CELEX: 31981L0715
Language: ro
Date: 1981-07-31 00:00:00
Title: A noua directivă a comisiei din 31 iulie 1981 de stabilire a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor

03/Volumul 04
            
            
               RO
            
            
               Jurnalul Ofícial al Uniunii Europene
            
            
               70
            
         31981L0715
   
               L 257/38
            
            
               JURNALUL OFÍCIAL AL UNIUNII EUROPENE
            
            
               
            
         
      A NOUA DIRECTIVĂ A COMISIEI
   
   din 31 iulie 1981
   de stabilire a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor
   (81/715/CEE)
   COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,
   având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Economice Europene,
   având în vedere Directiva 70/373/CEE a Consiliului din 20 iulie 1970 privind introducerea modalităților de prelevare de probe și a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor (1), modificată ultima dată de Actul de aderare al Greciei, în special articolul 2,
   întrucât această directivă impune ca efectuarea controlului oficial al furajelor în scopul verificării conformității cu cerințele din dispozițiile prevăzute de actele cu putere de lege sau actele administrative referitoare la calitatea și compoziția furajelor să se desfășoare pe baza modalităților de prelevare de probe și a metodelor comunitare de analiză;
   întrucât Directivele 71/250/CEE (2), 71/393/CEE (3), 72/199/CEE (4), 73/46/CEE (5), 74/203/CEE (6), 75/84/CEE (7), 76/372/CEE (8) și 78/633/CEE (9) ale Comisiei, modificate ultima dată de Directiva din 30 iulie 1981, au stabilit deja câteva din metodele comunitare de analiză; întrucât progresul lucrărilor înregistrat de la acea dată arată că este de dorit să se adopte un al nouălea set de metode;
   întrucât măsurile prevăzute în prezenta directivă sunt în conformitate cu avizul Comitetului permanent pentru furaje,
   ADOPTĂ PREZENTA DIRECTIVĂ:
   Articolul 1
   Statele membre solicită ca analizele pentru controlul oficial al furajelor, în ceea ce privește conținutul de avoparcină și sodiu monensin, să fie efectuate în conformitate cu metodele descrise în anexă.
   Articolul 2
   Statele membre pun în aplicare actele cu putere de lege și actele administrative necesare aducerii la îndeplinire a prezentei directive la 1 decembrie 1981 și informează de îndată Comisia cu privire la aceasta.
   Articolul 3
   Prezenta directivă se adresează statelor membre.
   
      Adoptată la Bruxelles, 31 iulie 1981.
      
         
            Pentru Comisie
         
         
            Președintele
         
         Gaston THORN
         
      
   
   
      (1)  JO L 170, 3.8.1970, p. 2.
   
      (2)  JO L 155, 12.7.1971, p. 13.
   
      (3)  JO L 279, 20.12.1971, p. 7.
   
      (4)  JO L 123, 29.5.1972, p. 6.
   
      (5)  JO L 83, 30.3.1973, p. 21.
   
      (6)  JO L 108, 22.4.1974, p. 7.
   
      (7)  JO L 32, 5.2.1975, p. 26.
   
      (8)  JO L 102, 15.4.1976, p. 8.
   
      (9)  JO L 206, 29.7.1978, p. 43.
   ANEXĂ
   1.   DETERMINAREA AVOPARCINEI PRIN DIFUZIUNE ÎNTR-UN MEDIU AGAR
   1.   OBIECTIV ȘI DOMENIU DE APLICARE
   Metoda se folosește pentru determinarea avoparcinei din furaje și preamestecuri. Limita inferioară de determinare este de 2 mg/kg (2 ppm). Prezența antibioti celor polieterice poate interfera în determinare.
   2.   PRINCIPIU
   Proba este extrasă cu un amestec de acetonă/apă/acid clorhidric. Activitatea antibiotică a extractului se determină prin măsurarea difuziunii avoparcinei într-un mediu agar inoculat cu Bacillus subtilis. Difuziunea este arătată prin formarea unor zone de inhibare a microorganismelor. Diametrul acestor zone este considerat a fi direct proporțional cu logaritmul concentrației de antibiotic raportat la intervalul concentrațiilor de antibiotice folosite.
   3.   MICROORGANISM: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)
   3.1   Menținerea culturii-mamă
   Se inoculează eprubete ce conțin lichid de mediu de cultură (4.1 ) cu Bacillus subtilis și se incubează peste noapte la 30 °C. Se păstrează cultura într-un frigider la aproximativ 4 °C. Se reinoculează lunar.
   3.2   Prepararea suspensiei de spori (1)
   
   Se recoltează cultura crescută dintr-un lichid agar proaspăt preparat (3.1) cu ajutorul a 2-3 ml de apă sterilă. Această suspensie se folosește pentru a inocula 300 ml de mediu de cultură (4.1) dintr-un balon Roux care se incubează timp de trei până la cinci zile la 30 °C. Se recoltează cultura crescută în 15 ml etanol (4.2) după ce s-a verificat germinarea la microscop, și se amest ecă bine. Această suspensie poate fi păstrată timp de cel puțin cinci luni la aproximativ 4 °C.
   4.   MEDII DE CULTURĂ ȘI REACTIVI
   4.1   Mediul de cultură (2)
   
   
               Peptonă
            
            
               6,0 g
            
         
               Triptonă
            
            
               4,0 g
            
         
               Extract de drojdie
            
            
               3,0 g
            
         
               Extract de carne
            
            
               1,5 g
            
         
               Glucoză
            
            
               1,0 g
            
         
               Agar
            
            
               15,0 g
            
         
               Apă
            
            
               1 000 ml
            
         
               pH 6,5 (după sterilizare).
            
            
                
            
         4.2.   Etanol 20 % (v/v): se diluează 200 ml de etanol cu 800 ml de apă.
   4.3.   Acid clorhidric, d: 1,18 până la 1,19.
   4.4.   Hidroxid de sodiu, soluție 2 M.
   4.5.   Soluție-tampon fosfată, 0,1 M:
   Fosfat diacid de potasiu, KH2PO4: 13,6 g.
   Apă până la 1 000 ml.
   Se ajustează pH-ul la 4,5.
   4.6.   Amestec de acetonă/apă/acid clorhidric (4.3): 65/32,5/2,5 (v/v/v).
   4.7.   Substanță standard: sulfat de avoparcină cu activitate cunoscută.
   5.   SOLUȚII STANDARD
   Se dizolvă o cantitate cântărită cu precizie de aproximativ 10 mg din substanța standard (4.7) în soluție-tampon fosfată (4.5) și se diluează cu această soluție-tampon pentru a obține o soluție-mamă ce conține 100 μg de avoparcină pe mililitru. Păstrată într-un balon închis la 4 °C, această soluție este stabilă până la maxim 7 zile.
   5.1   Pentru preamestecuri
   Din această soluție -mamă se prepară prin diluare succesivă cu soluție-tampon (4.5) următoarele soluții:
   
      
   
               S8
               
            
            
               4,0 µg/ml
            
         
               S4
               
            
            
               2,0 µg/ml
            
         
               S2
               
            
            
               1,0 µg/ml
            
         
               S1
               
            
            
               0,5 µg/ml
            
         5.2   Pentru furaje
   Din această soluție-mamă se prepară prin diluare succesivă cu soluție-tampon (4.5) următoarele soluții:
   
      
   
               S8
               
            
            
               2,0 µg/ml
            
         
               S4
               
            
            
               1,0 µg/ml
            
         
               S2
               
            
            
               0,5 µg/ml
            
         
               S1
               
            
            
               0,25 µg/ml
            
         6.   PREPARAREA EXTRACTULUI ȘI A SOLUȚIILOR DE TESTARE
   6.1.   Preamestecurile
   Se cântărește o cantitate de probă de aproximativ 10 mg care să conțină 10 până la 100 mg avoparcină. Se transferă într-o balon gradat de 100 ml cu 60 ml de mixtură (4.6) și se amestecă timp de 15 minute cu un agitator mecanic. Se verifică pH-ul și se ajustează la pH 2, dacă este necesar, cu acid clorhidric (4.3). Se completează volumul cu amestecul (4.6) și se amestecă bine. Se filtrează o porție prin hârtie de filtru corespunzătoare (de exemplu Whatman nr. 1), îndepărtând primii 5 ml de filtrat. Se ia o cotă-parte și se ajustează pH-ul la 4,5 cu soluție de hidroxid de sodiu (4.4). Se diluează cu soluție-tampon (4.5) pentru a se obține o concentrație de avoparcină dorită de 4 μg/ml (= U8).
   Din această soluție se prepară soluțiile U4 (conținut estimat: 2 μg/ml), U2 (conținut estimat: 1 μg/ml) și U1 (conținut estimat: 0,5 μg/ml) prin diluare succesivă (1 + 1) cu soluție-t ampon (4.5).
   6.2   Furaje
   Se cântărește o cantitate de probă de 50 g și se agită 100 ml de amestec (4,6) timp de 30 de minute într-un agitator mecanic. Se decantează extractul prin centrifugare (se folosesc eprubete închise de centrifugare), se ia o cotă-parte din extractul clar (a se vedea tabelul menționat în continuare) și se ajustează la pH 4,5 cu soluție de hidroxid de sodiu (4.4). Se diluează această cotă-parte cu soluție-tampon pentru a obține U8 (a se vedea tabelul de mai jos).
   Din această soluție se prepară soluțiile U4 (conținut estimat: 1 μg/ml), U2 (conținut estimat: 0,5 μg/ml) și U1 (conținut estimat: 0,25 μg/ml) prin diluare succesivă (1 + 1) cu soluție-tampon (4.5).
   
               Nivelul estimat de avoparcină (mg/kg)
            
            
               5
            
            
               7,5
            
            
               10
            
            
               15
            
            
               20
            
            
               40
            
         
               Greutatea eșantionului [g(± 0,1 g)]
            
            
               50
            
            
               50
            
            
               50
            
            
               50
            
            
               50
            
            
               50
            
         
               Volumul amestecului (4.6) (ml)
            
            
               100
            
            
               100
            
            
               100
            
            
               100
            
            
               100
            
            
               100
            
         
               Volumul extractului decantat (ml)
            
            
               20
            
            
               15
            
            
               20
            
            
               15
            
            
               20
            
            
               10
            
         
               Volumul final (ml): U8
               
            
            
               25
            
            
               25
            
            
               50
            
            
               50
            
            
               100
            
            
               100
            
         
               Concentrația U8 estimată (μg/ml)
            
            
               2
            
            
               aprox. 2
            
            
               2
            
            
               aprox. 2
            
            
               2
            
            
               2
            
         7.   PROCEDURA DE ANALIZĂ
   7.1   Inocularea mediului de analiză
   Se inoculează mediul de testare (4.1) cu suspensie de sp ori (3.2) la 50–60 °C. Prin încercări preliminare pe plăcile cu mediu de testare (4.1) se determină cantitatea de suspensie de spori necesară pentru obținerea celor mai mari și mai clare zone de inhibare cu diferite concentrații de avoparcină.
   7.2   Pregătirea plăcilor
   Difuziunea în agar se efectuează pe plăci cu cele patru concentrații ale soluției standard (S8, S4, S2, S1) și cu cele patru concentrații ale soluției de testare (U8, U4, U2, U1). Aceste patru concentrații de extract și standard trebuie puse pe fiecare lamelă. În acest scop se aleg plăcile suf icient de mari pentru a permite formarea în mediul agar a cel puțin opt orificii cu un diametru de 10 – 13 mm și cu cel puțin 30 de mm între centre. Testele pot fi efectuate pe plăcile de sticlă cu un inel de aluminiu sau plastic pe ele, cu un diametru de 200 mm și o înălțime de 20 mm.
   Se toarnă pe plăci o cantitate de mediu (4.1) inoculat ca la punctul 7.1 pentru a obține un strat de 2 mm grosime (60 ml pentru o lamelă cu diametru de 200 mm). Se lasă să se uniformizeze, se fac orificii și în ele se pun volumele de soluție de testare și soluție standard (între 0,10 și 0,15 ml pe orificiu, în funcție de diametru), măsurate cu exactitate. Fiecare concentrație se aplică de cel puțin patru ori astfel încât fiecare determinare să fie supus ă unei evaluări a 32 de zone de inhibare.
   7.3   Incubarea
   Se incubează plăcile timp de 16-18 ore la 30 °C.
   8.   EVALUAREA
   Se măsoară diametrul zonelor de inhibare cu o precizie de până la 0.1 mm. Se înregistrează valoarea medie a măsurătorilor pentru fiecare concentrație, pe hârtie milimetrică cu semilogaritmi, indicând logaritmul concentrațiilor în raport cu diametrele zonelor de inhibare. Se trasează „cele mai potrivite” linii pentru soluția standard și a extractului, ca în exemplul menționat în continuare.
   Se determină punctul „optim” pentru nivelul cel mai ridicat de soluție standard (SL) folosind formula:
   
               a)
            
            
               
                  
            
         Se determină punctul „optim” pentru nivelul cel mai ridicat de soluție standard (SH) folosind formula:
   
               b)
            
            
               
                  
            
         În același mod se determină punctul „optim” pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL), și nivelul cel mai ridicat de extract (UH), înlocuind U1, U2, U4 și U8 cu S1, S2, S4 și S8 în formulele menționate anterior.
   Valorile SL și SH se înregistrează pe aceeași h& acirc;rtie milimetrică și se unesc pentru a obține linia „cea mai potrivită” pentru soluția standard. În același mod se înregistrează UL și UH și se unesc pentru a obține linia „cea mai potrivită” pentru extract.
   În absența oricărei interfețe, liniile trebuie să fie paralele. Pentru scopuri practice, liniile pot fi considerate paralele dacă valorile (SH-SL) și (UH-UL) nu diferă cu mai mult de 10 % din valoarea medie a acestora.
   În cazul în care se constată că liniile nu sunt paralele, fie U1 și S1, fie U2 și S2 trebuie înlăturate și SL, SH, UL și UH calculate folosind formule alternative, pentru a obține linii alternative „optime”:
   
               
                           a′)
                        
                        
                           
                              
                        
                     
            
               sau
            
            
               
                  
            
         
      
   
               
                           b′)
                        
                        
                           
                              
                        
                     
            
               sau
            
            
               
                  
            
         și în același mod pentru UL și UH. Liniile alternative „optime” trebuie verificate pentru paralelism ca mai înainte. Faptul că rezultatul a fost calculat pe trei niveluri trebuie indicat în raportul final.
   
      Atunci când liniile sunt considerate paralele, se calculează logaritmul activității relative (log A) folosind una din următoarele formule.
   
      Pentru patru nivele
   
   
               c)
            
            
               
                  
            
         
      Pentru trei nivele
   
   
               d)
            
            
               
                  
            
         sau
   
               d′)
            
            
               
                  
            
         Activitatea efectivă = activitatea presupusă activitatea relativă.
   Dacă activitatea relativă nu se încadrează în intervalul de 0,5-2,0, se repetă testul efectuând ajustările corespunzătoare concentrațiilor de extract, sau dacă acest lucru nu este posibil, soluțiilor standard. Dacă activitatea relativă nu poate fi încadrată în intervalul necesar, orice rezultat obținut trebuie considerat ca fiind aproximativ și acest lucru trebuie indicat în raportul final.
   
      Atunci când liniile nu sunt considerate a fi paralele, se repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este încă obținut, determinarea se consideră ca fiind nesatisfăcătoare.
   9.   REPETABILITATEA
   Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate pe același eșantion, de către același analist, nu trebuie să depășească:
   
               —
            
            
               2 mg/kg în valoare absolută, pentru un conținut de avoparcină de 2 până la 10 mg/kg;
            
         
               —
            
            
               20 % raportat la valoarea cea mai mare pentru un conținut de 10 până la 25 mg/kg;
            
         
               —
            
            
               5 mg/kg în valoare absolută, pentru un conținut de 25 până la 50 mg/kg;
            
         
               —
            
            
               10 % raportat la valoarea cea mai mare, pentru un conținut peste 50 mg/kg.
            
         2.   DETERMINAREA SODIULUI MONENSIN PRIN DIFUZIUNE ÎN MEDIU AGAR
   1.   OBIECTIVUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE
   Metoda se folosește la determinarea sodiului monensin în furaje și preamestecuri. Limita inferioară de determinare este de 10 mg/kg (10 ppm) (3).
   2.   PRINCIPIUL
   Proba se extrage cu 90 % de metanol. Extractul este supus unor proceduri corespunzătoare în conformitate cu conținutul de monensin de sodiu din eșantion. Activitatea antibiotică este determinată prin măsurarea difuziunii sodiului monensin în mediul agar inoculat cu Bacillus subtilis. Difuziunea este indicată de formarea de zone de inhibare ale microorganismului. Diametrul acestor zone este considerat a fi direct proporțional cu logaritmul concentrației antibiotice raportat la intervalul de concentrații antibiotice folosite. Sensibilitatea sistemului de testare este redusă în prezența ionilor de sodiu.
   3.   MICROORGANISM: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)
   3.1.   Menținerea culturii-mamă
   Se inoculează eprubete ce conțin lichid de mediu de cultură (4.1) cu Bacillus subtilis și se incubează peste noapte la 30 °C. Se păstrează cultura într-un frigider la temperatură de aproximativ 4 °C. Se reinoculează lunar.
   3.2   Prepararea suspensiei de spori (4)
   
   Se recoltează cultura crescută dintr-un lichid agar proaspăt preparat (3.1) cu ajutorul a 2-3 ml de apă sterilă. Această suspensie se folosește pentru a inocula 300 ml de mediu de cultură (4.1) dintr-un balon Roux care se incubează timp de trei până la cin ci zile la 30 °C. Se recoltează cultura crescută în 15 ml etanol 20 % (4.2) după ce s-a verificat germinarea la microscop, și se amestecă bine. Această suspensie trebuie păstrată timp de cel puțin cinci luni la aproximativ 4 °C.
   4.   MEDIILE DE CULTURĂ ȘI REACTIVII
   4.1   Mediul de cultură (5)
   
   
               Triptonă
            
            
               10,0 g
            
         
               Extract de drojdie
            
            
               3,0 g
            
         
               Extract de carne
            
            
               1,5 g
            
         
               Glucoză
            
            
               1,0 g
            
         
               Agar (în funcție de calitate)
            
            
               10,0 până la 20,0 g
            
         
               Apă
            
            
               1 000 ml
            
         
               pH 6,5 (după sterilizare).
            
            
                
            
         4.2   Mediul de analiză
   
               Glucoză
            
            
               10,0 g
            
         
               Extract de drojdie
            
            
               2,5 g
            
         
               Fosfat acid de potasiu, K2HPO4
               
            
            
               0,69 g
            
         
               Fosfat diacid de potasiu, KH2PO4
               
            
            
               0,45 g
            
         
               Agar (în funcție de calitate)
            
            
               10,0 până la 20,0 g
            
         
               Apă
            
            
               1 000 ml
            
         
               pH 6 (după sterilizare).
            
            
                
            
         4.3.   Etanol 20 % (v/v): se diluează 200 ml de etanol cu 800 ml apă.
   4.4.   Metanol, anhidră.
   4.5.   Metanol 90 % (v/v): se diluează 900 ml de metanol (4.4) în 100 ml apă.
   4.6.   Metanol 50 % (v/v): se diluează 500 ml de metanol (4.4) în 500 ml apă.
   4.7.   Oxid de aluminiu, granulat (alcoa F, 20 de ochiuri, alumină activată UG1:F. Lancaster & Co., sau un echivalent).
   4.8.   Substanțe standard: sodiu monensin cu activitate cunoscută (de exemplu de la laboratorul Internațional pentru Standarde Biologice, Laboratorul Central Veterinar, Weybridge, Surrey KT 15 3 NB UK).
   5.   APARATURA
   5.1.   Evaporator rotativ în vid cu un balon de 250 ml cu fundul rotund.
   5.2.   Tub de sticlă pentru cromatografie, diametru interior: 25 mm, lungime: 400 mm, cu un capăt deschis cu diametru de 2 mm.
   5.3.   Tub de sticlă pentru cromatografie, diametru interior: 11 mm, lungime: aproximativ 300 mm, cu un capăt deschis cu diametru de 2 mm.
   6.   SOLUȚIILE STANDARD
   Se dizolvă o cantitate cântărită exact de substanță standard (4.8) în metanol (4.4) și se diluează pentru a obține o soluție-mamă ce conține 800 μg sodiu monensin pe mililitru. Păstrată în baloane închise la 4 °C, această soluție este stabilă timp de cel mult două săptămâni.
   Din această soluție-mamă se prepară prin diluție succesivă cu metanol 50 % (4.6) următoarele soluții:
   
               S8
               
            
            
               8,0 µg/ml
            
         
               S4
               
            
            
               4,0 µg/ml
            
         
               S2
               
            
            
               2,0 µg/ml
            
         
               S1
               
            
            
               1,0 µg/ml
            
         7.   PREPARAREA EXTRACTULUI
   7.1   Extracția
   7.1.1   Preamestecurile
   Se cântărește o cantitate de eșantion de 2 g, se adaugă 100 ml de metanol 90 % (4.5), se omogenizează și se centrifughează timp de câteva minute. Se diluează soluția supernatantă cu metanol 50 % (4.6) pentru a obține un conținut estimat de sodiu monensin de 8 μg/ml (= U8).
   7.1.2   Furajele cu un nivel de sodiu monensin de minim 50 ppm
   Se cântărește o cantitate de eșantion de 10–20 g, se adaugă 100 ml de metanol 90 %, se omogenizează timp de 15 minute și se lasă să se stabilizeze.
   Se introduce un tampon de vată la capătul îngust al tubului de sticlă (5.2) și se adaugă oxid de aluminiu lovind ușor până când coloana ajunge 75-80 mm înălțime.
   Se decantează extractul în coloana oxidului de aluminiu și se colectează filtratul. Se diluează 30 ml de filtrat cu 50 ml de apă. Se fac diluări succesive cu metanol 50 % (4.6) pentru a se obține un conținut estimat de sodiu monensin de 8 μg/ml (= U8).
   7.1.3   Furajele cu un nivel de sodiu monensin mai mic de 50 ppm ( până la 10 ppm)
   Se cântărește o cantitate de eșantion de 10-20 g, se adaugă 100 ml de metanol 90 % (4.5), se omogenizează timp de 15 minute. Se centrifughează până se limpezește.
   Pentru un eșantion care conține 20 ppm de sodiu monensin se iau 40 ml de lichid supernatant. Pentru un eșantion care conține 10 ppm, se iau 80 ml și se evaporă până la uscare în vid, într-un evaporator rotativ (5.1) la maxim 40 °C. Se dizolvă reziduul în 10 ml de metanol 90 % (4.5).
   Se introduce un tampon de vată la capătul îngust al tubului de sticlă (5.3) și se adaugă oxid de aluminiu lovind ușor până ce coloana ajunge 75-80 mm înălțime.
   Se decantează soluția de metanol din re ziduu în coloana de oxid de aluminiu și se colectează filtratul. Se spală coloana cu 10 ml de metanol 90 % și soluția obținută se combină cu filtratul.
   Se evaporă soluția până la uscare în vid, în evaporator rotativ (5.1) la o temperatură sub 40 °C. Se dizolvă reziduul în 10 ml de metanol anhidric (4.4) și se completează până la 20 ml cu apă. Se centrifughează la cel puțin 4 000 r/min timp de cel puțin cinci minute. Se fac diluări succesive cu metanol 50 % (4.6) pentru a obține un conținut estimat de 8 μg/ml (= U8).
   7.2   Soluțiile de analiză
   Din soluția U8 se prepară soluțiile U4 (conținut estimat 4 μg/ml), U2 (conținut estimat 2 μg/ml) și U1 (conținut estimat 1 μg/ml) prin diluări succesive (1 + 1) cu metanol 50 % (4.6).
   8.   PROCEDURA DE ANALIZĂ
   8.1   Inocularea mediului de analiză
   Se inoculează mediul de analiză (4.2) cu suspensie de spori (3.2) la 50–60 °C. Prin teste preliminare pe plăcile cu mediu de testare (4.2) se determină cantitatea de suspensie de spori necesară pentru obținerea celor mai mari și mai clare zone de inhibare cu diferite concentrații de sodiu monensin.
   8.2   Pregătirea plăcilor
   Difuziunea în agar se efectuează pe plăcile cu cele patru concentrații ale soluției standard (S8, S4, S2, S1) și cu cele patru concentrații ale soluției de testare (U8, U4, U2, U1). Aceste patru concentrații de extract și standard trebuie puse pe fiecare lamelă. În acest scop se aleg plăcile suficient de mari pentru a permite formarea în mediul agar a cel puțin opt orificii cu un diametru de 10 – 13 mm și cu cel puțin 30 de mm între centre. Testele pot fi efectuate pe plăcile de sticlă cu un inel de aluminiu sau plastic pe ele, cu un diametru de 200 mm și o înălțime de 20 mm.
   Se toarnă pe plăci o cantitate de mediu (4.2) inoculat ca la punctul 8.1 pentru a obține un strat de 2 mm grosime (60 ml pentru o lamelă cu diametru de 200 mm). Se lasă să se uniformizeze, se fac orificii și în ele se pun volumele de soluție de testare și soluție standard (între 0,10 și 0,15 ml pe orificiu, în funcție de diametru), măsurate cu exactitate. Fiecare concentrație se aplică de cel puțin patru ori astfel încât fiecare determinare este supusă unei evaluări a 32 de zone de inhibare.
   8.3   Incubare
   Se incubează plăcile timp de aproximativ 18 ore la 35-37 °C.
   9.   EVALUARE
   Se măsoară diametrul zonelor de inhibare cu o precizie de până la 0,1 mm. Se înregistrează valoarea medie a măsurătorilor pentru fiecare concentrație, pe hârtie milimetrică cu semilogaritmi, indicând logaritmul concentrațiilor în raport cu diametrele zonelor de inhibare. Se schițează linii „optime” pentru soluția standard și a extractului, ca în exemplul menționat în continuare.
   Se determină punctul „optim” pentru nivelul cel mai scăzut de soluție standard (SL) folosind formula:
   
               a)
            
            
               
                  
            
         Se determină punctul „optim” pentru nivelul cel mai ridicat de soluție standard (SH) folosind formula:
   
               b)
            
            
               
                  
            
         În același mod se determină punctul „optim” pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL), și nivelul cel mai ridicat de extract (UH), înlocuind U1, U2, U4 și U8 cu S1, S2, S4 și S8 în formulele menționate anterior.
   Valorile SL și SH se înregistrează pe aceeași hârtie milimetrică și se unesc pentru a obține linia „cea mai potrivită” pentru soluția standard. În același mod se înregistrează UL și UH și se unesc pentru a obține linia „cea mai potrivită” pentru extract.
   În absența oricărei interfețe liniile trebuie să fie paralele. Pentru scopuri practice, liniile pot fi considerate paralele dacă valorile (SH-SL) și (UH-UL) nu diferă cu mai mult de 10 % din valoarea medie a acestora.
   Dacă liniile nu sunt paralele, fie U1 și S1, fie U2 și S2 trebuie înlăturate și SL, SH UL și UH calculate folosind formule alternative, pentru a obține linii alternative „optime”:
   
               
                           a')
                        
                        
                           
                              
                        
                     
            
               sau
            
            
               
                  
            
         
      
   
               
                           b')
                        
                        
                           
                              
                        
                     
            
               sau
            
            
               
                  
            
         și în același mod pentru UL și UH. Liniile alternative „optime” se verifică pentru paralelism ca mai înainte. Faptul că rezultatul a fost calculat pe trei niveluri se menționează în raportul final.
   
      Atunci când liniile sunt considerate paralele, se calculează logaritmul activității relative (log A) folo sind una din următoarele formule.
   
      Pentru patru nivele
   
   
               c)
            
            
               
                  
            
         
      Pentru trei nivele
   
   
               d)
            
            
               
                  
            
         sau
   
               d')
            
            
               
                  
            
         Activitatea efectivă = activitatea estimată activitatea relativă.
   Dacă activitatea relativă nu se încadrează în intervalul de 0,5-2,0, se repetă testul efectuând ajustările corespunzătoare concentrațiilor de extract, sau dacă acest lucru nu este posibil, soluțiilor standard. Dacă activitatea relativă nu poate fi încadrată în intervalul necesar, orice rezultat obținut trebuie considerat ca fiind aproximativ și acest lucru trebuie indicat în raportul final.
   
      Atunci când liniile nu sunt considerate a fi paralele, se repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este încă obținut, determinarea se consideră ca fiind nesatisfăcătoare.
   10.   REPETABILITATE
   Diferența între rezultatele a două determinări efectuate pe același eșantion, de către același analist, nu trebuie să depășească:
   
               —
            
            
               20 % raportat la valoarea cea mai ridicată a conținutului de sodiu monensin de la 10 la 25 mg/kg;
            
         
               —
            
            
               5 mg/kg în valoare absolută pentru un conținut de 25 la 50 mg/kg;
            
         
               —
            
            
               10 % raportat la valoarea cea mai ridicată pentru un conținut peste 50 mg/kg.
            
         
      (1)  Se pot folosi și alte metode cu condiția să se fi stabilit că acestea produc suspensii de spori similare.
   
      (2)  Se poate folosi orice mediu de cultură din comerț care are o compoziție similară și dă aceleași rezultate.
   
      (3)  1 mg de sodiu monensin este echivalent cu 1 000 unități UK.
   
      (4)  Se pot folosi și alte metode dacă s-a stabilit că acestea dau suspensii de spori similare.
   
      (5)  Se poate folosi orice mediu de cultură din comerț care are o compoziție similară și dă aceleași rezultate