CELEX: 31984L0004
Language: es
Date: 1983-12-20 00:00:00
Title: Directiva 84/4/CEE de la Comisión, de 20 de diciembre de 1983, por la que se modifican las Directivas 71/393/CEE, 72/199/CEE y 78/633/CEE por las que se establecen métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales

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31984L0004

Directiva 84/4/CEE de la Comisión, de 20 de diciembre de 1983, por la que se modifican las Directivas 71/393/CEE, 72/199/CEE y 78/633/CEE por las que se establecen métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales  

Diario Oficial n° L 015 de 18/01/1984 p. 0028 - 0038 Edición especial en finés : Capítulo 3 Tomo 17 p. 0033  Edición especial en español: Capítulo 03 Tomo 29 p. 0233  Edición especial sueca: Capítulo 3 Tomo 17 p. 0033  Edición especial en portugués: Capítulo 03 Tomo 29 p. 0233 

 DIRECTIVA DE LA COMISIÓN    de 20 de diciembre de 1983    por la que se modifican las Directivas 71/393/CEE ,   72/199/CEE y 78/633/CEE por las que se establecen   métodos de análisis comunitarios para el control   oficial de los alimentos para animales     ( 84/4/CEE )    LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,    Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad   Económica Europea ,    Vista la Directiva 70/373/CEE del Consejo , de 20 de   julio de 1970 , relativa a la introducción de modos   de toma de muestras y de métodos de análisis   comunitarios para el control oficial de los alimentos   para animales (1) , modificada en último lugar por   el Acta de adhesión de Grecia , y , en particular ,   su artículo 2 ,    Considerando que las Directivas 71/393/CEE (2) ,   72/199/CEE (3) y 78/633/CEE (4) de la Comisión   establecen , respectivamente , los métodos de   determinación de las materias grasas brutas , de la   virginiamicina y de la bacitracina-cinc ; que resulta   necesario sustituir dichos métodos   por otros adaptados a la evolución de los conocimientos   científicos y técnicos ;    Considerando que las medidas previstas en la presente   Directiva se ajustan al dictamen del Comité permanente   de alimentos animales ,    HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :    Artículo 1    En el Anexo de la Directiva 71/393/CEE , se sustituye   el texto de la Parte 4 , « Determinación de las   materias grasas brutas » , por el que figura en el   Anexo I de la presente Directiva .    Artículo 2    En el Anexo II de la Directiva 72/199/CEE , se   sustituye el texto de la Parte 5 « Determinación   de la virginiamicina : por difusión en gelosa » ,   por el que figura en el Anexo II de la presente Directiva .    Artículo 3    En el Anexo de la Directiva 78/633/CEE , se sustituye el   texto de la Parte 1 , « Determinación de la   bacitracina-cinc : por difusión en gelosa » , por el   que figura en el Anexo III de la presente Directiva .    Artículo 4    Los Estados miembros aplicarán las disposiciones   legales , reglamentarias y administrativas necesarias para   cumplir las disposiciones de la presente Directiva , a   más tardar el 1 de junio de 1984 e informarán de ello   inmediatamente a la Comisión .    Artículo 5    Los destinatarios de la presente Directiva serán los   Estados miembros .    Hecho en Bruselas , el 20 de diciembre de 1983 .    Por la Comisión    Poul DALSAGER    Miembro de la Comisión    (1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .    (2) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1972 , p. 7 .    (3) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .    (4) DO n º L 206 de 29 . 7 . 1978 , p. 43 .    ANEXO I     « 4 . DETERMINACIÓN DE LAS MATERIAS   GRASAS BRUTAS    1 . Objeto y ámbito de aplicación    El método permite determinar el contenido   de materias grasas brutas de los alimentos para   animales . No es válido para el análisis   de las semillas y frutos oleaginosos definidos   en el Reglamento ( CEE ) n º 136/66/CEE del   Consejo , de 22 de septiembre de 1966 .    Según la naturaleza del alimento , debe   aplicarse uno u otro de los procedimientos descritos a   continuación .    1.1 . Procedimiento A    Aplicable a los alimentos simples de origen   vegetal , con excepción de los que se sabe que   contienen materias grasas que no pueden extraerse   completamente mediante el éter de petróleo sin   hidrólisis previa . En estas excepciones   se incluyen los glútenes , las levaduras , las proteínas   de soja y de patatas . El procedimiento es aplicable   asimismo a los piensos compuestos , con excepción de los   que contengan leche en polvo o cuyas materias grasas no   puedan extraerse completamente mediante el éter de   petróleo sin hidrólisis previa .    1.2 . Procedimiento B    Aplicable a los alimentos simples de origen   animal , así como a los alimentos mencionados en el   punto 1.1 como excepciones para la aplicación   del procedimiento A .    2 . Principio    2.1 . Procedimiento A    Se extrae la muestra por medio de éter   de petróleo . Se destila el disolvente , y se   seca y pesa el residuo .    2.2 . Procedimiento B    Se trata la muestra en caliente mediante ácido   clorhídrico . Se enfría y filtra la mezcla .   Después de lavarlo y secarlo , el residuo se   somete al análisis según el procedimiento A .    3 . Reactivos    3.1 . Éter de petróleo , intervalo de   ebullición : 40 a 60 ° C . El índice   de bromo debe ser inferior a 1 y el residuo de   evaporación inferior a 2 mg/100 ml .    3.2 . Sulfato de sodio , anhidro .    3.3 . Ácido clorhídrico 3 N .    3.4 . Coadyudante de filtración , como por ejemplo   tierra de diatomeas , Hiflo-supercel .    4 . Aparatos    4.1 . Extractor . Si el aparato está provisto   de un sifón ( aparato Soxhtel ) , el   caudal de reflujo debe regularse de forma que   se obtengan por 10 menos 10 ciclos por hora . Si   se trata de un aparato sin sifón , el caudal   líquido refluido debe ser de alrededor de 10 ml   por minuto .    4.2 . Cartuchos de extracción , exentos de sustancias   solubles en el éter de petróleo , cuya porosidad   sea compatible con las exigencias del punto 4.1 .    4.3 . Estufa de secado , bien por vacío a   75 ° C ± 3 ° C , bien a presión atmosférica   a 100 ° C ± 3 ° C .    5 . Modo de operación    5.1 . Procedimiento A ( véase observación 8.1 )    Pesar , con error no superior a 1 mg , 5 g de   muestra , introducirlos en un cartucho de   extracción ( 4.2 ) y cubrirlos con una torunda   de algodón desgrasado .    Colocar el cartucho en un extractor ( 4.1 )   y extraer durante seis horas por medio de éter   de petróleo ( 3.1 ) . Recoger en un matraz   seco provisto de piedra pómez (1) y tarado .    Eliminar el disolvente por destilación . Secar   el residuo mediante colocación del matraz   durante una hora y media en una estufa de secado   ( 4.3 ) . Dejar enfriar en un secador y pesar .   Secar de nuevo durante treinta minutos para   asegurarse de que el peso de la materia grasa se   mantiene constante ( la pérdida de peso entre   dos pesadas sucesivas debe ser inferior a 1 mg ) .    5.2 . Procedimiento B    Pesar , con error inferior a 1 mg , 2,5 g de   de la muestra ( ver observación 8.2 ) ,   introducirlos en un cilindro de 400 ml o en un   matraz cónico de 300 ml y añadir 100 ml de   ácido clorhídrico 3 N ( 33 ) y algunos fragmentos   de piedra pómez . Cubrir el cilindro   con un vidrio de reloj o dotar al matraz cónico   de un refrigerador de reflujo . Llevar la   mezcla a ebullición suave con ayuda de una llama   pequeña o de una placa eléctrica , y mantenerla   así durante una hora . Evitar que el producto se   pegue a las paredes del recipiente .    Enfriar y añadir una cantidad de coadyudante   de filtración ( 3.4 ) suficiente para evitar cualquier   pérdida de materia grasa en el momento de la   filtración . Filtrar en un papel filtro doble   humedecido , exento de materias grasas . Lavar   el residuo con agua fría hasta la neutralidad   del filtrado . Comprobar que el filtrado no contiene   materias grasas . La presencia de éstas indica   que debe efectuarse una extracción , de la   muestra mediante éter de petróleo , según el   procedimiento A , antes de la hidrólisis .    Colocar el papel filtro doble que contiene   el residuo en un vidrio de reloj , y secar durante   una hora y media en la estufa a 100 ° C ± 3 ° C .    Introducir el papel filtro doble que contiene   el residuo seco en un cartucho de extracción   ( 4.2 ) y cubrirlo con una torunda de algodón   desgrasado . Colocar el cartucho en un   extractor ( 4.1 ) y continuar la operación   tal como se indica en los párrafos segundo   y tercero del punto 5.1 .    6 . Cálculo de los resultados    Expresar el resultado de la pesada en partes   por ciento de muestra .    7 . Reproducibilidad    La diferencia entre dos determinaciones paralelas   efectuadas en una misma muestra mediante el mismo   análisis no debe superar :    0,2 % en valor absoluto , para los contenidos   de materias grasas brutas inferiores al 5 % ,    4,0 % del resultado más elevado para los contenidos   del 5 al 10 % ,    0,4 % en valor absoluto , para los contenidos   superiores al 10 % .    8 . Observaciones    8.1 . Para los productos con alto contenido   de materias grasas , difíciles de desleír   o no apropiados para la obtención de una muestra   de ensayo reducida homogénea , ha de procederse   del modo siguiente .    Pesar , con un error inferior a 1 mg , 20 g de   la muestra y mezclarlos con 10 g o más de sulfato   de sodio anhidro ( 3.2 ) . Extraer mediante éter   de petróleo ( 3.1 ) tal como se indica en el   punto 5.1 . Completar el extracto obtenido hasta   500 ml con éter de petróleo ( 3.1 ) y   homogeneizarlo . Introducir 50 ml de la solución   en un matraz pequeño seco , provisto de algunos   fragmentos de piedra pómez (1) y tarado . Eliminar   el disolvente por destilación , secar y   continuar la operación tal como se indica en el   último párrafo del punto 5.1 .    Eliminar el disolvente del residuo de extracción   presente en el cartucho , reducir el residuo a una   finura de 1 mm , colocarlo de nuevo en el   cartucho ( no añadir sulfato de sodio ) y continuar   la operación tal como se indica en los párrafos   segundo y tercero del punto 5.1 .    El contenido de materias grasas brutas en   partes por ciento de muestras se determina mediante   la fórmula :     ( 10 a + b ) × 5    en la que :    a = masa , en gramos , del residuo de la primera   extracción ( parte alícuota del extracto ) ,    b = masa , en gramos , del residuo de la segunda   extracción .    8.2 . La cantidad para ensayo de los productos   pobres en materias grasas puede aumentarse a 5 g . »    (1) Sustituir los fragmentos de piedra pómez   por perlas de vidrio cuando la materia grasa deba   someterse a exámenes cualitativos ulteriores .    ANEXO II     « 5 . DETERMINACIÓN DE LA VIRGINIAMICINA     - por difusión en gelosa -    1 . Objeto y ámbito de aplicación    El método permite determinar la virginiamicina   en los alimentos y en las premezclas . El límite   inferior de la determinación es de 2 mg/kg   ( 2 ppm ) (1) .    2 . Principio    Se somete la muestra a una extracción mediante una   solución metanólica de Tween 80 . El extracto se   decanta o centrifuga , y se diluye después .   Su actividad antibiótica se determina por mediación   de la difusión de la virginiamicina en un   medio de gelosa , sembrado con Micrococcus luteus . La   difusión se manifiesta por la formación de   zonas de inhibición del microorganismo . El diámetro   de dichas zonas se considera directamente proporcional   al logaritmo de la concentración de antibiótico   para la gama de concentraciones utilizadas .    3 . Microorganismos : « Micrococcus luteus »   ATCC 9341 ( NCTC 8340 , NCIB 8553 )    3.1 . Mantenimiento de la cepa    Sembrar el medio de cultivo ( 4.1 ) , en tubos   inclinados , con Micrococcus luteus . Incubar durante   veinticuatro horas a 30 ° C , conservar en   frigorífico a unos 4 ° C y renovar la siembra   cada quince días .    3.2 . Preparación de la suspensión bacteriana (a)    Recoger los gérmenes en un tubo de gelosa   ( 3.1 ) , de preparación reciente , con ayuda   de 2 a 3 ml de solución de cloruro   sódico ( 4.3 ) . Sembrar con esta suspensión   250 ml del medio de cultivo ( 4.1 ) en un matraz   de Roux e incubar durante dieciocho a veinte horas a   30 ° C . Recoger los gérmenes en 25 ml. de   solución de cloruro sódico ( 4.3 ) y homogeneizar .    Diluir la suspensión a 1/10 con ayuda de la   solución de cloruro sódico ( 4.3 ) . La   transmisión luminosa de la suspensión , medida   a 650 mm bajo un espesor de 1 cm por comparación   con la solución de cloruro sódico ( 4.3 ) , debe   ser de alrededor del 75 % . Esta suspensión   puede conservarse una semana a unos 4 ° C .    4 . Medios de cultivo y reactivos    4.1 . Medio de mantenimiento de la cepa y de base   de la determinación (b)    Peptona de carne * 6,0 g *    Triptona * 4,0 g *    Extracto de levadura * 3,0 g *    Extracto de carne * 1,5 g *    Glucosa * 1,0 g *    Gelosa * 10,0 a 20,0 g *    Agua * 1 000 ml *    pH 6,5 ( tras esterilización ) * *    4.2 . Tampón fosfato , pH 6    Hidrogenofosfato de potasio K2HPO4 * 2,0 g *    Dihidrogenofosfato de potasio KH2PO4 * 8,0 g *    Agua hasta * 1 000 ml *    4.3 . Solución a 0,8 % ( p/v ) de cloruro   sódico : disolver en agua 8 g de cloruro   sódico , diluir hasta 1 000 ml y esterilizar .    4.4 . Matanol .    4.5 . Mezcla de tampón fosfato ( 4.2 ) y   de metanol ( 4.4 ) : 80/20 ( v/v ) .    4.6 . Solución en metanol al 0,5 % ( p/v )   de Tween 80 : disolver 5 g de Tween 80 en metanol   ( 4.4 ) y diluir hasta 1 000 ml con metanol .    4.7 . Sustancia de referencia : virginiamicina   de actividad conocida .    5 . Soluciones de referencia    Disolver una cantidad pesada exactamente   de la sustancia de referencia ( 4.7 ) en el metanol   ( 4.4 ) y diluir con metanol ( 4.4 ) para obtener   una solución madre a 1 000 µg de virginiamicina/ml .   Conservada en un matraz tapado a 4 ° C , esta   solución es estable durante 5 días .    Preparar , a partir de esta solución y mediante   diluciones sucesivas con la ayuda de la mezcla ( 4.5 ) ,   las soluciones siguientes :    S8 1 µg/ml    S4 0,5 µg/ml    S2 0,25 µg/ml    S1 0,125 µg/ml    6 . Preparación del extracto y de las soluciones    6.1 . Extracción    6.1.1 . Productos cuyo contenido en viginiamicina   no excede de 100 mg/kg    Pesar una cantidad de muestra de 50,0 g .   Añadir 200 ml de solución ( 4.6 ) , agitar   durante 30 minutos y dejar luego sedimentar   o centrifugar . Recoger 20 ml de la solución   sobrenadante y evaporar hasta 5 ml en un evaporador   rotatorio a una temperatura que no exceda de   40 ° C . Disolver el residuo con ayuda de la   mezcla ( 4.5 ) para obtener una concentración   supuesta de virginiamicina de 1 µg/ml ( = U8 ) .    6.1.2 . Productos cuyo contenido en virginiamicina   es superior a 100 mg/kg    Pesar una cantidad de muestra que no exceda   de 10,0 g y contenga de 1 a 50 mg de virginiamicina .   Añadir 100 ml de solución ( 4.6 ) , agitar   durante 30 minutos , y dejar sedimentar luego o   centrifugar . Disolver la solución sobrenadante   con ayuda de la mezcla ( 4.5 ) para obtener una   concentración de virginiamicina de 1 µg/ml ( = U8 ) .    6.2 . Soluciones del extracto    Preparar , a partir de la solución U8 y   por diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con ayuda de la   mezcla ( 4.5 ) , las soluciones U4 ( concentración   supuesta : 0,5 µg/ml , U2 ( concentración supuesta :   0,25 µg/ml ) y U1 ( concentración supuesta :   0,125 µg/ml ) .    7 . Modalidades de la determinación    7.1 . Inoculación del medio de cultivo    Sembrar a unos 50 ° C el medio de base   de la determinación ( 4.1 ) con la suspensión   bacteriana ( 3.2 ) . Mediante ensayos preliminares   sobre placas con el medio ( 4.1 ) , determinar   la cantidad de suspensión bacteriana que permite   obtener para las diferentes concentraciones de   virginiamicina zonas de inhibición lo más   amplias posibles sin dejar de ser nítidas .    7.2 . Preparación de las cajas    La difusión en gelosa se efectúa en cajas   con las cuatro concentraciones de la solución de   referencia ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las cuatro   concentraciones del extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) .   Cada caja debe recibir necesariamente las cuatro   concentraciones de la referencia y del extracto .   A tal fin , hay que elegir la dimensión de las   cajas de forma que se puedan excavar en el medio de gelosa   por lo menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de   diámetro , cuyos centros no disten menos de   30 mm . Pueden emplearse como cajas placas   de vidrio planas , coronadas por un anillo de aluminio o de   materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm   de altura .    Introducir en las cajas una cantidad del   medio ( 4.1 ) , sembrado tal como se indica en 7.1 ,   que permita obtener una capa de unos 2 mm de grosor   ( 60 ml para una caja de 200 mm de diámetro ) .   Dejar solidificar , excavar las cavidades y depositar   en ellas volúmenes exactamente medidos de las   soluciones de la referencia y del extracto ( 0,10 a   0,15 ml por cavidad según el diámetro ) . Repetir   por lo menos cuatro veces cada concentración , de   forma que cada determinación comprenda la valoración   de 32 zonas de inhibición .    7.3 . Incubación    Incubar las cajas durante dieciséis a   dieciocho horas a 30 ° C I 2 ± ° C .    8 . Valoración    Medir el diámetro de las zonas de inhibición   con un error no superior a 0,1 mm . Para cada   concentración , registrar las medidas en papel   semilogarítmico , trasladando el logaritmo   de las concentraciones en relación con los diámetros   de las zonas de inhibición . Trazar las rectas   más ajustadas para la solución de referencia   y para el extracto , por ejemplo , mediante   el procedimiento siguiente :    Determinar el punto más apropiado del nivel   más bajo de la solución de referencia ( SL )   con ayuda de la fórmula :     ( a ) SL = ( 7s1 + 4s2 + s4 - 2s8 ) /10    Determinar el punto más apropiado del nivel   más alto de la solución de referencia ( SH ) con   ayuda de la fórmula :     ( b ) SH = ( 7s8 + 4s4 + s2 - 2s1 ) /10    Determinar del mismo modo los puntos más apropiados   del extracto para el nivel más bajo ( UL ) y el   nivel más alto ( UH ) sustituyendo S1 , S2 , S4 y   S8 en las fórmulas anteriores por U1 , U2 , U4 y U8 .    Consignar los valores SL y SH en la misma gráfica .   Al unir los dos puntos , se obtiene la recta más   ajustada para la solución de referencia . Si se   sigue el mismo método para UL y UH , se obtiene la   recta más ajustada para el extracto .    Si no hubiere ninguna interferencia , las rectas se   consideran paralelas cuando ( SH - SL ) y ( UH - UL )   no difieren en más de un 10 % de su media .    Si las rectas no son paralelas , pueden eliminarse   U1 y S1 , o U8 y S8 . Los valores SL , SH , UL y UH   que permiten obtener las rectas más ajustadas   se calculan entonces con ayuda de las fórmulas   siguientes :     ( a' ) SL = ( 5s1 + 2s2 - s4 ) /6 ó   ( 5s2 + 2s4 - s8 ) /6     ( b' ) SH = ( 5s4 + 2s2 - s1 ) /6 ó   ( 5s8 + 2s4 - s2 ) /6    y de fórmulas análogas para UL y UH . La   utilización de esta alternativa obliga a respetar los   mismos criterios de paralelismo .    En el boletín de análisis debe mencionarse la   obtención de un resultado procedente de tres niveles .    Cuando las rectas se consideren paralelas , hay   que calcular el logaritmo de la actividad relativa   ( log A ) mediante una de las fórmulas siguientes ,   según el número de niveles ( 4 o 3 ) utilizados   para la valoración del paralelismo .    Para 4 niveles :     ( c ) log A = ( ( u1 + u2 + u4 + u8 - s1 - s2 - s4 -   s8 ) × 0,602 ) / ( u4 + u8 + s4 + s8 - u1 - u2 -   s1 - s2 )    Para 3 niveles :     ( d ) log A = ( ( u1 - u2 - u4 - s1 - s2 - s4 )   × 0,401 ) / ( u4 - s4 - u1 - s1 )    o     ( d' ) log A = ( ( u2 - u4 - u8 - s2 - s4 - s8 )   × 0,401 ) / ( u8 - s8 - u2 - s2 )    Actividad del extracto de la muestra = actividad   de la referencia correspondiente × A :     ( U8 = S8 × A )    Si la actividad relativa no se encuentra en la   gama de valores comprendidos entre 0,5 y 2,0 , ha de   repetirse la determinación procediendo a los   ajustes apropiados de las concentraciones del extracto   o , en su caso , de las soluciones de referencia .   Cuando actividad no pueda encuadrarse en la gama de   los valores exigidos , el resultado se considerará   aproximado y así se hará constar en el boletín   de análisis .    Cuando las rectas no se consideren paralelas ,   se repetirá la determinación . Si tampoco ahora   se lograre el paralelismo , la determinación se   considerará insatisfactoria .    Expresar el resultado en miligramos de virginiamicina   por kilogramo de alimento .    9 . Reproducibilidad    La diferencia entre los resultados de dos   determinaciones efectuadas en la misma muestra por el   mismo analista no debe exceder de :    2 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos   de virginiamicina inferiores a 10 mg/kg ,    20 por 100 del resultado más alto , para los   contenidos de 10 a 25 mg/kg ,    5 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos   de 25 a 50 mg/kg ,    10 por 100 del resultado más alto , para los   contenidos superiores a 50 mg/kg . »    (1) 1 mg de virginiamicina equivale a 1 000 unidades   « UK » .    (a) Pueden utilizarse otros métodos , siempre   que esté demostrado que producen suspensiones   bacterianas análogas .    (b) Puede utilizarse cualquier medio de cultivo   comercial de composición análoga y que   dé los mismos resultados .    ANEXO III     « 1 . DETERMINACIÓN DE LA BACITRACINA-CINC     - por difusión en gelosa -    1 . Objeto y ámbito de aplicación    El método permite determinar la bacitracina-cinc   en los alimentos las premezclas . El límite inferior   de la determinación es de 5 mg/kg ( 5 ppm ) (1) .    2 . Principio    Se extrae la muestra a pH 2 mediante una mezcla   de etanol , agua y ácido clorhídrico y una   solución de sulfuro sódico . El sulfuro sódico   permite precipitar las sales de cobre solubles   que pudieran obstaculizar la determinación . El   extracto , llevado a pH 6,5 , se concentra ( en   caso necesario ) y diluye . Su actividad   antibiótica se determina por medición de la   difusión de la bacitracina-cinc en un medio de   gelosa , sembrado con Micrococcus luteus ( flavus ) .   La difusión se manifiesta mediante la formación   de zonas de inhibición del microorganismo . El   diámetro de dichas zonas se considera directamente   proporcional al logaritmo de la concentración   de antibiótico para la gama de concentraciones   utilizadas .    3 . Microorganismo : « Micrococcus luteus   ( flavus ) » ATCC 10240    3.1 . Mantenimiento de la cepa    Sembrar el medio de cultivo ( 4.1 ) , en tubos   inclinados , con Micrococcus luteus ( flavus ) .   Incubar durante veinticuatro horas a 30 ° C ,   conservar en frigorífico a unos 4 ° C y renovar   la siembra cada quince días .    3.2 . Preparación de la suspensión bacteriana (a)    Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa ( 3.1 ) ,   de preparación reciente , con la ayuda de 2 a 3 ml   de solución de cloruro sódico ( 4.3 ) . Sembrar   con esta suspensión 250 ml del medio de cultivo   ( 4.1 ) en un matraz de Roux e incubar durante   dieciocho a veinte horas a 30 ° C . Recoger   los gérmenes en 25 ml de solución de cloruro   sódico ( 4.3 ) y homogeneizar .    Diluir la suspensión a 1/10 con ayuda de la   solución de cloruro sódico ( 4.3 ) . La   transmisión luminosa de la solución , medida   a 650 mm bajo un espesor de 1 cm por comparación   con la solución de cloruro sódico ( 4.3 ) ,   debe ser de alrededor del 75 % . Esta suspensión   puede conservarse una semana a unos 4 ° C .    4 . Medios de cultivo y reactivos    4.1 . Medio de mantenimiento de la cepa (b)    Peptona de carne 6,0 g    Triptona 4,0 g    Extracto de levadura 3,0 g    Extracto de carne 1,5 g    Glucosa 1,0 g    Gelosa 10,0 a 20,0 g    Agua 1 000 ml    pH 6,5 - 6,6 ( tras esterilización )    4.2 . Medio de base de la determinación (b)    Triptona 10,0 g    Extracto de levadura 3,0 g    Extracto de carne 1,5 g    Glucosa 1,0 g    Gelosa 10,0 a 20,0 g    Tween 80 1 ml    Agua 1 000 ml    pH 6,5 ( tras esterilización )    4.3 . Solución al 0,8 % ( p/v ) de cloruro   sódico : disolver en agua 8 g de cloruro sódico ,   diluir a 1 000 ml y esterilizar .    4.4 . Mezcla de metanol/agua/ácido clorhídrico   ( 4.6 ) : 80/17,5/2,5 ( v/v/v ) .    4.5 . Tampón fasfato , pH 6,5    Fosfato bipotásico K2HPO4 22,15 g    Fosfato monopotásico KH2PO4 27,85 g    Agua hasta 1 000 ml    4.6 . Ácido clorhídrico , d : 1,18-1,19    4.7 . Ácido clorhídrico , 0,1 M    4.8 . Solución 1 M de hidróxido sódico    4.9 . Solución 0,5 M , aproximadamente , de sulfuro   sódico    4.10 . Solución al 0,04 % ( p/v ) de púrpura   de bromocresol :    disolver 0,1 g de púrpura de bromocresol en   18,5 ml de solución 0,01 M de hidróxido sódico .   Completar hasta 250 ml con agua y homogeneizar .    4.11 . Sustancia de referencia : bacitracina-cinc   de actividad conocida ( en UI ) .    5 . Soluciones de referencia    Pesar una cantidad de sustancia de referencia   ( 4.11 ) correspondiente a 1 050 UI ( según el   título indicado ) . Añadir 5 ml de ácido   clorhídrico 0,1 M ( 4,7 ) y dejar reposar   quince minutos . Añadir 30 ml de agua , ajustar   el pH a 4,5 con la ayuda del tampón fosfato   ( 4.5 ) ( unos 4 ml ) , completar hasta 50 ml con   agua y homogeneizar ( 1 ml = 21 UI ) .    Preparar , a partir de esta solución y   mediante diluciones sucesivas con ayuda del   tampón fosfato pH 6,5 ( 4.5 ) , las soluciones   siguientes :    S8 0,42 UI/ml    S4 0,21 UI/ml    S2 0,105 UI/ml    S1 0,0525 UI/ml    6 . Preparación del extracto    6.1 . Extracción    6.1.1 . Premezclas y alimentos minerales    Pesar una cantidad de mezcla de 2,0 a 5,0 g ,   añadir 29,0 ml de la mezcla ( 4.4 ) y 1,0 ml de   solución de sulfuro sódico ( 4.9 ) ; agitar   brevemente . Comprobar que el pH es de alrededor de   2 . Agitar durante 10 minutos , añadir 30 ml   de tampón fosfato ( 4.5 ) , agitar durante 15 minutos   y centrifugar . Tomar una parte alícuota de la   solución sobrenadante y ajustar el pH a 6,5 con   ayuda de la solución 1 M de hidróxido sódico   ( 4.8 ) utilizando un pHmetro o la solución de   púrpura de bromocresol ( 4.10 ) como indicador .    Diluir con ayuda del tampón fosfato ( 4.5 ) para   obtener una concentración supuesta en bacitracina-cinc   de 0,42 UI/ml ( = U8 ) .    6.1.2 . Concentrados proteínicos    Pesar una cantidad de muestra de 10,0 g ,   añadir 49,0 ml de la mezcla ( 4.4 ) y 1,0 ml de   la solución de sulfuro sódico ( 4.9 ) ;   agitar brevemente . Comprobar que el pH es de   alrededor de 2 . Agitar durante 10 minutos ,   añadir 50 ml de tampón fosfato ( 4.5 ) , agitar   durante 15 minutos y centrifugar . Tomar una   parte alícuota de la solución sobrenadante   y ajustar el pH a 6,5 con ayuda de la solución 1 M   de hidróxido sódico ( 4.8 ) utilizando un   pHmetro o la solución de púrpura de bromocresol   ( 4.10 ) como indicador .    Evaporar aproximadamente la mitad del volumen   en un evaporador rotatorio a una temperatura que no   exceda de 35 ° C . Diluir con ayuda del tampón   fosfato ( 4.5 ) para obtener una concentración   supuesta en bacitracina-cinc de 0,42 UI/ml ( = U8 ) .    6.1.3 . Otros alimentos    Pesar una cantidad de muestra de 10 g ( 20,0 g   para una concentración supuesta de bacitracina-cinc   de 5 mg/kg ) . Añadir 24,0 ml de mezcla ( 4.4 ) y   1,0 ml de solución de sulfuro sódico ( 4.9 ) ;   homogeneizar durante 10 minutos . Añadir 25 ml   de tampón fosfato ( 4.5 ) , agitar durante 15 minutos   y centrifugar . Tomar 20 ml de la solución   sobrenadante y ajustar el pH a 6,5 con ayuda de   la solución 1 M de hidróxido sódico ( 4.8 )   utilizando un pHmetro o la solución de   púrpura de bromocresol ( 4.10 ) como indicador .   Evaporar hasta 4 ml aproximadamente en un   evaporador rotatorio a una temperatura que no   exceda de 35 ° C . Diluir el residuo con ayuda   del tampón fosfato ( 4.5 ) para obtener una   concentración supuesta de bacitracine-cinc de   0,42 UI/ml ( = U8 ) .    6.2 . Soluciones del extracto    Preparar , a partir de la solución U8 y por   diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con la ayuda del   tampón fosfato ( 4.5 ) , las soluciones U4   ( concentración supuesta : 0,21 UI/ml ) , U2   ( concentración supuesta : 0,105 UI/ml ) y U1   ( concentración supuesta : 0,0525 UI/ml ) .    7 . Modalidades de determinación    7.1 . Inoculación del medio de cultivo    Sembrar a unos 50 ° C el medio de base de la   determinación ( 4.2 ) con la suspensión bacteriana   ( 3.2 ) mediante ensayos preliminares en placas   con el medio ( 4.2 ) , determinar la cantidad de   suspensión bacteriana que permite obtener para   las diferentes concentraciones de bacitracina-cinc zonas   de inhibición lo más amplias posibles sin dejar   de ser nítidas .    7.2 . Preparación de las cajas    La difusión en gelosa se efectúa en cajas con   las cuatro concentraciones de la solución de   referencia ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las cuatro   concentraciones del extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) .   Cada caja debe recibir necesariamente las cuatro   concentraciones de referencia y del extracto .   A tal fin , hay que elegir la dimensión de las   cajas de forma que se puedan excavar en el medio   de gelosa por lo menos 8 cavidades de 10 a 13 mm   de diámetro , cuyos centros no disten menos   de 30 mm . Pueden emplearse como cajas placas de   vidrio planas , coronadas por un anillo de aluminio   o de materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm   de altura .    Introducir en las cajas una cantidad del medio ( 4.2 ) ,   sembrado tal como se indica en 7.1 , que permita   obtener una capa de unos 2 mm de grosor ( 60 ml   para una caja de 200 mm de diámetro ) . Dejar   solidificar , excavar las cavidades y depositar   en ellas volúmenes exactamente medidos de las   soluciones de referencia y del extracto ( 0,10 a   0,15 ml por cavidad según el diámetro ) .   Repetir por lo menos cuatro veces cada concentración ,   de forma que cada determinación comprenda la   valoración de 32 zonas de inhibición .    7.3 . Incubación    Incubar las cajas durante dieciséis a dieciocho   horas a 30 ° C ± 2 ° C .    8 . Valoración    Medir el diámetro de las zonas de inhibición   con un error no superior a 0,1 mm . Para cada   concentración , registrar las medidas medias en   papel semilogarítmico , trasladando el   logaritmo de las concentraciones en relación con   los diámetros de las zonas de inhibición .   Trazar las rectas más ajustadas para la solución   de referencia y para el extracto , por ejemplo ,   mediante el procedimiento siguiente :    Determinar el punto más apropiado del nivel   más bajo de la solución de referencia ( SL )   con ayuda de la fórmula :     ( a ) SL = ( 7s1 + 4s2 + s4 - 2s8 ) /10    Determinar el punto más apropiado del nivel más   alto de la solución de referencia ( H ) con ayuda de   la fórmula :     ( b ) SH = ( 7s8 + 4s4 + s2 - 2s1 ) /10    Determinar del mismo modo los puntos más   apropiados del extracto para el nivel más   bajo ( UL ) y el nivel más alto ( UH )   sustituyendo S1 , S2 , S4 y S8 en las fórmulas   anteriores por U1 , U2 , U4 y U8 .    Consignar los valores SL y SH en la misma gráfica .   Al unir los dos puntos se obtiene la recta más   ajustada para la solución de referencia . Si se   sigue el mismo método para UL y UH se obtiene la   recta más ajustada para el extracto .   Si no hubiere ninguna interferencia , las rectas   serían paralelas . En la práctica , se consideran   paralelas cuando ( SH - SL ) y ( UH - UL ) nodifieren en más de un 10 % de su media .    Si las rectas no son paralelas , pueden eliminarse   U1 y S1 , o U8 y S8 . Los valores SL , SH , UL y UH   que permiten obtener las rectas más ajustadas se   calculan entonces con ayuda de las fórmulas   siguientes :     ( a' ) SL = ( 5s1 + 2s2 - s4 ) /6 ó   ( 5s2 - 2s4 - s8 ) /6     ( b' ) SH = ( 5s4 - 2s2 - s1 ) /6 ó   ( 5s8 + 2s4 - s2 ) /6    y de fórmulas análogas para UL y UH .   La utilización de esta alternativa obliga a   respetar los mismos criterios de paralelismo . En   el boletín de análisis debe mencionarse la   obtención de un resultado procedente de tres   niveles .    Cuando las rectas se consideren paralelas ,   hay que calcular el logaritmo de la actividad   relativa ( log A ) mediante una de las fórmulas   siguientes , según el número de niveles ( 4 o 3 )   utilizados para la valoración del paralelismo .    Para 4 niveles :     ( c ) log A = ( ( u1 + u2 + u4 + u8 - s1 - s2 -   s4 - s8 ) × 0,602 ) / ( u4 + u8 + s4 + s8 - u1 -   u2 - s1 - s2 )    Para 3 niveles :     ( d ) log A = ( ( u1 - u2 - u4 - s1 - s2 - s4 )   × 0,401 ) / ( u4 - s4 - u1 - s1 )     ( d' ) log A = ( ( u2 - u4 - u8 - s2 - s4 - s8 )   × 0,401 ) / ( u8 - s8 - u2 - s2 )    Actividad del extracto de la muestra = actividad   de la referencia correspondiente × A :     ( U8 = S8 × A )    Si la actividad relativa no se encuentra en la   gama de valores comprendidos entre 0,5 y 2,0 ,   ha de repetirse la determinación procediendo   a los ajustes apropiados de las concentraciones   del extracto o , en su caso , de las soluciones   de referencia . Cuando esta actividad no pueda   encuadrarse en la gema de los valores exigidos ,   el resultado se considerará aproximado y así   se hará constar en el boletín de análisis .    Cuando las rectas no se consideren paralelas ,   se repetirá la determinación . Si tampoco   ahora se lograre el paralelismo , la   determinación se considerará insatisfactoria .    Expresar el resultado en miligramos de   bacitracinacinc por kilogramo de alimento .    9 . Reproducibilidad    La diferencia entre los resultados de dos   determinaciones efectuadas en la misma muestra por   el mismo analista no debe exceder de :    2 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos   de bacitracina-cinc inferiores a 19 mg/kg ,    20 % del resultado más alto , para los contenidos   de 10 a 25 mg/kg ,    5 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos   de 25 a 50 mg/kg ,    10 % del resultado más alto , para los contenidos   superiores a 50 mg/kg . »    (1) 1 mg de bacitracina-cinc ( calidad para   alimentos para animales ) equivale a 42 unidades   internacionales ( UI ) .    (a) Pueden utilizarse otros métodos , siempre   que esté demostrado que producen suspensiones   bacterianas análogas .    (b) Puede utilizarse cualquier medio de cultivo   comercial de composición análoga y que   dé los mismos resultados .