CELEX: 
Language: lv
Date: 2018-01-30 00:00:00
Title: KOMISIJAS ĪSTENOŠANAS REGULA (ES) …/.. ar kuru Īstenošanas regulu (ES) 2016/1240 groza attiecībā uz valsts intervencei un privātās uzglabāšanas atbalsta saņemšanai atbilstīga piena un piena produktu analīzes metodēm un kvalitātes novērtēšanu

KOMISIJAS ĪSTENOŠANAS REGULA (ES) …/..
            
            
               (30.1.2018),
            
            
               ar kuru Īstenošanas regulu (ES) 2016/1240 groza attiecībā uz valsts intervencei un privātās uzglabāšanas atbalsta saņemšanai atbilstīga piena un piena produktu analīzes metodēm un kvalitātes novērtēšanu
            
            
               EIROPAS KOMISIJA,
            
            
               ņemot vērā Līgumu par Eiropas Savienības darbību,
            
            
               ņemot vērā Eiropas Parlamenta un Padomes 2013. gada 17. decembra Regulu (ES) Nr. 1306/2013 par kopējās lauksaimniecības politikas finansēšanu, pārvaldību un uzraudzību un Padomes Regulu (EEK) Nr. 352/78, (EK) Nr. 165/94, (EK) Nr. 2799/98, (EK) Nr. 814/2000, (EK) Nr. 1290/2005 un (EK) Nr. 485/2008 atcelšanu
                  1
                un jo īpaši tās 62. panta 2. punkta i) apakšpunktu,
            
            
               tā kā:
            
            
               (1)Komisijas Deleģētā regula (ES) 2016/1238
                  2
                un Komisijas Īstenošanas regula (ES) 2016/1240
                  3
                nosaka noteikumus par valsts intervenci un privātās uzglabāšanas atbalstu. Komisijas Regula (EK) Nr. 273/2008
                  4
                nosaka metodes, kas jāpiemēro, novērtējot to, vai piens un piena produkti atbilst atbilstības prasībām, kuras minētajās regulās noteiktas attiecībā uz valsts intervenci un privātās uzglabāšanas atbalstu.
            
            
               (2)Ņemot vērā piena un piena produktu analīzē un kvalitātes novērtēšanā izmantotās metodikas tehnisko attīstību, būtu jāizdara būtiskas izmaiņas, lai vienkāršotu [noteikumus] un atjauninātu atsauces uz ISO standartiem. Tiecoties pēc skaidrības un efektivitātes un ņemot vērā Regulas (EK) Nr. 273/2008 noteikumos izdarāmo grozījumu apmēru un tehnisko raksturu, attiecīgie minētās regulas noteikumi būtu jāiestrādā Īstenošanas regulā (ES) 2016/1240.
            
            
               (3)Lai nodrošinātu vienādu atbilstību jaunajiem standartiem un metodēm visās dalībvalstīs, būtu jāatvēl laboratorijām pietiekami daudz laika procedūru pārskatīšanai un atjaunināto metožu ieviešanai.
            
            
               (4)Tāpēc Īstenošanas regula (ES) 2016/1240 būtu attiecīgi jāgroza.
            
            
               (5)Juridiskās noteiktības labad Regula (EK) Nr. 273/2008 būtu jāatceļ.
            
            
               (6)Šajā regulā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Lauksaimniecības tirgu kopīgās organizācijas komitejas atzinumu,
            
            
               IR PIEŅĒMUSI ŠO REGULU.
            
            
               1. pants
            
            
               Īstenošanas regulu (ES) 2016/1240 groza šādi:
            
            
               (1)regulas 4. pantu groza šādi:
            
            
               (a)panta 1. punktu groza šādi:
            
            
               i) punkta d) apakšpunktu aizstāj ar šādu:
            
         
         
            
               “attiecībā uz sviestu – šīs regulas IV pielikuma I un Ia daļa;”
            
            
               ii) punkta e) apakšpunktu aizstāj ar šādu:
            
            
               “attiecībā uz vājpiena pulveri – šīs regulas V pielikuma I un Ia daļa.”;
            
            
               (b)panta 2. punktu aizstāj ar šādu:
            
            
               “2. Attiecīgi I, IV un V pielikumā minētās metodes, kas jāizmanto, lai noteiktu valsts intervencei atbilstīgas labības, sviesta un vājpiena pulvera kvalitāti, ir noteiktas attiecīgo Eiropas vai starptautisko standartu jaunākajās redakcijās, kas ir spēkā vismaz 6 mēnešus pirms Regulas (ES) Nr. 1308/2013 12. pantā noteiktā valsts intervences laikposma pirmās dienas.”;
            
            
               (2)iekļauj šādu 60.a pantu:
            
            
               "60.a pants
            
            
               Īpaši noteikumi par pārbaudēm, kas saistītas ar valsts intervenci un privātās uzglabāšanas atbalstu attiecībā uz pienu un piena produktiem
            
            
               1. Sviesta, vājpiena pulvera un siera atbilstību privātās uzglabāšanas atbalsta saņemšanai nosaka saskaņā ar metodēm, kas izklāstītas attiecīgi VI, VII un VIII pielikumā. 
            
            
               Minētās metodes nosaka, atsaucoties uz attiecīgo Eiropas vai starptautisko standartu jaunākajām redakcijām, kas ir spēkā vismaz 6 mēnešus pirms Regulas (ES) Nr. 1308/2013 12. pantā noteiktā valsts intervences laikposma pirmās dienas.
            
            
               2. To pārbaužu rezultātus, kas veiktas, piemērojot šajā regulā izklāstītās metodes, izvērtē saskaņā ar IX pielikumu.”;
            
            
               (3)pielikumus groza saskaņā ar šīs regulas pielikumu.
            
            
               2. pants
            
            
               Komisijas Regulu (EK) Nr. 273/2008 atceļ.
            
            
               3. pants 
            
            
               Šī regula stājas spēkā septītajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Savienības Oficiālajā Vēstnesī.
            
            
               Šī regula uzliek saistības kopumā un ir tieši piemērojama visās dalībvalstīs.
            
            
               Briselē, 30.1.2018
            
            
               
                     Komisijas vārdā –
               
               
                     priekšsēdētājs
                     Jean-Claude JUNCKER
               
            
         
         
            
                  
                     (1)
                  
                        OV L 347, 20.12.2013., 549. lpp.
               
               
                  
                     (2)
                  
                        Komisijas 2016. gada 18. maija Deleģētā regula (ES) 2016/1238, ar ko Eiropas Parlamenta un Padomes Regulu (ES) Nr. 1308/2013 papildina attiecībā uz valsts intervenci un privātās uzglabāšanas atbalstu (OV L 206, 30.7.2016., 15. lpp.).
               
               
                  
                     (3)
                  
                        Komisijas 2016. gada 18. maija Īstenošanas regula (ES) 2016/1240, ar ko paredz noteikumus par to, kā Eiropas Parlamenta un Padomes Regulu (ES) Nr. 1308/2013 piemēro attiecībā uz valsts intervenci un privātās uzglabāšanas atbalstu (OV L 206, 30.7.2016., 71. lpp.).
               
               
                  
                     (4)
                  
                        Komisijas 2008. gada 5. marta Regula (EK) Nr. 273/2008, ar kuru nosaka sīki izstrādātus noteikumus Padomes Regulas (EK) Nr. 1255/1999 piemērošanai attiecībā uz piena un piena produktu analīžu un kvalitātes vērtēšanas metodēm (OV L 88, 29.3.2008., 1. lpp.).
               
            
      
    ---documentbreak--- 
      
         
         
            
               LV
            
            
               PIELIKUMS
            
            
               Īstenošanas regulas (ES) 2016/1240 pielikumus groza šādi:
            
            
               1) IV pielikumu groza šādi:
            
            
               a) I daļas 2. punkta otro daļu aizstāj ar šādu:
            
            
               “Katru paraugu novērtē atsevišķi. Atkārtota paraugu ņemšana un atkārtota vērtēšana nav atļauta.”;
            
            
               b) iekļauj šādu Ia daļu:
            
            
               “Ia daļa
            
            
               Valsts intervencei paredzēta nesālīta sviesta analīžu metodes
            
            
                     
                        Parametrs
                     
                  
                  
                     
                        Metode
                     
                  
               
                     
                        Tauki
                           1
                        
                     
                  
                  
                     
                        ISO 17189 vai ISO 3727 3. daļa
                     
                  
               
                     
                        Ūdens
                     
                  
                  
                     
                        ISO 3727 1. daļa
                     
                  
               
                     
                        Beztauku sausna 
                     
                  
                  
                     
                        ISO 3727 2. daļa
                     
                  
               
                     
                        Tauku skābums
                     
                  
                  
                     
                        ISO 1740
                     
                  
               
                     
                        Peroksīda skaitlis 
                     
                  
                  
                     
                        ISO 3976
                     
                  
               
                     
                        Tauki, kas nav piena tauki 
                     
                  
                  
                     
                        ISO 17678
                     
                  
               
                     
                        Sensoriskās īpašības
                     
                  
                  
                     
                        ISO 22935 2. un 3. daļa un pēc tam punktu tabula
                     
                  
               
               Punktu tabula
            
            
                     
                        Izskats
                     
                  
                  
                     
                        Konsistence
                     
                  
                  
                     
                        Smarža un garša 
                     
                  
               
                     
                        Punkti
                     
                  
                  
                     
                        Piezīmes
                     
                  
                  
                     
                        Punkti
                     
                  
                  
                     
                        Piezīmes
                     
                  
                  
                     
                        Punkti
                     
                  
                  
                     
                        Piezīmes
                     
                  
               
                     
                        5
                     
                  
                  
                     
                        Ļoti labi
                     
                     
                        Nevainojams
                     
                     
                        Visaugstākā kvalitāte
                     
                     
                        (vienādi sauss)
                     
                  
                  
                     
                        5
                     
                  
                  
                     
                        Ļoti labi
                     
                     
                        Nevainojama
                     
                     
                        Visaugstākā kvalitāte
                     
                     
                        (vienādi ziežams)
                     
                  
                  
                     
                        5
                     
                  
                  
                     
                        Ļoti labi
                     
                     
                        Nevainojama
                     
                     
                        Visaugstākā kvalitāte
                     
                     
                        (pilnīgi tīra delikāta smarža)
                     
                  
               
                     
                        4
                     
                  
                  
                     
                        Labi
                     
                     
                        (nav acīmredzamu defektu)
                     
                  
                  
                     
                        4
                     
                  
                  
                     
                        Labi
                     
                     
                        (nav acīmredzamu defektu)
                     
                  
                  
                     
                        4
                     
                  
                  
                     
                        Labi
                     
                     
                        (nav acīmredzamu defektu)
                     
                  
               
                     
                        1, 2 vai 3
                     
                  
                  
                     
                        Jebkāds defekts
                     
                  
                  
                     
                        1, 2 vai 3
                     
                  
                  
                     
                        Jebkāds defekts
                     
                  
                  
                     
                        1, 2 vai 3
                     
                  
                  
                     
                        Jebkāds defekts
                     
                  
               
               ”;
            
            
               2) V pielikumā iekļauj šādu Ia daļu:
            
            
               “Ia daļa
            
            
               Valsts intervencei paredzēta vājpiena pulvera analīžu metodes
            
            
                     
                        Parametrs
                     
                  
                  
                     
                        Metode
                     
                  
               
                     
                        Olbaltumvielas
                     
                  
                  
                     
                        ISO 8968 1. daļa
                     
                  
               
                     
                        Tauki
                     
                  
                  
                     
                        ISO 1736
                     
                  
               
                     
                        Ūdens
                     
                  
                  
                     
                        ISO 5537
                     
                  
               
                     
                        Skābums
                     
                  
                  
                     
                        ISO 6091
                     
                  
               
                     
                        Laktāti
                     
                  
                  
                     
                        ISO 8069
                     
                  
               
                     
                        Fosfatāzes tests
                     
                  
                  
                     
                        ISO 11816 1. daļa
                     
                  
               
                     
                        Nešķīdības indekss
                     
                  
                  
                     
                        ISO 8156
                     
                  
               
                     
                        Piedeguma daļiņas
                           2
                        
                     
                  
                  
                     
                        ADPI
                     
                  
               
                     
                        Mikroorganismi
                     
                  
                  
                     
                        ISO 4833 1. daļa
                     
                  
               
                     
                        Paniņas
                     
                  
                  
                     
                        I papildinājums
                     
                  
               
                     
                        Siera sūkalas
                           3
                        
                     
                  
                  
                     
                        II un III papildinājums
                     
                  
               
                     
                        Skābās sūkalas
                           4
                        
                     
                  
                  
                     
                        ISO 8069 vai inspicēšana uz vietas
                     
                  
               
                     
                        Sensoriskā vērtēšana
                           5
                        
                     
                  
                  
                     
                        ISO 22935 2. un 3. daļa
                     
                  
               
               
            
               I papildinājums
            
            
               VĀJPIENA PULVERIS: FOSFATIDILSERĪNA UN FOSFATIDILETANOLAMĪNA KVANTITATĪVA NOTEIKŠANA
            
         
         
            
               Metode: apgrieztās fāzes HPLC
            
            
               1.MĒRĶIS UN PIEMĒROŠANAS JOMA
            
            
               Šī metode apraksta procedūru fosfatidilserīna (PS) un fosfatidiletanolamīna (PE) kvantitatīvai noteikšanai vājpiena pulverī, un tā ir piemērota paniņu sausnas detektēšanai vājpiena pulverī.
            
            
               2.DEFINĪCIJA
            
            
               PS + PE saturs: vielas masas daļa, ko nosaka, izmantojot turpinājumā aprakstīto procedūru. Rezultātu izsaka dipalmitoilfosfatidiletanolamīna (PEDP) miligramos uz 100 g pulvera.
            
            
               3.METODES PRINCIPS
            
            
               Aminofosfolipīdu ekstrakcija ar metanolu no atjaunota piena. PS un PE kā o-ftalskābes dialdehīda (OPA) atvasinājumu noteikšana ar apgrieztās fāzes HPLC un fluorescences detektēšanu. PS un PE satura kvantitatīva noteikšana analizējamajā paraugā, salīdzinot ar standartparaugu, kas satur zināmu daudzumu PEDP.
            
            
               4.REAĢENTI
            
            
               Visi reaģenti ir atzītas analītiskas tīrības pakāpes reaģenti. Izmanto destilētu ūdeni vai ūdeni ar vismaz līdzvērtīgu tīrību, ja vien nav noteikts citādi.
            
            
               4.1.
                     Standartmateriāls: PEDP ar vismaz 99 % tīrību
            
            
               Piezīme. Standartmateriālu uzglabā – 18 °C temperatūrā.
            
            
               4.2.
                     Reaģenti standartparauga un analizējamā parauga sagatavošanai
            
            
               4.2.1.
                     HPLC tīrības pakāpes metanols
            
            
               4.2.2.
                     HPLC tīrības pakāpes hloroforms
            
            
               4.2.3.
                     Triptamīna monohidrohlorīds
            
            
               4.3.
                     Reaģenti o-ftalskābes dialdehīda derivatizācijai
            
            
               4.3.1.
                     Nātrija hidroksīda 12 M šķīdums ūdenī
            
            
               4.3.2.
                     Borskābes 0,4 M šķīdums ūdenī, kura pH ar nātrija hidroksīdu (4.3.1.) koriģēts uz 10,0
            
            
               4.3.3.
                     2-merkaptoetanols
            
            
               4.3.4.
                     o-ftalskābes dialdehīds (OPA)
            
         
         
            
               4.4.
                     HPLC eluēšanas šķīdinātāji
            
            
               4.4.1.
                     Eluēšanas šķīdinātājus sagatavo, izmantojot HPLC tīrības pakāpes reaģentus.
            
            
               4.4.2.
                     HPLC tīrības pakāpes ūdens
            
            
               4.4.3.
                     Pārbaudītas fluorimetriskās tīrības metanols
            
            
               4.4.4.
                     Tetrahidrofurāns
            
            
               4.4.5.
                     Nātrija dihidrogēnfosfāts
            
            
               4.4.6.
                     Nātrija acetāts
            
            
               4.4.7.
                     Etiķskābe
            
            
               5.APARATŪRA
            
            
               5.1.
                     Analītiskie svari, kuros var nosvērt ar 1 mg precizitāti un kuru iedaļas vērtība ir 0,1 mg
            
            
               5.2.
                     Vārglāzes ar 25 ml un 100 ml ietilpību
            
            
               5.3.
                     Pipetes, ar kurām var izdalīt 1 ml un 10 ml
            
            
               5.4.
                     Magnētiskais maisītājs
            
            
               5.5.
                     Mērpipetes, ar kurām var izdalīt 0,2 ml, 0,5 ml un 5 ml
            
            
               5.6.
                     Mērkolbas ar 10 ml, 50 ml un 100 ml ietilpību
            
            
               5.7.
                     Šļirces ar 20 μl un 100 μl ietilpību
            
            
               5.8.
                     Ultraskaņas vanna
            
            
               5.9.
                     Centrifūga, kas var darboties ar 27 000 × g
            
            
               5.10.
                     Stikla flakoni ar aptuveni 5 ml ietilpību 
            
            
               5.11.
                     Mērcilindrs ar 25 ml ietilpību
            
         
         
            
               5.12.
                     pH metrs ar precizitāti līdz 0,1 pH vienībai
            
            
               5.13.
                     HPLC iekārta
            
            
               5.13.1.
                     Gradienta režīma sūknēšanas sistēma, kas spēj darboties ar 1,0 ml/min 200 bāru spiedienā
            
            
               5.13.2.
                     Autosamplers ar derivatizācijas iespēju
            
            
               5.13.3.
                     Kolonnas termostats, kas spēj kolonnā uzturēt 30 °C ± 1 °C temperatūru
            
            
               5.13.4.
                     Fluorescences detektors, kas spēj darboties ar 330 nm ierosas viļņu garumu un 440 nm emisijas viļņu garumu
            
            
               5.13.5.
                     Integrators vai datu apstrādes programma, kas spēj izmērīt smailes laukumu
            
            
               5.13.6.
                     LiChrospher® – 100 kolonna (250 × 4,6 mm) vai līdzvērtīga kolonna, pildīta ar oktadecilsilānu (C 18), kura daļiņu izmērs ir 5 μm
            
            
               6.PARAUGU ŅEMŠANA
            
            
               Paraugu ņemšanu veic saskaņā ar standartu ISO 707.
            
            
               7.PROCEDŪRA
            
            
               7.1.
                     Iekšējā standartšķīduma sagatavošana
            
            
               7.1.1.
                     Mērkolbā ar 100 ml ietilpību (5.6.) iesver 30,0 ± 0,1 mg triptamīna monohidrohlorīda (4.2.3.) un uzpilda līdz atzīmei ar metanolu (4.2.1.).
            
            
               7.1.2.
                     1 ml šā šķīduma ar pipeti (5.3.) iepilina 10 ml mērkolbā (5.6.) un uzpilda līdz atzīmei ar metanolu (4.2.1.), lai iegūtu triptamīna koncentrāciju 0,15 mM.
            
            
               7.2.
                     Analizējamā parauga šķīduma sagatavošana
            
            
               7.2.1.
                     Vārglāzē ar 25 ml ietilpību (5.2.) iesver 1,000 ± 0,001 g vājpiena pulvera parauga. Ar pipeti (5.3.) pievieno 10 ml destilēta ūdens, kura temperatūra ir 40 °C, un ar magnētisko maisītāju (5.4.) maisa 30 minūtes, lai izšķīdinātu visas piciņas.
            
            
               7.2.2.
                     Mērkolbā ar 10 ml ietilpību (5.6.) ar pipeti (5.5.) iepilina 0,2 ml atjaunota piena, ar šļirci (5.7.) pievieno 100 μl 0,15 mM triptamīna šķīduma (7.1.) un uzpilda līdz tilpumam ar metanolu (4.2.1.). Rūpīgi samaisa, apvēršot otrādi, un uz 15 minūtēm ievieto ultraskaņas vannā (5.8.).
            
            
               7.2.3.
                     Centrifugē (5.9.) 10 minūtes ar 27 000 g × g un supernatantu savāc stikla flakonā (5.10.).
            
            
               Piezīme. Līdz HPLC analīzes veikšanai analizējamā parauga šķīdums jāuzglabā 4 °C temperatūrā.
            
            
               7.3.
                     Ārējā standartšķīduma sagatavošana
            
         
         
            
               7.3.1.
                     Mērkolbā ar 50 ml ietilpību (5.6.) iesver 55,4 mg PEDP (4.1.) un, izmantojot mērcilindru (5.11.), pievieno aptuveni 25 ml hloroforma (4.2.2.). Kolbu noslēdz ar aizbāzni, uzkarsē līdz 50 °C ± 1 °C un rūpīgi maisa, līdz PEDP izšķīdis. Kolbu atdzesē līdz 20 °C, uzpilda līdz tilpumam ar metanolu (4.2.1.) un maisa, apvēršot otrādi.
            
            
               7.3.2.
                     1 ml šā šķīduma ar pipeti (5.3.) iepilina 100 ml mērkolbā (5.6.) un uzpilda līdz tilpumam ar metanolu (4.2.1.). 1 ml šā šķīduma ar pipeti (5.3.) iepilina 10 ml mērkolbā (5.6.), pievieno 100 μl (5.7.) 0,15 mM triptamīna šķīduma (7.1.) un uzpilda līdz tilpumam ar metanolu (4.2.1.). Maisa, apvēršot otrādi.
            
            
               Piezīme. Līdz HPLC analīzes veikšanai references parauga šķīdums jāuzglabā 4 °C temperatūrā.
            
            
               7.4.
                     Derivatizācijas reaģenta sagatavošana
            
            
               10 ml mērkolbā (5.6.) iesver 25,0 ± 0,1 mg OPA (4.3.4.), pievieno 0,5 ml (5.5.) metanola (4.2.1.) un rūpīgi maisa, lai izšķīdinātu OPA. Uzpilda līdz atzīmei ar borskābes šķīdumu (4.3.2.) un ar šļirci (5.7.) pievieno 20 μl 2-merkaptoetanola (4.3.3.).
            
            
               Piezīme. Derivatizācijas reaģentu uzglabā 4 °C temperatūrā brūna stikla flakonā, un tas saglabājas stabils vienu nedēļu.
            
            
               7.5.
                     Noteikšana ar HPLC
            
            
               7.5.1.
                     Eluēšanas šķīdinātāji (4.4.)
            
            
               Šķīdinātājs A: 0,3 mM nātrija dihidrogēnfosfāta un 3 mM nātrija acetāta šķīdums (kura pH ar etiķskābi koriģēts uz 6,5 ± 0,1): metanols: tetrahidrofurāns = 558:440:2 (v/v/v).
            
            
               Šķīdinātājs B: metanols.
            
            
               7.5.2.
                     Ieteicamais eluēšanas gradients
            
            
                     
                        Laiks (min)
                     
                  
                  
                     
                        Šķīdinātājs A (%)
                     
                  
                  
                     
                        Šķīdinātājs B (%)
                     
                  
                  
                     
                        Plūsmas ātrums (ml/min)
                     
                  
               
                     
                        Sākums
                     
                  
                  
                     
                        40
                     
                  
                  
                     
                        60
                     
                  
                  
                     
                        0
                     
                  
               
                     
                        0,1
                     
                  
                  
                     
                        40
                     
                  
                  
                     
                        60
                     
                  
                  
                     
                        0,1
                     
                  
               
                     
                        5,0
                     
                  
                  
                     
                        40
                     
                  
                  
                     
                        60
                     
                  
                  
                     
                        0,1
                     
                  
               
                     
                        6,0
                     
                  
                  
                     
                        40
                     
                  
                  
                     
                        60
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
               
                     
                        6,5
                     
                  
                  
                     
                        40
                     
                  
                  
                     
                        60
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
               
                     
                        9,0
                     
                  
                  
                     
                        36
                     
                  
                  
                     
                        64
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
               
                     
                        10,0
                     
                  
                  
                     
                        20
                     
                  
                  
                     
                        80
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
               
                     
                        11,5
                     
                  
                  
                     
                        16
                     
                  
                  
                     
                        84
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
               
                     
                        12,0
                     
                  
                  
                     
                        16
                     
                  
                  
                     
                        84
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
               
                     
                        16,0
                     
                  
                  
                     
                        10
                     
                  
                  
                     
                        90
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
               
                     
                        19,0
                     
                  
                  
                     
                        0
                     
                  
                  
                     
                        100
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
               
                     
                        20,0
                     
                  
                  
                     
                        0
                     
                  
                  
                     
                        100
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
               
                     
                        21,0
                     
                  
                  
                     
                        40
                     
                  
                  
                     
                        60
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
               
                     
                        29,0
                     
                  
                  
                     
                        40
                     
                  
                  
                     
                        60
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
               
                     
                        30,0
                     
                  
                  
                     
                        40
                     
                  
                  
                     
                        60
                     
                  
                  
                     
                        0
                     
                  
               
            
               Piezīme. Eluēšanas gradientu var nākties nedaudz mainīt, lai sasniegtu 1. attēlā redzamo izšķirtspēju.
            
            
               Kolonnas temperatūra: 30 °C.
            
            
               7.5.3.
                     Injekcijas tilpums: 50 μl derivatizācijas reaģenta un 50 μl parauga šķīduma.
            
            
               7.5.4.
                     Kolonnas līdzsvarošana
            
            
               Sākot ikdienas darbu, kolonnu 15 minūtes skalo ar 100 % šķīdinātāju B, tad iepilda A:B = 40:60 un 15 minūtes līdzsvaro ar 1 ml/min. Izdara tukšo testu, ievadot metanolu (4.2.1.).
            
            
               Piezīme. Pirms ilgtermiņa uzglabāšanas kolonnu 30 minūtes skalo ar metanolu:hloroformu = 80:20 (v/v).
            
            
               7.5.5.
                     PS + PE satura noteikšana analizējamajā paraugā
            
         
         
            
               7.5.6.
                     Veic hromatogrāfisko analīžu sēriju, laiku starp analīzēm saglabājot nemainīgu, lai iegūtu konstantus aiztures laikus. Pēc katriem 5–10 analizējamā parauga šķīdumiem ievada ārējo standartšķīdumu (7.3.), lai aprēķinātu atbildes koeficientu.
            
            
               Piezīme. Pēc katrām 20–25 analīzēm kolonnu tīra, vismaz 30 minūtes skalojot ar 100 % šķīdinātāju B (7.5.1.).
            
            
               7.6.
                     Integrēšanas režīms
            
            
               7.6.1.
                     PEDP smaile
            
            
               PEDP eluējas kā viena smaile. Smailes laukumu nosaka, veicot integrēšanu starp divām ieplakām.
            
            
               7.6.2.
                     Triptamīna smaile
            
            
               Triptamīns eluējas kā viena smaile (1. attēls). Smailes laukumu nosaka, veicot integrēšanu starp divām ieplakām.
            
            
               7.6.3.
                     PS un PE smaiļu grupas
            
            
               Aprakstītajos apstākļos (1. attēls) PS eluējas kā divas nepilnīgi atdalītas galvenās smailes, pirms kurām ir zemāka smaile. PE eluējas kā trīs nepilnīgi atdalītas galvenās smailes. Katras smaiļu kopas kopējo laukumu nosaka, novelkot bāzes līniju, kā parādīts 1. attēlā.
            
            
               8.REZULTĀTU APRĒĶINĀŠANA UN IZTEIKŠANA
            
            
               PS un PE saturu analizējamajā paraugā aprēķina šādi: C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2)),
            
            
               kur:
            
            
               C = PS vai PE saturs (mg/100 g pulvera) analizējamajā paraugā,
            
            
               A1 = standartparauga šķīduma (7.3.) PEDP smailes laukums,
            
            
               A2 = analizējamā parauga šķīduma (7.2.) PS vai PE smailes laukums,
            
            
               T1 = standartparauga šķīduma (7.3.) triptamīna smailes laukums,
            
            
               T2 = analizējamā parauga šķīduma (7.2.) triptamīna smailes laukums.
            
            
               9.METODES PAREIZUMS 
            
            
               Piezīme. Atkārtojamības vērtības aprēķinātas saskaņā ar IDF starptautisko standartu
                  6
               .
            
            
               9.1.
                     Atkārtojamība
            
         
         
            
               Atkārtojamības relatīvā standartnovirze, kas izsaka to neatkarīgo analītisko rezultātu mainīgumu, kurus viens un tas pats laborants ieguvis, vienu un to pašu paraugu testējot ar vienu un to pašu aparatūru tādos pašos apstākļos un īsā laika intervālā, nedrīkst pārsniegt 2 %. Ja šādos apstākļos ir veiktas divas noteikšanas, relatīvā starpība starp abiem rezultātiem nedrīkst būt lielāka par 6 % no rezultātu vidējā aritmētiskā.
            
            
               9.2.
                     Reproducējamība
            
            
               Ja laboranti dažādās laboratorijās ir veikuši divas noteikšanas, vienu un to pašu paraugu testējot ar atšķirīgu aparatūru atšķirīgos apstākļos, abu rezultātu relatīvā starpība nedrīkst būt lielāka par 11 % no rezultātu vidējā aritmētiskā.
            
            
               10.ATSAUCES
            
            
               10.1.
                     Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., ‘Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids’. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).
            
            
            
               1. attēls.
            
            
               HPLC attēls, kurā redzami OPA atvasinājumi fosfatidilserīns (PS) un fosfatidiletanolamīns (PE) atjaunota vājpiena pulvera metanola ekstraktā. Parādīts PS, PE un triptamīna (iekšējais standarts) smaiļu integrēšanas režīms.
            
            
               
                  
            
            
            
            
               
                  Fluorescence (brīvi izvēlētas vienības)
               
            
            
            
               II papildinājums
            
            
               SIERA SŪKALU DETEKTĒŠANA INTERVENCES KRĀJUMIEM PAREDZĒTĀ VĀJPIENA PULVERĪ, NOSAKOT KAZEĪNMAKROPEPTĪDUS AR AUGSTEFEKTĪVO ŠĶIDRUMA HROMATOGRĀFIJU (HPLC)
            
            
               1.DARBĪBAS JOMA UN PIEMĒROŠANAS JOMA
            
            
               Ar šo metodi iespējams, nosakot kazeīnmakropeptīdus, detektēt siera sūkalas intervences krājumiem paredzētā vājpiena pulverī.
            
            
               2.ATSAUCE
            
            
               Starptautiskais standarts ISO 707 “Piens un piena produkti. Norādījumi par paraugu ņemšanu”.
            
            
               3.DEFINĪCIJA
            
            
               Siera sūkalu sausnas saturu izsaka masas procentos, ko nosaka pēc kazeīnmakropeptīdu satura saskaņā ar aprakstīto procedūru.
            
         
         
            
               4.PRINCIPS
            
            
               –Vājpiena atjaunošana no pulvera, tauku un olbaltumvielu atdalīšana ar trihloretiķskābi, pēc tam centrifugēšana vai filtrēšana.
            
            
               –Kazeīnmakropeptīdu (CMP) daudzuma noteikšana supernatantā, izmantojot augstefektīvo šķidruma hromatogrāfiju (HPLC).
            
            
               –To rezultātu novērtēšana, kuri iegūti, paraugus salīdzinot ar standartparaugiem, kas sastāv no vājpiena pulvera, kuram ir vai nav pievienota zināma procentuālā daļa sūkalu pulvera.
            
            
               5.REAĢENTI
            
            
               Visi reaģenti ir atzītas analītiskas tīrības pakāpes reaģenti. Izmanto destilētu ūdeni vai ūdeni ar vismaz līdzvērtīgu tīrību.
            
            
               5.1.
                     Trihloretiķskābes šķīdums
            
            
               Ūdenī izšķīdina 240 g trihloretiķskābes (CCl3COOH) un uzpilda līdz 1 000 ml. Šķīdumam jābūt dzidram un bezkrāsainam.
            
            
               5.2.
                     Eluenta šķīdums, pH 6,0
            
            
               Aptuveni 700 ml ūdens izšķīdina 1,74 g dikālija hidrogēnfosfāta (K2HPO4), 12,37 g kālija dihidrogēnfosfāta (KH2PO4) un 21,41 g nātrija sulfāta (Na2SO4). Vajadzības gadījumā pH koriģē uz 6,0, izmantojot fosforskābes vai kālija hidroksīda šķīdumu.
            
            
               Uzpilda ar ūdeni līdz 1 000 ml un homogenizē.
            
            
               Piezīme.
                     Eluenta sastāvu var atjaunināt, lai tas atbilstu standartu sertifikātam vai kolonnu pildījuma materiāla ražotāja ieteikumiem.
            
            
               Eluenta šķīdumu pirms izmantošanas filtrē caur membrānas filtru, kura poru diametrs ir 0,45 μm.
            
            
               5.3.
                     Skalošanas šķīdinātājs
            
            
               Vienu tilpumu acetonitrila (CH3CN) sajauc ar deviņiem tilpumiem ūdens. Maisījumu pirms izmantošanas filtrē caur membrānas filtru, kura poru diametrs ir 0,45 μm.
            
            
               Piezīme.
                     Var izmantot jebkuru citu baktericīdas iedarbības skalošanas šķīdinātāju, kas nepasliktina kolonnas izšķirtspēju.
            
            
               5.4.
                     Standartparaugi
            
            
               5.4.1.
                     Vājpiena pulveris, kas atbilst šīs regulas prasībām (t. i., [0])
            
            
               5.4.2.
                     Tas pats vājpiena pulveris, kuram piemaisīti 5 % (m/m) siera sūkalu pulvera ar standartsastāvu (t. i., [5]).
            
            
               6.APARATŪRA
            
         
         
            
               6.1.
                     Analītiskie svari
            
            
               6.2.
                     Fakultatīvi – centrifūga, kas spēj sasniegt centrbēdzes spēku 2 200 g un ir aprīkota ar centrifūgas mēģenēm, kuras noslēdzamas ar aizbāzni vai korķi un kuru ietilpība ir aptuveni 50 ml
            
            
               6.3.
                     Mehāniskais kratītājs
            
            
               6.4.
                     Magnētiskais maisītājs
            
            
               6.5.
                     Stikla piltuves ar aptuveni 7 cm diametru
            
            
               6.6.
                     Vidēji ātras filtrācijas filtrpapīrs ar aptuveni 12,5 cm diametru
            
            
               6.7.
                     Stikla filtrēšanas iekārta ar membrānas filtru, kura poru diametrs ir 0,45 μm
            
            
               6.8.
                     Mērpipetes, ar kurām var izdalīt 10 ml (ISO 648, A klase vai ISO/R 835), vai dozēšanas sistēma, ar ko divās minūtēs var izdalīt 10,0 ml
            
            
               6.9.
                     Dozēšanas sistēma, kas spēj izdalīt 20,0 ml ūdens aptuveni 50 °C temperatūrā
            
            
               6.10.
                     Termostatējama ūdens vanna, noregulēta uz 25 °C ± 0,5 °C
            
            
               6.11.
                     HPLC iekārta ar turpmāk norādītajām sastāvdaļām
            
            
               6.11.1.
                     Sūknis
            
            
               6.11.2.
                     Rokas vai automātiskais injektors ar 15–30 μl ietilpību
            
            
               6.11.3.
                     Divas secīgi savienotas TSK 2 000-SW kolonnas (garums 30 cm, iekšējais diametrs 0,75 cm) vai līdzvērtīgas kolonnas (piem., viena TSK 2000-SWxl, viena Agilent Technologies Zorbax GF 250) un priekškolonna (3 cm × 0,3 cm), piepildīta ar I 125 vai līdzvērtīgas efektivitātes materiālu.
            
            
               6.11.4.
                     Termostatējama kolonnu krāsns, noregulēta uz 35 ± 1 °C
            
            
               6.11.5.
                     Maināma viļņu garuma UV detektors, ar ko iespējams veikt mērījumus pie 205 nm ar jutību 0,008 Å
            
            
               6.11.6.
                     Integrators, ar ko iespējams veikt integrēšanu starp ieplakām
            
            
               Piezīme.Var strādāt ar kolonnām, kas uzglabātas istabas temperatūrā, bet to izšķirtspēja ir nedaudz mazāka. Tādā gadījumā temperatūrai katrā atsevišķā analīžu kārtā nevajadzētu atšķirties vairāk kā par ± 5 °C.
            
            
               7.PARAUGU ŅEMŠANA
            
            
               7.1.
                     Paraugus ņem saskaņā ar Starptautiskajā standartā ISO 707 noteikto kārtību. Tomēr dalībvalstis var izmantot citu paraugu ņemšanas metodi ar nosacījumu, ka tā atbilst minētā standarta principiem.
            
         
         
            
               7.2.
                     Paraugu uzglabā apstākļos, kas nepieļauj tā bojāšanos vai sastāva izmaiņas.
            
            
               8.PROCEDŪRA
            
            
               8.1.
                     Analizējamā parauga sagatavošana
            
            
               Piena pulveri pārnes traukā, kura ietilpība ir aptuveni divreiz lielāka par pulvera tilpumu un kurš aprīkots ar hermētisku vāku. Trauku tūlīt noslēdz. Piena pulveri labi samaisa, trauku vairākkārt apvēršot.
            
            
               8.2.
                     Analizējamā porcija
            
            
               Centrifūgas mēģenē (6.2.) vai piemērotā kolbā ar aizbāzni (50 ml) iesver 2,000 ± 0,001 g analizējamā parauga.
            
            
               8.3.
                     Tauku un olbaltumvielu atdalīšana
            
            
               8.3.1.
                     Analizējamajai porcijai pievieno 20,0 ml silta ūdens (50 °C). Pulveri izšķīdina, piecas minūtes kratot ar mehānisko kratītāju (6.3.). Mēģeni ievieto ūdens vannā (6.10.) un ļauj temperatūrai stabilizēties līdz 25 °C.
            
            
               8.3.2.
                     Divu minūšu laikā, enerģiski maisot ar magnētisko maisītāju (6.4.), pievieno 10,0 ml trihloretiķskābes šķīduma (5.1.) aptuveni 25 °C temperatūrā. Mēģeni uz 60 minūtēm ievieto ūdens vannā (6.10.).
            
            
               8.3.3.
                     Centrifugē (6.2.) 10 minūtes ar 2 200 g vai filtrē caur filtrpapīru (6.6.), izlejot pirmos 5 ml filtrāta.
            
            
               8.4.
                     Hromatogrāfiskā noteikšana
            
            
               8.4.1.
                     HPLC iekārtā (6.11.) ievada 15–30 μl precīzi nomērīta supernatanta vai filtrāta (8.3.3.), darbojoties ar plūsmas ātrumu 1,0 ml eluenta šķīduma (5.2.) minūtē.
            
            
               1. piezīme. Atkarībā no lietoto kolonnu iekšējā diametra vai kolonnu ražotāja instrukcijām var izmantot citu plūsmas ātrumu.
            
            
               2. piezīme. Katrā pārtraukumā kolonnas skalo ar ūdeni. Tajās nekad neatstāj eluenta šķīdumu (5.2.).
            
            
               Pirms katra vairāk nekā 24 stundu ilga pārtraukuma kolonnas skalo ar ūdeni, tad vismaz trīs stundas mazgā ar šķīdumu (5.3.), kura plūsmas ātrums ir 0,2 ml minūtē.
            
            
               8.4.2.
                     Analizējamā parauga [E] hromatogrāfiskās analīzes rezultātā iegūst hromatogrammu, kurā katru smaili identificē pēc tās aiztures laika.
            
            
                     
                        II smaile:
                     
                  
                  
                     
                        hromatogrammas otrā smaile ar aiztures laiku aptuveni 12,5 minūtes.
                     
                  
               
                     
                        III smaile:
                     
                  
                  
                     
                        hromatogrammas trešā smaile, kas atbilst CMP, ar aiztures laiku aptuveni 15,5 minūtes.
                     
                  
               
               Kolonnas vai kolonnu izvēle var būtiski ietekmēt atsevišķo smaiļu aiztures laikus.
            
            
               Integrators (6.11.6.) automātiski aprēķina katras smailes laukumu A:
            
            
                     
                        AII:
                     
                  
                  
                     
                        II smailes laukums,
                     
                  
               
                     
                        AIII:
                     
                  
                  
                     
                        III smailes laukums.
                     
                  
               
         
            
               Pirms kvantitatīvas interpretācijas ir svarīgi pārbaudīt katras hromatogrammas izskatu, lai konstatētu jebkādas novirzes aparatūras vai kolonnu nepareizas darbības vai analizētā parauga izcelsmes vai īpašību dēļ.
            
            
               Šaubu gadījumā analīzi atkārto.
            
            
               8.5.
                     Kalibrēšana
            
            
               8.5.1.
                     Standartparaugiem (5.4.) precīzi piemēro 8.2.–8.4.2. punktā aprakstīto procedūru.
            
            
               Izmanto svaigi sagatavotus šķīdumus, jo 8 % trihloretiķskābes vidē CMP noārdās. Zudumus lēš kā 0,2 % stundā 30 °C temperatūrā.
            
            
               8.5.2.
                     Pirms paraugu hromatogrāfiskās noteikšanas kolonnas kondicionē, šķīdumā (8.5.1.) atkārtoti ievadot standartparaugu (5.4.2.), līdz CMP atbilstošās smailes laukums un aiztures laiks kļūst konstants.
            
            
               8.5.3.
                     Atbildes koeficientus R nosaka, ievadot tādu pašu filtrāta (8.5.1.) tilpumu, kāds izmantots paraugiem.
            
            
               9.REZULTĀTU IZTEIKŠANA
            
            
               9.1.
                     Aprēķināšanas metode un formulas
            
            
               9.1.1.
                     Atbildes koeficientu R aprēķināšana
            
            
                     
                        II smaile:
                     
                  
                  
                     
                        RII = 100/(AII[0]),
                     
                  
               
                     
                        kur:
                     
                  
               
                     
                        RII 
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        II smailes atbildes koeficients,
                     
                  
               
                     
                        AII [0] 
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        standartparauga [0] II smailes laukums, kas iegūts atbilstoši 8.5.3. punktam.
                     
                  
               
                     
                        III smaile:
                     
                  
                  
                     
                        RIII = W/(AIII[5] – AIII[0]),
                     
                  
               
            
                     
                        kur:
                     
                  
               
                     
                        RIII
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        III smailes atbildes koeficients,
                     
                  
               
                     
                        AIII [0] un AIII [5]
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        standartparaugu [0] un [5] III smailes laukums, kas iegūts atbilstoši 8.5.3. punktam,
                     
                  
               
                     
                        W
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        sūkalu daudzums standartparaugā [5], t. i., 5.
                     
                  
               
               9.1.2.
                     Parauga [E] smaiļu relatīvā laukumu aprēķināšana
            
            
               SII[E] = RII × AII[E]
            
            
               SIII[E] = RIII × AIII[E]
            
            
               SIV[E] = RIV × AIV[E],
            
            
                     
                        kur:
                     
                  
               
                     
                        SII [E], SIII [E], SIV [E]
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        parauga [E] attiecīgi II, III un IV smailes relatīvais laukums,
                     
                  
               
                     
                        AII [E], AIII [E] 
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        parauga [E] attiecīgi II un III smailes laukums, kas iegūts atbilstoši 8.4.2. punktam
                     
                  
               
                     
                        RII, RIII
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        atbildes koeficienti, kas aprēķināti atbilstoši 9.1.1. punktam.
                     
                  
               
               9.1.3.
                     Parauga [E] III smailes relatīvā aiztures laika aprēķināšana: RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5]),
            
            
                     
                        kur:
                     
                  
               
                     
                        RRTIII [E]
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        parauga [E] III smailes relatīvais aiztures laiks,
                     
                  
               
                     
                        RTIII [E]
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        parauga [E] III smailes aiztures laiks, kas iegūts atbilstoši 8.4.2. punktam,
                     
                  
               
                     
                        RTIII [5]
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        kontrolparauga [5] III smailes aiztures laiks, kas iegūts atbilstoši 8.5.3. punktam.
                     
                  
               
         
            
               9.1.4.
                     Eksperimentos ir pierādīts, ka pastāv lineāra sakarība starp III smailes relatīvo aiztures laiku, t. i., RRTIII [E], un pievienotā sūkalu pulvera procentuālo daļu, ja tā ir līdz 10 %.
            
            
               –RRTIII [E] ir < 1,000, ja sūkalu saturs ir > 5 %,
            
            
               –RRTIII [E] ir ≥ 1,000, ja sūkalu saturs ir ≤ 5 %.
            
            
               Pieļaujamā RRTIII vērtību nenoteiktība ir ± 0,002.
            
            
               Parasti RRTIII [0] vērtība nedaudz novirzās no 1,034. Atkarībā no kolonnu stāvokļa vērtība var tuvoties 1,000, tomēr tā vienmēr būs lielāka.
            
            
               9.2.
                     Siera sūkalu pulvera procentuālās daļas aprēķināšana paraugā
            
            
               W = SIII[E] – [1,3 + (SIII[0] – 0,9)],
            
            
                     
                        kur:
                     
                  
               
                     
                        W 
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        siera sūkalu procentuālā daļa (m/m) paraugā [E],
                     
                  
               
                     
                        SIII [E] 
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        analizējamā parauga [E] III smailes relatīvais laukums, kas iegūts atbilstoši 9.1.2. punktam,
                     
                  
               
                     
                        1,3
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        III smailes vidējais relatīvais laukums, izteikts siera sūkalu gramos uz 100 g, noteikts dažādas izcelsmes vājpiena pulverī bez piemaisījumiem. Šis skaitlis ir iegūts eksperimentāli,
                     
                  
               
                     
                        SIII [0]
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        III smailes relatīvais laukums, kas ir vienāds ar RIII × AIII [0]. Šīs vērtības ir iegūtas atbilstoši 9.1.1. un 8.5.3. punktam,
                     
                  
               
                     
                        (SIII [0] – 0,9)
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        vidējā relatīvā laukuma 1,3 korekcija, kas jāveic, ja SIII [0] nav vienāds ar 0,9. Eksperimentāli noteiktais kontrolparauga [0] III smailes vidējais relatīvais laukums ir 0,9.
                     
                  
               
               9.3.
                     Procedūras pareizums
            
            
               9.3.1.
                     Atkārtojamība
            
            
               Starpība starp rezultātiem, ko viens un tas pats analizētājs ieguvis, veicot divas noteikšanas vienlaikus vai uzreiz vienu pēc otras, ar vienu un to pašu aparatūru testējot identisku materiālu, nepārsniedz 0,2 % (m/m).
            
            
               9.3.2.
                     Reproducējamība
            
            
               Starpība starp diviem atsevišķiem un neatkarīgiem rezultātiem, kas iegūti, divās dažādās laboratorijās analizējot identisku testa materiālu, nepārsniedz 0,4 % (m/m).
            
            
               9.4.
                     Interpretācija
            
            
               9.4.1.
                     Pieņem, ka paraugā nav sūkalu, ja III smailes relatīvais laukums SIII [E], izteikts gramos siera sūkalu uz 100 g produkta, ir ≤ 2,0 +(SIII[0] – 0,9),
            
            
               kur:
            
            
                     
                        2,0
                     
                  
                  
                     
                        ir III smailes relatīvā laukuma maksimāli pieļaujamā vērtība, ņemot vērā III smailes vidējo relatīvo laukumu, t. i., 1,3, nenoteiktību, kas rodas vājpiena pulvera sastāva mainīguma dēļ, un metodes reproducējamību (9.3.2.),
                     
                  
               
                     
                        (SIII [0] – 0,9)
                     
                  
                  
                     
                        ir korekcija, kas jāveic, ja laukums SIII [0] nav 0,9 (skatīt 9.2. punktu).
                     
                  
               
               9.4.2.
                     Ja III smailes relatīvais laukums SIII [E] ir > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) un II smailes relatīvais laukums SII [E] ≤ 160, siera sūkalu saturu nosaka, kā norādīts 9.2. punktā.
            
            
               9.4.3.
                     Ja III smailes relatīvais laukums SIII [E] ir > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) un II smailes relatīvais laukums SII [E] ≤ 160, nosaka kopējo olbaltumvielu saturu (P %), tad novērtē pēc 1. un 2. grafika.
            
            
               9.4.4.
                     Dati, kas iegūti, analizējot tādus sausā vājpiena paraugus bez piemaisījumiem, kuriem ir augsts kopējais olbaltumvielu saturs, ir apkopoti 1. un 2. grafikā.
            
         
         
            
               Nepārtrauktā līnija attēlo lineāro regresiju, kuras koeficienti ir aprēķināti ar mazāko kvadrātu metodi.
            
            
               Pārtrauktā taisnā līnija norāda III smailes relatīvā laukuma augšējo robežu ar varbūtību, ka 90 % gadījumu tā netiek pārsniegta.
            
            
               1. un 2. grafika pārtraukto taisno līniju vienādojumi ir šādi:
            
            
                     
                        SIII = 0,376 P % – 10,7
                     
                  
                  
                     
                        (1. grafiks),
                     
                  
               
                     
                        SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93
                     
                  
                  
                     
                        (2. grafiks),
                     
                  
               
               kur attiecīgi:
            
            
                     
                        SIII
                     
                  
                  
                     
                        ir III smailes relatīvais laukums, ko aprēķina pēc kopējā olbaltumvielu satura vai pēc smailes relatīvā laukuma SII [E],
                     
                  
               
                     
                        P %
                     
                  
                  
                     
                        ir kopējais olbaltumvielu saturs, izteikts masas procentos,
                     
                  
               
                     
                        SII [E]
                     
                  
                  
                     
                        ir parauga relatīvais laukums, kas aprēķināts atbilstoši 9.1.2. punktam.
                     
                  
               
               Šie vienādojumi ir ekvivalenti 9.2. punktā minētajam skaitlim 1,3.
            
            
               Nesakritību (T1 un T2) starp atrasto relatīvo laukumu SIII [E] un relatīvo laukumu SIII izsaka šādi: T1 = SIII[E] – [(0,376 P % – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] - 0,9)].
            
            
               9.4.3.2.
            
            
                     
                        Ja T1 un/vai T2
                     
                  
                  
                     
                        ir nulle vai mazāks, siera sūkalu klātbūtne nav nosakāma.
                     
                  
               
                     
                        Ja T1 un T2
                     
                  
                  
                     
                        ir lielāks par nulli, paraugā ir siera sūkalas.
                     
                  
               
               Siera sūkalu saturu aprēķina pēc šādas formulas: W = T2 + 0,91,
            
            
               kur:
            
            
               0,91 ir attālums uz vertikālās ass starp nepārtraukto un pārtraukto taisno līniju.
            
            
               
            
               III papildinājums
            
            
               SIERA SŪKALU SAUSNAS NOTEIKŠANA VĀJPIENA PULVERĪ
            
            
               1.MĒRĶIS: KONSTATĒT, VAI SAUSAJAM VĀJPIENAM IR PIEVIENOTA SIERA SŪKALU SAUSNA
            
            
            
               2.ATSAUCES: STARPTAUTISKAIS STANDARTS ISO 707
            
            
         
         
            
               3.DEFINĪCIJA
            
            
               Siera sūkalu sausnas saturu izsaka masas procentos un nosaka pēc kazeīnmakropeptīdu satura saskaņā ar aprakstīto procedūru.
            
            
               4.PRINCIPS
            
            
               Paraugus analizē ar apgrieztās fāzes augstefektīvo šķidruma hromatogrāfiju (HPLC procedūra), lai noteiktu kazeīnmakropeptīdu A. Rezultātu novērtē, salīdzinot ar standartparaugiem, kas sastāv no vājpiena pulvera ar zināmu procentuālo daļu sūkalu pulvera un bez tās. Rezultāti, kas pārsniedz 1 % (m/m), norāda uz siera sūkalu sausnas klātbūtni.
            
            
               5.REAĢENTI
            
            
               Visi reaģenti ir atzītas analītiskas tīrības pakāpes reaģenti. Izmanto destilētu ūdeni vai ūdeni ar vismaz līdzvērtīgu tīrību. Acetonitrilam jābūt ar spektroskopisku vai HPLC kvalitāti.
            
            
               5.1.
                     Trihloretiķskābes šķīdums
            
            
               Ūdenī izšķīdina 240 g trihloretiķskābes (CCl3COOH) un uzpilda līdz 1 000 ml. Šķīdumam jābūt dzidram un bezkrāsainam.
            
            
               5.2.
                     Eluenti A un B
            
            
               Eluents A: 1 000 ml mērkolbā iepilda 150 ml acetonitrila (CH3CN), 20 ml izopropanola (CH3CHOHCH3) un 1,00 ml trifluoretiķskābes (TFA, CF3COOH). Uzpilda ar ūdeni līdz 1 000 ml.
            
            
               Eluents B: 1 000 ml mērkolbā ielej 550 ml acetonitrila, 20 ml izopropanola un 1,00 ml TFA. Uzpilda ar ūdeni līdz 1 000 ml. Eluenta šķīdumu pirms izmantošanas filtrē caur membrānas filtru, kura poru diametrs ir 0,45 μm.
            
            
               5.3.
                     Kolonnas glabāšana
            
            
               Pēc analīžu veikšanas kolonnu skalo ar eluentu B (gradienta režīmā) un pēc tam skalo ar acetonitrilu (30 minūtes gradienta režīmā). Kolonnu uzglabā acetonitrilā.
            
            
               5.4.
                     Standartparaugi
            
            
               5.4.1.
                     Sausā vājpiena pulveris, kas atbilst intervences krājumiem noteiktajām prasībām (t. i., [0]).
            
            
               5.4.2.
                     Tas pats vājpiena pulveris, kuram piemaisīti 5 % (m/m) siera sūkalu pulvera ar standartsastāvu (t. i., [5]).
            
            
               5.4.3.
                     Tas pats vājpiena pulveris, kuram piemaisīti 50 % (m/m) siera sūkalu pulvera ar standartsastāvu (t. i., [50]).
            
            
               6.APARATŪRA
            
            
               6.1.
                     Analītiskie svari
            
            
               6.2.
                     Fakultatīvi – centrifūga, kas spēj sasniegt centrbēdzes spēku 2 200 g un ir aprīkota ar centrifūgas mēģenēm, kuras noslēdzamas ar aizbāzni vai korķi un kuru ietilpība ir aptuveni 50 ml
            
         
         
            
               6.3.
                     Mehāniskais kratītājs
            
            
               6.4.
                     Magnētiskais maisītājs
            
            
               6.5.
                     Stikla piltuves ar aptuveni 7 cm diametru
            
            
               6.6.
                     Vidēji ātras filtrācijas filtrpapīrs ar aptuveni 12,5 cm diametru
            
            
               6.7.
                     Stikla filtrēšanas iekārta ar membrānas filtru, kura poru diametrs ir 0,45 μm
            
            
               6.8.
                     Mērpipetes, ar kurām var izdalīt 10 ml (ISO 648, A klase vai ISO/R 835), vai dozēšanas sistēma, ar ko divās minūtēs var izdalīt 10,0 ml
            
            
               6.9.
                     Dozēšanas sistēma, kas spēj izdalīt 20,0 ml ūdens aptuveni 50 °C temperatūrā
            
            
               6.10.
                     Termostatējama ūdens vanna, noregulēta uz 25 °C ± 0,5 °C
            
            
               6.11.
                     HPLC iekārta ar turpmāk norādītajām sastāvdaļām
            
            
               6.11.1.
                     Binārā gradienta režīma sūknēšanas sistēma
            
            
               6.11.2.
                     Rokas vai automātiskais injektors ar 100 μl ietilpību
            
            
               6.11.3.
                     Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 kolonna (garums 25 cm, iekšējais diametrs 0,46 cm) vai līdzvērtīga lielporu silikagela apgrieztās fāzes kolonna
            
            
               6.11.4.
                     Termostatējama kolonnu krāsns, noregulēta uz 35 ± 1 °C
            
            
               6.11.5.
                     Mainīga viļņu garuma UV detektors, kas ļauj veikt mērījumus pie 210 nm (vajadzības gadījumā var izmantot lielāku viļņu garumu līdz 220 nm) ar 0,02 Å jutību
            
            
               6.11.6.
                     Integrators, kuru var iestatīt integrēšanai līdz kopējai bāzes līnijai vai starp ieplakām
            
            
               Piezīme. Kolonnas darbība istabas temperatūrā ir iespējama, ja istabas temperatūra svārstās ne vairāk par 1 °C, pretējā gadījumā rodas pārāk daudz CMPA aiztures laika variāciju.
            
            
               7.PARAUGU ŅEMŠANA
            
            
               7.1.
                     Paraugus ņem saskaņā ar Starptautiskajā standartā ISO 707 noteikto kārtību. Tomēr dalībvalstis var izmantot citu paraugu ņemšanas metodi ar nosacījumu, ka tā atbilst minētā standarta principiem.
            
            
               7.2.
                     Paraugu uzglabā apstākļos, kas nepieļauj tā bojāšanos vai sastāva izmaiņas.
            
            
               8.PROCEDŪRA
            
         
         
            
               8.1.
                     Analizējamā parauga sagatavošana
            
            
               Piena pulveri pārnes traukā, kura ietilpība ir aptuveni divreiz lielāka par pulvera tilpumu un kurš aprīkots ar hermētisku vāku. Trauku tūlīt noslēdz. Piena pulveri labi samaisa, trauku vairākkārt apvēršot.
            
            
               8.2.
                     Analizējamā porcija
            
            
               Centrifūgas mēģenē (6.2.) vai piemērotā kolbā ar aizbāzni (50 ml) iesver 2,00 ± 0 001 g analizējamā parauga.
            
            
               Piezīme. Maisījumu gadījumā nosver tādu analizējamā parauga daudzumu, lai attaukotā parauga porcija atbilstu 2,00 g.
            
            
               8.3.
                     Tauku un olbaltumvielu atdalīšana
            
            
               8.3.1.
                     Analizējamajai porcijai pievieno 20,0 ml silta ūdens (50 °C). Pulveri izšķīdina, piecas minūtes kratot ar mehānisko kratītāju (6.3.). Mēģeni ievieto ūdens vannā (6.10.) un ļauj temperatūrai stabilizēties līdz 25 °C.
            
            
               8.3.2.
                     Divu minūšu laikā, rūpīgi maisot ar magnētisko maisītāju (6.4.), vienmērīgi pievieno 10,0 ml trihloretiķskābes šķīduma (5.1.) aptuveni 25 °C temperatūrā. Mēģeni uz 60 minūtēm ievieto ūdens vannā (6.10.).
            
            
               8.3.3.
                     Centrifugē (6.2.) 10 minūtes ar 2 200 g vai filtrē caur filtrpapīru (6.6.), izlejot pirmos 5 ml filtrāta.
            
            
               8.4.
                     Hromatogrāfiskā noteikšana
            
            
               8.4.1.
                     Apgrieztās fāzes HPLC metode izslēdz iespēju iegūt viltuspozitīvus rezultātus skābo paniņu pulvera klātbūtnes dēļ.
            
            
               8.4.2.
                     Pirms apgrieztās fāzes HPLC analīzes ir jāoptimizē gradienta apstākļi. Gradienta režīma sistēmām, kuru mirušais tilpums (tilpums no punkta, kurā saplūst šķīdinātāji, līdz injektora cilpas tilpumam, ieskaitot) ir aptuveni 6 ml, optimālais CMPA aiztures laiks ir 26 ± 2 minūtes. Gradienta režīma sistēmām, kuru mirušais tilpums ir mazāks (piemēram, 2 ml), optimālajam aiztures laikam vajadzētu būt 22 minūtēm.
            
            
               Ņem šķīdumus, kas sagatavoti no standartparaugiem (5.4.) bez siera sūkalām un ar 50 % siera sūkalu.
            
            
               100 μl supernatanta vai filtrāta (8.3.3.) ievada HPLC iekārtā, kas darbojas 1. tabulā dotajos izmēģinājuma gradienta apstākļos.
            
            
            
               1. tabula
            
            
               Izmēģinājuma gradienta apstākļi hromatogrāfijas optimizēšanai
            
            
                     
                        Laiks
                     
                     
                        (min)
                     
                  
                  
                     
                        Plūsma
                     
                     
                        (ml/min)
                     
                  
                  
                     
                        % A
                     
                  
                  
                     
                        % B
                     
                  
                  
                     
                        Līkne
                     
                  
               
                     
                        Sākums
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
                  
                     
                        90
                     
                  
                  
                     
                        10
                     
                  
                  
                     
                        *
                     
                  
               
                     
                        27
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
                  
                     
                        60
                     
                  
                  
                     
                        40
                     
                  
                  
                     
                        lineāra
                     
                  
               
                     
                        32
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
                  
                     
                        10
                     
                  
                  
                     
                        90
                     
                  
                  
                     
                        lineāra
                     
                  
               
                     
                        37
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
                  
                     
                        10
                     
                  
                  
                     
                        90
                     
                  
                  
                     
                        lineāra
                     
                  
               
                     
                        42
                     
                  
                  
                     
                        1,0
                     
                  
                  
                     
                        90
                     
                  
                  
                     
                        10
                     
                  
                  
                     
                        lineāra
                     
                  
               
            
               Divu hromatogrammu salīdzinājumam būtu jāparāda CMPΑ smailes atrašanās vieta.
            
         
         
            
            
               Sākotnējo šķīdinātāja sastāvu, kas izmantojams normālajam gradientam (skatīt 8.4.3.), var aprēķināt pēc šādas formulas: % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) × 30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) × 1,11,
            
            
            
                     
                        kur:
                     
                  
               
                     
                        RTcmpA
                     
                  
                  
                     
                        :
                     
                  
                  
                     
                        CMPΑ aiztures laiks izmēģinājuma gradienta režīmā,
                     
                  
               
                     
                        10
                     
                  
                  
                     
                        :
                     
                  
                  
                     
                        sākotnējais % B izmēģinājuma gradienta režīmā,
                     
                  
               
                     
                        2,5
                     
                  
                  
                     
                        :
                     
                  
                  
                     
                        % B viduspunktā mīnus % B sākumpunktā normāla gradienta režīmā,
                     
                  
               
                     
                        13,5
                     
                  
                  
                     
                        :
                     
                  
                  
                     
                        izmēģinājuma gradienta viduspunkta laiks,
                     
                  
               
                     
                        26
                     
                  
                  
                     
                        :
                     
                  
                  
                     
                        prasītais CMPΑ aiztures laiks,
                     
                  
               
                     
                        6
                     
                  
                  
                     
                        :
                     
                  
                  
                     
                        izmēģinājuma gradienta un normālā gradienta slīpuma attiecība,
                     
                  
               
                     
                        30
                     
                  
                  
                     
                        :
                     
                  
                  
                     
                        % B sākumpunktā mīnus % B pēc 27 minūtēm izmēģinājuma gradienta režīmā,
                     
                  
               
                     
                        27
                     
                  
                  
                     
                        :
                     
                  
                  
                     
                        izmēģinājuma gradienta ilgums.
                     
                  
               
            
               8.4.3.
                     Ņem analizējamo paraugu šķīdumus
            
            
               100 μl precīzi nomērīta supernatanta vai filtrāta (8.3.3.) ievada HPLC iekārtā, kas darbojas ar plūsmas ātrumu 1,0 ml eluenta šķīduma (5.2.) minūtē.
            
            
               Eluenta sastāvu analīžu sākumā nosaka saskaņā ar 8.4.2. punktu. Parasti tas ir tuvs attiecībai A:B = 76:24 (5.2.). Tūlīt pēc ievadīšanas sākas lineārais gradients, kura rezultātā pēc 27 minūtēm tiek sasniegta par 5 % lielāka B procentuālā daļa. Pēc tam sākas lineārais gradients, kura rezultātā eluenta sastāvs piecās minūtēs sasniedz 90 % B. Šādu sastāvu saglabā piecas minūtes, pēc tam piecu minūšu laikā lineārā gradienta režīmā to maina līdz sākotnējam sastāvam. Atkarībā no sūknēšanas sistēmas iekšējā tilpuma nākamo ievadīšanu var veikt 15 minūtes pēc sākotnējo apstākļu sasniegšanas.
            
            
               1. piezīme. CMPA aiztures laikam vajadzētu būt 26 ± 2 minūtes. To var panākt, mainot pirmā gradienta sākuma un beigu apstākļus. Tomēr % B starpība pirmā gradienta sākuma un beigu apstākļos paliek 5 % B.
            
            
               2. piezīme. Eluentiem vajadzētu būt pietiekami degazētiem, un tiem arī būtu jāpaliek degazētiem. Tas ir būtiski, lai gradienta režīma sūknēšanas sistēma darbotos pareizi. CMPA smailes aiztures laika standartnovirzei vajadzētu būt mazākai par 0,1 minūti (n = 10).
            
            
               3. piezīme. Pēc katriem pieciem paraugiem jāievada references paraugs [5], kas jāizmanto, lai aprēķinātu jauno atbildes koeficientu R (9.1.1.).
            
            
               8.4.4.
                     Analizējamā parauga [E] hromatogrāfiskās analīzes rezultātus iegūst kā hromatogrammu, kurā CMPA smaili nosaka pēc tās aiztures laika, kas ir aptuveni 26 minūtes.
            
            
               Integrators (6.11.6.) automātiski aprēķina CMPA smailes augstumu H. Katrā hromatogrammā jāpārbauda bāzes līnijas atrašanās vieta. Ja bāzes līnija atrodas nepareizā vietā, analīze vai integrēšana ir jāatkārto.
            
            
               Piezīme. Ja CMPA smaile ir pietiekami atdalīta no citām smailēm, bāzes līniju novelk starp ieplakām, pretējā gadījumā pret kopējo bāzes līniju novelk perpendikulus, kuru sākumpunktam jābūt tuvu pie CMPA smailes (tātad ne pie t = 0 min!). Standartam un analizējamajiem paraugiem izmanto viena veida integrēšanu, un kopējas bāzes līnijas gadījumā pārbauda tās atbilstību paraugiem un standartam.
            
            
               Pirms kvantitatīvas interpretācijas ir svarīgi pārbaudīt katras hromatogrammas izskatu, lai konstatētu jebkādas novirzes aparatūras vai kolonnas nepareizas darbības vai analizējamā parauga izcelsmes vai īpašību dēļ. Šaubu gadījumā analīzi atkārto.
            
            
               8.5.
                     Kalibrēšana
            
            
               8.5.1.
                     Standartparaugiem (5.4.1.–5.4.2.) precīzi piemēro 8.2.–8.4.4. punktā aprakstīto procedūru. Izmanto svaigi sagatavotus šķīdumus, jo CMP 8 % trihloretiķskābes vidē istabas temperatūrā noārdās. Šķīdums saglabā stabilitāti 24 stundas 4 °C temperatūrā. Ja tiek veiktas garas analīžu virknes, automātiskajā injektorā vēlams izmantot dzesējamu paraugu paplāti.
            
            
               Piezīme. 8.4.2. punktu var izlaist, ja % B sākotnējos apstākļos ir zināms no iepriekšējām analīzēm.
            
            
               References parauga [5] hromatogrammai vajadzētu būt analogai 1. attēlā parādītajai. Šajā attēlā pirms CMPA smailes ir divas mazas smailes. Ir būtiski iegūt līdzīgu atdalīšanu.
            
            
               8.5.2.
                     Pirms paraugu hromatogrāfiskās noteikšanas ievada 100 μl standartparauga bez siera sūkalām [0] (5.4.1.).
            
         
         
            
               CMPA smailes aiztures laikā hromatogrammai nebūtu jāuzrāda smaile.
            
            
               8.5.3.
                     Atbildes koeficientus R nosaka, ievadot tādu pašu filtrāta (8.5.1.) tilpumu, kāds izmantots paraugiem.
            
            
               9.REZULTĀTU IZTEIKŠANA
            
            
               9.1.
                     Aprēķināšanas metode un formulas
            
            
               9.1.1.
                     Atbildes koeficienta R aprēķināšana
            
            
               CMPA smaile: R = W/H,
            
            
                     
                        kur:
                     
                  
               
                     
                        R
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        CMPA smailes atbildes koeficients,
                     
                  
               
                     
                        H
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        CMPA smailes augstums,
                     
                  
               
                     
                        W
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        sūkalu daudzums standartparaugā [5].
                     
                  
               
            
               9.2.
                     Siera sūkalu pulvera procentuālās daļas aprēķināšana paraugā
            
            
               W(E) = R × H(E),
            
            
                     
                        kur:
                     
                  
               
                     
                        W(E)
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        siera sūkalu procentuālā daļa (m/m) paraugā [E],
                     
                  
               
                     
                        R
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        CMPA smailes atbildes koeficients (9.1.1.),
                     
                  
               
                     
                        H(E)
                     
                  
                  
                     
                        =
                     
                  
                  
                     
                        parauga (E) CMPA smailes augstums.
                     
                  
               
               Siera sūkalu sausnas klātbūtni uzskata par konstatētu, ja W(E) ir lielāks par 1 % un starpība starp tā aiztures laiku un standartparauga [5] aiztures laiku ir mazāka par 0,2 minūtēm.
            
            
               9.3.
                     Procedūras pareizums
            
            
               9.3.1.
                     Atkārtojamība
            
            
               Starpība starp rezultātiem, ko viens un tas pats analizētājs ieguvis, veicot divas noteikšanas vienlaikus vai uzreiz vienu pēc otras, ar vienu un to pašu aparatūru testējot identisku materiālu, nepārsniedz 0,2 % (m/m).
            
            
               9.3.2.
                     Reproducējamība
            
            
               Nav noteikta.
            
            
               9.3.3.
                     Linearitāte
            
            
               No 0 % līdz 16 % siera sūkalu jāiegūst lineāra attiecība ar korelācijas koeficientu > 0,99.
            
            
               9.4.
                     Interpretācija
            
         
         
            
               1 % robeža ietver nenoteiktību reproducējamības dēļ.
            
            
            
               1. attēls.
            
            
               Ni—4.6. standarts
            
            
            
               
                  CMPA
               
            
            
               
            
               ”;
            
            
               3) pievieno šādus pielikumus:
            
            
               “VI PIELIKUMS
            
            
               Privātai uzglabāšanai paredzēta sviesta analīžu metodes
            
            
                     
                        Parametrs
                     
                  
                  
                     
                        Metode
                     
                  
               
                     
                        Tauki
                           7
                        
                     
                  
                  
                     
                        ISO 17189 vai ISO 3727 3. daļa
                     
                  
               
                     
                        Ūdens
                     
                  
                  
                     
                        ISO 3727 1. daļa
                     
                  
               
                     
                        Beztauku sausna (izņemot sāli)
                     
                  
                  
                     
                        ISO 3727 2. daļa
                     
                  
               
                     
                        Sāls
                     
                  
                  
                     
                        ISO 15648
                     
                  
               
            
            
            
            
            
            
            
            
         
         
            
               VII PIELIKUMS
            
            
               Privātai uzglabāšanai paredzēta vājpiena pulvera analīžu metodes
            
            
                     
                        Parametrs
                     
                  
                  
                     
                        Metode
                     
                  
               
                     
                        Tauki
                     
                  
                  
                     
                        ISO 1736
                     
                  
               
                     
                        Olbaltumvielas
                     
                  
                  
                     
                        ISO 8968 1. daļa
                     
                  
               
                     
                        Ūdens
                     
                  
                  
                     
                        ISO 5537
                     
                  
               
            
               VIII PIELIKUMS
            
            
               Privātai uzglabāšanai paredzēta siera analīžu metodes
            
            
               1. Papildinājumā izklāstīto analīžu metodi izmanto, lai pārliecinātos par to, ka siers, kas gatavots tikai no aitas piena, kazas piena vai bifeļmātes piena vai no aitas, kazas un bifeļmātes piena maisījuma, nesatur govs piena kazeīnu.
            
            
               Uzskata, ka govs piena kazeīna klātbūtne ir konstatēta, ja govs piena kazeīna saturs analizētajā paraugā ir vienāds ar vai augstāks par tā saturu references paraugā, kas satur 1 % govs piena, kā noteikts papildinājumā.
            
            
               2. Var lietot metodes, ar kurām detektē govs piena kazeīnu 1. punktā minētajos sieros, ja:
            
            
               a) to detektēšanas robeža ir maksimāli 0,5 % un
            
            
               b) ar tām nevar iegūt viltuspozitīvus rezultātus, un
            
            
               c) govs piena kazeīns ir detektējams ar vajadzīgo jutību pat pēc ilgstošiem nogatavināšanas periodiem, kādi var gadīties parastos tirdzniecības apstākļos.
            
            
               Ja minētie nosacījumi nav izpildīti, izmanto papildinājumā izklāstīto metodi. 
            
            
               Papildinājums
            
            
               METODE GOVS PIENA UN KAZEINĀTA DETEKTĒŠANAI SIEROS, KAS GATAVOTI NO AITAS PIENA, KAZAS PIENA VAI BIFEĻMĀTES PIENA VAI NO AITAS, KAZAS UN BIFEĻMĀTES PIENA MAISĪJUMIEM
            
            
            
               1.DARBĪBAS JOMA 
            
            
               Govs piena un kazeināta detektēšana sieros, kas gatavoti no aitas piena, kazas piena, bifeļmātes piena vai no aitas, kazas un bifeļmātes piena maisījumiem, ar γ-kazeīnu izoelektrisko fokusēšanu pēc plazminolīzes.
            
            
               2.PIEMĒROŠANAS JOMA
            
            
               Šī metode ir piemērota sensitīvai un specifiskai svaiga govs piena un termiski apstrādāta govs piena un kazeināta detektēšanai svaigos un nogatavinātos sieros, kas gatavoti no aitas piena, kazas piena, bifeļmātes piena vai no aitas, kazas un bifeļmātes piena maisījumiem. Tā nav piemērota, lai konstatētu, vai pienam un sieram ir piemaisīti termiski apstrādāti govs piena sūkalu olbaltumvielu koncentrāti.
            
         
         
            
               3.METODES PRINCIPS
            
            
               3.1.
                     Kazeīnu izolēšana no siera un references standartiem
            
            
               3.2.
                     Izolēto kazeīnu šķīdināšana un šķelšana ar plazmīnu (EC.3.4.21.7.)
            
            
               3.3.
                     Ar plazmīnu apstrādāto kazeīnu izoelektriskā fokusēšana urīnvielas klātbūtnē un olbaltumvielu iekrāsošana
            
            
               3.4.
                     Iekrāsoto γ3 un γ2 kazeīna joslu (govs piena klātbūtnes pierādījums) novērtēšana, no parauga iegūtās joslas salīdzinot ar joslām, kas tajā pašā gelā iegūtas no references standartiem, kuri satur 0 % un 1 % govs piena.
            
            
               4.REAĢENTI
            
            
               Ja vien nav norādīts citādi, izmanto analītiski tīras vielas. Izmanto divreiz destilētu ūdeni vai ūdeni ar līdzvērtīgu tīrību.
            
            
               Piezīme. Turpmāk izklāstītās prasības attiecas uz laboratorijā sagatavotiem urīnvielu saturošiem poliakrilamīda geliem, kuru izmēri ir 265 x 125 x 0,25 mm. Ja izmanto cita izmēra un cita veida gelu, atdalīšanas apstākļus var nākties koriģēt.
            
            
               Izolelektriskā fokusēšana
            
            
               4.1.
                     Reaģenti urīnvielu saturošu poliakrilamīda gelu iegūšanai
            
            
               4.1.1.
                     Gela izejšķīdums
            
            
               Ūdenī izšķīdina:
            
            
               4,85 g akrilamīda,
            
            
               0,15 g N, N'-metilēn-bis-akrilamīda (BIS),
            
            
               48,05 g urīnvielas,
            
            
               15,00 g glicerīna (87 masas %),
            
            
               uzpilda līdz 100 ml, glabā ledusskapī brūna stikla pudelē.
            
            
               Piezīme. Norādīto neirotoksisko akrilamīdu iesvaru vietā var izmantot iepriekš sajauktu akrilamīda/BIS šķīdumu, kas pieejams tirdzniecībā. Ja šāds šķīdums satur 30 % (w/v) akrilamīda un 0,8 % (w/v) BIS, norādīto iesvaru vietā izmanto 16,2 ml tilpumu. Izejšķīduma glabāšanas laiks ir ne ilgāks kā 10 dienas; ja tā vadītspēja ir lielāka par 5 μS, to dejonizē, 30 minūtes maisot ar 2 g MB-3 amberlīta, tad filtrē caur 0,45 μm membrānas filtru.
            
            
               4.1.2.
                     Gela šķīdums
            
            
               Sagatavo gela šķīdumu, piedevas un amfolītus
                  8
                samaisot ar gela izejšķīdumu (sk. 4.1.1.).
            
         
         
            
               9,0 ml izejšķīduma,
            
            
               24 mg β-alanīna,
            
            
               500 μl amfolīta pH 3,5–9,5,
            
            
               250 μl amfolīta pH 5–7,
            
            
               250 μl amfolīta pH 6–8.
            
            
               Gela šķīdumu divas līdz trīs minūtes maisa un degazē ultraskaņas vannā vai vakuumā.
            
            
               Piezīme. Gela šķīdumu sagatavo tieši pirms tā uzliešanas (sk. 6.2. punktu).
            
            
               4.1.3.
                     Katalizatora šķīdumi
            
            
               4.1.3.1.
                     N, N, N', N' – tetrametiletilēndiamīns (Temed)
            
            
               4.1.3.2.
                     40 % (w/v) amonija persulfāts (PER):
            
            
               ūdenī izšķīdina 800 mg PER un uzpilda līdz 2 ml.
            
            
               Piezīme. Vienmēr izmanto svaigi sagatavotu PER šķīdumu.
            
            
               4.2.
                     Kontaktšķīdums
            
            
               Petroleja vai šķidrais parafīns
            
            
               4.3.
                     Anoda šķīdums
            
            
               Ūdenī izšķīdina 5,77 g fosforskābes (85 masas %) un atšķaida līdz 100 ml. 
            
            
               4.4.
                     Katoda šķīdums
            
            
               Ūdenī izšķīdina 2,00 g nātrija hidroksīda un atšķaida ar ūdeni līdz 100 ml.
            
            
               Parauga sagatavošana
            
            
               4.5.
                     Reaģenti olbaltumvielu izolēšanai 
            
         
         
            
               4.5.1.
                     Atšķaida etiķskābi (25,0 ml ledus etiķskābes uzpilda ar ūdeni līdz 100 ml).
            
            
               4.5.2.
                     Dihlormetāns
            
            
               4.5.3.
                     Acetons
            
            
               4.6.
                     Olbaltumvielas šķīdinošs buferšķīdums
            
            
               Ūdenī izšķīdina
            
            
               5,75 g glicerīna (87 masas %),
            
            
               24,03 g urīnvielas,
            
            
               250 mg ditiotreitola
            
            
               un uzpilda līdz 50 ml.
            
            
               Piezīme. Uzglabā ledusskapī, maksimālais glabāšanas laiks ir viena nedēļa.
            
            
               4.7.
                     Reaģenti kazeīnu šķelšanai ar plazmīnu
            
            
               4.7.1.
                     Amonija karbonāta buferšķīdums
            
            
               0,2 mol/l amonija hidrogēnkarbonāta šķīduma (1,58 g/100 ml ūdens), kas satur 0,05 mol/l etilēndiamīntetraetiķskābes (EDTA, 1,46 g/100 ml), ar 0,2 mol/l amonija karbonāta šķīdumu (1,92 g/100 ml ūdens), kas satur 0,05 mol/l EDTA, titrē līdz pH 8.
            
            
               4.7.2.
                     Liellopu plazmīns (EC. 3.4.21.7) ar vismaz 5 vien./ml aktivitāti.
            
            
               4.7.3.
                     ε-aminokapronskābes šķīdums fermentu inhibēšanai
            
            
               2,624 g ε-aminokapronskābes (6 amino-n-heksānskābe) izšķīdina 100 ml 40 % (v/v) etanola.
            
            
               4.8.
                     Standarti
            
            
               4.8.1.
                     Sertificētus references standartus maisījumam no aitas un kazas vājpiena, kas sarecināts ar himozīnu un satur 0 % un 1 % govs piena, var iegādāties Komisijas References materiālu un mērījumu institūtā (Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440 Geel, Belgium).
            
            
               4.8.2.
                     Laboratorijas pagaidu standartu sagatavošana no bifeļmātes piena, kas sarecināts ar himozīnu un satur 0 % un 1 % govs piena
            
            
               Vājpienu sagatavo, 37 °C temperatūrā 20 minūtes ar 2 500 g centrifugējot neapstrādāta nefasēta bifeļmātes vai govs piena. Pēc tam mēģeni un tās saturu strauji atdzesē līdz 6–8 °C, tad pilnībā noņem virsējo tauku slāni. Lai pagatavotu 1 % standartu, 1 l vārglāzē 495 ml bifeļmātes vājpiena pievieno 5,00 ml govs vājpiena un, pievienojot atšķaidītu pienskābi (10 % w/v), koriģē pH uz 6,4. Noregulē temperatūru uz 35 °C un pievieno 100 μl teļa himozīna (himozīna aktivitāte 1:10 000, aptuveni 3 000 vien./ml), maisa 1 minūti, pārklāj vārglāzi ar alumīnija foliju un vienu stundu atstāj 35 °C temperatūrā, ļaujot veidoties rūgušpiena biezmasai. Kad rūgušpiena biezmasa izveidojusies, visu ar himozīnu sarecināto pienu liofilizē bez iepriekšējas homogenizācijas vai sūkalu notecināšanas. Pēc liofilizēšanas to sasmalcina, lai iegūtu viendabīgu pulveri. Lai sagatavotu 0 % standartu, veic to pašu procedūru, izmantojot tīru bifeļmātes vājpienu. Standartus uzglabā – 20 °C temperatūrā.
            
         
         
            
               Piezīme. Pirms standartu sagatavošanas ir ieteicams pārbaudīt bifeļmātes piena tīrību, veicot ar plazmīnu apstrādāto kazeīnu izoelektrisko fokusēšanu.
            
            
               Reaģenti olbaltumvielu iekrāsošanai
            
            
               4.9.
                     Fiksators
            
            
               Ūdenī izšķīdina 150 g trihloretiķskābes un uzpilda līdz 1 000 ml.
            
            
               4.10.
                     Atkrāsojošais šķīdums
            
            
               500 ml metanola un 200 ml ledus etiķskābes ar destilētu ūdeni atšķaida līdz 2 000 ml.
            
            
               Piezīme. Katru dienu sagatavo svaigu atkrāsojošo šķīdumu; to var sagatavot, sajaucot vienādus 50 % (v/v) metanola un 20 % (v/v) ledus etiķskābes izejšķīdumu tilpumus.
            
            
               4.11.
                     Iekrāsojošie šķīdumi
            
            
               4.11.1.
                     Iekrāsojošais šķīdums (1. izejšķīdums)
            
            
               Izmantojot magnētisko maisītāju (aptuveni 45 minūtes), 3,0 g Coomassie briljantzilā G-250 (C.I. 42655) izšķīdina 1 000 ml 90 % (v/v) metanola un izfiltrē caur diviem vidēji ātras filtrācijas kroku filtriem.
            
            
               4.11.2.
                     Iekrāsojošais šķīdums (2. izejšķīdums)
            
            
               5,0 g vara sulfāta pentahidrāta izšķīdina 1 000 ml 20 % (v/v) etiķskābes.
            
            
               4.11.3.
                     Iekrāsojošais šķīdums (darba šķīdums)
            
            
               Tieši pirms iekrāsošanas sajauc kopā 125 ml katra izejšķīduma (4.11.1. un 4.11.2.).
            
            
               Piezīme. Iekrāsojošais šķīdums jāsagatavo tā izmantošanas dienā.
            
            
               5.IEKĀRTA
            
            
               5.1.
                     Stikla plates (265 × 125 × 4 mm); gumijas veltnis (platums 15 cm); līmeņojams galds
            
            
               5.2.
                     Gela nesējloksne (265 × 125 mm)
            
            
               5.3.
                     Segloksne (280 × 125 mm); katrai garajai malai pielīmē līmlentes sloksni (280 × 6 × 0,25 mm) (sk. 1. attēlu)
            
            
               5.4.
                     Elektrofokusēšanas kamera ar dzesēšanas plati (piem., 265 × 125 mm) un piemērotu strāvas avotu (≥ 2,5 kV) vai automātiska elektroforēzes ierīce
            
         
         
            
               5.5.
                     Termostatējams cirkulācijas kriostats, noregulēts uz 12 ± 0,5 °C
            
            
               5.6.
                     Centrifūga, noregulējama uz 3 000 g
            
            
               5.7.
                     Elektrodu plāksnes (≥ 265 mm garas)
            
            
               5.8.
                     Plastmasas pilināmās pudeles anoda un katoda šķīdumiem
            
            
               5.9.
                     Parauga aplikatori (10 × 5 mm, viskoze vai filtrpapīrs ar zemu olbaltumvielu adsorbētspēju)
            
            
               5.10.
                     Nerūsējošā tērauda vai stikla iekrāsošanas un atkrāsošanas trauki (piem., 280 × 150 mm instrumentu paplātes) 
            
            
               5.12.
                     Regulējams stieņa homogenizators (vārpstas diametrs 10 mm), 8 000–20 000 apgr./min.
            
            
               5.13.
                     Magnētiskais maisītājs
            
            
               5.14.
                     Ultraskaņas vanna
            
            
               5.15.
                     Plēves sakausētājs
            
            
               5.16.
                     Mikropipetes, 25 μl
            
            
               5.17.
                     Vakuumcentrifūga vai liofilizators
            
            
               5.18.
                     Termostatējama ūdens vanna, kas noregulējama uz 35 un 40 ± 1 °C, ar kratītāju
            
            
               5.19.
                     Densitometrs, kura rādījumi nolasāmi pie λ = 634 nm
            
            
               6.PROCEDŪRA
            
            
               6.1.
                     Parauga sagatavošana
            
            
               6.1.1.
                     Kazeīnu izolēšana
            
            
               Centrifūgas mēģenē ar 100 ml ietilpību iesver 5 g sausās masas ekvivalentu siera vai references standarta daudzumu, pievieno 60 ml destilēta ūdens un homogenizē ar stieņa homogenizatoru (8 000–10 000 apgr./min.). Ar atšķaidītu etiķskābi (4.5.1.) koriģē pH uz 4,6 un centrifugē (5 minūtes, 3 000 g). Dekantē taukus un sūkalas, atlikumu ar 20 000 apgr./min. homogenizē 40 ml destilēta ūdens, kura pH ar atšķaidītu etiķskābi (4.5.1.) koriģēts uz 4,5, pievieno 20 ml dihlormetāna (4.5.2.), atkal homogenizē un centrifugē (5 min, 3 000 g). Ar lāpstiņu noņem kazeīna slāni, kas atrodas starp ūdens fāzi un organisko fāzi (sk. 2. attēlu), un abas fāzes dekantē. Kazeīnu rehomogenizē 40 ml destilēta ūdens (sk. iepriekš) un 20 ml dihlormetāna (4.5.2.) un centrifugē. Šo procedūru atkārto, līdz abas ekstrakcijas fāzes ir bezkrāsainas (divas līdz trīs reizes). Olbaltumvielu atlikumu homogenizē ar 50 ml acetona (4.5.3.) un filtrē caur vidēji ātras filtrācijas kroku filtrpapīru. Katru reizi atlikumu mazgā uz filtra ar divām atsevišķām 25 ml acetona porcijām un ļauj nožūt gaisā vai žāvē ar slāpekļa plūsmu, tad piestā saberž smalkā pulverī.
            
            
               Piezīme. Sausie kazeīna izolāti jāglabā – 20 °C temperatūrā.
            
            
               6.1.2.
                     β-kazeīnu šķelšana ar plazmīnu, lai palielinātu γ-kazeīnu koncentrāciju
            
         
         
            
               25 mg izolēto kazeīnu (6.1.1.) disperģē 0,5 ml amonija karbonāta buferšķīduma (4.7.1.) un homogenizē 20 minūtes, piemēram, apstrādājot ar ultraskaņu. Uzkarsē līdz 40 °C un pievieno 10 μl plazmīna (4.7.2.), samaisa un 40 °C temperatūrā vienu stundu inkubē, nepārtraukti kratot. Lai inhibētu fermentu, pievieno 20 μl ε-aminokapronskābes šķīduma (4.7.3.), tad pievieno 200 mg cietās urīnvielas un 2 mg ditiotreitola.
            
            
               Piezīme. Lai iegūtu lielāku simetriju fokusētajās kazeīna joslās, pēc ε-aminokapronskābes pievienošanas šķīdumu ieteicams liofilizēt un tad izšķīdināt atlikumu 0,5 ml olbaltumvielas šķīdinošā buferšķīduma (4.6.).
            
            
               6.2.
                     Urīnvielu saturošu poliakrilamīda gelu sagatavošana
            
            
               Ar dažu ūdens pilienu palīdzību gela nesējloksni (5.2.) izveltnē uz stikla plates (5.1.), ar papīra dvieli vai salveti nosusina lieko ūdeni. Tādā pašā veidā uz citas stikla plates izveltnē segloksni (5.3.) ar starplikām (0,25 mm). Plati novieto horizontāli uz līmeņojama galda.
            
            
               Sagatavotajam un atgaisotajam gela šķīdumam (4.1.2.) pievieno 10 μl Temed (4.1.3.1.), samaisa un pievieno 10 μl PER šķīduma (4.1.3.2.), rūpīgi samaisa un tūlīt vienmērīgi izlej segloksnes centrā. Vienu gela nesējplates malu (ar loksni uz leju) novieto uz segloksnes plates un lēnām pieliec, lai starp loksnēm veidotos vienmērīga gela kārta bez gaisa pūslīšiem (3. attēls). Izmantojot plānu lāpstiņu, gela nesējplati uzmanīgi noliec pilnībā un uz tās novieto vēl trīs stikla plates smagumam. Kad polimerizācija ir beigusies (aptuveni pēc 60 minūtēm), uz gela nesējloksnes polimerizējušos gelu noņem kopā segloksni, atdalot stikla plates. Nesējloksnes otru pusi rūpīgi notīra, lai noņemtu gela atliekas un urīnvielu. Gela “sendviča” garākās malas sakausē kopā, lai izveidotos caurulīte, un to uzglabā ledusskapī (ne ilgāk par sešām nedēļām).
            
            
               Piezīme. Segloksni ar starplikām var izmantot atkārtoti. Poliakrilamīda gelu var sagriezt mazākos gabalos, tas ir ieteicams, ja ir maz paraugu vai ja izmanto automātisku elektroforēzes ierīci (divi geli, izmēri 4,5 × 5 cm).
            
            
               6.3.
                     Izolelektriskā fokusēšana
            
            
               Dzesēšanas termostatu iestata uz 12 °C. Gela nesējloksnes otru pusi noslauka ar petroleju, pēc tam dažus pilienus petrolejas iepilina (4.2.) dzesēšanas bloka centrā. Pēc tam uz tā izveltnē gela “sendviču” ar nesējloksni uz leju, raugoties, lai neveidotos gaisa pūslīši. Noslauka lieko petroleju un noņem segloksni. Elektrodu plāksnes samērcē ar anoda šķīdumu un katoda šķīdumu (4.3. un 4.4.), nogriež tās gela garumā un novieto paredzētajā stāvoklī (attālums starp elektrodiem 9,5 cm).
            
            
            
               Izoelektriskās fokusēšanas apstākļi
            
            
               6.3.1.
                     Gela izmēri 265 × 125 × 0,25 mm
            
            
                     
                        Solis
                     
                  
                  
                     
                        Laiks
                     
                     
                        (min.)
                     
                  
                  
                     
                        Spriegums
                     
                     
                        (V)
                     
                  
                  
                     
                        Strāvas stiprums
                     
                     
                        (mA)
                     
                  
                  
                     
                        Jauda
                     
                     
                        (W)
                     
                  
                  
                     
                        Voltstundas
                     
                     
                        (Vh)
                     
                  
               
                     
                        1. Priekšfokusēšana
                     
                  
                  
                     
                        30
                     
                  
                  
                     
                        maksimāli
                     
                     
                        2 500
                     
                  
                  
                     
                        maksimāli
                     
                     
                        15
                     
                  
                  
                     
                        konstanta 4
                     
                  
                  
                     
                        aptuveni 300
                     
                  
               
                     
                        2. Parauga fokusēšana
                           9
                        
                     
                  
                  
                     
                        60
                     
                  
                  
                     
                        maksimāli
                     
                     
                        2 500
                     
                  
                  
                     
                        maksimāli
                     
                     
                        15
                     
                  
                  
                     
                        konstanta 4
                     
                  
                  
                     
                        aptuveni 1 000
                     
                  
               
                     
                        3. Nobeiguma fokusēšana
                     
                  
                  
                     
                        60
                     
                  
                  
                     
                        maksimāli
                     
                     
                        2 500
                     
                  
                  
                     
                        maksimāli
                     
                     
                        5
                     
                  
                  
                     
                        maksimāli
                     
                     
                        20
                     
                  
                  
                     
                        aptuveni 3 000
                     
                  
               
                     
                  
                  
                     
                        40
                     
                  
                  
                     
                        maksimāli
                     
                     
                        2 500
                     
                  
                  
                     
                        maksimāli
                     
                     
                        6
                     
                  
                  
                     
                        maksimāli
                     
                     
                        20
                     
                  
                  
                     
                        aptuveni 3 000
                     
                  
               
                     
                  
                  
                     
                        30
                     
                  
                  
                     
                        maksimāli
                     
                     
                        2 500
                     
                  
                  
                     
                        maksimāli
                     
                     
                        7
                     
                  
                  
                     
                        maksimāli
                     
                     
                        25
                     
                  
                  
                     
                        aptuveni 3 000
                     
                  
               
               Piezīme.
                     Ja maina gela biezumu vai platumu, attiecīgi jākoriģē strāvas stiprums un jauda (piemēram, ja izmanto gelu, kura izmēri ir 265 × 125 × 0,5 mm, strāvas stiprums un jauda jādivkāršo).
            
            
               6.3.2.
                     Sprieguma programmas piemērs automātiskajai elektroforēzes ierīcei (2 geli, izmēri 5,0 × 4,5 cm), elektrodus novieto tieši uz gela (bez elektrodu plāksnēm)
            
            
                     
                        Solis
                     
                  
                  
                     
                        Spriegums
                     
                  
                  
                     
                        Strāvas stiprums
                     
                  
                  
                     
                        Jauda
                     
                  
                  
                     
                        Temperatūra
                     
                  
                  
                     
                        Voltstundas
                     
                  
               
                     
                        1. Priekšfokusēšana
                     
                  
                  
                     
                        1 000 V
                     
                  
                  
                     
                        10,0 mA
                     
                  
                  
                     
                        3,5 W
                     
                  
                  
                     
                        8 °C
                     
                  
                  
                     
                        85 Vh
                     
                  
               
                     
                        2. Parauga fokusēšana
                     
                  
                  
                     
                        250 V
                     
                  
                  
                     
                        5,0 mA
                     
                  
                  
                     
                        2,5 W
                     
                  
                  
                     
                        8 °C
                     
                  
                  
                     
                        30 Vh
                     
                  
               
                     
                        3. Fokusēšana
                     
                  
                  
                     
                        1 200 V
                     
                  
                  
                     
                        10,0 mA
                     
                  
                  
                     
                        3,5 W
                     
                  
                  
                     
                        8 °C
                     
                  
                  
                     
                        80 Vh
                     
                  
               
                     
                        4. Fokusēšana
                     
                  
                  
                     
                        1 500 V
                     
                  
                  
                     
                        5,0 mA
                     
                  
                  
                     
                        7,0 W
                     
                  
                  
                     
                        8 °C
                     
                  
                  
                     
                        570 Vh
                     
                  
               
               2. solī parauga aplikatoru uzliek pie 0 Vh.
            
            
               2. solī parauga aplikatoru noņem pie 30 Vh.
            
            
               6.4.
                     Olbaltumvielu iekrāsošana
            
            
               6.4.1.
                     Olbaltumvielu fiksēšana
            
            
               Tūlīt pēc strāvas padeves pārtraukšanas elektrodu plāksnes noņem, un gelu tūlīt ievieto iekrāsošanas / atkrāsošanas traukā, kurā iepildīti 200 ml fiksatora (4.9.); atstāj tajā uz 15 minūtēm, nepārtraukti krata.
            
         
         
            
               6.4.2.
                     Gela plates mazgāšana un iekrāsošana
            
            
               Kārtīgi notecina fiksatoru, gela plati mazgā divreiz pa 30 sekundēm, katru reizi izmantojot 100 ml atkrāsošanas šķīduma (4.10.). Nolej atkrāsošanas šķīdumu un piepilda trauku ar 250 ml iekrāsošanas šķīduma (4.11.3.); viegli kratot, ļauj iekrāsoties 45 minūtes.
            
            
               6.4.3.
                     Gela plates atkrāsošana
            
            
               Nolej iekrāsošanas šķīdumu, gela plati divreiz mazgā, katru reizi izmantojot 100 ml atkrāsošanas šķīduma (4.10.), tad 15 minūtes krata kopā ar 200 ml atkrāsošanas šķīduma; atkrāsošanas procedūru atkārto vismaz divas vai trīs reizes, līdz pamats ir tīrs un bezkrāsains. Pēc tam gela plati skalo ar destilētu ūdeni (2 × 2 minūtes) un žāvē gaisā (2–3 stundas) vai ar fēnu (10–15 minūtes).
            
            
               1. piezīme.
                     Fiksēšanu, mazgāšanu, iekrāsošanu un atkrāsošanu veic 20 °C temperatūrā. To neveic paaugstinātā temperatūrā.
            
            
               2. piezīme.
                     Ja dod priekšroku jutīgākai iekrāsošanai ar sudrabu (piemēram, Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No 17-1150-01), ar plazmīnu apstrādātie kazeīna paraugi jāatšķaida līdz 5 mg/ml.
            
            
               7.IZVĒRTĒŠANA
            
            
               Izvērtēšanu veic, nezināma sastāva parauga olbaltumvielu joslas salīdzinot ar references standartu joslām uz tā paša gela. Govs piena detektēšanu sieros, kas gatavoti no aitas piena, kazas piena un bifeļmātes piena vai no aitas, kazas un bifeļmātes piena maisījumiem, veic, nosakot γ3- un γ2-kazeīnus, kuru izoelektriskie punkti izvietojas starp pH 6,5 un pH 7,5 (4.a, 4.b un 5. attēls). Detektēšanas robeža ir mazāka par 0,5 %.
            
            
               7.1.
                     Vizuāla novērtēšana
            
            
               Ja veic govs piena daudzuma vizuālo novērtēšanu, paraugu un standartu koncentrācijas ieteicams koriģēt, lai aitas, kazas un/vai bifeļmātes γ2- un γ3- kazeīna koncentrācija būtu tāda pati (sk. “γ2 E, G, B” un “γ3 E, G, B” 4.a, 4.b un 5. attēlā). Pēc tam par govs piena daudzumu (mazāks par, vienāds ar vai lielāks par 1 %) nezināma sastāva paraugā var spriest tieši, govs piena γ3- un γ2-kazeīna koncentrāciju (sk. “γ3 C” un “γ2 C” 4.a, 4.b un 5. attēlā) salīdzinot ar koncentrāciju 0 % un 1 % references standartos (aitas, kazas piens) vai laboratorijas pagaidu standartos (bifeļmātes piens).
            
            
               7.2.
                     Densitometriska novērtēšana
            
            
               Lai noteiktu govs piena γ2- un γ3-kazeīna smailes laukuma attiecību pret aitas, kazas un/vai bifeļmātes piena γ2- un γ3-kazeīna smailes laukumu (sk. 5. attēlu), izmanto densitometru (5.19.), ja pieejams. Šo lielumu salīdzina ar tā 1 % references standarta (aitas, kazas piens) vai tā laboratorijas pagaidu standarta (bifeļmātes piens) γ2- un γ3-kazeīna smailes laukuma attiecību, kas analizēts uz tā paša gela.
            
            
               Piezīme. Metode darbojas apmierinoši, ja 1 % references standartā iegūst skaidru pozitīvu signālu par govs piena γ2- un γ3-kazeīniem, bet 0 % references standartā to neiegūst. Ja tā nav, procedūru optimizē, precīzi ievērojot metodes norādījumus.
            
            
               Paraugu uzskata par pozitīvu, ja govs piena γ2- un γ3-kazeīnu vai atbilstošo smaiļu laukumu attiecības ir vienādas ar vai lielākas par 1 % references standarta līmeni.
            
            
               8.ATSAUCES
            
            
               Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).
            
            
               Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).
            
            
               Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).
            
            
               Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).
            
            
               Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).
            
         
         
            
            
            
               1. attēls.
            
            
               Shematisks segloksnes attēlojums
            
            
               
            
               2. attēls.
            
            
               Kazeīna slānis, kas pēc centrifugēšanas atrodas starp ūdens fāzi un organisko fāzi
            
            
               
            
            
            
            
               3. attēls.
            
            
               Noliekšanas paņēmiens, ko izmanto ultraplānu poliakrilamīda gelu iegūšanai
            
            
            
               
                  
            
            
               a = starplika (0,25 mm), b = segloksne (5.3.), c, e = stikla plates (5.1.), d = gela šķīdums (4.1.2.), f = gela nesējloksne (5.2.)
            
            
            
               4.a attēls
            
            
               Ar plazmīnu apstrādātu kazeīnu izoelektriskā fokusēšana no siera, kas gatavots no aitas piena un kazas piena un satur dažādus govs piena daudzumus
            
            
               
                  
               
         
         
            
               % CM = govs piena procentuālā daļa, C = govs, E = aita, G = kaza
            
            
               Parādīta IEF gela augšējā daļa.
            
            
            
               4.b attēls
            
            
               Ar plazmīnu apstrādātu kazeīnu izoelektriskā fokusēšana no siera, kas gatavots no aitas, kazas un bifeļmātes piena maisījumiem, kuri satur dažādus govs piena daudzumus
                  
               
            
               % CM = govs piena procentuālā daļa, 1 + = paraugs, kas satur 1 % govs piena un kam piemaisīts tīrs govs piena kazeīns, kurš parādās joslas vidū. C = govs, E = aita, G = kaza, B = bifeļmāte
            
            
               Parādīts IEF gela kopējais atdalīšanas attālums. 
            
            
            
               5. attēls.
            
            
               Standartu densitogrammu (STD) un no aitas un kazas piena maisījuma gatavota siera paraugu densitogrammu superpozīcija pēc izoelektriskās fokusēšanas
            
            
               
                  
               
            
               a, b = standarti, kas satur 0 % un 1 % govs piena, c–g = siera paraugi, kas satur 0 %, 1 %, 2 %, 3 % un 7 % govs piena. C = govs, E = aita, G = kaza.
            
            
               IEF gela augšējā daļa skenēta pie λ = 634 nm.
            
            
               
            
            
               IX PIELIKUMS
            
            
               Analīžu izvērtēšana
            
            
               1. Kvalitātes nodrošināšana
            
            
               Analīzes veic laboratorijās, kas izraudzītas saskaņā ar Regulas (EK) Nr. 882/2004
                  10
                12. pantu vai ko norīkojušas dalībvalsts kompetentās iestādes.
            
            
               2. Paraugu ņemšana un strīdi par analīžu rezultātiem
            
         
         
            
               1. Paraugu ņemšanu veic saskaņā ar attiecīgajam produktam piemērojamo regulējumu. Ja paraugu ņemšanas noteikumi nav skaidri noteikti, izmanto ISO 707 “Piens un piena produkti. Norādījumi par paraugu ņemšanu” noteikumus.
            
            
               2. Laboratorijas ziņojumos par analīžu rezultātiem iekļauj informāciju, kas ir pietiekama, lai varētu veikt rezultātu izvērtēšanu saskaņā ar papildinājumu.
            
            
               3. Savienības noteikumos prasīto analīžu vajadzībām ņem dubultparaugus.
            
            
               4. Ja rodas strīds par rezultātiem, maksājumu aģentūra prasa vēlreiz veikt attiecīgā produkta analīzi, un izmaksas sedz zaudētāja puse.
            
            
               Minēto analīzi veic ar nosacījumu, ka ir pieejami aizzīmogoti produkta paraugu dublikāti, kurus ir pienācīgi uzglabājusi kompetentā iestāde. Pieprasījumu veikt analīzi ražotājs nosūta maksājumu aģentūrai 7 darbdienu laikā pēc pirmās analīzes rezultātu paziņošanas. Maksājumu aģentūra analīzi veic 21 darbdienas laikā pēc pieprasījuma saņemšanas.
            
            
               5. Pārsūdzības rezultāts ir galīgs.
            
            
               6. Ja piecu darbdienu laikā pēc paraugu ņemšanas ražotājs var pierādīt, ka paraugu ņemšana nav veikta pareizi, to atkārto, ja vien tas iespējams. Ja paraugu ņemšanu atkārtot nevar, sūtījums jāakceptē.
            
            
               Papildinājums
            
            
               Sūtījuma atbilstības normatīvajām robežvērtībām izvērtēšana
            
            
               1. Princips
            
            
               Ja tiesību aktos par valsts intervenci un privāto uzglabāšanu ir noteiktas sīki izstrādātas paraugu ņemšanas procedūras, ievēro minētās procedūras. Visos citos gadījumos izmanto paraugu, kas sastāv no vismaz 3 parauga vienībām, kas izlases veidā paņemtas no kontrolei nodotā preču sūtījuma. Var sagatavot apvienotu paraugu. Iegūto rezultātu salīdzina ar normatīvajām robežvērtībām, aprēķinot 95 % ticamības intervālu kā divkāršu standartnovirzi; attiecīgā standartnovirze ir atkarīga no tā, vai 1) metode ir validēta starptautiskā sadarbībā ar σr un σR vērtībām, vai 2) iekšējās validācijas gadījumā ir aprēķināta iekšējā reproducējamība. Tad šis ticamības intervāls būs vienāds ar rezultāta mērījumu nenoteiktību. 
            
            
               2. Starptautiskā sadarbībā validēta metode
            
            
               Šādā gadījumā ir noteikta atkārtojamības standartnovirze σr un reproducējamības standartnovirze σR, un laboratorija var apliecināt validētās metodes atbilstību veiktspējas raksturlielumiem.
            
            
               Aprēķina vidējo aritmētisko 
                   no n atkārtotiem mērījumiem.
            
            
               Paplašināto nenoteiktību (k = 2) no 
                   aprēķina kā
            
            
            
               Ja mērījuma galīgo rezultātu x aprēķina pēc formulas 
                  , 
                  , 
                   vai 
                  , jāievēro parastā standartnoviržu apvienošanas procedūra.
            
            
               Uzskata, ka sūtījums neatbilst augšējai normatīvajai robežvērtībai UL, ja:
            
            
               
                  ,
            
            
               pretējā gadījumā uzskata, ka tas atbilst UL.
            
         
         
            
               Uzskata, ka preču sūtījums neatbilst apakšējai normatīvajai robežvērtībai LL, ja
            
            
               
                  ,
            
            
               pretējā gadījumā uzskata, ka tas atbilst LL.
            
            
            
               3. IEKŠĒJĀ VALIDĒŠANA AR IEKŠĒJĀS REPRODUCĒJAMĪBAS STANDARTNOVIRZES APRĒĶINĀŠANU
            
            
               Ja tiek izmantotas šajā regulā nenorādītas metodes un precizitātes mērījumi nav veikti, veic iekšējo validēšanu. Izvērstās nenoteiktības U aprēķināšanai formulā attiecīgi σr un σR vietā lieto iekšējās atkārtojamības standartnovirzi sir un iekšējās reproducējamības standartnovirzi siR.
            
            
               Lai noteiktu atbilstību normatīvajām robežvērtībām, jāievēro 1. punktā izklāstītie noteikumi. Tomēr, ja preču sūtījums ir novērtēts kā normatīvajai robežvērtībai neatbilstošs, mērījumus atkārto ar šajā regulā norādīto metodi un rezultātu izvērtē saskaņā ar 1. punktu.”
            
         
         
            
                  
                     (1)
                   Izmantojamo metodi apstiprina maksājumu aģentūra.
               
               
                  
                     (2)
                   Piedeguma daļiņu analīzes var veikt sistemātiski. Tomēr šādas analīzes veic vienmēr, ja sensoriskā vērtēšana netiek veikta.
               
               
                  
                     (3)
                   Izmantojamo metodi (vienu vai abas) apstiprina maksājumu aģentūra.
               
               
                  
                     (4)
                   Izmantojamo metodi apstiprina maksājumu aģentūra.
               
               
                  
                     (5)
                   Sensorisko vērtēšanu veic tad, ja to uzskata par vajadzīgu pēc riska analīzes, kuru apstiprinājusi maksājumu aģentūra.
               
               
                  
                     (6)
                   IDF starptautiskais standarts 135B/1991. Piens un piena produkti. Analītisko metožu precizitātes parametri. Starplaboratoriju pētījumu procedūras izklāsts.
               
               
                  
                     (7)
                   Izmantojamo metodi apstiprina maksājumu aģentūra.
               
               
                  
                     (8)
                   Ir apstiprināts, ka Ampholine® pH 3,5–9,5 (Pharmacia) un Resolyte® pH 5–7 un pH 6–8 (BDH, Merck) ir īpaši piemērots, lai iegūtu vajadzīgo γ-kazeīnu atdalīšanu.
               
               
                  
                     (9)
                  
                        Parauga aplicēšana: pēc priekšfokusēšanas (1. solis) ar pipeti 18 μl paraugšķīduma un standartšķīduma uzpilina uz parauga aplikatoriem (10 × 5 mm), novieto tos uz gela 1 mm attālumā vienu no otra un garenvirzienā 5 mm attālumā no anoda un viegli piespiež. Fokusēšanu veic iepriekš aprakstītajos apstākļos, pēc 60 minūšu ilgas parauga fokusēšanas parauga aplikatorus uzmanīgi noņem.
               
               
                  
                     (10)