nešiklio toksiškumas nėra gerai žinomas, tyrimo vadovas gali nuspręsti taikyti ir neigiamą kontrolę (naudojant orą), ir nešiklio kontrolę, tačiau primygtinai rekomenduojama to nedaryti. Jeigu istoriniai duomenys rodo, kad nešiklis netoksiškas, neigiamos kontrolės (naudojant orą) grupės naudoti nebūtina, turėtų būti taikoma tik nešiklio kontrolė. Jeigu atlikus nešiklyje paruoštos bandomosios cheminės medžiagos išankstinį tyrimą nustatoma, kad medžiaga nėra toksiška, vadinasi, ir nešiklis, esant ištirtai koncentracijai, nėra toksiškas, todėl turėtų būti taikoma kontrolė naudojant šį nešiklį.
                           
                        POVEIKIO SĄLYGOS
                  
                     Koncentracijų taikymas
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga dujų, garų, aerozolių arba jų mišinių pavidalu. Per tyrimą naudotina fizinė būsena priklauso nuo fizinių ir cheminių bandomosios cheminės medžiagos savybių, pasirinktos koncentracijos ir (arba) fizinio pavidalo, kuris veikiausiai bus tvarkant ir naudojant bandomąją cheminę medžiagą. Higroskopinės ir chemiškai reaguojančios bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti bandomos sauso oro sąlygomis. Turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad būtų išvengta sprogių koncentracijų susidarymo. Iš dalelių sudaryta medžiaga gali būti apdorojama mechaniškai, siekiant sumažinti dalelių dydį. Daugiau patarimų pateikta RD Nr. 39 (2).
                           
                        
                     Dalelių dydžio pasiskirstymas
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Dalelių rūšiavimas pagal dydį turėtų būti taikomas visiems aerozoliams ir garams, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Kad poveikis būtų padarytas visoms svarbioms kvėpavimo takų sritims, rekomenduojama naudoti aerozolius, kurių masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) yra 1–3 μm, o geometrinis standartinis nuokrypis (σg) – 1,5–3,0 (4). Nors turėtų būti imamasi pagrįstų priemonių, kad šio standarto būtų laikomasi, jeigu jo įgyvendinti neįmanoma, turėtų būti pateikta ekspertų nuomonė. Pvz., metalų garų dalelės gali būti mažesnės už šį standartą, o įelektrintų dalelių ir pluoštų – didesnės.
                           
                        
                     Bandomosios cheminės medžiagos paruošimas nešiklyje
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Geriausia, kad bandomoji cheminė medžiaga būtų bandoma nenaudojant nešiklio. Jeigu būtina naudoti nešiklį norint pasiekti reikiamą bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją ir užtikrinti reikiamą dalelių dydį, pirmenybė turėtų būti teikiama vandeniui. Visuomet, kai bandomoji cheminė medžiaga ištirpinama nešiklyje, turėtų būti įrodytas jos stabilumas.
                           
                        POVEIKIO SĄLYGŲ STEBĖJIMAS
                  
                     Oro srautas kameroje
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Kiekvieno poveikio metu turėtų būti atidžiai reguliuojamas, nuolat stebimas ir ne rečiau kaip kartą per valandą registruojamas per poveikio kamerą tekantis oro srautas. Bandymo atmosferoje susidariusios koncentracijos (arba jos pastovumo laiko atžvilgiu) stebėjimas realiuoju laiku yra vienas iš visų dinaminių parametrų matavimų, suteikiantis galimybę netiesiogiai kontroliuoti visus svarbius dinaminius inhaliacinius parametrus. Jeigu koncentracija stebima tiesiogiai, oro srautų matavimo dažnumas gali būti sumažintas iki vieno matavimo kiekvieną dieną per kiekvieną poveikio seansą. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tam, kad būtų išvengta pakartotinio įkvėpimo dozės davimo tik per nosį kamerose. Deguonies koncentracija turėtų būti ne mažesnė kaip 19 %, anglies dioksido – ne didesnė kaip 1 %. Jeigu yra pagrindo manyti, kad šio standarto įgyvendinti neįmanoma, turėtų būti matuojamos deguonies ir anglies dioksido koncentracijos. Jeigu pirmąją poveikio dieną atlikti matavimai rodo, kad šių dujų lygiai yra tinkami, daugiau matavimų atlikti nebūtina.
                           
                        
                     Kameros temperatūra ir santykinis drėgnis
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Kameroje turėtų būti palaikoma 22 ± 3 °C temperatūra. Ir dozę duodant tik per nosį, ir per visą kūną, jeigu įmanoma, per kiekvieną poveikio seansą turėtų būti nuolat stebimas ir kas valandą registruojamas santykinis drėgnis gyvūnų kvėpavimo zonoje. Tinkamiausias santykinis drėgnis – 30–70 %, tačiau jis gali būti nepasiekiamas (pvz., bandant vandens pagrindo mišinius) arba neišmatuojamas dėl trukdžių, atsirandančių bandomajai cheminei medžiagai taikant bandymo metodą.
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga. Vardinė koncentracija
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Jeigu įmanoma, turėtų būti apskaičiuota ir užregistruota vardinė koncentracija poveikio kameroje. Vardinė koncentracija yra sukurtos bandomosios cheminės medžiagos masės ir viso oro srauto, perleisto per inhaliacinių kamerų sistemą, tūrio santykis. Vardinė koncentracija nėra naudojama apibūdinti poveikį gyvūnui, tačiau, vardinę koncentraciją palyginus su faktine, nustatomas generavimo, kurį užtikrina bandymų sistema, efektyvumas, kuriuo remiantis galima nustatyti generavimo problemas.
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga. Faktinė koncentracija
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Faktinė koncentracija yra bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, nustatyta paėmus ėminį iš inhaliacinėje kameroje esančios gyvūno kvėpavimo zonos. Faktines koncentracijas galima nustatyti specialiaisiais metodais (pvz., taikant tiesioginio ėminių ėmimo, adsorbcijos arba cheminių reakcijų metodus ir tada atliekant analizinį apibūdinimą) arba nespecialiaisiais metodais, pvz., atliekant gravimetrinę analizę naudojant filtrus. Gravimetrinė analizė gali būti taikoma tik vienos sudedamosios dalies miltelių aerozoliams arba mažo lakumo skystųjų dalelių aerozoliams ir turėtų būti grindžiama tinkamais prieš tyrimą atliktais bandomosios cheminės medžiagos savybių apibūdinimais. Iš daugiau kaip vienos sudedamosios dalies sudarytų miltelių aerozolių koncentracijos taip pat gali būti nustatomos atliekant gravimetrinę analizę. Tačiau tam reikalingi analitiniai duomenys, įrodantys, kad ore esančios medžiagos sudėtis panaši į pirminės medžiagos sudėtį. Jeigu tokios informacijos nėra, tyrimo metu gali reikėti vienodais intervalais atlikti pakartotinę bandomosios cheminės medžiagos (geriausia, kad ji būtų ore) analizę. Jeigu aerozolinės medžiagos gali garuoti arba sublimuoti, turėtų būti įrodyta, kad pasirinktu metodu surinktos visos fazės.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Jeigu įmanoma, per visą tyrimą turėtų būti naudojama viena bandomosios cheminės medžiagos partija, o bandomasis ėminys turėtų būti laikomas tokiomis sąlygomis, kad būtų išsaugotas jo grynumas, homogeniškumas ir stabilumas. Prieš pradedant tyrimą reikėtų apibūdinti bandomosios cheminės medžiagos savybes, įskaitant jos grynumą ir, jeigu tai techniškai įmanoma, tapatumą, taip pat nustatytų teršalų ir priemaišų kiekius. Be kitų duomenų, tai galima pagrįsti šiais duomenimis: sulaikymo trukme ir susijusia didžiausios koncentracijos sritimi, molekuline mase, nustatyta atlikus spektroskopinę arba dujų chromatografijos analizę, arba kitais įverčiais. Nors bandomojo ėminio tapatumo nustatymas nėra bandymų laboratorijos pareiga, bandymų laboratorijai gali būti naudinga patvirtinti bent kai kurias pateikėjo nurodytas savybes (pvz., spalvą, fizinę būseną ir t. t.).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Jeigu įmanoma, turėtų būti palaikoma pastovi poveikio atmosfera. Poveikio sąlygų pastovumui įrodyti gali būti naudojamas stebėjimo realiuoju laiku prietaisas, pvz., aerozoliams gali būti naudojamas aerozolių fotometras, garams – bendro angliavandenilių kiekio analizatorius. Faktinė kameroje susidariusi koncentracija turėtų būti matuojama kiekvieną poveikio dieną, ne mažiau kaip tris kartus pagal kiekvieną poveikio lygį. Jeigu tai neįmanoma dėl nedidelių oro srauto greičių arba mažų koncentracijų, gali būti imamas vienas ėminys per vieną poveikio laikotarpį. Būtų geriausia, kad tokiu atveju šis ėminys būtų imamas per visą poveikio laikotarpį. Atskiri kameroje susidariusios koncentracijos ėminiai neturėtų nukrypti nuo vidutinės kameroje susidariusios koncentracijos daugiau kaip ± 10 %, kai tiriamos dujos ir garai, arba daugiau kaip ± 20 %, kai tiriami skystųjų arba kietųjų dalelių aerozoliai. Turėtų būti apskaičiuotas ir ataskaitoje nurodytas pusiausvyros nusistovėjimo kameroje laikotarpis (t95). Poveikio laikotarpis apima bandomosios cheminės medžiagos sukūrimo trukmę. Į šį laikotarpį įtraukiamas pusiausvyros nusistovėjimo kameroje laikotarpis (t95) ir irimo laikas. t95 apskaičiavimo gairės pateiktos RD Nr. 39 (2).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Jeigu tiriami labai sudėtingi mišiniai, sudaryti iš dujų ir (arba) garų, ir aerozoliai (pvz., deginimo atmosferos ir bandomosios cheminės medžiagos, pučiamos iš specialiai varomų galutinio naudojimo produktų arba prietaisų), kiekvienos fazės veikimas inhaliacinėje kameroje gali būti skirtingas. Todėl iš kiekvienos fazės (dujų ir (arba) garų ir aerozolio) turėtų būti parinkta bent viena indikacinė cheminė medžiaga (analitė); paprastai šiuo tikslu pasirenkama pagrindinė veiklioji mišinio cheminė medžiaga. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga yra mišinys, turėtų būti nurodyta viso mišinio, o ne tik veikliosios sudedamosios dalies arba indikacinės cheminės medžiagos (analitės) analizinė koncentracija. Daugiau informacijos apie faktines koncentracijas pateikta RD Nr. 39 (2).
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga. Dalelių dydžio pasiskirstymas
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Aerozolių dalelių dydžio pasiskirstymas turėtų būti nustatomas bent kartą per savaitę pagal kiekvieną koncentracijos lygį, naudojant pakopinį ėmiklį arba alternatyvų prietaisą, pvz., aerodinaminį dalelių rūšiuotuvą (ADR). Jeigu galima įrodyti, kad pakopiniu ėmikliu ir alternatyviu prietaisu gaunami lygiaverčiai rezultatai, atliekant tyrimą gali būti naudojamas alternatyvus prietaisas.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Siekiant įsitikinti pagrindinio prietaiso surenkamuoju veiksmingumu, kartu su pagrindiniu prietaisu turėtų būti naudojamas antrasis prietaisas, pvz., gravimetrinis filtras, gaudyklė arba barboteris. Atlikus dalelių dydžio analizę nustatyta masės koncentracija turėtų neviršyti priimtinų filtruojamosios analizės būdu nustatytos masės koncentracijos ribų [žr. RD Nr. 39 (2)]. Jeigu, taikant visas bandomas koncentracijas, lygiavertiškumą galima įrodyti pradiniame tyrimo etape, tolesnius patvirtinamuosius matavimus galima praleisti. Gyvūnų gerovės sumetimais turėtų būti imamasi priemonių, kad būtų kuo mažiau negalutinių duomenų, dėl kurių galėtų reikėti pakartoti tyrimą.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Garuose esančios dalelės turėtų būti rūšiuojamos tuo atveju, jeigu bent kiek tikėtina, kad susidarant aerozoliui gali kondensuotis garai, arba jeigu garų atmosferoje aptinkama dalelių, dėl kurių gali susidaryti mišrių fazių.
                           
                        STEBĖJIMAI
                  
                              31.
                           
                           
                              Prieš poveikio laikotarpį, poveikio laikotarpiu ir pasibaigus poveikio laikotarpiui, turėtų būti atliekami klinikiniai gyvūnų stebėjimai. Atsižvelgiant į gyvūnų reakciją poveikio laikotarpiu, stebėjimus gali reikėti atlikti dažniau. Jeigu gyvūnų stebėjimą apsunkina gyvūnų uždaromųjų vamzdelių naudojimas, prastas poveikio per visą kūną kamerų apšvietimas arba neskaidrios atmosferos, gyvūnai turėtų būti atidžiai apžiūrimi po dozės davimo. Stebėjimais prieš kitos dienos poveikį galima įvertinti toksinio poveikio grįžtamumą arba pasunkėjimą.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Visi stebėjimai registruojami, išsaugant atskirus įrašus apie kiekvieną gyvūną. Kai gyvūnai numarinami dėl humaniškų priežasčių arba randami nugaišę, kiek įmanoma tiksliau užregistruojamas žūties laikas.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Narveliuose turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir gleivinės, kvėpavimo ir kraujotakos sistemų, centrinės nervų sistemos, somatomotorinės veiklos ir elgsenos pakitimai. Ypač reikėtų stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Matuojant temperatūrą tiesiojoje žarnoje, galima gauti patvirtinamųjų sulėtėjusio kvėpavimo arba nukritusios ar pakilusios temperatūros įrodymų, susijusių su dozės davimu arba izoliavimu. Į tyrimo protokolą gali būti įtraukti papildomi vertinimai, pvz., kinetikos, biomonitoringo, plaučių funkcijos, plaučių audinyje besikaupiančių mažo tirpumo medžiagų užsilaikymo ir elgsenos pokyčių.
                           
                        KŪNO MASĖ
                  
                              34.
                           
                           
                              Kiekvieno gyvūno masė turėtų būti registruojama prieš pat pirmąjį poveikį (nulinę dieną), o vėliau – dukart per savaitę (pvz., pirmadieniais ir penktadieniais, siekiant įrodyti gyvūnų atsigavimą per savaitgalį, kai nedaroma poveikio, arba tokiais laiko intervalais, kad būtų galima įvertinti sisteminį toksiškumą) ir kai gyvūnas nugaišta arba yra numarinamas. Jeigu per pirmąsias dvi savaites nepasireiškia jokio poveikio, likusiu tyrimo laikotarpiu kūno masė gali būti matuojama kas savaitę. Pagalbiniai (grįžtamumo tyrimų) gyvūnai (jeigu naudojami) atsigavimo laikotarpiu turėtų būti ir toliau sveriami kas savaitę. Baigus tyrimą, visi gyvūnai turėtų būti pasverti netrukus po numarinimo, kad būtų galima tiksliai apskaičiuoti organų ir kūno masių santykius.
                           
                        PAŠARŲ IR VANDENS SUVARTOJIMAS
                  
                              35.
                           
                           
                              Pašarų suvartojimas turėtų būti matuojamas kas savaitę. Gali būti matuojamas ir vandens suvartojimas.
                           
                        KLINIKINĖ PATOLOGIJA
                  
                              36.
                           
                           
                              Klinikinės patologijos vertinimai turėtų būti taikomi visiems gyvūnams, įskaitant kontrolinius ir pagalbinius (grįžtamumo tyrimų) gyvūnus, kai jie numarinami. Turėtų būti užregistruotas laikotarpis nuo poveikio pabaigos iki kraujo paėmimo, ypač jeigu tiriama pasekmė sparčiai nyksta. Ėminių ėmimas baigus duoti dozę būtinas pagal tuos parametrus, kuriems būdingas trumpas plazmos pusinės eliminacijos laikas (pvz., COHb, CHE ir MetHb).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              1 lentelėje nurodyti klinikinės patologijos parametrai, kurie paprastai privalomi atliekant visus toksikologinius tyrimus. Nereikalaujama visada atlikti šlapimo analizę, tačiau ji gali būti atliekama, jeigu manoma, kad tai būtų naudinga atsižvelgiant į numatomą arba nustatytą toksiškumą. Kad būtų geriau apibūdintas bandomosios cheminės medžiagos toksiškumas, tyrimo vadovas gali nuspręsti įvertinti papildomus parametrus (pvz., cholinesterazė, lipidai, hormonai, rūgščių ir bazių balansas, methemoglobinas arba Heinco kūneliai, kreatino kinazė, mieloidų ir eritroidų santykis, troponinai, arterinio kraujo dujos, laktato dehidrogenazė, sorbitolio dehidrogenazė, glutamato dehidrogenazė ir gamaglutamiltranspeptidazė.
                              
                                 1   lentelė
                              
                              
                                 Įprastiniai klinikinės patologijos parametrai
                              
                              
                                          Hematologiniai tyrimai
                                       
                                    
                                          Eritrocitų kiekis
                                          Hematokritas
                                          Hemoglobino koncentracija
                                          Vidutinis hemoglobino kiekis eritrocituose
                                          Vidutinis eritrocito tūris
                                          Vidutinė eritrocitų hemoglobino koncentracija
                                          Retikulocitai
                                       
                                       
                                          Bendras leukocitų kiekis
                                          Įvairių leukocitų kiekiai
                                          Trombocitų kiekis
                                          Krešėjimo aktyvumas (pasirinkti vieną rodiklį):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Protrombino laikas
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Krešėjimo laikas
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Dalinis tromboplastino laikas
                                                   
                                                
                                    
                                          Klinikinės chemijos tyrimai
                                       
                                    
                                          Gliukozė (8)
                                          
                                          Bendras cholesterolio kiekis
                                          Trigliceridai
                                          Kraujo šlapalo azoto kiekis
                                          Bendras bilirubino kiekis
                                          Kreatininas
                                          Bendras baltymų kiekis
                                          Albuminas
                                          Globulinas
                                       
                                       
                                          Alanino aminotransferazė
                                          Aspartato aminotransferazė
                                          Šarminė fosfatazė
                                          Kalis
                                          Natris
                                          Kalcis
                                          Fosforas
                                          Chloridas
                                       
                                    
                                          Šlapimo analizė (neprivaloma)
                                       
                                    
                                          Išvaizda (spalva ir drumstumas)
                                          Tūris
                                          Savitasis svoris arba osmosinis slėgis
                                          pH
                                       
                                       
                                          Bendras baltymų kiekis
                                          Gliukozė
                                          Kraujas ir (arba) kraujo kūneliai
                                       
                                    
                        
                              38.
                           
                           
                              Jeigu yra įrodymų, kad pagrindinė kaupimosi ir užsilaikymo vieta yra apatiniai kvėpavimo takai (t. y. alveolės), tada, norint kiekybiškai išanalizuoti prielaidomis pagrįsto dozės poveikio parametrus, daugiausia dėmesio skiriant alveolitui, plaučių uždegimui ir fosfolipidozei, būtų galima rinktis bronchoalveolinio plovimo (BAP) metodą. Šis metodas suteikia galimybę tinkamai ištirti dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybę ir per tam tikrą laiką įvykusius alveolių pažeidimų pokyčius. BAP skystis gali būti analizuojamas siekiant nustatyti įvairių leukocitų kiekius, bendrą baltymų kiekį ir laktato dehidrogenazę. Kiti parametrai, į kuriuos būtų galima atsižvelgti, yra parametrai, rodantys lizosomų pažeidimus, fosfolipidozę, fibrozę ir dirginamąjį arba alerginį uždegimą, galbūt įtraukiant uždegimą sukeliančių citokinų ir (arba) chemokinų tyrimą. BAP matavimais paprastai papildomi histopatologinių tyrimų rezultatai, tačiau BAP matavimai negali atstoti šių tyrimų rezultatų. Plaučių plovimo gairės pateiktos RD Nr. 39 (2).
                           
                        BENDROJI PATOLOGIJA IR ORGANŲ MASĖ
                  
                              39.
                           
                           
                              Turėtų būti visiškai nuleidžiamas visų bandomųjų gyvūnų, įskaitant nugaišusius atliekant bandymą arba numarintus ir pašalintus iš tyrimo gyvūnų gerovės sumetimais, kraujas (jeigu įmanoma) ir atliekamas šių gyvūnų bendrasis skrodimas. Turėtų būti užregistruotas laikas nuo kiekvieno paskutinio dozės davimo kiekvienam gyvūnui iki to gyvūno numarinimo. Jeigu skrodimo negalima atlikti iš karto po to, kai aptinkamas nugaišęs gyvūnas, gyvūnas turėtų būti laikomas pakankamai šaltoje vietoje (bet neužšaldomas), siekiant kuo labiau pristabdyti autolizę. Skrodimai turėtų būti atliekamai kaip galima anksčiau, paprastai – per dieną arba dvi. Visi dideli patologiniai pakitimai turėtų būti užregistruojami pagal kiekvieną gyvūną, ypatingą dėmesį skiriant kvėpavimo takų pakitimams.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              2 lentelėje nurodyti organai ir audiniai, kurie turėtų būti užkonservuojami atliekant bendrąjį skrodimą, naudojant histopatologiniam tyrimui tinkamą fiksavimo terpę. Skliausteliuose ([…]) nurodyti organai ir audiniai, taip pat kai kurie kiti organai ir audiniai, dėl kurių konservavimo sprendžia tyrimo vadovas. Paryškintuoju šriftu nurodytieji organai turėtų būti nuvalyti ir pasverti kaip galima greičiau po atskyrimo, kol neišdžiuvo. Skydliaukė ir sėklidžių prielipai turėtų būti sveriami tik esant reikalui, nes valymo įrankiai gali pakenkti histopatologiniam tyrimui. Audiniai ir organai turėtų būti fiksuojami 10 % buferiniame formaline arba kitokiame tinkamame fiksatyve kaip galima greičiau po skrodimo, ne mažiau kaip 24–48 valandos iki valymo, atsižvelgiant į ketinamą naudoti fiksatyvą.
                              
                                 2   lentelė
                              
                              
                                 Atliekant bendrąjį skrodimą konservuojami organai ir audiniai
                              
                              
                                 Antinksčiai
                              
                              Kaulų čiulpai (ir (arba) šviežiai paruošta punkcija)
                              
                                 Smegenys (įskaitant didžiųjų smegenų, smegenėlių ir pailgųjų smegenų (smegenų tilto) išpjovas)
                              [Akys (tinklainė, regos nervas) ir akių vokai]
                              
                                 Širdis
                              
                              
                                 Inkstai
                              
                              Gerklos (trys lygiai, į vieną lygį įtraukiant antgerklio pagrindą)
                              
                                 Kepenys
                              
                              
                                 Plaučiai (visos vieno lygmens skiltys, įskaitant pagrindinius bronchus)
                              Limfmazgiai, imami iš plaučių vartų srities, ypač jeigu tiriamos mažo tirpumo kietųjų dalelių bandomosios cheminės medžiagos. Atliekant nuodugnesnius tyrimus, per kuriuos nagrinėjami imuniniai aspektai, gali būti imama daugiau mazgų, pvz., iš tarpuplaučio, kaklo, pažandžių ir (arba) ausų sričių.
                              Nosiaryklės audiniai (ne mažiau keturių lygių; į vieną lygį įtraukiant nosiaryklės latakus ir nosies limfinius audinius (NLA))
                              Stemplė
                              [Uoslės receptoriai]
                              Kiaušidės
                              Sėklinės pūslelės
                              Stuburo smegenys (sprando, krūtinės ląstos ir juosmens)
                              
                                 Blužnis
                              
                              Skrandis
                              
                                 Sėklidės
                              
                              
                                 Užkrūčio liauka
                              
                              Skydliaukė
                              Trachėja (ne mažiau kaip du lygiai, iš kurių vienas – išilginis keteros pjūvis ir vienas – skersinis pjūvis
                              [Šlapimo pūslė]
                              Gimda
                              Visi labai pakitę audiniai
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Plaučiai turėtų būti išimami sveiki, pasveriami ir apdorojami tinkamu fiksatyvu užtikrinant 20–30 cm vandens sluoksnio slėgį, kad būtų išsaugota plaučių struktūra (5). Išpjovos turėtų būti imamos iš visų vieno lygmens skilčių, įskaitant pagrindinius bronchus, bet, jeigu atliekamas plaučių plovimas, neišplautos skiltys turėtų būti išpjaunamos trimis lygmenimis (ne iš eilės).
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Tiriami ne mažiau kaip keturi nosiaryklės audinių lygiai; vienas iš jų turėtų apimti nosinę ryklės angą (5, 6, 7, 8, 9), kad būtų galima tinkamai ištirti ragėjantįjį, pereinamąjį (be blakstienėlių, kvėpuojamąjį), kvėpuojamąjį (su blakstienėlėmis, kvėpuojamąjį) ir uodžiamąjį epitelius bei limfodrenažinį audinį (NALT; 10, 11). Turėtų būti ištirti trys gerklų lygiai; vienas iš jų turėtų apimti antgerklio pagrindą. Turėtų būti ištirti ne mažiau kaip du trachėjos lygiai; vienas iš jų turėtų būti išilginis pagrindinių bronchų išsišakojimo keteros pjūvis ir vienas – skersinis pjūvis.
                           
                        HISTOPATOLOGINIS TYRIMAS
                  
                              43.
                           
                           
                              Turėtų būti atliktas visų 2 lentelėje nurodytų organų ir audinių histopatologinis tyrimas, apimantis kontrolinę ir didžiausiosios koncentracijos grupes, taip pat visus gyvūnus, kurie tyrimo metu nugaišo arba buvo numarinti. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas kvėpavimo takams, tiksliniams organams ir labai pakitusiems audiniams. Visose grupėse turėtų būti tiriami didžiausiosios koncentracijos grupės gyvūnų organai ir audiniai, dėl kurių nustatyta pakitimų. Norėdamas įrodyti aiškią reakciją į tam tikrą koncentraciją, tyrimo vadovas gali nuspręsti atlikti papildomų grupių histopatologinius tyrimus. Jeigu naudojama pagalbinė (grįžtamumo tyrimų) grupė, atliekant histopatologinį tyrimą turėtų būti tiriami visi audiniai ir organai, kuriems padarytas poveikis dozę gavusiose grupėse. Jeigu didžiausiosios koncentracijos grupėje nebaigus bandymo nugaišta labai daug gyvūnų ar kyla kitokių problemų, mažinančių duomenų reikšmingumą, turėtų būti atliktas kito pagal dydį (mažesnio) koncentracijos lygio histopatologinis tyrimas. Reikėtų mėginti rasti sąsajų tarp bendrųjų stebėjimų ir mikroskopinės analizės rezultatų.
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITOS
                  
                     Duomenys
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Turėtų būti pateikti kiekvieno gyvūno kūno masės, pašarų suvartojimo, klinikinės patologijos tyrimų, organų masės ir histopatologinių tyrimų duomenys. Klinikinių stebėjimų duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, pagal kiekvieną bandomąją grupę nurodant naudotų gyvūnų skaičių, gyvūnų, kuriems pasireiškė toksiškumo požymių, skaičių, atliekant bandymą nugaišusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičių, kiekvieno gyvūno žūties laiką, taip pat pateikiant toksinio poveikio aprašymą, pasireiškimo laiką ir grįžtamumą, skrodimo išvadas. Visi rezultatai – kiekybiniai ir papildomi – turėtų būti įvertinti taikant tinkamą statistinį metodą. Gali būti taikomas bet kuris visuotinai pripažintas statistinis metodas; statistiniai metodai turėtų būti parenkami planuojant tyrimą.
                           
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikta tokia informacija (jeigu taikytina):
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomieji gyvūnai ir jų laikymas
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Laikymo sąlygų aprašymas, nurodant gyvūnų skaičių narvelyje (arba skaičiaus pokytį), kraiko medžiagą, aplinkos temperatūrą ir santykinį drėgnį, šviesos ir tamsos kaitą paros metu ir šėrimo režimą.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Naudota rūšis (padermė) ir, jeigu tai ne žiurkės, kitos rūšies naudojimo pagrindimas. Gali būti pateikti pirminiai ir istoriniai duomenys, jeigu jie gauti tiriant gyvūnus, kuriems buvo taikomos panašios poveikio, laikymo ir nešėrimo sąlygos.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Gyvūnų skaičius, amžius ir lytis.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Atsitiktinės atrankos metodas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Prieš bandymą sudarytų sąlygų aprašymas, nurodant šėrimo režimą, izoliavimo ir apsaugos nuo ligų būdą.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Fizinė būsena, grynumas ir, jeigu taikytina, fizinės ir cheminės savybės (įskaitant izomeriją).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Identifikavimo duomenys ir Cheminių medžiagų santrumpų tarnybos (angl. CAS) registracijos numeris, jeigu jis žinomas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nešiklis
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nešiklio naudojimo pagrindimas ir nešiklio parinkimo pagrindimas (jeigu tai ne vanduo).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Istoriniai arba vienalaikiai duomenys, įrodantys, kad nešiklis nedaro neigiamo poveikio tyrimo rezultatams.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhaliacinė kamera
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Išsamus inhaliacinės kameros aprašas, nurodant tūrį ir pateikiant diagramą.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Įrangos, naudotos darant poveikį gyvūnams ir kuriant atmosferą, šaltinis ir aprašas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Temperatūros, drėgnio, dalelių dydžio ir faktinės koncentracijos matavimo įranga.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Oro šaltinis ir kondicionavimo sistema.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Įrangos kalibravimo siekiant užtikrinti homogenišką bandymo atmosferą metodai.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Slėgių skirtumas (teigiamas ar neigiamas).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kameroje esančios dozės davimo angos (jeigu dozė duodama tik per nosį); gyvūnų vieta kameroje (jeigu dozė duodama per visą kūną).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Bandymo atmosferos pastovumas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Temperatūros ir drėgnio jutiklių vieta ir kameroje sukurtos bandymo atmosferos ėminių ėmimas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tiekiamo ir (arba) ištraukiamo oro apdorojimas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Oro srauto greičiai, per dozės davimo angą tekančio oro srauto greitis (jeigu dozė duodama tik per nosį) arba gyvūnų kiekis kameroje (jeigu dozė duodama per visą kūną).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Inhaliacinės kameros pusiausvyros pasiekimo laikas (t95).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tūrio pokyčių kiekis per valandą.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Matavimo prietaisai (jeigu naudojami).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Poveikio duomenys
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tikslinės koncentracijos parinkimo pagrindiniam tyrimui pagrindimas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Vardinės koncentracijos (inhaliacinėje kameroje sukurtos bandomosios cheminės medžiagos bendrosios masės ir viso per kamerą perleisto oro srauto tūrio santykis).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Faktinės bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, nustatytos gyvūnų kvėpavimo zonoje; jeigu bandomi mišiniai, įgaunantys įvairias fizines būsenas (dujos, garai, aerozoliai), kiekviena iš šių būsenų gali būti analizuojama atskirai.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Visos koncentracijos ore turėtų būtų nurodomos masės vienetais (pvz., mg/l, mg/m3 ir t. t.), o ne tūrio vienetais (pvz., ppm, ppb ir t. t.).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Dalelių dydžio pasiskirstymas, masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) ir geometrinis standartinis nuokrypis (σg), nurodant jų apskaičiavimo metodus. Turėtų būti pateiktos atliktos atskiros dalelių dydžio analizės.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos paruošimą, nurodant procedūras, taikytas siekiant sumažinti kietųjų medžiagų dalelių dydį arba paruošti bandomosios cheminės medžiagos tirpalus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Įrangos, naudotos kuriant bandymo atmosferą ir veikiant gyvūnus bandymo atmosfera, aprašas (pageidautina, pateikiant diagramą).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Išsami informacija apie įrangą, naudotą stebėti kameros temperatūrą, drėgnį ir oro srautą kameroje (t. y. kalibravimo kreivės nubrėžimas).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Išsami informacija apie įrangą, naudotą imti ėminius, skirtus nustatyti kameroje susidariusią koncentraciją ir dalelių dydžio pasiskirstymą.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Išsami informacija apie taikytą cheminės analizės metodą ir metodo tinkamumo patvirtinimą (nurodant bandomosios cheminės medžiagos regeneravimo iš ėminių ėmimo terpės veiksmingumą).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Atsitiktinės atrankos, taikytos suskirstant gyvūnus į bandomąją ir kontrolinę grupes, metodas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (nurodant pašaro tipą ir (arba) šaltinį, vandens šaltinį).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Bandomųjų koncentracijų parinkimo pagrindimas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatai
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kameros temperatūrų, drėgnio ir oro srautų lentelės.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kameros vardinės ir faktinės koncentracijos duomenų lentelės.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Dalelių dydžių lentelės, pateikiant analizinių ėminių ėmimo duomenis, dalelių dydžių pasiskirstymą ir MMAS bei σg skaičiavimus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kiekvieno gyvūno reakcijos duomenų ir koncentracijos lygio lentelės (t. y. gyvūnų, kuriems pasireiškė toksiškumo požymių, įskaitant gaištamumą, poveikio pobūdį, sunkumą, pasireiškimo laiką ir trukmę).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kiekvieno gyvūno masės lentelės.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Pašaro suvartojimo lentelės.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Klinikinės patologijos duomenų lentelės.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kiekvieno gyvūno skrodimo išvados ir histopatologinių tyrimų rezultatai, jeigu yra.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Visų kitų išmatuotų parametrų lentelės.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatų aptarimas ir aiškinimas
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas metodų, taikytų siekiant laikytis šio bandymo metodo kriterijų, pvz., susijusių su ribine koncentracija arba dalelių dydžiu, aprašymui.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Atsižvelgiant į bendruosius rezultatus, turėtų būti aprašyta dalelių įkvėpimo galimybė, ypač jeigu nebuvo įmanoma taikyti dalelių dydžio kriterijaus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Pateikiant bendrąjį tyrimo vertinimą, turėtų būti nurodytas metodų, taikytų nustatyti vardines ir faktines koncentracijas, nuoseklumas ir faktinės koncentracijos santykis su vardine koncentracija.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      turėtų būti aprašyta tikėtina žūties priežastis ir vyraujantis veikimo būdas (sisteminis ar vietinis).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Atsižvelgiant į OECD rekomendaciniame dokumente dėl pasekmių žmonėms (3) nustatytus kriterijus, turėtų būti pateiktas paaiškinimas, ar kilo poreikis humaniškai numarinti gyvūnus, patiriančius skausmą arba sunkią ilgalaikę kančią.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Turėtų būti nurodytas (-i) tikslinis (-iai) organas (-ai).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Turėtų būti apibrėžti nepastebimo neigiamo poveikio lygis (NNPL) ir mažiausio pastebimo neigiamo poveikio lygis (MPNPL).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation, Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229–258.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231–238.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419–428.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies keičiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006, OL L 353, 2008 12 31, p. 1.
                           
                        
                     1 priedėlis
                     APIBRĖŽTIS
                     Bandomoji cheminė medžiaga– naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga arba mišinys.
                  “
            
                  5)
               
               
                  B.29 ir B.30 skyriai pakeičiami taip:
                  „B.29.   PUSIAU LĖTINIS TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS. 90 DIENŲ TYRIMAS
                  
                  SANTRAUKA
                  Šis atnaujintasis B.29 bandymo metodas parengtas tam, kad būtų galima išsamiai apibūdinti pusiau lėtinį bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą, pasireiškiantį 90 dienų laikotarpiu duodant dozę per kvėpavimo takus, ir gauti patikimų duomenų, reikalingų kiekybiniams inhaliacinės rizikos vertinimams. 10 patinų ir 10 patelių grupės 90 dienų (13 savaičių) laikotarpiu šešias valandas per parą veikiamos a) bandomąja chemine medžiaga, taikant tris arba daugiau koncentracijos lygių, b) išvalytu oru (neigiama kontrolė) ir (arba) c) nešikliu (nešiklio kontrolė). Paprastai gyvūnai veikiami penkias dienas per savaitę, tačiau galima taikyti ir septynių dienų per savaitę poveikį. Bandymai visada atliekami ir su patinais, ir su patelėmis, tačiau, jeigu žinoma, kad kurios nors lyties gyvūnai yra jautresni tam tikrai bandomajai cheminei medžiagai, patinams ir patelėms gali būti taikomi skirtingi koncentracijos lygiai. Šis metodas tyrimo vadovui suteikia lanksčią galimybę įtraukti pagalbines (grįžtamumo tyrimų) grupes, taikyti numarinimą nebaigus bandymo, bronchoalveolinį plovimą (BAP), atlikti neurologinius tyrimus ir papildomus klinikinius patologinius bei histopatologinius tyrimus, kad būtų galima geriau apibūdinti bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą.
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ 413 (OECD bandymo gairės Nr. 413) (2009). Originalios pusiau lėtinio toksiškumo įkvėpus bandymų gairės „Test Guideline“ 413 (TG 413) priimtos 1981 m. (1). Šis (B.29) bandymo metodas (lygiavertis atnaujintosioms TG 413 (2009)) atnaujintas siekiant jį suderinti su mokslo pasiekimais ir patenkinti dabartines ir būsimas reglamentavimo reikmes.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Pusiau lėtinio toksiškumo įkvėpus tyrimai pirmiausia atliekami siekiant nustatyti reglamentavimo tikslais taikytinas koncentracijas, skirtas įvertinti darbo aplinkoje darbuotojams gresiančią riziką. Be to, jie atliekami siekiant įvertinti žmonių gyvenamosiose vietose gresiančią riziką, transportavimo riziką ir aplinkosauginę riziką. Šis metodas suteikia galimybę apibūdinti neigiamą poveikį, sukeltą 90 dienų (apie 10 % žiurkės gyvenimo trukmės) kasdien per kvėpavimo takus duodant kartotinę bandomosios cheminės medžiagos dozę. Atlikus pusiau lėtinio toksiškumo įkvėpus tyrimus gauti duomenys gali būti naudojami atliekant kiekybinius rizikos vertinimus ir parenkant per lėtinio poveikio tyrimus taikytinas koncentracijas. Šis bandymo metodas nėra specialiai skirtas nanomedžiagų bandymams. Aprašant šį bandymo metodą vartojamos apibrėžtys pateiktos šio skyriaus pabaigoje ir rekomendaciniame dokumente (RD) Nr. 39 (2).
                           
                        PIRMINIAI ASPEKTAI
                  
                              3.
                           
                           
                              Siekdama užtikrinti aukštesnę tyrimo kokybę ir kaip galima labiau sumažinti gyvūnų naudojimą, bandymų laboratorija, prieš atlikdama tyrimą, turėtų įvertinti visą turimą informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą. Pasirinkti tinkamas bandymų koncentracijas gali padėti informacija apie bandomosios cheminės medžiagos tapatumą, cheminę struktūrą, fizines ir chemines savybes, taip pat toksiškumo bandymų in vitro arba in vivo rezultatai, numatomas (-i) panaudojimo būdas (-ai) ir galimas poveikis žmogui, turimi (Q)SAR duomenys ir toksikologiniai duomenys apie panašios struktūros chemines medžiagas, taip pat duomenys, gauti atlikus kitus kartotinio poveikio tyrimus. Jeigu yra tikėtinas arba jeigu atliekant tyrimą pastebimas neurotoksinis poveikis, tyrimo vadovas gali nuspręsti įtraukti atitinkamus vertinimus, pvz., funkcinių stebėjimų rinkinį (FSR) ir judėjimo aktyvumo vertinimą. Nors gali būti labai svarbu užtikrinti tinkamą su konkrečiais tyrimais susijusių dozių davimo laiką, ši papildoma veikla neturėtų trukdyti įgyvendinti pagrindinio tyrimo planą.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Ėsdinančių arba dirginančių bandomųjų cheminių medžiagų tirpalai gali būti bandomi taikant koncentracijas, kurioms esant pasiekiamas reikiamas toksiškumo lygis. Daugiau informacijos pateikta RD Nr. 39 (2). Tačiau veikiant gyvūnus šiomis medžiagomis taikytinos tikslinės koncentracijos turėtų būti gana mažos, kad nesukeltų ženklaus skausmo ir kančių, bet pakankamos, kad būtų galima pratęsti koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivę iki tokių lygių, kuriems esant būtų pasiektas reglamentavimo arba mokslinis tikslas, kurio siekiama bandymu. Šios koncentracijos turėtų būti parenkamos atsižvelgiant į konkretų atvejį ir, pageidautina, remiantis tinkamai suplanuotu ribų nustatymo tyrimu, suteikiančiu informacijos apie pavojingas pasekmes, dirginimo ribinę vertę ir poveikio pasireiškimo laiką (žr. 11–13 skirsnius). Turėtų būti pateiktas koncentracijos pasirinkimo pagrindimas.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Gaištantys gyvūnai arba skausmą ar sunkias ilgalaikes kančias akivaizdžiai patiriantys gyvūnai turėtų būti humaniškai numarinami. Gaištantys gyvūnai laikomi atliekant bandymą nugaišusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištančius arba sunkiai kenčiančius gyvūnus priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra pateikti OECD rekomendaciniame dokumente dėl pasekmių žmonėms (3).
                           
                        METODO APRAŠYMAS
                  
                     Gyvūnų rūšies parinkimas
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių padermių graužikai. Tinkamiausia rūšis yra žiurkės. Jeigu naudojama kita rūšis, turėtų būti pateiktas jos naudojimo pagrindimas.
                           
                        
                     Gyvūnų paruošimas
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Patelės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos. Atsitiktinės atrankos dieną gyvūnai turėtų būti jauni, bet suaugę, 7–9 savaičių amžiaus. Kūno masė pagal kiekvieną lytį turėtų ± 20 % tikslumu atitikti vidutinę tos lyties gyvūnų masę. Gyvūnai atrenkami atsitiktine tvarka, paženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir ne mažiau kaip penkias paras iki bandymo pradžios laikomi savo narveliuose, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų.
                           
                        
                     Gyvūnų laikymas
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Kad būtų patogiau stebėti ir kad būtų išvengta painiavos, kiekvienas gyvūnas turėtų būti išskirtinai paženklintas, pageidautina, naudojant poodinius atsakiklius. Bandomųjų gyvūnų laikymo patalpos temperatūra turėtų būti 22 ± 3 °C. Tinkamiausias santykinis drėgnis – 30–70 %, bet jis gali būti nepasiekiamas, jeigu naudojamas nešiklis yra vanduo. Prieš dozės davimą ir davus dozę gyvūnai turėtų būti laikomi narveliuose suskirstyti grupėmis pagal lytį ir koncentraciją; narvelyje laikomų gyvūnų skaičius turėtų būti toks, kad būtų galima aiškiai stebėti kiekvieną gyvūną ir kad būtų patiriama kuo mažiau žalos dėl kanibalizmo ir grumtynių. Jeigu dozė gyvūnams duodama tik per nosį, gali reikėti juos pripratinti prie uždaromųjų vamzdelių. Uždaromieji vamzdeliai gyvūnams neturėtų kelti didelės fizinės, terminės arba suvaržymo įtampos. Varžymas gali turėti fiziologinių pasekmių, pvz., turėti poveikio kūno temperatūrai (hipertermija) ir (arba) per minutę įkvepiamam tūriui. Jeigu yra bendrųjų duomenų, rodančių, kad tokių pastebimų pokyčių neįvyksta, pripratinimas prie uždaromųjų vamzdelių nebūtinas. Gyvūnai, kurių visas kūnas veikiamas aerozoliu, poveikio laikotarpiu turėtų būti laikomi atskirai, kad bandomasis aerozolis nebūtų filtruojamas per kitų narvelyje esančių gyvūnų kailį. Išskyrus poveikio laikotarpį, gyvūnams šerti tinka įprastas ir sertifikuotas laboratorijose naudojamas pašaras, duodant neribotą geriamo vandens kiekį. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką.
                           
                        
                     Inhaliacinės kameros
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Parenkant inhaliacinę kamerą, turėtų būti atsižvelgiama į bandomosios cheminės medžiagos pobūdį ir bandymo tikslą. Pirmenybė teikiama dozės davimui tik per nosį (ši sąvoka apima sąvokas „tik per galvą“, „tik per nosį“ ir „tik per šnipą“). Pirmenybė dozės davimui tik per nosį paprastai teikiama tiriant skystųjų arba kietųjų dalelių aerozolius ir garus, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Specialieji tyrimo tikslai gali būti sėkmingiau pasiekti taikant poveikio per visą kūną metodą, tačiau tai turi būti pagrįsta tyrimo ataskaitoje. Siekiant užtikrinti atmosferos pastovumą naudojant poveikio per visą kūną kamerą, visa bandomųjų gyvūnų užimama erdvė turėtų neviršyti 5 % kameros tūrio. Poveikio tik per nosį ir poveikio per visą kūną metodų principai ir konkretūs šių metodų privalumai bei trūkumai aprašyti RD Nr. 39 (2).
                           
                        TOKSIŠKUMO TYRIMAI
                  
                     Ribinės koncentracijos
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Kitaip nei ūmaus poveikio tyrimams, pusiau lėtinio toksiškumo įkvėpus tyrimams ribinių koncentracijų nenustatyta. Didžiausioji bandytina koncentracija turėtų būti nustatoma atsižvelgiant į šiuos dalykus: 1) didžiausiąją pasiekiamą koncentraciją, 2) „blogiausiu atveju“ taikytiną poveikio žmonėms lygį, 3) poreikį užtikrinti tinkamą deguonies tiekimą ir (arba) 4) gyvūnų gerovės aspektus. Jeigu nėra duomenimis pagrįstų ribų, gali būti taikomos Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 (13) nustatytos ūmaus poveikio ribos (t. y. neviršijant 5 mg/l koncentracijos, jeigu tai aerozoliai, 20 mg/l, jeigu tai garai, ir 20 000 ppm, jeigu tai dujos); žr. RD Nr. 39 (2). Jeigu atliekant dujų arba labai lakių bandomųjų cheminių medžiagų (pvz., šaldymo medžiagų) bandymus būtina viršyti šias ribas, turi būti pateiktas pagrindimas. Ribinė koncentracija turėtų sukelti akivaizdų toksiškumą nesukeldama pernelyg didelio streso gyvūnams ir netrumpindama jų gyvenimo trukmės (3).
                           
                        
                     Ribų nustatymo tyrimas
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Prieš pradedant pagrindinį tyrimą, dažniausiai gali reikėti atlikti ribų nustatymo tyrimą. Ribų nustatymo tyrimas yra išsamesnis už orientacinį tyrimą, nes jis susijęs ne tik su koncentracijų parinkimu. Per ribų nustatymo tyrimą gautos žinios gali padėti sėkmingai atlikti pagrindinį tyrimą. Pvz., ribų nustatymo tyrimas gali suteikti techninės informacijos apie analizės metodus, dalelių dydžius, toksinio poveikio mechanizmų nustatymą, klinikinės patologijos ir histopatologinių tyrimų duomenis ir apytikrius vertinimus, koks NNPL ir kokia didžiausioji leidžiama koncentracija (DLK) galėtų būti taikomi atliekant pagrindinį tyrimą. Tyrimo vadovas gali nuspręsti atlikti ribų nustatymo tyrimą, kad nustatytų kvėpavimo takų dirginimo ribinę vertę (pvz., atliekant histopatologinį kvėpavimo takų tyrimą, plaučių funkcijos tyrimus arba bronchoalveolinį plovimą), didžiausiąją koncentraciją, kuri būtų leidžiama kaip nesukelianti pernelyg didelio streso gyvūnams, ir parametrus, kuriais būtų geriausiai apibūdinamas bandomosios cheminės medžiagos toksiškumas.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Ribų nustatymo tyrimas gali būti atliekamas taikant vieną arba daugiau koncentracijos lygių. Atsižvelgiant į pasirinktas pasekmes, kiekvieną koncentracijos lygį atitinkanti dozė duodama šešiems patinams ir trims–šešioms patelėms. Ribų nustatymo tyrimas turėtų trukti ne mažiau kaip penkias dienas, bet paprastai – ne ilgiau kaip 28 dienas. Tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateiktas per pagrindinį tyrimą taikytinų koncentracijų parinkimo pagrindimas. Pagrindinio tyrimo tikslas – įrodyti koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybę remiantis numanoma sunkiausia pasekme. Tinkamiausia mažiausioji koncentracija – nepastebimo neigiamo poveikio lygio koncentracija, didžiausioji – akivaizdų toksiškumą sukelianti koncentracija, nesukelianti pernelyg didelio streso gyvūnams ir netrumpinanti jų gyvenimo trukmės (3)
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Parenkant per ribų nustatymo tyrimą taikytinus koncentracijos lygius, turėtų būti atsižvelgiama į visą turimą informaciją, įskaitant struktūros ir savybių ryšius ir duomenis apie panašias chemines medžiagas (žr. 3 skirsnį). Ribų nustatymo tyrimu gali būti patikrintos ir (arba) atmestos pasekmės, kurios laikomos sunkiausiomis mechaniniu požiūriu vertinamomis pasekmėmis, pvz., cholinesterazės inhibavimas organiniais fosforo junginiais, methemoglobino susidarymas veikiant eritrocitotoksinėms medžiagoms, skydliaukės hormonų (T3, T4) reakcija į tirotoksines medžiagas, poveikis baltymams, laktatdehidrogenazei arba neutrofilams atliekant bronchoalveolinį plovimą, siekiant pašalinti nekenksmingas prastai tirpstančias daleles arba plaučius dirginančius aerozolius.
                           
                        
                     Pagrindinis tyrimas
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Pagrindinis pusiau lėtinio toksiškumo tyrimas paprastai atliekamas taikant tris koncentracijos lygius ir prireikus taikant vienalaikę neigiamą kontrolę (naudojant orą) ir (arba) nešiklio kontrolę (žr. 18 skirsnį). Parenkant poveikio lygius turėtų būti pasitelkiami visi turimi duomenys, įskaitant sisteminio toksiškumo tyrimų rezultatus, metabolizmo ir kinetinių savybių duomenis (labai svarbu užtikrinti, kad nebūtų taikomos tokios didžiausiosios koncentracijos, kuriomis būtų įsotinti kinetiniai procesai). Kiekviena bandomoji grupė sudaroma iš dešimties graužikų patinų ir dešimties patelių, kurie 13 savaičių laikotarpiu (bendra tyrimo trukmė ne trumpesnė kaip 90 dienų) penkias dienas per savaitę šešias valandas per parą veikiami bandomąja chemine medžiaga. Gyvūnai gali būti veikiami ir septynias dienas per savaitę (pvz., tiriant įkvepiamus vaistus). Jeigu žinoma, kad kurios nors lyties gyvūnai yra jautresni konkrečiai bandomajai cheminei medžiagai, siekiant nustatyti kuo tikslesnę koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybę, kaip aprašyta 15 skirsnyje, skirtingų lyčių gyvūnams gali būti taikomi skirtingi koncentracijos lygiai. Jeigu naudojant kitos rūšies graužikus nei žiurkės dozė duodama tik per nosį, ilgiausia poveikio trukmė gali būti pakoreguojama siekiant sumažinti tos rūšies gyvūnų patiriamą kančią. Jeigu taikomas trumpesnis nei šešių valandų per parą poveikis arba jeigu būtina atlikti ilgalaikio (pvz., 22 valandų per parą) poveikio per visą kūną tyrimą, turėtų būti pateiktas atitinkamas pagrindimas (žr. RD Nr. 39) (2). Poveikio metu gyvūnas neturėtų būti šeriamas, išskyrus atvejus, kai poveikio trukmė ilgesnė kaip šešios valandos. Vandens gali būti duodama per visą poveikio per visą kūną laikotarpį.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Turėtų būti nurodyta, kokiam organui (-ams) skirtos pasirinktos tikslinės koncentracijos, ir taikant šias koncentracijas turėtų būti užtikrinta aiški koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybė:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          taikant didžiausiąją koncentraciją turėtų būti padarytas toksinis poveikis, tačiau neturėtų pasireikšti ilgalaikių požymių arba gyvūnai neturėtų nugaišti, nes tokiu atveju nebūtų galima atlikti prasmingo vertinimo,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          tarpinis (-iai) koncentracijos lygis (-iai) turėtų skirtis tiek, kad būtų galima nustatyti toksinio poveikio lygius tarp mažiausiosios ir didžiausiosios koncentracijos,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          taikant mažiausiąją koncentraciją neturėtų būti daroma toksinio poveikio ir neturėtų būti pastebima jo požymių.
                                       
                                    
                        
                     Numarinimas nebaigus bandymo
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Jeigu numatoma marinti gyvūnus nebaigus bandymo, kiekvienam poveikio lygiui naudotinas gyvūnų skaičius turėtų būti padidintas numatomu iki tyrimo pabaigos numarinti gyvūnų skaičiumi. Turėtų būti pateiktas marinimo nebaigus tyrimų taikymo pagrindimas; atliekant statistinę analizę, turėtų būti tinkamai atsižvelgiama į numarinamų gyvūnų skaičių.
                           
                        
                     Pagalbinis (grįžtamumo) tyrimas
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Siekiant nustatyti toksinio poveikio grįžtamumą, tvarumą arba delsą, reikiamos trukmės, bet ne ilgesniu kaip 14 dienų laikotarpiu po dozės davimo gali būti atliekamas pagalbinis (grįžtamumo) tyrimas. Pagalbinės (grįžtamumo) grupės sudaromos iš dešimties patinų ir dešimties patelių, kurie per pagrindinį tyrimą veikiami kartu su bandomaisiais gyvūnais. Pagalbinės (grįžtamumo) grupės turėtų būti veikiamos didžiausiąja bandomosios cheminės medžiagos koncentracija; prireikus turėtų būti taikoma vienalaikė kontrolė naudojant orą ir (arba) nešiklį (žr. 18 skirsnį).
                           
                        
                     Kontroliniai gyvūnai
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Su vienalaikės neigiamos kontrolės (naudojant orą) gyvūnais turėtų būti elgiamasi taip pat, kaip su bandomosios grupės gyvūnais, išskyrus tai, kad jie veikiami išvalytu oru, o ne bandomąja chemine medžiaga. Jeigu siekiant palengvinti bandymo atmosferos sukūrimą naudojamas vanduo arba kita cheminė medžiaga, atliekant tyrimą naudojama nešiklio kontrolės grupė, o ne neigiamos kontrolės (naudojant orą) grupė. Jeigu įmanoma, kaip nešiklis turėtų būti naudojamas vanduo. Jeigu kaip nešiklis naudojamas vanduo, kontroliniai gyvūnai turėtų būti veikiami oru, kurio drėgnis turėtų būti toks pat, koks taikomas grupėms, kurioms duodama dozė. Tinkamas nešiklis turėtų būti parenkamas remiantis tinkamai atliktu išankstiniu tyrimu arba istoriniais duomenimis. Jeigu nešiklio toksiškumas nėra gerai žinomas, tyrimo vadovas gali nuspręsti taikyti ir neigiamą kontrolę (naudojant orą), ir nešiklio kontrolę, tačiau primygtinai rekomenduojama to nedaryti. Jeigu istoriniai duomenys rodo, kad nešiklis netoksiškas, neigiamos kontrolės (naudojant orą) grupės naudoti nebūtina, turėtų būti taikoma tik nešiklio kontrolė. Jeigu atlikus nešiklyje paruoštos bandomosios cheminės medžiagos išankstinį tyrimą nustatoma, kad medžiaga nėra toksiška, vadinasi, ir nešiklis, esant ištirtai koncentracijai, nėra toksiškas, todėl turėtų būti taikoma kontrolė naudojant šį nešiklį.
                           
                        POVEIKIO SĄLYGOS
                  
                     Koncentracijų taikymas
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga dujų, garų, aerozolių arba jų mišinių pavidalu. Per tyrimą naudotina fizinė būsena priklauso nuo fizinių ir cheminių bandomosios cheminės medžiagos savybių, pasirinktų koncentracijų ir (arba) fizinio pavidalo, kuris veikiausiai bus tvarkant ir naudojant bandomąją cheminę medžiagą. Higroskopinės ir chemiškai reaguojančios bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti bandomos sauso oro sąlygomis. Turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad būtų išvengta sprogių koncentracijų susidarymo. Iš dalelių sudarytos medžiagos gali būti apdorojamos mechaniškai, siekiant sumažinti dalelių dydį. Daugiau patarimų pateikta RD Nr. 39 (2).
                           
                        
                     Dalelių dydžio pasiskirstymas
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Dalelių rūšiavimas pagal dydį turėtų būti taikomas visiems aerozoliams ir garams, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Kad poveikis būtų padarytas visoms svarbioms kvėpavimo takų sritims, rekomenduojama naudoti aerozolius, kurių masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) yra 1–3 μm, o geometrinis standartinis nuokrypis (σg) – 1,5–3,0 (4). Nors turėtų būti imamasi pagrįstų priemonių, kad šio standarto būtų laikomasi, jeigu jo įgyvendinti neįmanoma, turėtų būti pateikta ekspertų nuomonė. Pvz., metalų garų dalelės bus mažesnės už šį standartą, o įelektrintų dalelių ir pluoštų – didesnės.
                           
                        
                     Bandomosios cheminės medžiagos paruošimas nešiklyje
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Geriausia, kad bandomoji cheminė medžiaga būtų bandoma nenaudojant nešiklio. Jeigu būtina naudoti nešiklį norint pasiekti reikiamą bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją ir užtikrinti reikiamą dalelių dydį, pirmenybė turėtų būti teikiama vandeniui. Visuomet, kai bandomoji cheminė medžiaga ištirpinama nešiklyje, turėtų būti įrodytas jos stabilumas.
                           
                        POVEIKIO SĄLYGŲ STEBĖJIMAS
                  
                     Oro srautas kameroje
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Kiekvieno poveikio metu turėtų būti atidžiai reguliuojamas, nuolat stebimas ir ne rečiau kaip kartą per valandą registruojamas per poveikio kamerą tekantis oro srautas. Bandymo atmosferoje susidariusios koncentracijos (arba jos pastovumo laiko atžvilgiu) stebėjimas realiuoju laiku yra vienas iš visų dinaminių parametrų matavimų, suteikiantis galimybę netiesiogiai kontroliuoti visus svarbius dinaminius inhaliacinius parametrus. Jeigu koncentracija stebima tiesiogiai, oro srautų matavimo dažnumas gali būti sumažintas iki vieno matavimo kiekvieną dieną per kiekvieną poveikio seansą. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tam, kad būtų išvengta pakartotinio įkvėpimo dozės davimo tik per nosį kamerose. Deguonies koncentracija turėtų būti ne mažesnė kaip 19 %, anglies dioksido – ne didesnė kaip 1 %. Jeigu yra pagrindo manyti, kad šio standarto įgyvendinti neįmanoma, turėtų būti matuojamos deguonies ir anglies dioksido koncentracijos. Jeigu pirmąją poveikio dieną atlikti matavimai rodo, kad šių dujų lygiai yra tinkami, daugiau matavimų atlikti nebūtina.
                           
                        
                     Kameros temperatūra ir santykinis drėgnis
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Kameroje turėtų būti palaikoma 22 ± 3 °C temperatūra. Ir dozę duodant tik per nosį, ir per visą kūną, jeigu įmanoma, per kiekvieną poveikio seansą turėtų būti nuolat stebimas ir kas valandą registruojamas santykinis drėgnis gyvūnų kvėpavimo zonoje. Tinkamiausias santykinis drėgnis – 30–70 %, tačiau jis gali būti nepasiekiamas (pvz., bandant vandens pagrindo mišinius) arba neišmatuojamas dėl trukdžių, atsirandančių bandomajai cheminei medžiagai taikant bandymo metodą.
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga. Vardinė koncentracija
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Jeigu įmanoma, turėtų būti apskaičiuota ir užregistruota vardinė koncentracija poveikio kameroje. Vardinė koncentracija yra sukurtos bandomosios cheminės medžiagos masės ir viso oro srauto, perleisto per inhaliacinių kamerų sistemą, tūrio santykis. Vardinė koncentracija nėra naudojama apibūdinti poveikį gyvūnui, tačiau, vardinę koncentraciją palyginus su faktine, nustatomas generavimo, kurį užtikrina bandymų sistema, efektyvumas, kuriuo remiantis galima nustatyti generavimo problemas.
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga. Faktinė koncentracija
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Faktinė koncentracija yra bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, nustatyta paėmus ėminį iš inhaliacinėje kameroje esančios gyvūno kvėpavimo zonos. Faktines koncentracijas galima nustatyti specialiaisiais metodais (pvz., taikant tiesioginio ėminių ėmimo, adsorbcijos arba cheminių reakcijų metodus ir tada atliekant analizinį apibūdinimą) arba nespecialiaisiais metodais, pvz., atliekant gravimetrinę analizę naudojant filtrus. Gravimetrinė analizė gali būti taikoma tik vienos sudedamosios dalies miltelių aerozoliams arba mažo lakumo skystųjų dalelių aerozoliams ir turėtų būti grindžiama tinkamais prieš tyrimą atliktais bandomosios cheminės medžiagos savybių apibūdinimais. Iš daugiau kaip vienos sudedamosios dalies sudarytų miltelių aerozolių koncentracijos taip pat gali būti nustatomos atliekant gravimetrinę analizę. Tačiau tam reikalingi analitiniai duomenys, įrodantys, kad ore esančios medžiagos sudėtis panaši į pirminės medžiagos sudėtį. Jeigu tokios informacijos nėra, tyrimo metu gali reikėti vienodais intervalais atlikti pakartotinę bandomosios cheminės medžiagos (geriausia, kad ji būtų ore) analizę. Jeigu aerozolinės medžiagos gali garuoti arba sublimuoti, turėtų būti įrodyta, kad pasirinktu metodu surinktos visos fazės.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Jeigu įmanoma, per visą tyrimą turėtų būti naudojama viena bandomosios cheminės medžiagos partija, o bandomasis ėminys turėtų būti laikomas tokiomis sąlygomis, kad būtų išsaugotas jo grynumas, homogeniškumas ir stabilumas. Prieš pradedant tyrimą reikėtų apibūdinti bandomosios cheminės medžiagos savybes, įskaitant jos grynumą ir, jeigu tai techniškai įmanoma, tapatumą, taip pat nustatytų teršalų ir priemaišų kiekius. Be kitų duomenų, tai galima pagrįsti šiais duomenimis: sulaikymo trukme ir susijusia didžiausios koncentracijos sritimi, molekuline mase, nustatyta atlikus spektroskopinę arba dujų chromatografijos analizę, arba kitais įverčiais. Nors bandomojo ėminio tapatumo nustatymas nėra bandymų laboratorijos pareiga, bandymų laboratorijai gali būti naudinga patvirtinti bent kai kurias pateikėjo nurodytas savybes (pvz., spalvą, fizinę būseną ir t. t.).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Jeigu įmanoma, turėtų būti palaikoma pastovi poveikio atmosfera. Poveikio sąlygų pastovumui įrodyti gali būti naudojamas stebėjimo realiuoju laiku prietaisas, pvz., aerozoliams gali būti naudojamas aerozolių fotometras, garams – bendro angliavandenilių kiekio analizatorius. Faktinė kameroje susidariusi koncentracija turėtų būti matuojama kiekvieną poveikio dieną, ne mažiau kaip tris kartus pagal kiekvieną poveikio lygį. Jeigu tai neįmanoma dėl nedidelių oro srauto greičių arba mažų koncentracijų, gali būti imamas vienas ėminys per vieną poveikio laikotarpį. Būtų geriausia, kad tokiu atveju šis ėminys būtų imamas per visą poveikio laikotarpį. Atskiri kameroje susidariusios koncentracijos ėminiai neturėtų nukrypti nuo vidutinės kameroje susidariusios koncentracijos daugiau kaip ± 10 %, kai tiriamos dujos ir garai, arba daugiau kaip ± 20 %, kai tiriami skystųjų arba kietųjų dalelių aerozoliai. Turėtų būti apskaičiuotas ir ataskaitoje nurodytas pusiausvyros nusistovėjimo kameroje laikotarpis (t95). Poveikio laikotarpis apima bandomosios cheminės medžiagos sukūrimo trukmę. Į šį laikotarpį įtraukiamas pusiausvyros nusistovėjimo kameroje laikotarpis (t95) ir irimo laikas. t95 apskaičiavimo gairės pateiktos RD Nr. 39 (2).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Jeigu tiriami labai sudėtingi mišiniai, sudaryti iš dujų ir (arba) garų, ir aerozoliai (pvz., deginimo atmosferos ir bandomosios cheminės medžiagos, pučiamos iš specialiai varomų galutinio naudojimo produktų arba prietaisų), kiekvienos fazės veikimas inhaliacinėje kameroje gali būti skirtingas. Todėl iš kiekvienos fazės (dujų ir (arba) garų ir aerozolio) turėtų būti parinkta bent viena indikacinė cheminė medžiaga (analitė); paprastai šiuo tikslu pasirenkama pagrindinė veiklioji mišinio sudedamoji dalis. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga yra mišinys, turėtų būti nurodyta viso mišinio, o ne tik veikliosios sudedamosios dalies arba indikacinės cheminės medžiagos (analitės) analizinė koncentracija. Daugiau informacijos apie faktines koncentracijas pateikta RD Nr. 39 (2).
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga. Dalelių dydžio pasiskirstymas
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Aerozolių dalelių dydžio pasiskirstymas turėtų būti nustatomas bent kartą per savaitę pagal kiekvieną koncentracijos lygį, naudojant pakopinį ėmiklį arba alternatyvų prietaisą, pvz., aerodinaminį dalelių rūšiuotuvą (ADR). Jeigu galima įrodyti, kad pakopiniu ėmikliu ir alternatyviu prietaisu gaunami lygiaverčiai rezultatai, atliekant tyrimą gali būti naudojamas alternatyvus prietaisas.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Siekiant įsitikinti pagrindinio prietaiso surenkamuoju veiksmingumu, kartu su pagrindiniu prietaisu turėtų būti naudojamas antrasis prietaisas, pvz., gravimetrinis filtras, gaudyklė arba barboteris. Atlikus dalelių dydžio analizę nustatyta masės koncentracija turėtų neviršyti priimtinų filtruojamosios analizės būdu nustatytos masės koncentracijos ribų [žr. RD Nr. 39 (2)]. Jeigu, taikant visas bandomas koncentracijas, lygiavertiškumą galima įrodyti pradiniame tyrimo etape, tolesnius patvirtinamuosius matavimus galima praleisti. Gyvūnų gerovės sumetimais turėtų būti imamasi priemonių, kad būtų kuo mažiau negalutinių duomenų, dėl kurių galėtų reikėti pakartoti tyrimą.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Garuose esančios dalelės turėtų būti rūšiuojamos tuo atveju, jeigu bent kiek tikėtina, kad susidarant aerozoliui gali kondensuotis garai, arba jeigu garų atmosferoje aptinkama dalelių, dėl kurių gali susidaryti mišrių fazių.
                           
                        STEBĖJIMAI
                  
                              32.
                           
                           
                              Prieš poveikio laikotarpį, poveikio laikotarpiu ir pasibaigus poveikio laikotarpiui, turėtų būti atliekami klinikiniai gyvūnų stebėjimai. Atsižvelgiant į gyvūnų reakciją poveikio laikotarpiu, stebėjimus gali reikėti atlikti dažniau. Jeigu gyvūnų stebėjimą apsunkina gyvūnų uždaromųjų vamzdelių naudojimas, prastas poveikio per visą kūną kamerų apšvietimas arba neskaidrios atmosferos, gyvūnai turėtų būti atidžiai apžiūrimi po dozės davimo. Stebėjimais prieš kitos dienos poveikį galima įvertinti toksinio poveikio grįžtamumą arba pasunkėjimą.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Visi stebėjimai registruojami, išsaugant atskirus įrašus apie kiekvieną gyvūną. Kai gyvūnai numarinami dėl humaniškų priežasčių arba randami nugaišę, kiek įmanoma tiksliau užregistruojamas žūties laikas.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Narveliuose turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir gleivinės, kvėpavimo ir kraujotakos sistemų, centrinės nervų sistemos, somatomotorinės veiklos ir elgsenos pakitimai. Ypač reikėtų stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Matuojant temperatūrą tiesiojoje žarnoje, galima gauti patvirtinamųjų sulėtėjusio kvėpavimo arba nukritusios ar pakilusios temperatūros įrodymų, susijusių su dozės davimu arba izoliavimu. Į tyrimo protokolą gali būti įtraukti papildomi vertinimai, pvz., kinetikos, biomonitoringo, plaučių funkcijos, plaučių audinyje besikaupiančių mažo tirpumo medžiagų užsilaikymo ir elgsenos pokyčių.
                           
                        KŪNO MASĖ
                  
                              35.
                           
                           
                              Kiekvieno gyvūno masė turėtų būti registruojama prieš pat pirmąjį poveikį (nulinę dieną), o vėliau – dukart per savaitę (pvz., pirmadieniais ir penktadieniais, siekiant įrodyti gyvūnų atsigavimą per savaitgalį, kai nedaroma poveikio, arba tokiais laiko intervalais, kad būtų galima įvertinti sisteminį toksiškumą) ir kai gyvūnas nugaišta arba yra numarinamas. Jeigu per pirmąsias dvi savaites nepasireiškia jokio poveikio, likusiu tyrimo laikotarpiu kūno masė gali būti matuojama kas savaitę. Pagalbiniai (grįžtamumo tyrimų) gyvūnai (jeigu naudojami) atsigavimo laikotarpiu turėtų būti ir toliau sveriami kas savaitę. Baigus tyrimą, visi gyvūnai turėtų būti pasverti netrukus po numarinimo, kad būtų galima tiksliai apskaičiuoti organų ir kūno masių santykius.
                           
                        PAŠARŲ IR VANDENS SUVARTOJIMAS
                  
                              36.
                           
                           
                              Pašarų suvartojimas turėtų būti matuojamas kas savaitę. Gali būti matuojamas ir vandens suvartojimas.
                           
                        KLINIKINĖ PATOLOGIJA
                  
                              37.
                           
                           
                              Klinikinės patologijos vertinimai turėtų būti taikomi visiems gyvūnams, įskaitant kontrolinius ir pagalbinius (grįžtamumo tyrimų) gyvūnus, kai jie numarinami. Turėtų būti užregistruotas laikotarpis nuo poveikio pabaigos iki kraujo paėmimo, ypač jeigu tiriama pasekmė sparčiai nyksta. Ėminių ėmimas baigus duoti dozę būtinas pagal tuos parametrus, kuriems būdingas trumpas plazmos pusinės eliminacijos laikas (pvz., COHb, CHE ir MetHb).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              1 lentelėje nurodyti klinikinės patologijos parametrai, kurie paprastai privalomi atliekant visus toksikologinius tyrimus. Nereikalaujama visada atlikti šlapimo analizę, tačiau ji gali būti atliekama, jeigu manoma, kad tai būtų naudinga atsižvelgiant į numatomą arba nustatytą toksiškumą. Kad būtų geriau apibūdintas bandomosios cheminės medžiagos toksiškumas, tyrimo vadovas gali nuspręsti įvertinti papildomus parametrus (pvz., cholinesterazė, lipidai, hormonai, rūgščių ir bazių balansas, methemoglobinas arba Heinco kūneliai, kreatino kinazė, mieloidų ir eritroidų santykis, troponinai, arterinio kraujo dujos, laktato dehidrogenazė, sorbitolio dehidrogenazė, glutamato dehidrogenazė ir gamaglutamiltranspeptidazė.)
                              
                                 1   lentelė
                              
                              
                                 Įprastiniai klinikinės patologijos parametrai
                              
                              
                                          Hematologiniai tyrimai
                                       
                                    
                                          Eritrocitų kiekis
                                          Hematokritas
                                          Hemoglobino koncentracija
                                          Vidutinis hemoglobino kiekis eritrocituose
                                          Vidutinis eritrocito tūris
                                          Vidutinė eritrocitų hemoglobino koncentracija
                                          Retikulocitai
                                       
                                       
                                          Bendras leukocitų kiekis
                                          Įvairių leukocitų kiekiai
                                          Trombocitų kiekis
                                          Krešėjimo aktyvumas (pasirinkti vieną rodiklį):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Protrombino laikas
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Krešėjimo laikas
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Dalinis tromboplastino laikas
                                                   
                                                
                                    
                                          Klinikinės chemijos tyrimai
                                       
                                    
                                          Gliukozė (9)
                                          
                                          Bendras cholesterolio kiekis
                                          Trigliceridai
                                          Kraujo šlapalo azoto kiekis
                                          Bendras bilirubino kiekis
                                          Kreatininas
                                          Bendras baltymų kiekis
                                          Albuminas
                                          Globulinas
                                       
                                       
                                          Alanino aminotransferazė
                                          Aspartato aminotransferazė
                                          Šarminė fosfatazė
                                          Kalis
                                          Natris
                                          Kalcis
                                          Fosforas
                                          Chloridas
                                       
                                    
                                          Šlapimo analizė (neprivaloma)
                                       
                                    
                                          Išvaizda (spalva ir drumstumas)
                                          Tūris
                                          Savitasis svoris arba osmosinis slėgis
                                          pH
                                       
                                       
                                          Bendras baltymų kiekis
                                          Gliukozė
                                          Kraujas ir (arba) kraujo kūneliai
                                       
                                    
                        
                              39.
                           
                           
                              Jeigu yra įrodymų, kad pagrindinė kaupimosi ir užsilaikymo vieta yra apatiniai kvėpavimo takai (t. y. alveolės), tada, norint kiekybiškai išanalizuoti prielaidomis pagrįsto dozės poveikio parametrus, daugiausia dėmesio skiriant alveolitui, plaučių uždegimui ir fosfolipidozei, būtų galima rinktis bronchoalveolinio plovimo (BAP) metodą. Šis metodas suteikia galimybę tinkamai ištirti dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybę ir per tam tikrą laiką įvykusius alveolių pažeidimų pokyčius. BAP skystis gali būti analizuojamas siekiant nustatyti įvairių leukocitų kiekius, bendrą baltymų kiekį ir laktato dehidrogenazę. Kiti parametrai, į kuriuos būtų galima atsižvelgti, yra parametrai, rodantys lizosomų pažeidimus, fosfolipidozę, fibrozę ir dirginamąjį arba alerginį uždegimą, galbūt įtraukiant uždegimą sukeliančių citokinų ir (arba) chemokinų tyrimą. BAP matavimais paprastai papildomi histopatologinių tyrimų rezultatai, tačiau BAP matavimai negali atstoti šių tyrimų rezultatų. Plaučių plovimo gairės pateiktos RD Nr. 39 (2).
                           
                        OFTALMOLOGINIS TYRIMAS
                  
                              40.
                           
                           
                              Naudojant oftalmoskopą arba lygiavertį įrenginį, prieš duodant bandomosios cheminės medžiagos dozę turėtų būti atliekami visų gyvūnų akies dugno, laužiamosios terpės, rainelės ir junginės oftalmologiniai tyrimai, o baigus duoti dozę – tokie pat didžiausiosios koncentracijos bei kontrolinės grupės tyrimai. Jeigu nustatoma akių pakitimų, turėtų būti tiriami ir visi kitų grupių, įskaitant pagalbinę (grįžtamumo tyrimų), gyvūnai.
                           
                        BENDROJI PATOLOGIJA IR ORGANŲ MASĖ
                  
                              41.
                           
                           
                              Turėtų būti visiškai nuleidžiamas visų bandomųjų gyvūnų, įskaitant nugaišusius atliekant bandymą arba numarintus ir pašalintus iš tyrimo gyvūnų gerovės sumetimais, kraujas (jeigu įmanoma) ir atliekamas šių gyvūnų bendrasis skrodimas. Turėtų būti užregistruotas laikas nuo kiekvieno paskutinio dozės davimo kiekvienam gyvūnui iki jo numarinimo. Jeigu skrodimo negalima atlikti iš karto po to, kai aptinkamas nugaišęs gyvūnas, gyvūnas turėtų būti laikomas pakankamai šaltoje vietoje (bet neužšaldomas), siekiant kuo labiau pristabdyti autolizę. Skrodimai turėtų būti atliekamai kaip galima anksčiau, paprastai – per dieną arba dvi. Visi dideli patologiniai pakitimai turėtų būti užregistruojami pagal kiekvieną gyvūną, ypatingą dėmesį skiriant kvėpavimo takų pakitimams.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              2 lentelėje nurodyti organai ir audiniai, kurie turėtų būti užkonservuojami atliekant bendrąjį skrodimą, naudojant histopatologiniam tyrimui tinkamą fiksavimo terpę. Skliausteliuose ([…]) nurodyti organai ir audiniai, taip pat kai kurie kiti organai ir audiniai, dėl kurių konservavimo sprendžia tyrimo vadovas. Paryškintuoju šriftu nurodytieji organai turėtų būti nuvalyti ir pasverti kaip galima greičiau po atskyrimo, kol neišdžiuvo. Skydliaukė ir sėklidžių prielipai turėtų būti sveriami tik esant reikalui, nes valymo įrankiai gali pakenkti histopatologiniam tyrimui. Audiniai ir organai turėtų būti fiksuojami 10 % buferiniame formaline arba kitokiame tinkamame fiksatyve kaip galima greičiau po skrodimo, ne mažiau kaip 24–48 valandos iki valymo, atsižvelgiant į ketinamą naudoti fiksatyvą.
                              
                                 2   lentelė
                              
                              
                                 Atliekant bendrąjį skrodimą konservuojami organai ir audiniai
                              
                              
                                 Antinksčiai
                              
                              Aorta
                              Kaulų čiulpai (ir (arba) šviežiai paruošta punkcija)
                              
                                 Smegenys (įskaitant didžiųjų smegenų, smegenėlių ir pailgųjų smegenų (smegenų tilto) išpjovas)
                              Akloji žarna
                              Gaubtinė žarna
                              Dvylikapirštė žarna
                              
                                 [Sėklidžių prielipai]
                              
                              [Akys (tinklainė, regos nervas) ir akių vokai]
                              Šlaunikaulis ir kelio sąnarys
                              Tulžies pūslė (jeigu yra)
                              [Harderio liaukos]
                              
                                 Širdis
                              
                              Klubinė žarna
                              Tuščioji žarna
                              
                                 Inkstai
                              
                              [Ašarų liaukos (viršakiduobinės)]
                              Gerklos (trys lygiai, įskaitant antgerklio pagrindą)
                              
                                 Kepenys
                              
                              
                                 Plaučiai (visos vieno lygmens skiltys, įskaitant pagrindinius bronchus)
                              Limfmazgiai, imami iš plaučių vartų srities, ypač jeigu tiriamos mažo tirpumo kietųjų dalelių bandomosios cheminės medžiagos. Atliekant nuodugnesnius tyrimus, per kuriuos nagrinėjami imuniniai aspektai, gali būti imama daugiau mazgų, pvz., iš tarpuplaučio, kaklo, pažandžių ir (arba) ausų sričių.
                              Limfmazgiai (labiausiai nutolę nuo infekcijos vartų)
                              Pieno liauka (patelių)
                              Raumuo (šlaunies)
                              Nosiaryklės audiniai (ne mažiau keturių lygių; į vieną lygį įtraukiant nosiaryklės latakus ir nosies limfinius audinius (NLA))
                              Stemplė
                              [Uoslės receptoriai]
                              
                                 Kiaušidės
                              
                              Kasa
                              Prieskydinės liaukos
                              Periferinis nervas (sėdimasis arba blauzdikaulio, pageidautina, arti raumens)
                              Hipofizė
                              Prostata
                              Tiesioji žarna
                              Seilių liaukos
                              Sėklinės pūslelės
                              Oda
                              Stuburo smegenys (sprando, krūtinės ląstos ir juosmens)
                              
                                 Blužnis
                              
                              Krūtinkaulis
                              Skrandis
                              Dantys
                              
                                 Sėklidės
                              
                              
                                 Užkrūčio liauka
                              
                              
                                 Skydliaukės
                              
                              [Liežuvis]
                              Trachėja (ne mažiau kaip du lygiai, iš kurių vienas – išilginis keteros pjūvis, ir vienas – skersinis pjūvis
                              [Šlapimtakis]
                              [Šlaplė]
                              Šlapimo pūslė
                              
                                 Gimda
                              
                              Tiksliniai organai
                              Visi labai pakitę audiniai ir jų masės
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Plaučiai turėtų būti išimami sveiki, pasveriami ir apdorojami tinkamu fiksatyvu užtikrinant 20–30 cm vandens sluoksnio slėgį, kad būtų išsaugota plaučių struktūra (5). Išpjovos turėtų būti imamos iš visų vieno lygmens skilčių, įskaitant pagrindinius bronchus, bet, jeigu atliekamas plaučių plovimas, neišplautos skiltys turėtų būti išpjaunamos trimis lygmenimis (ne iš eilės).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Tiriami ne mažiau kaip keturių lygių nosiaryklės audiniai; vienas iš jų turėtų būti nosinės ryklės angos audinys (5) (6) (7) (8) (9), kad būtų galima tinkamai ištirti ragėjantįjį, pereinamąjį (be blakstienėlių, kvėpuojamąjį), kvėpuojamąjį (su blakstienėlėmis, kvėpuojamąjį) ir uodžiamąjį epitelius bei limfodrenažinį audinį (NALT) (10) (11). Turėtų būti ištirti trys gerklų lygiai; vienas iš jų turėtų būti antgerklio pagrindas. Turėtų būti ištirti ne mažiau kaip du trachėjos lygiai; vienas iš jų turėtų būti išilginis pagrindinių bronchų išsišakojimo keteros pjūvis ir vienas – skersinis pjūvis.
                           
                        HISTOPATOLOGINIS TYRIMAS
                  
                              45.
                           
                           
                              Turėtų būti atliktas visų 2 lentelėje nurodytų organų ir audinių histopatologinis tyrimas, apimantis kontrolinę ir didžiausiosios koncentracijos grupes, taip pat visus gyvūnus, kurie tyrimo metu nugaišo arba buvo numarinti. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas kvėpavimo takams, tiksliniams organams ir labai pakitusiems audiniams. Visose grupėse turėtų būti tiriami didžiausiosios koncentracijos grupės gyvūnų organai ir audiniai, dėl kurių nustatyta pakitimų. Norėdamas įrodyti aiškią reakciją į tam tikrą koncentraciją, tyrimo vadovas gali nuspręsti atlikti papildomų grupių histopatologinius tyrimus. Jeigu naudojama pagalbinė (grįžtamumo tyrimų) grupė, atliekant histopatologinį tyrimą turėtų būti tiriami visi audiniai ir organai, kuriems padarytas poveikis dozę gavusiose grupėse. Jeigu didžiausiosios koncentracijos grupėje nebaigus bandymo nugaišta labai daug gyvūnų ar kyla kitokių problemų, mažinančių duomenų reikšmingumą, turėtų būti atliktas kito pagal dydį (mažesnio) koncentracijos lygio histopatologinis tyrimas. Reikėtų mėginti rasti sąsajų tarp bendrųjų stebėjimų ir mikroskopinės analizės rezultatų.
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITOS
                  
                     Duomenys
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Turėtų būti pateikti kiekvieno gyvūno kūno masės, pašarų suvartojimo, klinikinės patologijos tyrimų, organų masės ir histopatologinių tyrimų duomenys. Klinikinių stebėjimų duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, pagal kiekvieną bandomąją grupę nurodant naudotų gyvūnų skaičių, gyvūnų, kuriems pasireiškė toksiškumo požymių, skaičių, atliekant bandymą nugaišusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičių, kiekvieno gyvūno žūties laiką, taip pat pateikiant toksinio poveikio aprašymą, pasireiškimo laiką ir grįžtamumą, skrodimo išvadas. Visi rezultatai – kiekybiniai ir papildomi – turėtų būti įvertinti taikant tinkamą statistinį metodą. Gali būti taikomas bet kuris visuotinai pripažintas statistinis metodas; statistiniai metodai turėtų būti parenkami planuojant tyrimą.
                           
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikta tokia informacija (jeigu taikytina):
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomieji gyvūnai ir jų laikymas
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Laikymo sąlygų aprašymas, nurodant gyvūnų skaičių narvelyje (arba skaičiaus pokytį), kraiko medžiagą, aplinkos temperatūrą ir santykinį drėgnį, šviesos ir tamsos kaitą paros metu ir šėrimo režimą.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Naudota rūšis (padermė) ir, jeigu tai ne žiurkės, kitos rūšies naudojimo pagrindimas. Gali būti pateikti pirminiai ir istoriniai duomenys, jeigu jie susiję su gyvūnais, kuriems buvo taikomos panašios poveikio, laikymo ir nešėrimo sąlygos.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Gyvūnų skaičius, amžius ir lytis.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Atsitiktinės atrankos metodas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Prieš bandymą sudarytų sąlygų aprašymas, nurodant šėrimo režimą, izoliavimo ir apsaugos nuo ligų būdą.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Fizinė būsena, grynumas ir, jeigu taikytina, fizinės ir cheminės savybės (įskaitant izomeriją).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Identifikavimo duomenys ir Cheminių medžiagų santrumpų tarnybos (angl. CAS) registracijos numeris, jeigu jis žinomas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nešiklis
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nešiklio naudojimo pagrindimas ir nešiklio parinkimo pagrindimas (jeigu tai ne vanduo).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Istoriniai arba vienalaikiai duomenys, įrodantys, kad nešiklis nedaro neigiamo poveikio tyrimo rezultatams.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhaliacinė kamera
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Išsamus inhaliacinės kameros aprašas, nurodant tūrį ir pateikiant diagramą.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Įrangos, naudotos darant poveikį gyvūnams ir kuriant atmosferą, šaltinis ir aprašas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Temperatūros, drėgnio, dalelių dydžio ir faktinės koncentracijos matavimo įranga.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Oro šaltinis ir kondicionavimo sistema.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Įrangos kalibravimo siekiant užtikrinti homogenišką bandymo atmosferą metodai.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Slėgių skirtumas (teigiamas ar neigiamas).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kameroje esančios dozės davimo angos (jeigu dozė duodama tik per nosį); gyvūnų vieta kameroje (jeigu dozė duodama per visą kūną).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Bandymo atmosferos pastovumas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Temperatūros ir drėgnio jutiklių vieta ir kameroje sukurtos bandymo atmosferos ėminių ėmimas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tiekiamo ir (arba) ištraukiamo oro apdorojimas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Oro srauto greičiai, per dozės davimo angą tekančio oro srauto greitis (jeigu dozė duodama tik per nosį) arba gyvūnų kiekis kameroje (jeigu dozė duodama per visą kūną).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Inhaliacinės kameros pusiausvyros pasiekimo laikas (t95).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tūrio pokyčių kiekis per valandą.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Matavimo prietaisai (jeigu naudojami).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Poveikio duomenys
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tikslinės koncentracijos parinkimo pagrindiniam tyrimui pagrindimas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Vardinės koncentracijos (inhaliacinėje kameroje sukurtos bandomosios cheminės medžiagos bendrosios masės ir viso per kamerą perleisto oro srauto tūrio santykis).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Faktinės bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, nustatytos gyvūnų kvėpavimo zonoje; jeigu bandomi mišiniai, įgaunantys įvairias fizines būsenas (dujos, garai, aerozoliai), kiekviena iš šių būsenų gali būti analizuojama atskirai.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Visos koncentracijos ore turėtų būtų nurodomos masės vienetais (pvz., mg/l, mg/m3 ir t. t.), o ne tūrio vienetais (pvz., ppm, ppb ir t. t.).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Dalelių dydžio pasiskirstymas, masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) ir geometrinis standartinis nuokrypis (σg), nurodant jų apskaičiavimo metodus. Turėtų būti pateiktos atliktos atskiros dalelių dydžio analizės.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos paruošimą, nurodant procedūras, taikytas siekiant sumažinti kietųjų medžiagų dalelių dydį arba paruošti bandomosios cheminės medžiagos tirpalus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Įrangos, naudotos kuriant bandymo atmosferą ir veikiant gyvūnus bandymo atmosfera, aprašas (pageidautina, pateikiant diagramą).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Išsami informacija apie įrangą, naudotą stebėti kameros temperatūrą, drėgnį ir oro srautą kameroje (t. y. kalibravimo kreivės nubrėžimas).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Išsami informacija apie įrangą, naudotą imti ėminius, skirtus nustatyti kameroje susidariusią koncentraciją ir dalelių dydžio pasiskirstymą.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Išsami informacija apie taikytą cheminės analizės metodą ir metodo tinkamumo patvirtinimą (nurodant bandomosios cheminės medžiagos regeneravimo iš ėminių ėmimo terpės veiksmingumą).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Atsitiktinės atrankos, taikytos suskirstant gyvūnus į bandomąją ir kontrolinę grupes, metodas.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (nurodant pašaro tipą ir (arba) šaltinį, vandens šaltinį).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Bandomųjų koncentracijų parinkimo pagrindimas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatai
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kameros temperatūrų, drėgnio ir oro srautų lentelės.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kameros vardinės ir faktinės koncentracijos duomenų lentelės.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Dalelių dydžių lentelės, pateikiant analizinių ėminių ėmimo duomenis, dalelių dydžių pasiskirstymą ir MMAS bei σg skaičiavimus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kiekvieno gyvūno reakcijos duomenų ir koncentracijos lygio lentelės (t. y. gyvūnų, kuriems pasireiškė toksiškumo požymių, įskaitant gaištamumą, poveikio pobūdį, sunkumą, pasireiškimo laiką ir trukmę).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kiekvieno gyvūno masės lentelės.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Pašaro suvartojimo lentelės.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Klinikinės patologijos duomenų lentelės.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Kiekvieno gyvūno skrodimo išvados ir histopatologinių tyrimų rezultatai, jeigu yra.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatų aptarimas ir aiškinimas
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas metodų, taikytų siekiant laikytis šio bandymo metodo kriterijų, pvz., susijusių su ribine koncentracija arba dalelių dydžiu, aprašymui.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Atsižvelgiant į bendruosius rezultatus, turėtų būti aprašyta dalelių įkvėpimo galimybė, ypač jeigu nebuvo įmanoma taikyti dalelių dydžio kriterijaus.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Pateikiant bendrąjį tyrimo vertinimą, turėtų būti nurodytas metodų, taikytų nustatyti vardines ir faktines koncentracijas, nuoseklumas ir faktinės koncentracijos santykis su vardine koncentracija.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Turėtų būti aprašyta tikėtina žūties priežastis ir vyraujantis veikimo būdas (sisteminis ar vietinis).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Atsižvelgiant į OECD rekomendaciniame dokumente dėl pasekmių žmonėms (3) nustatytus kriterijus, turėtų būti pateiktas paaiškinimas, ar kilo poreikis humaniškai numarinti gyvūnus, patiriančius skausmą arba sunkią ilgalaikę kančią.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Turėtų būti nurodytas (-i) tikslinis (-iai) organas (-ai).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Turėtų būti apibrėžti nepastebimo neigiamo poveikio lygis (NNPL) ir mažiausio pastebimo neigiamo poveikio lygis (MPNPL).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation, Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Whalan.E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229–258.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231–238.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419–428.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies keičiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006, OL L 353, 2008 12 31, p. 1.
                           
                        
                     1 priedėlis
                     APIBRĖŽTIS
                     Bandomoji cheminė medžiaga– naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga arba mišinys.
                  
                  B.30.   LĖTINIO TOKSIŠKUMO TYRIMAI
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 452 (OECD bandymo gairės Nr. 452) (2009). Originalios bandymo gairės TG 452 priimtos 1981 m. Šis atnaujintasis B.30 bandymo metodas parengtas atsižvelgiant į poreikį įvertinti naujausius pasiekimus gyvūnų gerovės srityje ir norminių reikalavimų pasikeitimus (1) (2) (3) (4). B.30 bandymo metodas buvo atnaujinamas kartu su šio priedo B.32 skyriumi „Kancerogeniškumo tyrimai“ ir šio priedo B.33 skyriumi „Jungtiniai lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimai“, siekiant gauti papildomos informacijos remiantis per tyrimą naudotais gyvūnais ir pateikti išsamesnių rekomendacijų dėl dozės parinkimo. Šis bandymo metodas skirtas taikyti bandant labai įvairias chemines medžiagas, įskaitant pesticidus ir pramonines chemines medžiagas.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Daugelis lėtinio toksiškumo tyrimų atliekami naudojant graužikų rūšis, todėl šis metodas pirmiausia taikytinas tyrimams, atliekamiems naudojant šias rūšis. Jeigu tokius tyrimus reikėtų atlikti naudojant ne graužikų rūšis, jiems taip pat gali būti taikomi aprašant šį bandymo metodą ir šio priedo B.27 skyriuje „90 dienų kartotinės dozės toksiškumo per virškinamąjį traktą ne graužikams tyrimas“ (5) išdėstyti principai ir procedūros su atitinkamais pakeitimais, kaip aprašyta OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 dėl lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimų planavimo ir atlikimo.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Atliekant lėtinio toksiškumo tyrimus, dozė paprastai gali būti duodama trimis būdais – per burną, per odą ir per kvėpavimo takus. Dozės davimo būdas parenkamas atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos fizines ir chemines savybes ir labiausiai paplitusį poveikio žmonėms būdą. Daugiau informacijos apie poveikio būdo parinkimą pateikta OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas iš esmės skirtas poveikio per virškinamąjį traktą būdui, nes šis būdas dažniausiai taikomas atliekant lėtinio toksiškumo tyrimus. Norint įvertinti žmonių sveikatai gresiančią riziką ir (arba) laikantis tam tikros reglamentavimo tvarkos gali reikėti atlikti ilgalaikio lėtinio toksiškumo tyrimus, per kuriuos dozė būtų duodama per odą ir kvėpavimo takus, tačiau techniniu požiūriu abu poveikio būdai yra gana sudėtingi. Šie tyrimai turės būti planuojami atsižvelgiant į konkretų atvejį, tačiau čia aprašytu bandymo metodu, skirtu įvertinti lėtinį toksiškumą, kai dozė duodama per burną, gali būti remiamasi rengiant inhaliacinių ir (arba) odinių tyrimų protokolą, atsižvelgiant į rekomendacijas dėl poveikio laikotarpių, klinikinių ir patologinių parametrų ir t. t. Yra parengtos OECD rekomendacijos dėl bandomųjų cheminių medžiagų dozių davimo per kvėpavimo takus (6) (7) ir per odą (6). Planuojant ilgesnius tyrimus, per kuriuos dozės duodamos per kvėpavimo takus, pirmiausia turėtų būti remiamasi šio priedo B.8 skyriumi (8) ir šio priedo B.29 skyriumi (9), taip pat OECD rekomendaciniu dokumentu dėl ūmaus poveikio įkvėpus bandymų (7). Jeigu bandymai atliekami taikant poveikio per odą būdą, turėtų būti remiamasi šio priedo B.9 skyriumi (10).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Atliekant lėtinio toksiškumo tyrimą gaunama informacijos apie galimus pavojus sveikatai, galinčius kilti dėl kartotinio poveikio gana ilgu naudojamos rūšies gyvūnų gyvenimo laikotarpiu. Tyrimas suteikia informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos toksinį poveikį, padeda nustatyti tikslinius organus ir kaupimosi galimybę. Be to, jis gali padėti apytiksliai nustatyti nepastebimo neigiamo poveikio lygį, kuris gali būti naudojamas nustatant saugaus poveikio žmonėms kriterijus. Taip pat pabrėžiamas gyvūnų kruopščių klinikinių stebėjimų būtinumas, kad būtų gauta kuo daugiau informacijos.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Pagal šį bandymo metodą atliekamų tyrimų tikslai:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          bandomosios cheminės medžiagos lėtinio toksiškumo nustatymas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          tikslinių organų nustatymas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybės apibūdinimas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          nepastebimo neigiamo poveikio lygio (NNPL) arba orientacinės dozės (OD) nustatymo pagrindo nustatymas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          žmonėms taikomų poveikio lygių lėtinio toksinio poveikio prognozavimas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          duomenų teikimas rengiant bandymų hipotezes dėl veikimo būdo (6).
                                       
                                    
                        PIRMINIAI ASPEKTAI
                  
                              7.
                           
                           
                              Vertindama bandomosios cheminės medžiagos toksines savybes, bandymų laboratorija, prieš atlikdama tyrimą, turėtų apsvarstyti visą turimą informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą, kad planuojant tyrimą pirmiausia būtų siekiama padidinti lėtinio toksiškumo tyrimo veiksmingumą ir sumažinti gyvūnų naudojimą. Parengti tyrimo planą padės informacija apie bandomosios cheminės medžiagos tapatumą, cheminę struktūrą, fizines ir chemines savybes, veikimo būdą, taip pat toksiškumo bandymų in vitro arba in vivo rezultatai, numatomas (-i) panaudojimo būdas (-ai) ir galimas poveikis žmogui, turimi (Q)SAR duomenys ir toksikologiniai duomenys apie panašios struktūros chemines medžiagas, turimi toksikokinetiniai duomenys (vienos dozės ir, jeigu yra, kartotinės dozės kinetinės savybės) ir duomenys, gauti atlikus kitus kartotinio poveikio tyrimus. Lėtinis toksiškumas turėtų būti nustatomas tik gavus pirminės informacijos apie toksiškumą, pagrįstos 28 dienų ir (arba) 90 dienų kartotinės dozės toksiškumo bandymais. Atliekant bendrąjį konkrečios bandomosios cheminės medžiagos galimo neigiamo poveikio sveikatai vertinimą, turėtų būti apsvarstyta galimybė taikyti etapinį lėtinio toksiškumo bandymo metodą (11) (12) (13) (14).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Prieš pradedant tyrimą, atsižvelgiant į bandymo planą ir tikslus, turėtų būti nustatyti tinkamiausi statistiniai rezultatų analizės metodai. Turėtų būti apsvarstyta, ar rengiant statistinius duomenis turėtų būti atlikta pataisa atsižvelgiant į išgyvenimo rodiklius ir analizė pirmalaikio vienos arba daugiau grupių pašalinimo atveju. Rekomendacijų dėl tinkamos statistinės analizės ir pagrindinės informacijos apie tarptautiniu mastu pripažintus statistinius metodus pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6), taip pat rekomendaciniame dokumente Nr. 35 dėl lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimų analizės ir vertinimo (15).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Atliekant lėtinio toksiškumo tyrimą, visada turėtų būti atsižvelgiama į pagrindinius principus ir aspektus, išdėstytus OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 19 dėl klinikinių požymių, kaip pasekmių žmonėms, pasireiškimo vertinant saugumą naudojamiems bandomiesiems gyvūnams pripažinimo, vertinimo ir taikymo (16), pirmiausia jo 62 skirsnyje. Tame skirsnyje teigiama: „Jeigu per kartotinės dozės tyrimus gyvūnams pasireiškia klinikinių požymių, kurie progresuoja ir dėl kurių toliau prastėja sveikatos būklė, turėtų būti priimtas informacija pagrįstas sprendimas, ar nereikėtų humaniškai numarinti gyvūno. Priimant sprendimą turėtų būti atsižvelgiama į informacijos, kuri būtų gauta tęsiant tyrimą su šiuo gyvūnu, vertės ir šio gyvūno bendrosios būklės santykį. jeigu nusprendžiama tęsti bandymą su šiuo gyvūnu, atsižvelgiant į poreikį, turėtų būti padidintas stebėjimų dažnumas. Be to, galbūt būtų įmanoma labai nepakenkiant bandymo tikslui laikinai nutraukti dozės davimą, jeigu dėl to sumažėtų skausmas ar kančia, arba sumažinti bandomąją dozę.“
                              
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Išsamių rekomendacijų dėl dozės parinkimo lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimams principų ir jų svarstymų pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6), taip pat Tarptautinio gamtos mokslų instituto leidiniuose (17) (18). Pagrindinė dozės parinkimo strategija priklauso nuo tyrimo pagrindinio tikslo arba tikslų (6 skirsnis). Parenkant tinkamus dozių dydžius, pavojų atranka turėtų būti vykdoma atsižvelgiant į mažų dozių sukeliamas reakcijas ir į tų pavojų reikšmę. Tai ypač svarbu tada, kai ketinama atlikti jungtinį lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimą (šio priedo B.33 skyrius) (11 skirsnis).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Turėtų būti apsvarstyta galimybė atlikti jungtinį lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimą (šio priedo B.33 skyrius), o ne atskirai atlikti lėtinio toksiškumo tyrimą (B.30 bandymo metodas) ir kancerogeniškumo tyrimą (šio priedo B.32 skyrius). Palyginti su dviem atskirais tyrimais, atliekant bendrą bandymą užtikrinamas didesnis veiksmingumas laiko ir išlaidų požiūriu, neprarandant duomenų kokybės nei lėtinio poveikio, nei kancerogeniškumo bandymo etapu. Tačiau, atliekant jungtinį lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimą (šio priedo B.33 skyrius), turėtų būti kruopščiai apsvarstyti dozės parinkimo principai (9 ir 20–25 skirsniai); be to, pripažinta, kad pagal tam tikras reglamentavimo sistemas gali reikėti atlikti atskirus tyrimus.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Aprašant šį bandymo metodą vartojamos apibrėžtys pateiktos šio skyriaus pabaigoje ir rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6).
                           
                        BANDYMO PRINCIPAS
                  
                              13.
                           
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga kasdien skirtingomis dozėmis duodama kelioms bandomųjų gyvūnų grupėms; įprastas dozės davimo laikotarpis – 12 mėnesių, tačiau, atsižvelgiant į norminius reikalavimus, gali būti taikomos ilgesnės arba trumpesnės trukmės (žr. 33 skirsnį). Ši trukmė parenkama taip, kad būtų pakankamai ilga, jog aiškiai pasireikštų kaupiamasis toksiškumas, tačiau jis nebūtų painiojamas su senėjimo pakitimais. Jeigu pasirenkama ne 12 mėnesių trukmė, ji turėtų būti pagrįsta, ypač jeigu ta trukmė trumpesnė nei 12 mėnesių. Bandomoji cheminė medžiaga paprastai duodama per burną, tačiau gali būti tinkamas ir dozės davimas per kvėpavimo takus arba per odą. Pagal tyrimo planą taip pat gali būti numatyta vienas arba daugiau kartu marinti gyvūnus nebaigus bandymo, pvz., po trijų ir šešių mėnesių; šiuo tikslu gali būti įtraukiamos papildomos gyvūnų grupės (žr. 19 skirsnį). Dozių davimo laikotarpiu atidžiai stebima, ar gyvūnams nepasireiškė toksiškumo požymių. Bandymo metu nugaišę arba numarinti gyvūnai skrodžiami, o baigus bandymą numarinami ir skrodžiami išgyvenę gyvūnai.
                           
                        METODO APRAŠYMAS
                  
                     Gyvūnų rūšies parinkimas
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Šiuo bandymo metodu pirmiausia vertinamas graužikams pasireiškiantis lėtinis toksiškumas (žr. 2 skirsnį), tačiau pripažįstama, kad pagal tam tikras reglamentavimo tvarkas gali reikėti atlikti panašius ne graužikų tyrimus. Gyvūnų rūšies pasirinkimas turėtų būti pagrįstas. Ne graužikų rūšims pasireiškiančio lėtinio toksiškumo tyrimų planas ir atlikimas prireikus turėtų būti grindžiami aprašant šį bandymą ir šio priedo B.27 skyriuje „90 dienų kartotinės dozės toksiškumo per virškinamąjį traktą ne graužikams tyrimas“ (5) išdėstytais principais. Daugiau informacijos apie gyvūnų rūšies ir padermės pasirinkimą pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6).
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Pagal šį bandymo metodą pirmenybė teikiama žiurkėms, tačiau gali būti naudojami ir kitų rūšių graužikai, pvz., pelės. Žiurkės ir pelės yra tinkamiausi bandomieji gyvūnai, nes jų gyvenimo trukmė palyginti trumpa, jos plačiai naudojamos atliekant farmakologinius ir toksikologinius tyrimus, jos jautrios auglių sukėlimui, yra pakankami gerai aprašytų padermių. Atsižvelgiant į šias savybes, yra daug informacijos apie jų fiziologiją ir patologiją. Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių padermių gyvūnai. Lėtinio toksiškumo tyrimas turėtų būti atliekamas naudojant tos pačios padermės ir iš to paties šaltinio gautus gyvūnus, kaip ir naudotieji per trumpesnės trukmės išankstinį (-ius) toksiškumo tyrimą (-us). Patelės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos.
                           
                        
                     Laikymo ir šėrimo sąlygos
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Gyvūnai gali būti laikomi po vieną arba mažomis tos pačios lyties grupėmis; galimybė laikyti gyvūnus po vieną turėtų būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu tai moksliškai pagrįsta (19) (20) (21). Narveliai turėtų būti išdėstyti taip, kad galimas narvelių išdėstymo poveikis tyrimo rezultatams turėtų būtų kuo mažesnis. Bandomųjų gyvūnų laikymo patalpos temperatūra turėtų būti 22 °C (± 3 °C). Nors santykinis drėgnis turėtų būti ne mažesnis kaip 30 % ir, pageidautina, ne didesnis kaip 70 % (išskyrus patalpų valymo metą), turėtų būti siekiama palaikyti 50–60 % santykinį drėgnį. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Šėrimo režimas turėtų atitikti visus bandomųjų gyvūnų rūšies mitybos reikalavimus; pašaro sudėtyje turėtų būti kuo mažiau teršalų, įskaitant (be kitų teršalų) pesticidų likučius, patvariuosius organinius teršalus, fitoestrogenus, sunkiuosius metalus ir mikotoksinus. Turėtų būti periodiškai – bent pradedant tyrimą ir pasikeitus naudojamai partijai – parengiama analitinė informacija apie pašarines medžiagas ir pašaro sudėtyje esančių teršalų lygius; ši informacija turėtų būti pateikta galutinėje ataskaitoje. Turėtų būti rengiama atitinkama analitinė informacija apie tyrimo metu naudojamą geriamąjį vandenį. Pašaro parinkimui gali turėti įtakos poreikis tinkamai įmaišyti bandomąją cheminę medžiagą ir laikytis gyvūnų mitybos reikalavimų, kai bandomoji cheminė medžiaga duodama su pašaru.
                           
                        
                     Gyvūnų paruošimas
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojami sveiki gyvūnai, ne trumpiau kaip septynias paras pratinti prie laboratorinių sąlygų ir anksčiau nenaudoti kitiems bandymams. Jeigu naudojami graužikai, dozė gyvūnams turėtų būti pradedama duoti kaip galima anksčiau po atjunkymo ir pripratinimo, pageidautina, ne vėliau nei gyvūnams sueina aštuonios savaitės. Gyvūnai turėtų būti apibūdinti nurodant rūšį, padermę, šaltinį, lytį, masę ir amžių. Pradedant tyrimą kiekvienos lyties gyvūnų kūno masės skirtumai turi būti kuo mažesni ir pagal kiekvieną lytį nenukrypti nuo visų tyrime dalyvaujančių gyvūnų kūno masės vidurkio daugiau kaip ± 20 %. Gyvūnai turėtų būti atsitiktine tvarka suskirstyti į kontrolines ir bandomąsias grupes. Gyvūnus suskirsčius atsitiktine tvarka, grupių vidutinės kūno masės pagal lytį neturėtų smarkiai skirtis. Jeigu yra statistiniu požiūriu didelių skirtumų, atsitiktinis suskirstymo etapas turėtų būti pakartotas (jeigu tai įmanoma). Kiekvienam gyvūnui turėtų būti suteiktas unikalus identifikavimo numeris, kuriuo gyvūnas visam laikui pažymimas jį ištatuiruojant, implantuojant mikroschemą arba kitu tinkamu būdu.
                           
                        PROCEDŪRA
                  
                     Gyvūnų skaičius ir lytis
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojami abiejų lyčių gyvūnai. Turėtų būti naudojama tiek gyvūnų, kad baigus tyrimą kiekvienoje grupėje liktų pakankamai gyvūnų išsamiai biologinei ir statistinei analizei. Jeigu naudojami graužikai, kiekvieno dydžio dozei skirtos grupės paprastai sudaromos iš 20 patinų ir 20 patelių; jeigu naudojami ne graužikai, rekomenduojama grupes sudaryti iš ne mažiau kaip keturių patinų ir keturių patelių. Jeigu tyrimams naudojamos pelės, į kiekvieno dydžio dozei skirtą grupę gali reikėti įtraukti daugiau gyvūnų, kad būtų galima atlikti visus reikiamus hematologinius tyrimus.
                           
                        
                     Rezervo sudarymas atsižvelgiant į gyvūnų marinimą nebaigus bandymo, pagalbinių grupių sudarymas ir kontrolinių gyvūnų parūpinimas
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Jeigu tai moksliškai pagrįsta, rengiantis tyrimui gali būti sudarytas rezervas (ne mažiau kaip po 10 kiekvienos lyties gyvūnų kiekvienoje grupėje) atsižvelgiant į gyvūnų marinimą nebaigus bandymo, pvz., po šešių mėnesių, kad būtų galima gauti informacijos apie toksikologinių pakitimų vystymąsi ir mechanistinės informacijos. Jeigu tokios informacijos apie bandomąją cheminę medžiagą jau turima remiantis anksčiau atliktais kartotinės dozės toksiškumo tyrimais, gyvūnų marinimo nebaigus bandymo moksliškai pagrįsti negalima. Taip pat gali būti naudojamos pagalbinės grupės, skirtos stebėti galimų tiriamos bandomosios cheminės medžiagos sukeltų toksikologinių pakitimų grįžtamumą; šios grupės paprastai naudojamos tik didžiausiajai tyrimo dozei ir kontrolei. Be to, gali būti numatyta papildoma kontrolinių gyvūnų grupė (paprastai – po penkis kiekvienos lyties gyvūnus), skirta prireikus stebėti ligos būklę tyrimo metu (22). Jeigu numatytas gyvūnų marinimas nebaigus bandymo arba pagalbinių ar kontrolinių grupių naudojimas, tyrimo plane numatytas gyvūnų skaičius turėtų būti padidintas numatytu nebaigus tyrimo numarinti gyvūnų skaičiumi. Šie gyvūnai turėtų stebimi taip pat, kaip pagrindinio tyrimo lėtinio toksiškumo etapo gyvūnai, įskaitant kūno masės stebėjimą, pašarų ir vandens suvartojimo stebėjimą, hematologinius ir klinikinės biochemijos matavimus ir patologinius tyrimus, tačiau taip pat gali būti numatyta (grupėse, kuriose numatytas gyvūnų marinimas nebaigus bandymo) atlikti tik tokius matavimus, kurie yra susiję su specifiniais, pagrindiniais matais, pvz., neurotoksiškumu arba imunotoksiškumu.
                           
                        
                     Dozių dydžių grupės ir dozuotė
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Rekomendacijos dėl visų su dozių dydžių parinkimu ir dozių dydžių skirtumų nustatymu susijusių aspektų pateiktos rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6). Turėtų būti naudojamos bent trijų dydžių dozės ir taikoma vienalaikė kontrolė, išskyrus atvejus, kai atliekamas ribinis bandymas (žr. 27 skirsnį). Dozių dydžiai paprastai grindžiami trumpesnio laikotarpio kartotinių dozių arba ribų nustatymo tyrimų rezultatais ir turėtų būti nustatomi atsižvelgiant į visus turimus toksikologinius ir toksikokinetinius duomenis apie bandomąją medžiagą arba panašias chemines medžiagas.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Jeigu dozė neturėtų būti ribojama atsižvelgiant į bandomosios medžiagos fizines ir chemines savybes arba biologinį poveikį, didžiausioji dozė paprastai turėtų būti parenkama tokia, kad būtų galima nustatyti pagrindinius tikslinius organus ir toksinį poveikį, nesukeliant kančios, sunkaus toksiškumo, liguistumo arba žūties. Atsižvelgiant į toliau 22 skirsnyje išdėstytus veiksnius, didžiausioji dozė turėtų būti parenkama tokia, kad ją taikant būtų sukeliami pastebimi toksiškumo požymiai, pvz., pasireiškiantys kūno masės prieaugio sumažėjimu (apie 10 %).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Tačiau, atsižvelgiant į tyrimo tikslus (žr. 6 skirsnį), didžiausioji dozė gali būti parinkta mažesnė už dozę, kurią taikant būtų pastebimi toksiškumo požymiai, pvz., jeigu taikant dozę sukeliamas dominantis neigiamas poveikis, turintis nedidelės įtakos gyvenimo trukmei arba kūno masei. Didžiausioji dozė neturėtų viršyti 1 000 mg/kg kūno masės per parą (ribinė dozė, žr. 27 skirsnį).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Dozių dydžiai ir dozių dydžių skirtumai gali būti parinkti tokie, kad būtų galima nustatyti dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybę ir NNPL arba gauti kitokį siekiamą tyrimo rezultatą, pvz., nustatyti orientacinę dozę (OD) (žr. 25 skirsnį) taikant mažiausiąją dozę. Nustatant mažesniąsias dozes, turėtų būti atsižvelgiama į tokius veiksnius, kaip numatomas dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivės nuolydis, dozės, kurias taikant atsiranda reikšmingų metabolizmo arba toksinio poveikio būdo pokyčių, kai tikimasi gauti ribinę vertę arba atskaitos tašką mažiausiosios dozės ekstrapoliavimui.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Dozių dydžių skirtumai parenkami atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos savybes ir aprašant šį metodą negali būti iš anksto numatyti, tačiau tinkamas bandymų veiksmingumas dažnai užtikrinamas tada, kai nustatant mažėjančius dozių dydžius taikomi koeficientai nuo 2 iki 4; be to, jeigu taikomi labai dideli dozių dydžių skirtumai (pvz., taikomi didesni koeficientai nei 6–10), dažnai patartina naudoti ketvirtąją bandomąją grupę. Apskritai reikėtų vengti taikyti didesnius koeficientus nei 10; jeigu tokie taikomi, jie turėtų būti pagrindžiami.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Kaip išsamiau aprašyta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6), konkrečios dozės turėtų būti nustatomos atsižvelgiant į tokius veiksnius:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          žinomus arba numanomus netiesiškumus arba dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivės išlinkio taškus,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toksikokinetines savybes ir dozių intervalus, kuriuose pasireiškia metabolizmo paskatinimo, įsotinimo efektai arba išorinės ir vidinės dozių tarpusavio netiesiškumas, arba kuriuose nurodytųjų dalykų nepasireiškia,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pirminius pakitimus, poveikio rodiklius arba pagrindinių aiškiai nepastebimų biologinių procesų veikimo požymius,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pagrindinius (arba numanomus) veikimo būdo aspektus, pvz., dozes, kurias taikant pradeda reikštis citotoksiškumas, sutrikdomi hormonų lygiai, nustelbiami homeostaziniai mechanizmai ir t. t.,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivės sritis, kuriose būtina atlikti ypač tikslius vertinimus, pvz., numanomos orientacinės dozės (OD) arba numanomos ribinės vertės sritis,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          numanomus poveikio žmonėms lygius.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Kontrolinė grupė – tai dozės negaunančių gyvūnų grupė arba nešiklio kontrolės grupė, jeigu bandomajai cheminei medžiagai duoti naudojamas nešiklis. Išskyrus poveikį bandomąja chemine medžiaga, su kontrolinės grupės gyvūnais turėtų būti elgiamasi lygiai taip pat, kaip su bandomųjų grupių gyvūnais. Naudojant nešiklį, kontrolinės grupės gyvūnams duodamas didžiausias nešiklio tūris, skiriamas dozę gaunančioms grupėms. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga duodama su pašaru ir dėl prastesnio skonio gyvūnai suvartoja mažiau pašaro, gali būti naudinga pasitelkti papildomą kartu šeriamą kontrolinę grupę, kad būtų užtikrinta geresnė kontrolė.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Jeigu, remiantis išankstinių tyrimų informacija, galima numatyti, kad, taikant šiam tyrimui aprašytas metodikas, vieno dydžio dozės, atitinkančios bent 1 000 mg/kg kūno masės per parą, bandymas nesukels neigiamo poveikio ir jeigu toksinio poveikio nesitikima atsižvelgiant į panašios struktūros cheminių medžiagų duomenis, visas trijų dydžių dozės tyrimas gali būti laikomas nebūtinu. 1 000 mg/kg kūno masės per parą ribinė vertė gali būti taikoma tada, kai nereikia skirti didesnės dozės atsižvelgiant į poveikį žmogui.
                           
                        
                     Bandomosios cheminės medžiagos dozių paruošimas ir davimas
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga paprastai duodama per burną, su pašaru ar geriamuoju vandeniu arba leidžiama zondu. Daugiau informacijos apie dozės davimo būdus ir metodus pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6). Dozės davimo būdas ir metodas parenkami atsižvelgiant į tyrimo tikslą, fizines ir chemines bandomosios cheminės medžiagos savybes, jos biologinį įsisavinimą ir vyraujantį poveikio žmonėms būdą ir metodą. Pasirinktas dozės davimo būdas ir metodas turi būti pagrįsti. Gyvūnų gerovės sumetimais dozės leidimas zondu paprastai turėtų būti pasirenkamas tik duodant tokias chemines medžiagas, kurių davimo būdas ir metodas iš esmės atitinka galimą poveikio žmogui būdą ir metodą (pvz., duodant vaistus). Maisto produktuose arba aplinkoje esančios cheminės medžiagos, įskaitant pesticidus, paprastai duodamos su pašaru arba vandeniu. Tačiau tam tikrais atvejais, pvz., tiriant poveikį darbe, gali būti tinkamesni kiti dozės davimo būdai.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Prireikus bandomoji cheminė medžiaga ištirpinama arba pagaminama jos suspensija tinkamame nešiklyje. Reikėtų atsižvelgti į šias nešiklio ir kitų priedų savybes, jeigu taikytina: poveikį sugerčiai, pasiskirstymui, metabolizmui arba bandomosios cheminės medžiagos sulaikymui; poveikį bandomosios cheminės medžiagos cheminėms savybėms, dėl kurių gali pasikeisti jos toksiškumo savybės; poveikį maisto ar vandens suvartojimui arba gyvūnų įmitimui. Rekomenduojama, jeigu įmanoma, pirmenybę teikti vandeniniam tirpalui arba suspensijai, tada svarstyti galimybę naudoti aliejaus (pvz., kukurūzų) tirpalą arba emulsija ir tik po to – galimybę naudoti tirpalus kituose nešikliuose. Jeigu kaip nešiklis naudojamas ne vanduo, turėtų būti žinomos to nešiklio toksinės savybės. Reikėtų turėti informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos stabilumą ir duodamų tirpalų arba pašarų homogeniškumą (jeigu taikytina) dozės davimo sąlygomis (pvz., su pašaru).
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Jeigu cheminės medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, svarbu užtikrinti, kad įmaišomi bandomosios cheminės medžiagos kiekiai netrikdytų įprasto mitybos režimo arba vandens balanso. Atliekant ilgalaikio toksiškumo tyrimus, kai dozė duodama su pašaru, bandomosios cheminės medžiagos koncentracija pašaro sudėtyje paprastai turėtų neviršyti 5 % viršutinės ribos visame pašarų kiekyje, kad būtų išvengta mitybos disbalanso. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga duodama su pašaru, gali būti taikoma pastovi koncentracija (mg/kg pašaro arba ppm) arba pastovus dozės dydis, nustatomas atsižvelgiant į gyvūno kūno masę (mg/kg kūno masės) ir apskaičiuojamas kas savaitę. Turėtų būti nurodytas pasirinktas variantas.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Jeigu dozė duodama per burną, bandomoji cheminė medžiaga gyvūnams duodama kasdien (septynias dienas per savaitę), paprastai – 12 mėnesių laikotarpiu (taip pat žr. 33 skirsnį), tačiau atsižvelgiant į norminius reikalavimus gali reikėti taikyti ilgesnę trukmę. Pasirinkus bet kurią kitą dozės davimo tvarką, pvz., penkių dienų per savaitę, ją būtina pagrįsti. Jeigu dozė duodama per odą, gyvūnai paprastai veikiami bandomąja chemine medžiaga ne trumpiau kaip šešias valandas per parą, septynias dienas per savaitę, kaip nurodyta šio priedo B.9 skyriuje (10), 12 mėnesių laikotarpiu. Dozės davimas per kvėpavimo takus vykdomas šešias valandas per parą, septynias paras per savaitę, bet gali būti taikomas ir penkių parų per savaitę poveikis, jeigu jis pagrindžiamas. Įprastas dozės davimo laikotarpis – 12 mėnesių. Jeigu naudojant kitos rūšies graužikus nei žiurkės dozė duodama tik per nosį, ilgiausia poveikio trukmė gali būti pakoreguojama siekiant sumažinti tos rūšies gyvūnų patiriamą kančią. Jeigu dozė duodama trumpiau kaip šešias valandas per parą, būtina tai pagrįsti. Taip pat žr. šio priedo B.8 skirsnį (8).
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Jeigu bandomoji cheminė medžiaga leidžiama zondu, tai turėtų būti daroma kasdien panašiu metu, naudojant skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Paprastai duodama viena dozė per parą, bet, jeigu, pvz., cheminė medžiaga turi vietinio dirginamojo poveikio, paros dozė gali būti duodama padalyta į kelias dalis (pvz., du kartus per parą). Didžiausias vienkartinis duodamo skysčio kiekis priklauso nuo bandomojo gyvūno dydžio. Tūris turėtų būti kaip įmanoma mažesnis ir, jeigu naudojami graužikai, paprastai neturėtų viršyti 1 ml/100 g kūno masės (22). Bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas, keičiant koncentraciją taip, kad visų dydžių dozių tūris būtų pastovus. Cheminėms medžiagoms, kurios gali turėti ėsdinamojo arba dirginamojo poveikio, taikoma išimtis; tokios medžiagos turi būti atskiestos siekiant išvengti sunkaus vietinio poveikio. Turėtų būti vengiama atlikti bandymus taikant koncentracijas, kurios galėtų turėti ėsdinamojo arba dirginamojo poveikio virškinimo traktui.
                           
                        
                     Tyrimo trukmė
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Nors Šis bandymo metodas pirmiausia sumanytas kaip 12 mėnesių lėtinio toksiškumo tyrimas, tyrimo planas gali būti taikomas trumpesniems (pvz., šešių arba devynių mėnesių) arba ilgesniems (pvz., 18 arba 24 mėnesių) tyrimams, atsižvelgiant į tam tikrų reglamentavimo tvarkų reikalavimus arba siekiant specifinių mechanistinių tikslų. Jeigu pasirenkama ne 12 mėnesių trukmė, ji turėtų būti pagrįsta, ypač jeigu ta trukmė trumpesnė nei 12 mėnesių. Pagalbinės grupės, įtrauktos tiriamos bandomosios cheminės medžiagos sukeliamų toksikologinių pakitimų grįžtamumo stebėjimo tikslais, turėtų negauti dozės ne mažiau kaip keturias savaites, bet ne ilgiau kaip trečdalį visos tyrimo trukmės nutraukus dozės davimą. Daugiau patarimų, įskaitant patarimus dėl išgyvenimo per tyrimą įvertinimo, pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6).
                           
                        STEBĖJIMAI
                  
                              34.
                           
                           
                              Visi gyvūnai turėtų būti tikrinami, ar jie sveiki arba nenugaišę; paprastai tai turėtų būti daroma kiekvienos dienos pradžioje ir pabaigoje, įskaitant savaitgalius ir švenčių dienas. Bendrieji klinikiniai stebėjimai turėtų būti atliekami bent kartą per parą, pageidautina, tuo pačiu paros metu, atsižvelgiant į stipriausią numatomą poveikį po dozės davimo, kai dozė leidžiama zondu.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Kartą prieš pirmąjį dozės davimą (kad būtų galima palyginti atskirus gyvūnus), po to – pasibaigus pirmajai tyrimo savaitei, o vėliau – kas mėnesį turėtų būti atliekami išsamūs visų gyvūnų klinikiniai stebėjimai. Stebėjimų protokolas turėtų būti sudarytas taip, kad stebėtojų kaita būtų kuo mažesnė ir kad stebėtojai būtų paskiriami neatsižvelgiant į bandomąją grupę. Kiekvieną kartą šie stebėjimai turėtų būti atliekami tuo pačiu metu, perkėlus gyvūną iš jo narvelio į tam skirtą vietą. Stebėjimai turėtų būti kruopščiai registruojami, pageidautina, pagal toje laboratorijoje aiškiai apibrėžtą vertinimo sistemą. Turėtų būti stengiamasi užtikrinti, kad stebėjimo sąlygų kaita būtų kuo mažesnė. Be kitų dalykų, turėtų būti registruojami odos, kailio, akių, gleivinės pakitimai, išskyrų atsiradimas ir autonominis aktyvumas (pvz., ašarojimas, plaukų pašiaušimas, vyzdžio dydis, neįprasti kvėpavimo pakitimai). Taip pat turėtų būti registruojami eisenos, pozos, reakcijos į paėmimą rankomis pakitimai, traukulių arba toninių judesių atsiradimas, stereotipinis (pvz., besaikis valymasis, pasikartojantis sukimasis ratu) arba keistas elgesys (pvz., savęs luošinimas, vaikščiojimas atbulomis) (24).
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Naudojant oftalmoskopą arba kitą tinkamą įrangą, prieš pirmąjį bandomosios cheminės medžiagos davimą turėtų būti atlikti visų gyvūnų oftalmologiniai tyrimai. Baigus tyrimą, turėtų būti atlikti visų gyvūnų arba bent didžiausiąją dozę gavusios grupės ir kontrolinės grupės oftalmologiniai tyrimai. Jeigu nustatoma akių pakitimų, susijusių su dozės davimu, turėtų būti ištirti visi gyvūnai. Jeigu struktūrinė analizė arba kita informacija rodo toksinį poveikį akims, akių tyrimų dažnumas turėtų būti didesnis.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Jeigu anksčiau atlikus cheminės medžiagos 28 dienų ir (arba) 90 dienų kartotinės dozės toksiškumo bandymus nustatyta, kad cheminė medžiaga gali sukelti neurotoksinį poveikį, prieš pradedant tyrimą ir kas tris mėnesius nuo tyrimo pradžios, bet ne ilgiau kaip 12 mėnesių laikotarpiu, o taip pat baigus tyrimą (jeigu jis trunka ilgiau nei 12 mėnesių) galima (bet neprivaloma) įvertinti jutimines reakcijas į įvairaus pobūdžio dirgiklius (24) (pvz., klausos, regos ir proprioreceptorinius) (25) (26) (27), spaudimo (jėgos) stiprumą (28) ir judėjimo aktyvumą (29). Išsamesnės informacijos apie procedūras, kurios galėtų būti taikomos, pateikta atitinkamuose literatūros šaltiniuose. Tačiau galima taikyti ir čia nurodytiems metodams alternatyvius metodus.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Jeigu anksčiau atlikus cheminės medžiagos 28 dienų ir (arba) 90 dienų kartotinės dozės toksiškumo bandymus nustatyta, kad cheminė medžiaga gali sukelti imunotoksinį poveikį, baigus tyrimą galima (bet neprivaloma) atlikti išsamesnius šios pasekmės tyrimus.
                           
                        
                     Kūno masė, pašarų ir (arba) vandens suvartojimas ir pašaro efektyvumas
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Visi gyvūnai turėtų būti pasveriami prieš pradedant duoti dozę, kitas 13 savaičių – ne rečiau kaip kartą per savaitę, o vėliau – bent kartą per mėnesį. Pirmąsias 13 savaičių – ne rečiau kaip kartą per savaitę, o vėliau – bent kartą per mėnesį turėtų būti matuojamas pašaro suvartojimas ir pašaro efektyvumas. Jeigu cheminė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, pirmąsias 13 savaičių – ne rečiau kaip kartą per savaitę, o vėliau – bent kartą per mėnesį turėtų būti matuojamas vandens suvartojimas. Galimybė matuoti vandens suvartojimą turėtų būti svarstoma ir atliekant tyrimus, per kuriuos pasikeičia gėrimo įpročiai.
                           
                        
                     Hematologiniai ir klinikinės biochemijos tyrimai
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Atliekant tyrimus, per kuriuos naudojami graužikai, po trijų, šešių ir dvylikos mėnesių, taip pat baigus tyrimą (jeigu jis trunka ilgiau nei 12 mėnesių), turėtų būti atlikti ne mažesnių kaip dešimties patinų ir dešimties patelių grupių hematologiniai tyrimai, visada naudojant tuos pačius gyvūnus. Jeigu atliekant tyrimus naudojamos pelės, norint atlikti visus reikiamus hematologinius tyrimus gali reikėti pagalbinių gyvūnų (žr. 18 skirsnį). Jeigu atliekant tyrimus naudojami ne graužikai, ėminiai dar nebaigus tyrimo ir jį baigus, kaip aprašyta graužikų atveju, imami iš mažesnio gyvūnų skaičiaus (pvz., jeigu tiriami šunys – iš keturių kiekvienos lyties gyvūnų kiekvienoje grupėje). Nepaisant to, ar naudojami graužikai, ar ne graužikai, matavimų po trijų mėnesių galima neatlikti, jeigu per anksčiau atliktą 90 dienų tyrimą, per kurį buvo taikomi panašūs dozių dydžiai, nebuvo pastebėta poveikio hematologiniams parametrams. Kraujo ėminiai turėtų būti imami iš nurodytos vietos, pvz., širdies punkcijos vietos arba iš užakiduobinio ančio, taikant nuskausminimą.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Turėtų būti ištirti šie parametrai (30): bendras leukocitų kiekis ir įvairių leukocitų kiekiai, eritrocitų kiekis, trombocitų kiekis, hemoglobino koncentracija, hematokritas (procentinė kraujo ląstelių tūrio dalis), vidutinis eritrocito tūris (VET), vidutinis hemoglobino kiekis eritrocituose (VHKE), vidutinė eritrocitų hemoglobino koncentracija (VEHK), protrombino laikas ir dalinis aktyvintas tromboplastino laikas. Atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą, prireikus gali būti matuojami ir kiti hematologiniai parametrai, pvz., Heinco kūneliai arba kita netipinė eritrocitų morfologija, arba methemoglobinas. Apskritai turėtų būti laikomasi lankstaus požiūrio, kuriuo būtų atsižvelgiama į pastebėtą ir (arba) numatomą atitinkamos bandomosios cheminės medžiagos poveikį. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga turi poveikio kraujodaros sistemai, gali reikėti nustatyti retikulocitų kiekį ir atlikti kaulų čiulpų citologijos tyrimus, tačiau to nebūtina daryti nuolat.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Siekiant ištirti svarbiausius toksinius poveikius audiniams, ypač inkstams ir kepenims, reikėtų atlikti kraujo ėminių, paimtų iš ne mažiau kaip dešimties kiekvienos grupės patinų ir dešimties patelių (visada iš tų pačių gyvūnų) tokiais pat laiko intervalais, kaip nurodyta dėl hematologinių tyrimų, klinikinius biocheminius tyrimus. Jeigu atliekant tyrimus naudojamos pelės, norint atlikti visus reikiamus klinikinės biochemijos tyrimus, gali reikėti pagalbinių gyvūnų. Jeigu atliekant tyrimus naudojami ne graužikai, ėminiai dar nebaigus tyrimo ir jį baigus, kaip aprašyta graužikų atveju, imami iš mažesnio gyvūnų skaičiaus (pvz., jeigu tiriami šunys – iš keturių kiekvienos lyties gyvūnų kiekvienoje grupėje). Nepaisant to, ar naudojami graužikai, ar ne graužikai, matavimų po trijų mėnesių galima neatlikti, jeigu per anksčiau atliktą 90 dienų tyrimą, per kurį buvo duodamos panašaus dydžio dozės, nebuvo pastebėta poveikio klinikinės biochemijos parametrams. Rekomenduojama, kad prieš kraujo pavyzdžių ėmimą gyvūnai (išskyrus peles) būtų nešeriami per naktį. Turėtų būti ištirti šie parametrai (30): gliukozė, šlapalas (šlapalo azotas), kreatininas, bendras baltymų kiekis, albuminas, kalcis, natris, kalis, bendras cholesterolio kiekis, ne mažiau kaip du atitinkami kepenų ląstelių tyrimai (alaninaminotransferazė, aspartataminotransferazė, glutamato dehidrogenazė ir bendras tulžies rūgščių kiekis) (31) ir ne mažiau kaip du atitinkami kepenų ir tulžies sistemos tyrimai (šarminė fosfatazė, gamaglutamiltransferazė, 5’-nukleotidazė, bendras bilirubino kiekis, bendras tulžies rūgščių kiekis) (31). Be to, atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą, gali būti naudinga išmatuoti kitus klinikinės chemijos parametrus, pvz., trigliceridų koncentraciją nešėrus, specifinius hormonus ir cholinesterazę. Apskritai turėtų būti laikomasi lankstaus požiūrio, kuriuo būtų atsižvelgiama į pastebėtą arba numatomą atitinkamos bandomosios cheminės medžiagos poveikį.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Turėtų būti atlikti ne mažiau kaip dešimties kiekvienos grupės patinų ir dešimties patelių šlapimo tyrimai, ėminius imant tokiais pat intervalais, kokie taikomi hematologinės ir klinikinės chemijos tyrimų tikslais. Matavimų po trijų mėnesių galima neatlikti, jeigu per anksčiau atliktą 90 dienų tyrimą, per kurį buvo duodamos panašaus dydžio dozės, nebuvo pastebėta poveikio šlapimo analizės rezultatams. Ekspertų rekomendacijoje dėl klinikinės patologijos tyrimų pateiktas toks parametrų sąrašas (30): išvaizda, tūris, osmosinis slėgis arba savitasis svoris, pH, bendras baltymų kiekis ir gliukozė. Taip pat gali būti tiriamas ketonas, urobilinogenas, bilirubinas ir paslėptasis kraujas. Prireikus išplėsti pastebėto (-ų) poveikio (-ų) tyrimą, gali būti naudojami papildomi parametrai.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Paprastai laikoma, kad pradiniai hematologiniai ir klinikinės biochemijos kintamieji prieš pradedant duoti dozę turėtų būti nustatomi atliekant šunų tyrimus, bet jų nebūtina nustatyti atliekant graužikų tyrimus (30). Visgi, jeigu istoriniai pradiniai duomenys (žr. 50 skirsnį) yra netinkami, turėtų būti svarstoma galimybė parengti minėtus duomenis.
                           
                        
                     Patologija
                  
                  
                     Bendrasis skrodimas
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              Paprastai atliekamas išsamus visų tiriamųjų gyvūnų bendrasis skrodimas, atidžiai ištiriant kūno paviršių ir visas jo angas, kaukolę, krūtinės ląstą, pilvo ertmes ir jų turinį. Tačiau taip pat gali būti numatyta (grupėse, kuriose numatytas gyvūnų marinimas nebaigus bandymo, arba pagalbinėse grupėse) atlikti tik tokius matavimus, kurie yra susiję su specifiniais, pagrindiniais matais, pvz., neurotoksiškumu arba imunotoksiškumu (žr. 19 skirsnį). Šių gyvūnų nebūtina skrosti ar su jais atlikti tolesnių procedūrų, aprašytų kituose skirsniuose. Kontrolinius gyvūnus gali reikėti skrosti atsižvelgiant į konkretų atvejį ir vadovaujantis tyrimo vadovo nuožiūra.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Turėtų būti pasveriami visų gyvūnų, išskyrus nurodytuosius 45 skirsnio paskutinėje dalyje, organai. Visų gyvūnų (išskyrus gaištančius ir (arba) numarintus nebaigus bandymo) antinksčiai, sėklidžių prielipai, širdis, inkstai, kepenys, kiaušidės, blužnis, sėklidės, skydliaukė (sveriama po fiksavimo, kartu su prieskydinėmis liaukomis) ir gimda turėtų būti nuvalyti, jeigu reikia, pašalinant prigludusius audinius, ir po skrodimo kuo greičiau pasverti, kol neišdžiuvo. Jeigu atliekant tyrimą naudojamos pelės, antinksčių sverti nebūtina.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Atsižvelgiant į audinio tipą ir numatomą vėliau atlikti histopatologinį tyrimą, tinkamiausioje fiksavimo terpėje turėtų būti konservuojami šie audiniai (32) (laužtiniuose skliaustuose nurodytų audinių konservuoti nebūtina):
                              
                                          Visi labai pakitę audiniai
                                       
                                       
                                          Širdis
                                       
                                       
                                          Kasa
                                       
                                       
                                          Skrandis (įskrandis, liaukinė skrandžio dalis)
                                       
                                    
                                          Antinksčiai
                                       
                                       
                                          Klubinė žarna
                                       
                                       
                                          Prieskydinė liauka
                                       
                                       
                                          [Dantys]
                                       
                                    
                                          Aorta
                                       
                                       
                                          Tuščioji žarna
                                       
                                       
                                          Periferinis nervas
                                       
                                       
                                          Sėklidės
                                       
                                    
                                          Smegenys (įskaitant didžiųjų smegenų, smegenėlių ir pailgųjų smegenų (smegenų tilto) išpjovas)
                                       
                                       
                                          Inkstai
                                       
                                       
                                          Hipofizė
                                       
                                       
                                          Užkrūčio liauka
                                       
                                    
                                          Akloji žarna
                                       
                                       
                                          Ašarų liauka (viršakiduobinė)
                                       
                                       
                                          Prostata
                                       
                                       
                                          Skydliaukė
                                       
                                    
                                          Gimdos kaklelis
                                       
                                       
                                          Kepenys
                                       
                                       
                                          Tiesioji žarna
                                       
                                       
                                          [Liežuvis]
                                       
                                    
                                          Koaguliatorių liauka
                                       
                                       
                                          Plaučiai
                                       
                                       
                                          Seilių liauka
                                       
                                       
                                          Trachėja
                                       
                                    
                                          Gaubtinė žarna
                                       
                                       
                                          Limfmazgiai (paviršiniai ir giluminiai)
                                       
                                       
                                          Sėklinės pūslelės
                                       
                                       
                                          Šlapimo pūslė
                                       
                                    
                                          Dvylikapirštė žarna
                                       
                                       
                                          Pieno liauka (patelėms – privaloma, patinams – jeigu galima ištirti akimi)
                                       
                                       
                                          Skeleto raumuo
                                       
                                       
                                          Gimda (su gimdos kakleliu)
                                       
                                    
                                          Sėklidžių prielipai
                                       
                                       
                                          [Viršutiniai kvėpavimo takai, įskaitant nosį, kriaukles ir šalutines nosies ertmes]
                                       
                                       
                                          Oda
                                       
                                       
                                          [Šlapimtakis]
                                       
                                    
                                          Akys (su tinklaine)
                                       
                                       
                                          Stemplė
                                       
                                       
                                          Stuburo smegenys (trys lygiai: sprando, krūtinės ląstos ir juosmens)
                                       
                                       
                                          [Šlaplė]
                                       
                                    
                                          [Šlaunikaulis su kelio sąnariu]
                                       
                                       
                                          [Uoslės receptoriai]
                                       
                                       
                                          Blužnis
                                       
                                       
                                          Makštis
                                       
                                    
                                          Tulžies pūslė (jeigu tiriamos ne žiurkės)
                                       
                                       
                                          Kiaušidės
                                       
                                       
                                          [Krūtinkaulis]
                                       
                                       
                                          Kaulų čiulpų išpjova ir (arba) šviežiai paruošta kaulų čiulpų punkcija
                                       
                                    
                                          Harderio liauka
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    Jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinksčiai, turėtų būti konservuojami abu organai. Atsižvelgiant į gautas klinikines ir kitokias išvadas, gali reikėti ištirti papildomus audinius. Be to, atsižvelgiant į žinomas bandomosios cheminės medžiagos savybes, turėtų būti konservuojami visi numanomi tiksliniai organai. Atliekant tyrimus, per kuriuos dozė duodama per odą, turėtų būti konservuojami organai, nurodyti kaip konservuotini, kai dozė duodama per burną; be to, labai svarbu, kad būtų paimti ir užkonservuoti specifiniai odos ėminiai iš poveikio vietos. Atliekant inhaliacinius tyrimus, konservuotinų ir tirtinų kvėpavimo takų audinių sąrašas turėtų būti sudaromas remiantis šio priedo B.8 skyriuje (8) ir šio priedo B.29 skyriuje (9) pateiktomis rekomendacijomis. Tiriant kitus organus ir (arba) audinius (be specialiai konservuojamų kvėpavimo takų audinių), turėtų būti tiriami organai, nurodyti dėl poveikio per virškinamąjį traktą būdo pateiktame organų sąraše.
                           
                        
                     Histopatologinis tyrimas
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              Yra parengtos toksikologinės patologijos tyrimų geriausiosios patirties gairės (32). Turėtų būti atlikti bent šie histopatologiniai tyrimai:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          visų didžiausiąją dozę gavusios grupės ir kontrolinės grupės gyvūnų audinių,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          visų per tyrimą nugaišusių arba numarintų gyvūnų audinių,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          visų audinių su plika akimi matomais pakitimais,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          tikslinių audinių arba visų kitų dydžių dozes gavusių grupių gyvūnų audinių, dėl kurių didžiausiąją dozę gavusioje grupėje nustatyta su dozės davimu susijusių pakitimų,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinksčiai, turėtų būti tiriami abu organai.
                                       
                                    
                        DUOMENYS IR ATASKAITOS
                  
                     Duomenys
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Turėtų būti pateikti kiekvieno gyvūno duomenys pagal visus vertinamus parametrus. Be to, visi duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, pagal kiekvieną bandomąją grupę nurodant pradedant bandymą turėtų gyvūnų skaičių, atliekant bandymą nugaišusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičių ir kiekvienos žūties arba numarinimo dėl humaniškų priežasčių laiką, gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičių, pastebėtų toksiškumo požymių aprašymą, įskaitant kiekvieno toksinio poveikio pasireiškimo laiką, trukmę ir sunkumą, gyvūnų su audinių pakitimais skaičių, pakitimų tipą ir gyvūnų su kiekvieno tipo pakitimais procentinę dalį. Gyvūnams, kuriems pasireiškė toksinis poveikis arba atsirado audinių pakitimų, be pakitimų lygmens įvertinimo, suvestinių duomenų lentelėse turėtų būti pateikti vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai (ištisinio bandymo duomenų).
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Istoriniai kontroliniai duomenys gali būti vertingi aiškinant tyrimo rezultatus, pvz., kai yra požymių, kad taikant vienalaikę kontrolę gauti duomenys iš esmės skiriasi, palyginti su naujausiais duomenimis, gautais stebint kontrolinius gyvūnus, esančius toje pačioje bandymo patalpoje arba kolonijoje. Istoriniai kontroliniai duomenys, jeigu jie vertinami, turėtų būti pateikti tos pačios laboratorijos ir turėtų būti susiję su to paties amžiaus ir padermės, išvestos penkerių metų laikotarpiu iki svarstomo tyrimo, gyvūnais.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Jeigu taikytina, skaitiniai rezultatai turėtų būti įvertinti tinkamu, visuotinai priimtinu statistiniu metodu. Statistiniai metodai ir analizei skirti duomenys turi būti pasirinkti planuojant bandymą (8 skirsnis). Parenkant duomenis, turėtų būti numatytos pataisos atsižvelgiant į gyvūnų išgyvenimą.
                           
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikta toliau nurodyta informacija.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizinė būsena, grynumas, fizinės ir cheminės savybės,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikavimo duomenys,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      cheminės medžiagos šaltinis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      partijos numeris,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      cheminės analizės pažyma.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nešiklis (jeigu naudojamas):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nešiklio pasirinkimo pagrindimas (jeigu tai ne vanduo).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomieji gyvūnai:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudota rūšis ir (arba) padermė ir pasirinkimo pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gyvūnų skaičius ir amžius pradedant bandymą, nurodant lytį,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kiekvieno gyvūno masė pradedant bandymą.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dozės davimo būdo ir dozės parinkimo pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jeigu taikytina, taikyti statistiniai duomenų analizės metodai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos ir pašaro paruošimą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analitiniai duomenys apie pasiektą koncentraciją, preparato stabilumą ir homogeniškumą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dozės davimo būdas ir išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos davimą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jeigu tai inhaliaciniai tyrimai: ar dozė duodama tik per nosį, ar per visą kūną,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      faktinės dozės (mg/kg kūno masės per parą) ir bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos pašare ir (arba) geriamajame vandenyje (mg/kg arba ppm) perskaičiavimo į faktinę dozę koeficientas, jeigu taikytina,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatai (turėtų būti pateiktos suvestinių duomenų lentelės ir kiekvieno gyvūno duomenys):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išgyvenimo duomenys,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kūno masė ir (arba) kūno masės pokyčiai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pašaro suvartojimas, pašaro efektyvumo skaičiavimai, jeigu jie buvo atlikti, ir vandens suvartojimas, jeigu taikytina,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toksinės reakcijos duomenys pagal lytį ir dozės dydį, nurodant toksiškumo požymius,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pastebėtų klinikinių požymių pobūdis, paplitimas (ir, jeigu įvertinta, sunkumas) ir trukmė (grįžtami ar negrįžtami),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmologinis tyrimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologiniai tyrimai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinikinės biochemijos tyrimai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      šlapimo tyrimai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      neurotoksiškumo arba imunotoksiškumo tyrimų rezultatai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      galutinė kūno masė,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      organų masė (ir masių santykiai, jeigu taikytina),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skrodimo išvados,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsamus visų su dozės davimu susijusių histopatologinio tyrimo rezultatų aprašymas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sugerties duomenys, jeigu yra.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Statistinis rezultatų apdorojimas, jeigu taikytina.
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatų aptarimas, apimantis:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybes,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      veikimo būdo informacijos svarstymą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      modeliavimo metodų aptarimą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      OD, NNPL ir MPNPL nustatymą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      istorinius kontrolinius duomenis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      reikšmę žmonėms.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Išvados.
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the SAFEty Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145–191.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Šio priedo B.27 skyrius. 90 dienų kartotinės dozės toksiškumo per virškinamąjį traktą ne graužikams tyrimas.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Šio priedo B.8 skyrius. Poūmis toksiškumas įkvėpus. 28 dienų tyrimas.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Šio priedo B.29 skyrius. Pusiau lėtinis toksiškumas įkvėpus. 90 dienų tyrimas.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Šio priedo B.9 skyrius. Kartotinės dozės (28 dienų) toksiškumas (per odą).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical SAFEty Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human SAFEty Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical SAFEty Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical SAFEty Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical SAFEty Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69–98.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              2010 m. rugsėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES dėl mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsaugos, OL L 276, 2010 10 20, p. 33.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3–906255–04–2.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15–23.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and SAFEty Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198–201.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              EMEA (draft) document ‘Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity’ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
                           
                        
                     1 priedėlis
                     APIBRĖŽTIS
                     Bandomoji cheminė medžiaga– naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga arba mišinys.
                  “
            
                  6)
               
               
                  B.32 ir B.33 skyriai pakeičiami taip:
                  „B.32.   KANCEROGENIŠKUMO TYRIMAI
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 451 (OECD bandymo gairės Nr. 451) (2009). Originalios kancerogeniškumo bandymo gairės TG 451 priimtos 1981 m. Šis atnaujintasis B.32 bandymo metodas parengtas atsižvelgiant į poreikį įvertinti naujausius pasiekimus gyvūnų gerovės srityje ir norminių reikalavimų pasikeitimus (2) (3) (4) (5) (6). B.32 bandymo metodas buvo atnaujinamas kartu su šio priedo B.30 skyriumi „Lėtinio toksiškumo tyrimai“ ir šio priedo B.33 skyriumi „Jungtiniai lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimai“, siekiant gauti papildomos informacijos remiantis per tyrimą naudotais gyvūnais ir pateikti išsamesnių rekomendacijų dėl dozės parinkimo. B.32 bandymo metodas skirtas taikyti bandant labai įvairias chemines medžiagas, įskaitant pesticidus ir pramonines chemines medžiagas. Reikėtų atkreipti dėmesį, kad kai kurios vaistams taikytinos išsamios nuostatos ir reikalavimai gali skirtis (žr. Tarptautinės konferencijos dėl suderinimo (ICH) Vaistų kancerogeniškumo bandymų gaires S1B).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Daugelis kancerogeniškumo tyrimų atliekami naudojant graužikų rūšis, todėl šis metodas pirmiausia taikytinas tyrimams, atliekamiems naudojant šias rūšis. Jeigu tokius tyrimus reikėtų atlikti naudojant ne graužikų rūšis, jiems turėtų būti taikomi aprašant šį bandymo metodą ir šio priedo B.27 skyriuje „90 dienų kartotinės dozės toksiškumo per virškinamąjį traktą ne graužikams tyrimas“ (6) išdėstyti principai ir procedūros su atitinkamais pakeitimais. Daugiau patarimų pateikta OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 dėl lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimų planavimo ir atlikimo (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Atliekant kancerogeniškumo tyrimus, dozė paprastai gali būti duodama trimis būdais – per burną, per odą ir per kvėpavimo takus. Dozės davimo būdas parenkamas atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos fizines ir chemines savybes ir labiausiai paplitusį poveikio žmonėms būdą. Daugiau informacijos apie poveikio būdo parinkimą pateikta OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas iš esmės skirtas poveikio per virškinamąjį traktą būdui, nes šis būdas dažniausiai taikomas atliekant kancerogeniškumo tyrimus. Norint įvertinti žmonių sveikatai gresiančią riziką ir (arba) laikantis tam tikros reglamentavimo tvarkos gali reikėti atlikti kancerogeniškumo tyrimus, per kuriuos dozė būtų duodama per odą ir kvėpavimo takus, tačiau techniniu požiūriu abu poveikio būdai yra gana sudėtingi. Šie tyrimai turės būti planuojami atsižvelgiant į konkretų atvejį, tačiau čia aprašytu bandymo metodu, skirtu įvertinti kancerogeniškumą, kai dozė duodama per burną, gali būti remiamasi rengiant inhaliacinių ir (arba) odinių tyrimų protokolą, atsižvelgiant į rekomendacijas dėl poveikio laikotarpių, klinikinių ir patologinių parametrų ir t. t. Yra parengtos OECD rekomendacijos dėl bandomųjų cheminių medžiagų dozių davimo per odą (7) ir kvėpavimo takus (7) (8). Planuojant ilgesnius tyrimus, per kuriuos dozės duodamos per kvėpavimo takus, pirmiausia turėtų būti remiamasi šio priedo B.8 skyriumi (9) ir šio priedo B.29 skyriumi (10), taip pat OECD rekomendaciniu dokumentu dėl ūmaus poveikio įkvėpus bandymų (8). Jeigu bandymai atliekami taikant poveikio per odą būdą, turėtų būti remiamasi šio priedo B.9 skyriumi (11).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Atliekant kancerogeniškumo tyrimą gaunama informacijos apie galimus pavojus sveikatai, galinčius kilti dėl kartotinio poveikio laikotarpiu, kuris gali atitikti ir visą naudojamos rūšies gyvūnų gyvenimo trukmę. Tyrimas suteikia informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos toksinį poveikį, įskaitant galimą kancerogeniškumą, ir gali padėti nustatyti tikslinius organus bei kaupimosi galimybę. Be to, jis gali padėti apytiksliai nustatyti nepastebimo neigiamo poveikio lygį, susijusį su toksiniu negenotoksinių kancerogenų poveikiu ir auglių sukėlimu; šis įvertis gali būti naudojamas nustatant saugaus poveikio žmonėms kriterijus. Taip pat pabrėžiamas gyvūnų kruopščių klinikinių stebėjimų būtinumas, kad būtų gauta kuo daugiau informacijos.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Pagal šį bandymo metodą atliekamų kancerogeniškumo tyrimų tikslai:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          nustatyti kancerogenines bandomosios cheminės medžiagos savybes, dėl kurių dažniau atsiranda neoplazmų, didėja piktybinių neoplazmų santykinė dalis arba trumpėja neoplazmų atsiradimo laikas, palyginti su vienalaikės kontrolės grupėmis,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kancerogeninio poveikio tikslinio (-ų) organo (-ų) nustatymas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          neoplazmų atsiradimo laiko nustatymas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          auglius sukeliančios dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybės apibūdinimas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          nepastebimo neigiamo poveikio lygio (NNPL) arba orientacinės dozės (OD) nustatymo pagrindo nustatymas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kancerogeninio poveikio ekstrapoliavimas siekiant nustatyti mažiausiosios dozės poveikio žmonėms lygius,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          duomenų teikimas rengiant bandymų hipotezes dėl veikimo būdo (2) (7) (12) (13) (14) (15).
                                       
                                    
                        PIRMINIAI ASPEKTAI
                  
                              7.
                           
                           
                              Vertindama galimą bandomosios cheminės medžiagos kancerogeniškumą, bandymų laboratorija, prieš atlikdama tyrimą, turėtų apsvarstyti visą turimą informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą, kad planuojant tyrimą pirmiausia būtų siekiama padidinti kancerogeniškumo tyrimo veiksmingumą ir sumažinti gyvūnų naudojimą. Labai svarbu turėti informacijos apie numanomo kancerogeno veikimo būdą ir atsižvelgti į šią informaciją (2) (7) (12) (13) (14) (15), nes tinkamiausio plano parinkimas gali priklausyti nuo, ar bandomoji cheminė medžiaga yra žinoma arba įtariama kaip kancerogeninė. Daugiau patarimų, susijusių su veikimo būdo aspektais, pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Parengti tyrimo planą padės informacija apie bandomosios cheminės medžiagos tapatumą, cheminę struktūrą, fizines ir chemines savybes, toksiškumo bandymų in vitro arba in vivo, įskaitant genotoksiškumo tyrimus, rezultatai, numatomas (-i) panaudojimo būdas (-ai) ir galimas poveikis žmogui, turimi (Q)SAR duomenys ir mutageniškumo ir (arba) genotoksiškumo, kancerogeniškumo ir kiti toksikologiniai duomenys apie panašios struktūros chemines medžiagas, turimi toksikokinetiniai duomenys (vienos dozės ir, jeigu yra, kartotinės dozės kinetinės savybės) ir duomenys, gauti atlikus kitus kartotinio poveikio tyrimus. Kancerogeniškumo vertinimas turėtų būti atliekamas tik gavus pirminės informacijos apie toksiškumą, pagrįstos 28 dienų ir (arba) 90 dienų kartotinės dozės toksiškumo bandymais. Be to, naudingos informacijos gali suteikti trumpalaikiai piktybinių auglių sukėlimo ir paskatinimo bandymai. Atliekant bendrąjį konkrečios bandomosios cheminės medžiagos galimo neigiamo poveikio sveikatai vertinimą, turėtų būti apsvarstyta galimybė taikyti etapinį kancerogeniškumo bandymo metodą (16) (17) (18) (19).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Prieš pradedant tyrimą, atsižvelgiant į bandymo planą ir tikslus, turėtų būti nustatyti tinkamiausi statistiniai rezultatų analizės metodai. Turėtų būti apsvarstyta, ar rengiant statistinius duomenis turėtų būti atlikta pataisa atsižvelgiant į išgyvenimo rodiklius, kaupiamosios auglių rizikos ir jos ryšio su išgyvenimo trukme analizė ir analizė pirmalaikio vienos arba daugiau grupių pašalinimo atveju. Rekomendacijų dėl tinkamos statistinės analizės ir pagrindinės informacijos apie tarptautiniu mastu pripažintus statistinius metodus pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7), taip pat rekomendaciniame dokumente Nr. 35 dėl lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimų analizės ir vertinimo (20).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Atliekant kancerogeniškumo tyrimą, visada turėtų būti atsižvelgiama į pagrindinius principus ir aspektus, išdėstytus OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 19 dėl klinikinių požymių, kaip pasekmių žmonėms, pasireiškimo vertinant saugumą naudojamiems bandomiesiems gyvūnams pripažinimo, vertinimo ir taikymo (21), pirmiausia jo 62 skirsnyje. Tame skirsnyje teigiama: „Jeigu per kartotinės dozės tyrimus gyvūnams pasireiškia klinikinių požymių, kurie progresuoja ir dėl kurių toliau prastėja sveikatos būklė, turėtų būti priimtas informacija pagrįstas sprendimas, ar nereikėtų humaniškai numarinti gyvūno. Priimant sprendimą turėtų būti atsižvelgiama į informacijos, kuri būtų gauta tęsiant tyrimą su šiuo gyvūnu, vertės ir šio gyvūno bendrosios būklės santykį. jeigu nusprendžiama tęsti bandymą su šiuo gyvūnu, atsižvelgiant į poreikį, turėtų būti padidintas stebėjimų dažnumas. Be to, galbūt būtų įmanoma labai nepakenkiant bandymo tikslui laikinai nutraukti dozės davimą, jeigu dėl to sumažėtų skausmas ar kančia, arba sumažinti bandomąją dozę.“
                              
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Išsamių rekomendacijų dėl dozės parinkimo lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimams principų ir jų svarstymų pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7), taip pat Tarptautinio gamtos mokslų instituto leidiniuose (22) (23). Pagrindinė dozės parinkimo strategija priklauso nuo tyrimo pagrindinio tikslo arba tikslų (6 skirsnis). Parenkant tinkamus dozių dydžius, pavojų atranka turėtų būti vykdoma atsižvelgiant į mažų dozių sukeliamas reakcijas ir į tų pavojų reikšmę. Tai ypač svarbu tada, kai ketinama atlikti jungtinį lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimą (šio priedo B.33 skyrius) (12 skirsnis).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Turėtų būti apsvarstyta galimybė atlikti jungtinį lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimą (šio priedo B.33 skyrius), o ne atskirai atlikti lėtinio toksiškumo tyrimą (šio priedo B.30 skyrius) ir kancerogeniškumo tyrimą (šio priedo B.32 skyrius). Palyginti su dviem atskirais tyrimais, atliekant jungtinį bandymą užtikrinamas didesnis veiksmingumas laiko ir išlaidų požiūriu, neprarandant duomenų kokybės nei lėtinio poveikio, nei kancerogeniškumo bandymo etapu. Tačiau, atliekant jungtinį lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimą (šio priedo B.33 skyrius), turėtų būti kruopščiai apsvarstyti dozės parinkimo principai (11 ir 22–25 skirsniai); be to, pripažinta, kad pagal tam tikras reglamentavimo sistemas gali reikėti atlikti atskirus tyrimus.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Aprašant šį bandymo metodą vartojamos apibrėžtys pateiktos šio skyriaus pabaigoje ir rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                           
                        BANDYMO PRINCIPAS
                  
                              14.
                           
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga kasdien, paprastai per burną, skirtingomis dozėmis duodama kelioms bandomųjų gyvūnų grupėms didžiąją jų gyvenimo trukmės dalį. Taip pat gali būti atliekami bandymai dozę duodant per kvėpavimo takus arba per odą. Atidžiai stebima, ar gyvūnams nepasireiškė toksiškumo požymių ir ar neatsirado neoplastinių pakitimų. Bandymo metu nugaišę arba numarinti gyvūnai skrodžiami, o baigus bandymą numarinami ir skrodžiami išgyvenę gyvūnai.
                           
                        METODO APRAŠYMAS
                  
                     Gyvūnų rūšies parinkimas
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas pirmiausia taikomas vertinant kancerogeniškumą graužikams (2 skirsnis). Galimybė naudoti ne graužikų rūšis gali būti svarstoma, jeigu turimi duomenys rodo, kad jie tinkamesni prognozuoti poveikį žmonių sveikatai. Gyvūnų rūšies pasirinkimas turėtų būti pagrįstas. Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, bet galima naudoti ir kitų rūšių graužikus, pvz., peles. Nors pelių naudojimas atliekant kancerogeniškumo bandymus gali būti nelabai naudingas (24) (25) (26), pagal kai kurias dabartines reglamentavimo programas kancerogeniškumo bandymai naudojant peles vis dar yra būtini, jeigu nenustatoma, kad toks tyrimas moksliniu požiūriu nėra būtinas. Žiurkės ir pelės yra tinkamiausi bandomieji gyvūnai, nes jų gyvenimo trukmė palyginti trumpa, jos plačiai naudojamos atliekant farmakologinius ir toksikologinius tyrimus, jos jautrios auglių sukėlimui, yra pakankami gerai aprašytų padermių. Atsižvelgiant į šias savybes, yra daug informacijos apie jų fiziologiją ir patologiją. Daugiau informacijos apie gyvūnų rūšies ir padermės pasirinkimą pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių padermių gyvūnai. Pageidautina, kad kancerogeniškumo tyrimai būtų atliekami naudojant tos pačios padermės ir iš to paties šaltinio gautus gyvūnus, kokie buvo naudojami per trumpesnį (-ius) išankstinį (-ius) toksiškumo tyrimą (-us), tačiau, jeigu žinoma, kad naudojant šios padermės ir iš šio šaltinio gautus gyvūnus sunku įgyvendinti per ilgesnės trukmės tyrimus paprastai taikomus išgyvenimo kriterijus [žr. rekomendacinį dokumentą Nr. 116 (7)], turėtų būti svarstoma galimybė naudoti tokią gyvūnų padermę, kurios išgyvenimo per ilgesnės trukmės tyrimą rodiklis būtų priimtinas. Patelės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos.
                           
                        
                     Laikymas ir šėrimas
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Gyvūnai gali būti laikomi po vieną arba mažomis tos pačios lyties grupėmis; galimybė laikyti gyvūnus po vieną turėtų būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu tai moksliškai pagrįsta (27) (28) (29). Narveliai turėtų būti išdėstyti taip, kad galimas narvelių išdėstymo poveikis tyrimo rezultatams turėtų būtų kuo mažesnis. Bandomųjų gyvūnų laikymo patalpos temperatūra turėtų būti 22 °C (± 3 °C). Nors santykinis drėgnis turėtų būti ne mažesnis kaip 30 % ir, pageidautina, ne didesnis kaip 70 % (išskyrus patalpų valymo metą), turėtų būti siekiama palaikyti 50–60 % santykinį drėgnį. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Šėrimo režimas turėtų atitikti visus bandomųjų gyvūnų rūšies mitybos reikalavimus; pašaro sudėtyje turėtų būti kuo mažiau teršalų, įskaitant (be kitų teršalų) pesticidų likučius, patvariuosius organinius teršalus, fitoestrogenus, sunkiuosius metalus ir mikotoksinus. Turėtų būti periodiškai – bent pradedant tyrimą ir pasikeitus naudojamai partijai – parengiama analitinė informacija apie pašarines medžiagas ir pašaro sudėtyje esančių teršalų lygius; ši informacija turėtų būti pateikta galutinėje ataskaitoje. Turėtų būti rengiama atitinkama analitinė informacija apie tyrimo metu naudojamą geriamąjį vandenį. Pašaro parinkimui gali turėti įtakos poreikis tinkamai įmaišyti bandomąją cheminę medžiagą ir laikytis gyvūnų mitybos reikalavimų, kai bandomoji cheminė medžiaga duodama su pašaru.
                           
                        
                     Gyvūnų paruošimas
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojami sveiki gyvūnai, ne trumpiau kaip septynias paras pratinti prie laboratorinių sąlygų ir anksčiau nenaudoti kitiems bandymams. Jeigu naudojami graužikai, dozė gyvūnams turėtų būti pradedama duoti kaip galima anksčiau po atjunkymo ir pripratinimo, pageidautina, ne vėliau nei gyvūnams sueina aštuonios savaitės. Gyvūnai turėtų būti apibūdinti nurodant rūšį, padermę, šaltinį, lytį, masę ir amžių. Pradedant tyrimą kiekvienos lyties gyvūnų kūno masės skirtumai turi būti kuo mažesni ir pagal kiekvieną lytį nenukrypti nuo visų tyrime dalyvaujančių gyvūnų kūno masės vidurkio daugiau kaip ± 20 %. Gyvūnai turėtų būti atsitiktine tvarka suskirstyti į kontrolines ir bandomąsias grupes. Gyvūnus suskirsčius atsitiktine tvarka, grupių vidutinės kūno masės pagal lytį neturėtų smarkiai skirtis. Jeigu yra statistiniu požiūriu didelių skirtumų, atsitiktinis suskirstymo etapas turėtų būti pakartotas (jeigu tai įmanoma). Kiekvienam gyvūnui turėtų būti suteiktas unikalus identifikavimo numeris, kuriuo gyvūnas visam laikui pažymimas jį ištatuiruojant, implantuojant mikroschemą arba kitu tinkamu būdu.
                           
                        PROCEDŪRA
                  
                     Gyvūnų skaičius ir lytis
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojami abiejų lyčių gyvūnai. Turėtų būti naudojama pakankamai gyvūnų, kad būtų galima atlikti išsamią biologinę ir statistinę analizę. Todėl kiekvienoje dozę gaunančioje ir vienalaikės kontrolės grupėje turėtų būti ne mažiau kaip po 50 kiekvienos lyties gyvūnų. Atsižvelgiant į tyrimo tikslą, gali būti įmanoma padidinti statistinį pagrindinių įverčių patikimumą nevienodai suskirstant gyvūnus į įvairių dydžių dozėms skirtas grupes, mažiausiajai dozei skirtas grupes sudarant iš daugiau kaip 50 gyvūnų, pvz., kad būtų galima apytikriai įvertinti kancerogeniškumą duodant mažiausiąsias dozes. Tačiau reikėtų pripažinti, kad nedaug padidinus grupės dydį tyrimo statistinis patikimumas padidės gana nežymiai. Daugiau informacijos apie statistinį tyrimo planavimą ir dozių dydžių parinkimą siekiant kuo labiau padidinti statistinį patikimumą pateikta OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                           
                        
                     Rezervo sudarymas atsižvelgiant į gyvūnų marinimą nebaigus bandymo ir pagalbinių (kontrolinių) grupių sudarymas
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Jeigu tai moksliškai pagrįsta, rengiantis tyrimui gali būti sudarytas rezervas atsižvelgiant į gyvūnų marinimą nebaigus bandymo, pvz., po 12 mėnesių, kad būtų galima gauti informacijos apie neoplastinių pakitimų vystymąsi ir mechanistinės informacijos. Jeigu tokios informacijos apie bandomąją cheminę medžiagą jau turima remiantis anksčiau atliktais kartotinės dozės toksiškumo tyrimais, gyvūnų marinimo nebaigus bandymo moksliškai pagrįsti negalima. Jeigu pagal tyrimo planą numatytas gyvūnų marinimas nebaigus bandymo, kiekvieno dydžio dozei skirtoje grupėje, kurioje numatytas gyvūnų marinimas nebaigus bandymo, paprastai turėtų būti po 10 kiekvienos lyties gyvūnų, o bendras pagal tyrimo planą numatytas gyvūnų skaičius turėtų būti padidintas numatomu iki tyrimo pabaigos numarinti gyvūnų skaičiumi. Gali būti numatyta papildoma kontrolinių gyvūnų grupė (paprastai – po penkis kiekvienos lyties gyvūnus), skirta prireikus stebėti ligos būklę tyrimo metu (30). Daugiau patarimų pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                           
                        
                     Dozių dydžių grupės ir dozuotė
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Rekomendacijos dėl visų aspektų, susijusių su dozių dydžių parinkimu ir dozių dydžių skirtumų nustatymu, pateiktos rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7). Turėtų būti taikomi ne mažiau kaip trys dozių dydžiai ir vienalaikė kontrolė. Dozių dydžiai paprastai grindžiami trumpesnio laikotarpio kartotinių dozių arba ribų nustatymo tyrimų rezultatais ir turėtų būti nustatomi atsižvelgiant į visus turimus toksikologinius ir toksikokinetinius duomenis apie bandomąją medžiagą arba panašias chemines medžiagas.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Jeigu dozė neturėtų būti ribojama atsižvelgiant į bandomosios medžiagos fizines ir chemines savybes arba biologinį poveikį, didžiausioji dozė turėtų būti parenkama tokia, kad būtų galima nustatyti pagrindinius tikslinius organus ir toksinį poveikį, nesukeliant kančios, sunkaus toksiškumo, liguistumo arba žūties. Atsižvelgiant į toliau 23 skirsnyje išdėstytus veiksnius, didžiausioji dozė paprastai turėtų būti parenkama tokia, kad ją taikant būtų sukeliami pastebimi toksiškumo požymiai, pvz., pasireiškiantys kūno masės prieaugio sumažėjimu (apie 10 %). Tačiau, atsižvelgiant į tyrimo tikslus (žr. 6 skirsnį), didžiausioji dozė gali būti parinkta mažesnė už dozę, kurią taikant būtų pastebimi toksiškumo požymiai, pvz., jeigu taikant dozę sukeliamas dominantis neigiamas poveikis, turintis nedidelės įtakos gyvenimo trukmei arba kūno masei.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Dozių dydžiai ir dozių dydžių skirtumai gali būti parinkti tokie, kad būtų galima nustatyti dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybę ir – atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos veikimo būdą – NNPL arba gauti kitokį siekiamą tyrimo rezultatą, pvz., nustatyti orientacinę dozę (OD) (žr. 25 skirsnį) taikant mažiausiąją dozę. Nustatant mažesniąsias dozes, turėtų būti atsižvelgiama į tokius veiksnius, kaip numatomas dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivės nuolydis, dozės, kurias taikant atsiranda reikšmingų metabolizmo arba toksinio poveikio būdo pokyčių, kai tikimasi gauti ribinę vertę arba atskaitos tašką mažiausiosios dozės ekstrapoliavimui.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Dozių dydžių skirtumai parenkami atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos savybes ir aprašant šį metodą negali būti iš anksto numatyti, tačiau tinkamas bandymų veiksmingumas dažnai užtikrinamas tada, kai nustatant mažėjančius dozių dydžius taikomi koeficientai nuo 2 iki 4; be to, jeigu taikomi labai dideli dozių dydžių skirtumai (pvz., taikomi didesni koeficientai nei 6–10), dažnai patartina naudoti ketvirtąją bandomąją grupę. Apskritai reikėtų vengti taikyti didesnius koeficientus nei 10; jeigu tokie taikomi, jie turėtų būti pagrindžiami.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Kaip išsamiau aptarta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7), konkrečios dozės turėtų būti nustatomos atsižvelgiant į tokius veiksnius:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          žinomus arba numanomus netiesiškumus arba dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivės išlinkio taškus,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toksikokinetines savybes ir dozių intervalus, kuriuose pasireiškia metabolizmo paskatinimo, įsotinimo efektai arba išorinės ir vidinės dozių tarpusavio netiesiškumas, arba kuriuose nurodytųjų dalykų nepasireiškia,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pirminius pakitimus, poveikio rodiklius arba pagrindinių aiškiai nepastebimų biologinių procesų veikimo požymius,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pagrindinius (arba numanomus) veikimo būdo aspektus, pvz., dozes, kurias taikant pradeda reikštis citotoksiškumas, sutrikdomi hormonų lygiai, nustelbiami homeostaziniai mechanizmai ir t. t.,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivės sritis, kuriose būtina atlikti ypač tikslius vertinimus, pvz., numanomos orientacinės dozės (OD) arba numanomos ribinės vertės sritis,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          numanomus poveikio žmonėms lygius.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Kontrolinė grupė – tai dozės negaunančių gyvūnų grupė arba nešiklio kontrolės grupė, jeigu bandomajai cheminei medžiagai duoti naudojamas nešiklis. Išskyrus poveikį bandomąja chemine medžiaga, su kontrolinės grupės gyvūnais turėtų būti elgiamasi lygiai taip pat, kaip su bandomųjų grupių gyvūnais. Naudojant nešiklį, kontrolinės grupės gyvūnams duodamas didžiausias nešiklio tūris, skiriamas dozę gaunančioms grupėms. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga duodama su pašaru ir dėl prastesnio skonio gyvūnai suvartoja mažiau pašaro, gali būti naudinga pasitelkti papildomą kartu šeriamą kontrolinę grupę, kad būtų užtikrinta geresnė kontrolė.
                           
                        
                     Bandomosios cheminės medžiagos dozių paruošimas ir davimas
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga paprastai duodama per burną, su pašaru ar geriamuoju vandeniu arba leidžiama zondu. Daugiau informacijos apie dozės davimo būdus ir metodus pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7). Dozės davimo būdas ir metodas parenkami atsižvelgiant į tyrimo tikslą, fizines ir chemines bandomosios cheminės medžiagos savybes, jos biologinį įsisavinimą ir vyraujantį poveikio žmonėms būdą ir metodą. Pasirinktas dozės davimo būdas ir metodas turi būti pagrįsti. Gyvūnų gerovės sumetimais dozės leidimas zondu paprastai turėtų būti pasirenkamas tik duodant tokias chemines medžiagas, kurių davimo būdas ir metodas iš esmės atitinka galimą poveikio žmogui būdą ir metodą (pvz., duodant vaistus). Maisto produktuose arba aplinkoje esančios cheminės medžiagos, įskaitant pesticidus, paprastai duodamos su pašaru arba vandeniu. Tačiau tam tikrais atvejais, pvz., tiriant poveikį darbe, gali būti tinkamesni kiti dozės davimo būdai.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Prireikus bandomoji cheminė medžiaga ištirpinama arba pagaminama jos suspensija tinkamame nešiklyje. Reikėtų atsižvelgti į šias nešiklio ir kitų priedų savybes, jeigu taikytina: poveikį sugerčiai, pasiskirstymui, metabolizmui arba bandomosios cheminės medžiagos sulaikymui; poveikį bandomosios cheminės medžiagos cheminėms savybėms, dėl kurių gali pasikeisti jos toksiškumo savybės; poveikį maisto ar vandens suvartojimui arba gyvūnų įmitimui. Rekomenduojama, jeigu įmanoma, pirmenybę teikti vandeniniam tirpalui arba suspensijai, tada svarstyti galimybę naudoti aliejaus (pvz., kukurūzų) tirpalą arba emulsija ir tik po to – galimybę naudoti tirpalus kituose nešikliuose. Jeigu kaip nešiklis naudojamas ne vanduo, turėtų būti žinomos to nešiklio toksinės savybės. Reikėtų turėti informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos stabilumą ir duodamų tirpalų ir pašarų homogeniškumą (jeigu taikytina) dozės davimo sąlygomis (pvz., su pašaru).
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Jeigu cheminės medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, svarbu užtikrinti, kad įmaišomi bandomosios cheminės medžiagos kiekiai netrikdytų įprasto mitybos režimo arba vandens balanso. Atliekant ilgalaikio toksiškumo tyrimus, kai dozė duodama su pašaru, bandomosios cheminės medžiagos koncentracija pašaro sudėtyje paprastai turėtų neviršyti 5 % viršutinės ribos visame pašarų kiekyje, kad būtų išvengta mitybos disbalanso. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga duodama su pašaru, gali būti taikoma pastovi koncentracija (mg/kg pašaro arba ppm) arba pastovus dozės dydis, nustatomas atsižvelgiant į gyvūno kūno masę (mg/kg kūno masės) ir apskaičiuojamas kas savaitę. Turėtų būti nurodytas pasirinktas variantas.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Jeigu dozė duodama per burną, bandomoji cheminė medžiaga gyvūnams duodama kasdien (septynias dienas per savaitę), paprastai (jeigu naudojami graužikai) – 24 mėnesių laikotarpiu (taip pat žr. 32 skirsnį). Pasirinkus bet kurią kitą dozės davimo tvarką, pvz., penkių dienų per savaitę, ją būtina pagrįsti. Jeigu dozė duodama per odą, gyvūnai paprastai veikiami bandomąja chemine medžiaga ne trumpiau kaip šešias valandas per parą, septynias dienas per savaitę, kaip nurodyta šio priedo B.9 skyriuje (11), 24 mėnesių laikotarpiu. Dozės davimas per kvėpavimo takus vykdomas šešias valandas per parą, septynias paras per savaitę, bet gali būti taikomas ir penkių parų per savaitę poveikis, jeigu jis pagrindžiamas. Įprastas dozės davimo laikotarpis – 24 mėnesiai. Jeigu naudojant kitos rūšies graužikus nei žiurkės dozė duodama tik per nosį, ilgiausia poveikio trukmė gali būti pakoreguojama siekiant sumažinti tos rūšies gyvūnų patiriamą kančią. Jeigu dozė duodama trumpiau kaip šešias valandas per parą, būtina tai pagrįsti. Taip pat žr. šio priedo B.8 skirsnį (9).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Jeigu bandomoji cheminė medžiaga leidžiama zondu, tai turėtų būti daroma kasdien panašiu metu, naudojant skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Paprastai duodama viena dozė per parą, bet, jeigu, pvz., cheminė medžiaga turi vietinio dirginamojo poveikio, paros dozė gali būti duodama padalyta į kelias dalis (pvz., du kartus per parą). Didžiausias vienkartinis duodamo skysčio kiekis priklauso nuo bandomojo gyvūno dydžio. Tūris turėtų būti kaip įmanoma mažesnis ir, jeigu naudojami graužikai, paprastai neturėtų viršyti 1 ml/100 g kūno masės (31). Bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas, keičiant koncentraciją taip, kad visų dydžių dozių tūris būtų pastovus. Cheminėms medžiagoms, kurios gali turėti ėsdinamojo arba dirginamojo poveikio, taikoma išimtis; tokios medžiagos turi būti atskiestos siekiant išvengti sunkaus vietinio poveikio. Turėtų būti vengiama atlikti bandymus taikant koncentracijas, kurios galėtų turėti ėsdinamojo arba dirginamojo poveikio virškinimo traktui.
                           
                        
                     Tyrimo trukmė
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Jeigu naudojami graužikai, įprasta tyrimo trukmė – 24 mėnesiai, t. y. didžioji naudojamų gyvūnų įprastos gyvenimo trukmės dalis. Atsižvelgiant į tiriamųjų gyvūnų rūšies padermę, gali būti taikoma trumpesnė arba ilgesnė trukmė, tačiau ji turėtų būti pagrįsta. Tam tikros pelių padermėms, pvz., AKR/J, C3H/J arba C57BL/6J, gali būti taikomas 18 mėnesių laikotarpis. Toliau pateikta rekomendacijų dėl tyrimo trukmės, jo nutraukimo ir dėl išgyvenimo; daugiau rekomendacijų, įskaitant patarimus dėl neigiamo kancerogeniškumo, susijusio su išgyvenimu per tyrimą, priimtinumo aspektų, pateikta OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 dėl lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimų planavimo ir atlikimo (7).
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Turėtų būti svarstoma galimybė nutraukti tyrimą, jeigu mažesnes dozes gavusiose grupėse arba kontrolinėje grupėje išgyvenusių gyvūnų procentinė dalis nebesiekia 25 %.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Jeigu dėl toksinio poveikio pirma laiko žūna tik didžiausiąją dozę gavusios grupės gyvūnai, tyrimo nereikėtų nutraukti.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Į kiekvienos lyties gyvūnų išgyvenimą atsižvelgiama atskirai.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Tyrimas neturėtų būti tęsiamas toliau, jeigu atliekant tyrimą gaunami duomenys nebesuteikia galimybės atlikti statistiniu požiūriu pagrįstą vertinimą.
                                       
                                    
                        STEBĖJIMAI
                  
                              33.
                           
                           
                              Visi gyvūnai turėtų būti tikrinami, ar jie sveiki arba nenugaišę; paprastai tai turėtų būti daroma kiekvienos dienos pradžioje ir pabaigoje, įskaitant savaitgalius ir švenčių dienas. Be to, kartą per parą turėtų būti patikrinama, ar gyvūnams nepasireiškė specifinių toksikologinės reikšmės požymių, atsižvelgiant į stipriausią numatomą poveikį po dozės davimo, kai dozė leidžiama zondu. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas auglių vystymuisi; turėtų būti registruojamas kiekvieno akivaizdžiai matomo ir užčiuopiamo auglio atsiradimo laikas, vieta, dydis, išvaizda ir išsivystymas.
                           
                        
                     Kūno masė, pašarų ir (arba) vandens suvartojimas ir pašaro efektyvumas
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Visi gyvūnai turėtų būti pasveriami prieš pradedant duoti dozę, kitas 13 savaičių – ne rečiau kaip kartą per savaitę, o vėliau – bent kartą per mėnesį. Pirmąsias 13 savaičių – ne rečiau kaip kartą per savaitę, o vėliau – bent kartą per mėnesį turėtų būti matuojamas pašaro suvartojimas ir pašaro efektyvumas. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, pirmąsias 13 savaičių – ne rečiau kaip kartą per savaitę, o vėliau – bent kartą per mėnesį turėtų būti matuojamas vandens suvartojimas. Galimybė matuoti vandens suvartojimą turėtų būti svarstoma ir atliekant tyrimus, per kuriuos pasikeičia gėrimo įpročiai.
                           
                        
                     Hematologiniai ir klinikinės biochemijos tyrimai bei kiti matavimai
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Siekiant per tyrimą gauti kuo daugiau informacijos, pirmiausia apie veikimo būdo aspektus, tyrimo vadovo nuožiūra gali būti paimti ėminiai, skirti hematologiniams ir klinikinės biochemijos tyrimams. Be to, gali būti naudinga atlikti šlapimo analizę. Daugiau informacijos apie tokių ėminių naudą atliekant kancerogeniškumo tyrimą pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7). Jeigu priimtina, kraujo ėminių ėmimas hematologiniams ir klinikinės biochemijos tyrimams ir šlapimo analizė gali būti atliekami per gyvūnų marinimo procedūrą (20 skirsnis) ir baigus tyrimą, šiuo tikslu panaudojant ne mažiau kaip po 10 kiekvienos lyties gyvūnų kiekvienoje grupėje. Kraujo ėminiai turėtų būti imami iš nurodytos vietos, pvz., širdies punkcijos vietos arba iš užakiduobinio ančio, taikant nuskausminimą, ir, jeigu taikytina, laikomi tinkamomis sąlygomis. Be to, tyrimams gali būti paruošti kraujo tepinėliai, ypač jeigu nustatoma, kad tikslinis organas yra kaulų čiulpai; tačiau tokių tyrimų nauda siekiant įvertinti kancerogeniškumą ir (arba) onkogeniškumą yra abejotina (32).
                           
                        PATOLOGIJA
                  
                     Bendrasis skrodimas
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Paprastai turėtų būti atliekamas išsamus visų tiriamųjų gyvūnų, išskyrus kontrolinius (žr. 20 skirsnį) ir kitus pagalbinius gyvūnus, bendrasis skrodimas, atidžiai ištiriant kūno paviršių ir visas jo angas, kaukolę, krūtinės ląstą, pilvo ertmes ir jų turinį. Kontrolinius ir kitus pagalbinius gyvūnus gali reikėti skrosti atsižvelgiant į konkretų atvejį ir vadovaujantis tyrimo vadovo nuožiūra. Atliekant kancerogeniškumo tyrimą organai paprastai nesveriami, nes dėl senėjimo pakitimų, o vėliau – dėl auglių išsivystymo organų svėrimo duomenys tampa nenaudingi. Tačiau jie gali būti svarbūs atliekant įrodomosios duomenų galios vertinimą, o ypač – svarstant veikimo būdo aspektus. Jeigu atliekant pagalbinį tyrimą sveriami organai, tai turėtų būti daroma nė vėliau kaip po metų nuo tyrimo pradžios.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Atsižvelgiant į audinio tipą ir numatomą vėliau atlikti histopatologinį tyrimą, tinkamiausioje fiksavimo terpėje turėtų būti konservuojami šie audiniai (33) (laužtiniuose skliaustuose nurodytų audinių konservuoti nebūtina):
                              
                                          Visi labai pakitę audiniai
                                       
                                       
                                          Širdis
                                       
                                       
                                          Kasa
                                       
                                       
                                          Skrandis (įskrandis, liaukinė skrandžio dalis)
                                       
                                    
                                          Antinksčiai
                                       
                                       
                                          Klubinė žarna
                                       
                                       
                                          Prieskydinė liauka
                                       
                                       
                                          [Dantys]
                                       
                                    
                                          Aorta
                                       
                                       
                                          Tuščioji žarna
                                       
                                       
                                          Periferinis nervas
                                       
                                       
                                          Sėklidės
                                       
                                    
                                          Smegenys (įskaitant didžiųjų smegenų, smegenėlių ir pailgųjų smegenų (smegenų tilto) išpjovas)
                                       
                                       
                                          Inkstai
                                       
                                       
                                          Hipofizė
                                       
                                       
                                          Užkrūčio liauka
                                       
                                    
                                          Akloji žarna
                                       
                                       
                                          Ašarų liauka (viršakiduobinė)
                                       
                                       
                                          Prostata
                                       
                                       
                                          Skydliaukė
                                       
                                    
                                          Gimdos kaklelis
                                       
                                       
                                          Kepenys
                                       
                                       
                                          Tiesioji žarna
                                       
                                       
                                          [Liežuvis]
                                       
                                    
                                          Koaguliatorių liauka
                                       
                                       
                                          Plaučiai
                                       
                                       
                                          Seilių liauka
                                       
                                       
                                          Trachėja
                                       
                                    
                                          Gaubtinė žarna
                                       
                                       
                                          Limfmazgiai (paviršiniai ir giluminiai)
                                       
                                       
                                          Sėklinės pūslelės
                                       
                                       
                                          Šlapimo pūslė
                                       
                                    
                                          Dvylikapirštė žarna
                                       
                                       
                                          Pieno liauka (patelėms – privaloma, patinams – jeigu galima ištirti akimi)
                                       
                                       
                                          Skeleto raumuo
                                       
                                       
                                          Gimda (su gimdos kakleliu)
                                       
                                    
                                          Sėklidžių prielipai
                                       
                                       
                                          [Viršutiniai kvėpavimo takai, įskaitant nosį, kriaukles ir šalutines nosies ertmes]
                                       
                                       
                                          Oda
                                       
                                       
                                          [Šlapimtakis]
                                       
                                    
                                          Akys (su tinklaine)
                                       
                                       
                                          Stemplė
                                       
                                       
                                          Stuburo smegenys (trys lygiai: sprando, krūtinės ląstos ir juosmens)
                                       
                                       
                                          [Šlaplė]
                                       
                                    
                                          [Šlaunikaulis su kelio sąnariu]
                                       
                                       
                                          [Uoslės receptoriai]
                                       
                                       
                                          Blužnis
                                       
                                       
                                          Makštis
                                       
                                    
                                          Tulžies pūslė (jeigu tiriamos ne žiurkės)
                                       
                                       
                                          Kiaušidės
                                       
                                       
                                          [Krūtinkaulis]
                                       
                                       
                                          Kaulų čiulpų išpjova ir (arba) šviežiai paruošta kaulų čiulpų punkcija
                                       
                                    
                                          Harderio liauka
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    Jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinksčiai, turėtų būti konservuojami abu organai. Atsižvelgiant į gautas klinikines ir kitokias išvadas, gali reikėti ištirti papildomus audinius. Be to, atsižvelgiant į žinomas bandomosios cheminės medžiagos savybes, turėtų būti konservuojami visi numanomi tiksliniai organai. Atliekant tyrimus, per kuriuos dozė duodama per odą, turėtų būti konservuojami organai, nurodyti kaip konservuotini, kai dozė duodama per burną; be to, labai svarbu, kad būtų paimti ir užkonservuoti specifiniai odos ėminiai iš poveikio vietos. Atliekant inhaliacinius tyrimus, konservuotinų ir tirtinų kvėpavimo takų audinių sąrašas turėtų būti sudaromas remiantis šio priedo B.8 ir B.29 skyriuose pateiktomis rekomendacijomis. Tiriant kitus organus ir (arba) audinius (be specialiai konservuojamų kvėpavimo takų audinių), turėtų būti tiriami organai, nurodyti dėl poveikio per virškinamąjį traktą būdo pateiktame organų sąraše.
                           
                        
                     Histopatologinis tyrimas
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Yra parengtos toksikologinės patologijos tyrimų geriausiosios patirties gairės (33). Turėtų būti ištirti bent šie audiniai:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          visi didžiausiąją dozę gavusios grupės ir kontrolinės grupės gyvūnų audiniai,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          visi per tyrimą nugaišusių arba numarintų gyvūnų audiniai,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          visi audiniai su plika akimi matomais pakitimais,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          jeigu didžiausiąją dozę gavusioje grupėje pastebima su dozės davimu susijusių histopatologinių pakitimų, tiriami tie patys visų kitų dydžių dozės gavusių grupių gyvūnų audiniai,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinksčiai, turėtų būti tiriami abu organai.
                                       
                                    
                        DUOMENYS IR ATASKAITOS
                  
                     Duomenys
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Turėtų būti pateikti kiekvieno gyvūno duomenys pagal visus vertinamus parametrus. Be to, visi duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, pagal kiekvieną bandomąją grupę nurodant pradedant bandymą turėtų gyvūnų skaičių, atliekant bandymą nugaišusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičių ir kiekvienos žūties arba numarinimo dėl humaniškų priežasčių laiką, gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičių, pastebėtų toksiškumo požymių aprašymą, įskaitant kiekvieno toksinio poveikio pasireiškimo laiką, trukmę ir sunkumą, gyvūnų su audinių pakitimais skaičių, pakitimų tipą ir gyvūnų su kiekvieno tipo pakitimais procentinę dalį. Gyvūnams, kuriems pasireiškė toksinis poveikis arba atsirado audinių pakitimų, be pakitimų lygmens įvertinimo, suvestinių duomenų lentelėse turėtų būti pateikti vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai (ištisinio bandymo duomenų).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Istoriniai kontroliniai duomenys gali būti vertingi aiškinant tyrimo rezultatus, pvz., kai yra požymių, kad taikant vienalaikę kontrolę gauti duomenys iš esmės skiriasi, palyginti su naujausiais duomenimis, gautais stebint kontrolinius gyvūnus, esančius toje pačioje bandymo patalpoje arba kolonijoje. Istoriniai kontroliniai duomenys, jeigu jie vertinami, turėtų būti pateikti tos pačios laboratorijos ir turėtų būti susiję su to paties amžiaus ir padermės, išvestos penkerių metų laikotarpiu iki svarstomo tyrimo, gyvūnais.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Jeigu taikytina, skaitiniai rezultatai turėtų būti įvertinti tinkamu, visuotinai priimtinu statistiniu metodu. Statistiniai metodai ir analizei skirti duomenys turi būti pasirinkti planuojant bandymą (9 skirsnis). Parenkant duomenis, turėtų būti numatytos pataisos atsižvelgiant į gyvūnų išgyvenimą.
                           
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikta toliau nurodyta informacija.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizinė būsena, grynumas, fizinės ir cheminės savybės,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikavimo duomenys,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      cheminės medžiagos šaltinis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      partijos numeris,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      cheminės analizės pažyma.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nešiklis (jeigu naudojamas):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nešiklio pasirinkimo pagrindimas (jeigu tai ne vanduo).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomieji gyvūnai:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudota rūšis ir (arba) padermė ir pasirinkimo pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gyvūnų skaičius ir amžius pradedant bandymą, nurodant lytį,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kiekvieno gyvūno masė pradedant bandymą.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dozės davimo būdo ir dozės parinkimo pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jeigu taikytina, taikyti statistiniai duomenų analizės metodai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos ir pašaro paruošimą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analitiniai duomenys apie pasiektą koncentraciją, preparato stabilumą ir homogeniškumą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dozės davimo būdas ir išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos davimą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jeigu tai inhaliaciniai tyrimai: ar dozė duodama tik per nosį, ar per visą kūną,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      faktinės dozės (mg/kg kūno masės per parą) ir bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos pašare ir (arba) geriamajame vandenyje (mg/kg arba ppm) perskaičiavimo į faktinę dozę koeficientas, jeigu taikytina,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatai (turėtų būti pateiktos suvestinių duomenų lentelės ir kiekvieno gyvūno duomenys)
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bendrieji duomenys:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išgyvenimo duomenys,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kūno masė ir (arba) kūno masės pokyčiai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pašaro suvartojimas, pašaro efektyvumo skaičiavimai, jeigu jie buvo atlikti, ir vandens suvartojimas, jeigu taikytina,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toksikonetiniai duomenys, jeigu yra,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmoskopinių tyrimų duomenys (jeigu yra),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologinių tyrimų duomenys (jeigu yra),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinikinės chemijos tyrimų duomenys (jeigu yra).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Klinikinės išvados:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toksiškumo požymiai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nukrypimų dažnumas (ir, jeigu įvertinta, dydis),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinikinių požymių pobūdis, sunkumas ir trukmė (laikinieji ar negrįžtamieji).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Skrodimo duomenys:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      galutinė kūno masė,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      organų masė ir masių santykiai, jeigu taikytina,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skrodimo išvados, nukrypimų dažnumas ir dydis.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Histopatologinis tyrimas:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      histopatologinių tyrimų, išskyrus neoplastinius, rezultatai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      neoplastinių tyrimų rezultatai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nustatytų didelių ir mikroskopinių pakitimų sąryšis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsamus visų su dozės davimu susijusių histopatologinio tyrimo rezultatų aprašymas, pateikiant sunkumo lygio vertinimus,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skaidrių tarpusavio peržiūros ataskaita.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Statistinis rezultatų apdorojimas, jeigu taikytina.
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatų aptarimas, apimantis:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      modeliavimo metodų aptarimą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybes,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      istorinius kontrolinius duomenis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      veikimo būdo informacijos svarstymą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      OD, NNPL ir MPNPL nustatymą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      reikšmę žmonėms.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Išvados.
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the SAFEty Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Šio priedo B.27 skyrius. 90 dienų kartotinės dozės toksiškumo per virškinamąjį traktą ne graužikams tyrimas.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Šio priedo B.8 skyrius. Poūmis toksiškumas įkvėpus. 28 dienų tyrimas.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Šio priedo B.29 skyrius. Pusiau lėtinis toksiškumas įkvėpus. 90 dienų tyrimas.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Šio priedo B.9 skyrius. Kartotinės dozės (28 dienų) toksiškumas (per odą).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793–801.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581–589.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51–56.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591–653.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical SAFEty Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human SAFEty Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical SAFEty Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical SAFEty Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical SAFEty Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69–98.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279–284.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105: 1196–1203.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              2010 m. rugsėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES dėl mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsaugos, OL L 276, 2010 10 20, p. 33.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86–23. Washington, D.C., US Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3–906255–04–2.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15–23.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Weingand K, et al. (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and SAFEty Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198–201.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P, et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
                           
                        
                     1 priedėlis
                     APIBRĖŽTIS
                     Bandomoji cheminė medžiaga– naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga arba mišinys.
                  
                  B.33.   JUNGTINIAI LĖTINIO TOKSIŠKUMO IR KANCEROGENIŠKUMO TYRIMAI
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 453 (OECD bandymo gairės Nr. 453) (2009). Originalios bandymo gairės TG 453 priimtos 1981 m. Šis atnaujintasis B.33 bandymo metodas parengtas atsižvelgiant į poreikį įvertinti naujausius pasiekimus gyvūnų gerovės srityje ir norminių reikalavimų pasikeitimus (1) (2) (3) (4) (5). B.33 bandymo metodas buvo atnaujinamas kartu su šio priedo B.32 skyriumi „Kancerogeniškumo tyrimai“ ir šio priedo B.30 skyriumi „Lėtinio toksiškumo tyrimai“, siekiant gauti papildomos informacijos remiantis per tyrimą naudotais gyvūnais ir pateikti išsamesnių rekomendacijų dėl dozės parinkimo. Šis bandymo metodas skirtas taikyti bandant labai įvairias chemines medžiagas, įskaitant pesticidus ir pramonines chemines medžiagas. Reikėtų atkreipti dėmesį, kad kai kurios vaistams taikytinos išsamios nuostatos ir reikalavimai gali skirtis [žr. Tarptautinės konferencijos dėl suderinimo (ICH) Vaistų kancerogeniškumo bandymų gaires S1B].
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Daugelis lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimų atliekami naudojant graužikų rūšis, todėl šis metodas pirmiausia taikytinas tyrimams, atliekamiems naudojant šias rūšis. Jeigu tokius tyrimus reikėtų atlikti naudojant ne graužikų rūšis, jiems taip pat gali būti taikomi čia ir šio priedo B.27 skyriuje „90 dienų kartotinės dozės toksiškumo per virškinamąjį traktą ne graužikams tyrimas“ (6) išdėstyti principai ir procedūros su atitinkamais pakeitimais, kaip aprašyta OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 dėl lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimų planavimo ir atlikimo (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Atliekant lėtinio toksiškumo ir (arba) kancerogeniškumo tyrimus, dozė paprastai gali būti duodama trimis būdais – per burną, odą ir kvėpavimo takus. Dozės davimo būdas parenkamas atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos fizines ir chemines savybes ir labiausiai paplitusį poveikio žmonėms būdą. Daugiau informacijos apie poveikio būdo parinkimą pateikta OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas iš esmės skirtas poveikio per virškinamąjį traktą būdui, nes šis būdas dažniausiai taikomas atliekant lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimus. Norint įvertinti žmonių sveikatai gresiančią riziką ir (arba) laikantis tam tikros reglamentavimo tvarkos gali reikėti atlikti ilgalaikius tyrimus, per kuriuos dozė būtų duodama per odą ir kvėpavimo takus, tačiau techniniu požiūriu abu poveikio būdai yra gana sudėtingi. Šie tyrimai turės būti planuojami atsižvelgiant į konkretų atvejį, tačiau čia aprašytu bandymo metodu, skirtu įvertinti lėtinį toksiškumą ir kancerogeniškumą, kai dozė duodama per burną, gali būti remiamasi rengiant inhaliacinių ir (arba) odinių tyrimų protokolą, atsižvelgiant į rekomendacijas dėl poveikio laikotarpių, klinikinių ir patologinių parametrų ir t. t. Yra parengtos OECD rekomendacijos dėl bandomųjų cheminių medžiagų dozių davimo per kvėpavimo takus (7) (8) ir odą (7). Planuojant ilgesnius tyrimus, per kuriuos dozės duodamos per kvėpavimo takus, pirmiausia turėtų būti remiamasi šio priedo B.8 skyriumi (9) ir šio priedo B.29 skyriumi (10), taip pat OECD rekomendaciniu dokumentu dėl ūmaus poveikio įkvėpus bandymų (8). Jeigu bandymai atliekami taikant poveikio per odą būdą, turėtų būti remiamasi šio priedo B.9 skyriumi (11).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Atliekant jungtinį lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimą gaunama informacijos apie galimus pavojus sveikatai, galinčius kilti dėl kartotinio poveikio laikotarpiu, kuris gali atitikti ir visą naudojamos rūšies gyvūnų gyvenimo trukmę. Tyrimas suteikia informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos toksinį poveikį, įskaitant galimą kancerogeniškumą, ir padeda nustatyti tikslinius organus bei kaupimosi galimybę. Be to, jis gali padėti apytiksliai nustatyti nepastebimo neigiamo poveikio lygį, susijusį su toksiniu negenotoksinių kancerogenų poveikiu ir auglių sukėlimu; šis įvertis gali būti naudojamas nustatant saugaus poveikio žmonėms kriterijus. Taip pat pabrėžiamas gyvūnų kruopščių klinikinių stebėjimų būtinumas, kad būtų gauta kuo daugiau informacijos.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Pagal šį bandymo metodą atliekamų lėtinio toksiškumo ir (arba) kancerogeniškumo tyrimų tikslai:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          nustatyti kancerogenines bandomosios cheminės medžiagos savybes, dėl kurių dažniau atsiranda neoplazmų, didėja piktybinių neoplazmų santykinė dalis arba trumpėja neoplazmų atsiradimo laikas, palyginti su vienalaikės kontrolės grupėmis,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          neoplazmų atsiradimo laiko nustatymas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          bandomosios cheminės medžiagos lėtinio toksiškumo nustatymas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          lėtinio toksiškumo ir (arba) kancerogeninio poveikio tikslinio (-ų) organo (-ų) nustatymas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybės apibūdinimas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          nepastebimo neigiamo poveikio lygio (NNPL) arba orientacinės dozės (OD) nustatymo pagrindo nustatymas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kancerogeninio poveikio ekstrapoliavimas siekiant nustatyti mažiausiosios dozės poveikio žmonėms lygius,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          žmonėms taikomų poveikio lygių lėtinio toksiškumo prognozavimas,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          duomenų teikimas rengiant bandymų hipotezes dėl veikimo būdo (2) (7) (12) (13) (14) (15).
                                       
                                    
                        PIRMINIAI ASPEKTAI
                  
                              7.
                           
                           
                              Vertindama galimą bandomosios cheminės medžiagos kancerogeniškumą ir lėtinį toksiškumą, bandymų laboratorija, prieš atlikdama tyrimą, turėtų apsvarstyti visą turimą informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą, kad planuojant tyrimą pirmiausia būtų siekiama padidinti jos toksinių savybių tyrimo veiksmingumą ir sumažinti gyvūnų naudojimą. Labai svarbu turėti informacijos apie numanomo kancerogeno veikimo būdą ir atsižvelgti į šią informaciją (2) (7) (12) (13) (14) (15), nes tinkamiausio plano parinkimas gali priklausyti nuo, ar bandomoji cheminė medžiaga yra žinoma arba įtariama kaip kancerogeninė. Daugiau patarimų, susijusių su veikimo būdo aspektais, pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Parengti tyrimo planą padės informacija apie bandomosios cheminės medžiagos tapatumą, cheminę struktūrą, fizines ir chemines savybes, veikimo būdą, taip pat toksiškumo bandymų in vitro arba in vivo, įskaitant genotoksiškumo tyrimus, rezultatai, numatomas (-i) panaudojimo būdas (-ai) ir galimas poveikis žmogui, turimi (Q)SAR duomenys ir mutageniškumo ir (arba) genotoksiškumo, kancerogeniškumo ir kiti toksikologiniai duomenys apie panašios struktūros chemines medžiagas, turimi toksikokinetiniai duomenys (vienos dozės ir, jeigu yra, kartotinės dozės kinetinės savybės) ir duomenys, gauti atlikus kitus kartotinio poveikio tyrimus. Lėtinis toksiškumas ir (arba) kancerogeniškumas turėtų būti nustatomas (-i) tik gavus pirminės informacijos apie toksiškumą, pagrįstos 28 dienų ir (arba) 90 dienų kartotinės dozės toksiškumo bandymais. Be to, naudingos informacijos gali suteikti trumpalaikiai piktybinių auglių sukėlimo ir paskatinimo bandymai. Atliekant bendrąjį konkrečios bandomosios cheminės medžiagos galimo neigiamo poveikio sveikatai vertinimą, turėtų būti apsvarstyta galimybė taikyti etapinį kancerogeniškumo bandymo metodą (16) (17) (18) (19).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Prieš pradedant tyrimą, atsižvelgiant į bandymo planą ir tikslus, turėtų būti nustatyti tinkamiausi statistiniai rezultatų analizės metodai. Turėtų būti apsvarstyta, ar rengiant statistinius duomenis turėtų būti atlikta pataisa atsižvelgiant į išgyvenimo rodiklius, kaupiamosios auglių rizikos ir jos ryšio su išgyvenimo trukme analizė ir analizė pirmalaikio vienos arba daugiau grupių pašalinimo atveju. Rekomendacijų dėl tinkamos statistinės analizės ir pagrindinės informacijos apie tarptautiniu mastu pripažintus statistinius metodus pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7), taip pat rekomendaciniame dokumente Nr. 35 dėl lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimų analizės ir vertinimo (20).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Atliekant kancerogeniškumo tyrimą, visada turėtų būti atsižvelgiama į pagrindinius principus ir aspektus, išdėstytus OECD rekomendaciniame dokumente dėl klinikinių požymių, kaip pasekmių žmonėms, pasireiškimo vertinant saugumą naudojamiems bandomiesiems gyvūnams pripažinimo, vertinimo ir taikymo (21), pirmiausia jo 62 skirsnyje. Tame skirsnyje teigiama: „Jeigu per kartotinės dozės tyrimus gyvūnams pasireiškia klinikinių požymių, kurie progresuoja ir dėl kurių toliau prastėja sveikatos būklė, turėtų būti priimtas informacija pagrįstas sprendimas, ar nereikėtų humaniškai numarinti gyvūno. Priimant sprendimą turėtų būti atsižvelgiama į informacijos, kuri būtų gauta tęsiant tyrimą su šiuo gyvūnu, vertės ir šio gyvūno bendrosios būklės santykį. jeigu nusprendžiama tęsti bandymą su šiuo gyvūnu, atsižvelgiant į poreikį, turėtų būti padidintas stebėjimų dažnumas. Be to, galbūt būtų įmanoma labai nepakenkiant bandymo tikslui laikinai nutraukti dozės davimą, jeigu dėl to sumažėtų skausmas ar kančia, arba sumažinti bandomąją dozę.“
                              
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Išsamių rekomendacijų dėl dozės parinkimo lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimams principų ir jų svarstymų pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7), taip pat Tarptautinio gamtos mokslų instituto leidiniuose (22) (23). Pagrindinė dozės parinkimo strategija priklauso nuo tyrimo pagrindinio tikslo arba tikslų (6 skirsnis). Parenkant tinkamus dozių dydžius, pavojų atranka turėtų būti vykdoma atsižvelgiant į mažų dozių sukeliamas reakcijas ir į tų pavojų reikšmę. Tai ypač svarbu parenkant dozes čia aprašomam bendram lėtinio toksiškumo ir (arba) kancerogeniškumo tyrimui.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Turėtų būti apsvarstyta galimybė atlikti čia aprašomą jungtinį lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimą, o ne atskirai atlikti lėtinio toksiškumo tyrimą (šio priedo B.30 skyrius) ir kancerogeniškumo tyrimą (šio priedo B.32 skyrius). Palyginti su dviem atskirais tyrimais, atliekant jungtinį bandymą užtikrinamas didesnis veiksmingumas laiko ir išlaidų požiūriu, taip pat šiek tiek mažesnis gyvūnų naudojimas, neprarandant duomenų kokybės nei lėtinio poveikio, nei kancerogeniškumo bandymo etapu. Tačiau, atliekant jungtinį lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimą, turėtų būti kruopščiai apsvarstyti dozės parinkimo principai (11 ir 22–26 skirsniai); be to, pripažinta, kad pagal tam tikras reglamentavimo sistemas gali reikėti atlikti atskirus tyrimus. Daugiau patarimų dėl bendro lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimo planavimo siekiant užtikrinti kuo didesnį tyrimo veiksmingumą mažinant naudojamų gyvūnų skaičių ir paprastinant įvairias bandymų procedūras pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Aprašant šį bandymo metodą vartojamos apibrėžtys pateiktos šio skyriaus pabaigoje ir rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                           
                        BANDYMO PRINCIPAS
                  
                              14.
                           
                           
                              Tyrimo planas sudaromas iš dviejų vienalaikių etapų – lėtinio toksiškumo bandymo etapo ir kancerogeniškumo bandymo etapo (informacijos apie šių etapų trukmę atitinkamai pateikta 34 ir 35 skirsniuose). Bandomoji cheminė medžiaga paprastai duodama per burną, tačiau gali būti tinkamas ir dozės davimas per kvėpavimo takus arba per odą. Lėtinio toksiškumo bandymo etapu bandomoji cheminė medžiaga kasdien skirtingo dydžio dozėmis duodama kelioms bandomųjų gyvūnų grupėms, kiekvienai grupei duodant vieno dydžio dozę; įprastas dozės davimo laikotarpis – 12 mėnesių, tačiau, atsižvelgiant į norminius reikalavimus, gali būti taikomos ilgesnės arba trumpesnės trukmės (žr. 34 skirsnį). Ši trukmė parenkama taip, kad būtų pakankamai ilga, jog aiškiai pasireikštų kaupiamasis toksiškumas, tačiau jis nebūtų painiojamas su senėjimo pakitimais. Pagal tyrimo planą taip pat gali būti numatyta vienas arba daugiau kartu marinti gyvūnus nebaigus bandymo, pvz., po trijų ir šešių mėnesių; šiuo tikslu gali būti įtraukiamos papildomos gyvūnų grupės (žr. 20 skirsnį). Kancerogeniškumo bandymo etapu bandomoji cheminė medžiaga kasdien, paprastai per burną, duodama kelioms bandomųjų gyvūnų grupėms didžiąją jų gyvenimo trukmės dalį. Abiem etapais atidžiai stebima, ar gyvūnams nepasireiškė toksiškumo požymių ir ar neatsirado neoplastinių pakitimų. Bandymo metu nugaišę arba numarinti gyvūnai skrodžiami, o baigus bandymą numarinami ir skrodžiami išgyvenę gyvūnai.
                           
                        METODO APRAŠYMAS
                  
                     Gyvūnų rūšies parinkimas
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas pirmiausia taikomas vertinant lėtinį toksiškumą ir kancerogeniškumą graužikams (2 skirsnis). Galimybė naudoti ne graužikų rūšis gali būti svarstoma, jeigu turimi duomenys rodo, kad jie tinkamesni prognozuoti poveikį žmonių sveikatai. Gyvūnų rūšies pasirinkimas turėtų būti pagrįstas. Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, bet galima naudoti ir kitų rūšių graužikus, pvz., peles. Nors pelių naudojimas atliekant kancerogeniškumo bandymus gali būti nelabai naudingas (24) (25) (26), pagal kai kurias dabartines reglamentavimo programas kancerogeniškumo bandymai naudojant peles vis dar yra būtini, jeigu nenustatoma, kad toks tyrimas moksliniu požiūriu nėra būtinas. Žiurkės ir pelės yra tinkamiausi bandomieji gyvūnai, nes jų gyvenimo trukmė palyginti trumpa, jos plačiai naudojamos atliekant farmakologinius ir toksikologinius tyrimus, jos jautrios auglių sukėlimui, yra pakankami gerai aprašytų padermių. Atsižvelgiant į šias savybes, yra daug informacijos apie jų fiziologiją ir patologiją. Ne graužikų rūšims pasireiškiančio lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimų planas ir atlikimas prireikus turėtų būti grindžiami aprašant šį bandymą ir šio priedo B.27 skyriuje „90 dienų kartotinės dozės toksiškumo per virškinamąjį traktą ne graužikams tyrimas“ (6) išdėstytais principais. Daugiau informacijos apie gyvūnų rūšies ir padermės pasirinkimą pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių padermių gyvūnai. Jungtinis lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimas turėtų būti atliekamas naudojant tos pačios padermės ir iš to paties šaltinio gautus gyvūnus, kokie buvo naudojami per trumpesnį (-ius) išankstinį (-ius) toksiškumo tyrimą (-us), tačiau, jeigu žinoma, kad naudojant šios veislės ir šio šaltinio gyvūnus sunku įgyvendinti per ilgesnės trukmės tyrimus paprastai taikomus išgyvenimo kriterijus [žr. rekomendacinį dokumentą Nr. 116 (7)], turėtų būti svarstoma galimybė naudoti tokią gyvūnų padermę, kurios išgyvenimo per ilgesnės trukmės tyrimą rodiklis būtų priimtinas. Patelės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos.
                           
                        
                     Laikymo ir šėrimo sąlygos
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Gyvūnai gali būti laikomi po vieną arba mažomis tos pačios lyties grupėmis; galimybė laikyti gyvūnus po vieną turėtų būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu tai moksliškai pagrįsta (27) (28) (29). Narveliai turėtų būti išdėstyti taip, kad galimas narvelių išdėstymo poveikis tyrimo rezultatams turėtų būtų kuo mažesnis. Bandomųjų gyvūnų laikymo patalpos temperatūra turėtų būti 22 °C (± 3 °C). Nors santykinis drėgnis turėtų būti ne mažesnis kaip 30 % ir, pageidautina, ne didesnis kaip 70 % (išskyrus patalpų valymo metą), turėtų būti siekiama palaikyti 50–60 % santykinį drėgnį. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Šėrimo režimas turėtų atitikti visus bandomųjų gyvūnų rūšies mitybos reikalavimus; pašaro sudėtyje turėtų būti kuo mažiau teršalų, įskaitant (be kitų teršalų) pesticidų likučius, patvariuosius organinius teršalus, fitoestrogenus, sunkiuosius metalus ir mikotoksinus. Turėtų būti periodiškai – bent pradedant tyrimą ir pasikeitus naudojamai partijai – rengiama analitinė informacija apie pašarines medžiagas ir pašaro sudėtyje esančių teršalų lygius; ši informacija turėtų būti pateikta galutinėje ataskaitoje. Turėtų būti rengiama atitinkama analitinė informacija apie tyrimo metu naudojamą geriamąjį vandenį. Pašaro parinkimui gali turėti įtakos poreikis tinkamai įmaišyti bandomąją cheminę medžiagą ir laikytis gyvūnų mitybos reikalavimų, kai bandomoji cheminė medžiaga duodama su pašaru.
                           
                        
                     Gyvūnų paruošimas
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojami sveiki gyvūnai, ne trumpiau kaip septynias paras pratinti prie laboratorinių sąlygų ir anksčiau nenaudoti kitiems bandymams. Jeigu naudojami graužikai, dozė gyvūnams turėtų būti pradedama duoti kaip galima anksčiau po atjunkymo ir pripratinimo, pageidautina, ne vėliau nei gyvūnams sueina aštuonios savaitės. Gyvūnai turėtų būti apibūdinti nurodant rūšį, padermę, šaltinį, lytį, masę ir amžių. Pradedant tyrimą kiekvienos lyties gyvūnų kūno masės skirtumai turi būti kuo mažesni ir pagal kiekvieną lytį nenukrypti nuo visų tyrime dalyvaujančių gyvūnų kūno masės vidurkio daugiau kaip ± 20 %. Gyvūnai turėtų būti atsitiktine tvarka suskirstyti į kontrolines ir bandomąsias grupes. Gyvūnus suskirsčius atsitiktine tvarka, grupių vidutinės kūno masės pagal lytį neturėtų smarkiai skirtis. Jeigu yra statistiniu požiūriu didelių skirtumų, atsitiktinis suskirstymo etapas turėtų būti pakartotas (jeigu tai įmanoma). Kiekvienam gyvūnui turėtų būti suteiktas unikalus identifikavimo numeris, kuriuo gyvūnas visam laikui pažymimas jį ištatuiruojant, implantuojant mikroschemą arba kitu tinkamu būdu.
                           
                        PROCEDŪRA
                  
                     Gyvūnų skaičius ir lytis
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojami abiejų lyčių gyvūnai. Turėtų būti naudojama pakankamai gyvūnų, kad būtų galima atlikti išsamią biologinę ir statistinę analizę. Todėl, jeigu naudojami graužikai, kiekvienoje dozę gaunančioje (kaip aprašyta 22 skirsnyje) ir vienalaikės kontrolės grupėje, skirtoje tyrimo kancerogeniškumo bandymo etapui, turėtų būti ne mažiau kaip po 50 kiekvienos lyties gyvūnų. Atsižvelgiant į tyrimo tikslą, gali būti įmanoma padidinti statistinį pagrindinių įverčių patikimumą nevienodai suskirstant gyvūnus į įvairaus dydžio dozėms skirtas grupes, mažiausiajai dozei skirtas grupes sudarant iš daugiau kaip 50 gyvūnų, pvz., kad būtų galima apytikriai įvertinti kancerogeniškumą duodant mažiausiąsias dozes. Tačiau reikėtų pripažinti, kad nedaug padidinus grupės dydį tyrimo statistinis patikimumas padidės gana nežymiai. Jeigu naudojami graužikai, kiekvienoje dozę gaunančioje (kaip aprašyta 22 skirsnyje) ir vienalaikės kontrolės grupėje, skirtoje tyrimo lėtinio toksiškumo bandymo etapui, turėtų būti ne mažiau kaip po 10 kiekvienos lyties gyvūnų. Reikėtų atkreipti dėmesį, kad šis skaičius yra mažesnis nei per lėtinio toksiškumo tyrimą (šio priedo B.30 skyrius). Tačiau aiškinti duomenis, šio bendro tyrimo lėtinio toksiškumo bandymo etapu gautus naudojant mažesnes gyvūnų grupes, padės duomenys, gauti naudojant daugiau gyvūnų tyrimo kancerogeniškumo bandymo etapu. Jeigu tyrimams naudojamos pelės, į lėtinio toksiškumo bandymo etapo kiekvieno dydžio dozei skirtą grupę gali reikėti įtraukti daugiau gyvūnų, kad būtų galima atlikti visus reikiamus hematologinius tyrimus. Daugiau informacijos apie statistinį tyrimo planavimą ir dozių dydžių parinkimą siekiant kuo labiau padidinti statistinį patikimumą pateikta OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                           
                        
                     Rezervo sudarymas atsižvelgiant į gyvūnų marinimą nebaigus bandymo, pagalbinės grupės sudarymas ir kontrolinių gyvūnų parūpinimas
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Jeigu tai moksliškai pagrįsta, rengiantis tyrimui gali būti sudarytas rezervas atsižvelgiant į gyvūnų marinimą nebaigus bandymo, pvz., lėtinio toksiškumo bandymo etapu – po 6 mėnesių, kad būtų galima gauti informacijos apie neoplastinių pakitimų vystymąsi ir mechanistinės informacijos. Jeigu tokios informacijos apie bandomąją cheminę medžiagą jau turima remiantis anksčiau atliktais kartotinės dozės toksiškumo tyrimais, gyvūnų marinimo nebaigus bandymo moksliškai pagrįsti negalima. Tyrimo lėtinio toksiškumo etapu, kuris paprastai trunka 12 mėnesių (34 skirsnis), nebaigus bandymo numarintų gyvūnų duomenimis bus galima pasinaudoti tyrimo kancerogeniškumo bandymo etapu ir taip sumažinti bendrą naudojamų gyvūnų skaičių. Tyrimo lėtinio toksiškumo bandymo etapu taip pat gali būti naudojamos pagalbinės grupės, skirtos stebėti tiriamos bandomosios cheminės medžiagos sukeltų toksikologinių pakitimų grįžtamumą. Sudarant šias pagalbines grupes gali būti apsiribojama tik didžiausiosios dozės grupe ir kontroline grupe. Gali būti numatyta papildoma kontrolinių gyvūnų grupė (paprastai – po penkis kiekvienos lyties gyvūnus), skirta prireikus stebėti ligos būklę tyrimo metu (30). Daugiau patarimų dėl nebaigus bandymo numatytų marinti, pagalbinių ir kontrolinių gyvūnų įtraukimo į tyrimo planą, kartu kaip galima labiau sumažinant bendrą naudojamų gyvūnų skaičių, pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Jeigu į tyrimo planą įtraukiami pagalbiniai gyvūnai ir (arba) jeigu pagal tyrimo planą numatomas gyvūnų marinimas nebaigus bandymo, šiuo tikslu įtraukiamoje kiekvieno dydžio dozei skirtoje grupėje paprastai turėtų būti po 10 kiekvienos lyties gyvūnų, o bendras pagal tyrimo planą numatytas gyvūnų skaičius turėtų būti padidintas numatomu iki tyrimo pabaigos numarinti gyvūnų skaičiumi. Gyvūnai, kuriuos numatyta marinti nebaigus bandymo, ir pagalbiniai gyvūnai turėtų stebimi taip pat, kaip pagrindinio tyrimo lėtinio toksiškumo etapo gyvūnai, įskaitant kūno masės stebėjimą, pašarų ir vandens suvartojimo stebėjimą, hematologinius ir klinikinės biochemijos matavimus ir patologinius tyrimus, tačiau taip pat gali būti numatyta (grupėse, kuriose gyvūnai bus marinami nebaigus bandymo) atlikti tik tokius matavimus, kurie yra susiję su specifiniais, pagrindiniais matais, pvz., neurotoksiškumu arba imunotoksiškumu.
                           
                        
                     Dozių dydžių grupės ir dozuotė
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Rekomendacijos dėl visų aspektų, susijusių su dozių dydžių parinkimu ir dozių dydžių skirtumų nustatymu, pateiktos rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7). Lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo bandymų etapais turėtų būti taikomi ne mažiau kaip trys dozių dydžiai ir vienalaikė kontrolė. Dozių dydžiai paprastai grindžiami trumpesnio laikotarpio kartotinių dozių arba ribų nustatymo tyrimų rezultatais ir turėtų būti nustatomi atsižvelgiant į visus turimus toksikologinius ir toksikokinetinius duomenis apie bandomąją medžiagą arba panašias chemines medžiagas.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Jeigu galima numatyti, kad vieno dydžio dozės, atitinkančios bent 1 000 mg/kg kūno masės per parą, bandymas nesukels neigiamo poveikio, visas trijų dydžių dozės tyrimas lėtinio toksiškumo bandymo etapu gali būti laikomas nebūtinu. Šiuo tikslu turėtų būti remiamasi išankstinių tyrimų informacija ir panašios struktūros cheminių medžiagų duomenimis pagrįsta nuomone, kad toksinio poveikio nebus. 1 000 mg/kg kūno masės per parą ribinė vertė gali būti taikoma tada, kai nereikia skirti didesnės dozės atsižvelgiant į poveikį žmogui.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Jeigu dozė neturėtų būti ribojama atsižvelgiant į bandomosios medžiagos fizines ir chemines savybes arba biologinį poveikį, didžiausioji dozė turėtų būti parenkama tokia, kad būtų galima nustatyti pagrindinius tikslinius organus ir toksinį poveikį, nesukeliant kančios, sunkaus toksiškumo, liguistumo arba žūties. Didžiausioji dozė paprastai turėtų būti parenkama tokia, kad ją taikant būtų sukeliami pastebimi toksiškumo požymiai, pvz., pasireiškiantys kūno masės prieaugio sumažėjimu (apie 10 %). Tačiau, atsižvelgiant į tyrimo tikslus (žr. 6 skirsnį), didžiausioji dozė gali būti parinkta mažesnė už dozę, kurią taikant būtų pastebimi toksiškumo požymiai, pvz., jeigu taikant dozę sukeliamas rūpimas neigiamas poveikis, turintis nedidelės įtakos gyvenimo trukmei arba kūno masei.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Dozių dydžiai ir dozių dydžių skirtumai gali būti parinkti tokie, kad būtų galima nustatyti dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybę ir – atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos veikimo būdą – NNPL arba gauti kitokį siekiamą tyrimo rezultatą, pvz., nustatyti orientacinę dozę (OD) (žr. 27 skirsnį). Nustatant mažesniąsias dozes, turėtų būti atsižvelgiama į tokius veiksnius, kaip numatomas dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivės nuolydis, dozės, kurias taikant atsiranda reikšmingų metabolizmo arba toksinio poveikio būdo pokyčių, kai tikimasi gauti ribinę vertę arba atskaitos tašką mažiausiosios dozės ekstrapoliavimui. Atliekant bendrą kancerogeniškumo ir (arba) lėtinio toksiškumo tyrimą, pirmiausia turėtų būti siekiama gauti informacijos kancerogeniškumo rizikos vertinimo tikslais, o informacijos apie lėtinį toksiškumą gavimas paprastai yra papildomas tikslas. Į tai būtina atsižvelgti parenkant per tyrimą taikytinus dozių dydžius ir dozių dydžių skirtumus.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Dozių dydžių skirtumai parenkami atsižvelgiant į tyrimo tikslus ir bandomosios cheminės medžiagos savybes ir aprašant šį metodą negali būti iš anksto tiksliai numatyti, tačiau tinkamas bandymų veiksmingumas dažnai užtikrinamas tada, kai nustatant mažėjančius dozių dydžius taikomi koeficientai nuo 2 iki 4; be to, jeigu taikomi labai dideli dozių dydžių skirtumai (pvz., taikomi didesni koeficientai nei 6–10), dažnai patartina naudoti ketvirtąją bandomąją grupę. Apskritai reikėtų vengti taikyti didesnius koeficientus nei 10; jeigu tokie taikomi, jie turėtų būti pagrindžiami.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Kaip aprašyta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7), konkrečios dozės turėtų būti nustatomos atsižvelgiant į tokius veiksnius:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          žinomus arba numanomus netiesiškumus arba dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivės išlinkio taškus,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toksikokinetines savybes ir dozių intervalus, kuriuose pasireiškia metabolizmo paskatinimo, įsotinimo efektai arba išorinės ir vidinės dozių tarpusavio netiesiškumas, arba kuriuose nurodytųjų dalykų nepasireiškia,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pirminius pakitimus, poveikio rodiklius arba pagrindinių aiškiai nepastebimų biologinių procesų veikimo požymius,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pagrindinius (arba numanomus) veikimo būdo aspektus, pvz., dozes, kurias taikant pradeda reikštis citotoksiškumas, sutrikdomi hormonų lygiai, nustelbiami homeostaziniai mechanizmai ir t. t.,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybės kreivės sritis, kuriose būtina atlikti ypač tikslius vertinimus, pvz., numanomos orientacinės dozės (OD) arba numanomos ribinės vertės sritis,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          numanomus poveikio žmonėms lygius, ypač parenkant vidutines ir mažiausiąsias dozes.
                                       
                                    
                        
                              28.
                           
                           
                              Kontrolinė grupė – tai dozės negaunančių gyvūnų grupė arba nešiklio kontrolės grupė, jeigu bandomajai cheminei medžiagai duoti naudojamas nešiklis. Išskyrus poveikį bandomąja chemine medžiaga, su kontrolinės grupės gyvūnais turėtų būti elgiamasi lygiai taip pat, kaip su bandomųjų grupių gyvūnais. Naudojant nešiklį, kontrolinės grupės gyvūnams duodamas didžiausias nešiklio tūris, skiriamas dozę gaunančioms grupėms. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga duodama su pašaru ir dėl prastesnio skonio gyvūnai suvartoja mažiau pašaro, gali būti naudinga pasitelkti papildomą kartu šeriamą kontrolinę grupę, kad būtų užtikrinta geresnė kontrolė.
                           
                        
                     Bandomosios cheminės medžiagos dozių paruošimas ir davimas
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga paprastai duodama per burną, su pašaru ar geriamuoju vandeniu arba leidžiama zondu. Daugiau informacijos apie dozės davimo būdus ir metodus pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7). Dozės davimo būdas ir metodas parenkami atsižvelgiant į tyrimo tikslą, fizines ir chemines bandomosios cheminės medžiagos savybes, jos biologinį įsisavinimą ir vyraujantį poveikio žmonėms būdą ir metodą. Pasirinktas dozės davimo būdas ir metodas turi būti pagrįsti. Gyvūnų gerovės sumetimais dozės leidimas zondu paprastai turėtų būti pasirenkamas tik duodant tokias chemines medžiagas, kurių davimo būdas ir metodas iš esmės atitinka galimą poveikio žmogui būdą ir metodą (pvz., duodant vaistus). Maisto produktuose arba aplinkoje esančios cheminės medžiagos, įskaitant pesticidus, paprastai duodamos su pašaru arba vandeniu. Tačiau tam tikrais atvejais, pvz., tiriant poveikį darbe, gali būti tinkamesni kiti dozės davimo būdai.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Prireikus bandomoji cheminė medžiaga ištirpinama arba pagaminama jos suspensija tinkamame nešiklyje. Reikėtų atsižvelgti į šias nešiklio ir kitų priedų savybes, jeigu taikytina: poveikį sugerčiai, pasiskirstymui, metabolizmui arba bandomosios cheminės medžiagos sulaikymui; poveikį bandomosios cheminės medžiagos cheminėms savybėms, dėl kurių gali pasikeisti jos toksiškumo savybės; poveikį maisto ar vandens suvartojimui arba gyvūnų įmitimui. Rekomenduojama, jeigu įmanoma, pirmenybę teikti vandeniniam tirpalui arba suspensijai, tada svarstyti galimybę naudoti aliejaus (pvz., kukurūzų) tirpalą arba suspensiją ir tik po to – galimybę naudoti tirpalus kituose nešikliuose. Jeigu kaip nešiklis naudojamas ne vanduo, turėtų būti žinomos to nešiklio toksinės savybės. Reikėtų turėti informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos stabilumą ir duodamų tirpalų ir pašarų homogeniškumą (jeigu taikytina) dozės davimo sąlygomis (pvz., su pašaru).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Jeigu cheminės medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, svarbu užtikrinti, kad įmaišomi bandomosios cheminės medžiagos kiekiai netrikdytų įprasto mitybos režimo arba vandens balanso. Atliekant ilgalaikio toksiškumo tyrimus, kai dozė duodama su pašaru, bandomosios cheminės medžiagos koncentracija pašaro sudėtyje paprastai turėtų neviršyti 5 % viršutinės ribos visame pašarų kiekyje, kad būtų išvengta mitybos disbalanso. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga duodama su pašaru, gali būti taikoma pastovi koncentracija (mg/kg pašaro arba ppm) arba pastovus dozės dydis, nustatomas atsižvelgiant į gyvūno kūno masę (mg/kg kūno masės) ir apskaičiuojamas kas savaitę. Turėtų būti nurodytas pasirinktas variantas.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Jeigu dozė duodama per burną, bandomoji cheminė medžiaga gyvūnams duodama kasdien (septynias dienas per savaitę), paprastai – 12 mėnesių laikotarpiu (lėtinio toksiškumo bandymo etapas) arba 24 mėnesių laikotarpiu (kancerogeniškumo bandymo etapas); taip pat žr. 33 ir 34 skirsnius. Pasirinkus bet kurią kitą dozės davimo tvarką, pvz., penkių dienų per savaitę, ją būtina pagrįsti. Jeigu dozė duodama per odą, gyvūnai paprastai veikiami bandomąja chemine medžiaga ne trumpiau kaip šešias valandas per parą, septynias dienas per savaitę, kaip nurodyta šio priedo B.9 skyriuje (11), 12 mėnesių laikotarpiu (lėtinio toksiškumo bandymo etapas) arba 24 mėnesių laikotarpiu (kancerogeniškumo bandymo etapas). Dozės davimas per kvėpavimo takus vykdomas šešias valandas per parą, septynias paras per savaitę, bet gali būti taikomas ir penkių parų per savaitę poveikis, jeigu jis pagrindžiamas. Įprastas dozės davimo laikotarpis – 12 mėnesių (lėtinio toksiškumo bandymo etapas) arba 24 mėnesiai (kancerogeniškumo bandymo etapas). Jeigu naudojant kitos rūšies graužikus nei žiurkės dozė duodama tik per nosį, ilgiausia poveikio trukmė gali būti pakoreguojama siekiant sumažinti tos rūšies gyvūnų patiriamą kančią. Jeigu dozė duodama trumpiau kaip šešias valandas per parą, būtina tai pagrįsti. Taip pat žr. šio priedo B.8 skirsnį (9).
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Jeigu bandomoji cheminė medžiaga leidžiama zondu, tai turėtų būti daroma kasdien panašiu metu, naudojant skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Paprastai duodama viena dozė per parą, bet, jeigu, pvz., cheminė medžiaga turi vietinio dirginamojo poveikio, paros dozė gali būti duodama padalyta į kelias dalis (pvz., du kartus per parą). Didžiausias vienkartinis duodamo skysčio kiekis priklauso nuo bandomojo gyvūno dydžio. Tūris turėtų būti kaip įmanoma mažesnis ir, jeigu naudojami graužikai, paprastai neturėtų viršyti 1 ml/100 g kūno masės (31). Bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas, keičiant koncentraciją taip, kad visų dydžių dozių tūris būtų pastovus. Cheminėms medžiagoms, kurios gali turėti ėsdinamojo arba dirginamojo poveikio, taikoma išimtis; tokios medžiagos turi būti atskiestos siekiant išvengti sunkaus vietinio poveikio. Turėtų būti vengiama atlikti bandymus taikant koncentracijas, kurios galėtų turėti ėsdinamojo arba dirginamojo poveikio virškinimo traktui.
                           
                        
                     Tyrimo trukmė
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Įprastas dozės davimo laikotarpis ir įprasta šio tyrimo lėtinio toksiškumo bandymo etapo trukmė – 12 mėnesių, tačiau, atsižvelgiant į tam tikrus reglamentavimo tvarkų reikalavimus arba siekiant specifinių mechanistinių tikslų, tyrimo planas gali būti taikomas ir trumpesnės (pvz., šešių arba devynių mėnesių) arba ilgesnės (pvz., 18 arba 24 mėnesių) trukmės tyrimams. Jeigu pasirenkama ne 12 mėnesių trukmė, ji turėtų būti pagrįsta, ypač jeigu ta trukmė trumpesnė nei 12 mėnesių. Visi šiam etapui skirtų dozių dydžių grupių gyvūnai nustatytu laiku numarinami, kad būtų galima įvertinti lėtinį toksiškumą ir neoplastinę patologiją. Pagalbinės grupės, įtrauktos tiriamos bandomosios cheminės medžiagos sukeliamų toksikologinių pakitimų grįžtamumo stebėjimo tikslais, turėtų negauti dozės ne mažiau kaip keturias savaites, bet ne ilgiau kaip trečdalį visos tyrimo trukmės nutraukus dozės davimą.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Jeigu naudojami graužikai, įprasta šio tyrimo kancerogeniškumo etapo trukmė – 24 mėnesiai, t. y. didžioji naudojamų gyvūnų įprastos gyvenimo trukmės dalis. Atsižvelgiant į tiriamųjų gyvūnų rūšies padermę, gali būti taikoma trumpesnė arba ilgesnė trukmė, tačiau ji turėtų būti pagrįsta. Tam tikros pelių padermėms, pvz., AKR/J, C3H/J arba C57BL/6J, gali būti taikomas 18 mėnesių laikotarpis. Toliau pateikta rekomendacijų dėl tyrimo trukmės, jo nutraukimo ir dėl išgyvenimo; daugiau rekomendacijų, įskaitant patarimus dėl neigiamo kancerogeniškumo, susijusio su išgyvenimu per tyrimą, priimtinumo aspektų, pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Turėtų būti svarstoma galimybė nutraukti tyrimą, jeigu mažesnes dozes gavusiose grupėse arba kontrolinėje grupėje išgyvenusių gyvūnų procentinė dalis nebesiekia 25 %.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Jeigu dėl toksinio poveikio pirma laiko žūna tik didžiausiąją dozę gavusios grupės gyvūnai, tyrimo nereikėtų nutraukti.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Į kiekvienos lyties gyvūnų išgyvenimą atsižvelgiama atskirai.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Tyrimas neturėtų būti tęsiamas toliau, jeigu atliekant tyrimą gaunami duomenys nebesuteikia galimybės atlikti statistiniu požiūriu pagrįstą vertinimą.
                                       
                                    
                        STEBĖJIMAI (LĖTINIO TOKSIŠKUMO BANDYMO ETAPAS)
                  
                              36.
                           
                           
                              Visi gyvūnai turėtų būti tikrinami, ar jie sveiki arba nenugaišę; paprastai tai turėtų būti daroma kiekvienos dienos pradžioje ir pabaigoje, įskaitant savaitgalius ir švenčių dienas. Bendrieji klinikiniai stebėjimai turėtų būti atliekami bent kartą per parą, pageidautina, tuo pačiu paros metu, atsižvelgiant į stipriausią numatomą poveikį po dozės davimo, kai dozė leidžiama zondu.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Kartą prieš pirmąjį dozės davimą (kad būtų galima palyginti atskirus gyvūnus), po to – pasibaigus pirmajai tyrimo savaitei, o vėliau – kas mėnesį turėtų būti atliekami išsamūs visų gyvūnų klinikiniai stebėjimai. Stebėjimų protokolas turėtų būti sudarytas taip, kad stebėtojų kaita būtų kuo mažesnė ir kad stebėtojai būtų paskiriami neatsižvelgiant į bandomąją grupę. Kiekvieną kartą šie stebėjimai turėtų būti atliekami tuo pačiu metu, perkėlus gyvūną iš jo narvelio į tam skirtą vietą. Stebėjimai turėtų būti kruopščiai registruojami, pageidautina, pagal toje laboratorijoje aiškiai apibrėžtą vertinimo sistemą. Turėtų būti stengiamasi užtikrinti, kad stebėjimo sąlygų kaita būtų kuo mažesnė. Be kitų dalykų, turėtų būti registruojami odos, kailio, akių, gleivinės pakitimai, išskyrų atsiradimas ir autonominis aktyvumas (pvz., ašarojimas, plaukų pašiaušimas, vyzdžio dydis, neįprasti kvėpavimo pakitimai). Taip pat turėtų būti registruojami eisenos, pozos, reakcijos į paėmimą rankomis pakitimai, traukulių arba toninių judesių atsiradimas, stereotipinis (pvz., besaikis valymasis, pasikartojantis sukimasis ratu) arba keistas elgesys (pvz., savęs luošinimas, vaikščiojimas atbulomis) (32).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Naudojant oftalmoskopą arba kitą tinkamą įrangą, prieš pirmąjį bandomosios cheminės medžiagos davimą turėtų būti atlikti visų gyvūnų oftalmologiniai tyrimai. Baigus tyrimą, turėtų būti atlikti visų gyvūnų arba bent didžiausiąją dozę gavusios grupės ir kontrolinės grupės gyvūnų oftalmologiniai tyrimai. Jeigu nustatoma akių pakitimų, susijusių su dozės davimu, turėtų būti ištirti visi gyvūnai. Jeigu struktūrinė analizė arba kita informacija rodo toksinį poveikį akims, akių tyrimų dažnumas turėtų būti didesnis.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Jeigu anksčiau atlikus cheminės medžiagos 28 dienų ir (arba) 90 dienų kartotinės dozės toksiškumo bandymus nustatyta, kad cheminė medžiaga gali sukelti neurotoksinį poveikį, prieš pradedant tyrimą ir kas tris mėnesius nuo tyrimo pradžios, bet ne ilgiau kaip 12 mėnesių laikotarpiu, o taip pat baigus tyrimą (jeigu jis trunka ilgiau nei 12 mėnesių) galima (bet neprivaloma) įvertinti jutimines reakcijas į įvairaus pobūdžio dirgiklius (32) (pvz., klausos, regos ir proprioreceptorinius) (33) (34) (35), spaudimo (jėgos) stiprumą (36) ir judėjimo aktyvumą (37). Išsamesnės informacijos apie procedūras, kurios galėtų būti taikomos, pateikta atitinkamuose literatūros šaltiniuose. Tačiau galima taikyti ir čia nurodytiems metodams alternatyvius metodus.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Jeigu anksčiau atlikus cheminės medžiagos 28 dienų ir (arba) 90 dienų kartotinės dozės toksiškumo bandymus nustatyta, kad cheminė medžiaga gali sukelti imunotoksinį poveikį, baigus tyrimą galima (bet neprivaloma) atlikti išsamesnius šios pasekmės tyrimus.
                           
                        
                     Kūno masė, pašarų ir (arba) vandens suvartojimas ir pašaro efektyvumas
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Visi gyvūnai turėtų būti pasveriami prieš pradedant duoti dozę, kitas 13 savaičių – ne rečiau kaip kartą per savaitę, o vėliau – bent kartą per mėnesį. Pirmąsias 13 savaičių – ne rečiau kaip kartą per savaitę, o vėliau – bent kartą per mėnesį turėtų būti matuojamas pašaro suvartojimas ir pašaro efektyvumas. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, pirmąsias 13 savaičių – ne rečiau kaip kartą per savaitę, o vėliau – bent kartą per mėnesį turėtų būti matuojamas vandens suvartojimas. Galimybė matuoti vandens suvartojimą turėtų būti svarstoma ir atliekant tyrimus, per kuriuos pasikeičia gėrimo įpročiai.
                           
                        
                     Hematologiniai ir klinikinės biochemijos tyrimai
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Atliekant tyrimus, per kuriuos naudojami graužikai, po trijų, šešių ir dvylikos mėnesių, taip pat baigus tyrimą (jeigu jis trunka ilgiau nei 12 mėnesių), turėtų būti atlikti visų tyrime dalyvaujančių gyvūnų (po 10 patinų ir 10 patelių kiekvienoje grupėje) hematologiniai tyrimai. Jeigu atliekant tyrimus naudojamos pelės, norint atlikti visus reikiamus hematologinius tyrimus gali reikėti pagalbinių gyvūnų (žr. 19 skirsnį). Jeigu atliekant tyrimus naudojami ne graužikai, ėminiai dar nebaigus tyrimo ir jį baigus, kaip aprašyta graužikų atveju, imami iš mažesnio gyvūnų skaičiaus (pvz., jeigu tiriami šunys – iš keturių kiekvienos lyties gyvūnų kiekvienoje grupėje). Nepaisant to, ar naudojami graužikai, ar ne graužikai, matavimų po trijų mėnesių galima neatlikti, jeigu per anksčiau atliktą 90 dienų tyrimą, per kurį buvo duodamos panašaus dydžio dozės, nebuvo pastebėta poveikio hematologiniams parametrams. Kraujo ėminiai turėtų būti imami iš nurodytos vietos, pvz., širdies punkcijos vietos arba iš užakiduobinio ančio, taikant nuskausminimą.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Turėtų būti ištirti šie parametrai (38): bendras leukocitų kiekis ir įvairių leukocitų kiekiai, eritrocitų kiekis, trombocitų kiekis, hemoglobino koncentracija, hematokritas (procentinė kraujo ląstelių tūrio dalis), vidutinis eritrocito tūris (VET), vidutinis hemoglobino kiekis eritrocituose (VHKE), vidutinė eritrocitų hemoglobino koncentracija (VEHK), protrombino laikas ir dalinis aktyvintas tromboplastino laikas. Atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą, prireikus gali būti matuojami ir kiti hematologiniai parametrai, pvz., Heinco kūneliai arba kita netipinė eritrocitų morfologija, arba methemoglobinas. Apskritai turėtų būti laikomasi lankstaus požiūrio, kuriuo būtų atsižvelgiama į pastebėtą ir (arba) numatomą atitinkamos bandomosios cheminės medžiagos poveikį. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga turi poveikio kraujodaros sistemai, gali reikėti nustatyti retikulocitų kiekį ir atlikti kaulų čiulpų citologijos tyrimus, tačiau to nebūtina daryti nuolat.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Siekiant ištirti svarbiausius toksinius poveikius audiniams, ypač inkstams ir kepenims, reikėtų atlikti kraujo ėminių, paimtų iš visų tyrime dalyvaujančių gyvūnų (po 10 patinų ir 10 patelių kiekvienoje grupėje) tokiais pat laiko intervalais, kaip nurodyta dėl hematologinių tyrimų, klinikinius biocheminius tyrimus. Jeigu atliekant tyrimus naudojamos pelės, norint atlikti visus reikiamus klinikinės biochemijos tyrimus, gali reikėti pagalbinių gyvūnų. Jeigu atliekant tyrimus naudojami ne graužikai, ėminiai dar nebaigus tyrimo ir jį baigus, kaip aprašyta graužikų atveju, imami iš mažesnio gyvūnų skaičiaus (pvz., jeigu tiriami šunys – iš keturių kiekvienos lyties gyvūnų kiekvienoje grupėje). Nepaisant to, ar naudojami graužikai, ar ne graužikai, matavimų po trijų mėnesių galima neatlikti, jeigu per anksčiau atliktą 90 dienų tyrimą, per kurį buvo duodamos panašaus dydžio dozės, nebuvo pastebėta poveikio klinikinės biochemijos parametrams. Rekomenduojama, kad prieš kraujo ėminių ėmimą gyvūnai (išskyrus peles) būtų nešeriami per naktį. (10). Turėtų būti ištirti šie parametrai (38): gliukozė, šlapalas (šlapalo azotas), kreatininas, bendras baltymų kiekis, albuminas, kalcis, natris, kalis, bendras cholesterolio kiekis, ne mažiau kaip du atitinkami kepenų ląstelių tyrimai (alaninaminotransferazė, aspartataminotransferazė, glutamato dehidrogenazė ir bendras tulžies rūgščių kiekis) (39) ir ne mažiau kaip du atitinkami kepenų ir tulžies sistemos tyrimai (šarminė fosfatazė, gamaglutamiltransferazė, 5’-nukleotidazė, bendras bilirubino kiekis, bendras tulžies rūgščių kiekis) (39). Be to, atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą, gali būti naudinga išmatuoti kitus klinikinės chemijos parametrus, pvz., trigliceridų koncentraciją nešėrus, specifinius hormonus ir cholinesterazę. Apskritai turėtų būti laikomasi lankstaus požiūrio, kuriuo būtų atsižvelgiama į pastebėtą arba numatomą atitinkamos bandomosios cheminės medžiagos poveikį.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Turėtų būti atlikti visų tyrime dalyvaujančių gyvūnų (po 10 patinų ir 10 patelių kiekvienoje grupėje) šlapimo tyrimai, ėminius imant tokiais pat intervalais, kokie taikomi hematologinės ir klinikinės chemijos tyrimų tikslais. Matavimų po trijų mėnesių galima neatlikti, jeigu per anksčiau atliktą 90 dienų tyrimą, per kurį buvo duodamos panašaus dydžio dozės, nebuvo pastebėta poveikio šlapimo analizės rezultatams. Ekspertų rekomendacijoje dėl klinikinės patologijos tyrimų pateiktas toks parametrų sąrašas (38): išvaizda, tūris, osmosinis slėgis arba savitasis svoris, pH, bendras baltymų kiekis ir gliukozė. Taip pat gali būti tiriamas ketonas, urobilinogenas, bilirubinas ir paslėptasis kraujas. Prireikus išplėsti pastebėto (-ų) poveikio (-ų) tyrimą, gali būti naudojami papildomi parametrai.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Paprastai laikoma, kad pradiniai hematologiniai ir klinikinės biochemijos kintamieji prieš pradedant duoti dozę turėtų būti nustatomi atliekant šunų tyrimus, bet jų nebūtina nustatyti atliekant graužikų tyrimus (38). Visgi, jeigu istoriniai pradiniai duomenys (žr. 58 skirsnį) yra netinkami, turėtų būti svarstoma galimybė parengti minėtus duomenis.
                           
                        PATOLOGIJA
                  
                     Bendrasis skrodimas
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Paprastai atliekamas išsamus visų bandomųjų gyvūnų bendrasis skrodimas, atidžiai ištiriant kūno paviršių ir visas jo angas, kaukolę, krūtinės ląstą, pilvo ertmes ir jų turinį. Tačiau taip pat gali būti numatyta (grupėse, kuriose numatytas gyvūnų marinimas nebaigus bandymo, arba pagalbinėse grupėse) atlikti tik tokius matavimus, kurie yra susiję su specifiniais, pagrindiniais matais, pvz., neurotoksiškumu arba imunotoksiškumu (žr. 21 skirsnį). Šių gyvūnų nebūtina skrosti ar su jais atlikti tolesnių procedūrų, aprašytų kituose skirsniuose. Kontrolinius gyvūnus gali reikėti skrosti atsižvelgiant į konkretų atvejį ir vadovaujantis tyrimo vadovo nuožiūra.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Turėtų būti pasveriami visų gyvūnų, išskyrus nurodytuosius 47 skirsnio paskutinėje dalyje, organai. Visų gyvūnų (išskyrus gaištančius ir (arba) numarintus nebaigus bandymo) antinksčiai, sėklidžių prielipai, širdis, inkstai, kepenys, kiaušidės, blužnis, sėklidės, skydliaukė (sveriama po fiksavimo, kartu su prieskydinėmis liaukomis) ir gimda turėtų būti nuvalyti, jeigu reikia, pašalinant prigludusius audinius, ir po skrodimo kuo greičiau pasverti, kol neišdžiuvo.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Atsižvelgiant į audinio tipą ir numatomą vėliau atlikti histopatologinį tyrimą, tinkamiausioje fiksavimo terpėje turėtų būti konservuojami šie audiniai (40) (laužtiniuose skliaustuose nurodytų audinių konservuoti nebūtina):
                              
                                          Visi labai pakitę audiniai
                                       
                                       
                                          Širdis
                                       
                                       
                                          Kasa
                                       
                                       
                                          Skrandis (įskrandis, liaukinė skrandžio dalis)
                                       
                                    
                                          Antinksčiai
                                       
                                       
                                          Klubinė žarna
                                       
                                       
                                          Prieskydinė liauka
                                       
                                       
                                          [Dantys]
                                       
                                    
                                          Aorta
                                       
                                       
                                          Tuščioji žarna
                                       
                                       
                                          Periferinis nervas
                                       
                                       
                                          Sėklidės
                                       
                                    
                                          Smegenys (įskaitant didžiųjų smegenų, smegenėlių ir pailgųjų smegenų (smegenų tilto) išpjovas)
                                       
                                       
                                          Inkstai
                                       
                                       
                                          Hipofizė
                                       
                                       
                                          Užkrūčio liauka
                                       
                                    
                                          Akloji žarna
                                       
                                       
                                          Ašarų liauka (viršakiduobinė)
                                       
                                       
                                          Prostata
                                       
                                       
                                          Skydliaukė
                                       
                                    
                                          Gimdos kaklelis
                                       
                                       
                                          Kepenys
                                       
                                       
                                          Tiesioji žarna
                                       
                                       
                                          [Liežuvis]
                                       
                                    
                                          Koaguliatorių liauka
                                       
                                       
                                          Plaučiai
                                       
                                       
                                          Seilių liauka
                                       
                                       
                                          Trachėja
                                       
                                    
                                          Gaubtinė žarna
                                       
                                       
                                          Limfmazgiai (paviršiniai ir giluminiai)
                                       
                                       
                                          Sėklinės pūslelės
                                       
                                       
                                          Šlapimo pūslė
                                       
                                    
                                          Dvylikapirštė žarna
                                       
                                       
                                          Pieno liauka (patelėms – privaloma, patinams – jeigu galima ištirti akimi)
                                       
                                       
                                          Skeleto raumuo
                                       
                                       
                                          Gimda (su gimdos kakleliu)
                                       
                                    
                                          Sėklidžių prielipai
                                       
                                       
                                          [Viršutiniai kvėpavimo takai, įskaitant nosį, kriaukles ir šalutines nosies ertmes]
                                       
                                       
                                          Oda
                                       
                                       
                                          [Šlapimtakis]
                                       
                                    
                                          Akys (su tinklaine)
                                       
                                       
                                          Stemplė
                                       
                                       
                                          Stuburo smegenys (trys lygiai: sprando, krūtinės ląstos ir juosmens)
                                       
                                       
                                          [Šlaplė]
                                       
                                    
                                          [Šlaunikaulis su kelio sąnariu]
                                       
                                       
                                          [Uoslės receptoriai]
                                       
                                       
                                          Blužnis
                                       
                                       
                                          Makštis
                                       
                                    
                                          Tulžies pūslė (jeigu tiriamos ne žiurkės)
                                       
                                       
                                          Kiaušidės
                                       
                                       
                                          [Krūtinkaulis]
                                       
                                       
                                          Kaulų čiulpų išpjova ir (arba) šviežiai paruošta kaulų čiulpų punkcija
                                       
                                    
                                          Harderio liauka
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    Jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinksčiai, turėtų būti konservuojami abu organai. Atsižvelgiant į gautas klinikines ir kitokias išvadas, gali reikėti ištirti papildomus audinius. Be to, atsižvelgiant į žinomas bandomosios cheminės medžiagos savybes, turėtų būti konservuojami visi numanomi tiksliniai organai. Atliekant tyrimus, per kuriuos dozė duodama per odą, turėtų būti tiriami organai, nurodyti kaip tirtini, kai dozė duodama per burną; be to, būtina paimti ir užkonservuoti specifinius odos ėminius iš poveikio vietos. Atliekant inhaliacinius tyrimus, konservuotinų ir tirtinų kvėpavimo takų audinių sąrašas turėtų būti sudaromas remiantis šio priedo B.8 skyriuje (9) ir šio priedo B.29 skyriuje (10) pateiktomis rekomendacijomis. Tiriant kitus organus ir (arba) audinius (be specialiai konservuojamų kvėpavimo takų audinių), turėtų būti tiriami organai, nurodyti dėl poveikio per virškinamąjį traktą būdo pateiktame organų sąraše.
                           
                        
                     Histopatologinis tyrimas
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Yra parengtos toksikologinės patologijos tyrimų geriausiosios patirties gairės (40). Turėtų būti atlikti bent šie histopatologiniai tyrimai:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          visų didžiausiąją dozę gavusios grupės ir kontrolinės grupės gyvūnų audinių,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          visų per tyrimą nugaišusių arba numarintų gyvūnų audinių,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          visų audinių su plika akimi matomais pakitimais,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          tikslinių audinių arba visų kitų dydžių dozes gavusių grupių gyvūnų audinių, dėl kurių didžiausiąją dozę gavusioje grupėje nustatyta su dozės davimu susijusių pakitimų,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinksčiai, turėtų būti tiriami abu organai.
                                       
                                    
                        STEBĖJIMAI (KANCEROGENIŠKUMO BANDYMO ETAPAS)
                  
                              51.
                           
                           
                              Visi gyvūnai turėtų būti tikrinami, ar jie sveiki arba nenugaišę; paprastai tai turėtų būti daroma kiekvienos dienos pradžioje ir pabaigoje, įskaitant savaitgalius ir švenčių dienas. Be to, kartą per parą turėtų būti patikrinama, ar gyvūnams nepasireiškė specifinių toksikologinės reikšmės požymių. Jeigu per tyrimą naudojamas zondas, gyvūnai turėtų būti tikrinami iš karto po dozės davimo. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas auglių vystymuisi; turėtų būti registruojamas kiekvieno akivaizdžiai matomo ir užčiuopiamo auglio atsiradimo laikas, vieta, dydis, išvaizda ir išsivystymas.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Visi gyvūnai turėtų būti pasveriami prieš pradedant duoti dozę, kitas 13 savaičių – ne rečiau kaip kartą per savaitę, o vėliau – bent kartą per mėnesį. Pirmąsias 13 savaičių – ne rečiau kaip kartą per savaitę, o vėliau – bent kartą per mėnesį turėtų būti matuojamas pašaro suvartojimas ir pašaro efektyvumas. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, pirmąsias 13 savaičių – ne rečiau kaip kartą per savaitę, o vėliau – bent kartą per mėnesį turėtų būti matuojamas vandens suvartojimas. Galimybė matuoti vandens suvartojimą turėtų būti svarstoma ir atliekant tyrimus, per kuriuos pasikeičia gėrimo įpročiai.
                           
                        
                     Hematologiniai ir klinikinės biochemijos tyrimai bei kiti matavimai
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Siekiant per tyrimą gauti kuo daugiau informacijos, pirmiausia apie veikimo būdo aspektus, gali būti paimti ėminiai, skirti hematologiniams ir klinikinės biochemijos tyrimams, tačiau jie imami tyrimo vadovo nuožiūra. Be to, gali būti naudinga atlikti šlapimo analizę. Informacijos apie šiuos parametrus suteiks duomenys apie gyvūnus, naudotus tyrimo lėtinio toksiškumo bandymo etapu, paprastai trunkančiu 12 mėnesių (34 skirsnis). Daugiau informacijos apie tokių ėminių naudą atliekant kancerogeniškumo tyrimą pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7). Jeigu imami kraujo ėminiai, tai turėtų būti daroma baigiantis bandymo laikotarpiui – prieš pat gyvūnų numarinimą arba marinimo procedūros metu. Šie ėminiai turėtų būti imami iš nurodytos vietos, pvz., širdies punkcijos vietos arba iš užakiduobinio ančio, taikant nuskausminimą. Be to, tyrimams gali būti paruošti kraujo tepinėliai, ypač jeigu nustatoma, kad tikslinis organas yra kaulų čiulpai; tačiau kancerogeniškumo bandymo etapu atliekamų kraujo tepinėlių tyrimų nauda siekiant įvertinti kancerogeniškumą ir (arba) onkogeniškumą yra abejotina (38).
                           
                        PATOLOGIJA
                  
                     Bendrasis skrodimas
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Paprastai atliekamas išsamus visų tiriamųjų gyvūnų, išskyrus kontrolinius ir kitus pagalbinius gyvūnus (žr. 20 skirsnį), bendrasis skrodimas, atidžiai ištiriant kūno paviršių ir visas jo angas, kaukolę, krūtinės ląstą, pilvo ertmes ir jų turinį. Kontrolinius ir kitus pagalbinius gyvūnus gali reikėti skrosti atsižvelgiant į konkretų atvejį ir vadovaujantis tyrimo vadovo nuožiūra. Atliekant kancerogeniškumo tyrimą organai paprastai nesveriami, nes dėl senėjimo pakitimų, o vėliau – dėl auglių išsivystymo organų svėrimo duomenys tampa nenaudingi. Tačiau jie gali būti svarbūs atliekant įrodomosios duomenų galios vertinimą, o ypač – svarstant veikimo būdo aspektus. Jeigu atliekant pagalbinį tyrimą sveriami organai, tai turėtų būti daroma nė vėliau kaip po metų nuo tyrimo pradžios.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Atsižvelgiant į audinio tipą ir numatomą vėliau atlikti histopatologinį tyrimą, tinkamiausioje fiksavimo terpėje turėtų būti konservuojami šie audiniai (40) (laužtiniuose skliaustuose nurodytų audinių konservuoti nebūtina):
                              
                                          Visi labai pakitę audiniai
                                       
                                       
                                          Širdis
                                       
                                       
                                          Kasa
                                       
                                       
                                          Skrandis (įskrandis, liaukinė skrandžio dalis)
                                       
                                    
                                          Antinksčiai
                                       
                                       
                                          Klubinė žarna
                                       
                                       
                                          Prieskydinė liauka
                                       
                                       
                                          [Dantys]
                                       
                                    
                                          Aorta
                                       
                                       
                                          Tuščioji žarna
                                       
                                       
                                          Periferinis nervas
                                       
                                       
                                          Sėklidės
                                       
                                    
                                          Smegenys (įskaitant didžiųjų smegenų, smegenėlių ir pailgųjų smegenų (smegenų tilto) išpjovas)
                                       
                                       
                                          Inkstai
                                       
                                       
                                          Hipofizė
                                       
                                       
                                          Užkrūčio liauka
                                       
                                    
                                          Akloji žarna
                                       
                                       
                                          Ašarų liauka (viršakiduobinė)
                                       
                                       
                                          Prostata
                                       
                                       
                                          Skydliaukė
                                       
                                    
                                          Gimdos kaklelis
                                       
                                       
                                          Kepenys
                                       
                                       
                                          Tiesioji žarna
                                       
                                       
                                          [Liežuvis]
                                       
                                    
                                          Koaguliatorių liauka
                                       
                                       
                                          Plaučiai
                                       
                                       
                                          Seilių liauka
                                       
                                       
                                          Trachėja
                                       
                                    
                                          Gaubtinė žarna
                                       
                                       
                                          Limfmazgiai (paviršiniai ir giluminiai)
                                       
                                       
                                          Sėklinės pūslelės
                                       
                                       
                                          Šlapimo pūslė
                                       
                                    
                                          Dvylikapirštė žarna
                                       
                                       
                                          Pieno liauka (patelėms – privaloma, patinams – jeigu galima ištirti akimi)
                                       
                                       
                                          Skeleto raumuo
                                       
                                       
                                          Gimda (su gimdos kakleliu)
                                       
                                    
                                          Sėklidžių prielipai
                                       
                                       
                                          [Viršutiniai kvėpavimo takai, įskaitant nosį, kriaukles ir šalutines nosies ertmes]
                                       
                                       
                                          Oda
                                       
                                       
                                          [Šlapimtakis]
                                       
                                    
                                          Akys (su tinklaine)
                                       
                                       
                                          Stemplė
                                       
                                       
                                          Stuburo smegenys (trys lygiai: sprando, krūtinės ląstos ir juosmens)
                                       
                                       
                                          [Šlaplė]
                                       
                                    
                                          [Šlaunikaulis su kelio sąnariu]
                                       
                                       
                                          [Uoslės receptoriai]
                                       
                                       
                                          Blužnis
                                       
                                       
                                          Makštis
                                       
                                    
                                          Tulžies pūslė (jeigu tiriamos ne žiurkės)
                                       
                                       
                                          Kiaušidės
                                       
                                       
                                          [Krūtinkaulis]
                                       
                                       
                                          Kaulų čiulpų išpjova ir (arba) šviežiai paruošta kaulų čiulpų punkcija
                                       
                                    
                                          Harderio liauka
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    Jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinksčiai, turėtų būti konservuojami abu organai. Atsižvelgiant į gautas klinikines ir kitokias išvadas, gali reikėti ištirti papildomus audinius. Be to, atsižvelgiant į žinomas bandomosios cheminės medžiagos savybes, turėtų būti konservuojami visi numanomi tiksliniai organai. Atliekant tyrimus, per kuriuos dozė duodama per odą, turėtų būti tiriami organai, nurodyti kaip tirtini, kai dozė duodama per burną; be to, būtina paimti ir užkonservuoti specifinius odos ėminius iš poveikio vietos. Atliekant inhaliacinius tyrimus, konservuotinų ir tirtinų kvėpavimo takų audinių sąrašas turėtų būti sudaromas remiantis šio priedo B.8 skyriuje (8) ir šio priedo B.29 skyriuje (9) pateiktomis rekomendacijomis. Tiriant kitus organus ir (arba) audinius (be specialiai konservuojamų kvėpavimo takų audinių), turėtų būti tiriami organai, nurodyti dėl poveikio per virškinamąjį traktą būdo pateiktame organų sąraše.
                           
                        
                     Histopatologinis tyrimas
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Yra parengtos toksikologinės patologijos tyrimų geriausiosios patirties gairės (40). Turėtų būti ištirti bent šie audiniai:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          visi didžiausiąją dozę gavusios grupės ir kontrolinės grupės gyvūnų audiniai,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          visi per tyrimą nugaišusių arba numarintų gyvūnų audiniai,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          visi audiniai su plika akimi matomais pakitimais,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          jeigu didžiausiąją dozę gavusioje grupėje pastebima su dozės davimu susijusių histopatologinių pakitimų, tiriami tie patys visų kitų dydžių dozes gavusių grupių gyvūnų audiniai,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinksčiai, turėtų būti tiriami abu organai.
                                       
                                    
                        DUOMENYS IR ATASKAITOS (KANCEROGENIŠKUMAS IR LĖTINIS TOKSIŠKUMAS)
                  
                     Duomenys
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Turėtų būti pateikti kiekvieno gyvūno duomenys pagal visus vertinamus parametrus. Be to, visi duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, pagal kiekvieną bandomąją grupę nurodant pradedant bandymą turėtų gyvūnų skaičių, atliekant bandymą nugaišusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičių ir kiekvienos žūties arba numarinimo dėl humaniškų priežasčių laiką, gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičių, pastebėtų toksiškumo požymių aprašymą, įskaitant kiekvieno toksinio poveikio pasireiškimo laiką, trukmę ir sunkumą, gyvūnų su audinių pakitimais skaičių, pakitimų tipą ir gyvūnų su kiekvieno tipo pakitimais procentinę dalį. Gyvūnams, kuriems pasireiškė toksinis poveikis arba atsirado audinių pakitimų, be pakitimų lygmens įvertinimo, suvestinių duomenų lentelėse turėtų būti pateikti vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai (ištisinio bandymo duomenų).
                           
                        
                              58.
                           
                           
                              Istoriniai kontroliniai duomenys gali būti vertingi aiškinant tyrimo rezultatus, pvz., kai yra požymių, kad taikant vienalaikę kontrolę gauti duomenys iš esmės skiriasi, palyginti su naujausiais duomenimis, gautais stebint kontrolinius gyvūnus, esančius toje pačioje bandymo patalpoje arba kolonijoje. Istoriniai kontroliniai duomenys, jeigu jie vertinami, turėtų būti pateikti tos pačios laboratorijos ir turėtų būti susiję su to paties amžiaus ir padermės, išvestos penkerių metų laikotarpiu iki svarstomo tyrimo, gyvūnais.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Jeigu taikytina, skaitiniai rezultatai turėtų būti įvertinti tinkamu, visuotinai priimtinu statistiniu metodu. Statistiniai metodai ir analizei skirti duomenys turi būti pasirinkti planuojant bandymą (9 skirsnis). Parenkant duomenis, turėtų būti numatytos pataisos atsižvelgiant į gyvūnų išgyvenimą.
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikta toliau nurodyta informacija.
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizinė būsena, grynumas, fizinės ir cheminės savybės,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikavimo duomenys,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      cheminės medžiagos šaltinis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      partijos numeris,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      cheminės analizės pažyma.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nešiklis (jeigu naudojamas):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nešiklio pasirinkimo pagrindimas (jeigu tai ne vanduo).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomieji gyvūnai:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudota rūšis ir (arba) padermė ir pasirinkimo pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gyvūnų skaičius ir amžius pradedant bandymą, nurodant lytį,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kiekvieno gyvūno masė pradedant bandymą.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dozės davimo būdo ir dozės parinkimo pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jeigu taikytina, taikyti statistiniai duomenų analizės metodai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos ir pašaro paruošimą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analitiniai duomenys apie pasiektą koncentraciją, preparato stabilumą ir homogeniškumą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dozės davimo būdas ir išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos davimą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jeigu tai inhaliaciniai tyrimai: ar dozė duodama tik per nosį, ar per visą kūną,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      faktinės dozės (mg/kg kūno masės per parą) ir bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos pašare ir (arba) geriamajame vandenyje (mg/kg arba ppm) perskaičiavimo į faktinę dozę koeficientas, jeigu taikytina,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatai (turėtų būti pateiktos suvestinių duomenų lentelės ir kiekvieno gyvūno duomenys):
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bendrieji duomenys:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išgyvenimo duomenys,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kūno masė ir (arba) kūno masės pokyčiai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pašaro suvartojimas, pašaro efektyvumo skaičiavimai, jeigu jie buvo atlikti, ir vandens suvartojimas, jeigu taikytina,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toksikonetiniai duomenys, jeigu yra,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmoskopinių tyrimų duomenys (jeigu yra),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologinių tyrimų duomenys (jeigu yra),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinikinės chemijos tyrimų duomenys (jeigu yra).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Klinikinės išvados:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Toksiškumo požymiai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nukrypimų dažnumas (ir, jeigu įvertinta, dydis),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinikinių požymių pobūdis, sunkumas ir trukmė (laikinieji ar negrįžtamieji).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Skrodimo duomenys:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      galutinė kūno masė,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      organų masė ir masių santykiai, jeigu taikytina,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skrodimo išvados, nukrypimų dažnumas ir dydis.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Histopatologinis tyrimas:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      histopatologinių tyrimų, išskyrus neoplastinius, rezultatai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      neoplastinių tyrimų rezultatai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nustatytų didelių ir mikroskopinių pakitimų sąryšis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsamus visų su dozės davimu susijusių histopatologinio tyrimo rezultatų aprašymas, pateikiant sunkumo lygio vertinimus,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      skaidrių tarpusavio peržiūros ataskaita.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Statistinis rezultatų apdorojimas, jeigu taikytina.
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatų aptarimas, apimantis:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      modeliavimo metodų aptarimą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybes,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      istorinius kontrolinius duomenis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      veikimo būdo informacijos svarstymą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      OD, NNPL ir MPNPL nustatymą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      reikšmę žmonėms.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Išvados.
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the SAFEty Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Šio priedo B.27 skyrius. 90 dienų kartotinės dozės toksiškumo per virškinamąjį traktą ne graužikams tyrimas.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Šio priedo B.8 skyrius. Poūmis toksiškumas įkvėpus. 28 dienų tyrimas.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Šio priedo B.29 skyrius. Pusiau lėtinis toksiškumas įkvėpus. 90 dienų tyrimas.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Šio priedo B.9 skyrius. Kartotinės dozės (28 dienų) toksiškumas (per odą).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793–801.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581–589.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51–56.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591–653.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical SAFEty Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human SAFEty Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1–7.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical SAFEty Assessments. Crit. Rev. Toxicol. 36: 9–35.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical SAFEty Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 37–68.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical SAFEty Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69–98.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279–284.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196–1203.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              2010 m. rugsėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES dėl mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsaugos, OL L 276, 2010 10 20, p. 33.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3–906255–06–9.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15–23.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and SAFEty Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198–201.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              EMEA (draft) document ‘Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity’ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
                           
                        
                     1 priedėlis
                     APIBRĖŽTIS
                     Bandomoji cheminė medžiaga– naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga arba mišinys.
                  “
            
                  7)
               
               
                  B.36 skyrius pakeičiamas taip:
                  „B.36.   TOKSIKOKINETIKA
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 417 (OECD bandymo gaires Nr. 417) (2010). Tyrimai, per kuriuos nagrinėjamos bandomosios cheminės medžiagos toksikokinetinės savybės, atliekami siekiant gauti tinkamos informacijos apie tos cheminės medžiagos sugertį, pasiskirstymą, biologinę transformaciją (t. y. metabolizmą) ir šalinimą, padėti susieti koncentraciją arba dozę su nustatytuoju toksiškumu ir padėti suprasti tos cheminės medžiagos toksinio poveikio mechanizmą. Toksikokinetinė informacija, kuria nurodoma, kad bandomieji gyvūnai sistemingai veikiami bandomąja chemine medžiaga, ir atskleidžiama, kurios dalys yra cirkuliacinės (pradinė cheminė medžiaga ir (arba) metabolitai), gali padėti suprasti toksikologinius tyrimus Pagrindiniai remiantis šiais tyrimais nustatyti toksikokinetiniai parametrai taip pat suteiks informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos galimybę kauptis audiniuose ir (arba) organuose ir galimybę sužadinti biologinę transformaciją, kaip bandomosios cheminės medžiagos poveikio rezultatą.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Toksikokinetiniai duomenys gali padėti įvertinti toksiškumo gyvūnams duomenų tinkamumą ekstrapoliuoti, siekiant nustatyti žmogui gresiančius pavojus ir (arba) įvertinti riziką. Be to, toksikokinetiniai tyrimai gali suteikti naudingos informacijos siekiant nustatyti per toksiškumo tyrimus taikytinus dozių dydžius (tiesinė ir netiesinė kinetika), taikant tam tikrą dozės davimo būdą sukeliamą poveikį, biologinį įsisavinimą ir su tyrimo planu susijusius aspektus. Tam tikri toksikokinetiniai duomenys gali būti naudojami kuriant fiziologija pagrįstus toksikokinetinius (FPTK) modelius.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Duomenis apie metabolitus ir (arba) toksikokinetines savybes galima panaudoti svarbiais tikslais, pvz., siekiant pagrįsti galimą toksinį poveikį, veikimo būdus ir jų sąsają su dozės dydžiu ir poveikio būdu. Be to, duomenys apie metabolizmą gali suteikti informacijos, kuri būti naudinga vertinant bandomosios cheminės medžiagos išorinių metabolitų poveikio toksikologinę svarbą.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Tinkami toksikokinetiniai duomenys padės pagrįsti tolesnį kiekybinių struktūros ir savybių ryšių, analogijos arba grupavimo metodų priimtinumą ir taikomumą vertinant cheminių medžiagų saugumą. Be to, kinetiniai duomenys gali būti naudojami vertinant toksikologinę kitų tyrimų (pvz., in vivo ir (arba) in vitro) reikšmę.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Jeigu nenurodoma kitokio dozės davimo būdo (pirmiausia žr. 74–78 skirsnius), Šis bandymo metodas taikomas bandomąją cheminę medžiagą duodant per burną.
                           
                        PIRMINIAI ASPEKTAI
                  
                              6.
                           
                           
                              Reglamentavimo sistemomis siekiama patenkinti skirtingas reikmes ir keliami skirtingi reikalavimai dėl pasekmių ir parametrų, susijusių su įvairių klasių cheminių medžiagų (pvz., pesticidų, biocidų, pramoninių cheminių medžiagų) toksikokinetinėmis savybėmis, vertinimo. Kitaip nei daugelio metodų atveju, šiuo bandymo metodu aprašomi toksikokinetinių savybių bandymai, apimantys įvairius matavimus ir pasekmes. Ateityje gali būti parengta keletas naujų bandymų metodų ir (arba) rekomendacinių dokumentų, skirtų atskirai išsamiau apibūdinti kiekvieną pasekmę. Tai, kokie bandymai arba vertinimai atliekami pagal šį bandymo metodą, nustatyta kiekvienos reglamentavimo sistemos reikalavimais.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Yra daug tyrimų, kurie galėtų būti atliekami siekiant reglamentavimo tikslais įvertinti bandomosios cheminės medžiagos toksikokinetines savybes. Tačiau, atsižvelgiant į konkrečias reglamentavimo reikmes arba aplinkybes, norint įvertinti bandomąją cheminę medžiagą gali reikėti atlikti ne visus šiuos galimus tyrimus. Planuojant toksikokinetinius tyrimus reikėtų laikytis lankstaus požiūrio, kuriuo būtų atsižvelgiama į tiriamos bandomosios cheminės medžiagos savybes. Kartais, siekiant ištirti bandomosios cheminės medžiagos keliamus pavojus ir riziką, gali reikėti išnagrinėti tik tam tikrą klausimų rinkinį. Tam tikrais atvejais toksikokinetiniai duomenys gali būti renkami atliekant vertinimus per kitus toksikologinius tyrimus. Dar kitais atvejais, atsižvelgiant į reglamentavimo reikmes ir (arba) vertinant bandomąją cheminę medžiagą kilus naujų klausimų, gali reikėti atlikti papildomus ir (arba) išsamesnius toksikokinetinius tyrimus.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Siekdama užtikrinti aukštesnę tyrimo kokybę ir išvengti nebūtino gyvūnų naudojimo, bandymų laboratorija, prieš atlikdama tyrimą, turėtų įvertinti visą turimą informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą ir susijusius metabolitus bei analogus. Šiuo tikslu galėtų būti naudojami duomenys, gauti taikant kitus susijusius bandymo metodus (tyrimus in vivo ir in vitro ir (arba) vertinimus in silico). Planuojant tyrimą ir aiškinant rezultatus, gali būti naudinga žinoti cheminės medžiagos fizines ir chemines savybes, pvz., oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientą (išreikštą log POW), pKa, tirpumą vandenyje, garų slėgį ir molekulinę masę). Šie dydžiai gali būti nustatomi taikant atitinkamus metodus, kaip aprašyta dėstant susijusius bandymus metodus.
                           
                        APRIBOJIMAI
                  
                              9.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas nėra skirtas taikyti ypatingomis aplinkybėmis, pvz., kai naudojamos apvaisintos arba maitinančios patelės ir jaunikliai arba kai siekiama įvertinti galimus cheminių medžiagų likučius maistinių gyvūnų organizme. Tačiau atlikus B.36 tyrimą gauti duomenys gali būti naudojami kaip pagalbinė informacija planuojant specialius tyrimus, per kuriuos siekiama ištirti minėtus dalykus. Šis bandymo metodas nėra skirtas nanomedžiagų bandymams. OECD bandymų gairių taikymo nanomedžiagoms galimybės išankstinio vertinimo ataskaitoje nurodoma, kad TG 417 (B.36 bandymo metodo atitikmuo) negali būti taikomos nanomedžiagoms (1).
                           
                        APIBRĖŽTYS
                  
                              10.
                           
                           
                              Aprašant šį metodą vartojamos apibrėžtys pateiktos priedėlyje.
                           
                        GYVŪNŲ GEROVĖS ASPEKTAI
                  
                              11.
                           
                           
                              Humaniško elgesio su gyvūnais gairės pateiktos OECD rekomendaciniame dokumente (RD) Nr. 19 (2). OECD rekomendaciniu dokumentu Nr. 19 rekomenduojama remtis atliekant visus aprašant šį bandymo metodą nurodytus tyrimus in vivo ir in vitro.
                           
                        METODŲ APRAŠYMAS
                  
                     Bandomieji tyrimai
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Rekomenduojama ir raginama atlikti bandomuosius tyrimus, skirtus parinkti toksikokinetiniams tyrimams (pvz., metabolizmo, masių balanso, analizės procedūrų, dozių nustatymo, CO2 iškvėpimo ir t. t.) taikytinus bandymų parametrus. Siekiant apibūdinti kuriuos nors iš šių parametrų gali ir nereikėti naudoti radioaktyviu izotopu žymėtąsias chemines medžiagas.
                           
                        
                     Gyvūnų parinkimas
                  
                  
                     Rūšis
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Pageidautina, kad per toksikokinetinius bandymus naudojamų gyvūnų rūšis (ir padermė) būtų tokia pat, kokia naudojama per kitus dominančios bandomosios cheminės medžiagos toksikologinius tyrimus. Paprastai turėtų būti naudojamos žiurkės, nes jos plačiai naudojamos atliekant toksikologinius tyrimus. Gali būti pagrįstas ir kitų arba papildomų rūšių naudojimas, jeigu svarbūs toksikologiniai tyrimai rodo didelį toksiškumą šioms rūšims arba jeigu įrodoma, kad su jomis susijęs toksiškumas ir (arba) toksikokinetika yra artimesni žmonėms. Gyvūnų rūšies ir jų padermės pasirinkimas turi būti pagrįstas.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Jeigu nurodyta kitaip, taikant šį bandymo metodą bandymai atliekami su žiurkėmis. Norint naudoti kitas gyvūnų rūšis, gali reikėti pakoreguoti kai kuriuos šio metodo aspektus.
                           
                        
                     Amžius ir padermė
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojami jauni, sveiki, suaugę gyvūnai (paprastai tokie, kuriems dozės davimo metu yra suėję 6–12 savaičių) (taip pat žr. 13 ir 14 skirsnius). Jeigu naudojami ne jauni suaugę gyvūnai, tai turėtų būti pagrįsta. Pradedant tyrimą, visi gyvūnai turėtų būti panašaus amžiaus. Atskirų gyvūnų kūno masės skirtumai turėtų nenukrypti nuo bandomosios grupės masės vidurkio daugiau kaip ± 20 %. Geriausia, kad būtų naudojama tokia pat padermė, kokia buvo naudojama sudarant tos bandomosios cheminės medžiagos toksikologinę duomenų bazę.
                           
                        
                     Gyvūnų skaičius ir lytis
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Kiekvienai bandomai dozei turėtų būti naudojama ne mažiau kaip po keturis vienos lyties gyvūnus. Naudojamų gyvūnų lyties pasirinkimas turėtų būti pagrįstas. Jeigu yra įrodymų, kad toksiškumas skirtingų lyčių gyvūnams gerokai skiriasi, turėtų būti svarstoma galimybė naudoti abiejų lyčių gyvūnus (po keturis patinus ir keturias pateles).
                           
                        
                     Laikymo ir šėrimo sąlygos
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Bandymų laikotarpiu gyvūnai paprastai turėtų būti laikomi po vieną. Ypatingomis aplinkybėmis gali būti pateisinamas gyvūnų laikymas grupėmis. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Bandomųjų gyvūnų laikymo patalpos temperatūra turėtų būti 22 °C (± 3 °C), santykinis drėgnis – 30–70 %. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio.
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Tiriant visus masių balanso ir metabolitų nustatymo aspektus, turėtų būti naudojama bandomoji cheminė medžiaga, žymėta radioaktyviu izotopu 14C; tačiau, jeigu galima įrodyti, kad:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          masių balansas ir metabolitai gali būti tinkamai įvertinti naudojant nežymėtą bandomąją cheminę medžiagą,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          nenaudojant radioaktyviu izotopu nežymėtą bandomąją cheminę medžiagą taikomo metodo analizinis tikslumas ir jautrumas yra toks pat arba didesnis nei būtų galima užtikrinti naudojant radioaktyviu izotopu žymėtą bandomąją cheminę medžiagą,
                                       
                                    radioaktyviu izotopu žymėtosios bandomosios cheminės medžiagos naudoti nebūtina. Be to, gali būti naudojami kiti radioaktyvus ir stabilūs izotopai, ypač jeigu nuo elemento bent iš dalies priklauso tos bandomosios cheminės medžiagos toksiškumas. Jeigu įmanoma, radioaktyvus izotopas turėtų būti molekulės branduolyje, kuris būtų metaboliškai stabilus (nepakeičiamas, nepašalinamas dėl metabolizmo kaip CO2 ir organizme netampantis vieno anglies atomo junginių dalimi). Norint atsekti bandomosios cheminės medžiagos metabolinį išliekamumą, gali reikėti pažymėti keletą molekulės vietų arba tam tikras jos sritis.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Radioaktyviais izotopais žymėtos ir nežymėtos bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti analizuojamos taikant atitinkamus metodus, siekiant nustatyti jų grynumą ir tapatumą. Radioaktyvios bandomosios cheminės medžiagos radiologinis grynumas turėtų būti didžiausias tos cheminės medžiagos atveju pasiekiamas grynumas (geriausia, kad jis būtų didesnis kaip 95 %); turėtų būti imamasi pagrįstų priemonių, kad būtų nustatytos priemaišos, kurių koncentracija 2 % arba didesnė. Grynumas ir nustatytų priemaišų tapatumas bei dalis turėtų būti nurodyti ataskaitoje. Pagal konkrečias reglamentavimo programas gali būti nuspręsta parengti daugiau rekomendacijų, padėsiančių apibrėžti ir apibūdinti iš mišinių sudarytas bandomąsias chemines medžiagas ir priemaišų nustatymo metodus.
                           
                        
                     Dozių parinkimas
                  
                  
                     Bandomasis tyrimas
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Paprastai bandomajam tyrimui pakanka vienos dozės per burną. Dozė turėtų būti netoksiška, tačiau pakankamai didelė, kad būtų galima nustatyti išskyrose (ir, jeigu reikia, plazmoje) esančius metabolitus, taip pat pasiekti nustatytą bandomojo tyrimo tikslą, kaip nurodyta šio bandymo metodo 12 skirsnyje.
                           
                        
                     Pagrindiniai tyrimai
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Per pagrindinius tyrimus rekomenduojama duoti dvi dozes, nes bent iš dviejų dozę gaunančių grupių surinkta informacija gali padėti nustatyti dozes kitiems toksiškumo tyrimams ir įvertinti dozės ir reakcijos sąryšį, pasireiškusį per jau atliktus toksiškumo bandymus.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Jeigu duodamos dvi dozės, jos abi turėtų būti pakankamai didelės, kad būtų galima nustatyti išskyrose (ir, jeigu reikia, plazmoje) esančius metabolitus. Parenkant dozes turėtų būti atsižvelgiama į informaciją, pagrįstą turimais toksiškumo duomenimis. Jeigu informacijos nėra (pvz., pagrįstos ūmaus toksiškumo per virškinamąjį traktą tyrimais, per kuriuos buvo registruojami klinikiniai toksiškumo požymiai, arba kartotinės dozės toksiškumo tyrimais), nustatant didesniąją dozę gali būti svarstoma galimybė taikyti vertę, kuri būtų mažesnė už LD50 (poveikio per burną arba odą būdai) arba LC50 (poveikio per kvėpavimo takus būdas) įvertį arba mažesnė už apatinę ūmaus toksiškumo intervalo įverčio vertę. Apskritai mažesnioji dozė turėtų būti trupmeninė didesniosios dozės dalis.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Kai tiriama tik vieno dydžio dozė, būtų geriausia, jeigu dozė būtų pakankamai didelė, kad būtų galima nustatyti išskyrose (ir, jeigu reikia, plazmoje) esančius metabolitus, nesukeliant akivaizdaus toksiškumo. Turėtų būti pagrįsta, kodėl neduodama antrojo dydžio dozės.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Kai reikia nustatyti dozės poveikį kinetiniams procesams, dviejų dozių gali nepakakti, o viena dozė turi būti pakankamai didelė, kad būtu įsotinti šie procesai. Jeigu po plazmos koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomybės kreive susidarančio ploto kitimas remiantis dviem per pagrindinį tyrimą taikytais dozių dydžiais nėra tiesinis, tai aiškiai rodo, kad kažkur tarp dviejų dozių dydžių įsotinamas vienas arba daugiau kinetinių procesų.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Jeigu cheminės medžiagos toksiškumas yra mažas, turėtų būti taikoma ne didesnė kaip 1 000 mg/kg kūno masės dozė (dozę duodant per burną ir per odą; rekomendacijos dėl dozės dydžio, kai dozė duodama per kvėpavimo takus, pateiktos šio priedo B.2 skyriuje; paprastai ši dozė turėtų neviršyti 2 mg/l). Atsižvelgiant į konkrečią cheminę medžiagą ir reglamentavimo reikmes, gali reikėti naudoti didesnę dozę. Dozės parinkimas turėtų būti pagrįstas.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Norint nustatyti kaupimosi galimybes ir (arba) tvarumą, gali pakakti vienos dozės toksikokinetinių ir pasiskirstymo audiniuose duomenų. Tačiau tam tikromis aplinkybėmis gali reikėti duoti kartotinę dozę: i) kai norima išsamiai išnagrinėti kaupimosi galimybes ir (arba) tvarumą arba toksikokinetinių savybių pakitimus (pvz., fermentų sužadinimo ir slopinimo) arba ii) kai to reikalaujama pagal reglamentavimo sistemą. Nors, atliekant kartotinės dozės tyrimus, paprastai pakanka duoti mažiausiąją kartotinę dozę, tam tikromis aplinkybėmis gali reikėti duoti ir didžiausiąją kartotinę dozę (taip pat žr. 57 skirsnį).
                           
                        
                     Bandomosios cheminės medžiagos davimas
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga turėtų būti ištirpinta tokiame pačiame nešiklyje, koks buvo naudojamas atliekant kitus bandomosios cheminės medžiagos toksiškumo tyrimus, per kuriuos bandomoji cheminė medžiaga buvo duodama zondu per burną, arba turėtų būti pagaminta homogeniška bandomosios cheminės medžiagos suspensija tokiame nešiklyje, jeigu apskritai yra informacijos apie nešiklį. Turėtų būti pateiktas nešiklio parinkimo pagrindimas. Nešiklio ir dozės dydžio parinkimas turėtų būti apsvarstyti planuojant tyrimą. Įprastas dozės davimo būdas – zondu, tačiau tam tikrais atvejais gali būti naudinga dozę duoti naudojant želatinos kapsulę arba paruošiant maistinį mišinį (abiem atvejais būtina pateikti pagrindimą). Turėtų būti pateiktas kiekvienam gyvūnui faktiškai duotos dozės patvirtinimas.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Didžiausias skysčio, kuris vienu kartu bus duodamas per burną zondu, tūris priklauso nuo bandomųjų gyvūnų dydžio, dozės nešiklio pobūdžio ir to, ar prieš duodant bandomosios cheminės medžiagos dozę gyvūnas kurį laiką nešeriamas. Turėtų būti pateiktas pašaro davimo arba ribojimo prieš dozės davimą pagrindimas. Paprastai, naudojant vandeninius ar nevandeninius nešiklius, tūris turėtų būti kiek įmanoma mažesnis. Dozės tūris paprastai turėtų neviršyti 10 ml/kg graužiko kūno masės. Geriau tirpstančioms riebaluose bandomosioms cheminėms medžiagoms naudojamų nešiklių tūris turėtų būti ne mažesnis kaip 4 ml/kg kūno masės. Duodant kartotinę dozę, kai visą parą nešerti negalima, turėtų būti apsvarstyta galimybė duoti mažesnę dozę (pvz., 2–4 ml/kg kūno masės). Jeigu įmanoma, gali būti apsvarstyta galimybė naudoti tokį dozės tūrį, kuris atitiktų duodamą per kitus bandomosios cheminės medžiagos tyrimus, per kuriuos dozė duodama per burną zondu.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Siekiant nustatyti biologinį įsisavinimą arba santykinę oralinę sugertį, gali būti taikomas intraveninis bandomosios cheminės medžiagos davimas ir atliekamas bandomosios cheminės medžiagos matavimas kraujyje ir (arba) išskyrose. Atliekant intraveninį tyrimą, naudojant tinkamą nešiklį duodama viena bandomosios cheminės medžiagos dozė (paprastai tokio pat dydžio kaip mažiausioji oralinė dozė, bet ne didesnė; žr. apie dozės parinkimą). Tinkamas šios medžiagos tūris (pvz., 1 ml/kg kūno masės) pasirinktoje davimo vietoje turėtų būti duodamas ne mažiau kaip keturiems reikiamos lyties gyvūnams (jeigu tai pagrįsta, gali būti naudojamos abi lytys; žr. 16 skirsnį). Cheminę medžiagą duodant intraveniniu būdu, būtina paruošti visiškai ištirpintą dozę arba jos suspensiją. Intraveniniam dozės davimo būdui naudojamas nešiklis neturėtų gadinti kraujo arba jo apytakos. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga duodama infuzijos būdu, turėtų būti nurodytas infuzijos greitis, kuris, jeigu naudojamas infuzijos siurblys, turėtų būti suvienodintas visiems gyvūnams. Jeigu taikomas kaniuliavimas per jungo veną (duodant cheminės medžiagos dozę ir (arba) imant kraują) arba jeigu dozė duodama per šlaunies arteriją, turėtų būti taikoma anestezija. Turėtų būti deramai parinktas anestezijos tipas, nes jis gali turėti įtakos toksikokinetikai. Prieš duodant bandomosios cheminės medžiagos dozę su nešikliu, gyvūnams turėtų būti duodama pakankamai laiko atsigauti.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Tiriant tam tikras bandomąsias chemines medžiagas, atsižvelgiant į jų fizines ir chemines savybes ir numatomą naudojimo arba poveikio žmonėms būdą, gali būti taikomi kitokie dozės davimo būdai, pvz., per odą arba kvėpavimo takus (žr. 74–78 skirsnius).
                           
                        
                     Matavimai
                  
                  
                     Masių balansas
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Masių balansas nustatomas sudedant su šlapimu, išmatomis ir iškvėptu oru pašalintą duotos (radioaktyvios) dozės procentinę dalį ir procentinę dalį audiniuose, likusioje skerdenoje ir narvelio paplavose (žr.46 skirsnį). Paprastai laikoma, kad bendras duotos bandomosios cheminės medžiagos (radioaktyvių izotopų) regeneravimas yra tinkamas, jeigu jis ne mažesnis kaip 90 %.
                           
                        
                     Sugertis
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Pradinį sugerties įvertį galima gauti iš masių balanso įverčio atimant dozės procentinę dalį virškinimo trakte ir (arba) išmatose. Kaip apskaičiuoti procentinę sugertį nurodyta 33 skirsnyje. Išskyrų tyrimai aprašyti 44–49 skirsniuose. Jeigu tikslaus sugerties, pasireiškusios davus dozę per burną, laipsnio nustatyti remiantis masių balanso tyrimais negalima (pvz., jeigu išmatose yra daugiau kaip 20 % duotos dozės), gali reikėti atlikti papildomus tyrimus. Šie tyrimai gali būti tokie: 1) bandomosios cheminės medžiagos davimas per burną ir bandomosios cheminės medžiagos kiekio tulžyje matavimas arba 2) bandomosios cheminės medžiagos davimas per burną ir intraveniniu būdu ir grynojo bandomosios cheminės medžiagos kiekio šlapime, taip pat iškvėptame ore ir skerdenoje matavimas pagal abu minėtuosius dozės davimo būdus. Pagal kiekvieną tyrimo planą atliekamas radioaktyvumo matavimas, taikomas kaip pakaitinis cheminei medžiagai pritaikytas bandomosios cheminės medžiagos ir metabolitų analizės metodas.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Jeigu atliekamas šalinimo su tulžimi tyrimas, paprastai dozė duodama per burną. Atliekant šį tyrimą, į ne mažiau kaip keturių reikiamos lyties (arba, jeigu tai pagrįsta, į abiejų lyčių) gyvūnų tulžies latakus turėtų būti įvedami vamzdeliai ir suleidžiama viena bandomosios cheminės medžiagos dozė. Suleidus bandomąją cheminę medžiagą, turėtų būti stebimas radioaktyvių izotopų ir (arba) bandomosios cheminės medžiagos šalinimas su tulžimi, stebint tiek laiko, kad būtų galima įvertinti šiuo būdu duodamos dozės procentinę dalį; šis įvertis gali būti naudojamas tiesiogiai apskaičiuoti oralinės sugerties laipsnį, kaip nurodyta toliau:
                              
                                 
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Kai kurių klasių bandomųjų cheminių medžiagų atveju tiesioginis absorbuotos dozės išskyrimas gali vykti per žarnų sieneles. Tokiais atvejais dozės procentinės dalies išmatose matavimas po dozės davimo, naudojant žiurkes, kurioms į tulžies latakus įvesti vamzdeliai, nelaikomas tinkamu neabsorbuotos dozės matavimu. Jeigu manoma, kad vyks šalinimas per žarnyną, rekomenduojama sugertą procentinę dozės dalį nustatyti remiantis sugertimi, apskaičiuojama lyginant šalinimą po dozės davimo per burną ir šalinimą po intraveninio dozės davimo (sveikoms žiurkėms arba žiurkėms, kurioms į tulžies latakus įvesti vamzdeliai) (žr. 35 skirsnį). Be to, jeigu manoma, kad būtina kiekybiškai įvertinti žarnyno sekreciją, rekomenduojama atlikti šalinimo matavimus naudojant žiurkes, kurioms į tulžies latakus įvesti vamzdeliai ir kurioms duota intraveninė dozė.
                           
                        
                     Biologinis įsisavinimas
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Biologinis įsisavinimas gali būti nustatomas remiantis plazmos ir (arba) kraujo kinetika grupėse, kurioms dozės duotos per burną arba intraveniniu būdu, kaip aprašyta 50–52 skirsniuose, atliekant specialią bandomosios cheminės medžiagos ir (arba) susijusių metabolitų cheminę analizę, taip apsieinant be radioaktyviu izotopu žymėtųjų cheminių medžiagų. Bandomosios cheminės medžiagos arba susijusių metabolitų biologinis įsisavinimas (F) gali būti apskaičiuojamas taip:
                              
                                 ,
                           
                        čia: PPK – plotas po koncentracijos plazmoje ir laiko tarpusavio priklausomybės kreive, band. – bandymo būdas (per burną, per odą arba per kvėpavimo takus).
                  
                              36.
                           
                           
                              Siekiant įvertinti sisteminio poveikio riziką, kai per gyvūnų tyrimus nustatyta sisteminė koncentracija lyginama su analogiškais biologinių stebėjimų duomenimis, gautais atlikus poveikio darbuotojams tyrimus, toksiškos sudedamosios dalies biologiniam įsisavinimui paprastai teikiama pirmenybė prieš procentinę sugertį. Padėtis gali tapti sudėtingesnė, jeigu dozių intervalas yra netiesinis, taigi svarbu, kad atliekant toksikokinetinius vertinimus dozės būtų nustatomos taikant tiesinį intervalą.
                           
                        
                     Pasiskirstymas audiniuose
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Norint nustatyti tikslinius audinius, suprasti pagrindinius toksinio poveikio mechanizmus ir gauti informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos ir metabolitų kaupimąsi ir tvarumą, svarbu turėti žinių apie bandomosios cheminės medžiagos ir (arba) jos metabolitų pasiskirstymą audiniuose. Bendros (radioaktyvios) dozės procentinė dalis audiniuose ir likusioje skerdenoje turėtų būti matuojama bent jau baigus šalinimo bandymą (pvz., paprastai ne vėliau kaip per septynias dienas po dozės davimo arba anksčiau, atsižvelgiant į specifines bandomosios cheminės medžiagos savybes). Jeigu baigiant tyrimą bandomosios cheminės medžiagos audiniuose neaptinkama (pvz., bandomoji cheminė medžiaga buvo pašalinta iki tyrimo pabaigos dėl trumpo pusinės eliminacijos laiko), turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad duomenys nebūti aiškinami neteisingai. Tokiu atveju pasiskirstymas audiniuose turėtų būti tiriamas esant didžiausiai bandomosios cheminės medžiagos (ir (arba) metabolitų) koncentracijai plazmoje ir (arba) kraujyje (Tmax) arba esant didžiausiam šalinimo su šlapimu greičiui (jeigu taikytina) (žr. 38 skirsnį). Be to, norint nustatyti bandomosios cheminės medžiagos ir (arba) jos metabolitų pasiskirstymą audiniuose, įvertinti priklausomybę nuo laiko (jeigu taikytina) ir padėti nustatyti masių balansą, ir (arba) paprašius kompetentingai institucijai, gali reikėti paimti audinius ir kitais laiko momentais. Audiniai, kurie turėtų būti imami: kepenys, riebalai, virškinimo traktas, inkstai, blužnis, visas kraujas, likusi skerdena, tikslinių organų audiniai ir kiti audiniai (pvz., skydliaukė, eritrocitai, lytiniai organai, oda, akys (ypač pigmentinių gyvūnų)), kurie gali būti svarbūs vertinant bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą. Siekiant kuo geriau panaudoti gyvūnus ir tuo atveju, kai atliekant pusiau lėtinio arba lėtinio toksiškumo tyrimus pastebimas toksiškumas tiksliniams organams, turėtų būti svarstoma galimybė tais pačiais laiko momentais ištirti papildomus audinius. Be to, ataskaitoje turėtų būti nurodyta (radioaktyvi) likutinė koncentracija, audinių ir plazmos (kraujo) santykis.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Be to, gali reikėti (taip pat kompetentingos institucijos prašymu) įvertinti pasiskirstymą audiniuose papildomais laiko momentais, pvz., esant didžiausiai koncentracijai plazmoje ir (arba) kraujyje (pvz., Tmax) arba esant didžiausiam šalinimo su šlapimu greičiui, nustatytiems atliekant atitinkamus plazmos ir (arba) kraujo kinetinius arba išsiskyrimo bandymus. Ši informacija gali būti naudinga norint suprasti toksiškumą ir bandomosios cheminės medžiagos ir metabolitų kaupimosi ir tvarumo galimybę. Turėtų būti pateiktas ėminių pasirinkimo pagrindimas; analizei skirti ėminiai paprastai turėtų būti tokie pat, kaip nurodyta pirmiau (žr. 37 skirsnį).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Kiekybinis radioaktyvumo įvertinimas pasiskirstymo audiniuose tyrimų tikslais gali būti atliekamas taikant organų skrodimą, homogenizavimą, deginimą ir (arba) tirpinimą, o tada – surinktų likučių scintiliacijos skystyje skaičiavimus (SSS). Nustatant bandomosios cheminės medžiagos pasiskirstymą organuose ir (arba) audiniuose, gali būti naudingi tam tikri metodai, kurie dabar yra daugiau ar mažiau išplėtoti, pvz., kiekybinis viso kūno autoradiografavimas arba receptorių mikroskopinis autoradiografavimas (3) (4).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Jeigu dozė duodama ne per burną, gali būti imami ir analizuojami specifiniai audiniai, pvz., plaučiai, jeigu tai inhaliaciniai tyrimai, ir oda, jeigu tai poveikio per odą tyrimai. Žr. 74–78 skirsnius.
                           
                        
                     Metabolizmas
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Siekiant nustatyti ir kiekybiškai įvertinti nepakitusią bandomąją cheminę medžiagą ir metabolitus, turėtų būti renkamos išskyros (ir, jeigu reikia, plazma), kaip aprašyta 44–49 skirsniuose. Kad būti lengviau nustatyti metabolitus tam tikro dydžio dozei skirtoje grupėje, gali būti kartu sudedamos atskirai paimtos išskyros. Rekomenduojama apibūdinti kiekvieno laikotarpio metabolitus. Tačiau, jeigu dėl ėminio ir (arba) radioaktyvumo nebuvimo to padaryti negalima, galima kartu sudėti skirtingais laikotarpiais paimtą šlapimą ir išmatas, tačiau negalima kartu sudėti skirtingų lyčių gyvūnų išskyrų arba skirtingas dozes gavusių gyvūnų išskyrų. Apibūdinant dozę gavusių gyvūnų šlapimą, išmatas, pasibaigusį radioaktyvumą ir, jeigu taikytina, tulžį, turėtų būti taikomi atitinkami kokybiniai ir kiekybiniai metodai.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Turėtų būti imamasi pagrįstų priemonių, kad būtų nustatyti visi metabolitai, kurių kiekis sudaro 5 % arba daugiau duodamos dozės, ir parengti bandomosios cheminės medžiagos apykaitos schemą. Turėtų būti nustatytos bandomosios cheminės medžiagos, kurių nustatytasis kiekis išskyrose sudaro 5 % arba daugiau duotos dozės. Nustatant šias chemines medžiagas turėtų būti tiksliai nustatyta jų struktūra. Paprastai nustatymas atliekamas metabolito kochromatografijos būdu, taikant žinomus standartus ir dvi nepanašias sistemas arba metodus, kuriais galima tiesiogiai nustatyti struktūrą, pvz., masių spektrometrijos, branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) ir t. t. Jeigu taikoma kochromatografija, chromatografijos metodų, pagal kuriuos, taikant dvi skirtingas tirpiklių sistemas, naudojama ta pati pastovi fazė, taikymas nėra laikomas tinkama dvimetode metabolitų nustatymo patikra, nes šie metodai nėra nepriklausomi. Nustatymas kochromatografijos būdu turėtų būti atliekamas naudojant dvi nepanašias, analitiškai nepriklausomas sistemas, pvz., atvirkštinės ir įprastos fazių plono sluoksnio chromatografiją (PSC) ir didelio slėgio skysčių chromatografiją (DSSC). Jeigu chromatografinis atskyrimas yra tinkamos kokybės, papildomas patvirtinimas spektroskopinėmis priemonėmis nebūtinas. Vienareikšmis nustatymas taip pat gali būti užtikrinamas taikant metodus, kuriais gaunama informacijos apie struktūrą, pvz., skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos (SC-MS) arba skysčių chromatografijos ir dvigubos masių spektrometrijos (SC-MS/MS), dujų chromatografijos ir masių spektrometrijos (DC-MS) ir BMR spektrometrijos.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Jeigu metabolitų, kurių kiekis duotoje dozėje sudaro 5 % arba daugiau, nustatyti neįmanoma, galutinėje ataskaitoje turėtų būti pateiktas pagrindimas ir (arba) paaiškinimas. Bandomosios cheminės medžiagos keliamų pavojų ir (arba) rizikos vertinimo tikslais siekiant geriau suprasti metabolinį kelią, gali būti naudinga nustatyti metabolitus, kurių kiekis duotoje dozėje yra mažesnis kaip 5 %. Jeigu įmanoma, turėtų būti pateikta informacija apie struktūrą. Šiuo tikslu gali būti apibūdinama plazma, kraujas arba kiti audiniai.
                           
                        
                     Šalinimas
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Duotos dozės šalinimo greitis ir laipsnis turėtų būti nustatomi matuojant iš šlapimo, išmatų ir iškvėpto oro regeneruotos (radioaktyvios) dozės procentinę dalį. Šie duomenys taip pat bus naudingi nustatant masių balansą. Tinkamais laiko intervalais turėtų būti nustatyti iš šlapimo, išmatų ir iškvėpto oro pašalintos bandomosios cheminės medžiagos (radioaktyvių izotopų) kiekiai (žr. 47–49 skirsnius). Kartotinės dozės bandymai turėtų būti tinkamai suplanuoti, kad būtų galima surinkti šalinimo duomenis ir pasiekti 26 skirsnyje aprašytus tikslus. Tai leis palyginti vienos dozės bandymus.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Jeigu bandomasis tyrimas parodė, kad su išvepiamu oru pašalinama nedaug bandomosios cheminės medžiagos (radioaktyvių izotopų) (kaip nurodyta 49 skirsnyje), per galutinį tyrimą iškvepiamo oro rinkti nereikia.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Kiekvienas gyvūnas turėtų būti įkeliamas į atskirą metabolizmo (šlapimo, išmatų ir iškvepiamo oro) kamerą, skirtą surinkti išskyras. Kiekvieno rinkimo laikotarpio (žr. 47–49 skirsnius) pabaigoje metabolizmo kameros turėtų būti išplautos tinkamu tirpikliu (vadinamuoju „narvų plovikliu“), kad būtų užtikrintas kuo didesnis bandomosios cheminės medžiagos (radioaktyvių izotopų) regeneravimas. Išskyrų rinkimas turėtų būti baigtas per septynias dienas arba regeneravus ne mažiau kaip 90 % duotos dozės (žiūrint, kas pirmiau įvyksta).
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Bendri bandomosios cheminės medžiagos (radioaktyvių izotopų) kiekiai šlapime turėtų būti nustatomi ne mažiau kaip dviem laiko momentais pirmąją rinkimo dieną (vienas iš šių laiko momentų turėtų būti 24 valandos po dozės davimo), o vėliau – kasdien iki tyrimo pabaigos. Siūloma pirmąją dieną pasirinkti daugiau kaip du ėminių ėmimo laiko momentus (pvz., po 6, 12 ir 24 val.). Siekiant gauti informacijos apie alternatyvius arba papildomus rinkimo laiko momentus, turėtų būti išanalizuoti bandomųjų tyrimų rezultatai. Turėtų būti pateiktas rinkimo tvarkaraščių pagrindimas.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Bendri bandomosios cheminės medžiagos (radioaktyvių izotopų) kiekiai išmatose turėtų būti nustatomi kasdien, pradedant po 24 valandų nuo dozės davimo, iki tyrimo pabaigos, išskyrus atvejus, kai bandomieji tyrimai rodo, kad turėtų būti taikomi alternatyvūs arba papildomi rinkimo laiko momentai. Turėtų būti pateiktas alternatyvių rinkimo tvarkaraščių pagrindimas.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Iškvėpto CO2 ir kitų lakių medžiagų rinkimas per konkretų tyrimą gali būti nutraukiamas, jeigu 24 valandų rinkimo laikotarpiu iškvėptame ore aptinkama mažiau kaip 1 % duotos dozės.
                           
                        
                     Laiko tyrimai
                  
                  
                     Plazmos ir (arba) kraujo kinetika
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Šių tyrimų tikslas – gauti bandomosios cheminės medžiagos pagrindinių toksikokinetinių parametrų [pvz., Cmax, Tmax, pusinės eliminacijos laiko (t1/2), PPK] įverčius. Šie tyrimai gali būti atliekami duodant vieną dozę, bet labiau tikėtina, kad reikės duoti dvi arba daugiau dozių. Dozės turėtų būti nustatomos atsižvelgiant į bandymo pobūdį ir (arba) nagrinėjamą klausimą. Nagrinėjant tokius klausimus kaip bandomosios cheminės medžiagos biologinis įsisavinimas ir (arba) siekiant išsiaiškinti dozės poveikį išsivalymui (pvz., išsiaiškinti, ar išsivalymo proceso įsotinimas priklauso nuo dozės), gali reikėti kinetinių duomenų.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Atliekant šiuos tyrimus, vieno dydžio dozei skirtoje grupėje turėtų būti ne mažiau kaip po keturis vienos lyties gyvūnus. Naudojamų gyvūnų lyties pasirinkimas turėtų būti pagrįstas. Jeigu yra įrodymų, kad toksiškumas skirtingų lyčių gyvūnams gerokai skiriasi, turėtų būti svarstoma galimybė naudoti abiejų lyčių gyvūnus (po keturis patinus ir keturias pateles).
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Davus bandomosios cheminės medžiagos (žymėtos radioaktyviu izotopu) dozę, iš kiekvieno gyvūno tinkamais laiko momentais, taikant tinkamą ėminių ėmimo metodiką, turėtų būti paimti kraujo ėminiai. Kraujo ėminių tūris ir kiekis, kuriuos galima gauti iš vieno gyvūno, gali būti ribojamas galimų kartotinio ėminių ėmimo poveikio gyvūno sveikatai ir (arba) fiziologijai ir (arba) analizės metodo jautrumui. Turėtų būti išanalizuoti kiekvieno gyvūno ėminiai. Tam tikromis aplinkybėmis (pvz., apibūdinant metabolitus) gali reikėti sudėti daugiau nei iš vieno gyvūno paimtus ėminius. Sudėtiniai ėminiai turėtų būti aiškiai identifikuojami, turėtų būti pateiktas ėminio sudėjimo pagrindimas. Jeigu naudojama radioaktyviu izotopu žymėtoji bandomoji cheminė medžiaga, gali reikėti atlikti bendrojo radioaktyvumo analizę. Jeigu tokia analizė atliekama, bendrasis radioaktyvumas turėtų būti analizuojamas visame kraujyje arba plazmoje ir raudonuosiuose kraujo kūneliuose, kad būtų galima apskaičiuoti kraujo kūnelių ir plazmos santykį. Kitais atvejais gali reikėti atlikti konkretesnius tyrimus, kuriems būtina nustatyti pirminį junginį ir (arba) metabolitus arba įvertinti jungimąsi su baltymais.
                           
                        
                     Kinetika kituose audiniuose
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Šių tyrimų tikslas – gauti informacijos apie laiką, suteikiančios galimybę nagrinėti klausimus, susijusius su tokiais aspektais kaip toksinio veikimo būdas, biologinis įsisavinimas ir biologinis tvarumas, kurie įvertinami nustatant cheminės medžiagos lygius įvairiuose audiniuose. Audiniai ir laiko momentų skaičius parenkami atsižvelgiant į nagrinėtiną klausimą ir bandomosios cheminės medžiagos toksikologinę duomenų bazę. Rengiant šių papildomų kinetikos audiniuose tyrimų planą turėtų būti atsižvelgiama į informaciją, surinktą taip, kaip aprašyta 37–40 skirsniuose. Per šiuos tyrimus gali būti duodama viena dozė arba duodamos kartotinės dozės. Turėtų būti pateiktas taikomo metodo pagrindimas.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Kinetikos kituose audiniuose tyrimų motyvai gali būti tokie:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          pailgėjusio pusinės eliminacijos iš kraujo laiko įrodymai, rodantys galimą bandomosios cheminės medžiagos kaupimąsi įvairiuose audiniuose, arba
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          noras išsiaiškinti, ar konkrečiuose audiniuose pasiekiamas pastovus lygis (pvz., per kartotinės dozės tyrimus, net jeigu galėjo būti akivaizdžiai pasiektas pastovus bandomosios cheminės medžiagos lygis kraujyje, gali kilti poreikis įsitikinti, ar pastovus lygis pasiektas ir tiksliniuose audiniuose).
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              Atliekant tokius laiko tyrimus, pagal kiekvieną dozės dydį ir laiko momentą ne mažiau kaip keturiems gyvūnams turėtų būti duodama tinkama oralinė bandomosios cheminės medžiagos dozė ir stebimas pasiskirstymo pasirinktuose audiniuose laikas. Jeigu nepastebima specifinio poveikio kurios nors lyties gyvūnams, gali būti naudojami tik vienos lyties gyvūnai. Ar analizuoti bendrąjį radioaktyvumą arba pirminę cheminę medžiagą ir (arba) metabolitus, priklauso ir nuo nagrinėjamo audinio. Pasiskirstymo audiniuose vertinimas turėtų būti atliekamas taikant tinkamus metodus.
                           
                        
                     Fermentų sužadinimas ir (arba) slopinimas
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Tyrimai, kuriais nagrinėjamas galimas poveikis fermentų sužadinimui ir (arba) slopinimui arba tiriamos bandomosios cheminės medžiagos biologinei transformacijai, gali būti reikalingi vienu arba daugiau iš šių atvejų:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          kai turimi įrodymai rodo, kad esama priklausomybės tarp bandomosios cheminės medžiagos biologinės transformacijos ir padidėjusio toksiškumo;
                                       
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          kai turimi toksiškumo duomenys rodo netiesinę dozės ir metabolizmo tarpusavio priklausomybę;
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          kai metabolitų nustatymo tyrimų rezultatai rodo, kad nustatytas galbūt toksiškas metabolitas, kuris galėjo susidaryti dėl bandomosios cheminės medžiagos sužadinto fermentų veikimo;
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          aiškinantis poveikį, kuris tariamai susijęs su fermentų sužadinimo reiškiniu;
                                       
                                    
                                          5.
                                       
                                       
                                          jeigu per bandymus in vitro arba in vivo, naudojant skirtingų rūšių gyvūnus arba taikant skirtingas sąlygas pastebima toksikologiniu požiūriu svarbių bandomosios cheminės medžiagos metabolinių savybių pokyčių, gali reikėti apibūdinti susijusius fermentus (pvz., I fazės fermentus, pvz., nuo citochromo P450 priklausomos monooksigenazės sistemos izofermentus, II fazės fermentus, pvz., sulfotransferazės arba uridindifosfato gliukuronoziltransferazės izofermentus, arba kitus susijusius fermentus). Ši informacija gali būti naudojama siekiant įvertinti tarprūšinio ekstrapoliavimo tinkamumą.
                                       
                                    
                        
                              57.
                           
                           
                              Vertinant su bandomąja chemine medžiaga susijusius toksikokinetinius pokyčius, turėtų būti taikomi atitinkami tyrimų protokolai, kurie turėtų būti tinkamai patvirtinti ir pagrįsti. Pavyzdinių tyrimo planų sandara: kartotinės radioaktyviu izotopu nežymėtos bandomosios cheminės medžiagos dozės davimas ir vienos radioaktyviu izotopu žymėtosios dozės davimas keturioliktą dieną arba kartotinės radioaktyviu izotopu žymėtosios bandomosios cheminės medžiagos dozės davimas ir ėminių ėmimas pirmą, septintą ir keturioliktą dieną, siekiant nustatyti metabolitų pobūdį. Duodant kartotinę radioaktyviu izotopu žymėtosios bandomosios cheminės medžiagos dozę taip pat galima gauti informacijos apie bioakumuliaciją (žr. 26 skirsnį).
                           
                        PAPILDOMI METODAI
                  
                              58.
                           
                           
                              Be dėstant šį bandymo metodą aprašytų bandymų in vivo, gali būti taikomi papildomi metodai, kuriais gali būti gauta naudingos informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos sugertį, pasiskirstymą, metabolizmą arba šalinimą tam tikrų rūšių gyvūnų organizmuose.
                           
                        
                     Tyrimų in vitro informacijos naudojimas
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              Atliekant tyrimus in vitro ir taikant atitinkamas bandymų sistemas, gali būti išnagrinėta keletas su bandomosios cheminės medžiagos metabolizmu susijusių klausimų. Galimiems metabolitams tirti gali būti naudojami ką tik atskirti arba išauginti kepenų hepatocitai ir ląstelinės frakcijos (pvz., mikrosomos ir citozolis arba S9 frakcijos). Rizikos vertinimo tikslais gali būti svarbu turėti žinių apie vietinį metabolizmą tiksliniame organe, pvz., plaučiuose. Šiais tikslais gali būti naudingos tikslinių audinių mikrosomų frakcijos. Mikrosomų tyrimai gali būti naudingi nagrinėjant galimus lyčių ir gyvenimo etapų skirtumus ir apibūdinant fermentų parametrus (Km ir Vmax), kurie gali padėti įvertinti metabolizmo priklausomybę nuo dozės atsižvelgiant į poveikio lygius. Be to, mikrosomos gali būti naudingos siekiant nustatyti specifinius fermentus, dalyvaujančius bandomosios cheminės medžiagos metabolizmo procesuose; tai gali būti svarbu tarprūšiniam ekstrapoliavimui (taip pat žr. 56 skirsnį). Taip pat gali būti tiriama biologinės transformacijos sužadinimo galimybė, naudojant dominančios bandomosios cheminės medžiagos dozę gavusių gyvūnų kepenų ląstelines frakcijas (pvz., mikrosomas ir citozolį), atliekant hepatocitų sužadinimo tyrimus in vitro arba remiantis specifinėmis ląstelių linijomis, išskiriančiomis reikiamus fermentus. Tam tikromis aplinkybėmis ir tinkamomis sąlygomis gali būt svarstoma galimybė nustatant galimus gyvūnų rūšių skirtumus biologinės transformacijos požiūriu naudoti žmogaus audinių ląstelines frakcijas. Tyrimų in vitro rezultatai taip pat gali būti naudingi kuriant FPTK modelius (5).
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Sugerties per odą tyrimais in vitro galima gauti papildomos informacijos, kuria remiantis būtų galima apibūdinti sugertį (6).
                           
                        
                              61.
                           
                           
                              Iš kepenų ląstelių paimtos pirminių ląstelių kultūros ir ką tik paimtos audinių dalys gali būti naudojamos nagrinėjant panašius klausimus kaip ir kepenų mikrosomų atveju. Tam tikrais atvejais atsakyti į specifinius klausimus gali būti įmanoma naudojant ląstelių linijas, dėl kurių nustatytas atitinkamo fermento išskyrimas, arba inžinerijos būdu gautas ląstelių linijas. Kartais gali būti naudinga ištirti specifinių citochromo P450 izosomų (pvz., CYP1A1, 2E1, 1A2 ir kitų) ir (arba) II fazės fermentų slopinimą ir sužadinimą naudojant pirminį junginį ir atliekant tyrimus in vitro. Gauta informacija gali būti naudinga panašios struktūros junginiams.
                           
                        
                     Per toksiškumo tyrimus gautų toksikokinetinių duomenų, kaip papildomos informacijos, naudojimas
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Kraujo, audinių ir (arba) išskyrų ėminiai, gauti atliekant kitus toksiškumo tyrimus, gali suteikti duomenų apie biologinį įsisavinimą, plazmos koncentracijos kaitą per tam tikrą laiką (PPK, Cmax), bioakumuliacijos galimybę, išsivalymo greičius ir su lytimi bei gyvenimo etapu susijusius metabolizmo ir kinetikos pokyčius.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Sudarant tyrimo planą, gali būti siekiama atsakyti į klausimus, susijusius su: sugerties įsotinimu, biologinės transformacijos arba šalinimo keliais esant didesnėms dozėms, naujų metabolinių kelių veikimu esant didesnėms dozėms ir toksinių metabolitų ribojimu taikant tik didesnes dozes.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Kiti pavojų vertinimo aspektai gali būti susiję su tokiais klausimais:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          jautrumu pagal amžių, atsižvelgiant į hematoencefalinio barjero, kepenų būklės ir (arba) detoksifikacijos galimybių skirtumus,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pogrupių jautrumu, atsižvelgiant į biologinės transformacijos galimybių arba kitokius toksikokinetinius skirtumus,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          poveikio dydžiu vaisiui, kai tas poveikis daromas cheminėms medžiagoms prasiskverbiant per placentą arba žindant naujagimį.
                                       
                                    
                        
                     Toksikokinetinio modeliavimo taikymas
                  
                  
                              65.
                           
                           
                              Toksikokinetiniai modeliai gali būti naudingi įvairiais pavojų ir rizikos vertinimo aspektais, pvz., prognozuojant sisteminį poveikį ir dozę vidaus audiniams. Be to, galima išnagrinėti specifinius veikimo būdo klausimus; šie modeliai gali būti tarprūšinio ekstrapoliavimo, poveikio būdų, dozės davimo būdų ir žmogui gresiančios rizikos vertinimo pagrindas. Duomenys, naudingi kuriant bandomajai cheminei medžiagai skirtus FPTK modelius, kai naudojamos bet kokios gyvūnų rūšys: 1) pasiskirstymo koeficientai, 2) biocheminės konstantos ir fiziologiniai parametrai, 3) su konkrečiu poveikio būdu susiję sugerties parametrai ir 4) tyrimų in vivo kinetiniai duomenys, skirti vertinti modelius [pvz., išsivalymo parametrai, skirti tam tikriems (> 10 %) šalinimo būdams, su metabolizmu susiję Km ir Vmax]. Kuriant modelius naudojami bandymų duomenys turėtų būti rengiami taikant moksliškai patikimus metodus, o modelių rezultatai turėtų būti patvirtinami. Siekiant palengvinti nekategorizuotų arba fiziologija pagrįstų modelių kūrimą, dažnai nustatomi su tam tikra bandomąja chemine medžiaga ir gyvūnų rūšimi susiję parametrai, pvz., sugerties greičiai, pasiskirstymo kraujyje ir audinyje rodikliai ir metabolizmo konstantos (7).
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITOS
                  
                              66.
                           
                           
                              Rekomenduojama tyrimo ataskaitoje nurodyti turinį.
                           
                        
                     Pagrindinė ataskaitos dalis
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              Ataskaitos pagrindinėje dalyje turėtų būti pateikta aprašant šį bandymo metodą nurodyta informacija, sugrupuota į toliau nurodytus skyrius ir skirsnius.
                           
                        
                     Santrauka
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              Šiame tyrimo ataskaitos skyriuje turėtų būti pateikta tyrimo plano santrauka ir taikytų metodų aprašas. Jame turėtų būti aiškiai pateikti pagrindiniai gauti rezultatai, susiję su masių balansu, metabolitų pobūdžiu ir gausa, likučiais audiniuose, išsivalymo greičiu, bioakumuliacijos galimybe, lyčių skirtumais ir t. t. Santrauka turėtų būti pakankamai išsami, kad ja remiantis būtų galima įvertinti gautus rezultatus.
                           
                        
                     Įvadas
                  
                  
                              69.
                           
                           
                              Šiame tyrimo ataskaitos skyriuje turėtų būti nurodyti tyrimo tikslai, loginis pagrindas ir planas, tai pat atitinkamos nuorodos ir susijusi istorinė informacija.
                           
                        
                     Medžiagos ir metodai
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              Šiame ataskaitos skyriuje turėtų būti pateikti išsamūs visos susijusios informacijos aprašai, kuriais apibūdinama:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          Bandomoji cheminė medžiaga
                                          Šiame poskyryje turėtų būti nuodytas bandomosios cheminės medžiagos tapatumas: cheminės medžiagos pavadinimas, molekulinė struktūra, kokybinis ir kiekybinis jos cheminės sudėties įvertinimas, cheminis grynumas ir, jeigu įmanoma, priemaišų tipas ir kiekiai. Be to, šiame poskyryje turėtų būti pateikta informacija apie fizines ir chemines savybes, nurodant fizinę būseną, spalvą, bendrąjį tirpumo ir (arba) pasiskirstymo koeficientą, stabilumą, jeigu taikytina, ėsdinamąsias savybes. Jeigu taikytina, turėtų būti pateikta informacija apie izomerus. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga žymėta radioaktyviu izotopu, šiame poskyryje turėtų būti pateikta tokia informacija: radionuklido tipas, žymės vieta, savitasis aktyvumas ir radiocheminis grynumas.
                                          Turėtų būti nurodyti nešiklių, skiediklių, suspensijos terpių ir emulsiklių arba kitų duodant bandomosios cheminės medžiagos dozes naudojamų medžiagų tipai arba pateikti šių medžiagų aprašai.
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          Bandomieji gyvūnai
                                          Šiame poskyryje turėtų būti pateikta informacija apie bandomuosius gyvūnus, nurodant pasirinktą gyvūnų rūšį, padermę ir amžių pradedant tyrimą ir tokio pasirinkimo pagrindą, taip pat kūno masę, sveikatos būklę ir gyvūnų laikymo sąlygas.
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          Metodai
                                          Šiame poskyryje turėtų būti pateikta išsami informacija apie tyrimo planą ir taikytą metodiką. Jame turėtų būti aprašyta:
                                          
                                                      1.
                                                   
                                                   
                                                      padarytų poveikio būdo ir poveikio sąlygų pakeitimų pagrindimas, jeigu taikytina;
                                                   
                                                
                                                      2.
                                                   
                                                   
                                                      dozių dydžių parinkimo pagrindimas;
                                                   
                                                
                                                      3.
                                                   
                                                   
                                                      planuojant tolesnius bandymais pagrįstus tyrimus naudoti bandomieji tyrimai, jeigu taikytina. Turėtų būti pateikti pamatiniai bandomųjų tyrimų duomenys;
                                                   
                                                
                                                      4.
                                                   
                                                   
                                                      kaip buvo paruoštas dozės tirpalas ir koks buvo naudojamas (jeigu buvo) tirpiklis arba nešiklis;
                                                   
                                                
                                                      5.
                                                   
                                                   
                                                      dozę gaunančių grupių skaičius ir gyvūnų skaičius grupėje;
                                                   
                                                
                                                      6.
                                                   
                                                   
                                                      dozių dydžiai ir tūris (ir, jeigu naudoti radioaktyvūs izotopai, savitasis dozės aktyvumas);
                                                   
                                                
                                                      7.
                                                   
                                                   
                                                      dozės davimo būdas (-ai) ir metodai;
                                                   
                                                
                                                      8.
                                                   
                                                   
                                                      dozių davimo dažnumas;
                                                   
                                                
                                                      9.
                                                   
                                                   
                                                      nešėrimo laikotarpis (jeigu taikytas);
                                                   
                                                
                                                      10.
                                                   
                                                   
                                                      bendras vienam gyvūnui tenkantis radioaktyvumas;
                                                   
                                                
                                                      11.
                                                   
                                                   
                                                      gyvūnų laikymas;
                                                   
                                                
                                                      12.
                                                   
                                                   
                                                      ėminių ėmimas ir tvarkymas;
                                                   
                                                
                                                      13.
                                                   
                                                   
                                                      taikyti analitiniai metabolitų išskyrimo, kiekybinio įvertinimo ir jų tapatumo nustatymo metodai;
                                                   
                                                
                                                      14.
                                                   
                                                   
                                                      taikytų metodų aptikimo riba;
                                                   
                                                
                                                      15.
                                                   
                                                   
                                                      kiti taikyti eksperimentiniai matavimai ir procedūros (įskaitant metodų tinkamumo metabolitų analizei patvirtinimą).
                                                   
                                                
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          Statistinė analizė
                                          Jeigu atliekama tyrimo rezultatų statistinė analizė, turėtų būti pateikta pakankamai informacijos apie analizės metodą ir kompiuterinę programą, kad nepriklausomas ekspertas arba statistikos specialistas galėtų iš naujo įvertinti bei atkurti analizės eigą.
                                          Jeigu taikomos modeliavimo tyrimų sistemos, pvz., FPTK, aprašant modelius turėtų būti pateiktas išsamus modelio aprašas, kad būtų galima atlikti nepriklausomą modelio atkūrimą ir patvirtinimą (žr. 65 skirsnį ir priedėlį „Apibrėžtys“).
                                       
                                    
                        
                     Rezultatai
                  
                  
                              71.
                           
                           
                              Visi duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, pateikiant atitinkamą statistinį įvertinimą, kaip aprašyta šio skyriaus tekste. Radioaktyvumo skaičiavimų duomenys turėtų būti apibendrinti ir pateikti atsižvelgiant į tyrimą, paprastai – mikrogramais arba miligramais, tenkančiais ėminio masei, tačiau gali būti naudojami ir kiti matavimo vienetai. Šiame skyriuje turėtų būti pateiktos grafinės rezultatų iliustracijos, tipinių chromatografijos ir spektrometrijos duomenų kopijos, metabolitų identifikavimo ir (arba) kiekybinio įvertinimo duomenys ir numanomi metaboliniai keliai, nurodant metabolitų molekulinę struktūrą. Be to, jeigu taikytina, šiame skyriuje turėtų būti pateikta tokia informacija:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          iš šlapimo, išmatų, iškvėpto oro ir narvelyje buvusio šlapimo ir išmatų paplavų regeneruotas radioaktyvių izotopų kiekis ir procentinė jų dalis:
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jeigu atliekant tyrimus dozė duodama per odą, taip pat turėtų būti pateikti duomenys apie bandomosios cheminės medžiagos regeneravimą iš paveiktos odos, odos nuoplovų ir apie liekamąjį radioaktyvumą odą gaubiančioje aparatūroje ir metabolizmo kameroje, taip pat odos plovimo tyrimo rezultatus. Išsamesnis aptarimas pateiktas 74–77 skirsniuose,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jeigu tai inhaliaciniai tyrimai, taip pat turėtų būti pateikti duomenys apie bandomosios cheminės medžiagos regeneravimą iš plaučių ir nosies audinių (8). Išsamesnis aptarimas pateiktas 78 skirsnyje;
                                                   
                                                
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          Pasiskirstymas audiniuose, nurodomas procentine duotos dozės dalimi ir koncentracija (mikrogramais, tenkančiais audinio gramui) ir pateikiant audinių ir kraujo kūnelių arba audinių ir plazmos santykius;
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          medžiagų balansas, sudarytas pagal kiekvieną tyrimą, pateikiant kūno audinių ir išskyrų aprašus;
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          koncentracijos plazmoje ir su plazma susiję toksikokinetiniai parametrai (biologinis įsisavinimas, PPK, Cmax, Tmax, išsivalymas, pusinės eliminacijos laikas), nustatyti atitinkamu (-ais) būdu (-ais) davus dozę;
                                       
                                    
                                          5.
                                       
                                       
                                          bandomosios cheminės medžiagos sugerties greitis ir laipsnis, nustatyti atitinkamu (-ais) būdu (-ais) davus dozę;
                                       
                                    
                                          6.
                                       
                                       
                                          iš išskyrų surinkti bandomosios cheminės medžiagos ir metabolitų kiekiai (nurodomi kaip duotos dozės procentinė dalis);
                                       
                                    
                                          7.
                                       
                                       
                                          nuoroda į papildomų duomenų šaltinius, kuriuose gali būti atskirų gyvūnų duomenų apie visas matuojamas pasekmes (pvz., dozės davimo būdas, procentinis regeneravimas, toksikokinetiniai parametrai ir t. t.);
                                       
                                    
                                          8.
                                       
                                       
                                          diagrama su siūlomais metabolizmo būdais ir metabolitų molekulinėmis struktūromis.
                                       
                                    
                        
                     Aptarimas ir išvados
                  
                  
                              72.
                           
                           
                              Šiame skyriuje autorius (-iai) turėtų:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          pateikti siūlomą metabolizmo būdą, pagrįstą bandomosios cheminės medžiagos metabolizmo ir perdavimo rezultatais;
                                       
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          aptarti galimas gyvūnų rūšių ir lyčių skirtumus, susijusius su bandomosios cheminės medžiagos perdavimu ir (arba) biologine transformacija;
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          pateikti lentelėse ir aptarti metabolitų tapatumą ir kiekį, išsivalymo greičius, bioakumuliacijos galimybę ir pirminės cheminės medžiagos ir (arba) metabolito (-ų) likučių audiniuose kiekį, taip pat, jeigu taikytina, galimus nuo dozės priklausomus toksikokinetinių parametrų pokyčius;
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          įtraukti į šį skyrių susijusius toksikokinetinius duomenis, gautus atliekant toksiškumo tyrimus;
                                       
                                    
                                          5.
                                       
                                       
                                          pateikti tikslią išvadą, kurią galima pagrįsti tyrimo rezultatais;
                                       
                                    
                                          6.
                                       
                                       
                                          įtraukti daugiau skyrių (jeigu reikia arba jeigu taikytina).
                                       
                                    
                        
                              73.
                           
                           
                              Norint pateikti pagalbinės bibliografinės informacijos, lentelių, diagramų, priedų ir t. t., turėtų būti įtraukiami papildomi skyriai.
                           
                        ALTERNATYVŪS POVEIKIO BŪDAI
                  
                     Poveikis per odą
                  
                  
                     Dozės davimas per odą
                  
                  
                              74.
                           
                           
                              Šiame skirsnyje pateikiama specifinės informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos toksikokinetines savybes, kai dozė duodama per odą. Nagrinėjant sugertį per odą reikėtų remtis šio priedo B.44 skyriumi [„Sugertis per odą. In vivo metodas“ (9)]. Nagrinėjant kitas pasekmes, pvz., pasiskirstymą ir metabolizmą, gali būti taikomas šis – B.36 – bandymo metodas. Dozę duodant per odą, gali būti duodama vieno arba daugiau dydžių bandomosios cheminės medžiagos dozės. Bandomoji cheminė medžiaga (pvz., neskiesta, skiesta arba preparuota medžiaga, kurios sudėtyje yra cheminės medžiagos, kuria daromas poveikis per odą) turėtų būti tokia pat, kuri gali turėti poveikio žmonėms arba kitoms galimoms tikslinėms gyvūnų rūšims (arba gali būti naudojamas realus tokios medžiagos pakaitalas). Dozės (-ių) dydis (-žiai) turėtų būti parenkami pagal šio bandymo metodo 20–26 skirsnius. Parenkant per odą duodamą dozę galima atsižvelgti į tokius veiksnius kaip numatomas poveikis žmogui ir (arba) dozės, kurias taikant buvo pastebėtas toksiškumas per kitus toksinio poveikio per odą tyrimus. Per odą duodamos dozės prireikus turėtų būti ištirpinamos tinkamame nešiklyje ir duodamos parenkant tokį tūrį, kurio pakaktų duoti dozę. Prieš pat bandymą nuo bandomųjų gyvūnų kūno sprando srityje nukerpamas kailis. Galima ir skusti, bet tai turėtų būti atliekama apytikriai prieš 24 valandas iki bandymo. Jeigu kailis kerpamas arba skutamas, reikėtų stengtis nenutrinti odos, nes dėl to gali pasikeisti jos pralaidumas. Bandomajai cheminei medžiagai uždėti turėtų būti nukerpama arba nuskutama apie 10 % kūno paviršiaus Jeigu cheminės medžiagos labai toksiškos, padengiamas paviršiaus plotas gali būti mažesnis nei apytikriai 10 %, bet kaip galima didesnis plotas turėtų būti padengiamas plonu vienodu sluoksniu. Toks pat paviršiaus ploto apdorojimas turėtų būti taikomas visoms bandymų per odą grupėms. Vietos, per kurias duodama dozė, turėtų būti apsaugotos tinkama gerai pritvirtinta danga. Gyvūnai turėtų būti laikomi atskirai.
                           
                        
                              75.
                           
                           
                              Turėtų būti atliktas odos plovimo tyrimas, skirtas įvertinti duotos bandomosios cheminės medžiagos dozės dydį, kuris gali būti pašalinamas nuo odos plaunant paveiktą odą švelniu muilu ir vandeniu. Šis tyrimas taip pat gali padėti nustatyti masių balansą, kai bandomoji cheminė medžiaga duodama per odą. Atliekant šį odos plovimo tyrimą, dviem gyvūnams turėtų būti duodama viena bandomosios cheminės medžiagos dozė. Dozės dydis turėtų būti parenkamas pagal šio bandymo metodo 23 skirsnį (taip pat žr. 76 skirsnį, kuriame aptariama sąlyčio su oda trukmė). Turėtų būti nustatyti plaunant regeneruojami bandomosios cheminės medžiagos kiekiai, kad būtų galima įvertinti bandomosios cheminės medžiagos pašalinimo plaunant veiksmingumą.
                           
                        
                              76.
                           
                           
                              Jeigu bandomoji cheminė medžiaga nėra pernelyg ėsdinanti, ji turėtų būti dedama ir laikoma ant odos ne trumpiau kaip šešias valandas. Pašalinant dangą, paveikta sritis turėtų būti nuplaunama pagal odos plovimo procedūrą (žr. 75 skirsnį). Turėtų būti ištirtas ant dangos ir paplavose likęs bandomosios cheminės medžiagos kiekis. Baigiant tyrimus, kiekvienas gyvūnas turėtų būti humaniškai numarintas pagal antrąjį (2) literatūros šaltinį, o paveikta oda turėtų būti nudirta. Turėtų būti ištirtas atitinkamoje paveiktos odos dalyje likęs bandomosios cheminės medžiagos (radioaktyvių izotopų) kiekis.
                           
                        
                              77.
                           
                           
                              Vertinant vaistų toksikokinetines savybes, atsižvelgiant į atitinkamą reglamentavimo sistemą gali reikėti taikyti kitokias procedūras.
                           
                        
                     Inhaliacinis poveikis
                  
                  
                              78.
                           
                           
                              Turėtų būti taikoma viena bandomosios cheminės medžiagos koncentracija (arba, jeigu reikia, daugiau). Koncentracija (-os) turėtų būti parenkamos pagal šio bandymo metodo 20–26 skirsnius. Inhaliacinis poveikis turėtų būti daromas naudojant nosies arba snukio gaubtus, kad būtų išvengta sugerties kitais poveikio būdais (8). Jeigu taikomos kitokios inhaliacinio poveikio procedūros, pakeitimai turėtų būti pagrįsti dokumentais. Turėtų būti nustatyta inhaliacinio poveikio trukmė; įprasta poveikio trukmė – 4–6 val.
                           
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the SAFEty of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation; Environmental Health and SAFEty Publications, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73–81.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25–40.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400–411.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Šio priedo B.45 skyrius. Sugertis per odą. In vitro metodas.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical SAFEty.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Šio priedo B.44 skyrius. Sugertis per odą. In vivo metodas.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Barton HA, et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical SAFEty Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York.
                           
                        
                     Priedėlis
                     APIBRĖŽTYS
                     
                        Sugertis– cheminės medžiagos sugėrimas į audinius arba perdavimas iš vieno audinio į kitą. Sugertis siejama su pirminiu junginiu ir visais jo metabolitais. Nereikėtų painioti su biologiniu įsisavinimu.
                     
                        Kaupimasis (bioakumuliacija)– bandomosios cheminės medžiagos kiekio audiniuose (paprastai – riebaliniuose audiniuose, davus kartotinę dozę) didėjimas laikui bėgant; jeigu bandomosios cheminės medžiagos patekimo į kūną greitis didesnis už tos medžiagos šalinimo greitį, bandomoji cheminė medžiaga kaupiasi organizme ir gali susidaryti toksiškos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos.
                     
                        SPMŠ– sugerties, pasiskirstymo, metabolizmo ir šalinimo santrumpa.
                     
                        PPK (plotas po plazmos koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomybės kreive)– plotas po kreive, susidarantis bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomybės grafike. Jis parodo bendrą per iš anksto nustatytą laikotarpį kūno absorbuotą bandomosios cheminės medžiagos kiekį. Jeigu priklausomybė tiesinė, PPK (nuo nulinio laiko momento iki begalybės) yra proporcingas bendram kūno sugertam bandomosios cheminės medžiagos kiekiui, nepaisant sugerties greičio.
                     
                        Autoradiografija (viso kūno autoradiografija)– metodika, skirta kokybiškai ir (arba) kiekybiškai įvertinti radioaktyvios bandomosios cheminės medžiagos buvimą audiniuose, naudojant rentgeno juostą arba modernesnę skaitmeninę fosforografiją, skirtą atvaizduoti radioaktyviu izotopu žymėtąsias molekules arba molekulių fragmentus registruojant tiriamo objekto spinduliuojamą radiaciją. Kiekybinė viso kūno autoradiografija, palyginti su organų skrodimu, gali būti naudingesnė vertinant bandomosios cheminės medžiagos pasiskirstymą ir bendrąjį radioaktyvios medžiagos regeneravimą bei išskyrimą audiniuose. Pvz., šis metodas naudingesnis tuo, kad jį galima taikyti kaip pavyzdį naudojant pigmentinį gyvūną, siekiant įvertinti galimą bandomosios cheminės medžiagos jungimąsi su melaninu, galinčiu surišti tam tikras molekules. Tačiau, nors šiuo metu galima gauti tinkamas viso kūno didelio masto mažo giminiškumo jungimosi vietų apžvalgas, jo geba atpažinti specifines tikslines vietas, pvz., jungimosi prie receptorių vietas, kurioms aptikti būtina gana didelė raiška ir didelis jautris, yra ribota. Taikant autoradiografiją, duodamo junginio masių balanso nustatymo bandymai turėtų būti atliekami kaip atskira bandymų grupė arba kaip atskiras tyrimas nei pasiskirstymo audiniuose bandymas; visos išskyros (taip pat galbūt įskaitant iškvėptą orą) ir visos skerdenos homogenizuojamos ir apibūdinamos atliekant scintiliacijos skystyje skaičiavimus.
                     
                        Šalinimas su tulžimi– šalinimas per tulžies latakus.
                     
                        Bioakumuliacija– žr. „Kaupimasis“.
                     
                        Biologinis įsisavinimas– duotos dozės dalis, pasiekianti sisteminę apytaką arba patenkanti į fiziologinio aktyvumo vietą. Paprastai bandomosios cheminės medžiagos biologinis įsisavinimas siejamas su pirminiu junginiu, tačiau gali būti siejamas ir su jo metabolitu. Nagrinėjama tik viena cheminė forma. Pastaba: biologinis įsisavinimas nėra tas pats, kas sugertis. Pvz., oralinės sugerties (t. y. patekimo į žarnų sieneles ir vartinę apytakos sistemą) ir biologinio įsisavinimo (t. y. patekimo į sisteminę kraujotaką ir audinius) skirtumų, be kitų priežasčių, gali atsirasti dėl cheminės medžiagos irimo vykstant metabolizmui per žarnų sieneles arba atgaliniam nutekėjimui į žarnos spindį arba dėl presisteminio metabolizmo kepenyse (10). Toksinės sudedamosios dalies (pirminio junginio arba metabolito) biologinis įsisavinimas yra labai svarbus parametras vertinant žmonėms gresiančią riziką (atliekant didžiausiųjų dozių ekstrapoliavimą į mažiausiąsias, vieno poveikio būdo ekstrapoliavimą į kitą), siekiant nustatyti vidinę vertę remiantis išorine NNPL arba OD verte (taikytos dozės). Tiriant per burną duotos dozės poveikį kepenims pakanka ištirti oralinę sugertį. Tačiau, jeigu poveikis daromas ne per patekimo vietą, vėliau vertinant riziką paprastai patikimiau taikyti biologinio įsisavinimo, o ne sugerties parametrą.
                     
                        Biologinis tvarumas– žr. „Tvarumas“.
                     
                        Biologinė transformacija– (paprastai fermentinis) dominančios bandomosios cheminės medžiagos virsmas kūne kita chemine medžiaga. Metabolizmo sinonimas.
                     
                        Cmax
                        – maksimali (didžiausia) koncentracija kraujyje (plazmoje, serume) davus dozę arba maksimalus (didžiausias) šalinimas (su šlapimu arba išmatomis) davus dozę.
                     
                        Išsivalymo greitis– kiekybinis matas, rodantis per laiko vienetą iš kraujo, plazmos arba tam tikro audinio pašalinamą bandomosios cheminės medžiagos kiekį.
                     
                        Atskira dalis– struktūrinė arba biocheminė kūno, audinio arba ląstelės dalis (arba) vienetas, atskirtas nuo likusios dalies.
                     
                        Detoksifikacijos būdai– procesų, kuriais toksiškos cheminės medžiagos pašalinamos iš kūno vykstant medžiagų apykaitai arba su išskyromis, seka.
                     
                        Pasiskirstymas– bandomosios cheminės medžiagos ir jos produktų išsisklaidymas po organizmą.
                     
                        Fermentai, izofermentai– baltymai, katalizuojantys chemines reakcijas. Izofermentai – tai fermentai, katalizuojantys panašias chemines reakcijas, tačiau turintys kitokią aminorūgščių seką.
                     
                        Fermentų parametrai– Km – Michaelio konstanta, Vmax – didžiausias greitis.
                     
                        Šalinimas– procesas (-ai), kuriuos (-iais) duota bandomoji cheminė medžiaga ir (arba) jos metabolitai pašalinami iš kūno.
                     
                        Išoriškai– veikiant iš organizmo arba sistemos išorės arba susidarant organizmo arba sistemos išorėje.
                     
                        Ekstrapoliacija– vienos arba daugiau nežinomų verčių išvedimas remiantis žinomais arba pastebėtais dalykais.
                     
                        Pusinės eliminacijos laikas (t1/2)– laikas, kurio reikia, kad bandomosios cheminės medžiagos koncentracija atskiroje dalyje sumažėtų per pusę. Paprastai ši sąvoka vartojama kalbant apie koncentraciją plazmoje arba apie bandomosios cheminės medžiagos kiekį visame kūne.
                     
                        Sužadinimas, fermentų sužadinimas– fermentų sintezė, kaip reakcija į aplinkos veiksnį arba molekulę sukėlėją.
                     
                        Tiesiškumas, tiesinė kinetika– kinetiniu požiūriu procesas yra tiesinis, jeigu visi perdavimo iš vienos atskirosios dalies į kitą greičiai yra proporcingi esamiems kiekiams arba koncentracijoms, t. y. pirmojo laipsnio. Išsivalymo ir pasiskirstymo dydžiai, taip pat pusinės eliminacijos laikai atitinkamai yra konstantos. Pasiektos koncentracijos yra proporcingos dozių dydžiams (poveikiui), lengviau prognozuoti akumuliaciją. Tiesiškumą arba netiesiškumą galima įvertinti lyginant susijusius parametrus (pvz., PPK), nustatytus davus skirtingas dozes arba po vienkartinio ir kartotinio poveikio. Jeigu priklausomybės nuo dozės nėra, tai gali būti požymis, kad junginio metabolizmo procese dalyvaujantys fermentai yra įsotinti; PPK padidėjimas po kartotinės dozės, palyginti su vienkartiniu poveikiu, gali būti metabolizmo slopinimo požymis, o PPK mažėjimas gali būti metabolizmo sužadinimo požymis [taip pat žr. (11)].
                     
                        Masių balansas– bandomosios cheminės medžiagos patekimo į sistemą ir pašalinimo iš jos apskaita.
                     
                        Medžiagos balansas– žr. „Masių balansas“.
                     
                        Toksinio poveikio mechanizmas (būdas), veikimo mechanizmas (būdas)– veikimo mechanizmas yra specifinės biocheminės sąveikos, per kurias pasireiškia bandomosios cheminės medžiagos poveikis. Veikimo būdas yra bendresnio pobūdžio būdai, kuriais pasireiškia bandomosios cheminės medžiagos toksiškumas.
                     
                        Metabolizmas– biologinės transformacijos sinonimas.
                     
                        Metabolitai– metabolizmo arba metabolinių procesų produktai.
                     
                        Oralinė sugertis– bandomosios cheminės medžiagos dozės procentinė dalis, absorbuota per dozės davimo vietą (t. y. per virškinimo traktą). Šis labai svarbus parametras gali būti naudojamas norint sužinoti duotos bandomosios cheminės medžiagos dalį, kuri pasiekia vartinę veną, o vėliau – kepenis.
                     
                        Pasiskirstymo koeficientas– cheminės medžiagos skirtingo tirpumo dviejuose tirpikliuose matas.
                     
                        Didžiausieji lygiai kraujyje (plazmoje, serume)– didžiausia koncentracija kraujyje (plazmoje, serume) davus dozę (taip pat žr. „Cmax“).
                     
                        Tvarumas (biologinis tvarumas)– ilgalaikis cheminės medžiagos išlikimas (biologinėje sistemoje) dėl atsparumo irimui ir (arba) šalinimui.
                     
                        Analogijos metodas– vienos arba daugiau cheminių medžiagų pasekmės informacijos naudojimas prognozuojant tikslinės cheminės medžiagos pasekmę.
                     
                        Receptorių mikroskopinė autoradiografija (arba receptorių mikroautoradiografija)– metodika, kuri gali būti taikoma tirti ksenobiotinių medžiagų sąveiką su konkrečiomis audinių sritimis arba ląstelių populiacijomis, pvz., atliekant jungimosi prie receptorių arba konkrečių veikimo būdų tyrimus, kuriems gali reikėti didelės raiškos ir didelio jautrio, kurių gali būti neįmanoma užtikrinti kitokiais metodais, pvz., viso kūno autoradiografijos.
                     
                        Dozės davimo būdas (per burną, intraveninis, per odą, įkvepiant ir t. t.)– priemonės, kuriomis cheminės medžiagos perduodamos į kūną (pvz., per burną zondu, per burną su pašaru, per odą, įkvepiant, suleidžiant į veną ir t. t.).
                     
                        Įsotinimas– būklė, kai vienas arba daugiau kinetinių procesų (pvz., sugertis, metabolizmas arba išsivalymas) yra maksimalaus lygio (t. y. „įsotintas“).
                     
                        Jautris– metodo arba prietaiso geba išskirti matavimo atsakus, rodančius skirtingus dominančio kintamojo lygius.
                     
                        Pastovūs lygiai kraujyje (plazmoje)– nepusiausvyrinė atviros sistemos būklė, kai visos sistemoje veikiančios jėgos nėra tiksliai atsveriamos priešinėmis jėgomis ir kai visų tos sistemos elementų koncentracija yra pastovi, nors medžiaga ir teka per sistemą.
                     
                        Sistemų modeliai (fiziologija pagrįsti toksikokinetiniai modeliai, farmakokinetika pagrįsti modeliai, fiziologija pagrįsti farmakokinetiniai modeliai, biologija pagrįsti modeliai ir t. t.)– abstraktūs modeliai, pagal kuriuos matematine kalba aprašomas sistemos veikimas.
                     
                        Tikslinis organas– audinys, kuriame pasireiškia pagrindinis neigiamas toksinės medžiagos poveikis.
                     
                        Bandomoji cheminė medžiaga– pagal šį bandymo metodą bandoma cheminė medžiaga arba mišinys.
                     
                        Pasiskirstymas audiniuose– abipusis bandomosios cheminės medžiagos judėjimas iš vienos kūno vietos į kitą. Pasiskirstymą audiniuose galima ištirti atliekant organų skrodimą, homogenizavimą, deginimą ir scintiliacijos skystyje skaičiavimus arba taikant kokybinę ir (arba) kiekybinę viso kūno autoradiografiją. Pirmasis metodas yra naudingas, kai norima nustatyti koncentraciją ir procentinį regeneravimą iš audinių ir likusios tų pačių gyvūnų skerdenos, tačiau juo gali būti pasiekiama nepakankama raiška visuose audiniuose ir užtikrinamas mažesnis nei idealus bendrasis regeneravimas (< 90 %). Žr. pirmiau pateiktą šio metodo apibrėžtį.
                     
                        Tmax
                        – laikas, kurio reikia norint pasiekti Cmax.
                     
                        Toksikokinetika (farmakokinetika)– cheminių medžiagų sugertis, pasiskirstymas, metabolizmas ir šalinimas laikui bėgant.
                     
                        Modelių patvirtinimas– modelio tinkamumo nuosekliai apibūdinti turimus toksikokinetinius duomenis įvertinimo procedūra. Modeliai gali būti vertinami taikant statistinį ir vizualinį modeliuojamų prognozių, gautų naudojant eksperimentines vertes, palyginimą su bendruoju nepriklausomu kintamuoju (pvz., laiku). Vertinimo apimtis turėtų būti pagrįsta atsižvelgiant į numatomą modelio paskirtį.
                  “
            
                  8)
               
               
                  Įtraukiamas B.52 skyrius:
                  „B.52.   ŪMUS TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS. ŪMAUS TOKSIŠKUMO KLASĖS NUSTATYMO METODAS
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 436 (OECD bandymo gaires Nr. 436) (2009). Pirmosios ūmaus toksiškumo įkvėpus bandymo gairės TG 403 priimtos 1981 m., vėliau jos buvo atnaujintos (žr. šio priedo B.2 skyrių (1)). Parengti ūmaus toksiškumo įkvėpus klasės (ŪITK) metodą (2) (3) (4) nuspręsta priėmus atnaujintąjį ūmaus toksiškumo per virškinamąjį traktą klasės (ŪOTK) metodą (šio priedo B.1 tris skyrius) (5). Retrospektyvus ūmaus toksiškumo įkvėpus klasės bandymo metodo veiksmingumo vertinimas parodė, kad šis metodas yra tinkamas taikyti klasifikavimo ir ženklinimo tikslais (6). Ūmaus toksiškumo įkvėpus klasės bandymo metodas suteiks galimybę atlikti nuoseklius veiksmus taikant pastovias tikslines koncentracijas, siekiant įvertinti bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą. Pagrindinė metodo pasekmė – mirtingumas, tačiau didelį skausmą arba kančią patiriantys gyvūnai arba gaištantys gyvūnai turėtų būti humaniškai numarinami siekiant sumažinti kančią. Pasekmių žmonėms gairės pateiktos OECD rekomendaciniame dokumente (RD) Nr. 19 (7).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Šio bandymo metodo taikymo ir aiškinimo gairės pateiktos rekomendaciniame dokumente Nr. 39 dėl ūmaus toksiškumo įkvėpus bandymų (RD Nr. 39) (8).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Aprašant šį bandymo metodą vartojamos apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje ir RD Nr. 39 (8).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Taikant šį bandymo metodą gaunama informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos pavojingas savybes siekiant ją įvertinti ir klasifikuoti pagal Reglamentą (EB) Nr. 1272/2008 (9) kaip ūmų toksiškumą sukeliančias chemines medžiagas. Jeigu reikalingi taškiniai LC50 įverčiai arba koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomybės tyrimai, reikėtų taikyti šio priedo B.2 skyriuje (1) aprašytą bandymo metodą. Daugiau rekomendacijų dėl bandymo metodo pasirinkimo pateikta RD Nr. 39 (8). Šis bandymo metodas nėra specialiai skirtas specialiosios paskirties medžiagų, pvz., mažo tirpumo izomerinių arba pluoštinių medžiagų arba dirbtinių nanomedžiagų, bandymams.
                           
                        PIRMINIAI ASPEKTAI
                  
                              5.
                           
                           
                              Prieš svarstydama galimybę atlikti bandymus pagal šį bandymo metodą, bandymų laboratorija, siekdama sumažinti bandymų su gyvūnais poreikį, turėtų peržiūrėti visą turimą informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą, įskaitant esamus tyrimus, kurių duomenys leistų neatlikti papildomų bandymų. Pasirinkti tinkamiausią gyvūnų rūšį, padermę, lytį, poveikio būdą ir tinkamas bandymų koncentracijas gali padėti informacija apie bandomosios cheminės medžiagos tapatumą, cheminę struktūrą, fizines ir chemines savybes, taip pat toksiškumo bandymų in vitro arba in vivo rezultatai, numatomi panaudojimo būdai ir galimas poveikis žmogui, turimi (Q)SAR duomenys ir toksikologiniai duomenys apie panašios struktūros chemines medžiagas. Jeigu, atsižvelgiant į ėsdinamąjį (11) arba stiprų dirginamąjį poveikį, numatoma, kad koncentracija gali sukelti didelį skausmą arba kančią, tokia koncentracija neturėtų būti bandoma pagal šį bandymo metodą [žr. RD Nr. 39 (8)].
                           
                        BANDYMO PRINCIPAS
                  
                              6.
                           
                           
                              Šis bandymas grindžiamas nuoseklia metodika, pagal kurią keturių valandų poveikio laikotarpiu gaunama pakankamai informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos ūmų toksiškumą įkvėpus, kad tą medžiagą būtų galima klasifikuoti. Atsižvelgiant į specialius reglamentavimo tikslus, gali būti taikomi ir kitokie poveikio laikotarpiai. Kad ir kokie būtų nustatytieji koncentracijos lygiai, bandymai atliekami naudojant po tris kiekvienos lyties gyvūnus. Atsižvelgiant į gyvūnų gaištamumą ir (arba) liguistumą, gali pakakti dviejų lygių, kad būtų galima spręsti apie bandomosios cheminės medžiagos ūmų toksiškumą. Jeigu pateikiama įrodymų, kad kurios nors lyties gyvūnai yra jautresni už kitos lyties gyvūnus, bandymas gali būti tęsiamas naudojant tik jautresniosios lyties gyvūnus. Remiantis pirmesniojo lygio taikymo rezultatais, nustatoma, kas turėtų būti daroma toliau, pvz.:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          daugiau bandymų atlikti nereikia;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          turėtų būti atliekami bandymai naudojant po tris kiekvienos lyties gyvūnus arba
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          turėtų būti atliekami bandymai naudojant šešis jautresniosios lyties gyvūnus, t. y. toksiškumo klasės apatinės ribos įverčiai turėtų būti nustatomi remiantis šešiais gyvūnais kiekvienoje koncentracijos lygio grupėje, nepaisant lyties.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymių, turėtų būti humaniškai numarinami ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi atliekant bandymą nugaišusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištančius arba sunkiai kenčiančius gyvūnus priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra pateikti rekomendaciniame dokumente Nr. 19 dėl pasekmių žmonėms (7).
                           
                        METODO APRAŠYMAS
                  
                     Gyvūnų rūšies parinkimas
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių padermių gyvūnai. Tinkamiausia rūšis yra žiurkės; jeigu naudojama kita rūšis, turėtų būti pateiktas jos naudojimo pagrindimas.
                           
                        
                     Gyvūnų paruošimas
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Patelės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos. Poveikio dieną gyvūnai turėtų būti jauni, bet suaugę, 8–12 savaičių amžiaus, o masė pagal kiekvieną lytį turėtų ± 20 % tikslumu atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę. Gyvūnai atrenkami atsitiktine tvarka ir paženklinami, kad būtų galima identifikuoti kiekvieną gyvūną. Ne mažiau kaip penkias paras iki bandymo pradžios gyvūnai laikomi savo narveliuose, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų. Prieš bandymą gyvūnai taip pat turėtų būti trumpai papratinami prie bandymo aparatūros, nes tai padės sumažinti įtampą, kylančią patekus į naują aplinką.
                           
                        
                     Gyvūnų laikymas
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Bandomųjų gyvūnų laikymo patalpos temperatūra turėtų būti 22 ± 3 °C. Tinkamiausias santykinis drėgnis – 30–70 %, bet jis gali būti nepasiekiamas, jeigu naudojamas nešiklis yra vanduo. Prieš dozės davimą ir davus dozę gyvūnai turėtų būti laikomi narveliuose suskirstyti grupėmis pagal lytį ir koncentraciją; narvelyje laikomų gyvūnų skaičius turėtų būti toks, kad būtų galima aiškiai stebėti kiekvieną gyvūną ir kad būtų patiriama kuo mažiau žalos dėl kanibalizmo ir grumtynių. Jeigu dozė gyvūnams duodama tik per nosį, gali reikėti juos pripratinti prie uždaromųjų vamzdelių. Uždaromieji vamzdeliai gyvūnams neturėtų kelti didelės fizinės, terminės arba suvaržymo įtampos. Varžymas gali turėti fiziologinių pasekmių, pvz., turėti poveikio kūno temperatūrai (hipertermija) ir (arba) per minutę įkvepiamam tūriui. Jeigu yra bendrųjų duomenų, rodančių, kad tokių pastebimų pokyčių neįvyksta, pripratinimas prie uždaromųjų vamzdelių nebūtinas. Gyvūnai, kurių visas kūnas veikiamas aerozoliu, poveikio laikotarpiu turėtų būti laikomi atskirai, kad bandomasis aerozolis nebūtų filtruojamas per kitų narvelyje esančių gyvūnų kailį. Išskyrus poveikio laikotarpį, gyvūnams šerti tinka įprastas ir sertifikuotas laboratorijose naudojamas pašaras, duodant neribotą geriamo vandens kiekį. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką.
                           
                        
                     Inhaliacinės kameros
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Parenkant inhaliacinę kamerą, turėtų būti atsižvelgiama į bandomosios cheminės medžiagos pobūdį ir bandymo tikslą. Pirmenybė teikiama dozės davimui tik per nosį (ši sąvoka apima sąvokas „tik per galvą“, „tik per nosį“ ir „tik per šnipą“). Pirmenybė dozės davimui tik per nosį paprastai teikiama tiriant skystųjų arba kietųjų dalelių aerozolius ir garus, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Specialieji tyrimo tikslai gali būti sėkmingiau pasiekti taikant poveikio per visą kūną metodą, tačiau tai turi būti pagrįsta tyrimo ataskaitoje. Siekiant užtikrinti atmosferos pastovumą naudojant poveikio per visą kūną kamerą, visa bandomųjų gyvūnų užimama erdvė turėtų neviršyti 5 % kameros tūrio. Poveikio tik per nosį ir poveikio per visą kūną metodų principai ir konkretūs šių metodų privalumai bei trūkumai aprašyti RD Nr. 39 (8).
                           
                        POVEIKIO SĄLYGOS
                  
                     Koncentracijų taikymas
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Rekomenduojama taikyti pastovų keturių valandų poveikio laikotarpį, neskaitant pusiausvirinimo laikotarpio. Siekiant užtikrinti specialiųjų reikalavimų laikymąsi gali būti taikomos kitokios trukmės, tačiau tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateiktas jų pagrindimas [žr. RD Nr. 39 (8)]. Gyvūnai, kurie veikiami poveikio per visą kūną kamerose, turėtų būti laikomi atskirai, kad kiti viename narvelyje laikomi gyvūnai laižydami nenurytų bandomosios cheminės medžiagos. Poveikio metu gyvūnas neturėtų būti šeriamas. Vandens gali būti duodama per visą poveikio per visą kūną laikotarpį.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga dujų, garų, aerozolių arba jų mišinių pavidalu. Per tyrimą naudotina fizinė būsena priklauso nuo fizinių ir cheminių bandomosios cheminės medžiagos savybių, pasirinktos koncentracijos ir (arba) fizinio pavidalo, kuris veikiausiai bus tvarkant ir naudojant bandomąją cheminę medžiagą. Higroskopinės ir chemiškai reaguojančios bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti bandomos sauso oro sąlygomis. Turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad būtų išvengta sprogių koncentracijų susidarymo.
                           
                        
                     Dalelių dydžio pasiskirstymas
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Dalelių rūšiavimas pagal dydį turėtų būti taikomas visiems aerozoliams ir garams, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Kad poveikis būtų padarytas visoms svarbioms kvėpavimo takų sritims, rekomenduojama naudoti aerozolius, kurių masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) yra 1–4 μm, o geometrinis standartinis nuokrypis (σg) – 1,5–3,0 (8) (13) (14). Nors turėtų būti imamasi pagrįstų priemonių, kad šio standarto būtų laikomasi, jeigu jo įgyvendinti neįmanoma, turėtų būti pateikta ekspertų nuomonė. Pvz., metalų garai gali būti mažesni už šį standartą, o įelektrintos dalelės, pluoštai ir higroskopinės medžiagos (dydžiui didėjant drėgnoje kvėpavimo takų aplinkoje) gali viršyti šį standartą.
                           
                        
                     Bandomosios cheminės medžiagos paruošimas nešiklyje
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Siekiant užtikrinti reikiamą bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją ir dalelių dydį atmosferoje, gali būti naudojamas nešiklis. Paprastai pirmenybė teikiama vandeniui. Siekiant užtikrinti reikiamą dalelių dydžio pasiskirstymą, iš dalelių sudaryta medžiaga gali būti apdorojama mechaniškai, tačiau turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad bandomoji medžiaga nebūtų suskaidyta arba kad būtų pakeistos jos savybės. Kai manoma, kad mechaniškai apdorojus bandomąją cheminę medžiagą pasikeitė jos cheminė sudėtis (pvz., dėl labai aukštos temperatūros, susidariusios dėl trinties pernelyg stipriai malant), bandomosios cheminės medžiagos sudėtis turėtų būti patikrinta analizės būdu. Turėtų būti imamasi tinkamų atsargumo priemonių, kad bandomoji cheminė medžiaga nebūtų užteršta. Nebūtina tikrinti netrapių granuliuotų medžiagų, kurios specialiai paruoštos taip, kad jų nebūtų galima įkvėpti. Turėtų būti atliekamas trynimo bandymas, skirtas įrodyti, kad tvarkant granuliuotą medžiagą nesusidaro įkvepiamų dalelių. Jeigu atliekant trynimo bandymą susidaro įkvepiamų dalelių, turėtų būti atliekamas toksiškumo įkvėpus bandymas.
                           
                        
                     Kontroliniai gyvūnai
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Vienalaikės neigiamos kontrolės (naudojant orą) grupė nebūtina. Jeigu bandymo atmosferos sukūrimo tikslais naudojamas nešiklis nėra vanduo, nešiklio kontrolinė grupė turėtų būti naudojama tik tuo atveju, jeigu nėra istorinių toksiškumo įkvėpus duomenų. Jeigu atlikus nešiklyje paruoštos bandomosios cheminės medžiagos toksiškumo tyrimą nustatoma, kad medžiaga nėra toksiška, vadinasi, ir nešiklis, esant ištirtai koncentracijai, nėra toksiškas; taigi nešiklio kontrolė nebūtina.
                           
                        POVEIKIO SĄLYGŲ STEBĖJIMAS
                  
                     Oro srautas kameroje
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Kiekvieno poveikio metu turėtų būti atidžiai reguliuojamas, nuolat stebimas ir ne rečiau kaip kartą per valandą registruojamas per kamerą tekantis oro srautas. Bandymo atmosferoje susidariusios koncentracijos (arba jos pastovumo) stebėjimas yra vienas iš visų dinaminių parametrų matavimų, suteikiantis galimybę netiesiogiai kontroliuoti visus svarbius dinaminius atmosferos kūrimo parametrus. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tam, kad būtų išvengta pakartotinio įkvėpimo dozės davimo tik per nosį kamerose, kai per poveikio sistemą tekantis oro srautas yra nepakankamas užtikrinti dinaminį bandomosios cheminės medžiagos atmosferos srautą. Yra nustatyti metodai, kurie gali būti taikomi norint įrodyti, kad pasirinktomis veikimo sąlygomis neįvyksta pakartotinio įkvėpimo (8) (15). Deguonies koncentracija turėtų būti ne mažesnė kaip 19 %, anglies dioksido – ne didesnė kaip 1 %. Jeigu yra pagrindo manyti, kad šių standartų įgyvendinti neįmanoma, turėtų būti matuojamos deguonies ir anglies dioksido koncentracijos.
                           
                        
                     Kameros temperatūra ir santykinis drėgnis
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Kameroje turėtų būti palaikoma 22 ± 3 °C temperatūra. Tiek dozę duodant tik per nosį, tiek veikiant visą kūną, santykinis drėgnis turėtų būti stebimas ir registruojamas ne mažiau kaip tris kartus, kai poveikio trukmė keturios valandos, ir kas valandą, kai poveikio trukmė mažesnė. Tinkamiausias santykinis drėgnis – 30–70 %, tačiau jis gali būti nepasiekiamas (pvz., bandant vandens pagrindo mišinius) arba neišmatuojamas dėl trukdžių, atsirandančių bandomajai cheminei medžiagai taikant bandymo metodą.
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga. Vardinė koncentracija
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Jeigu įmanoma, turėtų būti apskaičiuota ir užregistruota vardinė koncentracija poveikio kameroje. Vardinė koncentracija yra sukurtos bandomosios cheminės medžiagos masės ir viso oro srauto, perleisto per kamerų sistemą, tūrio santykis. Vardinė koncentracija nėra naudojama apibūdinti poveikį gyvūnui, tačiau, vardinę koncentraciją palyginus su faktine, nustatomas generavimo, kurį užtikrina bandymų sistema, efektyvumas, kuriuo remiantis galima nustatyti generavimo problemas.
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga. Faktinė koncentracija
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Faktinė koncentracija yra bandomosios cheminės medžiagos koncentracija inhaliacinės kameros gyvūno kvėpavimo zonoje. Faktines koncentracijas galima nustatyti specialiaisiais metodais (pvz., taikant tiesioginio ėminių ėmimo, adsorbcijos arba cheminių reakcijų metodus ir tada atliekant analizinį apibūdinimą) arba nespecialiaisiais metodais, pvz., atliekant gravimetrinę analizę naudojant filtrus. Gravimetrinė analizė gali būti taikoma tik vienos sudedamosios dalies miltelių aerozoliams arba mažo lakumo skystųjų dalelių aerozoliams ir turėtų būti grindžiama tinkamais prieš tyrimą atliktais bandomosios cheminės medžiagos savybių apibūdinimais. Iš daugiau kaip vienos sudedamosios dalies sudarytų miltelių aerozolių koncentracijos taip pat gali būti nustatomos atliekant gravimetrinę analizę. Tačiau tam reikalingi analitiniai duomenys, įrodantys, kad ore esančios medžiagos sudėtis panaši į pirminės medžiagos sudėtį. Jeigu tokios informacijos nėra, tyrimo metu gali reikėti vienodais intervalais atlikti pakartotinę bandomosios cheminės medžiagos (geriausia, kad ji būtų ore) analizę. Jeigu aerozolinės medžiagos gali garuoti arba sublimuoti, turėtų būti įrodyta, kad pasirinktu metodu surinktos visos fazės. Tyrimo ataskaitoje turėtų būti nurodytos tikslinės, vardinės ir faktinės koncentracijos, tačiau atliekant statistinę analizę, skirtą apskaičiuoti mirtinas koncentracijos vertes, naudojamos tik faktinės koncentracijos.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Jeigu įmanoma, turėtų būti naudojama viena bandomosios cheminės medžiagos partija, o bandomasis ėminys turėtų būti laikomas tokiomis sąlygomis, kad būtų išsaugotas jo grynumas, homogeniškumas ir stabilumas. Prieš pradedant tyrimą reikėtų apibūdinti bandomosios cheminės medžiagos savybes, įskaitant jos grynumą ir, jeigu tai techniškai įmanoma, tapatumą, taip pat nustatytų teršalų ir priemaišų kiekius. Be kitų duomenų, tai galima pagrįsti šiais duomenimis: sulaikymo trukme ir susijusia didžiausios koncentracijos sritimi, molekuline mase, nustatyta atlikus spektroskopinę arba dujų chromatografijos analizę, arba kitais įverčiais. Nors bandomojo ėminio tapatumo nustatymas nėra bandymų laboratorijos pareiga, bandymų laboratorijai gali būti naudinga patvirtinti bent kai kurias pateikėjo nurodytas savybes (pvz., spalvą, fizinę būseną ir t. t.).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Poveikio atmosfera turėtų būti kaip įmanoma pastovesnė ir turėtų būti stebima nuolat ir (arba) su pertraukomis, atsižvelgiant į analizės metodą. Jeigu ėminiai imami su pertraukomis, per keturių valandų tyrimą kameros atmosferos ėminiai turėtų būti imami ne mažiau kaip du kartus. Jeigu tai neįmanoma dėl nedidelių oro srauto greičių arba mažų koncentracijų, gali būti imamas vienas ėminys per visą poveikio laikotarpį. Jeigu ėminiai pastebimai skiriasi, tiriant kitas koncentracijas per poveikio laikotarpį turėtų būti imami keturi ėminiai. Atskiri kameroje susidariusios koncentracijos ėminiai neturėtų nukrypti nuo vidutinės kameroje susidariusios koncentracijos daugiau kaip ± 10 %, kai tiriamos dujos ir garai, arba daugiau kaip ± 20 %, kai tiriami skystųjų arba kietųjų dalelių aerozoliai. Turėtų būti apskaičiuotas ir užregistruotas pusiausvyros nusistovėjimo kameroje laikotarpis (t95). Į poveikio trukmę įtraukiamas laikas, per kurį susidaro bandomoji cheminė medžiaga, ir atsižvelgiama į laiką, kurio reikia, kad būtų pasiekta t95. t95 apskaičiavimo gairės pateiktos RD Nr. 39 (8).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Jeigu tiriami labai sudėtingi mišiniai, sudaryti iš garų ir (arba) dujų, ir aerozoliai (pvz., deginimo atmosferos ir bandomosios cheminės medžiagos, pučiamos iš specialiai varomų galutinio naudojimo produktų arba prietaisų), kiekvienos fazės veikimas inhaliacinėje kameroje gali būti skirtingas, todėl iš kiekvienos fazės (garų ir (arba) dujų ir aerozolio) turėtų būti parinkta bent viena indikacinė cheminė medžiaga (analitė); paprastai šiuo tikslu pasirenkama pagrindinė veiklioji mišinio cheminė medžiaga. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga yra mišinys, turėtų būti nurodyta viso mišinio, o ne tik veikliosios sudedamosios dalies (analitės) analizinė koncentracija. Daugiau informacijos apie faktines koncentracijas pateikta RD Nr. 39 (8).
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga. Dalelių dydžio pasiskirstymas
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Aerozolių dalelių dydžio pasiskirstymas turėtų būti nustatomas bent kartą per kiekvieną keturių valandų trukmės poveikio laikotarpį naudojant pakopinį ėmiklį arba alternatyvų prietaisą, pvz., aerodinaminį dalelių rūšiuotuvą. Jeigu galima įrodyti, kad pakopiniu ėmikliu arba alternatyviu prietaisu gaunami lygiaverčiai rezultatai, atliekant tyrimą gali būti naudojamas alternatyvus prietaisas. Siekiant įsitikinti pagrindinio prietaiso surenkamuoju veiksmingumu, kartu su pagrindiniu prietaisu turėtų būti naudojamas antrasis prietaisas, pvz., gravimetrinis filtras, gaudyklė arba barboteris. Atlikus dalelių dydžio analizę nustatyta masės koncentracija turėtų neviršyti priimtinų filtruojamosios analizės būdu nustatytos masės koncentracijos ribų [žr. RD Nr. 39 (8)]. Jeigu lygiavertiškumą galima įrodyti pradiniame tyrimo etape, tolesnius patvirtinamuosius matavimus galima praleisti. Gyvūnų gerovės sumetimais turėtų būti imamasi priemonių, kad būtų kuo mažiau negalutinių duomenų, dėl kurių galėtų reikėti pakartoti poveikį. Garuose esančios dalelės turėtų būti rūšiuojamos tuo atveju, jeigu bent kiek tikėtina, kad susidarant aerozoliui gali kondensuotis garai, arba jeigu garų atmosferoje aptinkama dalelių, dėl kurių gali susidaryti mišrių fazių (žr. 14 skirsnį).
                           
                        PROCEDŪRA
                  
                     Pagrindinis bandymas
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Kiekvienam lygiui naudojama po tris kiekvienos lyties gyvūnus arba po šešis jautresniosios lyties gyvūnus. Jeigu naudojant kitos rūšies graužikus nei žiurkės dozė duodama tik per nosį, ilgiausia poveikio trukmė gali būti pakoreguojama siekiant sumažinti tos rūšies gyvūnų patiriamą kančią. Pradinei dozei taikytina koncentracija parenkama kaip vienas iš keturių nustatytųjų lygių: pradinis koncentracijos lygis turėtų būti toks, kuris, tikėtina, sukels toksiškumą kai kuriems dozę gaunantiems gyvūnams. Pagal dujoms, garams ir aerozoliams (nurodytiems 2–4 priedėliuose) skirtas bandymų schemas bandymai turėtų būti atliekami taikant ribines CLP 1–4 kategorijų vertes (9), nustatytas dujoms (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) (2 priedėlis), garams (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 h) (3 priedėlis) ir aerozoliams (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4h) (4 priedėlis). 5 kategorija, kuri nėra reglamentuojama Reglamentu (EB) Nr. 1272/2008 (9), yra susijusi su koncentracijomis, viršijančiomis atitinkamas ribines koncentracijas. Kiekvienai pradinei koncentracijai taikoma atitinkama bandymų schema. Atsižvelgiant į humaniškai numarintų arba nugaišusių gyvūnų skaičių, bandymo procedūra vykdoma vadovaujantis pateiktomis rodyklėmis, kol nebus galima nustatyti kategorijos.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Laiko tarpas tarp dozių davimo grupėms nustatomas atsižvelgiant į toksiškumo požymių atsiradimo laiką, trukmę ir sunkumą. Kito koncentracijos lygio dozės davimas gyvūnams nukeliamas iki to laiko, kai bus pagrįstai įsitikinta, kad pirmiau bandytieji gyvūnai išgyveno. Rekomenduojamas uždelsto toksiškumo stebėjimo laikotarpis tarp kiekvieno koncentracijos lygio dozių davimo – trys arba keturios paros. Prireikus, pvz., reakcijos be traukulių atveju, laiko tarpas gali būti koreguojamas.
                           
                        
                     Ribinis bandymas
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Ribinis bandymas atliekamas tada, kai bandomoji cheminė medžiaga yra nežinoma arba kai manoma, kad ji iš esmės netoksiška, t. y. sukelianti toksinį poveikį tik taikant didesnę nei norminę koncentraciją. Informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą galima gauti remiantis žiniomis apie panašias bandytas chemines medžiagas arba panašius mišinius, atsižvelgiant į toksikologinės reikšmės turinčių sudedamųjų dalių tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos išvis nėra arba kai numanoma, kad bandomoji cheminė medžiaga yra toksiška, turėtų būti atliekamas pagrindinis bandymas [daugiau rekomendacijų pateikta RD Nr. 39 (8)].
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Taikant įprastą procedūrą, po tris kiekvienos lyties gyvūnus arba šeši jautresniosios lyties gyvūnai veikiami 20 000 ppm koncentracija, jeigu tai dujos, 20 mg/l koncentracija, jeigu tai garai, 5 mg/l koncentracija, jeigu tai dulkių ir (arba) miglos tipo medžiagos (jeigu tokios koncentracijos pasiekiamos); ši procedūra taikoma kaip šiam bandymo metodui skirtas ribinis bandymas. Atliekant aerozolių bandymus, pirmiausia turėtų būti siekiama užtikrinti įkvepiamą dalelių dydį (t. y. MMAS turėtų būti 1–4 μm). Daugelio bandomųjų cheminių medžiagų atveju tai įmanoma pasiekti, kai koncentracija yra 2 mg/l. Atlikti aerozolių bandymus taikant didesnę kaip 2 mg/l koncentraciją turėtų būti mėginama tik tuo atveju, jeigu įmanoma pasiekti įkvepiamą dalelių dydį [žr. RD Nr. 39 (8)]. Pagal GHS (16) gyvūnų gerovės sumetimais rekomenduojama neatlikti bandymų viršijant ribinę koncentraciją. Galimybė atlikti GHS 5 kategorijos (16), kuri nėra reglamentuojama Reglamentu (EB) Nr. 1272/2008 (9), medžiagų bandymus turėtų būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu labai tikėtina, kad tokio bandymo rezultatai turės tiesioginės reikšmės žmonių sveikatos apsaugai; tokiu atveju tyrimo ataskaitoje pateikiamas pagrindimas. Tiriant potencialiai sprogias bandomąsias chemines medžiagas turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad nesusidarytų sprogimui palankių sąlygų. Siekiant išvengti nebūtino gyvūnų naudojimo, prieš ribinį bandymą turėtų būti atliktas atskiras bandymas be gyvūnų, siekiant įsitikinti, ar įmanoma pasiekti ribiniam bandymui reikalingas kameros sąlygas.
                           
                        STEBĖJIMAI
                  
                              29.
                           
                           
                              Poveikio laikotarpiu turėtų būti dažnai atliekami klinikiniai gyvūnų stebėjimai. Baigus duoti dozę, dozės davimo dieną klinikiniai stebėjimai turėtų būti atliekami bent du kartus arba daugiau, atsižvelgiant į gyvūnų reakciją į gautą dozę, o vėliau – bent kartą per parą, iš viso stebint 14 dienų. Tikslios stebėjimų laikotarpio trukmės nenustatoma; ji turėtų būti parenkama atsižvelgiant į klinikinių požymių atsiradimo laiką ir gyvūnų atsigavimo laikotarpio trukmę. Svarbu atkreipti dėmesį į toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo laiką, ypač jeigu toksiškumo požymių atsiranda tik po tam tikro laiko. Visi stebėjimai sistemingai registruojami, išsaugant atskirus įrašus apie kiekvieną gyvūną. Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus ir (arba) kuriems pasireiškia ilgalaikių sunkios kančios požymių, gyvūnų gerovės sumetimais turėtų būti humaniškai numarinami. Atliekant klinikinių toksiškumo požymių tyrimus, turėtų būti imamasi atsargumo priemonių, kad prasta pradinė išvaizda ir trumpalaikiai kvėpavimo takų pakitimai, atsiradę dėl poveikio procedūros, nebūtų palaikyti dozės davimo poveikiu. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus Rekomendaciniame dokumente dėl pasekmių žmonėms (7). Kai gyvūnai numarinami dėl humaniškų priežasčių arba randami nugaišę, kiek įmanoma tiksliau užregistruojamas žūties laikas.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Narveliuose turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir gleivinės pakitimai, taip pat kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgsenos pakitimai. Jeigu įmanoma, turėtų būti išskirti vietinis ir sisteminis poveikiai. Ypač reikėtų stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Matuojant temperatūrą tiesiojoje žarnoje, galima gauti patvirtinamųjų sulėtėjusio kvėpavimo arba nukritusios ar pakilusios temperatūros įrodymų, susijusių su dozės davimu arba izoliavimu.
                           
                        
                     Kūno masė
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Kiekvieno gyvūno masė turėtų būti vieną kartą užregistruojama pratinimo laikotarpiu, tada poveikio dieną dar nedavus dozės (nulinė diena) ir bent pirmąją, trečiąją ir septintąją dienomis (o vėliau – kas savaitę), taip pat žūties arba numarinimo metu, jeigu tai įvyksta po pirmosios dienos. Kūno masė yra labai svarbus toksiškumo gyvūnams rodiklis, todėl gyvūnai, kurių masė, palyginti su vertėmis, gautomis prieš tyrimą, nukrenta 20 % arba daugiau, turėtų būti atidžiai stebimi. Pasibaigus poveikio pasekmių stebėjimo laikotarpiui, išgyvenę gyvūnai pasveriami ir humaniškai numarinami.
                           
                        
                     Patologija
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Visiems bandomiesiems gyvūnams, įskaitant nugaišusius atliekant bandymą arba numarintus ir pašalintus iš tyrimo gyvūnų gerovės sumetimais, daromas bendrasis skrodimas. Jeigu skrodimo negalima atlikti iš karto po to, kai aptinkamas nugaišęs gyvūnas, gyvūnas turėtų būti laikomas pakankamai šaltoje vietoje (bet neužšaldomas), siekiant kuo labiau pristabdyti autolizę. Skrodimai turėtų būti atliekamai kaip galima anksčiau, paprastai – per dieną arba dvi. Visi dideli patologiniai pakitimai turėtų būti užregistruojami pagal kiekvieną gyvūną, ypatingą dėmesį skiriant kvėpavimo takų pakitimams.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Norint padidinti tyrimo aiškinamąją reikšmę, gali būti atliekamos papildomos apžiūros, iš anksto numatytos pagal tyrimo planą, pvz., išgyvenusių žiurkių plaučių svėrimas ir (arba) dirginimo įrodymų gavimas atliekant kvėpavimo takų apžiūrą mikroskopu. Taip pat gali būti tiriami organai, turintys didelės 24 valandas arba ilgiau išgyvenusių gyvūnų patologijos požymių, arba organai, apie kuriuos žinoma arba dėl kurių manoma, kad jiems buvo pakenkta. Mikroskopu apžiūrėjus visus kvėpavimo takus, galima gauti naudingos informacijos apie bandomąsias chemines medžiagas, kurios reaguoja su vandeniu, pvz., rūgštis ir higroskopines bandomąsias chemines medžiagas.
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITOS
                  
                     Duomenys
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Turėtų būti pateikti kiekvieno gyvūno masės duomenys ir skrodimo išvados. Klinikinių stebėjimų duomenys turėtų būti apibendrinti lentelėse, pagal kiekvieną bandomąją grupę nurodant naudotų gyvūnų skaičių, gyvūnų, kuriems pasireiškė toksiškumo požymių, skaičių, atliekant bandymą nugaišusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičių, kiekvieno gyvūno žūties laiką, taip pat pateikiant toksinio poveikio aprašymą, pasireiškimo laiką ir grįžtamumą, skrodimo išvadas.
                           
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikta tokia informacija (jeigu taikytina):
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomieji gyvūnai ir jų laikymas:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      laikymo sąlygų aprašymas, nurodant gyvūnų skaičių narvelyje (arba skaičiaus pokytį), kraiko medžiagą, aplinkos temperatūrą ir santykinį drėgnį, šviesos ir tamsos kaitą paros metu ir šėrimo režimą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudota rūšis (padermė) ir, jeigu tai ne žiurkės, kitos rūšies naudojimo pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      atsitiktinės atrankos metodas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą arba šaltinį, vandens šaltinį),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prieš bandymą sudarytų sąlygų aprašymas, nurodant šėrimo režimą, izoliavimo ir apsaugos nuo ligų būdą.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizinė būsena, grynumas ir, jeigu taikytina, fizinės ir cheminės savybės (įskaitant izomeriją),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikavimo duomenys ir Cheminių medžiagų santrumpų tarnybos (angl. CAS) registracijos numeris, jeigu jis žinomas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nešiklis:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nešiklio naudojimo pagrindimas ir nešiklio parinkimo pagrindimas (jeigu tai ne vanduo),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      istoriniai arba vienalaikiai duomenys, įrodantys, kad nešiklis nedaro neigiamo poveikio tyrimo rezultatams.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Inhaliacinė kamera:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inhaliacinės kameros aprašas, nurodant matmenis ir tūrį,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      įrangos, naudotos darant poveikį gyvūnams ir kuriant atmosferą, šaltinis ir aprašas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      temperatūros, drėgnio, dalelių dydžio ir faktinės koncentracijos matavimo įranga,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oro šaltinis, tiekiamo ir (arba) ištraukiamo oro apdorojimas ir kondicionavimo sistema,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      įrangos kalibravimo siekiant užtikrinti homogenišką bandymo atmosferą metodai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      slėgių skirtumas (teigiamas ar neigiamas),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kameroje esančios dozės davimo angos (jeigu dozė duodama tik per nosį); gyvūnų vieta sistemoje (jeigu dozė duodama per visą kūną),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandymo atmosferos laikinas homogeniškumas ir (arba) pastovumas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      temperatūros ir drėgnio jutiklių vieta ir kameroje sukurtos bandymo atmosferos ėminių ėmimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oro srauto greičiai, per dozės davimo angą tekančio oro srauto greitis (jeigu dozė duodama tik per nosį) arba gyvūnų kiekis kameroje (jeigu dozė duodama per visą kūną),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informacija apie deguonies ir anglies dioksido kiekio matavimo įrangą, jeigu tokia naudota,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inhaliacinės kameros pusiausvyros pasiekimo laikas (t95),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tūrio pokyčių kiekis per valandą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      matavimo prietaisai (jeigu naudojami).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Poveikio duomenys:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tikslinės koncentracijos parinkimo pagrindiniam tyrimui pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vardinės koncentracijos (inhaliacinėje kameroje sukurtos bandomosios cheminės medžiagos bendrosios masės ir viso per kamerą perleisto oro srauto tūrio santykis),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      faktinės bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, nustatytos gyvūnų kvėpavimo zonoje; jeigu bandomi mišiniai, įgaunantys įvairias fizines būsenas (dujos, garai, aerozoliai), kiekviena iš šių būsenų gali būti analizuojama atskirai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      visos koncentracijos ore turėtų būti nurodomos masės vienetais (pvz., mg/l, mg/m3 ir t. t.); skliaustuose taip pat gali būti nurodoma tūrio vienetais (pvz., ppm, ppb),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dalelių dydžio pasiskirstymas, masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) ir geometrinis standartinis nuokrypis (σg), nurodant jų apskaičiavimo metodus. Turėtų būti nurodytos atliktos atskiros dalelių dydžio analizės.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos paruošimą, nurodant procedūras, taikytas siekiant sumažinti kietųjų cheminių medžiagų dalelių dydį arba paruošti bandomosios cheminės medžiagos tirpalus. Jeigu mechaniniais procesais galėjo būti pakeista bandomosios cheminės medžiagos sudėtis, pateikite bandomosios cheminės medžiagos sudėties patikros analizių rezultatus,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      įrangos, naudotos kuriant bandymo atmosferą ir veikiant gyvūnus bandymo atmosfera, aprašas (pageidautina, pateikiant diagramą),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie taikytą cheminės analizės metodą ir metodo tinkamumo patvirtinimą (nurodant bandomosios cheminės medžiagos regeneravimo iš ėminių ėmimo terpės veiksmingumą),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandomųjų koncentracijų parinkimo pagrindimas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatai:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kameros temperatūrų, drėgnio ir oro srautų lentelės,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kameros vardinės ir faktinės koncentracijos duomenų lentelės,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dalelių dydžių lentelės, pateikiant analizinių ėminių ėmimo duomenis, dalelių dydžių pasiskirstymą ir MMAS bei σg skaičiavimus,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kiekvieno gyvūno reakcijos duomenų ir jam taikyto koncentracijos lygio lentelės (t. y. gyvūnų, kuriems pasireiškė toksiškumo požymių, nurodant gaištamumą, poveikio pobūdį, sunkumą ir trukmę),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kiekvieno gyvūno masė, nustatyta tyrimo dienomis; žūties data ir laikas, jeigu gyvūnas nugaišo dar prieš numatytą numarinimą; toksiškumo požymių atsiradimo laikas ir ar šių požymių pasireiškimas kiekvieno gyvūno atveju buvo grįžtamasis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kiekvieno gyvūno skrodimo išvados ir histopatologinių tyrimų rezultatai, jeigu yra,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kategorija pagal CLP klasifikaciją ir LC50 ribinė vertė.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatų aptarimas ir aiškinimas
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas metodų, taikytų siekiant laikytis šio bandymo metodo kriterijų, pvz., susijusių su ribine koncentracija arba dalelių dydžiu, aprašymui,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      atsižvelgiant į bendruosius rezultatus, turėtų būti aprašyta dalelių įkvėpimo galimybė, ypač jeigu nebuvo įmanoma taikyti dalelių dydžio kriterijaus,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pateikiant bendrąjį tyrimo vertinimą, turėtų būti nurodytas metodų, taikytų nustatyti vardines ir faktines koncentracijas, nuoseklumas ir faktinės koncentracijos santykis su vardine koncentracija,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      turėtų būti aprašyta tikėtina žūties priežastis ir vyraujantis veikimo būdas (sisteminis ar vietinis),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      atsižvelgiant į OECD rekomendaciniame dokumente dėl pasekmių žmonėms (7) nustatytus kriterijus, turėtų būti pateiktas paaiškinimas, ar kilo poreikis humaniškai numarinti gyvūnus, patiriančius skausmą arba sunkią ilgalaikę kančią.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Šio priedo B.2 skyrius. Ūmus toksiškumas įkvėpus.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243–254.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537–549.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129–134.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Šio priedo B.1 tris skyrius. Ūmus toksiškumas per virškinamąjį traktą. Ūmaus toksiškumo klasės nustatymo metodas.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies keičiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006, OL L 353, 2008 12 31, p. 1.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Šio priedo B.40 skyrius. Odos ėsdinimas in vitro. Odos sluoksnio elektrinės varžos (OSEV) bandymas.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Šio priedo B.40 bis skyrius. Odos ėsdinimas in vitro. Žmogaus odos modelio bandymas.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160–167
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Available: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html]
                           
                        
                     1 priedėlis
                     APIBRĖŽTIS
                     Bandomoji cheminė medžiaga– naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga arba mišinys.
                  
                  
                     2 priedėlis
                     
                        Procedūra, atliktina taikant kiekvieną pradinę dujų koncentraciją (ppm/4 h)
                     
                     Bendros pastabos (12)
                     
                     Šiame priede kiekvienai pradinei koncentracijai pateiktos atitinkamos bandymų schemos, kuriomis nurodytos taikytinos procedūros.
                     2a priedėlis. Pradinė koncentracija – 100 ppm.
                     2b priedėlis. Pradinė koncentracija – 500 ppm.
                     2c priedėlis. Pradinė koncentracija – 2 500 ppm.
                     2d priedėlis. Pradinė koncentracija – 20 000 ppm.
                     Atsižvelgiant į humaniškai numarintų arba nugaišusių gyvūnų skaičių, bandymų procedūra vykdoma vadovaujantis pateiktomis rodyklėmis.
                  
                  
                     2a priedėlis
                     
                        Ūmus inhaliacinis toksiškumas.
                     
                     
                        Bandymų procedūra taikant pradinę 100 ppm/4 h dujų koncentraciją
                     
                     
                        
                  
                  
                     2b priedėlis
                     
                        Ūmus inhaliacinis toksiškumas.
                     
                     
                        Bandymų procedūra taikant pradinę 500 ppm/4 h dujų koncentraciją
                     
                     
                        
                  
                  
                     2c priedėlis
                     
                        Ūmus inhaliacinis toksiškumas.
                     
                     
                        Bandymų procedūra taikant pradinę 2 500 ppm/4 h dujų koncentraciją
                     
                     
                        
                  
                  
                     2d priedėlis
                     
                        Ūmus inhaliacinis toksiškumas.
                     
                     
                        Bandymų procedūra taikant pradinę 20 000 ppm/4 h dujų koncentraciją
                     
                     
                        
                  
                  
                     3 priedėlis
                     
                        Procedūra, atliktina taikant kiekvieną pradinę garų koncentraciją (mgl/l/4 h)
                     
                     Bendros pastabos (13)
                     
                     Šiame priede kiekvienai pradinei koncentracijai pateiktos atitinkamos bandymų schemos, kuriomis nurodytos taikytinos procedūros.
                     3a priedėlis. Pradinė koncentracija – 0,5 mg/l.
                     3b priedėlis. Pradinė koncentracija – 2,0 mg/l.
                     3c priedėlis. Pradinė koncentracija – 10 mg/l.
                     3d priedėlis. Pradinė koncentracija – 20 mg/l.
                     Atsižvelgiant į humaniškai numarintų arba nugaišusių gyvūnų skaičių, bandymų procedūra vykdoma vadovaujantis pateiktomis rodyklėmis.
                  
                  
                     3a priedėlis
                     
                        Ūmus inhaliacinis toksiškumas.
                     
                     
                        Bandymų procedūra taikant pradinę 0,5 mg/l/4 h garų koncentraciją
                     
                     
                        
                  
                  
                     3b priedėlis
                     
                        Ūmus inhaliacinis toksiškumas.
                     
                     
                        Bandymų procedūra taikant pradinę 2 mg/l/4 h garų koncentraciją
                     
                     
                        
                  
                  
                     3c priedėlis
                     
                        Ūmus inhaliacinis toksiškumas.
                     
                     
                        Bandymų procedūra taikant pradinę 10 mg/l/4 h garų koncentraciją
                     
                     
                        
                  
                  
                     3d priedėlis
                     
                        Ūmus inhaliacinis toksiškumas.
                     
                     
                        Bandymų procedūra taikant pradinę 20 mg/l/4 h garų koncentraciją
                     
                     
                        
                  
                  
                     4 priedėlis
                     
                        Procedūra, atliktina taikant kiekvieną pradinę aerozolių koncentraciją (mgl/l/4 h)
                     
                     Bendros pastabos (14)
                     
                     Šiame priede kiekvienai pradinei koncentracijai pateiktos atitinkamos bandymų schemos, kuriomis nurodytos taikytinos procedūros.
                     4a priedėlis. Pradinė koncentracija – 0,05 mg/l.
                     4b priedėlis. Pradinė koncentracija – 0,5 mg/l.
                     4c priedėlis. Pradinė koncentracija – 1 mg/l.
                     4d priedėlis. Pradinė koncentracija – 5 mg/l.
                     Atsižvelgiant į humaniškai numarintų arba nugaišusių gyvūnų skaičių, bandymų procedūra vykdoma vadovaujantis pateiktomis rodyklėmis.
                  
                  
                     4a priedėlis
                     
                        Ūmus inhaliacinis toksiškumas.
                     
                     
                        Bandymų procedūra taikant pradinę 0,05 mg/l/4 h garų koncentraciją
                     
                     
                        
                  
                  
                     4b priedėlis
                     
                        Ūmus inhaliacinis toksiškumas.
                     
                     
                        Bandymų procedūra taikant pradinę 0,5 mg/l/4 h aerozolių koncentraciją
                     
                     
                        
                  
                  
                     4c priedėlis
                     
                        Ūmus inhaliacinis toksiškumas.
                     
                     
                        Bandymų procedūra taikant pradinę 1 mg/l/4 h aerozolių koncentraciją
                     
                     
                        
                  
                  
                     4d priedėlis
                     
                        Ūmus inhaliacinis toksiškumas.
                     
                     
                        Bandymų procedūra taikant pradinę 5 mg/l/4 h aerozolių koncentraciją
                     
                     
                        
                  “
            
                  9)
               
               
                  C.10 skyrius keičiamas taip:
                  „C.10.   AEROBINIO NUOTEKŲ TVARKYMO MODELIAVIMO BANDYMAS: C.10-A: VEIKLIOJO DUMBLO AERATORIAI. C.10-B: BIOLOGINĖS PLĖVELĖS
                  
                  
                     C.10-A:   veikliojo dumblo aeratoriai
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires (TG) 303 (2001) (OECD bandymų gairės Nr. 303). XX a. šeštajame dešimtmetyje buvo suprasta, kad pradėtos naudoti naujos paviršinio aktyvumo medžiagos sukelia pernelyg didelę putodarą nuotekų valymo įrenginiuose ir upėse. Šios medžiagos nebuvo nuodugniai pašalinamos taikant aerobinį valymą ir tam tikrais atvejais jos apribodavo organinės medžiagos šalinimą. Todėl buvo atliekami įvairūs tyrimai siekiant nustatyti, kaip paviršinio aktyvumo medžiagas būtų įmanoma pašalinti iš nuotekų, ir ar pramonės pagamintos naujos cheminės medžiagos atitinka nuotekų valymo reikalavimus. Siekiant šių tikslų taikyti pavyzdiniai įrenginiai, atitinkantys dviejų pagrindinių tipų aerobinį biologinį nuotekų valymą (valymas veikliuoju dumblu ir perkoliacija arba filtravimas). Būtų buvę nepatogu ir labai brangu platinti kiekvieną naują cheminę medžiagą ir stebėti didelius valymo įrenginius net vietiniu mastu.
                           
                        PRADINIAI SVARSTYMAI
                  
                     Veikliojo dumblo aeratoriai
                  
                  
                              2.
                           
                           
                              Pateikiamas veikliojo dumblo pavyzdinių įrenginių, kurių dydis yra 300–2 000 ml aprašymas. Kai kurie įrenginiai ganėtinai panašūs į tikrus įrenginius, t. y. jie turi dumblo nusodintuvus, kai dumblas pumpuojamas atgal į aeracijos rezervuarą, o kituose įrenginiuose nėra nusodintuvo, pvz., Swisher (1). Aparatų dydis turi būti kruopščiai pasirenkamas, nes, pirma, aparatas turi būti ganėtinai didelis, kad būtų tinkamas mechaniniam veikimui, ir pakankamai erdvus, kad iš jo būtų galima imti ėminius nepadarant jokio poveikio aparato eksploatavimui, nors, kita vertus, aparatas netūrėtų būti toks didelis, jog jam reikėtų numatyti daug erdvės ir medžiagų.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Plačiausiai ir veiksmingiausiai naudojami dviejų tipų aparatai, t. y. Husmano įrenginiai (2) ir akytųjų indų įrenginiai (3) (4); pirmasis naudojamas tiriant paviršinio aktyvumo medžiagas, kurios aprašytos šiame bandymo metode. Kiti įrenginiai taip pat buvo gana plačiai naudojami, pvz., Eckenfelder (5). Atliekant šį modeliavimo bandymą tenka skirti gana daug lėšų ir gerokai pasistengti, todėl tuo pat metu buvo nagrinėti paprastesni ir pigesni atrankos bandymai (jie pateikiami šio priedo (6) C.4–F skyriuje). Naudojant įvairias paviršinio aktyvumo medžiagas ir kitas chemines medžiagas įrodyta, kad atrankos bandymų reikalavimus atitikusios medžiagos (lengvai biologiškai skaidžios) taip pat buvo suskaidytos atliekant modeliavimo bandymą. Atrankos bandymų reikalavimų neatitikusios kai kurios medžiagos atitiko būdingojo biologinio skaidumo bandymo reikalavimus (šio priedo C.12 (7) ir C.19 (8) skyriai), tačiau tik dalis iš šios grupės medžiagų buvo suskaidytos atliekant modeliavimo bandymą, nors būdingojo biologinio skaidumo bandymo reikalavimų neatitikusios cheminės medžiagos nebuvo suskaidytos atliekant modeliavimo bandymus (9) (10) (11).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Tam tikrais tikslais pakanka vienodomis darbo sąlygomis atliktų modeliavimo bandymų; rezultatai pateikiami kaip procentinė pašalintos cheminės bandomosios cheminės medžiagos arba ištirpusios organinės anglies dalis. Šio bandymo aprašymas pateiktas šiame bandymo metode. Tačiau šiame tekste pateikiama keletas variantų, priešingai negu ankstesnėje šio skyriaus versijoje, kurioje aprašytas sintetinių nuotekų valymas tik vieno tipo aparatūra ir šiam tikslui pasirenkant bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio mikrobų populiacijos suvienodinimo procedūrą bei naudojant ganėtinai apytikslį dumblo nuostolių metodą. Aprašomas alternatyvus aparatūros tipas, sugerties režimas, nuotekos ir dumblo nuostolių pašalinimas. Šis tekstas nuosekliai atitinka standartą ISO 11 733 (12), kuris nuodugniai patikrintas jį rengiant, tačiau metodas nebuvo patikrintas atliekant tarplaboratorinio lyginimo bandymą.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija kitais tikslais nuotekose turi būti žinoma tiksliau ir todėl privaloma rinktis išsamesnį metodą. Pvz., dumblo nuostolių norma turi būti tiksliau kontroliuojama kiekvieną dieną ir bandymo atlikimo laikotarpiu bei įrenginiai naudojami pasirenkant kelias nuostolių normas. Siekiant užtikrinti visa apimantį metodą, atliekant bandymus taip pat turėtų būti naudojamos dvi arba trys skirtingos temperatūros. Šį metodą yra aprašęs Birch (13) (14) ir jo santrauka pateikta 6 priedėlyje. Tačiau dabartinės žinios nėra pakankamos siekiant nustatyti, kuris kinetinis modelis valant nuotekas taikytinas cheminių medžiagų biologiniam skaidumui ir apskritai vandens aplinkoje. 6 priedėlyje kaip pavyzdys nurodytas Mono kinetikos taikymas galioja tik 1 mg/l arba didesnės koncentracijos cheminėms medžiagos, tačiau kai kurių nuomone net šis teiginys turi būti pagrindžiamas. Bandymai naudojant koncentracijas, visapusiškiau atitinkančias nustatomąsias nuotekose, nurodyti 7 priedėlyje, tačiau jie ir pateiktieji 6 priedėlyje yra įtraukti į priedėlius, tačiau jie nėra skelbiami kaip atskirieji bandymo metodai.
                           
                        
                     Filtrai
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Kur kas mažiau dėmesio skiriama pavyzdiniams laistomiesiems reaktoriams; turbūt todėl, kad jie yra gerokai griozdiškesni ir ne tokie kompaktiški, palyginti su veikliojo dumblo įrenginio modeliais. Gerikte ir kt. sukūrė laistomuosius reaktorius ir naudojo juos taikydami bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio mikrobų populiacijos suvienodinimo procedūrą (15). Šie reaktoriai buvo ganėtinai dideli (aukštis 2 m; talpa 60 l) ir kiekvienam reikėjo ne mažiau negu 2 l/h nuotekų. Bauman ir kt. (16) laistomuosius reaktorius modeliavo poliesterio minkštos masės strypelius įkišdami į 1 m vamzdžius (vidinis vamzdžio skersmuo 14 mm); prieš įkišant į vamzdžius šiuos strypelius pastarieji koncentruotame veikliajame dumble būdavo palaikomi ne trumpiau negu 30 min. Bandomoji cheminė medžiaga, kuri buvo vienintelis anglies šaltinis mineralinių druskų tirpale, tiekta vamzdžiu žemyn ir biologinis skaidymas vertintas nuotekose matuojant ištirpusią organinę anglį (toliau – DOC) ir CO2 kiekį išsiskiriančiose dujose.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Biologinių filtrų veikimas modeliuotas kitais būdais (15); mažu kampu į horizontalę pakreiptų besisukančių vamzdžių vidiniais paviršiais leista srūti nuotekoms (apie 250 ml/h) su bandomąja chemine medžiaga ir be šios medžiagos bei surinktame ištakyje nustatytas DOC kiekis ir (arba) konkrečios bandomosios cheminės medžiagos kiekis.
                           
                        BANDYMO METODO ESMĖ
                  
                              8.
                           
                           
                              Taikant šį metodą nustatomas pašalinamas vandenyje ištirpusių organinių cheminių medžiagų kiekis vykstant pirminiam biologiniam skaidymui ir (arba) visiškam biologiniam skaidymui, kurį nuolat naudojamose bandymo sistemose, modeliuojančiose aktyviojo dumblo procesus, užtikrina aerobiniai mikroorganizmai. Lengvai skaidoma organinė terpė ir organinė bandomoji cheminė medžiaga yra anglies ir energijos šaltiniai mikroorganizmams.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Naudojami du nuolatos vienodomis sąlygomis, kurios pasirenkamos atsižvelgiant į bandymo tikslą, vienu metu veikiantys bandymo įrenginiai (veikliojo dumblo įrenginiai arba akytieji indai). Paprastai vidutinė hidraulinė išbuvimo trukmė yra 6 val., o vidutinis dumblo amžius (dumblo išbuvimo trukmė) yra 6–10 dienų. Dumblas naudojamas vienu iš dviejų metodų: tik į vieną iš įrenginių įleidžiamą organinę terpę paprastai įleidžiama bandomosios cheminės medžiagos, kurios koncentracija yra nuo10 mg/l ištirpusios organinės anglies (DOC) iki 20 mg/l DOC. Antrasis įrenginys naudojamas kaip kontrolinis įrenginys siekiant nustatyti organinės terpės biologinį skaidymą.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Dažnai imamuose ištakio ėminiuose visų pirma turėtų būti nustatomas DOC kiekis arba cheminis deguonies suvartojimas (COD) ir atliekant specialią analizę įvertinama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija (jeigu reikia) ištakyje iš įrenginio, į kurį buvo leidžiama bandomoji cheminė medžiaga. DOC ir COD koncentracijų skirtumas ištakyje iš bandomojo ir kontrolinio įrenginių laikomas atsiradusiu dėl bandomosios cheminės medžiagos arba jos organinių metabolitų. Šis skirtumas lyginamas su įterpiant bandomąją medžiagą intakyje užtikrinta DOC arba COD koncentracija, kad būtų nustatytas bandomosios cheminės medžiagos pašalinimas.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Biologinį skaidymą paprastai galima atskirti nuo bioadsorbcijos ir šiuo tikslu nuodugniai išanalizuojant šalinimo–laiko kreivę bei galima paprastai patvirtinti taikant lengvo biologinio skaidymo, kuriam pasirenkama aklimatizuota sėjimo kultūra iš įrenginio, į kurį buvo įterpta bandomosios cheminės medžiagos.
                           
                        INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
                  
                              12.
                           
                           
                              Bandomosios cheminės medžiagos grynumas, tirpumas vandenyje, lakumas ir sugerties charakteristikos turėtų būti žinomos siekiant teisingai aiškinti rezultatus. Su lakiosiomis ir netirpiomis cheminėmis medžiagomis paprastai neįmanoma atlikti bandymų, jeigu nesiimama specialių atsargumo priemonių (žr. 5 priedėlį). Taip pat turėtų būti žinoma cheminė struktūra ar bent jau empirinė formulė siekiant apskaičiuoti teorines vertes ir (arba) patikrinti išmatuotas parametrų vertes, pvz., teorinį deguonies poreikį (toliau – ThOD), ištirpusią organinę anglį (DOC) ir cheminį deguonies suvartojimą (COD).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Informacija apie bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą mikroorganizmams (žr. 4 priedėlį) gali praversti renkantis atitinkamas atliekant bandymą taikomas koncentracijas ir gali būti svarbi aiškinant mažas biologinio skaidumo vertes.
                           
                        ATITIKTIES LYGIS
                  
                              14.
                           
                           
                              Šį pradinį modeliavimo (patvirtinimo) bandymą taikant pirminio biologinio skaidymo paviršinio aktyvumo medžiagoms turi būti pašalinama daugiau negu 80 % konkrečios cheminės medžiagos, kad paviršinio aktyvumo medžiagą būtų leidžiama pateikti rinkai. Jeigu neužtikrinama 80 % vertė, galima atlikti šį modeliavimo (patvirtinimo) bandymą ir paviršinio aktyvumo medžiagą rinkai galima pateikti tik tuo atveju, jeigu pašalinama daugiau negu 90 % konkrečios cheminės medžiagos. Dėl cheminių medžiagų apskritai nekeliamas atitikties ir (arba) neatitikties klausimas ir užtikrinamą procentinę pašalinimo dalį galima naudoti apytiksliai apskaičiuojant galimą koncentraciją aplinkoje, taikytiną įvertinant cheminių medžiagų keliamą pavojų. Rezultatai dažnai pateikiami pagal modelį „viskas ar nieko“. Atlikus tam tikrą grynųjų cheminių medžiagų tyrimų skaičių nustatyta, kad daugiau negu trijų ketvirčių atvejais buvo pašalinta > 90 % DOC ir 80 % atvejų pašalinta daugiau negu 90 % cheminių medžiagų, kurioms nebuvo būdingas bent kiekis didesnis biologinis skaidumas.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Atliekant šį bandymą nuotekose viso labo yra tik kelios cheminės medžiagos (pvz., paviršinio aktyvumo medžiagos), kurių koncentracijos (apie 10 mg C/1) naudojamos atliekant bandymą. Kai kurios cheminės medžiagos, jeigu jų koncentracijos atitinka nurodytąsias vertes, gali veikti kaip inhibitoriai, tačiau kitų cheminių medžiagų šalinimo kinetika gali būti skirtinga esant mažoms koncentracijoms. Skaidymą įmanoma įvertinti tiksliau, jeigu būtų naudojami modifikuoti metodai, kiek įmanoma mažesnės bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos ir surinktus duomenis būtų galima naudoti apskaičiuojant kinetines konstantas. Tačiau būtinų eksperimentinių metodų patikimumas kol kas nėra iki galo validuotas ir taip pat neparengti biologinio skaidymo reakcijas apibūdinantys kinetiniai modeliai (žr. 7 priedėlį).
                           
                        ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS
                  
                              16.
                           
                           
                              Siekiant užtikrinti, kad bandymo procedūra būtų taikoma pagal reikalavimus, tikslinga bandymus su cheminėmis medžiagomis, kurių ypatybės yra žinomos, retkarčiais atlikti kartu su bandomųjų cheminių medžiagų tyrimu. Šioms cheminėms medžiagoms priskiriama adipo rūgštis, 2-fenilfenolis, 1-naftoliai, difeno rūgštis, 1-naftalenkarboksirūgštis ir t. t. (9) (10) (11).
                           
                        BANDYMO REZULTATŲ ATKURIAMUMAS
                  
                              17.
                           
                           
                              Parengta kur kas mažiau, palyginti su ataskaitomis apie lengvo biologinio skaidumo bandymus, tyrimų ataskaitų apie modeliavimo bandymus. Kartotinių ėminių (paimtų vienu metu) tyrimų rezultatų atkuriamumas yra aukštas (10–15 %), jeigu bandymas atliekamas su cheminėmis medžiagomis, kurios suskaidomos 80 % ar daugiau procentų, tačiau kur kas mažiau suskaidomų cheminių medžiagų rezultatų kintamumas yra didesnis. Per 9 savaites, leidžiamas atliekant bandymą, skirtingais atvejais taip pat buvo nustatyti tam tikrų ribinių cheminių medžiagų ganėtinai nesugretinami rezultatai (pvz., 10 %, 90 %).
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Naudojant dviejų tipų aparatus buvo nustatyti mažai besiskiriantys rezultatai, tačiau tam tikros cheminės medžiagos išsamiau ir nuosekliau suskaidytos buitinėse nuotekose negu OECD sintetinėse nuotekose.
                           
                        BANDYMO METODO APRAŠYMAS
                  
                     Aparatūra
                  
                  
                     Bandymo sistema
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Vienos bandomosios cheminės medžiagos bandymo sistemą sudaro bandymo įrenginys ir kontrolinis įrenginys; tačiau atliekant tik specialias analizes (pirminis biologinis skaidymas) pakanka vien bandymo įrenginio. Vieną kontrolinį įrenginį galima naudoti su keliais bandymo įrenginiais, jeigu bandymai atliekami su ta pačia ar skirtingomis bandomosiomis medžiagomis. Jeigu naudojamas bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio mikrobų populiacijos suvienodinimas (3 priedėlis) kiekvienas bandymo įrenginys privalo turėti atskirą kontrolės įrenginį. Galima naudoti aktyviojo dumblo įrenginio modelį, Husmano įrenginį, (1 priedėlio 1 pav.) arba akytąjį indą (1 priedėlio 2 pav.). Abiem atvejais būtini pakankamo dydžio laikymo indai, kuriuose būtų kaupiamas intakiai ir ištakiai, bei intakio dozavimo siurbliai (intakis maišomas su bandomosios cheminės medžiagos tirpalu arba tiekiamas atskirai).
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Kiekvieną aktyviojo dumblo įrenginį sudaro žinomos talpos aeracinis rezervuaras, kurio talpa yra apie 3 litrai veikliojo dumblo, ir maždaug 1,5 litro talpos skirtuvas (antrinis nusodintuvas); talpą galima šiek tiek pakeisti, jeigu reguliuojamas skirtuvo aukštis. Leidžiama naudoti skirtingo dydžio indus, jeigu juos ketinama naudoti taikant palyginamojo dydžio hidraulines apkrovas. Jeigu bandymo patalpoje neįmanoma išlaikyti pageidaujamo intervalo temperatūrą, rekomenduojama naudoti indus su vandeniu užpildyta ertme, jeigu vandens temperatūrą įmanoma reguliuoti. Pneumatiniu siurbliu ar dozavimo siurbliu veiklusis dumblas reguliariais intervalais nuolatos ar su pertrūkiais iš skirtuvo recirkuliuojamas į aeracinį rezervuarą.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Akytojo indo sistemą sudaro vidinis akytasis cilindras kūgio formos dugnu, įdėtas į šiek tiek didesnį tokios pačios formos indą, pagamintą iš nelaidžios plastikinės medžiagos. Akytajam indui tinkama medžiaga būtų akytasis polietilenas, kurio didžiausias poros dydis neviršija 90 μm, o medžiaga ne storesnė negu 2 mm. Dumblas iš valomos organinės terpės išskiriamas vykstant skirtuminiam perėjimui per akytąją sienelę. Ištakiai surenkami žiedo pavidalo ertmėje, iš kurios jie srūva į kaupiamąjį indą. Nusodinimo procesas nevyksta, todėl dumblas nėra grąžinamas. Visą sistemą galima sumontuoti vandens vonioje, kurioje vandens temperatūrą įmanoma reguliuoti termostatinėmis priemonėmis. Akytieji indai užsikemša ir pradiniuose etapuose per jų kraštus gali tekėti skystis. Šiuo atveju akytasis įdėklas pakeičiamas švariu įdėklu, tačiau pirmiau dumblas siurbiamas iš indo į švarią talpyklą bei tada pakeičiamas užsikimšęs įdėklas. Nušluosčius nepralaidų išorinį cilindrą įterpiamas švarus įdėklas ir dumblas grąžinamas į indą. Prie užsikimšusio įdėklo šonų prilipęs visas dumblas taip pat rūpestingai nugramdomas ir perkeliamas. Užsikimšę indai valomi plona vandens čiurkšle, kad būtų pašalinamas likęs dumblas, ir mirkant natrio hipochlorito tirpale, o tada vandenyje ir galiausiai kruopščiai skalaujami vandeniu.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Dumblą aeruojant abiejų sistemų aeraciniuose rezervuaruose būtina taikyti tinkamus metodus, pvz., akyto stiklo antgalį (difuzoriaus akmenis) ir suslėgtąjį orą. Jeigu reikia, oras turi būti valomas jį leidžiant per tinkamą filtrą ir kondicionuojamas. Sistema turi tekėti pakankamas oro kiekis, kad būtų išlaikomos aerobinės sąlygos ir kad atliekant bandymą dumblo dribsniai visą laiką būtų suspenduoti.
                           
                        
                     Filtravimo įtaisas ar centrifuga
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Ėminių filtravimo įtaisas su būtino akytumo (nominalusis apertūros skersmuo 0,45 μm) membraniniais filtrais, sugeriančiais tirpiąsias chemines medžiagas ir išskiriančiais kuo mažesnį organinės anglies kiekį. Jeigu naudojami organinę anglį išskiriantys filtrai, jie kruopščiai plaunami karštu vandeniu, kad būtų pašalinta išplaunamoji organinė anglis. Antraip leidžiama naudoti centrifugą, tinkančią užtikrinti 40 000 m/s2.
                           
                        
                     Analizės įranga
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Įrenginiai, būtini nustatyti:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          DOC (ištirpusią organinę anglį) ir TOC (bendrąją organinę anglį) arba COD (cheminį deguonies suvartojimą),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          konkrečią cheminę medžiagą, jeigu reikia,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          suspenduotas medžiagas, pH, deguonies koncentraciją vandenyje,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          temperatūrą, rūgštingumą ir šarmingumą,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          amonio, nitritų ir nitratų kiekį, jeigu bandymas atliekamas nitrifikacijos sąlygomis.
                                       
                                    
                        
                     Vanduo
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Vandentiekio vanduo, kuriame mažiau negu 3 mg/l DOC. Nustatomas šarmingumas, jeigu nėra žinomas.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Dejonizuotas vanduo, kuriame mažiau negu 2 mg/l DOC.
                           
                        
                     Organinė terpė
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Kaip organinę terpę leidžiama naudoti sintetines nuotekas, buitines nuotekas ar abiejų mišinį. Įrodyta (žr. (11) (14)), kad naudojant tik buitines nuotekas pašalinama didesnė DOC procentinė dalis ir kad šiuo atveju net įmanoma šalinti tam tikras chemines medžiagas ir jas biologiškai skaidyti, nors šios cheminės medžiagos nėra biologiškai skaidomos, jeigu naudojamos OECD sintetinės nuotekos. Taip pat jeigu nuolat ar su pertrūkiais pridedama buitinių nuotekų, veiklųjį dumblą dažnai pavyksta stabilizuoti, įskaitant esminę ypatybę tinkamai nusistovėti. Vadinasi, rekomenduojama naudoti buitines nuotekas. Išmatuojamos kiekvienos organinės terpės naujos partijos DOC arba COD vertės. Turėtų būti žinomas organinės terpės rūgštingumas arba šarmingumas. Jeigu rūgštingumas ar šarmingumas yra per mažas, į organinę terpę gali tekti įterpti tinkamo buferinio tirpalo (natrio hidrokarbonato arba kalio dihidrofosfato), kad atliekant bandymą aeracijos rezervuare pH vertė būtų maždaug 7,5 ± 0,5. Kiekvienu pavieniu atveju nustatomas įterptinas buferinio tirpalo kiekis ir pasirenkamas jo įterpimo laikas. Jeigu mišiniai naudojami nuolat ar su pertrūkiais, turi būti užtikrinama beveik pastovi mišinio DOC vertė (arba COD vertė), pvz., šiuo tikslu naudojant skiedimą vandeniu.
                           
                        
                     Sintetinės nuotekos
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Kiekviename vandentiekio vandens litre ištirpinama: 160 mg peptono, 110 mg mėsos ekstrakto, 30 mg karbamido, 28 mg bevandenio kalio dihidrofosfato (K2HPO4), 7 mg natrio chlorido (NaCl), 4 mg kalcio chlorido dihidrato (CaCl2.2H2O), 2 mg magnio sulfato heptahidrato (Mg2SO4.7H20). Šios OECD sintetinės nuotekos yra pavyzdinės ir jas naudojant užtikrinama vidutinė 100 mg/l DOC koncentracija intakyje. Antraip leidžiama naudoti kitokią sudėtį, kai užtikrinama beveik tokia pati DOC koncentracija, labiau atitinkanti tikrųjų nuotekų vertę. Jeigu būtinas mažesnės koncentracijos intakis, sintetinės nuotekos skiedžiamos, pvz., 1:1 santykiu, vandentiekio vandeniu, kad būtų užtikrinta maždaug 50 mg/l koncentracija. Naudojant mažesnės koncentracijos intakį būtų skatinamas greitesnis nitrifikuojančių organizmų augimas ir šis keitimas turėtų būti naudojamas tuo atveju, jeigu turi būti tiriamas nitrifikuojančių nuotekų įrenginių modeliavimas. Koncentruotų šių sintetinių nuotekų galima pasiruošti iš distiliuoto vandens ir jas laikyti vieną savaitę maždaug 1 °C temperatūroje. Jeigu reikia, skiedžiama distiliuotu vandeniu. (Ši terpė neatitinka reikalavimų, pvz., azoto koncentracija yra labai didelė, palyginti maža anglies koncentracija, tačiau kol kas geresnė priemonė nėra pasiūlyta, t. y. kaip buferinio skysčio įterpti daugiau fosfato ir papildomą peptono kiekį.)
                           
                        
                     Buitinės nuotekos
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Naudojamos šviežios nusistovėjusios nuotekos, kiekvieną dieną rinktos iš valymo įrenginių, į kuriuos daugiausiai patenka buitinės nuotekos. Jos turėtų būti renkamos iki pirminio nusodinimo ir iš pirminio nusodinimo rezervuaro nuleidimo kanalo arba iš veikliojo dumblo įrenginio tiekimo bei turi būti beveik be stambiųjų dalelių. Nuotekas galima naudoti jas palaikius kelias dienas (tačiau apskritai jos neturėtų būti laikomos ilgiau negu septynias dienas) maždaug 4 °C temperatūroje, jeigu įrodoma, kad laikant DOC vertė (arba COD vertė) nėra kiek daugiau sumažėjusi (t. y. mažiau negu 20 %). Siekiant apriboti sistemos trukdžius kiekvienos naujos partijos DOC vertė (arba COD vertė) prieš pradedant naudoti turėtų būti koreguojama atsižvelgiant į atitinkamą pastovią vertę, pvz., skiedžiant vandentiekio vandeniu.
                           
                        
                     Veiklusis dumblas
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Veiklusis dumblas sėjimo kultūrai įterpti renkamas iš nuotekų valymo įrenginio aeracijos rezervuaro arba iš laboratorinio veikliojo dumblo įrenginio, kuriuo valomos tik buitinės nuotekos.
                           
                        
                     Pradiniai bandomosios cheminės medžiagos tirpalai
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Cheminių medžiagų, kurios yra atitinkamo tirpumo, reikiamos koncentracijos pradiniai tirpalai pasiruošiami (pvz., 1–5 g/l) iš dejonizuoto vandens ar iš sintetinių nuotekų mineralinės dalies. (Netirpiosios ir lakiosios cheminės medžiagos aprašytos 5 priedėlyje). Nustatoma pradinių tirpalų DOC vertė ir bendrosios organinės anglies (TOC) vertė ir pakartojami kiekvienos naujos partijos matavimai. Jeigu DOC ir TOC vertės skirtumas viršija 20 %, patikrinamas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas vandenyje. Bandomosios cheminės medžiagos DOC vertė arba koncentracijos vertė, išmatuota taikant specialią pradinio tirpalo analizę, lyginama su vardine verte siekiant nustatyti, ar atsistatymas yra ganėtinai geras (paprastai galima tikėtis > 90 %). Įvertinama, visų pirma dispersijų atžvilgiu, ar DOC galima ar negalima naudoti kaip analizės parametrą, arba įmanoma naudoti tik bandomajai cheminei medžiagai būdingą analizės metodą. Dispersijoms būtina centrifuguoti ėminius. Specialiu analizės metodu išmatuojama kiekvienos naujos partijos DOC, COD vertė arba bandomosios cheminės medžiagos kiekis.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Nustatoma pradinio tirpalo pH vertė. Jeigu nustatomos kraštutinės vertės, jos patvirtina, kad bandymo sistemos veikliojo dumblo pH vertei galėjo būti padarytas poveikis pridėjus cheminės medžiagos. Šiuo atveju pradinis tirpalas neutralizuojamas mažu neorganinės rūgšties ar bazės kiekiu siekiant užtikrinti, kad pH vertė būtų 7 ± 0,5, tačiau privaloma rūpintis, jog nebūtų nusodinama bandomoji cheminė medžiaga.
                           
                        PROCEDŪRA
                  
                              33.
                           
                           
                              Aprašyta procedūra taikoma veikliojo dumblo įrenginiams; ją teko šiek tiek pritaikyti akytojo indo sistemai.
                           
                        
                     Sėjimo kultūros ruošimas
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Prieš pradedant bandymą į bandymo sistemą įterpiama veikliojo dumblo arba mažos mikroorganizmų koncentracijos sėjimo kultūros. Aeruojama sėjimo kultūra kambario temperatūroje laikoma tol, kol pradedama naudoti, ir ją būtina naudoti per 24 val. Pirmuoju atveju iš veiksmingai eksploatuojamo nuotekų biologinio valdymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio, kuriam tiekiamos daugiausiai buitinės nuotekos, paimamas veikliojo dumblo mėginys. Jeigu turi būti modeliuojamos nitrifikavimo sąlygos, dumblas imamas iš nuotekų valymo įrenginio su nitrifikacijos procesu. Nustatoma suspenduotų medžiagų koncentracija ir, jeigu reikia, dumblas sutankinamas taip, kad į bandymo sistemą būtų įterpiamas tik būtinasis dumblo kiekis. Užtikrinama, kad sausosios medžiagos koncentracija būtų apie 2,5 g/l.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Antruoju atveju kaip sėjimo kultūra naudojamas 2 ml/l–10 ml/l koncentracijos ištakis iš buitinių nuotekų biologinio valymo įrenginio. Norint naudoti kiek įmanoma daugiau skirtingų rūšių bakterijų gali būti tikslinga pridėti iš kitų įvairių šaltinių, pvz., paviršinio vandens, paimtos sėjimo kultūros. Šiuo atveju veikliojo dumblo dribsnių susidarymas ir jų kiekio didėjimas vyksta bandomojoje sistemoje.
                           
                        
                     Organinės terpės dozavimas
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Užtikrinama, kad intakio ir ištakio talpyklos bei intakio indų ir ištakio indų jungiamieji vamzdeliai būtų kruopščiai išvalyti, kad iš pat pradžių ir atliekant bandymą būtų užkirstas kelias augti mikroorganizmams. Bandymo sistemos sumontuojamos patalpoje, kurioje įmanoma reguliuoti temperatūrą (paprastai 20–25 °C), arba naudojami bandymo įrenginiai su vandeniu užpildyta ertme. Pasiruošiamas pakankamas kiekis būtinos organinės terpės (27–29 pastraipos). Pirmiausiai organinės terpės pripildomas aeracinis rezervuaras ir skirtuvas bei įterpiama sėjimo kultūra (34, 35 pastraipos). Pradedama aeracija, kad dumblas būtų suspenduojamas, prisotinamas deguonies, ir imamasi dozuoti intakį bei regeneruoti nusodintąjį dumblą. Iš laikymo indų paimtos organinės terpės įdedama į bandymo ir kontrolinių įrenginių aeracijos rezervuarus (20, 21 pastraipos) ir iš panašių laikymo indų paimami atitinkami ištakių kiekiai. Norint užtikrinti įprastą 6 val. hidraulinę išbuvimo trukmę organinė terpė pumpuojama 0,5 l/val sparta. Siekiant užtikrinti šią spartą, matuojamas kiekvieną dieną įterpiamos organinės terpės kiekis ir šiuo tikslu daromi įrašai apie laikymo induose sumažėjusios terpės kiekį. Gali tekti taikyti kitus įterpimo būdus siekiant nustatyti su pertrūkiais atliekamo cheminių medžiagų išleidimo ir „didelio vienkartinio“ cheminių medžiagų kiekio poveikį.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Jeigu ruošiamą organinę terpę ketinama naudoti ilgiau negu vieną dieną, privaloma rinktis aušinimą 4 °C temperatūroje arba kitus tinkamus išsaugojimo metodus siekiant užtikrinti, kad už bandymo įrenginių ribų neaugtų mikrobai ir nevyktų biologinio skaidymo procesas (29 pastraipa). Jeigu naudojamos sintetinės nuotekos, koncentruotą pradinį tirpalą (pvz., 10 kartų viršijantį įprastą koncentraciją, 28 pastraipa) leidžiama pasiruošti ir laikyti maždaug 4 °C temperatūroje. Prieš naudojant šį pradinį tirpalą galima pagal reikalavimus maišyti su atitinkamu vandentiekio vandens kiekiu; jį leidžiama pumpuoti tiesiogiai, tačiau atitinkamas vandentiekio vandens kiekis turi būti tiekiamas atskirai.
                           
                        
                     Bandomosios cheminės medžiagos dozavimas
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Į intakio laikymo indą įpilamas atitinkamas bandomosios cheminės medžiagos pradinio tirpalo kiekis (31 pastraipa) arba naudojant atskirą siurblį šis tirpalas pumpuojamas tiesiogiai į aeracijos rezervuarą. Įprasta vidutinė bandymo koncentracija intakyje turėtų būti 10–20 mg/l DOC, o didžiausia koncentracijos vertė neturėtų viršyti 50 mg/l. Jeigu bandomosios cheminės medžiagos tirpumas vandenyje yra mažas arba jeigu numatomas galimas toksinis poveikis, koncentracija mažinama iki 5 mg/l DOC arba dar iki mažesnės vertės, tačiau tik tuo atveju, kai specialus analizės metodas yra prieinamas ir kai jis taikomas (naudojant specialius dozavimo metodus leidžiama įterpti mažai vandenyje tirpių ištirpusių bandomųjų cheminių medžiagų, žr. 5 priedėlį).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Bandomąją cheminę medžiagą imama įterpti po laikotarpio, kai sistema yra stabilizuojama ir veiksmingai šalina (apie 80 %) organinės terpės DOC. Prieš pradedant įterpinėti bandomąją cheminę medžiagą privaloma patikrinti, ar visi įrenginiai veikia vienodai veiksmingai; jeigu jie veikia skirtingai, šiuo atveju paprastai rekomenduojama sumaišyti skirtingą dumblą ir į kiekvieną įrenginį įdėti vienodą šio dumblo kiekį. Jeigu kaip sėjimo kultūra naudojama (maždaug) 2,5 g/l (sausoji masė) veikliojo dumblo, bandymo pradžioje galima įterpti bandomosios cheminės medžiagos, nes iš pradžių pridedant kaskart vis didesnius kiekius yra užtikrinama, kad veiklusis dumblas tinkamiau prisitaikytų prie bandomosios cheminės medžiagos. Kad ir kokiu būdu būtų pridedama bandomosios cheminės medžiagos, laikymo inde (-uose) rekomenduojama reguliariais intervalais matuoti atitinkamą srautą ir (arba) kiekius.
                           
                        
                     Veikliojo dumblo tvarkymas
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Atliekant bandymą veikliojo dumblo kietųjų dalelių koncentracija nepaisant naudojamos sėjimo kultūros paprastai stabilizuojasi 1–3 g/l sausosios masės intervalo ribose, tačiau šiuo atveju svarbi organinės terpės kokybė ir koncentracija bei koncentracija priklauso nuo naudojimo sąlygų, esamų mikroorganizmų pobūdžio ir bandomosios cheminės medžiagos poveikio.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Suspenduotų kietųjų medžiagų kiekis aeracijos rezervuare nustatomas ne rečiau negu kartą per savaitę ir perteklinis dumblas yra šalinamas siekiant išlaikyti 1–3 g/l (sausosios masės) koncentraciją arba koreguojama vidutinė pastovi dumblo amžiaus vertė (paprastai 6–10 dienų). Jeigu, pvz., pasirenkama 8 dienų dumblo išbuvimo trukmė, kiekvieną dieną iš aeracijos rezervuaro išimama ir pašalinama 1/8 veikliojo dumblo kiekio dalis. Ši operacija atliekama kasdien arba geriausiai būtų naudoti automatinį su pertrūkiais veikiantį eksploatavimo siurblį. Išlaikant pastovią ar griežtai apibrėžtas ribas atitinkančią suspenduotų medžiagų koncentraciją nepavyksta užtikrinti pastovios dumblo išbuvimo trukmės (toliau – DST), kuri laikytina eksploataciniu kintamuoju, nuo kurio priklauso bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos nuotakyje vertė.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Atliekant bandymą bet koks prie aeracijos rezervuaro ir skirtuvo sienelių prilipęs dumblas ne rečiau negu kartą per dieną šalinamas taip, kad dumblas vėl būtų suspenduojamas. Reguliariai tikrinami ir valomi visi vamzdžiai ir vamzdynas siekiant užtikrinti, kad nesusidarytų biologinė plėvelė. Skirtuve nusistovėjęs dumblas recirkuliuojamas į aeracijos rezervuarą; šiuo tikslu rekomenduojama naudoti trūkųjį pumpavimą. Akytojo indo sistemoje recirkualiavimas nenaudojamas, tačiau šiuo atveju užtikrinama, kad švarūs vidiniai indai būtų įstatomi pirmiau negu gerokai padidėja kiekis inde (21 pastraipa).
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Husmano įrenginiuose gali sutrikti dumblo nusodinimo ir šalinimo procesai. Šias triktis galima pašalinti naudojant vieną ar kelias toliau aprašytas procedūras; jos vienu metu taikomos bandymo ir kontroliniuose įrenginiuose:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          reguliariai, pvz., kiekvieną savaitę, galima pridėti šviežio dumblo ar dribsniklio (pvz., 2 ml/indas su 50 g/l FeCl3), tačiau užtikrinama, kad nevyktų bandomosios cheminės medžiagos reakcija su FeCl3 arba kad ji nebūtų nusodinama,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pneumatinį siurblį galima pakeisti peristaltiniu siurbliu siekiant sukurti dumblo recirkuliacijos srautą, kurio dydis beveik lygus intakio srautui, naudotinam nusodintame dumble sukuriant anaerobinę zoną (pneumatinio siurblio geometrinės ypatybės apriboja būtiniausią grąžinamo dumblo srautą, kad jis būtų maždaug 12 kartų didesnis negu intakio srautas),
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dumblą iš skirtuvo trūkiuoju būdu galima pumpuoti į aeracijos rezervuarą (pvz., 5 min. kas 2,5 val. ir recirkuliuoti 1 l/val–1,5 l/val.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      siekiant pašalinti putojimo sukeltus nuostolius galima naudoti mažiausios koncentracijos netoksišką priešputį (pvz., silikoninę alyvą),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orą per skirtuve esantį dumblą galima pūsti trumpais stipriais pliūpsniais (pvz., 10 sek. kartą per valandą),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      organinę terpę tolygiais tarpsniais galima įvedinėti į aeracijos rezervuarą (pvz., 3–10 min. kartą per valandą).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     Ėminių ėmimas ir analizė
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Reguliariais intervalais matuojama aeracijos rezervuarų veikliajame dumble ištirpusio deguonies koncentracija, temperatūra ir pH vertė. Užtikrinama, kad visada būtų pakankamas deguonies kiekis (> 2 mg/l) ir kad temperatūros vertė atitiktų privalomojo intervalo ribas (paprastai 20 °C – 25 °C). Į aeracijos indą ar į intakį įterpiant nedidelius neorganinės bazės arba rūgšties kiekius arba didinant organinės terpės buferinę talpą (žr. 27 pastraipą) užtikrinama, kad pH vertė būtų 7,5 ± 0,5. Vykstant nitrifikacijos procesui susidaro rūgštis, oksiduojant 1 mg N sukuriamas maždaug 7 mg CO3
                                 - ekvivalentas. Matavimo dažnumas priklauso nuo matuotino parametro ir sistemos stabilumo bei matuojama gali būti kasdien ar kartą per savaitę.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Išmatuojama intakių į kontrolinius ir bandymo indus DOC arba COD vertė. Taikant specialią analizę išmatuojama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandomajame intakyje arba ji apytiksliai apskaičiuojama naudojant pradinio tirpalo koncentraciją (31 pastraipa), išmatuojamas naudotas kiekis ir į bandymo įrenginį įleistas nuotekų kiekis. Rekomenduojama apskaičiuoti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją siekiant sumažinti koncentracijos duomenų kintamumą.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Iš surinkto ištakio (pvz., 24 val. jungtinis kiekio) imami tinkami ėminiai ir filtruojami per membraną (poros dydis 0,45 μm) arba 15 minučių centrifuguojami užtikrinant maždaug 40 000 m/s2. Leidžiama centrifuguoti, jeigu filtravimą sunku atlikti. Nustatoma DOC arba COD vertė siekiant išmatuoti visišką biologinį suskaidymą ir, jeigu būtina, naudojant bandomajai cheminei medžiagai būdingą analizės metodą išmatuojamas pirminis biologinis suskaidymas.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Taikant COD vertę gali sunkiai sektis atlikti analizę, kai naudojamos mažos koncentracijos, todėl rekomenduojama tik tuo atveju, jeigu pasirenkama ganėtinai didelė bandymo koncentracija (apie 30 mg/l). Taip pat, jeigu naudojamos lengvai adsorbuojamos cheminės medžiagos, rekomenduojama, kad dumblo adsorbuojamos cheminės medžiagos kiekis būtų matuojamas naudojant šiai bandomajai medžiagai būdingą analizės metodą.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Ėminių ėmimo dažnumas priklauso nuo numatomos bandymo trukmės. Rekomenduojamas dažnumas – trys kartai per savaitę. Jeigu įrenginiai eksploatuojami veiksmingai, laukiama nuo vienos iki ne daugiau negu 6 savaičių po bandomosios cheminės medžiagos įterpimo, kol pasibaigus pritaikymui nusistovės stabili būsena. Siekiant įvertinti bandymo rezultatus visų pirmiausiai būtina nustatyti 15 validuotų kreivės plokščiosios dalies verčių (59 pastraipa); ši procedūra paprastai trunka 3 savaites. Bandymą galima užbaigti, jeigu užtikrinamas pakankamas šalinimo mastas (pvz., > 90 %), ir jeigu turimos minėtos 15 verčių, kurios atitinka per 3 savaites kiekvieną dieną atliktą analizę. Bandymo trukmė paprastai neturi būti ilgesnė negu 12 savaičių po bandomosios cheminės medžiagos įterpimo.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Jeigu dumble vyksta nitrifikacijos procesas ir jeigu turi būti tiriamas bandomosios cheminės medžiagos poveikis nitrifikacijai, bent vieną kartą per savaitę analizuojami iš bandymo ir kontrolinių įrenginių ištakio paimti ėminiai siekiant nustatyti amonio ir (arba) nitritų bei nitratų kiekį.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Visos analizės turėtų būti atliekamos kai tik įmanoma, ypač azoto kiekio nustatymas. Jeigu analizių atlikimas turi būti atidedamas, sklidinuose sandariai užkimštuose buteliuose ir tamsoje ėminiai laikomi apie 40 °C temperatūroje. Jeigu ėminiai turi būti laikomi ilgiau negu 48 val., jie saugomi užšaldyti, parūgštinti (pvz., 10 ml/l 400 g/l sieros rūgšties tirpalo) arba pridedant tinkamos toksiškos cheminės medžiagos (pvz., 20 ml/l 10 g/l gyvsidabrio (II) chlorido tirpalo). Pasirūpinama, kad pasirinkus išsaugojimo metodą nebūtų daromas poveikis analizės rezultatams.
                           
                        
                     Bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio mikrobų populiacijos suvienodinimo procedūra
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Jeigu turi būti suvienodinama bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio mikrobų populiacija (3 priedėlis), tarp bandymo įrenginio ir jo kontrolinio įrenginio aeracijos rezervuarų kiekvieną dieną sukeičiamas vienodas veikliojo dumblo kiekis (150 ml–1 500 ml dumblo aeracijos rezervuarams, kuriuose yra 3 litrai skysčio). Jeigu didelį bandomosios cheminės medžiagos kiekį sugeria dumblas, šiuo atveju keičiamas tik skirtuvuose nusistojęs skystis. Apskaičiuojant bandymo rezultatus (55 pastraipa) abiem atvejais naudojamas pataisos faktorius.
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITŲ TEIKIMAS
                  
                     Rezultatų apdorojimas
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Kiekvieno pasirinkto įvertinimo laiko bandomosios cheminės medžiagos pašalinta procentinė DOC arba COD dalis apskaičiuojama pagal šią lygtį:
                              
                                 
                              kur:
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          pašalinta procentinė DOC arba COD dalis t laiko momentu
                                       
                                    
                                          Cs
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          su bandoma chemine medžiaga siejama intakio DOC arba COD vertė, visų pirmiausiai įvertinta remiantis pradiniu tirpalu (mg/l)
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          t laiko momentu bandomajame ištakyje išmatuota DOC arba DOC vertė (mg/l)
                                       
                                    
                                          Eo
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          t laiko momentu kontroliniame ištakyje išmatuota DOC arba COD vertė (mg/l)
                                       
                                    
                        
                              53.
                           
                           
                              Atliekant bandymą DOC arba COD šalinimo mastas iš kontrolinio įrenginio organinės terpės praverčia vertinant veikliojo dumblo biologinio skaidymo veiksmingumą. Pašalinama procentinė dalis apskaičiuojama pagal šią lygtį:
                              
                                 
                              kur:
                              
                                          DB
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          iš kontrolinio įrenginio organinės terpės t laiko momentu pašalinta procentinė DOC arba COD dalis
                                       
                                    
                                          CM
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          kontrolinio ištakio organinės terpės DOC arba COD vertė (mg/l)
                                       
                                    Arba su organine terpe susijusi pašalinta DOC arba COD dalis ir bandomoji cheminė medžiaga bandymo įrenginyje apskaičiuojama pagal šią lygtį:
                              
                                 
                              kur:
                              
                                          DT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          bendra procentinė iš bandomojo intakio pašalinta DOC arba COOD dalis
                                       
                                    
                                          CT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          bendro bandomojo intakio DOC ar COD vertė arba apskaičiuota atsižvelgiant į pradinius tirpalus (mg/l)
                                       
                                    
                        
                              54.
                           
                           
                              Pašalintas bandomosios cheminės medžiagos kiekis, jeigu matuojama naudojant specialų analizės metodą kiekvieno įvertinimo metu, apskaičiuojamas pagal šią lygtį:
                              
                                 
                              kur:
                              
                                          DST
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          procentinė bandomosios cheminės medžiagos pradinio pašalinimo dalis t laiko momentu
                                       
                                    
                                          Si
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          išmatuota arba apytiksliai apskaičiuota bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandomajame intakyje (mg/l)
                                       
                                    
                                          Se
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          išmatuota bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandomajame ištakyje laiko momentu t (mg/l)
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              Jeigu naudojama bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio mikrobų populiacijos suvienodinimo procedūra, bandomosios cheminės medžiagos skiedimas aeracijos rezervuare kompensuojamas taikant dumblo keitimo procedūrą ir pataisos faktorių (žr. 3 priedėlį). Jeigu naudota 6 val. vidutinė hidraulinė išbuvimo trukmė ir jeigu aeracijos rezervuare esančio veikliojo dumblo pakeista pusė kiekio, siekiant apibrėžti tikrąjį bandomosios cheminės medžiagos šalinimo mastą Dtc nustatytos kasdieninės išmetimo vertės (Dt, 52 pastraipa) turi būti tikslinamos pagal lygtį:
                              
                                 
                           
                        
                     Tyrimo rezultatų išraiška
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Brėžiamas šalinamos procentinės dalies Dt (arba Dtc) ir Dst, jeigu turima, priklausomybės nuo laiko grafikas (žr. 2 priedėlį). Atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos (per se arba kaip DOC) šalinimo kreivės formą galima daryti tam tikras su šalinimo procesu susijusias išvadas.
                           
                        
                     Adsorbavimas
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Jeigu pradėjus bandymą nustatomas didelio kiekio DOC šalinimas iš bandomosios cheminės medžiagos, šiuo atveju tikėtina, kad bandomoji cheminė medžiaga šalinama ją absorbuojant veikliojo dumblo kietosioms medžiagoms. Šį šalinimą įmanoma įrodyti nustatant adsorbuojamos bandomosios medžiagos kiekį ir šiuo tikslu atliekant specialią analizę. Neįprasta, jeigu atliekant bandymą iš adsorbuojamų cheminių medžiagų būtų šalinamas didelis DOC kiekis; paprastai didelis kiekis šalinamas iš pradžių, o vėliau jis laipsniškai mažėja ir prilygsta pusiausvyros vertei. Tačiau jeigu adsorbuojant bandomąją cheminę medžiagą buvo sukeltas vienoks ar kitoks mikrobų populiacijos aklimatizavimas, šalinimas DOC kiekis iš bandomosios cheminės medžiagos vėliau turėtų didėti ir atitikti aukštą kreivės plokščiosios srities vertę.
                           
                        
                     Vėlavimo tarpsnis
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Kaip ir atliekant statinius bandymus, darant daugelio bandomųjų cheminių medžiagų atrankos bandymus būtinas vėlavimo tarpsnis, kol visiškai užbaigiamas biologinis skaidymas. Vėlinimo tarpsnyje skaidančios bakterijos aklimatizuojasi arba prisitaiko ir bandomoji cheminė medžiaga šiame etape beveik nešalinama; tada prasideda pradinis šių bakterijų augimas. Laikoma, kad šis etapas yra pasibaigęs, o skaidymo etapas yra prasidėjęs, jeigu pašalinta maždaug 10 % pradinio bandomosios cheminės medžiagos kiekio (pasibaigus adsorbcijai, jeigu ji vyksta). Vėlavimo tarpsnis dažnai būna labai kintantis, todėl jį sunkiai sekasi atkurti.
                           
                        
                     Kreivės plokščiosios dalies tarpsnis
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              Atliekant nepertraukiamą bandymą šalinimo kreivės plokščiosios dalies tarpsnis apibrėžiamas kaip didžiausio skaidymo tarpsnis. Kreivės plokščiosios dalies tarpsnis neturėtų būti trumpesnis negu 3 savaitės ir per jį turi būti išmatuota apie 15 galiojančių verčių.
                           
                        
                     Vidutinis bandomosios cheminės medžiagos šalinimo laipsnis
                  
                  
                              60.
                           
                           
                              Vidutinė vertė apskaičiuojama naudojant kreivės plokščiosios dalies tarpsnio bandomosios cheminės medžiagos šalinimo vertes (Dt). Suapvalinus iki artimiausio sveikojo skaičiaus (1 %) nustatomas bandomosios cheminės medžiagos šalinimo laipsnis. Taip pat rekomenduojama apskaičiuoti vidutinės vertės 95 % pasikliovimo intervalą.
                           
                        
                     Organinės terpės šalinimas
                  
                  
                              61.
                           
                           
                              Brėžiama iš kontrolinio įrenginio (DB) organinės terpės šalinamos DOC arba COD procentinės dalies priklausomybės nuo laiko kreivė. Vidutinis šalinimo laipsnis nurodomas taip pat kaip bandomosios medžiagos šalinimo laipsnis (60 pastraipa).
                           
                        
                     Biologinio skaidymo požymiai
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Jeigu veiklusis dumblas didesnio bandomosios cheminės medžiagos kiekio neadsorbuoja ir šalinimo kreivė yra būdinga biologinio skaidymo kreivė su vėlinimu, skaidymo etapą ir kreivės plokščiosios dalies tarpsnį (58, 59 pastraipos), išmatuotą šalinimą galima patikimai laikyti biologiniu skaidymu. Jeigu iš pradžių šalinamas didelis kiekis, modeliavimo bandymas neturi skirtis biologinio ir abiotinio šalinimo procesų atžvilgiais. Šiais atvejais ir kitais atvejais, jeigu kyla kokių nors dvejonių dėl biologinio skaidymo (pvz., jeigu vyksta išpūtimas), analizuojamos adsorbuotos bandomosios cheminės medžiagos ar atliekami papildomi statiniai biologinio skaidymo bandymai remiantis biologinius procesus aiškiai apibūdinančiais parametrais. Šie bandymai – tai deguonies suvartojimo metodai (šio priedo (6) C.4 D, E ir F skyrius) arba bandymas matuojant susidariusio anglies dioksido kiekį (šio priedo (6) C.4 C skyrius) ar ISO viršutinės erdvės tyrimo metodas (18) naudojant modeliavimo bandymo iš anksto apdorotą sėjimo kultūrą. Jeigu išmatuojamas pašalintas DOC kiekis ir pašalintas konkrečios cheminės medžiagos kiekis ir jeigu nustatomas didelis pašalinamos procentinės dalies skirtumas (pirmoji vertė mažesnė negu pastaroji), šiuo atveju galima daryti prielaidą, kad ištakiuose yra tarpinių organinių produktų, kurie kur kas sunkiau skaidomi negu pradinė cheminė medžiaga.
                           
                        
                     Bandymo rezultatų validumas
                  
                  
                              63.
                           
                           
                              Informacija apie įprastą sėjimo kultūros biologinį skaidymą gaunama tuo atveju, jeigu nustatomas kontrolinio įrenginio organinės terpės šalinimo laipsnis (53 pastraipa). Bandymas laikomas galiojančiu, jeigu DOC arba COD šalinimo laipsnis kontroliniame (-iuose) įrenginyje (-iuose) yra > 80 % po dviejų savaičių ir nebuvo pastebėta jokių neįprastų ypatybių.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Jeigu buvo naudota lengvai biologiškai skaidoma (etaloninė) cheminė medžiaga, biologinio skaidymo laipsnis (Dt, 52 pastraipa) turėtų būti > 90 %.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Jeigu bandymas atliekamas nitrifikacijos sąlygomis, vidutinė ištakių koncentracija turėtų būti < 1 mg/l amoniako-N ir < 2 mg/l nitritų-N.
                           
                        
                              66.
                           
                           
                              Jeigu šių kriterijų (63–65 pastraipos) nėra laikomasi, bandymas kartojamas naudojant iš kito šaltinio paimtą sėjimo kultūrą, išbandoma etaloninė cheminė medžiaga ir persvarstomos visos bandymo procedūros.
                           
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              Į bandymo ataskaitą turi būti įtraukiama:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tapatybės nustatymo duomenys,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizinis pobūdis ir, jeigu reikia, fizinės bei cheminės savybės.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandymo sistemos tipas; bet kokie netirpių ir lakiųjų cheminių medžiagų bandymo pakeitimai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      organinės terpės tipas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pramoninių nuotekų dalis nuotekose ir jų pobūdis, jeigu žinoma,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sėjimo kultūra, pobūdis ir ėminių ėmimo vieta (-os), koncentracija ir išankstinis apdorojimas, jeigu taikytas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandomosios cheminės medžiagos pradinis tirpalas: DOC ir TOC kiekis; paruošimo būdas, jeigu suspensija; naudota bandymo koncentracija; priežastys, jeigu kraštinis intervalas yra 10–20 g/l DOC; įterpimo metodas; pirmo įdėjimo data; bet kokie pokyčiai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vidutinis dumblo amžius ir vidutinė hidraulinė išbuvimo trukmė; dumblo nuostolių nustatymo metodas; dumblo išsipūtimo mažinimo metodai, dumblo nuostoliai ir t. t.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudoti analizės metodai; bandymo temperatūra,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dumblo pūtimosi savybės, dumblo indeksas (DI), veikliojo mišinio drumzlinumas (VMD),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bet kokie nuokrypiai nuo standartinių procedūrų ir visos aplinkybės, dėl kurių gali būti daromas poveikis rezultatams.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo rezultatai:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      visi išmatuoti duomenys (DOC, COD, speciali analizė, pH, temperatūra, deguonies koncentracija, suspenduotos medžiagos, N cheminės medžiagos, jeigu reikia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      visos apskaičiuotosios Dt (arba Dtc), DB, DSt vertės, pateiktos lentelėje ir šalinimo kreivės,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informacija apie vėlinimo ir kreivės plokščiosios dalies tarpsnius, bandymo trukmę, bandomosios cheminės medžiagos šalinimo ir kontrolinio įrenginio organinės terpės šalinimo laipsnį bei statistinė informacija ir pareiškimai apie biologinį skaidymą bei bandymo validumas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatų aptarimas.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Swisher RD (1987). „Surfactant Biodegradation“, 2nd Edn. Marcel Dekker Inc. New York, 1085 pp.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698–706.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Medmenham, UK.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909–915.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Eckenfelder, W.W (19) US EPA.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Chapter C.4 of this Annex, Determination of ‘Ready’ Biodegradability.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Šio priedo C.12 skyrius, Biologinis skaidymas, Modifikuotas SCAS bandymas.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Šio priedo C.19 skyrius. Dirvožemio ir nuotekų dumblo adsorbcijos koeficiento (K
                                    OC
                                 ) nustatymas naudojant didelio našumo skysčių chromatografiją (HPLC).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157–173.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45–55.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. pp 113–138, In: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              ISO 11733 (1995; revised 2004). Evaluation of the elimination and biodegradability of organic substances in an aqueous medium - activated sludge simulation test.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33–48.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340–343.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753–758.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 91–98 ISBN 011 751661 9.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              ISO 14593 (1998). Water Quality - Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels.
                           
                        
                     1 priedėlis
                     
                        1 paveikslas
                     
                     
                        Biologinio skaidumo įvertinimo įranga
                     
                     Husmano įrenginys
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 Laikymo indas
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 Dozavimo siurblys
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 Aeracijos rezervuaras (3 l talpos)
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 Nusodintuvas
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 Pneumatinis siurblys
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 Surinkimo indas
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 Aeratorius
                              
                           
                                 H.
                              
                              
                                 Oro srauto matuoklis
                              
                           
                        2 paveikslas
                     
                     
                        Biologinio skaidumo įvertinimo įranga
                     
                     Akytasis indas
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 Laikymo indas
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 Dozavimo siurblys
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 Akytasis aeravimo rezervuaras
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 Išorinis nelaidus indas
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 Surinkimo indas
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 Oro sklaidytuvas
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 Oro srauto matuoklis
                              
                           
                        3 paveikslas
                     
                     
                        3 litrų talpos akytojo indo aeravimo rezervuaro dalys
                     
                     
                        
                  
                  
                     2 priedėlis
                     
                        Šalinimo kreivės pavyzdys
                     
                     
                        
                  
                  
                     3 priedėlis
                     [INFORMACINIS PRIEDAS]
                     BANDYMO ĮRENGINIŲ MIKROBŲ POPULIACIJOS SUVIENODINIMAS
                     Siekiant pamėginti suvienodinti bandymo įrenginio, kuriam tiekiamos nuotekos ir bandomoji cheminė medžiaga, bei kontrolinio įrenginio, kuriam tiekiamos tik nuotekos, mikrobų populiaciją pradėta taikyti kasdieninė dumblo apkeitimo procedūra (1). Ši procedūra vadinama mikrobų populiacijos suvienodinimo procedūra, o metodas – suvienodintos mikrobų populiacijos įrenginių metodas. Mikrobų populiacijos suvienodinimo procedūra iš pradžių buvo atliekama naudojant Husmano veikliojo dumblo įrenginius, tačiau ji taip pat naudota akytųjų indų įrenginiuose (2) (3). Įrenginių, kuriuose naudota mikrobų populiacijos suvienodinimo procedūra, ir įrenginių, kuriuose ji nebuvo taikoma, Husmano įrenginys ar akytasis indas, rezultatai skyrėsi ne per daugiausiai, todėl neverta gaišti laiko ir eikvoti energiją bei įrenginiuose taikyti minėtą procedūrą.
                     Naudojant dumblo apkeitimą galima sudaryti gana didelio šalinimo regimybę, nes dalis bandomosios cheminės medžiagos yra perkeliama ir bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertės bandymo ir kontroliniuose ištakiuose beveik suvienodėja. Todėl būtina naudoti pataisos faktorius, kurie pasirenkami atsižvelgiant į pakeistąją dalį ir vidutinę hidraulinio išbuvimo trukmę. Išsamesnė informacija apie apskaičiavimą paskelbta (1).
                     Patikslintosios DOC ar COD šalinimo laipsnio vertės apskaičiuojamos pagal šią bendrąją formulę:
                     
                        
                     kur:
                     
                                 Dtc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 patikslintoji DOC ar COD šalinimo procentinė dalis
                              
                           
                                 Dt
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 apskaičiuotoji DOC ar COD šalinimo procentinė dalis
                              
                           
                                 a
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 veikliojo dumblo įrenginių pakeičiamosios frakcijos tūris
                              
                           
                                 r
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 vidutinė hidraulinė išbuvimo trukmė (h)
                              
                           Jeigu, pvz., aeracijos rezervuaro pusė tūrio yra pakeičiama (a = 0,5) ir vidutinė hidraulinė išbuvimo trukmė yra 6 val. pataisos apskaičiavimo formulė:
                     
                        
                     
                        LITERATŪRA
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131–1135.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test. pp. 113–138. In: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
                              
                           
                  
                     4 priedėlis
                     VEIKLIOJO DUMBLO SLOPINIMO ĮVERTINIMAS
                     
                        Procesas naudojant bandomąsias chemines medžiagas
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Atliekant modeliavimo bandymą cheminė medžiaga (ar nuotekos) gali būti biologiškai neskaidoma ar pašalinama ir net gal slopinti dumblo mikroorganizmų veiklą. Kitos cheminės medžiagos biologiškai skaidomos, jeigu jų maža koncentracija, tačiau būdamos didelės koncentracijos jos sukuria slopinamąjį poveikį (hormezė). Slopinamąjį poveikį galima nustatyti ankstyvajame etape arba apibrėžti atliekant toksiškumo bandymą, kuriam naudojama panaši ar tapati sėjimo kultūra, pasirinkta modeliavimo bandymui (1). Galima rinktis deguonies suvartojimo slopinimo metodą (šio 2 priedėlio C.11 skyrius), ISO 8 192 (3)) arba dumblo organizmų augimo slopinimo metodą (ISO 15 522 (4)).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Atliekant modeliavimo bandymą bet koks slopinimas būtų akivaizdžiai įrodomas nustačius, kad ištirpusios organinės anglies (DOC) arba cheminio deguonies suvartojimo (COD) skirtumas bandymo indo ištakyje ir kontrolinio indo ištakyje yra didesnis negu DCO, kuri įterpta kaip bandomoji cheminė medžiaga. Kitu būdu išreikšta procentinė DOC šalinimo iš organinės terpės vykstant poveikiui dalis (ir biocheminis deguonies suvartojimas BOD, cheminis deguonies suvartojimas COD ir (arba) NH+
                                    4) būtų sumažinama įterpus bandomosios cheminės medžiagos. Jeigu tai nustatoma, bandymas turėtų būti pakartojamas bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją mažinant tol, kol būtų užtikrinamas toks lygis, kad slopinimas būtų panaikinamas, ir turbūt koncentracija būtų toliau mažinama, kol bandomojo cheminė medžiaga būtų biologiškai suskaidyta. Tačiau jeigu bandomoji cheminė medžiaga (ar nuotekos) procesą neigiamai veikia pasirinkus visas bandomąsias koncentracijas, galima daryti prielaidą, kad cheminę medžiagą būsią sunku, o gal ir neįmanoma skaidyti biologinėmis priemonėmis, tačiau galbūt būtų verta pakartoti bandymą naudojant iš kito šaltinio gautą veiklųjį dumblą ir (arba) dumblui taikyti kelių etapų aklimatizavimo procesą.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Priešingai, jeigu atliekant modeliavimo bandymą bandomoji cheminė medžiaga biocheminėmis priemonėmis pašalinama pirmame etape, jos koncentracija turėtų būti didinama, jeigu privaloma nustatyti, ar cheminė medžiaga gali sukelti slopinamąjį poveikį.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Primintina, kad mėginant nustatyti slopinimo laipsnį veikliojo dumblo populiacija gali pakisti, todėl mikroorganizmai ilgainiui galėtų įgyti atsparumą slopinančiosios cheminės medžiagos poveikiui.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Slopinimo laipsnio apskaičiavimas:
                                 BOD (biocheminio deguonies suvartojimo), DOC, COD šalinimo Ro iš bandymo ir kontrolės įrenginių bendroji procentinė dalis apskaičiuojama pagal lygtį:
                                 
                                    
                                 kur:
                                 
                                             I
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             bandymo ar kontrolinių ėminių indų intakio BOD, DOC, COD koncentracija (mg/l)
                                          
                                       
                                             E
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             atitinkamos ištakio koncentracijos (mg/l)
                                          
                                       I ir E vertės DOC vertės atžvilgiu turi būti tikslinamos atsižvelgiant į bandymo įrenginiuose naudojamą bandomąją cheminę medžiagą, antraip slopinimo procentinės dalies apskaičiavimas nebūtų tikslus.
                                 Dėl naudojamos cheminės medžiagos atsirandančio slopinimo laipsnį galima apskaičiuoti pagal šią lygtį:
                                 
                                    
                                 kur:
                                 
                                             Rc
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             procentinė pašalinimo dalis kontrolinių ėminių induose
                                          
                                       
                                             Rt
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             procentinė pašalinimo dalis bandymo induose
                                          
                                       
                           
                        LITERATŪRA
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Reynolds L et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Šio priedo C.11 skyrius. Biologinis skaidymas. Veikliojo dumblo respiracijos slopinimo bandymas.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 ISO 8192 (2007) Water quality - Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 ISO 15522 (1999) Water Quality - Determination of the inhibitory effect of water constituents on activated sludge microorganisms.
                              
                           
                  
                     5 priedėlis
                     
                        Mažai vandenyje tirpios bandomosios cheminės medžiagos ir lakiosios cheminės medžiagos
                     
                     
                        Mažai vandenyje tirpios cheminės medžiagos
                     
                     Apie mažai vandenyje tirpių ir netirpių cheminių medžiagų naudojimą atliekant bandymus, kuriais modeliuojamas nuotekų valymas, kol kas tėra paskelbtos kelios ataskaitos (1) (2) (3).
                     Nėra sukurto bendro bandomosios cheminės medžiagos paskleidimo metodo, kuris būtų taikomas visoms netirpioms cheminėms medžiagoms. Du iš standarte ISO 10 634 (4) aprašytų keturių metodų, atrodo, būtų tinkami paskleisti bandomąsias chemines medžiagas, jeigu bandomosios cheminės medžiagos tiriamos modeliavimo metodais; taikant paskleidimo metodus naudojami emulsikliai ir (arba) ultragarso energija. Turėtų būti nustatomas sukurto paskleidimo stabilumas; jis vertinamas ne trumpesniu negu 24 val. laikotarpiu. Tinkamai stabilizuotos dispersijos laikomos nuolat maišomoje talpykloje (38 pastraipa); tada tam tikromis dozėmis į aeracinį rezervuarą tiekiamos atskirai nuo buitinių (ar sintetinių) nuotekų.
                     Jeigu dispersijos yra stabilios, šiuo atveju ištiriama, kaip galima nustatyti dispersinės formos bandomąją cheminę medžiagą. Kažin ar DOC vertė būtų tinkama, todėl privaloma parengti bandomajai cheminei medžiagai tinkamą specialų analizės metodą, kurį būtų galima taikyti ištakiams, ištakių medžiagoms ir veikliajam dumblui. Bandomosios cheminės medžiagos pokytis modeliuojant veikliojo dumblo procesą turėtų būti apibrėžiamas skystosios ir kietosios medžiagos fazėje. Vadinasi, turėtų būti apskaičiuojamas „masės balansas“ siekiant nustatyti, ar bandomoji cheminė medžiaga buvo biologiškai suskaidyta. Tačiau šiuo atveju būtų patvirtinamas tik pirminis biologinis skaidymas. Visišką biologinį suskaidymą turėtų būti mėginama įrodyti atliekant respirometrinį lengvo biologinio skaidumo bandymą (šio priedo (5) C, F arba D C.4 skyrius) ir šiuo tikslu naudoti dumblą su sėjimo kultūra, kuris atliekant modeliavimo bandymą veikiamas bandomąją chemine medžiaga.
                     
                        Lakiosios cheminės medžiagos
                     
                     Nesiliauja svarstymas ir ginčai dėl nuotekų apdorojimo modeliavimo taikymo lakiosioms cheminėms medžiagoms. Panašiai kaip dėl mažai vandenyje tirpių bandomųjų cheminių medžiagų, tėra paskelbtos tik kelios ataskaitos, kuriose aprašyti modeliavimo bandymai naudojant lakiąsias chemines medžiagas. Įprasto tipo maišymo įrenginys pritaikomas užsandarinant aeracijos rezervuarus ir nusodintuvus, srauto matuokliais matuojant ir reguliuojant oro srautą bei per gaudykles tekančias išėjimo dujas, kad būtų surinkta lakioji organinė medžiaga. Tam tikrais atvejais naudojamas vakuuminis siurblys, kuriuo išėjimo dujos ištraukiamos per „šaltąją“ gaudyklę arba analizinė gaudyklė su „Tenax“ ir dujų chromatografijos analizėms skirtu silikageliu. Gaudyklėje esanti bandomoji cheminė medžiaga gali būtų nustatoma analizės metodu.
                     Bandymas atliekamas dviem etapais. Įrenginiai iš pradžių naudojami be dumblo, tačiau su sintetinėmis nuotekomis ir bandomąja chemine medžiaga, kuri pumpuojama į aeracijos rezervuarą. Penkias dienas imami intakio, ištakio ir išėjimo dujų ėminiai ir analizuojami bandomosios cheminės medžiagos atžvilgiu. Naudojant gautus duomenis galima apskaičiuoti procentinę iš sistemos pašalintos bandomosios cheminės medžiagos dalį (Rvs).
                     Tada naudojimo sąlygomis, tapačiomis atliekant šalinimo tyrimą, atliekamas įprastas biologinis bandymas (su dumblu). Taip pat matuojamos DOC arba COD vertės siekiant patikrinti, ar įrenginiai veikia pagal reikalavimus. Pirmame bymo etape atliekamos vienkartinės analizės siekiant intakyje, ištakyje ir išėjimo dujose nustatyti bandomosios cheminės medžiagos kiekį; po aklimatizavimo analizės atliekamos dažniau. Tada naudojantis nuostovios būsenos duomenis galima vėl apskaičiuoti skystojo etapo metu taikant visus procesus (RT) (fizinius ir biologinius) pašalintos bandomosios cheminės medžiagos procentinę dalį ir iš sistemos pašalintą proporcingą dalį (RV).
                     Apskaičiavimas:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Atliekant ne biologinį bandymą iš sistemos pašalintą procentinę bandomosios cheminės medžiagos dalį (RVP) galima apskaičiuoti pagal šią lygtį:
                                 kur:
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos pašalinimas dėl lakiųjų junginių šalinimo (%),
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             gaudyklėje surinktas bandomosios cheminės medžiagos kiekis, išreikštas skystosios fazės koncentracijos ekvivalentu,
                                          
                                       
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos koncentracija intakyje (mg/l).
                                          
                                       
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Atliekant biologinį bandymą procentinę iš sistemos pašalintos bandomosios cheminės medžiagos dalį (RV) galima apskaičiuoti pagal šią lygtį:
                                 kur:
                                 
                                             RV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos pašalinimas dėl lakiųjų junginių šalinimo (%) atliekant biologinį bandymą,
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             atliekant biologinį bandymą gaudyklėje surinktas bandomosios cheminės medžiagos kiekis, išreikštas skystosios fazės skystojo intakio koncentracijos ekvivalentu (mg/l),
                                          
                                       
                                             SI
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos koncentracija intakyje (mg/l).
                                          
                                       
                           
                                 c)
                              
                              
                                 Atliekant biologinį bandymą ir taikant visus procesus pašalinta procentinė bandomosios cheminės medžiagos dalis (RT) apskaičiuojama pagal šią lygtį:
                                 kur:
                                 SE= bandomosios cheminės medžiagos koncentracija (skystame) ištakyje (mg/l).
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 Vadinasi, vykstant biologiniam skaidymui ir adsorbcijai pašalinta procentinė dalis (RBA) apskaičiuojama pagal šią lygtį:
                                 Turėtų būti atliekami atskiri bandymai siekiant nustatyti, ar bandomoji cheminė medžiaga yra adsorbuojama; jeigu adsorbuojama, šiuo atveju galima taikyti tolesnį koregavimą.
                              
                           
                                 e)
                              
                              
                                 Palyginus iš biologinio (Rv) bandymo sistemų ir nebiologinio bandymo (Rvp) sistemų pašalintos bandomosios cheminės medžiagos proporcijas galima nustatyti bendrąjį poveikį, kurį biologinis valymas padarė bandomąją cheminę medžiagą išleidžiant į atmosferą.
                                 
                                             
                                                Pavyzdys:
                                             
                                          
                                          
                                             Benzenas
                                          
                                       Dumblo išbuvimo trukmė = 4 dienos
                                 Sintetinių nuotekų išbuvimo trukmė = 8 val.
                                 
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             SI = 150 mg/l
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             150 mg/l (SEP = 0)
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             22,5 mg/l
                                          
                                       
                                             SE
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             50 μg/l
                                          
                                       Vadinasi,
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 %, RV = 15 %
                                          
                                       
                                             RT
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 % ir RBA = 85 %.
                                          
                                       Daroma prielaida, kad dumblas neabsorbuoja benzeno.
                              
                           
                        LITERATŪRA
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939–854.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 ISO 10634 (1995) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Šio priedo C.4 skyrius. Lengvo biologinio skaidumo nustatymas.
                              
                           
                  
                     6 priedėlis
                     
                        Dumblo išbuvimo trukmės (SRT) poveikis cheminių medžagų apdorojamumui
                     
                     ĮVADAS
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Naudojant aprašytą metodą įvertinama, ar bandomas chemine medžiagas (paprastai dėl savo sudėties laikomas biologiškai skaidžiomis, tačiau ne lengvai skaidžiomis) įmanoma biologiškai suskaidyti laikantis tų reikalavimų, kurie taikomi nuotekų valymo įrenginiams. Rezultatai pateikiami kaip procentinė pašalinimo ir biologinio suskaidymo vertė. Atsižvelgiant į veikliojo dumblo įrenginių naudojimo sąlygas ir intakio pasirinkimą galima taikyti įvairias bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos ištakyje vertes. Atliekant bandymus taikoma tik viena nominalioji dumblo dribsnių koncentracija arba viena nominalioji dumblo išbuvimo trukmė (SRT) ir pasirinkus aprašytus dumblo nuostolių režimus SRT vertė gali gerokai skirtis atliekant bandymą (kiekvieną kitą dieną ir vieną dieną).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Pasirinkus šį variantą (1) (2) SRT kontroliuojama nustatant kur kas mažesnes ribines vertes per kiekvieną 24 val. laikotarpį (būtent taip nutinka pasirinkus didelį mastą), todėl ištakiuose nusistovi pastovesnė koncentracija. Rekomenduojama naudoti buitines nuotekas, nes šiuo atveju užtikrinama tolygesnė ir didesnė procentinė pašalinimo dalis. Taip pat nustatomas tam tikro SRT verčių skaičiaus poveikis ir atliekant nuodugnesnius tyrimus galima apibūdinti temperatūros intervalų poveikį ištakio koncentracijai.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Apskritai kol kas nėra susitarta, kokius kinetinius modelius taikyti, kai valant nuotekas biologiškai skaidomos cheminės medžiagos. Nuspręsta (1) (2), kad renkant duomenis taikytinas bakterijų augimo ir substrato naudojimo Mono kinetikos modelis, nes šis metodas skirtas taikyti tik toms cheminėms medžiagoms, kurių pagaminami dideli kiekiai ir todėl sukuriama didesnė negu 1 mg/l koncentracija. Supaprastinto modelio tinkamumas ir padarytos prielaidos buvo pagrįstos naudojant alkoholio etoksilatus, kuriems būdingas kintančio laipsnio pirminis biologinis skaidumas.
                                 
                                             
                                                Pastaba.
                                             
                                          
                                          
                                             Šis metodas variantas didesniąja dalimi atitinka šio bandymo metodo C.10-A aprašymą ir toliau pateikiama tik ta informacija, kuri neatitinka teksto.
                                          
                                       
                           BANDYMO METODO ESMĖ
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Veikliojo dumblo akytieji indai, naudojami siekiant palengvinti (beveik) nenutrūkstamąjį mišriojo skysčio nuostolių susidarymą, siekiant labai tiksliai kontroliuoti dumblo išbuvimo trukmę (SRT arba θs), taikomi nenaudojant bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio mikrobų populiacijos suvienodinimo procedūros ir pasirenkant SRT verčių bei, jeigu reikia, temperatūros verčių intervalą. Išbuvimo trukmė paprastai būna 2–10 dienų ir pasirenkama 5–20 °C temperatūra. Nuotekos (pirmenybė teikiama buitinėms nuotekoms) ir bandomosios cheminės medžiagos tirpalas į įrenginį atskirai tiekiami tokiais kiekiais, kad būtų užtikrinama privaloma nuotekų išbuvimo trukmė (3–6 val.) ir reikiama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija intakyje. Siekiant užsitikrinti galimybę palyginti, tuo pačiu metu eksploatuojami kontroliniai įrenginiai, kuriems bandomoji cheminė medžiaga nėra tiekiama.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Leidžiama naudoti kitų tipų įrenginius, tačiau būtina ypač stengtis tinkamai kontroliuoti SRT. Pvz., pasirinkus įrenginius su įrengtu nusodintuvu, gali tekti taikyti leidžiamąją kietųjų medžiagų nuostolių, kurių randasi iš įrenginio ištekant ištakiui, nuokrypą. Be to, turėtų būti imamasi specialių atsargumo priemonių siekiant išvengti paklaidų, kurių gali įsivelti kintant nusodintuve esančio dumblo kiekiui.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Kiekvienas įrenginys naudojamas apibrėžus jo eksploatavimo sąlygų rinkinį ir, kai užtikrinama pusiausvyra, vidutinės pastovios bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos ištakiuose ir, jeigu reikia, DOC koncentracijos nusistovi maždaug per tris savaites. Įvertinama ne tik procentinė pašalintos bandomosios cheminės medžiagos ir, jeigu reikia, DOC procentinė dalis, tačiau taip pat brėžiamas įrenginio eksploatavimo sąlygų ir koncentracijos ištakyje santykio grafikas. Remiantis minėtais dalykais galima apskaičiuoti pradines kinetines konstantas ir sąlygas, kurias pasirinkus būtų įmanoma numatyti bandomosios cheminės medžiagos apdorojimo sąlygas.
                              
                           INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Taikomos C.10 A skyriaus 12 ir 13 pastraipos.
                              
                           ATITIKTIES LYGIS
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Taikomos C.10 A skyriaus 14 ir 15 pastraipos.
                              
                           ETALONINĖ BANDOMOJI CHEMINĖ MEDŽIAGA
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Taikoma C.10 A skyriaus 16 pastraipa.
                              
                           BANDYMO REZULTATŲ ATKURIAMUMAS
                     
                                 10.
                              
                              
                                 Taikomos C.10 A skyriaus 17 ir 18 pastraipos.
                              
                           BANDYMO METODO APRAŠYMAS
                     
                        Aparatūra
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Tinkamas įrenginys būtų modifikuota akytojo indo sistema (6.1 priedėlis). Ją sudaro iš akytojo propileno (jo storis 3,2 mm; poros dydis maždaug 90 μm) pagamintas vidaus indas (arba įdėklas); jį gaminant naudota sandūrinė suvirinimo siūlė. (Šis įrenginys yra kur kas tvirtesnis negu aprašytasis šio skyriaus C.10 A 21 pastraipoje). Įdėklas įstatomas į nelaidų polietileninį išorinį indą, sudarytą iš dviejų dalių: apskrito dugno, kuriame išgręžtos angos dviem oro linijoms ir dumblo išleidimo linijai prijungti, bei ant šio pagrindo užsukto viršutinio cilindro, turinčio išėjimo angą, įrengtą taip, kad būtų užtikrinama žinoma akytojo indo tūrio vertė (3 l). Vienoje iš oro linijų yra difuzoriaus akmenys, o kita linija yra atviru galu ir į inde esančius akmenis nukreipta statmenu kampu. Šia sistema sukuriama būtina turbulencija siekiant užtikrinti, kad indo turinys būtų visiškai sumaišomas ir kad ištirpusio deguonies koncentracijų vertės būtų didesnės negu 2 mg/l.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Reikiamas įrenginių skaičius reguliuojamoje temperatūroje (intervalas 5–20 °C (± 1 °C) laikomas vandens voniose ar pastovios temperatūros patalpose. Būtina naudoti siurblius, kuriais į aeracijos rezervuarus būtų leidžiamas bandomosios cheminės medžiagos tirpalas ir nusistojusios nuotekos (leidimo norma atitinkamai 0–1,0 ml/min ir 0–25 ml/min), o trečiuoju siurbliu iš aeracijos rezervuarų šalinamas perteklinis dumblas. Labai mažas būtinasis perteklinio dumblo srautas sukuriamas naudojant siurblį, nustatytą veikti didesne sparta, ir įjungiamą veikti su pertrūkiais (trūkųjį veikimą užtikrina laikmačio jungiklis, įsijungiantis ir veikiantis 10 sekundžių per min.); siurblio tiekimo intervalas yra 3 ml/min., todėl užtikrinama 0,5 ml/min. šalinimo norma.
                              
                           
                        Filtravimo įtaisas ar centrifuga
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Taikoma C10 A skyriaus 23 pastraipa.
                              
                           
                        Analizės įranga
                     
                     
                                 14.
                              
                              
                                 Taikoma C.10 A skyriaus 24 pastraipa.
                              
                           
                        Vanduo
                     
                     
                                 15.
                              
                              
                                 Taikomos C.10 A skyriaus 25 ir 26 pastraipos.
                              
                           
                        Organinė terpė
                     
                     
                                 16.
                              
                              
                                 Taikoma C.10 A skyriaus 27 pastraipa.
                              
                           
                        Sintetinės nuotekos
                     
                     
                                 17.
                              
                              
                                 Taikoma C.10 A skyriaus 28 pastraipa.
                              
                           
                        Buitinės nuotekos
                     
                     
                                 18.
                              
                              
                                 Taikoma C.10 A skyriaus 29 pastraipa.
                              
                           
                        Veiklusis dumblas
                     
                     
                                 19.
                              
                              
                                 Taikoma C10 A skyriaus 30 pastraipa.
                              
                           
                        Pradiniai bandomosios cheminės medžiagos tirpalai
                     
                     
                                 20.
                              
                              
                                 Taikomos C.10 A skyriaus 31 ir 32 pastraipos.
                              
                           BANDYMO EIGA
                     
                        Sėjimo kultūros ruošimas
                     
                     
                                 21.
                              
                              
                                 Taikoma tik C.10 A skyriaus 34 pastraipa – naudojamas veiklusis dumblas (apie 2,5 g/l).
                              
                           
                        Bandymo įrenginių skaičius
                     
                     
                                 22.
                              
                              
                                 Norint atlikti paprastą bandymą, t. y. išmatuoti procentinę pašalinamą dalį, pakanka vieno SRT, tačiau siekiant gauti duomenis, reikalingus apskaičiuojant pradines kinetines konstantas, būtina turėti 4 ar 5 SRT vertes. Paprastai pasirenkamos 2–10 dienų vertės. Praktinėms reikmėms bandymą patogu vienu metu atlikti su 4 ar 5 SRT vertėmis; vykdant išsamesnius tyrimus naudojamos tos pačios SRT vertės ar turbūt skirtingų verčių intervalas, kai pasirenkamos kitos temperatūros vertės (5–20 °C). Pirminiam biologiniam skaidumui (pagrindinis naudojimas) paprastai reikalingas tik vienas įrenginys, kuriame taikomas tam tikrų sąlygų rinkinys. Tačiau visiškam biologiniam skaidumui būtinas kontrolinis įrenginys, kuriame naudojamos kiekvieno rinkinio sąlygos ir kuriam tiekiamos nuotekos, o ne bandomoji cheminė medžiaga. Jeigu daroma prielaida bandomąją cheminę medžiagą esant naudojamose nuotekose, vertinant pirminį biologinį skaidumą privaloma naudoti kontrolinius įrenginius ir atitinkamai tikslinti apskaičiavimus.
                              
                           
                        Organinės terpės ir bandomosios cheminės medžiagos dozavimas
                     
                     
                                 23.
                              
                              
                                 C.10 A skyriaus 36–39 pastraipos yra taikomos, tačiau atkreiptinas dėmesys, kad bandomosios cheminės medžiagos tirpalas dozuojamas atskirai ir kad pasirenkami skirtingi dumblo šalinimo laipsniai. Be to, stebimi ir, jeigu reikia, ± 10 % tikslumu reguliuojami intakių, ištakių srautai ir dumblo šalinimo dažnumas, pvz., du kartus per dieną. Jeigu pasirinkus buitines nuotekas kyla sunkumų taikant analizės metodus, atliekamas bandymas naudojant sintetines nuotekos, tačiau šiuo atveju turi būti užtikrina, kad taikant skirtingą terpę būtų gaunami palyginami kinetiniai duomenys.
                              
                           
                        Veikliojo dumblo įrenginių tvarkymas
                     
                     
                                 24.
                              
                              
                                 Taikomos C.10 A skyriaus 40–43 pastraipos, tačiau SRT vertė kontroliuojama tik „tolygiu“ dumblo šalinimu.
                              
                           
                        Ėminių ėmimas ir analizė
                     
                     
                                 25.
                              
                              
                                 Taikomos C.10 A skyriaus 44–50 pastraipos, išskyrus bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertę ir DOC vertę, kurios nustatymas nėra privalomas; COD vertė neturėtų būti naudojama.
                              
                           DUOMENYS IR ATASKAITŲ TEIKIMAS
                     
                        Rezultatų apdorojimas
                     
                     
                                 26.
                              
                              
                                 Taikomos C.10 A skyriaus 52–54 pastraipos.
                              
                           
                        Tyrimo rezultatų išraiška
                     
                     
                                 27.
                              
                              
                                 Taikomos C.10 A skyriaus 56–62 pastraipos.
                              
                           
                        Kinetinių konstantų apskaičiavimas
                     
                     
                                 28.
                              
                              
                                 Laikytina, kad veikiau vertėtų nurodyti vidutinę stabilios būsenos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos ištakyje vertę ir apibūdinti, kaip ji kinta atsižvelgiant į įrenginio eksploatavimo sąlygas, negu nurodyti procentinę pirminio biologinio skaidumo dalį. Šį reikalavimą galima įvykdyti pasinaudojus 6.2 priedėlio (6) lygtimi, kurią pritaikius galima apskaičiuoti KS, μm ir θSC vertes ir kritinę dumblo išbuvimo trukmę.
                                 (Antraip apytiksles KS ir μm vertes galima nustatyti naudojant nesudėtingą kompiuterinę programą, kad pagal 2 lygtį (6.2 priedėlis) apskaičiuota teorinė kreivė būtų suderinama su gautomis eksperimentinėmis vertėmis. Nors joks nurodytas tirpalas nebus unikalus, tačiau galima apskaičiuoti apytiksles KSr ir μm vertes).
                              
                           
                        Rezultatų kintamumas
                     
                     
                                 29.
                              
                              
                                 Įprastas dalykas, kad nustatomos pavienių cheminių medžiagų skirtingos kinetinių parametrų vertės. Paprastai laikoma, kad dumblo ruošimo sąlygos bei pagrindinės bandymo sąlygos (nurodytos 5 pastraipoje ir atliekant kitus bandymus) daro didelį poveikį nustatomoms vertėms. Vieną iš šio kintamumo atžvilgių aptaria Grady ir kt. (4), kuris pasiūlė, kad terminai „esamas“ ir „būdingas“ turėtų būti taikomi dviem ekstremaliosioms sąlygoms, apibūdinančioms tas fiziologinės būklės ribas, kuriomis atliekant bandymą įmanoma apibūdinti sėjimo kultūrą. Jeigu atliekant bandymą nenumatoma galimybė būklei kisti, šiuo atveju kinetinių parametrų vertės atitinka aplinkos sąlygas, kuriomis mikroorganizmai buvo paimti; šios vertės vadinamos „esamomis“ arba užtikrinamomis šiuo metu. Savo ruožtu, jeigu atliekant bandymą nustatomos tokios sąlygos, kad būtų sudaryta galimybė sukurti baltymų sintezės sistemą ir taip užtikrinta didžiausia galima augimo norma, apskaičiuoti kinetiniai parametrai vadinami „būdingais“ ir jie priklauso tik nuo substrato pobūdžio bei sėjimo kultūros bakterijų tipo. Rekomendacinės esamosios vertės apskaičiuojamos išlaikant mažą substrato koncentracijos ir atitinkamų mikroorganizmų (So/Xo) santykį, pvz., 0,0025, ir būdingosios vertės nustatomos taikant didelį santykį, pvz., bent jau 20. Abiem atvejais So vertė turėtų būti lygi atitinkamai Ks vertei ar ją viršyti, pusinės soties konstanta.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 Kintamumas ir kiti biologinio skaidumo kinetiniai parametrai buvo aptarti neseniai surengtame SETAC seminare (5). Remiantis šiais tyrimais, pateikiant jų ataskaitas ir rengiant jų projektus ateityje bus galima aiškiau suprasti nuotekų valymo įrenginiuose galiojančius kinetinius parametrus siekiant patikimiau aiškinti turimus duomenis bei siūlyti tinkamesnius būsimų bandymų metodų projektus.
                              
                           
                        LITERATŪRA
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33–48.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340–343.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411–422.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742–748.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4–6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
                              
                           
                  
                     6.1 priedėlis
                     
                        Akytasis indas su SRT kontrole
                     
                     
                        
                  
                  
                     6.2 priedėlis
                     
                        Kinetinių konstantų apskaičiavimas
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Padarius prielaidą, kad taikoma Mono kinetika ir atsižvelgiant į veikliųjų kietųjų medžiagų bei substrato masių balansą veikliojo dumblo sistemoje (1) galima sudaryti šias nuostovios būsenos išraiškas:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [1]
                                          
                                       arba
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [2]
                                          
                                       kur:
                                 
                                             S1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             substrato koncentracija ištakyje, (mg/l)
                                          
                                       
                                             KS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             pusinės soties konstanta, kuriai esant koncentracija μ = μm/2 (mg/l)
                                          
                                       
                                             μ
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             savitoji augimo sparta (d–1)
                                          
                                       
                                             μm
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             didžiausia μm(d–1) vertė
                                          
                                       
                                             Kd
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             savitoji veikliųjų kietųjų medžiagų irimo sparta (d–1)
                                          
                                       
                                             θS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             vidutinė dumblo išbuvimo trukmė, SRT (d)
                                          
                                       Išnagrinėjus šią lygtį daromos šios išvados:
                                 
                                             i)
                                          
                                          
                                             ištakio koncentracija nėra susijusi su intakio koncentracija (S0); vadinasi, procentinė biologinio skaidymo vertė skiriasi atsižvelgiant į intakio koncentraciją, S0;
                                          
                                       
                                             ii)
                                          
                                          
                                             vienintelis įrenginio kontrolinis parametras, darantis poveikį S1, yra dumblo išbuvimo trukmė, θS;
                                          
                                       
                                             iii)
                                          
                                          
                                             jeigu intakyje koncentracijos vertė yra S0, kritinė dumblo išbuvimo trukmė būtų:
                                             
                                                         
                                                            
                                                      
                                                      
                                                         [3]
                                                      
                                                   kur:
                                             θSC= kritinė dumblo išbuvimo trukmė; jeigu ji būtų trumpesnė, šiuo atveju atitinkami mikroorganizmai būtų pašalinami iš įrenginio.
                                          
                                       
                                             iv)
                                          
                                          
                                             kiti lygties (2) parametrai siejami su kinetiniais augimo parametrais, todėl temperatūros vertė, tikėtina, darys poveikį ištakio substrato lygiui ir kritiniam dumblo amžiui, t. y. dumblo išlaikymo trukmė, būtina užtikrinant tam tikrą valymo laipsnį ilgėja, jeigu pasirenkama žemesnė temperatūra.
                                          
                                       
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Atsižvelgiant į akytojo indo sistemos kietųjų medžiagų masės balansą ir darant prielaidą, kad kietųjų medžiagų koncentracija įrenginio ištakyje X2, palyginti su koncentracija aeracijos rezervuare, yra maža, X1, dumblo išbuvimo trukmė
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [4]
                                          
                                       ir
                                 
                                    
                                 kur:
                                 
                                             V
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             aeracijos rezervuaro tūris (l)
                                          
                                       
                                             X1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             kietųjų medžiagų koncentracija aeracijos rezervuare (mg/l)
                                          
                                       
                                             X2
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             kietųjų medžiagų koncentracija ištakyje (mg/l)
                                          
                                       
                                             Q0
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             ištakio srautas (l/d)
                                          
                                       
                                             Q1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             perteklinio dumblo srautas (l/d)
                                          
                                       Vadinasi, iš anksto pasirinktą bet kokią dumblo išbuvimo trukmę įmanoma kontroliuoti reguliuojant perteklinio dumblo srautą Q1.
                                 Išvados
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Pagrindinis bandymo tikslas – leisti susidaryti ištakio koncentracijai ir, vadinasi, taip numatyti bandomosios cheminės medžiagos lygius priimančiuosiuose vandenyse.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Brėžiant S1 kreivę, kai atsižvelgiama į θS, kartais įmanoma nesunkiai įvertinti kritinę dumblo išbuvimo trukmę, pvz., 3 kreivė 1 pvz., Jeigu šito padaryti neįmanoma, θSC galima apskaičiuoti, kartu su apytikrėmis μm ir KS vertėmis, kai S1 kreivė brėžiama atsižvelgiant į S1•θS.
                                 Pertvarkius 1 lygtį gaunama
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [5]
                                          
                                       Jeigu Kd vertė yra maža, šiuo atveju 1 + θs • Kd ~ 1 ir [5] virsta:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [6]
                                          
                                       Vadinasi, brėžiamas grafikas turėtų būti tiesi linija (žr. 2 pav.), kurios krypties koeficientas 1/μm, ir atkarpa KS/μm; taip pat θS ~1/μm.
                                 
                                    1   paveikslas
                                 
                                 
                                    Trys temperatūros vertės; penkios SRT vertės
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    2   paveikslas
                                 
                                 
                                    Regresijos tiesė SRT S1 atsižvelgiant į S1, kai T = 5 °C
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    Žodynėlis
                                 
                                 ištakio koncentracija
                                 kreivė
                              
                           
                  
                     7 priedėlis
                     BANDYMAS ESANT MAŽAM (μg/l) KONCENTRACIJOS INTERVALUI
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Daug cheminių medžiagų vandens aplinkoje, net nuotekose, būna labai mažos koncentracijos (μg/l). Kadangi jų koncentracijos mažos, todėl šios cheminės medžiagos, ko gero, nėra augimą sukeliantys pirminiai substratai ir veikiau tikėtina, kad jos būsiančios suskaidytos kaip neaugantys antriniai substratai, veikiantys kartu su gamtoje pasitaikančiomis organinėmis medžiagomis. Vadinasi, šių cheminių medžiagų skaidymas neatitinka 6 priedėlyje aprašyto modelio. Aprašyta daug modelių, kuriuos būtų galima taikyti, ir atsižvelgiant į nuotekų valymo sistemose pasirenkamas sąlygas vienu metu galima taikyti daugiau negu vieną modelį. Siekiant išspręsti šį klausimą privaloma atlikti kur kas daugiau mokslinių tyrimų.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Kol kas galima taikyti pagrindinėje teksto dalyje (C.10 A skyriuje) aprašytą procedūrą, tačiau tik pirminio biologinio skaidumo atžvilgiu, ir šiuo tikslu naudoti tinkamas mažas koncentracijas (< 100 μg/l) ir patvirtintas analizės procedūras. Procentinę biologinę skaidymo vertę galima apskaičiuoti (žr. Bandymo metodo 54 pastraipą), jeigu atsižvelgiama į abiotinius procesus (adsorbciją, lakumą ir t. t.). Pavyzdžiu laikytinas Niholmo ir jo kolegų (1)(2) atliktas tyrimas naudojant 4 val. ciklą pildymo ir išleidimo sistemoje. Jie pateikė 5 cheminių medžiagų, įterpiamų į sintetines nuotekas (5–100 μg/l), pseudopirmojo laipsnio konstantas. (Nustatant visišką biologinį skaidymą galima naudoti 14C pažymėtąsias bandomąsias chemines medžiagas). Minėtas aprašymas nepatenka į šio bandymo metodo taikymo sritį, nes kol kas nėra parengtų suderintų procedūrų, nors į standarte ISO 14 592 (3) pasiūlytą metodą įtrauktos 14C paženklintųjų cheminių medžiagų naudojimo gairės.
                              
                           
                        SCAS bandymas
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Vėliau buvo pasiūlytas paprastesnis dviejų etapų bandymas (4) (5) (6); po pusiau nepertraukiamo veikimo aktyviojo dumblo (SCAS) metodo atliekami trumpalaikiai kinetiniai bandymai su mėginiais, paimtais iš SCAS įrenginių. SCAS sistema naudojama žinant šalinamo dumblo kiekį (priešingai negu originaliame C.12 bandymo metode) ir į ją tiekiamos modifikuotos OECD sintetinės nuotekos arba buitinės nuotekos. Sintetinės nuotekos buvo modifikuotos (dėl kintančios pH vertės ir per mažos dumblo nusėdimo gebos) į jas įterpiant fosfato buferio, mielių ekstrakto, geležies (III) chlorido ir mikroelementų druskų bei jų COD vertė padidinta maždaug 750 mg/l (šiuo tikslu padidinta peptono ir mėsos ekstrakto koncentracija). Įrenginiai naudoti 24 val. ciklu: 23 val. aeracija, dumblo šalinimas, nusodinimas, nusistojusio skysčio (ištakio šalinimas), tada sintetinių nuotekų ir bandomosios cheminės medžiagos įterpimas, ne didesnės negu 100 μg/l koncentracijos (t. y. maždaug tokia pati koncentracija kaip naudotoji atliekant trumpalaikį bandymą). Kartą per savaitę 10 % bendro dumblo kiekio pakeičiama šviežiu dumblu siekiant išlaikyti subalansuotą mikrobų populiaciją.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Pradėjus aeraciją ir ją užbaigus matuojamos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos ir bandymas tęsiamas tol, kol užtikrinamas tolygus bandomosios cheminės medžiagos šalinimas; šis procesas trunka nuo vienos savaitės iki kelių mėnesių.
                              
                           
                        Trumpalaikis bandymas
                     
                     
                                 5.
                              
                              
                                 Trumpalaikis bandymas (pvz., 8 val.) atliekamas siekiant nustatyti veikliajame dumble, kurio kilmė yra žinoma, tačiau skirtinga, esančios bandomosios cheminės medžiagos irimo pseudopirmojo laipsnio kinetinę konstantą. Dumblo ėminiai paimami iš SCAS reaktorių – aeracijos laikotarpio pabaigoje, kai organinio substrato koncentracija maža – atliekant aklimatizacijos eksperimentą (3, 4 pastraipos). Dumblą taip pat galima paimti ir palyginti iš gretimo SCAS įrenginio, kuriame nenaudota bandomoji cheminė medžiaga. Įterpiami dviejų ar daugiau koncentracijų (koncentracijos intervalas 1–50 μg/l) dumblo ir bandomosios cheminės medžiagos mišiniai yra aeruojami nepridedant sintetinių nuotekų arba kito organinio substrato. Ne ilgesnį negu 24 val. laikotarpį reguliariais intervalais nustatomas tirpale likusios bandomosios cheminės medžiagos kiekis, pvz., kas valandą (šiuo atžvilgiu paisoma cheminės medžiagos skaidomumo). Prieš atliekant būtiną analizę ėminiai yra centrifuguojami.
                              
                           
                        Apskaičiavimai
                     
                     
                                 6.
                              
                              
                                 Naudojant SCAS įrenginius gauti duomenys taikomi apskaičiuojant bandomosios cheminės medžiagos procentinę šalinimo dalį (54 pastraipa). Taip pat vidutinę greičio konstantą K1 (normalizuotą suspenduotų medžiagų koncentraciją) galima apskaičiuoti pagal šią lygtį:
                                 
                                    
                                 kur:
                                 
                                             t
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             aeracijos trukmė (23 val.)
                                          
                                       
                                             Ce
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentracija aeracijos laikotarpio pabaigoje (μg/l)
                                          
                                       
                                             Ci
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentracija aeracijos laikotarpio pradžioje (μg/l)
                                          
                                       
                                             SS
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             veikliojo dumblo suspenduotų medžiagų koncentracija (g/l)
                                          
                                       
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Atliekant trumpalaikį bandymą brėžiama likusios log % koncentracijos priklausomybė nuo trukmės ir linijos pradinės dalies (10–50 % skaidymas) statumas yra tapatus K1. Konstanta normalizuojama dumblo kietųjų medžiagų koncentracijos atžvilgiu ir šiuo tikslu kreivės krypties koeficientas dalinamas iš dumblo kietųjų medžiagų koncentracijos. Į pateikiamą rezultatą taip pat turi būti įtraukta informacija apie bandomosios cheminės medžiagos koncentracijas ir suspenduotas medžiagas, dumblo išbuvimo trukmę, dumblo įkrovą, šaltinį ir duomenys (jeigu turima) apie bandomosios cheminės medžiagos pradinį poveikį.
                              
                           
                        Rezultatų kintamumas
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Kintamumas ir kiti biologinio skaidumo kinetiniai parametrai buvo aptarti neseniai surengtame SETAC seminare (7). Remiantis šiais tyrimais, pateikiant jų ataskaitas ir rengiant jų projektus ateityje bus galima aiškiau suprasti nuotekų valymo įrenginiuose galiojančius kinetinius parametrus siekiant patikimiau aiškinti turimus duomenis bei siūlyti tinkamesnius būsimų bandymų metodų projektus.
                              
                           
                        LITERATŪRA
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339–353.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505–1510.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality - Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations in water.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851–864.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711–735.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4–6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
                              
                           
                  
                     C. 10-B.   Biologinės plėvelės
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Modeliavimo bandymai paprastai atliekami su cheminėmis medžiagomis, kurios neatitiko lengvo biologinio skaidomumo atrankos bandymo (šio priedo (9) C.4 A–F skyrius), tačiau kurios atitiko būdingojo biologinio skaidumo bandymo reikalavimus. Visų pirma modeliavimo bandymai taip pat taikomi bet kokiai cheminei medžiagai, apie kurią būtina gauti daugiau informacijos, ypač tas chemines medžiagas, kurių gaminami dideli kiekiai, o šiaip atliekamas veikliojo dumblo bandymas (C.10 A). Tačiau tam tikromis aplinkybėmis būtina speciali informacija apie cheminės medžiagos elgseną, kai ši medžiaga naudojama valant nuotekas, jeigu taikoma biologinė plėvelė, būtent laistomieji reaktoriai, pasukamieji nardinamieji reaktoriai, kybantieji sluoksniai.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Gerike ir kt. (1) naudojo didelius, bandomųjų matmenų laistomuosius reaktorius, kuriuos naudojant taikyta bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio mikrobų populiacijos suvienodinimo procedūra. Šie reaktoriai užima daug vietos ir jiems reikia palyginti didelių nuotekų ar sintetinių nuotekų kiekių. Truesdale ir kt. (2) aprašo mažesnius filtrus (6 pėd. × 6 col. skersmens), į kuriuos tiekiamos nuotekos be paviršinio aktyvumo medžiagos, tačiau kuriems vis tiek būtina tiekti gana didelius kiekius. Reikalingas ne trumpesnis negu 14 savaičių laikotarpis, kol susiformuoja „brandi“ biologinė plėvelė, ir būtinas papildomas 4–8 savaičių laikotarpis po bandomosios paviršinio aktyvumo medžiagos įterpimo, kad galėtų vykti aklimatizavimo procesas.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Baumann ir kt. (3) sukūrė kur kas mažesnį filtrą, kuriame naudojami poliesterio minkštos masės strypeliai, iš anksto panardinami į veiklųjį dumblą, atstojantį biologinės plėvelės formavimąsi skatinančią inertinę terpę. Naudota bandomoji cheminė medžiaga, kuri buvo vienintelis anglies šaltinis, ir biologinis skaidumas įvertinamas išmatavus ištirpusios organinės anglies (DOC) vertę intakyje ir ištakyje bei atsižvelgiantį į CO2 kiekį išėjimo dujose.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Visiškai skirtingo požiūrio laikėsi Gloyna ir kiti. (4), kuris išrado sukamąjį vamzdinį reaktorių. Ant pasukamojo vamzdžio vidinio paviršiaus žinomame plote buvo išauginta biologinė plėvelė; šiuo tikslu per nedideliu kampu į horizontalę pakreipto vamzdžio viršutinę dalį buvo leidžiamas intakis. Naudojant reaktorių buvo tiriamas paviršinio aktyvumo medžiagų biologinis skaidumas (5) ir nustatinėjamas tinkamiausias biologinės plėvelės storis bei per plėvelę vykstanti difuzija (6). Kiti autoriai toliau tobulino reaktorių, įskaitant jo modifikavimą, kad būtų įmanoma nustatyti CO2 kiekį išėjimo dujose.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Sukamąjį vamzdinį reaktorių Analitikų nuolatinis komitetas (Jungtinė Karalystė) patvirtino kaip standartinį metodą, taikytiną įvertinant cheminių medžiagų biologinį skaidumą (7), nuotekų apdorojamumą ir jų toksiškumą (8). Toliau aprašytiems metodams būdingas paprastumas, glaustumas, atkuriamumas ir juos taikant naudojamas palyginti nedidelis organinės terpės kiekis.
                           
                        BANDYMO METODO ESMĖ
                  
                              6.
                           
                           
                              Ant iš lėto besisukančio pakreipto vamzdžio vidinio paviršiaus pilamos sintetinės ar buitinės nuotekos ir bandomoji cheminė medžiaga (pilamas jų mišinys ar jos pilamos atskirai). Ant vidinio paviršiaus išauginamas į biologinio filtro terpėje naudojamuosius mikroorganizmus panašių mikroorganizmų sluoksnis. Pasirenkamos tokios reaktoriaus eksploatavimo sąlygos, kad būtų užtikrinamas reikiamas organinės medžiagos šalinimas ir, jeigu reikia, amonio oksidavimas.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Ištakis iš vamzdžio yra surenkamas ir arba nusodinamas, ir (arba) filtruojamas; tada taikant specialų metodą atliekama ištirpusios organinės anglies (DOC) ir bandomosios cheminės medžiagos analizė. Tuo pačiu metu ir tomis pačiomis sąlygomis, siekiant turėti galimybę palyginti, eksploatuojami kontroliniai įrenginiai, kuriems bandomoji cheminė medžiaga nėra tiekiama. DOC koncentracijų skirtumas ištakyje iš bandomojo ir kontrolinio įrenginių laikomas atsiradusiu dėl bandomosios cheminės medžiagos arba jos organinių metabolitų. Šis skirtumas lyginamas su įterpiamos bandomosios cheminės medžiagos koncentracija (kaip DOC) siekiant apskaičiuoti pašalinamą bandomosios cheminės medžiagos kiekį.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Biologinį skaidymą nuo bioadsorbcijos paprastai įmanoma atskirti nuodugniai išnagrinėjus šalinimo ir laiko kreivę. Patvirtinimą paprastai galima užsitikrinti atliekant lengvo biologinio skaidymo bandymą (deguonies suvartojimo arba anglies dioksido susidarymo); šiuo atveju naudojama aklimatizuota sėjimo kultūra, bandymo pabaigoje paimta iš reaktorių, į kuriuos tiekiama bandomoji cheminė medžiaga.
                           
                        INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
                  
                              9.
                           
                           
                              Bandomosios cheminės medžiagos grynumas, tirpumas vandenyje, lakumas ir sugerties charakteristikos turėtų būti žinomos siekiant teisingai aiškinti rezultatus.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Su lakiosiomis ir mažai tirpiomis cheminėmis medžiagomis paprastai neįmanoma atlikti bandymų, jeigu nesiimama specialių atsargumo priemonių (žr. C.10 skyriaus 5 priedėlį). Taip pat turėtų būti žinoma cheminė struktūra ar bent jau empirinė formulė siekiant apskaičiuoti teorines vertes ir (arba) patikrinti išmatuotas parametrų vertes, pvz., teorinį deguonies poreikį (toliau – ThOD), ištirpusią organinę anglį (DOC).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Informacija apie bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą mikroorganizmams (žr. C,10 A skyriaus 4 priedėlį) gali praversti renkantis atitinkamas atliekant bandymą taikomas koncentracijas ir gali būti svarbi aiškinant mažas biologinio skaidumo vertes.
                           
                        ATITIKTIES LYGIAI
                  
                              12.
                           
                           
                              Iš pradžių buvo reikalauta, kad paviršinio aktyvumo medžiagų pirminis biologinis skaidumas būtų 80 % ar didesnis, ir šiuo atveju cheminę medžiagą būdavo leidžiama pateikti rinkai. Jeigu neužtikrinama 80 % vertė, galima atlikti šį modeliavimo (patvirtinimo) bandymą ir paviršinio aktyvumo medžiagą rinkai galima pateikti tik tuo atveju, jeigu pašalinama daugiau negu 90 % konkrečios cheminės medžiagos. Dėl cheminių medžiagų apskritai nekeliamas atitikties ir (arba) neatitikties klausimas ir užtikrinamą procentinę pašalinimo dalį galima naudoti apytiksliai apskaičiuojant galimą koncentraciją aplinkoje, taikytiną įvertinant cheminių medžiagų keliamą pavojų. Atlikus grynųjų cheminių medžiagų tam tikrą skaičių tyrimų nustatyta, kad daugiau negu trimis ketvirčiais atvejų buvo pašalinta > 90 % DOC ir 80 % pašalinta daugiau negu 90 % cheminių medžiagų atveju, kurioms nebuvo būdingas bent kiekis didesnis biologinis skaidumas.
                           
                        ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS
                  
                              13.
                           
                           
                              Siekiant užtikrinti, kad bandymo procedūra būtų taikoma pagal reikalavimus, tikslinga retkarčiais atlikti bandymus su etaloninėmis cheminėmis medžiagomis, kurių ypatybės yra žinomos. Šioms cheminėms medžiagoms priskiriama adipo rūgštis, 2-fenilfenolis, 1-naftoliai, difeno rūgštis, 1-naftalenkarboksirūgštis.
                           
                        BANDYMO REZULTATŲ ATKURIAMUMAS
                  
                              14.
                           
                           
                              Laboratorija Jungtinėje Karalystėje nustatė, kad santykinis standartinis nuokrypis atliekant bandymus turi būti 3,5 % ir 5 % tarp bandymų (7).
                           
                        BANDYMO METODO APRAŠYMAS
                  
                     Įrenginys
                  
                  
                     Sukamieji vamzdiniai reaktoriai
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Įrenginį sudaro (žr. 8 priedėlio 1 ir 2 pav.) akrilo vamzdžių grupė (kiekvieno ilgis 30,5 cm ir 5 cm vidinis skersmuo), paremta guma apjuostais ratais, įtaisytais į metalinį atraminį rėmą. Kiekvienas vamzdis turi išorinę briauną (apie 0,5 cm storio), kad jis nenuslystų nuo ratų, vidaus paviršius išklotas šiurkščia iš labai plonų minkštojo plieno pluošto siūlelių pagaminta kempine ir viršutinėje (tiekimo) dalyje yra 0,5 cm storio skystį sulaikanti vidinė briauna. Vamzdžiai į horizontalę pakreipti maždaug vieno laipsnio kampu, kad bandomąją terpę leidžiant į švarų vamzdį būtų užtikrinama reikiama sąlyčio trukmė. Gumos juosta apjuosti ratai sukami lėtaeigiu, keičiamo sukių dažnio varikliu. Vamzdžių temperatūra kontroliuojama įrenginį sumontuojant pastoviosios temperatūros patalpoje.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Kiekvieną reaktoriaus vamzdį įdėjus į šiek tiek didesnį užtaisytu galu vamzdį ir užtikrinus, kad jungtys nebūtų laidžios dujoms, šiuo atveju šarminiame tirpale galima surinkti išėjimo CO2 ir tada išmatuoti jų kiekį (6).
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Organinės terpės, į kurią įterpta bandomosios cheminės medžiagos, jeigu taikoma, kiekvienam vamzdžiui tiekimo atsarga 24 val. yra 20 l laikymo inde (A) (žr. 2 pav.). Jeigu reikia, atskirai galima įterpti bandomosios cheminės medžiagos tirpalo. Netoli kiekvieno laikymo indo dugno yra anga, tinkamu vamzdeliu, pvz., iš silikoninio kaučiuko, per peristaltinį siurblį (B) yra sujungta su stikliniu arba akrilo tiekimo vamzdeliu, kuris 2–4 cm įkištas į pakreipto vamzdžio (C) viršutinę (tiekimo) dalį. Ištakiui leidžiama lašėti iš apatinės pakreiptojo vamzdžio dalies; ištakis surenkamas kitame laikymo inde (D). Prieš atliekant analizę laukiama, kol ištakis nusistovi, arba jis filtruojamas.
                           
                        
                     Filtravimo įtaisas–centrifuga
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Ėminių filtravimo įtaisas su būtino akytumo (nominalusis apertūros skersmuo 0,45 μm) membraniniais filtrais, adsorbuojančiais organines chemines medžiagas arba išskiriančiais kuo mažesnį organinės anglies kiekį. Jeigu naudojami organinę anglį išskiriantys filtrai, jie kruopščiai plaunami karštu vandeniu, kad būtų pašalinta išplaunamoji organinė anglis. Antraip leidžiama naudoti centrifugą, tinkančią užtikrinti 40 000 m/s2.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Analizės įranga, naudojama nustatyti:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          DOC ir (arba) bendrąją organinę anglį (TOC) arba cheminį deguonies suvartojimą (COD),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          konkrečią cheminę medžiagą (HPLC, GC ir t. t.), jeigu reikia,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pH, temperatūrą, rūgštingumą, šarmingumą,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          amonio, nitritų ir nitratų kiekį, jeigu bandymas atliekamas nitrifikacijos sąlygomis.
                                       
                                    
                        
                     Vanduo
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Vandentiekio vanduo, kuriame mažiau negu 3 mg/l DOC.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Distiliuotas ar dejonizuotas vanduo, kuriame mažiau negu 2 mg/l DOC.
                           
                        
                     Organinė terpė
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Kaip organinę terpę leidžiama naudoti sintetines nuotekas, buitines nuotekas ar abiejų mišinį. Įrodyta, kad naudojant tik buitines nuotekas pašalinama didesnė procentinė DOC dalis (veikliojo dumblo įrenginiuose) ir kad šiuo atveju net įmanoma biologiškai skaidyti tam tikras chemines medžiagas, nors šios cheminės medžiagos nėra biologiškai skaidomos, jeigu naudojamos OECD sintetinės nuotekos. Vadinasi, rekomenduojama naudoti buitines nuotekas. Išmatuojamos kiekvienos organinės terpės naujos partijos DOC (arba COD) vertės. Turėtų būti žinoma organinės terpės rūgštingumo arba šarmingumo vertė. Jeigu rūgštingumo ar šarmingumo vertė yra per maža, į organinę terpę gali tekti įleisti tinkamo buferinio tirpalo (natrio hidrokarbonato arba kalio dihidrofosfato), kad atliekant bandymą pH vertė reaktoriuje būtų maždaug 7,5 ± 0,5. Įterptinas buferinio tirpalo kiekis nustatomas ir jo įterpimo laikas pasirenkamas kiekvienu pavieniu atveju.
                           
                        
                     Sintetinės nuotekos
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Kiekviename vandentiekio vandens litre ištirpinama: 160 mg peptono, 110 mg mėsos ekstrakto, 30 mg karbamido, 28 mg bevandenio kalio dihidrofosfato (K2HPO4), 7 mg natrio chlorido (NaCl), 4 mg kalcio chlorido dihidrato (CaCl2.2H2O), 2 mg magnio sulfato heptahidrato (Mg2SO4.7H20). Šios OECD sintetinės nuotekos yra pavyzdinės ir jas naudojant užtikrinama vidutinė 100 mg/l DOC koncentracija intakyje. Antraip leidžiama naudoti kitokias sudėtis, kai užtikrinama beveik tokia pati DOC koncentracija, kuri labiau atitinka tikrųjų nuotekų vertę. Koncentruotų šių sintetinių nuotekų galima pasiruošti iš distiliuoto vandens ir jas laikyti vieną savaitę maždaug 1 °C temperatūroje. Jeigu reikia, skiedžiama vandentiekio vandeniu. (Ši terpė neatitinka reikalavimų, pvz., azoto koncentracija yra labai didelė, palyginti maža anglies koncentracija, tačiau kol kas geresnė priemonė nėra pasiūlyta, t. y. kaip buferinio skysčio įterpti daugiau fosfato ir papildomą peptono kiekį).
                           
                        
                     Buitinės nuotekos
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Naudojamos šviežios nusistovėjusios nuotekos, kiekvieną dieną rinktos iš valymo įrenginių, į kuriuos daugiausiai patenka buitinės nuotekos. Jos turėtų būti renkamos iki pirminio nusodinimo ir iš pirminio nusodinimo rezervuaro nuleidimo kanalo arba iš veikliojo dumblo įrenginio tiekimo bei turi būti beveik be stambiųjų dalelių. Nuotekas galima naudoti jas palaikius kelias dienas maždaug 4 °C temperatūroje, jeigu įrodoma, kad laikant DOC vertė (arba COD vertė) nėra kiek daugiau sumažėjusi (t. y. mažiau negu 20 %). Siekiant apriboti sistemos trukdžius kiekvienos naujos partijos DOC vertė (arba COD vertė) prieš pradedant naudoti turėtų būti reguliuojama atsižvelgiant į atitinkamą pastovią vertę, pvz., skiedžiant vandentiekio vandeniu.
                           
                        
                     Tepalas
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Glicerolio arba alyvuogių aliejumi leidžiama tepti peristaltinio siurblio velenėlius: abu aliejus leidžiama naudoti su silikoninio kaučiuko vamzdeliais.
                           
                        
                     Pradiniai bandomosios cheminės medžiagos tirpalai
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Atitinkamo tirpumo cheminių medžiagų pradiniai tirpalai pasiruošiami reikiamos koncentracijos (pvz., 1–5 g/l) iš dejonizuoto vandens ar iš sintetinių nuotekų mineralinės dalies. Dėl netirpiųjų cheminių medžiagų žr. C.10 A skyriaus 5 priedėlį. Šis metodas nepritaikytas lakiosioms cheminėms medžiagoms, jeigu vamzdiniai reaktoriai nėra modifikuoti (16 pastraipa). Nustatomos pradinių tirpalų DOC ir TOC vertės ir pakartojami kiekvienos naujos partijos matavimai. Jeigu DOC ir TOC vertės skirtumas viršija 20 %, patikrinamas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas vandenyje. Bandomosios cheminės medžiagos DOC vertė arba koncentracijos vertė, išmatuota taikant specialią pradinio tirpalo analizę, lyginama su nominaliąja verte siekiant nustatyti, ar atsistatymas yra ganėtinai geras (paprastai galima tikėtis > 90 %). Įvertinama, visų pirma dispersijų atžvilgiu, ar DOC galima ar negalima naudoti kaip analizės parametro, arba įmanoma naudoti tik bandomajai cheminei medžiagai būdingą analizės metodą. Iš dispersijų paimti mėginiai turi būti centrifuguojami. Naudojant specialų analizės metodą išmatuojama kiekvienos naujos partijos DOC, COD vertė arba bandomosios cheminės medžiagos kiekis.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Nustatoma pradinio tirpalo pH vertė. Jeigu nustatomos kraštutinės vertės, jos patvirtina, kad bandymo sistemos veikliojo dumblo pH vertei galėjo būti padarytas poveikis pridėjus cheminės medžiagos. Šiuo atveju pradinis tirpalas neutralizuojamas mažu neorganinės rūgšties ar bazės kiekiu siekiant užtikrinti, kad pH vertė būtų 7 ± 0,5, tačiau privaloma rūpintis, jog nebūtų nusodinama bandomoji cheminė medžiaga.
                           
                        PROCEDŪRA
                  
                     Organinės terpės paruošimas dozavimui
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Užtikrinama, kad intakio ir ištakio talpyklos bei intakio indų ir ištakio indų jungiamieji vamzdeliai būtų kruopščiai išvalyti, kad iš pat pradžių ir atliekant bandymą būtų užkirstas kelias augti mikroorganizmams.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Iš kietųjų medžiagų arba iš koncentruoto pradinio tirpalo kiekvieną dieną pasiruošiama sintetinių nuotekų (23 pastraipa); jos ruošiamos tinkamai skiedžiant vandentiekio vandenį. Išmatuojamas būtinasis kiekis cilindre ir pridedama į švarų intakio indą. Taip pat, jeigu reikia, į sintetines nuotekas prieš skiedimą įdedamas reikiamas kiekis bandomosios cheminės medžiagos pradinio tirpalo arba etaloninės cheminės medžiagos. Bandomosios cheminės medžiagos atskirą atskiestą tirpalą leidžiama pasiruošti atskiroje talpykloje ir į pakreiptuosius vamzdžius šį tirpalą tiekti skirtingu dozavimo siurbliu, jeigu taip ruoštis tirpalą yra patogiau arba jeigu būtina išvengti bandomosios cheminės medžiagos nuostolių.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Antraip (šiam būdui teikiama pirmenybė) naudojamos kiekvieną dieną šviežiai surinktos, jeigu įmanoma, nusistovėjusios buitinės nuotekos (24 pastraipa).
                           
                        
                     Sukamųjų vamzdinių reaktorių naudojimas
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Vienai bandomajai cheminei medžiagai ištirti reikalingi du tapatūs vamzdiniai reaktoriai, kurie sumontuojami pastovios temperatūros (paprastai 22 ± 2 °C) patalpoje.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Peristaltiniai siurbliai sureguliuojami taip, kad į 18 ± 2 sūk./min. sukamus pakreiptus vamzdžius būtų tiekiama 250 ± 25 ml/h organinės terpės (be bandomosios medžiagos). Atliekant bandymą siurblio vamzdžiai iš pradžių ir paskui reguliariai sutepami tepalu (25 pastraipa) norint užtikrinti tinkamą veikimą ir prailginti vamzdyno eksploatavimo trukmę.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Vamzdžių pokrypis į horizontalę sureguliuojamas taip, kad tiekiamos medžiagos išbuvimo trukmė švariame vamzdyje būtų 125 ± 12,5 sek. Išbuvimo trukmė apskaičiuojama į mitybinę terpę pridedant nebiologinio žymeklio (pvz., NaCL, inertinio dažiklio): trukmė, per kurią sukuriama didžiausia koncentracija ištakyje, laikoma vidutine išbuvimo trukme (jeigu naudojama storiausia plėvelė, šiuo atveju išbuvimo trukmė gali pailgėti ne daugiau negu 30 min.).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Nustatyta, kad taikant šias normas, greitį ir trukmę užtikrinamas pakankamas (> 80 %) DOC (arba COD) pašalinimas ir paruošiami nitrifikuoti ištakiai. Srauto dydis turėtų būti keičiamas, jeigu šalinimas yra nepakankamas arba jeigu turi būti modeliuojama konkretaus valymo įrenginio veikla. Pastaruoju atveju organinės terpės dozavimo norma koreguojama taip, kad reaktoriaus veiklos parametrai atitiktų valymo įrenginio veiklos parametrus.
                           
                        
                     Sėjimo kultūros įdėjimas
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Jeigu naudojamos sintetinės nuotekos, kad pradėtų augti mikroorganizmai gali pakakti oru atliekamo sėjimo kultūros įdėjimo, tačiau antraip būtina 3 dienas pridėti po 1 ml/l nusodintojo dumblo.
                           
                        
                     Matavimai
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Reguliariais intervalais tikrinama, ar dozės, normos ir sūkių dažnio vertės atitinka nustatytąsias ribines vertes. Taip pat matuojama ištakio pH vertė, ypač tuo atveju, jeigu numanoma vyksiant nitrifikacijos procesą.
                           
                        
                     Ėminių ėmimas ir analizė
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Ėminių ėmimo metodas, modelis ir dažnumas pasirenkami atsižvelgiant į bandymo tikslą. Pvz., imami žvalgomieji intakio ir ištakio ėminiai arba ėminiai imami ilgesniu laikotarpiu, pvz., 3–6 val. Pirmuoju etapu, kai nenaudojama bandomoji cheminė medžiaga, ėminiai imami du kartus per savaitę. Ėminiai 15 min. (18 pastraipa) filtruojami per membranas ar centrifuguojami maždaug 40 000 m/sec2. Prieš atliekant membraninį filtravimą gali tekti palaukti, kol ėminiai nusistovės ir (arba) juos filtruoti per stambų filtrą. Ne mažiau negu du kartus nustatomos DOC (arba COD) vertės ir, jeigu reikia, BOD, amonio, nitritų ir (arba) nitratų vertės.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Visos analizės turėtų būti atliekamos iš karto po ėminių paėmimo ar jų paruošimo. Jeigu analizių atlikimas turi būti atidedamas, sklidinuose sandariai užkimštuose buteliuose ir tamsoje ėminiai laikomi apie 4 °C temperatūroje. Jeigu ėminius būtina laikyti ilgiau negu 48 val., jie sandėliuojami užšaldyti, parūgštinti arba pridedant tinkamos toksiškos cheminės medžiagos (pvz., 20 ml/l 10 g/l gyvsidabrio (II) chlorido tirpalo). Pasirūpinama, kad naudojant išsaugojimo metodą nebūtų daromas poveikis analizės rezultatams.
                           
                        
                     Darbinės būsenos paruošimo laikotarpis
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Šiuo laikotarpiu paviršinė biologinė plėvelė auga, kol jos storis atitinka optimalią vertę; paprastai šis laikotarpis trunka maždaug dvi savaites ir jo trukmė neturėtų viršyti šešių savaičių. DOC (arba COD) šalinimo vertė (44 pastraipa) didėja ir ima atitikti kreivės plokščiosios srities vertę. Kai abiejuose vamzdžiuose užtikrinama panaši kreivės plokščiosios dalies vertė, vienas iš vamzdžių likusiai bandymo daliai pasirenkamas kaip kontrolinis vamzdis; šioje bandymo dalyje vamzdžių veikimo parametrai neturėtų kisti.
                           
                        
                     Bandomosios cheminės medžiagos įterpimas
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Šiame etape į kitą reaktorių įterpiama reikiamos koncentracijos (paprastai 10–20 mg C/l) cheminė medžiaga. Į kontrolinį vamzdį tiekiama tik organinė terpė.
                           
                        
                     Aklimatizavimo laikotarpis
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Du kartus per savaitę privalomai atliekamos DOC (arba COD) analizės ir, jeigu turi būti įvertintas pirminis biologinis skaidumas, atliekant specialią analizę taip pat matuojama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija. Nuo pirmojo bandomosios cheminės medžiagos įterpimo laukiama nuo vienos iki šešių savaičių (ar ilgiau, jeigu pasirenkamos specialios sąlygos), kol pasibaigia aklimatizavimas. Kai procentinės šalinimo dalies (43–45 pastraipos) vertė ima atitikti didžiausią vertę, per 3 savaites nustatomos 12–15 galiojančių kreivės plokščiosios dalies tarpsnio reikšmių siekiant įvertinti vidutinę šalinimo procentinę dalį. Bandymas laikomas užbaigtu, jeigu užtikrinamas ganėtinai didelis šalinimo laipsnis. Bandymo trukmė paprastai neturi būti ilgesnė negu 12 savaičių po pirmojo bandomosios cheminės medžiagos įterpimo.
                           
                        
                     Plėvelės šalinimas
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Ganėtinai reguliariais intervalais iš vamzdžių staigiai šalinami dideli perteklinės plėvelės kiekiai. Siekiant rezultatų palyginamumą apsaugoti nuo poveikio, atliekant bandymus turi būti aprėpiami bent du išsamūs augimo ir šalinimo ciklai.
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITŲ TEIKIMAS
                  
                     Rezultatų apdorojimas
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Kiekvieno pasirinkto įvertinimo laiko bandomosios cheminės medžiagos šalinimo procentinė DOC arba COD dalis apskaičiuojama pagal šią lygtį:
                              
                                 
                              kur:
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          pašalinta procentinė DOC arba COD dalis t laiko momentu;
                                       
                                    
                                          Cs
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          su bandomąja chemine medžiaga susijusi DOC (arba COD) koncentracija ištakyje; ją geriausiai apskaičiuoti atsižvelgiant į pradinio tirpalo koncentraciją (mg/l) ir pridėtą jo kiekį;
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          t laiko momentu bandomajame ištakyje išmatuota DOC (arba COD) vertė (mg/l);
                                       
                                    
                                          Eo
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          t laiko momentu kontroliniame ištakyje išmatuota DOC (arba COD) vertė (mg/l).
                                       
                                    Apskaičiuojamos etaloninės cheminės medžiagos vertės, jeigu ji bandoma.
                           
                        
                     Kontrolinio reaktoriaus veikimo parametrai
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Atliekant bandymą DOC (arba COD) šalinimo laipsnis (DB) iš kontrolinio reaktoriaus organinės terpės praverčia vertinant biologinės plėvelės biologinio skaidymo veiksmingumą. Pašalinama procentinė dalis apskaičiuojama pagal šią lygtį:
                              
                                 
                              kur:
                              Cm= kontrolinio intakio organinės terpės DOC (arba COD) vertė (mg/l).
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Pašalintas bandomosios cheminės medžiagos kiekis (DST), jeigu matuojama naudojant specialų analizės metodą kiekvieno įvertinimo metu, apskaičiuojamas pagal šią lygtį:
                              
                                 
                              kur:
                              
                                          Si
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          išmatuota arba verčiau apytiksliai apskaičiuota bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandomajame intakyje (mg/l)
                                       
                                    
                                          Se
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          laiko momentu t išmatuota bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandomajame ištakyje (mg/l)
                                       
                                    Jeigu taikant analizės metodus nustatoma nekintančio nuotekų atitikmens teigiamoji vertė Sc mg/l, procentinė šalinimo vertė (DSC) apskaičiuojama pagal šią lygtį:
                              
                                 
                           
                        
                     Tyrimo rezultatų išraiška
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Brėžiamas šalinimo procentinės dalies Dt ir DST (arba DSC), jeigu turima, priklausomybės nuo laiko grafikas (žr. C.10 A skyriaus 2 priedėlį). Naudojamas vidutinis (išreikštas kaip artimiausias sveikasis skaičius) ir standartinis nuokrypis, susijęs su DT (ir DST, jeigu turima) 12–15 verčių, nustatytų kreivės plokščiosios dalies tarpsnyje kaip bandomosios cheminės medžiagos procentinė šalinimo dalis. Atsižvelgiant į šalinimo kreivės formą galima daryti kelias su šalinimo procesais susijusias išvadas.
                           
                        
                     Adsorbavimas
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Jeigu pradėjus bandymą nustatomas didelio kiekio DOC šalinimas iš bandomosios cheminės medžiagos, šiuo atveju tikėtina, kad bandomoji cheminė medžiaga šalinama todėl, kad ją absorbuoja biologinė plėvelė. Šį procesą gali būti įmanoma įrodyti iš plėvelės paimtoje kietojoje medžiagoje nustačius adsorbuotos bandomosios cheminės medžiagos kiekį. Neįprasta, jeigu atliekant bandymą iš adsorbuojamų cheminių medžiagų būtų šalinamas didelis DOC kiekis; paprastai didelis kiekis šalinamas iš pradžių, o vėliau jis laipsniškai mažėja ir prilygsta pusiausvyros vertei. Tačiau jeigu adsorbuojant bandomąją cheminę medžiagą buvo sukeltas mikrobų populiacijos aklimatizavimas, šalinimas DOC kiekis iš bandomosios cheminės medžiagos vėliau turėtų didėti ir atitikti aukštą kreivės plokščiosios srities vertę.
                           
                        
                     Vėlavimo tarpsnis
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              Kaip ir atliekant statinius bandymus, darant daugelio bandomųjų cheminių medžiagų atrankos bandymus būtinas vėlavimo tarpsnis, kol visiškai užbaigiamas biologinis skaidymas. Vėlinimo tarpsnyje skaidančios bakterijos aklimatizuojasi arba prisitaiko ir šiame etape beveik nešalinama bandomoji cheminė medžiaga; tada prasideda pradinis šių bakterijų augimas. Laikoma, kad šis etapas yra pasibaigęs, o skaidymo etapas yra prasidėjęs, jeigu pašalinta maždaug 10 % pradinio bandomosios cheminės medžiagos kiekio (pasibaigus adsorbcijai, jeigu ji vyksta). Vėlavimo tarpsnis dažnai būna labai kintantis, todėl jį sunkiai sekasi atkurti.
                           
                        
                     Kreivės plokščiosios dalies tarpsnis
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Atliekant nepertraukiamą bandymą šalinimo kreivės plokščiosios dalies tarpsnis apibrėžiamas kaip didžiausio skaidymo etapas. Kreivės plokščiosios dalies tarpsnis neturėtų būti trumpesnis negu 3 savaitės ir per jį turi būti išmatuota apie 15 galiojančių verčių.
                           
                        
                     Vidutinis bandomosios cheminės medžiagos šalinimo laipsnis
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Vidutinė vertė apskaičiuojama naudojant kreivės plokščiosios dalies tarpsnio bandomosios cheminės medžiagos šalinimo vertes (Dt) (ir Dst, jeigu turima). Suapvalinus iki artimiausio sveikojo skaičiaus (1 %) nustatomas bandomosios cheminės medžiagos šalinimo laipsnis. Taip pat rekomenduojama apskaičiuoti vidutinės vertės 95 % pasikliovimo intervalą. Panašiai apskaičiuojamas organinės terpės kontroliniame inde vidutinis šalinimo laipsnis (DB).
                           
                        
                     Biologinio skaidymo požymiai
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Jeigu biologinė plėvelė neadsorbuoja didesnio bandomosios cheminės medžiagos kiekio ir šalinimo kreivė yra būdinga biologinio skaidymo kreivė su vėlinimu, skaidymo etapą ir kreivės plokščiosios dalies tarpsnį (48, 49 pastraipos), išmatuotą šalinimą galima patikimai laikyti biologiniu skaidymu. Jeigu iš pradžių šalinamas didelis kiekis, modeliavimo bandymas neturi skirtis biologinio ir abiotinio šalinimo procesų atžvilgiais. Šiais atvejais ir kitais atvejais, jeigu kyla kokių nors dvejonių dėl biologinio skaidymo (pvz., jeigu vyksta išpūtimas), analizuojama plėvelės ėminiuose adsorbuota bandomoji cheminė medžiaga ar remiantis biologinius procesus aiškiai apibūdinančiais parametrais atliekami papildomi statiniai (atrankos) biologinio skaidymo bandymai. Šie bandymai – tai deguonies suvartojimo metodai (šio priedo D, E ir F C.4 skyrius) arba CO2 matavimo bandymas (šio priedo V.4–C skyrius arba viršutinės erdvės tyrimas) (10); kaip sėjimo kultūra naudojama iš atitinkamo reaktoriaus paimta iš anksto apdorota biologinė plėvelė.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Jeigu išmatuojamas pašalintas DOC kiekis ir pašalintas konkrečios cheminės medžiagos kiekis ir jeigu nustatomas didelis pašalinimo procentinių dalių skirtumas (pirmoji dalis mažesnė negu pastaroji), šiuo atveju galima daryti prielaidą, kad ištakiuose yra tarpinių organinių produktų, kurie kur kas sunkiau skaidomi; šie dalykai turi būti ištirti.
                           
                        
                     Bandymų rezultatų validumas
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Bandymas laikomas validuotu, jeigu DOC (arba COD) šalinimo laipsnis (DB) kontroliniuose įrenginiuose yra > 80 % po dviejų savaičių, jeigu ir nebuvo pastebėta jokių neįprastų ypatybių.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Jeigu bandoma lengvai biologiškai skaidoma (etaloninė) cheminė medžiaga, biologinio skaidymo laipsnis turėtų būti > 90 % ir bet kokių dviejų verčių skirtumas neturėtų būti didesnis negu 5 %. Jeigu šių dviejų kriterijų nėra laikomasi, šiuo atveju persvarstytinos bandymo procedūros ir (arba) naudotinos kito šaltinio buitinės nuotekos.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Be to, dviejų įrenginių (jeigu naudojami) biologinio skaidymo vertės apdorojant bandomąją cheminę medžiagą neturėtų skirtis daugiau negu 5 %. Jeigu šio kriterijaus vertės neatitinka nustatytųjų, tačiau šalinimo laipsnis yra didelis, analizė atliekama dar tris savaites. Jeigu šalinimo laipsnis yra mažas, tiriamas bandomosios cheminės medžiagos slopinamasis poveikis, jeigu jis nėra žinomas, ir bandymas kartojamas naudojant mažesnę bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją, kai šitą įmanoma padaryti.
                           
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Į bandymo ataskaitą turi būti įtraukiama:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tapatybės nustatymo duomenys,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizinis pobūdis ir, jeigu reikia, fizinės bei cheminės savybės.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bet kokie bandymo sistemos keitimai, ypač tuo atveju, jeigu bandymai atliekami su netirpiomis arba lakiomis medžiagomis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      organinės terpės tipas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pramoninių nuotekų dalis nuotekose ir jų pobūdis, jeigu naudojamos ir žinoma,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sėjimo kultūros įdėjimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pradinis bandomosios cheminės medžiagos tirpalas – DOC (ištirpusios organinės anglies) ir TOC (bendrosios organinės anglies) kiekis; kaip paruošta, jeigu suspensija; naudota (-os) bandymo koncentracija (-os), priežastys, jeigu nesilaikoma intervalo 10–20 mg/l DOC; pridėjimo metodas; pirmo įdėjimo data; bet kokie koncentracijos pokyčiai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vidutinė hidraulinė išbuvimo trukmė (be augimo); vamzdžio sūkių dažnis; apytikslis pokrypio kampas, jeigu jį įmanoma nustatyti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      plėvelės šalinimo informacija; trukmė ir intensyvumas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandymo temperatūra ir intervalas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudoti analizės metodai.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo rezultatai:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      visi išmatuoti duomenys (DOC, COD, speciali analizė, pH, temperatūra, N cheminės medžiagos, jeigu reikia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      visos apskaičiuotosios Dt (arba Dtc), DB, Ds vertės, pateiktos lentelėje ir šalinimo kreivės,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informacija apie vėlinimo ir kreivės plokščiosios dalies tarpsnius, bandymo trukmę, bandomosios cheminės medžiagos, etaloninės cheminės medžiagos (jeigu buvo bandyta) organinės terpės (kontrolinio įrenginio) šalinimo laipsnį bei statistinė informacija ir pareiškimai apie biologinį skaidymą bei bandymo validumas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatų aptarimas.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753–758.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441–444.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355–1357.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92–94.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865–881.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Šio priedo C.4 skyrius. Lengvo biologinio skaidumo nustatymas AF.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of released inorganic carbon in sealed vessels.
                           
                        
                     8 priedėlis
                     
                        1 paveikslas
                     
                     
                        Sukamieji vamzdžiai
                     
                     
                        
                     
                        Žodynėlis
                     
                     plano vaizdas
                     A-B vaizdas
                     varomieji ratai
                     atraminiai ratai
                     pavaros variklis
                     lėtinančioji pavara
                     vidinė briauna
                     kreipimo mechanizmas
                     kūginė krumplinė pavara
                     
                        2 paveikslas
                     
                     
                        Srauto diagrama
                     
                     
                        
                     A: Tiekimo talpykla
                     B: Peristaltinis siurblys
                     C: Sukamasis vamzdis
                     D: Ištakio rinkimo indas
                     
                        SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS:
                     
                     Bandomoji cheminė medžiaga– bet kokia naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga ar mišinys.
                     Cheminės medžiagos– „pabrėžtina, kad terminas „cheminė medžiaga“ UNCED sutartyse ir kituose dokumentuose vartojamas platesne reikšme ir apima chemines medžiagas, produktus, preparatus ar bet kokius kitus terminus, kurie gali būti vartojami esamose sistemose siekiant nurodyti aprėptį“.
                  “
            
                  10)
               
               
                  Įterpiami C.27, C.28, C.29 ir C.30 skyriai:
                  „C.27.   TOKSIŠKUMO BANDYMAS SU CHIRONOMIDAIS NUOSĖDOSE IR VANDENYJE, NAUDOJANT NUOSĖDAS SU ĮTERPTA BANDOMĄJA CHEMINE MEDŽIAGA
                  
                  ĮVADAS
                  
                              2.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires (TG) Nr. 218 (2004). Šiuo bandymo metodu siekiama įvertinti ilgalaikį cheminių medžiagų poveikį nuosėdose gyvenančioms gėlųjų vandenų dvisparnio vabzdžio Chironomus sp. lervoms. Šis bandymas grindžiamas turimais toksiškumo bandymo su Chironomus riparius ir Chironomus tentans protokolais, kurie parengti Europoje (1) (2) (3) ir Šiaurės Amerikoje (4) (5) (6) (7) (8) ir patikrinti tarplaboratorinio lyginimo bandymais (1) (6) (9). Taip pat leidžiama naudoti kitas dvisparnių vabzdžių rūšis, pvz., Chironomus yoshimatsui (10) (11), kurios tinkamai pagrįstos dokumentais.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Pasirinkus šiame bandymo metode naudojamą poveikio metodą į nuosėdas įterpiama bandomoji cheminė medžiaga. Atitinkamo poveikio scenarijaus pasirinkimas priklauso nuo numatomo bandymo taikymo. Pasirinkus bandomosios cheminės medžiagos įterpimo į nuosėdas scenarijų turi būti modeliuojami nuosėdose paprastai susikaupiantys cheminių medžiagų lygiai. Į šią poveikio sistemą įtrauktas bandomosios cheminės medžiagos įtepimas į nuosėdų—vandens bandymo sistemos nuosėdas.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Cheminės medžiagos, kurias būtina ištirti siekiant nustatyti jų poveikį nuosėdose gyvenantiems organizmams, paprastai šiame skyriuje išlieka ilgą laikotarpį. Nuosėdose gyvenančius organizmus galima veikti keliais būdais. Kiekvieno poveikio būdo santykinė svarba ir laikas, sugaištamas, kol taikant kiekvieną būdą užtikrinamas bendrasis toksiškas poveikis, priklauso nuo atitinkamos cheminės medžiagos fizinių ir cheminių savybių. Jei tai lengvai absorbuojamos cheminės medžiagos (pvz., kai Kow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuosėdomis susijusios cheminės medžiagos, užteršto maisto nurijimas galėtų būti tinkamas poveikio būdas. Siekiant, kad stipriomis lipofilinėmis savybėmis pasižyminčių cheminių medžiagų toksiškumas būtų vertinamas tinkamai, galima svarstyti galimybę, ar nereikėtų į nuosėdas įterpti maisto prieš taikant bandomąją cheminę medžiagą. Norint atsižvelgti į visus galimus poveikio būdus pagrindinis dėmesys taikant šį bandymo metodą skiriamas ilgalaikiui poveikiui. Bandymo trukmė naudojant C. Riparius ir C. Yoshimatsui yra 20–28 dienos ir 28–65 dienos, jeigu pasirenkama C. tentans. Jeigu konkrečiam tikslui, pvz., tiriant nestabilių cheminių medžiagų poveikį, būtini trumpalaikiai duomenys, papildomus kartotinius ėminius galima paimti po dešimties parų laikotarpio.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Išmatuotas poveikis yra bendras išsiritusių suaugusiųjų skaičius ir išsiritimo trukmė. Rekomenduojama, kad lervų išgyvenimo ir augimo rodikliai būtų matuojami tik po dešimties parų laikotarpio, jeigu būtini papildomi trumpalaikiai duomenys, ir šiuo atveju, jeigu reikia, naudojant papildomus pakartotinius ėminius.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Rekomenduojama naudoti sintetines nuosėdas. Sintetinės nuosėdos keliais atžvilgiais yra tinkamesnės negu natūralios nuosėdos:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          darant bandymą kintamumas yra sumažinamas, nes kintamumas sudaro atkuriamą „standartinę matricą“ ir nėra būtina nustatyti neužterštą ir švarų nuosėdų šaltinį,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          bandymus galima pradėti bet kuriuo metu ir nepaisyti bandomųjų nuosėdų sezoninio kintamumo bei šiuo atveju nebūtina iš anksto apdoroti nuosėdų, kad iš jų būtų pašalinta būdingoji fauna; naudojant sintetines nuosėdas taip pat sumažinamos išlaidos, išleidžiamos lauke renkant įprastiems bandymams reikalingą nuosėdų kiekį,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          naudojant sintetines nuosėdas galima lyginti toksiškumą ir atitinkamai klasifikuoti chemines medžiagas.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Taikomų sąvokų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                           
                        BANDYMO METODO ESMĖ
                  
                              7.
                           
                           
                              Pirmos stadijos chironomidų lervos veikiamos tam tikros koncentracijos bandomąja chemine medžiaga nuosėdų–vandens sistemose. Bandomoji cheminė medžiaga įterpiama į nuosėdas ir pirmos stadijos lervos sudedamos į bandymo laboratorines stiklines, kuriose nuosėdų ir vandens koncentracijos yra stabilizuotos. Bandymo pabaigoje matuojama chironomidų išsinėrimo ir augimo sparta. Taip pat galima matuoti lervų išgyvenimą ir masę po 10 parų, jeigu reikia (naudojant kartotinius ėminius, kai būtina). Šie duomenys analizuojami taikant regresijos modelį siekiant įvertinti koncentraciją, kuri būtų x % sumažinusi lervų išsinėrimą, arba lervų išgyvenimą ar augimą (pvz., EC15, EC50 ir t. t.) arba hipotezę tikrinant statistiniais kriterijais siekiant nustatyti NOEC/LOEC (stebimo poveikio nedarančią koncentraciją ir (arba) mažiausią stebimo poveikio koncentraciją). Pastaruoju atveju pasitelkus statistinius kriterijus poveikio vertes būtina lyginti su kontrolinėmis vertėmis.
                           
                        INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
                  
                              8.
                           
                           
                              Turėtų būti žinomas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas vandenyje, jos garų slėgis, išmatuotas ar apskaičiuotas nuosėdų susidarymas ir stabilumas vandenyje bei nuosėdose. Turėtų būti prieinamas analizės metodas kiekybiniam bandomosios cheminės medžiagos kiekiui nustatyti paviršiniame vandenyje, porų vandenyje ir nuosėdose su žinomu ir praneštu tikslumu bei aptikimo riba. Naudinga informacija laikytina bandomosios cheminės medžiagos struktūrinė formulė ir grynumas. Bandomosios cheminės medžiagos cheminis išliekamumas (pvz., išsklaidymas, abiotinis ir biotinis suirimas ir t. t.) taip pat laikytinas naudinga informacija. Išsamios bandomųjų cheminių medžiagų, kurios dėl jų fizinių ir cheminių savybių sunkiai pritaikomos bandymams atlikti, gairės pateiktos (12).
                           
                        ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS
                  
                              9.
                           
                           
                              Bandymus su etaloninėmis cheminėmis medžiagomis galima atlikti periodiškai ir juos darant būtų užtikrinama, kad bandymo protokolas ir bandymo sąlygos būtų patikimos. Etaloninės toksiškos medžiagos, tinkamos naudoti atliekant tarplaboratorinio lyginimo bandymus ir patvirtinimo tyrimus: lindanas, trifluralinas, pentachlorfenolis, kadmio chloridas ir kalio chloridas (1) (2) (5) (6) (13).
                           
                        BANDYMO VALIDUMAS
                  
                              10.
                           
                           
                              Bandymas laikomas validuotu, jeigu taikomos šios sąlygos:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          bandymo pabaigoje lervų išsinėrimas kontroliniuose bandiniuose turi būti ne mažesnis negu 70 %; (1) (6),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          
                                             C. riparius ir C. yoshimatsui iš kontrolinių indų suaugėliais turėtų tapti 12–23 dienomis po lervų įleidimo į indus; C. tentans, šis laikotarpis turi būti 20–65 dienos,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          bandymo pabaigoje pH vertė ir ištirpusio deguonies koncentracija turėtų būti matuojama kiekviename inde; deguonies koncentracijos vertė esant naudojamai temperatūrai turėtų būti bent 60 % soties ore vertės ir paviršinio vandens pH vertė visuose bandymo induose turėtų atitikti 6–9 intervalą,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          vandens temperatūra neturėtų skirtis daugiau negu ± 1,0 °C. Vandens temperatūrą galima reguliuoti naudojant izoterminę patalpą ir šiuo atveju patalpos temperatūra turėtų būti patvirtinama atitinkamu laiko intervalu.
                                       
                                    
                        BANDYMO METODO APRAŠYMAS
                  
                     Bandymo indai
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Tyrimas atliekamas naudojant 600 ml laboratorines stiklines (skersmuo 8 cm). Leidžiama rinktis kitus indus, tačiau juos naudojant turėtų būti užtikrinamas tinkamas paviršinio vandens ir nuosėdų storis. Nuosėdų paviršiaus plotas turėtų būti toks, kad vienai lervai tektų 2–3 cm2. Nuosėdų storio ir paviršinio vandens sluoksnio storio santykis turėtų būti 1:4. Bandymo indai ir kiti įrenginiai, kurie liesis su bandymo sistema, turėtų būti vien iš stiklo ar kitos cheminiu atžvilgiu neutralios medžiagos (pvz., teflono).
                           
                        
                     Rūšių pasirinkimas
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Renkantis atliekant bandymą naudojamą rūšį pirmenybė teikiama Chironomus riparius. Taip pat leidžiama naudoti Chironomus tentans, tačiau juos sunkiau prižiūrėti ir jiems būtinas ilgesnis bandymo laikotarpis. Be to, leidžiama naudoti Chironomus yohimatsui. Su Chironomus riparius susiję kultūrų auginimo metodai aprašyti 2 priedėlyje. Taip pat pateikiama informacija apie kitų rūšių, t. y. Chironomus tentans (4) ir Chironomus yoshimatsui (11), kultūrų auginimo sąlygas. Rūšies tapatybės nustatymas turi būti patvirtinamas prieš bandymą, tačiau patvirtinimas nėra būtinas prieš kiekvieną bandymą, jeigu organizmas paimtas iš vietoje išaugintos kultūros.
                           
                        
                     Nuosėdos
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Pirmenybė teikiama pasiruoštoms nuosėdoms (jos dar vadinamos pertvarkytomis, dirbtinėmis ar sintetinėmis nuosėdomis). Tačiau jeigu naudojamos natūralios nuosėdos, turėtų būti nurodomos jų charakteristikos (bent pH, organinės anglies kiekis, kitų parametrų apibrėžtis, pvz., C/N santykis, ir taip pat rekomenduojama pateikti granuliometrinę sudėtį) ir nuosėdose neturi būti jokių teršalų bei kitų organizmų, kurie galėtų konkuruoti su chironomidais ar juos vartoti. Taip pat rekomenduojama, kad prieš nuosėdas pradedant naudoti toksiškumo bandymui su chironomidais, natūralios nuosėdos kondicionuojamos septynias dienas tomis pačiomis sąlygomis, kurios taikomos kitam bandymui. Atliekant šį bandymą (1) (15) (16) rekomenduojama naudoti iš dirbtinio dirvožemio, kuris naudojamas taikant bandymo metodą C.8 (14), pasiruoštas sintetines nuosėdas:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          4–5 % durpių (sausoji masė): pH vertė kiek įmanoma turi būti 5,5–6,0; privaloma naudoti smulkiai sumaltus (dalelių dydis ≤ 1 mm) durpių miltelius; jos turi būti džiovintos tik ore;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          20 % (sausoji masė) kaolino molio (pageidautina, kad kaolinito jame būtų daugiau negu 30 %);
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          75–76 % (sausoji masė) kvarcinio smėlio (smulkusis smėlis turėtų sudaryti didžiausią dalį, daugiau negu 50 % dalelių dydis 50–200 μm);
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          įpilama dejonizuoto vandens, kad galutinio mišinio drėgnumas būtų 30—50 %;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          įdedama chemijos požiūriu gryno kalcio karbonato (CaCO3), kad galutinio nuosėdų mišinio pH vertė būtų 7,0 ± 0,5; galutinio mišinio sudėtyje turėtų būti 2 % (± 0,5 %) organinės anglies ir jos kiekis koreguojamas atitinkamais durpių ir smėlio kiekiais atsižvelgiant į a–c.
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              Turėtų būti žinomas durpių, kaolino molio ir smėlio gavimo šaltinis. Nuosėdų sudedamosios dalys turėtų būti patikrinamos, ar jose nėra cheminės taršos pėdsakų (pvz., sunkiųjų metalų, chlororganinių komponentų, fosfororganinių komponentų ir t. t.). Sintetinių nuosėdų pasiruošimo pavyzdys aprašytas 3 priedėlyje. Taip pat leidžiama maišyti sausąsias sudedamąsias dalis, jeigu įmanoma įrodyti, kad užpylus paviršinio vandens nėra atskiriamos nuosėdų sudedamosios dalys (pvz., neima plūduriuoti kietosios durpių dalelės) ir kad durpės ar nuosėdos yra kondicionuotos pagal reikalavimus.
                           
                        
                     Vanduo
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Kaip bandymo vandenį leidžiama rinktis bet kokį vandenį, atitinkantį 2 ir 4 priedėliuose išvardytas skiedimui tinkamo vandens chemines savybes. Bet kokį tinkamą vandenį, natūralų vandenį (paviršinį ar gruntinį), regeneruotą vandenį (žr. 2 priedėlį) arba vandentiekio vandenį, iš kurio pašalintas chloras, leidžiama rinktis kaip kultūros auginimo vandenį ir bandymo vandenį, jeigu chironomidai jame be streso požymių išgyvena kultūros veisimo ir bandymo laikotarpiu. Bandymo vandens pH vertė pradedant bandymą turėtų būti 6–9, o bendrasis kietumas ne didesnis negu 400 mg/l kaip CaCO3. Tačiau jeigu galima daryti prielaidą, kad vandens kietumo jonai gali sąveikauti su bandomąja chemine medžiaga, turėtų būti naudojamas mažesnio kietumo vanduo (vadinasi, šiuo atveju neleidžiama rinktis Elendt Medium M4). Atliekant tyrimą turėtų būti naudojamas to paties tipo vanduo. 4 priedėlyje išvardytų vandens kokybės charakteristikų vertės turėtų būti matuojamos ne rečiau negu du kartus per metus arba kilus įtarimui, kad šios charakteristikos yra gerokai pakitusios.
                           
                        
                     Pradiniai tirpalai. Nuosėdos su įterpta bandomąja chemine medžiaga
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Pasirinktos koncentracijos nuosėdos su įterpta bandomąja chemine medžiaga paprastai pasiruošiamos bandomosios cheminės medžiagos tirpalo įpilant tiesiogiai į nuosėdas. Bandomosios cheminės medžiagos pradinis tirpalas ištirpinamas dejonizuotame vandenyje ir maišymo įtaisu, tiekimo maišikliu ar rankomis maišomas su sintetinėmis nuosėdomis. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga sunkiai tirpsta vandenyje, ją galima ištirpinti kuo mažesniame tinkamo organinio tirpiklio kiekyje (pvz., heksane, acetone arba chloroforme). Šis tirpalas maišomas su 10 g smulkaus kvarco smėlio vienam bandymo indui. Palaukiama, kol tirpiklis išgaruoja ir jis turi būti visiškai pašalinamas iš smėlio; tada bandymo laboratorinėje stiklinėje smėlis maišomas su reikiamu nuosėdų kiekiu. Norint bandomąją cheminę medžiagą soliubilizuoti, disperguoti ar emulguoti leidžiama naudoti tik lengvai garuojančias medžiagas. Atkreiptinas dėmesys, kad ruošiantis nuosėdas turi būti atsižvelgiama į bandomoje cheminėje medžiagoje ir smėlio mišinyje esantį smėlį (t. y. nuosėdos turėtų būti pasiruošiamos naudojant mažiau smėlio). Privaloma pasirūpinti, kad į nuosėdas įterpiama bandomoji cheminė medžiaga būtų kruopščiai ir tolygiai paskirstoma nuosėdose. Jeigu būtina, galima analizuoti ėminio dalį siekiant nustatyti vienalytiškumą.
                           
                        BANDYMO PLANAS
                  
                              17.
                           
                           
                              Sudarant bandymo planą pasirenkamos bandymo koncentracijos ir jų paskirstymas, kiekvienos koncentracijos indų skaičius ir lervų skaičius inde. Pateikiamas EC taško nustatymo, NOEC nustatymo ir ribos bandymo atlikimo aprašymas.
                           
                        
                     Regresinės analizės planas
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Bandymui naudotos koncentracijos būtinai turi aprėpti poveikio koncentraciją (pvz., EC15, EC50) ir dominančio medžiagos poveikio koncentracijos verčių diapazoną. Apskritai tikslumo ir ypač validumo vertes, kurias naudojant galima įvertinti poveikio koncentracijas (ECx), įmanoma patikslinti, jeigu poveikio koncentracijos vertės atitinka bandomųjų koncentracijų intervalą. Nereikėtų ekstrapoliuoti gerokai mažesnių negu mažiausioji teigiamoji koncentracija arba didesnių negu didžiausioji koncentracija verčių. Pradinis intervalo nustatymo bandymas praverčia renkantis naudotinų koncentracijų intervalą (žr. 27 pastraipą).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Jeigu turi būti nustatomos poveikio koncentracijos (ECx), turėtų būti atliekami bent penki bandymai naudojant kiekvieną koncentracijos vertę ir trys kartotiniai bandymai. Bet kuriuo atveju rekomenduojama naudoti pakankamą bandomųjų koncentracijų skaičių, kad modelis būtų reikiamai įvertinamas. Koncentracijų koeficiento vertė neturėtų būti didesnė negu 2 (išimtį leidžiama taikyti tais atvejais, jeigu dozės ir reakcijos santykio kreivė turi nuolaidų statumą). Kartotinių ėminių skaičių atliekant kiekvieną apdorojimą galima mažinti, jeigu padidėja skirtingą atsaką sukeliančių bandomųjų koncentracijų skaičius. Didinant kartotinių ėminių skaičių arba mažinant bandomųjų koncentracijų intervalo ribas būtų taikomi siauresni bandymo pasikliovimo intervalai. Papildomi kartotiniai ėminiai būtini tuo atveju, jeigu reikia įvertinti 10 parų lervų išgyvenimą ir augimą.
                           
                        
                     NOEC/LOEC įvertinimo planas
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Jeigu reikia įvertinti LOEC arba NOEC, turėtų būti naudojamos ne mažiau negu keturių kartotinių bandymų penkios bandomosios koncentracijos ir koncentracijų koeficiento vertė ne turėtų viršyti 2. Kartotinių bandymų skaičius turėtų būti pakankamas siekiant užtikrinti reikiamą statistinę galią, kad būtų aptinkamas 20 % skirtumas nuo kontrolinio 5 % reikšmingumo lygmens (p = 0,05). Nustatant vystymosi greitį paprastai naudojama dispersinė analizė (ANOVA), pvz., Dunnett bandymas ir Williams bandymas (17) (18) (19) (20). Nustatant išskridimo normą galima naudoti Cochran-Armitage, Fisher (su Bonferroni pataisa) arba Mantel-Haentzal bandymus.
                           
                        
                     Ribinis bandymas
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Ribinį bandymą galima atlikti (viena bandomoji koncentracija ir kontrolinis ėminys), jeigu darant pradinį intervalo nustatymo bandymą nebuvo nustatyta jokių poveikių. Ribinio bandymo tikslas – atlikti bandymą naudojant ganėtinai didelę koncentraciją, kad sprendimą priimantys asmenys galėtų išskirti galimą toksinį bandomosios cheminės medžiagos poveikį ir kad būtų nustatyta ribinė koncentracijos vertė, kuri jokiu būdu neturi būti naudojama. Rekomenduojama 1 000 mg/kg (sausoji masė). Paprastai poveikiui bandomąja medžiaga ir kontroliniam ėminiui būtini ne mažiau negu šeši pakartotiniai bandymai. Turi būti įrodoma pakankama statistinė galia aptikti 20 % skirtumą nuo kontrolinės vertės esant 5 % reikšmingumo lygiui (p = 0,05). Jeigu atsakas nurodomas metriniais vienetais (vystymosi greitis ir masė), t-bandymas yra tinkamas statistinis metodas, jeigu duomenys atitinka šio bandymo reikalavimus (atitiktis, vienalytės dispersijos). Jeigu šių reikalavimų nesilaikoma, leidžiama naudoti nelygiavertės dispersijos t-bandymą arba neparametrinį bandymą, pvz., Wilcoxon-Mann-Whithey bandymą. Nustatant išsiritimo normą atliktinas Fisher bandymas.
                           
                        PROCEDŪRA
                  
                     Poveikio sąlygos
                  
                  
                     Nuosėdų su įterpta bandomąja chemine medžiaga ir vandens sistemos pasiruošimas
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Bandomosios cheminės medžiagos įtepimo procedūra aprašyta bandymo metode C.8: Nustatant toksiškumą sliekams rekomenduojama taikyti bandomąją medžiagą (14). Nuosėdos su įterpta bandomąja medžiaga dedamos į indus ir užpilamos paviršiniu vandeniu, kad būtų užtikrintas nuosėdų ir vandens santykis 1:4 (žr. 11 ir 15 pastraipas). Nuosėdų sluoksnio storis turėtų būti 1,5—3 cm. Kad į vandens tūrį pilant bandymo vandenį nuosėdų sudedamosios dalys neatsiskirtų ir kietosios dalelės vėl nebūtų suspenduojamos skystyje, nuosėdas leidžiama uždengti plastiko disku, kol vanduo pilamas ant nuosėdų, ir vėliau diskas nedelsiant nuimamas. Taip pat leidžiama naudoti kitus įtaisus.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Bandymo indai turėtų būti uždengiami (pvz., stiklo plokštėmis) Jeigu būtina, atliekant tyrimą leidžiama įpilti vandens, kad būtų užtikrinamas pradinis vandens tūris ir kompensuojama išgaruojanti vandens dalis. Papildomai turėtų būti pilamas distiliuotas ar dejonizuotas vanduo, kad nesusidarytų druskos.
                           
                        
                     Stabilizavimas
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Pasiruošus nuosėdas su įterpta bandomąja chemine medžiaga ir paviršiniu vandeniu rekomenduojama palaukti, kol bandomoji cheminė medžiaga iš hidratuotos fazės pereis į nuosėdas (3) (4) (6) (13). Šis procesas turėtų būti visų pirma atliekamas laikantis darant bandymą taikomų temperatūros ir aeracijos sąlygų. Nuosėdoms ir cheminei medžiagai būdinga tam tikra pusiausvyros nusistovėjimo trukmė bei ji gali aprėpti kelias valandas ar dienas ir retais atvejais ne daugiau negu kelias savaites (4–5 savaites). Šiuo atveju būtų pakankamai laiko biologiškai suskaidyti daugelį cheminių medžiagų ir pusiausvyra nenusistovėtų, tačiau rekomenduojama rinktis 48 val. pusiausvyros nusistovėjimo laikotarpį. Kito šio pusiausvyros nusistovėjimo laikotarpio pabaigoje turėtų būti matuojama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija paviršiniame vandenyje, porų vandenyje ir nuosėdose, bent jau didžiausios koncentracijos ir mažiausios koncentracijos (žr. 38 pastraipą). Naudojantis šiais bandomosios cheminės medžiagos analiziniais nustatymais galima apskaičiuoti masės balansą ir išreikšti rezultatus atsižvelgiant į išmatuotas koncentracijas.
                           
                        
                     Bandomųjų organizmų pridėjimas
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Keturias ar penkias dienas prieš bandomųjų organizmų įdėjimą į bandymo indus, kiaušinėlių masė turėtų būti paimama iš sėjimo kultūrų ir sudedama į mažus indus auginimo terpėje. Leidžiama naudoti iš kamieninės kultūros gautą terpę arba šviežią pasiruoštą terpę. Jeigu naudojama pastaroji, į auginimo terpę turėtų būti įdedamas mažas kiekis pašaro, pvz., žaliųjų dumblių ir (arba) įlašinami keli lašeliai smulkiai sumaltų žuvų maisto gabalėlių suspensijos filtrato (žr. 2 priedėlį). Turėtų būti naudojamos tik neseniai padėtų kiaušinėlių masės. Paprastai lervos ima ristis po kelių dienų nuo kiaušinėlių padėjimo (Chironomus riparius 20 °C temperatūroje išsirita per 2–3 dienas, Chironomus tentans 23 °C temperatūroje išsirita per 1–4 dienas ir Chironomus yoshimatui 25 °C temperatūroje) ir lervos augdamos pereina keturias stadijas, iš kurių kiekviena trunka 4–8 dienas. Atliekant bandymą turėtų būti naudojamos pirmosios stadijos lervos (2–3 arba 1–4 dienų po išsiritimo). Mašalų stadiją įmanoma nustatyti pagal galvutės apvalkalo plotį (6).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Pirmos stadijos dvidešimt lervų buka pipete atsitiktinai paskirstoma kiekvienam bandymo indui, kuriame yra nuosėdų su įterpta bandomąja chemine medžiaga ir vandens. Vandens aeravimas turi būti nutraukiamas, kol lervos dedamos į bandymo indą, ir ši būsena išlaikoma dar 24 valandas po lervų įdėjimo (žr. 25 ir 32 pastraipas). Pagal taikomą bandymo planą (žr. 19 ir 20 pastraipas) kiekviena koncentracija veikiama ne mažiau negu 60 lervų, jeigu nustatomas ES taškas, arba 80 lervų, jeigu apibrėžiama NOEC.
                           
                        
                     Bandomosios koncentracijos
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Intervalo nustatymo bandymas gali būti naudingas siekiant apibrėžti darant galutinį bandymą pasirinktinų koncentracijų intervalą. Šiuo tikslu naudojamos labai besiskiriančių bandomosios cheminės medžiagos koncentracijų serijos. Siekiant užtikrinti galutiniam bandymui naudojamų chironomidų vienodą paviršiaus tankumą, jie veikiami kiekviena bandomosios cheminės medžiagos koncentracija tol, kol įvertinamos atitinkamos bandomosios koncentracijos ir kartotiniai ėminiai nėra reikalingi.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Atliekant galutinį bandymą naudojamos bandomosios koncentracijos pasirenkamos atsižvelgiant į intervalo nustatymo bandymo rezultatą. Turėtų būti naudojamos ne mažiau negu penkios koncentracijos kaip aprašyta 18–20 pastraipose.
                           
                        
                     Kontroliniai ėminiai
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Kontrolinių ėminių indai be jokios bandomosios cheminės medžiagos, tačiau su nuosėdomis, turėtų būti naudojami atliekant bandymą su atitinkamu skaičiumi kartotinių ėminių (žr. 19–20 pastraipą). Jeigu taikant bandomąją cheminę medžiagą naudotas tirpiklis (žr. 16 pastraipą), turėtų būti įdedamas tirpiklio kontrolinis ėminys.
                           
                        
                     Bandymo sistema
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Naudojamos statinės sistemos. Išskirtiniais atvejais leidžiama naudoti pusiau statines ar dinamines sistemas su trūkiuoju ar tolygiu paviršinio vandens atnaujinimu, pvz., jeigu vandens kokybės reikalavimai neatitinka taikomų bandomajam organizmui ar daro poveikį cheminei pusiausvyrai (pvz., ištirpusio deguonies lygiai pernelyg sumažėja, labai padidėja šalinimo produktų koncentracija arba iš nuosėdų ima sunktis mineralų skystis ir daro poveikį pH ir (arba) vandens kietumo vertėms). Tačiau paprastai pakanka kitų paviršinio vandens kokybės gerinimo metodų, pvz., aeracijos, ir jiems teiktina pirmenybė.
                           
                        
                     Pašaras
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Lervas būtina maitinti; pageidautina kiekvieną dieną ar bent tris kartus per savaitę. Per pirmąsias 10 parų jaunoms lervoms per dieną turėtų pakakti 0,25–0,5 mg (C. yoshimatui lervoms 0,35–0,5 mg) žuvų maisto (vandens suspensija arba smulkiai sumaltas maistas, pvz., Tetra-Min arba Tetra-Phyll, išsami informacija pateikta 2 priedėlyje). Senesnėms lervoms pašaro reikia šiek tiek daugiau: likusiai bandymo daliai kiekvieną dieną lervoms turėtų pakakti 0,5–1 mg. Pašaro kiekis turėtų būti mažinamas visų apdorojimų atvejais ir kontrolinėje grupėje, jeigu nustatomas grybelio atsiradimas arba jeigu aptinkama, kad kontrolinės grupės gyvūnai gaišta. Jeigu grybelio augimo nepavyksta sustabdyti, bandymas turi būti pakartotas. Jeigu bandymai atliekami su lengvai absorbuojamomis cheminėmis medžiagomis (pvz., kai Kow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuosėdomis susijusiomis cheminėmis medžiagomis, išgyvenimui ir natūraliam augimui būtiną pašaro kiekį galima įterpti į sintetines nuosėdas prieš stabilizavimo laikotarpį. Šiuo tikslu turi būti naudojamas ne žuvų maistas, o augalinis pašaras, pvz., pridedama 0,5 % (sausoji masė) smulkiai sumaltų lapų, pvz., didžiosios dilgėlės (Urtica dioeca), baltojo šilkmedžio (Morus alba), persinio dobilo (Trifolium repens), daržinio špinato (Spinacia oleracea) arba galima naudoti kitą augalinę medžiagą (Cerophyl arba alfa celiuliozę).
                           
                        
                     Inkubacijos sąlygos
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Rekomenduojama visų pirma 24 valandas po lervų įdėjimo nestipriai aeruoti bandymo indų paviršinį vandenį ir vėliau aeruojama per visą bandymo atlikimo trukmę (privaloma stebėti, ar ištirpusio deguonies koncentracijos vertė nėra mažesnė negu 60 % soties ore vertės (ASV)). Aeruojant naudojama stiklinė Pastero pipetė, pritvirtinta 2–3 cm virš nuosėdų sluoksnio (t. y. vienas ar keli burbulai per sek.). Darant bandymus su lakiosiomis cheminėmis medžiagomis galima nuspręsti nuosėdų–vandens sistemos neaeruoti.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Atliekant bandymą išlaikoma pastovi 20 °C (± 2 °C) temperatūra. Atliekant bandymą su C. tentans ir C. yoshimatui atitinkamai rekomenduojama pasirinkti 25 °C (± 2 °C) temperatūrą. Naudojamas 16 val. apšvietimo laikotarpis; šviesos intensyvumo vertės turėtų būti 500–1 000 liuksų.
                           
                        
                     Poveikio trukmė
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Poveikis prasideda lervas įdėjus į indus su bandomąją chemine medžiaga ir kontrolinių ėminių indus. Jeigu naudojami C. riparius ir C. yoshimatsui, poveikio trukmė yra 28 dienos, o kai pasirenkama C. tentans – 65 dienos. Jeigu mašalai atsiranda anksčiau, bandymą galima nutraukti ne anksčiau negu po penkių dienų atsiradus paskutiniam kontrolinės grupės suaugusiajam.
                           
                        
                     Stebėjimai
                  
                  
                     Lervų išsinėrimas
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Nustatoma vystymosi trukmė ir bendras visų iki galo išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius. Patinėliai lengviau atpažįstami žiūrint į jų plunksniškus čiuptuvėlius.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Bandymo indai turėtų būti stebimi bent tris kartus per savaitę siekiant nustatyti bet kokią neįprastą veikseną (pvz., nuosėdų susidarymą, neįprastą plūduriavimą) palyginti su kontroliniai indais. Numatomo lervų išsinėrimo laikotarpiu būtina skaičiuoti kasdieną atsirandančius mašalus. Kiekvieną dieną registruojami visi atsiradę mašalai ir nurodoma jų lytis. Nustačius tapatybę mašalai pašalinami iš indų. Turėtų būti registruojamos visos prie užbaigiant bandymą padėtos kiaušinėlių masės ir po to pašalinamos, kad lervos pakartotinai nebūtų įdėtos į nuosėdas. Taip pat registruojamas matomų lėliukų skaičius, kurios nėra išsiritusios. Išsineriančių lervų skaičiavimo gairės pateiktos 5 priedėlyje.
                           
                        
                     Augimas ir išgyvenimas
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Jeigu privaloma pateikti duomenis apie 10 parų lervų išgyvenimą ir augimą, iš pradžių turi būti įtraukiami papildomi bandymo indai, kad juos būtų galima naudoti vėliau. Šių papildomų indų nuosėdos sijojamos 250 μm sietu siekiant surinkti lervas. Nejudumas ar nepakankamas atsakas į mechaninius dirgiklius yra gaišimo kriterijai. Neatsigavusios lervos taip pat turėtų būti laikomos nugaišusiomis (bandymo pradžioje nugaišusios lervos galėjo būti žuvusios nuo mikrobų). Nustatoma bandymo inde išgyvenusių lervų sausoji masė (be pelenų) ir apskaičiuojama vidutinė pavienė indo sausoji masė. Tikslinga nustatyti, kurios stadijos yra išgyvenusi lerva; šiuo tikslu galima matuoti kiekvieno individo galvos apvalkalo plotį.
                           
                        
                     Analiziniai matavimai
                  
                  
                     Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Prieš pradedant bandymą (t. y. prieš įdedant lervas) bent iš kiekvieno apdorojimo indo imami biriųjų nuosėdų ėminiai ir į juos atsižvelgiant bei naudojant analizinį nustatymą įvertinama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija nuosėdose. Bandymo pradžioje ir pabaigoje rekomenduojama analizuoti bent paviršinio vandens, porų vandens ir nuosėdų ėminius (žr. 24 pastraipą) esant didžiausiai koncentracijai ir mažesnei koncentracijai. Nustačius bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją gaunama informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos elgseną ir (arba) pasiskirstymą vandens–nuosėdų sistemoje.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Jeigu atliekami tarpiniai matavimai (pvz., 7 dieną) ir jeigu analizei atlikti reikalingi dideli ėminiai, kuriuos paėmus bandymo sistemai būtų padarytas poveikis, analiziniai nustatymai turėtų būti atliekami naudojant iš panašiai apdorotų papildomų bandymo indų paimtus ėminius (įskaitant bandomųjų organizmų buvimą), tačiau biologiniam stebėjimui nenaudotų indų.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Siekiant izoliuoti laisvąjį vandenį rekomenduojama naudoti 30 min. trukmės centrifugavimo procedūrą, pvz., 10 000 g ir 4 °C. Tačiau jeigu įrodoma, kad bandomosios cheminės medžiagos filtrai neadsorbuoja, taip pat galima rinktis filtravimą. Tam tikrais atvejais gali nebūti įmanoma analizuoti porų vandens koncentracijų, nes ėminys yra pernelyg mažas.
                           
                        
                     Fiziniai ir cheminiai parametrai
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Tinkamu būdu turėtų būti matuojama bandymo indų pH ir temperatūros vertės (žr. 10 pastraipą). Bandymo pradžioje ir jo pabaigoje turėtų būti matuojama kontrolinių ėminių ir vieno bandymo indo kietumo ir amoniako vertės esant didžiausiai koncentracijai.
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITŲ TEIKIMAS
                  
                     Rezultatų apdorojimas
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Šio bandymo tikslas – nustatyti bandomosios cheminės medžiagos poveikį mašalų patelių ir patinėlių vystymosi greičiui ir bendram jų skaičiui, arba, jeigu atliekamas 10 parų bandymas, poveikį lervų išgyvenimui ir jų masei. Jeigu neturima duomenų apie statistiniu požiūriu skirtingą lyčių jautrumą, atliekant statistinę analizę patinėlių ir patelių rezultatus galima sujungti. Apie lyčių jautrumo skirtumus galima spręsti naudojant statistines priemones, pvz., atliekant χ2-r × 2 lentelės bandymą. Jeigu reikia, po 10 parų turi būti nustatomas lervų išgyvenimas ir vidutinė kiekvieno indo sausoji masė.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Visų pirmiausiai remiantis bandymo pradžioje (žr. 38 pastraipą) išmatuotomis nuosėdų koncentracijomis apskaičiuojamos sausąja mase pagrįstos ir išreikštos poveikio koncentracijos.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Indo statistinius duomenis, norint apskaičiuoti EC50 arba bet kokio kito ECx taškinį įvertį, leidžiama naudoti kaip patikimus kartotinius duomenis. Apskaičiuojant kiekvieno ECx pasikliovimo intervalą turėtų būti atsižvelgiama į kiekvieno indo skirtingumą arba būti įrodoma, kad šis kintamumas yra toks mažas ir kad jo galima nepaisyti. Jeigu modeliui taikomas mažiausiųjų kvadratų metodas, kiekvieno indo statistikos duomenims taikoma transformacija siekiant pagerinti dispersijos vienalytiškumą. Tačiau ECx vertės turėtų būti apskaičiuojamos atsaką transformavus į pradinę vertę.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Jeigu taikant statistinę analizę siekiama apibrėžti NOEC/LOEC ir šiuo tikslu tikrinama hipotezė, turi būti atsižvelgiama į su indais susijusį skirtingumą, pvz., įterpiant ANOVA. Antraip jeigu susiklosto situacijos, kad įprastos ANOVA prielaidos gali būti pažeidžiamos, galima naudoti išsamesnius bandymus (21).
                           
                        
                     Išsinėrimo santykis
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Išsinėrimo santykiai yra kiekybiniai duomenys ir juos galima analizuoti atliekant Cochran-Armitage bandymą, taikomą mažėjimo tvarka, jeigu laikoma, kad atsakas į dozę būsiąs monotoninis ir šie duomenys atitinka minėtą prielaidą. Jeigu ne, šiuo atveju leidžiama rinktis Fisher arba Mantel-Haentzal bandymą su pakoreguotomis pagal Bonferroni-Holm p vertėmis. Jeigu turima įrodymų, kad naudojant tą pačią koncentraciją kartotinių ėminių kintamumas yra didesnis negu būtų galima nustatyti atsižvelgiant į binominį skirstinį (dažnai vadinamą „pertekline dispersija“), šiuo atveju turėtų būti pasirenkamas (21) pasiūlytas išsamus Cochran-Armitage arba Fisher bandymas.
                              Nustatoma inde išsiritusių mašalų suma ne ir dalinama iš įdėtų lervų skaičiaus na:
                              
                                 
                              kur:
                              
                                          ER
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          išsinėrimo santykis
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          iš indo išsinėrusių mašalų skaičius
                                       
                                    
                                          na
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          į indą įdėtų lervų skaičius
                                       
                                    
                        
                              47.
                           
                           
                              Jeigu ėminiai yra dideli ir jeigu nustatoma perteklinė dispersija, šiuo atveju galima rinktis kitą alternatyvą, t. y. išsinėrimo santykį laikyti nenutrūkstamuoju atsaku ir rinktis Williamso bandymą, jeigu daroma prielaida, kad atsakas į dozę būsiąs monotoninis ir atitiksiąs šiuos ER duomenis. Jeigu monotoniškumas nėra užtikrinamas, pirmenybė teiktina Duneto bandymui. Didelio ėminio dydis šiuo atveju apibrėžiamas išsinėrusių mašalų ir neišsinėrusių mašalų skaičiumi, kuris abiem atvejais viršija penkis, atsižvelgiant į kartotinį ėminį (indą).
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Norint taikyti ANOVA metodų vertes, ER vertės pirmiausiai turėtų būti transformuojamos naudojant arksinuso kvadratinės šaknies transformaciją arba Tukey-Freeman transformaciją siekiant gauti apytikslį įprastą skirstinį ir suvienodinti dispersijas. Leidžiama naudoti Cochran-Armitage, Fisherio (Bonferroni) arba Mantel-Haentzal bandymus, jeigu taikomi absoliutieji dažniai. Arcsin-sqrt transformacija taikoma pasirenkant ER vertės kvadratinės šaknies arksinusą (sin–1).
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Išsinėrimo santykių ECx vertės apskaičiuojamos naudojant regresijos analizę (arba, pvz., probit (22), logit, Weitbull, atitinkamą komercinę programinę įrangą ir t. t.). Jeigu regresijos analizė nepavyksta (pvz., jeigu tėra mažiau negu du daliniai atsakai), naudojami kiti neparametriniai metodai, pvz., slankiojo vidurkio metodas ar interpoliacijos metodas.
                           
                        
                     Vystymosi greitis
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Vidutinė vystymosi trukmė yra vidutinis laikotarpis nuo lervų įdėjimo (nulinė bandymo diena) ir iki eksperimentinės mašalų kohortos išsinėrimo. (Apskaičiuojant tikrąją vystymosi trukmę turėtų būti atsižvelgiama į lervų amžių, kai jos buvo įdedamos). Vystymosi greitis yra atvirkštinis dydis vystymosi trukmės atžvilgiu (vienetas: 1/diena) ir atitinka tą lervos vystymosi atkarpą, kuris vyksta per vieną dieną. Vystymosi greičiui, palyginti su šių nuosėdų toksiškumo tyrimų įvertinimu, teikiama pirmenybė, nes jo dispersija yra mažesnė, ir jis vienalytiškesnis bei glaudžiau atitinka įprastą pasiskirstymą, jeigu lyginama su vystymosi trukme. Vadinasi, leidžiama veikiau rinktis patikimą parametrinį bandymą su vystymosi greičiu negu su vystymosi trukme. Vystymosi greičio kaip nenutrūkstamo atsako ECx vertes galima įvertinti naudojant regresijos analizę (pvz., (23), (24)).
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Atliekant šiuos statistinius tyrimus laikoma, kad tikrinimo x dieną pastebėtas mašalų skaičius išsinėrė per vidutinį laiko intervalą nuo x dienos iki x-1 dienos (l = tikrinimo intervalo trukmė (paprastai viena diena)). Vienam indui taikoma vidutinė vystymosi greičio vertė (x) apskaičiuojama pagal šią lygtį:
                              
                                 
                              kur:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          indui taikoma vidutinė vystymosi greičio vertė
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          tikrinimo intervalo indeksas
                                       
                                    
                                          m
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          didžiausias tikrinimo intervalų skaičius
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          per tikrinimo intervalą i išsinėrusių mašalų skaičius
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          bendras eksperimento pabaigoje išsinėrusių mašalų skaičius (=
                                       
                                    
                                          xi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          per intervalą i išsinėrusių mašalų vystymosi greitis
                                       
                                    
                                 
                              kur:
                              
                                          dienai
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          tikrinimo diena (diena po poveikio)
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          tikrinimo intervalo i trukmė (dienos, paprastai 1 diena)
                                       
                                    
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Į bandymo ataskaitą turi būti įtraukiama bent ši informacija:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizinis pobūdis ir, jeigu reikia, fizinės bei cheminės savybės (tirpumas vandenyje, garų slėgis, pasiskirstymo dirvoje koeficientas (ar nuosėdose, jeigu žinomas), stabilumas vandenyje ir t. t.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      cheminės tapatybės nustatymo duomenys (bendrinis pavadinimas, cheminis pavadinimas, struktūrinė formulė, CAS numeris ir t. t.), įskaitant grynumą ir analinės metodas atliekant bandomosios cheminės medžiagos kiekybinį nustatymą.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomosios rūšys:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudojami bandomieji gyvūnai: rūšis, mokslinis pavadinimas, organizmo gavimo šaltinis ir veisimo sąlygos,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informacija apie kiaušinėlių masės ir lervų tvarkymą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gyvūnų amžius, kai jie buvo įdėti į bandymo indus.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudotos nuosėdos, t. y. natūralios ar sintetinės nuosėdos,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jei naudojamos natūralios nuosėdos, nuosėdų ėminių ėmimo vieta ir jos aprašymas, įskaitant, jeigu įmanoma, taršos aprašas; charakteristikos: pH, organinės anglies kiekis, C/N santykis ir granuliometrinė analizė (jeigu reikia),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sintetinių nuosėdų pasiruošimas: sudedamosios dalys ir charakteristikos (organinės anglies kiekis, pH, drėgmė ir t. t. bandymo pradžioje),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandymo vandens pasiruošimas (jeigu naudojamas regeneruotas vanduo) ir charakteristikos (deguonies koncentracija, pH. Laidumas, kietumas ir t. t. bandymo pradžioje),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nuosėdų ir vandens sluoksnių storis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      paviršinio vandens ir porų vandens tūris; drėgnųjų nuosėdų masė su porų vandeniu ir be jo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandymo indai (medžiaga ir dydis),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandomosios cheminės medžiagos įterpimo į nuosėdas metodas: naudotos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, kartotinių ėminių skaičius ir naudoti tirpikliai, jeigu buvo naudoti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nuosėdų—vandens sistemos, į kurią įterpta bandomosios cheminės medžiagos, stabilizavimo pusiausvyros fazė: trukmė ir sąlygos,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inkubacijos sąlygos: temperatūra, šviesos ciklas ir intensyvumas, aeracija (dažnumas ir intensyvumas),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie maistą, įskaitant jo tipą, paruošiamą, kiekį ir maitinimo tvarką.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatai:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominaliosios bandomosios koncentracijos, išmatuotos bandomosios koncentracijos ir visų analizių rezultatai siekiant bandymo inde nustatyti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vandens kokybė bandymo induose, t. y. pH, temperatūra, ištirpęs deguonis, kietumas ir amoniako kiekis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išgaruojančio bandymo vandens papildymas, jeigu taikoma,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      iš kiekvieno indo per dieną išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lervų, kurios inde neišsinėrė kaip mašalai, skaičius,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vidutinė pavienė lervų sausoji masė inde ir tam tikros stadijos lervų sausoji masė inde, jeigu reikia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsinėrusių mašalų skaičius atliekant tapatų bandymą ir bandomoji koncentracija (mašalų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      atliekant tapatų bandymą išsinėrusių mašalų vidutinis vystymosi greitis ir apdorojimo norma (mašalų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toksinio poveikio įvertinimai, pvz., ECx (ir susiję pasikliovimo intervalai), NOEC ir (arba) LOEC bei jiems nustatyti naudoti statistikos metodai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatų aptarimas, įskaitant bet kokį poveikį bandymo rezultatams, kuris būtų padarytas nukrypus nuo šio bandymo metodo.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              ASTM International/E1706–00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and SAFEty Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Šio priedo bandymo metodas C.8. Toksiškumas sliekams.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482–491.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312.
                           
                        
                     1 priedėlis
                     SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS
                     Šiame bandymo metode vartojamų terminų apibrėžtys:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Pasiruoštosios nuosėdos ar regeneruotos, dirbtinės arba sintetinės nuosėdos yra natūralių nuosėdų fizines sudedamąsias dalis atitinkančių medžiagų mišinys.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Paviršinis vanduo – bandymo inde ant nuosėdų užpiltas vanduo.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Laisvasis vanduo ar porų vanduo – ertmes tarp nuosėdų ir dirvožemio kietųjų dalelių užpildantis vanduo.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Nuosėdos su įterpta bandomąja chemine medžiaga – nuosėdos, į kurias prileista bandomosios cheminės medžiagos.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga – bet kokia naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga ar mišinys.
                              
                           
                  
                     2 priedėlis
                     
                        Rekomendacijos dėl Chironomus riparius auginimo
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 
                                    Chironomus lervas galima auginti kristalizatoriuose ar didelėse talpyklose. Ant talpyklos dugno plonu sluoksniu (5–10 mm storio) paskleidžiamas smulkus kvarco smėlis. Taip pat įrodyta (pvz., Merck, Art 8117), kad diatomitas yra tinkamas substratas (pakanka plonesnio sluoksnio, vos kelių mm storio). Po to užpilamas kelių centimetrų storio vandens sluoksnis. Jeigu reikia, įpilama papildomo vandens, kad būtų atkuriamas išgaravęs kiekis ir sustabdomas džiūvimas. Jeigu reikia, vandenį leidžiama pakeisti. Turėtų būti užtikrinamas nuosaikus aeravimas. Lervų auginimo indai turėtų būti laikomi tinkamuose narvuose, kad išsinėrę suaugusieji vabzdžiai nepajėgtų pasprukti. Narvas turėtų būti ganėtinai erdvus, kad galėtų spiestis išsinėrę suaugusieji vabzdžiai; antraip populiacija gali nesusiformuoti (mažiausi matmenys yra 30 × 30 × 30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Narvai turėtų būti laikomi kambario temperatūroje arba pastovių aplinkos sąlygų patalpoje 20 ± 2 °C temperatūroje; šviesiojo laikotarpio trukmė 16 val. (šviesos intensyvumas apie 1 000 liuksų), 8 val. tamsos. Parengta ataskaitų, kuriose nurodoma, kad jeigu oro drėgnumas yra mažesnis negu 60 % RH, gali sumažėti reprodukcija).
                              
                           
                        Skiedimo vanduo
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Leidžiama naudoti bet kokį tinkamą natūralų ar sintetinį vandenį. Paprastai naudojamas šulinio vanduo, vanduo, iš kurio pašalintas chloras, ir dirbtinės terpės (pvz., Elendt „M4“ arba „M7“ priemonė, žr. toliau). Prieš naudojimą vanduo turi būti aeruojamas. Jeigu būtina, kultūrų auginimo vandenį leidžiama atnaujinti pilant panaudotą vandenį iš kultūrų auginimo indų ar jį leidžiant per sifoną; būtina stengtis nepažeisti lervų vamzdžių.
                              
                           
                        Lervų šėrimas
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 
                                    Chironomus lervos turėtų būti šeriamos žuvų maisto dribsniais (Tetra Min®, Tetra Phyll® arba kita panašia patentuota žuvų maisto rūšimi); vienam indui per dieną skiriama apie 250 mg pašaro. Pašarą galima pateikti sausą, sumaltą milteliais arba kaip vandens suspensiją: 1,0 g maisto dribsnių įdedama į 20 ml skiedimo vandens ir išmaišoma, kol gaunamas vienalytis mišinys. Šio ruošinio apie 5 ml per dieną leidžiama įdėti į kiekvieną indą (prieš naudojant būtina pakratyti). Vyresnėms lervoms duodama daugiau pašaro.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Šėrimas koreguojamas atsižvelgiant į vandens kokybę. Jeigu auginimo terpė „susidrumsčia“, duodamo pašaro kiekis turėtų būti sumažinamas. Duodamo pašaro kiekiai turi būti kruopščiai stebimi. Jeigu duodamas per mažas pašaro kiekis, lervos persikelia į vandens storymę, o skiriant per daug pašaro suintensyvėja mikroorganizmų veikla ir sumažėja deguonies koncentracija. Abiem minėtomis sąlygomis sumažėja augimo greitis.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Ruošiant naujus kultūrų auginimo indus į juos taip pat galima šiek tiek įdėti žaliųjų dumblių (pvz., Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris).
                              
                           
                        Išsinėrusių suaugusiųjų mašalų šėrimas
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Kai kurie tyrinėtojai pasiūlė, kad išsinėrusius suaugusius mašalus būtų galima šerti naudojant prisotintame sacharozė tirpale išmirkytus vilnos tamponus.
                              
                           
                        Lervų išsinėrimas
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Suaugę mašalai ima rastis iš lervų auginimo indų po 13–15 dienų 20 ± 2 °C temperatūroje. Patinėliai lengviau atpažįstami žiūrint į jų plunksniškus čiuptuvėlius.
                              
                           
                        Kiaušinėlių masė
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Kol suaugę mašalai būna veisimo narve, visi lervų auginimo indai turėtų būti tikrinami tris kartus per savaitę, ar juose nėra drebučių pavidalo kiaušinėlių masės. Jeigu randama šios kiaušinėlių masės, ji turėtų būti atsargiai pašalinama. Kiaušinėliai turėtų būti sudedami į mažą indelį su veisimo vandens ėminiu. Kiaušinėlių masė naudojama pradedant inde auginti naują kultūrą (pvz., 2–4 kiaušinėlių masė viename inde) arba atliekant toksiškumo bandymus.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Pirmos stadijos lervos turėtų išsiristi po 2–3 dienų.
                              
                           
                        Naujų kultūrų auginimo indų ruošimas
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Išauginus kultūras turėtų būti įmanoma kiekvieną savaitę ar rečiau paruošti naują lervų kultūros auginimo indą atsižvelgiant į bandymo atlikimo reikalavimus ir pašalinant senesnius indus, kai išsineria suaugę mašalai. Taikant šią sistemą mažomis pastangomis reguliariai tiekiami suaugę mašalai.
                              
                           
                        Bandymo tirpalų „M4“ ir „M7“ ruošimas
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendtas (1990) aprašė „M4“ terpę. „M7“ terpė ruošiama kaip „M4“ terpė, išskyrus 1 lentelėje išvardytas chemines medžiagas, kurių koncentracijos „M7“, palyginti su „M4“, yra keturis kartus mažesnės. Leidinys apie „M7“ terpę yra rengiamas (Elendto pateiktas pranešimas). Bandomasis tirpalas neturėtų būti ruošiamas pagal Elendtą ir Bias (1990), jeigu norima gauti NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 ir K2HPO4 koncentracijas, nes pradinių tirpalų ruošimas nėra tapati veikla.
                              
                           
                        „M7“ terpės ruošimas
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Kiekvienas pradinis tirpalas (I) paruošiamas atskirai ir iš šių pradinių tirpalų (I) paruošiamas kombinuotasis pradinis tirpalas (II) (žr. 1 lentelę). 50 ml kombinuotojo pradinio tirpalo (II) ir 2 lentelėje nurodyti kiekvieno makroelementų pradinio tirpalo kiekiai praskiedžiami iki 1 litro dejonizuoto vandens, kad taip būtų pasiruošta „M7“ terpė. Vitaminų pradinis tirpalas pasiruošiamas į dejonizuotą vandenį įmaišius tris vitaminus kaip nurodyta 3 lentelėje ir 0,1 ml kombinuotojo vitaminų pradinio tirpalo įmaišoma į galutinę „M7“ terpę prieš pat naudojimo pradžią. (Vitaminų pradinis tirpalas laikomas sušaldytas mažomis alikvotinėmis dalimis.) Terpė aeruojama ir stabilizuojama.
                              
                           
                        LITERATŪRA
                     
                     BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
                     
                        1   lentelė
                     
                     
                        „M4“ ir „M7“ terpei skirtų mikroelementų pradiniai tirpalai
                     
                     
                                 Pradiniai tirpalai (I)
                              
                              
                                 Kiekis (mg), praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens
                              
                              
                                 Ruošiant kombinuotą pradinį tirpalą (II): maišomi nurodyti pradinių tirpalų (I) kiekiai (mg) ir praskiedžiami iki 1 litro dejonizuoto vandens
                              
                              
                                 Galutinės bandomųjų tirpalų koncentracijos (mg/l)
                              
                           
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                              
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                           
                                 H3BO3
                                     (15)
                                 
                              
                              
                                 57 190
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 2,86
                              
                              
                                 0,715
                              
                           
                                 MnCl2 · 4 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 7 210
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,361
                              
                              
                                 0,090
                              
                           
                                 LiCl (15)
                                 
                              
                              
                                 6 120
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,306
                              
                              
                                 0,077
                              
                           
                                 RbCl (15)
                                 
                              
                              
                                 1 420
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,071
                              
                              
                                 0,018
                              
                           
                                 SrCl2 · 6 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 3 040
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,152
                              
                              
                                 0,038
                              
                           
                                 NaBr (15)
                                 
                              
                              
                                 320
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,016
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 Na2MoO4 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 1 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,063
                              
                              
                                 0,016
                              
                           
                                 CuCl2 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 335
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,017
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 ZnCl2
                                 
                              
                              
                                 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,013
                              
                              
                                 0,013
                              
                           
                                 CaCl2 · 6 H2O
                              
                              
                                 200
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,010
                              
                              
                                 0,010
                              
                           
                                 KI
                              
                              
                                 65
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0033
                              
                              
                                 0,0033
                              
                           
                                 Na2SeO3
                                 
                              
                              
                                 43,8
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0022
                              
                              
                                 0,0022
                              
                           
                                 NH4VO3
                                 
                              
                              
                                 11,5
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,00058
                              
                              
                                 0,00058
                              
                           
                                 Na2EDTA · 2 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 5 000
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 2,5
                              
                              
                                 0,625
                              
                           
                                 FeSO4 · 7 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 1 991
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,249
                              
                           
                        
                     
                        2   lentelė
                     
                     
                        M4 ir M7 terpėms skirti makroelementų pradiniai tirpalai
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Kiekis praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens
                                 (mg)
                              
                              
                                 Ruošiant M4 ir M7 terpę įdedamas makroelementų pradinių tirpalų kiekis
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Galutinės bandomųjų tirpalų M4 ir M7 koncentracijos
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 CaCl2 · 2 H2O
                              
                              
                                 293 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 293,8
                              
                           
                                 MgSO4 · 7 H2O
                              
                              
                                 246 600
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                 123,3
                              
                           
                                 KCl
                              
                              
                                 58 000
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 5,8
                              
                           
                                 NaHCO3
                                 
                              
                              
                                 64 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 64,8
                              
                           
                                 NaSiO3 · 9 H2O
                              
                              
                                 50 000
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                 10,0
                              
                           
                                 NaNO3
                                 
                              
                              
                                 2 740
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,274
                              
                           
                                 KH2PO4
                                 
                              
                              
                                 1 430
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,143
                              
                           
                                 K2HPO4
                                 
                              
                              
                                 1 840
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,184
                              
                           
                        
                     
                        3   lentelė
                     
                     
                        M4 ir M7 terpei skirtas vitaminų pradinis tirpalas. Visi trys vitaminų tirpalai maišomi siekiant paruošti vieną vitaminų pradinį tirpalą
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Kiekis praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens
                                 (mg)
                              
                              
                                 Ruošiant M4 ir M7 terpę įdedamas vitaminų pradinio tirpalo kiekis
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Galutinės bandomųjų tirpalų M4 ir M7 koncentracijos
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 Tiamino hidrochloridas
                              
                              
                                 750
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,075
                              
                           
                                 Ciankobalaminas (B12)
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,0010
                              
                           
                                 Biotinas
                              
                              
                                 7,5
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,00075
                              
                           
                        LITERATŪRA
                     
                     Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33.
                     Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167.
                  
                  
                     3 priedėlis
                     SINTETINIŲ NUOSĖDŲ RUOŠIMAS
                     
                        Nuosėdų sudėtis
                     
                     Sintetinės nuosėdos turėtų būti sudarytos iš šių sudedamųjų dalių:
                     
                                 Sudedamoji dalis
                              
                              
                                 Charakteristikos
                              
                              
                                 Nuosėdų sausosios
                                 procentinė dalis)
                              
                           
                                 Durpės
                              
                              
                                 Naujosios Zelandijos kiminų durpės, jų pH kiek įmanoma atitinka 5,5–6,0, jokių augalų matomų liekanų, smulkiai sumaltos (kietųjų dalelių dydis ≤ 1 mm), džiovintos ore
                              
                              
                                 4–5
                              
                           
                                 Kvarcinis smėlis
                              
                              
                                 Grūdelių dydis: > 50 % dalelių dydžio vertės intervalas turėtų būti 0–200 μm
                              
                              
                                 75–76
                              
                           
                                 Kaolito molis
                              
                              
                                 Kaolinito kiekis ≥ 30 %
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Organinė anglis
                              
                              
                                 Pakoreguota pridedant durpių ir smėlio
                              
                              
                                 2 (± 0,5)
                              
                           
                                 Kalcio karbonatas
                              
                              
                                 CaCO3, milteliai, cheminiu atžvilgiu grynas
                              
                              
                                 0,05–0,1
                              
                           
                                 Vanduo
                              
                              
                                 Laidumas ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30–50
                              
                           
                        Pasiruošimas
                     
                     Durpės džiovinamos ore ir malamos tol, kol gaunami smulkūs milteliai. Suspensija iš nustatyto durpių miltelių kiekio ir dejonizuoto vandens pasiruošiama didelio našumo homogenizavimo įrenginiu. Naudojant CaCO3 koreguojama, kad šios suspensijos pH vertė būtų 5,5 ± 0,5. Švelniai maišant suspensija kondicionuojama ne trumpiau negu dvi dienas 20 ± 2 °C temperatūroje siekiant stabilizuoti pH ir paruošti stabilią mikroorganizmų populiaciją. pH matuojama dar kartą ir jo vertė turėtų būti 6,0 ± 0,5. Tada durpių suspensija maišoma su kitomis sudedamosiomis dalimis (smėliu ir kaolino moliu) ir dejonizuotu vandeniu siekiant gauti vienalytes nuosėdas, kuriose vandens kiekis sudaro 30—50 % sausosios masės. Dar kartą matuojama galutinio mišinio pH vertė ir, jeigu reikia, naudojant CaCO3 koreguojama, kol pH vertė ima atitikti 6,5–7,5 vertę. Imami nuosėdų ėminiai siekiant nustatyti sausąją masę ir organinės anglies kiekį. Taip pat rekomenduojama, kad prieš pradedant nuosėdas naudoti chironomidų toksiškumo bandymui, sintetinės nuosėdos būtų kondicionuojamos septynias dienas tomis pačiomis sąlygomis, kurios taikomos kitam bandymui.
                     
                        Sandėliavimas
                     
                     Sintetinių nuosėdų ruošimo visas sudedamąsias sausas dalis galima laikyti sausoje ir vėsioje vietoje kambario temperatūroje. Sintetinės (drėgnos) nuosėdos neturėtų būti sandėliuojamos prieš jas imant naudoti atliekamam bandymui. Jos turėtų būti naudojamos iš karto po 7 dienas trukusio kondicionavimo laikotarpio, kuriuo baigiamas ruošimo etapas.
                     
                        LITERATŪRA
                     
                     Chapter C.8 of this Annex. Toxicity for Earthworms.
                     Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. SAFEty 39: 10–20.
                  
                  
                     4 priedėlis
                     
                        Tinkamo skiedimo vandens cheminės charakteristikos
                     
                     
                                 Cheminė medžiaga
                              
                              
                                 Koncentracijos
                              
                           
                                 Kietosios dalelės
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Bendroji organinė anglis
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Nejonizuotas amoniakas
                              
                              
                                 < 1 mg/l
                              
                           
                                 Kietumas (kaip CaCO3)
                              
                              
                                 < 400 mg/l (17)
                                 
                              
                           
                                 Liekamasis chloras
                              
                              
                                 < 10 mg/l
                              
                           
                                 Suminis organinių fosforo pesticidų kiekis
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Suminis organinių chloro pesticidų ir polichlorintų bifenilų kiekis
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Suminis organinio chloro kiekis
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     5 priedėlis
                     
                        Chironomidų lervų išsiritimo stebėjimo gairės
                     
                     Į bandymo stiklines įdedamos išsiritimo gaudyklės. Gaudyklės reikalingos nuo 20 dienos iki bandymo pabaigos. Gaudyklės brėžinio pavyzdys pateiktas toliau:
                     
                        
                     A: nailono ekranas
                     B: apversti plastiko gaubtai
                     C: bebriaunė laboratorinė poveikio stiklinė
                     D: vandens keitimo ekrano angos
                     E: vanduo
                     F: nuosėdos
                  
                  C.28.   TOKSIŠKUMO BANDYMAS SU CHIRONOMIDAIS NUOSĖDOSE IR VANDENYJE, NAUDOJANT VANDENĮ SU ĮTERPTA BANDOMĄJA CHEMINE MEDŽIAGA
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires Nr. 219 (2004). Šiuo bandymo metodu siekiama įvertinti ilgalaikį cheminių medžiagų poveikį nuosėdose gyvenančioms gėlųjų vandenų dvisparnio vabzdžio Chironomus sp. lervoms. Šis metodas iš esmės pagrįstas BBA gairėmis; šiuo atveju naudojama nuosėdų—vandens sistema su dirbtiniu dirvožemiu ir vandens storymės poveikio scenarijumi (1). Atliekant šį bandymą taip pat atsižvelgiama į turimus toksiškumo bandymo su Chironomus riparius ir Chironomus tentans protokolus, kurie parengti Europoje (1) (2) (3) ir Šiaurės Amerikoje (4) (5) (6) (7) (8) ir patikrinti tarplaboratorinio lyginimo bandymais (1) (6) (9). Taip pat leidžiama naudoti kitas dvisparnių vabzdžių rūšis, pvz., Chironomus yoshimatsui (10) (11), kurios tinkamai pagrįstos dokumentais.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Taikant šį bandymo metodą kaip poveikio scenarijus pasirenkamas bandomosios cheminės medžiagos įterpimas į vandenį. Atitinkamo poveikio scenarijaus pasirinkimas priklauso nuo numatomo bandymo taikymo. Vandens poveikio scenarijumi, kai, be kita ko, į vandens storymę įterpiama bandomoji cheminė medžiaga, ketinama modeliuoti pesticidų sklidimą ir scenarijus apima pradines didžiausias koncentracijas porų vandenyje. Šis scenarijus taip pat taikytinas kitų poveikio tipų atvejais (įskaitant cheminių medžiagų išsiliejimą), išskyrus ilgiau negu bandymo laikotarpis trunkančius kaupimosi procesus.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Cheminės medžiagos, kurias būtina ištirti siekiant nustatyti jų poveikį nuosėdose gyvenantiems organizmams, paprastai šiame skyriuje išlieka ilgą laikotarpį. Nuosėdose gyvenančius organizmus galima veikti keliais būdais. Kiekvieno poveikio būdo santykinė svarba ir laikas, sugaištamas, kol taikant kiekvieną būdą užtikrinamas bendrasis toksiškas poveikis, priklauso nuo atitinkamos cheminės medžiagos fizinių ir cheminių savybių. Jei tai lengvai absorbuojamos cheminės medžiagos (pvz., kai Kow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuosėdomis susijusios cheminės medžiagos, užteršto maisto nurijimas galėtų būti tinkamas poveikio būdas. Siekiant, kad stipriomis lipofilinėmis savybėmis pasižyminčių cheminių medžiagų toksiškus būtų reikiamai vertinamas, galima svarstyti galimybę, ar nereikėtų į nuosėdas įterpti pašaro prieš taikant bandomąją cheminę medžiagą. Norint atsižvelgti į visus galimus poveikio būdus pagrindinis dėmesys taikant šį bandymo metodą skiriamas ilgalaikiam poveikiui. Bandymo trukmė naudojant C. Riparius ir C. Yoshimatsui yra 20–28 dienos ir 28–65 dienos, jeigu pasirenkama C. tentans. Jeigu konkrečiam tikslui, pvz., tiriant nestabilių cheminių medžiagų poveikį, būtini trumpalaikiai duomenys, papildomus kartotinius ėminius galima paimti po dešimties parų laikotarpio.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Išmatuotas poveikis yra bendras išsiritusių suaugusiųjų skaičius ir išsiritimo trukmė. Rekomenduojama, kad lervų išgyvenimo ir augimo rodikliai būtų matuojami tik po dešimties parų laikotarpio, jeigu būtini papildomi trumpalaikiai duomenys ir jeigu reikia naudoti papildomus pakartotinius ėminius.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Rekomenduojama naudoti sintetines nuosėdas. Sintetinės nuosėdos keliais atžvilgiais yra tinkamesnės negu natūralios nuosėdos:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          kintamumas darant bandymą yra sumažinamas, nes kintamumas sudaro atkuriamą „standartinę matricą“ ir nėra būtina nustatyti neužterštą ir švarų nuosėdų šaltinį,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          bandymus galima pradėti bet kuriuo metu ir nepaisyti bandomųjų nuosėdų sezoninio kintamumo bei šiuo atveju nebūtina iš anksto apdoroti nuosėdų, kad iš jų būtų pašalinta būdingoji fauna; naudojant sintetines nuosėdas taip pat sumažinamos išlaidos, išleidžiamos lauke renkant įprastiems bandymams reikalingą nuosėdų kiekį,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          naudojant sintetines nuosėdas galima lyginti toksiškumą ir atitinkamai klasifikuoti chemines medžiagas: toksiškumo bandymų, kuriems naudotos natūralios ir dirbtinės nuosėdos, duomenys buvo lyginami atsižvelgiant į kelias chemines medžiagas (2).
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Taikomų sąvokų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                           
                        BANDYMO METODO ESMĖ
                  
                              7.
                           
                           
                              Pirmos stadijos chironomidų lervos veikiamos tam tikros koncentracijos bandomąja chemine medžiaga nuosėdų-vandens sistemose. Pradėjus bandymą viena pirmosios stadijos lerva įdedama į bandymo stiklinę, kurioje yra nuosėdų–vandens sistema ir į kurios vandenį vėliau įleidžiama bandomosios cheminės medžiagos. Bandymo pabaigoje matuojama chironomidų išsinėrimo ir augimo sparta. Taip pat galima matuoti lervų išgyvenimą ir masę po 10 parų, jeigu reikia (naudojant kartotinius ėminius, kai būtina). Šie duomenys analizuojami taikant regresijos modelį ir siekiant įvertinti koncentraciją, kuri būtų x % sumažinusi lervų išsinėrimą, arba lervų išgyvenimą ar augimą (pvz., EC15, EC50 ir t. t.) arba hipotezę tikrinant statistiniais kriterijais siekiant nustatyti NOEC/LOEC (stebimo poveikio nedarančią koncentraciją ir (arba) mažiausią stebimo poveikio koncentraciją). Pastaruoju atveju pasitelkus statistinius kriterijus poveikio vertes būtina lyginti su kontrolinėmis vertėmis.
                           
                        INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
                  
                              8.
                           
                           
                              Turėtų būti žinomas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas vandenyje, jos garų slėgis, išmatuotas ar apskaičiuotas nuosėdų susidarymas ir stabilumas vandenyje bei nuosėdose. Turėtų būti prieinamas analizės metodas kiekybiniam bandomosios cheminės medžiagos kiekiui nustatyti paviršiniame vandenyje, porų vandenyje ir nuosėdose su žinomu ir praneštu tikslumu bei aptikimo riba. Naudinga informacija laikytina bandomosios cheminės medžiagos struktūrinė formulė ir grynumas. Bandomosios cheminės medžiagos cheminis išliekamumas (pvz., išsklaidymas, abiotinis ir biotinis suirimas ir t. t.) taip pat laikytinas naudinga informacija. Išsamios bandomųjų cheminių medžiagų, su kurioms dėl jų fizinių ir cheminių savybių sunku daryti bandymą, gairės pateiktos (12).
                           
                        ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS
                  
                              9.
                           
                           
                              Bandymus su etaloninėmis cheminėmis medžiagomis galima atlikti periodiškai ir juos darant būtų užtikrinama, kad bandymo protokolas ir bandymo sąlygos būtų patikimos. Etaloninės toksiškos medžiagos, tinkamos naudoti atliekant tarplaboratorinio lyginimo bandymus ir patvirtinimo tyrimus: lindanas, trifluralinas, pentachlorfenolis, kadmio chloridas ir kalio chloridas (1) (2) (5) (6) (13).
                           
                        BANDYMO VALIDUMAS
                  
                              10.
                           
                           
                              Bandymas laikomas validuotu, jeigu taikomos šios sąlygos:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          lervų išsinėrimas kontroliniuose ėminiuose bandymo pabaigoje turi būti ne mažesnis negu 70 %; (1) (6),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          
                                             C. riparius ir C. yoshimatsui iš kontrolinių indų suaugėliais turėtų tapti 12–23 dienomis po lervų įleidimo į indus; C. tentans, šis laikotarpis turi būti 20–65 dienos,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          bandymo pabaigoje pH vertė ir ištirpusio deguonies koncentracija turėtų būti matuojama kiekviename inde; deguonies koncentracijos vertė esant naudojamai temperatūrai turėtų būti bent 60 % soties ore vertės ir paviršinio vandens pH vertė visuose bandymo induose turėtų atitikti 6–9 intervalą,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          vandens temperatūra neturėtų skirtis daugiau negu ± 1,0 °C. Vandens temperatūrą galima reguliuoti naudojant izoterminę patalpą ir šiuo atveju patalpos temperatūra turėtų būti patvirtinama atitinkamais laiko intervalais.
                                       
                                    
                        BANDYMO METODO APRAŠYMAS
                  
                     Bandymo indai
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Tyrimas atliekamas naudojant 600 ml laboratorines stiklines (skersmuo 8 cm). Leidžiama rinktis kitus indus, tačiau juos naudojant turėtų būti užtikrinamas tinkamas paviršinio vandens ir nuosėdų storis. Nuosėdų paviršiaus plotas turėtų būti toks, kad vienai lervai tektų 2–3 cm2. Nuosėdų storio ir paviršinio vandens sluoksnio storio santykis turėtų būti 1:4. Bandymo indai ir kiti įrenginiai, kurie liesis su bandymo sistema, turėtų būti vien iš stiklo ar kitos cheminiu atžvilgiu neutralios medžiagos (pvz., teflono).
                           
                        
                     Rūšių pasirinkimas
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Renkantis atliekant bandymą naudojamą rūšį pirmenybė teikiama Chironomus riparius. Taip pat leidžiama naudoti Chironomus tentans, tačiau juos sunkiau prižiūrėti ir jiems būtinas ilgesnis bandymo laikotarpis. Be to, leidžiama naudoti Chironomus yohimatsui. Su Chironomus riparius susiję kultūrų auginimo metodai aprašyti 2 priedėlyje. Taip pat pateikiama informacija apie kitų rūšių, t. y. Chironomus tentans (4) ir Chironomus yoshimatsui (11), kultūrų auginimo sąlygos. Rūšies tapatybės nustatymas turi būti patvirtinamas prieš bandymą, tačiau patvirtinimas nėra būtinas prieš kiekvieną bandymą, jeigu organizmas paimtas iš vietoje išaugintos kultūros.
                           
                        
                     Nuosėdos
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Pirmenybė teikiama pasiruoštoms nuosėdoms (jos dar vadinamos pertvarkytomis, dirbtinėmis ar sintetinėmis nuosėdomis). Tačiau jeigu naudojamos natūralios nuosėdos, turėtų būti nurodomos jų charakteristikos (bent pH, organinės anglies kiekis, kitų parametrų apibrėžtis, pvz., C/N santykis, ir taip pat rekomenduojama pateikti granuliometrinę sudėtį) ir nuosėdose neturi būti jokių teršalų ir kitų organizmų, kurie galėtų konkuruoti su chironomidais ar juos vartoti. Taip pat rekomenduojama, kad prieš pradedant nuosėdas naudoti toksiškumo bandymui su chironomidais, natūralios nuosėdos kondicionuojamos septynias dienas tomis pačiomis sąlygomis, kurios taikomos kitam bandymui. Atliekant šį bandymą (1) (15) (16) rekomenduojama naudoti iš dirbtinio dirvožemio, kuris naudojamas taikant bandymo metodą C.8 (14), pasiruoštas sintetines nuosėdas:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          4–5 % durpių (sausoji masė): pH vertė kiek įmanoma turi būti 5,5–6,0; privaloma naudoti smulkiai sumaltus (dalelių dydis ≤ 1 mm) durpių miltelius; jos turi būti džiovintos tik ore;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          20 % (sausoji masė) kaolino molio (pageidautina, kad kaolinito jame būtų daugiau kaip 30 %);
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          75–76 % (sausoji masė) kvarcinio smėlio (smulkusis smėlis turėtų sudaryti didžiausią dalį, daugiau negu 50 % dalelių dydis 50–200 μm);
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          įpilama dejonizuoto vandens, kad galutiniame mišinyje drėgnumas sudarytų 30–50 %;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          įdedama chemijos požiūriu gryno kalcio karbonato (CaCO3), kad galutinio nuosėdų mišinio pH vertė būtų 7,0 ± 0,5;
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          galutinio mišinio sudėtyje turėtų būti be 2 % (± 0,5 %) organinės anglies ir jos kiekis turi būti koreguojamas atitinkamais durpių ir smėlio kiekiais atsižvelgiant į a–c.
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              Turėtų būti žinomas durpių, kaolino molio ir smėlio gavimo šaltinis. Nuosėdų sudedamosios dalys turėtų būti patikrinamos, ar jose nėra cheminės taršos pėdsakų (pvz., sunkiųjų metalų, chlororganinių komponentų, fosfororganinių komponentų ir t. t.). Sintetinių nuosėdų pasiruošimo pavyzdys aprašytas 3 priedėlyje. Taip pat leidžiama maišyti sausąsias sudedamąsias dalis, jeigu įmanoma įrodyti, kad užpylus paviršinio vandens nėra atskiriamos nuosėdų sudedamosios dalys (pvz., neima plūduriuoti kietosios durpių dalelės) ir kad durpės ar nuosėdos yra kondicionuotos pagal reikalavimus.
                           
                        
                     Vanduo
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Kaip bandymo vandenį leidžiama rinktis bet kokį vandenį, atitinkantį 2 ir 4 priedėliuose išvardytas skiedimui tinkamo vandens chemines savybes. Bet kokį tinkamą vandenį, natūralų vandenį (paviršinį ar gruntinį), regeneruotą vandenį (žr. 2 priedėlį) arba vandentiekio vandenį, iš kurio pašalintas chloras, leidžiama rinktis kaip kultūros auginimo vandenį ir bandymo vandenį, jeigu chironomidai jame be streso požymių išgyvena kultūros veisimo ir bandymo laikotarpiu. Bandymo vandens pH vertė pradedant bandymą turėtų būti 6–9, o bendrasis kietumas ne didesnis negu 400 mg/l kaip CaCO3. Tačiau jeigu galima daryti prielaidą, kad vandens kietumo jonai gali sąveikauti su bandomąja chemine medžiaga, turėtų būti naudojamas mažesnio kietumo vanduo (vadinasi, šiuo atveju neleidžiama rinktis Elendt Medium M4). Atliekant tyrimą turėtų būti naudojamas to paties tipo vanduo. 4 priedėlyje išvardytų vandens kokybės charakteristikų vertės turėtų būti matuojamos ne rečiau negu du kartus per metus arba kilus įtarimui, kad šios charakteristikos yra gerokai pakitusios.
                           
                        
                     Pradiniai tirpalai. Vanduo su įterpta bandomąja chemine medžiaga
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Bandymo koncentracijos apskaičiuojamos remiantis vandens storymės koncentracijomis, t. y. paviršiniu nuosėdų vandeniu. Pasirinktų koncentracijų bandomieji tirpalai paprastai pasiruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradiniai tirpalai visų pirmiausiai turėtų būti ruošiami bandomąją cheminę medžiagą tirpinant bandymo terpėje. Norint pasiruošti tinkamos koncentracijos pradinio tirpalo tam tikrais atvejais gali tekti naudoti tirpiklius ar dispergatorius. Tinkami tirpikliai – acetonas, etanolis, metanolis, metoksietanolis, etilenglikolio dimetileteris, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Naudotini dispergatoriai – „Cremophor RH40“, „Tween 80“, metilceliuliozė 0,01 % ir HCO-40. Soliubilizavimo priemonės koncentracija galutinėje bandymo terpėje turėtų būti kuo mažesnė (t. y. ≤ 0,1 ml/l) ir vienoda kiekvieną kartą veikiant bandomąja chemine medžiaga. Jeigu naudojama soliubilizavimo priemonė, ji neturi daryti jokio didesnio poveikio chironomidų lervų išgyvenimui arba akivaizdaus neigiamo poveikio šioms lervoms, kaip kad nustatoma darant kontrolinį bandymą vien tik su tirpikliu. Tačiau turėtų būti imamasi visų priemonių, kad šios medžiagos nebūtų naudojamos.
                           
                        BANDYMO PLANAS
                  
                              17.
                           
                           
                              Sudarant bandymo planą pasirenkamos bandymo koncentracijos ir jų paskirstymas, kiekvienos koncentracijos indų skaičius ir lervų skaičius inde. Pateikiamas EC taško nustatymo, NOEC nustatymo ir ribos bandymo atlikimo aprašymas. Pirmenybė teikiama regresinei analizei, o ne hipotezės tikrinimo metodui.
                           
                        
                     Regresinės analizės planas
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Bandymui naudotos koncentracijos būtinai turi aprėpti poveikio koncentraciją (pvz., EC15, EC50) ir dominančio medžiagos poveikio koncentracijos verčių diapazoną. Apskritai tikslumo ir ypač validumo vertes, kurias naudojant galima įvertinti poveikio koncentracijas (ECx), įmanoma patikslinti, jeigu poveikio koncentracijos vertės atitinka bandymo koncentracijų intervalą. Nereikėtų ekstrapoliuoti gerokai mažesnių negu mažiausioji teigiamoji koncentracija arba didesnių negu didžiausioji koncentracija verčių. Pradinis intervalo nustatymo bandymas praverčia renkantis naudotinų koncentracijų intervalą (žr. 27 pastraipą).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Jeigu turi būti nustatomos poveikio koncentracijos (ECx), turėtų būti atliekami bent penki bandymai naudojant kiekvieną koncentracijos vertę ir trys kartotiniai bandymai. Bet kuriuo atveju rekomenduojama naudoti pakankamą bandymo koncentracijų skaičių, kad būtų užtikrinamas reikiamas modelio įvertinimas. Koncentracijų koeficiento vertė neturėtų būti didesnė negu 2 (išimtį leidžiama taikyti tais atvejais, jeigu dozės ir reakcijos santykio kreivė turi nuolaidų statumą). Kartotinių ėminių skaičių atliekant kiekvieną apdorojimą galima mažinti, jeigu padidėja skirtingą atsaką sukeliančių bandymo koncentracijų skaičius. Didinant kartotinių ėminių skaičių arba mažinant bandymo koncentracijų intervalo ribas būtų taikomi siauresni bandymo pasikliovimo intervalai. Papildomi kartotiniai ėminiai būtini tuo atveju, jeigu būtina įvertinti 10 parų lervų išlikimą ir augimą.
                           
                        
                     NOEC/LOEC įvertinimo planas
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Jeigu turi būti vertinama LOEC arba NOEC, turėtų būti naudojamos ne mažiau negu keturių kartotinių bandymų penkios bandomosios koncentracijos ir koncentracijų koeficiento vertė neturėtų viršyti 2. Kartotinių bandymų skaičius turėtų būti pakankamas siekiant užtikrinti reikiamą statistinę galią, kad būtų aptinkamas 20 % skirtumas nuo kontrolinio 5 % reikšmingumo lygmens (p = 0,05). Nustatant vystymosi greitį paprastai naudojama dispersinė analizė (ANOVA), pvz., Dunnett bandymas ir Williams bandymas (17) (18) (19) (20). Nustatant išskridimo normą galima naudoti Cochran-Armitage, Fisher (su Bonferroni pataisa) arba Mantel-Haentzal bandymus.
                           
                        
                     Ribinis bandymas
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Ribinį bandymą galima atlikti (viena bandomoji koncentracija ir kontrolinis ėminys), jeigu darant pradinį intervalo nustatymo bandymą nebuvo nustatyta jokių poveikių. Atliekant ribinį bandymą siekiama nurodyti, kad toksinė bandomosios cheminės medžiagos vertė yra didesnė negu darant bandymą nustatyta ribinė koncentracija. Naudojant šį bandymo metodą negalima pateikti jokių pasiūlymų dėl rekomenduojamos koncentracijos; ši teisė suteikta pareigūnui. Paprastai būtini ne mažiau negu šeši pakartotiniai bandymai poveikiui bandomąja medžiaga ir kontroliniai bandymai. Turėtų būti įrodoma pakankama statistinė galia aptikti 20 % skirtumą nuo kontrolinės vertės esant 5 % reikšmingumo lygiui (p = 0,05). Jeigu atsakas nurodomas metriniais vienetais (vystymosi greitis ir masė), t-bandymas yra tinkamas statistinis metodas, jeigu duomenys atitinka šio bandymo reikalavimus (atitiktis, vienalytės dispersijos). Jeigu šių reikalavimų nesilaikoma, leidžiama naudoti nelygiavertės dispersijos t-bandymą arba ne parametrinį bandymą, pvz., Wilcoxon-Mann-Whithey bandymą. Nustatant išsinėrimo normą atliktinas Fisher bandymas.
                           
                        PROCEDŪRA
                  
                     Poveikio sąlygos
                  
                  
                     Vandens–nuosėdų sistemos su įterpta bandomąja chemine medžiaga paruošimas
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Į bandymo indus įdedami atitinkami sintetinių nuosėdų kiekiai (žr. 13–14 dalis ir 3 priedėlį), kad būtų paruoštas ne plonesnis negu 1,5 cm sluoksnis. Vandens pilama tiek, kol nusistovi 6 cm vandens storymė (žr. 15 pastraipą). Nuosėdų sluoksnio ir vandens storymės santykis neturėtų viršyti 1:4 bei nuosėdų sluoksnio storis neturėtų būti didesnis negu 3 cm. Nuosėdų–vandens sistema prieš įdedant į ją bandomuosius gyvūnus turėtų būti švelniai aeruojama septynias dienas (žr. 14 pastraipą ir 3 priedėlį). Kad į vandens storymę pilant bandymo vandenį nuosėdų sudedamosios dalys neatsiskirtų ir kietosios dalelės vėl nebūtų suspenduojamos skystyje, nuosėdas leidžiama uždengti plastiko disku, kol vanduo pilamas ant nuosėdų, ir vėliau diskas nedelsiant nuimamas. Taip pat leidžiama naudoti kitus įtaisus.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Bandymo indai turėtų būti uždengiami (pvz., stiklo plokštėmis) Jeigu būtina, atliekant tyrimą leidžiama įpilti vandens, kad būtų užtikrinamas pradinis vandens tūris ir kompensuojama išgaruojanti vandens dalis. Papildomai turėtų būti pilamas distiliuotas ar dejonizuotas vanduo siekiant užkirsti kelią, kad nesusidarytų druskos.
                           
                        
                     Bandomųjų organizmų įdėjimas
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Keturias ar penkias dienas prieš bandomuosius organizmus įdedant į bandymo indus, kiaušinėlių masė turėtų būti paimama iš sėjimo kultūrų ir sudedama į mažus indus auginimo terpėje. Leidžiama naudoti iš kamieninės kultūros gautą terpę arba šviežią pasiruoštą terpę. Jeigu naudojama pastaroji, į auginimo terpę turėtų būti įdedamas mažas kiekis pašaro, pvz., žaliųjų dumblių ir (arba) įlašinami keli lašeliai smulkiai sumaltų žuvų maisto gabalėlių suspensijos filtrato (žr. 2 priedėlį). Turėtų būti naudojamos tik neseniai padėtų kiaušinėlių masės. Paprastai lervos ima ristis po kelių dienų nuo kiaušinėlių padėjimo (Chironomus riparius 20 °C temperatūroje išsirita per 2–3 dienas, Chironomus tentans 23 °C temperatūroje išsirita per 1–4 dienas ir Chironomus yoshimatui 25 °C temperatūroje) ir lervos augdamos pereina keturias stadijas, iš kurių kiekviena trunka 4–8 dienas. Atliekant bandymą turėtų būti naudojamos pirmosios stadijos lervos (2–3 arba 1–4 dienų po išsiritimo). Mašalų stadiją įmanoma nustatyti pagal galvutės apvalkalo plotį (6).
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Pirmos stadijos dvidešimt lervų buka pipete atsitiktinai paskirstoma kiekvienam bandymo indui, kuriame yra nuosėdų su įterpta bandomąja chemine medžiaga ir vandens. Vandens aeravimas turi būti nutraukiamas, kol lervos dedamos į bandymo indą, ir ši būsena išlaikoma dar 24 valandas po lervų įdėjimo (žr. 24 ir 32 pastraipas). Pagal taikomą bandymo planą (žr. 19 ir 20 pastraipas) kiekviena koncentracija veikiama ne mažiau negu 60 lervų, jeigu nustatomas ES taškas, arba 80 lervų, jeigu apibrėžiama NOEC.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Po dvidešimt keturių valandų nuo lervų įdėjimo, į paviršinio vandens storymę įleidžiama bandomoji cheminė medžiaga ir vanduo vėl imamas šiek tiek aeruoti. Maži bandomosios cheminės medžiagos tirpalų kiekiai pipete įterpiami po vandens paviršiumi. Tada paviršinis vanduo turėtų būti išmaišomas (stengiamasi nesukelti nuosėdų).
                           
                        
                     Bandomosios koncentracijos
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Intervalo nustatymo bandymas gali būti naudingas siekiant apibrėžti darant galutinį bandymą pasirinktinų koncentracijų intervalą. Šiuo tikslu naudojamos labai besiskiriančių bandomosios cheminės medžiagos koncentracijų serijos. Siekiant užtikrinti galutiniam bandymui naudojamų chironomidų vienodą paviršiaus tankumą, jie veikiami kiekviena bandomosios cheminės medžiagos koncentracija tol, kol įvertinamos atitinkamos bandomosios koncentracijos ir kartotiniai ėminiai nėra reikalingi.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Atliekant galutinį bandymą naudojamos bandomosios koncentracijos pasirenkamos atsižvelgiant į intervalo nustatymo bandymo rezultatą. Turėtų būti naudojamos ne mažiau negu penkios koncentracijos kaip aprašyta 18–20 pastraipose.
                           
                        
                     Kontroliniai ėminiai
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Kontrolinių ėminių indai be jokios bandomosios cheminės medžiagos, tačiau su nuosėdomis, turėtų būti naudojami atliekant bandymą su atitinkamu skaičiumi kartotinių ėminių (žr. 19–20 pastraipą) Jeigu taikant bandomąją cheminę medžiagą naudotas tirpiklis (žr. 16 pastraipą), turėtų būti įdedama tirpiklio kontrolinis ėminys.
                           
                        
                     Bandymo sistema
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Naudojama statinė sistema. Išskirtiniais atvejais leidžiama naudoti pusiau statines ar dinamines sistemas su trūkiuoju ar tolygiu paviršinio vandens atnaujinimu, pvz., jeigu vandens kokybės reikalavimai neatitinka taikomų bandomajam organizmui ar daro poveikį cheminei pusiausvyrai (pvz., ištirpusio deguonies lygiai pernelyg sumažėja, labai padidėja šalinimo produktų koncentracija arba iš nuosėdų ima sunktis mineralų skystis ir daro poveikį pH ir (arba) vandens kietumo vertėms. Tačiau paprastai pakanka kitų paviršinio vandens kokybės gerinimo metodų, pvz., aeracijos, ir jiems teiktina pirmenybė.
                           
                        
                     Pašaras
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Lervas būtina šert; pageidautina kiekvieną dieną ar bent tris kartus per savaitę. Per pirmąsias 10 parų jaunoms lervoms per dieną turėtų pakakti 0,25–0,5 mg (C. yoshimatui lervoms 0,35–0,5 mg) žuvų maisto (vandens suspensija arba smulkiai sumaltas maistas, pvz., Tetra-Min arba Tetra-Phyll, išsami informacija pateikta 2 priedėlyje). Senesnėms lervoms reikia šiek tiek daugiau pašaro: likusiai bandymo daliai kiekvieną dieną lervoms turėtų pakakti 0,5–1 mg. Pašaro kiekis turėtų būti mažinamas visų poveikių bandomąja chemine medžiaga atvejais ir kontroliuojamas, jeigu nustatomas grybelio atsiradimas arba jeigu aptinkama, kad gaišta kontrolinės grupės gyvūnai. Jeigu grybelio augimo nepavyksta sustabdyti, bandymas turi būti pakartotas. Jeigu bandymai atliekami su lengvai absorbuojamomis cheminėmis medžiagomis (pvz., kai Kow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuosėdomis susijusiomis cheminėmis medžiagomis, išgyvenimui ir natūraliam augimui būtiną pašaro kiekį galima įterpti į sintetines nuosėdas prieš stabilizavimo laikotarpį. Šiuo tikslu turi būti naudojamas ne žuvų maistas, o augalinis pašaras, pvz., pridedama 0,5 % (sausoji masė) smulkiai sumaltų lapų, pvz., didžiosios dilgėlės (Urtica dioeca), baltojo šilkmedžio (Morus alba), persinio dobilo (Trifolium repens), daržinio špinato (Spinacia oleracea) arba galima naudoti kitą augalinę medžiagą (Cerophyl arba alfa celiuliozę).
                           
                        
                     Inkubacijos sąlygos
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Rekomenduojama visų pirma 24 valandas po lervų įdėjimo nestipriai aeruoti bandymo indų paviršinį vandenį ir vėliau aeruojama per visą bandymo atlikimo trukmę (privaloma stebėti, ar ištirpusio deguonies koncentracijos vertė nėra mažesnė negu 60 % soties ore vertės (ASV)). Aeruojant naudojama stiklinė Pastero pipetė, pritvirtinta 2–3 cm virš nuosėdų sluoksnio (t. y. vienas ar keli burbulai per sek.). Darant bandymus su lakiosiomis cheminėmis medžiagomis galima apsispręsti ir neaeruoti nuosėdų–vandens sistemos.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Atliekant bandymą išlaikoma pastovi 20 °C (± 2 °C) temperatūra. Atliekant bandymą su C. tentans ir C. yoshimatui atitinkamai rekomenduojama pasirinkti 23 °C(± 2 °C) temperatūrą. Naudojamas 16 val. apšvietimo laikotarpis; šviesos intensyvumo vertės turėtų būti 500–1 000 liuksų.
                           
                        
                     Poveikio trukmė
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Poveikis prasideda lervas įdėjus į indus su bandomąją chemine medžiaga ir kontrolinių ėminių indus. Jeigu naudojami C. riparius ir C. yoshimatsui, poveikio trukmė yra 28 dienos, o kai pasirenkama C. tentans – 65 dienos. Jeigu mašalai atsiranda anksčiau, bandymą galima nutraukti ne anksčiau negu po penkių dienų atsiradus paskutiniam kontrolinės grupės suaugusiajam.
                           
                        STEBĖJIMAI
                  
                     Lervų išsinėrimas
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Nustatoma vystymosi trukmė ir bendras visų iki galo išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius. Patinėliai lengviau atpažįstami žiūrint į jų plunksniškus čiuptuvėlius.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Bandymo indai turėtų būti stebimi bent tris kartus per savaitę siekiant nustatyti bet kokią neįprastą veikseną (pvz., nuosėdų susidarymą, neįprastą plūduriavimą) palyginti su kontroliniais indais. Numatomo lervų išsinėrimo laikotarpiu būtina skaičiuoti kasdieną atsirandančius mašalus. Kiekvieną dieną registruojami visi atsiradę mašalai ir nurodoma jų lytis. Nustačius tapatybę mašalai pašalinami iš indų. Turėtų būti registruojamos visos prieš užbaigiant bandymą padėtos kiaušinėlių masės ir po to pašalinamos, kad lervos pakartotinai nebūtų įdėtos į nuosėdas. Taip pat registruojamas matomų lėliukų skaičius, kurios nėra išsiritusios. Išsineriančių lervų skaičiavimo gairės pateiktos 5 priedėlyje.
                           
                        
                     Augimas ir išgyvenimas
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Jeigu privaloma pateikti duomenis apie 10 parų lervų išlikimą ir augimą, iš pradžių turi būti įtraukiami papildomi bandymo indai, kad juos būtų galima naudoti vėliau. Šių papildomų indų nuosėdos sijojamos 250 μm sietu siekiant surinkti lervas. Gaišimo kriterijai yra nejudumas ar nepakankamas atsakas į mechaninius dirgiklius. Neatsigavusios lervos taip pat turėtų būti laikomos nugaišusiomis (bandymo pradžioje nugaišusios lervos galėjo būti žuvusios nuo mikrobų). Nustatoma bandymo inde išgyvenusių lervų sausoji masė (be pelenų) ir apskaičiuojama vidutinė pavienio indo sausoji masė. Tikslinga nustatyti, kurios stadijos yra išgyvenusi lerva; šiuo tikslu galima matuoti kiekvieno individo galvos apvalkalo plotį.
                           
                        
                     Analiziniai matavimai
                  
                  
                     Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Bandymo pradžioje (geriausiai būtų vieną valandą po bandomosios cheminės medžiagos įterpimo) ir jo pabaigoje rekomenduojama analizuoti bent paviršinio vandens, porų vandens ir nuosėdų ėminius esant didžiausiai koncentracijai ir mažesnei koncentracijai. Nustačius bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją gaunama informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos elgseną ir (arba) pasiskirstymą vandens–nuosėdų sistemoje. Bandymo pradžioje imant nuosėdų ėminius gali būti padarytas poveikis bandymo sistemai (pvz., pašalinamos bandomosios lervos); vadinasi, turėtų būti naudojami papildomi bandymo indai siekiant bandymo pradžioje ir jį atliekant, jeigu reikia, atlikti analizinius nustatymus (žr. 39 pastraipą). Nuosėdų matavimų gali nereikėti atlikti, jeigu bandomosios cheminės medžiagos pasiskirstymas tarp vandens ir nuosėdų buvo aiškiai apibrėžtas atlikus vandens ir (arba) nuosėdų tyrimą palyginamomis sąlygomis (pvz., nuosėdų ir vandens santykis, poveikio tipas, organinės anglies kiekis nuosėdose).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Jeigu atliekami tarpiniai matavimai (pvz., 7 dieną) ir jeigu analizei atlikti reikalingi dideli ėminiai, kuriuos paėmus bandymo sistemai būtų padarytas poveikis, analiziniai nustatymai turėtų būti atliekami naudojant iš panašiai apdorotų papildomų bandymo indų paimtus ėminius (įskaitant bandomųjų organizmų buvimą), tačiau biologiniam stebėjimui nenaudotų indų.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Siekiant izoliuoti laisvąjį vandenį rekomenduojama 30 min. taikyti centrifugavimą, pvz., 10 000 g ir 4 °C. Tačiau jeigu įrodoma, kad bandomosios cheminės medžiagos filtrai neadsorbuoja, taip pat galima rinktis filtravimą. Tam tikrais atvejais gali nebūti įmanoma analizuoti porų vandens koncentracijų, nes ėminys yra pernelyg mažas.
                           
                        
                     Fiziniai ir cheminiai parametrai
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Tinkamu būdu turėtų būti matuojama bandymo induose esančio bandymo vandens pH, ištirpusio deguonies ir temperatūros vertės (žr. 10 pastraipą). Bandymo pradžioje ir jo pabaigoje turėtų būti matuojama kontrolinių ėminių ir vieno bandymo indo kietumo ir amoniako vertės esant didžiausiai koncentracijai.
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITŲ TEIKIMAS
                  
                     Rezultatų apdorojimas
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Šio bandymo tikslas – nustatyti bandomosios cheminės medžiagos poveikį mašalų patelių ir patinėlių vystymosi greičiui ir bendram jų skaičiui, arba, jeigu atliekamas 10 parų bandymas, poveikį lervų išgyvenimui ir jų masei. Jeigu neturima duomenų apie statistiniu požiūriu skirtingą lyčių jautrumą, atliekant statistinę analizę patinėlių ir patelių rezultatus galima sujungti. Apie lyčių jautrumo skirtumus galima spręsti naudojant statistines priemones, pvz., atliekant χ2-r × 2 lentelės bandymą. Jeigu reikia, po 10 parų turi būti nustatomas lervų išgyvenimas ir vidutinė kiekvieno indo sausoji masė.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Paviršinio vandens koncentracijomis išreikštos poveikio koncentracijos visų pirmiausiai apskaičiuojamos remiantis bandymo pradžioje išmatuotomis koncentracijomis (žr. 38 pastraipą).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Norint apskaičiuoti EC50 arba bet kokio kito ECx taškinį įvertį indo statistinius duomenis leidžiama naudoti kaip patikimus kartotinius duomenis. Apskaičiuojant kiekvieno ECx pasikliovimo intervalą turėtų būti atsižvelgiama į kiekvieno indo skirtingumą arba būti įrodoma, kad šis kintamumas yra toks mažas, kad jo galima nepaisyti. Jeigu modeliui taikomas mažiausiųjų kvadratų metodas, kiekvieno indo statistikos duomenims taikoma transformacija siekiant pagerinti dispersijos vienalytiškumą. Tačiau ECx vertės turėtų būti apskaičiuojamos atsaką transformavus į pradinę vertę.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Jeigu taikant statistinę analizę siekiama apibrėžti NOEC/LOEC ir šiuo tikslu tikrinama hipotezė, turi būti atsižvelgiama į su indais susijusį skirtingumą, pvz., įterpiant ANOVA. Antraip jeigu susiklosto situacijos, kad įprastos ANOVA prielaidos gali būti pažeidžiamos, galima naudoti išsamesnius bandymus (21).
                           
                        
                     Išsinėrimo santykis
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Išsinėrimo santykiai yra kiekybiniai duomenys ir juos galima analizuoti atliekant Cochran-Armitage bandymą, taikomą mažėjimo tvarka, jeigu laikoma, kad dozės ir atsakos santykis būsiąs monotoniškas ir šie duomenys atitinka minėtą prielaidą. Jeigu ne, šiuo atveju leidžiama rinktis Fisher arba Mantel-Haentzal bandymą su pakoreguotomis pagal Bonferroni-Holm p vertėmis. Jeigu turima įrodymų, kad naudojant tą pačią koncentraciją kartotinių ėminių kintamumas yra didesnis negu būtų galima nustatyti atsižvelgiant į binominį skirstinį (dažnai vadinamą „pertekline dispersija“), šiuo atveju turėtų būti pasirenkamas (21) pasiūlytas išsamus Cochran-Armitage arba Fisher bandymas.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Viename inde išsiritusių mašalų skaičius ne nustatomas ir dalinamas iš įdėtų lervų skaičiaus na:
                              
                                 
                              kur:
                              
                                          ER
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          išsinėrimo santykis
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          viename inde išsinėrusių mašalų skaičius
                                       
                                    
                                          na
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          į indą įdėtų lervų skaičius
                                       
                                    
                        
                              48.
                           
                           
                              Jeigu ėminiai yra dideli ir jeigu nustatoma perteklinė dispersija, šiuo atveju galima rinktis kitą alternatyvą, t. y. išsinėrimo santykį laikyti nenutrūkstamuoju atsaku ir rinktis Williamso bandymą, jeigu daroma prielaida, kad atsakas į dozę būsiąs monotoninis ir atitiksiąs šiuos ER duomenis. Jeigu monotoniškumas nėra užtikrinamas, pirmenybė teiktina Duneto bandymui. Didelio ėminio dydis šiuo atveju apibrėžiamas išsinėrusių mašalų ir neišsinėrusių mašalų skaičiumi, kuris abiem atvejais viršija penkis, atsižvelgiant į kartotinį ėminį (indą).
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Norint taikyti ANOVA metodų vertes, ER vertės pirmiausiai turėtų būti transformuojamos naudojant arksinuso kvadratinės šaknies transformaciją arba Tukey-Freeman transformaciją siekiant gauti apytikslį įprastą skirstinį ir suvienodinti dispersijas. Leidžiama naudoti Cochran-Armitage, Fisherio (Bonferroni) arba Mantel-Haentzal bandymus, jeigu taikomi absoliutieji dažniai. Arksinuso kvadratinės šaknies transformacija taikoma pasirenkant ER vertės kvadratinės šaknies arksinusą (sin–1).
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Išsinėrimo santykių ECx vertės apskaičiuojamos naudojant regresijos analizę (arba, pvz., probit (22), logit, Weitbull, atitinkamą komercinę programinę įrangą ir t. t.). Jeigu regresijos analizė nepavyksta (pvz., jeigu tėra mažiau negu du daliniai atsakai), naudojami kiti ne parametriniai metodai, pvz., slankiojo vidurkio metodas ar interpoliacijos metodas.
                           
                        
                     Vystymosi greitis
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Vidutinė vystymosi trukmė yra vidutinis laikotarpis nuo lervų įdėjimo (nulinė bandymo diena) ir iki eksperimentinės mašalų kohortos išsinėrimo. (Apskaičiuojant tikrąją vystymosi trukmę turėtų būti atsižvelgiama į lervų amžių, kai jos buvo įdedamos). Vystymosi greitis yra atvirkštinis dydis vystymosi trukmės atžvilgiu (vienetas: 1/diena) ir atitinka tą lervos vystymosi atkarpą, kuris vyksta per vieną dieną. Vystymosi greičiui, palyginti su šių nuosėdų toksiškumo tyrimų įvertinimu, teikiama pirmenybė, nes jo dispersija yra mažesnė, ir jis vienalytiškesnis bei glaudžiau atitinka įprastą pasiskirstymą, jeigu lyginama su vystymosi trukme. Vadinasi, leidžiama veikiau rinktis patikimą parametrinį bandymą su vystymosi greičiu negu su vystymosi trukme. Vystymosi greičio kaip nenutrūkstamo atsako ECx vertes galima įvertinti naudojant regresijos analizę (pvz., (23), (24)).
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Atliekant šiuos statistinius tyrimus laikoma, kad tikrinimo x dieną pastebėtas mašalų skaičius išsinėrė per vidutinį laiko intervalą nuo x dienos iki x-1 dienos (l = tikrinimo intervalo trukmė (paprastai viena diena)). Vienam indui taikoma vidutinė vystymosi greičio vertė (x) apskaičiuojama pagal šią lygtį:
                              
                                 
                              kur:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          indui taikoma vidutinė vystymosi greičio vertė
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          tikrinimo intervalo indeksas
                                       
                                    
                                          m
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          didžiausias tikrinimo intervalų skaičius
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          per tikrinimo intervalą i išsinėrusių mašalų skaičius
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          bendras eksperimento pabaigoje išsinėrusių mašalų skaičius (=)
                                       
                                    
                                          xi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          per intervalą i išsinėrusių mašalų vystymosi greitis
                                       
                                    
                                 
                              kur:
                              
                                          dienai
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          tikrinimo diena (diena po poveikio)
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          tikrinimo intervalo i trukmė (dienos, paprastai 1 diena)
                                       
                                    
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Į bandymo ataskaitą turi būti įtraukiama bent ši informacija:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizinis pobūdis ir, jeigu reikia, fizinės bei cheminės savybės (tirpumas vandenyje, garų slėgis, pasiskirstymo dirvoje koeficientas (ar nuosėdose, jeigu žinomas), stabilumas vandenyje ir t. t.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      cheminės tapatybės nustatymo duomenys (bendrinis pavadinimas, cheminis pavadinimas, struktūrinė formulė, CAS numeris ir t. t.), įskaitant grynumą ir analinės metodas atliekant bandomosios cheminės medžiagos kiekybinį nustatymą.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomosios rūšys:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudojami bandomieji gyvūnai: rūšis, mokslinis pavadinimas, organizmo gavimo šaltinis ir veisimo sąlygos,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informacija apie kiaušinėlių masės ir lervų tvarkymą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      gyvūnų amžius, kai jie buvo įdėti į bandymo indus.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudotos nuosėdos, t. y. natūralios ar sintetinės nuosėdos,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jei naudojamos natūralios nuosėdos, nuosėdų ėminių ėmimo vieta ir jos aprašymas, įskaitant, jeigu įmanoma, taršos aprašas; charakteristikos: pH, organinės anglies kiekis, C/N santykis ir granuliometrinė analizė (jeigu reikia),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sintetinių nuosėdų pasiruošimas: sudedamosios dalys ir charakteristikos (organinės anglies kiekis, pH, drėgmė ir t. t. bandymo pradžioje),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandymo vandens pasiruošimas (jeigu naudojamas regeneruotas vanduo) ir charakteristikos (deguonies koncentracija, pH. Laidumas, kietumas ir t. t. bandymo pradžioje),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nuosėdų ir vandens sluoksnių storis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      paviršinio vandens ir porų vandens tūris; drėgnųjų nuosėdų masė su porų vandeniu ir be jo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandymo indai (medžiaga ir dydis),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pradinių tirpalų ruošimo metodai ir bandomosios koncentracijos,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandomosios cheminės medžiagos taikymas: naudotos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, kartotinių ėminių skaičius ir naudoti tirpikliai, jeigu buvo naudoti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inkubacijos sąlygos: temperatūra, šviesos ciklas ir intensyvumas, aeracija (dažnumas ir intensyvumas),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie pašarą, įskaitant jo tipą, paruošimą, kiekį ir maitinimo tvarką.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatai:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominaliosios bandomosios koncentracijos, išmatuotos bandomosios koncentracijos ir visų analizių rezultatai siekiant bandymo inde nustatyti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vandens kokybė bandymo induose, t. y. pH, temperatūra, ištirpęs deguonis, kietumas ir amoniako kiekis,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išgaruojančio bandymo vandens papildymas, jeigu taikoma,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      iš kiekvieno indo per dieną išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lervų, kurios iš indo neišsinėrė kaip mašalai, skaičius,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vidutinė pavienė lervų sausoji masė inde ir tam tikros stadijos lervų sausoji masė inde, jeigu reikia,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsinėrusių mašalų skaičius atliekant tapatų bandymą ir bandomoji koncentracija (mašalų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      atliekant tapatų bandymą išsinėrusių mašalų vidutinis vystymosi greitis ir apdorojimo norma (mašalų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toksinio poveikio įvertinimai, pvz., ECx (ir susiję pasikliovimo intervalai), NOEC ir (arba) LOEC bei jiems nustatyti naudoti statistikos metodai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatų aptarimas, įskaitant bet kokį poveikį bandymo rezultatams, kuris būtų padarytas nukrypus nuo šio bandymo metodo.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              ASTM International/E1706–00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and SAFEty Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Šio priedo C.8 skyrius. Toksiškumas sliekams.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577–585.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485–1494.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312.
                           
                        
                     1 priedėlis
                     SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS
                     Šiame metode vartojamų terminų apibrėžtys:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Pasiruoštosios nuosėdos ar regeneruotos, dirbtinės arba sintetinės nuosėdos yra natūralių nuosėdų fizines sudedamąsias dalis atitinkančių medžiagų mišinys.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Paviršinis vanduo – bandymo inde ant nuosėdų užpiltas vanduo.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Laisvasis vanduo ar porų vanduo – ertmes tarp nuosėdų ir dirvožemio kietųjų dalelių užpildantis vanduo.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Vanduo su įterpta bandomąja chemine medžiaga – bandymo vanduo, į kurias prileista bandomosios cheminės medžiagos.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga – bet kokia naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga ar mišinys.
                              
                           
                  
                     2 priedėlis
                     
                        Rekomendacijos dėl Chironomus riparius auginimo
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 
                                    Chironomus lervas galima auginti kristalizatoriuose ar didelėse talpyklose. Ant talpyklos dugno plonu sluoksniu (5–10 mm storio) paskleidžiamas smulkus kvarco smėlis. Taip pat įrodyta (pvz., Merck, Art 8117), kad diatomitas yra tinkamas substratas (pakanka plonesnio sluoksnio, vos kelių mm storio). Po to įpilamas kelių centimetrų storio vandens sluoksnis. Jeigu reikia, įpilama papildomo vandens, kad būtų atkuriamas išgaravęs kiekis ir užkertamas kelias džiuvimui. Jeigu reikia, vandenį leidžiama pakeisti. Turėtų būti užtikrinamas nuosaikus aeravimas. Lervų auginimo indai turėtų būti laikomi tinkamuose narvuose, kad išsinėrę suaugusieji vabzdžiai nepajėgtų pasprukti. Narvas turėtų būti ganėtinai erdvus, kad galėtų spiestis išsinėrę suaugusieji vabzdžiai; antraip populiacija gali nesusiformuoti (mažiausi matmenys yra 30 × 30 × 30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Narvai turėtų būti laikomi kambario temperatūroje arba pastovių aplinkos sąlygų patalpoje 20 ± 2 °C temperatūroje; šviesiojo laikotarpio trukmė 16 val. (šviesos intensyvumas apie 1 000 liuksų), 8 val. tamsos. Parengta ataskaitų, kuriose nurodoma, kad jeigu oro drėgnumas yra mažesnis negu 60 % RH, gali sumažėti reprodukcija).
                              
                           
                        Skiedimo vanduo
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Leidžiama naudoti bet kokį tinkamą natūralų ar sintetinį vandenį. Paprastai naudojamas šulinio vanduo, vanduo, iš kurio pašalintas chloras, ir dirbtinės terpės (pvz., Elendt „M4“ arba „M7“ priemonė, žr. toliau). Prieš naudojant vanduo turi būti aeruojamas. Jeigu būtina, kultūrų auginimo vandenį leidžiama atnaujinti pilant panaudotą vandenį iš kultūrų auginimo indų ar jį leidžiant per sifoną; būtina stengtis nepažeisti lervų vamzdžių.
                              
                           
                        Lervų šėrimas
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 
                                    Chironomus lervos turėtų būti šeriamos žuvų maisto dribsniais (Tetra Min®, Tetra Phyll® arba kita panašia patentuota žuvų maisto rūšimi); vienam indui per dieną skiriama apie 250 mg pašaro. Maistą galima pateikti sausą, sumaltą milteliais arba kaip vandens suspensiją: 1,0 g maisto dribsnių įdedama į 20 ml skiedimo vandens ir išmaišoma, kol gaunamas vienalytis mišinys. Šio ruošinio apie 5 ml per dieną leidžiama įdėti į kiekvieną indą (prieš naudojant būtina pakratyti). Vyresnėms lervoms būtina duoti daugiau pašaro.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Šėrimas koreguojamas atsižvelgiant į vandens kokybę. Jeigu auginimo terpė „susidrumsčia“, duodamo pašaro kiekis turėtų būti sumažinamas. Duodamo pašaro kiekiai turi būti kruopščiai stebimi. Jeigu duodamas per mažas pašaro kiekis, lervos persikelia į vandens storymę, o skiriant per daug pašaro suintensyvėja mikroorganizmų veikla ir sumažėja deguonies koncentracija. Abiejų tipų sąlygomis gali sumažėti augimo greitis.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Ruošiant naujus kultūrų auginimo indus į juos taip pat galima šiek tiek įdėti žaliųjų dumblių (pvz., Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris).
                              
                           
                        Išsinėrusių suaugusiųjų mašalų šėrimas
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Kai kurie tyrinėtojai pasiūlė, kad išsinėrusius suaugusius mašalus būtų galima šerti naudojant prisotintame sacharozė tirpale išmirkytus vilnos tamponus.
                              
                           
                        Lervų išsinėrimas
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Suaugę mašalai ima rastis iš lervų auginimo indų po 13–15 dienų 20 ± 2 °C temperatūroje. Patinėliai lengviau atpažįstami žiūrint į jų plunksniškus čiuptuvėlius.
                              
                           
                        Kiaušinėlių masė
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Kol suaugę mašalai būna veisimo narve, visi lervų auginimo indai turėtų būti tikrinami tris kartus per savaitę, ar juose nėra drebučių pavidalo kiaušinėlių masės. Jeigu randama šios kiaušinėlių masės, ji turėtų būti atsargiai pašalinta. Kiaušinėliai turėtų būti sudedami į mažą indelį su veisimo vandens ėminiu. Kiaušinėlių masė naudojama pradedant inde auginti naują kultūrą (pvz., 2–4 kiaušinėlių masė viename inde) arba atliekant toksiškumo bandymus.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Pirmos stadijos lervos turėtų išsiristi po 2–3 dienų.
                              
                           
                        Naujų kultūrų auginimo indų ruošimas
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Išauginus kultūras turėtų būti įmanoma kiekvieną savaitę ar rečiau paruošti naują lervų kultūros auginimo indą atsižvelgiant į bandymo atlikimo reikalavimus ir pašalinant senesnius indus, kai išsineria suaugę mašalai. Taikant šią sistemą mažomis pastangomis reguliariai tiekiami suaugę mašalai.
                              
                           
                        Bandymo tirpalų „M4“ ir „M7“ ruošimas
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendtas (1990) aprašė „M4“ terpę. „M7“ terpė ruošiama kaip „M4“ terpė, išskyrus 1 lentelėje išvardytas chemines medžiagas, kurių koncentracijos „M7“, palyginti su „M4“, yra keturis kartus mažesnės. Leidinys apie „M7“ terpę yra rengiamas (Elendto pateiktas pranešimas). Bandomasis tirpalas neturėtų būti ruošiamas pagal Elendtą ir Bias (1990), jeigu norima gauti NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 ir K2HPO4 koncentracijas, nes pradinių tirpalų ruošimas nėra tapati veikla.
                              
                           
                        Terpės „M7“ ruošimas
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Kiekvienas pradinis tirpalas (I) paruošiamas atskirai ir iš šių pradinių tirpalų (I) paruošiamas kombinuotasis pradinis tirpalas (II) (žr. 1 lentelę). 50 ml kombinuotojo pradinio tirpalo (II) ir 2 lentelėje nurodyti kiekvieno makroelementų pradinio tirpalo kiekiai skiedžiami iki 1 litro dejonizuoto vandens, kad taip būtų pasiruošta „M7“ terpė. Vitaminų pradinis tirpalas pasiruošiamas į dejonizuotą vandenį įmaišius tris vitaminus kaip nurodyta 3 lentelėje ir 0,1 ml kombinuotojo vitaminų pradinio tirpalo įmaišoma į galutinę „M7“ terpę prieš pat naudojimo pradžią. (Vitaminų pradinis tirpalas laikomas sušaldytas mažomis alikvotinėmis dalimis). Terpė aeruojama ir stabilizuojama.
                                 
                                    1   lentelė
                                 
                                 
                                    M4 ir M7 terpei skirtų mikroelementų pradiniai tirpalai
                                 
                                 
                                             Pradiniai tirpalai (I)
                                          
                                          
                                             Kiekis (mg), praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens
                                          
                                          
                                             Ruošiant kombinuotą pradinį tirpalą (II): maišomi nurodyti pradinių tirpalų (I) kiekiai (mg) ir praskiedžiami iki 1 litro dejonizuoto vandens
                                          
                                          
                                             Galutinės bandomųjų tirpalų koncentracijos (mg/l)
                                          
                                       
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                          
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                       
                                             H3BO3
                                                 (18)
                                             
                                          
                                          
                                             57 190
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             2,86
                                          
                                          
                                             0,715
                                          
                                       
                                             MnCl2 • 4 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             7 210
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,361
                                          
                                          
                                             0,090
                                          
                                       
                                             LiCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             6 120
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,306
                                          
                                          
                                             0,077
                                          
                                       
                                             RbCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 420
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,071
                                          
                                          
                                             0,018
                                          
                                       
                                             SrCl2 • 6 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             3 040
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,152
                                          
                                          
                                             0,038
                                          
                                       
                                             NaBr (18)
                                             
                                          
                                          
                                             320
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             Na2MoO4 • 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,063
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                       
                                             CuCl2 • 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             335
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,017
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             ZnCl2
                                             
                                          
                                          
                                             260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                       
                                             CaCl2 • 6 H2O
                                          
                                          
                                             200
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                       
                                             KI
                                          
                                          
                                             65
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                       
                                             Na2SeO3
                                             
                                          
                                          
                                             43,8
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                       
                                             NH4VO3
                                             
                                          
                                          
                                             11,5
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                       
                                             Na2EDTA • 2 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             5 000
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             2,5
                                          
                                          
                                             0,625
                                          
                                       
                                             FeSO4 • 7 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             1 991
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,249
                                          
                                       
                                    2   lentelė
                                 
                                 
                                    M4 ir M7 terpėms skirti makroelementų pradiniai tirpalai
                                 
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Kiekis praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Ruošiant M4 ir M7 terpę įdedamas makroelementų pradinių tirpalų kiekis
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Galutinės bandomųjų tirpalų M4 ir M7 koncentracijos
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             CaCl2 • 2 H2O
                                          
                                          
                                             293 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             293,8
                                          
                                       
                                             MgSO4 • 7 H2O
                                          
                                          
                                             246 600
                                          
                                          
                                             0,5
                                          
                                          
                                             123,3
                                          
                                       
                                             KCl
                                          
                                          
                                             58 000
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             5,8
                                          
                                       
                                             NaHCO3
                                             
                                          
                                          
                                             64 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             64,8
                                          
                                       
                                             NaSiO3 • 9 H2O
                                          
                                          
                                             50 000
                                          
                                          
                                             0,2
                                          
                                          
                                             10,0
                                          
                                       
                                             NaNO3
                                             
                                          
                                          
                                             2 740
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,274
                                          
                                       
                                             KH2PO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 430
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,143
                                          
                                       
                                             K2HPO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 840
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,184
                                          
                                       
                                    3   lentelė
                                 
                                 
                                    M4 ir M7 terpei skirtas vitaminų pradinis tirpalas
                                 
                                 Visi trys vitaminų tirpalai maišomi siekiant paruošti vieną vitaminų pradinį tirpalą.
                                 
                                    
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Kiekis praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Ruošiant M4 ir M7 terpę įdedamas vitaminų pradinio tirpalo kiekis
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Galutinės bandomųjų tirpalų M4 ir M7 koncentracijos
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             Tiamino hidrochloridas
                                          
                                          
                                             750
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,075
                                          
                                       
                                             Ciankobalaminas (B12)
                                          
                                          
                                             10
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,0010
                                          
                                       
                                             Biotinas
                                          
                                          
                                             7,5
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,00075
                                          
                                       
                           
                        LITERATŪRA
                     
                     BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
                     Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33.
                     Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167.
                  
                  
                     3 priedėlis
                     SINTETINIŲ NUOSĖDŲ RUOŠIMAS
                     
                        Nuosėdų sudėtis
                     
                     Sintetinės nuosėdos turėtų būti sudarytos iš šių sudedamųjų dalių:
                     
                                 Sudedamoji dalis
                              
                              
                                 Charakteristikos
                              
                              
                                 nuosėdų sausosios
                                 procentinė dalis)
                              
                           
                                 Durpės
                              
                              
                                 Naujosios Zelandijos kiminų durpės, jų pH kiek įmanoma atitinka 5,5–6,0, jokių augalų matomų liekanų, smulkiai sumaltos (kietųjų dalelių dydis ≤ 1 mm), džiovintos ore
                              
                              
                                 4–5
                              
                           
                                 Kvarcinis smėlis
                              
                              
                                 Grūdelių dydis: > 50 % dalelių dydžio vertės intervalas turėtų būti 0–200 μm
                              
                              
                                 75–76
                              
                           
                                 Kaolito molis
                              
                              
                                 Kaolinito kiekis ≥ 30 %
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Organinė anglis
                              
                              
                                 Pakoreguota pridedant durpių ir smėlio
                              
                              
                                 2 (±0,5)
                              
                           
                                 Kalcio karbonatas
                              
                              
                                 CaCO3, milteliai, cheminiu atžvilgiu grynas
                              
                              
                                 0,05–0,1
                              
                           
                                 Vanduo
                              
                              
                                 Laidumas ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30–50
                              
                           
                        Pasiruošimas
                     
                     Durpės džiovinamos ore ir malamos tol, kol gaunami smulkūs milteliai. Suspensija iš nustatyto durpių miltelių kiekio ir dejonizuoto vandens pasiruošiama didelio našumo homogenizavimo įrenginiu. Naudojant CaCO3 koreguojama, kad šios suspensijos pH vertė būtų 5,5 ± 0,5. Švelniai maišant suspensija kondicionuojama ne trumpiau negu dvi dienas 20 ± 2 °C temperatūroje siekiant stabilizuoti pH ir paruošti stabilią mikroorganizmų populiaciją. pH matuojama dar kartą ir jo vertė turėtų būti 6,0 ± 0,5. Tada durpių suspensija maišoma su kitomis sudedamosiomis dalimis (smėliu ir kaolino moliu) ir dejonizuotu vandeniu siekiant gauti vienalytes nuosėdas, kuriose vandens kiekis sudaro 30—50 % sausosios masės. Dar kartą matuojama galutinio mišinio pH vertė ir, jeigu reikia, naudojant CaCO3 koreguojama, kol pH vertė ima atitikti 6,5–7,5 vertę. Imami nuosėdų ėminiai siekiant nustatyti sausąją masę ir organinės anglies kiekį. Taip pat rekomenduojama, kad prieš pradedant nuosėdas naudoti chironomidų toksiškumo bandymui, sintetinės nuosėdos būtų kondicionuojamos septynias dienas tomis pačiomis sąlygomis, kurios taikomos kitam bandymui.
                     
                        Sandėliavimas
                     
                     Sintetinių nuosėdų ruošimo visas sudedamąsias sausas dalis galima laikyti sausoje ir vėsioje vietoje kambario temperatūroje. Sintetinės (drėgnos) nuosėdos neturėtų būti sandėliuojamos prieš jas imant naudoti atliekamam bandymui. Jos turėtų būti naudojamos iš karto po 7 dienas trukusio kondicionavimo laikotarpio, kuriuo baigiamas ruošimo etapas.
                     
                        LITERATŪRA
                     
                     Chapter C.8 of this Annex. Toxicity for Earthworms.
                     Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. SAFEty 39: 10–20.
                  
                  
                     4 priedėlis
                     
                        Tinkamo skiedimo vandens cheminės charakteristikos
                     
                     
                                 Cheminė medžiaga
                              
                              
                                 Koncentracijos
                              
                           
                                 Kietosios dalelės
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Bendroji organinė anglis
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Nejonizuotas amoniakas
                              
                              
                                 < 1 mg/l
                              
                           
                                 Kietumas (kaip CaCO3)
                              
                              
                                 < 400 mg/l (20)
                                 
                              
                           
                                 Liekamasis chloras
                              
                              
                                 < 10 mg/l
                              
                           
                                 Suminis organinių fosforo pesticidų kiekis
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Suminis organinių chloro pesticidų ir polichlorintų bifenilų kiekis
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Suminis organinio chloro kiekis
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     5 priedėlis
                     
                        Chironomidų lervų išsiritimo stebėjimo gairės
                     
                     Į bandymo stiklines įdedamos išsiritimo gaudyklės. Gaudyklės reikalingos nuo 20 dienos iki bandymo pabaigos. Gaudyklės brėžinio pavyzdys pateiktas toliau:
                     
                        
                     
                                 A
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 nailono ekranas
                              
                           
                                 B
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 apversti plastiko gaubtai
                              
                           
                                 C
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 bebriaunė laboratorinė poveikio stiklinė
                              
                           
                                 D
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 vandens keitimo ekrano angos
                              
                           
                                 E
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 vanduo
                              
                           
                                 F
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 nuosėdos
                              
                           
                  C.29.   LENGVAS BIOLOGINIS SKAIDUMAS. CO2 SANDARIUOSE INDUOSE (VIRŠUTINĖS ERDVĖS TYRIMAS)
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires (TG) Nr. 310 (2006). Šis metodas yra atrankos metodas, kurį naudojant įvertinamas lengvas biologinis cheminių medžiagų skaidumas, ir pateikiama panaši informacija šešiems bandymo metodams, aprašytiems šio priedo C.4 skirsnyje A–F dalyse. Todėl cheminę medžiagą, kurios rezultatai pagal šį bandymo metodą yra teigiami, galima laikyti lengvai biologiškai skaidoma ir, vadinasi, sparčiai suyrančia aplinkoje.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Bandant mažai tirpias chemines medžiagas ir gerai adsorbuojamas medžiagas, pirmiausiai būtų pasirenkamas gerai paruoštas anglies dioksido (CO2) metodas (1), pagrįstas Sturmo originaliu bandymu (2), kuriuo organinių cheminių medžiagų biologinis skaidumas vertinamas matuojant anglies dioksidą, kurį išskiria mikroorganizmai. Šis metodas taip pat pasirenkamas tiriant tirpiąsias (tačiau ne lakiąsias) chemines medžiagas, nes anglies dioksido išsiskyrimą daugelis specialistų laiko vieninteliu akivaizdžiu mikroorganizmų veiklos įrodymu. Ištirpusią organinę anglį galima šalinti taikant fizinius–cheminius procesus – adsorbciją, lakiųjų junginių šalinimą, nusodinimą, hidrolizę – bei naudojant mikroorganizmų veiklą ir daugelį ne biologinių reakcijų, kurioms vykstant naudojamas deguonis; retais atvejais CO2 iš organinių cheminių medžiagų išsiskiria vykstant abiotiniams procesams. Naudojant originalų ir modifikuotą Sturmo bandymą (1) (2) CO2 į absorbuojantį indą iš skystosios fazės pašalinamas naudojant borbatavimą (t. y. pučiant oro burbulus, kad CO2 būtų šalinamas per skystą terpę), o pasirinkus Larsono (3) (4) CO2 versiją CO2 iš reakcijos indo į absorberius perkeliamas per viršutinės erdvės orą, kuriame nėra CO2, ir, be to, nenutrūkstamai kratant bandymo indą. Reakcijos indas yra kratomas tik naudojant Larsono modifikaciją; maišymas nurodomas tik netirpiosioms cheminėms medžiagoms (žr. standartą ISO 9439 (5)) ir originalioje JAV versijoje (6); abiejuose nurodomas veikiau borbatavimas negu viršutinės erdvės pakeitimas. Kitame oficialiame JAV EPA metode (7), pagrįstame Gledhillo metodu (8), kratomas reakcijos indas užsandarinamas nuo atmosferos ir išsiskyręs CO2 surenkamas vidinėje šarminėje gaudyklėje tiesiogiai iš dujinės fazės, kaip įprastose Warburg/Barcroft respiratorinėse kolbose.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Tačiau įrodyta, kad įprastą, modifikuotą Sturmo bandymą atliekant su tam tikromis cheminėmis medžiagomis (9), neorganinė anglis (IC) kaupiasi terpėje. Skaidant 20 mg C/l anilino nustatyta, kad IC koncentracija buvo gana didelė, t. y. 8 mg/l. Vadinasi, šarminėse gaudyklėse surenkamas CO2, iš tikrųjų neatitina viso to CO2 kiekio, kuris mikrobiologiškai išskiriamas tarpiniais laikotarpiais, kai vyksta skaidymas. Todėl reikalavimas, kad > 60 % teorinio didžiausio CO2 išsiskiriančio ThCO2) kiekio turi būti surenkama per „10 parų langą“ (10 parų iš karto po to, kai užtikrinamas 10 % biologinis skaidymas), jeigu bandomąją cheminę medžiagą ketinama laikyti lengvai biologiškai skaidoma, nebūtų taikomas tam tikroms cheminėms medžiagoms, kurios būtų klasifikuojamos atsižvelgiant į šalinamą ištirpusios organinės anglies (DOC) kiekį.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Jeigu procentinė skaidymo dalis yra mažesnė negu tikėtasi, IC, ko gero, kaupiasi bandomajame tirpale. Vadinasi, skaidomumą galima nustatyti taikant kitus lengvo biologinio skaidumo bandymus.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kiti Sturmo metodikos trūkumai (nepatogi, reikia gaišti daug laiko, lengvai įmanoma padaryti eksperimentinę klaidą ir netaikoma lakiosioms cheminėms medžiagoms) jau anksčiau paskatino kurti sandariųjų indų metodiką, tačiau ne Gledhillo, o veikiau pratekančių dujų (10) (11). Boatman ir kt. (12) apžvelgė ankstesnius metodus ir priėmė uždarosios viršutinės erdvės sistemą, kurią taikant inkubacijos pabaigoje terpė parūgštinama ir CO2 išleidžiamas į viršutinę erdvę. CO2 kiekis matuotas naudojant dujų chromatografijos (GC)/IC analizę; ėminiai automatiškai imti iš viršutinės erdvės, tačiau nebuvo atsižvelgiama į skystosios fazės ištirpusią neorganinę anglį (DIC). Be to, buvo naudoti labai maži indai (20 ml), į kuriuos tilpdavo tik 10 ml terpės, todėl sunkiai sekdavosi, pvz., įterpti reikiamus labai mažus netirpių bandomųjų cheminių medžiagų kiekius, ir (arba) terpėje su sėjimo kultūra galėdavo būti nepakankamas bandomąsias chemines medžiagas galinčių suskaidyti mikroorganizmų kiekis arba galėdavo jų apskritai nebūti.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Šie trūkumai pašalinti ėmus naudoti nepriklausomus Struijs ir Stoltenkamp (13) bei Birch ir Fletcher tyrimus; pastarieji tyrėjai visų pirmiausiai rėmėsi savo patirtimi naudojant aparatą, būtiną atliekant anaerobinį biologinio skaidymo bandymą (15). Taikant ankstesnį metodą (13) CO2 kiekis matuojamas viršutinėje erdvėje, kai užtikrinamas parūgštinimas ir pusiausvyra, o pasirinkus pastarąjį (14) matuojamas dujinės ir skystosios fazės DIC kiekis be apdorojimo; daugiau negu 90 % susiformavusio IC buvo skystosios fazės. Abu metodai pranašesni už Sturmo bandymą, nes pirmųjų atveju bandymo sistema yra mažesnė ir lengvai tvarkoma bei pritaikyti tirti lakiąsias chemines medžiagas ir nenumatyta galimybė atidėti susiformavusio CO2 kiekio matavimą.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Abu metodai įtraukti į ISO Viršutinės erdvės CO2 standartą (16), kuris patikrintas atliekant tarplaboratorinio lyginimo bandymą (17), ir būtent šiuo standartu grindžiamas šis bandymo metodas. Šie du metodai taip pat įtraukti į JAV EPA metodą (18). Rekomenduojama taikyti du CO2 kiekio matavimo metodus, būtent CO2 viršutinėje erdvėje po rūgštinimo (13) ir IC skystojoje fazėje, kai pridedama perteklinio šarmo. Pastarąjį metodą pasiūlė Petersonas atliekant CONCAWE tarplaboratorinio lyginimo bandymą (19), kai šis viršutinės erdvės metodas buvo modifikuotas siekiant matuoti savitąjį biologinį skaidumą. Pakeitimai, padaryti šio priedo dėl lengvo biologinio skaidumo C.4 skyriuje 1992 m. (20) persvarstant metodus, įtraukti į šį bandymo metodą, kad sąlygos (terpė, trukmė ir t. t.) kitais atžvilgiais būtų tapačios persvarstyto Strumo bandymo (20) sąlygoms. Birch ir Fletcher (14) įrodė, kad atliekant šį viršutinės erdvės bandymą buvo gauti labai panašūs rezultatai kaip kad su tomis pačioms cheminėmis medžiagomis darant persvarstytų bandymo metodų OECD tarplaboratorinio lyginimo bandymą (21).
                           
                        BANDYMO METODO ESMĖ
                  
                              8.
                           
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga (paprastai 20 mg/l) – vienintelis anglies ir energijos šaltinis – inkubuojama į buferinę mineralinių druskų terpę, į kurią įsėjama įvairių mikroorganizmų populiacija. Bandymas atliekamas sandariose kolbose su viršutine oro erdve, kuri yra deguonies šaltinis aerobiniam biologiniam skaidymui. CO2 išsiskyrimas vykstant visiškam bandomosios cheminės medžiagos biologiniam skaidymui nustatomas matuojant IC kiekį, išsiskyrusį bandymo kolbose ir viršijantį tuščiojo bandinio kolbose, į kurias įdėta tik terpės su sėjimo kultūra, išsiskiriantį IC kiekį. Biologinio skaidymo apimtis išreiškiama kaip teorinio didžiausio IC išsiskyrimo (ThIC) procentinė dalis atsižvelgiant į iš pradžių įdėtą bandomosios cheminės medžiagos kiekį (kaip organinės anglies).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Taip pat galima matuoti pašalinamą DOC kiekį ir (arba) bandomosios cheminės medžiagos pirminio biologinio skaidymo apimtį (20).
                           
                        INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
                  
                              10.
                           
                           
                              Bandomosios cheminės medžiagos organinės anglies kiekis (% w/w) turi būti žinomas arba atsižvelgiant į jos cheminę struktūrą, arba nustatomas matuojant, kad būtų galima apskaičiuoti procentinę skaidymo dalį. Jei tai lakiosios bandomosios cheminės medžiagos, išmatuota ar apskaičiuota Henrio dėsnio konstanta naudinga apibrėžiant tinkamą viršutinės erdvės skysčio tūrio santykį. Informacija apie bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą mikroorganizmams praverčia pasirenkant tinkamą tiriamąją koncentraciją ir aiškinant mažą biologinį skaidymą patvirtinančius rezultatus: rekomenduojama įtraukti slopinimo nustatymo bandymą, jeigu nėra žinoma, ar bandomoji cheminė medžiaga slopina mikroorganizmų veiklą (žr. 24 pastraipą).
                           
                        METODO PRITAIKOMUMAS
                  
                              11.
                           
                           
                              Šiuo bandymu tiriamos vandenyje tirpios ir netirpios bandomosios cheminės medžiagos, todėl turėtų būti užtikrinama reikiama bandomosios cheminės medžiagos dispersija. Pasirinkus viršutinėje erdvėje rekomenduojamą taikyti skysčio tūrio santykį 1:2, galima bandyti lakiąsias chemines medžiagas, kurių Henrio dėsnio konstanta yra 50 Pa.m3 mol–1, nes šių bandomųjų cheminių medžiagų proporcija viršutinėje erdvėje neviršys 1 % (13). Atliekant bandymus su lakesnėmis cheminėmis medžiagomis galima rinktis mažesnę viršutinę erdvę, tačiau šių medžiagų biologinis pasisavinamumas gali būti apribotas tuo atveju, jeigu jos mažai tirpsta vandenyje. Tačiau vartotojai turi užtikrinti, kad viršutinės erdvės santykis su skysčio tūriu ir bandomosios cheminės koncentracija būtų toks, jog užtektų deguonies visiško biologinio skaidymo procesui (pvz., nenaudoti didelės substrato koncentracijos ir mažo viršutinės erdvės tūrio). Gairės dėl šio klausimo pateiktos (13) (23).
                           
                        ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS
                  
                              12.
                           
                           
                              Siekiant patikrinti bandymo procedūrą tuo pačiu metu turėtų būti daromas bandymas naudojant etaloninę cheminę medžiagą, kurios biologinis skaidomumas yra žinomas. Šiuo tikslu galima naudoti aniliną, natrio benzoatą ar etilenglikolį, jeigu tiriamos vandenyje tirpios bandomosios cheminės medžiagos, ir 1-oktanolį tiriant mažai tirpias bandomąsias chemines medžiagas (13). Šių cheminių medžiagų biologinio skaidomumo vertė per 14 dienų turi atitikti > 60 % teorinio didžiausio neorganinės anglies (IC) išsiskyrimo.
                           
                        ATKURIAMUMAS
                  
                              13.
                           
                           
                              Atliekant ISO metodo (17) tarplaboratorinio lyginimo bandymą nustatyti toliau pateikti rezultatai; jį atliekant taikytos rekomenduotos sąlygos, įskaitant 20 mg anglies bandomosios cheminės medžiagos litre.
                              
                                          Bandomoji cheminė medžiaga
                                       
                                       
                                          Vidutinė biologinio skaidymo procentinė dalis
                                          (28d)
                                       
                                       
                                          Variacijos koeficientas
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Laboratorijų skaičius
                                       
                                    
                                          Anilinas
                                       
                                       
                                          90
                                       
                                       
                                          16
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                    
                                          1-oktanolis
                                       
                                       
                                          85
                                       
                                       
                                          12
                                       
                                       
                                          14
                                       
                                    Kintamumo (atkartojamumo) vertė atliekant bandymą su anilinu buvo maža ir variacijos koeficientai atliekant beveik visus bandymus nebuvo didesni negu 5 %. Šiais dviem atvejais, kai atkartojamumas buvo mažas, didesnį kintamumą, ko gero, sukėlė didesnis išsiskiriantis IC kiekis tuščiojo bandinio kolbose. Atkartojamumo vertė buvo mažesnė darant bandymus su 1-oktanoliu, tačiau vis dėlto mažesnė negu 10 % iš atliktų 79 % bandymų. Didesnį kintamumą atliekant bandymus galėjo sukelti dozavimo paklaidos, nes į sandarias bandymo kolbas reikėdavę įterpti mažus 1-oktanolio kiekius (3–4 μl). Didesni variacijos koeficientai galėjo būti nustatomi todėl, kad buvo naudojama mažesnės koncentracijos bandomoji cheminė medžiaga, visų pirma tuo atveju, kai koncentracijos buvo mažesnės negu 10 mg C/l. Šią priklausomybę iš dalies įmanoma panaikint sėjimo kultūroje sumažinant bendrosios neorganinės anglies (TIC) koncentraciją.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              ES atlikus tarplaboratorinio lyginimo bandymus (24) su penkiomis paviršinio aktyvumo medžiagomis (10 mg/C/l) nustatyti šie rezultatai:
                              
                                          Bandomoji cheminė medžiaga
                                       
                                       
                                          Vidutinė procentinė biologinio skaidymo dalis
                                          (28d)
                                       
                                       
                                          Variacijos koeficientas
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Laboratorijų skaičius
                                       
                                    
                                          Tetrapropilenas
                                          Benzensulfonatas
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                       
                                          45
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Diizooktilsulfo-sukcinatas
                                          (anijoninė)
                                       
                                       
                                          72
                                       
                                       
                                          22
                                       
                                       
                                          9
                                       
                                    
                                          Heksadeciltrimetil (21)
                                          
                                          amonio chloridas chloride
                                          (katijoninė)
                                       
                                       
                                          75
                                       
                                       
                                          13
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Izo-nonilfenolis-(etoksilatas)9
                                          
                                          (nejoninis)
                                       
                                       
                                          41
                                       
                                       
                                          32
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Kokamidopropil
                                          dimetilhidroksi
                                          sulfobetainas
                                          (amfoterinė)
                                       
                                       
                                          60
                                       
                                       
                                          23
                                       
                                       
                                          11
                                       
                                    Nustatytais rezultatais įrodoma, kad apskritai kintamumas buvo didesnis mažesniosios gerai skaidomų paviršinių medžiagų dalies. Atliekant bandymus mažesnis negu 15 % kintamumas nustatytas daugiau negu 90 % atvejų, o didžiausia kintamumo vertė buvo 30–40 %.
                              
                                          PASTABA:
                                       
                                       
                                          Daugelis paviršinių medžiagų nėra sudarytos iš vieno dydžio molekulių, nes jas sudaro izomerfai, homologai ir t. t., kurie suskyla po skirtingos charakteristikos vėlinimo laikotarpių ir veikiant skirtingoms kinetinėms greičio konstantoms, todėl randasi „neryškios“ sumažėjusios kreivės ir 60 % atitikties vertė gali nebūti užtikrinama per „10 parų langą“ net tuo atveju, kai kiekvieno pavienio dydžio molekulės sudarys > 60 % per 10 dienų, jeigu bandymas atliekamas su vieno dydžio molekulėmis. Šio reikalavimo laikymąsi taip pat įmanoma užtikrinti naudojant kitus sudėtingus mišinius.
                                       
                                    
                        METODO APRAŠYMAS
                  
                     Aparatūra
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Įprasta laboratorinė įranga:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          stiklinės serumo kolbos, užkimštos butilkaučiuko kamščiais ir apspaudžiamaisiais aliuminio sandarikliais; rekomenduojamas „125 ml“ dydis; šiuo atveju bendras tūris būtų apie 160 ml (Vadinasi, turėtų būti žinoma, kad kiekvienos kolbos tūris yra 160 ± 1 ml); leidžiama naudoti mažesnę kolbą, jeigu rezultatai atitinka 66 ir 67 pastraipose aprašytas sąlygas;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          anglies analizatorius arba kitas įtaisas (pvz., dujų chromatografas) neorganinei angliai išmatuoti;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          didelio tikslumo švirkštai dujų ir skysčio ėminiams imti;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          rotacinis kratytuvas reguliuojamos temperatūros aplinkoje;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          oro be CO2 dujų tiekimas – šio oro tiekimą galima užtikrinti leidžiant orą per natrio kalkes arba naudojant 80 % N2/20 % 02 dujų mišinį (pasirinktinas) (žr. 28 pastraipą);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          membraninis filtravimo įtaisas (porų dydis 0,20–0,45 μm) (pasirenkamas);
                                       
                                    
                                          g)
                                       
                                       
                                          organinės anglies analizatorius (pasirenkamas).
                                       
                                    
                        
                     Cheminiai reagentai
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Naudojami visais atžvilgiais analiziškai gryni cheminiai reagentai.
                           
                        
                     Vanduo
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojamas distiliuotas arba dejonizuotas vanduo, kuriame yra ≤ 1 mg/l bendros organinės anglies. Šis kiekis sudaro ≤ 5 % pradinio organinės anglies kiekio, įterpto rekomenduojama bandomosios cheminės medžiagos doze.
                           
                        
                     Mineralinių druskų terpės pradiniai tirpalai
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Pradiniai tirpalai ir mineralinių druskų terpė yra tapatūs nurodytiesiems ISO standarte 14 593 (16) ir C.4 „lengvo biologinio skaidumo“ bandymuose (20). Didesnės koncentracijos amonio chloridą (2,0 g/l vietoj 0,5 g/l) turėtų būti privaloma naudoti tik labai išskirtiniais atvejais, pvz., kai bandomosios cheminės medžiagos koncentracija yra > 40 mg C/l. Pradiniai tirpalai turėtų būti laikomi šaldytuve ir šalinami po šešių mėnesiu arba anksčiau, jeigu aptinkama įrodymų, kad yra padidėjęs mikrobų augimas. Pasiruošiami šie pradiniai tirpalai:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          kalio dihidrofosfato (KH2PO4), 8,50 g
                                          bevandenio kalio dihidrofosfato (K2HPO4) 21,75 g
                                          dinatrio vandenilio fosfato dihidrato (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g
                                          amonio chlorido (NH4Cl) 0,50 g
                                          Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro. Šio tirpalo pH vertė turėtų būti 7,4 (± 0,2). Jeigu ši vertė neužtikrinama, pasiruošiamas naujas tirpalas.
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          kalcio chlorido dihidrato (CaCl2.2H2O) 36,40 g
                                          Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro.
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          magnio sulfato heptahidrato (MgSO4.7H2O) 22,50 g
                                          Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro.
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          geležies (III) chlorido (FeCl3.6H20) 0,25 g
                                          Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro bei įlašinamas vienas lašas koncentruoto HCl.
                                       
                                    
                        
                     Mineralinės terpės pasiruošimas
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              10 ml a tirpalo maišoma su maždaug 800 ml vandens (17 pastraipa), tada įpilama po 1 ml b, c ir d tirpalų ir su vandeniu praskiedžiama iki 1 litro (17 pastraipa).
                           
                        
                     Kiti cheminiai reagentai
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Koncentruota ortofosforo rūgštis (H3PO4) (> 85 % masė tūrio vienetui).
                           
                        
                     Natrio hidroksido tirpalas 7M
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              280 g natrio hidroksido (NaOH) ištirpinama 1 litre vandens (17 pastraipa). Nustatoma ištirpusios neorganinės anglies koncentracija šiame tirpale ir ši vertė taikoma apskaičiuojant bandymo rezultatą (žr. 55 ir 61 pastraipas), ypač atsižvelgiant į 66 pastraipos b punkto pagrįstumo kriterijų. Paruošiamas šviežias tirpalas, jeigu ištirpusios neorganinės anglies (DC) koncentracija yra per didelė.
                           
                        
                     Bandomoji cheminė medžiaga
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Iš ganėtinai vandenyje tirpios bandomosios cheminės medžiagos (17 pastraipa) ar iš bandomojoje terpėje tirpios bandomosios cheminės medžiagos (19 pastraipa) pasiruošiamas pradinis tirpalas, kurio koncentracija turi būti 100 kartų didesnė negu atliekant bandymą naudotina galutinė koncentracija; gali tekti koreguoti pradinio tirpalo pH vertę. Pradinis tirpalas turėtų būti įterpiamas į mineralinę terpę siekiant užtikrinti 2–40 mg C/l galutinę organinės anglies koncentraciją (tinkamiausia koncentracija būtų 20 mg/l). Jeigu naudojamos mažesnės koncentracijos negu nurodytosios, gali būti neužtikrinamas reikiamas tikslumas. Į kolbas galima įšvirkšti aukštaslėgiais švirkštais tirpių ir netirpių skystųjų cheminių medžiagų. Mažai tirpias ir netirpias bandomąsias chemines medžiagas gali tekti specialiai apdoroti (25). Galima rinktis:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          tiesioginį žinomos masės kiekio įdėjimą;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          dispergavimą ultragarsu prieš įdėjimą;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          privalomą dispergavimą emulsikliais siekiant nustatyti, ar jie sukelia kokį nors slopinamąjį ar skatinamąjį poveikį mikroorganizmų veiklai prieš pridėjimą;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          skystųjų bandomųjų cheminių medžiagų arba tirpalo adsorbciją į tinkamą lakųjį tirpiklį, į inertinę terpę ar inertinę medžiagą (pvz., stiklo pluošto filtrą) ir tolesnį tirpiklio garinimą, jeigu naudojamas, ir tiesioginį žinomo kiekio įdėjimą;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          bandomosios cheminės medžiagos tirpalo lakiame tirpiklyje žinomo kiekio įdėjimą į tuščią bandymo indą ir vėlesnį tirpiklio išgarinimą.
                                       
                                    C, d ir e punktuose nurodytos medžiagos arba tirpikliai turi būti išbandyti siekiant nustatyti, ar jie sukelia kokį nors skatinamąjį arba slopinamąjį poveikį mikroorganizmų veiklai (žr. 42 pastraipos b punktą).
                           
                        
                     Etaloninė cheminės medžiaga
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Iš (tirpios) etaloninės cheminės medžiagos vandenyje pasiruošiamas pradinis tirpalas (17 pastraipa), kurio koncentracija būtų 100 kartų didesnė negu naudotina atliekant bandymą galutinė koncentracija (20 mg/l).
                           
                        
                     Slopinimo poveikio tikrinimas
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Jeigu taikomos lengvo biologinio skaidymo vertinimo sąlygos, šiuo atveju bandomosios cheminės medžiagos dažnai nėra kiek nors labiau suskaidomos. Viena iš galimų priežasčių – bandomoji cheminė medžiaga slopina sėjimo kultūrą būdama tokios koncentracijos, kokios ši medžiaga naudojama atliekant bandymą. Slopinimo poveikio tikrinimą galima įtraukti į bandymo planą siekiant palengvinti slopinimo nustatymą (nukreiptą atgal), nes šis slopinimas gali būti tikėtina priežastis arba skatinimo veiksnys. Antraip atlikus slopinimo poveikio tikrinimą galima atmesti minėtus trukdžius ir įrodyti, kad nulinis ar nedidelis skaidymas priskirtinas tik atsparumui mikroorganizmų poveikiui laikantis bandymo sąlygų. Siekiant gauti informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą (aerobiniams) mikroorganizmams bandomojoje terpėje pasiruošiamas tirpalas, į kurį įtraukiama bandomoji cheminė medžiaga ir etaloninė cheminė medžiaga (19 pastraipa), atitinkamai kiekvienos įdedama vienodos koncentracijos (žr. 22 ir 23 pastraipas).
                           
                        
                     Sėjimo kultūra
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Sėjimo kultūrą galima gauti iš įvairių šaltinių: veikliojo dumblo; nuotekų ištakio (neapdoroto chloru); paviršinių vandenų ir dirvožemių; ar iš pastarųjų mišinio (20). Naudojant etaloninę cheminę medžiagą turėtų būti nustatomas šaltinio biologinio skaidymo veiksmingumas. Kad ir koks būtų šaltinis, bandomąja chemine medžiaga anksčiau paveikti mikroorganizmai neturėtų būti naudojami, jeigu procedūra turi būti taikoma kaip lengvo biologinio skaidumo bandymas.
                              
                                          
                                             Įspėjimas.
                                       
                                       
                                          Veikliajame dumble, nuotekose ir nuotekų ištakyje yra patogeninių organizmų, todėl turi būti dirbama laikantis atsargumo priemonių.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Remiantis patirtimi optimalus sėjimo kultūros kiekis:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          kurio pakanka reikiamai biologinio skaidymo veiklai užtikrinti,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kuris suskaido nustatytą procentinę etaloninės cheminės medžiagos dalį (žr. 66 pastraipą),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kurį naudojant išauga 102–105 koloniją sudarančių vienetų milimetre galutinio mišinio,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kurį naudojant galutiniame mišinyje paprastai užtikrinama 4 mg/l suspenduotų medžiagų koncentracija, jeigu pasirenkamas veiklusis dumblas; leidžiama naudoti ne didesnes negu 30 mg/l koncentracijas, tačiau tuščiojo bandinio kolbose (26) gali išsiskirti gerokai daugiau CO2,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kurio indėlis į pradinę organinės anglies, įterptos naudojant bandomąją cheminę medžiagą, koncentraciją yra mažesnis negu 10 %,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          paprastai yra 1–10 ml sėjimo kultūros 1 litrui bandomojo tirpalo.
                                       
                                    
                        
                     Veiklusis dumblas
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Veiklusis dumblas surenkamas šviežias iš nuotekų valymo įrenginio aeracijos rezervuaro ar laboratorinio įrenginio, kuriuo valomos visų pirma buitinės nuotekos. Jeigu reikia, stambiosios dalelės turėtų būti pašalinamos per sietą (pvz., naudojant sietą, kurio akutės dydis 1 mm2) ir dumblas turi būti laikomas aerobinėmis sąlygomis, kol jį bus imta naudoti.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Antraip pašalinus visas stambiąsias daleles, dumblas nusodinamas ar centrifuguojamas (pvz., 1 100 × g, 10 minučių). Nupilamas nusistojęs skystis. Dumblą galima nuplauti į mineralinį tirpalą. Koncentruotas dumblas suspenduojamas mineralinėje terpėje, kad būtų gautos 3–5 g koncentracijos suspenduotos medžiagos. Po to jis aeruojamas atsižvelgiant į nustatytus reikalavimus.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Dumblas turėtų būti imamas iš tinkamai veikiančio įprasto valymo įrenginio. Jeigu dumblas turi būti imamas iš didelio našumo valymo įrenginio arba jeigu manoma, kad dumble yra inhibitorių, šis dumblas turi būti plaunamas. Gerai sumaišytas, pakartotinai suspenduotas dumblas paliekamas nusistoti arba centrifuguojamas, nupilamas nuo jo skystis ir išplautas dumblas dar kartą suspenduojamas kitame mineralinės terpės tūryje. Šie veiksmai kartojami tol, kol galima manyti, kad substrato pertekliaus arba inhibitorių neliko.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Visiškai užbaigus pakartotinį suspendavimą arba iš neapdoroto dumblo prieš pradedant naudoti imamas ėminys, kad būtų nustatyta suspenduotų medžiagų sausoji masė.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Pagal kitą būdą homogenizuojamas aktyvusis dumblas (3–5 g/l suspenduotų medžiagų.) Dumblas maišomas 2 min. vidutiniu greičiu mechaniniame maišiklyje. Sumaišytas dumblas paliekamas 30 min. arba ilgiau, jei to reikia, ir dekantuojamas skystis, kuris naudojamas kaip sėjimo kultūra, pagal normą 10 ml/l mineralinės terpės
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Iš tuščiojo bandinio kolbos išsiskiriantį CO2 kiekį galima dar labiau sumažinti, jeigu dumblas per naktį būtų aeruojamas CO2 neturinčiu oru. Atliekant šį bandymą (13) 4 mg/l veikliojo dumblio kietųjų medžiagų naudojama kaip sėjimo kultūros koncentracija.
                           
                        
                     Biologinio nuotekų valymo ištakis
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Antraip sėjimo kultūrą galima paimti iš biologinio nuotekų valymo įrenginio ištakio arba laboratorinio įrenginio, kuriam tiekiamos vien buitinės nuotekos. Ėminys laikomas aerobinėmis sąlygomis ir naudojamas paėmimo dieną arba, jeigu reikia, iš anksto kondicionuojamas. Ištakis turėtų būti filtruojamas per stambų filtrą siekiant pašalinti dideles kietąsias daleles ir tada išmatuojama pH vertė.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Norint jame sumažinti IC kiekį, filtratas 1 val. borbatuojamas CO2 neturinčiu oru (15-e pastraipa), ir naudojant ortofosforo rūgštį (20 pastraipa) kartu išlaikoma pH vertė 6,5. Naudojant natrio hidroksidą atkuriama pradinė pH vertė ir po maždaug 1 val. trukmės nusodinimo iš sėjimo kultūros paimamas reikiamas kiekis nusistojusio skysčio. Taikant šią borbatavimo procedūrą sėjimo kultūroje sumažinamas IC kiekis. Pvz., jeigu didžiausias rekomenduotas filtruoto ir borbatuoto ištakio kiekis (100 ml) litrui buvo naudotas kaip sėjimo kultūra, IC kiekis tuščiojo bandinio kolbose atitiko 0,4–1,3 mg/l (14), t. y. atitiko bandomosios cheminės medžiagos 2–6,5 % C esant 20 mg C/l koncentracijai ir 4–13 % esant 10 mg C/l koncentracijai.
                           
                        
                     Paviršiniai vandenys
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Ėminys imamas iš atitinkamo paviršinio vandens. Jis turėtų būti laikomas aerobinėmis sąlygomis ir naudojamas paėmimo dieną. Jeigu reikia, ėminio koncentracija turėtų būti didinama filtruojant arba centrifuguojant. Kiekviename bandymo inde naudotinos sėjimo kultūros kiekis turėtų atitikti 26 pastraipoje nustatytus kriterijus.
                           
                        
                     Dirvožemiai
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Paimamas tinkamo dirvožemio ėminys; jis imamas iš ne didesnio negu 20 cm gylio nuo dirvožemio paviršiaus. Prieš imantis sietu, kurio akučių dydis 2 mm, sijoti dirvožemio ėminį iš jo turėtų būti išrenkami akmenys, augalų liekanos ir bestuburiai (jeigu ėminys yra pernelyg drėgnas, kad būtų galima jį sijoti nedelsiant, šiuo atveju ėminys iš dalies džiovinamas oru – tokį ėminį sijoti būtų lengviau). Ėminys turėtų būti laikomas aeravimo sąlygomis ir naudojamas paėmimo dieną (jeigu ėminys turi būti gabenamas nesandariai užrištame juodos spalvos polietileno maiše, ėminį galima laikyti ne ilgiau negu vieną mėnesį 2–4 °C temperatūroje).
                           
                        
                     Pradinis sėjimo kultūros kondicionavimas
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Sėjimo kultūrai leidžiama taikyti pradinį kondicionavimą, kad ji atitiktų bandymo sąlygas, tačiau ėminio neleidžiama iš naujo pritaikyti prie bandomosios cheminės medžiagos. Taikant pradinį kondicionavimą gali būtų sumažinamas CO2 išsiskyrimas iš tuščiojo bandinio kolbų. Pradinis kondicionavimas – tai 30 mg/l bandymo terpe atskiesto veikliojo dumblo aeravimas 5–7 dienas bandymo temperatūroje CO2 neturinčiu oru.
                           
                        BANDYMO ATLIKIMO TVARKA
                  
                     Kolbų skaičius
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Bandymui reikalingų kolbų skaičius (15-a pastraipa) priklauso nuo analizės atlikimo dažnumo ir bandymo trukmės.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Rekomenduojama, kad po pakankamo laiko intervalų skaičiaus, pvz., tokio, kad būtų galima identifikuoti 10 parų langą, būtų atliekama trijų kolbų analizė. Bandymo pabaigoje taip pat analizuojamos ne mažiau negu penkios kolbos (15-a pastraipa) iš a, b ir c rinkinių (žr. 42 pastraipą) siekiant užtikrinti 95 % pasikliovimo intervalus, kad būtų apskaičiuota vidutinė biologinio skaidymo procentinė vertė.
                           
                        
                     Terpė su sėjimo kultūra
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Naudojamos sėjimo kultūros koncentracija turi būti 4 mg/l veikliojo dumblo sausosios masės. Nedelsiant prieš naudojimą pasiruošiamas pakankamas kiekis terpės su sėjimo kultūra, pvz., šiuo atveju 2 ml tinkamai apdoroto veikliojo dumblo (27–32 pastraipos) įdedama į 2 000 mg/l–1 litrą mineralinių druskų terpės (19 pastraipa). Jeigu turi būti naudojamas biologinio valymo įrenginio ištakis, ne daugiau negu 100 ml ištakio (33 pastraipa) įdedama į 900 ml mineralinių druskų terpės (19 pastraipa) ir terpe atskiedžiama iki 1 litro.
                           
                        
                     Kolbų paruošimas
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Alikvotinės terpės su sėjimo kultūra dalys paskleidžiamos kolbose, kad viršutinės erdvės ir skysčio santykis būtų 1:2 (pvz., įdedama į 107–160 ml talpos kolbas). Leidžiama pasirinkti kitus santykius, tačiau šiuo atveju atsižvelgtina į 11 pastraipoje išdėstytą įspėjimą. Naudojant bet kurio iš šių dviejų tipų sėjimo kultūrą turi būti siekiama užtikrinti, kad terpė su įmaišyta sėjimo kultūra būtų reikiamai išmaišyta, nes tik šitaip įmanoma garantuoti tolygų terpės pasiskirstymą bandymo kolbose.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Kolbų rinkiniai (15a pastraipa) paruošiami taip, kad juose būtų:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          bandymo indai (žymimi FT) su bandomąja chemine medžiaga;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          tuščiojo bandinio kolbos (žymimos FB), kuriose yra tik bandomoji terpė ir sėjimo kultūra; taip pat turi būti pridedamos visos cheminės medžiagos, tirpikliai, priemonės ar stiklo pluošto filtrai, naudojami bandomąją cheminę medžiagą įterpiant į bandymo indus;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          procedūros tikrinimo indai (žymimi FC), kuriuose yra etaloninė cheminė medžiaga;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          jeigu reikia, tikrinant galimą slopinimo poveikį naudojami indai (žymimi FI) su bandomąja chemine medžiaga ir tokios pačios koncentracijos etalonine chemine medžiaga (24 pastraipa) kaip atitinkamai kolbose FT ir FC;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          tikrinant galimą abiotinį skaidymą naudojami indai (žymimi FS) kaip a + 50 mg/l HgCl2 arba sterilizuoti kitomis priemonėmis (pvz., naudojant autoklavą).
                                       
                                    
                        
                              43.
                           
                           
                              Siekiant užtikrinti 10–20 mg C/l koncentraciją kaip vandeniniai pradiniai tirpalai (22, 23 ir 24 pastraipos) įterpiamos vandenyje tirpios bandomosios cheminės medžiagos ir etaloninės cheminės medžiagos.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Netirpios bandomosios cheminės medžiagos ir netirpios etaloninės cheminės medžiagos atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos pobūdį įvairiais būdais įdedamos į kolbas (žr. 22a-e pastraipas); šiuo atveju prieš įdedant terpę su sėjimo kultūra ar terpę įdėjus (šiuo atveju paisoma bandomosios cheminės medžiagos poveikio metodo). Jeigu naudojama viena iš 22a-e pastraipoje nurodytų procedūrų, šiuo atveju tuščiojo bandinio kolbos FB (42b pastraipa) turėtų būti tvarkomos panašiu būdu, tačiau išskyrus bandomąją cheminę medžiagą arba etaloninę cheminę medžiagą.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Lakios bandomosios cheminės medžiagos į sandarias kolbas (47 pastraipa) turėtų būti įšvirkščiamos mažais švirkštais. Dozė apskaičiuojama atsižvelgiant į įšvirkštą tūrį ir bandomosios cheminės medžiagos tankį.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Jeigu reikia, turėtų būti įpilama vandens, kad kiekviename inde būtų vienodas skysčio tūris. Privaloma užtikrinti, kad viršutinės erdvės ir skysčio santykis (paprastai 1:2) ir bandomosios cheminės medžiagos koncentracija būtų tokia, kad viršutinėje erdvėje būtų pakankamas visiškam biologiniams suskaidymui reikalingas deguonies kiekis.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Tada visos kolbos sandarinamos, pvz., butilkaučiuko sandarikliais ir aliuminio gaubteliais. Šiame etape (45 pastraipa) turėtų būti įterpiamos lakios bandomosios cheminės medžiagos. Jeigu turi būti stebimas DOC koncentracijos bandomajame tirpale sumažėjimas ir laiko atskaitos pradžioje atliekama pradinės IC koncentracijos analizė (sterilūs kontroliniai bandiniai, 42e pastraipa) ar analizuojamos kitos tiriamosios medžiagos, iš bandymo indo paimamas atitinkamas ėminys. Po to bandymo indas ir jo turinys yra šalinamas.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Užkimštos kolbos dedamos į rotacinį kratytuvą (15d pastraipa); kratymo dažnis turi būti toks, kad kolbų turinys būtų tinkamai maišomas ir suspenduojamas (pvz., 150–200 sūk./min.) ir inkubuojama tamsoje 20 °C temperatūroje (± 1 °C).
                           
                        
                     Ėminių ėmimas
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Ėminių ėmimo tvarka priklauso nuo vėlavimo fazės ir nuo bandomosios cheminės medžiagos biologinio skaidymo kinetinio greičio. Kolbos paaukojamos, kad ėminių ėmimo dieną būtų galima atlikti analizę; ėminiai imami bent kartą per savaitę ar dažniau (pvz., du kartus per savaitę), jeigu būtina nubrėžti visiško suskaidymo kreivę. Reikiamas lygiagrečiai paruoštų kolbų skaičius paimamas iš kratytuvo, t. y. FT, FB ir FC ir, jeigu naudojama, FI ir FS (žr. 42 pastraipą). Bandymas paprastai daromas 28 dienas. Jeigu atsižvelgiant į biologinį skaidymą daroma išvada, kad kreivės plokščioji dalis užtikrinama anksčiau negu per 28 dienas, bandymą galima užbaigti anksčiau negu per 28 dienas. Ėminiai imami iš penkių kolbų, paliktų atlikti analizę 28-ają bandymo dieną, ir rezultatai naudojami apskaičiuojant procentinės biologinio skaidymo dalies pasikliautinuosius rėžius ar variacijos koeficientus. Iš kolbų, kurios naudojamos nustatant slopinimo poveikį ar abiotinį skaidymą, ėminių nebūtina imti taip dažnai kaip iš kitų kolbų; pakanka juos imti 1 ir 28 dieną.
                           
                        
                     Neorganinės anglies (IC) analizė
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              CO2 išsiskyrimas kolbose nustatomas inkubacijos laikotarpiu matuojant neorganinės anglies (IC) koncentracijos padidėjimą. Rekomenduojami atliekant bandymą išsiskyrusios IC anglies kiekio matavimo du metodai ir jie aprašyti toliau. Naudojant šiuos metodus gali būti nustatomi šiek tiek besiskiriantys rezultatai, todėl atliekant bandymą turėtų būti naudojamas tik vienas metodas.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              
                                 A Metodas rekomenduojamas tuo atveju, jeigu terpėje galėtų būti, pvz., stiklo filtro popieriaus ir (arba) netirpios bandomosios cheminės medžiagos likučių. Šią analizę galima atlikti naudojant dujų chromatografą, jeigu neturimas anglies analizatorius. Privaloma pasirūpinti, kad analizuojant viršutinės erdvės dujas kolbų temperatūros vertė atitiktų ar beveik atitiktų bandymo temperatūros vertę. B metodas gali būti patogesnis taikyti laboratorijose, kuriose IC kiekis matuojamas anglies analizatoriais. Svarbu, kad natrio hidroksido tirpalas (21 pastraipa), kurį naudojant CO2 verčiamas karbonatu, būtų šviežiai pasiruoštas arba jo kiekis žinomas, kad į jį būtų galima atsižvelgti apskaičiuojant bandymo rezultatus (66-b pastraipa).
                           
                        
                     A metodas:   rūgštinimas iki pH < 3
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Prieš pradedant kiekvieną analizės dalį IC analizatorius kalibruojamas naudojant atitinkamą IC standartą (pvz., 1 % w/w CO2 mišinyje su N2 dujomis). Koncentruota ortofosforo rūgštis (20 pastraipa) įšvirkščiama per kiekvienos kolbos sandariklį; kolbos pasirenkamos siekiant sumažinti terpės pH vertę iki < 3 (pvz., įšvirkščiama 1 ml į 107 ml bandomosios terpės). Kolbos vėl sudedamos į kratytuvą. Kolbas vieną valandą pakračius kratytuvu esant bandymo temperatūrai, jos išimamos iš kratytuvo; alikvotinės dujų dalys (pvz., 1 ml) paimamos iš kiekvienos kolbos viršutinės erdvės ir įleidžiamos į IC analizatorių. Išmatuotos IC koncentracijos registruojamos kaip mg C/l.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Šio metodo esmė – užbaigus rūgštinti, kai pH < 3 ir užtikrinus pusiausvyrą 20 °C, CO2 pasiskirstymo tarp skystosios ir dujinės fazės bandymo kolbose pusiausvyros konstantos vertė yra 1,0, jeigu matuojama kaip koncentracija. Šis dalykas bandymo sistemos atžvilgiu bent vieną kartą turėtų būti įrodomas taip:
                              Naudojant bevandenio natrio karbonato (Na2 CO3) tirpalą, pasiruoštą iš CO2 neturinčio vandens, koncentruota ortofosforo rūgštimi (20 pastraipa) rūgštinant vandenį, kol pH vertė pasidaro 6,5, borbatuojant CO2 neturinčiu oru ir naudojamu šarmu užtikrinus neutralų pH, pasiruošiamos kolbos su 5 ir 10 mg/l IC koncentracija. Užtikrinama, kad viršutinės erdvės tūrio santykis su skysčio tūriu būtų toks pats kaip atliekant bandymus (pvz., 1:2). Rūgštinama ir užtikrinama pusiausvyra kaip aprašyta 52 pastraipoje bei matuojama IC koncentracijos viršutinės erdvės ir skystosiose fazėse. Patikrinama, ar dvi koncentracijos atitinka tokias pačias paklaidas. Jeigu paklaidos nėra tapačios, operatorius turėtų persvarstyti procedūras. Šis IC pasiskirstymas tarp skystosios ir dujinės fazės neturi būti tikrinimas kiekvieną kartą atliekant bandymą; jį galima atlikti kartu su kalibravimu.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Jeigu turi būti matuojamas pašalinamas DOC kiekis (tik vandenyje tirpių bandomųjų cheminių medžiagų), turėtų būti imami skystos fazės ėminiai iš atskirų kolbų (neparūgštintų), filtruojami membraniniu filtru ir įleidžiami į DOC analizatorių. Šias kolbas galima naudoti atliekant kitas analizes, jeigu reikia, siekiant nustatyti pirminį biologinį skaidumą.
                           
                        
                     B metodas:   CO2 perskaičiavimas į karbonatą
                  
                  
                              55.
                           
                           
                              Prieš pradedant kiekvienos partijos analizes, IC analizatorius kalibruojamas naudojant atitinkamą standartą, pvz., 0–20 mg/l koncentracijos, išreikštos IC, natrio vandenilio karbonato (NaHCO3) tirpalą CO2 neturinčiame vandenyje (žr. 53 pastraipą). Natrio hidroksido tirpalo (7M, 21 pastraipa) (pvz., 1 ml į 107 ml terpės) įšvirkščiama per kiekvienos pasirinktos kolbos sandariklį ir kolbos kratomos 1 val. esant bandymo temperatūrai. Visose kolbose, panaudotose konkrečią dieną, tačiau nebūtinai kiekvieno ėminio ėmimo atveju per visą bandymą, naudojamas tas pats NaOH tirpalas. Jeigu visų ėminių ėmimo atvejais būtinos absoliučios tuščiosios IC vertės, kiekvieną kartą naudojant NaOH tirpalą privaloma nustatyti IC. Kolbos išimamos iš kratytuvo ir paliekamos nusistoti. Pakankamas kiekis (pvz., 50–1000 μl) skystosios fazės iš kiekvienos kolbos ištraukiama švirkštu. Ėminiai įleidžiami į IC analizatorių ir užrašomos IC koncentracijos. Turėtų būti užtikrinama, kad naudojamas analizatorius būtų tinkamai pritaikytas analizuoti pagal minėtą metodą paruoštus šarminius ėminius.
                           
                        
                              56.
                           
                           
                              Šio metodo esmė – įdėjus šarmo ir užbaigus kratymą, IC koncentracija viršutinėje erdvėje nėra reikšminga. Šį bandymo sistemos parametrą galima patikrinti naudojant IC standartus, pridedant šarmo ir užtikrinant pusiausvyrą bei IC koncentraciją matuojant viršutinėje erdvėje ir skystosios fazės (žr. 53 pastraipą). Koncentracijos vertė viršutinėje erdvėje turėtų būti beveik lygi nuliui. Šio patikrinimo dėl beveik visiškos CO2 absorbcijos nebūtina atlikti kiekvieną kartą darant bandymą.
                           
                        
                              57.
                           
                           
                              Jeigu turi būti matuojamas šalinamas DOC kiekis (tik vandenyje tirpios bandomosios cheminės medžiagos), skystosios fazės ėminiai turėtų būti imami iš atskirų kolbų (į kurias nebuvo dėta šarmo), filtruojami membraniniu filtru ir įleidžiami į DOC analizatorių. Šias kolbas galima naudoti atliekant kitas analizes, jeigu reikia, kad būtų išmatuotas pirminis biologinis skaidumas
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITŲ TEIKIMAS
                  
                     Rezultatų apskaičiavimas
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Darant prielaidą, kad bandomoji cheminė medžiaga 100 % skyla į CO2, teorinis didžiausias išsiskyręs neorganinės anglies (IC) kiekis, viršijantis išsiskiriantį tuščiuose kontroliniuose bandiniuose, yra lygus TOC, kuri įdedama į kiekvieną kolbą bandymo pradžioje, t. y.:
                              
                                 
                              Bendroji neorganinės anglies (TIC) masė (mg) kiekvienoje kolboje yra:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          1 lygtis
                                       
                                    kur:
                              
                                          VL
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          skysčio kolboje tūris (litrais)
                                       
                                    
                                          CL
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          IC koncentracija skystyje (kaip anglies mg/l)
                                       
                                    
                                          VH
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          viršutinės erdvės tūris (litrais)
                                       
                                    
                                          CH
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          IC koncentracija viršutinėje erdvėje (kaip anglies mg/l)
                                       
                                    TIC apskaičiavimai taikant du analizės metodus, naudojamus išmatuoti IC, kai atliekamas šis bandymas, aprašyti toliau 60 ir 61 pastraipose. Procentinė biologinio skaidymo dalis (% D) kiekvienu atveju apskaičiuojama pagal šią lygtį:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          2 lygtis
                                       
                                    kur:
                              
                                          TICt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          bendroji neorganinė anglis (TIC) mg bandymo kolboje t laiko momentu
                                       
                                    
                                          TICb
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          vidutinė bendroji neorganinė anglis (TIC) mg tuščiojo bandinio kolbose t laiko momentu
                                       
                                    
                                          TOC
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          į bandymo indą iš pradžių įdėta TOC (mg).
                                       
                                    Procentinė biologinio skaidymo dalis % D apskaičiuojama bandymo (FT), etaloninės (FC) ir, jeigu įtraukta, slopinimo stebėjimo kontrolinės (FI) kolbų atsižvelgiant į atitinkamus TIC kiekius, išsiskyrusius iki kiekvieno ėminio ėmimo laiko.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Jeigu bandymo laikotarpiu gerokai padidėja TIC kiekis steriliuose kontroliniuose bandiniuose (FS), šiuo atveju galima daryti išvadą, kad bandomoji cheminė medžiaga buvo abiotinėmis sąlygomis suskaidyta, ir šį procesą turi būti atsižvelgiama apskaičiuojant 2 lygties D vertę.
                           
                        
                     Rūgštinimas iki pH < 3
                  
                  
                              60.
                           
                           Rūgštinimu užtikrinus pH < 3 ir pusiausvyrą, suvienodėja TIC koncentracija skystojoje ir dujinėje fazėse; IC koncentraciją būtina matuoti tik dujinėje fazėje. Vadinasi, naudojantis 1 lygtimi 
                                 , kur VB = serumo kolbos tūris.
                        
                     CO2 perskaičiavimas į karbonatą
                  
                  
                              61.
                           
                           Pasirinkus šį metodą apskaičiavimai atliekami pagal 1 lygtį, tačiau mažo IC kiekio dujinėje fazėje nepaisoma, t. y 
                                 , ir 
                                 .
                        
                     Rezultatų išraiška
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Biologinio skaidymo kreivė gaunama procentinę biologinio skaidymo dalį D, kaip liniją brėžiant atsižvelgiant į inkubacijos trukmę, jeigu įmanoma, vėlavimo fazę, biologinio skaidymo fazę, 10 parų langą ir kreivės plokščiosios dalies fazę, t. y. fazę, kai nurodoma užtikrinama didžiausia skaidymo vertė ir biologinio skaidymo kreivė išsilygina. Jeigu panašių bandymo indų FT (< 20 % skirtumas) nustatomi palyginamieji rezultatai, brėžiama vidutinė kreivė (žr. 2 priedėlio 1 pav.); jeigu jie nenustatomi, brėžiama kiekvieno indo atskira kreivė. Kreivės plokščiosios dalies tarpsnio biologinio skaidymo procentinės dalies vidutinė vertė apibrėžiama arba įvertinama didžiausia vertė (pvz., kai kreivė leidžiasi kreivės plokščiosios dalies fazėje), tačiau svarbu įvertinti, ar pastaruoju atveju vertė nėra išskirtis. Šis didžiausias biologinio skaidymo lygis bandymo ataskaitoje pavadinamas „bandomosios cheminės medžiagos biologinio skaidymo laipsniu“. Jeigu bandymo indų skaičius buvo nepakankamas, kad būtų galima nurodyti kreivės plokščiąją dalies tarpsnį, apskaičiuojant vidutinę vertę naudojami paskutinę bandymo dieną išmatuoti duomenys. Ši paskutinė vertė, vidutinė penkių tapačių indų vertė, naudojama nurodant procentinės biologinio skaidymo dalies nustatymo glaudumą. Taip pat nurodoma 10 parų lango pabaigoje nustatyta vertė.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Tuo pačiu būdu brėžiama etaloninės cheminės medžiagos kreivė FC, ir, jeigu įtraukta, abiotinio šalinimo patikrinimo Fs ir slopinimo kontrolės FI kreivės.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Tuščiuose kontroliniuose bandiniuose (FB) esantys TIC kiekiai užrašomi; taip pat užrašomi Fs kolbose (abiotinių sąlygų tikrinimas) esantys kiekiai, jeigu šie indai buvo naudojami atliekant bandymą.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Apskaičiuojama FI indų D vertė remiantis teorine IC išeiga, numatoma tik pagal etaloninio mišinio komponentą. Jeigu 28 dieną [[(DFC
                                  (22) – DFI
                                  (23))/DFC] × 100 > 25 %, galima daryti prielaidą, kad bandomoji cheminė medžiaga slopina sėjimo kultūrą, ir todėl šiuo poveikiu galima pagrįsti mažas DFT vertes, nustatytas taikant bandymo sąlygas. Šiuo atveju bandymą galima pakartoti naudojant mažesnę bandymo koncentraciją ir verčiau sumažinant DIC sėjimo kultūroje ir tuščiuose kontroliniuose bandiniuose susiformavusią bendrąją neorganinę anglį, nes naudojant mažesnę koncentraciją vis tiek sumažinamas metodo tikslumas. Antraip galima naudoti kitą sėjimo kultūrą. Jeigu bandymo kolboje Fs (abiotinėmis sąlygomis) nustatomas gerokas (> 10 %) TIC kiekio padidėjimas, šiuo atveju gali būti įvykę abiotinio skaidymo procesai.
                           
                        
                     Rezultatų validumas
                  
                  
                              66.
                           
                           
                              Bandymas laikomas validuotu, jeigu:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          vidutinė skaidymo procentinė dalis induose FC su etaloninėmis cheminėmis medžiagomis yra > 60 % iki 14 inkubacijos dienos ir
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          tuščiuose kontroliniuose bandiniuose FB esantis vidutinis TIC kiekis bandymo pabaigoje yra > 3 mg C/l.
                                       
                                    Jeigu šios ribinės vertės nėra užtikrinamos, bandymas turėtų būti kartojamas naudojant iš kito šaltinio paimtą sėjimo kultūrą ir (arba) turėtų būti persvarstytos procedūros. Pvz., jeigu tuščiuosiuose bandiniuose susidaro didelis IC kiekis, turėtų būti taikoma 27–32 pastraipose nurodyta procedūra.
                           
                        
                              67.
                           
                           
                              Jeigu bandomosios cheminės medžiagos kiekis nesudaro 60 % ThIC ir jeigu įrodoma, kad ši medžiaga nėra inhibitorius (65 pastraipa), bandymas turėtų būti kartojamas pasirinkus didesnę sėjimo kultūros koncentraciją (ne daugiau negu 30 mg/l veikliojo dumblo ir 100 ml/l ištakio) arba sėjimo kultūrą iš kitų šaltinių, ypač tuo atveju, jeigu skaidymo vertė 20–60 %.
                           
                        
                     Rezultatų interpretavimas
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              Biologinio skaidymo per 10 parų langą vertė > 60 % ThIC atliekant bandymą įrodo, kad aerobinėmis sąlygomis bandomoji cheminė medžiaga yra lengvai biologiškai skaidoma.
                           
                        
                              69.
                           
                           
                              Jeigu 60 % ThIC vertė nėra užtikrinama, nustatoma terpės pH vertė kolbose, kurios nebuvo paveiktos rūgštimi arba šarmu; mažesnė negu 6,5 vertė galėtų būti laikoma įrodymu, kad vyko nitrifikacijos procesas. Šiuo atveju kartojamas bandymas su didesnės koncentracijos buferiniu tirpalu.
                           
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              Paruošiama kiekvieno bandymo (FT) % D, etaloninės (FC) ir, jeigu įtraukta, kiekvienos ėminių ėmimo dienos slopinimo kontrolinės kolbos (FC) verčių lentelė. Jeigu gaunami lygiagrečiai paruoštų kolbų palyginamieji rezultatai, brėžiama vidutinės % D vertės kreivė atsižvelgiant į laiką. Registruojamas TIC kiekis tuščiojo bandinio kolbose (FB) ir DOC vertė steriliuose kontroliniuose bandiniuose (FS) ir (arba) kitos tiriamosios medžiagos bei procentinė jų šalinimo dalis.
                           
                        
                              71.
                           
                           
                              Nustatoma vidutinė kreivės plokščiosios dalies tarpsnio vertė % D arba naudojama didžiausia vertė, jeigu biologinio skaidymo kreivė leidžiasi kreivės plokščiosios dalies tarpsnyje, ir šis dalykas pranešamas kaip „bandomosios cheminės medžiagos biologinio skaidymo laipsnis“. Būtina užtikrinti, kad pastaruoju atveju didžiausia vertė nebūtų išskirtis.
                           
                        
                              72.
                           
                           
                              Į bandymo ataskaitą turi būti įtraukta ši informacija:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bendrasis pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, struktūrinė formulė ir atitinkamos fizinės-cheminės savybės,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandomosios cheminės medžiagos grynumas (priemaišos).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nuoroda į šį bandymo metodą,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudotos bandymo sistemos aprašymas (pvz., indo tūris, viršutinės erdvės ir skysčio santykis, maišymo metodas ir t. t.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandomosios cheminės medžiagos ir etaloninės cheminės medžiagos taikymo bandymo sistemoje: naudotos bandomosios koncentracijos ir anglies kiekis, įdėtas į kiekvieną bandymo kolbą, bet koks tirpiklių naudojimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie naudotą sėjimo kultūrą, bet koks išankstinis apdorojimas ir išankstinis kondicionavimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inkubacijos temperatūra,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      IC analizės principo pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pagrindinės naudotų IC analizatorių charakteristikos (ir bet kokie kiti naudoti analizės metodai),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pakartotinių bandymų skaičius.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatai:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lentelėje pateikti neapdoroti duomenys ir apskaičiuotos biologinio skaidymo vertės,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandomųjų ir etaloninių cheminių medžiagų skaidymo procentinės dalies grafikas atsižvelgiant į laiką, vėlavimo fazė, skaidymo fazė, 10 parų langas ir statumas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      procentinė šalinimo dalis kreivės plokščiosios dalies fazėje, bandymo pabaigoje ir po 10 parų lango,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bet kokio bandymo rezultatų atmetimo priežastys,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bet kokie kiti faktai, susiję su taikyta procedūra,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatų aptarimas.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Šio priedo C.4 skyrius. Lengvo biologinio skaidumo nustatymas. CO2 išsiskyrimo tyrimo metodas (Metodas C.4-C).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159–167.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153–1161.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195–1210.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              ISO 9439 (1990; revised 1999). Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium - Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922–929.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801–812.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181–185.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51–53.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233–243.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. SAFEty 19: 204–211.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507–524.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527–1550.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              ISO 14593, (1999) Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis of inorganic carbon in sealed vessels (C02 headspace test).
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Battersby NS (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813–1822.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR and Starkey M (1999). An „inherent“ biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219–3235.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Šio priedo C.4 skyrius. Lengvo biologinio skaidumo nustatymas.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Šio priedo C.11 skyrius. Veikliojo dumblo respiracijos slopinimo bandymas.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319–327.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              ES (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              ISO 10634 (1996) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
                           
                        
                     1 priedėlis
                     SANTRUMPOS IR SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS
                     IC– neorganinė anglis.
                     ThCO2– teorinis anglies dioksidas (mg) yra anglies dioksido kiekis, apskaičiuotas kaip išsiskiriantis iš žinomo ar išmatuoto anglies kiekio bandomojoje cheminėje medžiagoje, visiškai ją suskaidžius; taip pat išreikštas kaip mg anglies dioksido, išsiskyrusio iš bandomosios cheminės medžiagos mg.
                     DOC– ištirpusi organinė anglis – tirpale esanti organinė anglis arba perleidžiama per 0,45 mikrometro filtrą ar liekanti nusistojusiame skystyje anglis užbaigus 15 minučių centrifugavimą taikant maždaug 4 000 g vertę (apie 40 000 m sek-2).
                     DIC– ištirpusi neorganinė anglis.
                     ThIC– teorinė neorganinė anglis.
                     TIC– bendroji neorganinė anglis.
                     Lengvai biologiškai skaidoma– siekiant nustatyti visišką biologinį skaidymą atliekamų tam tikrų specialių atrankos bandymų reikalavimus atitinkančių cheminių medžiagų sutartinis klasifikavimas; atliekant šiuos bandymus laikomasi labai griežtų reikalavimų, todėl daroma prielaida, kad šios cheminės medžiagos turi būti greitai ir visiškai skaidomos vandens aplinkoje aerobinėmis sąlygomis.
                     10 parų langas– 10 parų iš karto po 10 % biologinio skaidymo užtikrinimo.
                     Būdingasis biologinis skaitomumas– cheminių medžiagų klasifikavimas remiantis neabejojamais biologinio skaidymo (pirminio ar visiško) įrodymais atliekant bet kokį biologinio skaidomumo bandymą.
                     Visiškas biologinis skaidymas– užtikrinamas skaidymo lygis, kai bandomąją cheminę medžiagą visiškai sunaudoja mikroorganizmai ir kai išskiriamas anglies dioksidas, vanduo, mineralinės druskos ir naujos mikrobiologinės ląstelinės sudedamosios dalys (biomasė).
                     Mineralizacija– visiškas organinio junginio skilimas į CO2 ir H2O aerobinėmis sąlygomis, ir į CH4, CO2 bei H2O anaerobinėmis sąlygomis.
                     Vėlavimo tarpsnis– trukmė nuo bandymo pradžios iki skaidančiųjų mikroorganizmų aklimatizavimo ir (arba) prisitaikymo ir bandomosios cheminės medžiagos arba organinės medžiagos biologinio skaidymo padidėjimo tiek, kad jį įmanoma nustatyti (pvz., 10 % didžiausio teorinio biologinio skaidymo ar mažesnio atsižvelgiant į matavimo metodikos tikslumą).
                     Skaidymo tarpsnis– trukmė nuo vėlavimo fazės pabaigos iki tos akimirkos, kai užtikrinamas 90 % aukščiausio skaidymo lygio.
                     Kreivės plokščiosios dalies tarpsnis– kreivės plokščiosios dalies fazė – tokia fazė, kai užtikrinamas didžiausias skaidymas ir biologinio skaidymo kreivė išsitiesina.
                     Bandomoji cheminė medžiaga– bet kokia naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga ar mišinys.
                  
                  
                     2 priedėlis
                     
                        Biologinio skaidymo kreivės pavyzdys
                     
                     
                        1   paveikslas
                     
                     
                        CO2 esančio 1-oktanolio biologinis skaidymas viršutinėje erdvėje
                     
                     
                        
                     Žodynėlis
                     biologinis skaidymas
                     skaidymo tarpsnis
                     aukščiausias biologinio skaidymo lygis
                     kreivės plokščiosios dalies fazė
                     10 parų langas
                     bandymo trukmė (dienomis)
                  
                  C.30.   BIOLOGINIS KAUPIMASIS DUGNO MAŽAŠERĖSE KIRMĖLĖSE
                  
                  ĮVADAS
                  
                              1.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires (TG) Nr. 317 (2010). Iš bandymo metodų, susijusių su išliekamumu aplinkoje, atitinkamai 1996 m. ir 2008 m. buvo paskelbta – Biologinio kaupimosi koncentracijos didėjimas: bandymas su žuvimis pratekėjimo sąlygomis (šio priedo 49 pastraipa, C.13 skyrius) ir Biologinis kaupimasis nuosėdose gyvenančiose Oligochaetes (53). Vandens aplinkos biologinio kaupimosi duomenų ekstrapoliavimas sausumos organizmams, pvz., sliekams, sunkiai įvykdomas, jeigu apskritai įmanomas. Vertinant biologinį cheminių medžiagų kaupimąsi dirvožemyje šiuo metu naudojami bandomosios cheminės medžiagos lipofilinėmis savybėmis, pvz., (14) (37), pagrįsti skaičiavimo modeliai, pvz., ES Techninių gairių dokumente (19). Poreikis parengti su terpe susijusį specialų bandymo metodą jau yra patenkintas, pvz., (55). Šis metodas yra ypač svarbus įvertinant antrinį apsinuodijimą sausumos mitybos grandinėse (4). Keli nacionaliniai bandymų metodai yra skirti biologiniam kaupimuisi organizmuose, išskyrus žuvis, pvz. (2) ir (72). Biologinio kaupimosi sliekuose ((Eisenia fetida, Savigny) ir enchitrėjuose iš užterštų dirvožemių matavimo metodą parengė Amerikos bandymų ir medžiagų draugija (ASTM) (3). Tarptautiniu mastu priimtas biologinio kaupimosi dirvožemyje su bandomąja medžiaga įvertinimo metodas padėtų geriau įvertinti cheminių medžiagų keliamą riziką sausumos ekologinėms sistemoms, pvz., (25) (29).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Dirvožemį vartojančius bestuburius veikia dirvožemyje esančios cheminės medžiagos. Be visų kitų gyvūnų, dugno mažašerės kirmėlės yra svarbios išlaikant dirvožemių struktūrą ir jų veiksmingumą (15) (20). Mažašerės kirmėlės gyvena dirvožemyje ir iš dalies dirvožemio paviršiuje (ypač miško paklotėje); biomasės atžvilgiu jos dažnai būna gausiausia rūšis (54). Permaišydami dirvožemio sudedamąsias dalis ir būdami kitų gyvūnų grobiu minėti gyvūnai gali daryti didelį poveikį chemines medžiagas pasisavinantiems kitiems gyvūnams, kaip antai, bestuburiams (pvz., plėšriosioms erkėms ir vabalams, pvz., (64)) arba stuburiniams (pvz., lapėms ir kirams). Kai kurios dugno mažašerių kirmėlių rūšys, dabartiniu metu naudojamos atliekant ekotoksikologinius bandymus, aprašytos 5 priedėlyje.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              ASTM Pavyzdinėse gairėse dėl dirvožemio toksiškumo arba biologinio kaupimosi laboratorinių bandymų atlikimo naudojant Lumbricid sliekus Eisenia fetida ir enchitrėjus Enchytraeus albidus (3) pateikta daug esminių ir naudingų nurodymų taikant esamą biologinio kaupimosi dirvožemyje bandymo metodą. Kiti dokumentai, į kuriuos daroma nuoroda šiame bandymo metode, yra šio priedo C.13 skyrius, Biologinio kaupimosi koncentracijos didėjimas: bandymas su žuvimis pratekėjimo sąlygomis (49) ir OECD TG 315: Biologinis kaupimasis nuosėdose gyvenančiuose Oligochates (53). Praktinė patirtis atliekant biologinio kaupimosi dirvožemyje tyrimus ir leidiniai, pvz., (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79), taip pat yra svarbūs šio bandymo metodo informacijos šaltiniai.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Šis bandymo metodas daugiausiai taikomas tiriant stabilias, neutralias organines chemines medžiagas, kurias paprastai adsorbuoja dirvožemiai. Naudojant šį metodą galima tirti biologinį stabilių metaloorganinių medžiagų kaupimąsi dirvožemyje. Jį taip pat galima taikyti tiriant metalus ir kitus mikroelementus.
                           
                        BŪTINOS SĄLYGOS
                  
                              5.
                           
                           
                              Cheminės medžiagos biologinio kaupimosi dugno mažašerėse kirmėlėse bandymai buvo atlikti naudojant sunkiuosius metalus (žr., pvz., (63)) ir patvarias organines medžiagas (jų log Kow vertės 3,0–6,0 (40)). Šie bandymai taip pat taikomi:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          cheminėms medžiagoms, kurių log Kow vertė didesnė negu 6,0 (ypač hidrofobinės cheminės medžiagos),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          cheminėms medžiagoms, laikomoms organinėmis cheminėmis medžiagomis, kurioms būdinga savybė biologiškai kauptis gyvuose organizmuose, pvz., aktyviosios paviršiaus cheminės medžiagos arba didelės sugerties cheminės medžiagos,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          cheminėms medžiagoms, kurioms savybė biologiškai kauptis būdinga atsižvelgiant į jų struktūros ypatybes, pvz., analoginės cheminės medžiagos, kurių žinomas biologinio kaupimosi potencialas, ir
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          metalams.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Prieš pradedant tyrimą turėtų būti žinoma informacija apie bandomąją cheminę medžiagą, pvz., bendrasis pavadinimas, cheminis pavadinimas (geriausiai nurodyti IUPAC pavadinimą), struktūrinė formulė, CAS registracijos numeris, grynumas, atsargumo priemonės, privalomosios sandėliavimo sąlygos ir analizės metodai. Be to, turėtų būti žinoma ši informacija:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          tirpumas vandenyje;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          oktanalio ir vandens pasiskirstymo koeficientas Kow;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          dirvožemio ir vandens pasiskirstymo koeficientas, išreikštas Koc;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          garų slėgis;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          skaidomumas (pvz., dirvožemyje, vandenyje);
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          žinomi metabolitai.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Galima naudoti žymėtąsias ir nežymėtąsias bandomąsias chemines medžiagas. Tačiau siekiant palengvinti analizę rekomenduojama naudoti žymėtąsias bandomąsias chemines medžiagas. Sprendimas priimamas atsižvelgiant į aptikimo ribas arba pradinės bandomosios cheminės medžiagos ir metabolitų matavimo reikalavimą. Jeigu naudojama žymėtoji bandomoji cheminė medžiaga ir matuojamas bendrasis radioaktyviųjų liekanų kiekis, svarbu užtikrinti, kad žymėtosios liekanos dirvožemyje ir bandomuosiuose organizmuose būtų apibūdinamos procentine pradinės cheminės medžiagos ir žymėtosios nepradinės cheminės medžiagos dalimi, pvz., stabilioje būsenoje paimtuose ėminiuose ar ėmimo tarpsnio pabaigoje siekiant sudaryti galimybę apskaičiuoti atitinkamos pradinės bandomosios cheminės medžiagos ir dirvožemio metabolitų (žr. 50 pastraipą) biologinio kaupimosi kriterijų. Šį aprašytąjį metodą gali tekti modifikuoti, pvz., pateikti pakankamą kiekį biomasės siekiant išmatuoti nežymėtosios organinės bandomosios cheminės medžiagos arba metalų kiekį. Matuojant bendrąjį radioaktyviųjų liekanų kiekį (skystiniu blyksimuoju skaitikliu, kai užbaigiama ekstrakcija, deginimas ar audinio soliubilizavimas) biologinio kaupimosi kriterijus (toliau – BAF) yra grindžiamas pradine bandomąja chemine medžiaga ir metabolitais. Apskaičiuojant BAF visų pirmiausiai turėtų būti atsižvelgiama į pradinės bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją organizmuose ir bendrąsias radioaktyviąsias liekanas. Vėliau biotos-sedimentų akumuliacijos faktorius (toliau – BSAF), perskaičiuotas į kirmėlių lipidų kiekį ir dirvožemio organinės anglies (OC) kiekį, turėtų būti apskaičiuotas naudojantis BAF, kad būtų užtikrintas skirtingų biologinio kaupimosi bandymų rezultatų palyginamumas.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Turėtų būti žinomas bandomosios cheminės medžiagos toksiškumas bandomųjų rūšių gyvūnams, pvz., poveikio koncentracija (ECx) ar mirtinoji koncentracija (LCx) sugerties tarpsnio laikotarpiu (pvz., (19)). Visų pirmiausiai turėtų būti pasirenkama tokia bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, kad šios medžiagos aštrios asimptotinės LC50 ji sudarytų apie 1 % ir būtų bent dešimt kartų didesnė negu jos aptikimo riba dirvožemyje naudojant analizės metodą. Jeigu turima, pirmenybė turėtų būti teikiama toksiškumo vertėms, nustatytoms atliktais ilgalaikės trukmės tyrimais apie subletalinius poveikius (51) (52). Jeigu šie duomenys neprieinami, naudinga informacija būtų gaunama atlikus ūmaus toksiškumo bandymą (žr. pvz., 23 pastraipą).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Turėtų būti naudojamas žinomo tikslumo, glaudumo ir jautrumo analizės metodas kiekybiškai nustatyti cheminę medžiagą bandomuosiuose tirpaluose, dirvožemyje ir biologinėse medžiagose bei žinoma išsami informacija apie ėminio ruošimą ir sandėliavimą bei medžiagų saugos duomenų lapai. Taip pat turėtų būti žinomos bandomosios medžiagos aptikimo ribos dirvožemyje ir kirmėlės audinyje. Jeigu naudojama 14C pažymėta bandomoji cheminė medžiaga, turėtų būti žinomas savitasis radioaktyvumas (t. y. Bq mol-1) ir procentinė su priemaišomis susijusi radioaktyvumo dalis. Bandomosios cheminės medžiagos savitasis radioaktyvumas turėtų būti ganėtinai didelis siekiant palengvinti analizę ir pasirinktos bandomosios koncentracijos neturėtų sukelti toksiško poveikio.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Bandymą leidžiama atlikti su dirbtiniu dirvožemiu arba su natūraliu dirvožemiu. Prieš pradedant bandymą turėtų būti žinoma informacija apie naudojamo natūralaus dirvožemio charakteristikas, pvz., dirvožemio kilmė arba jo sudedamosios dalys, pH, organinės anglies kiekis, granuliometrinė sudėtis (procentinė smėlio, nuosėdų ir molio dalis) ir vandens sulaikymo geba (3) (48).
                           
                        BANDYMO METODO ESMĖ
                  
                              11.
                           
                           
                              Bandomosios cheminės medžiagos biologinį kaupimąsi apibūdinantys parametrai – biologinio kaupimosi kriterijus (BAF), sugerties greičio konstanta (ks) ir šalinimo greičio konstanta (ke). Sąvokų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Bandymą sudaro dvi dalys: sugerties (poveikio) tarpsnis ir šalinimo tarpsnis (tarpsnis po poveikio). Sugerties tarpsnyje tapačios kirmėlių grupės suleidžiamos į dirvožemį, į kurį yra įterpta bandomoji cheminė medžiaga. Be bandomųjų gyvūnų, kontrolinių kirmėlių grupės laikomos tomis pačiomis sąlygomis, tačiau be bandomosios cheminės medžiagos. Išmatuojama bandomųjų organizmų sausoji masė ir lipidų kiekis. Šį matavimą galima atlikti naudojant kontrolinės grupės kirmėles. Analizės fono vertes (tuščiąsias vertes) galima gauti analizuojant kontrolinių kirmėlių ėminius ir dirvožemį. Šalinimo tarpsniui kirmėlės perkeliamos į dirvožemį be bandomosios cheminės medžiagos. Šalinimo tarpsnis visada būtinas, nebent bandomosios cheminės medžiagos įsisavinimas sugerties etape būtų gana nedidelis. Pasirinkus šalinimo tarpsnį gaunama informacija apie greitį, kuriuo bandomieji organizmai (pvz., 27)) šalina bandomąją cheminę medžiagą. Jeigu per sugerties tarpsnį stabili būsena nėra užtikrinama, nustatant kinetinius parametrus – biologinio kaupimosi kinetinį kriterijų BAFk, sugerties ir šalinimo greičio konstantą (-as) – visų pirmiausiai turėtų būti remiamasi vienalaikiu sugerties ir šalinimo tarpsnių rezultatų pritaikymu. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija kirmėlėse ir jas veikiančios medžiagos koncentracija stebima per abu bandymo etapus.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Sugerties tarpsniu atliekami matavimai; ėminiai imami ne daugiau negu 14 dienų (enchytraeids) arba 21 dieną (sliekų atveju), kol užtikrinama nuostovi būsena (11) (12) (67). Nuostovi būsena užtikrinama tuo atveju, kai kirmėlių koncentracija atsižvelgiant į laiką yra lygiagreti laiko ašiai ir atlikus paimtų ne trumpesniais negu dviejų dienų intervalais ėminių tris einančias viena po kitos koncentracijos analizes jų tarpusavio rezultatai skiriasi ne daugiau negu ± 20 % (remiamasi statistiniais palyginimais, pvz., dispersine analize, regresijos analize).
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Per šalinimo tarpsnį bandomieji organizmai perkeliami į indus su tuo pačiu substratu, tačiau be bandomosios cheminės medžiagos. Per šalinimo tarpsnį atliekami matavimai imant ėminius 14 dienų (enchytraeids) arba 21 dieną (sliekų atveju), jeigu po ankstesnio analizinio nustatymo neužregistruojama, kad bandomosios cheminės medžiagos likučių kiekis kirmėlėse sumažėjo 90 %. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija kirmėlėse šalinimo tarpsnio pabaigoje registruojama kaip nepašalintieji likučiai. Biologinio kaupimosi kriterijus esant nuostoviajai būsenai (BAFss) visų pirmiausiai apskaičiuojamas ir kaip koncentracijos kirmėlėse (Ca) bei dirvožemyje (Cs) santykis akivaizdžiai nuostovioje būsenoje, ir kaip kinetinis biologinio kaupimosi kriterijus (BAFK), t. y. kaip sugerties iš dirvožemio greičio konstantos (ks) ir šalinimo greičio konstantos (ke) santykis (žr. 1 priedėlyje pateiktas sąvokų apibrėžtis); šiuo atveju daroma prielaida dėl pirmojo laipsnio kinetikos (apskaičiavimai nurodyti 2 priedėlyje). Jeigu yra akivaizdu, kad pirmojo laipsnio kinetika nėra taikoma, turėtų būti pasirenkami kiti modeliai.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Naudojant kompiuterizuotas modelines lygtis (gairės pateiktos 2 priedėlyje) apskaičiuojama sugerties greičio konstanta, šalinimo greičio konstanta (ar konstantos, jeigu naudojami kiti modeliai), kinetinis biologinio kaupimosi kriterijus (BAFK) ir, jeigu įmanoma, kiekvieno iš šių parametrų pasikliautinieji rėžiai. Bet kokio modelio atitiktį galima nustatyti taikant koreliacijos koeficientą arba mišrios koreliacijos koeficientą (jeigu koeficientų vertė yra beveik lygi vienetui, šiuo atveju atitiktis yra pakankama) ar taikant chi kvadrato kriterijų. Be to, įvertintųjų parametrų standartinės paklaidos ar pasikliautinojo rėžio dydžiu galima remtis apsisprendžiant dėl modelio atitikties.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Siekiant sumažinti lipofiliškų bandomųjų cheminių medžiagų rezultatų kintamumą biologinio kaupimosi kriterijai turėtų būti išreiškiami atsižvelgiant į lipidų kiekį ir organinės anglies kiekį (dirvožemio kg organinės anglies (OC) kg-1 kirmėlių lipidų kiekis). Šis metodas grindžiamas tuo, kad cheminių medžiagų tam tikrų klasių atžvilgiu galima nurodyti aiškų jų biologinio kaupimosi gebos ir lipofiliškumo sąryšį; šis santykis gerai pagrįstas tiriant žuvis (47). Nustatytas lipidų kiekio žuvyje ir šių cheminių medžiagų biologinio kaupimosi sąryšis. Panašus tarpusavio ryšys nustatytas bentosiniams organizmams, pvz., (30) (44). Panašiai šis tarpusavio ryšys įrodytas dugno mažašerėms kirmėlėms, pvz., (5) (6) (7) (14). Jeigu turimas pakankamas kiekis kirmėlės audinio, bandomųjų gyvūnų lipidų kiekį galima nustatyti naudojant tą pačią biologinę medžiagą, kuri buvo pasirinkta apibrėžiant bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją. Matuojant lipidų kiekį antraip galima naudoti kontroliniu gyvūnus.
                           
                        BANDYMO VALIDUMAS
                  
                              17.
                           
                           
                              Bandymas laikomas validuotu, jeigu laikomasi šių kriterijų:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          bandymo pabaigoje bendrasis gaištamumas sugerties tarpsniu ir šalinimo tarpsniu neturėtų viršyti 10 % (sliekai) arba 20 % (enchytraeids) viso naudotų kirmėlių skaičiaus,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          jei tai Eisenia fetida ir Eisenia andrei, sugerties tarpsnio ir šalinimo tarpsnio pabaigoje išmatuota vidutinė sumažėjusi masė neturėtų būti didesnė negu 20 %, palyginti su pradine šviežių gyvūnų mase (š. m.) kiekvieno tarpsnio pradžioje.
                                       
                                    
                        METODO APRAŠYMAS
                  
                     Bandomųjų gyvūnų rūšys
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Atliekant biologinio kaupimosi bandymą rekomenduojama pasirinkti kelių rūšių dugno mažašeres kirmėles. Dažniausiai naudojamos Eisenia fetida arba Eisenia andrei (Lumbricidae), arba Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus, ar Enchytraeus luxuriosus (Enchytraeidae)) rūšys aprašytos 5 priedėlyje.
                           
                        
                     Aparatūra
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Būtina pasirūpinti, kad nebūtų naudojamos medžiagos, įrangos bet kokios dalys, galinčios tirpdyti, adsorbuoti bandomąją cheminę medžiagą ar pašalinti kitas chemines medžiagas ir neigiamai paveikti bandomuosius gyvūnus. Atsižvelgiant į apkrovos dydį, t. y. bandomųjų dugno mažašerių kirmėlių skaičių, leidžiama naudoti iš cheminiu atžvilgiu inertiškos medžiagos pagamintus ir tinkamos talpos įprastus keturkampio arba cilindro formos indus. Su bandymo terpe besiliečianti bet kokia įranga gali būti iš nerūdijančio plieno, plastiko ar stiklo. Bandymo indai turėtų būti tinkamai uždengti, kad iš jų neištrūktų mažašerės kirmėlės, tačiau taip pat užtikrinamas reikiamas oro tiekimas. Naudojant chemines medžiagas, kurioms būdingas didelis sugerties koeficientas, pvz., sintetinius piretroidus, gali tekti rinktis silanizuotą stiklą. Susiklosčius aprašytosioms situacijoms įrangą tenka šalinti, kai ji baigiama naudoti (49). Privaloma pasirūpinti, kad atliekant bandymus naudotos žymėtosios priemonės ir lakiosios cheminės medžiagos nepatektų į aplinką. Gaudyklės (pvz., stiklinės dujų plovimo kolbos) turėtų būti naudojamos su tinkamais adsorbentais, galinčiais sulaikyti bet kokias iš bandymo indų garuojančias liekanas.
                           
                        
                     Dirvožemis
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Atliekant bandymą naudojamas tokios kokybės dirvožemis, kad būtų užtikrinamas bandomųjų organizmų išgyvenimas ir ypač dauginimasis aklimatizavimo laikotarpiu bei bandymo laikotarpiais ir kad šie gyvūnai neįgautų neįprastos išvaizdos ar nepradėtų keistai elgtis. Mažašerės kirmėlės turėtų įsirausti į dirvožemį.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Atliekant bandymus kaip substratą rekomenduojama naudoti šio priedo (48) C.8 skyriuje aprašytą dirbtinį dirvožemį. Atliekant biologinio kaupimosi bandymus naudotino dirbtinio dirvožemio pasiruošimo ir dirbtino dirvožemio sandėliavimo rekomendacijos pateiktos 4 priedėlyje. Ore džiovintą dirbtinį dirvožemį, kol jis bus pradėtas naudoti, galima sandėliuoti kambario temperatūros sąlygomis.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Tačiau iš neužterštų vietovių paimtus natūralius dirvožemius galima naudoti kaip bandymo ir (arba) kirmėlių auginimo dirvožemį. Natūralūs dirvožemiai turėtų būti apibūdinami bent savo kilme (paėmimo vieta), pH, organinės anglies kiekiu, granuliometrine sudėtimi (procentinė smėlio, nuosėdų ir molio dalis), vandens sulaikymo geba ir procentine vandens kiekio dalimi (3). Prieš pradedant naudoti, jeigu atliekama dirvožemio arba jo sudedamųjų dalių mikroteršalų analizė, šiuo atveju būtų gaunama naudingos informacijos. Jeigu naudojamas žemės ūkio paskirties žemės lauko dirvožemis, prieš imant ėminius (50) jis neturėtų būti buvęs apdorotas javų apsaugos produktais ar ne trumpiau negu vienerius metus netręštas gyvulių mėšlu ir ne trumpiau negu šešis mėnesius netręštas organinėmis trąšomis. Natūralių dirvožemių tvarkymo procedūros prieš imantis juos naudoti ekotoksikologiniams bandymams su mažašerėmis kirmėlėmis aprašyti (3). Natūralių dirvožemių laikymo trukmė laboratorijoje turėtų būti kiek įmanoma trumpesnė.
                           
                        
                     Bandomosios cheminės medžiagos taikymas
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga įterpiama į dirvožemį. Turėtų būti atsižvelgiama į bandomosios cheminės medžiagos fizines ir chemines savybes. Vandenyje tirpi bandomoji cheminė medžiaga prieš įmaišant ją į dirvožemį turėtų būti visiškai ištirpinama vandenyje. Įterpiant mažai vandenyje tirpią bandomąją cheminę medžiagą rekomenduojama taikyti tokią įterpimo procedūrą, kai viena ar daugiau (dirbtinio) dirvožemio sudedamųjų dalių dengiama bandomąja chemine medžiaga. Pvz., kvarcinį smėlį ar jo dalį galima mirkyti tinkamame organiniame tirpiklyje ištirpytos bandomosios cheminės medžiagos tirpale; vėliau šis tirpiklis yra iš lėto išgarinamas. Padengtą sudedamąją dalį vėliau galima įmaišyti į dirvožemį. Pagrindinis šios procedūros pranašumas – į dirvožemį nepakliūna tirpiklio. Jeigu naudojamas natūralus dirvožemis, bandomoji cheminė medžiaga įterpiama į ore džiovintą dirvožemio dalį kaip aprašyta pirmiau (ruošiantis dirbtinį dirvožemį) arba bandomoji cheminė medžiaga įmaišoma į drėgną dirvožemį ir vėliau taikoma garinimo procedūra, jeigu buvo naudota stabilizavimo priemonė. Apskritai kiek įmanoma turėtų būti stengiamasi, kad drėgnas dirvožemis susiliestų su tirpikliu. Turėtų būti atsižvelgiama į šiuos dalykus (3):
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          jeigu naudojamas ne vanduo, o kitas tirpiklis, pastarasis turi būti tinkamas maišyti su vandeniu ir (arba) jį turi būti įmanoma pašalinti (pvz., išgarinti), kad dirvožemyje liktų tik bandomoji cheminė medžiaga,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          jeigu naudojamas tirpiklio kontrolinis ėminys, neigiamo kontrolinio mėginio naudoti nebūtina. tirpiklio kontrolinio ėminio koncentracija turėtų būti didžiausia į dirvožemį įterpto tirpiklio koncentracija ir turėtų būti naudojamas tos pačios partijos tirpiklis, kuris buvo pasirinktas ruošiantis pradinį tirpalą; renkantis tinkamą soliubilizavimo priemonę pagrindiniai kriterijai turėtų būti tirpiklio toksiškumas ir lakumas bei bandomosios cheminės medžiagos tirpumas pasirinktame tirpiklyje.
                                       
                                    
                        
                              24.
                           
                           
                              Pasirinkus vandenyje ir organiniuose tirpikliuose mažai tirpias chemines medžiagas, 2,0–2,5 g smulkiai malto kvarcinio smėlio grūstuvėje ar piestoje galima sumaišyti vienam bandymo indui su tam tikru bandomosios cheminės medžiagos kiekiu, kad būtų pasiruošta reikiama bandomoji koncentracija. Šis kvarcinio smėlio ir bandomosios cheminės medžiagos mišinys įterpiamas į iš anksto sudrėkintą dirvožemį ir kruopščiai sumaišomas su reikiamu dejonizuoto vandens kiekiu siekiant užtikrinti būtiną drėgmės kiekį. Galutinis mišinys paskirstomas po bandymo indus. Procedūra kartojama pasirinkus kiekvieną bandomąją procedūrą ir taip pat pasiruošiami atitinkami kiekvieno bandymo indo kontroliniai bandiniai su 2,0–2,5 g smulkiai sumalto kvarcinio smėlio.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Bandomąją cheminę medžiagą įterpus į dirvožemį turėtų būti nustatyta jos koncentracija. Bandomosios cheminės medžiagos tolydus pasiskirstymas dirvožemyje turi būti patikrintas prieš į dirvožemį įdedant bandomuosius gyvūnus. Į ataskaitą turėtų būti įtrauktas pasirinkto bandomosios cheminės medžiagos įterpimo metodo apibūdinimas ir nurodomos jo pasirinkimo priežastys.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Dirvožemio ir porų vandens fazės pusiausvyrą geriausiai būtų užtikrinti prieš įdedant organizmus; rekomenduojama pasirinkti keturių dienų laikotarpį su 20 °C temperatūra. Daugelio mažai vandenyje tirpstančių organinių cheminių medžiagų laikotarpis, kol nusistovi tikroji pusiausvyra tarp adsorbuojamų ir ištirpusių frakcijų, gali trukti kelias dienas ar mėnesius. Atsižvelgiant į tyrimo tikslą, pvz., jeigu turi būti modeliuojamos aplinkos sąlygos, dirvožemį su įterpta bandomąja chemine medžiaga galima „brandinti“ ilgesnį laikotarpį, pvz., metalų šis laikotarpis gali trukti tris savaites 20 °C temperatūroje (22).
                           
                        
                     Bandomųjų organizmų auginimas
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Mažašerės kirmėlės visų pirmiausiai turėtų būti laikomos skaidrioje laboratorinėje kultūroje. Laboratorinės kultūros, skirtos Eisenia fetida, Eisenia andrei, ir Enchytraeid rūšims, metodų gairės pateiktos 5 priedėlyje (žr. taip pat (48) (51) (52)).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Atliekant bandymus naudojamos mažašerės kirmėlės neturėtų sirgti jokiomis įmanomomis nustatyti ligomis, nebūtų kokiu nors atžvilgiu neįprastos ar apniktos parazitų.
                           
                        BANDYMO ATLIKIMAS
                  
                              29.
                           
                           
                              Bandomuosius organizmus sugerties tarpsnio laikotarpiu veikia bandomoji cheminė medžiaga. Sugerties tarpsnio trukmė turėtų būti 14 dienų (enchytraeids) arba 21 diena (sliekai), jeigu nėra įrodoma, kad nebuvo užtikrinta nuostovi būsena.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Šalinimo tarpsniui mažašerės kirmėlės perkeliamos į dirvožemį be bandomosios cheminės medžiagos. Pirmasis ėminys turėtų būti imamas 4–24 val. po šalinimo tarpsnio pradžios. Ėminių ėmimo pavyzdžiai pasirinkus 21 dienos sugerties tarpsnį ir 21 dienos šalinimo tarpsnį yra pateikti 3 priedėlyje.
                           
                        
                     Bandomieji organizmai
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Daugelio rūšių dirvožemio enchitrėjų masė yra labai maža (pvz., 5–10 mg Enchytraeus albidus individo šlapioji masė ir dar mažesnė Enchytraeus crypticus ir Enchytraeus luxuriosus masė); norint išmatuoti masę ir atlikti cheminę analizę gali tekti sujungti tapačių bandymo indų mažašeres kirmėles (t. y. siekiant gauti vieną audinio analizės rezultatą turėtų būti naudojamos visos tapataus indo mažašerės kirmėlės). Į kiekvieną tapatų indą įleidžiama po 20 enchitrėjų individų ir turėtų būti naudojami bent trys tapatūs indai. Jeigu bandomosios cheminės medžiagos analizinio nustatymo riba yra didelė, gali tekti naudoti daugiau mažašerių kirmėlių. Jeigu pasirenkami tų rūšių gyvūnai, kurių individo masė yra didesnė (Eisenia fetida ir Eisenia andrei), galima naudoti vieną individą iš tapačių indų.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Atliekant bandymą naudojami sliekai turėtų būti panašios masės (pvz., Eisenia fetida ir Eisenia andrei individų masė turėtų būti 250–600 mg). Enchitrėjų (pvz., Enchytraeus albidus) ilgis turėtų būti maždaug 1 cm. Visos mažašerės kirmėlės, naudojamos specialiam bandymui, turėtų būti gautos iš to paties šaltinio ir būti suaugę gyvūnai su kliteliumu (clitellum) (žr. 5 priedėlį). Gyvūno amžius ir masė gali daryti įtaką BAF vertėms (pvz., atsižvelgiant į skirtingą lipidų kiekį ir (arba) kiaušinėlių turėjimą), todėl šiuos parametrus privalomas tiksliai užrašyti ir į juos atsižvelgtina aiškinant rezultatus. Be to, kokonus galima padėti per sugerties tarpsnį, kuris taip pat darys poveikį BAF vertėms. Rekomenduojama, kad bandomųjų mažašerių kirmėlių ėminio dalis būtų pasveriama prieš bandymą siekiant įvertinti vidutinę sausąją ir šlapiąja masę.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Turėtų būti pasirinkamas didelis dirvožemio ir mažašerių kirmėlių santykis siekiant užtikrinti, kad sugerties tarpsniu bandomosios cheminės medžiagos koncentracija dirvožemyje sumažėtų kuo mažiau. Rekomenduojama, kad bandymo inde, jeigu pasirinkta Eisenia fetida ir Eisenia andrei, vienai mažašerei kirmėlei tektų ne mažiau negu 50 g sausosios masės (s. m.), o enchitrėjams būtų skirta ne mažiau negu 10–20 g sausosios masės. Šiuose induose turėtų būti 2–3 cm dirvožemio sluoksnis (enchitrėjams) arba 4–5 cm sluoksnis sliekams.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Atliekant bandymą naudojamos mažašerės kirmėlės išimamos iš auginimo kultūros (pvz., enchitrėjai išimami juvelyro žnyplelėmis). Suaugę gyvūnai perkeliami į bandymo dirvožemį be bandomosios cheminės medžiagos, kur jie aklimatizuojami ir šeriami (žr. 36 pastraipą). Jeigu bandymo sąlygos skiriasi nuo auginimo sąlygų, 24–72 val. aklimatizavimo tarpsnio turėtų pakakti, kad mažašerės kirmėlės prisitaikytų prie bandymo sąlygų. Po aklimatizavimo sliekai nuplaunami juos perkeliant į stiklinius indus (pvz., Petrio lėkšteles) su švariu vandeniu, tada pasveriami ir suleidžiami į bandymo dirvožemį. Prieš pasveriant mažašerės kirmėlės atsargiai prispaudžiamos prie lėkštelės krašto, kad nuo jų nutekėtų perteklinis vanduo, arba kruopščiai ir sausai nušluostomos šiek tiek suvilgyta popierine servetėle.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Bandomųjų gyvūnų įsirausimas į dirvožemį turėtų būti stebimas ir aprašomas. Atliekant bandymus su sliekais, gyvūnai (kontroliniai ir poveikį patyrę gyvūnai) į dirvožemį įsirausia per kelias valandas; ši trukmė turėtų būti tikrinama ne vėliau negu po 24 valandų nuo sliekų suleidimo į bandymo indus. Jeigu sliekai neįsirausia į dirvožemį (pvz., daugiau negu 10 % per ilgesnį laikotarpį negu pusė sugerties tarpsnio), vadinasi, bandymo sąlygos nėra tinkamos ar bandomieji organizmai nėra sveiki. Šiuo atveju bandymas turėtų būti nutraukiamas ir kartojamas iš naujo. Enchitrėjai daugiausiai gyvena plyšiuose tarp dirvožemio porų ir dažnai su aplinkiniu substratu gali liestis tik jų apvalkalas; laikoma, kad poveikis besirausiantiems ir nesirausiantiems enchitrėjams yra vienodas ir su nesirausiančiais enchitrėjais nėra būtina pakartoti bandymą.
                           
                        
                     Šėrimas
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Šėrimas turėtų būti numatomas tuo atveju, jeigu pasirenkamas dirvožemis su mažu bendru organinės anglies kiekiu. Jeigu naudojamas dirbtinis dirvožemis, rekomenduojama savaitinė šėrimo norma (t. y. mažašerės kirmėlės turėtų būti šeriamos kartą per savaitę) yra 7 mg sauso mėšlo vienam dirvožemio sausosios masės gramui, kai šeriami sliekai, ir rekomenduojama savaitinė 2–2,5 mg maltų avižų dribsnių norma vienam dirvožemio sausosios masės gramui, kai šeriami enchitrėjai (11). Pirmoji pašaro dalis į dirvožemį turėtų būti įmaišoma iš karto prieš į jį įleidžiant bandomuosius organizmus. Tikslinga rinktis to paties tipo pašarą, kuris naudotas auginant (žr. 5 priedėlį).
                           
                        
                     Šviesa ir temperatūra
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Bandymai turėtų būti atliekami pasirinkus reguliuojamą 16/8 valandų šviesos ir tamsos ciklą bei bandymo indų vietoje užtikrinant 400–800 lx apšvietimą. Atliekant bandymą visą laiką turėtų būti naudojama 20 ± 2 °C temperatūra.
                           
                        
                     Bandomosios koncentracijos
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Naudojama pavienė koncentracija. Atvejai, kai būtina taikyti papildomą (-as) koncentraciją (-as), turėtų būti pagrindžiami. Jeigu bandomosios cheminės medžiagos toksiškumas (ECx) beveik tapatus analizinei aptikimo ribai, rekomenduojama naudoti žymėtąją bandomąją cheminę medžiagą (didelio savitojo radioaktyvumo žymeklį). Jeigu naudojami metalai, koncentracijos audinyje ir dirvožemyje turėtų būti didesnės negu fono lygis.
                           
                        
                     Tapatūs indai
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Norint atlikti kinetinius matavimus (sugerties ir šalinimo tarpsnis), vienoje ėminių ėmimo vietoje turėtų būti ne mažiau negu trys tapatūs indai. Bendro pasiruoštų tapačių indų skaičiaus turėtų pakakti, kad būtų aprėpiama visa ėminių ėmimo trukmė per sugerties ir šalinimo tarpsnius.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Biologiniams stebėjimams ir matavimams atlikti (pvz., sausosios ir šlapiosios masės santykis, lipidų kiekis) ir fono koncentracijoms mažašerėse kirmėlėse ir dirvožemyje analizuoti turėtų būti paruošta ne mažiau negu 12 tapačių indų neigiamai kontrolei (iš keturių indų ėminiai imami pradžioje, keturi – sugerties pabaigoje ir dar keturi – šalinimo pabaigoje), jeigu kaip tirpiklis naudojamas tik vanduo. Jeigu taikant bandomąją cheminę medžiagą naudojama kokia nors soliubilizavimo priemonė, be paveiktų tapačių indų, turėtų būti paruošti tirpiklio kontroliniai ėminiai (ėminiai imami iš keturių tapačių indų sugerties tarpsnio pradžioje ir jo pabaigoje ir ėminiai imami iš keturių indų šalinimo tarpsnio pabaigoje) su visomis sudedamosiomis dalimis, išskyrus bandomąjį objektą. Šiuo atveju taip pat galima pateikti keturis papildomus neigiamos kontrolės (be tirpiklio) tapačius indus siekiant užtikrinti pasirenkamąjį ėminių ėmimą sugerties tarpsnio pabaigoje. Šiuos tapačius indus biologiniu atžvilgiu galima lyginti su tirpiklio kontroliniais ėminiais siekiant gauti informacijos apie galimą tirpiklio poveikį bandymo organizmams. Rekomenduojama paruošti pakankamą papildomų rezervinių tapačių indų skaičių (pvz., aštuonis) poveikiui ir kontroliniam (-iams) ėminiui (-iams).
                           
                        
                     Dirvožemio kokybės matavimo dažnumas
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Dirvožemio pH, dirvožemio drėgnumas ir temperatūra (nuolat) bandymo patalpoje turėtų būti matuojama sugerties ir šalinimo tarpsnių pradžioje ir pabaigoje. Dirvožemio drėgnumas vieną kartą per savaitę turėtų būti koreguojamas pasveriant bandymo indus ir tikrąsias mases palyginant su pradinėmis masėmis bandymo pradžioje. Sumažėjęs vandens kiekis turėtų būti kompensuojamas pripilant dejonizuoto vandens.
                           
                        
                     Mažašerių kirmėlių ir dirvožemio ėminių ėmimas bei analizė
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Sugerties ir šalinimo tarpsnių tvarkaraščio pavyzdys atliekant biologinio kaupimosi bandymus su mažašerėmis kirmėlėmis ir enchitrėjais pateiktas 3 priedėlyje.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Dirvožemio ėminys imamas iš bandymo indų, kad pirmiau negu į juos įleidžiami sliekai, ir sugerties bei šalinimo tarpsniais būtų nustatyta bandomosios cheminės medžiagos koncentracija. Atliekant bandymą bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos nustatomos sliekuose ir dirvožemyje. Apskritai matuojamos bendrosios dirvožemio koncentracijos. Antraip galima matuoti koncentracijas porų vandenyje; šiuo atveju prieš pradedant tyrimą numatomas atitinkamas pagrindimas ir būtini metodai, kurie įtraukiami į ataskaitą.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Sugerties ir šalinimo tarpsniais sliekų bei dirvožemio ėminiai imami ne mažiau negu šešis kartus. Jeigu įrodoma, kad bandomoji cheminė medžiaga yra stabili, imamų dirvožemio ėminių skaičių galima sumažinti. Rekomenduojama, kad sugerties tarpsnio pradžioje ir pabaigoje būtų analizuojami ne mažiau negu trys kartotiniai ėminiai. Jeigu sugerties tarpsnio pabaigoje išmatuota dirvožemio koncentracija nuo pradinės koncentracijos skiriasi daugiau negu 30 %, taip pat turėtų būti analizuojami kitomis dienomis paimti dirvožemio ėminiai.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Iš nustatyto tapataus indo dirvožemio sliekai išimami kiekvienu ėminių ėmimo metu (pvz., tapataus indo dirvožemį paskleidus plokščiame padėkle ir lanksčiomis juvelyro žnyplelėmis išrinkus sliekus), neatidėliotinai nuplaunami vandeniu negilioje stiklinėje ar plieniniame padėkle. Pašalinamas perteklinis vanduo (žr. 34 pastraipą). Sliekai atsargiai sudedami į iš anksto pasvertą indą, nedelsiant pasveriami, įskaitant jų virškinimo trakto turinį.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Tada sliekams (Eisenia sp.) turėtų būti leidžiama valytis savo virškinamąjį traktą visą naktį, pvz., ant drėgno filtravimo popieriaus, uždengtoje Pietrio lėkštutėje (žr. 34 pastraipą). Po virškinamojo trakto valymo turėtų būti nustatoma sliekų masė siekiant įvertinti galimą biomasės sumažėjimą atliekant bandymą (žr. validumo kriterijus 17 pastraipoje), Enchitrėjai sveriami ir jų audinio analizė atliekama be jų virškinamojo trakto valymo, nes šią valymo procedūrą sunku atlikti atsižvelgiant į mažą šių sliekų dydį. Nustačius galutinę masę sliekai turėtų būti nedelsiant nudobiami naudojant patį tinkamiausią metodą (pvz., skystuoju azotu ar sušaldomi –18 °C temperatūroje).
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Užterštą virškinamojo trakto turinį sliekai per šalinimo tarpsnį pakeičia švariu dirvožemiu. Vadinasi, matuojant iš karto prieš šalinimo tarpsnį paimto ėminio sliekus su nevalytu virškinamuoju traktu (šiuo atveju enchitrėjus) yra įtraukiamas užterštas virškinamojo trakto dirvožemis. Daroma prielaida, kad didesnioji dalis gėlavandenių mažašerių kirmėlių virškinamojo trakto turinio po 4–24 val. trukmės šalinimo tarpsnio pakeičiama švariomis nuosėdomis, pvz., (46). Panašios išvados buvo pateiktos dėl sliekų atlikus tyrimus apie žymėtojo kadmio ir cinko kaupimąsi (78). Atliekant bandymą su enchitrėjais šio šalinimo tarpsnio pirmojo ėminio koncentraciją galima laikyti audinio koncentracija pašalinus virškinamojo trakto turinį. Siekiant atsižvelgti į tiriamo objekto koncentracijos skiedimą, kuris neužterštu dirvožemiu atliekamas per sugerties tarpsnį, virškinamojo trakto turinio masę galima vertinti remiantis šlapiąja sliekų mase ir sliekų pelenų mase arba sliekų sausąja mase ir sliekų pelenų masės santykiais.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Dirvožemio ir sliekų ėminiai visų pirma turėtų būti analizuojami iš karto po pašalinimo (t. y. per 1–2 dienas) siekiant užkirsti kelią skaidymuisi ar kitiems nuostoliams ir rekomenduojama apskaičiuoti apytikslį sugerties ir šalinimo greitį vykdant bandymą. Jeigu analizė atidedama, ėminiai turėtų būti laikomi reikiamomis sąlygomis, pvz., užšaldyti (≤ –18 °C).
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Turėtų būti patikrinama, ar cheminės analizės glaudumas ir atkuriamumas bei bandomosios cheminės medžiagos regeneracija iš dirvožemio ir sliekų ėminiai atitinka nustatytam metodui taikomus reikalavimus; ataskaitoje turėtų būti nurodomas šalinimo veiksmingumas, aptikimo riba (LOD) ir kiekybinio nustatymo riba (LOQ). Taip pat turėtų būti patikrinama, ar kontroliniuose induose nėra nustatomos tokios bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, kurios viršytų fono koncentraciją. Jeigu kontrolinės grupės sliekuose bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandomajame organizme Ca yra > 0, šis veiksnys įtraukiamas apskaičiuojant kinetinius parametrus (žr. 2 priedėlį). Atliekant bandymą visi ėminiai turėtų būti tvarkomi taip, kad tarša ir nuostoliai būtų kuo mažesni (pvz., dėl bandomosios cheminės medžiagos įgerties į ėminių ėmimo įtaisą).
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Dirbant su žymėtosiomis bandomosiomis cheminėmis medžiagomis, įmanoma analizuoti pradinę medžiagą ir metabolitus. Po to ėminiai turėtų būti „išvalomi“, kad pradinę bandomąją cheminę medžiagą atskirai būtų įmanoma įvertinti kiekybiškai. Jeigu pavieniai metabolitai analizuojamame (-uose) ėminyje (-iuose) viršija 10 % bendrojo radioaktyvumo, rekomenduojama nustatyti šių metabolitų tapatybę.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Turėtų būti registruojamas ir įtraukiamas į ataskaitą bendrasis regeneravimas ir bandomosios cheminės medžiagos regeneravimas iš sliekų, dirvožemio ir, jeigu naudojamos, gaudyklių su adsorbentais, siekiant sulaikyti išgaravusią bandomąja medžiagą.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Atliekant bandymus su enchitrėjais, kurie yra mažesni negu sliekai, iš atitinkamo bandymo indo paimtus pavienius individus leidžiama sujungti į visumą. Jeigu pasirinkus sujungimą tenka mažinti tapačių indų skaičių, šiuo atveju apribojimas statistinių procedūrų, kurias galima taikyti duomenims, skaičius. Jeigu būtina taikyti specialią statistinę procedūrą ir statistinę galią, atliekant bandymą šiuo atveju turėtų būti naudojamas atitinkamas tapačių bandymo indų skaičius, kad būtų užtikrinamas norimas sujungimas į visumą arba taikoma procedūra ir galia.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Rekomenduojama, kad BAF būtų išreiškiamas kaip bendros sausosios masės funkcija, jeigu reikia (t. y. hidrofobiškų cheminių medžiagų), arba kaip lipidų kiekio funkcija. Turėtų būti taikomi tinkami lipidų kiekio nustatymo metodai (šiam tikslui turėtų būti pritaikomi keli esami metodai, pvz., (31) (58)). Šie metodai – chloroformo ir (arba) metanolio ekstrakcijos metodika. Tačiau siekiant išvengti chlorintų tirpiklių naudojimo reikėtų rinktis modifikuotą Bligh ir Dyer metodą (9) (aprašymas pateiktas (17)). Renkantis skirtingus metodus gali nepavykti nustatyti tapačių verčių, todėl svarbu pateikti išsamią informaciją apie naudotą metodą. Jeigu įmanoma, t. y. jeigu turimas pakankamas slieko audinio kiekis, lipidų analizę geriausia atlikti naudojant tą patį bandinį ar ekstraktą, kuris naudotas analizuojant bandomąją cheminę medžiagą, nes lipidai dažnai turi būti pašalinami iš ekstrakto prieš jį pradedant analizuoti chromatografu (49). Antraip kontrolinius gyvūnus galima naudoti matuojant lipidų kiekį, kuriuo vėliau galima remtis normalizuojant BAF vertes. Pasirinkus pastarąjį metodą sumažinama įrangos tarša bandomąja chemine medžiaga.
                           
                        DUOMENYS IR ATASKAITŲ TEIKIMAS
                  
                     Rezultatų apdorojimas
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Bandomosios cheminės medžiagos sugerties kreivė gaunama aritmetinėje skalėje brėžiant šios cheminės medžiagos koncentraciją sliekuose ir jiems poveikį sugerties tarpsiu darančią koncentraciją atsižvelgiant į jos kitimą laike. Kai kreivė pasiekia kreivės plokščiąją dalį ar nuostoviąją būseną (žr. sąvokų apibrėžtis 1 priedėlyje), biologinio kaupimosi kriterijus nuostovioje būsenoje (BAFss) apskaičiuojamas taip:
                              
                                 
                              Ca yra bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandomajame organizme
                              Ca yra bandomosios cheminės medžiagos koncentracija dirvožemyje
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Jeigu nuostovioji būsena nėra užtikrinama, greičio konstantomis grindžiamas BAFK turėtų būti nustatomas vietoje BAFss kaip aprašyta toliau:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          biologinio kaupimosi kriterijus (BAFK) nustatomas kaip santykis ks/ke,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          sugerties ir šalinimo greitis visų pirmiausiai apskaičiuojami vienu metu (žr. 2 priedėlio 11 lygtį),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          šalinimo greičio konstanta (ke) paprastai apskaičiuojama atsižvelgiant į šalinimo kreivę (t. y. tiriamojo objekto koncentracijos sliekuose kreivę šalinimo tarpsniu); tada šalinimo greičio konstanta ks apskaičiuojama atsižvelgiant į ke ir Ca vertę, kuri gaunama remiantis sugerties kreive, žr. 2 priedėlį, kuriame aprašyti šie metodai; Tinkamiausias BAFK ir greičio konstantų ks ir ke nustatymo metodas – netiesinio parametro įvertinimo metodai naudojant kompiuterį. Jeigu šalinimas akivaizdžiai nėra pirmo laipsnio, šiuo atveju turėtų būti taikomi sudėtingesni modeliai
                                       
                                    
                        
                     Bandymo ataskaita
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukiama ši informacija:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomoji cheminė medžiaga:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bet kokia turima informacija apie bandomosios cheminės medžiagos ūmųjį ar ilgalaikį toksiškumą (pvz., ECx, LCx„ NOEC) dirvožemio sliekams,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      grynumas, fizinis pobūdis, fizinės ir cheminės savybės, pvz., log Kow, tirpumas vandenyje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      cheminės tapatybės nustatymo duomenys, bandomojo objekto šaltinis, bet kokio naudoto tirpiklio tapatybė ir koncentracija,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jeigu naudojama žymėtoji bandomoji cheminė medžiaga, šiuo atveju nurodoma tiksli žymėtųjų atomų padėtis, savitasis radioaktyvumas ir radiocheminis grynumas.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandomųjų rūšių gyvūnai:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mokslinis pavadinimas, veislė, bet koks išankstinis apdorojimas, aklimatizavimas, gyvūnų amžiaus intervalas ir t. t.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Bandymo sąlygos:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudotos bandymo procedūros,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pasirinkto apšvietimo tipas ir charakteristikos bei apšvietimo laikotarpio (ių) trukmė,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandymo planas (pvz., bandymo indų skaičius ir dydis, dirvožemio masė ir dirvožemio sluoksnio storis, tapačių indų skaičius, sliekų skaičius tapačiame inde, bandomųjų koncentracijų skaičius, sugerties ir šalinimo tarpsnių trukmė, ėminių ėmimo dažnumas),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandymo indo medžiagos pasirinkimo pagrindimas,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tiriamojo objekto paruošimo metodas ir naudojimas bei konkretaus metodo pasirinkimo priežastys,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nominaliosios bandymo koncentracijos, išmatuotų verčių vidurkiai ir jų standartiniai nuokrypiai bandymo induose bei šių verčių nustatymo metodai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dirbtinio dirvožemio sudedamųjų dalių šaltinis arba, jeigu naudojama, natūrali terpė, dirvožemio kilmė, bet kokio išankstinio apdorojimo aprašymas, kontrolinių bandinių rezultatai (išgyvenimas, biomasės didėjimas, veisimasis), dirvožemio charakteristikos (pH, bendros organinės anglies kiekis, granuliometrinė sudėtis (procentinė smėlio, nuosėdų ir molio dalis), vandens sulaikymo geba (WHCdidž.) procentinė vandens dalis bandymo pradžioje ir pabaigoje ir bet kokie kiti atlikti matavimai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      išsami informacija apie dirvožemio ir sliekų ėminių apdorojimą, įskaitant duomenis apie ruošimo, sandėliavimo, bandomosios medžiagos įterpimo procedūras, bandomojo objekto sliekuose ir dirvožemyje ekstrakcijos bei analizės procedūras (ir glaudumą) ir lipidų kiekį (jeigu matuojamas) bei bandomojo objekto regeneravimą.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatai:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sliekų iš kontrolinių indų ir sliekų iš kiekvieno bandymo indo gaištamumas bei bet koks pastebėtas neprastas elgesys (pvz., vengimas įsirausti į dirvą, dauginimosi nebuvimas su enchitrėjais atliekant biologinio kaupimosi bandymą),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dirvožemio ir bandomųjų organizmų sausosios masės santykis su šlapiąja mase (naudingas atliekant normalizavimą),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      šlapioji kirmėlių masė kiekvieną kartą imant ėminius; šlapioji sliekų masė bandymo pradžioje ir kiekvieną kartą imant ėminius prieš virškinamojo trakto turinio pašalinimą ir jį pašalinus,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandomųjų organizmų lipidų kiekis (jeigu nustatomas),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      bandomosios cheminės medžiagos sugerties kirmėlėse ir jos šalinimo iš kirmėlių kinetiką ir trukmę iki nuostoviosios būsenos apibūdinančios kreivės,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      visų ėminių ėmimo laiko Ca ir Cs (su standartiniu nuokrypiu ir intervalu, jeigu reikia) (Ca išreiškiama viso kūno sausosios ir šlapiosios masės kg–1, Cs išreiškiama dirvožemio sausosios ir šlapiosios masės kg–1). Jeigu būtinas nuosėdų akumuliacijos faktorius (BSAF) (pvz., siekiant lyginti su skirtingo lipidų kiekio gyvūnais atliktų dviejų ar daugiau bandymų rezultatus), Ca taip pat galima išreikšti organizmo lipidų kiekiu (g kg–1) ir Cs galima išreikšti kaip dirvožemio organinės anglies kiekį (g kg-1),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      BAF (išreikštas kaip dirvožemio kg kirmėlių –1 kg), dirvožemiui poveikio greičio konstanta ks (išreikšta g dirvožemio kg–1 kirmėlių dienų–1) ir šalinimo greičio konstanta (išreikšta diena–1); BSAF (išreikštą kg dirvožemio OC kg–1 kirmėlių lipidų kiekio) galima pateikti papildomai,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      jeigu buvo išmatuota: procentinė dalis dirvožemyje ir bandomuosiuose gyvūnuose aptiktos pradinės cheminės medžiagos, metabolitų ir susijusių liekanų (t. y. bandomosios cheminės medžiagos, kurios neįmanoma ekstrahuoti naudojant įprastus ekstrahavimo metodus, procentinė dalis),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      naudoti duomenų statistinės analizės metodai.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatų įvertinimas:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatų atitiktis 17 pastraipoje išvardytiems validumo kriterijams,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      netikėti ar neįprasti rezultatai, pvz., nevisiškas bandomosios cheminės medžiagos pašalinimas iš bandomųjų gyvūnų.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATŪRA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688–00a.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM International, E1676–04: 26 pp.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation - New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235–276.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93–99.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. SAFEty 25: 154–165.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. SAFEty 31: 185–191.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Bell AW (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1–13.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911–917.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185–196.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida. J. Soils Sediments 3: 13–20.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System. Chemosphere 20: 91–100.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2–29.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., The Netherlands, pp. 555–576.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, ES, Standards, Measurement and Testing Programme.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bachmann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140–145.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH), įsteigiantis Europos cheminių medžiagų agentūrą, iš dalies keičiantis Direktyvą 1999/45/EB bei panaikinantis Tarybos reglamentą (EEB) Nr. 793/93, Komisijos reglamentą (EB) Nr. 1488/94, Tarybos direktyvą 76/769/EEB ir Komisijos direktyvas 91/155/EEB, 93/67/EEB, 93/105/EB bei 2000/21/EB, OL L 396, 2006 12 30, p. 1.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Galima parsisiųsti šiuo adresu: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). SAFEty factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 pp.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195–208.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32: 1897–1905.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29: 1501–1514.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78–84.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225–1231.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099–1105.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701–707.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15–20.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59–81.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              ISO 11268–2 (1998) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Jaenike J (1982). „Eisenia foetida“ is two biological species. Megadrilogica 4: 6–8.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080–2090.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953–961.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767–775.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399–3404.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305–312.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University München, 137 pp.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588–595.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. SAFEty 36: 17–26.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244–1249.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Šio priedo C.8 skyrius. Toksiškumas sliekams.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Šio priedo C.13 skyrius. Biologinis kaupimasis: bandymas su žuvimis pratekėjimo sąlygomis.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Šio priedo C.21 skyrius. Dirvožemio mikroorganizmai: azoto transformacijos bandymas.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Oecd (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287–388.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378–396.
                           
                        
                              56.
                           
                           
                              Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77–81.
                           
                        
                              57.
                           
                           
                              Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida. RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.
                           
                        
                              58.
                           
                           
                              Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431–1436.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp.
                           
                        
                              61.
                           
                           
                              Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105–129.
                           
                        
                              62.
                           
                           
                              Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. SAFEty 27: 107–127.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110–2120.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413–433.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Schmelz R and Collado R (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 57: 93–100.
                           
                        
                              66.
                           
                           
                              Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.
                           
                        
                              67.
                           
                           
                              Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563.
                           
                        
                              68.
                           
                           
                              Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320.
                           
                        
                              69.
                           
                           
                              Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67–81.
                           
                        
                              70.
                           
                           
                              Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167–1171.
                           
                        
                              71.
                           
                           
                              UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.
                           
                        
                              72.
                           
                           
                              US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000.
                           
                        
                              73.
                           
                           
                              Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277–285.
                           
                        
                              74.
                           
                           
                              Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
                           
                        
                              75.
                           
                           
                              Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023–1033.
                           
                        
                              76.
                           
                           
                              Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates. Environmental Pollution 136: 409–417.
                           
                        
                              77.
                           
                           
                              Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161–165.
                           
                        
                              78.
                           
                           
                              Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843–1851.
                           
                        
                              79.
                           
                           
                              Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406.
                           
                        
                     1 priedėlis
                     SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biologinis kaupimasis – bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos padidėjimas organizme ar jo paviršiuje, palyginti su bandomosios cheminės medžiagos koncentracija aplinkinėje terpėje. Biologinį kaupimąsi sukelia biologinės koncentracijos ir su užterštu maistu ar grobiu susijęs bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos organizme didėjimo procesai (žr. toliau).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biologinio kaupimosi koncentracijos didėjimas – su cheminės medžiagos pasisavinimu visų pirmiausiai iš aplinkinės terpės (t. y. per kūno paviršių ir praryjamą dirvožemį) susijęs bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos padidėjimas organizme ar jo paviršiuje, palyginti su bandomosios cheminės koncentracija aplinkinėje terpėje.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Su užterštu maistu ar grobiu susijęs bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos organizme didėjimas – su pasisavinimu iš užteršto maisto ar grobio susijęs bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos padidėjimas organizme ar jo paviršiuje, palyginti su bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos maiste ar grobyje. Dėl su užterštu maistu ar grobiu susijusio bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos organizme didėjimo bandomasis objektas gali būti perduodamas į maisto grandines ar jose kauptis.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Bandomosios cheminės medžiagos šalinimas – šios cheminės medžiagos išskyrimas iš bandomojo organizmo audinio veikliaisiais ar pasyviaisiais procesais, kurie vyksta neatsižvelgiant į bandomojo objekto buvimą ar jo nebuvimą aplinkinėje terpėje
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biologinio kaupimosi kriterijus (BAF) bet kuriuo sugerties tarpsnio metu atliekant šį biologinio kaupimosi bandymą – bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandomajame organizme ar jo paviršiuje ((Ca g·kg-1 kirmėlių sausosios masės), padalinta iš cheminės medžiagos koncentracijos aplinkinėje terpėje (Cs kaip g·kg-1 dirvožemio sausosios masės); BAF vienetas yra dirvožemio kg kirmėlių kg-1).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Nuostoviosios būsenos biologinio kaupimosi kriterijus (BAFss) yra nuostovosios būsenos BAF ir ilgą laiką bent kiek labiau nesikeičia, bandomosios cheminės medžiagos koncentracija aplinkinėje terpėje (Cs kaip g kg-1 dirvožemio sausosios masės) yra pastovus šiuo laikotarpiu.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biologinio kaupimosi kriterijai, apskaičiuoti tiesiogiai naudojantis pasisavinimo iš dirvožemio greičio konstantos ir šalinimo greičio konstantos (ks ir ke, žr. toliau) santykiu, vadinami kinetiniu biologinio kaupimosi kriterijumi (BAFK).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biotos-nuosėdų akumuliacijos kriterijus (BSAF) – pagal į lipidų kiekį normalizuota bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandomajame organizme ar jo paviršiuje, padalyta iš pagal organinę anglį normalizuotos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos dirvožemyje esant nuostoviajai būsenai. Tada Ca yra išreikšta kaip g kg-1 organizmo lipidų kiekio ir Cs išreikšta kaip g kg-1 dirvožemio organinės anglies kiekio; BSAF matuojamas kg OC kg-1 lipidų vienetais.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Nuostovioji būsena yra apibrėžiama kaip sugerties ir šalinimo procesų pusiausvyra, nusistovinti vienu metu per sugerties tarpsnį. Nuostovioji būsena užtikrinama brėžiant BAF kreivę atsižvelgiant į laiką, kai kreivė būna lygiagreti laiko ašiai ir kai trijų viena pa kitos atliktų ėminių, kurie paimti ne trumpesniais negu dviejų dienų intervalais, BAF analizių rezultatai vieni nuo kitų skiriasi ne daugiau negu 20 % ir trims ėminių ėmimo laikotarpiams nebūdingi statistiškai reikšmingi skirtumai. Jeigu naudojamos lėčiau pasisavinamos bandomosios cheminės medžiagos, tinkamesnis būtų septynių dienų intervalas (49).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Organinės anglies ir vandens pasiskirstymo koeficientas (Koc) – cheminės medžiagos koncentracijos dirvožemio organinės anglies dalyje ar prie jos santykis su cheminės medžiagos koncentracija vandenyje esant pusiausvyrai.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficientas (Kow) – n-oktanolio cheminis tirpumas vandenyje esant pusiausvyrai, taip pat kartais išreiškiamas kaip Pow. Kow (log Kow) logaritmas naudojamas apibūdinant vandens organizmų biologinio kaupimo cheminį potencialą.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Pasisavinimo arba sugerties tarpsnis yra laikotarpis, per kurį bandomuosius organizmus veikia bandomoji cheminė medžiaga.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Pasisavinimo iš dirvožemio greičio konstanta (k2) – skaitinė vertė, kuria apibrėžiamas bandomojo objekto koncentracijos didėjimas bandomajame organizme arba jo paviršiuje, kai šį didėjimą sukelia pasisavinimo iš dirvožemio tarpsnis. ks išreiškiamas kaip g dirvožemio kg-1 kirmėlių d-1.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Šalinimo tarpsnis – laikotarpis po bandomųjų organizmų iš užterštos terpės perkėlimo į terpę be bandomojo objekto; šiuo laikotarpiu tiriamas cheminės medžiagos šalinimas (ar grynasis jos kiekio mažėjimas) iš bandomųjų organizmų.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Šalinimo greičio konstanta (ke) – skaitinė vertė, kuria apibrėžiamas bandomojo objekto koncentracijos bandomajame organizme ar jo paviršiuje mažėjimo greitis po to, kai bandomieji organizmai iš terpės su bandomuoju objektu perkeliami į terpę be šios cheminės medžiagos; ke išreiškiamas d-1.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga – bet kokia naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga ar mišinys.
                              
                           
                  
                     2 priedėlis
                     
                        Pasisavinimo ir šalinimo parametrų skaičiavimas
                     
                     Svarbiausias biologinio kaupimosi bandymo rezultatas yra biologinio kaupimosi kriterijus BAF. Išmatuotą BAF galima apskaičiuoti koncentraciją bandomajame organizme Ca dalinant iš koncentracijos dirvožemyje Cs esant nuostoviajai būsenai. Jeigu nuostovioji būsena per sugerties tarpsnį nėra užtikrinama, BAFK apskaičiuojamas pagal greičio konstantas, o ne pagal BAFss. Tačiau pabrėžtina, ar BAF grindžiamas nuostoviosios būsenos koncentracijomis ar negrindžiamas.
                     Kinetinis biologinio kaupimosi kriterijus (BAFK), pasisavinimo iš dirvožemio greičio konstanta (ks) ir šalinimo greičio konstanta (ke) gaunama įprastu būdu, t. y. naudojant kompiuterinius netiesinio parametro apskaičiavimo metodus, pvz., taikant (68) aprašytus modelius. Jeigu duota koncentracijos kitimo laike duomenų aibė ir lygčių modelis
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [1 lygtis]
                              
                           arba
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [2 lygtis]
                              
                           kur:
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 cheminės medžiagos koncentracija kirmėlėse [g kg-1 šlapiosios arba sausosios masės]
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 sugerties greičio konstanta audinyje [g dirvožemio kg-1 kirmėlių d-1]
                              
                           
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 cheminės medžiagos koncentracija dirvožemyje [g kg-1 šlapiosios arba sausosios masės]
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 šalinimo greičio konstanta [d-1]
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 laikotarpis sugerties tarpsnio pabaigoje,
                              
                           taikant šias kompiuterių programas apskaičiuojamos BAFK, ks ir ke vertės.
                     Jeigu nepaveiktų kirmėlių, pvz., nulinę dieną, fono koncentracija gerokai skiriasi nuo nulinės vertės (ši situacija gali susiklostyti, pvz., metalų atžvilgiu, ši fono koncentracija (Ca,0) turėtų būti įtraukta į šias lygtis, kurios įgauna šią formą:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [3 lygtis]
                              
                           ir
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [4 lygtis]
                              
                           Tais atvejais, jeigu sugerties tarpsniu nustatomas didelis bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos sumažėjimas dirvožemyje, galima rinktis šiuos modelius, pvz., (67) (79):
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [5 lygtis]
                              
                           kur:
                     
                                 Cs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 cheminės medžiagos koncentracija dirvožemyje [g kg-1 šlapiosios arba sausosios masės]
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 skilimo greičio dirvožemyje konstanta [d-1]
                              
                           
                                 C0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 pradinė cheminės medžiagos koncentracija dirvožemyje [g kg-1 šlapiosios arba sausosios masės]
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [6 lygtis]
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [7 lygtis]
                              
                           kur:
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 cheminės medžiagos koncentracija kirmėlėse [g kg-1 šlapiosios arba sausosios masės]
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 sugerties greičio konstanta audinyje [g dirvožemio kg-1 kirmėlių d-1]
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 skilimo greičio dirvožemyje konstanta [d-1]
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 šalinimo greičio konstanta [d-1]
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 laikotarpis sugerties tarpsnio pabaigoje.
                              
                           Jeigu nuostovioji būsena užtikrinama per sugerties tarpsnį (t. y. t = ∞), 1 lygtį
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [1 lygtis]
                              
                           galima suprastinti iki:
                     
                        
                     arba
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [8 lygtis]
                              
                           Tada ks/ke x Cs yra arti bandomojo objekto koncentracijos kirmėlės audinyje nuostoviosios būsenos sąlygomis (Ca,ss).
                     Biotos-nuosėdų akumuliacijos kriterijų (BSAF) galima apskaičiuoti taip:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [9 lygtis]
                              
                           kur foc yra dirvožemio organinės anglies dalis ir flip yra kirmėlės lipidų dalis; abi vertės visų pirmiausiai nustatomos pagal iš bandymo paimtus ėminius bei remiantis atitinkamai sausąja arba šlapiąja mase.
                     Šalinimo kinetiką galima modeliuoti naudojantis šalinimo tarpsnio duomenimis ir taikant toliau nurodytą pavyzdinę lygtį ir kompiuterinį ne linijinio parametro apskaičiavimo metodą. Jeigu duomenų taškai brėžiami kaip laiko funkcija ir gaunama bandomojo objekto koncentracijos gyvūnuose tolygi ir proporcinga mažėjimo linija, galima naudoti vieno skyriaus modelį (9 lygtis) siekiant aprašyti šalinimo trukmę.
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [10 lygtis]
                              
                           Šalinimo procesai kartais būna dviejų tarpsnių ir patvirtina greitą Ca vertės mažėjimą pirmuosiuose tarpsniuose; tada bandomųjų objektų netekimas lėtėja vėlesniais šalinimo tarpsniais, pvz., (27) (68). Du tarpsnius galima paaiškinti darant prielaidą, kad organizme yra du skirtingi skyriai, iš kurių bandomasis objektas šalinamas skirtingu greičiu. Šiais atvejais turėtų būti studijuojama speciali literatūra, pvz., (38) (39) (40) (78).
                     Naudojant pirmiau nurodytas pavyzdines lygtis taip pat galima apskaičiuoti kinetinius parametrus (ks ir ke) ir šiuo tikslu visiems sugerties tarpsnio ir šalinimo tarpsnio duomenims tuo pačiu metu taikant pirmojo laipsnio kinetikos modelį. Nuorodos į metodo, kurį taikant šiuo jungtiniu būdu galima apskaičiuoti sugerties greičio ir šalinimo greičio konstantas, aprašymą pateiktos 41), 73) ir 70).
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [11 lygtis]
                              
                           
                                 
                                    Pastaba:
                                 
                              
                              
                                 Kai sugerties ir šalinimo parametrai vienu metu apskaičiuojami remiantis jungtiniais sugerties ir šalinimo duomenimis, 11 lygtyje pateiktasis „m“ yra deskriptorius, kurį naudojant kompiuterio programa atitinkamo tarpsnio duomenų rinkiniams įmanoma priskirti papildomus lygties dėmenis ir teisingai atlikti įvertinimą ((m = 1 naudojamas sugerties tarpsniui; m = 2 naudojamas šalinimo tarpsniui).
                              
                           Vis dėlto šias pavyzdines lygtis reikėtų naudoti apdairiai, ypač tuo atveju, kai atliekant bandymą kinta bandomosios cheminės medžiagos biologinis įsisavinamumas ar (biologinis) skaidymas (žr. pvz., 79)).
                  
                  
                     3 priedėlis
                     DIRVOŽEMIO BIOLOGINIO KAUPIMOSI BANDYMŲ TVARKARAŠČIO PAVYZDŽIAI
                     
                        Bandymas su sliekais
                     
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Sugerties tarpsnis su 8 ėminių ėmimo datomis, naudojamomis apskaičiuojant kinetiką
                                 
                                             Diena
                                          
                                          
                                             Veikla
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             Pasiruošto dirvožemio kondicionavimas 48 val.;
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             Bandomosios cheminės medžiagos įtepimas į dirvožemio dalį; bet kokio tirpiklio garinimas; dirvožemio sudedamųjų dalių maišymas; dirvožemio paskirstymas bandymo indams; pusiausvyros užtikrinimas bandymo sąlygomis 4 dienas (3 savaitės, jeigu į dirvožemį įterpiamas metalas);
                                          
                                       
                                             nuo – 3 iki – 1
                                          
                                          
                                             Bandomųjų organizmų išėmimas iš auginimo kultūros siekiant juos aklimatizuoti; dirvožemio sudedamųjų dalių pasiruošimas ir drėkinimas;
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             Dirvožemio temperatūros ir pH matavimas; dirvožemio ėminių pašalinimas iš paveiktų indų ir tirpiklio kontrolinių ėminių, kad būtų nustatyta bandomosios cheminės medžiagos koncentracija; maisto normos dėjimas; kirmėlių svėrimas ir atsitiktinis paskirstymas po bandymo indus; pakankamų kirmėlių ėminių dalies išlaikymas siekiant nustatyti analizines fono vertes, šlapiąją ir sausąją masę ir lipidų kiekį; visų bandymo indų svėrimas siekiant kontroliuoti dirvožemio drėgmės kiekį; oro tiekimo kontrolė, jeigu naudojama uždaroji bandymo sistema;
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Oro tiekimo kontrolė, kirmėlių elgsenos ir temperatūros registravimas dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas siekiant nustatyti bandomojo objekto koncentraciją;
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną;
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Oro tiekimo, kirmėlių elgsenos ir temperatūros kontrolė;
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną;
                                          
                                       
                                             5–6
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 3 dieną;
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną; maisto normos davimas dirvožemio drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompensuojant išgaravusį vandenį;
                                          
                                       
                                             8–9
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 3 dieną;
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną;
                                          
                                       
                                             11–13
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 3 dieną;
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną; maisto normos davimas dirvožemio drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompensuojant išgaravusį vandenį;
                                          
                                       
                                             15–16
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 3 dieną;
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną;
                                          
                                       
                                             18–20
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 3 dieną;
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną; dirvožemio temperatūros ir pH matavimas; dirvožemio drėgnumo kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus; sugerties tarpsnio pabaiga; kirmėlių perkėlimas iš likusių paveiktų tapačių indų į indus su švariu dirvožemiu šalinimo tarpsniui (virškinamojo trakto turinys nėra šalinamas); dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas iš tirpiklio kontrolinių ėminių.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Veiklos iki poveikio (pusiausvyros nustatymo tarpsnis) turėtų būti planuojamos atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos savybes.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             3 dienoms numatyta veikla turėtų būti vykdoma kasdien (bent darbo dienomis).
                                          
                                       
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Šalinimo tarpsnis
                                 
                                             Diena
                                          
                                          
                                             Veikla
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             Dirvožemio sudedamųjų dalių pasiruošimas ir drėkinimas; pasiruošto dirvožemio kondicionavimas 48 val.;
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             Dirvožemio sudedamųjų dalių maišymas; dirvožemio paskirstymas po bandymo indus; inkubacija bandymo sąlygomis 4 dienas;
                                          
                                       
                                             0 (sugerties tarpsnio pabaiga)
                                          
                                          
                                             Dirvožemio temperatūros ir pH matavimas; svėrimas ir atsitiktinis kirmėlių paskirstymas po bandymo indus; maisto normos įdėjimas; kirmėlių iš likusių paveiktų tapačių indų perkėlimas į indus su švariu dirvožemiu; dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas po 4–6 val. siekiant nustatyti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją;
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Oro tiekimo kontrolė, kirmėlių elgsenos ir temperatūros registravimas; dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas siekiant nustatyti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją;
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną;
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Oro tiekimo, kirmėlių elgsenos ir temperatūros kontrolė;
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną;
                                          
                                       
                                             5–6
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 3 dieną;
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną; maisto normos davimas dirvožemio drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompensuojant išgaravusį vandenį;
                                          
                                       
                                             8–9
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 3 dieną;
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną;
                                          
                                       
                                             11–13
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 3 dieną;
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną; maisto normos davimas dirvožemio drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompensuojant išgaravusį vandenį;
                                          
                                       
                                             15–16
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 3 dieną;
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną;
                                          
                                       
                                             18–20
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 3 dieną;
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną; dirvožemio temperatūros ir pH matavimas; dirvožemio drėgnumo kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus; dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas iš tirpiklio kontrolinių ėminių.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Dirvožemis prieš šalinimo tarpsnį turėtų būti pasiruošiamas taip pat kaip prieš sugerties tarpsnį.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             3 dienoms numatyta veikla turėtų būti vykdoma kasdien (bent darbo dienomis).
                                          
                                       
                           
                        Bandymas su enchitrėjais
                     
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Sugerties tarpsnis su 8 ėminių ėmimo datomis, naudojamomis apskaičiuojant kinetiką
                                 
                                             Diena
                                          
                                          
                                             Veikla
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             Pasiruošto dirvožemio kondicionavimas 48 val.;
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             Bandomosios cheminės medžiagos įtepimas į dirvožemio dalį; bet kokio tirpiklio garinimas; dirvožemio sudedamųjų dalių maišymas; dirvožemio paskirstymas bandymo indams; pusiausvyros užtikrinimas bandymo sąlygomis 4 dienas (3 savaitės, jeigu į dirvožemį įterpiamas metalas);
                                          
                                       
                                             nuo – 3 iki – 1
                                          
                                          
                                             Bandomųjų organizmų išėmimas iš auginimo kultūros siekiant juos aklimatizuoti; dirvožemio sudedamųjų dalių pasiruošimas ir drėkinimas;
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             Dirvožemio temperatūros ir pH matavimas; dirvožemio ėminių pašalinimas iš paveiktų indų ir tirpiklio kontrolinių ėminių, kad būtų nustatyta bandomosios cheminės medžiagos koncentracija; maisto normos dėjimas į dirvožemį; kirmėlių svėrimas ir atsitiktinis paskirstymas po bandymo indus; pakankamų kirmėlių ėminių dalies išlaikymas siekiant nustatyti analizines fono vertes, šlapiąją ir sausąją masę ir lipidų kiekį; visų bandymo indų svėrimas siekiant kontroliuoti dirvožemio drėgmės kiekį; oro tiekimo kontrolė, jeigu naudojama uždaroji bandymo sistema;
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Oro tiekimo kontrolė, kirmėlių elgsenos ir temperatūros registravimas; dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas siekiant nustatyti bandomojo objekto koncentraciją;
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną;
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Oro tiekimo, kirmėlių elgsenos ir temperatūros kontrolė;
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną;
                                          
                                       
                                             5–6
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 3 dieną;
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną; maisto normos davimas į dirvožemį; dirvožemio drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompensuojant išgaravusį vandenį;
                                          
                                       
                                             9
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną;
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 3 dieną;
                                          
                                       
                                             11
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną;
                                          
                                       
                                             12–13
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 3 dieną;
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             Tas pats kaip 1 dieną; maisto normos dėjimas į dirvožemį; dirvožemio temperatūros ir pH matavimas; dirvožemio drėgnumo kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus; sugerties tarpsnio pabaiga; kirmėlių perkėlimas iš likusių paveiktų tapačių indų į indus su švariu dirvožemiu šalinimo tarpsniui (virškinamojo trakto turinys nėra šalinamas); dirvožemio ir kirmėlių ėminių ėmimas iš tirpiklio kontrolinių ėminių.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Veiklos iki poveikio (pusiausvyros nustatymo tarpsnis) turėtų būti planuojamos atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos savybes.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             3 dienoms numatyta veikla turėtų būti vykdoma kasdien (bent darbo dienomis).
                                          
                                       
                           
                  
                     4 priedėlis
                     
                        Dirbtinis dirvožemis. Ruošimo ir sandėliavimo rekomendacijos
                     
                     Natūralūs dirvožemiai apskritus metus iš konkretaus šaltinio gali būti neprieinami ir vietiniai organizmai bei esami mikroteršalai gali daryti įtaką bandymui, todėl atliekant šį bandymą rekomenduojama naudoti šio priedo C.8 skyriuje Toksiškumas sliekams (48) nurodytą dirbtinį substratą, dirbtinį dirvožemį. Kelių rūšių bandomieji gyvūnai gali išgyventi, augti ir daugintis šiame dirvožemyje ir todėl užtikrinamas didžiausias bandymų ir kultūros auginimo sąlygų standartizavimas bei bandymo palyginamumas laboratorijoje ir tarplaboratorinis bandymo palyginamumas.
                     Sudedamosios dirvožemio dalys:
                     
                                 Durpės:
                              
                              
                                 10 %
                              
                              
                                 Kiminų durpės pagal OECD gaires 207 (48);
                              
                           
                                 Kvarcinis smėlis:
                              
                              
                                 70 %
                              
                              
                                 Pramoninis kvarcinis smėlis (džiovintas ore); grūdelių dydis: daugiau negu 50 % kietųjų dalelių turėtų būti 50–200 μm, tačiau visos dalelės turėtų būti ≤ 2 mm;
                              
                           
                                 Kaolinito molis:
                              
                              
                                 20 %
                              
                              
                                 Kaolinito kiekis ≥ 30 %;
                              
                           
                                 Kalcio karbonatas:
                              
                              
                                 ≤ 1 %
                              
                              
                                 CaCO3, milteliai, cheminių atžvilgiu gryni.
                              
                           Dirbtinio dirvožemio organinės anglies kiekį leidžiama sumažinti, pvz., durpių kiekį mažinant iki 4–5 % sauso dirvožemio kiekio ir atitinkamai didinant smėlio kiekį. Taip sumažinus organinės anglies kiekį galima apriboti dirvožemio (organinės anglies) gebą sugerti bandomąją cheminę medžiagą ir todėl galėtų padidėti bandomosios cheminės medžiagos prieinamumas kirmėlėms. Įrodyta, kad Enchytraeus albidus ir Eisenia fetida gali atitikti dauginimuisi taikomus validumo kriterijus, jeigu bandant naudojami lauko dirvožemiai su mažesniu organinės anglies kiekiu, pvz., 2,7 % (33), 61), ir yra patvirtinta patirtimi, kad šį dalyką taip pat galima užtikrinti naudojant dirbtinį dirvožemį su 5 % durpių.
                     
                        Paruošimas
                     
                     Dirvožemio sausosios sudedamosios dalys kruopščiai išmaišomos (pvz., dideliame laboratorijos maišytuve). Jos sumaišomos maždaug prieš savaitę iki bandymo pradžios. Sumaišytos sausosios dirvožemio sudedamosios dalys turėtų būti drėkinamos dejonizuotu vandeniu bent prieš 48 val. iki bandomojo objekto įterpimo siekiant užtikrinti rūgštingumo pusiausvyrą ir (arba) jį stabilizuoti. Nustatant pH vertę naudojamas dirvožemio ir 1 M KCl tirpalas (santykis 1:5). Jeigu pH vertė neatitinka privalomojo intervalo (6,0 ± 0,5), į dirvožemį įterpiamas pakankamas kiekis CaCO3 arba pasiruošiama nauja dirvožemio partija.
                     Dirbtinio dirvožemio didžiausia vandens sulaikymo geba (WHC) nustatoma pagal standartą ISO 11268-2 (35). Bent dvi dienos iki bandymo pradžios sausas dirbtinis dirvožemis yra drėkinamas įpilant reikiamą kiekį dejonizuoto ar regeneruoto vandens siekiant užtikrinti maždaug pusę galutinio vandens kiekio. Galutinis vandens kiekis turėtų būti 40 %–60 % didžiausios vandens sulaikymo gebos. Iš anksto sudrėkintas dirvožemis bandymo pradžioje išskirstomas į tiek dalių, kiek atliekant bandymą numatoma naudoti bandomųjų koncentracijų ir kontrolinių bandinių, bei naudojant bandomojo objekto tirpalą ir (arba) įpilant dejonizuoto arba regeneruoto vandens užtikrinama, kad drėgmės kiekio vertė būtų 40–60 % didžiausios vandens sulaikymo gebos. Drėgmės kiekis nustatomas bandymo pradžioje ir pabaigoje (105 °C temperatūroje). Drėgmės kiekis turėtų kuo geriausiai atitikti tam tikros rūšies gyvūnų reikalavimus (drėgmės kiekį taip pat galima tikrinti taip: dirvožemį nestipriai suspaudus delne, tarp pirštų turi atsirasti vandens lašeliais).
                     
                        Sandėliavimas
                     
                     Drėgnosios dirbtinio dirvožemio sudedamosios dalys iki naudojimo pradžios turi būti laikomos kambario temperatūros sąlygomis. Pasiruoštą, iš anksto sudrėkintą dirvožemį galima lakyti vėsioje vietoje ne ilgiau negu tris dienas iki tiriamojo objekto įterpimo į dirvožemį; būtina pasirūpinti, kad išgaruotų kuo mažesnis vandens kiekis. Dirvožemis su įterptu bandomuoju objektu turėtų būti naudojamas nedelsiant, jeigu neturima informacijos, iš kurios būtų matyti, kad tam tikrą dirvožemį leidžiama laikyti nepadarant jokio poveikio bandomojo subjekto toksiškumui ir biologiniam įsisavinamumui. Po to dirvožemio su įterptu bandomuoju objektu ėminius galima sandėliuoti tam tikram bandomajam objektui rekomenduojamomis sąlygomis, kol bus atliekama analizė.
                  
                  
                     5 priedėlis
                     
                        Atliekant biologinio kaupimosi iš dirvožemio bandymus rekomenduojamos naudoti dugno mažašerių kirmėlių rūšys
                     
                     
                        Sliekai
                     
                     Rekomenduojama bandomoji rūšis yra Eisenia fetida (Savigny 1826), priklausanti Lumbricidae šeimai. Nuo 1972 m. ji skiriama į du porūšius (Eisenia fetida and Eisenia andrei (10)). Pagal Jaenike (36) jos yra iš tikrųjų atskiros rūšys. Eisenia fetida yra lengvai atpažįstami pagal šviečias segmentus jungiančias juosteles, o Eisenia Andrei yra vienalyčiai, tamsiai raudonos spalvos. Jie, ko gero, yra kilę iš Juodosios jūros regiono ir šiandien išplitę po visą pasaulį, ypač žmogaus modifikuotose buveinėse, pvz., komposto krūvose. Abiejų rūšių sliekus galima naudoti atliekant ekotoksikologinius ir biologinio kaupimosi bandymus.
                     
                        Eisenia fetida ir Eisenia andrei galima įsigyti rinkoje, pvz., kaip masalą žuvims. Palyginti su kitų rūšių sliekais, minėtieji gyvena trumpiau, subręsta maždaug per 2–3 mėnesius (kambario temperatūros sąlygomis). Jiems tinkamiausia temperatūra yra maždaug 20–24 °C. Jie mėgsta palyginti drėgnus substratus, kurių pH yra beveik neutralus ir kurių didelę dalį sudaro organinės medžiagos. Šių rūšių gyvūnai jau maždaug 25 metus plačiai naudojami atliekant standartinius ekotoksikologijos bandymus, todėl jų auginimas yra gerai reglamentuotas (48) (77).
                     Abiejų rūšių gyvūnus galima auginti įvairių tipų gyvūninėse atliekose. Standarte ISO (35) rekomenduojama iš arklių ar galvijų mėšlo ir durpių (50:50) paruošta auginimo terpė. Terpės pH vertė turėtų būti maždaug 6–7 (koreguojama naudojant kalcio karbonatą), mažas joninis laidumas (mažesnis negu 6 mS/cm arba mažesnis negu 0,5 % druskos koncentracijos) ir neturėtų būti pernelyg užteršta amoniaku arba gyvūnų šlapimu. Taip pat leidžiama naudoti rinkai pateikiamą sodininkystės dirvožemį be priedų arba dirbtinį dirvožemį pagal OECD (48) ar jų abiejų mišinį santykiu 50:50. Substratas turėtų būti drėgnas, tačiau ne pernelyg. Galima naudoti 10–50 litrų auginimo dėžes.
                     Siekiant gauti standartinio amžiaus ir masės sliekus geriausia juos išsiauginti iš kokonų. Todėl suaugę sliekai sudedami į auginimo dėžę su šviežiu substratu kokonams auginti. Remiantis sukaupta patirtimi galima tvirtinti, kad neblogas auginimo greitis užtikrinamas tuo atveju, kai maždaug 100 suaugusių sliekų laikomi 1 kg substrato (šlapioji masė) Po 28 dienų suaugę sliekai yra pašalinami. Iš kokonų išsiritę sliekai bandymams naudojami subrendę, t. y. ne anksčiau negu po 2 mėnesių, tačiau ne vėliau negu po 12 mėnesių.
                     Minėtų rūšių sliekus galima laikyti sveikais, jeigu jie rausiasi substrate, nemėgina iš jo išsirangyti ir be perstojo dauginasi. Jeigu sliekai šliaužia labai lėtai arba jiems susiformuoja geltonos spalvos užpakalinis galas (turima omenyje (Eisenia fetida), šiuo atveju galima manyti, kad substrato yra per daug. Šiuo atveju rekomenduojama naudoti šviežią substratą ir (arba) dėžėje sumažinti individų skaičių.
                     
                        Papildomos parinktos nuorodos
                     
                     Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1–58.
                     Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1–81.
                     Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
                     Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49–55.
                     Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180–201.
                     Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London, 31: 1–171.
                     Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331–338 pp.
                     
                        Enchitrėjai
                     
                     Rekomenduojamoji rūšis yra Enchytraeus albidus Henle 1837 (baltieji sliekai). Enchytraeus albidus yra viena iš didžiausių (ne didesnės negu 15 mm) Enchytraeidae šeimos mažašerės kirmėlės ir jos išplitusios visame pasaulyje, pvz., (8). Enchytraeus albidus gyvena jūrose, ežeruose ir sausumoje esančiose buveinėse; jos daugiausiai veisiasi pūvančiose organinėse medžiagose (jūros dumbliuose, komposte) ir retai jų pasitaiko pievose (42). Šios kirmėlės veisiasi skirtingoje ekologinėje aplinkoje ir pagal tam tikrus šių kirmėlių sandaros skirtumas galima daryti išvadą, kad gali būti skirtingų šios rūšies porūšių.
                     
                        Enchytraeus albidus tiekiamos rinkai ir parduodamos kaip žuvų pašaras. Privaloma patikrinti, ar kultūra nėra užteršta kitomis, paprastai mažesnių rūšių gyvūnais (60). Jeigu nustatoma tarša, visos kirmėlės turėtų būti nuplaunamos vandeniu Petrio lėkštelėje. Tada naudojant stereomikroskopą išrankiojami suaugę Enchytraeus albidus individai, kurie būtų naudojami pradedant naują auginimą. Visos kitos kirmėlės pašalinamos. Jų gyvenimo ciklas yra trumpas, nes šios kirmėlės subręsta per 33 dienas (18 °C temperatūroje) ir per 74 dienas (12 °C temperatūroje). Atliekant bandymą turėtų būti naudojamos tik tos kultūros, kurios laboratorijoje buvo laikytos ne trumpiau negu 5 savaites (viena karta) ir dėl kurių nekilo jokių sunkumų.
                     Kitos Enchytraeus rūšys taip pat yra tinkamos, visų pirma Enchytraeus luxuriosus. Šios rūšies gyvūnai dažniausiai gyvena dirvožemyje (jų naujas aprašymas pateiktas (65)). Jeigu naudojamos kitos Enchytraeus rūšys, jos turėtų būti aiškiai identifikuojamos ir nurodomos šios rūšies pasirinkimo priežastys.
                     
                        Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) yra rūšis, priklausanti tai pačiai grupei kaip Enchytraeus luxuriosus. Patikimai nenustatyta, kad ji būtų išplitusi laukuose, nes jos aprašymai susiję tik su sliekų auginimu ir komposto krūvomis (Römbke 2003). Todėl jai taikomi pirminiai ekologiniai reikalavimai nėra nustatyti. Tačiau pastaruoju metu atlikus įvairių sričių laboratorinius tyrimus nustatyta, kad šios rūšies kirmėlės prisitaiko prie gana didelių dirvožemio savybių parametrų paklaidų, pvz., pH ir tekstūros (Jänsch ir kt. 2005). Pastaraisiais metais šios rūšies individai dažnai naudoti atliekant ekotoksikologijos tyrimus, nes juos lengva auginti ir patogu naudoti, pvz., Kuperman ir kt. 2003). Tačiau šios kirmėlės yra mažos (3–12 mm; vidutinis dydis 7 mm (Westheide & Müller 1996) ir todėl jas būna sunkiau tvarkyti, jeigu lyginama su Enchytraeus albidus. Jeigu ši rūšis naudojama vietoj Enchytraeus albidus, galima rinktis mažesnį bandymo indą, tačiau šia pasirinktimi nėra privaloma naudotis. Be to, nereikėtų užmiršti, kad šios rūšies individai veisiasi labai greitai, t. y. nauja palikuonių karta išauga greičiau negu per 20 dienų 20 ± 2 °C temperatūros sąlygomis (Achazi ir kt. 1999) ir net greičiau, jeigu auginami aukštesnės temperatūros sąlygomis.
                     
                        Enchytraeus albidus (taip pat kitų Enchytraeus rūšių) rūšies enchitrėjus galima auginti didelės plastiko dėžėse (pvz., 30 × 60 × 10 cm arba 20 × 12 × 8 cm, pritaikytose mažoms kirmėlėms auginti), pripildytose dirbtinio dirvožemio ir rinkai pateikiamo neužteršto sodo dirvožemio be priedų mišinio. Kompostavimo medžiagos nereikėtų rinktis, nes joje gali būti toksiškų cheminių medžiagų, pvz., sunkiųjų metalų. Prieš naudojant auginimo dirvožemį jo gyvūnija turėtų būti pašalinama, t. y. šiuo tikslu jis turėtų būti tris kartus sušaldomas. Taip pat leidžiama naudoti dirbtinį dirvožemį be priemaišų, tačiau šiuo atveju dauginimosi greitis būtų mažesnis, palyginti su tuo greičiu, kuris yra užtikrinamas pasirinkus mišrius substratus. Substrato pH vertė turėtų būti 6,0 ± 0,5. Auginimo kultūra laikoma inkubatoriuje 15 ± 2 °C temperatūroje, be šviesos. Bet kokiu atveju turėtų būti vengiama aukštesnės negu 23 °C temperatūros. Dirbtinis ir (rba) natūralus dirvožemis turėtų būti drėgnas, tačiau ne šlapias. Dirvožemį šiek tiek suspaudus delne turėtų rastis tik nedideli vandens lašeliai. Bet kokiu atveju neturėtų būti sukuriamos bedeguonės sąlygos (pvz., jeigu naudojamas dangtis, jame turi būti pakankamai angų, kad būtų užtikrinama reikiama oro kaita). Auginimo dirvožemis turėtų būti aeruojamas, t. y. atsargiai maišomas kartą per savaitę.
                     Traiškytomis avižomis, kurios beriamos į dirvožemio paviršiaus ertmes ir užberiamos dirvožemiu, kirmėlės turėtų būti šeriamos bent kartą per savaitę be apribojimų. Jeigu ankstesnio šėrimo pašaras dar yra likę dėžėje, duodamo pašaro kiekis turėtų būti atitinkamai koreguojamas. Jeigu likusį pašarą apninka grybelis, pašarą būtina keisti kitu traiškytų avižų kiekiu. Siekiant skatinti dauginimąsi, traiškytas avižas kas dvi savaites galima papildyti rinkai pateikiamais vitaminais papildytais baltymų milteliais. Po trijų mėnesių gyvūnai perkeliami į šviežiai pasiruoštą auginimo ar veisimo substratą. Sandariuose induose laikytinas traiškytas avižas prieš naudojant reikėtų apdoroti autoklave ar pakaitinti, kad būtų išvengta miltų erkių (pvz., Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) ar plėšriųjų erkių (pvz., Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina) sukeliamų infekcijų. Užbaigus dezinfekavimą pašaras turi būti sumalamas taip, kad jį būtų įmanoma lengvai paskleisti dirvožemio paviršiuje. Pašarą taip pat gali atstoti kepimo mielės ar žuvų maistas „TetraMin®“.
                     Apskritai auginimo sąlygos laikomos tinkamomis, jeigu kirmėlės nemėgina išsigauti iš substrato, greitai šliaužti dirvožemiu, kirmėlėse nematyti blizgaus išorinio paviršiaus su prilipusiomis dirvožemio dalelėmis, kirmėlės būna daugiau ar mažiau baltos spalvos ir jeigu galima pamatyti skirtingo amžiaus kirmėlių. Tiesą sakant, kirmėles galima laikyti sveikomis, jeigu jos nuolat dauginasi.
                     
                        Papildomos parinktos nuorodos
                     
                     Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126.
                     Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51–83.
                     Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656.
                     Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607–616.
                     Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488.
                     Westheide W and Graefe U (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267.
                  “
            
         (1)  Ši informacija pateikiama tik naudotojų patogumui. Gali būti naudojamos lygiavertės kompiuterinės programos, jeigu galima įrodyti, kad jas naudojant gaunami tokie pat rezultatai.
      
         (2)  Jeigu nėra informacijos apie lyčių jautrumą, naudojamos abiejų lyčių žiurkės, t. y. kiekvienai koncentracijai naudojama po vieną skirtingos lyties gyvūną. Remiantis turima informacija arba per šį poveikio seansą pastebėjus, kad kurios nors lyties gyvūnai yra jautresni, per tolesnius bandymus kiekvienam koncentracijos lygiui naudojama 10 jautresniosios lyties gyvūnų (kiekvienam koncentracijos ir laiko trukmės deriniui naudojama po du gyvūnus).
      
         (3)  Jeigu taikomas Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008, dujoms, garams ir aerozoliams taikytinos ribinės koncentracijos atitinkamai yra 20 000 ppm, 20 mg/l ir 5 mg/l. Numatant, kad medžiaga yra toksiška, arba atsižvelgiant į orientacinio tyrimo rezultatus, turėtų būti parinktos mažesnės pradinės koncentracijos. Jeigu yra reglamentavimo arba mokslinių reikmių, gali būti taikomos didesnės koncentracijos.
      
         (4)  Būtų geriausia, jeigu kito koncentracijos lygio dozės davimas gyvūnams būtų nukeliamas iki to laiko, kai bus pagrįstai įsitikinta, kad pirmiau dozę gavę gyvūnai išgyveno. Tai tyrimo vadovui suteiktų galimybę pakoreguoti tikslinę koncentraciją ir trukmes, taikytinas per kitą poveikio seansą.
      
         (5)  Mažiausioji dozė (koncentracija × laikas), dėl kurių gyvūnai nugaišo per bandymus taikant pradinę koncentraciją (pirmasis poveikio seansas), bus naudojama kaip orientyras, nustatant kitą koncentracijos ir poveikio trukmės derinį. Paprastai koncentracija mažinama du kartus (1/2L), ir gyvūnai veikiami naujais laiko intervalais, naudojant smulkesnį tinklelį, sudarytą taikant geometrinį poveikio laikotarpių suskirstymą remiantis koeficientu 1,4 (√2; žr. 11 nuorodą), ir šiuos laikotarpius išdėstant apie trukmę, per kurią pirmojo poveikio metu pastebėtas mažiausiasis mirtinas dozės dydis (laikas × koncentracija). Šiame paveiksle (1 paveikslas) per I poveikio seansą gaištamumas pirmą kartą pastebėtas po 15 minučių; todėl per II seansą taikytinos trukmės nustatytos kaip vidurinę trukmę pasirenkant 30 min., t. y. 15, 21, 30, 42 ir 60 minučių. Po dviejų poveikio seansų primygtinai rekomenduojama remiantis duomenimis nubraižyti panašų grafiką, kaip parodyta pirmiau, ir patikrinti, ar koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomybės tiesė sudaro 45 laipsnių kampą (n = 1) arba ar koncentracijos, laiko ir reakcijos tarpusavio priklausomybės tiesė yra nelabai nuožulni (pvz., n = 2) ar nuožulnesnė (pvz., n = 0,8). Pastaraisiais atvejais primygtinai rekomenduojama atitinkamai pakoreguoti toliau taikytinas koncentracijas ir trukmes.
      
         (6)  Tam tikrais atvejais gali reikėti padidinti koncentraciją (2L), taikytiną per naujus laiko intervalus, nustatytus naudojant dar smulkesnį tinklelį, sudarytą taikant geometrinį poveikio laikotarpių suskirstymą remiantis koeficientu 1,4 (√2), ir šiuos laikotarpius išdėstant apie trukmę, per kurią pirmojo poveikio metu pastebėtas mažiausiasis mirtinas koncentracijos lygis. Pageidautina, kad trumpiausia poveikio trukmė būtų ilgesnė kaip 5 minutės; ilgiausia trukmė turėtų neviršyti 8 valandų.
      
         (7)  Atliekant kai kuriuos serumo ir plazmos matavimus, ypač gliukozės, pageidautina, kad gyvūnai naktį negautų pašaro. Pagrindinė tokio poreikio priežastis yra ta, kad dėl padidėjusių nuokrypių, kurių neišvengiamai atsirastų, jeigu gyvūnai būtų šeriami, būtų paslėpti sunkiau pastebimi padariniai ir būtų sunku aiškinti rezultatus. Tačiau, kita vertus, naktį gyvūnams neduodant maisto gali būti padaryta neigiamos įtakos bendrajai gyvūnų medžiagų apykaitai ir, ypač atliekant šėrimo tyrimus, gali būti iškraipytas kasdienis bandomosios cheminės medžiagos poveikis. Jeigu būtų nuspręsta nešerti gyvūnų per naktį, klinikiniai biocheminiai tyrimai turėtų būti atliekami jau atlikus ketvirtosios tyrimo savaitės funkcinius stebėjimus.
      
         (8)  Kadangi dėl ilgo nešėrimo laikotarpio gali atsirasti gliukozės kiekio matavimo skirtumų, lyginant gavusius dozę ir kontrolinius gyvūnus, tyrimo vadovas turėtų nustatyti, ar reikėtų nešerti gyvūnų. Jeigu taikomas nešėrimo laikotarpis, jis turėtų būti pritaikytas naudojamai rūšiai; žiurkėms turėtų būti taikomas 16 val. laikotarpis (nešėrimas per naktį). Gliukozės kiekis nešeriamų gyvūnų organizme gali būti nustatomas po nešėrimo per naktį paskutiniąją poveikio savaitę arba po nešėrimo per naktį prieš skrodimą (pastaruoju atveju – kartu su visais kitais patologijos parametrais).
      
         (9)  Kadangi dėl ilgo nešėrimo laikotarpio gali atsirasti gliukozės kiekio matavimo skirtumų, lyginant gavusius dozę ir kontrolinius gyvūnus, tyrimo vadovas turėtų nustatyti, ar reikėtų nešerti gyvūnų. Jeigu taikomas nešėrimo laikotarpis, jis turėtų būti pritaikytas naudojamai rūšiai; žiurkėms turėtų būti taikomas 16 val. laikotarpis (nešėrimas per naktį). Gliukozės kiekis nešeriamų gyvūnų organizme gali būti nustatomas po nešėrimo per naktį paskutiniąją poveikio savaitę arba po nešėrimo per naktį prieš skrodimą (pastaruoju atveju – kartu su visais kitais patologijos parametrais).
      
         (10)  Atliekant kai kuriuos serumo ir plazmos matavimus, ypač gliukozės, pageidautina, kad gyvūnai per naktį negautų pašaro. Pagrindinė tokio poreikio priežastis yra ta, kad dėl padidėjusių nuokrypių, kurių neišvengiamai atsirastų, jeigu gyvūnai būtų šeriami, būtų paslėpti sunkiau pastebimi padariniai ir būtų sunku aiškinti rezultatus. Tačiau reikėtų atkreipti dėmesį, kad per naktį gyvūnams neduodant maisto gali būti padaryta neigiamos įtakos bendrajai gyvūnų medžiagų apykaitai ir, ypač atliekant šėrimo tyrimus, gali būti iškraipytas kasdienis bandomosios cheminės medžiagos poveikis. Visi gyvūnai turėtų būti tiriami tokios pat fiziologinės būklės, todėl pageidautina, kad išsamūs arba neurologiniai tyrimai turėtų būti numatyti kitai dienai nei klinikinės biochemijos tyrimams skirtų ėminių ėmimas.
      
         (11)  Ėsdinimas galėtų būti vertinamas remiantis ekspertų nuomone, grindžiama tokiais įrodymais: patirtimi su žmonėmis ir gyvūnais, esamais (in vitro) duomenimis, pvz., šio priedo B.40 skyriumi (10) ir B.40 bis skyriumi (11) arba OECD TG 435 (12), pH vertėmis, informacija apie panašias chemines medžiagas arba kitais susijusiais duomenimis.
      
         (12)  Toliau pateiktose lentelėse pateiktos nuorodos į visuotinai suderintą cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistemą (angl. GHS). ES atitikmuo – Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008. Reglamentu (EB) Nr. 1272/2008 (9) nereglamentuojamas 5 kategorijos cheminių medžiagų ūmus toksiškumas įkvėpus.
      
         (13)  Toliau pateiktose lentelėse pateiktos nuorodos į visuotinai suderintą cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistemą (angl. GHS). ES atitikmuo – Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008. Reglamentu (EB) Nr. 1272/2008 (9) nereglamentuojamas 5 kategorijos cheminių medžiagų ūmus toksiškumas įkvėpus.
      
         (14)  Toliau pateiktose lentelėse pateiktos nuorodos į visuotinai suderintą cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistemą (angl. GHS). ES atitikmuo – Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008. Reglamentu (EB) Nr. 1272/2008 (9) nereglamentuojamas 5 kategorijos cheminių medžiagų ūmus toksiškumas įkvėpus.
      
         (15)  Šios medžiagos skiriasi M4 ir M7 kaip pirmiau nurodyta.
      
         (16)  Šie tirpalai ruošiami atskirai, tada sumaišomi ir nedelsiant apdorojami autoklave.
      
         (17)  Tačiau jeigu galima daryti prielaidą, kad vandens kietumo jonai gali sąveikauti su bandomąja chemine medžiaga, turėtų būti naudojamas mažesnio kietumo vanduo (vadinasi, šiuo atveju neleidžiama rinktis Elendt Medium M4).
      
         (18)  Šios medžiagos skiriasi M4 ir M7 kaip pirmiau nurodyta.
      
         (19)  Šie tirpalai ruošiami atskirai, tada sumaišomi ir nedelsiant apdorojami autoklave.
      
         (20)  Tačiau jeigu galima daryti prielaidą, kad vandens kietumo jonai gali sąveikauti su bandomąja chemine medžiaga, turėtų būti naudojamas mažesnio kietumo vanduo (vadinasi, šiuo atveju neleidžiama rinktis Elendt Medium M4).
      
         (21)  SiO2 buvo įdėta siekiant neutralizuoti toksiškumą.
      
         (22)  Skaidymo FC induose, kuriuose yra etaloninė cheminė medžiaga, procentinė dalis.
      
         (23)  Procentinė skaidymo dalis FI induose.