CELEX: 32017R0735
Language: bg
Date: 2017-02-14
Title: Регламент (ЕС) 2017/735 на Комисията от 14 февруари 2017 година за изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес, на приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH) (Текст от значение за ЕИП. )

28.4.2017   
               
               
                  BG
               
               
                  Официален вестник на Европейския съюз
               
               
                  L 112/1
               
            РЕГЛАМЕНТ (ЕС) 2017/735 НА КОМИСИЯТА
      от 14 февруари 2017 година
      за изменение, с цел адаптиране към техническия прогрес, на приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH)
      (текст от значение за ЕИП)
      ЕВРОПЕЙСКАТА КОМИСИЯ,
      като взе предвид Договора за функционирането на Европейския съюз,
      като взе предвид Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета от 18 декември 2006 г. относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH), за създаване на Европейска агенция по химикали, за изменение на Директива 1999/45/ЕО и за отмяна на Регламент (ЕИО) № 793/93 на Съвета и Регламент (ЕО) № 1488/94 на Комисията, както и на Директива 76/769/ЕИО на Съвета и директиви 91/155/ЕИО, 93/67/ЕИО, 93/105/ЕО и 2000/21/ЕО на Комисията (1), и по-специално член 13, параграф 2 от него,
      като има предвид, че:
      
                  (1)
               
               
                  В Регламент (ЕО) № 440/2008 на Комисията (2) се съдържат методите за изпитване за целите на определянето на физичните и химичните свойства, токсичността и екотоксичността на химикали, които методи да бъдат използвани за целите на Регламент (ЕО) № 1907/2006.
               
            
                  (2)
               
               
                  Необходимо е да се актуализира Регламент (ЕО) № 440/2008, за да се включат нови и осъвременени методи за изпитване, наскоро приети от Организацията за икономическо сътрудничество и развитие (ОИСР), за да се вземе под внимание техническият напредък и да се гарантира намаляването на броя на животните, които се използват за опитни цели, в съответствие с Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета (3). Проведени бяха консултации със заинтересованите страни по проекта за настоящия документ.
               
            
                  (3)
               
               
                  Адаптирането към техническия прогрес съдържа двадесет метода за изпитване: един нов метод за определяне на физично/химично свойство, пет нови метода и един актуализиран метод за изпитване за оценка на екотоксичността, два актуализирани метода за изпитване за оценка на съдбата и поведението в околната среда и четири нови и седем актуализирани метода за изпитване за определяне на въздействието върху здравето на човека.
               
            
                  (4)
               
               
                  ОИСР редовно прави преглед на своите насоки с оглед идентифицирането на онези, които са научно остарели. С настоящото адаптиране към техническия прогрес се заличават шест метода за изпитване, за които съответните указания на ОИСР за изпитвания са отменени.
               
            
                  (5)
               
               
                  Поради това Регламент (ЕО) № 440/2008 следва да бъде съответно изменен.
               
            
                  (6)
               
               
                  Мерките, предвидени в настоящия регламент, са в съответствие със становището на комитета, учреден съгласно член 133 от Регламент (ЕО) № 1907/2006,
               
            ПРИЕ НАСТОЯЩИЯ РЕГЛАМЕНТ:
      Член 1
      Приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 се изменя в съответствие с приложението към настоящия регламент.
      Член 2
      Настоящият регламент влиза в сила на двадесетия ден след деня на публикуването му в Официален вестник на Европейския съюз.
      
      
         Настоящият регламент е задължителен в своята цялост и се прилага пряко във всички държави членки.
         Съставено в Брюксел на 14 февруари 2017 година.
         
            
               За Комисията
            
            
               Председател
            
            Jean-Claude JUNCKER
         
      
      
         (1)  ОВ L 396, 30.12.2006 г., стр. 1.
      
         (2)  Регламент (ЕО) № 440/2008 на Комисията от 30 май 2008 година за определяне на методи за изпитване в съответствие с Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH) (ОВ L 142, 31.5.2008 г., стр. 1).
      
         (3)  Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 22 септември 2010 г. относно защитата на животните, използвани за научни цели (ОВ L 276, 20.10.2010 г., стр. 33).
      
         ПРИЛОЖЕНИЕ
         Приложението към Регламент (ЕО) № 440/2008 се изменя, както следва:
         
                     1)
                  
                  
                     В Част А се добавя следната глава:
                     „А.25   ДИСОЦИАЦИОННИ КОНСТАНТИ ВЪВ ВОДА (ТИТРИМЕТРИЧЕН МЕТОД — СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕН МЕТОД — КОНДУКТОМЕТРИЧЕН МЕТОД)
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР 112 (1981).
                     
                        Предпоставки
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Подходящ метод за анализ
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Разтворимост във вода
                              
                           
                        Информация за насоки
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Структурна формула
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Електрическа проводимост за кондуктометричния метод
                              
                           
                        Отговаряне на изискванията
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Всички методи за изпитване могат да се извършват с вещества с квалификация „чист“ или вещества с търговско качество. Възможното влияние на онечистванията върху резултатите следва да бъде взето предвид.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Титриметричният метод не е подходящ за вещества с малка разтворимост (вж. „Разтвори за изпитване“ по-долу).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Спектрофотометричният метод е приложим само за вещества, които имат осезаемо различни абсорбционни спектри в ултравиолетовата и видимата област (UV/VIS-абсорбционни спектри) за дисоциираните и недисоциираните форми. Настоящият метод може също да е подходящ за вещества с малка разтворимост и за дисоциации, различни от киселинно-основните, например комплексообразуване.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 В случаите, в които е валидно уравнението на Онсагер, може да се използва кондуктометричният метод, дори при умерено ниски концентрации, и дори в случай на равновесия, различни от киселинно-основните.
                              
                           
                        Стандартни документи
                     
                     Настоящият метод за изпитване се основава на методите, посочени в позоваванията, изброени в раздел „Литература“ и на „Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification“ на Агенцията на САЩ за опазване на околната среда, 18 август 1978 г.
                     МЕТОД — ВЪВЕДЕНИЕ, ЦЕЛ, ОБХВАТ, ОТНОСИМОСТ, ПРИЛАГАНЕ И ГРАНИЦИ НА ИЗПИТВАНЕТО
                     Дисоциацията на дадено вещество във вода е от значение при оценката на неговото въздействие върху околната среда. Тя определя формата на веществото, която на свой ред определя неговото поведение и пренасяне. Тя може да повлияе върху адсорбцията на химикала в почвата и седиментите и абсорбцията в биологични клетки.
                     
                        Определения и мерни единици
                     
                     
                        Дисоциация е обратимото разделяне на два или повече химични вида, които могат да бъдат йонни. Процесът обичайно се означава като
                     
                        RX ⇌ R
                        ++ X
                        –
                     
                     а концентрационната равновесна константа, определяща реакцията, е
                     
                        
                     Например в конкретния случай, в който R е водород (веществото е киселина), константата е
                     
                        
                     или
                     
                        
                     
                        Референтни вещества
                     
                     Следните референтни вещества не е необходимо да се използват при всички случаи, когато се изследва ново вещество. Те се предоставят най-вече за извършване, от време на време, на калибриране на метода, и за даване на възможност за сравняване на резултатите, когато е приложен друг метод.
                     
                                  
                              
                              
                                 pKa
                                     (1)
                                 
                              
                              
                                 Темп. в °C
                              
                           
                                 
                                    р-Нитрофенол
                              
                              
                                 7,15
                              
                              
                                 25 (1)
                                 
                              
                           
                                 Бензоена киселина
                              
                              
                                 4,12
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 
                                    p-Хлороанилин
                              
                              
                                 3,93
                              
                              
                                 20
                              
                           Би било от полза да има вещество с няколко pK, както е посочено в „Принцип на метода“ по-долу. Такова вещество може да бъде:
                     
                                 Лимонена киселина
                              
                              
                                 pKa (8)
                              
                              
                                 Темп. в °C
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1) 3,14
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 2) 4,77
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 3) 6,39
                              
                              
                                 20
                              
                           
                        Принцип на метода за изпитване
                     
                     Описаният химичен процес като цяло е само слабо зависим от температурата в температурния обхват, относим към околната среда. Определянето на стойността на дисоциационната константа изисква измерване на концентрациите на дисоциираните и недисоциираните форми на химичното вещество. От познанията за стехиометрията на дисоциационната реакция, посочена по-горе в „Определения и мерни единици“, може да бъде определена съответната константа. В конкретния случай, описан в настоящия метод за изпитване, вещество реагира като киселина или основа, и най-подходящият начин за определянето е чрез определяне на относителните концентрации на йонизираните и нейонизираните форми на веществото и pH на разтвора. Връзката между тези термини е дадена в уравнението за pKa по-горе в „Определения и мерни единици“. Някои вещества са с повече от една дисоциационна константа и могат да бъдат разработени сходни уравнения. Някои от методите, описани тук, също са подходящи за дисоциации, различни от киселинно-основните.
                     
                        Критерии за качество
                     
                     
                        Повторяемост
                     
                     Определянето на дисоциационната константа трябва да се извърши с повторения (минимум три определяния) в рамките на ± 0,1 log единици.
                     ОПИСАНИЕ НА ПРОЦЕДУРИТЕ НА ИЗПИТВАНЕТО
                     Съществуват два основни подхода при определянето на pKa. Единият включва титруване на известно количество вещество със стандартна киселина или основа, според случая; Другият включва определяне на относителната концентрация на йонизираните и нейонизираните форми на веществото и нейната зависимост от pH.
                     
                        Подготовка
                     
                     Методите, основани на тези принципи, могат да бъдат класифицирани като титриметрични, спектрофотометрични и кондуктометрични процедури.
                     
                        Разтвори за изпитване
                     
                     При титриметричния и при кондуктометричния метод химичното вещество следва да се разтвори в дестилирана вода. При спектрофотометричния и при други методи се използват буферни разтвори. Концентрацията на изпитваното вещество не трябва да надвишава по-ниската от стойностите 0,01 M или половината от концентрацията на насищане, а при приготвянето на разтворите следва да бъде използвана формата на веществото с възможно най-голямата степен на чистота. Ако веществото е само умерено разтворимо, преди добавянето към концентрациите, посочени по-горе, то може да се разтвори в малко количество разтворител, който може да се смесва с вода.
                     Разтворите следва да бъдат проверени за наличието на емулсии, като се използва сноп за Тиндалов ефект, особено ако се използва съразтворител за повишаване на разтворимостта. Когато се използват буферни разтвори, концентрацията на буфера не трябва да превишава 0,05 M.
                     
                        Условия на изпитването
                     
                     
                        Температура
                     
                     Температурата следва да се контролира до най-малко ± 1°C. Определянето следва да се осъществява за предпочитане при 20°C.
                     Ако се очаква значима зависимост от температурата, определянето трябва да се проведе поне при две други различни температури. Температурните интервали трябва да бъдат 10°C в този случай, а температурният контрол ± 0,1°C.
                     
                        Анализи
                     
                     Методът се определя в зависимост от природата на изпитваното вещество. Той трябва да е с достатъчна чувствителност, позволяваща определянето на различните химични видове при всяка концентрация на изпитвания разтвор.
                     
                        Провеждане на изпитването
                     
                     
                        Титриметричен метод
                     
                     Изпитваният разтвор се определя чрез титруване със стандартен разтвор на основа или киселина, както е уместно, като се измерва рН след всяко добавяне на титрант. Преди еквивалентния пункт следва да бъдат направени най-малко 10 последователни добавяния. Ако равновесието се достига достатъчно бързо, може да бъде използван записващ потенциометър. За този метод трябва да бъдат точно известни както общото количество вещество, така и неговата концентрация. Трябва да се вземат предпазни мерки, за да се изключи въглеродният диоксид. Подробности за процедурата, предпазните мерки и изчисленията са дадени в стандартните изпитвания, напр. препратки (1), (2), (3), (4).
                     
                        Спектрофотометричен метод
                     
                     Намира се дължина на вълната, при която йонизираната и нейонизираната форма на веществото имат осезаемо различни коефициенти на екстинкция. UV/VIS-абсорбционният спектър се получава от разтвори с постоянна концентрация при стойности на рН, при които веществото по същество остава нейонизирано и напълно йонизирано при няколко междинни стойности на pH. Това може да се направи или като се добавя на порции концентрирана киселина (основа) към относително голям обем от разтвор на веществото в многокомпонентен буфер, първоначално при високи (ниски) стойности на pH (препратка 5), или чрез добавяне на равни обеми изходен разтвор на веществото, например във вода или метанол, към постоянни обеми на различни буферни разтвори, които покриват желания обхват от стойности на pH. От стойностите на pH и на абсорбцията при избраната дължина на вълната се изчислява достатъчен брой стойности за pKa, като се използват данни най-малко при 5 стойности на pH, при които веществото е йонизирано най-малко 10 процента и по-малко от 90 процента. Допълнителни експериментални данни и методи за изчисление са дадени в препратка (1).
                     
                        Кондуктометричен метод
                     
                     Като се използва клетка с предварително известна малка константа на клетката, се определя проводимостта на приблизително 0,1 М разтвор на веществото във вода за измерване на електрическата проводимост. Измерват се също и проводимостите на няколко внимателно извършени разреждания на този разтвор. Концентрацията се намалява наполовина всеки път, като поредицата трябва да обхваща най-малко един порядък на концентрацията. Граничната проводимост при безкрайно разреждане се намира чрез извършване на подобен опит с натриевата сол и екстраполиране. Степента на дисоциация може да се изчисли от проводимостта на всеки разтвор с помощта на уравнението на Онсагер, и следователно с помощта на закона на Оствалд за разреждането дисоциационната константа може да бъде изчислена като K = α2C/(1 – α, където C е концентрацията в молове на литър, а α е дисоциираната фракция. Трябва да се вземат предпазни мерки, за да се изключи CO2. Допълнителни експериментални данни и методи за изчисление са дадени в текстове на стандарти и препратки (1), (6) и (7).
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Обработка на резултатите
                     
                     
                        Титриметричен метод
                     
                     Изчислява се pKa за 10 измерени точки от титрувалната крива. Изчисляват се средната стойност и стандартното отклонение за такива стойности на pKa. Следва да бъде включена графика на pH спрямо обема стандартна основа или киселина, заедно с таблично представяне.
                     
                        Спектрофотометрични методи
                     
                     Абсорбцията и pH за всеки спектър се представят в табличен вид. От точките с данни за междинните спектри се изчисляват най-малко пет стойности за pKa, изчисляват се също и средната стойност и стандартното отклонение за тези резултати.
                     
                        Кондуктометричен метод
                     
                     Еквивалентната проводимост Λ се изчислява за всяка концентрация на киселина и за всяка концентрация на смес от един еквивалент киселина, плюс 0,98 еквивалент на несъдържащ карбонати натриев хидроксид. Киселината е в излишък, за да се избегне наличието на излишък на OH– поради хидролиза. 1/Λ се нанася на графика спрямо √C и Λo на солта може да се намери чрез екстраполация до нулева концентрация.
                     Λo на киселината може да бъде изчислено на база на данни от литературата за H+ и Na+. Стойността на pKa може да бъде изчислена от α = Λi /Λo и Ka = α2C/(1 – α) за всяка концентрация. По-добри стойности за Ka могат да бъдат получени чрез корекции за мобилност и активност. Следва да се изчислят средната стойност и стандартното отклонение за стойностите на pKa.
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Следва да бъдат представени всички необработени данни и изчислени стойности на pKa, заедно с метода за изчисление (за предпочитане в таблична форма, като например предложената в препратка (1) както и статистическите параметри, описани по-горе. За титриметричните методи следва да се представи подробна информация за стандартизацията на титрантите.
                     За спектрофотометричния метод следва да бъдат представени всички спектри. За кондуктометричния метод следва да се протоколира подробна информация за определянето на константата на клетката. Следва да бъде посочена информация за използваната техника, аналитичните методи и естеството на всички използвани буфери.
                     Следва да бъде(ат) протоколирана(и) температурата(ите) на изпитването.
                     ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, pp. 1186-1188 (1969).
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ASTM D 1293 — Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973).
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 ASTM D 1125 — Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Standard Method 205 — APHA/AWWA/NPCF (see above(4)).
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 
                                    Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).“
                              
                           
               
                     2)
                  
                  
                     В Част Б глава Б.5 се заменя със следното:
                     „Б.5   ОСТРО ДРАЗНЕЩО/КОРОЗИВНО ДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ ОЧИТЕ
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 405 (2012). Насоките за изпитване на ОИСР за изпитването на химикали се преразглеждат периодично, за да се гарантира, че отразяват възможно най-добрите налични научни постижения. При предходни преразглеждания на посочените насоки за изпитване специално внимание е отделено на възможностите за усъвършенстване на метода посредством оценка на цялата съществуваща информация за изпитвания химикал с оглед избягване на ненужно изпитване върху лабораторни животни, като по този начин се отделя внимание на опасенията във връзка с хуманното отношение към животните. В TG 405 (приети през 1981 г. и актуализирани през 1987 г., 2002 г., и 2012 г.) се съдържа препоръка преди да се пристъпи към изпитване in vivo за остро дразнещо/корозивно действие върху очите, да се извърши основан на тежестта на доказателствата анализ (1) на относимите налични данни. Когато липсват достатъчно данни, се препоръчва те да бъдат получени чрез извършване на последователно изпитване (2)(3). Стратегията за изпитването включва извършването на валидирани и приети изпитвания in vitro и е изложена като приложение към настоящия метод за изпитване. За целите на Регламент (ЕО) № 1907/2006 относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH) (2), в относимите насоки на ЕСНА (21) е включена също и интегрирана стратегия за изпитване. Изпитването на животни трябва да се извършва само ако това е определено за необходимо след разглеждане на съществуващите алтернативни методи и използването на тези, които са определени като подходящи. Към момента на изготвяне на настоящия актуализиран метод за изпитване съществуват ситуации, при които използването на този метод е все още необходимо или изисквано по силата на някои нормативни уредби.
                     Последната актуализация е съсредоточена главно върху използването на аналгетици и анестетици, без да се засяга основната концепция и структурата на насоката за изпитванията. Междуведомственият координационен комитет за валидиране на алтернативни методи (ICCVAM) (3) и независима международна научна група за партньорска оценка преразгледаха ползата и ограниченията при обичайното използване на местни анестетици, общи аналгетици и хуманен край по време на in vivo изпитванията за безопасност при дразнене на очите (12). Заключението от прегледа е, че използването на местни анестетици и общи аналгетици би могло да доведе до избягване на повечето или всички болки и дистрес, без това да засяга резултата от изпитването, и в него се препоръчва използването на тези вещества във всички случаи. Настоящият метод за изпитване взема този преглед под внимание. Местните анестетици, общите аналгетици и хуманният край следва редовно да бъдат използвани по време на изпитванията in vivo за остро дразнещо и корозивно действие върху очите. Изключенията, при които те не се използват, следва да бъдат обосновани. Облекченията, описани в настоящия метод, ще доведат до значително намаляване или избягване на болката и дистреса при животните в повечето случаи, при които все още са необходими изпитвания in vivo за безопасност при дразнене на очите.
                     Балансираното изпреварващо овладяване на болката следва да включва i) обичайно предварително третиране с местен анестетик (напр. пропаракаин или тетракаин) и общ аналгетик (напр. бупренорфин), ii) обичайно последващо третиране с общи аналгетици (напр. бупренорфин и мелоксикам), iii) планирано наблюдение, мониторинг и регистриране на клинични признаци на болка и/или дистрес при животни, и iv) планирано наблюдение, мониторинг и регистриране на естеството, тежестта и развитието на всички наранявания на очите. По-подробна информация е дадена в актуализираните процедури, описани по-долу. След прилагането на изпитвания химикал следва да не се прилагат допълнителни местни анестетици или аналгетици с цел да се избегне пречене на изследването. Аналгетиците с противовъзпалително действие (напр. мелоксикам) не следва да се прилагат локално и дозите за системно приложение не следва да оказват влияние на ефектите върху очите.
                     Определенията са дадени в допълнението към метода за изпитване.
                     ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ
                     В интерес на научната стойност на проучването и на хуманното отношение към животните е да не се разглежда провеждането на изпитване in vivo преди да бъдат оценени в основан на тежестта на доказателствата анализ всички налични данни, относими към потенциалното корозивно/дразнещо действие на химикала върху очите. Такива данни включват доказателства от съществуващи проучвания върху хора и/или лабораторни животни, доказателства за корозивно/дразнещо действие на едно или повече структурно подобни вещества или смеси от такива вещества, данни, доказващи висока киселинност или алкалност на химикала (4) (5), както и резултати от валидирани и приети изпитвания in vitro или ех vivo за корозивно действие върху кожата и корозивно/дразнещо действие върху очите (6) (13) (14) (15) (16) (17). Проучванията могат да бъдат извършени преди основан на тежестта на доказателствата анализ или в резултат от този анализ.
                     За някои химикали такъв анализ може да покаже необходимост от изследване in vivo за потенциала на химикала за корозивно/дразнещо действие върху очите. Във всички такива случаи, преди да се разгледа провеждане на изпитване in vivo, се препоръчва да се извърши проучване за корозивно действие на химикала върху кожата in vitro и/или in vivo и да бъде направена оценка в съответствие със стратегията за последователно изпитване в метод за изпитване Б.4 (7) или с интегрираната стратегия за изпитване, описани в насоките на ЕСНА (21).
                     Стратегия за последователно изпитване, която включва прилагането на валидирани in vitro или ех vivo изпитвания за корозивно/дразнещо действие върху очите, е включена като допълнение към настоящия метод за изпитване и, за целите на REACH, в насоките на ЕСНА (21). Препоръчва се такава стратегия за изпитване да се приложи преди започването на изпитване in vivo. За нови химикали се препоръчва подход за поетапно изпитване с цел получаване на достоверни научни данни за корозивното/дразнещо действие на химикала. За съществуващи химикали с недостатъчно данни за корозивно/дразнещо действие върху очите и кожата стратегията може да се приложи, за да се получат липсващите данни. Използването на друга стратегия или процедура за изпитване или решението да не се прилага поетапен подход за изпитване следва да бъдат обосновани.
                     ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО IN VIVO
                     
                     След предварителното третиране с общ аналгетик и индукцията в подходяща местна анестезия химикалът, предназначен за изпитване, се прилага в единична доза върху едно от очите на опитното животно; нетретираното око служи за контрола. През определени интервали от време се отчита и оценява степента на дразнещо/корозивно действие върху конюнктивата, роговицата и ириса. Другите ефекти върху очите, както и неблагоприятните системни ефекти също се описват с оглед извършването на цялостна оценка на токсичното действие. Продължителността на наблюдението следва да бъде достатъчно голяма, за да може да направи оценка дали ефектите са обратими, или не.
                     Животните, показващи признаци на тежък стрес и/или болка в който и да е момент от изпитването, или лезии, които съответстват на хуманния край, описан в настоящия метод за изпитване (вж. точка 26), следва да бъдат умъртвени по хуманен начин и химикалът следва да бъде оценен по съответния начин. Критериите за вземане на решение за умъртвяване по хуманен начин на животните в терминално състояние и тези, които изпитват тежко страдание, са предмет на ръководство на ОИСР (8).
                     ПОДГОТОВКА НА ИЗПИТВАНЕТО IN VIVO
                     
                     
                        Избор на видове
                     
                     Предпочитаните опитни животни са зайците албиноси, като се използват млади, здрави, полово зрели животни. Използването на други животински породи или видове следва да бъде обосновано.
                     
                        Подготовка на животните
                     
                     Двете очи на всяко експериментално животно, което е избрано за евентуално включване в изпитването, следва да се прегледат през последните 24 часа преди началото му. Животните, при които се установяват признаци на очно дразнене, очни дефекти или предшестващо увреждане на роговицата, не следва да се използват.
                     
                        Условия на отглеждане и хранене
                     
                     Животните трябва да бъдат индивидуално настанени. В опитното помещение, в което се намират зайците, следва да се поддържа температура 20°C (± 3°C). Въпреки че относителната влажност следва да бъде поне 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 %, освен по време на почистване на стаята, целта е относителната влажност да се поддържа в интервала 50—60 %. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. Прекомерният светлинен интензитет трябва да се избягва. При храненето могат да се прилагат обичайните лабораторни диети, с неограничен достъп до питейна вода.
                     ПРОЦЕДУРА ЗА ИЗПИТВАНЕ
                     
                        Използване на местни анестетици и общи аналгетици
                     
                     За да се избегнат или да се сведат до минимум болката и дистреса при изпитванията за безопасност за очите се препоръчват следните процедури. Алтернативни процедури, за които е определено, че водят до избягване или облекчаване на болката и дистреса в същата или в по-голяма степен, могат да бъдат използвани като заместващи.
                     
                                 —
                              
                              
                                 Шестдесет минути преди прилагането на изпитвания химикал се прилага 0,01 mg/kg бупренорфин чрез подкожно инжектиране, с цел осигуряване на терапевтично равнище на обща аналгезия. За бупренорфина и за други подобни опиоидни аналгетици с общо действие не е известно или не се очаква да доведат до изменения в резултатите, свързани с очите (12).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Пет минути преди прилагането на изпитвания химикал към всяко око се прилагат една или две капки местен очен анестетик (например 0,5 % пропакаинхидрохлорид или 0,5 % тетракаинхидрохлорид). С цел да се предотврати евентуално пречене на проучването се препоръчва местен анестетик, който не съдържа консерванти. За всяко животно нетретираното с изпитван химикал око, което е третирано с местни анестетици, служи за контрола. Ако изпитваният химикал се очаква да причини значителна болка и дистрес, обикновено не следва да бъде изпитван in vivo. Независимо от това, в случай на съмнение или когато се налага провеждането на изпитване, следва да се обмислят допълнителни прилагания на местен анестетик на интервал от 5 минути преди прилагането на изпитвания химикал. Потребителите следва да имат предвид, че множество прилагания на местни анестетици биха могли да причинят леко увеличаване на тежестта и/или времето за изчезване на причинени по химичен път лезии.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Осем часа след прилагането на изпитвания химикал, чрез подкожно инжектиране се прилагат 0,01 mg/kg бупренорфин и 0,5 mg/kg мелоксикам, за да се осигури продължаващо терапевтично равнище на обща аналгезия. Въпреки че няма данни, които да сочат, че мелоксикамът има противовъзпалително въздействие върху очите, когато се прилага чрез подкожно инжектиране веднъж дневно, мелоксикамът следва да не бъде прилаган, най-малко до 8 часа след прилагането на изпитвания химикал, за да се избегне всякакво възможно пречене на проучването (12).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 След първоначалния период от 8 часа след прилагането на изпитвания химикал 0,01 mg/kg бупренорфин се прилага чрез подкожно инжектиране веднъж на всеки 12 часа, заедно с 0,5 mg/kg мелоксикам чрез подкожно инжектиране на всеки 24 часа, докато очните лезии изчезнат и не се наблюдават клинични признаци на болка и дистрес. Налични са препарати от аналгетици със забавено освобождаване, които биха могли да бъдат използвани, за да се намали честотата на дозиране с аналгетици.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Ако превантивната или местната аналгезия са недостатъчни, след прилагането на изпитвания химикал следва незабавно да бъдат дадени „спасителни“ аналгетици. Ако животното показва признаци на болка и дистрес по време на изследването, незабавно се дава „спасителна доза“ от 0,03 mg/kg бупренорфин чрез подкожно инжектиране и, ако е необходимо, се повтаря веднъж на всеки 8 часа, вместо 0,01 mg/kg мелоксикам чрез подкожно инжектиране на всеки 12 часа. Мелоксикам 0,5 mg/kg се прилага чрез подкожно инжектиране на всеки 24 часа, заедно със „спасителната“ на доза бупренорфин, но не преди най-малко 8 часа след прилагането на изпитвания химикал.
                              
                           
                        Прилагане на изпитвания химикал
                     
                     Изпитваният химикал следва да се постави в конюнктивалната торбичка на едното око на всяко от животните след леко издърпване на долния клепач по-напред от очната ябълка. След това двата клепача се държат долепени за около една секунда, за да се избегне загуба на материал. Другото око не се третира и служи за контрола.
                     
                        Промиване
                     
                     Очите на опитните животни не следва да се промиват в продължение най-малко на 24 часа след накапването на изпитвания химикал, освен в случаите, когато той е в твърдо агрегатно състояние (виж точка 18) и когато корозивният или дразнещият ефект се проявява непосредствено след третирането. Промивка може да се направи на 24-ия час след третирането, ако е необходимо.
                     Използването на сателитна група животни за изследване на влиянието на промивката не се препоръчва, освен ако не е научно обосновано. Ако е необходима сателитна група, следва да бъдат използвани два заека. Условията на промиването следва да бъдат внимателно документирани, например дата и час на промиването; състав и температура на разтвора за промиване; продължителност, обем и скорост на прилагане.
                     
                        Доза
                     
                     1)   Изпитване на течности
                     
                     Когато се изпитват течности се използва доза от 0,1 ml. Не следва да се използват пулверизатори с помпа за поставяне на химикала директно върху окото. Течният спрей следва да се изпръска и да се събере в контейнер, след което от него се взема необходимото количество от 0,1 ml и се поставя в окото.
                     2)   Изпитване на химикали в твърдо агрегатно състояние
                     
                     Когато се изпитват химикали, които са в твърдо агрегатно състояние, пастообразни или под формата на частици, следва да се прилага количество с обем 0,1 ml или маса не повече от 100 mg. Химикалът, който се изпитва, следва да бъде стрит до фин прах. Обемът на твърдия материал следва да бъде измерен след леко уплътняване, например чрез почукване върху съда, в който се извършва измерването. Когато твърдият изпитван химикал не е бил отстранен от окото на изпитваното животно чрез физиологични механизми в първата времева точка на наблюдението (1 час след третирането), окото може да се изплакне с физиологичен разтвор или дестилирана вода.
                     3)   Изпитване на аерозоли
                     
                     Препоръчва се химикалът от всички пулверизатори с помпа или аерозоли да бъде събран в контейнер преди накапването в окото. Изключение се прави само за химикали в аерозолни флакони под налягане, които не могат бъдат събрани поради изпаряване. В такива случаи окото следва да се придържа отворено и изпитваният химикал се прилага директно върху предната му повърхност с едно изпръскване в продължение на около една секунда от разстояние 10 cm. Това разстояние може да варира в зависимост от налягането на аерозола и съдържанието му. Следва да се положи грижа окото да не бъде увредено от налягането на аерозола. В подходящи случаи може да бъде необходимо да се оцени потенциалът за „механично“ увреждане на окото от налягането на аерозола.
                     Оценка на дозата от аерозола може да бъде направена чрез симулиране на изпитването, както следва: химикалът се напръсква върху тегловна хартия през отвор с размерите на заешко око, разположен непосредствено пред хартията. Чрез разликата в теглото на хартията преди и след напръскването се определя приблизително количеството, напръскано върху окото. За летливи химикали дозата може да се оцени чрез претегляне на контейнер за химикала, който се претегля преди и след отстраняването на изпитвания химикал.
                     
                        Първоначално изпитване (изпитване in vivo за дразнещо/корозивно действие с използване на едно животно)
                     
                     Категорично се препоръчва in vivo изпитването да се извърши първоначално с използване на едно животно (вж. Допълнение към настоящия метод за изпитване: Стратегия за последователно изпитване за дразнещо и корозивно действие върху очите). Наблюденията трябва да дават възможност за определяне на тежестта и обратимостта преди да се пристъпи към потвърждаващо изпитване с второ животно.
                     Когато това изпитване се проведе съгласно описаната процедура и резултатите показват, че химикалът е с корозивно или силно дразнещо действие върху очите, не следва да се извършва по-нататъшно изпитване за дразнещо действие върху очите.
                     
                        Потвърдително изпитване (изпитване in vivo за дразнещо действие върху очите с използване на допълнителни животни).
                     
                     Когато при първоначалното изпитване не се наблюдава корозивно или силно дразнещо действие, дразнещият ефект или негативният отговор следва да се потвърдят, като се третират най-много две допълнителни животни. Ако при първоначалното изпитване се наблюдава дразнещо действие, се препоръчва потвърдителното изпитване да се извърши чрез последователно изпитване върху едно животно наведнъж, вместо едновременна експозиция на двете допълнителни животни. Ако при второто животно се наблюдава корозивно или силно дразнещо действие, изпитването не се продължава. Ако резултатите от второто животно са достатъчни, за да позволят определяне на класифицирането на опасността, тогава не следва да се извършва по-нататъшно изпитване.
                     
                        Период на наблюдение
                     
                     Продължителността на периода на наблюдение следва да бъде достатъчна за цялостната оценка на големината и обратимостта на наблюдаваните ефекти. Независимо от това, изпитването следва да се прекрати във всеки момент, в който опитното животно покаже признаци на силна болка или дистрес (8). Обикновено за да се установи дали ефектите са обратими, животните следва да се наблюдават в продължение на 21 дни след прилагането на изпитвания химикал. Ако обратимостта бъде установена преди края на 21-дневния период, изследването следва да се прекрати в момента на установяването.
                     
                        Клинични наблюдения и степенуване на очните реакции
                     
                     Очите следва да бъдат цялостно оценени за наличието или липсата на лезии върху очите един час след прилагането на изпитвания химикал, след което оценките трябва да са най-малко ежедневни. Животните следва да бъдат оценявани няколко пъти дневно в продължение на първите 3 дни, за да гарантира своевременно вземане на решенията за прекратяване. Изпитваните животни следва да бъдат редовно оценявани през цялото време на изследването за клинични признаци на болка и/или дистрес (напр. повтарящо се докосване с лапа или триене на окото, прекомерно мигане, прекомерно сълзене) (9) (10) (11), най-малко два пъти на ден, с минимум от 6 часа между наблюденията или по-често, ако е необходимо. Това е необходимо, за да се направи i) адекватна оценка на животните за признаци на болка и дистрес с цел вземане на информирани решения относно необходимостта от увеличаване на дозировката на аналгетици и ii) оценка на животните за доказателства за определен хуманен край с цел вземане на информирани решения за това дали е уместно умъртвяването на животни по хуманен начин, и за гарантиране, че тези решения се извършват своевременно. Обикновено следва да бъде използвано флуоресцеиново оцветяване, а когато се счита за целесъобразно се използва и биомикроскоп с шпалт-лампа (напр. при оценка на дълбочината на увреждането, когато е налице язва на роговицата) като помощно средство при откриването и измерването на увреждането на окото, за оценка на това дали са изпълнени установените критерии за умъртвяване на животни по хуманен начин. Могат да бъдат събирани цифрови снимки на наблюдаваните увреждания с цел позоваване и осигуряване на непрекъснато записване на степента на увреждане на очите. Изпитването на животните не следва да продължава по-дълго от необходимото за получаване на окончателна информация. Животните, които показват признаци на силна болка или дистрес, следва да бъдат умъртвени незабавно по хуманен начин и химикалът следва да бъде оценен по съответния начин.
                     Животните със следните очни увреждания, настъпили след накапването, следва да бъдат умъртвени по хуманен начин (вж. таблица 1 за описание на степените на увреждане): перфорация на роговицата или значима язва на роговицата, включително стафилома; кръв в предната камера на окото; непрозрачност на роговицата, степен 4; отсъствие на реакция на светлината (промени в ириса от 2 степен), което персистира за 72 часа; язви на конюнктивата; некроза на конюнктивата или мигателните ципи; или лющене на мъртва тъкан. Това се налага, защото обикновено тези увреждания са необратими. Освен това се препоръчва следните очни увреждания да се използват като крайни точки за прекратяване на изследванията по хуманни съображения преди края на предвидения 21-дневен период на наблюдение. Тези увреждания се смятат за прогнозиращи по отношение на тежки наранявания в резултат от дразнещо или корозивно действие, или на наранявания, за които не се очаква да са напълно обратими до края на 21-дневния период на наблюдение: тежки увреждания (като напр. язва на роговицата, простираща се извън повърхностните слоеве на стромата), унищожаване на канта > 50 % (видно от избледняването на конюнктивната тъкан) и тежка инфекция на окото (гнойна секреция). Комбинация от: васкуларизация на повърхността на роговицата (т.е. панус); област на флуоресцеиново оцветяване, която не намалява с течение на времето, въз основа на ежедневна оценка; и/или липса на липса на повторна епителизация 5 дни след прилагането на изпитвания химикал може също да бъде счетена за потенциално полезен критерий за оказване на влияние върху клиничното решение за предсрочно прекратяване на проучването. Взети поотделно обаче тези констатации са недостатъчни за обосноваване на предсрочното прекратяване на проучването. След установяването на тежки ефекти върху очите следва да бъде консултиран лекуващ или квалифициран за лабораторни животни ветеринарен лекар, или персонал, обучен за установяване на клинични увреждания, за клиничен преглед с оглед определяне определи дали комбинацията от тези ефекти обосновава преждевременното прекратяване на проучването. Степента на очните реакции (конюнктива, роговица и ирис) следва да се определя и записва 1, 24, 48 и 72 часа след прилагането на изпитвания химикал (таблица 1). Опитните животни, при които не се развиват очни увреждания, могат да бъдат умъртвени не по-рано от 3 дни след накапването. Опитните животни с увреждания, които не са тежки, следва да се наблюдават до отшумяване на увреждането или в продължение на 21 дни, след което изпитването се прекратява. Като минимум наблюденията следва да се извършват и записват след 1 час, 24 часа, 48 часа, 72 часа, 7 дни, 14 дни и 21 дни, за да се прецени състоянието на уврежданията и тяхната обратимост или необратимост. Ако е необходимо, следва да се извършват по-чести наблюдения, за да се определи дали изпитваното животно следва да бъде умъртвено по хуманни съображения или изключено от изследването поради отрицателни резултати.
                     Степените на очните увреждания (таблица 1) трябва да бъдат записвани при всеки преглед. Всички други очни увреждания (например панус, оцветяване, изменения в предната камера) или неблагоприятни общи ефекти също следва да се протоколират.
                     Прегледът на реакциите може да се улесни чрез използване на бинокулярна лупа, ръчна шпалт-лампа, биомикроскоп или друг подходящ уред. След отчитане на наблюденията на 24-ия час очите могат допълнително да се изследват с помощта на флуоресцеин.
                     Степенуването на очните реакции непременно е субективно. За да се постигне съответствие в степенуването на очните реакции и да се подпомогнат изпитващите лаборатории, както и тези, в които се провеждат интерпретират наблюденията, персоналът, извършващ наблюдението, следва да бъде достатъчно обучен да прилага класификационната скала.
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Оценка на резултатите
                     
                     Баловата оценка на очното дразнене следва да се разглежда заедно с естеството, тежестта и обратимостта или необратимостта на настъпилите увреждания. Индивидуалната балова оценка не е абсолютен стандарт за определяне на дразнещите свойства на даден химикал, тъй като се оценяват и други ефекти на изпитвания химикал. Вместо това индивидуалният бал следва да се разглежда като референтна стойност, която има съдържание само когато е подкрепена от пълното описание и оценка на всички наблюдения.
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обосновка на изпитването in vivo: основан на тежестта на доказателствата анализ на съществуващите данни от предишни изпитвания, включително резултатите от прилагането на стратегията за последователно изпитване:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             описание на относимите данни от предходни изпитвания;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни, получени при всяка стъпка от стратегията за изпитване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             описание на извършените изпитвания in vitro, включително подробно представяне на процедурите за изпитване и резултатите, получени за изпитваните/референтните химикали;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             описание на проведеното изследване in vivo за дразнещо/корозивно действие върху кожата, включително получените резултати;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             основан на тежестта на доказателствата анализ с оглед извършване на in vivo проучване.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитван химикал:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             данни за идентификация (напр. химично наименование и, при наличност, CAS номер, чистота, известни онечиствания, източник, номер на партидата);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             физична природа и физични и химични свойства (например рН, летливост, разтворимост, стабилност, реакция с вода);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             в случай на смес следва да бъдат идентифицирани компонентите, включително идентификационни данни на веществата компоненти (напр. химично наименование и CAS номера, ако има такива), както и техните концентрации;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             приложена доза.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Носител:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             химично идентифициране, концентрация (когато е необходимо), използван обем;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             обосноваване на избора на носител.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитвани животни:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             използван вид/порода, обосновка за използване на животни, различни от зайци албиноси;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             възраст на всяко животно в началото на изследването;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             брой на животните от всеки пол в изпитваните и контролните групи (когато се изисква);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             индивидуална телесна маса на всяко животно в началото и в края на изпитването;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             източник за доставка на животните, условия на отглеждане, диета и т.н.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Анестетици и аналгетици
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             дози и време на прилагане на местни анестетици и общи аналгетици;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             когато се използва местен анестетик, за него се представят данни за идентификация, чистота, тип и потенциал за взаимодействие с изпитвания химикал.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Резултати:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             описание на метода, използван за степенуване с балови оценки на дразненето във всеки момент на наблюдение (напр. използване на ръчна шпалт-лампа, биомикроскоп, флуоресцеин);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             представяне в табличен вид на данните за отклика при дразнещо/корозивно действие за всяко животно във всички моменти на наблюдение до отстраняването на всяко животно от изпитването;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             текстово описание на степента и естеството на наблюдаваните прояви на дразнещо/корозивно действие;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             описание на всички други очни увреждания (например васкуларизация, образуване на панус, адхезии, оцветяване);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             описание на местните и общите неблагоприятни ефекти, различни от очни увреждания, протоколиране на клиничните признаци на болка и дистрес, цифрови снимки и хистопатологични наблюдения, ако такива са налице.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обсъждане на резултатите
                                 
                              
                           
                        Тълкуване на резултатите
                     
                     Екстраполацията на резултатите от проучванията на очното дразнене върху лабораторни животни към хора е валидна само в ограничена степен. В много случаи зайците албиноси са по-чувствителни от хората към вещества с дразнещо или корозивно действие върху очите.
                     При тълкуването на данните следва внимателно да се изключи възможността дразненето да е предизвикано вследствие на вторична инфекция.
                     ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Barratt, M.D., et al. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard, ECVAM Workshop Report 8, ATLA 23, 410 — 429.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 de Silva, O., et al. (1997), Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies, Food Chem. Toxicol 35, 159 — 164.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Worth A.P. and Fentem J.H. (1999), A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Young, J.R., et al. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals, Toxicol. In Vitro, 2, 19 — 26.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 — 231.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Fentem, J.H., et al. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in vitro 12, pp.483 — 524.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Глава Б.4 от настоящото приложение, Остра токсичност: кожно дразнещо/корозивно действие.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Wright EM, Marcella KL, Woodson JF. (1985), Animal pain: evaluation and control, Lab Animal, May/June, 20-36.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 National Research Council (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 National Research Council (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing, NIH Publication No. 10-7514, Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences.
                                 http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Глава Б.40 от настоящото приложение, In vitro кожна корозия: транскутанно измерване на електрическото съпротивление на кожата (TER).
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Глава Б.40А от настоящото приложение, In vitro кожна корозия: изпитване върху модел на човешка кожа.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Глава Б.47 от настоящото приложение, Метод за изпитване на непрозрачност и пропускливост на говеждата роговица за идентификация на i) химикали, причиняващи сериозно увреждане на очите и ii) химикали, не изискващи класифициране за дразнещо действие върху очите или сериозно увреждане на очите.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Глава Б.48 от настоящото приложение, Метод за изпитване с изолирани птичи очи за определяне на i) химикали, причиняващи сериозно увреждане на очите и ii) химикали, не изискващи класифициране за дразнещо действие върху очите или сериозно увреждане на очите.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 U.S. EPA (2003), Label Review Manual: 3rd Edition, EPA737-B-96-001, Washington, DC: U.S., Environmental Protection Agency.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 UN (2011), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 EC (2008), Regulation (EC) No. 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on Classification, Labelling and Packaging of Substances and Mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No. 1907/2006. Official Journal of the European Union L353, 1-1355.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 ECHA Guidance on information requirements and chemical safety assessment, Chapter R.7a: Endpoint specific guidance.
                                 http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf
                              
                           
                        Таблица 1
                     
                     
                        Скала на очните увреждания
                     
                     
                                 Роговица
                              
                              
                                 Степен
                              
                           
                                 Непрозрачност: степен на плътност (стойностите следва да се отчитат от най-плътния участък) (*1)
                                 
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Отсъствие на язва или непрозрачност
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Разпръснати или дифузни зони на непрозрачност (различни от леко замъгляване на нормалния блясък); детайлите от ириса са ясно видими
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Лесно забележима полупрозрачна област; детайлите от ириса са леко замъглени
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Зона със седефен цвят; детайлите от ириса не се забелязват; едва различима големина на зеницата
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Непрозрачна роговица; ирисът не се различава през непрозрачната роговица
                              
                              
                                 4
                              
                           
                                 Максимален бал: 4
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Ирис
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Нормално
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Забележимо увеличени гънки, конгестия, оток, умерена перикорнеална хиперемия; или инжектиране; ирисът реагира на светлина (бавната реакция се смята за ефект
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Кръвоизлив, видимо макроскопски разрушаване на нормалната структура, или липса на реакция на светлина
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Максимален бал: 2
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Конюнктиви
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Еритем (отнася се за палпебралната и булбарната конюнктива; с изключение на роговицата и ириса)
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Нормално
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Хиперемия на някои кръвоносни съдове (след инжектиране)
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Дифузно кървавочервено оцветяване; отделните кръвоносни съдове са трудно различими
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Дифузно оцветяване, цвят на говеждо месо
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Максимален бал: 3
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Хемоза
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Оток (отнася се за клепачите и/или мигателните ципи)
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Нормално
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Наличие на оток над нормалното състояние
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Ясно изразен оток с частично обръщане на клепачите
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Оток със затворени приблизително наполовина клепачи
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Оток със затворени повече от наполовина клепачи
                              
                              
                                 4
                              
                           
                                 Максимален бал: 4
                              
                              
                                  
                              
                           
                        Допълнение
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                           
                              Киселинен/алкален резерв
                           : За киселинните препарати това е количеството (g) натриев хидроксид за 100 g от препарата, необходимо за получаване на определена стойност на рН. За алкалните препарати това е количеството (g) натриев хидроксид, еквивалентно на количеството (g) сярна киселина за 100 g от препарата, необходимо за получаване на определена стойност на рН (Young et al. 1988).
                        
                           
                              Химикал
                           : Вещество или смес.
                        
                           
                              Вещества, които не са с дразнещо действие
                           : Вещества, които не се класифицират като вещества с дразнещо действие върху очите от категория I, II, или III по EPA; или вещества с дразнещо действие върху очите от категория 1, 2, 2A или 2B на Глобалната хармонизирана система за класифициране и етикетиране на химикали (GHS); или от категория 1 или 2 на ЕС (17) (18) (19).
                        
                           
                              Химикал с корозивно действие върху очите
                           : а) химикал, който причинява необратимо тъканно увреждане на окото; б) химикали, които се класифицират като такива с дразнещо действие върху очите от категория 1 на GHS, с дразнещо действие върху очите от категория I по EPA, или от категория 1 на ЕС (17) (18) (19).
                        
                           
                              Химикал с дразнещо действие върху очите
                           : а) химикал, който причинява обратимо изменение в окото; б) химикали, които са класифицирани като химикали с дразнещо действие върху очите от категория II или III по EPA; или химикали с дразнещо действие върху очите от категория 2, 2A или 2B на Глобалната хармонизирана система за класифициране и етикетиране на химикали (GHS); или от категория 2 на ЕС (17) (18) (19).
                        
                           
                              Химикал със силно дразнещо действие върху очите
                           : а) химикал, който причинява тъканно увреждане на окото, което не преминава до 21 дни след прилагането или причинява сериозно физическо влошаване на зрението; б) химикали, които се класифицират като такива с дразнещо действие върху очите от категория 1 на GHS, или с дразнещо действие върху очите от категория I по EPA, или от категория 1 на ЕС (17) (18) (19).
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                        
                           
                              Поетапен подход
                           : Стратегия за поетапно изпитване, при която цялата съществуваща информация за даден изпитван химикал се разглежда по конкретен ред, като на всеки етап се прилага процес, основан на тежестта на доказателствата, за определяне дали съществува достатъчно информация за вземане на решение за класифициране с оглед на опасността, преди да се премине към следващия етап. Ако потенциалът за дразнещо действие на даден изпитван химикал може да се определи въз основа на съществуващата информация, не се налага допълнително изпитване. Ако потенциалът за дразнещо действие на даден изпитван химикал не може да се определи въз основа на съществуващата информация, се провежда процедура за поетапно последователно изпитване върху животни, докато стане възможно да се направи ясно класифициране.
                        
                           
                              Процес, основан на тежестта на доказателствата
                           : Силните и слабите страни на дадено събиране на информация се използват като основа за заключение, което може да не е очевидно от индивидуалните данни.
                     
                     
                        ДОПЪЛНЕНИЕ КЪМ МЕТОД ЗА ИЗПИТВАНЕ Б.5
                         (4)
                     
                     СТРАТЕГИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНО ИЗПИТВАНЕ ЗА ОЦЕНКА НА ДРАЗНЕЩО/КОРОЗИВНО ДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ ОЧИТЕ
                     
                        Общи съображения
                     
                     В интерес на научната стойност на проучването и на благополучието на животните е важно да се избягва ненужното използване на опитни животни и да се допускат колкото е възможно по-малко изпитвания, за които се очаква, че ще предизвикат тежки увреждания при животни. Преди разглеждането на изпитване in vivo следва да се оцени цялата информация, относима към потенциала за дразнещо/корозивно действие на даден химикал върху очите. Възможно е вече да съществуват достатъчни доказателства, въз основа на които химикалът може да се класифицира по отношение на потенциала си за дразнещо/корозивно действие върху очите, без да е необходимо да се извършват изпитвания върху лабораторни животни. Затова чрез основан на тежестта на доказателствата анализ и стратегия за последователно изпитване ще се сведе до минимум необходимостта от изпитвания in vivo, особено когато се очаква химикалът да предизвика тежки увреждания.
                     Препоръчва се да се извърши основан на тежестта на доказателствата анализ за оценка на съществуващата информация за дразнещо/корозивно действие на химикалите върху очите и за определяне дали да се проведат други проучвания, различни от изпитвания in vivo върху очите, които могат да подпомогнат характеризирането на такъв потенциал. Когато са нужни по-нататъшни проучвания, се препоръчва относимите експериментални данни да се получат, като се приложи стратегията за последователно изпитване. За веществата, които не са изпитвани досега, следва да се използва стратегията за последователно изпитване, за да се съберат данните, необходими за оценката на тяхното корозивно/дразнещо действие върху очите. Първоначалната стратегия за изпитване, описана в настоящото допълнение, е разработена на семинар на ОИСР (1). По-късно тя е утвърдена и разширена в рамките на Хармонизираната интегрирана система за класифициране на опасностите във връзка с въздействията на химичните вещества върху човешкото здраве и околната среда, приета на 28-ата съвместна среща на Комитета по химикалите и работната група по химикалите през ноември 1998 г. (2), и актуализирана от експертна група на ОИСР през 2011 г.
                     Въпреки че посочената стратегия за последователно изпитване не е включена като неразделна част от метод В.5, тя представлява препоръчителният подход за определяне на свойствата, свързани с дразнещо/корозивно действие върху очите. Този подход представлява както най-добра практика, така и стандарт за етика при изпитванията in vivo за оценка на дразнещото/корозивното действие върху очите. В метода за изпитване са дадени указания за провеждането на изпитването in vivo и се обобщават факторите, които следва да се вземат предвид преди разглеждането на такова изпитване. Стратегията за последователно изпитване предлага основан на тежестта на доказателствата подход за оценка на съществуващите данни за дразнещото/корозивното действие върху очите на химикалите и поетапен подход за получаване на относими данни за химикалите, за които са необходими допълнителни изследвания или за които досега не са извършвани изследвания. В стратегията се включва извършване първоначално на валидирани и приети изпитвания in vitro или ех vivo, а след това на изследвания по МИ Б.4 при определени условия (3) (4).
                     
                        Описание на стратегията за поетапно изпитване
                     
                     Преди да се предприемат изпитвания в рамките на стратегията за последователно изпитване (вж. фигурата), следва да се оцени цялата налична информация с оглед определяне на необходимостта от провеждане на изпитване in vivo върху очите. Въпреки че значима информация може да се получи и при оценката на отделни параметри (например екстремални стойности на рН), следва съществуващата информация да бъде оценена в нейната цялост. При вземане на решение, основано на тежестта на доказателствата, следва да бъдат оценени всички относими данни за ефектите на даден химикал и на неговите структурни аналози, и следва да се представи обосновка за взетото решение. На първо място следва да се обърне внимание на свързаните с хора и животни съществуващи данни по отношение на химикала, а след това следва да се оценят резултатите от изпитванията in vitro или ех vivo. Във всички случаи, когато е възможно, следва да се избягва провеждането на in vivo изпитвания на корозивни химикали. Факторите, които се вземат под внимание в стратегията за изпитване, включват:
                     
                                  
                              
                              
                                 Оценка на съществуващите данни за хора и/или животни и/или in vitro данни от валидирани и международно приети методи (стъпка 1).
                                 Съществуващите данни за хора, като например клинични проучвания, проучвания от трудова медицина, протоколирани случаи и/или данни от изпитвания върху животни и/или изследвания на очите, и/или in vitro данни от валидирани и международно приети методи за корозивно/дразнещо действие върху очите, следва да се разглеждат с предимство, защото те осигуряват информация, пряко свързана с въздействието върху очите. След това следва да се оценят данните за корозивно/дразнещо действие върху кожата, налични от проучвания върху хора и/или животни, и/или изследвания in vitro от валидирани и международно приети методи, свързани с корозия на кожата. Химикалите, за които е известно че са корозивни или силно дразнещи за очите, и химикалите, показващи корозивно или силно дразнещо действие върху кожата, не следва да се накапват в очите на животните; такива химикали следва да се разглеждат като корозивни и/или дразнещи също и за очите. Също така не е необходимо да се провеждат in vivo изпитвания на химикали, за които съществуват достатъчно данни от предходни проучвания за отсъствие на дразнещо или корозивно действие върху очите.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Анализ на зависимостта „структура-активност“ (SAR) (стъпка 2).
                                 Резултатите от изпитвания на структурно подобни химикали следва да се вземат под внимание, ако са налични. Когато за структурно подобни вещества или смеси от такива вещества съществуват достатъчно данни за хора и/или животни, показващи потенциала им за корозивно/дразнещо действие върху очите, може да се приеме, че химикалът за изпитване ще предизвика същия отклик. В тези случаи е възможно да не е необходимо изпитване на химикала. Съгласно стратегията за последователно изпитване негативните данни от проучвания на структурно подобни вещества или смеси от такива вещества не се смятат като достатъчно доказателство, за да се приеме отсъствие на корозивен или дразнещ ефект за даден химикал. За установяване на потенциала за корозивно/дразнещо действие върху кожата и очите следва да се използват валидирани и приети SAR подходи.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Физични и химични свойства и реакционна способност на химикала (стъпка 3).
                                 Химикалите, показващи екстремални стойности на рН, като ≤ 2,0 или ≥ 11,5 могат да предизвикат силно изразени локални ефекти. Когато даден химикал може да се определи като корозивен или дразнещ за очите въз основа на екстремални стойности на рН, може да се вземе под внимание и неговият киселинен/алкален резерв (буферен капацитет) (5)(6)(7). Когато буферният капацитет позволява да се предположи, че даден химикал може да не е корозивен за очите (т.е. химикали с екстремална стойност на рН и ниска стойност за киселинния/алкалния резерв), следва да се проведе по-нататъшно изпитване за потвърждаване на това предположение, за предпочитане посредством валидирано и прието изпитване in vitro или ех vivo (вж. точка 10).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Разглеждане на друга налична информация (стъпка 4).
                                 На този етап следва да се оцени цялата налична информация за общата токсичност по дермален път на постъпване. Острата дермална токсичност на изпитвания химикал също следва да се вземе под внимание. Когато е доказано, че даден химикал проявява силна токсичност по дермален път, е възможно да не е необходимо той да бъде изпитван върху очите. Въпреки че не винаги съществува връзка между острата дермална токсичност и дразнещото/корозивното действие върху очите, може да се допусне, че даден агент, който е силно токсичен по дермален път, ще прояви силна токсичност и при накапване в очите. Такива данни могат да се разгледат също и между стъпки 2 и 3.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Оценка на корозивното действие на химикала върху кожата, ако тя също е необходима за регулаторни цели (стъпка 5).
                                 Най-напред следва да се оцени потенциалът за корозивно и силно дразнещо действие върху кожата, в съответствие с метод за изпитване Б.4 (4) и придружаващото го допълнение (8), включително използването на валидирани и международно приети in vitro методи за изпитване за корозия на кожата (9) (10) (11). Ако е доказано, че химикалът предизвиква корозия или силно дразнене на кожата, може също да се смята, че той има и корозивно или силно дразнещо действие върху очите. По този начин не се изискват допълнителни изпитвания. Ако химикалът не предизвиква корозия или силно дразнене на кожата, следва да се извърши изпитване in vitro или ex vivo за действие върху очите.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Резултати от изпитвания in vitro или ех vivo (стъпка 6).
                                 За химикалите, за които е доказано корозивно или силно дразнещо действие при изпитване in vitro или ех vivo, валидирано и международно прието конкретно за оценка на корозивно/дразнещо действие върху очите (12)(13), не е необходимо изпитване върху животни. Може да се приеме, че тези химикали ще предизвикат подобни силно изразени ефекти in vivo. Когато не съществуват валидирани и приети изпитвания in vitro/ex vivo, следва да се пропусне стъпка 6 и да се премине направо към стъпка 7.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Изпитване in vivo върху зайци (стъпки 7 и 8).
                                 Изпитването in vivo за действие върху очите следва да започне с първоначално изпитване върху едно животно. Когато резултатите от това изпитване показват, че химикалът проявява силно дразнещо или корозивно действие върху очите, не следва да се извършва по-нататъшно изпитване. Ако при посоченото изпитване не бъде наблюдаван никакъв корозивен или силно дразнещ ефект, се извършва потвърждаващо изпитване с две допълнителни животни. В зависимост от резултатите от потвърждаващо изпитване може да са необходими допълнителни изпитвания. [виж метод за изпитване Б.5]
                              
                           
                        СТРАТЕГИЯ ЗА ИЗПИТВАНЕ И ОЦЕНКА НА ДРАЗНЕЩО/КОРОЗИВНО ДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ ОЧИТЕ
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Дейност
                                 
                              
                              
                                 
                                    Констатация
                                 
                              
                              
                                 
                                    Заключение
                                 
                              
                           
                                 
                                    1
                                 
                              
                              
                                 Съществуващи данни за хора и/или животни и/или in vitro данни от валидирани и международно приети методи, показващи действие върху очите
                              
                              
                                 Тежко увреждане на очите
                              
                              
                                 Апикална крайна точка; смята се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва.
                              
                           
                                 С дразнещо действие върху очите
                              
                              
                                 Апикална крайна точка; смята се, че е с дразнещо действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва.
                              
                           
                                 Действието върху очите не е корозивно/не е дразнещо
                              
                              
                                 Апикална крайна точка; смята се, че не е с корозивно или дразнещо действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва.
                              
                           
                                 Съществуващи данни за хора и/или животни и/или in vitro данни от валидирани и международно приети методи, показващи корозивно действие върху кожата
                              
                              
                                 Корозивно действие върхy кожата
                              
                              
                                 Допуска се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва.
                              
                           
                                 Съществуващи данни за хора и/или животни и/или in vitro данни от валидирани и международно приети методи, показващи силно дразнещо действие върху кожата
                              
                              
                                 Силно дразнещо действие върху кожата
                              
                              
                                 Допуска се, че е с дразнещо действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    липсва информация или от наличната информация не може да се направи заключение
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    2
                                 
                              
                              
                                 Извършва се SAR за корозивно/дразнещо действие върху очите
                              
                              
                                 Прогнозира се тежко увреждане на очите.
                              
                              
                                 Допуска се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва.
                              
                           
                                 Прогнозира се дразнещо действие върху очите.
                              
                              
                                 Допуска се, че е с дразнещо действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва.
                              
                           
                                 Разглежда се SAR за корозия на кожата.
                              
                              
                                 Прогнозира се корозия на кожата.
                              
                              
                                 Допуска се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Не могат да бъдат направени прогнози, или въз основа на прогнозите не може да се направи заключение, или прогнозите са негативни
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    3
                                 
                              
                              
                                 Измерете рН (буферния капацитет, когато е относимо).
                              
                              
                                 pH ≤ 2 или ≥ 11,5 (с висок буферен капацитет, когато е относимо)
                              
                              
                                 Допуска се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо да се изпитва.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    2 < pH < 11,5, или pH ≤ 2,0 или ≥ 11,5 с нисък буферен капацитет или без буферен капацитет, когато е относимо
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    4
                                 
                              
                              
                                 Разглеждат се наличните данни за общата токсичност по дермален път
                              
                              
                                 Силно токсичен при концентрации, които могат да бъдат изпитвани върху очите.
                              
                              
                                 Химикалът е прекомерно токсичен и не може да се проведе изпитване. Не е необходимо да се изпитва.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Липсва такава информация или химикалът не е силно токсичен
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    5
                                 
                              
                              
                                 Оценява се опитно потенциалът за корозия на кожата, съгласно стратегията за изпитване в глава Б.4 от настоящото приложение, когато това се изисква и за регулаторни цели
                              
                              
                                 Реакция за корозивно или силно дразнещо действие
                              
                              
                                 Допуска се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо по-нататъшно изпитване.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Химикалът не проявява корозивно или силно дразнещо действие върху кожата.
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    6
                                 
                              
                              
                                 Провежда се валидирано и утвърдено изпитване (или изпитвания) in vitro или ех vivo върху очите
                              
                              
                                 Реакция за корозивно или силно дразнещо действие
                              
                              
                                 Допуска се, че е с корозивно или силно дразнещо действие върху очите, при условие че извършеното изпитване може да се използва за определяне на химикали с корозивно/силно дразнещо действие, и при условие че химикалът е в рамките на областта на приложимост на изпитването. Не е необходимо по-нататъшно изпитване.
                              
                           
                                 Реакция за дразнещо действие
                              
                              
                                 Допуска се, че е с дразнещо действие върху очите, при условие че извършеното изпитване (или изпитвания) може да се използва за правилно определяне на химикали с корозивно, силно дразнещо и дразнещо действие, и при условие че химикалът е в рамките на областта на приложимост на изпитването (или изпитванията). Не е необходимо по-нататъшно изпитване.
                              
                           
                                 Реакция за липса на дразнещо действие
                              
                              
                                 Допуска се, че не е с дразнещо действие върху очите, при условие че извършеното изпитване (или изпитвания) може да се използва за правилно определяне на химикали, които не са с дразнещо действие, за правилното им разграничаване от химикали, които са с дразнещо, силно дразнещо или корозивно действие върху очите, и при условие че химикалът е в рамките на областта на приложимост на изпитването. Не е необходимо по-нататъшно изпитване.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Не може да се използва валидирано и прието изпитване (или изпитвания) in vitro или ех vivo върху очите, за да се стигне до заключение
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    7
                                 
                              
                              
                                 Извършва се първоначално изпитване in vivo върху очите върху един заек.
                              
                              
                                 Тежко увреждане на очите
                              
                              
                                 Смята се, че е с корозивно действие върху очите. Не е необходимо по-нататъшно изпитване.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Липсва тежко увреждане или не се наблюдава реакция.
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    8
                                 
                              
                              
                                 Извършва се потвърждаващо изпитване върху едно или две допълнителни животни.
                              
                              
                                 Корозивно или дразнещо действие
                              
                              
                                 Смята се, че е с корозивно или дразнещо действие върху очите. Не е необходимо по-нататъшно изпитване.
                              
                           
                                 Липсва корозивно или дразнещо действие
                              
                              
                                 Смята се, че не е с дразнещо или корозивно действие върху очите. Не е необходимо по-нататъшно изпитване.
                              
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 — 24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Глава Б.4 от настоящото приложение, Остра токсичност: кожно дразнещо/корозивно действие.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 — 26.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 12, pp.483 — 524.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 — 231.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Допълнение към Глава Б.4 от настоящото приложение, Стратегия за последователно изпитване за дразнения и корозивно действие върху кожата.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Глава Б.40 от настоящото приложение, In Vitro кожна корозия: транскутанно измерване на електрическото съпротивление на кожата (TER).
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Глава Б.40А от настоящото приложение, In Vitro кожна корозия: изпитване върху модел на човешка кожа.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Глава Б.47 от настоящото приложение, Метод за изпитване на непрозрачност и пропускливост на говеждата роговица за идентификация на вещества с корозивно и дразнещо действие върху очите.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Глава Б.48 от настоящото приложение, Метод за изпитване с изолирани птичи очи за определяне на вещества с корозивно и силно дразнещо действие върху очите.
                              
                           
               
                     3)
                  
                  
                     В Част Б глава Б.10 се заменя със следното:
                     Б.10   Изпитване in vitro за хромозомни аберации при бозайници
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на Насоки за изпитване на ОИСР 473 (2016). Той е част от поредица от методи за изпитване от областта на генетичната токсикология. Разработен е документ на ОИСР, съдържащ ясна информация относно изпитванията в областта на генетичната токсикология, и преглед на актуалните изменения на посочените Насоки (1).
                     Целта на изпитването in vitro за хромозомни аберации е да се идентифицират химикали, причиняващи структурни хромозомни аберации в култивирани клетки от бозайници (2) (3) (4). Структурните аберации могат да бъдат два типа: хромозомни и хроматидни. В изследванията in vitro за хромозомни аберации може да възникне полиплоидия (включително ендоредупликация). Докато анеугени могат да предизвикат полиплоидия, полиплоидията сама по себе си не е показание за анеугенен потенциал и може просто да показва смущение на клетъчния цикъл или цитотоксичност (5). Това изпитване не е предназначено да измерва анеуплоидия. За откриването на анеуплоидия се препоръчва изпитване in vitro за микроядра на клетки (6).
                     При изпитването in vitro за хромозомни аберации могат да се използват култури от установени клетъчни линии или първични клетъчни култури с човешки произход или с произход от гризачи. Използваните клетки следва да се избират въз основа на способността на растеж в културата, стабилността на кариотипа (включително броя на хромозомите) и спонтанната честота на хромозомните аберации (7). Към настоящия момент наличните данни не позволяват да се направят категорични препоръки, но дават възможност да се предполага, че при оценяване на опасностите от химикали е важно да се разглеждат статусът на p53, генетичната (кариотипна) стабилност, капацитетът за поправка на ДНК и произходът (произход от гризачи спрямо човешки произход) на клетките, избрани за изпитване. По този начин ползвателите на настоящия метод за изпитване са насърчавани, с увеличаването на познанията в тази област, да обърнат внимание на влиянието на тези и други клетъчни характеристики върху параметрите на дадена клетъчна линия при откриването на предизвикване на хромозомни аберации.
                     Използваните определения са дадени в допълнение 1.
                     ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ
                     Изпитванията, провеждани in vitro, по принцип изискват използването на екзогенен източник на метаболитно активиране, освен когато клетките са с капацитет за метаболизиране по отношение на изпитваните химикали. Екзогенната система на метаболитно активиране не възпроизвежда изцяло in vivo условия. Следва внимателно да се избягват условия, които биха довели до изкуствено предизвикани положителни резултати, т.е. хромозомно увреждане, което не е причинено от прякото взаимодействие между изпитваните химикали и хромозомите; такива условия включват промени в pH или осмолалитета (8) (9) (10), взаимодействие с компонентите на средата (11) (12) или прекомерно високи нива на цитотоксичност (13) (14) (15) (16).
                     Настоящият тест се използва за откриване на хромозомни аберации, които може да са резултат от кластогенни събития. Анализът на предизвикването на хромозомни аберации следва да бъде извършен като се използват клетки в метафаза. Поради това от съществено значение е клетките да претърпят митоза както при третираните, така и при нетретираните култури. За произведени наноматериали може да е необходимо специфично адаптиране на настоящия метод за изпитване, но то не е описано в настоящия метод за изпитване.
                     Преди използването на метода за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Такива съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа.
                     ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     Клетъчните култури с човешки произход или с произход от други бозайници се подлагат на експозиция на изпитвания химикал със и без екзогенен източник на метаболитно активиране, освен когато се използват клетки с достатъчен капацитет за метаболизиране (вж. точка 13). На предварително определени интервали след началото на експозицията на клетъчните култури на изпитвания химикал, те се третират с блокиращ метафазата химикал (напр. колцемид или колхицин), събират се, оцветяват се и клетките в метафаза се анализират под микроскоп за наличието на хроматиден и хрозозомен тип аберации.
                     ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
                     
                        Приготвяне
                     
                     
                        Клетки
                     
                     Могат да се използват разнообразни клетъчни линии (например яйчникови клетки от китайски хамстер (CHO), бял дроб от китайски хамстер V79, бял дроб от китайски хамстер (CHL)/IU, TK6) или първични клетъчни култури, включително и лимфоцити от периферна кръв от човек или от други бозайници. Изборът на използваните клетъчни линии следва да е научно обоснован. Когато се използват първични клетки, от съображения за хуманно отношение към животните следва да се разгледа използването на първични клетки от човешки произход, когато това е осъществимо, и от тях да се вземат проби в съответствие с човешките етични принципи и правната рамка. Човешките лимфоцити от периферна кръв следва да бъдат получени от млади (на приблизителна възраст 18—35 години) индивиди, които не са пушачи, без известни заболявания и за които не е известно наскоро да са били подложени на експозиция на генотоксични агенти (напр. химикали, йонизиращи лъчения) на нива, които биха увеличили фоновата честота на хромозомните аберации. Това би гарантирало ниските и съгласувани стойности на фоновата честота на хромозомни аберации. Базовата честота на хромозомни аберации нараства с възрастта и тази тенденция е по-изразена при индивидите от женски пол, отколкото при индивидите от мъжки пол (17) (18). Броят на донорите следва да бъде посочен, ако се обединят клетките от повече от един донор в обща група за използване. Необходимо е да се докаже, че клетките са преминали през делене от началото на третирането с изпитвания химикал до вземането на проби от клетките. Клетъчните култури се поддържат във фаза на експоненциален растеж (клетъчни линии) или деленето им се стимулира (първични култури от лимфоцити) с оглед експозиция на клетките през различни етапи от клетъчния цикъл, тъй като чувствителността на клетъчните етапи по отношение на изпитваните химикали може да не е известна. Първичните клетки, чието делене трябва да бъде стимулирано с митогенни агенти, обикновено не се синхронизират повече по време на експозиция на изпитвания химикал (напр. човешки лимфоцити след 48-часова митогенна стимулация). Използването на синхронизирани клетки по време на третирането не е препоръчително, но може да бъде приемливо, ако е обосновано.
                     
                        Среди и условия за отглеждане на културата
                     
                     За отглеждането на културите трябва да бъдат използвани подходящи среда за отглеждане и инкубационни условия (съдове за отглеждане, влажна атмосфера с 5 % CO2 ако е целесъобразно, температура на инкубиране от 37 °C). Клетъчните линии следва да се проверяват рутинно за стабилност на модалния брой на хромозомите и отсъствие на замърсяване от Mycoplasma (7) (19), и клетките не следва да се използват, ако са замърсени или ако има промени в модалния брой на хромозомите. Нормалната продължителност на клетъчния цикъл на клетъчните линии или първичните култури, използвани в лабораторията, провеждаща изпитването, следва да бъде установена и следва да съответства на публикуваните характеристики на клетките (20).
                     
                        Приготвяне на културите
                     
                     Клетъчни линии: размножават се клетки от изходни култури, посяват се в среда за отглеждане с такава посевна гъстота, че клетките в суспензии или в монослоеве да продължат експоненциалния си растеж до събирането (напр. следва да се избягва сливането при клетки, отглеждани в монослоеве).
                     Лимфоцити: цяла кръв, третирана с антикоагулант (напр. хепарин), или изолирани лимфоцити се отглеждат (напр. в продължение на 48 часа за човешки лимфоцити) в присъствието на митоген, [напр. фитохемаглутинин (PHA) за човешки лимфоцити] за предизвикване на клетъчно делене преди експозиция на изпитвания химикал.
                     
                        Метаболитно активиране
                     
                     При използването на клетки с недостатъчен ендогенен капацитет за метаболизиране следва да се използват екзогенни метаболизиращи системи. Най-често използваната система, която се препоръчва по подразбиране, освен ако няма основание за друго, е постмитохондрична фракция (S9) с добавка на ко-фактор, приготвена от черен дроб на гризачи (обикновено плъхове), третирани с ензимно индуциращи агенти като Ароклор 1254 (21) (22) (23) или съчетание от фенобарбитал и β-нафтофлавон (24) (25) (26) (27) (28) (29). Последното съчетание не противоречи на Стокхолмската конвенция за устойчивите органични замърсители (30) и е доказано, че е също толкова ефективно, колкото Ароклор 1254, за индуцирането на оксидази със смесени функции (24) (25) (26) (28). Фракцията S9 обикновено се използва в концентрации, вариращи от 1 до 2 % (об./об.), но може да се увеличи до 10 % (об./об.) в окончателната среда за изпитване. Използването на продукти, намаляващи митотичния индекс, особено продукти, образуващи комплекси с калция (31), следва да се избягва по време на третирането. Изборът на типа и концентрацията на използваната екзогенна система за метаболитно активиране или метаболитен индуктор може да бъде повлиян от класа химикали, който се изпитва.
                     
                        Приготвяне на химикала за изпитване
                     
                     Твърдите изпитвани химикали следва да се подготвят в подходящи разтворители и, ако е необходимо, да се разредят преди третиране на клетките (вж. точка 23). Течните химикали за изпитване могат да се добавят директно в системата за изпитване и/или да се разредят преди третирането на системата за изпитване. Газообразните или летливите химикали за изпитване следва да бъдат изпитвани чрез подходящи изменения на стандартните протоколи, като например третиране в запечатани съдове за отглеждане (32) (33) (34). Приготвянето на изпитвания химикал следва да се извърши непосредствено преди третирането, освен ако данните за стабилността показват, че е допустимо съхранение.
                     
                        Условия на изпитването
                     
                     
                        Разтворители
                     
                     Разтворителят трябва да бъде избран с цел оптимизиране на разтворимостта на изпитваните химикали, без да се оказва негативно влияние върху извършването на изследването, като например промяна на клетъчния растеж, засягане на целостта на изпитвания химикал, реакция със съдовете за отглеждане, нарушаване на системата за метаболитно активиране. Препоръчва се винаги когато е възможно най-напред да се разглежда възможността за използване на вода като разтворител (или среда за отглеждане). Добре утвърдени разтворители са например водата или диметилсулфоксидът. Като цяло органичните разтворители не следва да надвишават 1 % (об./об.), а водните разтворители (физиологичен разтвор или вода) не трябва да превишават 10 % (об./об.) в окончателната среда за третиране. Ако се използват разтворители, които не са добре утвърдени (напр. етанол или ацетон), използването им следва да бъде подкрепено от данни за съвместимостта им с изпитваните химикали и системата за изпитване, както и за това, че не са генотоксични при използваната концентрация. При липса на подкрепящи данни е важно да се включат нетретирани контроли (виж допълнение 1), за да се докаже, че избраният разтворител не предизвиква никакви неблагоприятни или кластогенни ефекти.
                     
                        Измерване на клетъчната пролиферация и цитотоксичността и избор на концентрации на третиране
                     
                     При определяне на най-високата концентрация на изпитвания химикал следва да се избягват концентрациите, които могат да доведат до изкуствено предизвикан положителен отклик, като например предизвикващите прекомерна цитотоксичност (вж. точка 22), утаяване в средата за отглеждане (вж. точка 32) или явни промени в pH или осмолалитета (вж. точка 5). Ако изпитваният химикал предизвиква явна промяна в pH на средата към момента на добавянето, pH може да бъде коригиран чрез буфериране на окончателната среда за третиране, за да се избегнат изкуствено предизвикани положителни резултати и да се поддържат подходящи условия за отглеждане.
                     Извършват се измервания на пролиферацията на клетките, за да се гарантира, че по време на изпитването достатъчно на брой третирани клетки са претърпели митоза, както и че третиранията са извършени при подходящи нива на цитотоксичност (вж. точки 18 и 22). Цитотоксичността следва да се определи в главния опит със и без метаболитно активиране, като се използва подходяща индикация на клетъчната смърт и растеж. Въпреки че оценката на цитотоксичността в първоначално изпитване може да бъде полезна за по-добро определяне на концентрациите, които ще се използват в главния опит, първоначалното изпитване не е задължително. Ако се извършва, то не следва да заменя измерването на цитотоксичността в главния опит.
                     Методите „относително удвояване на популации (RPD)“ или „относителен ръст в количеството клетки (RICC)“ са подходящи за оценка на цитотоксичността в цитогенетични изследвания (13) (15) (35) (36) (55) (вж. допълнение 2 за формули). В случай на продължителни периоди на третиране и пробовземане след началото на третирането, по-дълги от 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл (т.е., за период общо над 3 клетъчни цикъла) RPD може да подцени цитотоксичността (37). При тези обстоятелства RICC може да бъде по-добър измерител, но оценката на цитотоксичността след 1,5 пъти нормалната продължителност на клетъчния цикъл би представлявала полезна прогнозна оценка с използването на RPD.
                     Въпреки че митотичният индекс (MI) е измерител за цитотоксичното/цитостатичното действие върху лимфоцитите в първични култури, той се влияе от това кога е измерен след третирането, от използвания митоген и от евентуални прекъсвания на клетъчния цикъл. Независимо от това MI е приемлив, тъй като другите измервания на цитотоксичността могат да се окажат обременителни и непрактични и е възможно да са неприложими за прицелната популация от лимфоцити, нарастваща в резултат от стимулиране с PHA.
                     Независимо от това, че препоръчителните параметри за цитотоксичността са RICC и RPD за клетъчни линии и MI за първични култури от лимфоцити, други показатели (например клетъчната цялост, апоптозата, некрозата, клетъчният цикъл) биха могли да предоставят полезна допълнителна информация.
                     Следва да бъдат оценени най-малко три концентрации на изпитване (без да се включват контролите на разтворител и положителните контроли), които отговарят на критериите за приемливост (подходяща цитотоксичност, брой на клетки и т.н.). Независимо от типа на клетките (клетъчни линии или първични култури от лимфоцити), при всяка изпитвана концентрация могат да се използват третирани култури с повторения или без повторение. Макар да се препоръчва използването на култури с повторение, използването на култури без повторение също е приемливо, при условие че е преброен същият общ брой клетки при културата без повторение и при културата с повторение. Използването на култури без повторение е от особено значение в случаите, когато се оценяват повече от 3 концентрации (виж точка 31). Резултатите, получени за културите с независими повторения при дадена концентрация, могат да бъдат обединени за анализа на данните (38). За изпитваните химикали, които показват слаба цитотоксичност или които не показват цитотоксичност, обичайно са подходящи приблизително 2 до 3-кратни концентрационни интервали. Там, където се среща цитотоксичност, избраните изпитвани концентрации следва да са в обхват, в който се получава цитотоксичност, както е описано в точка 22, и да включват концентрации, при които има умерена, слаба и нулева цитотоксичност. Множество изпитвани химикали показват стръмни криви концентрация-отклик и за да се получат данни за слаба и умерена цитотоксичност, или за да се проучи подробно връзката доза-отклик, е необходимо да се използват по-близко разположени концентрации и/или над три концентрации (култури без повторение или с повторения), по-специално в ситуации, при които се изисква повтаряне на опита (вж. точка 47).
                     Ако максималната концентрация е базирана на цитотоксичност, най-високата концентрация следва да има за цел постигане на 55 ± 5 % цитотоксичност при използване на препоръчаните параметри за цитотоксичност (т.е. намаляване при RICC и RPD за клетъчни линии и намаляване при MI за първични култури от лимфоцити до 45 ± 5 % от паралелната отрицателна контрола). Трябва да се внимава при тълкуването на положителните резултати, които се срещат само в горния край на диапазона 55 ± 5 % цитотоксичност (13).
                     За малко разтворимите изпитвани химикали, които не са цитотоксични при концентрации, по-ниски от най-ниската неразтворима концентрация, най-високата анализирана концентрация трябва да предизвиква помътняване или утайка, видима с невъоръжено око или с помощта на инвертен микроскоп в края на третирането с изпитвания химикал. Дори ако цитотоксичността се наблюдава над най-ниската неразтворима концентрация, препоръчително е да се извърши изпитване само при една концентрация, която предизвиква помътняване или е с видима утайка, тъй като от утайката могат да се получат изкуствено предизвикани въздействия. При концентрацията, водеща до образуването на утайка, трябва да се вземат мерки, за да се гарантира, че утайката не пречи на провеждането на изпитването (напр. оцветяване или броене). Определянето на разтворимостта в средата за отглеждане преди началото на опита може да се окаже полезно.
                     Ако не се наблюдава утайка или ограничаваща цитотоксичност, най-високата изпитвана концентрация следва да съответства на 10 mM, 2 mg/ml или 2 μl/ml, в зависимост от това коя от стойностите е най-ниска (39) (40) (41). Когато изпитваният химикал не е с определен състав, например вещество с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологичен материал (UVCB) (42), екстракт от околната среда и др., може да е необходимо стойността на най-високата концентрация да е по-голяма (напр. 5 mg/ml), при липсата на достатъчна цитотоксичност, за да се увеличи концентрацията на всеки от компонентите. Следва да се отбележи обаче, че тези изисквания могат да се различават по отношение на фармацевтични продукти за хуманна употреба (43).
                     
                        Контроли
                     
                     Паралелните отрицателните контроли (вж. точка 15), състоящи се само от разтворител в средата за третиране, и третирани по същия начин като културите, които се третират, следва да се включат за всяко време на събиране.
                     Паралелните положителни контроли са необходими за доказване на способността на лабораторията за идентифициране на кластогени при условията на използвания протокол за изпитването и на ефективността на екзогенната система за метаболитно активиране, когато е приложимо. Примери за положителни контроли са дадени в таблица 1 по-долу. Като положителни контроли могат да бъдат използвани алтернативни химикали, ако това е обосновано. Тъй като изпитванията in vitro върху клетки от бозайници за генетична токсичност са достатъчно стандартизирани, използването на положителни контроли може да се ограничи до кластоген, изискващ метаболитно активиране. При условие че това се извършва паралелно с изпитването без активиране при същата продължителност на третирането, откликът на тази единична положителна контрола ще докаже както активността на системата за метаболитно активиране, така и способността за реагиране на системата за изпитване. Независимо от това, дългосрочното третиране (без S9) следва да има своя собствена положителна контрола, тъй като продължителността на третирането ще се различава от тази при изпитването, при което се използва метаболитно активиране. Всяка положителна контрола следва да бъде използвана при една или повече концентрации, които се очаква да породят възпроизводими и откриваеми увеличения спрямо фона, за да се докаже чувствителността на системата за изпитване (т.е. ефектите са ясни, но не разкриват непосредствено на четящото устройство идентичността на кодираните предметни стъкла), и откликът следва да не бъде накърнен от цитотоксичност, надхвърляща границите, посочени в метода за изпитване.
                     
                        Таблица 1.
                     
                     
                        Препоръчителни референтни химикали за оценка на пригодността на лабораторията и за подбор на положителни контроли.
                     
                     
                                 Категория
                              
                              
                                 Химикал
                              
                              
                                 CASRN
                              
                           1.   Кластогени, активни без метаболитно активиране
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Метилметансулфонат
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Митомицин С
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 4-нитрохинолин-N-оксид
                              
                              
                                 56-57-5
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Цитозин арабинозид
                              
                              
                                 147-94-4
                              
                           2.   Кластогени, изискващи метаболитно активиране
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Бензо(a)пирен
                              
                              
                                 50-32-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Циклофосфамид
                              
                              
                                 50-18-0
                              
                           ПРОЦЕДУРА
                     
                        Третиране с изпитвания химикал
                     
                     Пролифериращите клетки се третират с изпитвания химикал при наличието и в отсъствието на система за метаболитно активиране.
                     
                        Време за събиране на културата
                     
                     За задълбочена оценка, която ще бъде необходима за заключение за отрицателни резултати следва да са спазени всичките три от следните опитни условия с използване на краткосрочно третиране със и без метаболитно активиране и дългосрочно третиране без метаболитно активиране (вж. точки 43, 44 и 45):
                     
                                 —
                              
                              
                                 Клетките следва да бъдат подложени на експозиция на изпитвания химикал без метаболитно активиране в продължение на 3 до 6 часа, и след време, равно на около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането (18) от тях следва да се вземе проба,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Клетките следва да бъдат подложени на експозиция на изпитвания химикал с метаболитно активиране, в продължение на 3 до 6 часа, и след време, равно на около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането (18) от тях следва да се вземе проба,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Клетките следва да бъдат подложени на експозиция непрекъснато без метаболитно активиране до вземането на проба след време, равно на около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл. Някои химикали (напр. нуклеозидни аналози) могат по-лесно да бъдат открити при третиране/периоди на пробовземане, по-дълги от 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл (24).
                              
                           В случай че някое от посочените по-горе опитни условия води до положителен отклик, може да не се наложи изследване на никоя от останалите схеми на третиране.
                     
                        Приготвяне на хромозомите
                     
                     Клетъчните култури се третират с колцемид или колхицин обикновено в продължение на един до три часа преди събирането. Всяка клетъчна култура се събира и обработва отделно за приготвянето на хромозомите. Приготвянето на хромозомите включва хипотонично третиране на клетките, фиксиране и оцветяване. При еднослойните култури е възможно към края на третирането с продължителност 3—6 часа да присъстват митотични клетки (които се идентифицират като кръгли и отделящи се от повърхността). Тъй като тези митотични клетки се отделят лесно, те могат да се загубят при премахване на средата, съдържаща изпитвания химикал. Ако има доказателство за значително увеличаване на броя на митотичните клетки в сравнение с контролите, вероятно указващо блокиране на митозата, тогава в момента на събирането клетките следва да се събират чрез центрофугиране и да се добавят обратно към културите, за да се избегне загубата на клетки, които са в митоза и са подложени на риск от хромозомни аберации.
                     
                        Анализ
                     
                     Всички предметни стъкла, включително и тези на положителните и отрицателните контроли, следва да се кодират независимо едно от друго преди микроскопския анализ за хромозомни аберации. Процедурите по фиксиране често водят до загуба на хромозоми в част от клетките в метафаза и следователно преброените клетки следва да съдържат известен брой центромери, равен на модалния брой +/– 2.
                     Следва да се преброят най-малко 300 добре разнесени метафази за всяка концентрация и контрола, за да се направи заключение, че даден изпитван химикал е ясно отрицателен (вж. точка 45). Когато се използват култури с повторения, посочените 300 клетки следва да бъдат разделени поравно между повторенията. Когато се използва култура без повторение на концентрация (вж. точка 21), следва да се преброят най-малко 300 добре разнесени метафази в тази култура без повторение. Преброяването на 300 клетки има предимството, че се увеличава статистическата мощност на теста и освен това рядко се наблюдават нулеви стойности (очаква се те да са само 5 %) (44). Броят на преброените метафази може да бъде намален, когато се наблюдава голям брой клетки с хромозомни аберации и изпитваният химикал се смята за ясно положителен.
                     Следва да се преброят клетките със структурна хромозомна аберация (или аберации) със и без празнини. Разкъсванията и празнините са определени в допълнение 1 съгласно (45) (46). Хроматидният и хромозомният тип аберации следва да се отчитат поотделно и да се класифицират по подтипове (разкъсвания, обмени). Процедурите, използвани в лабораториите, следва да гарантират, че анализът на хромозомните аберации се извършва от добре обучени преброители и че му е направена партньорска оценка, ако е подходящо.
                     Въпреки че целта на изпитването е да се открият структурни хромозомни аберации, от значение е да се регистрират честотите на полиплоидия и на ендоредупликация, когато се наблюдават тези събития. (Вж. точка 2).
                     
                        Пригодност на лабораторията
                     
                     За да се установи наличието на достатъчно опит по отношение на изпитването преди рутинното изпитване, лабораторията следва да е извършила поредица от опити с действащи чрез различни механизми положителни референтни химикали, чрез използване на различни отрицателни контроли (използване на различни разтворители/носител). Този положителен и отрицателен отклик при контролите следва да съответства на литературата. Това не се прилага за лаборатории, които разполагат с опит, т.е. които разполагат с налична база данни за предходни периоди, както е определено в точка 37.
                     Подбрани химикали за положителни контроли (вж. таблица 1 в точка 26) следва да бъдат изследвани с краткосрочно и дългосрочно третиране в отсъствието на метаболитно активиране, и също така с краткосрочно третиране с метаболитно активиране, за доказване на пригодността за откриване на кластогенни химикали и за определяне на ефективността на системата за метаболитно активиране. Следва да бъде избран обхват от концентрации на химикалите от подбора така, че да се получават възпроизводими и свързани с концентрацията увеличения над фоновите стойности с цел да се демонстрират чувствителността и динамичният обхват на системата за изпитване.
                     
                        Данни за контролите за предходни периоди
                     
                     Лабораторията следва да установи:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Размах и разпределение при положителните контроли от предходни периоди,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Размах и разпределение при отрицателните (без третиране и за разтворител) контроли от предходни периоди.
                              
                           При първото придобиване на данни за разпределението при отрицателните контроли от предходни периоди паралелните отрицателни контроли следва да бъдат съобразени с публикуваните данни за контролите, когато такива са налице. При добавяне на повече опитни данни към разпределението при контролите паралелните отрицателни контроли следва в идеалния случай да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % на това разпределение (44) (47). Базата данни с отрицателни контроли от предходни периоди на лабораторията следва първоначално да се създаде с минимум 10 опита, но е за предпочитане тя да се състои най-малко от 20 опита, проведени при сравними опитни условия. Лабораториите трябва да използват методи за контрол на качеството, като например контролни карти (напр. C-карти или карти за средна стойност (X-bar) (48)), за определяне на варирането на данните им за положителните и отрицателните контроли, и за доказване, че методологията е „под контрол“ в техните лаборатории (44). В литературата (47) могат да се намерят допълнителни препоръки относно начина на създаване и използване на данни от предходни периоди (т.е. критерии за включване и изключване на данни в данните за предходни периоди и критериите за приемливост за даден опит).
                     Всички промени в опитния протокол следва да бъдат разглеждани от гледна точка на тяхната съгласуваност със съществуващите бази данни на дадената лаборатория за контролите за предходни периоди. Всички значителни несъответствия следва да водят до създаването на нова база данни за контролите за предходни периоди.
                     Данните за отрицателните контроли следва да включват броя на клетките с хромозомни аберации при култури без повторение или сбора за културите с повторения, както е описано в точка 21. Паралелните отрицателни контроли в идеалния случай следва да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % от разпределението от базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди (44) (47). Когато данните за паралелните отрицателни контроли попадат извън 95 %-ните граници за контрол, те могат да бъдат приемливи за включване в разпределението при контролите от предходни периоди, при условие че тези данни не са екстремални стойности, силно различаващи се от нормалните, и има доказателства, че системата за изпитване е „под контрол“ (вж. точка 37), както и доказателства за липса на техническа или човешка грешка.
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Представяне на резултатите
                     
                     Следва да бъде оценен процентът на клетки със структурна хромозомна аберация (или аберации). Хроматидният и хромозомният тип аберации, класифицирани по подтипове (разкъсвания, обмени), следва да бъдат изброени поотделно със съответния брой и честоти за опитните и контролните култури. Празнините се записват и протоколират отделно, но не се включват в общата честота на аберациите. Процентът на полиплоидия и/или ендоредуплицирани клетки се протоколира, ако е наблюдаван.
                     Следва също да се протоколират паралелните измервания на цитотоксичността за всички третирани, отрицателни и положителни контролни култури в главния опит (или главните опити) за аберации.
                     Следва да се предоставят данни за отделните култури. В допълнение към това всички данни следва да бъдат обобщени в табличен вид.
                     
                        Критерии за приемливост
                     
                     Приемливостта на дадено изпитване се основава на следните критерии:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Паралелната отрицателна контрола се счита за приемлива за допълване към базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди, както е описано в точка 39.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Паралелните положителни контроли (вж. точка 26) трябва да предизвикват отклици, които са съвместими с генерираните в базата данни за положителните контроли за предходни периоди, и да генерират статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Критериите за клетъчна пролиферация в контролата на разтворител трябва да бъдат спазени (точки 17 и 18).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Всичките три опитни условия са били подложени на изпитване, освен ако едно от тях е довело до положителни резултати (вж. точка 28).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Достатъчен брой клетки и концентрации са годни за анализ (точки 31 и 21).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Критериите за избор на най-високата концентрация са съвместими с описаните в точки 22, 23 и 24.
                              
                           
                        Оценка и тълкуване на резултатите
                     
                     При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно положителен, ако в някое от опитните условия (вж. точка 28):
                     
                                 а)
                              
                              
                                 при най-малко една от изпитваните концентрации се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола,
                              
                           
                                 б)
                              
                              
                                 увеличението е свързано с дозата при оценка, извършена с подходящ трендов тест,
                              
                           
                                 в)
                              
                              
                                 някой от резултатите е извън разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %; вж. точка 39).
                              
                           Ако са изпълнени всички тези критерии се смята, че изпитваният химикал може да предизвика хромозомни аберации в култивирани клетки от бозайници в тази система за изпитване. Препоръки за най-подходящите статистически методи могат да се намерят в литературните източници (49) (50) (51).
                     При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно отрицателен, ако във всички изследвани опитни условия (вж. точка 28):
                     
                                 а)
                              
                              
                                 в никоя от изпитваните концентрации не се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола,
                              
                           
                                 б)
                              
                              
                                 няма увеличение, свързано с дозата при оценка, извършена с подходящ трендов тест,
                              
                           
                                 в)
                              
                              
                                 всички резултати са в рамките на разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %; вж. точка 39).
                              
                           Тогава се смята, че изпитваният химикал не може да предизвика хромозомни аберации в култивирани клетки от бозайници в тази система за изпитване.
                     Няма изискване за потвърждаване на ясно положителен или ясно отрицателен отклик.
                     В случай че откликът не е нито ясно отрицателен, нито ясно положителен, както е описано по-горе, или с цел подпомагане на установяването на биологичната относимост на даден резултат, данните следва да се оценяват чрез експертна оценка и/или чрез допълнителни изследвания. Преброяването на допълнителни клетки (когато е уместно) или извършването на опит с повторение с възможност за използване на изменени опитни условия (напр. интервал на разполагане на концентрациите, други условия на метаболитно активиране (т.е. концентрация на S9 или произход на S9)) могат да се окажат полезни.
                     В редки случаи дори след допълнителни изследвания наборът от данни не позволява стигането до заключение за положителни или отрицателни резултати и следователно за отклика на изпитвания химикал се заключава, че е неясeн.
                     Едно увеличение в броя на полиплоидните клетки може да показва, че изпитваните химикали имат потенциал да инхибират митотични процеси и да предизвикват бройни хромозомни аберации (52). Увеличението в броя на клетки с ендоредуплицирани хромозоми може да е показателно за това, че изпитваните химикали имат потенциала да инхибират развитието на клетъчния цикъл (53) (54) (вж. точка 2). Следователно броят на полиплоидните клетки и броят на клетките с ендоредуплицирани хромозоми следва да се записват поотделно.
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитван химикал:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             източник, номер на партидата, крайна дата за употреба, ако има такава
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             стабилност на самия изпитван химикал, ако е известна;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             разтворимост и стабилност на изпитвания химикал в разтворител, ако са известни.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             измерване на рН, осмолалитет и утайка в средата за отглеждане, към която е добавен изпитваният химикал, когато е уместно.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Вещество с една съставка:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             химична идентификация, като наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, SMILES или InChI код, структурна формула, чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и др.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Вещество, включващо повече съставки, UVCB и смеси:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             характеризирани, доколкото е възможно, от химическата идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Разтворител:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка на избора на разтворител.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             следва също да бъде посочено и процентното съдържание на разтворителя в окончателната среда за отглеждане.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Клетки:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             тип и източник на клетките
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             кариотипни особености и пригодност на използвания тип клетки;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за клетъчни линии — отсъствие на микоплазма;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за клетъчни линии — информация за продължителността на клетъчния цикъл, времето за удвояване или индекса на пролиферация;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             пол на донорите на кръв, възраст и всякаква относима информация по отношение на донор, цяла кръв или изолирани лимфоцити, използван митоген;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за клетъчни линии — брой пасажи, ако е наличен;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за клетъчни линии — методи за поддържане на клетъчните култури;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за клетъчни линии — модален брой на хромозомите.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Условия на изпитването:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             идентичност и концентрация на химикала, блокиращ метафазата, и времетраене на експозицията на клетките;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             концентрация на изпитвания химикал, изразена като крайна концентрация в средата за отглеждане (напр. μg или mg/ml или mM от среда за отглеждане).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка за избора на концентрациите и броя на културите, в т.ч. напр. данни за цитотоксичността и ограничения, свързани с разтворимостта;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             състав на средите, концентрация на CO2, ако е приложимо, влажност;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             концентрация (и/или обем) на разтворителя и изпитвания химикал, добавени в средата за отглеждане;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             температура на инкубиране;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             време на инкубиране;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             времетраене на третирането;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             време на събиране след третирането;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             гъстота на клетките при посяване, ако е уместно;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             тип и състав на системата за метаболитно активиране (източник на S9, метод на приготвяне на S9 микс, концентрация или обем на S9 микс и S9 в окончателната среда за отглеждане, контрол на качеството на S9);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             химикали за положителни и за отрицателни контроли, крайни концентрации за всяко условие на третиране;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи на подготовка на предметното стъкло и използвана техника на оцветяване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             критерии за приемливост на изследванията;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             критерии за преброяване на аберациите;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             брой на анализираните метафази;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи за измерване на цитотоксичността;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             всякаква допълнителна информация, относима към цитотоксичността и използвания метод;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             критерии за считане на изследванията за положителни, отрицателни или неясни;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи, използвани за определяне на pH, осмолалитета и утайката.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Резултати:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             броят на третираните клетки и броят на събраните клетки за всяка култура, когато се използват клетъчни линии
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             измервания на цитотоксичността, напр. RPD, RICC, MI, други наблюдения, ако има такива;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             информация за продължителността на клетъчния цикъл, времето за удвояване или индекса на пролиферация при клетъчни линии;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             признаци на утаяване и час на определяне;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             определение за аберации, в т.ч. празнини;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             брой на преброените клетки, брой на клетките с хромозомни аберации и тип на хромозомните аберации, дадени отделно за всяка третирана и контролна култура, като се включват празнини и без празнини;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             изменения в плоидността (полиплоидни клетки и клетки с ендоредуплицирани хромозоми, представени поотделно), ако се наблюдават;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             зависимостта концентрация—отклик, където е възможно;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             паралелни данни от отрицателни (разтворител) и положителни контроли (концентрации и разтворители);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни от отрицателни (разтворител) и положителни контроли за предходни периоди, с размах, средни стойности и стандартни отклонения и 95 % граници за контрол за разпределението, както и брой данни;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             статистически анализи; p-стойности, ако има такива.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обсъждане на резултатите.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Заключения.
                                 
                              
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Evans, H.J. (1976), „Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens“, in Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed.), Plenum Press, New York and London, pp. 1-29
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), „The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture“ in Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al. (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York- Oxford, pp. 427-432.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosomal aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Muehlbauer, P.A. et al. (2008), „Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/4, pp. 318-327.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Глава Б.49 от настоящото приложение: Изпитване in vitro за микроядра на клетки от бозайници.
                                 
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 ILSI paper (draft), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol.257/2, pp. 147-204.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Morita, T. et al. (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 268/2, pp. 297-305.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789-886.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Long, L.H. et al. (2007), Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/1-2, pp. 177-183.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Nesslany, F. et al. (2008), Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/6, pp. 439-452.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 191-201.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Kirkland, D. et al. (2005), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 584/1-2, pp. 1–256.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Greenwood, S. et al. (2004), Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 43/1, pp. 36–44.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Hilliard, C.A. et al. (1998), Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 31/4, pp. 316–326.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Hedner K. et al. (1982), Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex, Human Genetics, Vol. 62, pp. 305-309.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Ramsey M.J. et al. (1995), The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting, Mutation Research, Vol. 338, pp. 95-106.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Coecke S. et al. (2005), Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, Vol. 33/3, pp. 261-287.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Henderson, L. et al. (1997), Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies, Mutagenesis, Vol.12/3, pp.163-167.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 31/6, pp. 347-363.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Maron, D.M., B.N. Ames (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 113/3-4, pp. 173-215.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Natarajan, A.T. et al. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Research, Vol. 37/1, pp. 83-90.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 66/3, pp. 277-290.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Ong, T.-m. et al. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55-65.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Elliot, B.M. et al. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, Vol. 7/3, pp. 175-177.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1976), „A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems“, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (eds.), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1994). Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 241-261.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28/1, pp. 51-59.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). На разположение на адрес: http://www.pops.int/.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes, Mutation Research, Vol. 190/3, pp. 225-8.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), „CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids“, in Genotoxic Effects of Airborne Agents, Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91-103.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Zamora, P.O. et al. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795-801.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Asakura, M. et al. (2008), An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay, Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122-130.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 655/1-2, pp. 1-3.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Galloway, S. et al. (2011), Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 77-83.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Honma, M. (2011), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 724/1-2, pp. 86-87.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 OECD (2014), Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487) ENV/JM/TG(2014)17. Предоставя се при поискване.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 741/1-2, pp. 32-56.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environmental and Molecular Muagenesis, Vol. 54/1, pp. 36-43.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. На разположение на адрес: https://federalregister.gov/a/2012-13774.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 OECD (2014), Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (eds.), Karger Publishers Inc., Connecticut.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1990), „Metaphase chromosome aberration assays in vitro“, in Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 62-86.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control Data, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed., John Wiley & Sons, New York.
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989), „Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
                              
                           
                                 (52)
                              
                              
                                 Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens, Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 29-46.
                              
                           
                                 (53)
                              
                              
                                 Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Research, Vol. 119/3, pp. 403-413.
                              
                           
                                 (54)
                              
                              
                                 Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), Aphidicolin — induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Research, Vol. 43/3, pp. 1362-1364.
                              
                           
                                 (55)
                              
                              
                                 Soper, K.A., S.M. Galloway (1994), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research, Vol. 312, pp. 139-149.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                           
                              Анеуплоидия
                           : всяко отклонение от обичайния диплоиден (или хаплоиден) брой на хромозомите с една или повече от една хромозома, но не и с цял набор (или набори) от хромозоми (полиплоидия).
                        
                           
                              Апоптоза
                           : програмирана клетъчна смърт, характеризираща се с редица етапи, водещи до разпадане на клетките на мембранносвързани частици, които впоследствие се елиминират чрез фагоцитоза или фрагментация.
                        
                           
                              Клетъчна пролиферация
                           : увеличение на броя на клетките в резултат на митотично клетъчно делене.
                        
                           
                              Химикал
                           : вещество или смес.
                        
                           
                              Хроматидно разкъсване
                           : прекъсване на отделна хроматида, при което има ясно изразена несъосност на една от хроматидите.
                        
                           
                              Хроматидна празнина
                           : неоцветена област (ахроматично увреждане) на отделна хроматида, с минимална несъосност на хроматидата.
                        
                           
                              Хроматиден тип аберация
                           : структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване на единични хроматиди или разкъсване и повторно съединяване между хроматиди.
                        
                           
                              Хромозомен тип аберация
                           : структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване или разкъсване и повторно съединяване на двете хроматиди на идентично място.
                        
                           
                              Кластоген
                           : всеки химикал, който причинява структурни хромозомни аберации в популации от клетки или еукариотни организми.
                        
                           
                              Концентрации
                           : отнася се за крайните концентрации на изпитвания химикал в средата за отглеждане.
                        
                           
                              Цитотоксичност
                           : за изследванията, обхванати от настоящия метод за изпитване, при които се използват клетъчни линии, цитотоксичността се определя като намаляване на относителното удвояване на популации (RPD) или относителен ръст в количеството клетки (RICC) на третираните клетки в сравнение с отрицателната контрола (вж. точка 17 и допълнение 2). за изследванията, обхванати от настоящия метод за изпитване, при които се използват първични култури от лимфоцити, цитотоксичността се определя като намаляване на митотичния индекс (MI) на третираните клетки в сравнение с отрицателната контрола (вж. точка 18 и допълнение 2).
                        
                           
                              Ендоредупликация
                           : процес, при които след S-период на удвояване на ДНК ядрото не навлиза в митоза, а започва друг S-период. Резултатът е хромозоми с 4, 8, 16, … хроматиди.
                        
                           
                              Генотоксичен
                           : общ термин, обхващащ всички видове увреждания на ДНК или на хромозоми, включително разкъсвания, делеции, адукти, изменения на нуклеотиди и връзки, прегрупирания, генни мутации, хромозомни аберации и анеуплоидия. Не всички типове генотоксични ефекти водят до мутации или трайно увреждане на хромозомите.
                        
                           
                              Митотичен индекс
                           : отношението на клетките в метафаза, разделени на общия брой клетки, наблюдавани в дадена клетъчна популация; показател за степента на пролиферация на тази популация.
                        
                           
                              Митоза
                           : делене на клетъчното ядро, обикновено разделено на профаза, прометафаза, метафаза, анафаза и телофаза.
                        
                           
                              Мутагенен
                           : води до наследствена промяна на ДНК последователност(и) на базовите двойки в гени, или на структурата на хромозоми (хромозомни аберации).
                        
                           
                              Бройна аберация
                           : промяна в броя на хромозомите в сравнение с нормалния брой, характерен за използваните клетки.
                        
                           
                              Полиплоидия
                           : бройни хромозомни аберации в клетки или организми, включващи цял набор (набори) от хромозоми, за разлика от аберациите в отделна хромозома или хромозоми (анеуплоидия).
                        
                           
                              Статус на p53
                           : Белтъкът p53 е включен в регулирането на клетъчния цикъл, апоптозата и поправката на ДНК. Клетките с дефицит на функционалния белтък p53, неспособни да блокират клетъчния цикъл или да елиминират увредените клетки чрез апоптоза или чрез други механизми (напр. предизвикване на поправка на ДНК), свързани с функциите на p53, в отговор на увреждане на ДНК, следва теоретично да са по-податливи на генни мутации или хромозомни аберации.
                        
                           
                              Относителен ръст в количеството клетки (RICC)
                           : увеличението на броя на клетките в културите, подложени на експозиция на химикал, спрямо увеличението в нетретираните култури, като отношението е изразено в проценти.
                        
                           
                              Относително удвояване на популации (RPD)
                           : увеличението на броя на удвояванията на популации в културите, подложени на експозиция на химикал, спрямо увеличението в нетретираните култури, като отношението е изразено в проценти.
                        
                           
                              S9 фракция от черен дроб
                           : супернатант от хомогенат на черен дроб след центрофугиране при 9 000 g, т.е. необработен екстракт от черен дроб.
                        
                           
                              S9 микс
                           : микс от S9 фракцията от черен дроб и кофактори, необходими за действието на метаболитни ензими.
                        
                           
                              Контрола на разтворител
                           : общ термин за определяне на контролните култури, които са само на разтворителя, който се използва за разтваряне на изпитвания химикал.
                        
                           
                              Структурна аберация
                           : промяна в хромозомната структура, която се открива при микроскопско изследване на етапа на метафаза на клетъчното делене, наблюдавана във вид на делеции и фрагменти, вътрешнохромозомни или междухромозомни преустройства.
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                        
                           
                              Нетретирани контроли
                           : култури, които не се третират (т.е. без изпитвания химикал и без разтворител), но се обработват паралелно по същия начин като културите, които се третират с изпитвания химикал.
                     
                     
                        Допълнение 2
                        
                           ФОРМУЛИ ЗА ОЦЕНКА НА ЦИТОТОКСИЧНОСТТА
                        
                        
                           Митотичен индекс (MI):
                        
                        
                           
                        Относителният ръст в количеството клетки (RICC) и относителното удвояване на популации (RPD) се препоръчват, тъй като и при двете се отчита делът на клетъчната популация, претърпяла делене.
                        
                           
                        
                           
                        където:
                        
                           Удвояване на популации = [log(брой на клетките след третиране ÷ първоначален брой на клетките)] ÷ log 2
                        Например, RICC или RPD на стойност 53 % показва 47 % цитотоксичност/цитостаза, а 55 % цитотоксичност/цитостаза, измерена с MI, означава, че действителният MI е 45 % от контролата.
                        Във всички случаи броят на клетките следва да бъде измерен преди третирането и да е един и същ при културите, подлежащи на третиране, и при отрицателните контролни култури.
                        Въпреки че параметърът RCC (т.е. брой на клетките в третираните култури/брой на клетките в контролните култури) е бил използван като параметър за цитотоксичност в миналото, той вече не се препоръчва, тъй като може да подцени цитотоксичността.
                        В отрицателни контролни култури удвояването на популацията следва да бъде съвместимо с изискването за вземане на проби от клетки след третирането, след време, равно на около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл, и митотичният индекс следва да бъде достатъчно по-висок, за да се получи достатъчен брой клетки в митоза и надеждно да се изчисли 50 % намаление.
                     “
               
                     4)
                  
                  
                     В Част Б глава Б.11 се заменя със следното:
                     „Б.11   Изпитване за хромозомни аберации в костен мозък на бозайници
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на Насоки за изпитване на ОИСР 475 (2016). Той е част от поредица от методи за изпитване от областта на генетичната токсикология. Разработен е документ на ОИСР, съдържащ ясна информация относно изпитванията в областта на генетичната токсикология, и преглед на актуалните изменения на посочените Насоки (1).
                     
                        In vivo изпитването за хромозомни аберации в костен мозък на бозайници е от особена значимост за оценка на генотоксичността, тъй като, въпреки че могат да варират според животинския вид, факторите за in vivo метаболизма, фармакокинетиката и процесите на поправка на ДНК са активни и допринасят за отклика. In vivo изследване също е от полза за по-нататъшното проучване на генотоксичността, установена чрез in vitro система.
                     In vivo изпитването на бозайници за хромозомни аберации се използва за откриване на структурни хромозомни аберации, предизвикани от изпитвани химикали в клетки от костен мозък на животни, обикновено гризачи (2) (3) (4) (5). Структурните хромозомни аберации могат да бъдат два вида: хромозомни или хроматидни. Макар че повечето аберации, предизвикани от генотоксични химикали, са от хроматиден тип, срещат се и такива от хромозомен тип. Хромозомните увреждания и свързаните с тях събития са причината за множество генетични болести у човека и има съществени доказателства, че когато посочените увреждания и свързаните с тях събития предизвикват промени в онкогените и тумор-подтискащите гени, участват в причиняването на рак на хора и експериментални системи. В изследванията in vivo за хромозомни аберации може да възникне полиплоидия (включително ендоредупликация). Увеличаването на полиплоидията само по себе си обаче не е показание за анеугенен потенциал и може просто да показва смущение на клетъчния цикъл или цитотоксичност. Това изпитване не е предназначено да измерва анеуплоидия. Изпитването in vivo за микроядра в еритроцити на бозайници (глава Б.12 от настоящото приложение) и изпитването in vitro за микроядра на клетки от бозайници (глава Б.49 от настоящото приложение) са съответните препоръчителни изпитвания in vivo и in vitro за откриване на анеуплоидия.
                     Определенията на използваните термини са дадени в допълнение 1.
                     ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ
                     В настоящия тест се използват обикновено гризачи, но в някои случаи може да е подходящо използването други видове, ако това е научно обосновано. Прицелната тъкан в настоящото изпитване е костният мозък, тъй като последният представлява високо васкуларизирана тъкан и съдържа популация клетки с бърз цикъл, които могат лесно да се изолират и обработят. Научната обосновка за използване на видове, различни от плъхове и мишки, следва да бъде предоставена в протокола. Ако се използват видове, различни от гризачи, препоръчва се измерването на хромозомни аберации в костния мозък да се интегрира в друго подходящо изпитване за токсичност.
                     Ако има доказателства, че изпитваният химикал (или химикали) или негов метаболит (или метаболити) няма да достигне до прицелната тъкан, може да не е подходящо да се използва настоящото изпитване.
                     Преди използването на метода за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Такива съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа.
                     ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
                     Животните се експонират на изпитвания химикал по подходящ път и се умъртвяват по хуманен начин в подходящ момент след третирането. Преди умъртвяването животните се третират с блокиращ метафазата агент (напр. колхицин или колцемид). След това се приготвят и оцветяват хромозомни препарати от клетките от костен мозък и клетките в метафаза се анализират за хромозомни аберации.
                     ПРОВЕРКА НА ПРИГОДНОСТТА НА ЛАБОРАТОРИЯТА
                     
                        Проучване на пригодността
                     
                     За да се установи дали е наличен достатъчно опит за провеждане на изследването преди той да бъде използван за рутинно изпитване, лабораторията следва да е доказала капацитет за възпроизвеждане на очаквани резултати от публикувани данни (напр. (6)) за честота на хромозомни аберации с минимум два химикала за положителни контроли (включително слаб отклик, предизвикан от ниски дози в положителни контроли), като например посочените в таблица 1, и със съвместими контроли на носител/разтворител (вж. точка 22). При тези опити следва да се използват дози, които дават възпроизводими и свързани с дозата увеличения, а опитите следва да доказват чувствителността и динамичния обхват на системата за изпитване в представляващата интерес тъкан (костен мозък), чрез използване на метода за преброяване, който ще се прилага в лабораторията. Това изискване не се прилага за лаборатории, които разполагат с опит, т.е. които разполагат с данни за предходни периоди, както е определено в точки 10—14.
                     
                        Данни за контролите за предходни периоди
                     
                     В хода на проучванията за пригодност лабораторията следва да установи:
                     
                                 —
                              
                              
                                 размах и разпределение при положителните контроли от предходни периоди, и
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 размах и разпределение при отрицателните контроли от предходни периоди.
                              
                           При първото придобиване на данни за разпределението при отрицателните контроли от предходни периоди паралелните отрицателни контроли следва да бъдат съобразени с публикуваните данни за контролите, когато такива са налице. При добавяне на повече опитни данни към разпределението за предходни периоди при контролите паралелните отрицателни контроли следва в идеалния случай да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % на това разпределение. Базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди следва да е статистически устойчива, за да се гарантира способността на лабораторията за оценка на разпределението на нейните данни за отрицателните контроли. В литература се посочва, че може да са необходими най-малко 10 опита, но е за предпочитане провеждането на минимум 20 опита при сравними условия на опитите. Лабораториите трябва да използват методи за контрол на качеството, като например контролни карти (напр. C-карти или карти за средна стойност (X-bar) (7)), за определяне на варирането на данните им, и за доказване, че методологията е „под контрол“ в техните лаборатории. В литературата (8) могат да се намерят допълнителни препоръки относно начина на създаване и използване на данни от предходни периоди (т.е. критерии за включване и изключване на данни в данните за предходни периоди и критериите за приемливост за даден опит).
                     В случай, че дадена лаборатория не е извършила достатъчен брой опити за установяване на статистически устойчиво разпределение при отрицателните контроли (вж. точка 11) по време на проучванията за пригодност (описани в точка 9), приемливо е разпределението да бъде установено по време на първите рутинни изпитвания. При този подход следва да се прилагат препоръките, посочени в литературата (8), и резултатите от отрицателните контроли, получени при тези опити, следва да продължат да са в съответствие с публикуваните данни за отрицателните контроли.
                     Всички промени в опитния протокол следва да бъдат разглеждани от гледна точка на тяхното отражение върху съгласуваността на произтичащите данни със съществуващите бази данни за контролите на дадената лаборатория за предходни периоди. Само значителни несъответствия следва да водят до създаването на нова база данни за контролите за предходни периоди, в случай че с експертна оценка се установи, че тя се различава от предходното разпределение (вж. точка 11). По време на повторното създаване може да не е необходима пълна база данни за отрицателните контроли за позволяване на провеждането на действителни изпитвания, при условие че лабораторията може да докаже, че стойностите на нейните паралелни отрицателни контроли остават в съответствие или с предишната им база данни, или със съответните публикувани данни.
                     Данните за отрицателните контроли следва да се състоят от срещането на структурни хромозомни аберации (изключвайки празнини) във всяко животно. Паралелните отрицателни контроли в идеалния случай следва да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % от разпределението от базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди. Когато данните за паралелните отрицателни контроли попадат извън 95 %-ните граници за контрол, те могат да бъдат приемливи за включване в разпределението при контролите от предходни периоди, при условие че тези данни не са екстремални стойности, силно различаващи се от нормалните, и има доказателства, че системата за изпитване е „под контрол“ (вж. точка 11), както и липсват доказателства за техническа или човешка грешка.
                     ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
                     
                        Приготвяне
                     
                     
                        Избор на животински вид
                     
                     Следва да се използват обичайно използвани в лабораториите породи от здрави млади полово зрели животни. Обичайно се използват плъхове, въпреки че мишките може също да са подходящи. Всеки друг подходящ вид бозайници може да се използват, ако е предоставена научна обосновка в протокола.
                     
                        Условия на отглеждане и хранене на животните
                     
                     За гризачи в помещението, в което се намират животните, температурата следва да е 22 °C (±3 °C). Въпреки че в идеалния случай относителната влажност следва да бъде 50—60 %, тя трябва да е поне 40 % и за предпочитане да не превишава 70 %, освен по време на почистване на помещението. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни хранителни режими с неограничен достъп до вода за пиене. Изборът на хранителен режим може да бъде повлиян от нуждата да се осигури подходящо смесване с изпитван химикал, когато прилагането му е по този път. Гризачите трябва да бъдат разпределени в малки групи (не повече от пет в клетка) от един и същ пол и третирана група, ако не се очаква агресивно поведение, за предпочитане в клетки с твърд под, с подходящо облагородяване на жизнената среда. Животните могат да се настаняват отделно само ако това е научно обосновано.
                     
                        Подготовка на опитните животни
                     
                     Обикновено се използват здрави, млади полово зрели животни (за гризачи в идеалния случай на възраст 6—10 седмици в началото на третирането, макар че малко по-възрастни животни също са приемливи), които се разпределят на случаен принцип в контролни групи и групи за третиране. Отделните животни се идентифицират индивидуално единствено чрез хуманни, минимално инвазивни методи (напр. чрез поставяне на пръстен, поставяне на марка, микрочип или биометрична идентификация, но не и чрез изрязване на уши или пръсти) и се аклиматизират към лабораторните условия поне пет дни. Клетките трябва да бъдат подредени по такъв начин, че възможните ефекти в резултат на местоположението на клетката да бъдат сведени до минимум. Кръстосаното замърсяване с положителната контрола и с изпитвания химикал следва да се избягва. В началото на изследването вариациите в теглото на животните следва да са минимални и да не превишават ± 20 % от средното тегло на всеки пол.
                     
                        Приготвяне на дозите
                     
                     Твърдите изпитвани химикали следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители, или да се смесят в хранителния режим или в питейната вода преди дозирането на животните. Течните изпитвани химикали могат да се дозират директно или да се разредят преди дозиране. При експозиция чрез инхалация изпитваните химикали могат да се прилагат като газ, пари или аерозол с твърда/течна фаза, в зависимост от техните физични и химични свойства. Следва да се използват пресни смеси на изпитвания химикал, освен ако данните за стабилността показват, че е допустимо съхранение и посочват подходящите условия за съхранение.
                     
                        Разтворител/носител
                     
                     Разтворителят/носителят не следва да има токсични ефекти при използваните нива на доза, а също така не следва да има съмнения за възможна химическа реакция с изпитваните химикали. Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им следва да се подкрепи от референтни данни за съвместимостта им. Препоръчва се винаги, когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на вода като разтворител/носител. Примери за обичайно използвани съвместими разтворители/носители са водата, физиологичният разтвор, разтворът на метилцелулоза, разтворът на натриевата сол на карбоксиметилцелулозата, маслиновото масло и царевичното масло. При липсата на предходни или публикувани данни за контроли, показващи, че избраният нетипичен разтворител/носител не предизвиква структурни аберации или други неблагоприятни ефекти, следва да се проведе първоначално изследване, за да се установи допустимостта на контролата на разтворител/носител.
                     
                        Контроли
                     
                     
                        Положителни контроли
                     
                     Във всяко изпитване обикновено следва да бъде включена група от животни, третирани с химикал за положителна контрола. Това може да се отмени, ако изпитващата лаборатория е доказала пригодността си за провеждане на изпитването и е установила размах при положителните контроли от предходни периоди. Когато не е включена паралелна положителна контролна група, във всеки опит следва да се включат контроли на преброяването (фиксирани и неоцветени предметни стъкла). Те могат да бъдат получени като в преброяването на проучването се включат подходящи референтни проби, които са били получени и съхранявани при отделен опит с положителни контроли, провеждан периодично (например на всеки 6—18 месеца) в лабораторията, в която се провежда изпитването; например, по време на изпитвания за пригодност и редовно след това, когато това е необходимо.
                     Химикалите за положителни контроли следва по надежден начин да предизвикват откриваемо увеличение в честотата на клетките със структурни хромозомни аберации в рамките над спонтанното равнище. Дозите за положителните контроли следва да са така избрани, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на преброяващия идентичността на кодираните проби. Приемливо е положителните контроли да се прилагат по път, различен от този за изпитвания химикал, чрез използване на различен график за третиране, и извършването на пробовземането да е само в точно определена времева точка. Освен това за положителна контрола може да се разгледа използването на химикали, принадлежащи към свързан химичен клас, когато е подходящо. Примери за химикали за положителни контроли са включени в таблица 1.
                     
                        Таблица 1.
                     
                     
                        Примери за химикали за положителни контроли
                     
                     
                                 Химикал
                              
                              
                                 CASRN
                              
                           
                                 Етилов метансулфонат
                              
                              
                                 62-50-0
                              
                           
                                 Метилов метансулфонат
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                 Етилнитрозоуреа
                              
                              
                                 759-73-9
                              
                           
                                 Митомицин С
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                 Циклофосфамид (монохидрат)
                              
                              
                                 50-18-0 (6055-19-2)
                              
                           
                                 Триетиленмеламин
                              
                              
                                 51-18-3
                              
                           
                        Отрицателни контроли
                     
                     При всяко време на вземане на проби следва да бъде включена отрицателна контролна група животни, която следва да бъде третирана по същия начин както третираните групи, с изключение на това, че не се третира с изпитвания химикал. Ако за прилагане на изпитвания химикал се използва разтворител/носител, контролната група трябва да получава този разтворител/носител. Ако обаче с данни за отрицателните контроли от предходни периоди са доказани последователно вариране между животните и честоти на клетките със структурни хромозомни аберации по всяко време на пробовземане за изпитващата лаборатория, може да е необходимо само едно единствено пробовземане за отрицателната контрола. Когато се използва едно единствено пробовземане за отрицателни контроли, това следва да бъде първото време на вземане на проба за изследването.
                     ПРОЦЕДУРА
                     
                        Брой и пол на животните
                     
                     Като цяло откликът с микроядра е сходен при мъжките и женските животни (9) и се очаква, че това ще важи също така за структурните хромозомни аберации; поради това повечето изследвания могат да бъдат извършени в рамките на който и да е от двата пола. Данни, показващи относими разлики между мъжките и женските (например разлики в общата токсичност, метаболизма, бионаличността, токсичността за костния мозък и т.н., включително например изследване за определяне на обхвата), биха насърчили използването на двата пола. В този случай може да е уместно да се извърши проучване с двата пола, например като част от изследване за токсичност с повтарящи се дози. Ако се използват и двата пола, може да е уместно да се приложи факторен дизайн. Подробна информация как да се анализират данните с използването на посочения дизайн е дадена в допълнение 2.
                     Числеността на групите при започване на изследването следва да бъде определена с оглед предоставяне на минимум 5 анализируеми животни от група от един пол, или от всеки пол, ако са използвани и двата пола. Когато експозицията на хора на химикали може да е специфична в зависимост от пола, като например при някои фармацевтични продукти, изпитването следва да се проведе с животни от подходящия пол. Като насока за типичните максимални изисквания за животни, едно проучване за костен мозък с две времена на пробовземане, три групи на определена доза и една паралелна отрицателна контролна група, плюс положителна контролна група (всяка група е съставена от пет животни от един и същ пол), ще изисква 45 животни.
                     
                        Нива на доза
                     
                     Ако се извършва предварително изследване за определяне на обхвата, поради това че към съответния момент няма подходящи данни, които да подпомогнат избора на доза, то следва да се извърши в същата лаборатория, като се използва същият вид, порода, пол и режим на третиране, който се използва и в главното изследване (10). С проучването следва да се направи опит да се установи максималната допустима доза (МДД), определена като най-високата доза, която ще се толерира без доказателства за ограничаваща изследването токсичност спрямо продължителността на периода на изследването (например чрез подтискане на телесното тегло или цитотоксичност за хемопоетичната система), но без смърт или доказателства за болка, страдание или дистрес, които изискват умъртвяване по хуманен начин (11).
                     Най-високата доза може също да се определи и като доза, която предизвиква известни признаци на токсичност за костния мозък.
                     Химикалите, които показват насищане по отношение на токсикокинетични свойства, или предизвикват процеси на детоксикация, които могат да доведат до намаляване на експозицията след дългосрочно третиране, могат да представляват изключения от критериите за определяне на дозата и следва да се оценяват за всеки отделен случай.
                     С цел получаване на информация за дозата и отклика дадено пълно проучване следва да включва отрицателна контролна група и най-малко три нива на доза, обикновено разделени с кратност 2, но не по-голяма от 4. Ако изпитваният химикал не предизвиква токсичност в изследването за определяне на обхвата или въз основа на съществуващите данни, най-високата доза за отделно прилагане следва да бъде 2 000 mg/kg телесно тегло. Ако обаче изпитваният химикал предизвиква токсичност, МДД следва да бъде най-високата приложена доза и използваните нива на доза следва да са в обхват от максималната доза до доза, която, предизвиква слаба токсичност или не е токсична. Когато токсичност за прицелната тъкан (костен мозък) се наблюдава при всички изпитвани нива на доза, препоръчително е допълнително проучване при нетоксични дози. За проучванията, целящи по-подробно характеризиране на количествената информация за доза-отклик, може да се изискват допълнителни групи на определена доза. За някои типове изпитвани химикали (напр. фармацевтични продукти за хуманна употреба), обхванати от специфични изисквания, тези граници могат да варират.
                     
                        Гранично изпитване
                     
                     Ако опити за определяне на обхвата на дозите, или съществуващи данни от свързани породи животни, посочват, че режим на третиране най-малко при пределна доза (описан по-долу) не предизвиква видими токсични ефекти (включително липса на подтискане на пролиферацията на костния мозък или на други доказателства за цитотоксичност за прицелната тъкан), и ако не може да се очаква генотоксичност на базата на проучвания in vitro за генотоксичност или данни от структурно подобни химикали, то тогава пълно изследване с три нива на доза може да не се смята за необходимо, при условие, че е доказано, че изпитваният химикал (или химикали) достига до прицелната тъкан (костен мозък). В такива случаи едно ниво на доза при пределната доза може да бъде достатъчно. За период на прилагане от >14 дни пределната доза е 1 000 mg/kg телесно тегло/ден. За период на прилагане от 14 дни или по-малко пределната доза е 2 000 mg/kg телесно тегло/ден.
                     
                        Прилагане на дозите
                     
                     При планирането на изследването следва да бъде взет предвид очакваният път на експозиция на човека. Поради това като обосновани могат да бъдат избрани например пътища на експозиция като хранителен режим, питейна вода, локално, подкожно, орално (през сонда), чрез вдишване, интратрахеално или имплантация. Във всички случаи пътят следва да се избере така, че да осигури достатъчна експозиция на прицелната тъкан (или тъкани). Интраперитонеалното инжектиране обикновено не се препоръчва, тъй като то не е очакван път на експозиция на човека, и следва да бъде използвано само със специална научна обосновка. Ако изпитваният химикал се смеси в хранителния режим или в питейната вода, по-специално в случай на еднократно дозиране, следва да се положи грижа закъснението между консумацията на храна и вода и пробовземането да е достатъчно, за да позволи откриването на ефектите (вж. точки 33—34). Максималният обем течност, който може да се приложи еднократно със сонда или инжекция, зависи от големината на изпитваното животно. Обемът обичайно не следва да превишава 1 ml на 100 g телесно тегло, освен в случаите, когато се прилагат водни разтвори, при които могат да бъдат използвани 2 ml на 100 g телесно тегло. Обеми, по-високи от този, следва да се обосноват. С изключение на дразнещи или корозивни изпитвани химикали, които обикновено предизвикват изострени ефекти при по-високи концентрации, варирането в изпитвания обем трябва да бъде сведено до минимум чрез регулиране на концентрацията с оглед осигуряване на прилагането на постоянен обем спрямо телесното тегло при всички нива на доза.
                     
                        График на третиране
                     
                     Изпитваните химикали обичайно се прилагат като еднократно третиране, но могат също да се прилагат като разделена доза (т.е. две или повече третирания в един и същи ден, разделени от не повече от 2—3 часа), за да се улесни прилагането на голям обем. При тези обстоятелства или при прилагане на изпитвания химикал чрез вдишване, графикът за пробовземане трябва да се определи въз основа на времето на последното прилагане на доза или края на експозицията.
                     Налице са малко данни относно пригодността на протокол с повтаряща се доза за това изпитване. Независимо от това, в случаите, когато е желателно това изпитване да бъде интегрирано в изпитване за токсичност с повтаряща се доза, следва да се вземат мерки за избягване на загубите на митотични клетки с хромозомни увреждания, което може да се случи при токсични дози. Такова интегриране е приемливо, когато най-високата доза е по-голяма или равна на пределната доза (вж. точка 29) и към група на определена доза е приложена пределната доза за продължителността на периода на третиране. Изпитването за микроядра (метод за изпитване Б.12) следва да се разглежда като предпочитаното изпитване in vivo за хромозомни аберации, когато се желае интегриране с други проучвания.
                     Пробите от костен мозък следва да се вземат в два отделни момента след еднократни третирания. За гризачи първият интервал на пробовземане следва да бъде времето, необходимо за завършване на 1,5 пъти нормалната продължителност на клетъчния цикъл (който нормално е 12—18 часа след периода на третиране). Тъй като времето за поемането и метаболизирането на изпитвания химикал (или химикали), както и ефектът му върху кинетиката на клетъчния цикъл, могат да повлияят върху оптималното време за откриване на хромозомни аберации, препоръчва се вземане на по-късна проба — 24 часа след вземането на първата проба. При първото вземане на проба следва да бъдат третирани всички групи на определена доза и да бъдат взети проби за анализ; независимо от това, при пробовземане на по-късен етап (или етапи) е необходимо да се прилага само най-високата доза. Ако въз основа на научна обосновка се използват режими на дозиране на повече от един ден, обичайно следва да се използва едно време на пробовземане до около 1,5 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след окончателното третиране.
                     След третирането и преди вземането на пробата, животните се инжектират интраперитонеално с подходяща доза на блокиращ метафазата агент (напр. колцемид или колхицин) и пробовземането се извършва след подходящ интервал от време. За мишки този интервал е приблизително 3-5 часа преди пробовземането, а за плъхове той е 2-5 часа. Клетките се събират от костния мозък и след набухване, фиксиране и оцветяване се анализират за хромозомни аберации (12).
                     
                        Наблюдения
                     
                     Общи клинични наблюдения върху изпитваните животни следва да бъдат извършвани поне един път дневно и клиничните признаци следва да бъдат записвани, за предпочитане по едно и също време (или времена) веднъж дневно и като се има предвид пиковият период за поява на очакваните ефекти след дозиране. По време на периода на дозиране всички животни следва да се наблюдават за заболеваемост и смъртност поне два пъти дневно. Теглото на всички животни следва да се измерва в началото на изследването, поне един път в седмицата по време на изследвания с повтаряща се доза, и при умъртвяването. При изследвания с продължителност най-малко една седмица консумацията на храна се измерва най-малко един път седмично. Ако изпитваният химикал се прилага чрез водата за пиене, консумацията на вода следва да се измерва при всяка смяна на водата и най-малко един път в седмицата. Животните, проявяващи нелетални признаци на прекомерна токсичност, следва да се умъртвят по хуманен начин преди приключването на периода на изпитване (11).
                     
                        Експозиция на прицелна тъкан
                     
                     В подходящо време (или времена) следва да се взема кръвна проба, за да се позволи изследване на плазмените нива на изпитваните химикали с цел доказване на експозиция на костен мозък, там където e обосновано и когато не са налични други данни за експозиция (вж. точка 44).
                     
                        Костен мозък и хромозомни препарати
                     
                     Непосредствено след умъртвяването по хуманен начин клетките от костния мозък се вземат от бедрената кост или големия пищял на животните, експонират се на хипотоничен разтвор и се фиксират. След това клетките в метафаза се разнасят по предметни стъкла и се оцветяват по установени методи (вж. (3) (12)).
                     
                        Анализ
                     
                     Всички предметни стъкла, включително тези на положителните и отрицателните контроли, следва да се кодират независимо едно от друго преди анализа и следва да се разбъркат на случаен принцип, така че преброяващият да не е запознат с условията на третирането.
                     Митотичният индекс следва да се определи като мярка на цитотоксичност в най-малко 1 000 клетки на едно животно за всички третирани животни (включително и положителните контроли), нетретирани животни и животни, които са отрицателни контроли на носител/разтворител.
                     Следва да се анализират минимум 200 метафази от всяко животно за структурни хромозомни аберации със и без празнини (6). Независимо от това, ако базата данни за отрицателните контроли за предходни периоди показва, че средната фонова честота на структурните хромозомни аберации е < 1 % в лабораторията, провеждаща изпитването, трябва да се обърне внимание на преброяването на допълнителни клетки. Хроматидният и хоромозомният тип аберации следва да се отчитат поотделно и да се класифицират по подтипове (разкъсвания, обмени). Процедурите, използвани в лабораториите, следва да гарантират, че анализът на хромозомните аберации се извършва от добре обучени преброители и че му е направена партньорска оценка, ако е подходящо. Като признават, че процедурите по подготовка на предметно стъкло често водят до разкъсване на част от метафазите с произтичаща загуба на хромозоми, преброените клетки трябва следователно да съдържат брой центромери, не по-малък от 2n ± 2, където n е хаплоидният брой хромозоми за дадения вид.
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Обработка на резултатите
                     
                     Индивидуалните данни за животните следва да се представят в таблица. За всяко животно следва да се оценят митотичният индекс, броят на преброените клетки в метафаза, броят на аберациите на клетка в метафаза и процентът на клетките със структурна хромозомна аберация (или аберации). Различните типове структурни хромозомни аберации следва да се изброяват със своя брой и честотота за третираните и контролните групи. Празнините, както и полиплоидните клетки и клетките с ендоредуплицирани хромозоми се записват отделно. Честотата на празнините се протоколира, но обичайно не се включва в анализа на общата честота на структурните аберации. Ако няма доказателства за разлика в отклика при различните полове, данните могат да се обединят за статистическия анализ. Данните за токсичност за животните и за клиничните признаци следва също да бъдат протоколирани.
                     
                        Критерии за приемливост
                     
                     Следните критерии определят приемливостта на изпитването:
                     
                                 а)
                              
                              
                                 Данните за паралелната отрицателна контрола се считат за приемливи за допълване към базата данни на дадената лаборатория за контролите за предходни периоди (вж. точки 11—14);
                              
                           
                                 б)
                              
                              
                                 Паралелните положителни контроли или контролите на преброяването трябва да предизвикват отклици, които са съвместими с генерираните в базата данни за положителните контроли за предходни периоди, и да генерират статистически значимо увеличение в сравнение с отрицателна контрола (вж. точки 20—21);
                              
                           
                                 в)
                              
                              
                                 Анализиран е подходящ брой дози и клетки;
                              
                           
                                 г)
                              
                              
                                 Критериите за избор на най-високата доза са съвместими с описаните в точки 25—28.
                              
                           
                        Оценяване и тълкуване на резултатите
                     
                     При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно положителен:
                     
                                 а)
                              
                              
                                 в най-малко една от третираните групи се наблюдава статистически значимо увеличение на честотата на клетките със структурни хромозомни аберации (без празнини) в сравнение с паралелната отрицателна контрола,
                              
                           
                                 б)
                              
                              
                                 това увеличение е свързано с дозата поне за едно време на пробовземане при оценка, извършена с подходящ трендов тест, и
                              
                           
                                 в)
                              
                              
                                 някой от тези резултати е извън разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %).
                              
                           Ако в даден момент на пробовземане е разгледана само най-високата доза, изпитваният химикал се счита за ясно положителен, ако се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола и резултатите са извън разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %). Препоръки за подходящи статистически методи могат да се намерят в литературата (13). При провеждане на анализ доза-отклик трябва да бъдат анализирани най-малко три третирани с определена доза групи. При статистическите тестове за опитна единица следва да се използва отделното животно. Положителните резултати от изпитването за хромозомни аберации показват, че изпитваният химикал предизвиква структурни хромозомни аберации в костния мозък на изпитвания животински вид.
                     При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно отрицателен, ако във всички изследвани опитни условия:
                     
                                 а)
                              
                              
                                 в никоя от третираните групи не се наблюдава статистически значимо увеличение на честотата на клетките със структурни хромозомни аберации (без празнини) в сравнение с паралелната отрицателна контрола,
                              
                           
                                 б)
                              
                              
                                 в никое от времената на пробовземане няма свързано с дозата увеличение при оценка, извършена с подходящ трендов тест,
                              
                           
                                 в)
                              
                              
                                 всички резултати са в рамките на разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %), и
                              
                           
                                 г)
                              
                              
                                 е наблюдавана експозиция на костен мозък на изпитвания химикал (или химикали).
                              
                           Препоръки за най-подходящите статистически методи могат да се намерят в литературата (13). Доказателствата за експозиция на костния мозък на изпитван химикал могат да включват намаляване на митотичния индекс или измервания на нивата на изпитвания химикал (химикали) в плазмата или в кръвта. При интравенозно приложение доказателства за експозиция не са необходими. Като алтернатива, за да се докаже експозицията на костния мозък, могат да се използват данни за абсорбция — разпределение — метаболизъм — екскреция (АРМЕ), получени при провеждането на независимо проучване, с използване на същия път за прилагане и същия животински вид. Отрицателните резултати показват, че при условията за провеждане на изпитването изпитваният химикал не предизвиква хромозомни аберации в костния мозък на изпитвания вид.
                     Няма изискване за потвърждаване на ясно положителен или ясно отрицателен отклик.
                     В случаите, когато откликът не е ясно отрицателен или положителен и за да се подпомогне установяването на биологичната относимост на даден резултат (например при увеличение, което е слабо или с гранична стойност), данните следва да се оценят чрез експертна оценка и/или допълнителни изследвания от съществуващите приключени опити. В някои случаи би могло да се окаже полезно анализирането на повече клетки или извършването на опит с повторение, като се използват модифицирани опитни условия.
                     В редки случаи дори след допълнителни изследвания данните не позволяват стигането до заключение, че изпитваният химикал предизвиква положителни или отрицателни резултати, и следователно за изследването се заключава, че е неясно.
                     Честотите на полиплоидните и ендоредуплицираните метафази сред общия брой метафази следва да се регистрират поотделно. Едно увеличение в броя на полиплоидните/ендоредуплицираните клетки може да показва, че изпитваният химикал има потенциал да инхибира митотичните процеси или клетъчния цикъл (вж. точка 3).
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                     
                        Обобщение
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитван химикал:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             източник, номер на партидата, крайна дата за употреба, ако има такава;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             стабилност на изпитвания химикал, ако е известна.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Вещество с една съставка:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             химична идентификация, като наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, SMILES или InChI код, структурна формула, чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и др.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Вещество, включващо повече съставки, UVCB и смеси:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             характеризирани, доколкото е възможно, от химическата идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Приготвяне на химикала за изпитване:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка за изборa на носител;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             разтворимост и стабилност на изпитвания химикал в разтворител/носител, ако са известни;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             приготвяне на формулировките за хранителен режим, питейна вода или инхалация;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             аналитични определяния, свързани с формулировките (напр. устойчивост, хомогенност, номинални концентрации), когато се извършват такива;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитвани животни:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             използван вид/порода и обосновка за избора;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             брой, възраст и пол на животните;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             източник за доставка на животните, условия на отглеждане, диета и т.н.;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             метод за еднозначно идентифициране на животните;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за краткосрочни изследвания: индивидуално тегло на животните в началото и в края на изпитването; за изследвания, по-дълги от една седмица: индивидуално телесно тегло по време на изследването и консумация на храна. следва да бъдат включени размахът, средната стойност и стандартното отклонение на телесното тегло за всяка група.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Условия на изпитването:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             положителни и отрицателни (на носител/разтворител) контроли;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни от изследването за установяване на обхвата, ако е проведено;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка за избора на нивото на доза;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробна информация за приготвянето на изпитвания химикал;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробна информация относно прилагането на изпитвания химикал;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка на пътя и продължителността на прилагането;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи за проверка дали изпитваният химикал (химикали) е достигнал до общото кръвообращение или до костния мозък;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             действителна доза (mg/kg телесно тегло дневно), изчислена от концентрацията на изпитвания химикал в хранителния режим/питейната вода (ppm), и консумация, ако е приложимо;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробности относно качество на храната и водата;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             метод за умъртвяване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             метод за аналгезия (когато е използван);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробно описание на графиците на третиране и вземане на проби и обосновки за направения избор;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи на приготвяне на предметни стъкла;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи за измерване на токсичността;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             идентичност на блокиращия метафазата химикал, неговата концентрация, доза и време на прилагане преди пробовземането;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             процедури за изолиране и съхраняване на проби;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             критерии за преброяване на аберациите;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             брой на анализираните клетки в метафаза на животно и брой на клетките, анализирани за определяне на митотичния индекс;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             критерии за приемливост на изпитването;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             критерии за считане на изследванията за положителни, отрицателни или недостатъчни за формулиране на заключение.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Резултати:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             състояние на животните преди и през целия период на изпитване, включително признаци на токсичност;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             митотичен индекс, посочен отделно за всяко животно;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             тип и брой аберации и аберантни клетки, посочен поотделно за всяко животно;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             общ брой на аберациите на група, със средни стойности и стандартни отклонения;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             брой клетки с аберации на група, със средни стойности и стандартни отклонения;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Изменения в плоидията, ако се наблюдават, включително честоти на полиплоидни и/или ендоредуплицирани клетки;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             взаимоотношение доза-отклик, където е възможно;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             статистически анализи и използвани методи;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни, доказващи експозицията на костния мозък;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни за паралелни отрицателни и положителни контроли с размах, средни стойности и стандартни отклонения;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни за отрицателни и положителни контроли за предходни периоди, с размах, средни стойности и стандартни отклонения, и 95 % граници за контрол за разпределението, както и обхванат времеви период и брой на наблюденията;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             спазени критерии за положителен или отрицателен отклик.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обсъждане на резултатите.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Заключение.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Позовавания.
                                 
                              
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Adler, I.D. (1984), „Cytogenetic Tests in Mammals“, in Mutagenicity Testing: A Practical Approach, Venittand, S., J.M. Parry (eds.), IRL Press, Washington, DC, pp. 275-306.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Preston, R.J. et al. (1987), Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells, Mutation Research, Vol. 189/2, pp. 157-165.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Richold, M. et al. (1990), „In Vivo Cytogenetics Assays“, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Tice, R.R. et al. (1994), Report from the working group on the in vivo mammalian bone marrow chromosomal aberration test, Mutation Research, Vol. 312/3, pp. 305-312.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Adler, I.D. et al. (1998), Recommendations for statistical designs of in vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 417/1, pp. 19-30.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2000), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, N°19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse, Methods in Molecular Biology, Vol. 1044, pp. 147-163.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Lovell, D.P. et al. (1989), „Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                           
                              Анеуплоидия
                           : всяко отклонение от обичайния диплоиден (или хаплоиден) брой на хромозомите с една или повече от една хромозома, но не и с кратни на цял набор (или набори) от хромозоми (вж. полиплоидия).
                        
                           
                              Центромера
                           : област (области) от хромозомата, с която нишки от делителното вретено се свързват по време на клетъчното делене, като така позволяват методично придвижване на дъщерните хромозоми към полюсите на дъщерните клетки.
                        
                           
                              Химикал
                           : вещество или смес.
                        
                           
                              Хроматиден тип аберация
                           : структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване на единични хроматиди или разкъсване и повторно съединяване между хроматиди.
                        
                           
                              Хромозомен тип аберация
                           : структурно увреждане на хромозомата, изразяващо се в разкъсване или разкъсване и повторно съединяване на двете хроматиди на идентично място.
                        
                           
                              Ендоредупликация
                           : процес, при които след S-период на удвояване на ДНК ядрото не навлиза в митоза, а започва друг S-период. Резултатът е хромозоми с 4, 8, 16, … хроматиди.
                        
                           
                              Празнина
                           : ахроматично увреждане, по-малко от ширината на една хроматида, с минимална несъосност на хроматидите.
                        
                           
                              Митотичен индекс
                           : отношението на броя на клетките в митоза към общия брой на клетките в дадена популация, което е мярка за пролиферационния статус на тази клетъчна популация.
                        
                           
                              Бройна аберация
                           : промяна в броя на хромозомите в сравнение с нормалния брой, характерен за използваните животни (анеуплоидия).
                        
                           
                              Полиплоидия
                           : бройна хромозомна аберация, свързана с промяна в броя на целия набор от хромозоми, за разлика от промяна в броя на част от хромозомния набор (вж. анеуплоидия).
                        
                           
                              Структурна хромозомна аберация
                           : промяна в хромозомната структура, която се открива при микроскопско изследване на етапа на метафаза на клетъчното делене, наблюдавана във вид на делеции и фрагменти, вътрехромозомни или междухромозомни преустройства.
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                     
                     
                        Допълнение 2
                        
                           ФАКТОРНИЯТ ДИЗАЙН ЗА ИДЕНТИФИЦИРАНЕ НА РАЗЛИКИ МЕЖДУ ПОЛОВЕТЕ ПРИ ИЗСЛЕДВАНЕ IN VIVO ЗА ХРОМОЗОМНИ АБЕРАЦИИ
                        
                        
                           Факторният дизайн и неговият анализ
                        
                        При този дизайн се изпитват минимум 5 мъжки и 5 женски животни на всяко равнище на концентрация, в резултат от което в дизайна се използват най-малко 40 животни (20 мъжки и 20 женски животни, плюс относимите положителни контроли).
                        Дизайнът, който е един от по-простите видове факторен дизайн, е равностоен на двуфакторния дисперсионен анализ, с пола и равнището на концентрация като главни ефекти. Данните могат да бъдат анализирани с помощта на множество стандартни статистически софтуерни пакети като например SPSS, SAS, STATA, Genstat, както и с използване на R.
                        Анализът разпределя варирането в набора от данни като вариране между половете, вариране между концентрациите и вариране, свързано с взаимодействието между половете и концентрациите. Всеки от компонентите се тества спрямо оценка на варирането между животните за повторения в рамките на групите животни от един и същ пол, които са на една и съща концентрация. Пълни подробности за използваната методика са на разположение в множество стандартни статистически учебници (вж. позоваванията) и в помощните текстове, предоставени със статистическите пакети.
                        Анализът продължава с проверка на компонента за взаимодействие пол х концентрация в ANOVA таблицата (5). При липсата на значим компонент за взаимодействие комбинираните стойности за половете или за равнищата на концентрация предоставят валидни статистически тестове между равнищата, въз основа на компонента за обединеното вътрешногрупово вариране на ANOVA.
                        Анализът продължава като се раздели оценката на варирането между концентрациите на контрасти, които дават възможност за тест за линейни и квадратични контрасти на отклиците за равнищата на концентрация. Когато е налице значимо взаимодействие пол х концентрация, този компонент също може да се подраздели на контрасти за линейно x пол и квадратично x пол взаимодействие. Тези компоненти предоставят възможност за тестове дали концентрационните отклици са успоредни за двата пола, или има диференциален отклик между двата пола.
                        Оценката на обединеното вътрешногрупово вариране може да се използва за предоставяне на възможност за тестове за сравнения по двойки на разликата между средните стойности. Тези сравнения могат да се правят между средните стойности за двата пола и между средните стойности за различното равнище на концентрация, като за сравнения с равнищата за отрицателните контроли. В случаите, когато е налице значимо взаимодействие, могат да се направят сравнения между средните стойности за различни концентрации в рамките на даден пол, или между средните стойности за половете при една и съща концентрация.
                        
                           Позовавания
                        
                        Съществуват много статистически учебници, в които се разглеждат теорията, планирането, методологията, анализа и тълкуването на факторните дизайни, вариращи от най-простите двуфакторни анализи до по-сложните форми, използвани в методологията за планиране на опити. По-долу е представен неизчерпателен списък. Някои книги предоставят практически примери за сравними модели, в някои случаи с код за провеждането на анализите с използване на различни софтуерни пакети.
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              “
               
                     5)
                  
                  
                     В Част Б глава Б.12 се заменя със следното:
                     „Б.12   Изпитване за микроядра в еритроцити на бозайници
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на Насоки за изпитване на ОИСР 474 (2014). Той е част от поредица от методи за изпитване от областта на генетичната токсикология. Разработен е документ на ОИСР, съдържащ ясна информация относно изпитванията в областта на генетичната токсикология, и преглед на актуалните изменения на посочените Насоки (1).
                     Изпитването in vivo за микроядра при бозайници е от особена значимост за оценка на генотоксичността, тъй като, въпреки че могат да варират според животинския вид, факторите за метаболизма in vivo, фармакокинетиката и процесите на поправка на ДНК са активни и допринасят за отклика. Изследването in vivo също е от полза за по-нататъшното проучване на генотоксичността, установена чрез in vitro система.
                     Изпитването in vivo за микроядра при бозайници се използва за откриване на предизвиквани от изпитвания химикал увреждания на хромозомите или митотичния апарат на еритробласти. С изпитването се прави оценка на образуването на микроядра в еритроцити, пробовзети от костен мозък или от периферни кръвни клетки на животни, обичайно гризачи.
                     Целта на изпитването за микроядра е да се идентифицират химикали, причиняващи цитогенно увреждане, което води до образуването на микроядра, съдържащи изоставащи хромозомни фрагменти или цели хромозоми.
                     Когато еритробласт в костен мозък се развие в незрял еритроцит (понякога наричан също полихроматичен еритроцит или ретикулоцит), главното ядро се екструдира; всяко образувано вече микроядро може да изостане в цитоплазмата. Онагледяването или откриването на микроядра се улеснява в тези клетки, тъй като те не съдържат главно ядро. Увеличаването на честотата на незрелите еритроцити с микроядра в третираните животни е показател за индуцирани структурни или бройни хромозомни аберации.
                     Новополучените еритроцити с микроядра се идентифицират и се определят количествено чрез оцветяване, последвано или от визуално преброяване с използване на микроскоп, или от автоматизиран анализ. Преброяването на достатъчен брой незрели еритроцити в периферната кръв или в костния мозък на полово зрели животни се улеснява значително чрез използване на автоматизирана платформа за преброяване. Подобни платформи са приемливи алтернативи на ръчната оценка (2). Сравнителни проучвания показват, че такива методи, при използване на подходящи еталони за калибриране, могат да предоставят по-добра междулабораторна и вътрешнолабораторна възпроизводимост и чувствителност от ръчното микроскопско броене (3) (4). Автоматизираните системи, които могат да измерят честотата на еритроцитите с микроядра, включват поточни цитометри (5), платформи за анализ на изображения (6) (7) и цитометри с лазерно сканиране (8), без да са ограничени до тези уреди.
                     Хромозомните фрагменти могат да бъдат разграничени от целите хромозоми с помощта на редица критерии, въпреки че това обикновено не се прави като част от изпитването. Това включва установяване на наличието или липсата на кинетохора или центромерна ДНК, които са характерни за интактните хромозоми. Липсата на кинетохора или центромерна ДНК показва, че микроядрото съдържа само хромозомни фрагменти, докато наличието показва хромозомна загуба.
                     Определенията на използваните термини са дадени в допълнение 1.
                     ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ
                     Прицелната тъкан за генетични увреждания в настоящото изпитване е костният мозък на млади полово зрели гризачи, тъй като еритроцитите се произвеждат в тази тъкан. Измерването на микроядрата в незрели еритроцити в периферна кръв е приемливо и при други видове бозайници, за които е доказана достатъчна чувствителност за откриване на химикали, причиняващи структурни или бройни хромозомни аберации в тези клетки (чрез предизвикване на образуването на микроядра в незрели еритроцити), и е предоставена научна обосновка. Честотата на незрели еритроцити с микроядра е главната крайна точка. Честотата на съдържащи микроядра зрели еритроцити в периферната кръв може също да се използва като крайна точка при видове без силна селективност на далака по отношение на клетки с микроядра и когато животните се третират непрекъснато в продължение на период, който надвишава жизнения цикъл на еритроцита в използвания вид (например 4 или повече седмици при мишки).
                     Ако има доказателства, че изпитваният химикал (или химикали) или негов метаболит (или метаболити) няма да достигне до прицелната тъкан, може да не е подходящо да се използва настоящото изпитване.
                     Преди използването на метода за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Такива съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа.
                     ПРИНЦИП НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ
                     Животните се експонират на въздействието на изпитвания химикал по подходящ път. Ако се използва костен мозък, животните се умъртвяват по хуманен начин в подходящ момент (или моменти) от време след третирането, костният мозък се извлича и препаратите се изготвят и оцветяват (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Когато се използва периферна кръв, кръвта се взема в подходящ момент (или моменти) от време след третирането и препаратите се изготвят и оцветяват (12) (16) (17) (18). Когато третирането се прилага остро, важно е да се изберат моменти от време за събиране на костен мозък или на кръв, в които може да бъде открита свързана с третирането индукция на незрели еритроцити с микроядра. В случай на вземане на проби от периферна кръв трябва също така да е изминало време, достатъчно за проявяването на тези събития в циркулиращата кръв. Препаратите се анализират за наличие на микроядра или чрез визуализиране с микроскоп, анализ на изображения, поточна цитометрия, или чрез цитометрия с лазерно сканиране.
                     ПРОВЕРКА НА ПРИГОДНОСТТА НА ЛАБОРАТОРИЯТА
                     
                        Проучване на пригодността
                     
                     За да се установи дали е наличен достатъчно опит за провеждане на изследването преди да се използва за рутинно изпитване, лабораторията следва да е доказала капацитет за възпроизвеждане на очаквани резултати от публикувани данни (17) (19) (20) (21) (22) за честота на микроядрата с минимум два химикала за положителни контроли (включително слаб отклик, предизвикан от ниски дози в положителни контроли), като например посочените в таблица 1, и със съвместими контроли на носител/разтворител (вж. точка 26). При тези опити следва да се използват дози, които дават възпроизводими и свързани с дозата увеличения, а опитите следва да доказват чувствителността и динамичния обхват на системата за изпитване в представляващата интерес тъкан (костен мозък или периферна кръв), чрез използване на метода за преброяване, който ще се прилага в лабораторията. Това изискване не се прилага за лаборатории, които разполагат с опит, т.е. които разполагат с налична база данни за предходни периоди, както е определено в точки 14—18.
                     
                        Данни за контролите за предходни периоди
                     
                     В хода на проучванията за пригодност лабораторията следва да установи:
                     
                                 —
                              
                              
                                 размах и разпределение при положителните контроли от предходни периоди, и
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 размах и разпределение при отрицателните контроли от предходни периоди.
                              
                           При първото придобиване на данни за разпределението при отрицателните контроли от предходни периоди паралелните отрицателни контроли следва да бъдат съобразени с публикуваните данни за контролите, когато такива са налице. При добавяне на повече опитни данни към разпределението за предходни периоди при контролите паралелните отрицателни контроли следва в идеалния случай да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % на това разпределение. Базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди следва да е статистически устойчива, за да се гарантира способността на лабораторията за оценка на разпределението на нейните данни за отрицателните контроли. В литература се посочва, че може да са необходими най-малко 10 опита, но е за предпочитане провеждането на минимум 20 опита при сравними условия на опитите. Лабораториите трябва да използват методи за контрол на качеството, като например контролни карти (напр. C-карти или карти за средна стойност (X-bar) (23)), за определяне на варирането на данните им, и за доказване, че методологията е „под контрол“ в техните лаборатории. В литературата (24) могат да се намерят допълнителни препоръки относно начина на създаване и използване на данни от предходни периоди (т.е. критерии за включване и изключване на данни в данните за предходни периоди и критериите за приемливост за даден опит).
                     В случай, че дадена лаборатория не е извършила достатъчен брой опити за установяване на статистически устойчиво разпределение при отрицателните контроли (вж. точка 15) по време на проучванията за пригодност (описани в точка 13), приемливо е разпределението да бъде установено по време на първите рутинни изпитвания. При този подход следва да се прилагат препоръките, посочени в литературата (24), и резултатите от отрицателните контроли, получени при тези опити, следва да продължат да са в съответствие с публикуваните данни за отрицателните контроли.
                     Всички промени в опитния протокол следва да бъдат разглеждани от гледна точка на тяхното отражение върху съгласуваността на произтичащите данни със съществуващите бази данни за контролите на дадената лаборатория за предходни периоди. Само значителни несъответствия следва да водят до създаването на нова база данни за контролите за предходни периоди, в случай че с експертна оценка се установи, че тя се различава от предходното разпределение (вж. точка 15). По време на повторното създаване може да не е необходима пълна база данни за отрицателните контроли за позволяване на провеждането на действителни изпитвания, при условие че лабораторията може да докаже, че стойностите на нейните паралелни отрицателни контроли остават в съответствие или с предишната им база данни, или със съответните публикувани данни.
                     Данните за отрицателните контроли следва да се състоят от срещането на незрели еритроцити с микроядра във всяко животно. Паралелните отрицателни контроли в идеалния случай следва да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % от разпределението от базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди. Когато данните за паралелните отрицателни контроли попадат извън 95 %-ните граници за контрол, те могат да бъдат приемливи за включване в разпределението при контролите от предходни периоди, при условие че тези данни не са екстремални стойности, силно различаващи се от нормалните, и има доказателства, че системата за изпитване е „под контрол“ (вж. точка 15), както и липсват доказателства за техническа или човешка грешка.
                     ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
                     
                        Приготвяне
                     
                     
                        Избор на животински вид
                     
                     Следва да се използват обичайно използвани в лабораториите породи от здрави млади полово зрели животни. Могат да се използват мишки, плъхове или други подходящи видове бозайници. Когато се използва периферна кръв, трябва да бъде установено, че отстраняването на клетки с микроядра от обращение чрез далака не компрометира откриването на индуцирани микроядра в избраните видове. За това съществуват категорични доказателства за периферна кръв от мишки и плъхове (2). Научната обосновка за използване на видове, различни от плъхове и мишки, следва да бъде предоставена в протокола. Ако се използват видове, различни от гризачи, препоръчва се измерването на индуцираните микроядра да се интегрира в друго подходящо изпитване за токсичност.
                     
                        Условия на отглеждане и хранене на животните
                     
                     За гризачи в помещението, в което се намират животните, температурата следва да е 22 °C (± 3 °C). Въпреки че в идеалния случай относителната влажност следва да бъде 50—60 %, тя трябва да е поне 40 % и за предпочитане да не превишава 70 %, освен по време на почистване на помещението. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни хранителни режими с неограничен достъп до вода за пиене. Изборът на хранителен режим може да бъде повлиян от нуждата да се осигури подходящо смесване с изпитван химикал, когато прилагането му е по този път. Гризачите трябва да бъдат разпределени в малки групи (не повече от пет в клетка) от един и същ пол и третирана група, ако не се очаква агресивно поведение, за предпочитане в клетки с твърд под, с подходящо облагородяване на жизнената среда. Животните могат да се настаняват отделно само ако това е научно обосновано.
                     
                        Подготовка на опитните животни
                     
                     Обикновено се използват здрави, млади полово зрели животни (за гризачи в идеалния случай на възраст 6—10 седмици в началото на третирането, макар че използването на малко по-възрастни животни също е приемливо), които се разпределят на случаен принцип в контролни групи и групи за третиране. Отделните животни се идентифицират индивидуално единствено чрез хуманни, минимално инвазивни методи (напр. чрез опръстеняване, поставяне на марка, микрочип или биометрична идентификация, но не и чрез изрязване на уши или пръсти) и се аклиматизират към лабораторните условия поне пет дни. Клетките трябва да бъдат подредени по такъв начин, че възможните ефекти в резултат на местоположението на клетката да бъдат сведени до минимум. Кръстосаното замърсяване с положителната контрола и с изпитвания химикал следва да се избягва. В началото на изследването вариациите в теглото на животните следва да са минимални и да не превишават ± 20 % от средното тегло на всеки пол.
                     
                        Приготвяне на дозите
                     
                     Твърдите изпитвани химикали следва да се разтворят или суспендират в подходящи разтворители или носители, или да се смесят в хранителния режим или в питейната вода преди дозирането на животните. Течните изпитвани химикали могат да се дозират директно или да се разредят преди дозиране. При експозиция чрез инхалация изпитваните химикали могат да се прилагат като газ, пари или аерозол с твърда/течна фаза, в зависимост от техните физични и химични свойства. Следва да се използват пресни смеси на изпитвания химикал, освен ако данните за стабилността показват, че е допустимо съхранение и посочват подходящите условия за съхранение.
                     
                        Условия на изпитване
                     
                     
                        Разтворител/носител
                     
                     Разтворителят/носителят не следва да има токсични ефекти при използваните нива на доза, а също така не следва да е възможна химическа реакция с изпитваните химикали. Ако се използват други освен добре познатите разтворители/носители, включването им следва да се подкрепи от референтни данни за съвместимостта им. Препоръчва се винаги, когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на вода като разтворител/носител. Примери за обичайно използвани съвместими разтворители/носители са водата, физиологичният разтвор, разтворът на метилцелулоза, разтворът на натриевата сол на карбоксиметилцелулозата, маслиновото масло и царевичното масло. При липсата на предходни или публикувани данни за контроли, показващи, че избраният нетипичен разтворител/носител не индуцира микроядра и не предизвиква други неблагоприятни ефекти, следва да се проведе първоначално изследване, за да се установи допустимостта на контролата на разтворител/носител.
                     
                        Контроли
                     
                     
                        Положителни контроли
                     
                     Във всяко изпитване обикновено следва да бъде включена група от животни, третирани с химикал за положителна контрола. Това може да се отмени, ако изпитващата лаборатория е доказала пригодността си за провеждане на изпитването и е установила размах при положителните контроли от предходни периоди. Когато не е включена паралелна положителна контролна група, във всеки опит следва да се включат контроли на преброяването (фиксирани и неоцветени предметни стъкла или проби от клетъчни суспензии, както е подходящо за метода за преброяване). Те могат да бъдат получени като в преброяването на проучването се включат подходящи референтни проби, които са били получени и съхранявани при отделен опит с положителни контроли, провеждан периодично (например на всеки 6—18 месеца); например, по време на изпитвания за пригодност и редовно след това, когато това е необходимо.
                     Химикалите за положителни контроли следва по надежден начин да предизвикват откриваемо увеличение в честотата на микроядрата над спонтанното равнище. Когато се използва ръчно преброяване с микроскоп, дозите за положителните контроли следва да са така избрани, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на преброяващия идентичността на кодираните проби. Приемливо е положителните контроли да се прилагат по път, различен от този за изпитвания химикал, чрез използване на различен график за третиране, и извършването на пробовземането да е само в точно определена времева точка. Освен това за положителна контрола може да се разгледа използването на химикали, принадлежащи към свързан химичен клас, когато е подходящо. Примери за химикали за положителни контроли са включени в таблица 1.
                     
                        Таблица 1.
                     
                     
                        Примери за химикали за положителни контроли.
                     
                     Химикали и CASRN
                     Етилов метансулфонат (CASRN 62-50-0]
                     Метилов метансулфонат (CASRN 66-27-3]
                     Етилнитрозоуреа (CASRN 759-73-9]
                     Митомицин С (CASRN 50-07-7]
                     Циклофосфамид (монохидрат) [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]
                     Триетиленмеламин (CASRN 51-18-3]
                     Колхицин (CASRN 64-86-8] или винбластин (CASRN 865-21-4] — както анеугени
                     
                        Отрицателни контроли
                     
                     При всяко време на вземане на проби следва да бъде включена отрицателна контролна група животни, която следва да бъде третирана по същия начин както третираните групи, с изключение на това, че не се третира с изпитвания химикал. Ако за прилагане на изпитвания химикал се използва разтворител/носител, контролната група трябва да получава този разтворител/носител. Ако обаче с данни за отрицателните контроли от предходни периоди са доказани последователно вариране между животните и честоти на клетките с микроядра по всяко време на пробовземане за изпитващата лаборатория, може да е необходимо само едно единствено пробовземане за отрицателната контрола. Когато се използва едно единствено пробовземане за отрицателни контроли, това следва да бъде първото време на вземане на проба за изследването.
                     Ако се използва периферна кръв, вместо паралелна отрицателна контрола за краткосрочните проучвания е приемлива проба преди третирането, когато произтичащите данни са в съответствие с базата данни на изпитващата лаборатория за контроли за предходни периоди. Доказано е, че по отношение на плъхове пробовземането на малки обеми (напр. под 100 μl/ден) преди третирането има минимално въздействие върху фоновата честота на микроядрата (25).
                     ПРОЦЕДУРА
                     
                        Брой и пол на животните
                     
                     Като цяло, откликът чрез микроядра е сходен у мъжките и женските животни и следователно повечето изследвания могат да бъдат извършени с който и да е пол (26). Данни, показващи относими разлики между мъжките и женските (например разлики в общата токсичност, метаболизма, бионаличността, токсичността за костния мозък и т.н., включително например в изследване за определяне на обхвата), биха насърчили използването на двата пола. В този случай може да е уместно да се извърши проучване с двата пола, например като част от изследване за токсичност с повтарящи се дози. Ако се използват и двата пола може да е уместно да се приложи факторен дизайн. Подробна информация за това как да се анализират данните с използването на посочения дизайн са дадени в допълнение 2.
                     Числеността на групите при започване на изследването следва да бъде определена с оглед предоставяне на минимум 5 анализируеми животни от група от един пол, или от всеки пол, ако са използвани и двата пола. Когато експозицията на хора на химикали може да е специфична в зависимост от пола, като например при някои фармацевтични продукти, изпитването следва да се проведе с животни от подходящия пол. Като насока за типичните максимални изисквания за животни, едно проучване за костен мозък, проведено в съответствие с параметрите, установени в точка 37, с три групи на определена доза и паралелни отрицателни и положителни контролни групи (всяка група е съставена от пет животни от един и същ пол), ще изисква между 25 и 35 животни.
                     
                        Нива на доза
                     
                     Ако се извършва предварително изследване за определяне на обхвата, поради това че към момента няма подходящи данни, които да са налични като помощно средство при избора на доза, то следва да се извърши в същата лаборатория, като се използва същият вид, порода, пол и режим на третиране, който се използва и в главното изследване (27). С проучването следва да се направи опит да се установи максималната допустима доза (МДД), определена като най-високата доза, която ще се толерира без доказателства за ограничаваща изследването токсичност спрямо продължителността на периода на изследването (например чрез подтискане на телесното тегло или цитотоксичност за хемопоетичната система, но без смърт или доказателства за болка, страдание или дистрес, които изискват умъртвяване по хуманен начин (28)).
                     Най-високата доза може също да се дефинира като доза, която предизвиква токсичност в костния мозък (напр. намаляване на дела на незрелите еритроцити в общия брой еритроцити в костния мозък или в периферната кръв с повече от 50 %, но до минимум 20 % от контролната стойност). При анализ на CD71-положителни клетки в периферното кръвообращение (т.е. чрез поточна цитометрия) обаче, тази много млада част от незрелите еритроцити откликва на токсични предизвикателства по-бързо, отколкото по-голямата РНК-положителна кохорта от незрели еритроцити. Поради това при дизайните с остра експозиция, изследващи CD71-положителната фракция незрели еритроцити, може да се прояви по-висока стойност за видимата токсичност, в сравнение с дизайните, които идентифицират незрели еритроцити въз основа на съдържанието на РНК. По тази причина, когато опитите включват третиране от пет дни или по-малко, най-високото ниво на доза за изпитвани химикали, които причиняват токсичност, може да се дефинира като дозата, която предизвиква статистически значимо намаление в дела на CD71-положителни незрели еритроцити в общия брой еритроцити, но до минимум 5 % от контролната стойност (29).
                     Химикалите, които показват насищане по отношение на токсикокинетични свойства, или предизвикват процеси на детоксикация, които могат да доведат до намаляване на експозицията след дългосрочно прилагане, могат да представляват изключения от критериите за определяне на дозата и следва да се оценяват за всеки отделен случай.
                     С цел получаване на информация за дозата и отклика дадено пълно проучване следва да включва отрицателна контролна група и най-малко три нива на доза, обикновено разделени с кратност 2, но не по-голяма от 4. Ако изпитваният химикал не предизвиква токсичност в изследване за определяне на обхвата или въз основа на съществуващите данни, най-високата доза за период на прилагане от 14 дни или повече следва да бъде 1 000 mg/kg телесно тегло/ден, а за периоди на прилагане от по-малко от 14 дни — 2 000 mg/kg телесно тегло/ден. Ако обаче изпитваният химикал предизвиква токсичност, МДД следва да бъде най-високата приложена доза и използваните нива на доза следва да са в обхват от максималната доза до доза, която, предизвиква слаба токсичност или не е токсична. Когато токсичност за прицелната тъкан (костен мозък) се наблюдава при всички изпитвани нива на доза, препоръчително е допълнително проучване при нетоксични дози. За проучванията, целящи по-подробно характеризиране на количествената информация за доза-отклик, може да се изискват допълнителни групи на определена доза. За някои типове изпитвани химикали (напр. фармацевтични продукти за хуманна употреба), обхванати от специфични изисквания, тези граници могат да варират.
                     
                        Гранично изпитване
                     
                     Ако опити за определяне на обхвата на дозите или съществуващи данни от подобни породи животни сочат, че режимът на третиране най-малко при пределна доза (описан по-долу) не предизвиква видими токсични ефекти (включително липса на подтискане на пролиферацията на костния мозък или на други доказателства за цитотоксичност за прицелната тъкан), и ако не може да се очаква генотоксичност на базата на проучвания in vitro за генотоксичност или на данни от структурно подобни химикали, то тогава провеждането на пълно изследване с три нива на доза може да не се смята за необходимо, при условие, че е доказано, че изпитваният химикал (или химикали) достига до прицелната тъкан (костен мозък). В такива случаи може да бъде достатъчно и едно ниво на доза при пределната доза. За период на прилагане от 14 дни или повече пределната доза е 1 000 mg/kg телесно тегло/ден. За период на прилагане от по-малко от 14 дни пределната доза е 2 000 mg/kg телесно тегло/ден.
                     
                        Прилагане на дозите
                     
                     При планирането на изследването следва да бъде взет предвид очакваният път на експозиция на човека. Поради това като обосновани могат да бъдат избрани например пътища на експозиция като хранителен режим, питейна вода, локално подкожно, орално (през сонда), вдишване, интратрахеално или имплантация. Във всички случаи пътят следва да се избере така, че да осигури достатъчна експозиция на прицелната тъкан (или тъкани). Интраперитонеалното инжектиране обикновено не се препоръчва, тъй като то не е очакван път на експозиция на човека, и следва да бъде използвано само със специална научна обосновка. Ако изпитваният химикал се смеси в хранителния режим или в питейната вода, по-специално в случай на еднократно дозиране, следва да се положи грижа закъснението между консумацията на храна и вода и пробовземането да е достатъчно, за да позволи откриването на ефектите (вж. точка 37). Максималният обем течност, който може да се приложи еднократно със сонда или инжекция, зависи от големината на изпитваното животно. Обемът обичайно не следва да превишава 1 ml на 100 g телесно тегло, освен в случаите, когато се прилагат водни разтвори, при които могат да бъдат използвани 2 ml на 100 g телесно тегло. Обеми, по-големи от този, следва да се обосноват. С изключение на дразнещи или корозивни изпитвани химикали, които обикновено предизвикват изострени ефекти при по-високи концентрации, варирането в изпитвания обем трябва да бъде сведено до минимум чрез регулиране на концентрацията с оглед осигуряване на прилагането на постоянен обем спрямо телесното тегло при всички нива на доза.
                     
                        График на третиране
                     
                     За предпочитане е да се извършват 2 или повече третирания, прилагани на интервали от 24 часа, особено когато това изпитване се интегрира в други изследвания за токсичност. Като алтернатива могат да се извършват еднократни третирания, ако това е научно обосновано (например при изпитвани химикали, за които е известно, че блокират клетъчния цикъл). Изпитваните химикали могат също да се прилагат като разделена доза, т.е. две или повече третирания в един и същи ден, разделени от не повече от 2—3 часа, за да се улесни прилагането на голям обем. При тези обстоятелства или при прилагане на изпитвания химикал чрез вдишване, графикът за пробовземане трябва да се определи въз основа на времето на последното прилагане на доза или края на експозицията.
                     Изпитването може да се извърши върху мишки или плъхове по един от следните три начина:
                     
                                 а.
                              
                              
                                 Животните се третират с изпитвания химикал еднократно. Проби от костен мозък се вземат най-малко два пъти (от независими групи животни), като се започне не по-рано от 24 часа след третирането, но не повече от 48 часа след третирането, с подходящ интервал (интервали) между пробите, освен ако за изпитвания химикал е известно, че има изключително дълъг период на полуразграждане. Вземането на проби по-рано от 24 часа след третирането следва да бъде обосновано. Проби от периферна кръв се вземат най-малко два пъти (от една и съща група животни), като се започне не по-рано от 36 часа след третирането, на подходящ(и) интервал(и) след първото пробовземане, но не повече от 72 часа. При първото вземане на проба следва да бъдат третирани всички групи на определена доза и да бъдат взети проби за анализ; независимо от това, при пробовземане на по-късен етап (или етапи) е необходимо да се прилага само най-високата доза. Когато е установен положителен отклик след дадено вземане на проба, не се изисква допълнително вземане на проба, освен ако е необходима количествена информация за доза-отклик. Описаните времена на събиране са следствие на кинетиката на появата и изчезването на микроядрата в тези 2 тъканни компартмента.
                              
                           
                                 б.
                              
                              
                                 Ако се прилагат 2 третирания на ден (напр. две третирания на 24-часови интервали), следва да се вземат проби веднъж между 18-ия и 24-ия час след последното третиране за костния мозък или веднъж между 36-ия и 48-ия час след последното третиране за периферната кръв (30). Описаните времена на събиране са следствие на кинетиката на появата и изчезването на микроядрата в тези 2 тъканни компартмента.
                              
                           
                                 в.
                              
                              
                                 Ако се използват три или повече третирания на ден (напр. три или повече третирания на приблизително 24-часови интервали), проби от костен мозък следва да се вземат не по-късно от 24 часа след окончателното третиране, а от периферна кръв следва да бъдат събрани не по-късно от 40 часа след последното третиране (31). Този вариант на третиране съчетава комбинация от Comet изследване (например вземане на проби 2-6 часа след окончателното третиране) с изпитването за микроядра, и интегриране на изпитването за микроядра с изследванията за токсичност с повтаряща се доза. Събраните данни подсказват, че индуцирането на микроядра може да се наблюдава в тези по-широки времеви рамки при 3 или повече прилагания (15).
                              
                           Могат да се използват други режими на дозиране или вземане на проби, когато това е относимо и научно обосновано, и да се улесни интегрирането с други изпитвания за токсичност.
                     
                        Наблюдения
                     
                     Общи клинични наблюдения върху изпитваните животни следва да бъдат извършвани поне един път дневно и клиничните признаци следва да бъдат записвани, за предпочитане по едно и също време (или времена) веднъж дневно и като се има предвид пиковият период за поява на очакваните ефекти след дозиране. По време на периода на дозиране всички животни следва да се наблюдават за заболеваемост и смъртност поне два пъти дневно. Теглото на всички животни следва да се измерва в началото на изследването, поне един път в седмицата по време на изследвания с повтаряща се доза, и при умъртвяването. При изследвания с продължителност най-малко една седмица консумацията на храна се измерва най-малко един път седмично. Ако изпитваният химикал се прилага чрез водата за пиене, консумацията на вода следва да се измерва при всяка смяна на водата и най-малко един път в седмицата. Животните, проявяващи нелетални признаци на прекомерна токсичност, следва да се умъртвят по хуманен начин преди приключването на периода на изпитване (28). При определени обстоятелства може да се проследява температурата на тялото на животните, тъй като предизвиканите от третирането хипер- и хипотермия допринасят за получаването на недостоверни резултати (32) (33) (34).
                     
                        Експозиция на прицелна тъкан
                     
                     В подходящо време (или времена) следва да се взема кръвна проба, за да се позволи изследване на плазмените нива на изпитваните химикали с цел доказване на експозиция на костен мозък, там където е обосновано и когато не са налични други данни за експозиция (вж. точка 48).
                     
                        Подготовка на костния мозък/кръвта
                     
                     Клетките на костния мозък обичайно се вземат от бедрената кост или големия пищял на животните непосредствено след умъртвяване по хуманен начин. Обичайно клетките се отстраняват, приготвят и оцветяват по установени методи. Малки обеми от периферна кръв могат да бъдат получени в съответствие с подходящи стандарти за хуманно отношение към животните или чрез метод, който позволява оцеляването на изпитваното животно, като например кръвотечение от опашната вена, или от друг подходящ кръвоносен съд, или чрез сърдечна пункция или вземане на проби от голям съд при умъртвяването на животни. За еритроцити както от костен мозък, така и от периферна кръв, в зависимост от метода за анализ, клетките могат да бъдат незабавно оцветени суправитално (16) (17) (18), препаратите за намазка се приготвят, след което се оцветяват за микроскопия, или се фиксират и оцветяват по подходящ начин за поточен цитометричен анализ. Използването на специфичен оцветител за ДНК (напр. акридиново оранжево (35) или Хьохст 33258 плюс пиронин-Y (36)) може да елиминира някои от артефактите, свързани с използването на оцветител, който не е специфичен за ДНК. Това предимство не изключва използването на конвенционални багрила (напр. Giemsa за микроскопски анализ). Могат също да се използват допълнителни системи (напр. целулозни колони за отстраняване на клетки с ядра (37), при условие че е доказано, че тези системи са съвместими с лабораторното приготвяне на пробата.
                     Когато тези методи са приложими, могат да се използват анти-кинетохорни антитела (39), FISH с панцентромерни ДНК сонди (40) или in situ белязване с панцентромерно-специфични праймери, заедно с подходящо контрастно оцветяване на ДНК (41), за определяне на естеството на микроядрата (хромозома/хромозомен фрагмент) с цел определяне дали механизмът за индуциране на микроядра се дължи на кластогенна и/или анеугенна активност. Могат да бъдат използвани и други методи за разграничаване на кластогените от анеугените, ако те са се доказали като ефективни.
                     
                        Анализ (ръчен и автоматизиран)
                     
                     Всички предметни стъкла или проби за анализ, включително тези на положителните и отрицателните контроли, следва да се кодират независимо едно от друго преди всякакъв вид анализ и следва да се разбъркат на случаен принцип, така че преброяващият ръчно да не е запознат с условията на третирането; такова кодиране не е необходимо при използването на автоматизирани системи за преброяване, които не разчитат на визуална проверка и не могат да бъдат засегнати от пристрастността на оператора. Пропорцията на незрелите от общо (незрели + зрели) еритроцити се определя за всяко животно, като се отброяват общо най-малко 500 еритроцита за костен мозък и 2 000 еритроцита за периферна кръв (42). Най-малко 4 000 незрели еритроцита на животно следва да се преброят за срещане на незрели еритроцити с микроядра (43). Ако базата данни за отрицателните контроли за предходни периоди показва, че средната фонова честота на незрели еритроцити с микроядра е < 0,1 % в лабораторията, провеждаща изпитването, трябва да се обърне внимание на преброяването на допълнителни клетки. При анализа на проби делът на незрелите еритроцити в общия брой еритроцити в третираните животни не трябва да бъде по-малък от 20 % от дела на контролата на носител/разтворител при преброяване с микроскопия и не по-малък от приблизително 5 % от дела на контролата на носител/разтворител при преброяване на CD71+ незрели еритроцити чрез цитометрични методи (вж. точка 31) (29). Например за изследване на костен мозък с преброяване чрез микроскопия, ако делът на контролата от незрели еритроцити в костния мозък е 50 %, горната граница на токсичността ще бъде 10 % незрели еритроцити.
                     Поради това, че далакът на плъховете задържа и унищожава еритроцити с микроядра, при анализа на периферна кръв от плъх, с цел поддържане на висока чувствителност на изследването, за предпочитане е анализът на незрелите еритроцити с микроядра да се ограничи до най-младата фракция. При използване на автоматизирани методи за анализ тези най-незрели еритроцити могат да бъдат идентифицирани въз основа на високото си съдържание на РНК или на високото равнище на трансферинови рецептори (CD71+), експресирани на повърхността им (31). Независимо от това, прякото сравнение на различни методи за оцветяване е показало, че задоволителни резултати могат да се получат с различни методи, включително с конвенционално оцветяване с акридиново оранжево (3) (4).
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Обработка на резултатите
                     
                     Индивидуалните данни за животните следва да се представят в таблица. За всяко изследвано животно следва да се дават поотделно броят на преброените незрели еритроцити, броят на незрелите еритроцити с микроядра и делът на незрелите еритроцити в общия брой на еритроцитите. При третиране на мишки непрекъснато в продължение на 4 или повече седмици също следва да се предоставят данните за броя и дела на зрелите еритроцити с микроядра, ако са събрани. Данните за токсичност за животните и за клиничните признаци следва също да бъдат протоколирани.
                     
                        Критерии за приемливост
                     
                     Следните критерии определят приемливостта на изпитването:
                     
                                 а.
                              
                              
                                 Данните за паралелната отрицателна контрола се считат за приемливи за допълване към базата данни на дадената лаборатория за контролите за предходни периоди (вж. точки 15—18).
                              
                           
                                 б.
                              
                              
                                 Паралелните положителни контроли или контролите на преброяването трябва да предизвикват отклици, които са съвместими с генерираните в базата данни за положителните контроли за предходни периоди и да генерират статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола (вж. точки 24—25).
                              
                           
                                 в.
                              
                              
                                 Анализиран е подходящ брой дози и клетки.
                              
                           
                                 г.
                              
                              
                                 Критериите за избор на най-високата доза са съвместими с описаните в точки 30—33.
                              
                           
                        Оценяване и тълкуване на резултатите
                     
                     При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно положителен:
                     
                                 а.
                              
                              
                                 в най-малко една от третираните групи се наблюдава статистически значимо увеличение на честотата на незрелите еритроцити с микроядра в сравнение с паралелната отрицателна контрола,
                              
                           
                                 б.
                              
                              
                                 това увеличение е свързано с дозата поне за едно време на пробовземане при оценка, извършена с подходящ трендов тест, и
                              
                           
                                 в.
                              
                              
                                 някой от тези резултати е извън разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %).
                              
                           Ако в даден момент на пробовземане е разгледана само най-високата доза, изпитваният химикал се счита за ясно положителен, ако се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола и резултатите са извън разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %). Препоръки за най-подходящите статистически методи могат да се намерят в литературните източници (44) (45) (46) (47). При провеждане на анализ доза-отклик трябва да бъдат анализирани най-малко три третирани с определена доза групи. При статистическите тестове за опитна единица следва да се използва отделното животно. Положителните резултати в изпитването за микроядра показва, че изпитваният химикал индуцира микроядра, които са резултат от хромозомно увреждане или увреждане на митотичния апарат в еритробластите на изпитвания животински вид. В случая, когато дадено изпитване е извършено с цел откриване на центромери в рамките на микроядра, даден изпитван химикал, който води до получаване на съдържащи центромера микроядра (центромерна ДНК или кинетохора, показващи загуба на цяла хромозома) е доказателство за това, че изпитваният химикал е анеуген.
                     При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно отрицателен, ако във всички изследвани опитни условия:
                     
                                 а.
                              
                              
                                 в никоя от третираните групи не се наблюдава статистически значимо увеличение на честотата на незрелите еритроцити с микроядра в сравнение с паралелната отрицателна контрола,
                              
                           
                                 б.
                              
                              
                                 в никое от времената на пробовземане няма свързано с дозата увеличение при оценка, извършена с подходящ трендов тест,
                              
                           
                                 в.
                              
                              
                                 всички резултати са в рамките на разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %), и
                              
                           
                                 г.
                              
                              
                                 е наблюдавана експозиция на костен мозък на изпитвания химикал (или химикали).
                              
                           Препоръки за най-подходящите статистически методи могат да се намерят в литературните източници (44) (45) (46) (47). Доказателствата за експозиция на костния мозък на изпитван химикал могат да включват намаляване на отношението на незрелите към зрелите еритроцити или измервания на нивата на изпитвания химикал в плазмата или в кръвта. При интравенозно приложение доказателства за експозиция не са необходими. Като алтернатива, за да се докаже експозицията на костния мозък могат да се използват данни за абсорбция — разпределение — метаболизъм — екскреция (АРМЕ), получени при провеждането на независимо проучване, с използване на същия път за прилагане и същия животински вид. Отрицателните резултати показват, че при условията за провеждане на изпитването изпитваният химикал не води до създаване на микроядра в незрелите еритроцити на изпитвания вид.
                     Няма изискване за потвърждаване на ясно положителен или ясно отрицателен отклик.
                     В случаите, когато отговорът не е ясно отрицателен или положителен и за да се подпомогне установяването на биологичната относимост на даден резултат (например при увеличение, което е слабо или с гранична стойност), данните следва да се оценят чрез експертна оценка и/или допълнителни изследвания от съществуващите приключени опити. В някои случаи би могло да се окаже полезно анализирането на повече клетки или извършването на опит с повторение, като се използват модифицирани опитни условия.
                     В редки случаи дори след допълнителни изследвания данните не позволяват стигането до заключение, че изпитваният химикал предизвиква положителни или отрицателни резултати, и следователно за изследването се заключава, че е неясно.
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обобщение
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитван химикал:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             източник, номер на партидата, крайна дата за употреба, ако има такава;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             стабилност на изпитвания химикал, ако е известна.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Вещество с една съставка:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             химична идентификация, като наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, SMILES или InChI код, структурна формула, чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и др.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Вещество с повече съставки, UVCB и смеси:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             характеризирани, доколкото е възможно, от химическата идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Приготвяне на химикала за изпитване:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка за избора на носител;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             разтворимост и стабилност на изпитвания химикал в разтворител/носител, ако са известни;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             приготвяне на формулировките за хранителен режим, питейна вода или инхалация;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             аналитични определяния, свързани с формулировките (напр. устойчивост, хомогенност, номинални концентрации), когато са извършвани такива;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитвани животни:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             използван вид/порода и обосновка за избора;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             брой, възраст и пол на животните;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             източник за доставка на животните, условия на отглеждане, хранителен режим и т.н.;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             метод за еднозначно идентифициране на животните;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за краткосрочни изследвания: индивидуално тегло на животните в началото и в края на изпитването; за изследвания, по-дълги от една седмица: индивидуално телесно тегло по време на изследването и консумация на храна. следва да бъдат включени размахът, средната стойност и стандартното отклонение на телесното тегло за всяка група.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Условия на изпитването:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             данни за положителните и отрицателните (носител/разтворител) контроли;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни от изследването за установяване на обхвата, ако е проведено;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка за избора на нивото на доза;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробна информация за приготвянето на изпитвания химикал;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробна информация относно прилагането на изпитвания химикал;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка на пътя и продължителността на прилагането;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи за проверка дали изпитваният химикал (химикали) е достигнал до общото кръвообращение или до прицелната тъкан;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             действителна доза (mg/kg телесно тегло дневно), изчислена от концентрацията на изпитвания химикал в хранителния режим/питейната вода (ppm), и консумация, ако е приложимо;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробности относно качество на храната и водата;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             метод за умъртвяване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             метод за аналгезия (когато е използван);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробно описание на графиците на третиране и вземане на проби и обосновки за направения избор;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи на приготвяне на предметни стъкла;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             процедури за изолиране и съхраняване на проби;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи за измерване на токсичността;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             критерии за преброяване на незрели еритроцити с микроядра;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             брой анализирани клетки/животно при определяне на честотата на незрели еритроцити с микроядра и за определяне на отношението на незрелите към зрелите еритроцити;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             критерии за приемливост на изпитването;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи, като използване на анти-кинетохорни антитела или специфични за центромерата ДНК сонди за определяне дали микроядрата съдържат цели хромозоми или хромозомни фрагменти, ако е приложимо.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Резултати:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             състояние на животните преди и през целия период на изпитване, включително признаци на токсичност;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             дял на незрелите еритроцити в общия брой еритроцити;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             брой на незрелите еритроцити с микроядра, посочен отделно за всяко животно;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             средна стойност ± стандартно отклонение на незрелите еритроцити с микроядра на група;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             взаимоотношение доза-отклик, където е възможно;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             статистически анализи и използвани методи;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни за паралелни отрицателни и положителни контроли с размах, средни стойности и стандартни отклонения;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни за отрицателни и положителни контроли за предходни периоди, с размах, средни стойности и стандартни отклонения, и 95 % граници за контрол за разпределението, както и обхванат времеви период и брой на точките с данни;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни, доказващи експозицията на костния мозък;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни за характеризиране, показващи дали микроядрата съдържат цели хромозоми или хромозомни фрагменти, ако е приложимо;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             критериите за положителен или отрицателен отклик, които са изпълнени.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обсъждане на резултатите.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Заключение.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Позовавания.
                                 
                              
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD(2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2007), in vivo erythrocyte micronucleus assay III. Validation and regulatory acceptance of automated scoring and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target cells and a single dose-level limit test, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, pp. 10-30.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: II. An efficient method of monitoring chromosomal damage in the rat, Toxicology Sciences, Vol. 94/1, pp. 92-107.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Dertinger, S.D. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: I. Intra- and interlaboratory comparison with microscopic scoring, Toxicological Sciences, Vol. 94/1, pp. 83-91.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Dertinger, S.D. et al. (2011), Flow cytometric scoring of micronucleated erythrocytes: an efficient platform for assessing in vivo cytogenetic damage, Mutagenesis, Vol. 26/1, pp. 139-145.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Parton, J.W., W.P. Hoffman, M.L. Garriott (1996), Validation of an automated image analysis micronucleus scoring system, Mutation Research, Vol. 370/1, pp. 65-73.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Asano, N. et al. (1998), An automated new technique for scoring the rodent micronucleus assay: computerized image analysis of acridine orange supravitally stained peripheral blood cells, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 404/1-2, pp. 149-154.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Styles, J.A. et al. (2001), Automation of mouse micronucleus genotoxicity assay by laser scanning cytometry, Cytometry, Vol. 44/2, pp. 153-155.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Heddle, J.A. (1973), A rapid in vivo test for chromosomal damage, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 187-190.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Schmid, W. (1975), The micronucleus test, Mutation Research, Vol. 31/1, pp. 9-15.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Heddle, J.A. et al. (1983), The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 123/1, pp. 61-118.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Mavournin, K.H. et al. (1990), The in vivo micronucleus assay in mammalian bone marrow and peripheral blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 239/1, pp. 29-80.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1983), Micronuclei in circulating erythrocytes: a rapid screen for chromosomal damage during routine toxicity testing in mice, Developments in Toxicology Environmental Science, Vol. 11, pp. 555-558.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1987), Guidelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erythrocytes, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 189/2, pp. 103-112.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1990), The in vivo erythrocyte micronucleus test: measurement at steady state increases assay efficiency and permits integration with toxicity studies, Fundamental and Applied Toxicology, Vol. 14/3, pp. 513-522.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1990), The micronucleus assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 245/4, pp. 245-249.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 CSGMT/JEMS.MMS — The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus test with mouse peripheral blood erythrocytes by acridine orange supravital staining: the summary report of the 5th collaborative study, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 278/2-3, pp. 83-98.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 CSGMT/JEMS.MMS — The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan (1995), Protocol recommended by the CSGMT/JEMS.MMS for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT) (CSGMT/JEMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), Mutagenesis, Vol. 10/3, pp. 153-159.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Salamone, M.F., K.H. Mavournin (1994), Bone marrow micronucleus assay: a review of the mouse stocks used and their published mean spontaneous micronucleus frequencies, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 23/4, pp. 239-273.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Krishna, G., G. Urda, J. Paulissen (2000), Historical vehicle and positive control micronucleus data in mice and rats, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 453/1, pp. 45-50.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Hayes, J. et al. (2009), The rat bone marrow micronucleus test--study design and statistical power, Mutagenesis, Vol. 24/5, pp. 419-424.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Wakata, A. et al. (1998), Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood: summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS. MMS. Collaborative Study Group for the Micronucleus Test. Environmental Mutagen Society of Japan. Mammalian Mutagenicity Study Group, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 32/1, pp. 84-100.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 108-120.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2000), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 LeBaron, M.J. et al. (2013), Influence of counting methodology on erythrocyte ratios in the mouse micronucleus test, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/3, pp. 222-228.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Higashikuni, N., S. Sutou (1995), An optimal, generalized sampling time of 30 +/- 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, Vol. 10/4, pp. 313-319.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2000), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. II. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated scoring, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 234-252.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Asanami, S., K. Shimono (1997), High body temperature induces micronuclei in mouse bone marrow, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 390/1-2, pp. 79-83.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Asanami, S., K. Shimono, S. Kaneda (1998), Transient hypothermia induces micronuclei in mice, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 413/1, pp. 7-14.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Spencer, P.J. et al. (2007), Induction of micronuclei by phenol in the mouse bone marrow: I. Association with chemically induced hypothermia, Toxicological Sciences, Vol. 97/1, pp. 120-127.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983), An application of Acridine Orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Research Letters, Vol. 120/4, pp. 241-247.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983), A simple fluorescent staining procedure for micronuclei and RNA in erythrocytes using Hoechst 33258 and pyronin Y, Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269-275.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Romagna, F., C.D. Staniforth (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 213/1, pp. 91-104.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Sun, J.T., M.J. Armstrong, S.M. Galloway (1999), Rapid method for improving slide quality in the bone marrow micronucleus assay; an adapted cellulose column procedure, Mutation Research, Vol. 439/1, pp. 121-126.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Miller, B.M., I.D. Adler (1990), Application of antikinetochore antibody staining (CREST staining) to micronuclei in erythrocytes induced in vivo, Mutagenesis, Vol. 5/4, pp. 411-415.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Miller, B.M. et al. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297-302.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Russo, A. (2002), PRINS tandem labeling of satellite DNA in the study of chromosome damage, American Journal of Medical Genetics, Vol. 107/2, pp. 99-104.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Gollapudi, B.B., L.G. McFadden (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Research, Vol. 347/2, pp. 97-99.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 OECD (2014), „Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Richold, M. et al. (1990), „In Vivo Cytogenetics Assays“, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Lovell, D.P. et al. (1989), „Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), Statistical analysis of data in mutagenicity assays: rodent micronucleus assay, Environmental Health Perspectives, Vol. 102/Suppl 1, pp. 49-52.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Kim, B.S., M. Cho, H.J. Kim (2000), Statistical analysis of in vivo rodent micronucleus assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 469/2, pp. 233-241.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                           
                              Центромера
                           : област (области) от хромозомата, с която нишки от делителното вретено се свързват по време на клетъчното делене, като така позволяват методично придвижване на дъщерните хромозоми към полюсите на дъщерните клетки.
                        
                           
                              Химикал
                           : вещество или смес.
                        
                           
                              Еритробласт
                           : ранен етап от развитието на еритроцита, непосредствено предхождащ незрелия еритроцит, в който клетката все още съдържа ядро.
                        
                           
                              Кинетохора
                           : белтъчна структура, която се образува върху центромерата в еукариотни клетки, свързва хромозомата към полимерите на микротръбички от митотичното вретено по време на митозата и мейозата и функционира по време на клетъчното делене за разделяне на сестринските хроматиди една от друга.
                        
                           
                              Микроядра
                           : малки ядра, отделни от главното клетъчно ядро и в допълнение към него, образувани по време на телофазата от митозата (мейозата) от изоставащи хромозомни фрагменти или цели хромозоми.
                        
                           
                              Нормохроматичен или зрял еритроцит
                           : напълно зрял еритроцит, който е загубил остатъчната РНК, която остава след загубата на ядрото и/или е загубил други краткоживеещи клетъчни маркери, които типично изчезват след загубата на ядрото след последното делене на еритробласта.
                        
                           
                              Полихроматичен или незрял еритроцит
                           : Новообразуван еритроцит в междинен етап на развитие, който се оцветява както със сините, така и с червените компоненти на класическо оцветяване на кръв, като това по Wright-Giemsa, поради наличие на остатъчна РНК в новообразуваната клетка. Такива новообразувани клетки са приблизително същите като ретикулоцитите, които се визуализират чрез витално оцветяване, което води до групиране на остатъчната РНК в ретикулум. Понастоящем за идентифициране на новообразувани червени кръвни клетки често се използват други методи, включително монохроматично оцветяване на РНК с флуоресцентни оцветители или белязване на краткоживеещи повърхностни маркери, като например CD71, с флуоресцентни антитела. Полихроматичните еритроцити, ретикулоцитите и CD71-положителните еритроцити са незрели еритроцити, но всеки от тях в известна степен има по-различно възрастово разпределение.
                        
                           
                              Ретикулоцит
                           : Новообразуван еритроцит, оцветен с витално оцветяване, което води до групиране на остатъчната клетъчна РНК в специфичен ретикулум. Ретикулоцитите и полихроматичните еритроцити имат сходно разпределение на клетъчната възраст.
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                     
                     
                        Допълнение 2
                        
                           ФАКТОРНИЯТ ДИЗАЙН ЗА ИДЕНТИФИЦИРАНЕ НА РАЗЛИКИ МЕЖДУ ПОЛОВЕТЕ ПРИ ИЗСЛЕДВАНЕ IN VIVO ЗА МИКРОЯДРА
                        
                        
                           Факторният дизайн и неговият анализ
                        
                        При този дизайн се изпитват минимум 5 мъжки и 5 женски животни на всяко равнище на концентрация, в резултат от което в дизайна се използват най-малко 40 животни (20 мъжки и 20 женски животни, плюс относимите положителни контроли).
                        Дизайнът, който е един от по-простите видове факторен дизайн, е равностоен на двуфакторния дисперсионен анализ, с пола и равнището на концентрация като главни ефекти. Данните могат да бъдат анализирани с помощта на множество стандартни статистически софтуерни пакети като например SPSS, SAS, STATA, Genstat, както и с използване на R.
                        Анализът разпределя варирането в набора от данни като вариране между половете, вариране между концентрациите и вариране, свързано с взаимодействието между половете и концентрациите. Всеки от компонентите се тества спрямо оценка на варирането между животните за повторения в рамките на групите животни от един и същ пол, които са на една и съща концентрация. Пълни подробности за използваната методика са на разположение в множество стандартни статистически учебници (вж. позоваванията) и в помощните текстове, предоставени със статистическите пакети.
                        Анализът продължава с проверка на компонента за взаимодействие пол х концентрация в ANOVA таблицата (6). При липсата на значим компонент за взаимодействие комбинираните стойности за половете или за равнищата на концентрация предоставят валидни статистически тестове между равнищата, въз основа на компонента за обединеното вътрешногрупово вариране на ANOVA.
                        Анализът продължава като се раздели оценката на варирането между концентрациите на контрасти, които дават възможност за тест за линейни и квадратични контрасти на отклиците за равнищата на концентрация. Когато е налице значимо взаимодействие пол х концентрация, този компонент също може да се подраздели на контрасти за линейно x пол и квадратично x пол взаимодействие. Тези компоненти предоставят възможност за тестове дали концентрационните отклици са успоредни за двата пола, или има диференциален отклик между двата пола.
                        Оценката на обединеното вътрешногрупово вариране може да се използва за предоставяне на възможност за тестове за сравнения по двойки на разликата между средните стойности. Тези сравнения могат да се правят между средните стойности за двата пола и между средните стойности за различните равнища на концентрация, като за сравнения с равнищата за отрицателните контроли. В случаите, когато е налице значимо взаимодействие, могат да се направят сравнения между средните стойности за различни концентрации в рамките на даден пол, или между средните стойности за половете при една и съща концентрация.
                        
                           Позовавания
                        
                        Съществуват много статистически учебници, в които се разглеждат теорията, планирането, методологията, анализа и тълкуването на факторните дизайни, вариращи от най-простите двуфакторни анализи до по-сложните форми, използвани в методологията „Планиране на опити“. По-долу е представен неизчерпателен списък. Някои книги предоставят практически примери за сравними модели, в някои случаи с код за провеждането на анализите с използване на различни софтуерни пакети.
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              “
               
                     6)
                  
                  
                     В част Б глава Б.15 се заличава.
                  
               
                     7)
                  
                  
                     В част Б глава Б.16 се заличава.
                  
               
                     8)
                  
                  
                     В част Б глава Б.18 се заличава.
                  
               
                     9)
                  
                  
                     В част Б глава Б.19 се заличава.
                  
               
                     10)
                  
                  
                     В част Б глава Б.20 се заличава.
                  
               
                     11)
                  
                  
                     В част Б глава Б.24 се заличава.
                  
               
                     12)
                  
                  
                     В Част Б глава Б.47 се заменя със следното:
                     „Б.47   Метод за изпитване на непрозрачност и пропускливост на говеждата роговица за идентифициране на i) химикали, предизвикващи сериозно увреждане на очите, и ii) химикали, които не изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 437 (2013). Методът за изпитване на непрозрачност и пропускливост на говеждата роговица (НПГР) е оценен през 2006 и 2010 г. от Междуведомствения координационен комитет за валидиране на алтернативни методи (ICCVAM), съвместно с Европейския център за валидиране на алтернативни методи (ECVAM) и Японския център за валидиране на алтернативни методи (JaCVAM) (1)(2). В първата оценка методът за изпитване НПГР е оценен по отношение на полезността му за идентифициране на химикали (вещества и смеси), предизвикващи сериозно увреждане на очите (1). Във втората оценка методът за изпитване НПГР е оценен по отношение на полезността му за идентифициране на химикали (вещества и смеси), които не са класифицирани за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите (2). Базата данни за валидиране на метода за изпитване НПГР съдържа общо 113 вещества и 100 смеси (2) (3). От тези оценки и тяхната партньорска оценка се стигна до заключението, че чрез метода за изпитване могат да правилно се идентифицират химикали (както вещества, така и смеси), предизвикващи сериозно увреждане на очите (категория 1), както и такива, които не изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите, както са определени в Глобалната хармонизирана система на Организацията на обединените нации (ООН) за класифициране и етикетиране на химикали (GHS) (4) и в Регламент (ЕО) № 1272/2008 относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси (CLP) (7) и поради това той беше одобрен като научно валиден и за двете цели. Сериозно увреждане на очите означава тъканно увреждане в очите или сериозно физическо увреждане на зрението в резултат на прилагането на изпитван химикал върху предната повърхност на очите, което не е напълно обратимо в рамките на 21 дни след прилагането му. Изпитваните химикали, предизвикващи сериозно увреждане на очите, се класифицират в категория 1 на GHS на ООН. Химикалите, които не са класифицирани за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите, са определени като такива, които не отговарят на изискванията за класифициране като категория 1 или 2 (2A или 2B) по GHS на ООН, т.е. те се наричат „без категория“ по GHS на ООН. Настоящият метод за изпитване обхваща препоръчителното използване и ограниченията на метода за изпитване НПГР въз основа на оценките на този метод. Основните разлики между първоначалния вариант за 2009 г. и актуализираната версия от 2013 г. на насоките за изпитване на ОИСР се отнасят, но не се ограничават до: използването на метода за изпитване НПГР за идентифициране на химикали, за които не се изисква класифициране съгласно GHS на ООН (точки 2 и 7); разяснения относно приложимостта на метода за изпитване НПГР за изпитването на алкохоли, кетони и твърди вещества (точки 6 и 7) и на вещества и смеси (точка 8); разяснения относно начина, по който следва да бъдат изпитвани повърхностноактивните вещества и смесите, съдържащи повърхностноактивни вещества (точка 28); актуализации и разяснения по отношение на положителни контроли (точки 39 и 40); актуализация на критериите за вземане на решение на метода за изпитване НПГР (точка 47); актуализация на критериите за приемане на изследването (точка 48); актуализация на елементите на протокола от изпитването (точка 49); актуализация на допълнение 1 по отношение на определения; добавянето на допълнение 2 за капацитета за прогнозиране на метода за изпитване НПГР при различните системи за класифициране; актуализиране на допълнение 3 относно списъка на химикали за изпитването за пригодност; и актуализация на допълнение 4 по отношение на държателя за роговица за НПГР (точка 1) и измервателното устройство за непрозрачност (точки 2 и 3).
                     Понастоящем е общоприето, че в обозримо бъдеще, нито едно изпитване in vitro за дразнене на очите няма да е в състояние да замести изпитването in vivo на Draize за действие върху очите при прогнозирането в целия спектър на дразнене, за различните класове химикали. При все това стратегическите комбинации от няколко алтернативни методи на изпитване в рамките на стратегия за поетапно изпитване може да са в състояние да заменят изпитването на Draize за действие върху очите (5). Подходът „отгоре надолу“ (5) е създаден да се използва, когато въз основа на съществуваща информация за даден химикал се очаква висок потенциал за дразнещо действие, а подходът „отдолу-нагоре“ (5) е създаден да се използва, когато въз основа на съществуващата информация за даден химикал се очаква, че няма да причини дразнене на очите, което да е достатъчно за да се изисква класифициране. Методът за изпитване НПГР е метод за изпитване in vitro, който може да се използва при определени обстоятелства и, със специфични ограничения, за класифициране и етикетиране на химикали за опасност за очите. Въпреки че не се смята за валиден като самостоятелен заместител на изпитването in vivo върху очи на зайци, методът за изпитване НПГР се препоръчва като първоначална стъпка в рамките на стратегия за изпитване, като например подхода „отгоре надолу“, предложен от Scott et al. (5) за идентифициране на химикали, предизвикващи сериозно увреждане на очите, т.е. химикали, които следва да бъдат класифицирани като категория 1 по GHS на ООН без по-нататъшно изпитване (4). Методът за изпитване НПГР се препоръчва и за идентифициране на химикали, които не изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите, както е определено от GHS на ООН („без категория“ по GHS на ООН) (4) в рамките на стратегия за изпитване, като например подходът „отдолу нагоре“ (5). Независимо това, даден химикал, за който не се прогнозира, че причинява сериозно увреждане на очите или не е класифициран за дразнене на очите/сериозно увреждане на очите с метода за изпитване НПГР, изисква допълнително изпитване (in vitro и/или in vivo) за определяне на окончателно класифициране.
                     Целта на настоящия метод за изпитване е да се опишат процедурите, използвани за оценка на потенциалната опасност за очите на изпитвания химикал, измерена чрез способността му да предизвиква непрозрачност и повишена пропускливост върху изолирана говежда роговица. Токсичният ефект върху роговицата се измерва чрез: i) намалено преминаване на светлина (непрозрачност), и ii) повишено пропускане на оцветител натриев флуоресцеин (пропускливост). Оценките за непрозрачността и пропускливостта на роговицата след експозиция на изпитвания химикал се комбинират, за да се получи in vitro балова оценка за дразнещото действие (ИВБОДД), която се използва за класифициране на степента на дразнещо действие на изпитвания химикал.
                     Определенията са дадени в допълнение 1.
                     ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ
                     Този метод за изпитване се базира на протокола за метода за изпитване НПГР на ICCVAM (6) (7), който първоначално е разработен от информация, получена от протокола на Института за in vitro науки (IIVS) и от протокол 124 на INVITTOX (8). Последният протокол представлява протоколът, използван за предхождащо валидирането изследване, финансирано от Европейската общност и проведено през периода 1997-1998 г. Тези два протокола се базират на метода за изпитване НПГР, за първи път протоколиран от Gautheron et al. (9).
                     Методът за изпитване НПГР може да се използва за определяне на химикали, предизвикващи сериозно увреждане на очите, както е определено в GHS на ООН, т.е. химикали, които следва да бъдат класифицирани като категория 1 по GHS на ООН (4). Когато методът за изпитване НПГР се използва за тази цел, той е с обща точност от 79 % (150/191), процент неверни положителни резултати 25 % (32/126), и процент неверни отрицателни резултати 14 % (9/65), в сравнение с данните отметода за изпитване in vivo върху очи на зайци, класифицирани според системата за класифициране GHS на ООН (3) (вж. допълнение 2, таблица 1). Когато изпитвани химикали от определени химични (напр. алкохоли, кетони) или физични (напр. твърди вещества) класове бъдат изключени от базата данни, методът за изпитване НПГР е с обща точност от 85 % (111/131), процент неверни положителни резултати 20 % (16/81) и процент неверни отрицателни резултати 8 % (4/50) за системата за класифициране GHS на ООН (3). Потенциалните недостатъци на метода за изпитване НПГР, когато се използва за определяне на химикали, предизвикващи сериозно увреждане на очите (категория 1 по GHS на ООН), се основават на високите проценти неверни положителни резултати за алкохоли и кетони и високия процент неверни отрицателни резултати за твърди вещества, отчетени в базата данни за валидиране (1) (2) (3). Независимо от това това, тъй като не всички прогнозни стойности за алкохоли и кетони са надценени от метода за изпитване НПГР и някои са правилно прогнозирани като категория 1 по GHS на ООН, за тези две органични функционални групи не се счита, че са извън областта на приложимост на метода за изпитване. От използващия настоящия метод за изпитване зависи решението дали евентуална надценена прогнозна стойност за алкохол или кетон може да бъде приета или следва да бъде извършено допълнително изпитване с подход, основан на тежестта на доказателствата. По отношение на процентите на неверните отрицателни резултати за твърди вещества следва да се отбележи, че твърдите вещества могат да доведат до променливи и екстремни условия на експозиция в in vivo изпитването на Draize за дразнещо действие върху очите, което може да доведе до неотносими прогнози на техния действителен дразнещ потенциал (10). Следва също така да се отбележи, че нито един от неверните отрицателни резултати, определени в базата данни за валидирането на ICCVAM (2) (3) в контекста на идентифицирането на химикали, предизвикващи сериозно увреждане на очите (категория 1 по GHS на ООН), не е довел до ИВБОДД ≤ 3, какъвто е критерият, използван за идентифициране на даден изпитван химикал като „без категория“ по GHS на ООН. Освен това в този контекст неверните отрицателни резултати по НПГР не са от критично значение, тъй като всички изпитвани химикали, които са с 3 < ИВБОДД ≤ 55, след това ще бъдат изпитвани с други достатъчно валидирани in vitro изпитвания или, като последна възможност, върху зайци, в зависимост от регулаторните изисквания, като се прилага стратегия за последователно изпитване с подход, основан на тежестта на доказателствата. Като се има предвид факта, че стойностите за някои твърди химикали са прогнозирани коректно по метода за изпитване НПГР като категория 1 по GHS на ООН, за това агрегатно състояние също не се смята, че е извън областта на приложимост на метода за изпитване. Изследователите биха могли да разгледат възможността за използване на този метод за изпитване за всякакви типове химикали, при които ИВБОДД > 55 следва да се приеме за показател за отклик с предизвикване на сериозно увреждане на очите, който следва да се класифицира като категория 1 по GHS на ООН без по-нататъшно изпитване. Независимо от това, както вече беше упоменато, положителните резултати, получени от алкохоли или кетони, следва да се тълкуват предпазливо, поради евентуално надценяване на прогнозните стойности.
                     Методът за изпитване НПГР може също така да се използва за определяне на химикали, които не изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите по системата за класифициране GHS на ООН (4). Когато методът за изпитване НПГР се използва за тази цел, той е с обща точност от 69 % (135/196), процент неверни положителни резултати 69 % (61/89), и процент неверни отрицателни резултати 0 % (0/107), в сравнение с данните от in vivo метода за изпитване върху очи на зайци, класифицирани според системата за класифициране GHS на ООН (3) (вж. допълнение 2, таблица 2). Полученият процент неверни положителни резултати (химикали „без категория“ по GHS на ООН, предизвикващи in vivo ИВБОДД > 3, вж. точка 47) е значително по-висок, но не е от критично значение в този контекст, тъй като всички изпитвани химикали, които са с 3 < ИВБОДД ≤ 55, след това ще бъдат изпитвани с други достатъчно валидирани in vitro изпитвания или, като последна възможност, върху зайци, в зависимост от регулаторните изисквания, като се прилага стратегия за последователно изпитване с подход, основан на тежестта на доказателствата. Методът за изпитване НПГР не проявява специфични недостатъци при изпитването на алкохоли, кетони и твърди вещества, когато целта е идентифициране на химикали, които не изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите („без категория“ по GHS на ООН) (3). Изследователите биха могли да разгледат възможността за използване на този метод за всякакви типове химикали, при които отрицателният резултат (ИВБОДД ≤ 3) следва да се приеме като показващ, че не се изисква класифициране („без категория“ по GHS на ООН). Тъй като методът за изпитване НПГР може да идентифицира правилно само 31 % от химикалите, за които не се изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите, настоящият метод за изпитване не следва да бъде първият избор за започване на подход „отдолу нагоре“ (5), ако са на разположение други валидирани и приети in vitro методи с подобна висока чувствителност, но с по-висока специфичност.
                     Базата данни за валидиране на метода за изпитване НПГР съдържа общо 113 вещества и 100 смеси (2) (3). Поради това методът за изпитване НПГР се смята за приложим за изпитването както на вещества, така и на смеси.
                     Методът за изпитване НПГР не се препоръчва за идентифицирането на изпитваните химикали, които следва да бъдат класифицирани като дразнещи за очите (категория 2 или категория 2A по GHS на ООН) или на изпитваните химикали, които следва да бъдат класифицирани като леко дразнещи за очите (категория 2B по GHS на ООН) поради значителния брой химикали от категория 1 по GHS на ООН, класифицирани на по-ниско ниво като химикали от категория 2, 2A или 2B по GHS на ООН, или химикали „без категория“ по GHS на ООН, класифицирани на по-високо ниво като химикали от категория 2, 2A или 2B по GHS на ООН (2) (3). За тази цел може да се изисква допълнително изпитване с друг подходящ метод.
                     Всички процедури с говежди очи и говежда роговица следва да съответстват на приложимите за изпитващата лаборатория разпоредби и процедури за работа с материали с животински произход, които включват тъкани и тъканни течности, но не се ограничават само до тях. Препоръчва се спазването на универсалните лабораторни предпазни мерки (11).
                     Въпреки че методът за изпитване НПГР не разглежда уврежданията на конюнктивата и ириса, той се отнася до действията върху роговицата, които са основната движеща сила за класифициране in vivo при разглеждането на Глобалната хармонизирана система на ООН за класифициране. Обратимостта на уврежданията на роговицата не може да се оцени сама по себе си чрез метода за изпитване НПГР. Въз основа на изследванията върху заешки очи бе предложено оценката за първоначалната дълбочина на увреждането на роговицата да се използва за определяне на някои типове необратими ефекти (12). Необходими са обаче нови научни познания, за да се разбере как настъпват необратимите ефекти, които не са свързани с първоначално високо равнище на увреждане. В заключение, методът за изпитване НПГР не позволява да се направи оценка на потенциала за обща токсичност, свързан с експозицията на очите.
                     Настоящият метод за изпитване ще бъде актуализиран периодично при вземане под внимание на нова информация и данни. Например, хистопатологията може потенциално да е от полза при необходимост от по-пълна характеристика на увреждането на роговицата. Както е очертано в Ръководство на ОИСР № 160 (13), потребителите се насърчават да съхранят роговицата и да приготвят хистопатологични образци, които могат да се използват за разработването на база данни и критерии за вземане на решение, които могат допълнително да подобрят точността на настоящия метод за изпитване.
                     Всяка лаборатория, която за първи път започва да прилага настоящия метод за изпитване, следва да използва химикалите за изпитване за пригодност, посочени в Допълнение 3. Лабораториите могат да използват тези химикали за доказване на своята техническа компетентност за прилагане на метода за изпитване НПГР преди предаване на данните от метода за изпитване НПГР за целите на регулаторното класифициране според степента на опасност.
                     ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     Методът за изпитване НПГР е органотипен модел, който осигурява краткотрайно поддържане на нормалната физиологична и биохимична функция на говеждата роговица in vitro. При този метод за изпитване увреждането, причинено от изпитвания химикал, се оценява посредством количествени измервания на измененията в непрозрачността и пропускливостта на роговицата, извършвани съответно с измервателно устройство за непрозрачност и спектрофотометър във видимата област. Двете измервания се използват за изчисляване на in vitro балова оценка за дразнещото действие (ИВБОДД), която се използва за in vitro категоризиране според класификацията по степен на опасност от дразнещо действие за прогнозиране на потенциала in vivo за дразнещо действие върху очите на изпитвания химикал (вж. критериите за решение в точка 48).
                     За метода за изпитване НПГР се използва изолирана роговица от очите на прясно заклан едър рогат добитък. Непрозрачността на роговицата се измерва количествено чрез количеството светлина, преминало през роговицата. Пропускливостта се измерва количествено като количеството оцветител натриев флуоресцеин, което преминава през цялата дебелина на роговицата, отчетено в средата в задното отделение. Изпитваните химикали се прилагат върху епителната повърхност на роговицата чрез добавяне в предното отделение на държателя за роговицата. В Допълнение 4 са дадени описание и схема на държател за роговицата, използван за метода за изпитване НПГР. Държатели за роговица могат да се набавят от различни източници на пазара или да се изработят.
                     
                        Източник и възраст на говеждите очи и избор на животински вид
                     
                     Едрият рогат добитък, който се изпраща за клане, обикновено се използва за консумация от човека или за други търговски цели. Като източник на роговица за целите на метода за изпитване НПГР се използват само здрави животни, смятани за подходящи за включване в хранителната верига на човека. Тъй като едрият рогат добитък може да бъде с различно тегло според породата, възрастта и пола, няма изискване за препоръчително тегло на животните при клане.
                     Когато се използват очи от различни по възраст животни, могат да се получат разлики в размерите на роговицата. Роговицата на едър рогат добитък на възраст над осем години обикновено е с хоризонтален диаметър > 30,5 mm и дебелина в средата на роговицата (CCT) ≥ 1 100 μm, докато роговица с хоризонтален диаметър < 28,5 mm и CCT < 900 μm обикновено се получава от едър рогат добитък на възраст под пет години (14). Поради това обикновено не се използват очи от едър рогат добитък на възраст над 60 месеца. Обичайно е да не се използват очи от едър рогат добитък на възраст под 12 месеца, тъй като тогава те все още са в развитие и дебелината и диаметърът на роговицата са значително по-малки от протоколираните за очи от възрастен добитък. Все пак се допуска да се използва роговица от млади животни (т.е. на възраст от 6 до 12 месеца), тъй като това дава някои предимства, като по-лесно набавяне, по-малък възрастов диапазон и намалена опасност, свързана с потенциална експозиция на работещите на спонгиформна енцефалопатия по говедата (15). Тъй като ще бъде от полза оценката на ефекта от размерите или дебелината на роговицата върху реагирането спрямо химикали с корозивно и дразнещо действие да продължи, потребителите се насърчават да протоколират предполагаемата възраст и/или тегло на животните, от които се доставя използваната в изследването роговица.
                     
                        Събиране и транспортиране на очите до лабораторията
                     
                     Очите се събират от работещите в кланицата. За минимизиране на механичните и други типове увреждания на очите, очите следва да бъдат извадени възможно най-бързо след умъртвяването и охладени незабавно след изваждането и по време на транспортирането. За да се избегне излагането на очите на въздействието на химикали с потенциално дразнещо действие, работещите в кланицата не трябва да използват детергенти при миенето на главите на животните.
                     Очите следва да бъдат изцяло потопени в охладен балансиран солен разтвор на Ханкс (HBSS) в съд с подходящи размери и транспортирани до лабораторията по начин, по който се свежда до минимум развалянето и/или бактериалното замърсяване. Тъй като очите се вземат по време на кланичния процес, те може да са експонирани на кръв и други биологични материали, включително бактерии и други микроорганизми. Поради това е важно да се осигури свеждане до минимум на риска от замърсяване [напр. като съдът с очите се държи върху мокър лед по време на пробовземането и транспортирането, и чрез добавяне на антибиотици към HBSS, в който се съхраняват очите при транспортирането (напр. 100 IU/ml пеницилин и 100 mg/ml стрептомицин)].
                     Интервалът от време между пробовземането на очите и използването на роговицата за метода за изпитване НПГР следва да бъде сведен до минимум (обикновено пробовземането и използването става в рамките на един и същ ден) и следва да се докаже, че не компрометира резултатите от изследването. Тези резултати се базират на критериите за подбор за очите, както и на отклика на положителната и отрицателната контрола. Всички очи, използвани в изследването, следва да бъдат от една и съща група очи, пробовзета през даден ден.
                     
                        Критерии за подбор за очи, използвани в метода за изпитване НПГР
                     
                     След пристигане в лабораторията очите се оглеждат внимателно за дефекти, включително за увеличена непрозрачност, драскотини и неоваскуларизация. Използват се само роговици от очи без такива дефекти.
                     Качеството на всяка роговица се оценява също и на по-късните етапи в изследването. Роговици, чиято непрозрачност надвишава седем единици за непрозрачност или стойност, еквивалентна за използваните измервателно устройство за непрозрачност и държатели за роговица, след първоначален период от един час за достигане на равновесие, следва да бъдат изхвърлени (БЕЛЕЖКА: измервателното устройство за непрозрачност следва да бъде калибрирано с еталони за непрозрачност, използвани за установяването на единиците за непрозрачност, вж. допълнение 4).
                     Всяка третирана група (изпитван химикал, паралелни отрицателна и положителна контроли) се състои от минимум три очи. За отрицателната контролa в метода за изпитване НПГР следва да се използват три роговици. Тъй като всички роговици са изрязани от цялата очна ябълка и поставени в отделенията за роговица, съществува вероятност стойностите за непрозрачност и пропускливост за отделните роговици (включително отрицателната контрола) да бъдат повлияни в резултат на човешката намеса при манипулациите. Освен това стойностите за непрозрачност и пропускливост от роговиците от отрицателната контрола се използват за коригиране на стойностите за непрозрачност и пропускливост на роговицата от третираната с химикала проба и от положителната контрола при изчисляването на ИВБОДД.
                     ПРОЦЕДУРА
                     
                        Приготвяне на очите
                     
                     Върху свободна от дефекти роговица се прави разрез, така че от склерата да остане пръстен от 2 до 3 мм за улесняване на последващите манипулации, като се внимава да се избягва увреждане на епитела и ендотела на роговицата. Изолираните роговици се поставят в специално изработени държатели за роговица, които се състоят от предно и задно отделение, които са съответно откъм епителната и ендотелната страна на роговицата. Двете отделения са пълни до преливане с предварително затоплена среда ЕМЕМ (Eagle's Minimum Essential Medium) без фенолово червено (първо задното отделение), като се внимава да няма мехури. След това устройството се уравновесява при 32 ± 1 °C в продължение на най-малко един час, за да може роговицата да достигне равновесие със средата и да се достигне до нормална метаболитна активност в степента, в която това е възможно (приблизителната температура на повърхността на роговицата in vivo е 32 °C).
                     След периода на достигане на равновесие, в двете отделения се добавя прясна предварително затоплена среда ЕМЕМ без фенолово червено и се отчитат базовите стойности за непрозрачността за всяка роговица. Роговиците с макроскопични тъканни увреждания (напр. драскотини, пигментация, неоваскуларизация) или непрозрачност > седем единици или стойност, еквивалентна за използваните измервателно устройство за непрозрачност и държатели за роговица, се изхвърлят. Най-малко три роговици се избират за отрицателна контрола (или контрола на разтворител). Останалите роговици се разпределят на групи за третиране и положителни контролни групи.
                     Тъй като топлинният капацитет на водата е по-висок от този на въздуха, водата осигурява по-стабилни температурни условия за инкубация. Поради това се препоръчва да се използва водна баня за поддържане на температура от 32 ± 1°C на държателя и неговото съдържание. От друга страна, могат да се използват и въздушни инкубатори, като се вземат необходимите мерки температурата да се поддържа стабилна (напр. като се затоплят предварително държателят и средата).
                     
                        Прилагане на изпитвания химикал
                     
                     Използват се два различни протокола за третиране — един за течности и повърхностноактивни вещества (твърди или течни) и един за твърди вещества, различни от повърхностноактивни.
                     Течностите се изпитват неразредени. Полутвърди вещества, кремообразни вещества и парафини обикновено се изпитват във вид на течности. Повърхностноактивните вещества в чист вид се изпитват при концентрации от 10 % w/v в 0,9 % разтвор на натриев хлорид, дестилирана вода или друг разтворител, за който е доказано, че не влияе неблагоприятно върху системата за изпитване. За използване на други концентрации на разреждане следва да се предостави подходяща обосновка. Смеси, съдържащи повърхностноактивни вещества, могат да се изпитват неразредени или разредени до подходяща концентрация в зависимост от относимия сценарий на експозиция in vivo. За изпитваната концентрация следва да се предостави подходяща обосновка. Роговицата се експонира на течностите или повърхностноактивните вещества в продължение на 10 минути. Използването на друга продължителност на експозицията следва да бъде придружено от подходяща научна обосновка. Моля, вижте допълнение 1 за определение за повърхностноактивно вещество и смес, съдържаща повърхностноактивно вещество.
                     Твърдите вещества, различни от повърхностноактивни вещества, обикновено се изпитват във вид на разтвори или суспензии при концентрация 20 % w/v в 0,9 % разтвор на натриев хлорид, дестилирана вода или друг разтворител, за който е доказано, че не влияе неблагоприятно върху системата за изпитване. При някои обстоятелства и подходяща научна обосновка твърдите вещества могат да се изпитват и в чист вид чрез пряко прилагане върху повърхността на роговицата, като се използва методът с отворено отделение (вж. точка 32). Роговицата се експонира на твърдите вещества в продължение на четири часа, но както и при течностите и повърхностноактивните вещества, при подходяща научна обосновка може да се приложи и друга продължителност на експозицията.
                     В зависимост от физичната природа и химичните характеристики на изпитвания химикал могат да се използват различни методи на третиране (напр. твърди вещества, течности, вискозни спрямо невискозни течности). Критичният фактор е да се осигури изпитваният химикал да покрива в достатъчна степен епителната повърхност и да бъде подходящо отстранен при етапите на измиване. Когато изпитваните химикали са невискозни или слабо вискозни течности, обикновено се използва методът със затворено отделение, а когато изпитваните химикали са полувискозни и вискозни течности и твърди вещества в чист вид, обикновено се използва методът с отворено отделение.
                     При метода със затворено отделение през отворите за дозиране върху горната повърхност в предното отделение се въвежда достатъчно количество от изпитвания химикал (750 μl), така че да покрие епителната страна на роговицата, след което по време на експозицията отворите се затварят със запушалките на отделението. Важно е да се осигури всяка роговица да се експонира на изпитвания химикал в продължение на съответния период от време.
                     При метода с отворено отделение пръстенът за затваряне на прозореца и стъкленият прозорец от предното отделение се отстраняват преди третирането. Контролата или изпитваният химикал (750 μl или количество от изпитвания химикал, което е достатъчно да покрие напълно роговицата) се прилагат непосредствено върху епителната повърхност на роговицата, като се използва микропипета. Ако при даден изпитван химикал използването на пипета е затруднено, той може да се зареди под налягане в пипета с позитивно изтласкване за улесняване на дозирането. Накрайникът на пипетата с позитивно изтласкване се поставя в накрайника на спринцовката по такъв начин, че материалът да може да бъде зареден под налягане в изтласкващия накрайник. Едновременно с това буталото на спринцовката се натиска, докато буталото на пипетата се изтегля нагоре. Ако на върха на пипетата се появят мехурчета въздух, изпитваният химикал се изважда (изтласква) и процесът се повтаря до запълване на накрайника без въздушни мехури. Ако е необходимо, може да се използва нормална спринцовка (без игла), тъй като тя позволява точно измерване на обема на изпитвания химикал и по-лесното му прилагане върху епителната повърхност на роговицата. След дозирането стъкленият прозорец се поставя отново на предното отделение, за да се затвори системата.
                     
                        Инкубация след експозиция
                     
                     След изтичане на времето за експозиция изпитваният химикал, отрицателната контрола или химикалът за положителна контрола се отстранява от предното отделение и епителът се измива с EMEM (с фенолово червено) най-малко три пъти (или докато не останат видими следи от изпитвания химикал). Средата със съдържание на фенолово червено се използва за измиване, защото може да се наблюдава промяната на цвета на фенолово червено, за да се определи ефективността на измиващите алкални или киселинни изпитвани химикали. Роговиците се измиват повече от три пъти, ако оцветяването на феноловото червено продължава да е изменено (жълто или пурпурно) или ако още има видими следи от изпитвания химикал. След като изпитваният химикал бъде отстранен от средата, роговиците се измиват за последен път с EMEM (без фенолово червено). EMEM (без фенолово червено) се използва за последното измиване, за да се осигури отстраняването на феноловото червено от предното отделение, преди да се направи измерването за непрозрачност. След това предното отделение се пълни отново с прясна среда ЕМЕМ без фенолово червено.
                     При течности или повърхностноактивни вещества след измиването роговиците се инкубират за още два часа при 32 ± 1 °C. В някои случаи може да е полезно да се удължи времето след експозицията и решението за това може да се вземе според индивидуалния случай. Роговици, третирани с твърди вещества, се измиват старателно в края на четиричасовата експозиция, но не изискват допълнителна инкубация.
                     В края на инкубационния период след експозицията за течности и повърхностноактивни вещества и в края на четиричасовата експозиция за твърди вещества, различни от повърхностноактивни, се отчитат непрозрачността и пропускливостта на всяка роговица. Също така се прави визуален оглед на всяка роговица и се записват относимите наблюдения (напр. обелване на тъканта, остатъци от изпитвания химикал, неравномерна непрозрачност). Тези наблюдения могат да бъдат важни, тъй като могат да се отразят като колебания в отчетените стойности от измервателното устройство за непрозрачност.
                     
                        Химикали за контроли
                     
                     Във всеки опит се включват паралелни отрицателни контроли или контроли на разтворител/носител, и положителни контроли.
                     Когато се изпитва течно вещество със 100 % концентрация, в метода за изпитване НПГР се включва паралелна отрицателна контрола (напр. 0,9 % разтвор на натриев хлорид или дестилирана вода), за да се позволи откриване на неспецифични промени в изпитваната система и за осигуряване на базова линия за крайните точки на изследването. Също така, тя осигурява проверка, че не се получава неподходящ отклик на дразнене в резултат от неподходящи условия на изследването.
                     Когато се изпитва разредена течност, повърхностноактивно вещество или твърдо вещество, в метода за изпитване НПГР се включва паралелна контролна група на разтворител/носител, за да се позволи откриване на неспецифични промени в изпитваната система и за осигуряване на базова линия за крайните точки на изследването. Може да се използва само разтворител/носител, за който е доказано, че не влияе неблагоприятно върху изпитваната система.
                     Химикал, за който е известно, че предизвиква положителен отклик, се включва във всеки опит като паралелна положителна контрола за проверка на целостта на системата за изпитване и правилното му провеждане. Независимо от това, за да се осигури възможността за оценка на варирането на отклика за положителната контрола във времето, големината на отклика на дразнещото действие не следва да е прекомерна.
                     Примери за положителни контроли за течни изпитвани химикали са 100 % етанол или 100 % диметилформамид. Пример за положителна контрола за твърди изпитвани химикали е 20 % w/v имидазол в 0,9 % разтвор на натриев хлорид.
                     Химикалите за сравнение са от полза за оценката на потенциала за дразнещо действие върху очите на неизвестни химикали от конкретен клас химикали или продуктов клас, или за оценка на относителния потенциал за дразнещо действие на химикали с дразнещо действие върху очите в рамките на конкретен размах от отклици на дразнене.
                     
                        Измерени крайни точки
                     
                     Непрозрачността се определя от количеството светлина, преминало през роговицата. Непрозрачността на роговицата се измерва количествено с помощта на измервателно устройство за непрозрачност, при което се получават стойности за непрозрачността, измерени по непрекъсната скала.
                     Пропускливостта се определя от количеството оцветител натриев флуоресцеин, което прониква през всички клетъчни слоеве на роговицата (т.е. от епитела по външната повърхност на роговицата през ендотела по вътрешната повърхност на роговицата). Един ml оцветител натриев флуоресцеин (4 или 5 mg/ml, когато се изпитват съответно течности и повърхностноактивни твърди вещества, или твърди вещества, различни от повърхностноактивни) се поставя в предното отделение на държателя за роговицата, в което се помества епителната страна на роговицата, докато задното отделение, в което се помества ендотелната страна на роговицата, се пълни с прясна EMEM. След това държателят се инкубира в хоризонтално положение в продължение на 90 ± 5 минути при 32 ± 1 °C. Количеството натриев флуоресцеин, което преминава в задното отделение, се измерва количествено с помощта на UV/VIS спектрофотометър. Спектрофотометричните измервания, оценени при 490 nm, се отчитат като стойности за оптичната плътност (OD490) или за абсорбцията, които се измерват по непрекъсната скала. Стойностите за пропускливостта на флуоресцеина се определят, като се използват стойностите OD490 на базата на спектрофотометър във видимата област, използващ стандартен ход на светлината от 1 cm.
                     Друга възможност е да се използва четец на 96-гнездна микротитърна плоча, при условие че: i) може да се определи линейният обхват на четеца на плочата за определяне на стойностите за флуоресцеин за OD490; и (ii), в 96-гнездната плоча се постави точният обем проби с флуоресцеин, за да се получат стойности OD490, еквивалентни на еталонната дължина на хода на светлината от 1 cm [това може да изисква гнездата да са пълни докрай (обикновено 360 μl)].
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Оценка на данните
                     
                     След като стойностите за непрозрачност и средна пропускливост (OD490) бъдат коригирани спрямо фоновата непрозрачност и стойностите за пропускливост OD490 на отрицателната контрола, средните стойности за непрозрачност и пропускливост OD490 за всяка третирана група се свързват в една изведена по емпиричен път формула за изчисляване на in vitro баловата оценка за дразнещото действие (ИВБОДД) за всяка третирана група както следва:
                     ИВБОДД = средната стойност на непрозрачност + (15 × средната стойност на пропускливост OD490)
                     Sina et al. (16) посочват, че тази формула е изведена по време на вътрешнолабораторни и междулабораторни изследвания. Получените данни в едно многолабораторно изследване за поредица от 36 съединения са били подложени на мултивариантен анализ за определяне на уравнението, което най-добре съгласува данните, получени in vivo и in vitro. Този анализ е извършен от учени от две отделни компании, които са извели приблизително идентични уравнения.
                     Стойностите за непрозрачността и пропускливостта следва да се оценяват и независимо, за да се определи дали даден изпитван химикал е предизвикал корозивност или силно дразнене само през една от двете крайни точки (вж. критериите за решението).
                     
                        Критерии за решението
                     
                     Граничните стойности на ИВБОДД за идентифициране на изпитвани химикали като предизвикващи сериозно увреждане на очите (категория 1 по GHS на ООН) и изпитвани химикали, които не изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите („без категория“ по GHS на ООН), са посочени по-долу:
                     
                                 ИВБОДД
                              
                              
                                 GHS на ООН
                              
                           
                                 ≤ 3
                              
                              
                                 Без категория
                              
                           
                                 > 3; ≤ 55
                              
                              
                                 Не може да се направи прогноза
                              
                           
                                 > 55
                              
                              
                                 Категория 1
                              
                           
                        Критерии за приемливост на изпитването
                     
                     Едно изпитване се смята за приемливо, когато положителната контрола дава ИВБОДД, попадаща в рамките на две стандартни отклонения от текущата средна стойност за предходни изследвания, която следва да се актуализира най-малко на всеки три месеца, или всеки път, когато в лаборатории, в които рядко се провеждат изпитвания (т.е. по-рядко от веднъж месечно), е проведено приемливо изпитване. Отклиците от отрицателната контрола или контролата на разтворител/носител следва да дават резултати със стойности за непрозрачност и пропускливост, които са по-ниски от установените горни граници за стойностите за фоновата непрозрачност и пропускливост за говежда роговица, третирана със съответната отрицателна контрола или контрола на разтворител/носител. Една изпитвана серия, включваща най малко три роговици, би следвало да е достатъчна за изпитването на даден химикал, когато полученото в резултат от нея класифициране е недвусмислено. Независимо от това, при наличие на гранични резултати в първата изпитвана серия следва (но не е задължително) да се разгледа втора изпитвана серия, както и трета, в случай на несъгласувани резултати за средните стойности на ИВБОДД между първата и втората изпитвана серия. В този контекст резултатът от първата изпитвана серия се смята за граничен, ако прогнозните стойности за 3-те роговици не са съгласувани, така че:
                     
                                 —
                              
                              
                                 2 от 3-те роговици са дали прогнозни стойности, несъгласувани със средната стойност за всички 3 роговици, ИЛИ,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 1 от 3-те роговици е дала прогнозна стойност, несъгласувана със средната стойност за всички 3 роговици, И несъгласуваният резултат е бил > 10 ИВБОДД единици от граничния праг от 55.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Ако при повторната изпитвана серия се потвърди прогнозната стойност от първоначалната изпитвана серия (въз основа на средната ИВБОДД стойност), тогава може да се вземе окончателно решение без допълнително изпитване. Ако при повторния аналитичен ход се получи прогнозна стойност, която е несъгласувана със стойността от първоначалния ход (въз основа на средната ИВБОДД стойност), тогава следва да се проведе трети и последен аналитичен ход, за да се вземе решение по отношение на неясните прогнозни стойности и да се класифицира изпитваният химикал. Може да е допустимо да бъдат отказани допълнителните изпитвания за класифициране и етикетиране, в случай че която и да е изпитвана серия доведе до прогнозна стойност за категория 1 по GHS на ООН.
                              
                           
                        Протокол от изпитването
                     
                     Протоколът от изпитването следва да включва следната информация, когато тя се отнася за провеждането на изпитването:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитвани химикали и химикали за контроли
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Наименование(-я) на химикала, като например структурното наименование, използвано от Службата за химични индекси CAS, следвано от други наименования, ако са известни; регистрационен номер по CAS (RN), ако е известен;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Чистота и състав на изпитвания химикал/химикала за контрола (в тегловни проценти), доколкото такава информация е налична;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Физични и химични свойства, като например агрегатно състояние, летливост, pH, стабилност, клас на химикала, водоразтворимост, относима към провеждането на изследването;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             обработка на изпитвания химикал/химикала за контрола, преди изпитването, ако е приложимо (напр. нагряване, стриване);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Стабилност, ако е известна.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Информация за финансиращия и за изпитващата лаборатория
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Име и адрес на финансиращия, на изпитващата лаборатория и на ръководителя на изследването;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Условия на метода за изпитване
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Използвано измервателно устройство за непрозрачност (напр. модел и спецификации) и инструментални настройки;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Информация за калибрирането на устройствата, използвани за измерване на непрозрачността и пропускливостта (напр. измервателно устройство за непрозрачност и спектрофотометър), за да се осигури линейност на измерванията;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Тип на използваните държатели за роговица (напр. модел и спецификации);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на друго използвано оборудване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Процедурата, използвана за осигуряване на цялостност (напр. точност и надеждност) на метода за изпитване във времето (напр. периодично изпитване на химикали за изпитване за пригодност).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Критерии за приемливост на изпитването
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Приемлив размах за паралелните положителни и отрицателни контроли, въз основа на данни от предходни изпитвания;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Ако е приложимо, приемлив размах за паралелни контроли с химикали за сравнение, въз основа на данни от предходни изпитвания.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Пробовземане и приготвяне на очите
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Идентификация на източника на очите (напр. кланицата, където са пробовзети);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Диаметър на роговицата като мярка на възрастта на животното и пригодност за изследването;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Условия на съхранение и транспортиране на очите (напр. дата и час на пробовземане на очите, период от време преди започване на изпитването, среда и температурни условия, в които са транспортирани, всякакви използвани антибиотици);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Приготвяне и поставяне на говеждите роговици, включително декларация за качеството им, температурата на държателите за роговица и критериите за подбор на роговица, използвани за изпитването.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Процедура за изпитване
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Брой на повторенията;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Идентичност на използваните отрицателни и положителни контроли (ако е приложимо, също и на разтворителя и на контролите с химикали за сравнение);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Концентрация (концентрации) на изпитвания химикал, прилагане, използвано време на експозиция и инкубационен период след експозицията;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на използваните критерии за оценка и за решение;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на използваните критерии за приемливост на изследването.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             описание на всякакви изменения на процедурата за изпитване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на използваните критерии за решение.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Резултати
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Представяне в табличен вид на данните за отделни изпитвани проби (напр. стойности за непрозрачност и OD490, изчислени ИВБОДД за изпитвания химикал, положителната, отрицателната контрола и контролите с химикали за сравнение (ако са включени), протоколирани в табличен вид, включително данни от повторенията на опити, когато е подходящо, и средни стойности ± стандартното отклонение за всеки опит);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на други наблюдавани ефекти;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Полученото in vitro класифициране, ако е приложимо.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обсъждане на резултатите.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Заключение
                                 
                              
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). Test Method Evaluation Report — In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. На разположение на адрес: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report: Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. NIH Publication No.10-7553. Research Triangle Park, NC:National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 OECD (2013). Streamlined Summary Document supporting the Test Guideline 437 for eye irritation/corrosion. Series on Testing and Assessment, No.189, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 UN (2011). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30 Rev 4, New York and Geneva: United Nations. На разположение на адрес: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P., and Zuang, V. (2010). A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches. Toxicol. in Vitro 24:1-9.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report — in vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. На разположение на адрес: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report — Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. На разположение на адрес: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay — SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicol. in Vitro 20:78-81.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. На разположение на адрес: [http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 OECD (2011). Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-severe Irritants. Series on Testing and Assessment, No. 160. Adopted October 25, 2011. Paris: Organisation for Economic Co-operation and Development.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on — Part I. The Lancet 349: 636-641.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam. Appl. Toxicol. 26:20-31.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Глава Б.5 от настоящото приложение, Остра токсичност: очно дразнещо/корозивно действие.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 OECD (1998). Series on Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring. No. 1: OECD Principles on Good Laboratory Practice (revised in 1997).
                                 На разположение на адрес: http://www.oecd.org/document/63/0,3343,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                           
                              Точност
                           : степента на близост между резултатите от метода за изпитване и приетите референтни стойности. Това е мярка за характеристиките на метода за изпитване и аспект на „относимостта“. Терминът често се използва взаимозаменяемо с термина „съответствие“, за да се обозначи относителният дял на правилните резултати при даден метод за изпитване.
                        
                           
                              Химикал за сравнение
                           : Химикал, използван като еталон за сравнение с изпитван химикал. Химикалът за сравнение следва да притежава следните свойства: i) постоянен и надежден източник (или източници); ii) структурно и функционално сходство с класа на изпитваните химикали; iii) известни физични/химични характеристики; iv) потвърждаващи данни за известни въздействия; и v) известен потенциал в рамките на размаха на желания отклик.
                        
                           
                              Подход „отдолу нагоре“
                           : поетапен подход, използван за химикали, за които се предполага, че не се изисква класифициране за дразнене или сериозно увреждане на очите, който започва с определяне на химикали, за които не се изисква класифициране (отрицателни резултати) по отношение на други химикали (положителен резултат).
                        
                           
                              Химикал
                           : Вещество или смес.
                        
                           
                              Роговица
                           : Прозрачната част на предната страна на очната ябълка, която покрива ириса и зеницата и пропуска светлината навътре.
                        
                           
                              Непрозрачност на роговицата
                           : Мярка за степента на непрозрачност на роговицата след експозиция на изпитвания химикал. Повишената непрозрачност на роговицата е показател за увреждане на роговицата. Непрозрачността може да се оценява субективно, както това се извършва в изпитването на Draize със заешки очи, или обективно с инструмент, като „измервателно устройство за непрозрачност“.
                        
                           
                              Пропускливост на роговицата
                           : Количествена мярка за увреждане на епитела на роговицата чрез определяне на количеството оцветител натриев флуоресцеин, преминаващо през всички клетъчни слоеве на роговицата.
                        
                           
                              Дразнене на очите
                           : Предизвикване на промени в очите вследствие на прилагане на изпитван химикал към предната повърхност на окото, които са напълно обратими в рамките на 21 дни след прилагането. Терминът е взаимозаменяем с „Обратими ефекти върху очите“ и с „Категория 2 по GHS на ООН“ (4).
                        
                           
                              Процент неверни отрицателни резултати
                           : Делът на всички положителни химикали, невярно определени като отрицателни по даден метод за изпитване. Това е един от показателите за характеристиките на метода за изпитване.
                        
                           
                              Процент неверни положителни резултати
                           : Делът на всички отрицателни химикали, невярно определени като положителни по даден метод за изпитване. Това е един от показателите за характеристиките на метода за изпитване.
                        
                           
                              Опасност
                           : Вътрешноприсъщо свойство на даден агент или ситуация, притежаващ потенциал да предизвика неблагоприятни ефекти, когато организъм, система или (суб-)популация бъдат експонирани на този агент.
                        
                           
                              
                                 In vitro балова оценка за дразнещо действие (ИВБОДД)
                           : Емпирично получена формула, използвана в метода за изпитване НПГР, при която средните стойности за непрозрачността и пропускливостта за всяка третирана група се комбинират в една in vitro балова оценка за всяка третирана група. ИВБОДД = средната стойност за непрозрачност + (15 × средната стойност за пропускливост).
                        
                           
                              Необратими въздействия върху очите
                           : Вж. „сериозно увреждане на очите“.
                        
                           
                              Смес
                           : Смес или разтвор, съставен от две или повече вещества, в която или който те не си взаимодействат (4).
                        
                           
                              Отрицателна контрола
                           : Нетретирано повторение, съдържащо всички компоненти на дадена изпитвана система. Тази проба се обработва с пробите, третирани с изпитвания химикал, и с други контролни проби, за определяне дали разтворителят взаимодейства с изпитваната система.
                        
                           
                              Некласифицирани
                           : химикали, които не са класифицирани за дразнене на очите (категория 2, 2A или 2B по GHS на ООН) или сериозно увреждане на очите (категория 1 по GHS на ООН). Терминът е взаимозаменяем с „без категория по GHS на ООН“.
                        
                           
                              Измервателно устройство за непрозрачност
                           : Инструмент, използван за измерване на „непрозрачността на роговицата“ чрез количествена оценка на пропусканата през роговицата светлина. Типичният инструмент има две отделения, всяко със свой собствен светлинен източник и фотоклетка. Едното отделение се използва за третираната роговица, а другото се използва за калибриране и нулиране на инструмента. Светлината от халогенна лампа се изпраща през едно контролно отделение (празно отделение без прозорци или течност) към фотоклетка и се сравнява със светлината, изпращана към фотоклетка през опитното отделение, в което се намира отделението с роговицата. Разликата в пропусканата светлина от фотоклетките се сравнява и на цифров екран се изписва цифровата стойност за непрозрачността.
                        
                           
                              Положителна контрола
                           : Повторение, съдържащо всички компоненти на дадена изпитвана система, и третирано с химикал, за който е известно, че предизвиква положителен отклик. За да се гарантира, че може да се направи оценка на варирането на отклика в положителната контрола във времето, големината на положителния отклик не следва да е прекомерна.
                        
                           
                              Обратими въздействия върху очите
                           : Вж. „Дразнене на очите“.
                        
                           
                              Надеждност
                           : мярка за степента, в която даден метод за изпитване може да се приложи възпроизводимо в една и съща лаборатория и в различни лаборатории по различно време, при използване на един и същи протокол. Оценката за нея се прави, като се изчислява вътрешнолабораторната и междулабораторната възпроизводимост и вътрешнолабораторната повторяемост.
                        
                           
                              Сериозно увреждане на очите
                           : Предизвикване на тъканно увреждане на окото или сериозно физическо влошаване на зрението след прилагане на изпитван химикал към предната повърхност на окото, което не е напълно обратимо в рамките на 21 дни след прилагането. Терминът е взаимозаменяем с „Необратими ефекти върху очите“ и с „Категория 1 по GHS на ООН“ (4).
                        
                           
                              Контрола на разтворител/носител
                           : Нетретирана проба, съдържаща всички компоненти на дадена изпитвана система, включително разтворителя или носителя, която се обработва с пробите, третирани с изпитвания химикал, и с други контролни проби, за определяне на базовия отклик при пробите, третирани с изпитвания химикал, разтворен в същия разтворител или носител. Когато се изпитва с паралелна отрицателна контрола тази проба показва също дали разтворителят или носителят взаимодействат с изпитваната система.
                        
                           
                              Вещество
                           : химичен елемент и неговите съединения в естествено състояние или получени чрез всеки производствен процес, включително всяка добавка, необходима за запазване на стабилността на продукта и всеки примес, извлечен от използвания процес, с изключение на всеки разтворител, който може да бъде отделен, без да се засяга стабилността на веществото или да се променя неговият състав (4).
                        
                           
                              Повърхностноактивно вещество
                           : също така наречено повърхностноактивен агент, представлява вещество, като например детергент, което е в състояние да намали повърхностното напрежение на дадена течност и по този начин да позволи образуването на пяна в течността, или проникването ѝ в твърди вещества; Известно е също като мокрител.
                        
                           
                              Смес, съдържаща повърхностноактивно вещество
                           : в контекста на настоящия метод за изпитване това е смес, съдържаща едно или повече повърхностноактивни вещества при крайна концентрация > 5 %.
                        
                           
                              Подход „отгоре надолу“
                           : поетапен подход, използван за химикал, за който се предполага, че предизвиква сериозно увреждане на очите, който започва с определяне на химикали, предизвикващи сериозно увреждане на очите (положителен резултат), по отношение на други химикали (отрицателен резултат).
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                        
                           
                              Стратегия за поетапно изпитване
                           : стратегия за поетапно изпитване, при която цялата съществуваща информация за даден изпитван химикал се разглежда по конкретен ред, като на всеки етап се прилага процес, основан на тежестта на доказателствата, за определяне дали съществува достатъчно информация за вземане решение за класифициране с оглед на опасността, преди да се премине към следващия етап. Ако потенциалът за дразнещо действие на даден изпитван химикал може да се определи въз основа на съществуващата информация, не се налага допълнително изпитване. Ако потенциалът за дразнещо действие на даден изпитван химикал не може да се определи въз основа на съществуващата информация, се провежда процедура за поетапно последователно изпитване върху животни, докато стане възможно да се направи ясно класифициране.
                        
                           
                              Глобална хармонизирана система на Организацията на обединените нации за класифициране и етикетиране на химикали (GHS на ООН)
                           : система, предлагаща класифициране на химикали (вещества и смеси) според стандартизирани видове и степени на физическа, здравна и екологична опасност и разглеждаща съответни съобщителни елементи, като например пиктограми, сигнални думи, предупреждения за опасност, препоръки за безопасност и информационни листове за безопасност, така че те да съобщават информация за тяхното неблагоприятно въздействие с оглед защита на хората (включително работодатели, работещи, служители в транспорта, потребители и аварийни служители) и на околната среда (4).
                        
                           
                              Категория 1 по GHS на ООН
                           : Вж. „Сериозно увреждане на очите“.
                        
                           
                              Категория 2 по GHS на ООН
                           : Вж. „Дразнене на очите“.
                        
                           
                              „Без категория“ по GHS на ООН
                           : Химикали, които не отговарят на изискванията за класифициране като категория 1 или 2 (2A или 2B) по GHS на ООН. Терминът е взаимозаменяем с „некласифицирани“.
                        
                           
                              Валидиран метод за изпитване
                           : метод за изпитване, за който са извършени изследвания за валидиране за определяне на относимостта (включително на точността) и надеждността му за конкретна цел. Важно е да се отбележи, че характеристиките на един валидиран метод за изпитване може да не са достатъчни по отношение на точността и надеждността, за да се счита той за приложим за предлаганата цел.
                        
                           
                              Процес, основан на тежестта на доказателствата
                           : Процесът на отчитане на силните и слабите страни на различни видове информация за достигане до дадено заключение относно потенциалната опасност на даден изпитван химикал, и в подкрепа на това заключение.
                     
                     
                        Допълнение 2
                        
                           КАПАЦИТЕТ ЗА ПРОГНОЗИРАНЕ НА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ НПГР
                        
                        
                           Таблица 1
                        
                        
                           Прогнозен капацитет на НПГР за идентифициране на химикали, предизвикващи сериозно увреждане на очите [категория 1 по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС спрямо различни от категория 1 (категория 2 + без категория); категория I по EPA на САЩ спрямо различни от категория I (категория II + категория III + категория IV)]
                        
                        
                                    Класиране Система
                                 
                                 
                                    №
                                 
                                 
                                    Точност
                                 
                                 
                                    Чувствителност
                                 
                                 
                                    Неверни отрицателни
                                 
                                 
                                    Специфичност
                                 
                                 
                                    Неверни положителни
                                 
                              
                                    %
                                 
                                 
                                    №
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    №
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    №
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    №
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    №
                                 
                              
                                    GHS на ООН
                                    Регламент CLP на ЕС
                                 
                                 
                                    191
                                 
                                 
                                    78,53
                                 
                                 
                                    150/191
                                 
                                 
                                    86,15
                                 
                                 
                                    56/65
                                 
                                 
                                    13,85
                                 
                                 
                                    9/65
                                 
                                 
                                    74,60
                                 
                                 
                                    94/126
                                 
                                 
                                    25,40
                                 
                                 
                                    32/126
                                 
                              
                                    EPA на САЩ
                                 
                                 
                                    190
                                 
                                 
                                    78,95
                                 
                                 
                                    150/190
                                 
                                 
                                    85,71
                                 
                                 
                                    54/63
                                 
                                 
                                    14,29
                                 
                                 
                                    9/63
                                 
                                 
                                    75,59
                                 
                                 
                                    96/127
                                 
                                 
                                    24,41
                                 
                                 
                                    31/127
                                 
                              
                           
                        
                           Таблица 2
                        
                        
                           Прогнозен капацитет на НПГР за идентифициране на химикалите, които не изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите („химикали, които не са с дразнещо действие“) [„без категория“ по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС спрямо различни от „без категория“ (категория 1 + категория 2); категория IV по EPA на САЩ спрямо различни от категория IV (категория I + категория II + категория III)]
                        
                        
                                    Класиране Система
                                 
                                 
                                    №
                                 
                                 
                                    Точност
                                 
                                 
                                    Чувствителност
                                 
                                 
                                    Неверни отрицателни
                                 
                                 
                                    Специфичност
                                 
                                 
                                    Неверни положителни
                                 
                              
                                    %
                                 
                                 
                                    №
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    №
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    №
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    №
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    №
                                 
                              
                                    GHS на ООН
                                    Регламент CLP на ЕС
                                 
                                 
                                    196
                                 
                                 
                                    68,88
                                 
                                 
                                    135/196
                                 
                                 
                                    100
                                 
                                 
                                    107/107
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    0/107
                                 
                                 
                                    31,46
                                 
                                 
                                    28/89
                                 
                                 
                                    68,54
                                 
                                 
                                    61/89
                                 
                              
                                    EPA на САЩ
                                 
                                 
                                    190
                                 
                                 
                                    82,11
                                 
                                 
                                    156/190
                                 
                                 
                                    93,15
                                 
                                 
                                    136/146
                                 
                                 
                                    6,85
                                 
                                 
                                    10/146
                                 
                                 
                                    45,45
                                 
                                 
                                    20/44
                                 
                                 
                                    54,55
                                 
                                 
                                    24/44
                                 
                              
                     
                        Допълнение 3
                        
                           ХИМИКАЛИ ЗА ИЗПИТВАНЕ ЗА ПРИГОДНОСТ ЗА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ НПГР
                        
                        Преди рутинното използване на настоящия метод за изпитване, лабораториите следва да докажат техническата си компетентност като правилно определят класификацията за опасност за 13-те химикала, препоръчани в Таблица 1. Тези химикали са подбрани да представляват размаха на отклиците за опасности за очите, въз основа на резултати от изпитването in vivo със заешки очи (TG 405) и системата за класифициране GHS на ООН (т.е. категории 1, 2A, 2B, или некласифицирани) (4). Други критерии за подбор са били това, че химикалите са налични в търговската мрежа, че са налични висококачествени in vivo референтни данни и че са налични висококачествени in vitro данни от метода за изпитване НПГР. Референтни данни са дадени в рационализирания обобщаващ документ (3) и в документа на ICCVAM за контекстуален преглед за метода за изпитване НПГР (2) (18).
                        
                           Таблица 1
                        
                        
                           Препоръчвани химикали за доказване на техническа компетентност по отношение на метода за изпитване НПГР
                        
                        
                                    Химикал
                                 
                                 
                                    CASRN
                                 
                                 
                                    Химичен клас (8)
                                    
                                 
                                 
                                    Агрегатно състояние:
                                 
                                 
                                    
                                       In vivo класифициране (9)
                                    
                                 
                                 
                                    Класифициране НПГР
                                 
                              
                                    Бензалкониев хлорид (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    Ониево съединение
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                              
                                    Хлорхексидин
                                 
                                 
                                    55-56-1
                                 
                                 
                                    Амин, Амидин
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                              
                                    Дибензоил-L-винена киселина
                                 
                                 
                                    2743-38-6
                                 
                                 
                                    Карбоксилна киселина, естер
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                              
                                    Имидазол
                                 
                                 
                                    288-32-4
                                 
                                 
                                    Хетероциклено
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                              
                                    Трихлорооцетна киселина (30 %)
                                 
                                 
                                    76-03-9
                                 
                                 
                                    Карбоксилна киселина
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                              
                                    2,6-Дихлоробензоилхлорид
                                 
                                 
                                    4659-45-4
                                 
                                 
                                    Ацилов халид
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Категория 2A
                                 
                                 
                                    Не може да се направи точна/надеждна прогноза
                                 
                              
                                    Етил-2-метилацетоацетат
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    Кетон, естер
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Категория 2B
                                 
                                 
                                    Не може да се направи точна/надеждна прогноза
                                 
                              
                                    Амониев нитрат
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    Неорганична сол
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Категория 2 (10)
                                    
                                 
                                 
                                    Не може да се направи точна/надеждна прогноза
                                 
                              
                                    EDTA, дикалиева сол
                                 
                                 
                                    25102-12-9
                                 
                                 
                                    Амин, карбоксилна киселина (сол)
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Некласифицирано
                                 
                                 
                                    Некласифицирано
                                 
                              
                                    Tween 20
                                 
                                 
                                    9005-64-5
                                 
                                 
                                    Естер, полиетер
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Некласифицирано
                                 
                                 
                                    Некласифицирано
                                 
                              
                                    2-меркаптопиримидин
                                 
                                 
                                    1450-85-7
                                 
                                 
                                    Ацилов халид
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Некласифицирано
                                 
                                 
                                    Некласифицирано
                                 
                              
                                    Фенилбутазон
                                 
                                 
                                    50-33-9
                                 
                                 
                                    Хетероциклено
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Некласифицирано
                                 
                                 
                                    Некласифицирано
                                 
                              
                                    Полиоксиетилен 23 лаурилов етер (BRIJ-35) (10 %)
                                 
                                 
                                    9002-92-0
                                 
                                 
                                    Алкохол
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Некласифицирано
                                 
                                 
                                    Некласифицирано
                                 
                              
                                    Съкращения: CASRN = Номер по Служба за химични индекси CAS
                                 
                              
                     
                        Допълнение 4
                        ДЪРЖАТЕЛ ЗА РОГОВИЦА ЗА НПГР
                        Държателите за роговицата за НПГР са изработени от инертен материал (напр. полипропилен). Държателите се състоят от две половини (предно и задно отделение) и имат две сходни цилиндрични вътрешни отделения. Всяко отделение е проектирано с вместимост около 5 ml и завършва със стъклен прозорец, през който се записват измерванията за непрозрачност. Всяко от вътрешните отделения е с диаметър 1,7 cm и дълбочина 2,2 cm (11). За да се избегнат течове се използва О-пръстен, разположен върху задното отделение. Роговиците се поставят с ендотелната страна надолу върху О-пръстена на задните отделения, а предните отделения се поставят върху епителната страна на роговиците. Отделенията се закрепват с три винта от неръждаема стомана, разположени по външните краища на отделението. В края на всяко отделение се намира стъклен прозорец, който може да се отстранява за улесняване на достъпа до роговицата. Между стъкления прозорец и отделението също е поставен О-пръстен за защита от течове. Два отвора върху горната страна на всяко отделение позволяват поставяне и отстраняване на средата и на изпитваните химикали. По време на третирането и инкубацията те се затварят с гумени капачки. Светлопреминаването през държателите за роговицата потенциално може да се промени, тъй като последиците от износването или натрупването на специфични остатъци от химикал по вътрешните отвори на отделението или по стъклените прозорци могат да засегнат разсейването или отразяването на светлината. Това би могло да доведе до увеличения или намаления на базовото светлопреминаване (и обратно, на базовите отчетени стойности за непрозрачност на роговицата) през държателите на роговицата, и може да бъде ясно изразено като забележими промени в очакваните базови първоначални измервания на непрозрачността на роговицата в отделните отделения (т.е. стойности на първоначалната непрозрачност на роговицата в отделни държатели за роговица могат рутинно да се различават с повече от 2 или 3 единици непрозрачност от очакваните базови стойности). Всяка лаборатория следва да разгледа възможността за създаване на програма за оценка на промяната на светлопреминаването през държателите за роговица, в зависимост от естеството на изпитваните химикали и честотата на използване на отделенията. За установяването на базови стойности, държателите за роговица могат да бъдат проверени преди рутинното използване чрез измерване на базовите стойности за непрозрачност (или светлопреминаване) за отделенията, напълнени с комплектен носител, без роговици. След това държателите за роговица се проверяват периодично за промени в светлопреминаването по време на периодите на използване. Всяка лаборатория може да определя честотата на проверките на държателите за роговица въз основа на изпитваните химикали, честотата на използване и наблюденията на промените в базовите стойности за непрозрачност на роговицата. Ако се наблюдават забележими промени в светлопреминаването през държателите за роговица, трябва да се вземат предвид подходящи процедури за почистване и/или полиране на вътрешната повърхност на държателите за роговица, или замяна.
                        
                           Държател за роговица: перспективно изображение в разглобен вид
                        
                        
                     
                        Допълнение 5
                        ИЗМЕРВАТЕЛНОТО УСТРОЙСТВО ЗА НЕПРОЗРАЧНОСТ
                        Измервателното устройство за непрозрачност е инструмент за измерване на светлопреминаването. Например, при оборудването OP-KIT от Electro Design (Riom, Франция), използвано за валидиране на метода за изпитване НПГР, светлината от халогенна лампа се изпраща през едно контролно отделение (празно отделение без прозорци или течност) към фотоклетка и се сравнява със светлината, изпращана към фотоклетка през опитното отделение, в което се намира отделението с роговицата. Разликата в светлопреминаването от фотоклетките се сравнява и на цифров екран се изписва цифровата стойност за непрозрачността. Определят се единиците за непрозрачност. Други видове измервателни устройства за непрозрачност, с различна структура (напр. не се изисква извършване на успоредни измервания на контролно и опитно отделение) могат да се използват, ако е доказано, че дават резултати, подобни на валидираното оборудване.
                        Измервателното устройство за непрозрачност следва да дава линеен отклик в обхват от отчетени стойности за непрозрачността, който обхваща граничните стойности, използвани за различните класификации, описани в Прогнозния модел (т.е. до граничната стойност, която определя корозивното/силно дразнещото действие). За да се гарантират линейни и точни отчетени стойности до 75-80 единици непрозрачност, необходимо е измервателното устройство за непрозрачност да се калибрира, като се използва серия от калибратори. Калибраторите се поставят в калибриращото отделение (отделение за роговицата, предназначено за поставяне на калибраторите) и се отчитат с измервателното устройство за непрозрачност. Калибриращата камера е предвидена да помества калибраторите на приблизително същото разстояние между източника на светлината и фотоклетката, на което се разполагат роговиците по време на измерването за непрозрачност. Референтните стойности и точката на първоначално настройване зависят от вида на използваното оборудване. Линейността на измерванията на непрозрачността следва да бъде осигурена чрез подходящи процедури (специфични за инструмента). Например, при оборудването OP-KIT от Electro Design (Riom, Франция), измервателното устройство за непрозрачност най-напред се калибрира за 0 единици непрозрачност, като се използва калибриращото отделение без калибратор. След това в калибриращото отделение последователно се поставят три различни калибратора и се измерва непрозрачността. Калибратори 1, 2 и 3 следва да дават отчетени стойности за непрозрачността, равни на зададените им, съответно 75, 150, и 225 единици ± 5 %.
                     “
               
                     13)
                  
                  
                     В Част Б глава Б.48 се заменя със следното:
                     „Б.48   Метод за изпитване с изолирани птичи очи за идентифициране на i) химикали, предизвикващи сериозно увреждане на очите, и ii) химикали, които не изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 438 (2013). Методът за изпитване с изолирани птичи очи (ИПО) е оценен през 2006 и 2010 г. от Междуведомствения координационен комитет за валидиране на алтернативни методи (ICCVAM), съвместно с Европейския център за валидиране на алтернативни методи (ECVAM) и Японския център за валидиране на алтернативни методи (JaCVAM) (1) (2) (3). В първата оценка методът за изпитване с ИПО е бил одобрен като научно валиден метод за изпитване за използване като скринингово изпитване за идентифициране на химикали (вещества и смеси), предизвикващи сериозно увреждане на очите (категория 1), определено в Глобалната хармонизирана система на Организацията на обединените нации (ООН) за класифициране и етикетиране на химикали (GHS) (1) (2) (4) и в Регламент (ЕО) № 1272/2008 относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси (CLP) (12). Във втората оценка методът за изпитване с ИПО е оценен по отношение на използването му като скринингово изпитване за идентифициране на химикали, които не са класифицирани за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите, както е определено в GHS на ООН (3) (4). Резултатите от изследването за валидиране и препоръките на експертната група за партньорската проверка подкрепиха първоначалната препоръка за използване на ИПО за класифициране на химикали, предизвикващи сериозно увреждане на очите (категория 1 по GHS на ООН), като наличната база данни не се е променила след първоначалното валидиране от ICCVAM. На този етап няма предложени допълнителни препоръки за разширяване на областта на приложимост на ИПО с оглед включване и на други категории. Бе извършена повторна оценка на in vitro и in vivo данните, използвани в изследването за валидиране, с акцент върху оценка на полезността на ИПО за идентифициране на химикали, които не изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите (5). Повторната оценка заключи, че методът за изпитване с ИПО може да се използва за идентифициране на химикали, които не изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите, както е определено в GHS на ООН (4) (5). Настоящият метод за изпитване обхваща препоръчителното използване и ограниченията на метода за изпитване с ИПО въз основа на тези оценки. Основните разлики между първоначалния вариант от 2009 г. и актуализираната версия от 2013 г. на Насоките за изпитване на ОИСР включват използването на метода за изпитване с ИПО за идентифициране на химикали, за които не се изисква класифициране съгласно системата за класифициране GHS на ООН, актуализиране на елементите на протокола от изпитването, актуализиране на допълнение 1 относно определенията и актуализиране на допълнение 2 за химикалите за изпитването за пригодност, но не се ограничават до тях.
                     Понастоящем е общоприето, че в обозримо бъдеще, нито едно изпитване in vitro за дразнене на очите няма да е в състояние да замести изпитването in vivo на Draize за действие върху очите при прогнозирането в целия спектър на дразнене, за различните класове химикали. При все това стратегическите комбинации от няколко алтернативни методи за изпитване в рамките на стратегия за (поетапно) изпитване може да са в състояние да заменят изпитването на Draize за действие върху очите (6). Подходът „отгоре надолу“ (7) е създаден да се използва когато въз основа на съществуваща информация за даден химикал се очаква висок потенциал за дразнещо действие, а подходът „отдолу-нагоре“ (7) е създаден да се използва когато въз основа на съществуващата информация за даден химикал се очаква, че няма да причини дразнене на очите, достатъчно за да се изисква класифициране. Методът за изпитване с ИПО е метод за изпитване in vitro, който може да се използва при определени обстоятелства и със специфични ограничения, както е описано в точки 8 и 10, за класифициране и етикетиране на химикали за опасност за очите. Въпреки че не се смята за валиден като самостоятелен заместител на изпитването in vivo върху очи на зайци, методът за изпитване с ИПО се препоръчва като първоначална стъпка в рамките на стратегия за изпитване, като например подхода „отгоре надолу“, предложен от Scott et al. (7) за идентифициране на химикали, предизвикващи сериозно увреждане на очите, т.е. химикали, които следва да бъдат класифицирани като категория 1 по GHS на ООН без по-нататъшно изпитване (4). Методът за изпитване с ИПО се препоръчва и за идентифициране на химикали, които не изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите, както е определено от GHS на ООН („без категория“, NC) (4) и следователно може да се използва като първоначална стъпка в рамките на стратегия за изпитване, основана на подход „отдолу нагоре“ (7). Независимо това, даден химикал, за който не се прогнозира, че причинява сериозно увреждане на очите или не е класифициран за дразнене на очите/сериозно увреждане на очите с метода за изпитване с ИПО, изисква допълнително изпитване (in vitro и/или in vivo) за определяне на окончателно класифициране. Освен това, съответните регулаторни органи следва да бъдат консултирани преди използването на ИПО при подход „отдолу нагоре“ по схеми за класифициране, различни от GHS на ООН.
                     Целта на настоящия метод за изпитване е да се опишат процедурите, използвани за оценка на потенциалната опасност за очите на изпитвания химикал, измерена чрез способността му да предизвиква или не токсичност в извадени птичи очи. Токсичният ефект върху роговицата се измерва чрез: i) качествена оценка на непрозрачността, ii) качествена оценка на увреждането на епитела при прилагане върху окото на флуоресцеин (задържане на флуоресцеин), iii) количествено измерване на увеличената дебелина (подуване), и iv) качествена оценка на макроскопичните морфологични увреждания по повърхността. Оценките за непрозрачност, подуване и увреждане на роговицата след експозиция на изпитвания химикал се определят поотделно, след което се комбинират, за да се направи класифициране за дразнещо действие върху очите.
                     Определенията са дадени в допълнение 1.
                     ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ
                     Този метод за изпитване се базира на протокола, предложен в Ръководство № 160 на ОИСР (8), разработен след международното изследване за валидиране на ICCVAM (1) (3) (9), за което принос имаха Европейският център за валидиране на алтернативни методи, Японският център за валидиране на алтернативни методи и „TNO Качество на живот“, департамент „Токсикология и приложна фармакология“ (Холандия). Протоколът се базира на информация, получена от публикувани протоколи, както и на текущия протокол, използван от TNO (10) (11) (12) (13) (14).
                     При валидирането на настоящия метод за изпитване, на изпитване е била подложена широка гама от химикали,, като емпиричната база данни на изследването за валидиране е наброявала 152 химикала, включително 72 вещества и 80 смеси (5). Настоящият метод за изпитване е приложим за твърди вещества, течности, емулсии и гелове. Течностите може да са на водна или друга основа; твърдите вещества може да са разтворими или неразтворими във вода. Газовете и аерозолите все още не са оценени с изследване за валидиране (24).
                     Методът за изпитване с ИПО може да се използва за идентифициране на химикали, предизвикващи сериозно увреждане на очите, т.е. химикали, които следва да бъдат класифицирани като категория 1 по GHS на ООН (4). Когато се използват за тази цел, установените ограничения на този метод за изпитване се базират на високите проценти неверни положителни резултати за алкохоли и високите проценти неверни отрицателни резултати за твърди и повърхностноактивни вещества (1) (3) (9). Независимо от това, процентите неверни положителни резултати в този контекст (химикали от категория 1 по GHS на ООН, идентифицирани като химикали, които не са от категория 1 по GHS на ООН), не са от критично значение, тъй като всички изпитвани химикали, за които се получават отрицателни резултати, след това ще бъдат изпитвани с друго достатъчно валидирано in vitro изпитване или изпитвания или, като последна възможност, върху зайци, в зависимост от регулаторните изисквания, като се прилага стратегия за последователно изпитване с подход, основан на тежестта на доказателствата. Следва да се отбележи, че твърдите вещества могат да доведат до променливи и екстремни условия на експозиция в in vivo изпитването на Draize за дразнещо действие върху очите, което може да доведе до неотносими прогнози на техния действителен дразнещ потенциал (15). Изследователите биха могли да разгледат възможността за използване на този метод за изпитване за всякакви типове химикали, при които положителен резултат следва да се приеме за показател за сериозно увреждане на очите, т.е. класифициране като категория 1 по GHS на ООН без по-нататъшно изпитване. Независимо от това, положителни резултати, получени при алкохоли, следва да се тълкуват предпазливо, поради риск от свръхпрогнозиране.
                     Когато методът за изпитване с ИПО се използва за идентифициране на изпитвани химикали като предизвикващи сериозно увреждане на очите (категория 1 по GHS на ООН), той е с обща точност от 86 % (120/140), процент неверни положителни резултати 6 % (7/113), и процент неверни отрицателни резултати 48 % (13/27), в сравнение с данните от метода in vivo за изпитване върху очи на зайци, класифицирани според системата за класифициране GHS на ООН (4) (5).
                     Методът за изпитване с ИПО може също така да се използва за идентифициране на химикали, които не изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите по системата за класифициране GHS на ООН (4). Съответните регулаторни органи следва да бъдат консултирани преди използването на ИПО при подход „отдолу нагоре“ по други схеми за класифициране. Този метод за изпитване може да се използва за всякакви типове химикали, при които може да се приеме при отрицателен резултат химикалът да не се класифицира за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите. Независимо от това, въз основа на един резултат от базата данни от валидирането, прогнозните стойности за съдържащи органичен разтворител противообрастващи бои могат да бъдат подценени (5).
                     Когато методът за изпитване с ИПО се използва за идентифициране на химикали, които не изискват класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите, той е с обща точност от 82 % (125/152), процент неверни положителни резултати 33 % (26/79), и процент неверни отрицателни резултати 1 % (1/73), в сравнение с данните от метода in vivo за изпитване върху очи на зайци, класифицирани според системата за класифициране GHS на ООН (4) (5). Когато изпитвани химикали от определени класове (т.е. съдържащи органичен разтворител противообрастващи бои) бъдат изключени от базата данни, методът за изпитване с ИПО е с обща точност от 83 % (123/149), процент неверни положителни резултати 33 % (26/78) и процент неверни отрицателни резултати 0 % (0/71) за системата за класифициране GHS на ООН (4) (5).
                     Методът за изпитване с ИПО не се препоръчва за идентифицирането на изпитваните химикали, които следва да бъдат класифицирани като дразнещи за очите (т.е. категория 2 или категория 2A по GHS на ООН) или на изпитваните химикали, които следва да бъдат класифицирани като леко дразнещи за очите (категория 2B по GHS на ООН) поради значителния брой химикали от категория 1 по GHS на ООН, класифицирани на по-ниско ниво като химикали от категория 2, 2A или 2B по GHS на ООН, или химикали „без категория“ по GHS на ООН, класифицирани на по-високо ниво като химикали от категория 2, 2A или 2B по GHS на ООН. За тази цел може да се изисква допълнително изпитване с друг подходящ метод.
                     Всички процедури с птичи очи следва да съответстват на приложимите за изпитващата лаборатория разпоредби и процедури за работа с материали с хуманен или животински произход, които включват тъкани и тъканна течност, но не се ограничават само с тях. Препоръчва се спазването на универсалните лабораторни предпазни мерки (16).
                     Въпреки че методът за изпитване с ИПО не разглежда уврежданията на конюнктивата и ириса, както са оценени в метода за изпитване за дразнещо действие върху очи на зайци, той се отнася до въздействието върху роговицата, на което основно се базира класифицирането in vivo, когато се взема предвид Глобалната хармонизирана система на ООН за класифициране. Също така, въпреки че с метода за изпитване с ИПО не може да се направи оценка на обратимостта на уврежданията върху роговицата сама по себе си, бе предложено въз основа на изследванията върху заешки очи оценката за първоначалната дълбочина на увреждането на роговицата да се използва за идентифицирането на някои типове необратимо действие (17). В частност, необходими са нови научни познания, за да се разбере как настъпват необратимите ефекти, които не са свързани с първоначално високо равнище на увреждане. В заключение, методът за изпитване с ИПО не позволява да се направи оценка на потенциала за обща токсичност, свързан с експозицията на очите.
                     Настоящият метод за изпитване ще бъде актуализиран периодично при вземане под внимание на нова информация и данни. Например, хистопатологията може потенциално да е от полза при необходимост от по-пълна характеристика на увреждането на роговицата. Потребителите се насърчават да съхранят очите и да приготвят хистопатологични образци, които могат да се използват за разработването на база данни и критерии за вземане на решение, които могат допълнително да подобрят точността на настоящия метод за изпитване. ОИСР e разработила ръководство за прилагането на in vitro методи за изпитване на токсичност върху очите, което съдържа подробни процедури за вземане на хистопатологични проби, както и информация за това къде да бъдат предадени екземплярите и/или хистопатологичните данни (8).
                     Всяка лаборатория, която започва да извършва това изследване за първи път, следва да използва химикалите за изпитването за пригодност, посочени в Допълнение 2 Лабораториите могат да използват тези химикали за доказване на своята техническа компетентност за прилагане на метода за изпитване с ИПО преди предаване на данните от ИПО за целите на регулаторното класифициране според степента на опасност.
                     ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     Методът за изпитване с ИПО е органотипен модел, който осигурява краткотрайно поддържане на птичето око in vitro. При този метод за изпитване увреждането, причинено от изпитвания химикал, се оценява посредством определяне на подуването, непрозрачността и задържането на флуоресцеин от роговицата. Докато последните два параметъра се оценяват качествено, анализът на подуването на роговицата се извършва количествено. Всяко измерване се преобразува в количествен резултат, който се използва за изчисляване на общ коефициент на дразнимост, или му се дава качествена категоризация, използвана за in vitro класифициране за опасност за очите като категория 1 по GHS на ООН или като некласифицирано по GHS на ООН. След това всеки от тези резултати може да се използва за прогнозиране на потенциала за сериозно увреждане на очите in vivo или на това, че няма за класифициране за опасност на очите по отношение на изпитвания химикал (вж. „Критерии за решението“). Независимо от това, не може да се определи класифициране за химикали, за които няма прогноза че предизвикват сериозно увреждане на очите, или че са некласифицирани с метода за изпитване с ИПО (вж. точка 11).
                     
                        Източник и възраст на птичите очи
                     
                     Традиционно за този анализ се използват очи от птици, събрани в кланица, където птиците се убиват за консумация от човека, като така отпада необходимостта от лабораторни животни. Използват се само очи на здрави животни, смятани за подходящи за включване в хранителната верига на човека.
                     Въпреки че не е провеждано контролирано изследване за оценка на оптималната възраст, възрастта и теглото на птиците, които традиционно се използват в този метод за изпитване, са тези на пилетата, които традиционно се обработват в птицекланици (т.е. на възраст приблизително 7 седмици, 1,5 — 2,5 kg).
                     
                        Събиране и транспортиране на очите до лабораторията
                     
                     Главите следва да се отстраняват незабавно след седиране на птиците, което обикновено става чрез електрически шок, и след срязване на шията за изтичане на кръвта. Източникът на птичи материал следва да е разположен в близост до лабораторията, за да може главите да се прехвърлят от кланицата в лабораторията достатъчно бързо, за да се сведе до минимум влошаването и/или бактериалното замърсяване. Интервалът от време между събирането на птичите глави и поставянето на очите в камерата за обливане след изваждането следва да бъде сведен до минимум (обикновено до два часа), за да се осигури спазването на критериите за приемливост на изследването. Всички очи, използвани в изследването, следва да бъдат от една и съща група очи, пробовзета през даден ден.
                     Тъй като дисекцията на очите се извършва в лабораторията, целите глави се транспортират от кланицата при стайна температура (обичайно между 18 °C и 25 °C) в пластмасови кутии, овлажнени с тъкани, намокрени с изотоничен солен разтвор.
                     
                        Критерии за подбор и брой на очите, използвани в метода с ИПО
                     
                     Очите с високо базово флуоресцеиново оцветяване (т.е. > 0,5) или с висока базова непрозрачност на роговицата (т.е. > 0,5) след изваждане се изхвърлят.
                     Всяка третирана група и паралелна положителна контрола се състои от минимум три очи. Отрицателната контролна група или контролата на разтворител (ако се използва разтворител, различен от солен разтвор) се състои от минимум едно око.
                     В случай на твърди материали, водещи до резултат NC по GHS се препоръчва втора серия с три очи за потвърждаване или отхвърляне на отрицателните резултати.
                     ПРОЦЕДУРА
                     
                        Приготвяне на очите
                     
                     Клепачите внимателно се изрязват, като се внимава да не се нарани роговицата. Целостта на роговицата бързо се проверява с капка 2 % (w/v) натриев флуоресцеин, приложен върху повърхността на роговицата в продължение на няколко секунди, и след това се изплаква с изотоничен солен разтвор. След това обработените с флуоресцеин очи се изследват с микроскоп с шпалт-лампа, за да се провери дали роговицата не е увредена (т.е. задържане на флуоресцеин и непрозрачност на роговицата ≤ 0,5).
                     Ако не е увредено, окото се изрязва от черепа, като се внимава да не се нарани роговицата. Очната ябълка се изважда от орбитата, като мигателната ципа се държи здраво с хирургически форцепс, а очните мускули се срязват с извита ножица с тъп връх. Важно е да се избегне нараняването на роговицата от прекомерен натиск (т.е. артефакти от натиск).
                     Когато окото се извади от орбитата, към него трябва да остане закрепена видима част от очния нерв. След като вече бъде извадено от орбитата, окото се поставя върху абсорбираща подложка и се изрязват мигателната ципа и останалата свързваща тъкан.
                     Изваденото око се поставя в скоба от неръждаема стомана, като роговицата се разполага вертикално. След това скобата се пренася в камера на обливащия апарат (18). Скобите следва да бъдат разположени в обливащия апарат, така че цялата роговица да може да се облее с изотоничния солен разтвор (3-4 капки в минута или 0,1 до 0,15 ml/min). Камерите на обливащия апарат трябва да бъдат с контролирана температура от 32 ± 1,5 °C. В Допълнение 3 е дадена схема на един типичен обливащ апарат и на скобите за очи, които могат да бъдат купени или изработени. Апаратът може да се модифицира според нуждите на всяка лаборатория (напр. за побиране на различен брой очи).
                     След поставяне в обливащия апарат очите отново се оглеждат с микроскоп с шпалт-лампа, за да се провери дали не са наранени по време на дисекцията. На този етап се измерва и дебелината в най-високата точка на роговицата, като се използва дълбокомерът на микроскопа с шпалт-лампа. Очите с: i), задържане на флуоресцеин > 0,5; ii) непрозрачност на роговицата > 0,5; или iii), други признаци на увреждане, се подменят. От очите, които не са отстранени въз основа на някой от тези критерии, се отстраняват очите с дебелина на роговицата, отклоняваща се с повече от 10 % от средната стойност за всички очи. Потребителите следва да имат предвид, че микроскопите с шпалт-лампа може да отчитат различни стойности за дебелината на роговицата при различни настройки за шпалт-широчината. Шпалт-широчината следва да се настрои на 0,095 mm.
                     След като всички очи бъдат подложени на оглед и одобрени, те се инкубират в продължение на приблизително 45 до 60 минути за уравновесяване спрямо изпитваната система преди дозиране. След периода на уравновесяване се извършва нулево еталонно измерване на дебелината и непрозрачността на роговицата, което да служи за база при отчитането (напр. време = 0). За базово измерване за тази крайна точка се използва резултатът за флуоресцеина, определен при дисекцията.
                     
                        Прилагане на изпитвания химикал
                     
                     Непосредствено след нулевите еталонни измервания окото (в държателя му) се изважда от обливащия апарат, поставя се в хоризонтално положение и върху роговицата се прилага изпитваният химикал.
                     Течните изпитвани химикали обикновено се изпитват неразредени, но може да се разреждат, ако това е необходимо (напр. като част от планирането на изследването). Предпочитан разтворител за разредени изпитвани химикали е физиологичният солен разтвор. Независимо от това, при контролирани условия могат да се използват и други разтворители, но трябва да се докаже, че е подходящо използването на разтворители, различни от физиологичния солен разтвор.
                     Течните изпитвани химикали се прилагат върху роговицата, така че цялата повърхност на роговицата да се покрие напълно с изпитвания химикал; стандартният обем е 0,03 ml.
                     Ако е възможно, твърдите изпитвани химикали следва да бъдат смлени възможно най-фино в хаван с чукало или подобно средство за смилане на прах. Прахът се прилага върху роговицата, така че повърхността да се покрие равномерно с изпитвания химикал; стандартното количество е 0,03 g.
                     Изпитваният химикал (в течно или твърдо състояние) се прилага в продължение на 10 секунди и след това се отмива от окото с изотоничен солен разтвор (приблизително 20 ml) при температура на околната среда. След това окото (в държателя му) се връща в обливащия апарат в първоначалното му изправено положение. В случай на необходимост може да се приложи допълнително изплакване след 10-секундното прилагане и в следващи времеви точки (напр. при откриване на остатъчни количества от изпитвания химикал върху роговицата). По принцип количеството солен разтвор, използван за допълнително изплакване, не е от критично значение, но наблюдението на прилепването на химикала по роговицата е важно.
                     
                        Химикали за контроли
                     
                     Във всеки опит следва да се включват паралелни отрицателни контроли или контроли на разтворител/носител, и положителни контроли.
                     Когато се изпитват течности със 100 % концентрация или твърди вещества, за паралелна отрицателна контрола в метода за изпитване с ИПО се използва физиологичен солен разтвор, за откриване на неспецифични промени в изпитваната система и за да се осигури, че условията на изследването не водят до неподходящ отклик на дразнене.
                     Когато се изпитват разредени течности, в метода за изпитване се включва паралелна контролна група на разтворител/носител за откриване на неспецифични промени в изпитваната система и за да се осигури, че условията на изследването не водят до неподходящ отклик на дразнене. Както е посочено в точка 31, може да се използва само разтворител/носител, за който е доказано, че не влияе неблагоприятно върху изпитваната система.
                     Във всеки опит се включва известен химикал с дразнещо действие върху очите като паралелна положителна контрола, за удостоверяване предизвикването на съответен отклик. Тъй като при този метод за изпитване изследването на ИПО се използва за определяне на химикали с корозивно или силно дразнещо действие, положителната контрола следва да е референтен химикал, който при този метод за изпитване предизвиква остър отклик. Независимо от това, за да се гарантира, че може да се направи оценка на варирането във времето на отклика на положителната контрола, големината на силния отклик не следва да е прекомерна. За положителната контрола следва да се генерират достатъчни данни in vitro, за да може да се изчисли статистически определен приемлив размах за положителната контрола. Ако за конкретна положителна контрола няма на разположение достатъчно данни от предходни изпитвания с метода за изпитване с ИПО, може да е необходимо да се проведат изследвания за набавяне на такава информация.
                     Примери за положителни контроли за течни изпитвани химикали са 10 % оцетна киселина или 5 % бензалкониев хлорид, а примери за положителни контроли за твърди изпитвани химикали са натриев хидроксид или имидазол.
                     Химикалите за сравнение са от полза за оценката на потенциала за дразнещо действие върху очите на неизвестни химикали от конкретен клас химикали или продуктов клас, или за оценка на относителния потенциал за дразнещо действие на химикали с дразнещо действие върху очите в рамките на конкретен размах от отклици на дразнене.
                     
                        Измерени крайни точки
                     
                     Роговиците за третиране се оценяват преди третирането и 30, 75, 120, 180 и 240 (± 5) минути след измиването, следващо третирането. Тези времеви точки осигуряват необходимия брой измервания през четиричасовия период на третиране, като същевременно между отделните измервания остава достатъчно време да се направят изискваните наблюдения върху всички очи.
                     Крайните точки, които се оценяват, са непрозрачност на роговицата, подуване на роговицата, задържане на флуоресцеин и морфологични ефекти (напр. образуване на вдлъбнатини или отпускане на епитела). Всички крайни точки, с изключение на задържането на флуоресцеин (което се определя само преди третирането и 30 минути след експозиция на изпитвания химикал), се определят във всяка от горните времеви точки.
                     Препоръчително е да се направят снимки за документиране на непрозрачността на роговицата, задържането на флуоресцеин, морфологичните ефекти и, ако се провежда, на хистопатологията.
                     След заключителното изследване след четири часа потребителите се насърчават да съхранят очите в подходящ фиксатор (напр. неутрален буфериран формалин) за евентуално хистопатологично изследване (виж точка 14 и позоваване (8) за повече подробности).
                     Подуването на роговицата се определя от измерванията на дебелината на роговицата, направени с оптичен дебеломер на микроскопа с шпалт-лампа. То се изразява процентно и се изчислява от измерванията на дебелината на роговицата по следната формула:
                     
                        
                     Средната процентна стойност за подуването на роговицата за всички изпитвани очи се изчислява за всички времеви точки, в които се извършва наблюдение. На базата на най-високата средна стойност за подуване на роговицата, отчетена в която и да е времева точка, се определя обща балова оценка на категоризация за всеки изпитван химикал (вж. точка 51).
                     Непрозрачността на роговицата се оценява като за баловата оценка се използва площта от роговицата, която е най-плътно непрозрачна, както е показано в таблица 1. Средната стойност за непрозрачност на роговицата за всички изпитвани очи се изчислява за всички времеви точки, в които се извършва измерване. На базата на най-високата средна стойност за непрозрачност на роговицата, отчетена в която и да е времева точка, се определя обща балова оценка на категоризация за всеки изпитван химикал (вж. точка 51).
                     
                        Таблица 1.
                     
                     
                        Балови оценки за непрозрачност на роговицата.
                     
                     
                                 Балова оценка
                              
                              
                                 Наблюдение
                              
                           
                                 0
                              
                              
                                 Липсва непрозрачност
                              
                           
                                 0,5
                              
                              
                                 Много слаба непрозрачност
                              
                           
                                 1
                              
                              
                                 Разпръснати или дифузни области; ясно се виждат детайли от ириса
                              
                           
                                 2
                              
                              
                                 Лесно забележима полупрозрачна област; детайлите на ириса са леко замъглени
                              
                           
                                 3
                              
                              
                                 Силна непрозрачност на роговицата; не се наблюдават специфичните детайли на ириса; размерите на лещата едва се забелязват
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 Пълна непрозрачност на роговицата; ирисът не се вижда
                              
                           Задържането на флуоресцеин се оценява единствено във времевата точка за отчитане 30-та минута, както е показано в таблица 2. Средната стойност за задържане на флуоресцеин за всички изпитвани очи се изчислява само за времевата точка за отчитане 30-та минута, и се използва за определяне на общата балова оценка на категоризация за всеки изпитван химикал (вж. точка 51).
                     
                        Таблица 2.
                     
                     
                        Балови оценки за задържане на флуоресцеин.
                     
                     
                                 Балова оценка
                              
                              
                                 Наблюдение
                              
                           
                                 0
                              
                              
                                 Липсва задържане на флуоресцеин
                              
                           
                                 0,5
                              
                              
                                 Много слабо оцветяване на отделни клетки
                              
                           
                                 1
                              
                              
                                 Оцветяване на отделни клетки, разпръснати по цялата третирана площ на роговицата
                              
                           
                                 2
                              
                              
                                 Фокално или сливащо се плътно оцветяване на отделни клетки
                              
                           
                                 3
                              
                              
                                 Сливащи се големи площи от роговицата, задържащи флуоресцеин
                              
                           Морфологичните ефекти включват „образуване на вдлъбнатини“ по епителните клетки на роговицата, „отпускане“ на епитела, „грапавост“ на повърхността на роговицата и „залепване“ на изпитвания химикал по роговицата. Тези наблюдения могат да са с различна тежест и да възникват едновременно. Класифицирането на тези наблюдения е субективно според тълкуването на изследователя.
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Оценка на данните
                     
                     Резултатите за непрозрачност на роговицата, подуване и задържане на флуоресцеин следва да бъдат оценени поотделно, за да се определи ИПО-клас за всяка крайна точка. След това ИПО-класовете за всяка крайна точка се комбинират, за да се направи класифициране за дразнещо действие за всеки изпитван химикал.
                     
                        Критерии за решението
                     
                     След като се направи оценка за всяка крайна точка, могат да се определят ИПО-класовете на базата на предварително зададен диапазон. Тълкуването на подуването на роговицата (таблица 3), непрозрачността (таблица 4), и задържането на флуоресцеин (таблица 5) с помощта на четири ИПО-класа се извършва съгласно следните скали: Важно е да се отбележи, че баловите оценки за подуване на роговицата, посочени в таблица 3, са приложими само ако дебелината се измерва с микроскоп с шпалт-лампа (например Haag-Streit BP900 с дълбокомер № 1 и настройка за шпалт-широчината 9, което е равно на 0,095 mm. Потребителите следва да имат предвид, че микроскопите с шпалт-лампа може да отчитат различни стойности за дебелината на роговицата при различни настройки за шпалт-широчината.
                     
                        Таблица 3.
                     
                     
                        Критерии за ИПО класифициране за подуване на роговицата.
                     
                     
                                 Средно подуване на роговицата (%) (*2)
                                 
                              
                              
                                 ИПО клас
                              
                           
                                 0 до 5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 > 5 до 12
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 > 12 до 18 (> 75 min след третиране)
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 > 12 до 18 (≤ 75 min след третиране)
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 > 18 до 26
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 > 26 до 32 (> 75 min след третиране)
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 > 26 до 32 (≤ 75 min след третиране)
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                                 > 32
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                        
                     
                        Таблица 4.
                     
                     
                        Критерии за ИПО класифициране за непрозрачност.
                     
                     
                                 Максимална средна балова оценка за непрозрачност (*3)
                                 
                              
                              
                                 ИПО клас
                              
                           
                                 0,0-0,5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 0,6-1,5
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 1,6-2,5
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 2,6-4,0
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                        
                     
                        Таблица 5.
                     
                     
                        Критерии за ИПО класифициране за средно задържане на флуоресцеин.
                     
                     
                                 Средна балова оценка за задържане на флуоресцеин на 30-та минута след третиране (*4)
                                 
                              
                              
                                 ИПО клас
                              
                           
                                 0,0-0,5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 0,6-1,5
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 1,6-2,5
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 2,6-3,0
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                        In vitro класифицирането за даден изпитван химикал се оценява, като се използва класифицирането по GHS, което съответства на комбинацията от категории, получени за подуване на роговицата, непрозрачност на роговицата и задържане на флуоресцеин, както е описано в таблица 6.
                     
                        Таблица 6.
                     
                     
                        Общо in vitro класифициране.
                     
                     
                                 Класифициране по GHS на ООН
                              
                              
                                 Комбинации на 3-те крайни точки
                              
                           
                                 Без категория
                              
                              
                                 3 × I
                                 2 × I, 1 × II
                              
                           
                                 Не може да се направи прогноза
                              
                              
                                 Други комбинации
                              
                           
                                 Категория 1
                              
                              
                                 3 × IV
                                 2 × IV, 1 × III
                                 2 × IV, 1 × II (*5)
                                 
                                 2 × IV, 1 × I (*5)
                                 
                                 Непрозрачност на роговицата ≥ 3 при 30 min (в най-малко 2 очи)
                                 Непрозрачност на роговицата = 4 във всяка времева точка (в най-малко 2 очи)
                                 Силно отпускане на епитела (в най-малко 1 око)
                              
                           
                        Критерии за приемливост на изпитването
                     
                     Едно изпитване се смята за приемливо, когато паралелната отрицателна контрола или контролата на разтворител/носител и паралелната положителна контрола се определят съответно като некласифицирана по GHS и от категория 1 по GHS.
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Протоколът от изпитването следва да включва следната информация, когато тя се отнася за провеждането на изпитването:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитвани химикали и химикали за контроли
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Наименование(-я) на химикала, като например структурното наименование, използвано от Службата за химични индекси CAS, следвано от други наименования, ако са известни;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Регистрационен номер по CAS (RN), ако е известен;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Чистота и състав на изпитвания химикал/химикала за контрола (в тегловни проценти), доколкото такава информация е налична;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Физични и химични свойства, като например агрегатно състояние, летливост, pH, стабилност, химичен клас, водоразтворимост, отнасяща се до провеждането на изследването;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Обработка на изпитвания химикал/химикала за контрола, преди изпитването, ако е приложимо (напр. нагряване, смилане);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Стабилност, ако е известна;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Информация за финансиращия и за изпитващата лаборатория
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Име и адрес на финансиращия, на изпитващата лаборатория и на ръководителя на изследването;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Идентификация на източника на очите (напр. кланицата, от която са събрани);
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Условия на метода за изпитване
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на използваната изпитвана система;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Използван микроскоп с шпалт-лампа (напр. модел) и инструментални настройки на използвания микроскоп с шпалт-лампа;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Препратка към резултатите за отрицателните и положителните контроли за предходни периоди и, ако е приложимо, данни за предходни периоди, доказващи приемлив размах за паралелни контроли с химикали за сравнение;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Процедурата, използвана за осигуряване на цялостност (т.е. точност и надеждност) на метода за изпитване във времето (напр. периодично изпитване на химикали за изпитването за пригодност).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Пробовземане и приготвяне на очите
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Възрастта и теглото на животното донор и, ако са налични, други специфични характеристики на животните, от които са събрани очите (напр. пол, порода);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Условията на съхранение и транспортиране на очите (напр. дата и час на пробовземане на очите, период от време между събирането на птичите глави и поставянето на извадените очи в камерата за обливане);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Приготвяне и поставяне на очите, включително декларация за качеството им, температурата на очните камери и критериите за подбор на очите, използвани за изпитването.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Процедура за изпитване
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Брой на повторенията;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Идентичност на използваните отрицателни и положителни контроли (ако е приложимо, също и на разтворителя и на контролите с химикали за сравнение);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Доза от изпитвания химикал, прилагане и времето на експозиция, които ще бъдат използвани;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Времеви точки, в които се извършват наблюденията (преди и след третиране);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на използваните критерии за оценка и за решение;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на използваните критерии за приемливост на изследването.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на всякакви изменения на процедурата за изпитване.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Резултати
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Таблично представяне на баловите оценки за подуване на роговицата, непрозрачност и задържане на флуоресцеин, получени за всяко отделно око и за всяка времева точка на наблюдение, включително средните балови оценки за всяко време на наблюдение на всички изпитвани очи;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Най-високата средна стойност на баловите оценки за подуване на роговицата, непрозрачност и задържане на флуоресцеин (от която и да е времева точка), и съответстващият ѝ ИПО клас.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на всички други наблюдавани ефекти;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Изведеното in vitro класифициране по GHS;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Ако са приложими, снимки на окото;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обсъждане на резултатите.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Заключение
                                 
                              
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report — In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517.: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. На разположение на адрес: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report — Current Status of in vitro Test Methods for Identifying Mild/Moderate Ocular Irritants: The Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. На разположение на адрес: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2011). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, UN New York and Geneva, 2011. На разположение на адрес: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Streamlined Summary Document Supporting OECD Test Guideline 438 on the Isolated Chicken Eye for Eye Irritation/Corrosion. Series on Testing and Assessment no. 188 (Part 1 and Part 2), OECD, Paris.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Глава Б.5 от настоящото приложение, Остра токсичност: очно дразнещо/корозивно действие.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Scott L, Eskes C, Hoffman S, Adriaens E, Alepee N, Bufo M, Clothier R, Facchini D, Faller C, Guest R, Hamernik K, Harbell J, Hartung T, Kamp H, Le Varlet B, Meloni M, Mcnamee P, Osborn R, Pape W, Pfannenbecker U, Prinsen M, Seaman C, Spielmann H, Stokes W, Trouba K, Vassallo M, Van den Berghe C, Van Goethem F, Vinardell P, Zuang V (2010). A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-up and Top-down Approaches. Toxicology In Vitro 24, 1-9.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 OECD (2011) Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-Severe Irritants. Series on Testing and Assessment no. 160, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 ICCVAM. (2006). Background review document: Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. На разположение на адрес: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) (2009). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET) / Isolated Chicken Eye Test, 13pp. На разположение на адрес: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871-929.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicology in Vitro 20,78-81.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. На разположение на адрес: http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                           
                              Точност
                           : степента на близост на на резултатите от метода за изпитване и приетите референтни стойности. Това е мярка за характеристиките на метода за изпитване и аспект на „относимостта“. Терминът често се използва взаимозаменяемо с термина „съответствие“, за да се обозначи относителният дял на правилните резултати при даден метод за изпитване.
                        
                           
                              Химикал за сравнение
                           : Химикал, използван като еталон за сравнение с изпитван химикал. Химикалът за сравнение следва да притежава следните свойства: i) постоянен и надежден източник (или източници); ii) структурно и функционално сходство с класа на изпитваните химикали; iii) известни физични/химични характеристики; iv) потвърждаващи данни за известни въздействия; и v) известен потенциал в размаха на желания отклик
                        
                           
                              Подход „отдолу нагоре“
                           : поетапен подход, използван за химикали, за които се предполага, че не се изисква класифициране за дразнене на очите или сериозно увреждане на очите, който започва с определяне на химикали, за които не се изисква класифициране (отрицателни резултати) по отношение на други химикали (положителен резултат).
                        
                           
                              Химикал
                           : Вещество или смес.
                        
                           
                              Роговица
                           : Прозрачната част на предната страна на очната ябълка, която покрива ириса и зеницата и пропуска светлината навътре.
                        
                           
                              Непрозрачност на роговицата
                           : Мярка за степента на непрозрачност на роговицата след експозиция на изпитвания химикал. Повишената непрозрачност на роговицата е показател за увреждане на роговицата.
                        
                           
                              Подуване на роговицата
                           : Обективно измерване, при изпитването с ИПО, на степента на разширение на роговицата след експозиция на изпитван химикал. Изразява се като процентна стойност и се изчислява от базовите (преди дозиране) измервания за дебелината на роговицата и дебелината, отчитана през редовни интервали от време след експозиция на изпитвания химикал в изпитването с ИПО. Степента на подуване е показател за увреждането на роговицата.
                        
                           
                              Дразнене на очите
                           : Предизвикване на промени в очите вследствие на прилагане на изпитван химикал към предната повърхност на окото, които са напълно обратими в рамките на 21 дни след прилагането. Терминът е взаимозаменяем с „Обратими ефекти върху очите“ и с „Категория 2 по GHS на ООН“ (4).
                        
                           
                              Процент неверни отрицателни резултати
                           : Делът на всички положителни химикали, невярно определени като отрицателни по даден метод за изпитване. Това е един от показателите за характеристиките на метода за изпитване.
                        
                           
                              Процент неверни положителни резултати
                           : Делът на всички отрицателни химикали, невярно определени като положителни по даден метод за изпитване. Това е един от показателите за характеристиките на метода за изпитване.
                        
                           
                              Задържане на флуоресцеин
                           : Субективно измерване при изпитването с ИПО за степента на задържане на натриев флуоресцеин от епителните клетки на роговицата след експозиция на изпитвано вещество. Степента на задържане на флуоресцеин е показател за увреждането на епитела на роговицата.
                        
                           
                              Опасност
                           : Вътрешноприсъщо свойство на даден агент или ситуация, притежаващ потенциал да предизвика неблагоприятни ефекти, когато организъм, система или (суб-)популация бъдат експонирани на този агент.
                        
                           
                              Необратими въздействия върху очите
                           : Вж. „сериозно увреждане на очите“ и „категория 1 по GHS на ООН“.
                        
                           
                              Смес
                           : Смес или разтвор, съставена (съставен) от две или повече вещества, в която (който) те не си взаимодействат (4).
                        
                           
                              Отрицателна контрола
                           : Нетретирано повторение, съдържащо всички компоненти на дадена изпитвана система. Тази проба се обработва с пробите, третирани с изпитвания химикал, и с други контролни проби, за определяне дали разтворителят взаимодейства с изпитваната система.
                        
                           
                              Некласифицирани
                           : вещества, които не са класифицирани за дразнене на очите (категория 2 по GHS на ООН) или сериозно увреждане на очите (категория 1 по GHS на ООН). Терминът е взаимозаменяем с „без категория“ по GHS на ООН“.
                        
                           
                              Положителна контрола
                           : Повторение, съдържащо всички компоненти на дадена изпитвана система, и третирано с химикал, за който е известно, че предизвиква положителен отклик. За да се гарантира, че може да се направи оценка на измененията във времето на отклика на положителната контрола, големината на силния отклик не следва да е прекомерна.
                        
                           
                              Надеждност
                           : мярка за степента, в която даден метод за изпитване може да се приложи възпроизводимо в една и съща лаборатория и в различни лаборатории по различно време, при използване на един и същи протокол. Оценката за нея се прави, като се изчислява вътрешнолабораторната и междулабораторната възпроизводимост и вътрешнолабораторната повторяемост.
                        
                           
                              Обратими въздействия върху очите:
                           : Вж. „дразнене на очите“ и „категория 2 по GHS на ООН“.
                        
                           
                              Сериозно увреждане на очите
                           : Предизвикване на тъканно увреждане на окото или сериозно физическо влошаване на зрението след прилагане на изпитван химикал към предната повърхност на окото, което не е напълно обратимо в рамките на 21 дни след прилагането. Терминът е взаимозаменяем с „Необратими ефекти върху очите“ и с „Категория 1 по GHS на ООН“ (4).
                        
                           
                              Микроскоп с шпалт-лампа
                           : Инструмент, използван за непосредствено изследване на очите под увеличение с биокулярен микроскоп чрез създаване на стереоскопично изправено изображение. При метода за изпитване с ИПО този инструмент се използва за наблюдаване на предната структура на птичите очи, както и за обективно измерване на дебелината на роговицата с дълбокомера, с който е комплектован.
                        
                           
                              Контрола на разтворител/носител
                           : Нетретирана проба, съдържаща всички компоненти на дадена изпитвана система, включително разтворителя или носителя, която се обработва с пробите, третирани с изпитвания химикал, и с други контролни проби, за определяне на базовия отклик при пробите, третирани с изпитвания химикал, разтворен в същия разтворител или носител. Когато се изпитва с паралелна отрицателна контрола, тази проба показва също дали разтворителят или носителят взаимодействат с изпитваната система.
                        
                           
                              Вещество
                           : химичен елемент и неговите съединения в естествено състояние или получени чрез всеки производствен процес, включително всяка добавка, необходима за запазване на стабилността на продукта и всеки примес, извлечен от използвания процес, с изключение на всеки разтворител, който може да бъде отделен, без да се засяга стабилността на веществото или да се променя неговият състав (4).
                        
                           
                              Повърхностноактивно вещество
                           : също така наречено повърхностноактивен агент, представлява вещество, като например детергент, което е в състояние да намали повърхностното напрежение на дадена течност и по този начин да позволи образуването на пяна в течността или проникването ѝ в твърди вещества; Известно е също като мокрител.
                        
                           
                              Подход „отгоре надолу“
                           : поетапен подход, използван за химикал, за който се предполага, че предизвиква сериозно увреждане на очите, който започва с определяне на химикали, предизвикващи сериозно увреждане на очите (положителен резултат), по отношение на други химикали (отрицателен резултат).
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                        
                           
                              Стратегия за поетапно изпитване
                           : стратегия за поетапно изпитване, при която цялата съществуваща информация за даден изпитван химикал се разглежда по конкретен ред, като на всеки етап се прилага процес, основан на тежестта на доказателствата, за определяне дали съществува достатъчно информация за вземане решение за класифициране с оглед на опасността, преди да се премине към следващия етап. Ако потенциалът за дразнещо действие на даден изпитван химикал може да се определи въз основа на съществуващата информация, не се налага допълнително изпитване. Ако потенциалът за дразнещо действие на даден изпитван химикал не може да се определи въз основа на съществуващата информация, се провежда процедура за поетапно последователно изпитване върху животни, докато стане възможно да се направи ясно класифициране.
                        
                           
                              Глобална хармонизирана система на Организацията на обединените нации за класифициране и етикетиране на химикали (GHS на ООН)
                           : система, предлагаща класифициране на химикали (вещества и смеси) според стандартизирани видове и степени на физическа, здравна и екологична опасност и разглеждаща съответни съобщителни елементи, като например пиктограми, сигнални думи, предупреждения за опасност, препоръки за безопасност и информационни листове за безопасност, така че те да съобщават информация за тяхното неблагоприятно въздействие с оглед защита на хората (включително работодатели, работещи, служители в транспорта, потребители и аварийни служители) и на околната среда (4).
                        
                           
                              Категория 1 по GHS на ООН
                           : вж. „сериозно увреждане на очите“ и/или „необратими ефекти върху очите“.
                        
                           
                              Категория 2 по GHS на ООН
                           : Вж. „дразнене на очите“ и/или „обратими ефекти върху очите“.
                        
                           
                              „Без категория“ по GHS на ООН
                           : Вещества, които не отговарят на изискванията за класифициране като категория 1 или 2 (2A или 2B) по GHS на ООН. Терминът е взаимозаменяем с „Некласифицирани“.
                        
                           
                              Валидиран метод за изпитване
                           : метод за изпитване, за който са извършени изследвания за валидиране за определяне на относимостта (включително на точността) и надеждността му за конкретна цел. Важно е да се отбележи, че характеристиките на един валидиран метод за изпитване може да не са достатъчни по отношение на точността и надеждността, за да се счита той за приложим за предлаганата цел.
                        
                           
                              Процес, основан на тежестта на доказателствата
                           : Процесът на отчитане на силните и слабите страни на различни видове информация за достигане до дадено заключение относно потенциалната опасност на даден химикал, и в подкрепа на това заключение.
                     
                     
                        Допълнение 2
                        
                           ХИМИКАЛИ ЗА ИЗПИТВАНЕ ЗА ПРИГОДНОСТ ЗА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ С ИПО
                        
                        Преди рутинното използване на метод за изпитване, който се придържа към настоящия метод за изпитване, лабораториите следва да докажат техническата си компетентност, като правилно определят класификацията за опасност за 13-те химикала, препоръчани в Таблица 1. Тези химикали са подбрани да представляват размаха на отклиците за опасности за очите, въз основа на резултати от изпитването in vivo със заешки очи (TG 405) и системата за класифициране GHS на ООН (т.е. категории 1, 2A, 2B, или некласифицирани по GHS на ООН) (4)(6). Други критерии за подбор са били това, че химикалите са налични в търговската мрежа, че са налични висококачествени in vivo референтни данни и че са налични висококачествени данни от in vitro метода за изпитване с ИПО. Референтни данни са дадени в рационализирания обобщаващ документ (5) и в документа на ICCVAM за контекстуален преглед за метода за изпитване с ИПО (9).
                        
                           Таблица 1:
                        
                        
                           Препоръчвани химикали за доказване на техническа компетентност по отношение на метода за изпитване с ИПО
                        
                        
                                    Химикал
                                 
                                 
                                    CASRN
                                 
                                 
                                    Химичен клас (13)
                                    
                                 
                                 
                                    Агрегатно състояние
                                 
                                 
                                    
                                       In vivo класифициране (14)
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       In vitro класифициране (15)
                                    
                                 
                              
                                    Бензалкониев хлорид (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    Ониево съединение
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                              
                                    Хлорхексидин
                                 
                                 
                                    55-56-1
                                 
                                 
                                    Амин, Амидин
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                              
                                    Дибензоил-L-винена киселина
                                 
                                 
                                    2743-38-6
                                 
                                 
                                    Карбоксилна киселина, естер
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                              
                                    Имидазол
                                 
                                 
                                    288-32-4
                                 
                                 
                                    Хетероциклено
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                              
                                    Трихлорооцетна киселина (30 %)
                                 
                                 
                                    76-03-9
                                 
                                 
                                    Карбоксилна киселина
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                              
                                    2,6-Дихлоробензоилхлорид
                                 
                                 
                                    4659-45-4
                                 
                                 
                                    Ацилов халид
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Категория 2A
                                 
                                 
                                    Не може да се направи прогноза (16)
                                    
                                 
                              
                                    Амониев нитрат
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    Неорганична сол
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Категория 2A (17)
                                    
                                 
                                 
                                    Не може да се направи прогноза (16)
                                    
                                 
                              
                                    Етил-2-метилацетоацетат
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    Кетон, естер
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Категория 2B
                                 
                                 
                                    Не може да се направи прогноза (16)
                                    
                                 
                              
                                    Диметилсулфоксид
                                 
                                 
                                    67-68-5
                                 
                                 
                                    Органично сярно съединение
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Без категория
                                 
                                 
                                    Без категория
                                 
                              
                                    Глицерол
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    Алкохол
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Без категория
                                 
                                 
                                    Без категория (гранично)
                                 
                              
                                    Метилциклопентан
                                 
                                 
                                    96-37-7
                                 
                                 
                                    Въглеводород (цикличен)
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Без категория
                                 
                                 
                                    Без категория
                                 
                              
                                    n-Хексан
                                 
                                 
                                    110-54-3
                                 
                                 
                                    Въглеводород (ацикличен)
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Без категория
                                 
                                 
                                    Без категория
                                 
                              
                                    Триацетин
                                 
                                 
                                    102-76-1
                                 
                                 
                                    Липид
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Некласифициран
                                 
                                 
                                    Без категория
                                 
                              
                                    Съкращения: CASRN = Номер по Служба за химични индекси CAS
                                 
                              
                     
                        Допълнение 3
                        
                           СХЕМИ НА ОБЛИВАЩ АПАРАТ ЗА ИПО И СКОБИ ЗА ОЧИ
                        
                        
                           (Вж. Burton et al. (18) за допълнителни общи описания на обливащия апарат и скобите за очи)
                        
                        
                                    Позиция №
                                 
                                 
                                    Описание
                                 
                                 
                                    Позиция №
                                 
                                 
                                    Описание
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    Изход топла вода
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    Отделение
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    Плъзгаща се врата
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    Държател за очите
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    Обливащ апарат
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    Птиче око
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    Оптичен измервателен инструмент
                                 
                                 
                                    12
                                 
                                 
                                    Изход солен разтвор
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    Вход топла вода
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    Застопоряващ винт
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    Солен разтвор
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                    Регулируемо горно рамо
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    Топла вода
                                 
                                 
                                    15
                                 
                                 
                                    Фиксирано долно рамо
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    Вход солен разтвор
                                 
                                 
                                     
                                 
                              “
               
                     14)
                  
                  
                     В Част Б глава Б.49 се заменя със следното:
                     „Б.49   Изпитване in vitro за микроядра в клетки от бозайници
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на Насоки за изпитване 487 на ОИСР (2014). Той е част от серия методи за изпитване от областта на генетичната токсикология. Разработен е документ на ОИСР, съдържащ ясна информация относно изпитванията в областта на генетичната токсикология, и преглед на актуалните изменения на посочените Насоки (1).
                     Изпитването in vitro за микроядра (MNvit) е изпитване за генотоксичност за откриване на микроядра (МЯ) в цитоплазмата на интерфазни клетки. Микроядрата могат да произлизат от ацентрични хромозомни фрагменти (т.е. с липсваща центромера) или от цели хромозоми, които не са в състояние да се придвижат към полюсите по време на анафазния стадий на клетъчното делене. Поради това изпитването MNvit e in vitro метод, който осигурява изчерпателна основа за изследване на потенциала за увреждане на хромозомите in vitro, тъй като могат да бъдат откривани както анеугени, така и кластогени (2) (3) в клетки, които са преминали през клетъчно делене по време на експозиция на изпитвания химикал или след това (вж. точка 13 за повече подробности). Микроядрата са увреждане, което е било предадено на дъщерните клетки, докато хромозомните аберации, преброени в метафазните клетки, могат да не бъдат предадени. И в двата случая измененията може да не са съвместими с оцеляването на клетките.
                     Настоящият метод за изпитване (МИ) позволява използването на протоколи със и без инхибитор на полимеризацията на актина — цитохалазин Б (цитоБ). Добавянето на цитоБ преди митозата води до клетки, които са двуядрени, и следователно позволява идентифицирането и анализа на микроядра само в онези клетки, които са преминали през една митоза (4) (5). Настоящият метод за изпитване позволява използването на протоколи без блокиране на цитокинезата, при условие че са налице доказателства за това, че анализираната популация на клетки е преминала през митоза.
                     В допълнение към използването на изпитването MNvit за идентифициране на химикали (вещества и смеси), които индуцират микроядра, използването на имунохимично маркиране на кинетохорите или хибридизация с центромерни/теломерни проби (флуоресцентна in situ хибридизация (FISH)) също може да предостави допълнителна информация относно механизмите на увреждане на хромозомите и образуване на микроядра (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17). Тези процедури на маркиране и хибридизация могат да бъдат използвани, когато е налице увеличено образуване на микроядра и изследователят пожелае да определи дали увеличението е в резултат от кластогенни и/или анеугенни ефекти.
                     Тъй като микроядрата в интерфазните клетки могат да бъдат оценени относително обективно, лабораторният персонал трябва да определи единствено броя на двуядрените клетки, когато се употребява цитоБ, и честотата на клетките с микроядра във всички случаи. В резултат на това предметните стъкла могат да бъдат преброени относително бързо, а анализът може да бъде автоматизиран. Поради това е практично да се преброят хиляди вместо стотици клетки в рамките на едно третиране, с което се увеличава мощността на статистическия тест. Накрая, тъй като микроядрата могат да се породят от изоставащи хромозоми, налице е потенциал за откриване на агенти, предизвикващи анеуплоидия, които се изследват трудно в рамките на конвенционални изпитвания за хромозомни аберации, напр. глава Б.10 от настоящото приложение) (18). Независимо от това, изпитването MNvit, описано в настоящия метод за изпитване, не дава възможност за разграничаване на химикалите, предизвикващи промени в броя на хромозомите и/или плоидност, от химикалите, предизвикващи кластогенност, без специални техники, каквато е техниката FISH, посочена в точка 4.
                     Изпитването MNvit е устойчиво и може да се провежда при разнообразни типове клетки и при наличието или в отсъствието на цитоБ. Налице са изчерпателни данни в подкрепа на валидността на изпитването MNvit с използване на различни типове клетки (култури от клетъчни линии или първични клетъчни култури) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36). Те включват по-конкретно данни от международните изпитвания за валидиране, координирани от Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (19) (20) (21) (22) (23) и от докладите от Международния семинар относно изпитването за генотоксичност (5) (17). Наличните данни също така бяха повторно оценени в рамките на ретроспективно изследване за валидиране, основано на тежестта на доказателствата, и извършено от Европейския център за валидиране на алтернативните методи (ECVAM) към Европейската комисия, и методът за изпитване беше одобрен като научно валиден от Научния консултативен комитет (НКК) на ECVAM (37) (38) (39).
                     При изпитването in vitro в клетки от бозайници могат да се използват култури от клетъчни линии или първични клетъчни култури с човешки произход или с произход от гризачи. Тъй като фоновата честота на микроядрата ще окаже влияние върху чувствителността на изпитването, препоръчва се използването на типове клетки със стабилна и определена фонова честота на образуване на микроядра. Използваните клетки се избират въз основа на способността на растеж в културата, стабилността на кариотипа (включително броя на хромозомите) и спонтанната честота на микроядрата (40). Към настоящия момент наличните данни не позволяват да се направят категорични препоръки, но дават възможност да се предполага, че при оценяване на опасностите от химикали е важно да се разглеждат статусът на p53, генетичната (кариотипна) стабилност, капацитетът за поправка на ДНК и произходът (произход от гризачи спрямо човешки произход) на клетките, избрани за изпитване. По този начин ползвателите на настоящия метод за изпитване се насърчават, с увеличаването на познанията в тази област, да обърнат внимание на влиянието на тези и други клетъчни характеристики върху параметрите на дадена клетъчна линия при откриването на предизвикване на микроядра.
                     Използваните определения са дадени в допълнение 1.
                     ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ
                     Изпитванията, провеждани in vitro, по принцип изискват използването на екзогенен източник на метаболитно активиране, освен когато клетките са с капацитет за метаболизиране по отношение на изпитваните химикали. Екзогенната система на метаболитно активиране не възпроизвежда изцяло in vivo условия. Следва внимателно да се избягват условия, които биха довели до изкуствено предизвикани положителни резултати, които не отразяват генотоксичността на изпитваните химикали. Такива условия включват промени в pH (41) (42) (43) или осмолалитета, взаимодействие със средата за отглеждане на клетки (44) (45) или прекомерно високи нива на цитотоксичност (вж. точка 29).
                     За целите на анализиране на индуцирането на микроядра от съществено значение е митозата да е настъпила както при третирани, така и при нетретирани култури. Най-информативният стадий за преброяване на микроядра е в клетки, които са завършили една митоза по време на третиране с изпитвания химикал, или след това. За произведени наноматериали е необходимо специфично адаптиране на настоящия метод за изпитване, но то не е описано в настоящия метод за изпитване.
                     Преди използването на метода за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Такива съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа.
                     ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     Клетъчните култури с човешки произход или с произход от други бозайници се подлагат на експозиция на изпитвания химикал със и без екзогенен източник на метаболитно активиране, освен когато се използват клетки с достатъчен капацитет за метаболизиране (вж. точка 19).
                     По време на експозицията на изпитвания химикал или след това клетките се отглеждат за период, който е достатъчен, за да позволи увреждането на хромозомите или други ефекти върху клетъчния цикъл/клетъчно делене да доведат до образуването на микроядра в интерфазните клетки. За предизвикването на анеуплоидия изпитваният химикал обикновено следва да бъде наличен по време на митозата. Събраните и оцветените интерфазни клетки се анализират за наличието на микроядра. В идеалния случай микроядрата следва да бъдат преброени само в онези клетки, които са преминали през митоза по време на експозицията на изпитвания химикал или по време на периода след третирането, ако се използва такъв. При култури, които са били третирани с блокер на цитокинезата, това се постига лесно с броене само на двуядрените клетки. При отсъствието на блокер на цитокинезата е важно да се докаже, че анализираните клетки вероятно са преминали през клетъчно делене въз основа на увеличаването на клетъчната популация по време на експозицията на изпитвания химикал или след това. За всички протоколи е важно да се докаже, че пролиферацията на клетки е настъпила както в контролните, така и в третираните култури, и степента на цитотоксичност или цитостаза, предизвикана от изпитвания химикал, следва да бъде оценена във всички култури, в които се извършва преброяване за наличието на микроядра.
                     ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
                     
                        Клетки
                     
                     Могат да се използват култивирани първични лимфоцити от периферна кръв с човешки произход или от други бозайници (7) (20) (46) (47) и редица клетъчни линии на гризачи, например клетки CHO, V79, CHL/IU и L5178Y или човешки клетъчни линии като TK 6 (19) (20) (21) (22) (23) (26) (27) (28) (29) (31) (33) (34) (35) (36) (вж. точка 6). Други клетъчни линии като HT29 (48), Caco-2 (49), HepaRG (50) (51), HepG2 клетки (52) (53), A549 и първични клетки от ембрион на сирийски хамстер (54) са били използвани за изпитване за микроядра, но на този етап не са широко валидирани. Поради това използването на други клетъчни линии и типове следва да бъде обосновано въз основа на техните доказани характеристики в рамките на изпитването, както е описано в раздела „Критерии за приемливост“. Съобщено е, че цитоБ има потенциално въздействие върху растежа на клетки L5178Y и затова не се препоръчва с тази клетъчна линия (23). Когато се използват първични клетки, от съображения за хуманно отношение към животните следва да се разгледа използването на клетки от човешки произход, когато това е осъществимо, и от тях да се вземат проби в съответствие с човешките етични принципи и правната рамка.
                     Човешките лимфоцити от периферна кръв следва да бъдат получени от млади (на приблизителна възраст 18—35 години) индивиди, които не са пушачи, без известни заболявания и за които не е известно наскоро да са били подложени на експозиция на генотоксични агенти (напр. химикали, йонизиращи лъчения) на нива, които биха увеличили фоновата честота на клетките с микроядра. Това би гарантирало ниските и съгласувани стойности на фоновата честота на клетките с микроядра. Базовата честота на клетките с микроядра нараства с възрастта и тази тенденция е по-изразена при индивидите от женски пол, отколкото при индивидите от мъжки пол (55). Броят на донорите следва да бъде посочен, ако се обединят клетките от повече от един донор в обща група за използване. Необходимо е да се докаже, че клетките са преминали през делене от началото на третирането с изпитвания химикал до вземането на проби от клетките. Клетъчните култури се поддържат във фаза на експоненциален растеж (клетъчни линии) или деленето им се стимулира (първични култури от лимфоцити) с оглед експозиция на клетките през различни етапи от клетъчния цикъл, тъй като чувствителността на клетъчните етапи по отношение на изпитваните химикали може да не е известна. Първичните клетки, чието делене трябва да бъде стимулирано с митогенни агенти, обикновено не се синхронизират повече по време на експозиция на изпитвания химикал (напр. човешки лимфоцити след 48-часова митогенна стимулация). Използването на синхронизирани клетки по време на третирането с изпитвания химикал не е препоръчително, но може да бъде приемливо, ако е обосновано.
                     
                        Среди и условия за отглеждане на културата
                     
                     За отглеждането на културите трябва да бъдат използвани подходящи среда за отглеждане и инкубационни условия (съдове за отглеждане, влажна атмосфера с 5 % CO2 ако е целесъобразно, температура на инкубиране от 37 °C). Клетъчните линии следва да се проверяват рутинно за стабилност на модалния брой на хромозомите и отсъствие на замърсяване от Mycoplasma, и клетките не трябва да се използват, ако са замърсени или ако има промени в модалния брой на хромозомите. Нормалната продължителност на клетъчния цикъл на клетъчните линии или първичните култури, използвани в лабораторията, провеждаща изпитването, следва да бъдат установени и следва да съответстват на публикуваните характеристики на клетките.
                     
                        Приготвяне на културите
                     
                     Клетъчни линии: размножават се клетки от изходни култури, посяват се в среда за отглеждане с такава посевна гъстота, че клетките в суспензии или в монослоеве да продължат експоненциалния си растеж до събирането (напр. сливането следва да се избягва при клетки, отглеждани в монослоеве).
                     Лимфоцити: цяла кръв, третирана с антикоагулант (напр. хепарин), или изолирани лимфоцити се отглеждат [напр. фитохемаглутинин (PHA) за човешки лимфоцити] за предизвикване на клетъчно делене преди експозиция на изпитвания химикал и цитоБ.
                     
                        Метаболитно активиране
                     
                     Следва да се използват екзогенни метаболизиращи системи при използването на клетки с недостатъчен ендогенен метаболичен капацитет. Най-често използваната система, която се препоръчва по подразбиране, освен ако е обоснована друга система, е пост-митохондриална фракция с добавка на ко-фактор (S9), приготвена от черен дроб на гризачи (обикновено плъхове), третирани с ензимно индуциращи агенти като Ароклор 1254 (56) (57) или съчетание от фенобарбитал и b-нафтофлавон (58) (59) (60). Последното съчетание не противоречи на Стокхолмската конвенция за устойчивите органични замърсители (61) и е доказано, че е също толкова ефективно, колкото Ароклор 1254, за индуцирането на оксидази със смесени функции (58) (59) (60). Фракцията S9 обикновено се използва в концентрации, вариращи от 1 до 2 % (v/v), но може да се увеличи до 10 % (v/v) в окончателната среда за изпитване. Използването на продукти, намаляващи митотичния индекс, особено продукти, образуващи комплекси с калция (62), следва да се избягва по време на третирането. Изборът на типа и концентрацията на използваната екзогенна система за метаболитно активиране или метаболитен индуктор може да бъде повлиян от класа химикали, който се изпитва.
                     
                        Приготвяне на химикала за изпитване
                     
                     Твърдите изпитвани химикали следва да се подготвят в подходящи разтворители и, ако е необходимо, да се разредят преди третиране на клетките. Течните химикали за изпитване могат да се добавят директно в системата за изпитване и/или да се разредят преди третирането на системата за изпитване. Газообразните или летливите химикали за изпитване следва да бъдат изпитвани чрез подходящи изменения на стандартните протоколи, като например третиране в запечатани съдове (63) (64) (65). Приготвянето на изпитвания химикал следва да се извърши непосредствено преди третирането, освен ако данните за стабилността показват, че е допустимо съхранение.
                     
                        Условия на изпитване
                     
                     
                        Разтворители
                     
                     Разтворителят трябва да бъде избран с цел оптимизиране на разтворимостта на изпитваните химикали, без да се оказва негативно влияние върху извършването на изследването, т.е. промяна на клетъчния растеж, засягане на целостта на изпитвания химикал, реакция със съдовете за отглеждане, нарушаване на системата за метаболитно активиране. Препоръчва се винаги, когато е възможно, най-напред да се разглежда възможността за използване на вода като разтворител (или среда за отглеждане). Добре утвърдени разтворители са например водата или диметилсулфоксидът (DMSO). Като цяло органичните разтворители следва да не надвишават 1 % (v/v). Ако цитоБ е разтворен в DMSO, общото количество органичен разтворител, използван както за изпитвания химикал, така и за цитоБ, следва да не превишава 1 % (v/v); в противен случай следва да се използват нетретирани контроли, за да се гарантира, че процентът на органичния разтворител няма неблагоприятно въздействие. Водните разтворители (физиологичен разтвор или вода) не трябва да превишават 10 % (об./об.) в окончателната среда за третиране. Ако се използват разтворители, които не са добре утвърдени (напр. етанол или ацетон), използването им следва да бъде подкрепено от данни за съвместимостта им с изпитвания химикал и системата за изпитване, както и за това, че не са генетично токсични при използваната концентрация. При липса на подкрепящи данни е важно да се включат нетретирани контроли (виж допълнение 1), както и контроли на разтворител, за да се докаже, че избраният разтворител не предизвиква никакви неблагоприятни или хромозомни ефекти (напр. анеуплоидия или кластогенност).
                     
                        Използване на цитоБ като блокер на цитокинезата
                     
                     Едно от най-важните съображения при извършването на изпитването MNvit е да се осигури, че преброяваните клетки са преминали през митоза по време на третирането или инкубационния период след третирането, ако се използва такъв. Поради това преброяването на микроядра следва да се ограничи до клетки, които са преминали през митоза по време на третирането или след това. ЦитоБ е агентът, който е бил най-широко използван за блокиране на цитокинезата, тъй като той инхибира съединяването на актина и по този начин предотвратява отделянето на дъщерни клетки след митозата, което води до образуването на двуядрени клетки (6) (66) (67). Когато се използва цитоБ, може същевременно да се измери и ефектът на изпитвания химикал върху кинетиката на клетъчната пролиферация. ЦитоБ следва да бъде използван като блокер на цитокинезата, когато се използват човешки лимфоцити, тъй като времената на клетъчния цикъл ще варират при различните донори и тъй като не всички лимфоцити ще реагират на стимулирането на фитохемаглутинина. ЦитоБ не е задължителен за други клетъчни типове, ако може да се установи, че те са преминали през делене, както е описано в точка 27. Освен това цитоБ обикновено не се използва, когато пробите се оценяват за микроядра с използване на поточни цитометрични методи.
                     За да се постигне оптималната честота на двуядрени клетки в контролните култури на разтворител, лабораторията трябва да определи за всеки тип клетки подходящата концентрация на цитоБ, и следва да докаже, че при нея се получава добър добив на двуядрени клетки за преброяване. Подходящата концентрация на цитоБ обикновено е между 3 и 6 μg/ml (19).
                     
                        Измерване на клетъчната пролиферация и цитотоксичността и избор на концентрации на третиране
                     
                     При определяне на най-високата концентрация на изпитвания химикал следва да се избягват концентрациите, които могат да доведат до изкуствено предизвикан положителен отклик, като например предизвикващите прекомерна цитотоксичност (вж. точка 29), утаяване в средата за отглеждане (вж. точка 30) или явни промени в pH или осмолалитета (вж. точка 9). Ако изпитваният химикал предизвиква явна промяна в pH на средата към момента на добавянето, pH може да бъде коригиран чрез буфериране на окончателната среда за третиране, за да се избегнат изкуствено предизвикани положителни резултати и да се поддържат подходящи условия за отглеждане.
                     Извършват се измервания на пролиферацията на клетките, за да се гарантира, че достатъчен брой третирани клетки са преминали през митоза по време на изследването, както и че третиранията са извършени при подходящи нива на цитотоксичност (вж. точка 29). Цитотоксичността следва да се определи в главния опит, със и без метаболитно активиране, като се използва подходяща индикация на клетъчната смърт и растеж (вж. точки 26 и 27). Въпреки че оценката на цитотоксичността в първоначално предварително изпитване може да бъде полезна за по-добро определяне на концентрациите, които ще се използват в основния опит, първоначалното изпитване не е задължително. Ако такова се извършва, то не следва да заменя измерването на цитотоксичността в главния опит.
                     Третирането на култури с цитоБ и измерването на относителните честоти на едноядрени, двуядрени и многоядрени клетки в културата осигурява точен метод за количествено определяне на ефекта върху пролиферацията на клетките и цитотоксичната или цитостатичната активност на дадено третиране (6) и гарантира, че се преброяват само клетки, които са преминали през делене по време на третирането или след него. За оценка на цитотоксичната и цитостатичната активност на дадено третиране чрез сравняване на стойностите в третираните и контролните култури се препоръчват индексът на пролиферация при блокиране на цитокинезата (CBPI) (6) (27) (68) или индексът на репликация (RI) от поне 500 клетки на култура (вж. допълнение 2 за формули). Оценката на други показатели за цитотоксичност (напр. клетъчната цялост, апоптоза, некроза, метафазно преброяване, клетъчен цикъл) може да предостави полезна информация, но не следва да се използват като заместител на CBPI или RI.
                     При изследвания без цитоБ е необходимо да се докаже, че клетките в културата са преминали през делене, така че съществена част от преброените клетки са преминали през делене по време на третирането с изпитвания химикал или след него, като в противен случай могат да се получат неверни отрицателни отклици. За оценка на цитотоксичната и цитостатичната активност в дадено третиране се препоръчва измерването на относителното удвояване на популации (RPD) или на относителния ръст в количеството клетки (RICC) (17) (68) (69) (70) (71) (вж. допълнение 2 за формули). При удължени времена на пробовземане (напр. третиране с продължителност 1,5-2 пъти нормалната продължителност на клетъчния цикъл и събиране след още 1,5-2 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл, което води до времена на пробовземане, по-дълги от 3-4 пъти нормалната продължителност на клетъчния цикъл като цяло, както е описано в точки 38 и 39), RPD може да подцени цитотоксичността (71). При тези обстоятелства по-добро измерване може да се постигне с RICC, или оценката на цитотоксичността след 1,5-2 пъти нормалната продължителност на клетъчния цикъл би представлявала полезна прогнозна оценка. Оценката на други маркери за цитотоксичност или цитостаза (напр. клетъчната цялост, апоптоза, некроза, метафазно преброяване, индекс на пролиферация (PI), клетъчен цикъл, нуклеоплазмени мостове или нуклеотидни мостове) може да предостави допълнителна полезна информация, но не следва да се използва като заместител на RPD или на RICC.
                     Следва да бъдат оценени най-малко три концентрации на изпитване (без да се включват контролите на разтворител и положителните контроли), които отговарят на критериите за приемливост (подходяща цитотоксичност, брой на клетки и т.н.). Независимо от типа на клетките (клетъчни линии или първични култури от лимфоцити), при всяка изпитвана концентрация могат да се използват третирани култури с повторения или без повторение. Макар да се препоръчва използването на култури с повторение, използването на култури без повторение също е приемливо, при условие че е преброен същият общ брой клетки при културата без повторение и при културата с повторение. Използването на култури без повторение е от особено значение в случаите, когато се оценяват повече от 3 концентрации (виж точки 44-45). Резултатите, получени за културите с независими повторения при дадена концентрация, могат да бъдат обединени за анализа на данните. За изпитваните химикали, показващи слаба цитотоксичност, или не показващи цитотоксичност, обичайно са подходящи приблизително 2 до 3-кратни концентрационни интервали. Там, където се среща цитотоксичност, избраните изпитвани концентрации следва да са в обхват, в който се получава цитотоксичност, както е описано в точка 29, и да включват концентрации, при които има умерена, слаба и нулева цитотоксичност. Множество изпитвани химикали показват стръмни криви концентрация-отклик и за да се получат данни за слаба и умерена цитотоксичност, или за да се проучи подробно връзката доза-отклик, е необходимо да се използват по-близко разположени концентрации и/или над три концентрации (култури без повторение или с повторения), по-специално в ситуации, при които се изисква повтаряне на опита (вж. точка 60).
                     Ако максималната концентрация е базирана на цитотоксичност, най-високата концентрация следва да има за цел постигане на 55 ± 5 % цитотоксичност при използване на препоръчаните параметри за цитотоксичност (т.е. намаляване при RICC и RPD за клетъчни линии, когато не се използва цитоБ, и намаляване при CBPI или RI, когато се използва цитоБ до 45 ± 5 % от паралелната отрицателна контрола) (72). Трябва да се внимава при тълкуването на положителните резултати, които се срещат само в горния край на този диапазон 55 ± 5 % цитотоксичност (71).
                     За малко разтворимите изпитвани химикали, които не са цитотоксични при концентрации, по-ниски от най-ниската неразтворима концентрация, най-високата анализирана концентрация трябва да предизвиква помътняване или утайка, видима с невъоръжено око или с помощта на инвертен микроскоп в края на третирането с изпитвания химикал. Дори ако цитотоксичността се наблюдава над най-ниската неразтворима концентрация, препоръчително е да се извърши изпитване само при една концентрация, която предизвиква помътняване или е с видима утайка, тъй като от утайката могат да се получат изкуствено предизвикани въздействия. При концентрацията, водеща до образуването на утайка, трябва да се вземат мерки, за да се гарантира, че утайката не пречи на провеждането на изпитването (напр. оцветяване или преброяване). Определянето на разтворимостта в средата за отглеждане преди началото на опита може да се окаже полезно.
                     Ако не се наблюдава утайка или ограничаваща цитотоксичност, най-високата изпитвана концентрация следва да съответства на 10 mM, 2 mg/ml или 2 μl/ml, в зависимост от това коя от стойностите е най-ниска (73) (74) (75). Когато изпитваният химикал не е с определен състав, например вещество с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологични материали (UVCB) (76), екстракт от околната среда и др., може да е необходимо стойността на най-високата концентрация да е по-голяма (напр. 5 mg/ml), при липсата на достатъчна цитотоксичност, за да се увеличи концентрацията на всеки от компонентите. Следва да се отбележи обаче, че тези изисквания могат да се различават по отношение на фармацевтични продукти за хуманна употреба (93).
                     
                        Контроли
                     
                     Паралелните отрицателните контроли (вж. точка 21), състоящи се само от разтворител в средата за третиране, и третирани по същия начин като културите, които се третират, следва да се включат за всяко време на събиране.
                     Паралелните положителни контроли са необходими за доказване на способността на лабораторията за идентифициране на кластогени и анеугени при условията на използвания протокол за изпитването и на ефективността на екзогенната система за метаболитно активиране (когато е приложимо). Примери за положителни контроли са дадени в таблица 1 по-долу. Като положителни контроли могат да бъдат използвани алтернативни химикали, ако това е обосновано.
                     Понастоящем не са известни анеугени, които изискват метаболитно активиране на тяхната генотоксична активност (17). Използването на положителни контроли може да се ограничи до кластоген, изискващ метаболитно активиране, тъй като in vitro изпитванията върху клетки от бозайници са достатъчно стандартизирани за краткосрочно третиране, извършено паралелно с метаболитно активиране, или без метаболитно активиране, като се използва същата продължителност на третирането. В този случай отклик на кластогенна положителна контрола без повторение ще докаже както активността на дадена система за метаболитно активиране, така и способността на изпитваната система за генериране на отклик. Независимо от това, дългосрочното третиране (без S9) следва да има своя собствена положителна контрола, тъй като продължителността на третирането ще се различава от тази при изпитването, при което се използва метаболитно активиране. Ако за положителна контрола без повторение за краткотрайно третиране с метаболитно активиране и без метаболитно активиране е избран кластоген, следва да бъде избран анеуген за дългосрочното третиране без метаболитно активиране. В клетките с капацитет за метаболизиране, които не изискват S9, следва да се използват положителни контроли както за кластогенност, така и за анеугенност.
                     Всяка положителна контрола следва да бъде използвана при една или повече концентрации, които се очаква да породят възпроизводими и откриваеми увеличения спрямо фона, за да се докаже чувствителността на системата за изпитване (т.е. ефектите са ясни, но не разкриват непосредствено на четящото устройство идентичността на кодираните предметни стъкла), и откликът следва да не бъде накърнен от цитотоксичност, надхвърляща границите, посочени в настоящия метод за изпитване.
                     
                        Таблица 1.
                     
                     
                        Препоръчителни референтни химикали за оценка на пригодността на лабораторията и за подбор на положителни контроли
                     
                     
                                 Категория
                              
                              
                                 Химикал
                              
                              
                                 CASRN
                              
                           
                                 1.   Кластогени, активни без метаболитно активиране
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Метилов метансулфонат
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Митомицин С
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 4-Нитрохинолин-N-оксид
                              
                              
                                 56-57-5
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Цитозин арабинозид
                              
                              
                                 147-94-4
                              
                           
                                 2.   Кластогени, изискващи метаболитно активиране
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Бензо(a)пирен
                              
                              
                                 50-32-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Циклофосфамид
                              
                              
                                 50-18-0
                              
                           
                                 3.   Анеугени
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Колхицин
                              
                              
                                 64-86-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Винбластин
                              
                              
                                 143-67-9
                              
                           ПРОЦЕДУРА
                     
                        График на третиране
                     
                     За да се увеличи в максимална степен вероятността за откриване на анеуген или кластоген, действащ на конкретен стадий от клетъчния цикъл, е важно достатъчен брой клетки, представляващи всички различни стадии на техните клетъчни цикли, да са третирани с изпитвания химикал. Всички третирания следва да започват и приключват, докато клетките растат експоненциално, а клетките следва да продължат да нарастват до момента на вземането на пробата. Поради това графикът на третиране за клетъчните линии и първичните клетъчни култури може да се различава в известна степен от графика за лимфоцитите, които изискват митогенна стимулация, за да започнат своя клетъчен цикъл (17). За лимфоцитите най-ефикасният подход е започване на третирането с изпитвания химикал 44-48 часа след стимулиране с PHA, когато клетките ще се делят асинхронно (6).
                     Публикуваните данни (19), показват, че повечето анеугени и кластогени ще бъдат открити в рамките на краткосрочно третиране от 3 до 6 часа при наличие и в отсъствие на S9, последвано от отстраняване на изпитвания химикал и вземане на проби след време, равно на около 1,5-2 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането (7).
                     Независимо от това, за задълбочена оценка, която ще бъде необходима за заключение за отрицателни резултати, следва да са спазени всичките три от следните опитни условия с използване на краткосрочно третиране със и без метаболитно активиране и дългосрочно третиране без метаболитно активиране (вж. точки 56, 57 и 58):
                     
                                 —
                              
                              
                                 клетките следва да бъдат подложени на експозиция на изпитвания химикал без метаболитно активиране в продължение на 3 до 6 часа, и след време, равно на около 1,5-2 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането от тях следва да се вземе проба (19),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 клетките следва да бъдат подложени на експозиция на изпитвания химикал с метаболитно активиране в продължение на 3 до 6 часа, и след време, равно на около 1,5-2 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането от тях следва да се вземе проба (19),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 клетките следва да бъдат подложени на експозиция непрекъснато без метаболитно активиране до вземането на проба след време, равно на около 1,5-2 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл.
                              
                           В случай че някое от посочените по-горе опитни условия води до положителен отклик, може да не се наложи изследване на никоя от останалите схеми на третиране.
                     Ако е известно или се допуска, че изпитваният химикал засяга продължителността на клетъчния цикъл (напр. при изпитване на нуклеозидни аналози), особено за p53-компетентни клетки (35) (36) (77), периодите на вземане на проби или възстановяване могат да бъдат удължени най-много с още 1,5-2,0 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл (т.е. общо 3,0 до 4,0 пъти продължителността на клетъчния цикъл след началото на краткосрочно и дългосрочно третиране). Тези варианти са насочени към ситуации, при които е възможно да има опасения, свързани с възможните взаимодействия между изпитвания химикал и цитоБ. При използване на удължени времена на вземане на проби (т.е. време на култивиране 3,0 до 4,0 пъти продължителността на клетъчния цикъл) трябва да се вземат мерки да се гарантира, че клетките все още активно се делят. Например, за лимфоцитите експоненциалният растеж може да намалее 96 часа след стимулацията и може да се достигне до сливане на еднослойните клетъчни култури.
                     Предложените графици на третиране на клетките са обобщени в таблица 2. Тези общи графици на третиране могат да бъдат изменяни (и следва да бъдат обосновани) в зависимост от стабилността или реакционната способност на изпитвания химикал или конкретните характеристики на използваните клетки, свързани с растежа.
                     
                        Таблица 2.
                     
                     
                        Третиране на клетки и времена за събиране за изпитването MNvit
                     
                     
                                 Лимфоцити, първични клетки и клетъчни линии, третирани с цитоБ
                              
                              
                                 + S9
                                 Краткосрочно третиране
                              
                              
                                 Извършва се третиране за 3—6 часа при наличието на S9;
                                 отстраняват се S9 и средата, в която се извършва третирането;
                                 добавят се прясна среда и цитоБ;
                                 събира се след 1,5-2,0 пъти нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането.
                              
                           
                                 – S9
                                 Краткосрочно третиране
                              
                              
                                 Извършва се третиране за 3—6 часа;
                                 отстранява се средата, в която се извършва третирането;
                                 добавят се прясна среда и цитоБ;
                                 събира се след 1,5-2,0 пъти нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането.
                              
                           
                                 – S9
                                 Разширено третиране
                              
                              
                                 Извършва се третиране в продължение на 1,5—2 нормални цикъла при наличието на цитоБ;
                                 събира се в края на периода на третирането.
                              
                           
                                 Клетъчни линии третирани без цитоБ
                                 (Идентични на графиците на третиране, описани по-горе, с изключение на това, че не се добавя цитоБ.)
                              
                           При еднослойните култури е възможно в края на третирането с продължителност 3—6 часа да присъстват митотични клетки (които се идентифицират като кръгли и отделящи се от повърхността). Тъй като тези митотични клетки се отделят лесно, те могат да се загубят при отстраняването на средата, съдържаща изпитвания химикал. Ако има доказателство за съществено увеличаване на броя на митотичните клетки в сравнение с контролите, вероятно указващо на блокиране на митозата, тогава клетките следва да се събират чрез центрофугиране и да се добавят обратно към културите, за да се избегне загубата на клетки, които са в митоза и са подложени на риск от микроядра/хромозомни аберации в момента на събирането.
                     
                        Събиране на клетки и подготовка на предметните стъкла
                     
                     Всяка култура следва да се събира и обработва отделно. Подготовката на клетките може да включва хипотонично третиране, но този етап не е необходим, ако е постигнато достатъчно разстилане на клетките по друг начин. В подготовката на предметните стъкла могат да бъдат използвани различни техники, при условие че са получени висококачествени клетъчни препарати за преброяване. Клетките с интактни клетъчна мембрана и цитоплазма следва да бъдат запазени, за да се даде възможност за откриването на микроядра и (при метода с блокиране на цитокинезата) и за надеждното идентифициране на двуядрените клетки.
                     Предметните стъкла могат да бъдат оцветявани чрез използване на различни методи, като Giemsa или флуоресцентни специфични оцветители за ДНК. Използването на подходящи оцветители (напр. акридиново оранжево (78) или Хьохст 33258 плюс пиронин-Y (79)) може да елиминира някои от артефактите, свързани с използването на оцветител, който не е специфичен за ДНК. Анти-кинетохорни антитела, FISH с панцентромерни ДНК сонди или in situ белязване с панцентромерно-специфични праймери, заедно с подходящо контрастно оцветяване на ДНК, могат да бъдат използвани за идентифициране на съдържанието (целите хромозоми ще бъдат оцветени, докато ацентричните хромозомни фрагменти няма да бъдат) на микроядрата, ако механистичната информация за тяхното образуване представлява интерес (16) (17). Могат да бъдат използвани и други методи за разграничаване на кластогените от анеугените, ако те са се доказали като ефективни и ако са валидирани. Например за определени клетъчни линии измерванията на суб-2N ядра като хиподиплоидни, използвайки технологии като напр. анализ на изображения, цитометрия с лазерно сканиране или поточна цитометрия, също така биха могли да предоставят полезна информация (80) (81) (82). Морфологичното наблюдение на ядрата също може да предостави индикации за възможна анеуплоидия. Освен това, изпитване за метафазни хромозомни аберации, за предпочитане в същия тип клетки и с протокол със сравнима чувствителност, би могло също да бъде полезен начин за определяне дали микроядрата се дължат на разкъсване на хромозоми (като се знае, че хромозомна загуба не би била открита в изпитването за хромозомни аберации).
                     
                        Анализ
                     
                     Всички предметни стъкла, включително тези за разтворителя и за нетретираните (ако се използват) и положителните контроли, следва да се кодират независимо преди микроскопския анализ на честотата на микроядрата. Когато се използва автоматизирана система за преброяване, например поточна цитометрия, цитометрия с лазерно сканиране или анализ на изображения, следва да се използват подходящи техники за контрол на всяко изместване или дрейф, Независимо че за преброяване на микроядрата се използва автоматична платформа, паралелно следва да се оценяват CBPI, RI, RPD, или RICC.
                     При култури, третирани с цитоБ, честотата на микроядрата следва да бъде анализирана при поне 2 000 двуядрени клетки на концентрация и контрола (83), разделени поравно между повторенията, ако се използват повторения. В случай на една култура на доза без повторение (вж. точка 28), в тази култура следва да бъдат преброени поне 2 000 двуядрени клетки на култура (83). Ако за преброяване при всяка концентрация са налични съществено по-малко от 1 000 двуядрени клетки на култура (за култури с повторения), или по-малко от 2 000 (при една култура без повторение), и ако не е открито съществено увеличение на микроядрата, изпитването следва да бъде повторено с използване на повече клетки или при по-малко цитотоксични концентрации, което от двете е уместно. Трябва да се внимава да не се преброяват двуядрени клетки с неправилна форма или такива, в които двете ядра се различават в голяма степен по размер. Освен това, двуядрените клетки не следва да се бъркат с недобре разнесените многоядрени клетки. Клетките, които съдържат повече от две основни ядра, следва да не бъдат анализирани за наличието на микроядра, тъй като базовата честота на микроядрата може да бъде по-висока при тези клетки (84). Преброяването на едноядрените клетки е приемливо, ако е доказано, че изпитваният химикал оказва влияние върху активността на цитоБ. В подобни случаи може да е полезно изпитване без цитоБ с повторение. Преброяването на едноядрени клетки в допълнение към двуядрените клетки може да предостави полезна информация (85) (86), но не е задължително.
                     При клетъчни линии, изпитвани без третиране с цитоБ, микроядрата следва да се преброят поне в 2 000 клетки на изпитвана концентрация и контрола (83), разделени поравно между повторенията, ако се използват повторения. Когато се използва култура без повторение на концентрация (вж. точка 28), в тази култура без повторение следва да се преброят най-малко 2 000 клетки на култура. Ако за преброяване при всяка концентрация са налични съществено по-малко от 1 000 клетки на култура (за култури с повторения) или по-малко от 2 000 (при една култура без повторение), и ако не е открито съществено увеличение на микроядрата, изпитването следва да бъде повторено с използване на повече клетки или при по-малко цитотоксични концентрации, което от двете е уместно.
                     Когато се употребява цитоБ, за оценка на пролиферацията на клетките (вж. допълнение 2) следва да бъдат определени CBPI или RI, като се използват поне 500 клетки на култура. Когато третиранията се извършват в отсъствие на цитоБ от съществено значение е да бъдат предоставени доказателства, че клетките в културата са преминали през делене, както е обсъдено в точки 24—28.
                     
                        Пригодност на лабораторията
                     
                     За да се натрупа достатъчно опит по отношение на изследването преди използването му за рутинно изпитване, лабораторията следва да е извършила поредица опити с положителни референтни химикали, действащи чрез различни механизми (най-малко по един със и един без метаболитно активиране, както и един действащ чрез анеугенен механизъм, избрани от химикалите, изброени в таблица 1) и различни отрицателни контроли (включително нетретирани култури и различни разтворители/носители). Положителният и отрицателният отклик при контролите следва да съответства на литературата. Това не се прилага за лаборатории, които разполагат с опит, т.е. които разполагат с налична база данни за предходни периоди, както е определено в точки 49—52.
                     Подбрани химикали за положителни контроли (вж. таблица 1) следва да бъдат изследвани с краткосрочно и дългосрочно третиране в отсъствието на метаболитно активиране, и също така с краткосрочно третиране с метаболитно активиране за доказване на пригодността за откриване на кластогенни и анеугенни химикали и за определяне на ефективността на системата за метаболитно активиране и за доказване на целесъобразността на процедурите за преброяване (микроскопски визуален анализ, поточна цитометрия, цитометрия с лазерно сканиране или анализ на изображения). Следва да бъде избран обхват от концентрации на химикалите от подбора така, че да се получават възпроизводими и свързани с концентрацията увеличения над фоновите стойности с цел да се демонстрират чувствителността и динамичният обхват на системата за изпитване.
                     
                        Данни за контролите за предходни периоди
                     
                     Лабораторията следва да установи:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Размах и разпределение при положителните контроли от предходни периоди,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Размах и разпределение при отрицателните (без третиране и за разтворител) контроли от предходни периоди.
                              
                           При първото придобиване на данни за разпределението при отрицателните контроли от предходни периоди паралелните отрицателни контроли следва да бъдат съобразени с публикуваните данни за отрицателните контроли, когато такива са налице. При добавяне на повече опитни данни към разпределението при контролите паралелните отрицателни контроли следва в идеалния случай да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % на това разпределение (87) (88). Базата данни с отрицателни контроли от предходни периоди на лабораторията следва първоначално да се създаде с минимум 10 опита, но е за предпочитане тя да се състои най-малко от 20 опита, проведени при сравними опитни условия. Лабораториите трябва да използват методи за контрол на качеството, като например контролни карти (напр. C-карти или карти за средна стойност (X-bar) (88)), за определяне на варирането на данните им за положителните и отрицателните контроли, и за доказване, че методологията е „под контрол“ в техните лаборатории (83). В литературата (87) могат да се намерят допълнителни препоръки относно начина на създаване и използване на данни от предходни периоди (т.е. критерии за включване и изключване на данни в данните за предходни периоди и критериите за приемливост за даден опит).
                     Всички промени в опитния протокол следва да бъдат разглеждани от гледна точка на съгласуваността на данните със съществуващите бази данни на дадената лаборатория за контролите за предходни периоди. Всички значителни несъответствия следва да водят до създаването на нова база данни за контролите за предходни периоди.
                     Данните за отрицателните контроли следва да включват броя на клетките с микроядра при култури без повторение или сбора за културите с повторения, както е описано в точка 28. Паралелните отрицателни контроли в идеалния случай следва да бъдат в рамките на граници за контрол 95 % от разпределението от базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди (87) (88). Когато данните за паралелните отрицателни контроли попадат извън 95 %-ните граници за контрол, те могат да бъдат приемливи за включване в разпределението при контролите от предходни периоди, при условие че тези данни не са екстремални стойности, силно различаващи се от нормалните, и има доказателства, че системата за изпитване е „под контрол“ (вж. точка 50), както и доказателства за липса на техническа или човешка грешка.
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Представяне на резултатите
                     
                     Ако се използва техниката на блокиране на цитокинезата, в оценката на индуцирането на микроядра се използват само честотите на двуядрените клетки с микроядра (независимо от броя на микроядрата в една клетка). Преброяването на броя на клетките с едно, две или повече микроядра може да се протоколира отделно и може да предостави полезна информация, но не е задължително.
                     Следва да се определят паралелните измервания на цитотоксичността и/или цитостазата за всички третирани култури, за отрицателните и положителните контролни култури (16). Следва да бъдат изчислени CBPI или RI за всички третирани и контролни култури като измервания на забавяне на клетъчния цикъл, когато се използва методът на блокиране на цитокинезата. В отсъствие на цитоБ следва да бъдат използвани RPD или RICC (вж. допълнение 2).
                     Следва да се предоставят данни за отделните култури. В допълнение към това всички данни следва да бъдат обобщени в табличен вид.
                     
                        Критерии за приемливост
                     
                     Приемливостта на дадено изпитване се основава на следните критерии:
                     
                                 —
                              
                              
                                 паралелната отрицателна контрола се смята за приемлива за допълване към базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди, както е описано в точка 50.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Паралелните положителни контроли (вж. точка 50) трябва да предизвикват отклици, които са съвместими с генерираните в базата данни за положителните контроли за предходни периоди, и да генерират статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Критериите за клетъчна пролиферация в контролата на разтворител трябва да бъдат спазени (точки 25—27).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Всичките опитни условия са били подложени на изпитване, освен ако едно от тях е довело до положителни резултати (точки 36—40).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Достатъчен брой клетки и концентрации са годни за анализ (точки 28 и 44—46).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Критериите за избор на най-високата концентрация са съвместими с описаните в точки 24—31.
                              
                           
                        Оценка и тълкуване на резултатите
                     
                     При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно положителен, ако в някое от изследваните опитни условия (вж. точки 36—39):
                     
                                 —
                              
                              
                                 при най-малко една от изпитваните концентрации се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола (89),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 увеличението е свързано с дозата при поне едно опитно условие, при оценка, извършена с подходящ трендов тест (вж. точка 28),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 някой от резултатите е извън разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %; вж. точка 52).
                              
                           Ако всички тези критерии са изпълнени се смята, че изпитваният химикал може да предизвика хромозомни разкъсвания и/или загуба или допълнително наличие в тази система за изпитване. Препоръки за най-подходящите статистически методи могат да се намерят в литературните източници (90) (91) (92).
                     При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно отрицателен, ако във всички изследвани опитни условия (вж. точки 36—39):
                     
                                 —
                              
                              
                                 в никоя от изпитваните концентрации не се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 няма увеличение, свързано с дозата при оценка, извършена с подходящ трендов тест,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 всички резултати са в рамките на разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди (напр. на основата на разпределение на Поасон с граници за контрол 95 %; вж. точка 52).
                              
                           Тогава се смята, че изпитваният химикал не може да предизвика хромозомни разкъсвания и/или загуба или допълнително наличие в тази система за изпитване. Препоръки за най-подходящите статистически методи могат да се намерят в литературните източници (90) (91) (92).
                     Няма изискване за потвърждаване на ясно положителен или ясно отрицателен отклик.
                     В случай че откликът не е нито ясно отрицателен, нито ясно положителен, както е описано по-горе, или с цел подпомагане на установяването на биологичната относимост на даден резултат, данните следва да се оценяват чрез експертна оценка и/или чрез допълнителни изследвания. Преброяването на допълнителни клетки (когато е уместно) или извършването на опит с повторение с възможност за използване на изменени опитни условия [напр. интервал на разполагане на концентрациите, други условия на метаболитно активиране (т.е. концентрация на S9 или произход на S9)] може да се окажат от полза.
                     В редки случаи дори след допълнителни изследвания наборът от данни не позволява стигането до заключение за положителни или отрицателни резултати и следователно се заключава, че е неясен.
                     Изпитваните химикали, които индуцират микроядра в изпитването MNvit, постигат това, като предизвикват хромозомни разкъсвания, хромозомни загуби или комбинация от двете. Последващият анализ, при който се използват антикинетохорни антитела, специфични за центромерата in situ сонди или други методи, може да бъде използван за определяне дали механизмът за индуциране на микроядра се дължи на кластогенна и/или анеугенна активност.
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитван химикал:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             източник, номер на партидата, крайна дата за употреба, ако има такава;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             стабилност на самия изпитван химикал, ако е известна;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             реакционна способност на изпитвания химикал с разтворителя/носителя или средата за клетъчните култури.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             разтворимост и стабилност на изпитвания химикал в разтворител, ако са известни.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             измерване на рН, осмолалитет и утайка в средата за отглеждане, към която е добавен изпитваният химикал, когато е уместно.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Вещество с една съставка:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             химична идентификация, като наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, SMILES или InChI код, структурна формула, чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и др.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Вещество с повече съставки, UVCB и смеси:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             характеризирани, доколкото е възможно, от химическата идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Разтворител:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка на избора на разтворител;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             процентно съдържание на разтворителя в окончателната среда за отглеждане.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Клетки:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             тип и източник на използваните клетки;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             дали използваният тип клетки е подходящ;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за клетъчни линии — отсъствие на микоплазма;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за клетъчни линии — информация за продължителността на клетъчния цикъл или индекса на пролиферация;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             при използване на лимфоцити — пол на кръвните донори, възраст и всякаква относима информация по отношение на донор, цяла кръв или изолирани лимфоцити, използван митоген;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             нормално (отрицателна контрола) време на клетъчен цикъл;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за клетъчни линии — брой пасажи, ако е наличен;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за клетъчни линии — методи за поддържане на клетъчните култури;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за клетъчни линии — модален брой на хромозомите;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Условия на изпитване:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             идентичност на блокера на цитокинезата (напр. цитоБ), ако се използва такъв, неговата концентрация и времетраене на експозицията на клетките;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             концентрация на изпитвания химикал, изразена като крайна концентрация в средата за отглеждане (напр. μg или mg/ml или mM от среда за отглеждане);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка за избора на концентрации и броя на култури, включително данни за цитотоксичността и граници на разтворимост;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             състав на средите, концентрация на CO2, ако е приложимо, влажност;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             концентрация (и/или обем) на разтворителя и изпитвания химикал, добавени в средата за отглеждане;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             температура и време на инкубация;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             времетраене на третирането;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             време на събиране след третирането;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             гъстота на клетките при посяване, ако е приложимо;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             тип и състав на системата за метаболитно активиране (източник на S9, метод на приготвяне на S9 микса, концентрация или обем на S9 микса и S9 в окончателната среда за отглеждане, контрол на качеството на S9, напр. ензимна активност, стерилност, метаболитен капацитет);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             химикали за положителни и отрицателни контроли, крайни концентрации и продължителности на третиранията и периоди на възстановяване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи на подготовка на предметните стъкла и използвана техника на оцветяване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             критерии за преброяване на клетки с микроядра (подбор на годни за анализ клетки и идентификация на микроядрата);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             брой на анализираните клетки;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи за измерване на цитотоксичността;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             всякаква допълнителна информация, относима към цитотоксичността и използвания метод;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             критерии за считане на изследванията за положителни, отрицателни или неясни;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             използван(и) метод(и) за статистически анализ;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи, като използване на анти-кинетохорни антитела или панцентромерни сонди, за определяне дали микроядрата съдържат цели хромозоми или хромозомни фрагменти, ако е приложимо;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи, използвани за определяне на pH, осмолалитета и утайката.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Резултати:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             определяне на приемливи клетки за анализ;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за клетъчни линии, в отсъствие на цитоБ — броят на третираните клетки и броят на събраните клетки за всяка култура;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             използвано измерване на цитотоксичността, напр. CBPI или RI в случай че се използва метод на блокиране на цитокинезата; RICC или RPD, когато не се използват методи на блокиране на цитокинезата; други наблюдения (напр. клетъчно сливане, апоптоза, некроза, преброяване на метафази, честота на двуядрените клетки);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             признаци на утаяване и час на определяне;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни за рН и осмолалитета на средата на третиране, ако са определени;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             разпределението на едноядрените, двуядрените и многоядрените клетки, ако се използва метод на блокиране на цитокинезата;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             брой на клетките с микроядра, даден отделно за всяка третирана и контролна култура, като по целесъобразност се посочва дали са от двуядрени или едноядрени клетки;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             зависимостта концентрация—отклик, където е възможно;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни от паралелни отрицателни (разтворител) и положителни контроли (концентрации и разтворители);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни от отрицателни (разтворител) и положителни контроли за предходни периоди, с размах, средни стойности и стандартно отклонение и 95 % граници за контрол за разпределението, както и брой данни;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             статистически анализ; p-стойности, ако има такива;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обсъждане на резултатите.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Заключения.
                                 
                              
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. (1997). Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 1-4.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Parry, J.M., A. Sors (1993). The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project. Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 3-15.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1985). Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay. Cytobios, Vol. 43/172-173, pp. 233-246.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2000). Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 167-172.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Fenech, M. (2007). Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols, Vol. 2/5, pp. 1084-1104.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1986). Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation. Mutation Research, Vol. 161/2, pp. 193-198.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Eastmond, D.A., J.D. Tucker (1989). Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 13/1, pp. 34-43.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Eastmond, D.A., D. Pinkel (1990). Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probe. Mutation Research, Vol. 234/5, pp. 9-20.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Miller, B.M. et al. (1991). Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA. Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297-302.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Farooqi, Z., F. Darroudi, A. T. Natarajan (1993). The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes. Mutagenesis, Vol. 8/4, pp. 329-334.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Migliore, L. et al. (1993). Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe. Mutation Research, Vol. 319/3, pp. 205-213.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Norppa, H., L. Renzi, C. Lindholm (1993). Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization. Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 519-525.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Eastmond, D.A, D.S. Rupa, L.S. Hasegawa (1994). Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes. Mutation Research, Vol. 322/1, pp. 9-20.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Marshall, R.R. et al. (1996). Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy. Mutation Research, Vol. 372/2, pp. 233-245.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Zijno, P. et al. (1996). Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes. Mutation Research, Vol. 372/2, 211-219.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders et al. (2003). Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research, Vol. 540/2, pp. 153-163.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Глава Б.10 от настоящото приложение: Тест in vitro за хромозомни аберации при бозайници.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2006). SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 13-36.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Clare, G. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 37-60.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Aardema, M.J. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 61-87.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Wakata, A. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 88-124.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Oliver, J. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 125-152.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Albertini, S. et al. (1997). Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 187-208.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Miller, B. et al. (1997). Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 45-59.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Miller, B. et al. (1998). Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Research, Vol. 410, pp. 81-116.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Kalweit, S. et al. (1999). Chemically induced micronucleus formation in V79 cells — comparison of three different test approaches. Mutation Research, Vol. 439/2, pp. 183-190.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 Kersten, B. et al. (1999). The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity. Mutation Research, Vol. 445/1, pp. 55-71.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 von der Hude, W. et al. (2000). In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells — results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances. Mutation Research, Vol. 468/2, pp. 137-163.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Garriott, M.L., J.B. Phelps, W.P. Hoffman (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Research, Vol. 517/1-2, pp. 123-134.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1999). Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU). Mutagenesis, Vol. 14/6, pp. 569-580.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Elhajouji, A., E. Lorge (2006). Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 1-152.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Kirkland, D. (2010). Evaluation of different cytotoxic and cytostatic measures for the in vitromicronucleus test (MNVit): Introduction to the collaborative trial. Mutation Research, Vol. 702/2, pp. 139-147.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Hashimoto K. et al. (2011). Comparison of four different treatment conditions of extended exposure in the in vitro micronucleus assay using TK6 lymphoblastoid cells. Regulatory Toxicology and Pharmacology, Vol. 59/1, pp. 28-36.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Honma, M., M. Hayashi (2011). Comparison of in vitro micronucleus and gene mutation assay results for p53-competent versus p53-deficient human lymphoblastoid cells. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/5, pp. 373-384.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Zhang, L.S. et al. (1995). A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test. Mutation Research Letters, Vol. 347/3-4, pp. 105-115.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 ECVAM (2006). Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 November 2006, На разположение на адрес: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 ESAC (2006). ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. На разположение на адрес: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Corvi, R. et al. (2008). ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT). Mutagenesis, Vol 23/4, pp. 271-283.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 ILSI paper (draft). Lorge, E., M.M. Moore, J. Clements, M. O'Donovan, M. Honma, A. Kohara, J. van Benthem, S. Galloway, M.J. Armstrong, A. Sutter, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Young-Tannir. Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. Mutation Research.
                                 
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1991). International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Research, Vol. 257/2, pp. 147-205.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Morita, T. et al. (1992). Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells. Mutation Research, Vol. 268/2, pp. 297-305.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 Brusick, D. (1986). Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations. Environmental Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789-886.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Long, L.H. et al. (2007). Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium. Mutation Research, Vol. 634/1-2, pp. 177-183.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Nesslany, F. et al. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environmental and Molecular Mutation., Vol. 49, pp. 439-452.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1985). Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutation Research, Vol. 147/1-2, pp. 29-36.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Fenech, M. (1997). The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method. Mutation Research, Vol. 392, pp. 11-18.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 Payne, C.M. et al. (2010). Hydrophobic bile acid-induced micronuclei formation, mitotic perturbations, and decreases in spindle checkpoint proteins: relevance to genomic instability in colon carcinogenesis. Nutrition and Cancer, Vol. 62/6, pp. 825-840.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Bazin, E. et al. (2010). Genotoxicity of a Freshwater Cyanotoxin,Cylindrospermopsin, in Two Human Cell Lines: Caco-2 and HepaRG. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 51/3, pp. 251-259.
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 Le Hegarat, L. et al. (2010). Assessment of the genotoxic potential of indirect chemical mutagens in HepaRG cellsby the comet and the cytokinesis-block micronucleus assays. Mutagenesis, Vol. 25/6, pp. 555-560.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 Josse, R. et al. (2012). An adaptation of the human HepaRG cells to the in vitro micronucleus assay. Mutagenesis, Vol. 27/3, pp. 295-304.
                              
                           
                                 (52)
                              
                              
                                 Ehrlich, V. et al. (2002). Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells. Mutagenesis, Vol. 17/3, pp. 257-260.
                              
                           
                                 (53)
                              
                              
                                 Knasmüller, S. et al. (2004). Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge. Toxicology, Vol. 198/1-3, pp. 315-328.
                              
                           
                                 (54)
                              
                              
                                 Gibson, D.P. et al. (1997). Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 61-70.
                              
                           
                                 (55)
                              
                              
                                 Bonassi, S. et al. (2001). HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 37/1, pp. 31-45.
                              
                           
                                 (56)
                              
                              
                                 Maron, D.M., B.N. Ames (1983). Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research, Vol. 113/3-4, pp. 173-215.
                              
                           
                                 (57)
                              
                              
                                 Ong, T.-m. et al. (1980). Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver. Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55-65.
                              
                           
                                 (58)
                              
                              
                                 Elliott, B.M. et al. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, Vol. 7, pp. 175-177.
                              
                           
                                 (59)
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1976). „A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems“, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing. de Serres, F.J. et al. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
                              
                           
                                 (60)
                              
                              
                                 Johnson, T.E., D. R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996). Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28, pp. 51-59.
                              
                           
                                 (61)
                              
                              
                                 UNEP (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). На разположение на адрес: http://www.pops.int/
                              
                           
                                 (62)
                              
                              
                                 Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987). Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes. Mutation Research, Vol.190/3, pp. 225-8.
                              
                           
                                 (63)
                              
                              
                                 Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982). „CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids“, in Genotoxic Effects of Airborne Agents. Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91-103.
                              
                           
                                 (64)
                              
                              
                                 Zamora, P.O. et al. (1983). Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay. Environmental Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795-801.
                              
                           
                                 (65)
                              
                              
                                 Asakura, M. et al. (2008). An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay. Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122-130.
                              
                           
                                 (66)
                              
                              
                                 Fenech, M. (1993). The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutation Research, Vol. 285/1, pp. 35-44.
                              
                           
                                 (67)
                              
                              
                                 Phelps, J.B., M.L. Garriott, W.P. Hoffman (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Research, Vol. 521/1-2, pp. 103-112.
                              
                           
                                 (68)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2004). Corrigendum to „Report from the in vitro micronucleus assay working group“. Mutation Research, 564, 97-100.
                              
                           
                                 (69)
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2008). Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects. Mutation Research, Vol. 655/1-2, pp. 1-3.
                              
                           
                                 (70)
                              
                              
                                 Surralles, J. et al. (1995). Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research, Vol. 341/3, pp. 169-184.
                              
                           
                                 (71)
                              
                              
                                 Honma, M. (2011). Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test. Mutation Research, Vol. 724, pp. 86-87.
                              
                           
                                 (72)
                              
                              
                                 Pfuhler, S. et al. (2011). In vitro genotoxicity test approaches with better predictivity: Summary of an IWGT workshop. Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 101-107.
                              
                           
                                 (73)
                              
                              
                                 OECD (2014). Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). ENV/JM/TG(2014)17. На разположение при поискване.
                              
                           
                                 (74)
                              
                              
                                 Morita T., M. Honma, K. Morikawa (2012). Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity. Mutation Research, Vol. 741, pp. 32-56.
                              
                           
                                 (75)
                              
                              
                                 Brookmire L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the in vitro Chromosome Aberrations Assay. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/1, pp. 36-43.
                              
                           
                                 (76)
                              
                              
                                 EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances. http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.
                              
                           
                                 (77)
                              
                              
                                 Sobol, Z. et al. (2012). Development and validation of an in vitro micronucleus assay platform in TK6 cells. Mutation Research, Vol.746/1, pp. 29-34.
                              
                           
                                 (78)
                              
                              
                                 Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 241-247.
                              
                           
                                 (79)
                              
                              
                                 MacGregor, J. T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269-275.
                              
                           
                                 (80)
                              
                              
                                 Bryce, S.M. et al. (2011). Miniaturized flow cytometry-based CHO-K1 micronucleus assay discriminates aneugenic and clastogenic modes of action. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/4, pp. 280–286.
                              
                           
                                 (81)
                              
                              
                                 Nicolette, J. et al. (2011). in vitro micronucleus screening of pharmaceutical candidates by flow cytometry in Chinese hamster V79 cells. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/5, pp. 355–362.
                              
                           
                                 (82)
                              
                              
                                 Shi, J., R. Bezabhie, A. Szkudlinska (2010). Further evaluation of a flow cytometric in vitro micronucleus assay in CHO-K1 cells: a reliable platform that detects micronuclei and discriminates apoptotic bodies. Mutagenesis, Vol. 25/1, pp. 33-40.
                              
                           
                                 (83)
                              
                              
                                 OECD (2014). Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines. OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on testing and assessment, No.198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (84)
                              
                              
                                 Fenech, M. et al. (2003). HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research, Vol. 534/1-2, pp. 65-75.
                              
                           
                                 (85)
                              
                              
                                 Elhajouji, A., M. Cunha, M. Kirsch-Volders (1998). Spindle poisons can induce polyploidy by mitotic slippage and micronucleate mononucleates in the cytokinesis-block assay. Mutagenesis, Vol. 13/2, pp. 193-8.
                              
                           
                                 (86)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2011). The in vitro MN assay in 2011: origin and fate, biological significance, protocols, high throughput methodologies and toxicological relevance. Archives of Toxicology, Vol. 85/8, pp. 873-99.
                              
                           
                                 (87)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2010). Compilation and use of genetic toxicity historical control Data. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol.723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (88)
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000). Statistical Methods for Quality Improvement. 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (89)
                              
                              
                                 Hoffman, W.P., M.L. Garriott, C. Lee (2003). „In vitro micronucleus test“, in Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, 2nd ed. Chow, S. (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, pp. 463-467.
                              
                           
                                 (90)
                              
                              
                                 Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed. John Wiley & Sons, New York.
                              
                           
                                 (91)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987). Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.
                              
                           
                                 (92)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989). Analysis of Data from in vitro Cytogenetic Assays. in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
                              
                           
                                 (93)
                              
                              
                                 International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                           
                              Анеуген
                           : всеки химикал или процес, който води до анеуплоидия в клетките или организмите чрез взаимодействие с компонентите на митотичния и мейотичния цикъл на клетъчно делене.
                        
                           
                              Анеуплоидия
                           : всяко отклонение от обичайния диплоиден (или хаплоиден) брой на хромозомите с една или повече от една хромозома, но не и с цял набор (или набори) от хромозоми (полиплоидия).
                        
                           
                              Апоптоза
                           : програмирана клетъчна смърт, характеризираща се с редица етапи, водещи до разпадане на клетките на мембранносвързани частици, които впоследствие се елиминират чрез фагоцитоза или фрагментация.
                        
                           
                              Клетъчна пролиферация
                           : увеличение на броя на клетките в резултат на митотично клетъчно делене.
                        
                           
                              Центромера
                           : областта от ДНК в хромозомата, в която се свързват двете хроматиди и върху която двете кинетохори са прикрепени една до друга.
                        
                           
                              Химикал
                           : вещество или смес.
                        
                           
                              Концентрации
                           : отнася се за крайните концентрации на изпитвания химикал в средата за отглеждане.
                        
                           
                              Кластоген
                           : всеки химикал, който причинява структурни хромозомни аберации в популации от клетки или еукариотни организми.
                        
                           
                              Цитокинеза
                           : процесът на клетъчно делене, който следва непосредствено след митозата, и в резултат на който се образуват две дъщерни клетки, всяка от които съдържа едно ядро.
                        
                           
                              Индекс на пролиферация при блокиране на цитокинезата (CBPI)
                           : отношението на клетките от второто делене в третираната популация спрямо нетретираната контрола (вж. допълнение 2 за формула).
                        
                           
                              Цитостаза
                           : потискане на растежа на клетките (вж. допълнение 2 за формула).
                        
                           
                              Цитотоксичност
                           : за изследванията, обхванати от настоящия метод за изпитване, извършвани в присъствието на цитохалазин Б, цитотоксичността се определя като намаляване на индекса на пролиферация при блокиране на цитокинезата (CBPI) или на индекса на репликация (RI) на третираните клетки в сравнение с отрицателната контрола (вж. точка 26 и допълнение 2).
                        за изследванията, обхванати от настоящия метод за изпитване, извършвани в отсъствието на цитохалазин Б, цитотоксичността се определя като намаляване на относителното удвояване на популации (RPD) или относителния ръст в количеството клетки (RICC) на третираните клетки в сравнение с отрицателната контрола (вж. точка 27 и допълнение 2).
                        
                           
                              Генотоксичен
                           : общ термин, обхващащ всички видове увреждания на ДНК или на хромозоми, включително разкъсвания, делеции, адукти, изменения на нуклеотиди и връзки, прегрупирания, генни мутации, хромозомни аберации и анеуплоидия. Не всички типове генотоксични ефекти водят до мутации или трайно увреждане на хромозомите.
                        
                           
                              Интерфазни клетки
                           : клетки, които не са в митоза.
                        
                           
                              Кинетохора
                           : структура, съдържаща белтък, свързана с центромерата на хромозомата, с която нишките на делителното вретено се свързват по време на клетъчното делене, като така позволяват методично придвижване на дъщерните хромозоми към полюсите на дъщерните клетки.
                        
                           
                              Микроядра
                           : малки ядра, отделни от главното ядро на клетките и в допълнение към него, получени по време на телофазата на митозата или мейозата чрез изоставащи хромозомни фрагменти или цели хромозоми.
                        
                           
                              Митоза
                           : делене на клетъчното ядро, обикновено разделено на профаза, прометафаза, метафаза, анафаза и телофаза.
                        
                           
                              Митотичен индекс
                           : отношението на клетките в метафаза, разделени на общия брой клетки, наблюдавани в дадена клетъчна популация; показател за степента на пролиферация на тази популация.
                        
                           
                              Мутагенен
                           : води до наследствена промяна на ДНК последователност(и) на базовите двойки в гени, или на структурата на хромозоми (хромозомни аберации).
                        
                           
                              Неспособност за отделяне
                           : неспособност на двойката хроматиди да се отделят една от друга и правилно да се разделят, за да се обособят в развиващите се дъщерни клетки, в резултат на което се получават дъщерни клетки с анормален брой хромозоми.
                        
                           
                              Статус на p53
                           : Белтъкът p53 е включен в регулирането на клетъчния цикъл, апоптозата и поправката на ДНК. Клетките с дефицит на функционалния белтък p53, неспособни да блокират клетъчния цикъл или да елиминират увредените клетки чрез апоптоза или чрез други механизми (напр. предизвикване на поправка на ДНК), свързани с функциите на p53, в отговор на увреждане на ДНК, следва теоретично да са по-податливи на генни мутации или хромозомни аберации.
                        
                           
                              Полиплоидия
                           : бройни хромозомни аберации в клетки или организми, включващи цял набор(и) от хромозоми в противовес на отделна хромозома или хромозоми (анеуплоидия).
                        
                           
                              Индекс на пролиферация (PI)
                           : метод за измерване на цитотоксичността, когато не се използва цитоБ (вж. Допълнение 2 за формула).
                        
                           
                              Относителен ръст в количеството клетки (RICC)
                           : метод за измерване на цитотоксичността, когато не се използва цитоБ (вж. Допълнение 2 за формула).
                        
                           
                              Относително удвояване на популации (RPD)
                           : метод за измерване на цитотоксичността, когато не се използва цитоБ (вж. Допълнение 2 за формула).
                        
                           
                              Индекс на репликация (RI)
                           : отношението на циклите на клетъчно делене, през които е преминала третирана култура, към нетретираната контрола по време на периода на експозиция и възстановяване (вж. Допълнение 2 за формула).
                        
                           
                              S9 фракция от черен дроб
                           : супернатант от хомогенат на черен дроб след центрофугиране при 9 000 g, т.е. необработен екстракт от черен дроб.
                        
                           
                              S9 микс
                           : микс от S9 фракцията от черен дроб и кофактори, необходими за метаболитна ензимна активност.
                        
                           
                              Контрола на разтворител
                           : общ термин за определяне на контролните култури, които са само на разтворителя, който се използва за разтваряне на изпитвания химикал.
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                        
                           
                              Нетретирана контрола
                           : култури, които не се третират (т.е. без изпитвания химикал и без разтворител), но се обработват паралелно по същия начин като културите, които се третират с изпитвания химикал.
                     
                     
                        Допълнение 2
                        
                           ФОРМУЛИ ЗА ОЦЕНКА НА ЦИТОТОКСИЧНОСТТА
                        
                        
                           
                              
                                 Когато се използва цитоБ
                              
                           , оценката на цитотоксичността следва да бъде основавана на индекса на пролиферация при блокиране на цитокинезата (CBPI) или на индекса на репликация (RI) (17) (69). CBPI посочва средния брой ядра на клетка и може да бъде използван за изчисляване на пролиферацията на клетките. RI посочва относителния брой на клетъчните цикли за клетка по време на периода на експозиция на цитоБ в третирани култури в сравнение с контролните култури и може да бъде използван за изчисляване на % на цитостаза:
                        % на цитостаза = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}
                        и:
                        
                                    T
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    култура за изпитване с третирания химикал
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    контролна култура
                                 
                              където:
                        
                           
                        Поради това CBPI на стойност 1 (всички клетки са едноядрени) е еквивалентен на 100 % цитостаза.
                        Цитостаза = 100-RI
                        
                           
                        
                                    T
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    третирани култури
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    контролни култури
                                 
                              Поради това RI на стойност 53 % означава, че в сравнение с броя на клетките, които са претърпели делене, за да образуват двуядрени и многоядрени клетки в контролната култура, само 53 % от този брой са претърпели делене в третираната култура, т.е. 47 % цитостаза.
                        
                           
                              
                                 Когато не се използва цитоБ
                              
                           , се препоръчва оценяване на цитотоксичността въз основа на относителния ръст в количеството клетки (RICC) или на относителното удвояване на популации (RPD) (69), тъй като и при двете се отчита делът на популацията на клетки, които са претърпели делене.
                        
                           
                        
                           
                        където:
                        
                           Удвояване на популации = [log(брой на клетките след третиране ÷ първоначален брой на клетките)] ÷ log 2
                        Поради това RICC или RPD на стойност 53 % показва 47 % цитотоксичност/цитостаза.
                        Чрез използване на индекса на пролиферация (PI) цитотоксичността може да бъде оценена чрез преброяване на броя на клонингите, които се състоят от 1 клетка (cl1), 2 клетки (cl2), 3 до 4 клетки (cl4) и 5 до 8 клетки (cl8)
                        
                           
                        PI е използван като ценен и надежден параметър за цитотоксичността също и по отношение на клетъчни линии, култивирани in vitro в отсъствието на цитоБ (35) (36) (37) (38) и може да се разглежда като полезен допълнителен параметър.
                        Във всички случаи броят на клетките преди третирането следва да е един и същ при културите, подлежащи на третиране, и при отрицателните контролни култури.
                        Въпреки че RCC (т.е. брой на клетките в третираните култури/брой на клетките в контролните култури) е бил използван като параметър за цитотоксичност в миналото, той вече не се препоръчва, тъй като може да подцени цитотоксичността.
                        Когато се използват автоматични системи за преброяване, например поточна цитометрия, цитометрия с лазерно сканиране или анализ на изображения, броят на клетките във формулата може да бъде заместен с броя на ядрата.
                        В отрицателни контролни култури удвояването на популации или индексът на репликация следва да бъдат съвместими с изискването за пробовземане на клетки след третиране във време, равняващо се на около 1,5-2,0 нормални клетъчни цикъла.
                     “
               
                     15)
                  
                  
                     В Част Б се добавят следните глави:
                     „Б.59   
                           In chemico кожна сенсибилизация: Изследване за директна реакционна способност спрямо пептиди (DPRA)
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 442C (2015). Кожният сенсибилизатор е вещество, което води до алергичен отклик след контакт с кожата, както е определено от Глобалната хармонизирана система на ООН за класифициране и етикетиране на химикали (GHS) (1) на Съвета за сигурност на ООН и от Регламент (ЕО) № 1272/2008 относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси (CLP) (18). Настоящият метод за изпитване обхваща процедура in chemico (изследване за директна реакционна способност спрямо пептиди — DPRA), която да се използва за подкрепа на разграничаването между кожни сенсибилизатори и непредизвикващи сенсибилизация вещества в съответствие с GHS на ООН и Регламента CLP.
                     Налице е общо съгласие по отношение на основните биологични събития, които са в основата на кожната сенсибилизация. Съществуващите знания за химичните и биологичните механизми, свързани с кожната сенсибилизация, бяха обобщени под формата на път, водещ до неблагоприятен ефект (AOP) (2), от молекулното иницииращо събитие през междинните събития до неблагоприятния ефект, а именно алергичния контактен дерматит при хората или свръхчувствителността при контакт при гризачи. В рамките на свързания с кожната сенсибилизация AOP, молекулното иницииращо събитие е ковалентното свързване на електрофилните вещества към нуклеофилните центрове в белтъците на кожата.
                     Оценката на кожната сенсибилизация обикновено е включвала използването на лабораторни животни. Класическите методи с използване на морски свинчета — изпитването на Magnusson—Kligman върху морски свинчета с максимизиране и изпитването на Buehler (метод за изпитване Б.6 (3)) — изследват както индукционната фаза, така и фазата на предизвикване на кожната сенсибилизация. Изпитването върху локални лимфни възли (LLNA) на мишки (LLNA, методът за изпитване Б.42 (4)) и двете му нерадиоактивни изменения: LLNA: DA (МИ Б.50 (5)) и LLNA: BrdU-ELISA (метод за изпитване Б.51 (6)), всички от които оценяват изключително индуктивния отговор, също са възприети, тъй като спрямо изпитванията върху морски свинчета предоставят предимство по отношение на хуманното отношение към животните, както и обективно измерване на индукционната фаза на кожната сенсибилизация.
                     Неотдавна методи за изпитване in chemico и in vitro на механистична основа бяха приети за научно валидни за оценка на химикали от гледна точка на опасността от кожна сенсибилизация. Независимо от това, с оглед на ограничения механистичен обхват по отношение на AOP, на всеки от наличните понастоящем методи за изпитване без използването на животни (2) (7), в рамките на Интегрираните подходи за изпитване и оценка (IATA) ще са необходими комбинации от методи без използване на животни (in silico, in chemico, in vitro), за да могат в пълна степен да бъдат заменени използваните понастоящем изпитвания върху животни.
                     DPRA е предложено с оглед на анализа на молекулното иницииращо събитие на свързания с кожната сенсибилизация AOP, а именно реакционната способност спрямо белтъци, чрез количествено определяне на реакционната способност на изпитваните химикали спрямо примерни синтетични пептиди, съдържащи лизин или цистеин (8). Впоследствие стойностите на процентното изчерпване на цистеинсъдържащи и лизинсъдържащи пептиди се използват, за да се категоризира дадено вещество в една от четири категории реакционна способност за подпомагане на разграничаването на кожни сенсибилизатори и непредизвикващи сенсибилизация вещества (9).
                     DPRA е било обект на оценка в изследване за валидиране, водено от референтна лаборатория на ЕС за алтернативи на изпитванията върху животни (EURL ECVAM), и последваща независима партньорска проверка от ESAC (консултативният научен комитет на EURL ECVAM), и DPRA е прието за научно валидно (10) за използване като част от IATA за подпомагане на разграничаването на кожни сенсибилизатори и непредизвикващи сенсибилизация вещества, за целите на класифицирането в класовете на опасност и на етикетирането. Примери за използването на данни от DPRA в комбинация с друга информация са описани в литературата (11) (12) (13) (14).
                     Определенията са дадени в допълнение I.
                     ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ, ПРИЛОЖИМОСТ И ОГРАНИЧЕНИЯ
                     Корелацията между реакционната способност спрямо белтъци и потенциала за кожна сенсибилизация е добре установена (15) (16) (17). Независимо от това, тъй като свързването с белтъци представлява само едно основно събитие, макар и да е молекулното иницииращо събитие на свързания с кожната сенсибилизация AOP, информацията за реакционната способност спрямо белтъци, генерирана с изпитвания и с методи, различни от изпитване, може да не е достатъчна сама по себе си, за да се направи заключение за отсъствие на потенциал за кожна сенсибилизация в химикалите. Ето защо данните, събрани с настоящия метод за изпитване, следва да се разглеждат в контекста на интегрирани подходи, като например IATA, като се комбинират с друга допълнителна информация, например информация, получена от химични аналози от in vitro изследвания, фокусирани върху други основни събития от AOP, свързан с кожната сенсибилизация, както и от методи, различни от изпитвания, включително асоцииране (read-across).
                     Настоящият метод за изпитване може да се използва в съчетание с друга допълнителна информация в подкрепа на разграничаването между кожните сенсибилизатори (категория 1 по GHS на ООН/Регламент CLP) и непредизвикващите сенсибилизация вещества в контекста на IATA. Настоящият метод за изпитване не може да се използва самостоятелно нито за определяне на подкатегории 1A и 1B за кожните сенсибилизатори съгласно определението по GHS на ООН/Регламент CLP, нито за прогнозиране на потенциала при решения във връзка с оценката на безопасността. Независимо от това, в зависимост от регулаторната рамка, положителният резултат с DPRA може да се използва самостоятелно за класифициране на даден химикал в категория 1 по GHS на ООН/Регламент CLP.
                     Методът за изпитване DPRA е доказано прехвърляем към лаборатории с опит в областта на анализа чрез високоефективна течна хроматография (HPLC). Нивото на възпроизводимостта в прогнозите, които могат да се очакват от метода за изпитване, е от порядъка на 85 % вътре в самата лаборатория и 80 % между лабораториите (10). Резултатите, получени при изследването за валидиране (18) и публикуваните изследвания (19) сочат, че точността на DPRA при разграничаването между кожните сенсибилизатори (т.е. категория 1 по GHS на ООН/Регламент CLP) и непредизвикващите сенсибилизация е 80 % (N=157) с чувствителност от 80 % (88/109) и специфичност 77 % (37/48), в сравнение с резултатите от LLNA. При DPRA подценяването при прогнозиране на химикалис малък до умерен потенциал (т.е. кожна сенсибилизация подкатегория 1B по GHS на ООН/Регламент CLP) е по-вероятно, отколкото при химикали, показващи голяма потенциал за кожна сенсибилизация (т.е. подкатегория 1A по GHS на ООН/Регламент CLP) (18) (19). Независимо от това стойностите за точността, посочени тук за DPRA като самостоятелен метод за изпитване, са само ориентировъчни, тъй като методът за изпитване трябва да се разглежда в съчетание с други източници на информация в контекста на IATA и в съответствие с разпоредбите на точка 9 по-горе. Освен това при оценяването на методи за сенсибилизация на кожата, които не използват животни, следва да се има предвид, че LLNA изпитването, както и други изпитвания върху животни, могат да не отразяват напълно положението при вида, представляващ интерес, т.е. при хората. Въз основа на цялостните налични данни бе показано, че DPRA е приложимо по отношение на изпитвани химикали, които обхващат различни органични функционални групи, механизми за отговор, потенциал за сенсибилизация на кожата (както е определена в in vivo проучвания) и физични и химични свойства (8) (9) (10) (19). Взета заедно, тази информация показва ползата от DPRA за подпомагане на определянето на опасността от кожна сенсибилизация.
                     В настоящия метод за изпитване терминът „изпитван химикал“ се използва за позоваване на това, което се изпитва, и не е свързан с приложимостта на DPRA за изпитване на вещества и/или смеси. Настоящият метод за изпитване не е приложим за изпитване на метални съединения, тъй като за тях е известно, че реагират с белтъци по механизми, различни от ковалентното свързване. Изпитваният химикал следва да бъде разтворим в подходящ разтворител при крайна концентрация от 100 mM (виж точка18). Независимо от това, изпитваните химикали, които не са разтворими при тази концентрация, могат да се изпитват при по-ниски концентрации на разтвори. В такъв случай даден положителен резултат все още може да бъде използван за подпомагане на идентифицирането на изпитвания химикал като кожен сенсибилизатор, но от отрицателен резултат не следва да се прави окончателно заключение за отсъствието на реакционна способност. Понастоящем информацията за приложимостта на DPRA за смеси с известен състав е ограничена (18) (19). Независимо от това DPRA се смята за технически приложим за изпитването на вещества с повече съставки и на смеси с известен състав (вж. точка 18). Преди използването на настоящия метод за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Такива съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа. Сегашният модел на прогнозиране не може да бъде използван за сложни смеси с неизвестен състав или за вещества с непознат или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологични материали (т.е. UVCB вещества) поради определеното моларно отношение на изпитвания химикал и пептида. За тази цел ще трябва да бъде разработен нов модел за прогнозиране въз основа на гравиметричен подход. В случаите, в които могат да бъдат представени доказателства за неприложимостта на метода за изпитване по отношение на други специфични категории химикали, методът за изпитване следва да не се използва за тези специфични категории химикали.
                     Настоящият метод за изпитване е метод in chemico, който не включва метаболитна система. Химикалите, които изискват ензимно биоактивиране за проявяване на потенциала си за кожна сенсибилизация (т.е. про-хаптени), не могат да бъдат откривани от метода за изпитване. Съобщава се, че химикали, които стават сенсибилизатори след абиотична трансформация (т.е. пре-хаптени), в някои случаи са правилно откривани от метода за изпитване (18). В светлината на изложеното по-горе отрицателните резултати, получени по метода за изпитване, следва да се тълкуват в контекста на посочените ограничения, както и във връзка с други източници на информация в рамките на IATA. Изпитвани химикали, които не се свързват ковалентно с пептида, но подпомагат окисляването му (например димеризация на цистеина) биха могли да доведат до потенциално надценявне на пептидното изчерпване, което води до възможни неверни положителни прогнози и/или до решения за класифициране в по-висок клас реакционна способност (вж. точки 29 и 30).
                     Както е описано, DPRA подкрепя разграничаването на кожни сенсибилизатори и непредизвикващи сенсибилизация вещества. Той обаче може да допринесе за оценка на потенциала за сенсибилизация (11), когато се използва в интегрирани подходи, като например IATA. Независимо от това се изисква по-нататъшна работа, за предпочитане въз основа на данни за човека, за определяне на това как резултатите от DPRA могат евентуално да послужат за информация за оценка на потенциала.
                     ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     DPRA е in chemico метод, който определя количествено остатъчната концентрация на цистеинсъдържащ или лизинсъдържащ пептид след 24-часова инкубация с изпитвания химикал при 25±2,5 °C. Синтетичните пептиди съдържат фенилаланин за подпомагане на откриването. Относителната пептидна концентрация се определя чрез високоефективна течна хроматография (HPLC) с градиентно елуиране и UV откриване при 220 nm. След това стойностите на процентното изчерпване на цистеинсъдържащи и лизинсъдържащи пептиди се изчисляват и се използват в прогнозен модел (вж. точка 29), който дава възможност за отнасяне на изпитвания химикал в един от четири класа за реакционна способност, използвани в подкрепа на разграничаването на сенсибилизатори и непредизвикващи сенсибилизация вещества.
                     Преди рутинното използване на метода, описан в настоящия метод за изпитване, лабораториите следва да докажат техническата си компетентност, като използват десетте вещества за изпитването за пригодност, изброени в допълнение 2.
                     ПРОЦЕДУРА
                     Настоящият метод за изпитване се основава на DB-ALM Протокол № 154 за DPRA (20), който е протоколът, използван за изследването за валидиране, координирано от EURL ECVAM. Препоръчва се този протокол да се използва при прилагането и използването на метода в лабораторни условия. По-долу е представено описание на основните компоненти и процедури за DPRA. Ако се използва алтернативен план за HPLC, трябва да бъде доказана неговата еквивалентност с валидирания план, описан в DB-ALM протокола (например чрез изпитване на веществата за изпитването за пригодност, изброени в допълнение 2).
                     
                        Приготвяне на цистеинсъдържащ и лизинсъдържащ пептид
                     
                     Изходни разтвори на цистеин (Ac-RFAACAA-COOH) и лизин (Ac-RFAAKAA-COOH), съдържащи синтетични пептиди с чистота над 85 % и за предпочитане в обхвата 90-95 %, трябва да бъдат прясно приготвени непосредствено преди инкубирането им с изпитвания химикал. Крайната концентрация на цистеинсъдържащия пептид следва да бъде 0,667 mM в фосфатен буфер с pH 7,5, а крайна концентрация на лизинсъдържащия пептид следва да бъде 0,667 mM в буфер амониев ацетат с pH 10,2. Аналитичните серии на анализа с HPLC следва да се планират така, че анализът с HPLC да отнема по-малко от 30 часа. За планирането на HPLC, използвано в изследването за валидиране и описано в настоящия метод за изпитване, в една отделна HPLC серия могат да бъдат включени до 26 проби (които включват изпитвания химикал, положителната контрола и подходящия брой контроли на разтворител въз основа на броя на отделните разтворители, използвани в изпитването, всяко от тях изпитвано в три повторения). За всички повторения, анализирани в една и съща серия, следва да се използват идентични изходни разтвори на цистеинсъдържащи и лизинсъдържащи пептиди. Препоръчително е преди да се използват индивидуалните партиди от пептиди, да се докаже подходящата им разтворимост.
                     
                        Приготвяне на изпитвания химикал
                     
                     Разтворимостта на изпитвания химикал в подходящ разтворител следва да бъде определена преди извършването на изследването, като се следва процедурата по разтваряне, описана в DB-ALM протокола за DPRA (20). Подходящият разтворител ще разтвори изпитвания химикал напълно. Тъй като в DPRA изпитваният химикал се инкубира в голям излишък на цистеинсъдържащия или на лизинсъдържащия пептид, визуалната проверка за образуването на бистър разтвор се счита за достатъчна за гарантиране, че изпитваният химикал (и всички негови компоненти в случай на изпитване на вещество с повече съставки или на смес) е разтворен. Подходящи разтворители са ацетонитрил, вода, 1:1 смес вода:ацетонитрил, изопропанол, ацетон или смес в съотношение 1:1 ацетон:ацетонитрил. Могат да бъдат използвани други разтворители, когато те не оказват влияние върху стабилността на пептида, при наблюдение с референтни контроли C (т.е. проби, състоящи се само от пептида, разтворен в подходящ разтворител; виж допълнение 3). Като последна възможност, ако изпитваният химикал не е разтворим в никой от посочените разтворители, следва да се направи опит за разтварянето му в 300 μl DMSO и за разреждане на получения разтвор с 2 700 μl ацетонитрил, и ако изпитваният химикал не е разтворим в тази смес, следва да се направят опити за разтваряне на същото количество от изпитвания химикал в 1 500 μl DMSO и да се разреди полученият разтвор с 1 500 μl ацетонитрил. Изпитваният химикал следва да бъде предварително претеглен в стъклени флакони и разтворен непосредствено преди изпитването в подходящ разтворител, за изготвяне на 100 mM разтвор. За смеси и за вещества, включващи повече съставки с известен състав, една чистота следва да се определи от сбора от дяловете на нейните съставки (с изключение на вода), и едно привидно молекулно тегло трябва да се определи, като се отчетат отделните молекулни тегла на всяка съставка в сместа (с изключение на вода) и техните дялове. След това получените чистота и привидно молекулно тегло трябва да се използват за изчисляване на теглото на изпитвания химикал, необходимо за изготвяне на 100 mM разтвор. За полимери, за които не може да бъде определено преобладаващо молекулно тегло, за изготвяне на 100 mM разтвор може да се вземе предвид молекулното тегло на мономера (или привидното молекулното тегло на различните мономери, съставляващи полимера). Независимо от това, при изпитването на смеси, вещества с повече съставки или полимери с известен състав, също следва да се вземе предвид изпитване на чистия химикал. За течности чистият химикал трябва да бъде изпитван като такъв, без предварително разреждане, чрез инкубирането му при моларно отношение от 1:10 и 1:50 съответно с цистеинсъдържащите и лизинсъдържащите пептиди. За твърди вещества изпитваният химикал следва да се разтвори в максималната си концентрация на разтваряне в същия разтворител, който е използван за приготвяне на разтвора с привидна концентрация 100 mM. След това той трябва да бъде изпитван като такъв, без последващо разреждане, чрез инкубирането му при моларно отношение от 1:10 и 1:50 съответно с цистеинсъдържащите и лизинсъдържащите пептиди. Непротиворечивите резултати (наличие или отсъствие на реакция) между разтвора с привидна концентрация 100 mM и чистия химикал следва да позволят да се направи категорично заключение относно резултата.
                     
                        Приготвяне на положителната контрола, референтните контроли и контролите за коелуиране
                     
                     Канелен алдехид (CAS 104-55-2; ≥95 % чистота) за хранителни цели следва да бъде използван като положителна контрола (ПК) при концентрация от 100 mM в ацетонитрил. Могат да се използват други подходящи положителни контроли, за предпочитане даващи стойности на изчерпването в средата на обхвата, ако са налични данни за предходни периоди, от които могат да се изведат сравними критерии за приемливост на серията. Освен това в аналитичната серия за анализа с HPLC следва също така да се включат референтни контроли (т.е. проби, съдържащи само пептида, разтворен в подходящия разтворител), като те се използват за проверка на пригодността на HPLC системата преди анализа (референтни контроли A), стабилността на референтните контроли във времето (референтни контроли B) и за проверка дали разтворителят, използван за разтваряне на изпитвания химикал, не оказва влияние върху процентното изчерпване на пептиди (референтни контроли C) (вж. допълнение 3). Подходящата референтна контрола за всеки химикал се използва, за да се изчисли процентното изчерпване на пептиди за този химикал (вж. точка 26). Освен това в серията трябва да бъде включена контрола за коелуиране, състояща се само от изпитвания химикал поотделно за всеки от изпитваните химикали, за откриване на евентуално коелуиране на изпитвания химикал с лизинсъдържащия или с цистеинсъдържащия пептид.
                     
                        Инкубиране на изпитвания химикал с разтворите на лизинсъдържащия и цистеинсъдържащия пептиди
                     
                     Разтворите на цистеинсъдържащия и лизинсъдържащия пептид трябва да бъдат инкубирани в стъклени автоматични дозатори с изпитвания химикал в съотношение 1:10 и 1:50 съответно. Ако се наблюдава утайка незабавно след добавяне на разтвора на изпитвания химикал в разтвор на пептида, поради малка разтворимост във вода на изпитвания химикал, в този случай не е сигурно колко от изпитвания химикал е останал в разтвора за реакция с пептида. Ето защо в такъв случай положителният резултат би могъл все още да се използва, но отрицателният резултат е несигурен и следва да се тълкува внимателно (вж. също така разпоредбите в точка 11 за изпитването на химикали, които не се разтварят до концентрация от 100 mM). Разтворът с реагентите следва да бъде оставен на тъмно при температура 25±2.5°C за 24±2 часа преди стартирането на HPLC анализа. Всеки изпитван химикал следва да бъде анализиран в три повторения и за двата пептида. Пробите трябва да се проверят визуално преди HPLC анализа. Ако се образува утайка или се наблюдава разделяне на фази, пробите могат да се центрофугират при ниска скорост (100-400xg), за да се предизвика утаяване на дъното на флакона като предпазна мярка, тъй като големите количества утайка могат да задръстят тръбичките и колоните при HPLC. Ако след инкубационния период се наблюдава утаяване или разделяне на фазите, пептидното изчерпване може да бъде подценено и в случай на отрицателен резултат не може да се направи заключение с достатъчна сигурност за отсъствието на реакционна способност.
                     
                        Построяване на стандартната калибрационна крива за HPLC
                     
                     Следва да бъде генерирана стандартна калибрационна крива както за цистеинсъдържащия, така и за лизинсъдържащия пептид. Пептидните еталони следва да се приготвят в разтвор от 20 % или 25 % ацетонитрил: буфер, с използване на фосфатен буфер (рН 7,5) за цистеинсъдържащия пептид, и буфер амониев ацетат (pH 10,2) за лизинсъдържащия пептид. Чрез еталони, получени след поредица от разреждания на пептидния изходен разтвор (0,667 mM), следва да се приготвят 6 калибрационни разтвора, които да покриват обхвата от 0,534 до 0,0167 mM. В стандартната калибрационна крива следва също да бъде включена празна проба от буфера за разреждане. Подходящите калибрационни криви трябва да са с r2 > 0,99.
                     
                        Подготовка и анализ с HPLC
                     
                     Пригодността на системата за HPLC следва да се провери преди извършването на анализа. Пептидното изчерпване се контролира чрез HPLC с UV детектор (детектор с фотодиодна матрица или абсорбционен детектор с фиксирана дължина на вълната 220 nm). Съответната колона се инсталира в системата за HPLC. В плана за HPLC, описан във валидирания протокол, като предпочитана колона се използва Zorbax SB-C-18 2,1 mm × 100 mm × 3,5 микрона. С тази колона за високоефективна течна хроматография с обърната фаза цялата система трябва да се уравновесява при 30 °C с 50 % фаза A (0,1 % v/v трифлуорооцетна киселина във вода) и 50 % за фаза Б (0,085 % v/v трифлуорооцетна киселина в ацетонитрил) най-малко 2 часа преди стартирането. HPLC анализът трябва да бъде извършен при скорост на потока 0,35 ml/min и линеен градиент от 10 % до 25 % ацетонитрил в продължение на 10 минути, последван от бързо нарастване до 90 % ацетонитрил за отстраняване на други материали. Следва да се инжектират равни обеми от всеки еталон, проба и контрола. Колоната трябва да бъде повторно уравновесявана на първоначалните условия в продължение на 7 минути между инжектиранията. Ако се използва различна колона за HPLC с обърната фаза, може да се наложи планираните параметри, описани по-горе, да се коригират, за да се гарантира подходящо елуиране и интегриране на цистеинсъдържащите и лизинсъдържащите пептиди, а също и обема на инжектиране, който може да варира според използваната система (обикновено в интервала от 3-10 μl). Важно е, ако се използва алтернативен план за HPLC, да бъде доказана неговата еквивалентност с валидирания план, описан по-горе (например чрез изпитване на веществата за изпитването за пригодност, изброени в допълнение 2). Абсорбцията се наблюдава при 220 nm. Ако се използва детектор с фотодиодна матрица, следва да бъде записана също и абсорбцията при 258 nm. Следва да се отбележи, че някои доставки на ацетонитрил могат да окажат отрицателно въздействие върху пептидната стабилност и това трябва да бъде оценено, когато се използва нова партида ацетонитрил. Отношението на площта на пика при 220 nm и площта на пика при 258 nm може да бъде използвано като показател за коелуиране. За всяка проба съотношение в интервала от 90 % < средна стойност (19) на отношението на площите за контролните проби <100 % би било добър показател за това, че не е имало коелуиране.
                     Може да има изпитвани химикали, които да подпомагат окисляването на цистеинсъдържащия пептид. Пикът на пептида, съдържащ димеризиран цистеин, може да бъде наблюдаван визуално. Ако изглежда, че е настъпила димеризация, това следва да се отбележи, тъй като процентът на пептидно изчерпване може да бъде надценен, което да доведе до неверни положителни прогнози и/или класифициране в по-висок клас за реакционна способност (вж. точки 29 и 30).
                     Анализът с HPLC за цистеинсъдържащи и лизинсъдържащи пептиди може да се извършва паралелно (ако са налични две системи за HPLC) или в различни дни. В случай че анализът се провежда в различни дни, всички разтвори с изпитвани химикали следва да бъдат прясно приготвени за двете изследвания през съответния ден на провеждането. Графикът за анализа следва да бъде изготвен така, че да се гарантира, че инжектирането на първата проба започва от 22 до 26 часа след смесването на изпитвания химикал с пептидния разтвор. Аналитичните серии на анализа с HPLC следва да се планират така, че анализът с HPLC да отнема по-малко от 30 часа. За планирането на HPLC, използвано в изследването за валидиране и описано в настоящия метод за изпитване, в една отделна HPLC серия могат да бъдат включени до 26 проби (вж. също точка 17). Пример за серия за анализ с HPLC е даден в приложение 3.
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Оценка на данните
                     
                     Концентрацията на цистеинсъдържащия или на лизинсъдържащия пептид се определя фотометрично при 220 nm във всяка проба чрез измерване на площта на подходящите пикове (площ под кривата, AUC) и чрез изчисляване на концентрацията на пептида, като се използва линейната калибрационна крива, получена от еталоните.
                     Процентът на пептидно изчерпване се определя във всяка проба, като се измерва площта на пика и стойността на тази площ се разделя на средната пикова площ на относимата референтна контрола C (вж. допълнение 3) съгласно формулата, описана по-долу.
                     
                        
                     
                        Критерии за приемливост
                     
                     Следните критерии трябва да бъдат изпълнени, за да се счита за валидна дадена серия:
                     
                                 а)
                              
                              
                                 стандартната калибрационна крива трябва да е с r2 > 0,99.
                              
                           
                                 б)
                              
                              
                                 средната стойност на процента на пептидно изчерпване на трите повторения за положителната контрола канелен алдехид трябва да е между 60,8 % и 100 % за цистеинсъдържащия пептид, между 40,2 % и 69,0 % за лизинсъдържащия пептид, максималното стандартно отклонение (SD) за повторенията на положителната контрола трябва да е < 14,9 % за процента на изчерпване на цистеина и < 11,6 % за процента на изчерпване на лизина, и
                              
                           
                                 в)
                              
                              
                                 средната пептидна концентрация на референтните контроли A следва да бъде 0,50±0,05 mM, а коефициентът на вариация (CV) на пептидните пикови площи за деветте референтни контроли B и C в ацетонитрил следва да бъде <15,0 %.
                              
                           Ако един или повече от тези критерии не e изпълнен, серията следва да се повтори.
                     Следните критерии трябва да бъдат изпълнени, за да се приемат за валидни резултатите от изпитването на даден химикал:
                     
                                 а)
                              
                              
                                 максималното стандартно отклонение за повторенията от изпитвания химикал следва да са <14,9 % за процента на изчерпване на цистеина и <11,6 % за процента на изчерпване на лизина,
                              
                           
                                 б)
                              
                              
                                 средната пептидна концентрация на трите референтни контроли C в подходящия разтворител следва да бъде 0,50±0,05 mM. Ако тези критерии не са изпълнени, данните следва да бъдат отхвърлени и серията трябва да се повтори за конкретния изпитван химикал.
                              
                           
                        Модел на прогнозиране
                     
                     Средният процент на изчерпване на цистеина и процентът изчерпване на лизина се изчислява за всеки изпитван химикал. Отрицателното изчерпване се смята за „0“ при изчисляването на средната стойност. Чрез използване на модела на прогнозиране цистеин 1:10/лизин 1:50, показан в таблица 1, за подпомагане на разграничаването на кожни сенсибилизатори и непредизвикващи сенсибилизация вещества в рамките на IATA следва да се използва праг от 6,38 % средно пептидно изчерпване. Възможно е прилагането на модела на прогнозиране за отнасяне на даден изпитван химикал към клас за реакционна способност (т.е. ниска, умерена и висока реакционна способност) да предостави полезна информация за оценка на потенциала в рамките на IATA.
                     
                        Таблица 1
                     
                     
                        Модел на прогнозиране цистеин 1:10/лизин 1:50
                         (20)
                     
                     
                                 Средна стойност на процентното изчерпване на цистеина и лизина
                              
                              
                                 Клас на реакционна способност
                              
                              
                                 Прогнозиране по DPRA (21)
                                 
                              
                           
                                 0 % ≤ среден % изчерпване ≤ 6,38 %
                              
                              
                                 Нулева или минимална реакционна способност
                              
                              
                                 Отрицателен резултат
                              
                           
                                 6,38 % < среден % изчерпване ≤ 22,62 %
                              
                              
                                 Ниска реакционна способност
                              
                              
                                 Положителен резултат
                              
                           
                                 22,62 % < среден % изчерпване ≤ 42,47 %
                              
                              
                                 Умерена реакционна способност
                              
                           
                                 42,47 % < среден % изчерпване ≤ 100 %
                              
                              
                                 Висока реакционна способност
                              
                           Може да има случаи, при които изпитваният химикал (веществото или една или няколко от съставките на вещество с повече съставки или смес) има значитетелна абсорбция при дължина на вълната 220 nm и е със същото време на задържане като пептида (коелуиране). Коелуирането може да бъде избягнато чрез леко адаптиране на плана за HPLC с оглед допълнително разделяне на времето за елуиране на изпитвания химикал и на пептида. Ако за избягване на коелуирането се използва алтернативен план за HPLC, трябва да бъде доказана неговата еквивалентност с валидирания план (например чрез изпитване на веществата за изпитването за пригодност, изброени в допълнение 2). Ако се наблюдава коелуиране, пикът на пептида не може да бъде интегриран и изчисляването на процента пептидно изчерпване не е възможно. Ако коелуиране на такива изпитвани химикали се наблюдава както при цистеинсъдържащия, така и при лизинсъдържащия пептид, тогава анализът следва да бъде протоколиран като „недостатъчен за формулиране на заключение“. В случаите, когато се наблюдава коелуиране само с лизинсъдържащия пептид, тогава може да се използва модел на прогнозиране цистеин 1:10, даден в таблица 2.
                     
                        Таблица 2
                     
                     
                        Модел на прогнозиране цистеин 1:10
                         (22)
                     
                     
                                 Процент изчерпване на цистеина (Cys)
                              
                              
                                 Клас на реакционна способност
                              
                              
                                 Прогнозиране по DPRA (23)
                                 
                              
                           
                                 0 % ≤ процент изчерпване на Cys ≤ 13,89 %
                              
                              
                                 Нулева или минимална реакционна способност
                              
                              
                                 Отрицателен резултат
                              
                           
                                 13,89 % < процент изчерпване на Cys ≤ 23,09 %
                              
                              
                                 Ниска реакционна способност
                              
                              
                                 Положителен резултат
                              
                           
                                 23,09 % < процент изчерпване на Cys ≤ 98,24 %
                              
                              
                                 Умерена реакционна способност
                              
                           
                                 98,24 % < процент изчерпване на Cys ≤ 100 %
                              
                              
                                 Висока реакционна способност
                              
                           Може да има други случаи, при които припокриването във времето на задържане между изпитвания химикал и един от двата пептида е непълно. В такива случаи стойностите на процентното пептидно изчерпване могат да бъдат оценени и използвани в модела на прогнозиране цистеин 1:10/лизин 1:50, но независимо от това отнасянето на изпитвания химикал към даден клас на реакционна способност не може да се извърши с точност.
                     Когато резултатът за даден изпитван химикал е недвусмислен, еднократен анализ с HPLC следва да е достатъчен както за цистеинсъдържащия, така и за лизинсъдържащия пептид. Независимо от това това, в случай на резултати, които се доближават до прага, използван за разграничаване на положителните от отрицателните резултати (т.е. гранични резултати), може да е необходимо допълнително изпитване. При ситуации, в които средната стойност на процента на изчерпване попада в интервала от 3 % до 10 % за модел на прогнозиране цистеин 1:10/лизин 1:50, или процентното изчерпване на цистеина попада в интервала от 9 % до 17 % за модел на прогнозиране цистеин 1:10, следва да се разгледа възможността за провеждане на втора серия, както и на трета серия в случай на наличие на несъответстващи резултати между първите две серии.
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитван химикал
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Вещество с една съставка
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Химична идентификация, като наименование(я) по IUPAC или по CAS, CAS номер(а), SMILES или InChI код, структурна формула, и/или други идентификатори;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Външен вид, разтворимост във вода, молекулно тегло и допълнителни относими физични и химични свойства, според наличността;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и т.н.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Обработка преди изпитването, ако се прилага (напр. затопляне, смилане);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         изпитвана концентрация (концентрации);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Условия на съхранение и стабилност, доколкото са налични.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Вещество с повече съставки, UVCB и смес:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         характеризиране, доколкото е възможно, чрез химическата идентичност (вж. по-горе), чистотата, количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките (вж. по-горе), доколкото са налични.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства, според наличността;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Молекулно тегло или привидно молекулно тегло в случай на смеси/полимери с известен състав или друга информация, относима към провеждането на изследването;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Обработка преди изпитването, ако се прилага (напр. затопляне, смилане);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Изпитвана концентрация (концентрации);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Условия на съхранение и стабилност, доколкото са налични.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Контроли
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Положителна контрола:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Химична идентификация, като наименование(я) по IUPAC или по CAS, CAS номер(а), SMILES или InChI код, структурна формула, и/или други идентификатори;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Външен вид, разтворимост във вода, молекулно тегло и допълнителни относими физични и химични свойства, според наличността;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и т.н.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Обработка преди изпитването, ако се прилага (напр. затопляне, смилане);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Изпитвана концентрация (концентрации);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Условия на съхранение и стабилност, доколкото са налични;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Препратка към резултатите за положителните контроли за предходни периоди, доказващи подходящи критерии за приемливост на серията, ако е приложимо.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Разтворител/носител
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Използван разтворител/носител и съотношение на съставките му, ако е приложимо;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Химична идентификация или идентификации, като наименование(я) по IUPAC или по CAS, CAS номер(а) и/или други идентификатори;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и т.н.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Външен вид, молекулно тегло и допълнителни относими физични и химични свойства, в случай че са използвани разтворители/носители, различни от упоменатите в метода за изпитване и в зависимост от наличността;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Условия на съхранение и стабилност, доколкото са налични;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Обосновка за избора на разтворител за всеки изпитван химикал;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         За ацетонитрила, резултати от изпитването за въздействие върху стабилността на пептида.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Приготвяне на пептидите, положителната контрола и изпитвания химикал
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Характеризиране на пептидните разтвори (доставчик, партида, точно тегло на пептида, добавен обем за изходния разтвор);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Характеризиране на положителния контролен разтвор (точно тегло на веществото за положителна контрола, добавен обем за разтвора за изпитване);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Характеризиране на разтворите на изпитвания химикал (точно тегло на изпитвания химикал, добавен обем за разтвора за изпитване);
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Настройка на уреда за HPLC и анализ
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Тип уред за HPLC, колони за HPLC и предпазни колони, детектор, автоматичен дозатор;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Параметри, относими към анализа с HPLC, като например температура на колоната, обеми на инжектиране, скорост на потока и градиент.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Пригодност на системата
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Площ на пика за пептида при 220 nm за всяко повторение на еталон и на референтна контрола A;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Линейна калибрационна крива, представена графично, и протоколирана стойност на r2;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Пептидна концентрация за всяко повторение на референтна контрола A;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Средна пептидна концентрация (mM) от трите референтни контроли A, SD и CV;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Пептидна концентрация на референтни контроли A и C.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Аналитична серия
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             За референтните контроли:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Площ на пика за пептида при 220 nm за всяко повторение на референтни контроли B и C;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Средна площ на пика на пептида при 220 nm на деветте референтни контроли B и C в ацетонитрил, SD и CV (за стабилност на референтните контроли за периода на анализа);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         За всеки използван разтворител, средна площ на пика на пептида при 220 nm на трите съответни референтни контроли C (за изчисляване на процента на пептидно изчерпване);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         За всеки използван разтворител, пептидната концентрация (mM) на трите съответни референтни контроли C;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         За всеки използван разтворител, средната пептидна концентрация (mM) на трите съответни референтни контроли C, SD и CV.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             За положителната контрола:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Площ на пика за пептида при 220 nm за всяко повторение;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Процент пептидно изчерпване за всяко повторение;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Среден процент пептидно изчерпване за трите повторения, SD и CV.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             За всеки изпитван химикал:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Външен вид на утайката в реакционната смес в края на инкубационния период, ако се наблюдава. Дали утайката е повторно разтворена или центрофугирана;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Наличие на коелуиране;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Описание на всякакви други относими наблюдения, ако е приложимо;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Площ на пика за пептида при 220 nm за всяко повторение;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Процент пептидно изчерпване за всяко повторение;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Среден процент пептидно изчерпване за трите повторения, SD и CV.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Средна стойност от стойностите на процента на изчерпване на цистеина и процента на изчерпване на лизина;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Използван модел на прогнозиране и прогноза по DPRA.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитване за пригодност
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Ако е приложимо, процедурата, използвана за доказване на пригодността на лабораторията за извършване на метода за изпитване (например чрез изпитване на вещества за изпитването за пригодност), или за доказване на възпроизводимостта на характеристиките на метода за изпитване във времето.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обсъждане на резултатите
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Обсъждане на резултатите, получени с метода за изпитване DPRA;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Обсъждане на резултатите от метода за изпитване в контекста на IATA, ако е налична друга относима информация.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Заключение
                                 
                              
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. На разположение на адрес: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No. 168, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Глава Б.6 от настоящото приложение: Кожна сенсибилизация.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Глава Б.42 от настоящото приложение: Изследване на локалните лимфни възли
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Глава Б.50 от настоящото приложение: Кожна сенсибилизация: изследване на локалните лимфни възли: DA.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Глава Б.51 от настоящото приложение: Кожна сенсибилизация: изследване на локалните лимфни възли: BrdU-ELISA
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Adler et al. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85:367-485.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Gerberick et al. (2004). Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens. Toxicological Sciences 81:332-343.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Gerberick et al. (2007). Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens: A classification tree model approach. Toxicological Sciences 97:417-427.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 EC EURL-ECVAM (2013). Recommendation on the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) for skin sensitisation testing. На разположение на адрес: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Jaworska et al. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. Journal of Applied Toxicology, published online, 14 May 2013, DOI: 10.1002/jat.2869.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Bauch et al. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potential. Regulatory Toxicology and Pharmacology 63: 489-504.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Nukada et al. (2013). Data integration of non-animal tests for the development of a test battery to predict the skin sensitizing potential and potency of chemicals. Toxicology in vitro 27:609 618.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Ball et al (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regulatory Toxicology and Pharmacology 60:389-400.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Landsteiner and Jacobs (1936). Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds. Journal of Experimental Medicine 64:625-639.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Dupuis and Benezra (1982). Allergic contact dermatitis to simple chemicals: a molecular approach. New York & Basel: Marcel Dekker Inc.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Lepoittevin et al. (1998). Allergic contact dermatitis: the molecular basis. Springer, Berlin.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 EC EURL ECVAM (2012). Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) Validation Study Report 74pp. Достъпно на: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Natsch et al. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, published online, 9 April 2013, DOI:10.1002/jat.2868.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) Protocol 154: Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing 17pp. Достъпно на: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment, No. 34. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, France.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 FDA (Food and Drug Administration (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation 22pp. Достъпно на: www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidance/ucm070107.pdf—138
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87).
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                           
                              Точност
                           : степента на близост между резултатите от метода за изпитване и приетите референтни стойности. Това е мярка за характеристиките на метода за изпитване и аспект на „относимостта“. Терминът често се използва взаимозаменяемо с термина „съответствие“, за да се обозначи относителният дял на правилните резултати при даден метод за изпитване (21).
                        
                           
                              AOP (път, водещ до неблагоприятен ефект)
                           : Последователност от събития от химичната структура на целеви химикал или група от сходни химикали през молекулното иницииращо събитие до представляващ интерес in vivo резултат (2).
                        
                           
                              Калибрационна крива
                           : Връзката между опитните стойности на отклика и аналитичната концентрация (наричана също стандартна крива) на познато вещество.
                        
                           
                              Химикал
                           : Вещество или смес.
                        
                           
                              Коефициент на вариация
                           : Мярка за варирането, която се изчислява за група от данни от повторения, като се раздели стандартното отклонение на средната стойност. Той може да бъде умножен по 100 за изразяване в проценти.
                        
                           
                              Опасност
                           : Вътрешно присъщо свойство на даден агент или ситуация, притежаващо потенциал да предизвика неблагоприятни ефекти, когато един организъм, система или (суб-)популация бъдат експонирани на този агент.
                        
                           
                              IATA (интегриран подход за изпитване и оценка)
                           : Структуриран подход, използван за идентифициране на опасност (потенциал), характеризиране на опасност (потенциал) и/или оценка на безопасността (потенциал и експозиция) на даден химикал или група от химикали, който стратегически интегрира и претегля всички данни, относими към предоставянето на информация за вземането на регулаторно решение по отношение на потенциалната опасност и/или риска, и/или необходимостта от допълнително целенасочено и следователно минимално изпитване.
                        
                           
                              Молекулно иницииращо събитие
                           : Предизвикано от химикал смущение в дадена биологична система на молекулно равнище, идентифицирано като стартиращо събитие за причинно-следствената последователност, водеща до неблагоприятен ефект.
                        
                           
                              Смес
                           : Смес или разтвор, съставена (съставен) от две или повече вещества, в която (който) те не си взаимодействат (1).
                        
                           
                              Вещество с една съставка
                           : Вещество, определено от неговия количествен състав, в който съдържанието на една основна съставка е най-малко 80 % (w/w).
                        
                           
                              Вещество с повече съставки
                           : Вещество, определено от неговия количествен състав, в който повече от една основна съставка се съдържа в концентрация ≥ 10 % (w/w) и < 80 % (w/w). Веществото с повече съставки е резултат от производствен процес. Разликата между смес и вещество с повече съставки е, че дадена смес е получена чрез смесване на две или повече вещества без химична реакция. Веществото с повече съставки е резултат от химична реакция.
                        
                           
                              Положителна контрола
                           : Повторение, съдържащо всички компоненти на дадена изпитвана система и третирано с вещество, за което е известно, че предизвиква положителен отклик. За да се гарантира, че може да се направи оценка на варирането на отклика в положителната контрола във времето, големината на положителния отклик не следва да е прекомерна.
                        
                           
                              Референтна контрола
                           : Нетретирана проба, съдържаща всички компоненти на дадена изпитвана система, включително разтворителя или носителя, която се обработва с пробите, третирани с изпитвания химикал, и с други контролни проби, за определяне на базовия отклик при пробите, третирани с изпитвания химикал, разтворен в същия разтворител или носител. Когато се изпитва с паралелна отрицателна контрола, тази проба показва също дали разтворителят или носителят взаимодействат с изпитваната система.
                        
                           
                              Относимост
                           : описание на взаимовръзката между изпитването и ефекта, представляващ интерес, и дали тя е значима и полезна за определена цел. Това е степента, в която изпитването правилно измерва или прогнозира биологичния ефект, представляващ интерес. Относимостта включва разглеждането на точността (съответствието) на метода за изпитване (21).
                        
                           
                              Надеждност
                           : мярка за степента, в която даден метод за изпитване може да се приложи възпроизводимо в една и съща лаборатория и в различни лаборатории по различно време, при използване на един и същи протокол. Оценката за нея се прави, като се изчислява вътрешнолабораторната и междулабораторната възпроизводимост и вътрешнолабораторната повторяемост (21).
                        
                           
                              Възпроизводимост
                           : Съгласуваността между резултатите, получени чрез изследване на един и същ химикал, като се използва един и същ протокол за изпитване (вж. надеждност) (21).
                        
                           
                              Чувствителност
                           : Относителният дял на всички положителни/активни химикали, които са класифицирани правилно чрез метода за изпитване. Това е мярка за точността на метода за изпитване, която предоставя категорични резултати и е важен фактор при оценката на относимостта на метода за изпитване (21).
                        
                           
                              Специфичност
                           : Относителният дял на всички отрицателни/неактивни химикали, които са класифицирани правилно чрез метода за изпитване. Това е мярка за точността на метода за изпитване, която предоставя категорични резултати и е важен фактор при оценката на относимостта на метода за изпитване (21).
                        
                           
                              Вещество
                           : химичен елемент и неговите съединения в естествено състояние или получени чрез всеки производствен процес, включително всяка добавка, необходима за запазване на стабилността на продукта и всеки примес, извлечен от използвания процес, с изключение на всеки разтворител, който може да бъде отделен, без да се засяга стабилността на веществото или да се променя неговият състав (1).
                        
                           
                              Пригодност на системата
                           : Определяне на характеристиките на уреда (напр. чувствителност) чрез анализ на референтен еталон преди извършването на анализ на аналитичната партида (22).
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : Терминът „изпитван химикал“ се използва за обозначаване на онова, което се изпитва.
                        
                           
                              Глобална хармонизирана система на Организацията на обединените нации за класифициране и етикетиране на химикали (GHS на ООН)
                           : система, предлагаща класифициране на химикали (вещества и смеси) според стандартизирани видове и степени на физическа, здравна и екологична опасност и разглеждаща съответни съобщителни елементи, като например пиктограми, сигнални думи, предупреждения за опасност, препоръки за безопасност и информационни листове за безопасност, така че те да съобщават информация за тяхното неблагоприятно въздействие с оглед защита на хората (включително работодатели, работещи, служители в транспорта, потребители и аварийни служители) и на околната среда (1).
                        
                           
                              UVCB
                           : Вещества с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологични материали.
                        
                           
                              Валиден метод за изпитване
                           : Метод за изпитване, за който се смята, че притежава достатъчна относимост и надеждност по отношение на конкретна цел и който се основава на научно обосновани принципи. Даден метод за изпитване никога не е валиден в абсолютен смисъл, а само по отношение на определена цел (21).
                     
                     
                        Допълнение 2
                        ВЕЩЕСТВА ЗА ИЗПИТВАНЕ ЗА ПРИГОДНОСТ
                        
                           
                              In chemico кожна сенсибилизация: Изследване за директна реакционна способност спрямо пептиди
                        
                        Преди рутинното използване на настоящия метод за изпитване, лабораториите следва да докажат техническата си компетентност, като правилно получат очакваната прогноза по DPRA за 10-те вещества за изпитване за пригодност, препоръчани в Таблица 1, и чрез получаване на стойности за изчерпването на цистеина и лизина, които попадат в съответния референтен обхват за 8 от 10-те вещества за изпитване за пригодност за всеки пептид. Тези вещества за изпитване за пригодност са подбрани като представителни за размаха от отклици за опасностите от кожна сенсибилизация. Други критерии за подбор са били, че те са налични в търговската мрежа, че са налични висококачествени in vivo референтни данни и че са налични висококачествени in vitro данни, генерирани с метода за изпитване DPRA, и че са били използвани в изследването за валидиране, координирано от EURL ECVAM, за доказване на успешното прилагане на метода за изпитване в лабораториите, участващи в изследването.
                        
                           Таблица 1
                        
                        
                           Препоръчвани вещества за изпитване за пригодност за доказване на техническата компетентност по отношение на изследването за директна реакционна способност спрямо пептиди
                        
                        
                                    Вещества за изпитване за пригодност
                                 
                                 
                                    CASRN
                                 
                                 
                                    Агрегатно състояние
                                 
                                 
                                    
                                       In vivo прогноза (24)
                                    
                                 
                                 
                                    Прогноза по DPRA (25)
                                    
                                 
                                 
                                    Обхват (26) на процентното изчерпване на цистеинсъдържащ пептид
                                 
                                 
                                    Обхват (26) на процентното изчерпване на лизинсъдържащ пептид
                                 
                              
                                    2,4-динитрохлоробензен
                                 
                                 
                                    97-00-7
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Сенсибилизатор
                                    (изключително силен)
                                 
                                 
                                    Положителен резултат
                                 
                                 
                                    90-100
                                 
                                 
                                    15-45
                                 
                              
                                    Оксазолон
                                 
                                 
                                    15646-46-5
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Сенсибилизатор
                                    (изключително силен)
                                 
                                 
                                    Положителен резултат
                                 
                                 
                                    60-80
                                 
                                 
                                    10-55
                                 
                              
                                    Формалдехид
                                 
                                 
                                    50-00-0
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Сенсибилизатор
                                    (силен)
                                 
                                 
                                    Положителен резултат
                                 
                                 
                                    30-60
                                 
                                 
                                    0-24
                                 
                              
                                    Бензилиденацетон
                                 
                                 
                                    122-57-6
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Сенсибилизатор
                                    (умерен)
                                 
                                 
                                    Положителен резултат
                                 
                                 
                                    80-100
                                 
                                 
                                    0-7
                                 
                              
                                    Фарнезал
                                 
                                 
                                    19317-11-4
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Сенсибилизатор
                                    (слаб)
                                 
                                 
                                    Положителен резултат
                                 
                                 
                                    15-55
                                 
                                 
                                    0-25
                                 
                              
                                    2,3-Бутандион
                                 
                                 
                                    431-03-8
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Сенсибилизатор
                                    (слаб)
                                 
                                 
                                    Положителен резултат
                                 
                                 
                                    60-100
                                 
                                 
                                    10-45
                                 
                              
                                    1-Бутанол
                                 
                                 
                                    71-36-3
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Непредизвикващ сенсибилизация
                                 
                                 
                                    Отрицателен резултат
                                 
                                 
                                    0-7
                                 
                                 
                                    0-5,5
                                 
                              
                                    6-Метилкумарин
                                 
                                 
                                    92-48-8
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Непредизвикващ сенсибилизация
                                 
                                 
                                    Отрицателен резултат
                                 
                                 
                                    0-7
                                 
                                 
                                    0-5,5
                                 
                              
                                    Млечна киселина
                                 
                                 
                                    50-21-5
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Непредизвикващ сенсибилизация
                                 
                                 
                                    Отрицателен резултат
                                 
                                 
                                    0-7
                                 
                                 
                                    0-5,5
                                 
                              
                                    4-Метоксиацетофенон
                                 
                                 
                                    100-06-1
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Непредизвикващ сенсибилизация
                                 
                                 
                                    Отрицателен резултат
                                 
                                 
                                    0-7
                                 
                                 
                                    0-5,5
                                 
                              
                     
                        Допълнение 3
                        
                           ПРИМЕРИ ЗА АНАЛИТИЧНА СЕРИЯ
                        
                        
                                    
                                       Еталони за калибриране и референтни контроли
                                    
                                 
                                 
                                    ЕТАЛ1
                                    ЕТАЛ2
                                    ЕТАЛ3
                                    ЕТАЛ4
                                    ЕТАЛ5
                                    ЕТАЛ6
                                    Буфер за разреждане
                                    Референтна контрола A, повт 1
                                    Референтна контрола A, повт 2
                                    Референтна контрола A, повт 3
                                 
                              
                                    
                                       Контроли за коелуиране
                                    
                                 
                                 
                                    Контрола за коелуиране 1 за изпитван химикал 1
                                    Контрола за коелуиране 2 за изпитван химикал 2
                                 
                              
                                    
                                       Референтни контроли
                                    
                                 
                                 
                                    Референтна контрола B, повт 1
                                    Референтна контрола B, повт 2
                                    Референтна контрола B, повт 3
                                 
                              
                                    
                                       Първи набор от повторения
                                    
                                 
                                 
                                    Референтна контрола C, повт 1
                                    Канелен алдехид, повт 1
                                    Проба 1, повт 1
                                    Проба 2, повт 1
                                 
                              
                                    
                                       Втори набор от повторения
                                    
                                 
                                 
                                    Референтна контрола C, повт 2
                                    Канелен алдехид, повт 2
                                    Проба 1, повт 2
                                    Проба 2, повт 2
                                 
                              
                                    
                                       Трети набор от повторения
                                    
                                 
                                 
                                    Референтна контрола C, повт 3
                                    Канелен алдехид, повт 3
                                    Проба 1, повт 3
                                    Проба 2, повт 3
                                 
                              
                                    
                                       Референтни контроли
                                    
                                 
                                 
                                    Референтна контрола B, повт 4
                                    Референтна контрола B, повт 5
                                    Референтна контрола B, повт 6
                                 
                              
                                    В аналитичната серия следва да бъдат включени три набора от референтни контроли (т.е. проби, съставени само от пептида, разтворен в подходящ разтворител):
                                    
                                                 
                                             
                                             
                                                Референтна контрола A: използвана за проверка на пригодността на системата за HPLC.
                                             
                                          
                                                 
                                             
                                             
                                                Референтна контрола B: включена в началото и в края на аналитичната серия, за да се провери стабилността на референтните контроли през периода на извършване на анализа.
                                             
                                          
                                                 
                                             
                                             
                                                Референтна контрола C: включена в аналитичната серия, за да се провери дали разтворителят, използван за разтваряне на изпитвания химикал, не оказва въздействие върху процента на пептидно изчерпване.
                                             
                                          
                              
                     Б.60   
                           In vitro кожна сенсибилизация: Метод за изпитване ARE-Nrf2 луцифераза
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 442D (2015). Кожният сенсибилизатор представлява вещество, което води до алергичен отклик след контакт с кожата, както е определено от Глобалната хармонизирана система на ООН за класифициране и етикетиране на химикали (GHS) (1) на Съвета за сигурност на ООН и от Регламент (ЕО) № 1272/2008 относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси (CLP) (27). Настоящият метод за изпитване обхваща in vitro процедура (изследване ARE-Nrf2 луцифераза), която да се използва за подкрепа на разграничаването между кожни сенсибилизатори и непредизвикващи сенсибилизация вещества в съответствие с GHS на ООН (1) и Регламента CLP.
                     Налице е общо съгласие по отношение на основните биологични събития, които са в основата на кожната сенсибилизация. Съществуващите знания за химичните и биологичните механизми, свързани с кожната сенсибилизация, бяха обобщени под формата на път, водещ до неблагоприятен ефект (AOP) (2), започващ от молекулното иницииращо събитие през междинните събития до неблагоприятния за здравето ефект, а именно алергичния контактен дерматит при хората или свръхчувствителността при контакт при гризачи (2) (3). Молекулното иницииращо събитие е ковалентното свързване на електрофилните вещества към нуклеофилните центрове в белтъците на кожата. Второто основно събитие в този AOP се извършва в кератиноцитите и включва възпалителни реакции, както и генна експресия, свързана със специфични сигнални пътища в клетките, като например пътищата, зависими от елемент за антиоксидантен отговор/отговор на електрофилно въздействие (ARE). Третото основно събитие е активирането на дендритни клетки, обичайно оценявано по експресията на специални повърхностни клетъчни маркери, хемокини и цитокини. Четвъртото основно събитие е Т-клетъчна пролиферация, която се оценя непряко чрез изследването на локални лимфни възли на мишки (4).
                     Оценката на кожната сенсибилизация обикновено е включвала използването на лабораторни животни. Класическите методи с използване на морски свинчета — изпитването на Magnusson—Kligman върху морски свинчета с максимизиране и изпитването на Buehler (метод за изпитване Б.6 (5)) — изследват както индукционната фаза, така и фазата на предизвикване на кожната сенсибилизация. Изпитването върху локални лимфни възли (LLNA) на мишки (LLNA, метод за изпитване Б.42 (4)) и двете му нерадиоактивни изменения: LLNA: DA (МИ Б.50 (6)) и LLNA: BrdU-ELISA (метод за изпитване Б.51 (7)), всички от които оценяват изключително индуктивния отговор, също са възприети, тъй като предоставят предимства спрямо изпитванията върху морски свинчета по отношение както на хуманното отношение към животните, така и на обективното измерване на индукционната фаза на кожната сенсибилизация.
                     Неотдавна in chemico и in vitro методи за изпитване на механистична основа бяха приети за научно валидни за оценка на химикали от гледна точка на опасността от кожната сенсибилизация. Независимо от това,с оглед на ограничения механистичен обхват по отношение на AOP, на всеки от наличните понастоящем методи за изпитване без използването на животни (2) (3), в рамките на Интегрираните подходи за изпитване и оценка (IATA) ще са необходими комбинации от методи без използване на животни (in silico, in chemico, in vitro), за да могат в пълна степен да бъдат заменени използваните понастоящем изпитвания върху животни.
                     Настоящият метод за изпитване (изследване ARE-Nrf2 луцифераза) се предлага за разглеждане на второто основно събитие, както е обяснено в точка 2. За кожните сенсибилизатори е установено, че индуцират гени, които се регулират от елемента, активиращ се в отговор на антиоксидантно въздействие (ARE) (8) (9). Нискомолекулни електрофилни вещества като кожните сенсибилизатори могат да въздействат върху рецепторния белтък Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), например чрез ковалентно изменение на неговия цистеинов остатък, което води до неговата дисоциация от транскрипционния фактор Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2). След това дисоциираният Nrf2 може да активира ARE-зависими гени, като например тези, които кодират ензими от фаза II от детоксикацията (8) (10) (11).
                     Понастоящем единственото in vitro изследване ARE-Nrf2 луцифераза, обхванато от настоящия метод за изпитване, е изследването KeratinoSensTM, за което са извършени изследвания за валидиране (9) (12) (13), последвани от независима партньорска проверка, извършена от референтната лаборатория на ЕС за алтернативи на изпитванията върху животни (EURL ECVAM) (14). Изследването KeratinoSensTM беше прието за научно валидно за използване като част от IATA за подпомагане на разграничаването на кожни сенсибилизатори и непредизвикващи сенсибилизация вещества, за целите на класифицирането в класовете на опасност и на етикетирането (14). Лабораториите, които желаят да прилагат метода за изпитване, могат да получат рекомбинантната клетъчна линия, използвана в изследването KeratinoSensTM, чрез лицензионно споразумение с разработилия метода за изпитване (15).
                     Определенията са дадени в допълнение 1.
                     ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ, ПРИЛОЖИМОСТ И ОГРАНИЧЕНИЯ
                     Тъй като активирането на пътя Keap1-Nrf2-ARE разглежда само второто основно събитие от AOP, свързан с кожната сенсибилизация, малко е вероятно информацията от методи за изпитване, основана на активирането на този път, да е достатъчна, когато е използвана самостоятелно, за да се направи заключение относно потенциала за кожна сенсибилизация на химикалите. Ето защо данните, събрани с настоящия метод за изпитване, следва да се разглеждат в контекста на интегрирани подходи, като например IATA, като се комбинират с друга допълнителна информация, като например информация, получена от химични аналози от изследвания in vitro, фокусирани върху други основни събития от AOP, свързан с кожната сенсибилизация, както и от методи, различни от изпитвания, включително асоцииране (read-across). Примери за това как да се използва методът за изпитване ARE-Nrf2 луцифераза в комбинация с друга информация, са описани в литературата (13) (16) (17) (18) (19).
                     Настоящият метод за изпитване може да се използва в подкрепа на разграничаването между кожните сенсибилизатори (т.е. категория 1 по GHS на ООН/Регламент CLP) и непредизвикващите сенсибилизация вещества в контекста на IATA. Настоящият метод за изпитване не може да се използва самостоятелно за определяне на подкатегории 1A и 1B за кожните сенсибилизатори съгласно определението по GHS на ООН/Регламент CLP, нито за прогнозиране на потенциала при решения във връзка с оценката на безопасността. Независимо от това, в зависимост от регулаторната рамка, даден положителен резултат може да се използва самостоятелно за класифициране на даден химикал в категория 1 по GHS на ООН/Регламент CLP.
                     Въз основа на набора от данни от изследването за валидиране и изпитване и на вътрешно извършеното изпитване, използвано за независимата партньорска проверка на метода на изпитване, бе доказано, че изследването KeratinoSensTM може да се прилага и в лаборатории с опит в клетъчните култури. Нивото на възпроизводимостта в прогнозите, които могат да се очакват от метода за изпитване, е от порядъка на 85 % вътре в самата лаборатория и между лабораториите (14). Точността (77 % — 155/201), чувствителността (78 % — 71/91) и специфичността (76 % — 84/110) на изследването KeratinoSensTM при разграничаването между кожните сенсибилизатори (т.е. категория 1 по GHS на ООН/Регламент CLP) и непредизвикващите сенсибилизация вещества, при сравнение с резултатите от LLNA, са изчислени, като са взети предвид всички данни, представени на EURL ECVAM за оценка и партньорска проверка на метода за изпитване (14). Тези стойности са подобни на онези, които бяха публикувани наскоро въз основа на вътрешно изпитване на около 145 вещества (77 % точност, 79 % чувствителност, 72 % специфичност) (13). При изследването KeratinoSensTM е по-вероятно подценяване при прогнозиране на химикали, които са с малък до умерен потенциал за кожна сенсибилизация (т.е. кожна сенсибилизация подкатегория 1B по GHS на ООН/Регламент CLP), отколкото при химикали, показващи голям потенциал за кожна сенсибилизация (т.е. подкатегория 1A по GHS на ООН/Регламент CLP) (13) (14). Взета като цяло, тази информация показва ползата от изследването KeratinoSensTM за подпомагане на определянето на опасността от кожна сенсибилизация. Независимо от това стойностите за точността, посочени тук за изследването KeratinoSensTM като самостоятелен метод за изпитване, са само ориентировъчни, тъй като методът за изпитване трябва да се разглежда в съчетание с други източници на информация в контекста на IATA и в съответствие с разпоредбите на точка 9 по-горе. Освен това при оценяването на методи за сенсибилизация на кожата, които не използват животни, следва да се има предвид, че LLNA, както и други изпитвания върху животни, могат да не отразяват напълно положението при вида, представляващ интерес, т.е. при хората.
                     В настоящия метод за изпитване терминът „изпитван химикал“ се използва за позоваване на онова, което се изпитва, и не е свързан с приложимостта на метода за изпитване ARE-Nrf2 луцифераза за изпитване на вещества и/или смеси. Въз основа на наличните понастоящем данни бе показано, че изследването KeratinoSensTM е приложимо по отношение на изпитвани химикали, които обхващат различни органични функционални групи, механизми за отговор, потенциал за кожна сенсибилизация (както е определена спроучвания in vivo ) и физични и химични свойства (9) (12) (13) (14). Бяха изпитвани основно вещества с една съставка, макар че съществува ограничен обем данни и за изпитването на смеси (20). Независимо от това методът за изпитване е технически приложим за изпитването на вещества с повече съставки и на смеси. Въпреки това, преди използването на настоящия метод за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Такива съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа. Освен това, когато се извършва изпитване на вещества с повече съставки или на смеси, следва да се обърне внимание на възможното влияние на цитотоксични съставки върху наблюдаваните отклици. Методът за изпитване е приложим за изпитвани химикали, които са разтворими или образуват стабилна дисперсия (т.е. колоиден разтвор или суспензия, в които изпитваният химикал не се утаява или разделя от разтворителя в отделна фаза) или във вода, или в DMSO (включително всички съставки на изпитвания химикал при изпитване на вещество с повече съставки или на смес). Изпитваните химикали, които не отговарят на тези условия при изискваната най-висока крайна концентрация от 2 000 μM (срв. с точка 22), все пак могат да се изпитват при по-ниски концентрации. В такъв случай резултатите, отговарящи на критериите за положителност, посочени в точка 39, могат да продължат да бъдат използвани за подпомагане на идентифицирането на изпитвания химикал като кожен сенсибилизатор, докато получен отрицателен резултат с концентрации < 1 000 μM следва да се смята за недостатъчен за формулиране на заключение (вж. модела на прогнозиране в точка 39). По принцип веществата с LogP до 5 са преминали успешно изпитването, докато силно хидрофобни вещества с LogP над 7 са извън известната приложимост на метода за изпитване (14). За вещества с LogP между 5 и 7 е налична само ограничена информация.
                     Отрицателните резултати следва да се тълкуват внимателно, тъй като веществата с изключителна реакционна способност спрямо лизинови остатъци могат да бъдат открити като отрицателни от метода за изпитване. Освен това, поради ограничения метаболитен капацитет на използваната клетъчна линия (21) и поради условията на опита, про-хаптените (т.е. химикалите, които изискват ензимно активиране, например чрез P450 ензими) и пре-хаптените (т.е. химикалите, активирани чрез самоокисление), по-специално тези с малка скорост на окисление, могат също да дадат отрицателни резултати. От друга страна изпитвани химикали, които не действат като сенсибилизатор, но които въпреки това са химични стресови фактори, могат да доведат до неверни положителни резултати (14). Освен това, силно цитотоксичните изпитвани химикали не винаги могат да бъдат надеждно оценени. Накрая, изпитвани химикали, които пречат на ензима луцифераза, могат да доведат до невъзможност за разграничаване на дейността на луциферазата в изследвания, основани на клетки, причинявайки или очевидно потискане, или увеличена луминесценция (22). Например за концентрации на фитоестрогени, по-високи от 1 μM, има данни, че влияят на сигналите за луминесценцията в други изпитвания с репортерни гени, основани на луциферазата, поради свръхактивиране на луциферазния репортерен ген (23). Вследствие на това експресията на луциферазата, получена при високи концентрации на фитоестрогени или подобни химикали, за които се подозира, че предизвикват подобно на фитоестрогени свръхактивиране на луциферазния репортерен ген, трябва да бъде внимателно разгледана (23). В случаите, в които могат да бъдат представени доказателства за неприложимостта на метода за изпитване по отношение на други специфични категории изпитвани химикали, методът за изпитване не следва да се използва за тези специфични категории.
                     В допълнение към подпомагането на разграничаването на кожни сенсибилизатори и непредизвикващи сенсибилизация вещества, изследването KeratinoSensTM също така предоставя информация концентрация-отклик, която потенциално може да допринесе за оценката на потенциала за сенсибилизация, когато се използва в интегрирани подходи като IATA (19). Изисква се обаче допълнителна работа, за предпочитане въз основа на надеждни данни за хора, за да се определи как резултатите от изследването KeratinoSensTM могат да допринесат за оценка на потенциала (24) и за подкатегоризиране на сенсибилизаторите в съответствие с GHS на ООН/Регламента CLP.
                     ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     В метода за изпитване ARE-Nrf2 луцифераза се използва безсмъртна монослойна клетъчна линия, получена от човешки кератиноцити от HaCaT, стабилно трансфектирана със селективен плазмид. Клетъчната линия съдържа луциферазния ген под контрола под транскрипционния контрол на конститутивен промотор с ARE-елемент от ген, за чиято експресия е известно, че се повишава от контактни сенсибилизатори (25) (26). Сигналът от луциферазата отразява активиране от сенсибилизатори на гени, зависими от ендогенен Nrf2, като зависимостта на сигнала от луциферазата от Nrf2 в рекомбинантните клетъчни линии е доказана (27). Това позволява количествено измерване (чрез откриване на луминесценция) на индукция на луциферазния ген, с използване добре познати луциферазни субстрати, излъчващи светлина, като показател за активността на транскрипционния фактор Nrf2 в клетки след експозиция на електрофилни вещества.
                     Изпитваните химикали се считат за положителни в изследването KeratinoSensTM, ако предизвикват статистически значима индукция на луциферазна дейност над определен праг (т.е. > 1,5 пъти или увеличение от 50 %) под определената прагова концентрация, която не оказва значимо влияние върху жизнеспособността на клетките (т.е. под 1 000 μM и при концентрация, при които жизнеспособността на клетките е над 70 % (9) (12)). За тази цел се определя максималната кратност на индукцията на луциферазна активност (Imax) по отношение на контролата на разтворител (отрицателната контрола). Освен това, тъй като клетките се експонират на поредица от концентрации на изпитваните химикали, концентрацията, необходима за статистически значима индукция на луциферазна активност над прага (т.е. стойността EC1,5 ) следва да се определи чрез интерполация от кривата доза-отклик (вж. точка 32 за изчисленията). На последно място, следва да се извършат паралелни измервания на цитотоксичността, за да се прецени дали равнищата на индукция на луциферазна активност се получават при субцитотоксични концентрации.
                     Преди рутинното използване на изследването ARE-Nrf2 луцифераза, което се придържа към настоящия метод за изпитване, лабораториите следва да докажат техническата си компетентност, като използват десетте вещества за изпитването за пригодност, изброени в допълнение 2.
                     На разположение са стандарти за ефективност (СЕ) (28) за улесняване на валидирането на нови или модифицирани in vitro методи за изпитване ARE-Nrf2 луцифераза, подобни на изследването KeratinoSenTM, и за даване на възможност за своевременно изменение на настоящия метод за изпитване с оглед на тяхното включване. Взаимното приемане на данните (MAD) според споразумението на ОИСР може да бъде гарантирано единствено за методи за изпитване, валидирани съгласно PS, ако тези методи за изпитване са преразгледани и включени в съответните насоки за изпитване на ОИСР.
                     ПРОЦЕДУРА
                     Понастоящем единственият метод, обхванат от настоящия метод за изпитване, е научно валидното изследване KeratinoSensTM (9) (12) (13) (14). Стандартните работни процедури (СРП) за изследването KeratinoSensTM са на разположение и трябва да бъдат използвани при прилагане и използване на метода за изпитване в лабораторията (15). Лабораториите, които желаят да прилагат метода за изпитване, могат да получат рекомбинантната клетъчна линия, използвана в изследването KeratinoSensTM, чрез лицензионно споразумение с разработилия метода за изпитване. В следващите точки се предоставя описание на основните компоненти и процедури на метода за изпитване ARE-Nrf2 луцифераза.
                     
                        Приготвяне на културите от кератиноцити
                     
                     Следва да се използва трансгенна клетъчна линия, които съдържа стабилна инсерция на луциферазния репортерен ген под контрола на ARE-елемент (например клетъчна линия KeratinoSens™). След получаване клетките се размножават (напр. 2 до 4 пасажа) и се съхраняват замразени като хомогенни изходни култури. Клетки от тези първоначални изходни култури могат да се размножават до максимален брой пасажи (т.е. 25 при KeratinoSensTM) и се използват за рутинни изпитвания, като се използва подходящата среда за поддържане (при KeratinoSensTM това са серум, съдържащ DMEM, и генитицин).
                     За изпитването клетките трябва да са достигнали 80-90 % сливане, и следва да се положат грижи, за да се гарантира, че клетките никога не се отглеждат до пълно сливане. Един ден преди изпитването клетките се събират и разпределят в 96-гнездни плаки (10 000 клетки/гнездо при KeratinoSensTM). Следва да се обърне внимание да се избягва утаяване на клетките при посяването, за да се гарантира хомогенно разпределение на броя на клетките между гнездата. Ако случаят не е такъв, тази стъпка може да породи голямо вариране между гнездата. При всяко извършено повтаряне, за измерване на луциферазната активност се използват три повторения и едно паралелно повторение, използвано за изследването на клетъчната жизнеспособност.
                     
                        Приготвяне на изпитвания химикал и веществата за контроли
                     
                     Изпитваният химикал и веществата за контроли се приготвят в деня на изпитването. За изследването KeratinoSensTM изпитваните химикали се разтварят в диметилсулфоксид (DMSO) до крайната желана концентрация (напр. 200 mM). Разтворите на DMSO могат да се смятат за самостоятелно стерилизиращи се, поради което не е необходимо стерилно филтруване. Неразтворимият в DMSO изпитван химикал се разтваря в стерилна вода или среда за отглеждане, и разтворите се стерилизират, напр. чрез филтруване. За изпитването на даден химикал, който няма определено молекулно тегло (MW), се приготвя изходен разтвор с концентрация по подразбиране (40 mg/ml или в 4 % (w/v)) в изследването KeratinoSensTM. При разтворители, различни от диметилсулфоксид, вода или среда за отглеждане, следва да се предостави достатъчна научна обосновка.
                     Въз основа на изходните разтвори на изпитвания химикал в DMSO се приготвят серийни разреждания с DMSO до получаване на 12 концентрации за разреждане на химикала за изпитване (от 0,098 до 200 mM в изследването KeratinoSensTM). За изпитван химикал, неразтворим в DMSO, разрежданията за получаване на концентрациите за разреждане се извършват с помощта на стерилна вода или на стерилна среда за отглеждане. Независимо от използвания разтворител, по-нататък концентрациите за разреждане се разреждат 25-кратно в среда за отглеждане, съдържаща серум, и накрая се използват за третиране с допълнително 4-кратно разреждане, така че крайните концентрации на изпитвания химикал да са в обхват от 0,98 до 2 000 μM в изследването KeratinoSensTM. Алтернативни концентрации могат да бъдат използвани при наличие на обосновка (напр. в случай на цитотоксичност или малка разтворимост).
                     Отрицателната контрола (на разтворител), използвана в изследването KeratinoSensTM, е DMSO (CAS No. 67-68-5, ≥ 99 % чистота), за която се приготвят шест гнезда на плака. Тя преминава през същото разреждане, както е описано в точка 22 за концентрациите за разреждане, така че окончателната концентрация на отрицателната контрола (на разтворител) да е 1 %, за която е известно, че не оказва влияние върху жизнеспособността на клетките и съответства на същата концентрация на DMSO, каквато е при изпитвания химикал и положителната контрола. За изпитван химикал, неразтворим в DMSO, разрежданията за който са направени във вода, равнището на DMSO във всички гнезда на крайния разтвор за изпитване трябва да се коригира на 1 %, както и за другите изпитвани химикали и вещества за контроли.
                     Положителната контрола, използвана при изследването KeratinoSensTM, е канелен алдехид (CAS No. 14371-10-9, ≥ 98 % чистота), за който се приготвя поредица от 5 концентрации за разреждане в обхват от 0,4 до 6,4 mM в DMSO (от 6,4 mM изходен разтвор) и се разрежда, както е описано за концентрациите за разреждане в точна 22, така че крайната концентрация на положителната контрола да е в обхват от 4 до 64 μM. Може да се използват други подходящи положителни контроли, за предпочитане генериращи EC1,5 стойности в средата на обхвата, ако има налични данни за предходни периоди за получаване на сравними критерии за приемливост на серията.
                     
                        Прилагане на изпитвания химикал и веществата за контроли
                     
                     За всеки изпитван химикал и вещество за положителна контрола е необходим един опит за извеждане на прогноза (положителна или отрицателна), състоящ се от най-малко две независимо извършени повтаряния, всяко от които съдържа по три повторения (т.е. n=6). В случай на наличие на несъответстващи резултати между двете независимо извършени повтаряния, следва да се извърши трето повтаряне, съдържащо три повторения (т.е. n = 9). Всяко независимо извършено повтаряне се извършва в различен ден с пресен изходен разтвор на изпитваните химикали и независимо събрани клетки. Клетките обаче могат да произхождат от един и същ пасаж.
                     След посяване, както е описано в точка 20, клетките се отглеждат в продължение на 24 часа в 96-гнездните микротитърни плаки. След това средата се отстранява и се заменя с прясна среда за отглеждане (150 μl среда за отглеждане, съдържаща серум, но без генетицин KeratinoSensTM), към която се добавят 50 μl от 25-кратно разреден изпитван химикал и вещества за контроли. Поне едно гнездо от плака следва да бъде оставено празно (без клетки и без третиране), за да се оценят фоновите стойности.
                     След това третираните плаки се инкубират за около 48 часа при 37 ± 1°C в присъствието на 5 % CO2 в изследването KeratinoSensTM. Следва да се вземат мерки за избягване на изпаряването на летливи изпитвани химикали и на кръстосаното замърсяване с изпитвани химикали между гнездата, като напр. плаките се покрият с фолио преди инкубирането с изпитвания химикал.
                     
                        Измервания на луциферазната активност
                     
                     Три фактора са от решаващо значение, за да се гарантира подходящи показания за луминесценцията:
                     
                                 —
                              
                              
                                 изборът на чувствителен луминометър,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 използването на формат на плака с достатъчна височина, за да се избегне светлинно кръстосано замърсяване; както и
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 използването на луциферазен субстрат, излъчващ достатъчно светлина, за да се гарантира достатъчна чувствителност и слабо вариране.
                              
                           Преди изпитването трябва да се извърши контролен опит по план, описан в допълнение 3, за да се гарантира, че тези три точки са изпълнени.
                     След 48-часова експозиция с изпитвания химикал и веществата за контроли при изпитването KeratinoSensTM, клетките се измиват с фосфатно буфериран физиологичен разтвор, и към всяко гнездо се добавя съответният лизиращ буфер за показанията за луминесценцията за 20 минути при стайна температура.
                     След това плаки с клетъчния лизат се слагат в луминометъра за отчитане на стойностите, което при изпитването KeratinoSensTM е програмирано: i) да се добави луциферазен субстрат към всяко гнездо на (т.е. 50 μl), ii) да се изчака 1 секунда, и iii) да се интегрира луциферазната активност в продължение на 2 секунди. В случай че се използват алтернативни настройки, напр. в зависимост от модела на използвания луминометър, те трябва да бъдат обосновани. Освен това също може да бъде използван субстрат, излъчващ светлина, при условие, че опитът за контрол на качеството от допълнение 3 е проведен успешно.
                     
                        Оценка на цитотоксичността
                     
                     При изследването KeratinoSensTM за жизнеспособността на клетките средата се заменя след 48-часовата време на експозиция с прясна среда, която съдържа MTT [3-(4,5-диметилтиазол- 2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид, тиазолил син тетразолиев бромид; CAS № 298-93-1) и клетките се инкубират в продължение на 4 часа при 337°C в присъствието на 5 % CO2. След това средата с MTT се отстранява и клетките се лизират (напр. чрез добавяне към всяко гнездо на 10 % разтвор на SDS) в продължение на една нощ. След разклащане абсорбцията се измерва при 600 nm с фотометър.
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Оценка на данните
                     
                     Следните параметри се изчисляват в изследването KeratinoSensTM:
                     
                                 —
                              
                              
                                 максималната средна стойност на кратността на индукцията на луциферазна активност (Imax), наблюдавана при която и да е концентрация на изпитвания химикал и положителната контрола;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 получена е стойността на EC1,5, представляваща концентрацията, при която индукцията на луциферазна активност е над прага от 1,5 пъти (т.е. 50 % увеличение на луциферазната активност); както и
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 стойностите на концентрацията IC50 and IC30 за 50 % и 30 % намаляване на клетъчната жизнеспособност.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Кратността на индукцията на луциферазна активност се изчислява по формула 1, а общата максимална кратност на индукцията (Imax) се изчислява като средната стойност на отделно извършените повтаряния.
                              
                           
                        Уравнение 1:
                     
                     
                        
                     където
                     
                                 Lпроба
                                 
                              
                              
                                 е отчетената стойност за луминесценцията в гнездото с изпитвания химикал
                              
                           
                                 Lпразна проба
                                 
                              
                              
                                 е отчетената стойност за луминесценцията в гнездото с празната проба, без клетки и без третиране
                              
                           
                                 Lразтворител
                                 
                              
                              
                                 е отчетената средна стойност за луминесценцията в гнездата, съдържащи клетки и контрола (отрицателна) на разтворител
                              
                           EC1,5 се изчислява чрез линейна интерполация в съответствие с формула 2, а общата EC1,5 се изчислява като средно геометрично на отделно извършените повтаряния.
                     
                        Уравнение 2:
                     
                     
                        
                     където
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 е най-ниската концентрация в μM с индукция > 1,5 пъти
                              
                           
                                 Cb
                                 
                              
                              
                                 е най-високата концентрация в μM с индукция < 1,5 пъти
                              
                           
                                 Ia
                                 
                              
                              
                                 е кратността на индукцията, измерена при най-ниската концентрация с индукция > 1.5 пъти (средна стойност от три гнезда с повторения)
                              
                           
                                 Ib
                                 
                              
                              
                                 е кратността на индукцията, измерена при най-високата концентрация в с индукция < 1,5 пъти (средна стойност от три гнезда с повторения)
                              
                           Жизнеспособността се изчислява по уравнение 3:
                     
                        Уравнение 3:
                     
                     
                        
                     където
                     
                                 Vпроба
                                 
                              
                              
                                 е отчетената стойност на абсорбцията на MTT в гнездото с изпитвания химикал
                              
                           
                                 Vпразна проба
                                 
                              
                              
                                 е отчетената стойност на абсорбцията на MTT в гнездото с празната проба, без клетки и без третиране
                              
                           
                                 Vразтворител
                                 
                              
                              
                                 е отчетената средна стойност на абсорбцията на MTT в гнездата, съдържащи клетки и контрола (отрицателна) на разтворител
                              
                           IC50 и IC30 се изчисляват чрез линейна интерполация в съответствие с формула 4, а общите IC50 и IC30 се изчисляват като средно геометрично на отделно извършените повтаряния.
                     
                        Уравнение 4:
                     
                     
                        
                     където
                     
                                 X
                              
                              
                                 е процентното намаление на концентрацията, което трябва да бъде изчислено (50 и 30 за IC50 и IC30)
                              
                           
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 е най-ниската концентрация в μM с > x % намаление на жизнеспособността
                              
                           
                                 Cb
                                 
                              
                              
                                 е най-високата концентрация в μM с < x % намаление на жизнеспособността
                              
                           
                                 Va
                                 
                              
                              
                                 е процентът жизнеспособност при най-ниската концентрация в с > x % намаление на жизнеспособността
                              
                           
                                 Vb
                                 
                              
                              
                                 е процентът жизнеспособност при най-високата концентрация с < x % намаление на жизнеспособността
                              
                           За всяка концентрация, показваща > 1,5 кратна индукция на луциферазна активност, се изчислява статистическата значимост (напр. чрез двустранен t-тест на Стюдънт), чрез сравняване на стойностите на луминесценцията за трите повторения със стойностите на луминесценцията в гнездата с контролата (отрицателна) на разтворител, за да се определи дали индукцията на луциферазна активност е статистически значима (p < 0,05). Най-ниската концентрация с > 1,5 кратна индукция на луциферазна активност е стойността, определяща стойността на EC1,5. Във всеки отделен случай се проверява дали тази стойност е под стойността на IC30, което показва, че има по-малко от 30 % намаление на клетъчната жизнеспособност при концентрацията, определяща EC1,5.
                     Препоръчва се данните да се проверяват визуално с помощта на графики. Ако не се наблюдава ясна крива доза-отклик, или ако получената крива доза-отклик е двуфазна (т.е. преминава два пъти през прага от 1,5), следва да се извърши повтаряне на опита, за да се провери дали това е специфично за изпитвания химикал, или се дължи на артефакт от опита. В случай че двуфазният отклик е възпроизводим в независим опит, следва да бъде отчетена долната стойност на EC1,5 (концентрацията, при която прагът от 1,5 е преминат за първи път).
                     В редките случаи, когато се наблюдава индукция над 1,5 пъти, която не е статистически значима, последвана от по-висока концентрация със статистически значима индукция, резултатите от това извършено повтаряне се смятат за валидни и положителни само ако статистически значимата индукция над прага от 1,5 е била получена при концентрация, която не е цитотоксична.
                     И накрая, за изпитвани химикали, водещи до 1,5 кратна или по-голяма индукция още при най-ниската изпитвана концентрация от 0,98 μM, стойността на EC1,5 < 0.98 се определя въз основа на визуалната проверка на кривата доза-отклик.
                     
                        Критерии за приемливост
                     
                     Когато се използва изследване KeratinoSensTM трябва да се спазват следните критерии. Първо, индукцията на луциферазна активност, получена при положителната контрола, канелен алдехид, следва да бъде статистически значима над прага от 1,5 (например чрез използване на T-тест) при най-малко една от изпитаните концентрации (от 4 до 64 μM).
                     Второ, стойността на EC1,5 трябва да бъде в рамките на две стандартни отклонения от средната стойност за изпитващата лаборатория за предходни периоди (напр. между 7 μM и 30 μM въз основа на набора от данни от валидирането), която следва да се актуализира редовно. Освен това средната индукция в трите повторения за канелен алдехид при 64 μM следва да бъде между 2 и 8. Ако последният критерий не е изпълнен, зависимостта доза-отклик за канеления алдехид следва да бъде проверена внимателно и изпитванията могат да бъдат приети само ако е налице ясна зависимост доза-отклик, с увеличаваща се индукция на луциферазна активност при нарастване на концентрациите на положителната контрола.
                     Накрая, средният коефициент на вариация при отчетената стойност на луминесценцията за отрицателната контрола (на разтворител) DMSO следва да бъде под 20 % при всяко извършено повтаряне, което се състои от 6 гнезда, изпитвани в три повторения. Ако варирането е по-голямо, резултатите следва да бъдат отхвърлени.
                     
                        Тълкуване на резултатите и модел за прогнозиране
                     
                     Прогнозата по KeratinoSensTM се счита за положителна, ако всички от посочените по-долу 4 условия са изпълнени във всичките 2 от 2 извършени повтаряния, или в същите 2 от 3 извършени повтаряния, в противен случай прогнозата по KeratinoSensTM се счита за отрицателна (фигура 1):
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Imax е по-голяма (>) от 1,5 пъти и разликата спрямо контролата (отрицателна) на разтворител е статистически значима (определена с двустранен t-тест на Стюдънт за несдвоени разлики);
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Клетъчната жизнеспособност е по-голяма (>) от 70 % при най-ниската концентрация с индукция на луциферазна активност над 1,5 пъти (т.е. при концентрацията, определяща ЕС1,5);
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Стойността на ЕС1,5 е по-малка от (<) 1 000 μM (или < 200 μg/ml за изпитвани химикали без определено MW);
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 има видима зависимост доза-отклик за луциферазната индукция (или двуфазен отклик, както е посочено в точка 33).
                              
                           Ако в дадено извършено повтаряне са изпълнени всички от първите три условия, но не може да бъде наблюдавана ясна зависимост доза-отклик за луциферазната индукция, тогава резултатът от това извършено повтаряне следва да се счита за недостатъчен за формулиране на заключение и може да бъде необходимо допълнително изпитване (фигура 1). Освен това, отрицателният резултат, получен с концентрации < 1 000 μM (или < 200 μg/ml за изпитвани химикали без определено MW), следва също да се разглежда като недостатъчен за формулиране на заключение (вж. точка 11).
                     
                        Фигура 1
                     
                     
                        Модел на прогнозиране, използвани в изследването KeratinoSensTM. Прогнозирането по KeratinoSensTM следва да се разглежда в рамките на IATA и в съответствие с разпоредбите на точки 9 и 11.
                     
                     
                        
                     В редки случаи изпитваните химикали, които индуцират луциферазна активност при равнища, които са много близки до цитотоксичните, могат да бъдат положителни в някои извършени повтаряния при нетоксични равнища (т.е. EC1,5, определяща концентрация под (<) IC30), а в други извършени повтаряния — само при цитотоксични равнища (т.е. EC1,5, определяща концентрация над (>) IC30). Такива изпитвани химикали се изпитват отново с по-стеснен анализ доза-отклик, с използване на по-малък коефициент на разреждане (напр. 1,33 или √2 (= 1,41) кратно разреждане между гнездата), за да се определи дали индукцията е получена при цитотоксични нива, или не (9).
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитван химикал
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Вещество с една съставка
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Химична идентификация, като наименование(я) по IUPAC или по CAS, CAS номер(а), SMILES или InChI код, структурна формула, и/или други идентификатори;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Външен вид, разтворимост във вода, разтворимост в DMSO, молекулно тегло и допълнителни относими физични и химични свойства, според наличността;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и т.н.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Обработка преди изпитването, ако се прилага (напр. затопляне, смилане);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Изпитвана концентрация (концентрации);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Условия на съхранение и стабилност, доколкото са налични.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Вещество с повече съставки, UVCB и смес:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         характеризиране, доколкото е възможно, чрез химическата идентичност (вж. по-горе), чистотата, количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките (вж. по-горе), доколкото са налични.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Външен вид, разтворимост във вода, разтворимост в DMSO и допълнителни относими физични и химични свойства, според наличността;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Молекулно тегло или привидно молекулно тегло в случай на смеси/полимери с известен състав или друга информация, относима към провеждането на изследването;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Обработка преди изпитването, ако се прилага (напр. затопляне, смилане);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Изпитвана концентрация (концентрации);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Условия на съхранение и стабилност, доколкото са налични.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Контроли
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Положителна контрола:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Химична идентификация, като наименование(я) по IUPAC или по CAS, CAS номер(а), SMILES или InChI код, структурна формула, и/или други идентификатори;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Външен вид, разтворимост във вода, разтворимост в DMSO, молекулно тегло и допълнителни относими физични и химични свойства, според наличността, където е приложимо;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и т.н.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Обработка преди изпитването, ако се прилага (напр. затопляне, смилане);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Изпитвана концентрация (концентрации);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Условия на съхранение и стабилност, доколкото са налични;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Препратка към резултатите за положителните контроли за предходни периоди, доказващи подходящи критерии за приемливост на серията, ако е приложимо.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Отрицателно контрола (носител)
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Химична идентификация, като наименование(я) по IUPAC или по CAS, CAS номер(а) и/или други идентификатори;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и т.н.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Външен вид, молекулно тегло и допълнителни относими физични и химични свойства в случай че са използвани отрицателни контроли/носители, различни от упоменатите в настоящия метод за изпитване и в зависимост от наличността;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Условия на съхранение и стабилност, доколкото са налични;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Обосновка за избора на разтворител за всеки изпитван химикал.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Условия на метода за изпитване
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Име и адрес на финансиращия, на изпитващата лаборатория и на ръководителя на изследването;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на използвания метод за изпитване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Използвана клетъчна линия, условия за нейното съхранение и източник (например мястото, от което са взети);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Брой пасажи и равнище на сливане на клетките, използвани за изпитването;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Метод на преброяване на клетките, използван за посяване преди изпитването, и мерки, предприети за гарантиране на хомогенно разпределение на броя на клетките (вж. точка 20);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             използван луминометър (напр. модел), включително настройки, използван луциферазен субстрат, и доказване на съответни измервания на луминесценцията въз основа на контролното изпитване, описано в допълнение 3;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Процедурата, използвана за доказване на пригодността на лабораторията за извършване на метода за изпитване (например чрез изпитване на вещества за изпитването за пригодност), или за доказване на възпроизводимостта на характеристиките на метода за изпитване във времето.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Процедура за изпитване
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Брой на извършените повтаряния и използвани повторения;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Концентрации на изпитвания химикал, процедура за прилагане и продължителност на експозицията (ако е различно от препоръчаното)
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на използваните критерии за оценка и за решение;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на използваните критерии за приемливост на изследването.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на всякакви изменения на процедурата за изпитване.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Резултати
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Представяне в табличен вид на Imax, EC1,5 и стойностите за жизнеспособността (т.е. IC50, IC30), получени за изпитвания химикал и за положителната контрола за всяко извършено повтаряне, както и средните стойности (Imax: средна стойност; EC1,5 и стойностите за жизнеспособността: средно геометрично) и SD, изчислени с използване на данните от всички отделно извършени повтаряния, и посочване на ранга на изпитвания химикал в съответствие с модела за прогнозиране;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Коефициент на вариация, получен за отчетените стойности за луминесценцията в отрицателната контрола за всеки опит;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Графика, показваща кривите доза-отклик за индукцията на луциферазна активност и за жизнеспособността;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на всякакви други относими наблюдения, ако е приложимо.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обсъждане на резултатите
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Обсъждане на резултатите, получени с изследването KeratinoSensTM;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Разглеждане на резултатите от метода за изпитване в рамките на контекста на IATA, ако е налична друга относима информация.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Заключение
                                 
                              
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. На разположение на адрес: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No. 168. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Adler S., Basketter D., Creton S., Pelkonen O., van Benthem J., Zuang V., Andersen K.E., Angers-Loustau A., Aptula A., Bal-Price A., Benfenati E., Bernauer U., Bessems J., Bois F.Y., Boobis A., Brandon E., Bremer S., Broschard T., Casati S., Coecke S., Corvi R., Cronin M., Daston G., Dekant W., Felter S., Grignard E., Gundert-Remy U., Heinonen T., Kimber I., Kleinjans J., Komulainen H., Kreiling R., Kreysa J., Leite S.B., Loizou G., Maxwell G., Mazzatorta P., Munn S., Pfuhler S., Phrakonkham P., Piersma A., Poth A., Prieto P., Repetto G., Rogiers V., Schoeters G., Schwarz M., Serafimova R., Tähti H., Testai E., van Delft J., van Loveren H., Vinken M., Worth A., Zaldivar J.M. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85, 367-485.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Глава Б.42 от настоящото приложение: Кожна сенсибилизация: изследване на локалните лимфни възли.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Глава Б.6 от настоящото приложение: Кожна сенсибилизация.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Глава Б.50 от настоящото приложение: Кожна сенсибилизация: изследване на локалните лимфни възли: DA.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Глава Б.51 от настоящото приложение: Кожна сенсибилизация: изследване на локалните лимфни възли: BrdU-ELISA.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Natsch A. (2010). The Nrf2-Keap1-ARE Toxicity Pathway as a Cellular Sensor for Skin Sensitizers-Functional Relevance and Hypothesis on Innate Reactions to Skin Sensitizers. Toxicological Sciences 113, 284-292.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Emter R., Ellis G., Natsch A. (2010). Performance of a novel keratinocyte-based reporter cell line to screen skin sensitizers in vitro. Toxicology and Applied Pharmacology 245, 281-290.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D., Kensler T.W. (2005). The role of Keap1 in cellular protective responses. Chem. Res. Toxicol. 18, 1779-1791.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Kansanen E., Kuosmanen S.M., Leinonen H., Levonen A.L. (2013). The Keap1-Nrf2 pathway: Mechanisms of activation and dysregulation in cancer. Redox Biol. 1(1), 45-49.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Natsch A., Bauch C., Foertsch L., Gerberick F., Normann K., Hilberer A., Inglis H., Landsiedel R., Onken S., Reuter H., Schepky A., Emter R. (2011). The intra- and inter-laboratory reproducibility and predictivity of the KeratinoSens assay to predict skin sensitizers in vitro: results of a ring-study in five laboratories. Toxicol. In Vitro 25, 733-744.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Natsch A., Ryan C.A., Foertsch L., Emter R., Jaworska J., Gerberick G.F., Kern P. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, 33, 1337-1352.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 EURL-ECVAM (2014). Recommendation on the KeratinoSensTM assay for skin sensitisation testing, 42 pp. На разположение на адрес: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/recommendation-keratinosens-skin-sensitisation.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) (2013) Protocol 155: KeratinoSensTM, 17 pp. Available: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Natsch A., Emter R., Ellis G. (2009). Filling the concept with data: integrating data from different in vitro and in silico assays on skin sensitizers to explore the battery approach for animal-free skin sensitization testing. Toxicol. Sci. 107, 106-121.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Ball N., Cagen S., Carrillo J.C., Certa H., Eigler D., Emter R., Faulhammer F., Garcia C., Graham C., Haux C., Kolle S.N., Kreiling R., Natsch A., Mehling A. (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regul. Toxicol. Pharmacol. 60, 389-400.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Bauch C., Kolle S.N., Ramirez T., Eltze T., Fabian E., Mehling A., Teubner W., van Ravenzwaay B., Landsiedel R. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potentials. Regul. Toxicol. Pharmacol. 63, 489-504.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Jaworska J., Dancik Y., Kern P., Gerberick F., Natsch A. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. J Appl Toxicol. 33, 1353-1364.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Andres E., Sa-Rocha V.M., Barrichello C., Haupt T., Ellis G., Natsch A. (2013). The sensitivity of the KeratinoSensTM assay to evaluate plant extracts: A pilot study. Toxicology In Vitro 27, 1220-1225.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez T., Kolle S., Eltze T., van Ravenzwaay B., Oesch F., Landsiedel R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch. Toxicol. 87, 1683-1969.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Thorne N., Inglese J., Auld D.S. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology. Chemistry and Biology 17, 646-657.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 OECD (2012). BG1Luc Estrogen Receptor Transactivation Test Method for Identifying Estrogen Receptor Agonists and Antagonists. OECD Guidelines for Chemical Testing No. 457. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87).
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Gildea L.A., Ryan C.A., Foertsch L.M., Kennedy J.M., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2006). Identification of gene expression changes induced by chemical allergens in dendritic cells: opportunities for skin sensitization testing. J. Invest. Dermatol., 126, 1813-1822.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Ryan C.A., Gildea L.A., Hulette B.C., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2004). Gene expressing changes in peripheral blood-derived dendritic cells following exposure to a contact allergen. Toxicol. Lett. 150, 301-316.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Emter R., van der Veen J.W., Adamson G., Ezendam J., van Loveren H., Natsch A. (2013). Gene expression changes induced by skin sensitizers in the KeratinoSens™ cell line: Discriminating Nrf2-dependent and Nrf2-independent events. Toxicol. in vitro 27, 2225-2232.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2015). Performance Standards for assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation ARE-Nrf2 luciferase test methods. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment N0 213, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No.34. OECD, Paris, France.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 NAFTA (North American Free Trade Agreement) (2012). Technical Working Group on Pesticides — (Quantitative) Structure Activity Relationship ((Q)SAR) Guidance Document. 186 pp. http://www.epa.gov/oppfead1/international/naftatwg/guidance/qsar-guidance.pdf
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                           
                              Точност
                           : степента на близост между резултатите от метода за изпитване и приетите референтни стойности. Това е мярка за характеристиките на метода за изпитване и аспект на „относимостта“. Терминът често се използва взаимозаменяемо с термина „съответствие“, за да се обозначи относителният дял на правилните резултати при даден метод за изпитване (29).
                        
                           
                              AOP (път, водещ до неблагоприятен ефект)
                           : Последователност от събития от химичната структура на целеви химикал или група от сходни химикали през молекулното иницииращо събитие до представляващ интерес in vivo резултат (2).
                        
                           
                              ARE
                           : елемент, активиращ се в отговор на антиоксидантно въздействие (наричан също EpRE, елемент, активиращ се в отговор на електрофилно въздействие), е елемент, активиращ се в отговор на въздействие, разположен в участъка на промотор, предшестващ останалите участъци в посоката на транскрипцията, в множество цитопротективни гени и гени от фаза II. Когато се активира чрез Nfr2, той е посредник при транскрипционната индукция на тези гени.
                        
                           
                              Химикал
                           : Вещество или смес.
                        
                           
                              Коефициент на вариация
                           : Мярка за варирането, която се изчислява за група от данни от повторения като се раздели стандартното отклонение на средната стойност. Той може да бъде умножен по 100 за изразяване в проценти.
                        
                           
                              EC1,5
                              
                           : Интерполирана концентрация за 1,5 кратна луциферазна индукция.
                        
                           
                              IC30
                              
                           : Концентрация, предизвикваща намаляване на клетъчната жизнеспособност с 30 %.
                        
                           
                              IC50
                              
                           : Концентрация, предизвикваща намаляване на клетъчната жизнеспособност с 50 %.
                        
                           
                              Опасност
                           : Вътрешно присъщо свойство на даден агент или ситуация, притежаващо потенциал да предизвика неблагоприятни ефекти когато един организъм, система или (суб-)популация бъдат експонирани на този агент.
                        
                           
                              IATA (интегриран подход за изпитване и оценка)
                           : Структуриран подход, използван за идентифициране на опасност (потенциал), характеризиране на опасност (потенциал) и/или оценка на безопасността (потенциал и експозиция) на даден химикал или група от химикали, който стратегически интегрира и претегля всички данни, относими към предоставянето на информация за вземането на регулаторно решение по отношение на потенциалната опасност и/или риска, и/или необходимостта от допълнително целенасочено и следователно минимално изпитване.
                        
                           
                              Imax
                              
                           : максималната кратност на индукцията на луциферазна активност (Imax) по отношение на контролата на разтворител (отрицателната контрола), измерена при която и да е концентрация на изпитван химикал
                        
                           
                              Keap1
                           : Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein) представлява рецепторен белтък, който може да регулира активността на Nrf2. В отсъствие на индукция рецепторният белтък Keap1 се насочва към транскрипционния фактор Nrf2, с оглед убиквитиниране и протеолитично разграждане в протеазомата. Ковалентно изменение на реактивните цистеинови остатъци на Keap1 от малки молекули може да доведе до дисоциация на Nrf2 от Keap1 (8) (10) (11).
                        
                           
                              Смес
                           : Смес или разтвор, съставена (съставен) от две или повече вещества, в която (който) те не си взаимодействат (1).
                        
                           
                              Вещество с една съставка
                           : Вещество, определено от неговия количествен състав, в който съдържанието на една основна съставка е най-малко 80 % (w/w).
                        
                           
                              Вещество с повече съставки
                           : Вещество, определено от неговия количествен състав, в който повече от една основна съставка се съдържа в концентрация ≥ 10 % (w/w) и < 80 % (w/w). Веществото с повече съставки е резултат от производствен процес. Разликата между смес и вещество с повече съставки е, че дадена смес е получена чрез смесване на две или повече вещества без химична реакция. Веществото с повече съставки е резултат от химична реакция.
                        
                           
                              Nrf2
                           : Ядреният фактор „(erythroid-derived 2)-like 2“ е транскрипционен фактор, участващ в пътя за антиоксидантен отговор. Когато Nrf2 не е убиквитиниран, той се отделя в цитоплазмата и се транслоцира в ядрото, където се свързва с ARE в участъка на промотора, предшестващ останалите участъци в посоката на транскрипцията в множество цитопротективни гени, като инициира транскрипцията им (8) (10) (11).
                        
                           
                              Положителна контрола
                           : Повторение, съдържащо всички компоненти на дадена изпитвана система и третирано с вещество, за което е известно, че предизвиква положителен отклик. За да гарантира, че може да се направи оценка на варирането на отклика в положителната контрола във времето, големината на положителния отклик не следва да е прекомерна.
                        
                           
                              Относимост
                           : описание на взаимовръзката между изпитването и ефекта, представляващ интерес, и дали тя е значима и полезна за определена цел. Това е степента, в която изпитването правилно измерва или прогнозира биологичния ефект, представляващ интерес. Относимостта включва разглеждането на точността (съответствието) на метода за изпитване (29).
                        
                           
                              Надеждност
                           : мярка за степента, в която даден метод за изпитване може да се приложи възпроизводимо в една и съща лаборатория и в различни лаборатории по различно време, при използване на един и същи протокол. Оценката за нея се прави като се изчислява вътрешнолабораторната и междулабораторната възпроизводимост и вътрешнолабораторната повторяемост (29).
                        
                           
                              Възпроизводимост
                           : Съгласуваността между резултатите, получени чрез изследване на същия химикал, като се използва същият протокол за изпитване (вж. надеждност) (29).
                        
                           
                              Чувствителност
                           : Относителният дял на всички положителни/активни химикали, които са класифицирани правилно чрез метода за изпитване. Това е мярка за точността на метода за изпитване, която предоставя категорични резултати и е важен фактор при оценката на относимостта на метода за изпитване (29).
                        
                           
                              Контрола на разтворител/носител
                           : Повторение, съдържащо всички съставки на дадена изпитвана система, с изключение на изпитвания химикал, но с разтворителя, който се използва. Използва се за определяне на базовия отклик на пробите, третирани с изпитвания химикал, разтворен в същия разтворител.
                        
                           
                              Специфичност
                           : Относителният дял на всички отрицателни/неактивни химикали, които са класифицирани правилно чрез метода за изпитване. Това е мярка за точността на метода за изпитване, която предоставя категорични резултати и е важен фактор при оценката на относимостта на метода за изпитване (29).
                        
                           
                              Вещество
                           : химичен елемент и неговите съединения в естествено състояние или получени чрез всеки производствен процес, включително всяка добавка, необходима за запазване на стабилността на продукта и всеки примес, извлечен от използвания процес, с изключение на всеки разтворител, който може да бъде отделен, без да се засяга стабилността на веществото или да се променя неговият състав (1).
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : Терминът „изпитван химикал“ се използва за обозначаване на онова, което се изпитва.
                        
                           
                              Глобална хармонизирана система на Организацията на обединените нации за класифициране и етикетиране на химикали (GHS на ООН)
                           : система, предлагаща класифициране на химикали (вещества и смеси) според стандартизирани видове и степени на физическа, здравна и екологична опасност и разглеждаща съответни съобщителни елементи, като например пиктограми, сигнални думи, предупреждения за опасност, препоръки за безопасност и информационни листове за безопасност, така че те да съобщават информация за тяхното неблагоприятно въздействие с оглед защита на хората (включително работодатели, работещи, служители в транспорта, потребители и аварийни служители) и на околната среда (1).
                        
                           
                              UVCB
                           : Вещества с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологични материали.
                        
                           
                              Валиден метод за изпитване
                           : Метод за изпитване, за който се смята, че притежава достатъчна относимост и надеждност по отношение на конкретна цел и който се основава на научно обосновани принципи. Даден метод за изпитване никога не е валиден в абсолютен смисъл, а само по отношение на определена цел (29).
                     
                     
                        Допълнение 2
                        ВЕЩЕСТВА ЗА ИЗПИТВАНЕ ЗА ПРИГОДНОСТ
                        
                           
                              In vitro кожна сенсибилизация: Метод за изпитване ARE-Nrf2 луцифераза
                        
                        Преди рутинното използване на настоящия метод за изпитване, лабораториите следва да докажат техническата си компетентност, като правилно получат очакваната прогноза по KeratinoSenTM за 10-те вещества за изпитване за пригодност, препоръчани в Таблица 1, и чрез получаване на стойности за EC1,5 и IC50, които попадат в съответния референтен обхват за минимум 8 от 10-те вещества за изпитване за пригодност. Тези вещества за изпитване за пригодност са подбрани като представителни за размаха от отклици за опасностите от кожна сенсибилизация. Други критерии за подбор са, че те са налични в търговската мрежа, че са налични висококачествени in vivo референтни данни и че са налични висококачествени in vitro данни от изследването KeratinoSensTM.
                        
                           Таблица 1
                        
                        
                           Препоръчвани вещества за доказване на техническа компетентност по отношение на изследването KeratinoSensTM
                           
                        
                        
                                    Вещества за изпитване за пригодност
                                 
                                 
                                    CASRN
                                 
                                 
                                    Агрегатно състояние
                                 
                                 
                                    
                                       In vivo прогноза (28)
                                    
                                 
                                 
                                    KeratinoSensTM Прогноза (29)
                                    
                                 
                                 
                                    Референтен обхват EC1,5 (μM) (3)
                                 
                                 
                                    Референтен обхват EC50 (μM) (30)
                                    
                                 
                              
                                    Изопропанол
                                 
                                 
                                    67-63-0
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Непредизвикващо сенсибилизация вещество
                                 
                                 
                                    Отрицателен резултат
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Салицилова киселина
                                 
                                 
                                    69-72-7
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Непредизвикващо сенсибилизация вещество
                                 
                                 
                                    Отрицателен резултат
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Млечна киселина
                                 
                                 
                                    50-21-5
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Непредизвикващо сенсибилизация вещество
                                 
                                 
                                    Отрицателен резултат
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Глицерол
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Непредизвикващо сенсибилизация вещество
                                 
                                 
                                    Отрицателен резултат
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Цинамилов алкохол
                                 
                                 
                                    104-54-1
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Сенсибилизатор (слаб)
                                 
                                 
                                    Положителен резултат
                                 
                                 
                                    25 — 175
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Етиленгликолдиметакрилат
                                 
                                 
                                    97-90-5
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Сенсибилизатор (слаб)
                                 
                                 
                                    Положителен резултат
                                 
                                 
                                    5 — 125
                                 
                                 
                                    > 500
                                 
                              
                                    2-Меркаптобензотиазол
                                 
                                 
                                    149-30-4
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Сенсибилизатор (умерен)
                                 
                                 
                                    Положителен резултат
                                 
                                 
                                    25 — 250
                                 
                                 
                                    > 500
                                 
                              
                                    Метилдибромоглутаронитрил
                                 
                                 
                                    35691-65-7
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Сенсибилизатор (силен)
                                 
                                 
                                    Положителен резултат
                                 
                                 
                                    < 20
                                 
                                 
                                    20 — 100
                                 
                              
                                    4-Метиламинофенолсулфат
                                 
                                 
                                    55-55-0
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Сенсибилизатор (силен)
                                 
                                 
                                    Положителен резултат
                                 
                                 
                                    < 12,5
                                 
                                 
                                    20 — 200
                                 
                              
                                    2,4-динитрохлоробензен
                                 
                                 
                                    97-00-7
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Сенсибилизатор (изключително силен)
                                 
                                 
                                    Положителен резултат
                                 
                                 
                                    < 12,5
                                 
                                 
                                    5 — 20
                                 
                              
                     
                        Допълнение 3
                        
                           КОНТРОЛ НА КАЧЕСТВОТО ПРИ ИЗМЕРВАНИЯТА НА ЛУМИНЕСЦЕНЦИЯТА
                        
                        
                           Основен опит за осигуряването на оптимални измервания на луминесценцията в изследването KeratinoSensTM
                           
                        
                        Следните три параметъра са от решаващо значение, за да се гарантира получаването на надеждни резултати с луминометъра:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    наличие на достатъчна чувствителност, даваща стабилен фон в гнездата с контролите;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    отсъствие на градиент в плаката, дължащ се на продължителното време за отчитане на стойностите; както и
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    отсъствие на светлинно замърсяване в прилежащите гнезда от гнезда с висока активност.
                                 
                              Преди изпитването се препоръчва да се гарантира наличието на подходящи измервания на луминесценцията чрез изпитване на план с контролна плака, описан по-долу (анализ с три повторения).
                        
                           План за плака за първия предварителен опит
                        
                        
                                     
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                    5
                                 
                                 
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    8
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    12
                                 
                              
                                    A
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    B
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    
                                       D
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 0,98
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 1,95
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 3,9
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 7,8
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 15,6
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 31,25
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 62,5
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 125
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 250
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 500
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 1000
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 2000
                                    
                                 
                              
                                    E
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    F
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    G
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    H
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    
                                       CA 4
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 8
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 16
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 32
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 64
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       Празна проба
                                    
                                 
                              
                           EGDMA= Етиленгликолдиметакрилат (CAS №: 97-90-5) силно индуциращ химикал
                        
                           CA= Канелен алдехид, положителна референтна контрола (CAS №: 104-55-2)
                        
                           Анализът за контрол на качеството следва да докаже:
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    ясна зависимост доза-отклик в ред D, с Imax > 20 пъти над фона (в повечето случаи се достигат стойности на Imax между 100 и 300);
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    отсъствие на зависимост доза-отклик в редове C и E (отсъствие на стойност на индукция над 1,5 (в идеалния случай не трябва да надхвърля 1,3) поради възможното светлинно замърсяване, особено в близост до гнезда с висока активност в реда с EGDMA;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    отсъствие на статистически значима разлика между редовете A, B, C, E, F и G (т.е. отсъствие на градиент в плаката); както и
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    варирането във всеки от редовете A, B, C, E, F и G и в гнездата с DMSO в ред H следва да бъде под 20 % (т.е. стабилен фон).
                                 
                              
                     Б.61   Метод за изпитване с пропускане на флуоресцеин за идентифициране на химикали с корозивно и силно дразнещо действие върху очите
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 460 (2012). Методът за изпитване с пропускане на флуоресцеин (FL) е in vitro метод за изпитване, който може да се използва при определени обстоятелства и със специфични ограничения за класифициране на химикали (вещества и смеси) като химикали с корозивно и силно дразнещо действие върху очите, както са определени в Глобалната хармонизирана система на Организацията на обединените нации (ООН) за класифициране и етикетиране на химикали (GHS) (категория 1), Регламент (ЕО) № 1272/2008 относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси (CLP) (31) (категория 1) и Агенцията на САЩ за защита на околната среда (EPA) (категория I) (1) (2). За целите на настоящия метод за изпитване химикалите със силно дразнещо действие върху очите се определят като химикали, които предизвикват тъканно увреждане на окото след прилагане на изпитван химикал, което не е обратимо в рамките на 21 дни, или които причиняват сериозно физическо влошаване на зрението, а химикалите с корозивно действие върху очите — като химикали, които причиняват необратимо тъканно увреждане на окото. Тези химикали са класифицирани като категория 1 по GHS на ООН, категория 1 по Регламент CLP на ЕС или категория I по EPA.
                     Независимо че методът за изпитване FL не се смята за валиден като пълен заместител на in vivo изпитването върху заешки очи, FL се препоръчва за използване като част от стратегия за поетапно изпитване за регулаторно класифициране и етикетиране. По този начин FL се препоръчва като първа стъпка от подход „отгоре надолу“ за идентифициране на химикали с корозивно/силно дразнещо действие върху очите, конкретно по отношение на ограничен брой типове химикали (т.е. разтворими във вода вещества и смеси) (3) (4).
                     Понастоящем е общоприето, че в обозримо бъдеще, нито едно in vitro изпитване за дразнене на очите няма да е в състояние да замести in vivo изпитването за действие върху очите (МИ Б.5 (5)) при прогнозирането в целия спектър на дразнене, за различните класове химикали. При все това стратегическите комбинации от няколко алтернативни методи за изпитване в рамките на стратегия за (поетапно) изпитване може да са в състояние да заменят in vivo изпитването за действие върху очите (4). Подходът „отгоре надолу“ (4) е създаден да се използва, когато, въз основа на наличната информация, се очаква химикалът да има висок потенциал за дразнещо действие.
                     Въз основа на модела на прогнозиране, подробно описан в точка 35, методът за изпитване FL може да идентифицира химикали в рамките на ограничена област на приложимост като химикали с корозивно/силно дразнещо действие върху очите (категория 1 по GHS на ООН; категория 1 по CLP на ЕС: категория I по EPA) без по-нататъшно изпитване. Същото се допуска за смесите, въпреки че за валидирането не са използвани смеси. Следователно, методът за изпитване FL може да се използва за определяне на корозивно/силно дразнещо действие върху очите на химикали, като се следва за последователно изпитване от МИ Б.5 (5). Независимо от това, даден химикал, за който с метода за изпитване FL не се прогнозира корозивно или силно дразнещо действие върху очите, трябва да бъде изпитан с един или повече допълнителни методи за изпитване (in vitro и/или in vivo), които дават възможност за точно определяне на i) химикали, които при FL дават in vitro неверни отрицателни резултати за корозивно/силно дразнещо действие върху очите (категория 1 по GHS на ООН; категория 1 по CLP на ЕС: категория I по EPA; ii) химикали, които не са класифицирани за корозивно/дразнещо действие върху очите (без категория по GHS на ООН; „Без категория“ по CLP на ЕС; категория IV по EPA; и/или iii) химикали, които са с умерено/леко дразнещо действие върху очите (категории 2A и 2B по GHS на ООН; категория 2 по CLP на ЕС: категории II и III по EPA;
                     Целта на настоящия метод за изпитване е да се опишат процедурите, използвани за оценка на потенциалното корозивно или силно дразнещо действие върху очите на изпитван химикал, измерено чрез способността му да предизвиква увреждания на непропусклив конфлуентен епителен монослой. Ненарушеността на трансепителната пропускливост е основна функция на епитела, като този в конюнктивата и роговицата. Трансепителната пропускливост се контролира от различни тесни връзки. Доказано е, че съществува корелация между увеличаването на пропускливостта на епитела на роговицата in vivo и нивото на възпаление и повърхностното увреждане, наблюдавано при развитието на дразненето на очите.
                     При метода за изпитване FL токсичните ефекти след краткосрочна експозиция на изпитвания химикал се измерват чрез увеличаване на пропускливостта по отношение на натриев флуоресцеин през епителния монослой на клетки на Мадин-Дарби от бъбрек на куче (MDCK), отглеждани върху пропускливи вложки. Полученото количество пропуснат флуоресцеин е пропорционално на предизвиканите от химикала увреждания на тесните връзки, дезмозомните връзки и клетъчните мембрани, и може да се използва за оценка на потенциала за токсичност върху очите на даден изпитван химикал. В допълнение 1 е дадена схема на MDCK клетки, отглеждани върху мембрана на вложка за метода за изпитване FL.
                     Определенията са дадени в допълнение 2.
                     ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ
                     Настоящият метод за изпитване се основава на протокол № 71 на INVITTOX (6), който е бил оценен в международно изследване за валидиране от Европейския център за валидиране на алтернативни методи (ECVAM), в сътрудничество с Междуведомствения координационен комитет на САЩ за валидиране на алтернативни методи (ICCVAM) и Японския център за валидиране на алтернативни методи (JaCVAM).
                     Методът за изпитване FL не се препоръчва за идентификацията на химикали, които следва да бъдат класифицирани като химикали със слабо/умерено дразнещо действие, или на химикали, които не следва да се класифицират за дразнещо действие върху очите (вещества и смеси) (т.е. категория 2A/2B, „Без категория“ по GHS на ООН; категория 2, „Без категория“ по CLP на ЕС; категории II/III/IV по EPA), както е доказано в изследването за валидиране (3) (7).
                     Методът за изпитване е приложим само при разтворими във вода химикали (вещества и смеси). Потенциалът за силно дразнещо действие върху очите на химикалите, които са разтворими във вода и/или при които токсичният ефект не е засегнат от разреждане, като цяло се прогнозира точно при използване на метода за изпитване FL (7). За категоризирането на химикала като разтворим във вода при опитните условия, той трябва да е разтворим в стерилен балансиран солен разтвор на Ханкс (HBSS), съдържащ калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и несъдържащ фенолово червено, в концентрация ≥ 250 mg/ml (една доза над граничната стойност от 100 mg/ml). Ако обаче изпитваният химикал е разтворим в концентрация, по-малка от 100 mg/ml, но при тази концентрация вече предизвиква индукция на FL от 20 % (т.е. FL20 < 100 mg/ml), той все пак може да бъде класифициран като категория 1 на GHS или категория I по EPA.
                     Установените ограничения на настоящия метод за изпитване изключват от областта на приложимост силните киселини и основи, фиксаторите на клетки и силно летливите химикали. Тези химикали са с механизми, които не се измерват по метода за изпитване FL, напр. значителна коагулация, осапуняване или специфични химични реакции. Други установени ограничения на настоящия метод за изпитване се основават на резултатите за прогнозния капацитет за цветни и вискозни изпитвани химикали (7). И за двата типа химикали се предполага, че е трудно да се отстранят от монослоя след краткосрочна експозиция, а също, че предсказуемостта на метода за изпитване може да се подобри, ако се използват по-голям брой етапи на промиване. Твърдите химикали, суспендирани в течност, имат склонност да се утаяват и крайната концентрация в клетките може да се окаже трудна за определяне. Когато химикалите от тези химични и физични класове бъдат изключени от базата данни, точността на FL навсякъде в системите за класификация на ЕС, EPA и GHS значително се подобрява (7).
                     Предвид целта на настоящия метод за изпитване (т.е. идентифициране само на химикали с корозивно/силно дразнещо действие върху очите) процентите неверни отрицателни резултати (вж. точка 13) не са от решаващо значение, тъй като такива химикали се изпитват впоследствие с други достатъчно валидирани in vitro изпитания или при зайци, в зависимост от регулаторните изисквания, като се прилага стратегия за последователно изпитване с подход, основан на тежестта на доказателствата (5) (вж. също точки 3 и 4).
                     Други установени ограничения на метода за изпитване FL се основават на проценти неверни отрицателни и неверни положителни резултати. Когато се използват като първа стъпка от подход „отгоре надолу“ за идентифициране на разтворими във вода вещества и смеси с корозивно/силно дразнещо действие върху очите (категория 1 по GHS на ООН; категория 1 по CLP на ЕС; категория I по EPA на САЩ) процентът неверни положителни резултати за метода за изпитване FL е варирал от 7 % (7/103; GHS на ООН и Регламент CLP на ЕС) до 9 % (9/99; EPA на САЩ), неверните отрицателни резултати са варирали от 54 % (15/28; EPA на САЩ) до 56 % (27/48; GHS на ООН и Регламент CLP на ЕС) в сравнение с in vivo резултатите. Групите химикали, показващи неверни положителни и/или неверни отрицателни резултати в метода за изпитване FL, не са определени тук.
                     Някои технически ограничения са специфични за клетъчната култура MDCK. Качеството на тесните връзки, които блокират пропускането на багрилото натриев флуоресцеин през монослоя, намалява с увеличаването на броя пасажи на клетките. Непълното образуване на тесните връзки води до повишено FL в нетретираните контроли. Поради това е важно определянето на допустимо максимално пропускане при нетретираните контроли (вж. точка 38: пропускане 0 %). При всички in vitro изследвания съществува потенциал клетките да се трансформират във времето, поради което е жизненоважно да се посочат обхватите за броя пасажи при изследванията.
                     Настоящата област на приложимост може да бъде разширена в някои случаи, но само след анализ на разширен набор от данни за проучени изпитвани химикали, за предпочитане получен чрез изпитване (3). Настоящият метод за изпитване ще бъде актуализиран по съответен начин при вземане под внимание на нова информация и данни.
                     Всяка лаборатория, която за първи път започва да извършва такива изследвания, следва да използва химикалите за изпитване на пригодност, посочени в допълнение 3. Лабораториите могат да използват тези химикали за доказване на своята техническа компетентност за прилагане на метода за изпитване FL преди предаване на данните от изследването за FL за целите на регулаторното класифициране според степента на опасност.
                     ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     Методът за изпитване FL е in vitro изследване, основано на цитотоксичността и функционирането на клетката, което се извършва върху конфлуентен монослой от тубуларни епителни клетки MDCK CB997, които се отглеждат върху полупропускливи вложки и служат за модел за in vivo епител на роговица в отсъствие на пролиферация. Клетъчната линия MDCK е добре позната и образува тесни връзки и дезмозомни връзки, сходни с установените в апикалната страна на епитела на конюнктивата и на роговицата. Тесните и дезмозомните връзки in vivo предотвратяват проникването на разтворени вещества и чужди материали в епитела на роговицата. Загубата на трансепителна пропускливост поради увредени тесни връзки и дезмозомни връзки е една от ранните прояви на предизвикано от химикал дразнене на очите.
                     Изпитваният химикал се прилага към конфлуетния слой от клетки, отглеждан върху апикалната страна на вложката. Обичайно се използва краткосрочна 1-минутна експозиция, за да се отрази нормалната скорост на клирънса при експозиция на човека. Предимство на краткосрочната експозиция е, че веществата и смесите във вода могат да се изпитват в чист вид, ако могат лесно да бъдат отстранени след експозицията. Това дава възможност за по-преки сравнения на резултатите с въздействието на химикала върху човека. След това изпитваният химикал се отстранява и към апикалната страна на монослоя се добавя нетоксичното и силно флуоресциращо багрило натриев флуоресцеин за 30 минути. Уврежданията, причинени от изпитвания химикал на тесните връзки, се определя от количеството флуоресцеин, пропуснато през клетъчния слой в рамките на определен период от време.
                     Количеството багрило натриев флуоресцеин, което преминава през монослоя и мембраната на вложката в определен обем разтвор, наличен в гнездото (към който се пропуска багрилото натриев флуоресцеин), се определя чрез спектрофлуорометрично измерване на концентрацията на флуоресцеина в гнездото. Количеството пропуснат флуоресцеин (FL) се изчислява спрямо отчетените стойности за интензитета на флуоресценция (FI) от две контроли: контрола с празна проба, и контрола на максимално пропускане. Процентът на пропускането и следователно количеството увреждания на тесните връзки се изразява, спрямо тези контроли, за всяка от определените концентрации на изпитвания химикал. След това се изчислява FL20 (т.е. концентрацията, която причинява 20 % FL спрямо стойността, отчетена за нетретирания конфлуентен монослой и вложките без клетки). Стойността на FL20 (mg/ml) се използва в модела на прогнозиране за идентифициране на химикали с корозивно и силно дразнещо действие върху очите (вж. точка 35).
                     Възстановяването е важна част от токсичния профил на даден изпитван химикал и то също се оценява чрез in vivo изпитването за дразнещо действие върху очите. Предварителни анализи показаха, че данните за възстановяването (до 72 часа след експозиция на химикали) потенциално биха могли да увеличат капацитета за предвиждане на протокол № 71 на INVITTOX, но е необходима допълнителна оценка, която може да бъде подпомогната от допълнителни данни, за предпочитане придобити чрез допълнително изпитване (6). Настоящият метод за изпитване ще бъде актуализиран по съответен начин при вземане под внимание на нова информация и данни.
                     ПРОЦЕДУРА
                     
                        Приготвяне на клетъчния монослой
                     
                     Монослоят от клетки MDCK CB997 се приготвя с отглеждане на субконфлуентни клетки в колби за клетъчни култури в среда DMEM/хранителна смес F12 (1x концентрат с L-глутамин, 15 mM HEPES, калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и 10 % топлинно инактивиран FCS/FBS). Важно е да се отбележи, че всички среди/разтвори, използвани по време на FL изследването, следва да съдържа калций при концентрация между 1,8 mM (200 mg/l) и 1,0 mM (111 mg/l) за да се гарантират образуването на тесни връзки и целостта. Обхватът на броя пасажи трябва да се контролира, за да се гарантира еднакво и възпроизводимо образуване на тесни връзки. За предпочитане е броят на пасажите на клетките да бъде в рамките на обхват 3-30 след размразяването, тъй като в рамките на този обхват пасажи клетките имат сходни функционални възможности, което допринася за възпроизводимостта на резултатите от изследването.
                     Преди извършване на метод за изпитване FL клетките се отделят от колбата чрез трипсинизация, центрофугират се и подходящ брой клетки се посява във вложките, поставени в 24-гнездни плаки (вж. допълнение 1). За посяване на клетките следва да се използват вложки с диаметър дванадесет mm с мембрана от смесени целулозни естери, дебелина 80-150 μm и размер на порите 0,45 μm. В изследването за валидиране са били използвани вложки Millicell-HA 12 mm. Свойствата на вложката и типа мембрана са важни, тъй като те могат да повлияят на клетъчния растеж и на свързването на химикала. Някои типове химикали могат да се свързват с мембраната на вложката Millicell-HA, което би могло да засегне тълкуването на резултатите. Химикалите за изпитване на пригодност (вж. допълнение 3) следва да бъдат използвани, за да се докаже еквивалентността, ако са използвани други мембрани.
                     Химическото свързване към мембраната на вложката е по-често срещано при катионните химикали, като бензалкониевият хлорид, които се привличат от заредената мембрана (7). Химическото свързване към мембраната на вложката може да увеличи времето на експозиция на химикала, което води до надценяване на токсичния потенциал на химикала, но може също и физически да намали проникването на флуоресцеин през вложката чрез свързване на багрилото към катионния химикал, свързан към мембраната на вложката, което води до подценяване на токсичния потенциал на химикала. Това може лесно да се наблюдава чрез експозиция само на мембраната на най-високата концентрация на изпитвания химикал и последващо добавяне на багрило натриев флуоресцеин при нормалната концентрация за стандартното време (без клетъчни контроли). Ако се получи свързване на багрилото натриев флуоресцеин, мембраната на вложката изглежда оцветена в жълто след промиването на изпитвания материал. В този контекст е от значение да се познават свойствата на свързване на изпитвания химикал, за да може да бъде тълкувано въздействието на химикалите върху клетките.
                     Посяването на клетките върху вложките следва да доведе до получаването на конфлуентен монослой в момента на експозицията на химикала. На вложка следва да бъдат добавени 1,6 × 105 клетки (400 μl от клетъчна суспензия с плътност 4 × 105 клетки/ml). При тези условия конфлуентен монослой се получава обикновено след 96 часа отглеждане в култура. Вложките следва да бъдат разгледани визуално преди посяване, така че да се гарантира, че всяко увреждане, отчетено с визуалния контрол, описан в точка 30, се дължи на боравенето.
                     Клетъчните култури MDCK следва да се съхраняват в инкубатори във влажна атмосфера при 5 % ± 1 % CO2 и 37 ± 1 °C. Клетките следва да не са заразени с бактерии, вируси, микоплазма и гъбички.
                     
                        Прилагане на изпитваните и контролните химикали
                     
                     За всяка опитна серия трябва да се приготви пресен изходен разтвор, който да се използва в рамките на 30 минути от приготвянето. Изпитваните химикали следва да бъдат приготвени в HBSS, съдържащ калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и несъдържащ фенолово червено, за да се избегне свързване със серумен белтък. Разтворимостта на химикала при 250 mg/ml в HBSS следва да се оцени преди изпитването. Ако при тази концентрация химикалът образува стабилна суспензия или емулсия (т.е. не се променя и не се утаява или разделя в повече от една фаза) за над 30 минути, HBSS все още може да се използва като разтворител. Независимо от това, ако за химикала е установено, че е неразтворим в HBSS при тази концентрация, трябва да бъде взето под внимание използването на други методи за изпитване вместо FL. Използването на леко минерално масло като разтворител в случаите, когато е установено, че химикалът е неразтворим в HBSS, следва да се разглежда предпазливо, тъй като няма достатъчно налични данни, за да се направи заключение относно характеристиките на FL изследването при такива условия.
                     Всички химикали, които ще бъдат изпитвани, се приготвят в стерилен HBSS, съдържащ калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и несъдържащ фенолово червено, от изходния разтвор, в пет разреждания с фиксирани масови концентрации: 1, 25, 100, 250 mg/ml, както и чист или наситен разтвор. При изпитване на твърди химикали следва да бъде включена много висока концентрация от 750 mg/ml,. Тази концентрация на химикала може да трябва да се прилага върху клетките с използване на пипета с позитивно изтласкване. Ако е констатирана токсичност между 25 и 100 mg/ml, следните допълнителни концентрации следва да бъдат изпитани два пъти: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml. Стойността на FL20 следва да бъде получена от тези концентрации, при условие че са изпълнени критериите за приемливост.
                     Изпитваните химикали се прилагат към конфлуентните клетъчни монослоеве след отстраняване на средата за отглеждане на клетки и измиване два пъти със стерилен топъл (37 °C) HBSS, съдържащ калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и несъдържащ фенолово червено. Преди това филтрите се проверяват визуално за съществуващи увреждания, които биха могли да бъдат невярно приписани на потенциални несъвместимости с изпитвани химикали. Във всяка серия трябва да се използват най-малко по три повторения за всяка концентрация на изпитвания химикал и за контролите. След 1 минута експозиция при стайна температура, изпитваният химикал следва да се отстранява внимателно чрез засмукване, монослоят трябва да се промие два пъти със стерилен топъл (37 °C) HBSS, съдържащ калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и несъдържащ фенолово червено, и пропускането на флуоресцеин следва да бъде измерено незабавно.
                     Във всяка серия трябва да се използват паралелни отрицателни (ОК) и положителни контроли (ПК), за да се докаже, че целостта на монослоя (ОК) и чувствителността на клетките са в границите на определен предходно установен интервал на приемливост. Предложеният химикал за ПК е Brij 35 (CAS № 9002-92-0) при 100 mg/ml. Тази концентрация следва да дава приблизително 30 % пропускане на флуоресцеин (приемлив обхват 20-40 % пропускане на флуоресцеин, т.е. увреждане на клетъчния слой). Предложеният химикал за ОК е HBSS, съдържащ калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и несъдържащ фенолово червено (нетретирана, празна контрола). Също така, във всяка серия следва да бъде включена контрола на максимално пропускане, за да се даде възможност за изчисляване на стойностите на FL20. Максималното пропускане се определя с използване на контролна вложка без клетки.
                     
                        Определяне на пропускливостта на флуоресцеин
                     
                     Незабавно след отстраняването на изпитваните и контролните химикали, към вложките (напр. Millicell-HA) се добавят 400 μl от 0,1 mg/ml разтвор на натриев флуоресцеин (0,01 % (w/v) в HBSS, съдържащ калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и несъдържащ фенолово червено. Културите се съхраняват в продължение на 30 минути при стайна температура. В края на инкубирането с флуоресцеин вложките внимателно се отстраняват от всяко гнездо. Извършва се визуална проверка на всеки филтър и всяко увреждане, което може да се е получило при боравенето, се записва.
                     Флуоресцеинът, пропуснат през монослоя и вложката, се определя количествено в разтвора, останал в гнездата, след отстраняване на вложките. Измерванията се извършват в спектрофлуорометър при дължини на вълната на възбуждане и емисия съответно 485 nm и 530 nm. Чувствителността на спектрофлуорометъра се настройва така, че да има най-голяма числова разлика между максималното FL (вложка без клетки) и минималното FL (вложка с конфлуентен монослой, третирана с ОК). Поради разликите в използвания спектрофлуорометър се предлага да се използва чувствителност, което ще даде на интензитет на флуоресценцията > 4 000 при контролата на максимално пропускане на флуоресцеин. Стойността на максималното FL не трябва да бъде по-голяма от 9 999. Интензитетът на флуоресценцията при максимално пропускане следва да попада в рамките на линейния обхват на използвания спектрофлуорометър.
                     
                        Тълкуване на резултатите и модел за прогнозиране
                     
                     Количеството FL е пропорционално на предизвиканите от химикала увреждания на тесните връзки. Процентът на FL за всяка изпитвана концентрация на химикал се изчислява въз основа на стойностите за FL, получени за изпитвания химикал, спрямо стойностите за FL от ОК (отчетена стойност от конфлуентния клетъчен монослой, третиран с ОК) и контролата на максимално пропускане (отчетена стойност за количеството FL през вложка без клетки).
                     Средният интензитет на флуоресценцията при максимално пропускане = x
                     Средният интензитет на флуоресценцията при 0 % пропускане (ОК) = y
                     Средното 100 % пропускане се получава чрез изваждане на средното 0 % пропускане от средното максимално пропускане,
                     т.е. x – y = z
                     Процентът на пропускане за всяка фиксирана доза се получава чрез изваждане на 0 %-ото пропускане от средната стойност на интензитета на флуоресценцията от отчетените стойности за трите повторения (m), и разделяне на тази стойност на 100 %-ото пропускане, т.е. % FL = [(m – y) / z] × 100 %, където:
                     
                                 M
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 средната стойност на интензитета на флуоресценцията от измерените стойности за трите повторения за съответната концентрация
                              
                           
                                 % FL
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 процентът на флуоресцеина, пропуснат през клетъчния слой
                              
                           Следва да се приложи следното уравнение за изчисляване на концентрацията на химикала, водеща до 20 % FL:
                     FLD = [(A – B) / (C – B)] × (MC – MB) + MB
                     
                     където:
                     
                                 D
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 % на инхибиране
                              
                           
                                 A
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 % увреждания (20 % пропускане на флуоресцеин)
                              
                           
                                 B
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 % пропускане на флуоресцеин < A
                              
                           
                                 C
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 % пропускане на флуоресцеин > A
                              
                           
                                 MC
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 Концентрация (mg/ml) на C
                              
                           
                                 MB
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 Концентрация (mg/ml) на B
                              
                           Граничната стойност на FL20 за прогнозирането на корозивно/силно дразнещо действие на химикали върху очите е дадеа по-долу:
                     
                                 FL20 (mg/ml)
                              
                              
                                 C&L по GHS на ООН
                              
                              
                                 C&L по Регламент CLP на ЕС
                              
                              
                                 C&L по EPA на САЩ
                              
                           
                                 ≤ 100
                              
                              
                                 Категория 1
                              
                              
                                 Категория 1
                              
                              
                                 Категория I
                              
                           
                                 C&L: класифициране и етикетиране
                              
                           Методът за изпитване FL се препоръчва само за идентифициране на разтворими във вода химикали с корозивно и силно дразнещо действие върху очите (категория 1 по GHS на ООН и Регламент CLP на ЕС категория 1, категория I по EPA) (вж. точки 1 и 10).
                     С цел да се идентифицират разтворими във вода химикали (вещества и смеси) (3) (6) (7), като „предизвикващи сериозно увреждане на очите“ (категория 1 по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС) или като „химикал с корозивно или силно дразнещо действие върху очите“ (категория I по EPA на САЩ), изпитваният химикал следва да предизвиква стойност FL20 при ≤ 100 mg/ml.
                     
                        Приемливост на резултатите
                     
                     Средната стойност при максимално пропускане на флуоресцеин (х) трябва да е по-голяма от 4 000 (вж. точка 31), средната стойност при 0 % пропускане (y) трябва да е равна на 300 или по-малка, а средната стойност при пропускане 100 % (z) трябва да е между 3 700 и 6 000.
                     Едно изпитване се смята за приемливо, ако положителната контрола е предизвикала от 20 % до 40 % увреждане на клетъчния слой (измерване като % пропускане на флуоресцеин).
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Данни
                     
                     Данните от отделните гнезда с повторения (напр. стойностите за интензитета на флуоресценцията и данните за изчисления процент FL за всеки изпитван химикал, включително класифициране) следва да бъдат представени в таблична форма за всяка серия. Освен това следва да се протоколират средните стойности ± стандартното отклонение на отделните измервания на повторения във всяка серия.
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитвани химикали и химикали за контроли
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Наименование(-я) на химикала, като например структурното наименование, използвано от Службата за химични индекси CAS, следвано от други наименования, ако са известни;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             CAS номер на химикала, ако е известен;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Чистота и състав на веществото или сместа (в тегловни проценти), доколкото се разполага с такава информация;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Физични и химични свойства, относими към провеждането на изследването (напр. агрегатно състояние, летливост, pH, стабилност, разтворимост във вода, клас на химикала);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Обработка на изпитвания/контролния химикал преди изпитването, ако е приложимо (напр. нагряване, стриване);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Условия за съхранение:
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обосновка на използвания метод за изпитване и протокол
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Следва да включва съображения относно областта на приложимост и ограниченията на метода за изпитване;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Условия на изпитване
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на използваната клетъчна система, включително сертификат за автентичност и микоплазмен статус на клетъчната линия;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Подробни данни за използваната процедура за изпитване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Използвана концентрация (концентрации) на изпитвания химикал;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Продължителност на експозицията на изпитвания химикал:
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Продължителност на инкубирането с флуоресцеин;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на всякакви изменения на процедурата за изпитване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на използваните критерии за оценка;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Позоваване на данни от предходни периоди за модела (напр. отрицателни и положителни контроли, химикали за сравнение, ако е приложимо);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Информация относно техническата компетентност, демонстрирана от лабораторията;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Резултати
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Таблично представяне на данните за отделните изпитвани химикали и контролите за всяка серия и за всяко измерване на повторение (включително индивидуални резултати, средни стойности и стандартни отклонения);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Получената класификация (класификации) с позоваване на модела за прогнозиране и/или критериите за решението, които са използвани;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на други наблюдавани ефекти;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обсъждане на резултатите.
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Следва включва съображения във връзка с резултати, от които не може да се достигне до заключение (точка 35: FL20 > 100 mg/ml) и по-нататъшно изпитване;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Заключения
                                 
                              
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications. ISBN: 978-92-1-117006-1. На разположение на адрес: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 U.S. EPA (1996), Label Review Manual: 2nd Edition, EPA737-B-96-001, Washington DC: U.S. Environmental Protection Agency.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 EC-ECVAM (2009), Statement on the scientific validity of cytotoxicity/cell-function based in vitro assays for eye irritation testing.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Scott, L. et al. (2010), A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches, Toxicol. In Vitro 24, 1-9
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Глава Б.5 от настоящото приложение, Остра токсичност: очно дразнещо/корозивно действие
                                 
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 EC-ECVAM (1999), INVITOX Protocol 71: Fluorescein Leakage Test, Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM). На разположение на адрес: [http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 EC-ECVAM (2008), Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34. OECD, Paris.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        
                           СХЕМА НА MDCK КЛЕТКИ, ОТГЛЕЖДАНИ ВЪРХУ МЕМБРАНА НА ВЛОЖКА, ЗА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ FL
                        
                        Конфлуентен слой от MDCK клетки се отглежда върху полупропускливата мембрана на вложка. Вложките се поставят в гнездата на 24-гнездови плаки.
                        Схема, взета от: Wilkinson, P.J. (2006), Development of an in vitro model to investigate repeat ocular exposure, Ph.D. Thesis, University of Nottingham, UK.
                     
                     
                        Допълнение 2
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                           
                              Точност
                           : степента на близост между резултатите от метода за изпитване и приетите референтни стойности. Това е мярка за характеристиките на метода за изпитване и аспект на „относимостта“. Терминът често се използва взаимозаменяемо с термина „съответствие“, за да се обозначи относителният дял на правилните резултати при даден метод за изпитване.
                        
                           
                              Химикал
                           : Вещество или смес.
                        
                           
                              Категория 1 по EPA
                           : Химикали, които предизвикват корозивно действие (необратимо разрушаване на очна тъкан) или корнеални усложнения или дразнене, траещи повече от 21 дни (2).
                        
                           
                              Регламент CLP на ЕС (Регламент (ЕО) № 1272/2008 относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси)
                           : въвежда в законодателството на Европейския съюз (ЕС) системата GHS на ООН за класифицирането на химикали (вещества и смеси).
                        
                           
                              Процент неверни отрицателни резултати
                           : Делът на всички положителни химикали, невярно определени като отрицателни по даден метод за изпитване. Това е един от показателите за характеристиките на метода за изпитване.
                        
                           
                              Процент неверни положителни резултати
                           : Делът на всички отрицателни химикали, невярно определени като положителни по даден метод за изпитване. Това е един от показателите за характеристиките на метода за изпитване.
                        
                           
                              FL20
                              
                           : Може да се оцени чрез определяне на концентрацията, при която изпитваният химикал предизвиква 20 % пропускане на флуоресцеин през клетъчния слой.
                        
                           
                              Пропускане на флуоресцеин
                           : количеството флуоресцеин, което се пропуска през клетъчния слой, измерено спектрофлуорометрично.
                        
                           
                              GHS (Глобална хармонизирана система на Организацията на обединените нации (ООН) за класифициране и етикетиране на химикали)
                           : система, предлагаща класифициране на химикали (вещества и смеси) според стандартизирани видове и степени на физическа, здравна и екологична опасност и разглеждаща съответни съобщителни елементи, като например пиктограми, сигнални думи, предупреждения за опасност, препоръки за безопасност и информационни листове за безопасност, така че те да съобщават информация за тяхното неблагоприятно въздействие с оглед защита на хората (включително работодатели, работещи, служители в транспорта, потребители и аварийни служители) и на околната среда.
                        
                           
                              Категория 1 по GHS
                           : Предизвикване на тъканно увреждане на окото или сериозно физическо влошаване на зрението след прилагане на изпитван химикал към предната повърхност на окото, което не е напълно обратимо в рамките на 21 дни след прилагането.
                        
                           
                              Опасност
                           : Вътрешно присъщо свойство на даден агент или ситуация, притежаващо потенциал да предизвика неблагоприятни ефекти когато един организъм, система или (суб-)популация бъдат експонирани на този агент.
                        
                           
                              Смес
                           : използва се в контекста на GHS на ООН като смес или разтвор, съставен от две или повече вещества, които не си взаимодействат.
                        
                           
                              Отрицателна контрола
                           : Нетретирано повторение, съдържащо всички компоненти на дадена изпитвана система. Тази проба се обработва с пробите, третирани с изпитвания химикал, и с други контролни проби, за определяне дали разтворителят взаимодейства с изпитваната система.
                        
                           
                              Некласифицирани
                           : Химикали, които не са класифицирани като категория 1, 2A или 2B по GHS на ООН; категория 1 или 2 по CLP на ЕС; или химикали с дразнещо действие върху очите от категория I, II или III по EPA.
                        
                           
                              Химикал с корозивно действие върху очите
                           : а) химикал, който предизвиква необратимо тъканно увреждане на окото. б) химикали, които са класифицирани като категория 1 по GHS на ООН; категория 1 по CLP на ЕС; или химикали с дразнещо действие върху очите от категория I по EPA.
                        
                           
                              Химикал с дразнещо действие върху очите
                           : а) химикал, който предизвиква обратимо изменение на окото след прилагане върху предната повърхност на окото; б) химикали, които са класифицирани като категория 2A или 2B по GHS на ООН; категория 2 по CLP на ЕС; или химикали с дразнещо действие върху очите от категория II или III по EPA.
                        
                           
                              Химикал със силно дразнещо действие върху очите
                           : химикал, който предизвиква тъканно увреждане на окото след прилагане върху предната повърхност на окото, което не е обратимо до 21 дни след прилагането или причинява сериозно физическо влошаване на зрението. б) химикали, които са класифицирани като категория 1 по GHS на ООН; категория 1 по CLP на ЕС; или химикали с дразнещо действие върху очите от категория I по EPA.
                        
                           
                              Положителна контрола
                           : повторение, съдържащо всички компоненти на дадена изпитвана система, и третирано с химикал, за който е известно, че предизвиква положителен отклик. За да гарантира, че може да се направи оценка на варирането на отклика в положителната контрола във времето, големината на положителния отклик не следва да е прекомерна.
                        
                           
                              Химикали за изпитването за пригодност
                           : подгрупа от списъка с референтните химикали, която може да се използва от лабораториите, които не са извършвали предходни такива изпитвания, за да демонстрират пригодност за извършване на валидирания референтен метод за изпитване.
                        
                           
                              Относимост
                           : описание на взаимовръзката между изпитването и ефекта, представляващ интерес, и дали тя е значима и полезна за определена цел. Това е степента, в която изпитването правилно измерва или прогнозира биологичния ефект, представляващ интерес. Относимостта включва разглеждането на точността (съответствието) на метода за изпитване (8).
                        
                           
                              Надеждност
                           : мярка за степента, в която даден метод за изпитване може да се приложи възпроизводимо в една и съща лаборатория и в различни лаборатории по различно време, при използване на един и същи протокол. Оценката за нея се прави като се изчислява вътрешнолабораторната и междулабораторната възпроизводимост и вътрешнолабораторната повторяемост.
                        
                           
                              Заместващо изпитване
                           : изпитване, предназначено да замести изпитване, което се използва рутинно и е прието за определяне на опасността и/или оценка на риска, и за което е установено, че предоставя равностойна или по-добра защита на здравето на хората или животните или на околната среда, според приложимото, в сравнение с приетото изпитване, за всички възможни изпитвани ситуации и химикали.
                        
                           
                              Чувствителност
                           : Относителният дял от всички положителни/активни химикали, които са класифицирани правилно чрез изпитването. Това е мярка за точността на метода за изпитване, който предоставя категорични резултати и е важен фактор при оценката на относимостта на метода за изпитване (8).
                        
                           
                              Сериозно увреждане на очите
                           : предизвикване на тъканно увреждане на окото или сериозно физическо влошаване на зрението след прилагане на изпитван химикал към предната повърхност на окото, което не е напълно обратимо в рамките на 21 дни след прилагането.
                        
                           
                              Контрола на разтворител/носител
                           : Нетретирана проба, съдържаща всички компоненти на дадена изпитвана система, включително разтворителя или носителя, която се обработва с пробите, третирани с изпитвания химикал, и с други контролни проби, за определяне на базовия отклик при пробите, третирани с изпитвания химикал, разтворен в същия разтворител или носител. Когато се изпитва с паралелна отрицателна контрола тази проба показва също дали разтворителят или носителят взаимодействат с изпитваната система.
                        
                           
                              Специфичност
                           : Относителният дял от всички негативни/неактивни химикали, които са класифицирани правилно чрез изпитването. Това е мярка за точността на метода за изпитване, която предоставя категорични резултати и е важен фактор при оценката на относимостта на метода за изпитване.
                        
                           
                              Вещество
                           : В контекста на GHS на ООН се използва за химични елементи и техни съединения, в естествено състояние, или получени чрез какъвто и да е производствен процес, включително всякаква добавка, необходима за запазването на устойчивостта на продукта и всякакъв примес, който е резултат от използвания процес, но с изключение на всякакви разтворители, които могат да се отделят без да се наруши устойчивостта на веществото или да се промени неговият състав.
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                        
                           
                              Стратегия за поетапно изпитване
                           : стратегия за поетапно изпитване, при която цялата съществуваща информация за даден изпитван химикал се разглежда по конкретен ред, като на всеки етап се прилага процес, основан на тежестта на доказателствата, за определяне дали съществува достатъчно информация за вземане решение за класифициране с оглед на опасността, преди да се премине към следващия етап. Ако потенциалът за дразнещо действие на даден изпитван химикал може да се определи въз основа на съществуващата информация, не се налага допълнително изпитване. Ако потенциалът за дразнещо действие на даден изпитван химикал не може да се определи въз основа на съществуващата информация, се провежда процедура за поетапно последователно изпитване върху животни, докато стане възможно да се направи ясно класифициране.
                        
                           
                              Валидиран метод за изпитване
                           : метод за изпитване, за който са извършени изследвания за валидиране за определяне на относимостта (включително на точността) и надеждността му за конкретна цел. Важно е да се отбележи, че един валидиран метод за изпитване може да не притежава достатъчно ефективност по отношение на точността и надеждността си, за да се счита за приложим за предлаганата цел (8).
                        
                           
                              Процес, основан на тежестта на доказателствата
                           : Процесът на отчитане на силните и слаби страни на различни видове информация за достигане до дадено заключение относно потенциалната опасност на даден химикал, и в подкрепа на това заключение.
                     
                     
                        Допълнение 3
                        
                           ХИМИКАЛИ ЗА ИЗПИТВАНЕ ЗА ПРИГОДНОСТ ЗА МЕТОДА ЗА ИЗПИТВАНЕ FL
                        
                        Преди рутинното използване на настоящия метод за изпитване, лабораториите следва да докажат техническата си компетентност като правилно определят класификацията за корозивност за очите за 8-те химикала, препоръчани в Таблица 1. Тези химикали са подбрани да представляват размаха на отклиците за местно дразнещо/корозивно действие върху очите, основан на резултати от изпитването in vivo със заешки очи (TG 405, МИ Б.5(5)) (т.е. категории 1, 2A, 2B, или без класифициране по GHS на ООН). Независимо от това, като се има предвид валидираната полза от изследването FL (т.е. за определяне само на химикали с корозивно/силно дразнещо действие върху очите), съществуват само два резултата от изпитването за целите на класифицирането на опасност (корозивно/силно дразнещо действие или действие, различно от корозивно/силно дразнещо действие) за доказване на пригодността. Други критерии за подбор са били това, че химикалите са налични в търговската мрежа, че са налични висококачествени in vivo референтни данни и че са налични висококачествени данни от метода за изпитване FL. По тази причина химикалите за изпитване на пригодност са подбрани от „Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing“ (8), който е използван за валидирането със задна дата на метода за изпитване FL.
                        
                           Таблица 1
                        
                        
                           Препоръчвани химикали за доказване на техническа компетентност по отношение на FL
                        
                        
                                    Химикал
                                 
                                 
                                    CAS №
                                 
                                 
                                    Химичен клас (32)
                                    
                                 
                                 
                                    Агрегатно състояние:
                                 
                                 
                                    
                                       In vivo класифициране (33)
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       In vitro класифициране (34)
                                    
                                 
                              
                                    Бензалкониев хлорид (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    Ониево съединение
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Химикал с корозивно/силно дразнещо действие
                                 
                              
                                    Прометазинхидрохлорид
                                 
                                 
                                    58-33-3
                                 
                                 
                                    Амин/амидин, хетероциклено, сярасъдържащо органично съединение
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Химикал с корозивно/силно дразнещо действие
                                 
                              
                                    Натриев хидроксид (10 %)
                                 
                                 
                                    1310-73-2
                                 
                                 
                                    Силна основа
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Химикал с корозивно/силно дразнещо действие
                                 
                              
                                    Натриев лаурилсулфат
                                 
                                 
                                    151-21-3
                                 
                                 
                                    Карбоксилна киселина (сол)
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Категория 1
                                 
                                 
                                    Химикал с корозивно/силно дразнещо действие
                                 
                              
                                    4-карбоксибензалдехид
                                 
                                 
                                    619-66-9
                                 
                                 
                                    Карбоксилна киселина, алдехид
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Категория 2(A)
                                 
                                 
                                    Без корозивно/без силно дразнещо действие
                                 
                              
                                    Амониев нитрат
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    Неорганична сол
                                 
                                 
                                    Твърдо
                                 
                                 
                                    Категория 2(A)
                                 
                                 
                                    Без корозивно/без силно дразнещо действие
                                 
                              
                                    Етил-2-метилацетоацетат
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    Кетон, естер
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Категория 2(B)
                                 
                                 
                                    Без корозивно/без силно дразнещо действие
                                 
                              
                                    Глицерол
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    Алкохол
                                 
                                 
                                    Течност
                                 
                                 
                                    Без категория
                                 
                                 
                                    Без корозивно/без силно дразнещо действие
                                 
                              
                                    Съкращения: CAS № = регистрационен номер по Службата за химични индекси.
                                 
                              
                     Б.62   
                           In vivo кометно изследване в алкална среда върху бозайници
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 489 (2016). Кометното in vivo (чрез гелна електрофореза на единични клетки) изследване в алкална среда върху бозайници (опростено наричано по-нататък кометно изследване) се използва за откриване на скъсвания във веригата на ДНК в клетки или ядра, изолирани от множество тъкани на животни, обикновено гризачи, които са били експонирани на потенциално генотоксичен материал (материали). Кометното изследване е преразгледано и са публикувани препоръки от различни експертни групи (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10). Настоящият метод за изпитване е част от поредица от методи за изпитване от областта на генетичната токсикология. Разработен е документ на ОИСР, съдържащ ясна информация относно изпитванията в областта на генетичната токсикология, и преглед на актуалните изменения на посочените Насоки (11).
                     Целта на кометното изследване е да бъдат идентифицирани химикали, които причиняват увреждане на ДНК. В алкални условия (> pH 13) кометното изследване може да открива едноверижни или двойноверижни скъсвания, произтичащи например от пряко взаимодействие с ДНК, алкално лабилни сайтове или като последица от временни скъсвания във веригата на ДНК, произтичащи от ексцизионна репарация на ДНК. Тези скъсвания във веригата могат да са поправими, което води до отсъствие на трайно въздействие, могат да са смъртоносни за клетката или да бъдат фиксирани в мутация, което доведе до постоянна жизнеспособна промяна. Те могат също така да доведат до увреждане на хромозомите, което също така е свързано с много човешки заболявания, включително рак.
                     Официалното валидиращо изпитване на in vivo кометното изпитване върху гризачи беше извършено в периода 2006—2012 г., координирано от Японския център за валидиране на алтернативни методи (JaCVAM) съвместно с Европейския център за валидиране на алтернативни методи (ECVAM), Междуведомствения координационен комитет за валидиране на алтернативни методи (ICCVAM) и Междуведомствения център за оценка на алтернативните методи (NICEATM) (12). Настоящият метод за изпитване включва препоръчителната употреба и ограниченията на кометното изследване, и се основава на окончателния протокол, използван във валидиращото изпитване (12), и върху допълнителни относими публикувани и непубликувани (собственост на лаборатории) данни.
                     Определенията на ключови термини са дадени в допълнение 1. Следва да се отбележи, че в това изпитване могат да бъдат използвани множество различни платформи (микроскопски предметни стъкла, гелни платформи, 96-гнездни плаки и др.). За удобство в останалата част на настоящия документ се използва терминът „предметно стъкло“, който обхваща и всички други платформи.
                     ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ
                     Кометното изследване е метод за измерване на скъсвания във веригата на ДНК в еукариотни клетки. Единични клетки/ядра, включени в агарозен гел върху предметно стъкло се лизират с дегергент и висока концентрация на сол. Това лизиране като стъпка разгражда клетъчните и и ядрените мембрани и позволява пропускането на бримки на навита ДНК, обикновено наричани нуклеоиди, и ДНК фрагменти. При електрофорезата при висок pH се получават структури, наподобяващи комети, които могат да се наблюдават с помощта на флуоресцентна микроскопия при използване на подходящи флуоресцентни оцветители; ДНК фрагментите мигрират от „главата“ в „опашката“ въз основа на размера им и тяхната големина и интензитетът на опашката на кометата спрямо общия интензитет (главата плюс опашката) отразява количеството на скъсванията на ДНК (13) (14) (15).
                     
                        In vivo кометното изследване в алкална среда е от особено значение за оценка на генотоксичната опасност, поради това че отклиците в изследването зависят от in vivo абсорбцията, разпределението, метаболизма и екскрецията (АРМЕ), а също и от процесите на поправка на ДНК. Те могат да варират според животинския вид, тъканта и типа увреждане на ДНК.
                     За отговаряне на изискванията за хуманно отношение към животните, по-специално за намаляване на използването на животни (3-те „R“ — заместване, намаляване, облекчаване), това изпитване може също да бъде интегрирано в други токсикологични изследвания, напр. изпитвания за токсичност с повтаряща се доза (10) (16) (17), или крайната точка може да се комбинира с други крайни точки за генотоксичност, като тези в in vivo изпитването за микроядра в еритроцити на бозайници (18) (19) (20). Кометното изследване най-често се извършва върху гризачи, въпреки че е прилагано към други бозайници и видове, различни от бозайници. Използването на видове, различни от гризачи, следва да е обосновано от научна и етична гледна точка за всеки отделен случай и категорично се препоръчва кометното изследване да се извършва само върху видове, различни от гризачи, като част от друго изследване за токсичност, а не като самостоятелно изпитване.
                     Изборът на път на експозиция и на тъкан (тъкани), които да бъдат проучени, трябва да се определя въз основа на цялото налично/съществуващо познание за изпитваните химикали, напр. предвиден/очакван път на експозиция на човека, метаболизъм и разпределение, потенциал за ефекти в точката на контакт, структурни признаци на токсичност, други данни за генотоксичност или токсичност, и целта на изследването. По този начин, когато е уместно, генотоксичният потенциал на изпитвания химикал може да се изследва в прицелната тъкан (тъкани) за канцерогенни и/или други токсични ефекти. Изследване също се счита за полезно за по-нататъшното проучване на генотоксичността, установена чрез in vitro система. Уместно е да се извърши in vivo кометно изследване в представляваща интерес тъкан, когато може разумно да се очаква, че представляващата интерес тъкан ще бъде достатъчно експонирана.
                     Изследването е максимално широкообхватно валидирано в соматични тъкани на мъжки плъхове в кръгови изследвания, като например изпитването на JaCVAM (12) и в Rothfuss et al., 2010 (10). В международното изпитване за валидиране на JaCVAM бяха използвани черен дроб и стомах. Черен дроб, защото е това е най-активният орган в метаболизма на химикалите и също така често е прицелен орган при канцерогенност. Стомах, защото обикновено е първото място за контакт за химикали след експозиция по орален път, въпреки че други области на стомашно-чревния тракт, като например дванадесетопръстникът и празното черво, също следва да се разглеждат като тъкани, представляващи точка на контакт, и могат да се разглеждат като по-относими при хората, отколкото жлезистия стомах на гризачите. Трябва да се положат грижи да се гарантира, че тези тъкани не са експонирани на прекомерно високи концентрации на изпитвания химикал (21). По принцип техниката е приложима за всички тъкани, от които могат да бъдат получени анализируеми суспензии от единични клетки/ядра. Собствени данни от няколко лаборатории доказват нейното успешно прилагане по отношение на множество различни тъкани и има много публикации, показващи приложимостта на техниката по отношение на органи или тъкани, различни от черен дроб и стомах, напр. празно черво (22), бъбреци (23) (24), кожа (25) (26) или пикочен мехур (27) (28), клетки от бял дроб и бронхоалвеоларен лаваж (относими към проучвания на инхалирани химикали) (29) (30), и също така са извършвани изпитвания в много органи (31) (32).
                     Независимо от това, че съществува интерес към генотоксичните ефекти в зародишни клетки, трябва да се отбележи, че стандартното кометно изследване в алкална среда, както е описано в настоящия метод за изпитване, не се счита за подходящо за измерване на скъсвания във веригата на ДНК в зрели зародишни клетки. Тъй като в един преглед на литературата относно използването на кометното изследване за генотоксичност за зародишните клетки (33) се посочват високи и вариращи фонови нива при уврежданията на ДНК, счита се, че са необходими изменения в протокола, заедно с подобрени проучвания за стандартизация и валидиране, преди кометното изследване върху зрели зародишни клетки (например сперма) да може да бъде включено в метода за изпитване. Освен това препоръчаният режим на експозиция, описан в настоящия метод на изпитване, не е оптимален, и за извършването на съдържателен анализ на скъсванията във веригата на ДНК в зрели сперматозоиди са необходими по-дълготрайни експозиции и периоди на пробовземане. В литературата са описани генотоксични ефекти, измерени чрез кометното изследване, в тестикуларни клетки на различни етапи на диференциране (34) (35). Следва да се отбележи обаче, че гонадите съдържат смес от соматични и зародишни клетки. По тази причина, положителни резултати в цялата гонада (тестис) не са непременно показателни за уврежданията в зародишни клетки; независимо от това, те посочват, че изпитваният химикал (химикали) и/или неговите метаболити са достигнали до гонадата.
                     Омрежванията не могат да бъдат открити по надежден начин със стандартните опитни условия за кометното изследване. При определени модифицирани опитни условия омрежванията ДНК-ДНК и ДНК-белтък и други изменения в базите, като например окислените бази, могат да бъдат открити (23) (36) (37) (38) (39). Но е необходимо да се извърши допълнителна работа, за да се характеризират адекватно необходимите изменения в протокола. По този начин откриването на омрежващи агенти не е основната цел на изследването, както е описано тук. Изследването е неподходящо за откриване на анеугени, дори и с изменения.
                     Поради настоящото състояние на познанията, с in vivo кометното изследване са свързани няколко допълнителни ограничения (вж. допълнение 3). Очаква се методът за изпитване да бъде преразгледан в бъдеще и, ако е необходимо, преработен в светлината на придобития опит.
                     Преди използването на метода за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо. Такива съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа.
                     ПРИНЦИП НА МЕТОДА
                     Животните се експонират на въздействието на изпитвания химикал по подходящ път. Подробно описание на дозирането и вземането на проби е дадено в точки 36—40. В избрания момент (моменти) на пробовземане се извършва дисекция на тъканите, представляващи интерес, и се приготвят суспензии от единични клетки/ядра (ако се прецени, че е полезно, може да се извърши in situ перфузия, например при черен дроб), които се поставят в агарозен гел, така че да бъдат обездвижени върху предметни стъкла. Клетките/ядрата се третират с лизиращ буфер за отстраняване на клетъчната и/или ядрената мембрана, и се експонират на силни основи, напр. с рН ≥ 13, за да се даде възможност за разплитане на ДНК и отделяне на освободените ДНК бримки и фрагменти. След това ядрената ДНК в агара се подлага на електрофореза. Нормалните нефрагментирани ДНК молекули остават на това място в агара, където са били ядрените ДНК, докато всички останали, фрагментираните ДНК и освободените ДНК бримки мигрират към анода. След електрофореза ДНК се визуализира с помощта на подходящ флуоресцентен оцветител. Препаратите следва да се анализират с помощта на микроскоп и системи за изцяло автоматичен или полуавтоматичен анализ на изображения. Количеството на ДНК, мигрирала по време на електрофорезата, и разстоянието на миграцията отразяват количеството и размера на фрагментите от ДНК. При кометното изследване има няколко крайни точки. За оценка на увреждането на ДНК се препоръчва съдържанието на ДНК в опашката ( % ДНК в опашката или % интензитет на опашката) (12) (40) (41) (42). След анализ на достатъчен брой ядра данните се анализират с подходящи методи с оглед преценяване на резултатите от анализа.
                     Следва да се отбележи, че изменението на различни аспекти на методологията, включително приготвянето на пробите, условията на електрофорезата, параметрите за визуален анализ (напр. интензитет на оцветяването, интензитет на светлината от крушката на микроскопа, поставяне на филтри върху микроскопа и динамични параметри на камерата) и условията на околната среда (напр. фоново осветление) са били проучени и могат да засегнат миграцията на ДНК (43) (44) (45) (46).
                     ПРОВЕРКА НА ПРИГОДНОСТТА НА ЛАБОРАТОРИЯТА
                     Всяка лаборатория трябва да установи пригодността си за извършване на кометното изследване чрез доказване на способността си за получаване на суспензии от единични клетки или ядра с достатъчно добро качество за всяка прицелна тъкан (тъкани) за всеки използван животински вид. Качеството на препаратите ще бъдат оценявано на първо място с това, че % ДНК в опашката за животни, третирани с носител, следва да попада в рамките на възпроизводим нисък обхват. Настоящите данни показват, че средната за групата стойност на % ДНК в опашката (въз основа на средната стойност на медианите — вж. точка 57 за подробна информация относно тези термини) в черен дроб на плъх следва за предпочитане да не превишава 6 %, което би съответствало на стойностите от изпитването за валидиране на JaCVAM (12) и от други публикувани и собствени данни. Към настоящия момент няма достатъчно данни за формулиране на препоръки за оптимални или приемливи обхвати за други тъкани. Това не изключва използването на други тъкани, ако това е обосновано. Протоколът от изпитването следва да осигури подходящ преглед на параметрите на кометното изследване в тези тъкани във връзка с публикуваната литература или със собствени данни. На първо място, желателно е нисък обхват на % ДНК в опашката при контролите да предоставя достатъчен динамичен обхват за откриване на положителен ефект. На второ място, всяка лаборатория трябва да може да възпроизвежда очаквани отклици за мутагени с пряко действие и промутагени, с различни начини на действие, както е предложено в таблица 1 (точка 29).
                     Вещества с положителен отклик могат да бъдат избрани например от изпитването за валидиране на JaCVAM (12) или от други публикувани данни (вж. точка 9), ако е уместно, с обосновка, и ясно показващи положителни отклици в тъканите, представляващи интерес. Способността за откриване на слаби ефекти на познати мутагени, например EMS при ниски дози, следва също да бъде доказана, например чрез установяване на зависимостта доза-отклик с подходящ брой дози и интервал между тях. Първоначалните усилия следва да се насочат към установяване на пригодността по отношение на най-обичайно използваните тъкани, като черен дроб от гризачи, при които може да се направи сравнение със съществуващите данни и очакваните резултати (12). Едновременно с това могат да бъдат събрани данни за други тъкани, напр. стомах/дванадесетопръстник/празно черво, кръв и други. Лабораторията трябва да докаже пригодността си за всяка отделна тъкан от всеки животински вид, върху който планира извършване на изпитване, както и че в тази тъкан може да бъде получен приемлив положителен отклик с познат мутаген (напр. EMS).
                     Следва да бъдат събрани данни за контролите на носител/отрицателните контроли, за да се докаже възпроизводимостта на отрицателните отклици и да се гарантира, че техническите аспекти на изследването са били правилно контролирани, или да се предложи необходимост от установяване на нови обхвати за контролите от предходни изследвания (вж. точка 22).
                     Следва да се отбележи че, доколкото при аутопсия могат да бъдат събрани и обработени за кометно изследване множество тъкани, лабораторията трябва да бъдат пригодна по отношение на събирането на множество тъкани от едно единствено животно, като по този начин се гарантира, че няма загуба на никакво потенциално увреждане на ДНК и че не се накърнява кометното изследване. Продължителността на периода от умъртвяването до отстраняването на тъканите за обработка може да бъде от решаващо значение (вж. точка 44).
                     При придобиването на пригодност по отношение на настоящото изпитване трябва да се вземе предвид хуманното отношение към животните и поради това при придобиването на компетентност в различните аспекти на изпитването могат да се използват тъкани от животни, използвани при други изпитвания. Освен това, може да не е необходимо провеждането на пълно изследване по време на етапите на установяване на нов метод на изпитване в дадена лаборатория и при придобиването на необходимите умения могат да се използват по-малко животни или концентрации на изпитване.
                     
                        Данни за контролите за предходни периоди
                     
                     В хода на проучванията на пригодността лабораторията следва да изгради база данни за предходни периоди, с оглед установяване на обхвати и разпределения за положителните и отрицателните контроли, за относимите тъкани и животински видове. В литературата (47) могат да се намерят препоръки относно начина на създаване и използване на данни от предходни периоди (т.е. критерии за включване и изключване на данни в данните за предходни периоди и критериите за приемливост за даден опит). Различните тъкани и различните животински видове, както и различните носители и пътища на прилагане, могат да дадат различни стойности за % ДНК в опашката при отрицателните контроли. Поради това по отношение на отрицателните контроли е важно да се установят обхвати за всяка тъкан и животински вид. Лабораториите трябва да използват методи за контрол на качеството, като например контролни карти (напр. C-карти или карти за средна стойност (X-bar) (48)), за определяне на варирането на данните им, и за доказване, че методологията е „под контрол“ в техните лаборатории. Подборът на подходящи вещества за положителни контроли, обхвати на дозиране и опитни условия на изпитването (напр. условия на електрофорезата) също може да се наложи да бъде оптимизиран с оглед на откриване на слаби ефекти (вж. точка 17).
                     Всички промени в опитния протокол следва да бъдат разглеждани от гледна точка на тяхната съгласуваност със съществуващите бази данни на дадената лаборатория за контролите за предходни периоди. Всички значителни несъответствия следва да водят до създаването на нова база данни за контролите за предходни периоди.
                     ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
                     
                        Приготвяне
                     
                     
                        Избор на животински вид
                     
                     Обичайно се използват най-разпространените лабораторни породи здрави, млади, полово зрели гризачи (на възраст 6-10 седмици в началото на третирането, макар че малко по-възрастни животни също са приемливи). Избор на животинския вид гризачи следва да се основава на i) видовете, използвани в други изследвания за токсичност (за да се даде възможност за корелация на данните и за интегрирани изследвания), ii) видовете, развили тумори в изследване за канцерогенност (при проучване на механизма на карциногенезата), или iii) видове с метаболизъм, който е най-относим към хората, ако са известни. В настоящото изпитване обикновено се използват плъхове. Независимо от това, могат да се използват други видове, ако това е обосновано от научна и етична гледна точка.
                     
                        Условия на отглеждане и хранене на животните
                     
                     За гризачи в помещението, в което се намират опитните животни, температурата в идеалния случай следва да е 22 °C (± 3 °C). В идеалния случай относителната влажност следва да бъде 50—60 %, като е поне 30 % и за предпочитане да не превишава 70 %, освен по време на почистване на помещението. Осветлението трябва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни хранителни режими с неограничен достъп до вода за пиене. Изборът на хранителен режим може да бъде повлиян от нуждата да се осигури подходящо смесване с изпитван химикал, когато прилагането му е по този път. Гризачите трябва да бъдат разпределени в малки групи (не повече от пет) от един и същ пол, ако не се очаква агресивно поведение. Животните могат да се настаняват отделно само ако това е научно обосновано. Твърдите подове следва да се използват винаги, когато е възможно, тъй като подовете с мрежесто покритие могат да причинят сериозни увреждания (49). Трябва да се осигури подходящо облагородяване на жизнената среда.
                     
                        Подготовка на опитните животни
                     
                     Животните се разпределят на случаен принцип в контролни групи и групи за третиране. На животните се дава уникална идентификация и те се аклиматизират към лабораторните условия в продължение на поне пет дни преди началото на третирането. Като метод, който идентифицира по уникален начин животните, трябва да се използва най-малко инвазивният метод. Подходящите методи включват опръстеняване, поставяне на марка, микрочип или биометрична идентификация. Изрязването на уши или пръсти не е научно обосновано в тези изпитвания. Клетките се подреждат така, че да бъдат сведени до минимум възможните ефекти, дължащи се на местоположение на клетката. В началото на изследването вариациите в теглото на животните следва да са минимални и да не превишават ± 20 %.
                     
                        Приготвяне на дозите
                     
                     Твърдите изпитвани химикали следва да се разтворят или суспендират в подходящи носители, или да се смесят в хранителния режим или в питейната вода преди дозирането на животните. Течните изпитвани химикали могат да се дозират директно или да се разредят преди дозиране. При експозиция чрез инхалация изпитваните химикали могат да се прилагат като газ, пари или аерозол с твърда/течна фаза, в зависимост от техните физични и химични свойства (50) (51).
                     Следва да се използват пресни смеси на изпитвания химикал, освен ако данните за стабилността показват, че е допустимо съхранение и посочват подходящите условия за съхранение.
                     
                        Условия на изпитване
                     
                     
                        Носител
                     
                     Носителят не следва да има токсични ефекти при използваните обеми на доза, а също така не следва да има съмнения за химическа реакция между него и изпитваните химикали. Ако се използват други освен добре познатите носители, включването им следва да се подкрепи от референтни данни за съвместимостта им по отношение на изпитвани животни, път на прилагане и крайна точка. Препоръчва се винаги, когато е възможно, първо да се разглежда възможността за прилагането на вода като разтворител/носител. Следва да се отбележи, че някои носители (по-специално вискозни носители) могат да предизвикат възпаление и да увеличат фоновите нива на скъсванията във веригата на ДНК в точката на контакт, особено при много прилагания.
                     
                        Контроли
                     
                     
                        Положителни контроли
                     
                     Към момента обичайно във всяко изпитване следва да се включи група от минимум 3 анализируеми животни от един пол, или от всеки пол, ако се използват и двата пола (вж. точка 32), третирани с вещество за положителна контрола. В бъдеще може да е възможно да се докаже пригодност, която да е достатъчна за намаляване на необходимите положителни контроли. Ако се използват множество моменти на пробовземане (напр. с протокол е единствено прилагане), необходимо е положителни контроли да се включат само при един от моментите на пробовземане, но следва да се гарантира балансиран план (вж. точка 48). Не е необходимо прилагането на вещества за паралелни положителни контроли по същия път като изпитвания химикал, въпреки че е важно, че същият път следва да бъде използван при измерването на ефекти в точката на контакт. Следва да се докаже, че веществата за положителни контроли предизвикват скъсвания във веригата на ДНК във всички тъкани, представляващи интерес във връзка с изпитвания химикал, и е вероятно EMS да бъде избраната положителна контрола, тъй като предизвиква скъсвания във веригата на ДНК във всички тъкани, които са били изследвани. Дозите на веществата за положителни контроли следва да бъдат подбрани така, че да се получат умерени ефекти, въз основа на които да може да се извърши критична оценка на параметрите и на чувствителността на изследването, и могат да се основават на кривите доза-отклик, установени от лабораторията по време на доказването на пригодността. Процентът на ДНК в опашката при животни за паралелни положителни контроли следва да бъде съгласуван с обхвата, предварително определен от лабораторията за всяка отделна тъкан и време на пробовземане за този животински вид (вж. точка 16). Примери за вещества за положителни контроли и някои от техните прицелни тъкани (при гризачи) са включени в таблица 1. Могат да бъдат избрани вещества, различни от посочените в таблица 1, ако това е научно обосновано.
                     
                        Таблица 1
                     
                     
                        Примери за вещества за положителни контроли и някои от техните прицелни тъкани
                     
                     Вещества и CAS RN №
                     Етилов метансулфонат (CAS RN 62-50-0) за всички тъкани
                     Етилнитрозоуреа (CAS RN 759-73-9) за черен дроб и стомах, дванайсетопръстник или празно черво
                     Метилов метансулфонат (CAS RN 66-27-3) за черен дроб, стомах, дванайсетопръстник или празно черво, клетки от бели дробове и бронхоалвеоларен лаваж (БАЛ), бъбреци, пикочен мехур, бял дроб, тестис и костен мозък/кръв
                     
                        N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (CAS RN: 70-25-7) за стомах, дванайсетопръстник или празно черво
                     1,2-Диметилхидразин 2HCl (CAS RN 306-37-6) за черен дроб и черва
                     
                        N-метил-N-нитрозоуреа (CAS RN 684-93-5) за черен дроб, костен мозък, кръв, бъбреци, стомах, празно черво и мозък.
                     
                        Отрицателни контроли
                     
                     За всяко изпитване, за всеки момент на пробовземане и за всяка тъкан следва да се включи група животни за отрицателни контроли, третирани само с носител, а във всяко друго отношение третирани по същия начин като третираните групи. Процентът на ДНК в опашката при животните за отрицателни контроли следва да бъде съгласуван с обхвата, предварително определен от лабораторията за всяка отделна тъкан и време на пробовземане за този животински вид (вж. точка 16). При липсата на предходни или публикувани данни за контроли, показващи, че избраният носител, броят на прилаганията или пътят на прилагане не предизвикват никакви неблагоприятни или генотоксични ефекти, следва да се извършат първоначални изследвания преди извършването на пълното изследване, за да се установи допустимостта на контролата на носител.
                     ПРОЦЕДУРА
                     
                        Брой и пол на животните
                     
                     Въпреки че има малко данни относно женски животни, от които да се направи сравнение между половете по отношение на кометното изследване, като цяло отклиците от други in vivo изпитвания за генотоксичност са сходни при мъжките и женските животни и поради това повечето изследвания могат да бъдат извършени с който и да е от двата пола. Данни, показващи относими разлики между мъжките и женските (например разлики в общата токсичност, метаболизма, бионаличността и т.н., включително например в изследване за определяне на обхвата) насърчават използването на двата пола. В този случай може да е уместно да се извърши проучване с двата пола, например като част от изследване за токсичност с повтарящи се дози. Ако се използват и двата пола, може да е уместно да се приложи факторен дизайн. Подробна информация за това как да се анализират данните с използването на посочения дизайн са дадени в допълнение 2.
                     Числеността на групите при започване на изследването (и по време на установяването на пригодността) следва да бъде определена с оглед предоставяне на минимум 5 анализируеми животни от група от един пол, или от всеки пол, ако са използвани и двата пола (по-малко в паралелната положителна контролна група — вж. точка 29). Когато експозицията на хора към химикали може да е специфична в зависимост от пола, като например при някои фармацевтични продукти, изпитването следва да се проведе с животни от подходящия пол. Като насока за типичните максимални изисквания за животни, едно проучване, проведено в съответствие с параметрите, установени в точка 33, с три групи на определена доза и паралелни отрицателни и положителни контролни групи (всяка група е съставена от пет животни от един и същ пол), ще изисква между 25 и 35 животни.
                     ГРАФИК НА ТРЕТИРАНЕ
                     Животните следва да бъдат третирани ежедневно за период от 2 или повече дни (т.е. две или повече третирания приблизително на 24-часови интервали), и следва да се вземат проби веднъж 2-6 часа (или в Tmax) след последното третиране (12). Пробите от разширени режими на дозиране (напр. 28-дневно ежедневно дозиране) са приемливи. Доказано е успешното комбиниране на кометното изпитване и изпитването за микроядра в еритроцити (10) (19). Независимо от това следва внимателно да се разгледа въпросът за логистиката, свързана с вземане на тъканни проби за кометния анализ, наред с изискванията на вземане на тъканни проби за други видове токсикологична оценка. Събирането 24 часа след последната доза, което е типично при едно изследване за обща токсичност, не е целесъобразно в повечето случаи (вж. точка 40 относно времето на пробовземане). Използването на други графици на третиране и вземане на проби следва да бъде обосновано (вж. допълнение 3). Например единично третиране с многократно вземане на проби може да се използва, следва обаче да се отбележи, че ще бъдат изисквани повече животни за проучване с едно прилагане поради необходимостта от множество моменти на пробовземане, но понякога това може да бъде за предпочитане, например когато изпитваният химикал предизвиква прекомерна токсичност след повтаряни прилагания.
                     Независимо от начина, по който се извършва изпитването, тое приемливо, когато изпитваният химикал дава положителен отклик или, при изследване с отрицателен ефект, ако с преки или косвени доказателства е доказана експозиция на прицелната тъкан (тъкани) или токсичност за тази тъкан, или ако е достигната пределната доза (вж. точка 36).
                     Изпитваните химикали могат също да се прилагат като разделена доза, т.е. две третирания в един и същи ден, разделени от не повече от 2—3 часа, за да се улесни прилагането на голям обем. При тези обстоятелства, времето на вземане на проби трябва да се определи въз основа на датата на последното прилагане на доза (вж. точка 40).
                     
                        Нива на доза
                     
                     Ако се извършва предварително изследване за определяне на обхвата, поради това че към момента няма подходящи данни, които да са налични от други относими проучвания като помощно средство при избора на доза, то следва да се извърши в същата лаборатория, като се използва същият вид, порода, пол и режим на третиране, който се използва и в главното изследване съгласно настоящите подходи за извършване на изследвания за определяне на обхвата на дозите. Проучването следва да има за цел установяване на максималната допустима доза (МДД), определена като доза, предизвикваща слаби токсични ефекти в сравнение с продължителността на периода на изследването (например ясни клинични признаци като неестествено поведение или реакции, лека загуба на телесно тегло или цитотоксичност за прицелната тъкан), но не смърт или признаци на болка, страдание или дистрес, които изискват умъртвяване. За нетоксичен изпитван химикал с период на прилагане от 14 дни или повече максималната (пределна) доза е 1 000 mg/kg телесно тегло/ден. За период на прилагане от по-малко от 14 дни максималната (пределна) доза е 2 000 mg/kg телесно тегло/ден. За някои типове изпитвани химикали (напр. фармацевтични продукти за хуманна употреба), обхванати от специфично регулиране, тези граници могат да варират.
                     Химикалите, които показват насищане по отношение на токсикокинетични свойства, или предизвикват процеси на детоксикация, които могат да доведат до намаляване на експозицията след дългосрочно прилагане, могат да представляват изключения от критериите за определяне на дозата и следва да се оценяват за всеки отделен случай.
                     В допълнение към максималната доза (МДД, максимално възможна доза, максимална експозиция или пределна доза) за всяко време на вземане на проби следва да бъдат избрани най-малко две допълнителни дози, на подходящо отстояние една от друга, в намаляваща последователност (за предпочитане разделени от 10), за да се докажат отклици, свързани с дозата както при острия, така и при субакутния вариант на кометното изследване. Нивата на доза обаче следва също така за предпочитане да обхващат от максималната до слаба токсичност или липса на токсичност. Когато токсичност за прицелната тъкан се наблюдава при всички изпитвани нива на доза, препоръчително е допълнително проучване при нетоксични дози (вж. точки 54-55). За проучванията, целящи по-подробно проучване на формата на кривата доза-отклик, може да се изисква допълнителна група (групи) на определена доза.
                     
                        Прилагане на дозите
                     
                     При планирането на изследването следва да бъде взет предвид очакваният път на експозиция на човека. Поради това като обосновани могат да бъдат избрани например пътища на експозиция като хранителен режим, питейна вода, локално подкожно, орално (през сонда), вдишване, интратрахеално или имплантация. Във всички случаи пътят следва да се избере така, че да осигури достатъчна експозиция на прицелната тъкан (или тъкани). Интраперитонеалното инжектиране обикновено не се препоръчва, тъй като то не е типичен относим път на експозиция на човека, и следва да бъде използвано само със специална обосновка (напр. някои вещества за положителни контроли, за целите на проучване, или за някои лекарства, които се прилаган по интраперитонеален път). Максималният обем течност, който може да се приложи еднократно със сонда или инжекция, зависи от големината на изпитваното животно. Обемът не следва да превишава 1 ml/100 g телесно тегло, освен в случаите, когато се прилагат водни разтвори, когато обемът може да достигне 2 ml/100 g телесно тегло. Обеми, по-високи от този (ако това е позволено от законодателството за хуманно отношение към животните), следва да се обосноват. Винаги, когато е възможно, следва да се постигат различни нива на доза чрез регулиране на концентрацията на формулировката за дозиране, за да се осигури постоянен обем във връзка с телесното тегло на всички нива на доза.
                     
                        Момент на пробовземане
                     
                     Моментът на пробовземане е критична променлива, защото се определя от периода, който е необходим изпитваните химикали да достигнат максимална концентрация в прицелната тъкан и да бъдат предизвикани скъсванията във веригата на ДНК, но преди тези скъсвания да бъдат отстранени, поправени или преди да доведат до смърт на клетките. Устойчивостта на някои увреждания, които водят до скъсвания във веригата на ДНК, откривани от кометното изследване, може да бъде много кратка, поне за някои химикали, изпитвани in vitro (52) (53). Съответно, ако има съмнения за такива преходни ДНК, следва да се вземат мерки за смекчаване на тези загуби, като се гарантира, че тъканите се събират достатъчно рано, евентуално по-рано от моментите по подразбиране, посочени по-долу. Оптималният момент (моменти) на вземане на проби може да бъде специфичен за химикала или за пътя, което води например до бърза експозиция на тъкан с интравенозно прилагане или експозиция при вдишване. Съответно, при наличие, моментите на вземане на проби следва да бъдат определени въз основа на данни за кинетиката (напр. времето (Tmax) на достигане на пикова концентрация в плазмата или в тъканта (Cmax), или в стационарно състояние при множество прилагания). При липса на данни за кинетиката подходящ компромис за измерване на генотоксичността е да се вземат проби от 2 до 6 часа след последното третиране за две или повече третирания, или както в периода 2-6 часа, така и 16-26 часа след еднократно прилагане, въпреки че следва да се положат грижи за аутопсия на всички животни в същия момент след последната (или единствената) доза. Информация относно появата на токсични ефекти в целеви органи (ако е налична) също може да бъде използвана за избор на подходящи моменти на вземане на проби.
                     
                        Наблюдения
                     
                     Общи клинични наблюдения, свързани със здравето на животните, следва да бъдат извършвани и записвани поне един път дневно, за предпочитане по едно и също време всеки ден и като се има предвид пиковият период за поява на очакваните ефекти след дозиране (54). Поне два пъти дневно всички животни следва да се наблюдават за заболяемост и смъртност. При по-дългосрочни изследвания всички животни трябва да бъдат претегляни поне веднъж седмично, както и при завършване на периода на изпитването. Консумацията на храна трябва да се измерва при всяка смяна на храни и поне веднъж седмично. Ако изпитваният химикал се прилага чрез водата за пиене, консумацията на вода следва да се измерва при всяка смяна на водата и най-малко един път в седмицата. Животни, проявяващи нелетални признаци на прекомерна токсичност, следва да бъдат умъртвени преди приключването на периода на изпитване, и като цяло не се използват за кометен анализ.
                     
                        Събиране на тъкани
                     
                     Тъй като е възможно предизвикването на скъсвания във веригата на ДНК (комети) да бъде изследвано в почти всяка тъкан, обосновката на избора на тъкан (тъкани), която трябва да бъде събрана, следва да бъде ясно определена и да се основава на причината за провеждането на изследването и на всички съществуващи данни за АРМЕ, генотоксичност, канцерогенност или други данни за токсичност на проучвания химикал. Важни фактори за разглеждане следва да включват пътя на прилагане (въз основа на вероятния път или пътища на експозиция на човека), прогнозираните разпределение в тъканите и абсорбция, ролята на метаболизма както и възможния механизъм на действие на изпитваните химикали. Черният дроб е тъканта, която е най-често изследвана и за които има най-много данни. Следователно, при липсата на каквато и да било съпътстваща информация и ако не са идентифицирани специфични тъкани, представляващи интерес, вземането на проба от черния дроб би било обосновано, тъй като това е първоначалното място за метаболизма на ксенобиотици и често е силно експониран както на базовото вещество (вещества), така и на метаболита (метаболитите). В някои случаи проверка на място на пряк контакт (например за химикали, прилагани орално, жлезистият стомах или дванадесетопръстникът/празното черво, или за инхалирани химикали — белият дроб) може да е относима в най-голяма степен. Допълнителни или алтернативни тъкани следва да бъдат подбрани въз основа на специфичните причини за провежданото изпитване, но може да се окаже полезно да се разгледат множество тъкани в същите животни, при условие че лабораторията е доказала пригодността си по отношение на тези тъкани и компетентността си при едновременно боравене с множество тъкани.
                     
                        Приготвяне на образците
                     
                     За процедурите, описани в следващите точки (44-49) е важно всички разтвори или стабилни суспензии да се използват до датата на изтичане на срока им на годност, или трябва да са прясно приготвени, ако е необходимо. Също така в следващите точки периодите от време, необходими за i) отстраняване на всяка тъкан след аутопсията, ii) обработване на всяка тъкан в суспензия от клетки/ядра и iii) обработване на суспензията и приготвяне на предметните стъкла, се считат за критични променливи (вж. определенията в допълнение 1), и по време на установяването на метода и доказването на пригодността следва да са определени приемливи периоди от време за всяка от тези стъпки.
                     Животните се умъртвяват в съответствие с действащото законодателство за хуманно отношение към животните и принципите за 3-те „R“, в подходящ момент (моменти) от време след последното третиране с изпитван химикал. Избраната тъкан (тъкани) се отстранява, извършва се дисекция на тъканта и част от нея се събира за кометното изследване, като в същото време част от същата част от тъканта следва да бъде нарязана и поставена във формалдехиден разтвор или подходящ фиксатор за евентуален хистопатологичен анализ (вж. точка 55) в съответствие със стандартни методи (12). Тъканта за кометното изследване се поставя в смилащ буфер, изплаква се със студен смилащ буфер в достатъчна степен, за да се отстрани остатъчната кръв, и се съхранява в леден смилащ буфер до обработката. Може също да се извърши in situ перфузия, напр. за черен дроб, бъбреци.
                     Съществуват множество публикувани методи за изолиране на клетки/ядра. Те включват смилане на тъкани като черен дроб и бъбреци, натривка на мукозни повърхности в случая със стомашно-чревния тракт, хомогенизиране и ензимно разграждане. При изпитването за валидиране на JaCVAM са проучени само изолирани клетки и следователно по отношение на установяването на метода и с оглед на възможността за позоваване на данни от изпитването на JaCVAM, за доказване на пригодността се предпочитат изолирани клетки. Бе установено обаче, че няма съществени различия в резултата от изследването, независимо дали са използвани изолирани клетки или ядра (8). Също така различни методи за изолиране на клетки/ядра (например хомогенизиране, смилане, ензимно разграждане и филтруване през мрежа) дават сравними резултати (55). Следователно могат да се използват или изолирани клетки, или изолирани ядра. Лабораторията трябва да извърши задълбочена оценка и валидиране на тъканно-специфични методи за изолиране на единични клетки/ядра. Както е обсъдено в точка 40, устойчивостта на някои увреждания, които водят до скъсвания във веригата на ДНК, откривани от кометното изследване, може да бъде много кратка (52) (53). Следователно, независимо от избрания метод за приготвяне на суспензии от единични клетки/ядра, важно е тъканите да се обработят във възможно най-кратък срок след умъртвяването на животните и да се поставят в условия, които намаляват отстраняването на увреждания (напр. чрез поддържане на тъканта при ниска температура). Клетъчните суспензии следва да се поддържат леденостудени, докато се приготвят за използване, така че да бъдат доказани минимално вариране между пробите и подходящи отклици от положителните и отрицателните контроли.
                     ПРИГОТВЯНЕ НА ПРЕДМЕТНИТЕ СТЪКЛА
                     Приготвянето на предметните стъкла следва да се извърши във възможно най-кратък срок след приготвянето на единичните клетки/ядра (в идеалния случай в рамките на един час), но температурата и времето между умъртвяването и приготвянето на предметното стъкло следва да бъдат строго контролирани и валидирани съгласно условията на лабораторията. Обемът на клетъчната суспензия, добавен към агароза с ниска температура на топене (обикновено 0,5-1,0 %) за приготвяне на предметните стъкла, следва да не води до намаляване на процента на агароза с ниска температура на топене до по-малко от 0,45 %. Оптималната гъстота на клетките се определя чрез системата за анализ на изображения, използвана за отчитане на кометите.
                     
                        Лизиране
                     
                     Условията на лизиране също представляват критична променлива и могат да повлияят на скъсванията на веригата, произтичащи от специфични видове модификации на ДНК (някои алкилирания на ДНК и адукти с бази). Поради това се препоръчва условията на лизиране да се поддържат възможно най-постоянни за всички предметни стъкла в рамките на опита. След като бъдат приготвени, предметните стъкла се потапят в охладен лизиращ разтвор в продължение на поне един час (или от предишната вечер) при около 2-8 °С и омекотена светлина, например жълта светлина (или на място, защитено от светлина), като се избягва излагането на бяла светлина, която може да съдържа UV компоненти. След този инкубационен период предметните стъкла трябва да се изплакнат, за да се отстранят остатъчните детергенти и соли преди стъпката за разплитане в алкална среда. Това може да се постигне чрез пречистена вода, буфер за неутрализиране или фосфатен буфер. Може да се използва също и буфер за електрофореза. Това би запазило алкалните условия в камерата за електрофореза.
                     
                        Разплитане и електрофореза
                     
                     Предметните стъкла следва да се поставят на случаен принцип върху платформата на устройство за електрофореза с потопен гел, съдържаща достатъчно разтвор за електрофореза, така че повърхностите на предметните стъкла да са напълно покрити (дълбочината на покриване следва също така да бъдат съгласувана от между различните серии). При друг тип устройства за електрофореза за кометното изследване, т.е. устройства с активно охлаждане, циркулиране и захранване за високо натоварване, по-пълното покриване с разтвор ще доведе до по-висок електрически ток при поддържане на постоянно напрежение. Следва да се използва балансиран план за поставяне на предметните стъкла във ваната за електрофореза за смекчаване на ефектите от евентуални трендове или от граничен ефект във ваната и за свеждане до минимум на варирането между партидите, т.е. във всяка серия на електрофореза следва да има един и същ брой предметни стъкла от всяко животно в проучването и следва да бъдат включени проби от различните групи на определена доза, отрицателните и положителните контроли. Предметните стъкла следва да бъдат оставени за най-малко 20 минути за разплитането на ДНК, след което се подлагат на електрофореза в контролирани условия, при които ще се постигне максимална чувствителност и динамичен обхват на изследването (т.е. които ще доведат до приемливи нива на % ДНК в опашката за отрицателните и положителните контроли, които осигуряват максимална чувствителност). Нивото на миграция на ДНК е линейно свързано с продължителността на електрофорезата, както и с потенциала (V/cm). Въз основа на изпитването на JaCVAM това би могло да бъде 0,7 V/cm в продължение на най-малко 20 минути. Продължителността на електрофорезата се смята за критична променлива и времето за електрофорезата следва да се определи с оглед оптимизиране на динамичния обхват. По-дълго време за електрофореза (напр. 30 или 40 минути, за да се постигне максимална чувствителност) обикновено води до по-силни положителни отклици с познати мутагени. Независимо от това, времената на електрофорезата могат също така да доведат до прекомерна миграция в контролните проби. Във всеки опит напрежението следва да се поддържа постоянно, а варирането на другите параметри следва да е в тесен и определен обхват, например в изпитването на JaCVAM 0,7 V/cm при изходен ток от 300 mA. Дълбочината на буфера следва да бъде коригирана, за да се получат необходимите условия, и следва да се поддържа по време на целия опит. Токът в началото и в края на електрофорезата следва да бъде записан. Оптималните условия трябва следователно да бъдат определени по време на първоначалното доказване на пригодност в съответната лаборатория по отношение на всяка проучвана тъкан. Стойността на температурата на разтвора за електрофореза по време на разплитането и на електрофорезата следва да се поддържа на ниско равнище, обикновено 2-10 °C (10). Температурата на разтвора за електрофореза в началото на разплитането, началото на електрофорезата и края на електрофорезата следва да се записва.
                     След приключването на електрофорезата предметните стъкла следва да се потопят/изплакнат в буфера за неутрализиране за най-малко 5 минути. Геловете могат да бъдат оцветявани и стойностите отчетени „в прясно състояние“ (напр. в рамките на 1-2 дни) или могат да бъдат дехидратирани за по-късно отчитане (напр. в рамките на 1-2 седмици след оцветяването) (56). Независимо от това, условията следва да бъдат валидирани по време на доказването на пригодността и данните за предходни периоди следва да се получат и съхранят поотделно за всяко от тези условия. В последния случай предметните стъкла трябва да бъдат дехидратирани чрез потапяне в чист етанол в продължение най-малко на 5 минути, да се оставят да се изсушат на въздух, след което да се съхранят при стайна температура или в контейнер в хладилник до отчитането.
                     
                        Методи за измерване
                     
                     Кометите следва да бъдат количествено отчетени чрез система за изцяло автоматичен или полуавтоматичен анализ на изображения. Предметните стъкла се оцветяват с подходящ флуоресцентен оцветител, напр. SYBR Gold, Green I, пропидиев йодид или етидиев бромид и измерванията се извършват при подходящо увеличение (напр. 200x) с микроскоп, оборудван за епифлуоресценция и с подходящи детектори, или цифров (напр. CCD) фотоапарат.
                     Клетките могат да бъдат класифицирани в три категории, както е описано в Атласа с изображения на комети (57), а именно такива, които могат да бъдат отчетени, такива, които не могат да бъдат отчетени и „фантомни“ (вж. точка 56 за допълнително обсъждане). Само клетки, които могат да бъдат отчетени (ясно определени глава и опашка без влияние от съседни клетки) следва да бъдат отчитани за % ДНК в опашката, за да се избегнат артефакти. Не е необходимо да се протоколира честотата на клетките, които не могат да бъдат отчетени. Честотата на „фантомните“ клетки следва да се определя въз основа на визуално отчитане (тъй като липсата на ясно дефинирана глава ще означава, че те не могат да бъдат лесно открити чрез анализ на изображения) на поне 150 клетки от проба (вж. точка 56 за допълнително обсъждане), и да се документира отделно.
                     Всички предметни стъкла за анализ, включително тези на положителните и отрицателните контроли, следва да се кодират независимо едно от друго и да се отчитат „сляпо“, така че отчитащият да не е запознат с условията на третирането. За всяка проба (на тъкан на животно) следва да бъдат анализирани най-малко 150 клетки (с изключение на фантомните — вж. точка 56). Отчитането на 150 клетки на едно животно в най-малко 5 животни на дадена доза (по-малко в паралелна положителна контрола — вж. точка 29) предоставя достатъчна статистическа мощност в съответствие с анализа на Smith et al., 2008 (5). Ако се използват предметни стъкла, може да се извърши отчитане на 2 или 3 предметни стъкла за всяка проба, като се използват пет животни за група. Няколко области от предметното стъкло следва да бъдат наблюдавани при плътност, която гарантира, че няма припокриване на опашки. Отчитането по ръбовете на предметните стъкла трябва да се избягва.
                     Скъсванията във веригата на ДНК в кометното изследване могат да бъдат измерени чрез независими крайни точки като % ДНК в опашката, дължина на опашката и момент на опашката. Всичките три измервания могат да се направят, ако се използва подходяща система със софтуер за анализ на изображения. Независимо от това % ДНК в опашката (известен също като % интензитет на опашката) се препоръчва за оценка и тълкуване на резултатите (12) (40) (41) (42), и се определя от интензитета на ДНК фрагмента в опашката, изразен като процент от общата стойност на интензитета за клетката (13).
                     
                        Увреждане на тъканите и цитотоксичност
                     
                     Положителните резултати в кометния анализ може да не се дължат единствено на генотоксичност, а токсичността за прицелната тъкан може също така да доведе до увеличаване на ДНК миграцията (12) (41). Обратно, при известни генотоксини често се наблюдава слаба или умерена цитотоксичност (12), което показва, че чрез кометното изследване само по себе си не е възможно да се разграничи миграцията на ДНК, предизвикана от генотоксичност, от тази, предизвикана от цитотоксичност. Независимо от това, когато се наблюдава увеличение на миграцията на ДНК, се препоръчва проверка на един или повече показатели за цитотоксичност, тъй като това може да спомогне за тълкуването на резултатите. Увеличението на миграцията на ДНК при наличието на ясни доказателства за цитотоксичност следва да се тълкува предпазливо.
                     Предложени са много измерители за цитотоксичността, от които хистопатологичните изменения се смятат за относим измерител на токсичността за тъканите. Наблюдения като възпалението, клетъчната инфилтрация, апоптичните или некротичните изменения се свързват с увеличаване на ДНК миграцията, но независимо от това, както се вижда от изпитването за валидиране на JaCVAM (12), няма окончателен списък на хистопатологичните изменения, които да са винаги свързани с увеличение на ДНК миграцията. Измененията в измерители от областта на клиничната химия (напр. ALT, AST) могат също така да предоставят полезна информация за увреждането на тъканите и допълнителни показатели, като например активиране на каспазата, оцветяване за TUNEL, оцветяване с Анексин V и други могат също да бъдат взети предвид. Съществуват обаче ограничени публикувани данни, съгласно които последните са били използвани за in vivo изследвания и някои могат да бъдат по-малко надеждни от други.
                     Фантомните клетки (или hedgehog-клетки) са клетки с микроскопско изображение, състоящо се от малка или несъществуваща глава и големи дифузни опашки, и се считат за силно увредени клетки, въпреки че етиологията тези клетки е несигурна (вж. допълнение 3). Поради външния им вид измерванията на % ДНК в опашката чрез анализ на изображения са ненадеждни и следователно фантомните клетки следва да се оценяват поотделно. Получаването на фантомни клетки следва да се отбележи и протоколира, а всички увеличения, за които се смята, че са свързани с изпитвания химикал, следва да се проучват и тълкуват внимателно. Знанията на потенциалния начин на действие на изпитваните химикали могат да помогнат при такива съображения.
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Обработка на резултатите
                     
                     Опитна единица е отделното животно и следователно както индивидуалните данни за животните, така и обобщените резултати следва да се представят в табличен вид. Поради йерархичния характер на данните се препоръчва да се определи медианната стойност на % ДНК в опашката за всяко предметно стъкло, и да се изчисли средното на медианните стойности за всяко животно (12). След това се определя средната стойност на средните за отделните животни, която да даде средна стойност за групата. Всички тези стойност следва да се включат в протокола. Могат да се използват алтернативни подходи (вж. точка 53), ако са научно и статистически обосновани. Статистически анализ може да се извърши, като се използват разнообразни подходи (58) (59) (60) (61). При избора на статистическите методи, които ще се използват, следва да се вземе предвид нуждата от трансформация (напр. log или квадратен корен) на данните и/или добавяне на малко число (напр. 0,001) към всички (дори различни от нулеви) стойности, както е обсъдено в горните препратки, за да се смекчи въздействието на нулевите стойности за клетката. Подробности за анализа на третирането/взаимодействията между половете, когато се използват животни и от двата пола, и последващият анализ на данни, при които са установени или не са установени различия, са дадени в допълнение 2. Данните за токсичността и за клиничните признаци следва също да бъдат протоколирани.
                     
                        Критерии за приемливост
                     
                     Приемливостта на дадено изпитване се основава на следните критерии:
                     
                                 а.
                              
                              
                                 Паралелната отрицателна контрола се счита за приемлива за допълване към базата данни на дадената лаборатория за отрицателните контроли за предходни периоди, както е описано в точка 16.
                              
                           
                                 б.
                              
                              
                                 Паралелните положителни контроли (вж. точка 29) трябва да предизвикват отклици, които са съвместими с генерираните в базата данни за положителните контроли за предходни периоди, и да генерират статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола.
                              
                           
                                 в.
                              
                              
                                 Анализирани са достатъчен брой клетки и дози (точки 52 и 36—38).
                              
                           
                                 г.
                              
                              
                                 Критериите за избор на най-високата доза са съвместими с описаните в точка 36.
                              
                           
                        Оценяване и тълкуване на резултатите
                     
                     При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно положителен, ако:
                     
                                 а.
                              
                              
                                 при най-малко една от изпитваните дози се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола,
                              
                           
                                 б.
                              
                              
                                 увеличението е свързано с дозата при оценка, извършена с подходящ трендов тест,
                              
                           
                                 в.
                              
                              
                                 някой от резултатите е извън разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди за даден вид, носител, път, тъкан и брой прилагания.
                              
                           Ако всички тези критерии са изпълнени, се смята, че изпитваният химикал може да предизвика скъсвания във веригата на ДНК в тъканите, изследвани в тази система за изпитване. Ако са изпълнени само един или два от тези критерии, вж. точка 62.
                     При условие, че са изпълнени всички критерии за приемливост, изпитваният химикал се счита за ясно отрицателен, ако:
                     
                                 а.
                              
                              
                                 в никоя от изпитваните концентрации не се наблюдава статистически значимо увеличение в сравнение с паралелната отрицателна контрола,
                              
                           
                                 б.
                              
                              
                                 няма увеличение, свързано с концентрацията, при оценка, извършена с подходящ трендов тест,
                              
                           
                                 в.
                              
                              
                                 всички резултати са в рамките на разпределението на данните за отрицателните контроли от предходни периоди за даден вид, носител, път, тъкан и брой прилагания.
                              
                           
                                 г.
                              
                              
                                 с преки или косвени доказателства е доказана експозиция на прицелната тъкан (тъкани) или токсичност за тази тъкан.
                              
                           Тогава се смята, че изпитваният химикал може да предизвика скъсвания във веригата на ДНК в тъканите, изследвани в тази система за изпитване.
                     Няма изискване за потвърждаване на ясно положителен или ясно отрицателен отклик.
                     В случай че откликът не е нито ясно отрицателен, нито ясно положителен (т.е. не всички критерии, изброени в точки 59 и 60, са изпълнени), и с цел подпомагане на установяването на биологичната относимост на даден резултат, данните следва да се оценяват чрез експертна оценка и/или чрез допълнителни изследвания, ако е научно обосновано. Отчитането на допълнителни клетки (когато е уместно) или извършването на опит с повторение с възможност за използване на оптимизирани опитни условия (напр. интервал на разполагане на дозите, други пътища на прилагане, други моменти на пробовземане и други) може да се окажат от полза.
                     В редки случаи дори след допълнителни изследвания наборът от данни не позволява стигането до заключение за положителни или отрицателни резултати и следователно се заключава, че е неясен.
                     За оценяване на биологичната относимост на даден положителен или неясен резултат се изисква информация относно цитотоксичността в прицелната тъкан (вж. точки 54-55). Когато се наблюдава положителен или неясен резултат само при наличието на ясни признаци на цитотоксичност, за изследването следва да се заключи, че е неясно по отношение на генотоксичността, освен ако има достатъчно информация в подкрепа на окончателно заключение. В случай на изследване с отрицателен резултат, когато са налице признаци за токсичност във всички изпитвани дози, може да е препоръчително допълнително проучване при нетоксични дози.
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитван химикал:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             източник, номер на партидата, при наличност;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             стабилност на изпитвания химикал, крайна дата за употреба или дата за повторен анализ, ако е известна.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Вещество с една съставка:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             химична идентификация, като наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, SMILES или InChI код, структурна формула, чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и др.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Вещество с повече съставки, UVCB и смеси:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             характеризирани, доколкото е възможно, от химическата идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Разтворител/носител:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка за избора на разтворител/носител;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             разтворимост и стабилност на изпитвания химикал в разтворител/носител, ако са известни;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             приготвяне на формулировките с дозите;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             аналитични определяния, свързани с формулировките (напр. устойчивост, хомогенност, номинални концентрации:
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитвани животни:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             използван вид/порода и обосновка за избора от научна и етична гледна точка;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             брой, възраст и пол на животните;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             източник, условия на отглеждане, хранителен режим, облагородяване на жизнената среда и т.н.;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             индивидуално тегло на животните в началото и в края на изпитването, в т.ч. обхват на телесното тегло, средни стойности и стандартно отклонение за всяка група;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Условия на изпитването:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             данни за положителните и отрицателните (носител/разтворител) контроли;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             резултати от изследването за установяване на обхвата (ако е проведено);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка за избора на нивото на доза;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробна информация за приготвянето на изпитвания химикал;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробна информация относно прилагането на изпитвания химикал;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка на пътя на прилагане;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             място на инжектирането (за подкожно и интравенозно проучвания);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи за пробоподготовка, при наличност хистопатологични анализи, особено за химикал, който дава положителен отклик в кометното изследване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             обосновка на избора на тъкан;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи за проверка дали изпитваният химикал е достигнал до прицелната тъкан, или до общото кръвообращение, ако са получени отрицателни резултати;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             действителна доза (mg/kg телесно тегло дневно), изчислена от концентрацията на изпитвания химикал в хранителния режим/питейната вода (ppm), и консумация, ако е приложимо;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробности относно качество на хранителния режим и водата;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробно описание на графиците на третиране и вземане на проби и обосновки за направения избор (напр. токсикокинетични данни, когато има такива);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             метод за облекчаване на болката, аналгезия;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             метод за умъртвяване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             процедури за изолиране и съхраняване на тъкани;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи за приготвяне на суспензии от единични клетки/ядра;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             източник и номера на партиди за всички реагенти (когато е възможно);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи за оценка на цитотоксичността;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             условия на електрофореза;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             техники за оцветяване; както и
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             методи за отчитане и измерване на комети.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Резултати:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Общи клинични наблюдения, ако има такива, преди и по време на периода на изпитване за всяко животно;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             доказателства за цитотоксичност, ако е извършвано изследване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за изследвания, по-дълги от една седмица: индивидуално телесно тегло на животните по време на изпитването, в т.ч. обхват на телесното тегло, средни стойности и стандартно отклонение за всяка група; консумация на храна:
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             взаимоотношение доза-отклик, където е очевидно;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             За всяка тъкан/животно — % ДНК в опашката (или други измерители, ако са избрани) и медианни стойности за предметно стъкло, средни стойности за всяко животно и средни стойности за всяка група;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни за паралелни отрицателни контроли/отрицателни контроли от предходни периоди, с размах, средни/медианни стойности и стандартни отклонения за всяка оценена тъкан;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни за паралелни положителни контроли/положителни контроли от предходни периоди;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             за тъкани, различни от черен дроб, крива доза-отклик с използване на положителната контрола. Това може да бъде от данните, събрани по време на доказването на пригодността (вж. точки 16-17) и следва да се придружава от обосновка, с позовавания на актуална литература, за целесъобразността на големината и разсейването на отклиците на контролите в тази тъкан;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             статистически анализи и използвани методи; и критерии за считане на даден отклик за положителен, отрицателен или неясен;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             честота на фантомните клетки във всяка група и на животно.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Обсъждане на резултатите
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Заключение
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Позовавания
                                 
                              
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Kirkland, D., G. Speit (2008), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens III. Appropriate follow-up testing in vivo, Mutation Research, Vol. 654/2, pp. 114-32.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Brendler-Schwaab, S. et al. (2005), The in vivo Comet assay: use and status in genotoxicity testing, Mutagenesis, Vol. 20/4, pp. 245-54.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing: result of the in vivo Comet assay workgroup, Mutation Research, Vol. 627/1, pp. 31-5.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Burlinson, B. (2012), The in vitro and in vivo Comet assays, Methods in Molecular Biology, Vol. 817, pp. 143-63.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Smith, C.C. et al. (2008), Recommendations for design of the rat Comet assay, Mutagenesis, Vol. 23/3, pp. 233-40.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Hartmann, A. et al. (2003), Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay, Mutagenesis, Vol. 18/1, pp. 45-51.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 McKelvey-Martin, V.J. et al. (1993), The single cell gel electrophoresis assay (Comet assay): a European review, Mutation Research, Vol. 288/1, pp. 47-63.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Tice, R.R. et al. (2000), Single cell gel/Comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 206-21.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Singh, N.P. et al. (1988), A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells, Experimental Cell Research, Vol. 175/1, pp. 184-91.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2010), Collaborative study on fifteen compounds in the rat-liver Comet assay integrated into 2- and 4-week repeat-dose studies, Mutation Research, Vol., 702/1, pp. 40-69.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 OECD (2014), Reports of the JaCVAM initiative international pre-validation and validation studies of the in vivo rodent alkaline comet assay for the detection of genotoxic carcinogens, Series on Testing and Assessment, Nos. 195 and 196, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Olive, P.L., J.P. Banath, R.E. Durand (1990), Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells using the „Comet“ assay, Radiation Research, Vol. 122/1, pp. 86-94.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Tice, R.R., G.H. Strauss (1995), The single cell gel electrophoresis/Comet assay: a potential tool for detecting radiation-induced DNA damage in humans, Stem Cells, Vol. 13/1, pp. 207-14.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Collins, A.R (2004), The Comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations, Molecular Biotechnology, Vol. 26/3, pp. 249-61.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 108-20.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Kushwaha, S. et al. (2010), Evaluation of multi-organ DNA damage by Comet assay from 28 days repeated dose oral toxicity test in mice: A practical approach for test integration in regulatory toxicity testing, Regulatory Toxicology and Pharmacology, Vol. 58/1, pp. 145–54.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Vasquez, M.Z. (2010), Combining the in vivo Comet and micronucleus assays: a practical approach to genotoxicity testing and data interpretation, 
                                       Mutagenesis
                                    , Vol. 25/2, pp. 187-99.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Bowen, D.E. (2011), Evaluation of a multi-endpoint assay in rats, combining the bone-marrow micronucleus test, the Comet assay and the flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, Mutation Research, Vol. 722/1, pp. 7-19.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Recio, L. et al. (2010), Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus (MN) and Comet assay protocol, The Journal of Toxicological Science, Vol. 35/2, pp. 149-62.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 O'Donovan, M., B. Burlinson (2013), Maximum dose levels for the rodent comet assay to examine damage at the site of contact or to the gastrointestinal tract, Mutagenesis, Vol. 28/6, pp. 621-3.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Hartmann, A. (2004), Use of the alkaline
                                    
                                       in vivo
                                    
                                    Comet assay for mechanistic genotoxicity investigations,
                                    Mutagenesis, Vol. 19/1, pp. 51-9.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Nesslany, F. (2007), In vivo Comet assay on isolated kidney cells to distinguish genotoxic carcinogens from epigenetic carcinogens or cytotoxic compounds, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 630/1, pp. 28-41.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Brendler-Schwaab, S.Y., B.A. Herbold (1997), A new method for the enrichment of single renal proximal tubular cells and their first use in the Comet assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 393/1-2, pp. 175-8.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Toyoizumi, T. et al. (2011), Use of the in vivo skin Comet assay to evaluate the DNA-damaging potential of chemicals applied to the skin, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 726/2, pp. 175-80.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Struwe, M. et al. (2008), Detection of photogenotoxicity in skin and eye in rat with the photo Comet assay, Photochemical and Photobiological Sciences, Vol. 7/2, pp. 240-9.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Wada, K. et al. (2012), A comparison of cell-collecting methods for the Comet assay in urinary bladders of rats, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 742/1-2, pp. 26-30.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 Wang, A. et al. (2007), Measurement of DNA damage in rat urinary bladder transitional cells: improved selective harvest of transitional cells and detailed Comet assay protocols, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/ 1-2, pp. 51-9.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), In Vivo Comet Assay Workgroup, part of the Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing. Fourth International Workgroup on Genotoxicity testing: results of the in vivo Comet assay workgroup, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, pp. 31-5.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Jackson, P. et al. (2012), Pulmonary exposure to carbon black by inhalation or instillation in pregnant mice: effects on liver DNA strand breaks in dams and offspring, Nanotoxicology, Vol. 6/5, pp. 486-500.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Sasaki, Y.F. et al. (2000), The comet assay with multiple mouse organs: comparison of Comet assay results and carcinogenicity with 208 chemicals selected from the IARC monographs and U.S. NTP Carcinogenicity Database, Critical Reviews in Toxicology, Vol. 30/6, pp. 629-799.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Sekihashi, K. et al. (2002), Comparative investigations of multiple organs of mice and rats in the Comet assay, Mutation Research, Vol. 517/1-2, pp. 53-74.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Speit, G, M. Vasquez, A. Hartmann (2009), The comet assay as an indicator test for germ cell genotoxicity,
                                    Mutation Research, Vol. 681/1, pp. 3-12.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Zheng, H., P.L. Olive (1997), Influence of oxygen on radiation-induced DNA damage in testicular cells of C3H mice, International Journal of Radiation Biology, Vol. 71/3, pp. 275-282.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Cordelli, E. et al. (2003), Evaluation of DNA damage in different stages of mouse spermatogenesis after testicular X irradiation, Journal of Radiation Research, Vol. 160/4, pp. 443-451.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Merk, O., G. Speit (1999), Detection of crosslinks with the Comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 33/2, pp. 167-72.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Pfuhler, S., H.U. Wolf (1996), Detection of DNA-crosslinking agents with the alkaline Comet assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 27/3, pp. 196-201.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Wu, J.H., N.J. Jones (2012), Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline Comet assay, Methods in Molecular Biology, Vol. 817, pp. 165-81.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Spanswick, V.J., J.M. Hartley, J.A. Hartley (2010), Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay,
                                    Methods in Molecular Biology, Vol. 613, pp. 267-282.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Kumaravel, T.S., A.N. Jha (2006), Reliable Comet assay measurements for detecting DNA damage induced by ionizing radiation and chemicals, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 605(1-2), pp. 7-16.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing: result of the in vivo Comet assay workgroup, Mutation Research, Vol.627/1, pp. 31-5.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Kumaravel, T.S. et al. (2009), Comet Assay measurements: a perspective, Cell Biology and Toxicology, Vol. 25/1, pp. 53-64.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 Ersson, C., L. Möller (2011), The effects on DNA migration of altering parameters in the Comet assay protocol such as agarose density, electrophoresis conditions and durations of the enzyme or the alkaline treatments, Mutagenesis, Vol. 26/6, pp. 689-95.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Møller, P. et al. (2010), Assessment and reduction of Comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group, Mutagenesis, Vol. 25/2, pp. 109-11.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Forchhammer, L. et al. (2010), Variation in the measurement of DNA damage by Comet assay measured by the ECVAG inter-laboratory validation trial, Mutagenesis, Vol. 25/2, pp. 113-23.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Azqueta, A. et al. (2011), Towards a more reliable comet assay: Optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions, Mutation Research, Vol. 724/1-2, pp. 41-45.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, John Wiley and Sons, New York 2nd ed.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Appendix A of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS No. 123)
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 Глава Б.8 от настоящото приложение: Субакутна инхалаторна токсичност: 28-дневно изследване.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 Глава Б.29 от настоящото приложение: Subchronic Inhalation Toxicity: 90-day Study.
                              
                           
                                 (52)
                              
                              
                                 Blakey, D.H., G.R. Douglas (1984), Transient DNA lesions induced by benzo[a]pyrene in Chinese hamster ovary cells, Mutation Research, Vol. 140/2-3, pp. 141-45.
                              
                           
                                 (53)
                              
                              
                                 Blakey, D.H., G.R. Douglas (1990), The role of excision repair in the removal of transient benzo[a]pyrene-induced DNA lesions in Chinese hamster ovary cells, Mutation Research, Vol. 236/1, pp. 35-41.
                              
                           
                                 (54)
                              
                              
                                 OECD (2002), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (55)
                              
                              
                                 Nakajima, M. (2012), Tissue sample preparation for in vivo rodent alkaline Comet assay, Genes and Environment, Vol. 34/1, pp. 50-4.
                              
                           
                                 (56)
                              
                              
                                 Hartmann, A. et al. (2003), Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay, Mutagenesis, Vol.18/1, pp.45–51.
                              
                           
                                 (57)
                              
                              
                                 Atlas of Comet Assay Images, Scientist Press Co., Ltd., Tokyo, Japan.
                              
                           
                                 (58)
                              
                              
                                 Lovell, D.P., G. Thomas, R. Dubow (1999), Issues related to the experimental design and subsequent statistical analysis of in vivo and in vitro Comet studies, Teratogenesis Carcinogenesis Mutagenesis, Vol. 19/2, pp. 109-19.
                              
                           
                                 (59)
                              
                              
                                 Wiklund, S.J., E. Agurell (2003), Aspects of design and statistical analysis in the Comet assay, Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 167-75.
                              
                           
                                 (60)
                              
                              
                                 Bright, J. et al. (2011), Recommendations on the statistical analysis of the Comet assay, Pharmaceutical Statistics, Vol. 10/6, pp. 485-93.
                              
                           
                                 (61)
                              
                              
                                 Lovell, D.P., T. Omori (2008), Statistical issues in the use of the Comet assay, Mutagenesis, Vol. 23/3, pp. 171-82.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                           
                              Електрофореза на единични клетки в алкална среда
                           : Чувствителна техника за откриване на първични увреждания на ДНК на равнището на отделната клетка/ядро.
                        
                           
                              Химикал
                           : Вещество или смес.
                        
                           
                              Комета
                           : Формата, която приемат нуклеоидите след подлагането им на въздействие на поле от електрофореза, поради нейното сходство с комета: главата е ядрото, а опашката е съставена от ДНК, мигрираща извън пределите на ядрото в електрическото поле.
                        
                           
                              Критична променлива/параметър
                           : Това е променлива от прококол, при която малки изменения могат да имат голямо въздействие върху извода от изследването. Критичните променливи могат да бъдат специфични за дадена тъкан. Критичните променливи следва да не бъдат изменяни, особено в рамките на изпитването, без да се вземе предвид начинът, по който изменението ще доведе до изменение на отклика при изследване, определено например според големината и варирането му в положителните и отрицателните контроли. В протокола от изпитването следва да се изброят измененията на критичните променливи, направени по време на теста или в сравнение със стандартния протокол за лабораторията, и да се представи обосновка за всяко изменение.
                        
                           
                              Интензитет на опашката или % ДНК в опашката
                           : Това съответства на интензивността на опашката на кометата спрямо общия интензитет (главата плюс опашката). Той отразява количеството скъсвания на ДНК, изразено като процент.
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                        
                           
                              UVCB
                           : Вещества с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологични материали.
                     
                     
                        Допълнение 2
                        
                           ФАКТОРНИЯТ ДИЗАЙН ЗА ИДЕНТИФИЦИРАНЕ НА РАЗЛИКИ МЕЖДУ ПОЛОВЕТЕ ПРИ IN VIVO КОМЕТНОТО ИЗСЛЕДВАНЕ
                        
                        
                           Факторният дизайн и неговият анализ
                        
                        При този дизайн се изпитват минимум 5 мъжки и 5 женски животни на всяко равнище на концентрация, в резултат от което в дизайна се използват най-малко 40 животни (20 мъжки и 20 женски животни, плюс относимите положителни контроли).
                        Дизайнът, който е един от по-простите видове факторен дизайн, е равностоен на двуфакторния дисперсионен анализ, с пола и равнището на концентрация като главни ефекти. Данните могат да бъдат анализирани с помощта на множество стандартни статистически софтуерни пакети като например SPSS, SAS, STATA, Genstat, както и с използване на R.
                        Анализът разпределя варирането в набора от данни като вариране между половете, вариране между концентрациите и вариране, свързано с взаимодействието между половете и концентрациите. Всеки от компонентите се тества спрямо оценка на варирането между животните, представляващи повторения в рамките на групите животни от един и същ пол, които са на една и съща концентрация. Пълни подробности за използваната методика са на разположение в множество стандартни статистически учебници (вж. позоваванията) и в помощните текстове, предоставени със статистическите пакети.
                        Анализът продължава с проверка на компонента за взаимодействие пол х концентрация в ANOVA таблицата (35). При липсата на значим компонент за взаимодействие комбинираните стойности за половете или за равнищата на концентрация предоставят валидни статистически тестове между равнищата, въз основа на компонента за обединеното вътрешногрупово вариране на ANOVA.
                        Анализът продължава като се раздели оценката на варирането между концентрациите на контрасти, които дават възможност за тест за линейни и квадратични контрасти на отклиците за равнищата на концентрация. Когато е налице значимо взаимодействие пол х концентрация, този компонент също може да се подраздели на контрасти за линейно x пол и квадратично x пол взаимодействие. Тези компоненти предоставят възможност за тестове дали концентрационните отклици са успоредни за двата пола, или има диференциален отклик между двата пола.
                        Оценката на обединеното вътрешногрупово вариране може да се използва за предоставяне на възможност за тестове за сравнения по двойки на разликата между средните стойности. Тези сравнения могат да се правят между средните стойности за двата пола и между средните стойности за различното равнище на концентрация, като за сравнения с равнищата за отрицателните контроли. В случаите, когато е налице значимо взаимодействие, могат да се направят сравнения между средните стойности за различни концентрации в рамките на даден пол, или между средните стойности за половете при една и съща концентрация.
                        
                           Позовавания
                        
                        Съществуват много статистически учебници, в които се разглеждат теорията, планирането, методологията, анализа и тълкуването на факторните дизайни, вариращи от най-простите двуфакторни анализи до по-сложните форми, използвани в методологията за планиране на опити. По-долу е представен неизчерпателен списък. Някои книги предоставят практически примери за сравними модели, в някои случаи с код за провеждането на анализите с използване на различни софтуерни пакети.
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987) Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007) Analysis of Variance and Covariance: How to choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990) The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997) Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971) Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009) Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                     
                        Допълнение 3
                        
                           НАСТОЯЩИ ОГРАНИЧЕНИЯ НА ИЗСЛЕДВАНЕТО
                        
                        Поради настоящото състояние на познанията, с in vivo кометното изследване са свързани няколко ограничения. Очаква се, че тези ограничения ще бъдат намалени или по-тясно определени, тъй като вече има повече натрупан опит с прилагането на изследването за отговор на въпроси, свързани с безопасността в нормативен контекст.
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Някои видове увреждане на ДНК могат да се окажат краткотрайни, т.е. могат да бъдат поправени твърде бързо, за да бъдат наблюдавани 24 или повече часа след последната доза. Няма установим списък с типовете кратковременни увреждания, нито на химикалите, които е вероятно да причиняват този тип увреждания, нито е известно в какъв период от време могат да бъдат открити този тип увреждания. Оптималният момент (моменти) на вземане на проби също може да бъде специфичен за химикала или за пътя, а моментите на вземане на проби следва да бъдат определени с оглед на кинетичните данни (напр. времето Tmax на достигане на пикова концентрация в плазмата или в тъканта), когато такива данни са налични. По-голямата част от изследванията за валидиране в подкрепа на настоящия метод за изпитване определят аутопсия 2 или 3 часа след прилагане на последната доза. Повечето изследвания в публикуваната литература описват прилагане на последната доза между 2 и 6 часа преди умъртвяването. Поради това тези опити са били използвани като основа за препоръката в рамките на метода за изпитване, че при отсъствието на данни, показващи противното — последната доза следва да бъде приложена в определена времева точка между 2 и 6 часа преди аутопсията.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Няма установими данни от проучвания, които разглеждат чувствителността на изпитването за откриване на краткотрайни увреждания на ДНК след прилагане чрез храна или питейна вода, в сравнение с прилагане чрез хранене през сонда. Увреждане на ДНК е открито след прилагане чрез фуражи и питейна вода, но съществуват малко такива протоколи, в сравнение с много по-големия опит със сонди и интраперитонеално прилагане. По този начин чувствителността на изследването може да бъде намалена за химикали, които предизвикват краткотрайни увреждания след прилагане чрез фуражи или питейна вода.
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Не са извършвани междулабораторни изследвания в тъкани, различни от черен дроб и стомах, и следователно не е установена препоръка за това как да се постигне чувствителен и възпроизводим отклик в тъкани, различни от черен дроб, като например очакван размах при положителни и отрицателни контроли. За черния дроб също така не е постигнато съгласие за определяне на по-ниска долна граница за стойността за отрицателната контрола.
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Макар че има няколко публикации, доказващи невъзможността за разграничаване при цитотоксичността in vitro, много малко данни са били публикувани in vivo и поради това не може да се препоръча нито един измерител на цитотоксичността. Хистопатологични изменения като възпалението, клетъчната инфилтрация, апоптичните или некротичните изменения се свързват с увеличаване на миграцията на ДНК, но независимо от това, както се вижда от изпитването за валидиране на JaCVAM (OECD, 2014), тези изменения не винаги водят до положителни резултати при кометното изследване и следователно няма окончателен списък на хистопатологичните изменения, които да са винаги свързани с увеличение на миграцията на ДНК. Фантомните клетки (hedgehogs или clouds, ghost cells) първоначално са били предложени като показател за цитотоксичност, но етиологията на тези клетки е несигурна. Съществуват данни, които предполагат, че е възможно те да са предизвикани от свързана с химикал цитотоксичност, механично/ензимно предизвикано увреждане, инициирано по време на пробоподготовката (Guerard et al., 2014) и/или по-екстремален ефект на генотоксичност от изпитвания химикал. Други данни изглежда сочат, че те се дължат на значителни увреждания на ДНК, които обаче по всяка вероятност могат да бъдат поправени (Lorenzo et al., 2013).
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Тъкани или клетъчни ядра са били успешно замразени за по-късен анализ. Това обикновено води до измеримо въздействие върху отклика на контролата на носител и положителната контрола (Recio et al., 2010; Recio at al., 2012; Jackson at al., 2013). Ако се използват, лабораторията следва да докаже компетентност по отношение на методологии замразяване и да потвърди приемлив нисък размах за % ДНК в опашката в прицелни тъкани на животни, третирани с носител, както и че все още могат да бъдат открити положителни отклици. В литературата замразяването на тъканите се описва с използване на различни методи. Понастоящем обаче не съществува съгласие относно най-добрите начини за замразяване и размразяване на тъкани, и как да се прецени дали даден потенциално изменен отклик може да окаже влияние върху чувствителността на изпитването.
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Неотдавнашни изследвания доказват, че се очаква списъкът с критичните променливи да продължи да се скъсява, а параметрите за критичните променливи да се дефинират по-точно (Guerard et al., 2014).
                                 
                              
                           Позовавания
                        
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Guerard, M., C. Marchand, U. Plappert-Helbig (2014), Influence of Experimental Conditions on Data Variability in the Liver Comet Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 55/2, pp. 114-21.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Jackson, P. et al. (2013), Validation of use of frozen tissues in high-throughput comet assay with fully-automatic scoring, Mutagenesis, Vol. 28/6, pp. 699-707.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Lorenzo, Y. et al. (2013), The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead, Mutagenesis, Vol. 28/4, pp. 427-32.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    OECD (2014), Reports of the JaCVAM initiative international pre-validation and validation studies of the in vivo rodent alkaline comet assay for the detection of genotoxic carcinogens, Series on Testing and Assessment, Nos. 195 and 196, OECD Publishing, Paris.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Recio L, Hobbs C, Caspary W, Witt KL, (2010), Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus (MN) and Comet assay protocol, J. Toxicol. Sci. 35:149-62.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Recio, L. et al. (2012), Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 53/2, pp. 101-13.
                                 
                              “
               
                     16)
                  
                  
                     В Част В глава В.13 се заменя със следното:
                     „В.13   Биоакумулация в риби: Експозиция по воден път и чрез хранителния режим
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 305 (2012). Основната цел на това преразглеждане на метода за изпитване е в две направления. На първо място, то цели да се включи изпитване на биоакумулацията чрез хранителен режим (36), подходящо за определяне на потенциала за биоакумулация на веществата с много малка разтворимост във вода. На второ място, то има за цел създаването на метод за изпитване, който, когато е целесъобразно, използва по-малко риба от съображения за хуманно отношение към животните, и който е икономически по-ефективен.
                     В годините след приемането на консолидирания метод за изпитване В.13 (1) са били изпитани редица вещества и е натрупан значителен опит както от лаборатории, така и от регулаторните органи. Това доведе до убеждението, че сложността на изпитването може да бъде намалена, ако са изпълнени определени критерии (срв. с точка 88), и че е възможен поетапен подход. Опитът показа също така, че биологични фактори като растежа и съдържанието на липиди в рибата могат да окажат силно влияние върху резултатите и може да е необходимо да се вземат предвид. Освен това се признава, че изпитването на много малко разтворими във вода вещества може да не е технически осъществимо. В допълнение, за много малко разтворими във вода вещества във водна среда експозицията по воден път може да е от ограничено значение в сравнение с пътя чрез хранителния режим. Това доведе до разработването на метод за изпитване, в който експозицията на рибата е чрез нейния хранителен режим (вж. точки 7-14 и 97 по-нататък). Валидирането (кръговото изпитване) на метода с експозиция чрез хранителния режим е проведено през 2010 г. (51).
                     Основните промени включват:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Изпитването на само една концентрация за изпитване може да се счита за достатъчно, когато е вероятно коефициентът на биоконцентрация (BCF) да не зависи от изпитваната концентрация.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 План за изпитването със сведена до минимум експозиция по воден път, в който е възможен ограничен брой точки на пробовземане, ако са изпълнени определени критерии.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Съдържанието на липиди в рибата следва да се измерва така, че BCF да може да бъде изразен на основата на 5 % съдържание на липиди.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 По-голям акцент върху оценката на кинетичния BCF (когато е възможно), освен оценката на BCF в стационарно състояние.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 За някои групи от вещества се предлага изпитване с експозиция чрез хранителния режим, когато това се счита за по-подходящо от изпитване с експозиция по воден път.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Теглото на рибата следва да се измерва, така че BCFk да може да бъде коригиран за понижаване на концентрацията в резултат от растеж.
                              
                           Преди провеждане някое от изпитванията за биоакумулация трябва да бъде известна следната информация за изпитваното вещество:
                     
                                 а)
                              
                              
                                 чувствителност на аналитичния метод за измерване на концентрацията в тъканите, във водната среда или в храната както на изпитваното вещество, така и на възможни метаболити (вж. точка 65).
                              
                           
                                 б)
                              
                              
                                 разтворимост във вода [МИ A.6]; (2)]; това следва да се определи в съответствие с метод, който е подходящ за (предполагаемия) обхват на разтворимостта, за да се получи надеждна стойност. За хидрофобни вещества това обикновено е методът на елуиране от колона.
                              
                           
                                 в)
                              
                              
                                 Коефициент на разпределение n-октанол—вода, K
                                    OW
                                     (37) [МИ А.8 (4), А.24 (5), А.23 (6)]; или друга подходяща информация за поведението при разпределение (напр. сорбция върху липиди, K
                                    OC); това следва да се определи в съответствие с метод, който е подходящ за (предполагаемия) обхват на K
                                    OW, за да се получи надеждна стойност. За хидрофобни вещества това обикновено е методът с бавно разбъркване [МИ А.23 (6)];
                              
                           
                                 г)
                              
                              
                                 Стабилност на веществото във вода (хидролиза [МИ В.7 (7)]);
                              
                           
                                 д)
                              
                              
                                 Стабилност на веществото в храни (особено при избор на метод за изпитване с експозиция чрез хранителния режим);
                              
                           
                                 е)
                              
                              
                                 Информация относно фототрансформацията, относима към условията на облъчване в изпитването (8);
                              
                           
                                 ж)
                              
                              
                                 Повърхностно напрежение (т.е. за вещества, при които log K
                                    OW не може да се определи) [МИ А.5 (9)];
                              
                           
                                 з)
                              
                              
                                 Парно налягане [МИ А.4 (10)];
                              
                           
                                 и)
                              
                              
                                 Всякаква информация относно биотично или абиотично разграждане във вода, като например (но не единствено) пълна биоразградимост [МИ В.4 части от II до VII (11), В.29 (12)], при необходимост;
                              
                           
                                 й)
                              
                              
                                 Информация за метаболити: структура, log K
                                    OW, образуване и разградимост, при необходимост;
                              
                           
                                 к)
                              
                              
                                 Константа на киселинна дисоциация (pK
                                    a) за вещества, които могат да се йонизират. Ако е необходимо, рН на водата за изпитване трябва да се коригира, за да се гарантира, че веществото е в нейонизирана форма при изпитването, ако това е съвместимо с рибния вид.
                              
                           Независимо от избрания метод на експозиция или схема за вземане на проби, настоящият метод за изпитване описва процедура за характеризиране на потенциала за биоакумулация на вещества в риба. Въпреки че проточните режими за изпитване са за предпочитане, полустатичните режими също са допустими, при условие че критериите за валидност (срв. точки 24 и 113) са изпълнени. При пътя на експозиция чрез хранителния режим проточната система не е необходима за поддържане на концентрации на изпитваното вещество във вода, но допринася за поддържане на достатъчни концентрации на разтворения кислород, за осигуряване на чиста вода и за отстраняване влияния, напр. от продукти от екскреция.
                     Независимо от избрания метод за изпитване, в настоящия метод за изпитване са дадени достатъчно подробности за извършване на изпитването, като същевременно се допуска достатъчна свобода за адаптиране на плана за опита към условията в отделните лаборатории и по отношение на променящите се характеристики на изпитваните вещества. Прилагането на изпитването за експозиция по воден път е най-подходящо при стабилни органични вещества със стойности на log K
                        OW между 1,5 и 6,0 (13), но все още може да се прилага за силно хидрофобни вещества (с log K
                        OW > 6,0), ако може да бъде доказана стабилна концентрация на изпитваното вещество във водата и напълно разтворено вещество. Ако не може да бъде доказана стабилна концентрация на изпитваното вещество във водата, изпитване по воден път не би било подходящо и следователно за рибата се изисква подход за изпитване на веществото с експозиция чрез хранителния режим (въпреки че тълкуването и използването на резултатите от изпитването с експозиция чрез хранителния режим може да зависи от правната рамка). Предварителни оценки на коефициента на биоконцентрация (BCF, понякога означаван като K
                        B) за органични вещества със стойности на log K
                        OW до около 9,0 могат да се получат чрез използване на уравнението на Bintein et al. (14). Предварителната оценка на коефициента на биоконцентрация за такива силно хидрофобни вещества може да бъде по-висока от стойността на коефициента на биоконцентрация в стационарно състояние (BCFSS), която се очаква да се получи при лабораторни опити, особено когато за предварителната оценка се използва обикновен линеен модел. Параметрите, които характеризират потенциала за биоакумулация, включват константата на скоростта на поглъщане (k
                        1), константите на скоростта на елиминиране, включително константата за скорост на очистване (k
                        2), коефициента на биоконцентрация в стационарно състояние (BCFSS), кинетичния коефициент на биоконцентрация (BCFK) и коефициента на биомултипликация от експозиция чрез хранителния режим (BMF) (38).
                     Изотопно белязаните изпитвани вещества могат да улеснят анализа на водата, храната и рибните проби, и могат да се използват за определяне дали ще са необходими идентификация и количествено определяне на метаболити. Ако се измерят само общите радиоактивни остатъци (например чрез изгаряне или разтваряне на тъкани), то BCF или BMF се основава на общото количество на базовото вещество, включително всеки задържан метаболит, а също и на асимилирания въглерод. Следователно стойностите на BCF или BMF, базирани на общите радиоактивни остатъци, не могат да се сравняват директно с BCF или BMF, получен при специфичен химичен анализ само на базовото вещество. При изследвания с изотопно белязани вещества, преди анализа могат да бъдат използвани процедури за разделяне като например ТСХ, ВЕТХ или ГХ (39), за да се определи BCF или BMF въз основа на базовото вещество. Когато се прилагат техники за разделяне, следва да се извършат идентификация и количествено определяне на базовото вещество и на относимите метаболити (40) (срв. точка 65), ако BCF или BMF следва да бъде определен въз основа на концентрацията на базовото вещество в рибата, а не от общите изотопно белязани остатъци. Възможно е също така да се комбинира изследване за метаболизма при рибите с изследване на разпределение in vivo чрез анализ и идентификация на остатъците в тъканите. Възможността за метаболизъм може да бъде прогнозирана с подходящи инструменти (напр. „QSAR toolbox“ на ОИСР (15) и патентовани QSAR програми).
                     Решението дали да се извърши изпитване с експозиция по воден път или с експозиция чрез хранителния режим, и при какъв план, следва да се основава на факторите в точка 3, разглеждани заедно с относимата правна рамка. Например за вещества, които имат висок log K
                        OW, но все пак имат значителна разтворимост във вода по отношение на чувствителността на наличните аналитични техники, на първо място трябва да се вземе предвид експозиция по воден път. Възможно е обаче информацията за разтворимостта във вода да не е окончателна за тези хидрофобни типове вещества, следователно преди да се вземе решение кой метод за изпитване да се използва, следва да бъде проучена възможността за приготвяне на стабилни, измерими концентрации на разтваряне във вода (стабилни емулсии не са позволени), приложими за изследване с експозиция по воден път (16). Не е възможно да се дадат точни насоки с предписания относно метода, който да бъде използван, въз основа на „гранични“ критерии за разтворимостта във вода и за коефициента на разпределение октанол-вода, тъй като други фактори (техники за анализ, разграждане, адсорбция и т.н.) могат да окажат подчертано влияние върху приложимостта на метода по причините, изложени по-горе. Независимо от това, при log K
                        OW над 5 и разтворимост във вода под ~ 0,01—0,1 mg/l се отбелязва обхватът от вещества, при които извършването на изпитването с експозиция по воден път може да е с нарастваща трудност.
                     Трябва да се имат предвид и други фактори, които могат да повлияят на избора на изпитване, включително потенциалът на веществото за адсорбция върху съдовете за изпитване и апаратите, неговата стабилност във воден разтвор спрямо стабилността му в храна за риби (17) (18) и т.н.
                     Информация за такива практически аспекти може да е налична от други извършени проучвания, отнасящи се за водна среда. В литературата (напр. (19)) е на разположение допълнителна информация относно оценката на аспектите, свързани с извършването на изследвания за биоакумулация.
                     За вещества, за които разтворимостта или поддържането на концентрацията във вода, както и анализът на тези концентрации не ограничават по никакъв начин осъществяването на метод с експозиция по воден път, този метод е предпочитан за определяне на потенциала за биоконцентрация на веществото. Във всички случаи следва да се провери, че концентрацията (концентрациите), която следва да се приложи при експозиция по воден път, е в рамките на водоразтворимостта в средите за изпитване. Могат да бъдат използвани различни методи за поддържането на стабилни концентрации на разтвореното изпитвано вещество, например използването на изходни разтвори или системи за пасивно дозиране (например метод на елуиране от колона), ако може да бъде доказано, че могат да бъдат поддържани стабилни концентрации и че средите за изпитване не са изменени в сравнение с препоръчаното в точка 27.
                     За силно хидрофобни вещества (log K
                        OW > 5 и разтворимост под ~ 0,01—0,1 mg/l) извършването на изпитването с експозиция по воден път може да е с нарастваща трудност. Ограниченията могат да се дължат на това, че концентрацията във вода не може да се поддържа на ниво, смятано за достатъчно постоянно (напр. поради сорбция върху стъклото на съдовете за експозиция или поради бързо усвояване от рибата), или че концентрациите във вода, които следва да се прилагат, са толкова ниски, че са в същия обхват като аналитичната граница на количествено определяне (41) или под нея. За тези силно хидрофобни вещества се препоръчва изпитването с експозиция чрез хранителния режим, при условие че изпитването съответства на нуждите на относимата правна рамка и оценката на риска.
                     За повърхностноактивни вещества следва да се вземе предвид дали е осъществимо изпитване за биоконцентрация по воден път, като се имат предвид свойствата на веществото, в противен случай изследването чрез хранителния режим вероятно е по-подходящо. Повърхностноактивните вещества са агенти, действащи на повърхността, които понижават повърхностното напрежение на границата между две течности. Поради техния амфифилен характер (т.е. съдържат както хидрофилна, така и хидрофобна част) те се натрупват на границата между две фази, като например границата между фази вода—въздух, границата между фази вода—храна, и стъклените стени, което затруднява определянето на тяхната концентрация във вода.
                     Изпитването чрез хранителния режим може да заобиколи някои аспекти на експозицията за сложни смеси със съставки с различни граници на разтворимост във вода, така че сравнима експозиция за всички съставки на сместа да е по-вероятна при този метод, отколкото при метода по воден път (срв. (20)).
                     Следва да се отбележи, че подходът чрез хранителния режим дава коефициент на биомултипликация от експозиция чрез хранителния режим (BMF), а не коефициент на биоконцентрация (BCF) (42). Съществуват подходи за оценка на кинетичния коефициент на биоконцентрация (BCFK) въз основа на данните, получени при изследването чрез хранителния режим (както е обсъдено в допълнение 8, но тези подходи следва да се използват предпазливо. По принцип при тези подходи се допуска кинетика от първи порядък и са приложими само за определени групи съединения. Малко вероятно е подобни подходи да могат да се прилагат за повърхностноактивни вещества (вж. точка 12).
                     План за изпитване със сведена до минимум експозиция по воден път с по-малко точки на пробовземане за намаляване броя на животните и/или ресурсите (вж. точка 83 по-долу) следва да се прилага само за веществата, при които има основания да се очаква, че поглъщането и очистването ще следват кинетика от първи порядък (т.е. по принцип нейонизирани органични вещества, вж. точка 88).
                     В.13-I:   Изпитване за биоконцентрация в риби при експозиция по воден път
                     
                     ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     Изпитването се състои от две фази: фаза на експозиция (поглъщане) и фаза след експозиция (очистване). По време на фазата на поглъщане група риби от един вид се експонират на изпитваното вещество при една или повече избрани концентрации, в зависимост от свойствата на изпитваното вещество (вж. точка 49). След това те се прехвърлят в среда, несъдържаща изпитваното вещество, за фазата на очистване. Фазата на очистване е необходима във всички случаи, освен ако поглъщането на веществото по време на фазата на поглъщането е било незначително. Концентрацията на изпитваното вещество във/върху рибата (или определени нейни тъкани) се проследява по време на двете фази на изпитването. Освен експонираната група, една контролна група риби се държи при идентични условия с изключение на отсъствието на изпитвано вещество, за да се отнесат възможните неблагоприятни ефекти, наблюдавани при изпитването за биоконцентрация, към съответната контролна група и да се получат концентрации за изпитваното вещество (43).
                     В изпитването по воден път фазата на поглъщане обикновено е с продължителност 28 дни. Продължителността може да се увеличи, ако е необходимо (срв. точка 18), или намали, ако е доказано, че стационарното състояние е постигнато по-рано (вж. допълнение 1, Определения и мерни единици). Предвиждане за дължината на фазата на поглъщането и времето за достигане на стационарното състояние може да се направи на база на уравненията от допълнение 5. След това започва периодът за очистване, в който рибите вече не са подложени на експозиция на изпитваното вещество, като те се прехвърлят в чист съд със същата среда, но без изпитвано вещество. Където е възможно, коефициентът на биоконцентрация се изчислява за предпочитане както като отношение между концентрацията в рибите (C
                        f) и концентрацията във водата (C
                        w) при стационарно състояние (BCFSS; вж. допълнение 1, определение), така и като кинетичен коефициент на биоконцентрация (BCFK; вж. допълнение 1, определения и мерни единици), който се оценя като отношение между константите на скоростта на поглъщане (k
                        1) и на скоростта на очистване (k
                        2), като се допуска кинетика от първи порядък (44).
                     Ако стационарното състояние не се постигне за 28 дни, или BCF се изчислява, като се използва кинетичният подход (вж. точка 38), или фазата на поглъщане може да бъде удължена. Ако това доведе до прекалено дълга от практическа гледна точка фаза на поглъщане за достигане на стационарно състояние (срв. точки 37 и 38, допълнение 5), кинетичният подход е за предпочитане. Като алтернатива за силно хидрофобни вещества следва да се вземе под внимание извършването на изследване чрез хранителния режим (45), при условие че изпитването чрез хранителния режим е съгласувано с относимата правна рамка.
                     Константите на скоростта на поглъщането и на очистването (загубата) (или константите, при които се използват по-сложни модели), коефициентът на биоконцентрация (стационарно състояние и/или кинетичен) и, когато е възможно, доверителните граници на всеки един от тези параметри се изчисляват от модела, който най-добре описва измерените концентрации на изпитваното вещество в рибата и водата (срв. допълнение 5).
                     Увеличението на масата на рибата по време на изпитването ще доведе до намаляване на концентрацията на изпитваното вещество в рибата, чиято маса нараства (т.нар. понижаване на концентрацията в резултат от растеж), като по този начин ще се подцени кинетичният BCF, ако не бъде коригиран с оглед на растежа (срв. точки 72 и 73).
                     BCF се основава на общата концентрация в рибата (т.е. концентрация на общо мокро тегло на рибата). За специални цели обаче могат да се използват определени тъкани или органи (например мускули, черен дроб), ако рибата е достатъчно голяма или може да се раздели на ядивна част (филе) и неядивна част (вътрешности). Тъй като при много органични вещества има ясна връзка между потенциала за биоконцентрация и хидрофобността, има също и съответна връзка между липидното съдържание в изпитваните риби и наблюдаваната биоконцентрация на такива вещества. Следователно, за да се намали този източник на вариране в резултатите от изпитването за веществата с висока липофилност (т.е. с log K
                        OW > 3), биоконцентрацията следва да се изразява като нормализирана към риба с 5 % съдържание на липиди (въз основа на мокрото тегло на цялото тяло) в допълнение към тази, изведена пряко от изследването. Това е необходимо, за да се осигури база, от която резултатите за различните вещества и/или изпитвани видове да могат да бъдат сравнявани едни с други. Стойността от 5 % съдържание на липиди се използва широко, тъй като това представлява средната стойност на липидното съдържание на рибите, които обикновено се използват в този метод за изпитване (21).
                     ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИЗПИТВАНОТО ВЕЩЕСТВО
                     В допълнение към свойствата на изпитваното вещество, дадени във Въведението (точка 3), друга необходима информация е токсичността по отношение на вида риба, която ще се използва в изпитването, за предпочитане асимптотичната LC50 (т.е. независима по време) и/или токсичността, прогнозирана от дългосрочни изпитвания на риби (напр. МИ В.47 (22), В.15 (23) и В.14 (24)).
                     Следва да е наличен подходящ аналитичен метод, с позната точност, прецизност и чувствителност, за количественото определяне на веществото в изпитваните разтвори и в биологичен материал, заедно с подробности за подготовката на пробата и нейното съхранение. Трябва също да се познава аналитичната граница на количествено определяне за изпитваното вещество както във вода, така и в рибните тъкани. Когато се използва изотопно белязано изпитвано вещество, то трябва да е с най-висока чистота (например за предпочитане > 98 %) и трябва да се знае процентът радиоактивност, свързан с онечистванията.
                     ВАЛИДНОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО
                     За да бъде тестът валиден, се прилагат следните условия:
                     
                                  
                              
                              
                                 Варирането на температурата на водата е по-малко от ± 2 °C, тъй като големите отклонения могат да засегнат биологичните параметри, относими към поглъщането и очистването, както и да причинят стрес на животните;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Концентрацията на разтворения кислород не пада под 60 % от стойността на насищане;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Концентрацията на изпитваното вещество в камерите се поддържа в рамките на ± 20 % от средното на измерените стойности по време на фазата на поглъщане;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Концентрацията на изпитваното вещество е под неговата граница на разтворимост във вода, като се има предвид ефектът, който водата за изпитване може да окаже върху действителната разтворимост (46);
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 смъртността или други неблагоприятни ефекти/болести както в контролната, така и в третираната риба, е по-малка от 10 % в края на изпитването; когато изпитването продължи повече от няколко седмици или месеци, смъртността или други неблагоприятни ефекти в двата набора риба следва да е по-малка от 5 % за месец и да не превишава общо 30 %. Значими различия в средния растеж между изпитваните и контролните групи, включени в пробовзетите риби, могат да са показател за токсично въздействие на изпитваното вещество.
                              
                           РЕФЕРЕНТНИ ВЕЩЕСТВА
                     Използването на референтни вещества с известен потенциал за биоконцентрация и слаб метаболизъм би било полезно при проверката на опитната процедура, когато се изисква (например когато дадена лаборатория не разполага с предишен опит с изпитването, или опитните условия са изменени).
                     ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
                     
                        Апаратура
                     
                     Трябва внимателно да се избягва използването на материали — за всички части от оборудването — които могат да се разтворят, абсорбират или изтекат и да окажат неблагоприятен ефект върху рибата. Могат да се използват стандартни правоъгълни или цилиндрични съдове, изработени от химически инертен материал, с подходящ обем спрямо скоростта на зареждане (срв. точка 43). Използването на тръби от мека пластмаса следва да се ограничи до минимум. Следва да бъдат използвани тръби от политетрафлуороетилен, неръждаема стомана и/или стъкло. Опитът показва, че за изпитвани вещества с висок коефициент на адсорбция, като синтетични пиретроиди например, може да се изисква използването на силанизирани стъкла. В такива ситуации оборудването трябва да се изхвърли след употреба. За предпочитане е системите за изпитване да се експонират на концентрации на изпитваното вещество, които ще се използват при изпитването, докато се изисква, за да се докаже поддържането на стабилни концентрации на експозиция преди въвеждането на изпитваните организми.
                     
                        Вода
                     
                     Обикновено в изпитването се използва натурална вода, която следва да се взема от незамърсен източник с еднородно качество на водата. При все това, възстановената вода (т.е. деминерализирана вода със специфични хранителни елементи, добавени в известни количества) може да е по-подходяща, за да се гарантира еднородно качество с течение на времето. Водата за разреждане, която е вода, смесена с изпитваното вещество преди постъпването им в съда за изпитване (срв. точка 30), следва да бъде с качество, което да позволява преживяването на избрания вид риба за периодите на аклиматизация и изпитване, без те да показват необичаен външен вид или поведение. В идеалния случай трябва да се докаже, че изпитваният вид може да преживее, да расте и да се възпроизвежда във водата за разреждане (например в лабораторна култура или изпитване за токсичност през целия жизнен цикъл). Водата за разреждане трябва да се характеризира поне чрез рН, твърдост, общо съдържание на твърди частици, общо съдържание на органичен въглерод (TOC (47)) и, за предпочитане, амониеви йони, нитрити и алкалност, а за морските видове — и соленост. Параметрите, които са важни за оптималното физическо състояние на рибите, не са напълно известни, но в допълнение 2 се дават препоръчителните максимални концентрации за определен брой параметри за сладководна и морска вода за изпитване.
                     Водата за разреждане трябва да има постоянно качество по време на целия период на изпитването. Нейният рН трябва да е в границите от 6,0 до 8,5 в началото на изпитването, но по време на дадено изпитване той трябва да е в обхват ± 0,5 рН единици. С цел да се гарантира, че водата за разреждане няма да повлияе прекомерно върху резултата от изпитването (например чрез образуване на комплексни съединения с изпитваното вещество) или да окаже неблагоприятно въздействие върху характеристиките на изходния запас от риби, трябва да се вземат проби за анализ на определени интервали, най-малко в началото и в края на изпитването. Прави се определяне на тежки метали (например Cu, Pb, Zn, Hg, Cd и Ni), основни аниони и катиони (например Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– и SO4
                        2–), пестициди (например общо органофосфорни и общо органохлорни пестициди), общ органичен въглерод и суспендирани частици, например на всеки три месеца, за които се знае, че водата за разреждане има относително постоянно качество. Ако е доказано, че качеството на водата за разреждане е постоянно поне за период от една година, определянията могат да се правят по-рядко и да се увеличат интервалите (например на всеки шест месеца).
                     Съдържанието на природни частици, а също и общият органичен въглерод на водата за разреждане трябва да са възможно най-ниски, за да се избегне адсорбция на изпитваното вещество върху органична материя, което може да намали неговата бионаличност и по този начин да доведе до подценяване на BCF. Максимално допустимата стойност е 5 mg/l за твърди частици (сухо вещество, непреминаващо през 0,45 μm филтър) и 2 mg/l за общия органичен въглерод (вж. допълнение 1). Ако е необходимо, водата за разреждане се филтрува преди употреба. Приносът към съдържанието на органичен въглерод във водата за изпитване от страна на изпитваната риба (екскрети) и от хранителни остатъци трябва да се поддържа на възможно най-ниско равнище (срв. точка 46).
                     
                        Изпитвани разтвори
                     
                     Приготвя се изходен разтвор от изпитваното вещество в подходяща концентрация. Той се приготвя за предпочитане чрез просто смесване или разбъркване на изпитваното вещество във водата за разреждане. Алтернатива, която може да бъде подходяща в някои случаи, е използването на система за дозиране с десорбция от твърда фаза. Използването на разтворители и диспергиращи средства (средства за повишаване на разтворимостта) обикновено не се препоръчва (срв. (25)); независимо от това използването на тези материали може да бъде приемливо с оглед на получаване на изходен разтвор с подходяща концентрация, но трябва да се положат всички усилия за свеждане до минимум на използването на тези материали и критичната им мицелна концентрация не трябва да се превишава (ако е относимо). Разтворители, които могат да се използват, са: ацетон, етанол, метанол, диметилформамид и триетиленгликол; диспергиращи средства, които са били използвани, са Tween 80, метилцелулоза 0,01 % и НСО-40. Концентрацията на разтворителя в окончателната среда за изпитване следва да бъде една и съща във всички третирания (т.е. независимо от концентрацията на изпитваното вещество) и следва да не надвишава съответните прагове на токсичност, определени за разтворителя при условията на изпитването. Максималното ниво е концентрация от 100 mg/l (или 0,1 ml/l). Малко вероятно е концентрация на разтворител от 100 mg/l да промени в значителна степен максималната концентрация на разтваряне на изпитваното вещество, която може да се постигне в средата (25). Приносът на разтворителя (заедно с изпитваното вещество) към общия органичен въглерод във водата за изпитване следва да е известен. По време на изпитването концентрацията на общия органичен въглерод в съдовете за изпитването не трябва да превишава концентрацията на органичен въглерод, произхождащ от изпитваното вещество, и на разтворителя или средството за повишаване на разтворимостта (48), ако се използва такова, с повече от 10 mg/1 (± 20 %). Съдържанието на органична материя може да има значително влияние върху количеството свободно разтворено изпитвано вещество при проточен тест за риби, особено за силно липофилните вещества. Твърдофазната микроекстракция (срв. точка 60) може да предостави важна информация за съотношението между свързани и свободно разтворени съединения, от които за последните се допуска, че представляват бионаличната фракция. Концентрацията на изпитваното вещество следва да бъде под границата на разтворимост на изпитваното вещество в средата за изпитването, независимо от използването на разтворител или средство за повишаване на разтворимостта. Трябва да се внимава, когато се използват лесно биоразградими разтворители, тъй като те могат да причинят проблеми с бактериален растеж в проточните изпитвания. Ако не е възможно да се приготви изходен разтвор без употребата на средство за повишаване на разтворимостта, следва да се обмисли целесъобразността на изследване с експозиция по воден път вместо изследване с експозиция чрез хранителния режим.
                     За проточни тестове се изисква система, която постоянно подава и разрежда изходен разтвор на изпитваното вещество (например система с измерваща помпа, пропорционално разреждащо устройство, сатуратор) или система за дозиране с десорбция от твърда фаза, за подаване на изпитваните концентрации към камерите за изпитване. За предпочитане е да се предвидят дневно поне пет подменяния на обема през всяка камера за изпитване. Проточният метод е за предпочитане, но където това не е възможно (например когато изпитваните организми са подложени на неблагоприятно въздействие), може да се използва полустатична техника, при условие че са удовлетворени критериите за валидност (срв. точка 24). Дебитите на изходните разтвори и водата за разреждане следва да се проверят 48 часа преди изпитването и след това поне веднъж на ден по време на изпитването. В тази проверка се включва определянето на дебита през всяка камера за изпитване и се гарантира, че то не варира с повече от 20 % както в самите камери, така и между камерите.
                     
                        Избор на видове
                     
                     Важни критерии при избора на видове са те да са достъпни, да могат да се получат с необходимите размери и да могат да се отглеждат удовлетворително в лабораторни условия. Други критерии за избор на вида риба включват любителското, търговското, екологичното значение, както и сравнимата чувствителност, успешно използване в миналото и т.н. Препоръчваните видове за изпитване са дадени в допълнение 3. Могат да се използват и други видове, но може да се наложи адаптиране на процедурата за изпитване за постигане на подходящи условия на изпитването. В този случай следва да се протоколира основанието за избор на вида и на опитния метод. Като цяло, използването на по-малки видове риби ще съкрати времето за достигане на стационарно състояние, но включването на повече риби (проби) може да е необходимо за адекватен анализ на съдържанието на липиди и концентрациите на изпитваното вещество в рибата. Освен това възможно е различията в скоростите на дишането и метаболизма между младите и по-възрастните риби може да затрудни сравняването на резултатите между различни изпитвания и различни изпитвани видове. Следва да се отбележи, че видовете риби, изпитвани по време на (ювенилен) етап от жизнен цикъл с бърз растеж може да усложни тълкуването на данните.
                     
                        Отглеждане на рибата (относимо към експозиция по воден път и чрез хранителния режим)
                     
                     Изходната популация риба следва да бъде аклиматизирана в продължение на поне две седмици във вода (срв. точка 28) при температурата на изпитването и хранена с достатъчен хранителен режим (срв. точка 45). Както водата, така и хранителният режим трябва да са от същия вид като тези, които ще се използват по време на изпитването.
                     След 48-часов период на свикване се отчита смъртността и се прилагат следните критерии:
                     
                                 —
                              
                              
                                 при смъртност над от 10 % от популацията за седем дни: отхвърля се цялата партида;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 при смъртност между 5 и 10 % от популацията за седем дни: аклиматизация за нови седем дни — ако смъртността е повече от 5 % през вторите седем дни: отхвърля се цялата партида;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 при смъртност под 5 % от популацията за седем дни: партидата се приема.
                              
                           Рибата, която се използва при изпитванията, не трябва да страда от никакви видими болести или отклонения. Всички болни риби трябва да се отстранят. Рибата не трябва да бъде лекувана от болести две седмици преди изпитването или по време на изпитването.
                     ПРОВЕЖДАНЕ НА ИЗПИТВАНЕТО
                     
                        Предварително изпитване
                     
                     Може да е полезно да се извърши предварителен опит с цел да се оптимизират условията на изпитване при окончателното изпитване, например избор на концентрация(и) на изпитваното вещество, продължителност на фазите на поглъщане и очистване, или да се определи дали е необходимо провеждането на цялостно изпитване. Планът за предварителното изпитване следва да бъдат такъв, че да се получи изискваната информация. Той може да бъде разгледан, ако сведено до минимум изпитване може да е достатъчно, за да се получи BCF, или ако е необходимо цялостно изследване (срв. точки 83—95 за сведеното до минимум изпитване).
                     
                        Условия на експозиция
                     
                     
                        Продължителност на фазата на поглъщане
                     
                     Прогноза за продължителността на фазата на поглъщане може да се направи на базата на практически опит (например, от предходно изследване или от изследване за акумулиране на натрупване на структурно подобно вещество) или от определени емпирични взаимовръзки, използващи познания относно водоразтворимостта или коефициента на разпределение октанол/вода на изпитваното вещество (при условие че поглъщането следва кинетика от първи порядък, срв. допълнение 5).
                     Фазата на поглъщане следва да се провежда 28 дни, освен ако може да се докаже, че стационарното състояние е постигнато по-рано (вж. допълнение 1, определения и мерни единици). Стационарно състояние е достигнато на графиката на изпитваното вещество в рибата (C
                        f) спрямо времето, когато кривата стане успоредна на времевата ос, и три последователни анализа на C
                        f, направени върху проби, взети на интервали от поне два дни, не се отличават с повече от ± 20 % един от друг, и няма значимо увеличение на C
                        f във времето между първия и последния от последователните анализи. Когато се анализират обединени проби, се изискват поне четири последователни анализа. За изпитвани вещества, които се усвояват бавно, е по-подходящо интервалите да бъдат по седем дни. Ако стационарното състояние не се постигне за 28 дни, или BCF се изчислява с използване само на кинетичния подход, който не е зависим от достигането на стационарно състояние, или фазата на поглъщане може да се удължи, като се правят допълнителни измервания, или до достигането на стационарно състояние, или с 60 дни, в зависимост от това кое удължение е по-кратко. Също така, концентрацията на изпитваното вещество в рибата в края на фазата на поглъщане трябва да бъде достатъчно висока, за да се осигури надеждна оценка на k
                        2 от фазата на очистването. Ако не се установи значимо поглъщане след 28 дни, изпитването може да се прекрати.
                     
                        Продължителност на фазата на очистването
                     
                     За веществата, следващи кинетика от първи порядък, период от време, равен на половината от продължителността на фазата на поглъщането обикновено е достатъчен за подходящо (например 95 %) намаляване на погълнатото вещество в тялото на рибата (срв. допълнение 5 за обяснение на оценката). Ако времето, необходимо за да се постигне 95 % загуба, е прекомерно дълго от практична гледна точка, например превишаващо два пъти нормалната продължителност на фазата на поглъщане (т.е. повече от 56 дни), може да се използва по-кратък период (напр. докато концентрацията на изпитваното вещество стане по-малко от 10 % от концентрацията в стационарно състояние). Независимо от това, по-дълги периоди на очистване могат да бъдат необходими за вещества, които имат по-сложни схеми на поглъщане и очистване, отколкото представените чрез модел с риби с един компартмент, който дава кинетика от първи порядък. Ако се наблюдават и/или очакват такива сложни модели, препоръчително е да се търси консултация от статистик в областта на биологията и/или специалист в областта на фармакокинетиката, за да се гарантира правилно планиране на изпитването. При удължаване на периода за очистване броят риби за пробовземане може стане ограничаващ и различията в растежа между рибите може да повлияе на резултатите. Периодът също ще се регулира чрез периода, през който концентрацията на изпитваното вещество в рибите остава над аналитичната граница на количествено определяне.
                     
                        Брой на изпитваните риби
                     
                     Избира се такъв брой риби за концентрация за изпитване, че да има минимум по 4 риби за всяка точка за пробовземане. Рибите следва да бъдат обединени, само ако анализът на една риба не е осъществим. Ако се цели по-голяма прецизност при изглаждането на крива (и производни параметри), или ако се изискват изследвания на метаболизма (например за да се направи разграничение между метаболити и базово вещество при използване на изотопно белязани изпитвани вещества), ще бъдат необходими повече риби за всяка точка за пробовземане. Липидното съдържание следва да се определи върху същия биологичен материал, който се използва за определяне на концентрацията на изпитваното вещество. Ако това не е осъществимо, може да бъдат необходими допълнителни риби (срв. точки 56 и 57).
                     Ако се използват полово зрели (т.е. достигнали полова зрялост) риби, те не следва преди изпитването или по време на изпитването да са в състояние на хвърляне на хайвер или наскоро да са преминали през това състояние. Следва също да се протоколира дали в опита се използват мъжки риби, женски риби, или риби и от двата пола. Ако се използват риби и от двата пола, следва да се документира, че разликите в растежа и липидното съдържание между половете не са значими преди началото на експозицията, по-специално ако се очаква, че обединяването на мъжки и женски риби ще бъде необходимо за гарантиране на концентрации на веществото и/или съдържание на липиди, които могат да бъдат определени.
                     За всяко изпитване се избират риби с близко тегло, така че най-малките да не са по-малки от две трети от теглото на най-големите. Рибите трябва да са от един и същи годишен клас и от един и същи източник. Понеже теглото и възрастта на една риба може да окаже значимо влияние върху стойностите на BCF (12), тези подробности се протоколират старателно. Препоръчва се подпроба от изходния рибен запас да се претегли малко преди началото на изпитването, за да се прецени средното тегло (срв. точка 61).
                     
                        Зареждане
                     
                     Следва да се използват големи съотношения вода към риба, за да се намали до минимум намаляването на концентрацията на изпитваното съединение във водата, причинено от прибавянето на риба в началото на изпитването, а също и за да се избегне намаляване на концентрацията на разтворения кислород. Важно е скоростта на зареждане да е подходяща спрямо използвания вид за изпитването. При всички случаи обичайно се препоръчва скорост на зареждане риба към вода от 0,1 до 1,0 g риба (мокро тегло) за литър вода на ден. По-високи скорости на зареждане риба към вода могат да се използват, ако се докаже, че изискваната концентрация на изпитваното вещество може да се поддържа в рамките на ± 20 % и че концентрацията на разтворения кислород не пада под 60 % от стойността на насищане.
                     При подбора на подходящи режими на зареждане се взема предвид нормалното местообитание на вида риба. Например дънните риби може да изискват повече място на дъното на аквариума за същия обем вода в сравнение с пелагичните рибни видове.
                     
                        Хранене
                     
                     По време на периодите на аклиматизация и изпитване хранителният режим на рибата е на база познато съдържание на липиди и общ белтък при количество, достатъчно да я поддържа здрава и да запазва теглото (допуска се известен растеж). По време на периодите на аклиматизация и изпитване храненето е ежедневно, на определено равнище в зависимост от използвания вид, опитните условия и енергийната стойност на храната (например за дъгова пъстърва е приблизително между 1 и 2 % от телесното тегло на ден). Скоростта на храненето следва да се избира така, че да се избягват бърз растеж и голямо увеличение на липидното съдържание. При необходимост количеството храна се преизчислява, например веднъж седмично, с оглед запазване на същата скорост на храненето. За целите на това изчисление теглото на рибата във всяка камера за изпитване се оценява на база на теглото на последно пробовзетата риба в тази камера. Рибата, останала в камерата, не се претегля.
                     Неконсумираната храна и изпражненията следва да се източват ежедневно от камерите за изпитване, малко след храненето (30 минути до един час). Камерите се поддържат колкото е възможно най-чисти по време на изпитването, така че концентрацията на органична материя да е възможно най-ниска (срв. точка 29), тъй като присъствието на органичен въглерод може да ограничи бионаличността на изпитваното вещество (12).
                     Понеже много от фуражите са получени от рибно месо, следва да се гарантира, че фуражът няма да окаже въздействие върху резултатите от изпитването или да предизвика неблагоприятни въздействия, напр. чрез съдържание на (следи от) пестициди, на тежки метали и/или на самото изпитвано вещество.
                     
                        Светлина и температура
                     
                     Препоръчва се от 12 до 16 часа излагане на светлина в денонощието, а температурата (± 2 °C) трябва да е подходяща за изпитвания вид (срв. допълнение 3). Типът и характеристиките на осветлението трябва да са познати. Трябва да се внимава относно възможната фототрансформация на изпитваното вещество при условията на облъчване на изследването. Използва се подходящо осветление, за да се избегне експозиция на рибата на неестествени фотопродукти. В някои случаи може да е подходяща употребата на екран, ограничаващ ултравиолетовите излъчвания под 290 nm.
                     
                        Концентрации на изпитване
                     
                     Изпитването първоначално е било планирано за неполярни органични вещества. За този тип вещество експозицията на рибата на единична концентрация се очаква да бъде достатъчна, тъй като не се очаква въздействие от концентрацията, въпреки че могат да бъдат необходими две концентрации за съответната правна рамка. Ако се изпитват вещества извън тази област, или са известни други признаци за възможна зависимост от концентрацията, изпитването трябва да се проведе с две или повече концентрации. Ако се изпитва само една концентрация, следва да бъде предоставена обосновка за използването на една концентрация (срв. точка 79). Също така, изпитваната концентрация следва да бъде толкова ниска, колкото е практически или технически възможно (т.е. да не е близо до границата на разтворимост).
                     В някои случаи може да се очаква, че биоконцентрацията на веществото зависи от водната концентрация (напр. за метали, при които поглъщането от рибите може да бъде поне частично регулирано). В такъв случай е необходимо изпитване на поне две, а за предпочитане повече концентрации (срв. точка 49), които са относими към околната среда. Също така за вещества, за които изпитваните концентрации трябва да бъдат в близост до границата на разтворимост по практически причини, се препоръчва изпитване на минимум две концентрации, тъй като това може да даде представа за надеждността на концентрациите на експозиция. Изборът на концентрации на изпитване следва да включва реалистичната концентрация от екологична гледна точка, както и концентрацията, която е относима към целта на специфичната оценка.
                     Концентрацията (концентрациите) на изпитваното вещество следва да бъдат избрани под неговото равнище на хроничните ефекти, или 1 % от острата му асимптотична LC50, в рамките на обхват, относим към околната среда, и поне един порядък над неговата граница на количествено определяне във вода чрез използвания метод за анализ. Най-високата допустима концентрация за изпитване може също да бъде определена чрез разделяне на острата 96 h LC50 на подходящо отношение остра/хронична (напр. подходящи отношения за някои вещества са около три, но някои са над 100). Ако се използва втора концентрация, тя следва да се различава от тази над нея с кратност десет. Ако това не е възможно поради критерия за токсичност (който ограничава най-горната концентрация за изпитване) и аналитичната граница (която ограничава най-ниската концентрация за изпитване), може да се използва кратност под десет, и трябва да бъде взето под внимание използване на изотопно белязано вещество (с най-голямата чистота, напр. за предпочитане > 98 %). Трябва да се внимава нито една от използваните концентрации да не е над границата на разтворимост на изпитваното вещество в изпитвателната среда.
                     
                        Контроли
                     
                     Една контрола с вода за разреждане или, ако е относимо (срв. точки 30 и 31), една контрола, съдържаща разтворител, следва да бъде изпитана в допълнение към изпитваните серии.
                     
                        Честота на измерванията на качеството на водата
                     
                     По време на изпитването разтвореният кислород, ТОС, рН и температурата следва да се измерват във всички съдове за изпитване и в съдовете с контроли. Общата твърдост и соленост (ако е относимо) се измерват в контролата (контролите) и в един съд. Ако се изпитват две или повече концентрации, измерват се тези параметри, които са с по-висока (или с най-високата) концентрация. Като минимум разтвореният кислород и солеността (ако е относимо) следва да се измерят три пъти — в началото, около средата и в края на периода на поглъщане — и веднъж седмично в периода на очистване. ТОС следва да се измерва в началото на изпитването (24 часа и 48 часа преди началото на изпитването във фазата на поглъщане) преди добавянето на рибата и най-малко веднъж седмично по време както на фазата на поглъщане, така и на фазата на очистване. Температурата следва да се измерва ежедневно, рН — в началото и края на всеки период, а твърдостта — веднъж за всяко изпитване. Желателно е температурата да се контролира непрекъснато поне в един съд.
                     
                        Пробовземане и анализ на рибата и водата
                     
                     
                        График за пробовземане на рибата и водата
                     
                     Проба от водата от камерите за изпитване за определяне на концентрацията на изпитваното вещество се взема преди добавянето на рибата и по време както на фазата на поглъщане, така и на фазата на очистване. Водата трябва да се пробовзема преди хранене, едновременно с пробовземането на рибата. За осигуряване на стабилни концентрации след въвеждането на рибата може да бъде полезно по-често вземане на проби. Концентрациите на изпитваното вещество следва да бъдат определени по време на фазата на поглъщане, за да се провери съответствието с критериите за валидност (точка 24). Ако анализите на водните проби в началото на фазата на очистването показват, че изпитваното вещество не се открива, това може да се използва като обосновка да не се измерва водата за изпитването и контролата на вода за изпитваното вещество за останалата част от фазата на очистването.
                     Рибите следва да бъдат пробовзети най-малко пет пъти през фазата на поглъщане и поне четири пъти през фазата на очистване за изпитваното вещество. Тъй като при някои случаи ще бъде трудно да се пресметне една сравнително точна оценка на стойността на BCF на база на този брой на пробите (особено когато има показания за кинетика, различна от обикновеното поглъщане от първи порядък, или от кинетиката на очистването), може би е препоръчително да се вземат проби по-често и в двата периода (срв. допълнение 4).
                     Липидното съдържание се определя върху същия биологичен материал, който се използва за определяне на концентрацията на изпитваното вещество, поне в началото и в края на фазата на поглъщане и в края на фазата на очистване. Ако това не е осъществимо, следва да се вземат проби от поне три отделни риби, за да се определи съдържанието на липиди за всяка от еднаквите три времеви точки. Броят на рибите за съд в началото на опита следва да бъде съответно коригиран (49). Като алтернатива, ако не бъдат открити значими количества от изпитваното вещество в контролните риби (т.е. рибите от изходната популация), контролните риби от изпитването могат да се анализират само за липидно съдържание, а анализът на изпитваното вещество в изпитваната група (групи) (и свързаните с това стойности на константата на скоростта на поглъщане, константата на скоростта на очистване и BCF) може да се коригира за промени в зависимост от липидното съдържание в контролната група по време на изпитването (50).
                     Мъртвите или болните риби не следва да се анализират за изпитваното вещество или за концентрацията на липиди.
                     Пример за приемлив график за пробовземане е даден в допълнение 4. Лесно могат да се изчислят и други графици, с помощта на други допускания за стойности на K
                        OW, за да се изчисли времето за експозиция за 95 % поглъщане (вж. допълнение 5 за изчисления).
                     Вземането на проби следва да продължи по време на фазата на поглъщане, докато се установи стационарно състояние (вж. допълнение 1, Определения и мерни единици) или до прекратяването по друг начин на фазата на поглъщане (след 28 или 60 дни, срв. точки 37 и 38). Преди началото на фазата на очистването рибата следва да се прехвърли в чисти съдове.
                     
                        Пробовземане и приготвяне на пробите
                     
                     Следва да се получат водни проби за анализ, например чрез източване през инертни тръбички от централна точка в камерата за изпитване. Както изглежда, нито филтруването, нито центрофугирането разделят винаги фракцията от изпитваното вещество, която не е бионалична, от бионаличната фракция. Ако се прилага техника на разделяне, с оглед на трудностите, свързани с бионаличността, в протокола от изпитването следва винаги да се представя обосновка за техниката за разделянето или валидиране на тази техника (25). Особено за силно хидрофобни вещества (т.е. вещества с log K
                        OW > 5) (12) (26), при които може да се получи адсорбция върху филтърната матрица или съдовете за центрофугиране, пробите следва да не се подлагат на тези третирания. Вместо това следва да се вземат мерки за поддържане на съдовете възможно най-чисти (срв. точка 46) и общото съдържание на органичен въглерод следва да се контролира и през двете фази — на поглъщане и на очистване (срв. точка 53). С цел да се избегнат евентуалните проблеми с намалената бионаличност, за малко разтворими и силно хидрофобни вещества за пробовземане могат да се използват техники с твърдофазна микроекстракция.
                     Пробовзетите риби следва да бъдат незабавно умъртвени чрез най-подходящия и хуманен метод (за измервания на цяла риба следва да не се извършват други процедури освен изплакване с вода (вж. точка 28) и изсушаване на рибата с помощта на попивателна хартия). Извършва се претегляне и измерване на цялата дължина (51). Измереното тегло и дължината на всяка отделна риба следва да бъдат свързани с концентрацията на анализираното вещество (и липидно съдържание, ако е приложимо), например с помощта на уникален идентификационен код за всяка пробовзета риба.
                     Желателно е рибата и водата да се анализират веднага след пробовземането, с цел да се избегне разграждането или други загуби, и да се изчислят приблизителни константи на скоростите на поглъщане и на очистване, докато продължава изпитването. Незабавните анализи също така избягват закъснението при определяне на достигането на плато (стационарно състояние).
                     Ако не се извършат незабавни анализи, пробите следва да се съхраняват чрез подходящ метод. Преди началото на изследването следва да бъде получена информация относно подходящия метод за съхранение на конкретното изпитвано вещество — например дълбоко замразяване, съхранение при 4 °C, извличане и др. Продължителността на съхраняването трябва да бъде избрана така, че да се гарантира, че веществото не се е разградило по време на съхранението.
                     
                        Качество на метода за анализ
                     
                     Понеже цялата процедура се обуславя по същество от точността, прецизността и чувствителността на метода за анализ, използван за изпитваното вещество, се проверява опитно дали точността, прецизността и възпроизводимостта на анализа на веществото, а също и аналитичният добив на изпитваното вещество от водата и рибата са задоволителни за конкретния метод. Това следва да бъде част от предварителните изпитвания. Също така се проверява дали изпитваното вещество не е откриваемо в използваната вода за разреждане. Ако е необходимо, коригират се стойностите на концентрацията на изпитваното вещество във водата и рибата, получени при изпитването за стойностите на аналитичния добив и фоновите стойности на контролите. С пробите вода и риба следва да се борави по начин, който намалява до минимум замърсяването и загубите (които, например, могат да се получат при адсорбция върху устройството за вземане на проба).
                     
                        Анализ на проби риба
                     
                     Ако при изпитването се използват изотопно белязани материали, може да се анализира общото количество изотопно белязани материали (т.е. базово вещество и метаболити) или пробите може да се почистят така, че базовото съединение да може да се анализира отделно. Ако BCF следва да се основава на базовото вещество, като минимум основните метаболити следва да се характеризират в края на фазата на поглъщане (вж. точка 6). Главните метаболити са онези, които са ≥ 10 % от общите остатъци в рибните тъкани, онези, които са ≥ 5 % при две последователни точки за вземане на проби, онези, които показват нарастващи нива по време на фазата на поглъщане, и онези, за които е известно, че представляват токсикологичен проблем. Ако BCF за цялата риба по отношение на общите изотопно белязани остатъци е ≥ 500, може би е препоръчително, а за някои категории вещества като пестицидите е силно препоръчително, да се идентифицират и количествено да се определят главните метаболити. Количественото определяне на такива метаболити може да се изисква от някои регулаторни органи. Ако продуктите на разграждането, представляващи ≥ 10 % от общите изотопно белязани остатъци в рибните тъкани, са идентифицирани и определени количествено, тогава се препоръчва да се направи същото и за продуктите на разграждането във водата за изпитване. Ако не е осъществимо, това трябва да бъде обяснено в протокола.
                     Концентрацията на изпитваното вещество обикновено следва да се определя за всяка отделна претеглена риба. Ако това не е възможно, може да се направи обединяване на пробите при всеки случай на пробовземане, но обединяването силно ограничава статистическите процедури, които могат да се приложат към данните, така че за да се пригодят желаното обединяване, статистическата процедура и мощността, в изпитването следва да бъдат включени достатъчен брой риби. Позовавания (27) и (28) могат да се използват като въведение към относимите процедури по обединяване.
                     BCF следва да се изразява и като нормализирана към риба с 5 % съдържание на липиди (въз основа на мокро тегло), в допълнение към изразяването, получено пряко при изследването (вж. точка 21), освен ако може да се аргументира, че изпитваното вещество не се акумулира главно в липиди. Липидното съдържание на рибата следва да се определя при всяко вземане на проба, когато е възможно, за предпочитане от същия екстракт като този, получен за анализа за изпитваното вещество, понеже липидите често трябва да се отстраняват от екстракта, преди той да може да бъде анализиран хроматографски. Независимо от това, анализът на изпитваните вещества често изисква специфични процедури за екстракция, които може да са в противоречие с методите за изпитване за определяне на липиди. В този случай (докато не се появят подходящи безразрушителни инструментални методи) се препоръчва използване на различна стратегия за определяне на липидното съдържание на рибата (вж. точка 56). За определянето на съдържанието на липиди следва да се използват подходящи методи (20). Техниката на екстракция с хлороформ/метанол (29) може да се препоръча като стандартен метод (30), но методът на Smedes (31) се препоръчва като алтернативна техника. Последният метод се характеризира със съпоставима ефикасност на извличането, висока точност, използване на органични разтворители, които са по-малко токсични, и удобно изпълнение. Могат да бъдат използвани други методи, за които точността е в благоприятно положение по отношение на препоръчителните методи, ако това е надлежно обосновано. Важно е да се дадат подробности за използвания метод.
                     
                        Измерване на растежа на рибите
                     
                     В началото на изпитването е необходимо да бъдат претеглени индивидуално пет до десет риби от изходната популация, и да бъде измерена тяхната обща дължина. Това могат да бъдат същите риби, които се използват за анализа на липиди (вж. точка 56). Теглото и дължината на рибите, използвани за всяко пробовземане от изпитваните и контролните групи, следва да се измерят преди извършването на химичен анализ или на анализ на липиди. Измерванията на тези риби могат да се използват за оценка на теглото и дължината на рибите, останали в изпитваните и контролните съдове (вж. точка 45).
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Обработка на резултатите
                     
                     Кривата на поглъщането на изпитваното вещество следва да се получи чрез начертаване на неговата концентрация във/върху рибата (или определени тъкани) във фазата на поглъщането спрямо времето в аритметични скали. Ако кривата е достигнала плато, т.е. стане приблизително асимптотична към времевата ос, BCF при стационарно състояние (BCFSS) следва да се изчисли от:
                     
                        
                     Развитието на C
                        f може да бъде повлияно от растежа на рибите (вж. точки 72 и 73). Средната концентрация на експозиция (Cw
                        ) се влияе от варирането във времето. Може да се очаква, че средно претеглената във времето концентрация е по-подходяща и точна за изследванията за биоакумулация, дори ако варирането е в рамките на съответния обхват на валидност (вж. точка 24). Средно претеглената във времето (TWA) концентрация във вода може да се изчисли съгласно допълнение 5, раздел 1.
                     Кинетичният коефициент на биоконцентрация (BCFK) следва да се определя като съотношение k
                        1/k
                        2, двете скоростни константи при кинетика от първи порядък. Скоростните константи k
                        1 и k
                        2, и BCFK могат да бъдат получени чрез едновременно изглаждане както на фазата на поглъщане, така и на фазата на очистване. Като алтернатива, k
                        1 и k
                        2 могат да се определят последователно (вж. допълнение 5 за описание и сравнение на тези методи). Константата на скоростта на очистване (k
                        2) може да се нуждае от корекция за понижаване на концентрацията в резултат от растеж (вж. точки 72 и 73). Ако кривата на поглъщането и/или на очистването очевидно не е от първи порядък, следва да се прилагат по-сложни модели (вж. позоваванията в приложение 5) и следва да се потърси консултация от статистик в областта на биологията и/или специалист в областта на фармакокинетиката.
                     
                        Данни за теглото/обема на рибите
                     
                     Мокрото тегло и общата дължина на всички отделни риби за всички интервали на пробовземане са представени в табличен вид отделно за изпитваните и контролните групи по време на фазата на поглъщане (включително изходната популация за стартиране на поглъщането) и на фазата на очистване. Измереното тегло и дължината на всяка отделна риба следва да бъдат свързани с анализираната химична концентрация, например с помощта на уникален идентификационен код за всяка пробовзета риба. Теглото е предпочитаният измерител за растежа за целите на коригирането на стойностите на кинетичния BCF за понижаване на концентрацията в резултат от растеж (вж. точка 73 и допълнение 5 за метода, използван за коригиране на данни за понижаване на концентрацията в резултат от растеж).
                     
                        Коригиране за понижаване на концентрацията в резултат от растеж и нормализиране за липиди
                     
                     Растежът на рибите по време на фазата на очистване може да намали измерените химични концентрации в рибата, в резултат на което общата константа на скоростта на очистването (k
                        2) е по-голяма, отколкото би била само поради процесите на отстраняване (напр. дишане, метаболизъм, дефекация). Кинетичните коефициенти на биоконцентрация следва да бъдат коригирани за понижаване на концентрацията в резултат от растеж. BCFSS също се влияе от растежа, но няма одобрена процедура за коригиране на BCFSS за растеж. В случаи на значителен растеж следва също така да бъде получен BCFK, коригиран за растеж (BCFKg), тъй като е възможно да е по-относим измерител на коефициента на биоконцентрация. Липидното съдържание на изпитваните риби (което е силно свързано с биоакумулацията на хидрофобни вещества) на практика може да варира в достатъчна степен, така че е необходима нормализация за определяне на липидното съдържание в риби (5 % w/w), за да се представи по смислен начин както кинетичният коефициент на биоконцентрация, така и коефициентът на биоконцентрация в стационарно състояние, освен ако може да се аргументира, че изпитваното вещество не се натрупва основно в липиди (напр. някои напълно флуорирани вещества могат да се свързват с белтъци). Уравнения и примери за тези изчисления могат да бъдат намерени в допълнение 5.
                     За коригирането на стойностите на кинетичния BCF за понижаване на концентрацията в резултат от растеж, константата на скоростта на очистване трябва да се коригира за растеж. Тази коригирана за растеж константа на скоростта на очистване (k
                        2g) се изчислява чрез изваждане на константата на скоростта на растежа (k
                        g, получена от данните за измереното тегло) от общата константа на скоростта на очистването (k
                        2). След това коригираният за растеж кинетичен коефициент на биоконцентрация се изчислява, като се раздели константата на скоростта на поглъщане (k
                        1) на коригираната за растеж константа на скоростта на очистване (k
                        2g) (вж. допълнение 5). В някои случаи този подход е изложен на риск. Например, за вещества с много бавно очистване, изпитвани в бързорастящи риби, получената k
                        2g може да е много малка и по този начин грешката в двете скоростни константи, използвани за нейното получаване, придобива изключително значение и в някои оценките за kg могат да бъдат по-големи от k
                        2. Алтернативен подход, който заобикаля необходимостта от коригиране за понижаване на концентрацията в резултат от растеж, включва използване на масата на изпитваното вещество за риба (на база цяла риба) при очистването, вместо обичайната маса на изпитваното вещество за единица тегло на рибата (концентрация). Това може лесно да бъде постигнато, тъй като настоящият метод за изпитване (МИ) следва да свързва записаните тъканни концентрации с теглата на отделните риби. Обикновената процедурата за това е очертана в допълнение 5. Следва да се отбележи, че k
                        2 все пак следва да се протоколира, независимо че се използва този алтернативен подход.
                     Кинетичният коефициент на биоконцентрация и коефициентът на биоконцентрация в стационарно състояние следва също да бъдат протоколирани по отношение на стойност на липидно съдържание на рибата по подразбиране 5 % (тегло/тегло), освен ако може да се аргументира, че изпитваното вещество не се натрупва основно в липиди. Данните за концентрация в риби, или BCF, се нормализират според съотношението между 5 % и действителното (индивидуално) средно липидно съдържание (в % мокро тегло) (вж. допълнение 5).
                     Ако върху една и съща риба са извършени химичен анализ и на анализ на липиди, тогава за изчисляване на нормализиран за липиди BCF следва да се използват нормализирани за липиди за отделната риба. Като алтернатива, ако растежът при подложените на експозиция и контролните риби е подобен, за корекция на липидите може да бъде използвано само липидното съдържание на контролните риби (вж. точка 56). Метод за изчисляване на нормализиран за липиди BCF е описан в допълнение 5.
                     
                        Тълкуване на резултатите
                     
                     Резултатите трябва да се тълкуват с внимание, когато измерените концентрации на изпитваните разтвори са на нива, близки до границата на откриване на метода за анализ.
                     Средният растеж както в изпитваните, така и в контролните групи следва по принцип да не се различава значимо, за да се изключат токсични ефекти. Константите на скоростта на растеж или кривите на растежа от двете групи следва да бъдат сравнени с подходяща процедура (52)).
                     Ясно определените криви на поглъщане и на очистване са показател за биоконцентрационни данни с добро качество. За скоростните константи резултат от χ2-тест за качество на приближението следва да показва добра пригодност (т.е. малък процент на грешка от измерване (32)) за модела на биоакумулация, така че константите на скоростта могат да се считат за надеждни (вж. допълнение 5). Ако се използва повече от една концентрация за изпитване, варирането в константите за поглъщане/очистване между изпитваните концентрации трябва да бъдат по-малки от 20 % (53). В противен случай може да се посочи зависимостта от концентрацията. Наблюдаваните значими разлики в константите на скоростите при поглъщане/очистване между приложените изпитвани концентрации трябва да се отчетат и да се дадат възможни обяснения. Обикновено 95 % доверителна граница на BCF при добре планирани изследвания доближава ± 20 % от получените стойности на BCF.
                     Ако се изпитват две или повече концентрации, резултатите от двете или от всички концентрации се използват, за да проучи дали резултатите са съвместими, и да се провери дали е налице зависимост от концентрацията. Ако с цел намаляване на използването на животни и/или ресурси се изпитва само една концентрация, следва да бъде предоставена обосновка за използването на една концентрация.
                     Полученият BCFSS е под въпрос, ако BCFK е значително по-голям от BCFSS, тъй като това може да е показател че не е достигнато стационарно състояние, или че не са били взети под внимание процесите на понижаване на концентрацията в резултат от растеж и на загубата. В случаите, когато BCFSS е много по-голям от BCFK, получаването на константите на скоростта на поглъщане и на очистване следва да бъде проверено за грешки и подложено на повторна оценка. Различна процедура за изглаждане може да подобри оценката на BCFK (вж. допълнение 5).
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Освен информацията за изпитваното вещество, посочена в точка 3, протоколът от изпитването включва следната информация:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитвано вещество:
                                 
                                 физична природа и, където е относимо, физични и химични свойства;
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             данни за химична идентификация, като наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, SMILES или InChI код, структурна формула, чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и др. (включително съдържание на органичен въглерод, ако е уместно).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             За вещества с повече съставки и UVCB (химични вещества с непознат или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологични материали) описание, доколкото е възможно, на химичната идентичност на отделните съставки и — за всяка от тях — нейното процентно съдържание в общата маса на веществото. Следва да се обобщи как методът за анализ, използван при изпитването, позволява измерването на концентрацията на веществото; трябва да бъдат описани всички аналитични процедури, включително точността на метода, границата на откриване на метода и границата на количествено определяне.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Ако е изотопно белязано, точното положение на белязания атом (атоми) и процент на радиоактивността, свързана с онечистванията.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Информация относно токсичността на изпитваното вещество за рибите (в идеалния случай за изпитвания вид риба). Токсичността следва да бъде протоколирана като остра 96 h LC50 и NOAEC и LOAEC от хронично изследване (т.е. изпитване за ранен стадий от жизнения цикъл или изпитване за целия жизнен цикъл, ако са налични).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Условия на съхранение на изпитвания химикал или на изпитваното вещество и стабилност на изпитвания химикал или на изпитваното вещество при условията на съхранение, ако се съхранява преди употреба.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитван вид:
                                 
                                 научно наименование, порода, източник, всякаква предварителна обработка, аклиматизация, възраст, пол (ако е относимо), обхват на размерите (тегло и дължина) и др.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Условия на изпитването:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             използвана процедура за изпитване (например проточна или полустатична); редовно изследване или изследване със сведен до минимум план (включително обяснение и обосновка).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Тип и характеристики на използваното осветление и фотопериода(ите).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             План на изпитването (например брой и размер на камерите за изпитване, скорост на подмяна на обема вода, скорост на зареждане, брой на повторенията, брой риби на повторение, брой на изпитваните концентрации, продължителност на фазите на поглъщане и на очистване, честота на вземане на проби от риба и вода),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Метод на приготвяне на изходни разтвори и честота на подновяване (разтворителят, неговата концентрация и приноса му към съдържанието на органичен въглерод във водата за изпитване трябва да се посочат, когато се използва) или описание на алтернативна система за дозиране.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Номиналните изпитвани концентрации, средните величини на измерваните стойности и техните стандартни отклонения в съдовете за изпитване и методът, по който са получени и честотата, с която се изчисляват.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Източник на вода за разреждане, описание на всякаква предварителна обработка, резултати от всякакво доказване на способността на изпитваната риба да живее във водата и характеристики на водата: рН, твърдост, температура, концентрация на разтворен кислород, остатъчни нива на хлор (ако се измерват), общо съдържание на органичен въглерод, суспендирани твърди частици, соленост на средата за изпитване (ако е уместно) и всякакви други направени измервания.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Качество на водата в съдовете за изпитване, рН, твърдост, ТОС, температура и концентрация на разтворен кислород; използвани методи и честота на измерванията.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Подробна информация за храненето, например тип на храната (храните), източник, състав (поне съдържание на липиди и белтъци, ако е възможно), избрана скорост на хранене, дадено количество и с каква честота;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Информация за третирането на пробите риба и вода, включително подробности от приготвянето, съхранението, екстракцията и аналитичните процедури (и прецизност) за изпитваното вещество, и липидно съдържание.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Методите за случаен подбор при третирането определяне на риба и разпределение на рибите по съдовете за изпитване.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Дата на въвеждане на изпитваните организми в разтворите за изпитване и продължителност на изпитването.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Описание на изпитванията за установяване на обхвата и резултатите от тях, ако има такива.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Резултати:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             резултати от всякакви извършени предварителни изследвания.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Смъртност при контролните риби и рибите във всяка камера за експозиция и всякакво наблюдавано необичайно поведение.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Информация за всички наблюдавани неблагоприятни ефекти.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Пълно описание на всички използвани процедури за химичен анализ, включително границите на откриване и на количествено определяне, варирането и аналитичния добив.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Липидното съдържание на рибата, включително използвания метод, и ако е получен, коефициентът за нормализация за липиди (L
                                                n, коефициент за изразяване на резултатите спрямо 5 % липидно съдържание в рибата).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Представяне в табличен вид на данните за теглото (и дължината), свързани с химичните концентрации за отделните риби (и липидното съдържание, ако е приложимо) както за контролните групи, така и за експонираните групи (например като се използват уникални идентификатори за всяка пробовзета риба) и изчисленията на получената константа (константи) на скоростта на растежа.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Таблични данни за концентрацията на изпитваното вещество в рибата (C
                                                f, свързана с отделните риби) и във водата (C
                                                w) (със средни стойности за изпитваната група и контролата, стандартно отклонение и обхват, ако е уместно) за всички времена на пробовземане (C
                                                f изразена в mg/kg мокро тегло за цялото тяло или за определени негови тъкани, например липиди и C
                                                w в mg/l). Стойностите на C
                                                w за контролните серии (фонът също се протоколира).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Криви (включително всички измерени данни), показващи следното (ако е приложимо, концентрациите могат да бъдат изразени по отношение на цялото тяло и липидното съдържание може да е нормализирано към 5 % от животното или от определени негови тъкани):
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         растеж, т.е. тегло на рибата спрямо времето или ln-трансформирано тегло спрямо времето (включително получената константа на скоростта на растежа, k
                                                            g);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         поглъщането и очистването на изпитваното вещество в рибата (върху една графика);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         времето за достигане на стационарно състояние (ако бъде постигнато);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ln-трансформирана концентрация спрямо времето за поглъщане (включително получената константа на скоростта на поглъщането, k
                                                            1);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ln-трансформирана концентрация (ln-концентрация) спрямо времето за очистване (включително получената константа на скоростта на очистването, k
                                                            2); както и
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         кривите както на фазата на поглъщане, така на фазата на очистване, показващи както данните, така и изгладения модел.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Ако при визуална проверка на графика се наблюдават очевидни стойности, силно различаващи се от нормалните, може да се приложи статистически валиден тест за стойности, силно различаващи се от нормалните, с оглед отстраняване на недостоверни точки с данни, както и документирана обосновка за тяхното пропускане.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Коефициентът на биоконцентрация в стационарно състояние (BCFSS), ако стационарното състояние е (почти) достигнато.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Кинетичният коефициент на биоконцентрация (BCFK) и получените константи на скоростта на поглъщане и на очистване k
                                                1 и k
                                                2, заедно с дисперсиите в k
                                                2 (наклон и пресечна точка), ако се използва последователно изглаждане.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Доверителни граници, стандартно отклонение (при наличие) и методи за изчисление/анализ на данни за всеки използван параметър за всяка концентрация на изпитваното вещество.
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Всякаква информация, отнасяща се до метаболити на изотопно белязано вещество и натрупването им.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Константа (константи) на скоростта на растежа (включително 95 % доверителен интервал (интервали)) и изчислени стойности на коригираната за растеж константа на скоростта на очистване (k
                                                            2g), полуразграждането и BCF (BCFKg).
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Всичко необичайно относно изпитването, всяко отклонение от тези процедури и всякаква друга относима информация.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Обобщаваща таблица с относимите измерени и изчислени данни, както е по-долу:
                                                         
                                                                     Константи на скоростта на поглъщане и на очистване за вещество и коефициенти на биоконцентрация (BCF)
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        g (константа на скоростта на растежа; ден– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        1 (обща константа на скоростта на поглъщане; l kg– 1 ден– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        2 (обща константа на скоростта на очистване; ден– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        2 (коригирана за растеж константа на скоростта на общото очистване; ден– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        C
                                                                        f (химична концентрация в рибата при стационарно състояние; mg kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност ± SD (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        C
                                                                        w (химична концентрация във водата; mg l– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност ± SD (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        L
                                                                        n (коефициент за нормализация за липиди):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност (3)
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFSS (BCF при стационарно състояние; l kg– 1)
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност ± SD (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFSSL (BCF при стационарно състояние с нормализация за липиди; l kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност ± SD (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFK (кинетичен BCF; l kg– 1)
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKg (коригиран за растеж кинетичен BCF; l kg– 1)
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        t
                                                                        1/2g (коригиран за растеж период на полуразграждане; ден):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKL (кинетичен BCF с нормализация за липиди; l kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKLG (коригиран за растеж кинетичен BCF с нормализация за липиди; l kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Въвежда се стойност
                                                                  
                                                               Резултатите, протоколирани като „не се открива/не може да се определи количествено при границата на откриване/количествено определяне“ при разработване на метода за предварителното изпитване и при плана за опита, следва да се избягват, защото такива резултати не могат да се използват за изчисляването на константите за скорост.
                                                      
                                                   
                                       
                           В.13 — II:   Изпитване върху риби при сведена до минимум експозиция по воден път
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Нарастващият опит, натрупан при провеждането и тълкуването на цялостното изпитване, както от лаборатории, така и регулаторни органи, показва, че — с някои изключения — за изчисляване на константите на скоростта на поглъщане и очистване се прилага кинетика от първи порядък. По този начин константите на скоростта на поглъщане и очистване могат да се оценяват, и кинетичният BCF да се получава, с минимум точки на пробовземане.
                     Първоначалната цел за проучването на алтернативни модели за BCF изследвания беше да се разработи малко изпитване, което да бъде използвано в стъпка на междинно изпитване за опровергаване или потвърждаване на оценките за BCF въз основа на K
                        OW и QSAR, и така да се елиминира необходимостта от цялостно изследване за много вещества, и да се сведат до минимум разходите и използването на животни чрез намаляване на пробовземанията и броя на извършваните аналитични серии. Макар и основният план на предходния метод за изпитване да беше следван, за да се даде възможност за интегриране на резултатите от изпитването със съществуващите данни за BCF и да се улесни изпълнението на изпитването и тълкуването на данните, целта бе да се представят оценки за BCF с достатъчна точност и прецизност за вземане на решения за оценка на риска. Много от същите съображения важат и за цялостното изпитване, напр. критериите за валидност (вж. точка 24) и спирането на изпитването, ако се наблюдава незначително поглъщане в края на фазата на поглъщане (вж. точки 16 и 38).
                     Веществата, които могат да отговарят на условията по плана за изпитването със свеждане до минимум на експозицията, следва да принадлежат към общата област, за която е разработен настоящият метод за изпитване, т.е. за неполярните органични вещества (вж. точка 49). Ако съществува признак, че веществото за изпитване може да има различно поведение (например ясно отклонение от кинетиката от първи порядък), следва да бъде извършено цялостно изпитване за регулаторни цели.
                     Обичайно продължителността на изпитването със свеждане до минимум на експозицията не е по-малка от тази на стандартното изпитване за BCF, но включва по-малко пробовземане на риби (вж. допълнение 6 за обяснението). Независимо от това, периодът за очистване може да бъде съкратен за бързо очиствани вещества, за да се избегне падането на концентрациите в рибата под границата на откриване/количествено определяне преди края на изпитването. Изпитването върху риби със свеждане до минимум на експозицията, при което се прилага само една концентрация, може да се използва за определяне на необходимостта от цялостно изпитване, и ако получените данни, използвани за изчисляване на константите за скорост и BCF, са устойчиви (вж. точка 93), цялостното изпитване може да отпадне, ако полученият BCF е далеч от регулаторните стойности, означаващи повод за загриженост.
                     В някои случаи може да е полезно планът за изпитването със свеждане до минимум на експозицията да се осъществява с повече от една концентрация за изпитване като предварително изпитване за определяне дали оценките за BCF за дадено вещество са зависими от концентрацията. Ако оценките за BCF от изпитването със свеждане до минимум на експозицията показват зависимост от концентрацията, ще е необходимо извършването на цялостното изпитване. Ако въз основа на такова изпитване със свеждане до минимум на експозицията оценките за BCF не показват зависимост от концентрацията, но резултатите не се считат за окончателни, след това всяко последващо цялостно изпитване може да бъде извършено само при една концентрация, като по този начин се намалява използването на животни в сравнение с цялостно изпитване при две (или повече) концентрации.
                     Веществата, които потенциално отговарят на условията за изпитването със свеждане до минимум на експозицията, следва:
                     
                                 —
                              
                              
                                 да е вероятно да показват приблизително кинетика на поглъщане и очистване от първи порядък, напр. от асоцииране (read-across) с подобни вещества;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 да имат log K
                                    OW < 6, освен ако не се очаква бърз метаболизъм (56);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 да са достатъчно разтворими във вода по отношение на техниката за анализ (вж. точка 24);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 да е ясно количествено определимо (т.е. концентрациите трябва да са най-малко с един порядък над границата на количествено определяне), както в рибите, така и във водата, препоръчва се изотопно белязване (вж. точка 23); както и
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 да имат период на очистване, по-голям от техния прогнозиран период на полуразграждане (вж. допълнение 5 за изчисления), или продължителността на очистването следва да бъде съответно коригирана (вж. точка 91). Изключение от това правило се допуска, ако се очаква бърз метаболизъм на веществото.
                              
                           ГРАФИК ЗА ПРОБОВЗЕМАНЕ ЗА ИЗСЛЕДВАНИЯ СЪС СВЕДЕН ДО МИНИМУМ ПЛАН
                     
                        Пробовземане на риби
                     
                     Вземане на проби от риби се намалява до четири точки на пробовземане:
                     
                                 —
                              
                              
                                 в средата и в края на фазата на поглъщане (последната е и начало на очистването) напр. след 14 и 28 дни (33).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 В средата на фазата на очистване и при прекратяване на изследването (когато концентрацията на веществото е < 10 % от максималната концентрация, или поне ясно е надвишила един период на полуразграждане на веществото), например след 7 и 14 дни очистване (33). Ако се очаква или наблюдава бързо очистване, може да е необходимо да се съкрати периодът за очистване, за да се избегнат концентрации в рибата, попадащи под границата на количествено определяне.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Измерването на липидите е като в цялостното изследване.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Корекцията за растеж е като в цялостното изследване.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 BCF се изчислява като кинетичен BCF.
                              
                           
                        Пробовземане на вода
                     
                     При сведения до минимум план водата се пробовзема както при цялостното изследване (вж. точка 54) или поне пет пъти, равномерно разпределени през фазата на поглъщане, и веднъж в седмицата във фазата на очистването.
                     
                        Изменения на плана
                     
                     Като се вземат предвид свойствата на изпитваното вещество, валидните прогнози от QSAR и конкретната цел на изследването, могат да бъдат разгледани някои промени в плана на изследването:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Ако е необходима по-голяма прецизност, за пробите в края на фазата на поглъщането могат да се използват повече на брой риби (6 или 8 вместо 4).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Включване на „допълнителна“ група риби, която ще се използва, ако очистването на 14-ия ден (или на прогнозирания край на фазата на очистване) не е било достатъчно за адекватно очистване (т.е. > 50 %). Ако прогнозираната продължителност на фазата на очистването е по-малка или по-голяма от 14 дни, графикът за пробовземане следва да се коригира (т.е. една група риби в прогнозирания край на фазата на очистването, и една група след изтичане на половината от това време).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Използване на две концентрации на изпитване за проучване на евентуална зависимост от концентрацията. Ако резултатите от изпитването със свеждане до минимум на експозицията, проведено с две концентрации за изпитване, показват, че BCF не е зависим от концентрацията (т.е. различава се с по-малко от 20 %), една концентрация за изпитване може да се смята за достатъчна при цялостно изпитване, ако се провежда такова.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Изглежда вероятно моделите на процесите на биоакумулация, например като тези, предложени от Arnot et al. (35), да могат да се използват за подпомагане при планирането на продължителността на фазите на поглъщане и очистване (виж също така допълнение 5).
                              
                           
                        Изчисления
                     
                     Обяснението за този подход е, че коефициентът на биоконцентрация при цялостно изпитване може да бъде определен или като коефициент на биоконцентрация в стационарно състояние (BCFSS) чрез изчисляване на отношението на концентрацията на изпитваното вещество в рибната тъкан към концентрацията на изпитваното вещество във водата, или чрез изчисляване на кинетичния коефициент на биоконцентрация (BCFK) като отношение на константата на скоростта на поглъщането k
                        1 към константата на скоростта на очистване k
                        2. BCFK е валиден дори ако концентрацията на дадено вещество в стационарно състояние не е постигната по време на поглъщането, при условие че поглъщането и очистването следват приблизително процеси с кинетика от първи порядък. Като абсолютен минимум, за да се направи оценка на константите на скоростта на поглъщане и очистване, се изискват две точки с данни, една в края на фазата на поглъщането (т.е. в началото на фазата на очистването) и една в края на фазата на очистването (или след значителна част от нея). Междинната точка за пробовземане се препоръчва като проверка на кинетиката на поглъщане и очистване (57). За изчисления вж. допълнения 5 и 6.
                     
                        Тълкуване на резултатите
                     
                     За оценка на валидността и информативната стойност на изпитването следва да се провери дали периодът за очистването надвишава един период на полуразграждане. Освен това BCFKm (кинетичният BCF, получен от изпитване със свеждане до минимум на експозицията) следва да се сравни със стойността на минимизирания BCFSS (която е BCFSS, изчислена в края на фазата на поглъщане, като се допуска, че е достигнато стационарно състояние. Това може само да бъде допуснато, тъй като броят на точките на пробовземане не е достатъчен за доказването му). Ако BCFKm < минимизирания BCFSS, минимизираният BCFSS следва да е предпочетената стойност. Ако BCFKm е по-малко от 70 % от минимизирания BCFSS, резултатите не са валидни и следва да се извърши цялостно изпитване.
                     Ако изпитването със свеждане до минимум на експозицията дава BCFKm в област на стойност, подлежаща на регулиране, следва да се извърши цялостно изпитване. Ако резултатът е далеч от стойност, подлежаща на регулиране (доста над или под), може да не е необходимо цялостно изпитване, или може да се извърши цялостно изпитване с единична концентрация, ако това се изисква от относимата правна рамка.
                     Ако след изпитване със свеждане до минимум на експозицията с една концентрация е преценено, че е необходимо цялостно изпитване, то може да се извърши с втора концентрация. Ако резултатите са съгласувани, по-нататъшно цялостно изпитване при различна концентрация може да бъде избегнато, като биоконцентрацията на веществото не се очаква да зависи от концентрацията. Ако изпитването със свеждане до минимум на експозицията е проведено при две концентрации и резултатите не показват зависимост от концентрацията, цялостното изпитване може да бъде проведено само с една концентрация (вж. точка 87).
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Протоколът от изпитването със свеждане до минимум на експозицията следва да включва цялата информация, изисквана за цялостното изпитване (вж. точка 81), с изключение на тази, която не е възможно да бъде получена (т.е. кривата, показваща времето за достигане на стационарно състояние и коефициентът на биоконцентрация в стационарно състояние; вместо последния следва да бъде посочен минимизираният BCFss). Освен това той следва да включва и мотивите за използване на изпитване със свеждане до минимум на експозицията, и получения от него BCFKm.
                     В.13 — III:   Изпитване за биоакумулация в риби при експозиция чрез хранителния режим
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Методът, описан в настоящия раздел, следва да се използва за вещества, при които методологията за експозиция по воден път не е практически осъществима (например поради това, че не могат да бъдат поддържани стабилни и измерими концентрации във вода, или поради това, че не може да бъде погълнато достатъчно количество вещество в тялото в рамките 60-дневна експозиция; вж. предходните раздели за метода с експозиция по воден път). Следва обаче да се има предвид, че крайната точка от това изследване е коефициентът на биомултипликация от експозиция чрез хранителния режим (BMF), а не коефициентът на биоконцентрация (BCF) (58).
                     На конференцията на SETAC Европа, проведена в Мадрид през май 2001 г. (36), беше представен нов метод за изпитване на биоакумулацията на малко разтворими във вода органични вещества. Тази работа се основаваше на различни протоколирани в литературата изследвания за биоакумулация с метод за дозиране, включващ фуражи с добавка (напр. (37)). Рано през 2004 г. на работна група на ЕС за PBT беше представен проект на протокол (38), предназначен за измерване на потенциала за биоакумулация на малко разтворими във вода органични вещества, при които методологията за експозиция по воден път не е практически осъществима, заедно с обяснителен документ (39), Допълнителна обосновка за метода е била, че възможната експозиция на околната среда на такива малко разтворими вещества (напр. log K
                        OW >5) може да бъде до голяма степен чрез хранителния режим (вж. (40) (41) (42) (43) (44). По тази причина в някои публикувани регламенти за химикали (59) се прави препратка към изпитвания с експозиция чрез хранителния режим. Следва да се отбележи обаче, че в описания тук метод експозицията по воден път внимателно се избягва и следователно стойност на BMF от настоящия метод за изпитване не може да бъде пряко сравнявана със стойност на BMF от проучване на място (в което може да се комбинират както водата, така и хранителният режим).
                     Този раздел от настоящия метод за изпитване се базира на посочения протокол (38) и е нов метод, които не е фигурирал в предходната версия на МИ В.13. Това алтернативно изпитване дава възможност пътят на експозиция чрез хранителния режим да бъде пряко проучен при контролирани лабораторни условия.
                     Потенциалните изследователи следва да се позовават на точки 1-14 от настоящия метод за изпитване за информация кога изпитване с експозиция чрез хранителния режим може да бъде предпочетено пред изпитване с експозиция по воден път. Дадена е информация относно съображения за различни вещества и тя следва да се разгледа преди провеждането на изпитване.
                     Използването на изотопно белязани изпитвани вещества може да се разглежда със сходни съображения като тези за метода с експозиция по воден път (вж. точки 6 и 65).
                     Методът чрез хранителния режим може да се използва за изпитване на повече от едно вещество в едно единствено изпитване, при условие че са спазени определени критерии; те са разгледани по-долу в точка 112. За улеснение методиката тук описва изпитване, при което се използва само едно изпитвано вещество.
                     Изпитването чрез хранителния режим е сходно с метода с експозиция по воден път в много отношения, очевидно с изключение на пътя на експозиция. В резултат на това много от аспектите на метода, описани тук, се припокриват с метода с експозиция по воден път, описан в предходния раздел. Доколкото е възможно са давани кръстосани препратки към относимите точки в предишния раздел, но в интерес на читаемостта и разбирането е неизбежно известно дублиране.
                     ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     Могат да се използват проточни или полустатични условия (вж. точка 4); проточни условия се препоръчват, за да се ограничи възможната експозиция на изпитваното вещество по воден път в резултат от десорбция от храни с добавка или изпражнения. Изпитването се състои от две фази: поглъщане (фураж с добавка от изпитваното вещество) и очистване (чист, нетретиран фураж) (вж. точка 16). Във фазата на поглъщането на „изпитвана“ група от риби се дава храна по определен хранителен режим от налична в търговската мрежа храна за риби с известен състав, към която ежедневно се добавя изпитваното вещество. В идеалния случай рибите трябва да консумират цялото количество дадена храна (вж. точка 141). След това по време на фазата на очистване на рибите се дава чистата, нетретирана храна за риби, налична в търговската мрежа. Що се отнася до метода с експозиция по воден път, могат да се използват при необходимост повече от една група на изпитване с различни концентрации на добавено изпитвано вещество, но за по-голямата част от силно хидрофобните изпитвани органични вещества е достатъчна една група на изпитване (вж. точки 49 и 107). Ако се използват полустатични условия, рибите следва да бъдат прехвърлени в нова среда и/или в нова изпитвателна камера в края на фазата на поглъщане (в случай че средата и/или апаратът, използвани във фазата на поглъщането, са били замърсени с изпитваното вещество чрез просмукване). Концентрациите на изпитваното вещество в рибите се измерват и в двете фази на изпитването. В допълнение към групата от риби, хранена с хранителния режим с добавка (изпитваната група), една контролна група риби се държи при идентични условия и се храни по същия начин, с изключение на това, че режимът с налична в търговската мрежа храна не включва добавка с изпитваното вещество. Тази контролна група позволява количествено определяне на фоновите нива на изпитваното вещество в неекспонираните риби и служи за сравнение за всеки несвързан с третирането неблагоприятен ефект, отбелязан в изпитваната група (групи) (60). Тя също така дава възможност за сравнение на константите на скоростта на растеж между групите като проверка, че са консумирани сходни количества от предлагания хранителен режим (потенциалните разлики във вкусовите качества между хранителните режими също трябва да се отчитат за обясняване на различните константи на скоростта на растеж; вж. точка 138). Важно е, че както през фазата на поглъщане, така и при очистването, изпитваните и контролните групи следва да бъдат хранени с еквивалентни в хранително отношение хранителни режими.
                     Фаза на поглъщане с продължителност 7-14 дни по правило е достатъчна, въз основа на опита на разработилите метода (38) (39). Този обхват следва да сведе до минимум разходите за извършване на изпитването, като същевременно се гарантира достатъчна експозиция за повечето вещества. В някои случаи обаче фазата на поглъщане може да бъде удължена (вж. точка 127). По време на фазата на поглъщане концентрацията на веществото в рибата може да не достигне стационарно състояние, така че обработката на данни и резултатите от този метод обикновено се основават на кинетичен анализ на тъканни остатъци. (Забележка: Уравненията за изчисляване на времето за достигане на стационарно състояние могат да се прилагат тук така, както в изпитването с експозиция по воден път — вж. допълнение 5). Фазата на очистването започва, когато на рибите за първи път се дава хранителен режим без добавка, и обикновено е с продължителност до 28 дни или докато изпитваното вещество вече не може да бъде количествено определено в цели риби, в зависимост от това кое настъпва по-рано. Фазата на очистването може да се съкрати или удължи спрямо срока от 28 дни, в зависимост от промяната във времето на измерените химични концентрации и размерите на рибите.
                     Настоящият метод позволява определянето на специфичния за веществото период на полуразграждане (t
                        1/2 от константата за скоростта на очистване, k
                        2), ефикасността на усвояването (абсорбцията в червата; a), кинетичния коефициент на биомултипликация от експозиция чрез хранителния режим (BMFK), коригирания за растеж кинетичен коефициент на биомултипликация от експозиция чрез хранителния режим (BMFKg), коригирания за липиди (61) кинетичен коефициент на биомултипликация от експозиция чрез хранителния режим (BMFKL) (и/или коригирания за растеж и за липиди кинетичен коефициент на биомултипликация от експозиция чрез хранителния режим, BMFKgL) за изпитваното вещество в рибите. Както за метода с експозиция по воден път, увеличението на масата на рибата по време на изпитването ще доведе до намаляване на концентрацията на изпитваното вещество в рибата, чиято маса нараства, като по този начин ще се подцени (кинетичният) BCF, ако не бъде коригиран с растежа (срв. точки 162 и 163). Освен това, ако се прецени, че стационарното състояние е постигнато във фазата на поглъщането, може да се изчисли ориентировъчен BMF в стационарно състояние. Налични са подходи, които правят възможно оценяването на кинетичния коефициент на биоконцентрация (BCFK) въз основа на данните, получени при изследването чрез хранителния режим (напр. (44) (45) (46) (47) (48). Предимствата и недостатъците на такива подходи се обсъждат в допълнение 8.
                     Изпитването е планирано главно за малко разтворими неполярни органични вещества, които следват приблизително кинетика на поглъщане и очистване от първи порядък в риби. Ако се изпитва вещество, които не следва приблизително кинетика на поглъщане и очистване от първи порядък, следва да се прилагат по-сложни модели (вж. позоваванията в приложение 5) и следва да се потърси консултация от статистик в областта на биологията и/или специалист в областта на фармакокинетиката.
                     Обикновено BMF се определя чрез анализ на изпитваното вещество в цяла риба (на база мокро тегло). Ако е относимо към целите на проучването, могат да бъдат пробовзети специфични тъкани (напр. мускули, черен дроб), ако рибата е разделена на ядивни и неядивни части (вж. точка 21). Освен това могат да се използват отстраняване и отделен анализ на стомашно-чревния тракт, за да се определи приносът към концентрациите в цялата риба за точките на пробовземане в края на фазата на поглъщане и в близост до началото на фазата на очистването, или като част от подход на масов баланс.
                     Липидното съдържание на пробовзетите цели риби следва да се измерва така, че концентрациите да могат да бъдат коригирани за липиди, при отчитане на липидното съдържание както на хранителния режим, така и на рибите (вж. точки 56 и 57 и допълнение 7).
                     Теглото на пробовзетите отделни екземпляри следва да бъде измерено и записано, и да бъде свързано с анализираната химична концентрация за съответния отделен екземпляр (например като се протоколира чрез използване на уникален идентификационен код за всяка пробовзета риба), за целите на изчисляването на растежа, който може да настъпи по време на изпитването. Общата дължина на рибата също следва да се измери, когато това е възможно (62). Данните за теглото също са необходими за оценяване на BCF с използване на данните от очистването от изпитването чрез хранителния режим.
                     ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИЗПИТВАНОТО ВЕЩЕСТВО
                     Следва да е на разположение информация за изпитваното вещество, както е описана в точки 3 и 22. Метод за анализ на концентрациите на изпитваното вещество във вода обикновено не е необходим; изискват се методи с подходяща чувствителност за измерването на концентрациите в храната за риби и в тъканите на рибите.
                     Методът може да се използва за изпитване на повече от едно вещество в едно единствено изпитване. Независимо от това, изпитваните вещества трябва да са съвместими едно с друго, така че да не си взаимодействат или да изменят своята химична идентичност при добавяне в храната за риби. Целта е измерените резултати за всяко вещество, изпитвано заедно с други, да не се различават значително от резултатите, които биха се получили, ако се проведат отделни изпитвания за всяко изпитвано вещество. Предварителната аналитична работа следва да установи аналитичния добив за всяко вещество от храна с множество добавки и от проба от рибна тъкан i) с висок аналитичен добив (напр. > 85 % от номиналния) и ii) с необходимата чувствителност за изпитване. Общата доза на веществата, изпитвани заедно, следва да е под комбинираната концентрация, която може да доведе до токсични ефекти (вж. точка 51). Освен това, възможните неблагоприятни ефекти в рибата и потенциалът за ефекти от взаимодействия (например метаболитни ефекти), свързани с едновременно изпитване на множество вещества, трябва да се вземат под внимание при планирането на опита. Едновременното изпитване на вещества, които могат да съществуват в йонизирано състояние, трябва да се избягва. По отношение на експозицията, методът е подходящ и за сложни смеси (вж. точка 13, въпреки че при анализа се прилагат същите ограничения, каквито за всеки друг метод).
                     ВАЛИДНОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО
                     За да бъде валидно дадено изпитване се прилагат следните условия (вж. точка 24):
                     
                                 —
                              
                              
                                 Варирането на температурата на водата е по-малко от ± 2 °C в третираните или контролните групи
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Концентрацията на разтворения кислород не пада под 60 % от стойността на насищане при равновесие с атмосферния въздух;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Концентрацията на изпитваното вещество в храната на рибата преди и в края на фазата на поглъщане е в рамките на обхват ± 20 % (въз основа на най-малко три проби от двете времеви точки)
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Предварителната аналитична работа върху хранителния режим с добавката следва да докаже висока степен на хомогенност на веществото в храната; най-малко три концентрации на проби от веществото, взети в началото на изпитването, трябва да не се отклоняват с повече от ± 15 % от средната стойност
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 В храната без добавка или в тъканите от контролните риби концентрации на изпитваното вещество не се откриват или присъстват единствено като следи, за разлика от третираните проби
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Смъртността или други неблагоприятни ефекти/болести в рибите както от контролната, така и от третираната група, следва да е по-малка от 10 % в края на изпитването; Ако изпитването се удължава на каквото и да е основание, неблагоприятните ефекти в двете групи са ≤ 5 % на месец и ≤ 30 % кумулативно. Значими различия в средния растеж между изпитваните и контролните групи, включени в пробовзетите риби, могат да са показател за токсично въздействие на изпитваното вещество.
                              
                           РЕФЕРЕНТНИ ВЕЩЕСТВА
                     Ако дадена лаборатория не е извършвала изследването преди това, или са направени съществени промени (например промяна на породата на рибите или доставчика, различни видове риби, значителна промяна в размера на рибите, в храна за риби или в метода за добавянето и др.), е целесъобразно да се проведе проучване на техническата компетентност, с използване на референтно вещество. Референтното вещество се използва най-вече за установяване дали техниката за добавяне в храната е подходяща, за да осигури максимална хомогенност и бионаличност на изпитваните вещества. Един пример, който се използва в случай на неполярни хидрофобни вещества, е хексахлоробензенът (HCB), но следва да бъдат взети предвид други вещества със съществуващи надеждни данни за поглъщането и биомултипликацията поради опасните свойства на HCB (63). Ако се използва основна информация за референтното вещество, тя трябва да се представи в протокола от изпитването, включително наименование, чистота, номер по CAS, структура, данни за токсичност (при наличност), както за изпитваните вещества (вж. точки 3 и 22).
                     ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
                     
                        Апаратура
                     
                     Материалите и апаратурата трябва да се използват както е описано в метода с експозиция по воден път (вж. точка 26). Трябва да бъде използвана проточна система или статична система за изпитване с обновяване, която да осигурява достатъчен обем вода за разреждане до съдовете за изпитване. Дебитите следва да се записват.
                     
                        Вода
                     
                     Трябва да се използва вода за изпитване, както е описано в метода с експозиция по воден път (вж. точки 27-29). Средата за изпитване следва да се характеризира, както е описано, и нейното качество трябва да остава постоянно по време на изпитването. Съдържанието на природни частици, а също и общият органичен въглерод трябва да са възможно най-ниски (≤ 5 mg/l твърди частици; ≤ 2 mg/l общ органичен въглерод) преди започване на изпитването. ТОС трябва да се измери само преди изпитването, като част от характеризирането на водата за изпитване (вж. точка 53).
                     
                        Хранителен режим
                     
                     Препоръчва се предлагана в търговската мрежа храна за риби (хранителен режим с плаващи и/или бавно потъващи пелети), която е характеризирана по отношение най-малко на съдържание на белтъци и на мазнини. Храната следва да е с еднакъв размер на пелетите, за да се повиши ефикасността на експозицията чрез фуража, т.е. рибата ще консумира повече от храната, вместо да консумира по-големите парчета и да пропуска по-малките. Пелетите следва да са подходящо оразмерени в съответствие с размерите на рибата в началото на изпитването (например може да се използват пелети с диаметър около 0,6-0,85 mm за риби с обща дължина между 3 и 7 cm, и 0,85-1,2 mm за риби с обща дължина между 6 и 12 cm). Размерите на пелетите могат да бъдат коригирани в зависимост от растежа на рибите в началото на фазата на очистване. Пример за подходящ състав на храната, доставяна от търговската мрежа, е даден в допълнение 7. При разработването на настоящия метод са били широко използвани хранителни режими за изпитване с общо липидно съдържание между 15 и 20 % (w/w). Храна за риби с толкова висока липидна концентрация може да не е налична в някои региони. В такива случаи изследванията могат да се проведат с по-ниска липидна концентрация в храната и при необходимост скоростта на хранене може да се коригира по подходящ начин за поддържане на здравето на рибите (въз основа на предварително изпитване). Общото съдържание на липиди в хранителния режим на изпитваната и на контролната група трябва да бъде измерено и записано преди началото на изпитването и в края на фазата на поглъщане. В протокола от изследването следва да бъдат представени подробни данни от доставчика на фуражи от търговската мрежа за анализа на хранителните елементи, влагата, влакнините и пепелното съдържание и, ако е възможно, минералите и пестицидните остатъци (напр. „стандартните“ приоритетни замърсители).
                     При добавянето на изпитваното вещество в храната следва да се положат всички възможни усилия, за да се гарантира хомогенност навсякъде в храната за изпитването. Концентрацията на изпитваното вещество в храната за групата за изпитване следва да се избира в зависимост от чувствителността на метода за анализ, токсичността на изпитваното вещество (NOEC, ако е известен) и относимите физични и химични данни. Ако се използва референтно вещество, за предпочитане е то да бъде включено в концентрация около 10 % от тази на изпитваното вещество (или във всеки случай толкова ниска, колкото е практически възможно), в зависимост от чувствителността на анализа (напр. за хексахлоробензена е приета за приемлива концентрация в храната от 1-100 μg/g; вж. (47) за повече информация относно ефикасността на усвояването на HCB).
                     Изпитваното вещество може да се добави към храна за риби по няколко начина, в зависимост от неговите физични характеристики и разтворимост (вж. допълнение 7 за повече подробности относно методите за добавяне):
                     
                                 —
                              
                              
                                 Ако е разтворимо и стабилно в триглицериди, веществото следва да се разтвори в малко количество рибно масло или хранително растително масло, преди да бъде смесено с храната за риби. В този случай трябва да се внимава да се избегне получаването на дажба с прекомерно високо съдържание на липиди, като се вземе предвид естественото съдържание на липиди във фуража с добавка, чрез добавяне на минимално известно количество масло, необходимо за достигане на разпределение и хомогенност на изпитваното вещество в храната, или;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Добавянето към храната следва да е с помощта на подходящ органичен разтворител, така че да не се компрометират хомогенността и бионаличността (възможно е в храната да се образуват (микро) кристали от изпитваното вещество, в резултат от изпаряване на разтворител, и няма лесен начин да се докаже, че това не се е случило; вж. (49)), или;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Невискозните течности следва да се добавят направо към храната за риби, но те трябва да бъдат добре смесени, за да се подпомогне хомогенността и да се улесни доброто усвояване. Техниката за смесване следва да гарантира хомогенността на фуража с добавката.
                              
                           В някои случаи, напр. при по-малко хидрофобни изпитвани вещества, за които има по-голяма вероятност за десорбция от храната, може да се окаже необходимо приготвените хранителни пелети да се покрият с малко количество царевично/рибено масло (вж. точка 142). В подобни случаи контролната храна трябва да се обработи по сходен начин, а за измерване на липидите следва да се използва крайният приготвен фураж.
                     Ако се използват резултатите за референтното вещество, те следва да бъдат сравними с данните от проучванията в литературата, извършвани при сходни условия, със сходна скорост на хранене (вж. точка 45), а специфичните за референтното вещество параметри следва да отговарят на относимите критерии в точка 113, (пунктове 3, 4 и 5).
                     Ако за носител се използва масло или носещ разтворител за изпитваното вещество, еквивалентно количество от същия носител (без изпитваното вещество) следва да се смеси с контролния хранителен режим с оглед да се поддържа еквивалентността с хранителния режим с добавка. Важно е, че както през фазата на поглъщане, така и при очистването, изпитваните и контролните групи следва да бъдат хранени с еквивалентни в хранително отношение хранителни режими.
                     Хранителният режим с добавка трябва да се съхранява при условия, които запазват стабилността на изпитваното вещество в рамките на фуражния микс (например с охлаждане), и тези условия се протоколират.
                     
                        Избор на видове риби
                     
                     могат да бъдат използвани видове риби, посочени при експозицията по воден път (вж. точка 32 и допълнение 3). Преди публикуването на настоящия МИ, в изследванията за биоакумулация на органични вещества чрез хранителния режим широко са използвани дъговата пъстърва (Oncorhynchus mykiss), шаранът (Cyprinus carpio) и Pimephales promelas. Изпитваният вид следва да имат поведение при хранене, което води до бърза консумация на приложената дажба храна, за да се гарантира, че всеки фактор, който влияе върху концентрацията на изпитваното вещество в храната (напр. просмукването във водата и възможността за експозиция по воден път), е сведен до минимум. Следва да бъдат използвани риби в рамките на препоръчания размер/тегло (вж. допълнение 3). Отделните риби следва да не са толкова малки, че да възпрепятстват лесното анализиране. Видовете, изпитвани по време на стадий от жизнения цикъл с бърз растеж, могат да усложнят тълкуването на данните, а високите скорости на растеж могат да окажат влияние върху изчисляването на ефикасността на усвояването (64).
                     
                        Отглеждане на рибата
                     
                     Преди започването на изпитването критериите за аклиматизацията, смъртността и допустимостта на заболявания са същите, както за метода с експозиция по воден път (вж. точки 33-35).
                     ПРОВЕЖДАНЕ НА ИЗПИТВАНЕТО
                     
                        Предварително изследване и изпитване за установяване на обхвата
                     
                     Аналитичната работа в предварителното изследване е необходима, за да се докаже аналитичен добив на веществото от храната с добавка/тъканта от риба с добавка. Изпитване за установяване на обхвата за избиране на подходяща концентрация в храната не е винаги необходимо. За доказване на отсъствието на неблагоприятни последици и за оценка на вкусовите качества на хранителния режим с добавка, на чувствителността на метода за анализ за рибната тъкан и храната, както и на подбора на подходящи скорост на хранене и интервали за пробовземане през фазата на очистване и др., могат да бъдат извършени предварителни опити с хранене, но те не са задължителни. Предварителното изследване може да бъде полезно за оценка на броя на рибите, необходими за вземане на проби по време на фазата на очистване. Това може да доведе до значително намаляване на броя на използваните риби, специално при изпитвани вещества, които са особено лесно метаболизиращи.
                     
                        Условия на експозиция
                     
                     
                        Продължителност на фазата на поглъщане
                     
                     Обикновено е достатъчна фаза на поглъщане с продължителност 7-14 дни, по време на която една група риби са хранени с контролен хранителен режим, а друга група риби са хранени с хранителен режим за изпитването ежедневно, при фиксирана дажба в зависимост от изпитвания вид и условията на опита, напр. между 1-2 % от теглото на тялото (мокро тегло) в случай на дъгова пъстърва. Скоростта на храненето следва да се избира така, че да се избягват бърз растеж и голямо увеличение на липидното съдържание. Ако е необходимо, фазата на поглъщане може да бъде удължена въз основа на практически опит от предходни изследвания или от познания за поглъщането/очистването на изпитваното вещество (или на аналога) в риби. Началото на изпитването се определя като моментът на първото подаване на храна с добавка. Денят от опита започва да тече от момента на хранене до малко преди момента на следващото хранене (например един час преди него). По този начин първият ден от опита за поглъщането започва от първото подаване на храна с добавка и приключва малко преди второто подаване на храна с добавка. На практика фазата на поглъщане приключва малко преди първото подаване на храна без добавено изпитвано вещество (например един час преди подаването), тъй като рибата ще продължи да смила храната с добавка и да абсорбира изпитваното вещество в междинните 24 часа. Важно е да се гарантира, че се достига натрупване на достатъчно високо (нетоксично) количество от изпитваното вещество в организма, предвид метода за анализ, така че по време на фазата на очистване да може да се измери спад поне с един порядък. В специални случаи може да се използва удължена фазата на поглъщане (до 28 дни), с допълнително вземане на проби, за опознаване на кинетиката на поглъщане. По време на поглъщането концентрацията в рибата може да не достигне стационарно състояние. Уравненията за изчисляване на времето за достигане на стационарно състояние като индикация за вероятната продължителност, необходима за постигане на значителни концентрации в рибите, могат да се прилагат тук така, както в изпитването с експозиция по воден път (вж. допълнение 5).
                     В някои случаи може да е известно, че поглъщането на веществото в рибата в рамките на 7-14 дни, поради недостатъчна аналитична чувствителност или поради ниска ефикасност на усвояването, ще се окаже недостатъчно, за да може използваната концентрация в храната да достигне концентрация в рибата, която да е достатъчно висока, за да се анализира спад от най-малко един порядък по време на очистването. В такива случаи може да е полезно да се увеличи продължителността на първоначалната фаза на хранене на повече от 14 дни или, особено за изключително лесно метаболизируеми вещества, следва да се разгледа по-висока концентрация в хранителния режим. Независимо от това трябва да се внимава погълнатото вещество в тялото по време на поглъщането да се запази под (оценката за) хроничната концентрация без наблюдаван ефект (NOEC) в рибната тъкан (вж. точка 138).
                     
                        Продължителност на фазата на очистването
                     
                     Очистването обикновено продължава до 28 дни, като започва след като на изпитваната група риби се подаде чиста, нетретирана храна след фазата на поглъщане. Очистването започва с първото подаване на храна без добавка, а не веднага след подаването на последната храна с добавка, тъй като рибата ще продължи да смила храната и да абсорбира изпитваното вещество в междинните 24 часа, както е посочено в точка126. Следователно първата проба при фазата на очистването се взема малко преди второто подаване на храна без добавка. Този период на очистване е планиран за откриване на вещества с потенциален период на полуразграждане до 14 дни, което съответства на периода при биоакумулиращи вещества (65), така че 28 дни включват два периода на полуразграждане на такива вещества. В случаите на много силно биоакумулиращи вещества може да е полезно да се удължи фазата на очистването (ако има признаци за това от предварителни изпитвания).
                     Ако едно вещество се очиства много бавно, така че не може да се определи точното време на полуразграждане при фазата на очистването, информацията може все пак да е достатъчна за целите на оценката като признак на висока степен на биоакумулация. И обратно, ако дадено вещество се очиства толкова бързо, че не могат да бъдат получени надеждни концентрация във времева точка нула (концентрация в края на поглъщането/началото на очистването, C
                        0,d) и k
                        2, може да се направи консервативна оценка за k
                        2 (вж. допълнение 7).
                     Ако анализите на рибите при по-ранните интервали (например 7 или 14 дни) показват, че веществото е очистено под равнищата на количествено определяне на нивата преди пълния 28-дневен период, тогава последващите пробовземания могат да се преустановят и изпитването може да бъде прекратено.
                     В малко случаи може да не се получи измеримо поглъщане на изпитваното вещество в края на периода на поглъщане (или при втората проба от очистването). Ако може да се докаже, че: i) критериите за валидност в точка 113 са изпълнени; и ii) отсъствието на поглъщане не се дължи на друг недостатък на изпитването (например продължителността на поглъщането не е достатъчна, недостатък в техниката за добавяне към храната, водещ до влошаване на бионаличността, липса на чувствителност на метода за анализ, риби, които не консумират храната и др.); може да е възможно изпитването да се прекрати, без да се налага повторното му стартиране с по-голям продължителност на поглъщането. Ако предварителната работа е показала, че е възможно случаят да е такъв, може да е препоръчително като част от подхода „масов баланс“, ако е възможно, да се извърши анализ на фекалиите за неразградено изпитвано вещество.
                     
                        Брой на изпитваните риби
                     
                     Подобно на изпитването с експозиция по воден път следва да бъдат избрани риби със сходно тегло и дължина, като най-малката риба е не по-малко от две трети от теглото на най-голямата (вж. точки 40-42).
                     Общият брой на рибите за проучването следва да бъде избран въз основа на графика за пробовземане (минимум една проба в края на фазата на поглъщане и четири до шест проби по време на фазата на очистване, но в зависимост от продължителността на фазите), като се отчита чувствителността на техниката за анализ, на концентрацията, която е вероятно да бъде постигната в края на фазата на поглъщане (въз основа на придобитите по-рано знания) и продължителността на очистването (ако придобитите по-рано знания позволяват оценка). Всеки път следва да бъдат пробовзети от пет до десет риби, с параметри на растежа (тегло и обща дължина), измервани преди извършването на химичен анализ или анализ на липиди.
                     Поради присъщото вариране в размера, скоростта на растеж и физиологията сред рибите, и вероятното вариране в количеството на подадената храна, която консумира всяка риба, следва да се пробовземат най-малко пет риби при всеки интервал от изпитваната група и пет от контролната група, за да се установи по адекватен начин средната концентрация и нейното вариране. Варирането между използваните риби вероятно ще допринесе повече за общото неконтролируемо вариране в изпитването, отколкото варирането, присъщо на използваните методики за анализ, и следователно обосновава използването на максимум до десет риби в точка за пробовземане в някои случаи. Независимо от това, ако в началото на очистването в контролните риби не са измерими фонови концентрации на изпитваното вещество, в последния интервал на пробовземане може да бъде достатъчен химичен анализ само на две-три контролни риби, при условие че останалите контролни риби във всички точки на пробовземане все пак се пробовземат за тегло и обща дължина (така че същият брой се пробовзема от изпитваните и от контролните групи за растеж). Рибите следва да се съхраняват, претеглени индивидуално (дори ако се окаже необходимо резултатите от пробата да се комбинират впоследствие) и с измерена обща дължина.
                     За стандартно изпитване, например с 28-дневна продължителност на очистване, включително пет пробовземания през очистването, това означава общо 59-120 риби от изпитваните и 50-110 риби от контролните групи, като се допуска, че техниката за анализ на веществото позволява анализът на липидното съдържание да се извършва върху същата риба. Ако анализът на липидното съдържание не може да бъде проведен върху същата риба, върху която е проведен химичният анализ, и ако използването на контролна риба само за анализ на липиди също не е осъществимо (вж. точка 56), ще се изискват допълнителни 15 риби (три от изходната популация в началото на изпитването, по три от всяка контролна и изпитвана група в началото на очистването и по три от всяка контролна и изпитвана група в края на опита). Пример за график за пробовземане с брой риби може да се намери в допълнение 4.
                     
                        Зареждане
                     
                     Трябва да се използват големи съотношения вода към риба, както е описано в метода с експозиция по воден път (вж. точки 43 и 44). Въпреки че скоростите на зареждане риба към вода не влияят върху концентрациите на експозиция в настоящото изпитване, препоръчва се скорост на зареждане от 0,1 до 1,0 g риба (мокро тегло) за литър вода на ден, за да се поддържат достатъчни концентрации на разтворения кислород и да се сведе до минимум стресът в изпитвания организъм.
                     
                        Хранителен режим за изпитването и хранене
                     
                     През периода на аклиматизация рибите следва да бъдат хранени с подходящ хранителен режим, както е описано по-горе (точка 117). Ако изпитването се провежда при проточни условия, потокът трябва да бъде спрян по време на храненето на рибите.
                     По време на изпитването хранителният режим за изпитваната група следва да се придържа към описания по-горе (точки 116-121). Изборът на прицелната концентрация на добавката следва да отчита вкусовите качества на храната (така че рибите да не избягват храната), в допълнение към разглеждането на специфичните за веществото фактори, аналитичната чувствителност, очакваната концентрация в хранителния режим при условия на околната среда и нивата на хроничната токсичност/погълнатото вещество в тялото. Номиналната концентрация на добавката на изпитваното вещество трябва да бъде документирана в протокола. Въз основа на опита, концентрации на добавка в обхвата 1-1 000 μg/g предоставят практичен работен обхват за изпитвани вещества, които не проявяват специфичен токсичен механизъм. За вещества, които действат чрез неспецифичен механизъм, нивата на остатъци в тъканите не трябва да превишават 5 μmol/g липиди, тъй като остатъците над това ниво вероятно предизвикват хроничните ефекти (19) (48) (50) (66). За други вещества трябва да се вземат мерки да няма неблагоприятни въздействия от натрупаната експозиция (вж. точка 127). Това се отнася особено за случаите, когато повече от едно от вещества се изпитват едновременно (вж. точка 112).
                     Подходящото количество изпитвано вещество може да се добави към храната за риби по един от три начина, както е описано в точка 119 и допълнение 7. Методите и процедурите за добавяне към фуража следва да бъдат документирани в протокола. Нетретираната храна се подава на контролните риби, като тя съдържа еквивалентно количество масло без добавка като носител, ако е използвано такова във фуража с добавка при фазата на поглъщане, или се обработва с „чист“ разтворител, ако за приготвянето на хранителния режим за изпитваната група като носител е използван разтворител. Третираните и нетретираните хранителни режими следва да бъдат измерени аналитично поне в три повторения за концентрация на изпитваното вещество преди началото на фазата на поглъщане и в края на тази фаза. След експозиция на третирания фураж (фаза на поглъщане), на рибите (и от двете групи) се подава нетретирана храна (фаза на очистване).
                     На рибите се подава фиксирана дажба (в зависимост от вида; например около 1-2 % от мокрото телесно тегло на ден в случай на дъгова пъстърва). Скоростта на храненето следва да се избира така, че да се избягват бърз растеж и голямо увеличение на липидното съдържание. Точната скорост на хранене, определена по време на опита, следва да бъде документирана. Първоначалното хранене следва да се основава на измерванията по график на теглото в изходната популация непосредствено преди началото на изпитването. Количеството фураж следва да се коригира въз основа на мокрото тегло на пробовзетите риби при всяко вземане на проби, за да се отчита растежът по време на опита. Теглото и дължините на рибите в съдовете за изпитване и контролните съдове могат да бъдат оценени въз основа на теглото и общите дължини на рибите, използвани при всяко вземане на проби; не се претеглят или измерват рибите, останали в съдовете за изпитване и контролните съдове. Важно е да се запази същата определена скорост на хранене по време на целия опит.
                     Храненето следва да се наблюдава, за да е сигурно, че рибите очевидно консумират цялото количество подадена храна с оглед да се гарантира, че в изчисленията се използват подходящите скорости на поглъщане. Предварителните опити с хранене или предходният опит следва да бъдат взети под внимание при избора на скорост на хранене, която ще гарантира, че се консумира цялото подавано веднъж дневно количество храна. В случай, че храната последователно се оставя неконсумирана, може да е препоръчително дозата да се разпредели върху допълнителен период на хранене във всеки ден от опита (напр. замяна на храненето веднъж дневно с хранене с половината количество два пъти дневно). Ако това е необходимо, второто хранене следва да се извършва в определено време и да е планирано така, че максималният възможен период от време да е преди пробовземане на риби (напр. времето за второто хранене се определя в рамките на първата половина от деня на опита).
                     Въпреки че като цяло рибите бързо консумират храната, важно е да се гарантира, че веществото остава адсорбирано върху храната. Следва да се положат усилия за избягване на диспергирането на изпитваното вещество във вода от храната, като по този начин рибата се експонира на действието на концентрации по воден път на изпитваното вещество, в допълнение към хранителния режим. Това може да се постигне чрез отстраняване на неконсумираната храна (и фекалии) от съдовете за изпитване и контролните съдове в рамките на един час след хранене, но за предпочитане в рамките на 30 минути. В допълнение, може да бъде използвана една система, в която водата се почиства редовно през филтър с активен въглен, за да се абсорбира евентуален „разтворен“ замърсител. Проточните системи могат да помогнат за бързо отмиване на хранителните частици и разтворените вещества (67). В някои случаи за разрешаването на този проблем може да помогне леко модифицирана техника за приготвяне на храни с добавка (вж. точка 119).
                     
                        Светлина и температура
                     
                     Както при метода с експозиция по воден път (вж. точка 48), препоръчва се от 12 до 16 часа излагане на светлина, а температурата (± 2 °C) трябва да е подходяща за изпитвания вид (срв. допълнение 3). Типът и характеристиките на осветлението трябва да са познати и да се документират.
                     
                        Контроли
                     
                     Следва да се използва една контролна група, като на рибите се подава същата дажба като на изпитваната група, но без изпитваното вещество във фуража. Ако за добавянето в храната на изпитваната група като носител е използвано масло или разтворител, храната на контролната група следва да се обработи по напълно идентичен начин, но в отсъствие на изпитваното вещество, така че хранителните режими на изпитваната група и контролната група да са еквивалентни (вж. точки 121 и 139).
                     
                        Честота на измерванията на качеството на водата
                     
                     Условията, описани в метода с експозиция по воден път, се прилага и тук, с изключение на това, че TOC трябва да се измери само преди изпитването като част от характеризирането на водата за изпитване (вж. точка 53).
                     
                        Пробовземане и анализ на рибата и хранителния режим
                     
                     
                        Анализ на проби хранителния режим
                     
                     Проби от хранителните режими за изпитване и от контролните хранителни режими следва да бъдат анализирани поне в три повторения за съдържание на изпитваното вещество и на липиди най-малко преди началото на фазата на поглъщане и в края на тази фаза. Методите на анализ и процедурите за осигуряване на хомогенност на хранителния режим трябва да бъдат включени в протокола.
                     Пробите следва да се анализират за изпитваното вещество чрез установения и валидиран метод. Следва да се проведе предварително изследване, за да се установи границата на количествено определяне, процент на аналитичен добив, преченията и аналитичното вариране в съответната матрична проба. Ако се изпитва изотопно белязан материал, следва да се разгледат съображения, подобни на тези при метода с експозиция по воден път, като анализът на водата се заменя с анализ на фуража (вж. точка 65).
                     
                        Анализ на риби
                     
                     При всяко пробовземане на риби се вземат 5-10 индивида от експонираните и контролните риби (в някои случаи броят на контролните риби може да бъде намален; вж. точка 134).
                     Пробовземанията следва да са по едно и също време за всеки ден от опита (по отношение на времето за хранене), и следва да бъдат планирани във времето така, че вероятността за останала в червата храна по време на фазата на поглъщане и началото на фазата на очистването да е сведена до минимум, за да се предотвратят недостоверните приноси към общите концентрации на изпитваното вещество (т.е. пробовзетите риби следва да бъдат отстранени в края на даден ден от опита, като се има предвид, че денят от опита започва с момента на хранене и приключва по време на следващото хранене, приблизително 24 часа по-късно. Очистването започва с първото хранене с храна без добавка; вж. точка 128). Първата проба от фазата на очистване (взета непосредствено преди второто хранене с храна без добавка) е важно, тъй като екстраполация обратно един ден от това измерване се използва, за да се изчисли концентрацията във времева точка нула (C
                        0,d, концентрацията в рибата в края на поглъщането/началото на очистването). Като вариант, стомашно-чревният тракт на рибата може да бъде отстранен и анализиран отделно в края на поглъщането и в дни 1 и 3 от очистването.
                     При всяко пробовземане рибите следва да бъдат отстранени от двата съда от изпитването и да се обработват по същия начин, както е описано в метода с експозиция по воден път (вж. точки 61-63).
                     Концентрациите на изпитваното вещество в цялата риба (мокро тегло) се измерват най-малко в края на фазата на поглъщане и по време на фазата на очистване както в контролните, така и в изпитваните групи. По време на фазата на очистване се препоръчват четири до шест точки за пробовземане (напр. 1, 3, 7, 14 и 28 дни). Като вариант може да бъде включена допълнителна точка за пробовземане след 1-3 дни поглъщане, за да се оцени ефикасността на усвояването от линейната фаза на поглъщане за рибата, докато все още е близо до началото на периода на експозиция. Съществуват две основни отклонения от графика: i) ако се използва удължена фаза на поглъщане за целите на проучването на кинетиката на поглъщането, ще има допълнителни точки за пробовземане по време на фазата на поглъщане и следователно ще е необходимо включването на допълнителни риби (вж. точка 126); ii) ако изпитването е било прекратено в края на фазата на поглъщане поради отсъствие на измеримо поглъщане (вж. точка 131). Отделните пробовзети риби следва да се претеглят (и да се измери тяхната обща дължина) за да се даде възможност да се определят константите на скоростта на растеж. Концентрациите на веществото в специфични тъкани от риби (ядивните и неядивните части) могат също да бъдат измерени в края на поглъщането и в избрани времена от очистването. Ако се изпитва изотопно белязан материал, следва да се разгледат съображения, подобни на тези при метода с експозиция по воден път, като анализът на водата се заменя с анализ на фуража (вж. точка 65).
                     При периодичното използване на референтно вещество (вж. точка 25) за предпочитане е концентрациите да се измерват в изпитваната група в края на поглъщането и във всички определени за изпитваното вещество (цяла риба) времена от очистването; концентрациите трябва се анализират само в контролната група в края на поглъщането (цяла риба). При определени обстоятелства (например ако техниките за анализ за изпитваното вещество и референтното вещество са несъвместими, така че да са необходими допълнителни риби, за да се следва графикът за пробовземане) може да се използва друг подход, както следва, за да се сведе до минимум броят на изискуемите допълнителни риби. Концентрациите на референтното вещество се измерват по време на очистването само през дни 1, 3 и две следващи точки на пробовземане, избрани така, че да могат да се направят надеждни оценки за концентрацията във времева точка нула (C
                        0,d) и за k
                        2 за референтното вещество.
                     Ако е възможно, липидното съдържание на отделните риби се определя при всяко пробовземане, или поне в началото и в края на фазата на поглъщане и в края на фазата на очистване. (вж. точки 56 и 67). В зависимост от метода за анализ (вж. точка 67 и допълнение 4), може да е възможно използването на една и съща риба както за съдържанието на липиди, така и за определяне на концентрацията на изпитваното вещество. Това се предпочита въз основа на свеждането до минимум на броя риби. Все пак, ако това не е възможно, може да бъде използван същият подход като описания в метода с експозиция по воден път (вж. точка 56 за тези алтернативни варианти за измерване на липидите). Методът, използван за количествено определяне на съдържанието на липиди, следва да бъде документиран в протокола.
                     
                        Качество на метода за анализ
                     
                     Следва да бъдат извършени опитни проверки, за да се гарантира специфичността, точността, прецизността и възпроизводимостта на специфичната за веществото техника за анализ, както и аналитичният добив на изпитваното вещество както от храната, така и от рибите.
                     
                        Измерване на растежа на рибите
                     
                     В началото на изпитването е необходимо да бъде претеглена проба от риби от изходната популация (и следва да бъде измерена тяхната обща дължина). Тези риби трябва да бъдат пробовзети малко време преди първото подаване на храна с добавка (напр. един час), и да се разпределят в опитен ден 0. Броят на рибите за тази проба следва да е поне същият като този за пробите по време на изпитването. Някои от тях могат да са същите риби, използвани за анализ на липиди преди началото на фазата на поглъщане (вж. точка 153). При всеки интервал на пробовземане рибите най-напред се претеглят и се измерва дължината им. Измереното тегло и дължината на всяка отделна риба следва да бъдат свързани с анализираната химична концентрация (и липидно съдържание, ако е приложимо), например с помощта на уникален идентификационен код за всяка пробовзета риба. Измерванията на тези риби могат да се използват за оценка на теглото и дължината на рибите, останали в изпитваните и контролните съдове.
                     
                        Оценка от опита
                     
                     Следва да се извършват и записват ежедневно наблюдения на смъртността. Следва да се извършват и записват допълнителни наблюдения за неблагоприятни ефекти, например за необичайно поведение или пигментация. Рибите се смятат за умрели, ако отсъстват дихателни движения и не се установява реакция при лек механичен стимул. Всички мъртви или очевидно намиращи се в терминално състояние риби следва да бъдат отстранени.
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Обработка на резултатите
                     
                     Резултатите от изпитването се използват за извеждане на константата за скорост на очистване (k
                        2) като функция на общото мокро тегло на рибата. Константата на скоростта на растежа, k
                        g, въз основа на средното увеличение на теглото на рибата, се изчислява и се използва за получаване на коригираната за растеж константа на скоростта на очистване, k
                        2g, ако това е целесъобразно. В допълнение следва да се протоколират ефикасността на усвояването (a; абсорбцията в червата), кинетичният коефициент на биомултипликация (BMFK) (при необходимост коригиран за растеж, BMFKg), неговата коригирана за липиди стойност (BMFKL или BMFKgL, ако е коригиран за понижаване на концентрацията в резултат от растеж) и скоростта на хранене. Също така, ако може да се направи оценка на времето за достигане на стационарно състояние по време на фазата на поглъщане (напр. 95 % от стационарното състояние или t
                        95 = 3,0/k
                        2), може да бъде включена оценка на BMF в стационарно състояние (BMFSS) (вж. точки 105 и 106 и допълнение 5), ако стойността на t
                        95 показва, че може да е било достигнато стационарно състояние. За този BMFSS следва да се прилага същата корекция за липиди като тази за кинетичния коефициент на биомултипликация (BMFK), за да се даде коригирана за липиди стойност, BMFSSL (следва да се отбележи, че не съществува приета процедура за корекция на BMF в стационарно състояние за понижаване на концентрацията в резултат от растеж). Формули и примерни изчисления са представени в допълнение 7. Налични са подходи, които правят възможно оценяването на кинетичния коефициент на биоконцентрация (BCFK) въз основа на данните, получени при изследването чрез хранителния режим. Този въпрос е разгледан в допълнение 8.
                     
                        Данни за теглото/обема на рибите
                     
                     Мокрото тегло и дължина на отделните риби за всички времеви периоди се представят в табличен вид отделно за изпитваните и за контролните групи за всички дни за пробовземане по време на фазата на поглъщане (изходната популация за началото на поглъщането; контролна група и изпитвана група за края на поглъщането и, ако се провеждат, фаза на поглъщане на ранен етап (напр. ден 1-3 от поглъщането) и фаза на очистване (например, ден 1, 2, 4, 7, 14, 28, за контролната и изпитваната група). Теглото е предпочитаният измерител за растежа за целите на корекцията за понижаване на концентрацията в резултат от растеж. Вж. по-долу (точки 162 и 163, и допълнение 5) за метода (методите), използван за коригиране на данните за понижаване на концентрацията в резултат от растеж.
                     
                        Данни за концентрацията на изпитваното вещество в рибите
                     
                     Измерванията за остатъци от изпитваното вещество в отделните риби (или в обединените рибни проби, ако не са възможни измервания в отделните риби), изразени в концентрация на мокро тегло (w/w), се представят в табличен вид за изпитваните и контролните риби за отделните времена на пробовземане. Ако е направен анализ на липиди за всяка отделна пробовзета риба, отделните коригирани за липиди концентрации, като липидната концентрация (w/w липиди), могат да бъдат получени и представени в табличен вид.
                     
                                 —
                              
                              
                                 Измерванията за остатъци от изпитваното вещество в отделните риби (или в обединените рибни проби, ако не са възможни измервания в отделните риби, вж. точка 66) за периода на очистване се преобразуват в естествени логаритми и се представят графично спрямо времето (деня). Ако при визуална проверка на графиката се наблюдават очевидни стойности, силно различаващи се от нормалните, може да се приложи статистически валиден тест за стойности, силно различаващи се от нормалните, с оглед отстраняване на недостоверни точки с данни, както и документирана обосновка за тяхното пропускане.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Изчислява се корелация с линеен метод на най-малките квадрати за данните за ln(концентрация) спрямо очистването (ден). Наклонът и пресечната точка на линията се протоколират като общата константа на скоростта на очистването (k
                                    2) и естествен логаритъм на получената концентрация във времева точка нула (C
                                    0,d) (вж. допълнения 5 и 7 за повече подробности). Ако това не е възможно, поради това че концентрациите попадат под границата на количествено определяне за втората проба от очистването, може да се направи консервативна оценка на k
                                    2 (вж. допълнение 7).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Стойностите на дисперсията за наклона и пресечната точка на линията се изчисляват с използване на стандартни статистически процедури и 90- (или 95-) процентните доверителни интервали около тези резултати се оценяват и представят.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Измерената средна концентрация в рибите за последния ден от поглъщането (измерена концентрация във времева точка нула, C
                                    0,m) също се изчислява и се сравнява с получената стойност C
                                    0,d. В случай, че получената стойност е по-ниска от измерената стойност, разликата може да предполага наличието на неразградена храна с добавка в червата. Ако получената стойност е много по-висока от измерената стойност, това може да бъде признак, че стойността, получена чрез линейна регресия от данните от пречистването, е погрешна и следва да се извърши повторна оценка (вж. допълнение 7).
                              
                           
                        Скорост на очистване и коефициент на биомултипликация
                     
                     За изчисляване на коефициента на биомултипликация от данните, първо трябва да бъде получена ефикасността на усвояването (абсорбция на изпитваното вещество в червата, α). За да се направи това, следва да бъде използвано уравнение A7.1 в допълнение 7, изискващо да бъдат известни получената концентрация в рибите във времева точка нула от фазата на очистване (C
                        0,d), (общата) константа на скоростта на очистване (k
                        2), концентрацията в храната (C
                        food), константата на скоростта на поглъщане на храна (I) и продължителността на периода на поглъщане (t). Наклонът и пресечната точка на линейната зависимост между ln(концентрация) и времето за очистване се протоколират като обща константа на скоростта на очистването (k
                        2 = наклон) и концентрация във времева точка нула (C
                        0,d = eintercept), както е посочено по-горе. Получените стойности трябва да бъдат проверени за достоверност от биологична гледна точка (напр. ефикасността на усвояването като част да е не по-голяма от 1). (I) се изчислява, като се раздели масата на храната на масата на рибите, на които ежедневно се подава храна (ако храната е била равна на 2 % от телесното тегло, (I) ще е 0,02). Независимо от това, може да се наложи скоростта на хранене, използвана при изчислението, да бъде коригирана за растеж на рибите (това може да се направи, като се използва известната константа на скоростта на растеж, за да се направи оценка на теглото на рибата при всяка времева точка по време на фазата на поглъщане; вж. допълнение 7). В случаите, когато k
                        2 и C
                        0,d не могат да бъдат получени, тъй като например концентрациите са под границата на откриване за втората проба от очистването, може да бъде направена консервативна оценка на k
                        2 и да се сложи „горна граница“ на BMFk (вж. допълнение 7).
                     След получаването на ефикасността на усвояването (α) може да се изчисли коефициентът на биомултипликация, като се умножи α по константата на скоростта на поглъщане (I) и се раздели на (общата) константа на скоростта на очистването (k
                        2). Коригираният за растеж коефициент на биомултипликация се изчислява по същия начин, но с използване на коригираната за растеж константа на скоростта на очистване (k
                        2g; вж. точки 162 и 163). Алтернативна оценка на ефикасността на усвояването може да бъде получена, ако анализът на тъканите е бил извършен върху риби, пробовзети в началния линеен етап от фазата на поглъщане; вж. точка 151 и допълнение 7). Тази стойност представлява независима оценка на ефикасността на усвояването за неекспониран като цяло организъм (т.е. рибите са близо до началото на фазата на поглъщане). Оценката на ефикасността на усвояването от данните за очистването обикновено се използва за получаване на BMF.
                     
                        Корекция за липиди и корекция за понижаване на концентрацията в резултат от растеж
                     
                     Растежът на рибите по време на фазата на очистване може да намали измерените химични концентрации в рибата, в резултат на което общата константа на скоростта на очистването (k2
                        ) е по-голяма, отколкото би била само поради процесите на отстраняване (напр. метаболизъм, дефекация) (вж. точка 72). Липидното съдържание на изпитваните риби (което е силно свързано с биоакумулацията на хидрофобни вещества) и липидното съдържание на храните може да варира достатъчно на практика, така че тяхното коригиране е необходимо, за да се представят по смислен начин коефициентите на биомултипликация. Коефициентът на биомултипликация следва да бъде коригиран за понижаване на концентрацията в резултат от растеж (като кинетичния BCF в метода с експозиция по воден път) и за липидно съдържание в храната по отношение на рибите (коефициент на корекция за липиди). Уравнения и примери за тези изчисления могат да бъдат намерени съответно в допълнения 5 и 7.
                     За коригирането на понижаването на концентрацията в резултат от растеж следва да бъде изчислена коригираната за растеж константа на скоростта на очистване (k
                        2g) (вж. допълнение 5 за уравнения). Тази коригирана за растеж константа на скоростта на очистване (k
                        2g) се използва за изчисляване на коригирания за растеж коефициент на биомултипликация, съгласно точка 73. В някои случаи този подход е невъзможен. Алтернативен подход, който заобикаля необходимостта от коригиране за понижаване на концентрацията в резултат от растеж, включва използване на масата на изпитваното вещество за риба (на база цяла риба) при очистването, вместо обичайната маса на изпитваното вещество за единица тегло на рибата (концентрация). Това може лесно да бъде постигнато, тъй като изпитванията по настоящия метод следва да свързват записаните тъканни концентрации с теглата на отделните риби. Обикновената процедурата за това е очертана в допълнение 5. Следва да се отбележи, че k
                        2 все пак следва да се оценява и протоколира, независимо че се използва този алтернативен подход.
                     С оглед да се извърши корекция за липидното съдържание в храната и рибите, когато не е извършен анализ на липидите във всички пробовзети риби, се извеждат средните липидни фракции (w/w) в рибите и в храната (68). След това коефициентът на корекция за липиди (Lc
                        ) се изчислява, като се раздели средната липидна фракция в рибите на средната липидна фракция в храната. Коефициентът на биомултипликация, независимо дали е коригиран за растеж или не, както е приложимо, се разделя на коефициента на корекция за липиди, за изчисляване на коригирания за липиди коефициент на биомултипликация.
                     Ако химичният анализ и анализът на липидите са проведени върху едни и същи риби във всяка точка на пробовземане, тогава данните от тъканите за корекцията за липиди за отделните риби могат да се използват за пряко изчисляване на коригирания за липиди BMF (вж. (37)). Графичното представяне на коригираните за липиди данни за концентрацията дава C
                        0,d на база липиди и k
                        2. След това математическият анализ може да продължи, като се използват същите уравнения в допълнение 7, но ефикасността на усвояването(a) се изчислява, като се използва нормализираната за липиди константа на скоростта на поглъщане на храна (I
                        lipid) и концентрацията в хранителния режим на база липиди (C
                        food-lipid). След това по подобен начин коригираните за липиди параметри се използват за изчисляване на BMF (следва да се отбележи, че за изчисление на коригирания за растеж и за липиди BMFKgL корекцията на константата на скоростта на растеж трябва също да се приложи към липидната фракция, а не към мокрото тегло на рибите.
                     
                        Тълкуване на резултатите
                     
                     Средният растеж както в изпитваните, така и в контролните групи следва по принцип да не се различава значимо, за да се изключат токсични ефекти. Константите на скоростта на растеж или кривите на растежа от двете групи следва да бъдат сравнени с подходяща процедура (69).
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     След завършване на изследването се изготвя окончателен протокол, съдържащ информацията за изпитваното вещество, изпитвания вид и условията на изпитване, както е посочено в точка 81 (като за метода с експозиция по воден път). Допълнително се изисква следната информация:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитвано вещество:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Всяка информация за устойчивостта на изпитваното вещество в приготвената храна;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Условия на изпитване:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Номинална концентрация на веществото в храната, техника на добавката, количество носител (липиди), използвано в процес на добавяне към храната (ако се използва такъв), измервания на концентрациите на изпитваното вещество в хранителния режим с добавка за всеки анализ (поне в три повторения преди началото на изследването и в края на поглъщането) и средни стойности;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Тип и качество на носещото масло или разтворител (чистота, доставчик и т.н.), използвани за добавяне към храната, ако се използват;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Използван тип храна (анализ на Weende (70), чистота или качество, доставчик и др.) и скорост на хранене по време на фазата на поглъщане, количество подадена храна и честота (включително всякакви корекции въз основа на теглото на пробовзетите риби);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Време, в което рибите са събрани и умъртвени за химичен анализ за всяка точка на пробовземане (напр. един час преди храненето на следващия ден);
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Резултати:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             резултати от всякакви извършени предварителни изследвания.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Информация за всички наблюдавани неблагоприятни ефекти;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Пълно описание на всички използвани процедури за химичен анализ, включително границите на откриване и на количествено определяне, варирането и аналитичния добив;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Измерените концентрации на липиди в храната (хранителен режим, с добавка и контролен), индивидуални, средни стойности и стандартни отклонения;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Представяне в табличен вид на данните за теглото (и дължината) на рибите, свързани с отделните риби както за контролните групи, така и за експонираните групи (например, като се използват уникални идентификатори за всяка риба) и изчисления, получена константа (константи) на скоростта на растежа и 95 % доверителен интервал;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Представяне в табличен вид на концентрацията на изпитваното вещество в рибата, измерена средна концентрация в края на поглъщането (C
                                                0,m), и получена (общата) константа на скоростта на очистването (k
                                                2) и концентрацията в рибата в началото на фазата на очистване (C
                                                0,d) заедно с дисперсиите на тези стойности (наклон и пресечна точка);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Представяне в табличен вид на данните за съдържанието на липиди в рибите (изброени спрямо специфичните концентрации на веществото, ако е приложимо), средни стойности за изпитвана група и контролата в началото на изпитването, края на поглъщането и края на очистването;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Криви (включително всички измерени данни), показващи следното (ако е приложимо, концентрациите могат да бъдат изразени по отношение на цялото тяло на животното или от определени негови тъкани):
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         растеж (т.е. дължина на рибата (и тегло) спрямо времето) или ln-трансформирано тегло спрямо времето;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         очистването на изпитваното вещество в рибата; както и
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ln-трансформирана концентрация (ln концентрация) спрямо времето за очистване (включително получената константа на скоростта на очистване k
                                                            2 и концентрацията в рибите в началото на фаза на очистването, получена от естествения логаритъм, C
                                                            0,d).
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Ако при визуална проверка на графика се наблюдават очевидни стойности, силно различаващи се от нормалните, може да се приложи статистически валиден тест за стойности, силно различаващи се от нормалните, с оглед отстраняване на недостоверни точки с данни, както и документирана обосновка за тяхното пропускане.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Изчислена коригирана за растеж константа на скоростта на очистване и коригиран за растеж период на полуразграждане.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Изчислена ефикасност на усвояването (α).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             „Суров“ BMF, коригиран за липиди и за понижаване на концентрацията в резултат от растеж, кинетичен BMF („суров“ и коригиран за липиди на база мокро тегло на цяла риба), тъканно-специфичен BMF, ако е приложимо.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Всякаква информация, отнасяща се до метаболити на изотопно белязано вещество и натрупването им.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Всичко необичайно относно изпитването, всяко отклонение от тези процедури и всякаква друга относима информация.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Обобщаваща таблица с относимите измерени и изчислени данни, както е по-долу:
                                             
                                                         Константи на скоростта на очистване на веществото и коефициенти на биомултипликация (BMFK)
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            g (константа на скоростта на растежа; ден– 1):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност (95 % CI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            2 (обща константа на скоростта на очистването, ден– 1):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност (95 % CI)
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            2g (коригирана за растеж константа на скоростта на очистване; ден– 1):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност (95 % CI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            0,m (измерена концентрация във времева точка нула, концентрацията в рибата в края на поглъщането) (μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            0,d (получена концентрация във времева точка нула, концентрацията във фазата на очистването; μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            I (определена скорост на поглъщане на фураж; g храна/g риба/ден):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            I
                                                            g (действителна скорост на подаване на храна, коригирана за растеж; g храна/g риба/ден) (72):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            food (концентрация на химикала в храната; μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            α (ефикасност на усвояването на веществото):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         BMFK (кинетичен BMF чрез хранителния режим):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност (95 % CI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         BMFKg (коригиран за растеж кинетичен BMF чрез хранителния режим):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност (95 % CI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            t
                                                            1/2g (коригиран за растеж период на полуразграждане в дни):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            Lc (коефициент на корекция за липиди):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност
                                                      
                                                   
                                                         BMFKgL (коригиран за растеж и за липиди кинетичен BMF):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност
                                                      
                                                   
                                                         BMFSS-L (ориентировъчен коригиран за липиди BMF в стационарно състояние) (72):
                                                      
                                                      
                                                         Въвежда се стойност ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                       
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Глава В.13 от настоящото приложение, Биоконцентрация: проточен тест върху риби.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Глава А.6 от настоящото приложение, Разтворимост във вода
                                 
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Li A, Doucette W.J. (1993), The effect of cosolutes on the aqueous solubilities and octanol/water partition coefficients of selected polychlorinated biphenyl congeners. Environ Toxicol Chem 12: 2031-2035
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Глава А.8 от настоящото приложение, Коефициент на разпределение (n-октанол/вода): метод „разклащане в стъкленица“.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Глава А.24 от настоящото приложение, Коефициент на разпределение (n-октанол/вода): метод с ВЕТХ.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Глава А.23 от настоящото приложение, Коефициент на разпределение (n-октанол/вода): метод на бавно разбъркване.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Глава В.7 от настоящото приложение, Хидролиза като функция от pH.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 (OECD (1997), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment Number 7: Guidance Document on Direct Phototransformation of Chemicals in Water OCDE/GD(97)21. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Глава А.5 от настоящото приложение, Повърхностно напрежение на водни разтвори.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Глава А.4 от настоящото приложение, Налягане на парите.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Глава В.4 от настоящото приложение, Пряка биологична разградимост.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Глава В.29 от настоящото приложение, Лесна биоразградимост — CO2 в запечатани съдове
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Connell D.W. (1988), Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102: 117-156.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993), Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR QSAR Environ. Res. 1: 29-39.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 OECD (2011), QSAR Toolbox 2.1. February 2011. Available from: http://www.oecd.org/document/54/0,3746,en_2649_34379_42923638_1_1_1_1,00.html.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Brown R.S., Akhtar P., Åkerman J., Hampel L., Kozin I.S., Villerius L.A. and Klamer H.J.C. (2001), Partition controlled delivery of hydrophobic substances in toxicity tests using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) films. Environ. Sci. Technol. 35: 4097-4102.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Fernandez J.D., Denny J.S. and Tietge J.E. (1998), A simple apparatus for administering 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin to commercially available pelletized fish food. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2058-2062.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Nichols J.W., Fitzsimmons P.N., Whiteman F.W. and Dawson T.D. (2004), A physiologically based toxicokinetic model for dietary uptake of hydrophobic organic compounds by fish: I. Feeding studies with 2,2′, 5,5′-tetrachlorobiphenyl. Toxicol. Sci. 77: 206-218.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Parkerton T.F., Arnot J.A., Weisbrod A.V., Russom C., Hoke R.A., Woodburn K., Traas T., Bonnell M., Burkhard L.P. and Lampi M.A. (2008), Guidance for evaluating in vivo fish bioaccumulation data. Integr. Environ. Assess. Manag. 4: 139-155.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Verbruggen E.M.J., Beek M., Pijnenburg J. and Traas T.P. (2008). Ecotoxicological environmental risk limits for total petroleum hydrocarbons on the basis of internal lipid concentrations. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2436-2448.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Schlechtriem C., Fliedner A. and Schäfers C. (2012), Determination of lipid content in fish samples from bioaccumulation studies: Contributions to the revision of OECD Test Guideline 305. Environmental Sciences Europe 2012, 24:13. published: 3 April 2012.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Глава В.47 от настоящото приложение, Риби, Изпитване за токсичност на ранни етапи от жизнения цикъл.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Глава В.15 от настоящото приложение, Риби, Краткосрочно изпитване за токсичност в стадии ембриони и ларви
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Глава В.14 от настоящото приложение, Изпитване за растеж на ювенилни (полово незрели) риби.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 OECD (2000), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 23: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures ENV/JM/MONO(2000)6. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 US-EPA (1994), Great Lake water quality initiative technical support document for the procedure to determine bioaccumulation factors 822-R-94-002. US EPA, Office of Water, Office of Science and Technology, Washington, DC, USA.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 US-FDA (1999), Pesticide analytical manual (PAM). Vol.1. US Food and Drug Administration, Rockville, MD, USA.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 US-EPA (1974), Section 5, A (1) Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson, J.F., Editor. US-EPA, Research Triangle Park, NC, USA
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Bligh E.G. and Dyer W.J. (1959), A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Gardner W.S., Frez W.A., Cichocki E.A. and Parrish C.C. (1985), Micromethod for lipids in aquatic invertebrates. Limnol. Oceanogr. 30: 1099-1105.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Smedes F. (1999), Determination of total lipid using non-chlorinated solvents. Analyst. 124: 1711-1718.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 OECD (2006), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 54: Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application. ENV/JM/MONO(2006)18. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Springer T.A., Guiney P.D., Krueger H.O. and Jaber M.J. (2008), Assessment of an approach to estimating aquatic bioconcentration factors using reduced sampling. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2271-2280.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Springer T.A. (2009), Statistical Research Related to Update of OECD Guideline 305. Wildlife International, Ltd, Easton, MD, USA.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Arnot J.A., Meylan W., Tunkel J., Howard P.H., Mackay D., Bonnell M. and Boethling R.S. (2009), A quantitative structure-activity relationship for predicting metabolic biotransformation rates for organic chemicals in fish. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1168-1177.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Parkerton T., Letinski D., Febbo E., Davi R., Dzambia C., Connelly M., Christensen K. and Peterson D. (2001), A practical testing approach for assessing bioaccumulation potential of poorly water soluble organic chemicals (presentation). in SETAC Europe 12th Annual Meeting: Madrid, Spain.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Fisk A.T., Cymbalisty C.D., Bergman Ã. and Muir D.C.G. (1996), Dietary accumulation of C12- and C16-chlorinated alkanes by juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Environ. Toxicol. Chem. 15: 1775-1782.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Anonymous (2004), Fish, dietary bioaccumulation study — Basic protocol, document submitted to the TC-NES WG on PBT.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Anonymous (2004), Background document to the fish dietary study protocol, document submitted to the TC-NES WG on PBT.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Bruggeman W.A., Opperhuizen A., Wijbenga A. and Hutzinger O. (1984), Bioaccumulation of super-lipophilic chemicals in fish, Toxicol. Environ. Chem. 7: 173-189.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Muir D.C.G., Marshall W.K. and Webster G.R.B. (1985), Bioconcentration of PCDDs by fish: effects of molecular structure and water chemistry. Chemosphere. 14: 829-833.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Thomann R.V. (1989), Bioaccumulation model of organic chemical distribution in aquatic food chains. Environ. Sci. Technol. 23: 699-707.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 Nichols J.W., Fitzsimmons P.N. and Whiteman F.W. (2004), A physiologically based toxicokinetic model for dietary uptake of hydrophobic organic compounds by fish: II. Stimulation of chronic exposure scenarios. Toxicol. Sci. 77: 219-229.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Gobas F.A.P.C., de Wolf W., Burkhard L.P., Verbruggen E. and Plotzke K. (2009), Revisiting bioaccumulation criteria for POPs and PBT assessments. Integr. Environ. Assess. Manag. 5: 624-637.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Sijm D.T.H.M. and van der Linde A. (1995), Size-dependent bioconcentration kinetics of hydrophobic organic chemicals in fish based on diffusive mass transfer and allometric relationships. Environ. Sci. Technol. 29: 2769-2777.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Fisk A.T., Norstrom R.J., Cymbalisty C.D. and Muir D.G.G. (1998), Dietary accumulation and depuration of hydrophobic organochlorines: Bioaccumulation parameters and their relationship with the octanol/water partition coefficient. Environ. Toxicol. Chem. 17: 951-961.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 McGrath J.A., Parkerton T.F. and Di Toro D.M. (2004), Application of the narcosis target lipid model to algal toxicity and deriving predicted-no-effect concentrations. Environ. Toxicol. Chem. 23: 2503-2517.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Poppendieck D.G. (2002), Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Desorption Mechanisms from Manufactured Gas Plant Site Samples. Dissertation. Department of Civil, Architectural and Environmental Engineering, University of Texas, Austin, TX, USA.
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 McCarty L.S. and Mackay D. (1993), Enhancing ecotoxicological modelling and assessment: body residues and modes of toxic action. Environ. Sci. Technol. 27: 1718-1728.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 OECD (2012), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 175: Part I — Validation Report of a ring test for the OECD TG 305 dietary exposure bioaccumulation fish test. Part II — Additional Report including comparative analysis of trout and carp results ENV/JM/MONO(2012)20. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕРНИ ЕДИНИЦИ
                        
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Ефикасността на усвояването (α) е измерител за относителното количество вещество, абсорбирано от червата в организма (α е безразмерна, но често се изразява като процент, а не като фракция).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Биоакумулацията обикновено се определя като процес, в който концентрацията на веществото в организма достига ниво, което надвишава тази в дихателната среда (напр. вода за дадена риба или въздух за даден бозайник), хранителния режим, или и двете (1).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Биоконцентрацията е увеличението в концентрацията на изпитваното вещество във или върху организъм (или определени негови тъкани), отнесено към концентрацията на изпитваното вещество в заобикалящата среда.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Коефициентът на биоконцентрация (BCF или K
                                       B) по всяко време от фазата на поглъщане в това изпитване за акумулация е концентрацията на изпитваното вещество във/върху рибата или определени нейни тъкани (C
                                       f като mg/kg), разделена на концентрацията на веществото в заобикалящата среда (C
                                       w като mg/l). BCF се изразява в l·kg– 1. Следва да се има предвид, че корекциите за растеж и/или стандартното съдържание на липиди не се отчитат.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Биомултипликацията е увеличението в концентрацията на изпитваното вещество във или върху организъм (или определени негови тъкани), отнесено към концентрацията на изпитваното вещество в храната.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Коефициентът на биомултипликация (BMF) представлява концентрацията на дадено вещество в хищник, отнесено към концентрацията в плячката на хищника (или в храната) при стационарно състояние. В метода, описан в настоящия метод за изпитване, експозицията във водна фаза внимателно се избягва и следователно стойността на BMF от настоящия метод за изпитване не може да бъде пряко сравнявана със стойност на BMF от проучване на място (в което може да се комбинират експозиция както по воден път, така и чрез хранителния режим).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Коефициентът на биомултипликация от експозиция чрез хранителния режим (BMF чрез хранителния режим) е термин, използван в настоящия метод за изпитване за описване на резултата от експозиция чрез хранителния режим, при която внимателно се избягва експозиция във водна фаза и следователно BMF чрез хранителния режим от настоящия метод за изпитване не може да бъде пряко сравняван със стойност на BMF от проучване на място (в което може да се комбинират експозиция както по воден път, така и чрез хранителния режим).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Фазата на очистването, или след излагането (загуба) е времето, което следва след прехвърлянето на изпитваните риби от среда, съдържаща изпитвано вещество, към среда, в която отсъства такова вещество, през което време се изследва очистването (или нетната загуба) на веществото от изпитваните риби (или определени техни тъкани).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Константата на скоростта на очистването (загубата) (k
                                       2) е числената стойност, определяща скоростта на намаляване на концентрацията на изпитваното вещество в изпитваната риба (или определени нейни тъкани), след прехвърлянето на изпитваната риба от среда, съдържаща изпитваното вещество, към среда, несъдържаща такова вещество (k
                                       2 се изразява в ден– 1).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Разтворен органичен въглерод (DOC) е измерител за концентрацията на въглерод с произход от разтворени органични източници в средата за изпитване.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Фазата на експозиция или фазата на поглъщане е времето, през което рибите са изложени на въздействието на изпитваното вещество.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Скоростта на поглъщане на храна (I) е средната стойност на храната, консумирана от всяка риба всеки ден, спрямо оценката за средното тегло на цялото тяло на рибата (изразено в g храна/g риба/ден).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Кинетичният коефициент на биоконцентрация (BCFK) е отношението на константата на скоростта на поглъщане, k
                                       1, към константата на скоростта на очистване, k
                                       2 (т.е. k
                                       1/k
                                       2 — вж. съответните определения в настоящото допълнение). По принцип стойността следва да бъде сравнима със BCFSS (вж. определението по-горе), но може да има отклонения, ако стационарното състояние е било несигурно или ако са били приложени корекции за растеж спрямо кинетичния BCF.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Кинетичният коефициент на биоконцентрация с нормализация за липиди (BCFKL) се нормализира към риба с 5 % съдържание на липиди.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Коригираният за растеж кинетичен коефициент на биоконцентрация с нормализация за липиди (BCFKgL) се нормализира към риба с 5 % съдържание на липиди и се коригира за растеж по време на периода на изследване, както е описано в допълнение 5.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Коефициентът на биоконцентрация в стационарно състояние с нормализация за липиди (BCFSSL) се нормализира към риба с 5 % съдържание на липиди.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Вещество с повече съставки за целите на REACH се определя като вещество, което има повече от една основна съставка в концентрация между 10 % и 80 % (w/w).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Коефициентът на разпределение октанол-вода (K
                                       OW) е съотношението на разтворимостта на веществото в n-октанол и вода при достигнато равновесие (Методи А.8 (2), А.24 (3), А.23 (4)); понякога изразяван също като P
                                       OW. Логаритъмът от K
                                       OW се използва като индикация за потенциала на веществото за биоконцентрация при водни организми.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Органичният въглерод под формата на твърди частици (POC) е измерител за концентрацията на въглерода с произход от суспендирани органични източници в средата за изпитване.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Твърдофазната микроекстракция (SPME) е техника за анализ без разтворител, разработен за разредени системи. При този метод влакна с полимерно покритие се експонират на газова или течна фаза, съдържаща представляващия интерес аналит. Като цяло се налага минимално време за анализ, така че да се достигне равновесие между твърдата и течната фаза, по отношение на измервания животински вид. Впоследствие концентрацията на представляващия интерес аналит може да бъде определена пряко от влакната или след извличането му от влакната в разтворител, в зависимост от техниката на определяне.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Стационарното състояние се достига на графиката на изпитваното вещество в рибата (C
                                       f) спрямо времето, когато кривата стане успоредна на времевата ос и три последователни анализа на C
                                       f направени върху проби, взети на интервали от поне два дни, не се отличават с повече от ± 20 % един от друг, и няма значимо увеличение на C
                                       f във времето между първия и последния от последователните анализи. Когато се анализират обединени проби, са необходими поне четири успешни анализа. За изпитвани вещества, които се усвояват бавно, е по-подходящо интервалите да бъдат по седем дни.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Коефициентът на биоконцентрация в стационарно състояние (BCFSS) не се променя значимо за дълъг период от време, като концентрацията на изпитваното вещество в заобикалящата среда през този период е постоянна (вж. определението за стационарно състояние).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Общият органичен въглерод (TOC) е измерител за концентрацията на въглерода с произход от всички органични източници в средата за изпитване, включително твърди частици и разтворени източници.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Константата на скоростта на поглъщане (k
                                       1) е числената стойност, определяща скоростта на нарастване на концентрацията на изпитваното вещество във/върху рибите, подложени на изпитване (или определени техни тъкани), когато рибите са експонирани на това вещество (k
                                       1 се изразява в l kg– 1 ден– 1).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Веществата с непознат или променлив състав, сложните продукти от реакции или биологичните материали са познати като UVCB.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Химикал означава вещество или смес.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Изпитван химикал е всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                                 
                              LITERATURE
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Gobas F.A.P.C., de Wolf W., Burkhard L.P., Verbruggen E. and Plotzke K. (2009), Revisiting bioaccumulation criteria for POPs and PBT assessments. Integr. Environ. Assess. Manag. 5: 624-637.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Глава А.8 от настоящото приложение, Коефициент на разпределение (n-октанол/вода): метод „разклащане в стъкленица“
                                    
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Глава А.24 от настоящото приложение, Коефициент на разпределение (n-октанол/вода): метод с ВЕТХ.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Глава А.23 от настоящото приложение, Коефициент на разпределение (n-октанол/вода): метод на бавно разбъркване.
                                 
                              
                     
                        Допълнение 2
                        
                           НЯКОИ ХИМИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПРИЕМЛИВА ВОДА ЗА РАЗРЕЖДАНЕ
                        
                        
                                    Компонент
                                 
                                 
                                    Гранична концентрация
                                 
                              
                                    Твърди частици
                                 
                                 
                                    5 mg/l
                                 
                              
                                    Общ органичен въглерод
                                 
                                 
                                    2 mg/l
                                 
                              
                                    Нейонизиран амоняк
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Остатъчен хлор
                                 
                                 
                                    10 μg/l
                                 
                              
                                    Общо органофосфорни пестициди
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Общо органохлорни пестициди плюс полихлорирани бифенили
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Общ органичен хлор
                                 
                                 
                                    25 ng/l
                                 
                              
                                    Алуминий
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Арсен
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Хром
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Кобалт
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Мед
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Желязо
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Олово
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Никел
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Цинк
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Кадмий
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Живак
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Сребро
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                     
                        Допълнение 3
                        
                           ВИДОВЕ РИБИ, КОИТО СЕ ПРЕПОРЪЧВАТ ЗА ИЗПИТВАНЕ
                        
                        
                                    Препоръчани видове
                                 
                                 
                                    Препоръчван обхват от температури за изпитване (°C)
                                 
                                 
                                    Препоръчвана обща дължина на изпитваното животно (cm) (74)
                                    
                                 
                              
                                    Danio rerio (73)
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    Риба зебра (Hamilton-Buchanan)
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    3,0 ± 0,5
                                 
                              
                                    
                                       Pimephales promelas
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Rafinesque) Pimephales promelas
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    5,0 ± 2,0
                                 
                              
                                    
                                       Cyprinus carpio
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Linnaeus) Шаран
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    8,0 ± 4,0 (75)
                                    
                                 
                              
                                    
                                       Oryzias latipes
                                    
                                    (Teleostei, Poecilliidae)
                                    (Temminck and Schlegel) Японска оризия
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    4,0 ± 1,0
                                 
                              
                                    
                                       Poecilia reticulata
                                    
                                    (Teleostei, Poeciliidae)
                                    (Peters) Гупи
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    3,0 ± 1,0
                                 
                              
                                    
                                       Lepomis macrochirus
                                    
                                    (Teleostei Centrarchidae)
                                    (Rafinesque) Слънчева риба
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    5,0 ± 2,0
                                 
                              
                                    
                                       Oncorhynchus mykiss
                                    
                                    (Teleostei Salmonidae)
                                    (Walbaum) Дъгова пъстърва
                                 
                                 
                                    13 – 17
                                 
                                 
                                    8,0 ± 4,0
                                 
                              
                                    
                                       Gasterosteus aculeatus
                                    
                                    (Teleostei, (Gasterosteidae)
                                    (Linnaeus) Триигла бодливка
                                 
                                 
                                    18 – 20
                                 
                                 
                                    3,0 ± 1,0
                                 
                              
                           Различни естуарни и морски видове са били използвани в по-малка степен, например:
                        
                        
                                    Петнист крокър
                                 
                                 
                                    (Leiostomus xanthurus)
                                 
                              
                                    Cyprinodon variegatus
                                 
                                 
                                    (Cyprinodon variegatus)
                                 
                              
                                    Атерина
                                 
                                 
                                    (Menidia beryllina)
                                 
                              
                                    Cymatogaster aggregata
                                 
                                 
                                    (Cymatogaster aggregata)
                                 
                              
                                    Морски език
                                 
                                 
                                    (Parophrys vetulus)
                                 
                              
                                    Leptocottus armatus
                                 
                                 
                                    (Leptocottus armatus)
                                 
                              
                                    Триигла бодливка
                                 
                                 
                                    (Gasterosteus aculeatus)
                                 
                              
                                    Лавpак
                                 
                                 
                                    (Dicentracus labrax)
                                 
                              
                                    Уклей
                                 
                                 
                                    (Alburnus alburnus)
                                 
                              Пресноводните риби, изброени в горната таблица, са лесни за отглеждане и/или са широко достъпни през цялата година, докато наличността на морските и естуарните видове е частично ограничено до съответните страни. Тези риби могат да бъдат развъждани и култивирани било в рибни ферми или лабораторно, при условия на контрол върху болести и паразити, така че тестовите животни да са здрави и с познат произход. Тези риби се намират в много части на света.
                        ЛИТЕРАТУРА
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Meyer A., Biermann C.H. and Orti G. (1993), The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: An invitation to the comparative method Proc. R. Soc. Lond. B. 252: 231-236.
                                 
                              
                     
                        Допълнение 4
                        
                           ГРАФИЦИ ЗА ПРОБОВЗЕМАНЕ ЗА ИЗПИТВАНИЯ С ЕКСПОЗИЦИИ ПО ВОДЕН ПЪТ И ЧРЕЗ ХРАНИТЕЛНИЯ РЕЖИМ
                        
                        1.   Теоретичен пример за график за пробовземане за цялостно изпитване на биоконцентрация с експозиция по воден път за вещество с log KOW = 4.
                        
                        
                                    Пробовземане на риби
                                 
                                 
                                    Времеви график за пробовземане
                                 
                                 
                                    Брой на пробите вода (76)
                                    
                                 
                                 
                                    Брой на рибите за проба (76)
                                    
                                 
                              
                                    Минимална изисквана честота (дни) (77)
                                    
                                 
                                 
                                    Допълнително пробовземане (дни) (77)
                                    
                                 
                              
                                    Фаза на поглъщане
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    – 1
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2 (78)
                                    
                                 
                                 
                                    4 (79)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2)
                                 
                                 
                                    (3 (81))
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    0,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    0,4
                                 
                                 
                                    2)
                                 
                                 
                                    4)
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    0,6
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    0,9
                                 
                                 
                                    2)
                                 
                                 
                                    4)
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    1,2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    1,7
                                 
                                 
                                    2)
                                 
                                 
                                    4)
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    2,4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    3,3
                                 
                                 
                                    2)
                                 
                                 
                                    4)
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    4,7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4 – 8 (80)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (3 (81))
                                 
                              
                                    Фаза на очистване
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Рибите се прехвърлят във вода без изпитваното вещество
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    5,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    4)
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    5,9
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    7,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    4)
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                    9,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    11,2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    4)
                                 
                              
                                    10
                                 
                                 
                                    14,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4 – 8 (80)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    17,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4 + 3 (81))
                                 
                              
                                    ОБЩО
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    40 – 72
                                    (48 – 80) (80)
                                    
                                 
                              2.   Теоретичен пример за график за пробовземане за изпитване за биоакумулация с експозиция чрез хранителния режим за вещество след фаза на поглъщане от 10 дни и фаза на очистване от 42 дни.
                        
                        
                                    Пробовземане
                                 
                                 
                                    Времеви график за пробовземане
                                 
                                 
                                    Брой проби от храна
                                 
                                 
                                    Брой на рибите за проба
                                 
                              
                                    Ден от фаза
                                 
                                 
                                    Допълнителни рибни проби?
                                 
                                 
                                    Изпитвана група
                                 
                                 
                                    Контролна група
                                 
                              
                                    Фаза на поглъщане
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    Възможно (82)
                                        (83)
                                    
                                 
                                 
                                    3 — изпитвана група
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    3 — контролна група (82)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (8 – 13) (83)
                                    
                                 
                              
                                    1A (84)
                                    
                                 
                                 
                                    1-3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    Да (85)
                                    
                                 
                                 
                                    3 — изпитвана група
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    3 — контролна група (82)
                                    
                                 
                                 
                                    (13 – 18) (86)
                                    
                                 
                                 
                                    (8 – 13) (86)
                                    
                                 
                              
                                    Фаза на очистване
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    Да (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    Да (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    28
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                    42
                                 
                                 
                                    Да (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                    (13 – 18) (86)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                    (8 – 13) (86)
                                    
                                 
                              
                                    ОБЩО
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    59 – 120
                                    (63 – 126) (85)
                                        (86)
                                    
                                 
                                 
                                    50 – 110
                                    (56 – 116) (85)
                                        (86)
                                    
                                 
                              
                           Забележка относно времето за фазите и пробовземанията: Фазата на поглъщане започва с първото подаване на храна с хранителен режим с добавка. За ден от опита се смята от дадено подаване на храна до малко преди следващото подаване на храна, 24 часа по-късно. Първото пробовземане (1 в таблицата) следва да се извърши малко преди първото подаване на храна (например, един час). Пробовземането по време на изследването следва в идеалния случай да се извършва малко преди подаването на храна на следващия ден (т.е. около 23 часа след последното подаване на храна). Фазата на поглъщане приключва малко преди първото подаване на храна с хранителен режим без добавка, когато започва фазата на очистването рибата (изпитвана група риби вероятно все още смилат фуража с добавка през междинните 24 часа след последното подаване на храна с хранителен режим с добавка). Това означава, че пробата в края на поглъщането следва да се вземе малко преди първото подаване на храна с хранителен режим без добавка, а първата проба от фазата на очистването следва да се вземе около 23 часа след първото подаване на храна с хранителен режим без добавка.
                     
                     
                        Допълнение 5
                        
                           ОБЩИ ИЗЧИСЛЕНИЯ
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Въведение
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Прогнозна оценка за продължителността на фазата на поглъщане
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Прогнозна оценка за продължителността на фазата на очистване
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Последователен метод: определяне на константата на скоростта на очистване (загуба) k
                                       2
                                    
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Последователен метод: определяне на константата на скоростта на поглъщане k1 (само за метода с експозиция по воден път)
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Едновременен метод за изчисляване на константите на скоростта на поглъщане и очистване (загуба) (само за метода с експозиция по воден път)
                                 
                              
                                 
                                    7.
                                 
                                 
                                    Корекцията за понижаване на концентрацията в резултат от растеж за кинетичния BCF и BMF
                                 
                              
                                 
                                    8.
                                 
                                 
                                    Нормализация за липиди към 5 % съдържание на липиди (само за метода с експозиция по воден път)
                                 
                              1.   ВЪВЕДЕНИЕ
                        Общия модел на биоакумулацията по воден път в риби може да се опише по отношение на процесите на поглъщане и на загуба, като се игнорира поглъщането с храната. Диференциалното уравнение (dC
                           f/dt), описващо скоростта на промяна в концентрацията в рибата (mg·kg– 1 · ден– 1) се получава по (1):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.1]
                                 
                              където:
                        
                                    
                                       k
                                       1
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Константа на скоростта на поглъщане в рибата от първи порядък (l·kg– 1·ден– 1).
                                 
                              
                                    
                                       k
                                       2
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Константа на скоростта на очистване от рибата от първи порядък (ден– 1).
                                 
                              
                                    
                                       kg
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Константа на скоростта на растеж на рибата от първи порядък („понижаване на концентрацията в резултат от растеж“) (ден– 1).
                                 
                              
                                    
                                       km
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Константа на скоростта на метаболитна трансформация от първи порядък (ден– 1).
                                 
                              
                                    
                                       ke
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Константа на скоростта на елиминиране чрез дефекация от първи порядък (day– 1).
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       w
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Концентрация във вода (mg · l– 1).
                                 
                              
                                    
                                       Cf
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Концентрация в риба (mg · kg– 1 мокро тегло).
                                 
                              За биоакумулиращи вещества може да се очаква, че средно претеглената във времето (TWA) е най-относимата концентрацията при експозиция във водата (Cw
                           ) в рамките на позволения обхват на колебания (вж. точка 24). Препоръчително е да се изчисли средно претеглената във времето концентрация във вода, съгласно процедурата в допълнение 6 от метод за изпитване В.20 (2). Следва да се отбележи, че ln-трансформацията на концентрацията във вода е подходяща, когато се очаква експоненциално намаляване между периодите на обновяване, напр. при планиране на полустатично изпитване. При проточна система ln-трансформация на концентрациите на експозиция може да не е необходима. Ако са получени, средно претеглените във времето концентрации във вода следва да бъдат протоколирани и използвани за последващи изчисления.
                        В стандартно изпитване за BCF в риби поглъщането и очистването могат да се опишат по отношение на два процеса с кинетика от първи порядък.
                        
                                    
                                       Скорост на поглъщане = k
                                       1 × C
                                       w
                                    
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.2]
                                 
                              
                                    
                                       Обща скорост на очистване = (k
                                       2 + k
                                       g + k
                                       m
                                       + k
                                       e) × C
                                       f
                                    
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.3]
                                 
                              При стационарно състояние, като се допуска, че растежът и метаболизмът са незначителни (т.е. стойностите за k
                           g и k
                           m не могат да бъдат разграничени от нула), скоростта на поглъщането е равна на скоростта на очистването, така че съчетаването на уравнения A5.2 и A5.3 дава следната зависимост:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.4]
                                 
                              където
                        
                                    
                                       C
                                       f-SS
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Концентрация в риби при стационарно състояние (mg · kg– 1 мокро тегло).
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       w-SS
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    Концентрация във вода при стационарно състояние (mg l– 1).
                                 
                              Отношението k
                           1/k
                           2 е известно като кинетичен BCF (BCFK) и следва да бъде равно на BCF в стационарно състояние (BCFSS), получен от отношението на концентрацията в стационарно състояние в риби към това във вода, но може да има отклонения, ако стационарното състояние е било несигурно или ако са били приложени корекции за растеж спрямо кинетичния BCF. Независимо от това, тъй като k
                           1 и k
                           2 са константи, за получаване на BCFK не е нужно да се достига стационарно състояние.
                        Въз основа на тези уравнения от първи порядък, настоящото допълнение 5 включва общите изчисления, необходими за методите с биоакумулация с експозиция както по воден път, така и чрез хранителния режим. Независимо от това, раздели 5, 6 и 8 се отнасят само за метода с експозиция както по воден път, но са включени тук, тъй като са „общи“ техники. Последователните (раздели 4 и 5) и едновременните (раздел 6) методи позволяват изчисляването на константите на поглъщане и очистване, които се използват за получаване на кинетичните BCF. Последователният метод за определяне на k
                           2 (раздел 4) е важен за метода чрез хранителния режим, тъй като е необходим, за да се изчислят както ефикасността на усвояването, така и BMF. Допълнение 7 описва подробно изчисленията, които са специфични за метода чрез хранителния режим.
                        2.   ПРОГНОЗНА ОЦЕНКА ЗА ПРОДЪЛЖИТЕЛНОСТТА НА ФАЗАТА НА ПОГЛЪЩАНЕ
                        Преди извършването на изпитването може да се получи оценка на k
                           2 и оттам някакъв процент от времето, необходимо за достигане на стационарно състояние, може да се получи от емпиричните зависимости между k
                           2 и коефициента на разпределение n-октанол/вода (K
                           OW), или между k
                           1 и BCF. Следва да се отбележи обаче, че уравненията в настоящия раздел се прилагат само когато поглъщането и очистването следват кинетика от първи порядък. Ако е очевидно, че случаят не е такъв, препоръчително е да се търси консултация от статистик в областта на биологията и/или специалист в областта на фармакокинетиката, ако прогнозните оценки за фазата на поглъщане са желателни.
                        Оценката за k
                           2 (ден– 1) може да се получи по няколко начина. Например, на първо място могат да се използват следните емпирични зависимости (87):
                        
                                    log k
                                       2 = 1,47 – 0,414logK
                                       OW
                                    
                                 
                                 
                                    (r2 = 0,95) [(3); [Уравнение A5.5]
                                 
                              или
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.6]
                                 
                              
                                    Където k
                                       1 = 520 × W– 0,32 (за вещества с log K
                                       OW > 3)
                                 
                                 
                                    (r
                                       2 = 0,85) [(4); [Уравнение A5.7]
                                 
                              И
                                       
                                 
                                 
                                    (r
                                       2 = 0,90) [(5); [Уравнение A5.8]
                                 
                              
                           W = средно тегло на третирана риба (грамове мокро тегло) в края на поглъщането/началото на очистването (88)
                        
                        За други свързани зависимости вж. (6). Може да се окаже полезно да се използват по-сложни модели за оценката на k2, ако например има вероятност от поява на значим метаболизъм (7) (8). Независимо от това, тъй като сложността на модела нараства, следва да се обърне по-голямо внимание на тълкуването на прогнозните оценки. Например присъствието на нитрогрупи би могло да е признак за бърз метаболизъм, но това не винаги е така. Поради това при определянето на графика на дадено изследване потребителят следва да съпостави резултатите от прогнозния метод с химичната структура и всякаква друга относима информация (например предварителни изследвания).
                        Времето за достигане на определен процент от стационарното състояние може да се получи чрез прилагане на оценката за k
                           2, от общото кинетично уравнение, описващо поглъщането и очистването (кинетика от първи порядък), като се допуска, че растежът и метаболизмът са незначителни. Ако по време на изследването има значителен растеж, описаните по-долу оценки няма да са надеждни. В такива случаи е по-добре да се използва коригираната за растеж k
                           2g, както е описано по-нататък (вж. раздел 7 от настоящото допълнение):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.9]
                                 
                              или, ако C
                           w е константа:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.10]
                                 
                              Когато се наближи стационарното състояние (t → ∞), уравнение A5.10 може да се съкрати (вж. (9) (10)) до:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.11]
                                 
                              или
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.12]
                                 
                              Тогава BCF × C
                           w е приближение на концентрацията в рибата при стационарно състояние (C
                           f-SS). [Забележка: същият подход може да се използва при оценка на BMF в стационарно състояние с изпитването чрез хранителния режим. В този случай в уравненията по-горе BCF се заменя с BMF, а C
                           w с C
                           food, концентрация в храната]
                        Уравнение A5.10 може да се напише така:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.13]
                                 
                              или
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.15]
                                 
                              Като приложим уравнение A5.14, може да се направи прогнозна оценка на времето за достигане на определен процент от стационарното състояние, когато е направена предварителна оценка на k
                           2 с помощта на уравнения A5.5 или A5.6.
                        Като насока, статистически оптималната продължителност на фазата на поглъщане за получаване на статистически приемливи данни (BCFK) е онзи период, който се изисква за кривата на логаритъма на концентрацията на изпитваното вещество в рибата, начертана спрямо линейното време за достигане на минимум 50 % от стационарното състояние (т.е. 0,69/k
                           2), но не повече от 95 % от стационарното състояние (т.е. 3,0/k
                           2) (11). В случай че акумулацията достигне стойност над 95 % от стационарното състояние, става възможно изчисляването на BCFSS.
                        Времето за достигане на 80 процента от стационарното състояние (като се използва уравнение A5.14) е:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.16]
                                 
                              или
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.17]
                                 
                              По подобен начин, времето за достигане на 95 процента от стационарното състояние е:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.18]
                                 
                              Например, продължителността на фазата на поглъщане (т.е. времето за достигане на определен процент от стационарното състояние, например t
                           80 или t
                           95) за изпитвано вещество с log K
                           OW = 4 ще бъде (използвайки уравнения A5.5, A5.16 и A5.17):
                        
                           logk
                           2 = 1,47 – 0,414 · 4
                        
                           k
                           2 = 0,652 ден– 1
                        
                        
                           
                        или 
                        Алтернативно изразът:
                        
                                    
                                       teSS
                                        = 6,54 · 10 – 3 · K
                                       OW + 55,31 (hours)
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.18]
                                 
                              може да се използва за изчисляване на времето за достигане на действително стационарно състояние (t
                           eSS) (12). За изпитвано вещество с log K
                           OW = 4 това води до:
                        
                           teSS
                            = 6,54 · 10 – 3 · 104 + 55,31 = 121 hours
                        
                        3.   ПРОГНОЗНА ОЦЕНКА ЗА ПРОДЪЛЖИТЕЛНОСТТА НА ФАЗАТА НА ОЧИСТВАНЕ
                        Прогнозна оценка за времето, необходимо за намаляване на погълнатото вещество в тялото до определен процент от първоначалната концентрация, може също да се получи от общото уравнение, описващо поглъщането и очистването (като се допуска кинетика от първи порядък, вж. уравнение A5.9 (1) (13).
                        За фазата на очистването се допуска, че C
                           w (или C
                           food за изпитването с експозиция чрез хранителния режим) е нула. Следователно уравнението може да се съкрати до:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.20]
                                 
                              или
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.21]
                                 
                              където C
                           f,0 е концентрацията при началото на периода на очистването.
                        Тогава 50 % очистване ще се достигне за времето (t
                           50):
                        
                           
                        или
                        
                           
                        По подобен начин 95 процента очистване ще се достигне при:
                        
                           
                        Ако 80 % поглъщане се използва за първия период (1,6/k
                           2) и 95 % загуба при фазата на очистването (3,0/k
                           2), тогава фазата на очистването е приблизително два пъти продължителността на фазата на поглъщането.
                        Следва да се отбележи, че оценките са базирани на допускането, че моделите на поглъщане и очистване ще следват кинетика от първи порядък. Ако е очевидно, че не се спазва кинетика от първи порядък, тези оценки не са валидни.
                        4.   ПОСЛЕДОВАТЕЛЕН МЕТОД: ОПРЕДЕЛЯНЕ НА КОНСТАНТАТА НА СКОРОСТТА НА ОЧИСТВАНЕ (ЗАГУБА) K
                           2
                        
                        За повечето данни за биоконцентрация се допуска, че са сравнително добре описани чрез прост модел с два компартмента/два параметъра, както е показано чрез правата линия на графиката, която апроксимира точките за концентрация в рибата (върху ln-скала) по време на фазата на очистването.
                        
                           
                        Текст на изображението
                        
                           In(concentration)
                           Cf2
                           Cf1
                           t2
                           t1
                           time
                        
                        Следва да се отбележи, че отклоненията от правата линия може да означават модел за очистване, който е по-сложен от кинетиката от първи порядък. За типовете очистване, отклоняващи се от кинетиката от първи порядък, може да се приложи графичният метод.
                        За изчисление на k
                           2 за множество времеви точки (точки на пробовземане) се извършва линейна регресия на ln(концентрацията) спрямо времето. Наклонът на регресионната линия е оценка за константата на скоростта на очистване k
                           2
                            (89). Концентрация в рибата в началото на фазата на очистването (C
                           0,d; която се равнява на средната концентрация в рибата в края на фазата на поглъщане) може лесно да бъде изчислена от пресечната точка (включително границите на грешката) (89):
                        
                                    
                                       C
                                       0,
                                          d
                                        = eintercept
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.21]
                                 
                              За изчисление на k
                           2, когато са налични само две времеви точки (точки на пробовземане) (както при сведения до минимум план), двете средни концентрации се заместват в следното уравнение
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.23]
                                 
                              където ln(C
                           f1) и ln(C
                           f2) са естествените логаритми на концентрациите съответно във времена t
                           1 и t
                           2, а t
                           2 и t
                           1 са времената, когато двете проби са взети, отнесени към началото на очистването (90).
                        5.   ПОСЛЕДОВАТЕЛЕН МЕТОД: ОПРЕДЕЛЯНЕ НА КОНСТАНТАТА НА СКОРОСТТА НА ПОГЛЪЩАНЕ K
                           1 (САМО ЗА МЕТОДА С ЕКСПОЗИЦИЯ ПО ВОДЕН ПЪТ)
                        За да се намери стойност на k1 при наличие на набор от последователни данни за концентрацията във времето за фазата на поглъщане, се използва компютърна програма за апроксимиране на следния модел:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.24]
                                 
                              където k
                           2 е дадена от предходното изчисление, C
                           f(t) и C
                           w(t) са съответно концентрациите в рибата и във водата във време t.
                        За изчисление на k
                           1 когато са налични само две времеви точки (точки на пробовземане) (както при сведения до минимум план), се използва следната формула
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.24]
                                 
                              където k
                           2 е дадена от предходното изчисление, C
                           f е концентрацията в рибата в началото на фазата на очистването, а C
                           w е средната концентрация във водата по време на фазата на поглъщане (91).
                        За оценка на пригодността може да се използва визуална проверка на наклона на k
                           1 и k
                           2, след начертаване спрямо данните от измерванията в точките на пробовземане. Ако се окаже, че последователният метод е дал непригодна оценка за k
                           1, тогава за изчисление на k
                           1 и k
                           2 следва да се приложи едновременният подход (вж. следващия раздел 6). Отново, полученият наклон следва да бъде сравняван спрямо начертаните измерени данни за визуална проверка на пригодността. Ако пригодността все още не е достатъчна, това може да бъде признак, че не се прилага кинетика от първи порядък и следва да се използват други по-сложни модели.
                        6.   ЕДНОВРЕМЕНЕН МЕТОД ЗА ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА КОНСТАНТИТЕ НА СКОРОСТТА НА ПОГЛЪЩАНЕ И ОЧИСТВАНЕ (ЗАГУБА) (САМО ЗА МЕТОДА С ЕКСПОЗИЦИЯ ПО ВОДЕН ПЪТ)
                        Могат да бъдат използвани компютърни програми за намиране на стойностите на k
                           1 и k
                           2 при наличие на набор от последователни данни за концентрацията във времето, по модела:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    0 < t < t
                                       c
                                    
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.25]
                                 
                              
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    
                                       t > t
                                       c
                                    
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.26]
                                 
                              където
                        
                                    
                                       t
                                       c
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    време в края на фазата на поглъщане.
                                 
                              Този подход пряко дава стандартните грешки за оценките на k
                           1 и k
                           2. Когато k
                           1/k
                           2 е заместено с BCF (вж. уравнение A5.4) в уравнения A5.25 и A5.26, стандартната грешка и 95 % CI на BCF също могат да бъдат оценени. Това е особено полезно при сравняването на различни оценки вследствие на трансформация на данните. Зависимата променлива (концентрацията в рибата) може да бъде апроксимирана с ln-трансформация или без нея, и произтичащата неопределеност на BCF може да бъде оценена.
                        Тъй като съществува силна корелация между двата параметъра k
                           1 и k
                           2, ако се оценят едновременно, може да е препоръчително първо да се изчисли k
                           2 само от данните за очистването (вж. по-горе);k
                           2 в повечето случаи може да се изчисли с относително висока прецизност от кривата на очистването. Впоследствие k
                           1 може бъде изчислена от данните за поглъщането чрез нелинейна регресия (92). Препоръчително е да се използва същата трансформация на данни, когато се прилага последователно изглаждане.
                        За оценка на пригодността може да се използва визуална проверка на получените наклони, след начертаване спрямо данните от измерванията в точките на пробовземане. Ако се окаже, че този метод е дал непригодна оценка за k1
                           , тогава за изчисление на k
                           1 и k
                           2 може да се приложи едновременният подход. Отново, изгладеният модел следва да бъде сравнен с начертаните измерени данни за визуална проверка на пригодността, и получените параметрични оценки за k
                           1, k
                           2 и получения BCF и техните стандартни грешки и/или доверителни интервали следва да бъдат съпоставени между различните типове апроксимация.
                        Ако пригодността не е достатъчна, това може да бъде признак, че не се прилага кинетика от първи порядък и следва да се използват други по-сложни модели. Едно от най-често срещаните усложнения е растежът на рибите по време на изпитването.
                        7.   КОРЕКЦИЯТА ЗА ПОНИЖАВАНЕ НА КОНЦЕНТРАЦИЯТА В РЕЗУЛТАТ ОТ РАСТЕЖ ЗА КИНЕТИЧНИЯ BCF И BMF
                        В настоящия раздел е описан стандартен метод за корекция поради растеж на рибите по време на изпитването (т.нар. „понижаване на концентрацията в резултат от растеж“), който е валиден само когато се прилага кинетика от първи порядък. В случай че са налице признаци, че не се прилага кинетика от първи порядък, е препоръчително да се търси консултация от статистик в областта на биологията, за подходящо коригиране за понижаване на концентрацията в резултат от растеж, или да се използва описаният по-долу подход, основан на масата.
                        В някои случаи на този метод за коригиране за понижаване на концентрацията в резултат от растеж му липсва прецизност, а понякога той не работи (например за много бавно очистващи се вещества, изпитвани в бързорастящи риби, получената константата на скоростта на очистване, коригирана за понижаване на концентрацията в резултат от растеж, k
                           2g, може да е много малка и по този начин грешката в двете константи на скоростта, използвани, за да бъде получена, става критична, и в някои случаи оценките за k
                           g могат да бъдат по-големи от k
                           2). В такива случаи може да се използва алтернативен подход (т.е. подход, основан на масата), при който се избягва необходимостта от корекция и който работи и когато не се прилага кинетика от първи порядък. Този подход е описан в края на настоящия раздел.
                        
                           Метод за коригиране на растежа с изваждане на константата на скоростта на растеж
                        
                        При стандартния метод всички данни за отделни тегла и дължини се преобразуват в естествени логаритми и ln(тегло) или ln(1/дължина) се начертава спрямо времето (ден), поотделно за изпитваните и за контролните групи. Същият процес се извършва отделно за данните от фазите на поглъщане и на очистване. Обичайно за коригирането за понижаване на концентрацията в резултат от растеж е по-целесъобразно да се използват данни за теглото от цялостното проучване за определяне на константата на скоростта на растежа (k
                           g), но статистически значимите разлики между константите на скоростта на растежа, получени за фазата на поглъщане и за фазата на очистване, може да са признак, че следва да бъде използвана константата на скоростта от фазата на очистването. Общите скорости на растеж от изследвания по воден път за изпитваните и контролните групи могат да се използват за извършване на проверка за всякакви свързани с третирането ефекти.
                        Изчислява се корелация с линеен метод на най-малките квадрати за ln(тегло на риба) спрямо ден (и за ln(1/тегло) спрямо ден) за всяка група (изпитвана или изпитвани и контролна групи, индивидуални данни, не средни дневни стойности) за цялото изследване, за фазите на поглъщане и на очистване, като се използват стандартни статистически процедури. Изчисляват се дисперсиите на наклоните на линиите и се използват за оценка на статистическата значимост (p = 0,05) на разликата между наклоните (константите на скоростите на растеж) с помощта на t-теста на Стюдънт (или с ANOVA, ако е изпитвана повече от една концентрация). Данните за теглото обикновено се предпочитат за целите на корекцията за растеж. Данните за дължината, обработени по същия начин, могат да са полезни при сравняване на контролните и изпитваните групи за свързани с третирането ефекти. Ако няма статистически значима разлика в анализа на данните за теглото, данните за изпитваните и контролните групи могат да бъдат обединени и да се изчисли обща константа на скоростта на растежа на рибите за изследването (k
                           g) като общ наклон на линейната корелация. Ако се наблюдават статистически значими разлики, константите на скоростта на растежа за всяка група риби и/или фаза от изследването се протоколират отделно. След това константата на скоростта от всяка третирана група следва да се използва за целите на коригирането за понижаване на концентрацията в резултат от растеж в тази група. Ако са отбелязани статистически разлики между константите на скоростта от фазата на поглъщане и от фазата на очистване, следва да се използват константите на скоростта, получени за фазата на очистване.
                        Изчислената константа на скоростта на растеж (k
                           g изразена като ден– 1) може да се извади от общата константа на скоростта на очистването (k
                           2), за да се получи константата на скоростта на очистване k
                           2g.
                        
                                    
                                       k
                                       2
                                       
                                          g
                                        = k
                                       2 – kg
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.27]
                                 
                              Константата на скоростта на поглъщане се разделя на коригираната за растеж константа на скоростта на очистване за да се получи коригираният за растеж кинетичен BCF, обозначаван като BCFKg (или BMFKg).
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.29]
                                 
                              Константата на скоростта на растеж, получена за изследване с експозиция чрез хранителния режим, се използва в уравнение A7.5 за изчисляване на коригирания за растеж BMFKg (вж. допълнение 7).
                        
                           Метод за коригиране за растеж, основан на масата
                        
                        Алтернатива на горния „Метод за коригиране на растежа с изваждане на константата на скоростта на растеж“, при която се избягва необходимостта от коригиране за растеж, може да се използва, както следва. Принципът е да се използват данни от очистването въз основа на масата за цяла риба, а не въз основа на концентрацията.
                        Тъканните концентрации от фазата на очистването (маса на изпитваното вещество/единица маса на риба) се преобразуват в маса на изпитваното вещество/риба: концентрациите и индивидуалните тегла на рибите се разполагат успоредно в таблична форма (например чрез използване на компютърна електронна таблица) и всяка концентрация се умножава по общото тегло на рибата за това измерване, за да се получи набор от маси на изпитваното вещество/риба за всички проби от фазата на очистване.
                        Получените стойности на естествения логаритъм на данните за масата на веществото се начертават спрямо времето за опита (фаза на очистване), както би било направено обичайно.
                        При метода с експозиция по воден път, константата на скоростта на поглъщане се получава по рутинния начин (вж. раздели 4 и 6, като следва да се отбележи, че в уравненията за апроксимация за k
                           1 следва да се използва „нормалната“ стойност на k
                           2), след което от горните данни се получава константата на скоростта на очистване. Тъй като получената стойност за константата на скоростта на очистване е независима от растежа поради това, че е получена на база маса на цяла риба, тя следва да бъде обозначена като k
                           2g, а не като k
                           2.
                        8.   НОРМАЛИЗАЦИЯ ЗА ЛИПИДИ КЪМ 5 % СЪДЪРЖАНИЕ НА ЛИПИДИ (САМО ЗА МЕТОДА С ЕКСПОЗИЦИЯ ПО ВОДЕН ПЪТ)
                        Резултатите за BCF (кинетичен и в стационарно състояние) от изпитванията с експозиция по воден път следва също да бъдат протоколирани по отношение на стойност на липидно съдържание на рибата по подразбиране 5 % мокро тегло, освен ако може да се аргументира, че изпитваното вещество не се натрупва основно в липиди (напр. някои напълно флуорирани вещества могат да се свързват с белтъци). Данните за концентрациите в риби или BCF трябва да бъдат преобразувани към основа 5 % съдържание на липиди мокро тегло. Ако дадена една и съща риба е използвана за измерване на концентрациите на веществото и на липидното съдържание във всички точки на пробовземане, това изисква всяка отделно измерена концентрация в рибата да бъде коригирана за липидното съдържание в дадената риба.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A5.30]
                                 
                              където
                        
                                    
                                       C
                                       f,L
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    нормализирана за липиди концентрация в рибата (mg kg– 1 мокро тегло)
                                 
                              
                                    
                                       L
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    липидна фракция (въз основа на мокро тегло)
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       f
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    концентрация на изпитваното вещество в рибата (mg kg– 1 мокро тегло)
                                 
                              Ако анализът за липиди не е извършен за всички пробовзети риби, за нормализация на BCF се използва средна стойност на липидите. За BCF в стационарно състояние следва да се използва средната стойност, отчетена в края на фазата на поглъщане в третираната група. За нормализация на кинетичен BCF може да има случаи, когато е оправдан различен подход, например ако съдържанието на липиди се е променило подчертано по време на фазата на поглъщане или на очистване. Независимо от това, така или иначе следва рутинно да се използва скорост на хранене, която свежда до минимум драматичните промени в липидното съдържание.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A6.1]
                                 
                              където
                        
                                    BCFKL
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    кинетичен BCF с нормализация за липиди (L kg– 1)
                                 
                              
                                    
                                       L
                                       n
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    средна липидна фракция (въз основа на мокро тегло)
                                 
                              
                                    BCFK
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    кинетичен BCF (L kg– 1)
                                 
                              ЛИТЕРАТУРА
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2004), A food web bioaccumulation model for organic chemicals in aquatic ecosystems, Environ. Toxicol. Chem. 23: 2343–2355.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Глава В.20 от настоящото приложение, Изпитване за размножаване на Daphnia magna.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Spacie A. and Hamelink J.L. (1982), Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1: 309-320.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993), Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR QSAR Environ. Res. 1: 29-39.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Kristensen P. (1991), Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute, Hørsholm, Denmark.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Arnot J.A., Meylan W., Tunkel J., Howard P.H., Mackay D., Bonnell M. and Boethling R.S. (2009), A quantitative structure-activity relationship for predicting metabolic biotransformation rates for organic chemicals in fish. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1168-1177.
                                 
                              
                                    (8)
                                 
                                 
                                    OECD (2011), QSAR Toolbox 2.1. February 2011. Available from: http://www.oecd.org/document/54/0,3746,en_2649_34379_42923638_1_1_1_1,00.html.
                                 
                              
                                    (9)
                                 
                                 
                                    Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975). Bioconcentration of 2,2′,4,4′ tetrachlorobiphenyl in rainbow trout as measured by an accelerated test. T. Am. Fish. Soc. 104: 785-792.
                                 
                              
                                    (10)
                                 
                                 
                                    Ernst W. (1985), Accumulation in aquatic organisms, in Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals, Sheeman, P., et al., Editors. John Wiley & Sons Ltd, New York, NY, USA: 243-255.
                                 
                              
                                    (11)
                                 
                                 
                                    Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. (1977), Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models. Can. J. Chem. Eng. 55: 614-622.
                                 
                              
                                    (12)
                                 
                                 
                                    Hawker D.W. and Connell D.W. (1988), Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.
                                 
                              
                                    (13)
                                 
                                 
                                    Konemann H. and van Leeuwen K. (1980), Toxicokinetics in fish: Accumulation and elimination of six chlorobenzenes by guppies. Chemosphere. 9: 3-19.
                                 
                              
                     
                        Допълнение 6
                        
                           УРАВНЕНИЯ ЗА ИЗПИТВАНЕТО С ЕКСПОЗИЦИЯ ПО ВОДЕН ПЪТ: ПЛАН СЪС СВЕЖДАНЕ ДО МИНИМУМ НА ЕКСПОЗИЦИЯТА
                        
                        Обяснението за този подход е, че коефициентът на биоконцентрация при цялостно изпитване може да бъде определен или като коефициент на биоконцентрация в стационарно състояние (BCFSS) чрез изчисляване на отношението на концентрацията на изпитваното вещество в рибната тъкан към концентрацията на изпитваното вещество във водата, или чрез изчисляване на кинетичния коефициент на биоконцентрация (BCFK) като отношение на константата на скоростта на поглъщането k
                           1 към константата на скоростта на очистване k
                           2. BCFK е валиден дори ако концентрацията на дадено вещество в стационарно състояние не е постигната по време на поглъщането, при условие че поглъщането и очистването следват приблизително процеси с кинетика от първи порядък.
                        Ако измерването на концентрацията на веществото в тъкани (C
                           f1) се извършва в момента, в който експозицията приключва (t
                           1) и концентрацията в тъканите (C
                           f2) се измерва отново след изтичането на определен период от време (t
                           2), константата на скоростта на очистване (k
                           2) се изчислява, като се използва уравнение A5.22 от допълнение 5.
                        След това константата на скоростта на поглъщане k
                           1 може да се определи по алгебричен път, като се използва уравнение A5.23 от допълнение 5 (където C
                           f е равно на C
                           f1 и t е равно на t
                           1) (1). По този начин кинетичният коефициент на биоконцентрация за плана със свеждане до минимум на експозицията (определен като BCFKm, за да се разграничава от кинетичните коефициенти на биоконцентрация, определени с помощта на други методи) е:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A6.2]
                                 
                              Концентрациите или резултатите следва да бъдат коригирани за понижаване на концентрацията в резултат от растеж и нормализирани към съдържание на липиди в рибите, равно на 5 %, както е описано в допълнение 5.
                        
                           BCFSS
                            при свеждане до минимум на експозицията се изчислява в края на фазата на поглъщане, като се се допуска, че е достигнато стационарно състояние. Това може само да бъде допуснато, тъй като броят на точките на пробовземане не е достатъчен за доказването му.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A6.2]
                                 
                              където
                        
                           
                              C
                              f-minSS
                           = Концентрация в риби при допускане за стационарно състояние в края на поглъщането (mg·kg– 1 мокро тегло).
                        
                           
                              C
                              w-minSS
                           = Концентрация във вода при допускане за стационарно състояние в края на поглъщането (mg l– 1).
                        ЛИТЕРАТУРА
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Springer T.A., Guiney P.D., Krueger H.O. and Jaber M.J. (2008), Assessment of an approach to estimating aquatic bioconcentration factors using reduced sampling. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2271-2280.
                                 
                              
                     
                        Допълнение 7
                        
                           УРАВНЕНИЯ ЗА ИЗПИТВАНЕТО С ЕКСПОЗИЦИЯ ЧРЕЗ ХРАНИТЕЛНИЯ РЕЖИМ:
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Пример за количество на съставките в подходяща налична в търговската мрежа храна за риби
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Примери за техники на добавяне на вещество в храната
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Изчисляване на ефикасността на усвояването и на коефициента на биомултипликация
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Корекция за липиди
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Оценка на разликите между измерената концентрация във времева точка нула (C0,m) и получената концентрация във времева точка нула (C0,d)
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Насоки за изпитвани вещества с много бързо очистване
                                 
                              1.   ПРИМЕР ЗА КОЛИЧЕСТВО НА СЪСТАВКИТЕ В ПОДХОДЯЩА НАЛИЧНА В ТЪРГОВСКАТА МРЕЖА ХРАНА ЗА РИБИ
                        
                                    Основна съставка
                                 
                                 
                                    рибно брашно
                                 
                              
                                    Суров белтък
                                 
                                 
                                    ≤ 55,0 %
                                 
                              
                                    Сурови мазнини
                                 
                                 
                                    ≤ 15,0 % (93)
                                    
                                 
                              
                                    Сурови влакнини
                                 
                                 
                                    ≥ 2,0 %
                                 
                              
                                    Влажност
                                 
                                 
                                    ≥ 12 %
                                 
                              
                                    Пепелно съдържание
                                 
                                 
                                    ≥ 8 %
                                 
                              2.   ПРИМЕРИ ЗА ТЕХНИКИ НА ДОБАВЯНЕ НА ВЕЩЕСТВО В ХРАНАТА
                        
                           Общи положения
                        
                        Контролните хранителни режими следва да бъдат приготвяни по съвсем същия начин като хранителния режим с добавка, но в отсъствие на изпитваното вещество.
                        За проверка на концентрацията на третирания хранителен режим следва да бъдат извлечени с подходящ метод за извличане в три повторения проби от дозираната храна, и следва да бъде измерена концентрацията или радиоактивността на изпитваното вещество в извлеците. Следва да бъдат доказани високи аналитични добиви (> 85 %) с малко вариране между пробите (три концентрации на веществото, измерени в проби, взети в началото на изпитването, не трябва да се отклоняват с повече от ± 15 % от средната стойност).
                        По време на изпитването чрез хранителния режим, три проби от хранителния режим за анализ следва да бъдат събрани в ден 0 и в края на фазата на поглъщане за определяне на съдържанието на изпитваното вещество в хранителния режим.
                        
                           Приготвяне на храна за риби с течен материал за изпитване (чист)
                        
                        Целевата номинална изпитвана концентрация в третираната храна за риби се определя например на 500 μg изпитвано вещество/g храна. Подходящото количество (по моларна маса или специфична радиоактивност) чисто изпитвано вещество се добавя към известна маса храна за риби в стъклен буркан или колба за ротационен изпарител. Масата на храната за риби следва да бъде достатъчна за продължителността на фазата на поглъщане (като се вземе предвид необходимостта от увеличаване на количествата на всяко подаване на храна поради растежа на рибите). Храната за риби/изпитваното вещество се смесват за една нощ чрез бавно обръщане в барабан (например чрез използване на смесител „Roto-Rack“ или чрез въртене, ако се използва колбата за ротационен изпарител). Хранителният режим с добавка трябва да се съхранява при условия, които запазват стабилността на изпитваното вещество в рамките на фуражния микс (например с охлаждане) до използването.
                        
                           Приготвяне на храна за риби с носител царевично или рибено масло
                        
                        Твърдите изпитвани вещества следва да бъдат стрити в хаван до фин прах. Течните вещества за изпитването могат да се добавят директно в царевичното или рибеното масло. Изпитваното вещество се разтваря в определено количество царевично или рибно масло (напр. 5-15 ml). Дозираното масло се прехвърля количествено в колба за ротационен изпарител с подходящ размер. Флаконът, използван за приготвяне на дозираното масло, трябва да се изплакне с две малки аликвотни части от масло и те следва да се добавят към колбата, за да се гарантира, че е прехвърлено цялото количество разтворено изпитвано вещество. За да се осигури пълно разтваряне/диспергиране в маслото (или ако в изследването се използва повече от едно изпитвано вещество) се добавя микро-бъркалка, колбата се запушва и сместа се разбърква бързо през нощта. Подходящо количество хранителен режим за риби за изпитването (обикновено във форма на пелети) се добавя към колбата и съдържанието на колбата се хомогенизира чрез непрекъснато обръщане на колбата в продължение най-малко на 30 минути, но за предпочитане през нощта. След това храната с добавка се съхранява по подходящ начин (напр. с охлаждане), за да се гарантира стабилността на изпитваното вещество в храната, докато тя бъде използвана.
                        
                           Приготвяне на храна за риби с органичен разтворител
                        
                        Подходящо количество от изпитваното вещество (по моларна маса или специфична радиоактивност), достатъчно за достигането на прицелната доза, се разтваря в подходящ органичен разтворител (напр. циклохексан или ацетон; 10-40 ml, но при необходимост и в по-голям обем, в зависимост от количеството храна, към която трябва да се добави добавката). Аликвотна част или цялото количество (добавяно на порции) от този разтвор се смесва с подходяща маса храна за риби, достатъчна при изпитването да се достигне изискваното номинално ниво на доза. Храната/изпитвано вещество могат да бъдат смесени в смесителна купа от неръждаема стомана и прясно дозираната храна за риби може да се остави в купата в лабораторна камина в продължение на два дни (като се разбърква от време на време), за да се позволи на излишъка от разтворителя да се изпари, или се смесват чрез непрекъсната ротация в колба за ротационен изпарител. При необходимост излишъкът от разтворител може да бъде „издухан“ със струя въздух или азот. Трябва да се вземат мерки, за да се гарантира, че изпитваното вещество не образува кристали при отстраняването на разтворителя. Хранителният режим с добавка трябва да се съхранява при условия, които запазват стабилността на изпитваното вещество в рамките на фуражния микс до използването (например с охлаждане).
                        3.   ИЗЧИСЛЯВАНЕ НА ЕФИКАСНОСТТА НА УСВОЯВАНЕТО И НА КОЕФИЦИЕНТА НА БИОМУЛТИПЛИКАЦИЯ
                        За изчисляване на ефикасността на усвояването първо трябва да бъде оценена общата константа на скоростта на очистването, в съответствие с раздел 4 от допълнение 5 (с използване на „последователния метод“, т.е. стандартна линейна регресия), като се използват средните концентрации на пробите от фазата на очистването. Константата на скоростта на хранене, I, и продължителността на поглъщането, t, са известни параметри за изследването. Измерената средна концентрация на изпитваното вещество в храната, C
                           food, е измервана променлива при изпитването. Концентрацията на изпитваното вещество в рибата в края на фазата на поглъщане, C
                           0,d, обикновено се получава от пресечната точка на графиката ln(концентрация) спрямо ден от очистването.
                        Ефикасността на усвояването на веществото (a, абсорбция на изпитваното вещество в червата) се изчислява, както следва:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A7.1]
                                 
                              където:
                        
                           
                              C
                              0,d
                           = получената концентрация в рибите във времева точка нула от фазата на очистване (mg kg– 1);
                        
                           
                              k
                              2
                           = обща (която не е коригирана за растеж) константа на скоростта на очистване (ден– 1), изчислена съгласно уравненията в допълнение 5, раздел 3;
                        
                           
                              I
                           = константата на скоростта на поглъщане на храна (g храна g– 1 риба ден– 1);
                        
                           
                              C
                              food
                           = концентрация в храната (mg kg– 1 храна);
                        
                           t= продължителност на периода на хранене (ден)
                        Независимо от това може да се наложи скоростта на хранене I, използвана в изчислението, да бъде коригирана за растеж на рибите, за да се даде точна ефикасност на усвояването a. При изпитванията със значим растеж на рибите по време на фазата на поглъщане (при които не се прави корекция на количествата фураж, за да се запази определената скорост на хранене), реалната скорост на хранене с течение на времето във фазата на поглъщане ще бъде по-ниска от определената, което ще води до по-висока „реална“ ефикасност на усвояването. (Следва да се отбележи, че това не е важно за общото изчисляване на BMF, тъй като членовете I в действителност се съкращават между уравнения A7.1 и A7.4). Средната скорост на хранене, коригирана за понижаване на концентрацията в резултат от растеж, I
                           g, може да бъде получена по няколко начина, но лесен и строг начин е да се използва известната константа на скоростта на растежа (k
                           g) с цел да се определят теглата на изпитваните риби в определени времеви точки от фазата на поглъщане, т.е.:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A7.2]
                                 
                              където
                        
                           
                              W
                              f(t)= средно тегло на рибата в деня t от фазата на поглъщане
                        
                           
                              W
                              f,0
                           = средно тегло на рибата в началото на опита
                        По този начин може да се оцени (поне) средното тегло в последния ден от експозицията (W
                           f,end-of-uptake). Тъй като скоростта на храненето е основана на W
                           f,0, действителната скорост на храненето за всеки ден от поглъщането може да бъде изчислена с помощта на тези две стойности за теглото. След това скоростта на хранене, коригирана за растеж, I
                           g, (g храна g– 1 риба ден– 1), която да се използва вместо I в случаи на бърз растеж през фазата на поглъщане, може да бъде изчислена като
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A7.3]
                                 
                              След получаването на ефикасността на усвояването може да се изчисли BMF, като се умножи тя по константата на скоростта на поглъщане I (или I
                           g, ако се използва за изчисляване на α) и произведението се раздели на общата константа на скоростта на очистването k
                           2:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A7.4]
                                 
                              Коригираният за растеж коефициент на биомултипликация също следва да се изчислява по същия начин, с използване на коригираната за растеж константа на скоростта на очистване (получена съгласно раздел 7 от допълнение 5). Отново, ако за да се изчисли α е използван I
                           g, той следва да се използва също и тук вместо I:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A7.5]
                                 
                              където:
                        
                           
                              α
                           = ефикасност на усвояването (абсорбция на изпитваното вещество в червата);
                        
                           
                              k
                              2
                           = обща (която не е коригирана за растеж) константа на скоростта на очистване (ден– 1), изчислена съгласно уравненията в допълнение 5, раздел 3;
                        
                           
                              k
                              2g
                           = коригирана за растеж константа на скоростта на очистване (ден– 1);
                        
                           
                              I
                           = константа на скоростта на поглъщане на храна (g храна g– 1 риба ден– 1);
                        Коригираният за растеж период на полуразграждане (t
                           1/2) се изчислява, както следва.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A7.6]
                                 
                              Ефикасността на усвояване на веществото от хранителния режим също може да се оцени, ако са определени остатъци в тъканите по време на етапа с линейна зависимост от фазата на поглъщане (между дни 1 и 3). В този случай ефикасността на усвояване на веществото (α) може да се определи, както следва:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A7.7]
                                 
                              където
                        
                           
                              C
                              fish
                              (t)
                           = концентрация на изпитваното вещество в рибата във време t (mg kg– 1 мокро тегло).
                        4.   КОРЕКЦИЯ ЗА ЛИПИДИ
                        Ако съдържанието на липиди е измерено в същите риби, които са използвани за химичен анализ, във всички интервали на пробовземане, индивидуалните концентрации следва да бъдат коригирани на база липиди и ln(концентрация, коригирана за липиди), начертана спрямо (ден от) очистването, за получаване на C
                           0,d и k
                           2. След това може да се изчисли ефикасността на усвояване (Уравнение A7.1) на база липиди, използвайки C
                           food на база липиди (т.е. C
                           food се умножава по средната липидна фракция в храната). Последващо изчисление с използване на уравнения A7.4 и A7.5 ще даде директно BMF, коригиран за липиди (и за понижаване на концентрацията в резултат от растеж).
                        В противен случай се получават средните липидни фракции (w/w) в рибата и в храната, както за третираната, така и за контролната група (за храната и за контролната група риби това обикновено е от данните, измерени в началото и края на експозицията; за третираната група риби това обикновено е от данните, измерени само в края на експозицията). В някои изследвания липидното съдържание в рибите може да нарасне подчертано; в тези случаи е по-подходящо да се използва средната липидна концентрация в изпитваните риби, изчислена от измерените стойности в края на експозицията и края на очистването. Като цяло, за определянето и на двете липидни фракции следва да се използват само данните от третираната група.
                        Коефициентът на корекция за липиди (Lc
                           ) се изчислява, както следва:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A7.8]
                                 
                              където L
                           fish и L
                           food са съответно средните липидни фракции в рибата и в храната.
                        Коефициентът на корекция за липиди се използва, за да се изчисли коригирания за липиди коефициент на биомултипликация (BMFL):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [Уравнение A7.9]
                                 
                              5.   ОЦЕНКА НА РАЗЛИКИТЕ МЕЖДУ ИЗМЕРЕНАТА КОНЦЕНТРАЦИЯ ВЪВ ВРЕМЕВА ТОЧКА НУЛА (C
                           0,m) И ПОЛУЧЕНАТА КОНЦЕНТРАЦИЯ ВЪВ ВРЕМЕВА ТОЧКА НУЛА (C
                           0,d)
                        Измерената концентрация във времева точка нула (C
                           0,m) и получената концентрация във времева точка нула (C
                           0,d) следва да бъдат сравнени. Ако те са много сходни, тогава това подкрепя модела с кинетика от първи порядък, използван за получаване на параметрите за очистването.
                        В някои изследвания може да има подчертана разлика между получената стойност във времева точка нула, C
                           0,d, и средната измерена концентрация във времева точка нула. C
                           0,m (вж. последното тире от точка 159 от настоящия метод за изпитване). Ако C
                           0,d е много по-ниска от C
                           0,m (C
                           0,d << C
                           0,m), разликата може да предполага наличието на неразградена храна с добавка в червата. Това може да се провери опитно чрез провеждането на отделен анализ на изрязани черва, ако допълнителни проби (цели риби) са били пробовзети и съхранени в края на фазата на поглъщане. В противен случай, ако към линейната регресия за фазата на очистването се приложи статистически валиден тест за стойности, силно различаващи се от нормалните, показващ че първата точка на пробовземане от очистването е погрешно завишена, може да е подходящо извършване на линейна регресия за получаване на k
                           2, но с пропускане на първата точка с концентрация от очистването. В такива случаи, ако неопределеността от линейната регресия е значително намалена и е ясно, че се следва приблизително кинетика на очистването от първи порядък, може да бъде уместно за изчисляването на ефикасността на усвояване да се използват получените стойности за C
                           0,d и k
                           2. Това следва да бъде цялостно обосновано в протокола. Възможно е също така при фазата на очистването да е следвана кинетика, различна от кинетиката от първи порядък. Ако това е вероятно (т.е. ако изглежда, че ln-трансформираните данни следват крива, в сравнение с графиката с правата линия от линейната регресия), тогава не е вероятно изчисленията за k
                           2 и C
                           0,d да бъдат валидни и следва да се търси консултация от статистик в областта на биологията.
                        Ако C
                           0,d е много по-висока от измерената стойност (C
                           0,d >> C
                           0,m), това може да показва: че веществото е очистено много бързо (т.е. точките на пробовземане са достигнали границата на количествено определяне на метода за анализ на много ранен етап от фазата на очистването, вж. раздел 6 по-долу); че е налице отклонение от кинетиката на очистване от първи порядък; че линейната регресия за получаване на k
                           2 и C
                           0,d е погрешна; или че в някои времеви точки на пробовземане е възникнал проблем с измерените концентрации в изследването. В такива случаи графиката с линейната регресия трябва да се проучи внимателно за доказателства за проби при границата на количествено определяне или близо до нея, за стойности, силно различаващи се от нормалните, или за очевидна кривина (сочеща кинетика, различна от кинетиката от първи порядък), и да бъде подчертана в протокола. Всяка последваща повторна оценка на линейната регресия за подобряване на стойностите от оценката трябва да бъде описана и обоснована. Ако се наблюдава очевидно отклонение от кинетиката от първи порядък, тогава не е вероятно изчисленията за k
                           2 и C
                           0,d да са валидни и следва да се търси консултация от статистик в областта на биологията.
                        6.   НАСОКИ ЗА ИЗПИТВАНИ ВЕЩЕСТВА С МНОГО БЪРЗО ОЧИСТВАНЕ
                        Както е посочено в точка 129 от метода на изпитване, някои вещества могат да се очистват толкова бързо, че да не могат да бъдат получени надеждни концентрация във времева точка нула, C
                           0,d и k
                           2, тъй като в пробите веществото в действителност вече не се измерва на много ранен етап (т.е. от втората проба от очистването нататък) от фазата на очистването (концентрации, отчетени на границата на количественото определяне). Тази ситуация е наблюдавана по време на кръговото изпитване, проведено в подкрепа на настоящия метод за изпитване с бензо[a]пирен, и е документирана в протокола за валидиране на метода. В такива случаи линейната регресия не може да се извърши надеждно, и е вероятно тя да даде нереално висока оценка на C
                           0,d, което води до привидна ефикасност на усвояване, много по-голяма от 1. В тези случаи е възможно да се изчисли консервативна оценка на k
                           2 и „горна граница“ на BMF.
                        Когато се използват онези точки с данни от фазата на очистване, в които е измерена концентрация, включително до първата концентрация „без откриване“ (концентрация, определена на границата на количествено определяне), линейната регресия (като се използват ln-трансформирани данни за концентрацията като функция от времето) ще даде оценка на k
                           2. За тези видове случаи вероятно това ще включва само две точки с данни (напр. пробовземане в дни 1 и 2 от очистването) и тогава оценка на k
                           2 може да се направи с помощта на уравнение A5.22 в допълнение 5. Тази оценка на k
                           2 може да се използва, за да се оцени ефикасността на усвояването съгласно уравнение A7.1, като стойността на C0,d в уравнението се замени с измерената концентрация във времева точка нула (C0,m) в случаите, когато C0,d е ясно оценена като много по-висока, отколкото би могло да се постигне при изпитването. Ако C0,m не е била измерима, тогава трябва да бъде използвана границата на откриване в рибните тъкани. Ако в някои случаи това дава стойност на α > 1, тогава се допуска, че ефикасността на усвояване е 1 като „най-лошият случай“.
                        Тогава максималният BMFK може да се оцени, като се използва уравнение A7.4, и следва да се цитира като стойност „много по-малка от“ (<<). Така например, при изследване, проведено със скорост на хранене 3 %, период на полуразграждане при очистването, по-кратък от 3 дни, и „най-лош случай“, при който α е 1, BMFK вероятно ще е под приблизително 0,13. Предвид целта на тази оценка и с оглед на факта, че по своя характер стойностите ще са консервативни, не е необходимо коригирането им за понижаване на концентрацията в резултат от растеж или за съдържание на липиди в храната или в рибите.
                     
                     
                        Допълнение 8
                        
                           ПОДХОДИ ЗА ОЦЕНКА НА ПРОБНИ BCF ОТ ДАННИТЕ, СЪБРАНИ ОТ ИЗСЛЕДВАНЕТО С ЕКСПОЗИЦИЯ ЧРЕЗ ХРАНИТЕЛНИЯ РЕЖИМ
                        
                        Методът чрез хранителния режим е включен в настоящия метод за изпитване с оглед изпитване за биоакумулацията на веществата, които на практика не могат да бъдат изпитвани чрез използването на експозиция по воден път. Методът чрез експозиция по воден път дава коефициент на биоконцентрация, докато методът чрез хранителния режим води пряко до информация за потенциала за биомултипликация на храната. В много режими за безопасност на химичните вещества се изисква информация относно биоконцентрацията по воден път (например при оценката на риска и Глобалната хармонизирана система за класифициране). Следователно съществува необходимост от използване на данните, получени от изследването с експозиция чрез хранителния режим, за оценка на даден коефициент на биоконцентрация, който е сравним с изпитванията, които се провеждат съгласно метода с експозиция по воден път (94). Този раздел разглежда подходи, които могат да бъдат следвани, за да се направи това, като същевременно се отчитат недостатъците, които са присъщи на оценките.
                        Изследването чрез хранителния режим измерва очистване за получаване на константата на скоростта на очистване k
                           2. Ако константата на скоростта на поглъщане може да се изчисли с наличните данни за случаи, когато рибите са били експонирани на изпитваното вещество чрез водата, тогава може да се направи оценка за кинетичния BCF.
                        Оценката за константата на скоростта на поглъщане при експозиция на изпитваното вещество по воден път се основава на множество допускания, като всички те допринасят за неопределеността на оценката. Освен това при този подход за оценка на BCF се допуска, че общата скорост на очистването (включително допринасящи фактори като разпределението в тялото и индивидуалните процеси на очистване) е независима от техниката за експозиция, предизвикваща поглъщането на изпитваното вещество в организма.
                        Основните допускания, присъщи на подхода за оценяването, могат да бъдат обобщени както следва.
                        Очистването след поглъщането чрез хранителен режим е същото като очистването след експозиция по воден път за дадено вещество
                        Поглъщането по воден път следва кинетика от първи порядък
                        В зависимост от използвания метод за оценка на поглъщането:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    поглъщането може бъде корелирано единствено с теглото на рибата
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    поглъщането може бъде корелирано само с коефициента на разпределение октанол-вода на веществото
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    поглъщането може бъде корелирано с комбинация от теглото на рибата и коефициента на разпределение октанол-вода на веществото
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    фактори, които могат да въздействат на поглъщането при изследването с експозиция по воден път на практика, като бионаличност на веществото, адсорбция върху апаратурата, размер на молекулите и т.н., имат слаб ефект
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    и, което е от изключително значение:
                                 
                              Базата данни („наборът за обучение“), използвана за разработването на метода за оценка, е представителна за разглежданото вещество
                        В няколко публикации в общодостъпни източници са изведени уравнения, свързващи поглъщането по воден път в риби чрез хрилете с коефициента на разпределение октанол-вода на дадено вещество, теглото на рибата (1) (2) (3) (4), обема и/или съдържанието на липиди, мембранната пропускливост/дифузията (5) (6), обема на вентилация на рибите (7) и с подход нетрайност/масовия баланс (8) (9) (10). Подробна оценка на такива методи в този контекст е дадена в Crookes & Brooke (11). Една публикация на Barber (12), съсредоточена върху моделирането на биоакумулацията чрез поглъщането чрез хранителен режим, също е полезна в този контекст, тъй като тя включва приноси от модели за скоростта на поглъщане чрез хрилете. Част от основния документ към протокола от 2004 чрез хранителния режим (13) също е посветена на този аспект.
                        Повечето от тези модели изглежда са получени с помощта на ограничени бази данни. За модели, при които са налични подробности за базата данни, използвана при разработването на модела, изглежда, че използваните типове вещества често са със сходна структура или са от сходен клас (по отношение на функционалността, напр. органохлорни съединения). Това увеличава неопределеността при използването на модел за прогнозиране на константата на скоростта на поглъщане за различен тип вещество, в допълнение към специфичните за изпитването съображения, като животински вид, температура и т.н.
                        В преглед на наличните техники (11) се подчертава, че нито един метод не е „по-правилен“ от останалите. Поради това следва да се даде ясна обосновка за използвания модел. Когато съществуват няколко метода, чието използване може да бъде обосновано, може да е разумно да се представят няколко оценки на k
                           1 (и следователно BCF) или обхват от стойности на k
                           1 (и BCF) според няколко метода за оценка на поглъщането. Независимо от това, предвид различията в отделните видове модели и набори от данни, използвани за тяхното разработване, вземането на средна стойност от оценките, получени по различни начини, не би било подходящо.
                        Някои изследователи са приели като изходно положение, че оценки на BCF от този тип изискват корекция по отношение на бионаличността за отчитане на адсорбцията на веществото върху разтворения органичен въглерод (DOC) в условия на експозиция по воден път, за привеждане на оценката в съответствие с резултатите от изследвания с експозиция по воден път (напр. (13) (14)). Независимо от това тази корекция може да не е подходяща, предвид ниските равнища на DOC, изисквани за изследванията с експозиция по воден път за оценка „в най-лошия случай“ (т.е. отношение на бионаличното вещество към веществото, измерено в разтвор). За силно хидрофобни вещества поглъщането чрез хрилете може да се ограничи от скоростта на пасивната дифузия в близост до повърхността на хрилете; в този случай е възможно корекцията да отчита този ефект, а не онова, за което е предназначена;
                        За предпочитане е съсредоточаване върху методи, които се нуждаят от входни параметри, за които данните ще бъдат лесно достъпни за веществата, изпитани съгласно изследването чрез хранителния режим, описано тук (напр. log K
                           OW, тегло на рибите). Други методи, които изискват по-сложни входни параметри, могат да се прилагат, но може да изискват извършването на допълнителни измервания в изследването, или подробни познания за изпитваното вещество или вида риби, които може да не са широко достъпни. В допълнение, изборът на модел може да бъде повлиян от степента на валидиране и областта на приложимост (виж (11) за преглед и сравнение на различни методи).
                        Следва да се има предвид, че резултантната оценка за k
                           1 и оценката за BCF са неопределени и може да се наложи да бъдат обработени в рамките на подход, основан на тежестта на доказателствата, заедно с получения BMF и параметрите на веществото (например размер на молекулата) за цялостна картина за потенциала за биоакумулация на веществото. Тълкуването и използването на тези параметри може да зависи от регулаторната рамка.
                        ЛИТЕРАТУРА
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Pärt P. and Opperhuizen A. (1993), The influence of temperature on the uptake rate constants of hydrophobic compounds determined by the isolated perfused gills of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquat. Toxicol. 25: 1-14.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., Part P. and Opperhuizen A. (1994), Experimentally determined blood and water flow limitations for uptake of hydrophobic compounds using perfused gills of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Allometric applications. Aquat. Toxicol. 30: 325-341.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Barber M.C. (2003), A review and comparison of models for predicting dynamic chemical bioconcentration in fish. Environ. Toxicol. Chem. 22: 1963-1992.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Opperhuizen A. (1986), Bioconcentration of hydrophobic chemicals in fish, in Aquatic Toxicology and Environmental Fate, STP 921, Poston, T.M. and Purdy, R., Editors. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA, USA: 304-315.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2004), A food web bioaccumulation model for organic chemicals in aquatic ecosystems. Environ. Toxicol. Chem. 23: 2343-2355.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Thomann R.V. (1989), Bioaccumulation model of organic chemical distribution in aquatic food chains. Environ. Sci. Technol. 23: 699-707.
                                 
                              
                                    (8)
                                 
                                 
                                    Hendriks A.J., van der Linde A., Cornelissen G. and Sijm D.T.H.M. (2001). The power of size. 1. Rate constants and equilibrium ratios for accumulation of organic substances related to octanol-water partition ratio and species weight. Environ. Toxicol. Chem. 20: 1399-1420.
                                 
                              
                                    (9)
                                 
                                 
                                    Campfens J. and Mackay D. (1997), Fugacity-based model of PCB bioaccumulation in complex aquatic food webs. Environ. Sci. Technol. 31: 577-583.
                                 
                              
                                    (10)
                                 
                                 
                                    Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2003), A generic QSAR for assessing the bioaccumulation potential of organic chemicals in aquatic food webs. QSAR Comb. Sci. 22: 337-345.
                                 
                              
                                    (11)
                                 
                                 
                                    Crookes M. and Brooke D. (2010), Estimation of fish bioconcentration factor (BCF) from depuration data. Draft Report. Environmental Agency, Bristol, UK.
                                 
                              
                                    (12)
                                 
                                 
                                    Barber M.C. (2008), Dietary uptake models used for modelling the bioaccumulation of organic contaminants in fish. Environ. Toxicol. Chem. 27: 755-777
                                 
                              
                                    (13)
                                 
                                 
                                    Anonymous (2004), Background document to the fish dietary study protocol, document submitted to the TC-NES WG on PBT.
                                 
                              
                                    (14)
                                 
                                 
                                    Gobas F. and Morrison H. (2000), Bioconcentration and biomagnification in the aquatic environment, in Handbook of property estimation methods for chemicals, Boethling, R.S. and Mackay, D., Editors. Lewis Publishers, Boca Racton, FL, USA: 189-231.
                                 
                              “
               
                     17)
                  
                  
                     В Част В глава В.20 се заменя със следното:
                     „В.20   Изпитване за размножаване на Daphnia magna
                        
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 211 (2012). Насоките за изпитване на ОИСР периодично се преразглеждат в контекста на научния напредък. Насоките за изпитване за размножаване 211 произхождат от Насоки за изпитване 202, част II, изпитване за размножаване на Daphnia sp. (1984). Като цяло е прието, че данните от изпитванията, проведени съгласно тази TG 202, могат да варират. Това доведе до значителни усилия за идентифициране на причините за това вариране с цел създаване на по-добър метод за изпитване. Насоките за изпитване 211 се основават на резултатите от тези научноизследователски дейности, кръгови изпитвания и изследвания за валидиране 1992 (1), 1994 (2) и 2008 (3).
                     Основните разлики между първата (TG 202, 1984) и втората версия (TG 211, 1998) на насоките за изпитване за размножаване са:
                     
                                 —
                              
                              
                                 препоръчваният за използване вид е Daphnia magna;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 продължителността на изпитването е 21 дни;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 при полустатичните изпитвания броят на животните, които следва да се използват за всяка изпитвана концентрация, се намалява от най-малко 40, за предпочитане разделени на четири групи по 10 животни, до най-малко 10 животни, отглеждани индивидуално (въпреки че за проточните изпитвания могат да се използват различни планове);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 бяха отправени по-специфични препоръки по отношение на средата за изпитване и условията на хранене.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Основните разлики между втората версия на насоките за изпитване за размножаване (TG 211, 1998) и настоящата версия са:
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 добавя се допълнение 7, за да се опишат процедурите за идентификация на пола на новороденото, ако се изисква. В съответствие с предходните версии на настоящия метод за изпитване, съотношението между половете е незадължителна крайна точка;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 зависимата променлива брой на живото поколение, получено от едно преживяло родителско животно, е допълнена с допълнителна зависима променлива за размножаването на Daphnia, а именно общ брой живо поколение, получено в края на изпитването от един родител от родител Daphnia в началото на изпитването, като от анализа се изключва случайната и/или непреднамерена смъртност при родителите. Целта на допълнителната зависима променлива е да приведе тази зависима променлива в съответствие с други методи за изпитване с размножаване при безгръбначни животни. Освен това, по отношение на тази зависима променлива е възможно при този метод за изпитване да се премахне източник на грешки, а именно влиянието на непреднамерената и/или случайната смъртност при родителите, ако това се случи по време на периода на експозиция.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Както за подхода с ECx (напр. ЕС 10 и ЕС50), така и за този с NOEC/LOEC, бяха включени допълнителни статистически насоки за планиране на изпитването и за обработка на резултатите.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Въвежда се гранично изпитване.
                              
                           Определенията, които са използвани, са дадени в допълнение 1.
                     ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     Първоначалната цел на изпитването е оценяване въздействието на химикалите върху репродуктивната способност на Daphnia magna. За тази цел млади женски животни Daphnia (родителски животни) на възраст по-малко от 24 часа при започването на изпитването се експонират на изпитваното вещество, прибавено към водата в обхват от концентрации. Изпитването продължава 21 дни. В края на изпитването се оценява общият брой получено живо поколение. Репродуктивната способност на родителските животни може да се изрази по друг начин (например броя на живото поколение, произлязло от животно за един ден от първия ден, когато е наблюдавано поколение), но тези начини трябва да се отчетат като допълнение към общия брой живо поколение, получено в края на изпитването. Поради особеното планиране на полустатичното изпитване в сравнение с други методи за изпитване за размножаване с безгръбначни, възможно е също да се отчита броят на живото поколение, произлязло от всяко отделно родителско животно. Това дава възможност, за разлика от други методи за изпитване за размножаване с безгръбначни, ако родителското животно умре случайно и/или непреднамерено през периода на изпитването, неговото поколение да може да бъде изключено от оценката на данните. Следователно, ако се появи смъртност при родителите в подложени на експозиция повторения, следва да се разгледа дали смъртността следва модел концентрация-отклик, например ако е налице значима регресия при отклика спрямо концентрацията на изпитвания химикал с положителен наклон (за това може да се използва статистически тест, подобен на трендовия тест на Кокрън-Армитидж). Ако смъртността не следва модел концентрация-отклик, тогава тези повторения с родителска смъртност следва да бъдат изключени от анализа на резултата от изпитването. Ако смъртността следва модел концентрация-отклик, смъртността при родителите следва да бъде представена като ефект на изпитвания химикал и повторенията не следва да бъдат изключени от анализа. Ако родителското животно умре по време на изпитването, т.е. случайно поради неправилно боравене или произшествие, или непреднамерено поради неизяснен инцидент, който не е свързан с въздействието на изпитвания химикал, или ако се окаже, че е мъжки индивид, тогава повторението се изключва от анализа (вж. повече в точка 51). Токсичното въздействие на изпитвания химикал върху репродуктивната способност се изразява като ECx чрез изглаждането на данните към подходящ модел чрез нелинейна регресия, за да се оцени концентрацията, която би причинила съответно х % намаляване на репродуктивната способност, или алтернативно като стойност NOEC/LOEC (4). За предпочитане е изпитваните концентрации да са разположени от двете страни на най-ниската от използваните концентрации с определен ефект (напр. EC10), което означава, че тази стойност се изчислява чрез интерполация, а не чрез екстраполация.
                     
                     Преживяемостта на родителските животни и времето на появяване на първото поколение трябва да се протоколират. Може също да се разгледат други свързани с химикали въздействия върху параметрите, като растеж (например дължина) и, възможно, вътрешна скорост на увеличаване на популацията (вж. точка 44).
                     ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИЗПИТВАНИЯ ХИМИКАЛ
                     Резултати от изпитването за остра токсичност (виж глава В.2 от настоящото приложение: изпитване за остра имобилизация с Daphnia sp.), извършен с Daphnia magna, може да е полезно при избиране на подходящ обхват от изпитвани концентрации при изпитвания за размножаване. Разтворимостта във вода и парното налягане на изпитвания химикал трябва да са известни и да е на разположение надежден аналитичен метод за количествено определяне на химикала в изпитваните разтвори с отчетени коефициент на аналитичния добив и граница на откриване.
                     Информацията за изпитвания химикал, която може да се използва при установяването на условията за изпитване, включва структурната формула, чистотата на химикала, стабилността на светлина, стабилността при условията на изпитването, pKa, Powи резултатите от изпитването за пълна биоразградимост (вж. Глава В.4. „Определяне на пряката биологична разградимост“, и Глава В.29, Лесна биоразградимост — CO2 в запечатани съдове) от настоящото приложение.
                     ВАЛИДНОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО
                     За да бъде изпитването валидно, при контролата (контролите) следва да са изпълнени следните критерии:
                     
                                 —
                              
                              
                                 смъртността на родителските животни (женските Daphnia) не превишава 20 % в края на изпитването;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 средният брой живо поколение, произлязло от преживяло в края на изпитването родителско животно, е ≥ 60.
                              
                           Забележка: Същия критерий за валидност (20 %) може да бъде използвани за случайна и непреднамерена смъртност при родителите за контролите, както и за всяка от изпитваните концентрации.
                     ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
                     
                        Апаратура
                     
                     Съдовете за изпитване и другите апарати, които ще бъдат в контакт с изпитваните разтвори, трябва да бъдат направени изцяло от стъкло или друг химически инертен материал. Съдовете за изпитване обичайно са стъклени бехерови чаши.
                     В допълнение ще се изискват някои или всички от следните уреди:
                     
                                 —
                              
                              
                                 устройство за измерване на съдържанието на кислород (с микроелектрод или друго подходящо оборудване за измерване на разтворения кислород в проби с малък обем),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 подходящ прибор за контрол на температурата;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 рН-метър;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 оборудване за определяне на твърдостта на водата;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 оборудване за определяне на концентрацията на общ органичен въглерод (ТОС) във водата, или оборудване за определяне на химична потребност от кислород (COD);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 адекватно оборудване за контрол на режима на светлина и за измерване на интензитета на светлината.
                              
                           
                        Изпитвани организми
                     
                     Видът, който следва да се използва при изпитването, е Daphnia magna Straus (95).
                     За предпочитане е клонът да е бил идентифициран чрез генотипа му. Проучване (1) показва, че характеристиката за репродуктивността на клон А (от IRCHA във Франция) (5) последователно отговаря на критерия за валидност от средно ≥ 60 живо поколение на родителско животно, преживяло при отглеждане при условията, описани в този метод за изпитване. Обаче други клонове са допустими, при условие че културата от Daphnia е показала, че отговаря на критериите за валидност на изпитването.
                     В началото на изпитването животните следва да са на възраст по-малко от 24 часа и не трябва да са първо поколение. Те следва да са от една здрава изходна популация (т.е. такава, която не проявява признаци на стрес, като висока смъртност, наличие на мъжки и ефипиуми, забавяне в създаването на първото поколение, обезцветени животни и т.н.). Изходната популация животни трябва да се поддържа в условия на отглеждане (светлина, температура, среда, хранене и животни на единица обем), подобни на тези, които ще се използват при изпитването. Ако средата на отглеждане на Daphnia, която ще се използва при изпитването, е различна от обичайно използваната за отглеждане на Daphnia, добра практика е преди изпитването да се включи период на аклиматизация от обикновено три седмици (т.е. едно поколение), за да се избегне подлагането на стрес на родителските животни.
                     
                        Среда за изпитване
                     
                     Препоръчва се при това изпитване да се използва среда, която е изцяло определена. Това може да предотврати употребата на добавки (например водорасли, екстракти от почвата), които са трудни за характеризиране, и по този начин да се подобри възможността за стандартизиране между лабораториите. Създадени са подходящи за тази цел среди на Elendt М4 (6) и М7 (вж. приложение 2). Обаче са допустими и други среди (например (7) (8), при условие че бъде показано, че параметрите на културата Daphnia отговарят на критериите за валидност на изпитването.
                     Ако се използват среди, които включват неопределени добавки, тези добавки следва да се определят ясно и в протокола от изпитването следва да се предостави информация за състава, по-специално по отношение на съдържанието на въглерод, тъй като това може да има принос по към предоставения хранителен режим. Препоръчва се да бъдат определени общият органичен въглерод (ТОС) и/или химичната потребност от кислород (COD) на изходния препарат от органичната добавка и да се направи оценка на произтичащия принос към ТОС и COD в приготвената среда за изпитване. Освен това се препоръчва нивата на ТОС в средата (т.е. преди добавянето на водораслите) да бъде под 2 mg/l (9).
                     Когато се изпитват химикали, съдържащи метали, е важно да се има предвид, че свойствата на средата за изпитване (например твърдост, капацитет за хелатообразуване) могат да влияят на токсичността на изпитвания химикал. Поради тази причина е желателно средата да бъде напълно определена. Обаче до момента единствените напълно определени среди, за които се знае, че са подходящи за дългосрочно отглеждане на Daphnia magna, са Elendt М4 и М7. И двете среди съдържат хелатен агент EDTA. Изследванията са показали (2), че видимата токсичност на кадмия е най-общо по-ниска, когато изпитването за размножаване се извършва в среди М4 и М7, в сравнение със среди, които не съдържат EDTA. Следователно М4 иМ7 не се препоръчват за изпитване на химикали, които съдържат метали, и другите среди, съдържащи известни хелатни агенти, също трябва да се избягват. За химикали, които съдържат метали може да е препоръчително да се използва алтернативна среда, като например възстановена твърда прясна вода по ASTM (9), която не съдържа EDTA. Тази комбинация от възстановена твърда прясна вода по ASTM и екстракти от водорасли (10) е подходяща за дългосрочно отглеждане на Daphnia magna (2).
                     Концентрацията на разтворения кислород следва да е над 3 mg/l в началото и по време на изпитването. Стойността на рН следва да е в обхват от 6 до 9 и обикновено следва да не варира с повече от 1,5 единици в никое от изпитванията. Препоръчва се твърдост над 140 mg/1 (като CaCO3). При изпитванията при тези нива и над тях е доказано, че репродуктивността е в съответствие с критериите за валидност (11) (12).
                     
                        Разтвори за изпитване
                     
                     Разтворите за изпитване с избраните концентрации обикновено се приготвят чрез разреждане на изходен разтвор. Изходните разтвори за предпочитане се приготвят без използването на каквито и да било разтворители или диспергиращи средства, ако е възможно, чрез смесване или разбъркване на изпитвания химикал в среда за изпитване с използване на механични средства, като например разклащане, разбъркване или ултрасонификация, или други подходящи методи. За предпочитане е системите за изпитване да се експонират на концентрации на изпитвания химикал, които ще се използват при изпитването, доколкото се изисква доказване на поддържането на стабилни концентрации на експозиция преди въвеждането на изпитваните организми. Ако разтварянето на изпитвания химикал във вода е е трудно, трябва да бъдат следвани процедурите, описани в насоките на ОИСР за изпитване на трудни вещества (13). Използването на разтворители или диспергиращи средства следва да се избягва, но в някои случаи може да се наложи, с цел да се получи изходен разтвор за дозиране с подходяща концентрация.
                     Към концентрациите на изпитване следва да бъдат включени допълнително една контрола на вода за разреждане с достатъчно повторения и, ако е неизбежно, контрола на разтворител с достатъчно повторения. По време на изпитването следва да се използват само разтворители или диспергиращи средства, за които е проучено, че нямат статистически значимо влияние върху зависимата променлива, или че то е само минимално. Примери за подходящи разтворители (напр. ацетон, етанол, метанол, диметилформамид и триетиленгликол) и диспергиращи средства (напр. Cremophor RH 40, метилцелулоза 0,01 % и НСО-40) са дадени в (13). Когато се използва разтворител или диспергиращо средство, неговата крайна концентрация не следва да е по-висока от 0,1 ml/l (36) и концентрацията следва да бъде една и съща във всички съдове за изпитване, с изключение на контролата на вода за разреждане. Независимо от това, следва да се положат всички усилия концентрацията на разтворителя да бъде поддържана на минимално равнище.
                     ПРОЦЕДУРА
                     
                        Условия на експозиция
                     
                     
                        Продължителност
                     
                     Изпитването продължава 21 дни.
                     
                        Зареждане
                     
                     Родителските животни се отглеждат индивидуално, едно животно в един съд за изпитване, обикновено с 50-100 ml среда (за Daphnia magna може да е възможен по-малък обем, особено за по-малките дафнии например Ceriodaphnia dubia) за всеки съд, освен ако за изпитването е необходим проточен режим.
                     За да се постигнат изискванията на аналитичната процедура, използвана при определяне на концентрацията на изпитвани химикал, понякога може да са необходими по-големи обеми, въпреки че е допустимо и обединяването на повторенията за химически анализ. Ако се използват обеми, по-големи от 100 ml, може да се наложи да се увеличи дажбата, подавана на Daphnia, за да се гарантира достатъчна наличност на храна и съответствие с критериите за валидност.
                     
                        Изпитвани животни
                     
                     За полустатичните изпитвания се използват най-малко 10 животни, разделени поотделно за всяка изпитвана концентрация, и най-малко 10 животни, разделени поотделно в контролните серии.
                     За проточните изпитвания е установено за уместно да се използват 40 животни, разделени на четири групи от 10 животни за всяка изпитвана концентрация (1). Може да се използва по-малък брой изпитвани организми и се препоръчва минимум 20 животни за концентрация, разделени в две или повече повторения с равен брой животни (например четири повторения, като всяко съдържа пет дафнии). Следва да се отбележи, че за изпитвания, при които животните са държани в групи, няма да бъде възможно да се изключи никакво поколение от статистическия анализ, ако е получена непреднамерена/случайна смъртност при родителите, когато размножаването е започнало, и следователно в тези случаи репродуктивната способност следва да се изразява като общ брой живо поколение, произлязло от родител, който е бил наличен в началото на изпитването.
                     Третиранията следва да се разпределят към съдовете за изпитването на случаен принцип и всяко последващо обработване на съдовете за изпитване следва да бъде извършено на случаен принцип. Неизпълнението на тези действия може да доведе до изместване, което може да се изтълкува погрешно като въздействие от концентрацията. По-специално, ако опитните единици се обработват по реда на третирането или концентрацията, тогава някой ефект, относим към времето, като умората на оператора или други грешки, може да доведе до по-големи въздействия при по-високи концентрации. Нещо повече, ако е вероятно резултатите от изпитването да са повлияни от първоначално условие или от условие на околната среда при изпитването, такива като местонахождение в лабораторията, следва да се помисли за спиране на изпитването.
                     
                        Хранене
                     
                     При полустатичните изпитвания храненето за предпочитане се прави дневно, но поне три пъти на седмица (т.е. съответстващи на подмяната на средата). Евентуалното разреждане на концентрациите на експозиция от хранителна добавка следва да се вземе предвид и да се избягва в максимално възможна степен с добре концентрирани суспензии водорасли. Отклоненията от това (например за проточните изпитвания) следва да бъдат протоколирани.
                     По време на изпитването хранителният режим на родителските животни за предпочитане са живи клетки от морски водорасли от едно или повече от следните: Chlorella sp., Pseudokirchneriella subcapitata (предходно Selenastrum capricornutum) и Desmodesmus subspicatus (предходно Scenedesmus subspicatus). Хранителният режим, който се прилага, следва да се основава на количеството органичен въглерод (С), осигурен за всяко родителско животно. Проучванията (14) показват, че за Daphnia magna нива на дажбата между 0,1 и 0,2 mg C/Daphnia/ден са достатъчни за получаването на изисквания брой живо поколение, за да се покрият критериите за валидност на изпитването. Дажбата може да се подава или при постоянна скорост по време на изпитването, или, ако е желателно, може да се използва по-ниска скорост в началото на изпитването, която може да се повиши по време на извършването на изпитването, за да се вземе предвид растежът на родителските животни. В този случай дажбата все още остава в препоръчания обхват от 0,1 — 0,2 mg C/Daphnia/ден по всяко време.
                     Ако за да се поддържа изискваното ниво на дажба (т.е. за удобство, тъй като измерването на въглерода изисква време) трябва да се използват заместващи измерители, такива като брой на клетките от морски водорасли или светлинна абсорбция, всяка лаборатория трябва да изготви собствена номограма, която свързва заместващия измерител със съдържанието на въглерод в културата от водорасли (вж. допълнение 3 за съвети за изготвянето на номограма). Номограмите следва да се проверяват поне веднъж годишно и по-често, ако условията за отглеждане на морските водорасли са се променили. Установено е, че светлинната абсорбция е по-добър заместител за съдържанието на въглерод, отколкото броят на клетките (15).
                     За да се минимизира обемът на средата с отглеждани водорасли, прехвърляна в съдовете за изпитване, Daphnia следва да се хранят с концентрирана суспензия от водорасли. Концентрацията на водорасли може да се постигне чрез центрофугиране, последвано от повторно суспендиране в средата за отглеждане на Daphnia.
                     
                        Светлина
                     
                     16 часа светлина при интензитет, непревишаващ 15-20 μE ߦ m– 2 ߦ s– 1, измерена на повърхността на водата на съда. За уреди за измерване на светлината, калибрирани в lux, еквивалентният диапазон от 1 000 — 1 500 lux за студена бяла светлина съответства приблизително на препоръчвания интензитет на светлината от 15-20 μE·m– 2 · s– 1.
                     
                        Температура
                     
                     Температурата на средата за изпитване е в интервал от 18-22°C. Обаче за всяко отделно изпитване температурата следва да не варира, ако е възможно, с повече от 2 °C в рамките на тези ограничения (например 18-20, 19-21 или 20-22°C) като интервал за деня. Може да е подходящо използването на допълнителни съдове за изпитване за целите на следенето на температурата.
                     
                        Аериране
                     
                     По време на изпитването съдовете следва да не се проветряват.
                     
                        Планиране на изпитването
                     
                     
                        Изпитване за определяне на обхват
                     
                     Когато е необходимо, се провежда изпитване за определяне на обхвата, например за пет концентрации на изпитвания химикал и две повторения за всяко третиране и контрола. Допълнителна информация за остра токсичност за Daphnia и/или други водни организми, получена от изпитвания с аналогични химикали или от литературата, може също да бъде полезна при вземането на решение за обхвата на концентрациите, които да се използват при изпитването за определяне на обхвата.
                     Продължителността на изпитването за определяне на обхвата е 21 дни или с продължителност, която е достатъчна да се направят надеждни прогнози за нивата на въздействие. В края на изпитването се оценява размножаването на Daphnia. Броят на родителите и срещането на поколение трябва да бъдат записани.
                     
                        Окончателно изпитване
                     
                     Обикновено следва да са налични поне пет изпитвани концентрации, обграждащи ефективна концентрация (напр. ECx) и подредени в геометрична прогресия с частно, което за предпочитане не превишава 3,2. Трябва да се използва подходящ брой повторения за всяка изпитвана концентрация т (вж. точки 24-25). Трябва да се представи обосновка, ако са използвани по-малко от пет концентрации. Следва да не се изпитват химикали над тяхната граница на разтворимост в изпитваната среда. Преди провеждане на опита е препоръчително да се разгледа статистическата мощност по плана за изпитването и използването на подходящи статистически методи (4). При определяне на обхвата от концентрации следва да се взема предвид следното:
                     
                                 i)
                              
                              
                                 когато се прави оценка на ECx за въздействие върху размножаването, се препоръчва да се използват концентрации, достатъчни за определяне на ECx с подходяща доверителна вероятност. За предпочитане е използваните концентрации за изпитване да обграждат оценката за ECx, така че ECx да се получава чрез интерполация, а не чрез екстраполация. Преимущество за следващия статистически анализ е да има повече изпитвани концентрации (напр. 10) и по-малко повторения на всяка концентрация (напр. 5, като по този начин общият брой на съдовете остава постоянен) и с 10 контроли.
                              
                           
                                 ii)
                              
                              
                                 При оценяването на LOEC и/или NOEC най-ниската изпитвана концентрация трябва да е достатъчно ниска, така че репродуктивната способност при тази концентрация да не е значимо по-ниска от тази при контролата. Ако случаят не е такъв, изпитването трябва да се повтори с намалена най-ниска концентрация.
                              
                           
                                 iii)
                              
                              
                                 При оценяването на LOEC и/или NOEC най-високата изпитвана концентрация трябва да е достатъчно висока, така че репродуктивната способност при тази концентрация да е значимо по-ниска от тази при контролата. Ако случаят не е такъв, изпитването трябва да се повтори с повишена най-висока концентрация, освен ако максималната изисквана концентрация на изпитване при изпитвания за хронични ефекти (т.е., 10 mg/l) е използвана като най-високата концентрация на изпитване при първоначалното изпитване.
                              
                           Ако при изпитване за определяне на обхвата не се наблюдават ефекти при най-високата концентрация (напр. при 10 mg/l), или когато изпитваният химикал е много вероятно да проявява слаба/нулева токсичност въз основа на отсъствието на токсичност за други организми, и/или малко/нулево поглъщане, изпитването за размножаване може да се извършва като гранично изпитване с пределна концентрация за изпитване например 10 mg/l и контрола. Както за групите за третиране, така и за контролните групи трябва да бъдат използвани по десет повторения. Когато е възможно да е необходимо гранично изпитване при проточна система, може да е достатъчен по-малък брой повторения. Гранично изпитване ще предостави възможност да се демонстрира, че няма статистически значимо въздействие при пределната концентрация, но ако бъдат отчетени статистически значими въздействия, обикновено ще се изисква цялостно изпитване.
                     
                        Контроли
                     
                     Допълнително към изпитваната серия следва да се стартира една серия с контрола на средата за изпитване и, ако е относимо, също и една серия с контрола, съдържаща разтворителя или диспергиращото средство. Когато се използва такава серия, концентрацията на разтворителя или на диспергиращото вещество следва да е същата като използваната в съдовете, съдържащи изпитвания химикал. Следва да се използва подходящ брой повторения (вж. точки 23-24).
                     Най-общо, при добре проведено изпитване коефициентът на вариация около средния брой живо поколение, произлязло от едно родителско животно в контролата(ите), следва да бъде ≤ 25 и това следва да се се протоколира при планиране на изпитвания, при които се използват самостоятелно отглеждани животни.
                     
                        Обновяване на средата за изпитване
                     
                     Честотата на обновяването на средата зависи от устойчивостта на изпитвания химикал, но следва да бъде поне три пъти на седмица. Ако от предварителните изпитвания за стабилност (вж. точка 7) концентрацията на изпитвания химикал не е стабилна (т.е. се намира извън обхвата от 80 — 120 % от номиналната или спада под 80 % от измерената първоначална концентрация) през максималния период на обновяване (т.е. 3 дни), следва да се разгледа възможност за по-често обновяване на средата или за използване на проточно изпитване.
                     Когато средата се обновява при полустатичните изпитвания, се подготвя втора серия от съдове за изпитване и родителските животни се прехвърлят в тях, например чрез стъклена пипета с подходящ диаметър. Количеството прехвърлена среда с Daphnia следва да се сведе до минимум.
                     
                        Наблюдения
                     
                     Резултатите от наблюденията, направени по време на изпитването, се записват в таблици (вж. примерите в допълнения 4 и 5). Ако се изискват други измервания (вж. точка 44), могат да се изискват допълнителни наблюдения.
                     
                        Поколение
                     
                     За да не консумира храната, предназначена за родителското животно, предпочита се поколението, произлязло от всяко родителско животно, да се отстранява и всекидневно да се преброява, считано от появяването на първото поколение. За целите на този метод за изпитване е необходимо да се преброява само живото поколение, но наличието на недоразвити яйца или мъртво поколение следва да бъде протоколирано.
                     
                        Смъртност
                     
                     За предпочитане е смъртността между родителските животни да се записва всеки ден, или най-малко с честота, равна на честотата на преброяване на поколението.
                     
                        Други параметри
                     
                     Въпреки че този метод за изпитване принципно е планиран да оценява въздействието върху репродуктивната способност, е възможно да се определят количествено в достатъчна степен и други въздействия, за да се позволи статистически анализ. Репродуктивната способност, изразена на едно преживяло родителско животно, т.е. броят живо поколение, произлязло от едно преживяло родителско животно по време на изпитването, може да се запише. Това може да се сравни с основната зависима променлива (репродуктивната способност, изразена на едно преживяло родителско животно в началото на изпитването, което не е умъртвено непреднамерено или случайно по време на изпитването). Ако се появи смъртност при родителите в подложени на експозиция повторения, следва да се разгледа дали смъртността следва модел концентрация-отклик, например ако е налице значима регресия при отклика спрямо концентрацията на изпитвания химикал с положителен наклон (за това може да се използва статистически тест, подобен на трендовия тест на Кокрън-Армитидж). Ако смъртността не следва модел концентрация-отклик, тогава тези повторения с родителска смъртност следва да бъдат изключени от анализа на резултата от изпитването. Ако смъртността следва модел концентрация-отклик, смъртността при родителите следва да бъде представена като ефект на изпитвания химикал и повторенията не следва да бъдат изключени от анализа на резултата от изпитването. Особено желателно е измерване на растежа, тъй като чрез него се набира информация за възможни сублетални въздействия, която може да е полезна, в допълнение към измерването само на репродуктивността; препоръчва се в края на изпитването да се измери дължината на родителските животни (т.е. дължината на тялото, като се изключи апикалният шип). Други параметри, които могат да се измерват или изчисляват, включват време за получаване на първото поколение (и следващите), брой и размер на животните от поколението, на животно, брой на неразвитото поколение, наличие на мъжки новородени (ОИСР, 2008 г.) или ефипиуми и, възможно, вътрешна скорост на нарастване на популацията (вж. допълнение 1 за определение и допълнение 7 за определяне на пола на новородените).
                     
                        Честота на аналитичните определяния и измервания
                     
                     Поне веднъж в седмицата следва да се измерват стойностите на концентрацията на кислород, температурата, твърдостта и рН, в прясна и стара среда, в контролата(ите) и при най-високата концентрация на изпитвания химикал.
                     По време на изпитването концентрациите на изпитвания химикал се определят на равни интервали.
                     При полустатичните изпитвания, където концентрацията на изпитвания химикал се очаква да остане в рамките на ± 20 % от номиналната (т.е. в обхвата 80-120 % — вж. точки 6, 7 и 39), се препоръчва да се анализират като минимум, най-високата и най-ниската концентрации на изпитване — прясно приготвени и при обновяването — веднъж през първата седмица на изпитването (т.е. прави се анализ на проба от същия разтвор — прясно приготвен и при обновяването). След това тези определяния се повтарят на интервали от поне една седмица.
                     За изпитвания, при които концентрацията на изпитвания химикал не се очаква да остане в рамките на ± 20 % от номиналната, е необходимо да се анализират всички концентрации на изпитване, прясно приготвени и при обновяването. Обаче при изпитванията, при които измерената начална концентрация на изпитвания химикал не е в рамките на ± 20 % от номиналната, но за които може да се предоставят достатъчно доказателства, показващи, че началните концентрации са повторяеми и стабилни (т.е., в диапазона 80—120 % от началната концентрация), химичните определяния могат да бъдат намалени през седмица 2 и 3 от изпитването до най-високата и най-ниската изпитвана концентрация. Във всички случаи определянето на концентрациите на изпитвания химикал преди обновяването е необходимо да се извършва само за един съд с повторение, за всяка изпитвана концентрация.
                     Ако се използва проточно изпитване, подходящ е режим за взимане на проби, подобен на описания при полустатичните изпитвания, но измерванията на „старите“ разтвори в този случай не са приложими. Препоръчително е обаче да се увеличи броят на вземането на проби през първата седмица (например три набора от измервания), за да се гарантира, че изпитваните концентрации остават стабилни. При тези видове изпитване дебитът на разредителя и изпитвания химикал трябва да се проверяват ежедневно.
                     Ако има доказателство, че през цялото време на изпитването концентрацията на химикала, който се изпитва, е била задоволително поддържана в рамките на ± 20 % от номиналната или измерената първоначална концентрация, резултатите могат да бъдат базирани на номиналната или на измерената първоначална стойност. Ако отклонението от номиналната или измерената първоначална концентрация е по-голямо от ± 20 процента, резултатите следва да се изразяват чрез среднопретеглената във времето стойност (вж. указания за изчислението в допълнение 6).
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Обработка на резултатите
                     
                     Целта на настоящото изпитване е да се определи въздействието на изпитвания химикал върху репродуктивната способност. Общият брой живо поколение за едно родителско животно следва да се изчислява за всеки съд за изпитване (т.е. повторение). Освен това репродуктивността може да се изчисли въз основа на произвеждането на живо поколение от преживелия родителски организъм. Въпреки това най-относимата от екологична гледна точка зависима променлива е общият брой живо поколение, произлязло от едно родителско животно, което не е умъртвено случайно (96) или непреднамерено (97) по време на изпитването. Ако родителското животно умре случайно или непреднамерено по време на изпитването, или се окаже мъжки индивид, повторението се изключва от анализа. Анализът тогава ще се основава на намален брой повторения. Ако се появи смъртност при родителите в подложени на експозиция повторения, следва да се разгледа дали смъртността следва модел концентрация-отклик, например ако е налице значима регресия при отклика спрямо концентрацията на изпитвания химикал с положителен наклон (за това може да се използва статистически тест, подобен на трендовия тест на Кокрън-Армитидж). Ако смъртността не следва модел концентрация-отклик, тогава тези повторения с родителска смъртност следва да бъдат изключени от анализа на резултата от изпитването. Ако смъртността следва модел концентрация-отклик, смъртността при родителите следва да бъде представена като ефект на изпитвания химикал и повторенията не следва да бъдат изключени от анализа на резултата от изпитването.
                     Като обобщение, когато за изразяване на ефектите се използват LOEC и NOEC или ECx, препоръчително е да се изчисли ефектът върху репродуктивността, като се използват и двете зависими променливи, посочени по-горе, а именно
                     
                                 —
                              
                              
                                 като общия брой живо поколение, произлязло от едно родителско животно, което не е умряло случайно или непреднамерено по време на изпитването, и;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 като броя на живото поколение, произлязло от едно преживяло родителско животно;
                              
                           и след това като окончателен резултат да се използва най-ниската стойност на LOEC и NOEC или ECx, изчислена с помощта на тези две зависими променливи.
                     Преди прилагането на статистическия анализ, например ANOVA процедури, сравнение на третиранията с контролите чрез t-тест на Стюдънт, тест на Дънет, тест на Уйлямс или тест на Йонкхере-Терпстра със стъпка назад, се препоръчва да се вземе предвид преобразуване на данните, ако това е необходимо за изпълнение на изискванията на определения статистически тест. Като непараметрични алтернативи може да се обмисли тест на Дън или тест на Ман-Уитни. За индивидуалните средни от третиране се изчисляват доверителни интервали от 95 %.
                     Броят на преживелите родителски животни в нетретираните контроли е критерий за валидност и трябва да бъде документиран и протоколиран. Също така всички други вредни въздействия, например необичайно поведение и токсикологично значими констатации, следва да се протоколират също и в окончателния протокол,.
                     
                        ECx
                     
                     Стойностите на ECx, включително свързаните с тях долни и горни доверителни граници, се изчисляват с помощта на подходящи статистически методи (например логистична функция или функция на Вейбул, метод на Спирмън-Карбър с изключване на данни, или обикновена интерполация). За изчисляване на EC10, EC50 или всяка друга стойност ECx, пълният набор от данни следва да бъде подложен на регресионен анализ.
                     
                        NOEC/LOEC
                     
                     Ако статистическия анализ е предназначен за определяне на NOEC/LOEC, трябва да се използват подходящи статистически методи съгласно документ на ОИСР № 54 „Съвременни подходи за статистически анализ на данни за екотоксичност: ръководство за прилагане“ (4). По принцип неблагоприятните въздействия на изпитвания химикал в сравнение с контролата се проучват чрез тестване на едностранна хипотеза при p ≤ 0,05.
                     Нормалното разпределение и хомогенността на дисперсията могат да бъдат тествани с помощта на подходящ статистически тест, напр. съответно тест на Шапиро-Уилк и тест на Левин (p ≤ 0,05). Може да бъде извършен еднофакторен ANOVA с последващи множествени сравнения. За изчисляване дали са налице статистически значими разлики (p ≤ 0,05) между контролите и различните концентрации на изпитвания химикал могат да се използват множествени сравнения (например тест на Дънет) или трендови тестове със стъпка назад (напр. тест на Уйлямс или тест на Йонкхере-Терпстра със стъпка назад) ( (избор на препоръчителния тест в съответствие с документ № 54 на ОИСР (4)). В противен случай за определяне на NOEC и LOEC могат да се използват непараметрични методи (напр. U-тест на Бонферони по Холм или трендов тест на Йонкхере-Терпстра).
                     
                        Гранично изпитване
                     
                     Ако е извършено гранично изпитване (сравнение на контрола и само на едно третиране) и са изпълнени критериите за използване на параметрични тестови процедури (нормалност, хомогенност), метричните отклици могат да бъдат оценени чрез тест на Стюдънт (t-тест). Ако тези изисквания не са изпълнени, може да се използва t-тест за нееднаква дисперсия (t-тест на Уелч) или непараметричен тест, напр. U-тест на Ман-Уитни.
                     За установяване на значими разлики между контролите (контрола и контрола на разтворител или на диспергиращо средство), повторенията на всяка контрола могат да се изпитват, както е описано при граничното изпитване. Ако при тези изпитвания не бъдат установени значими разлики, всички повторения на контроли и контроли на разтворител могат да бъдат обединени. В противен случай всички третирания следва да бъдат сравнявани с контролата на разтворител.
                     
                        Протокол от изпитването
                     
                     Протоколът от изпитването трябва да включва следното:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитван химикал:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             физическа природа и относими физични и химични свойства;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             данни за химичната идентификация, включително чистота.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Изпитван вид:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             клон (да се уточни, ако е определен геномът му), доставчик или източник (ако е известен) и прилаганите условия за отглеждане. Ако се използват вид, различен от Daphnia magna, това следва да се протоколира и обоснове.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Условия на изпитването:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             използваната при изпитването процедура (т.е. полустатична или проточна, обем, зареждане в брой Daphnia за литър);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             период на излагане на светлина и интензитет на светлината;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             план на изпитването (напр. брой повторения, брой родители в едно повторение);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробности за използваната среда за отглеждане;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ако са използвани, добавки от органични материали, включително състав, източник, метод на приготвяне, TOC/COD на изходния препарат, оценка на получената стойност на TOC/COD в средата за изпитване;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             подробна информация за храненето, включително количеството (в mg C/daphnia/ден) и график (например вида на храната(ите), включително характерното наименование (вид) на водораслите и, ако са известни, щамът, условията на отглеждане);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             метод на приготвяне на изходните разтвори и честотата на обновяване (ако се използват разтворител или диспергиращо средство, те следва да се посочат, както и тяхната концентрация).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Резултати:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             резултатите от всички предварителни проучвания върху стабилността на изпитвания химикал;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             номиналните изпитвани концентрации и резултатите от всички анализи за определяне на концентрацията на изпитвания химикал в съдовете за изпитване (вж. примерни таблици с данни в допълнение 5); следва да се протоколират също коефициентът на аналитичния добив на метода и границата на определяне;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             качество на водата в съдовете за изпитване (т.е. рН, температура и концентрация на разтворения кислород и ТОС и/или COD, и твърдост, където е необходимо) (вж. примерна таблица с данни в допълнение 4);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             цялостен запис за получен брой живо поколение по време на изпитването от всяко родителско животно (вж. примерна таблица с данни в допълнение 4);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             брой на мъртвите сред родителските животни и ден на настъпване на смъртта (вж. примерна таблица с данни в допълнение 4);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             коефициент на вариация за репродуктивната способност в контролите (основан на общия брой живо поколение за родителско животно, преживяло в края на изпитването);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             графика на общия брой живо поколение за родителско животно във всяко повторение, с изключение на всички родителски животни, при които е възможно смъртта да е настъпила случайно или непреднамерено по време на изпитването, спрямо концентрацията на изпитвания химикал;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             по целесъобразност, графика на общия брой живо поколение, произлязло от преживяло родителско животно във всяко повторение, спрямо концентрацията на изпитвания химикал
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             когато е целесъобразно, най-ниска концентрация, при която се наблюдава ефект (LOEC) за репродуктивността, включително описание на използваните статистически процедури и указание за това, каква големина на въздействие може да се очаква да бъде открита (за осигуряване на това може да се извърши анализ на мощността преди началото на опита), и концентрация без наблюдавано въздействие (NOEC) върху репродуктивността; информация за това коя зависима променлива е използвана за изчисляване на стойностите на LOEC и NOEC (като общ брой живо поколение за родителско животно, което не е умъртвено случайно или непреднамерено по време на изпитването или като общ брой живо поколение за преживяло родителско животно), където е уместно, следва също да бъдат протоколирани LOEC или NOEC за смъртността на родителските животни;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             където е подходящо, стойността ECx за репродуктивността и доверителни интервали (напр. 90 % или 95 %) и графика на изгладения модел, използван за нейното изчисляване, наклон на кривата концентрация-отклик, и нейната стандартна грешка;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             други наблюдавани биологически ефекти или измервания: протоколиране на всички други биологични ефекти, които са били наблюдавани или измерени (например растеж на родителски животни), включително и подходяща обосновка;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             обяснение за всички отклонения от метода за изпитване.
                                          
                                       
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD Test Guidelines Programme. Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, U.K., 20-21 March 1993.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (1997). Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.6. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 OECD (2008). Validation report for an enhancement of OECD TG 211 Daphnia magna reproduction test. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, No.88. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment Number 54. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Baird, D.J., et al. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Straus. Ecotox. and Environ. Safety, 21, 257-265.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Elendt, B.-P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 EPA (2002). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. Fifth Edition. EPA/821/R-02/012. U.S. Environmental Protection Agency, Office of Water, Washington, DC. www.epa.gov/waterscience/methods
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Vigano, L. (1991). Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, 775-782.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 ASTM. (2008) Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians. In: Annual Book of ASTM Standards; Water and Environmental Technology, vol. 11.04; ASTM E729 — 96 (2007) American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Baird, D.J., et al. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988. (H. Løkke, H. Tyle and F. Bro-Rasmussen. Eds.) pp 144-148.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Parkhurst, B.R., J.L Forte. And G.P. and Wright (1981) Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26: 1-8.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Cowgill, U.M. and Milazzo, D.P. (1990). The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2): 185-196.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Sims, I.R., S. Watson. and D. Holmes (1993) Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environ. Toxicol. and Chem., 12, 2053-2058.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Sims, I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459-466.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        За целите на настоящия метод за изпитване са използвани следните определения:
                        
                           
                              Случайна смъртност
                           : смъртност, която не е свързана с химикал, и която е причинена от случайно въздействие (т.е. известна причина).
                        
                           
                              Химикал
                           : вещество или смес.
                        
                           
                              ECx
                           : концентрацията на изпитвания химикал, разтворен във вода, в резултат от която репродуктивността на Daphnia magna намалява с х % по време на определен период на експозиция.
                        
                           
                              Непреднамерена смъртност
                           : смъртност, която не е свързана с химикал, и която е с неизвестна причина.
                        
                           
                              Вътрешна скорост на нарастване на популацията
                           : мярка за растеж на популацията, която интегрира репродуктивната способност и специфичната за възрастта смъртност (1) (2) (3). При популации в стационарно състояние тя е нула. При нарастващи популации е положителна, а при намаляващи популации е отрицателна. Последната очевидно не води до устойчивост и накрая води до изчезване.
                        
                           
                              Граница на откриване
                           : най-ниската концентрация, която може да се открие, но не може да се определи количествено.
                        
                           
                              Граница на определяне
                           : най-ниската концентрация, която може да се измери количествено.
                        
                           
                              Най-ниска концентрация, при която се наблюдава ефект (LOEC)
                           : най-ниската изпитвана концентрация, при която за химикала се наблюдава статистически значимо въздействие върху репродуктивната способност и смъртността на родителските животни (при p < 0,05) в сравнение с контролната, в рамките на дадено време на експозиция. Независимо от това, всички изпитвани концентрации над LOEC трябва да имат вредно въздействие, равно или по-голямо от наблюдаваното при LOEC. Когато тези две условия не могат да бъдат удовлетворени, трябва да се даде цялостно обяснение за това как е била избрана LOEC (и следователно NOEC).
                        
                           
                              Смъртност
                           : дадено животно се записва като мъртво, когато е неподвижно, т.е. когато не е способно да плува, или ако не се наблюдава движение на придатъците и постабдомена в рамките на 15-секундно леко разклащане на съда за изпитване. (Ако се използва друга дефиниция, това трябва да се протоколира, заедно с референтните данни за нея).
                        
                           
                              Концентрация без наблюдавано въздействие (NOEC)
                           : това е изпитваната концентрация непосредствено преди LOEC, която, при сравнение с контролата, няма статистически значимо въздействие (p < 0,05), в рамките на дадено време на експозиция.
                        
                           
                              Поколение
                           : младите Daphnia, произлезли от родителските животни по време на изпитването.
                        
                           
                              Родителски животни
                           : онези женски Daphnia, които присъстват в началото на изпитването, и чиято репродуктивна способност е обект на проучването.
                        
                           
                              Репродуктивната способност
                           : броят живо поколение, произлязло от родителски животни в рамките на периода на изпитване
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                        Литература
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Wilson, E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Poole, R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, p 532.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Meyer, J. S., Ingersoll, C. G., McDonald, L.L. and Boyce, M.S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, 1156-1166.
                                 
                              
                     
                        Допълнение 2
                        
                           ПРИГОТВЯНЕ HA НАПЪЛНО ОПРЕДЕЛЕНА СРЕДА HA ELENDT М7 И M4
                        
                        
                           Аклиматизация към средите на Elendt M7 и M4
                        
                        Някои лаборатории срещат трудности при директното прехвърляне на Daphnia към среди М4 (1) и М7. Независимо от това са постигнати някои успехи при постепенната аклиматизация, т.е. преместване от собствена среда към 30 % Elendt, след това към 60 % Elendt и след това към 100 % Elendt. Може да се наложи периодите на аклиматизация да бъдат дълги по един месец.
                        
                           Приготвяне
                        
                        
                           Микроелементи
                        
                        Първо, във вода с подходяща чистота, т.е. дейонизирана, дестилирана или с обратна осмоза, се приготвят отделени изходни разтвори (I) от индивидуални микроелементи. От тези различни изходни разтвори (I) се приготвя втори отделен изходен разтвор (II), който съдържа всички микроелементи (комбиниран разтвор), т.е.:
                        
                                    Изходен разтвор (изходни разтвори) I
                                    (едно вещество)
                                 
                                 
                                    Количество, добавено към вода
                                 
                                 
                                    Концентрация (по отношение на средата М4)
                                 
                                 
                                    За приготвяне на комбинирания изходен разтвор II се добавя следното количество изходен разтвор I към вода
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    ml/l
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    M 4
                                 
                                 
                                    M 7
                                 
                              
                                    H3BO3
                                    
                                 
                                 
                                    57 190 
                                 
                                 
                                    20 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    MnCl2ߦ4 H2O
                                 
                                 
                                    7 210 
                                 
                                 
                                    20 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    LiCl
                                 
                                 
                                    6 120 
                                 
                                 
                                    20 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    RbCl
                                 
                                 
                                    1 420 
                                 
                                 
                                    20 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    SrCl2ߦ6 H2O
                                 
                                 
                                    3 040 
                                 
                                 
                                    20 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    NaBr
                                 
                                 
                                    320
                                 
                                 
                                    20 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    Mo Na2O4 ߦ2 H2O
                                 
                                 
                                    1 260 
                                 
                                 
                                    20 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    CuCl2ߦ2 H2O
                                 
                                 
                                    335
                                 
                                 
                                    20 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    ZnCl2
                                    
                                 
                                 
                                    260
                                 
                                 
                                    20 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    CoCl2ߦ6 H2O
                                 
                                 
                                    200
                                 
                                 
                                    20 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    KI
                                 
                                 
                                    65
                                 
                                 
                                    20 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2SeO3
                                    
                                 
                                 
                                    43,8
                                 
                                 
                                    20 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    NH4VO3
                                    
                                 
                                 
                                    11,5
                                 
                                 
                                    20 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2EDTAߦ2 H2O
                                 
                                 
                                    5 000 
                                 
                                 
                                    2 000 -кратно
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    —
                                 
                              
                                    FeSO4ߦ7 H2O
                                 
                                 
                                    1 991 
                                 
                                 
                                    2 000 -кратно
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    —
                                 
                              
                                    И при разтвор на Na2EDTA, и при разтвор на FeSO4 разтворите се приготвят отделно, изливат се заедно и незабавно се автоклавират. Това дава:
                                 
                              
                                    Fe-EDTA разтвор
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    1 000 -кратно
                                 
                                 
                                    20,0
                                 
                                 
                                    5,0
                                 
                              
                           М4 и М7 среда
                        
                        Средите М4 и М7 се приготвят чрез използване на изходен разтвор II, хранителните макроелементи и витамини, както следва:
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Количество, добавено към вода
                                 
                                 
                                    Концентрация (по отношение на средата М4)
                                 
                                 
                                    Количество изходен разтвор, прибавено за приготвяне на средата
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    ml/l
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    M 4
                                 
                                 
                                    M 7
                                 
                              
                                    Изходен разтвор II
                                    (комбинирани микроелементи)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20-кратно
                                 
                                 
                                    50
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    Изходни разтвори на хранителни макроелементи (едно веществo)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    CaCl2ߦ2 H2O
                                 
                                 
                                    293 800 
                                 
                                 
                                    1 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    MgSO4ߦ7 H2O
                                 
                                 
                                    246 600 
                                 
                                 
                                    2 000 -кратно
                                 
                                 
                                    0,5
                                 
                                 
                                    0,5
                                 
                              
                                    KCl
                                 
                                 
                                    58 000 
                                 
                                 
                                    10 000 -кратно
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    NaHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    64 800 
                                 
                                 
                                    1 000 -кратно
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2SiO3ߦ9 H2O
                                 
                                 
                                    50 000 
                                 
                                 
                                    5 000 -кратно
                                 
                                 
                                    0,2
                                 
                                 
                                    0,2
                                 
                              
                                    NaNO3
                                    
                                 
                                 
                                    2 740 
                                 
                                 
                                    10 000 -кратно
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    KH2PO4
                                    
                                 
                                 
                                    1 430 
                                 
                                 
                                    10 000 -кратно
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    K2HPO4
                                    
                                 
                                 
                                    1 840 
                                 
                                 
                                    10 000 -кратно
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    Комбиниран изходен разтвор на витамини
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    10 000 -кратно
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    Комбинираният изходен разтвор на витамини е приготвен чрез добавяне на 3 витамина към 1 литър вода, както е показано по-долу:
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Тиаминхидрохлорид
                                 
                                 
                                    750
                                 
                                 
                                    10 000 -кратно
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Цианокобаламин (B12)
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    10 000 -кратно
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Биотин
                                 
                                 
                                    7,5
                                 
                                 
                                    10 000 -кратно
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              Комбинираният изходен разтвор на витамини се съхранява замразен на малки аликвотни части. Витамините се добавят към средата малко преди употреба.
                        
                                    
                                       N.B:
                                    
                                 
                                 
                                    За да се избегне утаяването на соли, когато се приготвя цялата среда, се прибавят аликвотните части от изходните разтвори към около 500 — 800 ml дейонизирана вода, и след това се допълва до 1 литър.
                                 
                              
                                    
                                       N.N.B.
                                    
                                 
                                 
                                    Първото публикуване на среда М4 може да се намери в Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
                                 
                              
                     
                        Допълнение 3
                        
                           АНАЛИЗ HA ОБЩИЯ ОРГАНИЧЕН ВЪГЛЕРОД (TOC) И СЪЗДАВАНЕ HA НОМОГРАМА ЗА СЪДЪРЖАНИЕ HA TOC В ХРАНАТА OT МОРСКИ ВОДОРАСЛИ
                        
                        Приема се, че съдържанието на въглерод в храната от морски водорасли обикновено не се измерва директно, а от корелации (т.е. номограми) с измервания заместители, като брой на клетките морски водорасли, или абсорбция на светлина.
                        TOC следва се измерва чрез високотемпературно окисляване, а не чрез методи с UV или персулфати. (За насоки вж.: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
                        За създаване на номограмата водораслите следва да се отделят от средата на растеж чрез центрофугиране, последвано ресуспендиране в дестилирана вода. Измерват се параметрите заместители и концентрацията на TOC във всяка проби в три повторения. Празните проби с дестилираната вода следва да се анализират и TOC концентрацията се изважда от TOC концентрацията на пробите от водорасли.
                        Номограмите следва да са линейни в изисквания обхват от концентрации на въглерод. По-долу са показани примери.
                        
                                    
                                       N.B.
                                    
                                 
                                 
                                    Te следва да не се използват за конверсия; необходимо е лабораториите да приготвят свои собствени номограми.
                                 
                              Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).
                        Регресия на mg/l сухо тегло спрямо mg С/l. Данни от концентрирани суспензии на клетки от полунепрекъснато култивиране, ресуспендирани в дестилирана вода.
                        ос „x“: mg С/l концентрирана храна от водорасли
                        ос „y“: mg/l сухо тегло концентрирана храна от водорасли
                        Коефициент на корекция – 0,980
                        Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).
                        Регресия на броя на клетките спрямо mg С/l. Данни от концентрирани суспензии на клетки от полунепрекъснато култивиране, ресуспендирани в дестилирана вода.
                        ос „x“: mg С/l концентрирана храна от водорасли
                        ос „y“: mg C/l концентрирана храна от водорасли
                        Коефициент на корекция – 0,926
                        Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).
                        Регресия на абсорбция спрямо mg C/1 (дължина 1 cm). Данни от концентрирани суспензии на клетки от полунепрекъснато култивиране, ресуспендирани в дестилирана вода.
                        ос „x“: mg С/l концентрирана храна от водорасли
                        ос „y“: Абсорбция при 440 nm на 1/10 разреждане на концентрирана храна от водорасли
                        Коефициент на корекция – 0,998
                     
                     
                        Допълнение 4
                        
                           ПРИМЕРНА ТАБЛИЦА ЗА ЗАПИСВАНЕ НА ОБНОВЯВАНЕ НА СРЕДА, ДАННИ ОТ ФИЗИЧЕН/ХИМИЧЕН МОНИТОРИНГ, ХРАНЕНЕ, РЕПРОДУКТИВНОСТ НА DAPHNIA И СМЪРТНОСТ ПРИ РОДИТЕЛСКИТЕ ЖИВОТНИ
                        
                        
                                    Опит №:
                                 
                                 
                                    Дата на началото:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Клон:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Среда:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Вид храна
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Изпитван химикал:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Номинална концентрация:
                                 
                              
                                    Ден
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                    5
                                 
                                 
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    8
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    12
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                    15
                                 
                                 
                                    16
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    18
                                 
                                 
                                    19
                                 
                                 
                                    20
                                 
                                 
                                    21
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Обновяване на средата (отметка)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    pH (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    нова
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    стара
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    O2 (mg/l) (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    нова
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    стара
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Темп. (°C) (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    нова
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    стара
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Предоставена храна (отметка)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Брой живо поколение (*7)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Общо
                                 
                              
                                    Съд 1
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    10
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Общо
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Кумулативна смъртност на родителски животни (*8)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                     
                        Допълнение 5
                        
                           ПРИМЕРНА ТАБЛИЦА ЗА ЗАПИСВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ ХИМИЧНИЯ АНАЛИЗ
                        
                        а)   Измерени концентрации
                        
                        
                                    Номинална концентрация
                                 
                                 
                                    Проба от седмица 1
                                 
                                 
                                    Проба от седмица 2
                                 
                                 
                                    Проба от седмица 3
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Прясна
                                 
                                 
                                    Стара
                                 
                                 
                                    Прясна
                                 
                                 
                                    Стара
                                 
                                 
                                    Прясна
                                 
                                 
                                    Стара
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              б)   Измерени концентрации като процент от номиналната
                        
                        
                                    Номинална концентрация
                                 
                                 
                                    Проба от седмица 1
                                 
                                 
                                    Проба от седмица 2
                                 
                                 
                                    Проба от седмица 3
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Прясна
                                 
                                 
                                    Стара
                                 
                                 
                                    Прясна
                                 
                                 
                                    Стара
                                 
                                 
                                    Прясна
                                 
                                 
                                    Стара
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                     
                        Допълнение 6
                        
                           ИЗЧИСЛЯВАНЕ HA СРЕДНО ПРЕТЕГЛЕНА ВЪВ ВРЕМЕТО СТОЙНОСТ
                        
                        
                           Средно претеглена във времето стойност
                        
                        Като се има предвид, че концентрацията на изпитвания химикал може да намалява в периода между обновяванията на средата, необходимо е да се прецени коя концентрация от обхвата на изпробваните концентрации върху родител Daphnia да се избере като представителна. Изборът следва да се основава на биологически и статистически преценки. Например, ако се смята, че репродуктивността е повлияна най-вече от изпробваната върхова концентрация, тогава се използва максималната концентрация. Обаче ако се смята, че акумулираният или по-дългосрочният ефект на токсичния химикал е по-важен, тогава е по-подходяща средна концентрация. B този случай подходящата средна величина, която се използва, е средно претеглената във времето стойност на концентрацията, тъй като с това се взема предвид варирането на моментната концентрация във времето.
                        
                           Фигура 1
                        
                        
                           Пример за средно претеглената във времето стойност
                        
                        Фигура 1 показва пример за (опростено) изпитване, което продължава седем дни, с обновяване на средата в дни 0, 2 и 4.
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Тънката зигзагообразна линия показва концентрацията във всяка времева точка. За намаляването на концентрацията се допуска, че следва процес на експоненциално намаляване.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Изобразените 6 точки представляват наблюдаваните концентрации, които са измерени в началото и в края на всеки период на обновяване.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Дебелата линия показва разположението на средно претеглената във времето стойност.
                                 
                              Средно претеглената във времето стойност се изчислява така, че зоната под средно претеглената във времето стойност да е равна на зоната под концентрационната крива. Изчисляването за по-горе посочения пример е посочено в таблица 1.
                        
                           Таблица 1
                        
                        
                           Изчисляване на средно претеглената във времето стойност
                        
                        
                                    Обновяване №
                                 
                                 
                                    Дни
                                 
                                 
                                    Конц 0
                                 
                                 
                                    Конц 1
                                 
                                 
                                    Ln(Конц 0)
                                 
                                 
                                    Ln(Конц 1)
                                 
                                 
                                    Площ
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    10,000
                                 
                                 
                                    4,493
                                 
                                 
                                    2,303
                                 
                                 
                                    1,503
                                 
                                 
                                    13,767
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    11,000
                                 
                                 
                                    6,037
                                 
                                 
                                    2,398
                                 
                                 
                                    1,798
                                 
                                 
                                    16,544
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    10,000
                                 
                                 
                                    4,066
                                 
                                 
                                    2,303
                                 
                                 
                                    1,403
                                 
                                 
                                    19,781
                                 
                              
                                    Общ брой дни:
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Обща площ:
                                 
                                 
                                    50,092
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Средно претеглена във времето стойност:
                                 
                                 
                                    7,156
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    „Дни“ е броят на дните в периода на обновяване
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    „Конц 0“ е измерената концентрация в началото на всеки период на обновяване
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    „Конц 1“ е измерената концентрация в края на всеки период на обновяване
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    „Ln(Конц 0)“ е естественият логаритъм на Конц 0
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    „Ln(Конц 1)“ е естественият логаритъм на Конц 1
                                 
                              „Площ“ е площта под експоненциалната крива за всеки период на обновяване. Изчислява се чрез:
                        
                           
                        Средно претеглената във времето стойност е общата площ, разделена на общия брой дни.
                        Разбира се, за изпитването за репродуктивност на Daphnia, таблицата би трябвало да се разшири до 21 дни.
                        Ясно е, че когато се извършват наблюдения само в началото и в края на всеки период на обновяване, е невъзможно да се потвърди, че процесът на намаляване е всъщност експоненциален. Различна крива би довела до различно изчисление за графата „Площ“. Обаче експоненциалният процес на намаляване не е неправдоподобен и вероятно е най-добрата крива, която да се използва при отсъствието на друга информация.
                        Независимо от това се изисква предпазливост, ако химическият анализ не доведе до намиране на някакво количество химикал в края на периода на обновяване. Ако не е възможно да се оцени колко бързо химикалът е отстранен от разтвора, е невъзможно да се получи реалистична площ под кривата и следователно е невъзможно да се постигне разумна среднопретеглена във времето стойност.
                     
                     
                        Допълнение 7
                        
                           НАСОКИ ЗА ИДЕНТИФИКАЦИЯ НА ПОЛА НА НОВОРОДЕНИТЕ
                        
                        Мъжки новородени могат да се получат при променящи се условия на околната среда, като например скъсяване на периода на излагане на светлина, температура, намаляване на концентрацията на храните и увеличаване на гъстотата на популацията (Hobaek and Larson, 1990; Kleiven et al., 1992). Получаването на мъжко потомство е също така известен отговор на някои регулатори на растежа на насекомите (Oda et al., 2005). При условия, при които химически стресови фактори предизвикват намаляване на годното за възпроизвеждане потомство от партеногенетичните женски животни, може да се очаква увеличение на броя на мъжките животни (ОИСР, 2008 г.). Въз основа на наличната информация не е възможно да се предвиди коя крайна точка ще бъде по-чувствителна — съотношението между половете или репродуктивността; независимо от това, налице са показания (позоваване „доклад за валидиране“, част 1), съгласно които това увеличение в броя на мъжките животни може да е по-малко чувствително от намалението на поколението. Тъй като основното предназначение на метода за изпитване е да се оцени броят на произлязлото поколение, появата на мъжки животни е незадължително наблюдение. Ако тази незадължителна крайна точка е оценена в дадено проучване, тогава следва да се ползва допълнителен критерий за валидност на изпитването — не повече от 5 % мъжки в контролите.
                        Най-практичният и лесен начин за разграничаване на пола на Daphnia е да използват техните фенотипни характеристики, тъй като мъжките и женските животни са генетично идентични и полът им се определя от околната среда. Мъжките и женските животни се различават по дължината и морфологията на първата двойка антени, които са по-дълги при мъжките, отколкото при женските (фиг. 1). Тази разлика се разпознава веднага след раждането, въпреки че по време на растежа се развиват и други вторични полови белези (напр. вж. фиг. 2 в Olmstead and LeBlanc, 2000).
                        За наблюдаване на морфологичния пол новородените, произлезли от всяко изпитвано животно, трябва да бъдат прехвърлени чрез пипета и поставени в блюдо на Петри със среда за изпитване. Средата се свежда до минимум, за да се ограничи движението на животните. Наблюдението на първата двойка антени може да се проведе под стереомикроскоп (× 10-60).
                        
                           Фигура 1
                        
                        
                           Мъжки (вляво) и женски (вдясно) от D. magna на възраст 24 часа. Мъжките животни могат да бъдат отличени от женските по дължината и морфологията на първата двойка антени, както е показано в кръговете (Tatarazako et al., 2004).
                        
                        ПОЗОВАВАНИЯ
                        Hobaek A and Larson P. 1990. Sex determination in Daphnia magna. Ecology 71: 2255-2268.
                        Kleiven O.T., Larsson P., Hobaek A. 1992. Sexual reproduction in Daphnia magna requires three stimuli. Oikos 65, 197-206.
                        Oda S., Tatarazako N, Watanabe H., Morita M., and Iguchi T. 2005. Production of male neonates in Daphnia magna (Cladocera, Crustacea) exposed to juvenile hormones and their analogs. Chemosphere 61:1168-1174.
                        OECD, 2008. Validation report for an enhancement of OECD TG 211 Daphnia magna reproduction test. OECD Series on Testing and Assessment, Number 88. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.
                        Olmstead, A.W., LeBlanc, G.A., 2000. Effects of endocrine-active chemicals on the development characteristics of Daphnia magna. Environmental Toxicology and Chemistry 19:2107-2113.
                        Tatarazako, N., Oda, S., Abe, R., Morita M. and Iguchi T., 2004. Development of a screening method for endocrine disruptors in crustaceans using Daphnia magna (Cladocera, Crustacea). Environmental Science 17, 439-449.
                     “
               
                     18)
                  
                  
                     В част В, глава В.29 параграф 66 се заменя със следното:
                     
                                 „66.
                              
                              
                                 Изпитването се смята за валидно, ако:
                                 
                                             а)
                                          
                                          
                                             средният процент на разграждане в съдовете FC, съдържащи референтния химикал, е > 60 % към 14-я ден на инкубацията; както и
                                          
                                       
                                             б)
                                          
                                          
                                             средното количество на общия неорганичен въглерод в празните контроли FB в края на изпитването е < 3mg C/l.
                                          
                                       Ако тези граници не са спазени, изпитването трябва да се повтори с инокулум от друг източник и/или трябва да се преразгледат използваните процедури. Например, ако високият добив на неорганичен въглерод в празните проби е проблем, трябва да се следва процедурата, посочена в точки 27—32.“
                              
                           
               
                     19)
                  
                  
                     В част В се добавят следните глави:
                     „В.47   Риби, изпитване за токсичност на ранни стадии от жизнения цикъл
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 210 (2013). Изпитванията, отнасящи се за ранните стадии при риби, имат за цел определяне на леталните и сублеталните въздействия на химикалите върху изпитваните стадии и видове. Те дават информация от значение за оценка на хроничните летални и сублетални въздействия на химикалите върху други видове риби.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Насоките за изпитване 210 се основават на предложение от страна на Обединеното кралство, което бе обсъдено на среща на експерти на ОИСР, състояла се в Medmenham (Обединено кралство) и са актуализирани през 2013 г., за да се отрази опитът при използването на изпитването и препоръките от семинар на ОИСР за изпитване за токсичност при риби, проведен през септември 2010 г. (1).
                              
                           ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Рибите на ранни стадии се експонират на обхват от концентрации на изпитвания химикал, разтворен във вода. Предпочитат се проточни условия; независимо от това, ако не е възможно, приемливи са полустатични условия. За повече подробности следва да се консултира Ръководството на ОИСР с насоки за изпитване за токсичност във водна среда на трудни вещества и смеси (2). Изпитването започва с поставяне на оплодените хайверни зърна в камерите за изпитване и продължава за период от време, специфичен за животинския вид, който е необходим за достигане на контролните риби до ювенилен стадий от жизнения цикъл. Леталното и сублеталното въздействие се оценяват и сравняват със стойностите при контролите, за да се определи най-ниска концентрация, при която се наблюдава ефект (LOEC) с цел да се определи i) концентрацията без наблюдавано въздействие (NOEC) и/или ii) ECx (напр. EC10, EC20), като се използва регресионен модел, за да се оцени концентрацията, която би причинила х % изменение на измерваното въздействие. Протоколирането на относимите концентрации с определено въздействие и параметри може да зависи от регулаторната рамка. Изпитваните концентрации трябва да обграждат ECx (напр. EC10, EC50) така, че ЕСх впоследствие да се получи след интерполация, а не след екстраполация (вж. допълнение 1 за определения).
                              
                           ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИЗПИТВАНИЯ ХИМИКАЛ
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Изпитваният химикал се отнася до това, което се изпитва. Разтворимостта във вода (вж. глава А.6 от настоящото приложение) и парното налягане (вж. глава А.4 от настоящото приложение) на изпитвания химикал трябва да са известни и да е на разположение надежден аналитичен метод за количествено определяне на химикала в изпитваните разтвори с известни и протоколирани точност и граница на количествено определяне. Въпреки че не са необходими за извършване на изпитването, резултатите от изпитването за остра токсичност (вж. глави В.1 или В.49 от настоящото приложение), за предпочитане извършено с видовете, избрани за настоящото изпитване, могат да предоставят полезна информация.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Ако методът за изпитване се използва за изпитване на смес, нейният състав следва да се охарактеризира възможно най-пълно, например чрез химичната идентичност на нейните съставки, количествения състав и специфичните свойства на веществата (като упоменатите по-горе). Преди използването на метода на изпитване за регулаторни изпитвания на смес, трябва да бъде преценено дали той ще предостави приемливи резултати за набелязаната регулаторна цел.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Полезна информация включва структурната формула, чистотата на веществото, стабилността във вода и на светлина, pKa, Pow и резултати от изпитване за пълна биоразградимост (напр. глава В.4 или В.29 от настоящото приложение).
                              
                           ВАЛИДНОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО
                     
                              
                                 7.
                              
                              
                                 За да бъде валидно дадено изпитване се прилагат следните условия:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             концентрацията на разтворен кислород трябва да бъде >60 % от стойността на насищане при равновесие с атмосферния въздух (ASV) по време на изпитването;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             температурата на водата не трябва да се различава с повече от ±1,5 °C между камерите за изпитване или между последователните дни по всяко време на изпитването, и следва да се поддържа в рамките на температурните диапазони, посочени за изпитваните видове (допълнение 2);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             аналитичното измерване на концентрациите на изпитване е задължително.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             цялостната преживяемост на оплодените хайверни зърна в контролите и преживяемостта след излюпване и, където е относимо, в контролите на разтворител, трябва да бъде по-голяма или равна на границите, определени в допълнение 2;
                                          
                                       
                           
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Ако се наблюдава малко отклонение от критериите за валидност на изпитването, последиците следва да се съобразят с надеждността на данните от изпитването и тези съображения следва да бъдат включени в протокола. Въздействията върху преживяемостта, излюпването или растежа при контролата на разтворител, в сравнение с отрицателната контрола, следва да бъдат протоколирани и обсъдени в контекста на надеждността на данните от изпитването.
                              
                           ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
                     
                        Камери за изпитване
                     
                     
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Могат да се използват всякакви съдове от стъкло, неръждаема стомана или други химически неутрални материали. Тъй като за силикона е известно, че проявява висок капацитет за абсорбиране на липофилни вещества, използването на силиконови тръби при проточните изследвания и използването на силиконови запушалки в контакт с вода следва да бъде сведено до минимум чрез използването например на монолитни стъклени аквариуми. Размерите на съдовете следва да са достатъчно големи, за да позволяват подходящ растеж в контролата, поддържане на концентрацията на разтворен кислород (напр. при малки видове риби това се постига със съд с обем 7 l) и съответствие с критериите за скорост на зареждане, посочени в точка 19. Препоръчва се камерите за изпитване да са разположени на случаен принцип в зоната на извършване на изпитването. Рандомизираният блоков план, при който всяко третиране е налично във всеки блок, се предпочита пред напълно рандомизирания. Камерите за изпитване следва да са защитени от нежелани смущения. За предпочитане е системата за изпитване да бъде кондиционирана с концентрации на изпитвания химикал за достатъчно дълъг период, за да се докажат стабилни концентрации на експозиция преди въвеждането на изпитваните организми.
                              
                           
                        Избор на видове
                     
                     
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Препоръчваните видове риби са дадени в таблица 1. Това не изключва използването и на други видове, но за постигане на подходящи условия на изпитването може да се наложи адаптиране на процедурата за изпитване. В този случай следва да се протоколира основанието за избор на видовете и на опитния метод.
                              
                           
                        Отглеждане за рибите за размножаване
                     
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Подробности относно отглеждането на рибния запас за размножаване при задоволителни условия могат да се намерят в допълнение 3 и в препратки към използваната литература (3) (4) (5).
                              
                           
                        Третиране на оплодените хайверни зърна, ембрионите и ларвите
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Първоначално оплодените хайверни зърна, ембрионите и ларвите могат да се експонират, в рамките на основния съд, в по-малки съдове от стъкло или неръждаема стомана, снабдени със страни или краища с отвори, за да се позволи протичане на изпитвания разтвор през съда. Нетурбулентно протичане през тези малки съдове може да се предизвика чрез поставянето им на ръчка, монтирана да премества съда нагоре и надолу, но като запазва винаги организмите във водата. Оплодените хайверни зърна на риби от семейството на сьомгата могат да се запазват с решетки или сито с достатъчно широки отвори, които да позволяват на ларвите да преминават през тях след излюпването.
                              
                           
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Когато за задържане на хайвера в основния съд за изпитване са били използвани контейнери с хайвер, решетки и сита, тези ограничители следва да се отстранят след излюпването на ларвите, съгласно насоките в допълнение 3, c изключение на ситата, които следва да се задържат, за да се предотврати изпускането на ларвите. Ако има нужда от прехвърляне на ларвите, те следва да не се излагат на въздух и не следва да се използват мрежи, да за се освободят ларвите от контейнерите с хайвера. Графикът за това прехвърляне е различен за различните видове и следва да се документира в протокола. Независимо от това прехвърляне не е винаги необходимо.
                              
                           
                        Вода
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Всяка вода, в която изпитваният вид показва съответните признаци за дългосрочна преживяемост и растеж, може да се използва като вода за изпитването (вж. допълнение 4). Необходимо е постоянно качество на водата по време на изпитването. За да се гарантира, че водата за разреждане няма да повлияе неправилно върху резултата от изпитването (например чрез образуване на комплекс с изпитвания химикал) или да навреди на рибния запас за размножаване, пробите за анализ следва да се вземат на интервали. Правят се измервания на тежки метали (например Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), основни аниони и катиони (например Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO42–), амоняк, общо пестициди с остатъчни нива на хлор, общ органичен въглерод и суспендирани твърди частици, например два пъти годишно, когато се знае, че водата за разреждане има относително постоянно качество. В случаите, когато е известно, че водата е с променливо качество, измерванията трябва да се провеждат по-често; честотата зависи от това колко променливо е качеството. Някои от химичните характеристики на приемливата вода за разреждане са изброени в допълнение 4.
                              
                           
                        Разтвори за изпитване
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 За изпитванията с проточна система се изисква система, която постоянно подава и разрежда изходен разтвор на изпитвания химикал (например система с измерваща помпа, пропорционално разреждащо устройство, сатуратор), за да се подават серии от концентрации към камерите за изпитване. Дебитът на изходните разтвори и този на водата за разреждане следва да се проверяват на интервали по време на изпитването и през това време не следва да варират с повече от 10 %. За подходящ се счита дебит, равен на поне пет обема на камера за изпитване за 24 часа (3). Независимо от това, ако се спазва скоростта на зареждане, посочена в параграф 19, за предотвратяване на бързото отстраняване на храна е възможна по-ниска скорост на протичане, напр. 2-3 обема на камера за изпитване.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Разтворите за изпитване при избраните концентрации се приготвят чрез разреждане на изходен разтвор. Изходният разтвор се приготвя за предпочитане чрез просто смесване и разбъркване на изпитвания химикал във водата за разреждане с помощта на механични средства (например разклащане и/или ултрасонификация). За постигане на подходящо концентриран изходен разтвор могат да се използват колони за насищане (колони за разтворимост) или методи за пасивно дозиране (6). Използването на разтворител за носител не е препоръчително. Независимо от това, в случай че е необходим разтворител, успоредно следва да се стартира изпитване с контрола на разтворител, при същата концентрация на разтворител, като тази при третиранията с химикала; т.е. нивото на разтворителя следва за предпочитане да бъде еднакво във всички концентрации, както и в контролата на разтворител. За някои системи за разреждане това може да е трудно от техническа гледна точка; тук концентрацията на разтворителя в контролата на разтворител следва да е равна на най-високата концентрация на разтворителя в третираната група. За вещества, които са трудни за изпитване, следва да се консултира Ръководство № 23 на ОИСР с насоки за изпитване за токсичност във водна среда на трудни вещества и смеси (2). Ако се използва разтворител, изборът на разтворител се определя в зависимост от химичните свойства на веществото. В Ръководство № 23 на ОИСР се препоръчва максимална концентрация от 100 μl/l. За да се избегне потенциалното влияние на разтворителя върху измерените крайни точки (7), препоръчително е концентрацията на разтворителя да се поддържа възможно най-ниска.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 При полустатичните изпитвания могат да се следват две различни процедури за обновяване. Или се приготвят нови разтвори за изпитване в чисти съдове и преживелите хайверни зърна и ларви внимателно се пренасят в новите съдове, или изпитваните организми се запазват в съдовете за изпитване, като известен дял (поне две трети) от обема на разтвора за изпитване/контролата се сменя.
                              
                           ПРОЦЕДУРА
                     
                        Условия на експозиция
                     
                     
                        Продължителност
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Изпитването трябва да започне възможно най-бързо след оплождането на хайверните зърна, като е за предпочитане те да са потопени в разтворите за изпитване преди започването на дробенето на бластодиска или колкото е възможно по-скоро след този етап. Продължителността на изпитването зависи от видовете, които се използват. Някои препоръчителни продължителности са дадени в допълнение 2.
                              
                           
                        Зареждане
                     
                     
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Броят на оплодените хайверни зърна в началото на изпитването следва да е достатъчен за спазване на статистическите изисквания. Те следва да са разпределени на случаен принцип сред третиранията и минимум 80 хайверни зърна, разпределени по равно между най-малко четири камери за изпитване с повторения, следва да бъдат използвани за всяка концентрация. Скоростта на зареждане (биомаса на обем разтвор за изпитване) следва да е достатъчно ниска с оглед поддържане на концентрация на разтворен кислород от поне 60 % от стойността на насищане при равновесие с атмосферния въздух без вентилация по време на стадиите хайверни зърна и ларви. За изпитванията с проточна система се препоръчва скорост на зареждане не по-голяма от 0,5 g мокро тегло/1 за 24 часа и не повече от 5 g/1 от разтвора по всяко време (3).
                              
                           
                        Светлина и температура
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Продължителността на излагане на светлина и температурата на водата следва да са подходящи за изпитваните видове (допълнение 2).
                              
                           
                        Хранене
                     
                     
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Храната и храненето са изключително важни и е от съществено значение да се предоставя подходящата храна за всеки стадий от жизнения цикъл, в подходящо време и в количества, които са достатъчни за поддържане на нормален растеж. Храненето следва да бъде приблизително равно в повторенията, освен ако не е коригирано, за да отчете смъртността. Излишната храна и изпражненията трябва да бъдат отстранявани, когато е необходимо, за да се избегне натрупване на отпадъци. Подробни хранителни режими са дадени в допълнение 3, но с натрупването на опит храната и хранителните режими непрекъснато се усъвършенстват с оглед подобряване на преживяемостта и оптимизиране на растежа. Живата храна осигурява източник за облагородяване на околната средата и следователно следва да се използва вместо сухата или замразена храна, или в допълнение към нея, когато това е подходящо за вида и стадия от жизнения цикъл.
                              
                           
                        Концентрации на изпитване
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Обичайно се изискват пет концентрации на изпитвания химикал, с минимум четири повторения на концентрация, разделени на равни интервали с кратност, която не надвишава 3,2. При избирането на обхвата на изпитваните концентрации следва да бъдат разгледани информация за изпитвания за остра токсичност, за предпочитане със същите видове, и/или изпитване за определяне на обхвата (1), ако са налични. Независимо от това, при избирането на обхвата на изпитваните концентрации следва да бъдат разгледани всички източници на информация, включително източници като например „read across“, данни от изпитвания за остра токсичност за рибни ембриони. Когато трябва да бъдат установени само емпирични NOEC, като окончателно изпитване може да бъде приемливо гранично изпитване или разширено гранично изпитване с по-малко от пет концентрации. Трябва да се представи обосновка, ако са използвани по-малко от пет концентрации. Не е нужно да се изпитват концентрации на изпитвания химикал, по-високи от 96-часова LC50, или 10 mg/1, според това коя от двете е по-ниска.
                              
                           
                        Контроли
                     
                     
                              
                                 23.
                              
                              
                                 в допълнение към серията от концентрации на изпитвания химикал следва да се изпита само една контрола на вода за разреждане и, ако е необходимо, една контрола на разтворител, съдържаща използван разтворител за носител (вж. точка 16).
                              
                           
                        Честота на аналитичните определяния и измервания
                     
                     
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Преди започване на периода на експозиция следва във всички повторения да бъде гарантирано правилното функциониране на системата за доставяне на химикала (например чрез измерване концентрации на изпитване). Следва да се установят изискваните методи за анализ, в това число подходяща граница на количествено определяне (LOQ) и достатъчни познания за стабилността на веществото в системата за изпитване. По време на изпитването концентрациите на изпитвания химикал се определят през постоянни интервали, за да се характеризира експозицията. Необходими са най-малко пет определяния. При проточните системи аналитичните измервания на изпитвания химикал в едно повторение за всяка концентрация следва да бъдат извършвани поне един път седмично, със систематична смяна между повторенията. Допълнителните аналитични определяния често подобряват качеството на резултатите от изпитването. Може да е необходимо пробите да бъдат филтрувани за отстраняване на всякакви твърди частици (например с използване на размер на порите 0,45 μm) или центрофугирани, за да се гарантира, че определянията на химикала се правят в истински разтвор. С цел да се намали адсорбцията на изпитвания химикал, филтрите трябва да бъдат наситени преди употреба. Когато измерените концентрации не остават в рамките на 80-120 % от номиналната концентрация, концентрации с определено въздействие трябва да бъдат определени и изразени по отношение на средноаритметичната стойност на концентрацията за проточните изпитвания (вж. допълнение 6 към метод за изпитване В.20 за изчисляването на средноаритметичната стойност (8)), и изразени по отношение на средната геометрична стойност на измерените концентрации за полустатичните изпитвания (вж. глава 5 в Ръководствоto на ОИСР за изпитване за токсичност във водна среда на трудни вещества и смеси (2)).
                              
                           
                              
                                 25.
                              
                              
                                 По време на изпитването разтвореният кислород, рН и температурата следва да се измерват във всички съдове за изпитване поне веднъж седмично, а солеността и твърдостта — в началото и в края на изпитването, ако има основания за това. За предпочитане е температурата да се наблюдава непрекъснато най-малко в един съд за изпитване.
                              
                           
                        Наблюдения
                     
                     26.   
                           Стадий на ембрионално развитие
                        : стадият на развитие на ембриона в началото на експозицията на изпитвания химикал следва да бъде проверен колкото е възможно по-точно. Това може да се направи, като се използва представителна извадка от хайверни зърна, запазени и изчистени по подходящ начин.
                     27.   
                           Излюпване u преживяемост
                        : наблюденията върху излюпването и преживяемостта следва да се правят поне веднъж на ден и се записва броят. Ако в началото на ембрионално развитие се наблюдават гъбички върху хайверните зърна (например в първия или втория ден от изпитването), тези хайверни зърна трябва да бъдат преброени и отстранени. Мъртвите ембриони, ларви и ювенилни екземпляри следва да се отстраняват веднага след като са забелязани, тъй като могат да се разложат бързо и да бъдат разкъсани от действията на другите риби. При отстраняването на мъртвите индивиди се полага изключителна грижа да не се наранят физически близкостоящите хайверни зърна/ларви. Признаците на смърт варират в зависимост от видовете и стадия от жизнения цикъл. Например:
                     
                                 —
                              
                              
                                 за новооплодени хайверни зърна: по-специално в ранните стадии това са: явна загуба на прозрачност и изменение в оцветяването, причинени от коагулация и/или утаяване на белтъци, водещи до бял непрозрачен вид;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 за ембрионите, ларвите и ювенилните екземпляри: неподвижност и/или липса на дихателни движения и/или липса на сърдечен ритъм и/или липса на реакция при механично стимулиране.
                              
                           28.   
                           Необичаен външен вид
                        : броят на ларвите и ювенилните екземпляри, които показват необичайна форма на тялото, следва да се записва на подходящи интервали в зависимост от продължителността на изпитването, а природата на необичайността във външния вид следва да се опише. Следва да се отбележи, че ларвите с аномалии и ювенилните екземпляри се срещат по естествен път и могат да бъдат от порядъка на няколко процента от контролата(ите) при някои видове. Когато деформациите и свързаното с тях необичайно поведение се смятат за толкова сериозни, че се наблюдава значително страдание за организма, и то е достигнало до точка, отвъд която няма да има възстановяване, той може да бъде отстранен от изпитването. Такива животни следва да бъдат умъртвени и третирани като смъртност при последващия анализ на данните. За повечето видове, които се препоръчват в настоящия метод за изпитване, е документирано нормално ембрионално развитие (9) (10) (11) (12).
                     29.   
                           Необичайно поведение
                        : необичайното поведение, като хипервентилация, некоординирано плуване, нетипично състояние на покой и нетипично поведение при хранене, следва да се записват на достатъчни интервали в зависимост от продължителността на изпитването (например веднъж дневно за видове, обитаващи топлите води). Тези въздействия, въпреки че е трудно да бъдат определени количествено, могат при наблюдаване да допринесат за тълкуването на данните за смъртността.
                     30.   
                           Тегло
                        : в края на изпитването всички преживели риби се претеглят на база повторения (като се протоколира броят животни в съответното повторение и средното тегло за животно): мокрото тегло (след попиване на водата) се предпочита, но независимо от това данните за сухото тегло също могат да бъдат протоколирани (13).
                     31.   
                           Дължина
                        : в края на изпитването следва да се измерят индивидуалните дължини. Препоръчва се обща дължина, но ако се появят гниене на опашния плавник или ерозия на перка, може да се използва стандартна дължина. За всички риби в дадено изпитване следва да бъде използван един и същ метод. Индивидуалната дължина може да бъде измерена например с шублер, цифров фотоапарат или калибриран окулярен микрометър. Типичните минимални дължини са определени в допълнение 2.
                     ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Обработка на резултатите
                     
                     
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Препоръчва се планът на опита и изборът на статистическия тест да позволяват достатъчна мощност (80 % или по-голяма) за откриване на изменения от биологично значение в крайните точки, за които се протоколира NOEC. Протоколирането на относимите концентрации с определено въздействие и параметри може да зависи от регулаторната рамка. Ако следва да бъде протоколирана дадена ECx, планът на опита и изборът на регресионен модел следва да дават възможност за оценка на ECx, така че i) 95-процентният доверителен интервал, протоколиран за ECx, да не съдържа нула и да не е прекомерно широк, ii) 95-процентният доверителен интервал за прогнозната средна стойност в ECx не съдържа контролната средна стойност, iii) няма значима липса на съгласуваност на регресионния модел с данните. Всеки подход изисква определянето на процентното изменение във всяка крайна точка, което е важно да бъде открито или оценено. Планът на опита следва да бъде изготвен така, че да се даде възможност за това. Когато посочените по-горе условия за определяне на ECx не са изпълнени, следва да се използва NOEC подходът. Малко вероятно е както едно и също процентно изменение да се прилага за всички крайни точки, така и осъществим опит да може да бъде планиран по такъв начин, че да отговаря на тези критерии за всички крайни точки, поради което при планирането на опита по подходящ начин е важно вниманието да се насочи към крайните точки, които са от значение за съответния опит. Статистически блокови схеми и насоки за всеки подход са на разположение в допълнения 5 и 6, като те дават насоки за обработката на данните и за избора на най-подходящия статистически тест или модел. Могат да се използват други статистически подходи, при условие че са научно обосновани.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Ще бъде необходимо варирането да се анализира във всеки набор от повторения, като се използват дисперсионен анализ или таблица на спрегнатост, и въз основа на този анализ се използват подходящи статистически методи за анализ. За да се направи множествено сравнение на резултатите при индивидуалните концентрации и тези при контролите, се препоръчват тест на Йонкхере-Терпстра със стъпка назад или тест на Уйлямс за непрекъснатия отклик, и тест на Кокрън-Армитидж със стъпка назад за двоичния отклик, които са съвместими с монотонна зависимост концентрация-отклик и липсват доказателства за дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение (14). Когато има доказателства за дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение, се препоръчва модификация на Рао-Скот на теста на Кокрън-Армитидж (15) (16), или към съотношенията от повторенията се прилагат тестовете на Уйлямс или на Дънет (след трансформация „аркуссинус от корен квадратен“), или тестът на Йонкхере-Терпстра. Когато данните не са съвместими с монотонна зависимост концентрация-отклик, методите на Дънет или на Дън, или на Ман-Уитни, може да се окажат полезни за непрекъснат отклик, а точният тест на Фишер — за двоичен отклик (14) (17) (18). Когато се прилага какъвто и да е статистически метод или модел, следва да се внимава да се гарантира удовлетворяването на изискванията на метода или модела (например от камера до камера се оценява и отчита при плана на опита и изпитването и използвания статистически тест или модел). Данните трябва да се оценяват по отношение на тяхната нормалност, като допълнение 5 посочва какво следва да се направи по отношение на остатъците в рамките на ANOVA. В допълнение 6 се разглеждат допълнителни съображения за регресионния подход. Следва да бъдат взети предвид трансформации с оглед удовлетворяване на изискванията за даден статистически тест. Независимо от това трансформациите, които да позволят изглаждането с регресионен модел, изискват голямо внимание, тъй като например 25 % изменение в нетрансформирания отклик не съответства на 25 % изменение в трансформиран отклик. Във всички анализи обектът за анализ и опитната единица е камерата за изпитване, а не отделната риба, и както тестването на хипотези, така и регресията, трябва да са съобразени с това (3) (14) (19) (20).
                              
                           
                        Протокол от изпитването
                     
                     
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Изпитван химикал:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Вещество с една съставка
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     химична идентификация, като наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, SMILES или InChI код, структурна формула, чистота, химическа идентичност на онечистванията, както е целесъобразно и практически осъществимо и др. (включително съдържание на органичен въглерод, ако е уместно).
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Вещество с повече съставки, UVCB и смеси:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     характеризирани, доколкото е възможно, напр. от химичната идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Изпитван вид:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         научно наименование, порода, източник и метод на събиране на оплодените хайверни зърна и последващо боравене.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Условия на изпитването:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         използвана процедура на изпитване (напр. полустатична или проточна, зареждане);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Продължителност(и) на излагане на светлина;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         план за изпитването (напр. брой на камерите за изпитване и повторенията, брой хайверни зърна в едно повторение, материал и размери на камерата за изпитване (височина, ширина, обем), обем вода на камера за изпитване);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         метод за приготвяне на изходния разтвор и честота на обновяване (при използване трябва да се посочат разтворителят и неговата концентрация);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         метод на дозиране на изпитвания химикал (напр. помпи, системи за разреждане)
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         коефициентът на аналитичния добив на метода и номиналните концентрации на изпитване, границата на количествено определяне, средните на измерените стойности и техните стандартни отклонения в съдовете за изпитване, методът за получаването им и доказателство, че измерванията се отнасят за концентрациите на изпитвания химикал в истински разтвор;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         характеристики на разтворимост във вода: рН, твърдост, температура, концентрация на разтворен кислород, нива на остатъци от хлор (ако са измерени), общо органичен въглерод (ако е измерен), суспендирани твърди частици (ако са измерени), соленост на изпитваната среда (ако е измерена) и всички други направени измервания;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         качество на водата в съдовете за изпитване, рН, твърдост, температура и концентрация на разтворен кислород;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         подробна информация за храненето (например вид на храната или храните, източник, дадено количество и честота).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Резултати, протоколирани на индивидуална база (или на база повторения) и като средна стойност и коефициент на вариация, според конкретния случай, за следните крайни точки:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         доказателство, че при контролите е изпълнен стандартът за приемливост по отношение на общата преживяемост за изпитваните видове (допълнение 2);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         данни за смъртността на всеки стадий (ембрион, ларва и ювенилен екземпляр) и кумулативна смъртност;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         дни до излюпването, брой на ларвите, които се излюпват всеки ден, и край на излюпването;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         брой на здравите риби в края на изпитването;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         данни за дължината (посочва се дали е стандартна или обща) и теглото на преживелите животни;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         срещане, описание и брой на морфологичните аномалии, ако има такива;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         срещане, описание и брой на въздействията върху поведението, ако има такива;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         подход за статистическия анализ (регресионен анализ или дисперсионен анализ) и обработката на данните (използван статистически тест или модел);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         концентрация без наблюдавано въздействие (NOEC) за всеки оценен отклик;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         най-ниска концентрация, при която се наблюдава ефект (LOEC) (при р = 0,05) за всеки оценен отклик;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ECx а всеки оценен отклик, ако е приложимо, и доверителен интервал (напр. 90 % или 95 %) и графика на изгладения модел, използван за нейното изчисляване, наклон на кривата концентрация-отклик, формула на регресионния модел, очакваните параметри на модела и техните стандартни грешки.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Всякакви отклонения от метода за изпитване:
                                             
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Обсъждане на резултатите, включително всякакво влияние на отклонения от метода за изпитване върху резултата от изпитването.
                                             
                                          
                                       
                                    Таблица 1
                                 
                                 
                                    Видове риби, които се препоръчват за изпитване
                                 
                                 
                                             СЛАДКОВОДНИ
                                          
                                          
                                             ЕСТУАРНИ и МОРСКИ
                                          
                                       
                                             
                                                Oncorhynchus mykiss
                                             
                                             Дъгова пъстърва
                                          
                                          
                                             
                                                Cyprinodon variegatus
                                             
                                             Cyprinodon variegatus
                                          
                                       
                                             
                                                Pimephales promelas
                                             
                                             Pimephales promelas
                                          
                                          
                                             Menidia sp.
                                             Атерина
                                          
                                       
                                             
                                                Danio rerio
                                             
                                             Зеброво данио
                                          
                                          
                                              
                                          
                                       
                                             
                                                Oryzias latipes
                                             
                                             Японска оризия или Медака
                                          
                                          
                                              
                                          
                                       
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.171, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88. 26 pp.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Brauhn, J.L. and R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Brungs, W.A. and B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Глава В.20 от настоящото приложение, Изпитване за размножаване на Daphnia magna.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Hansen, D.J. and P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer and J.L. Hamelink), ASTM STP 634.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Gonzalez-Doncel, M. et al (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C..
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Oris, J.T., S.C. Belanger, and A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 — 376.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Dunnett C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096-1121.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Rand, G.M. and S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 McClave, J.T., J.H. Sullivan and J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Дължина на тялото до развилката на опашната перка (FL): отнася се за дължина от върха на муцуната до края на средните лъчи на опашната перка и се използва при риби, при които е трудно да посочи краят на гръбначния стълб (www.fishbase.org)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Стандартна дължина (SL): отнася се за дължина на рибата, измервана от върха на муцуната до задния край на последния прешлен или до задния край на средно-страничната част на подопашната става. По-просто казано, това измерване изключва дължината на опашната перка. (www.fishbase.org)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Обща дължина (TL): отнася се за дължина от върха на муцуната до върха на по-дългият дял от опашната перка, обикновено измерван чрез притискане на дяловете по дължината на страничната линия. Това е измерване по права линия, не се измерва по контура на тялото (www.fishbase.org)
                                    
                                       Фигура 1
                                    
                                    
                                       Описание на използваните различни дължини
                                    
                                    
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Химикал: вещество или смес.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       ECx: (концентрация, при която се наблюдава х % от въздействието) е концентрацията, която причинява х % от дадено въздействие върху изпитвани организми в рамките на даден период на експозиция, при сравнение с контрола. Например EC50 е концентрация, за която е направена оценка, че предизвиква дадено въздействие върху изпитвана крайна точка в 50 % от експонираната популация в рамките на определен период на експозиция.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Изпитван химикал: всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Най-ниска концентрация, при която се наблюдава ефект (LOEC) е най-ниската изпитвана концентрация на изпитван химикал, при която за химикала се наблюдава статистически значимо въздействие (при p < 0,05) в сравнение с контролата. Независимо от това, всички изпитвани концентрации над LOEC трябва да имат вредно въздействие, равно или по-голямо от наблюдаваното при LOEC. Когато тези две условия не могат да бъдат удовлетворени, трябва да се даде цялостно обяснение за това как е била избрана LOEC (и следователно NOEC). В допълнения 5 и 6 се предоставят насоки.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Концентрацията без наблюдавано въздействие (NOEC) е изпитваната концентрация непосредствено под LOEC, която при сравнение с контролата няма статистически значимо въздействие (р < 0,05) в рамките на даден период на експозиция.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       UVCB: Вещества с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологични материали.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry (Международен съюз по чиста и приложна химия).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       SMILES: Спецификация за опростено линейно въвеждане на молекули (Simplified Molecular Input Line Entry Specification).
                                 
                              
                     
                        Допълнение 2
                        
                           УСЛОВИЯ ЗА ИЗПИТВАНЕ, ПРОДЪЛЖИТЕЛНОСТ И КРИТЕРИИ ЗА ПРЕЖИВЯЕМОСТ ПРИ ПРЕПОРЪЧАНИТЕ ВИДОВЕ
                        
                        
                                    ВИДОВЕ
                                 
                                 
                                    УСЛОВИЯ НА ИЗПИТВАНЕ
                                 
                                 
                                    ПРЕПОРЪЧИТЕЛНА ПРОДЪЛЖИТЕЛНОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО
                                 
                                 
                                    Типична минимална средна обща дължина на контролните риби в края на изследването (mm) (98)
                                    
                                 
                                 
                                    ПРЕЖИВЯЕМОСТ ПРИ КОНТРОЛИТЕ (минимална)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Температура (°C)
                                 
                                 
                                    Соленост (0/00)
                                 
                                 
                                    Период на излагане на светлина (часове)
                                 
                                 
                                    при излюпването
                                 
                                 
                                    след излюпването
                                 
                              
                                    
                                       Сладководни:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oncorhynchus mykiss
                                       
                                    
                                    Дъгова пъстърва
                                 
                                 
                                    10 ± 1,5 (99)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12 – 16 (100)
                                    
                                 
                                 
                                    2 седмици след хранене ad libitum на контролите (или 60 дни след излюпване)
                                 
                                 
                                    40
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Pimephales promelas
                                       
                                    
                                    Pimephales promelas
                                 
                                 
                                    25 ± 1,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    16
                                 
                                 
                                    32 дни след началото на изпитването (или 28 дни след излюпване)
                                 
                                 
                                    18
                                 
                                 
                                    70 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Danio rerio
                                       
                                    
                                    Зеброво данио
                                 
                                 
                                    26 ± 1,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12 – 16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    30 дни след излюпване
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    70 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oryzias latipes
                                       
                                    
                                    Японска оризия или Медака
                                 
                                 
                                    25 ± 2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12– 16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    30 дни след излюпване
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                              
                                    
                                       Естуарни и Морски:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Cyprinodon variegatus
                                       
                                    
                                    Cyprinodon variegatus
                                 
                                 
                                    25 ± 1,5
                                 
                                 
                                    15-35 (102)
                                    
                                 
                                 
                                    12 – 16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    32 дни след началото на изпитването (или 28 дни след излюпване)
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                              
                                    
                                       Menidia sp.
                                    
                                    Атерина
                                 
                                 
                                    22 – 25
                                 
                                 
                                    15-35 (102)
                                    
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    28 дни
                                 
                                 
                                    20
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                                 
                                    60 %
                                 
                              
                              
                     
                        Допълнение 3
                        
                           НАСОКИ ЗА ХРАНЕНЕ И БОРАВЕНЕ ЗА ЖИВОТНИТЕ ЗА РАЗВЪЖДАНЕ И ЖИВОТНИТЕ ЗА ИЗПИТВАНЕ ОТ ПРЕПОРЪЧВАНИТЕ ВИДОВЕ
                        
                        
                                    ВИДОВЕ
                                 
                                 
                                    ХРАНА (*9)
                                    
                                 
                                 
                                    ВРЕМЕ НА ПРЕХВЪРЛЯНЕ СЛЕД ИЗЛЮПВАНЕ
                                 
                                 
                                    ВРЕМЕ ДО ПЪРВОТО ХРАНЕНЕ
                                 
                              
                                    Риби за размножаване
                                 
                                 
                                    Новоизлюпени ларви
                                 
                                 
                                    Ювенилни екземпляри
                                 
                              
                                    Тип
                                 
                                 
                                    Честота
                                 
                              
                                    
                                       Сладководни:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oncorhynchus mykiss
                                       
                                    
                                    Дъгова пъстърва
                                 
                                 
                                    храна за пъстърва
                                 
                                 
                                    Няма (1)
                                    
                                 
                                 
                                    стартова храна за пъстърва науплии от артемии (BSN)
                                 
                                 
                                    2-4 пъти на ден
                                 
                                 
                                    14-16 дни след излюпване или при изплуване (не е от съществено значение)
                                 
                                 
                                    19 дни след излюпване, или при изплуване
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Pimephales promelas
                                       
                                    
                                    Pimephales promelas
                                 
                                 
                                    науплии от артемии, храна във вид на люспи замразени артемии
                                 
                                 
                                    науплии от артемии
                                 
                                 
                                    науплии от артемии, храна във вид на люспи
                                 
                                 
                                    2-3 пъти на ден
                                 
                                 
                                    след като излюпването е 90 %
                                 
                                 
                                    2 дни след излюпването
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Danio rerio
                                       
                                    
                                    Зеброво данио
                                 
                                 
                                    науплии от артемии, храна във вид на люспи
                                 
                                 
                                    храна от ларви от търговската мрежа, протозоа (2), белтъци (3)
                                    
                                 
                                 
                                    BSN48, храна във вид на люспи
                                 
                                 
                                    BSN веднъж дневно; храна във вид на люспи два пъти дневно
                                 
                                 
                                    след като излюпването е 90 %
                                 
                                 
                                    2 дни след излюпването
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oryzias latipes
                                       
                                    
                                    Японска оризия или Медака
                                 
                                 
                                    храна във вид на люспи
                                 
                                 
                                    BSN, храна във вид на люспи (или протозоа или ротатории)
                                 
                                 
                                    BSN48, храна във вид на люспи (или ротатории)
                                 
                                 
                                    BSN веднъж дневно; храна във вид на люспи два пъти на ден или храна във вид на люспи и ротатории веднъж на ден
                                 
                                 
                                    не е приложимо.
                                 
                                 
                                    6-7 дни след хвърляне на хайвера
                                 
                              
                                    
                                       Естуарни и Морски:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Cyprinodon variegatus
                                       
                                    
                                    Cyprinodon variegatus
                                 
                                 
                                    науплии от артемии, храна във вид на люспи замразени артемии
                                 
                                 
                                    науплии от артемии (BSN)
                                 
                                 
                                    BSN48
                                 
                                 
                                    2-3 пъти на ден
                                 
                                 
                                    не е приложимо.
                                 
                                 
                                    1 ден след излюпване/при изплуване
                                 
                              
                                    
                                       Menidia sp.
                                    
                                    Атерина
                                 
                                 
                                    науплии от артемии, храна във вид на люспи
                                 
                                 
                                    науплии от артемии (BSN)
                                 
                                 
                                    BSN48
                                 
                                 
                                    2-3 пъти на ден
                                 
                                 
                                    не е приложимо
                                 
                                 
                                    1 ден след излюпване/при изплуване
                                 
                              
                              
                     
                        Допълнение 4
                        
                           НЯКОИ ХИМИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПРИЕМЛИВА ВОДА ЗА РАЗРЕЖДАНЕ
                        
                        
                                    Компонент
                                 
                                 
                                    Гранична концентрация
                                 
                              
                                    Твърди частици
                                 
                                 
                                    5 mg/l
                                 
                              
                                    Общ органичен въглерод
                                 
                                 
                                    2 mg/l
                                 
                              
                                    Нейонизиран амоняк
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Остатъчен хлор
                                 
                                 
                                    10 μg/l
                                 
                              
                                    Общо органофосфорни пестициди
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Общо органохлорни пестициди плюс полихлорирани бифенили
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Общ органичен хлор
                                 
                                 
                                    25 ng/l
                                 
                              
                                    Алуминий
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Арсен
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Хром
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Кобалт
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Мед
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Желязо
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Олово
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Никел
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Цинк
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Кадмий
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Живак
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Сребро
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                     
                        Допълнение 5
                        
                           СТАТИСТИЧЕСКИ НАСОКИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА NOEC
                        
                        
                           Общи положения
                        
                        Единицата за анализ е съдът с повторение. Следователно, по отношение на непрекъснатите измервания, като например размера, следва да бъде изчислена средната стойност или медианата за повторението и тези стойности от повторението са данните за анализ. Мощността на използваните статистически тестове трябва да бъде доказана, за предпочитане въз основа на достатъчна база с данни от предходни периоди за всяка лаборатория. Статистическият тест, който ще се използва, следва за всяка крайна точка да предоставя въздействие върху размера, което може да бъде открито със 75-80 % мощност.
                        Базите данни, налични към момента на разработване на настоящия метод за изпитване, установяват възможната мощност според препоръчаните статистически процедури. Индивидуалната лаборатория следва да докаже способността си да изпълни това изискване за мощност или чрез извършване на свой собствен анализ на мощността, или като докаже, че коефициентът на вариация (CV) за всеки отклик не надвишава 90-ия процентил от коефициентите на вариация, използвани при разработването на насоките за изпитване. Тези коефициенти на вариация са дадени в таблица 1. Ако за дадено повторение са налични само средни стойности или медиани, коефициентът на вариация в рамките на повторението може да бъде игнориран.
                        
                           Таблица 1
                        
                        
                           90-и процентил на CV за избрани сладководни видове
                        
                        
                                    Животински вид
                                 
                                 
                                    Отклик
                                 
                                 
                                    CV между повторенията
                                 
                                 
                                    CV в рамките на повторението
                                 
                              
                                    Дъгова пъстърва
                                 
                                 
                                    Дължина
                                 
                                 
                                    17,4
                                 
                                 
                                    9,8
                                 
                              
                                    Тегло
                                 
                                 
                                    10,1
                                 
                                 
                                    28
                                 
                              
                                    Pimephales promelas
                                 
                                 
                                    Дължина
                                 
                                 
                                    16,9
                                 
                                 
                                    13,5
                                 
                              
                                    Тегло
                                 
                                 
                                    11,7
                                 
                                 
                                    38,7
                                 
                              
                                    Зеброво данио
                                 
                                 
                                    Дължина
                                 
                                 
                                    43,7
                                 
                                 
                                    11,7
                                 
                              
                                    Тегло
                                 
                                 
                                    11,9
                                 
                                 
                                    32,8
                                 
                              За почти всички статистически тестове, използвани за оценка на лабораторни токсикологични изследвания, представляващите интерес сравнения са на третирани групи спрямо контроли. Поради това не е целесъобразно да се изисква ANOVA F-тест за значимост преди да се използват тестовете на Дънет или на Уйлямс, нито тест на Кръскал-Уолис за значимост, преди да се използва тест на Йонкхере-Терпстра, тест на Ман-Уитни или тест на Дън (Hochberg and Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964).
                        Тестът на Дънет има вградена настройка за множествени сравнения и използването на F-теста като референтен се отразява неблагоприятно на неговите неверни положителни и неверни отрицателни резултати. По подобен начин, тестовете на Уйлямс със стъпка назад и на Йонкхере-Терпстра, като се използва 0,05 ниво на значимост при всяка стъпка, запазват общо 5 % неверни положителни резултати и използването на F-теста или теста на Кръскал-Уолис като референтен се отразява неблагоприятно на този процент и на мощността на теста. На тестовете на Ман-Уитни и на Дън трябва да се направи корекция за множественост, като се препоръчва корекцията на Бонферони-Холм.
                        Задълбочено обсъждане за повечето от препоръките за тестване на хипотези и проверка на допусканията, на които се основават тези тестове, се съдържа в OECD (2006), който съдържа също и обширна библиография.
                        
                           Третиране на контролите при използване на разтворител
                        
                        Ако се използва разтворител, следва да бъдат включени както контрола на вода за разреждане, така и контрола на разтворител. Двете контроли следва да се сравняват за всеки отклик и да се обединят за статистическия анализ, ако не се установи значима разлика между контролите. В противен случай за определянето на NOEC или за оценката на ECx следва да се използва контролата на разтворител, а контролата на вода за разреждане не се използва. Вж. ограничение в критериите за валидност (точка 7)
                        За дължина, тегло, дял на излюпени хайверни зърна или смъртност при ларви, или ларви с аномалии, и първи или последен ден на излюпване или изплуване следва да се използва T-тест или тест на Ман-Уитни за сравняване на контролата на вода за разреждане с контролата на разтворител, при 0,05 ниво на значимост, като се игнорират всички третирани групи. Резултатите от тези тестове следва да се протоколират.
                        
                           Размери (дължина и тегло)
                        
                        Стойностите на дължината и теглото на отделната риба могат да са с нормално или log-нормално разпределение. Във всички случаи средните стойности от повторение като тенденция са с нормално разпределение по силата на централната гранична теорема и както е потвърдено от данни от над 100 изследвания, отнасящи се до влияние върху ранни стадии от жизнения цикъл за три сладководни вида. Като алтернатива, когато данните или базите данни за предходни периоди предполагат log-нормално разпределение за стойностите на дължината на отделната риба, могат да се изчислят логаритмите на средните стойности от повторение за отделната риба и след това данните за анализа могат да бъдат антилогаритмите на тези логаритми на средните стойности от повторение.
                        Данните следва да бъдат оценени за съвместимост с нормалното разпределение и хомогенност на дисперсията. За тази цел следва да се използват остатъците от ANOVA модел, с концентрацията като единствена независима променлива. За визуално определяне могат да бъдат използвани диаграми на разсейване и хистограми или диаграми „стъбло с листа“. Като алтернатива може да се използва формален тест, като тестовете на Шапиро-Уилк или на Андерсън-Дарлинг. Съгласуваността с хомогенност на дисперсията може да бъде оценена визуално чрез оглед на същата диаграма на разсейване, или формално с теста на Левин. Оценката за нормалност и хомогенност на дисперсията е необходима само за параметрични тестове (напр. на Уйлямс, Дънет).
                        Следва да се обърне внимание на евентуални стойности, силно различаващи се от нормалните, и тяхното въздействие върху анализа. Могат да бъдат използвани тестът на Тюки за стойности, силно различаващи се от нормалните, и визуална инспекция на същите графики на остатъците, описани по-горе. Следва да се припомни, че наблюденията представляват цели повторения, поради което изпускане на стойности, силно различаващи се от нормалните, следва да се извършва само след внимателно разглеждане.
                        Статистическите тестове, които се възползват от характеристиките на плана на опита и очакванията от биологична гледна точка, са трендовите тестове със стъпка назад, като тест на Уйлямс и тест на Йонкхере-Терпстра. Тези тестове допускат монотонна концентрация-отклик и данните трябва да бъдат оценени за съвместимост с това допускане. Това може да бъде направено визуално от диаграма на разсейване на средните от изпитване спрямо изпитваната концентрация. От полза ще е припокриването на тази диаграма на разсейване със сегментирана линейна диаграма, която свързва средните стойности на концентрацията, претеглени с размера на пробата от повторението. Голямо отклонение на тази сегментирана линейна диаграма от монотонността сочи възможна необходимост от използване на тестове, различни от трендовите. Като алтернатива могат да се използват формални тестове. Прост формален тест представлява да се изчислят линейните и квадратните контрасти на концентрационните средни. Ако квадратният контраст е значим, а линейният контраст не е значим, това е показател за възможен проблем, свързан с монотонността, който следва да бъде допълнително оценен от диаграми. Когато нормалността и хомогенността на дисперсията може да представляват проблем, тези контрасти могат да бъдат построени от данни, трансформирани чрез подреждане по рангова скала. Може да се използват алтернативни процедури, като например теста на Бартоломю за монотонността, но те увеличават сложността.
                        
                           Фигура 2
                        
                        
                           Схема за NOEC — размери (дължина и тегло)
                        
                        Освен ако данните не са съгласувани с допусканията за тези тестове, NOEC се определя чрез прилагане със стъпка назад на тест на Уйлямс или на тест на Йонкхере-Терпстра. OECD (2006) дава подробна информация за тези процедури. За данните, които не са в съответствие с изискванията за трендов тест със стъпка назад, може да се използва тест на Дънет или тест на Тамхане-Дънет (T3), като и двата имат вградена корекция за множественост. Тези тестове допускат нормалност, в случая с теста на Дънет — хомогенност на дисперсията. Когато тези условия не са изпълнени, може да бъде използван непараметричният тест на Дън. OECD (2006) съдържа подробна информация за всички тези тестове. Фигура 2 дава обзор как да се избере тест.
                        
                           Излюпване на хайверните зърна и преживяване на ларвите
                        
                        Данните са делът на излюпените хайверни зърна или на ларвите, които преживяват в отделните повторения. Тези дялове трябва да бъдат оценени за дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение, която се среща често, но не е универсална при такива измервания. Схемата във фигура 3 е насока за избор на тест; вж. текста за подробни описания.
                        Обикновено се използват два теста. Това са C(α)-тестът на Тарон (Tarone, 1979) и хи-квадрат тестовете, всеки от тях се прилага поотделно за всяка изпитвана концентрация. Ако дори само в една изпитвана концентрация се установи дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение, следва да се използват методи, които са съобразени с това.
                        
                           Формула 1
                        
                        
                           C(α)-тест на Тарон (Tarone, 1979)
                        
                        
                           
                        където ̂ е средният дял за дадена концентрация, m е броят на съдовете с повторения, nj
                            е броят на субектите в повторение j, а xj
                            е броят на представляващите отклик субекти в това повторение, например неизлюпените или мъртвите. Този тест се прилага поотделно за всяка изпитвана концентрация. Този тест може да се разглежда като коригиран хи-квадрат тест, но ограниченото симулиране на мощността, извършено от Тарон, показа че той е с по-голяма мощност от тази на хи-квадрат теста.
                        
                           Фигура 3
                        
                        
                           Схема за NOEC — излюпени хайверни зърна и смъртност при ларви
                        
                        Когато няма значими доказателства за дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение, може да се използва тестът на Кокрън-Армитидж със стъпка назад. Този тест игнорира повторенията, поради което, когато съществуват такива доказателства, се препоръчва корекцията на Рао-Скот на теста на Кокрън-Армитидж (RSCA), която отчита повторенията, размерите при повторенията и дисперсията, по-голяма от очакваната при биномно разпределение. Алтернативни тестове са тестовете на Уйлямс със стъпка назад и на Йонкхере-Терпстра и тестът на Дънет, както е описан във връзка с измерването на размери. Тези тестове се прилагат независимо от това дали има или няма дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение, но са с малко по-малка мощност (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao and Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996).
                        
                           Първи или последен ден на излюпване или изплуване
                        
                        Откликът е цяло число, даващо деня от изпитването, в който се наблюдава посоченото наблюдение за даден съд с повторение. Диапазонът от стойности като цяло е доста ограничен и често има висок процент на свързани стойности, напр. еди и същ първи ден на излюпване се наблюдава във всички контролни повторения и, може би, в една или две ниски концентрации на изпитване. Параметрични тестове, като тези на Уйлямс и на Дънет, не са подходящи за такива данни. Освен в случаите, когато има доказателства за сериозна немонотонност, тестът на Йонкхере-Терпстра със стъпка назад е с голяма мощност за откриване на въздействия на изпитвания химикал. В противен случай може да бъде използван тест на Дън.
                        
                           Аномалии на ларви
                        
                        Откликът е броят на ларвите с някакви аномалии. Често този отклик е рядко срещан и има някои от същите проблеми като първия ден на излюпване, като също така понякога показва колебания концентрация-отклик. Ако данните поне приблизително следват монотонна концентрационна форма, тестът на Йонкхере-Терпстра със стъпка назад е мощен при откриване на въздействия. В противен случай може да бъде използван тест на Дън.
                        ПОЗОВАВАНИЯ
                        Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken.
                        Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121.
                        Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252.
                        Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491.
                        Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648.
                        Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454.
                        Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York.
                        Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton.
                        Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133.
                        Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London.
                        OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris..
                        Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) — A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585.
                        Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) — A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385.
                        Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988); Order restricted statistical inference, Wiley.
                        Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590.
                        Williams D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117.
                        Williams D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531.
                        Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949-952.
                        Williams D.A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14.
                     
                     
                        Допълнение 6
                        
                           СТАТИСТИЧЕСКИ НАСОКИ ЗА ОЦЕНКИ ОТ РЕГРЕСИЯ
                        
                        
                           Общи положения
                        
                        Наблюденията, използвани за изглаждане на модел, са средните стойности от повторение (дължина и тегло) или дяловете в повторение ( излюпени хайверни зърна и смъртност при ларви) (OECD 2006).
                        Обикновено се препоръчва използването на претеглена регресия с тегло размерът на извадката от повторението. Възможни са други схеми за претегляне, като претегляне от прогнозна средна стойност на отклика, или комбинация от това и размера на извадката от повторението. Претегляне чрез реципрочната стойност на дисперсията в извадката при определена концентрация не се препоръчва (Bunke et al. 1999, Seber and Wild, 2003, Motulsky and Christopoulos 2004, Huet et al. 2003).
                        Всяка трансформация на отклиците преди анализа следва да запази независимостта на наблюденията и ECх и нейните доверителни граници следва да бъдат изразени в оригиналните мерни единици, а не в преобразувани единици. Например, 20 % изменение в логаритъма на дължината не е еквивалентно на 20 % изменение в дължината (Lyles et al. 2008, Draper and Smith 1999).
                        Схемата във фигура 4 представя преглед на оценките на ECx. Подробностите са описани в текста по-долу.
                        
                           Фигура 4
                        
                        
                           Схема за оценка на ECx за средна дължина, средно тегло или дял на излюпени хайверни зърна или смъртност от повторение, вж. текста за повече подробности
                        
                        
                           Съображения относно излюпени хайверни зърна и смъртност при ларви
                        
                        При излюпените хайверни зърна и смъртността при ларви като цяло най-добро е изглаждането с модел с намаляване, освен ако не се изглажда с probit модел, както е описано по-долу. Т.е. следва да се моделира делът на хайверните зърна, които не се излюпват, или ларвите, които умират. Причината за това е, че ECx означава концентрация, при която е налице изменение, равно на х % от средната стойност на отклика в контролата. Ако в контролата има 5 % хайверни зърна, които не се излюпват, и се моделира липсата на излюпване, тогава ЕС20 означава концентрация, при която е налице изменение, равно на 20 % от 5-те % хайверни зърна в контролата, които не се излюпват, и това е изменение от 0,2*0,05=0,01, или 1 процентен пункт, до 6 % хайверни зърна, които не се излюпват. Такова малко изменение не може да бъде оценено по никакъв смислен начин от наличните данни и не е с важно биологично значение. Докато ако се моделира делът на излюпените хайверни зърна, делът между контролите ще бъде 95 % в този пример и 20 % намаление от средната стойност в контролите би било изменение на 0,95*0,2=0,18, т.е. от 95 % излюпени на 77 % (= 95-18) излюпени и концентрацията, водеща до такова въздействие, може да бъде оценена и е вероятно да е от по-голям интерес. Това не е въпрос с измерванията на размера, въпреки че неблагоприятните въздействия върху размера по принцип означават намаляване на размера.
                        
                           Модели за размер (дължина или тегло) и процент на излюпване или преживяване на ларвите.
                        
                        С изключение на хорметичния модел на Brain-Cousеns, всички тези модели са описани и препоръчвани в OECD (2006). Т.нар. ОИСР 2-5 също се обсъждат при опити за екотоксичност в Slob (2002). Съществуват, разбира се, много други модели, които биха могли да бъдат полезни. В Bunke et al. (1999) са изброени множество модели, които не са включени тук, и са дадени многобройни препратки към други модели. Изброените по-долу се предлагат като особено подходящи и широко използвани при опити за екотоксичност.
                        
                           С 5 концентрации на изпитване, плюс контрола
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Bruce-Versteeg
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Обикновен експоненциален (ОИСР 2)
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Експоненциален с параметър, определящ формата (ОИСР 3)
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Обикновен експоненциален с долна граница (ОИСР 4)
                                 
                              
                           С 6 концентрации на изпитване, плюс контрола
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Експоненциален с параметър, определящ формата, и долна граница (ОИСР 5)
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Michaelis-Menten
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Hill
                                 
                              Когато има видими следи от хормезис (малко вероятно при процента на излюпване или преживяването на ларвите, но понякога се наблюдава при наблюденията на размерите)
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    хорметичен Brain-Cousеns; Brain and Cousens (1989)
                                 
                              
                           Алтернативни модели за процента на неизлюпване и смъртността на ларвите
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Моделите с увеличаване за тези отклици могат да бъдат пригодени чрез probit (или логистични) модели, ако липсват доказателства за дисперсия, по-голяма от очакваната при биномно разпределение, и честотата в контролите е оценена в пригодността на модела. Това не е предпочитаният метод, тъй като той третира индивида, а не повторението, като единица за анализ (Morgan 1992, O'Hara Hines and Lawless 1993, Collett 2002, 2003).
                                 
                              
                           Съответствие (goodness of fit) на единствен модел
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Визуално се сравняват наблюдаваното и прогнозираното процентно намаление при всяка изпитвана концентрация (Motulsky and Christopoulos 2004, Draper and Smith 1999).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Сравнява се средният квадрат на грешката от регресията със средния квадрат на чистата грешка, с помощта на F-тест (Draper and Smith 1999).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Проверява се дали всички компоненти на модел се различават значимо от нула (т.е. определя се дали всички компоненти на модела са важни (Motulsky and Christopoulos 2004).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Точки с остатъците от регресията спрямо изпитваната концентрация, евентуално върху скала log(конц.). Не следва да има никакъв модел за тази диаграма; точките следва да бъдат случайно разпръснати около хоризонтална линия на височина нула.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Данните трябва да бъдат оценени за нормалност и хомогенност на дисперсията по същия начин, както е посочено в допълнение 5.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Освен това нормалността на остатъците в регресионния модел следва да бъде оценена, като се използват същите методи, посочени в допълнение 5 за остатъците от ANOVA
                                 
                              
                           Сравняване на модели
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Използват се коригираните информационни критерии на Акайке (AICc). По-малките стойности на AICc означават по-добра съгласуваност и ако AICc(B)-AICc(A)≥10, модел A почти със сигурност е по-добър от модел B (Motulsky and Christopoulos (2004).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Двата модела се сравняват визуално по отношение на тяхната степен на изпълнение на горепосочените критерии за единствен модел.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Препоръчва се прилагането на принципа на простотата, съгласно който се използва най-простият модел, който се съгласува сравнително добре с данните (Ratkowsky 1993, Lyles et.al 2008).
                                 
                              
                           Качество на оценката на ECx
                           
                        
                        Доверителният интервал (CI) за ECx следва да не бъде прекомерно широк. Необходима е статистическа преценка при вземането на решение за това колко широк може да е доверителния интервал, така че стойността ECx да запази полезността си. Симулации на регресионни модели, съгласувани с данни за излюпването на хайверни зърна и за размерите показват, че около 75 % от доверителните интервали за ECx (x = 10, 20 или 30) обхващат не повече от две концентрации на изпитване. Това дава общи насоки относно какво е приемливо, и практически насоки относно какво е постижимо. Много автори твърдят, че е необходимо да се протоколират доверителните интервали за всички параметри на модела, и че широките доверителни интервали за параметрите на модела показват неприемливи модели (Ott and Longnecker 2008, Alvord and Rossio 1993, Motulsky and Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber and Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005).
                        CI за ECx (или всеки друг параметър на модела) следва да не съдържа нула (Motulsky and Christopoulos 2004). В регресионните модели той е еквивалентен на минималната значима разлика, която често се посочва в подходите с тестване на хипотези (напр. Wang et al 2000). Той също така съответства на това доверителният интервал за средните отклици при LOEC да не съдържа средната стойност на контролата. Следва да се зададе въпросът дали оценките на параметъра са научно достоверни. Например ако доверителният интервал за y0 е ± 20 %, оценката за EC10 не е достоверна. Ако моделът предвижда 20 % въздействие при концентрация със стойност C и наблюдаваното максимално въздействие при тази и при по-ниски стойности на концентрацията е 10 %, тогава EC20 не е достоверна (Motulsky and Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005).
                        ECx следва да не изисква екстраполация извън обхвата от положителни концентрации (Draper and Smith 1999, OECD 2006). Например, обща насока за стойността на ECx може да е, че тя не трябва превишава около 25 % под най-ниската изпитвана концентрация, или над най-високата изпитвана концентрация.
                        ПОЗОВАВАНИЯ
                        Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163.
                        Brain P. and Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93-96.
                        Bunke, O., Droge, B. and Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240.
                        Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London.
                        Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London.
                        Draper, N.R. and Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons.
                        Environment Canada (2005); Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46
                        Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York.
                        Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, and C.R. Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878–886.
                        Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London.
                        Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA.
                        O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121
                        OECD (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.
                        Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA
                        Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199.
                        Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003
                        Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312
                        Wang, Q., D.L. Denton, and R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000.
                     
                     В.48   Краткосрочно изследване на размножаването при риби
                     
                     ВЪВЕДЕНИЕ
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 229 (2012). Необходимостта от разработване и валидиране на изследване, позволяващо откриване на ендокринно активни химикали, произлиза от загрижеността, че нивата на химикали в околната среда могат да причинят неблагоприятни въздействия както за хората, така и за дивата флора и фауна, поради взаимодействието на тези химикали с ендокринната система. През 1998 г. ОИСР стартира с висок приоритет дейност по преразглеждане на съществуващите Насоки за изпитване и по разработване на нови Насоки за изпитване за скрининг и изпитвания за потенциални нарушители на функциите на ендокринната система. Един от елементите на дейността бе да се разработи насока за изпитване за скрининг на химикали, активни в ендокринната система на риби. Краткосрочното изследване на размножаването при риби премина през обширна програма за валидиране, състояща се от междулабораторни изследвания с подбрани химикали, за доказване уместността и надеждността на изследването за откриване на химикали, които оказват въздействие върху размножаването при риби чрез различни механизми, в това число ендокринни механизми (1, 2, 3, 4, 5). Всички крайни точки на насоките за изпитване на ОИСР са валидирани за Pimephales promelas, и поднабор от крайни точки е валидиран за японската оризия (т.е. вителогенин и вторични полови белези) и за зебровото данио (т.е. вителогенин). Работата по валидирането е преминала през партньорска проверка от група от експерти, назначени от националните координатори на Програмата на ОИСР за насоки за изпитване (6) частично, и от независима група експерти по поръчка на Американската агенция за защита на околната среда (29). Изследването не е предназначено за идентифициране на специфични механизми на хормонални нарушения, тъй като изпитваните животни имат интактна хипоталамус-хипофиза-гонадна ос (ХХГ ос), която може да реагира на химикали, оказващи въздействие върху ХХГ оста на различни равнища.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Настоящият метод за изпитване описва скринингово изследване in vivo, при което полово зрели мъжки и хвърлящи хайвер женски индивиди се държат заедно и се експонират на даден химикал през ограничена част от жизнения им цикъл (21 дни). При приключване на 21-дневния период на експозиция като крайни точки се измерват два биомаркера в мъжки и женски индивиди, в качеството им на показатели за ендокринна активност на изпитвания химикал; тези крайни точки са вителогенин и вторични полови белези. Вителогенин се измерва в Pimephales promelas, японска оризия и зеброво данио, докато вторични полови белези се измерват в Pimephales promelas и японска оризия. Освен това плодовитостта в количествено отношение се наблюдава ежедневно по време на изпитването. Гонадите също се запазват и хистопатологията може да бъде оценена за определяне на репродуктивното здраве на изпитваните животни и за увеличаване на тежестта на доказателствата от други крайни точки.
                              
                           
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Това биологично изследване служи като скринингово изследване in vivo на репродукцията и неговото прилагане следва да се разглежда в контекста на „Концептуалната рамка на ОИСР за изпитване и оценка на химикали, нарушаващи функциите на ендокринната система“ (30). В тази концептуална рамка краткосрочното изследване на размножаването при риби е предложено в равнище 3 като изследване in vivo, предоставящо данни относно избран(и) ендокринен(ни) механизъм(и)/път(ища).
                              
                           ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Вителогенинът (VTG) обикновено се произвежда от черния дроб на женски яйценосни гръбначни животни в отговор на циркулиращия ендогенен естроген. Той е прекурсор на белтъците в яйчния жълтък и след образуването си в черния дроб преминава в кръвообращението, откъдето стига до яйчника и там се модифицира в образуващия се хайвер. Вителогенинът е почти неоткриваем в плазмата на незрели женски и мъжки риби поради липса на достатъчно циркулиращ естроген; черният дроб обаче може да синтезира и секретира VTG в отговор на външно естрогенно стимулиране.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Измерването на VTG служи за откриване на химикали с различни естрогенни механизми на действие. Откриването на химикали с естрогенно действие е възможно чрез измерване на индуцирането на VTG в мъжки риби, и е много добре документирано в научната литература, преминала през партньорска проверка (напр. (7)). Индуцирането на VTG е доказано и след експозиция на андрогени, които могат да се ароматизират (8, 9). Намаляването на равнището на циркулиращ естроген в женските животни, например посредством инхибиране на ароматазата, превръщаща ендогенния андроген в природния естроген 17β-естрадиол, води до намаляване на нивото на VTG, което се използва за откриване на химикали, притежаващи свойства на инхибитори по отношение на ароматазата (10, 11). Биологичната значимост на отговора с VTG след естрогенно/ароматазно инхибиране е установена и е широко документирана. Възможно е обаче образуването на VTG в женски животни да е също така повлияно от обща токсичност и начини на токсично действие, различни от ендокринните, напр. хепатотоксичност.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Успешно са разработени и стандартизирани за рутинна употреба няколко метода за измерване. Такъв е случаят със специфичните за отделните видове ензимно-свързани имуносорбентни анализи (ELISA), използващи имунохимия за количествено определяне на получавания VTG в малки проби от кръв или черен дроб, взети от отделните риби (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Проби за измерване на VTG се вземат от кръв от Pimephales promelas, кръв или хомогенат глава/опашка от зеброво данио и черен дроб от японска оризия. При японската оризия е налице добра корелация между VTG, измерен от кръв и от черен дроб (19). В допълнение 6 са дадени препоръчителните процедури за събирането на проби за анализ на VTG. Комплектите за измерване на VTG са широко разпространени; такива комплекти следва да се основават на валидиран специфичен за отделните видове ELISA метод.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Вторичните полови белези в мъжки екземпляри от някои видове риби са видими външно, количествено определяеми и чувствителни към нивата на циркулиращите ендогенни андрогени; такъв е случаят с Pimephales promelas и японската оризия, но не и със зебровото данио, което не притежава количествено определяеми вторични полови белези. Женските запазват способността си за развиване на мъжки вторични полови белези, когато са експонирани на андрогенни химикали във вода. В научната литература са на разположение няколко проучвания, документиращи този тип отговор в Pimephales promelas (20) и японската оризия (21). Намаляването при вторични полови белези у мъжките индивиди следва да се тълкува внимателно поради неголямата статистическата мощност, и следва да се основава на експертна оценка и на тежестта на доказателствата. Съществуват ограничения за използването на зебровото данио в настоящото изследване поради липсата на количествено определяеми вторични полови белези, реагиращи на андрогенно активни химикали.
                              
                           
                              
                                 8.
                              
                              
                                 При Pimephales promelas основният показател за външна андрогенна експозиция е броят на размножителните туберкули, разположени по муцуната на женския индивид. При оризията броят на папиларните израстъци представлява основният маркер на екзогенна експозиция на андрогенни химикали при женските риби. Допълнение 5А и допълнение 5Б посочват препоръчваните процедури, които трябва да се спазват при оценката на половите белези съответно при Pimephales promelas и оризията.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 21-дневното изследване на риби включва количествена оценка на получаването на хайверни зърна и запазване на гонадите за незадължително хистопатологично изследване. Някои регулаторни органи могат да изискват тази допълнителна крайна точка за по-пълна оценка на репродуктивното здраве на изпитваните животни, или в случаи, когато при VTG и вторичните полови характеристики не е имало отклик на експозицията на химикала. Въпреки че някои крайни точки могат да са с висока диагностична стойност (напр. индуциране на VTG в мъжки и образуване на туберкули в женски), не всички крайни точки (напр. плодовитост и гонадна хистопатология) в изследването са предназначени за недвусмислено идентифициране на специфични клетъчни механизми на действие. Обратно, наборът от крайни точки, взети заедно, позволява да се правят изводи по отношение на възможни ендокринни смущения и по този начин да се предоставят насоки за по-нататъшно изпитване. Въпреки че не е ендокринно специфична, плодовитостта, поради нейната доказана чувствителност към известните ендокринно активни химикали (5), е важна крайна точка за включване, тъй като когато тя и други крайни точки не са повлияни, това дава по-голяма увереност, че дадено съеднинение е малко вероятно да е ендокринно активно. Въпреки това, когато е засегната, плодовитостта ще допринесе значително за изводите по отношение на тежестта на доказателствата. Насоки за тълкуване на данните и приемането на резултатите от изпитването са предоставени по-нататък в настоящия метод за изпитване.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Определенията, използвани за този метод за изпитване, са дадени в Допълнение 1.
                              
                           ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 В рамките на изследването мъжки и женски риби, способни на размножаване, се експонират заедно в съдове за изпитване. Техният статус на полово зрели и способни на размножаване индивиди позволява ясното разграничаване на половете и следователно дава възможност за свързан с пола анализ на всяка крайна точка, и гарантира тяхната чувствителност към външни химикали. При завършване на изпитването полът се потвърждава с макроскопско изследване на гонадите след отваряне на корема с ножици. Преглед на съответните условия на биологичното изследване е даден в допълнение 2. Изследването обикновено започва с риби, пробовзети от популация, която е в състояние на хвърляне на хайвер; застаряващи индивиди не следва да се използват. Указания относно възрастта на рибите и репродуктивния им статус са дадени в раздела за подбора на риби. Изпитването се провежда, като се използват три концентрации на експозиция на химикал, както и контрола на вода и, ако е необходимо, контрола на разтворител. За зебровото данио се използват два съда или повторения на третиране (всеки съд съдържа 5 мъжки и 5 женски). За Pimephales promelas се използват четири съда или повторения на третиране (всеки съд съдържа 2 мъжки и 4 женски). Това е така с цел приспособяване към териториалното поведение на мъжките при Pimephales promelas, като се поддържа достатъчна мощност на изследването. За оризията се използват четири съда или повторения на третиране (всеки съд съдържа 3 мъжки и 3 женски). Експозицията се провежда в продължение на 21 дни и вземане на проби от риби се извършва на 21-ия ден от експозицията. Плодовитостта в количествено отношение се наблюдава ежедневно.
                              
                           
                              
                                 12.
                              
                              
                                 При вземането на проби на 21-ия ден от експозицията животните се умъртвяват по хуманен начин. Вторичните полови белези се измерват при Pimephales promelas и японската оризия (виж допълнение 5А и допълнение 5Б); кръвни проби за определяне на VTG се вземат от зебровото данио и Pimephales promelas, като алтернатива хомогенат глава/опашка може да се вземе от зебровото данио за определяне на VTG (допълнение 6); черен дроб за анализа на VTG се взема от оризията (допълнение 6). Гонадите се фиксират или цели, или след дисекция, за евентуална хистопатологична оценка (22).
                              
                           КРИТЕРИИ ЗА ПРИЕМАНЕ НА ИЗПИТВАНЕТО
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 За да са приемливи резултатите от изпитването, се прилагат следните условия:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             смъртността в контролите на вода (или на разтворител) не трябва да надвишава 10 % в края на периода на експозиция;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             концентрацията на разтворен кислород трябва да бъде най-малко 60 от стойността на насищане при равновесие с атмосферния въздух (ASV) по време на периода на експозиция;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             температурата на водата трябва да се различава с не повече от ± 1,5 °C между съдовете за изпитване по всяко време на периода на експозиция, и се поддържа в диапазон от 2 °C в рамките на температурните диапазони, посочени за изпитваните видове (допълнение 2).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             следва да бъдат на разположение доказателства, че концентрацията на изпитвания химикал в разтвора е била задоволително поддържана в рамките на ± 20 % от усреднените измерени стойности;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             доказателства, че рибата активно хвърля хайвер във всички повторения преди да започне експозицията на химикала, и в повторенията с контроли по време на изпитването.
                                          
                                       
                           ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
                     
                        Апаратура
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Обикновено лабораторно оборудване и специално следното:
                                 
                                             а.
                                          
                                          
                                             устройства за измерване на съдържанието на кислород и рН-метри;
                                          
                                       
                                             б.
                                          
                                          
                                             оборудване за определяне твърдост и алкалност на водата;
                                          
                                       
                                             в.
                                          
                                          
                                             подходяща апаратура за контрол на температурата и за предпочитане продължителен мониторинг;
                                          
                                       
                                             г.
                                          
                                          
                                             съдове, направени от химически инертни материали и с подходящ капацитет по отношение на препоръчителната гъстота на зареждане и отглеждане (вж. допълнение 2);
                                          
                                       
                                             д.
                                          
                                          
                                             субстрат за хвърляне на хайвер за Pimephales promelas и зебровото данио, допълнение 4 съдържа необходимите подробности;
                                          
                                       
                                             е.
                                          
                                          
                                             подходящи точни везни (т.е. точност до ± 0,5 mg).
                                          
                                       
                           
                        Вода
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Всяка вода, в която изпитваният вид показва съответните признаци за дългосрочно преживяване и растеж, може да се използва като вода за изпитването. Необходимо е постоянно качество на водата по време на изпитването. Стойността на рН на водата следва да е от 6,5 до 8,5, но по време на дадено изпитване трябва да е в диапазон ± 0,5 рН единици. За да се гарантира, че водата за разреждане няма да повлияе неправилно върху резултата от изпитването (например чрез образуване на комплекс с изпитвания химикал), пробите за анализ следва да се вземат на интервали. Следва да се правят измервания за тежки метали (например Cu, Pb, Zn, Hg, Cd и Ni), основни аниони и катиони (например Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– и SO4
                                    2–), пестициди (например общо органофосфорни и общо органохлорни пестициди), общ органичен въглерод и суспендирани частици, например на всеки три месеца, когато се знае, че водата за разреждане има относително постоянно качество. Ако е доказано, че качеството на водата е постоянно най-малко в продължение на една година, определянията могат да се правят по-рядко и могат да се увеличат интервалите (например на всеки шест месеца). Някои от химичните характеристики на приемливата вода за разреждане са изброени в допълнение 3.
                              
                           
                        Разтвори за изпитване
                     
                     
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Разтворите за изпитване при избраните концентрации се приготвят чрез разреждане на изходен разтвор. Изходният разтвор се приготвя за предпочитане чрез просто смесване и разбъркване на изпитвания химикал във водата за разреждане с помощта на механични средства (например разклащане или ултрасонификация). За постигане на подходящо концентриран изходен разтвор могат да се използват колони за насищане (колони за разтворимост). Използването на разтворител за носител не е препоръчително. Независимо от това, в случай че е необходим разтворител, успоредно следва да се проведе изпитване на контрола на разтворител, при същата концентрация на разтворител, като тази при третиранията с химикала. За трудно разтворими изпитвани химикали е възможно разтворителят да бъде технически най-доброто решение; следва да се консултира Ръководството на ОИСР с насоки за изпитване за токсичност във водна среда на трудни вещества и смеси (23). Изборът на разтворител се определя в зависимост от химичните свойства на веществото или сместа. Ръководството на ОИСР препоръчва максимум от 100μl/l, което следва да се спазва. Независимо от това неотдавнашен преглед (24) подчерта допълнителни проблеми при използването на разтворители за изпитване на ендокринна активност. Поради това се препоръчва концентрацията на разтворителя, ако е необходим, да бъде сведена до минимум, когато това е технически осъществимо (в зависимост от физичните и химичните свойства на изпитвания химикал).
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Използва се проточна система за изпитване. Такава система постоянно подава и разрежда изходен разтвор на изпитвания химикал (например система с измерваща помпа, пропорционално разреждащо устройство, сатуратор), за да се подават серии от концентрации към камерите за изпитване. Параметрите на потока на изходния разтвор и водата за разреждане следва да се проверяват на интервали, за предпочитане всеки ден по време на извършването на изпитването, и през това време не следва да се променят с повече от 10 %. Трябва внимателно да се избягва използването на нискокачествени пластмасови тръби или други материали, които могат да съдържат биологично активни химикали. При избора на материали за проточната система трябва да бъде взета под внимание възможна адсорбция на изпитвания химикал върху този материал.
                              
                           
                        Отглеждане на рибата
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Рибата за изпитването следва да се избира от лабораторна популация, за предпочитане от един и същ рибен запас, която е била аклиматизирана в продължение на поне две седмици преди изпитването, при условия, свързани с качеството на водата и осветлението, подобни на тези, използвани при изпитването. Важно е скоростта на зареждане и гъстотата на отглеждане (за определения, виж допълнение 1) да са подходящи за използваните за изпитването видове (вж. допълнение 2).
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 След 48-часов период на свикване се отчита смъртността и се прилагат следните критерии:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             при смъртност, по-голяма от 10 % от популацията за седем дни: отхвърля се цялата партида;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             при смъртност между 5 % и 10 % от популацията: аклиматизация за нови седем дни; ако смъртността е повече от 5 % през вторите седем дни, се отхвърля цялата партида;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             при смъртност по-малко от 5 % от популацията за седем дни: партидата се приема.
                                             
                                          
                                       
                           
                              
                                 20.
                              
                              
                                 По време на аклиматизационния период, в периода преди експозицията или по време на периода на експозиция рибата не следва да бъде лекувана от заболявания.
                              
                           
                        Период преди експозицията и подбор на риби
                     
                     
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Препоръчва се едноседмичен до двуседмичен период преди експозицията, в който животните се поставят в съдове, подобни на съдовете при действителното изпитване. Рибите следва да бъдат хранени ad libitum през време на периода на отглеждане и по време на фазата на експозиция. Фазата на експозиция започва с полово диморфни възрастни риби от лабораторна доставка на зрели животни, способни на размножение (напр. с ясно видими вторични полови белези що се отнася до Pimephales promelas и японската оризия) и активно хвърлящи хайвер. Само за общ ориентир (и без да се разглежда изолирано от наблюдаването на настоящия репродуктивен статус на дадена партида от риби), Pimephales promelas трябва да бъде на възраст приблизително 20 (± 2) седмици, като се приема, че рибите от този вид са били отглеждани при 25 ± 2 °C през жизнения им цикъл. Японската оризия трябва да бъде на възраст приблизително 16 (± 2) седмици, като се приема, че рибите от този вид са били отглеждани при 25 ± 2 °C през жизнения им цикъл. Зебровото данио трябва да бъде на възраст приблизително 16 (± 2) седмици, като се приема, че рибите от този вид са били отглеждани при 26 ± 2 °C през жизнения им цикъл. Получаването на хайверни зърна следва да се оценява ежедневно по време на фазата преди експозицията. Препоръчва се хвърлянето на хайвера да се наблюдава във всички съдове с повторения преди включване във фазата на експозиция от изследването. На този етап не могат да бъдат дадени количествени насоки относно желателното ежедневно получаване на хайверни зърна, но е сравнително обичайно да се наблюдава средно хвърляне на > 10 хайверни зърна/женска/ден за всеки вид. Следва да се използва рандомизиран блоков план в съответствие с получените хайверни зърна, за разпределяне в повторенията на различните опитни равнища, за да се осигури балансирано разпределение при повторенията.
                              
                           ПЛАНИРАНЕ НА ИЗПИТВАНЕТО
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Използват се три концентрации на изпитвания химикал, една контрола (вода) и, ако е необходимо, една контрола на разтворител. Данните могат да бъдат анализирани, за да се определят статистически значими разлики между отклиците в третиранията и контролите. Тези анализи ще дадат информация дали вместо за употреба при оценка на риска, не се изисква по-нататъшно по-дългосрочно изпитване за неблагоприятни последици (а именно преживяване, развитие, растеж и размножение) (25).
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 За зебровото данио, в ден 21 на опита се пробовземат мъжки и женски животни от всяко ниво на третиране (5 мъжки и 5 женски животни във всяко от двете повторения) и от контролата(ите), за измерване на VTG. За оризията, в ден 21 на опита се пробовземат мъжки и женски животни от всяко ниво на третиране (3 мъжки и 3 женски животни във всяко от четирите повторения) и от контролата(ите), за измерване на VTG и вторични полови белези. За Pimephales promelas в ден 21 на опита се пробовземат мъжки и женски животни (2 мъжки и 4 женски животни във всяко от четирите повторения) и от контролата(ите), за измерване на VTG и вторични полови белези. Изисква се количествена оценка на плодовитостта, и гонадните тъкани се фиксират изцяло или им се извършва дисекция за евентуална хистопатологичната оценка, ако се изисква.
                              
                           
                        Избор на концентрации на изпитване
                     
                     
                              
                                 24.
                              
                              
                                 За целите на това изпитване най-високата изпитвана концентрация трябва да се определя от максимално поносимата концентрация (МПК), определена при изпитване за определяне на обхвата, или от други данни за токсичност, или 10 mg/l, или максималната разтворимост във вода, в зависимост от това коя е най-ниска. МПК се определя като най-високата изпитвана концентрация на химикала, която води до по-малко от 10 % смъртност. При използването на този подход се допуска, че са налице емпирични данни за смъртността от остра и друга токсичност, от които може да се оцени МПК. Оценката на МПК може да бъде неточна и обикновено се изисква определена професионална преценка.
                              
                           
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Изискват се три изпитвани концентрации, раздалечени на равни интервали една от друга с кратност, която не надвишава 10, и контрола на вода за разреждане (както и контрола на разтворител, ако е необходимо). Препоръчва се раздалечаване с кратност между 3,2 и 10.
                              
                           ПРОЦЕДУРА
                     
                        Подбор и измерване теглото на изпитваните риби
                     
                     
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Важно е варирането в теглото на рибите в началото на изпитването да се сведе до минимум. Подходящи диапазони на размерите за различните видове, които се препоръчват за използване в настоящото изпитване, са дадени в допълнение 2. За цялата партида от риби, използвани в изпитването, стойностите на индивидуалните тегла в началото на изпитването следва да се запазят в ± 20 % от средноаритметичното тегло на рибите от същия пол. Препоръчва се да се измерва и теглото на подпроба от рибния запас преди изпитването с цел да се оцени средното тегло.
                              
                           
                        Условия на експозиция
                     
                     
                        Продължителност
                     
                     
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Продължителността на изпитването е 21 дни, след период преди експозицията. Препоръчаният период преди експозицията е една до две седмици.
                              
                           
                        Хранене
                     
                     
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Рибите следва да бъдат хранени ad libitum с подходяща храна (допълнение 2) в достатъчно количество за поддържане на телесното състояние. Следва да се полагат грижи за избягване на развитието на микроби и на помътняване на водата. Като обща насока дневната порция може да бъде разделена на две или три равни части за многократно ежедневно хранене, с поне три часа между всяко хранене. Еднократна по-голяма порция е приемлива, особено за съботите и неделите. Даването на храна се прекратява 12 часа преди пробовземането/аутопсията.
                              
                           
                              
                                 29.
                              
                              
                                 Храната за риби следва да бъде оценявана за наличието на замърсители, като например органохлорни пестициди, полициклични ароматни въглеводороди (PAH), полихлорирани бифенили (PCB). Храна с повишени нива на фитоестрогени, които биха нарушили отклика при изследването с познати естрогенни агонисти (напр. 17b-естрадиол), следва да се избягва.
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 Неконсумираната храна и фекалните отпадъци следва да се отстраняват от съдовете за изпитване най-малко два пъти седмично, напр. чрез внимателно почистване на дъното на всеки съд, с използване на сифон.
                              
                           
                        Светлина и температура
                     
                     
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Продължителността на излагане на светлина и температурата на водата следва да са подходящи за изпитваните видове (допълнение 2).
                              
                           
                        Честота на аналитичните определяния и измервания
                     
                     
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Преди започване на периода на експозиция следва да бъде гарантирано правилното функциониране на системата за доставяне на химикала. Всички необходими методи за анализ следва да бъдат установени, включително с достатъчно информация за стабилността на химикала в системата за изпитване. По време на изпитването концентрациите на изпитвания химикал се определят през постоянни интервали, както следва: дебитът на водата за разреждане и на изходния разтвор на токсичния химикал следва да се проверяват, за предпочитане ежедневно, но като минимум два пъти седмично и през време на изпитването не следва да се променят с повече от 10 %. Препоръчва се действителните концентрации на изпитвания химикал да се измерват във всички съдове в началото на изпитването и след това на интервали от една седмица.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Препоръчва се резултатите да се основават на измерени концентрации. Обаче ако концентрацията на изпитвания химикал в разтвора е поддържана на задоволително ниво в рамките на ± 20 % от номиналната концентрация по време на изпитването, тогава резултатите могат да се основават или на номиналната, или на измерената стойност.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Възможно е да се наложи филтруване (напр. с използване на отвори с размер 0,45 μm) или центрофугиране на пробите. Ако е необходимо, центрофугирането се препоръчва като процедура. Обаче в случай че изпитваният материал не се адсорбира върху филтрите, филтруването също може да е приемливо.
                              
                           
                              
                                 35.
                              
                              
                                 По време на изпитването разтвореният кислород, температурата и рН следва да бъдат измервани във всеки съд за изпитване най-малко веднъж седмично. Общата твърдост и алкалността следва да се измерват в контролите и в един съд с най-висока концентрация най-малко веднъж седмично. За предпочитане е температурата да се наблюдава непрекъснато най-малко в един съд за изпитване.
                              
                           
                        Наблюдения
                     
                     
                              
                                 36.
                              
                              
                                 По време на изследването или при приключването му се оценяват редица общи (напр. преживяване) и биологични отклици (напр. нива на VTG). Изисква се ежедневно наблюдаване на плодовитостта в количествено отношение. Измерването и оценката на тези крайни точки и ползата от тях са описани по-долу.
                              
                           
                        Преживяване
                     
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Рибите следва да се преглеждат всеки ден през периода на изпитването и всякаква смъртност следва да се записва, а мъртвите екземпляри да се отстраняват колкото е възможно по-бързо. Мъртвите риби не следва да се заменят нито в съдовете с контроли, нито в съдове за третиране. Полът на рибите, които умират по време на изпитването, трябва да се определи чрез макроскопска оценка на гонадите.
                              
                           
                        Поведение и външен вид
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Всяко необичайно поведение (в сравнение с контролите) трябва да бъде отбелязвано; това може да включва признаци на обща токсичност, включително хипервентилация, некоординирано плуване, загуба на равновесие, и нетипично състояние на покой или нетипично поведение при хранене. Освен това следва да бъдат отбелязвани и външните аномалии (като кръвоизлив, обезцветяване). Такива признаци на токсичност следва да се разглеждат внимателно при интерпретирането на данните, тъй като те могат да сочат концентрации, при които биомаркерите за ендокринна активност не са надеждни. Такива наблюдения на поведението могат също да предоставят полезна качествена информация за потенциалните бъдещи изисквания за изпитвания на риби. Така например, териториалната агресивност при нормални мъжки или при женски, придобили мъжки вторични полови белези, е наблюдавана при Pimephales promelas при андрогенна експозиция; при зебровото данио характерното поведение при чифтосване и хвърляне на хайвера, проявяващо се непосредствено след изгрев, се ограничава или се възпрепятства от естрогенна или антиандрогенна експозиция.
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Тъй като някои аспекти на външния вид (предимно цветът) могат да се променят бързо при боравенето, важно е качествените наблюдения да бъдат извършени преди отстраняването на животните от системата за изпитване. От досегашния опит с Pimephales promelas се предполага, че някои ендокринно активни химикали може първоначално да предизвикат промени в следните външни характеристики: оцветяване на тялото (светло или тъмно), начини на оцветяване (наличие на вертикални ленти) и форма на тялото (главата и гръдната област). Поради това наблюденията на външния вид на рибите следва да бъдат правени по време на изпитването и при приключване на изследването
                              
                           
                        Плодовитост
                     
                     
                              
                                 40.
                              
                              
                                 Ежедневните количествени наблюдения на хвърлянето на хайвера следва да се записват на основа повторение. Получените хайверни зърна следва да бъдат записвани като брой хайверни зърна/преживяла женска/ден на основа повторение. Хайверните зърна ще бъдат отстранявани ежедневно от камерите за изпитване. Субстратите за хвърляне на хайвер трябва да се поставят в камерата за изпитване за Pimephales promelas и зебровото данио, за да се даде възможност на рибите да хвърлят хайвера си в нормални условия. В допълнение 4 се дават допълнителни подробности за препоръчителни субстрати за хвърляне на хайвер за зебровото данио (приложение 4А) и Pimephales promelas (приложение 4Б). Не се счита за необходимо да се предоставя субстрат за хвърляне на хайвер на оризията.
                              
                           
                        Умъртвяване на риби по хуманен начин
                     
                     
                              
                                 41.
                              
                              
                                 На ден 21, т.е. при приключване на експозицията, рибите следва да бъдат подложени на евтаназия с подходящи количества трикаин (трикаинов метансулфонат, метакаин, MS-222 (CAS 886-86-2), 100-500 mg/l буфериран с 300 mg/l NaHCO3 (натриев хидрогенкарбонат, CAS 144-55-8), за да се намали дразненето на мукозните мембрани; след това се вземат проби от кръв или тъкани за определяне на VTG, както е обяснено в раздела за VTG.
                              
                           
                        Наблюдение на вторични полови белези
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Някои химикали с активно действие върху ендокринната система могат да предизвикат промени в специализирани вторични полови белези (брой размножителни туберкули при мъжки Pimephales promelas, брой на папиларните израстъци при оризията от мъжки пол). Следва да се отбележи, че химикали с определени начини на действие могат да са причина за анормална проява на вторични полови белези при животни от противоположния пол; например агонисти на андрогенните рецептори като например тренболон, метилтестостерон и дихидротестостерон, могат да предизвикат поява на подчертано развити размножителни туберкули у женски Pimephales promelas, или развитие на папиларни израстъци при оризията от женски пол (11, 20, 21). Протоколирано е също, че агонисти на естрогенните рецептори могат да намалят броя на размножителните туберкули и размера на дорзалните отлагания на колаген при полово зрели мъжки индивиди от Pimephales promelas (26, 27). Такива макроскопски наблюдения на морфологията могат да предоставят полезна качествена и количествена информация за потенциалните бъдещи изисквания за изпитвания на риби. Броят и размерът на размножителните туберкули при Pimephales promelas и папиларните израстъци при оризията могат да бъдат количествено определени директно или, по-практично, в консервирани екземпляри. Препоръчваните процедури за оценка на вторични полови белези при Pimephales promelas и при оризията са на разположение съответно в допълнение 5А и допълнение 5Б.
                              
                           
                        Вителогенин (VTG)
                     
                     
                              
                                 43.
                              
                              
                                 Пробовземането на кръв се извършва от опашната артерия/вена с хепаринизирана микрокапилярка за хематокрит или, като алтернативен вариант, чрез сърдечна пункция със спринцовка. В зависимост от размера на рибата обемът на кръвта за пробовземане обикновено варира между 5 и 60 μl на индивид за Pimephales promelas и 5-15 μl на индивид за зеброво данио. Плазмата се отделя от кръвта чрез центрофугиране и се съхранява с протеазни инхибитори при – 80 °C до анализа за вителогенин. Като алтернатива, при оризията се използва черният дроб, а при зебровото данио като източник на тъкан за определяне на VTG може да се използва хомогенат глава/опашка (допълнение 6). Измерването на VTG следва да се основава на валидиран хомоложен ELISA метод, като се използва хомоложен VTG стандарт и хомоложни антитела. Препоръчва се използването на метод, който позволява да се открият нива VTG от порядъка на няколко ng/ml плазма (или ng/mg тъкан), което е фоновото ниво при неекспонирани мъжки риби.
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Контролът на качеството на анализа на VTG се извършва чрез използването на еталони, празни проби и анализи с най-малко две повторения. За всеки ELISA метод следва да се проведе изпитване за матричен ефект (ефект на разреждане на пробата), за да се определи минималният коефициент на разреждане на пробата. Всяка ELISA плака, използвана за изследвания на VTG, следва да включва следните проби за контрол на качеството: най-малко 6 еталона за калибриране, покриващи диапазона от очаквани концентрации на VTG, и поне една празна проба за изследване за неспецифично свързване (анализ в две повторения). абсорбцията при тези празни проби следва да е по-малко от 5 % от максималната абсорбция на еталона за калибриране. Следва да се анализират най-малко две аликвотни части (две повторения в отделни гнезда) от всяко разреждане на проба. Повторенията в отделни гнезда, които се различават с повече от 20 %, следва да бъдат анализирани повторно.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 Коефициентът на корелация (R2) за калибрационните криви трябва да бъде по-голям от 0,99. Независимо от това, високата корелация не е достатъчна, за да гарантира адекватна прогноза за концентрацията във всички диапазони. В допълнение към достатъчно високата степен на корелация за калибрационната крива, концентрацията на всеки еталон, както е изчислена от калибрационната крива, следва да попада между 70 и 120 % от неговата номинална концентрация. В случай, че трендът на номиналните концентрации се отдалечава от тренда на регресионната линия (напр. при по-ниски концентрации), може да е необходимо калибрационната крива да се раздели на ниски и високи диапазони, или да се използва нелинеен модел за подходящо изглаждане на данните от абсорбцията. Ако кривата е раздвоена, и двата линейни участъка следва да са с R2 > 0,99.
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Границата на откриване (LOD) се определя като границата, под която концентрацията е твърде ниска за откриване на веществото, а границата на количествено определяне (LOQ) се определя като границата, под която концентрацията е твърде ниска за откриване на веществото, умножена по най-ниската кратност на разреждане.
                              
                           
                              
                                 47.
                              
                              
                                 Всеки ден, в който се извършват изследвания за VTG, се анализира проба с внесена добавка с използване на еталон, който е референтен между различни изследвания (допълнение 7). Отношението на очакваната концентрация към измерената концентрация се протоколира заедно с резултатите от всеки набор от изследвания от този ден.
                              
                           
                        Оценка на гонадната хистопатология
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Извършването на гонадна хистопатология може да се изисква от регулаторните органи за проучване на прицелния орган по оста ХХГ след експозиция на химикали. В тази връзка гонадите се фиксират или in situ, или им се прави дисекция. Когато се изисква хистопатология, при оценката на ендокринна активност на изпитвания химикал се търсят специфични ендокринно-свързани отклици при гонадите. Тези диагностични отклици по същество включват наличието на тестикулни ооцити, хиперплазия на Лайдиговите клетки, намалено образуване на жълтък, увеличени сперматогонии и перифоликуларна хиперплазия. Други увреждания на гонадите, като атрезия на ооцити, дегенерация на тестисите и изменения на стадии, могат да имат различни причини. В документа с насоки за хистопатологията на гонадите за риби се определят процедури, които ще бъдат използвани в дисекцията, фиксирането, разрязването и хистопатологичната оценка на гонадите (22).
                              
                           ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Оценка на отклиците на биомаркерите чрез дисперсионен анализ (ANOVA)
                     
                     
                              
                                 49.
                              
                              
                                 За идентифициране на потенциална активност на даден химикал се сравняват отклиците между третираните и контролните групи с помощта на дисперсионен анализ (ANOVA). Когато се използва контрола на разтворител, за всяка крайна точка следва да се приложи подходящ статистически тест между контролите на вода за разреждане и на разтворител. Насоки за работата с данните за контролите на вода за разреждане и на разтворител при последващия статистически анализ могат да се намерят в източник OECD, 2006c (28). Всички биологични данни, свързани с отклици, следва да се анализират и протоколират отделно по пол. Ако изискваните допускания за използване на параметричен метод не са изпълнени — не е налице нормалност на разпределението (например тест на Шапиро-Уилк) или дисперсията е хетерогенна (тест на Бартлет или тест на Левин), преди извършването на ANOVA следва да се разгледа трансформиране на данните с оглед хомогенизиране на дисперсията, или извършване на ANOVA с претеглени средни. За немонотонна зависимост доза-отклик могат да се използват тестът на Дънет (параметричен) върху множествени сравнения по двойки, или тестът на Ман-Уитни с корекция на Бонферони (непараметричен). Ако зависимостта е приблизително монотонна, могат да се използват други статистически тестове (напр. тестът на Йонкхере-Терпстра или тестът на Уйлямс). За подпомагане при вземането на решение относно използването на най-подходящия статистически тест в допълнение 8 е представена статистическа блокова схема. Допълнителна информация може да бъде получена също и от документа на ОИСР „Съвременни подходи за статистически анализ на данни за екотоксичност“ (28).
                              
                           
                        Протоколиране на резултатите от изпитването
                     
                     
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Данните от изследването следва да включват:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Извършваща изпитвания лаборатория:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Отговорен персонал и неговите отговорности, свързани с изследването
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Всяка лаборатория трябва да е показала компетентността си чрез използване на набор от представителни химикали
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Изпитван химикал:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Характеризиране на изпитвания химикал
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Физична природа и относими физични и химични свойства
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Метод и честота на приготвяне на изпитваните концентрации
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Информация за стабилността и биоразградимостта
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Разтворител:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Характеристика на разтворителя (естество, използвана концентрация)
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Обосновка за избора на разтворителя (когато разтворителят е различен от вода)
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Изпитвани животни:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Биологични видове и порода
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Доставчик и специални съоръжения на доставчика
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Възраст на рибите в началото на изпитването и репродуктивен статус/статус по отношение на хвърляне на хайвера
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Подробни данни за процедурата за аклиматизация на животните
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Телесно тегло на рибите в началото на експозицията (от подпроба от рибния запас)
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Условия на изпитване:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Използвана процедура на изпитване (тип изпитване, скорост на зареждане, гъстота на отглеждане и т.н.);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Метод за приготвяне на изходни разтвори и скорост на потока;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Номиналните концентрации на изпитване, измерваните седмично концентрации на разтворите за изпитването и използвания аналитичен метод, средни величини на измерените стойности и стандартни отклонения в съдовете за изпитване, и доказателство, че измерванията се отнасят за концентрациите на изпитвания химикал в истински разтвор;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Характеристиките на водата за разреждане (включително рН, твърдост, алкалност, температура, концентрация на разтворен кислород, нива на остатъци от хлор, общо съдържание на органичен въглерод, суспендирани твърди частици и всякакви други направени измервания)
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Качество на водата в съдовете за изпитване: рН, твърдост, температура и концентрация на разтворен кислород;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Подробна информация за храненето (например вид на храната(ите), източник, дадено количество и честота, и анализи за съдържание на относими замърсители, ако има такива (напр. полихлорирани бифенили, полициклични ароматни въглеводороди и органохлорни пестициди).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Резултати
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Доказателство, че контролите отговарят на критериите за приемане на изпитването;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Данни за смъртността при всички нива на концентрацията на изпитване и в контролите;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Използваните техники за статистически анализ, обработка на данните и обосновка за използваните техники;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Данни за макроскопски биологични наблюдения на морфологията, включително вторични полови белези, получени хайверни зърна и VTG;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Резултати от анализите на данните, за предпочитане в таблична и графична форма;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Проява на необичайни реакции от страна на рибите и всякакви видими въздействия, причинени от изпитвания химикал
                                                      
                                                   
                                       
                           НАСОКИ ЗА ИНТЕРПРЕТИРАНЕТО И ПРИЕМАНЕТО НА РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ ИЗПИТВАНЕТО
                     
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Този раздел съдържа някои съображения, които трябва да се вземат предвид при тълкуването на резултатите от изпитването за различните измерени крайни точки. Резултатите трябва да се интерпретират внимателно, когато изглежда, че изпитваният химикал предизвиква ясно изразено токсично действие или оказва въздействие върху общото състояние на животното.
                              
                           
                              
                                 52.
                              
                              
                                 При задаването на обхвата на изпитваните концентрации трябва да се внимава да не се превишава максималната поносима концентрация, за да се даде възможност за съдържателно интерпретиране на данните. Важно е да има поне едно третиране, при което не са налице признаци на токсично въздействие. Признаците на заболяване и на токсично въздействие следва да бъдат подробно оценявани и протоколирани. Например, възможно е образуването на VTG в женски животни да е също така повлияно от обща токсичност и начини на токсично действие, различни от ендокринните, напр. хепатотоксичност. Независимо от това, тълкуването на въздействията може да бъде подкрепено чрез други нива на третиране, които да не водят до невъзможност за разграничаване поради системна токсичност.
                              
                           
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Има няколко аспекта, които трябва да бъдат взети предвид при приемането на резултатите от изпитването. Като насока, нивата на VTG в контролните групи мъжки и женски животни следва да бъдат разграничени и разделени от около три порядъка при Pimephales promelas и зебровото данио, и от около един порядък при оризията. Примери за диапазона на стойностите, които се срещат в контролните групи и в групите на третиране, могат да бъдат намерени в протоколите за валидиране (1, 2, 3, 4). Високите стойности на VTG в контролни мъжки екземпляри могат да поставят под съмнение реагирането на биологичното изследване и способността му да открива слаби естрогенни агонисти. Ниските стойности на VTG в контролни женски екземпляри могат да поставят под съмнение реагирането на биологичното изследване и способността му да открива инхибитори на ароматазата и естрогенни антагонисти. Изследванията за валидиране са били използвани за изготвянето на тези насоки.
                              
                           
                              
                                 54.
                              
                              
                                 По отношение на количественото определяне на получаването на хайверни зърна, то показва значително вариране [коефициентът на вариация (CV) може да варира от 20 до 60 %], което накърнява способността на изследването за откриване на значимо намаляване на получаването на хайверни зърна, по-малко от 70 %,когато CV наближава 50 % или повече. Когато CV е ограничен до по-ниски стойности (около 20-30 %), тогава изпитването ще има приемлива мощност (80 %) за откриване на 40-50 % намаляване на получаването на хайверни зърна. Планът на изпитването, използван за Pimephales promelas, включващ четири повторения на ниво на третиране, следва да позволява по-голяма мощност за крайната точка плодовитост в сравнение с план на изпитването само с 2 повторения.
                              
                           
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Ако дадена лаборатория не е извършвала изследването преди това, или са направени съществени промени (например промяна на породата на рибите или доставчика), е целесъобразно да се проведе проучване на техническата компетентност. Препоръчва се да се използват химикали, които обхващат широк спектър от механизми на действие или въздействия върху някои от крайните точки от изпитването. На практика всяка лаборатория се насърчава да изгради собствени контролни данни за предходни периоди за мъжките и женските индивиди, както и да извърши изпитване на химикал, представляващ положителна контрола за естрогенна активност (напр. 17β-естрадиол при 100 ng/l, или известен слаб агонист), в резултат на което се увеличава VTG в мъжките риби, на химикал, представляващ положителна контрола за потискане на ароматазата (напр. фадрозол или прохлораз при 300 μg/l), в резултат на което се намалява VTG в женския индивид, и на химикал, представляващ положителна контрола за андрогенна активност (напр. 17β-тренболон при 5 μg/l), в резултат на което се индуцират вторични полови белези в женски Pimephales promelas и японска оризия. Всички тези данни могат да бъдат сравнявани с наличните данни от изследванията за валидиране (1, 2, 3), за да се гарантира компетентността на лабораторията.
                              
                           
                              
                                 56.
                              
                              
                                 Като цяло, измерванията на VTG следва да се считат за положителни, ако се наблюдава статистически значимо увеличаване на VTG при мъжките индивиди (p < 0,05), или статистически значимо намаление при женските индивиди (p < 0,05) най-малко при най-високата доза на изпитване, в сравнение с контролната група, и при липса на признаци за обща токсичност. Положителният резултат се подкрепя допълнително от доказване на биологически реалистична връзка между дозата и кривата на отклика. Както беше споменато по-горе, намалението на VTG може да не е изцяло с ендокринен произход; независимо от това положителният резултат по принцип следва да се тълкува като доказателство за ендокринна активност in vivo и обичайно следва да води до предприемане на действия за допълнително изясняване.
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Извършването на оценка на гонадна хистопатология може да се изисква от регулаторните органи за определяне на репродуктивното здраве на изпитваните животни и за даване на възможност за оценка на тежестта на доказателствата по отношение на резултатите от изпитването. Извършването на гонадна хистопатология може да не бъде необходимо в случаи, когато има положителен резултат или за VTG, или за вторичните полови белези (т.е. VTG се увеличава или намалява, или се индуцират вторични полови белези).
                              
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2006a). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1A). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.60, Paris.
                              
                           
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2006b). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1B). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.61, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2007). Final report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances. Phase 2: Testing Negative Substances. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.78, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Owens JW (2007). Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay. CEFIC LRI Project, Endocrine. http://www.cefic-lri.org/index.php?page=projects (accessed 18/09/08).
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 US EPA (2007). Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report. 15 December 2007. US Environmental Protection Agency, Washington, DC. 104 pp.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 OECD (2008). Report of the Validation Peer Review for the 21-Day Fish Endocrine Screening Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.94, Paris.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Sumpter J.P. and S. Jobling (1995). Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environmental Health Perspectives; 103 Suppl 7:173-8 Review.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Pawlowski S., et al. (2004). Androgenic and estrogenic effects of the synthetic androgen 17alpha-methyltestosterone on sexual development and reproductive performance in the fathead minnow (Pimephales promelas) determined using the gonadal recrudescence assay. Aquatic Toxicology; 68(3):277-91.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Andersen L., et al (2006). Short-term exposure to low concentrations of the synthetic androgen methyltestosterone affects vitellogenin and steroid levels in adult male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology; 76(3-4):343-52.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Ankley G.T., et al. (2002). Evaluation of the aromatase inhibitor fadrozole in a short-term reproduction assay with the fathead minnow (Pimephales promelas). Toxicological Sciences; 67(1):121-30.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Panter G.H., et al. (2004). Successful detection of (anti-)androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development. Aquatic Toxicology; 70(1):11-21.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Parks L.G., et al. (1999). Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 123(2):113-25.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Panter G.H., et al. (1999). Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to endocrine disrupting chemicals. CEFIC-EMSG research report reference AQ001. CEFIC, Brussels, Belgium.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Fenske M., et al. (2001). Development and validation of a homologous zebrafish (Danio rerio Hamilton- Buchanan) vitellogenin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its application for studies on estrogenic chemicals. Comp. Biochem. Phys. C 129 (3): 217-232.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Holbech H., et al. (2001). Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 130: 119-131
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Rose J., et al. (2002). Vitellogenin induction by 17b-estradiol and 17a-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C 131: 531-539.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Brion F., et al. (2002). Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry; vol 21: 1699-1708.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Yokota H., et al. (2001). Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes). Jpn J Environ Toxicol 4:87–98.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Tatarazako N., et al. (2004). Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the Medaka. Journal of Health Science 50:301-308.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Ankley G.T., et al. (2003). Effects of the androgenic growth promoter 17-beta-trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environmental Toxicology and Chemistry; 22(6): 1350-60.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Seki M, et al (2004). Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry; 23(3):774-81.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 OECD (2010). Guidance Document on Fish Gonadal Histopathology. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 123, Paris.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Hutchinson T.H., et al. (2006a). Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Review. Aquatic Toxicology, 76; pp.69–92.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Hutchinson T.H., et al. (2006b). Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as „signposts,“ not „traffic lights,“ in risk assessment. Environmental Health Perspectives; 114 Suppl 1:106-14.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Miles-Richardson S.R., et al. (1999). Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas). Aquat. Toxicol. 47, 129-145.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Martinovic D., et al. (2008). Characterization of reproductive toxicity of vinclozolin in the fathead minnow and co-treatment with an androgen to confirm an anti-androgenic mode of action. Environ. Toxicol. Chem. 27, 478-488.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 OECD (2006c), Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 US EPA (2008), Peer-Review Results for the Fish Short-Term Reproduction Assay, dated 30 January 2008, US Environmental Protection Agency, Washington DC. 110 pp.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 OECD (2012), OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupters, OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 150, OECD, Paris.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        СЪКРАЩЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                           
                              Химикал
                           : вещество или смес.
                        
                           
                              CV
                           : коефициент на вариация
                        
                           
                              ELISA
                           : Ензимно-свързан имуносорбентен анализ
                        
                           
                              ХХГ ос
                           : хипоталамус-хипофиза-гонадна ос
                        
                           
                              Скорост на зареждане
                           : мокрото тегло на рибите на обем вода.
                        
                           
                              МПК
                           : максимално поносима концентрация, която представлява около 10 % от LC50.
                        
                           
                              Гъстота на отглеждане
                           : брой на рибите на обем вода.
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                        
                           
                              VTG
                           : вителогенинът е фосфолипогликопротеин, който е прекурсор на белтъците в яйчния жълтък и обикновено се среща в полово активните женски индивиди от всички яйценосни видове.
                     
                     
                        Допълнение 2
                        
                           ОПИТНИ УСЛОВИЯ ЗА СКРИНИНГОВОТО ИЗСЛЕДВАНЕ НА ЕНДОКРИННАТА СИСТЕМА ПРИ РИБИ
                        
                        
                                    
                                                1.
                                             
                                             
                                                Препоръчани видове
                                             
                                          
                                 
                                    Pimephales promelas
                                 
                                 
                                    Японска оризия
                                    (Oryzias latipes)
                                 
                                 
                                    Зеброво данио
                                    (Danio rerio)
                                 
                              
                                    
                                                2.
                                             
                                             
                                                Тип на изпитването
                                             
                                          
                                 
                                    Проточно
                                 
                                 
                                    Проточно
                                 
                                 
                                    Проточно
                                 
                              
                                    
                                                3.
                                             
                                             
                                                Температура на водата
                                             
                                          
                                 
                                    25 ± 2 °C
                                 
                                 
                                    25 ± 2 °C
                                 
                                 
                                    26 ± 2 °C
                                 
                              
                                    
                                                4.
                                             
                                             
                                                Качеството на осветлението
                                             
                                          
                                 
                                    Луминесцентни крушки (широк спектър)
                                 
                                 
                                    Луминесцентни крушки (широк спектър)
                                 
                                 
                                    Луминесцентни крушки (широк спектър)
                                 
                              
                                    
                                                5.
                                             
                                             
                                                Светлинен интензитет
                                             
                                          
                                 
                                    10-20 μE/m2/s, 540-1 000  lux, или 50-100 ft-c (заобикалящи равнища на осветеност в лабораторията)
                                 
                                 
                                    10-20 μE/m2/s, 540-1 000  lux, или 50-100 ft-c (заобикалящи равнища на осветеност в лабораторията)
                                 
                                 
                                    10-20 μE/m2/s, 540-1 000  lux, или 50-100 ft-c (заобикалящи равнища на осветеност в лабораторията)
                                 
                              
                                    
                                                6.
                                             
                                             
                                                Продължителност на излагане на светлина (преходните фази на разсъмване и здрач са по избор, но не се считат за необходими)
                                             
                                          
                                 
                                    16 h светлина, 8 h тъмнина
                                 
                                 
                                    12-16 h светлина, 12-8 h тъмнина
                                 
                                 
                                    12-16 h светлина, 12-8 h тъмнина
                                 
                              
                                    
                                                7.
                                             
                                             
                                                Скорост на зареждане
                                             
                                          
                                 
                                    < 5 g на l
                                 
                                 
                                    < 5 g на l
                                 
                                 
                                    < 5 g на l
                                 
                              
                                    
                                                8.
                                             
                                             
                                                Размер на камерата за изпитване
                                             
                                          
                                 
                                    10 l (най-малко)
                                 
                                 
                                    2 l (най-малко)
                                 
                                 
                                    5 l (най-малко)
                                 
                              
                                    
                                                9.
                                             
                                             
                                                Обем на изпитвания разтвор
                                             
                                          
                                 
                                    8 l (най-малко)
                                 
                                 
                                    1,5 l (най-малко)
                                 
                                 
                                    4 l (най-малко)
                                 
                              
                                    
                                                10.
                                             
                                             
                                                Обменени обеми на изпитвани разтвори
                                             
                                          
                                 
                                    Най-малко 6 дневно
                                 
                                 
                                    Най-малко 5 дневно
                                 
                                 
                                    Най-малко 5 дневно
                                 
                              
                                    
                                                11.
                                             
                                             
                                                Възраст на изпитваните организми
                                             
                                          
                                 
                                    Вж. точка 21
                                 
                                 
                                    Вж. точка 21
                                 
                                 
                                    Вж. точка 21
                                 
                              
                                    
                                                12.
                                             
                                             
                                                Приблизително мокро тегло на полово зряла риба (g)
                                             
                                          
                                 
                                    Женски: 1,5 ± 20 %
                                    Мъжки: 2,5 ± 20 %
                                 
                                 
                                    Женски: 0,35 ± 20 %
                                    Мъжки: 0,35 ± 20 %
                                 
                                 
                                    Женски: 0,65 ± 20 %
                                    Мъжки: 0,4 ± 20 %
                                 
                              
                                    
                                                13.
                                             
                                             
                                                Брой на рибите на съд за изпитване
                                             
                                          
                                 
                                    6 (2 мъжки и 4 женски)
                                 
                                 
                                    6 (3 мъжки и 3 женски)
                                 
                                 
                                    10 (5 мъжки и 5 женски)
                                 
                              
                                    
                                                14.
                                             
                                             
                                                Брой третирания
                                             
                                          
                                 
                                    = 3 (плюс подходящи контроли)
                                 
                                 
                                    = 3 (плюс подходящи контроли)
                                 
                                 
                                    = 3 (плюс подходящи контроли)
                                 
                              
                                    
                                                15.
                                             
                                             
                                                Брой съдове на третиране
                                             
                                          
                                 
                                    най-малко 4
                                 
                                 
                                    най-малко 4
                                 
                                 
                                    най-малко 2
                                 
                              
                                    
                                                16.
                                             
                                             
                                                Брой на рибите на концентрация на изпитване
                                             
                                          
                                 
                                    16 полово зрели женски и 8 мъжки (4 женски и 2 мъжки във всеки един съд с повторение)
                                 
                                 
                                    12 полово зрели женски и 12 мъжки (3 женски и 3 мъжки във всеки един съд с повторение)
                                 
                                 
                                    10 полово зрели женски и 10 мъжки (5 женски и 5 мъжки във всеки един съд с повторение)
                                 
                              
                                    
                                                17.
                                             
                                             
                                                Режим на хранене
                                             
                                          
                                 
                                    Живи или замразени полово зрели артемии или науплии от артемии два или три пъти дневно (ad libitum), налични в търговската мрежа храни или комбинация от горепосочените
                                 
                                 
                                    Науплии от артемии два или три пъти дневно (ad libitum), налични в търговската мрежа храни или комбинация от горепосочените
                                 
                                 
                                    Науплии от артемии два или три пъти дневно (ad libitum), налични в търговската мрежа храни или комбинация от горепосочените
                                 
                              
                                    
                                                18.
                                             
                                             
                                                Аериране
                                             
                                          
                                 
                                    Няма, освен в случаите, когато концентрацията на разтворения кислород падне под 60 % от стойността на насищане при равновесие с атмосферния въздух
                                 
                                 
                                    Няма, освен в случаите, когато концентрацията на разтворения кислород падне под 60 % от стойността на насищане при равновесие с атмосферния въздух
                                 
                                 
                                    Няма, освен в случаите, когато концентрацията на разтворения кислород падне под 60 % от стойността на насищане при равновесие с атмосферния въздух
                                 
                              
                                    
                                                19.
                                             
                                             
                                                Вода за разреждане
                                             
                                          
                                 
                                    Вода с чиста повърхност, кладенчова или възстановена вода или дехлорирана чешмяна вода
                                 
                                 
                                    Вода с чиста повърхност, кладенчова или възстановена вода или дехлорирана чешмяна вода
                                 
                                 
                                    Вода с чиста повърхност, кладенчова или възстановена вода или дехлорирана чешмяна вода
                                 
                              
                                    
                                                20.
                                             
                                             
                                                Период преди експозицията
                                             
                                          
                                 
                                    препоръчват се 7-14 дни
                                 
                                 
                                    препоръчват се 7-14 дни
                                 
                                 
                                    препоръчват се 7-14 дни
                                 
                              
                                    
                                                21.
                                             
                                             
                                                Продължителност на експозицията на химикала
                                             
                                          
                                 
                                    21-d
                                 
                                 
                                    21-d
                                 
                                 
                                    21-d
                                 
                              
                                    
                                                22.
                                             
                                             
                                                Биологични крайни точки
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                преживяване
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                поведение
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                плодовитост
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                2-чни полови белези
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                VTG
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                като вариант гонадна хистопатология
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                преживяване
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                поведение
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                плодовитост
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                2-чни полови белези
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                VTG
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                като вариант гонадна хистопатология
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                преживяване
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                поведение
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                плодовитост
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                VTG
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                като вариант гонадна хистопатология
                                             
                                          
                              
                                    
                                                23.
                                             
                                             
                                                Приемливост на изпитването
                                             
                                          
                                 
                                    Разтворен кислород ≥ 60 % от стойността на насищане; средна температура 25 ± 2 °C; 90 % преживели риби в контролите; измерени концентрации на изпитване в рамките на 20 % от средните измерени стойности на ниво на третиране.
                                 
                                 
                                    Разтворен кислород ≥ 60 % от стойността на насищане; средна температура 25 ± 2 °C; 90 % преживели риби в контролите; измерени концентрации на изпитване в рамките на 20 % от средните измерени стойности на ниво на третиране.
                                 
                                 
                                    Разтворен кислород ≥ 60 % от стойността на насищане; средна температура 26 ± 2 °C; 90 % преживели риби в контролите; измерени концентрации на изпитване в рамките на 20 % от средните измерени стойности на ниво на третиране.
                                 
                              
                     
                        Допълнение 3
                        
                           НЯКОИ ХИМИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПРИЕМЛИВА ВОДА ЗА РАЗРЕЖДАНЕ
                        
                        
                                    КОМПОНЕНТ
                                 
                                 
                                    КОНЦЕНТРАЦИИ
                                 
                              
                                    Твърди частици
                                 
                                 
                                    < 20 mg/l
                                 
                              
                                    Общ органичен въглерод
                                 
                                 
                                    < 2 mg/l
                                 
                              
                                    Нейонизиран амоняк
                                 
                                 
                                    < 1 μg/l
                                 
                              
                                    Остатъчен хлор
                                 
                                 
                                    < 10 μg/l
                                 
                              
                                    Общо органофосфорни пестициди
                                 
                                 
                                    < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Общо органохлорни пестициди плюс полихлорирани бифенили
                                 
                                 
                                    < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Общ органичен хлор
                                 
                                 
                                    < 25 ng/l
                                 
                              
                     
                        Допълнение 4А
                        
                           СУБСТРАТ ЗА ХВЪРЛЯНЕ НА ХАЙВЕР ЗА ЗЕБРОВО ДАНИО
                        
                        
                           
                              Вана за хвърляне на хайвера
                           : всякакви стъклени съдове за инструменти с примерни дължина 22 cm × широчина 15 cm × дълбочина 5,5 cm, покрити с отстранима телена решетка от неръждаема стомана (с ширина на отворите 2 mm). Решетката следва да покрива отвора на съда за инструменти на равнище, по-ниско от ръба на съда.
                        Върху решетката следва да бъде фиксиран субстрат за хвърляне на хайвер. Той следва да представлява структура, в която рибите да могат да се движат. Например, подходяща е изкуствена аквариумна растителност, изработена от зелен пластмасов материал (NB: следва да се обърне внимание на възможна адсорбция на изпитвания химикал върху пластмасовия материал). Пластмасата следва да бъде промита в достатъчно количество топла вода за период, достатъчен, за да се гарантира, че няма да преминат химикали във водата за изпитването. Когато се използват стъклени материали, следва да се гарантира, че при извършване на енергични движения рибите не се увреждат и не си пречат.
                        Разстоянието между ваната и стъклените стени трябва да бъде най-малко 3 cm, за да се гарантира, че хвърлянето на хайвер не се извършва извън ваната. Хвърленият във ваната хайвер пропада през решетката и може да бъде пробовзет 45-60 min след началото на периода на осветление. Прозачните хайверни зърна не се слепват и могат лесно да бъдат преброени, като се използва напречно осветление. Когато се използват пет женски животни на съд, брой на хайверните зърна до 20 на ден може да се счита за нисък, до 100 за среден и над 100 за висок. Ваната за хвърляне на хайвер следва да се отстрани, хайверните зърна се събират и ваната се поставя отново в съда за изпитване или възможно най-късно вечерта, или много рано сутринта. Времето до повторното поставяне не следва да надвишава един час, защото в противен случай е възможно сигналът от субстрата за хвърляне на хайвер да предизвика чифтосване и хвърляне на хайвер по необичайно време. Ако в дадена ситуация се изисква по-късно въвеждане на ваната за хвърляне на хайвер, това следва да бъде направено поне 9 часа след началото на периода на осветление. През тази късна част от деня вече не се предизвиква хвърляне на хайвер.
                     
                     
                        Допълнение 4Б
                        
                           СУБСТРАТ ЗА ХВЪРЛЯНЕ НА ХАЙВЕР ЗА PIMEPHALES PROMELAS
                        
                        Две или три комбинирани пластмасови/керамични/от неръждаема стомана къщички с форма на керемида и вани за хвърляне на хайвер се поставят във всяка камера за изпитване (напр. сив полукръгъл улук с дължина 80 mm, поставен върху вана с дължина 130 mm, с опорен издатък) (вж. изображението). За аклиматизирани по подходящ начин керемиди от поливинилхлорид или керамичен материал е доказано, че са подходящи като субстрат за хвърляне на хайвер (Thorpe et al, 2007).
                        Препоръчително е керемидите да са шлайфани за подобряване на прилепването. Ваната също така следва да бъде преградена, за да се предотврати достъпът на рибите до падналите хайверни зърна, освен ако ефикасността на прилепването на хайверните зърна не е доказана за използвания субстрат за хвърляне на хайвер.
                        Основата е проектирана да побира всички хайверни зърна, които не са прилепнали към повърхността на керемидата, и следователно биха паднали на дъното на контейнера (или хайверни зърна, положени направо върху плоската пластмасова основа). Преди употреба всички субстрати за хвърляне на хайвер трябва да се промият в продължение на минимум 12 часа във вода за разреждане.
                        Thorpe KL, Benstead R, Hutchinson TH, Tyler CR, 2007. An optimised experimental test procedure for measuring chemical effects on reproduction in the fathead minnow, Pimephales promelas. Aquatic Toxicology, 81, 90–98.
                     
                     
                        Допълнение 5А
                        
                           ОЦЕНКА НА ВТОРИЧНИ ПОЛОВИ БЕЛЕЗИ У PIMEPHALES PROMELAS ЗА ОТКРИВАНЕ НА ОПРЕДЕЛЕНИ ХИМИКАЛИ С АКТИВНО ДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ ЕНДОКРИННАТА СИСТЕМА
                        
                        
                           Преглед
                        
                        При изпитвания за нарушители на функциите на ендокринната система потенциално важните характеристики на външния вид на полово зрели Pimephales promelas включват цвят на тялото (т.е. светло/тъмно оцветяване), начини на оцветяване (т.е. наличието или отсъствието на вертикални ленти), форма на тялото (т.е., форма на главата и гръдната област, разширяване на коремната кухина), както и специализирани вторични полови белези (т.е., брой и размер на размножителните туберкули, размери на дорзалните отлагания на колаген и яйцеполагалото).
                        Размножителните туберкули са разположени върху главата (дорзалните отлагания) на репродуктивно активните мъжки Pimephales promelas и обикновено са подредени двустранно симетрично (Jensen et al. 2001). При контролните женски и ювенилните животни от мъжки и женски пол не се наблюдава развитие на туберкули (Jensen et al. 2001). Възможни са до осем отделни туберкули около очите и между ноздрите на мъжките екземпляри. Най-голям брой и най-големи туберкули са разположени в два успоредни реда, непосредствено под ноздрите и над устата. При много риби съществуват групи от туберкули под долната челюст; тези, които са най-близо до устата, обикновено са един чифт, докато разположените вентрално от тях могат да се състоят от до четири туберкули. Действителният брой на туберкулите рядко е повече от 30 (обхват от 18—28; Jensen et al. 2001). Преобладаващите туберкули (по отношение на броя) представляват единични, относително заоблени структури, с височина приблизително равна на радиуса. Повечето репродуктивно активни мъжки животни също имат поне няколко туберкули, които са разширени и подчертано развити по такъв начин, че не могат да бъдат разграничени като отделни структури.
                        Някои типове химикали, нарушаващи функциите на ендокринната система, могат да причинят необичайната поява на някои вторични полови белези в другия пол; например агонисти на андрогенните рецептори като например 17α-метилтестостерон или 17β-тренболон, могат да предизвикат поява на подчертано развити размножителни туберкули у женски Pimephales promelas (Smith, 1974 г.; Ankley et al. 2001; 2003), докато агонисти на естрогенните рецептори могат да предизвикат намаляване на размножителните туберкули у мъжки индивиди (Miles-Richardson et al. 1999; Harries et al. 2000).
                        По-долу е представено описание на характеризирането на размножителни туберкули у Pimephales promelas въз основа на процедурите, използвани в лабораторията на Американската агенция за защита на околната среда в Duluth, MN. Специфичните продукти и/или оборудване могат да бъдат заменени с налични сравними материали.
                        Наблюдението се извършва най-добре с помощта на увеличително стъкло с осветително тяло или със стереомикроскоп с осветително тяло и увеличение 3X. Рибата се наблюдава дорзално с предната част в посока напред (глава към наблюдателя).
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Рибата се поставя в малко блюдо на Петри (напр. 100 mm в диаметър), с предната част в посока напред, с коремния дял надолу. Визьорът се фокусира, за да се даде възможност за идентифициране на туберкулите. Рибата се обръща леко и бавно от една страна на друга, за да се идентифицират областите с туберкули. Туберкулите се преброяват и ранжират.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Наблюдението се повтаря по отношение на предната част на коремния дял, чрез поставяне на рибата дорзално с предната част в посока напред в блюдото на Петри.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Наблюденията трябва да бъдат извършени в рамките на 2 минути за всяка риба.
                                 
                              
                           Броене и ранжиране на туберкулите
                        
                        Определени са шест конкретни области за оценка на наличието и развитието на туберкули в полово зрели Pimephales promelas. Разработен е образец за отбелязване на местоположението и количеството на налични туберкули (вж. в края на настоящото допълнение). Броят на туберкулите се записва и техните размери могат да бъдат количествено ранжирани като: 0- липсва, 1-наличен, 2-уголемен и 3-подчертано развит за всеки организъм (фиг. 1).
                        Ранг 0 — липса на туберкули. Ранг 1 — наличен, присвоява се на всеки туберкул, който има точка, чиято височина е почти равна на радиуса му. Ранг 2 — уголемен, присвоява се при тъкан с външен вид, наподобяващ звездичка, обикновено с голяма радиална база с вдлъбнатини или бразди, излизащи от центъра. Височината на туберкула често е по-неравна, но понякога може до известна степен да е закръглена. Ранг 3 — подчертано развит, обикновено е доста голям и закръглен, с по-неопределена структура. Понякога тези туберкули са разположени заедно, образувайки обща маса по протежение на отделна област или съчетание от области (B, C и D, описани по-долу). Оцветяването и формата са сходни с ранг 2, но понякога са твърде произволни. Използването на тази рангова система най-общо води като цяло до резултати от ранжирането < 50 в нормален контролен мъжки индивид, притежаващ 18 до 20 броя туберкули (Jensen et al. 2001).
                        
                           Фигура 1
                        
                        Действителният брой на туберкулите при някои риби може да е по-голям от полетата в образеца за определена област на ранжиране. В такъв случай вътре могат да бъдат отбелязани допълнителни числа, вдясно или вляво от полето. Следователно не е необходимо образецът да показва симетрия. Допълнителен метод за отбелязване на местоположението на туберкули, които са чифтни или съединени вертикално по протежение на хоризонталната равнина на устата, може да се осъществи чрез двойно отбелязване на два ранга на туберкули в едно поле.
                        
                           Области за отбелязване на местоположението:
                        
                        
                                     
                                 
                                 
                                    A — туберкули, разположени около окото. Положението се отбелязва дорзално към вентрално около предния край на окото. Обичайно са много при полово зрели мъжки от контроли, не са налични при женски, като цяло чифтни (един в близост до всяко око) или единични при женски животни, експонирани на андрогени.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    B-туберкули, разположени между ноздрите (сензорни канали). Обикновено чифтни при мъжките в контролите с по-висок ранг за развитие (2- уголемен или 3- подчертано развит). Не са налични при женски от контролите, с известно срещане и развитие при женски животни, експонирани на андрогени.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    C — туберкули, разположени непосредствено задно от ноздрите, успоредно на устата. Обикновено уголемени или подчертано развити при полово зрели мъжки от контроли. Налични или уголемени при по-слабо развитите мъжки или при женски животни, експонирани на андрогени.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    D — туберкули, разположени успоредно по линията на устата. Като цяло се ранжират като развити в контролните животни от мъжки пол. Липсващи в контролните животни от женски пол, но налични при женски животни, експонирани на андрогени.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    E — туберкули, разположени по долната челюст, близо до устата, обикновено малки и обичайно чифтни. Варират при контролните или третираните мъжки, и третираните женски индивиди.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    F — туберкули, разположени вентрално от E. Обикновено малки и чифтни. Налични в контролните животни от мъжки пол и при женски животни, експонирани на андрогени.
                                 
                              Позовавания
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Ankley GT, Jensen KM, Kahl MD, Korte JJ, Makynen ME. 2001. Description and evaluation of a short-term reproduction test with the fathead minnow (Pimephales promelas). Environ Toxicol Chem 20:1276-1290.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Ankley GT, Jensen KM, Makynen EA, Kahl MD, Korte JJ, Hornung MW, Henry TR, Denny JS, Leino RL, Wilson VS, Cardon MC, Hartig PC, Gray EL. 2003. Effects of the androgenic growth promoter 17-β trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environ Toxicol Chem 22:1350-1360.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Harries JE, Runnalls T, Hill E, Harris CA, Maddix S, Sumpter JP, Tyler CR. 2000. Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol 34:3003-3011.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Jensen KM, Korte JJ, Kahl MD, Pasha MS, Ankley GT. 2001. Aspects of basic reproductive biology and endocrinology in the fathead minnow (Pimephales promelas). Comp Biochem Physiol C 128:127-141.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Kahl MD, Jensen KM, Korte JJ, Ankley GT. 2001. Effects of handling on endocrinology and reproductive performance of the fathead minnow. J Fish Biol 59:515-523.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Miles-Richardson SR, Kramer VJ, Fitzgerald SD, Render JA, Yamini B, Barbee SJ, Giesy JP. 1999. Effects of waterborne exposure of 17-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of fathead minnows (Pimephales promelas). Aquat Toxicol 47:129-145.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Smith RJF. 1974. Effects of 17α-methyltestosterone on the dorsal pad and tubercles of fathead minnows (Pimephales promelas). Can J Zool 52:1031-1038.
                                 
                              
                           
                        Текст на изображението
                        
                           Образец за туберкули
                           ID
                           Ранжиране с числови стойности на ранга
                           Дата
                           1-наличен
                           Общ резултат
                           2-уголемен
                           3-подчертано развит
                           A
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           B
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           C
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           D
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           E
                           X1
                           X1
                           F
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                        
                     
                     
                        Допълнение 5Б
                        
                           ОЦЕНКА НА ВТОРИЧНИ ПОЛОВИ БЕЛЕЗИ У ЯПОНСКАТА ОРИЗИЯ ЗА ОТКРИВАНЕ НА ОПРЕДЕЛЕНИ ХИМИКАЛИ С АКТИВНО ДЕЙСТВИЕ ВЪРХУ ЕНДОКРИННАТА СИСТЕМА
                        
                        По-долу е представено описание на измерването на папиларните израстъци (*10), които са вторични полови белези при японската оризия (Oryzias latipes).
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    След изрязване на черния дроб (допълнение 6), трупът се поставя в конична епруветка, съдържаща около 10 ml 10 % неутрален буфериран формалин (горна страна: глава, долна страна: опашка). Ако гонадата е фиксирана в разтвор, различен от 10 % неутрален буфериран формалин, прави се напречен разрез през трупа между предната област на аналната перка и ануса, с използване на бръснач, като се внимава да не се увреди половият отвор и самата гонада (фиг. 3). Краниалната част от тялото на рибата се поставя в разтвора на фиксатора за запазване на гонадата, а опашната част от тялото на рибата се поставя в 10 % неутрален буфериран формалин, както е описано по-горе.
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    След поставянето на тялото на рибата в 10 % неутрален буфериран формалин задният край на аналната перка се захваща с пинцети и се разтваря за около 30 секунди, за да се запази аналната перка отворена. При захващането на аналната перка с пинцети се захващат няколко лъча на перката в предната област, като се внимава да не се надраскат папиларните израстъци.
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    След държането на аналната перка отворена в продължение на около 30 секунди, тялото на рибата се съхранява в 10 % неутрален буфериран формалин при стайна температура до измерването на папиларните израстъци (измерването следва да се проведе след фиксиране в продължение най-малко на 24 часа).
                                 
                              Измерване
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    След фиксиране на тялото на рибата в 10 % неутрален буфериран формалин в продължение най-малко на 24 часа, трупът на рибата се взема от коничната епруветка и формалинът се избърсва върху филтърна хартия (или хартиена кърпа).
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Рибата се поставя с корема нагоре. След това аналната перка се изрязва внимателно с малки ножици за дисекция (за предпочитане е да се изреже аналната перка с малко количество птеригиофор).
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    С пинцети се захваща предната област от отрязаната анална перка и тя се поставя върху предметно стъкло с няколко капки вода. След това аналната перка се покрива с покривно стъкло. При захващането на аналната перка с пинцети се внимава да не се надраскат папиларните израстъци.
                                 
                              
                                 
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Отчита се броят членчета с папиларни израстъци, като се използва брояч под биологичен микроскоп (изправен или инвертен микроскоп). Папиларните израстъци се познават, когато в задната част на членчетата се вижда малко образувание от израстъци. В работната таблица се записва броят на членчетата с папиларни израстъци във всеки лъч на перка (напр. първи лъч на перка: 0, втори лъч на перка: 10, трети лъч на перка: 12 и т.н.) и се вписва сумата им в таблицата в Excel за всеки отделен екземпляр. Ако е необходимо, аналната перка се фотографира и върху снимката се отчита броят на членчетата с папиларни израстъци.
                                 
                              
                                 
                                    (5)
                                 
                                 
                                    След измерването аналната перка се поставя в коничната епруветка, описана в 1) и се съхранява.
                                 
                              
                           Фиг. 1.
                        
                        
                           Схема, показваща разликата при половете по отношение на формата и размера на аналната перка. A, мъжка; B, женска. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218.
                        
                        
                           Фиг. 2.
                        
                        
                           А, папиларни израстъци върху членчета от лъч на анална перка. J.P., членче; A.S., аксиално пространство; P., израстък. B, дистален край на лъч на перка. Дистално в края на лъча са разположени колагенни фибри (Actinotrichia) (Act.). Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218.
                        
                        
                           Фиг. 3.
                        
                        
                           Снимка на тяло на риба, показваща мястото на срязване, когато гонадата се фиксира в разтвор на фиксатор, различен от 10 % неутрален буфериран формалин. В този случай останалата част от тялото се разрязва между предната област на аналната перка и ануса с помощта на бръснач (червена лента), и предната част от тялото на рибата се поставя в разтвора на фиксатор за гонади, а опашната част от тялото на рибата се поставя в 10 % неутрален буфериран формалин.
                        
                        
                     
                        Допълнение 6
                        
                           ПРЕПОРЪЧИТЕЛНИ ПРОЦЕДУРИ ЗА СЪБИРАНЕТО НА ПРОБИ ЗА АНАЛИЗ НА ВИТЕЛОГЕНИН
                        
                        Трябва да се вземат мерки за избягване на кръстосано замърсяване между пробите с VTG от мъжки и от женски животни.
                        
                           
                              Процедура 1А:
                              Вземане на кръвна проба от опашна вена/артерия от Pimephales promelas
                        
                        След подлагане на анестезия, опашното стъбло частично се отрязва със скалпел и се взема кръв от опашната вена/артерия с хепаринизирана микрокапилярка за хематокрит. След вземането на кръвната проба плазмата бързо се отделя чрез центрофугиране при 15 000 g за 3 минути (или алтернативно при 15 000 g за 10 минути при 4 °C). По избор, процентът хематокрит може да се определи след центрофугирането. Частта плазма се отстранява от микрокапилярката за хематокрит и се съхранява в центрофужна епруветка с 0,13 единици апротинин (протеазен инхибитор) при – 80 °C, докато може да бъде извършено определяне на VTG. В зависимост от размера на Pimephales promelas (който зависи от пола) събираемият обем плазма обикновено е в интервала от 5 до 60 микролитра на риба (Jensen et al. 2001).
                        
                           
                              Процедура 1B:
                              Вземане на кръвна проба от сърце от Pimephales promelas
                        
                        Като алтернатива, кръвна проба може също така да се вземе чрез сърдечна пункция с помощта на хепаризирана спринцовка (1 000 единици хепарин/ml). Кръвта се прехвърля в епендорфови епруветки (държани върху лед) и се центрофугира (5 минути, 7 000 g, стайна температура). Плазмата следва да се прехвърли в чисти епендорфови епруветки (в аликвотни части, ако обемът на плазмата позволява това) и бързо да се замрази при температура – 80 °C до нейното анализиране (Panter et al., 1998).
                        
                           
                              Процедура 2A:   Изрязване на черен дроб от японска оризия
                        
                        
                           Отстраняване на изпитваната риба от камерата за изпитване
                        
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Изпитваната риба следва да се отстрани от изпитвателната камера с помощта на малко кепче. Следва да се внимава изпитваната риба да не попадне в други камери за изпитване.
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    По принцип изпитваните риби следва да бъдат отстранявани в следния ред: контрола, контрола на разтворител (където е приложимо), най-ниска концентрация, средна концентрация, най-висока концентрация и положителна контрола. В допълнение, всички мъжки животни следва да бъдат отстранени от дадена камера за изпитване преди да бъдат отстранени оставащите женски.
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Полът на всяка изпитвана риба се определя въз основа на външни вторични полови белези (напр. формата на аналната перка).
                                 
                              
                                 
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Изпитваната риба се поставя в контейнер за пренасяне и се пренася до работното място за изрязване на черния дроб. За точност и за потвърждаване, че броят на рибите, които са отстранени от камерата за изпитване, и броят на рибите, останали в камерата за изпитване, са в съответствие с очакванията, се проверяват етикетите на камерата за изпитване и на контейнера за пренасяне.
                                 
                              
                                 
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Ако полът не може да бъде определен по външния вид на рибата, от камерата за изпитване се отстраняват всички риби. В този случай полът следва да бъде определен чрез наблюдение на гонадата или на вторични полови белези под стереомикроскоп.
                                 
                              
                           Изрязване на черния дроб
                        
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Изпитваните риби се прехвърлят от контейнера за пренасяне в разтвор за подлагане на анестезия с помощта на малкото кепче.
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    След анестезирането изпитваните риби се прехвърлят върху филтърната хартия (или хартиена кърпа) с пинсети (разпространени в търговската мрежа). При захващането на изпитваните риби пинцетите се прилагат отстрани на главата, за да се предотврати счупването на опашката.
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Водата се избърсва от повърхността на изпитваните риби върху филтърната хартия (или хартиената кърпа).
                                 
                              
                                 
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Рибата се поставя с корема нагоре. След това се прави малък напречен разрез между областта на врата вентрално и областта в средата на корема с помощта на ножици за дисекция.
                                 
                              
                                 
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Ножиците за дисекция се вкарват в малката инцизия и се разрязва коремът от определена точка каудално от бранхиалната мантия до краниално от ануса по средната линия на корема. Внимава се ножиците за дисекция да не се вкарват прекомерно дълбоко, за да се избегне увреждане на черния дроб и гонадата.
                                 
                              
                                 
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Под стереомикроскоп се извършват следните операции.
                                 
                              
                                 
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Изпитваната риба се поставя с корема нагоре върху хартиената кърпа (стъклено блюдо на Петри или предметно стъкло също така са на разположение).
                                 
                              
                                 
                                    (8)
                                 
                                 
                                    Стените на коремната кухина се разширяват с прецизни пинсети и вътрешните органи се екстериоризират. Също така, приемливо е екстериоризирането на вътрешните органи да се извърши чрез отстраняване на едната страна от стената на коремната кухина, ако е необходимо.
                                 
                              
                                 
                                    (9)
                                 
                                 
                                    С помощта на друг чифт прецизни пинцети се разкрива свързаната част на черния дроб и жлъчния мехур. След това се захваща жлъчният канал и се прекъсва жлъчният мехур. Внимава се да не се пробие жлъчният мехур.
                                 
                              
                                 
                                    (10)
                                 
                                 
                                    Захваща се хранопроводът и по същия начин стомашно-чревният тракт се изрязва от черния дроб. Внимава се да не се допусне изтичане на съдържанието на стомашно-чревния тракт. Стомашно-чревният тракт се изрязва каудално от ануса и се отстранява от коремната кухина.
                                 
                              
                                 
                                    (11)
                                 
                                 
                                    Отстранява се масата от мазнини и други тъкани от периферията на черния дроб. Внимава се да не се надраска черният дроб.
                                 
                              
                                 
                                    (12)
                                 
                                 
                                    С помощта на прецизните пинцети се захваща областта на вратата на черния дроб и черният дроб се отстранява от коремната кухина.
                                 
                              
                                 
                                    (13)
                                 
                                 
                                    Черният дроб се поставя върху предметното стъкло. С помощта на прецизните пинцети от повърхността на черния дроб се отстраняват всякакви допълнителни мазнини и чужди тъкани (напр. перитонеумът), ако е необходимо.
                                 
                              
                                 
                                    (14)
                                 
                                 
                                    Теглото на черния дроб се измерва като тара с 1,5 ml микроепруветка, с помощта на електронна аналитична везна. Стойността се вписва в работния лист (точност: 0,1 mg). Потвърждава се информацията за идентифициране, намираща се върху етикета на микроепруветката.
                                 
                              
                                 
                                    (15)
                                 
                                 
                                    Капачката на микроепруветката, съдържаща черния дроб, се затваря. Тя се съхранява в охладителен статив (или охладителен статив с лед).
                                 
                              
                                 
                                    (16)
                                 
                                 
                                    След изрязването на всеки черен дроб инструментите за дисекцията се почистват или се заменят с чисти.
                                 
                              
                                 
                                    (17)
                                 
                                 
                                    Отстранява се черният дроб от всички риби, намиращи се в контейнера за пренасяне, както е описано по-горе.
                                 
                              
                                 
                                    (18)
                                 
                                 
                                    След като черният дроб е изрязан от всички риби в контейнера за пренасяне (т.е. от всички мъжки или женски в дадена камера за изпитване) всички екземпляри от черен дроб се поставят на статив за епруветки с етикет за идентификация и се слагат за съхранение във фризер. Когато черният дроб се дава за предварителна обработка непосредствено след изрязването, екземплярите се пренасят до следващото работно място в охладителен статив (или охладителен статив с лед).
                                 
                              След изрязването на черния дроб трупът на рибата е на разположение за гонадна хистология и за измерване на вторични полови белези.
                        
                           Екземпляри
                        
                        Ако не се използват за предварителна обработка непосредствено след изрязването, екземплярите от черен дроб, взети от изпитваните риби, се съхраняват при ≤ – 70 °C.
                        
                           Фиг-1
                        
                        
                           Прави се разрез с ножици точно пред гръдните перки.
                        
                        
                           Фиг-2
                        
                        
                           Средната линия на корема се разрязва с ножица до точка, разположена приблизително 2 mm краниално от ануса.
                        
                        
                           Фиг-3
                        
                        
                           Коремните стени се разтварят с пинцети за разкриване на черния дроб и други вътрешни органи
                        
                        (като алтернатива, коремните стени могат да се забодат латерално).
                        Стрелката показва черния дроб.
                        
                           Фиг-4
                        
                        
                           С помощта на пинцети се прави дисекция на черния дроб и същият се изрязва.
                        
                        
                           Фиг-5
                        
                        
                           Червата леко се издърпват с помощта на пинцети.
                        
                        
                           Фиг-6
                        
                        
                           Двата края на червата и мезентериалните връзки се отрязват с ножици.
                        
                        
                           Фиг-7 (женски)
                        
                        
                           Процедурата е идентична като тази при мъжките.
                        
                        
                           Фиг-8
                        
                        
                           Завършената процедура.
                        
                        
                           
                              Процедура 2 B:   Японска оризия (Oryzias latipes), предварителна обработка на черен дроб за анализ на вителогенин
                        
                        Взема се бутилката с буфера за хомогенат от комплекта за ELISA и се охлажда с натрошен лед (температура на разтвора: ≤ 4 °C). Ако се използва буфер за хомогенат от EnBio ELISA система, разтворът се размразява при стайна температура и след това бутилката се охлажда с натрошен лед.
                        Изчислява се обемът на буфера за хомогенат за черния дроб въз основа на теглото му (добавят се 50 μl буфер за хомогенат на mg тегло на черен дроб). Например, ако теглото на черния дроб е 4,5 mg, обемът на буфера за хомогенат за черния дроб е 225 μl. Изготвя се списък с обемите на буфера за хомогенат за всички екземпляри черен дроб.
                        
                           Подготовка на черния дроб за предварителната обработка
                        
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Непосредствено преди предварителната обработка микроепруветката от 1,5 ml, съдържаща черния дроб, се взема от фризера.
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Предварителна обработка на черния дроб от животни от мъжки пол следва да се извършва преди тази при женските животни, за да се предотврати замърсяване с вителогенин. Освен това, предварителната обработка за изпитваните риби следва да се извършва в следния ред: контрола, контрола на разтворител (където е приложимо), най-ниска концентрация, средна концентрация, най-висока концентрация и положителна контрола.
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Броят на взетите от фризера в даден момент микроепруветки от 1,5 ml, съдържащи проби черен дроб, не следва да надвишава броя, който може да се центрофугира по това време.
                                 
                              
                                 
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Микроепруветките от 1,5 ml, съдържащи проби черен дроб, се подреждат на охладителния статив с лед по реда на екземпляра (няма нужда от размразяване на черния дроб).
                                 
                              
                           Извършване на предварителната обработка
                        
                        1)   Добавяне на буфера за хомогенат
                        Проверява се списъкът за обема на буфера за хомогенат, който да се използва за определена проба черен дроб и микропипетата се настройва (диапазон на обемите: 100-1 000 μl) към подходящия обем. Поставя се чист връх на микропипетата.
                        Буферът за хомогенат се взема от бутилката с реактива и се добавя в микроепруветката от 1,5 ml, съдържаща проба черен дроб.
                        Буферът за хомогенат се добавя във всички микроепруветки от 1,5 ml, съдържащи проба черен дроб, в съответствие с гореописаната процедура. Не е необходимо да се сменя върхът на микропипетата с нов. Независимо от това, ако върхът е замърсен или се предполага, че е замърсен, той следва да бъде сменен.
                        2)   Хомогенизиране на черния дроб
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Поставя се нов пестик за хомогенизиране в хомогенизатора за микроепруветката.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Пестикът се поставя в микроепруветката от 1,5 ml. Хомогенизаторът се държи за натиск върху черния дроб между повърхността на пестика и вътрешната стена на микроепруветката от 1,5 ml.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Хомогенизаторът за микроепруветката се оставя да функционира в продължение на 10 до 20 секунди. Микроепруветката от 1,5 ml се охлажда с натрошен лед по време на функционирането.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Пестикът се изважда от микроепруветката от 1,5 ml и се оставя в покой в продължение на около 10 секунди. След това се извършва визуална проверка на състоянието на суспензията.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Ако в суспензията се наблюдават парченца от черен дроб, операции 3) и 4) се повтарят, за да се приготви задоволителен хомогенат.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Суспендираният хомогенат от черен дроб се охлажда на охладителния статив с лед до центрофугирането.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Пестикът се сменя с нов за всеки хомогенат.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Всички екземпляри от черен дроб се хомогенизират с буфер за хомогенат в съответствие с гореописаната процедура.
                                 
                              3)   Центрофугиране на суспендирания хомогенат от черен дроб
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Потвърждава се, че температурата на охладената центрофуга е ≤ 5 °C.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Микроепруветките от 1,5 ml, съдържащи суспендирания хомогенат от черен дроб, се поставят в охладената центрофуга (коригира се балансът, ако е необходимо).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Суспендираният хомогенат от черен дроб се центрофугира при 13 000 g за 10 минути при ≤ 5 °C. Ако супернатантите са достатъчно разделени обаче, центробежната сила и времето могат да бъдат коригирани според необходимостта.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    След центрофугирането се проверява дали супернатантът е достатъчно разделен (повърхностен слой: липиди, среден слой: супернатант, дънен слой: чернодробна тъкан). Ако разделянето не е достатъчно, суспензията се центрофугира отново при същите условия.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Всички екземпляри се отстраняват от охладената центрофуга и се подреждат на охладителния статив с лед по реда на екземпляра. Внимава се да не се суспендира повторно някой от разделените след центрофугирането слоеве.
                                 
                              4)   Събиране на супернатанта
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    На статива за епруветки се поставят четири микроепруветки от 0,5 ml за съхранение на супернатанта.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    От всеки супернатант (разделен като междинен слой) с микропипетата се вземат по 30 μl и се поставят в една микроепруветка от 0,5 ml. Внимава се да не се вземе от липидите в повърхностния слой, или от чернодробната тъкан в дънния слой.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Супернатантът се събира и се поставя в други микроепруветки от 0,5 ml по същия начин, както е описано по-горе.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Останалата част от супернатанта се събира с микропипетата (ако е осъществимо: ≥ 100 μl). След това супернатантът се поставя в оставащата микроепруветка от 0,5 ml. Внимава се да не се вземе от липидите в повърхностния слой, или от чернодробната тъкан в дънния слой.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Капачката на микроепруветката от 0,5 ml се затваря и върху етикета се отбелязва обемът на супернатанта. След това микроепруветките се охлаждат незабавно върху охладителния статив с лед.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Върхът на пипетата се сменя с нов за всеки супернатант. Ако към върха остава прикрепено голямо количество липиди, той се сменя незабавно с нов, за да се избегне замърсяване на екстракта от черен дроб с мазнини.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Цялото количество центрофугиран супернатант се поставя в четири микроепруветки от 0,5 ml съгласно процедурата, описана по-горе.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    След поставянето на супернатантата в микроепруветките от 0,5 ml, всички те се поставят на статива за епруветки с етикет за идентификация, след което се замразяват незабавно във фризера. Ако концентрациите на VTG се измерват непосредствено след предварителната обработка, една микроепруветка от 0,5 ml (съдържаща 30 μl супернатант) се съхранява на хладно на статива за епруветки и се прехвърля на работното място, където се провежда изпитването с ELISA. В такъв случай оставащите микроепруветки се поставят на стативите за епруветки и се замразяват във фризера.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    След събирането на супернатанта остатъкът се отстранява по подходящ начин.
                                 
                              
                           Съхранение на образците
                        
                        Микроепруветките от 0,5 ml, съдържащи супернатанта от хомогената от черен дроб, се съхраняват при ≤ – 70 °C до използването им за ELISA.
                        
                           
                              Процедура 3А:
                              Вземане на кръвна проба от опашна вена/артерия от зеброво данио
                        
                        Непосредствено след анестезията опашното стъбло се разрязва напречно и кръвта се отстранява от опашната артерия/вена с хепаринизирана микрокапилярка за хематокрит. Обемът на кръвта варира от 5 до 15 μl в зависимост от размера на рибата. Равен обем буфер с апротинин (6 μg/ml в PBS) се добавя към микрокапилярката и плазмата се разделя от кръвта чрез центрофугиране (5 минути при 600 g). Плазмата се събира в епруветките за изпитването и се съхранява при температура – 20 °C до анализа за VTG или за други представляващи интерес белтъци.
                        
                           
                              Процедура 3B:   Кръвна проба чрез сърдечна пункция при зеброво данио
                        
                        За да се избегне съсирването на кръвта и разграждането на белтъците, пробите се вземат във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), съдържащ хепарин (1 000 единици/ml) и протеазния инхибитор апротинин (2 TIU/ml). Като съставки за буфера са препоръчителни хепарин (амониева сол) и лиофилизиран апротинин. За вземане на кръв се препоръчва спринцовка (1 ml) с фиксирана тънка игла (напр. Braun Omnikan-F). Спринцовката трябва да се запълни предварително с буфер (около 100 μl) за пълно елуиране на малките обеми кръв от всяка риба. Кръвните проби се вземат чрез сърдечна пункция. Първоначално рибата трябва да бъде анестезирана с MS-222 (100 mg/l). Правилното извършване на анестезията позволява на ползвателя да различава пулсирането на сърцето на зебровото данио. При извършването на сърдечната пункция буталото на спринцовката се държи под слаб натиск. Обемът на кръвната проба, който може да бъде взет, варира между 20 и 40 микролитра. След сърдечната пункция сместа от кръвта и буфера следва да бъде поставена в епруветката за изпитване. Плазмата се отделя от кръвта чрез центрофугиране (20 мин.; 5 000 g) и следва да се съхранява при –80 °C докато бъде необходима за анализ.
                        
                           
                              Процедура 3С:
                              СОП: Зеброво данио, хомогенизиране на главата и опашката
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Рибите се подлагат на анестезия и евтаназия в съответствие с описанието на изпитването.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Главата и опашката се изрязват от рибата в съответствие с фигура 1.
                                    Важно: Всички инструменти за дисекция и плоскостта за разрязване трябва да се промият и почистят по подходящ начин (например с 96 % етанол) между обработването на всяка отделна риба, за да се предотврати „замърсяване с вителогенин“ от женски или индуцирани мъжки.
                                    
                                    
                                       Фигура 1
                                    
                                    
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Теглото на обединените глава и опашка от всяка риба се измерва с точност до един mg.
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    След като се претеглят, частите се поставят в подходящи епруветки (напр. 1,5 ml епендорфова епруветка) и се замразяват при –80 °С до хомогенизирането, или направо се хомогенизират върху лед с два пластмасови пестика. (Могат да се използват други методи, ако те се извършват върху лед и резултатът е хомогенна маса). Важно: Епруветките следва да бъдат номерирани по подходящ начин, така че главата и опашката от рибата да могат да бъдат свързани с частта от тялото, останала след изрязването им и използвана за хистология на гонадите.
                                    
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Когато се достигне до хомогенна маса, се добавя леденостуден буфер за хомогенизиране
                                        (*11) в количество, равно на 4 пъти теглото на тъканта. Продължава се работата с пестиците, докато сместа стане хомогенна. Важна забележка: За всяка риба се използват нови пестици.
                                    
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Пробите се поставят върху лед до центрофугирането при 4 °C на 50 000g за 30 min.
                                 
                              
                                 
                                    7.
                                 
                                 
                                    Използва се пипета за поставяне на порции от 20 μl супернатант в поне две епруветки, чрез потапяне на върха на пипетата под слоя мазнини на повърхността, и внимателно изсмукване на супернатанта, без фракции от мазнини или пелети.
                                 
                              
                                 
                                    8.
                                 
                                 
                                    Епруветките се съхраняват при – 80 °C до момента на употребата.
                                 
                              
                     
                        Допълнение 7
                        
                           ПРОБИ С ВНЕСЕНА ДОБАВКА ВИТЕЛОГЕНИН И ЕТАЛОН, КОЙТО Е РЕФЕРЕНТЕН МЕЖДУ РАЗЛИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ
                        
                        Всеки ден, в който се извършват изследвания за VTG, се анализира проба с внесена добавка с използване на еталон, който е референтен между различни изследвания. Вителогенинът, използван за получаването на еталона, референтен между различни изследвания, ще е от партида, различна от използваната за приготвяне на еталони за калибриране за извършваното изследване.
                        Пробата с внесена добавка се приготвя чрез добавяне на предварително известно количество от еталона, референтен между различни изследвания, в проба от плазма от контролен мъжки екземпляр. В пробата се внася добавка с цел постигане на концентрация на вителогенин между 10 и 100 пъти по-висока от очакваната концентрация на вителогенин в контролен мъжки екземпляр. Пробата от плазма от контролен мъжки екземпляр, в която се внася добавка, може да бъде от отделна риба, или може да бъде съставена от няколко риби.
                        Подпроба от плазма от контролен мъжки екземпляр, в която не е внесена добавка, се анализира най-малко в две гнезда с повторения. Пробата с внесена добавка също се анализира най-малко в две гнезда с повторения. Средното количество вителогенин в двете проби от плазма от контролен мъжки екземпляр, в които не е внесена добавка, се добавя към изчисленото количество вителогенин, внесено като добавка в пробите, за да се определи очаквана концентрация. Отношението на тази очаквана концентрация към измерената концентрация се протоколира заедно с резултатите от всеки набор от изследвания от този ден.
                     
                     
                        Допълнение 8
                        
                           БЛОКОВА СХЕМА ЗА СТАТИСТИЧЕСКИЯ АНАЛИЗ
                        
                        
                     В.49   Изпитване за остра токсичност при рибни ембриони (ТРЕ)
                     
                     УВОД
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (TG) 236 (2013 г.). Той описва изпитване за остра токсичност при рибни ембриони (ТРЕ) със зеброво данио (Danio rerio). Това изпитване е предназначено за определяне на остра токсичност на химикали върху стадиите на развитие на рибните ембриони. Изпитването за остра токсичност при рибни ембриони се основава на проучвания и действия за валидиране, извършени по отношение на зеброво данио (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14). Изпитването за остра токсичност при рибни ембриони е успешно прилагано за широк спектър от химикали, проявяващи различни начини на действие, разтворимост, летливост и хидрофобност (прегледани в (15) и (16).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Определенията, използвани за този метод за изпитване, са дадени в допълнение 1.
                              
                           ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Новооплодените хайверни зърна на зеброво данио са изложени на изпитвания химикал за период от 96 часа. На всеки 24 часа до четири апикални наблюдения се записват като показатели за смъртност (6): i) коагулация на оплодените хайверни зърна; ii) отсъствие на образуване на сомити; iii) отсъствие на отделяне на опашката от жълтъчната торбичка; и iv) отсъствие на сърдечна дейност. В края на периода на експозиция острата токсичност се определя въз основа на положителен резултат при всяко от четирите записани апикални наблюдения и се изчислява LC50.
                              
                           ПЪРВОНАЧАЛНИ СЪОБРАЖЕНИЯ
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Полезна информация относно специфичните за веществото свойства включват структурната формула, молекулното тегло, чистотата, стабилността във вода и на светлина, pKa и Kow, разтворимостта във вода и парното налягане, както и резултатите от изпитването за пълна биоразградимост (МИ В.4 (17) или МИ В.29 (18)). Разтворимостта и парното налягане може да се използват за изчисляване на константата по закона на Хенри, която ще покаже дали се очакват загуби на изпитвания химикал поради изпарение. Следва да е на разположение и надежден метод за анализ за характеризиране на веществото в изпитвания разтвор, с известна и протоколирана точност и граница на откриване.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Ако методът за изпитване се използва за изпитване на смес, нейният състав следва да бъде характеризиран, доколкото е възможно, напр. чрез химичната идентичност на нейните съставки, техния количествен състав и специфичните свойства на нейните съставки (вж. точка 4). Преди използването на метода за изпитване на смес с регулаторна цел следва да се обмисли дали той ще предостави приемливи за планираната регулаторна цел резултати.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Що се отнася до вещества, които могат да бъдат активирани чрез метаболизъм, има доказателства, че ембрионите на зеброво данио действително имат капацитет за биотрансформация (19) (20) (21) (22). Капацитетът за метаболизиране на рибните ембриони обаче невинаги е подобен на този на ювенилните или полово зрелите екземпляри. Например метаболитният прекурсор на токсични вещества алиловият алкохол (9) е пропуснат в изпитването за остра токсичност при рибни ембриони. Ето защо, ако има някакви признаци, че метаболити или други продукти на трансформацията от значение могат да бъдат по-токсични от базовото съединение, също се препоръчва да се извърши изпитването с тези метаболити/продукти на трансформация, както и да се използват тези резултати, когато се правят заключения относно токсичността на изпитвания химикал, или алтернативно да се извърши друго изпитване, при което се отделя допълнително внимание на метаболизма.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 За вещества с молекулно тегло ≥ 3kDa, такива с много обемиста молекулярна структура, както и вещества, които причиняват забавяне на излюпването, което може да възпрепятства или намали експозицията след излюпването, не се очаква ембрионите да са чувствителни поради ограничената бионаличност на веществото и може да са по-подходящи други изпитвания за токсичност.
                              
                           ВАЛИДНОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 За да са приемливи резултатите от изпитването, се прилагат следните критерии:
                                 
                                             а)
                                          
                                          
                                             Общият процент на оплождане на всичкия събран хайвер следва да бъде ≥ 70 % в изпитваната партида.
                                          
                                       
                                             б)
                                          
                                          
                                             Температурата на водата следва да се поддържа на 26 ± 1 °C в камерите за изпитване по всяко време по време на изпитването.
                                          
                                       
                                             в)
                                          
                                          
                                             Общата преживяемост на ембрионите в отрицателната контрола (контрола на вода за разреждане) и, когато е приложимо, в контролата на разтворителя следва да бъде ≥ 90 % до края на експозицията от 96 часа.
                                          
                                       
                                             г)
                                          
                                          
                                             Експозицията на положителната контрола (например 4,0 mg/l 3,4-дихлороанилин за зеброво данио) следва да доведе до минимална смъртност от 30 % в края на експозицията от 96 часа.
                                          
                                       
                                             д)
                                          
                                          
                                             Скоростта на излюпване в отрицателната контрола (и контролата на разтворителя, ако е приложимо) следва да е ≥80 % в края на 96-часовата експозиция.
                                          
                                       
                                             е)
                                          
                                          
                                             В края на 96-часовата експозиция концентрацията на разтворения кислород в отрицателната контрола и най-високата изпитвана концентрация следва да бъде ≥80 % от стойността на насищане.
                                          
                                       
                           ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
                     
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Преглед на препоръчителните условия на поддържане и изпитване е наличен в допълнение 2.
                              
                           
                        Апаратура
                     
                     
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Нужно е следното оборудване:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             съдове за рибите, направени от химични инертни материали (напр. стъкло) и с подходящ капацитет по отношение на препоръчителната гъстота на зареждане (вж. „Поддържане на риби за размножаване“, точка 14);
                                          
                                       
                                             б)
                                          
                                          
                                             инвертен и/или бинокулярен микроскоп с капацитет за поне 80-кратно увеличение. Ако температурата в стаята, която се използва за запис на наблюденията, не може да се регулира на 26±1 °C, температурата трябва да се поддържа с помощта на напречно задвижвана платформа с контролирана температура или други методи;
                                          
                                       
                                             в)
                                          
                                          
                                             камери за изпитване; например стандартни 24-гнездни плаки с дълбочина от около 20 mm. (вж. „Камери за изпитване“, точка 11);
                                          
                                       
                                             г)
                                          
                                          
                                             например самозалепващо фолио за покриване на 24-гнездните плаки;
                                          
                                       
                                             д)
                                          
                                          
                                             инкубатор или климатизирано помещение с контролирана температура, позволяващи да се поддържа температура от 26 ± 1 °C в гнездата (или камерите за изпитване);
                                          
                                       
                                             е)
                                          
                                          
                                             рН-метър;
                                          
                                       
                                             ж)
                                          
                                          
                                             кислородомер;
                                          
                                       
                                             з)
                                          
                                          
                                             уред за определяне твърдостта на водата и проводимостта;
                                          
                                       
                                             и)
                                          
                                          
                                             вана за хвърляне на хайвера: вани от стъкло, неръждаема стомана или други инертни материали; телена мрежа (размер на решетката 2 ± 0,5 mm) от неръждаема стомана или друг инертен материал, за защита на вече поставените хайверни зърна; субстрат за хвърляне на хайвер (например изкуствени растения от инертен материал) (МИ В.48, допълнение 4а, (23));
                                          
                                       
                                             й)
                                          
                                          
                                             пипети с разширени отвори за събиране на хайверните зърна;
                                          
                                       
                                             к)
                                          
                                          
                                             стъклени съдове за приготвяне на различни изпитвани концентрации и на водата за разреждане (стъкленици, градуирани колби, градуирани цилиндри и градуирани пипети) или за събиране на хайвера на зеброво данио (например стъкленици, блюда кристализатори);
                                          
                                       
                                             л)
                                          
                                          
                                             ако за провеждане на изпитването се използват алтернативни системи на експозиция, като проточно (24) или пасивно дозиране (25), са необходими подходящи съоръжения и оборудване.
                                          
                                       
                           
                        Камери за изпитване
                     
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Следва да се използват камери за изпитване от стъкло или полистирен (например 24-гнездни плаки с капацитет на запълване от 2,5—5 ml на гнездо). В случай на съмнения за адсорбция върху полистирен (например при неполярни планарни вещества с високо KOW), за да се намалят загубите, дължащи се на адсорбцията (26), следва да се използват инертни материали (стъкло). Камерите за изпитване следва да бъдат произволно разположени в инкубатора.
                              
                           
                        Вода и условия на изпитване
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Препоръчително е водата за поддържане да се разрежда, за да се постигне равнище на твърдост, характерно за голяма част от повърхностните води. Водата за разреждане следва да се приготвя от възстановена вода (27). Постигнатата степен на твърдост следва да бъде еквивалентна на 100—300 mg/l СаСО3, за да се предотврати прекомерно утаяване на калциев карбонат. Може да се използват и други добре характеризирани повърхностни или изворни води. Възстановената вода може да се адаптира до вода за поддържане с ниска твърдост чрез разреждане с дейонизирана вода до съотношение от 1:5 за постигане на минимална твърдост от 30—35 mg/l CaCO3. Преди да се добави изпитваният химикал, водата се аерира до насищане с кислород. В хода на изпитването температурата в гнездата следва да се поддържа на 26±1°С. Стойността на pH следва да бъде в границите между рН 6,5 и 8,5 и в рамките на този диапазон да не варира с повече от 1,5 единици в хода на изпитването. Ако се очаква, че рН няма да се запази в този диапазон, следва да се направи корекция на рН преди началото на изпитването. Корекцията на рН следва да се направи по такъв начин, че концентрацията на изходния разтвор да не се промени в значителна степен и да не се предизвика никаква химична реакция или утаяване на изпитвания химикал. Препоръчва се използването на хлороводород (HCl) и натриев хидроксид (NaOH), за да се коригира рН в разтворите, съдържащи изпитващия химикал.
                              
                           
                        Разтвори за изпитване
                     
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Разтворите за изпитване на избраните концентрации могат да се приготвят например чрез разреждане на изходен разтвор. Изходните разтвори следва да се приготвят за предпочитане чрез просто смесване или разбъркване на изпитвания химикал във водата за разреждане, като се използват механични средства (например разклащане и/или с помощта на ултразвук). Ако разтварянето на изпитвания химикал във вода е трудно, трябва да бъдат следвани процедурите, описани в ръководството на ОИСР с насоки № 23 за боравене с трудни вещества и смеси (28). Използването на разтворители следва да се избягва, но в някои случаи може да се изисква с цел да се получи изходен разтвор с подходяща концентрация. Когато за подготовката на изходния разтвор се използва разтворител, неговата окончателна концентрация не следва да превишава 100 μl/l и следва да бъде еднаква във всички съдове за изпитване. Когато се използва разтворител, се изисква допълнителна контрола на разтворител.
                              
                           
                        Поддържане на риби за размножаване
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 За получаването на хайвер се използват риби за развъждане от неекспонирани диви екземпляри на зеброво данио с добре документиран процент на оплождане на хайвера. По рибите следва да няма макроскопски симптоми на инфекции и заболявания и те следва да не са били подлагани на медикаментозно (интензивно или профилактично) лечение 2 месеца преди хвърлянето на хайвера. Рибите за развъждане се поддържат в аквариуми с препоръчителен капацитет на зареждане от 1 l вода на риба и фиксиран светъл период с продължителност от 12—16 часа (29) (30) (31) (32) (33). Оптималната скорост на филтруване следа да бъде коригирана; прекалено високата скорост на филтруване причинява сериозни смущения на водата и следва да се избягва. За условията на хранене вж. допълнение 2. Следва да се избягва прехранването и качеството на водата и чистотата на аквариумите следва да се следят редовно и, ако е необходимо, да се възстановяват до изходното състояние.
                              
                           
                        Изпитване за пригодност
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 В качеството си на референтен химикал 3,4-дихлороанилинът (използван в изследванията за валидиране (1) (2)), следва да бъде изпитан в пълния диапазон концентрация-отклик с цел да се провери чувствителността на използвания рибен щам, като за предпочитане е това да става два пъти годишно. Всяка лаборатория, която за първи път започва да извършва такъв анализ, следва да използва референтния химикал. Лабораториите могат да използват този химикал за доказване на своята техническа компетентност за извършване на изследването преди предаване на данните за регулаторни цели.
                              
                           
                        Получаване на хайвер
                     
                     
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Хайверът на зеброво данио може да бъде набавен чрез използване на групи за хвърляне на хайвер (в отделни резервоари за хвърляне на хайвер) или чрез масово хвърляне на хайвера (в резервоарите за поддържане). Що се отнася до групите за хвърляне на хайвер, мъжките и женските риби (напр. в съотношение 2:1) в дадена група за развъждане се поставят в резервоари за хвърляне на хайвер няколко часа преди настъпването на тъмнина в деня преди изпитването. Тъй като при зебровото данио групите за хвърляне на хайвер могат понякога да не успеят да хвърлят хайвера си, препоръчва се едновременно използване на най-малко три резервоара за хвърляне на хайвер. С цел да се предотврати евентуално отклонение в генетично отношение хайверните зърна се събират, смесват и подбират на произволен принцип от минимум три групи за развъждане.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Що се отнася до събирането на хайверните зърна, ваните за хвърляне на хайвер се поставят в резервоарите за хвърляне на хайвер или в резервоарите за поддържане преди настъпване на тъмната част на денонощието в деня преди изпитването или преди настъпване на светлата част на денонощието в деня на изпитването. С цел да се попречи на полово зрелите екземпляри зеброво данио да изядат хайвера ваните за хвърляне на хайвер се покриват с мрежа от инертен материал с подходящ размер на отворите (прибл. 2 ± 0,5 mm). Ако се сметне за необходимо, към мрежата могат да бъдат фиксирани изкуствени растения, изработени от инертен материал (например пластмаса или стъкло), за да служат като стимул за хвърляне на хайвер (3) (4) (5) (23) (35). Следва да се използват устойчиви пластмасови материали, от които не се освобождават вещества (например фталати). Чифтосването, хвърлянето на хайвера и оплождането се извършват в рамките на 30 минути след настъпване на светлата част на денонощието, след което ваните със събраните хайверни зърна могат да бъдат внимателно отстранени. След като бъдат събрани от ваните за хвърляне на хайвер се препоръчва хайверните зърна да се изплакват с възстановена вода.
                              
                           
                        Делене на хайвера
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 При температура от 26°С след около 15 минути оплоденият хайвер преминава през първия стадий на делене и последващи синхронни деления на 4, 8, 16 и 32 клетъчни бластомера (вж. допълнение 3) (35). В тези стадии оплодените хайверни зърна могат ясно да бъдат идентифицирани чрез образуването на бластула.
                              
                           ПРОЦЕДУРА
                     
                        Условия на експозиция
                     
                     
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Двадесет ембриона на концентрация (един ембрион на гнездо) се експонират на изпитвания химикал. Експозицията следва да бъде такава, че да позволява поддържане на ± 20 % от номиналната концентрация на химикала в хода на изпитването. Ако в статична система това не е възможно, следва да се приложи полустатичен интервал на обновяване (например обновяване на всеки 24 часа). В тези случаи концентрациите на експозицията поне за най-високите и най-ниските изпитвани концентрации трябва да се проверяват в началото и в края на всеки интервал на експозиция (вж. точка 36). Ако поддържане на концентрация на експозицията в интервал ± 20 % от номиналната концентрация не е възможно, всички концентрации трябва да бъдат измерени в началото и в края на всеки интервал на експозиция (вж. точка 36). При обновяване следва да се внимава ембрионите да продължават да бъдат покрити с малка част от старите изпитвани разтвори, за да се предотврати тяхното изсушаване. Планът на изпитването може да бъде адаптиран, така че да изпълнява изискванията за изпитване на конкретни вещества (напр. проточни (24) или пасивни системи за дозиране (25) за лесно разградими или силно адсорбиращи се вещества (29) или други за летливи вещества (36) (37)). Във всеки случай следва да се подхожда внимателно, за да се минимизира стресът на ембрионите. Камерите за изпитване следва да бъдат кондиционирани с изпитваните разтвори поне 24 часа преди началото на изпитването. Условията на изпитване са обобщени в допълнение 2.
                              
                           
                        Концентрации на изпитване
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Обикновено, за да се отговори на статистическите изисквания, са необходими пет концентрации на изпитвания химикал, равно отдалечени една от друга с кратност, която не надвишава 2,2. Следва да се представи обосновка, ако са използвани по-малко от пет концентрации. За предпочитане е най-високата изпитвана концентрация да предизвиква 100 % смъртност, а най-ниската изпитвана концентрация да няма видим ефект, както е посочено в точка 28. Изпитване за определяне на обхвата, проведено преди окончателното изпитване, позволява да се избере подходящият диапазон на концентрация. За определяне на обхвата обикновено се използват по десет ембриона на концентрация. Указанията по-долу се отнасят за извършване на изпитване в 24-гнездни плаки. Ако за изпитването се използват различни камери (например малки блюда на Петри) или се изпитват повече концентрации, указанията трябва съответно да бъдат коригирани.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Подробности и визуални инструкции относно разпределението на концентрациите във всички 24-гнездни плаки са предоставени в точка 27 и в допълнение 4, фигура 1.
                              
                           
                        Контроли
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Изискват се контроли на водата за разреждане както под формата на отрицателна контрола, така и под формата на вътрешни контроли на плаките. Ако при вътрешната контрола на плаката се констатира повече от един мъртъв ембрион, плаката се отхвърля, като по този начин се намалява броят на концентрациите, използвани за определянето на LC50. При отхвърляне на цялата плака способността за оценка и разграничаване на наблюдаваните ефекти може да бъде затруднена, особено ако е отхвърлена плаката с контролата на разтворител или плака, в която са засегнати и третираните ембриони. В първия случай изпитването трябва да се повтори. Във втория загубата на цяла третирана група или групи поради смъртност във вътрешната контрола може да ограничи възможността за оценка на ефектите и за определяне на стойностите на LC50.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Положителна контрола при фиксирана концентрация от 4 mg/l 3,4-дихлороанилин се извършва за всяка партида хайвер, която се използва за изпитване.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Когато се използва разтворител, на разтворителя се излага допълнителна група от 20 ембриона в отделна 24-гнездна плака, която служи за контрола на разтворителя. За да може изпитването да се счете за приемливо, следва да се докаже, че разтворителят не оказва значимо въздействие по време на излюпването и преживяването и че не предизвиква каквито и да било други неблагоприятни ефекти върху ембрионите (вж. точка 8в).
                              
                           
                        Начало на експозицията и продължителност на изпитването
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Изпитването започва възможно най-скоро след оплождането на хайвера и приключва след 96-часова експозиция. Ембрионите следва да бъдат потапяни в изпитваните разтвори преди да започне дробенето на бластодиска или най-късно до 16-ия клетъчен стадий. За да се сведе до минимум забавянето на началото на експозицията, не по-късно от 90 минути след оплождането на случаен принцип се избират хайверни зърна, чийто брой надвишава поне два пъти необходимия за третираната група, и те се пренасят в съответните концентрации и контроли (напр. в 100-милилитрови блюда кристализатори; хайверните зърна следва да бъдат изцяло покрити).
                              
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 До 180 минути след оплождането живите оплодени хайверни зърна следва да бъдат отделени от неоплодените хайверни зърна и да се прехвърлят в 24-гнездни плаки, предварително подготвени в продължение на 24 часа и напълнени с 2 ml/гнездо прясно приготвени изпитвани разтвори. С помощта на стереомикроскоп (за предпочитане с ≥30-кратно увеличение) се подбират оплодени хайверни зърна в процес на дробене, при които не се наблюдават явни недостатъци при дробенето (например асиметрия, образуване на везикули), нито нараняване на хориона. Относно събирането и разделянето на хайверните зърна вж. допълнение 3, фиг. 1 и 3 и допълнение 4, фиг. 2.
                              
                           
                        Разпределение на хайверните зърна в 24-гнездните плаки
                     
                     
                              
                                 27.
                              
                              
                                 В гнездните плаки се поставя следният брой хайверни зърна (вж. също допълнение 4, фиг. 1)
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             20 хайверни зърна на една плака за всяка изпитвана концентрация;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             20 хайверни зърна на една плака като контрола на разтворител (ако е необходимо);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             20 хайверни зърна на една плака като положителна контрола;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             4 хайверни зърна във водата за разреждане във всяка от горните плаки като вътрешна контрола на плаката;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             24 хайверни зърна на една плака във вода за разреждане като отрицателна контрола.
                                          
                                       
                           
                        Наблюдения
                     
                     
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Апикалните наблюдения за всеки изпитван ембрион включват: коагулация на ембрионите, отсъствие на образуване на сомити, неотделяне на опашка и отсъствие на сърдечна дейност (таблица 1). Тези наблюдения се използват за определяне на леталитета: Всеки положителен резултат при някой от тези фактори за наблюдения означава, че ембрионът на зебровото данио е мъртъв. Освен това излюпването в третираните и контролните групи се записва ежедневно, като се започва от 48-ия час. Наблюденията се записват на всеки 24 часа до края на изпитването.
                                 
                                    Таблица 1.
                                 
                                 
                                    Апикални наблюдения за остра токсичност при зеброво данио 24—96 часа след оплождането.
                                 
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Време на експозиция
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             24 часа
                                          
                                          
                                             48 часа
                                          
                                          
                                             72 часа
                                          
                                          
                                             96 часа
                                          
                                       
                                             Коагулирани ембриони
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Отсъствие на образуване на сомити
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Неотделяне на опашката
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Отсъствие на сърдечна дейност
                                          
                                          
                                              
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                           
                              
                                 29.
                              
                              
                                 
                                    Коагулация на ембриона: Коагулираните ембриони са млечнобели и под микроскопа изглеждат тъмни (вж. допълнение 5, фиг. 1). Броят на коагулираните ембриони се определя след 24, 48, 72 и 96 часа.
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 
                                    Отсъствие на образуване на сомити: При температура от 26 ± 1 °C при нормално развит ембрион на зеброво данио след 20 часа се образуват около 20 сомита (вж. допълнение 5, фигура 2). Нормално развитият ембрион извършва спонтанни движения (контракции от единия до другия край). Спонтанните движения са индикация за образуването на сомити. Отсъствието на сомити се записва след 24, 48, 72 и 96 часа. Отсъствието на образувани сомити след 24 часа може да се дължи на общо забавяне на развитието. Образуването на сомити следва да навакса забавянето най-късно след 48 часа. Ако това не стане, ембрионите се считат за мъртви.
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 
                                    Неотделяне на опашката: При нормално развиващ се ембрион на зеброво данио отделянето на опашката (вж. допълнение 5, фигура 3) от жълтъка се наблюдава след удължаване на задната част на тялото на ембриона. Неотделянето на опашка се записва след 24, 48, 72 и 96 часа.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 
                                    Отсъствие на сърдечна дейност: При нормално развиващ се ембрион на зеброво данио при температура от 26 ± 1 °C сърдечната дейност започва да се долавя след 48 часа (вж. допълнение 5, фигура 4). Записът на тази крайна точка изисква особено внимание, тъй като нередовната (хаотична) сърдечна дейност не следва да се записва като летална. Освен това доловима сърдечна дейност без циркулация в абдоминалната аорта се счита за нелетална. При записа на тази крайна точка ембрионите, при които липсва сърдечна дейност, следва да се наблюдават под микроскоп при минимално увеличение 80X в продължение на поне една минута. Отсъствието на сърдечна дейност се записва след 48, 72 и 96 часа.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Процентът на излюпване във всички третирани и контролни групи следва да се записва от 48-ия час нататък и да се протоколира. Въпреки че излюпването не се използва като крайна точка за изчисляване на LC50, то осигурява експозиция на ембриона без потенциална бариерна функция на хориона, и в този смисъл може да помогне за интерпретацията на данните.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Подробни описания на нормалното (35) и примери за ненормално развитие на ембриони на зеброво данио са представени в допълнния 3 и 5.
                              
                           
                        Аналитични измервания
                     
                     
                              
                                 35.
                              
                              
                                 В началото и в края на изпитването се измерват рН, общата твърдост и проводимостта в контролата(ите) и в най-високата концентрация на изпитвания химикал. В системите с полустатично обновяване рН следва да се измерва преди и след обновяването на водата. Концентрацията на разтворения кислород се измерва в края на изпитването в отрицателните контроли и в най-високата изпитвана концентрация с жизнеспособни ембриони, като тя следва да съответства на критериите за валидност на изпитването (вж. точка 8е). Ако съществуват опасения, че температурата в различните 24-гнездни плаки е различна, температура се измерва в три произволно избрани съда. За предпочитане е температурата да се записва непрекъснато по време на изпитването или, като минимум, всеки ден.
                              
                           
                              
                                 36.
                              
                              
                                 В статична система концентрацията на изпитвания химикал следва да се измерва, като минимум, в най-високите и най-ниските изпитвани концентрации, но за предпочитане във всички третирания в началото и в края на изпитването. В полустатичните (с обновяване) изпитвания, при които концентрацията на изпитвания химикал се очаква да остане в рамките на ± 20 % от номиналната стойност, се препоръчва като минимум да се анализират най-високите и най-ниските изпитвани концентрации, когато са прясно приготвени, и непосредствено преди обновяване. За изпитвания, при които концентрацията на изпитвания химикал не се очаква да остане в рамките на ± 20 % от номиналната стойност, трябва да се анализират всички изпитвани концентрации, когато са прясно приготвени, и непосредствено преди обновяване. Ако обемът не е достатъчен за анализ, може да бъде от полза изпитваните разтвори да се обединят, или да се използват сурогатни камери от същия материал и със същото съотношение обем/повърхностна площ като това при 24-гнездните плаки. Силно се препоръчва резултатите да се основават на измерени концентрации. Когато концентрациите не се задържат в рамките на 80—120 % от номиналната концентрация, концентрациите с определено въздействие следва да бъдат изразени спрямо средната геометрична стойност на измерените концентрации; за повече информация вж. глава 5 от Ръководството на ОИСР с насоки за изпитване за токсичност във водна среда на трудни вещества и смеси (28).
                              
                           ГРАНИЧНО ИЗПИТВАНЕ
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Като се използват процедурите, описани в настоящия метод за изпитване, може да се направи гранично изпитване при 100 mg/l от изпитвания химикал или при неговата граница на разтворимост в средата за изпитване (в зависимост от това коя е по-ниска), за да се докаже, че LC50 е по-голяма от тази концентрация. Граничното изпитване следва да се извърши с 20 ембриона в третиранията, положителната контрола и, ако е необходимо, в контролата на разтворител, и с 24 ембриона в отрицателната контрола. Ако процентът на леталитет при изпитваната концентрация надвишава смъртността в отрицателната контрола (или контролата на разтворител) с 10 %, следва да се извърши цялостно проучване. Всички наблюдавани ефекти следва да бъдат записани. Ако при отрицателната контрола (или контролата на разтворител) смъртността надвишава 10 %, изпитването е невалидно и следва да се повтори.
                              
                           ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Обработка на резултатите
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 В настоящото изпитване отделните гнезда се считат за независими повторения за целите на статистическия анализ. Дяловете на ембрионите с поне един положителен резултат при апикалните наблюдения на 48-ия и/или 96-ия час се начертават срещу изпитваните концентрации. При изчисляването на наклоните на кривата, стойностите на LC50 и доверителните граници (95 %) следва да се прилагат подходящи статистически методи (38) и следва да се направи консултация с документа на ОИСР относно „Съвременни подходи за статистически анализ на данни за екотоксичност“ (39).
                              
                           
                        Протокол от изпитването
                     
                     
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Изпитван химикал:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Вещества с една съставка
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     химична идентификация, като например наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, код SMILES или InChI, структурна формула, чистота, химична идентичност на онечистванията, доколкото е целесъобразно и практически осъществимо, и т.н. (включително съдържание на органичен въглерод, ако е приложимо).
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Вещество с повече съставки, UVCB и смеси:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     определени, доколкото е възможно, с химичната си идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Изпитвани организми:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         научно наименование, порода, източник и метод на събиране на оплодените хайверни зърна и последваща обработка.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Условия на изпитване:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         използвана процедура на изпитване (например полустатична с обновяване);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         времетраене на осветлението:
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         план на изпитването (например брой на камерите за изпитване, видове контроли);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         качествени характеристики на водата за поддържане на рибите (например рН, твърдост, температура, проводимост, разтворен кислород);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         концентрация на разтворен кислород, рН, обща твърдост, температура и проводимост на изпитваните разтвори в началото и след 96 часа;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         метод за приготвяне на изходните разтвори и разтворите за изпитване, както и честота на обновяване;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         обосновка за използването на разтворител и обосновка за избора на разтворител, ако е различен от вода;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         номиналните изпитвани концентрации и резултатите от всички анализи за определяне на концентрацията на изпитвания химикал в съдовете за изпитване; следва да се отчете коефициентът на аналитичния добив на метода и границата на количественото определяне;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         доказателства, че контролите изпълняват общите критерии за валидност по отношение на преживяването;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         процент на оплождане на хайверните зърна;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         процент на излюпване в третираните и контролните групи.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Резултати:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         максималната концентрация, при която не е настъпила смъртност през периода на изпитването;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         минималната концентрация, при която е отчетена 100-процентова смъртност през периода на изпитването;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         кумулативна смъртност за всяка концентрация в препоръчаните часове за наблюдение;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         стойности на LC50 след 96 часа (и като вариант след 48 часа) за смъртността с доверителни граници от 95 %, ако е възможно;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         графика на кривата концентрация-смъртност в края на изпитването;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         смъртност в контролите (отрицателни контроли, вътрешни контроли на плаките, както и използваните положителна контрола и всякаква контрола на разтворител);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         данни за резултатите от всяко от четирите апикални наблюдения;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         проява и описание на морфологичните и физиологичните аномалии, ако има такива (вж. примерите, предоставени в допълнение 5, фигура 2);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         инциденти в хода на изпитването, които биха могли да повлияят на резултатите;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         статистически анализ и обработка на данните (пробит-анализ, модел на логистична регресия и средногеометричната стойност за LC50);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         наклон и доверителни граници на регресията на (трансформираната) крива концентрация-отклик.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Евентуално отклонение от метода за изпитване и съответните обяснения.
                                             
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Дискусия и интерпретиране на резултатите.
                                             
                                          
                                       
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2011) Validation Report (Phase 1) for the Zebrafish Embryo Toxicity Test: Part I and Part II. Series on Testing and Assessment No. 157, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2012) Validation Report (Phase 2) for the Zebrafish Embryo Toxicity Test: Part I and Part II (Annexes). Series on Testing and Assessment No. 179, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Braunbeck, T., Böttcher, M., Hollert, H., Kosmehl, T., Lammer, E., Leist, E., Rudolf, M. and Seitz, N. (2005) Towards an alternative for the acute fish LC50 test in chemical assessment: The fish embryo toxicity test goes multi-species-an update. ALTEX 22: 87-102.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 ISO (2007) International Standard Water quality — Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs (Danio rerio). ISO 15088:2007(E) International Organization for Standardization.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Nagel, R. (2002) DarT: The embryo test with the zebrafish (Danio rerio) — a general model in ecotoxicology and toxicology. ALTEX 19: 38-48.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Schulte, C. and Nagel, R. (1994) Testing acute toxicity in embryo of zebrafish, Brachydanio rerio as alternative to the acute fish test — preliminary results. ATLA 22, 12-19.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Bachmann, J. (2002) Development and validation of a teratogenicity screening test with embryos of the zebrafish (Danio rerio). PhD-thesis, Technical University of Dresden, Germany.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Lange, M., Gebauer, W., Markl, J. and Nagel, R. (1995) Comparison of testing acute toxicity on embryo of zebrafish (Brachydanio rerio), and RTG-2 cytotoxicity as possible alternatives to the acute fish test. Chemosphere 30/11: 2087-2102.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Knöbel, M., Busser, F.J.M., Rico-Rico, A., Kramer, N.I., Hermens, J.L.M., Hafner, C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Scholz, S. (2012). Predicting adult fish acute lethality with the zebrafish embryo: relevance of test duration, endpoints, compound properties, and exposure concentration analysis. Environ. Sci. Technol. 46, 9690-9700.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Kammann, U., Vobach, M. and Wosniok, W. (2006) Toxic effects of brominated indoles and phenols on zebrafish embryos. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 51: 97-102.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Groth, G., Kronauer, K. and Freundt, K.J. (1994) Effects of N,N-diemethylformamide and its degradation products in zebrafish embryos. Toxicol. In Vitro 8: 401-406.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Groth, G., Schreeb, K., Herdt, V. and Freundt, K.J. (1993) Toxicity studies in fertilized zebrafish fish eggs treated with N-methylamine, N,N-dimethylamine, 2-aminoethanol, isopropylamine, aniline, N-methylaniline, N,N-dimethylaniline, quinone, chloroacetaldehyde, or cyclohexanol. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 50: 878-882.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Nguyen, L.T. and Janssen, C.R. (2001) Comparative sensitivity of embryo-larval toxicity assays with African catfish (Clarias gariepinus) and zebra fish (Danio rerio). Environ. Toxicol. 16: 566-571.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Cheng, S.H., Wai, A.W.K., So, C.H. and Wu, R.S.S. (2000) Cellular and molecular basis of cadmium-induced deformities in zebrafish embryos. Environ. Toxicol. Chem. 19: 3024-3031.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Belanger, S. E., Rawlings J. M. and Carr G. J. (2013) Use of Fish Embryo Toxicity Tests for the Prediction of Acute Fish Toxicity to Chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry 32: 1768—1783.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Lammer, E., Carr, G. J., Wendler, K., Rawlings, J. M., Belanger, S. E., Braunbeck, T. (2009) Is the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio) a potential alternative for the fish acute toxicity test? Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol.: 149 (2), 196—209
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Глава В.4 от настоящото приложение: Пълна биоразградимост.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Глава В.29 от настоящото приложение: Пълна биоразградимост, CO2 в херметично затворени съдове.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Weigt, S., Huebler, N., Strecker, R., Braunbeck, T., Broschard, T.H. (2011) Zebrafish (Danio rerio) embryos as a model for testing proteratogens. Toxicology 281: 25-36.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Weigt, S., Huebler, N., Strecker, R., Braunbeck, T., Broschard, T.H. (2012) Developmental effects of coumarin and the anticoagulant coumarin derivative warfarin on zebrafish (Danio rerio) embryos. Reprod. Toxicol. 33: 133-141.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Incardona, J.P, Linbo, T.L., Scholz, N.L. (2011) Cardiac toxicity of 5-ring polycyclic aromatic hydrocarbons is differentially dependent on the aryl hydrocarbon receptor 2 isoform during zebrafish development. Toxicol. Appl. Pharmacol. 257: 242-249.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Kubota, A., Stegeman, J.J., Woodin, B.R., Iwanaga, T., Harano, R., Peterson, R.E., Hiraga, T., Teraoka, H. (2011) Role of zebrafish cytochrome P450 CYP1C genes in the reduced mesencephalic vein blood flow caused by activation of AHR2. Toxicol. Appl. Pharmacol. 253: 244-252.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Глава В.48 от настоящото приложение: Краткосрочно изследване на размножаването при риби. Вж. допълнение 4a.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Lammer, E., Kamp, H.G., Hisgen, V., Koch, M., Reinhard, D., Salinas, E.R., Wendlar, K., Zok, S., Braunbeck, T. (2009) Development of a flow-through system for the fish embryo toxicity test (FET) with zebrafish (Danio rerio). Toxicol. in vitro 23: 1436-1442.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Brown, R.S., Akhtar, P., Åkerman, J., Hampel, L., Kozin, I.S., Villerius, L.A., Klamer, H.J.C., (2001) Partition controlled delivery of hydrophobic substances in toxicity tests using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) ﬁlms. Environ. Sci. Technol. 35, 4097-4102.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Schreiber, R., Altenburger, R., Paschke, A., Küster, E. (2008) How to deal with lipophilic and volatile organic substances in microtiter plate assays. Environ. Toxicol. Chem. 27, 1676-1682.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 ISO (1996) International Standards. Water quality — Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)]. ISO 7346-3: Flow-through method. Достъпен на: [http://www.iso.org].
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Series on Testing and Assessment No. 23, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Laale, H.W. (1977) The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio, in fisheries research. A literature review. J. Fish Biol. 10: 121-173.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Westerfield, M. (2007) The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). 5th edition. Eugene, University of Oregon Press, Institute of Neuroscience, USA.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Canadian Council on Animal Care (2005) Guidelines on: the Care and Use of Fish in Research, Teaching and Testing, ISBN: 0-919087-43-4 http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Fish.pdf
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Европейска Комисия (2007 г.), Препоръка на Комисията от 18 юни 2007 г. относно насоки за настаняване и грижи за животни, използвани за опитни и други научни цели (нотифицирано под номер С(2007) 2525) (текст от значение за ЕИП) [http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2007:197:0001:0089:BG:PDF]
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Европейски съюз (2010 г.), Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 22 септември 2010 г. относно защитата на животните, използвани за научни цели. Официален вестник на Европейския съюз ОВ L 276, 20.10.2010 г., стр. 33.
                                 http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:BG:PDF
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Nagel, R. (1986) Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling (Brachydanio rerio, Ham.-Buch.). J. Appl. Ichthyol. 2: 173-181.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Kimmel, C.B., Ballard, W.W., Kimmel, S.R., Ullmann, B. and Schilling, T.F. (1995) Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203: 253-310.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Глава В.2 от настоящото приложение: Daphnia sp., Изпитване за остра имобилизация.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Weil, M., Scholz, S., Zimmer, M., Sacher, F., Duis, K. (2009) Gene expression analysis in zebrafish embryos: a potential approach to predict effect conentrations in the fish early life stage test. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1970-1978
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 ISO (2006) International Standard. Water quality — Guidance on statistical interpretation of ecotoxicity data ISO TS 20281. Достъпен на: [http://www.iso.org].
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 OECD (2006) Guidance Document on Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No. 54. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Braunbeck, T., Lammer, E., 2006. Detailed review paper „Fish embryo toxicity assays“. UBA report under contract no. 20385422 German Federal Environment Agency, Berlin. 298 pp.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                           
                              Апикална крайна точка
                           : Причиняване на въздействие на равнище популация.
                        
                           
                              Бластула
                           : Клетъчна формация около животинския полюс, която обхваща известна част от жълтъка.
                        
                           
                              Химикал
                           : Вещество или смес
                        
                           
                              Епиболия
                           : е масивна пролиферация, касаеща основно епидермални клетки в стадия на гаструлация на ембриона и тяхното движение от дорзалната към вентралната страна, което служи за интернализиране на ентодермалните клетъчни слоеве чрез процес, напомнящ инвагинация, и инкорпориране на жълтъка в ембриона.
                        
                           
                              Проточно изпитване
                           : Изпитване с постоянен поток на изпитвани разтвори през системата за изпитване по време на периода на експозицията.
                        
                           
                              Вътрешна контрола на плаката
                           : Вътрешна контрола, при която се използват 4 пълни с вода за разреждане гнезда на всяка 24-гнездна плака с цел установяване на потенциално замърсяване на плаката от производителя или от изследователя по време на процедурата, както и евентуално въздействие на плаката, което може да повлияе на резултата от изпитването (например температурен градиент).
                        
                           
                              IUPAC
                           : International Union of Pure and Applied Chemistry (Международен съюз по чиста и приложна химия).
                        
                           
                              Вода за поддържане
                           : Вода, в която се осъществява развъждането на полово зрелите риби.
                        
                           
                              Медианна летална концентрация (LC50)
                           : Концентрация на изпитвания химикал, която се счита за летална при 50 % от изпитваните организми в хода на изпитването.
                        
                           
                              Полустатично изпитване с обновяване
                           : Изпитване с редовно обновяване на изпитваните разтвори след определени периоди (напр. на всеки 24 часа).
                        
                           
                              SMILES
                           : Спецификация за опростено линейно въвеждане на молекули
                        
                           
                              Сомит
                           : При развиващите се ембриони на гръбначните животни сомитите са мезодермални маси, разположени напречно на невралната тръба, от които в крайна сметка се развива дермата (дерматом), скелетната мускулатура (миотом) и гръбначният стълб (склеротом).
                        
                           
                              Статично изпитване
                           : Изпитване, при което изпитваните разтвори остават непроменени през целия период на изпитването.
                        
                           
                              Изпитван химикал
                           : Всяко вещество или смес, изпитвано(а) чрез използването на настоящия метод за изпитване.
                        
                           
                              UVCB
                           : Вещества с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологични материали
                     
                     
                        Допълнение 2
                        
                           ПОДДЪРЖАНЕ, РАЗМНОЖАВАНЕ И ТИПИЧНИ УСЛОВИЯ ЗА ПРОВЕЖДАНЕ НА ИЗПИТВАНИЯ ЗА ОСТРА ТОКСИЧНОСТ ПРИ ЕМБРИОНИ НА ЗЕБРОВО ДАНИО
                        
                        
                                    
                                       Зеброво данио (Danio rerio)
                                    
                                 
                              
                                    Произход на вида.
                                 
                                 
                                    Индия, Бирма, п-в Малака, Суматра
                                 
                              
                                    Полов диморфизъм
                                 
                                 
                                    Женски: изпъкнал корем при носене на хайвера
                                    Мъжки: по-тънки, с оранжев нюанс между сини надлъжни ивици (особено очевидни на равнището на аналната перка)
                                 
                              
                                    Режим на хранене
                                 
                                 
                                    Суха храна във вид на люспи (максимум 3 % от теглото на рибата на ден) 3 до 5 пъти дневно; допълнително науплии от артемии (Artemia spec.) и/или малки водни бълхи с подходящ размер от незамърсен източник. Храненето с жива храна осигурява източник за облагородяване на средата и следователно, когато е възможно, следва да се дава жива храна. За да се гарантира оптимално качество на водата, излишната храна и изпражненията следва да се отстраняват приблизително един час след хранене.
                                 
                              
                                    Приблизително тегло на полово зряла риба
                                 
                                 
                                    Женски: 0,65 ±0,13 g
                                    Мъжки: 0,5 ±0,1 g
                                 
                              
                                    Поддържане на възрастните риби
                                 
                                 
                                    Осветление
                                 
                                 
                                    Луминесцентни крушки (широк спектър); 10—20 μE/m2/s, 540—1080 lux, или 50—100 ft-c (заобикалящи равнища на осветеност в лабораторията); 12—16 часа фотопериод
                                 
                              
                                    Температура на водата
                                 
                                 
                                    26 ± 1 °C
                                 
                              
                                    Качество на водата
                                 
                                 
                                    O2 ≥80 % наситеност, твърдост: напр. ~30—300 mg/l CaCO3, NO3
                                       -: ≤48 mg/l, NH4
                                       + и NO2
                                       -: <0,001 mg/l, остатъчен хлор <10 μg/l, общо органичен хлор <25 ng/l, pH = 6,5—8,5
                                 
                              
                                    Допълнителни критерии за качество на водата
                                 
                                 
                                    Твърди частици <20 mg/l, общо органичен въглерод <2 mg/l, общо органофосфорни пестициди <50 ng/l, общо органохлорни пестициди плюс полихлорирани бифенили <50 ng/l
                                 
                              
                                    Размер на контейнера за поддържане
                                 
                                 
                                    напр.180 l, 1 риба/l
                                 
                              
                                    Пречистване на вода
                                 
                                 
                                    Постоянно (филтруване с активен въглен); други възможности включват комбинация между полустатично поддържане с обновяване или проточна система с непрекъснато обновяване на водата
                                 
                              
                                    Препоръчително съотношение между мъжките и женските риби за размножаване
                                 
                                 
                                    2:1 (или масово хвърляне на хайвер)
                                 
                              
                                    Аквариуми за хвърляне на хайвера
                                 
                                 
                                    например 4-литрови аквариуми със стоманена решетка на дъното и изкуствени растения като стимул за хвърляне на хайвера; външни нагреватели или масово хвърляне на хайвера в аквариумите за поддържане
                                 
                              
                                    Структура и външен вид на хайвера
                                 
                                 
                                    Стабилен хорион (т.е. силно прозрачен, нелепкав, диаметър ~ 0,8—1,5 mm)
                                 
                              
                                    Процент на хвърляне на хайвера
                                 
                                 
                                    Една полово зряла женска хвърля поне 50—80 хайверни зърна на ден. В зависимост от породата процентът на хвърляне на хайвера може да бъде значително по-висок. Процентът на оплождане следва да е ≥70 %. При риби, които за първи път хвърлят хайвер, процентът на оплождане на хайвера при първите няколко хвърляния може да е по-нисък.
                                 
                              
                                    Тип изпитване
                                 
                                 
                                    Статично, полустатично с обновяване, проточно, температура от 26 ± 1 °C, 24 часово аклиматизиране на камерите за изпитване (например 24-гнездни плаки с 2,5—5 ml на кухина)
                                 
                              
                     
                        Допълнение 3
                        
                           НОРМАЛНО РАЗВИТИЕ НА ЕМБРИОНИ НА ЗЕБРОВО ДАНИО ПРИ 26°C
                        
                        
                     
                        Допълнение 4
                        
                           Фиг. 1
                        
                        
                           Разположение на 24-гнездните плаки
                        
                        
                                    1-5
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    пет концентрации на изпитване/химикал;
                                 
                              
                                    nC
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    отрицателна контрола (вода за разреждане);
                                 
                              
                                    iC
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    вътрешна контрола на плаката (вода за разреждане);
                                 
                              
                                    pC
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    положителна контрола (3,4-DCA 4 mg/l);
                                 
                              
                                    sC
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    контрола на разтворител
                                 
                              
                           Фиг. 2
                        
                        
                           Схема на процедурата на изпитване за остра токсичност при ембриони на зеброво данио (отляво надясно): получаване на хайверни зърна, събиране на хайверни зърна, предварителна експозиция веднага след оплождането в стъклени съдове, подбор на оплодени хайверни зърна с инвертен или бинокулярен микроскоп и разпределение на оплодените яйца в 24-гнездни плаки, подготвени със съответните концентрации на изпитване/контроли, n = брой на хайверните зърна, необходими за концентрацията на изпитване/контролата (тук 20), hpf = часове след оплождането.
                        
                     
                        Допълнение 5
                        
                           АТЛАС НА ЛЕТАЛНИТЕ КРАЙНИ ТОЧКИ ЗА ИЗПИТВАНЕТО ЗА ОСТРА ТОКСИЧНОСТ ПРИ ЗЕБРОВО ДАНИО
                        
                        Следните апикални крайни точки са показател за остра токсичност и вследствие на това смърт на ембрионите: коагулация на ембриона, неотделяне на опашката, отсъствие на образуване на сомити и отсъствие на сърдечна дейност. За илюстрация на тези крайни точки са избрани следните микрографики.
                        
                           Фиг. 1
                        
                        
                           Коагулация на ембриона
                        
                        При наблюдаване в светло поле коагулираните ембриони на зебровото данио показват различни непрозрачни включения.
                        
                           Фиг. 2
                        
                        
                           Отсъствие на образуване на сомити
                        
                        Въпреки че е изостанал в развитието си с приблизително 10 часа, 24-часовият ембрион на зеброво данио в (а) показва добре развити сомити (→), докато ембрионът в (б) не показва никакви признаци на образуване на сомити (→). Въпреки ясно изразения оток на жълтъчната торбичка (*) 48-часовият ембрион на зеброво данио във (в) показва отчетливо образуване на сомити (→), докато 96-часовият ембрион на зеброво данио, изобразен в (г), не показва никакви признаци на образуване на сомити (→). Да се отбележи също така гръбначното изкривяване (сколиоза) и перикардния оток (*) на ембриона в (г).
                        
                           Фиг. 3
                        
                        
                           е отделяне на опашна пъпка в страничен изглед
                        
                        
                           Фиг. 4
                        
                        
                           Отсъствие на сърдечна дейност
                        
                        Отсъствието на сърдечна дейност по дефиниция трудно се илюстрира с микрограф. Има показания за отсъствие на сърдечна дейност при липса на сърдечни конвулсии (двойна стрелка). Неподвижността на кръвните клетки например в абдоминалната аорта (→ в подложката) не е индикатор за отсъствие на сърдечна дейност. Да се отбележи също така отсъствието на образуване на сомити при този ембрион (*, хомогенен вместо сегментиран вид на мускулните тъкани). Времето за наблюдение, необходимо за да се регистрира отсъствие на сърдечна дейност, следва да е поне една минута при минимално увеличение от 80×.
                     
                     В.50   Изпитване за токсичност без седименти при Myriophyllum spicatum
                        
                     
                     УВОД
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Този метод за изпитване съответства на насоките за изпитване № 238 на ОИСР (2014 г.). Той е създаден с цел оценка на токсичността на химикалите върху Myriophyllum spicatum, подводно двусемеделно растение от семейство Haloragaceae. Той се основава на съществуващ метод за изпитване на ASTM (1), модифициран като система за изпитване без седименти (2) с цел оценка на присъщата екотоксичност на изпитваните химикали (независимо от начина, по който изпитваният химикал се разпределя между водата и седимента). Система за изпитване без седименти се характеризира с ниска степен на аналитична сложност (само във водната фаза) и резултатите могат да бъдат анализирани паралелно и/или в сравнение с тези, получени от изпитването при Lemna sp. (3); в допълнение изискването за стерилни условия позволява въздействието на микроорганизмите и водораслите (поглъщане/разграждане на химикала и т.н.) да се поддържа на възможно най-ниско равнище. Настоящото изпитване не замества други изпитвания за токсичност във водна среда; то следва по-скоро да ги допълва с цел да се постигне по-пълна оценка на опасностите и рисковете за водните растения. Методът за изпитване е валидиран чрез кръгово изпитване (4).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Описани са подробности от изпитването с обновяване (полустатично) на изпитвания разтвор и без обновяване (статично) на изпитвания разтвор. В зависимост от целите на изпитването и регулаторните изисквания се препоръчва прилагането на полустатичния метод, например за вещества, които бързо се отстраняват от разтвора в резултат от изпарение, адсорбция, фоторазграждане, хидролиза, утаяване или биоразграждане. Допълнителни насоки са дадени в (5). Настоящият метод за изпитване се прилага за вещества, за които методът на изпитване е валидиран (вж. подробности в протокола от кръговото изпитване (4)) или за формулировки или известни смеси; при изпитване на смеси съставките им следва да бъдат в максимална степен идентифицирани и количествено определени. Методът за изпитване без седимент при Myriophyllum spicatum допълва изпитването за токсичност вода-седимент при Myriophyllum spicatum (6). Преди използването на метода за изпитване на смес с регулаторна цел следва да се обмисли дали той може да предостави подходящи за целта резултати и ако да — защо. Подобни съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа.
                              
                           ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Постоянно растящи растителни култури от вида Myriophyllum spicatum (само в модифицирана среда на Andrews, вж. допълнение 2) се отглеждат под формата на монокултури в различни концентрации на изпитвания химикал за срок от 14 дни в система за изпитване без седименти. Целта на изпитването е да се определят количествено свързаните с химикала въздействия върху вегетативния растеж през този период въз основа на оценки на избрани измервани променливи. Измерваните променливи са ръстът на поника, страничните разклонения и корените, както и промените в свежото и сухото тегло и увеличението на броя на прешлените. В допълнение отличителни качествени изменения на изпитваните организми, като например деформиране, или хлороза и некроза, проявяващи се под формата на пожълтяване или бяло и кафяво оцветяване, също се вземат предвид. С цел количествено определяне на свързани с химикала въздействия растежът в изпитваните разтвори се сравнява с този в контролите и концентрацията, при която се осъществява x % инхибиране на растежа, се определя и се изразява като ЕСх; „х“ може да бъде всяка стойност в зависимост от нормативните изисквания, например EC10, EC20, EC50. Следва да се отбележи, че оценките на EC10 и EC20 са надеждни и подходящи само при тестове, при които коефициентите на вариация в контролните растения падат под оценяваното равнище на въздействие, т.е. за устойчива оценка на EC20 коефициентите на вариация следва да бъдат <20 %.
                              
                           
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Следва да се определи както средната специфична скорост на растежа (прогнозирана въз основа на оценка на дължината на основния поник и три допълнителни измервани променливи) и добива (прогнозиран въз основа на увеличението на дължината на основния поник и три допълнителни измервани променливи) от нетретираните и третираните растения. Специфичната скорост на растежа (r) и добива (y) впоследствие се използват за определяне съответно на ErCx (напр. ErC10, ErC20, ErC50) и EyCx (напр. EyC10, EyC20, EyC50).
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 В допълнение най-ниската концентрация, при която се наблюдава въздействие (LOEC), и концентрацията без наблюдавано въздействие (NOEC) могат да бъдат определени статистически.
                              
                           ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИЗПИТВАНИЯ ХИМИКАЛ
                     
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Следва да е наличен метод за анализ с достатъчна чувствителност за количествено определяне на изпитвания химикал в средата на изпитване. Информацията относно изпитвания химикал, която може да бъде полезна при установяване на условията на изпитване, включва структурната формула, чистотата и онечистванията, водоразтворимостта, стабилността във вода и на светлина, константата на киселинна дисоциация (рКа), коефициента на разпределение октанол-вода (Kow), парното налягане и биоразградимостта. Разтворимостта във вода и парното налягане може да се използват за изчисляване на константата по закона на Хенри, която ще покаже дали се очакват значителни загуби на изпитвания химикал през периода на изпитването. Това ще помогне да се разбере дали следва да се предприемат определени стъпки за контролиране на тези загуби. Когато информацията за разтворимостта и стабилността на изпитвания химикал е несигурна, се препоръчва те да бъдат оценени в условията на изпитване, т.е. среда на растеж, температура, режим на осветеност, които ще бъдат използвани при изпитването.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Контролът на рН в изпитваната среда е особено важен, например при изпитване на метали или вещества, които са неустойчиви на хидролиза. Допълнителни насоки за изпитване на химикали, чиито физични и химични свойства затрудняват тяхното изпитване, са дадени в ръководство на ОИСР с насоки (5).
                              
                           ВАЛИДНОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 За да бъде валидно изпитването, времето за удвояване на дължината на основния поник в контролата трябва да е под 14 дни. Използването на средата и на условията на изпитване, описани в настоящия метод на изпитване, позволяват постигането на този критерий с помощта на статичен или полустатичен режим на изпитване.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Средната стойност на коефициента на вариация на добива, въз основа на измервания на свежото тегло на поника (т.е. от началото до края на изпитването), и допълнителните измервани променливи (вж. точка 37) в контролните култури не надвишават 35 % между повторенията.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Повече от 50 % от повторенията на контролната група се съхраняват в стерилна среда през 14-дневния срок на експозицията, което означава без видимо замърсяване с други организми като водорасли, гъбички и бактерии (бистър разтвор). Забележка: Насоки за това как да се направи оценка на стерилността се предоставят в протокола от кръговото изпитване (4).
                              
                           РЕФЕРЕНТЕН ХИМИКАЛ
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Референтните химикали, като 3,5-дихлорофенола, използвани в кръговото изпитване (4), могат да се изпитват за проверка на процедурата на изпитване; данните от кръговото изпитване показват, че средните стойности на ЕС50 за 3,5-дихлорфенола при различните зависими променливи (вж. точки 37—41 от настоящия метод на изпитване) са между 3,2 и 6,9 mg/l (вж. протокола от кръговото изпитване за подробности относно доверителния интервал за тези стойности). Желателно е референтният химикал да се изпитва най-малко два пъти годишно или, когато изпитването се извършва по-рядко, да се извършва едновременно с определянето на токсичността на изпитвания химикал.
                              
                           ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
                     
                        Апаратура
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Цялото оборудване в контакт със средата на изпитване следва да е направено от стъкло или друг химически инертен материал. Стъклените съдове, използвани за отглеждане на култури и за изпитване, следва да бъдат почистени от химични замърсители, които биха могли да проникнат в средата на изпитване, както и да бъдат стерилни. Съдовете за изпитването следва да бъдат достатъчно високи, така че поникът в контролните съдове да може да расте във водна среда, без да достига повърхността на изпитваната среда в края на изпитването. Препоръчва се използването на дебелостенни тръби за изпитване от боросиликатно стъкло без отвор, с вътрешен диаметър около 20 mm и дължина 250 mm, и алуминиеви капачки.
                              
                           
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Тъй като модифицираната среда на Andrews съдържа захароза (която стимулира растежа на гъбички и бактерии), изпитваните разтвори трябва да се приготвят в стерилни условия. Всички течности, както и оборудването, се стерилизират преди употреба. Стерилизация се извършва посредством обработка с горещ въздух (210 °С) в продължение на 4 часа или чрез обработка в автоклав в продължение на 20 минути при температура от 121 °С. В допълнение непосредствено преди употреба всички колби, блюда, чаши и т.н., както и останалото оборудване, се подлагат на обработка с пламък върху стерилна работна маса.
                              
                           
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Културите и съдовете за изпитването не следва да се съхраняват заедно. Това се постига най-добре с използването на осигуряващи необходимите за растежа параметри на околната среда отделни климатични камери, инкубатори или помещения. Осветлението и температурата следва да могат да се контролират и да се поддържат на постоянно ниво.
                              
                           
                        Изпитван организъм
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 
                                    Myriophyllum spicatum е подводно двусемеделно растение от семейство Haloragaceae. Между юни и август над водната повърхност се показват неразличими розово-бели цветове. Растенията са вкоренени в земята чрез система от устойчиви коренища и се срещат в цялото северно полукълбо в еутрофни, но незамърсени и наситени на калций спокойни води с кален субстрат. Myriophyllum spicatum предпочита сладките води, но може да бъде открито и в бракични води.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 За изпитването за токсичност без седименти са необходими стерилни растения. Ако лабораторията за изпитване не разполага с редовни култури от Myriophyllum spicatum, стерилен растителен материал може да бъде получен от друга лаборатория или (нестерилен) растителен материал може да бъде взет на място или предоставен от търговски доставчик; ако растенията са събрани на място, следва да се предвиди извършване на таксономна проверка на вида. Ако са събрани на място или предоставени от търговски доставчик, растенията следва да се стерилизират (1) и съхраняват в култура в същата среда, която се използва за изпитването, в течение на минимум осем седмици преди да се използват. Полевите обекти за събиране на място на началните култури трябва да са без явни източници на замърсяване. Необходимо е специално внимание, за да се гарантира, че при събирането на Myriophyllum spicatum на място е взет правилният вид, особено в региони, където растението може да се кръстоса с други видове от същия род. Ако са получени от друга лаборатория, те следва да се съхраняват по същия начин в течение на минимум три седмици. За източника на растителен материал и вида, използвани в изпитването, следва винаги да се протоколира.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Качеството и еднородността на използваните за изпитването растения оказват значително влияние върху резултата от изпитването и поради това растенията следва да бъдат грижливо подбрани. Следва да се използват млади бързорастящи растения без видими увреждания или обезцветяване (хлороза). Подробности за подготвянето на изпитваните организми са дадени в допълнение 4.
                              
                           
                        Култивиране
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 За намаляване на честотата за поддържане на културата (например когато не са планирани изпитвания с Myriophyllum за известен период), културите могат да се съхраняват при намалено осветление и температура (50 μE m– 2 s– 1, 20 ± 2 °C). Подробности за култивирането са дадени в допълнение 3.
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Най-малко от 14 до 21 дни преди изпитването достатъчно изпитвани организми се прехвърлят по стерилен начин в прясна стерилна среда и се култивират в течение на 14—21 дни при условията на изпитването като предкултура. Подробности за приготвянето на предкултури са дадени в допълнение 4.
                              
                           
                        Среда за изпитване
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 В система за изпитване без седименти се препоръчва използването само на една хранителна среда за Myriophyllum spicatum, както е описано в допълнение 2. За култивиране и изпитвания на Myriophyllum spicatum се препоръчва използването на модифицирана среда на Andrews, както е описано в (1). Модифицираната среда на Andrews се подготвя от пет отделно приготвени изходни хранителни разтвора с добавка на 3 % захароза. Подробности за приготвянето на средата са дадени в допълнение 2.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 За получаването на разтворите за изпитване е необходима десетократна концентрация на модифицираната среда на Andrews (чрез разреждане, когато е уместно). Съставът на тази среда е даден в допълнение 2.
                              
                           
                        Разтвори за изпитване
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Разтворите за изпитване обикновено се приготвят чрез разреждане на изходен разтвор. Изходните разтвори на изпитвания химикал обикновено се приготвят чрез разтваряне на химикала в деминерализирана (т.е. дестилирана или дейонизирана) вода. Хранителните вещества се добавят чрез използване на десетократната концентрация на модифицираната среда на Andrews.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Стерилизацията на изходните разтвори на изпитвания химикал може да се извършва в автоклав при температура от 121°С в продължение на 20 минути или чрез стерилно филтруване, при условие че използваната техника за стерилизация не променя характеристиките на изпитвания химикал. Изпитваните разтвори могат да се приготвят и в стерилна деминерализирана вода или среда при стерилни условия. При избора на процедурата на стерилизация на изходните разтвори на изпитвания химикал следва да се вземат под внимание термостабилността и адсорбцията върху различни повърхности. Поради това се препоръчва изходните разтвори да се приготвят в стерилни условия, т.е. за разтварянето на изпитвания химикал да се използва стерилен материал в стерилни условия (напр. стерилизация чрез фламбиране, шкафове с ламинарен поток и т.н.) в стерилна вода. Тази техника на приготвяне на стерилни изходни разтвори се използва както за веществата, така и за смесите.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Най-високата изпитвана концентрация на изпитвания химикал обикновено не следва да надвишава неговата разтворимост във вода при условията за провеждане на изпитването. За изпитвани химикали с малка водоразтворимост може да е необходимо да се приготви концентриран изходен разтвор или химикалът да се диспергира, като се използва органичен разтворител или диспергиращо средство, за да се улесни добавянето на точни количества от изпитвания химикал към средата на изпитване и да се подпомогне неговото диспергиране и разтваряне. Следва да се положат всички усилия, за да се избегне използването на такива материали. Следва да няма фитотоксичност в резултат на използването на спомагателни разтворители или диспергиращи средства. Например обичайно използваните разтворители, които не предизвикват фитотоксичност при концентрации до 100 μl/l, включват ацетон и диметилформамид. Ако се използва разтворител или диспергиращо средство, следва да бъде отчетена неговата крайна концентрация и тя да се поддържа на минимално ниво (≤ 100 μl/l), а всички третирани и контролни проби следва да съдържат еднаква концентрация на разтворителя или диспергиращото средство. Допълнителни насоки относно използването на диспергиращи средства са дадени в (5).
                              
                           
                        Изпитвани и контролни групи
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Предварителното познаване на токсичността на изпитвания химикал по отношение на Myriophyllum spicatum, например от изпитване за определяне на обхват, ще помогне при избирането на подходящи изпитвани концентрации. В окончателното изпитване за токсичност обикновено следва да се използват пет (както в изпитването на потискането на растежа на видове от рода Lemna, глава С.26 от настоящото приложение) до седем изпитвани концентрации, подредени в геометрична прогресия; те следва да бъдат подбрани така, че стойностите на NOEC и ЕС50 да попадат в обхвата на концентрациите (вж. по-долу). За предпочитане е кратността на разделяне между изпитваните концентрации да не надхвърля 3,2; могат обаче да се използват и по-големи стойности, при които кривата концентрация-отклик е полегата. Следва да се представи обосновка, ако са използвани по-малко от пет концентрации. При всяка от изпитваните концентрации следва да се използват най-малко пет повторения.
                              
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 При задаването на обхвата на изпитваните концентрации (за изпитване за определяне на обхват и/или за окончателно изпитване за токсичност) трябва да се има предвид следното:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             за определяне на ECx изпитваните концентрации следва да обграждат стойността на ECx, за да се гарантира подходяща доверителна вероятност. Например, ако се оценява EC50, най-високата изпитвана концентрация следва да е по-висока от стойността на EC50. Ако стойността на EC50 попада извън обхвата на изпитваните концентрации, свързаните с нея доверителни интервали ще бъдат големи и правилната оценка за статистическата съгласуваност на модела може да не е възможна.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Ако целта е да се оцени LOEC/NOEC, най-ниската изпитвана концентрация следва да е достатъчно ниска, така че растежът да не бъде значимо по-малък от този в контролата. В допълнение най-високата изпитвана концентрация следва да е достатъчно висока, така че растежът да бъде значимо по-малък от този в контролата. Ако това не е така, изпитването ще трябва да се повтори с използване на различен обхват за концентрациите (освен ако най-високата концентрация е на границата на разтворимостта или максимално изискваната пределна концентрация, например 100 mg/1).
                                          
                                       
                           
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Всяко изпитване следва да включва контроли, които да са съставени от същата хранителна среда, изпитвани организми (избор на възможно най-хомогенен растителен материал — свежи странични разклонения от предкултурите, скъсени на 2,5 cm от основата), условия на околната среда и процедури, както в съдовете за изпитване, но без изпитвания химикал. Ако се използва спомагателен разтворител или диспергиращо средство, следва да бъде включена допълнително контролна третирана проба, като разтворителят/диспергиращото средство следва да присъстват в същата концентрация като тази в съдовете с изпитвания химикал. Броят на повторенията на съдове с контроли (и съдове с разтворител, ако е приложимо) следва да бъде поне десет.
                              
                           
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Ако не се изисква определяне на NOEC, планът за изпитването може да бъде променен, като се увеличи броят на концентрациите и се намали броят на повторенията за всяка от концентрациите. Във всички случаи обаче броят на контролните повторения следва да е най-малко десет.
                              
                           
                        Експозиция
                     
                     
                              
                                 29.
                              
                              
                                 Свежите странични разклонения от предкултурата, скъсени на 2,5 cm от основата, се разпределят на случаен принцип в съдовете за изпитване при стерилни условия; всеки съд за изпитване следва да съдържа по едно странично разклонение с дължина от 2,5 cm с апикална меристема в единия край. Избраният растителен материал във всеки съд за изпитване следва да е с едно и също качество.
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 За минимизиране на влиянието на пространствените различия в интензитета на светлината и температурата се изисква схема за случаен подбор за разполагане на съдовете за изпитване в инкубатора. При извършване на наблюдения също се изискват блокова схема или промяна на разполагането на случаен принцип (или по-честа промяна на разполагането).
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Ако предварително изпитване за стабилност показва, че концентрацията на изпитвания химикал не може да бъде поддържана (т.е. измерената концентрация пада под 80 % от първоначално измерената концентрация) за времето на изпитването (14 дни), се препоръчва полустатичен режим на изпитване. В този случай растенията следва да бъдат експонирани в прясно приготвени разтвори за изпитване и за контроли най-малко един път по време на изпитването (например ден 7). Честотата на експониране в прясна среда ще зависи от стабилността на изпитвания химикал; може да е необходима по-голяма честота, за да се поддържа почти постоянна концентрация за силно нестабилни или летливи химикали.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Сценарият на експозиция чрез прилагане към листата (пръскане) не е включен в настоящия метод за изпитване.
                              
                           
                        Условия на изпитване
                     
                     
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Следва да се използва топло и/или студено бяло флуоресцентно осветление за осигуряване на светлинно облъчване в диапазона от около 100—150 μE m– 2 s– 1, когато се измерва като фотосинтетично активно излъчване (400—700 nm) в точки, чието разстояние от източника на светлина е еднакво с това на дъното на съда за изпитване (еквивалентно приблизително на 6 000—9 000 lux), като се използва цикъл светлина-тъмнина в съотношение 16:8 часа. Методът за детектиране и измерване на светлината, по-специално видът на сензора, оказва влияние върху измерваната стойност. Сферичните сензори (които реагират на светлина, излъчвана от всички ъгли над и под равнината на измерване) и „косинусовите“ сензори (които реагират на светлината, излъчвана от всички ъгли над равнината на измерване), са за предпочитане пред еднопосочните сензори и ще отчитат по-високи показания за описания тук вид многоточков източник на светлина.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Температурата в съдовете за изпитване следва да бъде 23° ± 2 °C. Необходимо е да се обърне допълнително внимание на отклонението в стойността на pH в някои специални случаи, например когато се изпитват нестабилни химикали или метали; рН следва да остане в диапазон от 6—9. Вж. (5) за допълнителни насоки.
                              
                           
                        Продължителност
                     
                     
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Изпитването се прекратява 14 дни след прехвърлянето на растенията в съдовете за изпитване.
                              
                           
                        Измервания и аналитични определения
                     
                     
                              
                                 36.
                              
                              
                                 В началото на изпитването дължината на основния поник на изпитвания организъм е 2,5 cm (вж. точка 29); тя се измерва с линийка (вж. допълнение 4) или чрез снимка и анализ на изображението. Дължината на основния поник на изпитвания организъм с обичаен или необичаен вид трябва да се определи в началото на изпитването, поне веднъж по време на 14-дневния период на експозиция и в края на изпитването. Забележка: Като алтернатива за онези, които не разполагат с анализ на изображения, ако работната маса е стерилизирана преди поставянето на растенията в съдовете за изпитване, за измерването на дължината на основния поник в началото и по време на изпитването може да се използва стерилна линийка. Следва да бъдат отбелязани промените в развитието на растението, например деформации на пониците, външния вид, показания за некроза, хлороза, пречупване или загуба на плавателността, както и в дължината и външния вид на корените. Следва да се отбележат и значими характеристики на средата на изпитване (например наличието на неразтворен материал, растеж на водорасли, гъбички и бактерии в съда за изпитване).
                              
                           
                              
                                 37.
                              
                              
                                 В допълнение към определянето на дължината на основния поник, по време на изпитването следва да се оценят и въздействията на изпитвания химикал върху три (или повече) от следните измервани променливи:
                                 
                                             i.
                                          
                                          
                                             Обща дължина на страничните разклонения
                                          
                                       
                                             ii.
                                          
                                          
                                             Обща дължина на поника
                                          
                                       
                                             iii.
                                          
                                          
                                             Обща дължина на корените
                                          
                                       
                                             iv.
                                          
                                          
                                             Свежо тегло:
                                          
                                       
                                             v.
                                          
                                          
                                             Сухо тегло:
                                          
                                       
                                             vi.
                                          
                                          
                                             Брой на прешлените
                                          
                                       
                                             
                                                Забележка 1:
                                             
                                          
                                          
                                             Наблюденията, направени по време на изпитването за определяне на обхвата, могат да помогнат при избора на относимите допълнителни измервания измежду изброените по-горе шест променливи.
                                          
                                       
                                             
                                                Забележка 2:
                                             
                                          
                                          
                                             Много желателно е определянето на свежото и сухото тегло (параметри iv и v).
                                          
                                       
                                             
                                                Забележка 3:
                                             
                                          
                                          
                                             Поради факта, че захарозата и светлината (експозицията на корените на светлина по време на изпитването) могат да окажат въздействие върху носителите на ауксин (хормон на растежа при растенията) и че някои химикали могат да имат начин на действие, подобен на този на ауксина, включването на крайните точки, свързани с измерването на корените (параметър iii), е под въпрос.
                                          
                                       
                                             
                                                Забележка 4:
                                             
                                          
                                          
                                             Резултатите от кръговото изпитване показват високи коефициенти на вариация (> 60 %) за общата дължина на страничните разклонения (параметър i). Общата дължина на страничните разклонения във всички случаи е включена в измерването на общата дължина на поника (параметър ii), която показва по-приемливи коефициенти на вариация от порядъка на <30 %.
                                          
                                       
                                             
                                                Забележка 5:
                                             
                                          
                                          
                                             Въз основа на горните съображения препоръчителните основни крайни точки за измерване са: обща дължина на поника, свежо тегло и сухо тегло (параметри ii, iv и v); използването на параметър vi — брой на прешлените — е оставено на преценката на лицето, провеждащо изследването.
                                          
                                       
                           
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Предимството на определянето на дължината на основния поник и на броя на прешлените е, че за всеки съд за изпитване и за всеки контролен съд това може да стане в началото, по време и в края на изпитването чрез заснемане и анализ на изображенията, като може да се използва също и (стерилна) линийка.
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Общата дължина на страничните разклонения, общата дължина на корените (като сума от всички странични разклонения или корени) и общата дължина на поника (като сбор от дължината на основния поник и общата дължина на страничните разклонения) могат да бъдат измерени с линийка в края на експозицията.
                              
                           
                              
                                 40.
                              
                              
                                 Свежото и/или сухото тегло следва да се определят в началото на изпитването от проба от предкултурата, представителна по отношение на това, което се използва за начало на изпитването, както и в края на изпитването с растителен материал от всеки съд за изпитване и всеки контролен съд.
                              
                           
                              
                                 41.
                              
                              
                                 Общата дължина на страничните разклонения, общата дължина на поника, общата дължина на корените, свежото тегло, сухото тегло и броят на прешлените могат да се определят, както следва:
                                 i.   
                                       Обща дължина на страничните разклонения
                                    : Дължината на страничните разклонения може да бъде определена чрез измерване на всички странични разклонения с линийка в края на експозицията. Общата дължина на страничните разклонения е сумата от всички странични разклонения във всеки съд за изпитване и всеки контролен съд.
                                 ii.   
                                       Обща дължина на поника
                                    : Дължината на основния поник може да бъде определена чрез анализ на изображенията или с помощта на линийка. Общата дължина на поника е сумата от общата дължина на страничните разклонения и дължината на основния поник във всеки съд за изпитване и всеки контролен съд в края на експозицията.
                                 iii.   
                                       Обща дължина на корените
                                    : Дължината на корените може да бъде определена чрез измерване на всички корени с линийка в края на експозицията. Общата дължина на корените е сумата от всички корени във всеки съд за изпитване и всеки контролен съд.
                                 iv.   
                                       Свежо тегло
                                    : Свежото тегло може да се определи чрез претегляне на изпитваните организми в края на експозицията. Целият растителен материал от всеки съд за измерване и от всеки контролен съд се изплаква с дестилирана вода и се подсушава с целулозна хартия. След тази подготовка свежото тегло се определя чрез претегляне. Началната биомаса (свежо тегло) се определя въз основа на проба от изпитваните организми, взета от същата партида, която е използвана за инокулацията на съдовете за изпитване.
                                 v.   
                                       Сухо тегло
                                    : След подготовката за определяне на свежото тегло изпитваните организми се изсушават при 60°С до постоянно тегло. Тази маса е сухото тегло. Началната биомаса (сухо тегло) се определя въз основа на проба от изпитваните организми, взета от същата партида, която е използвана за инокулацията на съдовете за изпитване.
                                 vi.   
                                       Брой на прешлените
                                    : Броят се всички прешлени по дължината на основния поник.
                              
                           
                        Честота на измерванията и аналитичните определяния
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Ако се използва схема за статично изпитване, pH на всяка третирана проба следва да се измери в началото и в края на изпитването. Ако се използва схема за полустатично изпитване, pH следва да се измерва във всяка партида от „свеж“ разтвор за изпитване преди всяко обновяване, както и в съответните „изчерпани“ разтвори.
                              
                           
                              
                                 43.
                              
                              
                                 Интензитетът на светлината следва да се измерва във вегетационната камера, в инкубатора или помещението в точки, които са на разстояние от източника на светлина, което е еднакво с това на изпитваните организми. Измерванията следва да се извършват най-малко веднъж по време на изпитването. Температурата на средата в заместващия съд, който се държи при същите условия във вегетационната камера, инкубатора или помещението, следва да се записва най-малко веднъж дневно (или постоянно от устройство за запис на данни).
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 По време на изпитването концентрациите на изпитвания(ите) химикал(и) се определят през подходящи интервали. При статични изпитвания минималното изискване е концентрациите да се определят в началото и в края на изпитването.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 При полустатични изпитвания, при които концентрациите на изпитвания(ите) химикал(и) не се очаква да останат в рамките на ± 20 % от номиналната концентрация, е необходимо да се анализират всички прясно приготвени изпитвани разтвори и същите разтвори при всяко обновяване. Обаче при тези изпитвания, при които измерените начални концентрации на изпитвания(ите) химикал(и) не са в рамките на ± 20 % от номиналната, но за които може да се предоставят достатъчно доказателства, показващи че началните концентрации са повторяеми и стабилни (т.е. в обхват 80—120 % от началната концентрация), химичните определяния могат да се извършат само за най-високата и най-ниската изпитвана концентрация. Във всички случаи определянето на изпитваните концентрации преди обновяването е необходимо да се извършва само за един съд с повторение за всяка изпитвана концентрация (или в един съд, в който е обединено съдържанието на всички повторения).
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Ако има доказателство, че изпитваната концентрация е била задоволително поддържана в рамките на ± 20 % от номиналната или измерваната първоначална концентрация през цялото време на изпитването, анализът на резултатите може да бъде базиран на номиналните или измерените първоначални стойности. Ако отклонението от номиналната или измерената първоначална концентрация не е в рамките на ± 20 %, анализът на резултатите следва да се базира на средногеометричната стойност на концентрацията по време на експозицията или на модели, които описват намаляването на концентрацията на изпитвания химикал (5).
                              
                           
                        Гранично изпитване
                     
                     
                              
                                 47.
                              
                              
                                 При определени условия, например когато предварителното изпитване показва, че изпитваният химикал няма токсични въздействия при концентрации до 100 mg/l или до неговата граница на разтворимост в изпитваната среда или, ако става дума за формулировки, до неговата граница на диспергиране, може да бъде осъществено гранично изпитване, включващо сравнение на отклика в контролна група и в една от третираните групи (100 mg/l или концентрация, равна на границата на разтворимост). Настоятелно се препоръчва това да е подкрепено с анализ на концентрацията на експозиция. Всички предходни условия на изпитване и критерии за валидност се прилагат и за гранично изпитване, с изключение на това, че броят на третираните повторения следва да се удвои. Растежът в контролната и третираната група може да се анализира чрез използване на статистически тест за сравняване на средните стойности, например t-тест на Стюдънт.
                              
                           ДАННИ И ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                        Зависими променливи
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Целта на изпитването е да се определят въздействията на изпитван химикал върху вегетативния растеж на Myriophyllum spicatum. Настоящият метод за изпитване описва две зависими променливи.
                                 а)   
                                       Средна специфична скорост на растеж
                                    : тази зависима променлива се изчислява на базата на промените в логаритмите на дължината на основния поник и, допълнително, на базата на промените в логаритмите на други измервани параметри, т.е. обща дължина на поника, свежо тегло, сухо тегло или брой на прешлените с течение на времето (изразено за ден) в контролите и във всяка третирана група. Забележка: за измерваните параметри „обща дължина на страничните разклонения“ и „обща дължина на корените“ е невъзможно да се изчисли средна специфична скорост на растежа. В началото на изпитването изпитваният организъм все още няма странични разклонения, нито корени (въз основа на приготвянето на предкултурата); изчисляването на средната специфична скорост на растежа не може да се определи, когато отправната стойност е нула.
                                 б)   
                                       Добив
                                    : тази зависима променлива се изчислява на базата на промените в дължината на основния поник и, допълнително, на базата на промените в други измервани параметри, т.е. за предпочитане обща дължина на поника, свежо тегло, сухо тегло или брой на прешлените и други параметри, ако се счетат за полезни — в контролите и във всяка третирана група до края на изпитването.
                              
                           
                              
                                 49.
                              
                              
                                 Оценките на токсичността следва да са базирани на дължината на основния поник и на измерването на още три допълнителни променливи (т.е. за предпочитане обща дължина на поника, свежо тегло, сухо тегло или брой на прешлените, вж. точка 37 и забележки 2, 4 и 5 към настоящата точка), тъй като някои химикали могат да оказват много по-голямо въздействие върху други измервани променливи, отколкото върху дължината на основния поник. Това въздействие не може да бъде открито само чрез изчисляване на дължината на основния поник.
                              
                           
                        Средна специфична скорост на растеж
                     
                     
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Средната специфична скорост на растеж за определен период се изчислява като логаритмичното нарастване в променливите за растеж — дължина на основния поник и три допълнителни измервани променливи (т.е. обща дължина на поника, свежо тегло, сухо тегло или брой на прешлените) — като се използва формулата, дадена по-долу, за всяко повторение на контрола и третирания:
                                 
                                    
                                 където:
                                 
                                    μi-j
                                    : средна специфична скорост на растеж за времето от i до j
                                 
                                    Ni
                                    : измервана променлива в съда за изпитване или в контролния съд в момента от време i
                                 
                                    Nj
                                    : измервана променлива в съда за изпитване или в контролния съд в момента от време j
                                 
                                    t: времеви интервал от i до j
                                 Изчислява се средната стойност на скоростта на растеж заедно с оценки на дисперсията за всяка третирана и контролна група.
                              
                           
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Средната специфична скорост на растеж следва да се изчисли за целия период на изпитване (времето „i“ в горната формула е началото на изпитването, а времето „j“ е краят на изпитването). За всяка изпитвана концентрация и контрола се изчислява средната стойност на средната специфична скорост на растеж заедно с оценките на дисперсията. Допълнително следва да се оцени скоростта на растеж сектор по сектор с цел да се оценят въздействията на изпитвания химикал, които възникват в периода на експозиция (например чрез проверка на log-трансформираните криви на растежа).
                              
                           
                              
                                 52.
                              
                              
                                 Процентът на потискане на скоростта на растежа (Ir) тогава може да се изчисли за всяка изпитвана концентрация (третирана група) съгласно следната формула:
                                 
                                    
                                 където:
                                 
                                    % Ir: процентно потискане в средната специфична скорост на растеж;
                                 
                                    μC: средна стойност на μ в контролата
                                 
                                    μT: средна стойност на μ в третираната група
                              
                           
                        Добив
                     
                     
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Въздействията върху добива се определят на базата на измерваната променлива дължина на основния поник и три допълнителни измервани променливи (т.е. за предпочитане обща дължина на поника, свежо тегло, сухо тегло или брой на прешлените), които присъстват във всеки съд за изпитване в началото и в края на изпитването. За свежото тегло или сухото тегло началната биомаса се определя на базата на проба от изпитваните организми, взета от същата партида, която е използвана за инокулацията на съдовете за изпитване. За всяка изпитвана концентрация и контрола се изчислява средната стойност на добива, заедно с оценките на дисперсията. Средното процентно потискане на добива ( % Iy) може да се изчисли за всяка третирана група, както следва:
                                 
                                    
                                 където:
                                 
                                    % Iy: процентното намаление на добива
                                 
                                    bC: крайната биомаса минус началната биомаса за контролната група
                                 
                                    bT: крайната биомаса минус началната биомаса в третираната група
                              
                           
                        Време за удвояване
                     
                     
                              
                                 54.
                              
                              
                                 За определяне на времето за удвояване (Td) на дължината на основния поник и придържането към този критерий за валидност при изследването (вж. точка 8) се използва следната формула с данните, получени от контролните съдове:
                                 Td = ln 2/μ,
                                 където μ е средната специфична скорост на растеж, определена според описанието в точки 50—52.
                              
                           
                        Построяване на кривите концентрация-отклик
                     
                     
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Следва да се построят кривите концентрация-отклик, които свързват средното процентно потискане на зависимата променлива (Ir или Iy, изчислени както е показано в точка 53) и логаритъма на концентрацията на изпитвания химикал.
                              
                           
                        Оценка на ECx
                        
                     
                     
                              
                                 56.
                              
                              
                                 Оценките на ECx следва да се основават на стойностите както на средната специфична скорост на растеж (ErCx), така и на добива (EyCx), всяка от които на свой ред следва да се основава на дължината на основния поник и евентуално на допълнителни измервани променливи (т.е. за предпочитане обща дължина на поника, свежо тегло, сухо тегло или брой на прешлените). Това е така, тъй като има химикали, които оказват различно въздействие върху общата дължина на поника и други измервани променливи. Следователно исканите параметри за токсичност са четири стойности на ECx за всяко изчислено ниво x на потискане на растежа: ErCx (дължина на основния поник); ErCx (т.е., за предпочитане обща дължина на поника, свежо тегло, сухо тегло или брой на прешлените); EyCx (дължина на основния поник); и EyCx (т.е., за предпочитане обща дължина на поника, свежо тегло, сухо тегло или брой на прешлените).
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Следва да се отбележи, че стойностите на ECx, изчислени с помощта на тези две зависими променливи, не са сравними и тази разлика се разпознава, когато се използват резултатите от изпитването. Стойностите на ECx, базирани на средната специфична скорост на растеж (ErCx), в повечето случаи ще бъдат по-високи от резултатите, базирани на добива (EyCx), ако се спазват условията за изпитване на настоящия метод за изпитване, което се дължи на математическата основа на съответните подходи. Тази разлика не следва да се интерпретира като разлика в чувствителността между двете зависими променливи — стойностите просто са различни от математическа гледна точка.
                              
                           
                        Статистически процедури
                     
                     
                              
                                 58.
                              
                              
                                 Целта е да се получи количествено съотношение концентрация-отклик чрез регресионен анализ. Може да се използва претеглена линейна регресия след извършване на линеаризираща трансформация на данните от отклика — например с пробит, или логит, или Вейбул модели (7), но предпочитаните процедури са тези на нелинейната регресия, които по-добре обработват неизбежните неравномерности и отклонения от гладките разпределения. При приближаване на нула или пълно инхибиране подобни неравномерности може да бъдат увеличени от трансформацията, като по този начин пречат на анализа (7). Следва да се отбележи, че стандартните методи на анализ с помощта на пробит, логит или Вейбул трансформации са предназначени за използване при двоични данни (например смъртност или преживяване) и следва да бъдат изменени, за да се приспособят към данните за скоростта на растежа или добива. Специфични процедури за определяне на стойности на ECx от непрекъснати данни могат да се намерят в (8), (9) и (10).
                              
                           
                              
                                 59.
                              
                              
                                 За анализа на всяка от зависимите променливи се използва съотношението концентрация-отклик, за да се изчислят точковите оценки на стойностите на ECx. По възможност следва да се определят 95 % доверителни граници за всяка от оценките. Съгласуваността на данните от отклика с регресионния модел следва да се оцени графично или статистически. Регресионният анализ следва да се извърши, като се използват отклиците при индивидуалните повторения, а не средните стойности за третираните групи.
                              
                           
                              
                                 60.
                              
                              
                                 Оценките на EC50 и доверителните граници могат да се получат също и чрез използване на линейна интерполация с boostrap процедура (10), ако наличните регресионни модели/методи са неподходящи за данните.
                              
                           
                              
                                 61.
                              
                              
                                 За оценяване на LOEC и следователно на NOEC е необходимо да се сравнят средните стойности от третиране, като се използват техники за дисперсионен анализ (ANOVA). Средната стойност за всяка концентрация след това се сравнява със средната стойност на контролата с помощта на съответния метод за множествени сравнения или трендов тест. Тестовете на Дънет или на Уйлямс могат да бъдат от полза (12) (13) (14) (15) (16). Необходимо е да се оцени дали е удовлетворено допускането при ANOVA за хомогенност на дисперсията. Тази оценка може да се извърши графично или чрез формален тест (15). Подходящи са тестовете на Левин или на Бартлет. Невъзможността за удовлетворяване на допускането за хомогенност на дисперсиите понякога може да се коригира чрез логаритмична трансформация на данните. Ако хетерогенността на дисперсията е екстремална и не може да се коригира чрез трансформация, следва да се обмисли анализ с методи като теста на Йонкхере за определяне на тренд със стъпка назад. Допълнителни насоки относно определянето на NOEC могат да се намерят в (10).
                              
                           
                              
                                 62.
                              
                              
                                 В най-новите научни разработки е дадена препоръка концепцията за NOEC да бъде изоставена и заменена с базирани на регресия точкови оценки на ECx. Не е установена подходящата стойност на x за това изпитване на Myriophyllum. Изглежда обаче, че диапазонът от 10 до 20 % е подходящ (в зависимост от избраната зависима променлива) и се предпочита да бъдат протоколирани както EC10, така и EC20 и техните доверителни граници.
                              
                           
                        Протоколиране
                     
                     
                              
                                 63.
                              
                              
                                 Протоколът от изпитването включва следното:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Изпитван химикал
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Вещество с една съставка:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     химична идентификация, като например наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, код SMILES или InChI, структурна формула, чистота, химична идентичност на онечистванията, доколкото е целесъобразно и практически осъществимо, и т.н. (включително съдържание на органичен въглерод, ако е приложимо).
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Вещество с повече съставки, UVCB или смес:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     определени, доколкото е възможно, с химичната си идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Животински видове за изпитването
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Научно име и източник.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Условия на изпитване
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         използвана процедура на изпитване (статична или полустатична);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         дата на началото на изпитването и неговата продължителност;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         среда за изпитване;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         описание на плана на проучването: съдове за изпитване и капаци, обем на разтворите, дължина на основния поник за един съд за изпитване в началото на изпитването;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         изпитвани концентрации (съответно номинална и измерена) и брой на повторенията за една концентрация;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         методи за приготвяне на изходните и изпитваните разтвори, включително използването на всякакви разтворители или диспергиращи средства.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         температура по време на изпитването;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         източник на светлина, интензитет на светлината и хомогенност;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         стойности на pH за изпитваните и контролните среди;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         метод за анализ на изпитвания химикал със съответните данни за оценка на качеството (изследвания за валидиране, стандартни отклонения или доверителни граници на анализите);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         методи за определяне на дължината на основния поник и други измервани променливи, например обща дължина на страничните разклонения, обща дължина на поника, обща дължина на корените, свежо тегло, сухо тегло или брой на прешлените.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         състояние на културата (стерилно или нестерилно) за всеки съд за изпитване и за всеки контролен съд при всяко наблюдение;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         всички отклонения от настоящия метод за изпитване.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Резултати
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         необработени данни: дължина на основния поник и други измервани променливи във всеки съд за изпитване и всеки контролен съд при всяко наблюдение и извършен анализ;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         средни стойности и стандартни отклонения за всяка измервана стойност;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         криви на растежа за всяка измервана променлива.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         изчислените зависими променливи за всяко повторение на третиране със средните стойности и коефициент на вариация за повторенията;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         графично представяне на взаимовръзката концентрация-въздействие;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         оценки на токсичните крайни точки за зависимите променливи, например EC50, EC10, EC20, и свързаните доверителни интервали; Ако са изчислени, LOEC и/или NOEC и статистическите методи, използвани за тяхното определяне;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ако е използван ANOVA, големината на въздействието, което може да се открие (например най-малката значима разлика);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         всяка стимулация на растеж, открита в което и да е третиране;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         всякакви визуални признаци за фитотоксичност, както и наблюдения на изпитваните разтвори;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         обсъждане на резултатите, включително всякакво влияние върху резултата от изпитването вследствие на отклонения от настоящия метод за изпитване.
                                                      
                                                   
                                       
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 ASTM Designation E 1913-04, Standard Guide for Conducting Static, Axenic, 14-Day Phytotoxicity Tests in Test Tubes with the Submersed Aquatic Macrophyte, Myriophyllum sibiricum Komarov.
                              
                           
                                 (1)
                              
                              
                                 Maletzki, D. et al. (2010), Myriophyllum spicatum als ökotoxikologischer Testorganismus: Methodenentwicklung eines sedimentfreien Testsystems und erste Ergebnisse mit 3,5-Dichlorphenol, Umweltwiss Schadst Forsch, No. 22, pp. 702–710.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Глава В.26 от настоящото приложение: Изпитване на потискането на растежа на видове от род Lemna,
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 OECD (2014), „Myriophyllum spicatum Toxicity Test: Results of an inter-laboratory ring test using a sediment-free test system“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series Testing and Assessment, No. 205, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 OECD (2000), „Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 23, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Глава В.51 от настоящото приложение: Изпитване за токсичност вода-седимент при Myriophyllum spicatum
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Christensen, E.R., N. Nyholm (1984), Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves, Environmental Science & Technology, Vol. 18/9, 713-718.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Nyholm, N. et al. (1992), Statistical treatment of data from microbial toxicity tests, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/2, pp. 157-167.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Bruce, R.D., D.J. Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/10, pp. 1485-1494.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 OECD (2006), „Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 54, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Norberg-King, T.J. (1988), An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach, National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88, US EPA, Duluth, MN.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of the American Statistical Association, Vol. 50/272, pp. 1096-1121.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics, Vol. 20/3, pp. 482-491.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics, Vol. 27/1, pp. 103-117.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics, Vol. 28/2, pp. 519-531.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Brain, P., R. Cousens (1989), An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses, Weed Research, Vol. 29/2, pp. 93-96.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Биомаса е свежото и/или сухото тегло на живите организми, съдържащи се в една популация. В това изпитване биомасата е сумата от основния поник, всички странични разклонения и всички корени.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Химикал означава вещество или смес.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Хлороза е промяната на цвета от зелен на жълтеникав на изпитван организъм, по-специално на прешлените.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       ECx
                                        е концентрацията на изпитвания химикал, разтворен в изпитваната среда, която води до x % (например 50 %) намаляване на растежа на Myriophyllum spicatum в рамките на определен период на експозиция (който трябва да бъде посочен изрично, ако се отклонява от пълната или нормалната продължителност на изпитването). С оглед на еднозначно обозначаване на стойността на EC, изведена от скоростта на растежа или от добива, символът „ErC“ се използва за скоростта на растежа, а „EyC“ се използва за добива, следван от използваната измервана променлива, напримерErC (дължина на основния поник).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Растеж е увеличение на измерваната променлива, например дължина на основния поник, обща дължина страничните разклонения, обща дължина на поника, обща дължина на корените, свежо тегло, сухо тегло или брой на прешлените, за периода на изпитването.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Скорост на растеж (средна специфична скорост на растеж) е логаритмичното нарастване на измерваната променлива през периода на експозиция. Забележка: Зависимите променливи, свързани със скоростта на растежа, не зависят от продължителността на изпитването, доколкото моделът на растеж на неекспонираните контролни организми е експоненциален.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Най-ниска концентрация, при която се наблюдава въздействие (LOEC), е най-ниската изпитвана концентрация, при която за химикала се наблюдава статистически значимо въздействие за забавяне на растежа (при p < 0,05) в сравнение с контролата, в рамките на дадено време на експозиция. При все това, всички изпитвани концентрации над LOEC следва да имат вредно въздействие, равно или по-голямо от наблюдаваното при LOEC. Когато тези две условия не могат да бъдат удовлетворени, следва да се даде пълно обяснение за това как е била избрана LOEC (и следователно NOEC).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Измервани променливи са всички видове променливи, които се измерват с цел да се изрази крайната точка на изпитването с помощта на една или няколко различни зависими променливи. При този метод за изпитване измервани променливи са дължината на основния поник, общата дължина на страничните разклонения, общата дължина на поника, общата дължина на корените, свежото тегло, сухото тегло и броят на прешлените.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Монокултура е култура с един растителен вид.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Некроза е мъртва (т.е. бледа или тъмнокафява) тъкан на изпитвания организъм.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Концентрация без наблюдавано въздействие (NOEC) е изпитваната концентрация непосредствено под LOEC.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Зависима променлива е променлива за оценяване на токсичността, получена от измервана променлива, описваща биомасата, чрез различни методи на изчисление. При настоящия метод за изпитване скоростите на растежа и добивът са зависими променливи, получени от измервани променливи като дължина на основния поник, обща дължина на поника, свежо тегло, сухо тегло или брой на прешлените.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Полустатично изпитване (с обновяване) е изпитване, при което изпитваният разтвор периодично се подменя на определени интервали по време на изпитването.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Статично изпитване е метод за изпитване без обновяване на изпитвания разтвор по време на изпитването.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Изпитван химикал е всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Крайна точка на изпитване описва като цел на изпитването общия показател, който ще бъде изменен от изпитвания химикал в сравнение с контролата. При настоящия метод за изпитване крайната точка на изпитването е потискането на растежа, което може да се изрази чрез различни зависими променливи на базата на една или повече измервани променливи.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Среда за изпитване е напълно синтетичната среда на растеж, върху която растат изпитваните растения, когато са подложени на въздействието на изпитвания химикал. Изпитваният химикал обикновено се разтваря в средата за изпитване.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       UVCB е вещество с неизвестен или променлив състав, сложен продукт от реакция или биологичен материал.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Добив е стойността на измервана променлива, чрез която се изразява биомасата в края на периода на експозиция минус измерваната променлива в началото на периода на експозиция. Забележка: Когато моделът на растеж на неекспонираните организми е експоненциален, зависимите променливи, базирани на добива, ще се понижат в хода на изпитването.
                                 
                              
                     
                        Допълнение 2
                        
                           МОДИФИЦИРАНА СРЕДА НА ANDREWS ЗА ИЗХОДНИ КУЛТУРИ И ПРЕДКУЛТУРИ
                        
                        Модифицираната среда на Andrews, която се изисква за изходните култури и предкултурите, се подготвя от пет отделно приготвени изходни хранителни разтвора с добавка на 3 % захароза.
                        
                           Таблица 1
                        
                        
                           Състав на хранителния разтвор на Andrews: (Обозначение на ASTM: E 1913-04)
                        
                        
                                    Приготвяне на хранителни изходни разтвори
                                 
                                 
                                    Приготвяне на хранителен разтвор
                                 
                              
                                    Изходен разтвор
                                 
                                 
                                    Химикал
                                 
                                 
                                    Първоначално тегло на 1000 ml
                                 
                                 
                                    ml на 5 l хранителен разтвор
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    KCl
                                 
                                 
                                    74,6 mg
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    KNO3
                                    
                                 
                                 
                                    8,08 g
                                 
                              
                                    Ca(NO3)2 × 4 H2O
                                 
                                 
                                    18,88 g
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    MgSO4 × 7 H2O
                                 
                                 
                                    9,86 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    Вж. по-долу изходен разтвор 3.1
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    KH2PO4
                                    
                                 
                                 
                                    2,72 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    FeSO4 × 7 H2O
                                 
                                 
                                    0,278 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    Na2EDTA × 2 H2O
                                 
                                 
                                    0,372 g
                                 
                              Изходните разтвори могат да се съхраняват в хладилник за 6 месеца (при температура от 5—10 °C). Само изходен разтвор № 5 има по-кратък срок на съхранение (два месеца).
                        
                           Таблица 2
                        
                        
                           Приготвяне на изходен разтвор 3.1. за приготвяне на изходен разтвор 3
                        
                        
                                    Химикал
                                 
                                 
                                    Първоначално тегло g/100 ml
                                 
                              
                                    MnSO4 * 4 H2O
                                 
                                 
                                    0,223
                                 
                              
                                    ZnSO4 * 7 H2O
                                 
                                 
                                    0,115
                                 
                              
                                    H3BO3
                                    
                                 
                                 
                                    0,155
                                 
                              
                                    CuSO4 * 5 H2O
                                 
                                 
                                    0,0125
                                 
                              
                                    (NH4)6Mo7O24 * 4 H2O
                                 
                                 
                                    0,0037
                                 
                              След приготвянето на изходен разтвор № 3.1 (таблица 2) този разтвор се подлага на дълбоко замразяване в около 11 ml-аликвотни части (при поне – 18°С). Дълбоко замразените порции имат срок на годност от пет години.
                        За приготвяне на изходен разтвор № 3, основен разтвор № 3.1 се размразява, 10 ml от него се поставят в мерителна колба от 1 l и се добавя ултрачиста вода до обозначението на колбата.
                        За да се получи модифицирана среда на Andrews, около 2 500 ml ултрачиста вода се поставят в мерителна колба с вместимост от 5 l. След добавяне на по 50 ml от всеки основен разтвор, 90 % от мерителната колба се запълват с ултрачиста вода и се коригира рН до 5,8.
                        След това се добавят 150 g разтворена захароза (3 % на 5 l); след това се добавя ултрачиста вода в мерителната колба до обозначението. Накрая хранителният разтвор се изсипва в колби Schott с вместимост от 1 l и се обработва в автоклав при 121°С в продължение на 20 минути.
                        Полученият по този начин хранителен разтвор може да се съхранява в хладилник при стерилни условия (при температура 5—10°С) за срок от три месеца.
                        
                           Модифицирана среда на Andrews за изпитвания за токсичност без седименти
                        
                        Десетократната концентрация на модифицираната среда на Andrews, която се изисква за получаване на изпитваните разтвори, се приготвя от петте изходни хранителни разтвора, посочени в таблици 1 и 2 по-горе, с добавка на 30 % захароза. За да се направи това се изсипват приблизително 100 ml ултрачиста вода в мерителна колба с вместимост от 1 l. След добавяне по 100 ml от всеки изходен разтвор, рН се коригира на 5,8. След това се добавя 30-процентен разтвор на захароза (300 g на 1 000 ml); след това мерителната колба се допълва до обозначението с ултрачиста вода.
                        Накрая хранителният разтвор се изсипва в колби Schott с вместимост от 0,5 l и се обработва в автоклав при 121°С в продължение на 20 минути.
                        Получената по този начин десетократна концентрация на модифицирания хранителен разтвор може да се съхранява в хладилник при стерилни условия (при температура 5—10°С) за срок от три месеца.
                     
                     
                        Допълнение 3
                        
                           ПОДДЪРЖАНЕ НА ИЗХОДНАТА КУЛТУРА
                        
                        В настоящото допълнение 3 се описва изходната култура на Myriophyllum spicatum L (103), подводно двусемеделно растение от семейство Haloragaceae. Между юни и август над водната повърхност се показват неразличими розово-бели цветове. Растенията са вкоренени в земята чрез система от устойчиви коренища и се срещат в цялото северно полукълбо в еутрофни, но незамърсени и наситени на калций спокойни води с кален субстрат. Myriophyllum spicatum предпочита сладките води, но може да бъде открито и в бракични води.
                        За изходна култура без седимент в лабораторни условия са необходими стерилни растения. Стерилни растения са налични в екотоксикологичната лаборатория на германската Umweltbundesamt (Федерална агенция по околна среда на Германия).
                        Като алтернатива изпитваните организми могат да бъдат получени от нестерилни растения в съответствие с обозначението на ASTM Е 1913-04. Вж. по-долу процедурата за култивиране на събрани на място растения от вида Myriophyllum sibiricum, взета от Ръководството на ASTM:
                        
                           „Ако се започва със събирани на място нестерилни растения, събирането на филизи на M. sibiricum се извършва през есента. Филизите се поставят в 20-литров аквариум, съдържащ 5 cm стерилен седимент, покрит с кварцов пясък или например с Turface® и 18 l вода с квалификация „чист“. Аквариумът се аерира и в него се поддържа температура от 15 °C и скорост на преминаване от 200 до 300 μmol m– 2 s– 1 в рамките на 16 часа дневно. Културата в аквариума може да се поддържа като резервен източник на растения, в случай че стерилните растителни култури бъдат унищожени поради механична повреда в камерата за растеж, поради замърсяване или по друга причина. Растенията, които се отглеждат в аквариума, не са стерилни и стерилните култури не могат да бъдат отглеждани в система за партидно култивиране. С цел стерилизация на културата растенията се отстраняват от аквариума и се изплакват с течаща дейонизирана вода в продължение на около 0,5 часа. При стерилни условия в шкаф с ламинарен въздушен поток растенията се дезинфектират за по-малко от 20 минути (до побеляване на по-голямата част от растителната тъкан, при което зелено остава само растящото връхче) в 3-процентен (w/v) разтвор на натриев хипохлорит, съдържащ 0,01 % подходящо повърхностно активно вещество. Дезинфектантът и растителният материал се разклащат. Сегменти с по няколко възела се прехвърлят в стерилни епруветки за култивиране, съдържащи 45 ml стерилизирана модифицирана среда на Andrews, и се затварят с плоски капачки за посевни епруветки. Във всяка камера за изпитване се поставя само един сегмент от растение. За да се гарантира, че посевният съд е добре затворен, се използва запечатващ филм за лабораторна употреба. След като стерилната култура е имплантирана, на всеки десет до дванадесет дни растителните сегменти с по няколко възела следва да се прехвърлят в нови камери за изпитване, съдържащи пресни течни хранителни среди. Както при култивирането в агарни посявки, растенията трябва да са стерилни и да останат стерилни за срок от осем седмици преди началото на изпитването.“
                        
                        Тъй като модифицираната среда на Andrews съдържа захароза (която стимулира растежа на гъбички и бактерии), всички материали, разтвори и култивирането трябва да се приготвят в стерилни условия. Всички течности, както и оборудването, се стерилизират преди употреба. Стерилизация се извършва посредством обработка с горещ въздух (210°С) в продължение на 4 часа или чрез обработка в автоклав в продължение на 20 минути при температура от 121°С. В допълнение непосредствено преди употреба всички колби, блюда, чаши и т.н., както и останалото оборудване се подлагат на обработка с пламък върху стерилната работна маса.
                        Изходните култури могат да бъдат поддържани при намалено осветление и температура (50 μE m– 2 s– 1, 20 ± 2 °C) за по-продължителни периоди, без да има нужда да бъдат повторно имплантирани. Средата за растеж на Myriophyllum следва да е същата като тази, използвана за изпитването, но за изходните култури може да се използва друга богата хранителна среда.
                        Растителните сегменти се разпределят при пълно отсъствие на чужди организми в няколко 500-милилитрови Ерленмайерови или/и 2 000-милилитрови Фернбахови колби, всяка от които съдържа съответно около 450 или 1 000 ml модифицирана среда на Andrews. След това колбите се запушват с целулозни тапи, така че да не проникват други организми.
                        В допълнение е абсолютно необходимо оборудването на стерилния работен плот да се обработи с пламък непосредствено преди да бъде използвано. В зависимост от броя и размера си растенията трябва да бъдат прехвърляни в пресни хранителни среди приблизително на всеки три седмици.
                        За обновяването на културата могат да се използват както връхчета, така и сегменти от средата на стеблото. Броят и размерът на прехвърлените растения (или сегменти от растения) зависят от това колко растения са необходими. Можете например да прехвърлите пет сегмента от поник в една Фернбахова колба и три сегмента от поник в една Ерленмайерова колба, като дължината на всеки сегмент е 5 cm. Всички вкоренени, цъфнали, мъртви сегменти или сегменти с други видими изменения се отстраняват.
                        
                           Фигура 1
                        
                        
                           Рязане на растения за изходна култура и предкултура след отглеждане в продължение на 3 седмици.
                        
                        Култивирането на растения трябва да се извършва в 500-милилитрови Ерленмайерови и 2 000-милилитрови Фернбахови колби в инкубатор с охлаждане, при температура от 20 ± 2 °C при непрекъснато осветление в диапазон около 100—150 μE m– 2 s– 1 или 6 000—9 000 Lux (подавано от източник в камерата с цветова температура „топла бяла светлина“).
                        
                           Фигура 2
                        
                        
                           Култивиране на растения в инкубатор с охлаждане с източник на осветление в камерата.
                        
                        Следва да се използват химически чисти (промити с киселина) и стерилни стъклени съдове за отглеждане, както и да се прилагат асептични техники за манипулиране. В случай на замърсяване на изходната култура, например с водорасли, гъби и/или бактерии, за обновяване на въпросната култура следва да се подготви нова култура или да се използва изходна култура от друга лаборатория.
                     
                     
                        Допълнение 4
                        
                           ПОДДЪРЖАНЕ НА ПРЕДКУЛТУРИТЕ И ПОДГОТОВКА НА ИЗПИТВАНИТЕ ОРГАНИЗМИ ЗА ИЗПИТВАНЕТО
                        
                        За да се получи предкултура, пониците на изходната култура се нарязват на сегменти, като във всеки сегмент се съдържат по два прешлена; сегментите се поставят във Фернбахови колби, напълнени с модифицирана среда на Andrews (с 3-процентен разтвор на захароза). Всяка колба може да съдържа до 50 сегмента от пониците. Трябва обаче да се внимава сегментите да са жизнеспособни и да нямат корени и странични разклонения, нито техни пъпки (вж. фигура 1 в допълнение 3).
                        Организмите в предкултурите се култивират в стерилни условия в продължение на 14 до 21 дни в осигуряваща необходимите параметри на околната среда климатична камера при режим на светлина/тъмнина в съотношение 16/8 часа. Избраният светлинен интензитет е в диапазона 100—150 μE m– 2 s– 1. Температурата в съдовете за изпитване следва да бъде 23 ± 2 °C.
                        Тъй като модифицираната среда на Andrews съдържа захароза (която стимулира растежа на водорасли, гъбички и бактерии), разтворите на изпитвания химикал следва да се приготвят и култивирането да се извършва в стерилни условия. Всички течности, както и оборудването, се стерилизират преди употреба. Стерилизация се извършва посредством обработка с горещ въздух (210° С) в продължение на 4 часа или чрез обработка в автоклав в продължение на 20 минути при температура от 121°С. В допълнение непосредствено преди употреба всички колби, блюда, чаши и т.н., както и останалото оборудване, се подлагат на обработка с пламък върху стерилната работна маса.
                        Пониците се отстраняват от колбите с предкултурите при пълно отсъствие на чужди организми, като се избира максимално хомогенен материал. За всяко изпитване се изискват най-малко 60 изпитвани организма (изпитване с осем концентрации на изпитвания химикал). За изпитването се вземат свежи странични разклонения от предкултури, скъсяват се до 2,5 cm от основата (измерването се извършва с линийка) и се прехвърлят в бехерова чаша, съдържаща стерилна модифицирана среда на Andrews. Тези пресни странични разклонения могат да бъдат използвани за целите на изпитване за токсичност без седименти при Myriophyllum spicatum.
                        
                           Фигура 2
                        
                        
                           Рязане на растения от предкултурата за целите на изпитването за токсичност без седимент при Myriophyllum spicatum.
                        
                        
                     В.51   Изпитване за токсичност в система вода-седимент при Myriophyllum spicatum
                        
                     
                     УВОД
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР 239 (2014 г.). Методи за изпитване има за плаващи едносемеделни водни растения от род Lemna (1) и за различни видове водорасли (2). Тези методи рутинно се използват за генериране на данни за справяне с риска от изпитваните химикали, по-специално химикалите с хербицидна активност, за неприцелни видове водни растения. Въпреки това в някои случаи може да са необходими данни за допълнителни макрофитни видове. В актуално публикувано ръководство от семинара на Society of Environmental Toxicology and Chemistry (Дружество по екологична токсикология и химия — SETAC) за оценка на свързания с използването на пестициди риск за водните макрофити (AMRAP) се предлага данни за един вкоренен макрофитен вид да се изискват за изпитвани химикали, за които е известно, че Lemna и водораслите не проявяват чувствителност към начина им на действие, или ако съществува проблем с разпределението в седимента, водещ до експозиция чрез усвояване през корените (3). В съответствие с настоящото разбиране и опит Myriophyllum spp. са най-предпочитани при необходимост от получаване на данни за потопени вкоренени във вода двусемеделни видове (4) (5) (6). Това изпитване не замества други изпитвания за токсичност във водна среда; то следва по-скоро да ги допълва с цел да се постигне по-пълна оценка на опасностите и рисковете за водните растения. Методът за изпитване в система вода-седимент на Myriophyllum spicatum допълва изпитването за токсичност без седимент при Myriophyllum spicatum (7).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 В настоящия документ се описва метод за изпитване, който позволява оценка на въздействието на изпитвания химикал върху вкоренени водни растения от вида Myriophyllum spicatum, растящи в система вода-седимент. Методът за изпитване се основава отчасти на вече съществуващи методи (1) (2) (8) и взема предвид последните изследвания, свързани с оценката на риска за водните растения (3). Методът в система вода-седимент е валидиран чрез международно кръгово изпитване, проведено с растения от род Myriophyllum, отглеждани при статични условия, които са били изложени на въздействието на изпитвания химикал чрез водната колона (9). Системата за изпитване обаче лесно може да се адаптира, за да се позволи експозиция чрез използване на седимент с добавка или експозиция чрез водната фаза при сценарии с полустатично или импулсно дозиране, въпреки че тези сценарии не са преминали официално през кръгово изпитване. Освен това общият метод може да се използва за други вкоренени, потопени и плаващи над водата водни видове, включително и други видове от род Myriophyllum (например Myriophyllum аquaticum) и Glyceria maxima (10). За алтернативни видове може да се наложат изменения на условията, плана и продължителността на изпитването. По-специално е необходима допълнителна работа за определяне на подходящите за Myriophyllum aquaticum процедури. Тези възможности не са представени подробно в настоящия метод за изпитване, в който се описва стандартният подход за експозиция на Myriophyllum spicatum в статична система чрез водната фаза.
                              
                           
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Този метод за изпитване се прилага за вещества, за които методът за изпитване е бил валидиран (вж. подробности в протокола от кръговото изпитване (9)), или за формулировки или известни смеси. Изпитване на растения от род Myriophyllum може да се проведе, за да се изпълни изискването от етап 1 за предоставяне на данни, налагащо се поради евентуално разпределение на изпитвания химикал в седиментния слой или заради проблеми, свързани с начина на действие/селективността. Лабораторно проведено изпитване на растения от род Myriophyllum може да се изисква също така като част от стратегия за изпитване на по-следващ етап с цел да се предложи решение на проблемите, свързани с риска за водните растения. Конкретната причина за провеждане на изпитването определя и пътя на експозицията (т.е. чрез вода или седимент). Преди използването на настоящия метод за изпитване на смес с регулаторна цел следва да се обмисли дали той може да предостави подходящи за целта резултати и ако да — защо. Подобни съображения не са необходими, когато има регулаторно изискване за изпитване на сместа.
                              
                           ПРИНЦИП НА ИЗПИТВАНЕТО
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Изпитването е предназначено да се оценят свързаните с химикала въздействия върху вегетативния растеж на растения от род Myriophyllum, растящи в стандартизирана среда (вода, седимент и хранителни елементи). За тази цел връхчетата на пониците на здрави нецъфнали растения се засаждат в стандартизиран изкуствен седимент, обогатен с допълнителни хранителни вещества, за да се гарантира подходящ растеж на растенията, след което се поддържат в среда Smart и Barko (допълнение 1). След период на имплантация, който дава възможност за образуване на корени, растенията се подлагат на серия от изпитвани концентрации, които се добавят във водната колона. Като алтернатива експозиция през седимента може да бъде стимулирана чрез добавяне на изпитвания химикал към изкуствения седимент и пресаждане на растенията в този седимент с добавка на химикал. И в двата случая след това растенията се поддържат в контролирани условия на околната среда в продължение на 14 дни. Въздействието върху растежа се определя чрез количествени оценки на дължината на поника, свежото тегло и сухото тегло, както и чрез качествени наблюдения на симптоми, като например хлороза, некроза или деформации при растежа.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 С цел количествено определяне на свързани с химикала въздействия растежът в изпитваните разтвори се сравнява с растежа в контролните растения и концентрацията, предизвикваща инхибиране на растежа до определените x %, се определя и изразява като ЕСх; „х“ може да бъде всяка стойност в зависимост от нормативните изисквания, например EC10, EC20 и EC50. Следва да се отбележи, че оценките на EC10 и EC20 са надеждни и подходящи само за тестове, при които коефициентите на вариация в контролните растения падат под оценяваното равнище на въздействие, т.е. за устойчива оценка на EC20 коефициентите на вариация следва да бъдат < 20 %.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Следва да се определи както средната специфична скорост на растежа (прогнозирана въз основа на оценки на дължината на поника, свежото тегло на поника и сухото тегло на поника) и добива (прогнозиран въз основа на увеличението на дължината на поника, свежото тегло на поника и сухото тегло на поника) от нетретираните и третираните растения. Специфичната скорост на растежа (r) и добива (y) впоследствие се използват за определяне съответно на ErCx (напр. ErC10, ErC20, ErC50) и EyCx (напр. EyC10, EyC20, EyC50).
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Ако се изисква, най-ниската концентрация, при която се наблюдава въздействие (LOEC), и концентрацията без наблюдавано въздействие (NOEC) могат да бъдат определени статистически от оценките за средната специфична скорост на растеж и за добива.
                              
                           ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИЗПИТВАНИЯ ХИМИКАЛ
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Следва да е наличен метод за анализ с достатъчна чувствителност за количествено определяне на химикалите в средата на изпитване.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Информацията относно изпитвания химикал, която може да бъде полезна за установяване на условията на изпитването, включва структурната формула, състава, в случай на вещество с повече съставки, UVCB, смеси или формулировки, чистота, разтворимост във вода, стабилност във вода и на светлина, константата на киселинна дисоциация (рКа), коефициент на разпределение октанол-вода (Kow), ако има данни — Kd за седимента, парно налягане и биоразградимост. Разтворимостта във вода и парното налягане може да се използват за изчисляване на константата по закона на Хенри, която ще покаже дали се очакват значителни загуби на изпитвания химикал през периода на изпитването. Ако съществува вероятност за загуба на изпитвани химикали, те следва да бъдат количествено определени и последващите мерки за контрол на подобни загуби следва да бъдат документирани. Когато информацията за разтворимостта и стабилността на изпитвания(ите) химикал(и) е несигурна, се препоръчва тези свойства да бъдат оценени в условията на изпитване, т.е., среда на растеж, температура, режим на осветеност, които ще бъдат използвани при изпитването. Забележка: когато се изпитват зависими от светлина пероксидиращи хербициди, използваното лабораторно осветление следва да съдържа еквивалентно наличие на слънчева ултравиолетова светлина, която се среща при естествената слънчева светлина.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 pH следва да се измерва и коригира в средата за изпитване в зависимост от случая. Контролът на рН в изпитваната среда е особено важен, например при изпитване на метали или химикали, които са неустойчиви на хидролиза. Допълнителни насоки за изпитване на химикали, чиито физични и химични свойства затрудняват тяхното изпитване, са дадени в ръководство на ОИСР с насоки (11).
                              
                           ВАЛИДНОСТ НА ИЗПИТВАНЕТО
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 За да бъдат валидни резултатите от изпитването, средната обща дължина на поника и средното общо свежо тегло на поника при контролните растения трябва поне да се удвои по време на етапа на експозицията в рамките на изпитването. В допълнение контролните растения трябва да не показват видими симптоми на хлороза, нито видими признаци на замърсяване с други организми като водорасли и/или бактериален филм по растенията, по повърхността на седимента и в средата за изпитване.
                              
                           
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Средната стойност на коефициента на вариация на добива, основан на измервания на свежото тегло на поника (т.е. от началото до края на изпитването), в контролните култури не надвишава 35 % между повторенията.
                              
                           РЕФЕРЕНТЕН ХИМИКАЛ
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Референтните химикали, като 3,5-дихлорофенола, които се използват в кръговото изпитване (9), следва да се изпитват периодично с цел проверка на процедурата на изпитване във времето. Данните от кръговото изпитване показват, че средната стойност на ЕС50 за 3,5-дихлорофенола при различните зависими променливи е между 4,7 и 6,1 mg/l (вж. протокола от кръговото изпитване за подробности относно доверителния интервал за тези стойности). Желателно е референтният химикал да се изпитва най-малко два пъти годишно или, когато изпитването се извършва по-рядко, да се извършва едновременно с окончателните изпитвания за токсичност. Насока за очакваните стойности на ЕС50 за 3,5-дихлорофенола е предоставена в Статистическия доклад от международното кръгово изпитване (9).
                              
                           ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА
                     
                        Изпитвателна апаратура
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Изпитването следва да се проведе при контролирани условия на околната среда, т.е. в климатична камера, помещение или лаборатория с контролируеми продължителност на деня, осветление и температура (вж. раздел „Условия на изпитване“, точки 56—58). Изходните култури следва да бъдат държани отделно от съдовете за изпитване.
                              
                           
                              
                                 15.
                              
                              
                                 За изследването следва да се използват стъклени съдове като аквариуми или бехерови чаши; обикновено се използват 2-литрови бехерови чаши (с височина около 24 cm и диаметър 11 cm). Други (т.е. по-големи) съдове обаче може също да са подходящи, при условие че позволяват достатъчна дълбочина на водата, при която растенията могат да растат без ограничения и да останат потопени за целия срок на изпитването.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Саксии от пластмаса или стъкло (с диаметър около 9 cm, височина от 8 cm и вместимост от 500 ml) могат да се използват като контейнери с цел поставяне на растенията в седимента. Като алтернатива използването на бехерови чаши е възможно и се предпочита в някои случаи (например при изпитване на хидрофобни химикали или химикали с висок коефициент на разпределение октанол-вода (Kow)).
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Изборът на размер на саксията/бехеровата чаша трябва да бъде съобразен с избора на съдове за изпитването и с предпочитания план на изпитването (вж. по-долу). Ако използвате план на изпитване А (един поник на саксия и три саксии на съд), може да са необходими по-малки саксии или по-големи съдове. Ако използвате план на изпитване Б (три поника на саксия и една саксия на съд), посочените размери на саксията и съда следва да са подходящи. Във всички случаи водата следва да бъде на минимум 12 cm над горния слой на седимента и съотношението между площта/обема на седимента и площта/обема на водата следва да бъде записано.
                              
                           
                        Изпитван организъм
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Общите подходи, описани в настоящия метод на изпитване, могат да бъдат използвани за изпитване на редица водни растителни видове. Изложените в настоящия метод условия на изпитване обаче са пригодени за изпитване на вида Myriophyllum spicatum. Този вид принадлежи към семейството двусемеделни растения Haloragaceae.
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 
                                    Myriophyllum spicatum (класовиден многолистник) е потопен вкоренен във водата вид, който толерира широк диапазон от условия и се среща както в неподвижни води, така и течащи водни басейни. М. spicatum е многогодишно растение, което през зимата умира до равнището на корените. Растенията обикновено цъфтят и образуват семена свободно, въпреки че вегетативното размножаване чрез аксиларни пъпки или стволови части, които се отделят по естествен път или вследствие на смущение, често е основен метод за колонизация.
                              
                           
                        Култивиране на изпитваните организми
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Растенията могат да бъдат получени от естествени популации или чрез доставчици на водни растения. И в двата случая източникът на растенията следва да се документира и да се направи проверка на идентичността на видовете. Необходимо е специално внимание, за да се гарантира, че при събирането на Myriophyllum spicatum на място е взет правилният вид, особено в региони, където растението може да се кръстоса с други видове от същия род. В случай на съмнение се препоръчва използването на проверени лабораторни култури от известни източници. Растения, които са били изложени на химични замърсители или са събрани от места, за които се знае, че са замърсени, следва да не се използват за целите на настоящото изпитване.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 В регионите, в които растенията от вида М. spicatum не са достъпни през зимните месеци, може да се наложи дългосрочно поддържане на изходни култури в оранжерийни или лабораторни условия. Изходните култури следва да се поддържат при условия, подобни на условията на изпитване, въпреки че облъчването и температурата може да се намалят, за да се намали честотата на поддържане на културата (например когато за известен период от време няма предвидени изпитвания на Myriophyllum). Препоръчва се за изпитването да се използват големи аквариуми и саксии, за да се предостави пространство за пролиферация. Съставът на седимента и водата следва да е същият като този, който се използва за целите на изпитването, въпреки че могат да се възприемат алтернативни методи за фертилизация на седимента (например използване на търговски формулировки на торове с бавно освобождаване).
                              
                           
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Изходните растения не следва да показват видими признаци на замърсяване с други организми, включително охлюви, нишковидни водорасли, гъби и насекоми, например яйца или ларви на Paraponyx stratiotata и ларви или полово зрели индивиди от семейство хоботници (Eubrychius velutus). Може да се наложи изплакване на растителния материал в прясна вода с цел премахване на видимо замърсяване. В допълнение следва да се положат усилия да се намали развитието на едноклетъчни водорасли и бактериалното замърсяване, въпреки че не е необходима пълна стерилност на растителния материал. Изходните култури следва да се наблюдават и пресаждат, както е необходимо, така че да се избегне замърсяването с водорасли и бактерии. Аерирането на изходните култури може да бъде от полза при проблеми със замърсяването с водорасли и бактерии.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Във всички случаи растенията се култивират/аклиматизират в условия, които са подобни, но не непременно идентични на използваните за целите на изпитването в рамките на подходящ период от време (т.е.> 2 седмици), преди да бъдат използвани в изпитването.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Цъфтящите изходни култури не следва да се използват за изпитване, тъй като скоростта на вегетативния растеж обикновено намалява по време на цъфтежа и след него.
                              
                           
                        Седимент
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 За използване в настоящото изпитване се препоръчва следният формулиран седимент, приготвен въз основа на изкуствения седимент, използван в метод за изпитване В.28 от настоящото допълнение (8). Седиментът се приготвя, както е описано в МИ В.28, с изключение на добавянето на хранителни вещества, описано по-долу:
                                 
                                             а)
                                          
                                          
                                             4–5 % торф (сухо тегло, съответно 2 ± 0,5 % органичен въглерод) възможно най-близо до рН от 5,5–6,0; важно е да се използва торф в прахообразна форма, фино смлян (за предпочитане с размер на частиците <1 mm) и изсушен само на въздух.
                                          
                                       
                                             б)
                                          
                                          
                                             20 % каолин (сухо тегло) (за предпочитане съдържанието на каолинит да е повече от 30 %);
                                          
                                       
                                             в)
                                          
                                          
                                             75—76 % кварцов пясък (сухо тегло) (следва да преобладава финият пясък с размер на частиците между 50 и 200 μm);
                                          
                                       
                                             г)
                                          
                                          
                                             Добавя се водна хранителна среда, така че окончателният седимент да съдържа 200 mg/kg сух седимент на амониев хлорид и натриев фосфат и съдържанието на влага в крайната смес да е в диапазона 30—50 %.
                                          
                                       
                                             д)
                                          
                                          
                                             Добавя се химически чист калциев карбонат (CaCO3), за да се коригира рН на крайната смес на седимента до 7,0 ± 0,5.
                                          
                                       
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Източникът на торф, каолинова глина и пясък следва да е известен и да бъде документиран. Ако произходът е неизвестен или поражда безпокойство, съответните компоненти следва да бъдат проверени за наличие на замърсяване с химикали (например тежки метали, органохлорни съединения, органофосфорни съединения).
                              
                           
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Сухите съставки на седимента следва да бъдат хомогенно смесени преди да се смеси добре водният хранителен разтвор със седимента. Влажният седимент следва да се приготви най-малко два дни преди употреба, за да може торфът изцяло да се напои и да се попречи на хидрофобните торфени частици да останат на повърхността, когато седиментът бъде залят със средата; преди употреба влажният седимент може да се съхранява на тъмно.
                              
                           
                              
                                 28.
                              
                              
                                 За целите на изпитването утайката се прехвърля в контейнери с подходящ размер, като например саксии с диаметър, позволяващ поставянето им в стъклените съдове (повърхността на седимента следва да покрива приблизително 70 % или повече от повърхността на съда). Когато по дъното на контейнера има дупки, може да се постави филтърна хартия, за да може седиментът да се задържи в контейнера. Саксиите се пълнят със седимента, като повърхността на седимента се заравнява преди да се бъде покрита с тънък слой (~ 2 до 3 mm) инертни материали, като например пясък, фин градинарски пясък (или натрошени корали), които да задържат седимента на място.
                              
                           
                        Среда за изпитване
                     
                     
                              
                                 29.
                              
                              
                                 За култивиране и изпитване на растения от вида Myriophyllum spicatum се препоръчва използването на среда Smart и Barko (12). Приготвянето на тази среда е описано в допълнение 1. Стойностите на pH на средата (водната фаза) в началото на изпитването следва да бъдат между 7,5 и 8,0 за оптималния растеж на растенията.
                              
                           
                        План на опита
                     
                     
                              
                                 30.
                              
                              
                                 Изпитването следва да включва минимум шест съда за изпитване с повторения за нетретирани контроли и минимум четири съда за изпитване с повторения за всяко от минимум пет равнища на концентрация.
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Ако не се изисква определяне на NOEC, планът за изпитването може да бъде променен, като се увеличи броят на концентрациите и се намали броят на повторенията за всяка от концентрациите.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Всеки съд за изпитване представлява повторение, съдържащо три поника. Съществуват два варианта за отглеждане на три поника във всеки съд за изпитване:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             План на изпитване A: един поник на саксия и три саксии на съд.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             План на изпитване Б: три поника на саксия и една саксия на съд.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Като алтернатива може да се приеме план на изпитване, включващ една саксия на съд за изпитване, при условие че повторенията бъдат коригирани според необходимото с цел постигане на необходимите критерии за валидност.
                                          
                                       
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Отделните съдове за изпитване следва да бъдат разпределени на случаен принцип между третираните групи. За минимизиране на влиянието на пространствените различия в интензитета на светлината и температурата се изисква схема за разполагане на случаен принцип на съдовете за изпитване в зоната за изпитване.
                              
                           
                        Концентрации на изпитвания химикал и контролни групи
                     
                     
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Концентрациите по принцип трябва да следват геометрична прогресия; кратността на разделяне между изпитваните концентрации не следва да надхвърля 3,2. Предварителното познаване на токсичността на изпитвания химикал, например от изпитване за определяне на обхвата, ще помогне при избирането на подходящи изпитвани концентрации.
                              
                           
                              
                                 35.
                              
                              
                                 За определяне на ECx изпитваните концентрации следва да обграждат ECx, за да се гарантира подходяща доверителна вероятност. Например, ако се оценява EC50, най-високата изпитвана концентрация следва да е по-висока от стойността на EC50. Ако стойността на EC50 попада извън обхвата на изпитваните концентрации, свързаните с нея доверителни интервали ще бъдат големи и правилната оценка за статистическата съгласуваност на модела може да не е възможна. Използването на повече изпитвани концентрации ще подобри доверителния интервал за получената стойност на ECx.
                              
                           
                              
                                 36.
                              
                              
                                 За да се определи LOEC/NOEC (крайна точка по избор), най-ниската концентрация на изпитването следва да бъде достатъчно ниска, така че растежът да не се различава съществено от растежа при контролните растения. В допълнение най-високата изпитвана концентрация следва да е достатъчно висока, така че растежът да бъде значително по-нисък от този в контролната проба. Използването на повече повторения ще увеличи статистическата мощност на модела, основан на липса на въздействие-концентрация и ANOVA.
                              
                           
                        Гранично изпитване
                     
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 В случаи, когато изпитване за определяне на обхвата показва, че изпитваният химикал няма неблагоприятно въздействие при концентрации до 100 mg/l или до неговата граница на разтворимост в изпитваната среда или, в случай на формулировки, до неговата граница на диспергиране, може да бъде осъществено гранично изпитване за сравняване на отклика в контролна група и в една от третираните групи — 100 mg/l или концентрация, равна на границата на разтворимост, или 1 000 mg/kg сух седимент. Това изпитване трябва да следва основните принципи на стандартно изпитване на зависимостта доза-отклик, с изключение на това, че се препоръчва увеличение на минималния брой повторения на шест съда за изпитване на контрола и концентрация. Растежът в контролната и третираната група може да се анализира чрез използване на статистически тест за сравняване на средните стойности, например t-тест на Стюдънт.
                              
                           
                        Разтвори за изпитване
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Разтворите за изпитване обикновено се приготвят с разреждане на изходен разтвор, получен чрез разтваряне или диспергиране на изпитвания химикал в среда Smart и Barko, като се използва деминерализирана (т.е. дестилирана или дейонизирана) вода (вж. допълнение 1).
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Най-високата концентрация на изпитване обикновено не следва да надвишава разтворимостта във вода на изпитвания химикал или, в случай на формулировки, диспергируемостта при условията на изпитване.
                              
                           
                              
                                 40.
                              
                              
                                 За изпитвани химикали с малка водоразтворимост може да е необходимо да се приготви концентриран изходен разтвор или химикалът да се диспергира, като се използва органичен разтворител или диспергиращо средство, за да се улесни добавянето на точни количества от изпитвания химикал към средата на изпитване и да се подпомогне неговото диспергиране и разтваряне. Следва да се положат всички усилия, за да се избегне използването на такива разтворители или диспергиращи средства. Не следва да има фитотоксичност в резултат на използването на спомагателни разтворители или диспергиращи средства. Например обичайно използваните разтворители, които не предизвикват фитотоксичност при концентрации до 100 μl/l, включват ацетон и диметилформамид. Ако се използва разтворител или диспергиращо средство, следва да бъде протоколирана неговата крайна концентрация и тя да се поддържа на минимално ниво (≤100 μl/l). При такива обстоятелства всички третирания и контроли (на разтворител) следва да съдържат еднаква концентрация на разтворителя или диспергиращото средство. Повторенията с нетретирани контроли, които не съдържат разтворител или диспергиращо средство, също са включени в плана на изпитването. Допълнителни насоки относно използването на диспергиращи средства са дадени в ръководството на ОИСР с насоки (11).
                              
                           ПРОЦЕДУРА НА ИЗПИТВАНЕ
                     
                              
                                 41.
                              
                              
                                 Процедурата на изпитване е различна в зависимост от пътя на прилагане на изпитвания химикал (т.е. чрез водната фаза или фазата на седимента). Следва да се вземе предвид вероятното поведение на изпитвания химикал в система вода-седимент, за да се направи информиран избор по отношение на режима на експозиция, който да бъде използван в изпитването (т.е. статичен или статичен с обновяване, вода с добавка или седимент с добавка). Изпитвания с използване на седимент с добавка могат да бъдат предпочитани в някои случаи за химикали, за които се предвижда значимо разпределение в седимента.
                              
                           
                        Фаза на имплантация
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Здравото връхче на поника, т.е. без странични поници, се отрязва от култивираното растение, като се цели дължина на поника 6 cm (± 1 cm). При план на изпитване A (един поник на саксия и три саксии на съд) във всяка саксия се засажда по едно връхче на поник. При план на изпитване Б (три поника на саксия и една саксия на съд) във всяка саксия, съдържаща седимент, се засаждат четири до пет поника.
                              
                           
                              
                                 43.
                              
                              
                                 И в двата случая се засаждат допълнителни саксии, за да се даде възможност за избор на еднородни растения в началото на изпитването, както и за да се осигурят резервни растения, които да се използват за проверка на растежа на корените непосредствено преди третирането, и резервни растения, които да бъдат събирани за измервания на биомасата и дължината на пониците в ден 0.
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Пониците се поставят така, че около три сантиметра от тях, обхващащи най-малко два възела, да остават под повърхността на седимента.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 След това саксиите се пренасят в съд за изпитване при същите условия на околната среда като тези по време на етапа на експозиция, и се съхраняват в продължение на седем дни в среда Smart и Barko, за да се предизвика развитие на корените.
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 След изтичане на този срок няколко растения от резервните саксии следва да бъдат извадени за проверка на растежа на корените. Ако не се наблюдава растеж на корените (т.е. няма видими връхчета на корени), етапът на имплантация следва да се удължи, докато растежът на корените стане видим. Тази стъпка се препоръчва, за да се гарантира, че при започване на изпитването растенията са във фаза на активен растеж.
                              
                           
                        Подбор на еднакъв растителен материал
                     
                     
                              
                                 47.
                              
                              
                                 При план на изпитване A (един поник на саксия и три саксии на съд) преди началото на изпитването се прави подбор на еднородни саксии. При план на изпитване Б (три поника на саксия и една саксия на съд) допълнителните растения се отстраняват, за да останат три еднакви по размер и външен вид растения.
                              
                           
                        Експозиция чрез водната фаза
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Избраните еднородни саксии се поставят в съдовете за изпитване в съответствие с изискванията на плана на проучването. След това в съдовете за изпитване се добавя среда Smart и Barko. Следва да се внимава, за да се избегне въздействие върху седимента. За тази цел средата може да се добави с помощта на фуния или пластмасов диск, с който да се покрие седиментът, докато средата се излива в съдовете, при условие че дискът бъде отстранен веднага след това. Като алтернатива саксиите с растенията могат да се поставят в съдовете за изпитване след добавянето на средата. И в двата случая в началото на експозицията може да се използва прясна среда, ако е необходимо да се сведе до минимум потенциалното натрупване на водорасли и бактерии, или да се позволи приготвянето на единични партиди разтвор за изпитване за повторенията.
                              
                           
                              
                                 49.
                              
                              
                                 Дължината на поника над седимента се измерва преди или след добавянето на средата.
                              
                           
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Съответните количества от изпитвания химикал могат да се добавят в средата за изпитване преди тя да бъде добавена в съдовете за изпитване. Като алтернатива изпитваният химикал може да бъде въведен в средата, след като тя е била добавена в съдовете за изпитване. В този случай следва да се внимава, за да се гарантира, че изпитваният химикал е разпределен хомогенно в системата за изпитване, без да се предизвиква въздействие върху седимента.
                              
                           
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Във всички случаи външният вид на средата за изпитване (например бистра, мътна и т.н.) се записва в началото на изпитването.
                              
                           
                        Експозиция чрез седимент
                     
                     
                              
                                 52.
                              
                              
                                 Седиментите с добавка с избрана концентрация се приготвят чрез добавяне на разтвор на изпитвания химикал директно към пресния седимент. Изходен разтвор на изпитвания химикал, разтворен в дейонизирана вода, се смесва с формулирания седимент с помощта на валцова мелница, смесител за фураж или смесване с ръка. Ако е малко разтворим във вода, изпитваният химикал може да бъде разтворен във възможно най-малък обем подходящ органичен разтворител (например хексан, ацетон или хлороформ). След това този разтвор се смесва с приблизително 10 g фин кварцов пясък за всеки съд за изпитване. Разтворителят се оставя да се изпари и след това пясъкът се смесва с подходящо количество седимент във всяка бехерова чаша. За разтваряне, диспергиране или емулгиране на изпитвания химикал могат да се използват само средства, които лесно се изпаряват. Обемът/теглото на добавения в изпитвания химикал пясък следва да се вземе предвид при окончателната подготовка на седимента (т.е. седиментът следва да се приготви с по-малко пясък). Следва да се внимава изпитваният химикал, добавен към седимента, да бъде старателно и равномерно разпределен в седимента.
                              
                           
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Седиментът с добавка се поставя в саксиите (както е описано по-горе). Растенията, избрани заради своята еднородност и подходящата си коренова система, се отстраняват от саксиите, използвани в етапа на имплантация, и се пресаждат в седимента с добавка, както е описано по-горе.
                              
                           
                              
                                 54.
                              
                              
                                 Саксиите се поставят в съдовете за изпитване в съответствие с изискванията на плана на проучването. След това внимателно (т.е. с помощта на фуния) се добавя средата Smart и Barko с цел да се избегне въздействие върху седимента. Дължината на поника над седимента се измерва преди или след добавянето на средата.
                              
                           
                        Поддържане на водните равнища за периода на изпитването
                     
                     
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Крайният обем на водата трябва да бъде записан и равнището на водата се маркира на всеки съд. Ако по време на изпитването повече от 10 % от водата се изпари, равнището на водата следва да се коригира, като се добави дестилирана вода. Ако е необходимо, бехеровите чаши може да бъдат свободно покрити с прозрачно покритие, например прозрачни пластмасови капачки, с цел да се минимизира изпарението и замърсяването със спори на водорасли.
                              
                           
                        Условия на изпитване
                     
                     
                              
                                 56.
                              
                              
                                 Използва се топло и/или студено бяло флуоресцентно осветление за осигуряване на светлинно облъчване в диапазон около 140 (± 20) μE · m– 2 s– 1, когато се измерва като фотосинтетично активно излъчване (400—700 nm) на повърхността на водата, и при съотношение между светлина и тъмнина от 16:8 часа. Разликите с избраното светлинно облъчване в зоната на изпитване следва да не надвишават диапазон от ± 15 %.
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Температурата в съдовете за изпитване е 20 ± 2°C.
                              
                           
                              
                                 58.
                              
                              
                                 Стойността на pH на контролната среда не следва да се повишава с повече от 1,5 единици по време на изпитването. Въпреки това, отклонение с повече от 1,5 единици не прави изпитването невалидно, при условие че може да се покаже, че посочените преди това критерии за валидност са изпълнени.
                              
                           
                        Продължителност на изпитването
                     
                     
                              
                                 59.
                              
                              
                                 Периодът на експозиция е 14 дни.
                              
                           
                        Измервания и аналитични опредяления
                     
                     
                              
                                 60.
                              
                              
                                 След етапа на имплантация и непосредствено преди третирането (т.е. в ден 0) резервни растения от пет произволно избрани саксии за плана с три растения на саксия, или 15 саксии за плана с едно растение в саксия, се събират за оценка на дължината на поника и измерване на свежото и сухото тегло, както е описано по-долу.
                              
                           
                              
                                 61.
                              
                              
                                 За прехвърлени в етапа на експозиция растения се правят следните оценки, както е показано в таблица 1:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Оценките на дължината на основния поник, броя на страничните поници и дължината на страничните поници се записват като минимум в края на периода на експозиция (например в ден 14).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Визуалните оценки на здравословното състояние на растенията се записват поне на три пъти по време на периода на експозиция (например в ден 0, 7 и 14).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Оценката на свежото и сухото тегло на поника се прави в края на изпитването (т.е. в ден 14).
                                          
                                       
                           
                              
                                 62.
                              
                              
                                 Дължината на поника се определя с помощта на линийка. Ако са налице странични поници, техният брой и дължина следва също да бъдат измерени.
                              
                           
                              
                                 63.
                              
                              
                                 Визуалните оценки на здравословното състояние на растенията се правят, като се записва външният вид на растенията и общото състояние на средата за изпитване. Наблюденията, които трябва да бъдат отбелязани, включват:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Некроза, хлороза или друга промяна на цвета, например прекомерно зачервяване в сравнение с контролните растения.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Развитие на замърсяване с бактерии или водорасли;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Аномалии на растежа, като например спиране на растежа, промяна на междувъзловото разстояние, изкривяване на пониците/листата, пролиферация на странични поници, загуба на листа, загуба на тургор и фрагментация на стъблото.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Визуалните оценки на здравословното състояние на корените се правят в края на изпитването, като корените внимателно се отмиват от седимента, за да се позволи наблюдение на кореновата система. По-долу е показано предложение за оценъчна скала, позволяваща сравнение с контролните растения:
                                             
                                                         1)
                                                      
                                                      
                                                         отсъствие на корени
                                                      
                                                   
                                                         2)
                                                      
                                                      
                                                         няколко корена
                                                      
                                                   
                                                         3)
                                                      
                                                      
                                                         умерено развитие на корените
                                                      
                                                   
                                                         4)
                                                      
                                                      
                                                         много добро развитие на корените, подобно на това в контролите
                                                      
                                                   
                                       
                           
                              
                                 64.
                              
                              
                                 Оценката на свежото тегло се прави в началото и в края на изпитването, като поникът се изрязва на равнището на седимента и след това се попива водата преди претегляне. Следва внимателно да се отстранят седиментните частици, които може да са останали в основата на поника. След това взетият от поника материал се поставя в сушилня при температура от около 60°С и се суши до постоянно тегло преди повторното претегляне и записване на сухото тегло.
                              
                           
                              
                                 65.
                              
                              
                                 В таблица 1 е представено обобщение на минималните биологични оценки, които трябва да бъдат направени по време на изпитването.
                                 
                                    Таблица 1
                                 
                                 
                                    График на оценка
                                 
                                 
                                             Ден след третирането
                                             (ДСТ)
                                          
                                          
                                             
                                                Myriophyllum spicatum
                                             
                                          
                                       
                                             Дължина на пониците, дължина и брой на страничните поници
                                          
                                          
                                             Визуална оценка на пониците
                                          
                                          
                                             Свежо и сухо тегло на пониците
                                             Визуална оценка на корените
                                          
                                          
                                             pH
                                             O2
                                             
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             -
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                       
                                             
                                                         A
                                                      
                                                      
                                                         :
                                                      
                                                      
                                                         показва, че в тези случаи се изисква оценка
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         :
                                                      
                                                      
                                                         показва, че не се изискват измервания
                                                      
                                                   
                                       
                           
                        Честота на измерванията и аналитичните определяния
                     
                     
                              
                                 66.
                              
                              
                                 Температурата на средата в допълнителен съд, който се държи при същите условия във вегетационната камера, инкубатора или помещението, следва да се записва най-малко веднъж дневно (или постоянно чрез устройство за запис на данни).
                              
                           
                              
                                 67.
                              
                              
                                 рН и концентрацията на разтворен кислород в средата за изпитване следва да се проверяват в началото на изпитването, най-малко един път в хода на изследването и в края на изследването във всички съдове с повторения. Във всеки от тези случаи измерванията следва да се правят по едно и също време на деня. Ако при приготвянето на повторенията за всяка изпитвана концентрация се използва общ разтвор, допустимо е да се извърши едно измерване за всеки общ разтвор в ден 0.
                              
                           
                              
                                 68.
                              
                              
                                 Облъчването следва да се измерва в климатичната камера, инкубатор или помещение в точки, разположени на същото равнище като повърхността на водата. Измерванията следва да се извършват най-малко веднъж в началото на изпитването или по време на изпитването. Методът за детектиране и измерване на светлината, особено видът на сензора, ще оказват влияние върху измерваната стойност. Сферичните сензори (които реагират на светлина, излъчвана от всички ъгли над и под равнината на измерване) и „косинусовите“ сензори (които реагират на светлината, излъчвана от всички ъгли над равнината на измерване), са за предпочитане пред еднопосочните сензори и ще отчитат по-високи показания за описания тук вид многоточков източник на светлина.
                              
                           
                        Аналитични измервания на изпитвания химикал
                     
                     
                              
                                 69.
                              
                              
                                 Правилното прилагане на изпитвания химикал следва да бъде подкрепено с аналитични измервания на концентрациите на изпитвания химикал.
                              
                           
                              
                                 70.
                              
                              
                                 За целите на анализа на изпитвания химикал водните проби следва да се вземат малко след началото на изпитването (т.е. за стабилните химикали в деня на прилагането или един час след прилагането — за химикали, които не са стабилни) и в края на изпитването за всички изпитвани концентрации.
                              
                           
                              
                                 71.
                              
                              
                                 Концентрациите в седимента и във водата между частиците на седимента следва да се определят в началото и в края на изпитването, поне за най-високата изпитвана концентрация, освен в случаите, когато за изпитваните химикали се знае, че са стабилни във вода (> 80 % от номиналната стойност). Измерванията в седимента и във водата между частиците на седимента може да не се окажат необходими, ако разпределението на изпитвания химикал между водата и седимента е ясно определено с изследване вода/седимент при сходни условия (напр. съотношение на седимента към водата, метод на прилагане, тип седимент).
                              
                           
                              
                                 72.
                              
                              
                                 Вземането на проби от седимента в началото на изпитването вероятно предизвиква смущения в системата за изпитване. Следователно може да са необходими допълнителни третирани съдове за изпитване с цел улесняване на аналитичните измервания в началото и в края на изпитването. Също така, когато се прецени, че е необходимо да се извършат междинни измервания, т.е. в ден 7, и анализите изискват големи седиментни проби, които не могат да бъдат лесно отстранени от системата за изпитване, аналитичните определяния следва да се извършват с помощта на допълнителни съдове за изпитване, които са третирани по същия начин като тези, използвани за биологичните оценки.
                              
                           
                              
                                 73.
                              
                              
                                 Препоръчва се центрофугиране на примерно 10 000 g при температура от 4°С в продължение на 30 минути с цел изолиране на интерстициалната вода. Ако обаче се докаже, че изпитваният химикал не се абсорбира от филтрите, филтруването може също да е приемливо. В някои случаи може да не е възможно да се анализират концентрациите във водата между частиците на седимента, ако пробата е с много малък размер.
                              
                           
                              
                                 74.
                              
                              
                                 В полустатични изпитвания (т.е. експозиция чрез водната фаза), при които не се очаква концентрацията на съответния изпитван химикал/съответните изпитвани химикали да остане в рамките на 20 % от номиналната концентрация в хода на изпитването без обновяване на изпитваните разтвори, при всяко обновяване следва да се вземат проби от използвани и прясно приготвени разтвори за изпитване за целите на анализа на изпитваната концентрация на химикала.
                              
                           
                              
                                 75.
                              
                              
                                 В случаи, при които измерената начална концентрация на изпитвания химикал не е в рамките на 20 % от номиналната стойност, но за които може да се предоставят достатъчно доказателства, показващи че началните концентрации са повторяеми и стабилни (т.е. в диапазона 80—120 % от началната концентрация), химичните определения могат да се извършат само за най-високата и най-ниската изпитвана концентрация.
                              
                           
                              
                                 76.
                              
                              
                                 Във всички случаи е необходимо определянето на концентрациите на изпитвания химикал да бъде извършвано само в един съд с повторение при всяка една изпитвана концентрация. Като алтернатива изпитваните разтвори на всички повторения за всяка концентрация могат да бъдат обединени за анализ.
                              
                           
                              
                                 77.
                              
                              
                                 Ако има доказателство, че концентрацията на изпитвания химикал е била поддържана в рамките на 20 % от номиналната или измерената първоначална концентрация през цялото време на изпитването, тогава анализът на резултатите и последващото извеждане на крайните точки могат да бъдат базирани на номиналните или измерените първоначални стойности.
                              
                           
                              
                                 78.
                              
                              
                                 В тези случаи концентрациите с определено въздействие следва да се основават на номиналната концентрация или на измерените водни концентрации в началото на изпитването.
                              
                           
                              
                                 79.
                              
                              
                                 Въпреки това, ако има доказателства, че концентрацията е намаляла (т.е. не се поддържа в рамките на 20 % от номиналната или измерената първоначална концентрация в третираното отделение) в хода на измерването, анализът на резултатите следва да се основава на средната геометрична концентрация по време на експозицията или на модели, описващи намаляването на концентрацията на изпитвания химикал в третираното отделение (11).
                              
                           ОЦЕНКА НА ДАННИТЕ
                     
                              
                                 80.
                              
                              
                                 В случаите, когато се изисква използване на разтворител/диспергиращо средство, данните от контролите на разтворител и нетретираните контроли могат да се обединят за целите на статистическите анализи, при условие че между отклиците в контролите на разтворител и в нетретираните контроли няма статистически значими разлики.
                              
                           
                        Зависими променливи
                     
                     
                              
                                 81.
                              
                              
                                 Целта на изпитването е да се определят въздействията на изпитвания химикал върху вегетативния растеж на изпитваните видове чрез използване на две зависими променливи — средна специфична скорост на растежа и добив, както следва:
                              
                           
                        Средна специфична скорост на растеж
                     
                     
                              
                                 82.
                              
                              
                                 Тази зависима променлива се основава на промените в логаритмите на общата дължина на поника, общото свежо тегло на поника и общото сухо тегло на поника с течение на времето в контролите и във всяка от третираните групи. Тази променлива се изчислява за всяко повторение на всяка контрола и третирана група. Средната дължина и средното тегло на трите растения във всеки съд за изпитване (повторение) и, впоследствие, скоростта на растеж за всяко повторение, следва да се изчисляват по следната формула:
                                 
                                    
                                 където:
                                 
                                             μi-j
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             средна специфична скорост на растеж за времето от i до j
                                          
                                       
                                             Ni
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             измервана променлива в съда за изпитване или в контролния съд в момента от време i
                                          
                                       
                                             Nj
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             измервана променлива в съда за изпитване или в контролния съд в момента от време j
                                          
                                       
                                             t
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             времеви интервал от i до j
                                          
                                       
                           
                              
                                 83.
                              
                              
                                 Въз основа на отклиците при повторенията следва да се изчислява средна стойност за скоростта на растеж заедно с оценки на дисперсията за всяка третирана и контролна група.
                              
                           
                              
                                 84.
                              
                              
                                 Средната специфична скорост на растеж следва да се изчисли за целия период на изпитване (времето „i“ в горната формула е началото на изпитването, а времето „j“ е краят на изпитването). За всяка изпитвана концентрация и контрола се изчислява средната стойност на скоростта за растеж заедно с оценките на дисперсията.
                              
                           
                              
                                 85.
                              
                              
                                 Процентът на потискане на скоростта на растежа (Ir) тогава може да се изчисли за всяка изпитвана концентрация (третирана група) съгласно следната формула:
                                 
                                    
                                 където:
                                 
                                             % Ir
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             процентно потискане в средната специфична скорост на растеж;
                                          
                                       
                                             μC
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             средна стойност на μ в контролата
                                          
                                       
                                             μT
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             средна стойност на μ в третираната група
                                          
                                       
                           
                        Добив
                     
                     
                              
                                 86.
                              
                              
                                 Тази зависима променлива се основава на промените в общата дължина на поника, общото свежо тегло на поника и общото сухо тегло на поника с течение на времето в контролите и всяка третирана група. Средното процентно потискане на добива ( % Iy) може да се изчисли за всяка третирана група, както следва:
                                 
                                    
                                 където:
                                 
                                             % Iy
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             процентното намаление на добива
                                          
                                       
                                             bC
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             крайната биомаса минус началната биомаса за контролната група
                                          
                                       
                                             bT
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             крайната биомаса минус началната биомаса в третираната група.
                                          
                                       
                           
                        Построяване на кривите концентрация-отклик
                     
                     
                              
                                 87.
                              
                              
                                 Следва да се построят кривите концентрация-отклик, които свързват средното процентно потискане на зависимата променлива (Ir или Iy), изчислено както е показано по-горе, и логаритъма на концентрацията на изпитвания химикал.
                              
                           
                        Оценка на ECx
                        
                     
                     
                              
                                 88.
                              
                              
                                 Оценките на ECx (например EC50) следва да се основават както на средната специфична скорост на растеж (ErCx), така и на добива (EyCx), всяко от които на свой ред следва да се основава на общото свежо тегло на поника, общото сухо тегло на поника и общата дължина на поника.
                              
                           
                              
                                 89.
                              
                              
                                 Следва да се отбележи, че стойностите на ECx, изчислени с помощта на тези две зависими променливи, не са сравними и тази разлика се разпознава, когато се използват резултатите от изпитването. Стойностите на ECx, базирани на средната специфична скорост на растеж (ErCx), в повечето случаи ще бъдат по-високи от резултатите, базирани на добива (EyCx), ако са спазени условията за изпитване по настоящия метод за изпитване, което се дължи на математическата основа на съответните подходи. Тази разлика не следва да се интерпретира като разлика в чувствителността между двете зависими променливи — стойностите просто са различни от математическа гледна точка.
                              
                           
                        Статистически процедури
                     
                     
                              
                                 90.
                              
                              
                                 Целта е да се получи количествено съотношение концентрация-отклик чрез регресионен анализ. Може да се използва претеглена линейна регресия след извършване на линеаризираща трансформация на данните от отклика — например в пробит, или логит, или Вейбул единици (13), но предпочитаните процедури са тези на нелинейната регресия, които по-добре обработват неизбежните неравномерности и отклонения от гладките разпределения. При приближаване към нула или пълно инхибиране подобни неравномерности може да бъдат увеличени от трансформацията, като по този начин пречат на анализа (13). Следва да се отбележи, че стандартните методи на анализ с помощта на пробит, логит или Вейбул трансформации са предназначени за използване при двоични данни (например смъртност или преживяване) и следва да бъдат изменени, за да се приспособят към данните за скоростта на растежа или добива. Специфични процедури за определяне на стойности на ECx от непрекъснати данни могат да се намерят в (14), (15), (16) и (17).
                              
                           
                              
                                 91.
                              
                              
                                 За анализа на всяка от зависимите променливи се използва съотношението концентрация-отклик, за да се изчислят точковите оценки на стойностите на ECx. Определят се доверителните граници от 95 % за всяка от оценките и съгласуваността на данните от отклика с регресионния модел следва да се оцени графично или статистически. Регресионният анализ следва да се извърши, като се използват отклиците при индивидуалните повторения, а не средните стойности за третираните групи.
                              
                           
                              
                                 92.
                              
                              
                                 Оценките на EC50 и доверителните граници могат да се получат също и чрез използване на линейна интерполация с boostrap процедура (18), ако наличните регресионни модели/методи са неподходящи за данните.
                              
                           
                              
                                 93.
                              
                              
                                 За оценяване на LOEC и оттам на NOEC е необходимо да се сравнят средните стойности от третиране, като се използват техники за дисперсионен анализ (ANOVA). Средната стойност за всяка концентрация след това се сравнява със средната стойност на контролата с помощта на съответния тест (напр. тестовете на Дънет или на Уйлямс) (19) (20) (21) (22). Необходимо е да се оцени дали е удовлетворено допускането при ANOVA за нормално разпределение (НР) и хомогенност на дисперсията (ХД). Тази оценка следва да се извършва чрез теста на Шапиро-Уилкс (НР) или теста на Левин (ХД). Невъзможността за удовлетворяване на допускането за НР и хомогенност на дисперсиите понякога може да се коригира чрез логаритмична трансформация на данните. Ако хетерогенността на дисперсията и/или отклонението от НР са екстремални и не могат да се коригират чрез трансформация, следва да се обмисли анализ с методи като t-теста на Бонферони-Уелч, теста на Йонкхере-Терпстра със стъпка назад и теста на Бонферони за медианите. Допълнителни насоки относно определянето на NOEC могат да се намерят в (16).
                              
                           
                        ПРОТОКОЛИРАНЕ
                     
                     
                              
                                 94.
                              
                              
                                 Протоколът от изпитването включва следните данни:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Изпитван химикал
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Вещество с една съставка:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     външен вид, разтворимост във вода и допълнителни относими физични и химични свойства;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     химична идентификация, като например наименование по IUPAC или CAS, CAS номер, код SMILES или InChI, структурна формула, чистота, химична идентичност на онечистванията, доколкото е целесъобразно и практически осъществимо, и т.н.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Вещество с повече съставки, UVCB и смеси:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     определени, доколкото е възможно, с химичната си идентичност (вж. по-горе), количествения състав и относимите физични и химични свойства на съставките.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Животински вид за изпитването
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Научно име и източник.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Условия на изпитване
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         продължителност и условия на етапа на имплантация;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         използвана процедура на изпитване (статична, полустатична, импулсна);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         дата на началото на изпитването и неговата продължителност;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         среда за изпитване, т.е. седимент и течна хранителна среда;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         описание на плана на проучването: климатичната камера/помещение или лаборатория, съдове за изпитване и капаци, обем на разтворите, дължина и тегло на изпитваните растения за всеки отделен съд за изпитване в началото на изпитването, съотношение между повърхността на седимента и повърхността на водата, съотношение между обема на седимента и обема на водата;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         изпитвани концентрации (съответно номинална и измерена) и брой на повторенията за една концентрация;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         методи за приготвяне на изходните и изпитваните разтвори, включително използването на всякакви разтворители или диспергиращи средства;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         температура по време на изпитването;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         източник на светлина, облъчване (μE · m– 2 s– 1)
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         стойности на рН за изпитваните и контролните среди, както и външен вид на средата за изпитване в началото и в края на изпитването;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         концентрации на кислород;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         метод за анализ със съответните данни за оценка на качеството (изследвания за валидиране, стандартни отклонения или доверителни граници на анализите);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         методи за определяне на измерваните променливи, напр. дължина, сухо тегло, свежо тегло;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         всички отклонения от настоящия метод за изпитване.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Резултати
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         необработени данни: дължина на поника и тегло на поника на растенията/саксия и други измервани променливи във всеки съд за изпитване и във всеки контролен съд при всеки случай на наблюдение и анализ в съответствие с графика на измерванията, представен в таблица 1;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         средни стойности и стандартни отклонения за всяка измервана променлива;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         криви на растежа за всяка концентрация;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         време за удвояване/скорост на растежа в контролата въз основа на дължината и свежото тегло на поника, включително коефициент на вариация за добива по отношение на свежо тегло;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         изчислените зависими променливи за всяко третирано повторение, със средни стойности и коефициент на вариация за повторенията;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         графично представяне на взаимовръзката концентрация/въздействие;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         оценки на токсичните крайни точки за зависимите променливи, напримерEC50 и свързаните доверителни интервали. Ако са изчислени, LOEC и/или NOEC и статистическите методи, използвани за тяхното определяне;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ако е използван ANOVA, размерът на въздействието, което може да се открие (например най-малката значима разлика);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         всяка стимулация на растеж, открита в което и да е третиране;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         всякакви визуални признаци за фитотоксичност, както и наблюдения на изпитваните разтвори;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         обсъждане на резултатите, включително всякакво влияние върху резултата от изпитването вследствие на отклонения от настоящия метод за изпитване.
                                                      
                                                   
                                       
                           ЛИТЕРАТУРА
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 
                                    Глава В.26 от настоящото приложение: Изпитване на потискането на растежа на видове от род Lemna.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Глава В.3 от настоящото приложение: Сладководни водорасли и цианобактерии, изпитване за потискане на растежа.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Maltby, L. et al. (2010), Aquatic Macrophyte Risk Assessment for Pesticides, Guidance from the AMRAP Workshop in Wageningen (NL), 14-16 January 2008.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Arts, G.H.P. et al. (2008), Sensitivity of submersed freshwater macrophytes and endpoints in laboratory toxicity tests, Environmental Pollution, Vol. 153, pp. 199-206.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 ISO 16191:2013 Water quality — Determination of the toxic effect of sediment on the growth behaviour of Myriophyllum aquaticum (Определяне на токсичното въздествие на седимент върху растежното поведение на Myriophyllum aquaticum).
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Knauer, K. et al. (2006), Methods for assessing the toxicity of herbicides to submersed aquatic plants, Pest Management Science, Vol. 62/8, pp. 715-722.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Глава В.50 от настоящото приложение: Изпитване за токсичност без седименти при Myriophyllum spicatum.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Глава В.28 от настоящото приложение: Изпитване за токсичност за хирономиди в система вода–седимент с използване на вода с добавка.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Ratte, M., H. Ratte (2014), „Myriophyllum Toxicity Test: Result of a ring test using M. aquaticum and M. spicatum grown in a water-sediment system“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 206, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Davies, J. et al. (2003), Herbicide risk assessment for non-target aquatic plants: sulfosulfuron — a case study, Pest Management Science, Vol. 59/2, pp. 231 — 237.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2000), „Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 23, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Smart, R.M., J.W. Barko (1985), Laboratory culture of submersed freshwater macrophytes on natural sediments, Aquatic Botany, Vol. 21/3, pp. 251-263.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Christensen, E.R., N. Nyholm (1984), Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves, Environmental Science Technology, Vol. 18/9, pp. 713-718.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Nyholm, N. et al. (1992), Statistical treatment of data from microbial toxicity tests, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/2, pp. 157-167.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Bruce, R.D., D.J. Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/10, 1485-1494.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 OECD (2006), „Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 54, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Brain, P., R. Cousens (1989), An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses, Weed Research, Vol. 29/2, pp/ 93-96.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Norberg-King, T.J. (1988), An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach, National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of the American Statistical Association, Vol. 50/272, pp. 1096-1121.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics, Vol. 20/3, pp. 482-491.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics, Vol. 27/1, pp. 103-117.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics, Vol. 28/2, pp. 519-531.
                              
                           
                        Допълнение 1
                        
                           СЪСТАВ НА СРЕДА SMART И BARKO
                        
                        
                                    Съставка
                                 
                                 
                                    Количеството реагент, прибавен към вода (*12) (mg/l)
                                 
                              
                                    CaCl2 · 2 H2O
                                 
                                 
                                    91,7
                                 
                              
                                    MgSO4 · 7 H2O
                                 
                                 
                                    69,0
                                 
                              
                                    NaHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    58,4
                                 
                              
                                    KHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    15,4
                                 
                              
                                    pH (въздушно равновесие)
                                 
                                 
                                    7,9
                                 
                              
                     
                        Допълнение 2
                        ОПРЕДЕЛЕНИЯ
                        
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Биомаса е свежото и/или сухото тегло на живите организми, съдържащи се в една популация. В това изпитване биомасата е сумата от основния поник, всички странични разклонения и всички корени.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Химикал означава вещество или смес.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Хлороза е промяната на цвета от зелен на жълтеникав на изпитван организъм, по-специално на прешлените.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       ECx
                                        е концентрацията на изпитвания химикал, разтворен в изпитваната среда, която води до x % (например 50 %) намаляване на растежа на Myriophyllum spicatum в рамките на определен период на експозиция (който трябва да бъде посочен изрично, ако се отклонява от пълната или нормалната продължителност на изпитването). С оглед на еднозначно обозначаване на стойността на EC, изведена от скоростта на растежа или от добива, символът „ErC“ се използва за скоростта на растежа, а „EyC“ се използва за добива, следван от използваната измервана променлива, напримерErC (дължина на основния поник).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Растеж е увеличение на измерваната променлива, например дължина на основния поник, обща дължина на страничните разклонения, обща дължина на поника, обща дължина на корените, свежо тегло, сухо тегло или брой на прешлените, за периода на изпитването.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Скорост на растеж (средна специфична скорост на растеж) е логаритмичното нарастване на измерваната променлива през периода на експозиция. Забележка: Зависимите променливи, свързани със скоростта на растежа, не зависят от продължителността на изпитването, доколкото моделът на растеж на неекспонираните контролни организми е експоненциален.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Най-ниска концентрация, при която се наблюдава въздействие (LOEC), е най-ниската изпитвана концентрация, при която за химикала се наблюдава статистически значимо въздействие за забавяне на растежа (при p < 0,05) в сравнение с контролата, в рамките на дадено време на експозиция. При все това, всички изпитвани концентрации над LOEC следва да имат вредно въздействие, равно или по-голямо от наблюдаваното при LOEC. Когато тези две условия не могат да бъдат удовлетворени, следва да се даде пълно обяснение за това как е била избрана LOEC (и следователно NOEC).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Измервани променливи са всички видове променливи, които се измерват с цел да се изрази крайната точка на изпитването с помощта на една или няколко различни зависими променливи. При този метод за изпитване измервани променливи са дължината на основния поник, общата дължина на страничните разклонения, общата дължина на поника, общата дължина на корените, свежото тегло, сухото тегло и броят на прешлените.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Монокултура е култура с един растителен вид.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Некроза е мъртва (т.е. бледа или тъмнокафява) тъкан на изпитвания организъм.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Концентрация без наблюдавано въздействие (NOEC) е изпитваната концентрация непосредствено под LOEC.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Зависима променлива е променлива за оценяване на токсичността, получена от измервана променлива, описваща биомасата чрез различни методи на изчисление. При настоящия метод за изпитване скоростите на растежа и добивът са зависими променливи, получени от измервани променливи като дължина на основния поник, обща дължина на поника, свежо тегло, сухо тегло или брой на прешлените.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Полустатично изпитване (с обновяване) е изпитване, при което изпитваният разтвор периодично се подменя на определени интервали по време на изпитването.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Статично изпитване е метод за изпитване без обновяване на изпитвания разтвор по време на изпитването.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Изпитван химикал е всяко вещество или смес, изпитвано(а) с използване на настоящия метод за изпитване.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Крайна точка на изпитване описва като цел на изпитването общия показател, който ще бъде изменен от изпитвания химикал в сравнение с контролната проба. При настоящия метод за изпитване крайната точка на изпитването е потискането на растежа, което може да се изрази чрез различни зависими променливи на базата на една или повече измервани променливи.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Среда на изпитване е напълно синтетичната среда на растеж, върху която растат изпитваните растения, когато са подложени на въздействието на изпитвания химикал. Изпитваният химикал обикновено се разтваря в средата на изпитване.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       UVCB е вещество с неизвестен или променлив състав, сложен продукт от реакция или биологичен материал.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Добив е стойността на измервана променлива, чрез която се изразява биомасата в края на периода на експозиция минус измерваната променлива в началото на периода на експозиция. Забележка: Когато моделът на растеж на неекспонираните организми е експоненциален, зависимите променливи, базирани на добива, ще се понижат в хода на изпитването.
                                 
                              “
               
            (1)  Стойност за 20 °C не е налична, но може да се допусне, че варирането между резултатите от измерванията е по-високо от очакваната температурна зависимост
         
            (2)  Регламент (ЕО) № 1907/2006 на Европейския парламент и на Съвета от 18 декември 2006 г. относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH), за създаване на Европейска агенция по химикали, за изменение на Директива 1999/45/ЕО и за отмяна на Регламент (ЕИО) № 793/93 на Съвета и Регламент (ЕО) № 1488/94 на Комисията, както и на Директива 76/769/ЕИО на Съвета и Директиви 91/155/ЕИО, 93/67/ЕИО, 93/105/ЕО и 2000/21/ЕО на Комисията. ОВ L 304, 22.11.2007 г., стр. 1.
         
            (3)  Междуведомственият координационен комитет за валидиране на алтернативни методи на САЩ
         
            (*1)  Зоната на непрозрачност на роговицата следва да бъде отбелязана.
         
            (4)  За използване на интегрирана стратегия за изпитване за дразнещо действие върху очите в рамките на REACH, вж. също ECHA, „Ръководство относно изискванията за информация и оценката на безопасността на химичните вещества“ глава R.7a: Endpoint specific guidance http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf
         
            (5)  Статистиците, които използват подход за моделиране, като например обобщени линейни модели (GLM), може да подхождат към анализа по различен, но сравним начин, но не получават непременно традиционната ANOVA таблица, която датира от алгоритмичните подходи за изчисляване на статистически данни, разработени в епохата преди появата на компютрите.
         
            (6)  Статистиците, които използват подход за моделиране, като например обобщени линейни модели (GLM), може да подхождат към анализа по различен, но сравним начин, но не получават непременно традиционната ANOVA таблица, която датира от алгоритмичните подходи за изчисляване на статистически данни, разработени в епохата преди появата на компютрите.
         
            (7)  Регламент (ЕО) № 1272/2008 на Европейския парламент и на Съвета от 16 декември 2008 г. относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси, за изменение и за отмяна на директиви 67/548/ЕИО и 1999/45/ЕО и за изменение на Регламент (ЕО) № 1907/2006 (ОВ L 353, 31.12.2008 г., стр. 1).
         
            (8)  за всеки изпитван химикал са определени химични класове, като за целта се използва стандартна схема за класификация, базираща се на системата за класификация MeSH (National Library of Medicine Medical Subject Headings) (на разположение на адрес: http//www.nlm.nih.gov/mesh).
         
            (9)  Базира се на резултати от in vivo изпитването със заешки очи (ОИСР TG 405) (17) и с използване на GHS на ООН (4).
         
            (10)  Класифицирането като 2A или 2B зависи от тълкуването на критерия от GHS на ООН за разграничаване между тези две категории, т.е. 1 от 3 спрямо 2 от 3 животни с ефекти в ден 7 са необходими за класифициране в категория 2A. Изследването in vivo е включвало 3 животни. Всички крайни точки, с изключение на зачервяване на конюнктивата при едно животно, са възстановени до оценка нула към ден 7 или по-рано. Едното животно, което не се е възстановило напълно до ден 7, е имало зачервяване на конюнктивата с оценка 1 (в ден 7), което се е възстановило напълно в ден 10.
         
            (11)  Дадените размери са за държател на роговица, използван за крави на възраст между 12 и 60 месеца. В случай че се използват животни на възраст от 6 до 12 месеца, държателят ще трябва да се конструира така, че всяко отделение да е с вместимост 4 ml, а всяко от вътрешните отделения да е с диаметър 1,5 cm и дълбочина 2,2 cm. При всяка нова конструкция за държател за роговица е важно съотношението между експонираната повърхностна площ на роговицата и обема на задното отделение да се запази както при традиционния държател. Това е необходимо, за да се гарантира стойностите за пропускливост да бъдат правилно определени за изчисляването на ИВБОДД по предлаганата формула.
         
            (12)  Регламент (ЕО) № 1272/2008 на Европейския парламент и на Съвета от 16 декември 2008 г. относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси, за изменение и за отмяна на директиви 67/548/ЕИО и 1999/45/ЕО и за изменение на Регламент (ЕО) № 1907/2006 (ОВ L 353, 31.12.2008 г., стр. 1).
         
            (*2)  най-висока средна балова оценка, отчетена в която и да е времева точка
         
            (*3)  Максимална средна балова оценка, отчетена в която и да е времева точка (въз основа на баловите оценки за непрозрачност, определени в таблица 1).
         
            (*4)  Въз основа на балови оценки, както са определени в таблица 2.
         
            (*5)  Комбинации, които могат да се получат с по-малка вероятност.
         
            (13)  за всеки изпитван химикал са определени химични класове, като за целта се използва стандартна схема за класификация, базираща се на системата за класификация MeSH (National Library of Medicine Medical Subject Headings) (на разположение на адрес: http//www.nlm.nih.gov/mesh)
         
            (14)  Базира се на резултати от изпитване in vivo със заешки очи (ОИСР TG 405) и се използва глобалната система GHS на ООН (4)(6).
         
            (15)  Въз основа на резултати от ИПО, както са определени в таблица 6.
         
            (16)  Комбинация от балови оценки по ИПО, различни от посочените в таблица 6 за идентифициране на „Без категория“ по GHS и категория 1 по GHS (вж. таблица 6)
         
            (17)  Класифицирането като 2A или 2B зависи от тълкуването на критерия от GHS на ООН за разграничаване между тези две категории, т.е. 1 от 3 спрямо 2 от 3 животни с ефекти в ден 7 са необходими за класифициране в категория 2A. In vivo изследването е включвало 3 животни. Всички крайни точки, с изключение на зачервяване на конюнктивата при едно животно, са възстановени до оценка нула към ден 7 или по-рано. Едното животно, което не се е възстановило напълно до ден 7, е имало зачервяване на конюнктивата с оценка 1 (в ден 7), което се е възстановило напълно в ден 10.
         
            (18)  Регламент (ЕО) № 1272/2008 на Европейския парламент и на Съвета от 16 декември 2008 г. относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси, за изменение и за отмяна на директиви 67/548/ЕИО и 1999/45/ЕО и за изменение на Регламент (ЕО) № 1907/2006 (ОВ L 353, 31.12.2008 г., стр. 1).
         
            (19)  В настоящия документ под средна стойност се разбира средното аритметично.
         
            (20)  Числата се отнасят до статистически генерирани прагови стойности и не са свързани с точността на измерването.
         
            (21)  Прогнозирането по DPRA следва да се разглежда в рамките на IATA и в съответствие с разпоредбите на точки 9 и 12.
         
            (22)  Числата се отнасят до статистически генерирани прагови стойности и не са свързани с точността на измерването.
         
            (23)  Прогнозирането по DPRA следва да се разглежда в рамките на IATA и в съответствие с разпоредбите на точки 9 и 12.
         
            (24)  In vivo прогнозите за опасност и (потенциал) се основават на данни от LLNA (19). In vivo потенциалът е изведен с използване на критериите, предложени от ECETOC (23).
         
            (25)  Прогнозирането по DPRA следва да се разглежда в рамките на IATA и в съответствие с разпоредбите на точки 9 и 11.
         
            (26)  Обхвати, определени въз основа на минимум 10 стойности на изчерпването, генерирани от 6 независими лаборатории.
         
            (27)  Регламент (ЕО) № 1272/2008 на Европейския парламент и на Съвета от 16 декември 2008 г. относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси, за изменение и за отмяна на директиви 67/548/ЕИО и 1999/45/ЕО и за изменение на Регламент (ЕО) № 1907/2006 (ОВ L 353, 31.12.2008 г., стр. 1).
         
            (28)  In vivo прогнозите за опасност (и потенциал) се основават на данни от LLNA (13). In vivo потенциалът е изведен с използване на критериите, предложени от ECETOC (24).
         
            (29)  Прогнозата по KeratinoSensTM следва да се разглежда в рамките на IATA и в съответствие с разпоредбите на точки 9 и 11 от настоящия метод за изпитване.
         
            (30)  Въз основа на наблюдавани стойности от предходни периоди (12).
         
            (31)  Регламент (ЕО) № 1272/2008 на Европейския парламент и на Съвета от 16 декември 2008 г. относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси, за изменение и за отмяна на директиви 67/548/ЕИО и 1999/45/ЕО и за изменение на Регламент (ЕО) № 1907/2006 (ОВ L 353, 31.12.2008 г., стр. 1).
         
            (32)  за всеки изпитван химикал са определени химични класове, като за целта се използва стандартна схема за класификация, базираща се на системата за класификация MeSH (National Library of Medicine Medical Subject Headings) (на разположение на адрес: http//www.nlm.nih.gov/mesh)
         
            (33)  Базира се на резултати от in vivo изпитване със заешки очи (ОИСР TG 405, МИ Б.5) и с използване на GHS на ООН и CLP на ЕС.
         
            (34)  Въз основа на резултатите, получени с FL (INVITTOX Протокол № 71(6))
         
            (35)  Статистиците, които използват подход за моделиране, като например обобщени линейни модели (GLM), може да подхождат към анализа по различен, но сравним начин, но не получават непременно традиционната ANOVA таблица, която датира от алгоритмичните подходи за изчисляване на статистически данни, разработени в епохата преди появата на компютрите.
         
            (36)  Вж. допълнение 1 за определения и мерни единици
         
            (37)  Понякога се означава чрез P
            OW; определя се чрез по метода „разклащане в стъкленица“ в МИ A.8 (4), метода с HPLC в МИ А.24 (54) и метода с бавно разбъркване в МИ A.23 (6). Понякога за определяне на log KOW се използва техниката с разпределителна колона. Налични са ограничен брой проучвания, при които се използва тази техника, главно за хлорирани бифенили и дибензодиоксини (напр. Li and Doucette, 1993) (3). За вещества, които могат да се йонизират, log K
            OW следва да се отнася за нейонизираната форма.
         
            (38)  Вж. допълнение 1 за определения и мерни единици
         
            (39)  ТСХ: тънкослойна хроматография; ВЕТХ: течна хроматография при високо налягане; ГХ: газова хроматография
         
            (40)  В някои правни рамки анализът на метаболитите може да бъде задължителен, когато са изпълнени определени условия (срв. точка 65).
         
            (41)  Като цяло, измерените концентрации във водата по време на фазата на поглъщането трябва да бъдат най-малко един порядък над границата на количествено определяне, така че да може да бъде измерен повече от един период на полуразграждане на погълнатото вещество в тялото във фазата на очистването на изследването.
         
            (42)  Вж. допълнение 1 за определения и мерни единици
         
            (43)  За повечето изпитвани вещества в идеалния случай не следва да има откриване в контролата на вода. Фонови концентрации могат да са относими само за естествени материали (напр. някои метали) и вещества, които са разпространени в околната среда.
         
            (44)  Ако кинетиката от първи порядък очевидно не е в сила, следва да се прилагат по-сложни модели (вж. позоваванията в допълнение 5) и се търси консултация от статистик в областта на биологията.
         
            (45)  Поглъщането може да бъде ограничено от ниски концентрации при експозиция поради малка разтворимост във вода в изпитването за биоконцентрация, докато при експозицията чрез хранителния режим могат да се достигнат много по-високи концентрации.
         
            (46)  За вещества с повече съставки, UVCB и смеси, за определяне на подходящите концентрации на експозиция следва да се вземе предвид разтворимостта във вода на всяка относима съставка.
         
            (47)  ТОС включва органичен въглерод от частици и разтворен органичен въглерод, т.е. TOC = POC + DOC.
         
            (48)  Макар и като цяло да не се препоръчва, ако е използван разтворител или средство за повишаване на разтворимостта, органичният въглерод с произход от това средство следва да бъде добавен към органичния въглерод от изпитваното вещество за оценка на концентрацията на органичния въглерод в съдовете за изпитване.
         
            (49)  Ако съдържанието на липиди не е анализирано в същата риба, в която е анализирано изпитваното вещество, рибата следва най-малкото да бъде със сходно тегло и (ако е относимо) — от същия пол.
         
            (50)  Тази алтернатива е валидна само ако рибите във всички изпитвани групи се държат в групи със сходни размери, ако рибите се отстраняват по един и същ модел и ако бъдат хранени по един и същ начин. Това гарантира, че растежът на рибите във всички групи на изпитване е сходен, ако изпитваната концентрация е по-ниска от токсичния обхват. Ако растежът е сходен, очаква се липидното съдържание също да е сходно. Различен растеж в контролата показва евентуално въздействие от страна на веществото и евентуално прави изследването невалидно.
         
            (51)  В допълнение към теглото следва да бъде записана общата дължина, тъй като сравнението на степента на нарастване на дължината по време на изпитването е добър показател за това дали е настъпило неблагоприятно въздействие.
         
            (52)  Може да се извърши t-тест за константите на скоростта на растеж, с цел да се тества дали се различава растежът между контролните и изпитваните групи, или F-тест в случай на анализ на дисперсията. Ако е необходимо може да се използва F-тест или тест за правдоподобно отношение за подпомагане при избора на подходящия модел на растеж (ОИСР монография 54, (32).
         
            (53)  Тези проценти допускат, че методите за анализ са надеждни и че полуразграждането е < 14 дни. Ако методите за анализ са по-малко надеждни, или полуразграждането е (значително) увеличено, тези стойности ще бъдат по-големи.
         
            (54)  
         
            CI: доверителен интервал (където е възможно да се оцени)
         
            (55)  
         
            SD: стандартно отклонение (където е възможно да се оцени)
         
            (56)  Изпитването със свеждане до минимум на експозицията в действителност може да бъде използвано за доказване на бърз метаболизъм, когато е известно, че е вероятна проява на бърз метаболизъм.
         
            (57)  Когато се измерват само две точки с данни, оценките за доверителните граници за BCFKm могат да бъдат направени чрез бутстрап методи. Когато са на разположение също и междинни точки с данни, доверителните граници за BCFKm могат да се изчислят както при цялостното изпитване.
         
            (58)  Вж. допълнение 1 за определения и мерни единици
         
            (59)  За целите на Регламент (ЕО) № 1907/2006 относно регистрацията, оценката, разрешаването и ограничаването на химикали (REACH) (ОВ L 396, 30.12.2006 г., стр. 1) този въпрос е разгледан в „Ръководство относно изискванията за информация и оценката на безопасността на химичните вещества“, глава R.7c, R.7.10.3.1; R.7.10.4.1; и фигура R7.10-2.
         
            (60)  За повечето изпитвани вещества в идеалния случай не следва да има откриване в контролата на вода. Фонови концентрации могат да са относими само за естествени материали (напр. някои метали) и вещества, които са разпространени в околната среда.
         
            (61)  Доколкото BMF се определя като отношение на концентрацията на дадено вещество в даден организъм към тази в храната за този организъм в стационарно състояние, липидите се вземат предвид чрез коригиране за съдържанието на липиди в организма и в храната, поради което се описва по-точно като „корекция“. Този подход се различава от „нормализацията“ към определено липидно съдържание в организма, каквато се извършва в изпитването за биоконцентрация при експозиция по воден път.
         
            (62)  Общата дължина следва също така да се запише по време на изпитването, тъй като тя е добър показател за това, дали е настъпило неблагоприятно въздействие.
         
            (63)  HCB е включен в приложения A и В към Стокхолмската конвенция, и в приложения I и III към Регламент (ЕО) № 850/2004 относно устойчивите органични замърсители (ОВ L 158, 30.4.2004 г., стр. 7)
         
            (64)  В случай на бърз растеж през фазата на поглъщане истинската скорост на хранене ще намалее под определената в началото на експозицията.
         
            (65)  В изследване с експозиция по воден път 14-дневен период на полуразграждане би съответствал на BCF от около 10 000 l/kg, като се използва риба от 1 g със съответна скорост на поглъщане от около 500 l/kg/ден (в съответствие с уравнението на Sijm et al (46)).
         
            (66)  Тъй като действителните вътрешни концентрации могат да бъдат определени само след като е било извършено изпитването, е необходима оценка на очакваната вътрешна концентрация (напр. въз основа на очаквания BMF и концентрацията в храната; вж. уравнение А5.8 в допълнение 5).
         
            (67)  Присъствието на изпитваното вещество в средата за изпитване в резултат на екскреция от риби или на просмукване от храна може да не е напълно предотвратимо. Следователно един от вариантите е да се измери концентрацията на веществото във вода в края на периода на поглъщане, особено ако се използва полустатична постановка, за подпомагане на установяването дали е имало експозиция по воден път.
         
            (68)  Този подход е специфичен за изследването чрез хранителния режим и се различава от процедурата, следвана при експозицията по воден път, оттам думата „корекция“ се използва вместо „нормализация“, за да се избегне объркване — вж. също бележка под линия в точка 106.
         
            (69)  Може да се извърши t-тест за константите на скоростта на растеж, с цел да се тества дали се различава растежът между контролните и изпитваните групи, или F-тест в случай на анализ на дисперсията. Ако е необходимо, може да се използва F-тест или тест за правдоподобно отношение за подпомагане при избора на подходящия модел на растеж (монография 54 на ОИСР, (32).
         
            (70)  Техника за анализ на храни за белтъци, липиди, сурови влакнини и пепелно съдържание; тази информация обикновено е налична от доставчика на фуража.
         
            (71)  
         
            CI: доверителен интервал (където е възможно да се оцени)
         
            (72)  
         
            SD: стандартно отклонение (където е възможно да се оцени)
         
            (73)  Meyer et al. (1)
         
            (74)  Следва да се отбележи, че в самото изпитване теглото се предпочита като измерител за получаване на размера и константата на скоростта на растежа. Въпреки това се признава, че дължината е по-практичен измерител, ако рибите трябва да бъдат избрани визуално в началото на даден опит (т.е. от изходната популация).
         
            (75)  Този обхват от дължини е посочен в Методите за изпитване за откриване на нови химични вещества и др. въз основа на японския Закон за контрол на химическите вещества (CSCL).
         
            (76)  Стойностите в скобите са броят на пробите (вода, риба), които трябва да се вземат, ако се прави допълнително пробовземане.
         
            (77)  Оценката на k
            2 преди изпитването при log K
            OW от 4,0 е 0,652 дни– 1. Общата продължителност на опита е определена на 3 × t
            SS = 3 × 4,6 дни, т.е. 14 дни. За оценка на t
            SS се прави препратка към допълнение 5.
         
            (78)  Вода се пробовзема след минимум три прехвърляния на обема на камерата.
         
            (79)  Тези риби се пробовземат от изходната популация.
         
            (80)  Ако са необходими изследвания с по-висока точност или за метаболизъм, които изискват повече риби, те следва да бъдат включени в извадката и по-специално пробовзети в края на фазите на поглъщане и очистване (вж. точка 40).
         
            (81)  Може да се изискват най-малко 3 допълнителни риби за извършване на анализ за съдържание на липиди, ако не е възможно да се използват същите риби, пробовзети за концентрации на веществото в началото на изпитването, в края на фазата на поглъщане и в края на фазата на очистване. Следва се отбележи, че в много случаи трябва да е възможно да се използват само 3-те контролни риби (вж. точка 56).
         
            (82)  3 проби от фуражи както от контролните, така и от изпитваните групи, анализирани за концентрации на изпитваното вещество и за съдържание на липиди.
         
            (83)  рибите се пробовземат от изходната популация колкото е възможно по-близо до началото на изследването; за съдържание на липиди трябва да бъдат пробовзети най-малко 3 риби от изходната популация в началото на изпитването.
         
            (84)  пробовземането (по избор) на ранен етап от фазата на поглъщането е източник на данни за изчисляване на усвояването на хранителния режим с изпитваното вещество, което може да бъде сравнено с ефикасността на усвояването, изчислена от данните от фазата на очистването.
         
            (85)  5 допълнителни риби могат да бъдат пробовзети за тъканно-специфичен анализ.
         
            (86)  Може да се изискват най-малко 3 допълнителни риби за извършване на анализ за съдържание на липиди, ако не е възможно да се използват същите риби, пробовзети за концентрации на веществото в началото на изпитването, в края на фазата на поглъщане и в края на фазата на очистване. Следва се отбележи, че в много случаи трябва да е възможно да се използват само 3-те контролни риби (вж. точки 56 и 153).
         
            (87)  Както при всяка емпирична зависимост, следва да се провери дали изпитваното вещество попада в приложното поле на зависимостта
         
            (88)  Теглото на рибата в края на фазата на поглъщане може да се оцени от данни от предходно изследване или от знания за увеличаването на размерите на изпитвания животински вид от началното тегло при типично изпитване за типична продължителност на поглъщането (напр. 28 дни).
         
            (89)  В повечето програми, които позволяват линейна регресия, са дадени също така стандартни грешки и доверителен интервал (CI) за оценките, напр. в Microsoft Excel с помощта на пакета с инструменти за анализ на данни.
         
            (90)  За разлика от метода с линейна регресия, когато се използва тази формула, не се дава стандартна грешка за k2.
         
            (91)  За разлика от процедурата с линейна апроксимация, този метод обикновено не дава стандартна грешка или доверителен интервал за оценката за k1.
         
            (92)  Трябва да се има предвид, че неопределеността при оценката на k2 не се използва правилно в модела за биоакумулация, когато тя се разглежда като константа при изглаждане на k1 в метода с последователно изглаждане. Следователно произтичащата неопределеност на BCF ще се различава между едновременния метод и метода с последователно изглаждане.
         
            (93)  В някои региони може да е възможно да се получи само храна за риби с липидна концентрация, която е далеч по-ниска от тази горна граница. В такива случаи изследванията следва да се проведат с по-ниската липидна концентрация в храната, както е доставена, и скоростта на хранене да се коригира по подходящ начин за поддържане на здравето на рибите. Липидите от хранителния режим следва да не се увеличават по изкуствен начин чрез добавяне на прекомерно количество масло.
         
            (94)  В природата пътят, водещ до най-голяма експозиция във водна среда за силно хидрофобни вещества вероятно ще бъде чрез поглъщане и по този начин оценката за BCF не е строго представителна за потенциала за биоакумулация на такова вещество.
         
            (95)  Други дафнии могат да се използват, при условие че съответно отговарят на критериите за валидност (критерият за валидност по отношение на репродуктивната способност при контролите следва да е относим към всички видове). Ако се използват други дафнии, те следва да бъдат ясно идентифицирани и използването им следва да е обосновано.
         
            (96)  Случайна смъртност: смъртност, която не е свързана с химикал, и която е причинена от случайно въздействие (т.е. известна причина)
         
            (97)  Непреднамерена смъртност: смъртност, която не е свързана с химикал, и която е с неизвестна причина
         
            (*6)  Посочва се кой съд е използван за опита
         
            (*7)  Записва се неразвитото поколение като „AB“ в съответната клетка
         
            (*8)  Записва се смъртността на всякакви родителски животни като „М“ в съответната клетка
         
            (98)  Типичната минимална средна обща дължина не е критерий за валидност, но отклоненията под указаната стойност следва внимателно да се проучат по отношение на чувствителността на изпитването. Минималната средна обща дължина е резултат от подбор на наличните данни към настоящия момент.
         
            (99)  Конкретната порода изпитвана дъгова пъстърва може да наложи използването на други температури. Рибният запас за размножаване трябва да се отглежда при същата температура като тази, която се използва за хайверните зърна. След доставката на получени от търговската мрежа хайверни зърна е необходимо кратко адаптиране (напр. 1-2 часа) към температурата на изпитване.
         
            (100)  Тъмнина за ларвите до една седмица след излюпването, с изключение на времето, когато се наблюдават, след това омекотена светлина по време на изпитването (12-16 часа излагане на светлина) (4).
         
            (101)  Независимо от условията на изпитване режимът на осветяване трябва да бъде постоянен.
         
            (102)  За всяко изпитване не трябва да варира повече от ± 2 0/00.
         
            (*9)  Храна следва да се дава до насищане. Излишната храна и изпражненията трябва да бъдат отстранявани, когато е необходимо, за да се избегне натрупване на отпадъци
         
                     замразени артемии
                  
                  
                     замразени артемии полово зрели Artemia sp.
                  
               
                     науплии от артемии (BSN)
                  
                  
                     науплии от артемии; новоизлюпени
                  
               
                     BSN48
                  
                  
                     науплии от артемии; на възраст 48 часа
                  
               
            (1)  ларвите от жълтъчната торбичка не се нуждаят от храна
         
            (2)  филтрувани от смесена култура
         
            (3)  гранули от ферментационен процес
         
            (*10)  Папиларните израстъци обикновено се появяват само при полово зрели мъжки и се намират на лъчите на перките, като се започне от втория, до седмия или осмия от задния край на аналната перка (фиг. 1 и 2). Независимо от това, израстъци рядко се появяват на първия лъч от задния край на аналната перка. Тази стандартна оперативна процедура (СОП) обхваща измерването на израстъците на първия лъч на перка (в настоящата СОП номерът на лъча на перка се отнася за поредния номер, считано от първия лъч в задния край на аналната перка).
         
            (*11)  Буфер за хомогенизиране:
         
                     —
                  
                  
                     (50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % смес от инхибитори на протеаза (Sigma): 12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl смес от инхибитори на протеаза.
                  
               
                     —
                  
                  
                     TRIS: TRIS-ULTRA PURE (ICN) напр. от Bie & Berntsen, Дания.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Смес от инхибитори на протеаза: От Sigma (за тъкани от бозайници) Продуктов номер P 8340.
                  
               
            БЕЛЕЖКА: Буферът за хомогенизирането следва да се използва на същия ден, в който е приготвен. По време на употреба се поставя върху лед.
         
            (103)  Carl von Linné (* 23 май 1707 г. в Росхулт/Елмхулт; † 10 януари 1778 г. в Упсала).
         
            (*12)  деминерализирана (т.е. дестилирана или дейонизирана) вода.