CELEX: 31978L0633
Language: el
Date: 1978-06-15 00:00:00
Title: Όγδοη οδηγία 78/633/ΕΟΚ της Επιτροπής της 15ης Ιουνίου 1978 περί καθορισμού των κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών

Avis juridique important

|

31978L0633

Όγδοη οδηγία 78/633/ΕΟΚ της Επιτροπής της 15ης Ιουνίου 1978 περί καθορισμού των κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών  

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 206 της 29/07/1978 σ. 0043 - 0055 Φινλανδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 10 σ. 0071  Ελληνική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 03 τόμος 22 σ. 0067  Σουηδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 10 σ. 0071  Ισπανική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 03 τόμος 14 σ. 0230  Πορτογαλική ειδική έκδοση : Κεφάλαιο 03 τόμος 14 σ. 0230 

ΟΓΔΟΗ ΟΔΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 15ης Ιουνίου 1978 περί καθορισμού των κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφώνΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,  Έχοντας υπόψη:  τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητος,  την οδηγία του Συμβουλίου 70/373/ΕΟΚ της 20ής Ιουλίου 1970 περί της εισαγωγής κοινοτικών μεθόδων δειγματοληψίας και αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών(1), όπως τελευταία συμπληρώθηκε με την πράξη προσχωρήσεως και κυρίως το άρθρο 2,  Εκτιμώντας:  ότι η οδηγία απαιτεί όπως ο επίσημος έλεγχος των ζωοτροφών εκτελείται με τη χρήση κοινοτικών μεθόδων δειγματοληψίας και αναλύσεως προς το σκοπό ελέγχου για τη συμμόρφωση με τις απαιτήσεις που περιγράφονται από τις νομοθετικές, κανονιστικές και  διοικητικές διατάξεις σχετικά με την ποιότητα και τη σύνθεση των ζωοτροφών- ότι οι κοινοτικές οδηγίες 71/250/ΕΟΚ της 15ης Ιουνίου 1971(2), 71/393/ΕΟΚ της 18ης Νοεμβρίου 1971(3), 72/199/ΕΟΚ της 27ης Απριλίου 1972(4), 73/46/ΕΟΚ της 5ης Δεκεμβρίου 1972(5), 74/203/ΕΟΚ της 25ης Μαρτίου 1974(6), 75/84/ΕΟΚ της 20ής Δεκεμβρίου  1974(7)και 76/372/ΕΟΚ της 1ης Μαρτίου 1976(8)έχουν ήδη καθορίσει έναν αριθμό κοινοτικών μεθόδων αναλύσεως- ότι λαμβάνοντας υπόψη την πρόοδο των εργασιών που σημειώθηκε έκτοτε, συνιστάται η υιοθέτηση μιας όγδοης σειράς μεθόδων- ότι τα προβλεπόμενα στην παρούσα οδηγία μέτρα είναι σύμφωνα με τη γνώμη της Μόνιμης Επιτροπής για τις Ζωοτροφές,  ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ:   Άρθρο 1  1. Τα Κράτη Μέλη ορίζουν όπως οι αναλύσεις για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών, σχετικά με το περιεχόμενό τους σε ψευδαργυρούχο βακιτρακίνη, φλαβοφωσφολιπόλη, σίδηρο, χαλκό, μαγγάνιο και ψευδάργυρο εκτελούνται σύμφωνα με τις μεθόδους που  περιγράφονται στο παράρτημα της παρούσας οδηγίας.  2. Οι γενικές διατάξεις που αναφέρονται στο Μέρος 1 "Εισαγωγή" του παραρτήματος της πρώτης οδηγίας 71/250/ΕΟΚ, με εξαίρεση το μέρος το οποίο αναφέρεται στην προπαρασκευή του δείγματος για ανάλυση, ισχύουν για τις μεθόδους που περιγράφονται στο παράρτημα  της παρούσας οδηγίας.   Άρθρο 2  Τα Κράτη Μέλη θέτουν σε ισχύ την 1η Ιανουαρίου 1979 τις νομοθετικές, κανονιστικές και διοικητικές διατάξεις που είναι αναγκαίες για να συμμορφωθούν προς την παρούσα οδηγία. Ενημερώνουν αμέσως περί αυτού την Επιτροπή.   Άρθρο 3  Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα Κράτη Μέλη.  Έγινε στις Βρυξέλλες, στις 15 Ιουνίου 1978.  Για την Επιτροπή Finn GUNDELACH Αντιπρόεδρος  (1) ΕΕ αριθ. Ν 170 της 3.8.1970, σ. 2.  (2) ΕΕ αριθ. Ν 155 της 12.7.1971, σ. 13.  (3) ΕΕ αριθ. Ν 279 της 20.12.1971, σ. 7.  (4) ΕΕ αριθ. Ν 123 της 29.5.1972, σ. 6.  (5) ΕΕ αριθ. Ν 83 της 30.3.1973, σ. 21.  (6) ΕΕ αριθ. Ν 108 της 22.4.1974, σ. 7.  (7) ΕΕ αριθ. Ν 32 της 5.2.1975, σ. 26.  (8) ΕΕ αριθ. Ν 102 της 15.4.1976, σ. 8.      ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ   1. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΨΕΥΔΑΡΓΥΡΙΚΗΣ ΒΑΚΙΤΡΑΚΙΝΗΣ ΔΙΑ ΔΙΑΧΥΣΕΩΣ ΣΕ ΜΕΣΟ ΠΕΡΙΕΧΟΝ ΑΓΑΡ  1. ΣΚΟΠΟΣ ΚΑΙ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της ψευδαργυρικής βακιτρακίνης στις ζωοτροφές, στα συμπυκνώματα και προμίγματα. Το κατώτατο όριο προσδιορισμού είναι 5 mg/kg (5 ppm) (1)(). Η μέθοδος δεν ισχύει όταν υπάρχουν παρεμβαλλόμενα υλικά, ιδιαίτερα μεγάλες  ποσότητες χαλκού και ασκορβικού οξέος.  2. ΑΡΧΗ Το δείγμα εκχυλίζεται pH 2 με μίγμα μεθανόλης/ύδατος/υδροχλωρικού οξέος. Το εκχύλισμα φέρεται σε pH 6,5, συμπυκνούται (όπου είναι ανάγκη) και αραιώνεται. Η αντιβιοτική του δράση προσδιορίζεται με μέτρηση της διαχύσεως της ψευδαργυρικής βακιτρακίνης σε  μέσο περιέχον άγαρ εμβολιασμένο με μικρόκοκκο Luteus (συνώνυμο M. Flavus). Η διάχυση εμφανίζεται δια του σχηματισμού ζωνών ανασχέσεως των μικροοργανισμών. Η διάμετρος των ζωνών αυτών λαμβάνεται ότι είναι κατ' ευθείαν ανάλογη προς το λογάριθμο της  αντιβιοτικής συγκεντρώσεως για το εύρος της χρησιμοποιουμένης αντιβιοτικής συγκεντρώσεως.  3. ΜΙΚΡΟ-ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΣ: ΜΙΚΡΟΚΟΚΚΟΣ LUTEUS ATCC 10240 3.1. Συντήρηση του αποθέματος καλλιέργειας Εμβολιάζεται με μικρόκοκκο Luteus, η καλλιέργεια (4.1) που περιέχει άγαρ σε κεκλιμένους σωλήνες. Επώαση για 24 ώρες σε 30-37 oC, διατήρηση σε ψυγείο σε θερμοκρασία περίπου 4 oC και επανεμβολιασμός της καλλιέργειας που περιέχει άγαρ κάθε δύο εβδομάδες.  3.2. Παρασκευή του βακτηριακού εναιωρήματος (2)() Συλλογή της αναπτύξεως των βακτηριδίων ενός σωλήνος που περιέχει πρόσφατη καλλιέργεια με άγαρ (3.1) με τη βοήθεια 2 έως 3 ml διαλύματος χλωριούχου νατρίου (4.3). Χρησιμοποίηση αυτού του εναιωρήματος για τον εμβολιασμό 250 ml καλλιέργειας (4.1) που  περιέχεται μέσα σε ένα δοχείο Roux και επώαση για 18 ως 20 ώρες σε 30 ως 37 oC. Συλλογή της αναπτύξεως των βακτηριδίων με τη βοήθεια 25 ml διαλύματος χλωριούχου νατρίου (4.3) και ανάμιξη. Αραίωση του εναιωρήματος στο ένα δέκατο με διάλυμα χλωριούχου  νατρίου (4.3). Η μετάδοση του φωτός δια του εναιωρήματος πρέπει να είναι περίπου 75%, μετρούμενη στα 650 nm με μία, κυψελίδα 1 cm σε σύγκριση με το διάλυμα χλωριούχου νατρίου (4.3).  4. ΜΕΣΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ  "" ID="1">4.1. Mέσο καλλιέργειας (3)()" ID="1">Πεπτόνη> ID="2">6,0 g"> ID="1">Τρυπτόνη> ID="2">4,0 g"> ID="1">Εκχύλισμα ζύμης> ID="2">3,0 g"> ID="1">Εκχύλισμα κρέατος> ID="2">1,5 g"> ID="1">Γλυκόζη> ID="2">1,0 g"> ID="1">Άγαρ> ID="2">15,0  g"> ID="1">Ύδωρ> ID="2">1 000 ml"> ID="1">pH 6,5 ως 6,6 (μετά την αποστείρωση)"" ID="1">4.2. Μέσο προσδιορισμού (3)()" ID="1">Τρυπτόνη> ID="2">10,0 g"> ID="1">Εκχύλισμα ζύμης> ID="2">3,0 g"> ID="1">Εκχύλισμα κρέατος> ID="2">1,5 g">  ID="1">Γλυκόζη> ID="2">1,0 g"> ID="1">Άγαρ> ID="2">20,0 g"> ID="1">Tween 80> ID="2">1 ml"> ID="1">Ύδωρ> ID="2">1 000ml"> ID="1">pH 6,5 (μετά την αποστείρωση)""" 4.3. Χλωριούχο νάτριο διάλυμα 0,8% (β/ο): διάλυση 8 gr χλωριούχου νατρίου α.π. σε νερό και αραίωση δια 1 000 ml και αποστείρωση.  4.4. Μίγμα καθαρής μεθανόλης/ύδατος/υδροχλωρικού οξέος α.π. (d: 1,18-1,19) 80/17,5/2,5 (o/o/o).  4.5. Φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 6,5 Όξινο φωσφορικό κάλιο K2HPO4 α.π. (22,15 g).  Δισόξινο φωσφορικό κάλιο KH2PO4 α.π. (27,85 g).  Νερό μέχρι 1 000 ml.  4.6. Υδροχλωρικό οξύ α.π. (d: 1,18 - 1,19).  4.7. Υδροχλωρικό οξύ α.π. (0,1 N).  4.8. Υδροξείδιο του νατρίου α.π. διάλυμα 1 N 4.9. Διάλυμα πορφυρής βρωμοκρεζόλης 0,04% (β/ο): διάλυση 0,1 g πορφυρής βρωμοκρεζόλης σε 18,5 ml διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου 0,01 N. Συμπλήρωση μέχρι του όγκου των 250 ml με νερό και ανάμιξη.  4.10. Πρότυπη ουσία: ψευδαργυρική βακιτρακίνη γνωστής δραστηριότητος (σε δ.μ.).  5. ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Ζύγιση μιας ποσότητος προτύπου ψευδαργυρικής βακιτρακίνης (4.10) που αντιστοιχεί σε 1 050 δ.μ. (σύμφωνα με τη δραστηριότητα). Προστίθενται 5 ml υδροχλωρικού οξέος 0,1 N (4,7) και αφήνεται σε ηρεμία για 15 λεπτά. Προστίθενται 30 ml ύδατος, ρυθμίζεται το  pH σε 4,5 με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 6,5 (4.5) (περίπου 4 ml), συμπληρώνεται με νερό μέχρι να γίνει ο όγκος του 50 ml και αναμιγνύεται καλώς (1 ml = 21 δ.μ.).  Από το διάλυμα αυτό παρασκευάζονται με διαδοχικές αραιώσεις με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 6,5 (4.5) τα ακόλουθα διαλύματα:  S8 0,42 δ.μ./ml S4 0,21 δ.μ./ml S2 0,105 δ.μ./ml S1 0,0525 δ.μ./ml 6. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ 6.1. Εκχύλιση 6.1.1. Συμπυκνώματα, προμίγματα και μεταλλικά τροφικά άλατα Ζυγίζεται μία ποσότητα δείγματος των 2,0 ως 5,0 g, προστίθενται 30 ml του μίγματος (4.4) και αναταράσσεται για λίγο. Ελέγχεται ότι το pH είναι περίπου 2. Αναταράσσεται για 10 λεπτά, προστίθενται 30 ml φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος pH 6,5 (4.5) και  αναταράσσεται για 15 λεπτά. Αραιώνεται με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (4.5) για να ληφθεί ένα αναμενόμενο περιεχόμενο σε ψευδαργυρική βακιτρακίνη των 0,42 δ.μ./ml (= U8).  6.1.2. Πρωτεϊνικά συμπυκνώματα Ζυγίζεται μία ποσότητα δείγματος των 10,0 g, προστίθενται 50 ml του μίγματος (4.4) και αναταράσσεται για λίγο. Ελέγχεται ότι το pH είναι περίπου 2. Αναταράσσεται για 10 λεπτά, προστίθενται 50 ml φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος pH 6,5 (4.5) και  αναταράσσεται για 15 λεπτά. Αραιώνεται με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (4.5) για να ληφθεί ένα αναμενόμενο περιεχόμενο σε ψευδαργυρική βακιτρακίνη 0,42 δ.μ./ml (= U8).  6.1.3. Άλλες τροφές Ζυγίζεται μία ποσότητα δείγματος των 10,0 (20,0 g για ένα αναμενόμενο περιεχόμενο σε ψευδαργυρική βακιτρακίνη 5 mg/kg), προστίθενται 25 ml του μίγματος (4.4) και ομογενοποιείται για 10 περίπου λεπτά. Προστίθενται 25 ml φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος  pH 6,5 (4.5), αναταράσσεται για 15 λεπτά και φυγοκεντρείται. Λαμβάνονται 20 ml υπερτονικού διαλύματος και ρυθμίζεται το pH σε 6,5 με τη βοήθεια διαλύματος χλωριούχου νατρίου 1 N (4.8) με το διάλυμα βρωμοκρεζόλης (4.9) σαν δείκτη. Εξατμίζεται σε περίπου  4 ml μέσα σε περιστροφικό εξατμιστήρα σε θερμοκρασία που δεν υπερβαίνει τους 35 oC. Αραιώνεται το ίζημα με νερό για να ληφθεί ένα αναμενόμενο περιεχόμενο σε ψευδαργυρική βακιτρακίνη 0,42 δ.μ./ml (= U8).  6.2. Αναλυτικά διαλύματα Από το διάλυμα U8 παρασκευάζονται διαλύματα U4 (αναμενόμενο περιεχόμενο: 0,21 δ.μ./ml), U2 (αναμενόμενο περιεχόμενο 0,105 δ.μ./ml) και U1 (αναμενόμενο περιεχόμενο: 0,0525δ.μ./ml) δια διαδοχικών αραιώσεων (1 + 1) με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (4.5).  7. ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 7.1. Εμβολιασμός του αναλυτικού μέσου Εμβολιάζεται το αναλυτικό μέσο (4.2) με το βακτηριακό εναιώρημα (3.2) σε θερμοκρασία 50 oC. Με προκαταρκτικές δοκιμές σε δίσκους με αναλυτικό μέσο (4.2) προσδιορίζεται η ποσότητα του βακτηριακού εναιωρήματος που απαιτείται για να δώσει τη μεγαλύτερη και  καθαρότερη ζώνη ανασχέσεως με διαφορετικές συγκεντρώσεις της ψευδαργυρικής βακιτρακίνης.  7.2. Παρασκευή των πλακών Η διάλυση μέσα στο άγαρ πραγματοποιείται σε πλάκες με τις τέσσερις συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυμάτων (S8, S4, S2, S1) και τις τέσσσερις συγκεντρώσεις των αναλυτικών διαλυμάτων (U8, U4, U2, U1). Οι τέσσερις συγκεντρώσεις των εκχυλισμάτων και των  προτύπων πρέπει οπωσδήποτε να τοποθετηθούν σε κάθε πλάκα. Για το σκοπό αυτό, οι πλάκες εκλέγονται αρκετά μεγάλες ώστε να επιτρέπουν την κατασκευή στο θρεπτικό μέσο με άγαρ τουλάχιστον οκτώ οπών διαμέτρου 10 έως 13 mm, τα κέντρα των οποίων απέχουν όχι  λιγότερο από 30 mm. Ο έλεγχος μπορεί να πραγματοποιείται σε πλάκες οι οποίες συνιστώνται από λεπτές υάλινες πλάκες επάνω στις οποίες τοποθετείται δακτύλιος από αλουμίνιο ή πλαστικό διαμέτρου 200 mm και ύψους 20 mm.  Εισάγεται μέσα στις πλάκες μια ποσότητα του μέσου (4.2) στο οποίο έχει γίνει εμβολιασμός όπως αναφέρεται στο εδάφιο 7.1, για να σχηματισθεί ένα στρώμα 2 mm πάχους (50 ml για πλάκα διαμέτρου 200 mm). Αφήνεται να στερεοποιηθεί στην οριζόντια θέση,  ανοίγονται οι οπές και τοποθετούνται σ' αυτές με ακρίβεια μετρημένοι όγκοι αναλυτικών και προτύπων διαλυμάτων (μεταξύ 0,10 και 0,15 ml ανά οπή, ανάλογα με τη διάμετρό της).  Για κάθε συγκέντρωση γίνονται τέσσερις επαναλήψεις έτσι ώστε ο προσδιορισμός να εξαρτάται από τον υπολογισμό 32 ζωνών ανασχέσεως.  7.3. Επώαση Η επώαση των πλακών γίνεται επί 16 ως 18 ώρες σε 28 ως 30 oC.  8. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ Μετράται η διάμετρος των ζωνών ανασχέσεως κατά προσέγγιση 0,1 mm. Καταγράφονται οι μέσες μετρήσεις για κάθε συγκέντρωση σε ημιλογαριθμικό χαρτί που δείχνει το λογάριθμο των συγκεντρώσεων σε συνάρτηση με τη διάμετρο των ζωνών ανασχέσεως. Σύρονται οι  γραμμές αρίστης προσαρμογής για το πρότυπο διάλυμα και το εκχύλισμα, όπως στο κατωτέρω παράδειγμα.  Προσδιορίζεται το σημείο αρίστης προσαρμογής για την κατώτατη στάθμη (SL) του προτύπου διαλύματος χρησιμοποιώντας τη σχέση:  α) SL =  Προσδιορίζεται το σημείο αρίστης προσαρμογής για την ανώτατη στάθμη (SH) του προτύπου διαλύματος χρησιμοποιώντας τη σχέση:  β) SH =  Παρομοίως υπολογίζονται τα σημεία αρίστης προσαρμογής για την κατώτατη στάθμη (UL) και την ανώτατη στάθμη του εκχυλίσματος (UH) δι' αντικαταστάσεως στις παρακάτω σχέσεις των S1, S2, S4 S8 με τα U1, U2, U4, U8.  Καταγράφονται οι υπολογισθείσες τιμές των SL και SH στο ίδιο ημιλογαριθμικό χαρτί και συνδέονται για να σχηματίσουν την ευθεία αρίστης προσαρμογής για το πρότυπο διάλυμα. Κατά τον ίδιο τρόπο καταγράφονται τα UL και UH και συνδέονται για να ληφθεί η  γραμμή αρίστης προσαρμογής για το εκχύλισμα.  Όταν δεν υπάρχει παρεμβολή οι γραμμές πρέπει να είναι παράλληλες. Για πρακτικούς λόγους οι γραμμές μπορεί να θεωρηθούν παράλληλες αν οι τιμές (SH-SL) και (UH-UL) δεν διαφέρουν περισσότερο από 10% από τη μέση τιμή τους.  Αν οι γραμμές βρεθεί ότι δεν είναι παράλληλες, είτε το U1 και Σ1ή U8 και S8 μπορεί να παραληφθούν, και τα SL, SH και UL και UH υπολογίζονται χρησιμοποιώντας τις εναλλακτικές σχέσεις που δίδουν εναλλακτικές γραμμές αρίστης προσαρμογής:  α) SL =  ή  β) SH =  ή  και ομοίως για τα UL και UH. Οι εναλλακτικές γραμμές αρίστης προσαρμογής πρέπει να ελέγχονται για την παραλληλότητά τους όπως και προηγουμένως. Το γεγονός ότι το αποτέλεσμα έχει υπολογισθεί από τρεις στάθμες πρέπει να αναφερθεί στην τελική έκθεση.  Όταν οι γραμμές θεωρούνται ότι είναι παράλληλες, υπολογίζεται ο λογάριθμος της σχετικής δραστηριότητος (log. A) με μία από τις ακόλουθες σχέσεις.  Για τέσσερις στάθμες γ) log. A =  Για τρεις στάθμες δ) log. A =  ή δ) log. A =  Πραγματική δραστηριότητα = υποθετική δραστηριότητα x σχετική δραστηριότητα.  Όταν οι γραμμές θεωρούνται ότι δεν είναι παράλληλες, επαναλαμβάνεται ο προσδιορισμός. Αν η παραλληλότης δεν επιτυγχάνεται πάλι υπολογίζεται ο λογάριθμος της σχετικής δραστηριότητος (log. A) χρησιμοποιώντας τη σχέση γ). Το λαμβανόμενο αποτέλεσμα  θεωρείται σαν προσεγγιστικό και αυτό πρέπει να αναφερθεί στην τελική έκθεση.  9. ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΟΤΗΤΑ Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα από τον ίδιο αναλυτή δεν πρέπει να υπερβαίνει:  20% της μεγίστης τιμής της περιεχόμενης ψευδαργυρικής βακιτρακίνης από 5 και μέχρι 25 mg/kg- 5 mg/kg κατ' απόλυτη τιμή, για περιεχόμενα μεγαλύτερα από 25 και μέχρι 50 mg/kg- 10% της μεγίστης τιμής για περιεχόμενα ανώτερα των 50 mg/kg.   2. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΦΛΑΒΟΦΩΣΦΟΛΙΠΟΛΗΣ ΔΙΑ ΔΙΑΧΥΣΕΩΣ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΜΕΣΟ ΜΕ ΑΓΑΡ  1. ΣΚΟΠΟΣ ΚΑΙ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της φλαβοφωσφολιπόλης στις ζωοτροφές, συμπυκνώματα και προμίγματα. Το κατώτερο όριο προσδιορισμού είναι 1 mg/kg (1 ppm).  2. ΑΡΧΗ Το δείγμα εκχυλίζεται με αραιωμένη μεθανόλη δια θερμάνσεως με ανακύκλωση. Το εκχύλισμα φυγοκεντρείται και καθαρίζεται (όπου είναι αναγκαίο) με ρητίνες ανταλλαγής ιόντων και αραιώνεται. Η αντιβιοτική δραστηριότητα προσδιορίζεται δια μετρήσεως της  διαχύσεως της φλαβοφωσφολιπόλης μέσα σε θρεπτικό μέσο περιέχον άγαρ εμβολιασμένο με σταφυλόκοκκο aureus. Η διάχυση παρουσιάζεται με το σχηματισμό ζωνών ανασχέσεως των μικροοργανισμών. Η διάμετρος των ζωνών αυτών θεωρείται ότι είναι κατ' ευθείαν ανάλογη  προς το λογάριθμο της αντιβιοτικής συγκεντρώσεως για το εύρος των αντιβιοτικών συγκεντρώσεων που χρησιμοποιούνται.  3. ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΣ: ΣΤΑΦΥΛΟΚΟΚΚΟΣ AUREUS ATCC 6538 P 3.1. Συντήρηση διατηρημένης καλλιέργειας Εμβολιάζεται το μέσο καλλιέργειας με άγαρ σε κεκλιμένους σωλήνες (4.1) με σταφυλόκοκκο aureus. Επωάζεται 24 ώρες σε 37 oC και διατηρείται μέσα σε ψυγείο σε θερμοκρασία 4o Κελσίου περίπου και ανανεώνεται ο εμβολιασμός κάθε μήνα.  3.2. Παρασκευή του βακτηριακού εναιωρήματος (4)() Φυλάσσονται δύο σωλήνες περιέχοντες το απόθεμα καλλιέργειας (3.1) και ανανεώνεται ο εμβολιασμός τους κάθε εβδομάδα. Επωάζονται για 24 ώρες σε 37 oC και διατηρούνται μέσα σε ψυγείο σε περίπου 4 oC.  24 ώρες πριν από την ανάλυση, με το ανάπτυγμα αυτό εμβολιάζονται δύο έως τέσσερις σωλήνες περιέχοντες μέσο καλλιέργειας (4.1). Επωάζονται για 16 έως 18 ώρες σε 37 oC. Παρασκευάζεται ένα εναιώρημα του αναπτύγματος στο διάλυμα του χλωριούχου νατρίου  (4.3). Η μετάδοση του φωτός με το εναιώρημα πρέπει να είναι περίπου 40%, μετρουμένη στα 578 mm με μία κυψελίδα 1 cm ως προς το διάλυμα χλωριούχου νατρίου (4.3).  4. ΜΕΣΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ  "" ID="1">4.1. Mέσο καλλιέργειας (5)()" ID="1">Πεπτόνη> ID="2">6,0 g"> ID="1">Τρυπτόνη> ID="2">4,0 g"> ID="1">Εκχύλισμα ζύμης> ID="2">3,0 g"> ID="1">Εκχύλισμα κρέατος> ID="2">1,5 g"> ID="1">Γλυκόζη> ID="2">1,0 g"> ID="1">Άγαρ> ID="2">15,0  g"> ID="1">Ύδωρ> ID="2">1 000 ml"> ID="1">pH 6,5 (μετά την αποστείρωση)"" ID="1">4.2. Αναλυτικό μέσο" ID="1">4.2.1. Βασική στιβάδα (6)()" ID="1">Πεπτόνη> ID="2">6,0 g"> ID="1">Εκχύλισμα ζύμης> ID="2">3,0 g"> ID="1">Εκχύλισμα κρέατος> ID="2">1,5  g"> ID="1">Άγαρ> ID="2">10,0 g"> ID="1">Ύδωρ> ID="2">1 000 ml"> ID="1">pH 6,5 (μετά την αποστείρωση)"""> 4.2.2. Στιβάδα εμβολιασμού Όπως και για το εδάφιο 4.1 με την προσθήκη 2,0 g αντιαφρώδους γαλακτώματος σιλικόνης (7)().  4.3. Διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,4% (β/ο): διαλύονται 4 g χλωριούχου νατρίου α.π. σε νερό και αραιώνονται 1 000 ml και αποστειρώνονται.  4.4. Καθαρή μεθανόλη.  4.5. Μεθανόλη 50%: αραιώνονται 500 ml μεθανόλης με 500 ml νερό.  4.6. Μεθανόλη 80%: αραιώνονται 800 ml μεθανόλης με 200 ml νερό.  4.7. Τρις (υδροξυμεθύλ) αμινομεθάνιο α.π.  4.8. Μεθανολικό διάλυμα χλωριούχου καλίου 1,5% (β/ο): διαλύονται 1,5 g χλωριούχου καλίου α.π. και 20 ml νερό και συμπληρούται μέχρι 100 ml με μεθανόλη (4.4).  4.9. Ανταλλάκτης κατιόντων: Dowex 50 Wx8, 20 ως 50 mesh, Na από (κατ. Serva αριθ. 41600) ή ισοδύναμο.  4.10. Ανταλλάκτης ανιόντων: Dowex 1x2, 50 ως 100 mesh, Cl από (κατ. Serva αριθ. 41010) ή ισοδύναμο. Πριν από τη χρήση διατηρείται από 12 14 ώρες σε 80% μεθανόλης (4.6).  4.11. Υαλοβάμβακας.  4.12. Ενδεικτικό χαρτί pH (pH 6,6 ως 8,1).  4.13. Ασκορβικό οξύ.  4.14. Πρότυπο υλικό: φλαβοφωσφολιπόλη γνωστής δραστηριότητος.  5. ΣΥΣΚΕΥΑΙ 5.1. Υάλινοι σωλήνες χρωματογραφίας, εσωτερικής διαμέτρου: 9 mm, μήκους: 150 ως 200 mm, με προσαρμοσμένη στρόφιγγα στο στενότερο μέρος του κατωτέρου άκρου και με εσμυρισμένη υάλινη άρθρωση (για τη σύνδεση με το σταγονομετρικό χωνί (5.2)) στο ανώτερο  άκρο.  5.2. Σταγονομετρικό χωνί 250 ml εφοδιασμένο με στρόφιγγα και εσμυρισμένη υάλινη άρθρωση.  5.3. 250 ml κωνική φιάλη με άρθρωση από εσμυρισμένο γυαλί.  5.4. Συμπυκνωτής με ανακύκλωση με άρθρωση από εσμυρισμένο γυαλί.  6. ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Διαλύεται μία ποσότητα του προτύπου υλικού (4.14) με ακρίβεια ζυγισμένη σε 50% μεθανόλη (4.5) και αραιώνεται για να δώσει ένα απόθεμα διαλύματος που περιέχει 100 μg/ml φλαβοφωσφολιπόλη. Διατηρείται σε πωματισμένα δοχεία σε 4 oC. Τα διαλύματα αυτά είναι  σταθερά μέχρι δύο μήνες.  Εκ του διαλύματος αποθέματος παρασκευάζονται δια διαδοχικών αραιώσεων με 50% μεθανόλης (4.5), τα ακόλουθα διαλύματα:  S8 0,2 μg/ml S4 0,1 μg/ml S2 0,05 μg/ml S1 0,025 μg/ml 7. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ 7.1. Εκχύλιση 7.1.1. Συμπυκνώματα, προμίγματα και μεταλλικά τροφικά άλατα Ζυγίζεται μία ποσότητα δείγματος 2,0 ως 5,0 g και προστίθενται περίπου 150 mg ασκορβικού οξέος (4.13). Ομογενοποιείται με 150 ml μεθανόλης 50% (4.5) μέσα σε κωνική φιάλη (5.3) και ρυθμίζεται το pH στα 8,1 ως 8,2 με περίπου 400 mg τρίς (υδροξυμεθύλ)  αμινομεθάνιο (4.7). Ελέγχεται το pH με ενδεικτικό χαρτί (4.12). Αφήνεται να ηρεμήσει για 15 λεπτά και μετά ξαναρυθμίζεται το pH στα 8,1 ως 8,2 με τρίς (υδροξυμεθύλ) αμινομεθάνιο (4.7) και βράζει για 10 λεπτά υπό ανακύκλωση (5.4) με συνεχή ανάδευση.  Αφήνεται να κρυώσει, φυγοκεντρείται το μίγμα και μεταγγίζεται το εκχύλισμα.  7.1.2. Άλλες τροφές Ζυγίζεται μία ποσότης δείγματος 5,0 ως 30,0 g περιέχουσα τουλάχιστον 30 μg φλαβοφωσφολιπόλη. Ομογενοποιείται με 150 ml μεθανόλης 50% (4.5) μέσα σε κωνική φιάλη (5.3) και ρυθμίζεται το pH στα 8,1 ως 8,2 με περίπου 400 mg τρις (υδροξυμεθύλ) αμινομεθάνιο  (4.7). Ελέγχεται το pH με ενδεικτικό χαρτί (4.12), αφήνεται σε ηρεμία για 15 λεπτά κατόπιν ξαναρυθμίζεται το pH από 8,1 ως 8,2 με τρις (υδροξυμεθύλ) αμινομεθάνιο (4.7) και βράζει για 10 λεπτά υπό ανακύκλωση (5.4) με συνεχή ανάδευση. Αφήνεται να κρυώσει,  φυγοκεντρείται το μίγμα και μεταγγίζεται το εκχύλισμα.  7.2. Καθαρισμός (αυτό το στάδιο μπορεί να παραληφθεί για τα συμπυκνώματα, προμίγματα και μεταλλικά τροφικά άλατα) Αναμιγνύονται 110 ml του εκχυλίσματος με 11 g του ανταλλάκτου κατιόντων (4.9), βράζει επί 1 λεπτό υπό ανακύκλωση (5.4) με συνεχή ανάδευση. Διαχωρίζεται ο ανταλλάκτης κατιόντων δια φυγοκεντρήσεως ή διηθήσεως. Αναμιγνύονται εκατό (100 ml) του εκχυλίσματος  με 150 ml μεθανόλης (4.4) και αποθηκεύεται το διάλυμα για 12 ως 15 ώρες σε 4 oC. Διηθείται η ινώδης μάζα ενώ είναι κρύα.  Τοποθετείται πώμα υαλοβάμβακος (4.11) στον πυθμένα σωλήνος (5.1), χύνονται στο σωλήνα 5 ml του ανταλλάκτου ανιόντων (4.10) και πλένεται η στήλη με 100 ml μεθανόλης 80% (4.6). Χρησιμοποιώντας το χωνί (5.2), μεταφέρεται στη στήλη ένας όγκος διηθήματος  τουλάχιστον 100 ml ο οποίος αναμένεται να περιέχει 16 μg φλαβοφωσφολιπόλη (200 ml για δείγμα ζωοτροφής 30 g το 1 ppm). Όπου είναι αναγκαίο, πριν από την τοποθέτησή του στη στήλη, αραιώνεται το διήθημα με μεθανόλη 80% (4.6) για να ληφθεί ένα αναμενόμενο  περιεχόμενο φλαβοφωσφολιπόλης 16 μg/100 ml. Ρυθμίζεται ο ρυθμός ροής σε περίπου 2 ml ανά λεπτό. Απομακρύνεται το υπόλειμμα. Κατόπιν πλένεται η στήλη με 50 ml μεθανόλης 80% (4.6) και απομακρύνεται το υπόλειμμα.  Εκλούεται η φλαβοφωσφολιπόλη με μεθανολικό διάλυμα χλωριούχου καλίου (4.5) διατηρώντας το ρυθμό ροής σε περίπου 2 ml ανά λεπτό. Συλλέγονται 50 ml της εκλούσεως σε ογκομετρική φιάλη, προστίθενται 30 ml νερού και αναμιγνύονται. Αυτό το διάλυμα πρέπει να  έχει ένα περιεχόμενο φλαβοφωσφολιπόλης 0,2 μg/ml (= U8).  7.3. Ανάλυση των διαλυμάτων Όπου είναι αναγκαίο (π.χ. όταν παραλείπεται το στάδιο καθαρισμού) αραιώνεται το εκχύλισμα που λαμβάνεται στο 7.1.1 με μεθανόλη 50% (4.5) για να ληφθεί ένα αναμενόμενο περιεχόμενο φλαβοφωσφολιπόλης 0,2 μg/ml (= U8).  Από το διάλυμα U8) παρασκευάζονται διαλύματα U4) (αναμενόμενο περιεχόμενο 0,1 μg/ml), U2) (αναμενόμενο περιεχόμενο 0,05 μg/ml) και U1) (αναμενόμενο περιεχόμενο 0,025 μg/ml), δια διαδοχικών αραιώσεων (1+1) με μεθανόλη 50% (4.5).  8. ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 8.1. Εμβολιασμός του αναλυτικού μέσου Εμβολιάζεται το αναλυτικό μέσο (4.2.2) με το βακτηριακό εναιώρημα (3.2) σε περίπου 50 oC. Με προκαταρκτικές προσεγγίσεις σε πλάκες με αναλυτικό μέσο (4.2.2) προσδιορίζεται η ποσότητα του βακτηριακού εναιωρήματος που απαιτείται για να δώσει τις  μεγαλύτερες και καθαρότερες ζώνες ανασχέσεως με διαφορετικές συγκεντρώσεις φλαβοφωσφολιπόλης (περίπου 30 ml ανά λίτρο).  8.2. Παρασκευή των πλακών Διάχυση δια μέσου του θρεπτικού μέσου άγαρ πραγματοποιείται σε πλάκες με τις τέσσερις συγκεντρώσεις του προτύπου διαλύματος (S8), S4), S2), S1)) και τις τέσσερις συγκεντρώσεις των αναλυτικών διαλυμάτων (U8), U4), U2), U1)). Οι τέσσερις αυτές  συγκεντρώσεις των εκχυλισμάτων και των προτύπων πρέπει αναγκαστικά να τοποθετηθούν σε κάθε πλάκα. Για το σκοπό αυτό εκλέγονται πλάκες αρκετά μεγάλες, ώστε να μπορούν να γίνουν μέσα στο θρεπτικό μέσο άγαρ τουλάχιστον οκτώ οπές με διαμέτρους 10 ως 13 mm  και των οποίων οι αποστάσεις των κέντρων να μην είναι μικρότερες από 30 mm. Ο έλεγχος μπορεί να πραγματοποιείται σε πλάκες οι οποίες συνίστανται από λεπτές υάλινες πλάκες, επάνω στις οποίες τοποθετείται δακτύλιος από αλουμίνιο ή πλαστικό διαμέτρου 200  mm και ύψους 20 mm.  Εισάγεται μέσα στις πλάκες μία ποσότητα του μέσου (4.2.1) που θα σχηματίσει ένα στρώμα πάχους 1,5 mm (45 ml για πλάκα διαμέτρου 200 mm). Αφήνεται να στερεοποιηθεί στην οριζόντια θέση και προστίθεται μία ποσότητα του μέσου (4.2.2) εμβολιασμένη, όπως  αναφέρεται στο 8.1, που θα σχηματίσει ένα στρώμα πάχους 1 mm (30 ml για πλάκα διαμέτρου 200 mm). Αφήνεται να στερεοποιηθεί στην οριζόντια θέση, ανοίγονται οι οπές και τοποθετούνται μέσα τους με ακρίβεια μετρημένοι όγκοι αναλυτικών και προτύπων  διαλυμάτων (μεταξύ 0,10 και 0,15 ml ανά οπή ανάλογα με τη διάμετρό τους). Για κάθε συγκέντρωση γίνονται τέσσερις επαναλήψεις, ώστε ο προσδιορισμός να εξαρτάται από τον υπολογισμό 32 ζωνών ανασχέσεως.  8.3. Η επώαση των πλακών γίνεται επί 16 ως 18 ώρες και σε 28 ως 30 oC.  9. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ Μετράται η διάμετρος των ζωνών ανασχέσεως κατά προσέγγιση 0,1 mm. Καταγράφονται οι μέσες μετρήσεις για κάθε συγκέντρωση σε ημιλογαριθμικό χαρτί που δείχνει το λογάριθμο συγκεντρώσεων σε συνάρτηση με τις διαμέτρους των ζωνών ανασχέσεως. Σύρονται οι  γραμμές αρίστης προσαρμογής για το πρότυπο διάλυμα και το εκχύλισμα, π.χ. ως ακολούθως: Προσδιορίζεται το σημείο αρίστης προσαρμογής για την κατώτατη στάθμη του προτύπου διαλύματος (SL) χρησιμοποιώντας τη σχέση:  α) SL =  Προσδιορίζεται το σημείο αρίστης προσαρμογής για την ανώτατη στάθμη (SH) του προτύπου διαλύματος χρησιμοποιώντας τη σχέση:  β) SH =  Παρόμοια υπολογίζονται τα σημεία αρίστης προσαρμογής για την κατώτατη στάθμη του εκχυλίσματος (UL) και την ανώτατη στάθμη του εκχυλίσματος (UH) δι' αντικαταστάσεως με U1, U2, U4 και U8 των S1, S2, S4 και S8 στις παραπάνω σχέσεις.  Καταγράφονται οι υπολογισθείσες τιμές των SL και SH στο ίδιο ημιλογαριθμικό χαρτί και συνδέονται για να σχηματίσουν τη γραμμή αρίστης προσαρμογής για το πρότυπο διάλυμα. Ομοίως καταγράφονται τα UL και UH και συνδέονται για να δώσουν τη γραμμή αρίστης  προσαρμογής για το εκχύλισμα.  Όταν δεν υπάρχει παρεμβολή οι γραμμές πρέπει να είναι παράλληλες. Για πρακτικούς λόγους οι γραμμές θεωρούνται παράλληλες αν οι τιμές (SH-SL) και (UH-UL) δεν διαφέρουν περισσότερο από 10% από τη μέση τιμή τους.  Αν βρεθεί ότι οι γραμμές δεν είναι παράλληλες, μπορεί να παραληφθούν είτε τα U1 και S1 ή τα U8 και S8, και τα SL, SH, UL και UH υπολογίζονται χρησιμοποιώντας τις εναλλακτικές σχέσεις που δίδουν εναλλακτικές γραμμές αρίστης προσαρμογής.  α) SL =  ή  β) SH =  ή  και ομοίως για τα UL και UH. Οι εναλλακτικές γραμμές αρίστης προσαρμογής πρέπει να ελέγχονται για την παραλληλότητα όπως και προηγουμένως. Το γεγονός ότι το αποτέλεσμα έχει υπολογισθεί από τρείς στάθμες πρέπει να αναφερθεί στην τελική έκθεση.  Όταν οι γραμμές θεωρούνται ότι είναι παράλληλες, υπολογίζεται ο λογάριθμος της σχετικής δραστηριότητος (log. A) με μία από τις ακόλουθες σχέσεις.  Για τέσσερις στάθμες γ) log. A =  Για τρεις στάθμες δ) log. A =  ή δ') log. A =  Πραγματική δραστηριότητα = υποθετική δραστηριότητα x σχετική δραστηριότητα.  Όταν οι γραμμές θεωρούνται ότι δεν είναι παράλληλες, επαναλαμβάνεται ο προσδιορισμός. Αν η παραλληλότητα δεν επιτυγχάνεται πάλι, υπολογίζεται ο λογάριθμος της σχετικής δραστηριότητος (log. A) με τη σχέση γ). Το λαμβανόμενο αποτέλεσμα πρέπει να θεωρείται  σαν προσεγγιστικό και αυτό πρέπει να αναφερθεί στην τελική έκθεση.  10. ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΟΤΗΤΑ Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών, που πραγματοποιούνται στο ίδιο δείγμα από τον ίδιο αναλυτή δεν πρέπει να υπερβαίνει:  0,5 mg/kg κατ' απόλυτη τιμή, για περιεχόμενα φλαβοφωσφολιπόλης από 1 και μέχρι 2 mg/kg- 25% της μεγίστης τιμής για περιεχόμενα μεγαλύτερα από 2 και μέχρι 10 mg/kg- 20% της μεγίστης τιμής για περιεχόμενα μεγαλύτερα από 10 και μέχρι 50 mg/kg- 5 mg/kg κατ' απόλυτη τιμή για περιεχόμενα μεγαλύτερα από 25 και μέχρι 50 mg/kg- 10% της μεγίστης τιμής για περιεχόμενα ανώτερα των 50 mg/kg.   3. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΙΧΝΟΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΣΙΔΗΡΟΥ, ΧΑΛΚΟΥ, ΜΑΓΓΑΝΙΟΥ ΚΑΙ ΨΕΥΔΑΡΓΥΡΟΥ  1. ΣΚΟΠΟΣ ΚΑΙ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ Η μέθοδος καθιστά δυνατό τον προσδιορισμό των ιχνοστοιχείων σιδήρου, χαλκού, μαγγανίου και ψευδαργύρου στις ζωοτροφές. Τα κατώτερα όρια προσδιορισμού είναι:  σίδηρος (Fe): 20 mg/kg χαλκός (Cu): 10 mg/kg μαγγάνιο (Mn): 20 mg/kg ψευδάργυρος (Zn): 20 mg/kg 2. ΑΡΧΗ Το δείγμα διαλύεται σε υδροχλωρικό οξύ μετά την καταστροφή της οργανικής ύλης, αν υπάρχει. Τα στοιχεία σίδηρος, χαλκός, μαγγάνιο και ψευδάργυρος προσδιορίζονται, μετά από κατάλληλη αραίωση, με φασματοσκοπία ατομικής απορροφήσεως.  3. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Εισαγωγικές παρατηρήσεις Για την παρασκευή των αντιδραστηρίων και των αναλυτικών διαλυμάτων χρησιμοποιείται νερό απαλλαγμένο από τα κατιόντα που πρόκειται να προσδιορισθούν, που λαμβάνεται είτε με διπλή απόσταξη ύδατος σε αποστακτήρα από βοριοπυριτική ύαλο ή από χαλαζία είτε με  διπλή επεξεργασία με ρητίνες ανταλλαγής ιόντων.  Τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι τουλάχιστον αναλυτικής ποιότητος (α.π.). Η καθαρότητα από τα στοιχεία που πρόκειται να προσδιορισθούν πρέπει να ελέγχεται με λευκό πείραμα. Αν απαιτείται, τα αντιδραστήρια πρέπει να καθαρίζονται επιπλέον.  Σε αντικατάσταση των προτύπων διαλυμάτων που περιγράφονται κατωτέρω, πρότυπα διαλύματα του εμπορίου μπορεί να χρησιμοποιηθούν με την προϋπόθεση ότι είναι εγγυημένα και έχουν ελεγχθεί πριν από τη χρήση.  3.1. Υδροχλωρικό οξύ α.π. (d: 1,19).  3.2. Υδροχλωρικό οξύ α.π. (6 N).  3.3. Υδροχλωρικό οξύ α.π.(0,5 N).  3.4. Υδροφθορικό οξύ 38 μέχρι 40% (ο/ο) που έχει περιεκτικότητα σιδήρου λιγότερο από 1 mg Fe/lt και ίζημα μετά από εξάτμιση, λιγότερο από 10 mg (ως θειικό άλας)\lit.,  3.5. Θειικό οξύ α.π. (d: 1,84).  3.6. Υπεροξείδιο του υδρογόνου α.π. (περίπου 100 όγκοι οξυγόνου 30% κατά βάρος).  3.7. Πρότυπο διάλυμα σιδήρου (1 000 mug Fe/ml) που παρασκευάζεται ως εξής: διαλύεται 1 gr σύρματος σιδήρου α.π. σε 200 ml υδροχλωρικού οξέος 6 N (3.2), προστίθενται 16 ml υπεροξειδίου του υδρογόνου (3.6) και συμπληρώνεται με νερό μέχρι όγκο ενός λίτρου.   3.7.1. Πρότυπο διάλυμα εργασίας σιδήρου (100 mug Fe/ml) που παρακευάζεται δι' αραιώσεως του προτύπου διαλύματος (3.7) με νερό 1+9.  3.8. Πρότυπο διάλυμα χαλκού (1 000 mug Cu/ml) που παρασκευάζεται ως εξής: διαλύεται 1 gr χαλκού υπό μορφή σκόνης α.π. σε 25 ml υδροχλωρικού οξέος 6 N (3.2), προστίθενται 5 ml υπεροξειδίου του υδρογόνου (3.6) και συμπληρώνεται με νερό μέχρι όγκο ενός  λίτρου.  3.8.1. Πρότυπο διάλυμα εργασίας χαλκού (10 mug Cu/ml) που παρασκευάζεται δι' αραιώσεως του προτύπου διαλύματος (3.8) με νερό 1+9 και στη συνέχεια δι' αραιώσεως του προκύπτοντος διαλύματος με νερό 1+9.  3.9. Πρότυπο διάλυμα μαγγανίου (1 000 mug Mn/ml) που παρασκευάζεται ως εξής: διαλύεται 1 g μαγγανίου υπό μορφή σκόνης α.π. σε 25 ml υδροχλωρικού οξέος 6 N (3.2) και συμπληρώνεται με νερό μέχρι όγκο ενός λίτρου.  3.9.1. Πρότυπο διάλυμα εργασίας μαγγανίου (10 mug Mn/ml) που παρασκευάζεται δι' αραιώσεως του προτύπου διαλύματος (3.9) με νερό 1+9 και στη συνέχεια δι' αραιώσεως του προκύπτοντος διαλύματος με νερό 1+9.  3.10. Πρότυπο διάλυμα ψευδαργύρου (1 000 mug Zn/ml) που παρασκευάζεται ως εξής: διαλύεται 1 g ψευδαργύρου υπό μορφή λωρίδος ή φύλλου α.π. σε 25 ml υδροχλωρικού οξέος 6 N (3.2) και συμπληρώνεται με νερό μέχρι όγκο ενός λίτρου.  3.10.1. Πρότυπο διάλυμα εργασίας ψευδαργύρου (10 mug Zn/ml) που παρασκευάζεται δι' αραιώσεως του προτύπου διαλύματος (3.10) με νερό 1+9 και στη συνέχεια δι' αραιώσεως του προκύπτοντος διαλύματος με νερό 1+9.  3.11. Διάλυμα χλωριούχου λανθανίου που παρασκευάζεται ως εξής: διαλύονται 12 g οξειδίου του λανθανίου σε 150 ml νερό, προστίθενται 100 ml υδροχλωρικού οξέος 6 N (3.2) και συμπληρώνεται με νερό μέχρι όγκο ενός λίτρου.  4. ΣΥΣΚΕΥΕΣ 4.1. Φούρνος με διαφράγματα με ρυθμιζόμενη θερμοκρασία και καταγραφικό.  4.2. Τα γυάλινα σκεύη πρέπει να είναι από ανθεκτικό πυριτικό βόριο. Συνιστάται η χρησιμοποίηση συσκευών αποκλειστικά για προσδιορισμούς ιχνοστοιχείων.  4.3. Χωνευτήρια από πλατίνα και (προαιρετικά) από χαλαζία.  4.4. Φασματοφωτόμετρο ατομικής απορρόφησης ανταποκρινόμενο στις απαιτήσεις της μεθόδου όσον αφορά την ευαισθησία και την ακρίβεια στο απαιτούμενο εύρος της περιοχής μετρήσεων.  5. ΜΕΘΟΔΟΣ 5.1. Δείγματα που περιέχουν οργανική ύλη 5.1.1. Αποτέφρωση και παρασκευή του διαλύματος που θα αναλυθεί (8)() ι) Τοποθετούνται 5 ως 10 g του δείγματος ζυγισμένα με προσέγγιση 0,2 mg σε ένα χωνευτήρι από χαλαζία ή πλατίνα (4.3) (βλέπε σημείωση β)), ξηραίνονται σε φούρνο σε 105 oC και τοποθετείται το χωνευτήρι σε κρύο φούρνο με διαφράγματα (4.1). Κλείεται ο  φούρνος (βλέπε σημείωση γ)) και προοδευτικά αυξάνεται η θερμοκρασία στους 450 μέχρι 475 oC μέσα σε 90 λεπτά περίπου. Διατηρείται αυτή η θερμοκρασία για 4 ως 16 ώρες (π.χ. κατά τη διάρκεια της νύχτας) ώστε να απομακρυνθεί η ανθρακώδης ύλη και στη  συνέχεια ανοίγεται ο φούρνος και αφήνεται να κρυώσει (βλέπε σημείωση δ)).  Υγραίνονται οι στάχτες με νερό, κατόπιν μεταφέρονται σε δοχείο των 250 ml. Ξεπλένεται το χωνευτήρι με περίπου 5 ml συνολικά υδροχλωρικού οξέος (3.1) και στη συνέχεια προστίθεται το διάλυμα αυτό σιγά και προσεκτικά στο δοχείο. (Πιθανόν να υπάρξει μια  ισχυρή αντίδραση οφειλόμενη στο σχηματισμό CO2). Προστίθεται υδροχλωρικό οξύ (3.1) κατά σταγόνες ανακατεύοντας ταυτόχρονα το περιεχόμενο του δοχείου, μέχρι να σταματήσει τελείως ο αναβρασμός. Εξατμίζεται μέχρι ξηρού, ανακατεύοντας πότε-πότε με μιά  γυάλινη ράβδο.  Στη συνέχεια προστίθενται 15 ml υδροχλωρικού οξέος 6 N (3.2) στο υπόλειμμα και κατόπιν περίπου 120 ml νερό. Αναδεύεται με τη βοήθεια της γυάλινης ράβδου, η οποία πρέπει να μείνει μέσα στο δοχείο και καλύπτεται στο δοχείο με ύαλο ωρολογίου. Αυξάνεται  σιγά-σιγά η θερμοκρασία στο σημείο βρασμού και διατηρείται στο σημείο αυτό μέχρις ότου δεν φαίνεται να διαλύεται άλλη στάχτη. Διηθείται με διηθητικό χαρτί καθαρό από στάχτες και συλλέγεται το διήθημα σε μία ογκομετρική φιάλη των 250 ml. Πλένεται το  δοχείο και το φίλτρο με 5 ml ζεστού υδροχλωρικού οξέος 6 N (3.2) και δυο φορές με βραστό νερό. Συμπληρώνεται η ογκομετρική φιάλη με νερό μέχρι τα 250 ml (συγκέντρωση HCl περίπου 0,5 N).  ιι) Αν το υπόλειμμα στο φίλτρο εμφανίζεται μαύρο (κάρβουνο) τοποθετείται πάλι στο φούρνο και αποτεφρώνεται στους 450 ως 475 oC. Αυτή η αποτέφρωση, που απαιτεί μόνο λίγες ώρες (περίπου τρεις ως πέντε ώρες), περατούται όταν η στάχτη εμφανίζεται άσπρη ή  σχεδόν άσπρη. Διαλύεται το υπόλειμμα με περίπου 2 ml υδροχλωρικού οξέος (3.1), εξατμίζεται μέχρι του ξηρού και προστίθενται 5 ml υδροχλωρικού οξέως (3.2). Θερμαίνεται, διηθείται το διάλυμα μέσα στην ογκομετρική φιάλη και συμπληρώνεται με νερό μέχρι τα  250 ml (συγκέντρωση HCl περίπου 0,5 N).  Σημειώσεις:  α) Στον προσδιορισμό των ιχνοστοιχείων πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στους κινδύνους μολύνσεως, ιδιαίτερα από τον ψευδάργυρο, το χαλκό και το σίδηρο. Γι' αυτό το λόγο ο εξοπλισμός που χρησιμοποιείται για την παρασκευή των δειγμάτων πρέπει να είναι  καθαρός από αυτά τα μέταλλα.  Για να μειωθεί ο γενικότερος κίνδυνος μολύνσεως, η εργασία πρέπει να γίνεται σε ατμόσφαιρα ελεύθερη από σκόνη με πάρα πολύ καθαρό εξοπλισμό και προσεχτικά πλυμένα γυάλινα σκεύη. Ο προσδιορισμός του ψευδαργύρου είναι ιδιαίτερα ευαίσθητος σε πολλούς  τύπους μόλυνσης, π.χ. από γυάλινα σκεύη, αντιδραστήρια, σκόνη κλπ.  β) Το βάρος του δείγματος που πρόκειται να αποτεφρωθεί υπολογίζεται από την κατά προσέγγιση περιεκτικότητα του ιχνοστοιχείου στη ζωοτροφή σε σχέση με την ευαισθησία του φασματοφωτομέτρου που χρησιμοποιήθηκε. Για μερικές ζωοτροφές φτωχές σε ιχνοστοιχεία  μπορεί να είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθούν αρχικά 10 ως 20 g δείγματος και να περιορίζεται ο όγκος του τελικού διαλύματος στα 100 ml.  γ) Η αποτέφρωση πρέπει να γίνει σε κλειστό φούρνο χωρίς έγχυση αέρα ή οξυγόνου.  δ) Η θερμοκρασία που δείχνει το πυρόμετρο δεν πρέπει να υπερβεί τους 475 oC.  5.1.2. Φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός 5.1.2.1. Παρασκευή διαλυμάτων βαθμονομήσεως Για κάθε ένα από τα στοιχεία που πρόκειται να προσδιορισθούν, παρασκευάζεται από τα πρότυπα διαλύματα εργασίας που δόθηκαν στα σημεία 3.71, 3.8.1, 3.9.1 και 3.10.1 μια σειρα από διαλύματα βαθμονόμησης, έτσι ώστε κάθε διάλυμα βαθμονόμησης να έχει  συγκέντρωση HCl περίπου 0,5 N και (στις περιπτώσεις σιδήρου, μαγγανίου και ψευδαργύρου) συγκέντρωση χλωριούχου λανθανίου ισοδύναμη με 0,1% La (β/ο). Οι συγκεντρώσεις των ιχνοστοιχείων που διαλέχτηκαν πρέπει να βρίσκονται μέσα στα όρια ευαισθησίας του  φασματοφωτόμετρου που χρησιμοποιήθηκε. Οι παρακάτω πίνακες δείχνουν, σαν παράδειγμα, τις συνθέσεις του τυπικού εύρους των διαλυμάτων βαθμονομήσεως. Εν τούτοις, ανάλογα με τον τύπο και την ευαισθησία του φασματοφωτόμετρου που χρησιμοποιείται, μπορεί να  είναι απαραίτητη η εκλογή άλλων συγκεντρώσεων.   ID="1"> Σίδηρος  "" ID="1">ml προτύπου διαλύματος εργασίας (3.7.1)" ID="1">(1 ml = 100 mug Fe)> ID="2">0> ID="3">0,5> ID="4">1> ID="5">2> ID="6">3> ID="7">4> ID="8">5"> ID="1">+ ml 6 N HCl (3.2)> ID="2">7> ID="3">7> ID="4">7> ID="5">7> ID="6">7> ID="7">7>  ID="8">7"">+ 10 ml διαλύματος χλωριούχου λανθανίου (3.11) και συμπληρώνεται με νερό μέχρι όγκο 100 ml.>  Χαλκός  "" ID="1">ml προτύπου διαλύματος εργασίας (3.8.1)" ID="1">(1 ml = 10 mug Cu)> ID="2">0> ID="3">1> ID="4">2> ID="5">4> ID="6">6> ID="7">8> ID="8">10"> ID="1">+ ml 6 N HCl (3.2)> ID="2">8> ID="3">8> ID="4">8> ID="5">8> ID="6">8> ID="7">8>  ID="8">8"">Συμπληρώνεται μέχρι όγκο 100 ml με νερό.>  Μαγγάνιο  "" ID="1">ml προτύπου διαλύματος εργασίας (3.9.1)" ID="1">(1 ml = 10 mug Mn)> ID="2">0> ID="3">1> ID="4">2> ID="5">4> ID="6">6> ID="7">8> ID="8">10"> ID="1">+ ml 6 N HCl (3.2)> ID="2">7> ID="3">7> ID="4">7> ID="5">7> ID="6">7> ID="7">7>  ID="8">7"">+ 10 ml διαλύματος χλωριούχου λανθανίου (3.11) και συμπληρώνεται με νερό μέχρι όγκο 100 ml.>  Ψευδάργυρος  "" ID="1">ml προτύπου διαλύματος εργασίας (3.10.1)" ID="1">(1 ml = 10 mug Zn)> ID="2">0> ID="3">0,5> ID="4">1> ID="5">2> ID="6">4> ID="7">6> ID="8">8"> ID="1">+ ml 6 N HCl (3.2)> ID="2">7> ID="3">7> ID="4">7> ID="5">7> ID="6">7>  ID="7">7> ID="8">7"">+ 10 ml διαλύματος χλωριούχου λανθανίου (3.11) και συμπληρώνεται με νερό μέχρι όγκο 100 ml.>> 5.1.2.2. Παρασκευή των διαλυμάτων για ανάλυση Για τον προσδιορισμό του χαλκού, το διάλυμα που παρασκευάστηκε από το σημείο 5.1.1 μπορεί γενικά να χρησιμοποιηθεί άμεσα. Αν απαιτείται να προσαρμοσθεί η συγκέντρωσή του μέσα στα όρια των διαλυμάτων βαθμονόμησης, μπορεί ένα μέρος του διαλύματος να μεταφερθεί με πιπέτα σε μια ογκομετρική φιάλη των 100 ml και να συμπληρωθεί με 0,5  N υδροχλωρικό οξύ (3.3) μέχρι ο όγκος να φτάσει τα 100.  Για τον προσδιορισμό του σιδήρου, μαγγανίου και ψευδαργύρου μεταφέρεται με πιπέτα ένα μέρος του διαλύματος που παρασκευάστηκε από το σημείο 5.1.1 μέσα σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml, προστίθενται 10 ml διαλύματος χλωριούχου λανθανίου (3.11) και  συμπληρώνεται με υδροχλωρικό οξύ 0,5 N (3.3) μέχρι τον όγκο των 100 ml (βλέπε επίσης σημείο 8 "Παρατήρηση").  5.1.2.3. Λευκό πείραμα Το λευκό πείραμα πρέπει να περιλαμβάνει όλα τα προβλεπόμενα στάδια της διαδικασίας, παραλειπομένου του υλικού του δείγματος.  Το διάλυμα βαθμονόμησης "0" δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί σαν "λευκό".  5.1.2.4. Μέτρηση της ατομικής απορρόφησης Μετράται η ατομική απορρόφηση των διαλυμάτων βαθμονόμησης και του διαλύματος που πρόκειται να αναληθεί χρησιμοποιώντας μια οξειδωτική φλόγα αέρα-ακετυλενίου στα ακόλουθα μήκη κύματος:  Fe: 248,3 nm Cu: 324,8 nm Mn: 279,5 nm Zn: 213,8 nm Κάθε μέτρηση γίνεται τέσσερις φορές.  5.2. Μεταλλικά τροφικά άλατα Αν το δείγμα δεν περιέχει οργανική ύλη, δεν είναι απαραίτητη προηγούμενη αποτέφρωση. Ακολουθείται η διαδικασία που περιγράφεται στο σημείο 5.1.1.(ι) αρχίζοντας από τη δεύτερη παράγραφο. Η εξάτμιση με υδροφθορικό οξύ μπορεί να παραλειφθεί.  6. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Χρησιμοποιώντας μια καμπύλη βαθμονόμησης, υπολογίζεται η συγκέντρωση του ιχνοστοιχείου στο δείγμα που αναλύεται και εκφράζεται το αποτέλεσμα σε mg ιχνοστοιχείου ανά kg δείγματος (ppm).  7. ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΟΤΗΤΑ Η διαφορά ανάμεσα στα αποτελέσματα δύο παραλλήλων προσδιορισμών, που εκτελέστηκαν στο ίδιο δείγμα από τον ίδιο αναλυτή, δεν πρέπει να υπερβαίνει:  - 5 mg/kg, κατ'απόλυτη τιμή, για περιεκτικότητες ιχνοστοιχείου μέχρι 50 mg/kg- - 10% του μεγαλύτερου αποτελέσματος για περιεκτικότητες ιχνοστοιχείου από 50 και μέχρι 100 mg/kg- - 10 mg/kg, με απόλυτη τιμή για περιεκτικότητες ιχνοστοιχείου 100 και μέχρι 200 mg/kg.  - 5% του μεγαλύτερου αποτελέσματος για περιεκτικότητες ιχνοστοιχείου ανώτερες από 200 mg/kg.  8. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ Η παρουσία μεγάλων ποσοτήτων φωσφορικών αλάτων μπορεί να προκαλέσει παρεμβολές στον προσδιορισμό του σιδήρου, μαγγανίου και ψευδαργύρου. Αυτή η παρεμβολή πρέπει να διορθωθεί με την προσθήκη διαλύματος χλωριούχου λανθανίου (3.11). Αν, εν τούτοις στο  δείγμα ο λόγος βάρους  > 2, η προσθήκη του διαλύματος χλωριούχου λανθανίου (3.11) στο διάλυμα που θα αναλυθεί και στα διαλύματα βαθμονόμησης μπορεί να παραλειφθεί.    (1)() 1 mg ψευδαργυρική βακιτρακίνη (ποιότητος για ζωοτροφές) είναι ισοδύναμο με 42 διεθνείς μονάδες (δ.μ.) (2)() Άλλες μέθοδοι μπορεί να χρησιμοποιηθούν με την προϋπόθεση ότι έχει καθιερωθεί ότι δίδουν παρόμοια βακτηριακά εναιωρήματα.  (3)()Οποιοδήποτε μέσο καλλιέργειας του εμπορίου παρόμοιας συνθέσεως και το οποίο δίδει τα ίδια αποτελέσματα είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί.(4)() Άλλοι τρόποι μπορεί να χρησιμοποιηθούν με την προϋπόθεση ότι έχει καθιερωθεί ότι δίδουν παρόμοια βακτηριακά  εναιωρήματα.  (5)()Κάθε μέσο καλλιέργειας του εμπορίου ανάλογης συνθέσεως και το οποίο παρέχει ίδια αποτελέσματα μπορεί να χρησιμοποιηθεί π.χ. oxoid αντιβιοτικό μέσο 1 (CM 327) με την προσθήκη oxoid άγαρ αριθ. 3 (L. 13). (6)()Κάθε μέσο καλλιέργειας του εμπορίου ανάλογης συνθέσεως και που παρέχει τα ίδια αποτελέσματα μπορεί να χρησιμοποιηθεί π.χ. oxoid αντιβιοτικό μέσο 2 (CM 335) με την προσθήκη oxoid άγαρ, αριθ. 3 (L. 13).(7)() π.χ. SE 2 από την Wacker Chemi GmbH,  Munich.  (8)() Ο πράσινος σανός (φρέσκος ή αποξηραμένος) πιθανό να περιέχει μεγάλες ποσότητες φυτικού διοξειδίου του πυριτίου, το οποίον μπορεί να συγκρατεί ιχνοστοιχεία και πρέπει να απομακρυνθεί. Για δείγματα προερχόμενα από τέτοιες ζωοτροφές πρέπει συνεπώς να  ακολουθηθεί η επόμενη τροποποημένη μέθοδος. Εκτελείται η εργασία 5.1.1. ι) μεχρι το στάδιο της διηθήσεως. Πλένεται το διηθητικό χαρτί που περιέχει το αδιάλυτο κατακράτημα, δυο φορές με βραστό νερό και τοποθετείται σε χωνευτήρι από πλατίνα (4.3).  Αποτεφρώνεται μέσα στο φούρνο με διαφράγματα (4.1) σε θερμοκρασία χαμηλότερη από 550oC μέχρις ότου όλη η ανθρακώδης ύλη εξαφανισθεί τελείως. Αφήνεται να κρυώσει, προστίθενται μερικές σταγόνες νερό, μετά 10 ως 15 ml υδροφθορικού οξέος (3.4) και  εξατμίζεται μέχρι ξηρού στους 150oC περίπου. Αν παραμείνει καθόλου διοξείδιο του πυριτίου στο υπόλειμμα, ξαναδιαλύεται σε μερικά ml υδροφθορικού οξέος (3.4) και εξατμίζεται μέχρι ξηρού. Προστίθενται πέντε σταγόνες θειικού οξέος (3.5) και θερμαίνεται  μέχρι να σταματήσει η παραγωγή άσπρου καπνού. Μετά την προσθήκη 5 ml υδροχλωρικού οξέος 6 N (3.2) και περίπου 30 ml νερού, θερμαίνεται, διηθείται το διάλυμα μέσα σε ογκομετρική φιαλη των 250 ml και συμπληρώνεται ο όγκος των 250 ml με νερό (η συγκέντρωση  του HCl είναι περίπου 0,5 N). Στη συνέχεια ακολουθείται η διαδικασία από το σημείο 5.1.3.