CELEX: 31984L0004
Language: bg
Date: 1983-12-20 00:00:00
Title: Директива на Комисията от 20 декември 1983 година за изменение на Директиви 71/393/ЕИО, 72/199/ЕИО и 78/633/ЕИО относно установяване на общностни методи за анализ за целите на официалния контрол на храните за животни

Важна правна забележка

|

31984L0004

Официален вестник n° L 015 , 18/01/1984 стр. 0028 - 0038 специално финландско издание: глава 3 том 17 стр. 0033  специално испанско издание: глава 03 том 29 стр. 0233  специално шведско издание: глава 3 том 17 стр. 0033  специално португалско издание глава 03 том 29 стр. 0233  специално чешко издание глава 03 том 06 стр. 26  - 36 специално испанско издание глава 03 том 06 стр. 26  - 36 специално унгарско издание глава 03 том 06 стр. 26  - 36 специално литвийско издание глава 03 том 06 стр. 26  - 36 LV.ES глава 03 том 06 стр. 26  - 36 MT.ES глава 03 том 06 стр. 26  - 36 PL.ES глава 03 том 06 стр. 26  - 36 SK.ES глава 03 том 06 стр. 26  - 36 специално словенско издание глава 03 том 06 стр. 26  - 36

		19831220Директива на Комисиятаот 20 декември 1983 годиназа изменение на Директиви 71/393/ЕИО, 72/199/ЕИО и 78/633/ЕИО относно установяване на общностни методи за анализ за целите на официалния контрол на храните за животни(84/4/ЕИО)КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ,като взе предвид Договора за създаване на Европейската икономическа общност,като взе предвид Директива 70/373/ЕИО на Съвета от 20 юли 1970 г. относно въвеждането на общностни методи за вземане на проби и анализ за целите на официалния контрол на храните за животни [1], последно изменена с Акта за присъединяване на Гърция, и по-специално член 2 от нея,като има предвид, че Директиви 71/393/ЕИО [2], 72/199/ЕИО [3] и 78/633/ЕИО [4] на Комисията определят методите на анализ на сурови масла и мазнини, вирджиниямицин и цинк бацитрацин; като има предвид, че е необходимо да се заменят тези методи с методи, които отразяват постиженията на научно-техническия прогрес;като има предвид, че мерките, предвидени в настоящата директива, са в съответствие със становището на Постоянния комитет по храните за животни,ПРИЕ НАСТОЯЩАТА ДИРЕКТИВА:Член 1В приложението към Директива 71/393/ЕИО част IV "Определяне на сурови масла и мазнини" се заменя с приложение I към настоящата директива.Член 2Приложение II към Директива 72/199/ЕИО, част 5 "Определяне на вирджиниямицин чрез дифузия в среда агар-агар" се заменя с приложение II към настоящата директива.Член 3В приложението към Директива 78/633/ЕИО част 1 "Определяне на цинк бацитрацин чрез дифузия в среда агар-агар" се заменя с приложение III към настоящата директива.Член 4Държавите-членки въвеждат в сила законовите, подзаконовите и административните разпоредби, необходими за да се съобразят с настоящата директива, не по-късно от 1 юни 1984 г. Те незабавно информират Комисията за това.Член 5Адресати на настоящата директива са държавите-членки.Съставено в Брюксел на 20 декември 1983 година.За КомисиятаPoul DalsagerЧлен на Комисията[1] ОВ L 170, 3.8.1970 г., стр. 2.[2] ОВ L 279, 20.12.1971 г., стр. 7.[3] ОВ L 123, 29.5.1972 г., стр. 6.[4] ОВ L 206, 29.7 1978 г., стр. 43.--------------------------------------------------19831220ПРИЛОЖЕНИЕ I"4. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СУРОВИ МАСЛА И МАЗНИНИ1. Задача и обхватНастоящият метод дава възможност за определяне на съдържанието на сурови масла и мазнини в храни за животни. Той не обхваща анализа на семена и плодове за добиване на масла, определени с Регламент 136/66/ЕИО на Съвета от 22 септември 1966 г.В зависимост от характера на животинските храни трябва да се използва един от двата описани метода.1.1. Метод АПриложим при храни за животни без примеси от растителен произход, с изключение на тези, за които е известно, че съдържат масла и мазнини, които не могат напълно да бъдат извлечени с петролен етер без предварителна хидролиза. Между тях са глутените, дрождите, соевите и картофените белтъчини. Настоящият метод е също така приложим за комбинирани храни за животни, с изключение на тези, които съдържат мляко на прах или от които не могат напълно да бъдат извлечени масла и мазнини с петролен етер без предварителна хидролиза.1.2. Метод БПриложим при директни храни за животни от животински произход, както и при храните за животни, посочени в точка 1.1, като изключение за метод А.2. Принцип2.1. Метод АПробата се извлича с петролен етер. Разтворителят се дестилира и утайката се изсушава и измерва.2.2. Метод БПробата се обработва термично със солна киселина Сместа се охлажда и се филтрира. След като бъде промит и изсушен, остатъкът се подлага на определяне съгласно метод А.3. Реактиви3.1. Петролен етер, диапазон на кипене: от 40 до 60 °С. Индексът на брома трябва да бъде по-малък от 1, а остатъкът след изпарението — по-малък от 2 mg/100 ml.3.2. Натриев сулфат, безводен.3.3. Солна киселина 3N.3.4. Филтрираща добавка например инфузорна пръст Hyflo-supercel.4. Апаратура4.1. Екстрактор. Ако апаратът е със сифон (Сокслетов апарат), дебитът на нагряването с обратен хладник трябва да бъде такъв, че да се получават около 10 цикъла на час; ако апаратът е без сифон, дебитът на нагряването на обратния хладник трябва да бъде около 10 ml в минута.4.2. Екстракционни патрони, свободни от разтворими вещества в петролен етер и чиято порьозност съответства на изискванията на точка 4.1.4.3. Сушилня или вакуумсушилня, настроена на 75 ± 3 °С или въздушна пещ, настроена на 100 ± 3 °С.5. Процедура5.1. Метод А (виж точка 8.1)Претеглят се 5 g от пробата с точност 1 mg, прехвърлят се в екстракционнен патрон (4.2) и се покриват с памучен обезмаслен тампон.Патронът се поставя в екстрактор (4.1) и се извлича в продължение на шест часа с петролен етер (3.1). Екстрактът се събира в суха претеглена колба, която съдържа късчета пемза [1].Чрез дестилация се отстранява разтворителят. Остатъкът се изсушава, като колбата се държи в продължение на един час и половина в сушилня (4.3). Оставя се да се охлади в сушилен шкаф и се претегля. Изсушава се отново в продължение на 30 минути, за да се гарантира, че теглото на маслата и мазнините ще остане постоянно (загубата на тегло между две последователни претегляния трябва да бъде по-малка от 1 mg).5.2. Метод БПретеглят се 2,5 г от пробата с точност 1 mg (виж точка 8.2), поставят се в бехерова чаша 400 ml или в ерленмайерова колба 300 ml и се добавят 100 мл солна киселина 3N (3.3) и късчета пемза. Бехеровата чаша се покрива с наблюдателно стъкло или се слага към коничната колба с обратен хладник. Сместа се нагрява до слабо кипене на слаб пламък или на котлон и така се държи в продължение на един час. Следи се продуктът да не залепне по стените на контейнера.Охлажда се и се добавя достатъчно количество от филтрационната добавка (3.4), за да се предотврати всякаква загуба на масла и мазнина при филтрирането. Филтрира се през навлажнена обезмаслена двойно филтрираща хартия. Остатъкът се промива в студена вода до получаване на неутрален филтрат. Филтратът се проверява за съдържание на масла или мазнини. Тяхното наличие показва, че пробата трябва да бъде извлечена с петролен етер, като се използва метод А преди хидролизата.Двойната филтрираща хартия, съдържаща сухия остатък, се поставя върху наблюдателно стъкло и се суши в продължение на час и половина в пещта при 100 ± 3 °С.Двойната филтрираща хартия се поставя в екстракционен патрон (4.2), който се покрива с памучен обезмаслен тампон. Патронът се поставя в екстрактора (4.1) и се продължава, както е посочено в точка 5.1, втори и трети параграф.6. Изразяване на резултатитеТеглото на остатъка се изразява като процент от пробата.7. ПовторяемостРазликата между резултатите на две паралелни определяния, извършени на същата проба от един и същ лаборант, не трябва да превишава:- 0,2 % в абсолютна стойност за съдържание на сурови масла и мазнини, по-ниски от 5 %,- 4,0 % по отношение на най-високия резултат за съдържание от 5 до 10 %,- 0,4 % в абсолютна стойност за съдържание над 10 %.8. Наблюдения8.1. При продукти с високо съдържание на масла и мазнини, които е трудно да се строшат или са неподходящи за изтегляне на хомогенна редуцирана проба за изпитване, се процедира, както следва.Претеглят се 20 g от пробата с точност 1 mg и се смесват с 10 g или повече безводен натриев сулфат (3.2). С петролен етер (3.1) се извлича, както е посочено в точка 5.1. Полученият екстракт се долива до 500 ml с петролен етер (3.1) и се хомогенизира. Вземат се 50 мл от разтвора и се поставят в малка суха претеглена колба, която съдържа късчета пемза [1]. Разтворителят се отстранява чрез дестилиране, изсушава се и се продължава, както е посочено в точка 5.1, последен параграф.Разтворителят се отстранява от остатъка от екстракцията, останал в патрона, остатъкът се строшава до едрина на частиците 1 mm, връща се в екстракционния патрон (без да се добавя натриев сулфат) и се продължава, както е посочено в точка 5.1, втори и трети параграф.Съдържанието на масла и мазнини се изчислява като процент от пробата, като се използва следната формула:(10 a + b) × 5където:а = масата в грамове на остатъка след първата екстракция (аликватна част на екстракта),b = масата в грамове на остатъка след втората екстракция.8.2. При продукти, които имат ниско съдържание на масла и мазнини, пробата за изпитване може да се увеличи до 5 g.[1] Късчетата пемза се заменят със стъклени перли, когато маслата или мазнините подлежат на по-нататъшни качествени изследвания.--------------------------------------------------19831220ПРИЛОЖЕНИЕ II"5. Определяне на вирджиниямицин— чрез дифузия в среда агар-агар —1. Задача и обхватМетодът е за определяне на вирджиниямицин в храни за животни и премикси. Долната граница на определяне е 2 mg/kg (2 ppm) [1].2. ПринципПробата се екстрахира с метанолов разтвор Tween 80. Екстрактът се декантира или центрофугира и се разрежда. Неговата антибиотична активност се определя чрез измерване дифузията на вирджиниямицина в агарова среда, засята с Micrococcus luteus. Дифузията става видима по образуването на зони на инхибиране в присъствието на микроорганизма. Диаметърът на тези зони се счита за правопропорционален на логаритъма на концентрацията на антибиотика в обхвата на изследваните антибиотични концентрации.3. Микроорганизъм: Micrococcus luteus АТСС 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)3.1. Поддържане на щамаИнокулира се епруветка скосен агар с хранителна среда (4.1) с Micrococcus luteus и се инкубира в течение на 24 часа при 30 °С. Културата се съхранява в хладилник при 4 °С. Реинокулира се на всеки две седмици.3.2. Приготвяне на бактериалната суспензия [2]Бактериите се събират от наскоро приготвена епруветка скосен агар (3.1) с 2 до 3 ml разтвор на натриев хлорид (4.3). С тази суспензия се инокулира колба на Roux, съдържаща 250 ml хранителна среда (4.1), и се култивира в продължение на 18 до 20 часа при 30 °С. Бактериите се събират в 25 ml разтвор на натриев хлорид (4.3) и се хомогенизира. Суспенсията се разрежда до 1/10 с разтвор на натриев хлорид (4.3). Пропускливостта на светлината на суспенсията трябва да бъде около 75 %, измерена при 650 mm в клетка 1 cm, спрямо разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия може да се съхранява една седмица при около 4 °С.4. Хранителна среда и реактиви4.1. Хранителна и изпитателна среда [3]Месен пептон | 6,0 g |Триптон | 4,0 g |Дрождиев екстракт | 3,0 g |Месен екстракт | 1,5 g |Глюкоза | 1,0 г |Агар-агар | 10,0 до 20,0 g |Вода | 1000 ml |рH 6,5 (след стерилизация). | |4.2. Фосфатен буфер рН 6Монокалиев фосфат K2HPO4 | 2,0 g |Дикалиев фосфат KH2PO4 | 8 g |Вода до | 1000 ml |4.3. Разтвор на натриев хлорид 0,8 % (w/v): разтваря се 8 g натриев хлорид във вода и се разрежда до 1000 ml; стерилизира се.4.4. Метанол.4.5. Смес от разтвор на фосфатен буфер (4.2)/метанол (4.4): 80/20 по обем.4.6. Метанолов разтвор на Tween 80 05 % (w/v): разтваря се 5 g Tween 80 в метанол (4.4) и се разрежда с метанол до 1000 ml.4.7. Стандартна субстанция: вирджиниямицин с известна активност.5. Стандартни разтвориРазтваря се точно претеглено количество стандартна субстанция (4.7) в метанол (4.4) и се разрежда с метанол (4.4), за да се получи изходен разтвор, съдържащ 1000 mg вирджиниямицин на 1 ml.Когато се съхранява в запушена колба при 4 °С, този разтвор е стабилен до пет дни.От този изходен разтвор се приготвят чрез последващо разреждане със сместа (4.5) следните разтвори:s8 | 1 | mg/ml |s4 | 0,5 | mg/ml |s2 | 0,25 | mg/ml |s1 | 0,125 | mg/ml |6. Приготвяне на екстракта и разтворите за изпитване6.1. Екстракция6.1.1. Продукти със съдържание на вирджиниямицин до 100 mg/kgВзема се 50 g от пробата, добавя се 200 ml разтвор (4.6) и се разтръсква в продължение на 30 минути. Оставя се да се утаи или се центрофугира, вземат се 20 ml от плаващия отгоре разтвор и се изпарява до около 5 ml в ротационен изпарител при температура, която не превишава 40 °С. Утайката се разрежда със сместа (4.5), за да се получи очакваното съдържание на вирджиниямицин от 1 mg/ml (= u8).6.1.2. Продукти със съдържание на вирджиниямицин, по-голямо от 100 mg/kgВзема се проба количество, което не превишава 10,0 g и съдържа между 1 и 50 mg вирджиниямицин, добавя се 100 мл разтвор (4.6) и се разтръсква в продължение на 30 минути. Оставя се да се утаи или се центрофугира, след което се разрежда плаващият отгоре разтвор със сместа (4.5), за да се получи очакваното съдържание на вирджиниямицин от 1 mg/ml (= u8).6.2. Разтвори за изпитванеОт разтвор u8 се приготвя разтвор u4 (очаквано съдържание: 0,5 mg), u2 (очаквано съдържание: 0,25 mg) и u1 (очаквано съдържание: 0,125 mg) чрез последователно разреждане (1 + 1) със сместа (4.5).7. Процедура на определяне7.1. Инокулиране на хранителната средаХранителната среда (4.1) се инокулира с бактериалната суспензия (3.2) при около 50 °С. Чрез предварителни опити в петри със среда (4.1) се определя количеството на бактериалната суспензия, което се изисква, за да се получат най-големи и ясни зони на инхибиране с различните концентрации на вирджиниямицин.7.2. Подготовка на паничкитеДифузията в агар се провежда в панички, като се използват четири концентрации на стандартния разтвор (s8, s4, s2, и s1) и четири концентрации на екстракта (u8, u4, u2, и u1). Тези четири концентрации на екстракта и стандартът е необходимо да се поставят във всяка паничка. За тази цел се изберат панички, достатъчно големи, за да позволят да се направят в агарова среда най-малко осем дупки с диаметър от 10 до 13 mm и не по-малко от 30 mm между центровете. Тестът може да се извърши на паничките, които се състоят от стъклен лист с поставени върху него алуминиеви или пластмасови пръстени с диаметър 200 mm и височина 20 mm.Излива се в паничката част от средата (4.1), инокулирана, както е указано в точка 7.1, за да се получи пласт дебел около 2 mm (60 ml за панички с диаметър 200 mm). Оставя се да се разстеле равномерно, пробиват се дупки и в тях се поставят точно премерени обеми от изпитваните и стандартните разтвори (между 0,10 и 0,15 ml на дупка в зависимост от диаметъра). За всяка проба разрежданията се повтарят най-малко четири пъти с всяка концентрация, така че всяко определяне да включва оценяването на 32 зони на инхибиране.7.3. ИнкубиранеПаничките се инкубират от 16 до 18 часа при 30 ± 2 °С.8. ОценяванеЗа предпочитане е диаметърът на зоните на инхибиране да се измери с точност до 0,1 mm. Записват се средните аритметични стойности на измерванията за всяка концентрация милиметрова хартия, която показва логаритъма на концентрациите спрямо диаметрите на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на най-добро съвпадане на стандартния разтвор и екстракта, например както по-долу:Определя се точката на "най-добро съвпадане" за най-ниското ниво на стандарта (SL), като се използва формулата:а) SL =7s+ 4s+ s- 2s810Определя се точката на "най-добро съвпадане" за най-високото ниво на стандарта (SН), като се използва формулата:б) SH =7s+ 4s+ s- 2s110По същия начин се изчисляват точките на "най-добро съвпадане" за най-ниското ниво на екстракта (UL) и най-високото ниво на екстракта (UH), като се заместят u8, u4, u2, и u1 и s8, s4, s2, и s1 в горните формули.Отбелязват се изчислените стойности на SL и SH на същата милиметрова хартия и се съединяват, за да се получи линията на "най-добро съвпадане" за стандартния разтвор. По същия начин се отбелязват UL и UH и се съединяват, за да се получи линията на "най-добро съвпадане" за екстракта.При отсъствие на външни влияния линиите трябва да бъдат успоредни. За практични цели линиите могат да се считат успоредни, ако стойностите (SH – SL) и (UH – UL) не се различават с повече от 10 % от тяхната средна аритметична стойност.Ако линиите не са успоредни, могат да се изключат или u1 и s1, или u8 и s8 и да изчислят SL, SH, UL и UH, като се използват алтернативните формули, за да се получат линиите на "най-добро съвпадане":(a′) SL = | 5s1 + 2s2 - s46 | или | 5s2 + 2s4 - s86 |(b′) SH = | 5s4 + 2s2 - s16 | или | 5s8 + 2s4 - s26 |и по-същия начин за UL и UH. Трябва да бъде удовлетворен същият критерий за успоредност. Фактът, че резултатът е бил изчислен от три нива, трябва да бъде отбелязан в крайния отчет.Когато линиите се считат за успоредни, се изчислява логаритъмът на относителната активност (log A) чрез една от следните формули, в зависимост от това дали за оценка на успоредността са били използвани четири или три нива.За четири нивав) Log A =× 0,602u+ u+ s+ s- u- u- s- s2За три ниваг′) Log A =× 0,401u+ s- u- s1илиг') Log A =× 0,401u+ s- u- s2Активността на екстракта от пробата = активността на съответния стандарт × А(u8 = s8 × А)Ако се установи, че относителната активност е извън обхвата от 0,5 до 2,0, изпитването се повторя, като се правят подходящи корекции на концентрациите на екстракта или ако това не е възможно — на стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да бъде вкарана в изисквания обхват, всеки получен резултат трябва да се счита за приблизителен и това трябва да бъде отбелязано в крайния отчет.Когато се счита, че линиите не са успоредни, определянето се повтаря. Ако и тогава не се постига успоредност, определянето трябва да счита за незадоволително.Резултатът се изразява в милиграми вирджиниямицин на килограм храни за животни.9. ПовторяемостРазликата между резултатите на две паралелни определяния, проведени с една и съща проба от същия лаборант, не трябва да превишават:- 2 mg/kg в абсолютна стойност за съдържание на вирджиниямицин до 10 mg/kg,- 20 % спрямо най-високата стойност за съдържание от 10 до 25 mg/kg,- 5 mg/kg в абсолютна стойност за съдържание от 25 до 50 mg/kg,- 10 % спрямо най-високата стойност за съдържание над 50 mg/kg.[1] 1 мг вирджиниямицин е еквивалентен на 1000 UK единици.[2] Могат да се използват други методи, при условие че е установено, че те дават подобни бактериални суспензии.[3] Може да се използва всяка комерсиална хранителна среда с подобен състав и даващи същите резултати."--------------------------------------------------19831220ПРИЛОЖЕНИЕ III"1. ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЦИНК БАЦИТРАЦИН— чрез дифузия в среда агар-агар —1. Задачи и обхватМетодът служи за определяне на цинк бацитрацин във храни за животни и премикси. Долната граница на определяне е 5 mg/kg (5ppm) [1].2. ПринципПробата се екстрахира при рН 2 със смес на метанол/вода/солна киселина и разтвор на натриев сулфат. Натриевият сулфат се добавя, за да се утаят всички разтворими медни соли, които могат да повлияят на изпитването. Екстрактът се довежда до рН 6,5, концентриран (когато е необходимо) и разреден. Неговата антибиотична активност се определя чрез измерване дифузията на вирджиниямицин в среда агар-агар, инокулирана с Micrococcus luteus (flavus). Дифузията става видима от образуването на зони на инхибиране в присъствието на микроорганизма. Диаметърът на тези зони се счита за правопропорционален на логаритъма на концентрацията на антибиотика в обхвата на изследваните антибиотични концентрации.3. Микроорганизъм: Micrococcus luteus АТСС 102403.1. Поддържане на щамаИнокулира се епруветка скосен агар с хранителна среда (4.1) с Micrococcus luteus (flavus) и се инкубира в продължение на 24 часа при 30 °С. Културата се съхранява в хладилник при 4 °С. Реинокулира се на всеки две седмици.3.2. Приготвяне на бактериалната суспензия [2]Бактериите се събират от наскоро приготвена епруветка скосен агар (3.1) с 2 до 3 ml разтвор на натриев хлорид (4.3). С тази суспензия се инокулира колба на Roux, съдържаща 250 ml хранителна среда (4.1) и се култивира в продължение на 18 до 20 часа при 30 °С. Бактериите се събират в 25 ml разтвор на натриев хлорид (4.3) и се хомогенизира. Суспенсията се разрежда до 1/10 с разтвор на натриев хлорид (4.3). Пропускливостта на светлината на суспенсията трябва да бъде около 75 %, измерена при 650 mm в клетка 1 cm, спрямо разтвор на натриев хлорид (4.3). Тази суспензия трябва да се съхранява една седмица при около 4 °С.4. Хранителна среда и реактиви4.1. Хранителна [3]Месен пептон | 6,0 g |Триптон | 4,0 g |Дрождиев екстракт | 3,0 g |Месен екстракт | 1,5 g |Глюкоза | 1,0 g |Агар-агар | 10,0 до 20,0 g |Вода | 1000 ml |рH 6,5 (след стерилизация). | |4.2. Изпитателна среда [4]Триптон | 10,0 g |Дрождиев екстракт | 3,0 g |Месен екстракт | 1,5 g |Глюкоза | 1,0 g |Агар-агар | 10,0 до 20,0 g |Tween 80 | 1 ml |Вода | 1000 ml |рH 6,5 (след стерилизация). | |4.3. Разтвор на натриев хлорид 0,8 % (w/v): разтварят се 8 g натриев хлорид във вода и се разрежда до 1000 ml; стерилизира се.4.4. Смес на метанол/вода/солна киселина (4.6):80/17,5/2,5 (v/v/v)4.5. Фосфатен буфер рН 6,5:Монокалиев фосфат K2HPO4 | 22,15 g |Дикалиев фосфат KH2PO4 | 27,85 g |Вода до | 1000 ml |4.6. Солна киселина (d: 1,18 до 1,19).4.7. Солна киселина (0,1 М).4.8. Натриев хидроксид разтвор 1 М.4.9. Натриев сулфид разтвор около 0,5 М.4.10. Разтвор на бромокрезол, пурпурен разтвор 0,04 % (w/v): разтваря се 0,1 g пурпурен бромокрезол в 18,5 ml разтвор на натриев хидроксид 0,01 М. Добавя се до 250 ml с вода и се смесва.4.11. Стандартна субстанция: цинк бацитрацин с известна активност (в i.u.).5. Стандартни разтвориРазтваря се количество от стандартна субстанция (4.11), което съответства на 1050 м.е. (съгласно посочената активност). Добавя се 5 ml солна киселина 0,1 М (4.7) и се оставят спокойно в продължение на 15 минути. Добавя се 30 ml вода, коригира се рН до 4,5 с фосфатен буфер (4.5) (около 4 ml), долива се до 50 ml с вода и се смесва добре (1 ml = 21 i.u.).От този разтвор се приготвят чрез последователно разреждане с фосфатен буфер (4.5) следните разтвори:s8 | 0,42 | i.u./ml |s4 | 0,21 | i.u./ml |s2 | 0,105 | i.u./ml |s1 | 0,0525 | i.u./ml |6. Приготвяне на екстракта и разтворите за изпитване6.1. Екстракция6.1.1. Премикси и минерални храниПретегля се от 2,0 до 5,0 g от пробата, добавя се 29,0 ml от сместа (4.4) и 1,0 ml разтвор на натриев сулфид (4.9) и се разтръсква за кратко. Проверява се дали рН е около 2. Разтръсква се в продължение на 10 минути, добавя се 30 ml фосфатен буфер (4.5), разтръсква се в продължение на 15 минути и се центрофугира. Взема се подходящ аликват от разтвора, който плава отгоре, и рН се довежда до 6,5 с помощта на хидроксиден разтвор 1 М (4.8) с рН метър или с разтвор на бромкрезол пурпур (4.10) като индикатор. Разрежда се с фосфатен буфер (4.5), за да се получи очакваното съдържание на цинк бацитрацин 0,42 i.u./ml (= u8).6.1.2. Протеинови концентратиПретегля се 10,0 от пробата, добавя се 49,0 ml от сместа (4.4) и 1,0 ml разтвор на натриев сулфид (4.9) и се разтръсква за кратко. Проверява се дали рН е около 2. Разтръсква се в продължение на 10 минути. Добавя се 50 ml фосфатен буфер (4.5), разтръсква се в продължение на 15 минути и се центрофугира. Взема се подходящ аликват от разтвора, който плава отгоре, и рН се довежда до 6,5 с помощта на хидроксиден разтвор 1 М (4.8) с рН метър или с разтвор на бромкрезол пурпур (4.10) като индикатор. Изпарява се до приблизително половината обем в ротационен изпарител при температура, която не превишава 35 °С.Разрежда се с фосфатен буфер (4.5), за да се получи очакваното съдържание на цинк бацитрацин 0,42 i.u./ml (= u8).6.1.3. Други храниПретегля се 10,0 g от пробата (20,0 g за очаквано съдържание на цинк бацитрацин 5 mg/kg). Добавя се 24,0 ml от сместа (4.4) и 1,0 ml разтвор на натриев сулфид (4.9) и се хомогенизира в продължение на 10 минути. Добавя се 25 ml фосфатен буфер (4.5), разтръсква се в продължение на 15 минути и се центрофугира. Взема се 20 ml от разтвора, който плава отгоре, и рН се довежда до 6,5 с помощта на хидроксиден разтвор 1 М (4.8) с рН метър или с разтвор на бромкрезол пурпур (4.10) като индикатор. Изпарява се около 4 ml в ротационен изпарител при температура, която не превишава 35 °С. Разрежда се с фосфатен буфер (4.5), за да се получи очакваното съдържание на цинк бацитрацин 0,42 i.u./мл (= u8).6.2. Разтвори за изпитванеОт разтвор u8 се приготвят разтвори u4 /очаквано съдържание: 0,21 i.u./ml), u2 (очаквано съдържание: 0,105 i.u./ml) и u1 (очаквано съдържание: 0,0525 i.u./ml) чрез последователно разреждане (1 + 1) със сместа (4.5).7. Процедура на изпитване7.1 Инокулиране на хранителната средаХранителната среда (4.2) се инокулира с бактериалната суспензия (3.2) при около 50 °С. Чрез предварителни опити в петри със среда (4.2) се определя количеството на бактериалната суспензия, което се изисква, за да се получат най-големи и ясни зони на инхибиране с различните концентрации на цинк бацитрацин.7.2. Подготовка на паничкитеДифузията в агар се осъществява в панички, като се използват четири концентрации на стандартния разтвор (s8, s4, s2, и s1) и четири концентрации на екстракта (u8, u4, u2, и u1). Тези четири концентрации на екстракта и стандарта е необходимо да се поставят във всяка паничка. За тази цел се избират панички, достатъчно големи да позволят да се направят в агарова среда най-малко осем дупки с диаметър от 10 до 13 mm и не по-малко от 30 mm между центровете. Тестът може да се извърши на панички, които се състоят от стъклен лист с поставени върху него алуминиеви или пластмасови пръстени с диаметър 200 mm и височина 20 mm.Излива се в паничката част от средата (4.2), инокулирана, както е указано в точка 7.1, за да се получи пласт, дебел около 2 mm (60 ml за панички с диаметър 200 mm). Оставя се да се разстеле равномерно, пробиват се дупки и в тях се поставят точно премерени обеми от изпитваните и стандартните разтвори (между 0,10 и 0,15 ml на дупка в зависимост от диаметъра). За всяка проба разрежданията се повтарят най-малко четири пъти с всяка концентрация, така че всяко определяне да включва оценяването на 32 зони на инхибиране.7.3. ИнкубиранеПаничките се инкубират от 16 до 18 часа при 30 ± 2 °С.8. ОценяванеЗа предпочитане е диаметърът на зоните на инхибиране да се измери с точност до 0,1 mm. Записват се средните аритметични стойности на измерванията за всяка концентрация на милиметрова хартия, която показва логаритъма на концентрациите спрямо диаметрите на зоните на инхибиране. Начертават се линиите на най-добро съвпадане на стандартния разтвор и екстракта, например както по-долу:Определя се точката на "най-добро съвпадане" за най-ниското ниво на стандарта (SL), като се използва формулата:а) SL =7s+ 4s+ s– 2s810Определя се точката на "най-добро съвпадане" за най-високото ниво на стандарта (SН), като се използва формулата:б) SH =7s+ 4s+ s– 2s110По същия начин се изчисляват точките на "най-добро съвпадане" за най-ниското ниво на екстракта (UL) и най-високото ниво на екстракта (UH), като се заместят u8, u4, u2, и u1 и s8, s4, s2, и s1 в горните формули.Отбелязват се изчислените стойности на SL и SH на същата милиметрова хартия и се съединяват, за да се получи линията на "най-добро съвпадане" за стандартния разтвор. По същия начин се отбелязват UL и UH и се съединяват, за да се получи линията на "най-добро съвпадане" за екстракта.При отсъствие на външни влияния линиите трябва да бъдат успоредни. За практични цели линиите могат да се считат успоредни, ако стойностите (SH – SL) и (UH – UL) не се различават с повече от 10 % от тяхната средна аритметична стойност.Ако линиите не са успоредни, могат да се изключат или u1 и s1, или u8 и s8 и да изчислят SL, SH, UL и UH, като се използват алтернативните формули, за да се получат линиите на "най-добро съвпадане":a′) SL = | 5s1 + 2s2 – s46 | или | 5s2 + 2s4 – s86 |б′) SH = | 5s4 + 2s2 -– s16 | или | 5s8 + 2s4 – s26 |и по-същия начин за UL и UH. Трябва да бъде удовлетворен същият критерий за успоредност. Фактът, че резултатът е бил изчислен от три нива, трябва да бъде отбелязан в крайния отчет.Когато линиите се считат за успоредни, се изчислява логаритъмът на относителната активност (log A) чрез една от следните формули, в зависимост от това дали четири или три нива са били използвани за оценка на успоредността.За четири нивав) log A =× 0,602u+ u+ s+ s– u– u– s– s2За три ниваг) log A =× 0,401u+ s– u– s1илигг′) log A =× 0,401u+ s– u– s2Активността на екстракта от пробата = активността на съответния стандарт × А(u8 = s8 × А)Ако се установи, че относителната активност е извън обхвата 0,5 до 2,0, изпитването се повтаря, като се направят подходящи корекции на концентрациите на екстракта или ако това не е възможно, на стандартните разтвори. Когато относителната активност не може да бъде вкарана в изисквания обхват, всеки получен резултат трябва да се счита за приблизителен и това трябва да бъде отбелязано в крайния отчет.Когато се счита, че линиите не са успоредни, определянето се повтаря. Ако и тогава не се постига успоредност, определянето трябва да счита за незадоволително.Резултатът се изразява в милиграми бацитрацин на килограм храни за животни.9. ПовторяемостРазликата между резултатите на две паралелни определяния, проведени върху същата проба от същия лаборант, не трябва да превишават:- 2 mg/kg в абсолютна стойност за съдържание на бацитрацин до 10 mg/kg,- 20 % спрямо най-високата стойност за съдържание от 10 до 25 mg/kg,- 5 mg/kg в абсолютна стойност за съдържание от 25 до 50 mg/kg,- 10 % спрямо най-високата стойност за съдържание над 50 mg/kg.[1] 1 мг фуражен клас цинк бацитрацин е еквивалентен на 42 международни единици (м.е.).[2] Могат да се използват други методи, при условие че е установено, че те дават подобни бактериални суспензии.[3] Може да се използва всяка комерсиална хранителна среда с подобен състав и даващи същите резултати.[4] Може да се използва всяка хранителна културална среда с подобен състав и даващи същите резултати."--------------------------------------------------