CELEX: 31991D0180
Language: pt
Date: 1991-02-14 00:00:00
Title: 91/180/CEE: Decisão da Comissão, de 14 de Fevereiro de 1991, que adopta determinados métodos de análise e testes para o leite cru e o leite tratado termicamente

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31991D0180

91/180/CEE: Decisão da Comissão, de 14 de Fevereiro de 1991, que adopta determinados métodos de análise e testes para o leite cru e o leite tratado termicamente  

Jornal Oficial nº L 093 de 13/04/1991 p. 0001 - 0048 Edição especial finlandesa: Capítulo 3 Fascículo 37 p. 0012  Edição especial sueca: Capítulo 3 Fascículo 37 p. 0012 

DECISÃO DA COMISSÃO de 14 de Fevereiro de 1991 que adopta determinados métodos de análise e testes para o leite cru e o leite tratado termicamente (91/180/CEE) A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,  Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,  Tendo em conta a Directiva 85/397/CEE do Conselho, de 5 Agosto de 1985, relativa aos problemas sanitários e de polícia sanitária no comércio intracomunitário de leite tratado termicamente (1), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva  89/662/CEE (2), e, nomeadamente, o no. 2 do seu artigo 10º.,  Considerando que, de acordo como o no. 2 do artigo 10º.da Directiva 85/397/CEE, a Comissão adopta os métodos de análise e os testes a utilizar para controlar a observância das normas relativas ao leite cru e ao leite tratado termicamente;  Considerando que, para o leite cru, é necessário adoptar, nomeadamente, métodos que permitam determinar o teor de germes, o teor de células, o ponto de congelação e a presença de antibióticos;  Considerando que, para o leite pasteurizado, é necessário adoptar, nomeadamente, métodos que permitam verificar a ausência de germes patogénicos, o número de coliformes, o teor de germes, a ausência de fosfatase, a presença de peroxidase, a ausência de  antibióticos e o ponto de congelação;  Considerando que, para o leite esterilizado e o leite «ultra alta temperatura» (UHT), é necessário adoptar, nomeadamente, métodos que permitam determinar o teor de germes e verificar a ausência de antibióticos;  Considerando que, por razões técnicas, é conveniente, numa primeira etapa, adoptar métodos de análise de referência e testes de referência para assegurar a observância de determinadas normas; que, em especial, é necessário prosseguir o exame das  condições de utilização dos métodos de rotina, métodos de análise e testes; que, enquanto se aguarda o resultado desse exame, incumbe às autoridades competentes velar por que sejam utilizados métodos de rotina adequados para efeitos de observância das  normas da Directiva 85//397/CEE;   Considerando que a definição dos métodos de análise de referência e dos testes compreende o estabelecimento dos processos de análise e a fixação de critérios de fidelidade para assegurar uma interpretação uniforme dos resultados;  Considerando que a presente decisão esta em conformidade com o parecer do Comité Veterinário Permanente,  ADOPTOU A PRESENTE DECISÃO:  Artigo 1º. Os processos da análise de referência e os testes de referência para o leite cru são os seguintes:  - determinação do ponto de congelação,  - contagem dos microrganismos-teor em germes a 30 gC,  - contagem das células somáticas,  - detecção de antibióticos e sulfamidas.  Artigo 2º. Os processos de análise de referência e os testes de referência para o leite pasteurizado são os seguintes:  - determinação do ponto de congelação,  - determinação da actividade fosfatásica,  - determinação da actividade peroxidásica,  - contagem dos microrganismos-teor de germes a 30 gC,  - contagem dos microrganismos-teor de germes a 21 gC,  - contagem dos coliformes - contagem das colónias a 30 gC,  - detecção de antibióticos e sulfamidas,  - detecção de microrganismos patogénicos.  Artigo 3º. Os processos de análise de referência e os testes de referência para o leite UHT e o leite esterilizado são os seguintes:  - determinação do ponto de congelação,  - contagem dos microrganismos-teor de germes a 30 gC,  - detecção de antibióticos e sulfamidas.  Artigo 4º. Os processos de análise de referência e os testes de referência, a aplicação dos critérios de fidelidade e a colheita de amostras devem ser efectuados de acordo com as regras fixadas no anexo 1.  Artigo 5º. Os processos de análise de referência e os testes de referência mencionados nos artigos 1º., 2º., 3º.são descritos no anexo 2.  Artigo 6º. A presente decisão será reexaminada antes de 31 de Dezembro de 1992, para se ter em conta a evolução dos conhecimentos científicos e técnicos.  Artigo 7º. Os Estados-membros são os destinatários da presente decisão. Feito em Bruxelas, em 14 de Fevereiro de 1991. Pela Comissão Ray MAC SHARRY Membro da Comissão (1) JO nº L 226 de 24. 8. 1985, p. 13.(2)  JO nº L 395 de 30. 12. 1989, p. 13.   ANEXO I     SUMÁRIO  Página II.  Disposições gerais .  4 II.  Amostragem do leite cru e do leite tratado termicamente .  6 I. DISPOSIÇÕES GERAIS  1.  Introdução As disposições gerais dizem respeito aos reagentes, ao material, à expressão dos resultados, aos critérios de fidelidade e aos relatórios de análise. As autoridades competentes dos Estados-membros e os laboratórios encarregados da colheita de amostras e  das análises do leite devem respeitar estas disposições.  2.  Reagentes 2.1.  Água 2.1.1.  Salvo indicação em contrário, a água utilizada para as operações de solução, diluição ou lavagem deve obrigatoriamente ser água destilada, água desionizada ou água desmineralizada de pureza pelo menos equivalente. Para as análises microbiológicas, a  água deve ser isenta de substâncias susceptíveis de afectar ou influenciar o crescimento de microrganismos nas condições de ensaio descritas.  2.1.2.  Desde que não sejam acompanhadas por nenhuma outra indicação, entende-se por «solução» e «diluição», respectivamente, «solução em água» e «diluição com água».  2.2.  Produtos químicos Salvo indicação em contrário, todos os produtos químicos utilizados devem ser de qualidade analítica reconhecida.  3.  Material 3.1.  Lista de material As listas do material relativas aos diferentes processos de referência dizem respeito ao material a utilizar para fins específicos e que apresente características específicas.  3.2.  Balança analítica Por balança entende-se uma balança capaz de pesar com uma precisão de 0,1 mg.  4.  Expressão dos resultados 4.1.  Resultados Salvo indicação em contrário, os resultados que constam do relatório de análise devem ser a média aritmética de dois ensaios que respeitem o critério da repetibilidade (5.1) fixado para o método em questão. Se o critério de repetibilidade não for  satisfeito, o ensaio deve ser repetido, na medida do possível, ou o resultado não pode ser considerando válido.  4.2.  Cálculo da percentagem Salvo indicação em contrário, o resultado deve ser calculado em percentagem, em massa, da amostra.  5.  Critérios de fidelidade: repetibilidade e reprodutibilidade 5.1.  Os critérios de fidelidade apresentados para cada processo definem-se do seguinte modo:  5.1.1.  A repetibilidade (r) é o valor abaixo do qual se situa o valor absoluto da diferença entre dois resultados individuais obtidos pelo mesmo processo, com um produto idêntico e nas mesmas condições (o mesmo operador, os mesmos aparelhos, o mesmo  laboratório e curto intervalo de tempo).  5.1.2.  A reprodutibilidade (R) é o valor abaixo do qual se situa o valor absoluto da diferença entre dois resultados individuais obtidos pelo mesmo processo, com um produto idêntico e em condições diferentes (operadores diferentes, aparelhos diferentes,  laboratórios diferentes e/ou diferentes intervalos de tempo).  5.1.3.  Salvo indicação em contrário, os valores de repetibilidade e de reprodutibilidade que constam dos pontos adequados de cada processo são estabelecidos para um intervalo de confiança de 95 %, conforme definido na norma ISO 5725: segunda edição, 1986. São  calculados a partir dos resultados de ensaios circulares reconhecidos, utilizados para avaliar os processos. No entanto, para alguns dos processos, não foram feitos ensaios circulares. Neste caso, os valores de repetibilidade e de reprodutibilidade são  valores estimados.  5.1.4.  Os ensaios circulares e os estudos referidos no número 5.1.3 devem ser planificados e realizados em conformidade com as orientações internacionais.  6.  Relatório de análise O relatório de análise deve especificar o processo utilizado e os resultados obtidos. Deve, além disso, indicar todos os pormenores do processo utilizado que não estejam especificados no processo de análise ou que sejam opcionais, bem como quaisquer  circunstâncias que tenham podido influenciar os resultados. O relatório de análise deve fornecer todas as informações necessárias à identificação completa da amostra.  II. AMOSTRAGEM DO LEITE CRU E DO LEITE TRATADO TERMICAMENTE  1.  Objectivo e domínio de aplicação A presente norma descreve o processo de referência de amostragem do leite cru e do leite tratado termicamente. Esta última norma, tal como os processos de transporte e de conservação das amostras, aplica-se tanto ao leite cru entregue pelos produtores  como ao leite cru e ao leite tratado termicamente conservados nos depósitos-cisterna e nas cisternas de transporte.  Os processos referidos nos pontos 2, 4.4, 5 e 6 aplicam-se à amostragem do leite tratado termicamente e que se destina ao consumo directo.  2.  Considerações de ordem geral A amostragem do leite cru e do leite tratado termicamente contidos em bilhas, cisternas, etc., deve ser efectuada por um operador autorizado, que tenha recebido uma formação adequada antes de proceder à amostragem.  Se tal for considerado necessário, as autoridades competentes ou o laboratório de análise ensinarão as técnicas de amostragem ao pessoal dela encarregado, a fim de garantir que a amostra é representativa e está em conformidade com o conjunto do lote.  Se tal for considerado necessário, as autoridades competentes ou o laboratório de análise dará ao pessoal encarregado da colheita de amostras instruções relativas à marcação da amostra, para assegurar a sua identificação.  3.  Equipamento destinado à colheita de amostras 3.1.  Generalidades O equipamento para a colheita de amostras deve ser de aço inoxidável ou de qualquer outro material adequado que tenha a resistência necessária, devendo ter sido concebido em função da utilização prevista (mistura, colheita de amostras, etc.). Os  agitadores manuais ou mecânicos para a mistura dos líquidos nos recipientes devem ter uma área suficiente para permitir misturar adequadamente o produto sem permitir que desenvolva um sabor a ranço. As conchas utilizadas na colheita de amostras devem  ter um cabo sólido, com um comprimento suficiente para permitir colher amostras á profundidade desejada no recipiente. A capacidade da concha deve ser de, pelo menos, 50 ml.  Os recipientes para as amostras, bem como as respectivas tampas, devem ser de vidro, metal ou material plástico adequado.  As matérias utilizadas no fabrico do material destinado à colheita de amostras (incluindo os recipientes e tampas) não devem provocar nenhuma alteração da amostra susceptível de afectar os resultados das análises. O material e os recipientes destinados  às amostras devem ter uma superfície limpa, seca, lisa e sem fendas, bem como arestas boleadas.  3.2.  Material destinado à colheita de amostras para análise microbiológica O material destinado à colheita de amostras (recipientes incluídos) deve respeitar o disposto no ponto 3.1 e ser esterilizado.  Quando o mesmo material for utilizado repetidas vezes, deve ser limpo e esterilizado após cada colheita, em conformidade com as instruções ou exigências do laboratório de análise ou da autoridade competente, de modo a não afectar os resultados das  sucessivas análises.  4.  Técnica de amostragem 4.1.  Generalidades Independentemente da análise a efectuar, e antes do amostragem, o leite deve ser convenientemente misturado por um meio manual ou mecânico.  A amostra deve ser colhida imediatamente após a mistura, quando o leite ainda está em movimento.  Quando são colhidas simultaneamente várias amostras de leite em cisternas para a realização de diferentes ensaios, a amostra destinada à análise microbiológica deve ser colhida em primeiro lugar.  O volume da amostra deve estar relacionado com as exigências da análise. A capacidade dos recipientes utilizados deve ser tal que estes fiquem quase completamente cheios com a amostra, permitindo simultaneamente uma boa mistura do conteúdo antes da  análise, mas evitando que, durante o transporte, haja alteração do estado físico da gordura.  4.2.  Amostragem manual 4.2.1.  Colheita em baldes e bilhas Para obter rapidamente a agitação desejada, mexer o agitador de cima para baixo no balde ou bilha, assegurando que há uma mistura adequada do leite e que a nata não adere ao bordo da bilha. Colher uma amostra representativa do lote no seu conjunto, de  acordo com o ponto 4.2.4.  4.2.2.  Colheita nos depósitos de refrigeração instalados nas explorações agro-pecuárias Agitar mecânica ou manualmente o leite até que seja obtida uma homogeneidade suficiente.  Agitar manualmente, se o volume do leite não permitir a utilização de um agitador mecânico.  4.2.3.  Colheita no recipiente de pesagem É essencial que, ao ser vazado no recipiente de pesagem, o leite seja bem misturado. Pode ser necessário completar a mistura por meio de uma agitação manual ou mecânica, a fim de se obter uma distribuição homogénea da matéria gorda. Quando o volume do  lote a amostrar ultrapassar a capacidade do recipiente de medida, dever-se-á colher uma amostra representativa da totalidade do lote, de acordo com o ponto 4.2.4.  4.2.4.  Amostragem de um lote dividido Quando a quantidade de leite a amostrar se encontra repartida por vários recipientes, deve ser colhida uma quantidade representativa em cada recipiente e anotada a quantidade de leite a que corresponde cada amostra. A menos que as amostras provenientes  de cada recipiente devam ser separadamente submetidas a análise, misturar porções dessas quantidades representativas à quantidade que se encontra no recipiente em que cada amostra foi colhida. Depois de misturar, colher uma (ou várias) amostra(s) destas  quantidades proporcionais.  4.2.5.  Colheita em grandes recipientes: depósitos-cisterna, camiões-cisterna e vagões-cisterna 4.2.5.1.  Antes de se proceder à amostragem, misturar o leite utilizando um método adequado.  Para misturar o conteúdo dos grandes recipientes, dos depósitos-cisterna, dos camiões-cisterna ou dos vagões-cisterna, aconselha-se a agitação mecânica (4.2.5.2).  O tempo de mistura depende do período durante o qual o leite esteve em repouso. Deve-se garantir que o processo de mistura utilizado em cada caso particular é adequado às exigências da análise que se pretende efectuar. A eficácia com que a mistura é  realizada afecta consideravelmente a comparabilidade dos resultados das análises efectuadas em amostras colhidas, seja em diferentes zonas do lote, seja à saída do depósito a intervalos regulares durante o seu esvaziamento. A forma de mistura do leite  (leite cru ou leite inteiro) é eficaz se a diferença do teor de matéria gorda entre duas amostras colhidas nestas condições for inferior a 0,1 %.  Num grande recipiente que tenha uma saída de descarga na parte inferior pode haver, no ponto de descarga, uma pequena quantidade de leite não representativa do conteúdo no seu conjunto, mesmo após ter sido efectuada a mistura. Por esta razão, é  preferível colher as amostras através de uma abertura «porta de homem». No caso de as amostras serem colhidas na saída de descarga, é conveniente deixar escoar uma quantidade de leite suficiente para garantir a representatividade das amostras.  4.2.5.2.  A mistura do conteúdo dos grandes recipientes ou dos depósitos-cisterna dos camiões-cisterna e dos vagões-cisterna pode ser efectuada:  - por meio de um agitador mecânico colocado no reservatório e accionado por um motor eléctrico,  - por meio de uma hélice ou de um agitador accionado por um motor eléctrico e colocado na abertura «porta de homem», estando o agitador mergulhado no leite,  - no caso dos camiões ou vagões-cisterna, por reciclagem do leite na mangueira de transferência ligada à bomba e introduzida na abertura «porta de homem»,  - por meio de ar comprimido filtrado e limpo. O ar deve ser utilizado com uma pressão e um volume mínimos, a fim de impedir que se desenvolva um sabor a ranço.  4.3.  Amostragem automática ou semi-automática Para colher as amostras do leite cru entregue pelos produtores pode utilizar-se um equipamento de colheita automático ou semi-automático, de acordo com as instruções dadas pelo laboratório encarregado da análise ou por outra autoridade competente.  Este equipamento deve ser sujeito às verificações prescritas pela autoridade responsável antes da sua primeira utilização e, posteriormente, a intervalos regulares. A adequação das técnicas de amostragem deve ser verificada para se poder estabelecer:  - o volume mínimo de leite colhido que pode ser convenientemente amostrado,  - a proporção de eventuais adições (relacionadas com o volume mínimo recolhido),  - a capacidade de proporcionar uma amostra representativa do conjunto após uma agitação adequada.  Para utilização de um equipamento automático ou semi-automático, a autoridade nacional competente pode definir:  - o volume mínimo de leite a partir do qual podem ser colhidas as amostras,  - o volume mínimo da amostra,  - a quantidade máxima de outros líquidos adicionados,  - as análises que podem ser realizadas ou as precauções a tomar.  4.4.  Amostragem do leite tratado termicamente destinado ao consumo directo e acondicionado para venda a retalho Quanto ao leite tratado termicamente destinado ao consumo directo e acondicionado em embalagens para a venda a retalho, as amostras são obrigatoriamente compostas pela embalagem intacta e não aberta. As amostras devem, se possível, ser colhidas aquando  do acondicionamento ou na câmara frigorífica do estabelecimento de tratamento, logo que possível após a transformação (para o leite pasteurizado, no próprio dia da transformação).  É conveniente colher, para cada tipo de leite tratado termicamente (pasteurizado, UHT e esterilizado), o número de amostras correspondente ao número de análises a efectuar, de acordo com as indicações dadas pelo laboratório encarregado da análise ou por  qualquer outra autoridade competente.  5.  Identificação da amostra Deve ser atribuída à amostra (ver ponto 2) um código de identificação que permita a sua rápida identificação de acordo com as indicações dadas pelo laboratório responsável pela análise ou pela autoridade competente.  6.  Transporte e armazenagem das amostras O laboratório responsável pelas análises prepara, em concordância com a autoridade nacional competente, instruções relativas aos prazos e condições de transporte e de armazenagem a respeitar entre a colheita das amostras e a sua análise, em função do  tipo de leite e do processo de análise a utilizar. As instruções devem estipular o seguinte:  - durante o transporte e a armazenagem devem ser tomadas precauções para isolar a amostra de qualquer odor indesejável e da luz directa do sol. Se o recipiente utilizado para as amostras for transparente, deve ser guardado ao abrigo da luz,  - as amostras de leite cru destinadas às análises microbiológicas devem ser transportadas e conservadas a uma temperatura situada entre 0 e 4 gC. O período que medeia entre a colheita e a análise deve ser tão curto quanto possível e não pode, em caso  algum, ultrapassar as 36 horas. A autoridade competente pode aceitar que a temperatura de conservação esteja compreendida entre 0 e 6 gC, desde que o prazo referido não exceda as 24 horas,  - as amostras de leite pasteurizado destinadas às análises microbiológicas devem ser transportadas e conservadas a uma temperatura situada entre 0 e 4 gC. O período que medeia entre a colheita e a análise deve ser tão curto quanto possível, não podendo,  em caso algum, ultrapassar 24 horas,  - as amostras de leites nem crus nem pasteurizados, destinadas às análises microbiológicas, devem ser conservadas por refrigeração no laboratório e o período que medeia entre a colheita e a análise deve ser tão curto quanto possível.  As precauções especiais a tomar para determinadas análises são indicadas na descrição dos diversos processos utilizáveis.   Anexo II     SUMÁRIO  Página I.  Determinação do ponto de congelação .  10 II.  Determinação da actividade fosfatásica .  16 III.  Determinação da actividade peroxidásica .  19 IV.  Enumeração de microrganismos - Ensaio de contagem em placa a 30 oC .  20 V.  Enumeração de microrganismos - Ensaio de contagem em placa a 21 oC .  25 VI.  Enumeração de coliformes - Método da contagem de colónias a 30 oC .  29 VII.  Enumeração de células somáticas .  33 VIII.  Detecção de antibióticos e de sulfamidas .  39 IX.  Detecção de microrganismos patogénicos .  48 I. DETERMINAÇÃO DO PONTO DE CONGELACAO  1.  Objectivo e domínio de aplicação No presente capítulo descreve-se o processo de referência para a determinação do ponto de congelação do leite cru, inteiro, pasteurizado, «ultra alta temperatura» (UHT) ou esterilizado, desnatado ou parcialmente desnatado, utilizando um aparelho  (crioscópio com sonda térmica) no qual o banho controlado por termostato é arrefecido por refrigeração eléctrica, sendo o termómetro de mercúrio em vidro substituído por uma sonda térmica.  Há dois tipos de instrumentos. O primeiro permite determinar o ponto de congelação máximo no «patamar» da curva de congelação, ao passo que o segundo, por razões comerciais, está regulado de modo a efectuar a leitura num momento determinado após o  início da congelação. Uma vez que as curvas de congelação podem variar não só de um leite para o outro mas também entre o leite e as soluções-padrão utilizadas para a calibração, este processo de referência requer a utilização de instrumentos de  pesquisa do patamar. Os instrumentos de tempo fixo podem ser utilizados no caso das análises de rotina para a triagem de leite.  O ponto de congelação pode ser utilizado para avaliar a proporção de água adicionada ao leite, desde que a acidez da amostra não ultrapasse 0,18 g de ácido láctico por 100 ml (ver 7.4).  2.  Definição Ponto de congelação do leite: é o valor médio obtido de acordo com o processo descrito e expresso em graus Celsius (gC).  3.  Princípio Arrefecimento de uma amostra de ensaio até à temperatura adequada, em função do aparelho utilizado e indução da cristalização por vibração mecânica, originando uma elevação rápida da temperatura até um patamar correspondente ao ponto de congelação da  amostra.  O aparelho é calibrado de modo a proporcionar leituras correctas para as duas soluções-padrão, utilizando um procedimento idêntico ao praticado com as amostras de leite. Nestas condições, o patamar corresponde ao ponto de congelação do leite, em graus  Celsius.  4.  Aparelhos e utensílios de vidro Material corrente de laboratório, em especial:  4.1.  Crioscópio O crioscópio consiste num banho de arrefecimento controlado por termóstato, sonda térmica (um termómetro de resistência semi-condutora) com circuito associado e galvanómetro ou «mostrador», agitador da amostra, dispositivo para iniciar a congelação e  tubos de amostra.  4.1.1.  Banho de arrefecimento Podem ser utilizados dois tipos de banho de arrefecimento.  4.1.1.1.  Tipo imersão Este tipo consiste num banho perfeitamente isolado contendo um líquido de arrefecimento adequado, agitado de tal modo que a diferença de temperatura entre dois pontos no líquido não exceda 0,2 gC. A temperatura do líquido não deve variar mais do que p  0,5 gC em torno do valor nominal especificado pelo fabricante.  É importante que o líquido no banho de arrefecimento seja mantido a um nível constante. Toda a superfície do tubo de amostra abaixo da marca de volume deve ser coberta pelo líquido de arrefecimento.  4.1.1.2.  Tipo circulação Uma corrente contínua de líquido de arrefecimento adequado circula em torno do tubo de amostra. A temperatura do líquido não deve variar mais do que p 0,5 gC em torno do valor nominal especificado pelo fabricante.  Um dos líquidos de arrefecimento adequados é constituído por uma solução aquosa a 33 % (v/v) de etano-1,2-diol (etilenoglicol).  4.1.2.  Sonda térmica e circuito associado A sonda térmica deve ser do tipo sonda de vidro, de diâmetro não superior a 1,80 p 0,2 mm e com um diâmetro condutor não superior a 0,31 mm. A constante de tempo da sonda deve ser inferior a 2 segundos e o valor de v (ver nota) deve ser elevado. A  tensão de trabalho utilizada, a corrente e a constante de dissipação devem ser tais que a temperatura da sonda não varie mais do que 0,0005 gC na vizinhança de -0,512 gC. A tolerância máxima da resistência deve ser de p 5 %.  Quando a sonda estiver na sua posição de trabalho no crioscópio, a extremidade da esfera de vidro deve estar no eixo do tubo da amostra e num ponto 44,6 p 0,1 mm abaixo do topo do tubo (ver figura na página 15). Deve existir um suporte para permitir ao  utilizador colocar a sonda nessa posição.  Nota v define as características de resistência-temperatura da sonda térmica de acordo com a forrmula:  -  d R  ×  R  =  T 2  ,  - d R d T × 1 R =v T2  em que T representa a temperatura em graus Kelvin,  R representa a resistência em ohms à temperatura T,  -  d R  ×  R  representa o coeficiente de temperatura,  - d R d T × 1 R  representa o coeficiente de temperatura,  v é uma constante que depende do material utilizado para construir a sonda térmica. Na prática corrente recomenda-se um valor superior a 3 000.  4.1.3.  Dispositivo de medição e de leitura 4.1.3.1.  Princípio de medição O aparelho utilizado deve funcionar com base no princípio da pesquisa do primeiro «patamar» na curva do ponto de congelação. O patamar é a parte da curva na qual a temperatura permanece constante a p 0,002 gC durante um mínimo de 20 segundos.  4.1.3.2.  Operação manual A resistência da sonda deve ser equilibrada por meio de uma ponte de Wheatstone ou por meio de um dispositivo semelhante, utilizando resistências estáveis de qualidade superior, cuja tolerância não seja superior a p 10 % e cujo coeficiente de  temperatura não exceda 2 × 10-5 gC.  A resistência variável (de equilíbrio) não deve afastar-se da linearidade em todo o seu campo de medida em mais do que 0,3 % do seu valor máximo.  Deverá existir um sistema que permita ajustar as resistências para fins de calibração.  A escala de medição deve ser graduada com intervalos não superiores a 0,001 gC.  4.1.3.3.  Operação automática O dispositivo de leitura deve permitir uma distinção de pelo menos 0,001 gC no intervalo de 0 a -1 gC.  A estabilidade do dispositivo de leitura e do seu circuito associado deve ser tal que as indicações sucessivas da mesma temperatura não variem mais do que 0,001 gC.  A linearidade do circuito deve ser tal que não provoque um erro superior a p 0,001 gC, em qualquer ponto do intervalo compreendido entre -0,400 e -0,600 gC, quando o aparelho for utilizado correctamente.  4.1.4.  Vareta de agitação Para se agitar a amostra de ensaio, utiliza-se uma vareta de metal inerte em relação ao leite e com um diâmetro compreendido entre 1 mm e 1,5 mm.  A vareta de agitação deve ser ajustada quanto à amplitude e montada verticalmente, com a sua extremidade inferior nivelada com a da sonda térmica. É permitida uma tolerância de cerca de 1,5 mm acima ou abaixo dessa posição.  A vareta de agitação deve vibrar lateralmente com uma amplitude suficiente, indicada pelo fabricante (não inferior a p 1,5 mm) para assegurar uma temperatura uniforme à amostra de ensaio durante a determinação. A vareta de agitação nunca deve tocar na  sonda ou na parede do tubo durante o seu funcionamento normal de agitação.  4.1.5.  Dispositivo para início da congelação Pode ser qualquer dispositivo que ao ser colocado em funcionamento provoque instantaneamente o início da congelação da amostra, de tal modo que a temperatura dessa amostra de ensaio se eleve até valores próximos do ponto de congelação. A vareta de  agitação pode ser utilizada para este efeito; um dos métodos consiste em aumentar a amplitude de vibração durante um a dois segundos, de forma a que esta bata nas paredes do tubo da amostra.  4.1.6.  Tubos de amostra Os tubos de amostra (ver figura 1) devem ser em vidro e ter um comprimento de 50,8 p 0,1 mm, um diâmetro exterior de 16,0 p 0,1 mm e um diâmetro interior de 13,5 p 0,1 mm. A espessura do vidro em todo o tubo não deve variar para além de 0,1 mm.  Os tubos devem ter uma marca situada 29,8 mm abaixo do bordo (21 mm acima da base do tubo) para indicar um volume de amostra de 2,5 p 0,1 ml.  4.1.7.  Alimentação eléctrica A tensão de alimentação deve ser estabilizada no interior do próprio aparelho ou externamente, de tal modo que as flutuações eventuais não excedam mais de p 1 % do valor nominal quando a alimentação principal variar p 6 %.  4.2.  Balança analítica 4.3.  Balão volumétrico com uma marca, com uma capacidade de 1 000 ml, classe A.  4.4.  Estufa de secagem, bem ventilada, regulável a 130 p 1 gC ou Forno eléctrico, ventilado, regulável a 300 p 25 gC.  4.5.  Exsicador 5.  Reagentes 5.1.  Água destilada num aparelho de vidro borossilicatado, fervida e arrefecida a 20 p 2 gC num balão munido de um tubo de absorção de dióxido de carbono.  5.2.  Cloreto de sódio, de qualidade analítica, finamente triturado, seco durante 5 horas a 300 p 25 gC no forno eléctrico (4.4) ou seco na estufa (4.4) a 130 p 1 gC durante pelo menos 24 horas e arrefecido à temperatura ambiente num exsicador eficaz.  5.3.  Preparações de soluções-padrão Pesar a quantidade adequada (ver o quadro 1) de cloreto de sódio seco (5.2) num recipiente de pesagem. Dissolver em água destilada (5.1), transferir quantitativamente para um balão calibrado de 1 000 ml de volume e completar com água à temperatura de 20  p 2 gC até à marca correspondente.  Conservar esta solução por um período máximo de 2 meses a uma temperatura próxima de 5 gC em frascos de polietileno bem rolhados, de capacidade não superior a 250 ml.  Ponto de congelação de soluções de cloreto de sódio a 20 oC     g NaCl/l oC  6,859  7,818  8,149  8,314  8,480  8,646  8,811  8,977  9,143 10,155 - 0,408 - 0,464 - 0,483 - 0,492 - 0,502 - 0,512 - 0,521 - 0,531 - 0,541 - 0,600 Antes de utilizar uma solução-padrão, inverter e rodar o frasco com cuidado várias vezes para misturar bem o seu conteúdo. A solução-padrão nunca deve ser agitada violentamente a fim de evitar a incorporação de ar.  As amostras de ensaio de uma solução-padrão devem ser retiradas do frasco por vazamento para uma proveta seca e limpa. Não devem ser utilizadas pipetas para este fim.  Não devem ser utilizadas soluções provenientes de frascos cheios a menos de um quarto e não devem ser utilizadas soluções preparadas há mais de dois meses se não tiverem sido conservadas com um fungicida (por exemplo, uma solução de tiomersal, 10 g/l).   6.  Calibração do crioscópio de sonda térmica O crioscópio deve ser ajustado de forma que a temperatura ambiente não se desvie mais do que 1 gC da temperatura de calibração. O crioscópio não pode ser exposto à luz solar ou sujeito a correntes de ar e a temperatura ambiente não pode exceder 26-27  gC.  Garantir que o crioscópio está em condições de funcionamento em conformidade com as instruções do fabricante e que foi ligado durante pelo menos 12 horas antes da calibração. Verificar a posição da sonda, a amplitude de vibração da vareta agitadora e a  temperatura dos líquidos criogénicos.  Escolher duas soluções-padrão (ver quadro 1) que limitem o intervalo do valor esperado para o ponto de congelação do leite que se pretende analisar. A diferença entre os pontos de congelação das duas soluções deve ser preferencialmente inferior a 0,100  gC.  (Com certos tipos de crioscópios actualmente disponíveis, o circuito associado à sonda térmica é projectado de maneira a ficar regulado para um valor específico do ponto de congelação dentro do campo de medida do instrumento. Neste caso, a selecção de  uma solução-padrão, entre as diversas possíveis, que possua esse ponto de congelação, facilita o processo de calibração; esse valor deve ser indicado pelo fabricante).  Com o auxílio de uma pipeta, introduzir 2,5 p 0,1 ml de uma solução-padrão num tubo de amostra seco e limpo e depois colocar o crioscópio em funcionamento.  Nota Os tubos de amostra utilizados para a calibração devem ser fabricados e tratados como os tubos utilizados para as amostras de leite (mesmo tipo de vidro, lavados e enxaguados com água desmineralizada). As temperaturas das soluções-padrão devem ser  semelhantes às das amostras de leite.  Regular os controlos de calibração conforme indicado pelo fabricante, até que a leitura do crioscópio seja igual ao ponto de congelação da solução-padrão. Repetir esta operação com as outras soluções-padrão e prosseguir alternadamente de tal modo que as  successivas leituras em cada solução proporcionem o valor correcto de congelação de cada uma, sem ajustamento posterior dos controlos de calibração. O crioscópio está então pronto para utilização e indicará directamente o ponto de congelação da amostra  de leite, sem ter que se efectuar qualquer correcção.  7.  Preparação da amostra para análise 7.1.  Se necessário, conservar as amostras a uma temperatura entre 0 e 5 gC.  7.2.  Eliminar da amostra quaisquer corpos estranhos visíveis ou matéria gorda sólida, por filtração se necessário para um recipiente seco e limpo, e misturar a amostra cuidadosamente. Se for utilizado um filtro, este deve ser inerte em relação ao leite e  eficaz à temperatura do laboratório.  7.3.  O leite pode ser analisado quando estiver à temperatura de conservação (entro 0 e 5 gC) ou pode ser levado até à temperatura do laboratório imediatamente antes de se iniciar a análise. No entanto, no momento de utilização, é necessário que as  soluções-padrão e as amostras de leite estejam à mesma temperatura.  7.4.  Determinar a acidez titulável do leite com a maior exactidão possível, ao mesmo tempo que se efectua a determinação do ponto de congelação. As amostras cuja acidez exceda 0,18 g de ácido láctico por 100 ml de leite não podem ser analisadas.  7.5.  O leite UHT e o leite esterilizado devem repousar pelo menos 20 minutos num recipiente aberto antes de serem analisados.  8.  Procedimento técnico 8.1.  Verificações preliminares Verificar se o nível e a temperatura do líquido de refrigeração estão de acordo com as instruções do fabricante e, se for caso disso, se a sonda térmica se encontra dentro de um tubo de amostra vazio no suporte da amostra. Ligar o crioscópio e verificar  se o líquido refrigerante está a ser agitado ou circula correctamente, conforme o caso. Depois de o crioscópio ter estado ligado durante pelo menos 12 horas, verificar a temperatura do líquido refrigerante e a posição e amplitude de vibração da vareta  de agitação.  8.2.  Verificação de rotina da calibração Antes de cada série de ensaios, medir o ponto de congelação de uma solução-padrão de cloreto de sódio (por exemplo, uma solução com um ponto de congelação de -0,512 gC) até que duas determinações consecutivas não difiram mais do que 0,001 gC. Se a média  destes valores diferir mais do que 0,002 gC em relação ao ponto de congelação da solução-padrão, calibrar novamente o crioscópio, conforme descrito no ponto 6.  Se o crioscópio estiver a ser utilizado continuamente, efectuar a verificação de rotina da calibração pelo menos uma vez por hora, respeitando as indicações do fabricante.  8.3.  Determinação do ponto de congelação do leite Inverter e rodar cuidadosamente várias vezes o frasco que contém a amostra. Evitar agitar a amostra violentamente para que não seja incorporado ar.  Com o auxílio de uma pipeta, introduzir 2,5 p 0,1 ml de leite num tubo de amostra seco e limpo. Garantir que a sonda e a vareta de agitação se encontram limpas e secas e, se necessário, limpar cuidadosamente de baixo para cima com um tecido muito macio,  limpo e que não largue pêlo.  Introduzir o tubo de amostra no crioscópio calibrado de acordo com as instruções do fabricante. O leite deve ser arrefecido e a congelação iniciada a uma temperatura especificada pelo fabricante, com uma aproximação de p 0,1 gC.  (Em alguns instrumentos automáticos esta temperatura pode ser observada no mostrador digital; nos instrumentos manuais, a precisão necessária é obtida se a congelação se iniciar quando o ponteiro do galvanómetro coincidir com a marca adequada).  Se, por qualquer razão, a congelação se iniciar antes ou depois do intervalo de temperaturas especificado, interromper o ensaio e repetir com outra amostra de leite para análise. Se a nova amostra congelar também antes da temperatura especificada,  deve-se aquecer uma amostra de ensaio à temperatura de 45 gC e manter a temperatura durante 5 minutos para permitir a fusão da matéria gorda cristalina.  Arrefecer seguidamente para a temperatura de ensaio e proceder imediatamente a uma nova análise. A temperatura do leite, depois de iniciada a congelação, subirá rapidamente para um valor que se mantém praticamente constante durante um certo período de  tempo, antes de descer novamente. O ponto de congelação corresponde à temperatura máxima atingida durante este período, devendo esse valor ser registado.  Nota O tempo durante o qual a temperatura se mantém constante e o intervalo de tempo entre o início da congelação e a obtenção da temperatura mais elevada diferem de uma amostra para outra, e serão consideravelmente menores para a água e para as  soluções-padrão de cloreto de sódio do que para o leite. É essencial que se faça o registo da temperatura mais elevada.  Quando a medição tiver sido completada satisfatoriamente, retirar o tubo, lavar com água e depois secar a sonda térmica e a vareta de agitação, de baixo para cima, com um tecido macio, limpo e que não largue pêlo, e fazer uma nova determinação com  outras amostras de ensaio.  Se a diferença entre os dois pontos de congelação obtidos for superior ao valor de repetibilidade (0,004 gC), efectuar uma segunda determinação com outra amostra de ensaio. Se os valores das duas determinações concordarem a menos de 0,004 gC, devem ser  registados e utilizados para o cálculo do resultado final.  8.4.  Arrefecimento da sonda Após a utilização do aparelho, colocar um tubo de ensaio vazio no suporte da amostra e baixar a cabeça do aparelho de modo a manter a sonda fria.  (Com alguns tipos de crioscópio isto pode não ser possível; nesses casos, é essencial garantir que a sonda esteja adequadamente arrefecida antes de se proceder às medições, por exemplo, fazendo várias determinações em branco até se obterem leituras  idênticas).  9.  Expressão dos resultados 9.1.  Cálculos Se a calibração for confirmada pela verificação de rotina, tomar como resultado a média dos dois valores aceitáveis obtidos para o ponto de congelação, arredondada à milésima.  Se a soma dos dois valores aceitáveis das determinações efectuadas em duplicado for um número ímpar, a média deve ser arredondada para o valor par mais próximo, conforme indicado no exemplo seguinte:  Ponto de congelação (oC)    Valores das determinações em duplicado Média - 0,544   - 0,545 - 0,545   - 0,546 - 0,544 - 0,546  9.2.  Precisão 9.2.1.  Repetibilidade (r): 0,004 oC.  9.2.2.  Reprodutibilidade (R): 0,006 oC. II. DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE FOSFATÁSICA  1.  Objectivo e domínio de aplicação O presente capítulo descreve o processo de referência para a determinação da actividade da fosfatase em leite pasteurizado.  2.  Definição 2.1.  A actividade fosfatásica é uma medida da quantidade de fosfatase alcalina activa presente no produto. Exprime-se pela quantidade de fenol, em mg por ml de leite pasteurizado, nas condições a seguir descritas.  2.2.  Todo o leite cuja actividade da fosfatase seja inferior a 4 mg/ml é considerado como sendo fosfatase negativa.  3.  Princípio do processo A actividade da fosfatase eventualmente presente na amostra é avaliada a partir da quantidade de fenol libertada do fenilfosfato dissódico adicionado à amostra. O fenol libertado reage com dibromoquinoaclorimida produzindo dibromoindofenol (de cor  azulada) medido colorimetricamente a 610 nm. Faz-se a comparação com uma amostra de controlo na qual a actividade da enzima foi destruída.  4.  Reagentes 4.1.  Tampão de borato e de hidróxido de bário 4.1.1.  Dissolver 50,0 g de hidróxido de bário [Ba(OH)2.8H2O] em água e ajustar o volume até 1 000 ml.  4.1.2.  Dissolver 22,0 g de ácido bórico (H3BO3) em água e ajustar o volume até 1 000 ml.  4.1.3.  Aquecer 500 ml de cada solução à temperatura de 50 gC, misturar as soluções, agitar, arrefecer rapidamente até cerca de 20 gC, ajustar o pH, se necessário, para 10,6 p 0,1 por adição da solução 4.1.1 ou 4.1.2. Filtrar. Conservar a solução num recipiente  hermeticamente fechado.  4.1.4.  Antes da utilização, diluir a solução com igual volume de água.  4.2.  Tampão para desenvolvimento da coloração Dissolver 6,0 g de metaborato de sódio (NaBO2) ou 12,6 g de NaBO2.4H2O e 20,0 g de cloreto de sódio (NaCl) em água e ajustar o volume para 1 000 ml.  4.3.  Tampão de coloração diluído Diluir 10 ml do tampão para desenvolvimento da coloração (4.2) em água e ajustar o volume para 100 ml.  4.4.  Substrato-tampão Dissolver 0,1 g de fenilfosfato dissódico desidratado isento de fenol em 100 ml de tampão (4.1.3) ou dissolver 0,5 g de fenilfosfato dissódico em 4,5 ml do tampão para desenvolvimento da coloração (4.2), adicionar duas gotas de solução BQC (4.6) e  deixar em repouso à temperatura ambiente durante 30 minutos. Eliminar a cor assim formada utilizando 2,5 ml de butanol-1 e deixar em repouso até que o butanol-1 se separe. Fazer a decantação do butanol-1 e eliminá-lo. Repetir a extração se necessário.  A solução pode ser conservada num frigorífico durante alguns dias; deixar a coloração desenvolver-se e proceder a uma nova extracção antes da utilização. Preparar o substrato-tampão imediatamente antes da utilização, diluindo 1 ml desta solução com o  tampão de borato e de hidróxido de bário (4.1.3) até perfazer 100 ml.  4.5.  Precipitante de zinco-cobre Dissolver 3,0 g de sulfato de zinco (ZnSO4, 7H2O) e 0,6 g de sulfato de cobre (II) (CuSO4, 5H2O) em água e ajustar o volume para 100 ml.  4.6.  Solução de 2,6-dibromoquinonaclorimida (solução BQC) Dissolver 40 p 1 mg de 2,6-dibromoquinonaclorimida (BQC) (C6H2Br2CINO6) em 10 ml de álcool etílico a 96 % (v/v).  Conservar a solução num frigorífico, numa garrafa de cor escura. Rejeitar a solução no caso de ter mudado de cor ou no caso de ter estado armazenada mais de um mês.  4.7.  Solução de sulfato de cobre (II) Dissolver 0,05 g de sulfato de cobre (II) (CuSO4.5H2O) em água e ajustar o volume até 100 ml.  4.8.  Soluções-padrão de fenol 4.8.1.  Pesar 200 p 2 mg de fenol anidro puro, transferir para um balão calibrado de 100 ml, adicionar água, misturar e ajustar o volume até 100 ml. Esta solução permanece estável durante vários meses quando armazenada no frigorífico.  4.8.2.  Diluir 10 ml da solução concentrada utilizando água, ajustar o volume até 100 ml e misturar. Uma quantidade de 1 ml contem 200 mg de fenol.  5.  Aparelhos e utensílios Notas:  a)  Todos os utensílios de vidro, rolhas e instrumentos de colheita de amostras devem ser cuidadosamente limpos. É recomendável lavá-los com água destilada recentemente fervida ou submetê-los a um tratamento com vapor.  b)  Certos tipos de rolhas de plástico podem provocar uma contaminação fenólica, não devendo ser permitida a sua utilização.  Material corrente de laboratório e, em especial:  5.1.  Balança analítica 5.2.  Banho-maria regulável para a temperatura de 37 p 1 gC.  5.3.  Espectrofotómetro permitindo efectuar leituras a um comprimento de onda de 610 nm.  5.4.  Tubos de ensaio, 16 ou 18 mm × 150 mm, de preferência graduados em divisões de 5 e 10 ml.  5.5.  Pipetas 5.6.  Funis de vidro, e dimensões adequadas, por exemplo, com 5 cm de diâmetro.  5.7.  Filtros de pregas, com pelo menos 9 cm de diâmetro para filtração a uma velocidade média.  5.8.  Balões calibrados, para a preparação de soluções-padrão.  6.  Técnica de procedimento Notas:  a)  Evitar a influência da luz solar directa durante a determinação.  b)  A contaminação com vestígios de saliva ou transpiração pode dar origem a falsos resultados positivos, devendo ser evitada. Assim, deve ser dada especial atenção ao processo de medições por pipeta.  6.1.  Preparação da amostra a testar 6.1.1.  Efectuar as análises imediatamente após a colheita de amostras. Caso contrário, manter a amostra no frigorífico, mas por um período de tempo que não exceda os dois dias.  6.2.  Amostra de ensaio Medir com uma pipeta 1 ml de amostra a testar para cada um dos dois tubos de ensaio (5.4), utilizando um desses tubos como controlo. 6.3.  Determinação 6.3.1.  Aquecer o tubo de ensaio de controlo durante dois minutos em água a ferver; cobrir o tubo de ensaio e a proveta que contém a água em ebulição, com uma folha de alumínio, para assegurar que todo o tubo seja aquecido. Arrefecer rapidamente até à  temperatura ambiente.  6.3.2.  Durante a parte restante do processo, tratar o tubo de ensaio de controlo e a amostra a testar de modo semelhante. Adicionar 10 ml de substrato-tampão (4.4) e misturar.  6.3.3.  Incubar imediatamente as amostras em banho-maria (5.2) durante 60 minutos, misturando de vez em quando o conteúdo (pelo menos quatro vezes).  6.3.4.  Aquecer em água a ferver, durante dois minutos, conforme descrito em 6.3.1. Arrefecer rapidamente até à temperatura ambiente.  6.3.5.  Adicionar 1 ml do precipitante de cobre-zinco (4.5) a cada tubo e misturar cuidadosamente.  6.3.6.  Filtrar através de papel de filtro seco, rejeitar os primeiros dois mililitros e, se necessário, filtrar de novo até que o filtrado fique completamente claro e recolher 5 ml num tubo de ensaio.  6.3.7.  Adicionar 5 ml de tampão para o desenvolvimento da coloração (4.2).  6.3.8.  Adicionar 0,1 ml de solução BQC (4.6), misturar e deixar que a coloração se desenvolva durante 30 minutos à temperatura ambiente.  6.3.9.  Medir a absorvência por comparação com o ensaio de controlo no espectrofotómetro (5.3), para um valor do comprimento de onda de 610 nm.  6.3.10.  Repetir a determinação com uma diluição adequada da amostra se a absorvência da solução-padão contendo 20 mg de fenol por tubo, medida conforme definido em 6.4.4. Preparar esta diluição misturando um volume da amostra a analisar com um volume adequado  de uma parte da mesma amostra, levada cuidadosamente à ebulição de modo a inactivar a fosfatase.  6.4.  Preparação da curva de calibração 6.4.1.  A partir de uma solução-padão de fenol (4.8.2), preparar uma série de soluções-padrão diluídas contendo 0 (ensaio de controlo), 2, 5, 10 e 20 g de fenol por mililitro. Com uma pipeta medir para cada um dos cinco tubos de ensaio respectivamente 1 ml de  água e 1 ml de cada uma das quatro soluções-padrão de fenol.  6.4.2.  Adicionar a cada tubo de ensaio 1 ml de solução de sulfato de cobre (II) (4.7), 5 ml do tampão de coloração diluído (4.3), 3 ml de água e 0,1 ml de solução BQC (4.6) e misturar.  6.4.3.  Deixar a coloração desenvolver-se durante 30 minutos à temperatura ambiente.  6.4.4.  Medir a absorvência por comparação com o resultado obtido com o conteúdo do tubo de controlo no espectrofotómetro, para um comprimento de onda de 610 nm.  6.4.5.  A partir dos valores de absorvência (6.4.4) obtidos para cada quantidade de fenol adicionado (6.4.1), calcular a recta de regressão pelo método dos mínimos quadrados.  7.  Expressão dos resultados 7.1.  Cálculo e fórmula 7.1.1.  Calcular a quantidade de fenol a partir da leitura de absorvência (6.3.9), recorrendo à recta de regressão obtida (6.4.5).  7.1.2.  Calcular a actividade da fosfatase, expressa em mg de fenol por mililitro de leite pasteurizado, recorrendo à fórmula seguinte:  Actividade fosfatásica = 2,4 × A × D em que A representa a quantidade de fenol em mg obtida em 7.1.1;  D representa o factor de diluição da preparação cuja diluição foi efectuada em 6.3.10 (no caso de não haver diluição, D = 1).  O valor 2,4 é o factor de dilução (¹/12 de 1 ml da amostra de ensaio) - ver o ponto 6.2 em associação com os pontos 6.3.2, 6.3.5 e 6.3.6.  7.2.  Precisão 7.2.1.  Repetibilidade (r): 2 mg de fenol/ml.  7.2.2.  Reprodutibilidade (R): 3 mg de fenol/ml (preliminar).  7.2.3.  Se for aplicada uma diluição de acordo com o ponto 6.3.10, os limites referidos nos pontos 7.2.1 e 7.2.2 referem-se aos resultados obtidos com a amostra diluída.  III. DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE PEROXIDÁSICA  1.  Objectivo e domínio de aplicação Neste capítulo descreve-se o processo de referência para a determinação da presença ou da ausência da enzima peroxidase no leite, servindo como controlo da pasteurização.  2.  Definições Reacção positiva ao teste da peroxidase Se o leite estiver bem pasteurizado, aparece uma coloração azul nos 30 segundos que se seguem à mistura.  Reacção negativa ao teste da peroxidase Não aparece qualquer coloração nos 30 segundos que se seguem à mistura.  3.  Princípio do processo A enzima peroxidase decompõe o peróxido de hidrogénio. O oxigénio atómico libertado transforma, por oxidação, a 1,4-fenilenodiamina incolor em indofenol púrpura (teste de Storch). A intensidade da cor é proporcional à concentração da enzima.  4.  Reagentes 4.1.  Solução de 1,4-fenilenodiamina Dissolver 2 g de 1,4-fenilenodiamina (C6H8N2) em água quente (50 gC) e ajustar o volume até 100 ml. Conservar a solução num frasco castanho escuro com uma rolha de vidro e num local fresco e ao abrigo da luz. Decorridos um ou dois dias após a sua  preparação, a solução de 1,4-fenilenodiamina forma um depósito que convém eliminar.  4.2.  Solução de peróxido de hidrogénio Diluir 9 ml de peróxido de hidrogénio a 30 % em água e ajustar o volume até 100 ml. Para estabilizar, adicionar 1 ml de ácido sulfúrico concentrado por litro de solução.  A solução de peróxido de hidrogénio é estável durante vários meses se for conservada em local fresco e ao abrigo da luz, num frasco com rolha de vidro, evitando qualquer contacto com compostos orgânicos.  5.  Técnica de procedimento 5.1.  Introduzir 5 ml do leite que se pretende analisar num tubo de ensaio limpo munido de uma tampa adequada.  5.2.  Adicionar 5 ml da solução de 1,4-fenilenodiamina (4.1).  5.3.  Adicionar duas gotas de solução de peróxido de hidrogénio (4.2).  5.4.  Examinar a coloração nos 30 segundos que se seguem à mistura. Se aparecer uma coloração azul decorridos mais de 30 segundos após a adição dos reagentes, a reacção é inconclusiva.  IV. ENUMERAÇÃO DE MICRORGANISMOS - ENSAIO DE CONTAGEM EM PLACA A 30 gC  1.  Objectivo e domínio de aplicação Neste capítulo descreve-se o processo de referência para a enumeração de microrganismos por meio de uma técnica de contagem de colónias a 30 gC. O método é aplicável ao leite cru, ao leite pasteurizado, ao leite UHT e ao leite esterilizado pré-incubado  a 30 gC durante 15 dias.  2.  Definição O termo «microrganismos» significa organismos que formam colónias contáveis quando incubados aerobicamente nas condições descritas.  3.  Princípios do método Misturar um determinado volume de amostra de leite com o meio de cultura em placas de Petri e deixar incubar a 30 gC durante 72 horas. Contar as colónias e calcular o número de microrganismos por mililitro de leite cru ou pasteurizado ou por 0,1 ml de  leite esterilizado ou UHT pré-incubado.  4.  Aparelhos e utensílios de vidro Material corrente de laboratório e, em especial:  4.1.  Aparelhagem 4.1.1.  Estufa de ar quente, regulável para funcionar a uma temperatura entre 170 e 175 gC.  4.1.2.  Autoclave, regulável para funcionar à temperatura de 121 p 1 gC.  4.1.3.  Incubadora, que mantenha uma temperatura de 30 p 1 gC em todos os pontos do seu interior.  4.1.4.  Medidor de pH, com compensação de temperatura, com uma precisão de p 0,1 unidade de pH.  4.1.5.  Banho-maria, regulável para uma temperatura de 45 p 1 gC.  4.1.6.  Lente, com uma ampliação de 2-4 x.  4.1.7.  Lente, com um ampliação de 8-10 x.  4.1.8.  Contador marcador 4.1.9.  Misturador com capacidade para misturar 1 ml da amostra da leite ou de uma diluição decimal com 9 ml de diluente e que funcione segundo o princípio de rotação excêntrica do conteúdo do tubo de ensaio.  4.2.  Utensílios de vidro 4.2.1.  Tubos de ensaio com tampas adequadas e com uma capacidade suficiente para conter, com espaço suficiente que permita uma agitação conveniente, 10 ml da diluição primária ou de outras diluições decimais.  4.2.2.  Balões com capacidade de 150 a 250 ml ou tubos com a capacidade aproximada de 20 ml, para conter o meio de cultura.  4.2.3.  Pipetas (com rolhas de algodão em rama) de vidro ou de material sintético esterilizado, com as extremidades não partidas, com capacidade nominal de 1 ml e tendo um orifício de saída com um diâmetro compreendido entre 1,75 e 3 mm.  4.2.4.  Placas de Petri de vidro ou de material sintético esterilizado transparente e incolor, tendo a placa inferior um diâmetro interno de cerca de 90-100 mm. A profundidade interna deve ser de 10 mm no mínimo. O fundo não deve apresentar irregularidades que  interfiram com a contagem das colónias.  4.2.5.  Esterilização dos utensílios de vidro Os utensílios de vidro devem ser esterilizados por um dos seguintes métodos:  a)  Numa estufa de ar quente (4.1.1), a uma temperatura compreendida entre 170 e 175 gC, durante 1 hora pelo menos;  b)  Em autoclave (4.1.2), a uma temperatura de 121 p 1 gC, durante 20 minutos pelo menos.  Na autoclave devem ser tomadas todas as precauções possíveis para assegurar uma penetração adequada do vapor: por exemplo, se o material for esterilizado em recipientes, estes não devem ser fechados hermeticamente e as rolhas ou as tampas dos balões ou  frascos devem estar soltas.  Os utensílios de vidro esterilizados na autoclave devem ser secos a fim de eliminar o vapor.  As pipetas devem ser esterilizadas numa estufa de ar quente (4.1.1).  5.  Meio de cultura - contagem dos germes do leite em placa de gelose (ágar) 5.1.  Composição Extracto de levedura 2,5 g Triptona 5,0 g D(+) glicose ou dextrose 1,0 g Leite em pó magro 1,0 g Gelose (ágar) 10 a 15 g, dependendo das propriedades de geleficação do ágar utilizado Água 1 000 ml O leite em pó magro deve ser isento de substâncias inibidoras. Isto deve ser verificado por testes comparativos, utilizando um leite em pó desnatado reconhecidamente isento de substâncias inibidoras.  Preparação Preparar uma suspensão dissolvendo os componentes em água pela ordem seguinte: extracto de levedura, triptona, glicose e finalmente o leite em pó desnatado. O aquecimento da suspensão facilita este processo. Adicionar depois o ágar e aquecer até à  ebulição, agitando continuamente até que o ágar esteja completamente dissolvido, ou submeter à acção de vapor durante cerca de 30 minutos.  Se necessário, filtrar com papel de filtro.  Verificar o pH com um medidor de pH (4.1.4); se necessário, ajustar o pH de modo que, após a esterilização, tenha o valor de 6,9 p 0,1 à temperatura de 25 gC, utilizando uma solução (pelo menos 0,1 mol/l) de hidróxido de sódio ou de acido clorídrico.  5.2.  Repartição, esterilização e conservação do meio de cultura Repartir o meio (5.1), em quantidades de 100 a 150 ml, por diversos balões, ou de 12 a 15 ml por diversos tubos (4.2.2). Rolhar os balões e os tubos.  Esterilizar em autoclave (4.1.2) à temperatura de 121 p 1 gC durante 15 minutos.  Verificar o pH do meio.  Se o meio de cultura não for utilizado imediatamente, conservá-lo num local protegido da luz e a uma temperatura entre 1 e 5 gC durante um período máximo de um mês após a sua preparação.  5.3.  Meio de cultura completo desidratado comercialmente disponível O meio de cultura (5.1) pode ser preparado a partir de um meio de cultura completo desidratado comercialmente disponível. Seguir as intruções do fabricante, mas adicionar o leite em pó desnatado antes da dissolução no caso de não ser um dos componentes  do produto.  Ajustar o pH para 6,9 p 0,1 a 25 gC conforme descrito no ponto 5.1 e depois fazer a repartição, esterilizar e armazenar o meio de acordo com as indicações especificadas em 5.2.  6.  Diluentes 6.1.  Solução salina de peptona Composição Peptona 1,0 g Cloreto de sódio (NaCl) 8,5 g Água 1 000 ml Preparação Dissolver os componentes em água, aquecendo se necessário.  Verificar o pH com um medidor de pH (4.1.4); se necessário ajustar o pH utilizando uma solução (pelo menos 0,1 mol/ml) de hidróxido de sódio ou de ácido clorídrico, de tal modo que, após a esterilização, seja de 7,0 p 0,1 à temperatura de 25 gC.  6.2.  Repartição, esterilização e conservação do diluente Repartir o diluente (6.1) por tubos de ensaio (4.2.1) em quantidades tais que, após a esterilização, cada tubo contenha 9,0 p 0,2 ml de diluente. Rolhar os tubos.  Esterilizar na autoclave (4.1.2) à temperatura de 121 p 1 gC durante 15 minutos.  Verificar o pH do diluente.  Se o diluente não for utilizado imediatamente, conservá-lo em local escuro a uma temperatura compreendida entre 1 e 5 gC durante um período máximo de um mês após a sua preparação.  6.3.  Diluentes desidratados disponíveis comercialmente O diluente (6.1) pode ser preparado a partir de pastilhas ou pós desidratados disponíveis comercialmente. Seguir as instruções do fabricante. Ajustar o pH conforme descrito no ponto 6.1 e repartir, esterilizar e armazenar os diluentes conforme descrito  no ponto 6.2.  7.  Técnica de procedimento 7.1.  Fusão do meio Antes de começar o exame microbiológico, fundir rapidamente a quantidade de meio necessária e arrefecer esse meio para a temperatura de 45 p 1 gC em banho-maria (4.1.5.).  7.2.  Preparação da amostra de leite Misturar convenientemente a amostra de leite de modo a obter-se uma distribuição dos microrganismos tão uniforme quanto possível, invertendo rapidamente o recipiente que contém a amostra 25 vezes. Evitar a formação de espuma ou deixar que esta se  disperse. O intervalo entre a mistura e a colheita da amostra de ensaio não deve exceder três minutos.  7.3.  Preparação da diluição primária (10-;) (leite cru e pasteurizado) Com uma pipeta esterilizada (4.2.3), adicionar 1 ml da amostra de leite (7.2), cru ou pasteurizado, a 9 ml de diluente (6.1) evitando qualquer contacto entre a pipeta e o diluente. A temperatura do diluente deve ser aproximadamente igual à da amostra de  leite. Misturar cuidadosamente esta diluição primária no misturador (4.1.9) durante um período de 5 a 10 segundos.  Obtém-se deste modo uma diluição primária de 10-;.  7.4.  Preparação das diluições decimais seguintes (leite cru e leite pasteurizado) Com uma pipeta esterilizada (4.2.3), adicionar 1 ml da diluição primária (7.3) a 9 ml de diluente (6.1), seguindo as instruções indicadas no ponto 7.3.  Obtém-se deste modo uma diluição de 10-$.  Repetir estas operações para se obter outras diluições decimais, até que seja previsível a obtenção do número adequado de microrganismos (8.1.1).  7.5.  Inoculação das placas de Petri 7.5.1.  Leite cru: com uma pipeta esterilizada (4.2.3), transferir 1 ml da amostra e/ou da diluição decimal adequada para uma placa (4.2.4). Devem ser examinadas pelo menos duas diluições. Para cada diluição preparar uma placa seleccionada de modo conveniente  (8.1.1).  7.5.2.  Leite pasteurizado: com uma pipeta esterilizada (4.2.3), transferir 1 ml da amostra e/ou da diluição decimal adequada para um placa (4.2.4). Devem ser examinadas pelo menos duas diluições. Para cada diluição preparar duas placas seleccionadas de modo  conveniente (8.1.1).  7.5.3.  Leite UHT e leite esterilizado (examinado após incubação durante 15 dias à temperatura de 30 gC - no. 5 do capítulo VII, anexo A, da Directiva 85/397/CEE):  Com uma pipeta esterilizada (4.2.3) transferir 0,1 ml da amostra de leite (7.2) para uma placa (4.2.4). Preparar duas placas.  7.6.  Vazamento Verter cerca de 15 a 18 ml de meio (7.1) em cada placa inoculada. Após o vazamento misturar imediatamente, fazendo girar a placa de Petri, a fim de se obter uma dispersão uniforme das colónias após a incubação.  O intervalo de tempo entre o fim da preparação da amostra de leite e a mistura, consoante o tipo de leite, da amostra de ensaio ou da diluição com o meio, não deve exceder 15 minutos.  Deixar em repouso sobre uma superfície horizontal fria e limpa até à solidificação do meio.  7.7. Incubação das placas de Petri Transferir as placas para a incubadora (4.1.3). Fazer a incubação com as placas invertidas. Não empilhar mais de seis placas em altura. As pilhas de placas devem ficar separadas umas das outras, das paredes e do tecto da incubadora.  Fazer a incubação à temperatura de 30 p 1 gC durante 72 p 2 horas.  7.8.  Contagem de colónias Efectuar a contagem de colónias nas placas de Petri que não contenham mais de 300 colónias.  Examinar as placas sob luz pouca intensa. Para facilitar a contagem pode utilizar-se uma lente (4.1.6) e/ou um contador marcador (4.1.8). Evitar confundir com pequenas colónias as partículas de material precipitado nas placas. Examinar cuidadosamente os  objectos duvidosos utilizando, se necessário, uma lente de maior ampliação (4.1.7), de modo a distinguir as colónias da matéria estranha.  As colónias invasoras são consideradas colónias únicas. Se menos de um quarto da placa estiver coberto por colónias invasoras, contar as colónias na parte não afectada da placa e calcular o número correspondente para toda a placa. Se mais de um quarto  da placa estiver coberta por colónias invasoras, rejeitar a placa.  8.  Cálculo e expressão dos resultados 8.1.  Leite cru e pasteurizado 8.1.1.  Utilizar os resultados das placas que contenham entre 10 e 300 colónias (ver 8.1.3 e 8.1.4).  8.1.2 O número de microrganismos por 1 ml de leite cru ou pasteurizado é dado pela fórmula seguinte:  8.1.2.  O número de microrganismos por 1 ml de leite cru ou pasteurizado é dado pela fórmula seguinte:   (n1 + 0,1 n2) d   S C(n1 + 0,1 n2) d  em que S Crepresenta a soma total das colónias contadas conforme descrito em 8.1.1,  (n1 + 0,1 n2) d representa o volume da amostra incubada, em que:  n1 representa o número de placas contadas na primeira diluição,  n2 representa o número de placas contadas na segunda diluição,  d representa o factor de diluição a partir do qual se obtiveram as primeiras contagens.  A contagem é arredondada a dois algarismos significativos. Quando o algarismo a ser arredondado é 5, faz-se o arredondamento de modo que o algarismo imediatamente à esquerda seja par.  Exemplo (leite pasteurizado):  Diluição 10-2: 278 e 290 colónias Diluição 10-3:  33 e  28 colónias Número/ml=  278 + 290 + 33 + 28   Número/ml = 278 + 290 +33 + 28 (2 + 0,1 × 2) 10-2 Número/ml=  0,022   = 629 0,022 = 28 590 = 29 000 = 2,9 × 10%.  8.1.3.  Se existirem apenas contagens inferiores a 10, indicar que o número de microrganismos por mililitro é «inferior a 10 × d por ml», sendo «d» o inverso do factor de diluição mais baixo.  8.1.4.  Se existirem apenas contagens superiores a 300 colónias e se a contagem for possível, efectuar uma estimativa e multiplicá-la pelo inverso do factor de diluição. Exprimir o resultado com a indicação «número estimado de microrganismos por mililitro».  8.2.  Leite UHT e esterilizado Considera-se que os teores em germes superiores a 10 colónias por 0,1 ml não satisfazem as exigências da Directiva 85/397/CEE.  9.  Precisão Não se dispõe ainda de nenhum resultado de ensaios circulares internacionalmente reconhecidos.  V. ENUMERAÇÃO DE MICRORGANISMOS - ENSAIO DE CONTAGEM EM PLACA A 21 gC  1.  Objectivo e domínio de aplicação No presente capítulo descreve-se o processo de referência para a enumeração de microrganismos por meio de uma técnica de contagem de colónias à temperatura de 21 gC, em leite pasteurizado após incubação do leite à temperatura de 6 gC durante 5 dias,  para determinar fundamentalmente o grau de contaminação do leite pasteurizado, com microrganismos psicrotróficos susceptíveis de se multiplicarem no leite à temperatura de 6 gC.  2.  Definição O termo «microrganismos» significa organismos que formam colónias contáveis quando incubados aerobicamente nas condições descritas.  3.  Princípio O leite pasteurizado é incubado à temperatura de 6 gC durante cinco dias. Mistura-se um volume determinado da amostra de leite com o meio de cultura em placas de Petri e faz-se a incubação à temperatura de 21 gC durante 25 horas. Faz-se a contagem das  colónias e calcula-se o número de microrganismos por 1 ml de leite pasteurizado.  4.  Aparelhos e utensílios de vidro Material corrente de laboratório e, em especial:  4.1.  Aparelhagem 4.1.1.  Estufa de ar quente, regulável para uma temperatura de 170-175 gC.  4.1.2.  Autoclave, regulável para a temperatura de 121 p 1 gC.  4.1.3.  Incubadoras, que mantenham uma temperatura uniforme de:  a)  6 p 0,2 gC;  b)  21 p 1 gC,  em todos os pontos do seu interior.  4.1.4.  Medidor de pH, com compensação de temperatura e com uma precisão de p 0,1 unidades de pH.  4.1.5.  Banho-maria, a uma temperatura de 45 p 1 gC.  4.1.6.  Lente, com uma ampliação de 2-4 x.  4.1.7.  Lente, com uma ampliação de 8-10 x.  4.1.8.  Marcador contador.  4.1.9.  Misturador, com capacidade para misturar 1 ml da amostra de leite ou de uma diluição decimal com 9 ml de diluente e que funcione segundo o princípio de rotação excêntrica do conteúdo do tubo de ensaio.  4.2.  Utensílios de vidro 4.2.1.  Tubos de ensaio, com tampas adequadas e com uma capacidade suficiente para conter 10 ml da diluição primária ou de outras diluições decimais, com um espaço livre adequado para proceder à mistura.  4.2.2.  Balões, com capacidade de 150 a 250 ml, ou tubos com cerca de 20 ml de capacidade, para conterem o meio de cultura.  4.2.3.  Pipetas, (com rolhas de algodão) feitas de vidro ou de material sintético inerte, com as extremidades não partidas, com uma capacidade nominal de 1 ml e possuindo um orifício de saída com um diâmetro de 1,75 a 3 mm.  4.2.4.  Placas de Petri, de vidro ou de material sintético esterilizado, transparente e incolor, possuindo o fundo das placas um diâmetro interno de cerca de 90-100 mm. A profundidade interna deve ser de 10 mm no mínimo. O fundo não deve ter irregularidades que  interfiram com a contagem das colónias.  4.2.5.  Esterilização dos utensílios de vidro Os utensílios de vidro devem ser esterilizados por um dos métodos seguintes:  a)  Sendo mantidos a uma temperatura compreendida entre 170 e 175 gC durante pelo menos uma hora numa estufa de ar quente (4.1.1);  b)  Sendo mantidos a uma temperatura de 121 p 1 gC durante pelo menos 20 minutos numa autoclave (4.1.2).  Na autoclave é necessário tomar todas as precauções para assegurar uma penetração adequada do vapor: se o material for esterilizado dentro de recipientes, estes não devem ser fechados hermeticamente e as tampas ou rolhas dos balões devem estar soltas.  Os utensílios de vidro esterilizados na autoclave devem ser secos a fim de se eliminar o vapor.  As pipetas devem ser esterilizadas numa estufa de ar quente (4.1.1).  5.  Meio de cultura - Contagem dos germes do leite em placa de gelose (ágar) 5.1.  Composição Extracto de levedura 2,5 g Triptona 5,0 g D(+) Glicose 1,0 g Leite em pó magro 1,0 g Ágar 10 a 15 g, dependendo das propriedades de gelificação do ágar utilizado Água 1 000 ml O leite em pó magro deve ser isento de substâncias inibidoras. Este facto deve ser verificado por testes comparativos realizados utilizando um leite em pó magro reconhecidamente isento de substâncias inibidoras.  Preparação Preparar uma suspensão e dissolver os componentes na água pela ordem seguinte: extracto de levedura, triptona, glicose e finalmente o leite em pó magro. O aquecimento da suspensão facilita este processo. Adicionar o ágar e aquecer até à ebulição,  agitando continuamente até que o ágar esteja completamente dissolvido, ou submeter à acção de vapor durante cerca de 30 minutos.  Se necessário filtrar com papel de filtro.  Verificar o pH um medidor de pH (4.1.4). Se necessário ajustar o pH utilizando uma solução (pelo menos 0,1 mol/l) de hidróxido de sódio ou de ácido clorídrico de tal modo que após a esterilização o seu valor seja de 6,9 p 0,1 à temperatura de 25 gC.  5.2.  Repartição, esterilização e conservação do meio de cultura Repartir o meio de cultura (5.1) em quantidades de 100 a 150 ml dentro de balões ou em quantidades de 12 a 15 ml dentro de tubos (4.2.2). Rolhar os balões e os tubos.  Esterilizar na autoclave (4.1.2) à temperatura de 121 p 1 gC durante 15 minutos.  Verificar o pH do meio.  Se o meio de cultura não for utilizado imediatamente, conservá-lo num local escuro a uma temperatura compreendida entre 1 e 5 gC pelo período máximo de um mês após a sua preparação.  5.3.  Meio de cultura desidratado disponível comercialmente O meio de cultura (5.1) pode ser preparado a partir de um meio de cultura desidratado disponível comercialmente. Seguir as instruções do fabricante, mas adicionar o leite em pó magro antes da dissolução, se este não for um dos componentes do produto.  Ajustar o pH para 6,9 p 0,1 à temperatura de 25 gC, conforme descrito no parágrafo 5.1, e depois repartir, esterilizar e conservar o meio conforme descrito no parágrafo 5.2.  6.  Diluentes 6.1.  Solução salina de peptona Composição Peptona 1,0 g Cloreto de sódio (NaCl) 8,5 g Água 1 000 ml Preparação Dissolver os componentes em água, aquecendo se necessário.  Verificar o pH com um medidor de pH (4.1.4); se necessário ajustar o pH utilizando uma solução (pelo menos 0,1 mol/l) de hidróxido de sódio ou de ácido clorídrico de tal modo que, após a esterilização, o seu valor seja de 7,0 p 0,1 à temperatura de 25  gC.  6.2.  Repartição, esterilização e conservação do diluente Repartir o diluente (6.1) por tubos de ensaio (4.2.1) em quantidades tais que, após a esterilização, cada tubo contenha 9,0 p 0,2 ml de diluente. Rolhar os tubos.  Esterilizar na autoclave (4.1.2) à temperatura de 121 p 1 gC durante 15 minutos.  Verificar o pH do diluente.  Se o diluente não for utilizado imediatamente, conservá-lo num local escuro, a uma temperatura compreendida entre 1 e 5 gC, durante o período máximo de um mês após a sua preparação.  6.3.  Diluentes desidratados disponíveis comercialmente Os diluentes (6.1) podem ser preparados a partir de pastilhas ou pós desidratados disponíveis comercialmente. Seguir as instruções do fabricante. Ajustar o pH conforme descrito no parágrafo 6.1 e depois repartir, esterilizar e conservar os diluentes  conforme descrito no parágrafo 6.2.  7.  Técnica de procedimento 7.1.  Fusão do meio Antes do início do exame microbiólogico, fundir rapidamente a quantidade de meio necessária e arrefecê-lo à temperatura de 45 p 1 gC, em banho-maria (4.1.5).  7.2.  Preparação da amostra de leite 7.2.1.  Fazer a incubação do leite pasteurizado em embalagem fechada ou, se não for possível, fazer a incubação de uma amostra representativa com pelo menos 100 ml, durante 120 p 2 horas, à temperatura de 6 p 0,5 gC, numa incubadora [4.1.3.a)].  7.2.2.  Após a incubação, misturar convenientemente a amostra de leite a fim de se obter uma distribuição dos microrganismos tão homogénea quanto possível, invertendo rapidamente o recipiente que contém a amostra 25 vezes. Evitar a formação de espuma ou  deixá-la dispersar. O intervalo entre a mistura e a colheita da amostra de ensaio não deve exceder três minutos.  7.3.  Preparação da diluição primária (10-;) Com uma pipeta esterilizada (4.2.3), adicionar 1 ml da amostra (7.2.2) a 9 ml de diluente (6.1) evitando o contacto entre a pipeta e o diluente. A temperatura do diluente deverá ser aproximadamente igual à temperatura da amostra de leite. Misturar esta  diluição primária cuidadosamente, utilizando um misturador (4.1.9), durante 5-10 segundos.  Obtém-se deste modo uma diluição primária de 10-;.  7.4.  Preparação de outras diluições decimais Com uma pipeta esterilizada (4.2.3), adicionar 1 ml da diluição primária (7.3) a 9 ml de diluente (6.1), de acordo com as instruções definidas em 7.3.  Obtém-se deste modo uma diluição de 10-$.  Repetir estas operações para se obter outras diluições decimais até que seja previsível a obtenção do número apropriado de microrganismos (8.1).  7.5.  Inoculação das placas de Petri Com uma pipeta esterilizada (4.2.3), transferir 1 ml da amostra e/ou da diluição decimal adequada para uma placa (4.2.4). Devem ser examinadas pelo menos duas diluições. Preparar duas placas para cada diluição seleccionada adequadamente (8.1).  7.6.  Vazamento Verter aproximadamente 15-18 ml de meio (7.1) em cada placa inoculada.  Misturar imediatamente após o vazamento, fazendo girar a placa de Petri o suficiente para obter colónias uniformemente dispersas depois da incubação. O intervalo de tempo entre o fim da preparação da amostra de leite e a mistura da diluição com o meio  não deve exceder 15 minutos.  Deixar em repouso sobre uma superfície horizontal limpa e fresca até o meio solidificar.  7.7.  Incubação das placas de Petri Transferir as placas para a incubadora [4.1.3.b)]. Fazer a incubação com as placas invertidas. Não empilhar mais de seis placas em altura. As pilhas de placas devem ficar separadas umas das outras, das paredes e do tecto da incubadora.  Fazer a incubação à temperatura de 21 p 1 gC durante 25 horas.  7.8.  Contagem de colónias Fazer a contagem das colónias nas placas de Petri que não contenham mais do que 300 colónias.  Examinar as placas sob luz pouco intensa. Para facilitar a contagem pode ser utilizada uma lente adequada (4.1.6) e/ou um contador marcador (4.1.8). Evitar confundir com pequenas colónias as partículas de material precipitado nas placas. Examinar  cuidadosamente os objectivos duvidosos utilizando, se necessário, uma lente de maior ampliação (4.1.7), de modo a distinguir as colónias da matéria estranha.  As colónias invasoras são consideradas colónias únicas. Se menos de um quarto da placa estiver coberto com colónias invasoras, contar as colónias na parte não afectada da placa e calcular o número correspondente para toda a placa. Se mais de um quarto  da placa estiver coberto com colónias invasoras, rejeitar a placa.  8.  Cálculo e expressão dos resultados 8.1.  Utilizar as contagens de todas as placas que contenham entre 10 e 300 colónias (ver 8.3 e 8.4).  8.2.  O número de microrganismos por 1 ml de leite pasteurizado é dado pela fórmula:   (n1 + 0,1 n2) d   S C (n1 + 0,1 n2) d  em que S C representa a soma das colónias contadas conforme descrito no parágrafo 8.1,  (n1 + 0,1 n2) d representa o volume da amostra inoculada, em que:  n1 representa o número de placas contadas na primeira diluição,  n2 representa o número de placas contadas na segunda diluição,  d é o factor de diluição a partir do qual foram obtidas as primeiras contagens.  A contagem é arredondada para dois algarismos significativos. Quando o algarismo a ser arredondado for 5, faz - se o arredondamento de modo que o algarismo imediatamente à esquerda seja par.  Exemplo:  Diluição 10-2: 278 e 290 colónias Diluição 10-3:  33 e  28 colónias Número/ml =  278 + 290 + 33 + 28   Número/ml = 278 + 290 +33 + 28 (2 + 0,1 × 2) 10-2 Número/ml=  0,022   = 629 0,022 = 28 590 = 29 000 = 2,9 × 10%.   8.3.  Se existirem apenas contagens inferiores a 10, indicar que o número de microrganismos por mililitro é «inferior a 10 × d», sendo «d» o inverso do factor de diluição mais baixo.  8.4.  Se existirem apenas contagens superiores a 300 colónias e se a contagem for possível, proceder a uma estimativa e multiplicá-la pelo inverso do factor de diluição. Exprimir o resultado com a indicação «número estimado de microrganismos por mililitro».  9.  Precisão Não existem nenhuns resultados de ensaios circulares internacionalmente reconhecidos.  VI. ENUMERAÇÃO DE COLIFORMES - MÉTODO DA CONTAGEM DE COLÓNAS A 30 gC  1.  Objectivo e domínio de aplicação Neste capítulo descreve-se o processo de referência para a enumeração de coliformes em leite pasteurizado, por meio de uma técnica de contagem de colónias à temperatura de 30 gC.  2.  Definição O termo «coliformes» significa bactérias que à temperatura de 30 gC formam colónias características ou colónias não características que fermentam a lactose com produção de gás nas condições descritas.  3.  Princípio Mistura-se um determinado volume da amostra de leite com o meio de cultura em placas de Petri e faz-se a incubação à temperatura de 30 gC durante 24 horas. Procede-se à contagem das colónias caractéristicas e, se necessário, confirma-se a identidade das  colónias não características, testando a sua capacidade para fermentar a lactose. Depois calcula-se o número de coliformes por mililitro de leite pasteurizado.  4.  Aparelhos e utensílios de vidro Material corrente de laboratório e, em especial:  4.1.  Aparelhagem 4.1.1.  Estufa de ar quente, regulável para uma temperatura de 170 e 175 gC.  4.1.2.  Autoclave, regulável para a temperatura de 121 p 1 gC.  4.1.3. Incubadora, que mantenha uma temperatura de 30 p 1 gC em todos os pontos do seu interior.  4.1.4.  Medidor de pH, com compensação de temperatura, com uma precisão de p 0,1 unidades de pH.  4.1.5.  Banho-maria, regulável para uma temperatura de 45 p 1 gC.  4.1.6.  Agulha de platina iridiada ou de cromo-níquel.  4.2.  Utensílios de vidro 4.2.1.  Tubos de ensaio, com rolhas apropriadas e com uma capacidade de 20 ml para conter o meio de confirmação (5.2) e campânulas de Durham com as dimensões apropriadas para utilização com os tubos de ensaio.  4.2.2.  Balões com a capacidade de 150 a 250 ml para conter o meio sólido selectivo (5.1).  4.2.3.  Pipetas (com rolhas de algodão) de vidro ou de material sintético esterilizado, com as extremidades não partidas, possuindo uma capacidade nominal de 1-10 ml, e com um orifício de saída com um diâmetro de 1,75 a 3 mm.  4.2.4.  Placas de Petri, em vidro ou em material sintético esterilizado, transparente e incolor, possuindo o fundo da placa um diâmetro interior de aproximadamente 90-100 mm. A profundidade interior deve ser, no mínimo, 10 mm. O fundo da placa não deve  apresentar irregularidades que interfiram com a contagem das colónias.  4.2.5.  Esterilização dos utensílios de vidro Os utensílios de vidro devem ser esterilizados utilizando um dos métodos seguintes:  a)  Em estufa de ar quente (4.1.1), a uma temperatura compreendida entre 170 e 175 gC durante, pelo menos, 1 hora;  b)  Em autoclave (4.1.2), à temperatura de 121 p 1 gC, durante 20 minutos pelo menos.  Na autoclave devem ser tomadas todas as precauções possíveis para assegurar uma penetração adequada do vapor: se o material for esterilizado em recipientes, estes não devem ser fechados hermeticamente e as tampas ou as rolhas dos balões ou dos frascos  devem estar soltas.  Os utensílios de vidro esterilizados na autoclave devem ser secos a fim de se eliminar o vapor.  Esterilizar as pipetas numa estufa de ar quente (4.1.1).  5.  Meio de cultura 5.1.  Ágar de lactose e bílis com vermelho neutro e violeta cristal (ágar VRBL) Meio sólido selectivo.  Composição Peptona 7 g Extracto de levedura 3 g Lactose (C12H22O11.H2O) 10 g Cloreto de sódio (NaCl) 5 g Sais biliares 1,5 g Vermelho neutro 0,03 g Violeta cristal 0,002 g Ágar 10-15 g (dependendo das propriedades de gelificação do ágar utilizado) Água 1 000 ml Preparação Preparar uma suspensão e dissolver os componentes em água e deixar em repouso durante alguns minutos. Em seguida misturar vigorosamente.  Verificar o pH com um medidor de pH (4.1.4); se necessário, ajustar o pH utilizando uma solução (pelo menos 0,1 mol/l) de hidróxido de sódio ou de ácido clorídrico, de tal modo que, após a ebulição, o seu valor seja de 7,4 p 0,1 à temperatura de 25 gC.   Levar rapidamente à ebulição agitando frequentemente e repartir imediatamente o meio em quantidades de 100 a 150 ml, introduzidas em balões esterilizados (4.2.2). Arrefecer o meio para 45 p 1 gC em banho-maria (4.1.5).  Verificar a esterilidade do meio no momento da sua utilização (ver 6.4).  Utilizar o meio nas três horas que se seguem à sua preparação.  5.2.  Caldo de bílis e lactose com verde brilhante. Meio de confirmação.  Composição Peptona 10 g Lactose (C12H22O11.H2O) 10 g Bílis de boi desidratada 20 g Verde brilhante 0,0133 g Água 1 000 ml Preparação Dissolver os componentes em água, levando à ebulição.  Verificar o pH com um medidor de pH (4.1.4) e ajustar o pH, se necessário, utilizando uma solução (pelo menos 0,1 mol/l) de hidróxido de sódio ou de ácido clorídrico, de tal modo que, após a esterilização o seu valor seja de 7,2 p 0,1 à temperatura de  25 gC.  Repartir o meio em quantidades de 10 ml, colocando-as em tubos de ensaio (4.2.1) com as campânulas de Durham (4.2.1). Rolhar os tubos.  Fazer a esterilização em autoclave (4.1.2), à temperatura de 121 p 1 gC, durante 15 minutos.  As campânulas de Durham não devem conter bolhas de ar após a esterilização.  Verificar o pH do meio.  Se o meio não for utilizado imediatamente, conservá-lo em local escuro, a uma temperatura compreendida entre 0 e 5 gC, durante um período máximo de um mês após a sua preparação.  5.3.  Meios de cultura desidratados disponíveis comercialmente Os meios de cultura (5.1 e 5.2) podem ser preparados a partir de meios desidratados disponíveis comercialmente. Seguir as instruções do fabricante. Ajustar o pH, repartir, ferver ou esterilizar e armazenar os meios conforme descrito em 5.1 e 5.2.  6.  Técnica de procedimento 6.1.  O meio Utilizar o meio (gelose VRBL) descrito em 5.1.  6.2.  Preparação da amostra de leite Agitar vigorosamente a amostra de leite a fim de se obter uma repartição dos microrganismos tão homogénea quanto possível, invertendo rapidamente o recipiente que contém a amostra 25 vezes. Evitar a formação de espuma ou deixá-la dispersar. O intervalo  de tempo entre a mistura e a colheita da amostra de ensaio não deve exceder três minutos.  6.3.  Inoculação das placas de Petri Inocular 3 ml da amostra de leite (6.2), transferindo com uma pipeta esterilizada (4.2.3) uma quantidade de 1 ml da amostra para cada uma das três placas (4.2.4).  6.4.  Vazamento Vazar o ágar VRBL (6.1) em cada placa inoculada em quantidades de aproximadamente 12 ml.  Misturar imediatamente após o vazamento, fazendo girar a place de Petri o suficiente para se obter colónias uniformemente dispersas após a incubação.  O intervalo de tempo entre o fim da preparação da amostra de leite e a mistura da amostra de ensaio com o meio não deve exceder 15 minutos.  Para controlar a esterilidade, preparar uma placa não inoculada de controlo com 12 ml de ágar VRBL idêntico ao das placas inoculadas.  Deixar em repouso numa superfície horizontal e limpa até o meio solidificar.  Após a solidificação completa do meio, verter pelo menos 4 ml de gelose VRBL (6.1) sobre a superfície do meio inoculado.  Deixar solidificar.  6.5.  Incubação das placas de Petri Transferir as placas para a incubadora (4.1.3). Fazer a incubação com as placas invertidas. Não empilhar mais de seis placas em altura. As pilhas de placas devem ficar separadas umas das outras, das paredes e do tecto da incubadora.  Fazer a incubação à temperatura de 30 p 1 gC durante 24 p 2 horas.  6.6.  Contagem de colónias 6.6.1.  Contar as colónias nas placas de Petri que não contenham mais de 150 colónias. Contar as colónias de cor vermelho escuro que possuam um diâmetro de pelo menos 0,5 mm, com ou sem auréola de precipitado, características dos coliformes.  6.6.2.  Se todas ou apenas algumas colónias apresentarem um aspecto não característico (por exemplo, diferirem das colónias típicas quanto à cor, dimensões ou formação do precipitado), efectuar um teste de confirmação (6.7).  6.7.  Teste de confirmação De acordo com as indicações referidas no parágrafo 6.6.2, efectuar um teste de confirmação com um número adequado de colónias não caractéristicas (por exemplo, entre três e cinco), fazendo a sua inoculação em tubos contendo caldo de bílis e lactose com  verde brilhante (5.2), utilizando uma agulha metálica (4.1.6). Fazer a incubação dos tubos à temperatura de 30 p 1 gC durante 24 p 2 horas.  Considerar as colónias que produzem gás nas campânulas de Durham como sendo colónias confirmadas de coliformes.  7.  Cálculo e expressão dos resultados 7.1.  Paras a contagem (ver 7.4), utilizar as placas que não contenham mais de 150 colónias.  7.2.  No caso de se efectuar um teste de confirmação, calcular o número de colónias de coliformes a partir da percentagem de colónias de coliformes confirmadas.  7.3.  O número de coliformes por 1 ml de leite pasteurizado é dado pela fórmula seguinte:   S C  ,  S C n   em que S C representa o número total de colónias de coliformes (7.1 em ligação com 7.3) encontradas no exame da amostra de leite (3 ml),  n representa o número de mililitros da amostra examinada (6.3.1) (3 ml).  A contagem é arredondada a dois algarismos significativos se houver mais de 100 colónias. Quando o número a arredondar for 5, o arredondamento é feito de tal modo que o número imediatamente à esquerda seja par.  Se todas as contagens forem superiores a 150 colónias, exprimir o resultado obtido com a indicação «número estimado de coliformes por mililitro».  8.  Precisão Não existem quaisquer resultados de ensaios circulares internacionalmente reconhecidos.  VII. ENUMERAÇÃO DE CÉLULAS SOMÁTICAS  No presente capítulo descreve-se dois procedimentos de referência para a contagem de células somáticas:  A.  Método microscópico B.  Método fluoro-opto-electrónico  A. Método microscópico 1.  Objectivo e domínio de aplicação Este procedimento especifica o método de referência para a contagem de células somáticas em leite cru.  Este procedimento especifica o método para a contagem do número de células numa amostra de leite para calibrar e verificar a precisão do método fluoro-opto-electrónico (ver B.1).  2.  Definição No âmbito deste método, as células somáticas são células (como, por exemplo, os leucócitos e as células epiteliais) cujos núcleos podem ser corados distintamente utilizando azul de metileno.  3.  Princípio Espalha-se 0,01 ml de leite em 1 cm$ de uma lâmina. A película formada é seca e corada. Efectua-se a contagem ao microscópio. O número de células somáticas contadas numa deterimanda área é multiplicado por um factor de multiplicação a fim de se obter o  número de células por mililitro.  4.  Reagentes Os produtos químicos utilizados devem ser de qualidade analítica.  Solução corante Composição Azul de metileno  0,6 g Etanol - 99 % 54,6 ml 1,1,1-tricloroetano ou tetracloroetano 40,6 ml Ácido acético glacial  6,6 ml Aviso O tetracoloroetano é tóxico. Se for utilizado, a preparação e a aplicação devem ser efectuadas em ambiente com exaustor.  Preparação Misturar o etanol e o 1,1,1-tricoloroetano ou tetracloroetano num frasco e aquecer em banho-maria à temperatura de 60-70 gC. Adicionar o azul de metileno, misturar cuidadosamente, arrefecer para 4 gC num frigorífico durante um período de 12 a 24 horas e  depois adicionar ácido acético glacial. Filtrar sobre filtro poroso, com poros de 10 a 12 micra no máximo, e conservar a solução corante num frasco hermeticamente fechado. No caso de haver formação de partículas ou sedimentos, filtrar novamente antes da  utilização.  5.  Aparelhos e utensílios de vidro 5.1.  Microscópio, com uma ampliação de 500 a 1 000 vezes.  5.2.  Micro-seringa, de 0,01 ml com uma precisão igual ou superior a p 2 %.  5.3.  Lâmina de suporte, com uma superfície marcada de 20 mm × 5 mm para a película, ou uma lâmina normalizada e um molde de 20 mm × 5 mm para a película.  5.4.  Placa de aquecimento horizontal (30-50 gC) para secagem das lâminas.  5.5.  Ventilador, (tipo secador de cabelo) para secagem de películas.  5.6.  Banho-maria, regulável para a temperatura de 30-40 gC para aquecer a amostra de leite.  5.7.  Micrómetro de objectiva, graduado em divisões de 0,01 mm.  6.  Técnica de procedimento 6.1.  Amostra de leite A amostra de leite deve ser analisada nas seis horas que se seguem à colheita dessa amostra. Durante a armazenagem, a temperatura da amostra não deve exceder 6 gC. Deve ser evitada a congelação.  6.2.  Preparação da amostra em laboratório Aquecer a amostra em banho-maria (5.6) à temperatura de 30-40 gC e depois misturar cuidadosamente. Arrefecer até à temperatura a que a micro-seringa (5.2) foi calibrada, por exemplo 20 gC.  6.3.  Pré-tratamento das lâminas Limpar as lâminas (5.3), por exemplo com etanol, secá-las com um papel que não liberte partículas, levá-las à chama e deixar arrefecer. Conservá-las numa caixa ao abrigo de poeiras.  6.4.  Preparação da película Retirar 0,01 ml da amostra de leite preparada como anteriormente referido, utilizando uma micro-seringa (5.2). Limpar cuidadosamente a parte exterior da seringa em contacto com o leite. Colocar o conteúdo da seringa na lâmina (5.3) definindo primeiro o  contorno do rectângulo (20 mm × 5 mm). Em seguida, espalhar a amostra nessa área de forma tão uniforme quanto possível. Secar completamente a película numa placa de aquecimento horizontal (5.4).  Devem ser preparadas e examinadas pelo menos duas películas de cada amostra de leite.  6.5.  Coloração das películas Mergulhar em solução corante (ver 4) durante 10 minutos. Secar completamente e, se necessário, utilizar um ventilador (5.5). Mergulhar as películas em água até à remoção completa do corante em excesso. Secar novamente e conservar, protegendo das  poeiras.  6.6.  Calibração do campo do microscópio A partir da ampliação escolhida (500 × - 1 000 ×), medir com a ajuda do micrómetro de objectiva (5.7) o diâmetro do campo do microscópio.  7.  Contagem e cálculo 7.1.  Contagem de células Utilizar um microscópio (5.1). Em vez de contar as células, conta-se apenas os núcleos claramente reconhecíveis e dos quais pelo menos a metade seja visível no campo do microscópio. Contar as bandas ou os campos situados no terço central da película,  evitando contar as bandas ou os campos seleccionados exclusivamente nas zonas periféricas da película. A cuidadosa preparação das películas e, consequentemente, a exactidão dos resultados devem ser verificados pelo menos mensalmente procedendo à  contagem em partes diferentes da película. A contagem também pode ser efectuada contando os campos microscópicos dispersos de tal modo que todas as partes da película se encontrem igualmente representadas.  7.2.  Determinação do número mínimo de células a contar Dado que a contagem de células somáticas ao microscópio pode também ser utilizada para a normalização dos processos de contagem automáticos e mecanizados, o coeficiente de variação das contagens em amostras idênticas não pode ser superior ao dos  instrumentos electrónicos. O coeficiente de variação para uma amostra de leite que contenha entre 400 000 e 600 000 células por mililitro não deve exceder 5 %.  O número de células somáticas a contar em cada amostra deve ser, de acordo com a lei de distribuição de Poisson, de pelo menos 400, a fim de se obter essa repetibilidade.  De acordo com a lei de distribuição de Poisson,  M = V = s$,  em que M representa o valor médio,  V representa a variância, e s representa o desvio-padrão.  O coeficiente de variação é dado por:  CV =  s × 100 %  ou CV =  100 %  ou CV =  100 %   CV = s × 100 % M ou CV = 100 % s ou CV = 100 % wM- M (média) representa o número de partículas (células) contadas (por exemplo, 400 para CV = 5 %).  7.3.  Cálculo do factor de multiplicação Quando se utilizar 0,01 ml de leite, o factor de multiplicação é calculado conforme indicado nos parágrafos 7.3.1 ou 7.3.2.  7.3.1.  Contagem das bandas ao longo da película O comprimento das bandas a contar é de 5 mm para cada uma. A largura de cada banda corresponde ao diâmetro do campo microscópico, conforme determinado pelo micrómetro de objectiva (5.7).  Factor de multiplicação =  20× 100   Factor de multiplicação =20 × 100 d × b em que d  representa o diâmetro do campo microscópico em milímetros, conforme determinado pelo micrómetro de objectiva (5.7),  b  representa o número de bandas contadas na totalidade.  7.3.2.  Contagem de campos microscópicos no terço central da película ou com o auxílio de uma grelha Factor de multiplicação =  20 × 5 × 100  =  12 732   Factor de multiplicação =20 × 5 × 100 P × d² × s 4 = 12 732 d² × s em que:  d  representa o diâmetro do campo microscópico em milimetros, conforme determinado pelo micrómetro de objectiva (5.7),  s  representa o número de campos contados.  7.4.  Cálculo do teor em células Multiplica-se o número de células somáticas contadas (7.1. e 7.2) pelo factor de multiplicação (7.3), a fim de se obter o número de células por mililitro de leite.  7.5.  Precisão O coeficiente de variação (ver 7.2) não deve exceder 5 %.  Não existem quaisquer resultados de ensaios circulares internacionalmente reconhecidos em matéria de precisão.   B. Processo fluoro-opto-electrónico 1.  Objectivo e domínio de aplicação Este procedimento especifica o método de referência que pode ser utilizado, após uma calibração adequada (ver A.1), para a contagem das células somáticas em leite cru, com ou sem conservantes químicos.  2.  Definição No âmbito deste método, as células somáticas são partículas que têm uma intensidade mínima de fluorescência devida à coloração do ADN do núcleo das células somáticas.  3.  Princípio Mistura-se convenientemente uma parte da amostra (por exemplo 0,2 ml) com a solução-tampão e com a solução fluorescente. Transfere-se parte dessa mistura, sob a forma de uma película fina, para um disco rotativo que serve de plano para observação no  microscópio. Cada célula produz um impulso eléctrico que é amplificado e registado. O número de células somáticas é impresso, em milhares de células por mililitro.  4.  Reagentes Salvo indicação em contrário, devem ser utilizados produtos químicos de qualidade analítica. A água utilizada deve ser destilada, desionizada e de uma pureza equivalente.  4.1.  Solução-tampão Composição Hidrogenoftalato de potássio 51,0 g Hidróxido de potássio 13,75 g Éter polietilenoglicol-mono-p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenílico (por exemplo Triton X-100), 1 % em volume 10,0 ml pH 5,7-5,9. Adicionar água destilada até perfazer o volume de 10 000 ml.  Preparação Misturar os diversos componentes. A conservação em recipientes estanques ao ar não deve exceder sete dias.  4.2.  Solução fluorescente (solução-mae) Composição Brometo de etídio 1,0 g Adicionar água destilada até perfazer o volume de 1 000 ml Preparação Dissolver o brometo de etídio em água. A conservação num frasco estanque à luz e ao ar não deve exceder dois meses.  4.3.  Solução fluorescente (solução de trabalho) Misturar 20 ml da solução-mae (4.2) à solução-tampão (4.1) de modo a obter 1 000 ml. A solução de trabalho não deve ser utilizada decorridos mais de sete dias.  4.4.  Solução de lavagem Composição Solução-tampão (4.1) 10,0 ml Éter polietilenoglicol-mono-p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenílico (por exemplo Triton X-100, 1 % em volume 10,0 ml Amónia, 25 % em volume 25,0 ml Adicionar água destilada até perfazer o volume de 10 000 ml.  Preparação Misturar os diversos componentes. O período de armazenagem não deve exceder 30 dias.  5.  Aparelhos e utensílios de vidro 5.1.  Aparelho de contagem, que funcione de acordo com o princípio da fluorescência óptica.  Nota Antes de ser utilizado, o instrumento deve ser calibrado. Assim, determina-se a relação entre o volume das partículas que se pretende contar e o limiar acima do qual são efectuadas as contagens. A calibração do aparelho é feita de acordo com as  instruções do fabricante, utilizando amostras cujo teor em células tenha sido determinado pelo método microscópico (A).  5.2.  Banho-maria, com circulação, regulável para a temperatura de 40 p 1 gC.  5.3.  Tubo de ensaio, com vedação apropriada e com uma capacidade de cerca de 15 ml.  6.  Amostra de leite 6.1.  A amostra deve ser conservada a baixa temperatura num tubo de ensaio (5.3). Se a amostra não tiver sido conservada quimicamente, a contagem não deve ser efectuada nas 24 horas que decorrem imediatamente após a ordenha, um vez que a contagem será muito  baixa. A temperatura de conservação não deve exceder 6 gC.  6.2.  Conservação A conservação química deve ser efectuada num período de 24 horas.  A conservação deve ser efectuada o mais rapidamente possível após a colheita de amostras.  6.2.1.  A conservação química das amostras pode ser efectuada pela adição de um dos seguintes conservantes:  - ácido ortobórico:  A concentração final de ácido ortobórico na amostra não deve exceder 0,6 g/100 ml. As amostras assim conservadas podem ser armazenadas durante mais 24 horas a uma temperatura compreendida entre 6 e 12 gC,  - dicromato de potássio:  A concentração final de dicromato de potássio não deve exceder 0,2 g/100 ml. As amostras assim conservadas podem ser armazenadas durante mais 72 horas a uma temperatura compreendida entre 6 e 12 gC,  - azida de sódio:  As amostras poden ser conservadas com azida de sódio até uma concentração final de 0,024 g/100 ml, desde que as amostras sejam arrefecidas para uma temperatura compreendida entre 6 e 12 gC imediatamente após a sua colheita, e contadas nas 48 horas  seguintes,  - bronopol:  As amostras podem ser conservadas com bronopol até uma concentração final de 0,05 g//100 ml, desde que essas amostras sejam arrefecidas para uma temperatura compreendida entre 6 e 12 gC imediatamente após a sua colheita, e contadas nas 72 horas  seguintes.  6.2.2.  As amostras já conservadas com ácido ortobórico podem ser conservadas durante mais 48 horas com a adição de dicromato de potássio.  Nota Para as amostras conservadas com dicromato de potássio devem ser observadas as normas locais relativas à descarga de efluentes.  7.  Técnica de procedimento 7.1.  Pré-tratamento das amostras O leite a examinar deve ser guardado após a ordenha durante pelo menos 24 horas, a uma temperatura compreendida aproximadamente entre 2 e 6 gC. A contagem das amostras no dia da ordenha não é recomendável sem que se tenha feito um tratamento prévio,  porque os resultados podem ser demasiado baixos. Se a contagem deste tipo de amostras tiver que se feita, as amostras devem ser pré-tratadas com dicromato de potássio durante pelo menos três horas (ver 6.2.1).  7.2.  Preparação Aquecer em banho-maria (5.2), à temperatura aproximada de 40 gC, a amostra pré-tratada (7.1) ou a amostra não tratada que tenha pelo menos um dia. Em seguida conservar a amostra à temperatura ambiente até à realização da contagem.  7.3.  Contagem das células A contagem deve ser efectuada utilizando o aparelho de contagem (5.1) nos 15 minutos seguintes ao aquecimento (ver 7.2). As amostras devem ser muito bem misturadas imediatamente antes da contagem, a fim de se obter uma distribuição tão homogénea quanto possível das células somáticas.  A diluição e a preparação subsequentes das amostras efectuam-se automaticamente no aparelho.  8.  Precisão Não se encontram disponíveis os valores da repetibilidade (r) e da reprodutibilidade (R) obtidos em ensaios circulares internacionalmente reconhecidos.  Futuramente, os critérios de precisão serão definidos por um laboratório de referência de contagem das células encarregado de organizar e de avaliar regularmente os ensaios circulares.  Os dados disponíveis à escala nacional permitem efectuar as estimativas seguintes:  número de células variável entre 400 000 e 500 000/ml:  - desvio-padrão para a repetibilidade:  sr = 20 000 células/ml (equivalente a um coeficiente de variação de 5 %-4 %),  - desvio-padrão para a reprodutibilidade:  sR = 40 000 células/ml (equivalente a um coeficiente de variação de 10 %-8 %).  9.  Controlo de exactidão O controlo de exactidão efectua-se utilizando amostras com um teor em células conhecido, determinado por contagem de células ao microscópio num laboratório nacional de referência.  VIII. DETECÇÃO DE ANTIBIÓTICOS E DE SULFAMIDAS  OBJECTIVO E DOMÍNIO DE APLICACAO No presente capítulo descreve-se o processo de referência que permite detectar a presença de antibióticos e de sulfamidas em leite cru e em leite tratado termicamente.  O processo de referência engloba:  A. Um processo qualitativo Consiste num processo inicial que permite seleccionar as amostras de leite que contêm antibióticos e sulfamidas. O processo descrito é um processo seleccionado entre diversos processos idênticos os quais utilizam todos, em princípio, Bacillus  stearothermophilus, variedade calidolactis, ATCC 10149, como organismo de ensaio. Considera-se que o processo escolhido é representativo destes ensaios de detecção.  B. Um processo para confirmação e identificação da penicilina Este processo deve ser utilizado para confirmar os resultados do processo qualitativo, e permite ainda identificar a penicilina e determinar a sua concentração.   A. Processo qualitativo 1.  Objectivo e domínio de aplicação Este processo descreve a técnica de detecção qualitativa de antibióticos e de sulfamidas no leite cru e no leite tratado termicamente, para concentrações superiores aos limites fixados no quadro que se segue:   Concentrações detectáveis de diversos antibióticos e sulfamidas (¹)    Limite de detecção Negativo Positivo Benzilpenicilina 0,002  0,006 Ampicilina 0,002  0,005 Cloxacilina 0,015  0,035 Nafcilina 0,006  0,011 Tetraciclina HCl 0,10   0,40  Oxitetraciclina 0,20   0,45  Clortetraciclina 0,15   0,50  Cloram-fenicol 7,  15,  Di-hidrostreptomicina 4,  13,  Neomicina 1,  22,  Kanamicina 9,  28,  Bacitracina 0,06   0,14  Eritromicina 1,   2,25  Rifamicina 0,01   0,14  Diafenilsulfona 0,01   0,1   Sulfametazina (sulfadimidina) 0,5    1,  (¹) A benzilpenicilina e a bacitracina são expressas em UI/ml; todos os outros antibióticos são expressos em mg/ml.  2.  Definição O leite contém antibióticos ou sulfamidas quando a cor do meio não se altera (ver 7.1).  3.  Princípio Adiciona-se a amostra de leite com a mistura de nutrientes a uma gelose de ágar contendo um indicador de pH e esporos de Bacillus stearothermophilus, variedade calidolactis ATCC 10149 (ver 5.4.1), que apresenta, de um modo geral, uma boa sensibilidade,  especialmente à penicilina. Após a incubação, o crescimento normal e a produção de ácidos pelo organismo provoca a mudança de cor do indicador de pH, que passa de púrpura a amarelo. A presença no leite de substâncias inibidoras do crescimento do  organismo tem como resultado a manutenção da cor púrpura do indicador de pH.  4.  Aparelhos e utensílios de vidro Material corrente de laboratório, designadamente:  4.1.  Aparelhos 4.1.1.  Incubadora, regulável para a temperatura de 64 p 1 gC.  4.1.2.  Banho-maria, regulável para a temperatura de 64 p 1 gC.  4.1.3.  Prateleira para tubos ou ampolas.  4.1.4.  Seringa para utilização única, com ponteiras descartáveis, adequada para colher amostras e distribuir quantidades de 0,1 ml.  4.1.5.  Pinça 4.1.6.  Estufa de ar quente, regulável para uma temperatura entre 170 gC e 175 gC.  4.1.7.  Autoclave, regulável para a temperatura de 121 gC p 1 gC.  4.1.8.  Medidor de pH 4.2.  Utensílios de vidro 4.2.1.  Frascos para as amostras, com fechos adequados.  Nota Algumas rolhas de borracha podem depositar substâncias inibidoras sobre a orla do gargalo do frasco.  4.2.2.  Placas de Petri, feitas de uma substância sintética esterilizada ou feitas de vidro incolor transparente, com um diâmetro interno mínimo de cerca de 140 mm, e com o fundo perfeitamente plano.  4.2.3.  Frascos, com uma capacidade de 250 ml.  4.2.4.  Pipetas, (rolhadas com algodão em rama), feitas de vidro ou de um material sintético esterilizado, com uma capacidade nominal de 1 ml e de 10 ml.  4.2.5.  Espátulas de vidro 4.2.6. Tubos ou ampolas, com tampas ou rolhas, com um diâmetro interno de 8 mm, aproximadamente.  4.2.7.  Esterilização dos utensílios de vidro Os utensílios de vidro devem ser esterilizados utilizando um dos processos seguintes:  a)  Em estufa de ar quente (4.1.6), a uma temperatura compreendida entre 170 e 175 gC, durante pelo menos uma hora;  b)  Em autoclave (4.1.7), à temperatura de 121 gC, durante 20 minutos pelo menos.  Na autoclave devem ser tomadas todas as precauções possíveis para garantir uma penetração adequada do vapor: se o material for esterilizado em recipientes, estes não devem ser fechados hermeticamente, devendo as rolhas ou as tampas dos balões ou dos  frascos ficar soltas.  Os utensílios de vidro esterilizados em autoclave devem ser secos a fim de se eliminar o vapor.  Esterilizar as pipetas na estufa de ar quente. 5.  Meios, soluções, organismo de ensaio Os componentes de base dos meios devem ser adequados para análises bacteriológicas. A água utilizada deve ser destilada em aparelhos de vidro ou deve ser desmineralizada de pureza equivalente. Não deve conter quaisquer substâncias inibidoras do  crescimento do organismo de teste.  5.1.  Meios 5.1.1.  Gelose nutritiva Composição Extracto de levedura 2 g Peptona 5 g Extracto de carne 1 g Cloreto de sódio 5 g Gelose 10-15 g Água destilada 1 000 ml Preparação Dissolver os componentes em água. Levar até ao ponto de ebulição agitando de vez em quando. Ajustar o pH de tal modo que após a esterilização o seu valor seja de 7,4 p 0,1 à temperatura de 25 gC.  Repartir quantidades de 10 ml por tubos de ensaio ou de 100 ml por frascos e inclinar para obter um declive.  Esterilizar à temperatura de 121 p 1 gC durante 15 minutos.  5.1.2.  Meio de ágar-ágar (gelose) Composição Cloreto de sódio 2 g Gelose 15 g Água 1 000 ml Solução de trimetropim ou de tetroxoprim (ver 5.1.3) (1) 10 ml.  Preparação Dissolver os componentes em água, excepto o trimetroprim ou tetroxoprim. Levar até ao ponto de ebulição agitando de vez em quando. Adicionar trimetroprim ou tetroxoprim e esterilizar à temperatura de 121 p 1 gC durante 15 minutos. Ajustar o pH de tal  modo que, após a esterilização, o seu valor seja de 7,0 p 0,1 à temperatura de 25 gC.  5.1.3.  Solução de trimetroprim ou de tetroxoprim Composição Trimetroprim 5 mg ou tetroxoprim 30 mg Etanol a 96 % 5 ml ou 30 ml Água até 1 000 ml Preparação Dissolver o trimetroprim ou o tetroxoprim (5 ou 30 ml) em etanol e completar o volume com água.  5.1.4.  Mistura nutritiva Composição Extracto de levedura 0,75 mg Glicose 5,0 mg Amido solúvel 8,0 mg Púrpura de bromocresol 0,025 g Água até 50 ml Preparação Dissover a mistura nutritiva e o indicador em água, aquecendo se necessário, e esterilizar por filtração. A mistura nutritiva encontra-se comercialmente disponível sob a forma de pastilhas.  5.2.  Soluções-padrão de penicilina 5.2.1.  Preparar uma solução de penicilina de 60 mg/ml = (100 UI/ml) dissolvendo cristais de benzilpenicilinato de sódio ou de potássio em água destilada e esterilizada num frasco esterilizado adequadamente rolhado.  5.2.2.  Preparar uma solução diluída de penicilina utilizando 1,25 ml da solução de penicilina (5.2.1) e adicionando água destilada e esterilizada até perfazer o volume de 1 000 ml. Essa solução diluída contém 0,075 mg de penicilina/ml (= 0,125 UI de  penicilina/ml).  5.2.3.  Preparar 75 ml de uma solução-padrão de penicilina contendo (0,004 mg de penicilina/ml (= 0,0067 UI de penicilina/ml), adicionando 71 ml de leite isento de inibidores (5.3) a 4 ml de solução diluída de penicilina (5.2.2) e misturar.   5.2.4.  As soluções de penicilina referidas nos parágrafos 5.2.1 a 5.2.3 devem ser preparadas no dia em que o teste é efectuado.  5.3.  Leite isento de substâncias inibidoras Preparar uma amostra de controlo de leite isento de substâncias inibidoras dissolvendo em água destilada e esterilizada leite em pó desnatado (10 % m/v) previamente testado e comprovadamente isento de substâncias inibidoras. Em alternativa, pode  distribuir-se por diversos frascos uma quantidade suficiente de leite fresco a granel testado e reconhecidamente isento de substâncias inibidoras, aquecida à temperatura de 100 gC durante uma hora e conservada depois num frigorífico a uma temperatura  entre 0-6 gC durante um período máximo de uma semana.  5.4.  Organismo de teste 5.4.1.  Utiliza-se como organismo de teste o Bacillus stearothermophilus, variedade calidolactis, estirpe ATCC 10149. A estirpe ATCC 10149 é idêntica à estirpe C 953.  5.4.2.  Preparar uma cultura de reserva para conservação da estirpe. A conservação efectua-se com gelose nutritiva inclinada (5.1.1). A gelose inclinada é inoculada à superfície, utilizando uma agulha impregnada com a cultura de ensaio, e depois faz-se a  incubação aerobiamente durante 48 horas à temperatura de 63 p 1 gC. Após a incubação fecha-se o tubo hermeticamente com uma rolha de borracha esterilizada. A cultura de reserva assim obtida pode ser mantida num frigorífico à temperatura de 0-5 gC  durante vários meses.  5.5.  Cultura de ensaio (suspensão de esporos) 5.5.1.  Transferir assepticamente 20 ml de ágar nutritivo previamente fundido (5.1.1) para uma placa de Petri esterilizada (4.2.2) e deixar arrefecer até à temperatura ambiente.  5.5.2.  Com uma pipeta esterilizada (4.2.4), transferir 5 ml de água destilada e esterilizada para um tubo que contenha a cultura de reserva (5.4.2) e retirar por lavagem os esporos que se encontram no ágar inclinado, com o auxílio de uma agulha esterilizada.  Conservar a suspensão de esporos à temperatura de 0-5 gC e utilizá-la nas 36 horas subsequentes.  5.5.3.  Com uma pipeta esterilizada (4.2.4), transferir 0,5 ml de suspensão de esporos (5.5.2) para uma placa que contém o meio (5.5.1) e espalhar cuidadosamente o inóculo por toda a superfície utilizando uma vareta de vidro encurvada. Fazer a incubação à  temperatura de 63 p 1 gC (4.1.1) durante 16-18 horas.  Quando se utiliza uma cultura de reserva (5.4.2) ou uma cultura preparada há mais de 36 horas, a técnica de repicagem deve ser executada pelo menos duas vezes com um intervalo de tempo não superior a 36 horas entre sub-culturas.  5.5.4.  Com uma pipeta esterilizada (4.2.4), transferir 10 ml de água destilada para uma placa que contenha a cultura (5.5.3) e remover da superfície os esporos em suspensão utilizando uma vareta de vidro.  Transferir a suspensão de esporos (4.2.3) para um frasco (5.2.3) contendo 250 ml de água destilada e esterilizada. Fecher o frasco e agitar vigorosamente. As culturas que não se destinam a ser utilizadas imediatamente para repicagem de sub-culturas  devem ser conservadas num frigorífico a uma temperatura entre 0-6 gC.  5.5.5.  A suspensão de esporos deve apresentar uma contagem da colónia viável entre 5 e 10 milhões por mililitro, numa placa de contagem com o meio de cultura de ágar incubado à temperatura de 63 p 1 gC durante 16-18 horas. A suspensão de esporos deve apresentar-se uniformemente turva e se contiver flocos ou sedimentos deve ser rejeitada, preparando-se nova suspensão a partir da cultura de reserva (5.4.2).  5.6.  Preparação dos tubos de ensaio/ampolas 5.6.1.  Fundir o meio de gelose (5.1.2) e depois arrefecer para a temperatura de 55 gC.  5.6.2.  Adicionar uma parte de suspensão de esporos recém-preparada (5.5.4) a cinco partes de meio de gelose (5.6.1) num tubo ou num frasco e misturar cuidadosamente.  5.6.3.  Transferir para um tubo esterilizado ou para uma ampola esterilizada (4.2.6) uma quantidade de 0,3 ml de meio inoculado (5.6.2) de modo a proporcionar uma camada uniforme de 5 mm de espessura e depois tapar com uma rolha ou com uma tampa, ou por fusão  da extremidade. Deixar que esses tubos de ensaio ou ampolas arrefeçam na posição vertical até à solidificação do meio e depois deixar em repouso durante pelo menos 12 horas.  5.6.4.  Os tubos de ensaio ou ampolas podem ser utilizados no mesmo dia ou podem ser conservados durante vários meses à temperatura de 0-6 gC desde que sejam arrefecidos imediatamente após a sua preparação.  6.  Técnica de procedimento 6.1.  As amostras devem ser testadas logo que possível e de preferência nas 24 horas a seguir à colheita, mantendo-se a sua temperatura compreendida entre 0 e 5 gC. Se não for possível proceder ao ensaio das amostras dentro desse período de 24 horas, devem  ser conservadas num congelador (a uma temperatura entre -30 e -15 gC) para minimizar a inactivação da penicilina.  6.2.  Identificar cada tubo ou ampola (5.6) de forma legível e indelével. Retirar a tampa ou a rolha. Colocar num suporte adequado (4.1.3) o número necessário de tubos ou ampolas para as amostras e controlos (5.2 e 5.3) que se pretende examinar.  6.3.  Adicionar a cada tubo ou ampola 50 microlitros da mistura nutriente (5.1.4).  6.4.  Misturar cuidadosamente as amostras de leite a examinar e transferir com uma seringa (4.1.4) a quantidade de 0,1 ml para os tubos ou ampolas com a identificação correspondente. Utilizar uma ponteira descartável diferente e limpa para cada amostra a  transferir.  6.5.  Repetir duas vezes a operação descrita em 6.4, utilizando a solução-padrão de penicilina contendo 0,004 mg/ml (= 0,0067 UI/ml) de penicilina, em vez da amostra de leite (5.2.3).  6.6.  Repetir duas vezes a operação descrita em 6.4 utilizando o controlo de leite isento de inibidores (5.3) em vez da amostra de leite.  6.7.  Tapar os tubos ou ampolas e colocar o suporte com os tubos/ambolas em banho-maria à temperatura de 63 p 1 gC (4.1.2) durante pelo menos 2;/2-2=/4 horas.  6.8.  Retirar do banho-maria o suporte com os tubos ou ampolas.  6.9.  Observar a cor do meio de ensaio (ver 7).  7.  Interpretação dos resultados 7.1.  Uma coloração púrpura do meio de ensaio em qualquer amostra de leite ou controlo contidos nos tubos ou ampolas indica a presença de antibióticos ou de sulfamidas na amostra ao nível correspondente à classificação «positivos», ou próximo disso, conforme  referido no quadro da página 39. A coloração dos tubos ou ampolas contendo a solução-padrão de penicilina (6.5) deverá continuar púrpura como prova de que o meio de ensaio é suficientemente sensível.  7.2.  Uma coloração púrpura parcial do meio de ágar ou uma coloração irregular nos tubos ou ampolas contendo a amostra de leite indica a presença de substâncias inibidoras de acordo com os níveis representados no quadro da página 39.  7.3.  Uma coloração amarela do meio de ensaio em qualquer das amostras de leite ou de controlo contidas nos tubos ou ampolas indica a ausência de substâncias inibidoras do organismo de teste.  7.4.  No caso de se verificar uma coloração púrpura em todas as amostras contidas nos tubos ou ampolas, incluindo o controlo negativo, isso significa que os tubos ou ampolas não contêm esporos activos, devendo as amostras ser novamente ensaiadas utilizando  preparações recentes de todos os meios reagentes e também do organismo de teste.  8.  Confirmação dos resultados 8.1.  Confirmar os resultados de todas as amostras recorrendo às reacções descritas em 7.1 e 7.2, de acordo com o «método B». Se for necessário conservar as amostras de leite antes dos ensaios de confirmação, devem ser congeladas a baixa temperatura para  evitar a degradação dos antibióticos.   B. Processo para a confirmação da presença de penicilinas e determinação da sua concentração 1.  Objectivo e domínio de aplicação Este processo descreve o ensaio de confirmação da presença de penicilinas ou de outros antibióticos e descreve o método de determinação da concentração da penicilina em amostras de leite com reacção positiva (A.7.1) ou duvidosa (A.7.2).  Sensibilidade de vários antibióticos a este processo Ver A.1.  2.  Definição 2.1.  A amostra de leite contém antibióticos incluindo sulfamidas quando, ensaiada pelo método descrito, apresentar uma zona de inibição clara de pelo menos 2 mm em torno do disco.  2.2.  Se uma amostra que contém antibióticos incluindo sulfamidas (2.1) e à qual se adicionou penicilinase (betalactamase) não apresentar nenhuma zona clara ou se apresentar uma zona clara de diâmetro inferior ao da respectiva amostra sem a adição de  penicilinase, então a substância inibidora é penicilina ou é penicilina e outro antibiótico, incluindo as sulfamidas.  2.3.  Se a zona não for inactivada pela penicilinase (2.2), a substância inibidora contida na amostra de leite é um antibiótico diferente da penicilina, mas pode ser também um outro resíduo [ver a Directiva 85/397/CEE, no. 1, alínea f), e no. 2, alínea b), do  anexo A].  Algumas das penicilinas semi-sintéticas, por exemplo a cloxacilina sódica, não são ou são parcialmente inactivadas pela penicilinase, ou são resistentes, não sendo portanto identificadas como penicilinas (ver 7.3).  3.  Princípio Coloca-se um disco de papel de filtro impregnado com leite que se pretende analisar, sobre a superfície de um meio de gelose inoculado com Bacillus stearothermophilus, variedade calidolactis. Um crescimento normal deste organismo após a incubação  provoca a turvação do meio. A presença no leite de substâncias inibidoras do crescimento do organismo de teste produz uma zona clara em torno do disco. As dimensões dessa zona dependem, entre outros factores, da concentração e tipo de substância  inibidora existente no leite.  4.  Aparelhos, utensílios de vidro e material 4.1.  Aparelho 4.1.1.  Ver A.4.1.  4.1.2.  Banho-maria, regulável para a temperatura de 80 gC p 1 gC.  4.2.  Utensílios de vidro Ver A.4.2.  4.3.  Discos de papel, isentos de substâncias inibidoras possuindo entre 9 e 13 mm de diâmetro, suspectíveis de absorver 130 mg de leite (conservar de preferência num excicador).  5.  Meios, soluções-padrão, solução de penicilinase, reagentes, organismo de teste, etc.  Os componentes dos meios devem ser adequados para as análises bactereológicas. A água utilizada deve ser água destilada em utensílios de vidro ou água desmineralizada de pureza equivalente, isenta de substâncias que possam inibir o crescimento dos  microrganismos.  5.1.  Meios 5.1.1.  Gelose nutritiva (A.5.1.1).  5.1.2.  Meio de ensaio para a detecção de substâncias inibidoras Composição Extracto de levedura 2,5 g Triptona 5 g Glicose 1 g Solução de trimetoprim (ou de tetroxoprim) (A5.1.3) 10 ml Ágar 10-15 g (conforme as propriedades gelificantes) Água 1 000 ml Preparação Dissolver completamente os componentes sólidos em água, aquecendo e agitando antes de adicionar a solução de trimetoprim ou de tetroxoprim. Depois da adição da solução de trimetoprim ou de tetroxoprim, ajustar o pH de tal modo que após a esterilização o  seu valor seja 8,0 p 0,1 à temperatura de 25 gC. Esterilizar o meio durante 15 minutos à temperatura de 121 p 1 gC.  5.2.  Soluções-padrão de penicilina em leite Ver A.5.2 Para a quantificação das sustâncias inibidoras (ver 8), preparar soluções-padrão de penicilina em leite isento de substâncias inibidoras (A.5.3), nas concentrações seguintes:  a)  0,004 mg/ml (0,0067 UI/ml);  b) 0,006 mg/ml (0,01 UI/ml);  c) 0,03 mg/ml (0,05 UI/ml);  d) 0,06 mg/ml (0,1 UI/ml).  5.3.  Solução de penicilinase 5.3.1.  Dissolver em água destilada e esterilizada uma quantidade de penicilinase (betalactamase) até se obter uma concentração de 1 000 U/ml. Esta solução, de preferência dividida em pequenas porções, pode ser conservada a uma temperatura entre 0-5 gC durante  quatro semanas no máximo.  Nota Não há normas internacionais uniformes para a penicilinase. Para efeitos do presente processo, admite-se que 10 unidades de penicilinase são o suficiente para inactivar 0,6 mg (= 1 UI) de penicilina. No caso de ser desconhecida a actividade da  penicilinase, é necessário verificar se o pressuposto anterior é válido. Caso contrário, deverá modificar-se a concentração da solução de penicilinase de modo adequado.  5.3.2.  Em vez de uma solução de penicilinase, podem ser utilizados discos impregnados com penicilinase disponíveis comercialmente desde que, após procedimento de controlo, se verificar que contêm a quantidade adequada de penicilinase.  5.4.  Organismo de teste Ver A.5.4.  5.5.  Cultura de ensaio (suspensão de esporos) Ver A.5.5.  5.6.  Preparação das placas de Petri 5.6.1.  Fundir o meio de teste para a detecção da presença de substâncias inibidoras (5.1.2) e depois arrefecer para a temperatura de 55 gC.  5.6.2.  Adicionar num frasco uma parte de suspensão de esporos recém-preparada (5.5) a um número necessário de partes do meio de ensaio para detecção de substâncias inibidoras (5.1.2), de modo a obter-se a densidade adequada de colónias no meio inoculado, e  misturar convenientemente.  5.6.3. Transferir o meio inoculado (5.6.2) para uma placa de Petri esterilizada (A.4.2.2), previamente aquecida à temperatura de 55 gC, de modo a formar uma camada de 0,6-0,8 mm de espessura. Para uma placa de Petri com 140 mm de diâmetro interno são  necessários cerca de 15 ml de meio de ensaio, para se obter uma espressura de 0,8 mm.  5.6.4.  Transferir as placas de Petri para uma superfície fria horizontal cuja posição é verificada previamente por meio de um nível de bolha, retirar as tampas e deixar solidificar o meio de ágar. Após a solidificação do meio, coloca-se novamente as tampas e  inverte-se as placas para minimizar a condensação sobre a superfície do meio.  5.6.5.  As placas de teste assim preparadas devem ser utilizadas preferencialmente no mesmo dia, podendo no entanto ser conservadas durante duas semanas desde que sejam mantidas à temperatura de 5 gC e colocadas em sacos de polietileno fechados, imediatamente  após a sua preparação.  5.6.6.  Marcar o fundo das placas de teste a fim deidentificar as amostras.  6.  Técnica de procedimento 6.1.  Preparação da amostra 6.1.1.  As amostras que proporcionem resultados positivos ou duvidosos no «método A» (A.7.1 e A.7.2) devem ser testadas novamente e submetidas a ensaio para identificação e quantificação da penicilina.  6.1.2.  Essas amostras de leite são aquecidas inicialmente à temperatura de 80 p 1 gC durante 10 minutos para evitar a interferência de substâncias inibidoras termicamente instáveis, não específicas.  6.1.3.  Depois de misturar muito bem, transferir cerca de 10 ml de leite aquecido para um frasco esterilizado de gargalo largo. Adicionar ao leite cerca de 0,4 ml da solução de penicilinase (5.3) e misturar convenientemente.  6.2. Detecção de substâncias inibidoras 6.2.1.  Mergulhar um disco de papel (4.3) na amostra de leite (6.1.2) utilizando um pinça limpa e seca. Remover qualquer excesso de leite fazendo passar o disco pela parede do frasco da amostra. Colocar o disco sobre a superfície da placa de teste (5.6) e  calcar suavemente com a pinça.  6.2.2.  Os discos impregnados com as diferentes amostras de leite devem ficar afastados uns dos outros pelo menos 20 mm e devem ficar afastados do bordo da placa pelo menos 10 mm.  6.2.3.  Para se verificar a sensibilidade devem ser colocados aleatoriamente discos (4.3) mergulhados nas soluções-padrão de penicilina [5.2.a)], entre os discos impregnados com a amostra de leite, sendo a sua proporção de pelo menos 2 % do número de discos  tratados com a amostra de leite, e devendo ser utilizados pelo menos cinco discos-padrão em cada ensaio.  6.2.4.  Depois de todos os discos terem sido colocados aleatoriamente no meio de ágar e identificados, inverter as placas e fazer a incubação à temperatura de 63 p 1 gC durante duas e meia a cinco horas.  6.2.5.  Após a incubação, examinar as placas em frente a uma fonte luminosa adequada para detectar as zonas claras de inibição em torno dos discos de papel. Medir as zonas claras.  6.2.6.  As zonas em torno dos discos que contêm a solução-padrão de penicilina (6.2.3) devem ter pelo menos 2 mm.  6.2.7.  A presença de zonas claras em torno dos discos impregnados com a amostra de leite, que possuam dimensões equivalentes ou superiores às indicadas em 6.2.6, revela a presença de substâncias inibidoras do organismo de teste.  6.3.  Identificação e quantificação da substância inibidora 6.3.1.  Efectuar duas vezes a operação descrita em 6.2.1, com a amostra de leite quente (6.1.2) e com a amostra tratada com penicilinase (6.1.3). Em vez de se adicionar penicilinase a 10 ml da amostra de leite, pode-se mergulhar nessa amostra um disco  impregnado com penicilinase (5.3.2), colocando-o em seguida na placa de teste.  6.3.2.  Efectuar duas vezes a operação descrita em 6.2.1 para cada uma das soluções-padrão de penicilina descritas em 5.2.a-d).  6.3.3.  Calcular a média dos diâmetros das zonas claras de inibiação correspondentes à amostra de leite, à amostra de controlo contendo penicilinase e às soluções-padrão de penicilina.  7.  Interpretação dos resultados (ver 2) 7.1.  Se não existir uma zona clara em torno do disco que contém o controlo de penicilinase, mas existir uma zona clara em torno do disco que contém a amostra de leite, igual ou superior à maior zona em torno do disco que contém a solução-padrão de penicilina  [5.2.a)], a substância inibidora da amostra de leite corresponde a um benzilpenicilinato de sódio (ou de potássio), com uma concentração de pelo menos 0,004 mg/ml.  7.2.  Se o diâmetro médio da zona clara em torno do disco que contém a penicilinase for igual ao diâmetro médio da zona clara em torno do disco que contém a amostra de leite, então o leite contém substâncias inibidoras impossíveis de inactivar com as  concentrações de penicilinase utilizadas neste processo.  7.3.  Se o diâmetro médio da zona clara em torno do disco que contém a penicilinase for inferior ao diâmetro médio da zona clara em torno do disco que contém a amostra de leite aquecida conforme descrito em 6.1.2, então a amostra de leite contém penicilina  juntamente com outros antibióticos, incluindo as sulfamidas, além de penicilina ou penicilina semi-sintética, que não podem ser identificadas com a concentração de penicilinase utilizada neste processo. As penicilinas sintéticas, tais como a cloxacilina  de sódio, podem não ser inactivadas pela penicilinase nas condições do ensaio, podendo consequentemente ser classificadas como inibidores diferentes da penicilina.  Nota As substâncias inibidoras diferentes da penicilina podem, se necessário, ser identificadas por processos adequados.  8.  Determinação do teor em penicilina 8.1.  A determinação do teor em penicilina pode ser efectuada, quer depois de traçada uma curva-padrão quer por cálculo baseado nas dimensões das zonas obtidas com as soluções-padrão de penicilina em leite [5.2.a-d)].  8.2.  Traçado de uma curva-padro Atendendo a que existe uma correlação linear entre o log10 da concentração de penicilina e o diâmetro das zonas de inibição, a curva-padrão pode ser traçada em papel semi-logarítmico com as concentrações de penicilina em ordenadas e o diâmetro das zonas  de inibição em abcissas. As zonas de inibição são calculadas pela média das leituras observadas em testes efectuados duas vezes. Os diâmetros das zonas de inibição são assinalados sobre um gráfico em função das concentrações das soluções-padrão de  penicilina e depois traça-se a curva-padrão.  8.3.  Cálcula As concentrações de penicilina na amostra de leite podem ser calculadas a partir dos diâmetros das respectivas zonas, utilizando a equação ou a curva-padrão. Para uma avaliação correcta, o raio das zonas de inibição deve ser pelo menos duas vezes  superior ao raio dos discos, mas não deve exceder cinco vezes o valor desse raio.  9.  Expressão dos resultados 9.1.  Os resultados são expressos em concentração de penicilina igual ou superior a 0,004 mg/ml (ou por indicação da concentração determinada) e para outras substâncias inibidoras são expressos em concentração equivalente em penicilina.  9.2.  Repetibilidade (r) e reprodutibilidade (R) Não há valores disponíveis nem significativos porque se utiliza um padrão para comparação.  IX. DETECÇÃO DE MICRORGANISMOS PATOGÉNICOS  1.  Objectivo e domínio de aplicação Em conformidade com as prescrições do anexo A, capítulo VII, ponto 2, da Directiva 85//397/CEE, no presente capítulo descreve-se as instruções que devem ser seguidas para a detecção dos microrganismos patogénicos no leite pasteurizado.  2.  Definição A análise deve recair sobre as bactérias mais frequentemente associadas às doenças de origem alimentar.  A pasteurização é um tratamento de protecção contra a presença no leite de germes patogénicos não termo-resistentes. Se as normas fixadas pelo anexo A, capítulo VII, ponto 2, da Directiva 85/397/CEE forem respeitadas relativamente à contagem de colónias  a 30 gC e a 21 gC, para coliformes e fosfatase, não é necessário efectuar uma análise específica para a detecção de germes patogénicos a não ser que haja a suspeita de o leite estar associado a intoxicações alimentares.  3.  Técnica de procedimento Os processos e as frequências das análises devem ser fixados pela autoridade nacional, de modo a permitir a emissão de certificados de salubridade para o leite tratado termicamente destinado às trocas comerciais intracomunitárias. Para a detecção dos  microrganismos patogénicos, aplicar os critérios e processos internacionalmente aceites, se existirem.  4.  Relatório dos resultados Para cada microrganismo patogénico investigado, dever-se-á exprimir o resultado do modo seguinte:  Número por mililitro de leite ou «presença» ou «ausência» no volume de leite pasteurizado necessário para o processo utilizado. O relatório deverá descrever claramente o processo utilizado.  (1) A utilização de meios de cultura contendo substâncias anti-folatos deve respeitar as regras relativas às patentes que as protegem.