CELEX: 31981L0715
Language: es
Date: 1981-07-31 00:00:00
Title: Novena Directiva 81/715/CEE de la Comisión, de 31 de julio de 1981, por la que se establecen métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales

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31981L0715

Novena Directiva 81/715/CEE de la Comisión, de 31 de julio de 1981, por la que se establecen métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales  

Diario Oficial n° L 257 de 10/09/1981 p. 0038 - 0046 Edición especial en finés : Capítulo 3 Tomo 13 p. 0233  Edición especial en español: Capítulo 03 Tomo 23 p. 0070  Edición especial sueca: Capítulo 3 Tomo 13 p. 0233  Edición especial en portugués: Capítulo 03 Tomo 23 p. 0070 

 NOVENA DIRECTIVA DE LA COMISIÓN    de 31 de julio de 1981    por la que se establecen métodos de análisis   comunitarios para el control oficial de los alimentos   para animales     ( 81/715/CEE )    LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,    Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad   Económica Europea ,    Vista la Directiva 70/373/CEE del Consejo , de 20 de   julio de 1970 , relativa a la introducción de métodos   de toma de muestras y de métodos de análisis   comunitarios para el control oficial de los alimentos   para animales (1) , modificada en último lugar por el   Acta de adhesión de Grecia , y , en particular , su   artículo 2 ,    Considerando que la Directiva mencionada prevé que los   controles oficiales de los alimentos para animales   destinados a comprobar que se cumplen las condiciones   establecidas en virtud de las disposiciones legales ,   reglamentarias o administrativas relativas a la   calidad y composición de los alimentos para animales   se efectuarán de acuerdo con métodos de toma de   muestras y métodos de análisis comunitarios ;    Considerando que las Directivas de la Comisión   71/250/CEE (2) , 71/393/CEE (3) , 72/199/CEE (4) ,   73/46/CEE (5) , 74/203/CEE (6) , 75/84/CEE (7) ,   76/372/CEE (8) y 78/633/CEE (9) , modificadas en último   lugar por la Directiva de 30 de julio de 1981 , han   establecido ya determinados métodos de análisis   comunitario ; que , habida cuenta del estado de los trabajos   efectuados desde entonces , es conveniente adoptar una   novena serie de métodos ;    Considerando que las medidas previstas en la presente   Directiva se ajustan al dictamen del Comité permanente   de la alimentación animal ,    HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :    Artículo 1    Los Estados miembros dispondrán que los análisis   previstos para los controles oficiales de los alimentos   para animales , en lo que se refiere a su contenido en   avoparcina y en monensina sódica , se efectúen de   acuerdo con los métodos descritos en el Anexo .    Artículo 2    Los Estados miembros aplicarán las disposiciones   legales , reglamentarias y administrativas necesarias para   cumplir las disposiciones de la presente Directiva el 1   de diciembre de 1981 e informarán de ello a la Comisión .    Artículo 3    Los destinatarios de la presente Directiva serán los   Estados miembros .    Hecho en Bruselas , el 31 de julio de 1981 .    Por la Comisión    El Presidente    Gaston THORN    (1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .    (2) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .    (3) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .    (4) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .    (5) DO n º L 83 de 30 . 3 . 1973 , p. 21 .    (6) DO n º L 108 de 22 . 4 . 1974 , p. 7 .    (7) DO n º L 32 de 5 . 2 . 1975 , p. 26 .    (8) DO n º L 102 de 15 . 4 . 1976 , p. 8 .    (9) DO n º L 206 de 29 . 7 . 1978 , p. 43 .    ANEXO    1 . DETERMINACIÓN DE AVOPARCINA POR DIFUSIÓN   DE GELOSA    1 . OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN    El método permite determinar la avoparcina en los   alimentos y en las premezclas . El límite inferior de   la determinación es de 2 mg/kg ( 2ppm ) . La   presencia de antibióticos polietéreos puede   interferir en la determinación .    2 . PRINCIPIO    La muestra se somete a una extracción con una   mezcla de acetona/agua/ácido clorhídrico . La   actividad antibiótica del extracto se determina   midiendo la difusión de la avoparcina en un medio   gelosado , sembrado con Bacillus subtilis . La difusión   se manifiesta por la formación de zonas de   inhibición del microorganismo . El diámetro   de estas zonas se considera directamente proporcional   al logaritmo de la concentración en antibiótico para   la gama de concentraciones utilizadas .    3 . MICROORGANISMO : BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633   ( NCIB 8054 )    3.1 . Mantenimiento de la cepa    Sembrar el medio de cultivo ( 4.1 ) en tubos   inclinados , con Bacillus subtilis . Incubar   durante una noche a 30 ° C , conservar en un   refrigerador a 4 ° C aproximadamente y renovar   la siembra todos los meses .    3.2 . Preparación de la suspensión de esporas (1)    Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa ( 3.1 ) ,   de preparación reciente , con ayuda de 2 a 3 ml de   agua esterilizada . Sembrar con esta suspensión 300 ml   del medio de cultivo ( 4.1 ) en un frasco de Roux   e incubar durante tres a cinco días a 30 ° C .   Después de controlar la esporulación al microscopio ,   recoger las esporas en 15 ml de etanol ( 4.2 ) y   homogeneizar . Esta suspensión puede conservarse   por lo menos cinco meses a 4 ° C aproximadamente .    4 . MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVOS    4.1 . Medio de mantenimiento de la cepa (2)    Peptona 6,0 g    Triptona 4,0 g    Extracto de levadura 3,0 g    Extracto de carne 1,5 g    Glucosa 1,0 g    Gelosa 15,0 g    Agua 1 000 ml    pH 6,5 ( después de la esterilización )    4.2 . Etanol al 20 % ( v/v ) : diluir 200 ml   de etanol en 800 ml de agua .    4.3 . Acido clorhídrico , d : 1,18-1,19 .    4.4 . Solución 2 M de hidrócido de sodio .    4.5 . Tampón fosfato 0,1 M :    dihidrógenofosfato de potasio , KH2PO4 : 13,6 g    agua hasta 1 000 ml    ajustar el pH a 4,5 .    4.6 . Mezcla acetona/agua/ácido clorhídrico   ( 4.3 ) : 65/32,5/2,5 ( v/v/v ) .    4.7 . Sustancia patrón : sulfato de avoparcina de   actividad conocida .    5 . SOLUCIONES PATRÓN    Disolver una cantidad exactamente pesada de 10 mg   aproximadamente de sustancia patrón ( 4,7 ) en   el tampón fosfato ( 4.5 ) y diluirla con dicho   tampón para obtener una solución madre   de avoparcina en 100 µg/ml . Conservada en   un frasco cerrado a 4 ° C , esta solución es   estable durante siete días .    5.1 . Para las premezclas    Preparar a partir de dicha solución y   mediante diluciones consecutivas con el tampón fosfato   ( 4,5 ) la soluciones siguientes :    S8 4 µg/ml    S4 2 µg/ml    S2 1 µg/ml    S1 0,5 µg/ml .    5.2 . Para los alimentos    Preparar a partir de dicha solución y mediante   diluciones consecutivas con el tampón fosfato   ( 4.5 ) las soluciones siguientes :    S8 2 µg/ml    S4 1,00 µg/ml    S2 0,50 µg/ml    S1 0,25 µg/ml .    6 . PREPARACIÓN DEL EXTRACTO Y DE LAS SOLUCIONES    6.1 . Premezclas    Pesar , con una precisión de 10 mg , una   cantidad de muestra que contenga de 10 a 100 mg   de avoparcina aproximadamente , transvasarla a un   matraz aforado de 100 ml , añadir 60 ml de la   mezcla ( 4.6 ) y agitar durante 15 minutos en   un agitador mecánico . Verificar el pH y ajustarlo a   2 , si fuere necesario , con ácido clorhídrico   ( 4.3 ) . Completar hasta el volumen con la   mezcla ( 4.6 ) y homogeneizar . Filtrar una parte   en un papel filtro adecuado ( por ej. Whatman n º 1 )   y eliminar los primeros 5 ml del filtrado . Tomar   una parte alícuota y ajustar el pH a 4,5 con   la solución de hidróxido de sodio ( 4.4 ) . Diluir   esta solución con el tampón de fosfato ( 4.5 ) para   obtener una concentración supuesta en avoparcina de   4 µg/ml ) ( = U8 ) .    Preparar a partir de dicha solución y   mediante diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con el   tampón fosfato ( 4.5 ) las soluciones U4   ( concentración supuesta : 2 µg/ml ) , U2   ( concentración supuesta : 1 µg/ml ) y   U1 ( concentración supuesta : 0,5 µg/ml ) .    6.2 . Alimentos    Pesar una cantidad de muestra de 50,0 g ,   añadir 100 ml de la mezcla ( 4.6 ) y agitar   durante 30 minutos en un agitador mecánico .   Clarificar el extracto mediante centrifugación   ( en tubos cerrados ) , tomar una parte alícuota   del extracto limpido ( véase el cuadro que   sigue ) y ajustar el pH a 4,5 con la solución   de hidróxido de sodio ( 4.4 ) . Diluir esta solución   con el tampón fosfato ( 4.5 ) para obtener la solución   U8 ( véase el cuadro que sigue ) .    Preparar a partir de dicha solución y mediante   diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con el tampón fosfato   ( 4.5 ) las soluciones U4 ( concentración supuesta :   1,0 µg/ml ) , U2 ( concentración supuesta :   9,5 µg/ml ) y U1 ( concentración supuesta :   0,25 µg/ml ) .    Contenido supuesto en avoparcina ( mg/kg ) * 5 * 7,5 *   10 * 15 * 20 * 40 *    Peso de la muestra en g ( ± 0,1 g ) * 50 * 50 *   50 * 50 * 50 * 50 *    Volumen de la mezcla ( 4,6 ) ( ml ) * 100 * 100 *   100 * 100 * 100 * 100 *    Volumen del extracto límpido ( ml ) * 20 * 15 * 20 *   15 * 20 * 10 *    Volumen final ( ml ) : U8 * 25 * 25 * 50 * 50 * 100 *   100 *    Concentración supuesta U8 en µg/ml * 2 * env. 2 *   2 * env. 2 * 2 * 2 *    7 . MODALIDADES DE DETERMINACIÓN    7.1 . Inoculación del medio de cultivo    Sembrar a 50-60 ° C el medio de base   de la determinación ( 4.1 ) con la suspensión de   esporar ( 3.2 ) . Mediante ensayos preliminares en   placas con el medio ( 4.1 ) , determinar la   cantidad de inóculo que permita obtener , para las   distintas concentraciones en avoparcina , zonas de   inhibición lo más extensas posibles y que además   sean nítidas .    7.2 . Preparación de las cajas    La difusión en gelosa se efectúa en cajas   con las cuatro concentraciones de la solución   patrón ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las cuatro   concentraciones del extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) .   Cada caja debe recibir necesariamente las cuatro   concentraciones del patrón y del extracto .   A tal fin , elegir la dimensión de las cajas   de forma que se puedan practicar en el medio   gelosado por lo menos ocho cavidades de 10 a 13 mm   de diámetro , cuyos centros no disten entre sí menos   de 30 mm . Se pueden utilizar como cajas placas de   vidrio planas , coronadas con un anillo de aluminio   o de materia plástica de 200 mm de diámetro y   20 mm de altura .    Introducir en las cajas una cantidad del medio   ( 4.1 ) , sembrado como se indica en 7.1 , que   permita obtener una capa de 2 mm de grosor   aproximadamente ( 60 ml para una caja de 200 mm de   diámetro ) . Dejar solidificar , practicar las   cavidades y depositar en las mismas los volúmenes   exactamente medidos de la solución patrón y   del extracto ( 0,10 a 0,15 ml por cavidad , según   el diómetro ) . Hacer por lo menos cuatro   repeticiones de cada concentración , de forma   que cada determinación sea objeto de una evaluación   de 32 zonas de inhibición .    7.3 . Incubación    Incubar las cajas durante 16 a 18 horas a 30 ° C .    8 . EVALUACIÓN    Medir el diámetro de las zonas de inhibición   con una precisión de 0,1 mm . Para cada   concentración , registrar las medidas medias en papel   semilogarítmico trazando el logaritmo de las   concentraciones frente a los diámetros de las   zonas de inhibición . Trazar las rectas más ajustadas   para la solución patrón y para el extracto procedente   de la misma , por ejemplo de la forma siguiente :    Determinar el punto más adecuado del nivel más   bajo de la solución patrón ( SL ) mediante la fórmula :     ( a ) SL = 7 S1 + 4 S2 + S4 - 2 S8/10    Determinar el punto más adecuado del nivel más alto de   la solución patrón ( SH ) mediante la fórmula :     ( b ) SH = ( 7 S8 + 4 S4 + S2 - 2 S1 ) /10    Determinar de la misma forma los puntos más   adecuados del extracto para el nivel más   bajo ( UL ) y el nivel más alto ( UH )   sustituyendo S1 , S2 , S4 y S8 en las fórmulas   anteriormente mencionadas por U1 , U2 , U4 y U8 .    Inscribir los valores SL y SH en el mismo gráfico .   Uniendo los dos puntos se obtiene la recta más   ajustada para la solución patrón . Procediendo   de la misma forma para UL y UH se obtiene la recta   más ajustada para el extracto .    A falta de toda interferencia , las rectas deben   ser paralelas . En la práctica , se consideran   paralelas cuando ( SH-SL ) y ( UH-UL ) no   difieren en más de 10 % de su media .    Si las rectas no fueren paralelas , pueden   eliminarse o bien U1 y S1 , o bien U8 y S8 .   Los valores SL , SH , UL y UH que permiten obtener   las rectas más ajustadas se calculan entonces las   fórmulas siguientes :     ( a ) SL = ( 5 S1 + 2 S2 - S4 ) /6 o   ( 5 S2 + 2 S4 - S8 ) /6     ( b ) SH = ( 5 S4 + 2 S2 - S1 ) /6 o   ( 5 S8 + 2 S4 - S2 ) /6    y fórmulas análogas para UL y UH . La   utilización de esta alternativa debe ser objeto   asimismo de verificación en lo que se refiere al   paralelismo de las rectas , tal como se ha indicado .   En el boletín de análisis deberá mencionarse   la obtención de un resultado procedente de tres   niveles .    Cuando las rectas se consideren paralelas , calcular   el logaritmo de la actividad relativa ( log. A )   mediante una de las fórmulas siguientes .    Para cuatro niveles     ( c ) Log. A = ( ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 -   S8 ) × 0,602 ) / ( U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 -   S1 - S2 )    Para tres niveles     ( d ) Log. A = ( ( U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4 )   × 0,401 ) / ( U4 + S4 - U1 - S1 )    o     ( d' ) Log. A = ( ( U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8 )   × 0,401 ) / ( U8 + S8 - U2 - S2 )    Actividad real = actividad supuesta × actividad   supuesta × actividad relativa .    Si la actividad relativa se encuentra fuera   de la gama de valores comprendida entre 0,5 y 2,0 ,   repetir la determinación procediendo a los ajustes   adecuados de las concentraciones de extracto o , en su   caso , de las soluciones patrón . Cuando dicha   actividad no pueda restablecerse en la gama de   valores requeridos , el resultado se considerará   aproximado y esta indicación deberá anotarse en el   boletín de análisis .    Cuando las rectas no se consideren paralelas , repetir   la determinación . Si no se lograse todavía el   paralelismo , la determinación deberá considerarse   no satisfactoria .    9 . REPETIBILIDAD    La diferencia entre los resultados de dos   determinaciones efectuadas en la misma muestra por el   mismo analista no deberá exceder de :     - 2 mg/kg , en valor absoluto , para los contenidos   en avoparcina de 2 a 10 mg/kg ,     - un 20 % del resultado más alto para los   contenidos de 10 a 25 mg/kg ,     - 5 mg , en valor absoluto , para los contenidos   de 25 a 50 mg/kg ,     - un 10 % del resultado más alto para los   contenidos superiores a 50 mg/kg .    2 . DETERMINACIÓN DE LA MONENSINA SÓDICA - POR   DIFUSIÓN DE GELOSA    1 . OBJETO Y ÁMBITO DE APLICACIÓN    El método permite determinar la monensina sódica   en los alimentos y las premezclas . El límite inferior   de la determinación es de 10 mg/kg ( 10 ppm ) (1) .    2 . PRINCIPIO    La muestra se somete a extracción con metanol al 90 % .   El extracto se somete a tratamientos adecuados según   el contenido en monensina sódica de la muestra . Su   actividad antibiótica se determina midiendo la   difusión de la monensina sódica en un medio gelosado ,   sembrado con Bacillus subtilis . La difusión se   manifiesta por la formación de zonas de inhibición   del microorganismo . El diámetro de estas zonas   se considera directamente proporcional al logaritmo   de la concentración en antibiótico para la gama   de concentraciones utilizadas . La sensibilidad de   este proceso se reduce en presencia de iones sodio .    3 . MICROORGANISMO : BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633   ( NCIB 8054 )    3.1 . Mantenimiento de la cepa    Sembrar el medio de cultivo ( 4.1 ) , en tubos   inclinados , con Bacillus subtilis . Incubar durante   una noche a 30 ° C , conservar en un refrigerador   a 4 ° C aproximadamente y renovar la siembra todos   los meses .    3.2 . Preparación de la suspensión de esporas (2)    Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa ( 3.1 ) ,   de preparación reciente , con ayuda de 2 a 3 ml de   agua esterilizada . Sembrar con esta suspensión 300 ml   del medio de cultivo ( 4.1 ) en un frasco de Roux e   incubar durante tres a cinco días a 30 ° C .   Después de controlar la esporulación al microscopio ,   recoger las esporas en 15 ml de etanol ( 4.3 ) y   homogeneizar . Esta suspensión puede conservarse   por lo menos cinco meses a 4 ° C aproximadamente .    4 . MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVOS    4.1 . Medio de mantenimiento de la cepa (3)    Triptona 10,0 g    Extracto de levadura 3,0 g    Extracto de carne 1,5 g    Glucosa 1,0 g    Gelosa ( según la calidad ) 10,0 a 20,0 g    Agua 1 000 ml    pH 6,5 ( después de la esterilización )    4.2 . Medio de base de la determinación    Glucosa 10,0 g    Extracto de levadura 2,5 g    Hidrogenofosfato de potasio , K2HPO4 0,69 g    Dihidrogenofosfato de potasio , KH2PO4 0,45 g    Gelosa ( según la calidad ) 10,0 a 20,0 g    Agua 1 000 ml    pH 6,0 ( después de la esterilización ) .    4.3 . Etanol al 20 % ( v/v ) : diluir 200 ml   de etanol en 800 ml de agua .    4.4 . Metanol , anhidro .    4.5 . Metanol al 90 % ( v/v ) : diluir 900 ml   de metanol ( 4.4 ) en 100 ml de agua .    4.6 . Metanol al 50 % ( v/v ) : diluir 500 ml   de metanol ( 4.4 ) en 500 ml de agua .    4.7 . Oxido de aluminio granulado ( Alcoa F , 20 mesh :   Activated Alumina UG1 : F. Lancester and Co. , o   equivalente ) .    4.8 . Sustancia patrón : monensina sódica de   actividad conocida ( disponible en particular en   el Internacional Laboratory for Biological Standards ,   Central Veterinary Laboratory , Weybridge , Surrey KT15   3NB , Gran Bretaña ) .    5 . EQUIPO    5.1 . Aparato rotatorio de evaporación al vacío ,   con matraz de fondo redondo de 250 ml .    5.2 . Tubo para cromatografía , de vidrio ,   diámetro interior : 25 mm , longitud : 400 mm ,   con una abertura aguzada de 2 mm de diámetro en un   extremo .    5.3 . Tubo para cromatografía , de vidrio ,   diámetro interior : 11 mm , longitud : 300 mm   aproximadamente , con una abertura aguzada de 2 mm   de diámetro en un extremo .    6 . SOLUCIONES PATRÓN    Disolver una cantidad exactamente pesada de sustancia   patrón ( 4.8 ) en metanol ( 4.4 ) y diluir para   obtener una solución madre de monensina sódica   a 800 µg . Conservada en un frasco cerrado a 4 ° C ,   esta solución es estable durante dos semanas .    Preparar , a partir de dicha solución y mediante   diluciones sucesivas con metanol al 50 % ( 4.6 ) ,   las soluciones siguientes :    S8 8 µ/ml    S4 4 µ/ml    S2 2 µ/ml    S1 1 µ/ml .    7 . PREPARACIÓN DEL EXTRACTO    7.1 . Extracción    7.1.1 . Premezclas    Pesar una cantidad de muestra de 2,0 g , añadir   100 ml de metanol al 90 % ( 4.5 ) , homogeneizar y a   continuación centrifugar durante algunos minutos .   Diluir la solución sobrenadante con metanol al   50 % ( 4.6 ) para obtener una concentración supuesta   en monensina sódica de 8 µ/ml ( = U8 ) .    7.1.2 . Alimentos cuyo contenido en monensina sódica   no sea inferior a 50 ppm    Pesar una cantidad de muestra de 10,0 a 20,0 g ,   añadir 100 ml de metanol al 90 % ( 4.5 ) , homogeneizar   durante 15 minutos y dejar reposar .    Introducir una torunda de algodón en la abertura   aguzada del tubo de vidrio ( 5.2 ) , añadir óxido   de aluminio ( 4.7 ) , sacudiendo ligeramente el tubo ,   hasta que la columna alcance 75 a 80 mm de altura .    Decantar el extracto de la columna de óxido de   aluminio y recoger el filtrado . Diluir 30 ml del   filtrado en 50 ml de agua . A continuación diluir   con metanol al 50 % ( 4.6 ) para obtener una   concentración supuesta en monensina sódica   de 8 µ/ml ( = U8 ) .    7.1.3 . Alimentos cuyo contenido en monensina   sódica sea inferior a 50 ppm ( hasta el límite   de 10 ppm )    Pesar una cantidad de muestra de 10,0 a 20,0 g ,   añadir 100 ml de metanol al 90 % ( 4.5 ) y   homogeneizar durante 15 minutos . Centrifugar para   obtener un extracto límpido .    Tomar 40 ml del líquido sobrenadante para una   muestra cuyo contenido en monensina sea de 20 ppm ;   80 ml para una muestra cuyo contenido sea de 10 ppm .   Evaporar en seco al vacío en un aparato rotatorio ( 5.1 )   a una temperatura que no exceda de 40 ° C . Disolver   el residuo en 10 ml de metanol al 90 % ( 4.5 ) .    Introducir una torunda de algodón en la abertura   aguzada de un tubo de vidrio ( 5.3 ) , añadir óxido   de aluminio ( 4.7 ) , sacudiendo ligeramente el tubo ,   hasta que la columna alcance 75 a 80 mm de altura .    Decantar la solución metanólica del residuo   de la columna de óxido de aluminio y recoger el   filtrado . Lavar la columna con 10 ml de metanol al   90 % ( 4.5 ) y añadir el agua del aclarado al filtrado .    Evaporar la solución en seco al vacío en el   aparato rotatorio ( 5.1 ) a una temperatura inferior a   40 ° C . Disolver el residuo en 10 ml de metanol   anhidro ( 4.4 ) y completar hasta 20 ml con agua .   Centrifugar a 4 000 rpm por lo menos durante 5 minutos .   A continuación diluir con metanol al 50 % ( 4.6 )   para obtener una concentración supuesta en monensina   sódica de 8 µ/ml ( = U8 ) .    7.2 . Soluciones del extracto    Preparar , a partir de la solución U8 y mediante   diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con metanol al 50 %   ( 4.6 ) , las soluciones U4 ( concentración supuesta :   4 µ/ml ) , U2 ( concentración supuesta : 2 µ/ml )   y U1 ( concentración supuesta : 1 µ/ml ) .    8 . MODALIDADES DE DETERMINACIÓN    8.1 . Inoculación del medio de cultivo    Sembrar a 50-60 ° C el medio de base de la   determinación ( 4.2 ) con la suspensión de   esporas ( 3.2 ) . Mediante ensayos preliminares en   placas con el medio ( 4.2 ) , determinar la cantidad   de inóculo que permita obtener , para las distintas   concentraciones en monensina sódica , zonas de   inhibición lo más extensas posible y que además   sean nítidas .    8.2 . Preparación de las cajas    La difusión se efectúa en cajas con las cuatro   concentraciones de la solución patrón ( S8 , S4 ,   S2 , S1 ) y las cuatro concentraciones del extracto   ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja debe recibir   necesariamente las cuatro concentraciones del patrón   y del extracto . A tal fin , elegir la dimensión de   las cajas de tal forma que se puedan practicar en   el medio gelosado por lo menos ocho cavidades de 10 a   13 mm de diámetro , cuyos centros no disten entre   sí menos de 30 mm . Se pueden utilizar como cajas   placas de vidrio planas , coronadas con un anillo de   aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro   y 20 mm de altura .    Introducir en las cajas una cantidad del medio ( 4.2 ) ,   sembrado como se indica en 8.1 , que permita obtener   una capa de 2 mm de grosor aproximadamente ( 60 ml   para una caja de 200 mm de diámetro ) . Dejar   solidificar , practicar las cavidades y depositar   en las mismas los volúmenes exactamente medidos   de la solución patrón y del extracto ( 0,10 a 0,15 ml   por cavidad , según el diámetro ) . Hacer por lo   menos cuatro repeticiones de cada concentración ,   de forma que cada determinación sea objeto de una   evaluación de 32 zonas de inhibición .    8.3 . Incubación    Incubar las cajas durante 18 horas aproximadamente   a 35-37 ° C .    9 . EVALUACIÓN    Medir el diámetro de las zonas de inhibición   con una precisión de 0,1 mm . Para cada concentración ,   registrar las medidas medias en papel semilogarítmico   trazando el logaritmo de las concentraciones frente   a los diámetros de las zonas de inhibición . Trazar   las rectas más ajustadas para la solución patrón   y para el extracto procedente de la misma , por   ejemplo , de la forma siguiente .    Determinar el punto más adecuado del nivel más   bajo de la solución patrón ( SL ) mediante la   fórmula :     ( a ) SL = ( 7 S1 + 4 S2 + S4 - 2 S8 ) /10    Determinar el punto más adecuado del nivel más   alto de la solución patrón ( SH ) mediante la   fórmula :     ( b ) SH = ( 7 S8 + 4 S4 + S2 - 2 S1 ) /10    Determinar de la misma forma los puntos más   adecuados del extracto para el nivel más bajo ( UL )   y el nivel más alto ( UH ) , sustituyendo S1 , S2 ,   S4 y S8 en las fórmulas anteriormente mencionadas   por U1 , U2 , U4 y U8 .    Inscribir los valores SL y SH en el mismo gráfico .   Uniendo los dos puntos se obtiene la recta más   ajustada para la solución patrón . Procediendo   de la misma forma para UL y UH se obtiene la recta   más ajustada para el extracto .    A falta de toda interferencia , las rectas deben   ser paralelas . En la práctica , se consideran   paralelas cuando ( SH - SL ) y ( UH - UL ) no difieren   en más del 10 % de su media .    Si las rectas no fueren paralelas , puede eliminarse   o bien U1 y S1 , o bien U8 y S8 . Los valores SL ,   SH , UL y UH que permitan obtener las rectas más   ajustadas se calculan entonces mediante las fórmulas   siguientes :     ( a ) SL = ( 5 S1 + 2 S2 - S4 ) /6 o   ( 5 S2 + 2 S4 - S8 ) /6     ( b ) SH = ( 5 S4 + 2 S2 - S1 ) /6 o   ( 5 S8 + 2 S4 - S2 ) /6    y fórmulas análogas para UL y UH . La utilización   de esta alternativa debe ser objeto asimismo de   una verificación en lo que se refiere al paralelismo   de las rectas , tal como se ha indicado . En el   boletín de análisis debe mencionarse la obtención   de un resultado procedente de tres niveles .    Cuando las rectas se consideren paralelas , calcular   el logaritmo de la actividad relativa ( log. A ) con   una de las fórmulas siguientes .    Para cuatro niveles     ( c ) log. A = ( ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2   - S4 - S8 ) × 0,602 ) / ( U4 + U8 + S4 + S8   - U1 - U2 - S1 - S2 )    Para tres niveles     ( d ) log. A = ( ( U1 + U2 + U4 - S1 - S2 - S4 )   × 0,401 ) / ( U4 + S4 - U1 - S1 ) , o     ( d ) log. A = ( ( U2 + U4 + U8 - S2 - S4 - S8 )   × 0,401 ) / ( U8 + S8 - U2 - S2 )    Actividad real = actividad supuesta × actividad   relativa .    Si la actividad relativa se encuentra fuera de   la gama de valores comprendidos entre 0,5 y 2,0 ,   repetir la determinación precediendo a los ajustes   adecuados de las concentraciones de extracto o ,   en su caso , de las soluciones patrón . Cuando   dicha actividad no pueda restablecerse en la gama de   valores requeridos , el resultado se considerará   aproximado y esta indicación deberá anotarse en   el boletín de análisis .    Cuando las rectas no se consideren paralelas , repetir   la determinación . Si no se lograse todavía el   paralelismo , la determinación deberá considerarse   no satisfactoria .    10 . REPETIBILIDAD    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   efectuadas en la misma muestra por el mismo analista   no deberá exceder de :     - un 20 % del resultado más alto para los contenidos   en monensina sódica de 10 a 25 mg/kg ,     - 5 mg/kg en valor absoluto , para los contenidos   de 25 a 50 mg/kg ,     - un 10 % del resultado más alto para los contenidos   superiores a 50 mg/kg .    (1) Pueden utilizarse otros métodos en la medida   en que esté probado que producen suspensiones de   esporas análogas .    (2) Puede utilizarse cualquier medio comercial de   composición análoga y que dé los mismos resultados .    (3) 1 mg de monensina sódica equivale a   1 000 unidades « UK » .    (4) Pueden utilizarse otros métodos en la medida   en que esté probado que producen suspensiones de   esporas análogas .    (5) Puede utilizarse cualquier medio comercial de   composición análoga y que dé los mismos resultados .