CELEX: 32008R0440
Language: lt
Date: 2008-05-30 00:00:00
Title: 2008 m. gegužės 30 d. Komisijos reglamentas (EB) NR. 440/2008 nustatantis bandymų metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH) (Tekstas svarbus EEE)

31.5.2008   
            
            
               LT
            
            
               Europos Sąjungos oficialusis leidinys
            
            
               L 142/1
            
         
      KOMISIJOS REGLAMENTAS (EB) NR. 440/2008
   2008 m. gegužės 30 d.
   nustatantis bandymų metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH)
   (Tekstas svarbus EEE)
   EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA,
   atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį,
   atsižvelgdama į 2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH), įsteigiantį Europos cheminių medžiagų agentūrą, iš dalies keičiantį Direktyvą 1999/45/EB bei panaikinantį Tarybos reglamentą (EEB) Nr. 793/93, Komisijos reglamentą (EB) Nr. 1488/94, Tarybos direktyvą 76/769/EEB ir Komisijos direktyvas 91/155/EEB, 93/67/EEB, 93/105/EB bei 2000/21/EB (1), ypač į jo 13 straipsnio 3 dalį,
   kadangi:
   
               (1)
            
            
               Remiantis Reglamentu (EB) Nr. 1907/2006, Bendrijos lygmeniu reikia nustatyti bandymų metodus, kurie būtų taikomi tais atvejais, kai norint surinkti informaciją apie cheminių medžiagų savybes būtina atlikti cheminių medžiagų bandymus.
            
         
               (2)
            
            
               1967 m. birželio 27 d. Tarybos direktyvos 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo (2) V priede nustatyti cheminių medžiagų bei preparatų fizinių ir cheminių savybių, toksiškumo ir ekotoksiškumo nustatymo metodai. Direktyvos 67/548/EEB V priedas išbrauktas Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2006/121/EB, kuri bus taikoma nuo 2008 m. birželio 1 d.
            
         
               (3)
            
            
               Direktyvos 67/548/EEB V priede nurodytus bandymų metodus reikėtų įtraukti į šį reglamentą.
            
         
               (4)
            
            
               Šiuo Reglamentu neuždraudžiama taikyti ir kitus bandymų metodus su sąlyga, kad jie būtų taikomi atsižvelgiant į Reglamento 1907/2006 13 straipsnio 3 dalį.
            
         
               (5)
            
            
               Kuriant bandymų metodus reikėtų labai gerai atsižvelgti į bandymų su gyvūnais pakeitimo, patobulinimo ir jų skaičiaus sumažinimo principus, visų pirma tais atvejais, kai tinkamais patvirtintais metodais galima pakeisti, patobulinti bandymus su gyvūnais arba sumažinti jų skaičių.
            
         
               (6)
            
            
               Šio reglamento nuostatos atitinka pagal Reglamento (EB) Nr. 1907/2006 133 straipsnį įsteigto komiteto nuomonę,
            
         PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENTĄ:
   1 straipsnis
   Įgyvendinant Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 taikomi bandymų metodai nustatyti šio reglamento priede.
   2 straipsnis
   Siekdama pakeisti, patobulinti bandymus su stuburiniais gyvūnais arba sumažinti jų skaičių, Komisija prireikus persvarsto šiame reglamente nurodytus bandymų metodus.
   3 straipsnis
   Nuorodos į Direktyvos 67/548/EEB V priedą laikomos nuorodomis į šį reglamentą.
   4 straipsnis
   Šis reglamentas įsigalioja kitą dieną po jo paskelbimo Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje.
   
      Jis taikomas nuo 2008 m. birželio 1 d.
      Priimta Briuselyje 2008 m. gegužės 30 d.
      
         
            Komisijos vardu
         
         Stavros DIMAS
         
         
            Komisijos narys
         
      
   
   
      (1)  OL L 396, 2006 12 30, p. 1, pataisyta OL L 136, 2007 5 29, p. 3.
   
      (2)  OL L 196, 1967 8 16, p. 1. Direktyva su paskutiniais pakeitimais, padarytais Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2006/121/EB (OL L 396, 2006 12 30, p. 850, pataisyta OL L 136, 2007 5 29, p. 281) – įrašyti atitinkamas nuorodas, kai bus paskelbtas 30-asis derinimas su technine pažanga.
   
      PRIEDAS
      A DALIS. FIZINIŲ IR CHEMINIŲ SAVYBIŲ NUSTATYMO
      METODAI TURINYS
      
                  A.1.
               
               LYDYMOSI/UŽŠALIMO TEMPERATŪRA
            
                  A.2.
               
               VIRIMO TEMPERATŪRA
            
                  A.3.
               
               SANTYKINIS TANKIS
            
                  A.4.
               
               GARŲ SLĖGIS
            
                  A.5.
               
               PAVIRŠIAUS ĮTEMPTIS
            
                  A.6.
               
               TIRPUMAS VANDENYJE
            
                  A.7.
               
               PASISKIRSTYMO KOEFICIENTAS
            
                  A.8.
               
               PLIŪPSNIO TEMPERATŪRA
            
                  A.9.
               
               DEGUMAS (KIETOSIOS MEDŽIAGOS)
            
                  A.10.
               
               DEGUMAS (DUJOS)
            
                  A.11.
               
               DEGUMAS (SĄLYTIS SU VANDENIU)
            
                  A.12.
               
               PIROFORINĖS KIETŲJŲ MEDŽIAGŲ IR SKYSČIŲ SAVYBĖS
            
                  A.13.
               
               SPROGSTAMOSIOS SAVYBĖS
            
                  A.14.
               
               UŽSIDEGIMO TEMPERATŪRA (SKYSČIAI IR DUJOS)
            
                  A.15.
               
               KIETŲJŲ MEDŽIAGŲ SANTYKINĖ UŽSIDEGIMO TEMPERATŪRA
            
                  A.16.
               
               OKSIDACINĖS SAVYBĖS (KIETOSIOS MEDŽIAGOS)
            
                  A.17.
               
               POLIMERŲ SKAITINĖS VIDUTINĖS MOLEKULINĖS MASĖS IR MOLEKULINĖS MASĖS PASISKIRSTYMAS
            
                  A.18.
               
               MAŽOS MOLEKULINĖS MASĖS MEDŽIAGŲ KIEKIS POLIMERUOSE
            
                  A.19.
               
               POLIMERŲ TIRPIMAS (EKSTRAHAVIMAS) VANDENYJE
            
                  A.20.
               
               OKSIDUOJAMOSIOS SAVYBĖS (SKYSČIAI)
            A.1.   LYDYMOSI/UŽŠALIMO TEMPERATŪRA.
      1.   METODAS
      Dauguma apibūdintų metodų yra pagrįsti OECD Test Guidelines (1). Pagrindiniai principai yra pateikti 2 ir 3 nuorodoje.
      1.1.   ĮVADAS
      Apibūdintieji metodai ir prietaisai turi būti taikomi nustatant medžiagų lydymosi temperatūrą, netaikant jokių apribojimų jų grynumo laipsniui.
      Metodo parinkimas priklauso nuo svarbiausių tiriamos medžiagos savybių. Todėl ribinis koeficientas priklausys nuo to, ar galima, ar negalima tą medžiagą lengvai, sunkiai pulverizuoti, ar visai neįmanoma.
      Kai kurioms medžiagoms labiau tinka nustatyti užšalimo arba kietėjimo temperatūrą, jų nustatymo standartai taip pat yra įtraukti į šį metodą.
      Jeigu dėl tam tikrų medžiagos savybių minėtų parametrų neįmanoma tinkamai išmatuoti, gali tikti skystėjimo temperatūra.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Lydymosi temperatūra – tai temperatūra, kuriai esant fazinis virsmas iš kietosios būsenos į skystąją vyksta atmosferos slėgyje ir ši temperatūra tiksliai atitinka užšalimo temperatūrą.
      Kadangi daugumos medžiagų fazinis virsmas vyksta virš temperatūrų ribos, ji dažnai apibūdinama kaip lydymosi riba.
      Vienetų atitikmenys (iš K į oC)
      t = T - 273,15
      
                  t
               
               
                  :
               
               
                  Celsijaus temperatūra, Celsijaus laipsniai ( oC).
               
            
                  T
               
               
                  :
               
               
                  termodinaminė temperatūra, kelvinai (K).
               
            1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nebūtina naudoti etalonines medžiagas visais tais atvejais, kai tiriama nauja medžiaga. Pirmiausia jos turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant šio metodo veikimą ir siekiant palyginti gautus rezultatus su kitų metodų rezultatais.
      Kai kurios kalibravimo medžiagos yra pateiktos nuorodose (4).
      1.4.   TYRIMO METODO ESMĖ
      Nustatoma fazinio virsmo iš kietosios būsenos į skystąją arba iš skystosios būsenos į kietąją temperatūra (temperatūrų riba). Praktikoje šildant/aušinant bandomos medžiagos mėginį atmosferos slėgyje, yra nustatoma pradinė lydymosi/užšalimo temperatūra ir galutinės lydymosi/užšalimo stadijos temperatūra. Apibūdinami penki metodų tipai, būtent: kapiliarinis metodas, karštosios pakopos metodai, užšalimo temperatūros nustatymas, terminės analizės metodai ir skystėjimo temperatūros nustatymas (pvz., naftos riebalų).
      Tam tikrais atvejais vietoje lydymosi temperatūros yra patogu matuoti užšalimo temperatūrą.
      1.4.1.   Kapiliarinis metodas
      1.4.1.1.   Lydymosi temperatūros matavimo prietaisai su skysčių vonia
      Nedidelis kiekis gerai susmulkintos medžiagos dedamas į kapiliarinį vamzdelį ir tvirtai užspaudžiamas. Kapiliarinis vamzdelis šildomas kartu su termometru, lydymosi metu nustatomas mažesnis nei apytikriai 1 K/min. temperatūros pakitimas. Nustatoma pradinė ir galutinė lydymosi temperatūra.
      1.4.1.2.   Lydymosi temperatūros imitavimo prietaisai su metaliniu bloku
      Taip kaip apibūdinta 1.4.1.1 punkte, išskyrus tai, kad kapiliarinis vamzdelis ir termometras dedami į pašildytą metalinį bloką, ir jie stebimi per bloke esančias skylutes.
      1.4.1.3.   Detekcija fotoelementu
      Kapiliariniame vamzdelyje esantis mėginys yra automatiškai šildomas metaliniame cilindre. Šviesos spindulys nukreipiamas pro medžiagą per cilindre esančią skylutę į tiksliai kalibruotą fotoelementą. Daugumos besilydančių medžiagų optinės savybės keičiasi nuo matinių iki skaidrių. Į fotoelementą patenkančios šviesos intensyvumas didėja ir siunčia sustabdymo signalą į skaitmeninį indikatorių, kuris rodo kaitinimo kameroje esančio platininio varžinio termometro temperatūrą. Šis metodas netinka kai kurioms ryškią spalvą turinčioms medžiagoms.
      1.4.2.   Lydymosi pakopos
      1.4.2.1.   Kofler karštasis strypas
      Kofler karštajame strype naudojami du metalo gabalai, turintys skirtingą terminį laidumą, šildomi elektra, kur strypas sukonstruojamas taip, kad temperatūros gradientas būtų beveik linijinis per visą jo ilgį. Karštojo strypo temperatūra gali svyruoti nuo 283 iki 573 K kartu su specialiu prietaisu temperatūrai parodyti, kurį sudaro judantis velenėlis su rodykle ir kilpelė, skirta konkrečiam strypui. Kad būtų nustatyta lydymosi temperatūra, labai plonas medžiagos sluoksnis dedamas tiesiai ant karšto strypo paviršiaus. Po kelių sekundžių taip skystosios ir kietosios fazės pasirodo ryški skiriamoji linija. Temperatūra skiriamojoje linijoje yra užrašoma rodyklę nustatant taip, kad ji būtų ant linijos.
      1.4.2.2.   Lydymosi temperatūros mikroskopas
      Keletas mikroskopo karštųjų stadijų yra naudojamos nustatant lydymosi temperatūrą esant labai mažam medžiagos kiekiui. Daugumoje karštųjų stadijų temperatūra yra matuojama jautriu termoelementu, bet kartais naudojami ir gyvsidabrio termometrai. Tipiškame mikroskopiniame karštosios pakopos lydymosi temperatūros nustatymo aparate yra kaitinimo kamera, kurią sudaro metalinė plokštelė, virš kurios ant šliaužiklio yra dedamas mėginys. Metalinės plokštelės centre yra skylė, per kurią patenka šviesa nuo mikroskopo apšvietimo veidrodėlio. Naudojimo metu kamera uždengiama stiklo plokštele, kad į erdvę, kurioje yra mėginys, nepatektų oro.
      Mėginio kaitinimą reguliuoja reostatas. Atliekant labai tikslius matavimus optinėmis anizotropinėmis medžiagomis, gali būti naudojama poliarizuota šviesa.
      1.4.2.3.   Menisko metodas
      Šis metodas yra visų pirma naudojamas poliamidams.
      Temperatūra, kurioje išnyksta silikoninės alyvos meniskas, esantis taip karštosios pakopos ir uždengiančiojo stiklo, prie kurio pridėtas poliamidinis pavyzdys, yra nustatoma vizualiai.
      1.4.3.   Užšalimo temperatūros nustatymo metodas
      Mėginys dedamas į specialų mėgintuvėlį, kuris įdedamas į aparatą užšalimo temperatūrai nustatyti. Aušinimo metu mėginys atsargiai ir nuolatos maišomas, o jo temperatūra yra matuojama atitinkamais intervalais. Kai kelis kartus užrašius rodmenis temperatūra nusistovi, ši temperatūra (su pakoreguota termometro paklaida) yra užrašoma kaip užšalimo temperatūra.
      Peršaldymo turi būti vengiama norint išlaikyti pusiausvyrą taip kietosios ir skystosios fazės.
      1.4.4.   Terminė analizė
      1.4.4.1.   Diferencinė ir terminė analizė (DTA)
      Pagal šią metodiką medžiagos ir etaloninės medžiagos temperatūrų skirtumas yra užrašomas kaip temperatūros funkcija, kai tai medžiagai ir etaloninei medžiagai yra naudojama ta pati kontroliuojamos temperatūros programa. Jeigu mėginyje įvyksta virsmas, kurio metu pakinta entalpija, tokį pasikeitimą parodo endoterminis (lydymosi) arba egzoterminis (užšalimo) nukrypimas nuo užrašytos temperatūros pagrindinės linijos.
      1.4.4.2.   Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija (DSK)
      Pagal šią metodiką įvesties energijų skirtumas medžiagoje ir etaloninėje medžiagoje užrašomas kaip temperatūros funkcija, kai tai medžiagai ir etaloninei medžiagai yra naudojama ta pati kontroliuojamos temperatūros programa. Ši energija – tai energija, reikalinga nustatyti medžiagos ir etaloninės medžiagos nuliniam temperatūrų skirtumui. Jeigu mėginyje įvyksta virsmas, kurio metu pakinta entalpija, tokį pasikeitimą parodo endoterminis (lydymosi) arba egzoterminis (užšalimo) nukrypimas nuo užrašyto šilumos srauto pagrindinės linijos.
      1.4.5.   Skystėjimo temperatūra
      Šis metodas buvo sukurtas naudoti naftos alyvoms, jis taip pat tinka aliejinėms medžiagoms, kurių lydymosi temperatūra yra žema.
      Iš anksto pašildytas mėginys atvėsinamas ypač greitai ir yra tikrinamas 3 K intervalais srauto charakteristikoms nustatyti. Žemiausia temperatūra, kuriai esant nustatytas medžiagos judėjimas, yra užrašoma kaip skystėjimo temperatūra.
      1.5.   KOKYBES KRITERIJAI
      Įvairių metodų, naudojamų lydymosi temperatūrai/lydymosi intervalui nustatyti, pritaikomumas ir tikslumas yra pateikti šioje lentelėje:
      METODŲ TAIKOMUMO LENTELĖ
      A.   Kapiliarinis metodas
      
      
                  Matavimo metodas
               
               
                  Medžiagos, kurias galima pulverizuoti
               
               
                  Medžiagos, kurių negalima pulverizuoti
               
               
                  Temperatūrų intervalas
               
               
                  Apskaičiuotas tikslumas (1)
                  
               
               
                  Galiojantis standartas
               
            
                  Lydymosi temperatūros prietaisai su skysčių vonia
               
               
                  Taip
               
               
                  Tik keletas
               
               
                  273–573 K
               
               
                  ±0,3 K
               
               
                  JIS K 0064
               
            
                  Lydymosi temperatūros priemonės su metaliniu bloku
               
               
                  Taip
               
               
                  Tik keletas
               
               
                  293– >573 K
               
               
                  +0,5 K
               
               
                  ISO 1218(E)
               
            
                  Detekcija fotoelementu
               
               
                  Taip
               
               
                  Keletas, naudojant prietaisus
               
               
                  253–573 K
               
               
                  +0,5 K
               
               
                   
               
            
         
      B.   Karštosios stadijos ir užšalimo metodai
      
      
                  Matavimo metodas
               
               
                  Medžiagos, kurias galima pulverizuoti
               
               
                  Medžiagos, kurių negalima lengvai pulverizuoti
               
               
                  Temperatūrų intervalas
               
               
                  Apskaičiuotas tikslumas (2)
                  
               
               
                  Galiojantis standartas
               
            
                  Kofler karšta-sis strypas
               
               
                  Taip
               
               
                  Ne
               
               
                  283–>573 K
               
               
                  ±1 K
               
               
                  ANSI/ASTM D 3451-76
               
            
                  Lydymosi temperatūros mikroskopas
               
               
                  Taip
               
               
                  Tik keletas
               
               
                  273–>573 K
               
               
                  +0,5 K
               
               
                  DIN 53736
               
            
                  Menisko metodas
               
               
                  Ne
               
               
                  Ypač poliamidams
               
               
                  293–>573 K
               
               
                  ±0,5 K
               
               
                  ISO 1218(E)
               
            
                  Užšalimo temperatūros nustatymo metodai
               
               
                  Taip
               
               
                  Taip
               
               
                  223–573 K
               
               
                  ±0,5 K
               
               
                  Pvz.. BS 4695
               
            
         
      C.   Terminė analizė
      
      
                  Matavimo metodas
               
               
                  Medžiagos, kurias galima pulverizuoti
               
               
                  Medžiagos, kurių negalima lengvai pulverizuoti
               
               
                  Temperatūrų intervalas
               
               
                  Apskaičiuotas tikslumas (3)
                  
               
               
                  Galiojantis standartas
               
            
                  Diferencinė terminė analizė
               
               
                  Taip
               
               
                  Taip
               
               
                  173–1 273 K
               
               
                  Iki 600 K ±0,5 K iki 1 273 K ±2,0 K
               
               
                  ASTM E 537-76
               
            
                  Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija
               
               
                  Taip
               
               
                  Taip
               
               
                  173–1 273 K
               
               
                  Iki 600 K ±0,5 K iki 1 273 K ± 2,0 K
               
               
                  ASTM E 537-76
               
            
         
      D.   Skystėjimo temperatūra
      
      
                  Matavimo metodas
               
               
                  Medžiagos, kurias galima pulverizuoti
               
               
                  Medžiagos, kurių negalima lengvai pulverizuoti
               
               
                  Temperatūrų intervalas
               
               
                  Apskaičiuotas tikslumas (4)
                  
               
               
                  Galiojantis standartas
               
            
                  Skystėjimo temperatūra
               
               
                  Naftos alyvoms ir alyvinėms medžiagoms
               
               
                  Naftos alyvoms ir alyvinėms medžiagoms
               
               
                  223-323 K
               
               
                  ±3,0 K
               
               
                  ASTM D 97-66
               
            1.6.   METODŲ APIBŪDINIMAS
      Beveik visų tyrimo metodų darbo eiga yra aprašyta tarptautiniuose ir nacionaliniuose standartuose (žr. 1 priedėlį).
      1.6.1.   Kapiliariniai metodai
      Jeigu smulkiai pulverizuotų medžiagų temperatūra yra didinama pamažu, paprastai būna lydymosi pakopos, parodytos 1 pav.
      1 paveikslas
      
         
      Lydymosi temperatūros nustatymo metu temperatūra yra užrašoma lydymosi pradžioje ir baigiamojoje stadijoje.
      1.6.1.1.   Lydymosi temperatūros prietaisai su skysčių vonios aparatu
      2 pav. parodytas standartizuotas stiklinis lydymosi temperatūros nustatymo aparatas (JIS K 0064); visos charakteristikos pateiktos milimetrais.
      2 paveikslas
      
         
      Vonios skystis
      Turi būti parenkamas atitinkamas skystis. Skysčio pasirinkimas priklauso nuo lydymosi temperatūros, kurią reikia nustatyti, pvz., parafininė alyva – temperatūra ne aukštesnė kaip 473 K, silikoninė alyva – temperatūra ne aukštesnė kaip 573 K.
      Jei lydymosi temperatūra aukštesnė negu 523 K, gali būti naudojamas mišinys iš trijų dalių sieros rūgšties ir dviejų dalių kalio sulfato (pagal masių santykį). Jeigu naudojamas toks mišinys, reikia imtis atitinkamų atsargumo priemonių.
      Termometras
      Turi būti naudojami tik tokie termometrai, kurie atitinka žemiau toliau pateiktų arba lygiaverčių standartų reikalavimus:
      ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.
      Darbo eiga
      Sausoji medžiaga grūstuvėje sutrinama į smulkius miltelius ir dedama į kapiliarinį vamzdelį, kurio vienas galas užlydytas, kad jį užpildžius medžiagos sluoksnis, stipriai ją suslėgus, būtų 3 mm storio. Norint gauti tolygiai suslėgtą mėginį, kapiliarinį vamzdelį iš apytikriai 700 mm aukščio reikėtų vertikalia kryptimi paleisti per stiklinį vamzdelį ant laikrodžio stiklo.
      Užpildytas kapiliarinis vamzdelis dedamas į vonią taip, kad vidurinė gyvsidabrio termometro galiuko dalis liestų vamzdelį toje vietoje, kur yra mėginys. Paprastai kapiliarinis vamzdelis dedamas į aparatą, kurio temperatūra yra apie 10 K žemesnė negu lydymosi temperatūra.
      Vonios skystis šildomas taip, kad temperatūra didėtų apie 3 K/min. Skystį reikia maišyti. Kai temperatūra yra 10 K žemesnė negu laukiama lydymosi temperatūra, temperatūros didėjimo greitis yra nustatomas taip, kad neviršytų 1 K/min.
      Apskaičiavimas
      Lydymosi temperatūra apskaičiuojama taip:
      T = TD+0,00016 (TD - TE)n
      kai:
      
                  T
               
               
                  =
               
               
                  koreguota lydymosi temperatūra, K
               
            
                  
                     TD
                  
               
               
                  =
               
               
                  D termometro parodymai, K
               
            
                  TE
                  
               
               
                  =
               
               
                  E termometro parodymai, K
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  D termometro gyvsidabrio stulpelio padalų skaičius ant iškilusios jo dalies.
               
            1.6.1.2.   Lydymosi temperatūros nustatymo prietaisai su metaliniu bloku
      Aparatūra
      
         Ją sudaro:
      
      
                  —
               
               
                  cilindrinis metalinis blokas, kurio viršutinė dalis yra tuščia ir sudaro ertmę (žr. 3 pav.),
               
            
                  —
               
               
                  metalinis kaištis su dviem ar keliomis skylutėmis, per kurias kapiliaras įstatomas į metalinį bloką,
               
            
                  —
               
               
                  metalinio bloko kaitinimo sistema, kuri, pavyzdžiui, yra tiekiama per bloke įtaisytą elektriną varžą,
               
            
                  —
               
               
                  reostatas energijos padavimui reguliuoti, jeigu kaitinimui naudojama elektra,
               
            
                  —
               
               
                  keturi langeliai iš šilumai atsparaus stiklo išorinėse kameros sienose, esantys visiškai priešingose pusėse statmenai vienas kitam. Priešais vieną iš šių langelių yra mikroskopo okuliaras kapiliariniam vamzdeliui stebėti. Kiti trys langeliai naudojami aparato vidui apšviesti lempomis,
               
            
                  —
               
               
                  kaitrai atsparaus stiklo kapiliarinis vamzdelis vienu uždaru galu (žr. 1.6.1.1).
               
            Termometras
      Žiūrėti 1.6.1.1 punkte nurodytus standartus. Taip pat naudojami panašaus tikslumo termoelektriniai matavimo prietaisai.
      3 paveikslas
      
         
      1.6.1.3.   Detekcija fotoelementu
      
         Aparatūra ir darbo eiga
      
      Aparatūrą sudaro metalinė kamera su automatizuota kaitinimo sistema. Trys kapiliarai užpildomi pagal 1.6.1.1 ir dedami į krosnį.
      Aparatui kalibruoti galima kelis kartus linijiniu būdu padidinti temperatūrą, o atitinkamai padidinta temperatūra yra elektriniu būdu suderinama pagal iš anksto pasirinktą konstantą ir tiesinį koeficientą. Savirašiai parodo tikrąją krosnies temperatūrą bei kapiliaruose esančios medžiagos temperatūrą.
      1.6.2.   Karštosios stadijos
      1.6.2.1.   Kofler karštasis strypas
      Žr. priedėlį.
      1.6.2.2.   Lydymosi temperatūros mikroskopas
      Žr. priedėlį.
      1.6.2.3.   Menisko metodas (poliamidai)
      Žr. priedėlį.
      Kaitinimo sparta lydymosi temperatūroje turėtų būti ne mažesnė kaip 1 K/min.
      1.6.3.   Užšalimo temperatūros nustatymo metodai
      Žr. priedėlį.
      1.6.4.   Terminė analizė
      1.6.4.1.   Diferencinė terminė analizė
      Žr. priedėlį.
      1.6.4.2.   Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija
      Žr. priedėlį.
      1.6.5.   Skystėjimo temperatūros nustatymas
      Žr. priedėlį.
      2.   DUOMENYS
      Kai kuriais atvejais reikalinga termometro korekcija.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      Į mėginio ataskaitą, jeigu įmanoma, įtraukiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  naudotas metodas,
               
            
                  —
               
               
                  tikslios medžiagos charakteristikos (identiškumas ir priemaišos) ir išankstinio gryninimo, jeigu toks naudojamas, stadija,
               
            
                  —
               
               
                  tikslumo apskaičiavimas.
               
            Ne mažiau kaip dviejų matavimų, patenkančių į apskaičiuotą tikslumo intervalą (žr. 1 lentelę), vidutinė temperatūra nurodoma kaip lydymosi temperatūra.
      Jei temperatūrų skirtumas tarp pradinės temperatūros ir temperatūros galutinėje lydymosi fazėje yra metodo tikslumo ribose, galutinės lydymosi fazės temperatūra yra laikoma lydymosi temperatūra; kitu atveju imamos dvi temperatūros.
      Jei medžiaga suyra ar išgaruoja prieš pasiekiant lydymosi temperatūrą, imama ta temperatūra, kuriai esant įvyko šis efektas.
      Visa informacija ir pastabos, svarbios duomenų aiškinimui, turi būti pateikiamos ataskaitoje, ypač atsižvelgiant į priemaišas ir medžiagos fizinę būseną.
      4.   LITERATŪRA
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 (final).
               
            
                  2)
               
               
                  IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, p. 803–834.
               
            
                  3)
               
               
                  R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
               
            
                  4)
               
               
                  IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 505–515.
               
            
         Priedėlis
         Papildomos techninės informacijos, pavyzdžiui, galima ieškoti šiuose standartuose.
         1.   Kapiliariniai metodai
         1.1.   Lydymosi temperatūros nustatymo prietaisai su skysčių vonia
         
                     ASM E 324-69
                  
                  
                     Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals
                  
               
                     BS 46-34
                  
                  
                     Method for the determination of melting point and/or melting range
                  
               
                     DIN 53181
                  
                  
                     Bestimmung des Schnelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren
                  
               
                     JIS K 00-64
                  
                  
                     Testing methods for melting point of chemical products.
                  
               1.2.   Lydymosi temperatūros nustatymo prietaisai su metaliniu bloku
         
                     DIN 53736
                  
                  
                     Visuelle Bestimmung der Schmeltztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
                  
               
                     ISO 1218 (E)
                  
                  
                     Plastics- polyamides -determination of „melting point“
                  
               2.   Karštosios stadijos
         2.1.   Kofler karštasis strypas
         
                     ANSI/ASTM D 3451-76
                  
                  
                     Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings
                  
               2.2.   Lydymosi temperatūros mikroskopas
         
                     DIN 53736
                  
                  
                     Visuelle Bestimmung der Schmeltztemperatur von eilkristallinen Kunststoffen.
                  
               2.3.   Menisko metodas (poliamidai)
         
                     ISO 1218 (E)
                  
                  
                     Plastics – polyamides – determination of „melting point“
                  
               
                     ANSI/ASTM D 2133-66
                  
                  
                     Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials
                  
               
                     NF T 51-050
                  
                  
                     Resines de poliamides. Determination du „point de fusion“ metode du menisque
                  
               3.   Užšalimo temperatūros nustatymo metodai
         
                     BS 4633
                  
                  
                     Method for determination of crystallizing point
                  
               
                     BS 4695
                  
                  
                     Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve)
                  
               
                     DIN 51421
                  
                  
                     Bestimmun des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen
                  
               
                     ISO 2207
                  
                  
                     Cires de petrole: determination de la temperature de figeage
                  
               
                     DIN 53175
                  
                  
                     Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsauren
                  
               
                     NF T 60-114
                  
                  
                     Point de fusion des paraffines
                  
               
                     NF T 20-051
                  
                  
                     Metode de determination du point de cristallisation (point de congelation)
                  
               
                     ISO 1392
                  
                  
                     Method for the determination of the freezing point
                  
               4.   Terminė analizė
         4.1.   Diferencinė terminė analizė
         
                     ASTM E 537-76
                  
                  
                     Standard method for assessing the thermal
                  
               
                     ASTM E 473-85
                  
                  
                     Standard definitions of terms relating to thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 472-86
                  
                  
                     Standard practice for reporting thermoanalytical data
                  
               
                     DIN 51005
                  
                  
                     Thermische Analyse, Begriffe
                  
               4.2.   Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija
         
                     ASTM E 537-76
                  
                  
                     Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differencial thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 473-85
                  
                  
                     Standard definitions of terms relating to thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 472-86
                  
                  
                     Standard practice for reporting thermoanalytical data
                  
               
                     DIN 51005
                  
                  
                     Thermische Analyse, Begriffe
                  
               5.   Skystėjimo temperatūros nustatymas
         
                     ASTM D 97-66
                  
                  
                     Echantillonnage et analyse des produits du
                  
               
                     ASTM D 97-66
                  
                  
                     Standard tes methos for pour point of petroleum oils
                  
               
                     ISO 3016
                  
                  
                     Petroleum oils – Determination of pour point
                  
               
      A.2.   VIRIMO TEMPERATŪRA
      1.   METODAS
      Dauguma apibūdintų metodų yra pagrįsti OECD Test Guideline (1). Pagrindiniai principai pateikti 2 ir 3 nuorodoje.
      1.1.   ĮVADAS
      Čia apibūdinti metodai ir prietaisai gali būti naudojami skystoms ir blogai besilydančioms medžiagoms, jei cheminių reakcijų, kuriose jos naudojamos, temperatūra nėra žemesnė nei virimo temperatūrą (pvz., autooksidacija, persigrupavimas, skilimas ir pan.). Šiuos metodus galima taikyti grynoms ir priemaišų turinčioms skystosioms medžiagoms.
      Ypatingas dėmesys atkreiptinas į tuos metodus, kuriuose naudojama detekcija fotoelementu ir terminė analizė, kadangi šiais metodais galima nustatyti tiek lydimosi, tiek virimo temperatūrą. Be to, matavimus galima atlikti automatiškai.
      Dinaminis metodas geras tuo, kad jį taip pat galima naudoti nustatant garų slėgį ir nebūtina virimo temperatūrą koreguoti iki normalaus slėgio (101,325 kPa), kadangi normalus slėgis matavimų metu gali būti nustatomas manostatu.
      
         Pastabos
      
      Priemaišų įtaka nustatant virimo temperatūrą labai priklauso nuo priemaišų svarbiausių savybių. Jeigu mėginyje yra lakiųjų priemaišų, kurios galėtų turėti įtakos rezultatams, medžiagą reikia išgryninti.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Normali virimo temperatūra yra apibrėžiama kaip temperatūra, kurioje skysčių garų slėgis yra lygus 101,325 kPa.
      Jeigu virimo temperatūra matuojama ne normaliame atmosferos slėgyje, temperatūros priklausomybė nuo garų slėgio gali būti apibūdinama Clausius-Clapeyron lygtimi:
      
         
      kai:
      
                  p
               
               
                  =
               
               
                  medžiagos garų slėgis paskaliais
               
            
                  Δ Hv
                  
               
               
                  =
               
               
                  garavimo šiluma, J mol-1
                  
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  universalioji molinė dujų konstanta = 8,314 J mol-1K-1
                  
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  termodinaminė temperatūra, K
               
            Virimo temperatūra yra nustatoma atsižvelgiant į matavimo metu esantį aplinkos slėgį.
      
         Vienetų atitikmenys
      
      Slėgis (vienetai: kPa)
      
                  100 kPa
               
               
                  =
               
               
                  1 baras = 0,1 MPa
                  („baras“ vis dar leistinas, bet nerekomenduojamas)
               
            
                  133 Pa
               
               
                  =
               
               
                  1 mm Hg = 1 Torr
                  (neleistini vienetai „mm Hg“ ir „Torr“)
               
            
                  1 atm
               
               
                  =
               
               
                  standartinė atmosfera = 101 325 Pa
                  (neleistinas vienetas „atm“)
               
            Temperatūra (vienetai: K)
      t = T - 273,15
      
                  t
               
               
                  :
               
               
                  Celsijaus temperatūra, Celsijaus laipsniai (° C)
               
            
                  T
               
               
                  :
               
               
                  termodinaminė temperatūra, kelvinai (K)
               
            1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nebūtina naudoti etalonines medžiagas visais tais atvejai, jeigu tiriama nauja medžiaga. Pirmiausia jos turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant šio metodo veikimą ir gautų rezultatų lyginimui su kitų metodų rezultatais.
      Kai kurias kalibravimo medžiagas galima rasti priede išvardytuose metoduose.
      1.4.   TYRIMO METODO ESMĖ
      Penki virimo temperatūros (virimo intervalo) nustatymo metodai yra pagrįsti virimo temperatūros matavimu, kiti du pagrįsti termine analize.
      1.4.1.   Nustatymas ebulioskopu
      Iš pradžių ebulioskopai buvo sukurti molekuliniam svoriui nustatyti didinant virimo temperatūrą, bet jie taip pat tinka tiksliems virimo temperatūros matavimams atlikti. Labai paprastas aparatas yra apibūdintas ASTM D 1120-72 (žr. priedėlį). Šiame aparate skystis šildomas aplinkos sąlygomis atmosferos slėgyje, kol užverda.
      1.4.2.   Dinaminis metodas
      Šį metodą sudaro garų pakartotino suskystinimo temperatūros matavimas atitinkamu termometru esant deflegmacijai verdant. Taikant šį metodą galima keisti slėgį.
      1.4.3.   Distiliacijos metodas virimo temperatūrai nustatyti
      Šį metodą sudaro skysčio distiliavimas ir garų pakartotino suskystinimo temperatūros matavimas bei distiliato kiekio nustatymas.
      1.4.4.   „Siwoloboff“ metodas
      Mėginys šildomas mėgintuvėlyje, panardintame į kaitinimo vonioje esantį skystį. Užlydytas kapiliarinis vamzdelis, kurio apatinėje dalyje yra oro burbuliukas, panardinamas į tą patį mėgintuvėlį.
      1.4.5.   Detekcija fotoelementu
      Pagal Siwoloboff metodą atliekamas automatinis fotoelektrinis matavimas, naudojant kylančius burbuliukus.
      1.4.6.   Diferencinė terminė analizė
      Pagal šią metodiką yra užrašomi medžiagos ir etaloninės medžiagos temperatūrų skirtumai kaip temperatūros funkcija, kai medžiagai ir etaloninei medžiagai yra taikoma ta pati kontroliuojama temperatūrą programa. Jeigu mėginyje įvyksta virsmas, kurio metu pasikeičia entalpija, tą pokytį parodo endoterminis nuokrypis (virimas) nuo pagrindinės užrašytų temperatūrų linijos.
      1.4.7.   Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija
      Šia metodika skirtumas tarp energijos įvesties į medžiagą ir į etaloninę medžiagą yra užrašomas kaip temperatūros funkcija, kai medžiagai ir etaloninei medžiagai yra taikoma ta pati kontroliuojama temperatūrų programa. Ši energija – tai energija, reikalinga nustatyti medžiagos ir etaloninės medžiagos nulinį temperatūrų skirtumą. Jeigu mėginyje įvyksta virsmas, kurio metu pasikeičia entalpija, tą pokytį parodo endoterminis nuokrypis (virimas) nuo pagrindinės užrašytų temperatūrų linijos.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Skirtingų metodų, naudojamų virimo temperatūrai/virimo intervalui nustatyti, taikymas ir tikslumas yra pateikti 1 lentelėje.
      1 lentelė
      Metodų palyginimas
      
                  Matavimo metodas
               
               
                  Apskaičiuotas tikslumas
               
               
                  Galiojantis standartas
               
            
                  Ebulioskopas
               
               
                  ± 1,4 K (iki 373 K) (5)
                      (6)
                  
                  ±2,5 K (iki 600 K) (5)
                      (6)
                  
               
               
                  ASTM D 1120-72 (5)
                  
               
            
                  Dinaminis metodas
               
               
                  ±0,5 K (iki 600 K) (6)
                  
               
               
                   
               
            
                  Distiliavimo procesas (virimo intervalas)
               
               
                  ±0,5 K (iki 600 K)
               
               
                  ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71
               
            
                  Pagal Siwoloboff
               
               
                  ±0,2 K (iki 600 K) (6)
                  
               
               
                   
               
            
                  Detekcija fotoelementu
               
               
                  ±0,3 K (373 K) (6)
                  
               
               
                   
               
            
                  Diferencinė terminė kalorimetrija
               
               
                  ±0,5 K (iki 600 K)
                  ±0,2 K (iki 1 273 K)
               
               
                  ASTM E 537-76
               
            
                  Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija
               
               
                  ±0,5 K (iki 600 K)
                  ±0,2 K (iki 1 273 K)
               
               
                  ASTM E 537-76
               
            1.6.   METODŲ APIBŪDINIMAS
      Kai kurių mėginio metodų darbo eiga yra apibūdinta tarptautiniuose ir nacionaliniuose standartuose (žr. priedą).
      1.6.1.   Ebulioskopas
      Žr. priedėlį
      1.6.2.   Dinaminis metodas
      Žr. A.4 tyrimo metodą. Garų slėgio nustatymas.
      Užrašoma stebėtoji virimo temperatūra, kai slėgis 101,325 kPa.
      1.6.3.   Distiliavimo procesas (virimo intervalas)
      Žr. priedėlį.
      1.6.4.   Siwoloboff metodas
      Mėginys kaitinamas mėgintuvėlyje, kurio skersmuo apie 5 mm, lydimosi temperatūros nustatymo aparate (1 pav.).
      1 pav. pavaizduotas standartizuotas lydymosi ir virimo temperatūros nustatymo aparatas (JIS K 0064) (stiklinis, visi duomenys nurodyti milimetrais).
      1 paveikslas
      
         
      Kapiliarinis vamzdelis (virinimo kapiliarinis vamzdelis), kuris užlydytas 1 cm virš apatinio galo, dedamas į mėgintuvėlio vamzdelį. Mėginio yra dedama tiek, kad užlydytoji kapiliarinio vamzdelio dalis būtų žemiau skysčio paviršiaus. Mėgintuvėlio vamzdelis su virinimo kapiliariniu vamzdeliu yra pritaisomas arba prie termometro gumine juostele, arba pritvirtinamas laikikliu iš šono (žr. 2 pav.).
      
                  
                     2 pav.
                  
                  
                     Pagal Siwoloboff
                  
               
               
                  
                     3 pav.
                  
                  
                     Modifikuotas variantas
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  
                     
               
            Vonios skystis parenkamas pagal virimo temperatūrą. Kai temperatūra siekia 573 K, gali būti naudojama silikoninė alyva. Parafininė alyva gali būti naudojama tik iki 473 K. Vonios skystis kaitinamas taip, kad temperatūra iš pradžių didėtų 3 K/min. Vonioje esantis skystis turi būti maišomas. Kai temperatūra siekia apie 10 K žemiau laukiamos virimo temperatūros, kaitinimas sumažinamas taip, kad temperatūros didėjimo greitis būtų 1 K/min. Pasiekus virimo temperatūrą, iš virinimo kapiliarinio vamzdelio pradeda kilti burbuliukai.
      Virimo temperatūra yra ta temperatūra, kai staiga atvėsinus burbuliukų nebelieka, o skystis staiga pradeda kilti kapiliariniu vamzdeliu. Termometras atitinkamai rodo medžiagos virimo temperatūrą.
      Modifikuotame variante (3 pav.) virimo temperatūra nustatoma lydimosi temperatūros nustatymo kapiliariniame vamzdelyje. Jis yra išploninamas ištempiant apie 2 cm (a), išsiurbiamas nedidelis kiekis mėginio. Atvirasis plonojo vamzdelio galiukas yra užlydomas taip, kad jo gale liktų mažas oro burbuliukas. Kaitinant aparatą lydimosi temperatūroje (b), oro burbuliukas plečiasi. Virimo temperatūra atitinka temperatūrą, kurioje medžiagos gumulėlis pasiekia vonioje esančio skysčio paviršių (c).
      1.6.5.   Detekcija fotoelementu
      Kapiliariniame vamzdelyje esantis mėginys kaitinamas įkaitintame metaliniame bloke.
      Šviesos spindulys nukreipiamas pro bloke esančias tam tinkančias skylutes per medžiagą į tiksliai kalibruotą fotoelementą.
      Didėjant mėginio temperatūrai virinimo kapiliariniame vamzdelyje atsiranda pavienių oro burbuliukų. Pasiekus virimo temperatūrą, burbuliukų labai padaugėja. Dėl to pasikeičia šviesos intensyvumas, kurį užregistruoja fotoelementas, ir paduodamas sustabdymo signalas į indikatorių, parodantį bloke esančio platininio varžinio termometro parodymus.
      Šis metodas yra ypač naudingas, kadangi leidžia nustatyti iki 253,15 K (-20 oC) žemesnę negu kambario temperatūrą nedarant jokių pakeitimų aparate. Prietaisas paprasčiausiai turi būti dedamas į aušinimo vonią.
      1.6.6.   Terminė analizė
      1.6.6.1   Diferencinė terminė analizė
      Žr. priedėlį.
      1.6.6.2   Diferencinė skenuojamoji kalorimetrija
      Žr. priedėlį.
      2.   DUOMENYS
      Esant nedideliems nukrypimams nuo normalaus slėgio (daugiausiai ± 5 kPa), virimo temperatūra normalizuojama iki Tn naudojantis tokiomis Sidney Young skaitmeninių verčių lygties vidutinėmis vertėmis:
      Tn = T + (fT x Δp)
      kai:
      
                  Δ p
               
               
                  =
               
               
                  (101,325 – p) [pastaba]
               
            
                  P
               
               
                  =
               
               
                  slėgio matavimas, kPa
               
            
                  fT
                  
               
               
                  =
               
               
                  virimo temperatūros pokyčio greitis, slėgis K/kPa
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  išmatuota virimo temperatūra, K
               
            
                  Tn
                  
               
               
                  =
               
               
                  virimo temperatūra, koreguota iki normalaus slėgio, K
               
            Daugumos medžiagų temperatūros korekcijos koeficientai fT ir jų aproksimavimo lygtys yra įtrauktos į pirmiau minėtus tarptautinius ir nacionalinius standartus.
      Pavyzdžiui, DIN 53171 metodas nurodo tokias apytikres korekcijas dažuose esantiems tirpikliams:
      2 lentelė
      Temperatūra. Korekcijos koeficientai fT
      
      
                  Temperatūra T (K)
               
               
                  Korekcijos koeficientas fT (K/kPa)
               
            
                  323,15
               
               
                  0,26
               
            
                  348,15
               
               
                  0,28
               
            
                  373,15
               
               
                  0,31
               
            
                  398,15
               
               
                  0,33
               
            
                  423,15
               
               
                  0,35
               
            
                  448,15
               
               
                  0,37
               
            
                  473,15
               
               
                  0,39
               
            
                  498,15
               
               
                  0,41
               
            
                  523,15
               
               
                  0,44
               
            
                  548,15
               
               
                  0,45
               
            
                  573,15
               
               
                  0,47
               
            3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      Į mėginio ataskaitą, jeigu įmanoma, įtraukiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  naudotas metodas,
               
            
                  —
               
               
                  tikslios medžiagos charakteristikos (identiškumas ir priemaišos) ir išankstinio gryninimo, jeigu toks naudojamas, stadija,
               
            
                  —
               
               
                  tikslumo apskaičiavimas.
               
            Ne mažiau kaip dviejų matavimų, patenkančių į apskaičiuotą tikslumo intervalą (žr. 1 lentelę), vidutinė temperatūra nurodoma kaip virimo temperatūra.
      Nurodomos išmatuotos virimo temperatūros ir jų vidurkiai, o slėgis(iai), kuriame buvo atlikti šie matavimai, nurodomas kPa. Pageidautina, kad slėgis būtų artimas normaliam atmosferos slėgiui.
      Visa informacija ir pastabos, svarbios duomenų aiškinimui, turi būti pateikiamos ataskaitoje, ypač atsižvelgiant į priemaišas ir medžiagos fizinę būseną.
      4.   LITERATŪRA
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final.
               
            
                  2)
               
               
                  IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, volume II.
               
            
                  3)
               
               
                  R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.
               
            
         Priedėlis
         Papildomos techninės informacijos, pavyzdžiui, galima ieškoti šiuose standartuose.
         1.   Ebulioskopas
         
                     ASTM D 1120-72
                  
                  
                     Standard test method for boiling point of engine anti-freezes
                  
               2.   Distiliavimo procesas (virimo intervalas)
         
                     ISO/R 918
                  
                  
                     Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)
                  
               
                     BS 4349/68
                  
                  
                     Method for determination of distillation of petroleum products
                  
               
                     BS 4591/71
                  
                  
                     Method for determination of distillation characteristics
                  
               
                     DIN 53171
                  
                  
                     Losungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes
                  
               
                     NF T 20-608
                  
                  
                     Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation
                  
               3.   Diferencinė terminė analizė ir diferencinė skenuojamoji kalorimetrija
         
                     ASTM E 537-76
                  
                  
                     Standard method for assessing the thermal
                  
               
                     ASTM E 473-85
                  
                  
                     Standard definitions of terms relating to thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 472-8
                  
                  
                     Standard practice for reporting thermaanalytical data
                  
               
                     DIN 51005
                  
                  
                     Thermische Analyse: Begriffe
                  
               
      A.3.   SANTYKINIS TANKIS
      1.   METODAS
      Apibūdintieji metodai yra pagrįsti OECD Test Guideline (1). Pagrindiniai principai yra pateikti 2 nuorodoje.
      1.1.   ĮVADAS
      Apibūdintieji santykinio drėgnumo nustatymo metodai yra be apribojimų taikomi kietosioms ir skystosioms medžiagoms atsižvelgiant į jų grynumo laipsnį. Naudotini metodai pateikti 1 lentelėje.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Kietųjų kūnų arba skysčių santykinis tankis  yra tikrinamos medžiagos tūrio masės, nustatytos 20 °C temperatūroje, santykis su tokio paties tūrio vandens mase, nustatyta 4 °C temperatūroje. Santykinis tankis dimensijos neturi.
      Medžiagos tankis ρ yra jos masės m ir tūrio v dalmuo.
      Tankis ρ nurodomas SI vienetais – kg/m3.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS (1) (3)
      Nebūtina etalonines medžiagas naudoti visais atvejais, kai tyrinėjama nauja medžiaga. Pirmiausia jos turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant metodo veikimą ir lyginant gautus rezultatus su kitais metodais gautais rezultatais.
      1.4.   METODŲ ESMĖ
      Naudojamos keturios metodų klasės.
      1.4.1.   Plūdrumo metodai
      1.4.1.1.   Areometras (skystosioms medžiagoms)
      
      Tankis gali būti pakankamai tiksliai ir greitai nustatomas plūduriuojančiu areometru, kuriuo įmanoma nustatyti skysčio tankį pagal imersijos gylį remiantis graduotos skalės parodymais.
      1.4.1.2.   Hidrostatinė pusiausvyra (skystosioms ir kietosioms medžiagoms)
      
      Mėginio, pasverto ore ir atitinkamame skystyje (pvz., vandenyje) svorių skirtumas gali būti naudojamas tankiui nustatyti.
      Kietiesiems kūnams matuojamas tankis – tai vienintelis naudoto konkretaus mėginio pavyzdys. Nustatant skysčių tankį, žinomo tūrio v kūnas yra sveriamas iš pradžių ore, po to – skystyje.
      1.4.1.3.   Panardintų kūnų metodas (skystosioms medžiagoms) (4)
      
      Pagal šį metodą skysčio tankis yra nustatomas pagal duomenų, gautų sveriant skystį prieš žinomo tūrio kūno panardinimą į jį, panardinus į jį ir ištraukus iš jo, skirtumą.
      1.4.2.   Piknometro metodai
      Kietiesiems kūnams ir skysčiams gali būti naudojami įvairių formų ir žinomo tūrio piknometrai. Tankis apskaičiuojamas paėmus pilno ir tuščio piknometro svorio ir jo žinomo tūrio skirtumą.
      1.4.3.   Oro palyginimo piknometras (kietiesiems kūnams)
      
      Bet kokios formos kietojo kūno tankį galima išmatuoti kambario temperatūroje su dujų palyginimo piknometru. Medžiagos tūris matuojamas įvairiai kalibruotame tūrio cilindre ore arba inertinėse dujose. Užbaigus tūrio matavimą, tankio apskaičiavimams vieną kartą matuojama masė.
      1.4.4.   Virpesių densitometras (5) (6) (7)
      
      Skysčio tankis gali būti matuojamas virpesių densitometru. U raidės formos mechaninis osciliatorius vibruojamas osciliatoriaus rezonanso dažniu, kuris priklauso nuo jo masės. Dedant mėginio, keičiasi osciliatoriaus rezonanso dažnis. Aparatas turi būti kalibruojamas pagal dvi žinomo tankio skystąsias medžiagas. Geriau šias medžiagas parinkti taip, kad jų tankiai apimtų matuotiną intervalą.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Skirtingų metodų, naudojamų santykiniam tankiui nustatyti, pritaikymo galimybė pateikta lentelėje.
      1.6.   METODŲ APIBŪDINIMAS
      Standartai, kuriuose, pavyzdžiui, reikėtų ieškoti informacijos apie papildomus techninius ypatumus, yra pateikti priede.
      Tyrimai turi vykti 20 oC temperatūroje, atliekant ne mažiau kaip du matavimus.
      2.   DUOMENYS
      Žr. standartus.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      Ataskaitoje apie tyrimą, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  naudotas metodas,
               
            
                  —
               
               
                  tikslios medžiagos charakteristikos (identiškumas ir priemaišos) bei išankstinio gryninimo, jeigu toks naudojamas, stadija.
               
            Santykinis tankis  pateikiamas kaip apibrėžta 1.2 punkte, kartu pateikiant duomenis apie matuotos medžiagos fizinę būseną.
      Pateikiama visa informacija ir pastabos, svarbios aiškinant rezultatus, kuriuos reikia pateikti ataskaitoje, ypač atsižvelgiant į priemaišas ir medžiagos fizinę būseną.
      Lentelė
      Metodų pritaikymas
      
                  Matavimo metodas
               
               
                  Tankis
               
               
                  Didžiausia galima dinaminė klampa
               
               
                  Galiojantis standartas
               
            
                  Kietieji kūnai
               
               
                  Skysčiai
               
            
                  
                              1.4.1.1.
                           
                           
                              Areometras
                           
                        
               
                   
               
               
                  Taip
               
               
                  5 Pa s
               
               
                  ISO 387
                  ISO 649-2
                  NF T 20-050
               
            
                  
                              1.4.1.2.
                           
                           
                              Hidrostatinė pusiausvyra
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              a)
                           
                           
                              kietieji kūnai
                           
                        
               
                  Taip
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  ISO 1183 (A)
               
            
                  
                              b)
                           
                           
                              skysčiai
                           
                        
               
                   
               
               
                  Taip
               
               
                  5 Pa s
               
               
                  ISO 901 ir 758
               
            
                  
                              1.4.1.3.
                           
                           
                              Panardintų kūnų metodas
                           
                        
               
                   
               
               
                  Taip
               
               
                  20 Pa s
               
               
                  DIN 53217
               
            
                  
                              1.4.2.
                           
                           
                              Piknometras
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  ISO 3507
               
            
                  
                              a)
                           
                           
                              kietieji kūnai
                           
                        
               
                  Taip
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  ISO 1183(B)
                  NF T 20-053
               
            
                  
                              b)
                           
                           
                              skysčiai
                           
                        
               
                   
               
               
                  Taip
               
               
                  500 Pa s
               
               
                  ISO 758
               
            
                  
                              1.4.3.
                           
                           
                              Oro palyginamasis piknometras
                           
                        
               
                  Taip
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  DIN 55990
                  Teil 3 DIN 53243
               
            
                  
                              1.4.4.
                           
                           
                              Virpesių densitometras
                           
                        
               
                   
               
               
                  Taip
               
               
                  5 Pa s
               
               
                   
               
            4.   LITERATŪRA
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2)
               
               
                  R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.
               
            
                  3)
               
               
                  IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508.
               
            
                  4)
               
               
                  Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.ll, p. 427–430.
               
            
                  5)
               
               
                  Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, p. 297–302.
               
            
                  6)
               
               
                  Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen –Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, p. 717–726.
               
            
                  7)
               
               
                  Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, p. 253–255.
               
            
         Priedėlis
         Papildomos techninės informacijos, pavyzdžiui, galima ieškoti šiuose standartuose:
         1.   Klampumo metodai
         1.1.   Areometras
         
                     DIN 12790, ISO 387
                  
                  
                     Areometras; bendrosios instrukcijos
                  
               
                     DIN 12791
                  
                  
                     I dalis. Tankio areometrai; konstrukcija
                     II dalis. Tankio areometrai; standartizuoti matmenys, paskirtis
                     III dalis. Naudojimas ir tyrimas
                  
               
                     ISO 649-2
                  
                  
                     Laboratoriniai stikliniai indai. Bendros paskirties tankio areometrai
                  
               
                     NF T 20-050
                  
                  
                     Cheminiai produktai pramoniniam naudojimui. Skysčių tankio Nustatymas. Areometrinis metodas
                  
               
                     DIN 12793
                  
                  
                     Laboratoriniai stikliniai indai: intervalo nustatymo areometrai
                  
               1.2.   Hidrostatinė pusiausvyra
         Kietosioms medžiagoms
         
                     ISO 1183
                  
                  
                     A metodas. Plastikų tankio ir santykinio tankio nustatymo metodai, išskyrus akytųjų plastikų
                  
               
                     NF T 20-049
                  
                  
                     Cheminiai produktai pramoniniam naudojimui. Kietųjų kūnų, išskyrus miltelių ir akytųjų medžiagų, tankio nustatymas. Hidrostatinės pusiausvyros metodas
                  
               
                     ASTM-D-792
                  
                  
                     Plastmasių savitasis sunkis ir tankis
                  
               
                     DIN 53479
                  
                  
                     Plastmasių ir elastinių medžiagų tyrimas; tankio nustatymas
                  
               Skystosioms medžiagoms
         
                     ISO 901
                  
                  
                     ISO 758
                  
               
                     DIN 51757
                  
                  
                     Mineralinių alyvų ir susijusių medžiagų tyrimas; tankio nustatymas
                  
               
                     ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 ir ASTM D 1481-62
                  
               
                     ASTM D 1298
                  
                  
                     Nevalytos naftos ir skystų naftos produktų tankio, savitojo sunkio arba API sunkio nustatymas areometrijos metodu
                  
               
                     BS 4714
                  
                  
                     Nevalytos naftos ir skystų naftos produktų tankio, savitojo sunkio arba API sunkio nustatymas areometrijos metodu
                  
               1.3.   Panardintų kūnų metodas
         
                     DIN 53217
                  
                  
                     Dažų, lakų ir panašių dengiančiųjų medžiagų tyrimas; tankio nustatymas; panardintų kūnų metodas
                  
               2.   Piknometrijos metodai
         2.1.   Skystosioms medžiagoms
         
                     ISO 3507
                  
                  
                     Piknometrai
                  
               
                     ISO 758
                  
                  
                     Skystieji cheminiai produktai; tankio nustatymas 20 oC temperatūroje
                  
               
                     DIN 12797
                  
                  
                     
                        Gay-Lussac piknometras (nelakiems skysčiams, kurie nėra per klampūs)
                  
               
                     DIN 12798
                  
                  
                     
                        Lipkin piknometras (skysčiams, kurių kinematinė klampa mažesnė kaip 100 × 10-6 m2 s-1 15 oC temperatūroje)
                  
               
                     DIN 12800
                  
                  
                     
                        Sprengel piknometras (skysčiams kaip DIN 12798)
                  
               
                     DIN 12801
                  
                  
                     
                        Reischauer piknometras (skysčiams, kurių kinematinė klampa mažesnė kaip 100 × 10-6 m2 s-1 20 oC temperatūroje, taip pat taikoma angliavandeniams ir vandens tirpalams su aukštesniu garų slėgiu, apytiksliai 1 baras 90 oC temperatūroje)
                  
               
                     DIN 12806
                  
                  
                     
                        Hubbard piknometras (visų rūšių klampiems skysčiams, kurių slėgis nėra per aukštas, ypač dažams, lakui ir bitumui)
                  
               
                     DIN 12807
                  
                  
                     
                        Bingham piknometras (skysčiams, kaip DIN 12801)
                  
               
                     DIN 12808
                  
                  
                     
                        Jaulmes piknometras (ypač etanoliui ir vandens tirpalui)
                  
               
                     DIN 12809
                  
                  
                     Piknometras su pagrindiniu termometru ir kapiliariniu vamzdeliu (skysčiams, kurie nėra per klampūs)
                  
               
                     DIN 53217
                  
                  
                     Dažų, lakų ir panašių produktų tyrimas; tankio nustatymas piknometru
                  
               
                     DIN 51757
                  
                  
                     7 punktas. Mineralinių alyvų ir susijusių medžiagų tyrimas; tankio nustatymas
                  
               
                     ASTM D 297
                  
                  
                     15 skirsnis. Gumos produktai – cheminė analizė
                  
               
                     ASTM D 2111
                  
                  
                     C metodas. Halogenizuoti organiniai junginiai
                  
               
                     BS 4699
                  
                  
                     Naftos produktų savitojo sunkio ir tankio nustatymo metodas (graduoto bikapiliarinio piknometro metodas)
                  
               
                     BS 5903
                  
                  
                     Naftos produktų santykinio tankio ir tankio nustatymo metodas kapiliariniu – užkimštu piknometru
                  
               
                     NF T 20-053
                  
                  
                     Cheminiai produktai pramoniniam naudojimui. Milteliuose ir skysčiuose esančių kietųjų dalelių tankio nustatymas
                  
               2.2.   Kietosioms medžiagoms
         
                     ISO 1183
                  
                  
                     B metodas. Plastikų, išskyrus akytųjų, tankio ir santykinio tankionustatymo metodai
                  
               
                     NF T 20-053
                  
                  
                     Cheminiai produktai pramoniniam naudojimui. Milteliuose ir skysčiuose esančių kietųjų dalelių tankio nustatymas. Piknometro metodas
                  
               
                     DIN 19683
                  
                  
                     Dirvožemių tankio nustatymas
                  
               3.   Oro palyginimo piknometras
         
                     DIN 55990
                  
                  
                     3 dalis: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte
                  
               
                     DIN 53243
                  
                  
                     Anstrichstoffe; chlorhaltige Polymere; Prüfung
                  
               
      A.4.   GARŲ SLĖGIS
      1.   METODAS
      Dauguma apibūdintų metodų yra pagrįsti OECD Test Guideline (1). Pagrindiniai principai pateikti 2 ir 3 nuorodoje.
      1.1.   ĮVADAS
      Naudinga turėti išankstinę informaciją apie šiam tyrimui reikalingos medžiagos struktūrą, lydymosi temperatūrą ir virimo temperatūrą.
      Nėra vienintelės matavimų eigos, taikytinos įvairiems garų slėgiams. Todėl garų slėgiui nuo < 10-4 iki 105 Pa matuoti rekomenduojama naudoti kelis metodus.
      Paprastai priemaišos turi įtakos garų slėgiui ir tai visų pirma priklauso nuo priemaišų rūšies.
      Jeigu bandinyje yra lakių priemaišų, kurios galėtų turėti įtakos rezultatams, medžiaga gali būti gryninama. Taip pat tiktų nustatyti garų slėgį techninėms medžiagoms.
      Kai kuriuose čia apibūdintuose metoduose naudojamas aparatas su metalinėmis dalimis; į tai turėtų būti atsižvelgiama tiriant ėsdinančias (ardančias) medžiagas.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Medžiagos garų slėgis yra apibrėžiamas kaip sočiųjų garų slėgis virš kietosios arba skystosios medžiagos. Esant termodinaminei pusiausvyrai grynos medžiagos garų slėgis – tai tik temperatūros funkcija.
      Naudotinas slėgio vienetas SI turėtų būti paskalis (Pa).
      Vienetai, kurie buvo istoriškai naudojami, kartu su atitikmenų koeficientais:
      
                  1 toras(1mmHg)
               
               
                  = 1,333 × 102 Pa
               
            
                  1 atmosfera
               
               
                  = 1,013 × 105 Pa
               
            
                  1 baras
               
               
                  = 105 Pa
               
            Temperatūros vienetas SI sistemoje – kelvinas (K).
      Universalioji molinė dujų konstanta R = 8,314 J mol-1 K-1.
      Dujų slėgio temperatūrinė priklausomybės yra apibūdinta Clausius-Clapeyron lygtimi:
      
         
      kai:
      
                  p
               
               
                  =
               
               
                  medžiagos garų slėgis paskaliais
               
            
                  Δ Hy
                  
               
               
                  =
               
               
                  garinimo šiluma, J mol-1
                  
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  universalioji molinė dujų konstanta, J mol-1 K-1
                  
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  termodinaminė temperatūra, K
               
            1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nebūtina naudoti etaloninių medžiagų visais tais atvejais, kai tiriama nauja medžiaga. Pirmiausia jos turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant šio metodo veikimą ir gautiems rezultatams palyginti su kitų metodų rezultatais.
      1.4.   TYRIMO METODŲ ESMĖ
      Garų slėgiui nustatyti yra siūlomi septyni metodai, kuriuos galima taikyti skirtingiems garų slėgio intervalams. Kiekvienu metodu garų slėgis yra nustatomas įvairiose temperatūrose. Kai temperatūrų intervalas ribotas, grynosios medžiagos garų slėgio logaritmas yra temperatūros inversijos tiesinė funkcija.
      1.4.1.   Dinaminis metodas
      Dinaminiu metodu yra matuojama virimo temperatūra, kuri priklauso nuo apibrėžto slėgio.
      Rekomenduojamas intervalas:
      10–10 Pa.
      Šis metodas taip pat rekomenduojamas nustatant normalią virimo temperatūrą ir yra patogus, kai temperatūra yra iki 600 K.
      1.4.2.   Statinis metodas
      Statiniuose procesuose, esant termodinaminei pusiausvyrai, uždaroje sistemoje susidaręs garų slėgis yra nustatomas apibrėžtoje temperatūroje. Šis metodas tinka vienkomponentėms ir daugiakomponentėms kietosioms ir skystosioms medžiagoms.
      Rekomenduojamas intervalas:
      10–10 Pa.
      Šis metodas taip pat gali būti naudojamas 1–10 Pa intervale, jeigu atsargiai elgiamasi.
      1.4.3.   Izoteniskopas
      Šis standartizuotas metodas taip pat yra statinis metodas, bet paprastai netinka daugiakomponentėms sistemoms. Papildomos informacijos galima gauti: ASTM metodas D-2879-86.
      Rekomenduojamas intervalas:
      nuo 100 iki 10 Pa.
      1.4.4.   Efuzijos metodas: garų slėgio pusiausvyra
      Medžiagos kiekis, išeinantis iš elemento per laiko vienetą per žinomo dydžio apertūrą yra nustatomas vakuume taip, kad medžiagos sugrįžimas į elementą būtų nedidelis (pvz., matuojant impulsą, generuotą jautrioje pusiausvyroje garų čiurkšle arba matuojant prarastą svorį).
      Rekomenduojamas intervalas:
      10-3–1 Pa.
      1.4.5.   Efuzijos metodas: svorio praradimu arba sugaudant išgaravusias medžiagas
      Metodas pagrįstas tiriamos medžiagos, garų pavidalu išlekiančios iš Knudsen elemento (4) per laiko vienetą per angą ultravakuumo sąlygomis, masės apskaičiavimui. Ištekėjusių garų masę galima gauti nustatant elemento prarastą masę arba kondensuojant garus žemoje temperatūroje ir nustatant išgarintos medžiagos kiekį chromatografinės analizės būdu. Garų slėgis apskaičiuojamas naudojant Hertz-Knudsen priklausomybę.
      Rekomenduojamas intervalas:
      10-3–1 Pa.
      1.4.6.   Dujų soties metodas
      Inertinių nešančiųjų dujų srovė leidžiama virš medžiagos taip, kad ji įsisotina jų garais. Medžiagos, perneštos žinomu nešančiųjų dujų kiekiu, kiekis yra matuojamas arba surenkant į tinkamą gaudyklę, arba betarpiška analizine technika. Tai naudojama garų slėgiui apskaičiuoti esant tam tikrai temperatūrai.
      Rekomenduojamas intervalas:
      10-4–1 Pa.
      Šį metodą taip pat galima naudoti 1–10 Pa intervale, jeigu atsargiai elgiamasi.
      1.4.7.   Sukamasis rotorius
      Sukamojo rotoriaus manometre tikrasis matavimo elementas – plieno rutuliukas, kybantis magnetiniame lauke ir besisukantis labai dideliu greičiu. Dujų slėgis yra nustatomas pagal nuo slėgio priklausantį plieno rutuliuko lėtėjimą.
      Rekomenduojamas intervalas:
      10-4–0,5 Pa.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Įvairūs garų slėgio nustatymo metodai yra palyginami pagal jų taikytinumą, pasikartojamumą, atkuriamumą, matavimo intervalą, galiojantį standartą. Tai padaryta šioje lentelėje.
      
                  Matavimo metodas
               
               
                  Medžiagos
               
               
                  Apskaičiuojamas pasikartojamumas (7)
                  
               
               
                  Apskaičiuotas atkuriamumas (7)
                  
               
               
                  Rekomenduojamas intervalas
               
               
                  Galiojantis standartas
               
            
                  kietosios
               
               
                  skystosios
               
            
                  
                              1.4.1.
                           
                           
                              Dinaminis metodas
                           
                        
               
                  Mažai tirpios
               
               
                  Taip
               
               
                  Iki 25 %
               
               
                  Iki 25 %
               
               
                  Nuo 103 Pa iki 2 × 103 Pa
               
               
                  —
               
            
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  1–5 %
               
               
                  1–5 %
               
               
                  Nuo 2 × 103 Pa iki 105 Pa
               
               
                  —
               
            
                  
                              1.4.2.
                           
                           
                              Statinis metodas
                           
                        
               
                  Taip
               
               
                  Taip
               
               
                  5–10 %
               
               
                  5–10 %
               
               
                  10 Pa– 105 Pa (8)
                  
               
               
                  NFT 20-048 (5)
               
            
                  
                              1.4.3.
                           
                           
                              Izoteniskopas
                           
                        
               
                  Taip
               
               
                  Taip
               
               
                  5–10 %
               
               
                  5–10 %
               
               
                  102 Pa– 105 Pa
               
               
                  ASTM-D
                  2879-86
               
            
                  
                              1.4.4.
                           
                           
                              Efuzijos metodas – garų slėgio pusiausvyra
                           
                        
               
                  Taip
               
               
                  Taip
               
               
                  5–20 %
               
               
                  Iki 50 %
               
               
                  10 -3 Pa– 1 Pa
               
               
                  NFT
                  20-047(6)
               
            
                  
                              1.4.5.
                           
                           
                              Efuzijos metodas – svorio praradimas
                           
                        
               
                  Taip
               
               
                  Taip
               
               
                  10–30 %
               
               
                  —
               
               
                  10-3 Pa–1 Pa
               
               
                  —
               
            
                  
                              1.4.6.
                           
                           
                              Dujų soties metodas
                           
                        
               
                  Taip
               
               
                  Taip
               
               
                  10–30 %
               
               
                  Iki 50 %
               
               
                  10-4 Pa– 1 Pa (8)
                  
               
               
                  —
               
            
                  
                              1.4.7.
                           
                           
                              Sukamojo rotoriaus metodas
                           
                        
               
                  Taip
               
               
                  Taip
               
               
                  10–20 %
               
               
                  —
               
               
                  10-4 Pa– 0,5 Pa
               
               
                  —
               
            1.6.   METODŲ APIBŪDINIMAS
      1.6.1.   Dinaminis matavimas
      1.6.1.1.   Aparatūra
      Paprastai matavimo aparatūrą sudaro virinimo indas su stikliniu arba metaliniu aušintuvu (1 pav), temperatūros matavimo įrenginys ir slėgio reguliavimo ir matavimo įrenginys. Paveiksle parodytas paprastas matavimo aparatas yra padarytas iš karščiui atsparaus stiklo ir sudarytas iš penkių dalių.
      Didelį, iš dalies dvigubų sienelių vamzdį sudaro matinio gaubto jungtis, aušintuvas, aušinimo indas ir įsiurbimo anga.
      Stiklo cilindras su Cottrell„siurbliu“ yra įtaisomas vamzdyje virinimo dalyje, o smulkinto stiklo paviršius yra nelygus, kad būtų išvengiama „kunkuliavimo“ virinimo metu.
      Temperatūra matuojama atitinkamu temperatūros jutikliu (pvz., varžiniu termometru, gaubto termoelementas, panardintas aparate iki matavimo padalos (1 pav, Nr. 5) per atitinkamą įsiurbimo angą (pvz., vidinį šlifą).
      Reikalingos jungtys yra padarytos taip, kad būtų galima reguliuoti slėgį ir tiktų matavimo įrenginiui.
      Kolba, kuri veikia kaip buferinis tūris, su matavimo aparatu yra sujungta kapiliariniu vamzdeliu.
      Virinimo indas kaitinamas kaitinimo elementu, iš apačios įdėtu į stiklinį aparatą. Kaitinimui reikalinga srovė nustatoma ir reguliuojama termoelementu.
      Vakuuminiu siurbliu sudaromas būtinas vakuumas tarp 102 Pa ir apytikriai 105 Pa.
      Slėgiui reguliuoti naudojamas atitinkamas vožtuvas orui arba azotui matuoti (matavimo intervalas apytikriai 102–105 Pa) ir ventiliuoti.
      Slėgis matuojamas manometru.
      1.6.1.2.   Matavimo eiga
      Garų slėgis matuojamas nustatant mėginio temperatūrą įvairiuose apibrėžtuose slėgiuose, apie 103–105 Pa. Nekintanti temperatūra esant pastoviam slėgiui rodo, kad pasiekta virimo temperatūra. Šio metodo negalima naudoti putokšliams matuoti.
      Medžiaga dedama į švarų sausą indą. Gali būti sunkumų naudojant nemiltelinius kietuosius kūnus, bet jų kartais nelieka pašildant aušinimo gaubtą. Kai tik indas užpildomas, aparato jungė užsandarinama, o medžiaga degazuojama. Tada nustatomas žemiausias norimas slėgis ir įjungiamas kaitinimas. Tuo pačiu metu temperatūros jutiklis sujungiamas su savirašiu.
      Pusiausvyra pasiekiama, kai esant pastoviam slėgiui užregistruojama pastovi temperatūra. Reikia būti ypač atsargiems ir virinimo metu vengti kunkuliavimo. Be to, ant aušintuvo turi vykti kondensacija. Nustatant blogai besilydančių medžiagų garų slėgį, stebėti, kad neužsikimštų kondensatorius.
      Užregistravus pusiausvyros tašką, nustatomas didesnis slėgis. Ši darbo eiga tęsiama, kol pasiekiama 105 Pa (iš viso apie 5–10 matavimo taškų). Kontrolei matavimo taškai turi būti kartojami slėgiui mažėjant.
      1.6.2.   Statinis matavimas
      1.6.2.1.   Aparatūra
      Aparatą sudaro indas su mėginiu, kaitinimo ir aušinimo sistema mėginio temperatūrai reguliuoti ir temperatūrai matuoti. Į aparatą taip pat įeina prietaisai slėgiui nustatyti ir matuoti. 2a ir 2b paveiksluose parodyti pagrindiniai naudoti principai.
      Prie mėginio kameros (2a pav.) iš vienos pusės yra pritvirtinamas atitinkamas didelio slėgio vožtuvas. U formos vamzdelis, kuriame yra atitinkamas manometro skystis, yra pritvirtinamas iš kitos pusės. Vienas U formos vamzdelio galas atsišakoja į vakuuminį siurblį, azoto cilindrą arba ventiliacijos vožtuvą ir manometrą.
      Vietoje U formos vamzdelio gali būti naudojamas manometras su slėgio indikatoriumi (2b pav.).
      Mėginio temperatūrai reguliuoti, mėginio indas su vožtuvu ir U formos vamzdeliu arba manometru dedamas į vonią, kurioje palaikoma pastovi ±0,2 K temperatūra. Temperatūra matuojama išorinėje indo, kuriame yra mėginys, sienelės pusėje arba pačiame inde.
      Vakuuminis siurblys su prieš srovę veikiančiu aušinimo sifonu naudojamas sudaryti vakuumą aparate.
      2a metodu medžiagos garų slėgis yra matuojamas netiesiogiai naudojant nulinį indikatorių. Tokiu būdu atsižvelgiama į tai, kad U formos vamzdelyje esančio skysčio tankis pasikeičia, jeigu temperatūra smarkiai keičiasi.
      Manometre gali būti naudojamas gyvsidabris, esant įprastam slėgiui iki 102 Pa, o silikatinės
      alyvos bei ftalatai tinka naudoti, kai slėgis yra žemesnis nei 102 Pa, bet ne žemesnis nei 10 Pa. Kai slėgis žemesnis nei 10-1 Pa, galima naudoti netgi manometrus su kaitinamosiomis membranomis. Kai slėgis žemesnis nei 102 Pa, naudojami ir kitokie manometrai.
      1.6.2.2.   Matavimų eiga
      Prieš matuojant visos 2 pav. pavaizduoto prietaiso dalys turi būti kruopščiai išvalytos ir išdžiovintos.
      Pagal 2a metodą U formos vamzdelis užpildomas pasirinktu skysčiu, kuris prieš užrašant parodymus gali būti degazuotas aukštesnėje temperatūroje.
      Tiriamoji medžiaga dedama į aparatą, kuris po to uždaromas, o temperatūra sumažinama tiek, kad būtų galima atlikti degazavimą. Temperatūra turi būti pakankamai žema, kad būtų užtikrintas oro išsiurbimas, bet daugiakomponenčių sistemų atveju tai neturi pakeisti medžiagos struktūros. Jeigu reikia, maišant galima greičiau nustatyti pusiausvyrą.
      Mėginį galima peršaldyti, pvz., skystu azotu (stengiantis, kad neįvyktų oro arba siurblyje esančio skysčio kondensacija) arba etanolio ir sauso ledo mišiniu. Žemai temperatūrai matuoti naudojama reguliuojamos temperatūros vonia, sujungta su ypač žemos temperatūros matuokliu.
      Atidarius mėginio indo vožtuvą, siurbiama kelias minutes, kad būtų pašalintas oras. Po to vožtuvas uždaromas, o mėginio temperatūra sumažinama iki žemiausio norimo lygio. Prireikus degazavimo veiksmai turi būti pakartojami kelis kartus.
      Mėginį kaitinant garų slėgis kyla. Tai pakeičia U formos vamzdelyje esančio skysčio pusiausvyrą. Jai atstatyti į aparatą per vožtuvą leidžiama azoto arba oro, kol slėgio indikatoriaus skystis vėl bus ties nuline padala. Tam reikalingą slėgį gali kambario temperatūroje parodyti precizinis manometras. Šis slėgis atitinka medžiagos garų slėgį tam tikroje matuojamoje temperatūroje.
      2b metodas yra panašus, bet garų slėgio parodymai nuskaitomi tiesiogiai.
      Garų slėgio priklausomybė nuo temperatūros yra nustatoma mažais intervalais (iš viso apytikriai 5-10 matavimo taškų) iki norimo maksimumo. Žemos temperatūros parodymus reikia pakartotinai išmatuoti.
      Jeigu iš pakartotinių matavimų gautos vertės nesutampa su esančiomis kreivėje, gautoje padidinus temperatūrą, tai gali būti dėl vienos iš šių priežasčių:
      
                  1.
               
               
                  Mėginyje tebėra oro (pvz., didelio klampumo medžiagose) arba liko medžiagų, kurių virimo temperatūra yra žema ir kuri/kurios išsiskiria kaitinimo metu. Jos gali būti pašalinamos išsiurbiant po papildomo peršaldymo.
               
            
                  2.
               
               
                  Aušinimo temperatūra yra nepakankamai žema. Šiuo atveju skystasis azotas naudojamas kaip aušalas.
                  Tiek 1, tiek 2 atveju matavimai turi būti pakartojami.
               
            
                  3.
               
               
                  Medžiagoje vyksta cheminė reakcija tyrinėjamame temperatūrų intervale (pvz., skilimas, polimerizacija).
               
            1.6.3.   Izoteniskopas
      Išsamų šio metodo aprašymą galima rasti 7 nuorodoje. Šio matavimo prietaiso principas pavaizduotas 3 paveiksle. Panašiai kaip statinis metodas, apibūdintas 1.6.2, izoteniskopas tinka tyrinėti kietuosius ir skystuosius kūnus.
      Jeigu tai skystieji kūnai, pati medžiaga naudojama kaip skystis pagalbiniame manometre. Į izoteniskopą dedamas toks kiekis skysčio, kurio pakanka kolbai užpildyti, ir prie izoteniskopo pritaisoma trumpoji manometro kojelė. Izoteniskopas pritaisomas prie vakuuminės sistemos, iš jos išsiurbiamas oras, po to užpildoma azotu. Sistemos išsiurbimas ir išvalymas kartojamas du kartus, kad būtų pašalinamas liekamasis deguonis. Užpildytas izoteniskopas dedamas horizontaliai, kad mėginys mėginio kolboje ir manometro sekcijoje (U dalis) pasklistų plonu sluoksniu. Slėgis sistemoje sumažinamas iki 133 Pa, o mėginys yra iš lengvo šildomas, kol ima virti (ištirpusių sujungtųjų dujų pašalinimas). Tada izoteniskopas dedamas taip, kad mėginys vėl atsirastų kolboje ir trumpojoje manometro kojelėje ir abu būtų pilni skysčio. Palaikomas toks pat slėgis kaip degazuojant; išsikišęs mėginio kolbos galiukas šildomas nedidelėje liepsnoje, kol išsiskyrę mėginio garai gerai pasklis ir išstums dalį mėginio iš viršutinės kolbos dalies ir manometro kojelės į izoteniskopo manometro sekciją, sudarydami garų pripildytą be azoto erdvę.
      Po to izoteniskopas dedamas į pastovios temperatūros vonią, azoto slėgis derinamas tol, kol jo slėgis tampa lygus mėginio slėgiui. Slėgio pusiausvyrą parodo izoteniskopo manometro sekcija. Pusiausvyros sąlygomis azoto garų slėgis yra lygus medžiagos garų slėgiui.
      Kietosioms medžiagoms, atsižvelgiant į slėgį ir temperatūrų intervalą, yra naudojami manometro skysčiai, nurodyti 1.6.2.1. Tokiu atveju kietasis kūnas, kurį reikia ištirti, dedamas į kolbą ir degazuojamas padidintoje temperatūroje. Degazuotas manometro skystis pilamas į ilgosios izoteniskopo kojelės kolbelę. Po to izoteniskopas palenkiamas taip, kad manometre esantis skystis nutekėtų į U formos vamzdelį. Garų slėgis, kaip temperatūros funkcija, yra matuojamas pagal 1.6.2.
      1.6.4.   Efuzijos metodas: garų slėgio pusiausvyra
      1.6.4.1.   Aparatūra
      Įvairūs aparatūros variantai yra apibūdinti literatūros 1 nuorodoje. Joje apibūdintas aparatas iliustruoja bendrą naudojamą principą (4 pav.). 4 paveiksle parodytos pagrindinės aparato sudedamosios dalys: tai didelio vakuumo nerūdijančio plieno arba stiklo indas, įranga vakuumui sudaryti ir matuoti bei įmontuotos sudedamosios dalys garų slėgiui matuoti svarstyklėmis. Į aparatą įmontuotos šios sudedamosios dalys:
      
                  —
               
               
                  garinimo krosnis su junge ir sukamąja įsiurbimo anga. Garinimo krosnis – tai cilindrinis indas, pavyzdžiui, iš vario arba chemiškai atsparaus, gero šiluminio laidumo lydinio. Taip pat galima naudoti stiklinį indą vario sienelėmis. Krosnies skersmuo apie 3-5 cm, aukštis – 2-5 cm. Garų srovė išleidžiama per skirtingo dydžio angas, kurių būna nuo vienos iki trijų. Krosnis šildoma apačioje esančia kaitinimo plokšte arba iš išorės apvyniota spirale. Kad šiluma nebūtų veltui eikvojama pagrindinei plokštei kaitinti, šildytuvas ant pagrindinės plokštės tvirtinamas mažo terminio laidumo metalu (melchioras arba chromnikelinis plienas), pvz., melchioro vamzdelis pritaisomas prie sukamosios angos, jeigu naudojama krosnis su keliomis angomis. Šio įtaiso privalumas – galima įtaisyti varinį strypą. Taip galima aušinti iš išorinės pusės naudojant aušinimo vonią,
               
            
                  —
               
               
                  jeigu varinės krosnies dangtelyje yra trys skirtingo skersmens angos, viena nuo kitos esančios 90o kampu, galima apimti įvairius garų slėgio intervalus per visą matavimų intervalą (angų skersmuo apytikriai 0,30–4,50 mm). Didelės angos naudojamos mažam garų slėgiui ir atvirkščiai. Sukant krosnį galima nustatyti norimą angą arba tarpinę padėtį garų srovėje (krosnies skylė – skydas – svarstyklių lėkštė), išsiskiria molekulių srautas arba jis nukreipiamas per krosnies angą į svarstyklių lėkštę. Kad būtų išmatuota medžiagos temperatūra, termoelementas arba varžinis termometras dedamas tinkamoje vietoje,
               
            
                  —
               
               
                  virš skydo yra labai jautrių mikrosvarstyklių lėkštė (žr. toliau). Svarstyklių lėkštės skersmuo yra apie 30 mm. Paauksuotas aliuminis yra tam tinkanti medžiaga,
               
            
                  —
               
               
                  svarstyklių lėkštė yra apgaubta cilindrine žalvarine arba varine šaldymo dėže. Atsižvelgiant į svarstyklių rūšį joje yra angos svarstyklių svirtelei ir anga dangtyje molekulių srovei, kuri turėtų garantuoti visišką garų kondensaciją ant svarstyklių lėkštės. Šilumos išsiskyrimas į išorę, pavyzdžiui, yra užtikrinamas vario strypeliu, sujungtu su šaldymo dėže. Strypelis yra ištraukiamas per pagrindinę plokštę ir nuo jos termiškai izoliuojamas, pavyzdžiui, chromnikelio plieno vamzdeliu. Strypelis panardinamas į Diuaro indą su skystu azotu, esančiu po pagrindine plokšte, arba skystasis azotas cirkuliuoja strypeliu. Taip šaldymo dėžė yra laikoma apytikriai –120 oC temperatūroje. Svarstyklių lėkštė aušinama tik spinduliavimu, kurio pakanka, kad tiriamasis slėgio intervalas būtų pakankamas (aušinama apie 1 valandą iki matavimų pradžios),
               
            
                  —
               
               
                  svarstyklės dedamos virš šaldymo dėžės. Tinka, pavyzdžiui, labai jautrios svarstyklės, 2 pečių elektroninės mikrosvarstyklės (8) arba labai jautrus judamosios ritės prietaisas (žr. OECD Test Guideline 104, Edition 12.05.81),
               
            
                  —
               
               
                  pagrindinėje plokštelėje taip pat yra elektrinės jungtys termoelementams (arba varžiniams termometrams) ir kaitinimo ritėms,
               
            
                  —
               
               
                  vakuumas inde sudaromas naudojant dalinį vakuuminį siurblį (reikalingas vakuumas apytikriai 1-2 × 10-3 Pa, gaunamas po 2 valandų siurbimo). Slėgis reguliuojamas atitinkamu jonizacijos manometru.
               
            1.6.4.2.   Matavimų eiga
      Indas užpildomas tiriamąja medžiaga ir uždaromas dangteliu. Gaubtas ir šaldytuvo dėžė įstumiami į krosnį. Aparatas uždaromas ir įjungiami vakuumo siurbliai. Slėgis prieš pradedant matavimus turėtų būti apie 10-4 Pa. Šaldymo dėžės aušinimas pradedamas esant 10-2 Pa.
      Kai pasiekiamas reikalingas vakuumo lygis, pradedama kalibravimo serija žemiausioje reikalaujamoje temperatūroje. Nustatoma atitinkama anga dangtelyje, garų srovė teka per gaubtą tiesiai virš angos, į ataušintą svarstyklių lėkštę. Svarstyklių lėkštė turi būti pakankamai didelė, kad visa per gaubtą nukreipta srovė patektų į ją. Garų srovės savo jėga veikia į svarstyklių lėkštę, ir molekulės kondensuojasi ant vėsaus paviršiaus.
      Dėl vienkartinės ir vienalaikės kondensacijos reaguoja savirašis. Įvertinus signalus gaunama dviejų rūšių informacija:
      
                  1.
               
               
                  Čia apibūdintame aparate garų slėgis yra nustatomas tiesiogiai pagal garų postūmio kiekį į svarstyklių lėkštę (čia nereikia žinoti molekulinio svorio (2)). Kai vertinami parodymai, turi būti atsižvelgiama į tokius geometrinius veiksnius, kaip krosnies anga ir molekulinio srauto kampas.
               
            
                  2.
               
               
                  Tuo pačiu metu kondensato masę galima matuoti ir taip galima apskaičiuoti garavimo koeficientą. Taip pat galima apskaičiuoti garų slėgį pagal garavimo koeficientą ir molekulinį svorį pagal Herzo lygtį (2).
               
            
         
      kai:
      
                  G
               
               
                  =
               
               
                  garavimo koeficientas (kg s-1 m-2)
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  molinė masė (g mol-1)
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatūra (K)
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  universalioji molinė dujų konstanta (J mol-1 K-1)
               
            
                  p
               
               
                  =
               
               
                  garų slėgis (Pa)
               
            Pasiekus reikalingą vakuumą, pradedami matavimai žemiausioje norimoje matavimų temperatūroje.
      Tolesniems matavimams temperatūra didinama mažais intervalais, kol pasiekiama didžiausia norima temperatūros vertė. Po to mėginys aušinamas ir galima užrašyti antrą garų slėgio kreivę. Jeigu antro matavimo metu nepavyksta patvirtinti pirmo matavimo rezultatų, gali būti, kad medžiaga irsta matuojamame temperatūros intervale.
      1.6.5.   Efuzijos metodas – pagal prarastą svorį
      1.6.5.1.   Aparatūra
      Efuzijos aparatą sudaro šios pagrindinės dalys:
      
                  —
               
               
                  rezervuaras, kuriame galima nustatyti pastovią temperatūrą ir jį galima išsiurbti ir kur sudėti efuzijos elementai,
               
            
                  —
               
               
                  didelio vakuumo siurblys (pvz., difuzinis siurblys arba turbomolekulinis siurblys) su vakuumo matuokliu,
               
            
                  —
               
               
                  gaudyklė, kurioje naudojamas suskystintas azotas arba sausasis ledas.
               
            Kaip pavyzdys 5 paveiksle pavaizduotas elektra šildomas aliumininis vakuumo rezervuaras su 4 nerūdijančio plieno efuzijos elementais. Apytikriai 0,3 mm storio nerūdijančio plieno folijoje yra 0,2–1,0 mm skersmens efuzijos antgaliai, prie efuzijos elemento pritaisyti įsriegiamu dangteliu.
      1.6.5.2.   Matavimo eiga
      Etalonine ir tiriamąja medžiagomis užpildomas kiekvienas efuzijos elementas, metalinė diafragma su antgaliu yra apsaugota įsriegtu dangteliu, kiekvienas elementas pasveriamas 0,1 mg tikslumu. Elementas dedamas į aparatą su nustatyta temperatūra, kuriame oras išsiurbiamas tiek, kad slėgis būtų viena dešimtąja mažesnis negu reikalaujama. Apibrėžtais laiko intervalais nuo 5 iki 30 valandų į aparatą įleidžiama oro, o efuzijos elemento masės nuostolis nustatomas pakartotinai ją pasveriant.
      Norint užtikrinti, kad lakiosios priemaišos neturėtų įtakos rezultatams, elementas pakartotinai sveriamas apibrėžtais laiko intervalais, kad būtų patikrinama, ar garavimo sparta yra pastovi ne mažiau kaip du tokius laiko intervalus.
      Garų slėgis p efuzijos elemente gaunamas:
      
         
      kai:
      
                  p
               
               
                  =
               
               
                  garų slėgis (Pa)
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  medžiagos, išeinančios iš elemento per laiką t, masė (kg)
               
            
                  t
               
               
                  =
               
               
                  laikas (s)
               
            
                  A
               
               
                  =
               
               
                  skylės plotas (m2)
               
            
                  K
               
               
                  =
               
               
                  korekcijos koeficientas
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  universalioji dujų konstanta (J mol-1 K-1)
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatūra (K)
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  molekulinė masė (kg mol-1)
               
            Korekcijos koeficientas K priklauso nuo cilindrinio antgalio ilgio santykio su jo spinduliu:
      
                  Koeficientas
               
               
                  0,1
               
               
                  0,2
               
               
                  0,6
               
               
                  1,0
               
               
                  2,0
               
            
                  K
               
               
                  0,952
               
               
                  0,909
               
               
                  0,771
               
               
                  0,672
               
               
                  0,514
               
            Pirmiau pateikta lygtis gali būti užrašoma taip:
      
         
      kai  ir tai yra efuzijos elemento konstanta.
      Ši efuzijos elemento konstanta E gali būti nustatoma su etaloninėmis medžiagomis (2,9) pagal šią lygtį:
      
         
      kai:
      
                  p(r)
               
               
                  =
               
               
                  etaloninės medžiagos garų slėgis (Pa)
               
            
                  M(r)
               
               
                  =
               
               
                  etaloninės medžiagos molekulinė masė (kg. × mol-l)
               
            1.6.6.   Dujų soties metodas
      1.6.6.1.   Aparatūra
      Tipišką aparatą, naudojamą šiam tyrimui atlikti, sudaro keletas sudedamųjų dalių, nurodytų 6a paveiksle, kurios apibūdinamos toliau (1).
      Inertinės dujos
      Nešančiosios dujos neturi sukelti cheminės reakcijos su tiriamąja medžiaga. Paprastai šiam tikslui tinka azotas, bet kartais gali būti reikalingos kitos dujos (10). Naudojamos dujos turi būti sausos (žr. 6a paveikslą, 4 punktą: santykinio drėgnio jutiklis).
      Srauto kontrolė
      Atitinkama dujų kontrolės sistema yra reikalinga tam, kad būtų užtikrinta, jog per soties kolonėlę einantis srautas būtų pastovus ir toks, koks pasirinktas.
      Garų surinkimo gaudyklės
      Tai priklauso nuo tam tikrų bandinio ypatybių ir pasirinkto analizės metodo. Garų turėtų būti sugaunamas toks kiekis ir taip, kad po to būtų galima atlikti analizę. Tam tikroms tiriamosioms medžiagoms tinka gaudyklės su tokiais skysčiais kaip heksanas arba etilenglikolis. Kitoms medžiagoms gali būti naudojami kietieji absorbentai.
      Kaip garų sugaudymo ir po to atliekamos analizės alternatyva gali būti naudojama betarpiška tyrimų technika, pavyzdžiui, chromatografas, gali būti naudojama kiekybiškai nustatyti kiekį medžiagos, perneštos žinomu kiekiu nešančiųjų dujų. Be to, galima išmatuoti mėginio masės nuostolius.
      Šilumokaitis
      Matuojant skirtingose temperatūrose gali reikėti į agregatą įmontuoti šilumokaitį.
      Sotintuvo kolonėlė
      Mėginys iš tirpalo dedamas ant atitinkamo nejudančio laikiklio. Apdengtas laikiklis dedamas į soties kolonėlę, kurios dydžiai ir srauto greitis turėtų būti tokie, kad būtų užtikrinta visiška nešančiųjų dujų sotis. Soties kolonėlėje turi būti pastovi temperatūra. Matuojant aukštesnėje negu kambario temperatūroje, vieta tarp soties kolonėlės ir gaudyklių turėtų būti šildoma, kad būtų išvengta tiriamos medžiagos kondensacijos.
      Kad būtų sumažintas masės pernešimas, pasireiškiantis difuzija, kapiliarinis vamzdelis gali būti įtaisomas už soties kolonėlės (6b pav.)
      1.6.6.2.   Matavimo darbo eiga
      Soties kolonėlės paruošimas
      Tiriamos medžiagos tirpalas labai lakiame tirpiklyje dedamas į atitinkamą laikiklio kiekį. Turėtų būti dedamas pakankamas kiekis mėginio, kad tyrimo metu išliktų sotis. Visas tirpiklis išgarinamas ore arba sukamajame garintuve, ir gerai išmaišyta medžiaga dedama į sotintuvo kolonėlę. Nustačius pastovią bandinio temperatūrą, sausas azotas leidžiamas per aparatą.
      Matavimas
      Gaudyklės arba betarpiškai įtaisytas detektorius yra sujungti su kolonėlės nutekamuoju vamzdeliu, užrašomas laikas. Srauto greitis yra tikrinamas pradžioje ir reguliariais intervalais eksperimento eigoje, naudojant barboterį (arba visą laiką – debitmačiu).
      Turi būti matuojamas slėgis prie sotintuvo išėjimo angos. Tai gali būti daroma vienu iš būdu:
      
                  a)
               
               
                  įmontuojant manometrą tarp sotintuvo ir gaudyklių (to gali nepakakti, kadangi taip padidėja įrangos užimama erdvė ir adsorbcinis paviršius); arba
               
            
                  b)
               
               
                  nustatant staigų slėgio mažėjimą visoje konkrečioje sugaudymo sistemoje, atskirame eksperimente naudojamą kaip srauto greičio funkcija (tai gali nelabai tikti skysčių gaudyklėms).
               
            Laikas, reikalingas surinkti tokį tiriamos medžiagos kiekį, reikalingą skirtingiems analizės metodams, yra nustatomas atliekant išankstinius matavimus arba apskaičiavimus. Medžiagos surinkimas tolesniems mėginiams gali vykti naudojant betarpiškai įmontuotą kiekio tyrimo techniką (pvz., chromatografą). Prieš apskaičiuojant garų slėgį tam tikroje temperatūroje, turi būti atliekami išankstiniai matavimai, norint nustatyti didžiausią srauto greitį, kuris visiškai įsotins nešančiąsias dujas medžiagos garais. Tai garantuojama, jeigu nešančiosios dujos yra leidžiamos per sotintuvą pakankamai lėtai, kad mažesnis greitis nesukeltų didesnio apskaičiuotojo garų slėgio.
      Specialus analizės metodas nustatomas pagal tiriamos medžiagos prigimtį (pvz., dujų chromatografija arba gravimetrija).
      Nustatomas medžiagos kiekis, perneštos žinomu nešančiųjų dujų tūriu.
      1.6.6.3.   Garų slėgio apskaičiavimas
      Garų slėgis apskaičiuojamas pagal garų slėgį (W/V) tokia lygtimi:
      
         
      kai:
      
                  p
               
               
                  =
               
               
                  garų slėgis (Pa)
               
            
                  W
               
               
                  =
               
               
                  išgarinto mėginio masė (g)
               
            
                  V
               
               
                  =
               
               
                  įsotintų dujų tūris (m3)
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  universalioji molinė dujų konstanta (J mol-1 K1)
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatūra (K)
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  tiriamos medžiagos molinė masė (g mol-1)
               
            Matuojamiems tūriams turi būti koreguojami debitmačio ir sotintuvo su nustatyta temperatūra slėgio bei temperatūrų skirtumai. Jeigu debitmatis yra žemiau garų gaudyklės, koregavimas gali būti reikalingas atsižvelgiant į išgarintos gaudyklės ingredientus (1).
      1.6.7.   Sukamasis rotorius (8, 11, 13)
      1.6.7.1.   Aparatūra
      Sukamojo rotoriaus metodu gali būti naudojamas sukamojo rotoriaus klampumo matuoklis, kaip parodyta 8 paveiksle. Eksperimentinės konstrukcijos schema parodyta 7 paveiksle.
      Paprastai matavimo aparatas susideda iš sukamojo rotoriaus matavimo galvutės, įdėtos į apvalkalą su nustatyta temperatūra (reguliuojama 0,1 oC ribose). Konteineris su mėginiu dedamas į apvalkalą su nustatyta temperatūra (reguliuojama 0,01 oC ribose), o visos kitos konstrukcijos dalys yra laikomos aukštesnėje temperatūroje, kad būtų išvengiama kondensacijos. Didelio vakuumo siurblys sujungiamas su sistema didelio vakuumo vožtuvais.
      Sukamojo rotoriaus matavimo galvutę sudaro vamzdelyje esantis plieninis rutuliukas (4–5 mm skersmens). Rutuliukas kybo magnetiniame lauke, jam stabilizuoti paprastai naudojamas nuolatinio magneto ir reguliavimo ričių derinys.
      Rutuliukas sukamas ričių sukeliamu sukamuoju lauku. Griebiančiosios ritės, matuojančios visada egzistuojantį žemą šoninį kamuoliuko įmagnetinimą, naudojamos išmatuoti jo sukimosi greitį.
      1.6.7.2.   Matavimų eiga
      Kai rutuliukas pasiekia tam tikrą sukimosi greitį v(o) (paprastai apie 400 sūkių per sekundę), tolesnis energijos padavimas liaujasi ir dėl dujų trinties įvyksta stabdymas.
      Sukimosi greičio sumažėjimas matuojamas kaip laiko funkcija. Kadangi trintis dėl magnetinio sustabdymo palyginti su dujų trintimi yra nežymi, dujų slėgis p apskaičiuojamas taip:
      
         
      kai:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  vidutinis dujų molekulių greitis
               
            
                  r
               
               
                  =
               
               
                  rutuliuko spindulys
               
            
                  p
               
               
                  =
               
               
                  rutuliuko tankis
               
            
                  σ
               
               
                  =
               
               
                  liestinio judesio kiekio perdavos koeficientas (ε = 1, kai rutuliuko paviršius idealiai sferinis)
               
            
                  t
               
               
                  =
               
               
                  laikas
               
            
                  v(t)
               
               
                  =
               
               
                  sukimosi greitis, praėjus laikui t
               
            
                  v(o)
               
               
                  =
               
               
                  pradinis sukimosi greitis
               
            Ši lygtis gali būti užrašyta taip:
      
         
      kai tn, tn-1 yra laikas, reikalingas tam tikram apsisukimų skaičiui N atlikti. Šie laiko intervalai tn ir tn-1 eina vienas paskui kitą, o tn > tn-1.
      Vidutinis dujų molekulių greitis apskaičiuojamas pagal:
      
         
      kai:
      
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatūra
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  universalioji molinė dujų konstanta
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  molio masė
               
            2.   DUOMENYS
      Bet kuriame iš ankstesnių metodų garų slėgis turėtų būti nustatomas naudojant mažiausiai dvi temperatūras. Kai ribos yra nuo 0 iki 50 oC, norint patikrinti garų slėgio kreivės tiesiškumą, reikėtų naudoti tris arba daugiau temperatūras.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  taikytas tyrimo metodas;
               
            
                  —
               
               
                  tikslios medžiagos charakteristikos (identiškumas ir priemaišos) ir išankstinio gryninimo pakopa, jeigu tokia yra,
               
            
                  —
               
               
                  mažiausiai du garų slėgio ir temperatūros dydžiai, pageidautina 0–50 C ribose,
               
            
                  —
               
               
                  visi neapdoroti duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  log p ir 1/T kreivės santykis,
               
            
                  —
               
               
                  garų slėgio apskaičiavimas ribose, esant 20 arba 25 oC.
               
            Jei pastebimas keitimasis (būklės keitimasis, skilimas), reikia pažymėti šią informaciją:
      
                  —
               
               
                  keitimosi pobūdis,
               
            
                  —
               
               
                  temperatūra, kurioje esant atmosferiniam slėgiui prasideda keitimasis,
               
            
                  —
               
               
                  garų slėgis 10 ir 20 oC žemiau keitimosi temperatūros ir 10 ir 20 C aukščiau šios temperatūros (jei keitimasis nėra iš kietos į dujinę būseną).
               
            Visa rezultatų aiškinimui svarbi informacija ir pastabos turi būti pateikiamos ataskaitoje, ypač reikia pateikti informaciją apie medžiagos priemaišas ir fizinę būklę.
      4.   LITERATŪRA
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2)
               
               
                  Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol II.
               
            
                  3)
               
               
                  R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I.
               
            
                  4)
               
               
                  Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, p. 593.
               
            
                  5)
               
               
                  NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa – Static method.
               
            
                  6)
               
               
                  NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method.
               
            
                  7)
               
               
                  ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure- temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.
               
            
                  8)
               
               
                  G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987,'VoI. 5 (4), p. 2440.
               
            
                  9)
               
               
                  Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, p. 1173.
               
            
                  10)
               
               
                  B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, p. 435.
               
            
                  11)
               
               
                  G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, Vol. 17 (2), p. 642.
               
            
                  12)
               
               
                  G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, voI. 20 (4), p. 1148.
               
            
                  13)
               
               
                  J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, Vol. 3 (3), p. 1715.
               
            
         1 priedėlis
         Apskaičiavimų metodas
         ĮVADAS
         Apskaičiuotosios garų slėgio vertės gali būti naudojamos:
         
                     —
                  
                  
                     nusprendžiant, kuris eksperimentinis metodas tinkamas,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pateikiant apskaičiavimus arba ribinę vertę tais atvejais, kai eksperimentinio metodo negalima taikyti dėl techninių priežasčių (taip pat ir kai garų slėgis labai žemas),
                  
               
                     —
                  
                  
                     padėti nustatyti tuos atvejus, kai pagrįstai neatliekami eksperimentiniai matavimai, kadangi aplinkos temperatūroje garų slėgis gali būti < 10-5 Pa.
                  
               APSKAIČIAVIMO METODAS
         Skystųjų ir kietųjų kūnų garų slėgis gali būti apskaičiuojamas naudojant pakeistą Watson koreliaciją (a). Vieninteliai reikalingi eksperimentiniai duomenys – tai normali virimo temperatūra. Metodas turi būti taikomas visame slėgių intervale nuo 105 Pa iki 10-5 Pa.
         Išsami informacija apie metodą pateikta leidinyje „Handbook of Chemical Property Estimation Methods“ (b).
         APSKAIČIAVIMŲ TVARKA
         Pagal b nuorodą garų slėgis apskaičiuojamas taip:
         
            
         kai:
         
                     T
                  
                  
                     = norima temperatūra
                  
               
                     Tb
                     
                  
                  
                     = normali virimo temperatūra
                  
               
                     Pvp
                     
                  
                  
                     = garų slėgis temperatūroje T
                  
               
                     ΔHvb
                     
                  
                  
                     = garinimo šiluma
                  
               
                     ΔZb
                     
                  
                  
                     = spūdumo koeficientas (apskaičiuotas esant 0,97)
                  
               
                     m
                  
                  
                     = empirinis koeficientas, priklausantis nuo fizikinės būsenos norimoje
                  
               Toliau
         
            
         kai KF – empirinis koeficientas atsižvelgiant į medžiagos poliškumą. Kelių junginių rūšims KF koeficientai yra išvardyti b nuorodoje.
         Gana dažnai galima gauti duomenis, kur virimo temperatūra pateikiama sumažintame slėgyje. Tokiu atveju pagal b nuorodą garų slėgis apskaičiuojamas taip:
         
            
         kai T1 – virimo temperatūra sumažintame slėgyje P1.
         ATASKAITA
         Naudojant apskaičiavimo metodą ataskaitoje pateikiama išsami apskaičiavimų dokumentacija.
         LITERATŪRA
         
                     a)
                  
                  
                     K.M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, vol. 35, p. 398.
                  
               
                     b)
                  
                  
                     W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.
                  
               
      
         2 priedėlis
         1 paveikslas
         Garų slėgio kreivės nustatymo pagal dinaminį metodą aparatūra
         
            
         2a paveikslas
         Garų slėgio kreivės nustatymo pagal statinį metodą (naudojant U formos manometrą) aparatūra
         
            
         2b paveikslas
         Garų slėgio kreivės nustatymo pagal statinį metodą (naudojant slėgio indikatorių) aparatūra
         
            
         3 paveikslas
         Izoteniskopas (žr. 7 nuorodą)
         
            
         4 paveikslas
         Garų slėgio kreivės nustatymo pagal garų slėgio pusiausvyros metodą aparatūra
         
            
         5 paveikslas
         Aparatūros garinimui žemame slėgyje efuzijos metodu, efuzijos elemento tūris 8 cm3, pavyzdys
         
            
         6a paveikslas
         Srauto sistemos pavyzdys garų slėgiui nustatyti dujų soties metodu
         
            
         6b paveikslas
         Garų slėgo nustatymo dujų soties metodu pavyzdys su kapiliariniu vamzdeliu, įtaisytu už įsotinimo kameros sistemos
         
            
         7 paveikslas
         Eksperimentinės įrangos pavyzdys sukamojo rotoriaus metodui
         
            
         8 paveikslas
         Sukamojo rotoriaus matavimo galvutės pavyzdys
         
            
      
      A.5.   PAVIRŠIAUS ĮTEMPTIS
      1.   METODAS
      Apibūdintieji metodai yra pagrįsti OECD Test Guideline (1). Pagrindiniai principai pateikti 2 nuorodoje.
      1.1.   ĮVADAS
      Apibūdintieji metodai turi būti taikomi vandeninių tirpalų paviršiaus įtempties matavimuose.
      Naudinga prieš atliekant šiuos bandymus iš anksto turėti informaciją apie medžiagos micelių tirpumą vandenyje, struktūrą, hidrolizines savybes ir kritines koncentracijas.
      Toliau išvardyti metodai yra taikytini daugumai cheminių medžiagų, netaikant jokių apribojimų jų grynumo laipsniui.
      Paviršiaus įtempties matavimuose cikliniu tenzometru apsiribojama vandeniniais tirpalais, kurių dinaminis klampumas mažesnis negu apytikriai 200 mPa s.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Gibso paviršiaus energija vienam paviršiaus vienetui laikoma paviršiaus įtemptimi.
      Paviršiaus įtemptis nurodoma:
      N/m (SI vienetais) arba
      mN/m (SI pogrupiais)
      1 N/m = 103 dinų/cm
      1 mN/m = 1 dina/cm nebevartojamoje cgs sistemoje
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Etaloninių medžiagų nereikia naudoti visais tais atvejais, kai tyrinėjama nauja medžiaga. Jos pirmiausia turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant metodų veikimą ir lyginti rezultatus su kitais metodais gautais rezultatais.
      Etaloninės medžiagos, kurios įeina į didelę grupę paviršiaus įtempčių, pateiktos 1 ir 3 nuorodose.
      1.4.   METODŲ ESMĖ
      Šie metodai yra pagrįsti matavimais didžiausios jėgos, reikalingos vertikaliai įtempti ant ąselės arba žiedo, esančio sąlytyje su matavimo stiklinėje esančio tiriamojo skysčio paviršiumi, norint skystį atskirti nuo to paviršiaus arba plokštelės, kurios kraštas liečiasi su tuo paviršiumi, kad būtų pritraukta susidariusi plėvelė.
      Vandenyje tirpios medžiagos, kai jų koncentracija ne mažesnė kaip 1 mg/l, yra tiriamos vandeniniuose tirpaluose esant pavienei koncentracijai.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Šie metodai yra žymiai tikslesni, negu tai gali būti reikalinga aplinkosaugai įvertinti.
      1.6.   METODŲ APIBŪDINIMAS
      Medžiagos tirpalas paruošiamas distiliuotame vandenyje. Šio tirpalo koncentracija turėtų sudaryti 90 % medžiagos soties tirpumo vandenyje; jeigu ši koncentracija viršija 1 g/l, tyrimui naudojama 1 g/l koncentracija. Medžiagų, kurių tirpumas vandenyje mažesnis kaip 1 mg/l, nereikia tirti.
      1.6.1.   Anodinis metodas
      Žr. ISO 304 ir NF T 73-060 (Paviršinio aktyvumo reagentai – paviršiaus įtempties nustatymas tempiant skystąsias plėveles).
      1.6.2.   Ąselės metodas
      Žr. ISO 304 ir NF T 73-060 (Paviršinio aktyvumo reagentai – paviršiaus įtempties nustatymas tempiant skystąsias plėveles).
      1.6.3.   Žiedo metodas
      Žr. ISO 304 ir NF T 73-060 (Paviršinio aktyvumo reagentai – paviršiaus įtempties nustatymas tempiant skystąsias plėveles).
      1.6.4.   OECD suderintas cirkuliarinis metodas
      1.6.4.1.   Aparatūra
      Parduodami tenzometrai tinka šiems matavimams. Juos sudaro šie elementai:
      
                  —
               
               
                  kilnojamasis mėginio stalelis,
               
            
                  —
               
               
                  matavimo sistema,
               
            1.6.4.1.1.   Kilnojamasis mėginio stalelis
      
      Kilnojamasis mėginio stalelis naudojamas kaip kontroliuojamos temperatūros matavimo indo, kuriame yra tiriamasis skystis, atrama. Kartu su jėgos matavimo sistema jis dedamas ant stovo.
      1.6.4.1.2.   Jėgos matavimo sistema
      
      Jėgos matavimo sistema (žr. paveikslą) yra virš mėginio stalelio. Jėgos matavimo paklaida neturi viršyti ±10-6 N, atitinkančią paklaidos ribą ±0,1 mg matuojant masę. Daugeliu atvejų parduodamų tenzometrų matavimo skalė yra kalibruota mN/m taip, kad paviršiaus įtemptis gali būti tiesiogiai parodoma mN/m, 0,1 mN/m tikslumu.
      1.6.4.1.3.   Matavimo kūnas (žiedas)
      
      Paprastai žiedas yra padarytas iš platinos ir iridžio vielos, kurios storis 0,4 mm, o perimetras 60 mm. Vielos žiedas pakabinamas horizontaliai ant metalinės ašies ir montažinio laikytuvo, kad būtų galima sujungti su jėgos matavimo sistema (žr. paveikslą).
      Paveikslas
      Matavimo kūnas
      (Visi matmenys nurodyti milimetrais)
      
         
      1.6.4.1.4.   Matavimo indas
      
      Matavimo indas su tiriamu tirpalu, kuris turi būti išmatuotas – tai stiklinis indas su kontroliuojama temperatūra. Jo konstrukcija turi būti tokia, kad matavimo metu tiriamo tirpalo skysčio temperatūra ir dujų fazė virš jo paviršiaus išliktų pastovios ir kad mėginys negaruotų. Tinka cilindriniai stikliniai indai, kurių vidinis skersmuo ne mažesnis kaip 45 mm.
      1.6.4.2.   Aparatūros paruošimas
      1.6.4.2.1.   Valymas
      
      Stikliniai indai turi būti kruopščiai išvalomi. Jeigu reikia, jie išplaunami karšta chromo sieros rūgštimi, o po to sirupo tirštumo sieros rūgštimi (83–98 % H3PO4 svorio) kruopščiai nuskalaujami vandeniu iš čiaupo ir galiausiai nuplaunami du kartus distiliuotu vandeniu, kol bus gaunama neutrali reakcija, po to išdžiovinama arba nuskalaujama dalimi mėginio tirpalo, kurį reikia išmatuoti.
      Žiedas iš pradžių turi būti gerai nuskalaujamas vandeniu, kad būtų pašalinamos bet kokios vandenyje tirpios medžiagos, trumpam pamerkiamas į chromo sieros rūgštį, nuplaunamas du kartus distiliuotu vandeniu, kol bus gaunama neutrali reakcija, ir galiausiai lengvai pašildomas virš metanolio liepsnos.
      
         Pastaba
      
      Tarša medžiagomis, kurios neištirpsta arba nesuyra veikiamos chromo sieros rūgštimi arba fosforo rūgštimi, pavyzdžiui, silikonai, yra pašalinama atitinkamais organiniais tirpikliais.
      1.6.4.2.2.   Aparato kalibravimas
      
      Aparatas patvirtinamas patikrinant nulinį tašką ir suderinant taip, kad prietaiso parodymai leistų patikimai nustatyti mN/m.
      Montažas
      Aparatas išlyginamas, pavyzdžiui, pagal tenzometro pagrindo spirito lygį, suderinant pagrinde esančius koreguojančius varžtus.
      Nulinio taško derinimas
      Įtaisius žiedą ant aparato ir prieš pamerkiant jį į skystį, tenzometro parodymai suderinami taip, kad rodytų nulį, ir patikrinama, kad žiedas kabėtų lygiagrečiai skysčio paviršiui. Tam tikslui skysčio paviršius gali būti naudojamas kaip veidrodis.
      Kalibravimas
      Tikrasis bandymo kalibravimas gali būti atliekamas naudojant dvi darbo eigas:
      
                  a)
               
               
                  naudojant masę: darbo eiga naudojant žinomos masės, 0,1–1,0 g, pasvarėlius, uždedamus ant žiedo. Kalibravimo koeficientas Φa, iš kurio turi būti padauginamas kiekvienas prietaiso parodymas, nustatomas pagal šią lygtį (1):
                  
                              
                                 
                           
                           
                               
                           
                        kai:
                  
                      (mN/m)
                  
                              m
                           
                           
                              =
                           
                           
                              pasvarėlio masė (g)
                           
                        
                              g
                           
                           
                              =
                           
                           
                              sunkio greitėjimas (981 cm s-2 jūros lygyje)
                           
                        
                              b
                           
                           
                              =
                           
                           
                              vidutinis žiedo perimetras (cm)
                           
                        
                              σa
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              tenzometro parodymai po to, kai ant žiedo uždedami pasvarėliai (mN/m).
                           
                        
            
                  b)
               
               
                  naudojant vandenį: darbo eiga naudojant gryną vandenį, kurio paviršiaus įtemptis, kai temperatūra, pavyzdžiui, lygi 23 oC, yra 72,3 mN/m. Ši darbo eiga greitesnė negu svorio kalibravimas, bet visuomet yra pavojus, kad vandens paviršiaus įtemptį iškreips taršos paviršinio aktyvumo medžiagomis pėdsakai.
                  Kalibravimo koeficientas Φb, iš kurio padauginami visi prietaiso parodymai, yra nustatomas pagal lygtį (2):
                  
                              
                                 
                           
                           
                               
                           
                        kai:
                  
                              σo
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              nuorodoje apie vandens paviršiaus įtemptį nurodyta vertė (mN/m)
                           
                        
                              σg
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              nuorodoje apie vandens paviršiaus įtemptį nurodyta vertė (mN/m) Abi tokioje pat temperatūroje
                           
                        
            1.6.4.3.   Mėginių paruošimas
      Vandeniniai tirpalai paruošiami iš tiriamųjų medžiagų naudojant reikalingas koncentracijas vandenyje, juose neturi būti jokių neištirpusių medžiagų.
      Tirpalas turi būti laikomas pastovioje temperatūroje (±0,5 oC). Kadangi tirpalo, esančio matavimo inde, paviršiaus įtemptis kinta laike, atliekami keli matavimai skirtingu laiku ir brėžiama kreivė, parodanti paviršiaus įtemptį kaip laiko funkciją. Jeigu niekas toliau nesikeičia, tai pusiausvyros būsena pasiekta.
      Tarša kitų medžiagų dulkėmis ir dujomis trukdo matavimams. Todėl darbas turi būti atliekamas po apsauginiu gaubtu.
      1.6.5.   Bandymo sąlygos
      Matavimai atliekami apytikriai 20 oC temperatūroje ir kontroliuojami ±0,5o C ribose.
      1.6.6.   Bandymo vykdymas
      Matuojami tirpalai perpilami į kruopščiai išvalytą matavimo indą stengiantis, kad nesusidarytų putų, po to matavimo indas dedamas ant bandymo aparato stalelio. Stalelio viršus su matavimo indu keliamas aukštyn, kol žiedas panyra žemiau matuojamo tirpalo paviršiaus. Po to stalelio viršus pamažu ir tolydžiai nuleidžiamas (apie 0,5 cm/min. greičiu), atskiriant žiedą nuo paviršiaus, kol bus pasiekta maksimali jėga. Skysčio sluoksnis, besiliečiantis su žiedu, neturi atsiskirti nuo žiedo. Užbaigus matavimus, žiedas vėl iškeliamas į paviršių, matavimai kartojami tol, kol bus gauta pastovi paviršiaus įtempties vertė. Kiekvienam nustatymui užrašomas tirpalo perpylimo į matavimo indą laikas. Matavimai užrašomi esant maksimaliai jėgai, reikalingai atskirti žiedą nuo skysčio paviršiaus.
      2.   DUOMENYS
      Norint apskaičiuoti paviršiaus įtemptį, aparato parodyta vertė mN/m pirma dauginama iš kalibravimo koeficiento Φa arba Φb (priklausomai nuo naudotos kalibravimo darbo eigos). Taip bus gaunama vertė, kuri taikoma tik apytikriai ir todėl ją reikia koreguoti.
      Harkins ir Jordan (4) paviršiaus įtempties vertėms, matuotoms žiedo metodu, empiriškai nustatė korekcijos koeficientus, kurie priklauso nuo žiedo matmenų, skysčio tankio ir jo paviršiaus įtempties.
      Kadangi korekcijos koeficiento nustatymas kiekvienam atskiram matavimui pagal Harkins ir Jordan lenteles yra daug pastangų reikalaujantis darbas, vandeninių tirpalų paviršiaus įtempčiai apskaičiuoti gali būti naudojama supaprastinta koreguotų paviršiaus įtempties verčių skaitymo tvarka tiesiogiai iš šios lentelės. (Interpoliacija turi būti naudojama parodymams, svyruojantiems tarp lentelėje pateiktų verčių).
      Lentelė
      Matuotos paviršiaus įtempties korekcija
      
         Tik vandeniniams tirpalams, ρ ≡ 1 g/cm3
         
      
      
                  r
               
               
                  = 9,55 mm (vidutinis žiedo spindulys)
               
            
                  r
               
               
                  = 0,185 mm (vidutinis laido spindulys)
               
            
         
      
                  Eksperimentinė vertė (mN/m)
               
               
                  Koreguotoji vertė (mN/m)
               
            
                  Svorio kalibravimas (žr. 1.6.4.2.2 (a))
               
               
                  Vandens kalibravimas (žr. 1.6.4.2.2 (b))
               
            
                  20
               
               
                  16,9
               
               
                  18,1
               
            
                  22
               
               
                  18,7
               
               
                  20,1
               
            
                  24
               
               
                  20,6
               
               
                  22,1
               
            
                  26
               
               
                  22,4
               
               
                  24,1
               
            
                  28
               
               
                  24,3
               
               
                  26,1
               
            
                  30
               
               
                  26,2
               
               
                  28,1
               
            
                  32
               
               
                  28,1
               
               
                  30,1
               
            
                  34
               
               
                  29,9
               
               
                  32,1
               
            
                  36
               
               
                  31,8
               
               
                  34,1
               
            
                  38
               
               
                  33,7
               
               
                  36,1
               
            
                  40
               
               
                  35,6
               
               
                  38,2
               
            
                  42
               
               
                  37,6
               
               
                  40,3
               
            
                  44
               
               
                  39,5
               
               
                  42,3
               
            
                  46
               
               
                  41,4
               
               
                  44,4
               
            
                  48
               
               
                  43,4
               
               
                  46,5
               
            
                  50
               
               
                  45,3
               
               
                  48,6
               
            
                  52
               
               
                  47,3
               
               
                  50,7
               
            
                  54
               
               
                  49,3
               
               
                  52,8
               
            
                  56
               
               
                  51,2
               
               
                  54,9
               
            
                  58
               
               
                  53,2
               
               
                  57,0
               
            
                  60
               
               
                  55,2
               
               
                  59,1
               
            
                  62
               
               
                  57,2
               
               
                  61,3
               
            
                  64
               
               
                  59,2
               
               
                  63,4
               
            
                  66
               
               
                  61,2
               
               
                  65,5
               
            
                  68
               
               
                  63,2
               
               
                  67,7
               
            
                  70
               
               
                  65,2
               
               
                  69,9
               
            
                  72
               
               
                  67,2
               
               
                  72,0
               
            
                  74
               
               
                  69,2
               
               
                  —
               
            
                  76
               
               
                  71,2
               
               
                  —
               
            
                  78
               
               
                  73,2
               
               
                  —
               
            Ši lentelė buvo sudaryta remiantis Harkins-Jordan korekcijomis. Ji panaši į vandens ir vandeninių tirpalų (tankis p = 1 g/cm) DIN standartą (DIN 53914) ir taikoma pardavinėjamam žiedui, kurio dimensijos R = 9,55 mm (vidutinis žiedo spindulys) ir r = 0,185 mm (žiedo laido spindulys). Lentelėje yra pateiktos koreguotos paviršiaus įtempties matavimų vertės, paimtos po kalibravimo su svoriais arba kalibravimo su vandeniu.
      Kitaip, be išankstinio kalibravimo, paviršiaus įtemptis gali būti apskaičiuojama pagal šią formulę:
      
         
      kai:
      
                  F
               
               
                  =
               
               
                  jėga, matuota dinamometru plėvelės nutrūkimo taške
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  žiedo spindulys
               
            
                  f
               
               
                  =
               
               
                  korekcijos koeficientas (1)
               
            3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      3.1.   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje, kiek įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  naudotas metodas,
               
            
                  —
               
               
                  naudoto vandens arba tirpalo rūšis,
               
            
                  —
               
               
                  tikslus ir išsamus medžiagos apibūdinimas (identiškumas ir priemaišos),
               
            
                  —
               
               
                  matavimo rezultatai: paviršiaus įtemptis (parodymai), nurodant tiek atskirus parodymus ir jų aritmetinį vidurkį, tiek koreguotą vidurkį (atsižvelgiant į įrangą ir korekcijos lentelę),
               
            
                  —
               
               
                  tirpalo koncentracija,
               
            
                  —
               
               
                  bandymo temperatūra,
               
            
                  —
               
               
                  naudoto tirpalo amžius; ypač laikas nuo paruošimo iki tirpalo matavimo,
               
            
                  —
               
               
                  paviršiaus įtempties priklausomybės nuo laiko perpylus tirpalą į matavimo indą apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  visa informacija ir pastabos, svarbios rezultatų, apie kuriuos reikia pranešti, aiškinimui, ypač atsižvelgiant į priemaišas ir medžiagos fizikinę būseną.
               
            3.2.   REZULTATŲ AIŠKINIMAS
      Laikant, kad 20 oC temperatūroje distiliuoto vandens paviršiaus įtemptis lygi 72,75 mN/m, medžiagos, kurių paviršiaus įtemptis mažesnė kaip 60 mN/m, pagal šio bandymo sąlygas, turėtų būti laikomos paviršinio aktyvumo medžiagomis.
      4.   LITERATŪRA
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2)
               
               
                  R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV
               
            
                  3)
               
               
                  Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, p. 511.
               
            
                  4)
               
               
                  Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, p. 1751.
               
            A.6.   TIRPUMAS VANDENYJE
      1.   METODAS
      Apibūdintasis metodas yra pagrįstas OECD Test Guideline (1).
      1.1.   ĮVADAS
      Šiam bandymui atlikti naudinga turėti išankstinių duomenų apie medžiagos struktūrinę formulę, garų slėgį, disociacijos konstantą ir hidrolizę (pH funkciją).
      Nėra atskiro metodo, apimančio visą tirpumo vandenyje intervalą.
      Du toliau apibūdinti bandymų metodai apima visą tirpumo intervalą bet nėra taikytini lakiosioms medžiagoms:
      
                  —
               
               
                  vienas, taikomas iš tikrųjų grynoms mažo tirpumo medžiagoms (< 10 gramų viename litre), ir kurios stabilios vandenyje, nurodytas kaip „kolonėlės eliuavimo metodas“,
               
            
                  —
               
               
                  kitas, kuris taikomas iš tikrųjų grynoms didesnio tirpumo medžiagoms (> 10 gramų viename litre) ir kurios yra pastovios vandenyje, nurodytas kaip „kolbos metodas“.
               
            Tiriamosios medžiagos tirpumą vandenyj e gali stipriai paveikti joje esančios priemaišos.
      1.2.   APIBRĖŽIMAS IR VIENETAI
      Medžiagos tirpumas vandenyje yra apibrėžiamas medžiagos soties masės koncentracija vandenyje tam tikroje temperatūroje. Tirpumas vandenyje yra apibrėžiamas masės vienetais tirpalo tūryje. SI vienetai – tai kg/m (taip pat gali būti naudojama gramai litre).
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Etaloninių medžiagų nereikia naudoti visais tais atvejais, kai tyrinėjama nauja medžiaga. Pirmiausiai jos turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant metodo veikimą ir palyginti gautus rezultatus su kitais metodais gautais rezultatais.
      1.4.   BANDYMO METODO ESMĖ
      Apytikris bandinio kiekis ir laikas, reikalingas soties masės koncentracijai gauti, turėtų būti nustatomas paprastu išankstiniu bandymu.
      1.4.1.   Kolonėlės reliuavimo metodas
      Šis metodas pagrįstas bandomosios medžiagos eliuavimu su vandeniu iš mikrokolonėlės, pakrautos inertine indiferentine medžiaga, pavyzdžiui, stiklo rutuliukais arba smėliu, padengta bandomosios medžiagos pertekliumi. Tirpumas vandenyje yra nustatomas tada, kai eliuato masės koncentracija yra pastovi. Tai parodoma koncentracijos kreivės plokščiąja dalimi kaip laiko funkcija.
      1.4.2.   Kolbos metodas
      Šiuo metodu medžiaga (kietosios medžiagos turi būti pulverizuojamos) ištirpinama vandenyje, kurio temperatūra šiek tiek aukštesnė negu bandymo temperatūra. Pasiekus sotį, mišinys ataušinamas ir laikomas bandymo temperatūroje, maišant tiek, kiek to reikia pusiausvyrai pasiekti. Matavimas gali būti atliekamas ir tiesiogiai bandymo temperatūroje, jeigu tinkamu bandinių parinkimu užtikrinama, kad bus pasiekta soties pusiausvyra. Po to medžiagos masės koncentracija vandeniniame tirpale, kuriame neturi būti jokių neištirpusių dalelių, yra nustatoma atitinkamu analitiniu metodu.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      1.5.1.   Pakartojamumas
      Kolonėlės eliuavimo metodu pakartojamumas gali būti < 30 %; kolbos metodu turėtų būti nustatoma < 15 %.
      1.5.2.   Jautrumas
      Tai priklauso nuo analizės metodo, bet masės koncentracija gali būti nustatoma iki 10-6 gramų viename litre.
      1.6.   METODO APIBŪDINIMAS
      1.6.1.   Bandymo sąlygos
      Bandymą geriau atlikti 20 ±0,5 oC temperatūroje. Jeigu manoma, kad tirpumas priklauso nuo temperatūros (> 3 % vienam oC), turėtų būti taip pat naudojamos dar dvi temperatūros vertės, ne mažiau kaip 10 oC didesnė ir mažesnė už iš pradžių pasirinktą temperatūrą. Tokiu atveju temperatūra turėtų būti kontroliuojama ±0,1 oC ribose. Pasirinktoji temperatūra turėtų būti išlaikoma pastovi visose svarbiose įrangos dalyse.
      1.6.2.   Išankstinis bandymas
      Į apytikriai 0,1 g bandinio (kietosios medžiagos turi būti pulverizuojamos), esančio stikliniu kamščiu užkimštame 10 ml graduotame cilindre kambario temperatūroje, palaipsniui pilami vis didesni distiliuoto vandens tūriai, nurodyti žemiau pateiktoje lentelėje:
      
                  0,1 g, ištirpstantis „x“ ml vandens
               
               
                  0,1
               
               
                  0,5
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  10
               
               
                  100
               
               
                  > 100
               
            
                  Apytikris tirpumas (gramai litre)
               
               
                  > 1 000
               
               
                  1 000–200
               
               
                  200–100
               
               
                  100–50
               
               
                  50–10
               
               
                  10–1
               
               
                  < 1
               
            Kiekvieną kartą įpylus nurodytą kiekį vandens, mišinys stipriai kratomas 10 minučių ir vizualiai tikrinama, ar nėra neištirpusių mėginio dalelių. Jeigu, pridėjus 10 ml vandens, mėginys arba jo dalys neištirpsta, eksperimentas turi būti pakartojamas 100 ml matavimo cilindre su didesniais tūriais vandens. Jeigu tirpumas mažesnis, laikas, reikalingas medžiagai ištirpinti, gali būti žymiai ilgesnis (turėtų būti skiriamos ne mažiau kaip 24 valandos). Apytikris tirpumas lentelėje yra pateiktas tokiame įdedamo vandens tūryje, kuriame mėginys visiškai ištirpsta. Jeigu medžiaga vis tiek yra akivaizdžiai netirpi, turėtų būti skiriama daugiau negu 24 valandos (daugiausiai 96 val.), arba reikėtų toliau skiesti, išsiaiškinant, ar turėtų būti naudojamas kolonėlės eliuavimo arba tirpumo kolboje metodas.
      1.6.3.   Kolonėlės eliuavimo metodas
      1.6.3.1.   Pagalbinė medžiaga, tirpiklis ir eliuatas
      Kolonėlės eliuavimo metode pagalbinė medžiaga turėtų būti inertiška. Medžiagos, kurias galima naudoti – tai stiklo rutuliukai ir smėlis. Atitinkamas lakus tirpiklis, atitinkantis analizinio reagento kokybę, turėtų būti naudojamas bandomajai medžiagai uždėti ant pagalbinės medžiagos. Du kartus distiliuotas stikliniame arba kvarciniame aparate destiliuotas vanduo, turėtų būti naudojamas kaip eliuatas.
      Pastaba
      Vanduo tiesiai iš organinio jonitinio filtro neturi būti naudojamas.
      1.6.3.2.   Pagalbinės medžiagos pakrovimas
      Pasveriama apie 600 mg pagalbinės medžiagos ir perpilama į 50 ml apvaliadugnę kolbą.
      Tinkamas, pasvertas bandomos medžiagos kiekis ištirpinamas pasirinktame tirpiklyje. Atitinkamas šio tirpalo kiekis dedamas į pagalbinę medžiagą. Tirpiklis turi būti visiškai išgarinamas, pavyzdžiui, sukamajame garintuve; priešingu atveju pagalbinės medžiagos soties nebus pasiekta dėl pasiskirstymo reiškinių ant pagalbinės medžiagos paviršiaus.
      Pagalbinės medžiagos pakrovimas gali sukelti problemų (klaidingi rezultatai), jeigu tiriamoji medžiaga yra nusodinama kaip alyva arba skirtinga kristalo fazė. Problemą reikėtų spręsti eksperimentiniu būdu ir apie tai pateikti išsamią informaciją.
      Pakrauta pagalbinė medžiaga paliekama įmirkti apie dvi valandas apytikriai 5 ml vandens, po to suspensija dedama į mikrokolonėlę. Kitais atvejais pakraunama sausa pagalbinė medžiaga gali būti supilama į vandens pripildytą mikrokolonėlę, po to apie dvi valandas leidžiama nusistovėti pusiausvyrai.
      Bandymo eiga
      Medžiagos eliuavimas iš pagalbinės medžiagos gali būti atliekamas dviem skirtingais būdais:
      
                  —
               
               
                  recirkuliaciniu siurbliu (žr. 1 paveikslą),
               
            
                  —
               
               
                  lyginančiuoju indu (žr. 4 paveikslą).
               
            1.6.3.3.   Kolonėlės eliuavimo metodas su recirkuliaciniu siurbliu
      Aparatūra
      Tipinės sistemos schema pateikta 1 paveiksle. Tinkanti mikrokolonėlė parodyta 2 paveiksle, nors tinka ir bet kokio kito dydžio, jeigu atitinka atkuriamumo ir jautrumo kriterijus. Kolonėlėje turėtų būti tiek laisvos erdvės, kad tilptų ne mažiau kaip penki vandens sluoksnio tūriai ir mažiausiai penki mėginiai. Kitais atvejais dydį galima sumažinti, jeigu naudojamas užkraunamasis tirpiklis, naudojamas pakeisti pradinius su priemaišomis pašalinamus penkis sluoksnio tūrius.
      Kolonėlė turėtų būti sujungta su recirkuliaciniu siurbliu, kuriuo galima kontroliuoti apytikriai 25 ml/h srautus. Siurblys sujungiamas su politetrafluoretileno (P.T.F.E) ir(arba) stiklinėmis jungtimis. Kolonėlė ir siurblys, juos sumontavus, turėtų paimti išmetamą kiekį ir nustatyti sluoksnio tūrio pusiausvyrą atmosferos slėgyje. Į kolonėlėje esančią medžiagą papildomai dedamas nedidelis (5 mm) stiklo vatos kaištis, kuris taip pat naudojamas dalelytėms filtruoti. Recirkuliacinis siurblys, pavyzdžiui, gali būti peristaltiniu siurbliu arba membraniniu siurbliu (reikia imtis atsargumo priemonių, kad vamzdyje esanti medžiaga nebūtų užteršiama ir(arba) neįvyktų absorbcija).
      Matavimo eiga
      Srautas leidžiamas per kolonėlę. Rekomenduojama, kad būtų naudojamas apytikriai 25 ml/val. debitas (apibūdintai kolonėlei tai – 10 sluoksnio tūrių/val.). Pirmieji penki sluoksnio tūriai (mažiausiai) yra išpilami, kad būtų pašalinamos vandenyje tirpios priemaišos. Po to recirkuliacinis siurblys dirba tol, kol pasiekiama pusiausvyra, kaip nustatyta penkiais vienas po kito dedamais mėginiais, kurių koncentracijos skiriasi ne daugiau kaip ± 30 % juos atsitiktinai parenkant. Šie mėginiai turėtų būti vienas nuo kito atskiriami laiko intervalais, kurio metu pasikeičia ne mažiau kaip 10 eliuato sluoksnio tūrių.
      1.6.3.4.   Kolonėlės eliuavimo metodas su išlyginančiuoju indu
      Aparatūra (žr. 3 ir 4 pav.)
      
      Išlyginantysis indas: išlyginančiojo indo jungtis yra padaroma iš matinio stiklo jungties, kuri sujungta PTFE vamzdeliais. Rekomenduojamas apie 25 ml/val. debitas. Viena po kitos sekančios eliuato frakcijos turėtų būti surenkamos ir analizuojamos pasirinktu metodu.
      Matavimo eiga
      Tos vidurinio eliuato intervalo frakcijos, kurių koncentracijos yra pastovios (± 30 %) ne mažiau kaip penkiose iš eilės einančiose frakcijose, yra naudojamos nustatyti tirpumą vandenyje.
      Abiem atvejais (naudojant recirkuliacinį siurblį arba išlyginantį indą) viską reikia dar kartą pakartoti su puse pirmojo debito kiekio. Jeigu abu rezultatai sutampa, bandymas yra patenkinamas; jeigu esant mažesniam debitui nustatomas akivaizdžiai didesnis tirpumas, debitas turi būti dalijamas pusiau, kol dviem vienas po kito einančiais matavimais bus nustatytas toks pat tirpumas.
      Abiem atvejais (naudojant recirkuliacinį siurblį arba išlyginantį indą) frakcijos turėtų būti patikrinamos, ar nėra koloidinių medžiagų, tikrinant, ar nėra Tindalio reiškinio (šviesos sklaidos). Dėl tokių dalelių rezultatai tampa negaliojančiais, o bandymas turėtų būti pakartojamas, pagerinant kolonėlės filtravimo darbo eigą.
      Turėtų būti užrašomas kiekvieno bandinio pH. Darbo eiga turėtų būti kartojama tokioje pat temperatūroje.
      1.6.4.   Kolbos metodas
      1.6.4.1.   Aparatūra
      Kolbos metodui reikalingos tokios medžiagos:
      
                  —
               
               
                  paprasti laboratoriniai stikliniai indai ir prietaisai,
               
            
                  —
               
               
                  prietaisas, tinkantis tirpalams suplakti kontroliuojamoje pastovioje temperatūroje,
               
            
                  —
               
               
                  centrifuga (geriau su reguliuojama temperatūra), jeigu reikia, su emulsijomis, ir
               
            
                  —
               
               
                  įrenginys analiziniam nustatymui.
               
            1.6.4.2.   Matavimo eiga
      Medžiagos kiekis, reikalingas norimam vandens tūriui įsotinti, yra apskaičiuojamas išankstiniu bandymu. Reikalingas vandens tūris priklauso nuo analizės metodo ir tirpumo intervalo. Apytikriai penki anksčiau nustatyti medžiagos kiekiai pasveriami į kiekvieną iš trijų stiklinių indų su stikliniais kamščiais (pvz., centrifugos vamzdžiai, kolbos). Pasirinktas vandens kiekis pilamas į kiekvieną indą, kiekvienas indas sandariai užkemšamas. Užkimšti indai kratomi 30 oC temperatūroje. (Turėtų būti naudojamas kratytuvas arba maišytuvas, galintys dirbti pastovioje temperatūroje, pvz., magnetinis maišymas termostatu kontroliuojamoje vandens vonioje). Po paros vienas indas išimamas ir pakartotinai nustatoma pusiausvyra per 24 valandas bandymo temperatūroje retsykiais pakratant. Inde esantis turinys centrifuguojamas bandymo temperatūroje, mėginio aiškioje hidratuotoje fazėje koncentracija nustatoma atitinkamu analiziniu metodu. Su kitomis dviem kolbomis elgiamasi taip pat, prieš tai nustatant pradinę pusiausvyrą 30 oC temperatūroje atitinkamai per dvi ir tris paras. Jeigu duomenys apie koncentraciją, gauti ne mažiau kaip iš paskutiniųjų dviejų indų, atitinka reikalavimus, bandymas yra patenkinamas. Visas bandymas turėtų būti pakartojamas naudojant ilgesnius pusiausvyros nustatymo laikus, jeigu 1, 2 ir 3 indo rezultatai krypsta į didesnes vertes.
      Matavimo eigą taip pat galima atlikti be išankstinio inkubacinio laikotarpio 30 oC temperatūroje. Kad būtų galima įvertinti soties pusiausvyros nustatymo koeficientą, mėginiai yra imami tada, kai maišymo laikas nebeturi įtakos tiriamojo tirpalo koncentracijai.
      Turėtų būti užrašomas kiekvieno mėginio pH.
      1.6.5.   Analizė
      Atliekant šiuos nustatymus pasirenkamas tai medžiagai tinkantis analizės metodas, kadangi nedideli tirpių medžiagų kiekiai gali būti didelių matuojamo tirpumo paklaidų priežastis. Tokių metodų pavyzdžiai: dujų arba skysčių chromatografija, titravimo metodai, fotometriniai metodai, voltamperometriniai metodai.
      2.   DUOMENYS
      2.1.   KOLONĖLĖS ELIUAVIMO METODAS
      Vidutinė vertė, gauta iš ne mažiau kaip penkių mėginių, iš eilės paimtų iš soties kreivės plokščiosios dalies, turėtų būti apskaičiuojama kiekvienam matavimui, kaip ir standartinis nuokrypis. Duomenys turėtų būti pateikiami tokiais vienetais: masė tirpalo tūriui.
      Vidurkiai, apskaičiuojami naudojant skirtingus dviejų bandymų srautus, yra palyginami, o jų pakartojamumas turėtų būti mažesnis kaip 30 %.
      2.2.   KOLBOS METODAS
      Duomenys turėtų būti gaunami kiekvienai iš trijų kolbų, o iš tų duomenų, kurie laikomi esantys pastovūs (pakartojamumas mažesnis kaip 15 %), išvedamas vidurkis ir pateikiamas masės vienam tirpalo tūriui vienetais. Tam gali tekti masės vienetus pakartotinai paversti tūrio vienetais, naudojant tankį, jeigu tirpumas labai didelis (> 100 gramų viename litre).
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      3.1.   KOLONĖLĖS ELIUAVIMO METODAS
      Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  išankstinio bandymo rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  išsamios medžiagos charakteristikos (tapatybė ir priemaišos),
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieno mėginio individualiosios koncentracijos, debitai ir pH,
               
            
                  —
               
               
                  ne mažiau kaip penkių mėginių vidutinės vertės ir standartiniai nuokrypiai, paimti iš soties kreivės plokščiosios dalies,
               
            
                  —
               
               
                  dviejų, vienas paskui kitą sekančių matavimų bendrasis vidurkis,
               
            
                  —
               
               
                  vandens temperatūra įsisotinimo metu,
               
            
                  —
               
               
                  naudotas analizės metodas,
               
            
                  —
               
               
                  naudotos pagalbinės medžiagos charakteristikos,
               
            
                  —
               
               
                  pagalbinės medžiagos pakrovimas,
               
            
                  —
               
               
                  naudotas tirpiklis,
               
            
                  —
               
               
                  bet kokio medžiagos cheminio nepastovumo įrodymai bandymo metu ir naudotas metodas
               
            
                  —
               
               
                  visa informacija, svarbi rezultatų aiškinimui, ypač apie priemaišas ir medžiagos fizinę būseną.
               
            3.2.   KOLBOS METODAS
      Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  išankstinio bandymo rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  išsamios medžiagos charakteristikos (identiškumas ir priemaišos),
               
            
                  —
               
               
                  kiekvienas individualus nustatymas ir vidurkis, jeigu kiekvienai kolbai buvo nustatoma daugiau negu viena vertė,
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieno mėginio pH,
               
            
                  —
               
               
                  skirtingų kolbų, kurių duomenys sutampa, bendrasis vertės vidurkis,
               
            
                  —
               
               
                  bandymo temperatūra,
               
            
                  —
               
               
                  naudotas analizės metodas,
               
            
                  —
               
               
                  bet kokio medžiagos cheminio nepastovumo įrodymai bandymo metu ir naudotas metodas,
               
            
                  —
               
               
                  visa informacija, svarbi rezultatų aiškinimui, ypač apie priemaišas ir medžiagos fizinę būseną.
               
            4.   LITERATŪRA
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2)
               
               
                  NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.
               
            
                  3)
               
               
                  NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.
               
            
         Priedėlis
         1 paveikslas
         Kolonėlės eliuavimo metodas su recirkuliaciniu siurbliu
         
            
         2 paveikslas
         Tipiška mikrokolonėlė
         
            (Visi matmenys pateikti milimetrais)
         
         
            
         3 paveikslas
         Tipiška mikrokolonėlė
         
            (Visi matmenys pateikti milimetrais)
         
         
            
         4 paveikslas
         Kolonėlės eliuavimo metodas su išlyginamuoju indu
         
            
      
      A.8.   PASISKIRSTYMO KOEFICIENTAS
      1.   METODAS
      Apibūdintasis „kratomos kolbos“ metodas yra pagrįstas OECD Test Guideline (1).
      1.1.   ĮVADAS
      Šiam bandymui naudinga turėti išankstinę informaciją apie medžiagos struktūrinę formulę, disociacijos konstantą, tirpumą vandenyje, hidrolizę, tirpumą n-oktanolyje ir paviršiaus įtemptį.
      Matavimai turėtų būti atliekami su jonizuojamomis medžiagomis, esančiomis tik nejonizuota forma (laisvoji riebalų rūgštis arba laisvoji bazė) ir gaunamomis naudojant atitinkamą buferinį tirpalą, kurio pH ne mažiau kaip vienu vienetu mažesnis (laisvoji riebalų rūgštis) arba didesnis (laisvoji bazė) kei pK.
      Šį bandymo metodą sudaro dvi atskiros darbo eigos: kratomos kolbos metodas ir efektyvoji skysčių chromatografija (HPLC). Pirmoji yra taikoma, kai log Pow vertė (žr. toliau esančius apibrėžimus) yra 2–4 ribose, o antroji – 0–6 ribose. Prieš atliekant bet kurį iš šių eksperimentų, pirma turėtų būti iš anksto apskaičiuojamas pasiskirstymo koeficientas.
      Kratomos kolbos metodas taikomas tik visiškai grynoms, vandenyje ir n-oktanolyje tirpioms medžiagoms. Jis netaikomas paviršinio aktyvumo medžiagoms (kurioms turėtų būti pateikiama apskaičiuota vertė arba apskaičiavimai, pagrįsti individualiu tirpumu n-oktanolyje ir vandenyje).
      HPLC metodas neturi būti taikomas stiprioms rūgštims ir bazėms, metalų kompleksiniams junginiams, paviršinio aktyvumo medžiagoms arba medžiagoms, reaguojančioms su eliuatu. Šioms medžiagoms turėtų būti pateikiama apskaičiuotoji vertė arba apskaičiavimas, pagrįstas individualiuoju tirpumu n-oktanolyje arba vandenyje.
      HPLC metodas yra mažiau jautrus priemaišoms, esančioms bandomajame junginyje, negu kratomos kolbos metodas. Nepaisant to, dėl priemaišų buvimo kai kuriais atvejais rezultatų aiškinimas tampa sudėtingas, kadangi tampa sunku priskirti smailes. Mišiniams, kurių juostos neišskaidytos, turėtų būti nustatomos viršutinė ir apatinė log P ribos.
      1.2.   APIBRĖŽIMAS IR VIENETAI
      Pasiskirstymo koeficientas (P) yra apibrėžiamas kaip medžiagos, ištirpintos dviejų fazių sistemoje, sudarytoje iš dviejų nesimaišančių tirpiklių, pusiausvyros koncentracijų (c) santykis. Jeigu tai n-oktanolis ir vanduo:
      
         
      Todėl pasiskirstymo koeficientas (P) yra dviejų koncentracijų dalmuo ir paprastai pateikiamas kaip jo dešimtainis logaritmas (log P).
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Kratomos kolbos metodas
      Etaloninių medžiagų nereikia naudoti visais tais atvejais, kai tyrinėjama nauja medžiaga. Pirmiausiai jos turėtų būti naudojamos kartkartėmis tikrinant metodo veikimą ir palyginti gautus rezultatus su kitais metodais gautais rezultatais.
      HPLC metodas
      Norint išmatuotus HPLC duomenis apie junginį susieti su jo P verte, turi būti brėžiamas kalibravimo log P palyginimo su chromatografiniais duomenimis grafikas, panaudojant ne mažiau kaip 6 pamatinius taškus. Vartotojas sprendžia, kokias tinkamas etalonines medžiagas naudoti. Jeigu įmanoma, ne mažiau kaip vieno etaloninio junginio Pow turėtų būti didesnis negu bandomosios medžiagos, o kitas P turėtų būti mažesnis negu bandomosios medžiagos. Jeigu log Pow vertės yra mažesnės nei 4, kalibravimas gali būti pagrindžiamas duomenimis, gautais kratomos kolbos metodu. Kai log P vertės didesnės nei 4, kalibravimas gali būti pagrindžiamas literatūroje patvirtintomis vertėmis, jeigu jos atitinka apskaičiuotąsias vertes. Norint gauti tikslesnes vertes, geriau pasirinkti tuos etaloninius junginius, kurie struktūros požiūriu yra susiję su bandomąja medžiaga.
      Išsamų daugumos chemikalų log Pow verčių sąrašą galima rasti 2 ir 3 nuorodose. Jeigu duomenų apie struktūriškai susijusių junginių pasiskirstymo koeficientus neįmanoma gauti, tada gali būti naudojamas bendresnio pobūdžio kalibravimas, nustatytas su kitais etaloniniais junginiais.
      Rekomenduojamų etaloninių medžiagų ir jų Pow verčių sąrašas pateiktas 2 priedėlyje.
      1.4.   METODO ESMĖ
      1.4.1.   Kratomos kolbos metodas
      Pasiskirstymo koeficientui nustatyti turi būti pasiekiama pusiausvyra tarp visų sąveikaujančių sistemos sudedamųjų dalių ir turi būti nustatytos koncentracijos medžiagų, ištirpintų tose dviejose fazėse. Šiam klausimui skirtos literatūros nagrinėjimas rodo, kad problemai spręsti gali būti naudojamos kelios metodikos, pvz., kruopštus dviejų fazių sumaišymas ir po to vykstantis jų atskyrimas, norint nustatyti tyrinėjamos medžiagos pusiausvyros koncentraciją.
      1.4.2.   HPLC metodas
      HPLC yra atliekama su analizinėmis kolonėlėmis, įkrautomis prekyboje esančiomis kietosiomis fazėmis su ilgomis angliavandenių grandinėmis (pvz., C8, C18), chemiškai sujungtomis su kvarcu. Chemikalai, įšvirkšti ant tokios kolonėlės, juda išilgai skirtingais greičiais, kadangi pasiskirstymas tarp judančiosios būsenos ir angliavandenio nuostoviosios būsenos yra skirtingo laipsnio. Chemikalų mišiniai dėl jų hidrofobiškumo yra pirma eliuliuojami vandenyje tirpiais chemikalais, po to alyvoje tirpiais chemikalais proporcingai jų angliavandenio ir vandens pasiskirstymo koeficientui. Tai leidžia nustatyti santykį tarp sulaikymo trukmės tokioje kolonėlėje (atvirkštinė fazė) ir n-oktanolio/vandens pasiskirstymo koeficientą. Pasiskirstymo koeficientas yra nustatomas iš talpinio faktoriaus k, gaunamo iš lygties:
      
         
      kai tR – bandomosios medžiagos sulaikymo trukmė, o to – vidutinis laikas, reikalingas tirpiklio molekulei pereiti per kolonėlę (pradinis laikas).
      Kiekybiniai analizės metodai nereikalingi, reikia tik nustatyti eliuavimo laiką.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      1.5.1.   Pakartojamumas
      Kratomos kolbos metodas
      Norint užtikrinti pasiskirstymo koeficiento tikslumą, turi būti atliekami dvigubi nustatymai esant trims skirtingoms bandymo sąlygoms, kuriomis apibrėžtas medžiagos kiekis, taip pat tirpiklio tūriai gali būti keičiami Nustatytos pasiskirstymo koeficiento vertės, išreikštos bendruoju logaritmu, turėtų patekti į ±0,3 log vienetų intervalą.
      HPLC metodas
      Norint padidinti pasikliovimą matavimais, turi būti atliekami kartotiniai nustatymai. Log P vertės, gautos iš pavienių matavimų, turėtų patekti į ±0,1 log vienetų intervalą.
      1.5.2.   Jautrumas
      Kratomos kolbos metodas
      Metode naudojamas matavimų intervalas yra nustatomas pagal analizės darbo eigos aptikimo ribą. Tai turėtų leisti įvertinti log Pow vertes intervale nuo 2 iki 4 (kartais, kai to reikalauja tam tikros sąlygos, šis intervalas log Pow gali būti išplečiamas iki 5), jeigu tirpinio koncentracija bet kokioje būsenoje nėra didesnė negu 0,01 molio viename litre.
      HPLC metodas
      HPLC metodas leidžia įvertinti log Pow pasiskirstymo koeficientus intervale 0–6.
      Paprastai junginio pasiskirstymo koeficientas gali būti įvertinamas iki ±0,1 log vienetų kratomos kolbos vertės. Tipiška koreliacija gali būti randama 4, 5, 6, 7, 8 literatūros nuorodose. Didesnį tikslumą galima pasiekti, jeigu koreliacijos grafikai yra pagrindžiami struktūriškai susijusiais etaloniniais junginiais (9).
      1.5.3.   Tikslumas
      Kratomos kolbos metodas
      Nernsto pasiskirstymo dėsnis praskiestiems tirpalams taikomas tik esant pastoviai temperatūrai, slėgiui ir pH. Jis taikomas tiktai grynai medžiagai, ištirpintai dviejuose grynuose tirpikliuose. Jeigu tuo pačiu metu keli skirtingi tirpiniai yra vienoje arba abiejose būsenose, tai gali turėti įtakos rezultatams.
      Dėl ištirpusių molekulių disociacijos arba asociacijos yra gaunami nukrypimai nuo Nersto pasiskirstymo dėsnio. Tokius nukrypimus rodo tai, kad pasiskirstymo koeficientas tampa priklausomu nuo tirpalo koncentracijos.
      Dėl naudojamos daugkartinės pusiausvyros šis bandymo metodas neturėtų būti naudojamas jonizuojamiems junginiams, jeigu nenaudojama korekcija. Tokiems junginiams reikėtų apsvarstyti galimybę vietoje vandens naudoti buferinius tirpalus; buferinio tirpalo pH turėtų būti ne mažesnis kaip vienas medžiagos pKa vienetas, ir reikėtų atsižvelgti į šio pH tinkamumą aplinkai.
      1.6.   METODO APIBŪDINIMAS
      1.6.1.   Išankstinis pasiskirstymo koeficiento įvertinimas
      Pasiskirstymo koeficientą geriau vertinti naudojant apskaičiavimo metodą (žr. 1 priedėlį) arba atitinkamais atvejais pagal bandomosios medžiagos tirpumo koeficientą grynuose tirpikliuose (10).
      1.6.2.   Kratomos kolbos metodas
      1.6.2.1.   Preparatas
      n-oktanolis: pasiskirstymo koeficiento nustatymas turėtų būti atliekamas su didelio grynumo analiziniais reagentais.
      Vanduo: turėtų būti naudojamas distiliuotas arba du kartus distiliuotas vanduo, naudojant stiklinį arba kvarcinį aparatą. Jonizuojamiems junginiams, jeigu tai pagrįsta, vietoje vandens turėtų būti naudojami buferiniai tirpalai.
      
         Pastaba
      
      Vanduo, paimtas tiesiogiai iš jonitinio filtro, neturėtų būti naudojamas.
      1.6.2.1.1.   Išankstinis tirpiklių sotinimas
      
      Prieš nustatant pasiskirstymo koeficientą, tirpiklio sistemos fazės yra abipusiai sotinamos purtant eksperimento temperatūroje. Kad tai būtų atlikta, pakanka ant mechaninės purtyklės 24 valandas purtyti du didelius standartinius butelius, kuriuose yra didelio grynumo analizinis n-oktanolis arba vanduo su pakankamu kiekiu kito tirpiklio, po to leidžiama pakankamai ilgai nusistovėti, kad atsiskirtų fazės ir nusistovėtų sotis.
      1.6.2.1.2.   Bandymo paruošimas
      
      Visas dviejų fazių sistemos tūris turėtų beveik užpildyti bandymo indą. Taip bus išvengta medžiagos nuostolių dėl lakumo. Naudotini tūrio koeficientas ir medžiagos kiekiai pasirenkami taip:
      
                  —
               
               
                  išankstinis pasiskirstymo koeficiento apskaičiavimas (žr. ankstesnį punktą),
               
            
                  —
               
               
                  mažiausias bandomos medžiagos kiekis, reikalingas analizei atlikti, ir
               
            
                  —
               
               
                  didžiausios koncentracijos apribojimas bet kurioje fazėje 0,01 molio vienam litrui.
               
            Atliekami trys bandymai. Pirmajame naudojamas apskaičiuotas n-oktanolio ir vandens tūrio santykis; antrajame – šis santykis dalinamas iš dviejų; o trečiajame – šis santykis dauginamas iš dviejų (pvz., 1:1; 1:2; 2:1).
      1.6.2.1.3.   Bandymo medžiaga
      
      Pagrindinis tirpalas paruošiamas iš anksto vandeniu įsotintame n-oktanolyje. Šio pagrindinio tirpalo koncentracija turėtų būti tiksliai nustatoma prieš jį naudojant pasiskirstymo koeficiento nustatymui. Šis tirpalas turėtų būti laikomas pastovumą užtikrinančiomis sąlygomis.
      1.6.2.2.   Bandymo sąlygos
      Turėtų būti išlaikoma pastovi bandymo temperatūra (± 1 oC), o temperatūros intervalas – 20–25 oC.
      1.6.2.3.   Matavimo eiga
      1.6.2.3.1.   Pasiskirstymo pusiausvyros nustatymas
      
      Kiekvienai bandymo sąlygai turėtų būti paruošiami dvigubi bandymo indai su reikalingu tiksliai pamatuotu dviejų tirpiklių kiekiu su būtinu pagrindinio tirpalo kiekiu.
      n-oktanolio fazės turėtų būti matuojamos pagal tūrį. Bandymo indai turėtų būti dedami arba į tinkamą purtyklę arba kratomi ranka. Jeigu naudojamas centrifugos vamzdis, rekomenduojama greitai sukti vamzdį 180 o apie jo skersinę ašį taip, kad bet koks pagautas oro kiekis iškiltų per tas dvi fazes. Patirtis parodė, kad pasiskirstymo pusiausvyrai nustatyti paprastai pakanka 50 tokių apsukų. Kad nekiltų abejonių, rekomenduojama 100 apsukų per penkias minutes.
      1.6.2.3.2.   Fazių atskyrimas
      
      Jeigu reikia, kad fazės atsiskirtų, mišinys centrifuguojamas. Tai turėtų būti atliekama laboratorine centrifuga kambario temperatūroje arba, jeigu naudojama centrifuga su nekontroliuojama temperatūra, centrifugos vamzdžiai, siekiant nustatyti pusiausvyrą, turėtų būti bandymo temperatūroje ne trumpiau kaip vieną valandą iki analizės.
      1.6.2.4.   Analizė
      Nustatant pasiskirstymo koeficientą yra būtina nustatyti bandomos medžiagos koncentracijas abiejose fazėse. Tą galima atlikti iš kiekvieno vamzdžio imant kiekvienos iš dviejų fazių alikvotinę dalį kiekvienai bandymo sąlygai ir jas analizuoti pagal pasirinktą darbo eigą. Visas medžiagos, esančios abiejose fazėse, kiekis turėtų būti apskaičiuojamas ir palyginamas su iš pradžių dėtos medžiagos kiekiu.
      Hidratuotos fazės mėginiai turėtų būti imami tokia tvarka, kad būtų kaip galima labiau sumažinamas pavojus įtraukti n-oktanolio pėdsakus: hidratuotos fazės mėginiui paimti gali būti naudojamas stiklinis švirkštas su nuimama adata. Iš pradžių švirkštas turėtų būti iš dalies pripildytas oro. Oras turėtų būti švelniai išstumiamas tuo pačiu metu įterpiant adatą per n-oktanolio sluoksnį. Į švirkštą įtraukiamas pakankamas tūris hidratuotos fazės. Švirkštas greitai ištraukiamas iš tirpalo ir nuimama adata. Švirkšto turinys gali būti naudojamas kaip hidratuotas mėginys. Dviejų atskirtų fazių koncentraciją geriau nustatyti tai medžiagai tinkamu metodu. Analizės metodų, kurie gali būti tinkami, pavyzdžiai:
      
                  —
               
               
                  fotometrinis metodas,
               
            
                  —
               
               
                  dujų chromatografija,
               
            
                  —
               
               
                  efektyvioji skysčių chromatografija.
               
            1.6.3.   HPLC metodas
      1.6.3.1.   Pasiruošimas
      Aparatūra
      Reikalingas skysčių chromatografas su įtaisytu impulsų nesukeliančiu siurbliu ir atitinkamu detektoriumi. Rekomenduojama naudoti injekcinį vožtuvą su injekcinėmis kilpomis. Tai, kad nuostoviojoje fazėje yra polinės grupės, gali smarkiai pakenkti HPLC kolonėlės darbą. Todėl nuostoviosiose fazėse turėtų būti mažiausias procentas polinių grupių (11). Gali būti naudojamos parduodamos mikrodalelių atvirkštinių fazių įkrovos arba jau įkrautos kolonėlės. Apsaugos kolonėlė gali būti dedama tarp įšvirkštimo sistemos ir analizinės kolonėlės.
      Judančioji fazė
      HPLC tinkantis metanolis ir HPLC tinkantis vanduo naudojami eliuentiniam tirpikliui paruošti, kuris prieš naudojimą degazuojamas. Turėtų būti naudojamas izokratinis eliuavimas. Turėtų būti naudojami metanolio/vandens santykiai su mažiausiu 25 % vandens kiekiu. Paprastai pakanka 3:1 (v/v) metanolio-vandens mišinio log P 6 junginiams eliuuoti per vieną valandą, kai debitas 1 ml/min. Jeigu junginių log P didelis, gali reikėti sutrumpinti eliuavimo laiką (taip pat ir etaloninių junginių), sumažinant judančiosios fazės poliškumą arba kolonėlės ilgį.
      Medžiagos, kurių tirpumas n-oktanolyje yra mažas, turi polinkį mažoms log Pow vertėms, kai naudojamas HPLC metodas; tokių junginių smailės kartais atsiranda įvykus tirpiklio frontui. Tai tikriausiai vyksta dėl to, kad pasiskirstymo procesas yra per lėtas pusiausvyrai pasiekti per normalų atskyrimo HPLC laiką. Tada debito mažinimas ir/arba metanolio/vandens santykio mažinimas gali būti veiksminga priemonė patikimai vertei gauti.
      Bandymo ir etaloniniai junginiai turėtų būti tirpūs judančiojoje fazėje ir pakankamos koncentracijos, kad juos būtų galima aptikti. Tik išimtiniais atvejais gali būti naudojami priedai su metanolio ir vandens mišiniu, kadangi priedai pakeičia kolonėlės savybes. Chromatogramose su priedais yra privaloma naudoti tokios pat rūšies atskirą kolonėlę. Jeigu metanolio ir vandens mišinys netinka, gali būti naudojami kiti organiniai vandenyje tirpūs mišiniai, pvz., etanolis ir vanduo arba acetonitrilas ir vanduo.
      Eliuato pH yra ypač svarbus jonizuojamiems junginiams. Jis turėtų būti kolonėlės eksploatacijos pH intervalo ribose, kuris paprastai yra 2-8. Rekomenduojama atlikti buferinius veiksmus. Reikia stengtis išvengti druskų nuosėdų ir kolonėlės gedimų, kurie pasireiškia dėl tam tikrų organinės fazės/buferinių mišinių. Nepatartina matuoti HPLC kvarcinėmis stacionariomis fazėmis, kai pH didesnis negu 8, kadangi dėl naudojamos šarminės judančiosios fazės gali greitai pablogėti kolonėlės veikimas.
      Tirpiniai
      Etaloniniai junginiai turėtų būti kiek įmanoma grynesni. Junginiai, kurie turi būti naudojami bandyme arba kalibravimui, jeigu įmanoma, ištirpinami judančiojoje fazėje.
      Bandymo sąlygos
      Matavimų metu temperatūra neturėtų svyruoti daugiau negu ± 2 K.
      1.6.3.2.   Matavimas
      
      Nulinio laiko to apskaičiavimas
      Nulinį laiką to galima nustatyti naudojant homologinę eilę (pvz., n-alkilmetilketonus) arba nepasiskirsčiusius organinius junginius (pvz., tiokarbamidas arba formamidas). Apskaičiuojant nulinį laiką to naudojant homologinę eilę, įšvirkščiami ne mažiau kaip septyni homologinės eilės nariai ir nustatomos atitinkamos sulaikymo trukmės. Neapdorotos sulaikymo trukmės tr(nc + 1)
      
      brėžiamos kaip tr(nc + 1) funkcija, o regresijos lygties – a ir b:
      tr (n c + 1) = a + b tr (n c)
      (nc – anglies atomų skaičius). Po to gaunamas nulinis laikas to pagal:
      Kalibravimo grafikas
      Po to sudaromas log k verčių ir log P santykio koreliacijos grafikas atitinkamiems etaloniniams junginiams. Praktiškai vienu metu įšvirkščiama nuo 5 iki 10 standartinių etaloninių junginių, kurių log P maždaug atitinka tikėtiną intervalą, ir nustatomos sulaikymo trukmės, geriau ant įrašančiojo integratoriaus, sujungto su aptikimo sistema. Apskaičiuojami atitinkami talpos koeficiento logaritmai log k ir brėžiamas log P, nustatyto kratomos kolbos metodu, funkcijos grafikas. Kalibruojama reguliariais intervalais, ne rečiau kaip kartą per dieną, kad būtų galima atlikti galimus pakitimus kolonėlės darbe.
      Mėginio talpos koeficiento nustatymas
      Įšvirkščiamas kiek įmanoma mažesnis mėginio judančiosios fazės kiekis. Nustatoma tokia sulaikymo trukmė (dvigubas nustatymas), kad būtų galima apskaičiuoti talpos koeficientą k. Iš etaloninių junginių koreliacijos grafiko galima interpoliuoti mėginio pasiskirstymo koeficientą. Jeigu pasiskirstymo koeficientas labai mažas arba labai didelis, būtina ekstrapoliacija. Tokiais atvejais ypač reikia atsižvelgti į regresijos tiesės pasikliovimo ribas.
      2.   DUOMENYS
      Kratomos kolbos metodas
      Nustatytų P verčių patikimumas gali būti patikrinamas palyginant dvigubo nustatymo vidurkius su suminiu vidurkiu.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  tikslios medžiagos charakteristikos (identiškumas ir priemaišos),
               
            
                  —
               
               
                  jeigu metodų neįmanoma panaudoti (pvz., paviršinio aktyvumo medžiaga), turėtų būti pateikiama apskaičiuotoji vertė arba duomenys, pagrįsti individualiu tirpumu n-oktanolyje ir vandenyje,
               
            
                  —
               
               
                  visa informacija ir pastabos, svarbios duomenų aiškinimui, ypač atsižvelgiant į medžiagoje esančias priemaišas ir jos fizinę būseną.
               
            Kratomos kolbos metodui:
      
                  —
               
               
                  išankstinio įvertinimo, jei toks buvo, rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  temperatūros nustatymas,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie analizės procedūras, naudotas nustatant koncentracijas,
               
            
                  —
               
               
                  centrifugavimo, jei jis buvo naudotas, laikas ir greitis,
               
            
                  —
               
               
                  kiekvienam nustatymui matuotos koncentracijos abiejose fazėse (tai reiškia, kad ataskaitoje bus pateikta iš viso 12 koncentracijų),
               
            
                  —
               
               
                  mėginio svoris, kiekvienos naudotos fazės tūris kiekviename mėgintuvėlyje ir visas apskaičiuotas mėginio kiekvienoje fazėje kiekis nusistovėjus pusiausvyrai,
               
            
                  —
               
               
                  apskaičiuotos pasiskirstymo koeficiento (P) vertės ir vidutinė vertė turėtų būti pateikiamos ataskaitoje kiekvienai bandymo sąlygų grupei, kaip ir visų nustatymų vidutinės vertės. Jeigu galima prielaida, kad koncentracija priklauso nuo pasiskirstymo koeficiento, tai turėtų būti nurodoma ataskaitoje,
               
            
                  —
               
               
                  turėtų būti pateikiami standartiniai individualiųjų P verčių nuokrypiai nuo vidutinės vertės,
               
            
                  —
               
               
                  visų nustatymų vidurkis P turėtų būti išreiškiamas logaritmu (dešimtainis logaritmas),
               
            
                  —
               
               
                  teoriškai apskaičiuotas P, jei ši vertė buvo nustatyta arba jeigu matuotoji vertė > 104,
               
            
                  —
               
               
                  naudoto vandens ir hidratuotos fazės pH eksperimento metu,
               
            
                  —
               
               
                  jeigu naudojami buferiai, buferių naudojimo vietoje vandens pagrindimas, buferių sudėtis, koncentracija ir pH, hidratuotos fazės pH prieš eksperimentą ir po jo.
               
            HPLC metodui:
      
                  —
               
               
                  išankstinių vertinimų, jeigu tokie buvo, rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  mėginiai ir etaloninės medžiagos, jų grynumas,
               
            
                  —
               
               
                  nustatymo temperatūros intervalas,
               
            
                  —
               
               
                  pH dydis, kuriam esant buvo atliekamas nustatymas,
               
            
                  —
               
               
                  išsami informacija apie analizes ir apsauginę kolonėlę, judančiąją fazę ir nustatymo vidurkius,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie kalibravimui naudotų etaloninių junginių sulaikymo ir literatūroje randamas trukmes
               
            
                  —
               
               
                  išsami informacija apie regresijos tiesės sudarymą (log k santykis su log P),
               
            
                  —
               
               
                  vidutiniai bandomo junginio duomenys apie sulaikymo trukmes ir interpoliuotą log P vertę,
               
            
                  —
               
               
                  įrenginių ir darbo sąlygų apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  eliuavimo profiliai,
               
            
                  —
               
               
                  į kolonėlę pakrautų mėginių ir etaloninių medžiagų kiekiai,
               
            
                  —
               
               
                  nulinis laikas ir kaip jis buvo matuojamas.
               
            4.   LITERATŪRA
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2)
               
               
                  C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
               
            
                  3)
               
               
                  Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
               
            
                  4)
               
               
                  L. Renberg, G. SundstrĖm and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, p. 683.
               
            
                  5)
               
               
                  H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, p. 219.
               
            
                  6)
               
               
                  B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, p. 73.
               
            
                  7)
               
               
                  W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1.
               
            
                  8)
               
               
                  J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, p. 675
               
            
                  9)
               
               
                  S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, p. 787
               
            
                  10)
               
               
                  O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, p. 223–339.
               
            
                  11)
               
               
                  R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, p. 479
               
            
                  12)
               
               
                  A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.
               
            
                  13)
               
               
                  R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.
               
            
                  14)
               
               
                  NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.
               
            
                  15)
               
               
                  C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459
               
            
                  16)
               
               
                  A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525
               
            
                  17)
               
               
                  C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, p. 1207.
               
            
                  18)
               
               
                  W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, p. 1113.
               
            
                  19)
               
               
                  D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, p. 382
               
            
                  20)
               
               
                  J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.
               
            
                  21)
               
               
                  R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984,
               
            
                  22)
               
               
                  Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Base11978.
               
            
                  23)
               
               
                  N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, p. 615.
               
            
         1 priedėlis
         Apskaičiavimo (vertinimo) metodai
         ĮVADAS
         Apskaičiavimo metodų, duomenų ir pavyzdžių bendrasis įvadas pateiktas „Handbook of Chemical Property Estimation Methods“ (a).
         Apskaičiuotosios Pow vertės gali būti naudojamos:
         
                     —
                  
                  
                     spręsti apie eksperimentinių metodų tinkamumą (kratomos kolbos metodo intervalas: log Pow vertės nuo 2 iki 4, HPLC intervalas: log Pow: nuo 0 iki 6),
                  
               
                     —
                  
                  
                     bandymo tinkamoms sąlygoms parinkti (pvz., etalonines medžiagas HPLC metodikose, n-oktanolio ir vandens tūrių santykį kratomos kolbos metode),
                  
               
                     —
                  
                  
                     galimų eksperimentinių paklaidų laboratorijos vidinės kontrolės priemone,
                  
               
                     —
                  
                  
                     Pow įverčiui gauti tais atvejais, kai eksperimentiniai metodai negali būti taikomi dėl techninių priežasčių.
                  
               VERTINIMO METODAS
         
            Išankstinis pasiskirstymo koeficiento įvertis
         
         Pasiskirstymo koeficientas gali būti įvertintas, naudojant bandomosios medžiagos tirpumo grynuose tirpikliuose vertes:
         Taigi:
         
            
         APSKAIČIAVIMO METODAI
         
            Apskaičiavimo metodų esmė
         
         Visi apskaičiavimo metodai remiasi formaliuoju molekulės dalinimu į atitinkamas mažesnes struktūras, kurių log Pow tikrieji pokyčiai yra žinomi. Tuomet visos molekulės log Pow apskaičiuojamas kaip atitinkamų dalių verčių suma pridedant pataisos dėl sąveikų molekulės viduje dėmenų sumą.
         Dalių konstantų ir pataisos dėmenų sąrašus galima rasti (b), (c), (d), (e). Kai kurie sąrašai yra nuolat atnaujinami (b).
         Kokybės kriterijai
         Paprastai apskaičiavimo metodo patikimumas mažėja kuo sudėtingesnė junginio sandara. Paprastų molekulių, turinčių mažą molekulinę masę ir vieną arba dvi funkcines grupes, atveju, tarp įvairiais fragmentavimo metodais gautų rezultatų ir išmatuotos vertės galima laukti 0,1 - 0,3 log Pow vieneto nuokrypio. Sudėtingesnių molekulių atveju paklaidos ribos gali būti didesnės. Tai priklauso nuo fragmentų konstantų patikimumo ir jų buvimo, taip pat nuo sugebėjimo įvertinti intramolekulines sąveikas (pvz., vandenilio jungtis) ir pataisos dėmenų teisingo naudojimo (mažiau problemų turint kompiuterinę programą CLOGP-3) (b). Joninių junginių atveju svarbu teisingai įvertinti krūvį arba jonizacijos laipsnį.
         Apskaičiavimo metodai
         Hansch π-metodas
         Pradinė hidrofobinio pakaito darinio konstanta, π, įvesta Fujira et al. (f) apibrėžiama taip:
         πx = log Pow (PhX) - log Pow (PhH)
         kai: Pow (PhX) aromatinio darinio pasiskirstymo koeficientas ir Pow (PhH) pradinio junginio pasiskirstymo koeficientas
         (pvz., pCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6) = 2,84-2,13 = 0,71).
         Pagal jo apibrėžimą π metodas labiausiai taikytinas pakaitų aromatiniame žiede atveju, π vertės didelei daliai pakaitų yra pateiktos lentelėse (b), (c), (d). Jos taikomos apskaičiuoti aromatinių molekulių arba aromatinių struktūrinių fragmentų log Pow.
         
         Rekker metodas
         Pagal Rekker (g) log Pow vertė apskaičiuojama taip:
         
            
         kai fi atstovauja įvairių molekulės fragmentų konstantoms ir ai – jų pasikartojimo dažnį tiriamoje molekulėje. Pataisos dėmenys gali būti išreikšti kaip vienos atskiros Cm, (vadinamosios „magiškosios konstantos“) sveikasis kartotinis. Fragmentų konstantos fi ir Cm buvo nustatytos iš 1 054 eksperimentinių Pow verčių sąrašo (825 junginiai), naudojant daugianarę regresinę analizę (c), (h). Sąveikos dėmenų nustatymas atliekamas pagal nustatytas taisykles, kurios aprašytos literatūroje (e), (h), (i).
         Hansch-Leo metodas
         Pagal Hansch ir Leo (c) log Pow vertė apskaičiuojama taip:
         
            
         kai fi atstovauja įvairių molekulės fragmentų konstantoms, F – pataisos dėmenis ir ai, bj – atitinkamus pasikartojimo dažnius. Atomų ir grupių fragmentinių verčių sąrašas ir pataisos dėmenų fi (vadinamųjų faktorių) sąrašas buvo nustatyti bandymų ir klaidų metodu, naudojant eksperimentines Pow vertes. Pataisos dėmenys buvo suskirstyti į keletą skirtingų klasių (a), (c). Atsižvelgti į visas taisykles ir pataisos dėmenis yra gana sudėtinga ir reikalauja daug laiko. Yra sukurti programų paketai (b).
         Kombinuotasis metodas
         Sudėtinių molekulių log Pow apskaičiavimas gali būti iš esmės pagerintas, jei molekulė dalinama į didesnes struktūrines dalis, kurių log Pow patikimos vertės randamos lentelėse (b), (c) arba gaunamos naudojant pačių atliktus matavimus. Vėliau tokie fragmentai (pvz., heterociklai, antrachinonas, azobenzenas) gali būti derinami Hansch π-vertėmis arba su Rekker arba Leo fragmentų konstantomis.
         Pastabos
         
                     i)
                  
                  
                     Apskaičiavimo metodai gali būti taikomi tik iš dalies arba visiškai jonizuotiems junginiams, jei įmanoma atsižvelgti į būtinuosius pataisos faktorius.
                  
               
                     ii)
                  
                  
                     Jei gali būti padaryta prielaida apie tarpmolekulinių vandenilinių jungčių buvimą, turi būti pridedami atitinkami pataisos dėmenys (maždaug nuo +0,6 iki +1,0 log Pow vieneto) (a). Tokių ryšių buvimo požymiai gali būti gauti naudojant molekulės erdvinius modelius arba spektroskopinius duomenis.
                  
               
                     iii)
                  
                  
                     Jei galimos kelios tautomerinės formos, apskaičiavimai turi remtis pačia patikimiausia forma.
                  
               
                     iv)
                  
                  
                     Būtina kruopščiai sekti fragmentų konstantų sąrašų pataisas.
                  
               Ataskaita
         Taikant apskaičiavimo (vertinimo) metodus, bandymų ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti tokia informacija:
         
                     —
                  
                  
                     medžiagos aprašymas (mišinys, priemaišos ir t. t.),
                  
               
                     —
                  
                  
                     kokio nors galimo intramolekulinio vandenilinio ryšio, disociacijos, krūvio ir visų kitų neįprastų veiksnių (pvz., tautomerijos) požymiai,
                  
               
                     —
                  
                  
                     apskaičiavimo metodo aprašymas,
                  
               
                     —
                  
                  
                     duomenų bazės identifikavimas arba šaltinis,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ypatumai pasirenkant fragmentus,
                  
               
                     —
                  
                  
                     išsamus apskaičiavimo dokumentavimas.
                  
               NUORODOS
         
                     a)
                  
                  
                     W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.
                  
               
                     b)
                  
                  
                     Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).
                  
               
                     c)
                  
                  
                     C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
                  
               
                     d)
                  
                  
                     Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.
                  
               
                     e)
                  
                  
                     R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. -Chill. Ther. 1979, vol. 14, 479.
                  
               
                     f)
                  
                  
                     T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.
                  
               
                     g)
                  
                  
                     R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977,vol.1.
                  
               
                     h)
                  
                  
                     C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,1459.
                  
               
                     i)
                  
                  
                     R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.
                  
               
      
         2 priedėlis
         Etaloninės medžiagos, rekomenduojamos naudoti taikant HPLC (high power liquid chromatography) – efektyviąją skysčių chromatografiją
         
                     Nr.
                  
                  
                     Etaloninė medžiaga
                  
                  
                     Log Pow
                     
                  
                  
                     pKa
                  
               
                     1
                  
                  
                     2-butanonas
                  
                  
                     0,3
                  
                  
                      
                  
               
                     2
                  
                  
                     4-acetilpiridinas
                  
                  
                     0,5
                  
                  
                      
                  
               
                     3
                  
                  
                     Anilinas
                  
                  
                     0,9
                  
                  
                      
                  
               
                     4
                  
                  
                     N-fenilacetamidas
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                      
                  
               
                     5
                  
                  
                     Benzilo alkoholis
                  
                  
                     1,1
                  
                  
                      
                  
               
                     6
                  
                  
                     p-metoksifenolis
                  
                  
                     1,3
                  
                  
                     pKa = 10,26
                  
               
                     7
                  
                  
                     Feniloksiacto rūgštis
                  
                  
                     1,4
                  
                  
                     pKa = 3,12
                  
               
                     8
                  
                  
                     Fenolis
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     pKa = 9,92
                  
               
                     9
                  
                  
                     2,4-dinitrofenolis
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     pKa = 3,96
                  
               
                     10
                  
                  
                     Benznitrilas
                  
                  
                     1,6
                  
                  
                      
                  
               
                     11
                  
                  
                     Fenilacetonitrilas
                  
                  
                     1,6
                  
                  
                      
                  
               
                     12
                  
                  
                     4-metilbenzilo alkoholis
                  
                  
                     1,6
                  
                  
                      
                  
               
                     13
                  
                  
                     Acetofenonas
                  
                  
                     1,7
                  
                  
                      
                  
               
                     14
                  
                  
                     2-nitrofenolis
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     pKa = 7,17
                  
               
                     15
                  
                  
                     3-nitrobenzenkarboninė rūgštis
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     pKa = 3,47
                  
               
                     16
                  
                  
                     4-chloranilinas
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     pKa = 4,15
                  
               
                     17
                  
                  
                     Nitrobenzenas
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                      
                  
               
                     18
                  
                  
                     3-fenilpropen-2-olis
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                      
                  
               
                     19
                  
                  
                     Benzenkarboninė rūgštis
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                     pKa = 4,19
                  
               
                     20
                  
                  
                     p-krezolis
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                     pKa = 10,17
                  
               
                     21
                  
                  
                     3-fenilakrilo rūgštis
                  
                  
                     2,1
                  
                  
                     pKa = 3,89 cis 4,44 trans
                  
               
                     22
                  
                  
                     Metilfenileteris
                  
                  
                     2,1
                  
                  
                      
                  
               
                     23
                  
                  
                     Metibenzoatas
                  
                  
                     2,1
                  
                  
                      
                  
               
                     24
                  
                  
                     Benzenas
                  
                  
                     2,1
                  
                  
                      
                  
               
                     25
                  
                  
                     3-metilbenzenkarboninė rūgštis
                  
                  
                     2,4
                  
                  
                     pKa = 4,27
                  
               
                     26
                  
                  
                     4-chlorfenolis
                  
                  
                     2,4
                  
                  
                     pKa = 9,1
                  
               
                     27
                  
                  
                     Trichloretilenas
                  
                  
                     2,4
                  
                  
                      
                  
               
                     28
                  
                  
                     Atrazinas
                  
                  
                     2,6
                  
                  
                      
                  
               
                     29
                  
                  
                     Etilbenzoatas
                  
                  
                     2,6
                  
                  
                      
                  
               
                     30
                  
                  
                     2,6-dichlorbenznitrilas
                  
                  
                     2,6
                  
                  
                      
                  
               
                     31
                  
                  
                     3-chlorbenzenkarboninė rūgštis
                  
                  
                     2,7
                  
                  
                     pKa = 3,82
                  
               
                     32
                  
                  
                     Toluenas
                  
                  
                     2,7
                  
                  
                      
                  
               
                     33
                  
                  
                     1-naftolis
                  
                  
                     2,7
                  
                  
                     pKa = 9,34
                  
               
                     34
                  
                  
                     2,3-dichloranilinas
                  
                  
                     2,8
                  
                  
                      
                  
               
                     35
                  
                  
                     Chlorbenzenas
                  
                  
                     2,8
                  
                  
                      
                  
               
                     36
                  
                  
                     Alilfenileteris
                  
                  
                     2,9
                  
                  
                      
                  
               
                     37
                  
                  
                     Brombenzenas
                  
                  
                     3,0
                  
                  
                      
                  
               
                     38
                  
                  
                     Etilbenzenas
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                      
                  
               
                     39
                  
                  
                     Benzofenonas
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                      
                  
               
                     40
                  
                  
                     4-fenilfenolis
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                     pKa = 9,54
                  
               
                     41
                  
                  
                     Timolis
                  
                  
                     3,3
                  
                  
                      
                  
               
                     42
                  
                  
                     1,4-dichlorbenzenas
                  
                  
                     3,4
                  
                  
                      
                  
               
                     43
                  
                  
                     Difenilaminas
                  
                  
                     3,4
                  
                  
                     pKa = 0,79
                  
               
                     44
                  
                  
                     Naftalinas
                  
                  
                     3,6
                  
                  
                      
                  
               
                     45
                  
                  
                     Fenilbenzoatas
                  
                  
                     3,6
                  
                  
                      
                  
               
                     46
                  
                  
                     [zopropilbenzenas
                  
                  
                     3,7
                  
                  
                      
                  
               
                     47
                  
                  
                     2,4,6-trichlorfenolis
                  
                  
                     3,7
                  
                  
                     pKa =6
                  
               
                     48
                  
                  
                     Difenilas
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                      
                  
               
                     49
                  
                  
                     Benzilbenzoatas
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                      
                  
               
                     50
                  
                  
                     2,4-dinitro-6-(antr- butil)-fenolis
                  
                  
                     4,1
                  
                  
                      
                  
               
                     51
                  
                  
                     1,2,4-trichlorbenzenas
                  
                  
                     4,2
                  
                  
                      
                  
               
                     52
                  
                  
                     Dodekankarboninė rūgštis
                  
                  
                     4,2
                  
                  
                      
                  
               
                     53
                  
                  
                     Difenileteris
                  
                  
                     4,2
                  
                  
                      
                  
               
                     54
                  
                  
                     n-butilbenzenas
                  
                  
                     4,5
                  
                  
                      
                  
               
                     55
                  
                  
                     Fenantrenas
                  
                  
                     4,5
                  
                  
                      
                  
               
                     56
                  
                  
                     Fluorantenas
                  
                  
                     4,7
                  
                  
                      
                  
               
                     57
                  
                  
                     Dibenzilas
                  
                  
                     4,8
                  
                  
                      
                  
               
                     58
                  
                  
                     2,6-difenilpiridinas
                  
                  
                     4,9
                  
                  
                      
                  
               
                     59
                  
                  
                     Trifenilaminas
                  
                  
                     5,7
                  
                  
                      
                  
               
                     60
                  
                  
                     DDT [2,2,2-trichlor-1,1-bis-(p-chlorfenil)etanas]
                  
                  
                     6,2
                  
                  
                      
                  
               
                     Kitos mažą log Pow turinčios etaloninės medžiagos
                  
               
                     1
                  
                  
                     Nikotino rūgštis
                  
                  
                     -0,07
                  
                  
                      
                  
               
      A.9.   PLIŪPSNIO TEMPERATŪRA
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Prieš atliekant šį bandymą, naudinga turėti išankstinę informaciją apie medžiagos degumą. Bandymo metodika taikytina skystosioms medžiagoms, kurių garai gali būti padegti uždegimo priemonėmis. Šiame tekste pateikti metodai patikimi tiktai tame pliūpsnio temperatūros intervale, kuris yra tam metodui nurodytas.
      Renkantis taikytiną metodą, būtina atsižvelgti į reakcijos tarp mėginio ir mėginio indo galimybę.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Pliūpsnio temperatūra – tai mažiausia temperatūra, su pataisa 101,325 kPa slėgiui, kurioje bandymo metodui apibrėžtomis sąlygomis virš skysčio atsiranda tiek garų, kad mėginio inde susidaro degus garų ir oro mišinys.
      Vienetai: oC;
      t = T - 273,15;
      (t vienetai – oC, T vienetai – K).
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Etalonines medžiagas nebūtina naudoti kiekvienu atveju tiriant naują medžiagą. Daugiausia jos turi būti naudojamos, kai reikia kartais tikrinti metodo veikimą ir norint lyginti su rezultatais, gautais kitais metodais.
      1.4.   METODO ESMĖ
      Medžiaga pilama į mėginio indą ir pagal atskiram bandymo metodui naudojamą metodiką šildoma arba aušinama iki bandymo temperatūros. Užsidegimo bandymai atliekami norint nustatyti, ar mėginys bandymo temperatūroje užsiliepsnoja ar neužsiliepsnoja.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      1.5.1.   Pakartojamumas
      Pakartojamumas kinta atsižvelgiant į pliūpsnio temperatūros intervalą ir taikomą bandymo metodą; didžiausias kintamumas 2 oC.
      1.5.2.   Jautrumas
      Jautrumas priklauso nuo taikyto bandymo metodo.
      1.5.3.   Specifiškumas
      Kai kurių bandymo metodų specifiškumas apribotas tam tikrais pliūpsnio temperatūros intervalais ir priklauso nuo medžiagai būdingų savybių (pvz., didelės klampos).
      1.6.   METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Ruošimas
      Bandomosios medžiagos mėginys įpilamas į bandymo aparatą pagal 1.6.3.1 ir (arba) 1.6.3.2.
      Saugai užtikrinti rekomenduojama, kad intensyviai reaguojančių ir nuodingų medžiagų mėginys būtų mažas, maždaug 2 cm3.
      1.6.2.   Bandymo sąlygos
      Aparatas, kiek tai atitinka saugą, turi būti dedamas nuo traukos apsaugotoje vietoje.
      1.6.3.   Bandymo eiga
      1.6.3.1   Pusiausvirasis metodas
      Žr. ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.
      1.6.3.2   Nepusiausvirasis metodas
      Abel aparatas:
      žr. BS 2000 170 dalį, NF M07-011, NF T66-009.
      Abel-Pensky aparatas:
      žr. EN 57, DIN 51755 1 dalį (temperatūra 5–65 oC), DIN 51755 2 dalį (temperatūra mažesnė nei 5 oC), NF M07-036.
      Tag aparatas:
      žr. ASTM D 56.
      Pensky-Martens aparatas:
      žr. ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.
      Pastabos
      Kai nepusiausviruoju metodu pagal 1.6.3.2 nustatoma, kad pliūpsnio temperatūra lygi 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC arba 55 ± 2 oC, jos vertė turi būti patvirtinta pusiausviruoju metodu, naudojant tą patį aparatą.
      Skelbti rezultatams gali būti taikomi tik tokie metodai, kuriais galima nustatyti pliūpsnio temperatūrą.
      Klampių skysčių (dažų, dervų ir panašių medžiagų), turinčių tirpiklių, pliūpsnio temperatūrai nustatyti gali būti taikomas tik klampių medžiagų pliūpsnio temperatūrai nustatyti tinkamas metodas.
      Žr. ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 1 dalį.
      
                  2.
               
               
                  DUOMENYS
               
            3.   ATASKAITA
      Jei įmanoma, bandymo ataskaitoje turi būti tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  tiksli medžiagos specifikacija (identifikavimas ir priemaišos),
               
            
                  —
               
               
                  turi būti nurodytas taikytas metodas, taip pat visi galimi nukrypimai,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatai ir visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.
               
            4.   NUORODOS
      Nėra
      A.10.   DEGUMAS (KIETOSIOS MEDŽIAGOS)
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Prieš atliekant šį bandymą, naudinga turėti išankstinę informaciją apie medžiagos potencialias sprogstamąsias savybes.
      Šis bandymas turi būti taikomas tik medžiagoms, turinčioms miltelių, granulių arba pastos pavidalą.
      Nenorint įtraukti visas medžiagas, kurios gali būti padegtos, tačiau tik greitai degančias arba kurių elgsena degant bet kuriuo atveju yra ypač pavojinga, labai degiomis medžiagomis laikomos tik tos medžiagos, kurių degimo greitis yra didesnis nei tam tikra ribinė vertė.
      Gali būti ypač pavojinga, jei įkaitimo zona plinta metaliniuose milteliuose, kadangi gesinant liepsną kyla sunkumų. Metaliniai milteliai turi būti laikomi labai degiomis medžiagomis, jei jie palaiko įkaitimo zonos plitimą miltelių masėje per tam tikrą laiką.
      1.2.   APIBRĖŽIMAS IR VIENETAI
      Degimo laikas reiškiamas sekundėmis.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nenurodytos.
      1.4.   METODO ESMĖ
      Formuojamas maždaug 250 mm ilgio vientisas medžiagos strypas arba miltelių juosta ir atliekamas išankstinis atrankos bandymas, norint nustatyti, ar padegus dujiniu degikliu vyksta degančios liepsnos plitimas ar rusenimas. Jei plitimas 200 mm juosta įvyksta per nustatytą laiką, tuomet degimo greičiui nustatyti bandymas atliekamas pagal visą programą.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nenurodyti.
      1.6.   METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Išankstinis atrankos bandymas
      Ant nedegios, neakytos ir šilumai nelaidžios pagrindo plokštės formuojamas maždaug 250 mm ilgio, 20 mm pločio ir 10 mm aukščio medžiagos strypas arba miltelių juosta. Vienas miltelių juostos galas karšta dujų degiklio liepsna (mažiausias skersmuo 5 mm) veikiamas tol, kol milteliai užsidega arba ne ilgiau kaip 2 minutes (metalų arba metalų lydinių milteliai veikiami 5 minutes). Reikia pasižymėti, ar degimo zona išilgai 200 mm plinta 4 min. bandymo laiko (arba 40 minučių metalų miltelių atveju). Jei medžiaga neužsidega ir degimo zona išilgai 200 mm miltelių juostos plinta su liepsna arba rusenant 4 minutes (arba 40 minučių) bandymo laiko, medžiaga neturi būti laikoma labai degia ir toliau jos bandyti nereikia. Jei degimo zona 200 mm ilgio medžiagos miltelių juosta plinta mažiau kaip 4 minutes arba mažiau kaip 40 minučių, jei tai metaliniai milteliai, turi būti atliekama toliau aprašyta veiksmų seka (1.6.2 punktas ir toliau).
      1.6.2.   Degimo greičio bandymas
      1.6.2.1.   Ruošimas
      Medžiagos milteliai arba granulės suberiamos į 250 mm ilgio formą, turinčią trikampio formos skerspjūvį, kurio vidinis aukštis 10 mm ir plotis 20 mm. Abejose formos pusėse išilgine kryptimi tvirtinamos dvi iš šonų ribojančios metalinės plokštės, kurios yra 2 mm aukštesnės nei viršutinis trikampio skerspjūvio kraštas (žr. paveikslą). Forma tris kartus numetama iš 2 cm aukščio ant kieto paviršiaus. Jei reikia, forma vėl pripildoma. Šoninės ribojančios plokštės nuimamos ir medžiagos perteklius nubraukiamas. Ant formos viršaus uždedama nedegi, neakyta ir blogai šilumą leidžianti pagrindo plokštė, įtaisas apverčiamas ir forma nuimama.
      Pastos pavidalo medžiagos dedamos ant nedegios, neakytos ir blogai šilumą leidžiančios pagrindo plokštės, pagaminant iš jų 250 mm ilgio juostelę, kurios skerspjūvio plotas apie 1 cm2.
      1.6.2.2.   Bandymų sąlygos
      Jei bandoma drėgmei jautri medžiaga, bandymas ją išėmus iš indo turi būti atliekamas kiek įmanoma greičiau.
      1.6.2.3.   Bandymo eiga
      Krūvelė dedama į traukos spintą skersai traukos krypčiai.
      Oro greitis turi būti pakankamas, kad dūmai negalėtų patekti į laboratoriją, ir bandymo metu turi nesikeisti. Apie įtaisą turi būti įtaisytas nuo traukimo saugantis ekranas.
      Krūvelei viename gale padegti naudojama karšta dujų degiklio liepsna (mažiausias skersmuo 5 mm). Kai krūvelė sudega 80 mm atstumu, kitoje 100 mm atkarpoje matuojamas degimo greitis.
      Bandymas atliekamas šešis kartus, jei teigiamas rezultatas negaunamas anksčiau, kiekvieną kartą naudojant švarią šaltą plokštę.
      2.   DUOMENYS
      Vertinant rezultatus, reikalinga degimo trukmė, nustatyta išankstiniame atrankos bandyme (1.6.1.) ir trumpiausia degimo trukmė, gauta ne daugiau kaip šešiuose bandymuose (1.6.2.3.).
      3.   ATASKAITA
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Jei įmanoma, bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  tiksli medžiagos specifikacija (identifikavimas ir priemaišos),
               
            
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos apibūdinimas, jos fizinė būsena, įskaitant drėgmės kiekį,
               
            
                  —
               
               
                  išankstinių atrankos bandymų ir degimo greičio bandymo, jei buvo atliekamas, rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.
               
            3.2.   REZULTATŲ AIŠKINIMAS
      Miltelių, granulių ir pastos pavidalo medžiagos turi būti laikomos labai degiomis, jei degimo trukmė bet kuriame bandyme, atliktame pagal 1.6.2 aprašytą metodiką, yra mažesnė kaip 45 sekundės. Metalų arba metalų lydinių milteliai laikomi labai degiais, jei jie gali būti padegti ir liepsna arba reakcijos zona visu bandiniu plinta 10 minučių arba mažiau.
      4.   NUORODOS
      NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.
      
         Priedėlis
         Paveikslas
         Forma ir priedai krūvelei ruošti
         (Visi matmenys milimetrais)
         
            
      
      A.11.   DEGUMAS (DUJOS)
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Šis metodas leidžia nustatyti, ar dujos, sumaišytos su oru kambario temperatūroje (maždaug 20 oC) ir atmosferos slėgyje, yra degios, o jei degios, tai koks yra degumo koncentracijos intervalas. Didinamos koncentracijos bandomųjų dujų mišiniai su oru veikiami elektros kibirkštimi ir stebima, ar mišinys užsidega.
      1.2.   APIBRĖŽIMAS IR VIENETAI
      Degumo intervalas yra intervalas tarp apatinės ir viršutinės sprogimo ribinės koncentracijos. Apatinė ir viršutinė sprogimo ribinė koncentracija yra tokia degių dujų mišinio su oru ribinė koncentracija, kuriai esant liepsnos plitimas nevyksta.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nenurodytos.
      1.4.   METODO ESMĖ
      Dujų koncentracija ore didinama pakopomis ir kiekvienos pakopos dujų mišinys veikiamas elektros kibirkštimi.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Neapibrėžti.
      1.6.   METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Aparatūra
      Bandymo indas – vertikaliai pastatytas stiklinis cilindras, kurio mažiausias vidinis skersmuo 50 mm ir mažiausias aukštis 300 mm. Uždegimo elektrodai, tarp kurių yra 3-5 mm atstumas, įdedami 60 mm nuo cilindro dugno. Cilindras turi slėgio mažinimo angą. Norint apriboti bet kokio sprogimo padarytą žalą, aparatas turi būti apsaugotas skydu.
      Uždegimo šaltiniu naudojama stovinčioji indukcinė 0,5 s trukmės kibirkštis, generuojama aukštos įtampos transformatoriaus, kurio išėjimo įtampa 10-15 kV (didžiausia imamoji galia 300 W). Tinkamos aparatūros pavyzdys aprašytas (2) nuorodoje.
      1.6.2.   Bandymo sąlygos
      Bandymas turi būti atliekamas kambario temperatūroje (maždaug 20 oC).
      1.6.3.   Bandymo eiga
      Žinomos koncentracijos dujų mišinys su oru leidžiamas į cilindrą, naudojant dozavimo siurblius. Per mišinį leidžiama kibirkštis ir stebima, ar liepsna atsiskiria nuo liepsnos šaltinio ir plinta savaime ar taip nevyksta. Dujų koncentracija keičiama 1 % tūr. pakopomis tol, kol dujos užsidega, kaip tai aprašyta anksčiau.
      Jei cheminė dujų sandara rodo, kad jos neturėtų būti degios, ir gali būti apskaičiuota jų stechiometrinio mišinio su oru sudėtis, tai 1 % pakopomis reikia tikrinti pradedant mišiniu, kuriame dujų yra 10 % mažiau nei stechiometrinės sudėties mišinyje, ir baigiant mišiniu, kuriame dujų yra 10 % daugiau nei stechiometrinės sudėties mišinyje.
      2.   DUOMENYS
      Šiai savybei nustatyti reikalingi tik duomenys apie liepsnos plitimą.
      3.   ATASKAITA
      Jei įmanoma, bandymo ataskaitoje turi būti tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  tiksli medžiagos specifikacija (identifikavimas ir priemaišos),
               
            
                  —
               
               
                  naudotos aparatūros aprašymas, nurodant matmenis,
               
            
                  —
               
               
                  temperatūra, kurioje bandymas buvo atliekamas,
               
            
                  —
               
               
                  bandytos koncentracijos ir gauti rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  bandymo rezultatas: nedegios dujos ar labai degios dujos,
               
            
                  —
               
               
                  jei padaryta išvada, kad dujos nedegios, tai turi būti nurodytas koncentracijos intervalas, kuriame tai buvo bandoma 1 % pakopomis,
               
            
                  —
               
               
                  turi būti pateikta visa rezultatams aiškinti reikalinga informacija ir pastabos.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.
               
            
                  2)
               
               
                  W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse- einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen'. Chem.-Ing.- Tech. 1984, vol. 56, 2, p. 126–127.Wortmann, T.Redeker und H.Schacke. 'Entwicklung
               
            A.12.   DEGUMAS (SĄLYTIS SU VANDENIU)
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Šis bandymo metodas gali būti taikomas norint nustatyti, ar dėl medžiagos reakcijos su vandeniu arba drėgme nesusidaro pavojingas kiekis vienos arba keleto rūšių dujų, kurios galėtų būti labai degios.
      Bandymo metodas gali būti taikomas kietosioms ir skystosioms medžiagoms. Šis metodas netaikytinas medžiagoms, kurios užsidega ore.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Labai degios: medžiagos, kurios sąlytyje su vandeniu arba drėgnu oru pavojingais kiekiais ne mažesne kaip 1 litras/kg per valandą sparta išskiria labai degias dujas.
      1.3.   METODO ESMĖ
      Medžiaga bandoma laikantis toliau aprašytos pakopų sekos; jei dujos kurios nors pakopoje užsiliepsnoja, toliau bandyti nebūtina. Jei žinoma, kad medžiaga su vandeniu intensyviai nereaguoja, pradėkite nuo 4 pakopos (1.3.4).
      1.3.1.   1 pakopa
      Bandomoji medžiaga dedama į lovelį su distiliuotu vandeniu 20 oC temperatūroje ir stebima, ar išsiskiriančios dujos užsiliepsnoja ar neužsiliepsnoja.
      1.3.2.   2 pakopa
      Bandomoji medžiaga dedama ant filtravimo popieriaus, padėto į lėkštelę su distiliuotu vandeniu 20 oC temperatūroje, ir stebima, ar išsiskiriančios dujos užsiliepsnoja ar neužsiliepsnoja. Filtravimo popierius skirtas tik tam, kad medžiaga būtų vienoje vietoje, kas padidintų užsiliepsnojimo galimybę.
      1.3.3.   3 pakopa
      Iš bandomosios medžiagos padaroma krūvelė, kurios aukštis apie 2 cm ir skersmuo 3 cm. Ant krūvelės lašinami keli lašai vandens ir stebima, ar išsiskiriančios dujos užsiliepsnoja ar neužsiliepsnoja.
      1.3.4.   4 pakopa
      Bandomoji medžiaga maišoma su distiliuotu vandeniu 20 oC temperatūroje ir kas valandą septynias valandas matuojama dujų išsiskyrimo sparta. Jei dujų skyrimosi sparta svyruoja arba septynias valandas didėja, matavimo trukmė turi būti padidinta ne ilgiau kaip iki penkių parų. Bandymas gali būti sustabdytas, jei išsiskyrimo sparta kuriuo nors momentu yra didesnė kaip 1 litras/kg per valandą.
      1.4   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nenurodytos.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      1.6.   METODŲ APRAŠYMAS
      1.6.1.   1 pakopa
      1.6.1.1.   Bandymo sąlygos
      Bandymas atliekamas kambario temperatūroje (maždaug 20 oC).
      1.6.1.2.   Bandymo eiga
      Nedidelis kiekis (skersmuo maždaug 2 mm) bandomosios medžiagos turi būti įdėta į lovelį su distiliuotu vandeniu. Reikia stebėti, ar i) skiriasi kokios nors dujos ir ii) ar jos užsiliepsnoja. Jei dujos užsiliepsnoja, medžiagos toliau bandyti nereikia, nes medžiaga laikoma pavojinga.
      1.6.2.   2 pakopa
      1.6.2.1.   Aparatūra
      Filtravimo popierius dedamas distiliuoto vandens, įpilto į bet kokį tinkamą indą, pvz., 100 mm skersmens garinimo lėkštelę, paviršiuje.
      1.6.2.2.   Bandymo sąlygos
      Bandymas atliekamas kambario temperatūroje (maždaug 20 oC).
      1.6.2.3.   Bandymo eiga
      Nedidelis kiekis (skersmuo maždaug 2 mm) bandomosios medžiagos dedamas filtravimo popieriaus centre. Reikia stebėti, ar i) skiriasi kokios nors dujos ir ii) ar jos užsiliepsnoja. Jei dujos užsiliepsnoja, medžiagos toliau bandyti nereikia, nes medžiaga laikoma pavojinga.
      1.6.3.   3 pakopa
      1.6.3.1.   Bandymo sąlygos
      Bandymas atliekamas kambario temperatūroje (maždaug 20 oC).
      1.6.3.2.   Bandymo eiga
      Iš bandomosios medžiagos daroma krūvelė, kurios aukštis apie 2 cm ir skersmuo 3 cm ir kurios viršuje yra padarytas įdubimas. Į įdubimą lašinami keli lašai vandens ir stebima, ar i) skiriasi kokios nors dujos ir ii) ar jos užsiliepsnoja. Jei dujos užsiliepsnoja, medžiagos toliau bandyti nereikia, nes medžiaga laikoma pavojinga.
      1.6.4.   4 pakopa
      1.6.4.1.   Aparatūra
      Surenkamas paveiksle parodytas aparatas.
      1.6.4.2.   Bandymo sąlygos
      Apžiūrėkite talpyklą su bandomąja medžiaga, ar jame nėra miltelių < 500 μm (dalelių dydis). Jei milteliai sudaro daugiau kaip 1 % visos medžiagos masės arba jei medžiaga yra trapi, tai norint atsižvelgti į dalelių dydžio mažėjimą laikymo ir krovimo metu, prieš bandymus visa medžiaga turi būti sumalta į miltelius; kitu atveju medžiaga turi būti bandoma tokia, kokia gauta. Bandymas turi būti atliekamas kambario temperatūroje (maždaug 20 oC) ir atmosferiniame slėgyje.
      1.6.4.3.   Bandymo eiga
      Į aparato lašinamąjį piltuvą įpilama 10-20 ml vandens, o į kūginę kolbą įdedama 10 g bandomosios medžiagos. Išsiskyrusių dujų tūris gali būti išmatuotas bet kuriuo tinkamu būdu. Atidaromas lašinamojo piltuvo čiaupas, kad vanduo galėtų tekėti į kūginę kolbą, ir paleidžiamas sekundmatis. Išsiskyrusių dujų kiekis kas valandą matuojamas septynias valandas. Jei per šį laiką išsiskyrusių dujų kiekis svyruoja arba jei šio laikotarpio pabaigoje išsiskyrusių dujų kiekis didėja, matavimai turi būti tęsiami ne ilgiau kaip penkias paras. Jei kuriuo nors matavimo momentu dujų išsiskyrimo sparta yra didesnė kaip 1 litras/kg per valandą, bandymą galima nutraukti. Šis bandymas turi būti pakartotas tris kartus.
      Jei cheminė dujų sudėtis nežinoma, dujos turi būti analizuojamos. Jei dujose yra labai degių komponentų ir nėra žinoma, ar visas mišinys yra labai degus, turi būti paruoštas ir pagal A. 11 metodą išbandytas tokios pačios sudėties mišinys.
      2.   DUOMENYS
      Medžiaga laikoma pavojinga, jei:
      
                  —
               
               
                  bet kurioje bandymo pakopoje įvyksta užsidegimas,
                  arba
               
            
                  —
               
               
                  degios dujos skiriasi didesne kaip 1 litras/kg bandomosios medžiagos per valandą sparta.
               
            3.   ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  tiksli medžiagos specifikacija (identifikavimas ir priemaišos),
               
            
                  —
               
               
                  bet kokio bandomosios medžiagos pradinio ruošimo detalės,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų rezultatai (1,2,3 ir 4 pakopos),
               
            
                  —
               
               
                  išsiskyrusių dujų cheminė sudėtis,
               
            
                  —
               
               
                  dujų išsiskyrimo sparta, jei vykdoma 4 pakopa (1.6.4),
               
            
                  —
               
               
                  visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.
               
            
                  2)
               
               
                  NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
               
            
         Priedėlis
         Paveikslas
         Aparatas
         
            
      
      A.13.   PIROFORINĖS KIETŲJŲ MEDŽIAGŲ IR SKYSČIŲ SAVYBĖS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Bandymo metodikos taikytinos kietosioms ir skystosioms medžiagoms, kurių maži kiekiai užsidega po trumpalaikio sąlyčio su oru kambario temperatūroje (maždaug 20 oC).
      Šis bandymo metodas netaikomas medžiagoms, kurios kambario temperatūros ore užsidega tik po kelių valandų arba dienų arba kurioms reikia aukštesnės temperatūros.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Laikoma, kad medžiagos turi piroforinių savybių, jei 1.6 apibrėžtomis sąlygomis jos užsidega arba apanglėja.
      Savaiminį skysčių užsidegimą gali tekti bandyti taikant A.15 metodą „Savaiminio užsidegimo temperatūra (skysčiai ir dujos)“.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nenurodytos.
      1.4.   METODO ESMĖ
      Kieta arba skysta medžiaga maišoma su inertišku nešikliu ir kambario temperatūroje penkias minutes laikoma ore. Jei skystos medžiagos neužsidega, jos sugeriamos filtravimo popieriumi ir kambario temperatūroje (maždaug 20 oC) penkias minutes laikomos ore. Kieta arba skysta medžiaga laikoma piroforine, jei ji užsidega, arba skystis uždega ar apdegina filtravimo popierių.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Pakartojamumas: kadangi tai labai svarbu saugai, vienintelio teigiamo rezultato pakanka, kad medžiaga būtų laikoma piroforine.
      1.6.   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Aparatūra
      Maždaug 10 cm skersmens porcelianinė lėkštutė kambario temperatūroje (maždaug 20 oC) apytikriai iki 5 mm pripildoma diatomito.
      Pastaba
      Diatomitas arba kuri nors kita panaši inertiška medžiaga, kurią būtų galima visur gauti, turi būti imama vietoje žemės, ant kurios bandomoji medžiaga galėtų būti išpilta avarijos atveju.
      Bandyti skysčiams, kurie neužsidega ore sumaišyti su inertiniu nešikliu, reikia turėti sausą filtravimo popierių.
      1.6.2.   Bandymo eiga
      a)   Milteliai
      1-2 cm3 bandomosios kietos medžiagos miltelių iš maždaug 1 m aukščio beriama ant nedegaus paviršiaus ir žiūrima, ar medžiaga užsidega krisdama arba per penkias minutes po nusėdimo.
      Bandymas kartojamas šešis kartus, jei medžiaga neužsidega.
      b)   Skysčiai
      Maždaug 5 cm3 bandomojo skysčio supilama į paruoštą porcelianinę lėkštutę ir stebima, ar medžiaga užsidega per penkias minutes.
      Jei per šešis bandymus medžiaga neužsidega, daromi tokie bandymai:
      0,5 ml mėginys švirkštu užpilamas ant akyto filtravimo popieriaus ir stebima, ar per penkias minutes po suvilgymo filtravimo popierius užsidega ar anglėja. Bandymas atliekamas tris kartus, jei popierius neužsidega arba neanglėja.
      2.   DUOMENYS
      2.1.   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Bandymas gali būti nutrauktas, kai kurio nors bandymo rezultatas yra teigiamas.
      2.2.   VERTINIMAS
      Jei su inertišku nešikliu sumaišyta ir ore padėta medžiaga užsidega per penkias minutes arba jei skystoji medžiaga per penkias minutes apdegina arba uždega joje suvilgytą ir ore padėtą filtravimo popierių, ji laikoma piroforine medžiaga.
      3.   ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  tiksli medžiagos specifikacija (identifikavimas ir priemaišos),
               
            
                  —
               
               
                  bandymų rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.
               
            
                  2)
               
               
                  Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.
               
            A.14.   SPROGSTAMOSIOS SAVYBĖS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Šis metodas pateikia bandymo schemą norint nustatyti, ar kelia sprogimo pavojų kieta arba pastos pavidalo medžiaga, veikiant liepsnai (terminis jautrumas) arba smūgiui ar trinčiai (jautrumas mechaniniams veiksniams), ir ar kelia sprogimo pavojų skysta medžiaga, veikiant liepsnai arba smūgiui.
      Metodas susideda iš trijų dalių:
      
                  (a)
               
               
                  terminio jautrumo bandymas (1);
               
            
                  (b)
               
               
                  mechaninio jautrumo smūgiui bandymas (1);
               
            
                  (c)
               
               
                  mechaninio jautrumo trinčiai bandymas (1).
               
            Šiuo metodu gauti duomenis leidžia įvertinti tikimybę įvykti sprogimui, jei veikia kai kurie įprasti veiksniai. Metodas neskirtas nustatyti, ar medžiaga gali sprogti bet kokiomis sąlygomis.
      Metodas tinka nustatyti, ar tam tikromis direktyvoje apibrėžtomis sąlygomis medžiaga kelia sprogimo pavojų (terminis ir mechaninis jautrumas). Jame naudojama kelių tipų aparatūra, kuri turi platų pritaikymą tarptautiniu mastu (1) ir kurią naudojant paprastai gaunami reikšmingi duomenys. Reikia pripažinti, kad metodas nėra tikslus. Be nurodytos aparatūros gali būti naudojami alternatyvūs aparatai, jei jie turi tarptautinį pripažinimą o rezultatai gali būti atitinkamai susieti su rezultatais, gautais nurodyta aparatūra.
      Bandymų atlikti nereikia, kai turima informacija apie medžiagos termodinamines savybes (pvz., susidarymo šilumą skilimo šilumą) ir (arba) kai kurių chemiškai aktyvių grupių (2) nebuvimas struktūrinėje formulėje leidžia pagrįstai neabejoti, kad medžiaga negali greitai suirti skiriantis dujoms arba šilumai (t.y. medžiaga nekelia jokio sprogimo pavojaus). Su skysčiais nereikia atlikti mechaninio jautrumo trinčiai bandymo.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Sprogstamosios medžiagos:
      medžiagos, kurios gali sprogti veikiant liepsnai arba kurios yra jautrios smūgiui ar trinčiai nurodytame aparate (arba mechaniškai yra jautresnės nei 1,3-dinitrobenzenas alternatyviame aparate).
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      1,3-dinitrobenzenas, techniškai gryna kristalinė medžiaga, išsijota per 0,5 mm sietą skirta trinties ir smūgio metodams.
      Perhidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazinas (RDX, heksogenas, ciklonitas – CAS 121-82-4), perkristalintas iš vandeninio cikloheksanono tirpalo, drėgnas išsijotas per 250 μm sietą ir išlikęs ant 150 μm sieto bei išdžiovintas 103 ± 2 oC temperatūroje (4 valandas), skirtas antros eilės trinties ir smūgio bandymams.
      1.4.   METODO ESMĖ
      Norint nustatyti trijų jautrumo bandymų saugos sąlygas, būtina atlikti išankstinius bandymus.
      1.4.1.   Saugaus naudojimo bandymai (3)
      Rūpinantis sauga, prieš atliekant pagrindinius bandymus labai maži medžiagos mėginiai (maždaug 10 mg) atviroje vietoje kaitinami dujų liepsnoje, veikiami smūgio bet kokiame patogios formos aparate ir veikiami trinties, naudojant medinį plaktuką ir priekalą arba bet kokios rūšies trinties aparatą. Tikslas – nustatyti, ar medžiaga yra tiek jautri ir sprogi, kad paskirtieji jautrumo bandymai, ypač terminio jautrumo bandymas, turi būti atliekami laikantis specialių saugos priemonių, kad būtų išvengta pavojaus sužeisti operatorių.
      1.4.2.   Terminis jautrumas
      Norint nustatyti, ar medžiaga gali sprogti intensyvaus kaitinimo ir apibrėžto uždaro tūrio sąlygomis, ji pagal šį metodą kaitinama plieniniame vamzdyje, uždarytame diafragma, turinčia skirtingą angos skersmenį.
      1.4.3.   Mechaninis jautrumas (smūgis)
      Taikant šį metodą medžiaga veikiama smūgio, kai nustatyto dydžio masė metama iš nustatyto aukščio.
      1.4.4.   Mechaninis jautrumas (trintis)
      Taikant šį metodą kietos arba pastos pavidalo medžiagos veikiamos trinties tarp standartinių paviršių nustatytomis apkrovos ir santykinio judėjimo sąlygomis.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nenurodyti.
      1.6.   METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Terminis jautrumas (liepsnos veikimas)
      1.6.1.1.   Aparatūra
      Aparatą sudaro vienkartinio naudojimo plieninis vamzdis su jam skirtu daugkartinio naudojimo uždarymo įtaisu (1 paveikslas), įstatytas į kaitinimo ir apsauginį įtaisą. Kiekvienas vamzdis yra giliojo tempimo plonalakščio plieno vamzdis (žr. priedėlį), vamzdžio vidinis skersmuo 24 mm, ilgis 75 mm, sienelių storis 0,5 mm. Atviras vamzdžio galas užriečiamas, kad jį būtų galima uždaryti diafragmos bloku. Jį sudaro slėgiui atspari diafragma, kurios centre esanti anga yra gerai pritvirtinta prie vamzdžio dviejų dalių sriegine jungtimi (veržle ir sandarikliu su sriegiu). Veržlė ir sandariklis su sriegiu pagaminti iš chromo manganinio plieno (žr. priedėlį), kuris nekibirkščiuoja iki 800 oC. Diafragmos yra 6 mm storio, pagamintos iš kaitrai atsparaus plieno (žr. priedėlį), ir turi įvairaus skersmens angas.
      1.6.1.2.   Bandymų sąlygos
      Paprastai medžiaga yra bandoma tokia, kokia yra gauta, nors kai kuriais atvejais, pvz., jei ji yra presuota, lieta arba kitokiu būdu tankinta, prieš bandant ją gali tekti smulkinti.
      Jei bandomos kietosios medžiagos, kiekvienam bandymui reikalingos medžiagos masė nustatoma atliekant dviejų pakopų tuščiąjį bandymą. Pasvertas vamzdis pripildomas 9 cm3 medžiagos, toliau medžiaga plūkama 80 N jėga, tenkančia visam vamzdžio skerspjūviui. Kad būtų saugu arba tais atvejais, kai bandinio fizinė forma dėl spaudimo gali pasikeisti, gali būti taikomos kitos pripildymo metodikos; pvz., jei medžiaga yra labai jautri trinčiai, plūkimas netinka. Jei medžiaga yra spūdi, jos dedama daugiau ir ji plūkama, kol vamzdis pripildomas tiek, kad iki viršaus lieka 55 mm. Nustatoma bendra masė, kurios reikia pripildyti iki 55 mm lygio, ir dedamos dar dvi tokios dalys, kiekvieną kartą plukant 80 N jėga. Po to plukant arba išimant medžiagos dedama tiek, kad iki vamzdžio viršaus liktų 15 mm. Atliekamas antras tuščiasis bandymas, iš pradžių su suplūktu kiekiu, kuris sudarytų vieną trečdalį pirmame tuščiajame bandyme nustatytos masės. Įdedamos dar dvi tokios dalys plukant 80 N jėga, po to, prireikus, įdedant arba išimant dalį medžiagos nustatomas jos 15 mm lygis iki viršaus. Kietosios medžiagos kiekis, nustatytas antrame tuščiajame bandyme, naudojamas kiekvienam bandymui, pripildant tris kartus vienodais kiekiais, kiekvieną kartą suspaudžiant iki 9 cm3 reikalinga tam jėga. (Tai galima palengvinti naudojant tarpinius žiedus).
      Skysčių ir gelių dedama į vamzdį iki 60 mm aukščio, ypatingą dėmesį kreipiant į gelių dėjimą, kad būtų išvengta tuštumų susidarymo. Ant vamzdžio iš apačios užstumiamas sandariklis su sriegiu, įstatoma diafragma su reikiamo skersmens anga ir, šiek tiek sutepus molibdeno disulfido pagrindu pagamintu tepalu, užsukama veržlė. Yra labai svarbu kontroliuoti, kad medžiaga visiškai nepatektų tarp jungės ir diafragmos arba tarp sriegių.
      Kaitinama propano dujomis iš pramoninio baliono, turinčio reduktorių (60-70 mbar), leidžiamomis per debitmatį ir tolygiai vamzdynu paskirstomomis (kaip rodo degiklių liepsnos stebėjimas) keturiems degikliams. Degikliai išdėstyti apie bandymo kamerą, kaip parodyta 1 paveiksle. Keturi degikliai bendrai suvartoja 3,2 litro propano per minutę. Galima deginti kitokias dujas ir naudoti kitokius degiklius, tačiau kaitinimo sparta turi būti tokia, kokia nurodyta 3 paveiksle. Visuose aparatuose kaitinimo sparta turi būti periodiškai tikrinama, naudojant dietilftalatu pripildytus vamzdžius, kaip parodyta 3 paveiksle.
      1.6.1.3.   Bandymų eiga
      Kiekvienas bandymas atliekamas tol, kol vamzdis sutrūkinėja į dalis, arba jis kaitinamas penkias minutes. Vertinama, kad bandyme įvyko sprogimas, jei jis baigiasi vamzdžio sutrūkimu į tris arba daugiau skeveldrų, kurios kai kuriais atvejais gali jungtis siauromis metalo juostomis, kaip parodyta 2 paveiksle. Jei bandymo metu susidaro mažiau skeveldrų arba jų visai nesusidaro, tuomet nelaikoma, kad įvyko sprogimas.
      Iš pradžių atliekama trijų bandymų serija su 6,0 mm skersmens diafragma, ir jei sprogimų neįvyksta, atliekama antroji trijų bandymų serija su 2 mm skersmens diafragma. Jei sprogimas įvyksta bet kurioje bandymų serijoje, tolesni bandymai nereikalingi.
      1.6.1.4.   Vertinimas
      Bandymų rezultatas laikomas teigiamu, jei sprogimas įvyksta bet kurioje anksčiau nurodytų bandymų serijoje.
      1.6.2.   Mechaninis jautrumas (smūgis)
      1.6.2.1.   Aparatūra (4 paveikslas)
      Pagrindinės tipiško aparato su krintančiu kūju dalys yra lietas plieninis blokas su pagrindu, priekalas, kolona, kreipikliai, krintantys svarsčiai, paleidžiantysis įtaisas ir mėginio laikiklis. Plieninis priekalas, 100 mm (skersmuo) × 70 mm (aukštis), varžtais tvirtinamas ant plieninio bloko, 230 mm (aukštis) × 250 mm (plotis) × 200 mm (aukštis), esančio ant lieto pagrindo 450 mm (ilgis) × 450 mm (plotis) × 60 mm (aukštis). Kolona, pagaminta iš besiūlio trauktinio plieninio vamzdžio, tvirtinama laikiklyje, priveržtame užpakalinėje plieninio bloko sienoje. Keturiais varžtais aparatas tvirtinamas prie vientiso betoninio bloko, 60 × 60 × 60 cm, tokiu būdu, kad kreipiklių strypai būtų vertikalūs ir krintantis svarstis kristų laisvai. Naudojami 5 ir 10 kg svarsčiai, pagaminti iš vientiso plieno. Visų svarsčių smogiamoji galvutė pagaminta iš grūdinto plieno, HRC 60–63, ir jos mažiausias skersmuo lygus 25 mm.
      Mėginys dedamas į smūgiavimo įtaisą, kurį sudaro du vienas ant kito uždėti koaksialūs plieniniai cilindrai, esantys tuščiaviduriame cilindro formos plieniniame kreipiamajame žiede. Vientiso plieno cilindrai turi būti 10 (-0,003, -0,005) mm skersmens ir 10 mm aukščio, jų paviršius turi būti poliruotas, kraštai apvalinti (kreivės spindulys 0,5 mm) ir HRC 58-65 kietumo. Tuščiavidurio cilindro išorinis skersmuo turi būti lygus 16 mm, poliruotos ištekintos angos skersmuo 10 (+0,005, +0,010) mm ir aukštis 13 mm. Smogiamasis įtaisas surinktas ant tarpinio priekalo (26 mm skersmuo ir 26 mm aukštis), pagaminto iš plieno, ir centruotas žiedu su angomis dujoms išleisti.
      1.6.2.2.   Bandymų sąlygos
      Mėginio tūris turi būti lygus 40 mm3, arba tūris turi atitikti bet kokį alternatyvųjį aparatą. Kietos medžiagos turi būti išbandytos sausos ir ruošiamos taip:
      
                  a)
               
               
                  milteliai sijojami (sieto akučių dydis 0,5 mm); bandoma visa tai, kas išbyra per sietą;
               
            
                  b)
               
               
                  presuotos, lietos ar kitu būdu tankintos medžiagos smulkinamos į mažus gabalus ir sijojamos; bandoma sijota 0,5-1 mm skersmens dalelių frakcija, kuri turi būti reprezentatyvi pradinės medžiagos dalis.
               
            Medžiagos, kurios paprastai tiekiamos pastos pavidalo, turi būti, jei tai įmanoma, bandomos išdžiovintos arba bet kuriuo atveju pašalinus kuo didesnę dalį skiediklio. Skysčiai bandomi tarp viršutinio ir apatinio cilindro esant 1 mm tarpui.
      1.6.2.3.   Bandymų eiga
      Atliekama šešių bandymų serija, metant 10 kg masės svarstį iš 0,40 m aukščio (40 J). Jei 40 J atveju šešių bandymų metu sprogimas įvyksta, turi būti atliekama kita 6 bandymų serija, metant 5 kg masės svarstį iš 0,15 m aukščio (7,5 J). Kituose aparatuose bandinys lyginamas su pasirinktąja etalonine medžiaga, naudojant nustatytą metodiką (pvz., kėlimo-metimo metodiką ir t. t.).
      1.6.2.4.   Vertinimas
      Bandymų rezultatas laikomas teigiamu, jei bent vieno bandymo metu, naudojant nurodytą smūgiavimo įtaisą, įvyksta sprogimas (liepsnos blyksniai ir (arba) garsas, prilygstantis sprogimo garsui) arba bandinys yra jautresnis nei 1,3-dinitrobenzenas ar heksogenas atliekant alternatyvų smūgio bandymą.
      1.6.3.   Mechaninis jautrumas (trintis)
      1.6.3.1.   Aparatūra (5 paveikslas)
      Trinties aparatą sudaro lieto plieno pagrindo plokštė, ant kurios montuojamas trinties įtaisas. Jį sudaro nejudantis porcelianinis kaištis ir judanti porcelianinė plokštė. Porcelianinė plokštė privirtinta prie vežimėlio, kuris juda dviem kreipikliais. Vežimėlis prijungtas prie elektros variklio jungiamuoju strypu, ekscentriniu krumpliaračiu ir atitinkama pavara tokiu būdu, kad porcelianinė plokštė po porcelianiniu kaiščiu juda tik kartą 10 mm į priekį ir atgal. Porcelianinį kaištį galima apkrauti, pvz., 120 arba 360 N apkrova.
      Plokščios porcelianinės plokštės pagamintos iš balto techninio porceliano (šiurkštumas nuo 9 iki 32 μm), jų matmenys: 25 mm (ilgis) × 25 mm (plotis) × 5 mm (storis). Cilindrinis 15 mm ilgio porcelianinis kaištis taip pat pagamintas iš balto techninio porceliano, jo skersmuo lygus 10 mm, ir galai turi šiurkštintą sferinį paviršių, kurio kreivės spindulys lygus 10 mm.
      1.6.3.2.   Bandymų sąlygos
      Bandinio tūris turi būti lygus 10 mm3 arba bandinio tūris turi atitikti bet kurį alternatyvų aparatą.
      Kietos medžiagos išbandomos sausos ir ruošiamos taip:
      
                  a)
               
               
                  milteliai sijojami (sieto akučių dydis 0,5 mm); bandoma visa tai, kas iškrenta per sietą;
               
            
                  b)
               
               
                  presuotos, lietos ar kitu būdu sutankintos medžiagos smulkinamos į mažus gabalus ir sijojamos; bandymuose naudojama sijota frakcija, kurios dalelių skersmuo < 0,5 mm.
               
            Medžiagos, kurios paprastai tiekiamos pastos pavidalu, turi būti bandomos sausos, jei galima. Jei sauso medžiagos pavidalo paruošti neįmanoma, pasta (pašalinus kiek įmanoma didesnį kiekį skiediklio) bandoma šablonu pagaminant 0,5 mm storio, 2 mm pločio ir 10 mm ilgio plėvelę.
      1.6.3.3.   Bandymų eiga
      Porcelianinis kaištis uždedamas ant bandomosios medžiagos ir veikiamas apkrova. Atliekant bandymą porceliano plokštės akytumo žymės turi būti skersai judėjimo krypties. Kaištis turi būti ant bandinio, po kaiščiu turi būti pakankamas kiekis bandinio medžiagos ir plokštė po kaiščiu turi judėti teisingai. Plokštelę padengti pastos pavidalo medžiaga naudojamas 0,5 mm storio saikiklis, turintis 2 × 10 mm griovelį. Porcelianinė plokštelė turi judėti po porcelianiniu kaiščiu 10 mm į priekį ir atgal per 0,44 sekundės. Kiekviena plokštelės ir kaiščio paviršiaus dalis turi būti naudojama tik vieną kartą; du kiekvieno kaiščio galai naudojami dviems bandymams ir kiekvienas iš dviejų plokštelės paviršių naudojamas trims bandymams.
      Atliekama šešių bandymų serija, naudojant 360 N apkrovą. Jei šių šešių bandymų metu gaunamas teigiamas rezultatas, turi būti atlikta kita šešių bandymų serija su 120 N apkrova. Kituose aparatuose bandinys lyginamas su pasirinkta etalonine medžiaga, taikant nustatytą metodiką (pvz., kėlimo-metimo metodiką ir t. t.).
      1.6.3.4.   Vertinimas
      Bandymų rezultatai laikomi teigiamais, jei kurio nors šių bandymų metu naudojant nustatytą Trinties aparatą įvyksta bent vienas sprogimas (prilygstantis sprogimui traškesys ir (arba) sprogimą primenantis garsas arba liepsnos blyksnis) arba jei jie atitinka lygiaverčius kriterijus vykdant alternatyvų trinties bandymą.
      2.   DUOMENYS
      Iš esmės medžiaga pagal šią direktyvą laikoma kelianti sprogimo pavojų, jei terminio jautrumo, jautrumo smūgiui arba trinčiai bandymo rezultatas yra teigiamas.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos identiškumas, sudėtis, grynumas, drėgmės kiekis ir t. t.,
               
            
                  —
               
               
                  bandinio fizinė forma ir ar jis buvo smulkinamas, trupinamas ir (arba) sijojamas,
               
            
                  —
               
               
                  stebėjimai vykdant terminio jautrumo bandymus (pvz., bandinio masė, skeveldrų skaičius ir t. t.),
               
            
                  —
               
               
                  stebėjimai vykdant mechaninio jautrumo bandymus (pvz., didelio dūmų kiekio susidarymas arba visiškas medžiagos irimas be garso, liepsnos, kibirkščių, traškesio ir t. t.),
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieno tipo bandymų rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  jei buvo naudojamas alternatyvus aparatas, turi būti pateiktas mokslinis pagrindimas, taip pat duomenys apie koreliaciją tarp rezultatų, gautų nustatytu aparatu, ir rezultatų, gautų lygiaverčiu aparatu,
               
            
                  —
               
               
                  visi naudingi komentarai, pvz., nuoroda į panašių medžiagų bandymus, kurie galbūt tiktų tinkamai paaiškinti rezultatus,
               
            
                  —
               
               
                  visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.
               
            3.2.   REZULTATŲ AIŠKINIMAS IR VERTINIMAS
      Bandymų ataskaitoje turi būti paminėti visi rezultatai, kurie laikomi klaidingais, anomaliais arba nereprezentatyviais. Jei kokius nors rezultatus reikia atmesti, turi būti pateiktas aiškinimas ir visų alternatyvių arba papildomų bandymų rezultatai. Jei anomalus rezultatas negali būti paaiškintas, jis turi būti priimtas toks, koks yra, ir turi būti naudojamas medžiagai atitinkamai klasifikuoti.
      4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.
               
            
                  2)
               
               
                  Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.
               
            
                  3)
               
               
                  Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol.3, p. 6–13 ir 30–42.
               
            
                  4)
               
               
                  NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.
               
            
         Priedėlis
         Terminio jautrumo bandyme naudojamų medžiagų specifikacijos pavyzdys (žr. DIN 1623)
         
                     1)
                  
                  
                     Vamzdis: medžiagos specifikacija Nr. 1.0336.505 g
                  
               
                     2)
                  
                  
                     Diafragma: medžiagos specifikacija Nr. 1.4873
                  
               
                     3)
                  
                  
                     Sandariklis su sriegiu ir veržlė: medžiagos specifikacija Nr. 1.3817
                  
               1 paveikslas
         Terminio jautrumo bandymo aparatas
         (visi matmenys milimetrais)
         
            
         2 paveikslas
         Terminio jautrumo bandymas
         (skeveldrų susidarymo pavyzdžiai)
         
            
         3 paveikslas
         Kaitinimo spartos kalibravimas terminio jautrumo bandymui
         
            
         Temperatūros ir laiko priklausomybės kreivė gauta kaitinant dibutilftalatą (27 cm3) uždarame (1,5 mm diafragma) vamzdyje, naudojant propano 3,2 litro per minutę srautą. Temperatūra matuota 1 mm skersmens chromelio/aliumelio termoelementas, įdėtas į apvalkalą iš nerūdijančio plieno ir įstatytas vamzdžio viduryje 43 mm žemiau jo briaunos. Kaitinimo sparta 135 oC–285 oC temperatūroje turi būti nuo 185 iki 215 K/minutę.
         4 paveikslas
         Jautrumo smūgiui bandymo aparatas
         
            (visi matmenys milimetrais)
         
         
            
         4 paveikslo
         tąsa
         
            
         5 paveikslas
         Jautrumo trinčiai bandyo aparatas
         
            
      
      A.15.   UŽSIDEGIMO TEMPERATŪRA (SKYSČIAI IR DUJOS)
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Šiuo bandymu neturi būti bandomos sprogstamosios medžiagos ir medžiagos, kurios užsidega sąlytyje su oru esant kambario temperatūrai. Bandymo metodika taikytina dujoms, skysčiams ir garams, kurie ore gali užsidegti susilietę su karštu paviršiumi.
      Užsidegimo temperatūra gali žymiai sumažėti, jei yra katalizinių priemaišų, dėl paviršiaus medžiagos arba dėl didesnio bandymo indo tūrio.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Užsidegimo laipsnis išreikiamas užsidegimo temperatūra. Užsidegimo temperatūra yra mažiausia temperatūra, kurioje bandomoji medžiaga užsidega, sumaišyta su oru esant bandymo metode apibrėžtoms sąlygoms.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Etaloninės medžiagos nurodytos standartuose (žr. 1.6.3). Jos pirmiausiai turi būti naudojamos tikrinti metodo veikimą ir lyginti rezultatus, gautus taikant kitus metodus.
      1.4.   METODO ESMĖ
      Taikant šį metodą nustatoma mažiausia gaubto vidinio paviršiaus temperatūra, kurioje užsidega po gaubtu įpurkštos dujos, garai arba skystis.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Pakartojamumas kinta atsižvelgiant į užsidegimo temperatūros intervalą ir taikytą metodą.
      Jautrumas ir specifiškumas priklauso nuo taikyto bandymo metodo.
      1.6.   METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Aparatūra
      Aparatas aprašytas 1.6.3 nurodytame metode.
      1.6.2.   Bandymo sąlygos
      Bandomosios medžiagos bandinys yra bandomas pagal 1.6.3 nurodytą metodą.
      1.6.3.   Bandymo eiga
      Žr. IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.
      2.   DUOMENYS
      Užrašykite bandymų temperatūrą, atmosferos slėgį, naudotą bandinio kiekį ir bandinio užsidegimo vėlinimosi trukmę.
      3.   ATASKAITA
      Jei įmanoma, bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  tiksli medžiagos specifikacija (identifikavimas ir priemaišos),
               
            
                  —
               
               
                  naudotas bandinio kiekis, atmosferos slėgis,
               
            
                  —
               
               
                  naudota apatatūra,
               
            
                  —
               
               
                  matavimų rezultatai (bandymų temperatūra, užsidegimo rezultatai, atitinkamų vėlinimosi trukmė),
               
            
                  —
               
               
                  visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.
               
            4.   NUORODOS
      Nėra.
      A.16.   KIETŲJŲ MEDŽIAGŲ SANTYKINĖ UŽSIDEGIMO TEMPERATŪRA
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Šiuo bandymu neturi būti bandomos sprogiosios medžiagos ir medžiagos, kurios sąlytyje su oru užsidega kambario temperatūroje.
      Šio bandymo tikslas – gauti išankstinę informaciją apie kietųjų medžiagų užsidegimą aukštesnėje temperatūroje.
      Jei medžiagos reakcijos su deguonimi arba egzoterminio jos skilimo metu susidariusi šiluma aplinkoje išsisklaido nepakankamai greitai, dėl savaiminio įkaitimo įvyksta užsidegimas. Taigi, užsidegimas įvyksta, kai šilumos susidarymo greitis yra didesnis nei jos netekimo greitis.
      Bandymo metodika yra naudinga kaip išankstinis kietųjų medžiagų atrankos bandymas. Atsižvelgiant į sudėtingą kietųjų medžiagų užsidegimo ir degimo prigimtį, šiuo metodu nustatyta užsidegimo temperatūra turi būti taikoma tik palyginimui.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Pagal šį metodą nustatyta užsidegimo temperatūra yra mažiausia aplinkos temperatūra, išreikšta oC, kurioje tam tikras medžiagos kiekis užsidega apibrėžtomis sąlygomis.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nenurodytos.
      1.4.   METODO ESMĖ
      Tam tikras bandomosios medžiagos kiekis kambario temperatūroje dedamas į krosnį; užrašoma bandinio viduje matuojamos temperatūros kitimo laike kreivė, krosnies temperatūrą 0,5 oC/min sparta didinant iki 400 oC arba iki lydymosi temperatūros, jei ji žemesnė. Šiame bandyme krosnies temperatūra, kurioje bandinio temperatūra pasiekia 400 C dėl savaiminio įkaitimo, vadinama užsidegimo temperatūra.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Aparatūra
      1.6.1.1.   Krosnis
      Laboratorinė krosnis (tūris apie 2 litrus), kuri turėtų programuojamą temperatūros reguliavimą ir kurioje būtų savaiminė oro cirkuliacija bei sprogimo slėgio mažinimo vožtuvas. Norint išvengti galimo sprogimo pavojaus, bet kokios skilimo metu susidarančios dujos turi nepatekti ant elektrinių kaitinimo elementų.
      1.6.1.2.   Kubas iš vielos tinklelio
      Iš nerūdijančio plieno pagamintas vielos tinklelis su 0,045 mm akutėmis turi būti supjaustytas pagal 1paveiksle pateiktą pavyzdį. Tinklelis turi būti sulankstytas kubu su atviru viršumi ir sutvirtintas viela.
      1.6.1.3.   Termoelementai
      Tinkami termoelementai.
      1.6.1.4.   Savirašis
      Bet koks dviejų koordinačių savirašis, kalibruotas nuo 0 oC iki 600 oC arba pagal atitinkamą įtampą.
      1.6.2.   Bandymo sąlygos
      Medžiagos bandomos tokios, kokios yra gaunamos.
      1.6.3.   Bandymo eiga
      Kubas pildomas bandomąja medžiaga ir švelniai tapšnojant jos dedama daugiau, kol kubas visiškai prisipildo. Toliau kubas kambario temperatūroje pakabinamas krosnies viduryje. Vienas termoelementas dedamas kubo viduryje, o temperatūrai krosnyje registruoti kitas termoelementas dedamas tarp kubo ir krosnies sienos.
      Krosnies ir bandinio temperatūra nuolat užrašoma, krosnies temperatūrą 0,5 oC/min sparta didinant iki 400 oC arba iki lydymosi temperatūros, jei ji yra žemesnė.
      Kai medžiaga užsidega, bandinyje esantis termoelementas rodys labai staigų temperatūros didėjimą palyginti su krosnies temperatūra.
      2.   DUOMENYS
      Norint vertinti, svarbu žinoti krosnies temperatūrą, kurioje bandinio temperatūra dėl jo savaiminio įkaitimo pasiekia 400 oC (žr. 2 paveikslą).
      3.   ATASKAITA
      Jei įmanoma, ataskaitoje turi būti tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  bandyti pateiktos medžiagos apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  matavimo rezultatai, įskaitant temperatūros kitimo laike kreivę,
               
            
                  —
               
               
                  visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus.
               
            4.   NUORODOS
      NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.
      1 paveikslas
      20 mm bandymo kubo pavyzdys
      
         
      2 paveikslas
      Tipiška temperatūros kitimo laike kreivė
      
         
      A.17.   OKSIDACINĖS SAVYBĖS (KIETOSIOS MEDŽIAGOS)
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Prieš atliekant šį bandymą naudinga turėti išankstinę informaciją apie bet kurias medžiagos potencialias sprogumo savybes.
      Šis bandymas netaikomas skysčiams, dujoms, sprogstamosioms arba labai degioms medžiagoms arba organiniams peroksidams.
      Šio bandymo atlikti nereikia, jei struktūrinės formulės analizė leidžia pagrįstai neabejoti, kad medžiaga negali egzotermiškai reaguoti su degiąja medžiaga.
      Norint išsiaiškinti, ar bandymas turi būti atliekamas taikant ypatingas saugumo priemones, turi būti daromas išankstinis bandymas.
      1.2.   APIBRĖŽIMAS IR VIENETAI
      Degimo trukmė: reakcijos laikas, kurį reakcijos zona sklinda palei krūvelę, bandymą atliekant pagal 1.6 aprašytą metodiką.
      Degimo greitis: išreikštas milimetrais per sekundę.
      Didžiausias degimo greitis: degimo greičio didžiausia vertė, gauta deginant mišinius, kuriuose oksidatorius sudaro nuo 10 % iki 90 % mišinio masės.
      1.3.   ETALONINĖ MEDŽIAGA
      Bandyme ir išankstiniame bandyme kaip etaloninė medžiaga naudojamas bario nitratas (analiziškai grynas).
      Etaloninis mišinys yra toks bario nitrato ir celiuliozės miltelių mišinys, paruoštas pagal 1.6, kurio degimo greitis yra didžiausias (paprastai tai mišinys, kuriame bario nitrato yra 60 % masės).
      1.4.   METODO ESMĖ
      Išankstinis bandymas atliekamas saugos tikslais. Toliau bandyti nereikia, jei išankstiniu bandymu nustatoma, kad bandomoji medžiaga turi oksidacinių savybių. Jei taip nėra, su medžiaga turi būti atliktas visas bandymas.
      Atliekant visą bandymą, bandomoji medžiaga ir atitinkama degioji medžiaga maišomos įvairiais santykiais. Iš kiekvieno mišinio paruošiama krūvelė, kuri viename gale padegama. Nustatytas didžiausias degimo greitis lyginamas su etaloninio mišinio didžiausiu degimo greičiu.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Jei reikia, tinka bet kuris malimo ir maišymo būdas su sąlyga, kad šešių atskirų bandymų didžiausio degimo greitis nuo aritmetinio vidurkio vertės skiriasi ne daugiau kaip 10 %.
      1.6.   METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Paruošimas
      1.6.1.1.   Bandomoji medžiaga
      Bandinį smulkinkite, kad dalelių dydis būtų < 0,125 mm pagal tokią metodiką: bandomąją medžiagą sijokite, likusiąją dalį malkite ir vėl sijokite, kol per sietą išsijojamas visas bandinys.
      Galima taikyti bet kokį malimo ir sijojimo būdą, kuris atitiktų kokybės kriterijus.
      Prieš ruošiant mišinį medžiaga išdžiovinama 105 oC temperatūroje iki pastoviosios masės. Jei bandomosios medžiagos skilimo temperatūra yra mažesnė kaip 105 oC, medžiaga turi būti išdžiovinta atitinkamoje mažesnėje temperatūroje.
      1.6.1.2.   Degiosios medžiagos
      Degioji medžiaga yra celiuliozės milteliai. Celiuliozės rūšis turi atitikti plonasluoksnėje chromatografijoje arba kolonėlinėje chromatografijoje naudojamą celiuliozę. Tinkama nustatyta celiuliozės rūšis, kurios daugiau kaip 85 % plaušelių ilgis yra nuo 0,020 iki 0,075 mm. Celiuliozės milteliai sijojami per sietą, kurio akučių dydis 0,125 mm. Visą bandymą turi būti naudojama celiuliozė iš tos pačios partijos.
      Prieš ruošiant mišinį celiuliozės milteliai džiovinami 105 oC temperatūroje iki pastoviosios masės.
      Jei išankstiniam bandymui naudojami medienos miltai, ruošiami spygliuočių medienos miltai, surinkus tą dalį, kuri nusisijoja per 1,6 mm dydžio akučių sietą, ji gerai sumaišoma, po to ne didesnis kaip 25 mm storio sluoksnis keturias valandas džiovinamas 105 oC temperatūroje. Atšaldoma ir laikoma sandariame inde, jį pripildžius kuo pilniau, kol reikės naudoti, geriausiai per 24 valandas po džiovinimo.
      1.6.1.3.   Padegimo šaltinis
      Padegimo šaltiniu turi būti naudojama karšta dujų degiklio liepsna (mažiausias skersmuo 5 mm). Jei naudojamas kitas uždegimo šaltinis (pvz., bandant inertinių dujų atmosferoje), būtina pateikti aprašymą ir pagrindimą.
      1.6.2.   Bandymo eiga
      
         Pastaba
      
      Oksidatorių mišiniai su celiulioze arba medienos miltais turi būti laikomi potencialiai sprogiais mišiniais ir su jais turi būti elgiamasi kiek galima atsargiau.
      1.6.2.1.   Išankstinis bandymas
      Išdžiovinta medžiaga gerai sumaišoma su išdžiovinta celiulioze arba medienos miltais imant 2 masės dalis bandomosios medžiagos ir 1 masės dalį celiuliozės arba medienos miltų ir mišinys, pripildant be plūkimo kūgio formos šabloną (pvz., laboratorinį stiklinį piltuvą, užkimšus jo kojelę), formuojamas į kūgio formos krūvelę, kurios matmenys 3,5 cm (pagrindo skersmuo) × 2,5 cm (aukštis).
      Krūvelė dedama ant šaltos nedegios, neakytos ir blogai šilumą praleidžiančios pagrindo plokštės. Bandymas turi būti atliktas traukos spintoje, kaip aprašyta 1.6.2.2.
      Padegimo šaltiniu prisiliečiama prie kūgio. Stebimas ir užrašomas vykstančios reakcijos intensyvumas ir trukmė.
      Jei reakcija vyksta intensyviai, medžiaga turi būti laikoma oksiduojančia.
      Kiekvienu atveju, jei kyla abejonių, būtina atlikti toliau aprašytą bandinių eilės bandymą.
      1.6.2.2.   Bandinių eilės bandymas
      Paruoškite oksidatoriaus ir celiuliozės mišinius, kuriuose oksidatoriaus kiekis kinta kas 10 % nuo 10 % iki 90 % masės. Norint degimo greičio didžiausią vertę gauti tiksliau, kraštiniams atvejams turi būti naudojami tarpinės sudėties oksidatoriaus ir celiuliozės mišiniai.
      Krūvelei paruošti naudojama forma. Iš metalo pagaminta forma yra 250 mm ilgio, o jos skerspjūvis yra trikampis, kurio vidinis aukštis 10 mm ir vidinis ilgis 20 mm. Abejose formos pusėse išilgine kryptimi tvirtinamos dvi šoninės metalinės plokštės, kurios yra 2 mm aukštesnės nei viršutinis trikampio skerspjūvio kraštas (žr. paveikslą). Šis įtaisas pripildomas mišinio, jo neplakant ir įpilant nedidelį perteklių. Forma vieną kartą numetama iš 2 cm aukščio ant kieto paviršiaus, o medžiagos perteklius nubraukiamas įstrižai pasukta plokštele. Šoninės plokštės nuimamos ir likę milteliai lyginami velenėliu. Po to ant formos viršaus uždedama nedegi, neakyta ir blogai šilumą praleidžianti pagrindo plokštė, įtaisas apverčiamas ir forma nuimama.
      Krūvelė dedama į traukos spintą skersai traukos krypčiai.
      Oro greitis turi būti pakankamas, kad dūmai negalėtų patekti į laboratoriją, ir bandymo metu turi nesikeisti. Apie įtaisą turi būti įtaisytas nuo traukimo saugantis ekranas.
      Kadangi celiuliozė ir kai kurios bandomosios medžiagos yra higroskopiškos, bandymas turi būti atliekamas kiek įmanoma greičiau.
      Vieną krūvelės galą padekite, prikišę prie jo liepsną.
      Po to, kai reakcijos zona įveikia pradinį 30 mm atstumą, matuokite reakcijos trukmę 200 mm atstumu.
      Bandymas atliekamas su etalonine medžiaga ir bent vieną kartą su kiekvienu iš bandomosios medžiagos mišinių su celiulioze.
      Jei nustatoma, kad didžiausias degimo greitis yra žymiai didesnis nei etaloninio mišinio didžiausias degimo greitis, bandymas gali būti nutrauktas; priešingu atveju bandymas turi būti pakartotas penkis kartus su kiekvienu iš trijų mišinių, kuriems gautas didžiausias degimo greitis.
      Jei kyla įtarimas, kad rezultatas yra klaidingai teigiamas, bandymas turi būti pakartotas vietoje celiuliozės naudojant inertišką medžiagą, kurios dalelių dydis būtų panašus, pvz., diatomitą. Be to, bandomosios medžiagos ir celiuliozės mišinys, kurio degimo greitis yra didžiausias, turi būti pakartotinai išbandytas inertiškoje atmosferoje (deguonies < 2 % pagal tūrį).
      2.   DUOMENYS
      Saugos tikslais turi būti laikoma, kad didžiausias degimo greitis, o ne jo vidutinė vertė yra bandomosios medžiagos oksidacines savybes apibūdinantis parametras.
      Vertinant imama didžiausia degimo greičio vertė, gauta atlikus šešis atitinkamo mišinio bandymus.
      Nubrėžkite kiekvieno mišinio didžiausiojo degimo greičio priklausomybės nuo oksidatoriaus koncentracijos kreivę. Iš kreivės nustatykite didžiausiąją degimo greičio vertę.
      Šešios išmatuotos degimo greičio vertės, gautos atliekant bandymus su mišiniu, kuriam nustatytas didžiausias degimo greitis, turi nesiskirti nuo aritmetinio vidurkio vertės daugiau kaip 10 %; kitu atveju turi būti patobulinti malimo ir maišymo metodai.
      Gautą didžiausiąjį degimo greitį palyginkite su etaloninio mišinio didžiausiuoju degimo greičiu (žr. 1.3).
      Jei bandymai atliekami inertiškoje atmosferoje, didžiausias reakcijos greitis lyginamas su etaloninio mišinio degimo inertiškoje atmosferoje didžiausiu greičiu.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Jei įmanoma, bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos identifikavimas, sudėtis, grynumas, drėgmės kiekis ir t. t.,
               
            
                  —
               
               
                  kiekvienas bandinio apdorojimo būdas (pvz., malimas, džiovinimas),
               
            
                  —
               
               
                  bandymuose naudotas uždegimo šaltinis,
               
            
                  —
               
               
                  matavimų rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  reakcijos pobūdis (pvz., degimas pliūpsniais paviršiuje, degimas visoje bandinio masėje, visa informacija apie degimo produktus ir t. t.),
               
            
                  —
               
               
                  visos papildomos pastabos, kurios būtų svarbios aiškinant rezultatus, įskaitant degimo intensyvumo aprašymą (liepsnojimas, kibirkščiavimas, rūkimas, lėtas rusenimas ir t. t.) ir apytikrę degimo trukmę, nustatytą išankstiniame saugos (atrankos) bandyme bandomajai ir etaloninei medžiagoms,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų su inertiška medžiaga rezultatai, jei yra,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų inertiškoje atmosferoje rezultatai, jei yra.
               
            3.2.   REZULTATŲ AIŠKINIMAS
      Laikoma, kad medžiaga yra oksiduojanti, jei:
      
                  a)
               
               
                  išankstinio bandymo reakcija vyksta intensyviai,
               
            
                  b)
               
               
                  atliekant išsamų bandymą bandomųjų mišinių degimo greitis yra didesnis arba lygus celiuliozės ir bario nitrato etaloninio mišinio didžiausiajam degimo greičiui.
               
            Norint išvengti klaidingai teigiamų rezultatų, juos aiškinant turi būti atsižvelgta į rezultatus, gautus atliekant medžiagos mišinių su inertiška medžiaga bandymus ir (arba) inertiškoje atmosferoje atliktų bandymų rezultatus.
      4.   NUORODOS
      NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.
      
         Priedėlis
         Paveikslas
         Krūvelei ruošti naudojama forma ir priedai
         (visi matmenys milimetrais)
         
            
      
      A.18.   POLIMERŲ SKAITINĖS VIDUTINĖS MOLEKULINĖS MASĖS IR MOLEKULINĖS MASĖS PASISKIRSTYMAS
      1.   METODAS
      Šis gel chromatografijos (Gel Permeation Chromatographic) metodas yra OECD TG 118 (1996) kopija. Pagrindiniai principai ir papildoma techninė informacija pateikta 1 nuorodoje.
      1.1.   ĮVADAS
      Kadangi polimerų savybės yra labai skirtingos, neįmanoma aprašyti vieną atskirą metodą tiksliai nustatantį atskyrimo ir vertinimo sąlygas, kurios apimtų visas galimybes ir specifinius atvejus, pasitaikančius atskiriant polimerus. Ypač sudėtingas polimerų sistemas dažnai neįmanoma paruošti gel chromatografijai (GPC). Kai GPC nenaudotina, molekulinę masę galima nustatyti kitų metodų pagalba (žr. papildymą). Tokiais atvejais turi būti pateiktos visos taikyto metodo detalės ir pagrindimas.
      Aprašytas metodas paruoštas DIN 55672 standarto (1) pagrindu. Visa detali informacija apie tai, kaip atlikti bandymus ir kaip vertinti duomenis, galima rasti šiame DIN standarte. Tuo atveju, kai būtina keisti bandymo sąlygas, šie keitimai turi būti pagrįsti. Galima taikyti kitus standartus, jei jie yra visiškai aprašyti. Aprašytame metode kalibravimui naudojami žinomo polidispersiškumo polistireno bandiniai ir metodą gali tekti keisti, pritaikant kai kuriems polimerams, pvz., vandenyje tirpiems ir ilgos šakotos grandinės polimerams.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Skaitinė vidutinė molekulinė masė Mn ir masinė vidutinė molekulinė masė Mw nustatomos taikant tokias lygtis:
      
                  
                     
               
               
                  
                     
               
            kuriose:
      Hi yra nuo pagrindo linijos išmatuotas detektoriaus signalo lygis sulaikymo tūriui Vi,
      Mi sulaikymo tūrį Vi atitinkančios polimero frakcijos molekulinė masė ir
      n yra duomenų taškų skaičius.
      Molekulinės masės skirstinio plotį, kuris yra sistemos dispersiškumo matas, nustato santykis Mw/Mn.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Kadangi GPC yra santykinis metodas, turi būti atliekamas kalibravimas. Paprastai šiam tikslui naudojami siaurame intervale pasiskirstę linijinės sandaros polistireno etalonai, kurių vidutinės molekulinės masės Mn ir Mw ir molekulinės masės pasiskirstymas yra žinomi. Kalibravimo kreivę nežinomo bandinio molekulinei masei nustatyti galima naudoti tik tuomet, jei bandiniui ir etalonams atskirti naudotos sąlygos buvo parinktos identišku būdu.
      Nustatyta priklausomybė tarp molekulinės masės ir eliuavimo tūrio galioja tik konkretaus bandymo specifinėmis sąlygomis. Svarbiausios sąlygos yra temperatūra, tirpiklis (arba tirpiklių mišinys), chromatografavimo sąlygos ir atskyrimo kolonėlė arba kolonėlių sistema.
      Taip nustatytos bandinio molekulinės masės yra santykinės vertės ir vadinamos „molekulinėmis masėmis pagal polistireną“. Tai reiškia, kad dėl sandaros ir cheminių skirtumų tarp bandinio ir etalonų molekulinės masės nuo absoliučiųjų verčių gali skirtis didesniu arba mažesniu laipsniu. Jei naudojami kiti etalonai, pvz., polietilenglikolis, polioksietilenas, polimetilmetakrilatas, poliakrilo rūgštis, turi būti nurodyta priežastis.
      1.4.   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Bandinio molekulinės masės skirstinys ir vidutinės molekulinės masės (Mn, Mw) gali būti nustatyti taikant GPC. GPC yra specialus skysčių chromatografijos metodas, kuriame bandinys atskiriamas pagal atskirų komponentų hidrodinaminius tūrius (2).
      Atskyrimas vyksta, kai bandinys praeina per kolonėlę, užpildytą poringa medžiaga, dažniausiai organiniu geliu. Mažos molekulės gali įsiskverbti į poras, tuo tarpu didelės molekulės ekskliuduojamos. Todėl didelių molekulių kelias yra trumpesnis ir jos išplaunamos pirmos. Vidutinio dydžio molekulės įsiskverbia į kai kurias poras ir išplaunamos vėliau. Mažiausios molekulės, kurių vidutinis hidrodinaminis spindulys yra mažesnis nei gelio poros, gali įsiskverbti į visas poras. Šios molekulės išplaunamos paskutinės.
      Teoriškai atskyrimą apsprendžia vien tik molekulių dydis, tačiau praktikoje sunku išvengti kai kurių trukdančių sugerties veiksnių. Netolygus kolonėlės užpildymas ir nenaudingi tūriai gali bloginti padėtį (2).
      Aptikimas atliekamas, pvz., matuojant lūžio rodiklį arba UV-sugertį, taip gaunama paprasta pasiskirstymo kreivė. Tačiau norint kreivei priskirti tikrąsias molekulinės masės vertes, kolonėlę reikia kalibruoti, leidžiant per ją žinomos molekulinės masės polimerus ir geriausiai būtų apskritai panašios sandaros polimerus, pvz., įvairius polistireno etalonus. Vertikaliojoje ašyje žymint įvairios molekulinės masės išplautų dalelių kiekį, kuris reiškiamas mase, o horizontaliojoje ašyje – molekulinės masės logaritmą, dažniausiai gaunama Gauso kreivė, kartais mažos molekulinės masės pusėje iškreipta nedidele uodega.
      1.5.   KOKYBĖS KERITERIJAI
      Eliuavimo tūrio pakartojamumas (variacijos koeficientas) turi būti geresnis nei 0,3 %. Jei vertinant skirtingu laiku darytą chromatogramą, ji neatitinka tik ką minėto kriterijaus, reikiamas analizės pakartojamumas turi būti užtikrintas atliekant pataisą vidiniu etalonu (1). Polidispersiškumas priklauso nuo etalonų molekulinės masės. Polistireno etalonų atveju tipiškos vertės yra tokios:
      
                  Mp < 2 000
               
               
                  Mw/Mn < 1,20
               
            
                  2 000 ≤ Mp ≤ 106
                  
               
               
                  Mw/Mn < 1,05
               
            
                  Mp > 106
                  
               
               
                  Mw/Mn < 1,20
               
            (Mp yra etalono molekulinė masė, atitinkanti smailės viršūnę)
      1.6.   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Etaloninių polistireno tirpalų ruošimas
      Polistireno etalonai ištirpinami juos kruopščiai sumaišant su pasirinktu eliuentu. Ruošiant tirpalus turi būti atsižvelta į gamintojo rekomendacijas.
      Pasirinktų etalonų koncentracijos priklauso nuo įvairių veiksnių, pvz., injekcijos tūrio, tirpalo klampio ir analizinio detektoriaus jautrumo. Norint išvengti perkrovos, didžiausias injekcijos tūris turi būti pritaikytas kolonėlės ilgiui. Taikant GPC medžiagų atskyrimui analizėje, tipiški injekcijos tūriai 30 cm × 7,8 mm kolonėlei paprastai yra 40-100 μ 1. Galima naudoti didesnį tūrį, tačiau jis neturi viršyti 250 μ 1. Prieš pradedant tikrąjį kolonėlės kalibravimą, turi būti nustatytas optimalus santykis tarp injekcijos tūrio ir koncentracijos.
      1.6.2.   Bandinio tirpalo ruošimas
      Iš esmės tie patys reikalavimai taikomi ruošiant bandinių tirpalus. Bandinys ištirpinamas tinkamame tirpiklyje, pvz., tetrahidrofurane, kruopščiai maišant. Jokiu būdu negalima tirpinti naudojant ultragarsinę vonią. Jei būtina, bandinio tirpalas gryninamas, filtruojant per membraninį filtrą, kurio porų dydis 0,2-2 μm.
      Galutinėje ataskaitoje turi būti pažymėta, ar buvo neištirpusių dalelių, nes tai gali būti didelės molekulinės masės medžiagų dalelės. Ištirpusių dalelių procentinei masės daliai nustatyti turi būti taikomas tinkamas metodas. Tirpalai turi būti panaudoti per 24 valandas.
      1.6.3.   Aparatūra
      
                  —
               
               
                  rezervuaras tirpikliui,
               
            
                  —
               
               
                  nudujinimo įtaisas (jei reikia),
               
            
                  —
               
               
                  siurblys,
               
            
                  —
               
               
                  pulsacijų slopintuvas (jei reikia),
               
            
                  —
               
               
                  injekcijos sistema,
               
            
                  —
               
               
                  chromatografinės kolonėlės,
               
            
                  —
               
               
                  detektorius,
               
            
                  —
               
               
                  debitmatis (jei reikia),
               
            
                  —
               
               
                  duomenų registruotuvas-procesorius,
               
            
                  —
               
               
                  atliekų indas.
               
            Turi būti užtikrinta, kad GPC sistema būtų inertiška naudojamiems tirpikliams (pvz., naudoti plieninius kapiliarus, jei tirpiklis tertrahidrofuranas).
      1.6.4.   Injekcijos ir tirpiklio tiekimo sistema
      Tam tikras bandinio tirpalo tūris griežtai nustatytoje zonoje įleidžiamas į kolonėlę, naudojant automatinį bandinio tiektuvą arba rankiniu būdu. Švirkšto plunžerio per greitas ištraukimas arba spaudimas įleidžiant rankiniu būdu gali būti molekulinių masių stebimo pasiskirstymo pokyčių priežastimi. Kiek įmanoma, tirpiklio tiekimo sistema turi būti be pulsacijų, geriausiu atveju jai reikia pulsacijų slopintuvo. Srautas yra apie 1 ml/min.
      1.6.5.   Kolonėlė
      Atsižvelgiant į bandinį, polimeras tiriamas naudojant vieną paprastą kolonėlę arba kelias nuosekliai sujungtas kolonėles. Prekyboje yra keletas kolonėlėms užpildyti naudojamų poringų medžiagų su apibrėžtomis savybėmis (pvz., porų dydžiu, ekskliudavimo ribomis). Atskyrimui naudojamo gelio arba kolonėlės aukščio pasirinkimas priklauso ir nuo bandinio savybių (hidrodinaminių tūrių, molekulinės masės pasiskirstymo) ir nuo specifinių atskyrimo sąlygų, pvz., tirpiklio, temperatūros ir srauto (1) (2) (3).
      1.6.6.   Teorinės lėkštelės
      Atskyrimui naudojama kolonėlė arba kolonėlių sistema turi būti apibūdinta teorinių lėkštelių skaičiumi. Tetrahidrofurano kaip eliuento atveju reikia į žinomo ilgio kolonėlę įleisti etilbenzeno arba kito tinkamo nepolinio tirpiklio tirpalą. Teorinių lėkštelių skaičius randamas pagal tokią lygtį:
      
                  
                     
               
               
                  arba
               
               
                  
                     
               
            kurioje:
      
                  N
               
               
                  =
               
               
                  teorinių lėkštelių skaičius
               
            
                  Ve
                  
               
               
                  =
               
               
                  smailės viršūnę atitinkantis eliuavimo tūris
               
            
                  W
               
               
                  =
               
               
                  smailės plotis pagrindo linijoje
               
            
                  W1/2
                  
               
               
                  =
               
               
                  smailės plotis per smailės aukščio vidurį
               
            1.6.7.   Atskyrimo efektyvumas
      Be teorinių lėkštelių skaičiaus, kuris apsprendžia juostos plotį, tam tikrą vaidmenį vaidina atskyrimo efektyvumas, kurį apibūdina kalibracinės kreivės statumas. Kolonėlės atskyrimo efektyvumas nustatomas pagal tokią priklausomybę:
      
         
      kurioje:
      
                  Ve, Mx
                  
               
               
                  =
               
               
                  polistireno, turinčio molekulinę masę Mx, eliuavimo tūris,
               
            
                  Ve, (10Mx)
               
               
                  =
               
               
                  polistireno, turinčio 10 kartų didesnę molekulinę masę, eliuavimo tūris.
               
            Sistemos atskiriamoji galia dažniausiai apibrėžiama taip:
      
         
      čia:
      
                  Ve1, V e2
                  
               
               
                  =
               
               
                  dviejų polistireno etalonų eliuavimo tūriai, atitinkantys smailės viršūnę,
               
            
                  W1, W2
                  
               
               
                  =
               
               
                  smailių pločiai pagrindo linijoje,
               
            
                  M1, M2
                  
               
               
                  =
               
               
                  molekulinės masės, atitinkančios smailių viršūnes (turi skirtis 10 kartų).
               
            Kolonėlės sistemai R vertė turi būti didesnė kaip 1,7 (4).
      1.6.8.   Tirpikliai
      Visi tirpikliai turi būti labai gryni (tetrahidrofurano grynumas 99,5 %). Tirpiklio indas (jei reikia, su inertinių dujų atmosfera) turi būti pakankamai didelis kolonėlei kalibruoti ir kelių bandinių analizei atlikti. Tirpiklis, prieš jį tiekiant siurbliu į kolonėlę, turi būti nudujintas.
      1.6.9.   Temperatūros reguliavimas
      Svarbių vidinių komponentų (injekcijos kilpos, kolonėlių, detektoriaus ir vamzdžių) temperatūra turi būti pastovi ir atitikti pasirinktą tirpiklį.
      1.6.10.   Detektorius
      Detektoriaus paskirtis – kiekybiškai registruoti iš kolonėlės išplauto bandinio koncentraciją. Norint, kas smailės nebūtų labai plačios, detektoriaus kiuvetės tūris turi būti kuo mažesnis. Jis neturi būti didesnis kaip 10 μl, išskyrus šviesos sklaidos ir klampio detektorius. Detektavimui paprastai naudojama diferencinė refraktometrija. Tačiau, jei to reikalauja bandinio specifinės savybės arba eliuavimo tirpiklis, gali būti naudojami kitų tipų detektoriai, pvz., UV/VIS, IR, klampio detektoriai ir t. t.
      2.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      2.1.   DUOMENYS
      Išsamių vertinimo kriterijų, taip pat duomenų kaupimui ir apdorojimui keliamų reikalavimų reikia ieškoti DIN standarte (1).
      Kiekvienam bandiniui turi būti atlikti du nepriklausomi bandymai. Bandiniai turi būti analizuojami atskirai.
      Kiekvieną kartą matuojant reikia gauti Mn, Mw, Mw/Mn ir Mp vertes. Būtina aiškiai nurodyti, kad išmatuotos vertės yra santykinės vertės, atitinkančios naudojamų etalonų molekulinę masę. Po sulaikymo tūrio arba sulaikymo trukmės verčių (galbūt pataisytų naudojant vidinį etaloną)
      nustatymo vienam šių dydžių atidedamos log Mp vertės (Mp yra kalibravimo etalono smailės viršūnę atitinkanti vertė). Kiekvienai molekulinės masės dešimtainei skilčiai būtina turėti bent du kalibravimo taškus, o visai kalibracinei kreivei, kuri turi apimti įvertintą bandinio molekulinę masę, turi būti bent penki matavimų taškai. Mažą molekulinę masę atitinkantis kalibracinės kreivės galinis taškas nustatomas pagal n – heksilbenzeną arba kitokį tinkamą nepolinį tirpiklį. Skaitinė vidutinė ir masinė vidutinė molekulinės masės paprastai apskaičiuojamos elektroninėmis duomenų apdorojimo priemonėmis, taikant 1.2 skyriaus formules. Atliekant apskaičiavimus rankiniu būdu, galima pasižiūrėti į ASTM D 3536-91 (3).
      Pasiskirstymo kreivė turi būti pateikta lentelės pavidalu arba kaip grafikas (diferencinis dažnis arba bendrojo kiekio procentinės dalys pagal log M). Vaizduojant grafiškai viena molekulinės masės dešimtainė skiltis paprastai turi būti 4 cm pločio, o smailės viršūnės aukštis turi būti apie 8 cm. Integralinių pasiskirstymo kreivių atveju atstumas ordinatėje tarp taškų, atitinkančių 0 ir 100 %, turi būti apie 10 cm.
      2.2.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:
      2.2.1.   Bandymų medžiaga
      
                  —
               
               
                  turima informacija apie bandomąją medžiagą (identiškumas, priedai, priemaišos),
               
            
                  —
               
               
                  bandinio apdorojimo aprašymas, pastebėjimai, problemos.
               
            2.2.2.   Aparatūra
      
                  —
               
               
                  tirpiklio rezervuaras, inertinės dujos, eliuento nudujinimas, eliuento sudėtis, priemaišos,
               
            
                  —
               
               
                  siurblys, pulsacijų slopintuvas, injekcijos sistema,
               
            
                  —
               
               
                  atskyrimo kolonėlės (gamintojas, visa informacija apie kolonėlių chakteristikas, pvz., porų dydis, atskyrimo medžiagos rūšis ir t. t., naudotų kolonėlių skaičius, ilgis ir jungimo tvarka),
               
            
                  —
               
               
                  kolonėlės (arba jų rinkinio) teorinių lėkštelių skaičius, atskyrimo efektyvumas (sistemos atskyrimo galia),
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie smailių simetriją,
               
            
                  —
               
               
                  kolonėlės temperatūra, temperatūros reguliavimo būdas,
               
            
                  —
               
               
                  detektorius (matavimo principas, tipas, kiuvetės tūris),
               
            
                  —
               
               
                  debitmatis, jei buvo naudotas (gamintojas, matavimo principas),
               
            
                  —
               
               
                  duomenų registravimo ir apdorojimo sistema (aparatinė įranga ir programinė įranga).
               
            2.2.3.   Sistemos kalibravimas
      
                  —
               
               
                  kalibracinės kreivės gavimo metodo detalus aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie šio metodo kokybės kriterijus (pvz., koreliacijos koeficientą, paklaidų kvadratų sumą ir t. t.),
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie visas ekstrapoliacijas, prielaidas ir aproksimacijas, darytas bandymo eigoje ir vertinant bei apdorojant duomenis,
               
            
                  —
               
               
                  visi matavimai, naudoti kalibracinei kreivei gauti, turi būti dokumentuoti lentelėje, kurioje kiekvienam kalibravimo taškui būtų pateikta tokia informacija:
                  
                              —
                           
                           
                              bandinio pavadinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandinio gamintojas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              etalonų būdingosios vertės Mp, Mn, Mw ir Mw/Mn, kokias pateikė gamintojas, arba gautos vėlesniuose matavimuose, kartu nurodant nustatymo metodo detales,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              injekcijos tūris ir injekcijos koncentracija,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kalibravimui naudota Mp vertė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išmatuotas eliuavimo tūris arba pataisyta sulaikymo trukmė, atitinkantys smailės viršūnę,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              smailės viršūnę atitinkanti apskaičiuota Mp vertė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              apskaičiuotos ir kalibravimui naudotos Mp vertės procentinė paklaida.
                           
                        
            2.2.4.   Vertinimas:
      
                  —
               
               
                  vertinimas laiko pagrindu: metodai taikyti reikiamam pakartojamumui užtikrinti (pataisų darymo metodas, vidinis standartas ir t.t),
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie tai, ar vertinimas buvo atliekamas pagal eliuavimo tūrį ar pagal sulaikymo trukmę,
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie vertinimo ribas, jei smailė nėra iki galo analizuota,
               
            
                  —
               
               
                  suglodinimo metodų aprašymas, jei jie buvo taikyti,
               
            
                  —
               
               
                  bandinio ruošimo ir išankstinio apdorojimo metodikos,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie neištirpusias daleles, jei yra,
               
            
                  —
               
               
                  injekcijos tūris (μ l) ir injekcijos koncentracija (mg/ml)
               
            
                  —
               
               
                  stebėjimų duomenys, nurodantys veiksnius, kurie yra nukrypimų nuo teorinio GPC profilio priežastis,
               
            
                  —
               
               
                  bandymo metodikose darytų visų keitimų detalus aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  detalės apie paklaidų intervalus,
               
            
                  —
               
               
                  bet kokia kita informacija ir stebėjimų duomenys, reikalingi duomenims interpretuoti.
               
            3.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.
               
            
                  2)
               
               
                  Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.
               
            
                  3)
               
               
                  ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
               
            
                  4)
               
               
                  ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
               
            
         Priedas
         Kitų metodų polimerų skaitinei vidutinei molekulinei masei nustatyti pavyzdžiai
         Gelchromatografija (GPC) yra labiausiai tinkamas būdas Mn nustatyti, ypač, jei yra rinkinys etalonų, kurių sandara yra panaši į polimero sandarą. Tačiau, jei norint taikyti GPC kyla praktinių sunkumų arba kai jau iš anksto tikimasi, kad medžiaga neatitiks Mn nustatyto kriterijaus (kas turi būti patvirtinta), yra alternatyvūs metodai, pvz.:
         1.   Koligatyviųjų savybių naudojimas
         
                     1.1.
                  
                  
                     Ebulioskopija (krioskopija):
                     matuojamas tirpiklio virimo temperatūros didėjimas (ebulioskopija) arba užšąlimo temperatūros mažėjimas (krioskopija), kai jame ištirpinama polimero. Metodas remiasi faktu, kad ištirpinto polimero įtaką virimo (užšalimo) temperatūros pokyčiui apsprendžia polimero molekulinė masė (1) (2).
                     Taikomumas: Mn < 20 000.
                  
               
                     1.2.
                  
                  
                     Garų slėgio mažėjimas:
                     matuojamas pasirinkto etaloninio skysčio garų slėgis prieš įdedant polimero ir po žinomų polimero kiekių pridėjimo (1) (2).
                     Taikomumas: Mn < 20 000 (teoriškai; tačiau praktikoje metodo reikšmė ribota).
                  
               
                     1.3.
                  
                  
                     Membraninė osmometrija:
                     remiasi osmoso principu, t. y. tirpiklio molekulių savaiminiu perėjimu per puslaidę membraną iš praskiesto tirpalo į koncentruotą tirpalą. Bandyme praskiesto tirpalo koncentracija yra nulinė, o koncentruotame tirpale yra polimero. Dėl tirpiklio siurbimo per membraną susidaro slėgių skirtumas, kurio dydis priklauso nuo polimero koncentracijos ir molekulinės masės (1) (3) (4).
                     Taikomumas: Mn20 000–200 000 intervale.
                  
               
                     1.4.
                  
                  
                     Osmometrija garų fazėje:
                     gryno tirpiklio aerozolio garavimo greitis lyginamas su bent trijų aerozolių, turinčių skirtingos koncentracijos polimero, garavimo greičiu (1) (2) (4).
                     Taikomumas: Mn < 20 000.
                  
               2.   Galinių grupių analizė
         Norint taikyti šį metodą, reikia žinoti bendrąją polimero sandarą ir jo galinių grupių (kurias nuo pagrindinės grandinės turi būti galima atskirti, pvz., taikant branduolių magnetinio rezonanso metodą arba titravimo (derivatizavimo) metodą) prigimtį. Pagal polimere esančių galinių grupių molekulinę koncentraciją gali būti nustatyta jo molekulinės masės vertė (7) (8) (9).
         Taikomumas: Mn iki 50 000 (pasikliovimui mažėjant).
         3.   Nuorodos
         
                     1)
                  
                  
                     Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York.
                  
               
                     2)
                  
                  
                     Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.
                  
               
                     3)
                  
                  
                     ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
                  
               
                     4)
                  
                  
                     Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, p. 25–52.
                  
               
                     5)
                  
                  
                     ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
                  
               
                     6)
                  
                  
                     Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
                  
               
                     7)
                  
                  
                     SchrĖder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.
                  
               
                     8)
                  
                  
                     Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
                  
               
                     9)
                  
                  
                     Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139–2146.
                  
               
      A.19.   MAŽOS MOLEKULINĖS MASĖS MEDŽIAGŲ KIEKIS POLIMERUOSE
      1.   METODAS
      Šis gelchromatografijos (Gel Permeation Chromatographic) metodas yra OECD TG 119 (1996) kopija. Pagrindiniai principai ir papildoma techninė informacija pateikta nuorodose.
      1.1.   ĮVADAS
      Kadangi polimerų savybės yra labai skirtingos, neįmanoma aprašyti vieną atskirą metodą, tiksliai nustatantį atskyrimo ir vertinimo sąlygas, kurios apimtų visas galimybes ir specifinius atvejus, pasitaikančius atskiriant polimerus. Ypač sudėtingas polimerų sistemas dažnai neįmanoma paruošti gelchromatografijai (GPC). Kai GPC nenaudotina, molekulinę masę galima nustatyti kitų metodų pagalba (žr. papildymą). Tokiais atvejais turi būti pateiktos visos taikyto metodo detalės ir pagrindimas.
      Aprašytas metodas paruoštas DIN 55672 standarto (1) pagrindu. Visa detali informacija apie tai, kaip atlikti bandymus ir kaip vertinti duomenis, galima rasti šiame DIN standarte. Tuo atveju, kai būtina keisti bandymo sąlygas, šie keitimai turi būti pagrįsti. Galima taikyti kitus standartus, jei jie yra visiškai aprašyti. Aprašytame metode kalibravimui naudojami žinomo polidispersiškumo polistireno bandiniai ir metodą gali tekti keisti, pritaikant kai kuriems polimerams, pvz., vandenyje tirpiems ir ilgos šakotos grandinės polimerams.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Mažesnė nei 1 000 daltonų molekulinė masė sąlygiškai apibrėžiama kaip maža molekulininė masė.
      Skaitinė vidutinė molekulinė masė Mn ir masinė vidutinė molekulinė masė Mw nustatomos taikant tokias lygtis:
      
                  
                     
               
               
                  
                     
               
            kuriose:
      
                  Hi
                  
               
               
                  =
               
               
                  yra nuo pagrindo linijos išmatuotas detektoriaus signalo lygis sulaikymo tūriui Vi,
               
            
                  Mi
                  
               
               
                  =
               
               
                  sulaikymo tūrį Vi atitinkančios polimero frakcijos molekulinė masė ir n yra duomenų taškų skaičius.
               
            Molekulinės masės skirstinio plotį, kuris yra sistemos dispersiškumo matas, duoda santykis Mw/Mn.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Kadangi GPC yra santykinis metodas, turi būti atliekamas kalibravimas. Paprastai šiam tikslui naudojami siaurame intervale pasiskirstę linijinės sandaros polistireno etalonai, kurių vidutinės molekulinės masės Mn ir Mw ir molekulinės masės pasiskirstymas yra žinomi. Kalibravimo kreivę nežinomo bandinio molekulinei masei nustatyti galima naudoti tik tuomet, jei bandiniui ir etalonams atskirti naudotos sąlygos buvo parinktos identišku būdu.
      Nustatyta priklausomybė tarp molekulinės masės ir eliuavimo tūrio galioja tik konkretaus bandymo specifinėmis sąlygomis. Svarbiausios sąlygos yra temperatūra, tirpiklis (arba tirpiklių mišinys), chromatografavimo sąlygos ir atskyrimo kolonėlė arba kolonėlių sistema.
      Taip nustatytos bandinio molekulinės masės yra santykinės vertės ir vadinamos „molekulinėmis masėmis pagal polistireną“. Tai reiškia, kad dėl sandaros ir cheminių skirtumų tarp bandinio ir etalonų molekulinės masės nuo absoliučiųjų verčių gali skirtis didesniu arba mažesniu laipsniu. Jei naudojami kiti etalonai, pvz., polietilenglikolis, polioksietilenas, polimetilmetakrilatas, poliakrilo rūgštis, turi būti nurodyta priežastis.
      1.4.   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Bandinio molekulinės masės skirstinys ir vidutinės molekulinės masės (Mn, Mw) gali būti nustatyti taikant GPC. GPC yra specialus skysčių chromatografijos metodas, kuriame bandinys atskiriamas pagal atskirų komponentų hidrodinaminius tūrius (2).
      Atskyrimas vyksta, kai bandinys praeina per kolonėlę, užpildytą poringa medžiaga, dažniausiai organiniu geliu. Mažos molekulės gali įsiskverbti į poras, tuo tarpu didelės molekulės ekskliuduojamos. Todėl didelių molekulių kelias yra trumpesnis ir jos išplaunamos pirmos. Vidutinio dydžio molekulės įsiskverbia į kai kurias poras ir išplaunamos vėliau. Mažiausios molekulės, kurių vidutinis hidrodinaminis spindulys yra mažesnis nei gelio poros, gali įsiskverbti į visas poras. Šios molekulės išplaunamos paskutinės.
      Teoriškai atskyrimą apsprendžia vien tik molekulių dydis, tačiau praktikoje sunku išvengti kai kurių trukdančių sugerties veiksnių. Netolygus kolonėlės užpildymas ir nenaudingi tūriai gali bloginti padėtį (2).
      Aptikimas atliekamas, pvz., matuojant lūžio rodiklį arba UV sugertį, gaunama paprasta pasiskirstymo kreivė. Tačiau norint kreivei priskirti tikrąsias molekulinės masės vertes, kolonėlę reikia kalibruoti, leidžiant per ją žinomos molekulinės masės polimerus ir geriausiai būtų apskritai panašios sandaros polimerus, pvz., įvairius polistireno etalonus. Vertikaliojoje ašyje žymint įvairios molekulinės masės išplautų dalelių kiekį, kuris reiškiamas mase, o horizontaliojoje ašyje – molekulinės masės logaritmą, paprastai gaunama Gauso kreivė, kartais mažos molekulinės masės pusėje iškreipta nedidele uodega.
      Pagal šią kreivę nustatomas mažos molekulinės masės medžiagų kiekis. Apskaičiavimas gali būti tikslus tik tuo atveju, jei mažos molekulinės masės dalelių atsakas yra ekvivalentiškas jų masės daliai polimere.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Eliuavimo tūrio pakartojamumas (variacijos koeficientas) turi būti geresnis nei 0,3 %. Jei vertinant skirtingu laiku darytą chromatogramą, ji neatitinka tik ką minėto kriterijaus, reikiamas analizės pakartojamumas turi būti užtikrintas atliekant korekciją vidiniu etalonu (1). Polidispersiškumas priklauso nuo etalonų molekulinės masės. Polistireno etalonų atveju tipiškos vertės yra tokios:
      
                  Mp < 2 000
               
               
                  Mw/Mn < 1,20
               
            
                  2 000 ≤ Mp ≤ 106
                  
               
               
                  Mw/Mn < 1,05
               
            
                  Mp > 106
                  
               
               
                  Mw/Mn < 1,20
               
            (Mp yra etalono molekulinė masė, atinkanti smailės viršūnę).
      1.6.   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Etaloninių polistireno tirpalų ruošimas
      Polistireno etalonai ištirpinami juos kruopščiai sumaišant su pasirinktu eliuentu. Ruošiant tirpalus turi būti atsižvelta į gamintojo rekomendacijas.
      Pasirinktų etalonų koncentracijos priklauso nuo įvairių veiksnių, pvz., injekcijos tūrio, tirpalo klampio ir analizinio detektoriaus jautrumo. Norint išvengti perkrovos, didžiausias injekcijos tūris turi būti pritaikytas kolonėlės ilgiui. Taikant GPC medžiagų atskyrimui analizėje, tipiški injekcijos tūriai 30 cm × 7,8 mm kolonėlei paprastai yra 40-100 μ 1. Galima naudoti didesnį tūrį, tačiau jis neturi viršyti 250 μ 1. Prieš pradedant tikrąjį kolonėlės kalibravimą, turi būti nustatytas optimalus santykis tarp injekcijos tūrio ir koncentracijos.
      1.6.2.   Bandinio tirpalo ruošimas
      Iš esmės tie patys reikalavimai taikomi ruošiant bandinių tirpalus. Bandinys ištirpinamas tinkamame tirpiklyje, pvz., tetrahidrofurane, kruopščiai maišant. Jokiu būdu negalima tirpinti naudojant ultragarsinę vonią. Jei būtina, bandinio tirpalas gryninamas, filtruojant per membraninį filtrą, kurio porų dydis 0,2–2 μm.
      Galutinėje ataskaitoje turi būti pažymėta, ar buvo neištirpusių dalelių, nes tai gali būti didelės molekulinės masės medžiagų dalelės. Ištirpusių dalelių procentinei masės daliai nustatyti turi būti taikomas tinkamas metodas. Tirpalai turi būti panaudoti per 24 valandas.
      1.6.3.   Pataisos atsižvelgiant į priemaišų ir priedų kiekį
      Paprastai būtina daryti medžiagų, kurių molekulinė masė M < 1 000, kiekio pataisas atsižvelgiant į esančių nepolimerinių medžiagų (pvz., priemaišų ir (arba) priedų) indėlį, išskyrus kai nustatytas kiekis ir taip jau < 1 %. Tai daroma polimero tirpalo arba GPC eliuato tiesioginės analizės būdu.
      Tais atvejais, kai išėjusio iš kolonėlės eliuato koncentracija tolesnei analizei per maža, jis turi būti koncentruojamas. Gali prireikti eliuatą išgarinti iki sauso likučio ir vėl jį ištirpinti. Eliuato koncentravimas turi būti atliktas tokiomis sąlygomis, kurios užtikrintų, kad eliuatas išliks nepakitęs. Eliuato apdorojimas po GPC pakopos priklauso nuo kiekybiniam nustatymui taikomo metodo.
      1.6.4.   Aparatūra
      
                  —
               
               
                  rezervuaras tirpikliui,
               
            
                  —
               
               
                  nudujinimo įtaisas (jei reikia),
               
            
                  —
               
               
                  siurblys,
               
            
                  —
               
               
                  pulsacijų slopintuvas (jei reikia),
               
            
                  —
               
               
                  injekcijos sistema,
               
            
                  —
               
               
                  chromatografinės kolonėlės,
               
            
                  —
               
               
                  detektorius,
               
            
                  —
               
               
                  debitmatis (jei reikia),
               
            
                  —
               
               
                  duomenų registruotuvas-procesorius,
               
            
                  —
               
               
                  atliekų indas.
               
            Turi būti užtikrinta, kad GPC sistema būtų inertiška naudojamiems tirpikliams (pvz., naudojant plieninius kapiliarus, jei tirpiklis tetrahidrofuranas).
      1.6.5.   Injekcijos ir tirpiklio tiekimo sistema
      Tam tikras bandinio tirpalo tūris griežtai nustatytoje zonoje įleidžiamas į kolonėlę, naudojant automatinį bandinio tiektuvą arba rankiniu būdu. Švirkšto plunžerio per greitas ištraukimas arba spaudimas įleidžiant rankiniu būdu gali būti molekulinių masių stebimo pasiskirstymo pokyčių priežastimi. Kiek įmanoma, tirpiklio tiekimo sistema turi būti be pulsacijų, geriausiu atveju jai reikia pulsacijų slopintuvo. Srautas yra apie 1 ml/min.
      1.6.6.   Kolonėlė
      Atsižvelgiant į bandinį, polimeras tiriamas naudojant vieną paprastą kolonėlę arba kelias nuosekliai sujungtas kolonėles. Prekyboje yra keletas kolonėlėms užpildyti naudojamų poringų medžiagų su apibrėžtomis savybėmis (pvz., porų dydžiu, ekskliudavimo ribomis). Atskyrimui naudojamo gelio arba kolonėlės aukščio pasirinkimas priklauso ir nuo bandinio savybių (hidrodinaminių tūrių, molekulinės masės pasiskirstymo) ir nuo specifinių atskyrimo sąlygų, pvz., tirpiklio, temperatūros ir srauto (1) (2) (3).
      1.6.7.   Teorinės lėkštelės
      Atskyrimui naudojama kolonėlė arba kolonėlių sistema turi būti apibūdinta teorinių lėkštelių skaičiumi. Tetrahidrofurano kaip eliuento atveju reikia į žinomo ilgio kolonėlę įleisti etilbenzeno arba kito tinkamo nepolinio tirpiklio tirpalą. Teorinių lėkštelių skaičius randamas pagal tokią lygtį:
      
                  
                     
               
               
                  arba
               
               
                  
                     
               
            kurioje:
      
                  N
               
               
                  =
               
               
                  teorinių lėkštelių skaičius,
               
            
                  Ve
                  
               
               
                  =
               
               
                  smailės viršūnę atitinkantis eliuavimo tūris,
               
            
                  W
               
               
                  =
               
               
                  smailės plotis pagrindo linijoje,
               
            
                  W1/2
                  
               
               
                  =
               
               
                  smailės plotis per smailės aukščio vidurį.
               
            1.6.8.   Atskyrimo efektyvumas
      Be teorinių lėkštelių skaičiaus, kuris apsprendžia juostos plotį, tam tikrą vaidmenį vaidina atskyrimo efektyvumas, kurį apibūdina kalibracinės kreivės statumas. Kolonėlės atskyrimo efektyvumas nustatomas pagal tokią priklausomybę:
      
         
      kurioje:
      
                  Ve, Mx
                  
               
               
                  =
               
               
                  polistireno, turinčio molekulinę masę Mx, eliuavimo tūris,
               
            
                  Ve, (10Mx)
               
               
                  =
               
               
                  polistireno, turinčio 10 kartų didesnę molekulinę masę, eliuavimo tūris.
               
            Sistemos atskiriamoji galia dažniausiai apibrėžiama taip:
      
         
      čia:
      
                  Ve1, Ve2
                  
               
               
                  =
               
               
                  dviejų polistireno etalonų eliuavimo tūriai, atitinkantys smailės viršūnę,
               
            
                  W1, W2
                  
               
               
                  =
               
               
                  smailių pločiai pagrindo linijoje,
               
            
                  M1, M2
                  
               
               
                  =
               
               
                  molekulinės masės, atitinkančios smailių viršūnes (turi skirtis 10 kartų).
               
            Kolonėlės sistemai R vertė turi būti didesnė kaip 1,7 (4).
      1.6.9.   Tirpikliai
      Visi tirpikliai turi būti labai gryni (tetrahidrofurano grynumas 99,5 %). Tirpiklio indas (jei reikia inertinių dujų atmosferoje) turi būti pakankamai didelis kolonėlei kalibruoti ir kelių bandinių analizei atlikti. Tirpiklis, prieš tai kaip jį tiekti siurbliu į kolonėlę, turi būti nudujintas.
      1.6.10.   Temperatūros reguliavimas
      Svarbių vidinių komponentų (injekcijos kilpos, kolonėlių, detektoriaus ir vamzdžių) temperatūra turi būti pastovi ir atitikti pasirinktą tirpiklį.
      1.6.11.   Detektorius
      Detektoriaus paskirtis – kiekybiškai registruoti iš kolonėlės išplauto bandinio koncentraciją. norint, kas smailės nebūtų labai plačios, detektoriaus kiuvetės tūris turi būti kuo mažesnis. Jis neturi būti didesnis kaip 10 μl, išskyrus šviesos sklaidos ir klampio detektorius. Detektavimui paprastai naudojama diferencinė refraktometrija. Tačiau, jei to reikalauja bandinio specifinės savybės arba eliuavimo tirpiklis, gali būti naudojami kitų tipų detektoriai, pvz., UV/VIS, IR, klampio detektoriai ir t. t.
      2.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      2.1.   DUOMENYS
      Išsamių vertinimo kriterijų, taip pat duomenų kaupimui ir apdorojimui keliamų reikalavimų reikia ieškoti DIN standarte (1).
      Kiekvienam bandiniui turi būti atlikti du nepriklausomi bandymai. Bandiniai turi būti analizuojami atskirai. Visais atvejais taip pat yra svarbu apskaičiuoti tuščiųjų bandinių, apdorojamų vienodai su bandiniu, duomenis.
      Būtina aiškiai nurodyti, kad išmatuotos vertės yra santykinės vertės, atitinkančios naudojamų etalonų molekulinę masę.
      Po sulaikymo tūrio arba sulaikymo trukmės verčių (galbūt pataisytų naudojant vidinį etaloną) nustatymo vienam šių dydžių atidedamos log Mp vertės (Mp yra kalibravimo etalono smailės viršūnę atitinkanti vertė). Kiekvienai molekulinės masės dešimtainei skilčiai būtina turėti bent du kalibravimo taškus, o visai kalibracinei kreivei, kuri turi apimti įvertintą bandinio molekulinę masę, turi būti bent penki matavimų taškai. Mažą molekulinę masę atitinkantis kalibracinės kreivės galinis taškas nustatomas pagal n – heksilbenzeną arba kitokį tinkamą nepolinį tirpiklį. Kreivės dalis, atitinkanti mažesnę nei 1 000 molekulinę masę, apskaičiuojama ir prireikus pataisoma atsižvelgiant į priemaišas ir priedus. Eliavimo kreivės paprastai vertinamos elektroninio duomenų apdorojimo būdu. Atliekant apskaičiavimus rankiniu būdu, galima pasižiūrėti į ASTM D 3536-91 (3).
      Jei kolonėlėje sulaikomas koks nors netirpus polimeras, jo molekulinė masė greičiausiai yra didesnė nei tirpiosios dalies, ir jei į jo kiekį neatsižvelgti, gaunamas mažos molekulinės masės medžiagų kiekio pervertinimas. Papildyme pateikiamos rekomendacijos, kaip daryti mažos molekulinės masės medžiagų kiekio pataisą atsižvelgiant į netirpų polimerą.
      Pasiskirstymo kreivė turi būti pateikta lentelės pavidalu arba kaip grafikas (diferencinis dažnis arba bendrojo kiekio procentinės dalys pagal log M). Vaizduojant grafiškai viena molekulinės masės dešimtainė skiltis paprastai turi būti 4 cm pločio, o smailės viršūnės aukštis turi būti apie 8 cm. Integralinių pasiskirstymo kreivių atveju atstumas ordinatėje tarp taškų, atitinkančių 0 ir 100 %, turi būti apie 10 cm.
      2.2.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:
      2.2.1.   Bandymų medžiaga
      
                  —
               
               
                  turima informacija apie bandomąją medžiagą (identiškumas, priedai, priemaišos),
               
            
                  —
               
               
                  bandinio apdorojimo aprašymas, pastebėjimai, problemos.
               
            2.2.2.   Aparatūra
      
                  —
               
               
                  tirpiklio rezervuaras, inertinės dujos, eliuento nudujinimas, eliuento sudėtis, priemaišos,
               
            
                  —
               
               
                  siurblys, pulsacijų slopintuvas, injekcijos sistema,
               
            
                  —
               
               
                  atskyrimo kolonėlės (gamintojas, visa informacija apie kolonėlių chakteristikas, pvz., porų dydis, atskyrimo medžiagos rūšis ir t. t., naudotų kolonėlių skaičius, ilgis ir jungimo tvarka),
               
            
                  —
               
               
                  kolonėlės (arba jų rinkinio) teorinių lėkštelių skaičius, atskyrimo efektyvumas (sistemos atskyrimo galia),
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie smailių simetriją,
               
            
                  —
               
               
                  kolonėlės temperatūra, temperatūros reguliavimo būdas,
               
            
                  —
               
               
                  detektorius (matavimo principas, tipas, kiuvetės tūris),
               
            
                  —
               
               
                  debitmatis, jei buvo naudotas (gamintojas, matavimo principas),
               
            
                  —
               
               
                  duomenų registravimo ir apdorojimo sistema (aparatinė įranga ir programinė įranga).
               
            2.2.3.   Sistemos kalibravimas
      
                  —
               
               
                  kalibracinės kreivės gavimo metodo detalus aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie šio metodo kokybės kriterijus (pvz., koreliacijos koeficientą, paklaidų kvadratų sumą ir t. t.),
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie visas ekstrapoliacijas, prielaidas ir aproksimacijas, darytas bandymo eigoje ir vertinant bei apdorojant duomenis,
               
            
                  —
               
               
                  visi matavimai, naudoti kalibracinei kreivei gauti, turi būti dokumentuoti lentelėje, kurioje kiekvienam kalibravimo taškui būtų pateikta tokia informacija:
                  
                              —
                           
                           
                              bandinio pavadinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandinio gamintojas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              etalonų būdingosios vertės Mp, Mn, Mw ir Mw/Mn, kokias pateikė gamintojas, arba gautos vėlesniuose matavimuose, kartu nurodant nustatymo metodo detales,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              injekcijos tūris ir injekcijos koncentracija,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kalibravimui naudota Mp vertė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išmatuotas eliuavimo tūris arba pataisyta sulaikymo trukmė, atitinkantys smailės viršūnę,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              smailės viršūnę atitinkanti apskaičiuota Mp vertė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              apskaičiuotos ir kalibravimui naudotos Mp vertės procentinė paklaida.
                           
                        
            2.2.4.   Informacija apie mažą molekulinę masę turinčio polimero kiekį
      
                  —
               
               
                  analizei taikytų metodų aprašymas ir bandymų atlikimo eiga,
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie mažos molekulinės masės medžiagų procentinę dalį (m/m), apskaičiuotą viso bandinio masei,
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie priemaišų, priedų ir kitų nepolimerinių medžiagų masės procentinę dalį, apskaičiuotą viso bandinio masei.
               
            2.2.5.   Vertinimas:
      
                  —
               
               
                  vertinimas laiko pagrindu: visi metodai taikyti reikiamam pakartojamumui užtikrinti (pataisų darymo metodas, vidinis standartas ir t. t.),
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie tai, ar vertinimas buvo atliekamas pagal eliuavimo tūrį ar pagal sulaikymo trukmę,
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie vertinimo ribas, jei smailė nėra iki galo analizuota,
               
            
                  —
               
               
                  suglodinimo metodų aprašymas, jei jie buvo taikyti,
               
            
                  —
               
               
                  bandinio ruošimo ir išankstinio apdorojimo metodikos,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie neištirpusias daleles, jei yra,
               
            
                  —
               
               
                  injekcijos tūris (μ l) ir injekcijos koncentracija (mg/ml),
               
            
                  —
               
               
                  stebėjimų duomenys, nurodantys veiksnius, kurie yra nukrypimų nuo teorinio GPC profilio priežastis,
               
            
                  —
               
               
                  bandymo metodikose darytų visų keitimų detalus aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  detalės apie paklaidų intervalus,
               
            
                  —
               
               
                  bet kokia kita informacija ir stebėjimų duomenys, reikalingi duomenims interpretuoti.
               
            3.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.
               
            
                  2)
               
               
                  Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.
               
            
                  3)
               
               
                  ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
               
            
                  4)
               
               
                  ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
               
            
         Priedas
         Nurodymai, kaip daryti mažos molekulinės masės medžiagos kiekio pataisas dėl netirpaus polimero buvimo
         Kai bandinyje yra netirpaus polimero, GPC analizės metu prarandama masė. Netirpus polimeras negrįžtamai sulaikomas kolonėlėje arba ant bandinio filtro, o tirpioji bandinio dalis praeina per kolonėlę. Jei galima įvertinti arba išmatuoti polimero lūžio rodiklio pokytį (dn/dc), tai galima įvertinti kolonėlėje prarastą masę. Tokiu atveju pataisa daroma, naudojant išorinį kalibravimą žinomos koncentracijos etaloninėmis medžiagomis bei dn/dc refraktometro atsakui kalibruoti. Čia pateiktame pavyzdyje naudojamas polimetilmetakrilato (pMMA) etalonas.
         Norint akrilo polimerų analizėje atlikti išorinį kalibravimą, GPC metodu analizuojamas žinomos koncentracijos pMMA tirpalas tetrahidrofurane ir gauti duomenys naudojami refraktometro konstantai nustatyti pagal lygtį:
         K = R/(C × V × dn/dc),
         kurioje:
         
                     K
                  
                  
                     =
                  
                  
                     refraktometro konstanta (mikrovoltas iš sekundės mililitrui),
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     pMMA etalono atsakas (mikrovoltas iš sekundės),
                  
               
                     C
                  
                  
                     =
                  
                  
                     pMMA etalono koncentracija (mg/ml),
                  
               
                     V
                  
                  
                     =
                  
                  
                     injekcijos tūris (ml), ir
                  
               
                     dn/dc
                  
                  
                     =
                  
                  
                     tetrahidrofurane ištirpinto pMMA lūžio rodiklio pokytis (ml/mg).
                  
               Tipiniai pMMA etalono duomenys:
         
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     2937 891,
                  
               
                     C
                  
                  
                     =
                  
                  
                     1,07 mg/ml,
                  
               
                     V
                  
                  
                     =
                  
                  
                     0,1 ml,
                  
               
                     dn/dc
                  
                  
                     =
                  
                  
                     9 × 10-5 ml/mg.
                  
               Toliau gautoji K vertė 3,05 × 1011 naudojama apskaičiuoti teoriškam detektoriaus atsakui, jei pro detektorių butų išplauta 100 % įšvirkšto polimero kiekio.
      
      A.20.   POLIMERŲ TIRPIMAS (EKSTRAHAVIMAS) VANDENYJE
      1.   METODAS
      Aprašytas metodas yra OECD TG 120 (1997) pataisytos versijos kopija. Kita techninė informacija pateikta (1) nuorodoje.
      1.1.   ĮVADAS
      Prieš taikant toliau išdėstytą metodą, kai kuriems polimerams, pvz., emulsiniams polimerams, gali būti reikalingi paruošiamieji darbai. Metodas netaikomas skystiesiems polimerams ir polimerams, kurie bandymo sąlygomis reaguoja su vandeniu.
      Kai metodą taikyti netikslinga arba neįmanoma, polimerų tirpimas (ekstrahavimas) gali būti tiriamas kitų metodų pagalba. Tokiais atvejais turi būti pateiktos visos metodo detalės ir pagrindimas.
      1.2   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.3   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Polimerų tirpimas (ekstrahavimas) vandeninėje terpėje nustatomas taikant kolbos metodą (žr. A.6 tirpumas vandenyje, kolbos metodas), kuriame daromi toliau aprašyti pakeitimai.
      1.4   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.5   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      1.5.1.   Įranga
      Bandant šiuo metodu reikalinga tokia įranga:
      
                  —
               
               
                  trupintuvas, pvz., malūnas žinomo dydžio dalelėms gauti,
               
            
                  —
               
               
                  purtyklė, kurioje būtų galima reguliuoti temperatūrą,
               
            
                  —
               
               
                  membraninių filtrų sistema,
               
            
                  —
               
               
                  atitinkama analizinė įranga,
               
            
                  —
               
               
                  standartizuoti sietai.
               
            1.5.2.   Bandinių ruošimas
      Reprezentatyvus bandinys iš pradžių turi būti susmulkintas iki 0,125-0,25 mm dydžio dalelių, naudojant atitinkamus sietus. Bandinio patvarumui užtikrinti arba malimo procese gali būti reikalingas aušinimas. Medžiagos gumos pagrindu gali būti trupinamos skystojo azoto temperatūroje (1).
      Jei reikiamo dydžio dalelių frakcijos gauti negalima, turi būti imtasi veiksmų dalelių dydžiui kiek įmanoma sumažinti, o rezultatas turi būti pateiktas ataskaitoje. Ataskaitoje būtina nurodyti būdą, kaip sutrupintas bandinys buvo laikomas prieš bandymą.
      1.5.3.   Bandymo eiga
      Į tris indus su stikliniais kamščiais atskirai pasveriami trys bandomosios medžiagos 10 g masės bandiniai ir į kiekvieną indą įpilama 1 000 ml vandens. Jei pasirodo, kad 10 g polimero apdoroti nėra galimybės, turi būti naudojamas kitas gretimas didžiausias kiekis, kurį galima apdoroti, o vandens tūris atitinkamai keičiamas.
      Indai gerai užkemšami ir purtomi 20 oC temperatūroje. Turi būti naudojamas purtymo arba maišymo įtaisas, galintis veikti pastovioje temperatūroje. Po 24 valandų kiekvieno indo turinys centrifuguojamas arba filtruojamas ir atinkamu analizės metodu skaidrioje vandeninėje fazėje nustatoma polimero koncentracija. Jei tinkamų metodų analizuoti vandeninėje terpėje nėra, bendrasis tirpumas (ekstrahuojamumas) gali būti nustaytas pagal sauso likučio ant filtro arba sausų centrifugavimo nuosėdų masę.
      Paprastai būtina kiekybiškai atskirti priemaišas ir priedus nuo mažos molekulinės masės medžiagų. Gravimetrinio nustatymo atveju, norint atsižvelgti į likučius, atsirandančius dėl bandymo metodikos taikymo, svarbu atlikti tuščiąjį bandymą be bandomosios medžiagos.
      Polimerų tirpimas (ekstrahavimas) vandenyje 37 oC temperatūros ir pH 2 bei pH 9 sąlygomis gali būti nustatytas tokiu pat būdu, kuris aprašytas atliekant bandymą 20 oC temperatūroje. pH vertė gali būti reguliuojama pridedant tinkamo buferinio tirpalo arba tinkamų rūgščių ar šarmų, pvz., druskos rūgšties, acto rūgšties, analiziškai gryno natrio ar kalio hidroksido, arba NH3.
      Atsižvelgiant į taikomą analizės metodą turi būti atliekami vienas arba du bandymai. Kai yra pakankamai specifiniai tiesioginės polimerų komponentų analizės vandeninėje terpėje metodai, turėtų pakakti vieno anksčiau aprašyto bandymo. Tačiau kai tokių metodų nėra, o polimero tirpimo (ekstrahavimo) nustatymas apribotas tik netiesiogine analize, vandeniniame ekstrakte nustatant tik bendrosios organinės anglies kiekį (BOA), turi būti atliktas papildomas bandymas. Be to, šis papildomas bandymas turi būti atliekamas tris kartus, naudojant 10 kartų mažesnius polimero bandinius ir tuos pačius vandens kiekius, kurie buvo naudojami pirmajame bandyme.
      1.5.4.   Analizė
      1.5.4.1.   Vieno dydžio bandinio analizė
      Gali būti tiesioginės polimero komponentų analizės vandeninėje terpėje metodai. Kaip alternatyvą galima būtų svarstyti galimybę netiesiogiai analizuoti ištirpintų (ekstrahuotų) polimerų komponentus, nustatant bendrąjį tirpiųjų dalių kiekį ir darant pataisas dėl polimerams nebūdingų komponentų buvimo.
      Analizė vandeninėje fazėje visų polimerinių medžiagų bendrajam kiekiui nustatyti galima:
      jei taikomas pakankamai jautrus metodas, pvz.:
      
                  —
               
               
                  BOA nustatymas, taikant šlapią suardymą persulfatu arba dichromatu CO2 gauti, kurio kiekis įvertinamas IR arba cheminės analizės metodu,
               
            
                  —
               
               
                  atominė absorbcinė analizė (AAS) arba jos induktyviai sužadintos plazmos (ICP) emisijos atitikmuo silicio arba metalų turintiems polimerams nustatyti,
               
            
                  —
               
               
                  UV absorbcija arba spektrofluorimetrija arilų polimerams,
               
            
                  —
               
               
                  LC-MS (skysčių chromatografija – masių spektroskopija) mažos molekulinės masės bandiniams,
               
            arba atliekamas vandeninio ekstrakto garinimas vakuume iki sauso likučio ir jo spektrinė analizė (IR, UV ir t. t.) arba likučio AAS (ICP) analizė.
      Jei pačios vandeninės fazės analizė neįmanoma, vandeninis ekstraktas turi būti ekstrahuojamas organiniu tirpikliu, kuris nesimaišo su vandeniu, pvz., chlorintuoju angliavandeniliu. Tirpiklis vėliau išgarinamas, o likutis analizuojamas, kaip anksčiau nurodyta, polimero kiekiui nustatyti. Visų šio likučio komponentų, kurie identifikuojami kaip priemaišos arba priedai, kiekis turi būti atimtas, kad būtų galima nustatyti paties polimero tirpimo (ekstrahavimo) laipsnį.
      Kai tokių medžiagų kiekis yra gana didelis, likutį gali tekti analizuoti, pvz., HPLC (didelio efektyvumo skysčių chromatografijos) arba GPC (gelchromatografijos) metodais, kurių pagalba priemaišos būtų atskirtos nuo monomero ir jo darinių, kad būtų galima nustatyti tikrąjį pastarųjų medžiagų kiekį.
      Kai kuriais atvejais gal būt pakaktų tiesiog išgarinti organinį tirpiklį iki sauso likučio ir jį pasverti.
      1.5.4.2.   Bandymas su dviem skirtingo dydžio bandiniais
      Visuose vandeniniuose ekstraktuose atliekama BOA analizė.
      Neištirpusi bandinio dalis (likutis po ekstrahavimo) analizuojama gravimetriškai. Jei po kiekvieno indo turinio centrifugavimo arba filtravimo, polimero likučiai lieka ant indo sienelių, indas turi būti skalaujamas filtratu tol, kol inde nelieka jokių matomų likučių. Toliau filtratas vėl centrifuguojamas arba filtruojamas. Ant filtro arba centrifugavimo mėgintuvėlyje esantis likutis džiovinamas vakuume 40 oC temperatūroje ir sveriamas. Džiovinama tol, kol gaunama pastovi masė.
      2.   DUOMENYS
      2.1.   BANDYMAS, ATLIKTAS NAUDOJANT VIENO DYDŽIO BANDINĮ
      Turi būti pateikti kiekvienai iš trijų kolbų gauti atskiri rezultatai ir jų vidutinės vertės, išreiškiant masės vienetais tirpalo tūriui (paprastai mg/1) arba masės vienetais polimero masei (paprastai mg/g). Taip pat papildomai turi būti pateiktas bandinio masės nuostolis (apskaičiuotas tirpinio masę dalinant iš pradinio bandinio masės). Turi būti apskaičiuoti variacijos koeficientai. Atskiri skaičiai turi būti pateikti visai medžiagai (polimeras + pagrindiniai priedai ir t. t.) ir tik polimerui (t. y. atimant tokių priedų indėlį).
      2.2.   BANDYMAS, ATLIKTAS NAUDOJANT DU SKIRTINGO DYDŽIO BANDINIUS
      Turi būti pateiktos atskiros BOA kiekio vandeniniuose ekstraktuose vertės, gautos dviejuose trigubuose bandymuose, ir kiekvieno bandymo vidutinė vertė, išreiškiant masės vienetais tirpalo tūriui (paprasta mgC/l), taip pat masės vienetais pradinio bandinio masei (paprastai mgC/g).
      Jei tarp rezultatų, gautų dideliam ir mažam bandinio masės bei vandens santykiui, skirtumo nėra, tai galėtų rodyti, kad visi ekstrahuojami komponentai buvo iš tikrųjų ekstrahuoti. Tokiu atveju, tiesioginė analizė paprastai nebūtina.
      Turi būti pateiktos likučių atskiros masės ir išreikštos pradinės bandinio masės procentais. Turi būti apskaičiuojamos bandyme gautos vidutinės vertės. Skirtumas tarp 100 ir nustatyto procentinio kiekio rodo tirpios ir ekstrahuojamos medžiagos procentinį kiekį pradiniame bandinyje.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:
      3.1.1.   Bandomoji medžiaga
      
                  —
               
               
                  turima informacija apie bandomąją medžiaga (identiškumas, priedai, priemaišos, mažos molekulinės masės medžiagų kiekis).
               
            3.1.2.   Bandymų sąlygos
      
                  —
               
               
                  naudotų metodikų ir bandymų sąlygų aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  analizės ir aptikimo metodų aprašymas.
               
            3.1.3.   Rezultatai
      
                  —
               
               
                  tirpumo (ekstahuojamumo) rezultatai, mg/1; atskiros ir vidutinės vertės ekstrahavimo bandymuose įvairiuose tirpaluose, suardyto polimero kiekis ir priemaišos, priedai ir t. t.,
               
            
                  —
               
               
                  tirpumo (ekstrahuojamumo) rezultatai mg/g polimero,
               
            
                  —
               
               
                  vandeninių ekstraktų BOA vertės, tirpalo masė ir apskaičiuotas kiekis procentais, jei matuotas,
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieno bandinio pH,
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie tuščiajame bandyme gautas vertes,
               
            
                  —
               
               
                  jei būtina, nuorodos į bandymo medžiagos nepatvarumą bandymo ir analizės eigoje,
               
            
                  —
               
               
                  visa informacija, kuri yra svarbi interpretuojant rezultatus.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.
               
            A.21.   OKSIDUOJAMOSIOS SAVYBĖS (SKYSČIAI)
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Šis bandymų metodas skirtas matuoti skystosios medžiagos gebą padidinti degiosios medžiagos degimo greitį arba degimo intensyvumą arba sudaryti mišinį su degiąja medžiaga, kuris užsidega savaime, kai dvi medžiagos sumaišomos kartu. Jis yra pagrįstas JT bandymu, taikomu oksiduojamiesiems skysčiams (1), ir jį atitinka. Tačiau, kadangi šis A.21 metodas visų pirma rengiamas siekiant atitikti Direktyvos 67/548 reikalavimus, reikia lyginti tik su viena etalonine medžiaga. Bandymas ir lyginimas su papildomomis etaloninėmis medžiagomis gali būti reikalingas, kai bandymų rezultatus numatoma naudoti kitais tikslais (9).
      Šio bandymo daryti nereikia, kai tiriant struktūrinę formulę neabejotinai nustatoma, kad medžiaga negali egzotermiškai reaguoti su degiąja medžiaga.
      Prieš darant šį bandymą naudinga turėti išankstinės informacijos apie visas galimas medžiagos sprogiąsias savybes.
      Šis bandymas netaikomas kietosioms medžiagoms, dujoms, sprogiosioms ar labai degioms medžiagoms arba organiniams peroksidams.
      Šio bandymo galima nedaryti, jei bandomosios medžiagos rezultatai jau yra gauti darant JT oksiduojamųjų skysčių bandymą.
      1.2.   APIBRĖŽTYS IR VIENETAI
      Vidutinė slėgio didėjimo trukmė – išmatuoto bandomojo mišinio slėgio didėjimo, palyginti su atmosferos slėgiu, nuo 690 kPa iki 2 070 kPa trukmės verčių vidurkis.
      1.3.   ETALONINĖ MEDŽIAGA
      Kaip etaloninė medžiaga naudojamas 65 % (m/m) vandeninis azoto rūgšties (analiziškai grynos) tirpalas (10).
      Be to, jei bandytojas numato, kad šio bandymo rezultatai gali būti naudojami kitais tikslais (9), pasirinktinai gali būti tikslinga naudoti papildomas etalonines medžiagas (11).
      1.4.   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Bandomasis skystis maišomas masių santykiu 1:1 su pluoštine celiulioze ir mišinys dedamas į slėginį indą. Jei maišant arba dedant įvyksta savaiminis užsidegimas, toliau bandymo daryti nereikia.
      Jei mišinys savaime neužsidega, daromas visas bandymas. Mišinys kaitinamas slėgio inde ir nustatomas vidutinis laikas, per kurį slėgis, palyginti su atmosferos slėgiu, padidėja nuo 690 kPa iki 2 070 kPa. Šis padidėjęs slėgis lyginamas su vidutine etaloninės (-ių) medžiagos (-ų) ir celiuliozės santykio 1:1 mišinio slėgio didėjimo trukme.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Darant penkis vienos medžiagos bandymus, aritmetinis vidurkis ir atskiri rezultatai turi skirtis ne daugiau kaip 30 %. Rezultatai, kurie palyginti su vidurkiu skiriasi daugiau kaip 30 %, turi būti atmesti, maišymo ir pripildymo metodika patobulinta ir bandymas pakartotas.
      1.6.   METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Pasiruošimas
      1.6.1.1.   Degioji medžiaga
      Kaip degioji medžiaga naudojama sausa pluoštinė celiuliozė, kurios plaušelių ilgis 50–250 μm, o vidutinis skersmuo – 25 μm (12). Ne didesnio kaip 25 mm storio celiuliozės sluoksnis 4 h džiovinamas iki pastoviosios masės esant 105 oC ir aušinamas bei prieš bandymą laikomas eksikatoriuje su džiovikliu. Vandens kiekis išdžiovintoje celiuliozėje turi būti mažesnis kaip 0,5 % sausos medžiagos masės (13). Prireikus džiovinimo trukmė turi būti padidinta tokiam drėgmės kiekiui pasiekti (14). Viso bandymo metu turi būti naudojama ta pati celiuliozės siunta.
      1.6.1.2.   Aparatūra
      1.6.1.2.1.   Slėginis indas
      
      Būtina turėti slėginį indą. Slėginį indą sudaro 89 mm ilgio ir 60 mm išorinio skersmens plieninis cilindras (žr. 1 paveikslą). Staklėmis gaminamos dvi plokštelės priešingiems cilindro galams (sumažinančios skerspjūvį iki 50 mm), kurios padėtų įtvirtinti cilindrą, įstatant uždegimo žvakę ir ventiliavimo angos aklidangtį. Indas su 20 mm skersmens anga iš abiejų galų viduje platinamas iki 19 mm gylio ir sriegiamas 1 „Britų standarto vamzdinis sriegis arba jo metrinis atitikmuo. Slėgio mažinimo atvamzdis įsriegiamas į kreivąjį slėginio indo paviršių 35 mm nuo vieno galo ir 90o kampu ištekintoms plokštelėms. Gręžiama 12 mm gylio anga, kurioje daromas sriegis įsukti atvamzdžiui, turinčiam“ Britų standarto vamzdinį (arba jo metrinio atitikmens) sriegį. Prireikus įstatomas inertinės medžiagos sandariklis hermetiškumui užtikrinti. Atvamzdžio ilgis, matuojant nuo slėginio indo korpuso, lygus 55 mm, jame išgręžiama 6 mm skersmens anga. Atvamzdžio galas platinamas ir įsriegiamas diafragminio tipo slėgio keitliui įsukti. Galima naudoti bet kurį slėgio matavimo įtaisą, kurio neveiktų karštos dujos arba skilimo produktai ir kuris galėtų matuoti slėgio didėjimo greitį nuo 690 iki 2 070 kPa ne ilgiau kaip per 5 ms.
      Į tolesnį nuo atvamzdžio slėginio indo galą įsukama uždegimo žvakė, turinti du elektrodus, vieną izoliuotą nuo korpuso, o kitą įžemintą žvakės korpuse. Į kitą slėginio indo galą įstatoma trūkioji membrana (trūkimo slėgis maždaug 2 200 kPa), kurią laiko kamštis su 20 mm anga. Prireikus uždegimo žvakė sandarinama inertinės medžiagos sandarikliu hermetiškumui užtikrinti. Visą sąranka tvirtinama laikančiajame stove naudojimui tinkamame aukštyje (2 paveikslas). Stovą paprastai sudaro mažaanglio plieno pagrindo plokštė, kurios matmenys yra 235 mm × 184 mm × 6 mm, ir 185 mm ilgio kvadratinė tuščiavidurė sekcija, kurios matmenys – 70 mm × 70 mm × 4 mm.
      Vienas kvadratinės tuščiavidurės sekcijos galas nupjaunamas iš abiejų priešingų šonų dviem plokščiabriaunėms 86 mm ilgio kojoms gauti. Šių plokščiųjų šonų galai nupjaunami 60o horizontalės atžvilgiu ir privirinami prie pagrindo plokštės. Viename viršutinio galo šone išpjaunama 22 mm pločio ir 46 mm gylio išdroža, į kurią įsistato slėginio indo atvamzdis, kai visa slėginio indo sąranka uždegimo žvake žemyn nuleidžiama į laikantįjį stovą. Prie žemesnės tuščiavidurės sekcijos sienos iš vidaus privirinamas 30 mm pločio ir 6 mm storio plieninis fiksatorius. Priešingoje sienoje įsriegiamos angos dviem 7 mm ilgio sparnuotiesiems varžtams, kurie neleistų slėginiam indui judėti. Slėginiam indui laikyti iš apačios prie šoninių sienų privirinamos dvi 12 mm pločio ir 6 mm storio plieninės juostos, įremtos į tuščiavidurės sekcijos pagrindą.
      1.6.1.2.2.   Uždegimo sistema
      
      Uždegimo sistemą sudaro 25 cm ilgio ir 0,6 mm skersmens Ni/Cr viela, kurios savitoji varža yra 3,85 Ω/m. Viela susukama į apviją naudojant 5 mm skersmens strypą ir tvirtinama prie uždegimo žvakės elektrodų. Apvijos konfigūracija turi atitikti vieną iš pavaizduotų 3 paveiksle. Atstumas nuo slėginio indo dugno iki apatinės uždegimo apvijos pusės turi būti 20 mm. Jei elektrodų ilgis nereguliuojamas, uždegimo vielos galai nuo apvijos iki slėginio indo dugno turi būti izoliuoti keraminiu apvalkalu. Viela kaitinama naudojant stabilizuotos įtampos srovės šaltinį, kuris galėtų tiekti mažiausiai 10 A stiprumo srovę.
      1.6.2.   Bandymo eiga
             (15)
         
      
      Aparatas su slėgio keitliu ir kaitinimo sistema, bet be trūkiosios membranos, tvirtinamas stove uždegimo žvake žemyn. Cheminėje stiklinėje stikline lazdele (16) sumaišoma 2,5 g bandomojo skysčio ir 2,5 g išdžiovintos celiuliozės. Saugai užtikrinti, maišant tarp operatoriaus ir mišinio turi būti saugos skydas. Jei mišinys užsidega maišant arba pilant į indą, toliau bandyti nereikia. Mišinį reikia dėti į slėginį indą mažomis dalimis tapšnojant ir užtikrinti, kad jis būtų dedamas apie uždegimo apviją ir gerai su ja liestųsi. Svarbu kad dedant mišinį apvija nebūtų deformuota, kadangi dėl to gali būti gauti klaidingi rezultatai (17). Trūkioji membrana dedama į vietą ir gerai užsukamas tvirtinimo kamštis. Indas su įkrova trūkiąja membrana į viršų įstatomas į laikantįjį stovą, kuris turi būti statomas tinkamoje šarvuotoje traukos spintoje arba deginimo kameroje. Prie uždegimo žvakės kontaktų jungiamas maitinimo šaltinis ir įjungiama 10 A srovė. Laikas nuo maišymo pradžios iki maitinimo įjungimo turi būti ne didesnis kaip 10 min.
      Slėgio keitliu gautas signalas užrašomas tinkama sistema, kuri leistų gauti nepertraukiamą laiko slėgio kitimo laike kreivę ir kartu ją analizuoti (pvz., pereinamųjų vyksmų sąvirašis, sujungtas su diagramų sąvirašiu). Mišinys kaitinamas tol, kol plyšta trūkioji membrana, arba bent 60 s. Jei trūkioji membrana neplyšta, mišinys paliekamas aušti prieš jį atsargiai atidarant, imantis atsargumo priemonių, jei slėginiame inde dar būtų per didelis slėgis. Medžiaga ir kiekviena etaloninė medžiaga bandoma penkis kartus. Užrašomas laikas, per kurį slėgis padidėja nuo 690 kPa iki 2 070 kPa virš atmosferos slėgio. Apskaičiuojama vidutinė slėgio didėjimo trukmė.
      Kartais medžiagos gali sukelti slėgio didėjimą (per didelį arba per mažą), kurio priežastis cheminės reakcijos, neapibūdinančios medžiagos oksiduojamųjų savybių. Tokiais atvejais norint nustatyti reakcijos tipą, bandymą gali tekti kartoti, vietoj celiuliozės naudojant inertinę medžiagą, pvz., diatomitą.
      2.   DUOMENYS
      Bandomosios medžiagos ir etaloninės (-ių) medžiagos (-ų) slėgio didėjimo trukmės vertės. Bandymų su inertine medžiaga slėgio didėjimo trukmės vertės, jei tokie bandymai daromi.
      2.1.   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Apskaičiuojamos bandomosios medžiagos ir etaloninės (-ių) medžiagos (-ų) vidutinės slėgio didėjimo trukmės vertės.
      Apskaičiuojama bandymų su inertine medžiaga slėgio didėjimo trukmės vertė, jei tokie bandymai daromi.
      Kai kurie rezultatų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje
      1 lentelė
      Rezultatų pavyzdžiai
             (18)
         
      
      
                  Medžiaga (19)
                  
               
               
                  1:1 mišinio su celiulioze vidutinė slėgio didėjimo trukmė
                  (ms)
               
            
                  Amonio dichromatas, sotusis vandeninis tirpalas
               
               
                  20 800
               
            
                  Kalcio nitratas, sotusis vandeninis tirpalas
               
               
                  6 700
               
            
                  Geležies (III) nitratas, sotusis vandeninis tirpalas
               
               
                  4 133
               
            
                  Ličio perchloratas, sotusis vandeninis tirpalas
               
               
                  1 686
               
            
                  Magnio perchloratas, sotusis vandeninis tirpalas
               
               
                  777
               
            
                  Nikelio nitratas, sotusis vandeninis tirpalas
               
               
                  6 250
               
            
                  Azoto rūgštis, 65 %
               
               
                  4 767 (20)
                  
               
            
                  Perchlorato rūgštis, 50 %
               
               
                  121 (20)
                  
               
            
                  Perchlorato rūgštis, 55 %
               
               
                  59
               
            
                  Kalio nitratas, 30 % vandeninis tirpalas
               
               
                  26 690
               
            
                  Sidabro nitratas, sotusis vandeninis tirpalas
               
               
                  
                      (21)
                  
               
            
                  Natrio chloratas, 40 % vandeninis tirpalas
               
               
                  2 555 (20)
                  
               
            
                  Natrio nitratas, 45 % vandeninis tirpalas
               
               
                  4 133
               
            
                  
                     Inertinė medžiaga
                  
               
               
                   
               
            
                  Vanduo: celiuliozė
               
               
                  
                      (21)
                  
               
            3.   ATASKAITA
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje pateikiama ši informacija:
      
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos identiškumas, sudėtis, grynumas ir kitos savybės,
               
            
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos koncentracija,
               
            
                  —
               
               
                  naudojamos celiuliozės džiovinimo metodika,
               
            
                  —
               
               
                  drėgmės kiekis naudojamoje celiuliozėje,
               
            
                  —
               
               
                  matavimų rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  inertinės medžiagos bandymų rezultatai, jei yra,
               
            
                  —
               
               
                  apskaičiuotosios vidutinės slėgio didėjimo trukmės vertės,
               
            
                  —
               
               
                  visi nukrypimai nuo šio metodo ir jų pagrįstumas,
               
            
                  —
               
               
                  visa papildoma informacija arba pastabos rezultatams interpretuoti.
               
            3.2.   REZULTATŲ AIŠKINIMAS (22)
      
      Bandymų rezultatai įvertinti:
      
                  a)
               
               
                  pagal tai, ar bandomosios medžiagos ir celiuliozės mišinys užsidega savaime; ir
               
            
                  b)
               
               
                  lyginant medžiagos ir etaloninės (-ių) medžiagos (-ų) vidutinę slėgio didėjimo nuo 690 kPa iki 2 070 kPa trukmę.
               
            Skystoji medžiaga turi būti laikoma oksidatoriumi, kai:
      
                  a)
               
               
                  medžiagos ir celiuliozės santykio 1:1 mišinys, masės dalimis, užsidega savaime; arba
               
            
                  b)
               
               
                  medžiagos ir celiuliozės santykio 1:1 mišinio, masės dalimis, vidutinė slėgio didėjimo trukmė yra mažesnė arba lygi 65 % (m/m) vandeninio azoto rūgšties tirpalo ir celiuliozės santykio 1:1 mišinio, masės dalimis, vidutinei slėgio didėjimo trukmei.
               
            Siekiant išvengti klaidingų teigiamų rezultatų, interpretuojant juos reikėtų atsižvelgti į rezultatus, gautus bandant medžiagą su inertine medžiaga.
      4.   NUORODOS
      Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.
      1 paveikslas
      Slėginis indas
      
         
      2 paveikslas
      Laikantysis stovas
      
         
      3 paveikslas
      Uždegimo sistema
      
         
      Pastaba: galima naudoti bet kurią iš šių schemų.
      
         (1)  Priklauso nuo prietaiso rūšies ir medžiagos grynumo.
      
         (2)  Priklauso nuo prietaiso rūšies ir medžiagos grynumo.
      
         (3)  Priklauso nuo prietaiso rūšies ir medžiagos grynumo.
      
         (4)  Priklauso nuo prietaiso rūšies ir medžiagos grynumo.
      
         (5)  Šis tikslumas tinka tik labai paprastai priemonei, pavyzdžiui, aprašytai ASTM D 1120-72; ji gali būti patobulinta sudėtingesniais ebulioskopiniais prietaisais.
      
         (6)  Tinka tik grynoms medžiagoms. Naudojant kitokiomis sąlygomis, reikėtų pagrįsti.
      
         (7)  Priklauso nuo grynumo laipsnio
      
         (8)  Šiuos metodus taip pat galima naudoti 1–10 Pa intervale, jeigu atsargiai elgiamasi.
      
         (9)  Pvz., JT transporto reglamentų kontekste.
      
         (10)  Prieš bandymus rūgštis turėtų būti titruojama jos koncentracijai patvirtinti.
      
         (11)  Pvz.: 1 nuorodoje naudojama 50 % (m/m) perchlorato rūgštis ir 40 % (m/m) natrio chloratas.
      
         (12)  Pvz., Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, katalogo Nr. 4021 050.
      
         (13)  Patvirtinama, pvz., titruojant Karlo Fišerio metodu.
      
         (14)  Be to, tokį drėgmės kiekį galima pasiekti kitu metodu, pvz., 24 h kaitinant vakuume esant 105 oC.
      
         (15)  Oksidatoriaus ir celiuliozės mišiniai turi būti laikomi potencialiai sprogiais mišiniais, todėl su jais reikia elgtis atsargiai.
      
         (16)  Praktiškai tai galima padaryti ruošiant didesnį nei bandymui reikia bandomojo skysčio ir celiuliozės 1:1 mišinio kiekį ir supilant 5 ±0,1 g į slėginį indą. Kiekvienam bandymui ruošiamas naujas mišinys.
      
         (17)  Visų pirma turi būti išvengta gretimų apvijos vijų sąlyčio.
      
         (18)  Žr. 1 nuorodą dėl klasifikavimo pagal JT transportavimo schemą.
      
         (19)  Sotieji tirpalai turi būti ruošiami esant 20 oC.
      
         (20)  Vidutinė vertė, gauta darant tarplaboratorinius lyginamuosius tyrimus.
      
         (21)  Didžiausias 2 070 kPa slėgis nebuvo pasiektas.
      
         (22)  Žr. 1 nuorodą dėl rezultatų pagal JT transportavimo reglamentus interpretavimo, kai naudojamos kelios etaloninės medžiagos.
   
   
      B DALIS. TOKSIŠKUMO IR KITO POVEIKIO SVEIKATAI NUSTATYMO METODAI
      TURINYS
      BENDRASIS ĮVADAS
      
                  B.1 bis.
               
               ŪMUS ORALINIS TOKSIŠKUMAS. FIKSUOTŲJŲ DOZIŲ METODAS
            
                  B.1 tris.
               
               ŪMUS ORALINIS TOKSIŠKUMAS. ŪMAUS TOKSIŠKUMO KLASĖS METODAS
            
                  B.2.
               
               ŪMINIS TOKSIŠKUMAS (INHALIACINIS)
            
                  B.3.
               
               ŪMINIS TOKSIŠKUMAS (PER ODĄ)
            
                  B.4.
               
               ŪMUS TOKSIŠKUMAS. ODOS DIRGINIMAS AR ĖSDINIMAS
            
                  B.5.
               
               ŪMUS TOKSIŠKUMAS. AKIŲ DIRGINIMAS AR ĖSDINIMAS
            
                  B.6.
               
               ODOS SENSIBILIZACIJA
            
                  B.7.
               
               PAKARTOTINOS DOZĖS (28 DIENO) TOKSIŠKUMAS (PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ)
            
                  B.8.
               
               KARTOTINIŲ DOZIŲ (28 DIENOS) TOKSIŠKUMAS (INHALIACINIS)
            
                  B.9.
               
               KARTOTINIŲ DOZIŲ (28 DIENOS) TOKSIŠKUMAS (PER ODĄ)
            
                  B.10.
               
               MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJŲ TYRIMAS IN VITRO
               
            
                  B.11.
               
               MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ KAULŲ ČIULPŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJOS TYRIMAS IN VIVO
               
            
                  B.12.
               
               MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ ERITROCITŲ MAŽŲJŲ BRANDUOLIŲ TYRIMAS IN VIVO
               
            
                  B.13/14.
               
               MUTAGENIŠKUMAS – GRĮŽTAMŲJŲ MUTACIJŲ BAKTERIJOSE TYRIMAS
            
                  B.15.
               
               MUTAGENIŠKUMO TYRIMAS IR ATRANKA PAGAL KARCINOGENIŠKUMĄ GENŲ MUTACIJOS – SACCAROMYCES CEREVISIAE
               
            
                  B.16.
               
               MITOZINĖ REKOMBINACIJA – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
               
            
                  B.17.
               
               MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ LĄSTELIŲ GENŲ MUTACIJŲ TYRIMAS IN VITRO
               
            
                  B.18.
               
               DNR PAŽAIDOS IR JŲ REPARACIJA – NEPLANUOTA DNR SINTEZĖ – ŽINDUOLIŲ LĄSTELĖSE IN VITRO
               
            
                  B.19.
               
               APSIKEITIMO SESERINĖMIS CHROMATIDĖMIS TYRIMAS IN VITRO
               
            
                  B.20.
               
               SU LYTIMI SUSIJĘS RECESYVINIS LETALUS TESTAS DROSOPHILA MELANOGASTER TARPE
            
                  B.21.
               
               ŽINDUOLIŲ LĄSTELIŲ TRANSFORMACIJOS TESTAI IN VITRO
               
            
                  B.22.
               
               GRAUŽIKŲ DOMINANTINIS LETALINIS TESTAS
            
                  B.23.
               
               ŽINDUOLIŲ SPERMATOGONIJŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJOS TYRIMAS
            
                  B.24.
               
               PELIŲ TAŠKINIS TESTAS
            
                  B.25.
               
               PELIŲ PAVELDĖTA TRANSLOKACIJA
            
                  B.26.
               
               SUBCHRONIŠKO ORALINIO TOKSIŠKUMO BANDYMAS 90 PARŲ KARTOTINĖS DOZĖS TYRIMAS SU GRAUŽIKAIS ORALINIAM TOKSIŠKUMUI NUSTATYTI
            
                  B.27.
               
               SUBCHRONIŠKO ORALINIO TOKSIŠKUMO BANDYMAS 90 PARŲ KARTOTINĖS DOZĖS TYRIMAS NE SU GRAUŽIKAIS ORALINIAM TOKSIŠKUMUI NUSTATYTI
            
                  B.28.
               
               PUSIAU CHRONINIS ODOS TOKSIŠKUMO TYRIMAS 90 DIENŲ TRUNKANTIS KARTOTINĖS DOZĖS DAVIMO GRAUŽIKAMS PER ODĄ TYRIMAS
            
                  B.29.
               
               PUSIAU CHRONINIS ĮKVĖPIMO TOKSIŠKUMO TYRIMAS 90 DIENŲ TRUNKANTIS KARTOTINĖS ĮKVEPIAMOS DOZĖS TYRIMAS GRAUŽIKŲ RŪŠYSE
            
                  B.30.
               
               CHRONINIS TOKSIŠKUMO TESTAS
            
                  B.31.
               
               TOKSIŠKO POVEIKIO PRENATALINIAM VYSTYMUISI TYRIMAS
            
                  B.32.
               
               KARCINOGENIŠKUMO TESTAS
            
                  B.33.
               
               KOMBINUOTAS CHRONINIO TOKSIŠKUMO/KARCINOGENIŠKUMO TESTAS
            
                  B.34.
               
               VIENOS KARTOS DAUGINIMOSI TOKSIŠKUMO TESTAS
            
                  B.35.
               
               TOKSIŠKO POVEIKIO DVIEJŲ KARTŲ REPRODUKCIJAI TYRIMAS
            
                  B.36.
               
               TOKSIKOKINETIKA
            
                  B.37.
               
               FOSFOROORGANINIŲ MEDŽIAGŲ ŪMAUS POVEIKIO SUKELTAS UŽDELSTAS NEUROTOKSIŠKUMAS
            
                  B.38.
               
               FOSFOROORGANINIŲ MEDŽIAGŲ 28 DIENŲ PAKARTOTINOS DOZĖS SUKELTO UŽDELSTO NEUROTOKSIŠKUMO TYRIMAS
            
                  B.39.
               
               NENUMATYTOS DNR SINTEZĖS (NDS) TYRIMAS ŽINDUOLIŲ KEPENŲ LĄSTELĖSE IN VIVO
               
            
                  B.40.
               
               ODOS SUARDYMAS IN VITRO. ODOS SLUOKSNIO ELEKTRINĖS VARŽOS (OSEV) BANDYMAS)
            
                  B.40BIS.
               
               ODOS SUARDYMAS IN VITRO. ŽMOGAUS ODOS MODELIO BANDYMAS
            
                  B.41.
               
               3T3 NRU FOTOTOKSIŠKUMO BANDYMAS IN VITRO
               
            
                  B.42.
               
               ODOS JAUTRINIMAS. VIETINIO LIMFMAZGIO TYRIMAS
            
                  B.43.
               
               NEUROTOKSIŠKO POVEIKIO GRAUŽIKAMS TYRIMAS
            
                  B.44.
               
               SUGERTIS PER ODĄ. IN VIVO METODAS
            
                  B.45.
               
               SUGERTIS PER ODĄ. IN VITRO METODAS
            BENDRASIS ĮVADAS
      A.   TIRIAMOSIOS MEDŽIAGOS APIBŪDINIMAS
      Tiriamosios medžiagos sudėtį, taip pat ir pagrindines priemaišas, bei jos svarbiausias fizines ir chemines savybes, tarp jų pastovumą, reikėtų žinoti dar prieš bet kokio toksikologinio tyrimo planavimą.
      Tiriamosios medžiagos fizinės ir cheminės savybės nulemia medžiagos patekimo kelio pasirinkimą, kai kurių tyrimo detalių planavimą, elgimąsi su medžiaga bei jos laikymą.
      Tiriamosios medžiagos (jeigu įmanoma ir pagrindinių priemaišų) dozuojamoje terpėje ar biologinėje medžiagoje nustatymo kokybinius ir kiekybinius analitinius metodus reikėtų parengti dar prieš tyrimą.
      Visa informacija susijusi su medžiagos nustatymu, fizikinėmis ir cheminėmis jos savybėmis, grynumu, tiriamosios medžiagos elgesiu reikėtų įtraukti į tyrimo ataskaitą.
      B.   GYVŪNŲ PRIEŽIŪRA
      Giežta aplinkos sąlygų kontrolė ir tinkama gyvūnų priežiūra yra būtini toksikologiniame tyrime.
      i)   Laikymo sąlygos
      Eksperimentinių gyvūnų kambarių ar aptvarų aplinkos sąlygos turėtų būti tinkamos tiriamosioms rūšims. Žiurkėms, pelėms ir jūrų kiaulytėms kambario temperatūra turėtų būti 22 oC ± 3 oC, santykinis drėgnis nuo 30 iki 70 %; triušiams temperatūra turėtų būti 20 ± 3 oC, santykinis drėgnis nuo 30 iki 70 %.
      Kai eksperimentinė įranga yra ypač jautri temperatūros poveikiui, tiriamajame metode reikėtų aprašyti jai tinkamas sąlygas. Visuose toksinių poveikių tyrimuose temperatūra ir drėgnis turėtų būti stebimi, registruojami ir įtraukiami į tyrimo baigiamąją ataskaitą.
      Apšvietimas turi būti dirbtinis, šviesos režimas – 12 valandų šviesos/12 valandų tamsos. Apšvietimo detalės turėtų būti registruojamos ir įtraukiamos į baigiamąją tyrimo ataskaitą.
      Jei metode kitaip nenurodoma, gyvūnai gali būti laikomi po vieną arba tos pačios lyties individų grupėmis, tačiau viename narve neturėtų būti daugiau negu penki gyvūnai.
      Eksperimentų su gyvūnais ataskaitose svarbu nurodyti gyvūnų laikymo būdą bei jų skaičių viename narve medžiagos poveikio bei vėlesniu stebėjimo periodu.
      ii)   Šėrimas
      Tyrimo metu gyvūnams duodami pašarai turi atitikti visus tos gyvūnų rūšies mitybos reikalavimus. Tais atvejais, kai tiriamoji medžiaga dedama į pašarus, jų galiojimo laikas turėtų būti sutrumpinamas dėl tiriamosios medžiagos sąveikos su pašaro sudedamosiomis dalimis. Į tokios reakcijos galimybę turėtų būti atsižvelgiama interpretuojant tyrimų rezultatus. Standartiniai laboratorinių gyvūnų pašarai turėtų būti duodami neribojant geriamo vandens kiekio. Pasirenkant minėtą poveikio metodą, pašaro turėtų būti duodama tiek, kad tai užtikrintų reikiamą tiriamosios medžiagos gaunamą kiekį.
      Maisto teršalai, kurie yra toksiški, neturėtų viršyti interferuojančių koncentracijų.
      C.   ALTERNATYVUS TYRIMAS
      Europos Sąjunga siekia vystyti ir tvirtinti alternatyvius metodus, kurie teiktų panašią informaciją kaip ir įprasti gyvūnų tyrimai, tačiau naudotų mažiau gyvūnų, sukeltų jiems mažiau skausmo arba visiškai išvengtų jų panaudojimo.
      Kai tik tokie metodai įsigalioja, juos privaloma taikyti rizikos įvertinimui, vėlesniam klasifikavimui ir kenksmingumo ženklinimui.
      D.   ĮVERTINIMAS IR INTERPRETACIJA
      Vertinant ir interpretuojant gyvūnų ir in vitro tyrimų rezultatus, reikia atsižvelgti į jų tiesioginės ekstrapoliacijos žmogui ribotumą, todėl gavus įrodymą apie medžiagos neigiamą poveikį žmonėms, tai turėtų patvirtinti gyvūnų tyrimų rezultatus.
      E.   LITERATŪROS ŠALTINIAI
      Dauguma šių metodų remiasi EBPO programos tyrimo Gairėmis ir turėtų būti atliekami pagal Geros laboratorinės praktikos principus, tam kad užtikrinti kuo didesnį duomenų pripažinimą.
      Papildomą informaciją galima būtų rasti EBPO gairėse ir bet kurioje tinkamoje spausdintoje literatūroje.
      B.1 BIS.   ŪMUS ORALINIS TOKSIŠKUMAS. FIKSUOTŲJŲ DOZIŲ METODAS
      1.   METODAS
      Šis bandymų metodas atitinka OECD TG 420 (2001)
      1.1   ĮVADAS
      Taikant tradicinius metodus ūmaus toksiškumo poveikis įvertinamas pagal gyvūno žūtį. Britų toksikologų draugija (British Toxicology Society) 1984 m. pasiūlė naują ūmaus toksiškumo bandymo būdą, pagrįstą kelių fiksuoto dydžio dozių davimu (1). Taikant šį būdą išvengiama gyvūnų žūties, kuri būtų poveikio įrodymas; jis pagrįstas aiškių toksiškumo požymių pasireiškimu, kai iš dozių serijos duodama viena fiksuoto dydžio dozė. Pasibaigus JK (2) ir tarptautinio (3) tinkamumo patvirtinimo tyrimui in vivo, 1992 m. ši procedūra buvo patvirtinta kaip bandymo metodas. Vėliau, taikant matematinius modelius, daugelyje tyrimų buvo įvertintos statistinės fiksuotų dozių metodikos savybės (4)(5)(6). Kartu daromi in vivo ir modeliavimo tyrimai įrodė metodikos atkuriamumą; ją taikant naudojama mažiau gyvūnų, jiems sukeliamos mažesnės kančios nei taikant tradicinius metodus ir ji leidžia suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus.
      Rekomendacijas dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Rekomendaciniame ūmaus oralinio toksiškumo bandymo dokumente (7). Be to, šiame rekomendaciniame dokumente yra papildomos informacijos apie B.1 bis bandymo metodo taikymą ir aiškinimą.
      Metodo esmę sudaro tai, kad darant pagrindinį tyrimą skiriamos vidutinio toksiškumo dozės ir išvengiama dozių, kurios sukeltų žūtį. Be to, nereikia skirti dozių, kurios, kaip žinoma, sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ėsdinančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai nužudomi ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi darant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo nužudyti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro rekomendacinio dokumento objektas (8).
      Taikant metodą gaunama informacijos apie medžiagos pavojingas savybes, todėl ją galima įvertinti ir klasifikuoti pagal visuotinai suderintą sistemą (Globally Harmonised System (GHS), skirtą ūmų toksiškumą sukeliančioms cheminėms medžiagoms klasifikuoti (9).
      Prieš tyrimo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudarytų medžiagos identiškumas ir cheminė struktūra, jos fizikocheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksikologiniai duomenys ir numatomas (-i) medžiagos naudojimo būdas (-ai). Ši informacija yra būtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus dėl bandymo reikalingumo žmonių sveikatai apsaugoti, ir padėti pasirinkti tinkamą pradinę dozę.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Ūmus oralinis toksiškumas – taikomas tam neigiamam poveikiui, kuris atsiranda davus per burną vieną medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h.
      
         Uždelsta mirtis – kai gyvūnas nežūsta arba nepanašus į gaištantį per 48 h, bet žūsta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį.
      
         Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg).
      
         Akivaizdus toksiškumas – bendrasis terminas, aprašantis aiškius toksiškumo požymius, atsiradusius davus bandomosios medžiagos (pavyzdžiai pateikti (3), kai davus kitą didžiausią fiksuotą dozę, galima laukti, kad didelio skausmo ir ilgalaikių didelių kančių požymiai, gaišimo būsenos požymiai (kriterijai pateikti rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8) pasireikš arba galima žūtis ištiks didesnę dalį gyvūnų.
      
         GHS – visuotinai suderinta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (OECD) (žmonių sveikata ir aplinka), JT pavojingų prekių gabenimo ekspertų komiteto (fizikocheminės savybės) ir Tarptautinės darbo organizacijos (ILO) (pavojų pranešimas) bendroji veikla, koordinuojama Tarporganizacinės cheminių medžiagų tinkamos vadybos programos (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)).
      
         Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsenos arba žūties reikia laukti anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Šios graužikų būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. (Daugiau detalių pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8)).
      
         LD50
          (medianinė mirtina dozė) – statistiškai apskaičiuojama viena medžiagos dozė, nuo kurios yra tikimybė žūti 50 % gyvūnų, gavusių dozę per burną. LD50 vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (mg/kg).
      
         Ribinė dozė – dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2 000 arba 5 000 mg/kg).
      
         Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba kai neišgyvena net gydomas gyvūnas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8)).
      
         Numatoma žūtis – klinikinių požymių, rodančių žūtį tam tikru momentu ateityje prieš eksperimento pabaigą, pvz., nesugebėjimas pasiekti vandenį arba pašarą, buvimas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8)).
      1.3   BANDYMO METODO ESMĖ
      Vienos lyties gyvūnų grupėms nuosekliai duodamos fiksuotos 5, 50, 300 ir 2 000 mg/kg dozės (išimtiniais atvejais galima spręsti apie papildomos fiksuotos 5 000 mg/kg dozės davimą, žr. 1.6.2 skirsnį). Pradinė dozė pasirenkama atsižvelgiant į orientacinį tyrimą, kaip dozė, kuri galėtų sukelti kai kuriuos toksiškumo požymius, bet kuri nebūtų sunkaus toksiško poveikio arba žūties priežastimi. Klinikiniai požymiai ir sąlygos, susijusios su skausmu, kančia ir neišvengiama žūtimi, išsamiai aprašytos atskirame OECD rekomendaciniame dokumente (8). Kitoms gyvūnų grupėms gali būti duodamos didesnės arba mažesnės fiksuotos dozės, atsižvelgiant į toksiškumo arba gaištamumo požymių buvimą arba nebuvimą. Ši procedūra tęsiama tol, tol identifikuojama dozė, sukelianti akivaizdų toksiškumą arba ne daugiau kaip vieno gyvūno žūtį, arba kai nėra jokio poveikio esant didžiausiai dozei ar kai gyvūnai žūsta esant mažiausiai dozei.
      1.4   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.4.1   Gyvūnų rūšies pasirinkimas
      Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės (7). Pasirinkimą lėmė tipinių LD50 bandymų informacinės apžvalgos, kurios parodė, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie pastebimi, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės (10). Tačiau, jei giminingos struktūros cheminių junginių toksikologinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad patinai gali būti jautresni, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai daromi su patinais, pateikiami atitinkami tai patvirtinantys duomenys.
      Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti dar be vados ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš duodant dozę turi būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20 % tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę.
      1.4.2   Laikymo ir šėrimo sąlygos
      Bandomų gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22 oC (± 3 oC). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Gyvūnai gali būti laikomi narveliuose pagal dozes, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti aiškiai matyti kiekvieną gyvūną.
      1.4.3   Gyvūnų ruošimas
      Gyvūnai atrenkami atsitiktinai, ženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir prieš dozių davimo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras, kad galėtų priprasti prie laboratorinių sąlygų.
      1.4.4   Dozių ruošimas
      Apskritai visų dydžių bandomosios medžiagos dozės skiriamos kaip pastovaus tūrio dozės, keičiant ruošiamos dozės koncentraciją. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui, galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias duodamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima duoti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai neturi būti didesnis kaip 1ml/100g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima naudoti 2 ml/100g kūno masės. Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama tirpalui (emulsijai, suspensijai) aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet naudojami tirpalai kituose nešikliuose. Jei nešiklis ne vanduo, turi būti žinomos jo toksikologinės charakteristikos. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat davimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu.
      1.5   DARBO EIGA
      1.5.1   Dozių davimas
      Bandomoji medžiaga duodama kaip viena dozė per skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma duoti vienos dozės, ji gali būti duodama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.
      Prieš duodant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės negauna pašaro, išskyrus vandenį, per naktį; pelės gauna vandens, bet negauna pašaro 3–4 h). Pasibaigus badavimo laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir duodama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3–4 h, pelės nešeriamos 1–2 h. Jei dozė duodama dalimis per tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę.
      1.5.2   Orientacinis tyrimas
      Orientacinio tyrimo tikslas – leisti pasirinkti atitinkamą pradinę pagrindinio tyrimo dozę. Bandomoji medžiaga nuosekliai duodama atskiriems gyvūnams pagal 1 priedo diagramą. Orientacinis tyrimas baigiamas, kai galima priimti sprendimą dėl pagrindinio tyrimo pradinės dozės (arba jei gyvūnai žūsta esant mažiausiai fiksuotai dozei).
      Orientacinio tyrimo pradinė dozė pasirenkama iš 5, 50, 300 ir 2 000 mg/kg dozių, kaip dozė, kuri galėtų parodyti akivaizdų toksiškumą, pagrįstą, jei įmanoma, in vivo ir in vitro duomenimis apie tą pačią cheminę medžiagą ir struktūriniu požiūriu giminingas chemines medžiagas. Neturint tokios informacijos, pradinė dozė būtų 300 mg/kg.
      Tarp dozių davimo kiekvienam gyvūnui turi būti mažiausiai 24 h laiko tarpas. Visi gyvūnai turėtų būti stebimi mažiausiai 14 parų.
      Išimtiniais atvejais ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5 000 mg/kg dydžio dozę (žr. 3 priedą). Dėl priežasčių, susijusių su gyvūnų gerove, neskatinama daryti bandymo taikant GHS 5 kategorijos intervalus (2 000–5 000 mg/kg) ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga.
      Tais atvejais, kai darant orientacinį tyrimą žūsta gyvūnas, gavęs mažiausią fiksuotą dozę (5 mg/kg), taikant įprastą procedūrą tyrimą reikia nutraukti ir medžiagą priskirti GHS 1 kategorijai (kaip nurodyta 1 priede). Tačiau jei reikalingas tolesnis klasifikavimo patvirtinimas, gali būti atliekama ši neprivaloma papildoma procedūra. 5 mg/kg dozė duodama antram gyvūnui. Jei šis antras gyvūnas žūsta, GHS 1 kategorija patvirtinama ir tyrimas iš karto nutraukiamas. Jei antras gyvūnas išgyvena, 5 mg/kg dozę gauna ne daugiau kaip trys papildomi gyvūnai. Kadangi yra didelė žūties rizika, gyvūnų gerovei apsaugoti jie turi gauti šią dozę paeiliui. Laiko tarpo tarp dozės davimo kiekvienam gyvūnui turi pakakti nustatyti, ar pirmiau dozę gavęs gyvūnas turi galimybę išgyventi. Jei žūsta antras gyvūnas, dozių davimas iš karto nutraukiamas ir nei vienas papildomas gyvūnas dozės nebegauna. Kadangi žuvus antram gyvūnui (neatsižvelgiant į bandymo nutraukimo momentu panaudotų gyvūnų skaičių) rezultatas yra A (2 arba daugiau žūčių), taikoma 2 priedo klasifikavimo taisyklė esant 5 mg/kg fiksuotai dozei (1 kategorija, jei žuvo 2 arba daugiau gyvūnų, 2 kategorija, jei žuvo ne daugiau kaip 1 gyvūnas). Be to, 4 priede pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, laukiant naujos GHS įgyvendinimo.
      1.5.3   Pagrindinis tyrimas
      1.5.3.1   Gyvūnų skaičius ir dozių dydis
      Veiksmai, kurių turi būti imamasi po bandymo su pradine doze, nurodyti 2 priede pateiktose schemose. Yra trys būdai: nutraukti bandymą ir priskirti medžiagą atitinkamai pavojaus klasei, bandyti esant didesnei fiksuotai dozei arba bandyti esant mažesnei fiksuotai dozei. Tačiau siekiant apsaugoti gyvūnus, darant pagrindinį tyrimą nebus kartojama dozė, sukėlusi žūtį darant orientacinį tyrimą (žr. 2 priedą). Patyrimas rodo, kad labiausiai tikėtinas pradinės dozės davimo rezultatas pasireikš tuo, kad medžiaga galės būti klasifikuota ir tolesnis bandymas nebus būtinas.
      Kiekvienai tiriamai dozei paprastai bus naudojama iš viso po penkis vienos lyties gyvūnus. Penkis gyvūnus sudarys vienas gyvūnas iš orientacinio tyrimo, gavusio pasirinktą dozę, ir keturi papildomi gyvūnai (išskyrus neįprastus atvejus, kai pagrindinio tyrimo dozė nebuvo įtraukta į orientacinį tyrimą).
      Laiko tarpą tarp kiekvieno dydžio dozių skyrimo lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės davimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai. Rekomenduojamas 3 arba 4 parų laikotarpis tarp kiekvieno dydžio dozės, jei prireikia, uždelstam toksiškumui stebėti. Laiko tarpas prireikus gali būti reguliuojamas, pvz., reakcijos be traukulių atveju.
      Kai sprendžiama, ar skirti didžiausią fiksuotą 5 000 mg/kg dozę, reikėtų laikytis 3 priede aprašytos metodikos (dar žr. 1.6.2 skirsnį).
      1.5.3.2   Ribinis bandymas
      Ribinis bandymas visų pirma daromas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t.y., toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Informacijos apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima gauti pasinaudojus žiniomis apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius arba produktus, atsižvelgiant į toksikologinį reikšmingumą turinčių komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos išvis nėra arba kai pagal tą informaciją bandomoji medžiaga gali būti toksiška, turi būti daromas pagrindinis bandymas.
      Taikant įprastą procedūrą, šioje rekomendacijoje ribiniu bandymu būtų orientacinis tyrimas esant 2 000 mg/kg (arba išimtinais atvejais 5 000 mg/kg), po kurio keturiems papildomiems gyvūnams būtų skirta tokio pat dydžio dozė.
      1.6   STEBĖJIMAI
      Gavę dozę gyvūnai atskirai mažiausiai vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, ypač per pirmąsias 4 h, ir toliau kasdien stebimi visas 14 parų, išskyrus kai gyvūnams reikia nutraukti tyrimą ir humaniškai nužudyti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksiškumo reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei jie vėluoja atsirasti (11). Visi stebėjimai yra sistemingai užrašomi atskirai apie kiekvieną gyvūną.
      Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus Rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9). Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai nužudyti. Kai gyvūnai nužudomi dėl humaniškų priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kiek įmanoma tiksliau.
      1.6.1   Kūno masė
      Atskira gyvūnų masė nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos davimą ir vėliau – mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas masės pokytis. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai sveriami ir humaniškai nužudomi.
      1.6.2   Patologija
      Visiems bandymo gyvūnams (įskaitant nugaišusius darant bandymą arba pašalintus iš tyrimo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) daromas bendrasis skrodimas. Aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai. Gyvūnams, kurie po dozės gavimo išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų daryti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos.
      2.   DUOMENYS
      Turi būti pateikiami atskirų gyvūnų duomenys. Be to, visi duomenys suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas naudotų gyvūnų skaičius, toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius, darant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių nužudytų gyvūnų skaičius, atskirų gyvūnų žūties laikas, toksiško poveikio aprašymas, to poveikio kitimas laike ir grįžtamumas, skrodimo duomenys.
      3.   ATASKAITOS RENGIMAS
      3.1   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei tinka:
      
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              fizinė būsena, grynumas ir, jei tinka, fizikocheminės savybės (įskaitant izomerizavimą),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Nešiklis (jei tinka):
                  
                              —
                           
                           
                              nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              naudota rūšis ir veislė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei tinka, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparatą, įskaitant duodamos medžiagos fizikinį pavidalą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie bandomosios medžiagos davimą, įskaitant dozavimo tūrį ir davimo laiką,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą (šaltinį), vandens šaltinį),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno reakcijos duomenų ir dozės dydžio lentelės (t. y. gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, įskaitant gaištamumą, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kūno masės ir jos kitimo lentelės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              atskirų gyvūnų masė dozės davimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba nužudymo dieną,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį nužudymą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir vystymasis, jų galimas grįžtamumas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno skrodimo ir histopatologiniai duomenys, jei yra.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas ir aiškinimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, p. 85–92.
               
            
                  2)
               
               
                  Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O., (1987) Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279–291.
               
            
                  3)
               
               
                  Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P., (1990) The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469–482.
               
            
                  4)
               
               
                  Whitehead, A. and Curnow, R.N., (1992) Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, p. 313–324.
               
            
                  5)
               
               
                  Stallard, N. and Whitehead, A., (1995) Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, p. 315–323.
               
            
                  6)
               
               
                  Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P., (2002) Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183–196.
               
            
                  7)
               
               
                  OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris.
               
            
                  8)
               
               
                  OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment No 19.
               
            
                  9)
               
               
                  OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].
               
            
                  10)
               
               
                  Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C., (1995) Comparison of the Up-and- Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223–231.
               
            
                  11)
               
               
                  Chan, P.K and Hayes, A.W., (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd. New York, USA.
               
            
         1 PRIEDAS
         ORIENTACINIO TYRIMO SCHEMA
         
            
         
            
      
      
         2 PRIEDAS
         PAGRINDINIO TYRIMO SCHEMA
         
            
         
            
      
      
         3 PRIEDAS
         BANDOMŲJŲ MEDŽIAGŲ, KURIŲ TIKĖTINOS LD50 VERTĖS YRA DIDESNĖS NEGU 2 000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI NEDARANT BANDYMO
         Pavojaus 5 kategorijos kriterijai yra apibrėžti, kad būtų galima identifikuoti bandomąsias medžiagas, kurių ūmaus toksiškumo pavojus yra palyginti mažas, tačiau kurios esant tam tikroms aplinkybėms gali būti pavojingos pažeidžiamoms populiacijoms. Tikėtina, kad šių medžiagų LD50 per burną arba odą yra 2 000-5 000 mg/kg arba ekvivalentinė dozė, kai medžiagos patenka kitais būdais. Bandomosios medžiagos galėtų būti priskirtos pavojaus kategorijai, apibrėžtai 2 000 mg/kg < LD550 < 5 000 mg/kg (5 kategorija pagal GHS), šiais atvejais:
         
                     a)
                  
                  
                     jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kurią nors iš 2 priedo bandymo schemų, pagrįstų gaištamumo dažnumu;
                  
               
                     b)
                  
                  
                     Jei jau yra patikimų duomenų, rodančių, kad LD50 yra 5 kategorijos verčių intervale, arba kiti tyrimai su gyvūnais arba toksiškas poveikis žmonėms rodo ūmaus tipo poveikį žmonių sveikatai;
                  
               
                     c)
                  
                  
                     gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo būdu, jei priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagrįstas ir
                     
                                 —
                              
                              
                                 yra patikimos informacijos, rodančios didelį toksišką poveikį žmonėms, arba
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pastebimas tam tikras gaištamumas, kai bandymas atliekamas duodant per burną dozes, siekiančias 4 kategorijos vertes, arba
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 jei tęsiant bandymus iki 4 kategorijos verčių ekspertų sprendimu patvirtinami reikšmingi klinikiniai toksiškumo požymiai, išskyrus viduriavimą, pasišiaušusius plaukus arba nesveiko gyvūno išvaizdą, arba
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 jei ekspertų sprendimu patvirtinama patikima informacija, rodanti galimą reikšmingą ūmų poveikį darant kitus tyrimus su gyvūnais.
                              
                           
               BANDYMAS ESANT DIDESNĖMS NEGU 2 000 MG/KG DOZĖMS
         Išimtiniais atvejais, ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5 000 mg/kg dydžio dozę. Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyvūnų gerovę, bandymas skiriant 5 000 mg/kg neskatinamas ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiamą kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga (9).
         Orientacinis tyrimas
         Sprendimo priėmimo taisyklės, taikomos 1 priede pateiktai nuosekliai procedūrai, išplečiamos, kad būtų galima įtraukti 5 000 mg/kg dozę. Taigi kai skiriama orientacinio tyrimo pradinė 5 000 mg/kg dozė, gavus A rezultatą (žūtis) reikės daryti bandymą su antru gyvūnu, skiriant 2 000 mg/kg; gavus B ir C rezultatus (akivaizdus toksiškumas arba jokio toksiškumo) pradinė pagrindinio tyrimo dozė gali būti 5 000 mg/kg. Panašiai, jei skiriama kita nei 5 000 mg/kg pradinė dozė, bandymas bus tęsiamas iki 5 000 mg/kg, jei esant 2 000 mg/kg dozei gaunami B arba C rezultatai; gavus A rezultatą, esant 5 000 mg/kg, pagrindinio tyrimo pradinė dozė yra 2 000 mg/kg, o gavus B ir C rezultatus, pagrindinio tyrimo pradinė dozė yra 5 000 mg/kg.
         Pagrindinis tyrimas
         Sprendimo priėmimo taisyklės, taikomos 2 priede pateiktai nuosekliai procedūrai, išplečiamos, kad būtų galima įtraukti 5 000 mg/kg dozę. Taigi kai skiriama pagrindinio tyrimo pradinė 5 000 mg/kg dozė, gavus A rezultatą (≥ 2 žūtys) reikės daryti 2 grupės bandymą, skiriant 2 000 mg/kg; gavus B rezultatą (akivaizdus toksiškumas ir (arba) ≤1 žūtis) arba C (jokio toksiškumo), medžiaga nebus klasifikuojama pagal GHS. Panašiai, jei naudojama kita nei 5 000 mg/kg pradinė dozė, bandymas bus tęsiamas iki 5 000 mg/kg, jei esant 2 000 mg/kg dozei gaunamas C rezultatas; gavus A rezultatą esant 5 000 mg/kg, medžiaga priskiriama GHS 5 kategorijai, o gavus B arba C rezultatus, medžiaga pagal GHS neklasifikuojama.
      
      
         4 PRIEDAS
         BANDYMŲ METODAS B.1 bis.
         Klasifikavimo pagal ES schemą rekomendacijos, taikomos pareinamajam laikotarpiui iki visiškai visuotinai suderintos klasifikavimo sistemos (GHS) įgyvendinimo (paimta iš (8) nuorodos)
         
            
         
            
      
      B.1 TRIS.   ŪMUS ORALINIS TOKSIŠKUMAS. ŪMAUS TOKSIŠKUMO KLASĖS METODAS
      1.   METODAS
      Šis bandymų metodas atitinka OECD TG 423 (2001)
      1.1   ĮVADAS
      Šiame bandyme taikomas ūmaus toksiškumo klasės metodas (1) – tai nuosekli procedūra, pagal kurią vienai pakopai naudojami 3 vienos lyties gyvūnai. Atsižvelgiant į gaištamumą ir (arba) gyvūno gaišimo būseną, vidutiniškai gali prireikti 2-4 pakopų, kad būtų galima spręsti apie bandomosios medžiagos toksiškumą. Ši metodika yra atkuriama, ją taikant naudojama daug mažiau gyvūnų ir ji leidžia suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus. Ūmaus toksiškumo klasės metodas pagrįstas biometriniais įvertinimais (2) (3) (4) (5), naudojant fiksuotas dozes, kurios pakankamai skiriasi, kad medžiagą būtų galima klasifikuoti ir įvertinti jos pavojų. 1996 m. priimto metodo tinkamumas buvo plačiai patvirtintas nacionaliniu (6) ir tarptautiniu mastu (7) darant in vivo bandymus ir lyginant su literatūroje pateiktais LD50 duomenimis.
      Rekomendacijas dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Rekomendaciniame ūmaus oralinio toksiškumo bandymo dokumente (8). Be to, šiame Rekomendaciniame dokumente yra papildomos informacijos apie B.l tris bandymo metodo taikymą ir aiškinimą.
      Nereikia duoti dozių, kurios, kaip žinoma, sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ėsdinančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai nužudomi ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi darant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo nužudyti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro rekomendacinio dokumento objektas (9).
      Metode naudojamos iš anksto nustatyto dydžio dozės, o rezultatai leidžia medžiagą įvertinti ir klasifikuoti pagal visuotinai suderintą sistemą {Globally Harmonised System (GHS)), skirtą ūmų toksiškumą sukeliančioms cheminėms medžiagoms klasifikuoti (10).
      Iš esmės šis metodas nėra skirtas tikslioms LD50 vertėms apskaičiuoti, bet juo galima nustatyti apibrėžtus žūtį sukeliančių dozių intervalus, kadangi tokio bandymo tikslas ir yra nustatyti, ar dalis gyvūnų žūsta. Šiuo metodu galima nustatyti LD50 vertę tik tais atvejais, kai mažiausiai dviejų dozių sukeliamas gaištamumas yra didesnis kaip 0 % ir mažesnis kaip 100 %. Kai skiriamos iš anksto pasirinktos dozės neatsižvelgiant į bandomąją medžiagą, o klasifikavimas tiesiogiai siejamas su stebimų skirtingos būsenos gyvūnų skaičiumi, laboratorijoms didėja galimybė pasiekti suderinamų ir atkartojamų rezultatų.
      Prieš tyrimo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudarytų medžiagos identiškumas ir cheminė struktūra, jos fizikocheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksikologiniai duomenys ir numatomas (-i) medžiagos naudojimo būdas (-ai). Ši informacija yra būtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus dėl bandymo reikalingumo žmonių sveikatai apsaugoti, ir padėti pasirinkti tinkamą pradinę dozę.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Ūmus oralinis toksiškumas – taikomas tam neigiamam poveikiui, kuris atsiranda davus per burną vieną medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h.
      
         Uždelsta mirtis – kai gyvūnas nežūsta arba nepanašus į gaištantį per 48 h, bet žūsta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį.
      
         Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg).
      
         GHS – visuotinai suderinta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema {Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). OECD (žmonių sveikata ir aplinka), JT pavojingų prekių pervežimo ekspertų komiteto (fizikocheminės savybės) ir ILO (pavojų pranešimas) bendroji veikla, koordinuojama Tarporganizacinės cheminių medžiagų tinkamos vadybos programos {Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)).
      
         Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsenos arba žūties reikia laukti anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Šios graužikų būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9).).
      
         LD
         
            50
         
         (medianinė mirtina dozė) – tai statistiškai apskaičiuojama viena medžiagos dozė, nuo kurios yra tikimybė žūti 50 % gyvūnų, gavusių dozę per burną. LD50 vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (mg/kg).
      
         Ribinė dozė –dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2 000 arba 5 000 mg/kg).
      
         Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba kai neišgyvena net gydomas gyvūnas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9)).
      
         Numatoma žūtis – klinikinių požymių, rodančių žūtį tam tikru momentu ateityje prieš eksperimento pabaigą, pvz., nesugebėjimas pasiekti vandenį arba pašarą, buvimas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9)).
      1.   3 BANDYMO METODO ESMĖ
      Šio bandymo esmę sudaro nuosekli metodika, pagal kurią vienai pakopai naudojant mažiausią įmanomą gyvūnų skaičių gaunama pakankamai informacijos apie bandomosios medžiagos ūmų toksiškumą, kad būtų galimą ją klasifikuoti. Grupė bandymo gyvūnų per burną gauna viena iš nustatytų bandomosios medžiagos dozių. Medžiaga bandoma taikant nuoseklią metodiką, kiekvienai pakopai naudojami trys vienos lyties gyvūnai (paprastai patelės). Su junginiu siejamas dozę gavusių gyvūnų gaišimas arba negaišimas per vieną iš pakopų lemia kitą pakopą, t. y.:
      
                  —
               
               
                  toliau bandyti nereikia,
               
            
                  —
               
               
                  duoti tokią pat dozę dar trims gyvūnams,
               
            
                  —
               
               
                  trims papildomiems gyvūnams duoti kitą didesnę arba mažesnę dozę.
               
            Bandymo metodika išsamiai aprašyta 1 priede. Metodas leidžia spręsti, ar bandomąją medžiagą priskirti vienai iš toksiškumo klasių, apibrėžtų fiksuotomis LD50 intervalo ribinėmis vertėmis.
      1.4   METODO APRAŠYMAS
      1.4.1   Gyvūnų rūšies pasirinkimas
      Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės (9). Pasirinkimą lėmė tipinių LD50 bandymų informacinės apžvalgos, kurios parodė, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie pastebimi, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės (11). Tačiau jei giminingos struktūros cheminių junginių toksikologinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad patinai gali būti jautresni, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai daromi su patinais, turėtų būti pateikti atitinkami tai patvirtinantys duomenys.
      Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti dar be vados ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš skiriant dozę turėtų būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20 % tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę.
      1.4.2   Laikymo ir šėrimo sąlygos
      Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22 oC (± 3 oC). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio. Gyvūnai gali būti laikomi narveliuose pagal dozes, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti aiškiai matyti kiekvieną gyvūną.
      1.4.3   Gyvūnų ruošimas
      Gyvūnai atrenkami atsitiktinai, ženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir prieš dozių davimo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų.
      1.4.4   Dozių ruošimas
      Apskritai visų dydžių bandomosios medžiagos dozės duodamos kaip pastovaus tūrio dozės, keičiant ruošiamos dozės koncentraciją. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias skiriamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima duoti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai neturėtų būti didesnis negu 1 ml/100g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima naudoti 2 ml/100g kūno masės. Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama tirpalui (emulsijai, suspensijai) aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet naudojami tirpalai kituose nešikliuose. Jei nešiklis yra ne vanduo, turi būti žinomos jo toksikologinės charakteristikos. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat davimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu.
      1.5   DARBO EIGA
      1.5.1   Dozių davimas
      Bandomoji medžiaga duodama kaip viena dozė per skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma duoti vieną dozę, ji gali būti duodama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.
      Prieš duodant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės negauna pašaro, išskyrus vandenį, per naktį; pelės gauna vandens, bet negauna pašaro 3–4 h). Pasibaigus badavimo laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir duodama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3–4 h, pelės nešeriamos 1–2 h. Jei dozė duodama dalimis per tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę.
      1.5.2   Gyvūnų skaičius ir dozių dydis
      Kiekvienai pakopai imami trys gyvūnai. Dozė, kuri turi būti naudojama kaip pradinė dozė, pasirenkama iš keturių fiksuotų dydžių: 5, 50, 300 ir 2 000 mg/kg kūno masės. Kaip pradinė turėtų būti pasirinkta dozė, kuriai esant tikrai nugaištų kai kurie iš dozę gavusių gyvūnų. Schemose, pateiktose 1 priede, aprašyta procedūra, kurios reikėtų laikytis kiekvienai pradinei dozei. Be to, 4 priede pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, laukiant naujos GHS įgyvendinimo.
      Kai turimoje informacijoje nurodoma, kad gyvūnai neturėtų gaišti esant didžiausiai pradinei dozei (2 000 mg/kg kūno masės), reikėtų daryti ribinį bandymą. Neturint informacijos apie bandomąją medžiagą, bet rūpinantis gyvūnų gerove, pradine doze reikėtų pasirinkti 300 mg/kg kūno masės.
      Laiko tarpą tarp kiekvieno dydžio dozių davimo lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės davimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai.
      Išimtiniais atvejais ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotos 5 000 mg/kg dydžio dozę (žr. 2 priedą). Dėl su gyvūnų gerove susijusių priežasčių, neskatinama daryti bandymą taikant GHS 5 kategorijos intervalus (2 000–5 000 mg/kg) ir apie tokio bandymo reikalingumą turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos arba aplinkos apsauga.
      1.5.3   Ribinis bandymas
      Ribinis bandymas visų pirma daromas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t. y., toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima sužinoti remiantis informacija apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius ar produktus, atsižvelgiant į toksikologinį reikšmingumą turinčių komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos visai nėra arba kai pagal tą informaciją bandomoji medžiaga gali būti toksiška, turi būti daromas pagrindinis bandymas.
      Kai skiriama viena 2 000 mg/kg kūno masės dozė, ribiniam bandymui galima imti šešis gyvūnus (po tris vienai pakopai). Išimtiniais atvejais, kai skiriama viena 5 000 mg/kg dozė, ribiniam bandymui galima naudoti tris gyvūnus (žr. 2 priedą). Jei pastebimas su medžiaga siejamas gaišimas, gali tekti daryti bandymą esant gretimai mažesnei dozei.
      1.6   STEBĖJIMAI
      Gavę dozę gyvūnai atskirai mažiausiai vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, ypač per pirmąsias 4 h, ir toliau kasdien stebimi visas 14 parų, išskyrus kai gyvūnams reikia nutraukti tyrimą ir humaniškai nužudyti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksiškumo reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei jie vėluoja atsirasti (12). Visi stebėjimai yra sistemingai užrašomi atskirai apie kiekvieną gyvūną.
      Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus Rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9). Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai nužudyti. Kai gyvūnai nužudomi dėl humaniškų priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kiek įmanoma tiksliau.
      1.6.1   Kūno masė
      Atskira gyvūnų masė turi būti nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos davimą ir vėliau mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas masės pokytis. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai pasveriami ir humaniškai nužudomi.
      1.6.2   Patologija
      Visiems bandomiesiems gyvūnams (įskaitant nugaišusius darant bandymą arba pašalintus iš tyrimo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) daromas bendrasis skrodimas. Turėtų būti aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai. Gyvūnams, kurie išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų atlikti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos.
      2.   DUOMENYS
      Turėtų būti pateikiami atskirų gyvūnų duomenys. Be to, visi duomenys suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas naudotų gyvūnų skaičius, gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, skaičius, darant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių nužudytų gyvūnų skaičius, atskirų gyvūnų žūties laikas, toksiškumo poveikio aprašymas, tokio poveikio kitimas laike ir grįžtamumas, skrodimo duomenys.
      3.   ATASKAITOS RENGIMAS
      3.1   BANDYMŲ ATASKAITA
      
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei tinka:
      
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              fizikinė būsena, grynumas ir, jei tinka, fizikocheminės savybės (įskaitant izomerizavimą),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Nešiklis (jei tinka):
                  
                              —
                           
                           
                              nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              naudota rūšis ir veislė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei tinka, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparatą, įskaitant duodamos medžiagos fizikinį pavidalą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie bandomosios medžiagos davimą, įskaitant dozavimo tūrį ir davimo laiką,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą (šaltinį), vandens šaltinį),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno reakcijos duomenų ir dozės dydžio lentelės (t. y. gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, įskaitant gaištamumą, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kūno masės ir jos kitimo lentelės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              atskirų gyvūnų masė dozės davimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba nužudymo dieną,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį nužudymą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir vystymasis, jų galimas grįžtamumas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno skrodimo ir histopatologiniai duomenys, jei yra.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas ir aiškinimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Roll R., Hofer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, p. 86
               
            
                  2)
               
               
                  Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336–341.
               
            
                  3)
               
               
                  Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559–610
               
            
                  4)
               
               
                  Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 729–734.
               
            
                  5)
               
               
                  Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, p. 129–134
               
            
                  6)
               
               
                  Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, p. 455–470.
               
            
                  7)
               
               
                  Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 659–670.
               
            
                  8)
               
               
                  OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
               
            
                  9)
               
               
                  OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.
               
            
                  10)
               
               
                  OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF .html].
               
            
                  11)
               
               
                  Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, p. 223–231.
               
            
                  12)
               
               
                  Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
               
            
         1 PRIEDAS
         PROCEDŪRA, TAIKOMA NAUDOJANT KIEKVIENĄ PRADINĘ DOZĘ
         BENDROSIOS PASTABOS
         Į šį priedą įtrauktose atitinkamose bandymo schemose aprašoma kiekvienos pradinės dozės procedūra, kurios reikia laikytis.
         
                     —
                  
                  
                     1 a priedas: pradinė dozė 5 mg/kg kūno masės
                  
               
                     —
                  
                  
                     1 b priedas: pradinė dozė 50 mg/kg kūno masės
                  
               
                     —
                  
                  
                     1 c priedas: pradinė dozė 300 mg/kg kūno masės
                  
               
                     —
                  
                  
                     1 d priedas: pradinė dozė 2 000 mg/kg kūno masės
                  
               Atsižvelgiant į humaniškai nužudytų arba žuvusių gyvūnų skaičių, bandymo eiga žymima rodyklėmis.
         
            1 A PRIEDAS
            PROCEDŪRA ESANT 5 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI
            
               
         
         
            1 B PRIEDAS
            PROCEDŪRA ESANT 50 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI
            
               
         
         
            1 C PRIEDAS
            PROCEDŪRA ESANT 300 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI
            
               
         
         
            1 D PRIEDAS
            PROCEDŪRA ESANT 2 000 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI
            
               
         
      
      
         2 PRIEDAS
         BANDOMŲJŲ MEDŽIAGŲ, KURIŲ TIKĖTINOS LD50 VERTĖS YRA DIDESNĖS NEGU 2 000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI NEDARANT BANDYMO
         Pavojaus 5 kategorijos kriterijai yra apibrėžti, kad būtų galima identifikuoti bandomąsias medžiagas, kurių ūmaus toksiškumo pavojus yra palyginti mažas, tačiau kurios esant tam tikroms aplinkybėms gali būti pavojingos pažeidžiamoms populiacijoms. Tikėtina, kad šių medžiagų LD50 per burną arba odą yra 2 000–5 000 mg/kg arba ekvivalentinė dozė, kai medžiagos patenka kitais būdais. Bandomosios medžiagos galėtų būti priskirtos pavojaus kategorijai, apibrėžtai 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (5 kategorija pagal GHS), šiais atvejais:
         
                     a)
                  
                  
                     jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kurią nors iš 2 priedo bandymo schemų, pagrįstų gaištamumo dažnumu;
                  
               
                     b)
                  
                  
                     jei jau yra patikimų duomenų, rodančių, kad LD50 yra 5 kategorijos verčių intervale, arba kiti tyrimai su gyvūnais arba toksiškas poveikis žmonėms rodo ūmaus tipo poveikį žmonių sveikatai;
                  
               
                     c)
                  
                  
                     gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo būdu, jei priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagrįstas ir
                     
                                 —
                              
                              
                                 yra patikimos informacijos, rodančios didelį toksišką poveikį žmonėms, arba
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pastebimas tam tikras gaištamumas, kai bandymas atliekamas duodant per burną dozes, siekiančias 4 kategorijos vertes, arba
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 jei tęsiant bandymus iki 4 kategorijos verčių ekspertų sprendimu patvirtinami reikšmingi klinikiniai toksiškumo požymiai, išskyrus viduriavimą, pasišiaušusius plaukus arba nesveiko gyvūno išvaizdą, arba
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 jei ekspertų sprendimu patvirtinama patikima informacija, rodanti galimą reikšmingą ūmų poveikį darant kitus tyrimus su gyvūnais.
                              
                           
               BANDYMAS ESANT DIDESNĖMS KAIP 2 000 MG/KG DOZĖMS
         Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyvūnų gerovę, bandymas su gyvūnais skiriant 5 kategorijos intervalo dozes (5 000 mg/kg) neskatinamas ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga (10). Neturi būti daromas joks bandymas esant didesnėms dozėms.
         Kai reikia bandyti naudojant 5 000 mg/kg dozę, reikalinga tik viena pakopa (t. y. trys gyvūnai). Jei žūsta pirmas dozę gavęs gyvūnas, dozavimas tęsiamas skiriant 2 000 mg/kg dozę pagal 1 priede pateiktas schemas. Jei pirmas gyvūnas lieka gyvas, dozę gauna kiti du gyvūnai. Jei žūsta tik vienas iš trijų gyvūnų, daroma prielaidą kad LD50 vertė yra didesnė negu 5 000 mg/kg. Jei žūsta abu gyvūnai, dozavimas tęsiamas skiriant 2 000 mg/kg dozę.
      
      
         3 PRIEDAS
         BANDYMŲ METODAS B.1 tris. Klasifikavimo pagal ES schemą rekomendacijos, taikomos pereinamajam laikotarpiui iki visiško visuotinai suderintos klasifikavimo sistemos (GHS) įgyvendinimo (paimta iš 8 nuorodos)
         
            
         
            
         
            
         
            
      
      B.2.   ŪMINIS TOKSIŠKUMAS (INHALIACINIS)
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Naudinga turėti išankstinę informaciją apie medžiagos dalelių dydžio pasiskirstymą, garų slėgį, lydymosi temperatūrą, virimo temperatūrą, pliūpsnio temperatūrą ir sprogumą (jeigu tinka).
      Taip pat žr. bendrąją įvadinę B(A) dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. bendrąją įvadinę B(B) dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   BANDYMO METODO ESMĖ
      Kelios eksperimentinių gyvūnų grupės yra veikiamos tiriamąja medžiaga apibrėžtą laikotarpį tam tikra tvarka suskirstytomis koncentracijomis, viena koncentracija naudojama vienai grupei. Po to atliekami poveikio ir žūties atvejų stebėjimai. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, atliekama autopsija, o užbaigus bandymą – likusiems gyviems gyvūnams atliekama autopsija.
      Gyvūnus, kurie turi aiškių ir ilgalaikių kančios ir skausmo požymių, reikia humaniškai nužudyti. Jeigu žinoma, kad dėl medžiagų, naudojamų dozavimo bandymuose, gali kilti skausmas ir kančia dėl jų ardančių (ėsdinančių) arba dirginančių savybių, tokie bandymai neturėtų būti atliekami.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   BANDYMO METODO APIBŪDINIMAS
      1.6.1.   Pasirengimas
      Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis laikymo ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento. Prieš bandymą sveiki jauni gyvūnai yra randomizuojami ir suskirstomi į reikalingą grupių skaičių. Jie neturi patirti dirbtinai sukurto poveikio, išskyrus atvejus, jei tai daryti rekomenduojama dėl tam tikro poveikio aparato tipo.
      Kietąsias tiriamas medžiagas gali tekti mikronizuoti, kad būtų gaunamos atitinkamo dydžio dalelės.
      Prireikus į tiriamąją medžiagą gali būti dedama atitinkamo tirpiklio, kad būtų gaunama atitinkama tiriamos medžiagos koncentracija atmosferoje, po to turėtų būti naudojama kontrolinė tirpiklių grupė. Jeigu tirpiklis ar kiti priedai yra naudojami dozavimui palengvinti, turėtų būti žinoma, kad jie nesukels toksiško poveikio. Atitinkamais atvejais gali būti naudojamasi ankstesniais duomenimis.
      1.6.2.   Bandymo sąlygos
      1.6.2.1.   Eksperimentiniai gyvūnai
      Jeigu nėra kontraindikacijų, pirmenybė atiduodama žiurkėm s. Turėtų būti panaudojamos plačiai naudojamos laboratorinės veislės. Kiekvienai lyčiai bandymo pradžioje naudojamų gyvūnų svorio įvairavimas neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio.
      1.6.2.2.   Skaičius ir lytis
      Ne mažiau kaip dešimt graužikų (penki patinėliai ir penkios patelės) yra naudojami kiekvienai koncentracijai. Patelės turėtų būti neturėjusios jauniklių ir nevaikingos.
      
         Pastaba: Atliekant ūminio toksiškumo bandymus su aukštesniaisiais negu graužikai gyvūnais turi būti apsvarstoma galimybė naudoti mažesnį gyvūnų skaičių. Dozės turėtų būti atidžiai parenkamos ir turėtų būti dedamos visos pastangos neviršyti vidutiniškai toksiškų dozių. Tokiuose bandymuose turėtų būti vengiama įvesti mirtinas tiriamosios medžiagos dozes.
      1.6.2.3.   Poveikio koncentracijos
      Koncentracijų skaičius turėtų būti pakankamas, ne mažiau trijų, ir taip paskirstytų, kad susidarytų bandymo grupės, turinčios tam tikrą toksiško poveikio intervalą ir mirštamumo procentą. Duomenų turi būti tiek, kad pakaktų sudaryti mirtinų koncentracijų kreivę ir atitinkamais atvejais būtų galima tinkamai nustatyti LC50.
      1.6.2.4.   Ribinis bandymas
      Jeigu penkis bandomus patinėlius ir penkias bandomas pateles paveikus 5 mg skystos arba kietos medžiagos viename litre dujų arba aerozolio (arba, jeigu tai neįmanoma dėl tiriamos medžiagos fizikinių arba cheminių, taip pat ir sprogumo savybių – maksimalia pasiekiama koncentracija) keturias valandas, per 14 dienų nebūna su tuo cheminiu junginiu susijusių nugaišimo atvejų, laikoma, kad tolesnis bandymas yra nereikalingas. (18th ATP, dir. 93/21/EEC, L1 10/93)
      1.6.2.5.   Poveikio trukmė
      Poveikio trukmė turėtų būti lygi keturioms valandoms.
      1.6.2.6.   Įrenginiai
      Gyvūnai turėtų būti bandomi inhaliaciniais įrenginiais, skirtais išlaikyti dinaminį oro srautą ne mažiau kaip 12 oro pasikeitimų per valandą, kad būtų užtikrintas pakankamas deguonies kiekis ir vienodai pasiskirstytų poveikio atmosfera. Jeigu naudojama kamera, ji turėtų būti tokios konstrukcijos, kad kaip galima būtų sumažinamas gyvūnų susigrūdimas ir kad jie įkvėptų kaip galima daugiau tiriamosios medžiagos. Paprastai, norint užtikrinti kameros atmosferos pastovumą, visas bandomų gyvūnų „tūris“ neturėtų viršyti 5 % bandymo kameros tūrio. Atskiroje kameroje gali būti paveikiama burna ir nosis, tik galva arba visas kūnas; du pirmieji būdai padeda sumažinti tiriamos medžiagos patekimą kitais keliais.
      1.6.2.7.   Stebėjimo laikotarpis
      Stebėjimo laikotarpis turėtų būti ne trumpesnis kaip 14 dienų. Tačiau stebėjimo trukmė neturėtų būti griežtai nustatoma. Ji turėtų būti nustatoma pagal toksines reakcijas, jų pasireiškimo dažnumą ir sveikimo laikotarpio trukmę; todėl, jeigu laikoma reikalinga, jis gali būti pailginamas. Labai svarbus yra laikas, kada toksiškumo požymiai atsiranda ir išnyksta, bei nugaišimo laikas, ypač jeigu yra tendencija, kad žūtis pasireiškia vėliau.
      1.6.3.   Darbo eiga
      Prieš pat poveikį gyvūnai yra sveriami ir po to paveikiami tiriama koncentracija tam skirtame aparate keturias valandas po to, kai kameroje nustatoma koncentracijos pusiausvyra. Pusiausvyros nustatymo trukmė turi būti trumpa. Temperatūra, kurioje vykdomas bandymas, turėtų būti išlaikoma 22 ± 3 oC. Tinkamiausias santykinis drėgnumas yra tarp 30 % ir 70 %, bet tam tikrais atvejais (pvz., atliekant tam tikrus aerozolių bandymus), tai gali būti neįgyvendinama. Išlaikant nedidelį neigiamą slėgį kameros viduje (≥ 5 mm vandens) užkertamas kelias tiriamajai medžiagai patekti į aplinką. Poveikio metu turėtų būti duodama pašaro ir vandens. Turėtų būti naudojamos atitinkamos bandymo atmosferos generavimo ir stebėsenos sistemos. Tokia sistema turėtų užtikrinti, kad kaip galima greičiau bus pasiektos pastovios poveikio sąlygos. Kamera turėtų būti tokios konstrukcijos ir taip veikti, kad kameros viduje būtų palaikomas vienodas bandymo atmosferos pasiskirstymas.
      Turėtų būti atliekami šie matavimai arba stebėsena:
      
                  a)
               
               
                  oro srauto greičio (visą laiką),
               
            
                  b)
               
               
                  tikrosios tiriamos medžiagos koncentracijos, matuojamos kvėpavimo zonoje ne mažiau kaip tris kartus poveikio metu (esant tam tikrai atmosferai, pvz., naudojant didelės koncentracijos aerozolius, gali tekti vykdyti dažnesnį monitoringą). Poveikio metu koncentracija neturėtų keistis daugiau negu ± 15 % vidutinės vertės. Tačiau naudojant tam tikrus aerozolius, šio kontrolės lygio gali būti neįmanoma pasiekti, tokiu atveju būtų priimtinas platesnis intervalas. Aerozolių dalelių dydžio analizė turėtų būti atliekama reikiamu dažnumu (ne rečiau kaip vieną kartą vienai bandomajai grupei),
               
            
                  c)
               
               
                  temperatūros ir drėgnumo, j eigų įmanoma, visą laiką.
               
            Poveikio metu ir po jo atliekami stebėjimai, kurie sistemingai užrašomi; apie kiekvieną gyvūną turėtų būti daromi atskiri įrašai. Pirmą dieną stebėjimai turėtų būti atliekami dažnai. Kruopštus klinikinis ištyrimas turėtų būti atliekamas ne rečiau kaip vieną kartą kiekvieną darbo dieną, kiti stebėjimai turėtų būti vykdomi kiekvieną dieną, imantis atitinkamų veiksmų iki minimumo sumažinti bandymo metu prarandamų gyvūnų skaičių, pvz., rastų negyvų gyvūnų autopsija arba užšaldymas ir nusilpusių arba gaištančių gyvūnų izoliavimas arba nužudymas.
      Stebimi odos ir kailio, akių, gleivinės pasikeitimai, taip pat respiratorinės, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos ir elgsenos pasikeitimai. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tremorų, konvulsijų, salivacijos, diarėjos, letargo, miego ir komos stebėjimams. Nugaišimo laikas turėtų būti užrašomas kaip galima tiksliau. Kiekvieno gyvūno svoris turėtų būti nustatomas kiekvieną savaitę po poveikio ir šiam nugaišus.
      Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, ir tiems, kurie išlieka gyvi bandymą sustabdžius, atliekama autopsija, ypač atkreipiant dėmesį į visus viršutinių ir apatinių kvėpavimo takų pokyčius. Turėtų būti užregistruojami visi dideli patologiniai pokyčiai. Jeigu reikalaujama, turėtų būti paimami audiniai histopatologiniam tyrimui.
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti apibendrinami lentelėse, nurodant kiekvienos bandomos grupės gyvūnų skaičių bandymo pradžioje, kiekvieno gyvūno nugaišimo laiką, gyvūnų, turinčių kitokius toksiškumo požymius, skaičių, pateikiant toksiškų poveikių ir autopsijos duomenų aprašymą. Turėtų būti apskaičiuojami ir registruojami svorio pasikeitimai, jeigu išgyvenama ilgiau negu vieną dieną. Gyvūnai, kurie humaniškai nužudomi dėl cheminio junginio sukeliamų kančių ir skausmo, yra užregistruojami kaip nugaišimo atvejai, kurių priežastis – cheminis junginys. LD50 gali būti nustatomas pripažintu metodu. Į duomenų vertinimą turėtų įeiti sąryšis, jeigu toks yra, tarp gyvūnų poveikio tiriamąja medžiaga ir visų specifinių rodiklių dažnumo ir stiprumo, taip pat ir elgsenos ir klinikinių parodymų, didesnių audinių pakitimų, kūno svorio pasikeitimų, mirštamumo ir kitų toksikologinių poveikių.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      3.1.   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  rūšis, veislė, gyvūnų tiekėjas, aplinkos sąlygos, pašarai ir pan.;
               
            
                  —
               
               
                  bandymo sąlygos: poveikio aparato apibūdinimas, taip pat aparato konstrukcija, tipas, dydžiai, oro šaltinis, aerozolių generavimo sistema, oro kondicionavimo metodas ir gyvūnų laikymo bandymo kameroje, jeigu tokia naudojama, būdas. Turėtų būti apibūdinama temperatūros, drėgnumo matavimo įranga, aerozolio koncentracijos ir dalelių dydžio pasiskirstymas.
               
            Duomenys apie poveikį
      Jie turėtų būti pateikiami lentelėse vidutinėmis vertėmis ir kintamumo vienetais (pvz., standartinis nuokrypis) ir, jeigu įmanoma, į juos turėtų būti įtraukti:
      
                  a)
               
               
                  oro srauto, tekančio inhaliacijos įrenginiu, greitis;
               
            
                  b)
               
               
                  oro temperatūra ir drėgnumas;
               
            
                  c)
               
               
                  nominalios koncentracijos (visas tiriamos medžiagos kiekis, įdėtas į inhaliacijos įrenginį, padalytas iš oro tūrio);
               
            
                  d)
               
               
                  tirpiklio, jeigu naudotas, rūšis;
               
            
                  e)
               
               
                  faktinės koncentracij os kvėpavimo bandymo zonoj e;
               
            
                  f)
               
               
                  masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAD) ir geometrinis standartinis nuokrypis (GSD);
               
            
                  g)
               
               
                  pusiausvyros nustatymo periodas;
               
            
                  h)
               
               
                  poveikio periodas;
                  
                              —
                           
                           
                              duomenų apie reakciją pagal lytį ir poveikį surašymas į lenteles (pvz., gyvūnų, kurie nugaišo arba buvo nužudyti bandymo metu, skaičius; toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius; paveiktų gyvūnų skaičius),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nugaišimo laikas poveikio metu arba po jo, priežastys ir kriterijai, kuriais naudotasi humaniškai nužudant gyvūnus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visi pastebėjimai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              LC50 vertė kiekvienai lyčiai, nustatyta stebėjimo laikotarpio pabaigoje (nurodant apskaičiavimo metodą),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              LC50 95 % pasikliautinasis intervalas (tais atvejais, kai gali būti pateikta),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dozės ir mirštamumo kreivė ir statumas (jeigu įmanoma pagal nustatymo metodą),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              autopsijos duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visi histopatologiniai duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultatų aptarimas (ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tam, kokį poveikį humaniškas gyvūnų nužudymas bandymo metu galėtų turėti apskaičiuojamai LC50 vertei),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultatų aiškinimas.
                           
                        
            3.2.   REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. bendrąją įvadinę B(D) dalį.
      4.   LITERATŪRA
      Žr. bendrąją įvadinę B(E) dalį.
      B.3.   ŪMINIS TOKSIŠKUMAS (PER ODĄ)
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. bendrąją įvadinę B(A) dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. bendrąją įvadinę B(B) dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   BANDYMO METODO ESMĖ
      Tiriamoji medžiaga dedama ant odos suskirstytomis dozėmis kelioms eksperimentinių gyvūnų grupėms, viena dozė – vienai grupei. Po to atliekami poveikio ir nugaišimo atvejų stebėjimai. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, atliekama autopsija, ir, užbaigus bandymą, autopsija daroma išlikusiems gyviems gyvūnams.
      Gyvūnus, kurie turi aiškių ir ilgalaikių kančios ir skausmo požymių, reikia humaniškai nužudyti. Jeigu žinoma, kad dėl medžiagų, naudojamų dozavimo bandymuose, gali kilti skausmas ir kančia dėl jų ardančių (ėsdinančių) arba dirginančių savybių, tokie bandymai neturėtų būti atliekami.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   BANDYMO METODO APIBŪDINIMAS
      1.6.1.   Pasirengimas
      Gyvūnai laikomi eksperimentiniuose narveliuose eksperimentinėmis laikymo ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento pradžios. Prieš bandymą sveiki jauni suaugę gyvūnai randomizuojami ir paskiriami į apdorojimo grupes. Apytikriai 24 valandas iki bandymo nuo gyvūno kūno sprando srityje pašalinamas kailis, jį nukerpant arba nuskutant. Jeigu kailis kerpamas arba skutamas, reikia stengtis nenubrūžinti odos, tai gali pakeisti pralaidumą. Tiriamajai medžiagai uždėti turėtų būti nukirpta ar nuskusta ne mažiau kaip 10 % kūno paviršiaus. Jeigu bandomos kietosios medžiagos, kurios atitinkamais atvejais gali būti pulverizuojamos, tiriamoji medžiaga turėtų būti pakankamai sudrėkinama vandeniu arba, jeigu reikia, atitinkamu tirpikliu, kad būtų užtikrinamas geras sąlytis su oda. Jeigu naudojamas tirpiklis, turėtų būti atsižvelgiama į tirpiklio poveikį tiriamosios medžiagos įsiskverbimui į odą. Skystos tiriamosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos.
      1.6.2.   Bandymo sąlygos
      1.6.2.1.   Eksperimentiniai gyvūnai
      Gali būti naudojamos suaugusios žiurkės arba triušiai. Gali būti naudojamos kitos rūšys, bet jų naudojimas turėtų būti pagrindžiamas. Turėtų būti panaudojamos plačiai naudojamos veislės. Kiekvienai lyčiai bandymo pradžioje naudojamų gyvūnų svorio įvairavimo intervalas neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio.
      1.6.2.2.   Skaičius ir lytis
      Kiekvienai dozei naudojama ne mažiau 5 gyvūnų. Jie visi turėtų būti vienos lyties. Jeigu naudojamos patelės, jos turėtų būti neturėjusios jauniklių ir būti nevaikingos. Jeigu galima gauti informacijos, parodančios, kad kuri nors lytis yra daug jautresnė, dozė taikoma tai lyčiai.
      
         Pastaba. Atliekant ūminio toksiškumo bandymus su aukštesniaisiais negu graužikai gyvūnais reikėtų išnagrinėti galimybę naudoti mažesnį gyvūnų skaičių. Dozės turėtų būti kruopščiai parenkamos, ir stengiamasi neviršyti vidutinio toksiškumo dozių. Tokių bandymų metu turėtų būti vengiama įvesti mirtinas tiriamosios medžiagos dozes.
      1.6.2.3.   Dozės
      Jų turėtų būti pakankamas skaičius, ne mažiau kaip trys, ir atitinkamai paskirstytų, kad susidarytų tiriamosios grupės, turinčios atitinkamą toksiško poveikio intervalą ir mirštamumo procentą. Duomenų turėtų būti tiek, kad būtų galima sudaryti dozės ir reakcijos kreivę ir, jeigu įmanoma, būtų galima nustatyti LD50.
      1.6.2.4.   Ribinis bandymas
      Jeigu naudojami graužikai, ribinis bandymas suleidžiant vieną dozę, ne mažesnę kaip 2 000 mg/kg kūno svorio, gali būti atliekamas su penkių patinėlių ir penkių patelių grupe, naudojant aukščiau apibūdintą darbo eigą. Jeigu cheminis junginys tampa nugaišimo priežastimi, reikėtų apsvarstyti, ar nereikėtų atlikti išsamų tyrimą.
      1.6.2.5.   Stebėjimo laikotarpis
      Stebėjimo laikotarpis turėtų būti ne trumpesnis kaip 14 dienų. Tačiau stebėjimų trukmė neturėtų būti griežtai nustatoma. Ji turėtų būti nustatoma pagal toksines reakcijas, jų pasireiškimo dažnumą ir sveikimo laikotarpio trukmę; todėl jis gali būti pailginamas, jeigu laikoma, kad to reikia. Svarbus yra laikas, per kurį toksiškumo požymių atsiranda ir išnyksta, taip pat nugaišimo laikas, ypač jeigu yra tendencija, kad žūtis pasireiškia vėliau.
      1.6.3.   Darbo eiga
      Gyvūnai turėtų būti laikomi atskiruose narveliuose. Tiriamoji medžiaga turėtų būti tolygiai uždedama ant plotelio, kurio dydis sudaro apie 10 % viso kūno paviršiaus. Jeigu medžiagos labai toksiškos, paveikiamas paviršius gali būti mažesnis, bet kaip galima didesnis plotas turėtų būti padengiamas kiek įmanoma plonesnių ir lygesniu sluoksniu.
      Tiriamoji medžiaga turėtų liestis su oda akytu marlės tvarsčiu ir nedirginančia lipnia juostele per visą 24 valandų poveikio laiką. Tiriamoji vieta ir toliau turėtų būti atitinkamai padengta, kad būtų išsaugotas marlės tvarstis ir tiriamoji medžiaga bei užtikrinama, kad gyvūnai nepraris tiriamosios medžiagos. Gali būti naudojami ribotuvai, kad tiriamoji medžiaga nebūtų praryjama, bet visiško imobilizavimo metodas nerekomenduojamas.
      Poveikio laikotarpio pabaigoje tiriamosios medžiagos likutis turėtų būti nuimamas, paprastai naudojant vandenį ar kokį kitą atitinkamą odos valymo būdą.
      Poveikio metu atliekami stebėjimai, kurie sistemingai užrašomi. Apie kiekvieną gyvūną turėtų būti daromi atskiri įrašai. Pirmą dieną stebėjimai turėtų būti atliekami dažnai. Kruopštus klinikinis ištyrimas turėtų būti atliekamas ne rečiau kaip vieną kartą kiekvieną darbo dieną, kiti stebėjimai turėtų būti vykdomi kiekvieną dieną, imantis atitinkamų veiksmų iki minimumo sumažinti bandymo metu prarandamų gyvūnų skaičių, pvz., rastų negyvų gyvūnų autopsija arba užšaldymas ir nusilpusių arba gaištančių gyvūnų izoliavimas arba nužudymas.
      Turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimai, taip pat respiratorinės, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos ir elgsenos pasikeitimai. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tremorų, konvulsijų, salivacijos, diarėjos, letargo, miego ir komos stebėjimams. Nugaišimo laikas turėtų būti užrašomas kaip galima tiksliau. Gyvūnams, kurie nugaišo bandymo metu ir kurie išliko gyvi dėl bandymo nutraukimo, yra atliekama autopsija. Visi dideli patologiniai pokyčiai turėtų būti registruojami. Jeigu nurodyta, turėtų būti paimami audiniai histopatologiniam ištyrimui.
      Priešingos lyties toksiškumo įvertinimas
      Užbaigus bandymą su viena lytimi, dozė skiriama ne mažiau kaip vienai grupei, susidedančiai iš 5 priešingos lyties gyvūnų, kad būtų nustatyta, ar šios lyties gyvūnai nėra labiau jautresni tiriamai medžiagai. Esant kitokioms sąlygoms, mažesnio gyvūnų skaičiaus naudojimas turėtų būti pagrindžiamas. Jeigu galima gauti pakankamai informacijos, įrodančios, kad tiriamos lyties gyvūnai yra daug jautresni, galima apsieiti be priešingos lyties gyvūnų bandymo.
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti apibendrinami lentelėse, kiekvienai grupei nurodant gyvūnų skaičių bandymo pradžioje, kiekvieno gyvūno nugaišimo laiką, gyvūnų, turinčių kitokius toksiškumo požymius, skaičių, pateikiant toksiškų poveikių ir autopsijos duomenų aprašymą. Turėtų būti nustatomas kiekvieno gyvūno svoris ir užrašomas prieš pat įvedant tiriamąją medžiagą, po to kartą per savaitę ir nugaišimo metu; turėtų būti apskaičiuojami svorio pasikeitimai ir užrašomi, jeigu išgyvenama ilgiau negu vieną dieną. Gyvūnai, kurie humaniškai nužudomi dėl cheminio junginio sukeliamų kančių ir skausmo, yra užregistruojami kaip žūties atvejai, kurių priežastis – cheminis junginys. LD50 gali būti nustatomas pripažintu metodu.
      Į duomenų vertinimą turėtų įeiti sąryšis, jeigu toks yra, tarp gyvūnų, paveiktų tiriamąja medžiaga, ir visų specifinių rodiklių dažnumo ir stiprumo, taip pat ir elgsenos ir klinikinių parodymų, didesnių audinių pakitimų, kūno svorio pasikeitimų, mirštamumo ir kitų toksikologinių poveikių.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      3.1.   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, turėtų būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  rūšis, veislė, gyvūnų tiekėjas, aplinkos sąlygos, pašaras ir pan.,
               
            
                  —
               
               
                  bandymo sąlygos (taip pat odos nuvalymo metodas ir tvarstymo būdas: uždaras arba neuždaras),
               
            
                  —
               
               
                  dozės (nurodant tirpiklį, jeigu naudojamas, ir koncentracijas),
               
            
                  —
               
               
                  gyvūnų, kuriems įvestos dozės, lytis,
               
            
                  —
               
               
                  duomenų lentelės pagal lytį ir dozes (t. y. gyvūnų, kurie nugaišo arba buvo nužudyti bandymo metu, skaičius, toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius, paveiktų gyvūnų skaičius),
               
            
                  —
               
               
                  nugaišimo laikas įvedus dozę, priežastys ir kriterijai, kuriais naudotasi humaniškai nužudant gyvūnus,
               
            
                  —
               
               
                  visi pastebėjimai,
               
            
                  —
               
               
                  išsamiame bandyme dalyvavusių lyčių LD50 vertės, kurios nustatytos per 14 dienų (nurodant apibrėžtą nustatymo metodą),
               
            
                  —
               
               
                  LD50 95 % pasikliautinasis intervalas (tais atvejais, kai gali būti pateikta),
               
            
                  —
               
               
                  dozės ir mirštamumo kreivė ir statumas, jeigu įmanoma nustatyti pagal nustatymo metodą,
               
            
                  —
               
               
                  autopsijos duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  visi histopatologiniai duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  bet kurio bandymo su priešinga lytimi rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas (ypatingas dėmesys turėtų būti atkreipiamas į tai, kokį poveikį apskaičiuojamai LD50 vertei gali turėti humaniškas gyvūnų nužudymas bandymo metu),
               
            
                  —
               
               
                  duomenų aiškinimas.
               
            3.2.   DUOMENŲ APSKAIČIAVIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. bendrąją įvadinę B(D) dalį.
      4.   LITERATŪRA
      Žr. bendrąją įvadinę B(E) dalį.
      B.4.   ŪMUS TOKSIŠKUMAS. ODOS DIRGINIMAS AR ĖSDINIMAS
      1.   METODAS
      Šis metodas atitinka OECD TG 404 (2002).
      1.1   ĮVADAS
      Rengiant šį atnaujintą metodą ypatingas dėmesys buvo kreipiamas į galimą gyvūnų gerovės pagerinimą ir į visos turimos informacijos apie bandomąją medžiagą įvertinimą, siekiant išvengti nebūtinų bandymų su laboratoriniais gyvūnais. Šiame metode rekomenduojama prieš darant aprašytą medžiagos ėsdinimo ar dirginimo in vivo bandymą daryti turimų atitinkamų duomenų įrodomosios vertės analizę. Jei duomenų nepakanka, jų galima gauti darant nuoseklųjį bandymą (1). Į bandymo strategiją, pateikiamą kaip šio metodo priedas, įtraukti įteisinti ir priimti in vitro bandymai. Be to, jei tinka, darant pradinį in vivo bandymą vietoj vienalaikio rekomenduojamas nuoseklusis trijų bandomųjų tamponų uždėjimo gyvūnui bandymas.
      Siekiant užtikrinti ir duomenų mokslinį patikimumą, ir gyvūnų gerovę, in vivo bandymai nedaromi tol, kol darant duomenų įrodomosios vertės analizę nebus įvertinti visi turimi duomenys, apibūdinantys galimą medžiagos ėsdinamąjį ar dirginamąjį poveikį odai. Tokius duomenis sudarys turimų tyrimų su žmonėmis ir (arba) laboratoriniais gyvūnais rezultatai, ėsdinimo ar dirginimo duomenys, gauti apie vieną arba kelias medžiagas, turinčias giminingą struktūrą, arba apie jų mišinius, duomenys, patvirtinantys medžiagos stiprias rūgštines arba šarmines savybes (2) (3), be to, įteisintų ir priimtų in vitro arba ex vivo bandymų rezultatai (4) (5) (5a). Ši analizė turėtų sumažinti poreikį in vivo bandyti tas medžiagas, apie kurių odos ėsdinamąjį ar dirginamąjį poveikį jau turima pakankamai kitų tyrimų metu gautų duomenų.
      Pirmenybė teikiama į šio metodo priedą įtrauktai nuosekliųjų bandymų strategijai, kurią sudaro įteisinti ir priimti in vitro arba ex vivo odos ėsdinimo ar dirginimo bandymai. Strategiją parengė ir vienbalsiai rekomendavo OECD seminaro dalyviai (6), ji buvo priimta ir rekomenduota kaip visuotinai suderintos cheminių medžiagų klasifikavimo sistemos (GHS) bandymų strategija (7). Rekomenduojama laikytis šios bandymų strategijos prieš pradedant in vivo bandymus. Naujoms medžiagoms rekomenduojamas nuoseklusis bandymo būdas moksliškai pagrįstiems duomenims apie medžiagos ėsdinimo ar dirginimo savybes gauti. Turimoms medžiagoms, apie kurių odos ėsdinimo ar dirginimo savybes duomenų nepakanka, ši strategija turėtų būti taikoma, jei trūksta duomenų. Kitokios bandymo strategijos arba metodikos taikymas arba sprendimas netaikyti nuoseklaus bandymų metodo turi būti pagrįstas.
      Jei ėsdinimo arba dirginimo savybių negalima nustatyti, darant duomenų įrodomosios vertės analizę, atitinkančią nuoseklaus bandymo strategiją, reikėtų spręsti klausimą apie in vivo bandymą (žr. priedą).
      1.2   SĄVOKOS
      
         Odos dirginimas: išnykstantis odos pažeidimas, bandomąja medžiaga veikiant ne ilgiau kaip 4 h.
      
         Odos ėsdinimas – neišnykstantis odos pažeidimas; būtent, matomoji nekrozė per epidermį ir odos nekrozė po bandomosios medžiagos uždėjimo ne ilgiau kaip keturioms valandoms. Ėsdinimo požymiai yra opos, kraujavimas, kruvini šašai ir, baigiantis 14 parų stebėjimo laikotarpiui, odos blukimas dėl jos šutimo, visiškai nuplikusios vietos ir randai. Neaiškiems pažeidimams nustatyti galima būtų daryti histopatologinį tyrimą.
      1.3   BANDYMO METODO ESMĖ
      Ant bandomo gyvūno odos dedama viena bandomosios medžiagos dozė; nepaveiktos gyvūno odos vietos naudojamos kontrolei. Nustatytais laiko tarpais nustatomas ir balais įvertinamas dirginimo ar ėsdinimo laipsnis, kuris papildomai aprašomas, siekiant išsamiai įvertinti poveikį. Tyrimo trukmės turi pakakti stebimo poveikio grįžtamumui arba negrįžtamumui įvertinti.
      Gyvūnai, kuriems kurioje nors bandymo stadijoje pasireiškia nuolatiniai sunkių kančių ir (arba) skausmo požymiai, turi būti humaniškai nužudomi, o medžiaga atitinkamai įvertinama. Kriterijai, pagal kuriuos priimamas sprendimas dėl humaniško gaištančių ir labai kenčiančių gyvūnų nužudymo, aprašyti (8) nuorodoje.
      1.4   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.4.1   Pasiruošimas in vivo bandymui
      1.4.1.1   Gyvūnų rūšies pasirinkimas
      Tinkamiausias laboratorinis gyvūnas – baltasis triušis; naudojami sveiki, jauni ir suaugę triušiai. Kitų rūšių naudojimas turi būti pagrįstas.
      1.4.1.2   Gyvūnų ruošimas
      Maždaug 24 h prieš bandymą nuo gyvūno reikia pašalinti kailį, jį trumpai nukerpant nugaros srityje. Reikia stengtis nenutrinti odos ir naudoti tik tuos gyvūnus, kurių oda yra sveika ir nepažeista.
      Kai kurių veislių triušiai turi tankių plaukų vietas, kurios labiau matomos tam tikrais metų laikais. Tokios tankių plaukų vietos neturi būti naudojamos bandymui.
      1.4.1.3   Laikymo ir šėrimo sąlygos
      Gyvūnai turi būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandomieji triušiai, temperatūra turi būti 20 oC (± 3 oC). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50-60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio.
      1.4.2   Bandymo eiga
      1.4.2.1   Bandomosios medžiagos uždėjimas
      Bandomoji medžiaga uždedama ant mažo odos ploto (maždaug 6 cm) ir uždengiama marlės tamponu, kuris tvirtinamas nedirginančia lipnia juosta. Jei tiesiogiai uždėti neįmanoma (pvz., skysčiai arba kai kurios pastos), bandomąją medžiagą reikėtų dėti ant marlės tampono, kuris būtų dedamas ant odos. Visą veikimo laikotarpį tamponas turi laisvai liesti odą, naudojant pusiau uždarą tvarstį. Jei bandomoji medžiaga dedama ant tampono, jis dedamas ant odos taip, kad medžiaga gerai liestųsi su oda ir tolygiai pasiskirstytų ant jos. Gyvūnai neturi pasiekti tampono ir praryti arba įkvėpti bandomosios medžiagos.
      Skystos bandomosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos. Bandant kietąsias medžiagas (kurios gali būti purškiamos, jei būtų manoma, kad tai daryti yra būtina), bandomąją medžiagą reikėtų sudrėkinti kiek įmanoma mažesniu vandens kiekiu (arba prireikus kitu tinkamu nešikliu), kurio pakaktų geram sąlyčiui su oda užtikrinti. Kai nešiklis yra ne vanduo, galima nešiklio įtaka bandomosios medžiagos dirginamajam poveikiui turi būti kiek įmanoma mažesnė.
      Pasibaigus veikimo laikotarpiui, kurio trukmė paprastai yra 4 h, bandomosios medžiagos likutis turi būti nuplautas, jei įmanoma, vandeniu arba kitu tinkamu tirpikliu, nepakeičiant odos reakcijos arba epidermio vientisumo.
      1.4.2.2   Dozės dydis
      Ant bandymo vietos dedama 0,5 ml skysčio arba 0,5 g kietosios medžiagos arba pastos dozė.
      1.4.2.3   Pradinis bandymas (in vivo odos dirginimo ar ėsdinimo bandymas su vienu gyvūnu)
      Labai rekomenduojama in vivo bandymą iš pradžių daryti su vienu gyvūnu, ypač kai yra įtarimas dėl ėsdinančiųjų medžiagos savybių. Tai atitinka nuosekliųjų bandymų strategiją (žr. 1 priedą).
      Kai po duomenų įrodomosios vertės analizės padaroma išvada, kad medžiaga yra ėsdinanti, bandymų su gyvūnais daryti nereikia. Didesnei daliai medžiagų, kurias galima laikyti ėsdinančiomis, in vivo bandymai paprastai nebūtini. Tačiau tais atvejais, kai turimi duomenys atrodo nepakankamai įrodantys, galima daryti ribotą bandymą su gyvūnais, taikant šį būdą: ant gyvūno paeiliui dedami ne daugiau kaip trys tamponai. Pirmasis tamponas nuimamas po trijų minučių. Jei jokios sunkios odos reakcijos nėra, dedamas antras tamponas, kuris nuimamas po valandos. Jei šioje stadijoje stebėjimai rodo, kad veikimą galima humaniškai pratęsti keturioms valandoms, dedamas trečias tamponas, kuris nuimamas po keturių valandų, ir odos reakcija įvertinama balais.
      Jei ėsdinantis poveikis pastebimas po bet kurio iš trijų nuoseklių paveikimų, bandymas nedelsiant baigiamas. Jei ėsdinančio poveikio nėra, nuėmus paskutinį tamponą, gyvūnas stebimas 14 parų, jei ėsdinimo požymių neatsiranda anksčiau.
      Tai atvejais, kai nesitikima, kad bandomoji medžiaga sukels ėsdinantį poveikį, o tik dirginantį, vienam gyvūnui keturioms valandoms dedamas vienas tamponas.
      1.4.2.4   Patvirtinamasis bandymas („in vivo“ odos dirginimo bandymas su papildomais gyvūnais)
      Jei darant pradinį bandymą ėsdinančio poveikio nėra, dirginantis poveikis arba neigiama reakcija turi būti patvirtinti naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus su vienu tamponu ir esant keturių valandų veikimo trukmei. Jei dirginantis poveikis pastebimas darant pradinį bandymą, patvirtinamąjį bandymą galima daryti nuosekliu būdu arba veikiant du papildomus gyvūnus vienu metu. Išimtiniais atvejais, kai pradinis bandymas nedaromas, dviem arba trims gyvūnams gali būti dedamas vienas tamponas, kuris nuimamas po keturių valandų. Kai naudojami du gyvūnai ir abiejų reakcija vienoda, toliau bandyti nereikia. Priešingu atveju dar daromas bandymas su trečiu gyvūnu. Neaiškias reakcijas gali tekti įvertinti naudojant papildomą gyvūną.
      1.4.2.5   Stebėjimo laikotarpis
      Stebėjimo laikotarpio trukmės turi pakakti pastebėto poveikio grįžtamumui visiškai įvertinti. Tačiau bandymas turi būti nutrauktas bet kuriuo momentu, kai tik gyvūnui pasireiškia ilgalaikiai didelio skausmo arba kančios požymiai. Poveikio grįžtamumui nustatyti gyvūnai po tamponų nuėmimo stebimi iki 14 parų. Jei grįžtamumas pastebimas anksčiau kaip po 14 parų, bandymas nutraukiamas tuo momentu.
      1.4.2.6   Klinikiniai stebėjimai ir odos reakcijos įvertinimas balais
      Stebima, ar visi gyvūnai neturi eritemos ir edemos požymių, o reakcija įvertinama po 60 minučių nuėmus tamponą vėliau – po 24, 48 ir 72 valandų. Darant pradinį bandymą su vienu gyvūnu, bandymo vieta taip pat tiriama iškart po tampono nuėmimo. Odos reakcija įvertinama balais ir užrašoma pagal lentelėje pateiktą gradavimo skalę. Jei odai padarytas pažeidimas po 72 h negali būti identifikuotas kaip dirginimas arba ėsdinimas, poveikio grįžtamumui nustatyti stebėjimą gali tekti tęsti iki 14 parų. Be dirginamojo poveikio stebėjimo, turi būti išsamiai apibūdintas ir užrašytas bet koks vietinis toksiškas poveikis, pvz., odos džiūvimas, ir bet koks sisteminis neigiamas poveikis (pvz., poveikis, pasireiškiantis kaip klinikiniai toksiškumo požymiai, ir poveikis kūno masei). Neaiškiems pažeidimams išaiškinti galima būtų daryti histopatologinį tyrimą.
      Odos reakcijos įvertinimas balais yra neišvengiamai subjektyvus. Siekiant labiau suderinti odos reakcijos įvertinimą balais, padėti bandymo laboratorijoms ir visiems, kurie vykdo ir aiškina stebėjimus, juos vykdantis personalas turi būti atitinkamai apmokytas taikyti įvertinimo balais sistemą (žr. toliau pateiktą lentelę). Tam galėtų būti naudingas iliustruotas odos dirginimo ir kitų pažeidimų įvertinimo vadovas (9).
      2.   DUOMENYS
      2.1   REZULTATŲ PATEIKIMAS
      Galutinėje ataskaitoje tyrimo rezultatai turi būti apibendrinti lentelėje, į kurią būtų įtraukti visi 3.1 skirsnio punktai.
      2.2   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS
      Odos sudirginimo rezultatai turi būti įvertinti pagal pažeidimų tipą ir sunkumą bei atsižvelgiant į grįžtamumą arba į jo nebuvimą. Atskiri rezultatai nėra medžiagos dirginamųjų savybių absoliutusis įvertis, kadangi dar vertinamas kitas bandomosios medžiagos poveikis. Į šiuos atskirus rezultatus reikėtų žiūrėti kaip į pamatines vertes, kurios turi būti vertinamos kartu su visais kitais tyrimo rezultatais.
      Vertinant sudirginimą turėtų būti atsižvelgta į odos pažeidimų grįžtamumą. Kai reakcija, pvz., plikimas (ribotame plote), hiperkeratozė, hiperplazija ir pleiskanojimas, pasireiškia baigiantis stebėjimo laikotarpio 14 parai, bandomoji medžiaga priskiriama dirginančioms.
      3.   ATASKAITOS RENGIMAS
      3.1   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
      
                   
               
               
                  
                     In vivo bandymo pagrindimas: jau turimų bandymo duomenų įrodomosios vertės analizė, įskaitant nuosekliųjų bandymų strategijos taikymo rezultatus:
                  
                              —
                           
                           
                              ankstesnių bandymų atitinkamų duomenų aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys, gauti kiekvienoje bandymų strategijos stadijoje,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              darytų in vitro bandymų aprašymas, įskaitant išsamią informaciją apie metodikas, rezultatus, gautus tiriant bandomąją ar etaloninę medžiagą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenų įrodomosios vertės analizė in vivo tyrimui daryti.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              identifikavimo duomenys (pvz., CAS numeris, šaltinis, grynumas, žinomos priemaišos, siuntos numeris),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              fizinė būsena ir fizikocheminės savybės (pvz., pH, lakumas, tirpumas, stabilumas),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sudėtis ir komponentų procentinė dalis, jei tai mišinys.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Nešiklis:
                  
                              —
                           
                           
                              identifikavimas, koncentracija (jei tinka), naudojamas tūris,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nešiklio pasirinkimo pagrindimas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              naudota rūšis ir veislė, kitų, ne baltųjų triušių, naudojimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvienos lyties gyvūnų skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              atskirų gyvūnų masė bandymo pradžioje ir pabaigoje,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              amžius tyrimo pradžioje,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              tampono dėjimo vietos ruošimo technika,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie naudojamas tampono medžiagas ir tampono dėjimo techniką,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie bandomosios medžiagos ruošimą, dėjimą ir nuėmimą.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno dirginimo ar ėsdinimo reakcijos balų, gautų visuose matavimo laiko taškuose, lentelių sudarymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visų pastebėtų pažeidimų aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pastebėto dirginimo arba ėsdinimo tipo ir laipsnio pasakojamasis aprašymas ir visi histopatologinio tyrimo rezultatai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kito kartu su dirginimu arba ėsdinimų pasireiškiančio neigiamo vietinio (pvz., odos džiūvimo) ir sisteminio poveikio aprašymas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410–429.
               
            
                  2)
               
               
                  Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, p. 19–26.
               
            
                  3)
               
               
                  Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, p. 709–720.
               
            
                  4)
               
               
                  ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation“, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.
               
            
                  5)
               
               
                  Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483–524.
               
            
                  5a)
               
               
                  Testing Method B.40 Skin Corrosion.
               
            
                  6)
               
               
                  OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecdl.org/ehs/test/background.htm).
               
            
                  7)
               
               
                  OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecdl.org/ehs/Class/HCL6.htm).
               
            
                  8)
               
               
                  OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecdl .org/ehs/test/monos.htm).
               
            
                  9)
               
               
                  EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
                  [Paprašius, galima gauti OECD sekretoriate].
               
            I LENTELĖ
      ODOS REAKCIJOS VERTINIMO BALAIS SKALĖ
      
         Eritemos ir šašų atsiradimas
      
      
                  Eritemos nėra …
               
               
                  0
               
            
                  Labai nedidelė eritema (vos pastebima) …
               
               
                  1
               
            
                  Aiškiai apibrėžta eritema …
               
               
                  2
               
            
                  Nuo vidutinės iki didelės eritemos …
               
               
                  3
               
            
                  Didelė eritema (burokėlio raudonumo) arba šašų susidarymas, trukdantis įvertinti eritemą …
               
               
                  4
               
            Didžiausias įmanomas: 4
      
         Edemos atsiradimas
      
      
                  Edemos nėra …
               
               
                  0
               
            
                  Labai nedidelė edema (vos pastebima) …
               
               
                  1
               
            
                  Nedidelė edema (plotelio kraštai aiškiai apibrėžti, nes yra pakilę) …
               
               
                  2
               
            
                  Vidutinė edema (kraštai pakilę maždaug 1 mm) …
               
               
                  3
               
            
                  Didelė edema (pakilusi daugiau kaip 1 mm ir išplitusi už veikiamo ploto ribų) …
               
               
                  4
               
            Didžiausias įmanomas: 4
      Neaiškiems pažeidimams paaiškinti galima būtų daryti histopatologinį tyrimą.
      
         PRIEDAS
         Nuosekliųjų bandymų strategija odos dirginimui ir ėsdinimui nustatyti
         BENDRIEJI KLAUSIMAI
         Siekiant gauti nuodugnių mokslinių rezultatų ir rūpinantis gyvūnų gerove, svarbu be reikalo nenaudoti gyvūnų ir kiek įmanoma mažinti visus bandymus, kurie gyvūnams gali sukelti sunkias reakcijas. Visa informacija apie medžiagos galimą ėsdinamąjį ar dirginamąjį poveikį odai turėtų būti įvertinta prieš sprendžiant, ar daryti in vivo bandymus. Jei jau yra pakankamai duomenų galimam bandomosios medžiagos ėsdinamajam arba dirginamajam poveikiui odai klasifikuoti, nereikia bandymų su laboratoriniais gyvūnais. Taigi taikant duomenų įrodomosios vertės analizę ir nuosekliųjų bandymų strategiją sumažėja būtinybė daryti in vivo bandymus, ypač jei tikėtina, kad medžiaga gali sukelti sunkias reakcijas.
         Turimai informacijai apie medžiagų dirginamąjį ir ėsdinamąjį poveikį įvertinti rekomenduojama taikyti duomenų įrodomosios vertės analizę, kuri leistų spręsti, ar tokio poveikio galimybei apibūdinti reikia daryti papildomus tyrimus, išskyrus in vivo odos tyrimus. Jei reikia papildomų tyrimų, atitinkamiems eksperimentiniams duomenims gauti, rekomenduojama taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Norint gauti duomenų apie nebandytas medžiagas, reikalingų jų ėsdinamajam ar dirginamajam poveikiui odai įvertinti, reikėtų taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Šiame priede aprašyta bandymų strategija buvo parengta OECD seminare (1) ir vėliau patvirtinta bei išplėsta kaip integruota darnioji pavojų dėl cheminių medžiagų poveikio žmonių sveikatai ir aplinkai klasifikavimo sistema (Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances), 1998 m. lapkričio mėn. priimta 28-ajame jungtiniame cheminių medžiagų komiteto ir cheminių medžiagų darbo grupės posėdyje (2).
         Nors ši nuosekliųjų bandymų strategija nėra sudėtinė B.4 bandymo metodo dalis, ji apibūdina rekomenduojamą būdą odos dirginimo ar ėsdinimo charakteristikoms nustatyti. Šis būdas atitinka geriausią praktiką ir yra odos dirginimo ar ėsdinimo in vivo bandymų etikos etalonas. Bandymo metode pateikiamos in vivo bandymų rekomendacijos ir apibendrinami veiksniai, į kuriuos reikėtų atkreipti dėmesį prieš pradedant tokį bandymą. Strategijoje siūlomas būdas, kaip įvertinti turimus duomenis apie bandomųjų medžiagų odos dirginimo ar ėsdinimo savybes, kad būtų galima gauti reikiamų duomenų apie medžiagas, kurioms reikalingi papildomi tyrimai arba kurios nebuvo tirtos. Be to, rekomenduojama daryti įteisintus ir priimtus odos ėsdinimo ar dirginimo in vitro arba ex vivo bandymus esant konkrečioms aplinkybėms.
         ĮVERTINIMO IR BANDYMO STRATEGIJOS APRAŠYMAS
         Siekiant nustatyti in vivo odos bandymų reikalingumą, prieš darant bandymus, kurie būtų nuosekliųjų bandymų strategijos dalis (schema), įvertinama visa turima informacija. Nors reikšmingos informacijos galima būtų gauti vertinant atskirus parametrus (pvz., pH ribines vertes), turėtų būti nagrinėjama visa turima informacija. Sprendimui priimti turi būti daroma visų atitinkamų duomenų apie konkrečios medžiagos arba jos analogų poveikį įrodomosios vertės analizė, kuri pagrįstų priimamą sprendimą. Didžiausias dėmesys turėtų būti kreipiamas į duomenis apie medžiagą gautus tiriant žmones ir gyvūnus, o vėliau tirti in vitro arba ex vivo bandymų duomenis. Ėsdinančiųjų medžiagų in vivo tyrimų reikėtų kiek įmanoma vengti. Toliau pateikiami bandymų strategijos veiksniai.
         
            Turimų duomenų gautų tiriant žmones ir gyvūnus, įvertinimas (1 pakopa). Iš pradžių nagrinėjami tiriant žmones gauti duomenys, pvz., klinikiniai arba profesinių susirgimų tyrimai ir bylų ataskaitos, ir (arba) bandymų su gyvūnais duomenys, pvz., vienkartinio arba kartotinio poveikio odai toksiškumo tyrimai, kadangi jie suteikia informacijos, tiesiogiai susijusios su poveikiu odai. Medžiagų, kurios yra žinomos kaip dirginančios arba ėsdinančios, ir medžiagų, kurios akivaizdžiai nėra ėsdinančios arba dirginančios, nereikia bandyti darant in vivo tyrimus.
         
            Struktūros ir aktyvumo ryšių (SAR) analizė (2 pakopa). Analizuojami giminingą struktūrą turinčių medžiagų bandymo rezultatai, jei tokie būtų. Kai tiriant žmones ir gyvūnus gautų duomenų apie giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius pakanka, norint įrodyti medžiagų gebą ėsdinti ar jautrinti odą galima daryti prielaidą kad įvertinimui pateiktos bandomosios medžiagos poveikis bus toks pats. Tokiais atvejais bandomosios medžiagos nebūtina bandyti. Taikant nuosekliųjų bandymų strategiją, neigiami duomenys, gauti tiriant giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius, nėra pakankamas įrodymas, kad medžiaga nėra ėsdinanti ar jautrinanti. Medžiagų geba ėsdinti ir dirginti odą nustatoma taikant įteisintus ir priimtus SAR metodus.
         
            Fizikocheminės savybės ir cheminis reaktyvumas (3 pakopa). Medžiagos, turinčios ribines pH vertes, pvz., ≤ 2,0 ir ≥ 11,5, gali turėti didelį vietinį poveikį. Jei ribinė pH vertė yra pagrindinė savybė, pagal kurią medžiaga identifikuojama kaip odą ėsdinanti medžiagą galima atsižvelgti į rūgšties ar šarmo atsargą (arba buferinę talpą) (3) (4). Jei buferinė talpa leidžia daryti prielaidą, kad medžiaga gali nebūti odą ėsdinanti medžiaga, tai turi būti patvirtinta darant papildomus bandymus ir geriau būtų taikyti įteisintą ir priimtą in vitro arba ex vivo bandymą (žr. 5 ir 6 pakopas).
         
            Toksiškumas per odą (4 pakopa). Jei buvo įrodyta, kad cheminė medžiaga yra labai toksiška per odą, in vivo odos dirginimo ar ėsdinimo tyrimas gali būti neįmanomas, nes bandomosios medžiagos kiekis, kuris įprastai dedamas ant odos, gali būti didesnis už labai didelio toksiškumo dozę, taigi gyvūnas gali žūti arba sunkiai kentėti. Be to, jei jau yra padaryti toksiškumo per odą tyrimai su baltaisiais triušiais, naudojant 2 000 mg/kg kūno masės arba didesnę ribinę dozę, ir nebuvo pastebėta odos dirginimo ar ėsdinimo, papildomas odos dirginimo ar ėsdinimo bandymas gali būti nereikalingas. Vertinant ūmų toksiškumą pirmiau darytuose tyrimuose, reikėtų atsižvelgti į kelias aplinkybes. Pvz., paskelbta informacija apie odos pažeidimus gali būti neišsami. Gali būti bandomi ir stebimi gyvūnai kitų, ne triušių rūšių, o rūšių jautrumas poveikiui gali labai skirtis. Be to, bandomosios medžiagos taikymo būdas gali netikti odos dirginimui ar ėsdinimui įvertinti (pvz., medžiagų skiedimas bandant toksiškumą per odą (5). Tačiau tais atvejais, kai toksiškumo per odą tyrimai su triušiais buvo gerai suplanuoti ir padaryti, neigiami rezultatai gali būti laikomi pakankamu įrodymu, kad medžiaga ėsdinanti arba dirginanti.
         
            In vitro arba ex vivo bandymų rezultatai (5 ir 6 pakopos). Medžiagų, kurios, kaip įrodyta, veikia kaip ėsdinančios arba labai dirginančios darant patvirtinto tinkamumo ir priimtą in vitro arba ex vivo bandymą (6) (7), skirtą šiam konkrečiam poveikiui įvertinti, nereikia bandyti su gyvūnais. Galima daryti prielaidą, kad tokios medžiagos turės panašų sunkų poveikį in vivo.
         
         
            Bandymas su triušiais in vivo (7 ir 8 pakopos). Jei atlikus duomenų įrodomosios vertės analizę priimamas sprendimas daryti bandymą in vivo, jį reikėtų pradėti pradiniu bandymu su vienu gyvūnu. Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad medžiaga yra odą ėsdinanti, toliau bandyti nereikia. Jei darant pradinį bandymą ėsdinamasis poveikis nepastebimas, dirginimo arba ėsdinimo poveikis patvirtinamas naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus, veikiamus keturias valandas. Jei darant pradinį bandymą pastebimas dirginamasis poveikis, patvirtinamasis bandymas gali būti daromas nuosekliu būdu arba tuo pat metu veikiant du papildomus gyvūnus.
         NUORODOS
         
                     1)
                  
                  
                     OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www1. oecd. org/ehs/test/b ackground. htm).
                  
               
                     2)
                  
                  
                     OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28l Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                  
               
                     3)
                  
                  
                     Worth, A.P., Fentem J.H, Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin prielaidą ATLA 26, p. 709–720.
                  
               
                     4)
                  
                  
                     Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) p. 19–26.
                  
               
                     5)
                  
                  
                     Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth 1 1,5, 1-56032-356-6, Chapter 31, p. 411–436.
                  
               
                     6)
                  
                  
                     Testing Method B.40.
                  
               
                     7)
                  
                  
                     Fentem, J.H., identifikuojama G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation prielaidą on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483–524.
                  
               Schema
         ODOS DIRGINIMO AR ĖSDINIMO BANDYMO IR ĮVERTINIMO STRATEGIJA
         
            
      
      B.5.   ŪMUS TOKSIŠKUMAS. AKIŲ DIRGINIMAS AR ĖSDINIMAS
      1.   METODAS
      Šis metodas atitinka OECD TG 405 (2002).
      1.1   ĮVADAS
      Rengiant šį atnaujintą metodą ypatingas dėmesys buvo kreipiamas į galimą gyvūnų gerovės pagerinimą ir į visos turimos informacijos apie bandomąją medžiagą įvertinimą, siekiant išvengti nebūtinų bandymų su laboratoriniais gyvūnais. Šiame metode rekomenduojama prieš darant aprašytą medžiagos ūmaus akių ėsdinimo ar dirginimo bandymą in vivo atlikti turimų atitinkamų duomenų įrodomosios vertės analizę (1). Jei duomenų nepakanka, jų galima gauti darant nuoseklųjį bandymą (2)(3). Į bandymo strategiją įtraukti šio metodo priede aprašyti įteisinti ir priimti in vitro bandymai. Be to, prieš numatant daryti in vivo akių bandymą akių ėsdinimui prognozuoti, rekomenduojama taikyti in vivo odos dirginimo ar ėsdinimo bandymą.
      Siekiant vienu metu užtikrinti duomenų mokslinį patikimumą ir gyvūnų gerovę, in vivo bandymai neturėtų būti numatomi tol, kol darant duomenų įrodomosios vertės analizę nebus įvertinti visi turimi duomenys, apibūdinantys galimą medžiagos ėsdinamąjį ar dirginamąjį poveikį akims. Tokius duomenis sudarys turimų tyrimų su žmonėmis ir (arba) laboratoriniais gyvūnais rezultatai, ėsdinimo ar dirginimo duomenys, gauti apie vieną arba kelias medžiagas, turinčias giminingą struktūrą, arba jų mišinius, duomenys, patvirtinantys medžiagos stiprias rūgštines arba šarmines savybes (4)(5), be to, įteisintų ir priimtų in vitro arba ex vivo odos ėsdinimo ir dirginimo bandymų rezultatai (6)(6a). Tyrimai gali būti daromi prieš duomenų įrodomosios vertės analizę arba kaip jos rezultatas.
      Tokia kai kurių medžiagų analizė gali parodyti, kad reikia daryti medžiagos akių ėsdinimo ar dirginimo gebos in vivo tyrimus. Visais šiais atvejais prieš numatant daryti in vivo akių bandymą, iš pradžių reikėtų daryti medžiagos poveikio odai in vivo tyrimą ir ją įvertinti pagal B.4 bandymo metodą (7). Duomenų įrodomosios vertės analizės ir nuosekliųjų bandymų strategijos taikymas turėtų sumažinti poreikį in vivo bandyti tokių medžiagų, apie kurias jau yra gauta pakankamai duomenų darant kitus tyrimus, akių ėsdinimo ar dirginimo poveikį. Jei taikant nuosekliųjų bandymų strategiją akių ėsdinimo arba dirginimo geba negali būti nustatyta net po odos ėsdinimo ir dirginimo in vivo tyrimo, galima daryti in vivo akių ėsdinimo ar dirginimo bandymą.
      Pirmenybė teikiama į šio metodo priedą įtrauktai nuosekliųjų bandymų strategijai, kurią sudaro įteisinti ir priimti in vitro arba ex vivo odos ėsdinimo ar dirginimo bandymai. Strategiją parengė ir vienbalsiai rekomendavo OECD seminaro dalyviai (8), ji buvo priimta ir rekomenduota kaip visuotinai suderintos cheminių medžiagų klasifikavimo sistemos (GHS) bandymų strategija (9). Rekomenduojama laikytis šios bandymų strategijos prieš pradedant in vivo bandymus. Naujoms medžiagoms rekomenduojamas nuoseklusis bandymo būdas moksliškai pagrįstiems duomenims apie medžiagos ėsdinimo ar dirginimo savybes gauti. Turimoms medžiagoms, apie kurių odos ėsdinimo ar dirginimo savybes duomenų nepakanka, ši strategija turėtų būti taikoma, jei trūksta duomenų. Kitokios bandymo strategijos arba metodikos taikymas arba sprendimas netaikyti nuoseklaus bandymų metodo turi būti pagrįstas.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Akių dirginimas – akių pokyčių sukėlimas, paveikus bandomąja medžiaga priekinį akies paviršių, kai pokyčiai visiškai išnyksta per 21 parą po veikimo.
      
         Akių ėsdinimas – akies audinių pažeidimas arba sunkus regėjimo pablogėjimas, paveikus bandomąja medžiaga priekinį akies paviršių, kai pažeidimai ne visiškai išnyksta per 21 parą po veikimo.
      1.3   BANDYMO METODO ESMĖ
      Ant bandomo gyvūno vienos akies dedama viena bandomosios medžiagos dozė; nepaveikta gyvūno akis naudojama kontrolei. Apibrėžtais laiko tarpais nustatomi ir balais įvertinami junginės, ragenos ir rainelės pažeidimai. Be to, poveikio išsamiam įvertinimui aprašomas bet koks kitas poveikis ir neigiamas sisteminis poveikis. Tyrimo trukmė turi būti pakakama poveikio grįžtamumui arba negrįžtamumui įvertinti.
      Gyvūnai, kuriems kurioje nors bandymo stadijoje pasireiškia nuolatiniai sunkių kančių ir (arba) skausmo požymiai, turi būti humaniškai nužudomi, o medžiaga atitinkamai įvertinama. Kriterijai, pagal kuriuos priimamas sprendimas dėl humaniško gaištančių ir labai kenčiančių gyvūnų nužudymo, aprašyti (10) nuorodoje.
      1.4   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.4.1   Pasiruošimas in vivo bandymui
      1.4.1.1   Gyvūnų rūšies pasirinkimas
      Tinkamiausias laboratorinis gyvūnas – baltasis triušis; naudojami sveiki, jauni ir suaugę triušiai. Kitų rūšių naudojimas turi būti pagrįstas.
      1.4.1.2   Gyvūnų ruošimas
      Abi kiekvieno bandymui numatyto gyvūno akys patikrinamos per 24 h iki bandymo pradžios. Gyvūnai, kuriems nustatomas akių dirginimas, akių defektai arba prieš tai buvęs ragenos pažeidimas, neturi būti naudojami.
      1.4.1.3   Laikymo ir šėrimo sąlygos
      Gyvūnai turi būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandymo triušiai, temperatūra turi būti 20 oC (± 3 oC). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio.
      1.4.2   Bandymo eiga
      1.4.2.1   Bandomosios medžiagos dėjimo būdas
      Bandomoji medžiaga dedama į kiekvieno gyvūno vienos akies junginės maišelį, švelniai atitraukiant apatinį voką nuo akies obuolio. Vokai švelniai suspaudžiami maždaug vienai sekundei, kad būtų išvengta medžiagos nuostolių. Kita neapdorota akis naudojama kontrolei.
      1.4.2.2   Akių plovimas
      Bandomo gyvūno akių, įdėjus bandomosios medžiagos, reikėtų neplauti mažiausiai 24 h, išskyrus kietąsias medžiagas (žr. 1.4.2.3.2 skirsnį) ir jei iš karto pasireiškia ėsdinimo arba dirginimo poveikis. Po 24 h akis galima plauti, jei manoma, kad tai reikia daryti.
      Nerekomenduojama naudoti pagalbinės gyvūnų grupės plovimo įtakai tirti, išskyrus kai tai yra moksliškai pagrįsta. Prireikus pagalbinės grupės, reikėtų naudoti du gyvūnus. Kruopščiai aprašomos plovimo sąlygos, pvz., plovimo laikas, plovimo tirpalo sudėtis ir temperatūra, trukmė, tūris ir tiekimo greitis.
      1.4.2.3   Dozės dydis
      1.4.2.3.1   Skysčių bandymas
      
      Bandant skysčius, naudojama 0,1 ml dozė. Nereikėtų naudoti purškiklio medžiagai tiesiai į akį purkšti. Prieš įpurškiant 0,1 ml į akį, skystis iš pradžių pumpuojamas ir surenkamas į indą.
      1.4.2.3.2   Kietųjų medžiagų bandymas
      
      Bandant kietąsias medžiagas, pastą ir daleles, naudojamos medžiagos tūris turi būti 0,1 ml arba masė – ne didesnė kaip 100 mg. Bandomoji medžiaga turi būti sumalta į smulkias dulkes. Kietosios medžiagos tūris matuojamas ją švelniai sutankinus, pvz., tapšnojant matavimo indą. Jei stebint pirmą kartą, praėjus 1 h po akies apdorojimo, kieta bandomoji medžiaga nepašalinama iš bandomo gyvūno akies veikiant fiziologiniams mechanizmams, akį galima praplauti fiziologiniu tirpalu arba distiliuotu vandeniu.
      1.4.2.3.3.   Aerozolių bandymas
      
      Prieš įlašinant į akį rekomenduojama visas purškiamąsias medžiagas ir aerozolius iš pradžių surinkti į indą. Viena išimtis daroma slėgimuose aerozolių purkštuvuose esančioms medžiagoms, kurių negalima sukaupti dėl garavimo. Tokiais atvejais akis atmerkiama ir bandomoji medžiaga maždaug vieną sekundę tiesiog švirkščiama į akį stačiu kampu iš 10 cm atstumo. Šis atstumas gali būti kitoks, atsižvelgiant į purkštuvo ir jo turinio slėgį. Reikia imtis atsargumo priemonių nepažeisti akies veikiant purškimo slėgiui. Atitinkamais atvejais gali tekti įvertinti mechaninio akies pažeidimo srauto jėga galimybę.
      Aerozolio dozei įvertinti galima modeliuoti šį įpurškimo bandymą: per triušio akies dydžio angą medžiaga purškiama ant pasverto popieriaus lapo, dedamo tiesiai prieš akį. Popieriaus masės padidėjimas naudojamas apytikriam į akį įpurkšto kiekio įvertinimui. Lakiųjų medžiagų dozė gali būti įvertinta pasveriant indą su medžiaga prieš įpurškimą ir po jo.
      1.4.2.4   Pradinis bandymas (in vivo akies dirginimo ar ėsdinimo bandymas su vienu gyvūnu)
      Kaip aiškiai nurodyta nuosekliųjų bandymų strategijos aprašyme (žr. 1 priedą), labai rekomenduojama in vivo bandymą iš pradžių daryti su vienu gyvūnu.
      Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad taikant aprašytąją metodiką medžiaga yra akį ėsdinanti arba labai ją dirginanti, kiti akies dirginimo bandymai neturi būti daromi.
      1.4.2.5   Vietinis nuskausminimas
      Galima naudoti vietinio nuskausminimo priemones atsižvelgiant į kiekvieną atskirą atvejį. Jei duomenų įrodomosios vertės analizė rodo, kad medžiaga gali sukelti skausmą arba pradinis bandymas rodo skausmingą gyvūno reakciją, prieš įlašinant bandomąją medžiagą galima naudoti vietinio nuskausminimo priemonę. Reikia kruopščiai parinkti vietinio nuskausminimo priemonės tipą, koncentraciją ir dozę, siekiant užtikrinti, kad dėl jos naudojimo nebūtų reakcijos į bandomosios medžiagos poveikį skirtumų. Kontrolinė akis nuskausminama panašiu būdu.
      1.4.2.6   Patvirtinamasis bandymas (in vivo akies dirginimo bandymas su papildomais gyvūnais)
      Jei darant pradinį bandymą ėsdinantis poveikis nepastebimas, dirginantis poveikis arba neigiama reakcija turi būti patvirtinta naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus. Jei darant pradinį bandymą pastebimas labai didelis dirginantis poveikis, rodantis galimą stiprų (neišnykstantį) poveikį darant patvirtinamąjį bandymą, šį bandymą rekomenduojama daryti nuosekliu būdu ir vietoj dviejų papildomų gyvūnų vienu metu naudoti vieną gyvūną. Jei antrajam gyvūnui pasireiškia ėsdinamasis arba sunkus dirginamasis poveikis, bandymas nutraukiamas. Silpnam arba vidutinio dydžio dirginamajam poveikiui patvirtinti gali būti reikalingi papildomi gyvūnai.
      1.4.2.7   Stebėjimo laikotarpis
      Stebėjimo laikotarpio trukmės turi pakakti stebimo poveikio dydžiui ir grįžtamumui visiškai įvertinti. Tačiau bandymas turi būti baigtas bet kuriuo momentu, kai tik gyvūnui pasireiškia ilgalaikiai didelio skausmo arba kančios požymiai (9). Poveikio grįžtamumui nustatyti gyvūnai paprastai stebimi 21 parą po bandomosios medžiagos davimo. Jei grįžtamumas pastebimas anksčiau nei baigiantis 21 parai, bandymas nutraukiamas tuo momentu.
      1.4.2.7.1   Klinikiniai stebėjimai ir akių reakcijos įvertinimas balais
      
      Akys tiriamos praėjus 1, 24, 48, ir 72 h po bandomosios medžiagos įdėjimo. Gyvūnai bandomi ne ilgiau, nei būtina galutinei informacijai gauti. Gyvūnai, kuriems pasireiškia ilgalaikis didelis skausmas arba kančia, turi būti iš karto humaniškai nužudyti, o medžiaga atitinkamai įvertinta. Turi būti humaniškai nužudomi gyvūnai, kuriems po įlašinimo atsiranda šie pažeidimai: ragenos pradūrimas arba didelės ragenos opos, įskaitant stafilomą; kraujo atsiradimas priekinėje akies kameroje; 4 balų ragenos drumstumas, kuris nepraeina po 48 h; šviesos reflekso nebuvimas (2 balų rainelės reakcija) ilgiau kaip 72 h; junginės membranos opos; junginės arba niktitacinės membranos nekrozė, arba nekrozinio audinio lupimasis. Nužudyti reikia todėl, kad tokie pažeidimai paprastai yra negrįžtami.
      Bandymas su gyvūnais, kuriems akių pažeidimų nepastebima, gali būti baigti ne anksčiau kaip ketvirtą parą po įlašinimo. Gyvūnai su nedideliais ir vidutiniais pažeidimais turi būti stebimi tol, kol pažeidimai pranyksta, arba 21 parą, t. y. iki tyrimo pabaigos. Apžiūrėti reikia po 7, 14 ir 21 paros, kad būtų galima nustatyti pažeidimų tipą ir jų grįžtamumą arba negrįžtamumą.
      Akių pažeidimo balai (junginės, ragenos ir rainelės) užrašomi kiekvienos apžiūros metu (1 lentelė). Be to, nurodomi visi kiti akies pažeidimai (pvz., panuso, dėmių atsiradimas) arba sisteminis neigiamas poveikis.
      Reakcijos tikrinimą galima palengvinti naudojant binokulinę lupą, rankinę plyšinę lempą, biologinį mikroskopą arba kitokį tinkamą įtaisą. Užrašius 24 h stebėjimus, akys gali būti tiriamos naudojant fluoresceiną.
      Akių reakcijos įvertinimas balais neišvengiamai yra subjektyvus. Siekiant labiau suderinti akių reakcijos įvertinimą balais ir padėti bandymo laboratorijoms ir visiems, kurie vykdo ir aiškina stebėjimus, juos vykdantis personalas turi būti atitinkamai mokomas taikyti įvertinimo balais sistemą.
      2.   DUOMENYS
      2.2   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS
      Akių dirginimo rezultatai įvertinami pagal pažeidimų tipą ir sunkumą bei atsižvelgiant į grįžtamumą arba į jo nebuvimą. Atskiri rezultatai nėra medžiagos dirginamųjų savybių absoliučiuoju įverčiu, kadangi dar įvertinamas kitas bandomosios medžiagos poveikis. Į šiuos atskirus rezultatus reikėtų žiūrėti kaip į pamatines vertes, reikšmingas tik tais atvejais, kai jas patvirtina išsamus visų kitų stebėjimų aprašymas ir įvertinimas.
      3.   ATASKAITOS RENGIMAS
      3.1   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
      
                   
               
               
                  
                     In vivo bandymo pagrindimas: jau turimų bandymo duomenų įrodomosios vertės analizė, įskaitant nuosekliųjų bandymų strategijos taikymo rezultatus:
                  
                              —
                           
                           
                              ankstesnių bandymų atitinkamų duomenų aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys, gauti kiekvienoje bandymų strategijos stadijoje,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              darytų in vitro bandymų aprašymas, įskaitant išsamią informaciją apie procedūras, rezultatus, gautus tiriant bandomąją ar etaloninę medžiagai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              daryto in vivo odos dirginimo ar ėsdinimo tyrimo aprašymas, įskaitant gautus rezultatus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenų įrodomosios vertės analizė in vivo tyrimui daryti.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              identifikavimo duomenys (pvz., CAS numeris, šaltinis, grynumas, žinomos priemaišos, siuntos numeris),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              fizikinė būsena ir fizikocheminės savybės (pvz., pH, lakumas, tirpumas, stabilumas, reagavimas su vandeniu),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sudėtis ir komponentų procentinė dalis, jei tai mišinys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              jei naudojama vietinio nuskausminimo priemonė: identifikavimas, grynumas, tipas, dozė ir galima sąveika su bandomąja medžiaga.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Nešiklis:
                  
                              —
                           
                           
                              identifikavimas, koncentracija (jei tinka), naudojamas tūris,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nešiklio pasirinkimo pagrindimas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              naudota rūšis ar veislė, kitų nei baltųjų triušių naudojimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno amžius tyrimo pradžioje,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvienos lyties gyvūnų skaičius bandymo ir kontrolinėje (jei reikia) grupėje,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              atskirų gyvūnų masė bandymo pradžioje ir pabaigoje,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir kt.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              metodo, taikyto dirginimui kiekvienu stebėjimo momentu įvertinti balais (pvz., rankinė plyšinė lempa, biologinis mikroskopas, fluoresceinas), aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno dirginimo ar ėsdinimo reakcijos duomenų, gautų kiekvienu stebėjimo momentu iki gyvūno pašalinimo iš bandymo, lentelių sudarymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              stebimo dirginimo arba ėsdinimo tipo ir laipsnio pasakojamasis aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visų kitų akies pažeidimų aprašymas (pvz., vaskuliarizacija, panuso susidarymas, sąaugų, dėmių atsiradimas),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bet kokio ne akims daromo neigiamo vietinio ir sisteminio poveikio aprašymas, visi histopatologinio tyrimo rezultatai, jei yra.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            3.2   REZULTATŲ AIŠKINIMAS
      Akių dirginimo rezultatų, gautų laboratoriniams gyvūnams, ekstrapoliavimas žmonėms tinka tik tam tikru laipsniu. Daugeliu atvejų baltieji triušiai yra jautresni akis dirginančioms arba ėsdinančioms medžiagoms nei žmonės.
      Aiškinant rezultatus reikia neįtraukti antrinės infekcijos sukelto dirginimo.
      4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410–429.
               
            
                  2)
               
               
                  de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G, Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, p. 159–164.
               
            
                  3)
               
               
                  Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, p. 161–177
               
            
                  4)
               
               
                  Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, p. 19–26.
               
            
                  5)
               
               
                  Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227–231.
               
            
                  6)
               
               
                  Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483–524.
               
            
                  6a)
               
               
                  Testing Method B.40 Skin Corrosion.
               
            
                  7)
               
               
                  Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion.
               
            
                  8)
               
               
                  OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicol ogical Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 – 24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
               
            
                  9)
               
               
                  OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
               
            
                  10)
               
               
                  OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
               
            1 LENTELĖ.
      AKIŲ PAŽEIDIMO VERTINIMO BALAIS SKALĖ
      Ragena
      Drumstis: tankumo laipsnis (duomenys imami iš tankiausios srities) (1)
      
      
                  Opėjimo arba drumsties nėra …
               
               
                  0
               
            
                  Išsibarsčiusios arba išsklaidytos drumsties sritys (išskyrus nedidelį normalaus blizgesio sumažėjimą), rainelės elementai aiškiai matomi …
               
               
                  1
               
            
                  Lengvai įžiūrima pusiau skaidri sritis, rainelės elementai šiek tiek dulsvi …
               
               
                  2
               
            
                  Perlamutrinės sritys, rainelės elementai nematomi, vyzdžio dydis vos įžiūrimas …
               
               
                  3
               
            
                  Ragena matinė, dėl drumsties rainelės nesimato …
               
               
                  4
               
            Didžiausias įmanomas: 4
      PASTABOS
      Rainelė
      
                  Normali …
               
               
                  0
               
            
                  Labai pagilėjusios raukšlės, kongestija, pabrinkimas, vidutiniškajunginės apie rageną hiperemija; arba injekcija; rainelė vis dar reaguoja į šviesą (vangi reakcija laikoma poveikiu) …
               
               
                  1
               
            
                  Kraujavimas, stiprus suardymas arba nėra reakcijos į šviesą …
               
               
                  2
               
            Didžiausias įmanomas: 2
      Junginė
      Raudonumas (taikoma voko ir obuolio j unginei, išskyrus rageną ir rainelę)
      
                  Normali …
               
               
                  0
               
            
                  Kai kurie kraujo indai aiškiai hiperemiški (įšvirkšta) …
               
               
                  1
               
            
                  Išsklaidyta tamsiai raudona spalva, atskiri indai sunkiai įžiūrimi …
               
               
                  2
               
            
                  Išsklaidyta jautienos raudonumo spalva …
               
               
                  3
               
            Didžiausias įmanomas: 3
      Chemozė
      Paburkimas (taikoma vokams ir (arba) niktitacinėms membranoms)
      
                  Paburkimo nėra …
               
               
                  0
               
            
                  Nedidelis paburkimas, didesnis nei normalus …
               
               
                  1
               
            
                  Akivaizdus paburkimas, vokai iš dalies išvirsta …
               
               
                  2
               
            
                  Paburkimas, pusiau užmerkti vokai …
               
               
                  3
               
            
                  Paburkimas, vokai užmerkti daugiau nei per pusę …
               
               
                  4
               
            Didžiausias įmanomas: 4
      
         PRIEDAS
         Nuosekliųjų bandymų strategija akių dirginimui ir ėsdinimui nustatyti
         BENDRIEJI KLAUSIMAI
         Siekiant gauti nuodugnių mokslinių rezultatų ir rūpinantis gyvūnų gerove, svarbu be reikalo nenaudoti gyvūnų ir kiek įmanoma mažinti visus bandymus, kurie gyvūnams gali iššaukti sunkias reakcijas. Visa informacija apie medžiagą dėl jos galimo ėsdinamojo ar dirginamojo poveikio odai turėtų būti įvertinta prieš sprendžiant dėl in vivo bandymų. Jei jau yra pakankamai duomenų galimam bandomosios medžiagos ėsdinamajam arba dirginamajam poveikiui odai klasifikuoti, nereikia bandymų su laboratoriniais gyvūnais Taigi taikant duomenų įrodomosios vertės analizę ir nuosekliųjų bandymų strategiją sumažėja būtinybė daryti in vivo bandymus, ypač jei tikėtina, kad medžiaga gali iššaukti sunkias reakcijas.
         Turimai informacijai apie medžiagų dirginamąjį ir ėsdinamąjį poveikį akims įvertinti rekomenduojama taikyti duomenų įrodomosios vertės analizę, kuri leistų spręsti, ar tokio poveikio galimybei apibūdinti reikia daryti papildomus tyrimus, išskyrus in vivo akių tyrimus. Jei reikia papildomų tyrimų, atitinkamiems eksperimentiniams duomenims gauti rekomenduojama taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Norint gauti duomenų apie nebandytas medžiagas, reikalingų jų ėsdinamajam ar dirginamajam poveikiui odai įvertinti, reikėtų taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Šiame priede aprašyta bandymų strategija buvo parengta OECD seminare (1). Vėliau ji buvo patvirtinta bei išplėsta kaip integruota darnioji pavojų dėl cheminių medžiagų poveikio žmonių sveikatai ir aplinkai klasifikavimo sistema, 1998 m. lapkričio mėn. priimta 28-ajame jungtiniame cheminių medžiagų komiteto ir cheminių medžiagų darbo grupės posėdyje (2).
         Nors ši nuosekliųjų bandymų strategija nėra sudėtinė B.5 bandymo metodo dalis, ji apibūdina rekomenduojamą būdą akių dirginimo ar ėsdinimo charakteristikoms nustatyti. Šis būdas atitinka geriausią praktiką ir yra akių dirginimo ar ėsdinimo in vivo bandymų etikos etalonas. Bandymo metode pateikiamos in vivo bandymų rekomendacijos ir apibendrinami veiksniai, į kuriuos reikėtų atkreipti dėmesį prieš pradedant tokį bandymą. Nuosekliųjų bandymų strategijoje siūlomas duomenų įrodomosios vertės analizės būdas, kuris leistų įvertinti turimus duomenis apie bandomųjų medžiagų akių dirginimo ar ėsdinimo savybes, kad būtų galima nuosekliai gauti reikiamų duomenų apie medžiagas, kurioms reikalingi papildomi tyrimai arba kurios nebuvo tirtos. Strategijoje nurodoma iš pradžių daryti įteisintus ir priimtus in vitro arba ex vivo bandymus ir tik po to naudoti odos ėsdinimo ar dirginimo bandymo metodą B.4 konkrečiomis aplinkybėmis (3) (4).
         ĮVERTINIMO IR BANDYMO STRATEGIJOS APRAŠYMAS
         Siekiant nustatyti in vivo akių bandymų reikalingumą, prieš darant bandymus, kurie būtų nuosekliųjų bandymų strategijos dalis (schema), įvertinama visa turima informacija. Nors reikšmingos informacijos galima būtų gauti vertinant atskirus parametrus (pvz., pH ribines vertes), turėtų būti nagrinėjama visa turima informacija. Sprendimui priimti turėtų būti daroma visų atitinkamų duomenų apie konkrečios medžiagos arba jos struktūrinių analogų poveikį įrodomosios vertės analizė, kuri pagrįstų priimamą sprendimą. Didžiausias dėmesys turėtų būti kreipiamas į duomenis apie medžiagą, gautus tiriant žmones ir gyvūnus, o vėliau tirti in vitro arba ex vivo bandymų duomenis. Ėsdinančiųjų medžiagų in vivo tyrimų reikėtų kiek įmanoma vengti. Toliau pateikiami bandymų strategijos veiksniai.
         
            Turimų duomenų, gautų tiriant žmones ir gyvūnus, įvertinimas (1 pakopa). Iš pradžių nagrinėjami tiriant žmones gauti duomenys, pvz., klinikiniai arba profesinių susirgimų tyrimai ir bylų ataskaitos, ir (arba) akių tyrimų su gyvūnais duomenys, kadangi jie suteikia informacijos, tiesiogiai susijusios su poveikiu akims. Toliau įvertinami turimi odos ėsdinimo ar dirginimo duomenys, gauti darant tyrimus su žmonėmis ir (arba) gyvūnais. Medžiagos, kurios yra žinomos kaip ėsdinančios arba labai dirginančios akis, neturėtų būti lašinamos į gyvūnų akis, be to, nereikėtų lašinti medžiagų, kurios ėsdina arba dirgina odą; tokios medžiagos laikomos ėsdinančiomis ir (arba) dirginančiomis akis. Medžiagos, apie kurias yra pakankamai duomenų, kad jos nėra ėsdinančios arba dirginančios, atsižvelgiant į ankstesnius akių tyrimus, irgi neturėtų būti bandomos darant in vivo akių tyrimus.
         
            Struktūros ir aktyvumo ryšių (SAR) analizė (2 pakopa). Analizuojami giminingą struktūrą turinčių medžiagų bandymo rezultatai, jei tokie būtų. Kai tiriant žmones ir gyvūnus gautų duomenų apie giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius pakanką norint įrodyti medžiagų gebą ėsdinti ar jautrinti akis, galima daryti prielaidą kad įvertinimui pateiktos bandomosios medžiagos poveikis bus toks pats. Tokiais atvejais bandomosios medžiagos nebūtina bandyti. Taikant nuosekliųjų bandymų strategiją, neigiami duomenys, gauti tiriant giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius, nėra pakankamas įrodymas, kad medžiaga nėra ėsdinanti ar jautrinanti. Medžiagų geba ėsdinti ir dirginti odą bei akis turi būti nustatoma taikant įteisintus ir priimtus SAR metodus.
         
            Fizikocheminės savybės ir cheminis reaktyvumas (3 pakopa). Medžiagos, turinčios ribines pH vertes, pvz., ≤ 2,0 arba ≥ 11,5, gali turėti didelį vietinį poveikį. Jei ribinė pH vertė yra pagrindinė savybė, pagal kuria medžiaga identifikuojama kaip akis ėsdinanti medžiaga, galima atsižvelgti į rūgšties ar šarmo atsargą (arba buferinę talpą) (5)(6). Jei buferinė talpa leidžia daryti prielaidą, kad medžiaga gali nebūti akis ėsdinanti medžiagą tai turi būti patvirtinta darant papildomus bandymus ir geriau būtų taikyti įteisintą ir priimtą in vitro arba ex vivo bandymą (žr. 5 ir 6 pakopas).
         
            Kitos turimos informacijos nagrinėjimas (4 pakopa). Šioje stadijoje įvertinama visa turima informacija apie sisteminį toksiškumą per odą. Nagrinėjamas ūmus bandomosios medžiagos toksiškumas per odą. Jei buvo įrodyta, kad bandomoji medžiaga yra labai toksiška per odą, nebūtina bandyti jos poveikio akims. Nors nebūtinai turi būti ryšys tarp ūmaus toksiškumo per odą ir akių dirginimo ar ėsdinimo, galima daryti prielaidą, kad medžiagai esant labai toksiškai per odą, ji taip pat bus labai toksiška jos įlašinus į akis. Be to, tokie duomenys gali būti nagrinėjami tarp 2 ir 3 pakopų.
         
            In vitro arba ex vivo bandymų rezultatai (5 ir 6 pakopos). Medžiagų, kurios pasirodė ėsdinančios arba labai dirginančios darant patvirtinto tinkamumo ir priimtą in vitro arba ex vivo bandymą (7)(8), skirtą šiam konkrečiam poveikiui akims arba odai įvertinti, nereikia bandyti su gyvūnais. Galima padaryti prielaidą kad tokios medžiagos turės panašų sunkų poveikį in vivo. Jei įteisintų ir priimtų in vitro ar ex vivo bandymų nėra, 5 ir 6 pakopos praleidžiamos ir iš karto pereinama prie 7 pakopos.
         
            Medžiagos dirginamojo arba ėsdinamojo poveikio odai įvertinimas in vivo (7 pakopa). Jei pirmiau išvardytų tyrimų duomenų nepakanka, norint atlikti įtikinamą duomenų įrodomosios vertės analizę apie medžiagos gebą dirginti ar ėsdinti akis, iš pradžių įvertinama in vivo medžiagos geba dirginti ar ėsdinti odą, taikant bandymo metodą B.4 (4) ir jo priedą (9). Jei įrodoma, kad medžiaga ėsdina arba labai dirgina odą, ji laikoma akis ėsdinančia ir dirginančia medžiagą jei kita informacija nepatvirtina priešingos išvados. Taigi in vivo akių bandymo daryti nereikėtų. Jei medžiaga nėra ėsdinanti arba labai dirginanti odą, turėtų būti daromas in vivo akių bandymas.
         
            Bandymas su triušiais in vivo (8 ir 9 pakopos). In vivo akių bandymą reikėtų pradėti darant pradinį bandymą su vienu gyvūnu. Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad medžiaga yra labai dirginanti arba ėsdinanti akis, toliau bandyti nereikia. Jei darant pradinį bandymą ėsdinimo arba sunkus dirginantis poveikis nepastebimas, daromas patvirtinamasis bandymas, naudojant du papildomus gyvūnus.
         NUORODOS
         
                     1)
                  
                  
                     OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicol ogical Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                  
               
                     2)
                  
                  
                     OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28t Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                  
               
                     3)
                  
                  
                     Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, p. 161–177.
                  
               
                     4)
                  
                  
                     Testing method B.4. Acute Toxicity: dermal irritation/corrosion.
                  
               
                     5)
                  
                  
                     Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, p. 19–26.
                  
               
                     6)
                  
                  
                     Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227–231.
                  
               
                     7)
                  
                  
                     Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483–524.
                  
               
                     8)
                  
                  
                     Testing Method B.40 Skin Corrosion.
                  
               
                     9)
                  
                  
                     Annex to Testing method B.4: A Sequential Testing Strategy for Skin Irritation and Corrosion.
                  
               Schema
         Akių dirginimo ar ėsdinimo bandymo ir įvertinimo strategija
         
            
         
            
      
      B.6.   ODOS SENSIBILIZACIJA
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      
         Pastabos
      
      Jautrūs ir galintys aptikti potencialius žmogaus odos alergenus tyrimai yra svarbūs klasifikuojant pavojus, kylančius žmonių sveikatai.
      Nėra vieno tyrimo metodo, tiksliai nustatančio visas odą galinčias sensibilizuoti medžiagas bei tinkančio visoms medžiagoms.
      Pasirenkant tyrimą, reikia atsižvelgti į medžiagos fizikines savybes, taip pat ir sugebėjimą prasiskverbti pro odą.
      Sukurti dviejų tipų tyrimai, naudojant jūrų kiaulytes, t. y. adjuvantiniai tyrimai, kuriais alerginės reakcijos sustiprinamos tiriamąją medžiagą ištirpinant (ar padarant suspensiją) Freudo pilname adjuvante (FPA) ir neadjuvantiniai tyrimai.
      Adjuvantiniai tyrimai tiksliau nustato žmogaus odą galinčias sensibilizuoti medžiagas negu tyrimai, kurie nenaudoja Freudo pilno adjuvanto.
      Nors gali būti naudojami ir kiti metodai, nustatantys odą sensibilizuoti galinčias medžiagas, jūrų kiaulytės maksimizacijos tyrimas (JKMT) yra plačiausiai naudojamas adjuvantinis tyrimas.
      Manoma, kad neadjuvantiniai tyrimai (plačiausiai naudojamas Buehlerio tyrimas) daugeliui medžiagų klasių yra mažiau jautrūs.
      Kartais dėl svarių priežasčių pasirenkamas Buehlerio tyrimas, naudojantis antodines aplikacijas, o ne jūrų kiaulytės maksimizacijos tyrimas, naudojantis įodines injekcijas. Naudojant Buehlerio tyrimą, tai reikėtų moksliškai pagrįsti.
      Šiame metode aprašyti jūrų kiaulytės maksimizacijos tyrimas (JKMT) ir Buehlerio tyrimas. Moksliškai pagrindus, galima naudoti ir kitus standartizuotus metodus.
      Pripažintam atrankos tyrimui pateikus teigiamą rezultatą, tiriamoji medžiaga gali būti apibūdinama kaip potencialus alergenas, ir tolesnis jūrų kiaulytės tyrimas nebūtinas. Pateikus neigiamą rezultatą, turi būti atliktas jūrų kiaulytės tyrimas, remiantis šiame metode aprašyta procedūra.
      Taip pat žiūrėkite Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      
         Odos sensibilizacija (alerginis kontaktinis dermatitas) – tai imuninės kilmės odos reakcija į medžiagą. Žmonėms atsakas gali pasireikšti odos niežėjimu, paraudimu, patinimu, spuogeliais, pūslėmis, pūslelėmis ar jų deriniu. Gyvūnų odos reakcijos skiriasi, jos pasireiškia paraudimu ir patinimu.
      Indukcinis poveikis – eksperimentinis organizmo poveikis tiriamąja medžiaga, siekiant sukelti organizmo padidėjusio jautrumo būklę.
      Indukcinis periodas – ne trumpesnis negu viena savaitė po indukcinio poveikio; jo metu gali išsivystyti organizmo padidėjusio jautrumo būklė.
      Provokacinis poveikis – pakartotinis organizmo poveikis tiriamąja medžiaga po indukcinio periodo, siekiant nustatyti, ar organizmas reaguoja padidintai jautriai (alergiškai).
      1.3.   KONTROLINĖS MEDŽIAGOS
      Naudojamos eksperimentinės technikos jautrumas ir rezultatų patikimumas turi būti įvertinamas kas šeši mėnesiai, naudojant medžiagas žinomas kaip silpno ar vidutinio stiprumo odos sensibilizatoriai.
      Tinkamai atlikus tyrimą, adjuvantiniame bandyme mažiausiai 30 %, o neadjuvantiniame bandyme mažiausiai 15 % gyvūnų atsakų rodo silpną/vidutinio stiprumo sensibilizatorių (alergeną).
      Yra naudojamos šios medžiagos:
      
                  CAS Nr.
               
               
                  EINECS Nr.
               
               
                  EINECS pavadinimas
               
               
                  Įprastas pavadinimas
               
            
                  101-86-0
               
               
                  202-983-3
               
               
                  cinamono rūgšties heksialdehidas
               
               
                  cinamono rūgšties heksialdehidas
               
            
                  149-30-4
               
               
                  205-736-8
               
               
                  benztiazol-2-tiolis (2-merkaptobenztiazolas)
               
               
                  kaptaksas
               
            
                  94-09-7
               
               
                  202-303-5
               
               
                  benzokainas
               
               
                  nordkainas
               
            Esant svarioms priežastims, atitinkamai pagrindus, galima naudoti kitas kontrolines medžiagas.
      1.4.   TIRIAMOJO METODO PRINCIPAS
      Iš pradžių tiriamieji gyvūnai paveikiami tiriamosios medžiagos įodinėmis injekcijomis ir (arba) antodinėmis aplikacijomis (indukcinis periodas). Praėjus 10-14 dienų poilsio laikotarpiui (indukciniam periodui), kurio metu gali pasireikšti imuninis atsakas, gyvūnai paveikiami provokacine doze. Tiriamųjų gyvūnų odos reakcijos į provokacinį poveikį apimtis ir laipsnis yra lyginami su kontrolinių gyvūnų, kurie patyrė imitacinį (nesensibilizuojančios medžiagos) indukcijos ir provokacijos poveikį.
      1.5.   TIRIAMOJO METODO APRAŠYMAS
      Jeigu tiriamąją medžiagą būtina nuplauti, reikia naudoti vandenį ar tinkamą tirpiklį, kad nepakistų gautas atsakymas ar odos vientisumas.
      1.5.1.   Jūrų kiaulytės maksimizacijos tyrimas (JKMT)
      
      1.5.1.1.   Pasiruošimas
      
      Sveikos jaunos suaugę jūros kiaulytės mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Gyvūnai prieš tyrimą atsitiktinės atrankos būdu paskirstomi į tyrimo grupes. Kailis gali būti pašalinamas žirklėmis, skutimu ar chemine depiliacija, stengiantis išvengti odos įbrėžimų. Gyvūnai pasveriami prieš tyrimo pradžią ir jo pabaigoje.
      1.5.1.2.   Tyrimo sąlygos
      
      1.5.1.2.1.   Tiriamieji gyvūnai
      Naudojamos baltų jūros kiaulyčių įprastinės linijos.
      1.5.1.2.2.   Skaičius ir lytis
      Gali būti naudojami patinai ir (arba) patelės. Patelės turi būti nevedusios jauniklių ir nepastojusios.
      Tiriamojoje grupėje turi būti mažiausiai 10 gyvūnų, o kontrolinėje mažiausiai 5. Panaudojus mažiau negu 20 tiriamųjų ir 10 kontrolinių jūros kiaulyčių, neįmanoma padaryti išvados, kad tiriamoji medžiaga yra alergenas; tiriant papildomą gyvūnų skaičių, griežtai rekomenduojamas bendras tiriamųjų gyvūnų skaičius turi būti ne mažesnis už 20, kontrolinių – ne mažesnis už 10.
      1.5.1.2.3.   Dozių lygiai
      Kiekvienam indukciniam poveikiui naudojama gerai organizmo toleruojama didžiausia tiriamosios medžiagos koncentracija, sukelianti nuo silpno iki vidutinio stiprumo odos sudirginimą. Provokaciniam poveikiui naudojama didžiausia nedirginanti odos tiriamosios medžiagos koncentracija. Jeigu būtina, tinkamos koncentracijos nustatomos parengtiniu tyrimu, naudojant du ar tris gyvūnus. Šiam tikslui galima būtų panaudoti ir FPA paveiktus gyvūnus.
      1.5.1.3.   Procedūra
      
      1.5.1.3.1.   Indukcija
      0 diena – tiriamoji grupė
      Menčių srityje atliekamos 0,1 ml tūrio trys poros įodinių injekcijų. Menčių srityje kailis pašalinamas taip, kad kiekvienos poros dalis yra kitoje nugaros vidurio pusėje.
      1 injekcija: FPA/vandens ar fiziologinio tirpalo mišinys santykiu 1:1
      2 injekcija: tiriamosios medžiagos, ištirpintos tinkamame tirpiklyje, pasirinkta koncentracija
      3 injekcija: tiriamosios medžiagos pasirinkta koncentracija, pagaminta panaudojant mišinį -FP A/vanduo ar fiziologinis tirpalas santykiu 1:1.
      Ruošiant 3 injekciją, vandenyje tirpios medžiagos tirpinamos vandenyje, po to maišomos su FPA. Kai medžiagos tirpios riebaluose ir netirpios vandenyje, pirmiausia padaroma suspensija su FPA, po to įpilama vandens. Tiriamosios medžiagos galutinė koncentracija turi būti tokia pati, kaip ir antrojoje injekcijoje.
      1 ir 2 injekcijos suleidžiamos arčiau galvos viena šalia kitos, tuo tarpu 3 injekcija suleidžiama arčiau uodegos esančiame tiriamajame plote.
      0 diena – kontrolinė grupė
      Tose pat vietose kaip ir tiriamiesiems gyvūnams atliekamos 0,1 ml tūrio trys poros įodinių injekcijų.
      1 injekcija: FPA/vandens ar fiziologinio tirpalo mišinys santykiu 1:1
      2 injekcija: neskiestas tirpiklis
      3 injekcija: tirpiklio 50 % tirpalas, pagamintas panaudojant mišinį – FP A/vanduo ar fiziologinis tirpalas santykiu 1:1.
      5–7 diena – tiriamoji ir kontrolinės grupės
      Jeigu tiriamoji medžiaga nedirgina odos, apytikriai 24 valandas prieš antodines indukcines aplikacijas, nuo tų pačių odos plotelių nukirpus ir (ar) nuskutus kailį, tepamas 0,5 ml 10 % natrio laurilo sulfato tirpalas vazeline (siekiant sukelti vietinį dirginimą).
      6–8 diena – tiriamoji grupė
      Nuo tiriamojo ploto vėl pašalinamas kailis. Filtravimo popierius (2 × 4 cm) sudrėkinamas (padengiamas) tiriamąja medžiaga, ištirpinta tirpiklyje, uždedamas ant tiriamojo ploto ir fiksuojamas okliuzine (nepralaidžia) tvarstomąja medžiaga 48 valandoms. Tirpiklio pasirinkimą reikia pagrįsti. Kietosios medžiagos yra susmulkinamos ir sumaišomos tirpiklyje. Skysčiai gali būti naudojami neskiesti.
      6-8 diena – kontrolinė grupė
      Nuo tiriamojo ploto vėl pašalinamas kailis. Viskas atliekama tai pat kaip ir tiriamojoje grupėje, vietoj tiriamosios medžiagos naudojant tirpiklį; vėliau viskas fiksuojama okliuzine (nepralaidžia) tvarstomąja medžiaga 48 valandoms.
      1.5.1.3.2.   Provokacija
      20–22 diena – tiriamoji ir kontrolinė grupės
      Nuo tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų šonų pašalinamas kailis. Lopas, sudrėkintas (padengtas) tiriamąja medžiaga, uždedamas ant vieno šono odos plotelio. Jeigu reikia, ant kito šono uždedamas lopas, sudrėkintas tirpikliu. Lopas yra fiksuojamos okliuzine tvarstomąja medžiaga 24 valandoms.
      1.5.1.3.3.   Stebėjimas ir vertinimas: tiriamoji ir kontrolinė grupės
      
                  —
               
               
                  praėjus maždaug 21 valandai po lopo nuėmimo, provokacinis plotas nuvalomas, nukerpamas ir (arba) nuskutamas, o jeigu būtina, depiliuojamas,
               
            
                  —
               
               
                  maždaug po 3 valandų (praėjus maždaug 48 valandoms nuo provokacinės aplikacijos pradžios) apžiūrima odos reakcija ir įvertinama balais, taip kaip paaiškinta priede,
               
            
                  —
               
               
                  praėjus maždaug 24 valandoms po šio apžiūrėjimo, odos reakcija apžiūrima antrą kartą (72 valandos) ir įvertinama balais.
               
            Skatinamas tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų vertinimas aklu būdu.
      Jeigu būtina išryškinti pirmoje provokacijoje pastebėtus rezultatus, praėjus maždaug vienai savaitei, atliekama antra provokacija (t. y. reprovokacija) su atitinkama nauja kontrolės grupe. Reprovokaciją taip pat galima atlikti su pradine kontroline grupe.
      Dėl indukcinių ir provokacinių procedūrų kilusios visos odos ir bet kokios neįprastos, taip pat ir somatinės, reakcijos, stebimos ir įvertinamos pagal Magnussono/Kligmano skalę (žiūrėti priedą). Kitos procedūros, pvz., histopatologinis tyrimas, odos raukšlės sustorėjimo matavimas, gali būti atliekamos tik išryškėjus neaiškioms reakcijoms.
      1.5.2.   Buehlerio tyrimas
      
      1.5.2.1.   Pasiruošimas
      
      Sveikos jaunos suaugusios jūros kiaulytės mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Gyvūnai prieš tyrimą atsitiktinės atrankos būdu paskirstomi į tyrimo grupes. Kailis gali būti pašalinamas žirklėmis, skutimu ar chemine depiliacija, stengiantis išvengti odos įbrėžimų. Gyvūnai pasveriami prieš tyrimo pradžią ir jo pabaigoje.
      1.5.2.2.   Tyrimo sąlygos
      
      1.5.2.2.1.   Tiriamieji gyvūnai
      Naudojamos baltų jūros kiaulyčių įprastinės linijos.
      1.5.2.2.2.   Skaičius ir lytis
      Gali būti naudojami patinai ir (arba) patelės. Patelės turi būti nevedusios jauniklių ir nepastojusios.
      Mažiausiai 20 gyvūnų naudojama tiriamojoje ir mažiausiai 10 gyvūnų kontrolinėje grupėse.
      1.5.2.2.3.   Dozių lygiai
      Kiekvienam indukciniam poveikiui naudojama didžiausia tiriamosios medžiagos koncentracija, sukelianti silpną ne pernelyg didelį odos sudirginimą. Provokaciniam poveikiui naudojama didžiausia nedirginanti odos tiriamosios medžiagos koncentracija. Jeigu būtina, tinkamos koncentracijos nustatomos parengtiniu tyrimu, naudojant du ar tris gyvūnus.
      Vandenyje tirpioms tiriamosioms medžiagoms tirpikliu naudojamas vanduo ar atskiestas nedirginantis ploviklio (detergento) tirpalas. Kitoms tiriamosioms medžiagoms indukcijai tirpikliu naudojamas 80 % etanolis, o provokacijai acetonas.
      1.5.2.3.   Procedūra
      
      1.5.2.3.1.   Indukcija
      0 diena – tiriamoji grupė
      Nuo vieno gyvūno šono pašalinamas kailis. Tyrimui naudojamas lopas turi būti pilnai prisigėręs tiriamosios medžiagos, ištirpintos tirpiklyje (tirpiklio pasirinkimą reikia pagrįsti; skystos tiriamosios medžiagos gali būti neskiedžiamos).
      Tyrimui naudojamas lopas (kompresas) pridedamas prie bandomojo ploto ir 6 h laikomas prispaustas prie odos okliuziniu lopu arba gaubteliu ir tinkama tvarstomąja medžiaga.
      Tyrimui naudojamas lopas turi būti okliuzinis. Jam tinka vatos sluoksnis, jis gali būti apvalus ar kvadratinis, maždaug 4-6 cm . Nepralaidi medžiaga geriausiai užtikrina okliuziją. Naudojant kitokią medžiagą, lopą reiktų ilgiau laikyti.
      0 diena – kontrolinė grupė
      Nuo vieno gyvūno šono pašalinamas kailis. Viskas atliekama tai pat kaip ir tiriamojoje grupėje, vietoj tiriamosios medžiagos naudojant tik tirpiklį. Tyrimui naudojamas lopas fiksuojamas tinkama tvarstomąja medžiaga 6 valandoms. Jeigu parodoma, kad imitacinė kontrolinė grupė nebūtina, gali būti naudojama paprasta kontrolinė grupė.
      6–8 ir 13–15 diena – tiriamoji ir kontrolinė grupė
      6–8 ir 13–15 dienomis ant to paties šono tiriamojo ploto (jei būtina, pašalinus kailį) atliekamos tokios pačios pakartotinos aplikacijos kaip ir 0 dieną.
      1.5.2.3.2.   Provokacija
      27–29 diena – tiriamoji ir kontrolinė grupė
      Nuo netirto tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų šono pašalinamas kailis. Ant tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų užpakalinio netirto šono dedamas prisigėręs reikiamo kiekio tiriamosios medžiagos okliuzinis lopas. Medžiaga turi būti didžiausios nedirginančios koncentracijos.
      Kada reikia, ant tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų priekinio netirto šono dedamas okliuzinis lopas, prisigėręs tik tirpiklio. Viskas fiksuojama tinkama tvarstomąja medžiaga 6 valandoms.
      1.5.2.3.3.   Stebėjimas ir vertinimas
      
                  —
               
               
                  praėjus maždaug 21 valandai po lopo nuėmimo, nuo provokacinio ploto pašalinamas kailis,
               
            
                  —
               
               
                  maždaug po 3 valandų (praėjus maždaug 30 valandų nuo provokacinės aplikacijos) apžiūrima odos reakcija ir įvertinama balais, taip kaip paaiškinta priede,
               
            
                  —
               
               
                  praėjus maždaug 24 valandoms po 30 valandų apžiūrėjimo (maždaug 54 valandoms po provokacinės aplikacijos), odos reakcija apžiūrima antrą kartą ir įvertinama balais.
               
            Skatinamas tiriamųjų ir kontrolinių gyvūnų vertinimas akluoju būdu.
      Jeigu būtina išryškinti pirmoje provokacijoje pastebėtus rezultatus, praėjus maždaug vienai savaitei, atliekama antra provokacija (t. y. reprovokacija) su atitinkama nauja kontrolės grupe. Reprovokaciją taip pat galima atlikti su pradine kontroline grupe.
      Dėl indukcinių ir provokacinių procedūrų kilusios visos odos ir bet kokios neįprastos, tame tarpe somatinės, reakcijos, stebimos ir įvertinamos pagal Magnussono/Kligmano skalę (žiūrėti priedėlį). Kitos procedūros, pvz., histopatologinis tyrimas, odos raukšlės sustorėjimo matavimas, gali būti atliekamos tik išryškėjus neaiškioms reakcijoms.
      2.   DUOMENYS (JKMT IR BUEHLERIO)
      Duomenys turi būti pateikti lentelės forma, parodant kiekvieno gyvūno odos reakciją kiekvieno stebėjimo metu.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS (JKMT IR BUEHLERIO)
      Jeigu prieš bandymą su jūrų kiaulytėmis buvo atliktas atrankos tyrimas, jo aprašymas ir šaltiniai (pvz., vietinio limfinio mazgo tyrimas, pelės akies patinimo tyrimas) turi būti pateikiami kartu su tiriamosios ir kontrolinės medžiagų gautais rezultatais.
      Tyrimo ataskaita (JKMT ir Buehlerio)
      Tyrimo ataskaitoje turėtų būti ši informacija.
      
                   
               
               
                  Tiriamieji gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              panaudotos jūrų kiaulyčių linijos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              skaičius, amžius ir gyvūnų lytis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gavimo šaltinis, laikymo sąlygos, pašarai ir kt.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tyrimo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              ploto aplikacijai paruošimo technika,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalės apie lopui panaudotas medžiagas ir techniką,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              atrankos tyrimo rezultatai su išvada apie indukcijai ir provokacijai naudotinas koncentracijas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalės apie tiriamosios medžiagos paruošimą, aplikaciją ir nuėmimą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tirpiklio parinkimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tirpiklio ir tiriamosios medžiagos koncentracijos, naudotos indukciniam ir provokaciniam poveikiui bei bendras medžiagos kiekis, sunaudotas indukcijai ir provokacijai.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              rezultatų suvestinė su paskutiniu jautrumo ir patikimumo patikrinimu (žr. 1.3), be to, informacija apie panaudotą medžiagą, koncentraciją ir tirpiklį,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno įvertinimas balais kartu su vertinimo sistema,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sukeltų poveikių prigimties ir laipsnio pasakojamasis aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              histopatologiniai duomenys.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   LITERATŪRA
      Šis metodas yra analogiškas EBPO 406 tyrimo gairėms.
      
         Priedėlis
         LENTELĖ
         Magnussono/Kligmano skalė reakcijai į provokacinį mėginį įvertinti
         0 = nėra matomų pakitimų
         1 = ribotas arba nevienodo intensyvumo paraudimas
         2 = vidutinis ir susiliejantis paraudimas
         3 = intensyvus paraudimas ir patinimas
      
      B.7.   PAKARTOTINĖS DOZĖS (28 DIENŲ) TOKSIŠKUMAS (PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ)
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žiūrėti Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žiūrėti Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   TIRIAMOJO METODO PRINCIPAS
      Tiriamosios medžiagos dozės duodamos 28 dienas kasdien paeiliui kelioms eksperimentinių gyvūnų grupėms – po vieną dozės lygį vienai grupei. Kiekvieną dieną medžiagos davimo periodu gyvūnai atidžiai stebimi toksiškumo požymiams nustatyti. Tyrimo metu žuvę arba nužudyti gyvūnai skrodžiami, o tie, kurie išgyveno, nužudomi ir skrodžiami tyrimo pabaigoje.
      Šio tiriamojo metodo specifinis tikslas yra medžiagos neurologinio poveikio nustatymas, o tai reikalauja labai atidžių gyvūnų klinikinių stebėjimų. Šis metodas nustato potencialiai neurotoksinius chemikalus, kas sąlygoja vėlesnius tyrimus šiuo aspektu. Be to šis metodas gali suteikti duomenų apie medžiagos imunologinį poveikį bei poveikį reproduktyvumui.
      1.4.   TIRIAMOJO METODO APRAŠYMAS
      1.4.1.   Pasiruošimas
      Sveiki jauni suaugę gyvūnai atsitiktinės atrankos principu suskirstomi į kontrolinę ir tiriamąsias grupes. Galimas narvų išdėstymo poveikis tyrimo rezultatams turėtų būtų minimalus. Kiekvienas gyvūnas individualiai pažymimas ir mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamas narvuose laboratorijos sąlygomis.
      Tiriamoji medžiaga leidžiama zondu arba duodama su pašarais ar geriamu vandeniu. Medžiagos patekimo į virškinamąjį traktą kelias priklauso nuo tyrimo tikslų bei fizikinių ir cheminių medžiagos savybių.
      Jeigu būtina, tiriamoji medžiaga yra ištirpinama arba padaroma jos suspensija tirpiklyje. Pirmiausia rekomenduojamas vandens tirpalas/suspensija, esant svarioms priežastims naudojamas aliejaus (pvz., kukurūzų) tirpalas/suspensija ir tik po to galimi tirpalai kituose tirpikliuose. Naudojamo tirpiklio (ne vandens) toksinės savybės turi būti žinomos. Turėtų būti nustatytas tiriamosios medžiagos pastovumas tirpiklyje.
      1.4.2.   Tyrimo sąlygos
      1.4.2.1.   Tiriamieji gyvūnai
      Nors gali būti naudojamos ir kitos graužikų rūšys, pirmenybė teikiama žiurkėms. Naudojamos jaunų sveikų suaugusių gyvūnų įprastos laboratorinės linijos. Patelės turi būti nevedę jauniklių ir nepastojusios. Medžiagos dozavimas prasideda tuoj po nujunkymo, bet ne vėliau nei gyvūnams sueina devynios savaitės.
      Tyrimo pradžioje gyvūnų kūno masės skirtumai turi būti minimalūs ir neviršyti tos lyties kūno masės vidurkio ± 20 %.
      Jeigu prieš ilgalaikį atliekamas preliminarinis pakartotinos dozės per virškinamąjį traktą tyrimas, abiejuose tyrimuose naudojami gyvūnai turi būti tos pačios linijos ir gauti iš to paties šaltinio.
      1.4.2.2.   Skaičius ir lytis
      Kiekvienam dozės lygiui turėtų būti panaudota mažiausiai 10 gyvūnų (penki patinai ir penkios patelės). Jeigu bandymo eigoje planuojamas dalies gyvūnų žudymas, tai pradinis jų skaičius turėtų būti tiek pat padidintas.
      Tam, kad 14 dienų po dozavimo būtų galima tirti toksinių poveikių grįžtamumą, pastovumą ar uždelstumą gali būti sudaryta papildoma 10 gyvūnų grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus), 28 dienas gaunanti didelę medžiagos dozę. Tokiais atvejais naudojama ir papildoma 10 gyvūnų kontrolinė grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus).
      1.4.2.3.   Dozių lygiai
      Iš viso turėtų būti panaudotos mažiausiai trys tiriamosios ir viena kontrolinė grupės. Su kontrolinės grupės gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat kaip ir su tiriamaisiais gyvūnais, išskyrus tai, kad jie negauna tiriamosios medžiagos. Jeigu duodant tiriamąją medžiagą naudojamas tirpiklis, kontrolinė grupė turėtų gauti didžiausią tiriamojoje grupėje panaudotą tirpiklio tūrį.
      Jeigu įvertinus turimus duomenis, nesitikima jokio 1 000 mg/kg k. m./d medžiagos dozės poveikio, galima atlikti ribinį bandymą. Jeigu dozių nustatymui nėra tinkamų duomenų, galima atlikti papildomus tyrimus.
      Dozės lygius reikia parinkti atsižvelgiant į jau turimus tiriamosios ar jai giminingos medžiagos toksiškumo ir (toksiko-) kinetinius duomenis. Pasirinktas aukščiausias dozės lygis turi sukelti toksinius poveikius, tačiau nesukelti gyvūno žūties ar nepakeliamų kančių. Kiti mažesni dozių lygiai turėtų sukelti atitinkamai mažesnius pokyčius (atsakus), o mažiausias dozės lygis turi turėti nepastebimą neigiamą poveikį (NNPL). Mažėjančia tvarka einantys dozių lygiai vienas nuo kito turėtų skirtis du-keturis kartus, tik ketvirtai papildomai tiriamajai grupei dažnai parenkamas didesnis intervalas tarp dozių (pvz., faktorius didesnis negu 10).
      Tiriamosios medžiagos, duodamos su pašarais ar geriamu vandeniu turi netrukdyti normaliam gyvūnų maitinimuisi ar vandens balansui. Kai tiriamoji medžiaga duodama su pašarais, jos dozė gali būti išreiškiama kaip pastovi pašarų koncentracija (ppm) arba kaip pastovus dozės lygis gyvūno kūno masės vienetui; kitus pasirinktus dozės išraiškos būdus reikėtų tiksliai apibrėžti. Zondu medžiagas reikia suleisti kasdien tuo pačiu laiku, be to, medžiagos dozės lygis gyvūno kūno masės vienetui turėtų būti pastovus.
      Jeigu prieš ilgalaikį atliekamas preliminarus pakartotinos dozės tyrimas, abiejuose tyrimuose gyvūnams turi būti duodami panašūs pašarai.
      1.4.2.4.   Ribinis bandymas
      Jeigu vieno dozės lygio, ne žemesnio negu 1 000 mg/kg k. m./d, ir atitinkamo procento pašaruose ar geriamame vandenyje (nustatant pagal gyvūno kūno masę, gaunant su pašarais ar geriamu vandeniu), tyrimas nesukelia pastebimų toksinių poveikių ir jeigu iš turimų duomenų apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, pilnas trijų dozių lygių tyrimas nebūtinas. Ribinis bandymas neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveikį žmogui, reikia naudoti didesnes dozes.
      1.4.2.5.   Stebėjimo periodas
      Stebėjimo periodas turėtų trukti 28 dienas. Papildoma gyvūnų grupė dar mažiausiai 14 dienų po tiriamosios medžiagos gavimo galėtų būti stebima, nustatant poveikių uždelstumą, pastovumą ar atsigavimą nuo jų.
      1.4.3.   Procedūra
      Gyvūnams tiriamoji medžiaga duodama 28 dienas kasdien septynias dienas savaitėje; jeigu laikomasi penkių dienų savaitėje režimo, tai reikia pagrįsti. Vienkartinė tiriamosios medžiagos dozė suleidžiama zondu, naudojant skrandžio vamzdelį ar tinkamą intubavimo (įleidimo) kaniulę. Maksimalus vienkartinis suleidžiamo skysčio tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Tiriamosios medžiagos tirpalo tūris neturi viršyti 1 ml/100 g kūno masės, tačiau naudojant vandeninį tiriamosios medžiagos tirpalą galima suleisti 2 ml/100 g kūno masės. Dirginamųjų ir ardančiųjų medžiagų, kurių didelės koncentracijos sukelia sunkius poveikius, tūrio svyravimai turi būti minimalūs.
      1.4.3.1.   Bendri stebėjimai
      Bendrus klinikinius stebėjimus reikia atlikti mažiausiai kartą per dieną geriausiai – tuo pačiu dienos metu, atsižvelgiant į laukiamų poveikių piką. Gyvūnų sveikatos būklę reikia registruoti. Mažiausiai du kartus per dieną visi gyvūnai turėtų būti patikrinami – ar sveiki, ar nepadvėsę. Dvesiantys ar patiriantys dideles kančias ir skausmą gyvūnai turi būti iškeliami iš narvų, pažymimi, humaniškai nužudomi ir skrodžiami.
      Prieš viso tyrimo pradžią atliekami atidesni klinikiniai visų gyvūnų stebėjimai (individų palyginimui), o vėliau mažiausiai kartą per savaitę. Kiekvieną kartą šie stebėjimai atliekami tuo pačiu metu, perkėlus gyvūną iš narvo į tam skirtą vietą. Geriausia, kai stebėjimai yra kruopščiai registruojami pagal toje laboratorijoje tiksliai apibūdintą vertinimo sistemą. Tyrimo aplinkybių svyravimas turi būti minimalus ir stebėtojai apie tyrimą turėtų nežinoti. Stebėjimo metu nereikėtų apsiriboti odos, kailio, akių, gleivinės pakitimų, išskyrų atsiradimų, autonominio aktyvumo (pvz., ašarojimo, plaukų pašiaušimo, vyzdžio dydžio, neįprastų kvėpavimo pakitimų) registravimu. Reikėtų registruoti eisenos, pozos, reakcijos į paėmimą rankomis pakitimus, kloninių ar toninių judesių atsiradimą bei stereotipinį (pvz., besaikį valymąsi, pasikartojantį sukimąsi ratu) ar keistą (pvz., savęs luošinimą, vaikščiojimą atbulomis) elgesį.
      Ketvirtą poveikio savaitę turėtų būti įvertintas juntamasis reaktyvumas į skirtingų tipų stimulą (pvz., klausos, regėjimo ir proprioreceptorinį), jėgos (spaudimo) stiprumas bei judamasis aktyvumas. Procedūrų papildomos detalės pateiktos Bendrojo įvado B dalyje.
      Jeigu prieš subchroninį (90 dienų) atliekamas preliminarinis pakartotinos dozės tyrimas, funkciniai stebėjimai ketvirtą savaitę gali būti neatliekami. Tokiu atveju šie stebėjimai atliekami subchroninio tyrimo metu. Iš kitos pusės, tokie funkciniai stebėjimai pakartotinos dozės tyrime padidina galimybę geriau parinkti dozių lygius tolesniam subchroniniam tyrimui.
      Išimtiniais atvejais funkciniai stebėjimai neatliekami ir tose grupėse, kuriose toksiškumo požymiai nustatomi tokio laipsnio, kad reikšmingai trukdo funkciniams tyrimams.
      1.4.3.2.   Kūno masė ir maisto/vandens suvartojimas
      Visus gyvūnus mažiausiai vieną kartą per savaitę reikia pasverti. Mažiausiai vieną kartą per savaitę reikia išmatuoti maisto ir vandens suvartojimą. Jeigu tiriamoji medžiaga yra duodama su geriamu vandeniu, vandens suvartojimas taip pat turi būti išmatuojamas nerečiau kaip kartą per savaitę.
      1.4.3.3.   Hematologija
      Tyrimo pabaigoje nustatoma: hematokritas, hemoglobino koncentracija, eritrocitų kiekis, bendras ir atskiras leukocitų kiekis, trombocitų kiekis ir kraujo krešėjimo laikas/potencialas.
      Kraujo pavyzdžius reikėtų paimti iš nurodomų vietų dar prieš arba gyvūnų žudymo metu ir saugoti atitinkamomis sąlygomis.
      1.4.3.4.   Klinikinė biochemija
      Tam, kad ištirti pagrindinius toksinius poveikius audiniams, o ypač inkstams ir kepenims, dar prieš arba gyvūnų žudymo metu (neskaitant dvesiančių gyvūnų ar nužudytų bandymo metu), reikėtų atlikti kraujo klinikinius biocheminius tyrimus. Prieš kraujo pavyzdžių paėmimą rekomenduojama iš vakaro gyvūnams badauti (2). Kraujo plazmoje arba serume tiriama: natris, kalis, bendras cholesterolis, šlapalas, kreatininas, bendras baltymas ir albuminas, mažiausiai du fermentai, rodantys poveikį kepenų ląstelėms (tokie kaip alaninaminotransferazė, aspartataminotransferazė, šarminė fosfatazė, gamaglutamiltranpeptidazė ir sorbitoldehidrogenazė). Tam tikromis aplinkybėmis papildomi fermentų (hepatinės ar kitos kilmės) ir tulžies rūgščių tyrimai gali suteikti naudingos informacijos.
      Jeigu paskutinę tyrimų savaitę atliekami neprivalomi šlapimo tyrimai, jis surenkamas per nurodytą laiko tarpą bei nustatoma: šlapimo tūris, išvaizda, kvapas, lyginamasis svoris, pH, baltymai, gliukozė ir kraujo ląstelės.
      Galima atlikti papildomus serumo rodiklių, rodančių pagrindinių audinių pažeidimus, tyrimus. Jeigu žinomas ar įtariamas tiriamosios medžiagos poveikis organizmo medžiagų apykaitai, galima tirti kalcį, fosforą trigliceridus badavus, specifinius hormonus, methemoglobiną bei cholinesterazę. Tam tikrų grupių medžiagoms arba pastebėjus kai kuriuos neigiamus pakitimus tokie tyrimai būtini.
      Naudojamos gyvūnų rūšys, pastebėti ir (ar) laukiami tiriamos medžiagos sukelti pokyčiai verčia lanksčiai pasirinkti tiriamuosius rodiklius.
      Jeigu turimi duomenys apie medžiagą yra prieštaringi, pagrindinį dėmesį dar prieš dozavimo pradžią reikėtų kreipti į hematologinių ir klinikinių biocheminių kintamųjų nustatymo kokybę.
      1.4.3.5.   Bendrasis skrodimas
      Kiekvienas tiriamasis gyvūnas turi būti skrodžiamas, atidžiai ištiriamas jo kūno paviršius bei visos jo angos, kaukolė, krūtinės ląsta, pilvo ertmės bei jų turinys. Vengiant išdžiuvimo, visų gyvūnų kepenys, inkstai, antinksčiai, sėklidės, prielipai, užkrūčio liauka, blužnis, smegenys bei širdis turi būti nuvalyti nuo prigludusių pašalinių audinių ir kuo greičiau pasverti.
      Audinius reikia konservuoti geriausiai jiems tinkamoje fiksavimo terpėje. Histopatologiškai reikėtų ištirti visus bendruosius pakenkimus, smegenis (jų būdingiausias dalis – didžiąsias smegenis, smegenėles ir smegenų tiltą), nugaros smegenis, skrandį, mažąsias ir didžiąsias žarnas (taip pat Peyerio plokšteles), kepenis, inkstus, antinksčius, blužnį, širdį, užkrūčio liauką skydliaukę, trachėją ir plaučius (pripučiant fiksuojamosios medžiagos, o po to panardinant), lytines liaukas, papildomus lytinius organus (pvz., gimdą, prostatą), šlapimo pūslę, limfinius mazgus (vienas limfinis mazgas turėtų atspindėti medžiagos patekimo kelią o kitas, esantis tolėliau, turėtų atspindėti sisteminius poveikius), esantį arčiau raumens periferinį nervą (sėdimąjį arba blauzdikaulio) bei kaulų čiulpų dalį (arba šviežiai paruoštą kaulų čiulpų punkciją). Gauti klinikiniai ir kitokie duomenys gali pareikalauti ištirti papildomus audinius. Be to, turėtų būti konservuojami visi numanomi tiksliniai organai.
      1.4.3.6.   Histopatologinis ištyrimas
      Visų kontrolinės ir didžiausios dozės grupių gyvūnų organus ir audinius reikia visiškai histopatologiškai ištirti. Jeigu didžiausios dozės gyvūnų grupėje dėl medžiagos poveikio kilo pakitimai, histopatologiškai ištirti galima ir kitų grupių gyvūnus.
      Visus bendruosius pakenkimus reikia ištirti.
      Papildomos grupės gyvūnų pakenktus audinius ir organus taip pat reikia histopatologiškai ištirti.
      2.   DUOMENYS
      Turėtų būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to visi duomenys turėtų būti sutraukti į lenteles, pateikiant kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičių tyrimų pradžioje, padvėsusių gyvūnų ar tyrimo metu humaniškumo sumetimais nužudytų bei gyvūnų su toksinio poveikio požymiais skaičių, kiekvienos žūties ar nužudymo laiką, pastebėtų toksinio poveikio požymių apibūdinimą, tame tarpe jų pasireiškimo pradžią, trukmę ir sunkumo laipsnį, gyvūnų su pakenkimais skaičių, pakenkimų tipą ir gyvūnų su įvairių tipų pakenkimais procentą.
      Jeigu įmanoma, skaitmeniniai rezultatai turėtų būti apdoroti tinkamais ir priimtinais statistiniais metodais. Statistiniai metodai turėtų būti pasirinkti planuojant tyrimą.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      
         Tyrimo ataskaita
      
      Tyrimo ataskaitoje turėtų būti ši informacija:
      
                   
               
               
                  Tiriamieji gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              panaudotos rūšys/linijos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gavimo šaltinis, laikymo sąlygos, pašarai ir kt.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje, kiekvieną savaitę ir tyrimo pabaigoje.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tyrimo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              pagrindimas, jeigu tirpikliu pasirinktas ne vanduo,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dozių lygių parinkimo paaiškinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalės apie tiriamosios medžiagos mišinio su pašarais paruošimą, preparato gauta koncentracija, pastovumas ir homogeniškumas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              poveikio tiriamąja medžiaga detalės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              perskaičiavimas tiriamosios medžiagos koncentracijos maiste/vandenyje (ppm) į faktinę dozę (mg/kg k. m./d), jeigu įmanoma,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              maisto ir vandens kokybė.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              kūno masė/kūno masės pokyčiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              maisto ir vandens suvartojimas, jeigu įmanoma,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie atsaką į toksinį poveikį, taip pat ir toksiškumo požymius, pagal lytį ir dozės lygį,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              klinikinių stebėjimų tipas, sunkumo laipsnis ir trukmė (kurie grįžtami, kurie ne),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              juntamojo aktyvumo, spaudimo (jėgos) stiprumo ir judamojo aktyvumo įvertinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              hematologiniai tyrimai su svarbiausiomis palyginamosiomis reikšmėmis;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              klinikiniai biocheminiai tyrimai su svarbiausiomis palyginamosiomis reikšmėmis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kūno masė nužudymo metu bei organų masė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              skrodimo duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visų histopatologinių duomenų smulkus aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              absorbcijos duomenys, jeigu yra,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinis rezultatų apdorojimas ten, kur tinka.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   LITERATŪRA
      Šis metodas yra analogiškas EBPO 407 tyrimo gairėms.
      B.8.   KARTOTINIŲ DOZIŲ (28 DIENOS) TOKSIŠKUMAS (INHALIACINIS)
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Naudinga turėti išankstinę informaciją apie medžiagos dalelių dydžio pasiskirstymą, garų slėgį, lydymosi temperatūrą, virimo temperatūrą, pliūpsnio temperatūrą ir sprogumą (atitinkamais atvejais).
      Taip pat žr. bendrąją įvadinę B(A) dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. bendrąją įvadinę B(B) dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   BANDYMO METODO ESMĖ
      Kelios eksperimentinių gyvūnų grupės kiekvieną dieną apibrėžtu laikotarpiu yra paveikiamos tiriamąja medžiaga suskirstytomis koncentracijomis, viena koncentracija naudojama vienai grupei 28 dienas. Jeigu tirpiklis naudojamas tam, kad būtų lengviau gaunama atitinkama tiriamosios medžiagos koncentracija aplinkoje, turėtų būti naudojama kontrolinė tirpiklio grupė. Medžiagos įvedimo laikotarpiu gyvūnai stebimi kiekvieną dieną toksiškumo požymiams nustatyti. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, atliekama autopsija, o bandymui pasibaigus, išlikusiems gyviems gyvūnams daroma autopsija.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   BANDYMO METODO APIBŪDINIMAS
      1.6.1.   Pasirengimas
      Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis laikymo ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento pradžios. Prieš bandymą sveiki jauni gyvūnai randomizuojami ir suskirstomi į reikalingą skaičių grupių. Tam tikrais atvejais į tiriamąją medžiagą gali būti dedama atitinkamo tirpiklio, kad būtų lengviau gaunama atitinkama medžiagos koncentracija aplinkoje. Jeigu tirpiklis arba kiti priedai naudojami dozavimui palengvinti, turi būti žinoma, kad jie nesukelia toksiško poveikio. Atitinkamais atvejais gali būti naudojami ankstesnių bandymų duomenys.
      1.6.2.   Bandymo sąlygos
      1.6.2.1.   Eksperimentiniai gyvūnai
      Jeigu nėra kontraindikacijų, pirmenybė atiduodama žiurkėms. Naudojamos įprastų laboratorinių veislių jauni, sveiki gyvūnai.
      Bandymą užbaigus naudotų gyvūnų svorio pokyčiai neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio.
      1.6.2.2.   Skaičius ir lytis
      Kiekvienoje bandymo grupėje turėtų būti naudojama ne mažiau 10 gyvūnų (penkios patelės ir penki patinėliai). Patelės turėtų būti neturėjusios jauniklių ir būti nevaikingos. Jeigu planuojami tarpiniai nužudymai, gyvūnų skaičius turėtų būti padidinamas tokiu gyvūnų skaičiumi, kuris buvo planuojamas nužudyti iki bandymo pabaigos. Be to, papildoma 10 gyvūnų grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus) gali būti paveikiama didele koncentracija 28 dienas ir po poveikio 14 dienų stebimi toksinių poveikių grįžtamumo, stabilumo arba uždelsto atsiradimo požymiai. Taip pat naudojama papildoma kontrolinė 10 gyvūnų grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus).
      1.6.2.3.   Poveikio koncentracija
      Turi būti ne mažiau kaip trys tiriamosios medžiagos koncentracijos ir viena kontrolinė arba tirpiklio kontrolinė grupė (atitinkanti didžiausios dozės tirpiklio koncentraciją), jeigu naudojamas tirpiklis. Išskyrus tuos atvejus, kai paveikiama tiriamąja medžiaga, su kontrolinės grupės gyvūnais turėtų būti elgiamasi visiškai taip pat, kaip su bandomosios grupės gyvūnais. Didžiausia koncentracija turėtų sukelti toksiškumo, poveikį, bet neturi būti mirštamumo arba tik kelių tokių atvejų priežastimi. Mažiausia koncentracija neturėtų sukelti jokio toksiškumo požymio. Jeigu yra praktinis poveikio žmogui įvertinimas, mažiausia dozė jį turėtų viršyti. Geriausia, jeigu vidurinė dozė galėtų sukelti mažiausius pastebimus toksiškumo poveikius. Jeigu naudojama daugiau negu viena tarpinė dozė, dozės turėtų būti išskirstomos intervalais taip, kad toksiškus poveikius būtų galima grupuoti. Mažų ir tarpinių dozių bei kontrolinėje grupėse žūties atvejų paplitimas turėtų būti nedidelis, kad būtų galima prasmingai įvertinti rezultatus.
      1.6.2.4.   Poveikio trukmė
      Kiekvienos dienos poveikio trukmė turėtų būti šešios valandos, bet gali būti reikalingi kitokie laikotarpiai, kad atitiktų specialius reikalavimus.
      1.6.2.5.   Įrenginiai
      Gyvūnai turėtų būti bandomi inhaliacinėje įrangoje, sukonstruotoje taip, kad būtų išlaikomas dinaminis oro srautas, kuriam esant per valandą oras pasikeičia ne mažiau kaip 12 kartų, užtikrinant pakankamą deguonies kiekį ir vienodą poveikio atmosferos pasiskirstymą. Jeigu naudojama kamera, ji turėtų būti taip suprojektuota, kad bandomieji gyvūnai nesibūriuotų ir kad įkvepiant tiriamosios medžiagos būtų kiek įmanoma padidintas poveikis. Paprastai, norint užtikrinti kameros atmosferos pastovumą, visas bandomųjų gyvūnų „tūris“ neturėtų viršyti 5 proc. bandymo kameros tūrio. Gali būti naudojamas burnos ir nosies, tik galvos arba atskirai viso kūno poveikis kameroje; du pirmieji sumažins kitais dviem atvejais sunaudojamą kiekį.
      1.6.2.6.   Stebėjimo laikotarpis
      Toksiškumo požymiai eksperimentiniams gyvūnams turėtų būti stebimi kiekvieną dieną viso poveikio metu ir sveikimo laikotarpiu. Nugaišimo laikas ir tas laikas, kai pasireiškia ir išnyksta toksiškumo požymiai, turėtų būti registruojamas.
      1.6.3.   Darbo eiga
      Gyvūnai 28 dienų laikotarpiu nuo penkių iki septynių dienų per savaitę kiekvieną dieną yra veikiami tiriamąja medžiaga. Gyvūnai, esantys bet kurioje papildomoje grupėje, kuri toliau stebima, turėtų būti laikomi dar 14 dienų neatliekant bandymų, kad būtų galima nustatyti atsigavimą po toksiškų poveikių arba tokių poveikių išsilaikymą. Temperatūra, kuriai esant vykdomas bandymas, turėtų būti palaikoma 22 ± 3 oC.
      Tinkamiausias santykinis drėgnumas yra tarp 30 ir 70 %, bet tam tikrais atvejais (pvz., atliekant tam tikrų aerozolių bandymus) tai gali būti neįgyvendinama. Išlaikant kameros viduje nedidelį neigiamą slėgį (≤ 5 mm vandens), tiriamoji medžiaga negalės patekti į aplinką. Poveikio metu neturi būti duodama pašaro ir vandens.
      Turėtų būti naudojama dinaminė inhaliacijos sistema, kartu su atitinkama analizės koncentracijos kontrolės sistema. Tinkamas poveikio koncentracijas rekomenduojama nustatyti bandomuoju tyrimu. Oro srautas turėtų būti nustatomas taip, kad poveikio kameroje būtų užtikrinamos vienarūšės sąlygos. Tokia sistema turėtų užtikrinti, kad kaip galima greičiau būtų nustatomos pastovios poveikio sąlygos.
      Turėtų būti matuojama arba kontroliuojama:
      
                  a)
               
               
                  oro srauto greitis (nenutrūkstamai);
               
            
                  b)
               
               
                  tikroji tiriamosios medžiagos koncentracija, matuojama kvėpavimo zonoje. Kasdieninio poveikio laikotarpiu koncentracija neturėtų svyruoti daugiau negu ±15 % vidutinės vertės. Tačiau tam tikrų aerozolių atveju šio kontrolės lygio neįmanoma pasiekti, tada būtų priimtinas platesnis intervalas. Viso bandymo metu kiekvienos dienos koncentracijos turėtų būti, kiek tai praktiškai įmanoma, išlaikomos pastovios. Aerozoliams ne mažiau kaip viena dalelių dydžio analizė turėtų būti atliekama kiekvienai bandomajai grupei per savaitę;
               
            
                  c)
               
               
                  temperatūra ir drėgnumas, jeigu įmanoma nenutrūkstamai.
               
            Poveikio metu ir po jo vykdomi nuolatiniai stebėjimai ir registravimas; kiekvienam gyvūnui turėtų būti daromi atskiri įrašai. Visi gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną, o toksiškumo požymiai registruojami nurodant pasireiškimo laiką, jų laipsnį ir trukmę. Turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir akies gleivinės pokyčiai, taip pat kvėpavimo, kraujo apytakos, vegetacinės ir centrinės nervų sistemų pokyčiai, somatomotorinės veiklos ir elgsenos sutrikimai. Kiekvieną savaitę turėtų būti nustatomas gyvūnų svoris. Taip pat rekomenduojama kiekvieną savaitę matuoti suvartoto pašaro kiekį. Reguliarus gyvūnų stebėjimas yra reikalingas tam, kad būtų užtikrinama, jog kiek įmanoma bus stengiamasi bandymo metu neprarasti gyvūnų dėl tokių priežasčių kaip kanibalizmas, audinių autolizė arba dėl netinkamo taikymo metodo. Bandymo laikotarpio pabaigoje išlikusiems gyviems nepagalbinio poveikio grupių gyvūnams atliekama autopsija. Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kenčiantys dideles kančias ar skausmą, kai tai pastebima, turėtų būti pašalinami, humaniškai nužudomi ir atliekama autopsija.
      Bandymo pabaigoje visiems gyvūnams, taip pat ir kontroliniams, atliekami tokie tyrimai:
      
                  i)
               
               
                  hematologija, taip pat bent jau kraujo kūnelių, hemoglobino koncentracijos, eritrocitų kiekio apskaičiavimas, visas ir diferencinis leukocitų kiekis ir krešėjimo matavimas;
               
            
                  ii)
               
               
                  klinikinė kraujo biochemija, taip pat įtraukiant ne mažiau kaip vieną kepenų ir inkstų funkcijų parametrą: alanino aminotransferazės serumas (anksčiau žinomas kaip glutamo piruvo transaminazė), aspartate aminotransferazės serumas (anksčiau žinomas kaip glutamo oksalato transminazė), šlapimo azotas, albuminas, kraujo kreatininas, visas bilirubino kiekis ir visas serumo baltymų kiekis;
               
            Kitus nustatymus, kurie gali būti reikalingi kompetentingam toksikologiniam įvertinimui atlikti, sudaro kalcio, fosforo, chloro, natrio, kalio, badavimo gliukozės nustatymas, lipidų, hormonų, rūgščių ir šarmų pusiausvyros, methemoglobino, cholinesterazės aktyvumo analizė.
      Atitinkamais atvejais gali būti naudojama papildoma klinikinė biochemija stebėtų toksiškumo poveikių tyrinėjimui išplėsti.
      1.6.3.1.   Bendroji nekroskopija
      Visiems bandymo gyvūnams turi būti atliekama visa bendroji nekroskopija. Bent jau kepenys, inkstai, antinksčiai, plaučiai ir sėklidės turėtų būti pasveriami drėgni tuojau pat po skrodimo, kad neišdžiūtų. Organai ir audiniai (kvėpavimo traktas, kepenys, inkstai, blužnis, sėklidės, antinksčiai, širdis ir visi kiti organai, kurie turi didelių matomų pažeidimų arba kurių dydis pasikeitęs) turėtų būti konservuojami atitinkamoje terpėje galimam histopatologiniam ištyrimui ateityje. Plaučiai turėtų būti išimami sveiki, pasveriami ir apdorojami atitinkamu fiksatyvu užtikrinant, kad bus išsaugota plaučių struktūra.
      1.6.3.2.   Histopatologinis ištyrimas
      Didelių koncentracijų grupėje ir kontrolinėje grupėj e(-se) turėtų būti atliekamas užkonservuotų organų ir audinių histologinis ištyrimas. Organai ir audiniai, pažeisti tiriamosios medžiagos, kuri įvesta didžiausiomis dozėmis, turėtų būti ištiriami visose mažesnių dozių grupėse. Visų papildomų grupių gyvūnai turėtų būti ištiriami histologiškai, ypatingą dėmesį skiriant tiems organams ir audiniams, kuriems nustatyta, kad kitose paveiktose grupėse tie poveikiai pasireiškė.
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti apibendrinami lentelėse, nurodant gyvūnų skaičių kiekvienos grupės bandymo pradžioje ir gyvūnų, kuriems atsirado kiekvienos rūšies pakenkimų, skaičių.
      Visi stebėti rezultatai turėtų būti įvertinami naudojant atitinkamą statistikos metodą. Gali būti naudojamas bet kuris pripažintas statistikos metodas.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      3.1.   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  rūšis, veislė, gyvūnų tiekėjas, aplinkos sąlygos, pašaras ir pan.;
               
            
                  —
               
               
                  bandymo sąlygos.
                  Poveikio aparato apibūdinimas bei brėžinys, tipas, matmenys, taip pat oro šaltinis, aerozolių generavimo sistema, oro kondicionavimo metodas ir gyvūnų laikymo sąlygų bandymo kameroje, jeigu tokia naudojama, apibūdinimas. Turėtų būti apibūdinama temperatūra, drėgnumo matavimo įranga ir atitinkamais atvejais aerozolio koncentracijų pastovumas ir dalelių dydžio pasiskirstymas.
                  Duomenys apie poveikį
                  Jie turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant vidutines vertes ir kintamumo vienetus (t. y. standartinis nuokrypis) ir, jeigu įmanoma, į juos turėtų būti įtraukiami:
                  
                              a)
                           
                           
                              oro srauto, tekančio per inhaliacijos įrenginį, greitis;
                           
                        
                              b)
                           
                           
                              oro temperatūra ir drėgnumas;
                           
                        
                              c)
                           
                           
                              nominalios koncentracijos (visas tiriamos medžiagos kiekis, įdėtas į inhaliacijos įrenginį, padalytas iš oro tūrio);
                           
                        
                              d)
                           
                           
                              tirpiklio rūšis, jeigu naudotas;
                           
                        
                              e)
                           
                           
                              faktinės koncentracijos bandymo kvėpavimo zonoje;
                           
                        
                              f)
                           
                           
                              masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAD) ir geometrinis standartinis nuokrypis (GSD);
                           
                        
            
                  —
               
               
                  duomenys apie toksinę reakciją pagal lytį ir koncentraciją;
               
            
                  —
               
               
                  nugaišimo laikas poveikio metu arba nurodant, ar gyvūnai išgyveno iki pabaigos;
               
            
                  —
               
               
                  toksiškų arba kitokių poveikių apibūdinimas; poveikių nesukeliančios koncentracijos;
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieno ypatingo požymio stebėjimo laikas ir tolesnė jo eiga;
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie maistą ir kūno svorį;
               
            
                  —
               
               
                  naudoti hematologiniai bandymai ir jų rezultatai;
               
            
                  —
               
               
                  naudoti klinikiniai biocheminiai bandymai ir jų rezultatai;
               
            
                  —
               
               
                  autopsijos duomenys;
               
            
                  —
               
               
                  išsamus visų histopatologinių duomenų aprašymas;
               
            
                  —
               
               
                  statistinis duomenų apdorojimas, jeigu įmanomas;
               
            
                  —
               
               
                  duomenų aptarimas;
               
            
                  —
               
               
                  duomenų aiškinimas.
               
            3.2.   DUOMENŲ APSKAIČIAVIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. bendrąją įvadinę B(D) dalį.
      4.   LITERATŪRA
      Žr. bendrąją įvadinę B(E) dalį.
      B.9.   KARTOTINIŲ DOZIŲ (28 DIENOS) TOKSIŠKUMAS (PER ODĄ)
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. bendrąją įvadinę B(A) dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. bendrąją įvadinę B(B) dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   BANDYMO METODO ESMĖ
      Tiriamoji medžiaga 28 dienas kiekvieną dieną dedama ant odos pamatuotomis dozėmis kelioms eksperimentinių gyvūnų grupėms, viena dozė – vienai grupei. Poveikio metu gyvūnai stebimi kiekvieną dieną toksiškumo požymiams nustatyti. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, atliekama autopsija, bandymą užbaigus likusiems gyviems gyvūnams atliekama autopsija.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   BANDYMO METODO APIBŪDINIMAS
      1.6.1.   Pasirengimas
      Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis laikymo ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento pradžios. Prieš bandymą sveiki jauni gyvūnai randomizuojami ir paskiriami į poveikio ir kontrolines grupes. Prieš pat bandymą nuo bandomųjų gyvūnų kūno sprando srityje nukerpamas kailis. Galima ir skusti, bet tai turėtų būti atliekama apytikriai prieš 24 valandas iki bandymo. Pakartotinai kirpti arba skusti paprastai reikia apytikriai kas savaitę. Jeigu kailis kerpamas arba skutamas, reikia stengtis nenubrūžinti odos. Tiriamajai medžiagai uždėti turėtų būti nukerpama ne mažiau kaip 10 % proc. kūno paviršiaus. Turėtų būti atsižvelgiama į gyvūno kūno svorį, nusprendžiant, koks plotas turėtų būti be kailio, ir į apdangalo dydį. Jeigu bandomos kietosios medžiagos, kurios prireikus gali būti pulverizuojamos, tiriamoji medžiaga turėtų būti pakankamai sudrėkinama vandeniu arba, tam tikrais atvejais, atitinkamu tirpikliu, kad būtų užtikrinamas geras sąlytis su oda. Skystos tiriamosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos. Dedamos nuo penkių iki septynių kartų per savaitę.
      1.6.2.   Bandymo sąlygos
      1.6.2.1.   Eksperimentiniai gyvūnai
      Gali būti naudojamos suaugusios žiurkės, triušiai arba jūrų kiaulytės. Gali būti naudojamos kitos rūšys, bet jų naudojimas turėtų būti pagrindžiamas.
      Bandymo pradžioje naudojamų gyvūnų svorio pakitimo intervalas neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio.
      1.6.2.2.   Skaičius ir lytis
      Kiekvienai dozei turėtų būti naudojama ne mažiau 10 gyvūnų (penkios patelės ir penki patinėliai), turinčių sveiką odą. Patelės turėtų būti neturėjusios jauniklių ir būti nevaikingos. Jeigu planuojami tarpiniai nužudymai, gyvūnų skaičius turėtų būti padidinamas tokiu gyvūnų skaičiumi, kuris buvo planuojamas nužudyti iki bandymo pabaigos. Be to, papildoma 10 gyvūnų grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus) gali būti veikiama didele doze 28 dienas ir po poveikio 14 dienų stebimi toksinio poveikio grįžtamumo, stabilumo arba uždelsto atsiradimo požymiai. Taip pat naudojama papildoma 10 kontrolinių gyvūnų grupė (po penkis kiekvienos lyties gyvūnus).
      1.6.2.3.   Dozės
      Reikalingos ne mažiau kaip trys dozės, kontrolinė grupė arba tirpiklio kontrolinė grupė, jeigu naudojamas tirpiklis. Poveikio laikas turėtų būti ne trumpesnis kaip šešios valandos per dieną. Tiriamoji medžiaga turėt būti uždedama panašiu laiku kiekvieną dieną ir intervalai (kas savaitę arba kas dvi savaites) suderinami taip, kad gyvūno kūno svorio atžvilgiu būtų išlaikoma pastovi dozė. Išskyrus tuos atvejus, kai paveikiama tiriamąja medžiaga, su kontrolinės grupės gyvūnais turėtų būti elgiamasi visiškai taip pat, kaip ir su bandomosios grupės objektais. Jeigu dozavimui palengvinti naudojamas tirpiklis, kontrolinei grupei turi būti skiriamos tokios pat dozės su tirpikliu, kokio skiriamos veikiamai grupei, ir ji turi gauti tokį patį tirpiklio kiekį, kurį gauna didžiausios dozės grupė. Didžiausia dozė turėtų sukelti toksiškumo poveikį, bet neturi būti mirštamumo arba tik kelių tokių atvejų priežastimi. Mažiausia dozė neturėtų sukelti jokių toksiškumo požymių. Jeigu yra praktini poveikio žmogui įvertinimas, mažiausia dozė jį turėtų viršyti. Geriausia, jeigu vidurinė dozė galėtų sukelti mažiausius pastebimus toksiškus poveikius. Jeigu naudojama daugiau negu viena tarpinė dozė, dozės turėtų būti išskirstomos intervalais taip, kad susidarytų toksiškų poveikių intensyvumo vertinimo skalė. Mažų ir tarpinių dozių bei kontrolinėse grupėse nugaišimo atvejų dažnumas turėtų būti nedidelis, kad būtų galima prasmingai įvertinti rezultatus.
      Jeigu tiriamoji medžiaga sukelia stiprų odos dirginimą, koncentracijos turėtų būti sumažinamos, ir dėl to, naudojant dideles dozes, turėtų susilpnėti kiti toksiški poveikiai arba jų nebūti. Be to, jeigu oda labai stipriai pažeidžiama, reikia bandymą nutraukti ir pradėti naują bandymą naudojant mažesnių koncentracijų dozes.
      1.6.2.4.   Ribinis bandymas
      Jeigu išankstinis bandymas naudojant 1 000 mg/kg dozę arba didesnę dozę, susijusią su tikėtinu poveikiu žmogui, jeigu toks žinomas, nesukelia aiškaus toksiškumo, laikoma, kad bandymo nereikia tęsti.
      1.6.2.5.   Stebėjimo laikotarpis
      Eksperimentiniai gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną, ar neatsiranda toksiškumo požymių. Turėtų būti registruojamas nugaišimo laikas ir laikas, kada atsirado ir išnyko toksiškumo požymiai.
      1.6.3.   Darbo eiga
      Gyvūnai turėtų būti laikomi atskiruose narveliuose. Gyvūnai yra paveikiami tiriamąja medžiaga, geriausiai – 28 dienas septynias dienas per savaitę. Gyvūnai, esantys bet kurioje papildomoje grupėje, kuri toliau stebima, turėtų būti laikomi dar 14 dienų neatliekant bandymų, kad būtų galima nustatyti atsigavimą po toksiškų poveikių arba tokių poveikių išsilaikymą. Poveikio laikas neturėtų būti trumpesnis kaip šešios valandos per dieną.
      Tiriamoji medžiaga turėtų būti tolygiai uždedama ant plotelio, kurio dydis sudaro apie 10 % viso kūno paviršiaus. Jeigu medžiagos labai toksiškos, paveikiamas paviršius gali būti mažesnis, bet kaip galima didesnis plotas turėtų būti padengiamas kiek įmanoma plonesniu ir vienodu sluoksniu.
      Tiriamoji medžiaga turėtų liestis su oda akytu marlės tvarsčiu ir nedirginančia lipnia juostele. Tiriamoji vieta ir toliau turėtų būti atitinkamai padengta, kad būtų išsaugotas marlės tvarstis ir tiriamoji medžiaga bei užtikrinama, kad gyvūnai nepraris tiriamosios medžiagos. Gali būti naudojami ribotuvai, kad tiriamoji medžiaga nebūtų praryjama, bet visiško imobilizavimo metodas nerekomenduojamas. Gali būti taikomas ir „apsauginio antkaklio“ metodas.
      Poveikio laikotarpio pabaigoje tiriamosios medžiagos likutis turėtų būti nuimamas, jeigu tai praktiškai įvykdoma – naudojant vandenį ar kokį kitą atitinkamą odos valymo būdą.
      Visi gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną, o toksiškumo požymiai registruojami nurodant pasireiškimo laiką, jų laipsnį ir trukmę. Turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir akies gleivinės pokyčiai, taip pat kvėpavimo, kraujo apytakos, vegetacinės ir centrinės nervų sistemų pokyčiai, somatomotorinės veiklos ir elgsenos sutrikimai. Kiekvieną savaitę turėtų būti nustatomas gyvūnų svoris. Taip pat rekomenduojama kiekvieną savaitę matuoti suvartoto pašaro kiekį. Reguliarus gyvūnų stebėjimas yra reikalingas tam, kad būtų užtikrinama, jog kiek įmanoma bus stengiamasi neprarasti gyvūnų dėl tokių priežasčių kaip kanibalizmas, audinių autolizė arba dėl netinkamo taikymo metodo. Bandymo laikotarpio pabaigoje išlikusiems gyviems nepagalbinio poveikio grupių gyvūnams atliekama autopsija. Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kenčiantys dideles kančias ar skausmą, kai tai pastebima, turėtų būti pašalinami, humaniškai nužudomi ir atliekama autopsija.
      Bandymo pabaigoje visiems gyvūnams, taip pat ir kontroliniams atliekami tokie tyrimai:
      
                  1)
               
               
                  hematologija, taip pat bent jau kraujo kūnelių, hemoglobino koncentracijos, eritrocitų kiekio apskaičiavimas, visas ir diferencinis leukocitų kiekis ir krešėjimo matavimas;
               
            
                  2)
               
               
                  klinikinė kraujo biochemija, taip pat įtraukiant ne mažiau kaip vieną kepenų ir inkstų funkcijų parametrą: alanino aminotransferazės serumas (anksčiau žinomas kaip glutamo piruvo transaminazė), aspartate aminotransferazės serumas (anksčiau žinomas kaip glutamo oksalato transminazė), šlapimo azotas, albuminas, kraujo kreatininas, visas bilirubino kiekis ir visas serumo baltymų kiekis.
               
            Kitus tyrimus, kurie gali būti reikalingi kompetentingam toksikologiniam įvertinimui atlikti, sudaro kalcio, fosforo, chloro, natrio, kalio, badavimo gliukozės nustatymas, lipidų, hormonų, rūgščių/šarmų pusiausvyros, methemoglobino, cholinesterazės aktyvumo analizė.
      Atitinkamais atvejais gali būti naudojama papildoma klinikinė biochemija stebėtų toksiškumo poveikių tyrinėjimui išplėsti.
      1.6.4.   Bendroji nekroskopija
      Visiems bandomiems gyvūnams turėtų būti atliekama visa bendroji nekroskopija. Bent jau kepenys, inkstai, antinksčiai ir sėklidės turėtų būti pasveriami drėgni tuojau pat po skrodimo, kad neišdžiūtų. Organai ir audiniai (tai yra tie organai, kurie turi didelių matomų pakenkimų arba kurių dydis pakitęs) turėtų būti konservuojami atitinkamoje terpėje galimam histopatologiniam ištyrimui ateityje.
      1.6.5.   Histopatologinis ištyrimas
      Didelių dozių grupėje ir kontrolinėje grupėje turėtų būti atliekamas užkonservuotų organų ir audinių histologinis ištyrimas. Organai ir audiniai, kurie turi defektų, atsirandančių įvedus didžiausias tiriamosios medžiagos dozes, turėtų būti ištiriami visose mažesnių dozių grupėse. Papildomos grupės gyvūnai turėtų būti ištiriami histologiškai, ypatingą dėmesį skiriant tiems organams ir audiniams, jeigu nustatyta, kad kitose paveiktose grupėse tie poveikiai pasireiškė.
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti apibendrinami lentelėse, kiekvienai bandomai grupei nurodant gyvūnų skaičių bandymo pradžioje ir gyvūnų, kuriems atsirado kiekvienos rūšies pakenkimų, skaičių.
      Visi stebėti rezultatai turi būti įvertinami naudojant atitinkamą statistikos metodą. Gali būti naudojamas bet kuris pripažintas statistikos metodas.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      3.1.   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  duomenys apie gyvūnus (rūšis, veislė, gyvūnų tiekėjas, aplinkos sąlygos, pašaras ir pan.);
               
            
                  —
               
               
                  bandymo sąlygos (taip pat tvarstymo būdas: uždaras ar neuždaras);
               
            
                  —
               
               
                  dozės (nurodant tirpiklį, j jeigu naudotas) ir koncentracijos;
               
            
                  —
               
               
                  poveikio nesukelianti dozė, jeigu įmanoma;
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie toksines reakcijas pagal lytį ir dozę;
               
            
                  —
               
               
                  nugaišimo laikas bandymo metu arba nurodant, ar gyvūnas išgyveno iki pabaigos;
               
            
                  —
               
               
                  toksiški arba kitokie poveikiai;
               
            
                  —
               
               
                  visų nenormalių požymių pastebėjimo laikas ir tolesnė eiga;
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie pašarą ir kūno svorį;
               
            
                  —
               
               
                  naudoti hematologiniai bandymai ir jų rezultatai;
               
            
                  —
               
               
                  naudoti klinikiniai biocheminiai bandymai ir jų rezultatai;
               
            
                  —
               
               
                  nekroskopijos duomenys;
               
            
                  —
               
               
                  išsamus visų histopatologinių duomenų aprašymas;
               
            
                  —
               
               
                  statistinis duomenų apdorojimas, jeigu įmanomas;
               
            
                  —
               
               
                  duomenų aptarimas;
               
            
                  —
               
               
                  duomenų aiškinimas.
               
            3.2.   DUOMENŲ APSKAIČIAVIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. bendrąją įvadinę B(D) dalį.
      4.   LITERATŪRA
      Žr. bendrąją įvadinę B(E) dalį.
      B.10.   MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJŲ TYRIMAS IN VITRO
      
      1.   METODAS
      Šis metodas pakartoja OECD TG 473 Žinduolių chromosomų aberacijos tyrimą in vitro (1997).
      1.1.   ĮVADAS
      Chromosomų aberacijų tyrimo tikslas – identifikuoti agentus, sukeliančius žinduolių ląstelių, kultivuojamų in vitro, chromosomų aberacijas (1) (2) (3). Struktūrinės aberacijos gali būti dviejų tipų – chromosominės arba chromatidinės. Nors dauguma cheminių mutagenų sukelia chromatidines aberacijas, tačiau pasitaiko ir chromosominių aberacijų. Poliploidiškumo reiškimosi intensyvumas rodo, kad cheminė medžiaga gali sukelti chromosomų skaičiaus pasikeitimus. Tačiau šio metodo tikslas nėra išmatuoti chromosomų skaičiaus pokyčius, ir paprastai tam jis nėra taikomas. Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra chromosomų mutacijos bei su jomis susiję įvykiai; esama pakankamai įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl chromosomų mutacijų bei su jomis susijusių įvykių.
      Tiriant chromosomų aberacijas in vitro galima naudoti gerai žinomų ląstelių linijų, ląstelių kamienų arba pirminių ląstelių kultūras. Naudojamos ląstelės pasirenkamos pagal jų sugebėjimą augti kultūroje, kariotipų stabilumą, chromosomų skaičių, chromosomų įvairovę ir spontaninį chromosomų aberacijų dažnį.
      Atliekant tyrimus in vitro reikia naudoti egzogeninį metabolinės aktyvacijos šaltinį. Ši metabolinės aktyvacijos sistema negali visiškai pakeisti žinduolių in vivo sąlygų. Reikia stengtis išvengti tokių sąlygų, kurioms esant būtų gaunami teigiami rezultatai, neatspindintys vidinio mutageniškumo ir galintys atsirasti pakeitus pH, osmosinį slėgį arba ypač padidėjus citotoksiškumui (4) (5).
      Šis tyrimas atliekamas, kai ieškoma galimų žinduolių mutagenų ar karcinogenų. Daugelis cheminių junginių, naudojant šį tyrimą, duodančių teigiamus rezultatus, yra žinduolių karcinogenai; tačiau nėra aiškaus ryšio tarp šio tyrimo ir karcinogeniškumo. Ryšys priklauso nuo cheminių medžiagų klasės; yra neginčijamų įrodymų kad šio tyrimo metu negalima nustatyti tam tikrų karcinogenų, nes pasirodo, jog jie veikia kitaip, ne tiesiogiai suardo DNR.
      Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Chromatidinė aeracija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip pavienių chromatidžių suardymas arba kaip chromatidžių suardymas ir susijungimas.
      
         Chromotidinė aeracija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip abiejų seserinių chromatidžių trūkis arba arba kaip jų abiejų trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje.
      
         Endoreduplikacija – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos S (sintezės) periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S (sintezės) periodas. Šitaip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 ir t. t. chromatidžių.
      
         Plyšys – achromatinė, mažesnė nei vienos chromatidės plotis spraga, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių.
      
         Mitozinis indeksas – itozės metafazėje esančių ląstelių santykis, padalintas iš viso ląstelių populiacijos skaičiaus, rodantis tos ląstelių populiacijos proliferacijos laipsnį.
      
         Chromosomų skaičiaus aberacija – ląstelėse esančių chromosomų skaičiaus pokytis palyginus su normaliu jų skaičiumi, būdingu panaudotoms ląstelėms.
      
         Poliploidiškumas – haploidinio chromosomų skaičiaus (n), išskyrus diploidinį skaičių (t. y. 3n, 4n ir t. t.), kartotinis.
      
         Struktūrinė aeracija – chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti, dalijimosi ciklo metafazėje esančias ląsteles tiriant mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, pokyčiai grandinių viduje ar tarp grandinių.
      1.3   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Ląstelių kultūros veikiamos tiriamąja chemine medžiaga esant metabolinei aktyvacijai arba jos nesant. Ląstelių kultūras paveikus tiriamąja medžiaga, tam tikrais laiko tarpais jos yra veikiamos ląstelių dalijimąsi metafazėje stabdančia medžiaga (pavyzdžiui Kolcemidu arba kolchicinu), surenkamos, dažomos, o metafazėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu, kad būtų nustatomos chromosomų aberacijos.
      1.4   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      1.4.1   Preparatai
      1.4.1.1   Ląstelės
      Galima naudoti įvairiausias ląstelių linijas, kamienus arba pirmines ląstelių, tarp jų ir žmonių ląstelių kultūras (pvz, kiniško žiurkėno fibroblastus, žmogaus ar kitų žinduolių periferinio kraujo limfocitus).
      1.4.1.2   Terpė ir kultivavimo sąlygos
      Kultūros turėtų būti kultivuojamos reikiamoje terpėje, esant reikiamoms inkubacijos sąlygoms (kultivavimui skirtuose induose, esant reikiamai CO2 koncentracijai, temperatūrai ir drėgmei). Pastoviai tikrinama, ar gerai žinomų ląstelių linijos ir kamienai išlaiko pastovų modalinį chromosomų skaičių, ar jos neužsikrėtusios mikoplazmomis, o jei yra užkrėstos, tai toliau nebenaudojamos. Turi būti žinoma ląstelių ciklo trukmė bei taikomos kultivavimo sąlygos.
      1.4.1.3   Kultūrų paruošimas
      Gerai žinomos ląstelių linijos ir kamienai: ląstelės yra padauginamos iš kamieninių kultūrų, pasėjamos kultūrinėje terpėje tokiu tankumu, kad prieš ląsteles surenkant, kultūros nesusilietų,, po to jos inkubuojamos 37 oC temperatūroje.
      Limfocitai: į kultūrinę terpę, turinčią mitogeno (pvz., fitohemagliutinino), įnešamas sveikų tiriamųjų kraujo, paveikto antikoaguliantu (pvz., heparinu), mėginys arba iš to kraujo išskirti limfocitai ir inkubuojama 37 oC temperatūroje.
      1.4.1.4   Metabolinė aktyvacija
      Ląstelės turėtų būti paveikiamos tiriamąja chemine medžiaga tiek esant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai, tiek ir nesant. Plačiausiai naudojama sistema yra iš graužikų kepenų, paveiktų tokiais fermentinį aktyvumą skatinančiais agentais kaip AROCLOR 1254 (6) (7) (8) (9) ar fenobarbitono ir ß-naftoflavono mišiniu (10) (11) (12), postmitochondrinė frakcija, praturtinta kofaktoriumi.
      Post-mitochondrinė frakcija paprastai naudojama tokių koncentracijų, kurių intervalas tyrimo metu naudojamoje galutinėje terpėje siekia 1–10 % (v/v). Metabolinės aktyvacijos sistema gali priklausyti nuo tiriamosios cheminės medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga naudoti daugiau nei vieną post-mitochondrinės frakcijos koncentraciją.
      Endogeninę aktyvaciją gali pagerinti, taikant tokias naujoves kaip genetinės inžinerijos pagalba gautas ląstelių linijas, gaminančias specifinius, aktyvacijoje dalyvaujančius fermentus. Tyrime naudojamų ląstelių linijų pasirinkimas turėtų būti moksliškai pagrįstas (pvz, pagal citochromo P450 izofermento svarbą tiriamos cheminės medžiagos metabolizmui).
      1.4.1.5   Tiriama cheminė medžiaga/preparatas
      Kietosios tiriamosios medžiagos turėtų būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinančiuosiuose įrenginiuose, o jeigu reikia, tai prieš paveikiant ląsteles šia medžiaga, ir praskiestos. Prieš tyrimą į tiriamąją sistemą gali būti tiesiogiai įnešamos ir (arba) praskiedžiamos skystosios tiriamosios medžiagos. Turėtų būti naudojami naujai paruošti tiriamosios medžiagos preparatai, jeigu šių medžiagų stabilumo tyrimo duomenys nerodo, kad juos galima saugoti.
      1.4.2   Tyrimo sąlygos
      1.4.2.1   Tirpiklis/tirpinantysis Įrenginys
      Neturėtų būti manoma, kad tirpiklis/tirpinantysis įrenginys chemiškai reaguos su tiriamąja chemine medžiaga ir turėtų būti užtikrinta, kad ląstelės liks išsaugotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai/tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturėtų būti vandens. Vandenį galima pašalinti molekuliniu filtru.
      1.4.2.2   Veikimo koncentracijos
      Parenkant pačią didžiausią koncentraciją, vadovaujamasi tokiais kriterijais, kaip citotoksiškumu, tirpumu tiriamojoje sistemoje ir pH arba osmosinio slėgio pokyčiais.
      Citotoksiškumas turėtų būti nustatomas pagrindinio eksperimento metu, esant metabolinei aktyvacijai, remiantis atitinkamais ląstelių vientisumo ir augimo rodikliais, tokiais kaip ląstelių kolonijų susiliejimo laipsnis, gyvų ląstelių skaičius arba mitozinis indeksas. Pirminio ekperimento metu būtų naudinga nustatyti toksiškumą ir tirpumą.
      Turėtų būti naudojamos bent trys koncentracijos. Jei nustatomas citotoksiškumas, tai šios koncentracijos turėtų svyruoti nuo maksimalaus iki minimalaus citotoksiškumo laipsnio arba jo apskritai neturėtų būti; tai reikš, kad koncentracijos turės būti atskirtos tiktai faktoriumi, esančiu tarp 2 ir √10. Ląstelių surinkimo metu didžiausia koncentracija turėtų parodyti, kad gerokai sumažėjo ląstelių kolonijų susiliejimo laipsnis ir ląstelių skaičius arba mitozinis indeksas (visi sumažėjo daugiau nei 50 %). Mitozinis indeksas yra tik netiesioginis citotoksinių/citostatinių efektų įvertinimo matas ir priklauso nuo laiko praėjusio po tiriamosios medžiagos poveikio. Tačiau mitozinis indeksas tinka ląstelių, auginamų suspensijoje, kultūroms, kuriose kiti toksiškumo tyrimai gali būti sudėtingi ir nepraktiški. Duomenys apie ląstelių ciklo kinetinius parametrus, tokius kaip vidutinis ląstelių kartos susiformavimo laikas, gali būti panaudoti kaip pagalbinė informacija. Tačiau vidutinis ląstelių kartos susiformavimo laikas, laikomas bendru vidurkiu, ne visada parodo, kad egzistuoja sulėtinto vystymosi subpopuliacijos, ir netgi menkas ląstelių susiformavimo laiko pailgėjimas gali būti susijęs su kur kas ilgesne optimalaus aberacijų skaičiaus atsiradimo trukme.
      Kai medžiagos yra pakankamai necitotoksinės, tai didžiausia tiriamoji koncentracija turėtų būti 5 μl/ml, 5,5 mg/ml arba 0,01 M, priklausomai nuo to, kuri iš visų išvardytų koncentracijų yra pati mažiausia.
      Kai medžiagos yra gana netirpios ir nėra toksiškos, o jų koncentracijos yra mažesnės už tas, kurioms esant medžiagos netirpsta, tai baigiantis veikimui tiriamąja medžiaga, didžiausios naudojamos dozės koncentracija turėtų viršyti tirpumo ribą paruoštoje, kultivavimui skirtoje terpėje. Kai kuriais atvejais, pavyzdžiui, kai toksiškumas pasireiškia tik tada, kai medžiagos koncentracija yra truputį didesnė už pačią mažiausią koncentraciją, kuriai esant medžiaga visiškai netirpsta, rekomenduojama patikrinti daugiau nei vieną koncentraciją, kurioje susiformuoja matomas precipitatas. Derėtų įvertinti tirpumą prieš veikimą tiriamąja chemine medžiaga, ir po jo, kadangi veikiant tiriamąja medžiaga, tirpumas gali pakisti dėl ląstelių ir S9 serumo, esančių tiriamojoje sistemoje. Netirpumą galima nustatyti plika akimi. Precipitato susidarymas neturėtų trukdyti įvertinti duomenis.
      1.4.2.3   Neigiami ir teigiami kontroliniai mėginiai
      Atliekant kiekvieną eksperimentą, esant metabolinei aktyvacijai, arba jos nesant, tuo pačiu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpikliai, tirpinntysis įrenginys) kontroliniai mėginiai. Kai naudojamasi metaboline aktyvacija, tai kartu su teigiamu kontroliniu mėginiu turi būti naudojama aktyvuojanti cheminė medžiaga tam, kad būtų sukuriamas atsakas į mutageną.
      Teigiamuose kontroliniuose mėginiuose turi būti tokios žinomo elastogeno koncentracijos, kurioms esant, bei veikiant tiriamąja medžiaga, būtų galima nesunkiai sumažinti pašalinį foną pakartotinai, o tai parodo tiriamosios sistemos jautrumą.
      Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunami efektai būtų ryškūs, bet tyrėjas ne iš karto atskleistų užkoduotas skaidres. Žemiau pateikiami teigiamuose kontroliniuose mėginiuose esančių cheminių medžiagų pavyzdžiai:
      
                  Metabolinės aktyvacijos sąlygos
               
               
                  Medžiaga
               
               
                  CAS Nr.
               
               
                  EINECS Nr.
               
            
                  Egzogeninė metabolinė aktyvacija nevyksta
               
               
                  metilmetansulfonatas
               
               
                  66-27-3
               
               
                  200-625-0
               
            
                  etilmetansulfonatas
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  etilnitrošlapalas
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  mitomicinas C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  4-nitrokvinolino-N-oksidas
               
               
                  56-57-5
               
               
                  200-281-1
               
            
                  Egzogeninė metabolinė aktyvacija vyksta
               
               
                  benzopirenas
               
               
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
            
                  ciklofosfamidas
                  ciklofosfamido-monohidratas
               
               
                  50-18-0
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
            Galima naudoti ir kitas teigiamas kontrolines chemines medžiagas. Kai įmanoma, tai apsvarstomas teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų, priklausančių konkrečiai klasei, panaudojimas.
      Auginant kiekvieną ląstelių rinkinį, reikia naudoti neigiamus kontrolinius mėginius, sudarytus iš terpėje esančio pavienio tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio ir kurie paveikiami šia terpe lygiai taip pat kaip ir ląstelių kultūros. Taip pat reikia papildomai naudoti ir nepaveiktus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesio į tai, kad anksčiau atliktų eksperimentų aprašuose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis nesukėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio.
      1.4.3   Tyrimo atlikimo metodika
      1.4.3.1   Veikimas tiriamąja chemine medžiaga
      Proliferuojančios ląstelės veikiamos tiriamąja medžiaga esant metabolinės aktyvacijos sistemai arba jos nesant. Limfocitai veikiami tiriamąja medžiaga, praėjus maždaug 48 valandoms po stimuliacijos mitogenu.
      
                  1.4.3.2
               
               
                  Paprastai naudojamos kiekvienos koncentracijos pakartotinės kultūros, ypač rekomenduojama tai daryti, kai kultivuojamos neigiamos kontrolinės kultūros, terpėje esant vien tik tirpiklio. Jeigu remiantis anksčiau atliktų eksperimentų aprašymais galima parodyti, kad tarp kartotinio pasėjimo kultūrų egzistuoja minimalus skirtumai 13, 14, tada pavienes kultūras bus galima tirti, terpėje esant skirtingoms tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijoms.
                  Dujinės ir lakiosios medžiagos tiriamos atitinkamais metodais, tokiais kaip kultivavimas užsandarintuose induose 15, 16.
               
            1.4.3.3   Kultūrų surinkimo laikas
      Atliekant pirmąjį eksperimentą, ląstelės, esant metabolinės aktyvacijos sistemai arba jos nesant tiriamąja chemine medžiaga veikiamos 3-6 valandas ir yra surenkamos praėjus maždaug kas 1,5 normalaus ląstelinio ciklo nuo poveikio pradžios 12. Jeigu eksperimentas atliekamas pagal šį protokolą, esant metabolinės aktyvacijos sistemai arba jos nesant ir gaunami neigiami rezultatai, tai reikia atlikti papildomą poveikio tiriamąja medžiaga eksperimentą, nesant metabolinės aktyvacijos sistemos ir ląstelės surenkamos, praėjus laiko tarpui, maždaug lygiam 1,5 ląstelinio ciklo trukmės. Kai kurios cheminės medžiagos yra lengviau nustatomos, jei tiriamąja medžiaga veikiama ilgiau, o mėginiai paimami tada, kai praeina daugiau nei 1,5 ląstelinio ciklo. Neigiami duomenys, gauti tuo metu, kai buvo naudojama metabolinė aktyvacija, turi būti patvirtinami kiekvienu atveju. Jei manoma, kad nereikia patvirtinti neigiamų rezultatų, tai privalo būti pagrįsta.
      1.4.3.4   Chromosomų paruošimas
      Paprastai likus 1–3 valandoms iki surinkimo ląstelių kultūros yra paveikiamos Kolcemidu® arba kolchicinu. Kiekviena ląstelių kultūra surenkama ir atskirai apdorojama tam, kad chromosomos būtų paruoštos. Ruošiant chromosomas, ląstelės paveikiamos hipotoniniu šoku, fiksuojamos ir dažomos.
      1.4.3.5   Analizė
      Prieš pradedant mikroskopinę analizę, visos skaidrės, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius mėginius, yra atskirai koduojamos. Kadangi fiksavimo metu metafazėje esančios ląstelės dažnai suyra bei prarandamos chromosomos, tai suskaičiuotos ląstelės turės centromeras, kurių skaičius bus lygus visų tipų ląstelių modaliniam skaičiui ≠2. Jei tiriant kartotinio pasėjimo kultūras, galima naudotis ta pačia kontrole, tai nustatytas centromerų skaičius bus lygus 200 gerai matomų metafazių. Centromerų skaičius gali sumažėti, kai stebima daug aberacijų.
      Nors šio tyrimo tikslas yra nustatyti chromosomų struktūrines aberacijas, svarbu poliploidiją bei endoduplikaciją registruoti tada, kai tai yra matoma.
      2.   DUOMENYS
      2.1.   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Ląstelė yra eksperimentinis vienetas, todėl nustatomas ląstelių, turinčių struktūrines aberacijas, išreiškiamas procentais. Reikia išvardinti chromosomų struktūrinių aberacijų skirtingus tipus, nurodant jų skaičių bei pasireiškimo dažnį tiriamose ir kontrolinėse ląstelių kultūrose. Atskirai registruojami chromosomų plyšiai, tačiau į juos neatsižvelgiama nustatant absoliutų aberacijos dažnį.
      Reikia taip pat registruoti tarpusavyje sutampančias priemones, kurios naudojamos citotoksiškumui vertinti visose paveiktose ir neigiamose kontrolinėse kultūrose, kai yra atliekami pagrindiniai eksperimentai, kurių metu nustatomos aberacijos.
      Reikėtų pateikti ir pavienius duomenis. Be to visus duomenis reikėtų pateikti apibendrintai, lentelių forma.
      Nėra reikalaujama, kad būtų patvirtintas aiškus teigiamas atsakas. Abejotini rezultatai patvirtinami, Atliekant toliau tyrimą, o pirmiausia pakeičiant eksperimento sąlygas, įsitikinama tuo, kad anksčiau gauti rezultatai yra abejotini. 1.4.3.3 skyriuje buvo aptarta būtinybė patvirtinti, kad buvo gauti neigiami rezultatai. Vėlesnių eksperimentų metu reikia apsvarstyti tiriamų parametrų pakeitimus, tam, kad ištirtų sąlygų spektras būtų praplėstas. Koncentracijų intervalo išretinimas bei metabolinės aktyvacijos sąlygos priklauso tiriamiesiems parametrams, kuriuos galima keisti.
      2.2.   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS
      Egzistuoja keli kriterijai, tokie, kaip nuo koncentracijos priklausomas bei pakartojamas chromosomines aberacijas turinčių ląstelių skaičiaus padidėjimas, kuriuo remiantis, nustatoma ar gautas rezultatas yra teigiamas. Pirmiausia reikia aptarti gautų rezultatų biologinę reikšmę. Vertinant tyrimo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus 3, 13. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis faktorius, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas.
      Poliploidinių ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti mitozę ir sukelti chromosomų skaičiaus ląstelėje pakitimus. Ląstelių, turinčių endoreduplikuotas chromosomas, skaičiaus padidėjimas gali parodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti ląstelinį ciklą 17, 18.
      Jei tiriant medžiagą, buvo gauti rezultatai, neatitinkantys aukščiau išvardintų kriterijų, tai šioje sistemoje medžiaga laikoma nemutageniška.
      Nors atliekant daugelį eksperimentų, bus gauti aiškūs teigiami ir neigiami rezultatai, tačiau retais atvejais, remiantis gautų duomenų visuma, nebus galima padaryti konkrečios išvados apie tiriamosios medžiagos aktyvumą. Net ir daug kartų pakartojus eksperimentą, rezultatai gali likti abejotini ar neaiškūs.
      Tiriant chromosomų aberacijas in vitro, gauti teigiami rezultatai, gauti atlikus tyrimą, rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia chromosomų aberacijas kultivuotose somatinėse žinduolių ląstelėse. Neigiami rezultatai rodo, kad esant tyrimo sąlygoms, tiriamoji medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų kultivuotose somatinėse žinduolių ląstelėse.
      3.   ATASKAITA
      TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija:
      
                   
               
               
                  Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys:
                  
                              —
                           
                           
                              priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas tirpinantysis įrenginys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Ląstelės:
                  
                              —
                           
                           
                              ląstelių tipas ir šaltinis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              panaudoto ląstelių tipo kariotipo ypatybės ir tinkamumas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ar ląstelės neužsikrėtusios mikoplazmomis, jei tai įmanoma nustatyti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              informacija apie ląstelinio ciklo trukmę,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kraujo donorų, iš kurių buvo gauti viso kraujo mėginiai ar iš kurių kraujo buvo išskirti limfocitai, lytis bei panaudotas mitogenas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių persėjimų skaičius, jei tai įmanoma nustatyti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių kultivavimo metodai, jei tai galima nustatyti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              modalinis chromosomų skaičius.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tyrimo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              metafazę sustabdančios cheminės medžiagos prigimtis, koncentracija bei laiko tarpas, per kurį ši medžiaga veikė ląsteles,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pagrindinė priežastis, dėl kurios buvo pasirinktos koncentracijos ir ląstelių kultūrų kultivavimo skaičius nurodant, jei įmanoma, citotoksiškumo tyrimo duomenis ir tirpumo ribas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              terpės sudėtis ir CO2 koncentracija, jei tai įmanoma nurodyti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios medžiagos koncentracija,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tirpinančiojo įrenginio darbinė talpa bei į jį įneštos tiriamosios medžiagos tūris,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubacijos temperatūra,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubacijos laikas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              veikimo tiriamąja medžiaga trukmė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių tankis pasėjimo metu, jei tai įmanoma nurodyti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metabolinės aktyvacijos sistemos tipas ir sudėtis, įskaitant tinkamumo kriterijus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teigiami ir neigiami kontroliniai mėginiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              skaidrių paruošimo būdai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberacijų vertinimo kriterijai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ištirtų metafazių skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksiškumo įvertinimo būdai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kriterijai, pagal kuriuos sprendžiama, ar tyrimų metu gauti rezultatai teigiami, neigiami bei abejotini.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              toksiškumo požymiai, pvz., ląstelių kultūrų kolonijų susiliejimo laipsnis, ląstelinio ciklo duomenys, ląstelių skaičius, mitozinis indeksas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              precipitacijos požymiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie terpės, kurioje buvo atliekamas veikimas, pH ir osmosinį slėgį, jei tai buvo nustatyta,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberacijų, įskaitant plyšius, apibūdinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių, esančių tiriamąja medžiaga veiktose bei kontrolinėse kolonijose ir turinčių chromosomų aberacijas, skaičius bei chromosomų aberacijų tipas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ploidiškumo pokyčiai, jei pastebimi,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinės analizės, jei tokios buvo atliktos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vienu metu gauti neigiamų (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) ir teigiamų kontrolinių mėginių tyrimų duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys, gauti anksčiau atliktų tyrimų metu išanalizavus neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis prietaisas) ir teigiamus kontrolinius mėginius, kartu nurodant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Evans, H.J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, p. 1–29.
               
            
                  2)
               
               
                  Ishidate, MJr. and Sofuni, T. (1985). The in Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, p. 427–432.
               
            
                  3)
               
               
                  Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C, Colman, S., Brown, B., Cannon, C, Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl.10), p. 1–175.
               
            
                  4)
               
               
                  Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, MJr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res,. 257, p. 147–204.
               
            
                  5)
               
               
                  Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, p. 297–305.
               
            
                  6)
               
               
                  Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347–364.
               
            
                  7)
               
               
                  Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173–215.
               
            
                  8)
               
               
                  Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and de Vogei, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, p. 83–90.
               
            
                  9)
               
               
                  Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, p. 277–290.
               
            
                  10)
               
               
                  Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G, Gibson, GG, Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175–177.
               
            
                  11)
               
               
                  Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, p. 85–88.
               
            
                  12)
               
               
                  Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, MJr., Ivett, J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, p. 241–261.
               
            
                  13)
               
               
                  Richardson, C, Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, p. 141–154.
               
            
                  14)
               
               
                  Soper, K.A. and Galloway, S.M. (1994). replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, p. 139–149.
               
            
                  15)
               
               
                  Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91–103.
               
            
                  16)
               
               
                  Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795–801.
               
            
                  17)
               
               
                  Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, p. 403–413.
               
            
                  18)
               
               
                  Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362–1364.
               
            B.11.   MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ KAULŲ ČIULPŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJOS TYRIMAS IN VIVO
      
      1.   METODAS
      Šis metodas pakartoja OECD TG 475, Žinduolių kaulų čiulpų chromosomų aberacijos tyrimą (1997).
      1.1   ĮVADAS
      Žinduolių chromosomų aberacijų tyrimas in vitro naudojamas nustatyti struktūrinėms chromosomų aberacijoms, kurias tiriamoji cheminė medžiaga sukelia žinduolių, paprastai griaužikų, kaulų čiulpų ląstelėse (1) (2) (3) (4). Chromosomų struktūrinės aberacijos gali būti dviejų tipų – chromosominės arba chromatidinės. Poliploidiškumo reiškimosi intensyvumas rodo, kad cheminė medžiaga gali sukelti chromosomų skaičiaus pasikeitimus. Dauguma cheminių mutagenų sukelia chromatidines aberacijas, tačiau pasitaiko ir chromosominių aberacijų. Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra chromosomų mutacijos bei su jomis susiję įvykiai; esama pakankamai įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl chromosomų mutacijų bei su jomis susijusių įvykių.
      Šiam tyrimui paprastai naudojamas griaužikų stuburo skliautas. Pagrindinis tiriamasis audinys yra kaulų čiulpai, kadangi jie yra išvagoti daugybės kraujagyslių, o be to, kaulų čiulpuose yra daug greitai besidauginančių ląstelių, kurios yra lengvai išskiriamos ir apdorojamos. Šio tyrimo metu nėra tiriami kitų rūšių žinduoliai bei jų audiniai.
      Šis chromosomų aberacijos tyrimas ypač svarbus, kai įvertinama mutagenų daroma žala, nes šio tyrimo metu galima ištirti metabolizmo, farmakokinetikos ir DNR pažaidų reparacinių procesų veiksnius in vivo, nors jie gali varijuoti tarp skirtingų žinduolių rūšių ir skirtingų audinių. Tyrimas in vivo naudingas ir tuo, kad vėliau galima ištirti mutageninius efektus, nustatytus in vitro.
      
      Jeigu įrodoma, kad tiriamoji cheminė medžiaga arba reaktyvus metabolitas neįsiskverbia į audinį, į kurį buvo nukreiptas, jis nėra naudojamas šiam tyrimui.
      Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Chromatidinė aeracija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip pavienių chromatidžių suardymas arba kaip chromatidžių suardymas ir susijungimas.
      
         Chromotidinė aeracija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip abiejų seserinių chromatidžių trūkis arba arba kaip jų abiejų trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje.
      
         Endoreduplikacija – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos S (sintezės) periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S (sintezės) periodas. Šitaip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 ir t. t. chromatidžių.
      
         Plyšys – achromatinė, mažesnė nei vienos chromatidės plotis spraga, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių.
      
         Mitozinis indeksas – mitozės metafazėje esančių ląstelių santykis, padalintas iš viso ląstelių populiacijos skaičiaus, rodantis tos ląstelių populiacijos proliferacijos laipsnį.
      
         Chromosomų skaičiaus aeracija – ląstelėse esančių chromosomų skaičiaus pokytis palyginus su normalių jų skaičiumi, būdingu panaudotoms ląstelėms.
      
         Poliploidiškumas – haploidinio chromosomų skaičiaus (n), išskyrus diploidinį skaičių (t. y. 3n, 4n ir t. t.), kartotinis.
      
         Struktūrinė aeracija – chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti, dalijimosi ciklo metafazėje esančias ląsteles tiriant mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, pokyčiai grandinių viduje ar tarp grandinių.
      1.3   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Gyvūnai veikiami tiriamąja chemine medžiaga pagal atitinkamą poveikio chemine medžiaga procedūrą ir atitinkamais laiko tarpais, praėjusiais po veikimo yra numarinami. Prieš numarinimą gyvūnai paveikiami agentu, sustabdančiu ląstelių dalijimąsi metafazėje (pvz., Kolcemidu® arba kolchicinu). Po to iš kaulų čiulpų ląstelių išskiriamos chromosomos, jos dažomos, ir metafazėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu, kad būtų nustatytos chromosomų aberacijos.
      1.4   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      1.4.1   Preparatai
      1.4.1.1   Gyvūnų rūšies pasirinkimas
      Paprastai naudojamos žiurkės, pelės ir kiniški žiurkėnai, tačiau gali būti panaudotos ir kitos atitinkamos žinduolių rūšys. Reikia panaudoti dažniausiai vartojamus jaunų sveikų suaugusių gyvūnų laboratorinius kamienus. Turimo pradžioje gyvūnų svorio variacijos turi būti minimalios ir neperžengti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūnų vidutinio svorio.
      1.4.1.2   Laikymo ir maitinimo sąlygos
      Taikomos Pagrindinio įvado B dalyje nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad drėgmė siektų 50–60 %.
      1.4.1.3   Gyvūnų paruošimas
      Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę bei tiriamąją (kuriai priskirti individai bus veikiami medžiaga) grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos poveikiai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas turi savo identifikacijos ženklą. Gyvūnams ne mažiau kaip 5 dienas leidžiama prisitaikyti prie laboratorinių sąlygų.
      1.4.1.4   Dozių paruošimas
      Kietosios tiriamosios medžiagos turėtų būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinančiuosiuose įrenginiuose, o jeigu reikia, tai prieš paveikiant ląsteles šia medžiaga, ir praskiestos. Prieš tyrimą į tiriamąją sistemą gali būti tiesiogiai įnešamos ir (arba) praskiedžiamos skystosios tiriamosios medžiagos. Turėtų būti naudojami naujai paruošti tiriamosios medžiagos preparatai, jeigu šių medžiagų stabilumo tyrimo duomenys nerodo, kad juos galima saugoti.
      1.4.2   Tyrimo sąlygos
      1.4.2.1   Tirpiklis/tirpinantysis Įrenginys
      Neturėtų būti manoma, kad tirpiklis/tirpinantysis įrenginys chemiškai reaguos su tiriamąja chemine medžiaga ir turėtų būti užtikrinta, kad ląstelės liks išsaugotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai/tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturėtų būti vandens. Vandenį galima pašalinti molekuliniu filtru.
      1.4.2.2   Kontroliniai mėginiai
      Kiekvieno tyrimo metu turi būti tiriami iš kiekvienai lyčiai priklausančių gyvūnų paimti bei tuo pačiu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai. Išskyrus tą atvejį, kai gyvūnai yra veikiami tiriamąja chemine medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir gyvūnai, paveikti tiriamąja chemine medžiaga (tiriamoji grupė).
      Teigiamuose kontroliniuose mėginiuose, paveiktuose tokia pačia tiriamosios cheminės medžiagos doze in vivo, turi būti aptinkamos struktūrinės aberacijos, kurioms esant, bei veikiant tiriamąja medžiaga, būtų galima nesunkiai sumažinti pašalinį foną pakartotinai, o tai parodo tiriamosios sistemos jautrumą. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunami efektai būtų ryškūs, bet tyrėjas ne iš karto atskleistų užkoduotas skaidres. Priimtina, kad teigiami kontroliniai mėginiai būtų suleisti gyvūnams tokiu būdu, kuris skiriasi nuo tiriamosios cheminės medžiagos suleidimo būdo bei būtų tik vienąkart dozuojami. Jeigu yra įmanoma, tai galima apsvarstyti teigiamų kontrolinių medžiagų, priklausančių cheminių medžiagų klase, panaudojimą. Toliau pateikiami teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai:
      
                  Medžiaga
               
               
                  CAS Nr.
               
               
                  EINECS Nr.
               
            
                  etilo metansulfonatas
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  etilo nitroslapalas
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  mitomicinas C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  ciklofosfamidas
                  ciklofosfamido monohidratas
               
               
                  50-18-0
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
            
                  trietilenmelaminas
               
               
                  51-18-3
               
               
                  200-083-5
               
            Neigiami kontroliniai mėginiai, paveikti arba vien tirpikliu arba vien tik tirpinančiuoju įrenginiu arba kiti mėginiai paveikti tuo pačiu būdu kaip ir tiriamosios grupės, turi būti paimami kiekvieną kartą nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų metu gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad variacijos laipsnis tarp gyvūnų ir ląstelių, kuriose stebimos chromosomų aberacijos, yra tinkamas. Jei neigiami kontroliniai mėginiai paimami tik vieną kartą tai pirmojo paėmimo laikas yra tinkamiausias. Taipogi reikia papildomai naudoti ir nepaveiktus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesioį tai, kad anksčiau atliktų eksperimentų aprašuose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys nesukėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio.
      1.5   BANDYMO ATLIKIMO METODIKA
      1.5.1   Gyvūnų skaičius ir lytis
      Kiekvienoje tiriamojoje ir kontrolinėje grupėje turi būti ne mažiau kaip 5 vienos lyties gyvūnai. Jei tyrimo metu galima gauti anksčiau atliktų tyrimų, kai buvo panaudota ta pati gyvūnų rūšis ir tas pats poveikio tiriama medžiaga būdas, duomenis, kurie rodo, kad toksiškumo tarp atskirų lyčių skirtumai yra labai nedideli, tai tada užteks ištirti vienos lyties gyvūnus. Jeigu žmogaus jautrumas cheminėms medžiagoms, kuriomis jis yra veikiamas, priklauso nuo lyties, pvz., jautrumas kai kurioms farmakologiškai aktyvioms medžiagoms, tai reikia ištirti atitinkamos lyties gyvūną.
      1.5.2   Veikimo tvarkaraštis
      Pirmiausia tik vieną kartą veikiama tiriamosiomis cheminėmis medžiagomis. Tiriamosiomis cheminėmis medžiagomis galima veikti, taikant vadinamąją išskaidytą dozę, kai tą pačią dieną du kartus paveikiama tiriamąja medžiaga ir padarius ne daugiau kaip keleto valandų pertrauką tam, kad būtų paveikta pakankamai dideliu tiriamosios medžiagos tūriu. Kitų dozių davimo tvarka turi būti moksliškai pagrindžiama.
      Veikiant tiriamąja medžiaga vienos dienos bėgyje, prieš tai reikia dukart atskirai paimti mėginius. Tiriant graužikus, pirmasis mėginys paimamas, praėjus maždaug 1,5 ląstelinio ciklo (šis normaliai trunka 12–18 valandų) po veikimo. Kadangi tiriamosios medžiagos įsiskverbimas bei metabolizmas o taipogi jos įtaka ląsteliniam ciklui gali paveikti optimalų laiką per kurį nustatomos chromosomų aberacijos, tai rekomenduojama, kad antrasis mėginys būtų paimamas būtų atliekamas praėjus 24 valandoms po veikimo. Jei dozės duodamos daugiau nei vieną dieną tai mėginys paimamas, praėjus po veikimo laiko tarpui, lygiam maždaug normalaus 1,5 ląstelinio ciklo trukmės.
      Prieš numarinant, atitinkama dozė metafazę sustabdančio agento (pvz., Kolcemido® ar kolchicino) suleidžiama gyvūnams į pilvo plėvę Po atitinkamo intervalo iš gyvūnų paimami mėginiai. Pelėms tas intervalas yra maždaug 3–5 valandos, kiniškiems žiurkėnams – 4–5 valandos. Iš kaulų čiulpų išskiriamos ląstelės ir analizuojamos, siekiant nustatyti chromosomų aberacijas.
      1.5.3   Dozės dydis
      Jeigu tyrimas atliekamas, siekiant surasti intervalą, nes nėra apie tai duomenų, tai jis turi būti atliekamas to pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei veikiant juos tiriamąja chemine medžiaga pagal tą patį tvarkaraštį, kuris buvo naudojamas pagrindinio tyrimo metu (5). Jeigu nustatomas toksiškumas, tai pirmąkart imant mėginius, naudojami trys doziniai lygiai. Šie doziniai lygmenys turi apimti visą intervalą, pradedant nuo maksimumo ir baigiant minimumu arba tokia doze, kuri visiškai nėra toksiška. Vėlesniu mėginių paėmimo metu naudojama tik pati didžiausia dozė. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, išryškėja toksiškumo, priklausomo nuo dozės požymiai, pasirodantys, kai naudojant tokį pat dozavimo tvarkaraštį, yra suleidžiama didžiausia dozė ir spėjama, kad ji bus mirtina. Cheminės medžiagos, kurios pasižymi specifiniu biologiniu aktyvumu, kai jų dozės būna mažos ir netoksinės (pavyzdžiui tokios kaip hormonai ir mitogenai) gali būti laikomos išimtimi, kai joms taikomi dozę nustatantys kriterijai ir tada jos tiriamos kiekvienu atveju atskirai. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kurią suleidus į kaulų čiulpus, pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (pavyzdžiui, mitozinis indeksas sumažėja daugiau nei 50 %).
      1.5.4   Ribų paieškos tyrimas
      Jeigu tyrimas atliekamas, esant vienam dozės lygmeniui, kuris, per vieną dieną atliekant pavienį arba du poveikius tiriamąja medžiaga, mažiausiai sudaro 2 000 mg/kg kūno masės ir jei nepastebima jokių toksinių efektų bei, remiantis struktūriškai panašių cheminių medžiagų tyrimų duomenimis, nebus tikimasi užregistruoti genotoksiškumo, tai tada laikomasi nuostatos, kad yra tikslinga atlikti pilną tyrimą panaudojant tris dozinius lygmenis. Atliekant ilgiau trunkančius tyrimus ir tiriamąja medžiaga veikiant iki 14 dienų, ribinė dozė turi siekti 2 000 mg/kg kūno masės, tuo atveju kai tiriamąja medžiaga veikiama ilgiau nei 14 dienų - 1 000 mg/kg kūno masės. Numatomas tiriamosios medžiagos poveikis žmogui gali parodyti, kad atliekant ribų paieškos tyrimą reikalingas aukštesnis dozinis lygmuo.
      1.5.5   Dozių davimas
      Tiriamoji medžiaga paprastai yra duodama, priverstinai maitinant per vamzdelį, įstatant jį į skrandį, tinkamai įvedant kanulę per vamzdelį arba injekciją į pilvą. Tiriamąją medžiagą galima įterpti ir kitais būdais, jei jie yra pagrindžiami. Maksimalus skysčio, priverstinai duodamo per vamzdelį arba įšvirkščiamo į pilvą vienu metu, tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 mg kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių davimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus sujaudrinančias ar irimą sukeliančias medžiagas, kurios, būdamos didesnių koncentracijų, sukelia žalingus reiškinius, tiriamosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad esant visiems dozės lygiams, tūris būtų pastovus.
      1.5.6   Chromosomų paruošimas
      Kai tik gyvūnai numarinami, iš jų iškart išimami kaulų čiulpai, pamerkiami į hipotoninį tirpalą ir fiksuojami. Vėliau kaulų čiulpų ląstelės išsklaidomos ant tepinėlių ir nudažomos.
      1.5.7   Analizė
      Mitozinis indeksas nustatomas įvertinant citotoksiškumą mažiausiai 1 000 ląstelių, gautų iš 1 gyvūno ir tai atliekama, ištiriant visus tiriamąja medžiaga veiktus (įskaitant teigiamus kontrolinius) ir neveiktus (neigiamus kontrolinius) gyvūnus.
      Išanalizuojama mažiausiai 100 ląstelių, gautų iš 1 gyvūno. Šis skaičius gali būti sumažinamas, jei stebima daug chromosomų aberacijų. Visos skaidrės (įskaitant teigiamų ir neigiamų kontrolinių mėginių skaidres) turi būti užkoduojamos nepriklausomai viena nuo kitos tam, kad jas būtų galima ištirti mikroskopu. Kadangi ruošiant skaidres, dažnai suardoma metafazėje esančios ląstelės bei prarandamos chromosomos, tai vėliau suskaičiuotos ląstelės turi turėti tokį centromerų skaičių, kuris būtų lygus 2n ± 2.
      2.   DUOMENYS
      2.1   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Kiekvieno gyvūno tyrimų rezultatai turi būti pateikiami lentelėse. Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Reikia nustatyti kiekvieno gyvūno ląstelių, chromosomų aberacijų vienoje ląstelėje skaičius bei ląstelių, turinčių chromosomas su struktūrinėmis aberacijomis, skaičių, išreiškiamą procentais. Reikia išvardinti skirtingus chromosomų struktūrinių aberacijų tipus, nurodant jų skaičių bei pasireiškimo dažnį gyvūnų, paveiktų ir nepaveiktų tiriamąja chemine medžiaga, grupėse. Atskirai registruojami plyšiai, tačiau į juos neatsižvelgiama, nustatant absoliutų aberacijos dažnį. Jeigu tarp atskirų lyčių nenustatoma jokių skirtumų pagal atsaką, tai abiejų lyčių tyrimo duomenys apjungiami tam, kad būtų galima atlikti statistinę analizę.
      2.2   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS
      Egzistuoja keli kriterijai, tokie, kaip nuo koncentracijos priklausomas bei pakartojamas chromosomines aberacijas turinčių ląstelių skaičiaus padidėjimas, kuriuo remiantis, nustatoma ar gautas rezultatas yra teigiamas. Pirmiausia reikia aptarti gautų rezultatų biologinę reikšmę. Vertinant tyrimo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus6. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis faktorius, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas. Abejotini rezultatai turėtų būti išsiaiškinti toliau tęsiant tyrimą ir pirmiausia pakeičiant eksperimento sąlygas.
      Poliploidinių ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti mitozę ir sukelti chromosomų skaičiaus ląstelėje pakitimus. Ląstelių, turinčių endoreduplikuotas chromosomas, skaičiaus padidėjimas gali parodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti ląstelinį ciklą (7), (8).
      Jei tiriant medžiagą buvo gauti rezultatai, neatitinkantys aukščiau išvardytų kriterijų, tai šioje sistemoje medžiaga laikoma nemutageniška.
      Nors atliekant daugelį eksperimentų, bus gauti aiškūs teigiami ir neigiami rezultatai, tačiau retais atvejais, remiantis gautų duomenų visuma, nebus galima padaryti konkrečios išvados apie tiriamosios medžiagos aktyvumą. Net ir daug kartų pakartojus eksperimentą rezultatai gali likti abejotini ar neaiškūs.
      Tiriant chromosomų aberacijas in vitro, teigiami rezultatai, gauti atlikus tyrimą, rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia chromosomų aberacijas tirtos gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse. Neigiami rezultatai rodo, kad esant tyrimo sąlygoms, tiriamoji medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų tirtos gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse.
      Reikia aptarti tą galimybę, ar tiriamoji medžiaga ar jos metabolitai pasieks bendrąją cirkuliaciją ar specifiniu būdu tą audinį, į kurį jie yra nukreipti (pvz., sisteminio toksiškumo atveju).
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                   
               
               
                  Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys:
                  
                              —
                           
                           
                              priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas tirpinantysis įrenginys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tiriamieji gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              panaudota rūšis ar kamienas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šaltinis, laikymo sąlygos, maitinimas ir pan.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno svoris prieš pradedant tyrimą ir kiekvienos grupės svorio intervalas, vidurkiai bei standartinis nukrypimas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tyrimo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ribų paieškos tyrimo, jei jis buvo vykdomas, duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pagrindinė priežastis, nulėmusios arti ribos esančio lygio pasirinkimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios medžiagos paruošimo apibūdinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios medžiagos davimo apibūdinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              priežastys, nulėmusios davimo būdo pasirinkimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodai, kuriais patvirtinama, kad tiriamoji cheminė medžiaga pateko į bendrąją cirkuliaciją ar audinį, į kurį ji buvo nukreipta, jei tai buvo padaryta,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios cheminės medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (pm) pervertimas į tikrąją dozę (mg/kūno masės kg/dienai), jei tai įmanoma,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie pašarų ir geriamojo vandens kokybę,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalus veikimo tiriamąja medžiaga atlikimo ir mėginio paėmimo tvarkaraščio aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodai toksiškumui įvertinti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metafazę sustabdančios medžiagos prigimtis, jos koncentracija bei veikimo ja trukmė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              skaidrių paruošimo būdai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberacijų įvertinimo kriterijai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių, kurios buvo išskirtos iš vieno gyvūno bei išanalizuotos, skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teigiamų, neigiamų ar abejotinų rezultatų nustatymo kriterijai.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              toksiškumo požymiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mitozinis indeksas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno ląstelėse esančių aberacijų tipas ir skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              absoliutus aberacijų vieno grupės gyvūnų ląstelėse skaičius, kartu nurodant vidurkius ir standartinius nukrypimus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelėse esančių aberacijų skaičius, kartu nurodant vidurkius ir standartinius nukrypimus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ploidiškumo pasikeitimai, jei buvo tokie stebimi,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinės analizės, jei tokios buvo atliktos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vienu metu gauti neigiami kontroliniai duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              anksčiau gauti neigiami kontroliniai duomenys, kartu pateikiant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vienu metu gauti teigiami kontroliniai duomenys.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Adler, ID. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., p. 275–306.
               
            
                  2)
               
               
                  Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, p. 157–165.
               
            
                  3)
               
               
                  Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115–141.
               
            
                  4)
               
               
                  Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test. Mutation Res., 312, p. 305–312.
               
            
                  5)
               
               
                  Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G, Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313–319.
               
            
                  6)
               
               
                  Loveli, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University Press, Cambridge. p. 184–232.
               
            
                  7)
               
               
                  Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 119, p. 403–413.
               
            
                  8)
               
               
                  Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362–1364.
               
            B.   12. MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ ERITROCITŲ MAŽŲJŲ BRANDUOLIŲ TYRIMAS IN VIVO
      
      1.   METODAS
      Šis metodas pakartoja OECD TG 474, žinduolių eritrocitų mažųjų branduolių tyrimą (1997).
      1.1   ĮVADAS
      Žinduolių mažųjų branduolių tyrimas in vivo naudojamas, kad analizuojant gyvūnų, paprastai graužikų, kaulų čiulpų eritrocitus bei periferinio kraujo ląsteles būtų galima nustatyti tiriamosios cheminės medžiagos pažeidimus, padarytus eritroblastų chromosomose arba mitoziniame aparate.
      Mažųjų branduolių tyrimo tikslas – identifikuoti chemines medžiagas, kurios sukeliančias citogenetinius pažeidimus, dėl kurių susiformuoja mažieji branduoliai, kai chromosomų fragmentai ar ištisos chromosomos įgyja pirminę struktūrą („išnyksta“).
      Kai kaulų čiulpų eritroblastas vystydamasis metu virsta polichromatiniu eritrocitu, pagrindinis (didysis) branduolys yra suspaudžiamas ir bet kuris susiformavęs mažasis branduolys gali likti už citoplazmos, neturinčios branduolio, ribų. Šiose ląstelėse galima pamatyti mažuosius branduolius, nes ląstelė yra praradusi savo pagrindinį branduolį. Jei gyvūnuose, paveiktuose tiriamąja chemine medžiaga, padaugėja polichromatinių eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, tai šitai rodo, kad chromosomos buvo „pažeistos“.
      Atliekant šį tyrimą paprastai naudojami graužikų kaulų čiulpai, nes būtent šiame audinyje susiformuoja polichromatiniai eritrocitai. Periferinio kraujo polichromatinių (nesubrendusių, turinčių mažuosius branduolius) eritrocitų tyrimą galima atlikti su bet kuria rūšimi, kurios blužnis nesugebėjo pašalinti eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, arba kuri buvo pakankamai jautri nustatytiems agentams, sukeliantiems chromosomų aberacijas, atžvilgiu. Mažuosius branduolius galima atskirti, pagal daugelį kriterijų. Vienas jų yra kinetochorų arba centromerinės DNR, esančios arba nesančios mažuosiuose branduoliuose, nustatymas. Tyrimo, kai gyvūnai veikiami tiriamąja chemine medžiaga kelias ar daugiau savaičių, pagrindinis tikslas taipogi gali būti periferiniame kraujyje esančių subrendusių (normochromatinių) eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, skaičiaus, palyginimas su subrendusių eritrocitų skaičiumi.
      Šis žinduolių mažųjų branduolių tyrimas in vivo yra ypač svarbus, įvertinant mutagenų daromą žalą, pagal kurią galima spręsti apie metabolizmą, farmakokinetiką bei DNR pažaidų reparaciją in vivo nulemiančius veiksnius, nors jie gali skirtis pagal gyvūnų rūšį, audinį ir genetinį lygmenį. Tyrimas in vivo taip pat naudingas toliau tiriant mutageninius efektus, nustatytus in vitro.
      
      Jeigu nustatoma, kad tiriamoji medžiaga ar reaktyvus metabolitas neįsiskverbė į audinį, į kurį buvo nukreiptas, tai atliekant šį tyrimą, jis nebenaudojamas.
      Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Centromera (kinetochoras) – chromosomos regionas, su kuriuo ląstelės dalijimosi metu asocijuojasi verpstės siūlai ir dėl to dukterinės chromosomos tvarkingai išsidėsto dukterinių ląstelių poliuose.
      
         Mažieji branduoliai – branduoliai, kurie yra atskirti nuo didžiojo ląstelės branduolio, tačiau jie yra papildomi branduoliai, susidarantys tada, kai mitozės telofazės metu chromosomų fragmentai ar ištisos chromosomos įgauna pirminę struktūrą („išnyksta“).
      
         Normochromatinis eritrocitas – subrendęs, neturintis ribosomų eritrocitas, kuris skiriasi nuo nesubrendusio polichromatinio eritrocito pagal taip, kaip dažais, ribosomų dažosi specifiškais dažais.
      
         Polichromatinis eritrocitas – nesubrendęs, tarpinėje vystymosi stadijoje esantis eritrocitas, kuris vis dar tebeturi ribosomas ir gali būti atskirtas nuo subrendusio normochromatinio eritrocito pagal kaip ribosomų atžvilgiu dažosi specifiniais dažais.
      1.3   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Gyvūnai veikiami tiriamąja medžiaga pasirinktu būdu. Jeigu naudojami kaulų čiulpai, tai praėjus tam tikriems laiko tarpams po veikimo tiriamąja medžiaga, gyvūnai numarinami, iš jų išimami kaulų čiulpai, paruošiami ir nudažomi jų preparatai (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Kai naudojamas periferinis kraujas, tai po veikimo tiriamąja medžiaga praėjus atitinkamiems laiko tarpams, paruošiami tepinėliai, kurie vėliau nudažomi (4) (8) (9) (10). Tiriant periferinį kraują, kaip galima mažiau laiko turi praeiti tarp paskutinio veikimo ir ląstelių surinkimo. Preparatai analizuojami, siekiant identifikuoti mažuosius branduolius.
      1.4   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      1.4.1   Preparatai
      1.4.1.1   Gyvūno rūšies pasirinkimas
      Kai naudojami kaulų čiulpai, rekomenduojama pasirinkti peles ar žiurkes, nors galima pasirinkti ir bet kokias kitas žinduolių rūšis. Kai naudojamas periferinis kraujas, rekomenduojama pasirinkti peles. Tačiau galima naudoti bet kokias kitas žinduolių rūšis, jeigu parodoma, kad tos rūšies žinduolio blužnis nesugeba pašalinti eritrocitus, turinčius mažuosius branduolius arba tos rūšies žinduolis pakankamai jautrus žinomiems agentams, struktūrines chromosomų aberacijas arba chromosomų skaičiaus viename chromosomų rinkinyje pakitimus. Rekomenduojama panaudoti įprastinius jaunų ir sveikų gyvūnų laboratorinius kamienus. Tyrimo pradžioje gyvūnų svorio variacijos turi būti minimalios ir neperžengti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūno vidutinio svorio.
      1.4.1.2   Laikymo ir maitinimo sąlygos
      Taikomos Pagrindinio įvado B dalyje nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad drėgmė siektų 50–60 %.
      1.4.1.3   Gyvūnų paruošimas
      Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę bei tiriamąją (kuriai priskirti individai bus veikiami chemine medžiaga) grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos efektai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas turi savo identifikacijos ženklą. Gyvūnams leidžiama aklimatizuotis prie laboratorinių sąlygų mažiausiai per 5 dienas.
      1.4.1.4   Dozių paruošimas
      Kietosios tiriamosios cheminės medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinamuosiuose įrenginiuose ir jei reikia, tai, prieš paruošiant jų dozes, skirtas gyvūnams, jos praskiedžiamos. Skystųjų tiriamųjų medžiagų dozės ruošiamos iškart arba prieš dozių paruošimą, jos praskiedžiamos. Prieš kiekvieną bandymą šviežiai paruošiami tiriamosios cheminės preparatai ir neatsižvelgiama į stabilumo tyrimo metu gautus duomenis, rodančius, kad medžiaga atitinka jos laikymui keliamus reikalavimus.
      1.4.2   Tyrimo sąlygos
      1.4.2.1   Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys
      Tirpiklis ar tirpinantysis prietaisas neturėtų sukelti jokio toksinio efekto, atitinkančio vartojamas dozes ir neturėtų kilti spėlionių, kad jis gali chemiškai reaguoti su tiriamąja medžiaga. Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/tirpinantieji įrengimai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį.
      1.4.2.2   Kontroliniai mėginiai
      Kiekvieno tyrimo metu turi būti tiriami iš kiekvienai lyčiai priklausančių gyvūnų paimti tarpusavyje sutampantys teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai. Išskyrus tą atvejį, kai gyvūnai veikiami tiriamąja chemine medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir gyvūnai, paveikti tiriamąja chemine medžiaga (tiriamoji grupė).
      Teigiamuose mėginiuose in vivo sąlygomis turi susidaryti mažieji branduoliai, esant tokiam veikimui, kuris kaip tikimasi, užgoš pašalinį foną. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunami efektai būtų ryškūs, bet kad tyrėjas ne iškart atskleistų užkoduotas skaidres. Priimtina, kad teigiamas kontrolinis mėginys būtų duodamas kitu būdu nei tiriamoji cheminė medžiaga ir mėginiai būtų tik vienąkart paimami. Be to, jei įmanoma, tai galima apsvarstyti teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų, priklausančių konkrečiai cheminių medžiagų klasei, panaudojimą. Žemiau pateikiami teigiamų kontrolinių medžiagų pavyzdžiai:
      
                  Medžiaga
               
               
                  CAS Nr.
               
               
                  EINECS Nr.
               
            
                  etilo metansulfonatas
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  N-etil-N- nitroslapalas
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  mitomicinas C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  ciklofosfamidas
                  ciklofosfamido monohidratas
               
               
                  50-18-0
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
            
                  trietilenmelaminas
               
               
                  51-18-3
               
               
                  200-083-5
               
            Neigiami kontroliniai mėginiai, paveikti arba vien tirpikliu arba vien tik tirpinamuoju įrenginiu arba kiti mėginiai paveikti tuo pačiu būdu kaip ir tiriamosios grupės turi būti kiekvienąkart paimami, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų metu gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad variacijos laipsnis tarp gyvūnų ir ląstelių, turinčių mažuosius branduolius, yra priimtini. Jei neigiami kontroliniai mėginiai paimami tik vieną kartą tai pirmojo paėmimo laikas yra pats priimtiniausias. Be to reikia papildomai panaudoti tiriamąja medžiaga nepaveiktus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų bei išspausdintus duomenis, rodančius, kad pasirinktas tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys nesukėlė jokių žalingų ar mutageninių efektų.
      Jei naudojamas periferinis kraujas, tai mėginys, naudojamas prieš veikimą tiriamąja medžiaga, gali būti naudojamas kaip neigiama kontrolė, tačiau tik trumpai trunkančių periferinio kraujo tyrimų metu (pavyzdžiui, 1–3 kartus veikiant tiriamąja medžiaga), kai gaunami duomenys atitinka pageidaujamą anksčiau naudotos kontrolės intervalą
      1.5   TYRIMO ATLIKIMO METODIKA
      1.5.1   Gyvūnų skaičius ir lytis
      Kiekvienoje tiriamojoje ir kontrolinėje grupėje turi būti mažiausiai 5 vienos lyties gyvūnai. Jei tyrimo metu galima gauti anksčiau atliktų tyrimų, panaudojant tą pačią gyvūnų rūšį ir tą patį veikimo tiriamąja medžiaga būdą, duomenis, kurie rodo, toksiškumo tarp atskirų lyčių skirtumai yra labai nedideli, tai tada užteks ištirti vienos lyties gyvūnus. Jeigu žmogaus jautrumas cheminėms medžiagoms, kuriomis jis veikiamas, priklauso nuo lyties, kaip antai jautrumo kai kurioms farmakologiškai aktyvioms medžiagoms atveju, tai reikia ištirti atitinkamą gyvūnų rūšį.
      1.5.2   Veikimo tvarkaraštis
      Nerekomenduojama laikytis veikimo tiriamąja chemine medžiaga atlikimo standartinio tvarkaraščio (t. y. 1, 2 ar daugiau veikimų atliekami kas 24 valandos). Geriau naudoti mėginius, kurių dozės davimo trukmė yra prailginta iki tol, kol šio tyrimo metu buvo nustatytas teigiamas efektas arba atliekant neigiamą kontrolinį tyrimą tol, kol buvo nustatytas toksiškumas arba buvo panaudota ribota dozė buvo duodama iki mėginio paėmimo. Tiriamosios cheminės medžiagos gali būti duodamos ir esant išskaidytai jų doze, t. y. per 1 dieną atliekami 2 poveikiai tiriamąja medžiaga ir abi procedūras skiria ne ilgesnis kaip kelių valandų laikotarpis tam, kad būtų duotas didelis medžiagos tūris.
      Tyrimas gali būti atliekamas 2 būdais:
      
                  a)
               
               
                  gyvūnai vienąkart veikiami tiriamąja chemine medžiaga. Kaulų čiulpų mėginiai paimami mažiausiai 2 kartus, ne anksčiau kaip praėjus 24 valandoms po veikimo tiriamąja medžiaga, bet ne vėliau kaip praėjus 48 valandoms po veikimo ir be to mėginiai paimami atitinkamu laiko momentu. Jeigu mėginiai imami anksčiau nei praėjus 24 valandoms po veikimo, tai turi būti nurodomos priežastys, paskatinusios imtis tokių veiksmų. Periferinio kraujo mėginiai imami mažiausiai 2 kartus, ne anksčiau kaip praėjus 36 valandoms po veikimo, atitinkamais laiko, praėjusio nuo to, kai buvo paimtas pirmasis mėginys, intervalais, bet ne ilgesniu kaip 72 valandų laikotarpiu. Kai paėmus vieną mėginį, nustatomas teigiamas atsakas, tai papildomas mėginio paėmimas nėra būtinas;
               
            
                  b)
               
               
                  jei per dieną atliekami du ir daugiau veikimų (pavyzdžiui, atliekami du ir daugiau veikimų kas 24 valandos), tai mėginiai paimami vienąkart, praėjus 18–24 valandoms po paskutinio kaulų čiulpų paveikimo tiriamąja medžiaga vienąkart, praėjus 36–48 valandoms po paskutinio periferinio kraujo ląstelių paveikimo tiriamąja medžiaga (12).
               
            Mėginiai gali būti papildomai paimami ir kitu laiko metu, jeigu tai manoma esą svarbu.
      1.5.3   Dozės dydis
      Jeigu atliekamas tyrimas, siekiant surasti intervalą, nes nėra duomenų apie tai, tai jis turi būti atliekamas to pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei veikiant juos tiriamąja chemine medžiaga pagal tą patį tvarkaraštį, kuris buvo naudojamas pagrindinio tyrimo metu (13). Jeigu nustatomas toksiškumas, tai pirmąkart imant mėginius, naudojami 3 doziniai lygiai. Šie doziniai lygmenys turi apimti visą intervalą, pradedant nuo maksimumo ir baigiant minimumu arba tokia doze, kuri visiškai nėra toksiška. Vėlesniu mėginių paėmimo metu naudojama tik pati didžiausia dozė. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, išryškėja toksiškumo, priklausomo nuo dozės požymiai, tokie, kurie pasirodo, kai naudojant tokį pat dozavimo tvarkaraštį, suleidžiama didžiausia dozė ir spėjama, kad ji bus mirtina. Cheminės medžiagos, kurios pasižymi specifiniu biologiniu aktyvumu, kai jų dozės būna žemos ir netoksinės (pavyzdžiui tokios kaip hormonai ir mitogenai) gali būti laikomos išimtimi, kai joms taikomi dozę nustatantys kriterijai ir tada jos tiriamos kiekvienu atveju atskirai. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kurią suleidus į kaulų čiulpus, pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (nesubrendusių eritrocitų skaičius, lyginant su absoliučiu visų eritrocitų, esančių kaulų čiulpuose ir periferiniame kraujyje, skaičiumi, sumažėja).
      1.5.4   Ribų paieškos tyrimas
      Jeigu tyrimas atliekamas, esant vienam doziniam lygmeniui, kuris, per vieną dieną atliekant pavienį arba du poveikius tiriamąja medžiaga, mažiausiai sudaro 2 000 mg/kūno/kg ir jei nepastebima jokių toksinių efektų bei, remiantis struktūriškai panašių cheminių medžiagų tyrimų duomenimis, nebus tikimasi užregistruoti genotoksiškumo, tai tada laikomasi nuostatos, kad yra tikslinga atlikti pilną tyrimą, panaudojant 3 dozinius lygmenis. Atliekant ilgiau užtrunkančius tyrimus ir tiriamąja medžiaga veikiant iki 14 dienų, ribinė dozė turi siekti 2 000 mg/kūno/kg, tuo atveju kai tiriamąja medžiaga veikiama ilgiau nei 14 dienų – 1 000 mg/kūno/kg. Numatomas tiriamosios medžiagos poveikis žmogui gali parodyti, kad, atliekant ribų paieškos tyrimą reikia naudoti aukštesnį dozinį lygmenį.
      1.5.5   Dozių davimas
      Tiriamoji medžiaga yra paprastai duodama, priverstinai maitinant per vamzdelį, įstatant jį į skrandį, tinkamai įvedant kanulę per vamzdelį arba injekciją į pilvą. Tiriamąją medžiagą galima įvesti ir kitais būdais, jei jie yra pagrindžiami. Maksimalus skysčio, priverstinai duodamo per vamzdelį arba įšvirkščiamo į pilvą vienu metu, tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 mg kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių davimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus suaudrinančias ar irimą sukeliančias medžiagas, kurios, būdamos didesnėmis koncentracijomis, sukelia žalingus efektus, tiriamosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad esant visiems doziniams lygmenims, tūris būtų pastovus.
      1.5.6   Kaulų čiulpų/kraujo paruošimas
      Kaulų čiulpų ląstelės paprastai gaunamos iš numarintų gyvūnų šlaunikaulių ir blauzdikaulių. Bendru atveju iš šlaunikaulių ir blauzdikaulių išskiriamos ląstelės ir, panaudojant gerai žinomus metodus, paruošiami jų preparatai, kurie po to nudažomi. Periferinis kraujas imamas iš uodeginės venos ar kito atitinkamo kraujo indo. Iš kraujo išskirtos ląstelės arba iškart dažomos supravitaliniais dažais (8) (9) (10) arba paruošiami tepinėliai, kurie vėliau yra nudažomi. DNR atžvilgiu naudojami specifiniai dažai, tokie kaip akridino oranžinis 14 arba Hoechst 33258 dažas, turintis pironino-Y 15, gali pašalinti kai kuriuos artefaktus, kurie atsiranda, naudojant DNR atžvilgiu nespecifinius dažus. Tačiau šis privalumas neatmeta galimybės naudoti ir įprastinius dažus (pavyzdžiui, Giemsa dažą). Galima naudoti ir papildomas sistemas, tokias kaip celiulioze užpildytas chromatografines kolonėles, skirtas branduolius turinčioms ląstelėms pašalinti (16), kadangi buvo parodyta, kad naudojant šias sistemas, mažuosius branduolius galima tinkamai išskirti laboratorinėmis sąlygomis.
      1.5.7   Analizė
      Nustatomas kiekvieno gyvūno nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykis, suskaičiuojant mažiausiai 200 eritrocitų, esančių kaulų čiulpuose ir 1 000 eritrocitų, esančių periferiniame kraujyje (17). Prieš pradedant mikroskopinę analizę, visos skaidrės, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius mėginius, užkoduojamos nepriklausomai vienos nuo kitų. Tam, kad identifikuoti nesubrendusius, mažuosius branduolius turinčius eritrocitus, reikia suskaičiuoti mažiausiai 2 000 eritrocitų, gautų iš vieno gyvūno. Papildoma informacija gali būti gaunama, kai skaičiuojami subrendę eritrocitai, turintys mažuosius branduolius. Kai skaidrės analizuojamos, tai nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykis turi būti ne mažesnis kaip 20 % kontrolinė vertės. Tuo atveju, kai gyvūnai buvo veikiami tiriamąja medžiaga mėnesį ir ilgiau, tai reikia suskaičiuoti mažiausiai 2 000 eritrocitų, gautų iš vieno gyvūno tam, kad galima būtų identifikuoti ląsteles, turinčias mažuosius branduolius. Vietoj rankinio įvertinimo galima naudoti automatizuotas analizės sistemas (vaizdo analizės ir ląstelių suspensijos srauto tėkmės citometrinės analizės sistemas), jeigu jos atitinkamai yra patvirtintos ir pagrįstos.
      2.   DUOMENYS
      2.1   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Kiekvieno gyvūno tyrimų rezultatai turi būti pateikiami lentelėse. Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Turi būti nustatytas kiekvieno gyvūno nesubrendusių eritrocitų ir nesubrendusių eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, skaičius bei nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis. Jeigu gyvūnai pastoviai veikiami tiriamąja medžiaga mėnesį ar ilgiau, tai turi būti pateikti duomenys apie subrendusius eritrocitus, jei tokie duomenys buvo renkami. Jeigu įmanoma, tai kiekvieno gyvūno atveju pateikiamas nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis bei eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, skaičius, išreikštas procentais Jeigu nenustatoma jokių atsako skirtumų tarp atskirų lyčių, tai abiejų lyčių tyrimo duomenys sujungiami tam, kad būtų galima atlikti statistinę analizę.
      2.2   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS
      Teigiamą rezultatą galima įvertinti keletu kriterijų, tokiais kaip nuo dozės priklausomas ląstelių, turinčių mažuosius branduolius skaičiaus padidėjimas arba akivaizdus ląstelių, turinčių mažuosius branduolius ir priklausančių pavienės dozės grupei pagal vienkartinį mėginio paėmimo laiką, skaičiaus padidėjimas. Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Įvertinant tyrimo metu gautus rezultatus, galima pasinaudoti statistiniais metodais (18) (19). Statistinis reikšmingumas turėtų būti vienintelis faktorius, pagal kurį sprendžiama, ar atsakas teigiamas, ar ne. Abejotini rezultatai turėtų būti išaiškinti, toliau tęsiant tyrimą ir pirmiausia pakeičiant eksperimentines sąlygas.
      Jei tiriant medžiagą gaunami rezultatai, neatitinkantys aukščiau išvardytų kriterijų, ši tiriamoji medžiaga laikoma nemutageniška.
      Nors daugumos eksperimentų metu buvo gauti aiškiai teigiami ar neigiami rezultatai, išimtiniais atvejais gautų rezultatų rinkinys neleis padaryti teisingos išvados apie tiriamosios medžiagos aktyvumą. Rezultatai gali likti abejotini ar neaiškūs, nepriklausomai nuo atliktų eksperimentų skaičiaus.
      Tiriant mažuosius branduolius in vitro, gauti teigiami rezultatai rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia mažųjų branduolių, kuriuos sąlygoja tiriamosios rūšies gyvūnų eritroblastų chromosomų ar mitozinio aparato pažeidimai, pasireiškimą. Neigiami rezultatai rodo, kad tiriamoji medžiaga nesukelia mažųjų branduolių atsiradimo tiriamos rūšies gyvūnų nesubrendusiuose eritroblastuose.
      Reikia aptarti tą galimybę, kai tiriamoji medžiaga arba jos metabolitai specifiniu būdu pasieks bendrąją cirkuliaciją ar tą audinį, į kurį jie yra nukreipti (pavyzdžiui, sisteminio toksiškumo atveju).
      3.   ATASKAITA
      TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                   
               
               
                  Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys:
                  
                              —
                           
                           
                              priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tiriamieji gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              panaudota rūšis ar kamienas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šaltinis, laikymo sąlygos, maitinimas ir pan.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno svoris prieš pradedant tyrimą ir kiekvienos grupės svorio riba, vidurkiai bei standartinis nukrypimas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tyrimo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ribų paieškos tyrimo, jei jis buvo vykdomas, rezultatai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pagrindinė priežastis, nulėmusi arti ribos esančio lygio pasirinkimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie tiriamosios medžiagos paruošimą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie tiriamosios medžiagos davimą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pagrindinė priežastis, nulėmusi davimo būdo pasirinkimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodai, kuriais patvirtinama, kad tiriamoji cheminė medžiaga pateko į bendrąją cirkuliaciją ar audinį, į kurį ji buvo nukreipta, jei tai buvo padaryta,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios cheminės medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (pm) pervertimas į tikrąją dozę (mg/kūno masės kg/dienai), jei tai įmanoma,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie pašarų ir geriamojo vandens kokybę,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalus veikimo tiriamąja medžiaga atlikimo ir mėginio paėmimo tvarkaraščio aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              skaidrių paruošimo metodai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodai toksiškumui įvertinti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nesubrendusių eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, skaičiavimo kriterijai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iš vieno gyvūno išskirtų bei išanalizuotų ląstelių skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teigiamų, neigiamų ar abejotinų rezultatų nustatymo kriterijai.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              toksiškumo požymiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno nesubrendusių, turinčių mažuosius branduolius, eritrocitų skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvienos grupės nesubrendusių, mažuosius branduolius turinčių eritrocitų skaičiaus vidurkis ir standartinis nukrypimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinės analizės, jei bet kokios buvo atliktos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vienu metu naudojamų neigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vienu metu naudojamų teigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenys.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Heddle, J.A. (1973). A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, p. 187–190.
               
            
                  2)
               
               
                  Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, p. 9–15.
               
            
                  3)
               
               
                  Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation Res. 123, p. 61–118.
               
            
                  4)
               
               
                  Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. and Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, p. 29–80.
               
            
                  5)
               
               
                  MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, CM. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice in: „Developments in Science and Practice of Toxicology“, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, p. 555–558.
               
            
                  6)
               
               
                  MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C, Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res. 189, p. 103–112.
               
            
                  7)
               
               
                  MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E. (1990). The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol, 14, p. 513–522.
               
            
                  8)
               
               
                  Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, p. 245–249.
               
            
                  9)
               
               
                  The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, p. 83–98.
               
            
                  10)
               
               
                  The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan)(1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 153–159.
               
            
                  11)
               
               
                  Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mutation Res., 312, p. 293–304.
               
            
                  12)
               
               
                  Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalized sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 313–319.
               
            
                  13)
               
               
                  Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G, Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313–319.
               
            
                  14)
               
               
                  Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res., 120, p. 241–247.
               
            
                  15)
               
               
                  MacGregor, J.T., Wehr, CM. and Langlois, R.G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, p. 269–275.
               
            
                  16)
               
               
                  Romagna, F. and Staniforth, CD. (1989). The automated bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, p. 91–104.
               
            
                  17)
               
               
                  Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, p. 97–99.
               
            
                  18)
               
               
                  Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assay. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115–141.
               
            
                  19)
               
               
                  Loveli, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G, Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184–232.
               
            B.   13/14. MUTAGENIŠKUMAS. GRĮŽTAMŲJŲ MUTACIJŲ BAKTERIJOSE TYRIMAS
      1.   METODAS
      Šis metodas pakartoja OECD TG 471, grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimą (1997).
      1.1.   ĮVADAS
      Tiriant grįžtamąsias mutacijas bakterijose, naudojami aminorūgščių reikalaujantys Salmonella typhimurium ir Escherichia coli kamienai tam, kad būtų galima nustatyti taškines mutacijas, tokias kaip vienos ar kelių DNR bazių porų pakaitos, intarpai ar delecijos (1) (2) (3). Šio grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimo principas yra tai, kad jo metu nustatomos mutacijos, kurios pakeičia tiriamuosiuose kamienuose esančias mutacijas taip, kad atkuria bakterijų funkcinį sugebėjimą sintetinti pagrindinę amino rūgštį. Bakterijos-revertantai aptinkamos pagal savo sugebėjimą augti terpėje, kurioje nėra amino rūgšties, reikalingos jų tėviniam tiriamajam kamienui.
      Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra taškinės mutacijos bei su jomis susiję įvykiai ir egzistuoja pakankamai įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl taškinių mutacijų. Grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimas yra nebrangus ir greitai bei pakankamai lengvai atliekamas. Dauguma tiriamųjų kamienų pasižymi keletu ypatybių, pagal kurias juos galima lengvai nustatyti, analizuojant mutacijas, DNR sekose, esančiose grįžtamųjų mutacijų vyksmo vietose bei sukuriančiose atsaką į signalą, padidintą ląstelių pralaidumą didelės molekulinės masės molekulėms ir DNR pažaidų atstatymo sistemų sunaikinimą arba pažaidoms atsparių DNR atkūrimo procesų suintensyvėjimą. Tiriant kamienų specifiškumą gaunama vertingos informacijos apie genotoksiškų agentų sukeltų mutacijų tipus. Tiriant chemines medžiagas, tarp jų ir lakius junginius, pasižyminčius skirtingomis fizikinėmis bei cheminėmis savybėmis, buvo sukaupta didelė duomenų apie įvairiausias struktūras bazė, kuri vartojama, vykdant grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimus bei naudojantis visuotinai pripažintais metodais.
      Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      
         Grįžtamųjų mutacijų tyrimas
         Salmonella typhimurium arba Escherichia coli kamienuose nustato kamieno, kuriam reikalinga aminorūgštis (atitinkamai histidinas ar triptofanas), mutaciją, dėl kurios atsiranda kamienas, kuriam nereikalinga aminorūgštis, tiekiama egzogeniniu būdu.
      
         Mutagenai, sukeliantys bazių porų pakaitas – agentai, sukeliantys DNR bazių porų pakaitas. Atliekant reversijos tyrimą nustatoma, kad pakaita gali vykti pradinės mutacijos ar kitoje bakterijos genomo vietoje.
      
         Mutagenai, sukeliantys skaitymo rėmelio pasislinkimą – agentai, sukeliantys vienos ar kelių DNR bazių porų intarpus ar delecijas, o dėl to pasislenka RNR molekulėje esantis skaitymo rėmelis.
      1.3.   PRADINIAI SVARSTYMAI
      Atliekant grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimą naudojamos prokariotinės ląstelės, kurios skiriasi nuo žinduolių ląstelių pagal tokius faktorius, kaip medžiagų transportas į ląstelę, metabolizmas, chromosomų struktūra bei DNR pažaidų atstatymo procesai. Paprastai atliekant tyrimus in vitro, reikia naudoti metabolinės aktyvacijos egzogeninį šaltinį. Metabolinės aktyvacijos sistemos in vitro negali absoliučiai imituoti žinduolių metabolinės aktyvacijos sąlygų in vivo. Taigi atliekant tyrimą negaunama tiesioginės informacijos apie žinduolių cheminių medžiagų mutageniškumą ir karcinogeniškumą.
      Grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimas paprastai naudojamas pirmiausia atrankai pagal genotoksiškumą o konkrečiai, pagal sugebėjimą sukelti taškines mutacijas. Gausi duomenų bazė parodė, kad daugelio cheminių medžiagų genotoksiškumas buvo nustatytas tiek grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimo tiek ir kitų tyrimų metu. Tačiau šio tyrimo metu negalima nustatyti keleto mutagenų ir šito priežastis yra dėl grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimo pagrindinio tikslo savitumo, metabolinės aktyvacijos skirtumų bei mutagenų paplitimo gamtoje skirtumų. Kita vertus, atsižvelgus į faktorius, padidinančius grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimo jautrumą, galima pervertinti mutageninį medžiagų aktyvumą.
      Grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimas netinka konkrečių cheminių medžiagų klasėms, pavyzdžiui junginiams, pasižymintiems pernelyg dideliu baktericidiniu aktyvumu (konkretūs antibiotikai) ir tiems junginiams, kurie, kaip manoma, blokuoja žinduolių ląstelių DNR replikacijos sistemą (keletas topoizomerazių inhibitorių ir nukleozidų analogų). Tokiais atvejais labiau tinka tirti žinduolių mutacijas.
      Nors vykdant šį tyrimą nustatoma, kad daugelis junginių karcinogeniški žinduolių atveju, tačiau šio tarpusavio ryšio nereikia suabsoliutinti. Tai priklauso nuo cheminių medžiagų klasės ir atliekant šį tyrimą neįmanoma nustatyti tam tikrų karcinogenų, kadangi jų veikimo mechanizmas nesiremia genotoksiškumu arba jie veikia visai kitaip nei bakterinėse ląstelėse.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Bakterinės ląstelės veikiamos tiriamąja medžiaga esant arba nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos sistemos. Pagal inkorporacijos į lėkštelę metodą šios suspensijos padengiamos agaru ir užliejamos ant minimalios terpės. Pagal išankstinės inkubacijos metodą suspensija iš pradžių inkubuojama su medžiaga, kuria bus veikiamos bakterinės ląstelės, o vėliau padengiama agaru ir po to užpilama ant minimalios terpės. Panaudojant abu metodus ir praėjus 2–3 inkubacijos dienoms, skaičiuojamos revertantų kolonijos ir lyginamos su spontaninių revertantų kolonijomis, auginamomis kontrolinėse lėkštelėse, tirpiklyje, skaičiumi.
      Atliekant grįžtamųjų mutacijų bakterijose tyrimą dažniausiai naudojama keletas procedūrų, tokių kaip inkorporacijos į lėkštelę (1) (2) (3) (4), išankstinės inkubacijos (2) (3) (5) (6) (7) (8), fliuktuacijos (9) (10) ir suspendavimo metodai. Taipogi buvo aprašytos dujinių ir lakiųjų medžiagų tyrimo modifikacijos (12).
      Tyrimo metodo aprašyme pateiktos bandymo atlikimo metodikos pirmiausia siejasi su inkorporacijos į lėkštelę ir išankstinės inkubacijos metodais. Šios dvi bandymo atlikimo metodikos tinka, atliekant eksperimentus, kai naudojama arba nenaudojama metabolinė aktyvacijos sistema. Kai kurios medžiagos priklauso tokioms cheminių medžiagų klasėms, kaip alifatiniai aminai, turintys trumpąją grandinę, dvivalenčiai metalai, turintys NO grupę, alkaloidai, turintys pirolizidiną, alilo grupę turintys junginiai bei azoto junginiai (3). Taip pat pripažįstama, kad naudojant tokias standartines tyrimo metodikas, kaip inkorporacijos į lėkštelę bei išankstinės inkubacijos metodus, ne visada galima nustatyti tam tikroms klasėms priklausančius mutagenus. Šie mutagenai yra laikomi „ypatingais atvejais“ ir ypač rekomenduojama, kad jų nustatymui būtų panaudojamos ir kitos, alternatyvios bandymo atlikimo metodikos. Šiuos „ypatingus atvejus“ galima identifikuoti, kartu pateikiant ir jų nustatymo metodikas: azodažai, diazo grupę turintys junginiai (3) (5) (6) (13), dujos bei lakiosios medžiagos (12) (14) (15) (16) ir glikozidai (17) (18). Nukrypimas nuo standartinės bandymo atlikimo metodikos turi būti moksliškai pagrįstas.
      1.5.   TYRIMO METODO APRAŠYMAS
      1.5.1.   Preparatai
      1.5.1.1.   Bakterijos
      Grynos bakterijų kultūros auginamos tol, kol pasiekia vėlyvąją eksponentinę ir ankstyvąją plato augimo fazę (apie 109 ląstelių/ml). Kultūros, pasiekusios vėlyvąją plato augimo fazę, neturi būti naudojamos. Svarbu yra tai, kad bakterijų kultūrose, kurios naudojamos eksperimentams, būtų didelis gyvų bakterijų ląstelių titras. Titras nustatomas arba pagal anksčiau gautas augimo kreives arba kiekvieno bandymo metu nustatant gyvų ląstelių skaičių pagal jų augimą lėkštelėje.
      Rekomenduojama inkubacijos temperatūra yra 37 oC
      Turi būti naudojami mažiausiai 5 bakterijų kamienai. Jų tarpe turi būti keturi Salmonella typhimurium kamienai (TA 1535, TA 1537 arba TA 97a arba TA 97; TA 98 ir TA 100), kurie, kaip buvo įrodyta daugelyje laboratorijų, yra patikimi ir atkuria atsaką. Šių keturių Salmonella typhimurium kamienų pirminės reversijos vietoje lokalizuota GC bazių pora ir yra žinoma, kad panaudojant šiuos kamienus, negalima identifikuoti kryžmiškai rišančių mutagenų ir hidrazinų. Šios medžiagos nustatomos, panaudojant Escherichia coli WP2 ir Salmonella typhimurium TA 102 kamienus (19), kurių pirminėje reversijos vietoje lokalizuota AT bazių pora. Taigi rekomenduojamas sekantis kamienų derinys:
      
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA1535, ir
               
            
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA1537 arba TA97 arba TA97a, ir
               
            
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA98, ir
               
            
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA100 ir
               
            
                  —
               
               
                  
                     E.
                     coli WP2 uvrA arba E. coli WP2 uvrA (pKM10l) arba S. typhimurium TA102.
               
            Tam, kad kryžmiškai surišantys mutagenai būtų nustatyti, reikia papildomai panaudoti S. typhimurium TA 102 arba E. coli WP 2 ar WP 2 (pKM 101) kamienus, sugebančius taisyti DNR pažaidas.
      Reikia naudoti gerai žinomas pagrindinės kultūros paruošimo, žymės patvirtinimo bei saugojimo metodikas. Reikia parodyti, kad aminorūgštis yra būtina kiekvieno preparato, paruošto iš užšaldytos pradinės kultūros, augimui (histidinas – S. typhimurium kamienams, o triptofanas – E. coli kamienams). Kitos fenotipinės charakteristikos, o būtent plazmidžių, turinčių R-faktorių, egzistavimas arba neegzistavimas, jei tai yra reikalinga (kamienų TA 98, TA 100 it TA 97a arba TA 97, WP 2 uvrA ir WP 2 uvrA (pKM 101) atsparumas ampicilinui bei kamieno TA 102 atsparumas ampicilinui ir tetraciklinui), būdingos mutacijos (S. typhimurium rfa mutacija, apsprendžianti jautrumą violetinei šviesai, E. coli uvr A mutacija arba S.typhimurium uvr B mutacija, nulemianti jautrumą ultravioletinei šviesai) (2) (3). Kamienai turi spontaniškai sukurti revertantų kolonijas, kurių skaičius turi atitikti dažnumo ribas, numatomas, remiantis anksčiau gautais laboratorijoje duomenimis ir pirmiausia turi atitikti literatūroje nurodytas ribas.
      1.5.1.2.   Terpė
      Naudojamas atitinkamas minimalus agaras (pavyzdžiui, turintis minimalios Vogel-Bonner terpės E ir gliukozės) ir ant viršaus užliejamas agaras, turintis histidino ir biotino arba triptofano tam, kad vyktų keleto ląstelių dalijimasis (1) (2) (9).
      1.5.1.3.   Metabolinė aktyvacija
      Bakterijos turi būti veikiamos tiriamąja medžiaga, tiek esant tiek ir nesant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai. Plačiausiai vartojama sistema yra iš graužikų kepenų, paveiktų tokiais fermentinį aktyvumą skatinančiais agentais kaip AROCLOR 1254 (1) (2) ar fenobarbitono ir P-naftoflavono mišiniu (18) (20) (21), post-mitochondrinė frakcija, praturtinta kofaktoriumi. Post-mitochondrinė frakcija paprastai vartojama koncentracijomis, kurių intervalas S9 mišinyje siekia nuo 5 iki 30 % (v/v). Metabolinės aktyvacijos sistema pasirenkama priklausomai nuo tiriamosios cheminės medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga varoti daugiau nei post-mitochondrinės frakcijos koncentraciją. Tiriant azodažus ir diazo grupę turinčius junginius, labiau tikslinga naudoti redukcinę metabolinę aktyvacijos sistemą (6) (13).
      1.5.1.4.   Tiriamoji medžiaga/preparatas
      Kietosios tiriamosios medžiagos turi būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinančiuosiuose įrenginiuose ir, jei reikia, tai prieš paveikiant jomis bakterijas, jos praskiedžiamos. Skystosios tiriamosios medžiagos įnešamos tiesiogiai į tyrimo sistemas ir/ar praskiedžiamos prieš veikiant jomis bakterijas. Kiekvieno bandymo metu turi būti paruošiami švieži preparatai, nekreipiant dėmesio į stabilumo tyrimo duomenis, rodančius, kad tiriamosios medžiagos atitinka saugojimui keliamus reikalavimus.
      Neturi kilti abejonių dėl to, kad tirpiklis/tirpinantysis įrenginys gali chemiškai reaguoti su tiriamąja medžiaga ir be to tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys turi būti suderintas su bakterijų išgyvenimu bei S9 aktyvumu (22). Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/tirpinantieji įrengimai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrengimą. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturi būti vandens.
      1.5.2.   Tyrimo sąlygos
      1.5.2.1.   Tiriamieji kamienai (žr. 1.5.1.1.)
      1.5.2.2.   Veikimo koncentracija
      Kriterijai, į kuriuos reikia atsižvelgti, nustatant didžiausią tiriamosios medžiagos koncentracija, yra medžiagos citotoksiškumas ir tirpumas galutiniame veikimo mišinyje.
      Būtų naudinga nustatyti toksiškumą bei netirpumą preliminarinio eksperimento metu. Citotoksiškumas gali būti nustatomas pagal revertantų skaičiaus sumažėjimą, šalutinės terpės praskaidrėjimą ar sunykimą arba pagal kultūrų, paveiktų tiriamąja medžiaga, išgyvenimo laipsnį. Medžiagos citotoksiškumas gali kisti dėl metabolinės aktyvacijos sistemų egzistavimo. Netirpumas gali būti įvertinamas plika akimi stebint precipitato susidarymą galutiniame reakciniame mišinyje, esant šiuo metu atliekamo eksperimento sąlygoms.
      Maksimali rekomenduojama tiriamų tirpių medžiagų, nepasižyminčių citotoksiškumu, koncentracija yra 5 mg/lėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje. Jei medžiagos, nepasižyminčios citotoksiškumu, netirpsta, jų koncentracijoms esant 5 mg/lėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje, tai esant vienai ar daugiau tirtų koncentracijų, tos medžiagos visai netirpsta galutiniame reakciniame mišinyje, skirtame, paveikti bakterijas. Tiriamosios medžiagos, kurios yra citotoksiškos, kai jų koncentracijos yra mažesnės nei 5 mg/lėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje, turi būti tiriamos tol, kol nustatoma koncentracija, kuriai esant, medžiagos pasižymi citotoksiniu aktyvumu. Precipitato susidarymas neturi trukdyti įvertinti duomenis.
      Reikia panaudoti mažiausiai 5 išanalizuojamas tiriamosios medžiagos koncentracijas, kurių vertes pradinio eksperimento metu skirtų intervalai, lygūs pusei log (V 10). Mažesni skiriamieji intervalai tinka tada, kai tiriama atsako priklausomybė nuo koncentracijos. Koncentracija, mažesnė už 5 mg/lėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje, pasirenkama tuo atveju, jei tiriamųjų medžiagų mutageniškumas yra gana neaiškus.
      1.5.2.3.   Neigiami ir teigiami kontroliniai mėginiai
      Atliekant kiekvieną eksperimentą kartu su metaboline aktyvacija arba be jos būtina vienu metu naudoti neigiamus (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) bei teigiamus kontrolinius mėginius, specifiškus bakterijų kamienui.
      Kai bandymų metu naudojama metabolinės aktyvacijos sistema, tai teigiama kontrolinė etaloninė medžiaga pasirenkama pagal naudoj amą bakterinio kamieno tipą.
      Žemiau pateikiami tinkamų teigiamų kontrolinių medžiagų, naudojamų, esant metabolinei aktyvacijai, pavyzdžiai:
      
                  CAS Nr.
               
               
                  EINECS Nr.
               
               
                  Medžiaga
               
            
                  781-43-1
               
               
                  212-308-4
               
               
                  9,10-dimetilantracenas
               
            
                  57-97-6
               
               
                  200-359-5
               
               
                  7,12-dimetilbenzaantracenas
               
            
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
               
                  benzpirenas
               
            
                  613-13-8
               
               
                  210-330-9
               
               
                  2-aminoantracenas
               
            
                  50-18-0
               
               
                   
               
               
                  ciklofosfamidas
               
            
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
               
                  ciklofosfamido monohidratas
               
            Žemiau pateikiama tinkama teigiama kontrolinė medžiaga, kai naudojamas redukcinės metabolinės aktyvacijos metodas:
      
                  CAS Nr.
               
               
                  EINECS Nr.
               
               
                  Medžiaga
               
            
                  573-58-0
               
               
                  209-358-4
               
               
                  Kongo raudonasis
               
            22-aminoantracenas neturi būti naudojamas kaip vienintelis S9 mišinio veikimo efektyvumo indikatorius. Jei 2-aminoantracenas yra naudojamas, tai kiekviena S9 mišinio partija išanalizuojama, panaudojant mutageną, kuriam yra reikalinga metabolinė aktyvacija mikrosominių fermentų pagalba, pavyzdžiui, benzpireną ar dimetilbenzaantraceną.
      Toliau pateikiami tinkamų teigiamų kontrolinių medžiagų, specifiškų bakterijų kamienui, naudojamų, nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos, pavyzdžiai:
      
                  CAS Nr.
               
               
                  EINECS Nr.
               
               
                  Medžiaga
               
               
                  Kamienas
               
            
                  26628-22-8
               
               
                  247-852-1
               
               
                  Natrio azidas
               
               
                  TA 1535 ir TA 100
               
            
                  607-57-8
               
               
                  210-138-5
               
               
                  2-nitrofluorenas
               
               
                  TA 98
               
            
                  90-45-9
               
               
                  201-995-6
               
               
                  9-aminoakridinas
               
               
                  TA 1537, TA 97 ir TA 97a
               
            
                  17070-45-0
               
               
                  241-129-4
               
               
                  ICD 191
               
               
                  TA 1537, TA 97 ir TA 97a
               
            
                  80-15-9
               
               
                  201-254-7
               
               
                  kumeno hidroksiperoksidas
               
               
                  TA 102
               
            
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
               
                  mitomicinas C
               
               
                  WP2 uvrA ir TA102
               
            
                  70-25-7
               
               
                  200-730-1
               
               
                  N-etil-N-nitro-N-nitrozoguanidinas
               
               
                  WP2, WP2uvrA ir WP2uvrA(pK M101)
               
            
                  56-57-5
               
               
                  200-281-1
               
               
                  4-nitrokvinolino-1- oksidas
               
               
                  WP2, WP2uvrA ir WP2uvrA(pK M101)
               
            
                  3688-53-7
               
               
                   
               
               
                  Furilfuramidas (AF2)
               
               
                  kamienai, turintys plazmidžių
               
            Kitas atitinkamas etalonines medžiagas irgi galima naudoti kaip teigiamus kontrolinius mėginius. Jei įmanoma, tai apsvarstomas konkrečios klasės cheminių medžiagų, kaip teigiamų kontrolinių mėginių, panaudojimas.
      Reikia panaudoti ir neigiamus kontrolinius mėginius, sudarytus vien tik iš tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio ir neturinčius tiriamosios medžiagos bei veiktus tokiu pat būdu kaip ir tiriamieji mėginiai. Be to reikia naudoti ir tiriamąja medžiaga neveiktus neigiamus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesio į anksčiau gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad pasirinktas tirpiklis nėra žalingas ir mutageniškas.
      1.5.3.   Bandymo atlikimo metodika
      Atliekant bandymą pagal inkorporacijos į lėkštelę metodą (1) (2) (3) (4), 2 ml padengiančiojo agaro sumaišoma su 0,05 ar 0,1 ml šviežiai išaugintos bakterijų kultūros (turinčios apie 108 gyvų ląstelių) ir 0,5 ml sterilaus buferio. Įprastiniu atveju atliekant bandymą, kai naudojama metabolinė aktyvacija, 0,5 ml metabolinės aktyvacijos mišinio, turinčio pakankamą post-mitochondrinės frakcijos kiekį (intervalo 5–30 % v/v ribose, metabolinės aktyvacijos mišinyje), sumaišoma su 2 ml padengiančiojo agaro, bakterijomis ir tiriamąja medžiaga/tiriamuoju tirpalu. Kiekvieno mėgintuvėlio turinys suplakamas ir užpilamas ant minimalaus agaro, esančio lėkštelėje, paviršiaus. Prieš inkubaciją padengiančiajam agarui leidžiama sukietėti.
      Atliekant bandymą pagal išankstinės inkubacijos metodą (2) (3) (5) (6), tiriamoji medžiaga/tiriamasis tirpalas iš anksto inkubuojamas su tiriamuoju bakteriniu kamienu (turinčiu apie 108 gyvų ląstelių) ir steriliu buferiu arba metabolinės aktyvacijos sistema (0,5 ml) ir įprastiniu atveju inkubuojamas 20 ar daugiau minučių 30–37 oC temperatūroje prieš sumaišant su padengiančiuoju agaru ir užpilant ant minimalaus agaro, esančio lėkštelėje, paviršiaus. Įprastiniu atveju 2 ml padengiančiojo agaro sumaišoma su 0,05 ar 0,1 ml tiriamosios medžiagos/tiriamojo tirpalo, 0,1 ml bakterijų ir 0,5 ml S9 mišinio ar sterilaus buferio. Atliekant išankstinę inkubaciją, mėgintuvėliai purtomi ant kratytuvo, kad jų turinys prisisotintų oro.
      Tam, kad tiriant kiekvieną dozę, būtų gaunamas patenkinamas variacijos koeficientas, atliekamas bakterijų išsėjimas į 3 lėkšteles. Jeigu atliekamas išsėjimas tik į 2 lėkšteles, tai jis moksliškai pagrindžiamas. Atsitiktinis lėkštelės praradimas nereiškia, kad bandymas nepavyko.
      Dujinės bei lakios medžiagos turi būti tiriamos atitinkamais metodais, jas laikant užsandarintuose induose (12) (14) (15) (16).
      1.5.4.   Inkubacija
      Atliekant konkretų bandymą visos lėkštelės turi būti inkubuojamos 48-72 valandas 37 oC temperatūroje. Po inkubacijos nustatomas revertantų kolonijų, esančių kiekvienoje lėkštelėje skaičius.
      2.   DUOMENYS
      2.1.   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Pateikiant rezultatus, nurodomas revertantų kolonijų, esančių vienoje lėkštelėje, skaičius. Taip pat reikia nurodyti revertantų kolonijų, esančių tiek teigiamose, tiek ir neigiamose (tirpiklio kontrolinis mėginys ir tiriamąja medžiaga neveiktas kontrolinis mėginys) kontrolinėse lėkštelėse, skaičių. Pateikiant duomenis apie tiriamąją medžiagą ir teigiamuss bei neigiamus (tirpiklio kontrolinis mėginys ir (ar) tiriamąja medžiaga neveiktas kontrolinis mėginys) kontrolinius mėginius, nurodomas revertantų kolonijų, esančių kiekvienoje lėkštelėje, skaičius, jo vidurkis bei standartinis nukrypimas.
      Nėra reikalaujama, kad būtų patvirtinta, jog buvo gautas aiškus teigiamas rezultatas. Abejotini rezultatai išaiškinami, tęsiant tyrimus, modifikuojant eksperimento sąlygas. Neigiami rezultatai patvirtinami kiekvienu atskiru atveju. Tais atvejais, kai manoma, jog nebūtina patvirtinti, kad buvo gauti neigiami rezultatai, šitai turi būti pagrįsta. Tęsiant eksperimentus apsvarstoma, ar reikia modifikuoti tiriamus parametrus tam, kad būtų išplėstas įvertinamų sąlygų intervalas. Tiriamieji parametrai, kuriuos galima modifikuoti, yra ribos, skiriančios koncentracijas, bandymo atlikimo metodai (inkorporacijos į lėkštelę bei išankstinės inkubacijos) bei metabolinės aktyvacijos sąlygos.
      2.2.   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS
      Egzistuoja keletas teigiamo rezultato įvertinimo kriterijų, tokių kaip su koncentracija susijęs mažiausiai vieno kamieno revertantų kolonijų, esančių vienoje lėkštelėje, skaičiaus padidėjimas virš tiriamos ribos, kai naudojama arba nenaudojama metabolinės aktyvacijos sistema ir/ar jį atkartojant, kai naudojama viena ar daugiau koncentracijų (23). Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Įvertinant tyrimo rezultatus, galima pasinaudoti statistiniais metodais (24). Tačiau statistikos svarba neturėtų tapti vieninteliu faktoriumi, apsprendžiančiu teigiamą atsaką.
      Jei tiriant medžiagą, gaunami rezultatai, neatitinkantys aukščiau minėtų kriterijų, tai medžiaga laikoma nemutageniška.
      Nors daugumos eksperimentų metu gaunami aiškiai teigiami arba neigiami rezultatai, tačiau išimtiniais atvejais, remiantis visais gautais rezultatais, negalima padaryti tinkamos išvados apie tiriamos medžiagos aktyvumą. Rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs, nepriklausomai nuo to, kiek kartų eksperimentas buvo pakartotas.
      Tiriant grįžtamąsias mutacijas bakterijose, gauti rezultatai rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia taškines mutacijas (bazių pakaitas arba skaitymo rėmelio pasislinkimą) arba Salmonella typhimurium ir (arba) Escherichia coli genome. Neigiami rezultatai rodo, kad esant tyrimo sąlygoms, tiriamoji medžiaga nesukelia mutacijų tiriamose bakterijų rūšyse.
      3.   ATASKAITA
      ATASKAITA APIE TYRIMĄ
      Ataskaitoje apie tyrimą turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                   
               
               
                  
                     Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys:
                  
                  
                              —
                           
                           
                              priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Kamienai:
                  
                              —
                           
                           
                              panaudoti kamienai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių, esančių vienoje kultūroje, skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kamieno charakteristikos.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tyrimo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              tiriamosios medžiagos kiekis vienoje lėkštelėje (mg/lėkštelė arba μl/lėkštelė), nurodant pagrindinę priežastį dėl kurios tiriant vieną koncentraciją, buvo pasirinkta konkreti dozė bei lėkštelių skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              panaudota terpė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metabolinės aktyvacijos sistemos tipas ir sudėtis, įskaitant ir sistemos tinkamumo kriterijus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              poveikio tiriamąja medžiaga atlikimo metodiką.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              toksiškumo požymiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              precipitacij os požymiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kolonijų vienoje lėkštelėje skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              revertantų kolonijų vienoje lėkštelėje skaičiaus vidurkis bei standartinis nukrypimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei jį įmanoma nurodyti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bet kokios statistinės analizės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vienu metu naudojamų neigiamų (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) ir teigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenys, nurodant intervalus, vidurkius bei standartinius nukrypimus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              anksčiau gauti neigiamų (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) ir teigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenys, nurodant intervalus, vidurkius bei standartinius nukrypimus.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347–364.
               
            
                  2)
               
               
                  Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173–215.
               
            
                  3)
               
               
                  Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312, p. 217–233.
               
            
                  4)
               
               
                  Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V. (1986). The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, p. 69–240.
               
            
                  5)
               
               
                  Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975). Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, I, p. 91–96.
               
            
                  6)
               
               
                  Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980). Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York., p. 273–285.
               
            
                  7)
               
               
                  Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. and Foster, R. (1980). Bacterial Mutation Assays. In: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, Cambridge University Press, p. 13–61.
               
            
                  8)
               
               
                  Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987). Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, p. 167–177.
               
            
                  9)
               
               
                  Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A. (1976). Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. Mutation Res., 38, p. 33–42.
               
            
                  10)
               
               
                  Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges (1984). The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, p. 141–161.
               
            
                  11)
               
               
                  Thompson, E.D. and Melampy, P. J. (1981). An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium. Environmental Mutagenesis, 3, p. 453–465.
               
            
                  12)
               
               
                  Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994). Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, p. 335–344.
               
            
                  13)
               
               
                  Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and Vaughn, V.L. (1984). Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res., 136, p. 33–47.
               
            
                  14)
               
               
                  Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992). Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, p. 2–141.
               
            
                  15)
               
               
                  Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G. (1977). Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, p. 249–258.
               
            
                  16)
               
               
                  Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D. (1987). Vaporization Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. Environmental Mutagenesis, 9, p. 421–441.
               
            
                  17)
               
               
                  Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979). Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium. Cancer Res., 39, p. 3780–3782.
               
            
                  18)
               
               
                  Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N. (1980). Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p. 4961–4965.
               
            
                  19)
               
               
                  Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G. (1990). Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, p. 285–291.
               
            
                  20)
               
               
                  Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: „In Vitro metabolic Activation in Mutagenesis Testing“ Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, p. 85–88.
               
            
                  21)
               
               
                  Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G, Gibson, GG, Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 175–177.
               
            
                  22)
               
               
                  Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N. (1981). Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., 88, p. 343–350.
               
            
                  23)
               
               
                  Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987). Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity. Mutation Res. 189, p. 83–91.
               
            
                  24)
               
               
                  Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W.D. and Tweats, D.J. (1989). Analysis of Data from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., Cambridge University Press, p. 28–65.
               
            B.15.   MUTAGENIŠKUMO TYRIMAS IR ATRANKA PAGAL KARCINOGENIŠKUMĄ GENŲ MUTACIJOS – SACCAROMYCES CEREVISIAE
      
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Siekiant įvertinti cheminių agentų (esant arba nesant metabolitinės aktyvacijos sistemos) sukeliamas genų mutacijas, gali būti naudojami įvairiausi haploidiniai ir diploidiniai Saccaromyces cerevisiae kamienai.
      Haploidiniuose kamienuose gali būti naudojamos tiesioginės mutacinės sistemos, tokios kaip mutacinis virsmas iš raudonos spalvos mutantų, kurių augimui reikalingas adeninas (ade-l, ade-2) į dvigubus baltos spalvos mutantus, kurių augimui reikalingas adeninas bei atrankos sistemos, tokios kaip atsparumo kanavalinui ir cikloheksimidui indukcinė sistema.
      Plačiausiai naudojamą grįžtamųjų mutacijų tyrimo sistemą sudaro haploidinis kamienas XV 185-14C, kuris turi geno, koduojančio ochros spalvą, beprasmes mutacijas ade 2-1, org 4-17, lys 1-1, trp 5-48, kurios tampa grįžtamosiomis mutacijomis atlikus bazių pakeitimą mutagenais, sukeliančiais vietos atžvilgiu specifines mutacijas arba geno, koduojančio ochros spalvą, veiklą slopinančias mutacijas. Kamienas XV 185-14C taip pat turi žymę his 1-7 –beprasmę mutaciją, kuri gali virsti grįžtamąja mutacija, įvykus mutacijai antroje vietoje, bei žymę hom 3-10, kuri tampa grįžtamąja mutacija paveikus ją mutagenais, sukeliančiais skaitymo rėmelio pasislinkimą.
      Tarp diploidinių S. cerevisiae kamienų plačiausiai naudojamas tėra tik vienas D7 kamienas, kuris yra homozigotiškas pagal i lv 1-92.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      Pasiruošimas tyrimui
      Prieš pradedant tyrimą, panaudojant atitinkamą prietaisą, reikėtų paruošti tiriamųjų ir kontrolinių medžiagų tirpalus. Jei tiriami organiniai, vandenyje netirpūs junginiai, tai reikėtų naudoti ne daugiau kaip 2 % organinių tirpiklių, tokių kaip etanolis, acetonas ar dimetilsulfoksidas (DMSO), tirpalus (v/v). Naudojant prietaisą galutinė tirpalo koncentracija neturėtų labai įtakoti ląstelių gyvybingumo bei augimo parametrų.
      
         Metabolitinė aktyvacija
      
      Ląstelės turėtų būti veikiamos tiriamosiomis medžiagomis, esant arba nesant egzogeninės metabolitinės aktyvacijos sistemos.
      Graužikų, iš anksto paveiktų fermentus skatinančiais agentais, kepenų postmitochondrinė frakcija, praturtinta kofaktoriumi yra plačiausiai naudojama metabolitinė aktyvacijos sistema. Metabolitinei aktyvacijai galima naudoti ir kitų rūšių bei audinių postmitochondrines frakcijas bei procedūras.
      Tyrimo sąlygos
      
         Tiriamieji kamienai
      
      Atliekant genų mutacijų tyrimus labiausiai yra naudojami haploidinis kamienas XV 185-14C ir diploidinis kamienas D7. Galima naudoti ir kitus kamienus.
      
         Terpė
      
      Nustatant kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko mutacijos, skaičių, naudojama atitinkama kultivavimui skirta terpė.
      
         Teigiamos ir neigiamos kontrolės
      
      Reikėtų vienu metu naudoti teigiamas, nepaveiktas tiriamąja medžiaga ir tirpiklio kontroles. Nustatant kiekvieną specifinę galutinę mutaciją, naudojamos atitinkamos teigiamos kontrolės.
      
         Veikimo koncentracija
      
      Reikėtų naudoti mažiausiai penkias, tinkamai atskirtas tiriamosios medžiagos koncentracijas. Toksinių medžiagų atveju, didžiausia tiriamoji koncentracija neturėtų sumažinti kolonijų išgyvenimo mažiau nei 5–10 %. Reikėtų tirti santykinai vandenyje netirpstančių medžiagų tirpumo ribą pagal atitinkamas procedūras. Lengvai vandenyje tirpstančių netoksiškų medžiagų didžiausia koncentracija turėtų būti nustatoma kiekvienu atveju.
      
         Inkubacijos sąlygos
      
      Lėkštelės inkubuojamos 4–7 dienoms 28-30 oC temperatūroje, tamsoje.
      
         Spontaninių mutacijų dažniai
      
      Reikėtų naudoti subkultūras, kuriose spontaninių mutacijų dažniai yra normalūs.
      
         Tikslių kopijų skaičius
      
      Atliekant prototrofų, atsirandančių dėl genų mutacijų bei ląstelių gyvybingumo tyrimą, reikėtų naudoti mažiausiai tris vienos koncentracijos tikslių kolonijų kopijų lėkšteles. Jei eksperimentų metu naudojamos tokios žymės kaip hom 3-10, pasižyminčios nedideliu mutacijų dažniu, reikėtų naudoti daugiau tikslių kolonijų kopijų lėkštelių tam, kad gaunami duomenys būtų statistiškai patikimi.
      Procedūra
      
         S. cerevisiae kamienai paprastai veikiami tiriamąja medžiaga, ląstelėms esant stacionarinėje arba augimo stadijoje skystoje terpėje. Iš pradžių eksperimentai atliekami su ląstelėmis, esančiomis augimo stadijoje; 1-5x10 ląstelių/ml veikiamos tiriamąja medžiaga 18 valandų 28–37 oC temperatūroje ant kratyklės; jeigu reikia, veikimo metu į terpę įnešamas atitinkamas metabolitinės aktyvacijos sistemos kiekis. Baigiantis veikimui, ląstelės centrifuguojamos, plaunamos ir pasėjamos į atitinkamą kultivavimui skirtą terpę. Po inkubacijos nustatomas plokštelėse kolonijų, kuriose neįvyko arba įvyko genų mutacijos, skaičius. Jei pirmojo eksperimento gauti rezultatai yra neigiami, tai antrasis eksperimentas atliekamas naudojant ląsteles, esančias stacionarinėje fazėje. Jeigu pirmojo eksperimento metu gauti rezultatai teigiami, jie patvirtinami atlikus atitinkamą nepriklausomą eksperimentą.
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant kolonijų skaičių, kolonijų, kuriose neįvyko ir kuriose įvyko mutacijos kiekį bei mutacijos dažnį. Visi rezultatai turėtų būti patvirtinti, atlikus nepriklausomą bandymą. Duomenis reikėtų įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  panaudotas kamienas,
               
            
                  —
               
               
                  tyrimo sąlygos: ląstelių stacionarioji ar augimo fazė, terpės sudėtis, inkubacijos temperatūra ir trukmė, metabolitinės aktyvacijos sistema,
               
            
                  —
               
               
                  veikimo sąlygos: veikimo laipsnis, veikimo procedūra ir trukmė, veikimo temperatūra, teigiamos ir neigiamos kontrolės,
               
            
                  —
               
               
                  kolonijų skaičius, kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko mutacijos bei mutacijos dažnis, dozės ir atsako sąsaja, jei įmanoma nurodyti, statistinis duomenų įvertinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų interpretavimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.16.   MITOZINĖ REKOMBINACIJA – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
      
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Mitozinė rekombinacija Saccharomyces cerevisiae gali būti nustatoma tarp genų (arba konkrečiau, tarp geno ir jo centromeros) ir genų viduje. Ši rekombinacija, vykstanti tarp genų, yra vadinama mitoziniu krosingoveriu, kurio metu susiformuoja atvirkštiniai produktai, tuo tarpu, kai rekombinacijos genų viduje metu susidaro neatvirkštiniai produktai, vadinami genų konversijomis. Apskritai, krosingoveris įvertinamas pagal homozigotinių kolonijų arba sektorių, turinčių recesyvinius genų alelius, produkcijos laipsnį heterozigotiniame kamiene, tuo tarpu genų konversija vertinama pagal prototrofinių revertantų, susiformavusių auksotrofiniame heteroaleliniame kamiene, turinčiame du neveiklius to paties geno alelius, skaičių. Siekiant nustatyti mitozinio geno konversiją, dažniausiai naudojami šie kamienai: D4 (heteroalelinis pagal ade 2 ir trp 5), D7 (heteroalelinis pagal trp 5), BZ34 (heteroalelinis pagal org 4) ir JD1 (heroalelinis pagal his 4 ir trp 5). Raudonos ir violetinės spalvos homozigotiniai sektoriai, sukuriantys mitozinį krosingoverį, gali būti vertinami, naudojant D5 arba D7 kamienus (taipogi galima įvertinti mitozinę genų konversiją ir grįžtamąją mutaciją, vykstančią ilv 1-92), kurie yra heteroaleliški pagal papildančiuosius geno ade 2 alelius.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      Pasiruošimas tyrimui
      Prieš pradedant tyrimą, panaudojant atitinkamą prietaisą, reikėtų paruošti tiriamųjų ir kontrolinių medžiagų tirpalus. Jei tiriami organiniai, vandenyje netirpūs junginiai, reikėtų naudoti ne daugiau kaip 2 % organinių tirpiklių, tokių kaip etanolis, acetonas ar dimetilsulfoksidas (DMSO), tirpalus (v/v). Naudojant prietaisą, galutinė tirpalo koncentracija neturėtų labai įtakoti ląstelių gyvybingumo bei augimo parametrų.
      
         Metabolitinė aktyvacija
      
      Ląstelės turėtų būti veikiamos tiriamosiomis medžiagomis, esant arba nesant egzogeninės metabolitinės aktyvacijos sistemos. Graužikų, iš anksto paveiktų fermentus skatinančiais agentais, kepenų postmitochondrinė frakcija praturtinta kofaktoriumi yra plačiausiai naudojama metabolitinė aktyvacijos sistema. Metabolitinei aktyvacijai galima naudoti ir kitų rūšių bei audinių postmitochondrines frakcijas bei procedūras.
      Tyrimo sąlygos
      
         Tiriamieji kamienai
      
      Dažniausiai naudojami diploidiniai D4, D5, D7 ir JD1. Galima naudoti ir kitus kamienus.
      
         Terpė
      
      Nustatant kolonijų, kuriose neįvyko mitozinė rekombinacija, skaičių ir kolonijų, kuriose įvyko mitozinė rekombinacija, dažnį, naudojama atitinkama terpė skirta kultivavimui.
      
         Teigiamos ir neigiamos kontrolės
      
      Reikėtų vienu metu naudoti teigiamas, nepaveiktas tiriamąja medžiaga ir tirpiklio kontroles. Nustatant kiekvieną specifinę galutinę rekombinaciją, naudojamos atitinkamos teigiamos kontrolės.
      
         Veikimo koncentracijos
      
      Reikėtų naudoti mažiausiai penkias, tinkamai atskirtas tiriamosios medžiagos koncentracijas. Reikėtų apsvarstyti citotoksiškumą ir tirpumą. Mažiausia koncentracija neturi įtakoti ląstelių gyvybingumo. Toksinių medžiagų atveju, didžiausia tiriamoji koncentracija neturėtų sumažinti kolonijų išgyvenimo mažiau nei 5–10 %. Reikėtų tirti santykinai vandenyje netirpstančių medžiagų tirpumo ribą pagal atitinkamas procedūras.
      Lengvai vandenyje tirpstančių netoksiškų medžiagų didžiausia koncentracija turėtų būti nustatoma kiekvienu atveju.
      
         Inkubacijos sąlygos
      
      Lėkštelės inkubuojamos 4–7 dienoms 28–30 oC temperatūroje, tamsoje. Analizei naudojamos plokštelės, kuriose, dėka mitozinio krosingoverio, atsiranda raudonos ir violetinės spalvos sektoriai, turėtų būti laikomos šaldytuve (apie 4 oC temperatūroje) papildomai vieną arba dvi dienas prieš nustatant atitinkamai nusidažiusių kolonijų skaičių.
      
         Spontaninės mitozinės rekombinacijos dažniai
      
      Reikėtų naudoti subkultūras, kuriose spontaninės mitozinės rekombinacijos dažniai yra normalūs.
      
         Tikslių kopijų skaičius
      
      Atliekant prototrofų, atsirandančių dėl mitozinio geno konversijos bei ląstelių gyvybingumo tyrimą, reikėtų naudoti mažiausiai tris vienos koncentracijos tikslių kolonijų kopijų lėkšteles. Tiriant recesyvinį homozigotiškumą, atsirandantį dėl mitozinio krosingoverio, reikėtų panaudoti daugiau lėkštelių, kad būtų galima nustatyti tinkamą kolonijų skaičių.
      Procedūra
      
         S.
         cerevisiae kamienai paprastai veikiami tiriamąja medžiaga, ląstelėms esant stacionarinėje arba augimo stadijoje skystoje terpėje. Iš pradžių eksperimentai atliekami su ląstelėmis, esančiomis augimo stadijoje; 1–5×107 ląstelių/ml veikiamos tiriamąja medžiaga 18 valandų 28–37 oC temperatūroje ant kratyklės; jeigu reikia, tai veikimo metu į terpę įnešamas atitinkamas metabolitinės aktyvacijos sistemos kiekis.
      Baigiantis veikimui, ląstelės centrifuguojamos, plaunamos ir pasėjamos į atitinkamą kultivavimui skirtą terpę. Po inkubacijos nustatomas plokštelėse kolonijų, kuriose neįvyko arba įvyko mitozinė rekombinacija, skaičius.
      Jei pirmojo eksperimento gauti rezultatai yra neigiami, tai antrasis eksperimentas atliekamas, naudojant ląsteles, esančias stacionarinėje fazėje. Jeigu pirmojo eksperimento metu gauti rezultatai teigiami, jie patvirtinami atlikus atitinkamą nepriklausomą eksperimentą.
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant kolonijų skaičių, kolonijų, kuriose neįvyko ir kuriose įvyko mitozinė rekombinacija, kiekį bei rekombinacijų dažnį.
      Visi rezultatai turėtų būti patvirtinti atlikus nepriklausomą bandymą.
      Duomenis reikėtų įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  panaudotas kamienas,
               
            
                  —
               
               
                  tyrimo sąlygos: ląstelių stacionarioji ar augimo fazė, terpės sudėtis, inkubacijos temperatūra ir trukmė, metabolitinės aktyvacijos sistema,
               
            
                  —
               
               
                  veikimo sąlygos: veikimo laipsnis, veikimo procedūra ir trukmė, veikimo temperatūra, teigiamos ir neigiamos kontrolės,
               
            
                  —
               
               
                  kolonijų skaičius, kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko rekombinacijos bei rekombinacijos dažnis, dozės ir atsako sąsaja, jei įmanoma nurodyti, statistinis duomenų įvertinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų interpretavimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.17.   MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ LĄSTELIŲ GENŲ MUTACIJŲ TYRIMAS IN VITRO
      
      1.   METODAS
      Šis metodas pakartoja OECD TG 476, žinduolių ląstelių genų mutacijų tyrimą in vitro (1997).
      1.1   ĮVADAS
      Žinduolių ląstelių genų mutacijų tyrimas in vitro gali būti naudojamas siekiant aptikti cheminių medžiagų sukeltas mutacijas. Tinkamoms ląstelių linijoms priklauso pelių limfomos ląstelių linija L5178Y, kiniškojo žiurkėno ląstelių linijos CHO, CHO-ASS2 bei V79 ir žmogaus limfoblastų linija TK (1). Naudojant šias linijas, dažniausiai įvertinamos timidinkinazę (TK) bei hipoksantinguaninfosforiboziltransferazę (HFRT) koduojančių genų bei ksantinguaninfosforiboziltransferazę (KFRT) koduojančio transgeno mutacijos. Atliekant TK, KFRT bei HFRT koduojančių genų mutacijų tyrimus, nustatomi ir skirtingi genetinių įvykių spektrai. Dėl to, kad TK ir KFRT koduojantys genai yra lokalizuoti autosominėse chromosomose, galima nustatyti genetinius įvykius (pavyzdžiui, didelių genų segmentų delecijas), kurie nėra nustatomi HFRT koduojančio geno, esančio X chromosomose, lokuse (2) (3) (4) (5) (6).
      Atliekant žinduolių ląstelių genų mutacijų tyrimą in vitro, galima naudoti gerai žinomas ląstelių linijas ar kamienus. Tyrimo metu naudojamos ląstelės atrenkamos pagal sugebėjimą augti kultūroje bei stabilumą spontaniškai vykstančių mutacijų atžvilgiu.
      Bendru atveju, kai tyrimai atliekami in vitro, reikia naudoti egzogeninį metabolinės aktyvacijos šaltinį. Ši metabolinė aktyvacijos sistema negali absoliučiai atitikti žinduolių sąlygų in vivo. Reikia stengtis vengti tokių sąlygų, kurioms esant bus gaunami rezultatai, neatspindintys vidinio mutageniškumo. Teigiami rezultatai, neatspindintys vidinio mutageniškumo, gali būti gaunami dėl pH ir osmosinio slėgio pokyčių bei didelio citotoksiškumo laipsnio (7).
      Šis tyrimas naudojamas atrinkti galimus žinduolių mutagenus bei karcinogenus. Daugelis junginių, kurie šio tyrimo metu pasirodo esą teigiami, yra žinduolių karcinogenai, tačiau nėra aiškaus tarpusavio ryšio tarp šio tyrimo ir karcinogeniškumo. Tarpusavio ryšys priklauso nuo cheminių medžiagų klasės ir vis daugėja įrodymų, kad šio tyrimo metu negalima nustatyti kai kurių karcinogenų, galbūt dėl to, kad jie nepasižymi genotoksiškumu arba bakterinėse ląstelėse veikia visiškai kitaip (6).
      Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Tiesioginės mutacijos – geno tėvinio tipo mutantinės formos mutacija, dėl kurios šio geno koduojamas baltymas praranda fermentinį aktyvumą arba šis pakinta.
      
         Bazių porų pakaitas sukeliantys mutagenai – medžiagos, sukeliančios vienos ar kelių bazių porų, esančių DNR molekulėje, pakaitas.
      
         Skaitymo rėmelio poslinkį sukeliantys mutagenai – medžiagos, sukeliančios vienos ar daugelio bazių porų intarpus ar iškritas.
      
         Fenotipinės ekspresijos laikas – laiko periodas, per kurį nepakitusio geno produktai pašalinami iš naujai mutavusių ląstelių.
      
         Mutavimo dažnis – mutantinių ir gyvų ląstelių skaičiaus santykis.
      
         Absoliutus santykinis augimas – per konkretų laiko tarpą ląstelių, lyginant su kontroline populiacija, padidėjęs skaičius, įvertinamas kaip suspensijos augimas, lyginant su neigiamos kontrolinės ląstelių grupės kloninio augimo efektyvumu, o pastarasis lyginamas su neigiamu kontroliniu mėginiu.
      
         Santykinis suspensijos augimas – fenotipinės ekspresijos periodu padidėjęs ląstelių, lyginant su neigiamu kontroliniu mėginiu, skaičius.
      
         Gyvybingumas – ląstelių, paveiktų tiriamąja medžiaga, kloninio augimo efektyvumas tuo metu, kai, pasibaigus ekspresijai, jos pasėjamos į terpę, esant sąlygoms, naudojamoms atrankai.
      
         Išgyvenimas – ląstelių, paveiktų tiriamąja medžiaga, kloninio augimo efektyvumas tuo metu, kai baigiantis veikimui tiriamąja medžiaga, jos pasėjamos į terpę; bendru atveju išgyvenimas lyginamas su kontrolinės ląstelių populiacijos išgyvenimu.
      1.3   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Ląstelės, nesugebančios sintetinti timidinkinazės (TK) dėl mutacijos TK+/- -> TK-/- , yra atsparios pirimidino analogo – trifluortimidino (TFT) – sukeliamiems citotoksiniams efektams. Ląstelės, sugebančios sintetinti TK, yra jautrios TFT, kuris blokuoja ląstelės metabolizmą bei sustabdo tolimesnį jos dalijimąsi. Taigi mutantinės ląstelės sugeba proliferuoti, esant terpėje TFT, kai tuo tarpu normalios ląstelės, sintetinančios TK, šito padaryti negali. Ląstelės nesugebančios sintetinti HFRT ir KFRT yra panašiai atrenkamos pagal atsparumą 6-tioguaninui (TG) arba 8-azaguaninui (AG). Jeigu žinduolių genų mutacijos yra tiriamos, panaudojant agentą, kuris yra naudojamas ląstelių atrankai ir yra bazių analogas arba cheminis junginys, tai reikia ypač atkreipti dėmesį į tiriamosios cheminės medžiagos savybes. Pavyzdžiui, reikia tirti bet kokį įtarimą keliantį tiriamosios medžiagos toksiškumą mutantinių ir normalių ląstelių atžvilgiu. Taigi atrankos sistemos arba atrankos agento parinkimas turi būti patvirtinamas tada, kai tiriamos cheminės medžiagos, savo struktūra panašios į agentą (8).
      Ląstelės, esančios suspensijoje arba vienasluoksnėje kultūroje, veikiamos tiriamąja medžiaga, esant arba nesant metabolinės aktyvacijos sistemos ir prieš pradedant tyrimą šiek tiek pakultivuojamos tam, kad būtų nustatytas citotoksiškumas bei vyktų fenotipo ekspresija (9) (10) (11) (12) (13). Įprastiniu atveju citotoksiškumas nustatomas pagal santykinį kloninio augimo efektyvumą ar absoliutų santykinį kultūros augimą, matuojamą tada, kai baigiasi ląstelių veikimas tiriamąja medžiaga. Kultūros, paveiktos tiriamąja medžiaga, palaikomos terpėje tam tikrą laiką, būdingą kiekvienam lokusui bei ląstelių tipui tam, kad vyktų beveik optimali atsiradusių mutacijų fenotipo ekspresija. Mutavimo dažnis nustatomas, pasėjant žinomą ląstelių skaičių į terpę, turinčią atrankai naudojamo agento tam, kad, siekiant įvertinti kloninio augimo efektyvumą, būtų identifikuotos mutantinės ląstelės, esančios terpėje, neturinčioje atrankai naudojamo agento. Pasibaigus inkubacijai, suskaičiuojamos kolonijos. Mutavimo dažnis nustatomas, suskaičiavus kolonijas, kuriose įvyko mutacijos ir kurios buvo auginamos terpėje, turinčioje arba neturinčioje atrankai naudojamo agento.
      1.4   TYRIMO METODO APRAŠYMAS
      1.4.1   Preparatai
      1.4.1.1   Ląstelės
      Šio tyrimo metu galima naudoti įvairius ląstelių tipus, įskaitant L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 klonus arba TK6 ląsteles. Tyrimo metu naudojami ląstelių tipai turi būti jautrūs cheminiams mutagenams, jų kloninio augimo efektyvumas turi būti pakankamai didelis bei jose vykstančių spontaninių mutacijų dažnis turi būti pakankamai stabilus. Ląstelės turi būti patikrintos, ar neužkrėstos mikoplazmomis, nes priešingu atveju, atliekant šį tyrimą, jos nėra naudojamos.
      Tyrimas parengiamas taip, kad jis būtų atliekamas, esant kuo didesniam nustatymo jautrumui bei visapusiškumui. Naudojamų ląstelių bei jų kultūrų skaičius ir tiriamosios medžiagos koncentracijos turi atspindėti šiuos apibrėžtus parametrus (14). Minimalus, gyvų ląstelių, išlikusių po veikimo tiriamąja medžiaga bei naudojamų kiekviename tyrimo etape, skaičius turi būti pagrįstas spontaninių mutacijų dažniu. Rekomenduojama panaudoti mažiausiai 10 6 ląstelių. Turi būti sudaryta galimybė susipažinti su anksčiau gautais duomenimis apie ląstelinę sistemą, rodančiais, kad tyrimas atliekamas nuosekliai.
      1.4.1.2   Terpė ir kultivavimo sąlygos
      Reikia naudoti atitinkamą terpę, skirtą kultivavimui bei laikytis atitinkamų inkubavimo sąlygų (kultivavimo indai, temperatūra, CO2 koncentracija ir drėgmė). Terpė turi būti parinkta atsižvelgiant į šio tyrimo metu naudojamas atrankos sistemas bei ląstelių tipą. Ypač svarbu tai, kad pasirinktos kultivavimo sąlygos užtikrintų optimalų ląstelių augimą ekspresijos metu bei normalių ir mutantinių ląstelių sugebėjimą suformuoti kolonijas.
      1.4.1.3   Kultūrų paruošimas
      Ląstelės padauginamos iš kamieninių kultūrų, pasėjamos į terpę, skirtą kultivavimui ir inkubuojamos 37 oC temperatūroje. Prieš pradedant šį tyrimą, kultūros turi būti išgryninamos, kad būtų atsikratyta jau anksčiau esančių mutantinių ląstelių.
      1.4.1.4   Metabolinė aktyvacija
      Ląstelės inkubuojamos su tiriamąja chemine medžiaga, tiek esant, tiek ir nesant atitinkamos metabolinės aktyvacijos sistemos. Plačiausiai vartojama sistema yra post-mitochondrinė frakcija, išskirta iš griaužikų kepenų, paveiktų tokiais fermentinį aktyvumą skatinančiais agentais kaip AROCLOR 1254 (15) (16) (17) (18) ar fenobarbitono ir β-naftoflavono mišiniu (19) (20) bei praturtinta kofaktoriumi.
      Post-mitochondrinė frakcija paprastai vartojama koncentracijomis, kurių intervalas tyrimo metu naudojamoje galutinėje terpėje siekia nuo 1–10 % (v/v). Metabolinės aktyvacijos sistema pasirenkama priklausomai nuo tiriamosios cheminės medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga varoti daugiau nei post-mitochondrinės frakcijos koncentraciją.
      Endogeninę aktyvaciją gali pagerinti daug tuo tikslu padarytų pasiekimų, įskaitant ir genetinės inžinerijos pagalba gautos ląstelių linijas, kurios gamina specifinius fermentus, dalyvaujančius aktyvacijoje. Tyrime naudojamos ląstelių linijos pasirenkamos moksliškai pagrįstai (pavyzdžiui pagal citochromo P450 izofermento svarbą tiriamos cheminės medžiagos metabolizmui).
      1.4.1.5   Tiriamosios medžiagos/Paruošimas
      Kietosios tiriamosios medžiagos turi būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinamuosiuose įrenginiuose ir, jeigu reikia, tai prieš tai, kai šia medžiaga bus paveiktos ląstelės, jos yra praskiedžiamos. Prieš paveikiant ląsteles skystosiomis tiriamosiomis medžiagomis arba po veikimo, šios medžiagos gali būti tiesiogiai įnešamos į tiriamąsias sistemas ir praskiedžiamos. Tiriamosios medžiagos preparatai gaminami prieš kiekvieną tyrimą, neatsižvelgiant į tai, kad šių medžiagų stabilumo tyrimo duomenys tenkina saugojimo sąlygas.
      1.4.2   Tyrimo sąlygos
      1.4.2.1   Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys
      Nesitikima, kad tirpiklis/tirpinantysis įrenginys chemiškai nereaguos su tiriamąja chemine medžiaga ir atitiks ląstelių išgyvenimą bei S9 aktyvumą. Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/tirpinantieji įrenginiai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturi būti vandens. Vandenį galima pašalinti, papildomai naudojant molekulinį filtrą.
      1.4.2.2   Veikimo koncentracijos
      Kai parenkama pati didžiausia koncentracija, tai vadovaujamasi tokiais kriterijais kaip citotoksiškumas, tirpumas tiriamojoje sistemoje ir pH arba osmosinio slėgio pokyčiai.
      Citotoksiškumas turi būti nustatomas pagrindinio eksperimento, naudojant arba nenaudojant metabolinės aktyvacijos sistemos, metu, remiantis atitinkamais rodikliais, rodančiais, kad ląstelės yra vientisos ir kad jos auga – santykiniu kloninio augimo efektyvumu arba absoliučiu santykiniu augimu. Būtų naudinga citotoksiškumą bei tirpumą nustatyti išankstinio eksperimento metu.
      Turi būti naudojamos bent 4 ištiriamos koncentracijos. Jei citotoksiškumas pasireiškia, tai šios koncentracijos turėtų svyruoti nuo maksimalaus iki minimalaus citotoksiškumo laipsnio arba jo apskritai neturėtų būti; šitai paprastai reikš, kad koncentracijos turės būti atskirtos tiktai faktoriumi, esančiu tarp 2 ir √10. Jei didžiausia koncentracija yra pagrįsta citotoksiškumu, tai esant jai, santykinis išgyvenimas arba santykinis absoliutus augimas turi sudaryti apie 10–20 % (bet ne mažiau kaip 10 %). Santykinai necitotoksiškų medžiagų atveju maksimali tiriamoji koncentracija turi būti 5 mg/ml, 5 μl/ml arba 1,01 M, bet kuriai esant mažiausiai.
      Santykinai netirpios medžiagos turi būti tiriamos kultivavimo sąlygomis, jų tirpumui siekiant ribą arba esant už jos. Netirpumas turi būti nustatomas galutinėje terpėje, kuria paveikiamos ląstelės. Prieš pradedant ir baigiant veikimą tiriamąja medžiaga, būtų naudinga nustatyti tirpumą, kadangi veikimo metu tirpumas gali pakisti dėl tiriamojoje sistemoje esančių ląstelių, S9 mišinio, serumo ir pan. netirpumą galima įvertinti plika akimi. Precipitatas neturi trukdyti rezultatų vertinimui.
      1.4.2.3   Kontroliniai mėginiai
      Atliekant kiekvieną eksperimentą, vienu metu reikia naudoti teigiamus ir neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontrolinius mėginius, esant arba nesant metabolinės aktyvacijos sistemos. Kai naudojama metabolinė aktyvacija, tai teigiamas kontrolinis mėginys turi būti cheminė medžiaga, kuria reikia aktyvuoti tam, kad ši sukeltų mutageninį atsaką.
      Teigiamų kontrolinių medžiagų pavyzdžiai:
      
                  Metabolinės aktyvacijos sąlygos
               
               
                  Lokusas
               
               
                  Medžiaga
               
               
                  CAS Nr.
               
               
                  EINECS Nr.
               
            
                  Egzogeninės metabolinės aktyvacijos nėra
               
               
                  HPRT
               
               
                  Etilmetansulfonatas
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  Etilnitrozošlapalas
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  TK (mažos ir didelės kolonijos)
               
               
                  Metilmetansulfonatas
               
               
                  66-27-3
               
               
                  200-625-0
               
            
                  XPRT
               
               
                  Etilmetansulfonatas
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  Etilnitrozošlapalas
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  Egzogeninė metabolinė aktyvacijos sistema yra
               
               
                  HPRT
               
               
                  3-Metilcholantrenas
               
               
                  56-49-5
               
               
                  200-276-4
               
            
                  N-nitrozodietilaminas
               
               
                  62-75-9
               
               
                  200-549-8
               
            
                  7,12-Dimetilbenzantracenas
               
               
                  57-97-6
               
               
                  200-359-5
               
            
                  TK (mažos ir didelės kolonijos)
               
               
                  Ciklofosfamidas
               
               
                  50-18-0
               
               
                  200-015-4
               
            
                  Ciklofosfamidmonohidr atas
               
               
                  6055-19-2
               
               
                   
               
            
                  Benzpirenas
               
               
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
            
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  XPRT
               
               
                  N-nitrozodimetilaminas (esant dideliems S9 mišinio kiekiams)
               
               
                  62-75-9
               
               
                  200-549-8
               
            
                  Benzpirenas
               
               
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
            Galima naudoti ir kitas teigiamas kontrolines etalonines medžiagas, pavyzdžiui, jei laboratorijoje buvo anksčiau gauti duomenys apie 5-bromo-2'-dezoksiuridiną (CAS Nr. 59– 14–3; Einecs Nr. 200–415–9), tai galima naudoti šią etaloninę medžiagą. Kai yra įmanoma, tai reikia apsvarstyti konkrečios klasės cheminių medžiagų, kaip teigiamų kontrolinių mėginių, panaudojimą.
      Reikia panaudoti ir neigiamus kontrolinius mėginius, sudarytus vien tik iš tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio ir neturinčius tiriamosios medžiagos bei paveiktus tokiu pat būdu kaip ir tiriamieji mėginiai. Be to reikia naudoti ir tiriamąja medžiaga neveiktus neigiamus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesio į anksčiau gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad pasirinktas tirpiklis nėra žalingas ir mutageniškas.
      1.4.3   Bandymo atlikimo metodika
      1.4.3.1   Veikimas tiriamąja medžiaga
      Proliferuojančios ląstelės paveikiamos tiriamąja medžiaga, tiek esant tiek ir nesant metabolinės aktyvacijos. Poveikis turi trukti atitinkamą laiką (efektyvus poveikis paprastai užtrunka 3–6 valandas). Poveikio trukmė gali būti prailginama vienu ar keliais ląstelės ciklais.
      Tiriant kiekvieną koncentraciją gali būti atliekami kultūrų, paveiktų tiriamąja medžiaga, 1 ar 2 pakartojimai. Kai atliekamas kultūrų, paveiktų tiriamąja medžiaga, vienetinis pakartojimas, tai koncentracijų skaičius padidinamas, kad užtikrinti, jog susidarys pakankamas analizuojamų kultūrų skaičius (turi būti naudojamos mažiausiai 8 tiriamosios koncentracijos). Reikia mažiausiai dukart panaudoti neigiamas (tirpikliu paveiktas) kontrolines kultūras.
      Dujinės ir lakios medžiagos turi būti tiriamos atitinkamais metodais, panaudojant užsandarintus indus (21), (22).
      1.4.3.2   Išgyvenimo, gyvybingumo bei mutavimo dažnio nustatymas
      Baigiantis veikimui tiriamąja medžiaga, ląstelės perplaunamos ir pakultivuojamos, siekiant nustatyti jų išgyvenimą bei užtikrinti mutantinio fenotipo ekspresiją. Pasibaigus veikimui tiriamąja medžiaga, iškart nustatomas citotoksiškumas, įvertinant santykinį kloninio augimo efektyvumą (išgyvenimą) arba absoliutų santykinį augimą.
      Kiekvienas lokusas turi apibrėžtą mažiausią laiko tarpą, per kurį turi įvykti beveik optimali naujai atsiradusio mutantinio fenotipų ekspresija (HFRT ir KFRT fenotipas turi mažiausiai ekspresuotis 6-8 dienas, o TK fenotipas – mažiausiai 2 dienas). Ląstelės auginamos terpėje, turinčioje arba neturinčioje agento, kurio pagalba mutantai atrenkami pagal kloninio augimo efektyvumą bei nustatomas jų skaičius. Gyvybingumas pradedamas nustatinėti (tam, kad būtų galima apskaičiuoti mutavimo dažnį) baigiantis ekspresijai, kai kamienai pasėjami į lėkštelę su terpe, kuri nėra skirta atrankai (nes neturi atrankai naudojamo agento).
      Jei L5178Y TK+/- tyrimo metu nustatoma, kad tiriamoji medžiaga yra teigiama, tai mažiausiai vienąkart nustatomas tiriamųjų kultūrų (esant pačiai didžiausiai teigiamai koncentracijai) bei teigiamų ir neigiamų kontrolinių kultūrų dydis. Jei L5178Y TK+/- tyrimo metu nustatoma, kad tiriamoji yra neigiama, tai nustatomas teigiamų bei neigiamų kontrolinių kolonijų skaičius. Atliekant TK6TK+/- tyrimą, taipogi galima įvertinti kolonijų dydį.
      2.   DUOMENYS
      2.1   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Pateikiant duomenis, turi būti nurodytas kontrolinių bei paveiktų tiriamąja medžiaga kultūrų nustatytas citotoksiškumas, gyvybingumas, kolonijų skaičius bei mutavimo dažnis. Jei atliekant L5178Y TK+/- tyrimą buvo gautas teigiamas atsakas, tai kolonijos vertinamos, panaudojant kriterijus, skirtus mažiausiai 1 tiriamosios medžiagos koncentracijai, kuria buvo veikiamos mažos ir didelės kolonijos bei teigiamos ir neigiamos kontrolinės kolonijos. Didelėse bei mažose kolonijose esančių mutantų molekulinė ir citogenetinė prigimtis buvo detaliai ištirta (23), (24). Atliekant TK+/- tyrimą, kolonijos buvo vertinamos, panaudojant normalaus augimo (didelės kolonijos) ir sulėtinto augimo (mažos kolonijos) kriterijus (25). Mutantinės ląstelės, kuriose įvyko dideli genetiniai pažeidimai, pasižymi ilgesniu nei paprastai dalijimosi periodu ir todėl jos suformuoja mažas kolonijas. Šis sutrikimas įprastiniu atveju gali pasireikšti arba kaip atskiro geno praradimas arba kariotipiškai įvertinamomis chromosomų aberacijomis. Cheminės medžiagos, sukeliančios gigantinių chromosomų aberacijas, skatina mažas kolonijas sudarančių mutantų susiformavimą (26). Mažiau pažeistos mutantinės ląstelės auga panašiai kaip ir tėvinės ląstelės bei sudaro dideles kolonijas.
      Reikia pateikti išgyvenimo (santykinio kloninio augimo efektyvumo) ar absoliutaus santykinio augimo duomenis. Mutavimo dažnis turi būti išreiškiamas kaip mutantinių ir išgyvenusių ląstelių skaičiaus santykis.
      Kiekvienos kultūros tyrimų duomenys pateikiami atskirai. Be to visi duomenys turi būti pateikiami apibendrintai, lentelių forma.
      Nėra būtina patvirtinti, kad buvo gautas teigiamas atsakas. Abejotini rezultatai išaiškinami tęsiant tyrimus, kurių metu pirmiausia pakeičiamos eksperimentinės sąlygos. Neigiami rezultatai patvirtinami kiekvienu atveju. Jei manoma, jog nėra reikalo patvirtinti, kad buvo gauti neigiami rezultatai, tai reikia pateikti pateisinančias aplinkybes. Vėliau atliekant eksperimentus, reikia apsvarstyti tiriamų parametrų pakeitimus tam, kad, analizuojant abejotinus bei neigiamus rezultatus, būtų išplėstas įvertinamų sąlygų spektras. Koncentracijas skiriančiosios ribos bei metabolinės aktyvacijos sąlygos yra tiriamieji parametrai, kuriuos galima modifikuoti.
      2.2   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS
      Egzistuoja keli teigiamo rezultato įvertinimo kriterijai, tokie kaip nuo koncentracijos priklausantis arba atkartojamas mutavimo dažnio padidėjimas. Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Įvertinant tyrimo rezultatus, galima pasinaudoti statistiniais metodais. Tačiau statistikos svarba neturėtų tapti vieninteliu faktoriumi, apsprendžiančiu teigiamą atsaką.
      Jei tiriant medžiagą, gaunami rezultatai, neatitinkantys aukščiau minėtų kriterijų, tai medžiaga laikoma nemutageniška.
      Nors daugumos eksperimentų metu gaunami aiškiai teigiami arba neigiami rezultatai, tačiau išimtiniais atvejais, remiantis visais gautais rezultatais, negalima padaryti tinkamos išvados apie tiriamos medžiagos aktyvumą. Rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs, nepriklausomai nuo to, kiek kartų eksperimentas buvo pakartotas.
      Teigiami rezultatai, gauti, tiriant žinduolių ląstelių genų mutacijas, rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia genų mutacijas panaudotose žinduolių ląstelėse. Nuo koncentracijos priklausantis teigiamas atsakas yra svarbiausias. Neigiami rezultatai rodo, kad, esant tyrimo sąlygoms tiriamoji medžiaga nesukelia genų mutacijų panaudotose žinduolių ląstelėse.
      3.   ATASKAITA
      ATASKAITA APIE TYRIMĄ
      Ataskaitoje apie tyrimą turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                   
               
               
                  Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys:
                  
                              —
                           
                           
                              priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Ląstelės:
                  
                              —
                           
                           
                              ląstelių tipas ir šaltinis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių kultūrų skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių persėjimų skaičius (jei jį galima nurodyti),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių kultūros palaikymo metodai (jei juos galima nurodyti),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ar neužsikrėtusios mikoplazmomis.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tyrimo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              pagrindinė priežastis, nulėmusi koncentracijų bei kultūrų skaičiaus pasirinkimą, įskaitant citotoksiškumo nustatymo duomenis bei tirpumo apribojimus (jei juos įmanoma nurodyti),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              terpės sudėtis ir CO2 koncentracija,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios medžiagos sudėtis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tirpinančiojo įrenginio darbinė talpa bei į jį įdėtos medžiagos tūris,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubacijos temperatūra,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubacijos trukmė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              veikimo tiriamąja medžiaga trukmė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių tankis veikimo metu,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metabolinės aktyvacijos sistemos tipas bei sudėtis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teigiami bei neigiami kontroliniai mėginiai, įskaitant jų tinkamumo kriterijus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ekspresijos trukmė (įskaitant pasėtų ląstelių skaičių, subkultivavimo bei mitybai skirtų medžiagų įnešimo tvarkaraščiai, jei juos įmanoma pateikti),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              atrankos agentai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kriterijai, kuriais vadovaujamasi, sprendžiant, ar tyrimų metu gauti rezultatai yra teigiami, neigiami ar abejotini,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvų bei mutantinių ląstelių skaičiaus nustatymo metodai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kolonijų dydis ir tipas (įskaitant „mažų“ bei „didelių“ kolonijų vertinimo kriterijus, kaip yra numatyta).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              toksiškumo požymiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              precipitacijos požymiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie pH bei osmosinį slėgį, veikiant tiriamąja medžiaga (jei tai buvo tiriama),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kolonijų dydis, jei buvo vertinamos bent neigiamos arba teigiamos kontrolės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              laboratorijos kompetentingumas L5178Y TK+/- sistemos pagalba nustatyti mutantus, sudarančius mažas kolonijas (jei tai būtina nurodyti),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dozės ir atsako tarpusavio ryšys (jei įmanoma nurodyti),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinės analizės (jei bet kokios buvo atliktos),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie vienu metu naudojamus neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) ir teigiamus kontrolinius mėginius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              anksčiau gauti duomenys apie neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) bei teigiamus kontrolinius mėginius, kartu nurodant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mutavimo dažnis.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
               
            
                  2)
               
               
                  Chu, E.H.Y. and Mailing, H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, p. 1306–1312.
               
            
                  3)
               
               
                  Liber, H.L. and Thilly, W.G. (1982). Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, p. 467–485.
               
            
                  4)
               
               
                  Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, p. 394–403.
               
            
                  5)
               
               
                  Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, p. 121–128.
               
            
                  6)
               
               
                  Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, p. 235–239.
               
            
                  7)
               
               
                  Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, p. 147–204.
               
            
                  8)
               
               
                  Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavournin, K.H. (1983). Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, p. 225–251.
               
            
                  9)
               
               
                  Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 196, p. 17–36.
               
            
                  10)
               
               
                  Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, p. 135–141.
               
            
                  11)
               
               
                  Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, p. 9–17.
               
            
                  12)
               
               
                  Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, p. 133–147.
               
            
                  13)
               
               
                  Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedures for the L5178Y/TK+/- – TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, p. 239–268.
               
            
                  14)
               
               
                  Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., Ed., Cambridge University Press, p. 66–101.
               
            
                  15)
               
               
                  Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, p. 365–373.
               
            
                  16)
               
               
                  Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347–364.
               
            
                  17)
               
               
                  Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutat. Res., 59, p. 61–108.
               
            
                  18)
               
               
                  Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173–215.
               
            
                  19)
               
               
                  Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis,_7, p. 175–177.
               
            
                  20)
               
               
                  Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Holland, p. 85–88.
               
            
                  21)
               
               
                  Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91–103.
               
            
                  22)
               
               
                  Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795–801.
               
            
                  23)
               
               
                  Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, p. 51–55.
               
            
                  24)
               
               
                  Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C, Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, p. 161–174.
               
            
                  25)
               
               
                  Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, p. 89–102.
               
            
                  26)
               
               
                  Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- - 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, p. 609–614.
               
            B.   18. DNR PAŽAIDOS IR JŲ REPARACIJA – NEPLANUOTA DNR SINTEZĖ – ŽINDUOLIŲ LĄSTELĖSE IN VITRO
      
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Neplanuotos DNR sintezės (NDS) tyrimo metu įvertinama DNR sintezė reparacijos metu, kai iškerpama bei pašalinama cheminiais ar fiziniais agentais pažeista DNR atkarpa. Tyrimas paremtas tričiu žymėto timidino (3H-TdR) įjungimu į žinduolių ląstelių, nesančių ląstelinio ciklo S (sintezės) fazėje, DNR. 3H -TdR įsijungimas į DNR gali būti nustatomas atliekant paveiktų ląstelių DNR autoradiografiją arba registruojant skystosios scintiliacijos įvykius (SSĮ). Išskyrus pirminius žiurkių hepatocitus, naudojamos žinduolių ląstelės kultivuojamos kartu su tyrimo agentu, esant arba nesant metabolitinės aktyvacijos sistemos. Taipogi NDS galima įvertinti ir sistemose in vivo.
      
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      Pasiruošimas tyrimui
      Tiriamosios, kontrolinės ar etaloninės medžiagos turėtų būti paruošiamos kultivavimui skirtoje terpėje arba, panaudojant atitinkamus prietaisus, ištirpinamos ar suspenduojamos ir vėliau praskiedžiamos kultivavimui skirta terpe, kad tyrimo metu būtų galima jas naudoti. Galutinė medžiagų koncentracija, pasiekta naudojant prietaisą, neturėtų įtakoti ląstelių gyvybingumo.
      Tyrimo metu galima naudoti žiurkių hepatocitų pirmines kultūras, žmogaus limfocitus arba gerai žinomas ląstelių linijas (pvz., žmogaus diploidinius fibroblastus).
      Ląstelės turėtų būti veikiamos tiriamąja medžiaga, esant arba nesant metabolitinės aktyvacijos sistemos.
      Tyrimo sąlygos
      
         Kultūrų skaičius
      
      Atliekant neplanuotos DNR sintezės tyrimą autoradiografijos metodu, reikėtų naudoti mažiausiai dvi ląstelių kultūras, o skystosios scintiliacijos įvykių registravimo metodu –mažiausiai šešias kultūras (arba mažiau, jei moksliškai pagrindžiama), būtinas kiekvienam eksperimento etapui.
      
         Teigiamos ir neigiamos kontrolės
      
      Atliekant kiekvieną eksperimentą, reikėtų vienu metu naudoti teigiamas ir neigiamas (neveiktas ir (ar) su prietaisu) kontroles, esant ar nesant metabolitinės aktyvacijos sistemos.
      Atliekant tyrimą ir naudojant žiurkių hepatocitų pirmines kultūras, naudojamos teigiamos kontrolės – 7,12-dimetilbenzantracenas (7,12-DMBA) arba 2-acetilaminofluorenas (2-AAF). Jei naudojamos gerai žinomos ląstelių linijos ir atliekamas neplanuotos DNR sintezės tyrimas tiek autoradiografijos, tiek ir skystosios scintiliacijos įvykių registravimo metodais, nesant metabolitinės aktyvacijos sistemos, 4-nitrokvinolin-N-oksidas naudojamas kaip teigiama kontrolė, o esant metabolitinės aktyvacijos sistemai – N-dimetilnitrozaminas.
      
         Veikimo koncentracijos
      
      Reikėtų naudoti daug tiriamosios medžiagos koncentracijų, išdėstytų dideliame intervale, pakankame atsakui nustatyti. Didžiausios koncentracijos tiriamoji medžiaga turėtų sukelti keletą citotoksinių efektų. Turėtų būti ištirti santykinai vandenyje netirpūs junginiai, kad būtų nustatyta jų tirpumo riba. Pavienio tyrimo metu turėtų būti nustatyta laisvai vandenyje tirpstančių netoksinių junginių didžiausia tiriamoji koncentracija.
      
         Ląstelės
      
      Kultivuojant kultūras reikėtų naudoti atitinkamą terpę ir laikytis atitinkamos CO2 koncentracijos, temperatūros bei drėgmės. Reikėtų periodiškai tikrinti gerai žinomas ląstelių linijas, siekiant nustatyti mikoplazmų sukeliamą infekciją.
      
         Metabolinė aktyvacija
      
      Kai tiriamos pirminės hepatocitų kultūros, metabolinės aktyvacijos nenaudojamos. Gerai žinomos ląstelių linijos bei limfocitai veikiami tiriamąja medžiaga, esant ar nesant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai.
      Procedūra
      
         Kultūrų paruošimas
      
      Gerai žinomos ląstelių linijos paruošiamos iš kamieninių kultūrų (veikiant tripsinu arba kratymu), pasėjamos atitinkamu tankumu į terpę kultivavimui skirtuose induose ir inkubuojamos 37 oC temperatūroje.
      Trumpalaikės žiurkių hepatocitų kultūros sukuriamos šviežiai disocijuotus hepatocitus pasėjant į atitinkamą terpę ir leidžiant jiems prisitvirtinti prie augimo paviršiaus.
      Žmogaus limfocitų kultūros paruošiamos atitinkamais metodais.
      
         Kultūrų veikimas tiriamąja medžiaga
      
      Pirminiai žiurkių hepatocitai
      Šviežiai išskirti žiurkių hepatocitai veikiami tiriamąja medžiaga terpėje, turinčioje 3H-TdR, atitinkamą laiko tarpą. Baigiantis veikimui, terpė atskiriama nuo ląstelių, kurios vėliau sudrėkinamos, fiksuojamos bei išdžiovinamos. Skaidres reikėtų panardinti į autoradiografinę emulsiją (galima naudoti ir fotografinę juostelę), eksponuoti, išryškinti nudažyti ir suskaičiuoti ląsteles.
      Gerai žinomos ląstelių linijos ir limfocitai
      Autoradiografija: Ląstelių kultūros veikiamos tiriamąja medžiaga atitinkamą laiko tarpą, po to veikiamos 3H-TdR. Laiko trukmė parenkama atsižvelgiant į tiriamosios medžiagos prigimtį, metabolitinių sistemų aktyvumus bei ląstelių tipą. Tam, kad būtų pasiekta pati intensyviausia neplanuota DNR sintezė, 3H-TdR turi būti įnešamas arba vienu metu su tiriamąja medžiaga arba praėjus kelioms minutėms po to, kai buvo įnešta tiriamoji medžiaga. Kuri procedūra bus pasirinkta, nulems tarpusavio sąveika tarp tiriamosios medžiagos ir 3H-TdR.. Siekiant atskirti neplanuotą DNR sintezę nuo pusiau konservatyvios DNR sintezės, pastaroji turi būti blokuojama, pvz., panaudojant neturinčią arginino terpę arba terpę, turinčią nedaug serumo, arba pridedant į terpę hidroksišlapalo.
      Skystosios scintiliacijos įvykių registacija: Prieš veikiant tiriamąja medžiaga, ląstelių perėjimas į S fazę turėtų būti blokuojamas taip, kaip aprašyta anksčiau; vėliau ląstelės veikiamos tiriamąja medžiaga taip, kaip tai atliekama autoradiografijos metu. Baigiantis inkubacijos periodui, iš ląstelių išskiriama DNR ir nustatomas absoliutus DNR bei į ją įsijungusio 3H-TdR kiekis.
      Reikėtų pabrėžti, kad jei, dirbant remiantis aprašytu metodu, naudojami žmogaus limfocitai, tai nestimuliuotų kultūrų atveju pusiau konservatyvios DNR sintezės nėra būtina blokuoti.
      Analizė
      
         
            Autoradiografiniai nustatymai
         
      
      Įvertinant neplanuotos DNR sintezės intensyvumą ląstelių kultūroje, neskaičiuojami branduoliai, esantys S fazėje. Reikėtų suskaičiuoti mažiausiai 50 ląstelių, esant vienai koncentracijai. Kiekvienoje skaidrėje reikia suskaičiuoti keletą atsitiktinių regionų, plačiai atskirtų vienas nuo kito. Į citoplazmą įsijungusio 3H-TdR kiekis turėtų būti nustatomas, suskaičiuojant tris branduolio apribotus laukelius, esančius jau suskaičiuotų ląstelių citoplazmoje.
      
         Skystosios scintiliacijos įvykių nustatymai
      
      Siekiant įvertinti neplanuotos DNR sintezės intensyvumą pagal užregistruotus skystosios scintiliacijos įvykius, reikėtų naudoti atitinkamą ląstelių kultūrų kiekį, esant kiekvienai koncentracijai tiriamajame bei kontroliniame mėginiuose.
      Visi rezultatai turėtų būti patvirtinti, atlikus nepriklausomą bandymą.
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse.
      2.1.   AUTORADIOGRAFINIAI NUSTATYMAI
      Reikėtų atskirai registruoti į citoplazmą įsijungusio 3H-TdR kiekį bei ląstelės branduolyje esančių granulių skaičių.
      Apibūdinant į citoplazmą įsijungusio 3H-TdR kiekio bei ląstelės branduolyje esančių granulių skaičiaus pasiskirstymą, galima naudoti vidurkį, medianą ir modą.
      2.2.   SKYSTOSIOS SCINTILIACIJOS ĮVYKIŲ NUSTATYMAI
      Nustatant skystosios scintiliacijos įvykius, 3H-TdR įsijungimą išreikšti dpm/μg DNR. Apibūdinant įsijungimo pasiskirstymą, galima panaudoti dpm/ug DNR vidurkį bei standartinį nukrypimą.
      Duomenis reikėtų įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  panaudotos ląstelės, tankumas ir peršėjimo numeris veikimo metu, ląstelių kultūrų skaičius,
               
            
                  —
               
               
                  ląstelių kultūrų kultivavimo metodai, įskaitant terpę, temperatūrą ir CO2 koncentraciją,
               
            
                  —
               
               
                  tiriamoji medžiaga, priemonė, koncentracijos ir tyrimo metu naudojamų koncentracijų pasirinkimo kriterijai,
               
            
                  —
               
               
                  metabolitinės aktyvacijos sistemų apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  veikimo tvarkaraštis,
               
            
                  —
               
               
                  teigiamos ir neigiamos kontrolės,
               
            
                  —
               
               
                  panaudotas autoradiografinis metodas,
               
            
                  —
               
               
                  ląstelių patekimo į S fazę blokavimo procedūros,
               
            
                  —
               
               
                  DNR išskyrimo ir absoliutaus kiekio nustatymo procedūros, atliekant skystosios scintiliacijos įvykių registraciją,
               
            
                  —
               
               
                  dozės ir atsako sąsaja, jei įmanoma,
               
            
                  —
               
               
                  statistinis įvertinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų interpretavimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.19.   APSIKEITIMO SESERINĖMIS CHROMATIDEMIS TYRIMAS IN VITRO
      
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis (ASC) tyrimas trunka trumpai ir jo metu nustatomi grįžtamieji apsikeitimai DNR tarp dviejų seserinių chromatidžių, esančių vienoje dvigubėjančioje chromosomoje. Apsikeitimas seserinėmis chromatidėmis pasikeitimą DNR replikacijos produktais iš pažiūros homologiškuose lokusuose. Pasikeitimo proceso metu neabejotinai įvyksta DNR trūkis ir susiuvimas, tačiau nedaug žinoma apie šio proceso molekulinius mechanizmus. Apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis nustatymui reikia skirtingai pažymėti seserines chromatides ir šitai galima padaryti, įjungiant bromdeoksiuridiną (BrdU) į chromosominę DNR dviejų ląstelinių ciklų metu.
      Žinduolių ląstelės veikiamos tiriamąja medžiaga in vitro,, naudojant arba nenaudojant žinduolių metabolitinę aktyvacijos sistemą, jeigu reikia, ir kultivuojamos dviejų replikacijos ciklų laikotarpiu terpėje, turinčioje bromdeoksiuridino. Paveikus vertės išsisukimo inhibitoriumi (pvz., kolchicinu), ląstelės surenkamos ir paruošiami chromosomų preparatai.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      Pasiruošimas tyrimui
      
                  —
               
               
                  Tyrimo metu galima naudoti pirmines kultūras (žmogaus limfocitai) arba gerai žinomas ląstelių linijas (pvz., kiniškojo žiurkėnų kiaušidžių ląsteles). Reikėtų patikrinti, ar ląstelių linijos neužsikrėtusios mikoplazmomis.
               
            
                  —
               
               
                  Reikėtų naudoti atitinkamą kultivavimui skirtą terpę bei parinkti inkubacijos sąlygas (pvz., temperatūra, indai, skirti kultivavimui, CO2 koncentracija bei drėgmė).
               
            
                  —
               
               
                  Prieš veikiant ląsteles tiriamosiomis medžiagomis, šios turi būti paruoštos kultivavimui skirtoje terpėje arba, panaudojant atitinkamus prietaisus, ištirpintos ar suspenduotos. Panaudojant tirpiklį kaip kontrolę, reikėtų stebėti, kad, naudojant atitinkamą prietaisą, pasiekta tiriamosios medžiagos galutinė koncentracija kultivavimui skirtoje sistemoje ypatingai neįtakotų ląstelių gyvybingumo ar augimo greičio bei apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis dažnumo.
               
            
                  —
               
               
                  Ląstelės turėtų būti veikiamos tiriamąja medžiaga, esant arba nesant egzogeninei žinduolių metabolitinės aktyvacijos sistemai. Jei naudojami ląstelių, turinčių metabolitinę aktyvacijos sistemą, tipai, tai aktyvumo greitis ir prigimtis turėtų atitikti tiriamąją cheminių junginių klasę.
               
            Tyrimo sąlygos
      
         Kultūrų skaičius
      
      Kiekvieno eksperimento etapo metu reikėtų naudoti mažiausiai dvi kultūras.
      
         Teigiamos ir neigiamos kontrolės
      
      Kiekvieno eksperimento metu reikėtų naudoti teigiamas kontroles, sudarytas tiek iš tiesiogiai veikiančio junginio, tiek junginio, kurį reikia metabolitiškai aktyvuoti; taipogi reikėtų naudoti kontrolę kartu su priemone.
      Toliau pateikiamos medžiagos, kurias galima naudoti kaip teigiamas kontroles:
      
                  —
               
               
                  tiesiogiai veikiąs junginys:
                  
                              —
                           
                           
                              etilmetansulfonatas,
                           
                        
            
                  —
               
               
                  netiesiogiai veikiąs junginys:
                  
                              —
                           
                           
                              ciklofosfamidas.
                           
                        
            Jeigu reikia, galima naudoti ir papildomą teigiamą kontrolę, priklausančią tai pačiai cheminių junginių klasei kaip ir tiriamoji medžiaga.
      
         Veikimo koncentracijos
      
      Reikėtų naudoti mažiausiai tris tiriamosios medžiagos koncentracijas, tinkamai atskirtas vieną nuo kitos. Didžiausia koncentracija turėtų sukelti intensyvų toksinį efektą, tačiau nesutrukdyti ląstelių replikacijos ciklui vykti. Panaudojant atitinkamas procedūras turėtų būti tiriami santykinai vandenyje netirpūs junginiai, kad būtų nustatyta jų tirpumo riba. Pavienio tyrimo metu turėtų būti nustatyta laisvai vandenyje tirpstančių netoksinių junginių didžiausia tiriamoji koncentracija.
      Procedūra
      
         Kultūrų paruošimas
      
      Gerai žinomos ląstelių linijos paruošiamos iš kamieninių kultūrų (veikiant tripsinu arba kratymu), pasėjamos atitinkamu tankumu į terpę kultivavimui skirtuose induose ir inkubuojamos 37 oC temperatūroje. Vienasluoksnių kultūrų atveju ląstelių, esančių kultivavimui skirtame inde, skaičius turėtų būti sureguliuotas taip, kad ląstelių surinkimo metu kultūros susimaišymas siektų ne daugiau 50 %. Ląsteles galima kultivuoti ir suspensijoje. Žmogaus limfocitų kultūros paruošiamos iš heparinizuoto kraujo, panaudojant atitinkamas procedūras ir inkubuojami 37 oC temperatūroje.
      
         Veikimas
      
      Ląstelės, esančios eksponentinėje augimo fazėje, veikiamos tiriamąja medžiaga atitinkamą laiko tarpą; dažniausiai užtenka 1-2 valandų, tačiau konkrečiais atvejais veikimas gali būti pratęsiamas iki dviejų ląstelinių ciklų. Ląstelės, nepasižyminčios pakankamu metabolitiniu aktyvumu, turėtų būti veikiamos tiriamąja medžiaga, esant ar nesant atitinkamai metabolitinės aktyvacijos sistemai. Baigiantis veikimui, ląstelės atplaunamos nuo neprisirišusios tiriamosios medžiagos ir kultivuojamos du replikacijos periodus terpėje, turinčioje bromdeoksiuridino. Ląsteles galima veikti vienu metu tiriamąja medžiaga ir bromdeoksiuridinu dviejų ląstelinių ciklų trukmės laiko periodu.
      Žmogaus limfocitų kultūros veikiamos tuo metu, kai jos yra pusiau sinchroninėje būsenoje.
      Ląstelės analizuojamos tada, kai jos pradeda dalintis antrą kartą po veikimo, užtikrinant, kad tiriamąja medžiaga buvo paveiktos ląstelės, esančios pačiuose jautriausiose medžiagos atžvilgiu ląstelinio ciklo fazėse. Visos kultūros, į kurias buvo įneštas bromdeoksiuridinas, laikomos tamsoje arba blankioje dienos šviesos lempų šviesoje iki tol, kol bus surinktos ląstelės tam, kad būtų sumažinta DNR, turinčios bromdeoksiuridino, fotolizė.
      
         Ląstelių surinkimas
      
      Prieš surenkant ląsteles, šios veikiamos verpstės išsisukimo inhibitoriumi (pvz., kolchicinu) 1-2 valandas. Kiekviena kultūra surenkama ir apdorojama atskirai, kad chromosomos būtų paruoštos.
      
         Chromosomų paruošimas ir dažymas
      
      Chromosomos paruošiamos standartiniais citogenetiniais metodais. Skaidrės, skirtos apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis demonstravimui, gali būti dažomos keliais būdais (pvz., panaudojant fluorescencinius dažus ir Giemsa dažymą).
      
         Analizė
      
      Analizuojamų ląstelių skaičius turėtų būti pagrįstas apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis spontaniniu kontroliniu dažniu. Įprastiniu atveju, tiriant apsikeitimą seserinėmis chromatidėmis, mažiausiai 25 gerai matomos metafazės yra analizuojamos. Skaidrės užkoduojamos prieš analizę. Žmogaus limfocitų atveju, analizuojamos tik metafazėje esančios chromosomos, turinčios 46 chromatides. Gerai žinomų ląstelių linijų atveju analizuojamos tik tos metafazinės chromosomos, kurios turi ± 2 modalinį skaičių centromerų. Reikėtų nurodyti ar, tiriant apsikeitimą seserinėmis chromatidėmis, skaičiuojamas žymės centromerinis perjungimas. Rezultatai turi būti patvirtinti, atlikus nepriklausomą eksperimentą.
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti pateikti lentelėse. Atskirai nuo paveiktų ir kontrolinių kultūrų turėtų būti atskirai pateiktas apsikeitimų seserinėmis chromosomomis kiekvienoje metafazinėje ir nemetafazinėje chromosomoje skaičius.
      Rezultatai turėtų būti įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.
      3.   ATASKAITA
      3.1   TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  panaudotos ląstelės, ląstelių kultūrų kultivavimo metodai,
               
            
                  —
               
               
                  tyrimo sąlygos: terpės sudėtis, CO2 koncentracija, tiriamosios medžiagos koncentracija, panaudota priemonė, inkubacijos temperatūra, veikimo laikas, panaudotas verpstės išsisukimo inhibitorius, jo koncentracija ir veikimo inhibitoriumi trukmė, panaudotos žinduolių metabolitinės aktyvacijos sistemos tipas, teigiamos ir neigiamos kontrolės,
               
            
                  —
               
               
                  ląstelių kultūrų, naudotų kiekviename eksperimento etape, skaičius,
               
            
                  —
               
               
                  skaidrių paruošimo metodo aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  išanalizuotų metafazių skaičius (kiekvienos kultūros tyrimų duomenys pateikiami atskirai),
               
            
                  —
               
               
                  apsikeitimų seserinėmis chromatidėmis vienoje ląstelėje ir vienoje chromosomoje vidurkis (kiekvienos kultūros tyrimų duomenys pateikiami atskirai),
               
            
                  —
               
               
                  apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis vertinimo kriterijai,
               
            
                  —
               
               
                  dozės pasirinkimo kriterijai,
               
            
                  —
               
               
                  dozės ir atsako sąsaja, jei įmanoma,
               
            
                  —
               
               
                  statistinis įvertinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų interpretavimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.20.   SU LYTIMI SUSIJĘS RECESYVINIS LETALUS TESTAS DROSOPHILA MELANOGASTER TARPE
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Su lytimi susijusio recesyvinio letalaus (LSRL) testo, panaudojant Drosophila melanogaster, metu vabzdžio embrioninės linijos ląstelėse nustatomos mutacijos, tiek taškinės, tiek ir nedidelės delecijos. Šis testas yra skirtas tiesioginėms mutacijoms analizuoti ir jo metu galima nustatyti mutacijas, lokalizuotas apie 800 lokusų, sudarančių apie 80 % visų X-chromosomos lokusų. X-chromosoma sudaro maždaug penktadalį haploidinio Drosophila genomo.
      
         Drosophila melanogaster X-chromosomoje vykstančios mutacijos pasireiškia fenotipiškai patinuose, turinčiuose mutantinį geną. Kada mutacija yra letali hemizigotinėmis sąlygomis, tai jos egzistavimas reiškia, kad viena iš dviejų patinų grupių neturės palikuonių, kuriuos normaliomis sąlygomis atsiveda heterozigotinės patelės. Atliekant LSRL testą, pasinaudojama šia informacija, specifiškai pažymint bei išdėstant chromosomas.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      Pasiruošimas tyrimui
      
         Padermės
      
      Gali būti naudojami gerai žinomos laukinės padermės patinai ir padermės Muller-5 patelės. Taipogi galima naudoti kitas atitinkamai pažymėtas patelių padermes, turinčias daug invertuotų X-chromosomų.
      
         Tiriamoji medžiaga
      
      Tiriamosios medžiagos turėtų būti tirpinamos vandenyje. Prieš pradedant veikimą, vandenyje netirpstančios medžiagos gali būti ištirpinamos arba suspenduojamos panaudojus atitinkamas priemones (pvz., etanolio ir Tween-60 arba Tween-80 mišinį), o tada praskiedžiamos vandeniu ar druskų tirpalu. Reikėtų vengti naudoti dimetilsulfoksidą (DMSO) kaip tirpinimo priemonę.
      
         Gyvūnų skaičius
      
      Testą reikėtų taip suplanuoti, kad iš anksto būtų numatytas jo jautrumas ir skiriamoji geba. Dažnai pasireiškiančios spontaninės mutacijos, stebimos atitinkamose kontrolėse turės didelės įtakos chromosomų, paveiktų tiriamąja medžiaga ir kurios turi būti analizuojamos, skaičiui.
      
         Davimo būdas
      
      Tiriamoji medžiaga gali būti duodama per os būdu, ją injekuojant arba veikiant dujomis ar garais. Tiriamąją medžiagą galima duoti ir su maistu, tačiau šitai daroma naudojant cukraus tirpalą. Jeigu reikia, medžiagos gali būti ištirpinamos 0,7 % NaCl tirpale ir injekuojamos į stemplę ar pilvelį.
      
         Teigiamų ir neigiamų kontrolių naudojimas
      
      Reikėtų naudoti neigiamas (priemonė) ir teigiamas kontroles. Tačiau, jei galima pasinaudoti anksčiau atliktų laboratorinių tyrimų duomenimis, tuo pačiu metu kontrolių naudoti nereikia.
      
         Veikimo dozė
      
      Reikėtų naudoti tris veikimo dozes. Atliekant išankstinį tiriamosios medžiagos įvertinimą, galima naudoti vieną dozę, kuri yra arba didžiausia toleruojamoji koncentracija, arba kuri sukelia kai kuriuos toksiškumo požymius. Veikiant netoksinėmis medžiagomis, reikėtų vatoti maksimalią veikimo koncentraciją.
      
         Procedūra
      
      Laukinio tipo patinai (3-5 dienų amžiaus) veikiami tiriamąja medžiaga ir poruojami individualiai su daugeliu Muller-5 ar kitos atitinkamai pažymėtos (turinčios daug invertuotų X-chromosomų) padermės nekaltų patelių. Kiekvieną 1-3 dieną apvaisintos patelės keičiamos nekaltomis patelėmis tam, kad būtų panaudotas visas embrioninių ląstelių ciklas. Šių patelių palikuonys vertinami pagal letalius efektus subrendusios spermos, vidurinėje ar vėlyvojoje stadijoje esančių spermatidžių, spermatocitų ir spermatogonijų atžvilgiu veikimo metu.
      Ankstesniuose kryžminimuose naudotoms heterozigotinėms pirmos palikuonių kartos (F1) patelėms leidžiama kryžmintis individualiai (viena patelė inde) su jų broliais. Kiekviena F2 karta įvertinama pagal laukinio tipo patinų neegzistavimą. Jei nustatoma, kad kultūra yra paimta iš F1 patelės, turinčios letalią X-chromosomos mutaciją (pvz., nebuvo pastebėta patinų su paveikta chromosoma), tai turėtų būti tiriamos tą patį genotipą turinčios šios patelės dukterys tam, kad būtų galima įsitikinti jog letalumas pasikartoja kitoje kartoje.
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti pateikti lentelėse, nurodant ištirtų X-chromosomų skaičių, nevaisingų patinų skaičių ir kiekvieno paveikto patino kiekvieno poravimosi periodo metu nustatytų letalių chromosomų skaičių, esant kiekvienai tiriamosios medžiagos koncentracijai, reikėtų registruoti skirtingų dydžių genų klasterių kiekvieno patino genome skaičių. Šie rezultatai turi būti patvirtinti, atlikus atskirą eksperimentą.
      Įvertinant su lytimi sukibusių recesyvių letalių genų testų rezultatus, reikėtų panaudoti atitinkamus statistinius metodus. Remiantis atitinkamais statistiniais metodais, reikėtų įvertinti ir apsvarstyti vieno patino recesyvių letalių genų kaupimąsi.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  padermė: panaudotos Drosophila padermės ar kamienai, vabzdžių amžius, paveiktų patinų skaičius, streilių patinų skaičius, sukurtų F2 kartos kultūrų skaičius, F2 kultūrų, neturinčių palikuonių, skaičius, chromosomų, turinčių letalią mutaciją, nustatytą embrioninės linijos ląstelėse, skaičius,
               
            
                  —
               
               
                  grupių, kurios veikiamos, dydžio nustatymo kriterijai,
               
            
                  —
               
               
                  tyrimo sąlygos: detalus veikimo ir mėginių paėmimo tvarkaraštis, veikimo koncentracijos, toksiškumo tyrimo duomenys, neigiamos (tirpiklis) ir teigiamos kontrolės, jeigu reikia,
               
            
                  —
               
               
                  letalių mutacijų įvertinimo kriterijai,
               
            
                  —
               
               
                  dozės ir atsako sąsaja, jei įmanoma,
               
            
                  —
               
               
                  duomenų įvertinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų interpretavimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.21.   ŽINDUOLIŲ LĄSTELIŲ TRANSFORMACIJOS TESTAI IN VITRO
      
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Siekiant nustatyti cheminių agentų, sukeliančių ląstelių piktybinę transformaciją in vivo ir ląstelių fenotipo pokyčius in vitro, gali būti naudojamos žinduolių ląstelių kultūrų sistemos. Plačiai naudojamoms ląstelių linijoms priklauso C3H10T1/2, 3T3, SHE bei Fischer žiurkių ląstelės ir testai grindžiami ląstelių morfologijos pokyčiais, ligos židinio formavimosi bei pri si tvirtinimo prie pusiau kieto agaro pokyčių tyrimais. Mažiau naudojamoms sistemoms priklauso tos, kurios naudojamos fiziologiniams bei morfologiniams ląstelių, paveiktų karcinogeninėmis cheminėmis medžiagomis, pokyčiams nustatyti. Nė vieno in vitro, testų metu nebuvo nustatyta mechanistinio ryšio tarp vėžio ir ląstelių pokyčiu. Naudojant kai kurias tiriamąsias sistemas, galima nustatyti protoonkogenų promotorius. Įvertinant tiriamosios medžiagos įtaką ląstelių kultūrų sugebėjimui suformuoti kolonijas (klonavimo efektyvumas) arba augimo greičiams, galima nustatyti citotoksiškumą. Citotoksiškumo įvertinamas tam, kad būtų nustatyta, jog tiriamoji medžiaga, kuria buvo veikiama, sukelia toksikologinį efektą ir kurios negalima naudoti visuose tyrimuose, apskaičiuojant transformacijos dažnį, kadangi šiuo atveju ląstelių inkubaciją ar persėjimą reikėtų pratęsti.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      Pasiruošimas tyrimui
      
         Ląstelės
      
      Priklausomai nuo naudojamo testo transformacijai įvertinti, galima naudoti įvairiausias ląstelių linijas ar pirmines ląsteles. Tyrėjas privalo užtikrinti, kad tiriamąsias ląsteles paveikus žinomais karcinogenais, šiose pasireiškia atitinkami fenotipiniai pokyčiai ir kad įrodyta bei dokumentiškai patvirtinta, jog tyrėjo laboratorijoje vartojamas testas yra oficialiai pripažįstamas ir patikimas.
      
         Terpė
      
      Atliekant transformacijos tyrimą, reikėtų naudoti atitinkamą terpę bei parinkti atitinkamas eksperimentines sąlygas.
      
         Tiriamoji medžiaga
      
      Prieš veikiant ląsteles, tiriamosios medžiagos gali būti paruošiamos kultivavimui skirtoje terpėje arba ištirpinamos ar suspenduojamos atitinkamomis priemonėmis. Tirpinančiosios priemonės galutinė koncentracija ląstelių kultūrų sistemoje neturėtų įtakoti ląstelių gyvybingumo, augimo greičio ar pasitaikančios transformacijos.
      
         Metabolitinė aktyvacija
      
      Ląstelės turėtų būti veikiamos tiriamąja medžiaga, tiek esant, tiek ir nesant metabolitinės aktyvacijos sistemos. Kai naudojami ląstelių, pasižyminčių metabolitiniu aktyvumu, tipai, tai aktyvumo prigimtis turėtų atitikti tą klasę, kuriai priklauso naudojamas cheminis junginys.
      Tyrimo sąlygos
      
         Teigiamų ir neigiamų kontrolių naudojimas
      
      Kiekvieno eksperimento metu reikėtų naudoti teigiamas kontroles, sudarytas tiek iš tiesiogiai veikiančio junginio, tiek iš junginio, kurį reikia metabolitiškai aktyvuoti; taipogi reikėtų naudoti ir neigiamas (priemonė) kontroles.
      Žemiau pateikiamos medžiagos, kurias galima naudoti kaip teigiamas kontroles:
      
                  —
               
               
                  tiesiogiai veikiantys junginiai:
                  
                              —
                           
                           
                              etilmetansulfonatas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              β-opropiolaktonas,
                           
                        
            
                  —
               
               
                  junginiai, kuriuos reikia aktyvuoti metabolitiškai:
                  
                              —
                           
                           
                              2-acetilaminofluorenas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              4-dimetilaminobenzenas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              7,12-dimetilbenzantracenas.
                           
                        
            Jeigu reikia, galima naudoti ir papildomą teigiamą kontrolę, priklausančią tai pačiai cheminių junginių klasei kaip ir tiriamoji medžiaga.
      
         Veikimo koncentracijos
      
      Tiriamąją medžiagą reikėtų vartoti keliomis koncentracijomis. Šios koncentracijos turėtų sukelti nuo koncentracijos priklausomą toksinį efektą, esant didžiausiai koncentracijai, ląstelių išgyvenimas turėtų sumažėti, tačiau esant mažiausiai koncentracijai, jis turėtų būti toks, kaip ir neigiamai kontrolei esant terpėje. Panaudojant atitinkamas procedūras turėtų būti tiriami santykinai vandenyje netirpūs junginiai, kad būtų nustatyta jų tirpumo riba. Pavienio tyrimo metu turėtų būti nustatyta laisvai vandenyje tirpstančių netoksinių junginių didžiausia tiriamoji koncentracija.
      Procedūra
      Ląstelės turėtų būti veikiamos atitinkamą laiką, priklausomai nuo naudojamos tyrimo sistemos ir veikimo metu galima pakartotinai veikti su ta pačia medžiagos doze, pakeičiant terpę (jei būtina, į terpę įnešama šviežiai paruošto metabolitinės aktyvacijos mišinio), jei veikimo laikas pailginamas. Ląstelės, nepasižyminčios efektyviai veikiančia metabolitine aktyvacija, turėtų būti veikiamos tiriamąja medžiaga, esant arba nesant atitinkamai metabolitinės aktyvacijos sistemai. Baigiantis veikimui, ląstelės atplaunamos nuo neprisirišusios tiriamosios medžiagos ir, kai nustatoma transformacija bei pasirodo transformuotas fenotipas, kultivuojamos atitinkamomis sąlygomis. Visi rezultatai patvirtinami, atlikus nepriklausomą eksperimentą.
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti pateikti lentelėse įvairiausiomis formomis, priklausomai nuo atlikto tyrimo, pvz., nurodant lėkštelių skaičių, teigiamas lėkšteles ar transformuotų ląstelių skaičių. Jeigu reikia, išgyvenimas išreiškiamas procentais kontrolės laipsnio atžvilgiu ir transformacijos dažnis išreiškiamas transformuotų ląstelių, esančių išgyvenusių ląstelių tarpe, skaičiumi.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  panaudotų ląstelių tipas, ląstelių kultūrų skaičius, ląstelių kultūrų kultivavimo metodai,
               
            
                  —
               
               
                  tyrimo sąlygos: tiriamosios medžiagos koncentracija, panaudota priemonė, inkubacijos laikas, veikimo trukmė ir dažnis, ląstelių populiacijos tankis veikimo metu, panaudotos egzogeninės metabolitinės aktyvacijos sistemos tipas, teigiamos ir neigiamos kontrolės, stebimo ląstelių fenotipo ypatumai, panaudota atrankos sistema (jei įmanoma), dozės pasirinkimo kriterijai,
               
            
                  —
               
               
                  gyvų ir transformuotų ląstelių skaičiaus nustatymo metodas,
               
            
                  —
               
               
                  statistinis įvertinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų interpretavimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.22.   GRAUŽIKŲ DOMINANTINIS LETALINIS TESTAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Dominantiniai letalūs efektai sukelia embriono arba gemalo mirtį. Veikiant chemine medžiaga, sukeliami dominantiniai letalūs efektai, kurie rodo, kad tiriamoji medžiaga paveikė tiriamosios rūšies gyvūnų embrionų audinius. Apskritai manoma, kad dominantiniai letalūs efektai pasireiškia dėl chromosomų pažeidimų (struktūrinės anomalijos arba chromosomų skaičiaus pokyčiai). Jei patelės paveikiamos medžiaga, ir jų embrionai žūsta, tai šitai taipogi įvyksta dėl toksinių efektų.
      Apskritai, gyvūnų patinai paveikiami tiriamąja medžiaga, o vėliau poruojami su nekaltomis patelėmis, nepaveiktomis tiriamąja medžiaga. Poruojant individus paeiliui, tam tikrais laiko tarpais, galima atskirai tirti įvairius embrioninės ląstelės vystymosi etapus. Jei, lyginant su kontrolinės grupės patelių negyvų implantų skaičiumi, šių implantų skaičius padaugėja kiekvienoje paveiktos grupės patelėje, tai rodo, kad implantacija nepavyko. Nesėkmė, atliekant išankstinę implantaciją, gali būti vertinama pagal corpora lutea kiekį arba lyginant absoliutų implantų tiriamos bei kontrolinės grupės patelėse skaičių. Absoliutus dominantinis letalus efektas apima nesėkmes, atliekant išankstinę bei vėlesnę implantacijas. Absoliutaus dominantinio letalaus efekto įvertinimas paremtas gyvų implantų, esančių tiriamos bei kontrolinės grupės patelėse, kiekio palyginimu. Konkrečiais laiko intervalais dėl ląstelių (tokių kaip spermatocitų ir (ar) spermatogonijų) žūties gali sumažėti implantų skaičius.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      Pasiruošimas tyrimui
      Jei įmanoma, tiriamosios medžiagos turėtų būti ištirpintos ar suspenduotos izotoniniame druskų tirpale. Vandenyje netirpios cheminės medžiagos turi būti ištirpintos ar suspenduotos, panaudojus atitinkamas priemones. Naudojama priemonė neturi trukdyti nei tiriamajai cheminei medžiagai veikti, nei toksiniams efektams pasireikšti. Reikėtų naudoti šviežiai paruoštus tiriamosios cheminės medžiagos preparatus.
      Tyrimo sąlygos
      
         Davimo būdas
      
      Paprastai tiriamasis junginys turėtų būti duodamas vienąkart. Remiantis toksikologine informacija, veikimą galima pakartoti. Paprastai tiriamoji medžiaga duodama per os, į trachėją įvedamu vamzdeliu arba injekuojant tiriamąją medžiagą į pilvą. Medžiagą galima duoti ir kitais būdais.
      
         Eksperimentiniai gyvūnai
      
      Rekomenduojama tirti žiurkes arba peles. Sveiki visiškai lytiškai subrendę gyvūnai atsitiktinai pasirenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolines grupes.
      
         Skaičius ir lytis
      
      Atsižvelgiant į spontaninę tiriamos biologinės rūšies variaciją, reikėtų naudoti pakankamą skaičių patinų, paveiktų tiriamąja medžiaga. Skaičius turėtų būti pasirenkamas, remiantis iš anksto nustatytu tyrimo testo jautrumu bei gaunamų duomenų patikimumu. Pavyzdžiui, atliekant tipinį testą, patinų, priklausančių grupėms, kurių kiekvienai duodama skirtinga dozė, turi būti tiek, kad vieno poravimosi periodo metu būtų apvaisinta 30–50 patelių.
      
         Teigiamų ir neigiamų kontrolių naudojimas
      
      Atliekant kiekvieną eksperimentą, paprastai vienu metu reikėtų naudoti teigimą bei neigiamą (priemonė) kontroles. Kai galima susipažinti su toje pačioje laboratorijoje ką tik atliktų eksperimentų, naudojant teigiamas kontroles, gautais patenkinamais rezultatais, tai šiuos rezultatus galima naudoti vietoj teigiamos kontrolės, naudojamos tuo pačiu metu. Teigiamos kontrolinės medžiagos turėtų būti naudojamos atitinkamomis mažomis dozėmis (pvz., MMS, injekuojamos į pilvą, dozė turi siekti 10 mg/kg), kad būtų parodytas tyrimo testo jautrumas.
      
         Veikimo dozė
      
      Reikėtų naudoti tris veikimo dozes. Didelė dozė turėtų sukelti toksiškumo požymius arba sumažinti gyvūnų, paveiktų tiriamąja medžiaga, vaisingumą. Konkrečiais atvejais užtenka ir pavienės didelės dozės.
      
         Ribų tyrimas
      
      Duodant netoksines tiriamąsias medžiagas vienąkart, jų koncentracija turi siekti 5 g/kg, o duodant pakartotinai – 1 g/kg.
      Procedūra
      Tiriamąsias medžiagas galima duoti įvairiai. Dažniausiai tiriamoji medžiaga duodama vienąkart.
      Pasibaigus veikimui, atitinkamais laiko tarpais pavieniai patinai paeiliui poruojami su tiriamąja medžiaga nepaveiktomis nekaltomis patelėmis. Patelės paliekamos su patinais laiko tarpui, lygiam vienai rujai arba tol, kol jie susiporuos, o tai nustatoma pagal spermos patekimą į makštį arba pagal makšties kamščio susidarymą.
      Pasibaigus veikimui, atliekama tiek poravimų, kiek yra numatyta veikimo tvarkaraštyje bei turėtų būti užtikrinta, kad pasibaigus veikimui, mėginai paimami atskirais embrioninės ląstelės vystymosi etapais.
      Patelės numarinamos praėjus pusei nėštumo periodo ir gimdos turinys tiriamas tam, kad būtų nustatytas gyvų bei žuvusių implantų skaičius. Reikia ištirti kiaušides, kad būtų nustatytas corpora lutea skaičius.
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant patinų ir nėščių bei nenėščių patelių skaičių. Reikėtų atskirai registruoti kiekvieno suporavimo rezultatus, nurodant kiekvieno patino ir patelės tapatybę. Taipogi kiekvienos patelės atveju reikėtų registruoti suporavimo savaitę, dozę, gautą iš patinų, gyvų bei negyvų implantų egzistavimo dažnį.
      Absoliutus dominantinių letalių efektų skaičius nustatomas, lyginant gyvų implantų skaičių tiriamosios bei kontrolinės grupės patelėse. Tiriamosios grupės patelių gyvų bei negyvų implantų skaičiaus santykis palyginamas su tokiu pačiu kontrolinės grupės implantų skaičiaus santykiu tam, kad nustatyti, ar implantacija nepavyko.
      Jei tarp pateikiamų duomenų, nurodomos ankstyvosios bei vėlyvosios mirtys, tai šitai turi būti aiškiai parodyta lentelėse. Jeigu nustatoma, kad išankstinė implantacija nepavyko, tai ji turi būti užregistruota. Ar išankstinė implantacija pavyko ar ne, sprendžiama, lyginant pagal corpora lutea ir implantų skaičiaus skirtumus arba pagal vidutinio implantų gimdoje skaičiaus sumažėjimą tiriamoj oje grupėje, lyginant su poravimais kontrolinėje grupėje.
      Rezultatai turėtų būti įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  rūšis, kamienas, panaudotų gyvūnų amžius bei svoris, eksperimentinėje bei kontrolinėse grupėse esančių kiekvienos lyties gyvūnų skaičius,
               
            
                  —
               
               
                  tiriamoji medžiaga, priemonė, dozės, ir dozių pasirinkimo kriterijai, neigiamos ir teigiamos kontrolės, toksiškumo tyrimų duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  davimo būdas ir veikimo tvarkaraštis,
               
            
                  —
               
               
                  suporavimo tvarkaraščiai,
               
            
                  —
               
               
                  metodas, kuriuo nustatoma, kad suporavimas įvyko,
               
            
                  —
               
               
                  numarinimo laikas,
               
            
                  —
               
               
                  dominantinių letalių mutacijų įvertinimo kriterijai,
               
            
                  —
               
               
                  dozės ir atsako sąsaja, jei įmanoma,
               
            
                  —
               
               
                  statistinis įvertinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų interpretavimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.23.   ŽINDUOLIŲ SPERMATOGONIJŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJOS TYRIMAS
      1.   METODAS
      Šis metodas pakartoja OECD TG 483 Žinduolių spermatogone'ų chromosomų aberacijos tyrimą (1997).
      1.1   ĮVADAS
      Žinduolių spermatogonijų chromosomų aberacijos tyrimo in vivo tikslas – identifikuoti medžiagas, sukeliančias žinduolių spermatogonijų chromosomų struktūrines aberacijas (1) (2) (3) (4) (5). Struktūrinės aberacijos gali būti 2 tipų: chromosominės ir chromatidinės. Dauguma mutagenų sukelia chromosomines mutacijas, tačiau pasitaiko ir chromatidinių aberacijų. Šis metodas nėra skirtas chromosomų skaičiaus rinkinyje pokyčiams įvertinti ir šiam tikslui minėtasis metodas paprastai nėra naudojamas. Chromosomų mutacijos bei su jomis susiję įvykiai sukelia daug genetinių ligų žmonių tarpe.
      Šio tyrimo metu nustatomi spermatogeninių gemalinių ląstelių chromosomų pokyčiai, kuriais remiantis prognozuojama apie paveldimų mutacijų atsiradimą gemalinėse ląstelėse.
      Atliekant šį tyrimą bendru atveju, panaudojami graužikai. Šio citogenetinio tyrimo metu in vivo nustatomos chromosominio tipo aberacijos, atsirandančios spermatogonijų mitozinėse chromosomose. Kitos ląstelės nėra naudojamos šiam tyrimui atlikti.
      Tam, kad spermatogonijose būtų identifikuotos chromatidinės aberacijos, tiriama ląstelių pirmoji mitozė, vykstanti iškart po to, kai ląstelės buvo paveiktos tiriamąja medžiaga tam, kad, ląstelėms dalijantis, šie pakitimai nebūtų prarandami. Papildomą informaciją apie tiriamąja medžiaga paveiktas spermatogonijų kamienines ląsteles galima gauti, analizuojant mejozines chromosomas bei ieškant chromosominių aberacijų ląstelių, esančių I diakinezės metafazės stadijoje, kai šios, paveiktos tiriamąja medžiaga, tampa spermatocitais, chromosomose.
      Šio tyrimo, atliekamo in vivo sąlygomis, metu siekiama nustatyti, ar somatinių ląstelių mutacijas sukeliantys mutagenai, gali jas sukelti ir gemalinėse ląstelėse. Be to, spermatogonijų tyrimas yra svarbus, įvertinant mutagenų padarytą žalą, pagal kurią sprendžiama apie faktorių, reguliuojančių metabolizmą, farmakokinetiką bei DNR pažaidų atstatymo procesus, reikšmę.
      Sėklidėse yra daug skirtingoms generacijoms priklausančių spermatogonijų, kurios tarpusavyje skiriasi pagal jautrumą cheminių medžiagų poveikiui. Todėl identifikuotos aberacijos parodo spermatogonijų populiacijų, kurių pagrindinę dalį sudaro daug diferencijuotų spermatogonijų, paveiktų tiriamąja medžiaga, bendrąjį atsaką. Priklausomai nuo jų lokalizacijos sėklidėse, skirtingų generacijų spermatogone'os gali arba patekti arba nepatekti į bendrąją cirkuliaciją, nes egzistuoja fizinis ir fiziologinis (Sertoli ląstelių bei kraujo ir sėklidžių) barjerai.
      Jeigu nustatoma, kad tiriamoji medžiaga arba reaktyvusis metabolitas nepasiekia audinio, į kurį buvo nukreiptas, tai šio tyrimo metu jis daugiau nebenaudojamas.
      Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Chromatidinė aeracija – chromosomos struktūros pakeitimas, sukuriant trūkį seserinėse chromatidėse ar tarp jų ir neleidžiant joms pakartotinai susijungti.
      
         Chromosominė aeracija – chromosomos struktūros pakeitimas, sukuriant arba trūkį, arba trūkį ir susijungimą toje pačioje vietoje abiejose seserinėse chromatidėse.
      
         Plyšys – achromatinė spraga, kurios plotis mažesnis už vienos chromatidės plotį ir chromatidė mažiausią skaičių klaidingai suporuotų bazių.
      
         Chromosomų skaičiaus aeracija – normalaus chromosomų, esančių ląstelėse, skaičiaus pokytis.
      
         Poliploidiškumas – haploidinio chromosomų skaičiaus (skirtingai nei haploidinio skaičiaus –3n, 4n ...) – didėjimas.
      
         Struktūrinė aeracija – chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti, mikroskopu analizuojant ląsteles, esančias dalijimosi ciklo metafazėje ir kuris atrodo kaip fragmentų, esančių tarp grandinių bei jų viduje, delecijos.
      1.3   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Gyvūnai veikiami tiriamąja chemine medžiaga pagal atitinkamą veikimo chemine medžiaga metodiką ir atitinkamais laiko momentais po veikimo, numarinami. Prieš numarinimą gyvūnai paveikiami agentu, sustabdančiu ląstelių dalijimąsi metafazėje (pavyzdžiui, kolchicinu arba Kolcemidu®).Iš gemalinių ląstelių išskiriamos chromosomos, jos dažomos ir metafazėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu, kad būtų nustatytos chromosomų aberacijos.
      1.4   TYRIMO METODO APRAŠYMAS
      1.4.1   Paruošimas
      1.4.1.1   Gyvūnų rūšies pasirinkimas
      Paprastai naudojami kiniško žiurkėno ir pelių patinėliai. Tačiau gali būti naudojami ir kitų atitinkamų žinduolių rūšių patinai. Reikia naudoti visuotinai naudojamus jaunų sveikų subrendusių gyvūnų kamienus. Tyrimo pradžioje gyvūnų svorio variacija turi būti minimali ir neviršyti ± 20 % vidutinio svorio.
      1.4.1.2   Laikymo ir maitinimo sąlygos
      Taikomos Pagrindinio Įvado B dalyje nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad drėgmė siektų 50–60 %.
      1.4.1.3   Gyvūnų paruošimas
      Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę bei tiriamąją (kuriai priskirti individai bus paveikti chemine medžiaga) grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos efektai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas turi savo identifikacijos ženklą. Prieš pradedant tyrimą, gyvūnams leidžiama aklimatizuotis prie laboratorinių sąlygų mažiausiai per 5 dienas.
      1.4.1.4   Dozių paruošimas
      Kietosios tiriamosios cheminės medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinamuosiuose įrenginiuose ir jei reikia, tai, prieš paruošiant jų dozes, skirtas gyvūnams, jos praskiedžiamos. Skystųjų tiriamųjų medžiagų dozės ruošiamos iškart arba prieš dozių paruošimą, jos praskiedžiamos. Prieš kiekvieną bandymą šviežiai paruošiami tiriamosios cheminės preparatai ir neatsižvelgiama į stabilumo tyrimo metu gautus duomenis, rodančius, kad medžiaga atitinka jos laikymui keliamus reikalavimus.
      1.4.2   Tyrimo sąlygos
      1.4.2.1   Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys
      Tirpiklis ar tirpinantysis prietaisas neturėtų sukelti jokio toksinio efekto, atitinkančio vartojamas dozes ir neturėtų kilti spėlionių, kad jis gali chemiškai reaguoti su tiriamąja medžiaga. Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/tirpinantieji įrenginiai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį.
      1.4.2.2   Kontroliniai mėginiai
      Kiekvieno tyrimo metu turi būti tiriami iš kiekvienai lyčiai priklausančių gyvūnų paimti vienu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai. Išskyrus tą atvejį, kai gyvūnai veikiami tiriamąja medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir gyvūnai, paveikti tiriamąja chemine medžiaga (tiriamoji grupė).
      Spermatogoninių ląstelių, paveiktų tokia pačia tiriamosios cheminės medžiagos doze in vivo, teigiamuose kontroliniuose mėginiuose turi būti nustatomos struktūrinės aberacijos, kurios, kaip tikimasi, užgoš lengvai nustatomą pašalinį foną.
      Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunami efektai būtų ryškūs, bet kad tyrėjas ne iškart dešifruotų užkoduotas skaidres. Priimtina, kad teigiami kontroliniai mėginiai būtų duodami gyvūnams kitaip nei tiriamoji medžiaga bei būtų tik vieną kartą paimami. Jeigu yra įmanoma, tai galima pasvarstyti apie konkrečiai klasei priklausančių medžiagų, kaip teigiamų kontrolinių mėginių, panaudojimą. Žemiau pateikiami tokie teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai:
      
                  Medžiaga
               
               
                  CAS Nr.
               
               
                  EINECS Nr.
               
            
                  ciklofosfamidas
                  ciklofosfamido monohidratas
               
               
                  50-18-0
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
            
                  cikloheksilaminas
               
               
                  108-91-8
               
               
                  203-629-0
               
            
                  mitomicinas C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  Monomerinis akrilamidas
               
               
                  79-06-1
               
               
                  201-173-7
               
            
                  Trietilenmelaminas
               
               
                  51-18-3
               
               
                  200-083-5
               
            Neigiami kontroliniai mėginiai, paveikti arba tirpikliu ar tik tirpinamuoju įrenginiu, arba paveikti taip pat kaip ir tiriamosios grupės, turi būti kiekvieną kartą paimami, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų metu gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad variacijos laipsnis tarp gyvūnų ir ląstelių, kuriose stebimos chromosomų aberacijos yra priimtini. Jei neigiami kontroliniai mėginiai paimami tik vieną kartą, tai pirmojo paėmimo laikas yra pats priimtiniausias. Be to reikia papildomai panaudoti tiriamąja medžiaga neveiktus kontrolinius mėginius, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų bei išspausdintus duomenis, rodančius, kad pasirinktas tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys nesukėlė jokių žalingų ar mutageninių efektų.
      1.5   BANDYMO ATLIKIMO METODIKA
      1.5.1   Gyvūnų skaičius
      Kiekvienoje tiriamojoje ir kontrolinėje grupėse turi būti mažiausiai 5 tiriami patinėliai.
      1.5.2   Veikimo tvarkaraštis
      Pirmiausia tik vienąkart arba dukart veikiama tiriamosiomis medžiagomis (pavienis veikimas arba 2 veikimai). Tiriamosiomis medžiagomis galima veikti, taikant taip vadinamą išskaidytą dozę, kai tą pačią dieną atliekami du veikimai tiriamąja medžiaga ir jų atlikimo laikas skiriasi ne daugiau kaip keletu valandų tam, kad būtų suteiktas pakankamai didelis tiriamosios medžiagos tūris. Kitų dozių davimo tvarka turi būti moksliškai pagrindžiama.
      Kai gyvūnų grupei duodama didžiausia koncentracija, tai, pasibaigus veikimui, mėginiai paimami 2 kartus. Kadangi tiriamoji medžiaga gali turėti įtakos ląstelės ciklo kinetikai, tai, pasibaigus veikimui, mėginiai paimami labai anksti bei labai vėlai 24-48 valandų laikotarpiu. Kai tiriamos kitos (ne didžiausios) dozės, tai pasibaigus veikimui, mėginiai paimami 24 valandų (arba 1,5 ląstelės ciklo trukmės) laikotarpiu, nebent yra žinomas kitas mėginių paėmimo laikas, kuris yra tinkamesnis, tiriant efektus (6).
      Be to mėginius galima paimti ir kitu metu. Pavyzdžiui, tiriant chemines medžiagas, sukeliančias chromosomų pertraukimus arba galinčias turėti įtakos nuo S nepriklausantiems efektams, mėginius galima paimti ir kitu tinkamu metu (1).
      Pakartotinio veikimo tvarkaraščio tinkamumas turi būti nustatomas kiekvienu atveju. Pagal pakartotinio veikimo tvarkaraštį, gyvūnai numarinami 24 valandų laikotarpiu (1,5 ląstelės ciklo trukmės) po paskutinio veikimo. Jeigu reikia, tai mėginiai yra papildomai paimami atitinkamu metu.
      Prieš numarinimą, gyvūnams į pilvo plėvę suleidžiama atitinkama dozė metafazę sustabdančio agento (pavyzdžiui, Kolcemido® ar kolchicino). Po atitinkamo intervalo iš gyvūnų paimami mėginiai, pelių atveju tai atliekama po 3-5 valandų, kiniškų žiurkėnų atveju tai atliekama po 4–5 valandų.
      1.5.3   Dozės dydis
      Jeigu atliekamas intervalo, apie kurį nėra duomenų, paieškos tyrimas, tai jis turi būti atliekamas to pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei veikiant juos tiriamąja chemine medžiaga pagal tą patį tvarkaraštį, kuris buvo naudojamas pagrindinio tyrimo metu (7). Jeigu nustatomas toksiškumas, tai pirmąkart imant mėginius, naudojami 3 doziniai lygiai. Šie doziniai lygmenys turi apimti visą intervalą, pradedant nuo maksimumo ir baigiant minimumu arba tokia doze, kuri visiškai nėra toksiška. Vėlesniu mėginių paėmimo metu naudojama tik pati didžiausia dozė. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, išryškėja toksiškumo, priklausomo nuo dozės požymiai, tokie, kurie pasirodo, kai naudojant tokį pat dozavimo tvarkaraštį, suleidžiama didžiausia dozė ir spėjama, kad j i bus mirtina.
      Medžiagos pasižyminčios specifiniu biologiniu aktyvumu, kai jų dozės būna mažos ir netoksinės (pavyzdžiui tokios kaip hormonai ir mitogenai) gali būti laikomos išimtimi, kai joms taikomi dozę nustatantys kriterijai ir tada jos tiriamos kiekvienu atveju. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, spermatogonijose pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (pavyzdžiui, I ir II mejozinės metafazės metu spermatogonijų mitozių santykis sumažėja; šis sumažėjimas neviršija 50 %).
      1.5.4   Ribų paieškos tyrimas
      Jeigu tyrimas atliekamas, esant vienam doziniam lygmeniui, kuris, per vieną dieną atliekant pavienį arba du poveikius tiriamąja medžiaga, mažiausiai sudaro 2 000 mg/kūno/kg ir jei nepastebima jokių toksinių efektų bei, remiantis struktūriškai panašių cheminių medžiagų tyrimų duomenimis, nebus tikimasi užregistruoti genotoksiškumo, tai tada laikomasi nuostatos, kad yra tikslinga atlikti pilną tyrimą panaudojant 3 dozinius lygmenis. Numatomas tiriamosios medžiagos poveikis žmogui gali parodyti, kad, atliekant ribų paieškos tyrimą reikia naudoti aukštesnį dozinį lygmenį.
      1.5.5   Dozių davimas
      Tiriamoji medžiaga yra paprastai duodama, priverstinai maitinant per vamzdelį, įstatant jį į skrandį, tinkamai įvedant kanulę per vamzdelį arba injekciją į pilvą. Tiriamąją medžiagą galima įvesti ir kitais būdais, jei jie yra pagrindžiami. Maksimalus skysčio, priverstinai duodamo per vamzdelį arba injekuojamo į pilvą vienu metu, tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 mg kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių davimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus sujaudrinančias ar irimą sukeliančias medžiagas, kurios, būdamos didesnėmis koncentracijomis, sukelia žalingus efektus, tiriamosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad esant visiems doziniams lygmenims, tūris būtų pastovus.
      1.5.6   Chromosomų paruošimas
      Iškart po numarinimo, iš gyvūnų išimami kaulų čiulpai, pamerkiami į hipotoninį tirpalą ir fiksuojami. Vėliau kaulų čiulpų ląstelės išsklaidomos ant skaidrių ir nudažomos.
      1.5.7   Analizė
      Išanalizuojama mažiausiai 100 vieno gyvūno ląstelių (mažiausiai 500 vienos grupės metafazių). Šis skaičius gali būti sumažinamas, jei stebima daug chromosomų aberacijų. Visi tepinėliai (įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius mėginius) turi būti užkoduojami nepriklausomai vienas nuo kito tam, kad būtų galima juos ištirti mikroskopu. Kadangi dažnai ruošiant skaidres, suardoma metafazėje esančios ląstelės bei prarandamos chromosomos, tai vėliau suskaičiuotos ląstelės turi turėti tokį centromerų skaičių, kuris būtų lygus 2 n ± 2.
      2.   DUOMENYS
      2.1   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Kiekvieno gyvūno tyrimų rezultatai turi būti pateikiami lentelėse. Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Turi būti nustatytas kiekvieno gyvūno ląstelių, turinčių struktūrines aberacijas ir chromosomų aberacijų vienoje ląstelėje skaičius. Turi būti išvardinti skirtingi chromosomų struktūrinių aberacijų tipai, nurodant jų skaičių bei pasireiškimo dažnį gyvūnų, paveiktų ir nepaveiktų tiriamąja chemine medžiaga, grupėse. Atskirai registruojama bei pranešama apie plyšių pasireiškimą, tačiau bendru atveju jie neįskaitomi, kai nustatomas absoliutinis aberacijų pasireiškimo dažnis.
      Jei stebima tiek mitozė, tiek ir mejozė, tai turi būti nustatytas spermatogonijų mitozių I ir II mejozinės metafazės metu santykis, naudojamas kaip citotoksiškumo matas paimant bendrą mėginį (turintį 100 vieno gyvūno ląstelių) iš visų tirtų bei neigiamų kontrolinių gyvūnų tam, kad būtų nustatytas galimas citotoksinis efektas. Jeigu stebima tik mitozė, tai kiekvieno gyvūno atveju, imant mažiausiai 1 000 ląstelių, nustatomas jų mitozinis indeksas.
      2.2   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS
      Teigiamą rezultatą galima įvertinti keletu kriterijų, tokiais kaip nuo dozės priklausomas ląstelių su chromosominėmis aberacijomis skaičiaus padidėjimas arba akivaizdus ląstelių, turinčių aberacijas ir priklausančių pavienės dozės grupei pagal vienkartinį mėginio paėmimo laiką, skaičiaus padidėjimas. Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Įvertinant tyrimo metu gautus rezultatus, galima pasinaudoti statistiniais metodais 8. Statistinis reikšmingumas turėtų būti vienintelis faktorius, apsprendžiantis teigiamą atsaką. Abejotini rezultatai turėtų būti išaiškinti, toliau tęsiant tyrimą ir pirmiausia pakeičiant eksperimentines sąlygas.
      Jei tiriant medžiagą, gaunami rezultatai, neatitinkantys aukščiau išvardintų kriterijų, ši tiriamoji medžiaga laikoma nemutageniška.
      Nors daugumos eksperimentų metu buvo gauti aiškiai teigiami ar neigiami rezultatai, išimtiniais atvejais gautų rezultatų rinkinys neleis padaryti teisingos išvados apie tiriamosios medžiagos aktyvumą. Rezultatai gali likti abejotini ar neaiškūs, nepriklausomai nuo atliktų eksperimentų skaičiaus.
      Tiriant chromosomų aberacijas in vitro, gauti teigiami rezultatai rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia chromosomų aberacijas tirtos gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse. Neigiami rezultatai rodo, esant tyrimo sąlygoms, tiriamoji medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų tirtos gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse.
      Reikia aptarti tą galimybę, ar tiriamoji medžiaga ar jos metabolitai pasieks bendrąją cirkuliaciją ar specifiniu būdu tą audinį, į kurį jie yra nukreipti (pavyzdžiui, sisteminio toksiškumo atveju).
      3.   ATASKAITA
      TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                   
               
               
                  Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys:
                  
                              —
                           
                           
                              priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tiriamieji gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              panaudota rūšis ar kamienas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius ir amžius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šaltinis, laikymo sąlygos, maitinimas ir pan.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno svoris prieš pradedant tyrimą ir kiekvienos grupės svorio riba, vidurkiai bei standartinis nukrypimas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tyrimo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              ribų paieškos tyrimo, jei jis buvo vykdomas, duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pagrindinė priežastis, nulėmusi dozės dydžio pasirinkimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pagrindinė priežastis, nulėmusi davimo būdo pasirinkimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios medžiagos paruošimo apibūdinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios medžiagos davimo būdo apibūdinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pagrindinė priežastis, nulėmusi numarinimo laiko pasirinkimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios cheminės medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (pm) pervertimas į tikrąją dozę (mg/kūno masės kg/dienai), jei tai įmanoma,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie pašarų ir geriamojo vandens kokybę,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              veikimo tiriamąja medžiaga ir mėginio paėmimo tvarkaraščio detalus aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodai toksiškumui įvertinti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metafazę sustabdančios medžiagos prigimtis, jos koncentracija bei veikimo ja trukmė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              skaidrių paruošimo metodai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aberacijų įvertinimo kriterijai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių, kurios buvo išskirtos iš vieno gyvūno bei išanalizuotos, skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teigiamų, neigiamų ar abejotinų rezultatų nustatymo kriterijai.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              toksiškumo požymiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mitozinis indeksas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              I ir II mejozinėse metafazėse esančių ląstelių spermatogoninių mitozių santykis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno ląstelių chromosomų aberacijų tipas ir skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              absoliutus aberacijų vienoje grupėje skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vienos grupės ląstelių, turinčių aberacijas, skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinės analizės, jei bet kokios buvo atliktos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie vienu metu naudotas neigiamas kontroles,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              anksčiau gauti duomenys apie neigiamus kontrolinius mėginius, nurodant intervalus, vidurkius bei standartinius nukrypimus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie vienu metu naudotus teigiamus kontrolinius mėginius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ploidiškumo pasikeitimai, jei buvo tokie stebimi.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C, Lambert, B. and Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, p. 477–484.
               
            
                  2)
               
               
                  Adler, I.D., (1984). Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J.M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, p. 275–306.
               
            
                  3)
               
               
                  Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E., (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, p. 289–294.
               
            
                  4)
               
               
                  Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetic Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115–141.
               
            
                  5)
               
               
                  Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, p. 207–209.
               
            
                  6)
               
               
                  Adler, I.D., Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, p. 313–318.
               
            
                  7)
               
               
                  Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G, Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, p. 313–319.
               
            
                  8)
               
               
                  Loveli, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184–232.
               
            B.24.   PELIŲ TAŠKINIS TESTAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Šis testas atliekamas naudojant peles, kuriose besivystantys embrionai yra veikiami cheminėmis medžiagomis. Šios medžiagos veikia besivystančių embrionų ląsteles -melanoblastus, kuriuose lokalizuoti genai, kontroliuojantys kailio plaukų spalvą. Besivystantys embrionai yra heterozigotiški pagal daugelį genų, apsprendžiančių kailio spalvą. Įvykus mutacijai melanoblasto tokio geno dominantiniame alelyje arba šį alelį praradus (dėl daugelio genetinių įvykių), iš melanoblasto atsirandančios ląstelės palikuonės įgyja recesyvų fenotipą ir dėl to pelių palikuonių kailyje atsiranda skirtingos spalvos taškai. Nustatomas palikuonių, turinčių tokius taškus, bei juos sukeliančių skaičius bei mutacijų dažnis ir palyginama su palikuonių, kilusių iš embrionų tik tirpikliu, taškų bei juos sukėlusių mutacijų skaičiumi ir dažniu. Pelių taškų tyrimo testo metu nustatomos spėjamos gemalinių ląstelių somatinės mutacijos.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      Pasiruošimas tyrimui
      Jei įmanoma, tiriamosios medžiagos turėtų būti ištirpintos ar suspenduotos izotoniniame druskų tirpale. Vandenyje netirpios cheminės medžiagos turi būti ištirpintos ar suspenduotos panaudojus atitinkamas priemones. Naudojama priemonė neturi trukdyti nei tiriamajai cheminei medžiagai veikti, nei toksiniams efektams pasireikšti. Reikėtų naudoti šviežiai paruoštus tiriamosios cheminės medžiagos preparatus.
      
         Eksperimentiniai gyvūnai
      
      T kamieno (nonagouti, a/a; šinšilės, violetinių akių, cch p/cch p; rudos, b/b; atmieštos spalvos, trumpų ausų, d se/d se; margas taškuotumas, s/s) pelės yra poruojamos arba su HT kamieno (blyškios, nonagouti, trumpų kojų, pa a bp/pa a bp; labai tankaus kailio ln fz/ln fz; perlų spalvos pe/pe) arba su C57 BL (nonagouti, a/a) pelėmis. Taip pat galima poruoti kamienų NMRI (nonagouti, a/a; albinosai, c/c) ir DBA (nonagouti, a/a; rudos, b/b; atmieštos spalvos d/d) peles tam, kad jų palikuonys turėtų nonagouti tipo mutaciją.
      
         Skaičius ir lytis
      
      Pakankamai nėščios patelės veikiamos kiekviena tiriamosios medžiagos doze tam, kad kiekvienu atveju jos atsivestų pakankamai palikuonių. Paimant atitinkamo dydžio mėginį, atsižvelgiama į pelių, paveiktų tiriamąja medžiaga, kailio taškuotumą bei kontrolinių duomenų gausą. Neigiamas rezultatas laikomas priimtinu, jei buvo įvertinta mažiausiai 300 palikuonių, kuriuos atsivedė patelės, paveiktos tiriamąja medžiaga.
      
         Teigiamų ir neigiamų kontrolių naudojimas
      
      Turi būti gaunami kontroliniai duomenys, vienu metu ištyrus peles, paveiktas tik tirpinimui naudojama priemone (neigiamomis kontrolėmis). Anksčiau toje pačioje laboratorijoje atliktų tyrimų kontroliniai duomenys irgi gali būti surenkami, kad būtų užtikrintas duomenų vientisumas ir padidėtų testo jautrumas. Jei buvo nustatyta, kad tiriamoji cheminė medžiaga nėra mutageniška, toje pačioje laboratorijoje turi būti atliekamas testas su mutageniška tiriamąja medžiaga ir gaunami teigiamų kontrolių tyrimo duomenys.
      
         Davimo būdas
      
      Paprastai tiriamoji medžiaga duodama nėščioms patelėms per vamzdelį, įvestą į trachėją arba infekuojant į pilvą.
      
         Veikimo dozė
      
      Naudojamos tris veikimo dozes, iš kurių viena sukelia toksiškumo požymius arba sumažina vados dydį. Naudojant netoksines chemines medžiagas, reikėtų duoti pačią didžiausią dozę, kuri praktiškai įmanoma.
      Procedūra
      Pavienis veikimas tiriamąja medžiaga įprastai atliekamas 8, 9 ar 10 nėštumo dieną, skaičiuojant nuo 1 dienos, kuri laikoma ta diena, kai makšties kamštis buvo pastebėtas pirmąsyk. Šios dienos atitinka 7,25, 8,25 ir 9,25 dienas, praėjusias nuo apvaisinimo. Tomis dienomis galima sėkmingai atlikti veikimus tiriamosiomis medžiagomis.
      
         Analizė
      
      Palikuonys yra užkoduojami ir, praėjus 3-4 savaitėms po gimimo, įvertinami pagal taškus. Skiriamos trys taškų klasės:
      
                  a)
               
               
                  baltos spalvos 5 mm diametro taškai, išsidėstę pilvo dalyje ir tikriausiai atsiradę dėl ląstelių žūties (BVPT);
               
            
                  b)
               
               
                  geltonos spalvos, panašūs į agouti taškai, stebimi krūties, lytinių liaukų, viršugalvio ašinėje ir kirkšninėje srityse, kurie, kaip manoma, atsirado dėl sutrikusios ląstelių diferenciacijos (SDT);
               
            
                  c)
               
               
                  pigmentuoti ir baltos spalvos taškai, išsimėtę kailyje ir, manoma, kad tai susiję su somatinėmis mutacijomis (SMT).
               
            Visos trys taškų klasės, išskyrus paskutiniąją, įvertinamos pagal genetinę reikšmę. Problemos, atsirandančios dėl taškų, atsirandančių, sutrikus ląstelių diferenciacijai, ar somatinių mutacijų, atskyrimo išsprendžiamos, atlikus kailio mėginių fluorescencinę analizę.
      Reikėtų registruoti akivaizdžias pagrindines morfologines anomalijas, pasireiškiančias palikuonių tarpe.
      2.   DUOMENYS
      Pateikiant duomenis, reikėtų nurodyti ištirtus palikuonius bei pateikti gyvūnų, turinčių vieną ar daugiau spėjamų somatinių mutacijų, skaičių. Paveiktų ir neigiamų kontrolinių grupių tyrimų duomenys turėtų būti palyginti atitinkamais metodais. Duomenys pateikiami, atsižvelgiant į kiekvieną vadą.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  poravimui panaudoti kamienai,
               
            
                  —
               
               
                  tiriamoje bei kontrolinėse grupėse esančių nėščių patelių skaičius,
               
            
                  —
               
               
                  vidutinis vados dydis tiriamojoje bei kontrolinėje grupėse gimimo bei atjunkymo metu,
               
            
                  —
               
               
                  tiriamosios cheminės medžiagos dozės,
               
            
                  —
               
               
                  metodas, kuriuo nustatoma, kad suporavimas įvyko,
               
            
                  —
               
               
                  panaudotas tirpiklis, – nėštumo diena, kurią buvo pradėtas veikimas tiriamąja medžiaga,
               
            
                  —
               
               
                  veikimo būdas,
               
            
                  —
               
               
                  absoliutus įvertintų palikuonių ir tiriamojoje bei kontrolinėje grupėse esančių BVPT, SMT ir SPT skaičius,
               
            
                  —
               
               
                  pagrindinės morfologinės anomalijos,
               
            
                  —
               
               
                  jei įmanoma, dozės ir atsako sąsaja SPT tyrimo atveju,
               
            
                  —
               
               
                  statistinis įvertinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų interpretavimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.25.   PELIŲ PAVELDĖTA TRANSLOKACIJA
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Tiriant paveldimą translokaciją pelėse, nustatomi žinduolių embrioninių ląstelių chromosomų struktūriniai bei skaičiaus pokyčiai, kurie išnyksta pirmos kartos palikuonyse. Nustatomi tokie chromosomų pokyčiai: atvirkštinės translokacijos ir X-chromosomos praradimas tuo atveju, jei tiriamos palikuonių patelės. Gyvūnų, turinčių translokacijas bei XO-patelių vaisingumas yra sumažėjęs ir pagal tai atrenkami F1 palikuonys, kurie bus naudojami citogenetinei analizei. Visiškas sterilumas stebimas konkrečių translokacijų atveju (X-autosoma ir c-t tipas). Atliekant citogenetinę analizę, translokacijos nustatomos arba F1 patinuose arba F1 patelių vyriškos lyties palikuonių ląstelėse, besidalijančiose mejozės būdu, ląstelėms esant diakinezės-I metafazės stadijoje. Atliekant citogenetinę analizę, XO-patelės nustatomos tik pagal kaulų čiulpų ląsteles, besidalijančias mitozės būdu ir turinčias tik 39 chromosomas.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      Pasiruošimas tyrimui
      Tiriamosios medžiagos ištirpinamos izotoniniame druskų tirpale. Vandenyje netirpios cheminės medžiagos ištirpinamos ar suspenduojamos, panaudojus atitinkamas priemones. Naudojami šviežiai paruošti tiriamosios cheminės medžiagos tirpalai. Jei priemonė duodama kartu su tiriamosios medžiagos doze, tai ji neturi trukdyti nei tiriamajai cheminei medžiagai veikti, nei toksiniams efektams pasireikšti.
      
         Davimo būdas
      
      Paprastai tiriamoji medžiaga duodama per os, į trachėją įvedamu vamzdeliu arba injekuojant tiriamąją medžiagą į pilvą. Medžiagą galima duoti ir kitais būdais.
      
         Eksperimentiniai gyvūnai
      
      Tam, kad palengvėtų kryžminimas bei citologinis patvirtinimas, šie eksperimentai atliekami su pelėmis. Specifinis pelių kamienas nėra būtinas. Tačiau vienam kamienui priklausančių gyvūnų vadoje vidutiniškai bei pastoviai turėtų būti daugiau nei aštuoni palikuonys.
      Naudojami sveiki lytiškai subrendę gyvūnai.
      
         Gyvūnų skaičius
      
      Gyvūnų, būtinų tyrimui atlikti, skaičius priklauso nuo spontaninės translokacijos dažnio bei mažiausio translokacijos sukėlimo greičio, kuris būtinas tam, kad būtų gaunamas teigiamas rezultatas.
      Testas paprastai atliekamas analizuojant patinų F1 palikuonis. Tiriant gyvūnų, kuriems buvo duota konkreti tiriamosios medžiagos dozė, grupę, reikėtų išanalizuoti mažiausiai 500 patinų F1 palikuonis. Jei tiriami patelių F1 palikuonys, tyrimui atlikti reikia po 300 patinų bei patelių.
      
         Teigiamų ir neigiamų kontrolių naudojimas
      
      Reikėtų remtis atitinkamais kontroliniais duomenimis, gautais atliekant tyrimą ir vienu metu naudojant kontroles bei anksčiau atliktų tyrimų metu naudotas kontroles. Kai galima susipažinti su toje pačioje laboratorijoje ką tik atliktų eksperimentų, naudojant teigiamas kontroles, gautais patenkinamais rezultatais, šiuos rezultatus galima naudoti vietoj teigiamos kontrolės, naudojamos tuo pačiu metu.
      
         Veikimo dozė
      
      Tyrimo metu paprastai naudojama pavienė ir pati didžiausia dozė, sukelianti silpniausiai pasireiškiančius toksinius efektus, tačiau neįtakojanti elgsenos dauginimosi metu ar išgyvenimo. Siekiant nustatyti dozės ir atsako sąsają, reikėtų panaudoti dvi nedideles papildomas dozes. Netoksinių cheminių medžiagų atveju reikėtų naudoti pačią didžiausią dozę.
      Procedūra
      
         Veikimas ir poravimas
      
      Veikti tiriamąja medžiaga galima dvejopai. Dažniausiai tiriamoji medžiaga duodama vienąkart. Taipogi medžiagą galima duoti 35 dienų laikotarpiu, septynias dienas per savaitę. Pasibaigus veikimui, atliekami poravimai pagal tvarkaraštį ir reikėtų užtikrinti, kad buvo paimti visų brendimo stadijų paveiktų embrioninių ląstelių mėginiai. Baigiantis poravimui, patinai ir patelės atskiriami ir patalpinami į atskirus narvelius. Kai patelės atsiveda jauniklius, registruojamas palikuonių gimimo data, vados dydis bei palikuonių lytis. Visi vyriškos lyties palikuonys atjunkomi, o visi moteriškos lyties palikuonys pašalinami nepaisant to, kad jie naudojami eksperimento metu.
      
         Translokacijos heterozigotiškumo tyrimas
      
      Galima naudotis vienu iš dviejų galimų metodų:
      
                  —
               
               
                  F1 palikuonių vaisingumo tyrimas ir gyvūnų, kurie gali turėti translokacijas, identifikavimas citogenetinės analizės būdu,
               
            
                  —
               
               
                  visų F1 vyriškos lyties palikuonių citogenetinė analizė, neatrenkant jų iš anksto pagal vaisingumą.
               
            
                  a)
               
               
                  Vaisingumo tyrimas
                  Sumažėjęs F1 gyvūno vaisingumas gali būti nustatomas, stebint vados gausą ir (ar) analizuojant patelių, kurios buvo naudojamos poravimui, gimdos turinį.
                  Atsižvelgiant į naudojamą pelių kamieną, reikia pasirinkti kriterijus, pagal kuriuos bus sprendžiama apie normalų ir sumažėjusį vaisingumą.
                  Vados dydžio stebėjimas: Tiriami F1 patinai yra laikomi atskirai arba nuo tame pačiame eksperimente naudojamų arba nuo visos pelių kolonijos patelių. Narvai stebimi kasdien, pradedant nuo 18 dienos, praėjusios po suporavimo. Patelėms atsivedus F2 palikuonis, užregistruojamas vados dydis bei palikuonių, kurie po to pašalinami, lytis. Jei tiriami moteriškos lyties F1 palikuonys, tai mažos F2 vados bus tiriamos vėliau. Translokacijas turinčios patelės identifikuojamos, atliekant translokacijos citogenetinę analizę, naudojant bet kurį jų vyriškos lyties palikuonį. XO patelės identifikuojamos pagal lyčių santykio jų palikuonių tarpe pokyčius – 1:1 (patinai/patelės) —→ 1:2 (patinai/patelės). Vėliau normalūs F1 gyvūnai toliau nebetiriami, jei F2 vados dydis pasiekia arba peržengia iš anksto nustatytą normalią ribą, priešingu atveju stebimos antroji bei trečioji F2 vados.
                  F1 gyvūnų, kurių negalima laikyti normaliais, baigus net trijų F2 vadų stebėjimus, atveju reikia arba tirti patelių, kurios buvo poruojamos su patinais, gimdos turinį arba reikia iškart pradėti gyvūnų citogenetinę analizę.
                  Gimdos turinio analizė: Translokacijas turinčių gyvūnų vados dydis sumažėja dėl embrionų žūties, todėl daug žuvusių implantų parodo, kad tiriamieji gyvūnai turi translokacijas. Kiekvienas F1 patinas, kuris bus tiriamas, suporuojamas su 2–3 patelėmis. Apvaisinimas nustatomas kiekvienos dienos rytą ieškant makšties kamščio susidarymo. Praėjus 14–16 dienų po apvaisinimo patelės numarinamos ir užregistruojami gyvi bei žuvę implantai, esantys gimdoje.
               
            
                  b)
               
               
                  Citogenetinė analizė
                  Sėklidės paruošiamos, išdžiovinant jas ore. Gyvūnai, turintys translokacijas, identifikuojami pagal pirminių spermatocitų, esančių mejozės diakinezės-I metafazės stadijoje, multivalentinių chromosomų konfigūracijas. Nustačius šiuos multivalentinius darinius mažiausiai dviejose ląstelėse, galima teigti, kad tiriamasis gyvūnas turi translokacijas.
                  Jei nebuvo vykdoma atranka pagal kryžminimus, tai visi F1 patinai tiriami citogenetiniu aspektu. Reikia mikroskopiškai ištirti mažiausiai 25 vieno patino ląsteles, esančias diakinezės-I metafazės stadijoje. Jei įtariama, kad F1 patinuose, turinčiuose menkas sėklides bei F1 XO patelėse mejozė nutraukiama, prieš prasidedant diakinezei, reikia ištirti šių patinų spermatogonijų arba kaulų čiulpų ląstelių bei patelių kaulų čiulpų ląstelių mitozines metafazines chromosomas. Mažiausiai dešimtyje ištirtų ląstelių nustatytos neįprastai ilgos ar trumpos chromosomos parodo, kad vienas ar kitas patinas yra sterilus pagal chromosomų translokacijas (c-t tipas). Kai kurios X-autosomų translokacijos, apsprendžiančios patinų sterilumą, gali būti nustatomos tiktai atliekant mitozinių chromosomų juostų elektroforezinę analizę. Jei tirtos patelės atveju bent 10 mitozės atvejų užregistruojamos 39 chromosomos, tokia patelė laikoma XO.
               
            2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse.
      Atliekant kiekvieną poravimą, registruojamas vidutinis vados dydis bei lyčių santykis, pradedant nuo tėvų poravimo ir baigiant palikuonių gimimu bei jų atjunkymu.
      Įvertinant F1 gyvūnų vaisingumą, pateikiamas vidutinis vados dydis normalių poravimų atveju bei atskirų F1 gyvūnų, turinčių translokacijas, vadų dydžiai. Tiriant gimdos turinį, pateikiamas vidutinis gyvų bei žuvusių implantų skaičius normalių poravimų atveju ir atskirų F1 gyvūnų, turinčių translokacijas, gyvų bei žuvusių transplantų skaičius kiekvieno poravimo atveju.
      Atliekant ląstelių, esančių diakinezės-I metafazės stadijoje, citogenetinę analizę, nurodomas multivalentinių chromosomų konfigūracijų tipų kiekis bei absoliutus ląstelių, naudotų, tiriant kiekvieną translokacijas turintį gyvūną, absoliutų skaičių.
      Tiriant sterilius F1 gyvūnus, pateikiamas absoliutus poravimų skaičius bei poravimo periodo trukmė. Nurodomi sėklidžių svoriai bei citogenetinės analizės duomenys.
      Tiriant XO pateles, nurodomas vidutinis vados dydis, lyčių santykis F2 palikuonių tarpe bei citogenetinės analizės duomenys.
      Jei numanomi F1 gyvūnai, turintys translokacijas, tiriami pagal vaisingumą, taip atrenkant juos iš anksto, pateikiamos lentelės, kuriose nurodoma, kiek iš tų F1 gyvūnų yra heterozigotų pagal translokacijas.
      Pateikiami eksperimentų, kurių metu naudojamos teigiamos bei neigiamos kontrolės, duomenys.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  pelių kamienas, gyvūnų amžius, gyvūnų, paveiktų tiriamąja medžiaga, kūno masė,
               
            
                  —
               
               
                  kiekvienos lyties tėvinių gyvūnų skaičius tiriamojoje bei kontrolinėje grupėse,
               
            
                  —
               
               
                  tyrimo sąlygos, detalus veikimo aprašymas, dozės, tirpikliai, suporavimo tvarkaraštis,
               
            
                  —
               
               
                  kiekvienos patelės atsivestų palikuonių skaičius bei lytis, palikuonių, užaugintų translokacijos tyrimams, skaičius bei lytis,
               
            
                  —
               
               
                  translokacijos tyrimo laikas bei kriterijai,
               
            
                  —
               
               
                  gyvūnų, turinčių translokacijas, detalus apibudinimas bei jų skaičius, įskaitant kryžminimo duomenis bei gimdos turinio analizės rezultatus, jei reikia,
               
            
                  —
               
               
                  citogenetinės procedūros ir mikroskopinės analizės apibūdinimas, pageidautina, pateikiant schemas,
               
            
                  —
               
               
                  statistinis įvertinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų interpretavimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.26.   SUBCHRONIŠKO ORALINIO TOKSIŠKUMO BANDYMAS 90 PARŲ KARTOTINĖS DOZĖS TYRIMAS SU GRAUŽIKAIS ORALINIAM TOKSIŠKUMUI NUSTATYTI
      1.   METODAS
      Šis subchroniško oralinio toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 408 (1998) kopija.
      1.1.   ĮVADAS
      Vertinant ir nustatant cheminių medžiagų toksiškumo charakteristikas, kartotinės dozės subchroniškas oralinis toksiškumas gali būti nustatomas gavus pradinę informaciją ūmaus ar 28 parų kartotinės dozės toksiškumo bandymais. 90 parų tyrimas suteikia informacijos apie galimus pavojus sveikatai, galinčius kilti po kartotinio veikimo ilgą laikotarpį, trunkantį nuo atjunkymo iki visiško subrendimo. Tyrimas suteiks informacijos apie svarbesnius toksiškumo poveikius, nurodys veikiamus organus ir kaupimosi galimybę, ir bus galima gauti nestebimo neigiamo poveikio lygio įvertį, kuris gali būti naudojamas dozių lygiui chroniško toksiškumo tyrimams pasirinkti ir žmonių saugos kriterijams nustatyti.
      Metodas papildomai išskiria neurologinio poveikio paskutiniąsias grandis ir nurodo imunologinės bei reprodukcijos sistemos poveikių požymius. Taip pat pabrėžiamas gyvūnų kruopščių klinikinių stebėjimų būtinumas, kad būtų gauta kuo daugiau informacijos. Šis tyrimas turėtų leisti identifikuoti chemines medžiagas, galinčias sukelti neurotoksiškumo, imunologinius ar reprodukcijos organų poveikius, o tai būtų pagrindas toliau tęsti nuodugnius tyrimus.
      Taip pat žr. B dalies bendrąjį įvadą.
      1.2.   SĄVOKOS
      
         Dozė – paskirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama mase (g, mg) ar bandomosios medžiagos mase bandymų gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg), ar pastovia koncentracija maiste (ppm).
      
         Dozavimas – yra bendras terminas, apimantis dozės dydį, jos dažnį ir dozavimo trukmę.
      
         NOAEL – termino „nestebimo neigiamo poveikio lygis“ (No observed adverse effect level) santrumpa, tai yra didžiausia dozė, kai neigiamas apdorojimo poveikis nepastebimas.
      1.3.   BANDYMO METODO ESMĖ
      Kasdien kelioms bandymų gyvūnų grupėms per burną duodamos skirtingos bandomosios medžiagos dozės, vienai grupei 90 parų laikotarpiu duodama vieno lygio dozė. Dozės davimo laikotarpiu gyvūnai yra atidžiai stebimi ieškant toksiškumo požymių. Darant bandymą nugaišę ar nužudyti gyvūnai skrodžiami, baigus bandymą išlikę gyvūnai taip pat nužudomi ir skrodžiami.
      1.4.   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.4.1.   Gyvūnų ruošimas
      Turi būti imami sveiki gyvūnai, bent penkias paras aklimatizuoti laboratorijos sąlygomis ir dar nenaudoti kitiems bandymams. Apibūdinant bandymų gyvūnus nurodoma rūšis, veislė, šaltinis, lytis, masė ir (ar) amžius. Gyvūnai į kontrolines ir apdorojimo grupes turi būti paskirstomi atsitiktinai. Narveliai turi būti išdėstomi taip, kad kuo mažiau pasireikštų pastatymo vietos įtaka. Kiekvienam gyvūnui turi būti paskirtas tik vienas identifikacijos numeris.
      1.4.2.   Dozių ruošimas
      Bandomoji medžiaga duodama pro zondą arba su maistu ar geriamuoju vandeniu. Dozės davimo per burną būdas priklauso nuo tyrimo tikslo ir bandomosios medžiagos fizikocheminių savybių.
      Jei būtina, bandomajai medžiagai ištirpdyti arba suspenduoti naudojamas atitinkamas nešiklis. Rekomenduojama kiekvieną kartą, jei tik leidžia sąlygos, iš pradžių bandyti paruošti vandeninius tirpalus/suspensijas, toliau tirpalą/emulsiją aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet nagrinėti kokius kitus nešiklius naudoti. Turi būti žinomos visų nešiklių, išskyrus vandenį, toksiškumo charakteristikos. Turi būti nustatytas bandomosios medžiagos stabilumas dozės davimo sąlygomis.
      1.4.3.   Bandymo sąlygos
      1.4.3.1.   Bandomieji gyvūnai
      Geriau tinka žiurkės, tačiau galima naudoti ir kitus graužikus, pvz., peles. Reikėtų naudoti gerai žinomų laboratorinių veislių jaunus suaugusius gyvūnus. Patelės turi būti dar be vados ir neapvaisintos. Duoti medžiagą reikėtų pradėti kuo anksčiau po atjunkymo, tačiau visuomet iki gyvūnui sukanka devynios savaitės. Gyvūnų masės kitimas prieš tyrimo pradžią turi būti kuo mažesnis ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties vidutinės masės. Jei tai yra pradinis tyrimas prieš ilgalaikį chroniško toksiškumo tyrimą, abiem tyrimams turi būti naudojami tos pačios veislės ir to paties šaltinio gyvūnai.
      1.4.3.2.   Skaičius ir lytis
      Kiekvienai dozei turi būti naudojama bent 20 gyvūnų (10 patelių ir 10 patinų). Jei planuojami tarpiniai skrodimai, gyvūnų skaičius turi būti padidintas tiek, kiek jų numatyta nužudyti iki bandymo pabaigos Remiantis ankstesnėmis žiniomis apie cheminę medžiagą ar labai panašių savybių medžiagą, galima numatyti į kontrolinio bandymo ir į didžiausios dozės grupę papildomai įtraukti pagalbinę 10 gyvūnų grupę (po penkis kiekvienos lyties), kad pasibaigus apdorojimo laikotarpiui galima būtų stebėti visų toksiškumo poveikių grįžtamumą ar išlikimą. Šio laikotarpio po apdorojimo trukmė turėtų būti atitinkamai nustatyta atsižvelgiant į stebimus poveikius.
      1.4.3.3.   Dozės
      Naudojamos bent trijų lygių dozės ir vienas lygiagretus kontrolinis bandinys, išskyrus atvejus, kai daromas ribinis bandymas (žr. 1.4.3.4). Dozių lygiai gali būti pagrįsti kartotinių dozių ar diapazono nustatymo tyrimų rezultatais ir turi būti atsižvelgta į visus esamus toksikologinius ir toksikokinetinius duomenis apie bandomąją medžiagą ar giminingas medžiagas. Jei bandomosios medžiagos fizikocheminis pobūdis ar biologinis poveikis dozės neriboja, didžiausia dozė turi būti pasirinkta tokia, kad gyvūnui būtų sukeltas tik toksiškumo poveikis, bet jis nežūtų ar nepatirtų didelių kančių. Mažėjančių dozių eilutė turi būti pasirinkta taip, kad būtų parodytas bet koks dozės sukeltas atsakas, o esant mažiausiam dozės lygiui – nestebimo neigiamo poveikio lygis (NOAEL). Mažėjančių dozių lygiams nustatyti paprastai yra optimalus dvigubas keturgubas tarpas, ir dažnai vietoj didelių tarpų tarp dozių (pvz., kai skirtumas tarp jų yra 6–10 kartų) geriau naudoti papildomą ketvirtą bandymų grupę.
      Kontrolinę grupę sudaro neapdorotų gyvūnų grupė arba nešiklį gaunanti kontrolinė grupė, jei bandomajai medžiagai duoti naudojamas nešiklis. Išskyrus apdorojimą bandomąja medžiaga, su kontrolinės grupės gyvūnais turi būti elgiamasi lygiai taip, kaip su bandymų grupių gyvūnais. Naudojant nešiklį, kontrolinės grupės gyvūnai gauna didžiausią nešiklio tūrį. Jei bandomoji medžiaga duodama su maistu ir dėl to pasireiškia maisto vartojimo mažėjimas, gali būti naudinga turėti lygiagrečiai maitinamą kontrolinę grupę, kad būtų galima nustatyti, ar vartojimo sumažėjimas yra dėl apetito stokos ar dėl toksikologinių pokyčių pagal bandymo modelį.
      Tam tikrais atvejais reikėtų atkreipti dėmesį į šias nešiklio ir kitų priedų charakteristikas: poveikius bandomosios medžiagos absorbcijai, pasiskirstymui, metabolizmui ar sulaikymui; poveikius bandomosios medžiagos cheminėms savybėms, galintiems pakeisti jos toksiškumo charakteristikas; ir poveikius maisto ar vandens vartojimui ar gyvūnų mitybos būsenai.
      1.4.3.4.   Ribinis bandymas
      Jei, taikant šiam tyrimui aprašytas metodikas, vienos dozės, atitinkančios bent 1 000 mg/kg kūno masės/parai, bandymas nesukelia jokio pastebimo neigiamo poveikio ir jei toksiškumo poveikio nelaukiama pagal struktūriškai giminingų medžiagų duomenis, visas trijų lygių dozės tyrimas gali būti laikomas nebūtinu. Ribinis bandymas taikomas, išskyrus atvejus, kai žmonių veikimas rodo, kad reikia naudoti didesnio lygio dozę.
      1.5.   BANDYMO EIGA
      1.5.1.   Dozių davimas
      Bandomosios medžiagos dozė 90 parų laikotarpiu gyvūnams duodama kasdien visas septynias dienas per savaitę. Bet kurį kitą režimą, pvz., penkių dienų per savaitę, reikia pagrįsti. Kai bandomoji medžiaga duodama pro zondą, gyvūnams turėtų būti duodama tik viena dozė naudojant skrandžio zondą ar tinkamą intubacinį vamzdelį. Didžiausias gyvūnui duodamas vienkartinis skysčio tūris priklauso nuo bandymų gyvūno dydžio. Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti po 2 ml/100 g kūno masės. Išskyrus dirginančias ar ėsdinančias medžiagas, kurios būdamos didesnės koncentracijos paprastai sukels dirginančius poveikius, bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas keičiant koncentraciją taip, kad visų dozių tūris būtų pastovus.
      Jei medžiagos duodamos su maistu ar geriamuoju vandeniu, svarbu garantuoti, kad naudojami bandomosios medžiagos kiekiai netrikdytų normalaus mitybos režimo ar vandens balanso. Bandomąją medžiagą duodant su maistu, galima naudoti pastovią koncentraciją maiste (ppm) ar pastovią dozę pagal gyvūno kūno masę; naudota alternatyva turi būti nurodyta. Medžiagą įleidžiant pro zondą, dozė turėtų būti duodama kasdien panašiu laiku ir prireikus pakoreguota pastoviam dozės lygiui pagal gyvūno kūno masę palaikyti. Jei 90 parų tyrimas daromas kaip pradinis prieš ilgalaikį chroniško toksiškumo tyrimą, abiem tyrimams turi būti vartojamas panašus maistas.
      1.5.2.   Stebėjimai
      Stebėjimo trukmė turi būti ne mažesnė kaip 90 parų. Pagalbinės grupės gyvūnai, skirti paskesniems stebėjimams, atitinkamą laiką turi būti niekaip neapdorojami, kad būtų galima konstatuoti toksiškumo poveikių išlikimą ar atsigavimą po jų.
      Bendras klinikinis tyrimas turi būti daromas bent kartą per dieną, geriau kasdien tuo pačiu laiku atsižvelgiant į intensyviausią laukiamo poveikio pasireiškimo laiką po medžiagos davimo. Turi būti registruojama gyvūnų klinikinė būsena. Bent du kartus per dieną, paprastai kiekvienos dienos rytą ir vakare, visi gyvūnai apžiūrimi ieškant liguistumo ir gaištamumo požymių.
      Bent vieną kartą prieš pirmąjį veikimą (kad būtų galima daryti palyginimus pačiam gyvūnui) ir kartą per savaitę po to visiems gyvūnams turi būti daromi išsamūs klinikiniai tyrimai. Šie tyrimai turi būti daromi ne pačiame gyvūno narvelyje, o geriau standartiškai įrengtoje vietoje ir kiekvieną kartą panašiu laiku. Jie turi būti kruopščiai registruojami, tam geriau būtų naudoti bandymų laboratorijos tiksliai apibrėžtą kiekybinio įvertinimo sistemą. Turi būti imamasi priemonių, garantuojančių kuo mažesnį stebėjimo sąlygų kitimą. Pastebėti simptomai turi apimti, jais neapsiribojant, odos, kailio, akių, gleivinių, sekrecijų ir ekskrecijų dažnį ir autonominį aktyvumą (pvz., ašarojimą, drebulį, vyzdžių dydį, neįprastą kvėpavimą). Taip pat turi būti registruojami eisenos pokyčiai, laikysena ir reakcija į tvarkymą, kloniniai ar toniniai judesiai, stereotipai (pvz., per dažnas kūno prisižiūrėjimas, nuolatinis sukimasis ratu) ar keistas elgesys (pvz., savęs žalojimas, vaikščiojimas atbulomis) (1).
      Prieš pradedant duoti bandomąją medžiagą ir baigiant tyrimą turi būti daromas, pageidautina visų, bet jei neįmanoma, tai bent didžiausios dozės ir kontrolinės grupių gyvūnų oftalmologinis tyrimas naudojant oftalmoskopą ar lygiavertę tinkamą įrangą. Jei nustatomi akių pakitimai, turi būti ištirti visi gyvūnai.
      Baigiantis veikimo laikui, bet jokiu būdu ne anksčiau kaip vienuoliktą savaitę, turi būti tikrinama sensorinė reakcija į įvairius dirgiklius (1) (pvz., klausos, regos ir proprioceptinius dirgiklius) (2), (3), (4), daromas grybšnio jėgos (5) ir motorinio aktyvumo (6) vertinimas. Kitos tinkamų metodų detalės pateikiamos atitinkamose nuorodose. Tačiau galima taikyti šių nuorodų metodams alternatyvius metodus.
      Tyrimo pabaigoje numatyti funkciniai stebėjimai gali būti nevykdomi, jei yra kitų tyrimų funkcinių stebėjimų duomenys, o kasdieniai klinikiniai stebėjimai nerodo jokių funkcinių sutrikimų.
      Išimtiniu atveju funkcinių stebėjimų galima taip pat nedaryti grupėms, kurių toksiškumo požymiai yra tokio laipsnio, kad jie labai trukdytų daryti funkcinius bandymus.
      1.5.2.1.   Kūno masė ir maisto/vandens suvartojimas
      Visi gyvūnai turi būti sveriami bent kartą per savaitę. Suvartojamo maisto kiekis turi būti matuojamas bent kas savaitę. Jei bandomoji medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, bent kas savaitę turi būti nustatomas ir suvartojamo vandens kiekis. Suvartojamo vandens kiekį rekomenduojama matuoti ir tuo atveju, kai, darant davimo su maistu ar pro zondą tyrimus, gali pakisti vandens suvartojimas.
      1.5.2.2.   Hematologiniai ir klinikiniai biocheminiai tyrimai
      Kraujo bandiniai turi būti imami iš nurodytos vietos ir prireikus laikomi atitinkamomis sąlygomis. Baigiantis bandymo laikotarpiui kraujas paimamas prieš pat gyvūnų nužudymą arba j į vykdant.
      Bandymo laikotarpio pabaigoje arba kai imami tarpiniai kraujo bandiniai, turi būti daromi šie hematologiniai tyrimai: hematokrito vertė, hemoglobino koncentracija, eritrocitų skaičius, bendras leukocitų skaičius ir leukocitų formulė, trombocitų skaičius ir kraujo krešėjimo laiko/gebos matavimas.
      Klinikiniai biocheminiai matavimai tiriant pagrindinius toksiškumo poveikius audiniams, ypač inkstams bei kepenims, turi būti daromi su kraujo pavyzdžiais, gautais iš kiekvieno gyvūno (išskyrus gaištančius ir (ar) nužudytus darant bandymą) prieš pat jo nužudymą ar jį vykdant. Panašiai kaip hematologiniams tyrimams, galima imti tarpinius bandinius klinikiniams biocheminiams bandymams. Rekomenduojama prieš kraujo ėmimą gyvūnų per naktį nešerti (3). Analizuojant serumą ar plazmą turi būti nustatomi natrio ir kalio jonai, gliukozė, bendras cholesterolis, karbamidas, kraujo karbamido azotas, kreatininas, bendras baltymų ir albumino kiekis ir daugiau kaip du enzimai, rodantys poveikius kepenų ląstelėms (pvz., alaninaminotransferazė, aspartataminotransferazė, šarminė fosfatazė, gama glutamiltranspeptidazė ir sorbitoldehidrogenazė). Taip pat galima įtraukti papildomų enzimų (kepenų ar kitokios kilmės) ir tulžies rūgščių matavimus, kurie tam tikromis sąlygomis gali suteikti naudingos informacijos.
      Paskutinę tyrimo savaitę pasirinktinai gali būti analizuojami šie nustatytu laiku paimtų šlapimo bandinių parametrai: išvaizda, tūris, osmoliališkumas ar santykinis tankis, pH, baltymai, gliukozė ir kraujas ar kraujo ląstelės.
      Be to, galima numatyti tyrimus bendrų audinių pakitimų serumo rodikliams nustatyti. Jei dėl žinomų savybių medžiaga gali veikti ar yra įtarimų, kad gali veikti susijusias medžiagų apykaitos kreives, reikėtų daryti kitas analizes, įskaitant kalcio, fosforo, badavimo trigliceridų, specifinių hormonų, metemoglobino ir cholinesterazės analizes. Šios analizės turi būti apibrėžtos tam tikrų klasių cheminėms medžiagoms ar daromos tam tikrų atvejų pagrindu.
      Apskritai tyrimą reikia daryti lanksčiai, atsižvelgiant į gyvūnų rūšį ir stebimus ar laukiamus konkrečios medžiagos poveikius.
      Jei istorinių pradinių duomenų nepakanka, reikia apsvarstyti, ar hematologinius ir klinikinius parametrus reikia nustatyti prieš pradedant dozavimą; paprastai nepatariama, kad šie duomenys būtų gauti prieš apdorojimą (7).
      1.5.2.3.   Bendroji autopsija
      Visiems tyrimui naudotiems gyvūnams turi būti daroma visiška ir išsami bendroji autopsija, kurią sudaro kruopštus kūno išorės paviršiaus, visų angų, kaukolės, krūtinės ir pilvo ertmių bei jų turinio tyrimas. Visų gyvūnų kepenys, inkstai, antinksčiai, sėklidės, sėklidžių prieklausai, gimdos, kiaušidės, užkrūčio liaukos, blužnis, smegenys ir širdis (išskyrus gaištančių ir (ar) nužudytų darant bandymą) atskiriami nuo juos laikančio audinio ir kiek įmanoma greičiau sveriami švieži, kad neišdžiūtų.
      Naudojant audiniui ir vėlesniam histopatologiniam tyrimui tinkamiausią fiksavimo terpę turi būti užkonservuojami šie audiniai: visi organai su makroskopiniais pakitimais, smegenys (tipiškos sritys, įskaitant didžiąsias smegenis, smegenėles ir kaulų čiulpus/Varoli tiltą), stuburo smegenys (trijų lygių: kaklo, vidurinio krūtinės ir juosmens), hipofizis, skydliaukė, prieskydinė liauka, užkrūčio liauka, stemplė, seilių liaukos, skrandis, plonosios ir storosios žarnos (įskaitant Peyerio plokšteles), kepenys, kasa, inkstai, antinksčiai, blužnis, širdis, trachėja ir plaučiai (konservuojant pripučiami fiksavimo terpės ir vėliau panardinami), aorta, lytinės liaukos, gimda, pagalbiniai lyties organai, patelių pieno liaukos, prostata, šlapimo pūslė, tulžies pūslė (pelių), limfmazgiai (sisteminiams poveikiams nustatyti geriau imti vieną limfmazgį dozės davimo kelyje, o kitą – toli nuo dozės patekimo kelio), periferiniai nervai (sėdmens ar blauzdikaulio) geriau prie pat raumens, kaulų čiulpų dalis (ir (ar) šviežiai išsiurbti kaulų čiulpai), oda ir akys (jei darant oftalmologinius tyrimus buvo pastebėti pakitimai). Klinikiniai ir kiti duomenys gali parodyti, jog būtina tirti papildomus audinius. Taip pat konservuojami visi organai, kurie pagal žinomas bandomosios medžiagos savybes gali būti jos paveikti.
      1.5.2.4.   Histopatologiniai tyrimai
      Turi būti daromi išsamūs histopatologiniai kontrolinių ir didelės dozės grupių gyvūnų užkonservuotų organų ir audinių tyrimai. Šie tyrimai turi būti išplėsti visoms kitų dozių gyvūnų grupėms, jei didelės dozės grupėje stebimi su apdorojimu susiję pokyčiai.
      Turėtų būti ištirti visi makroskopiniai pakitimai.
      Jei naudojama pagalbinė grupė, turi būti daromas histopatologinis tyrimas tų audinių ir organų, kuriems buvo nustatyti poveikiai medžiagą gavusiose grupėse.
      2.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      2.1.   DUOMENYS
      Turi būti pateikti kiekvieno gyvūno duomenys. Papildomai visi duomenys turi būti apibedrinami lentelėse, kiekvienai bandymų grupei nurodomas bandymo pradžioje turėtų gyvūnų skaičius, darant bandymą rastų negyvų ar dėl humaniškų priežasčių nužudytų gyvūnų skaičius ir kiekvienos žūties ar nužudymo dėl humaniškų priežasčių laikas, gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičius, stebimų toksiškumo požymių aprašymas, įskaitant kiekvieno toksiškumo poveikio atsiradimo momentą, trukmę ir sunkumą, gyvūnų su organų pakitimais skaičių, pakitimų tipą ir gyvūnų su kiekvieno tipo pakitimais procentinę dalį.
      Jei tinka, skaitmeniniai rezultatai turi būti įvertinti atitinkamu ir plačiai taikomu statistiniu metodu. Statistiniai metodai ir analizei skirti duomenys turi būti pasirinkti planuojant bandymą.
      2.2.   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
      2.2.1.   Bandomoji medžiaga:
      
                  —
               
               
                  fizinė būsena, grynumas ir fizikocheminės savybės,
               
            
                  —
               
               
                  cheminio identifikavimo duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  nešiklis (jei naudojamas): nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei nešiklis ne vanduo.
               
            2.2.2.   Bandymų gyvūnai:
      
                  —
               
               
                  naudota rūšis ir veislė,
               
            
                  —
               
               
                  gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
               
            
                  —
               
               
                  šaltinis, laikymo sąlygos, maistas ir t. t.,
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje.
               
            2.2.3.   Bandymo sąlygos:
      
                  —
               
               
                  dozės dydžio parinkimo pagrindimas,
               
            
                  —
               
               
                  detalės apie bandomosios medžiagos/preparato ruošimą, jo dėjimą į maistą, gautą koncentraciją, preparato stabilumą ir vienalytiškumą,
               
            
                  —
               
               
                  detalės apie bandomosios medžiagos davimo būdą,
               
            
                  —
               
               
                  tikrosios dozės (mg/kg kūno masės/parai) ir bandomosios medžiagos koncentracijos maiste/geriamajame vandenyje (ppm) perskaičiavimo į tikrąją dozę faktorius, jei naudojamas,
               
            
                  —
               
               
                  detalės apie maisto ir vandens kokybę.
               
            2.2.4.   Rezultatai:
      
                  —
               
               
                  kūno masė ir kūno masės pokyčiai,
               
            
                  —
               
               
                  maisto ir vandens suvartojimas, jei tinka,
               
            
                  —
               
               
                  toksiškumo atsako duomenys pagal lytį ir dozę, įskaitant toksiškumo požymius,
               
            
                  —
               
               
                  klinikinių stebėjimų prigimtis, sunkumas ir trukmė (grįžtamojo pobūdžio ar ne),
               
            
                  —
               
               
                  oftalmologinio tyrimo rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  jutiminio aktyvumo, grybšnio jėgos ir motorinio aktyvumo vertinimai (jei yra),
               
            
                  —
               
               
                  hematologiniai bandymai su atitinkamomis bazinės tiesės vertėmis,
               
            
                  —
               
               
                  klinikiniai biocheminiai bandymai su atitinkamomis bazinės tiesės vertėmis,
               
            
                  —
               
               
                  kūno masė nužudant, organų masė ir organo/kūno masės santykis,
               
            
                  —
               
               
                  skrodimo duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  išsamus visų histopatologinio tyrimo rezultatų aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  absorbcijos duomenys, jei yra,
               
            
                  —
               
               
                  statistinis rezultatų apdorojimas, jei daromas.
               
            Rezultatų aptarimas.
      Išvados.
      3.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
               
            
                  2)
               
               
                  Tupper, D.E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, p. 999–1003.
               
            
                  3)
               
               
                  Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J.Toxicol. Environ. Health, 9, p. 691–704.
               
            
                  4)
               
               
                  Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, p. 267–283.
               
            
                  5)
               
               
                  Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assesment of Fore- and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., I, p. 233–236.
               
            
                  6)
               
               
                  Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, p. 599–609.
               
            
                  7)
               
               
                  Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, p. 198–201.
               
            B.27.   SUBCHRONIŠKO ORALINIO TOKSIŠKUMO BANDYMAS 90 PARŲ KARTOTINĖS DOZĖS TYRIMAS NE SU GRAUŽIKAIS ORALINIAM TOKSIŠKUMUI NUSTATYTI
      1.   METODAS
      Šis subchroniško oralinio toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 409 (1998) kopija.
      1.1.   ĮVADAS
      Vertinant ir nustatant cheminių medžiagų toksiškumo charakteristikas, kartotinės dozės subchroniškas oralinis toksiškumas gali būti nustatomas gavus pradinę informaciją ūmaus ar 28 parų kartotinės dozės toksiškumo bandymais. 90 parų tyrimas suteikia informacijos apie galimus pavojus sveikatai, galinčius kilti po pakartotinio veikimo ilgą laikotarpį, trunkantį nuo greito augimo iki suaugusio amžiaus pradžios. Tyrimas suteiks informacijos apie svarbesnius toksiškumo poveikius, nurodys veikiamus organus ir kaupimosi galimybę, ir bus galima gauti nestebimo neigiamo poveikio lygio įvertį, kuris gali būti naudojamas dozių lygiui chroniško toksiškumo tyrimams pasirinkti ir žmonių saugos kriterijams nustatyti.
      Bandymo metodas leidžia identifikuoti cheminių medžiagų veikimo neigiamus poveikius ne graužikų rūšims ir turi būti taikomas tik:
      
                  —
               
               
                  jei kitais tyrimais nustatyti poveikiai rodo, kad paaiškinimui/apibūdinimui reikalinga kita, ne graužikų rūšis, ar
               
            
                  —
               
               
                  jei toksikokinetiniai tyrimai rodo, kad tinkamiausias laboratorininio gyvūno pasirinkimas yra tam tikra ne graužikų rūšis, ar
               
            
                  —
               
               
                  jei kitos specifinės priežastys pateisina ne graužikų naudojimą.
               
            Taip pat žr. B dalies bendrąjį įvadą.
      1.2.   SĄVOKOS
      
         Dozė – paskirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama mase (g, mg) ar bandomosios medžiagos mase bandymų gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg), ar pastovia koncentracija maiste (ppm).
      
         Dozavimas – bendras terminas, apimantis dozės dydį, jos dažnį ir dozavimo trukmę.
      
         NOAEL – termino „nestebimo neigiamo poveikio lygis“(No observed adverse effect level) santrumpa, ir tai yra didžiausia dozė, kai neigiamas apdorojimo poveikis nepastebimas.
      1.3.   BANDYMO METODO ESMĖ
      Kasdien kelioms bandymų gyvūnų grupėms per burną duodamos skirtingos bandomosios medžiagos dozės, vienai grupei 90 parų duodama vieno lygio dozė. Dozės davimo laikotarpiu gyvūnai yra atidžiai stebimi ieškant toksiškumo požymių. Darant bandymą nugaišę ar nužudyti gyvūnai skrodžiami, baigus bandymą išlikę gyvūnai taip pat nužudomi ir skrodžiami.
      1.4.   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.4.1.   Gyvūnų rūšies parinkimas
      Paprastai naudojama ne graužikų rūšis yra šuo, jis turi būti apibrėžtos veislės; dažnai yra naudojamas skalikas. Gali būti naudojami kiti gyvūnai, pvz., kiaulės, mažosios kiaulės. Primatai nerekomenduojami, tad jų naudojimas turi būti pagrįstas. Turi būti naudojami jauni ir sveiki gyvūnai, šuniui dozes geriau pradėti duoti 4–6 mėnesių ir ne vyresniam kaip devynių mėnesių amžiaus. Jei tai yra pradinis tyrimas prieš ilgalaikį chroniško toksiškumo tyrimą, abiem tyrimams turi būti naudojami tos pačios rūšies/veislės gyvūnai.
      1.4.2.   Gyvūnų ruošimas
      Turi būti imami sveiki gyvūnai, aklimatizuoti laboratorijos sąlygomis ir dar nenaudoti kitiems bandymams. Aklimatizavimo trukmė priklausys nuo pasirinktų rūšių ir jų šaltinio. Šunims ar specialiai šiuo tikslu augintoms kiaulėms iš vietinės kolonijos rekomenduojama penkių parų aklimatizacija, o jei gyvūnai yra iš išorinių šaltinių, – bent dviejų savaičių aklimatizacija. Apibūdinant bandomuosius gyvūnus nurodoma rūšis, veislė, šaltinis, lytis, masė ir (ar) amžius. Gyvūnai į kontrolines ir apdorojimo grupes turi būti paskirstomi atsitiktinai. Narveliai turi būti išdėstomi taip, kad kuo mažiau pasireikštų pastatymo vietos įtaka. Kiekvienam gyvūnui turi būti paskirtas tik vienas identifikacijos numeris.
      1.4.3.   Dozių ruošimas
      Bandomoji medžiaga duodama su maistu ar geriamuoju vandeniu pro zondą arba kapsulėmis. Dozės davimo būdas priklauso nuo tyrimo tikslo ir bandomosios medžiagos fizikocheminių savybių.
      Jei būtina, bandomajai medžiagai ištirpinti arba suspenduoti naudojamas atitinkamas nešiklis. Rekomenduojama kiekvieną kartą, jei tik leidžia sąlygos, iš pradžių bandyti paruošti vandeninius tirpalus/suspensijas, toliau tirpalą/emulsiją aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet nagrinėti kitų nešiklių naudojimą. Turi būti žinomos visų nešiklių, išskyrus vandenį, toksiškumo charakteristikos. Turi būti nustatytas bandomosios medžiagos stabilumas medžiagos davimo sąlygomis.
      1.5.   BANDYMO EIGA
      1.5.1.   Gyvūnų skaičius ir lytis
      Kiekvienai dozei turi būti naudojami bent aštuoni gyvūnai (keturios patelės ir keturi patinai). Jei planuojami tarpiniai skrodimai, gyvūnų skaičius turi būti padidintas tiek, kiek numatyta nužudyti gyvūnų iki bandymo pabaigos. Baigiant tyrimą gyvūnų skaičiaus turi pakakti svarbiam toksiškumo poveikių įvertinimui. Remiantis ankstesnėmis žiniomis apie cheminę medžiagą ar labai panašių savybių medžiagą, galima būtų numatyti į kontrolinio bandymo ir į didžiausios dozės grupę papildomai įtraukti pagalbinę aštuonių gyvūnų grupę (po keturis kiekvienos lyties), kad pasibaigus apdorojimo laikotarpiui būtų galima stebėti visų toksiškumo poveikių grįžtamumą ar išlikimą. Šio laikotarpio po apdorojimo trukmė turėtų būti tinkamai nustatyta atsižvelgiant į stebimus poveikius.
      1.5.2.   Dozavimas
      Naudojamos bent trijų lygių dozės ir vienas lygiagretus kontrolinis bandinys, išskyrus atvejus, kai daromas ribinis bandymas (žr. 1.5.3). Dozių lygiai gali būti pagrįsti kartotinių dozių ar diapazono nustatymo tyrimų rezultatais, ir turi būti atsižvelgta į visus esamus toksikologinius ir toksikokinetinius duomenis apie bandomąją medžiagą ar giminingas medžiagas. Jei bandomosios medžiagos fizikocheminė prigimtis ar biologiniai poveikiai dozės neriboja, didžiausia dozė turi būti pasirinkta tokia, kad gyvūnui būtų sukeltas tik toksiškumo poveikis, bet jis ne žūtų ar nepatirtų didelių kančių. Mažėjančių dozių eilutė turi būti pasirinkta taip, kad būtų parodytas bet koks dozės sukeltas atsakas, o esant mažiausiam dozės lygiui – nestebimo neigiamo poveikio lygis (NOAEL). Mažėjančių dozių lygiams nustatyti paprastai yra optimalus dvigubas-keturgubas tarpas ir dažnai vietoj didelių tarpų tarp dozių (pvz., kai skirtumas tarp jų yra 6–10 kartų) geriau naudoti papildomą ketvirtą bandymų grupę.
      Kontrolinę grupę sudaro neapdorotų gyvūnų grupė arba nešiklį gaunanti kontrolinė grupė, jei bandomajai medžiagai duoti naudojamas nešiklis. Išskyrus apdorojimą bandomąja medžiaga, su kontrolinės grupės gyvūnais turi būti elgiamasi lygiai taip, kaip su bandomųjų grupių gyvūnais. Naudojant nešiklį, kontrolinės grupės gyvūnai turi gauti didžiausią nešiklio kiekį. Jei bandomoji medžiaga yra duodama su maistu, ir dėl to pasireiškia maisto vartojimo mažėjimas, gali būti naudinga turėti lygiagrečiai maitinamą kontrolinę grupę, kad būtų galima nustatyti, ar vartojimo sumažėjimas yra dėl apetito stokos ar dėl toksikologinių pokyčių pagal bandymo modelį.
      Jei tinka, reikia atkreipti dėmesį į šias nešiklio ir kitų priedų charakteristikas: poveikius bandomosios medžiagos absorbcijai, pasiskirstymui, metabolizmui ar sulaikymui; poveikius bandomosios medžiagos cheminėms savybėms, galinčioms pakeisti jos toksiškumo charakteristikas; ir poveikius maisto ar vandens vartojimui ar gyvūnų mitybos būsenai.
      1.5.3.   Ribinis bandymas
      Jei taikant šiam tyrimui aprašytas metodikas vienos dozės, atitinkančios bent 1 000 mg/kg kūno masės/parai, bandymas nesukelia jokių pastebimų neigiamų poveikių ir jei toksiškumo poveikių nelaukiama pagal struktūriškai giminingų medžiagų duomenis, visas trijų lygių dozės tyrimas gali būti laikomas nebūtinu. Ribinis bandymas taikomas, išskyrus atvejus, kai poveikis žmonėms rodo, kad reikia naudoti didesnio lygio dozę.
      1.5.4.   Dozių davimas
      Bandomosios medžiagos dozė 90 parų gyvūnams duodama kasdien visas septynias dienas per savaitę. Bet kurį kitą režimą, pvz., penkių dienų per savaitę, reikia pagrįsti. Kai bandomoji medžiaga duodama pro zondą, gyvūnams turėtų būti duodama tik viena dozė naudojant skrandžio zondą ar tinkamą intubacinį vamzdelį. Didžiausias gyvūnui duodamas vienkartinis skysčio tūris priklauso nuo bandymų gyvūno dydžio. Paprastai tūris turėtų būti kiek įmanoma mažesnis. Išskyrus dirginančias ar ėsdinančias medžiagas, kurios būdamos didesnės koncentracijos paprastai sukelia dirginančius poveikius, bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas keičiant koncentraciją taip, kad tūris visoms dozėms būtų pastovus.
      Jei medžiagos duodamos su maistu ar geriamuoju vandeniu, svarbu garantuoti, kad naudojami bandomosios medžiagos kiekiai netrikdytų normalaus mitybos režimo ar vandens balanso. Bandomąją medžiagą duodant su maistu, galima naudoti pastovią koncentraciją maiste (ppm) ar pastovią dozę pagal gyvūno kūno masę; naudota alternatyva turi būti nurodyta. Medžiagą įleidžiant pro zondą ar duodant kapsulę, dozė turėtų būti duodama kasdien panašiu laiku ir prireikus pakoreguota pastoviam dozės lygiui pagal gyvūno kūno masę palaikyti. Jei 90 parų tyrimas daromas kaip pradinis prieš ilgalaikį chroniško toksiškumo tyrimą, abiem tyrimams turi būti vartojamas panašus maistas.
      1.5.5.   Stebėjimai
      Stebėjimo trukmė turi būti ne mažesnė kaip 90 parų. Pagalbinės grupės gyvūnai, skirti paskesni ems stebėjimams, atitinkamą laiką turi būti niekaip neapdorojami, kad būtų galima konstatuoti toksiškumo poveikių išlikimą ar atsigavimą po jų.
      Bendras klinikinis tyrimas turi būti daromas bent kartą per dieną, geriau kasdien tuo pačiu laiku atsižvelgiant į intensyviausio laukiamų poveikių pasireiškimo laiką po medžiagos davimo. Turi būti registruojama gyvūnų klinikinė būsena. Bent du kartus per dieną, paprastai rytą ir vakare, visi gyvūnai apžiūrimi ieškant liguistumo ir gaištamumo požymių.
      Bent vieną kartą prieš pirmąjį veikimą (kad būtų galima daryti palyginimus pačiam gyvūnui), ir kartą per savaitę po to visiems gyvūnams turi būti daromi išsamūs klinikiniai tyrimai. Šie tyrimai turi būti daromi ne pačiame gyvūno narvelyje, o geriau standartiškai įrengtoje vietoje ir kiekvieną kartą panašiu laiku. Turi būti imamasi priemonių, garantuojančių kuo mažesnį stebėjimo sąlygų kitimą. Toksiškumo požymiai turi būti kruopščiai registruojami, įskaitant jų pradžią, laipsnį ir trukmę. Stebėjimai turi apimti, jais neapsiribojant, odos, kailio, akių, gleivinių, sekrecijų ir ekskrecijų dažnį ir autonominį aktyvumą (pvz., ašarojimą, drebulį, vyzdžių dydį, neįprastą kvėpavimą). Taip pat turi būti registruojami eisenos pokyčiai, laikysena ir reakcija į tvarkymą, kloniniai ar toniniai judesiai, stereotipai (pvz., per dažnas kūno prisižiūrėjimas, nuolatinis sukimasis ratu) ar keistas elgesys.
      Prieš pradedant duoti bandomąją medžiagą ir baigiant tyrimą turi būti daromas, pageidautina visų, bet jei neįmanoma, tai bent didžiausios dozės ir kontrolinės grupių gyvūnų oftalmologinis tyrimas naudojant oftalmoskopą ar lygiavertę tinkamą įrangą. Jei nustatomi akių pakitimai, turi būti ištirti visi gyvūnai.
      1.5.5.1.   Kūno masė ir maisto/vandens suvartojimas
      Visi gyvūnai turi būti sveriami bent kartą per savaitę. Suvartojamo maisto kiekis turi būti matuojamas bent kas savaitę. Jei bandomoji medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, bent kas savaitę turi būti nustatomas ir suvartojamo vandens kiekis. Suvartojamo vandens kiekį rekomenduojama matuoti ir tuo atveju, kai darant davimo su maistu ar pro zondą tyrimus gali pakisti vandens suvartojimas.
      1.5.5.2.   Hematologiniai ir klinikiniai biocheminiai tyrimai
      Kraujo bandiniai turi būti imami iš nurodytos vietos ir prireikus laikomi atitinkamomis sąlygomis. Baigiantis bandymo laikotarpiui kraujas paimamas prieš pat gyvūnų nužudymą arba jį vykdant.
      Tyrimo pradžioje, vėliau visą bandymo laiką kas mėnesį arba bandymo viduryje ir galiausiai bandymo pabaigoje turi būti daroma hematologinė analizė, įskaitant hemoglobino koncentraciją, eritrocitų skaičių, bendrą leukocitų skaičių ir leukocitų formulę, trombocitų skaičių ir kraujo krešėjimo gebos, pvz., krešėjimo laiko, protrombino laiko ar tromboplastino laiko, matavimą.
      Klinikiniai biocheminiai matavimai tiriant pagrindinius toksiškumo poveikius audiniams, ypač inkstams bei kepenims, turi būti daromi su kraujo pavyzdžiais, gautais iš kiekvieno gyvūno (išskyrus gaištančius ir (ar) nužudytus darant bandymą) pradedant tyrimą, vėliau visą bandymo laiką kas mėnesį arba bandymo viduryje ir galiausiai baigiant bandymą. Parametrai, kuriuos reikia tirti, yra elektrolitų pusiausvyra, angliavandenių apykaita ir kepenų bei inkstų funkcijos. Konkrečių bandymų pasirinkimui įtakos turės bandomosios medžiagos veikimo būdų stebėjimas. Prieš kraujo ėmimą gyvūnai turi būti nemaitinami gyvūno rūšį atitinkantį laiką. Rekomenduojama nustatyti kalcį, fosforą, chloridus, natrį, kalį, badavimo gliukozę, alaninaminotransferazę, aspartataminotransferazę, ornitindekarboksilazę, gama glutamiltranspeptidazę, karbamido azotą, albuminą, kraujo kreatininą, bendrą bilirubiną ir bendrą serumo baltymų kiekį.
      Šlapimą reikia tirti bent pradedant tyrimą, vėliau per tyrimo vidurį ir galiausiai tyrimo pabaigoje analizuojant nustatytu laiku paimtus bandinius. Šlapimo analizė apima išvaizdą, tūrį, osmoliališkumą ar santykinį tankį, pH, baltymus, gliukozę ir kraują ar kraujo ląsteles. Galima naudoti papildomus parametrus, jei būtina išplėsti stebimo (-ų) poveikio (-ių) tyrimą.
      Be to, galima numatyti tyrimus bendrų audinių pakitimų rodikliams nustatyti. Kitos analizės, kurių gali prireikti norint tinkamai įvertinti medžiagos toksiškumą, apima lipidų, hormonų, rūgščių ir šarmų pusiausvyros, metemoglobino ir cholinesterazės inhibavimo analizę. Galima naudoti papildomus klinikinius biocheminius bandymus, jei būtina išplėsti stebimų poveikių tyrimą. Šios analizės turi būti apibrėžtos tam tikrų klasių cheminėms medžiagoms ar daromos tam tikrų atvejų pagrindu.
      Apskritai tyrimą reikia daryti lanksčiai, atsižvelgiant į gyvūnų rūšį ir stebimus ar laukiamus konkrečios medžiagos poveikius.
      1.5.5.3.   Bendroji autopsija
      Visiems tyrimui naudotiems gyvūnams daroma visiška ir išsami bendroji autopsija, kurią sudaro kruopštus kūno išorės paviršiaus, visų angų, kaukolės, krūtinės ir pilvo ertmių bei jų turinio tyrimas. Visų gyvūnų kepenys su tulžies pūsle, inkstai, antinksčiai, sėklidės, sėklidžių prieklausai, kiaušidės, gimdos, skydliaukė (su prieskydine liauka), užkrūčio liaukos, blužnis, smegenys ir širdis (išskyrus gaištančių ir (ar) nužudytų darant bandymą) atskiriami nuo juos laikančio audinio ir kuo greičiau sveriami švieži, kad neišdžiūtų.
      Naudojant audiniui ir vėlesniam histopatologiniam tyrimui tinkamiausią fiksavimo terpę, turi būti užkonservuojami šie audiniai: visi organai su makroskopiniais pakitimais, smegenys (tipiškos sritys, įskaitant didžiąsias smegenis, smegenėles ir kaulų čiulpus/Varoli tiltą), stuburo smegenys (trijų lygių: kaklo, vidurinio krūtinės ir juosmens), hipofizis, akys, skydliaukė, prieskydine liauka, užkrūčio liauka, stemplė, seilių liaukos, skrandis, plonosios ir storosios žarnos (įskaitant Peyerio plokšteles), kepenys, tulžies pūslė, kasa, inkstai, antinksčiai, blužnis, širdis, trachėja ir plaučiai, aorta, lytinės liaukos, gimda, pagalbiniai lyties organai, patelių pieno liaukos, prostata, šlapimo pūslė, limfmazgiai (sisteminiams poveikiams nustatyti geriau imti vieną limfmazgį dozės davimo kelyje, o kitą – toli nuo dozės davimo kelio), periferiniai nervai (sėdmens ar blauzdikaulio) geriau prie pat raumens, kaulų čiulpų dalis (ir (ar) šviežiai išsiurbti kaulų čiulpai) ir oda. Klinikiniai ir kiti duomenys gali parodyti, jog būtina tirti papildomus audinius. Taip pat konservuojami visi organai, kurie pagal žinomas bandomosios medžiagos savybes gali būti jos paveikti.
      1.5.5.4.   Histopatologiniai tyrimai
      Turi būti daromi išsamūs histopatologiniai kontrolinių ir didelės dozės grupių gyvūnų užkonservuotų organų ir audinių tyrimai. Šie tyrimai turi būti išplėsti visoms kitų dozių gyvūnų grupėms, jei didelės dozės grupėje stebimi su apdorojimu susiję pokyčiai.
      Turėtų būti ištirti visi makroskopiniai pakitimai.
      Jei naudojama pagalbinė grupė, turi būti daromas histopatologinis tyrimas audinių ir organų, kuriems buvo nustatyti poveikiai medžiagą gavusiose grupėse.
      2.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      2.1.   DUOMENYS
      Turi būti pateikti kiekvieno gyvūno duomenys. Papildomai visi duomenys turi būti apibendrinami lentelėse, kiekvienai bandymų grupei nurodomas bandymo pradžioje turėtų gyvūnų skaičius, darant bandymą rastų negyvų ar dėl humaniškų priežasčių nužudytų gyvūnų skaičius ir kiekvienos žūties ar nužudymo dėl humaniškų priežasčių laikas, gyvūnų su toksiškumo požymiais skaičius, stebimų toksiškumo požymių aprašymas, įskaitant kiekvieno toksiškumo poveikio atsiradimo momentą, trukmę ir sunkumą, gyvūnų su organų pakitimais skaičių, pakitimų tipą ir gyvūnų su kiekvieno tipo pakitimais procentinę dalį.
      Jei tinka, skaitmeniniai rezultatai turi būti įvertinti atitinkamu ir plačiai taikomu statistiniu metodu. Statistiniai metodai ir analizei skirti duomenys turi būti pasirinkti planuojant bandymą.
      2.2.   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
      2.2.1.   Bandomoji medžiaga:
      
                  —
               
               
                  fizikinė būsena, grynumas ir fizikocheminės savybės,
               
            
                  —
               
               
                  cheminio identifikavimo duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  nešiklis (jei naudojamas): nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei nešiklis ne vanduo.
               
            2.2.2.   Bandymų gyvūnai:
      
                  —
               
               
                  naudota rūšis ir veislė,
               
            
                  —
               
               
                  gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
               
            
                  —
               
               
                  šaltinis, laikymo sąlygos, maistas ir t. t.,
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje.
               
            2.2.3.   Bandymo sąlygos:
      
                  —
               
               
                  dozės dydžio parinkimo pagrindimas,
               
            
                  —
               
               
                  detalės apie bandomosios medžiagos/preparato ruošimą, jo dėjimą į maistą, gautą koncentraciją, preparato stabilumą ir vienalytiškumą,
               
            
                  —
               
               
                  detalės apie bandomosios medžiagos davimo būdą,
               
            
                  —
               
               
                  tikrosios dozės (mg/kg kūno masės/parai) ir bandomosios medžiagos koncentracijos maiste/geriamajame vandenyje (ppm) perskaičiavimo į tikrąją dozę faktorius, jei naudojamas,
               
            
                  —
               
               
                  detalės apie maisto ir vandens kokybę.
               
            2.2.4.   Rezultatai:
      
                  —
               
               
                  kūno masė ir kūno masės pokyčiai,
               
            
                  —
               
               
                  maisto ir vandens suvartojimas, jei tinka,
               
            
                  —
               
               
                  toksiškumo atsako duomenys pagal lytį ir dozę, įskaitant toksiškumo požymius,
               
            
                  —
               
               
                  klinikinių stebėjimų prigimtis, sunkumas ir trukmė (grįžtamojo pobūdžio ar ne),
               
            
                  —
               
               
                  oftalmologinio tyrimo rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  hematologiniai bandymai su atitinkamomis bazinės tiesės vertėmis,
               
            
                  —
               
               
                  klinikiniai biocheminiai bandymai su atitinkamomis bazinės tiesės vertėmis,
               
            
                  —
               
               
                  kūno masė nužudant, organų masė ir organo/kūno masės santykis,
               
            
                  —
               
               
                  skrodimo duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  išsamus visų histopatologinio tyrimo rezultatų aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  statistinis rezultatų apdorojimas, jei daromas.
               
            Rezultatų aptarimas.
      Išvados.
      B.28.   PUSIAU CHRONINIS ODOS TOKSIŠKUMO TYRIMAS 90 DIENŲ TRUNKANTIS KARTOTINĖS DOZĖS DAVIMO GRAUŽIKAMS PER ODĄ TYRIMAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Tiriamoji medžiaga uždedama nustatytomis dozėmis ant keleto eksperimentinių grupių gyvūnų odos paviršiaus, vieną dozę duodant vienos grupės gyvūnams 90 dienų. Uždedant medžiagą, gyvūnai stebimi kiekvieną dieną tam, kad būtų nustatomi toksiškumo požymiai. Gyvūnai, kurie miršta tyrimo metu, yra skrodžiami, o likę gyvi gyvūnai skrodžiami tyrimo pabaigoje.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      1.6.1.   Pasiruošimas tyrimui
      Prieš tyrimą gyvūnai mažiausiai 5 dienas yra laikomi ir šeriami eksperimentinėje fermoje. Prieš pradedant tyrimą sveiki gyvūnų jaunikliai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes. Visai prieš pat tyrimą nuo tiriamųjų gyvūnų nugaros nukerpamas kailis. Kailį galima ir nuskusti, tačiau tai reikėtų atlikti likus vienai parai iki tyrimo pradžios. Paprastai kartotinis nukirpimas ar nuskutimas atliekamas kas savaitę. Kai kailis kerpamas arba skutamas, reikia stengtis nenubrūžinti odos. Uždedant tiriamąją medžiagą reikia stengtis, kad būtų nuvalyta ne mažiau kaip 10 % viso kūno paviršiaus. Sprendžiant, kuri kūno paviršiaus dalis bus nuvalyta ir kiek bus uždedama tiriamosios medžiagos, reikia atsižvelgti į gyvūno kūno masę. Tiriant kietąsias medžiagas, jei reikia, jos gali būti sutrinamos į miltelius, tiriamąją medžiagą reikėtų pakankamai sudrėkinti vandeniu arba, jei būtina, panaudoti tinkamą įrenginį tam, kad būtų galima užtikrinti gerą tiriamosios medžiagos ir odos sąlytį. Skystosios tiriamosios medžiagos paprastai vartojamos nepraskiestos. Medžiagos paprastai uždedamos 5–7 dienas per savaitę.
      1.6.2.   Tyrimo sąlygos
      1.6.2.1.   Eksperimentiniai gyvūnai
      
      Gali būti naudojama suaugusi žiurkė, triušis ar jūrų kiaulytė. Gali būti naudojamos ir kitos rūšys, tačiau reikia apsvarstyti jų panaudojimą. Tyrimo pradžioje kūno masės variacijos ribos turėtų siekti ± 20 % kūno masės vidurkio. Jei prieš ilgalaikį tyrimą yra atliekamas pusiau chroninis odos tyrimas, tai abiejų tyrimų metu reikėtų naudoti tos pačios rūšies ar kamieno gyvūnus.
      1.6.2.2.   Skaičius ir lytis
      
      Duodant medžiagą skirtinga doze, reikėtų naudoti mažiausiai 20 gyvūnų (10 patelių ir 10 patinėlių), turinčių sveiką odą. Patelės turi būti negimdžiusios ir ne nėščios. Jei numarinimai numatomi iš anksto, tai tiriamų gyvūnų skaičius padidinamas padidinant gyvūnų, kuriuos numatoma numarinti prieš užbaigiant tyrimą, skaičių. Be to, 90 dienų bėgyje papildoma 20 gyvūnų (po 10 kiekvienos lyties) grupė veikiama didele medžiagos doze ir praėjus mėnesiui po veikimo, stebimas toksinių efektų grįžtamumas, nepertraukiamumas ar sulėtintas pasireiškimas.
      1.6.2.3.   Dozė
      
      Turėtų būti naudojamos mažiausiai 3 tiriamosios dozės naudojant kontrolinę dozę arba kontrolinį prietaisą, jei toks yra naudojamas. Dozės poveikis turėtų išlikti mažiausiai 6 valandas per dieną. Tiriamoji medžiaga turėtų būti duodama kiekvieną dieną tuo pačiu metu ir medžiaga, kuria veikiama, turi būti duodama tokiu kiekiu su pertraukomis (kas savaitę ar kas dvi savaites), kad būtų palaikoma ta pati medžiagos dozė gyvūno kūno masės atžvilgiu. Išskyrus veikimą tiriamąja medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turėtų būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamosios grupės individai. Jei prietaisas naudojamas dozavimui, tai medžiaga, duodama kontrolinės grupės gyvūnams, naudojant prietaisą, turi būti dozuojama tokiu pat būdu kaip ir medžiaga, duodama tiriamosios grupės gyvūnams bei turi būti gaunamas toks kiekis, koks buvo gautas, davus didžiausią medžiagos dozę tiriamajai grupei. Davus didžiausią medžiagos dozę, turėtų pasireikšti toksiniai efektai, tačiau ši dozė neturi būti mirtina arba gali sukelti tik pavienių gyvūnų mirtį. Mažiausia duota dozė neturėtų sukelti jokio toksiškumo. Ši dozė turėtų būti mažesnė nei toji, kuri vartojama praktiškai įvertinant poveikį žmogui. Geriausia, jog tarpinė dozė sukeltų minimalaus toksiškumo požymius. Jeigu naudojama daugiau nei viena tarpinė dozė, tai dozės turi būti padalijamos taip, kad sukeltų toksiškumą palaipsniui. Mirtingumo laipsnis mažos ir tarpinės dozės grupėse, o taipogi kontrolinėje grupėje turi būti žemas tam, kad būtų galima įvertinti rezultatų reikšmingumą.
      Jeigu tiriamoji medžiaga, kuria veikiama, ypač suerzina odą, tai reikėtų sumažinti jos koncentracijas ir šitai galbūt susilpnintų medžiagos, duodamos didele doze, sukeliamus toksinius efektus arba šie visai išnyktų. Jei oda buvo ypač pažeista, tai reikia tučtuojau nutraukti tyrimą ir pradėti naują, naudojant mažesnes tiriamosios medžiagos koncentracijas.
      1.6.3.   Ribų tyrimas
      
      Jei atliekamas išankstinis tyrimas, naudojant 1 000 mg kilogramui arba didesnę dozę, kuri, kaip nustatoma, nesukelia jokių toksinių efektų žmogui, tai laikomasi nuostatos, jog tolimesnis tyrimas nėra būtinas.
      1.6.4.   Stebėjimų laikotarpis
      
      Tiriamieji gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną, registruojant toksiškumo požymius. Reikia nurodyti mirties bei toksiškumo požymių pasireiškimo ir išnykimo laiką.
      1.6.5.   Procedūra
      
      Gyvūnai turėtų būti laikomi atskirai. Geriausiu atveju gyvūnai turėtų būti veikiami duodama tiriamąja medžiaga septynis kartus per savaitę 90 dienų laikotarpiu.
      Gyvūnai, esantys bet kurioje pagalbinėje grupėje ir skirti vėlesniems stebėjimams, turėtų būti laikomi dar mėnesį, neveikiant juos medžiaga tam, kad būtų galima jų atsistatymą po toksinių efektų poveikio ar pačių toksinių efektų pasireiškimo nepertraukiamumą. Veikimas medžiaga turėtų trukti šešias valandas per dieną.
      Tiriamoji medžiaga turėtų būti tvarkingai uždedama ant odos paviršiaus, sudarančio apie 10 % viso kūno paviršiaus ploto. Jei naudojamos ypač toksiškos medžiagos, tai odos paviršiaus, ant kurio uždedamos medžiagos, plotas gali būti mažesnis, tačiau reikėtų kaip galima daugiau šio ploto tvarkingai padengti plona ir tikslia kaip fotojuosta, plėvele.
      Veikimo metu tiriamoji medžiaga kontaktuoja su oda, padengus pastarąją poringa marle ar odos neerzinančia juostele. Vėliau tiriamoji odos vieta yra taip padengiama, kad išliktų poringa marlė bei tiriamoji medžiaga ir kad būtų užtikrinta, jog gyvūnai nepraris tiriamosios medžiagos. Tam, kad būtų išvengta prarijimo, galima naudoti ribojančias priemones, tačiau visiška imobilizacija nėra rekomenduojama.
      Veikimo pabaigoje nuo odos, ją plaunant vandeniu ar kokiu kitu atitinkamu valymo būdu turėtų būt pašalintas tiriamosios medžiagos likutis.
      Visi gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną ir registruojami toksiškumo požymiai, įskaitant jų pasireiškimo pradžią, laipsnį bei trukmę. Stebint narveliuose laikomus gyvūnus, reikia registruoti odos bei kailio, o taip pat akių ir gleivinių membranas bei kvėpavimo, apytakos, autonominės bei centrinės nervų sistemos pokyčius, somatomotorinį aktyvumą ir elgseną. Kiekvieną savaitę reikėtų įvertinti pašaro suvartojimą (ir vandens suvartojimą kai tiriamoji medžiaga yra duodama su geriamu vandeniu) bei pasverti gyvūnus. Reikėtų kiek įmanoma pastoviau stebėti gyvūnus tam, kad užtikrinti, jog šie nebūtų prarandami tyrimo metu dėl tokių priežasčių kaip kanibalizmas, audinių autolizė bei laikymo vietos praradimas. Baigiantis tyrimui, visi likę gyvi nepagalbinės grupės gyvūnai, nepaveikti tiriamąja medžiaga, skrodžiami. Nugaišę gyvūnai turėtų būti pašalinami ir, kai nurodoma, skrodžiami.
      Įprastiniu atveju visi gyvūnai, įskaitant ir kontrolinius individus, yra tiriami šitaip:
      
                  a)
               
               
                  Prieš pradedant duoti tiriamąją medžiagą bei pasibaigus tyrimui, panaudojant oftalmoskopą ar jam ekvivalentišką tinkamą prietaisą, turėtų būti ištiriamos visų, bet pirmiausia gavusių didžiausią dozę ir priklausančių kontrolinei grupei, gyvūnų akys. Jeigu nustatomi pokyčiai akyse, reikėtų ištirti visus gyvūnus.
               
            
                  b)
               
               
                  Prieš pasibaigiant tyrimui, reikėtų įvertinti tokius hematologinius rodiklius kaip hematokritas, hemoglobino koncentracija, eritrocitų skaičius, absoliutus bei skirtingų populiacijų leukocitų skaičius ir įvertinti krešėjimo potencialą, remiantis tokiais kriterijais, kaip krešėjimo trukme, protrombino ir tromboplastino susidarymo trukmė arba kraujo plokštelių (trombocitų) skaičius.
               
            
                  c)
               
               
                  Prieš pasibaigiant tyrimui, reikėtų atlikti kraujo biocheminius tyrimus. Atliekant šiuos tyrimus, reikėtų, jei reikalinga, nustatyti elektrolitų balansą, angliavandenių metabolizmą bei įvertinti kepenų ir inkstų veiklą. Parenkant specifinius tyrimus, reikėtų atsižvelgti į tiriamosios medžiagos veikimo būdo tyrimo duomenis. Siūloma nustatyti kalcį, fosforą, chlorą, natrį, kalį, badavimo metu susidarančią gliukozę (atsižvelgiant į konkrečiai gyvūnų rūšiai/veislei galimą badavimo laikotarpį), serumo glutamato piruvato transaminazę (4), serumo glutamato oksalacetato transaminazę (5), ornitino dekarboksilazę, gama glutamilo transpeptidazę, šlapale esantį azotą, albuminą, bendrą bilirubino, esančio kraujo kreatinine, kiekį bei atlikti serumo baltymų bendro kiekio nustatymą. Kitiems tyrimams, kurie gali būti reikalingi pakankamam toksikologiniam įvertinimui, priklauso lipidų, hormonų rūgščių/šarmų balanso, methemoglobino ir cholinesterazės aktyvumo nustatymas. Papildomi biocheminiai tyrimai gali būti atliekami tuo atveju, kai būtina detaliau išnagrinėti nustatytus reiškinius.
               
            
                  d)
               
               
                  Nereikalaujama, kad pagal nusistovėjusią tvarką būtų atliekama šlapimo analizė, išskyrus tuos atvejus, kai remiantis duomenimis, numatomas arba nustatomas toksiškumas.
               
            Jeigu neįmanoma gauti anksčiau atliktų tyrimų pagrindinių duomenų, tai, prieš pradedant medžiagos davimą dozėmis, reikėtų apsvarstyti hematologinius ir klinikinius biocheminius parametrus.
      
         Pagrindinis skrodimas
      
      Turėtų būti atliktas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, kurio metu tiriamas kūno išorinis paviršius, visos angos, kiaušo, krūtinės ir pilvo ertmės bei jų turinys. Po skrodimo kuo skubiau pasveriamos kepenys, inkstai, antinksčiai, tiroidinė liauka (kartu su paratireoidiniais dariniais) ir kiaušinėliai tam, kad būtų išvengta jų džiūties. Vėlesniems histopatologiniams tyrimams turėtų būti išsaugomi tokie audiniai ir organai, laikomi tinkamoje terpėje: visi esminiai pažeidimai, smegenys – įskaitant pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūvius, smegenėlių ir smegenų žievę, hipofizė, tiroidinė/paratiroidinė liauka, bet koks užkrūčio liaukos audinys, (trachėja), plaučiai, širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys, blužnis, inkstai, antinksčiai, kasa, lytinės liaukos, gimda (pagalbiniai lytiniai organai), tulžies pūslė, stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, tuščioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, riestoji žarna, šlapimo pūslė, pagrindinis (didysis) limfmazgis, (moterų pieno liauka), (šlaunies raumenynas), periferinis nervas, (akys), (šlaunikaulis, įskaitant ir segmentinį paviršių), (stuburo smegenys trimis lygiais – sprando, krūtinės ląstos ir juosmens) ir (ašarų liaukos). Audinius, paminėtus skliausteliuose, reikia tirti tik tada, kai nustatomas toksiškumas arba tiriamas medžiagos poveikis organui).
      
         Histopatologinis tyrimas
      
      
                  a)
               
               
                  Reikėtų visapusiškai histopatologiškai ištirti kontrolinės grupės ir tos grupės, kuriai duodama didelė medžiagos dozė, gyvūnus.
               
            
                  b)
               
               
                  Reikėtų ištirti visus pagrindinius pažeidimus.
               
            
                  c)
               
               
                  Reikėtų ištirti gyvūnų, kurie veikiami kitomis medžiagos dozėmis, organus, paveikiamus medžiaga.
               
            
                  d)
               
               
                  Jei naudojamos žiurkės, reikėtų histopatologiniu aspektu ištirti gyvūnų, kurie veikiami mažomis ir tarpinėmis medžiagos dozėmis, plaučius tam, kad įsitikinti, jog jie nėra užkrėsti, nes šituo remiantis nesunkiai galima įvertinti gyvūnų sveikatos būklę. Vėliau šių gyvūnų nebereikia tirti histopatopatologiniu aspektu, tačiau būtina atlikti gyvūnų, kurie veikiami didele medžiagos doze, histopatologinę analizę.
               
            
                  e)
               
               
                  Kai naudojama pagalbinė grupė, tai reikia atlikti audinių ir organų, kuriuose, tiriant kitas gyvūnų grupes, paveiktas tiriamąja medžiaga, buvo pastebėti medžiagos sukelti efektai, histopatologinę analizę.
               
            2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje, gyvūnų, kuriuose buvo pastebėti pažeidimai, skaičius, pažeidimų tipai bei gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo pažeidimai, skaičius, išreikštas procentais. Rezultatus reikėtų vertinti atitinkamu statistiniu metodu. Galima naudoti bet kokį statistinį metodą, vartojamą visuotinu mastu.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Jei įmanoma, tai tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  rūšis, veislė, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos, pašaras,
               
            
                  —
               
               
                  tyrimo sąlygos,
               
            
                  —
               
               
                  dozės lygiai (įskaitant prietaisą, jei šis buvo naudojamas) ir koncentracijos,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie toksinį atsaką pagal tirtą lytį ir duotą dozę,
               
            
                  —
               
               
                  jei įmanoma, dozės lygis, kuriam esant jokių efektų nebuvo pastebėta,
               
            
                  —
               
               
                  mirties laikas arba tyrimo metu, arba jei gyvūnai išliko iki numarinimo,
               
            
                  —
               
               
                  toksinių ir kitų efektų apibūdinimas (ypač atkreipiant dėmesį į klinikinių tyrimų duomenis),
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių pastebėjimo momentas,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie pašarą bei kūno masę,
               
            
                  —
               
               
                  oftalmologinių stebėjimų rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  naudoti hematologiniai tyrimai ir jų metu gauti rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  naudoti klinikinės biochemijos tyrimai ir jų metu gauti visi (įskaitant bet kurios šlapimo analizės) duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  skrodimo metu gauti duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  visų histopatologinių tyrimų metu gautų duomenų detalus apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų statistinė analizė, jei įmanoma,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aiškinimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.29.   PUSIAU CHRONINIS ĮKVĖPIMO TOKSIŠKUMO TYRIMAS 90 DIENŲ TRUNKANTIS KARTOTINĖS ĮKVEPIAMOS DOZĖS TYRIMAS GRAUŽIKŲ RŪŠYSE
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Tiriamąja medžiaga laipsniškomis koncentracijomis veikiama keletas eksperimentinių gyvūnų grupių kiekvieną dieną apibrėžtą laikotarpį, vienos grupės gyvūnus veikiant vienos koncentracijos medžiaga 90 dienų laikotarpiu. Kai naudojamas prietaisas, norint pasiekti atitinkamą tiriamosios medžiagos koncentraciją atmosferoje, turėtų būti naudojama kontrolinė grupė, kurios gyvūnai veikiami medžiaga to prietaiso pagalba. Veikimo metu gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną tam, kad būtų registruojami toksinių efektų pasireiškimo požymiai. Gyvūnai, kurie nugaišta tyrimo metu, skrodžiami, o atlikus tyrimą visi tie gyvūnai, kurie liko gyvi.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      1.6.1.   Pasirengimas
      
      Prieš tyrimą gyvūnai mažiausiai 5 dienas yra laikomi eksperimentinėje fermoje, kur jie šeriami. Prieš pradedant tyrimą sveiki gyvūnų jaunikliai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes. Jei būtina, kartu su tiriamąja medžiaga, kuria veikiama, naudojamas atitinkamas prietaisas, kuris sukuria atitinkamą tiriamosios medžiagos koncentraciją atmosferoje. Jei dozavimui naudojamas prietaisas ar kiti priedai, tai jie neturėtų sukelti toksinių efektų. Jei yra reikalinga, tai galima naudotis anksčiau vykdytų tyrimų duomenimis.
      1.6.2.   Tyrimo sąlygos
      
      
         Eksperimentiniai gyvūnai
      
      Tinkamiausia naudoti gyvūnų rūšis – žiurkės, nebent yra kontraindikacijų. Reikėtų naudoti įprastinius jaunų sveikų gyvūnų laboratorinius kamienus ir geriausia pradėti duoti medžiagą dozėmis, kai bet kuriuo atveju žiurkės yra šešių ir ne daugiau kaip aštuonerių savaičių amžiaus. Naudojamų gyvūnų kūno masės nukrypimas tyrimo pradžioje neturėtų būti didesnis nei ± 20 % vidutinės kūno masės. Jei prieš pradedant ilgalaikį tyrimą, yra atliekamas pusiau chroninis įkvėpimo tyrimas, tai abiejų tyrimų metu yra naudojamos tos pačios rūšys ir kamienai.
      
         Skaičius ir lytis
      
      Esant kiekvienai medžiagos, kuria veikiama, koncentracijai, reikėtų naudoti mažiausiai 20 gyvūnų (10 patelių ir 10 patinėlių). Patelės turėtų būti dar negimdžiusios ir ne nėščios. Jeigu numatoma atlikti gyvūnų, esančių grupėje, numarinimą, tiriamų gyvūnų skaičius turi būti padidintas tiek, kiek gyvūnų planuojama numarinti prieš pasibaigiant tyrimui. Be to, 90 dienų laikotarpiu papildoma 20 (po 10 kiekvienos lyties) gyvūnų grupė gali būti veikiama didele tiriamosios medžiagos koncentracija, kad praėjus mėnesiui po veikimo būtų stebimas toksinių efektų grįžtamumas, išlikimo pastovumas bei pavėluotas pasireiškimas.
      
         Medžiagos, kuria veikiama, koncentracijos
      
      Turėtų būti naudojamos mažiausiai 3 tiriamosios bei viena kontrolinė koncentracijos. Išskyrus tą laikotarpį, kai veikiama tiriamąja medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turėtų būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamosios grupės individai. Esant didžiausiai koncentracijai, turėtų pasireikšti toksiniai efektai, tačiau ši koncentracija neturėtų būti mirtina arba jei mirtina, tai tik keletas individų turi nugaišti. Mažiausia koncentracija neturėtų sukelti jokio toksiškumo. Ši koncentracija turėtų būti mažesnė nei toji, kuri vartojama praktiškai įvertinant poveikį žmogui. Geriausia būtų, kad vidutinė koncentracija sukeltų minimalius toksiškumo požymius. Jeigu naudojama daugiau nei viena vidutinė koncentracija, tai koncentracijos turi būti padalijamos taip, kad toksiškumo požymiai pasireikštų laipsniškai. Kontrolinės grupės ir grupių, kurios veikiamos mažomis bei tarpinėmis koncentracijomis, gyvūnų mirtingumas turėtų būti toks, kad būtų galima įvertinti rezultatų reikšmingumą.
      
         Veikimo trukmė
      
      Tyrimų kameroje suvienodinus esančios ore medžiagos koncentracijas, kasdien atliekamas veikimas turėtų trukti šešias valandas.
      
         Prietaisas
      
      Gyvūnai turėtų būti tiriami įkvėpimo tyrimui skirtu prietaisu, suprojektuotu taip, kad palaikytų pastovų dinaminį oro srautą vykstant mažiausiai 12 oro pasikeitimų per valandą tam, kad užtikrintų tinkamą deguonies koncentraciją anksčiau pasiskirsčiusiame ore, kuriuo veikiama. Jei naudojama kamera, ji turėtų būti sukonstruota taip, kad gyvūnai joje būtų kuo mažiau susigrūdę, o tiriamoji medžiaga kuo geriau patektų į gyvūnų kvėpuojamąjį traktą. Tam, kad būtų užtikrintas kameroje esančio oro pastovumas, tūris, kurį užima tiriamieji gyvūnai, neturėtų viršyti 5 % tyrimui naudojamos kameros tūrio. Kameroje esančius gyvūnus galima veikti tiriamąja medžiaga, šiai patenkant į gyvūnų organizmą per burną ir nosį arba per visą kūno paviršių; pirmieji du medžiagos patekimo būdai labai sumažina medžiagos patekimą į organizmą kitais būdais.
      
         Stebėjimų laikotarpis
      
      Visi gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną ir registruojami toksiškumo požymiai, nurodant jų pasireiškimo pradžią, laipsnį ir trukmę. Reikėtų užregistruoti mirties laiką ir tą momentą, kai toksiškumo požymiai pasireiškia bei išnyksta.
      1.6.3.   Procedūra
      
      Geriausia, kad tiriamosios medžiagos dozė gyvūnams būtų duodama septynis kartus per savaitę 90 dienų laikotarpiu. Bet kokios kitos pagalbinės grupės gyvūnai turi būti laikomi dar mėnesiui ir neduodant jiems medžiagos tam, kad būtų stebimas jų organizmo atsistatymas po toksinio poveikio arba toksinių efektų pasireiškimo pastovumas. Tyrimo metu turėtų būti palaikoma 22 ± 3 oC temperatūra. Optimali santykinė drėgmė turėtų būti 30–70 %, tačiau kai kuriais atvejais (pvz., tiriant aerozolius) tai nebūtina. Veikimo metu pašaras ir girdymas turėtų išlikti nepakitę.
      Reikėtų naudoti dinaminę įkvėpimo sistemą kartu su atitinkama analitine koncentracijos kontrolės sistema. Atitinkamos medžiagos, kuria veikiama, koncentracijoms nustatyti reikėtų atlikti bandomąjį tyrimą. Oro srautą reikėtų sureguliuoti taip, kad būtų užtikrintos homogeniškos sąlygos kameroje, kurioje veikiama tiriamąja medžiaga. Sistema turėtų užtikrinti, kad veikimo sąlygų pastovumas būtų pasiekiamas kaip galima greičiau.
      Matavimai ar stebėjimas turėtų būti grindžiamas:
      
                  a)
               
               
                  oro srauto intensyvumu (pastoviai);
               
            
                  b)
               
               
                  tikrąja tiriamosios medžiagos, esančios kvėpuojamojoje zonoje, koncentracija. Atliekant veikimą kasdien, tiriamosios medžiagos koncentracija neturėtų keistis ±15 % vidutinės vertės. Tačiau dulkių ir aerozolių atveju toks kontrolės lygis nebūtinas ir priimtinos platesnės ribos. Kasdieninės koncentracijos turėtų būti palaikomos kuo pastovesnės. Kuriant palaikančiąją sistemą, reikėtų atlikti dalelių dydžio analizę tam, kad būtų užtikrintas aerozolių koncentracijų pastovumas. Veikimo metu reikėtų kaip galima dažniau atlikti analizę tam, kad būtų nustatomas dalelių pasiskirstymo pastovumas;
               
            
                  c)
               
               
                  temperatūra ir drėgmė;
               
            
                  d)
               
               
                  atliekamo ir po jo sekančio veikimo metu užregistruojami ir sistemingai protokoluojami stebėjimai; reikėtų atskirai registruoti kiekvieną gyvūną. Visus gyvūnus reikėtų stebėti kasdien ir registruoti toksiškumo požymius, įskaitant požymių pasireiškimo laiką, laipsnį bei trukmę. Stebint narveliuose laikomus gyvūnus, reikia registruoti odos bei kailio, o taip pat akių ir gleivinių membranas bei kvėpavimo, apytakos, autonominės bei centrinės nervų sistemos pokyčius, somatomotorinį aktyvumą ir elgseną. Kiekvieną savaitę reikėtų įvertinti pašaro suvartojimą (ir vandens suvartojimą kai tiriamoji medžiaga yra duodama su geriamu vandeniu) bei pasverti gyvūnus. Reikėtų kiek įmanoma pastoviau stebėti gyvūnus tam, kad užtikrinti, jog šie nebūtų prarandami tyrimo metu dėl tokių priežasčių kaip kanibalizmas, audinių autolizė bei laikymo vietos praradimas. Baigiantis tyrimui, visi likę gyvi nepagalbinės grupės gyvūnai, nepaveikti tiriamąja medžiaga yra skrodžiami. Nugaišę gyvūnai turėtų būti pašalinami ir, kai nurodyta, skrodžiami.
               
            Įprastai visi gyvūnai, įskaitant ir kontrolinius individus, tiriami taip:
      
                  a)
               
               
                  prieš pradedant duoti tiriamąją medžiagą bei pasibaigus tyrimui, panaudojant oftalmoskopą ar jam ekvivalentišką tinkamą prietaisą, turėtų būti ištiriamos visų, bet pirmiausia gavusių didžiausią dozę ir priklausančių kontrolinei grupei, gyvūnų akys. Jeigu nustatomi pokyčiai akyse, reikėtų ištirti visus gyvūnus;
               
            
                  b)
               
               
                  baigiantis tyrimui reikėtų įvertinti tokius hematologinius rodiklius kaip hematokritas, hemoglobino koncentracija, eritrocitų skaičius, absoliutus bei skirtingų populiacijų leukocitų skaičius bei nustatyti krešėjimo potencialą, remiantis tokiais rodikliais, kaip krešėjimo trukme, protrombino ir tromboplastino susidarymo trukme arba kraujo plokštelių (trombocitų) skaičiumi;
               
            
                  c)
               
               
                  baigiantis tyrimui reikėtų atlikti kraujo biocheminius tyrimus. Atliekant šiuos tyrimus, reikėtų, jei reikalinga, nustatyti elektrolitų balansą, angliavandenių metabolizmą bei įvertinti kepenų ir inkstų veiklą. Parenkant specifinius tyrimus, reikėtų atsižvelgti į tiriamosios cheminės medžiagos veikimo būdo tyrimo metu gautus duomenis. Siūloma nustatyti kalcį, fosforą, chlorą natrį, kalį, badavimo metu susidarančią gliukozę (atsižvelgiant į konkrečiai gyvūnų rūšiai galimą badavimo laikotarpį), serumo glutamato piruvato transaminazę (4), serumo glutamato oksalacetato transaminazę (5), ornitino dekarboksilazę, y glutamino transpeptidazę, šlapale esantį azotą, albuminą, bendrą bilirubino, esančio kraujo kreatinine, kiekį bei atlikti serumo baltymų bendro kiekio nustatymą. Kitiems tyrimams, kurie gali būti reikalingi tam, kad būtų atliktas pakankamas toksikologinis įvertinimas, priklauso lipidų, hormonų rūgščių/šarmų balanso, methemoglobino ir cholinesterazės aktyvumo nustatymas. Papildomi biocheminiai tyrimai gali būti atliekami tuo atveju, kai būtina detaliau išnagrinėti nustatytus reiškinius.
               
            
                  d)
               
               
                  nereikalaujama, kad šlapimo analizė būtų atliekama pagal nusistovėjusią tvarką, išskyrus tuos atvejus, kai remiantis duomenimis, numatomas arba nustatomas toksiškumas.
               
            Jeigu anksčiau atliktų pagrindinių tyrimų duomenys laikomi nepakankamais, prieš pradedant duoti dozes reikia apsvarstyti hematologinių ir klinikinių biocheminių parametrų nustatymą.
      
         Pagrindinis skrodimas
      
      Turėtų būti atliktas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, kurio metu tiriamas kūno išorinis paviršius, visos angos, kiaušo, krūtinės ir pilvo ertmės bei jų turinys. Po skrodimo kuo skubiau pasveriamos inkstai, kepenys, antinksčiai ir kiaušinėliai tam, kad būtų išvengta jų džiūties. Vėlesniems histopatologiniams tyrimams turėtų būti išsaugomi tokie audiniai ir organai, laikomi tinkamoje terpėje: visi esminiai pažeidimai, plaučiai, kurie turėtų būti išimti nepažeisti, pasverti ir apdoroti tinkamu fiksatyvu tam, kad būtų išlaikyta plaučių struktūra (efektyvi procedūra – perfuzija fiksatyvu), smegenys – įskaitant pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūvius, smegenėlių ir smegenų žievę, hipofizė, tiroidinė/paratiroidinė liauka, bet koks užkrūčio liaukos audinys, trachėja ir plaučiai, širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys, blužnis, inkstai, antinksčiai, kasa, lytinės liaukos, gimda (pagalbiniai lytiniai organai), (oda), tulžis (jei yra duomenys), stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, tuščioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, riestoji žarna, šlapimo pūslė, pagrindinis (didysis) limfmazgis, (moterų pieno liauka), (šlaunies raumenynas), periferinis nervas, krūtinkaulis su kaulų čiulpais, (akys), (šlaunikaulis, įskaitant ir segmentinį paviršių), (stuburo smegenys trimis lygiais – sprando, krūtinės ląstos ir juosmens). Audinius, paminėtus skliausteliuose, reikia tirti tik tada, kai nustatomas toksiškumas arba tiriamas medžiagos poveikis į tikslinį organą.
      
         Histopatologinis tyrimas:
      
      
                  a)
               
               
                  reikėtų visapusiškai histopatologiškai ištirti kontrolinės grupės ir tos grupės, kuriai duodama didelė medžiagos dozė, gyvūnus;
               
            
                  b)
               
               
                  reikėtų ištirti visus pagrindinius pažeidimus;
               
            
                  c)
               
               
                  reikėtų ištirti gyvūnų, kurie veikiami kitomis medžiagos dozėmis, organus, paveikiamus medžiaga;
               
            
                  d)
               
               
                  mažų ir vidutinių dozių grupių gyvūnų plaučiai taip pat turėtų būti ištirti histopatologiškai, kadangi tai gali padėti lengviau įvertinti gyvūnų sveikatos būklę. Tolesnė šių grupių gyvūnų histopatologinė analizė neprivaloma. Tačiau visada būtina ištirti didelių dozių grupės gyvūnų organus, turinčius pažeidimo požymių;
               
            
                  e)
               
               
                  kai naudojama pagalbinė grupė, tai reikia atlikti audinių ir organų, kuriuose, tiriant kitas gyvūnų grupes, paveiktas tiriamąja medžiaga, buvo pastebėti medžiagos sukelti efektai, histopatologinę analizę.
               
            2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje, gyvūnų, kuriuose buvo pastebėti pažeidimai, skaičius, pažeidimų tipai bei gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo pažeidimai, skaičius, išreikštas procentais. Rezultatus reikėtų vertinti atitinkamu statistiniu metodu. Galima naudoti bet kokį visuotinai vartojamą statistinį metodą.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Jei įmanoma, tai tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  rūšis, veislė, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos, pašaras,
               
            
                  —
               
               
                  tyrimo sąlygos:
                  Aparato, kuris naudojamas veikimui medžiaga, aprašymas: įskaitant konstrukciją, tipą, išmatavimus, oro šaltinį, dalelių ir aerozolių sukūrimo sistemą, vėdinimo metodą, veikimą iškvėptu oru ir gyvūnų laikymo kameroje, kai ji naudojama, metodą. Reikėtų aprašyti matuojamą temperatūrą, drėgmę ir, jei reikia, aerozolių koncentracijų arba dalelių dydžio stabilumą.
                  Veikimo metu gauti duomenys: duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant vidurkius ir variacijos dydį (pvz., standartinį nukrypimą) ir pateikiant:
                  
                              a)
                           
                           
                              oro srauto, pereinančio per įkvėpimo įrangą, greičius;
                           
                        
                              b)
                           
                           
                              oro temperatūrą ir drėgmę;
                           
                        
                              c)
                           
                           
                              nominalias koncentracijas (absoliutus įkvėpimo įrangoje esantis tiriamosios medžiagos kiekis, padalytas iš oro tūrio);
                           
                        
                              d)
                           
                           
                              prietaiso, jei jis naudojamas, pobūdį;
                           
                        
                              e)
                           
                           
                              tikrąsias koncentracijas, esančias tiriamoje kvėpuojamoje zonoje;
                           
                        
                              f)
                           
                           
                              vidutinius dalelių dydžius (jei įmanoma nurodyti):
                           
                        
            
                  —
               
               
                  duomenys apie toksinį atsaką pagal tirtą lytį ir duotą dozę,
               
            
                  —
               
               
                  jei įmanoma, duomenų lygis, kuriam esant, jokių efektų nebuvo pastebėta,
               
            
                  —
               
               
                  mirties laikas arba tyrimo metu, arba jei gyvūnai išliko iki numarinimo,
               
            
                  —
               
               
                  toksinių ir kitų efektų apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių pastebėjimo momentas,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie pašarą bei kūno masę,
               
            
                  —
               
               
                  oftalmologinių stebėjimų rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  naudoti hematologiniai tyrimai ir jų metu gauti rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  naudoti klinikinės biochemijos tyrimai ir jų metu gauti visi (įskaitant bet kurios šlapimo analizės) duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  skrodimo metu gauti duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  visų histopatologinių tyrimų metu gautų duomenų detalus apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų statistinė analizė (jei įmanoma),
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aiškinimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.30.   CHRONINIS TOKSIŠKUMO TESTAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Tiriamoji medžiaga paprastai duodama septynis kartus per savaitę atitinkamu būdu keletui eksperimentinių gyvūnų grupių, vieną dozę duodant vienai grupei didžiąją gyvūnų gyvenimo dalį. Veikimo tiriamąja medžiaga ir jam pasibaigus eksperimentiniai gyvūnai stebimi kasdien, siekiant nustatyti toksiškumo požymius.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      Pasiruošimas tyrimui
      Prieš tyrimą mažiausiai 5 dienas gyvūnai yra laikomi ir šeriami eksperimentinėje fermoje. Prieš pradedant tyrimą sveiki gyvūnų jaunikliai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes.
      Tyrimo sąlygos
      
         Eksperimentiniai gyvūnai
      
      Labiausiai naudojama rūšis yra žiurkės.
      Remiantis anksčiau atliktų tyrimų duomenimis, gali būti naudojamos ir kitos (graužikų arba negraužikų) rūšys. Reikėtų naudoti įprastinių laboratorinių kamienų gyvūnų sveikus jauniklius ir medžiagos davimas doze turėtų prasidėti iškart po atjunkymo.
      Tyrimo pradžioje kūno masės variacijos ribos turėtų neviršyti ± 20 % kūno masės vidurkio. Jei prieš ilgalaikį tyrimą yra atliekamas pusiau chroninis oralinis tyrimas, tai abiejų tyrimų metu reikėtų naudoti tos pačios rūšies ar kamieno gyvūnus.
      
         Skaičius ir lytis
      
      Duodant medžiagą skirtinga doze graužikams ir kartu naudojant kontrolinę grupę, reikėtų naudoti mažiausiai 40 gyvūnų (20 patelių ir 20 patinėlių). Patelės turi būti negimdžiusios ir ne nėščios. Jei numarinimai numatomi iš anksto, tai tiriamų gyvūnų skaičius padidinamas padidinant gyvūnų, kuriuos numatoma numarinti prieš užbaigiant tyrimą, skaičių.
      Negraužikų atveju priimtina, kad būtų naudojamas mažesnis gyvūnų skaičius, tačiau kiekvienoje grupėje turi būti mažiausiai po 4 kiekvienos lyties gyvūnus.
      
         Dozė ir veikimo dažnumas
      
      Turėtų būti naudojamos mažiausiai 3 tiriamosios dozės naudojant kontrolinę grupę. Didžiausia dozė turėtų sukelti aiškiai pasireiškiantį toksiškumą, nesukeliant perteklinio mirtingumo. Mažiausia dozė neturėtų sukelti akivaizdaus toksiškumo.
      Tarpinė dozė turėtų būti išdėstyta tarp aukščiausios ir žemiausios dozių.
      Pasirenkant dozes reikėtų remtis anksčiau atliktų toksiškumo tyrimų ir testų duomenimis.
      Veikimas turėtų būti atliekamas kasdien.
      Jei cheminė medžiaga duodama sumaišius ją su vandeniu ar pašaru, ji turėtų būti pastoviai prieinama.
      
         Kontrolė
      
      Kartu reikėtų naudoti kontrolinę grupę, identišką grupėms, kurios veikiamos, bet kuriuo aspektu, išskyrus veikimą tiriamąja medžiaga.
      Ypatingais atvejais, tokiais kaip įkvėpimo tyrimai naudojant aerozolius arba oraliniai tyrimai naudojant nežinomo biologinio aktyvumo emulsiklius, reikėtų taipogi naudoti ir neigiamą kontrolinę grupę. Neigiama kontrolinė grupė veikiama tuo pačiu būdu kaip ir tiriamosios grupės, išskyrus tai, kad gyvūnai neveikiami jokia tiriamąja medžiaga nei prietaisu.
      
         Davimo būdas
      
      Duodama paprastai dviem būdais – per burną ir kvėpuojamąjį traktą. Davimo būdo pasirinkimas priklauso nuo tiriamosios medžiagos fizikinių ir cheminių ypatybių ir panašaus veikimo būdo žmonių tarpe.
      Duodant per odą susiduriama su didelėmis praktinio pobūdžio problemomis. Chroninis sisteminis toksiškumas, atsirandantis dėl poodinės absorbcijos, įprastiniu atveju gali įtakoti kito oralinio testo metu gaunamus duomenis ir gaunama daug informacijos apie poodinės absorbcijos, įvertintos, anksčiau atlikus poodinio toksiškumo testus, perteklių.
      
         Oraliniai tyrimai
      
      Jei tiriamoji medžiaga absorbuojama iš virškinamojo trakto ir jei šis įsisavinimo būdas yra vienas iš būdų, kuriuo žmonės susiduria su tiriamąja medžiaga, tai pasirenkamas davimo per burną būdas, nebent nustatomos kontraindikacijos. Gyvūnai gali gauti tiriamąją medžiagą su maistu, ištirpintą vandenyje arba su kapsule. Geriausia, kad dozavimas būtų atliekamas septynis kartus per savaitę kasdien, nes dozuojant penkis kartus per savaitę gali paskatinti atsistatymą bei pašalinti toksiškumą tuo metu, kai nėra dozuojama ir šitai gali turėti įtakos gaunamiems rezultatams bei vėliau atliekamam jų įvertinimui. Tačiau pirmiausia, remiantis praktiniu patyrimu, rekomenduojama vykdyti dozavimą penkis kartus per savaitę.
      
         Įkvėpimo tyrimai
      
      Dėl to, kad įkvėpimo tyrimuose susiduriama su didesnėmis techninėmis problemomis nei duodant tiriamąją medžiagą kitais būdais, čia pateikiamas detalus vadovas, nurodantis kaip duoti medžiagą šiuo būdu. Reikėtų pažymėti, kad ypatingų situacijų atveju lašinimas į trachėją yra alternatyvus problemos sprendimo būdas.
      Atliekant ilgalaikius veikimus, paprastai remiamasi veikimu žmonių atžvilgiu, veikiant gyvūnus kasdien šešias valandas po to, kai suvienodinamos koncentracijos kameros viduje, penkiskart per savaitę (protarpinis veikimas) arba, atsižvelgiant į galimą aplinkos veikimą, veikiama 22–24 valandas per dieną septynis kartus per savaitę (pastovus veikimas), vieną valandą per dieną šeriant kameroje laikomus gyvūnus tuo pačiu metu.
      Abiem atvejais gyvūnai pastoviai veikiami nustatytomis tiriamosios medžiagos koncentracijomis. Pagrindinis protarpinio ir pastoviojo veikimų skirtumas yra tai, kad protarpinis veikimas užtrunka 17–18 valandų, per kurias gyvūnai atsigauna po efektų, atsiradusių dėl kasdieninio veikimo, o šitai užtrunka žymiai ilgiau savaitgaliais.
      Protarpinio ar pastoviojo veikimo pasirinkimas priklauso nuo tyrimo tikslų bei nuo žmogaus veikimo, kuris turi būti imituojamas. Tačiau reikia apsvarstyti ir konkrečius techninius sunkumus. Pavyzdžiui, pastoviojo veikimo teikiamų privalumų, imituojant aplinkos sąlygas, reikia atsisakyti, nes veikimo metu gyvūnus reikia šerti ir girdyti ir dėl to, kad reikia sukurti žymiai sudėtingesnį (bei labiau patikimesnį) aerozolį ir garus bei imtis priežiūros.
      
         Veikimo kamera
      
      Gyvūnai turėtų būti tiriami įkvėpimo tyrimui skirta įranga, suprojektuota taip, kad palaikytų pastovų dinaminį oro srautą vykstant mažiausiai 12 oro pasikeitimų per valandą tam, kad užtikrintų tinkamą deguonies koncentraciją anksčiau pasiskirsčiusiame ore, kuriuo veikiama. Kontrolinė kamera bei toji, kurioje atliekamas veikimas turėtų būti identiškos pagal konstrukciją ir modelį tam, kad veikimo sąlygos visais aspektais būtų užtikrintos, išskyrus veikimą tiriamąja medžiaga. Nežymus neigiamas slėgis kameros viduje paprastai palaikomas tam, kad tiriamoji medžiaga nepatektų į supančią aplinką. Tiriami gyvūnai kamerose turėtų būti nesusigrūdę. Siekiant užtikrinti kameros oro stabilumą, tūris, kurį užima tiriamieji gyvūnai, neturėtų viršyti 5 % tyrimui naudojamos kameros tūrio.
      Reikėtų atlikti tokius matavimus arba priežiūrą:
      
                  i)
               
               
                  oro srautas: oro srauto, patenkančio per kamerą, greitis turi būti pastoviai prižiūrimas;
               
            
                  ii)
               
               
                  koncentracija: kasdieninio veikimo metu tiriamosios medžiagos koncentracija neturėtų peržengti ± 15 % vidutinės vertės;
               
            
                  iii)
               
               
                  temperatūra ir drėgmė: graužikų atveju temperatūra turėtų būti palaikoma 22 ± 2 oC ir drėgmė kameroje turėtų siekti nuo 30 % iki 70 %, išskyrus tą atvejį, kai naudojamas vanduo tam, kad tiriamoji medžiaga virstų suspensija kameros atmosferoje. Reikėtų pastoviai stebėti temperatūrą bei drėgmę;
               
            
                  iv)
               
               
                  dalelių dydžio matavimai: reikėtų nustatyti kameros atmosferoje esančių dalelių, įskaitant skysčius ar kietuosius aerozolius, dydžius. Aerozolių dalelės turėtų būti tokio dydžio, kad naudojamas tiriamasis gyvūnas jas galėtų įkvėpti. Kameros atmosferos mėginiai turėtų būti įnešami į gyvūnų kvėpuojamąją zoną. Oro mėginys, remiantis gravimetrine analize, turėtų atspindėti dalelių, kuriomis gyvūnai veikiami, pasiskirstymą ir visus aerozolius, esančius suspensijoje, netgi jei didžioji aerozolio dalis nėra įkvepiama. Dalelių dydį reikėtų nustatinėti kaip galima dažniau, kuriant sistemą tam, kad būtų užtikrintas aerozolio stabilumas ir po to kuo dažniau veikimų metu tam, kad būtų galima tinkamai nustatyti dalelių, kuriomis gyvūnai veikiami, pasiskirstymą.
               
            
         Tyrimo trukmė
      
      Davimas turėtų trukti mažiausiai 12 mėnesių.
      Procedūra
      
         Stebėjimai
      
      Detalus klinikinis tyrimas turėtų būti atliekamas vienąkart per dieną. Kasdien reikėtų atlikti papildomus stebėjimus ir imtis atitinkamų veiksmų sumažinti gyvūnų gaišimą tyrimo metu, pavyzdžiui, skrosti ar užšaldyti tuos gyvūnus, kurie buvo rasti nugaišę ir izoliuoti ar numarinti silpnus bei mirštančius gyvūnus. Reikėtų kruopščiai nustatyti toksinių efektų pasireiškimo laiką bei eigą, o taip pat sumažinti gyvūnų gaišimą dėl ligos, autolizės ar kanibalizmo.
      Turėtų būti registruojami visų gyvūnų klinikiniai požymiai, įskaitant regos bei neurologinius pokyčius, o taip pat mirtingumas. Reikėtų registruoti ir toksinių sąlygų, įskaitant ir įtariamus auglius, pasireiškimo laiką bei eigą.
      Pirmųjų trylikos tyrimo savaičių bėgyje kartą per savaitę reikėtų registruoti visų gyvūnų kūno masę ir po to vienąkart per savaitę kas mėnesį. Pirmųjų 13 tyrimo savaičių bėgyje kas savaitę reikėtų įvertinti pašaro įsisavinimą ir vėliau kas trys mėnesiai, nebent sveikatos būklė ar svoris verčia elgtis kitaip.
      
         Hematologinis tyrimas
      
      Reikėtų atlikti hematologinį tyrimą (pvz., nustatant hemoglobino kiekį, eritrocitų užimamą tūrį kraujyje absoliutų eritrocitų, leukocitų ir trombocitų skaičių arba kitus rodiklius kraujo krešėjimo aktyvumui įvertinti) praėjus trims, šešiems mėnesiams, o paskui kas pusę metų, surenkant kraujo mėginius iš visų negraužimų ir iš 10 kiekvienos lyties ir visų grupių žiurkių. Jei įmanoma, kraujo mėginiai imami iš tų pačių žiurkių tokiu pačiu laiko intervalu. Be to, iš negraužikų reikėtų paimti išankstinius mėginius tyrimui.
      Jei, remiantis klinikiniais stebėjimais, spėjama, kad tyrimo metu sutriko gyvūnų sveikata, paveiktų gyvūnų kraujo analizė turėtų būti atliekama kitaip.
      Gyvūnų, kuriems buvo duota didžiausia medžiagos dozė bei kontrolinės grupės individų kraujo mėginių analizė atliekama kitu būdu. Kitos grupės (ar grupių), kuriai (-ioms) buvo duota mažesnė dozė, kraujo analizė atliekama kitaip, jei tarp didžiausią dozę gavusios ir kontrolinės grupės egzistuoja pagrindinis skirtumas arba tai buvo nustatyta patologinių tyrimų metu.
      
         Šlapimo analizė
      
      Šlapimo mėginiai, turėtų būti paimti iš visų negraužimų ir iš 10 kiekvienos lyties ir visų grupių graužikų, jei įmanoma, tų pačių kaip ir hematologiniam tyrimui. Mėginiai, paimti arba iš atskirų gyvūnų, arba mėginių rinkinys, paimtas iš vienos lyties ar graužikų grupės, turėtų būti ištirti taip:
      
                  —
               
               
                  išorė: individualaus gyvūno šlapimo tūris bei tankis,
               
            
                  —
               
               
                  baltymų, gliukozės, ketonų, paslėpto kraujo kiekis (pusiau kiekybiškai),
               
            
                  —
               
               
                  nuosėdų mikroskopinis vaizdas (pusiau kiekybiškai).
               
            
         Klinikinė chemija
      
      Maždaug kas šešis mėnesius ir tyrimo pabaigoje iš visų negraužikų bei 10 kiekvienos lyties ir visų grupių žiurkių, jei įmanoma, iš tų pačių žiurkių esant tam pačiam laiko tarpui, turėtų būti surenkami kraujo mėginiai, kad vėliau būtų ištirti klinikinės chemijos aspektu. Be to iš visų negraužikų turėtų būti paimami išankstiniai mėginiai. Paėmus mėginius, paruošiama plazma ir atliekami tokie matavimai:
      
                  —
               
               
                  absoliuti baltymo koncentracija,
               
            
                  —
               
               
                  albumino koncentracija,
               
            
                  —
               
               
                  kepenų funkciniai testai (tokie kaip šarminės fosfatazės aktyvumo nustatymo testas, glutamino piruvato transaminazės (4) aktyvumo nustatymo testas ir glutamato oksal acetato transaminazės (5) aktyvumo nustatymo testas), gama glutamiltranspeptidazė, ornitino dekarboksilazė,
               
            
                  —
               
               
                  angliavandenių metabolizmas, įvertinant gliukozės kraujyje trūkumą,
               
            
                  —
               
               
                  inkstų funkciniai testai, tokie kaip šlapalo nustatymas kraujyje.
               
            
         Pagrindinis skrodimas
      
      Turėtų būti atliktas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, įskaitant tuos kurie nugaišo eksperimentų metu arba buvo numarinti tada, kai buvo nustatyta, jog jie miršta. Prieš numarinimą turėtų būti paimti visų gyvūnų kraujo mėginiai tam, kad būtų atlikta diferencinė kraujo analizė. Visi akivaizdžiai matomi sutrikimai, augliai ar sutrikimai, kurie, kaip įtariama, gali būti augliai, turėtų būti užkonservuoti. Reikėtų stengtis rasti sąsajas tarp pagrindinių stebėjimų ir mikroskopinių analizių.
      Histopatologiniams tyrimams turėtų būti išsaugomi tokie audiniai ir organai: smegenys (6) (pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūviai, smegenėlių ir smegenų žievės), hipofizė, tiroidinė liauka (įskaitant paratiroidinę liauką), užkrūčio liauka, plaučiai (įskaitant trachėją), širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys (6), blužnis, inkstai (6), antinksčiai (6), stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, tuščioj i žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, riestoji žarna, gimda, šlapimo pūslė, limfmazgiai, kasa, lytinės liaukos (6), pagalbiniai lytiniai organai, moterų pieno liauka, oda, raumenynas, periferinis nervas, stuburo smegenys (sprando, krūtinės ląstos ir juosmens), krūtinkaulis su kaulų čiulpais, šlaunikaulis (įskaitant ir segmentinį paviršių) bei akys. Plaučių ir šlapimo pūslės pripildymas fiksuojančiąja medžiaga yra optimalus būdas išsaugoti šiuos audinius; plaučių pripildymas įkvėpimo tyrimuose yra svarbus atitinkamų histopatologinių tyrimų aspektu. Ypatingų tyrimų, tokių, kaip įkvėpimo tyrimai, atveju, reikėtų tirti visą kvėpuojamąjį traktą, įskaitant nosies ertmę, gerklas ir ryklę.
      Jei atliekami kiti klinikiniai tyrimai, tai šių procedūrų metu gauta informacija turėtų būti prieinama, atliekant mikroskopinę analizę, nes ta informacija yra pagrindinė patologo darbo gairė.
      
         Histopatologinis tyrimas
      
      Visi akivaizdūs pokyčiai, ypač bet kurio organo augliai ir kiti sutrikimai, turėtų būti tiriami mikroskopiškai. Be to, rekomenduojama atlikti tokias procedūras:
      
                  a)
               
               
                  Visų užkonservuotų organų ir audinių mikroskopinę analizę, visapusiškai apibūdinant sutrikimus, rastus:
                  
                              1.
                           
                           
                              visuose gyvūnuose, kurie nugaišo arba buvo numarinti tyrimo metu;
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              visuose tiriamosios grupės, kuriai buvo duota didelė medžiagos dozė, bei kontrolinės grupės gyvūnuose;
                           
                        
            
                  b)
               
               
                  organai arba audiniai, kurių anomalijas sukėlė arba galėjo sukelti tiriamoji medžiaga, taipogi tiriami grupės, gavusios mažą dozę, gyvūnuose;
               
            
                  c)
               
               
                  jei tyrimo metu gautas rezultatas įrodo, kad gyvūnų gyvenimo normali trukmė ypač sutrumpėjo arba atsirado efektai, galintys turėti įtakos toksiniam atsakui, tai sekanti dozė turėtų būti tiriama taip, kaip aprašyta aukščiau;
               
            
                  d)
               
               
                  manoma, kad informacija apie sutrikimų, įprastiniu atveju pasitaikančių tiriamųjų gyvūnų kamiene, dažnumą laboratorinėmis sąlygomis (pvz., remiantis anksčiau atliktų tyrimų duomenimis) yra būtina teisingai įvertinant pokyčių gyvūnuose, paveiktuose tiriamąja medžiaga, reikšmę.
               
            2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti apibendrinti pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje, gyvūnų, kuriuose buvo pastebėti pakitimai, skaičius, pakitimų tipai bei gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo pakitimai, skaičius, išreikštas procentais. Rezultatus reikėtų vertinti atitinkamu statistiniu metodu. Galima naudoti bet kokį visuotinai vartojamą statistinį metodą.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Jei įmanoma, tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  rūšis, veislė, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos, pašaras,
               
            
                  —
               
               
                  tyrimo sąlygos:
                  Aparato, kuris naudojamas veikimui medžiaga, aprašymas:
                  įskaitant konstrukciją, tipą, išmatavimus, oro šaltinį, dalelių ir aerozolių sukūrimo sistemą, vėdinimo metodą, veikimą iškvėptu oru ir gyvūnų laikymo kameroje, kai ji naudojama, metodą. Reikėtų aprašyti matuojamą temperatūrą, drėgmę ir, jei reikia, aerozolių koncentracijų arba dalelių dydžio stabilumą.
                  Veikimo metu gauti duomenys:
                  Duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant vidurkius ir variacijos dydį (pvz., standartinį nukrypimą) ir pateikiant:
                  
                              a)
                           
                           
                              oro srauto, pereinančio per įkvėpimo įrangą, greitį;
                           
                        
                              b)
                           
                           
                              oro temperatūrą ir drėgmę;
                           
                        
                              c)
                           
                           
                              nominalias koncentracijas (absoliutus įkvėpimo įrangoje esančios tiriamosios medžiagos kiekis, padalytas iš oro tūrio);
                           
                        
                              d)
                           
                           
                              tirpiklio, jei jis naudojamas, tipą;
                           
                        
                              e)
                           
                           
                              tikrąsias koncentracijas, esančias tiriamoje kvėpuojamoje zonoje;
                           
                        
                              f)
                           
                           
                              vidutinius dalelių dydžius (jei įmanoma nurodyti),
                           
                        
            
                  —
               
               
                  dozių dydžiai (įskaitant tirpiklį, jei naudojamas) ir koncentracijos vertės,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie toksinį atsaką pagal tirtą lytį ir duotą dozę,
               
            
                  —
               
               
                  nestebimo poveikio dozės dydis,
               
            
                  —
               
               
                  mirties laikas arba tyrimo metu, arba jei gyvūnai išliko iki numarinimo,
               
            
                  —
               
               
                  toksinių ir kitų efektų apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių, pastebėjimo momentas,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie pašarą bei kūno masę,
               
            
                  —
               
               
                  oftalmologinių stebėjimų rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  naudoti hematologiniai tyrimai ir jų metu gauti rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  naudoti klinikinės biochemijos tyrimai ir jų metu gauti visi (įskaitant bet kurios šlapimo analizės) duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  skrodimo metu gauti duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  visų histopatologinių tyrimų metu gautų duomenų detalus apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų statistinė analizė, jei įmanoma,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aiškinimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.31.   TOKSIŠKO POVEIKIO PRENATALINIAM VYSTYMUISI TYRIMAS
      1.   METODAS
      Šis metodas atitinka TG 414 (2001).
      1.1   ĮVADAS
      Šis toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi bandymo metodas skirtas suteikti bendros informacijos apie poveikį veisiančios patelės gimdoje augančio vaisiaus prenataliniam vystymuisi; tai gali būti poveikio motinai, iškaitant žūtį, įvertinimas, struktūrinės anomalijos arba vaisiaus augimo pakitimai. Funkciniai trūkumai, nors ir yra svarbi vystymosi dalis, nėra šio bandymo metodo sudėtinė dalis. Jie gali būti bandomi darant atskirą tyrimą arba kaip šio tyrimo papildymas, taikant neurotoksiško poveikio vystymuisi bandymo metodą. Prireikus gauti informacijos apie funkcinių trūkumų ir kito postnatalinio poveikio bandymą, reikėtų susipažinti su toksiško poveikio dviejų kartų reprodukcijai tyrimu ir neurotoksiško poveikio vystymuisi tyrimu.
      Gali tekti šį bandymo metodą specialiai pritaikyti atskiriems atvejams atsižvelgiant į konkrečias žinias, pvz., bandomosios medžiagos fizikochemines arba toksikologines savybes. Toks pritaikymas priimtinas, kai įrodantys moksliniai duomenys rodo, kad dėl to bandymas bus informatyvesnis. Tokiais atvejais šie moksliniai įrodymai turi būti kruopščiai aprašyti tyrimo ataskaitoje.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Vystymosi toksikologija – organizmo vystymuisi neigiamo poveikio, galinčio atsirasti dėl medžiagos veikimo prieš apvaisinimą, prenataliniu arba postnataliniu metu iki lytinio subrendimo, tyrimas. Pagrindinius toksiško poveikio vystymuisi požymius sudaro: 1) organizmo žūtis, 2) struktūros anomalijos, 3) augimo pakitimas ir 4) funkciniai trūkumai. Vystymosi toksikologija pirmiau buvo vadinama teratologija.
      
         Neigiamas poveikis – bet koks su apdorojimu susijęs pakitimas palyginti su etalonu, mažinantis organizmo gebą išgyventi, daugintis arba prisitaikyti prie aplinkos. Vystymosi toksikologiją plačiausia prasme sudaro bet koks poveikis, kuris trukdo apvaisinto kiaušinėlio normaliam vystymuisi, prieš gimimą ir po jo.
      
         Augimo pakitimas – palikuonio organo arba kūno masės ar dydžio pakitimas.
      
         Pakitimai (anomalijos) – struktūriniai vystymosi pakitimai, kuriuos sudaro išsigimimai ir nukrypimai (28).
      
         Išsigimimas/didelė anomalija – struktūrinis pakitimas, laikomas kenksmingu gyvūnui (be to, gali būti mirtinas) ir paprastai retas.
      
         Nukrypimas/maža anomalija – struktūrinis pakitimas, kurio kenksmingas poveikis gyvūnui yra mažas arba jo visai nėra; gali būti laikinas ir gana dažnai pasitaikyti kontrolinėje populiacijoje.
      
         Apvaisintas kiaušinėlis – apvaisinto kiaušinėlio dalių visuma bet kurioje vystymosi stadijoje nuo apvaisinimo iki gimimo, įskaitant ekstraembrionines membranas, gemalą arba vaisių.
      
         Implantacija (nidacija) – blastocistos susijungimas su gimdos epitelio gleivine, įskaitant jos prasiskverbimą per gimdos epitelį ir jos įaugimą į gleivinę.
      
         Gemalas – visų organizmų ankstyvoji arba vystymosi stadija, tiksliau apvaisinto kiaušinėlio vystymosi produktas nuo didžiosios ašies pasirodymo iki pagrindinių struktūrų atsiradimo.
      
         Toksiškas poveikis gemalui – kenksmingas poveikis normaliai struktūrai, vystymuisi, augimui, ir (arba) gemalo gyvybingumui.
      
         Vaisius – apvaisintas palikuonis postembrioniniu laikotarpiu.
      
         Toksiškas poveikis vaisiui – kenksmingas poveikis normaliai struktūrai, vystymuisi, augimui ir (arba) vaisiaus gyvybingumui.
      
         Persileidimas – apvaisintų produktų, gemalo arba negyvybingo vaisiaus priešlaikinis pašalinimas iš gimdos.
      
         Resorbcija – reiškinys, kai gimdoje implantuotas apvaisintas kiaušinėlis žūsta ir yra resorbuojamas arba buvo resorbuotas.
      
         Ankstyvoji resorbcija – implantacijos pėdsakai be atpažįstamo gemalo ar vaisiaus.
      
         Vėlyvoji resorbcija – žuvęs gemalas arba vaisius su išoriniais išsigimimą rodančiais pakitimais.
      
         NOAEL – nesančio neigiamo poveikio lygio (No observed adverse effect level) santrumpa, ir tai yra didžiausia dozė arba veikimo koncentracija, jei nepastebėtas su apdorojimu susietas neigiamas poveikis.
      1.3   ETALONINĖ MEDŽIAGA
      Nėra.
      1.4   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Paprastai bandomoji medžiaga duodama veisiančiai patelei ne vėliau kaip nuo implantacijos iki likus vienai parai iki numatyto nužudymo, kuris turi įvykti kiek įmanoma arčiau normalaus atsivedimo dienos, nerizikuojant prarasti duomenis, jei įvyktų priešlaikinis atsivedimas. Bandymų metodas nėra skirtas tik organogenezės laikotarpiui tirti (pvz., 5–15 parų graužikams, 6–18 para triušiams), juo taip pat tiriamas poveikis visą veisimo laikotarpį nuo ikiimplantacinio laikotarpio, jei tinka, iki likus vienai parai iki cezario pjūvio darymo. Prieš pat cezario pjūvio darymą patelės nužudomos, tiriamas gimdos turinys ir įvertinamos vaisiaus išoriškai matomos anomalijos bei minkštojo audinio ir griaučių pakitimai.
      1.5   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      1.5.1   Gyvūnų rūšies pasirinkimas
      Rekomenduojama bandymams pasirinkti tinkamiausią rūšį ir naudoti tas laboratorines rūšis bei veisles, kurios yra paprastai naudojamos darant toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi bandymus. Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkė, o ne graužikų – triušis. Kitos rūšies naudojimą būtina pagrįsti.
      1.5.2   Laikymo ir šėrimo sąlygos
      Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22 oC (± 3 oC) graužikams ir 18 oC (± 3 oC) triušiams. Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio.
      Poruojama šiam tikslui pritaikytuose narveliuose. Pageidautina suporuotus gyvūnus laikyti atskirai, tačiau leidžiamas laikymas nedidelėmis grupėmis.
      1.5.3   Gyvūnų ruošimas
      Naudojami sveiki ir ankstesniuose bandymuose nedalyvavę gyvūnai, kurie mažiausiai 5 paras pratinami prie laboratorinių sąlygų. Apibūdinama bandomo gyvūno rūšis, veislė, šaltinis, lytis, masė ir (arba) amžius. Kiek įmanoma, visų bandymo grupių gyvūnai turi būti vienodos masės ir amžiaus. Kiekvienai dozei naudojamos jaunos, suaugusios vados neturėjusios patelės. Patelės poruojamos su tos pačios rūšies ir veislės patinais, be to, reikėtų vengti poravimo su tų pačių tėvų palikuonimis. Graužikams 0 veisimo diena yra vaginalinio kamščio ir (arba) spermos atsiradimo diena; triušiams 0 diena paprastai yra suporavimo arba dirbtinio apvaisinimo diena, jei taikomas šis metodas. Apvaisintos patelės suskirstomos atsitiktiniu būdu į kontrolinę ir bandomą grupę. Narveliai išdėstomi taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks galimas poveikis dėl narvelio vietos. Kiekvienam gyvūnui turėtų būti priskirtas savitas identifikavimo numeris. Apvaisintos patelės nešališkai paskirstomos į kontrolinę ir bandymo grupes; jei patelės apvaisinamos grupėmis, kiekvienos grupės gyvūnai turi būti tolygiai paskirstomi į grupes. Patelės, apvaisintos to paties patino, panašiu būdu tolygiai paskirstomos tarp grupių.
      1.6   DARBO EIGA
      1.6.1   Gyvūnų skaičius ir lytis
      Kiekvienoje bandymo ir kontrolinėje grupėje turi būti pakankamas patelių skaičius, kad darant skrodimą būtų maždaug 20 patelių su implantacijos vietomis. Grupės, kuriose būtų mažiau kaip 16 patelių su implantacijos vietomis, gali netikti. Patelių gaištamumas nebūtinai turi būti bandymo rezultatų negaliojimo priežastis, jei jis nėra didesnis kaip maždaug 10 %.
      1.6.2   Dozių ruošimas
      Jei dozių ruošimui lengvinti naudojamas nešiklis arba kitas priedas, reikėtų atsižvelgti į tokias jo charakteristikas: poveikį absorbcijai, pasiskirstymui, medžiagų apykaitai ir bandomosios medžiagos sulaikymui arba išskyrimui; poveikį bandomosios medžiagos cheminėms savybėms, dėl kurių gali pasikeisti jos toksiškumo charakteristikos; poveikį maisto ar vandens suvartojimui arba gyvūnų įmitimui. Nešiklis neturi turėti toksiško poveikio vystymuisi ir reprodukcijai.
      1.6.3   Dozavimas
      Paprastai bandomosios medžiagos reikėtų duoti kasdien nuo implantacijos dienos (pvz., 5 paros po suporavimo) ir baigti dieną prieš numatytą cezario pjūvį. Jei išankstiniai tyrimai, kai jie buvo atlikti, nerodo, kad galimi ikiimplantaciniai nuostoliai, bandymą galima pratęsti ir įtraukti visą veisimo laikotarpį nuo suporavimo iki vienos paros prieš numatytą nužudymą. Gerai žinoma, kad netinkama priežiūra arba įtampa nėštumo metu gali būti prenatalinio vados netekimo priežastimi. Siekiant apsisaugoti nuo prenatalinio vados netekimo dėl veiksnių, nesusijusių su bandoma medžiaga, reikėtų be reikalo neiti prie patelių arba vengti išorinių veiksnių sukeliamos įtampos, pvz., triukšmo.
      Turi būti naudojamos mažiausiai trijų dozių grupės ir lygiagrečiai viena kontrolinė grupė. Sveiki gyvūnai paskirstomi atsitiktiniu būdu į kontrolinę ir bandomų gyvūnų grupes. Dozės koncentracijos turėtų skirtis taip, kad būtų galima graduoti toksiškumo poveikį. Jei nėra apribojimų dėl fizikocheminių arba biologinių bandomosios medžiagos savybių, didžiausia dozė pasirenkama siekiant sukelti tam tikrą toksišką poveikį vystymuisi ir (arba) patelei (klinikiniai požymiai arba kūno masės mažėjimas), bet ne žūtį arba sunkias kančias. Mažiausiai viena tarpinė dozė turėtų sukelti mažiausią stebimą toksišką poveikį. Mažiausia dozė neturėtų sukelti jokio toksiško poveikio patelei arba vaisiaus vystymuisi. Turi būti pasirinkta mažėjanti dozės koncentracijos seka siekiant parodyti kiekvieną su dozės dydžiu susietą reakciją ir nesančio neigiamo poveikio lygį (NOAEL). Mažėjančioms dozės koncentracijos vertėms nustatyti dažnai pakanka dvigubo arba keturgubo koncentracijos skirtumo; tačiau norint naudoti labai didelius intervalus tarp dozių (pvz., daugiklis didesnis kaip 10), dažnai gerai būtų pridėti ketvirtą bandymo grupę. Nors siekiama nustatyti NOAEL patelei, tyrimai, kuriais tokia koncentracija nenustatoma, gali būti taip pat priimtini (1).
      Dozių koncentracijos pasirenkamos atsižvelgiant į visus turimus toksiškumo duomenis ir papildomą informaciją apie bandomosios medžiagos arba giminingų medžiagų apykaitą ir toksikokinetiką. Be to, ši informacija padės parodyti dozavimo režimo tinkamumą.
      Lygiagrečiai naudojama kontrolinė grupė. Ši grupė turėtų būti medžiagos negaunanti kontrolinė grupė arba nešiklį gaunanti kontrolinė grupė, jei bandomajai medžiagai duoti naudojamas nešiklis. Visoms grupėms turėtų būti duodamas vienodas bandomosios medžiagos arba nešiklio tūris. Kontrolinės (-ių) grupės (-ių) gyvūnai prižiūrimi tokiu pat būdu, kaip ir bandymo grupės gyvūnai. Nešiklio kontrolinės grupės turėtų gauti nešiklio kiekį, atitinkanti didžiausią naudoj amą kiekį (kokį gauna mažiausia doze veikiama grupė).
      1.6.4   Ribinis bandymas
      Jei darant bandymą pagal šiame tyrime aprašytas metodikas su viena per burną duodama mažiausiai 1 000 mg/kg kūno masės per parą doze, toksiškas poveikis veisiančiai patelei arba jos palikuonims nepastebimas ir jei tokio poveikio nelaukiama, atsižvelgiant į turimus duomenis (pvz., giminingos struktūros ir (arba) apykaitos junginių duomenis), nebūtina daryti viso tyrimo naudojant tris dozių koncentracijas. Atsižvelgiant į laukiamą poveikį žmonėms, ribiniam bandymui gali tekti naudoti didesnes dozių per burną koncentracijas. Kalbant apie kitus davimo būdus, pvz., įkvėpimą arba veikimą per odą, bandomosios medžiagos fizikocheminės savybės dažnai gali apibrėžti ir riboti didžiausią pasiekiamą veikimo koncentraciją (pvz., dėjimas ant odos neturi sukelti sunkaus vietinio toksiško poveikio).
      1.6.5   Dozių davimas
      Bandomoji medžiaga arba nešiklis paprastai duodamas per burną, naudojant zondą. Jei naudojamas kitas davimo būdas, bandymų laboratorija turėtų pagrįsti sprendimą ir paaiškinti pasirinkimą, be to, padaryti atitinkamus būtinus pakeitimus (2) (3) (4). Bandomoji medžiaga turėtų būti duodama kiekvieną dieną maždaug tuo pačiu metu.
      Dozė atskiram gyvūnui paprastai turėtų būti nustatoma atsižvelgiant į patį paskutinį jo svėrimą. Tačiau reikia imtis atsargumo priemonių reguliuojant dozės dydį paskutinius tris veisimo mėnesius. Dozė pasirenkama atsižvelgiant į turimus duomenis, kad būtų išvengta per didelio toksiško poveikio patelei. Tačiau jei pastebimas per didelis toksiškas poveikis patelėms, tie gyvūnai turi būti humaniškai nužudomi. Jei per didelio toksiškumo požymiai pasireiškia kelioms veisiančioms patelėms, reikėtų spręsti dėl šios dozės grupės nužudymo. Kai bandomoji medžiaga duodama per zondą, gyvūnams turėtų būti duodama tik viena dozė, naudojant skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Didžiausias gyvūnui duodamas vienkartinis skysčio tūris priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Tūris neturi būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti po 2 ml/100 g kūno masės. Jei kaip nešiklis naudojamas kukurūzų aliejus, tūris neturėtų būti didesnis kaip 0,4 ml/100 g kūno masės. Bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas, keičiant koncentracij ą taip, kad visų dozių tūris būtų pastovus.
      1.6.6   Patelių stebėjimas
      Klinikinis tyrimas ir užrašai daromi mažiausiai kartą per dieną, geriau kasdien tuo pačiu laiku, atsižvelgiant į didžiausio laukiamo poveikio pasireiškimo laiką po medžiagos davimo. Užrašoma gyvūnų būklė, įskaitant gaištamumą, liguistumą, atitinkamus elgesio pokyčius ir visus akivaizdžius toksiškumo požymius.
      1.6.7   Kūno masė ir maisto suvartojimas
      Gyvūnai sveriami 0 veisimo dieną arba ne vėliau kaip 3 veisimo dieną, jei suporuoti gyvūnai tiekiami iš išorinio veislyno, pirmąją dozavimo dieną, mažiausiai kas 3 dieną dozavimo laikotarpiu ir numatyto nužudymo dieną.
      Maisto suvartojimas turėtų būti registruojamas kas tris paras ir turi sutapti su kūno masės nustatymu.
      1.6.8   Skrodimas
      Patelės nužudomos dieną prieš numatomą atsivedimą. Patelės, kurioms prieš numatomą nužudymą pasireiškia persileidimo arba priešlaikinio atsivedimo požymiai, turėtų būti nužudomos ir daromas bendrasis makroskopinis tyrimas.
      Nužudytai arba darant tyrimą žuvusiai patelei turėtų būti daromas makroskopinis tyrimas visoms struktūros anomalijoms arba patologiniams pakitimams nustatyti. Darant cezario pjūvį ir vėlesnį vaisiaus tyrimą, pateles geriau būtų vertinti nežinant bandymo grupės, kad būtų kiek įmanoma sumažinta sisteminė paklaida.
      1.6.9   Gimdos turinio tyrimas
      Iš karto po nužudymo arba kiek įmanoma greičiau po patelės žūties gimda išimama gyvūno veisimo būsenai įvertinti. Gimdos, kuriose nėra veisimo požymių, turėtų būti papildomai tiriamos (pvz., graužikų atveju apdorojant amonio sulfidu arba Salewski metodu arba taikant kitą metodą triušiams) neveisimo būsenai patvirtinti (5).
      Gimdos su vaisiumi, įskaitant kaklelį, pasveriamos. Gyvūnų, žuvusių darant tyrimą, gimdos su vaisiumi nesveriamos.
      Turėtų būti nustatytas veisiančių patelių geltonkūnių (corpora luted) skaičius.
      Gimdos turinys tiriamas gemalo arba žuvusių ir gyvybingų vaisių skaičiui nustatyti. Turėtų būti apibūdintas resorbcijos laipsnis, siekiant nustatyti santykinį apvaisinto kiaušinėlio žūties laiką (žr. 1.2 skirsnį).
      1.6.10   Vaisiaus tyrimas
      Nustatoma kiekvieno vaisiaus masė ir lytis.
      Tiriami kiekvieno vaisiaus išoriniai pakitimai (6).
      Reikėtų ištirti vaisiaus griaučių ir minkštųjų audinių pakitimus (pvz., nukrypimus ir išsigimimus arba anomalijas) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). Pageidautina, bet nereikalaujama klasifikuoti vaisiaus pakitimus. Jei daroma klasifikacija, turi būti aiškiai nurodyti kriterijai kiekvienai kategorijai apibrėži. Ypatingą dėmesį reikėtų atkreipti į lytinio dauginimosi trakto pakitimų požymius.
      Kiekvienos graužikų vados pusė paruošiama griaučių pakitimams tirti. Likusi dalis paruošiama minkštų audinių pakitimų tyrimui ir jie tiriami taikant priimtus arba tinkamus serijinių pjūvių metodus arba kruopštaus bendrojo skrodimo metodus.
      Jei naudojami ne graužikai, pvz., triušiai, tiriami visi vaisiai minkštų audinių ir griaučių pakitimams nustatyti. Vaisių kūnai įvertinami darant kruopštų skrodimą minkštų audinių pakitimams nustatyti, be to, gali būti įtrauktos metodikos papildomai įvertinti širdies vidinę struktūrą (25). Nupjaunama pusė tokiu būdu ištirtų vaisių galvų, kurios apdorojamos minkštųjų audinių pakitimams įvertinti (įskaitant akis, smegenis, nosies kanalus ir liežuvį), taikant standartinius serijinių pjūvių metodus (26) arba tokio paties jautrumo metodą. Šių vaisių kūnai ir likę sveiki vaisiai apdorojami ir tiriami jų griaučių pakitimai, taikant tuos pačius metodus, kurie aprašyti graužikams.
      2.   DUOMENYS
      2.1   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Duomenys pateikiami atskirai kiekvienai patelei bei jų palikuonims ir suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei ir kiekvienai kartai nurodomas gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, darant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių nužudytų gyvūnų skaičius, visų gyvūnų žūties arba nužudymo laikas, veisiančių patelių skaičius, toksiško poveikio požymių turinčių gyvūnų skaičius, pastebėtų toksiškumo požymių aprašymas, įskaitant pradžios laiką, trukmę ir bet kokio toksiško poveikio sunkumą, taikyti gemalo ar vaisiaus stebėjimų būdai ir atitinkami vados duomenys.
      Skaitmeniniai rezultatai turi būti įvertinti taikant atitinkamą statistinį metodą, naudojant vadą kaip duomenų analizės statistinį vienetą. Turi būti taikomas visuotinai priimtas statistinis metodas; statistiniai metodai pasirenkami kaip tyrimo schemos dalis ir turi būti pagrįsti. Turėtų būti pateikti duomenys apie gyvūnus, kurie neišgyveno iki numatyto nužudymo laiko. Prireikus šie duomenys gali būti naudojami grupių vidutinėms vertėms apskaičiuoti. Tokiems gyvūnams gautų duomenų tinkamumas ir jų įtraukimas arba neįtraukimas į kurios nors grupės vidurkį (-ius) turi būti pagrįstas kiekvienu atskiru atveju.
      2.2   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS
      Toksiškumo prenataliniam vystymuisi tyrimas įvertinamas atsižvelgiant į stebimą poveikį. Įvertinimą turi sudaryti ši informacija:
      
                  —
               
               
                  patelės ir gemalo ar vaisiaus bandymo rezultatai, įskaitant ryšį tarp gyvūno veikimo bandomąja medžiaga ir bet kokio stebimo poveikio dažnumo ir sunkumo, arba tokio ryšio nebuvimą,
               
            
                  —
               
               
                  kriterijai, taikyti vaisiaus išorės, minkštųjų audinių ir griaučių pakitimams klasifikuoti, jei buvo klasifikuojama,
               
            
                  —
               
               
                  prireikus, ankstesni duomenys apie kontrolinius gyvūnus tyrimo rezultatų interpretavimui pagerinti,
               
            
                  —
               
               
                  skaičiai, naudoti visoms procentinėms dalims arba rodikliams apskaičiuoti,
               
            
                  —
               
               
                  atitinkama tyrimo rezultatų statistinė analizė, jei reikia, kurioje pakaktų informacijos apie analizės metodą, kad nepriklausomas ekspertas ar statistikos specialistas galėtų iš naujo įvertinti bei atkurti analizės eigą.
               
            Visuose tyrimuose, kuriuos darant negauta jokio toksiško poveikio, turėtų būti numatyti papildomi tyrimai bandomosios medžiagos absorbcijai ir biologiniam kaupimuisi nustatyti.
      2.3   REZULTATŲ INTERPRETAVIMAS
      Toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi tyrimas suteiks informacijos apie poveikį patelėms veisimo metu ir jų palikuonių vystymuisi gimdoje dėl kartotinio veikimo medžiaga. Tyrimo rezultatus reikėtų interpretuoti atsižvelgiant į rezultatus, gautus darant pusiau lėtinio toksiškumo, toksiško poveikio reprodukcijai ir toksikokinetinius tyrimus. Kadangi iš esmės tiriamas bendrasis toksiškumas, kaip toksiškas poveikis patelėms, ir toksiškas poveikis vystymuisi, jo rezultatai leis tam tikru laipsniu atskirti poveikį vystymuisi, nesant bendrojo toksiškumo, ir poveikį, kuris sukeliamas esant koncentracijai, kuri sukelia toksišką poveikį patelei (27).
      3.   ATASKAITOS RENGIMAS
      3.   1 BANDYMŲ ATASKAITA
      Ataskaitą turi sudaryti ši konkreti informacija:
      
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              fizikinė būsena ir, jei reikia, fizikocheminės savybės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį, jei žinomas ar priskirtas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              grynumas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Nešiklis (jei naudojamas):
                  
                              —
                           
                           
                              nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              naudota rūšis ir veislė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius ir amžius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              atskirai kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              dozės koncentracijos pasirinkimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalės apie bandomosios medžiagos preparato ruošimą arba jos dėjimą į pašarą, gauta koncentracija, preparato stabilumas ir vienalytiškumas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos davimo detalės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos koncentracijos pašare ar geriamajame vandenyje (ppm) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg kūno masės per parą), jei tinka,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aplinkos sąlygos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pašaro ir vandens kokybės detalės.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
               
            
                   
               
               
                  Toksiško poveikio patelei duomenys atsižvelgiant į dozę, įskaitant šiuos, bet jais neapsiribojant:
                  
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, išgyvenusių gyvūnų skaičius, veisiančių patelių skaičius, persileidimų ir priešlaikinių atsivedimų skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              žūties darant tyrimą diena arba iki nužudymo išgyvenusių gyvūnų skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie gyvūnus, neišgyvenusius iki numatyto nužudymo, pranešami, bet neįtraukiami į statistinį grupių palyginimą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visų anomalių klinikinių požymių pastebėjimo diena ir jų vėlesnė eiga,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kūno masė, kūno masės kitimas ir gimdos su vaisiumi masė, įskaitant, neprivalomai, kūno masės kitimą su pataisa gimdos su vaisiumi masei,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pašaro suvartojimas ir, jei matuojamas, vandens suvartojimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              skrodimo rezultatai, įskaitant gimdos masę,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              patelei ir vystymuisi gautos NOAEL vertės.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Toksiško poveikio vystymuisi duomenys pagal dozę vadoms su implantais, įskaitant:
                  
                              —
                           
                           
                              geltonkūnių skaičių,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              implantacijų skaičių, gyvų ir žuvusių vaisių bei resorbcijų skaičių ir procentinę dalį,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              priešimplantacinių ir poimplantacinių nuostolių skaičių ir procentinę dalį.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Toksiško poveikio vystymuisi duomenys pagal dozę vadoms su gyvais vaisiais, įskaitant:
                  
                              —
                           
                           
                              gyvų palikuonių skaičių ir procentinę dalį,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lyčių santykį,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vaisiaus kūno masę, pageidautina pagal lytį ir abiejų lyčių kartu,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išorinius, minkštųjų audinių ir griaučių išsigimimus ir kitus svarbius pakitimus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              klasifikavimo kriterijus, jei tinka,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vaisių ir vadų, turinčių kokių nors išorinių, minkštųjų audinių arba griaučių pakitimų, visą skaičių ir procentinę dalį, be to, atskirų anomalijų ir kitų atitinkamų pakitimų tipus ir dažnumą.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; p. 399–410.
               
            
                  2)
               
               
                  Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied Toxicology 14; p. 386–398.
               
            
                  3)
               
               
                  Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CIIT Activities 17; p. 1–8.
               
            
                  4)
               
               
                  US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Developmental Toxicity Study.
               
            
                  5)
               
               
                  Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte. Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experimentelle Pathologie, p. 247–367.
               
            
                  6)
               
               
                  Edwards, J. A. (1968) The external Development of the Rabbit and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D.H.M. Woolam (ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.
               
            
                  7)
               
               
                  Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. Congenital Anomalies 16; p. 171–173.
               
            
                  8)
               
               
                  Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techniquefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenital Anomalies 32; p. 381 –391.
               
            
                  9)
               
               
                  Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following Heat Exposure in the Rat. Teratology 47, p. 229–242.
               
            
                  10)
               
               
                  Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; p. 476.
               
            
                  11)
               
               
                  Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morphology 127, p. 291–306.
               
            
                  12)
               
               
                  Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of Foetal Maturity. Teratology 11; p. 313–320.
               
            
                  13)
               
               
                  Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity Studies. Toxicology and Applied Pharmacology 9; p. 398–408.
               
            
                  14)
               
               
                  Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in Rats: Malformations or Variations? Teratology 8; p. 309–316.
               
            
                  15)
               
               
                  Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD (Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to Ethylene Glycol. Teratology 46; p. 169–181.
               
            
                  16)
               
               
                  Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, p. 163–173.
               
            
                  17)
               
               
                  Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible Influence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy 41; p. 411–445.
               
            
                  18)
               
               
                  Staples, RE. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone. Stain Technology 39; p. 61–63.
               
            
                  19)
               
               
                  Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton. American Journal of Anatomy 36; p. 313–355.
               
            
                  20)
               
               
                  Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 4; p 181–188.
               
            
                  21)
               
               
                  Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957) The Genesis of the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL.
               
            
                  22)
               
               
                  Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Teratology. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J.G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, p. 251–277.
               
            
                  23)
               
               
                  Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977) Handbook of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY.
               
            
                  24)
               
               
                  Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techniques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28; p. 233–239.
               
            
                  25)
               
               
                  Staples, RE. (1974) Detection of visceral Alterations in Mammalian Foetuses. Teratology 9; p. 37–38.
               
            
                  (26)
               
               
                  Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, H.J. and Kwasigroch, TE. (eds.). University of Chicago, Chicago, IL, p. 126–144.
               
            
                  (27)
               
               
                  US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for Developmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register 56; 63798-63826.
               
            
                  (28)
               
               
                  Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Teratology 55; p. 249–292.
               
            B.32.   KARCINOGENIŠKUMO TESTAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Tiriamoji medžiaga paprastai duodama septynis kartus per savaitę atitinkamu būdu keletui eksperimentinių gyvūnų grupių, vieną dozę duodant vienai grupei didžiąją gyvūnų gyvenimo dalį. Veikimo tiriamąja medžiaga metu ir jam pasibaigus eksperimentiniai gyvūnai stebimi kasdien, siekiant nustatyti toksiškumo požymius, ypač auglių vystymąsi.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      Prieš tyrimą gyvūnai mažiausiai 5 dienas yra laikomi ir šeriami eksperimentinėje fermoje. Prieš pradedant tyrimą sveiki gyvūnų jaunikliai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes.
      1.6.1.   Eksperimentiniai gyvūnai
      
      Remiantis anksčiau atliktų tyrimų rezultatais, gali būti naudojamos kitos (graužikų arba negraužikų) rūšys. Reikėtų naudoti įprastinių laboratorinių kamienų gyvūnų sveikus jauniklius, medžiagos davimas doze turėtų prasidėti iškart po atjunkymo.
      Tyrimo pradžioje kūno masės variacijos ribos turėtų siekti ± 20 % kūno masės vidurkio. Jei prieš ilgalaikį tyrimą yra atliekamas pusiau chroninis oralinis tyrimas, tai abiejų tyrimų metu reikėtų naudoti tos pačios rūšies ar kamieno gyvūnus.
      1.6.2.   Skaičius ir lytis
      
      Duodant medžiagą skirtinga doze graužikams ir kartu naudojant kontrolinę grupę, reikėtų naudoti mažiausiai 100 gyvūnų (50 patelių ir 50 patinėlių). Patelės turi būti negimdžiusios ir ne nėščios. Jei numarinimai numatomi iš anksto, tiriamų gyvūnų skaičius padidinamas padidinant gyvūnų, kuriuos numatoma numarinti prieš užbaigiant tyrimą, skaičių.
      1.6.3.   Dozė ir veikimo dažnumas
      
      Turėtų būti naudojamos mažiausiai 3 tiriamosios dozės naudojant kontrolinę grupę. Didžiausia dozė turėtų sukelti minimalų toksiškumą, pasireiškiantį nežymiu kūno masės priaugimo sumažėjimu (mažesniu nei 10 %), iš esmės nepakeičiant įprastinės gyvenimo trukmės dėl efektų, kurie skiriasi nuo auglių atsiradimo.
      Mažiausia dozė neturėtų trikdyti gyvūno normalaus augimo, vystymosi bei gyvenimo trukmės ar sukelti toksiškumo. Apskritai, ši dozė neturėtų būti mažesnė nei didelės dozės dešimtoji dalis (10 %).
      Tarpinė dozė turėtų būti išdėstyta tarp aukščiausios ir žemiausios dozių.
      Pasirenkant dozes reikėtų remtis anksčiau atliktų toksiškumo testų ir tyrimų duomenimis.
      Veikimas turėtų būti atliekamas kasdien.
      Jei cheminė medžiaga duodama sumaišius ją su vandeniu ar pašaru, ji turėtų būti pastoviai prieinama.
      1.6.4.   Kontrolė
      
      Kartu reikėtų naudoti kontrolinę grupę, identišką grupėms, kurios veikiamos, bet kuriuo aspektu, išskyrus veikimą tiriamąja medžiaga.
      Ypatingais atvejais, tokiais kaip įkvėpimo tyrimai naudojant aerozolius arba oraliniai tyrimai naudojant nežinomo biologinio aktyvumo emulsiklius, reikėtų taipogi naudoti ir neigiamą kontrolinę grupę. Neigiama kontrolinė grupė veikiama tuo pačiu būdu kaip ir tiriamosios grupės, išskyrus tai, kad gyvūnai neveikiami jokia tiriamąja medžiaga nei prietaisu.
      1.6.5.   Davimo būdas
      
      Duodama paprastai trimis būdais – per burną, odą ir kvėpuojamąjį traktą. Davimo būdo pasirinkimas priklauso nuo tiriamosios medžiagos fizikinių ir cheminių ypatybių ir panašaus veikimo būdo žmonių tarpe.
      1.6.5.1.   Oraliniai tyrimai
      Jei tiriamoji medžiaga absorbuojama iš virškinamojo trakto ir jei šis įsisavinimo būdas yra vienas iš būdų, kuriuo žmonės susiduria su tiriamąja medžiaga, tai pasirenkamas davimo per burną būdas, nebent nustatomos kontraindikacijos. Gyvūnai gali gauti tiriamąją medžiagą su maistu, ištirpintą vandenyje arba su kapsule.
      Geriausia, kad dozavimas būtų atliekamas septynis kartus per savaitę kasdien, nes dozavimas penkis kartus per savaitę gali paskatinti atsistatymą bei pašalinti toksiškumą tuo metu, kai nėra dozuojama ir šitai gali turėti įtakos gaunamiems rezultatams bei vėliau atliekamam jų įvertinimui. Tačiau pirmiausia remiantis praktiniu patyrimu, rekomenduojama vykdyti dozavimą penkis kartus per savaitę.
      1.6.5.2.   Odos tyrimai
      Odos veikimas jos nudažymu gali būti pasirinktas kaip pagrindinio būdo, kuriuo veikiami žmonės imitacija bei kaip odos sutrikimų sukėlimo modelinė sistema.
      1.6.5.3.   Įkvėpimo tyrimai
      Dėl to, kad įkvėpimo tyrimuose susiduriam su didesnėmis techninėmis problemomis, nei duodant tiriamąją medžiagą kitais būdais, čia pateikiamas detalus vadovas, nurodantis, kaip duoti medžiagą šiuo būdu. Reikėtų pažymėti, kad ypatingų situacijų atveju lašinimas į trachėją yra alternatyvus problemos sprendimo būdas.
      Atliekant ilgalaikius veikimus, paprastai remiamasi veikimu žmonių atžvilgiu, veikiant gyvūnus kasdien šešias valandas po to, kai suvienodinamos koncentracijos kameros viduje, penkiskart per savaitę (protarpinis veikimas) arba, atsižvelgiant į galimą aplinkos veikimą, veikiama 22-24 valandas per dieną septynis kartus per savaitę (pastovus veikimas), vieną valandą per dieną šeriant kameroje laikomus gyvūnus tuo pačiu metu. Abiem atvejais gyvūnai pastoviai veikiami nustatytomis tiriamosios medžiagos koncentracijomis. Pagrindinis protarpinio ir pastoviojo veikimų skirtumas yra tai, kad protarpinis veikimas užtrunka 17-18 valandų, per kurias gyvūnai atsigauna po efektų, atsiradusių dėl kasdieninio veikimo, o šitai užtrunka žymiai ilgiau savaitgaliais.
      Protarpinio ar pastoviojo veikimo pasirinkimas priklauso nuo tyrimo tikslų bei nuo žmogaus veikimo, kuris turi būti imituojamas. Tačiau reikia apsvarstyti ir konkrečius techninius sunkumus. Pavyzdžiui, pastoviojo veikimo teikiamų privalumų, imituojant aplinkos sąlygas, reikia atsisakyti, nes veikimo metu gyvūnus reikia šerti ir girdyti ir dėl to, kad reikia sukurti žymiai sudėtingesnį (bei labiau patikimesnį) aerozolį ir garus, bei imtis priežiūros.
      1.6.6.   Veikimo kamera
      
      Gyvūnai turėtų būti tiriami įkvėpimo tyrimui skirta įranga, suprojektuota taip, kad palaikytų pastovų dinaminį oro srautą vykstant mažiausiai 12 oro pasikeitimų per valandą tam, kad užtikrintų tinkamą deguonies koncentraciją anksčiau pasiskirsčiusiame ore, kuriuo veikiama. Kontrolinė kamera bei toji, kurioje atliekamas veikimas turėtų būti identiškos pagal konstrukciją ir modelį tam, kad veikimo sąlygos visais aspektais būtų užtikrintos, išskyrus veikimą tiriamąja medžiaga. Nežymus neigiamas slėgis kameros viduje paprastai palaikomas tam, kad tiriamoji medžiaga nepatektų į supančią aplinką. Tiriami gyvūnai kamerose turėtų būti nesusigrūdę. Siekiant užtikrinti kameros oro stabilumą, tūris, kurį užima tiriamieji gyvūnai, neturėtų viršyti 5 % tyrimui naudojamos kameros tūrio.
      Reikėtų atlikti tokius matavimus arba priežiūrą:
      
                  i)
               
               
                  oro srautas: oro srauto, patenkančio per kamerą, greitis turi būti pastoviai prižiūrimas;
               
            
                  ii)
               
               
                  koncentracija: kasdieninio veikimo metu tiriamosios medžiagos koncentracija neturėtų peržengti ± 15 % vidutinės vertės. Viso tyrimo laikotarpiu reikėtų išlaikyti kasdienines koncentracijas, jei tai praktiškai įmanoma padaryti;
               
            
                  iii)
               
               
                  temperatūra ir drėgmė: graužikų atveju temperatūra turėtų būti palaikoma apie 22 ± 2 oC ir drėgmė kameroje turėtų siekti nuo 30 % iki 70 %, išskyrus tą atvejį, kai naudojamas vanduo tam, kad tiriamoji medžiaga virstų suspensija kameros atmosferoje. Reikėtų pastoviai stebėti temperatūrą bei drėgmę;
               
            
                  iv)
               
               
                  dalelių dydžio matavimai: reikėtų nustatyti kameros atmosferoje esančių dalelių, įskaitant skysčius ar kietuosius aerozolius, dydžius. Aerozolių dalelės turėtų būti tokio dydžio, kad naudojamas tiriamasis gyvūnas jas galėtų įkvėpti. Kameros atmosferos mėginiai turėtų būti įnešami į gyvūnų kvėpuojamąją zoną. Oro mėginys, remiantis gravimetrine analize, turėtų atspindėti dalelių, kuriomis gyvūnai veikiami, pasiskirstymą ir visus aerozolius, esančius suspensijoje, netgi jei didžioji aerozolio dalis nėra įkvepiama. Dalelių dydį reikėtų nustatinėti kaip galima dažniau, kuriant sistemą tam, kad būtų užtikrintas aerozolio stabilumas ir po to kuo dažniau veikimų metu tam, kad būtų galima tinkamai nustatyti dalelių, kuriomis gyvūnai veikiami, pasiskirstymą.
               
            1.6.7.   Tyrimo trukmė
      
      Karcinogeniškumo testas trunka didžiąją tiriamųjų gyvūnų gyvenimo dalį. Pelių ir žiurkėnų atveju tyrimą reikėtų baigti po 18 mėnesių, o žiurkių atveju – po vienerių metų; tačiau konkrečių gyvūnų kamienų, kurių gyvenimo trukmė yra ilgesnė ir (ar) esant lėtam auglių vystymuisi, atveju, tyrimą reikėtų baigti po vienerių metų (pelės ir žiurkėnai) bei po 30 mėnesių (žiurkės). Priešingu atveju, toks pratęstas tyrimas baigiamas, jei gyvūnų, priklausančių kontrolinei bei mažiausios dozės grupėms, skaičius siekia 25 %. Jei užbaigiamas testas, kurio metu buvo nustatytas aiškus lyčių skirtumas pagal atsaką, kiekviena lytis apsvarstoma atskirai. Jei dėl akivaizdžių toksiškumo priežasčių miršta grupė, gavusi didelę dozę, nebūtina baigti tyrimą, pasireiškiant toksinėms reakcijoms, kurios nesukelia problemų kitoms tiriamosioms grupėms. Neigiamas testo rezultatas priimtinas tada, kai ne daugiau kaip 10 % bet kurios grupės gyvūnų nugaišta eksperimento metu dėl autolizės, kanibalizmo ar laikymo sąlygų ir po 18 mėnesių išlieka ne mažiau kaip 50 % visų grupių pelių bei po vienerių metų – ne mažiau kaip 50 % visų grupių žiurkėnų.
      1.6.8.   Procedūra
      
      1.6.8.1.   Stebėjimai
      
      Kasdien reikėtų atlikti narveliuose laikomų gyvūnų odos ir kailio, akių bei gleivinių membranų, o taipogi kvėpuojamojo trakto, apytakos, autonominės bei centrinės nervų sistemų, somatomotorinio ir elgsenos pakitimų stebėjimus.
      Reguliariai atliekami gyvūnų stebėjimai yra būtini, kaip galima labiau užtikrinant, kad gyvūnai nenugaištų tyrimo metu dėl tokių priežasčių, kaip kanibalizmas, audinių autolizė bei vietos pakeitimas. Nugaišę gyvūnai turėtų būti pašalinti ir, jei nurodyta, skrodžiami.
      Reikėtų registruoti visų gyvūnų klinikinius požymius bei mirtingumą. Ypatingas dėmesys turi būti skiriamas auglių vystymuisi: turėtų būti registruojamas kiekvieno akivaizdžiai matomo bei užčiuopiamo auglio pasireiškimo laikas, vieta, dydis ir išorė.
      Pirmąsias 13 tyrimo savaičių reikėtų nustatyti pašaro (ir vandens, jei tiriamoji medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu) įsisavinimą ir vėliau tai daryti maždaug kas trys mėnesiai, nebent sveikatos būklė ar kūno masės pokyčiai verčia elgtis kitaip.
      Pirmąsias 13 tyrimo savaičių bent vienąkart per mėnesį reikėtų pasverti visus gyvūnus.
      1.6.8.2.   Klinikiniai tyrimai
      
         Hematologinis tyrimas
      
      Jei, remiantis laikomų narveliuose gyvūnų stebėjimais, spėjama, kad tyrimo metu sutriko gyvūnų sveikata, turi būti atliekama gyvūnų, paveiktų tiriamąja medžiaga, diferencinė kraujo analizė.
      Praėjus vieneriems metams bei 18 mėnesių iš gyvūnų paimami kraujo tepinėliai. Kraujo diferencinė analizė atliekama gyvūnų, gavusių didžiausią medžiagos dozę bei kontrolinės grupės gyvūnų atveju. Jei šie duomenys, ypač tie, kurie buvo gauti prieš numarinimą arba patologinių tyrimų duomenys rodo, kad reikia ištirti kraują, tai atliekama grupės, gavusios mažesnę dozę, diferencinė kraujo analizė.
      
         Pagrindinis skrodimas
      
      Turėtų būti atliktas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, įskaitant tuos kurie nugaišo eksperimentų metu arba buvo numarinti tada, kai buvo nustatyta, jog jie miršta. Visi akivaizdžiai matomi augliai ar sutrikimai, kurie, kaip įtariama, gali būti augliai, turėtų būti užkonservuoti.
      Histopatologiniams tyrimams turėtų būti išsaugomi, laikant atitinkamoje terpėje, tokie audiniai ir organai: smegenys (pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūviai, smegenėlių ir smegenų žievė), hipofizė, tiroidinė/paratiroidinė liauka, užkrūčio liaukos audinys, plaučiai ir trachėja, širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys, blužnis, inkstai, antinksčiai, stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, tuščioj i žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, riestoji žarna, gimda, šlapimo pūslė, limfmazgiai, kasa, lytinės liaukos, pagalbiniai lytiniai organai, moterų pieno liauka, oda, raumenynas, periferinis nervas, stuburo smegenys (sprando, krūtinės ląstos ir juosmens), krūtinkaulis su kaulų čiulpais, šlaunikaulis, (įskaitant ir segmentinį paviršių) ir akys.
      Plaučių ir šlapimo pūslės pripildymas fiksuojančiąja medžiaga yra optimalus būdas išsaugoti šiuos audinius; plaučių pripildymas įkvėpimo tyrimuose yra svarbus atitinkamų histopatologinių tyrimų aspektu. Įkvėpimo tyrimų atveju, reikėtų išsaugoti visą kvėpuojamąjį traktą, įskaitant nosies ertmę, gerklas ir ryklę.
      
         Histopatologinis tyrimas
      
      
                  a)
               
               
                  Reikėtų atlikti visų gyvūnų, kurie nugaišo arba buvo numarinti tyrimo metu, o taipogi visų kontrolinės bei gavusios didelę dozę grupių gyvūnų pilną histopatologinę analizę.
               
            
                  b)
               
               
                  Reikėtų mikroskopiškai ištirti visose grupėse akivaizdžiai matomus auglius ar sutrikimus, kurie, kaip įtariama, gali būti augliai.
               
            
                  c)
               
               
                  Jei gavusios didelę dozę ir kontrolinė grupės skiriasi pagal neoplastinių sutrikimų pasireiškimą, tai reikėtų ištirti konkrečius šių grupių organus ar audinius.
               
            
                  d)
               
               
                  Jei gavusios didelę dozę grupės gyvūnų išgyvenamumas ypač skiriasi nuo kontrolinės grupės, tai reikėtų detaliai ištirti kitą, mažesnę dozę gavusią grupę.
               
            
                  e)
               
               
                  Jei egzistuoja įrodymai, kad toksiniai ar kiti efektai galėjo sukelti neoplastinį atsaką grupėje, gavusioje didelę dozę, tai reikėtų detaliai ištirti kitą, mažesnę dozę gavusią grupę.
               
            2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje, gyvūnų, kuriuose buvo pastebėti augliai tyrimo metu, jų nustatymo laikas bei gyvūnų, kuriuose buvo nustatyti augliai numarinimo metu. Rezultatus reikėtų vertinti atitinkamu statistiniu metodu. Galima naudoti bet kokį statistinį metodą, vartojamą visuotinu mastu.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Jei įmanoma, tai tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  rūšis, veislė, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos, pašaras,
               
            
                  —
               
               
                  tyrimo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              Aparato, kuris naudojamas veikimui medžiaga, aprašymas
                              Įskaitant konstrukciją, tipą, išmatavimus, oro šaltinį, dalelių ir aerozolių sukūrimo sistemą, vėdinimo metodą, veikimą iškvėptu oru ir gyvūnų laikymo kameroje, kai ji naudojama, metodą. Reikėtų aprašyti matuojamą temperatūrą, drėgmę ir, jei reikia, aerozolių koncentracijų arba dalelių dydžio stabilumą.
                           
                        
                              —
                           
                           
                              Veikimo metu gauti duomenys
                              Duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant vidurkius ir variacijos dydį (pvz., standartinį nukrypimą) ir pateikiant:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          oro srauto, pereinančio per įkvėpimo įrangą, greičius;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          oro srauto, pereinančio per įkvėpimo įrangą, greičius;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          oro temperatūrą ir drėgmę;
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          nominalias koncentracijas (absoliutus įkvėpimo įrangoje esančios tiriamosios medžiagos kiekis, padalytas iš oro tūrio);
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          prietaiso, jei jis naudojamas, pobūdį;
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          tikrąsias koncentracij as, esančias tiriamoj e kvėpuoj amoj e zonoj e;
                                       
                                    
                                          g)
                                       
                                       
                                          vidutinius dalelių dydžius (jei įmanoma nurodyti):
                                       
                                    
                        
            
                  —
               
               
                  duomenys apie toksinį atsaką pagal tirtą lytį ir duotą dozę,
               
            
                  —
               
               
                  jei įmanoma, duomenų lygis, kuriam esant, jokių efektų nebuvo pastebėta,
               
            
                  —
               
               
                  mirties laikas arba tyrimo metu, arba jei gyvūnai išliko iki numarinimo,
               
            
                  —
               
               
                  toksinių ir kitų efektų apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių, pastebėjimo momentas,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie pašarą bei kūno masę,
               
            
                  —
               
               
                  oftalmologinių stebėjimų rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  naudoti hematologiniai tyrimai ir jų metu gauti rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  skrodimo metu gauti duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  visų histopatologinių tyrimų metu gautų duomenų detalus apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų statistinė analizė, jei įmanoma,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aiškinimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.33.   KOMBINUOTAS CHRONINIO TOKSIŠKUMO/KARCINOGENIŠKUMO TESTAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Kombinuoto chroninio toksiškumo/karcinogeniškumo testo tikslas yra nustatyti medžiagos, kuria žinduoliai veikiami ilgiau nei įprasta, chroninius ir karcinogeninius efektus.
      Tuo tikslu karcinogeninio testo metu naudojama mažiausiai viena papildoma, tiriamąja medžiaga veikiama, bei kontrolinė grupė. Dozė, kuri duodama papildomai grupei, veikiamai didele doze, yra didesnė, nei ta, kuri duodama grupei karcinogeniškumo testo metu. Karcinogeniškumo testo metu tiriamas tiek bendras gyvūnų toksiškumas, tiek ir atsakas į karcinigeną. Papildomos grupės, veikiamos tiriamąja medžiaga gyvūnai tiriami bendrojo toksiškumo aspektu.
      Tiriamoji medžiaga paprastai duodama septynis kartus per savaitę atitinkamu būdu keletui eksperimentinių gyvūnų grupių, vieną dozę duodant vienai grupei didžiąją gyvūnų gyvenimo dalį. Veikimo tiriamąja medžiaga metu ir jam pasibaigus eksperimentiniai gyvūnai stebimi kasdien, siekiant nustatyti toksiškumo požymius bei auglių vystymąsi.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      Prieš tyrimą gyvūnai mažiausiai 5 dienas yra laikomi ir šeriami eksperimentinėje fermoje. Prieš pradedant tyrimą sveiki gyvūnų jaunikliai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes.
      1.6.1.   Eksperimentiniai gyvūnai
      
      Labiausiai naudojama rūšis yra žiurkės. Remiantis anksčiau atliktų tyrimų duomenimis, gali būti naudojamos ir kitos (graužikai arba negraužikai) rūšys. Reikėtų naudoti įprastinių laboratorinių kamienų gyvūnų sveikus jauniklius, medžiagos davimas doze turėtų prasidėti iškart po atjunkymo.
      Tyrimo pradžioje kūno masės variacijos ribos turėtų siekti ± 20 % kūno masės vidurkio. Jei prieš ilgalaikį tyrimą yra atliekamas pusiau chroninis oralinis tyrimas, tai abiejų tyrimų metu reikėtų naudoti tos pačios rūšies ar kamieno gyvūnus.
      1.6.2.   Skaičius ir lytis
      
      Duodant medžiagą skirtinga doze graužikams ir kartu naudojant kontrolinę grupę, reikėtų naudoti mažiausiai 100 gyvūnų (50 patelių ir 50 patinėlių). Patelės turi būti negimdžiusios ir ne nėščios. Jei numarinimai numatomi iš anksto, tiriamų gyvūnų skaičius padidinamas padidinant gyvūnų, kuriuos numatoma numarinti prieš užbaigiant tyrimą, skaičių.
      Papildomoje grupėje, skirtoje patologiniam tyrimui bei veikiamoje tiriamąja medžiaga, turėtų būti po 20 kiekvienos lyties gyvūnų, tuo tarpu kai papildomoje kontrolinėje grupėje turėtų būti po 10 kiekvienos lyties gyvūnų.
      1.6.3.   Dozė ir veikimo dažnis
      
      Tam, kad būtų įvertintas karcinogeniškumas, reikėtų naudoti mažiausiai 3 tiriamąsios dozes, naudojant kontrolinę grupę. Didžiausia dozė turėtų sukelti minimalų toksiškumą, pasireiškiantį nežymiu kūno masės priaugimo sumažėjimu (mažiau nei 10 %), nepakeičiant iš esmės normalios gyvenimo trukmės dėl kitų efektų, besiskiriančių nuo auglių.
      Mažiausia dozė neturėtų trukdyti normaliam gyvūno augimui, vystymuisi ar gyvenimo trukmei ar sukelti toksiškumo. Apskritai, ši dozė turi būti ne mažesnė kaip dešimtoji (10 %) didelės dozės dalis.
      Tarpinė dozė turėtų būti išdėstyta tarp didžiausios ir mažiausios dozių.
      Pasirenkant dozes reikėtų remtis anksčiau atliktų toksiškumo tyrimų ir testų duomenimis.
      Atliekant chroninio toksiškumo testą, naudojamos papildomos, veikiamos tiriamąja medžiaga bei kontrolinės grupės. Didelė dozė, duodama papildomos tiriamosios grupės gyvūnams, turėtų sukelti konkrečius toksiškumo požymius.
      Veikimas turėtų būti atliekamas kasdien.
      Jei cheminė medžiaga duodama, sumaišius ją su vandeniu ar pašaru, ji turėtų būti pastoviai prieinama.
      1.6.4.   Kontrolė
      
      Kartu reikėtų naudoti kontrolinę grupę, identišką grupėms, kurios veikiamos, bet kuriuo aspektu, išskyrus veikimą tiriamąja medžiaga.
      Ypatingais atvejais, tokiais kaip įkvėpimo tyrimai naudojant aerozolius arba oraliniai tyrimai naudojant nežinomo biologinio aktyvumo emulsiklius, reikėtų taipogi naudoti papildomą kontrolinę grupę, neveikiamą prietaisu.
      1.6.5.   Davimo būdas
      
      Duodama paprastai trimis būdais – per burną, odą ir kvėpuojamąjį traktą. Davimo būdo pasirinkimas priklauso nuo tiriamosios medžiagos fizikinių ir cheminių ypatybių ir panašaus veikimo būdo žmonėms.
      1.6.5.1.   Oraliniai tyrimai
      Jei tiriamoji medžiaga absorbuojama iš virškinamojo trakto ir jei šis įsisavinimo būdas yra vienas iš būdų, kuriuo žmonės susiduria su tiriamąja medžiaga, tai pasirenkamas davimo per burną būdas, nebent nustatomos kontraindikacijos. Gyvūnai gali gauti tiriamąją medžiagą su maistu, ištirpintą vandenyje arba su kapsule.
      Geriausia, kad dozavimas būtų atliekamas septynis kartus per savaitę kasdien, nes dozavimas penkis kartus per savaitę gali paskatinti atsistatymą bei pašalinti toksiškumą tuo metu, kai nėra dozuojama, o tai gali turėti įtakos gaunamiems rezultatams bei vėliau atliekamam jų įvertinimui. Tačiau pirmiausia remiantis praktiniu patyrimu, rekomenduojama vykdyti dozavimą penkis kartus per savaitę.
      1.6.5.2.   Odos tyrimai
      Odos veikimas jos nudažymu gali būti pasirinktas kaip pagrindinio būdo, kuriuo veikiami žmonės imitacija bei kaip odos sutrikimų sukėlimo modelinė sistema.
      1.6.5.3.   Įkvėpimo tyrimai
      Dėl to, kad įkvėpimo tyrimuose susiduriama su didesnėmis techninėmis problemomis, nei duodant tiriamąją medžiagą kitais būdais, čia pateikiamas detalus vadovas, nurodantis, kaip duoti medžiagą šiuo būdu. Reikėtų pažymėti, kad ypatingų situacijų atveju lašinimas į trachėją yra alternatyvus problemos sprendimo būdas.
      Atliekant ilgalaikius veikimus, paprastai remiamasi veikimu žmonių atžvilgiu, veikiant gyvūnus kasdien šešias valandas po to, kai suvienodinamos koncentracijos kameros viduje, penkiskart per savaitę (protarpinis veikimas) arba, atsižvelgiant į galimą aplinkos veikimą, veikiama 22–24 valandas per dieną septynis kartus per savaitę (pastovus veikimas), vieną valandą per dieną šeriant kameroje laikomus gyvūnus tuo pačiu metu. Abiem atvejais gyvūnai pastoviai veikiami nustatytomis tiriamosios medžiagos koncentracijomis. Pagrindinis protarpinio ir pastoviojo veikimų skirtumas yra tai, kad protarpinis veikimas užtrunka 17-18 valandų, per kurias gyvūnai atsigauna po efektų, atsiradusių dėl kasdieninio veikimo, o šitai užtrunka žymiai ilgiau savaitgaliais.
      Protarpinio ar pastoviojo veikimo pasirinkimas priklauso nuo tyrimo tikslų bei nuo žmogaus veikimo, kuris turi būti imituojamas. Tačiau reikia apsvarstyti ir konkrečius techninius sunkumus. Pavyzdžiui, pastoviojo veikimo teikiamų privalumų, imituojant aplinkos sąlygas, reikia atsisakyti, nes veikimo metu gyvūnus reikia šerti ir girdyti ir dėl to, kad reikia sukurti žymiai sudėtingesnį (bei labiau patikimesnį) aerozolį ir garus bei imtis priežiūros.
      1.6.6.   Veikimo kamera
      
      Gyvūnai turėtų būti tiriami įkvėpimo tyrimui skirta įranga, suprojektuota taip, kad palaikytų pastovų dinaminį oro srautą vykstant mažiausiai 12 oro pasikeitimų per valandą tam, kad užtikrintų tinkamą deguonies koncentraciją anksčiau pasiskirsčiusiame ore, kuriuo veikiama. Kontrolinė kamera bei toji, kurioje atliekamas veikimas turėtų būti identiškos pagal konstrukciją ir modelį tam, kad veikimo sąlygos visais aspektais būtų užtikrintos, išskyrus veikimą tiriamąja medžiaga. Nežymus neigiamas slėgis kameros viduje paprastai palaikomas tam, kad tiriamoji medžiaga nepatektų į supančią aplinką. Tiriami gyvūnai kamerose turėtų būti nesusigrūdę. Siekiant užtikrinti kameros atmosferos stabilumą, tūris, kurį užima tiriamieji gyvūnai, neturėtų viršyti 5 % tyrimui naudojamos kameros tūrio.
      Reikėtų atlikti tokius matavimus arba priežiūrą:
      
                  i)
               
               
                  oro srautas: oro srauto, patenkančio per kamerą, greitis turi būti pastoviai prižiūrimas;
               
            
                  ii)
               
               
                  koncentracija: kasdieninio veikimo metu tiriamosios medžiagos koncentracija neturėtų peržengti ± 15 % vidutinės vertės. Viso tyrimo laikotarpiu reikėtų stengtis, kad koncentracijos būtų palaikomos kaip galima labiau pastovios kiekvieną dieną, jei tai įmanoma praktiškai;
               
            
                  iii)
               
               
                  temperatūra ir drėgmė: graužikų atveju temperatūra turėtų būti palaikoma 22 ± 2 oC ir drėgmė kameroje turėtų siekti nuo 30 % iki 70 %, išskyrus tą atvejį, kai naudojamas vanduo tam, kad tiriamoji medžiaga virstų suspensija kameros atmosferoje. Reikėtų pastoviai stebėti temperatūrą bei drėgmę;
               
            
                  iv)
               
               
                  dalelių dydžio matavimai: reikėtų nustatyti kameros atmosferoje esančių dalelių, įskaitant skysčius ar kietuosius aerozolius, dydžius. Aerozolių dalelės turėtų būti tokio dydžio, kad naudojamas tiriamasis gyvūnas jas galėtų įkvėpti. Kameros atmosferos mėginiai turėtų būti įnešami į gyvūnų kvėpuojamąją zoną. Oro mėginys, remiantis gravimetrine analize, turėtų atspindėti dalelių, kuriomis gyvūnai veikiami, pasiskirstymą ir visus aerozolius, esančius suspensijoje, netgi jei didžioji aerozolio dalis nėra įkvepiama. Dalelių dydį reikėtų nustatinėti kaip galima dažniau, kuriant sistemą tam, kad būtų užtikrintas aerozolio stabilumas ir po to kuo dažniau veikimų metu tam, kad būtų galima tinkamai nustatyti dalelių, kuriomis gyvūnai veikiami, pasiskirstymą.
               
            1.6.7.   Tyrimo trukmė
      
      Karcinogeniškumo testas trunka didžiąją tiriamųjų gyvūnų gyvenimo dalį. Pelių ir žiurkėnų atveju tyrimą reikėtų baigti po 18 mėnesių, o žiurkių atveju – po vienerių metų; tačiau konkrečių gyvūnų kamienų, kurių gyvenimo trukmė yra ilgesnė ir (ar) esant lėtam auglių vystymuisi, atveju, tyrimą reikėtų baigti po vienerių metų (pelės ir žiurkėnai) bei po 30 mėnesių (žiurkės). Priešingu atveju, toks pratęstas tyrimas baigiamas, jei gyvūnų, priklausančių kontrolinei bei mažiausios dozės grupėms, skaičius siekia 25 %. Jei užbaigiamas testas, kurio metu buvo nustatytas aiškus lyčių skirtumas pagal atsaką, kiekviena lytis apsvarstoma atskirai. Jei dėl akivaizdžių toksiškumo priežasčių miršta grupė, gavusi didelę dozę, nebūtina baigti tyrimą, pasireiškiant toksinėms reakcijoms, kurios nesukelia problemų kitoms tiriamosioms grupėms. Neigiamas testo rezultatas priimtinas tada, kai ne daugiau kaip 10 % bet kurios grupės gyvūnų nugaišta eksperimento metu dėl autolizės, kanibalizmo ar laikymo sąlygų ir po 18 mėnesių išlieka ne mažiau kaip 50 % visų grupių pelių bei žiurkėnų, po 24 mėnesių – ne mažiau kaip 50 % žiurkių.
      Atliekant chroninio toksiškumo testą, mažiausiai metus naudojamos papildomos grupės, veikiamos tiriamąja medžiaga ir sudarytos iš 20 kiekvienos lyties gyvūnų bei kontrolinės grupės, sudarytos iš 10 kiekvienos lyties gyvūnų. Turėtų būti numatytas gyvūnų numarinimas, kad butų galima tirti tiriamosios medžiagos sukeltus patologinius procesus, kuriems neturi įtakos gyvūnų senėjimas.
      1.6.8.   Procedūra
      
      1.6.8.1.   Stebėjimai
      
      Kasdien reikėtų atlikti narveliuose laikomų gyvūnų odos ir kailio, akių bei gleivinių membranų, o taipogi kvėpuojamojo trakto, apytakos, autonominės bei centrinės nervų sistemų, somatomotorinio ir elgsenos pakitimų stebėjimus.
      Reikėtų atitinkamais laiko tarpais atlikti papildomų tiriamųjų grupių gyvūnų klinikinį tyrimą. Reguliariai atliekami gyvūnų stebėjimai yra būtini, kaip galima labiau užtikrinant, kad gyvūnai nenugaištų tyrimo metu dėl tokių priežasčių, kaip kanibalizmas, audinių autolizė bei vietos pakeitimas. Nugaišę gyvūnai turėtų būti pašalinti ir skrodžiami, jei nurodyta.
      Reikėtų registruoti visų gyvūnų klinikinius požymius bei mirtingumą. Ypatingas dėmesys turi būti skiriamas auglių vystymuisi: turėtų būti registruojamas kiekvieno akivaizdžiai matomo bei užčiuopiamo auglio pasireiškimo laikas, vieta, dydis ir išorė; reikėtų registruoti toksinių sąlygų pasireiškimo laiką bei eigą.
      Pirmąsias 13 tyrimo savaičių reikėtų nustatyti pašaro (ir vandens, jei tiriamoji medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu) įsisavinimą ir vėliau tai daryti maždaug kas trys mėnesiai, nebent sveikatos būklė ar kūno masės pokyčiai verčia elgtis kitaip.
      Pirmąsias 13 tyrimo savaičių bent vienąkart per savaitę, o vėliau – bent kartą per mėnesį reikėtų pasverti visus gyvūnus.
      1.6.8.2.   Klinikiniai tyrimai
      
         Hematologinis tyrimas
      
      Praėjus trims, šešiems mėnesiams, o paskui kas pusę metų ir surinkus kraujo mėginius iš kiekvienos grupės dešimties kiekvienos lyties žiurkių, reikėtų atlikti hematologinį tyrimą (nustatant hemoglobino kiekį, eritrocitų užimamą tūrį kraujyje absoliutų eritrocitų, leukocitų ir trombocitų skaičių arba kitus rodiklius kraujo krešėjimo aktyvumui įvertinti). Jei įmanoma, tai kraujo mėginiai imami iš tų pačių žiurkių tokiu pačiu laiko tarpu.
      Jei, remiantis laikomų narveliuose gyvūnų stebėjimais, spėjama, kad tyrimo metu sutriko gyvūnų sveikata, reikėtų atlikti diferencinę gyvūnų, paveiktų tiriamąja medžiaga, kraujo analizę. Atliekama diferencinė gyvūnų, kuriems buvo duota didžiausia medžiagos dozė, bei kontrolinės grupės individų kraujo analizė. Kitos grupės (ar grupių), kuriai (-ioms) buvo duota mažesnė dozė, diferencinė kraujo analizė atliekama, jei egzistuoja pagrindinis skirtumas tarp didžiausią dozę gavusios ir kontrolinės grupės arba tai buvo nustatyta patologinių tyrimų metu.
      
         Šlapimo analizė
      
      Reikėtų surinkti šlapimo mėginius iš kiekvienoje grupėje esančių 10 kiekvienos lyties žiurkių, jei įmanoma, surenkant iš tų pačių žiurkių tais pačiais laiko tarpais, kaip tai buvo atliekama hematologinių tyrimų metu. Reikėtų atlikti kiekvieno gyvūno arba mėginių rinkinio, arba vienos lyties gyvūnų, esančių, vienoje graužikų grupėje, tokius tyrimus:
      
                  —
               
               
                  išvaizda: individualaus gyvūno šlapimo tūris bei tankumas,
               
            
                  —
               
               
                  baltymų, gliukozės, ketonų, paslėpto kraujo kiekis (pusiau kiekybiškai),
               
            
                  —
               
               
                  nuosėdų mikroskopinis vaizdas (pusiau kiekybiškai).
               
            
         Klinikinė chemija
      
      Maždaug kas šešis mėnesius ir tyrimo pabaigoje iš visų negraužikų bei 10 kiekvienos lyties ir visų grupių žiurkių, jei įmanoma, iš tų pačių žiurkių esant tam pačiam laiko tarpui, turėtų būti surenkami kraujo mėginiai, kad vėliau būtų ištirti klinikinės chemijos aspektu. Paėmus mėginius, paruošiama plazma ir atliekami tokie matavimai:
      
                  —
               
               
                  absoliuti baltymo koncentracija,
               
            
                  —
               
               
                  albumino koncentracija,
               
            
                  —
               
               
                  kepenų funkciniai testai (tokie kaip šarminės fosfatazės aktyvumo nustatymo testas, glutamino piruvato transaminazės (4) aktyvumo nustatymo testas ir glutamato oksal acetato transaminazės (5) aktyvumo nustatymo testas), gama glutamiltranspeptidazė, ornitino dekarboksilazė,
               
            
                  —
               
               
                  angliavandenių metabolizmas, įvertinant gliukozės kraujyje trūkumą,
               
            
                  —
               
               
                  inkstų funkciniai testai, tokie kaip šlapalo nustatymas kraujyje.
               
            
         Pagrindinis skrodimas
      
      Turėtų būti atliktas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, įskaitant tuos, kurie nugaišo eksperimentų metu arba buvo numarinti tada, kai buvo nustatyta, jog jie miršta. Prieš numarinimą turėtų būti paimti visų gyvūnų kraujo mėginiai tam, kad būtų atlikta diferencinė kraujo analizė. Visi akivaizdžiai matomi sutrikimai, augliai ar sutrikimai, kurie, kaip įtariama, gali būti augliai, turėtų būti užkonservuoti. Reikėtų stengtis rasti sąsajas tarp pagrindinių stebėjimų ir mikroskopinių analizių.
      Histopatologiniams tyrimams turėtų būti išsaugomi visi audiniai ir organai, tokie kaip: smegenys (7) (pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūviai, smegenėlių ir smegenų žievės), hipofizė, tiroidinė liauka (įskaitant paratiroidinę liauką), užkrūčio liaukos audinys, plaučiai (įskaitant trachėją), širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys (7), blužnis, inkstai (7), antinksčiai (7), stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, tuščioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, riestoji žarna, gimda, šlapimo pūslė, limfmazgiai, kasa, lytinės liaukos (7), pagalbiniai lytiniai organai, moterų pieno liauka, oda, raumenynas, periferinis nervas, stuburo smegenys (sprando, krūtinės ląstos ir juosmens), krūtinkaulis su kaulų čiulpais, šlaunikaulis (įskaitant sąnarį) ir akys.
      Nors plaučių ir šlapimo pūslės pripildymas fiksuojančiąja medžiaga yra optimalus būdas išsaugoti šiuos audinius; plaučių pripildymas įkvėpimo tyrimuose yra svarbus atitinkamų histopatologinių tyrimų aspektu. Ypatingų tyrimų, tokių, kaip įkvėpimo tyrimai, atveju, reikėtų tirti visą kvėpuojamąjį traktą, įskaitant nosies ertmę, gerklas ir ryklę.
      Jei atliekami kiti klinikiniai tyrimai, tai šių procedūrų metu gauta informacija turėtų būti prieinama, atliekant mikroskopinę analizę, nes ta informacija yra pagrindinė patologo darbo gairė.
      
         Histopatologinis tyrimas
      
      Atliekant chroninio toksiškumo tyrimą:
      Reikėtų detaliai ištirti visų, gavusių didelę dozę bei kontrolinių grupių gyvūnų užkonservuotus organus. Jei tiriant didelę dozę gavusią papildomą grupę, nustatomi su tiriamąja medžiaga susiję patologiniai pokyčiai, bet kurios kitos tiriamąja medžiaga veiktos grupės gyvūnų organai, veikti tiriamąja medžiaga, turėtų būti pilnai ištirti histologiniu aspektu, o taip pat tai turi būti padaryta tiriamųjų grupių, atliekant karcinogeniškumo tyrimą bei jo pabaigoje, atveju.
      Atliekant karcinogeniškumo testą:
      
                  a)
               
               
                  reikėtų atlikti visų gyvūnų, kurie nugaišo arba buvo numarinti testo metu, o taipogi visų kontrolinės bei gavusios didelę dozę grupių gyvūnų pilną histopatologinę analizę;
               
            
                  b)
               
               
                  reikėtų mikroskopiškai ištirti visose grupėse akivaizdžiai matomus auglius ar sutrikimus, kurie, kaip įtariama, gali būti augliai;
               
            
                  c)
               
               
                  jei gavusios didelę dozę ir kontrolinė grupės skiriasi pagal neoplastinių sutrikimų pasireiškimą, tai reikėtų ištirti konkrečius šių grupių organus ar audinius;
               
            
                  d)
               
               
                  jei gavusios didelę dozę grupės gyvūnų išgyvenamumas ypač skiriasi nuo kontrolinės grupės, tai reikėtų detaliai ištirti kitą, mažesnę dozę gavusią grupę;
               
            
                  e)
               
               
                  jei egzistuoja įrodymai, kad toksiniai ar kiti efektai galėjo sukelti neoplastinį atsaką grupėje, gavusioje didelę dozę, tai reikėtų detaliai ištirti kitą, mažesnę dozę gavusią grupę.
               
            2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti apibendrinami pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje, gyvūnų, kuriuose buvo pastebėti pakitimai, skaičius, pakitimų tipai bei gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo pakitimai, skaičius, išreikštas procentais. Rezultatus reikėtų vertinti atitinkamu statistiniu metodu. Galima naudoti bet kokį visuotinai vartojamą statistinį metodą.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Jei įmanoma, tai tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  rūšis, veislė, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos, pašaras,
               
            
                  —
               
               
                  tyrimo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              Aparato, kuris naudojamas veikimui medžiaga, aprašymas
                              Įskaitant konstrukciją, tipą, išmatavimus, oro šaltinį, dalelių ir aerozolių sukūrimo sistemą, vėdinimo metodą, veikimą iškvėptu oru ir gyvūnų laikymo kameroje, kai ji naudojama, metodą. Reikėtų aprašyti matuojamą temperatūrą, drėgmę ir, jei reikia, aerozolių koncentracijų arba dalelių dydžio stabilumą.
                           
                        
                              —
                           
                           
                              Veikimo metu gauti duomenys
                              Duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant vidurkius ir variacijos dydį (pvz., standartinį nukrypimą) ir pateikiant:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          oro srauto, pereinančio per įkvėpimo įrangą, greičius;
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          oro temperatūrą ir drėgmę;
                                       
                                    
                                          c)
                                       
                                       
                                          nominalias koncentracijas (absoliutus įkvėpio įrangoje esančios tiriamosios medžiagos kiekis, padalytas iš oro tūrio);
                                       
                                    
                                          d)
                                       
                                       
                                          prietaiso, jei jis naudojamas, pobūdį;
                                       
                                    
                                          e)
                                       
                                       
                                          tikrąsias koncentracijas, esančias tiriamoje kvėpuojamoje zonoj e;
                                       
                                    
                                          f)
                                       
                                       
                                          vidutinius dalelių dydžius (jei įmanoma nurodyti):
                                       
                                    
                        
            
                  —
               
               
                  dozių dydžiai (įskaitant prietaisą, jei toks buvo naudotas) ir jų koncentracijos,
               
            
                  —
               
               
                  auglių aptikimo duomenys tiriant pagal lytį duotą dozę ir auglių tipą,
               
            
                  —
               
               
                  mirties laikas arba tyrimo metu, arba jei gyvūnai išliko iki numarinimo (įskaitant ir papildomos kontrolinės grupės gyvūnus),
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie toksinį atsaką pagal tirtą lytį ir duotą dozę,
               
            
                  —
               
               
                  toksinių ir kitų efektų apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių pastebėjimo momentas,
               
            
                  —
               
               
                  oftalmologinių stebėjimų rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie pašarą bei kūno masę,
               
            
                  —
               
               
                  naudoti hematologiniai tyrimai ir jų metu gauti rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  naudoti klinikinės biochemijos tyrimai ir jų metu gauti visi (įskaitant bet kurios šlapimo analizės) rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  skrodimo metu gauti duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  visų histopatologinių tyrimų metu gautų duomenų detalus apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų statistinė analizė ir visų naudotų metodų aprašymai,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aiškinimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.34.   VIENOS KARTOS DAUGINIMOSI TOKSIŠKUMO TESTAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Tiriamoji medžiaga duodama laipsniškomis dozėmis keleto eksperimentinių grupių gyvūnų patinams bei patelėms. Patinams dozės turėtų būti duodamos augimo metu ir pasibaigus mažiausiai vienai spermatogenezei (praėjus maždaug 56 dienoms – pelių patinams ir 70 dienų – žiurkių patinams) tam, kad būtų galima įvertinti bet kokius neigiamus tiriamosios medžiagos poveikius spermatogenezei.
      Tėvinės (P) kartos patelėms turi būti duodama dozė, praėjus mažiausiai dviems rujoms tam, kad būtų galima įvertinti bet kokius neigiamus tiriamosios medžiagos poveikius kiaušinėlių subrendimo atžvilgiu. Tada gyvūnai suporuojami. Tiriamoji medžiaga duodama abejoms lytims poravimosi metu ir vėliau duodama tik patelėms, iš pradžių nėštumo, o vėliau žindymo metu. Medžiagos davimo įkvepiant metodą reikia modifikuoti.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      1.6.1.   Pasiruošimas tyrimui
      
      Prieš pradedant tyrimą sveiki gyvūnų jaunikliai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes. Mažiausiai penkias dienas prieš testą gyvūnai yra laikomi eksperimentinėje fermoje, kur jie šeriami bei girdomi. Rekomenduojama, kad tiriamoji medžiaga būtų duodama kartu su pašaru ar geriamuoju vandeniu. Taipogi galima naudoti ir kitus davimo būdus. Visiems gyvūnams tiriamosios medžiagos dozė turėtų būti duodama tuo pačiu metodu atitinkamo eksperimentinio periodo metu. Jei dozavimui naudojamas įrenginys ar kiti priedai, tai jie neturėtų sukelti toksinių efektų. Dozė turėtų būti duodama septynis kartus per savaitę.
      1.6.2.   Eksperimentiniai gyvūnai
      
      
         Rūšių parinkimas
      
      Labiausiai naudojamos gyvūnų rūšys yra pelės arba žiurkės. Reikėtų naudoti sveikus gyvūnus, kurių atžvilgiu anksčiau nebuvo taikytos eksperimentinės procedūros. Tiriamieji gyvūnai turėtų būti apibūdinami pagal rūšį, kamieną, lytį, svorį ir (ar) amžių.
      Norint tinkamai įvertinti vaisingumą, reikėtų tirti tiek patinus, tiek ir pateles. Prieš pradedant duoti dozę, visi tiriamieji bei kontroliniai gyvūnai turėtų būti atjunkyti.
      
         Skaičius ir lytis
      
      Kiekvienoje – tiriamojoje ir kontrolinėje – grupėje turėtų būti pakankamas gyvūnų skaičius –apie 20 nėščių patelių, gimdančių arba arti nėštumo pabaigos.
      Tai daroma siekiant užtikrinti pakankamą nėštumu ir prieauglio skaičių tam, kad būtų galima įvertinti tiriamosios medžiagos sugebėjimo daryti įtaką vaisingumui, nėštumui ir patelių elgesiui tėvinės kartos P gyvūnuose nuo apvaisinimo iki subrendimo, pirmosios kartos F1 palikuonių žindymui, augimui bei vystymuisi svarbą.
      1.6.3.   Tyrimo sąlygos
      
      Pašaras ir vanduo turėtų būti duodami ad libitum. Artėjant gimdymui, nėščios patelės turėtų būti atskiriamos, perkeliant jas gimdymui ar motinoms skirtus narvelius, kurie turi būti aprūpinti būtiniausiomis medžiagomis gūžtai įrengti.
      1.6.3.1.   Dozė
      
      Turėtų būti naudojamos mažiausiai trys tiriamosios bei viena kontrolinė grupės. Jei tiriamoji medžiaga duodama naudojant prietaisą, kontrolinė grupė kartu su prietaisu turėtų gauti didžiausią tiriamosios medžiagos tūrį. Jei tiriamoji medžiaga pašaro pasisavinimą ar sunaudojimą, tada reikia panaudoti gretutinę maitinamą kontrolinę grupę. Būtų geriausia, kad nekreipiant dėmesio į tiriamosios medžiagos fizikinės/cheminės prigimties ar biologinių veikimo efektų sukeliamus apribojimus, didžiausia dozė sukeltų toksiškumą, bet ne mirtį tėvinės kartos (P) gyvūnų tarpe. Tarpinė tiriamosios medžiagos dozė turėtų sukelti minimalius toksinius efektus ir maža dozė neturėtų sukelti jokių pastebimų žalingų efektų tėvams ar palikuonims. Kai kiekvienam gyvūnui medžiagos dozė duodama per zondą arba su kapsule, tai ji parenkama, atsižvelgus į kiekvieno gyvūno kūno masę ir kalibruojama kiekvieną savaitę priklausomai nuo kūno masės pokyčių. Nėštumo metu medžiagos davimas dozėmis patelėms gali būti pagrindžiamas kūno masės duomenimis 0 arba 6 nėštumo dieną, jei to pageidaujama.
      1.6.3.1.   Ribų tyrimas
      
      Jei vartojant mažo toksiškumo medžiagas dozė –1 000 mg kilogramui – netrukdo dauginimuisi, laikomasi nuostatos, kad tyrimai naudojant kitas dozes nėra būtini. Jei išankstinio tyrimo metu naudojama didelė dozė, sukelianti akivaizdų toksiškumą patelėse, nepažeidžia vaisingumo, tai laikomasi nuostatos, jog tyrimai, naudojant kitas dozes nėra būtini.
      1.6.3.3.   Testo atlikimas
      
         Eksperimentų tvarkaraščiai
      
      Kasdieninis dozės davimas tėvinės (P) kartos patinams turėtų prasidėti tada, kai jie sulaukia 5-9 savaičių amžiaus, buvo atjunkyti ir mažiausiai penkias dienas aklimatizavosi. Žiurkių tarpe dozės davimas dar pratęsiamas 10 savaičių, likusių iki suporavimo periodo (tarp pelių – dar aštuonioms savaitėms). Poravimosi periodo pabaigoje patinai turėtų būti numarinami ir tiriami arba kitu atveju juos galima palikti gyvus ir šerti tyrimo metu tam, kad atsivestų antrąją vadą, po kurios jie turėtų būti numarinti bei tiriami prieš pasibaigiant tyrimui. Tėvinės (P) kartos patelėms dozė turėtų būti pradėta duoti iškart po penkias dienas trukusios aklimatizacijos ir tęstis mažiausiai dvi savaites iki poravimosi periodo pradžios. Šioms patelėms dozė turėtų būti duodama kasdien maždaug tris savaites trunkančio poravimosi periodo bei nėštumo metu iki F1 kartos palikuonių atjunkymo. Reikėtų apsvarstyti dozės davimo tvarkaraščio pakeitimus, remiantis kita prieinama informacija, tokia kaip tiriamosios medžiagos sukeliamas metabolizmas arba bioakumuliacija.
      
         Poravimosi procedūra
      
      Tiriant toksiškumo įtaką dauginimuisi, poruojama arba santykiu 1:1 (vienas patinas su viena patele) arba santykiu 1:2 (vienas patinas su dviem patelėmis).
      Poruojant santykiu 1:1, viena patelė laikoma kartu su vienu patinu tol, kol prasideda nėštumas arba praeina trys savaitės. Kiekvieną rytą patelės turėtų būti tiriamos, ieškant spermos arba makšties kamščio. Nulinė nėštumo diena yra ta, kai randama sperma arba susidaręs makšties kamštis.
      Tos poros, kurioms nepasiseka susiporuoti, turėtų būti akivaizdžiai nevaisingomis.
      Todėl galima imtis tokių papildomų procedūrų kaip poravimo su kitais tikrai veisliniais patinais ar patelėmis, mikroskopiškai analizuojant dauginimosi organus ir tiriant kiaušinėlio ir spermatozoidų susiformavimo ciklą.
      
         Vados dydžiai
      
      Gyvūnams, kuriems vaisingumo tyrimo metu duodama dozė, leidžiama normaliai atsivesti palikuonių ir prižiūrėti juos iki atjunkymo, nestandartizuojant vados dydžio.
      Kai atliekamas vados dydžio standartizavimas, siūloma atlikti tokią procedūrą. Praėjus 1-4 dienoms po gimimo, kiekvienos vados dydis gali būti nustatomas, pašalinant perteklinį prieauglį atrankos būdu, stengiantis, kad vienoje vadoje liktų keturi patinėliai ir keturios patelės.
      Jei neįmanoma vienoje vadoje turėti po keturis kiekvienos lyties palikuonis, tai priimtinas dalinis palikuonių skaičiaus reguliavimas (pvz., penki patinėliai ir trys patelės). Tų vadų, kuriose yra mažiau nei aštuoni palikuonys, skaičius nėra reguliuojamas.
      1.6.4.   Stebėjimai
      
      Testo metu kiekvienas gyvūnas turėtų būti stebimas kasdien. Reikėtų registruoti atitinkamus elgesio pokyčius, komplikuoto arba užsitęsusio nėštumo požymius ir visus toksiškumo požymius, įskaitant mirtingumą. Prieš poravimosi periodą ir jo metu reikėtų kasdien įvertinti pašaro sunaudojimą. Pasibaigus gimdymui ir prasidėjus laktacijai, tuo pat metu reikėtų pasverti vadą per įvertinti pašaro sunaudojimą (ir tuo pat metu įvertinti geriamo vandens sunaudojimą, jei tiriamoji medžiaga duodama su vandeniu). Pirmąją dozės davimo dieną ir vėliau po savaitės reikėtų pasverti tėvinės (P) kartos patinus ir pateles. Reikėtų pranešti apie šiuos stebėjimus, atliktus ištyrus kiekvieną gyvūną atskirai.
      Nėštumo trukmė turėtų būti pradedama skaičiuoti nuo nulinės dienos. Kiekviena vada turi būti pradėta tirti kaip galima greičiau tam, kad būtų galima nustatyti naujagimių lytį, gimimų skaičių ir pagrindines anomalijas.
      Nugaišę ir ketvirtą dieną po gimimo numarinti jaunikliai turėtų būti išsaugoti ir ištirti, ieškant galimų sutrikimų. Gimę jaunikliai turėtų būti pasverti ir vados pasvertos gimimo rytą, po ketvirtą bei septintą dieną ir po savaitės bei kol baigsis tyrimas, kai kiekvienas gyvūnas bus pasvertas atskirai.
      Reikėtų registruoti fizinius ar elgesio sutrikimus veislinėse patelėse bei jų palikuonyse.
      1.6.5.   Patologija
      
      1.6.5.1.   Skrodimas
      
      Tyrimo metu numarinus ar nugaišus tėvinės kartos (P) gyvūnams, juos reikėtų makroskopiškai ištirti tam, kad nustatyti bet kokias struktūrines anomalijas ar patologinius pakitimus, ypač atkreipiant dėmesį į dauginimosi organus. Nugaišę ar mirštantys gyvūnai turėtų būti ištirti, siekiant nustatyti sutrikimus.
      1.6.5.2.   Histopatologinis tyrimas
      
      Mikroskopiniam tyrimui reikėtų išsaugoti tėvinės kartos (P) gyvūnų kiaušides, gimdą, gimdos kaklelį, makštį, sėklides, sėklidės prielipą, spermą gaminančius maišelius, prostatą, koaguliacijos liauką, hipofizę bei tiriamąja medžiaga paveiktus organus. Jei atliekant tyrimus ir naudojant daug skirtingų dozių, šie organai nebuvo tirti, juos reikėtų mikroskopiškai ištirti didelę dozę gavusiuose gyvūnuose, kontrolinės grupės gyvūnuose bei tyrimo metu nugaišusiuose gyvūnuose, jei tai praktiškai įmanoma padaryti.
      Tų gyvūnų organai, kuriuose buvo nustatytos anomalijos, turėtų būti ištirti visuose likusiuose tėvinės kartos (P) gyvūnuose. Šiuo atveju, reikėtų mikroskopiškai tirti tuos audinius, kuriuose pastebėti pagrindiniai patologiniai pokyčiai. Kaip buvo pasiūlyta suporavimo procedūrų metu, tų gyvūnų, kurie, kaip įtariama, gali būti nevaisingi, dauginimosi organai turi būti mikroskopiškai tiriami.
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti apibendrinami pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje, vaisingų bei nėščių patelių skaičius, pokyčių tipai ir gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo pokyčiai, skaičius, išreikštas procentais.
      Jei įmanoma, išreikšti skaičiais rezultatai turėtų būti apdorojami pasitelkus atitinkamą statistinį metodą. Reikėtų naudoti bet kokį visuotinai naudojamą statistinį metodą.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Jei įmanoma, tai tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  panaudota rūšis/kamienas,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie toksinį atsaką pagal tirtą lytį ir duotą dozę, įskaitant vaisingumą, nėštumą ir gyvybingumą,
               
            
                  —
               
               
                  mirties laikas tyrimo metu arba jei gyvūnai išliko iki tyrimo pabaigos,
               
            
                  —
               
               
                  lentelė, kurioje pateikiama kiekvienos vados kūno masė, vidutinis jauniklių svoris vidurkiai ir kiekvieno jauniklio kūno masė tyrimo pabaigoje,
               
            
                  —
               
               
                  toksiniai ar kiti efektai, turinys įtakos dauginimuisi, palikuonims bei jų vystymuisi,
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių stebėjimo laikas,
               
            
                  —
               
               
                  tėvinės kartos (P) gyvūnų svoris,
               
            
                  —
               
               
                  skrodimo metu gauti duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  mikroskopinių tyrimų duomenų detalus apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų statistinė analizė, jei įmanoma tai padaryti,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aiškinimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.35.   TOKSIŠKO POVEIKIO DVIEJŲ KARTŲ REPRODUKCIJAI TYRIMAS
      1.   METODAS
      Šis metodas atitinka OECD TG 416 (2001).
      1.1   ĮVADAS
      Šis dviejų kartų reprodukcijos bandymo metodas skirtas suteikti bendros informacijos apie bandomosios medžiagos poveikį patinų ir patelių reprodukcijos sistemų vientisumui ir veiksmingumui, įskaitant lytinių liaukų funkciją, rujos ciklą, poravimosi elgesį, apvaisinimą, veisimą, atsivedimą, laktaciją, atjunkymą ir palikuonių augimą bei vystymąsi. Be to, tyrimas gali suteikti informacijos apie bandomosios medžiagos poveikį naujagimių liguistumui, gaištamumui, pirminių duomenų apie toksišką poveikį prenataliniam ir postnataliniam vystymuisi ir parengti vėliau daromų bandymų gaires. Taikant šį metodą tiriamas ne tik F1 kartos augimas ir vystymasis, jis taip pat skirtas patinų ir patelių reprodukcijos sistemų vientisumui bei veiksmingumui ir F2 kartos augimui bei vystymuisi įvertinti. Norint gauti papildomos informacijos apie toksišką poveikį vystymuisi ir funkcinius trūkumus, šį protokolą galima papildyti tyrimais, aprašytais atitinkamuose toksiško poveikio vystymuisi ir (arba) neurotoksiško poveikio vystymuisi metoduose, arba šie parametrai galėtų būti tiriami darant atskirus tyrimus, kuriuose būtų taikomi atitinkami bandymų metodai.
      1.2   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Kelioms patinų ir patelių grupėms duodamos skirtingos bandomosios medžiagos dozės. P kartos patinai turėtų gauti dozę augdami ir mažiausiai vieną visą spermatogenezės ciklą (maždaug 56 paras pelėms ir 70 parų žiurkėms), kad būtų galima gauti informacijos apie neigiamą poveikį spermatogenezei. Poveikis spermai yra nustatomas pagal kelis spermos parametrus (pvz., spermos morfologiją ir spermatozoidų judrumą), audinių preparatuose ir darant detalų histopatologinį tyrimą. Jei duomenys apie spermatogenezę yra gauti ankstesniame pakankamos trukmės kartotinos dozės tyrime, pvz., 90 parų tyrime, P kartos patinus nebūtina įtraukti į įvertinimą. Tačiau rekomenduojama išsaugoti P kartos spermos ėminius arba skaitmeninius užrašus, kad juos vėliau galima būtų įvertinti. P kartos patelės turi gauti dozę augdamos ir kelis visus rujos ciklus, kad būtų galima nustatyti bet kokį neigiamą bandomosios medžiagos poveikį normaliam rujos ciklui. Bandomoji medžiaga duodama tėvų kartos (P) gyvūnams poruojantis, veisimo metu ir iki jų Fl palikuonių atjunkymo. Po atjunkymo medžiaga toliau duodama F1 palikuonims iki jų subrendimo, poravimosi ir, atsiradus F2 kartai, iki šios kartos palikuonių atjunkymo.
      Visiems gyvūnams atiekami klinikiniai stebėjimai ir patologiniai tyrimai toksiškumo požymiams nustatyti, kreipiant ypač didelį dėmesį į poveikįpatinų ir patelių reprodukcijos sistemų vientisumui ir veiksmingumui bei palikuonių augimui ir vystymuisi.
      1.3   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      1.3.1   Gyvūnų rūšies pasirinkimas
      Tinkamiausia bandymo gyvūnų rūšis yra žiurkės. Jei naudojama kita rūšis, pasirinkimas turi būti pagrįstas ir padaromi atitinkami reikalingi pakeitimai. Neturi būti naudojamos mažo vaisingumo veislės arba veislės, kurioms dažnai pasireiškia vystymosi trūkumai. Tyrimo pradžioje naudojamų gyvūnų masės skirtumas turi būti kiek įmanoma mažesnis ir kiekvienai lyčiai neturi būti didesnis kaip 20 % vidutinės masės.
      1.3.2   Laikymo ir šėrimo sąlygos
      Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22 oC (± 3 oC). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė tinkamai įmaišyti bandomąją medžiagą, duodant ją šiuo būdu.
      Gyvūnai gali būti laikomi narveliuose atskirai arba mažomis tos pačios lyties grupėmis. Poruojama turi būti šiam tikslui pritaikytuose narveliuose. Pasitvirtinus susiporavimui, suporuotos patelės turi būti laikomos po vieną atsivedimo arba veisimo narveliuose. Suporuotos žiurkės gali būti laikomos mažomis grupėmis ir atskiriamos likus vienai arba dviem paroms iki atsivedimo. Artėjant atsivedimui, suporuotos patelės turi būti aprūpinamos atitinkamais ir nustatytais pakratais.
      1.3.3   Gyvūnų ruošimas
      Naudojami jauni ir sveiki, ankstesniuose bandymuose nedalyvavę gyvūnai, kurie mažiausiai 5 paras yra pratinami prie laboratorijos sąlygų. Apibūdinama bandymo gyvūno rūšis, veislė, šaltinis, lytis, masė ir (arba) amžius. Turi būti žinoma visų gyvūnų tarpusavio giminystė, kad būtų išvengta vienų tėvų gyvūnų poravimosi. Gyvūnai atsitiktinai suskirstomi į kontrolinę ir bandymo grupę (rekomenduojama grupuoti taikant sluoksniavimą pagal kūno masę). Narveliai išdėstomi taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks galimas poveikis dėl narvelio vietos. Kiekvienam gyvūnui turėtų būti priskirtas savitas identifikavimo numeris. P kartos gyvūnams tai daroma prieš pradedant duoti bandomąją medžiagą. F1 kartos gyvūnams tai daroma poravimui pasirinktiems gyvūnams po jų atjunkymo. Duomenys apie visų pasirinktų Fl gyvūnų kilmės vadą turi būti registruojami. Be to, rekomenduojama kiek manoma anksčiau atskirai identifikuoti žiurkiukus, kai numatoma atskirai juos sverti arba daryti kokius nors funkcinius bandymus.
      Pradėjus duoti dozes tėvų kartos (P) gyvūnams jie turi būti maždaug 5-9 savaičių. Visų bandomųjų grupių gyvūnai turi būti kiek įmanoma vienodos masės ir amžiaus.
      1.4   DARBO EIGA
      1.4.1   Gyvūnų skaičius ir lytis
      Kiekvienoje bandymo ir kontrolinėje grupėje turi būti pakankamas patelių skaičius, kad atsivedimo momentu arba jam artėjant būtų ne mažiau kaip 20 veisiančių patelių. Tai gali būti neįmanoma bandant medžiagas, sukeliančias nepageidaujamą su bandoma medžiaga siejamą poveikį (pvz., nevaisingumą, per didelį toksiškumą esant didelei dozei). Tikslas – gauti pakankamą atsivedančių patelių skaičių, kad būtų galima reikšmingai įvertinti, kokia yra bandomosios medžiagos geba paveikti vaisingumą, veisimą, motinos elgesį, žindymą, F1 palikuonio augimą ir vystymąsi nuo apvaisinimo iki subrendimo ir jo palikuonių (F2) vystymąsi iki atjunkymo. Todėl nepavykus gauti norimą veisiančių patelių skaičių (t. y. 20), tyrimas nebūtinai bus netinkamas ir turi būti vertinamas atsižvelgiant į kiekvieną atskirą atvejį.
      1.4.2   Dozių ruošimas
      Rekomenduojama bandomąją medžiagą duoti per burną (su pašaru, geriamuoju vandeniu arba per zondą), išskyrus kai manoma, kad tinkamesnis būtų kitas davimo būdas (pvz., per odą arba įkvepiant).
      Prireikus bandomoji medžiaga ištirpinama arba suspenduojama tinkamame nešiklyje. Rekomenduojama visais įmanomais atvejais iš pradžių tirti galimybę naudoti vandeninį tirpalą ar suspensiją, vėliau tirpalą ar emulsiją aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet galimybę tirpinti kitame nešiklyje. Turi būti žinomos nešiklio, išskyrus vandenį, toksiškumo savybės. Turėtų būti nustatytas bandomosios medžiagos stabilumas nešiklyje.
      1.4.3   Dozavimas
      Turi būti naudojamos mažiausiai trijų dozių grupės ir lygiagrečiai viena kontrolinė grupė. Jei nėra apribojimų dėl fizikocheminių arba biologinių bandomosios medžiagos savybių, didžiausia dozė pasirenkama siekiant sukelti tam tikrą toksišką poveikį, bet ne žūtį arba sunkias kančias. Nelaukto žūstamumo atveju, tyrimai, kuriuose tėvų kartos (P) gyvūnų žūstamumas yra maždaug kaip 10 % mažesnis, paprastai yra dar priimtini. Turi būti pasirinkta mažėjanti dozės koncentracijos seka, siekiant parodyti kiekvieną su dozės dydžiu susietą reakciją ir nesančio neigiamo poveikio lygį (NOAEL). Mažėjančioms dozės koncentracijos vertėms nustatyti dažnai pakanka dvigubo arba keturgubo koncentracijos skirtumo ir dažnai geriau būtų papildomai naudoti ketvirtą bandymo grupę, užuot naudojus labai didelius intervalus tarp dozių (pvz., daugiklis didesnis kaip 10). Darant su pašaru dedamos medžiagos tyrimus, dozės neturėtų skirtis daugiau kaip 3 kartus. Dozės dydis turėtų būti pasirenkamas atsižvelgiant į visus turimus toksiškumo duomenis, ypač kartotinų dozių tyrimo rezultatus. Be to, reikėtų nagrinėti visą papildomą informaciją apie bandomojo junginio arba giminingų medžiagų apykaitą ir kinetiką. Kartu ši informacija padėtų parodyti dozavimo režimo tinkamumą.
      Kontrolinė grupė turėtų būti medžiagos negaunanti grupė arba nešiklį gaunanti kontrolinė grupė, jei bandomajai medžiagai duoti naudojamas nešiklis. Išskyrus tai, kad kontrolinės grupės gyvūnai nepaveikiami bandomąja medžiaga, jie prižiūrimi tokiu pat būdu, kaip ir bandymo grupės gyvūnai. Jei naudojamas nešiklis, kontrolinės grupės turėtų gauti nešiklio kiekį, atitinkanti didžiausią naudoj amą tūrį. Jei bandomoji medžiaga duodama su pašaru ir dėl to sumažėja pašaro suvartojimas arba įsisavinimas, gali tekti naudoti lygiagrečiai šeriamą kontrolinę grupę. Vietoj lygiagrečiai šeriamos kontrolinės grupės galima naudoti duomenis, gautus kontroliuojamuose tyrimuose, skirtuose įvertinti sumažėjusio pašaro suvartojimo įtaką reprodukcijos parametrams.
      Reikėtų atsižvelgti į šias nešiklio ir kitų priedų savybes: poveikį absorbcijai, pasiskirstymui, medžiagų apykaitai ir bandomosios medžiagos sulaikymui; poveikį bandomosios medžiagos cheminėms savybėms, dėl kurių gali pasikeisti jos toksiškumo savybės; poveikį maisto ar vandens suvartojimui arba gyvūnų įmitimui.
      1.4.4   Ribinis bandymas
      Jei darant bandymą pagal šiame tyrime aprašytas metodikas su viena mažiausiai 1 000 mg/kg kūno masės per parą doze, kuri yra duodama per burną, arba su atitinkamos procentinės dalies doze, dedama į pašarą arba į geriamą vandenį, toksiškas poveikis tėvų grupių gyvūnams arba jų palikuonims nepastebimas ir jei tokio poveikio nelaukiama, atsižvelgiant į turimus duomenis apie giminingos struktūros ir (arba) apykaitos junginius, nebūtina daryti visą tyrimą, naudojant kelias dozių koncentracijas. Ribinis bandymas nedaromas, kai poveikis žmonėms rodo, kad reikia naudoti didesnes per burną duodamas dozes. Kalbant apie kitus davimo būdus, pvz., įkvėpimą arba veikimą per odą, bandomosios medžiagos fizikocheminės savybės dažnai gali apibrėžti ir riboti didžiausią pasiekiamą poveikio lygį.
      1.4.5   Dozių davimas
      Gyvūnai gauna bandomosios medžiagos dozę septynias dienas per savaitę. Geriau duoti per burną (su pašaru, geriamuoju vandeniu arba naudojant zondą). Jei duodama kitu būdu, jis turi būti pagrįstas, be to, gali tekti daryti atitinkamus pakeitimus. Atitinkamu bandymo laikotarpiu visi gyvūnai turi gauti dozę vienodu būdu. Kai bandomoji medžiaga duodama per zondą, reikia naudoti skrandžio vamzdelį. Vienu metu duodamo skysčio tūris neturi būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės (0,4 ml/100 g kūno masės yra didžiausias kiekis naudojant kukurūzų aliejų), išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti po 2 ml/100 g kūno masės. Išskyrus dirginančias arba ėsdinančias medžiagas, kurios esant didesnei koncentracijai turi sunkesnį poveikį, bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas, keičiant koncentraciją taip, kad visų dozių tūris būtų pastovus. Darant tyrimus su zondu, žiurkiukai dažniausiai gauna bandomosios medžiagos netiesiogiai su pienu tol, kol atjunkyti patys pradeda gauti dozes. Jei tyrimai daromi medžiagą dedant į pašarą arba geriamąjį vandenį, žiurkiukai papildomai gauna bandomosios medžiagos tiesiogiai, kai paskutinę laktacijos laikotarpio savaitę jie pradeda ėsti patys.
      Jei medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, svarbu užtikrinti, kad naudojami bandomosios medžiagos kiekiai netrukdytų įprastai mitybai arba vandens pusiausvyrai. Kai bandomoji medžiaga duodama su pašaru, galima naudoti pastovią koncentraciją (ppm) arba pastovią dozę pagal gyvūno kūno masę; naudotas variantas turi būti nurodytas. Jei medžiaga duodama per zondą, dozė turėtų būti duodama kiekvieną dieną panašiu laiku ir reguliuojama mažiausiai kartą per savaitę pastoviam dozės ir gyvūno kūno masės santykiui užtikrinti. Reikėtų atsižvelgti į informaciją dėl placentinio pasiskirstymo, reguliuojant per zondą duodamą dozę, nustatomą pagal gyvūno masę.
      1.4.6   Bandymo programos
      Kasdieninės dozės tėvų kartos (P) patinams ir patelėms pradedamos duoti, kai jie sulaukia 5-9 savaičių. Kasdieninės F1 patinų ir patelių dozės pradedamos duoti po atjunkymo; reikėtų turėti omenyje, kad tais atvejais, kai bandomoji medžiaga duodama su pašaru arba geriamuoju vandeniu, tiesioginis F1 kartos žiurkiukų veikimas bandomąja medžiaga gali vykti laktacijos laikotarpiu. Abiem lytims (P ir F1) dozės turi būti toliau duodamos mažiausiai 10 savaičių prieš poravimo laikotarpį. Dozės toliau duodamos abiem lytims 2 savaites poravimosi laikotarpiu. Kai patinai nebereikalingi įvertinant poveikį reprodukcijai, jie turi būti humaniškai nužudomi ir ištiriami. Tėvų kartos (P) patelėms dozės duodamos toliau visą veisimo laiką ir iki F1 palikuonių atjunkymo. Reikėtų atsižvelgti į dozavimo programos pakeitimus, pagrįstus turima informacija apie bandomąją medžiagą, įskaitant turimus toksiškumo, medžiagų apykaitos indukcijos arba biologinio kaupimosi duomenis. Kiekvieno gyvūno dozė paprastai turėtų būti pagrįsta pačiu paskutiniu atskiro gyvūno masės nustatymu. Tačiau reikia imtis atsargumo priemonių reguliuojant dozės dydį paskutinius tris veisimo mėnesius.
      P ir F1 kartų patinų ir patelių apdorojimas tęsiamas iki jų nužudymo. Visi P ir F1 suaugę patinai ir patelės turi būti humaniškai nužudomi, kai jų nebereikia norint įvertinti poveikį reprodukcijai. Visi poravimui nepasirinkti F1 palikuonys ir visi F2 palikuonys po atjunkymo turi būti humaniškai nužudomi.
      1.4.7   Poravimo eiga
      1.4.7.1   Tėvų kartos (P) poravimas
      Kiekvienam suporavimui patelė atskirai uždaroma į narvelį su vienu tą pačią dozę gaunančiu patinu (1:1 poravimas) tol, kol jie susiporuoja, arba 2 savaitėms. Kiekvieną dieną patelės tiriamos dėl spermos arba makšties kamščių atsiradimo. 0 veisimo diena apibrėžiama kaip diena, kai randama spermos arba makšties kamštis. Jei poravimas nesėkmingas, galima būtų spręsti dėl pakartotino patelių poravimo su patikrintais tos pačios grupės patinais. Pateikiant duomenis poruojamos poros turi būti aiškiai identifikuotos. Reikėtų vengti vienų tėvų palikuonių poravimo.
      1.4.7.2   F 1 kartos poravimas
      Norint poruoti F1 kartos palikuonis F2 kartai gauti, atjunkimo metu iš kiekvienos vados pasirenkamas mažiausiai vienas patinas ir viena patelė poravimui su kitais tą pačią dozę gavusiais kitos vados žiurkiukais. Kiekvienos vados žiurkiukų pasirinkimas turi būti atsitiktinis, jei vienoje vadoje nėra reikšmingų kūno masės arba išvaizdos skirtumų. Tais atvejais, kai skirtumų yra, pasirenkami geriausi kiekvienos vados atstovai. Praktiškai tai geriausiai būtų daryti pagal kūno masę, bet gali labiau tikti atranka pagal išvaizdą. F1 palikuonys poruojami tik pasiekę lytinę brandą.
      Turėtų būti įvertintos poros be palikuonių, siekiant nustatyti aiškią nevaisingumo priežastį. Šiam tikslui galbūt reikėtų taikyti metodikas, numatančias papildomo poravimo galimybes su kitais patikrintais patinais arba patelėmis, dauginimosi organų mikroskopinį tyrimą ir rujos ciklų arba spermatogenezės tyrimą.
      1.4.7.3   Antrasis poravimas
      Tam tikrais atvejais, pvz., kai dėl apdorojimo pakinta vados dydis arba pastebimas neaiškus poveikis per pirmąjį poravimą, rekomenduojama P arba Fl kartų suaugusius gyvūnus dar kartą poruoti naujai vadai gauti. Rekomenduojama dar kartą poruoti vados nedavusias pateles arba patinus su patikrintais priešingos lyties reproduktoriais. Jei laikoma, kad yra būtina bet kurios kartos antroji vada, gyvūnai turėtų būti poruojami praėjus savaitei nuo paskutinės vados atjunkymo.
      1.4.7.4   Vados dydis
      Gyvūnams leidžiama normaliai atsivesti vadą ir auginti palikuonis iki atjunkymo. Standartizuoti vados dydį neprivaloma. Standartizavus vados dydį, detaliai aprašomas taikytas metodas.
      1.5   STEBĖJIMAI
      1.5.1   Klinikiniai stebėjimai
      Bendrasis klinikinis stebėjimas atliekamas kas dieną, o nustatant davimo per zondą laiką, reikėtų atsižvelgti į didžiausio laukiamo poveikio po medžiagos davimo laiką. Turi būti užrašomi visi elgesio pokyčiai, sunkaus arba ilgesnio atsivedimo požymiai ir visi toksiškumo požymiai. Mažiausiai kas savaitę turėtų būti daromas papildomas detalesnis kiekvieno gyvūno tyrimas, kurį patogu daryti gyvūną sveriant. Du kartus per dieną ir prireikus kartą per dieną savaitgaliais visi gyvūnai turi būti stebimi liguistumo požymiams ir mirtingumui nustatyti.
      1.5.2   Tėvų kartos gyvūnų kūno masė ir pašaro ar vandens suvartojimas
      Tėvų kartų (P ir F1) gyvūnai sveriami pirmąją dozės davimo dieną ir vėliau mažiausiai kartą per savaitę. Tėvų kartos (P ir F1) patelės sveriamos ne mažiau kaip 0, 7, 14, ir 20 arba 21 veisimo dieną, laktacijos metu sveriamos tomis pačiomis dienomis, kaip ir vada, ir gyvūnų nužudymo dieną. Šie rezultatai turi būti pateikiami ataskaitoje atskirai apie kiekvieną suaugusį gyvūną. Poravimo ir veisimo laikotarpiu pašaro suvartojimas turi būti matuojamas mažiausiai kas savaitę. Vandens suvartojimas matuojamas mažiausiai kas savaitę, jei bandomoji medžiaga duodama su vandeniu.
      1.5.3   Rujos ciklas
      P ir F1 kartų patelių rujos ciklo trukmė ir normalumas įvertinamas prieš suporavimą ir, nebūtinai, poravimo metu darant makšties tepinėlius tol, kol bus gautas suporavimo įrodymas. Makšties ar gimdos kaklelio ląstelės turi būti imamos atsargiai, kad nebūtų pažeista gleivinė ir tokiu būdu nebūtų sukeltas netikras veisimas (1).
      1.5.4   Spermos parametrai
      Užrašoma visų nužudytų P ir Fl patinų sėklidžių ir antsėklidžių masė ir vienas kiekvieno organo pavyzdys paliekamas histopatologiniam tyrimui (žr. 1.5.7, 1.5.8.1 skirsnius). Iš kiekvienos P ir Fl patinų grupės bent 10 gyvūnų pogrupio sėklidės ir antsėklidžiai naudojami homogenizavimui atsparioms spermatidėms ir antsėklidžių uodegoje sukauptiems spermatozoidams suskaičiuoti. Turi būti surinkta to paties pogrupio patinų sperma iš antsėklidžių uodegos arba iš sėklinio latako spermos judrumui ir morfologijai įvertinti. Jei pastebimas su bandoma medžiaga susijęs poveikis arba jei yra kituose tyrimuose gautų duomenų apie galimą poveikį spermatogenezei, turėtų būti tiriama visų kiekvienos dozės grupės patinų sperma; priešingu atveju galima apsiriboti kontrolinės grupės ir didžiausios dozės grupės P ir Fl patinų spermatozoidų skaičiavimu.
      Skaičiuojamas bendras homogenizavimui atsparių sėklidžių spermatidžių ir antsėklidžių uodegos spermatozoidų skaičius (2) (3). Spermos atsargas uodegoje galima apskaičiuoti pagal suspensijos, naudojamos kokybiniam įvertinimui, spermatozoidų koncentraciją ir tūrį, ir spermatozoidų, išgautų vėliau sumalant ir (arba) homogenizuojant likusį uodegos audinį, skaičių. Visų dozių patinų grupių pasirinktų pogrupių gyvūnų spermatozoidai skaičiuojami iškart po gyvūnų nužudymo, išskyrus kai filmuojama analoginiu arba skaitmeniniu būdu arba kai bandiniai yra užšaldomi ir analizuojami vėliau. Šiais atvejais kontrolinės ir didelės dozės grupės gali būti analizuojamos pirmos. Jei su bandomąja medžiaga susijusio poveikio (pvz., poveikio spermatozoidų skaičiui, judrumui arba morfologijai) nėra, kitų grupių analizuoti nebūtina. Jei didelę dozę gavusioje grupėje pastebimas su bandomąja medžiaga susijęs poveikis, reikia įvertinti ir mažesnių dozių grupes.
      Antsėklidžio (arba sėklinio latako) spermatozoidų judrumas įvertinimas arba filmuojamas iš karto po nužudymo. Sperma turi būti išgauta, kiek įmanoma mažinant galimybę jai pakenkti ir skiedžiama judrumui analizuoti, taikant tinkamus metodus (4). Subjektyviai arba objektyviai įvertinama vis labiau judresnių spermatozoidų procentinė dalis. Kai daroma kompiuterinė judėjimo analizė (5) (6) (7) (8) (9) (10), didėjantis judrumas nustatomas pagal vartotojo nustatytas ribines vertes vidutiniam greičiui išilgai trajektorijos ir tiesiškumui arba tiesiškumo indeksui. Jei ėminiai filuojami (11) arba skrodimas įrašinėjamas kitu būdu, vėliau galima analizuoti tik kontrolinę ir didelę dozę gavusių P ir F1 patinų grupes, išskyrus kai pastebimas su bandomąja medžiaga susijęs poveikis; šiuo atveju dar reikia įvertinti mažesnių dozių grupes. Neturint analoginio arba skaitmeninio vaizdo įrašo, visi visų apdorotų grupių ėminiai analizuojami darant skrodimą.
      Daromas antsėklidžio (arba sėklinio latako) spermos ėminio morfologinis įvertinimas. Spermatozoidai (bent 200 vienam ėminiui) ištiriami kaip fiksuoti preparatai bei skystoje terpėje (12) ir klasifikuojami kaip normalūs arba nenormalūs. Morfologinės spermatozoidų anomalijos būtų spermatozoidų sulipimas, izoliuotos galvutės ir deformuotos galvutės ir (arba) uodegėlės. Daromas visų dozių grupių pasirinktų pogrupių patinų įvertinimas iš karto po gyvūnų nužudymo arba vėliau pagal analoginius arba skaitmeninius vaizdo įrašus. Fiksuotus tepinius galima analizuoti ir vėliau. Šiais atvejais kontrolinių ir didžiausios dozės grupės gali būti analizuojamos pirmos. Jei su bandomąja medžiaga susijusio poveikio (pvz., poveikio spermatozoidų morfologijai) nėra, kitų grupių analizuoti nebūtina. Jei didelę dozę gavusioje grupėje pastebimas su bandomąja medžiaga susijęs poveikis, reikia įvertinti ir mažesnių dozių grupes.
      Jei kuris nors iš pirmiau išvardytų spermos įvertinimo parametrų jau buvo tiriamas darant bent 90 parų sisteminio toksiškumo tyrimą, šio įvertinimo nebūtina kartoti darant dviejų kartų tyrimą. Tačiau rekomenduojama pasilikti P kartos spermos ėminius arba skaitmeninius vaizdo įrašus, kad prireikus būtų galima įvertinti vėliau.
      1.5.5   Palikuonys
      Kiekviena vada tiriama kiek įmanoma greičiau po atsivedimo (0 laktacijos para) norint nustatyti žiurkiukų skaičių ir lytį, negyvagimius, gyvus palikuonis ir tai, ar yra išsigimimų. Nulinę parą rasti negyvi žiurkiukai, jei jie nemaceruoti, tiriami galimiems defektams ir žūties priežasčiai nustatyti, vėliau užkonservuojami. Gyvi žiurkiukai suskaičiuojami ir atskirai pasveriami atsivedimo metu (0 laktacijos para) arba pirmą parą, o vėliau – reguliariai, pvz., 4, 7, 14, ir 21 laktacijos parą. Užrašomos pastebėtos patelių arba palikuonių fizinės ir elgesio anomalijos.
      Palikuonių fizinis vystymasis daugiausia registruojamas pagal kūno masės padidėjimą. Kiti fiziniai parametrai (pvz., ausų ir akių atsivėrimas, dantų prasikalimas, kailio augimas) gali suteikti papildomos informacijos, tačiau šiuos duomenis būtų geriau vertinti registruojant lytinio brendimo duomenis (pvz., amžius ir kūno masė makšties atsidarymo arba apyvarpės atsiskyrimo metu) (13). Rekomenduojama daryti Fl palikuonių funkcinius tyrimus (pvz., motorinio aktyvumo, sensorinės funkcijos, refleksų ontogenezės) prieš ir po atjunkimo, visų pirma, susietus su lytiniu brendimu, jei tokia analizė neįtraukta į atskirus tyrimus. Nustatomas poravimui pasirinktų F1 atjunkytų gyvūnų makšties atsidarymo ir apyvarpės atsiskyrimo laikas. Išmatuojamas F2 žiurkiukų anogenitalinis atstumas nulinę parą po gimimo, jei buvo nustatytas F1 lyčių santykio arba lytinio subrendimo laiko pakitimas.
      Funkcinių stebėjimų galima nedaryti tose grupėse, kuriose yra aiškių neigiamo poveikio požymių (pvz., reikšmingas masės didėjimo sumažėjimas ir t. t.). Jei daromi funkciniai tyrimai, jie nedaromi poravimui atrinktiems žiurkiukams.
      1.5.6   Bendroji autopsija
      Nužudyti arba darant tyrimą žuvę visi tėvų kartos (P ir F1) gyvūnai, visi žiurkiukai su išorinėmis anomalijomis arba klinikiniais požymiais, be to, atsitiktinai pasirinktas iš kiekvienos F1 ir F2 kartos žiurkiukas ar lyties atstovas ar vada tiriama makroskopiškai struktūros anomalijoms arba patologiniams pakitimams nustatyti. Ypatingas dėmesys kreipiamas į reprodukcijos sistemos organus. Humaniškai nužudyti leisgyviai žiurkiukai ir negyvi žiurkiukai, jei nemaceruoti, tiriami galimiems defektams ir žūties priežasčiai nustatyti, vėliau užkonservuojami.
      Tiriama visų pirmą kartą gimdžiusių patelių gimda implantavimo vietų buvimui ir skaičiui nustatyti, stengiantis nepakenkti histopatologiniam įvertinimui.
      1.5.7   Organų masė
      Nužudžius nustatoma visų P ir Fl kartų tėvų kūno ir šių organų masė (poriniai organai sveriami atskirai):
      
                  —
               
               
                  gimdos, kiaušidžių,
               
            
                  —
               
               
                  sėklidės, antsėklidžio (viso ir uodegos),
               
            
                  —
               
               
                  prostatos,
               
            
                  —
               
               
                  sėklinių pūslelių su koaguliatorių liaukomis ir jų skysčiais ir prostatos (kaip vieno vieneto),
               
            
                  —
               
               
                  smegenų, kepenų, inkstų, blužnies, hipofizio, skydliaukės, antinksčių liaukų ir žinomų veikiamų organų.
               
            Po nužudymo nustatoma skrodimui pasirinktų F1 ir F2 žiurkiukų masė. Sveriami šie vieno atsitiktinai pasirinkto žiurkiuko ar lyties ar vados (žr. 1.5.6 skirsnį) organai: smegenys, blužnis ir užkrūčio liauka.
      Bendrojo skrodimo ir organų masės rezultatai įvertinami atsižvelgiant į stebėjimus kitų kartotinės dozės tyrimų metu, jei įmanoma.
      1.5.8   Histopatologiniai tyrimai
      1.5.8.1   Tėvai
      Histopatologiniam tyrimui fiksuojami ir atitinkamoje terpėje konservuojami šie tėvų (P ir Fl) kartos gyvūnų organai ir audiniai arba jų tipiniai ėminiai:
      
                  —
               
               
                  makštis, gimda ir kaklelis, kiaušidės (konservuojamos atitinkamoje fiksavimo priemonėje),
               
            
                  —
               
               
                  viena sėklidė (konservuojama Bouin arba panašioje fiksavimo priemonėje), vienas antsėklidis, sėklinės pūslelės, prostata ir koagulianto liaukos,
               
            
                  —
               
               
                  visų poravimui pasirinktų P ir F1 gyvūnų organas (-ai), ankstesniuose tyrimuose identifikuotas (-i) kaip veikiamas (-i) organai.
               
            Daromi išsamūs histopatologiniai visų poravimui pasirinktų P ir Fl gyvūnų, priklausančių kontrolinėms ir didelės dozės grupėms, užkonservuotų organų ir audinių tyrimai. P gyvūnų kiaušidžių tyrimas neprivalomas. Dar tiriami mažos bei vidutinės dozės grupių organai, kuriems pasireiškia su bandomąja medžiaga siejami pakitimai, kad būtų lengviau nustatyti NOAEL. Be to, daromas histopatologinis mažos ir vidutinės dozės grupių gyvūnų, kuriems įtariamas sumažėjęs vaisingumas, pvz., kurie negalėjo susiporuoti, pastoti, būti reproduktoriumi arba atsivesti sveikus palikuonis, arba kurių rujos ciklas arba spermatozoidų skaičius, judrumas arba morfologija buvo paveikti, reprodukcijos organų įvertinimas. Turi būti ištirti visi dideli pažeidimai, pvz., atrofija arba augliai.
      Daromas išsamus sėklidžių histopatologinius tyrimas (pvz., naudojant Bouin fiksavimo skystį, į parafiną įlietus ėminius ir 4-5 μm storio skersinius pjūvius), siekiant nustatyti su bandomąja medžiaga susietą poveikį, pvz., spermatidžių sulaikymą, gemalų ląstelių sluoksnių arba tipų trūkumą, daugiabranduoles dideles ląsteles arba spermatogeninių ląstelių atitrūkimą į prošvaisą (14). Nepaliesto antsėklidžio tyrimas, tiriant galvutę, kūną ir uodegą, gali būti daromas įvertinant išilginį pjūvį. Antsėklidis įvertinamas leukocitų infiltracijai, ląstelių vyraujančių tipų pokyčiui, netipiškoms ląstelėms ir spermatozoidų fagocitozei nustatyti. Patinų reprodukcijos organų tyrimui gali būti naudojamas dažymas PAS (jodo perrūgšties ir Šifo reagentu) arba hematoksilinu.
      Po laktacijos kiaušidėje turi būti pirminiai ir augantys folikulai ir dideli laktacijos geltonkūniai. Darant histopatologinį tyrimą turėtų būti nustatytas kokybinis pirminių folikulių populiacijos sumažėjimas. Fl patelėms daromas kiekybinis pirminių folikulų įvertinimas; gyvūnų skaičius, kiaušidės skerspjūvio pasirinkimas ir pjūvių ėminių dydis turi statistiškai atitikti taikomą įvertinimo metodiką. Tyrimą sudaro pirminių folikulų, kurie gali būti sujungti su mažais augančiais folikulais, skaičiaus nustatymas, siekiant palyginti paveiktas ir kontrolines kiaušides (15) (16) (17) (18) (19).
      1.5.8.2   Atjunkyti jaunikliai
      Histopatologiniam tyrimui fiksuojami ir tinkamoje terpėje laikomi audiniai, turintys makroskopinių anomalijų, ir visų žiurkiukų veikiami organai, turintys išorinių anomalijų arba klinikinių požymių, be to, atsitiktinai pasirinktas vienas F1 ir F2 kartų žiurkiukas ar lytis ar vada, nepasirinkta poravimui. Daromas išsamus histopatologinis konservuoto audinio apibūdinimas, ypatingą dėmesį kreipiant reprodukcijos sistemai.
      2.   DUOMENYS
      2.1   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Duomenys pateikiami atskirai ir suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei ir kiekvienai kartai nurodomas gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, darant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių nužudytų gyvūnų skaičius, visų gyvūnų žūties arba nužudymo laikas, vaisingų gyvūnų skaičius, veisiančių patelių skaičius, toksiško poveikio požymių turinčių gyvūnų skaičius, pastebėtų toksiškumo požymių aprašymas, įskaitant pradžios laiką, trukmę ir bet kokio toksiško poveikio sunkumą, taikyti tėvų ir palikuonių stebėjimo būdai, histopatologinių pakitimų tipai ir atitinkami vados duomenys.
      Skaitmeniniai rezultatai turi būti įvertinti taikant atitinkamą visuotinai priimtą statistinį metodą; statistiniai metodai pasirenkami kaip tyrimo schemos dalis ir turi būti pagrįsti. Duomenims analizuoti gali padėti dozės ar reakcijos statistiniai modeliai. Ataskaitoje turi būti pakankamas kiekis informacijos apie analizės metodą ir taikytą kompiuterio programą, kad nepriklausomas ekspertas ar statistikos specialistas galėtų iš naujo įvertinti bei atkurti analizės eigą.
      2.2   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS
      Šio toksiško poveikio dviejų kartų reprodukcijai tyrimo duomenys įvertinami atsižvelgiant į pastebimą poveikį, įskaitant skrodimą ir mikroskopinio tyrimo rezultatus. Įvertinamas ryšis tarp bandomosios medžiagos ir anomalijų buvimo, nebuvimo, dažnumo ir sunkumo, įskaitant makroskopinius pakitimus, nustatytus veikiamus organus, paveiktą vaisingumą klinikines anomalijas, paveiktą reprodukavimo gebą ir vados charakteristikas, kūno masės pokyčius, poveikį gaištamumui ir bet kokį kitą toksišką poveikį arba tokio ryšio nebuvimas. Įvertinant rezultatus reikia atsižvelgti į bandomosios medžiagos fizikochemines savybes ir toksikokinetinius duomenis, jei tokie būtų.
      Tinkamai darant toksiško poveikio reprodukcijai bandymą turi būti gautas patenkinamas poveikio nesukeliančios dozės įvertis ir neigiamo poveikio reprodukcijai, atsivedimui, laktacijai, postnataliniam vystymuisi, įskaitant augimą ir lytinį brendimą supratimas.
      2.3   REZULTATŲ AIŠKINIMAS
      Toksiško poveikio dviejų kartų reprodukcijai tyrimas suteiks informacijos apie kartotinio medžiagos naudojimo poveikį visais reprodukcijos ciklo tarpsniais. Pirmiausia tyrimas suteikia informacijos apie reprodukcijos parametrus ir palikuonių vystymąsi, augimą, brendimą ir išlikimą. Tyrimo rezultatai turėtų būti aiškinami atsižvelgiant į pusiau lėtinio toksiško poveikio, toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi ir į toksikokinetinių bei kitų atliktųtyrimų rezultatus. Šio tyrimo rezultatai gali būti naudojami įvertinant cheminės medžiagos papildomų tyrimų būtinumą. Tyrimo rezultatų ekstrapoliavimas žmonėms gali tikti tik tam tikru laipsniu. Jie labiausiai tinka, kai reikia gauti informacijos apie poveikio nesukeliančias dozes ir leistiną poveikį žmonėms (20) (21) (22) (23).
      3.   ATASKAITOS RENGIMAS
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitą turi sudaryti ši informacija:
      
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              fizinė būsena ir, jei reikia, fizikocheminės savybės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identifikavimo duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              grynumas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Nešiklis (jei naudojamas):
                  
                              —
                           
                           
                              nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              naudota rūšis ir veislė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras, kraiko medžiagos ir t. t.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              atskirai kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              dozės koncentracijos pasirinkimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detali informacija apie bandomosios medžiagos preparato ruošimą arba jos dėjimą į pašarą, gautos koncentracijos vertės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              preparato stabilumas ir vienalytiškumas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detali informacija apie bandomosios medžiagos davimą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos koncentracijos pašare ar geriamajame vandenyje (ppm) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg kūno masės per parą), jei tinka,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detali informacija apie pašaro ir vandens kokybę.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              pašaro suvartojimas ir, jei matuojamas, vandens suvartojimas, pašaro efektyvumas (kūno masės padidėjimas vienam suvartoto pašaro gramui), P ir F1 gyvūnų atveju nurodomas suvartotos bandomosios medžiagos kiekis, išskyrus bendrojo buvimo laikotarpį ir mažiausiai paskutinį laktacijos laikotarpio trečdalį,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              absorbcijos duomenys (jei yra),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              P ir Fl gyvūnų, pasirinktų poravimui, kūno masės duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vados ir žiurkiukų masės duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tėvų kartų kūno masė nužudant ir absoliučios bei santykinės organų masės duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              klinikinių požymių tipas, sunkumas ir trukmė (grįžtami ar negrįžtami),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              žūties darant tyrimą laikas arba gyvūnai, išgyvenę iki nužudymo,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksiškumo duomenys pagal lytį ir dozę, įskaitant poravimo, vaisingumo, veisimo, gimstamumo, gyvybingumo ir laktacijos rodiklius; ataskaitoje nurodomi skaičiai, naudojami rodikliams apskaičiuoti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksiškas arba kito tipo poveikis reprodukcijai, palikuonims, postnataliniam augimui ir t. t.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              skrodimo rezultatai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalus visų histopatologinių rezultatų aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              P ir F1 patelių, turinčių normalų ciklą, skaičius ir ciklo trukmė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              suminis spermatozoidų antsėklidžio uodegoje skaičius, vis labiau judresnių spermatozoidų procentinė dalis, morfologiškai normalių spermatozoidų procentinė dalis ir spermatozoidų, su kiekviena identifikuota anomalija, procentinė dalis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              poravimosi laikas, įskaitant parų iki poravimosi skaičių,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              veisimo trukmė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              implantacijų, geltonkūnių skaičius, vados dydis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gimusių gyvų žiurkiukų skaičius ir poimplantaciniai nuostoliai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              žiurkiukų su aiškiai matomais išsigimimais skaičius; pateikiamas silpniausių žiurkiukų skaičius, jei buvo nustatomas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              žiurkiukų fiziniai duomenys ir kiti postnatalinio vystymosi duomenys; įvertinti fiziniai parametrai turi būti pagrįsti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              žiurkiukų ir suaugusių gyvūnų funkcinių stebėjimų duomenys, kai tinka,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinis duomenų apdorojimas, jei reikia.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados, įskaitant patelėms ir palikuonims gautas NOAEL vertes.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.
               
            
                  2)
               
               
                  Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology 12:92–108.
               
            
                  3)
               
               
                  Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility 54:103–107.
               
            
                  4)
               
               
                  Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology 5:39–44
               
            
                  5)
               
               
                  Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3):237–244.
               
            
                  6)
               
               
                  Chapin, R.E. et al., (1992).Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology 6:267–273
               
            
                  7)
               
               
                  Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration. Journal of Andrology 13:409–421.
               
            
                  8)
               
               
                  Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology 5:449–458.
               
            
                  9)
               
               
                  Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida. pp. 319–333.
               
            
                  10)
               
               
                  Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401–415.
               
            
                  11)
               
               
                  Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andrology 8:330–337.
               
            
                  12)
               
               
                  Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491–505.
               
            
                  13)
               
               
                  Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17:298303.
               
            
                  14)
               
               
                  Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.
               
            
                  15)
               
               
                  Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.
               
            
                  16)
               
               
                  Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, p. 421–426.
               
            
                  17)
               
               
                  Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Assessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven, New York.
               
            
                  18)
               
               
                  Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive Toxicology 5:379–383.
               
            
                  19)
               
               
                  Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.
               
            
                  20)
               
               
                  Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and CD. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.
               
            
                  21)
               
               
                  Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.
               
            
                  22)
               
               
                  Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.
               
            
                  23)
               
               
                  Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.
               
            B.36.   TOKSIKOKINETIKA
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4.   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Tiriamoji medžiaga duodama atitinkamu būdu. Atsižvelgiant į tyrimo tikslą, tam tikrais periodais medžiaga gali būti duodama paviene ar kartotinėmis dozėmis keleto eksperimentinių grupių gyvūnams. Vėliau, priklausomai tuo tyrimo tipo, kūno skysčiuose, audiniuose ir (ar) ekskretuose nustatoma medžiaga ir (ar) metabolitai.
      Galima tirti „nežymėtas“ ir „žymėtas“ tiriamosios medžiagos formas. Jei naudojama žymė, tai ji į tiriamąją medžiagą turi būti įvesta taip, kad būtų galima gauti kuo išsamesnės informacijos apie junginio likimą.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Nėra.
      1.6.   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      
         Pasiruošimas tyrimui
      
      Mažiausiai penkias dienas prieš tyrimą sveiki gyvūnų jaunikliai aklimatizuojami laboratorinėmis sąlygomis. Prieš pradedant tyrimą gyvūnai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes. Ypatingais atvejais galima naudoti labai jaunus gyvūnus, nėščias pateles, bei gyvūnus, iš anksto paveiktus tiriamąja medžiaga.
      
         Tyrimo sąlygos
      
      Eksperimentiniai gyvūnai
      Toksikokinetiniai tyrimai gali būti atliekami panaudojant vieną ar daugiau atitinkamų gyvūnų rūšių, ir reikia atsižvelgti į rūšis, kurios yra naudojamos ir kurios pasirinktos naudoti kituose tos pačios tiriamosios medžiagos toksikologiniuose tyrimuose. Jei teste naudojami graužikai, tai jų kūno masės variacija neturėtų viršyti ± 20 % kūno masės vidurkio.
      Skaičius ir lytis
      Tiriant absorbciją ir ekskreciją, iš pradžių kiekvienoje grupėje, kuriai duodama skirtinga dozė, turėtų būti po keturis gyvūnus. Lyties pasirinkimas nėra būtinas, tačiau ypatingais atvejais reikėtų tirti abi lytis. Jei egzistuoja lyčių skirtumai pagal atsaką, tai reikėtų ištirti po keturis kiekvienos lyties gyvūnus. Tiriant negraužikus, galima naudoti tik keletą gyvūnų. Kai tiriamas medžiagos pasiskirstymas audiniuose, tyrimo pradžioje reikėtų atsižvelgti į grupės dydį pagal gyvūnų, kurie bus numarinti numatytu laiko momentu, ir laiko momentų, kurių metu bus tiriami gyvūnai, skaičių.
      Kai tiriamas metabolizmas, tai grupės dydis priklauso nuo tyrimo poreikių. Atliekant daugelio dozių ir daugelio laiko momentų tyrimus, reikėtų atsižvelgti į grupės dydį pagal laiko momentus ir numatomus numarinimus, tačiau grupėje turi būti ne mažiau kaip du gyvūnai. Grupė turėtų būti pakankamai didelė, kad būtų galima tinkamai apibūdinti tiriamosios medžiagos ir (ar) metabolitų pasisavinimą, stabilizavimąsi bei pašalinimą.
      
         Dozė
      
      Kai duodama pavienė dozė, tai mažiausiai dvi jos koncentracijos turėtų būti naudojamos. Turėtų būti duodama maža, nesukelianti toksinių efektų, dozė ir didelė dozė, kuriai esant, pasireiškia toksiniai efektai arba galėtų pakisti toksikokinetiniai parametrai.
      Kai duodama pakartotinė dozė, užtenka tik mažos koncentracijos dozės, tačiau ypatingais atvejais reikėtų naudoti ir didelės koncentracijos dozę.
      
         Davimo būdas
      
      Toksikokinetinių tyrimų metu reikėtų naudoti tą patį davimo būdą ir, jei reikia, tą patį prietaisą kuris buvo naudojamas ar buvo pasirinktas naudoti kituose toksikologiniuose tyrimuose. Tiriamoji medžiaga eksperimentiniams gyvūnams paprastai duodama per os su zondu ar pašaru, uždedama ant odos arba duodama įkvėpti konkrečiais laiko momentais. Tiriamosios medžiagos intraveninė injekcija gali būti naudinga siekiant nustatyti santykinę medžiagos, duodamos kitais būdais, absorbciją. Be to, atlikus tiriamosios medžiagos intraveninę injekciją galima gauti naudingos informacijos apie jos pasiskirstymą.
      Reikėtų apsvarstyti tą galimybę, kai priemonė gali trukdyti tiriamosios medžiagos davimui. Reikėtų atkreipti dėmesį į absorbcijos skirtumus, kai tiriamosios medžiagos duodamos per zondą ir su pašaru, bei nustatyti tikslią tiriamosios medžiagos, duodamos su pašaru, dozę.
      
         Stebėjimai
      
      Kiekvieną dieną reikėtų stebėti visus gyvūnus bei registruoti toksiškumo požymius ir kitus svarbius klinikinius parametrus, įskaitant efektų pasireiškimo laiką, laipsnį bei trukmę.
      
         Procedūra
      
      Pasvėrus visus tiriamuosius gyvūnus, atitinkamu būdu jiems duodama tiriamoji medžiaga. Jeigu reikia, tiriamieji gyvūnai įtvirtinami prieš duodant medžiagą.
      Absorbcija
      Duodamos medžiagos absorbcijos greitis bei apimtis gali būti įvertinami įvairiais metodais, panaudoj ant arba nenaudoja ant etaloninių grupių (8), pvz.:
      
                  —
               
               
                  nustatant tiriamosios medžiagos ir (ar) metabolitų kiekį ekskretuose, tokiuose kaip šlapimas, tulžis, išmatos, iškvėptas oras ir tai, kas yra gyvūno lavone be vidurių,
               
            
                  —
               
               
                  lyginant tiriamąją ir kontrolinę arba tiriamąją ir etaloninę grupes pagal biologinį atsaką (pvz., atliekant ūmaus toksiškumo tyrimus),
               
            
                  —
               
               
                  lyginant tiriamąj ą ir etaloninę grupes pagal medžiagos ekskrecij ą per inkstus,
               
            
                  —
               
               
                  nustatant tiriamosios medžiagos ir (ar) metabolitų zoną, esančią žemiau plazmos ir laiko kreivės ir gautus duomenis lyginant su etaloninės grupės tyrimų duomenimis.
               
            Pasiskirstymas
      Šiuo metu medžiagos pasiskirstymą galima analizuoti dviem būdais:
      
                  —
               
               
                  tiriant visą kūną autoradiografijos metodu, gaunama naudingos kokybinės informacijos,
               
            
                  —
               
               
                  pasibaigus veikimui tiriamąja medžiaga, skirtingu laiko momentu numarinant gyvūnus bei nustatant tiriamosios medžiagos ir (ar) metabolitų kiekį bei koncentraciją audiniuose ir organuose, gaunama kiekybinės informacijos.
               
            Ekskrecija
      Tiriant ekskreciją, surenkamas šlapimas, išmatos, iškvėptas oras ir tam tikrais atvejais, tulžis. Pasibaigus veikimui tiriamąja medžiaga, reikėtų kelissyk nustatyti tiriamosios medžiagos ir (ar) metabolitų kiekį šiuose ekskretuose tol, kol ekskrecijos būdu pasišalins apie 95 % duotos medžiagos, arba kai praeis savaitė, pasirenkant vieną iš dviejų.
      Ypatingais atvejais reikėtų apsvarstyti tiriamos medžiagos ekskreciją į laktacijos tyrime naudojamų gyvūnų pieną.
      Metabolizmas
      Biologiniai mėginiai turėtų būti tiriami atitinkamais metodais tam, kad būtų nustatyta metabolizmo apimtis bei pobūdis. Reikėtų nustatyti metabolitų struktūrą bei pasiūlyti galimus metabolitinės apykaitos kelius, jei anksčiau atliktų toksikologinių tyrimų metu liko neišspręstų problemų. Tyrimai in vitro, padėtų gauti informacijos apie metabolitinės apykaitos kelius.
      Detalesnę informaciją apie metabolizmo ir toksiškumo sąsają galima gauti atlikus tokius biocheminius tyrimus, kaip metabolitinių fermentinių sistemų efektų tyrimai, endogeninių nebaltyminės kilmės sulfihidrilinių junginių pasišalinimo analizė bei tiriamosios medžiagos susirišimo su makromolekulėmis tyrimas.
      2.   DUOMENYS
      Atsižvelgiant į atlikto tyrimo pobūdį, duomenys turėtų būti pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles ir, jei reikia, pateikiant papildomai ir paveikslus. Kiekvienos tirtos grupės atveju reikėtų nurodyti, jei to reikalaujama, laiko, dozės bei medžiagos pasiskirstymo audiniuose bei organuose matavimų vidurkius ir statistines variacijas. Absorbcijos laipsnis bei ekskrecijos apimtis ir greičiai turėtų būti nustatyti atitinkamais metodais. Kai atliekami metabolizmo tyrimai, reikėtų pateikti identifikuotų metabolitų struktūrą bei galimus metabolitinės apykaitos kelius.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   TYRIMO ATASKAITA
      Atsižvelgiant į atlikto tyrimo pobūdį, tyrimo ataskaitoje, jei įmanoma, turėtų būti pateikiama tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  panaudota rūšis, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos,
               
            
                  —
               
               
                  žymėtų medžiagų, jei šios buvo naudojamos, apibūdinimas,
               
            
                  —
               
               
                  dozių dydžiai ir kaip dažnai jos buvo duodamos,
               
            
                  —
               
               
                  davimo būdas ir bet kokie prietaisai, jei buvo naudoti,
               
            
                  —
               
               
                  užregistruoti toksiniai ir kiti efektai,
               
            
                  —
               
               
                  tiriamosios medžiagos ir (ar) metabolitų biologiniuose mėginiuose, įskaitant iškvėptą orą, nustatymo metodai,
               
            
                  —
               
               
                  lyties, dozės, režimo, laiko, audinių bei organų atžvilgiu atliktų matavimų išdėstymas paeiliui,
               
            
                  —
               
               
                  ekskrecijos ir absorbcijos apimties laiko ribose pateikimas,
               
            
                  —
               
               
                  metabolitų identifikacijos biologiniuose mėginiuose bei apibūdinimo metodai,
               
            
                  —
               
               
                  biocheminiai metabolizmo įvertinimo metodai,
               
            
                  —
               
               
                  galimi metabolitinės apykaitos keliai,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų interpretavimas.
               
            3.2.   ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      4.   NUORODOS
      Žr. Bendrojo įvado B dalį.
      B.37.   FOSFOROORGANINIŲ MEDŽIAGŲ ŪMAUS POVEIKIO SUKELTAS UŽDELSTAS NEUROTOKSIŠKUMAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Vertinant toksinius medžiagų poveikius reikia žinoti, kad kai kurios medžiagų klasės sukelia specifinius neurotoksiškumo tipus, nenustatomus įprastais toksiškumo tyrimais. Pavyzdžiui, kai kurios fosforoorganinės medžiagos sukelia uždelstą neurotoksiškumą ir vertinant šios grupės medžiagas į tai reikėtų atsižvelgti.
      Nustatant medžiagas, sukeliančias uždelstą polineuropatiją, gali būti taikomi atrankos tyrimai in vitro, tačiau neigiami tyrimo in vitro duomenys dar neįrodo, kad duotoji medžiaga yra ne neurotoksiška.
      Žiūrėti Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Fosforoorganinės medžiagos reiškia fosforoorganinius esterius, tioesterius ar fosforoorganinius anhidridus, fosfonoorganines ar fosforamidoorganines rūgštis ar giminingas fosforotiono, fosforonotiono ar fosforotioamido rūgštis, ar kitas medžiagas, kurios gali sukelti uždelstą neurotoksiškumą, būdingą šiai medžiagų klasei.
      Uždelstas neurotoksiškumas yra sindromas, susijęs su ataksijos, nugaros smegenų ir periferinio nervo distalinės aksonopatijos ilgai trunkančiu uždelsimu bei neuropatijos sukeltu esterazės slopinimu nervų audiniuose.
      1.3.   KONTROLINĖS MEDŽIAGOS
      Norint parodyti, jog laboratorinėmis sąlygomis tiriamųjų rūšių atsakas reikšmingai nesikeičia, pozityvinė kontrolės grupė gali gauti kontrolinę medžiagą.
      Plačiai naudojamas neurotoksikantas yra tri-o-tolilfosfatas (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, CAS nomenklatūra: fosforo rūgštis, tris(2-metilfenil)esteris), taip pat žinomas kaip tris-o-krezilfosfatas.
      1.4.   TIRIAMOJO METODO PRINCIPAS
      Naminėms vištoms, kurios, jeigu reikia, yra apsaugotos nuo ūmaus cholinerginio poveikio, per virškinamąjį traktą duodama tiriamosios medžiagos vienkartinė dozė. 21 dieną stebimi gyvūnų elgesio nukrypimai, ataksija ir paralyžius. Paprastai praėjus 24 ir 48 valandoms po dozavimo, atsitiktiniu atrankos būdu paimtoms iš kiekvienos grupės vištoms atliekami biocheminiai tyrimai, t. y. nustatomas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimas. Praėjus 21 dienai po medžiagos poveikio, likusios vištos nužudomos ir tam tikri nervų audiniai ištiriami histopatologiškai.
      1.5.   TIRIAMOJO METODO APRAŠYMAS
      1.5.1.   Pasiruošimas
      Sveikos jaunos suaugusios vištos, nesirgusios virusinėmis ligomis ir negydytos, neturinčios eisenos pakitimų, atsitiktinės atrankos principu paskirstomos į tiriamąją ir kontrolinę grupes ir mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis.
      Reikia naudoti pakankamai didelius narvus arba aptvarus, kurie leistų vištoms laisvai judėti bei laisvai stebėti jų eiseną.
      Tiriamoji medžiaga turėtų būti dozuojama per virškinamąjį traktą, naudojant zondą, želatinines kapsules arba panašiu metodu. Skysčiai gali būti leidžiami neskiesti arba ištirpinti tirpiklyje, tokiame, kaip kukurūzų aliejus; kadangi didelės dozės kietųjų medžiagų želatininėse kapsulėse gali būti neefektyviai absorbuojamos, jas reikėtų ištirpinti. Naudojamo tirpiklio (ne vandens) toksinės savybės turi būti žinomos, o jeigu nežinomos, tai prieš tyrimą jos turi būti nustatytos.
      1.5.2.   Tyrimo sąlygos
      1.5.2.1.   Tiriamieji gyvūnai
      Rekomenduojamos nuo 8 iki 12 mėnesių amžiaus jaunos suaugusios naminės vištos (Gallus gallus domesticus), dedančios kiaušinius. Turėtų būti naudojamos standartinio dydžio veislės ir linijos vištos, užaugintos sąlygomis, leidžiančiomis laisvai judėti.
      1.5.2.2.   Skaičius ir lytis
      Be tiriamosios grupės turi būti dar tirpiklio kontrolinė bei pozityvinės kontrolės grupės. Su tirpiklio kontrolinės grupės gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat kaip ir su tiriamaisiais gyvūnais, išskyrus tai, kad jie negautų tiriamosios medžiagos.
      Kiekvienoje paukščių grupėje reikia panaudoti tokį skaičių vištų, kad mažiausiai šešias galima būtų nužudyti biocheminiams tyrimams (po tris, praėjus dviems skirtingiems laiko tarpams) ir kad po 21 stebėjimo dienos patologiniams tyrimams išgyventų dar šešios vištos.
      Pozityvinės kontrolės grupė gali būti tiriama paraleliai su kitomis grupėmis arba gali būti panaudojama nesena istorinė kontrolės grupė. Šioje grupėje turi būti mažiausiai šešios vištos, paveiktos žinomais uždelsto veikimo neurotoksikantais, trys vištos yra skirtos biochemijai ir trys patologijai. Rekomenduojama periodiškai atnaujinti istorinius duomenis. Kai tyrimo laboratorija pakeičia keletą esminių tyrimo elementų (pvz., vištų liniją, pašarus, laikymo sąlygas), turi būti gauti nauji pozityvinės kontrolės duomenys.
      1.5.2.3.   Dozių lygiai
      Pagrindiniame tyrime naudotinų dozių lygių nustatymui reikalingas preliminarinis tyrimas su atitinkamu vištų ir dozių grupių skaičiumi. Nustatant pagrindinio tyrimo dozės ribas, preliminariniame tyrime yra būtinos kelių paukščių žūtys. Norint užkirsti kelią dėl ūmaus cholinerginio poveikio kylančioms mirtims, galima naudoti atropiną ar kitą apsauginę medžiagą, kuri netrukdytų uždelsto neurotoksiškumo atsakams. Apskaičiuojant maksimalią nemirtiną tiriamosios medžiagos dozę, galima panaudoti daugybę tiriamųjų metodų (žiūrėkite metodą B. 1 bis). Parenkant dozę, gali būti naudingi jau turimi vištų duomenys arba bet kokia kita toksikologinė informacija.
      Atsižvelgiant į preliminarinio tyrimo rezultatus ir aukščiausią ribinę 2 000 mg/kg kūno masės dozę, tiriamosios medžiagos dozės lygis pagrindiniame tyrime turi būti kuo aukštesnis. Bet kokia žūtis per 21 dieną turi nepakeisti reikalingo išgyvenusių paukščių skaičiaus – šešių biocheminiams ir šešių histologiniams tyrimams. Užkertant kelią dėl ūmaus cholinerginio poveikio kylančioms žūtims, galima naudoti atropiną arba bet kurią kitą apsauginę medžiagą, netrukdančią uždelsto neurotoksiškumo atsakams.
      1.5.2.4.   Ribinis bandymas
      Jeigu tirtas dozės lygis, ne žemesnis, negu 2 000 mg/kg kūno masės, nesukelia pastebimų toksinių poveikių ir jeigu iš turimų duomenų apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, didesnių dozių tyrimai nebūtini. Ribinis bandymas neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveikį žmogui, reikia naudoti didesnes dozes.
      1.5.2.5.   Stebėjimo periodas
      
      Stebėjimo periodas turėtų trukti 21 dieną.
      1.5.3.   Procedūra
      Po to, kai paukštis gauna apsauginę medžiagą, kuri užkerta kelią nuo dėl ūmaus cholinerginio poveikio galimai žūčiai, duodama tiriamosios medžiagos vienkartinė dozė.
      1.5.3.1.   Bendrasis stebėjimas
      
      Stebėjimai prasideda tuoj pat po medžiagos gavimo. Pirmas dvi dienas visos vištos atidžiai stebimos kelis kartus, o vėliau mažiausiai vieną kartą dienoje, kol jos nužudomos arba praeina 21 diena. Visi toksiškumo požymiai turi būti registruojami, žymint jų pradžią, tipą, ryškumą ir elgesio nukrypimų trukmę. Ataksiją reikėtų vertinti mažiausiai pagal keturių lygių skalę, reikėtų žymėti paralyžių. Norint pastebėti minimalų toksinį poveikį, vištos, atrinktos patologijai, mažiausiai du kartus per savaitę išimamos iš narvų ir stebimas jų judamasis aktyvumas, priverčiant jas judėti, pvz., kopėčiomis. Dvesiantys ir patiriantys dideles kančias bei skausmą paukščiai išimami iš narvų, pažymimi, humaniškai nužudomi ir skrodžiami.
      1.5.3.2.   Kūno masė
      
      Prieš tiriamosios medžiagos davimą visas vištas reikia pasverti, vėliau sveriama mažiausiai vieną kartą per savaitę.
      1.5.3.3.   Biochemija
      
      Atsitiktinės atrankos būdu šešios vištos iš kiekvienos tiriamosios ir tirpiklio kontrolinių grupių bei trys vištos iš pozityvinės kontrolinės grupės (jei ši grupė paraleliai tiriama) praėjus kelioms dienoms po dozavimo nužudomos, išimamos galvos smegenys ir juosmens dalies nugaros smegenys bei ištiriamas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimo aktyvumas. Kartais naudinga ištirti sėdimojo nervo audinio neuropatijos sukeltą esterazės slopinimo aktyvumą. Paprastai, praėjus 24 valandoms, nužudomi trys kontrolinės ir trys tiriamosios grupės paukščiai, o praėjus 48 valandoms, dar po tris, tuo tarpu trys pozityvinės kontrolės vištos nužudomos po 24 valandų. Jeigu klinikiniai intoksikacijos požymiai (tai visada gali būti nustatyta stebint cholinerginių požymių pradžios laiką) rodo, kad toksinė medžiaga perduodama labai lėtai, tada geriau paukščių audinių pavyzdžius imti du kartus tarp 24 ir 72 valandų po dozavimo.
      Taip pat galima tirti acetilcholinesterazę (AChE). Tačiau gali įvykti spontaninė AChE reaktyvacija in vivo, o tai gali sąlygoti nepakankamą medžiagos, kaip AChE inhibitoriaus, j ėgos įvertinimą.
      1.5.3.4.   Bendrasis skrodimas
      
      Visų gyvūnų bendrojo skrodimo metu reikia apžiūrėti galvos bei nugaros smegenų išvaizdą.
      1.5.3.5.   Histopatologinis ištyrimas
      
      Išgyvenusių visą stebėjimo periodą ir nepanaudotų biocheminiams tyrimams paukščių nervų audiniai turi būti mikroskopiškai ištirti. Audiniai turi būti fiksuojami in situ, naudojant perfuzijos techniką. Reikia įtraukti smegenėlių (vidurinįjį-pailgąjį lygį), pailgųjų smegenų, nugaros smegenų ir periferinių nervų dalis. Reikia paimti nugaros smegenų atkarpas iš viršutinio kaklinio segmento, vidurinės-krūtininės ir juosmens-kryžmens dalių. Reikia paimti blauzdikaulio nervo distalines ir jo atšakų į skrandžio raumenį bei sėdimojo nervo atkarpas. Šias atkarpas reikia dažyti būdingais mielinui ir specifiniais aksonui dažais.
      2.   DUOMENYS
      Pasirinktų metodų (biochemijos, histopatologijos ir elgesio stebėjimo) požiūriu gauti neigiami rezultatai paprastai nereikalauja uždelsto neurotoksiškumo tyrimo tęsimo. Tik šiuo požiūriu dviprasmiai arba negalutiniai rezultatai gali reikalauti tolesnio įvertinimo.
      Turėtų būti pateikiami kiekvieno paukščio duomenys. Be to, visi duomenys turi būti pateikiami lentelių forma, nurodant kiekvienoje tirtoje grupėje tyrimo pradžioje buvusių paukščių skaičių, paukščių skaičių su pažeidimais, elgesio ar biocheminiais pakitimais, šių pažeidimų ar pakitimų tipus ir jų sunkumo laipsnį bei paukščių procentą su kiekvieno pažeidimo ar pakitimo tipu ir sunkumo laipsniu.
      Gautus duomenis reikia vertinti pagal pakitimų pasireiškimą ir sunkumo laipsnį bei nustatant koreliacinius ryšius tarp elgesio, biochemijos ir histopatologinių pakitimų bei visų kitų pastebėtų pakitimų tiriamojoje ir kontrolinėje grupėse.
      Skaitmeniniai rezultatai turėtų būti apdoroti tinkamais ir priimtinais statistiniais metodais. Statistiniai metodai turėtų būti pasirinkti planuojant tyrimą.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje turėtų būti ši informacija:
      
                   
               
               
                  Tiriamieji gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              panaudotos linijos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius ir amžius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gavimo šaltinis, laikymo sąlygos ir kt.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tyrimo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              detalės apie tiriamosios medžiagos paruošimą, pastovumą ir homogeniškumą, kur to reikalaujama,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tirpiklio pasirinkimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalės apie poveikį tiriamąja medžiaga,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalės apie pašarų ir vandens kokybę,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dozės pasirinkimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duotų dozių detalizavimas, tame tarpe naudotas tirpiklis, jo tūris ir duotos medžiagos fizikinė forma,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalės apie naudotas apsaugines medžiagas ir poveikį jomis.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              kūno masės duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              grupės toksinio atsako duomenys, taip pat ir žuvimai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              stebėti klinikiniai pokyčiai, sunkumo laipsnis ir trukmė (kurie grįžtami, kurie ne),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              smulkus biocheminių metodų ir gautų duomenų aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              skrodimo duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              smulkus visų gautų histopatologinių duomenų aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinis rezultatų apdorojimas ten, kur tinka.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   LITERATŪRA
      Šis metodas yra analogiškas EBPO 418 tyrimo gairėms.
      B.38.   FOSFOROORGANINIŲ MEDŽIAGŲ 28 DIENŲ PAKARTOTINOS DOZĖS SUKELTO UŽDELSTO NEUROTOKSIŠKUMO TYRIMAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Vertinant toksinius medžiagų poveikius reikia žinoti, kad kai kurios medžiagų grupės sukelia specifinius neurotoksiškumo tipus, nenustatomus įprastais toksiškumo tyrimais. Pavyzdžiui, kai kurios fosforoorganinės medžiagos sukelia uždelstą neurotoksiškumą ir vertinant šios grupės medžiagas į tai reikėtų atsižvelgti.
      Nustatant medžiagas, sukeliančias uždelstą polineuropatiją, gali būti taikomi atrankos tyrimai in vitro, tačiau neigiami tyrimo in vitro duomenys dar neįrodo, kad duotoji medžiaga yra ne neurotoksiška.
      Šis 28 dienų uždelsto neurotoksiškumo tyrimas rodo kylančią riziką sveikatai, gaunant medžiagą pakartotinai per tam tikrą laiko tarpą. Šis tyrimas rodys reakciją į dozę bei įvertins nepastebimą neigiamą poveikio lygį, reikalingą nustatant medžiagos saugumo kriterijus.
      Žiūrėti Bendrojo įvado B dalį.
      1.2.   SĄVOKOS
      Fosforoorganinės medžiagos reiškia fosforoorganinius esterius, tioesterius ar fosforoorganinius anhidridus, fosfonoorganines ar fosforamidoorganines rūgštis ar giminingas fosforotiono, fosforonotiono ar fosforotioamidino rūgštis, ar kitas medžiagas, kurios gali sukelti uždelstą neurotoksiškumą, būdingą šiai medžiagų klasei.
      Uždelstas neurotoksiškumas yra sindromas, susijęs su ataksijos, nugaros smegenų ir periferinio nervo distalinės aksonopatijos ilgai trunkančiu uždelsimu bei neuropatijos sukeltu esterazės slopinimu nervų audiniuose.
      1.3.   TIRIAMOJO METODO PRINCIPAS
      Naminėms vištoms per virškinamąjį traktą 28 dienas kasdien duodama tiriamoji medžiaga. Medžiagos davimo periodu ir praėjus 14 dienų po to rečiausiai vieną kartą dienoje stebimi gyvūnų elgesio nukrypimai, ataksija ir paralyžius. Paprastai praėjus 24 ir 48 valandoms po paskutinio dozavimo, atsitiktiniu atrankos būdu paimtoms iš kiekvienos grupės vištoms atliekami biocheminiai tyrimai, t. y. nustatomas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimas. Praėjus dviems savaitėms po paskutinės dozės, likusios vištos nužudomos ir tam tikri nervų audiniai ištiriami histopatologiškai.
      1.4.   TIRIAMOJO METODO APRAŠYMAS
      1.4.1.   Pasiruošimas
      Sveikos jaunos suaugusios vištos, nesirgusios virusinėmis ligomis ir negydytos, neturinčios eisenos pakitimų, atsitiktinės atrankos principu paskirstomos į tiriamąsias ir kontrolinę grupes ir mažiausiai 5 dienas prieš tyrimą aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis.
      Turi būti naudojami pakankamai dideli narvai arba aptvarai, kurie leistų vištoms laisvai judėti bei laisvai stebėti jų eiseną.
      Tiriamoji medžiaga kasdien septynias dienas per savaitę dozuojama per virškinamąjį traktą, naudojant zondą arba želatinines kapsules. Skysčiai gali būti leidžiami neskiesti arba ištirpinti tirpiklyje, tokiame kaip kukurūzų aliejus; kadangi didelės dozės kietųjų medžiagų želatininėse kapsulėse gali būti neefektyviai absorbuojamos, jas reikėtų ištirpinti. Naudojamo tirpiklio (ne vandens) toksinės savybės turi būti žinomos, o jeigu nežinomos, tai prieš tyrimą jos turi būti nustatytos.
      1.4.2.   Tyrimo sąlygos
      1.4.2.1.   Tiriamieji gyvūnai
      Rekomenduojamos nuo 8 iki 12 mėnesių amžiaus jaunos suaugusios naminės vištos (Gailus gailus domesticus), dedančios kiaušinius. Turėtų būti naudojamos standartinio dydžio veislės ir linijos vištos, užaugintos sąlygomis, leidžiančiomis laisvai judėti.
      1.4.2.2.   Skaičius ir lytis
      Reikia sudaryti mažiausiai tris tiriamąsias grupes bei vieną tirpiklio kontrolinę grupę. Su tirpiklio kontrolinės grupės gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat kaip ir su tiriamaisiais gyvūnais, išskyrus tai, kad jie negautų tiriamosios medžiagos.
      Kiekvienoje paukščių grupėje reikia panaudoti tokį skaičių vištų, kad mažiausiai šešias galima būtų nužudyti biocheminiams tyrimams (po tris, praėjus dviems skirtingiems laiko tarpams) ir, kad praėjus 14 dienų po paskutinio dozavimo patologiniams tyrimams išgyventų dar šešios vištos.
      1.4.2.3.   Dozių lygiai
      Dozės lygius reikia parinkti atsižvelgiant į uždelsto neurotoksiškumo ūmaus tyrimo tris rezultatus arba į jau turimus tiriamosios medžiagos toksiškumo ar kinetinius duomenis. Pasirinktas aukščiausias dozės lygis turi sukelti toksinius poveikius, geriausiai uždelstą neurotoksiškumą, tačiau turi nesukelti gyvūno žūties ar nepakeliamų kančių. Sekantys mažėjančia tvarka einantys dozių lygiai turi sukelti atitinkamai mažesnius pokyčius (atsakus), o mažiausias dozės lygis turėtų nesukelti pastebimų neigiamų poveikių.
      1.4.2.4.   Ribinis bandymas
      Jeigu tirtas dozės lygis, ne žemesnis, negu 1 000 mg/kg kūno masės/d nesukelia pastebimų toksinių poveikių ir jeigu iš turimų duomenų apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, didesnių dozių tyrimai nebūtini. Ribinis bandymas neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveikį žmogui, reikia naudoti didesnes dozes.
      1.4.2.5.   Stebėjimo periodas
      Visi paukščiai stebimi mažiausiai vieną kartą per dieną visą medžiagos dozavimo periodą ir 14 dienų po to, iki atliekamas skrodimas.
      1.4.3.   Procedūra
      Paukščiams tiriamoji medžiaga duodama 28 dienas kasdien septynias dienas per savaitę.
      1.4.3.1.   Bendrasis stebėjimas
      Stebėjimai prasideda tuoj pat po medžiagos gavimo. 28 dozavimo dienas ir 14 dienų po to visos vištos atidžiai stebimos mažiausiai vieną kartą per dieną, po to jos nužudomos. Visi toksiškumo požymiai turi būti registruojami, žymint jų pradžią, tipą, sunkumo laipsnį ir elgesio nukrypimų trukmę. Nereikėtų apsiriboti elgesio nukrypimų stebėjimais. Ataksiją reikėtų vertinti mažiausiai pagal keturių lygių skalę, reikėtų žymėti paralyžių. Norint pastebėti minimalų toksinį poveikį, vištos mažiausiai du kartus per savaitę išimamos iš narvų ir stebimas jų judamasis aktyvumas, priverčiant judėti, pvz., kopėčiomis. Dvesiantys ir patiriantys dideles kančias bei skausmą paukščiai išimami iš narvų, pažymimi, humaniškai nužudomi ir skrodžiami.
      1.4.3.2.   Kūno masė
      Prieš pirmąjį tiriamosios medžiagos davimą visas vištas reikia pasverti, vėliau mažiausiai vieną kartą per savaitę.
      1.4.3.3.   Biochemija
      Atsitiktinės atrankos būdu šešios vištos iš kiekvienos tiriamosios ir tirpiklio kontrolinių grupių, praėjus kelioms dienoms po paskutinės dozės, nužudomos, išimamos galvos smegenys ir juosmens dalies nugaros smegenys bei ištiriamas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimo aktyvumas. Kartais naudinga ištirti sėdimojo nervo audinio neuropatijos sukeltą esterazės slopinimo aktyvumą. Paprastai, praėjus 24 valandoms po paskutinės dozės, nužudomi trys kontrolinės ir trys kiekvienos tiriamosios grupės paukščiai, o praėjus 48 valandoms, dar po tris. Jeigu ūmaus arba kitų tyrimų (pvz. toksikokinetinių) duomenys rodo, kad po paskutinės dozės geriau pasirinkti kitą žudymo laiką, negu siūloma, tai reikia raštiškai pagrįsti.
      Taip pat galima tirti acetilcholinesterazę (AChE). Tačiau gali įvykti spontaninė AChE reaktyvacija in vivo, o tai gali sąlygoti nepakankamą medžiagos, kaip AChE inhibitoriaus, j ėgos įvertinimą.
      1.4.3.4.   Bendrasis skrodimas
      Bendrojo skrodimo metu reikia apžiūrėti visų gyvūnų galvos bei nugaros smegenų išvaizdą.
      1.4.3.5.   Histopatologinis ištyrimas
      Išgyvenusių visą stebėjimo periodą ir nepanaudotų biocheminiams tyrimams paukščių nervų audiniai turi būti mikroskopiškai ištirti. Audiniai turi būti fiksuojami in situ, naudojant perfuzijos techniką. Reikia įtraukti smegenėlių (vidurinįjį-pailgąjį lygį), pailgųjų smegenų, nugaros smegenų ir periferinių nervų dalis. Reikia paimti nugaros smegenų atkarpas iš viršutinio kaklinio segmento, vidurinės-krūtininės ir juosmens-kryžmens dalių. Reikia paimti blauzdikaulio nervo distalines ir jo atšakų į skrandžio raumenį bei sėdimojo nervo atkarpas. Šias atkarpas reikia dažyti būdingais mielinui ir specifiniais aksonui dažais. Pradžioje reikia mikroskopiškai ištirti visų kontrolinės ir didžiausios dozės grupių paukščių fiksuotus audinius. Jeigu didžiausios dozės grupėje nustatomi pakitimai, galima mikroskopiškai tirti viduriniosios ir mažiausios dozės grupių paukščių audinius.
      2.   DUOMENYS
      Pasirinktų metodų (biochemijos, histopatologijos ir elgesio stebėjimo) požiūriu gauti neigiami rezultatai paprastai nereikalauja uždelsto neurotoksiškumo tyrimo tęsimo. Tik šiuo požiūriu dviprasmiai arba negalutiniai rezultatai gali reikalauti tolesnio įvertinimo.
      Turėtų būti pateikiami kiekvieno paukščio duomenys. Be to, visi duomenys turi būti pateikiami lentelių forma, nurodant kiekvienoje tirtoje grupėje tyrimo pradžioje buvusių paukščių skaičių, paukščių skaičių su pažeidimais, elgesio ar biocheminiais pakitimais, šių pažeidimų ar pakitimų tipus ir sunkumo laipsnį bei paukščių procentą su kiekvieno pažeidimo ar pakitimo tipu ir sunkumo laipsniu.
      Gautus duomenis reikia vertinti pagal pakitimų pasireiškimą ir sunkumo laipsnį bei nustatant koreliacinius ryšius tarp elgesio, biochemijos ir histopatologinių pakitimų bei visų kitų pastebėtų pakitimų tiriamosiose ir kontrolinėje grupėse.
      Skaitmeniniai rezultatai turėtų būti apdoroti tinkamais ir priimtinais statistiniais metodais. Statistiniai metodai turėtų būti pasirinkti planuojant tyrimą.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje turėtų būti ši informacija:
      
                   
               
               
                  Tiriamieji gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              panaudotos linijos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius ir amžius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gavimo šaltinis, laikymo sąlygos ir kt.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tyrimo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              detalės apie tiriamosios medžiagos paruošimą, pastovumą ir homogeniškumą, kur to reikalaujama,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tirpiklio pasirinkimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalės apie poveikį tiriamąja medžiaga,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalės apie pašarų ir vandens kokybę,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dozės pasirinkimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duotų dozių detalizavimas, taip pat ir naudotas tirpiklis, jo turis ir duotos medžiagos fizikinė forma,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pagrindimas, pasirinkus biocheminiams tyrimams kitą laiką (ne po 24 ir 48 valandų).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              kūno masės duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie toksinį atsaką pagal dozės lygį, taip pat ir žuvimai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nepastebimas neigiamas poveikio lygis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              stebėti klinikiniai pokyčiai, sunkumo laipsnis ir trukmė (kurie grįžtami, kurie ne),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              smulkus biocheminių metodų ir gautų duomenų aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              skrodimo duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              smulkus visų gautų histopatologinių duomenų aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinis rezultatų apdorojimas ten, kur tinka.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   LITERATŪRA
      Šis metodas yra analogiškas EBPO 419 tyrimo gairėms.
      B.39.   NENUMATYTOS DNR SINTEZĖS (NDS) TYRIMAS ŽINDUOLIŲ KEPENŲ LĄSTELĖSE IN VIVO
      
      1.   METODAS
      Šis metodas pakartoja OECD TG 486 Nenumatytos DNR sintezės (NDS) tyrimą žinduolių kepenų ląstelėse in vivo (1997).
      1.1   ĮVADAS
      Nenumatytos DNR sintezės (NDS) tyrimo žinduolių kepenų ląstelėse in vivo tikslas -identifikuoti medžiagas, kurios vykdo DNR pažaidų reparaciją žinduolių, paveiktų tiriamąja medžiaga, kepenų ląstelėse 1, 2, 3, 4.
      Šio tyrimo metu galima ištirti kepenyse esančių cheminių medžiagų sukeliamus genotoksinius efektus. Galutinis nustatytas dydis parodo, kad iš pradžių kepenų ląstelėse atsiranda DNR pažaidos, o vėliau vyksta DNR pažaidų reparacija. Apskritai, absorbuotų junginių metabolizmo pagrindinė vieta yra kepenys. Todėl kepenys yra tinkamas DNR pažaidų tyrimo in vivo objektas.
      Jeigu nustatoma, kad tiriamoji medžiaga nepasiekia audinio, į kurį buvo nukreipta, tai ji laikoma netinkama šiam tyrimui.
      Nenumatytos DNR sintezės (NDS) produktai analizuojami, įvertinant žymėtų nukleozidų transportą į ląsteles, kuriose nevyksta numatyta DNR sintezė (paprastai vykstanti ląstelės ciklo S fazės metu). Plačiausiai naudojamas metodas, skirtas šiam įvertinimui, yra tričiu (3H) žymėto timidino autoradiografija. Atliekant nenumatytos DNR sintezės (NDS) tyrimus in vitro,, daugiausiai naudojamos žiurkių kepenys. Galima naudoti ir kitus audinius, tačiau jie nėra šio tyrimo objektas.
      Nenumatytos DNR sintezės (NDS) nustatymas priklauso nuo pažaidos vietoje iškirptų DNR bazių, pakeistų kitomis, skaičiaus. Todėl nenumatytos DNR sintezės tyrimas ypač vertingas tada, kai siekiama identifikuoti „ilgų fragmentų pažaidų“ (fragmentų ilgis siekia nuo 20 iki 30 bazių), sukeltų, paveikus tiriamąja medžiaga, reparacijas. Tuo tarpu „trumpų fragmentų pažaidos“ nustatomos, esant žymiai mažesniam jautrumui. Be to, mutageniniai įvykiai pasireiškia dėl nevykstančios pažaidų reparacijos, klaidingai vykstančios reparacijos ar klaidingos DNR replikacijos. Nenumatytos DNR sintezės aktyvumas neparodo pažaidų reparacijos efektyvumo. Visai įmanoma, kad mutagenas sąveikauja su DNR, tačiau pažaidos reparacija iškirpos atstatymo būdu nevyksta. Nenumatytos DNR sintezės tyrimo metu negaunant specifinės informacijos apie mutageninį aktyvumą, šį trūkumą kompensuoja didelis matavimo jautrumas, nes tiriamas visas genomas.
      Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Ląstelės, kuriose vyksta reparacija – atliekant šį tyrimą laboratorijoje, patvirtinama, kad branduolinio tinklo granulių (BTG) išraiška didesnė negu nustatytoji vertė.
      
         Branduolinio tinklo granulės (BTG) – kiekybinis nenumatytos DNR sintezės aktyvumo ląstelėse, atliekant nenumatytos DNR sintezės tyrimą autoradiografijos metodu, įvertinimo matas, išreiškiamas iš branduolinio tinklo granulių (BG) skaičiaus atimant vidutinį citoplazminių granulių, esančių nukleoplazminiuose ploteliuose, skaičių (CG): BTG = BG -CG. BGT nustatomas kiekvienoje ląstelėje ir tada apskaičiuojama kultūroje ar paraleliose kultūrose esančių ląstelių BTG bendra vertė.
      
         Nenumatyta DNR sintezė (NDS) – DNR reparacinė sintezė, vykstanti po cheminėmis medžiagomis ar fiziniais agentais sukeltos DNR pažaidos apimto regiono iškirpimo bei pašalinimo.
      1.3   TYRIMO METODO PRINCIPAS
      Tiriant nenumatytą DNR sintezę (NDS) žinduolių kepenų ląstelėse in vivo, parodoma, kad reparacinė DNR sintezė vyksta po to, kai cheminėmis medžiagomis ar fiziniais agentais sukeltos DNR pažaidos apimtas regionas iškerpamas ir pašalinamas. Šis tyrimas bendru atveju yra pagrįstas 3H žymėto timidino įterpimu į kepenų ląstelių, kurios sudaro labai nedidelę ląstelių, esančių ląstelinio ciklo S fazėje, dalį, DNR. 3H žymėto timidino transportas į ląstelę vertinamas autoradiografijos metodu, kadangi šis metodas nėra toks jautrus ląstelių, esančių S fazėje, atžvilgiu, kaip scintiliacijos skystyje nustatymo metodas.
      1.4   TYRIMO METODO APIBŪDINIMAS
      1.4.1   Preparatai
      1.4.1.1   Gyvūnų rūšies pasirinkimas
      Dažniausiai yra naudojamos žiurkės, tačiau gali būti panaudotos ir kitos atitinkamos žinduolių rūšys. Reikia panaudoti dažniausiai vartojamus jaunų sveikų suaugusių gyvūnų laboratorinius kamienus. Tyrimo pradžioje gyvūnų svorio variacijos turi būti minimalios ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūnų vidutinio svorio.
      1.4.1.2   Laikymo ir maitinimo sąlygos
      Taikomos Pagrindinio Įvado B dalyje nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad drėgmė siektų 50–60 %.
      1.4.1.3   Gyvūnų paruošimas
      Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę bei tiriamąją grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos efektai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas turi savo identifikacijos ženklą. Prieš pradedant tyrimą, gyvūnams leidžiama aklimatizuotis prie laboratorinių sąlygų mažiausiai 5 dienas.
      1.4.1.4   Dozių paruošimas
      Kietosios tiriamosios cheminės medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinamuosiuose įrenginiuose ir jei reikia, tai, prieš paruošiant jų dozes, skirtas gyvūnams, jos praskiedžiamos. Skystųjų tiriamųjų medžiagų dozės ruošiamos iškart arba prieš dozių paruošimą, jos praskiedžiamos. Prieš kiekvieną bandymą šviežiai paruošiami tiriamosios cheminės preparatai ir neatsižvelgiama į stabilumo tyrimo metu gautus duomenis, rodančius, kad medžiaga atitinka jos laikymui keliamus reikalavimus.
      1.4.2   Tyrimo sąlygos
      1.4.2.1   Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys
      Tirpiklis ar tirpinantysis prietaisas neturėtų sukelti jokio toksinio efekto, atitinkančio vartojamas dozes ir neturėtų kilti spėlionių, kad jis gali chemiškai reaguoti su tiriamąja medžiaga. Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/tirpinantieji įrenginiai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį.
      1.4.2.2   Kontroliniai mėginiai
      Atliekant kiekvieną nepriklausomą eksperimento dalį, vienu metu turi būti naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrengimas) kontroliniai mėginiai.. Išskyrus tą atvejį, kai gyvūnai veikiami tiriamąja chemine medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir gyvūnai, paveikti tiriamąja chemine medžiaga (tiriamoji grupė).
      Teigiami kontroliniai mėginiai turi būti žinomos medžiagos, sukeliančios nenumatytą DNR sintezę, kai jos duodamos tokia doze, kuri, kaip tikimasi, užgoš lengvai nustatomą pašalinį foną. Kai vartojamos vidutinį atsaką sukeliančios dozės, tai reikia naudoti teigiamus kontrolinius mėginius, kuriems yra būtina metabolinė aktyvacija 4. Dozės turi būti taip parenkamos kad gaunami efektai būtų aiškūs, bet tyrėjas negalėtų iškart dešifruoti užkoduotų skaidrių. Teigiamoms kontrolinėms medžiagoms priklauso:
      
                  Mėginių paėmimo laikas
               
               
                  Medžiaga
               
               
                  CAS Nr.
               
               
                  EINECS Nr.
               
            
                  Ankstyvasis mėginių paėmimas (2–4 valandos)
               
               
                  N-nitrozodimetilaminas
               
               
                  62-75-9
               
               
                  200-249-8
               
            
                  Vėlyvasis mėginių paėmimas (12–16 valandų
               
               
                  N-2-fluorenilacetamidas (2-AAF)
               
               
                  53-96-3
               
               
                  200-188-6
               
            Kitos atitinkamos teigiamos kontrolinės medžiagos irgi gali būti naudojamos. Priimtina, kad teigiama kontrolinė medžiaga duodama kitu būdu nei tiriamoji medžiaga.
      1.5   BANDYMO ATLIKIMO METODIKA
      1.5.1   Gyvūnų skaičius ir lytis
      Atsižvelgiant į tiriamojo atsako natūraliąją biologinę variaciją, reikia panaudoti tinkamą gyvūnų skaičių. Kiekvienoje grupėje turi būti mažiausiai 3 tiriamieji gyvūnai. Jei sukaupiama anksčiau atliktų bandymų duomenų bazė, tai vienu metu naudojamose teigiamose ir neigiamose kontrolinėse grupėse turi būti po 1 ar 2 gyvūnus.
      Jei tyrimo metu galima gauti anksčiau atliktų tyrimų, panaudojant tą pačią gyvūnų rūšį ir tą patį poveikio tiriamąja medžiaga būdą, duomenis, kurie rodo, toksiškumo tarp atskirų lyčių skirtumai yra labai nedideli, tai tada užteks ištirti vienos lyties, pirmiausia patinus, gyvūnus. Jeigu žmogaus jautrumas cheminėms medžiagoms, kuriomis jis veikiamas, priklauso nuo lyties, kaip antai jautrumo kai kurioms farmakologiškai aktyvioms medžiagoms atveju, tai reikia ištirti atitinkamą gyvūnų rūšį.
      1.5.2   Veikimo tvarkaraštis
      Bendru atveju tiriamosios medžiagos duodamos tik vieną kartą.
      1.5.3   Dozės dydžiai
      Paprastai naudojami 2 dozės dydžiai. Didžiausia doze laikoma dozė, kuri sukelia toksiškumo požymius taip, kad didesniosios dozės, duodamos tokiu pačiu būdu, bus mirtinos. Apskritai, žemesnioji dozė turi sudaryti nuo 25 % iki 50 % didesniosios dozės.
      Medžiagos, pasižyminčios specifiniu biologiniu aktyvumu, kai jų dozės būna žemos ir netoksinės (pavyzdžiui tokios kaip hormonai ir mitogenai) gali būti laikomos išimtimi, kai joms taikomi dozę nustatantys kriterijai ir tada jos tiriamos kiekvienu atveju atskirai. Jeigu nėra tinkamų duomenų ir tuo tikslu atliekama intervalo paieška, tai ji atliekama toje pačioje laboratorijoje, panaudojant tos pačios rūšies.kamieno, lyties gyvūnus bei tą patį veikimo būdą kaip ir pagrindinio tyrimo metu.
      Didžiausia dozė gali taipogi būti apibrėžiama kaip dozė, kurią davus, kepenyse pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (pavyzdžiui, piknotiniai branduoliai).
      1.5.4   Ribų paieškos tyrimas
      Jeigu tyrimas atliekamas, esant vienam doziniam lygmeniui, kuris, per vieną dieną atliekant pavienį arba du poveikius tiriamąja medžiaga, mažiausiai sudaro 2 000 mg/kūno/kg ir jei nepastebima jokių toksinių efektų bei, remiantis struktūriškai panašių cheminių medžiagų tyrimų duomenimis, nebus tikimasi užregistruoti genotoksiškumo, tai tada laikomasi nuostatos, kad yra tikslinga atlikti pilną tyrimą, panaudojant 3 dozinius lygmenis. Prognozuojamas tiriamosios medžiagos poveikis žmogui gali parodyti, kad, atliekant ribų paieškos tyrimą reikia naudoti aukštesnį dozinį lygmenį.
      1.5.5   Dozių davimas
      Tiriamoji medžiaga yra paprastai duodama, priverstinai maitinant per vamzdelį, įstatant jį į skrandį, tinkamai įvedant kanulę per vamzdelį arba injekciją į pilvą. Tiriamąją medžiagą galima įvesti ir kitais būdais, jei jie yra pagrindžiami. Tačiau įvedimas į pilvo ertmę nerekomenduojamas, nes tiriamoji medžiaga gali tiesiogiai paveikti kepenis per cirkuliacinę sistemą. Maksimalus skysčio, priverstinai duodamo per vamzdelį arba injekuojamo į pilvą vienu metu, tūris priklauso nuo tiriamojo gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 mg kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių davimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus sujaudrinančias ar irimą sukeliančias medžiagas, kurios, būdamos didesnėmis koncentracijomis, sukelia žalingus efektus, tiriamosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad esant visiems doziniams lygmenims, tūris būtų pastovus.
      1.5.6   Kepenų ląstelių paruošimas
      Kepenų ląstelės yra paruošiamos, paimant jas iš gyvūnų, paveiktų tiriamąja medžiaga, po dozės davimo praėjus 12–16 valandų. Apskritai, anksčiau atliekamas papildomas mėginio paėmimas (įprastiniu atveju – po veikimo praėjus 2–4 valandoms) yra būtinas, nebent 12–16 valandų laikotarpiu buvo gautas aiškus teigiamas atsakas. Tačiau mėginius paimti galima ir kitu metu, kuris pagrindžiamas, remiantis toksikokinetinių tyrimų duomenimis.
      Perleidžiant kolagenazę per kepenis in situ ir sudarant sąlygas naujai disocijavusioms kepenų ląstelėms pačioms prisitvirtinti prie tinkamo paviršiaus, gaunamos žinduolių kepenų ląstelių trumpalaikės kultūros Neigiamų kontrolinių gyvūnų kepenų ląstelių gyvybingumas mažiausiai turi siekti 50 %.
      1.5.7   Nenumatytos DNR sintezės (NDS) nustatymas
      Šviežiai išskirtos žinduolių kepenų ląstelės paprastai inkubuojamos terpėje, turinčioje 3H žymėto timidino atitinkamam laikui (pavyzdžiui, nuo 3 iki 8 valandų). Baigiantis inkubacijai, terpė turi būti atskiriama nuo ląstelių, kurios vėliau gali būti inkubuojamos terpėje, turinčioje nežymėto timidino perteklių tam, kad sumažėtų neįsijungusio timidino radioaktyvumas (vadinamasis „šaltasis persekiojimas“). Po inkubacijos ląstelės sudrėkinamos, fiksuojamos bei džiovinamos. Jei inkubacija užtrunka ilgiau, tai nežymėto timidino perteklius terpėje nėra būtinas. Skaidrės pamerkiamos į autoradiografinę emulsiją, eksponuojamos tamsoje (jas šaldant 1-2 savaites), išryškinamos, dažomos ir skaičiuojamos sidabro granulės, susidariusios ekspozicijos metu. Iš kiekvieno gyvūno paimtų mėginių paruošiama nuo 2 iki 3 skaidrių.
      1.5.8   Analizė
      Ląstelės, esančios paruoštose skaidrėse, turi pasižymėti normaliomis morfologinėmis ypatybėmis tam, kad būtų galima įvertinti svarbią neplanuotą DNR sintezę. Preparatai tiriami mikroskopu, ieškant akivaizdžių toksiškumo požymių (pavyzdžiui, piknotinių branduolių arba sumažėjusio įvestos žymės radioaktyvumo).
      Prieš skaičiuojant granules, skaidrės užkoduojamos. Normaliai kiekvieno gyvūno atveju 2 skaidrėse įvertinama 100 ląstelių. Jei kiekvieno gyvūno atveju įvertinama mažiau nei 100 ląstelių, tai šitai pagrindžiama. Granulės neskaičiuojamos branduoliuose, jei ląstelės yra S fazėje, tačiau reikia nurodyti ląstelių, esančių S fazėje, skaičių.
      
         3H žymėto timidino įjungimas į morfologiškai normalių ląstelių branduolius bei citoplazmą, įvertinamas pagal sidabro granulių sankaupas, turi būti tiriamas atitinkamais metodais.
      Grain counts are determined over the nuclei (nuclear grains, NG) and nucleus equivalent areas over the cytoplasm (cytoplasmic grains, CG). CG counts are measured by either taking the most heavily labelled area of cytoplasm, or by taking an average of two to three random cytoplasmic grain counts adjacent to the nucleus. Other counting methods (e.g. whole cell counting) may be used if they can be justified (6).
      2.   DUOMENYS
      2.1   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Turi būti pateikiami duomenys apie kiekvieną skaidrę bei tirtą gyvūną. Be to visi duomenys pateikiami apibendrintai, lentelių forma. Branduolinio tinklo granulių (BTG) skaičius nustatomas kiekvienoje ląstelėje, kiekvieno gyvūno ląstelėse bei kiekvienos dozės ar laiko intervalo atveju, iš branduolio granulių (BG) skaičiaus atimant citoplazminių granulių (CG) skaičių. Jei skaičiuojamos ląstelės, kuriose vyksta „reparacija“, tai kriterijai, taikomi šioms ląstelėms apibūdinti, turi būti pagrindžiami bei remtis anksčiau gautais neigiamų kontrolinių mėginių tyrimo duomenimis.rezultatai, pateikiami skaičiais, gali būti vertinami statistiniais metodais. Jei atliekami statistiniai tyrimai, tai prieš pradedant bandymą, jie turi būti pasirinkti bei pagrindžiami.
      2.2   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS
      Teigiamų/neigiamų atsakų kriterijų pavyzdžiai:
      
                  teigiami
               
               
                  i)
               
               
                  BTG vertės yra aukščiau nustatyto slenkstinio lygio, kuris pagrindžiamas, remiantis anksčiau laboratorijoje gautais duomenimis;
               
            
                  arba
               
               
                  ii)
               
               
                  BTG vertės yra žymiai didesnės už kontrolinio mėginio, naudojamo tuo tuo pačiu metu, vertę;
               
            
                  neigiami
               
               
                  i)
               
               
                  BTG vertės atitinka arba yra mažesnės už anksčiau naudoto kontrolinio mėginio slenkstinį lygį;
               
            
                  arba
               
               
                  ii)
               
               
                  BTG vertės yra nežymiai didesnės už kontrolinio mėginio, naudojamo tuo pačiu metu, vertę.
               
            Reikia aptarti duomenų biologinę vertę: atsižvelgiama į tokius parametrus, kaip variacija tarp atskirų gyvūnų, dozės ir atsako tarpusavio ryšys bei citotoksiškumas. Tačiau statistinė svarba neturėtų būti vieninteliu faktoriumi, apsprendžiančiu, ar atsakas teigiamas ar ne.
      Nors daugumos eksperimentų metu buvo gauti aiškiai teigiami ar neigiami rezultatai, išimtiniais atvejais gautų rezultatų rinkinys neleis padaryti teisingos išvados apie tiriamosios medžiagos aktyvumą. Rezultatai gali likti abejotini ar neaiškūs, nepriklausomai nuo atliktų eksperimentų skaičiaus.
      Teigiami rezultatai, gauti, tiriant neplanuotą DNR sintezę (NDS) žinduolių kepenų ląstelėse in vivo, rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia DNR pažaidas žinduolių kepenų ląstelėse in vivo, o pažaidų reparacija vyksta neplanuotos DNR sintezės (NDS) metu in vitro. Neigiamas rezultatas rodo, kad esant tyrimo sąlygoms, tiriamoji medžiaga nesukelia DNR pažaidų, nustatomų šio tyrimo metu.
      Reikia aptarti tą galimybę, ar tiriamoji medžiaga ar jos metabolitai pasieks bendrąją cirkuliaciją ar specifiniu būdu tą audinį, į kurį jie yra nukreipti (pavyzdžiui, sisteminio toksiškumo atveju).
      3.   ATASKAITA
      TYRIMO ATASKAITA
      Tyrimo ataskaitoje turi būti pateikiama tokia informacija:
      
                   
               
               
                  Tirpiklis/tirpinantysis įrenginys:
                  
                              —
                           
                           
                              priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios cheminės medžiagos, esančios tirpiklyje/tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tiriamieji gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              panaudota rūšis ar kamienas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šaltinis, laikymo sąlygos, maitinimas ir pan.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno svoris prieš pradedant tyrimą ir kiekvienos grupės svorio riba, vidurkiai bei standartinis nukrypimas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tyrimo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              teigiami ir neigiami (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) kontroliniai mėginiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              intervalo paieškos tyrimo, jei jis buvo vykdomas, duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pagrindinė priežastis, nulėmusi dozės dydžio pasirinkimą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie tiriamosios medžiagos paruošimą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie tiriamosios medžiagos davimą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pagrindinė priežastis, nulėmusi davimo būdo pasirinkimą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodai, kuriais patvirtinama, kad tiriamoji cheminė medžiaga pateko į bendrąją cirkuliaciją ar audinį, į kurį ji buvo nukreipta, jei tai įmanoma nurodyti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tiriamosios cheminės medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (pm) pervertimas į tikrąją dozę (mg/kūno masės kg/dienai), jei tai įmanoma,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie pašarų ir geriamojo vandens kokybę,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalus veikimo tiriamąja medžiaga ir mėginio paėmimo tvarkaraščio aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodai toksiškumui įvertinti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kepenų ląstelių paruošimo ir kultivavimo metodai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              panaudotas autoradiografinis metodas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              paruoštų skaidrių ir įvertintų ląstelių skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              įvertinimo kriterijai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teigiamų, neigiamų ar abejotinų rezultatų nustatymo kriterijai.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              branduolinių, citoplazminių bei branduolinio tinklo granulių, esančių kiekvienos skaidrės, gyvūno ar gyvūnų grupės ląstelėse, skaičiaus vidurkiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinės analizės, jei bet kokios buvo atliktos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksiškumo požymiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duomenys apie tuo pačiu metu naudotus neigiamus (tirpiklis/tirpinantysis įrenginys) ir teigiamus kontrolinius mėginius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              anksčiau gauti duomenys apie neigiamus kontrolinius mėginius, nurodant intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              „ląstelių, kuriose vyksta reparacija“, skaičius, jeigu jis buvo nustatytas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių, esančių S fazėje skaičius, jeigu jis buvo nustatytas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių gyvybingumas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M.G. (1985). An Assessment of the In Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay. Mutation Res., 156, p. 1–18.
               
            
                  2)
               
               
                  Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987). A Protocol and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. Mutation Res. 189, p. 123–133.
               
            
                  3)
               
               
                  Kennelly, J.C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B., Benford, D.J., Dean, S.W. and Mitchell, I. de G. (1993). In Vivo Rat Liver UDS Assay. In: Kirkland D.J. and Fox M., (Eds) Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 52–77.
               
            
                  4)
               
               
                  Madle, S., Dean, S.W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, B., Doolittle, D.J., Furihata, C, Hertner, T., McQueen, C.A. and Mori, H. (1993). Recommendations for the Performance of UDS Tests In Vitro and In Vivo. Mutation Res.. 312, p. 263–285.
               
            
                  5)
               
               
                  Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, C. (1993). Assessment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS). Mutation Res.. 291, p. 21–27.
               
            
                  6)
               
               
                  Mirsalis, J.C., Tyson, C.K. and Butterworth, B.E. (1982). Detection of Genotoxic Carcinogens in the In Vivo/In Vitro Hepatocyte DNA Repair Assay. Environ. Mutagen, 4, p. 553–562.
               
            B.40.   ODOS SUARDYMAS IN VITRO. ODOS SLUOKSNIO ELEKTRINĖS VARŽOS (OSEV) BANDYMAS)
      1.   METODAS
      Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 430 (2004).
      1.1   ĮVADAS
      Odos suardymu vadinamas negrįžtamas odos audinių pažeidimas po bandomosios medžiagos uždėjimo [kaip apibrėžta pagal Visuotinai suderintą cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistemą (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures- GHS)] (1). Odos suardomumui įvertinti pagal šį metodą nenaudojami gyvi gyvūnai.
      Odos suardomumas paprastai buvo įvertinamas naudojant laboratorinius gyvūnus (2). Kadangi buvo susirūpinta, kad ši procedūra gyvūnams sukelia skausmą ir kančias, buvo pataisytas B.4 bandymo metodas, pagal kurį odos suardymą galima nustatyti taikant alternatyvius in vitro metodus ir išvengti gyvūnams sukeliamo skausmo ir kančių.
      Pirmasis žingsnis apibrėžiant alternatyvius bandymus, kurie gali būti naudojami odos suardomumui bandyti reguliavimo tikslais, buvo pradiniai tinkamumo patvirtinimo tyrimai (3). Vėliau buvo atliekamas oficialus odos suardymui įvertinti skirtų in vitro metodų (4) (5) tinkamumo patvirtinimas (6) (7) (8). Pagal šių tyrimų rezultatus ir kitus paskelbtus duomenis (9), buvo pateikta rekomendacija, pagal kurią in vitro odos suardomumui įvertinti galėtų būti taikomi šie bandymai (9) (10) (11): žmogaus odos modelio bandymas (žr. B. 40bis bandymo metodą) ir odos sluoksnio elektrinės varžos bandymas (šis metodas).
      Tinkamumo patvirtinimo ir kituose paskelbtuose tyrimuose buvo gauti duomenys, kad žiurkių odos sluoksnio varžos (OSEV) bandymu (12) (13) galima patikimai atskirti žinomas odą suardančias ir odos nesuardančias medžiagas (5) (9).
      Naudojant šiame metode aprašytą bandymą, galima nustatyti ardančias chemines medžiagas ir mišinius. Be to, galima nustatyti neardančias medžiagas ir mišinius, jei rezultatams patvirtinti išanalizuojama kita turima informacija (pvz., pH, struktūros ir aktyvumo santykių, žmonėms ir (arba) gyvūnams gautų duomenų) įrodomoji vertė (1) (2) (11) (14). Paprastai šiuo bandymu negaunama informacijos apie odos dirginimą ir nėra galimybės ardančias medžiagas suskirstyti į kategorijas, kaip tai leidžia daryti Visuotinai suderinta klasifikavimo sistema (GHS) (1).
      Norint visiškai įvertinti vienkartinio odos veikimo vietinį poveikį odai, rekomenduojama taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją, kuri pridedama prie B.4 bandymo metodo (2) ir numatyta Visuotinai suderintoje sistemoje (GHS) (1). Šią bandymo strategiją sudaro odos suardymo in vitro bandymai (kaip aprašyta šiame metode) ir odos dirginimo bandymai prieš sprendžiant klausimą dėl bandymų su gyvais gyvūnais.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Odos suardymas
         
            in vivo:
          negrįžtamas odos pažeidimas; būtent, matomoji nekrozė per epidermį ir odos nekrozė po bandomosios medžiagos uždėjimo ne ilgiau kaip keturioms valandoms. Odos suardymo požymiai yra opos, kraujavimas, kruvini šašai ir, baigiantis 14 parų stebėjimo laikotarpiui, odos blukimas dėl jos lupimosi, visiškai nuplikusios vietos ir randai. Neaiškiems pažeidimams nustatyti reikėtų atlikti histopatologinį tyrimą.
      
         Odos sluoksnio elektrinė varža (OSEV): pilnutinės odos elektrinės varžos matas, išreikštas varžos verte kiloomais. Paprastas ir pastovus metodas užtvaro funkcijai įvertinti, registruojant jonų praėjimą per odos sluoksnį jonais Vitstono tiltelio aparato pagalba.
      1.3   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      1 lentelė
      Etaloninės cheminės medžiagos
      
                  Pavadinimas
               
               
                  EINECS Nr.
               
               
                  CAS Nr.
               
               
                   
               
            
                  1,2-diaminopropanas
               
               
                  201-155-9
               
               
                  78-90-0
               
               
                  Labai ardanti
               
            
                  Akrilo rūgštis
               
               
                  201-177-9
               
               
                  79-10-7
               
               
                  Labai ardanti
               
            
                  2-tret-butilfenolis
               
               
                  201-807-2
               
               
                  88-18-6
               
               
                  Ardanti
               
            
                  Kalio hidroksidas (10 %)
               
               
                  215-181-3
               
               
                  1310-58-3
               
               
                  Ardanti
               
            
                  Sieros rūgštis (10 %)
               
               
                  231-639-5
               
               
                  7664-93-9
               
               
                  Ardanti
               
            
                  Oktano rūgštis (kaprilo rūgštis)
               
               
                  204-677-5
               
               
                  124-07-02
               
               
                  Ardanti
               
            
                  4-amino-1,2,4-triazolas
               
               
                  209-533-5
               
               
                  584-13-4
               
               
                  Neardanti
               
            
                  Eugenolis
               
               
                  202-589-1
               
               
                  97-53-0
               
               
                  Neardanti
               
            
                  Fenetilbromidas
               
               
                  203-130-8
               
               
                  103-63-9
               
               
                  Neardanti
               
            
                  Tetrachloretenas
               
               
                  204-825-9
               
               
                  27-18-4
               
               
                  Neardanti
               
            
                  Izostearino rugstis
               
               
                  250-178-0
               
               
                  30399-84-9
               
               
                  Neardanti
               
            
                  4-(metiltio)-benzaldehidas
               
               
                  222-365-7
               
               
                  3446-89-7
               
               
                  Neardanti
               
            Didesnė dalis išvardytų medžiagų yra paimta iš ECVAM tarptautiniam tinkamumo patvirtinimo tyrimui (4) atrinktų cheminių medžiagų sąrašo. Jų atranka pagrįsta šiais kriterijais:
      
                  i)
               
               
                  vienodas ardančių ir neardančių medžiagų skaičius;
               
            
                  ii)
               
               
                  naudojamos prekyboje esančios medžiagos, kurios priklauso didesnei atitinkamų cheminių junginių klasių daliai;
               
            
                  iii)
               
               
                  įtrauktos labai ardančios ir mažiau ardančios medžiagos, siekiant nustatyti ardomojo poveikio stiprumu pagrįstus skirtumus;
               
            
                  iv)
               
               
                  pasirinktos cheminės medžiagos, su kuriomis būtų galima dirbti laboratorijoje, nesukeliant kitų rimtų, išskyrus odos suardymą, pavojų.
               
            1.4   BANDYMO METODO PRINCIPAS
      Bandomoji medžiaga uždedama ant odos diskų epidermio paviršiaus ne ilgiau kaip 24 h, kai diskai yra įdėti į dviejų kamerų bandymo sistemą, kurioje odos diskai šias kameras skiria. Imami humaniškai nužudytų 28–30 parų amžiaus žiurkių odos diskai. Ardančios medžiagos identifikuojamos pagal jų gebą paveikti normalaus stratum corneum vientisumą ir užtvaro funkciją, kuri matuojama kaip OSEV sumažėjimas mažiau ribinės vertės (12). Nustatant žiurkių OSEV, buvo pasirinkta ribinė 5 kΏ vertė, pagrįsta dideliu kiekiu duomenų plačiam cheminių medžiagų ratui, pagal kuriuos didžioji dauguma verčių buvo aiškiai didesnės (dažnai > 10 kΩ) arba gerokai mažesnės (dažnai < 3 kΩ) už šią vertę (12). Paprastai medžiagos, kurios gyvūnams nėra ardančios, bet yra dirginančios arba nedirginančios, nesumažina OSEV iki vertės, mažesnės už šią ribinę vertę. Be to, naudojant kitus odos preparatus arba kitą įrangą, ribinė vertė gali pasikeisti, todėl reikėtų atlikti papildomą tinkamumo įvertinimą.
      Bandymo procedūros dalį sudaro dažiklio surišimo pakopa, atliekant patvirtinamąjį OSEV teigiamų rezultatų, įskaitant vertes apie 5 kΩ, bandymą. Dažiklio surišimo pakopoje nustatoma, ar jonų pralaidumas padidėja dėl fizinio stratum corneum suardymo. Buvo įrodyta, kad OSEV metodu naudojant žiurkių odą galima numatyti in vivo odos suardomumą bandyme su triušiais, įvertinamą pagal B.4 bandymo metodą (2). Reikia pažymėti, kad in vivo bandymas su triušiais labai mažina odos suardomumo ir odos dirginimo duomenis palyginti su žmonių odos lopinėlio bandymu (15).
      1.5   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.5.1   Gyvūnai
      Pasirinktoji rūšis yra žiurkės, nes šiame bandyme jų odos jautrumas cheminėms medžiagoms buvo įrodytas anksčiau (10). Amžius (kai paimama oda) ir žiurkių veislė yra ypač svarbi užtikrinant, kad plaukų folikulai būtų ramybės būsenoje prieš suaugusių plaukų augimo pradžią.
      Jaunų, maždaug 22 parų amžiaus patinų arba patelių (Wistar arba panašios veislės žiurkių) nugaros ir šonų plaukai atsargiai nukerpami mažomis žirklėmis. Gyvūnai plaunami atsargiai trinant nukirptą plotą panardintą į antibiotiko tirpalą (kurio sudėtyje yra, pvz., streptomicino, penicilino, chloramfenikolio ir amfotericino, kurių koncentracijos pakaktų bakterijų augimui slopinti). Trečią arba ketvirtą dieną po pirmo plovimo gyvūnai dar kartą plaunami antibiotikais ir panaudojami per 3 dienas po antro plovimo, kai stratum corneum atsigauna po plaukų kirpimo.
      1.5.2   Odos diskų paruošimas
      Gyvūnai humaniškai nužudomi, kai jie yra 28 – 30 dienų amžiaus; šis amžius yra ribinis. Nudiriama kiekvieno gyvūno oda nuo gyvūno nugaros ir šonų ir pašalinami pertekliniai poodiniai riebalai, juos atsargiai nuskutant nuo odos. Išpjaunami odos diskai, kurių kiekvieno skersmuo maždaug 20 mm. Odą diskų gamybai galima panaudoti vėliau, jei įrodoma, kad teigiamų ir neigiamų kontrolinių bandymų duomenys atitinka duomenis, gautus su ką tik paruošta oda.
      Kiekvienas odos diskas dedamas ant vieno PTFE (politetrafluoretileno) vamzdelio galo, užtikrinant, kad epidermio paviršius liestųsi su vamzdeliu. Ant vamzdelio galo užspaudžiamas žiedinis tarpiklis odos žiedui nejudamai laikyti, o audinio perteklius apkarpomas. Vamzdelio ir žiedinio tarpiklio matmenys pateikti 2 paveiksle. Žiedinis tarpiklis ir PTFE vamzdelis kruopščiai užsandarinami vazelinu. Spyruokliniu spaustuku vamzdelis tvirtinamas rinktuvo kameroje su MgSO4 tirpalu (154 mmol/l) (1 paveikslas). Odos diskas turi būti visiškai panardintas į MgSO4 tirpalą. Iš vienos žiurkės odos galima pagaminti 10–15 odos diskų.
      Prieš pradedant bandymą matuojama dviejų odos diskų elektrinė varža, kaip kiekvieno gyvūno odos kokybės kontrolės procedūros dalis. Abiejų diskų varža turi būti didesnė kaip 10 kΩ, kad likusius diskus būtų galima naudoti bandymui. Jei varžos vertė yra mažesnė kaip 10 kΩ, kiti iš tos odos pagaminti diskai išmetami.
      1.5.3   Bandomosios ir kontrolinės medžiagų uždėjimas
      Siekiant užtikrinti tinkamą bandymo modelio veikimą, kiekvienas bandymas turi būti vykdomas lygiagrečiai atliekant kontrolinius teigiamus ir neigiamus bandymus. Turi būti naudojami vieno gyvūno odos diskai. Rekomenduojamos teigiamo ir neigiamo kontrolinių bandymų medžiagos yra 10 mol/l vandenilio chlorido rūgštis ir distiliuotas vanduo.
      Skystos bandomosios medžiagos (150 μl) tolygiai užpilamos ant epidermio sluoksnio vamzdelio viduje. Kai tiriamos kietos medžiagos, ant disko tolygiai uždedamas pakankamas kietos medžiagos kiekis, kad būtų padengtas visas epidermio paviršius. Ant kietos medžiagos viršaus užpilama dejonizuoto vandens (150 μl) ir vamzdelis nestipriai pakratomas. Siekiant pasiekti didžiausią įmanomą sąlytį su oda, kietas medžiagas gali tekti pašildyti iki 30 oC, kad bandomoji medžiaga išsilydytų arba suminkštėtų, arba sumalti į granules arba miltelius.
      Kiekvienai bandomajai ir kontrolinei medžiagai naudojami trys odos diskai. Bandomoji medžiaga uždedama 24 h esant 20 – 23 oC. Bandomoji medžiaga pašalinama plaunant ją ne didesnės kaip 30 oC temperatūros vandentiekio vandens srove tol, kol daugiau medžiagos nebeįmanoma pašalinti.
      1.5.4   OSEV matavimai
      Odos pilnutinė varža matuojama kaip OSEV, išmatuota naudojant žemos įtampos, kintamosios srovės Vitstono tiltelį (13). Bendrosios tiltelio specifikacijos: 1–3 V darbinė įtampa, sinusinė arba stačiakampio formos kintamoji 50–1 000 Hz srovė ir bent 0,1–30 kΩ matavimo intervalas. Tinkamumo patvirtinimo matavimams naudojamas tiltelis matuoja induktyvumą, talpą ir varžą iki 2 000 H, 2 000 μF ir 2 MΩ, esant 100 Hz arba 1 kHz dažniui, ir naudojant nuoseklaus arba lygiagretaus jungimo vertes. Atliekant suardomumo bandymo OSEV matavimus, užrašoma varža, esant 100 Hz dažniui ir naudojant nuoseklaus jungimo vertes. Prieš matuojant elektrinę varžą odos paviršiaus įtemptis sumažinama įpilant epidermiui padengti pakankamą tūrį 70 % etanolio. Po kelių sekundžių etanolis iš vamzdelio pašalinamas ir audinys drėkinamas įpilant 3 ml MgSO4 tirpalo (154 mmol/l). Tiltelio elektrodai dedami iš abiejų odos disko pusių jo varžai kΩ išmatuoti (1 paveikslas). Elektrodų matmenys ir elektrodų ilgiai žemiau dantytų spaustukų pateikti 2 paveiksle. Spaustukas, prijungtas prie vidinio elektrodo, matuojant varžą remiasi į PTFE vamzdelio viršų, siekiant užtikrinti, kad reikiama elektrodo dalis būtų įmerkta į MgSO4 tirpalą. Išorinis elektrodas įstatomas į rinktuvo kamerą taip, kad jis remtųsi į kameros dugną. Užtikrinamas nekintamas atstumas tarp spyruoklinio spaustuko ir PTFE vamzdelio dugno (2 paveikslas), kadangi šis atstumas turi įtakos gautai varžos vertei. Dėl tos pačios priežasties atstumas tarp vidinio elektrodo ir odos disko turi būti pastovus ir kiek įmanoma mažesnis (1–2 mm).
      Jei išmatuota varžos vertė yra didesnė kaip 20 kΩ, tai gali būti dėl bandomosios medžiagos likučių, dengiančių odos disko epidermio paviršių. Galima mėginti dar kartą pašalinti šią dangą, pvz., užkimšti PTFE vamzdelio angą pirštinėtu nykščiu ir purtyti maždaug 10 s; MgSO4 tirpalas išpilamas ir varža dar kartą matuojama, įpylus naujo MgSO4 tirpalo.
      Bandymo aparato savybės bei matmenys ir taikoma matavimo procedūra gali turėti įtakos gautoms OSEV vertėms. 5 kΩ ardymo ribinė vertė buvo nustatyta pagal duomenis, gautus naudojant šiame metode aprašytą konkretų aparatą ir procedūrą. Gali būti taikomos kitos ribinės ir kontrolinės vertės, jei pakinta bandymo sąlygos arba naudojamas kitas aparatas. Taigi metodą ir varžos ribines vertes būtina kalibruoti, bandant eilę etalonų, pasirinktų iš tinkamumo patvirtinimo tyrime naudotų cheminių medžiagų (4) (5), arba iš medžiagų, kurių klasė atitinka tiriamų cheminių medžiagų klasę. Tinkamų etaloninių cheminių medžiagų rinkinys pateiktas 1 lentelėje.
      1.5.5   Dažiklio surišimo metodai
      Veikiant tam tikroms neardančioms medžiagoms varža gali sumažėti iki mažesnės kaip ribinė 5 kΩ vertė, todėl jonai galėtų prasiskverbti per stratum corneum ir todėl mažėtų elektrinė varža (5). Pvz., neutraliosios organinės medžiagos ir paviršinio aktyvumo savybių turinčios cheminės medžiagos (įskaitant ploviklius, emulsiklius ir kitas paviršinio aktyvumo medžiagas) gali pašalinti odos riebalus, todėl užtvaras tampa pralaidesnis jonams. Taigi, jei nėra akivaizdžių odos pažeidimų, o bandomųjų medžiagų OSEV vertės yra mažesnės kaip 5 kΩ arba arti šios vertės, turi būti atliekamas kontrolinių bandinių ir apdorotų audinių dažiklio skverbties įvertinimas, siekiant nustatyti, ar gautos OSEV vertės buvo padidėjusio odos pralaidumo ar odos suardymo rezultatas (3)(5). Pastaruoju atveju, kai įtrūksta stratum corneum, ant odos paviršiaus uždėtas sulforodamino B dažiklis greitai skverbiasi ir nudažo apačioje esantį audinį. Šis konkretus dažiklis yra atsparus daugeliui įvairių cheminių medžiagų, ir jo neveikia toliau aprašyta ekstrahavimo procedūra.
      1.5.5.1   Sulforodamino B dažiklio uždėjimas ir pašalinimas
      Po OSEV įvertinimo magnio sulfatas išpilamas iš vamzdelio ir oda kruopščiai apžiūrima, ieškant akivaizdžių jos pažeidimų. Jei nėra akivaizdžių didesnių pažeidimų, sulforodamino B dažiklio (rūgščiojo raudonojo 52; C.I. 45100; EINECS numeris 222-529-8; CAS numeris 3520-42-1), 150 μ l 10 % (m/V) tirpalo distiliuotame vandenyje užpilama ant kiekvieno disko epidermio paviršiaus 2 valandoms. Vėliau šie odos diskai maždaug 10 s plaunami kambario temperatūros vandentiekio vandeniu dažiklio pertekliui/nesurištam dažikliui pašalinti. Kiekvienas odos diskas atsargiai išimamas iš PTFE vamzdelio ir įdedamas į buteliuką (pvz., 20 ml stiklinį scintiliacinį buteliuką) su dejonizuotu vandeniu (8 ml). Indai nestipriai kratomi 5 min., kad būtų pašalintas likęs nesurištas dažiklio kiekis. Ši plovimo procedūra kartojama, odos diskai išimami ir įdedami į indus su 30 % (m/V) natrio dodecilsulfato tirpalo distiliuotame vandenyje ir inkubuojami per naktį esant 60 oC.
      Po inkubavimo kiekvienas diskas išimamas ir išmetamas, o likęs tirpalas centrifuguojamas 8 min 21 oC temperatūroje (santykinė išcentrinė jėga ~175 × g). 1 ml tirpalo virš nuosėdų skiedžiamas penkis kartus (V/V) [t.y. 1 ml + 4 ml] 30 % (m/V) natrio dodecil sulfato tirpalu distiliuotame vandenyje. Tirpalo optinis tankis matuojamas esant 565 nm bangos ilgiui.
      1.5.5.2   Dažiklio kiekio apskaičiavimas
      Sulforodamino B dažiklio kiekis vienam diskui apskaičiuojamas pagal optinio tankio vertes (5) (sulforodamino B dažiklio molinis ekstinkcijos koeficientas = 8,7 × l04 , esant 565 nm; molekulinė masė = 580). Dažiklio kiekis ant kiekvieno disko nustatomas, naudojant atitinkamą kalibravimo kreivę, vėliau apskaičiuojamas kartotinių bandinių vidutinis dažiklio kiekis.
      2.   DUOMENYS
      Bandomajai medžiagai, be to, teigiamiems ir neigiamiems kontroliniams bandiniams gautos varžos vertės (kΩ) ir vidutinės dažiklio kiekio vertės (μg/diskui), jei tinka, pateikiamos lentelėse (atskirų bandymų duomenys ir vidutinė vertė ± standartinis nuokrypis), įskaitant lygiagrečių/kartotinių bandymų rezultatus, vidurkius ir atskiras vertes.
      2.1   REZULTATŲ INTERPRETAVIMAS
      Vidutiniai OSEV rezultatai yra priimtini, jei bandymo laboratorijoje lygiagrečiai atliekamų teigiamų ir neigiamų kontrolinių bandymų vertės patenka į metodui priimtinus intervalus. Priimtini varžos intervalai, taikant pirmiau aprašytą metodą ir aparatūrą, pateikti šioje lentelėje:
      
                  Kontrolinis bandymas
               
               
                  Medžiaga
               
               
                  Varžos intervalas (kΩ)
               
            
                  Teigiamas
               
               
                  10 mol/l druskos rūgštis
               
               
                  0,5-1,0
               
            
                  Neigiamas
               
               
                  Distiliuotas vanduo
               
               
                  10–25
               
            Vidutiniai dažiklio surišimo rezultatai yra priimtini, jei lygiagrečios kontrolinių bandymų vertės patenka į metodui priimtinus intervalus. Rekomenduojami kontrolinėms medžiagoms priimtini dažiklio kiekio intervalai, taikant pirmiau aprašytą metodą ir aparatūrą, pateikti toliau:
      
                  Kontrolinis bandymas
               
               
                  Medžiaga
               
               
                  Dažiklio kiekio intervalas (μg/diskas)
               
            
                  Teigiamas
               
               
                  10 mol/l druskos rūgštis
               
               
                  40–100
               
            
                  Neigiamas
               
               
                  Distiliuotas vanduo
               
               
                  15–35
               
            Laikoma, kad bandomoji medžiaga neardo odos:
      
                  i)
               
               
                  jei bandomosios medžiagos OSEV vidutinė vertė yra didesnė kaip 5 kΩ, arba
               
            
                  ii)
               
               
                  OSEV vidutinė vertė yra lygi 5 kΩ arba mažesnė kaip 5 kΩ, ir
                  
                              —
                           
                           
                              odos diske nematyti akivaizdžių pažeidimų, ir
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vidutinis dažiklio ant disko kiekis yra gerokai mažesnis už vidutinį dažiklio ant disko kiekį, gautą lygiagrečiai atliekant teigiamą kontrolinį bandymą su 10 mol/l HCl.
                           
                        
            Laikoma, kad bandomoji medžiaga ardo odą:
      
                  i)
               
               
                  jei OSEV vidurkis yra 5 kΩ arba mažesnis kaip 5 kΩ, ir odos diskas yra akivaizdžiai pažeistas, arba
               
            
                  ii)
               
               
                  OSEV vidurkis yra lygus 5 kΩ arba mažesnis kaip 5 kΩ, ir
                  
                              —
                           
                           
                              odos diske nematyti akivaizdžių pažeidimų, bet
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vidutinis dažiklio ant disko kiekis yra lygus vidutiniam dažiklio ant disko kiekiui, gautam lygiagrečiai atliekant teigiamą kontrolinį bandymą su 10 mol/l HCl, arba didesnis.
                           
                        
            3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      3.1   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija:
      
                   
               
               
                  Bandomoji ir kontrolinė medžiagos:
                  
                              —
                           
                           
                              cheminis (-iai) pavadinimas (-ai), pvz., IUPAC arba CAS pavadinimas, ir CAS numeris, jei žinomas;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              medžiagos arba preparato grynumas ir sudėtis (masės procentine (-ėmis) dalimi (-is), fizinė prigimtis;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              fizikocheminės savybės, pvz., fizikinė būsena, pH, stabilumas, tirpumas vandenyje, svarbios atliekamam bandymui;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios ir(arba) kontrolinės medžiagų apdorojimas prieš bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              stabilumas, jei žinomas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              naudota rūšis ir lytis;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų amžius, kai naudojami odos donorais;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šaltinis, laikymo sąlygos, šėrimas ir t. t;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie odos paruošimą.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              bandymo aparato kalibravimo kreivės;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kalibravimo kreivės, skirtos dažiklio surišimo bandymui;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              OSEV matavimams taikomos bandymų procedūros detalės;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dažiklio surišimo įvertinimui taikomos bandymo procedūros detalės; jei taikoma;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visų bandymo procedūrų pakeitimų aprašymas;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              taikytų vertinimo kriterijų aprašymas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              lentelėse pateikti OSEV ir dažiklio surišimo bandymo (jei taikoma) duomenys pagal atskirus gyvūnus ir atskirius odos bandinius;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visų pastebėtų reiškinių aprašymas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
               
            
                  2)
               
               
                  Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corrosion.
               
            
                  3)
               
               
                  Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, p. 219–255.
               
            
                  4)
               
               
                  Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12, p. 471–482.
               
            
                  5)
               
               
                  Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxic. in Vitro 12, p. 483–524.
               
            
                  6)
               
               
                  OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, p. 62.
               
            
                  7)
               
               
                  Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. The report and recommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, p. 129–147.
               
            
                  8)
               
               
                  ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
               
            
                  9)
               
               
                  ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, p. 275–280.
               
            
                  10)
               
               
                  ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf .
               
            
                  11)
               
               
                  OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st –2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat
               
            
                  12)
               
               
                  Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An in vitro skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, p. 507–512.
               
            
                  13)
               
               
                  Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, J. (1992). The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial. Toxic. in Vitro 6, p. 191–194.
               
            
                  14)
               
               
                  Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: p. 709–720.
               
            
                  15)
               
               
                  Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, M., Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, p. 845–852.
               
            
                  16)
               
               
                  Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An In Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial Validation. Toxic. in Vitro. 2, p. 7–17.
               
            1 paveikslas
      Žiurkių odos OSEV bandymo aparatas
      
         
      2 paveikslas
      Politetrafluoretileno (PFTE) ir rinktuvo vamzdelių bei naudojamų elektrodų matmenys
      
         
      
         Viršuje pavaizduoto aparto svarbiausi parametrai:
      
      
                  —
               
               
                  PTFE vamzdelio vidinis skersmuo,
               
            
                  —
               
               
                  elektrodų ir PTFE bei rinktuvo vamzdelių ilgio santykis turi būti toks, kad elektrodai neliestų odos disko ir standartinio ilgio elektrodo atkarpa būtų panardinta į MgSO4 tirpalą,
               
            
                  —
               
               
                  MgSO4 tirpalo tūris rinktuvo vamzdelyje turi užtikrinti 1 paveiksle parodytą skysčio lygių rinktuvo ir PTFE vamzdeliuose santykį,
               
            
                  —
               
               
                  odos diskas turėtų būti pakankamai tvirtai pritvirtintas prie PTFE vamzdelio, kad elektrinės varžos rodmuo būtų tikrasis odos savybių matas.
               
            B.40BIS.   ODOS SUARDYMAS IN VITRO. ŽMOGAUS ODOS MODELIO BANDYMAS
      1.   METODAS
      Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 431 (2004).
      1.1   ĮVADAS
      Odos suardymu vadinamas negrįžtamas odos audinių pažeidimas po bandomosios medžiagos uždėjimo [kaip apibrėžta pagal Visuotinai suderintą cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistemą (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures– GHS)] (1). Odos suardomumui įvertinti pagal šį metodą nenaudojami gyvi gyvūnai arba jų audiniai.
      Odos suardomumas paprastai buvo įvertinamas naudojant laboratorinius gyvūnus (2). Kadangi buvo susirūpinta, kad ši procedūra gyvūnams sukelia skausmą ir kančias, buvo pataisytas B.4 bandymo metodas, pagal kurį odos suardymą galima nustatyti taikant alternatyvius in vitro metodus, taip išvengiant gyvūnams sukeliamo skausmo ir kančių.
      Pirmasis žingsnis apibrėžiant alternatyvius bandymus, kurie gali būti naudojami odos suardomumui bandyti reguliavimo tikslais, buvo pradiniai tinkamumo patvirtinimo tyrimai (3). Vėliau buvo atliekamas oficialus odos suardymui įvertinti skirtų in vitro metodų (4) (5) tinkamumo patvirtinimas (6) (7) (8). Pagal šių tyrimų rezultatus ir kitus paskelbtus duomenis (9), buvo pateikta rekomendacija, pagal kurią in vitro odos suardomumui įvertinti galėtų būti taikomi šie bandymai (10) (11) (12) (13): žmogaus odos modelio bandymas (šis metodas) ir odos sluoksnio elektrinės varžos bandymas (žr. B.40 bandymo metodą).
      Tinkamumo patvirtinimo tyrimuose buvo gauti duomenys, kad bandymais, kuriuose naudojami žmogaus odos modeliai (3) (4) (5) (9), galima patikimai atskirti žinomas odą suardančias ir odos nesuardančias medžiagas. Be to, pagal bandymo protokolą galima gauti smarkiai odą suardančių ir mažiau suardančių medžiagų skirtumo rodmenį.
      Naudojant šiame metode aprašytą bandymą, galima nustatyti ardančias chemines medžiagas ir mišinius. Be to, galima nustatyti neardančias medžiagas ir mišinius, jei rezultatams patvirtinti išanalizuojama kita turima informacija (pvz., pH, struktūros ir aktyvumo santykių, žmonėms ir (arba) gyvūnams gautų duomenų) įrodomoji vertė (1) (2) (13) (14). Paprastai šiuo bandymu negaunama reikiamos informacijos apie odos dirginimą ir nėra galimybės ardančias medžiagas suskirstyti į kategorijas, kaip tai leidžia daryti Visuotinai suderinta klasifikavimo sistema (GHS) (1).
      Norint visapusiškai įvertinti vienkartinio odos veikimo vietinį poveikį odai, rekomenduojama taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją, kuri pridedama prie B.4 bandymo metodo (2) ir numatyta Visuotinai suderintoje klasifikavimo sistemoje (GHS) (1). Šią bandymo strategiją sudaro odos suardymo in vitro bandymai (kaip aprašyta šiame metode) ir odos dirginimo bandymai prieš sprendžiant klausimą dėl bandymų su gyvais gyvūnais.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Odos suardymas
         
            in vivo –
          negrįžtamas odos pažeidimas; būtent, matoma epidermio ir tikrosios odos (dermio) nekrozė praėjus ne daugiau kaip keturioms valandoms po bandomosios medžiagos uždėjimo. Tipiniai suardymo požymiai: opos, kraujavimas, kruvini šašai ir, baigiantis 14 parų stebėjimo laikotarpiui, odos blukimas dėl jos lupimosi, visiškai nuplikusios vietos ir randai. Neaiškūs pažeidimai turėtų būti vertinami pasitelkiant histopatologinį tyrimą.
      
         Ląstelių gyvybingumas – parametras suminiam ląstelių populiacijos aktyvumui matuoti (pvz., ląstelių mitochondrinių dehidrogenazių geba redukuoti vitalinį dažiklį MTT), kuris, atsižvelgiant į galutinį matuojamą dydį ir taikomą bandymo schemą, yra susijęs su suminių ląstelių kiekiu ir (arba) jų gyvybingumu.
      1.3   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      1 lentelė
      Etaloninės cheminės medžiagos
      
                  Pavadinimas
               
               
                  EINECS Nr.
               
               
                  CAS Nr.
               
               
                   
               
            
                  1,2-diaminopropanas
               
               
                  201-155-9
               
               
                  78-90-0
               
               
                  Labai ardanti
               
            
                  Akrilo rūgštis
               
               
                  201-177-9
               
               
                  79-10-7
               
               
                  Labai ardanti
               
            
                  2-tret-butilfenolis
               
               
                  201-807-2
               
               
                  88-18-6
               
               
                  Ardanti
               
            
                  Kalio hidroksidas (10 %)
               
               
                  215-181-3
               
               
                  1310-58-3
               
               
                  Ardanti
               
            
                  Sieros rūgštis (10 %)
               
               
                  231-639-5
               
               
                  7664-93-9
               
               
                  Ardanti
               
            
                  Oktano rūgštis (kaprilo rūgštis)
               
               
                  204-677-5
               
               
                  124-07-02
               
               
                  Ardanti
               
            
                  4-amino-1,2,4-triazolas
               
               
                  209-533-5
               
               
                  584-13-4
               
               
                  Neardanti
               
            
                  Eugenolis
               
               
                  202-589-1
               
               
                  97-53-0
               
               
                  Neardanti
               
            
                  Fenetilbromidas
               
               
                  203-130-8
               
               
                  103-63-9
               
               
                  Neardanti
               
            
                  Tetrachloretenas
               
               
                  204-825-9
               
               
                  27-18-4
               
               
                  Neardanti
               
            
                  Izostearino rūgštis
               
               
                  250-178-0
               
               
                  30399-84-9
               
               
                  Neardanti
               
            
                  4-(metiltio)-benzaldehidas
               
               
                  222-365-7
               
               
                  3446-89-7
               
               
                  Neardanti
               
            Didesnė išvardytų medžiagų dalis yra įtraukta į ECVAM tarptautiniam tinkamumo patvirtinimo tyrimui (4) atrinktų cheminių medžiagų sąrašą. Jų atranka pagrįsta šiais kriterijais:
      
                  i)
               
               
                  vienodas ardančių ir neardančių medžiagų skaičius;
               
            
                  ii)
               
               
                  naudojamos prekyboje esančios medžiagos, kurios priklauso didesnei atitinkamų cheminių junginių klasių daliai;
               
            
                  iii)
               
               
                  siekiant nustatyti ardomojo poveikio stiprumu pagrįstus skirtumus, įtrauktos labai ardančios ir mažiau ardančios medžiagos;
               
            
                  iv)
               
               
                  pasirinktos tokios cheminės medžiagos, su kuriomis būtų galima dirbti laboratorijoje nesukeliant kitų rimtų, išskyrus odos suardymą, pavojų.
               
            1.4   BANDYMO METODO PRINCIPAS
      Bandomoji cheminė medžiaga uždedama ant trijų matmenų žmogaus odos modelio, kurį sudaro bent jau rekonstruotas epidermis ir funkcinis stratum corneum. Ardančios medžiagos nustatomos pagal jų sugebėjimą po tam tikro veikimo laikotarpio sumažinti ląstelių gyvybingumą [nustatomą, pvz., taikant MTT redukavimo bandymą (15)] iki lygio, kuris būtų mažesnis už apibrėžtą ribinį lygį. Žmogaus odos modelio bandymas pagrįstas hipoteze, kad ardančios cheminės medžiagos gali prasiskverbti per stratum corneum difuzijos arba suardymo būdu ir yra citotoksiškos po juo esančių sluoksnių ląstelėms.
      1.4.1   Procedūra
      1.4.1.1   Žmogaus odos modeliai
      Žmogaus odos modelius galima pasigaminti arba pirkti (pvz., EpiDermTM ir EPISKINTM modelius) (16) (17) (18) (19) arba sukurti ar pasigaminti bandymų laboratorijoje (20) (21). Pripažįstama, kad naudojant žmogaus odą būtina atsižvelgti į nacionalinius ir tarptautinius etinius aspektus bei sąlygas. Turi būti patvirtintas visų naujų modelių tinkamumas (bent tokiu mastu, kuris aprašytas 1.4.1.1.2). Šiam bandymui naudojami žmogaus odos modeliai turi atitikti šias sąlygas:
      1.4.1.1.1   Bendrosios modelio sąlygos
      
      Epiteliui sukurti turi būti naudojami žmogaus keratinocitai. Po veikiančiu stratum corneum turi būti daugybiniai gyvybingų epitelio ląstelių sluoksniai. Be to, odos modelis gali turėti stromos komponentų sluoksnį. Stratum corneum turi būti daugiasluoksnis ir turėti būtinąjį riebalinį profilį, kad būtų gautas veikiantis užtvaras, kurio tvirtumo pakaktų citotoksinių markerių greitai skverbčiai atsispirti. Modelio sulaikomosios savybės turi neleisti medžiagai apeiti stratum corneum ir patekti į gyvybingąjį audinį. Jei bandomosios medžiagos galėtų apeiti stratum corneum, odos veikimo medžiaga modeliavimas būtų netinkamas. Odos modelis neturi būti užterštas bakterijomis (įskaitant mikoplazmą) arba grybeliais.
      1.4.1.1.2   Funkcinės modelio sąlygos
      
      Gyvybingumas paprastai kiekybiškai įvertinamas naudojant MTT arba kitus medžiagų apykaitoje dalyvaujančius vitalinius dažiklius. Šiais atvejais iš neigiamo kontrolinio bandinio audinio ekstrahuoto (ištirpinto) dažiklio poptinis tankis turi būti bent 20 kartų didesnis už vien tik ekstrahavimo tirpiklio optinį tankį [apžvalga pateikta (22)]. Neigiamo kontrolinio bandinio audinys turi būti patvarus kultūroje (užtikrinti panašius gyvybingumo matavimus) visą bandomojo veikimo trukmę. Stratum corneum turi būti pakankamai tvirtas, kad galėtų atsispirti greitai cheminių citotoksinių markerių (pvz., 1 % Triton X-100) skverbčiai. Šią savybę galima įvertinti veikimo trukme, per kurią ląstelių gyvybingumas sumažėja 50 % (ET50) (pvz., EpiDermTM ir EPISKINTM modeliams šis laikas > 2 h). Turi akivaizdžiai matytis, kad audinys geba atsikurti laikui bėgant, ir, pageidautina, skirtingose laboratorijose. Be to, jis turi padėti nustatyti etaloninių cheminių medžiagų ardomojo poveikio stiprumą (žr. 1 lentelę), kai tokios medžiagos naudojamos pagal pasirinktą bandymo protokolą.
      1.4.1.2   Bandomosios ir kontrolinės medžiagų uždėjimas
      Kiekvienam apdorojimui (veikimo trukmei) naudojami du kartotiniai audinio bandiniai, įskaitant kontrolinius bandinius. Tiriant skystąsias medžiagas, naudojamos bandomosios medžiagos kiekio turi pakakti tolygiam odos paviršiaus padengimui medžiaga, kurios reikėtų naudoti ne mažiau kaip 25 μL/cm2. Jei tiriamos kietosios medžiagos, turi būti uždedamas pakankamas medžiagos kiekis odos paviršiui tolygiai uždengti, ją reikėtų sudrėkinti dejonizuotu arba distiliuotu vandeniu geram sąlyčiui su oda užtikrinti. Prireikus kietosios medžiagos prieš naudojimą sumalamos į miltelius. Paviršiaus padengimo metodas turi būti tinkamas bandomajai medžiagai (žr. pvz., 5 nuorodą). Pasibaigus veikimo laikotarpiui, bandomoji medžiaga turi būti kruopščiai nuplauta nuo odos paviršiaus su atitinkamu buferiniu tirpalu arba 0,9 % NaCl.
      Norint užtikrinti adekvačias eksperimentinio modelio charakteristikas, kiekvienam bandymui naudojami lygiagretūs teigiami ir neigiami kontroliniai bandiniai. Rekomenduojamos teigiamų kontrolinių bandinių medžiagos yra ledinė acto rūgštis arba 8 mol/l KOH. Rekomenduojamos neigiamų kontrolinių bandinių medžiagos yra 0,9 % NaCl arba vanduo.
      1.4.1.3   Ląstelių gyvybingumo matavimai
      Ląstelių gyvybingumas matuojamas tik naudojantis kiekybiniais patvirtintais metodais. Be to, naudojamas gyvybingumo matavimas turi tikti naudojamai trijų matmenų audinio konstrukcijai matuoti. Nespecifinis dažiklių surišimas turi netrukdyti gyvybingumo matavimui. Todėl baltymais surišami dažikliai ir medžiagų apykaitoje nedalyvaujantys dažikliai netinka (tarkim, neutralusis raudonasis). Dažniausiai naudojamas MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolinio bromido, tiazolilo mėlynojo, EINECS numeris 206-069-5, CAS numeris 298-93-1)] redukavimo bandymas, kuriuo, kaip buvo įrodyta, gaunami tikslūs ir atkuriami rezultatai (5), tačiau galima naudoti kitus dažiklius. Esant reikiamai inkubacijos temperatūrai, odos bandinys 3 h įdedamas į atitinkamos koncentracijos MTT tirpalą (pvz., 0,3–1mg/ml). Mėlynos formazano nuosėdos ekstrahuojamos tirpikliu (izopropanoliu) ir formazano koncentracija nustatoma matuojant optinį tankį, kai bangos ilgis yra nuo 540 iki 595nm.
      Bandomosios medžiagos cheminis vitalinio dažiklio veikimas gali būti panašus į medžiagų apykaitą ląstelėse, todėl būtų gautas klaidingas gyvybingumo įvertis. Buvo įrodyta, kad taip atsitinka, kai tokia bandomoji medžiaga nėra visiškai nuplaunama nuo odos (9). Jei bandomoji medžiaga tiesiogiai veikia vitalinį dažiklį, turi būti naudojami papildomi kontroliniai bandiniai, skirti bandomųjų medžiagų trukdžiams nustatyti ir gyvybingumo matavimo pataisoms padaryti (9) (23).
      2.   DUOMENYS
      Kiekvienam audiniui lentelėse pateikiamos optinio tankio vertės ir apskaičiuotos ląstelių gyvybingumo procentinės vertės, gautos bandomajai medžiagai ir teigiamiems bei neigiamiems kontroliniams bandiniams, įskaitant kartotinių bandymų, jei atliekami, duomenis, vidutines ir atskiras vertes.
      2.1   REZULTATŲ INTERPRETAVIMAS
      Kiekvieno bandomojo bandinio gautos optinio tankio vertės gali būti naudojamos nustatant gyvybingumo procentinę dalį lyginant su neigiamais kontroliniais bandiniais, kurių gyvybingumo vertė pagal susitarimą prilyginama 100 %. Ribinė ląstelių gyvybingumo procentinės dalies vertė, skirianti ardančias ir neardančias bandomąsias medžiagas (arba skirtingas ar suardymo savybių klases), arba statistinė (-ės) procedūra (-os), taikyta (-os) rezultatams įvertinti ir ardančioms medžiagoms nustatyti, turi būti aiškiai apibrėžtos ir patvirtintos dokumentais, be to turi būti įrodytas jų tinkamumas. Apskritai, šios ribinės vertės yra nustatytos optimizuojant bandymą, patikrintos pradinio tinkamumo patvirtinimo etapu ir patvirtintos atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimą. Kaip pavyzdys, pateikiama suardymo savybių prognozė, taikant EpiDermTM modelį (9):
      laikoma, kad bandomoji medžiaga suardo odą:
      
                  i)
               
               
                  jei po 3 min. veikimo odos gyvybingumas yra mažesnis kaip 50 %, arba
               
            
                  ii)
               
               
                  jei po 3 min. veikimo gyvybingumas yra lygus 50 % arba didesnis, bet po 1 h veikimo gyvybingumas yra mažesnis kaip 15 %.
               
            Laikoma, kad bandomoji medžiaga neardo odos:
      
                  i)
               
               
                  jei po 3 min. veikimo gyvybingumas yra lygus 50 % arba didesnis, bet po 1 h veikimo gyvybingumas yra lygus 15 % arba didesnis.
               
            3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      3.1   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje turi būti ši informacija:
      
                   
               
               
                  bandomoji ir kontrolinė medžiagos:
                  
                              —
                           
                           
                              cheminis (-iai) pavadinimas (-ai), pvz., IUPAC arba CAS pavadinimas, CAS numeris, jei žinomas;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              medžiagos arba preparato grynumas ir sudėtis (masės procentinė (-ės) dalis (-ys));
                           
                        
                              —
                           
                           
                              fizikocheminės savybės, pvz., fizikinė būsena, pH, stabilumas, tirpumas vandenyje, svarbios atliekamam bandymui:
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomųjų/kontrolinių medžiagų apdorojimas prieš bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              stabilumas, jei žinomas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Naudoto odos modelio ir protokolo pagrindimas.
               
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              naudota ląstelių sistema;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              informacija apie matavimo prietaiso (pvz., spektrofotometro), naudoto ląstelių gyvybingumui matuoti, kalibravimą;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visa konkretų odos modelį patvirtinanti informacija, įskaitant jo tinkamumą;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              taikytos bandymo procedūros detalės;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              naudotos bandomosios dozės;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visų bandymo procedūros pakeitimų aprašymas;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nuoroda į anksčiau sukauptus duomenis apie modelį;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              taikytų vertinimo kriterijų aprašymas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              atskirų tiriamųjų bandinių duomenų lentelės;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kitų pastebėtų reiškinių aprašymas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvada.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
               
            
                  2)
               
               
                  Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corrosion.
               
            
                  3)
               
               
                  Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23, p. 219–255.
               
            
                  4)
               
               
                  Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro 12, p. 471–482.
               
            
                  5)
               
               
                  Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxic. In Vitro 12, p. 483–524.
               
            
                  6)
               
               
                  OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, p. 62.
               
            
                  7)
               
               
                  Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. Test report and recommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, p. 129–147.
               
            
                  8)
               
               
                  ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
               
            
                  9)
               
               
                  Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, P., Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C., Kaufmann, T., Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, p. 371–401.
               
            
                  10)
               
               
                  ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275–280.
               
            
                  11)
               
               
                  ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365–67.
               
            
                  12)
               
               
                  ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
               
            
                  13)
               
               
                  OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st –2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat
               
            
                  14)
               
               
                  Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, p. 709–720.
               
            
                  15)
               
               
                  Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity asssays. J.Immunol. Meth. 65, p. 55–63.
               
            
                  16)
               
               
                  Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klausner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxic. In Vitro 8, p. 889–891.
               
            
                  17)
               
               
                  Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural characterization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, p. 211–225.
               
            
                  18)
               
               
                  Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Pouradier DX (1994). The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxicology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: p. 133–140.
               
            
                  19)
               
               
                  Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, Thivolet J (1991). In vitro and post –transplantation differentiation of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental Cell Research 193: p. 310–319.
               
            
                  20)
               
               
                  Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and Rosenberg, H. (1992). The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology 9, p. 163–171.
               
            
                  21)
               
               
                  Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., Parentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengineering 43/8, p. 747–756.
               
            
                  22)
               
               
                  Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical assessment of the use of microculture tetrazolium assays to measure cell growth and function. Growth Regulation 5, p. 69–84.
               
            
                  23)
               
               
                  Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation: results and evaluation by the Management Team. Toxic. InVitro 15, p. 57–93.
               
            B.41.   3T3 NRU FOTOKSIŠKUMO BANDYMAS IN VITRO
      
      1.   METODAS
      Šis metodas atitinka OECD TG 432 (2004).
      1.1   ĮVADAS
      Fototoksiškumas apibrėžiamas kaip toksinis atsakas į ant kūno uždėtą medžiagą, kuri atsiranda arba padidėja (matosi, esant mažesnėms dozėms) paveikus šviesa, arba kai sistemingai veikiama chemine medžiaga, oda yra apšvitinama.
      3T3 NRU fototoksiškumo in vitro bandymas naudojamas bandomosios medžiagos fototoksiniam potencialui nustatyti, kuris atsiranda sužadinus medžiagą ją veikiant šviesa. Bandymu įvertinamas fotocitotoksiškumas, nustatant santykinį ląstelių gyvybingumo mažėjimą, kai jos veikiamos chemine medžiaga esant šviesai, palyginti su gyvybingumo mažėjimu tamsoje. Tikėtina, kad šiuo bandymu nustatytos medžiagos yra fototoksinės in vivo po to, kai jomis sistemingai buvo veikiama oda ir kai jos joje pasiskirsto arba kai jomis paveikiama konkreti odos vieta.
      Apie daug cheminių medžiagų rūšių yra paskelbta, jog jos sukelia fototoksinį poveikį (1) (2) (3) (4). Visų jų bendra savybė – gebėjimas sugerti saulės šviesos bangų ilgio energiją. Pagal pirmąjį fotochemijos dėsnį (Grotthaus-Draper dėsnį) fotocheminei reakcijai vykti turi būti sugertas pakankamas šviesos kvantų kiekis. Taigi prieš planuojant biologinį bandymą, turi būti nustatytas bandomosios cheminės medžiagos UV/matomosios šviesos sugerties spektras pagal OECD tyrimų rekomendaciją 101. Buvo padaryta prielaida, kad jei molinis ekstinkcijos/sugerties koeficientas yra mažesnis kaip 10 l × mol-1 × cm-1, maža tikimybė, kad cheminė medžiaga yra fotochemiškai aktyvi. Tokių medžiagų nebūtina bandyti atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo in vitro arba bet kurį kitą biologinį bandymą neigiamam fotocheminiam poveikiui nustatyti (1) (5). Taip pat žr. 1 priedą.
      3T3 NRU fototoksiškumo in vitro bandymo patikimumas ir tinkamumas buvo įvertintas neseniai (6) (7) (8) (9). Buvo įrodyta, kad pagal 3T3 NRU fototoksiškumo in vitro bandymą galima prognozuoti ūmų fototoksinį poveikį gyvūnams ir žmonėms in vivo. Bandymas neskirtas kitokio pobūdžio žalingam poveikiui, kuris gali atsirasti kartu veikiant cheminei medžiagai ir šviesai, pvz., fotogenotoksiškumui, fotoalergijai arba fotokancerogeniškumui, nustatyti ir juo neįmanoma įvertinti fototoksinio potencialo. Be to, bandymu nebuvo siekiama nustatyti netiesioginius fototoksiškumo mechanizmus, bandomosios medžiagos metabolitų poveikį arba mišinių poveikį.
      Nors iš esmės reikalaujama, kad atliekant visus in vitro bandymus genotoksiniam ir kancerogeniniam potencialui prognozuoti, būtina naudoti metabolines sistemas, fototoksikologijoje iki šiol yra tik reti pavyzdžiai, kai medžiaga turi patirti metabolinį virsmą, kad in vivo arba in vitro ji veiktų kaip fototoksinė medžiaga. Todėl reikalavimas šį bandymą atlikti naudojant metabolinės aktyvacijos sistemą nėra laikomas būtinu arba moksliškai pagrįstu.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Energinė apšvieta – ultravioletinės (UV) arba matomosios šviesos, krentančios ant paviršiaus, intensyvumas, išreiškiamas W/m2 arba mW/cm2.
      
         Šviesos dozė – ultravioletinės (UV) arba matomosios šviesos, krentančios ant paviršiaus, kiekis (= intensyvumas × laikas), išreikštas J (= W × s) ploto vienetui, pvz., J/m2 arba J/cm2.
      
         UV šviesos bangų juostos – TRK (Tarptautinė radiacijos komisija) rekomendavo šiuos žymenis: UVA (315 – 400 nm), UVB (280–315 nm) ir UVC (100–280 nm). Be to, naudojami kiti žymenys; UVB ir UVA skiriamoji riba dažnai yra 320 nm, o UVA galima padalyti į UV-A1 ir UV-A2, skiriamąją ribą nustačius ties maždaug 340 nm.
      
         Ląstelių gyvybingumas – suminio ląstelių populiacijos aktyvumo įvertinimo parametras (pvz., vitalinio neutraliojo raudonojo dažiklio sugėrimas ląstelių lizosomose), kuris, atsižvelgiant į galutinį matuojamą dydį ir taikomą bandymo schemą, yra susijęs su suminių ląstelių kiekiu ir/arba jų gyvybingumu.
      
         Santykinis ląstelių gyvybingumas – ląstelių gyvybingumas, palyginti su gyvybingumu, gautu neigiamiems kontroliniams bandiniams (tirpikliams), kuriems buvo taikoma visa bandymo procedūra (arba +Irr arba –Irr), tačiau jie nebuvo veikiami bandomąja chemine medžiaga.
      
         FDF (fotodirginimo faktorius) – faktorius, išreiškiantis dviejų vienodai efektyvių bandomosios medžiagos citotoksinių koncentracijos verčių (IC50), gautų nesant (–Irr) ir esant (+Irr) necitotoksiniam švitinimui UVA/matomąja šviesa, santykį.
      
         IC
         
            50
          – bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant ląstelių gyvybingumas sumažėja 50 %.
      
         VFE (vidutinis fotoefektas) – matmuo, nustatytas atliekant koncentracijos ir atsako kreivių, gautų nesant (–Irr) ir esant (+Irr) necitotoksiniam švitinimui UVA/matomąja šviesa, matematinę analizę.
      
         Fototoksiškumas – ūmus toksinis atsakas, kuris atsiranda, kai oda iš pradžių veikiama tam tikromis cheminėmis medžiagomis, o vėliau šviesa, arba kuris panašiai sukeliamas, kai oda švitinama po to, kai į ją buvo sistemingai injekuojama cheminė medžiaga.
      1.3   BANDYMO METODO PRINCIPAS
      3T3 NRU fototoksiškumo in vitro bandymas yra pagrįstas cheminės medžiagos citotoksiškumo lyginimu, kai ji bandoma, būdama apšvitinta modeliuojamos saulės šviesos necitotoksine doze, ir tamsoje. Šiame bandyme citotoksiškumas yra išreiškiamas kaip su koncentracija susietas vitalinio neutraliojo raudonojo (NR) dažiklio sugėrimo mažėjimas, išmatuotas praėjus 24 h po apdorojimo chemine medžiaga ir švitinimo (10). NR yra silpnas katijoninis dažiklis, kuris ne difuzijos būdu lengvai prasiskverbia per ląstelių membranas, susikaupdamas ląstelių lizosomose. Dėl jautrių lizosomos membranų ląstelių paviršiaus pakitimų lizosomos darosi trapios, be to, vyksta kiti pakitimai, kurie laipsniškai tampa negrįžtamais. Dėl tokių ksenobiotikais sukeltų pakitimų mažėja NR sugėrimas ir surišimas. Taigi įmanoma atskirti gyvybingas, pažeistas arba žuvusias ląsteles, kuo ir grindžiamas šis bandymas.
      Balb/c 3T3 ląstelės 24 h laikomos kultūroje monosluoksniui gauti. Iš pradžių 1 h inkubuojama po dvi 96 duobučių lėkšteles vienai bandomajai cheminei medžiagai, esant aštuonioms skirtingoms bandomosios medžiagos koncentracijos vertėms. Vėliau viena iš lėkštelių apšvitinama didžiausia necitotoksinio švitinimo doze, o kita lėkštelė laikoma tamsoje. Tuomet abiejų lėkštelių apdorojimo terpė yra keičiama kultūros terpe ir dar po 24 h inkubavimo ląstelių gyvybingumas nustatomas, matuojant neutraliojo raudonojo sugėrimą. Ląstelių gyvybingumas išreiškiamas kaip procentinė neapdorotų tirpiklio kontrolinių bandinių gyvybingumo dalis ir apskaičiuojamas kiekvienai bandomajai koncentracijai. Fototoksiniam potencialui prognozuoti lyginami atsakai į skirtingas medžiagos, apšvitintos arba laikytos tamsoje, koncentracijas, kai lygis paprastai būna IC50, t. y. toks kad ląstelių gyvybingumas sumažėja iki 50 % palyginti su neapdorotais kontroliniais bandiniais.
      1.4   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.4.1   Paruošiamieji darbai
      1.4.1.1   Ląstelės
      Atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimą, buvo naudojama nepertraukiama pelių fibroblastų linija, Balb/c 3T3, 31 klonas, iš American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, JAV arba European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, JK, todėl rekomenduojama naudoti šias ląsteles, gautas iš reikalavimus atitinkančios ląstelių saugyklos. Pagal tą pačią bandymo procedūrą galima naudoti kitas ląsteles arba ląstelių linijas, jei kultivavimo sąlygos pritaikomos specifiniams ląstelių poreikiams, tačiau turi būti įrodytas lygiavertiškumas.
      Ląstelės turi būti reguliariai tikrinamos, ar jos neužterštos mikoplazma, ir naudojamos tik, jei jos visiškai nėra (11).
      Svarbu, kad ląstelių jautrumas UV spinduliuotei būtų reguliariai tikrinamas pagal šiame metode aprašytą kokybės kontrolės procedūrą. Kadangi ląstelių jautrumas UVA gali padidėti didėjant persėjimų skaičiui, turėtų būti naudojamos mažiausio turimo persėjimų skaičiaus Balb/c 3T3 ląstelės, pageidautina mažesnio kaip 100 (žr. 1.4.2.2.2 skirsnį ir 2 priedą).
      1.4.1.2.   Terpės ir auginimo sąlygos
      Įprastu būdu persėjant ląsteles ir atliekant bandymo procedūras, turi būti naudojama tinkama kultivavimo terpė ir paisoma inkubavimo sąlygų, pvz., Balb/c 3T3 ląstelių terpė yra DMEM (Dulbecco 's Modified Eagle's Medium), papildyta 10 % naujagimių veršelių serumu, 4 mmol/l glutamino, penicilinu (100 TV) ir streptomicinu (100 μg/ml); inkubuojama drėgnoje atmosferoje, esant 37 oC, o CO2 kiekis siekia 5–7,5 %, priklausomai nuo buferinio tirpalo (žr. 1.4.1.4 skirsnio antrą pastraipą). Ypač svarbu, kad ląstelių kultivavimo sąlygos užtikrintų ląstelių ciklo trukmę, kuri atitinka įprastą naudojamų ląstelių arba jų linijų gyvavimo laikotarpį
      1.4.1.3   Kultūrų ruošimas
      Užšaldytų pradinių kultūrų ląstelės sėjamos kultivavimo terpėje atitinkamu tankiu ir bent kartą persėjamos prieš jas naudojant 3T3 NRU fototoksiškumo bandyme in vitro.
      
      Fototoksiškumo bandymui naudojamos ląstelės sėjamos į kultivavimo terpę tokiu tankiu, kad pasibaigus bandymui, t. y. kai nustatomas gyvybingumas, praėjus 48 h po ląstelių pasėjimo, atskiros ląstelių kolonijos nesusilietų,. Balb/c/3T3 linijos ląstelėms, kultivuojamoms 96 duobučių lėkštelėse, rekomenduojamas ląstelių tankis yra 1 × 10 ląstelių vienoje duobutėje.
      Kiekvienai bandomajai cheminei medžiagai skirtos ląstelės vienodai sėjamos į 2 atskiras 96 duobučių lėkšteles, kurios lygiagrečiai naudojamos visame bandyme, esant vienodoms kultivavimo sąlygoms, išskyrus laikotarpį, kai vienos lėkštelės ląstelės švitinamos (+Irr), o kitos – laikomos tamsoje(-Irr).
      1.4.1.4   Bandomosios medžiagos ruošimas
      Tiriamos cheminės medžiagos turi būti iš naujo ruošiamos prieš pradedant bandymą, išskyrus atvejus, kai turimi duomenys įrodo jų stabilumą laikymo sąlygomis. Rekomenduojama visus cheminės medžiagos paruošimo ir ląstelių pradinio apdorojimo darbus atlikti tokiomis apšvietimo sąlygomis, kuriomis prieš švitinimą būtų išvengta bandomosios medžiagos fotoaktyvinimo arba skilimo.
      Bandomosios medžiagos ištirpinamos buferiniuose druskų tirpaluose, pvz., Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), arba kituose fiziologiškai pusiausviruose buferiniuose tirpaluose, kuriuose neturi būti baltymų komponentų (pvz., pH indikatorinių dažiklių ir vitaminų), kad būtų išvengta trukdžių švitinant. Kadangi švitinamos ląstelės maždaug 50 min. laikomos ne CO2 inkubatoriuje, reikia imtis priemonių šarmo koncentracijos didėjimui išvengti. Jei naudojami mažos talpos buferiniai tirpalai, pvz., EBSS, pH didėjimo išvengti galima, jei ląstelės inkubuojamos esant 7,5 % CO2. Jei ląstelės inkubuojamos esant tik 5 % CO2, reikėtų pasirinkti didesnės talpos buf erinį tirpalą.
      Cheminės medžiagos, kurių tirpumas vandenyje yra ribotas, turi būti tirpinamos atitinkamame tirpiklyje. Jei naudojamas tirpiklis, jo tūris visose kultivavimo terpėse, t. y. neigiamuose (tirpiklių) kontroliniuose bandiniuose ir visų bandomosios medžiagos koncentracijos verčių bandiniuose, turi būti vienodas, ir tirpiklis neturi būti citotoksinis esant tokiai jo koncentracijai. Bandomosios medžiagos koncentracijos vertės pasirenkamos taip, kad nesusidarytų nuosėdos arba drumsti tirpalai.
      Rekomenduojami tirpikliai yra dimetilsulfoksidas (DMSO) ir etanolis (ETOH). Gali tikti ir kiti mažai citotoksiniai tirpikliai. Prieš naudojant turi būti patikrintos visų tirpiklių konkrečios savybės, pvz., reagavimas su bandomąja medžiaga, fototoksinio efekto gesinimas, radikalų sugavimo ir (arba) cheminio stabilumo tirpiklyje savybės.
      Tirpinimui palengvinti galima naudoti sūkurinį ir (arba) ultragarsinį maišymą ir(arba) šildymą iki atitinkamos temperatūros, jei tai neturi įtakos bandomosios cheminės medžiagos stabilumui.
      1.4.1.5   Švitinimo sąlygos
      1.4.1.5.1   Šviesos šaltinis
      
      Tiriant fototoksiškumą, tinkamo šviesos šaltinio bei šviesos filtrų pasirinkimas yra svarbiausias veiksnys. UVA bei matomosios šviesos sritys paprastai yra susijusios su fototoksinėmis reakcijomis in vivo (3) (12), o UVB sritis apskritai yra mažiau svarbi ir yra ypač citotoksinė; citotoksinės savybės stiprėja 1 000 kartų, jei bangos ilgis sumažėja nuo 313 iki 280 nm (13). Tarp tinkamo šviesos šaltinio pasirinkimo kriterijų turi būti reikalavimas, kad šviesos šaltinio spinduliuotė atitiktų bandomąja chemine medžiaga sugeriamos spinduliuotės bangos ilgius (sugerties spektrą), o šviesos dozės (pasiekiamos per priimtiną veikimo trukmę) pakaktų žinomoms fototoksinėms medžiagoms rasti. Be to, naudojami bangų ilgiai ir dozės neturi per daug kenkti bandymo sistemai, pvz., šilumos spinduliavimas (infraraudonoji sritis).
      Manoma, kad optimalus būdas dirbtinei šviesai gauti yra saulės šviesos imitatoriai. Filtruojamojo saulės šviesos imitatoriaus švitinimo galios pasiskirstymas turi būti artimas (14) nurodytai dienos šviesai lauko sąlygomis. Saulės šviesos imitatoriuose naudojamos ksenono ir gyvsidabrinės metalų halogenidų (legiruotos) lempos (15). Pastarųjų privalumas – mažesnis spinduliuojamos šilumos kiekis, be to, jos yra pigesnės, tačiau ne taip tiksliai atitinka saulės šviesos spektrą palyginti su ksenono lempomis. Kadangi didelę visų saulės šviesos imitatorių spinduliuotės dalį sudaro UVB spinduliuotė, jie turi būti tinkamai filtruojami, kad susilpnintų labai citotoksinę UVB bangų ilgio spinduliuotę. Kadangi ląstelių kultūrai naudojamos plastikinės medžiagos turi UV stabilizatorių, spektras turi būti matuojamas per tokio paties, kaip ir bandyme naudojamo tipo 96 duobučių lėkštelės dangtį. Kad ir kokių būtų imamasi priemonių spektro dalims silpninti filtravimu ir nepaisant neišvengiamo įrangos filtruojamojo poveikio, šiuos filtrus praėjusios šviesos spektras neturi nukrypti nuo etaloninės dienos šviesos lauko sąlygomis (14). Filtruojamojo saulės šviesos imitatoriaus, naudojamo vykdant 3T3 NRU fototoksiškumo in vitro bandymo tinkamumo patvirtinimo tyrimą, spinduliuotės spektro skirstinio pavyzdys pateiktas (8) (16). Taip pat žr. 2 priedo 1 paveikslą.
      1.4.1.5.2   Dozimetrija
      
      Šviesos intensyvumas (energinė apšvieta) turėtų būti reguliariai tikrinamas prieš kiekvieną fototoksiškumo bandymą, naudojant tinkamą plačiajuostį UV spinduliuotės matuoklį. Intensyvumas turi būti matuojamas per tokio paties, kaip ir bandyme naudojamo tipo 96 duobučių plokštelės dangtį. UV spinduliuotės matuoklis turi būti kalibruojamas pagal šviesos šaltinį. UV spinduliuotės matuoklio veikimą būtina tikrinti, ir šiam tikslui rekomenduojama naudoti antrą to paties tipo ir vienodo kalibravimo UV spinduliuotės matuoklį. Būtų geriausia, jei filtruojamo šviesos šaltinio spektrinei energinei apšvietai matuoti ir plačiajuosčio UV spinduliuotės matuoklio kalibravimui tikrinti kas tam tikrą ilgesnį laiko tarpą būtų naudojamas spektroradiometras.
      Buvo nustatyta, kad 5 J/cm dozė (išmatuota UVA srityje) nėra citotoksinė Balb/c 3T3 ląstelėms ir jos pakanka sužadinti chemines medžiagas, kad būtų sukeltos fototoksinės reakcijos (6) (17), pvz., norint pasiekti 5 J/cm2 per 50 min laikotarpį, nustatoma 1,7 mW/cm2 energinė apšvieta. Žr. 2 priedo 2 paveikslą. Jei naudojama kita ląstelių linija arba skirtingas šviesos šaltinis, švitinimo dozę gali tekti kalibruoti taip, kad būtų galima pasirinkti tokį dozės režimą, kuris nebūtų kenksmingas ląstelėms, bet kuriuo gautos dozės pakaktų sužadinti etalonines fototoksines medžiagas. Šviesos trukmė apskaičiuojama taip:
      
                  
                     
               
               
                  (1 J = 1 W × s)
               
            1.4.2   Bandymo sąlygos
      1.4.2.1   Bandomosios medžiagos koncentracijos vertės
      Cheminės medžiagos, bandomos šviesoje (+Irr) ir tamsoje (-Irr), koncentracijos verčių intervalas turi būti tinkamai nustatytas dozės intervalo radimo bandymais. Gali būti naudinga nustatyti pradinį tirpumą ir po 60 min. (arba po tiek laiko, kiek skiriama apdorojimui), kadangi tirpumas laikui bėgant arba švitinimo laikotarpiu gali pasikeisti. Siekiant išvengti toksiškumo, kurį sukelia netinkamos kultivavimo sąlygos arba labai šarminės arba rūgštinės cheminės medžiagos, ląstelių kultūrų pH vertės intervalas, pridėjus cheminės medžiagos, turėtų būti 6,5–7,8.
      Didžiausia bandomosios medžiagos koncentracija turi atitikti fiziologines bandymo sąlygas, pvz., turėtų būti išvengta įtempimo, kurį sukelia osmozė ir pH. Nelygu, kokia yra bandomoji cheminė medžiaga, gali tekti atsižvelgti į kitas fizikochemines savybes, pvz., į veiksnius, ribojančius didžiausią bandomąją koncentraciją. Palyginti mažai tirpios medžiagos, kurios nėra toksinės iki pat soties koncentracijos, turėtų būti bandomos esant didžiausiai įmanomai koncentracijai. Apskritai turėtų būti išvengta bandomosios medžiagos nuosėdų susidarymo esant bet kuriai bandomajai koncentracijai. Didžiausia bandomosios medžiagos koncentracija neturėtų būti didesnė kaip 1 000 μg/ml; osmolingumas neturi būti didesnis kaip 10 mmol. Naudojamos 8 bandomosios medžiagos koncentracijos vertės, kurios, skiedžiamos pagal tą patį skiedimo faktorių, sudaro geometrinę progresiją (žr. 2.1 skirsnio antrąją pastraipą).
      Jei yra informacijos (gautos intervalo radimo bandymu), kad atliekant bandymą tamsoje (-Irr) bandomoji cheminė medžiaga nėra citotoksinė iki pat ribinės koncentracijos, bet švitinama (+Irr) yra labai citotoksinė, norint atitikti tinkamos duomenų kokybės reikalavimą, (+Irr) ir (-Irr) bandymams pasirinktini koncentracijos intervalai gali skirtis.
      1.4.2.2   Kontroliniai bandiniai
      1.4.2.2.1   Ląstelių jautrumas spinduliuotei, ankstesnių bandymų duomenys:
      
      Turi būti reguliariai (maždaug kas penktą pas ėjimą) tikrinamas ląstelių jautrumas šviesos šaltiniui, įvertinant jų gyvybingumą po veikimo didėjančiomis spinduliuotės dozėmis. Įvertinant turi būti naudojamos kelios spinduliuotės dozės, įskaitant tokias, kurios yra gerokai didesnės negu naudojama 3T3 NRU fototoksiškumo bandymui. Lengviausias šių dozių kiekybinio įvertinimo būdas – matuoti šviesos šaltinio UV spinduliuotės dalis. Ląstelės sėjamos tokiu tankumu, kuris naudojamas 3T3 NRU fototoksiškumo in vitro bandyme, ir apšvitinamos kitą dieną. Dar po dienos išmatuojamas ląstelių gyvybingumas, naudojant neutraliojo raudonojo sugėrimą. Turi būti įrodyta, kad gautos didžiausios necitotoksinės dozės (pvz., atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimą: 5 J/cm [UVA]) pakanka etaloninėms cheminėms medžiagoms (1 lentelė) tinkamai klasifikuoti.
      1.4.2.2.2   Jautrumas spinduliuotei, atliekamų bandymų tikrinimas:
      
      Bandymas atitinka kokybės kriterijus, jei apšvitintiems neigiamiems/tirpiklio kontroliniams bandiniams gauta gyvybingumo vertė yra didesnė kaip 80 % palyginti su tamsoje laikomu neigiamu/tirpiklio kontroliniu bandiniu.
      1.4.2.2.3   Tirpiklio kontrolinių bandinių ląstelių gyvybingumas:
      
      Iš tirpiklio kontrolinių bandinių ekstrahuoto neutraliojo raudonojo absoliutus optinis tankis (OD540NRU) rodo, ar vienoje duobutėje pasėtos 1 × 104 ląstelės augo dvi bandymo dienas esant normaliam dvigubėjimo laikui. Bandymas atitinka priimtinumo kriterijus, jei vidutinė neapdorotų kontrolinių bandinių OD540 Nru vertė yra > 0,4 (t. y. maždaug dvidešimt kartų didesnė už fonui naudojamo tirpiklio optinį tankį).
      1.4.2.2.4   Teigiamas kontrolinis bandinys:
      
      Lygiagrečiai kiekvienam 3T3 NRU fototoksiškumo in vitro bandymui turi būti bandoma žinoma fototoksinė medžiaga. Rekomenduojamas chlorpromazinas (CPZ). CPZ bandant pagal etaloninį 3T3 NRU fototoksiškumo in vitro bandymo protokolą, buvo apibrėžti šie bandymo priimtinumo kriterijai: CPZ apšvitinus (+Irr): IC50 = 0,1- 2,0 ug/ml, CPZ tamsoje (-Irr): IC50=7,0-90,0 ug/ml. Fotodirginimo faktorius (FDF) turėtų būti > 6. Turi būti kontroliuojami teigiamam kontroliniam bandiniui anksčiau gauti duomenys.
      Vietoj chlorpromazino kaip lygiagrečiai bandomi teigiami kontroliniai bandiniai gali būti naudojamos kitos fototoksinės medžiagos, tinkančios dėl cheminės medžiagos klasės arba tirpumo charakteristikų.
      1.4.3   Bandymo procedūra (6) (7) (8) (16) (17):
      1.4.3.1   1-oji diena:
      Į kraštines 96 duobučių audinių kultūros mikrotitravimo lėkštelės duobutes įlašinama po 100 μl kultivavimo terpės (= tuštieji bandiniai). Į likusias duobutes įlašinama po 100 μl ląstelių suspensijos, kurios koncentracija 1 x 105 ląstelių/ml kultivavimo terpės (=1 x 104 ląstelių/duobutei). Paruošiama po dvi lėkšteles kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai, tirpikliui ir teigiamiems kontroliniams bandiniams.
      Ląstelės inkubuojamos 24 h (žr. 1.4.1.2 skirsnį) tol, kol jos sudaro pusiau susiliejantį monosluoksnį. Per šį inkubavimo laikotarpį ląstelės atsigauna, prilimpa ir eksponentiškai didėja jų skaičius.
      1.4.3.2   2-oji diena:
      Pasibaigus inkubavimui, kultivavimo terpė nupilama nuo ląstelių, kurios kruopščiai plaunamos 150 μl inkubavimui naudoto buferinio tirpalo. Įpilama 100 μl buferinio tirpalo, kuriame būtų tinkamos koncentracijos bandomoji cheminė medžiaga, arba tirpiklis (tirpiklio kontrolinis bandinys). Naudojamos 8 skirtingos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertės. Ląstelės su bandomąja medžiaga inkubuojamos tamsoje 60 min. (žr. 1.4.1.2 skirsnį ir 1.4.1.4 skirsnio antrąją pastraipą).
      Iš dviejų lėkštelių, paruoštų kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai ir kontroliniams bandiniams, viena atsitiktinai pasirenkama citotoksiškumui nustatyti (-Irr) (t. y. kontrolinė lėkštelė), o kita (apdorojamoji lėkštelė) – fototoksiškumui nustatyti (+Irr).
      Esant kambario temperatūrai, ląstelės 50 min. veikiamos šviesa (+Irr) per 96 duobučių lėkštelės dangtį, naudojant didžiausią dar necitotoksinę spinduliuotės dozę (taip pat žr. 2 priedą). Neapšviestos lėkštelės (-Irr) 50 min. (= veikimo šviesa trukmė) laikomos tamsioje dėžėje, esant kambario temperatūrai.
      Bandomasis tirpalas nupilamas ir ląstelės kruopščiai du kartus plaunamos 150 μl inkubavimui naudoto buferinio tirpalo, kuriame nebūtų bandomosios medžiagos. Buferinis tirpalas keičiamas kultivavimo terpe ir ląstelės inkubuojamos (žr. 1.4.1.2 skirsnį.) per naktį (18–22 h).
      1.4.3.3   3-oji diena:
      1.4.3.3.1   Mikroskopinis tyrimas
      
      Ląstelių augimas, morfologija ir monosluoksnio vientisumas turi būti ištirtas fazių kontrasto mikroskopu. Turi būti užrašyti ląstelių morfologiniai pokyčiai ir poveikis jų augimui.
      1.4.3.3.2   Neutraliojo raudonojo dažiklio sugėrimo bandymas
      
      Ląstelės plaunamos 150 μl iš anksto pašildyto buferinio tirpalo. Plovimo tirpalas pašalinamas atsargiai išleidžiant. Į terpę be serumo (16) įpilama 100 μl 50 μg/ml neutralaus raudonojo (NR) (3-amino-7-dimetilamino-2-metilfenazino hidrochlorido, EINECS numeris 209-035-8; CAS numeris 553-24-2; C.I. 50040) ir 3 h inkubuojama, kaip aprašyta 1.4.1.2 skirsnyje. Po inkubavimo NR terpė pašalinama ir ląstelės plaunamos 150 μl buferinio tirpalo. Buferinio tirpalo perteklius pašalinamas nusausinant arba centrifuguojant.
      Įpilama tiksliai 150 μl tirpalo NR desorbuoti (tik ką paruošto: 49 dalys vandens + 50 dalių etanolio + 1 dalis acto rūgšties).
      Mikrotitravimo lėkštelė nestipriai purtoma 10 min. ant mikrotitravimo lėkštelės kratytuvo tol, kol NR ekstrahuojamas iš ląstelių ir susidaro vienalytis tirpalas.
      Spektrofotometru matuojamas NR ekstrakto optinis tankis esant 540 nm, palyginamuoju tirpalu naudojant tuščiuosius bandinius. Duomenys saugomi atitinkamo formato elektroninėje laikmenoje vėlesnei analizei.
      2.   DUOMENYS
      2.1   DUOMENŲ KOKYBĖ IR KIEKYBĖ
      Pagal bandymų duomenis turėtų būti įmanoma atlikti reikšmingą koncentracijos ir atsako, gauto veikiant šviesa ir tamsoje, analizę ir, jei įmanoma, nustatyti bandomosios medžiagos koncentraciją, kuriai esant ląstelių gyvybingumas sumažėja 50 % (IC50). Jei nustatomas citotoksiškumas, koncentracijos intervalas ir atskiros koncentracijos vertės turi būti parinktos tokiu būdu, kad sujungus bandymo duomenis būtų įmanoma gauti kreivę.
      Aiškiai teigiamiems ir aiškiai neigiamiems rezultatams (žr. 2.3 skirsnio pirmąją pastraipą) gali pakakti pradinio bandymo, patvirtinto vienu pradiniu dozės intervalo radimo bandymu arba keliais bandymais.
      Dviprasmiški, ribiniai arba neaiškūs rezultatai turi būti išaiškinti atliekant papildomus bandymus (taip pat žr. 2.4 skirsnio antrą pastraipą). Tokiais atvejais reikėtų apsvarstyti galimybę keisti bandymo sąlygas. Bandymo sąlygos, kurias galima keisti – tai koncentracijos intervalas arba tarpai tarp jos verčių, pradinio inkubavimo trukmė ir švitinimo-veikimo trukmė. Vandenyje nepatvarioms medžiagoms labiau gali tikti trumpesnė veikimo trukmė.
      2.2   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS
      Duomenims įvertinti galima apskaičiuoti fotodirginimo (PDF) arba vidutinį fotoefektą (VFE).
      Fototoksiškumo matams apskaičiuoti (žr. toliau) atskirų koncentracijos ir atsako verčių aibė turi būti aproksimuojama nubrėžiant tinkamą tolydžią koncentracijos ir atsako kreivę (modelį). Kreivė pagal duomenis paprastai parenkama taikant netiesinės regresijos metodą (18). Norint įvertinti duomenų kintamumo įtaką parinktajai kreivei rekomenduojama taikyti savaiminio gerinimo (bootstrap) metodą.
      Fotodirginimo faktorius (FDF) apskaičiuojamas taikant šią formulę:
      
         
      Jei IC50 apšvietimo ir tamsos sąlygomis negalima apskaičiuoti, negalima nustatyti bandomosios medžiagos FDF. Vidutinis fotoefektas (VFE) yra pagrįstas visų koncentracijos ir atsako kreivių lyginimu (19). Jis apibrėžiamas kaip tipinių fotoefekto verčių rinkinio svertinis vidurkis
      
         
      Kurią nors koncentraciją C atitinkantis fotoefektas PEC apibrėžiamas kaip atsako REC ir dozės DEC efektų sandauga, t. y. PEC = REC x DEC. Atsako efektas REC yra atsakų, nustatomų tamsoje ir veikiant šviesa, skirtumas, t. y. REC = RC(-Irr) – RC(+Irr). Dozės efektas apibrėžiamas lygtimi
      
         
      kurioje C* atitinka ekvivalentinę koncentraciją, t. y. koncentraciją, kuriai esant +Irr atsakas lygus -Irr atsakui, esant C koncentracijai. Jei C* negalima nustatyti todėl, kad +Irr kreivės atsako vertės yra sistemingai didesnės arba mažesnės už RC(-Irr), dozės efektas prilyginamas 1. Svoriniai faktoriai wi nustatomi pagal didžiausią atsako vertę, t. y. Wi = MAX{Ri(+Irr), Ri(-Irr)}. Koncentracijos verčių Ci tinklelis pasirenkamas taip, kad į kiekvieną koncentracijos verčių intervalą, apibrėžtą bandyme naudojamomis koncentracijos vertėmis, patektų vienodas taškų skaičius. VFE apskaičiuojamas pagal didžiausią koncentracijos vertę, kuriai esant bent viena iš dviejų kreivių vis dar rodo bent 10 % atsako vertę. Jei ši didžiausia koncentracija yra didesnė kaip +Irr bandyme naudojama didžiausia koncentracija, likusioji +Irr kreivės dalis nustatoma atsako vertei „0“. Atsižvelgiant į tai, ar VFE vertė yra didesnė arba ne didesnė už tinkamai pasirinkta ribinę vertę (VFEC = 0,15), cheminė medžiaga klasifikuojama kaip fototoksinė.
      Programinės įrangos rinkinį, kuris naudojamas apskaičiuojant FDF ir VFE, galima rasti (20).
      2.3   REZULTATŲ INTERPRETAVIMAS
      Pagal tinkamumo patvirtinimo tyrimo duomenis (8) prognozuojama, kad bandomoji medžiaga, kurios FDF<2 arba VFE < 0,1, yra nefototoksinė. Kai 2<FDF<5 arba 0,1 < VFE < 0,15, prognozuojama: tikėtina, kad fototoksinė; o kai FDF > 5 arba VFE > 0,15, prognozuojama: fototoksinė.
      Visos laboratorijos, pradedančios taikyti šį bandymą, iš pradžių turi išbandyti 1 lentelėje išvardytas etalonines medžiagas prieš pradėdamos bandyti bandomąsias medžiagas jų fototoksiškumui įvertinti. FDF arba VFE vertės turi būti artimos 1 lentelėje nurodytoms vertėms.
      
         1 lentelė
      
      
                  Cheminis pavadinimas
               
               
                  EINECS Nr.
               
               
                  CAS Nr.
               
               
                  PDF
               
               
                  VFE
               
               
                  Sugerties maksimumas
               
               
                  Tirpiklis (9)
                  
               
            
                  Amiodaronas HCl
               
               
                  243-293-2
               
               
                  [19774-82-4]
               
               
                  > 14,4
               
               
                  0,27 – 0,54
               
               
                  242 nm
                  300 nm
                  (petys)
               
               
                  etanolis
               
            
                  Cholorpromazina s HCl
               
               
                  200-701-3
               
               
                  [69-09-0]
               
               
                  > 71,6
               
               
                  0,33 – 0,63
               
               
                  309 nm
               
               
                  etanolis
               
            
                  Norfloksacinas
               
               
                  274-614-4
               
               
                  [70458-96-7]
               
               
                  > 18,5
               
               
                  0,34– 0,90
               
               
                  316 nm
               
               
                  acetonitrilas
               
            
                  Antracenas
               
               
                  204-371-1
               
               
                  [120-12-7]
               
               
                  > 45,3
               
               
                  0,19 – 0,81
               
               
                  356 nm
               
               
                  acetonitrilas
               
            
                  Fotoporfirinas IX, dinatrio
               
               
                  256-815-9
               
               
                  [50865-01-5]
               
               
                  nėra FDF
               
               
                  0,54– 0,74
               
               
                  402 nm
               
               
                  etanolis
               
            
                  L-histidinas
               
               
                   
               
               
                  [7006-35-1]
               
               
                  1,1 - 1,7
               
               
                  0,05 – 0,10
               
               
                  211 nm
               
               
                  vanduo
               
            
                  Heksacholorfena s
               
               
                  200-733-8
               
               
                  [70-30-4]
               
               
                  1,0-1,9
               
               
                  0,00– 0,05
               
               
                  299 nm
                  317 nm
                  (petys)
               
               
                  etanolis
               
            
                  Natrio laurilsulfatas
               
               
                  205-788-1
               
               
                  [151-21-3]
               
               
                  > 14,4
               
               
                  0,00– 0,05
               
               
                  nesugeria ma
               
               
                  vanduo
               
            2.4   DUOMENŲ INTERPRETAVIMAS
      Jei fototoksinis poveikis stebimas tik esant didžiausiai bandomajai koncentracijai (ypač, vandenyje tirpių bandomųjų cheminių medžiagų), pavojui įvertinti gali reikėti papildomų analizės duomenų, pavyzdžiui, sugerties per odą, cheminės medžiagos kaupimosi odoje duomenų ir(arba) kitų bandymų duomenų, kaip antai cheminės medžiagos in vitro bandymų su gyvūnų arba žmonių oda arba su odos modeliais duomenų.
      Jei toksiškumas nenustatomas (+Irr ir -Irr) ir jei blogas tirpumas riboja bandomosios koncentracijos vertes, gali būti suabejota bandomosios medžiagos tinkamumu bandyti šiuo metodu ir turėtų būti numatytas patvirtinamasis bandymas, naudojant, pvz., kitą modelį.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta bent tokia informacija:
      
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              identifikavimo duomenys, įprasti bendrieji pavadinimai, IUPAC pavadinimai ir CAS numeris, jei žinomas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              fizikinė būsena ir grynumas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              fizikocheminės savybės, svarbios atliekamam tyrimui,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              UV/matomosios srities sugerties spektras,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              stabilumas ir fotocheminis stabilumas, jei žinomas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Tirpiklis:
                  
                              —
                           
                           
                              tirpiklio pasirinkimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios cheminės medžiagos tirpumas tirpiklyje,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tirpiklio kiekio, esančio apdorojimo terpėje, procentinė dalis.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Ląstelės:
                  
                              —
                           
                           
                              ląstelių tipas ir šaltinis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mikoplazmos nebuvimo patvirtinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių sėjimų skaičius, jei žinomas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių jautrumas spinduliuotei, nustatytas švitinimo įranga, naudojama atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo in vitro bandymą.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos (1); inkubacija prieš ir po apdorojimo:
                  
                  
                              —
                           
                           
                              kultivavimo terpės tipas ir sudėtis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubacijos sąlygos (CO2 koncentracija, temperatūra, drėgmė),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubacijos trukmė (prieš apdorojimą, po apdorojimo).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos (2); apdorojimas chemine medžiaga:
                  
                  
                              —
                           
                           
                              bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, kuri naudojama švitinant ir nešvitinant, pasirinkimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              riboto bandomosios cheminės medžiagos tirpumo atveju ir nesant citotoksiškumo: didžiausios bandytos koncentracijos pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              apdorojimo terpės tipas ir sudėtis (buferinis druskos tirpalas),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              cheminio apdorojimo trukmė.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos (3); švitinimas:
                  
                  
                              —
                           
                           
                              pasirinkto šviesos šaltinio pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šviesos šaltinio ir radiometro gamintojas ir tipas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šviesos šaltinio spektrinės energinės apšvietos charakteristikos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              naudojamo (-ų) filtro (-ų) praleidimo ir sugerties charakteristikos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              radiometro charakteristikos ir jo kalibravimo detalės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šviesos šaltinio atstumas iki bandymo sistemos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              UVA energinė apšvieta esant šiam atstumui, išreikšta mW/cm2,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              švitinimo UV/matomąja šviesa trukmė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              UVA dozė (energinė apšvieta laikas), išreikšta J/cm2
                              
                           
                        
                              —
                           
                           
                              švitinamų ląstelių kultūrų ir lygiagrečiai tamsoje laikomų ląstelių kultūrų temperatūra.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos (4); gyvybingumo bandymas, naudojant neutralųjį raudonąjį:
                  
                  
                              —
                           
                           
                              apdorojimo neutraliuoju raudonuoju terpės sudėtis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubavimo su neutraliuoju raudonuoju trukmė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubavimo sąlygos (CO2 koncentracija, temperatūra, drėgmė),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              neutraliojo raudonojo ekstrahavimo sąlygos (tirpiklis, trukmė),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              neutraliojo raudonojo optinio tankio spektrofotometrinio matavimo bangos ilgis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              antrasis (etaloninis) bangos ilgis, jei naudojamas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              spektrofotometriniam matavimui naudoto palyginamojo tirpalo sudėtis, jei buvo naudojamas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              ląstelių gyvybingumas, nustatytas kiekvienai bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertei, išreikštas lygiagrečių tirpiklio kontrolinių bandinių gyvybingumo vidurkio procentine dalimi,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              koncentracijos ir atsako kreivės (santykinis ląstelių gyvybingumas kaip cheminės medžiagos koncentracijos funkcija), gautos lygiagreti ems (+Irr) ir (-Irr) bandymams,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              koncentracijos ir atsako kreivių analizė: jei įmanoma, IC50 (+Irr) ir IC50 (-Irr) apskaičiavimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dviejų koncentracijos ir atsako kreivių, gautų švitinant ir tamsoje, lyginimas, apskaičiuojant fotodirginimo faktorių (FDF) arba vidutinį fotoefektą (VFE),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandymo priimtinumo kriterijai; lygiagretus tirpiklio kontrolinis bandinys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              švitintų ir nešvitintų ląstelių absoliutusis gyvybingumas (neutraliojo raudonojo ekstrakto optinis tankis),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              anksčiau gauti neigiamų ir tirpiklių kontrolinių bandinių duomenys; vidutinės vertės ir standartiniai nuokrypiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandymo priimtinumo kriterijai; lygiagretus teigiamas kontrolinis bandinys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              teigiamo kontrolinio bandinio IC50 (+Irr) ir IC50 (-Irr) bei FDF/VFE,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              anksčiau gauti teigiamų kontrolinių bandinių duomenys: IC50 (+Irr) ir IC50 (-Irr) bei FDF/VFE; vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 30 -31th October 2001, Secretariat's Final
               
            
                  2)
               
               
                  Loveli W.W. (1993). A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7: p. 95–102.
               
            
                  3)
               
               
                  Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic substances. In „Research Progress in Organic, Biological and Medicinal Chemistry“ Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam, p XI-XXXV.
               
            
                  4)
               
               
                  Spielmann, H., Loveli, W.W., Holzle, E., Johnson, B.E., Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sladowski, D. (1994). In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, p. 314–348.
               
            
                  5)
               
               
                  Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In „The science of Photobiology“ Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New York. 2nd edition, p. 79–110.
               
            
                  6)
               
               
                  OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.7 „Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water“ Environment Directorate, OECD, Paris.
               
            
                  7)
               
               
                  Spielmann, H, Balls, M., Doring, B., Holzhūtter, H.G, Kalweit, S., Klecak, G, L'Eplattenier, H, Liebsch, M., Loveli, W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8, p. 793–796.
               
            
                  8)
               
               
                  Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA, 26, p. 7–8.
               
            
                  9)
               
               
                  Spielmann, H, Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, G De Silva, O., Holzhūtter, H.G, Clothier, R, Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Loveli, W.W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EU/COLIPA In vitro phototoxicity validation study: results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In Vitro 12, p. 305–327.
               
            
                  10)
               
               
                  OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 30 -31th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 15th March 2002, OECD ENV7EHS, available upon request from the Secretariat.
               
            
                  11)
               
               
                  Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Lett., 24, 119-124.
               
            
                  12)
               
               
                  Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control for cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225-237.
               
            
                  13)
               
               
                  Lambert L. A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicology“, edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, p 515-530.
               
            
                  14)
               
               
                  Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825-1829.
               
            
                  15)
               
               
                  ISO 10977. (1993). Photography – Processed photographic colour films and paper prints – Methods for measuring image stability.
               
            
                  16)
               
               
                  Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, International Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vienna, 1993, ISBN 3900734275
               
            
                  17)
               
               
                  ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure: In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 1998.
               
            
                  18)
               
               
                  Spielmann, H, Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, O., Holzhūtter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Loveli, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals from Annex VII of the European Union Directive 76/768/EEC, in the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, p. 679–708.
               
            
                  19)
               
               
                  Holzhūtter, H.G, and Quedenau, J. (1995) Mathematical modeling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, p. 127–138.
               
            
                  20)
               
               
                  Holzhūtter, H.G. (1997). A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, p. 445–462.
               
            
                  21)
               
               
                  http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_2349687_l_l_l_l,00. html
               
            
         1 PRIEDAS
         3T3 NRU fototoksiškumo bandymo svarba, taikant nuoseklųjį metodą cheminių medžiagų fototoksiškumui tirti
         
            
      
      
         2 PRIEDAS
         1 paveikslas
         Filtruoto saulės šviesos imitatoriaus spektrinės galios skirstinys
         
            
         (žr. 1.4.1.5.1 skirsnio antrąją pastraipą)
         1 paveiksle pateiktas filtruoto saulės šviesos imitatoriaus priimtino spektrinės energinės apšvietos skirstinio pavyzdys. Jis yra gautas metalų halogenidais legiruotam šaltiniui, naudojamam 3T3 NRU fototoksiškumo bandymo tinkamumo patvirtinimo tyrime (6) (8) (17). Parodyta dviejų skirtingų filtrų ir 96 duobučių ląstelių kultūros lėkštelės dangčio filtruojamojo poveikio įtaka. H2 filtras buvo naudojamas tik toms bandymo sistemoms, kurios gali ištverti didesnį UVB spinduliuotės kiekį (odos modelio ir raudonųjų kraujo kūnelių fotohemolizės bandymai). Atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo bandymą, buvo naudojamas H1 filtras. Paveiksle parodytas papildomas filtruojamasis lėkštelės dangčio poveikis, kuris iš esmės stebimas UVB srityje, švitinimo spektre vis dar liekant UVB spinduliuotės kiekiui, kurio pakanka cheminėms medžiagoms, paprastai sugeriančioms UVB bangų ilgį, pvz., amiodaronui, sužadinti (žr. 1 lentelę).
         2 paveikslas
         Balb/c 3T3 ląstelių jautrumas švitinimui (išmatuotas UVA srityje)
         Ląstelių gyvybingumas (neutraliojo raudonojo sugėrimo % palyginti su kontroliniais bandiniais tamsoje)
         
            
         (žr. 1.4.1.5.2 skirsnio antrąją pastraipą; 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2)
         UVA srityje matuojamas Balb/c 3T3 ląstelių jautrumas švitinimui saulės šviesos imitatoriumi, kuris naudojamas vykdant 3T3 NRU fototoksiškumo bandymo tinkamumo patvirtinimo tyrimą. Paveiksle parodyti rezultatai, gauti 7 skirtingose laboratorijose, vykdant pradinį tinkamumo patvirtinimo tyrimą (1). Dvi kreivės su šviesiais simboliais buvo gautos senesnėms ląstelėms (didelis persėjimų skaičius), kurios turėjo būti pakeistos naujomis ląstelių pradinėmis kultūromis, o kreivės su juodais simboliais rodo ląsteles su priimtinu švitinimo ištveriamumu.
         Pagal šiuos duomenis buvo gauta didžiausia necitotoksinė švitinimo dozė 5 J/cm2 (vertikali brūkšniuota linija). Horizontali brūkšniuota linija papildomai rodo didžiausią priimtiną švitinimo poveikį, nurodytą 1.4.2.2 skirsnyje.
      
      B.42.   ODOS JAUTRINIMAS. VIETINIO LIMFMAZGIO TYRIMAS
      1.   METODAS
      Šis bandymų metodas atitinka OECD TG 429 (2002)
      1.1   ĮVADAS
      Vietinio limfmazgio tyrimas (Local Lymph Node Assay - LLNA) yra pakankamai įteisintas ir priimtas, kad būtų galima pagrįsti jo, kaip naujo metodo, patvirtinimą (1) (2) (3). Tai yra antrasis metodas, leidžiantis nustatyti galimą cheminių medžiagų sukeliamą gyvūnų odos jautrinimą. Pagal kitą metodą (B.6) naudojami bandymai su jūrų kiaulytėmis, ypač, maksimizacijos ir Buehlerio bandymas su jūros kiaulytėmis (4).
      LLNA yra pakaitinis metodas odą jautrinančioms cheminėms medžiagoms identifikuoti ir patvirtinti, kad tam tikrų medžiagų geba jautrinti odą nėra didelė. Nereikia manyti, kad visais atvejais vietoj bandymo su jūrų kiaulytėmis reikėtų taikyti LLNA bandymą; tai labiau reiškia, kad šis bandymas yra lygiavertis ir gali būti taikomas kaip pakaitinis metodas, pagal kurį teigiamų ir neigiamų rezultatų paprastai nebereikia papildomai patvirtinti.
      LLNA turi tam tikrų pranašumų atsižvelgiant į mokslo pažangą ir gyvūnų gerovę. Tiriamas odos jautrinimo indukcinis periodas ir gaunami kiekybiniai duomenys, tinkami reakcijai į dozę įvertinti. Yra paskelbta išsami informacija apie LLNA tinkamumo patvirtinimą ir susijusių darbų apžvalga (5) (6) (7) (8). Be to, reikia pažymėti, kad silpnai arba vidutiniškai jautrinančios medžiagos, kurios yra rekomenduotos kaip tinkamos teigiamo poveikio kontrolinės medžiagos bandymams su jūrų kiaulytėmis, tinka naudoti LLNA metodui (6) (8) (9).
      LLNA yra in vivo metodas, todėl jautrinančiam poveikiui dėl sąlyčio įvertinti naudojami gyvūnai. Tačiau taikant šį metodą yra galimybė sumažinti šiam tikslui reikalingų gyvūnų skaičių. Be to, LLNA iš esmės pagerina būdą, kuriuo gyvūnai naudojami jautrinimui dėl sąlyčio bandyti. LLNA yra pagrįstas imunologinių reiškinių, kuriuos cheminės medžiagos sukelia jautrinimo indukcijos periodu, nagrinėjimu. Kitaip nei darant bandymus su jūrų kiaulytėmis, taikant LLNA nereikia sukelti ypač didelio odos jautrumo reakcijų. Be to, taikant LLNA nereikia naudoti aktyvuojančiųjų priedų, kurie reikalingi darant maksimizacijos bandymą su jūrų kiaulytėmis. Taigi LLNA sumažina gyvūnų kančias. Nežiūrint į LLNA pranašumus palyginti su tradiciniais bandymais su jūrų kiaulytėmis, reikia pripažinti, kad yra tam tikrų apribojimų, dėl kurių gali tekti taikyti tradicinius bandymus su jūrų kiaulytėmis (pvz., klaidingi neigiami rezultatai tiriant kai kuriuos metalus taikant LLNA, klaidingi teigiami rezultatai tiriant tam tikrus odos dirgiklius) (10).
      Dar žr. B dalies įvadą.
      1.2   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Pagrindinis principas, kuriuo pagrįstas LLNA metodas, yra jautrinančiųjų medžiagų sukelta pirminė limfocitų proliferacija cheminės medžiagos uždėjimo vietą drenuojančiame limfmazgyje. Si proliferacija yra proporcinga naudojamai dozei (ir alergeno gebai jautrinti), taigi tai yra paprastas būdas objektyviai ir kiekybiškai išmatuoti jautrinimą. Taikant LLNA, ši proliferacija įvertinama kaip dozės ir reakcijos santykis, lyginant proliferaciją bandymo grupėse ir nešiklį gavusiose kontrolinėse grupėse. Nustatomas proliferacijos paveiktose grupėse ir kontrolinėse nešiklio grupėse santykis, vadinamas dirginimo rodikliu, kuris turi būti lygus mažiausiai trims, kad bandomoji medžiaga galėtų būti toliau vertinama kaip galinti odą dirginanti medžiaga. Čia aprašyti metodai yra pagrįsti radioaktyviųjų indikatorių naudojimu ląstelių proliferacijai išmatuoti. Tačiau gali būti naudojami kiti parametrai proliferacijai įvertinti, jei jie pagrįsti atitinkamais moksliniais duomenimis, įskaitant išsamias nuorodas ir metodo aprašymą.
      1.3   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.3.1   Pasiruošimas
      1.3.1.1   Laikymo ir šėrimo sąlygos
      Gyvūnai turėtų būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandomieji gyvūnai, temperatūra turi būti 20 oC (± 3 oC). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio.
      1.3.1.2   Gyvūnų ruošimas
      Gyvūnai pasirenkami atsitiktinai, ženklinami, kad būtų įmanoma kiekvieną identifikuoti (tačiau netaikomas joks ausų ženklinimas), ir laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras prieš pradedant duoti dozes, kad galėtų priprasti prie laboratorijos sąlygų. Prieš apdorojimo pradžią visi gyvūnai tiriami, siekiant įsitikinti, ar jie neturi pastebimų odos pažeidimų.
      1.3.2   Bandymo sąlygos
      1.3.2.1   Bandymo gyvūnai
      Šiam bandymui pasirinkta gyvūnų rūšis – pelės. Naudojamos jaunos suaugusios CBA/Ca arba CBA/J veislės pelių patelės, kurios yra be vados ir neapvaisintos. Pradedant tyrimą, gyvūnų amžius turi būti 8-12 savaičių, o gyvūnų masės skirtumas turi būti kiek įmanoma mažesnis ir neviršyti 20 % vidutinės masės. Galima naudoti kitas veisles ir patinus, jei yra gauta pakankamai duomenų, kurie rodytų, kad nėra esminių veislei ir (arba) lyčiai būdingų reakcijos į LLNA skirtumų.
      1.3.2.2   Patikimumo tikrinimas
      Teigiamo poveikio kontrolinės gyvūnų grupės naudojamos siekiant parodyti bandymo tinkamumą ir laboratorijos kompetenciją sėkmingai atlikti bandymą. Teigiamo poveikio kontrolinių gyvūnų grupėms turi pasireikšti teigiama LLNA reakcija esant veikimo dozei, kuri turėtų užtikrinti jautrinimo rodiklio padidėjimą (SI) > 3 palyginti su neigiamo poveikio kontroline grupe. Teigiamo poveikio kontrolinė dozė pasirenkama taip, kad indukcija būtų aiški, bet ne per didelė. Tinkamiausios medžiagos yra heksilcinamono aldehidas (CAS Nr. 101-86-0, EINECS Nr. 202-983-3) ir merkaptobenztiazolas (CAS Nr. 149-30-4, EINECS Nr. 205-736-8). Gali pasitaikyti aplinkybės, kai pateikus pakankamai įrodymų galima naudoti kitas kontrolines medžiagas, atitinkančias pirmiau nurodytus kriterijus. Nors paprastai teigiamo poveikio kontrolinė grupė gali būti reikalinga darant kiekvieną tyrimą, gali būti situacijų, kai bandymų laboratorijos turės ankstesnius teigiamo poveikio kontrolinius duomenis, kurie leistų parodyti patenkinamos reakcijos pastovumą šešis mėnesius arba ilgesnį laikotarpį. Tokiais atvejais gali pakakti rečiau daromo teigiamo poveikio kontrolinio bandymo, esant ne didesniems kaip 6 mėnesių intervalams. Nors teigimo poveikio kontrolinė medžiaga turi būti bandoma nešiklyje, kuris būtų žinomas, kaip sukeliantis vienodą reakciją (pvz., acetonas, alyvuogių aliejus), gali būti reikalaujama bandyti naudojant netipinį nešiklį (klinikiniu arba cheminiu požiūriu atitinkantį mišinį). Tokiu atveju reikia patikrinti galimą teigiamo poveikio kontrolinės medžiagos ir tokio netipinio nešiklio sąveiką.
      1.3.2.3   Gyvūnų skaičius, dozės dydis ir nešiklio pasirinkimas
      Vienos dozės grupėje naudojami mažiausiai keturi gyvūnai, esant ne mažiau kaip trims bandomosios medžiagos koncentracijos vertėms, taip pat neigiamo poveikio kontrolinė grupė, paveikiama tik bandomosios medžiagos nešikliu, ir, prireikus, teigiamo poveikio kontrolinė grupė. Tais atvejais, kai reikia surinkti atskirų gyvūnų duomenis, vienos dozės grupėje turi būti ne mažiau kaip penki gyvūnai. Kontrolinių grupių gyvūnai prižiūrimi kaip ir medžiaga veikiamų grupių gyvūnai, išskyrus tai, kad jie negauna bandomosios medžiagos.
      Dozė ir nešiklis turi būti pasirenkami atsižvelgiant į rekomendacijas, pateiktas nuorodoje (1). Dozės pasirenkamos iš koncentracijos verčių eilutės 100 %, 50 %, 25 %,10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % ir t. t. Pasirenkant tris nuoseklias koncentracijos vertes, turėtų būti atsižvelgta į turimus ūmaus toksiškumo ir odos dirginimo duomenis, kad didžiausia koncentracija turėtų kiek įmanoma didesnį poveikį, bet būtų išvengta sisteminio toksiškumo ir per didelio vietinio odos dirginimo (2) (11).
      Nešiklis pasirenkamas taip, kad bandymo koncentracijos vertės ir tirpumas būtų kiek įmanoma didesni ir kad tirpalas ar suspensija tiktų bandomajai medžiagai uždėti. Pirmumo tvarka rekomenduojamas nešiklis yra acetonas arba alyvuogių aliejus (4:1 V/V), dimetilformamidas, metiletilketonas, propilenglikolis ir dimetilsulfoksidas (2) (10), tačiau galima naudoti kitus nešiklius, jei tai būtų tinkamai moksliškai pagrįsta. Tam tikrais atvejais papildomai kontrolei gali tekti naudoti klinikiniu požiūriu atitinkantį tirpiklį arba komercinį preparatą, turintį bandomosios medžiagos. Reikia ypač stengtis užtikrinti, kad į nešiklį būtų dedama hidrofilinių medžiagų, kurios drėkintų odą ir iš karto nenutekėtų. Taigi reikėtų vengti naudoti grynai vandeninius nešiklius.
      1.3.3   Bandymo eiga
      1.3.3.1   Bandymo planas
      Eksperimentinis tyrimo planas atrodo taip:
      
                   
               
               
                  
                     1 diena
                  
                  Atskirai nustatoma ir užrašoma kiekvieno gyvūno masė. Ant kiekvienos ausies išorinės pusės užlašinama 25 μ l atitinkamai atskiesto bandomosios medžiagos tirpalo, vien tik nešiklio arba teigiamo poveikio kontrolinės medžiagos (prireikus).
               
            
                   
               
               
                  
                     2 ir 3 dienos
                  
                  Kartojama 1 dieną daryta procedūra.
               
            
                   
               
               
                  
                     4 ir 5 dienos
                  
                  Bandomoji medžiaga nenaudojama.
               
            
                   
               
               
                  
                     6 diena
                  
                  Užrašoma kiekvieno gyvūno masė. Į visų pelių uodegos veną suleidžiama 250 μ l valgomosios druskos ir fosfatinio buferio tirpalo (PBS), turinčio 20 μCi (7,4e + 8 Bq) 3 H-metiltimidino. Galima suleisti 250 μL PBS, turinčio 2 μCi (7,4e + 7 Bq) 125I-joddeoksiuridino ir 10-5 mol/l fluordeoksiuridino.
                  Po penkių valandų gyvūnai nužudomi. Drenuojamieji ausų limfmazgiai išpjaunami iš kiekvienos ausies ir kiekvienos bandymo grupės išpjovos sudedamos į PBS (jungtinio apdorojimo grupės metodas); taikant kitą metodą, galima išpjauti atskirų gyvūnų limfmazgius ir kiekvieno gyvūno atskirai sudėti į PBS (atskiro gyvūnų apdorojimo metodas). Limfmazgių identifikavimo ir skrodimo aprašymą bei schemas galima rasti 10 nuorodos I priede.
               
            1.3.3.2   Ląstelių suspensijos ruošimas
      Ruošiama jungtinio apdorojimo grupių arba atskirų gyvūnų poros limfmazgių ląstelių suspensija (LNC), švelniai mechaniniškai susmulkinant per 200 μm nerūdijančio plieno tinklelį. Limfmazgių ląstelės du kartus plaunamos PBS pertekliumi ir 18 h nusodinamos 5 % trichloracto rūgšties (TCA) esant 4 oC (2). Nuosėdos vėl suspenduojamos 1 ml TCA ir suspensija supilama į scintiliacinius mėgintuvėlius, turinčius 10 ml scintiliacinio skysčio, kai reikia skaičiuoti H, arba tiesiai į mėgintuvėlius gama impulsams skaičiuoti, kai reikia nustatyti 125I.
      1.3.3.3   Ląstelių proliferacijos nustatymas (radioaktyviųjų junginių patekimas)
      
         3H-metiltimidino patekimas matuojamas skaičiuojant β scintiliacijas kaip skilimų skaičių per minutę (DPM). 125I-joddeoksiuridino patekimas matuojamas skaičiuojant 125I ir išreiškiamas kaip DPM. Atsižvelgiant į taikomą metodą, patekimas bus išreiškiamas DPM/apdorotai grupei (jungtinis metodas) arba DPM/gyvūnui (atskirų gyvūnų metodas).
      1.3.3.4   Stebėjimai
      1.3.3.4.1   Klinikiniai stebėjimai
      
      Gyvūnai kruopščiai apžiūrimi kartą per dieną bet kokiems klinikiniams požymiams (vietiniam dirginimui lašinimo vietoje arba sisteminiam toksiškumui) nustatyti. Visi pastebėjimai yra sistemingai registruojami apie kiekvieną atskirą gyvūną.
      1.3.3.4.2   Kūno masė
      
      Kaip nurodyta 1.3.3.1 skirsnyje, atskirai kiekvieno gyvūno masė nustatoma bandymo pradžioje ir po numatyto gyvūno nužudymo.
      1.3.4   Rezultatų apskaičiavimas
      Rezultatai išreiškiami kaip dirginimo rodiklis (Stimulation Index – SI). Taikant jungtinio apdorojimo metodą, SI gaunamas bendrą visos apdorotos grupės gautą radioaktyviųjų junginių patekimo dydį dalijant iš visai nešiklio kontrolinei grupei gauto patekimo dydžio; šis dalmuo yra vidutinė SI vertė. Taikant atskirų gyvūnų apdorojimo metodą, SI gaunamas dalijant kiekvienos bandomosios medžiagos grupės vidutinę DPM/gyvūnui vertę ir teigiamo poveikio kontrolinės grupės vidutinę DPM/gyvūnui vertę iš tirpiklio/nešiklio kontrolinės grupės vidutinės DPM/gyvūnui vertės. Taigi nešiklio kontrolinės grupės vidutinė SI vertė lygi 1.
      Jei SI apskaičiuoti taikomas atskiro gyvūno metodas, galima daryti statistinę duomenų analizę. Pasirinkdamas tinkamą statistinės analizės metodą, tyrėjas turi suvokti netolygios sklaidos ir kitų susijusių problemų galimybę, dėl to gali tekti duomenis transformuoti arba taikyti neparametrinę statistinę analizę. Tinkamas būdas duomenims interpretuoti – įvertinti visus atskirus duomenis, gautus tiriant apdorotos grupės ir kontrolinės grupės, kurioje naudojamas nešiklis, gyvūnus, ir iš šių duomenų gauti geriausiai atitinkančią dozės ir reakcijos santykio kreivę, atsižvelgiant į pasikliautinuosius rėžius (8) (12) (13). Tačiau tyrėjas turi būti pasiruošęs galimiems atskirų grupės gyvūnų reakcijos „riktams“, ir dėl to gali tekti taikyti kitą reakcijos matą (pvz., medianinę, bet ne vidutinę vertę) arba pašalinti riktą.
      Sprendžiant dėl teigiamos reakcijos, dirginimo rodiklis turi būti ≥ 3, kartu būtina atsižvelgti į dozės ir reakcijos santykį ir, jei tinka, statistinį reikšmingumą (3) (6) (8) (12) (14).
      Jei gauti rezultatai nėra visiškai aiškūs, reikėtų atsižvelgti į įvairias bandomosios medžiagos savybes, įskaitant tai, ar jos struktūra gimininga žinomų odą jautrinančių medžiagų struktūrai, ar ji sukelia per didelį odos dirginimą, ir pasireiškusio dozės ir reakcijos santykio tipą. Šie ir kiti klausimai yra išsamiai aptarti kitur (7).
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turi būti suvesti į lenteles, kuriose nurodomos vidutinės bei atskiros DPM vertės ir dirginimo rodikliai, taikomi kiekvienos dozės grupei (įskaitant nešiklio kontrolinę grupę).
      3.   ATASKAITOS RENGIMAS
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Ataskaitą turi sudaryti ši informacija:
      
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              identifikavimo duomenys (pvz., CAS numeris, jei yra; grynumas; žinomos priemaišos; siuntos numeris),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              fizikinė būsena ir fizikocheminės savybės (pvz., lakumas, stabilumas, tirpumas),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              jei mišinys, jo sudėtis ir komponentų procentinė dalis.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Nešiklis:
                  
                              —
                           
                           
                              identifikavimo duomenys [grynumas; koncentracija (jei tinka); naudojamas tūris],
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nešiklio pasirinkimo pagrindimas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandomo gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              naudota pelių veislė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūno mikrobiologinė būsena, jei žinoma,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius, amžius ir lytis.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie bandomosios medžiagos ruošimą ir dėjimą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dozės koncentracijos pasirinkimo pagrindimas, įskaitant intervalo nustatymo tyrimo rezultatus, jei tyrimas buvo daromas; naudotos nešiklio ir bandomosios medžiagos koncentracijos vertės, suminis dedamos medžiagos kiekis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą ar šaltinį, vandens šaltinį).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Patikimumo tikrinimas:
                  
                              —
                           
                           
                              paskutinės patikimumo patikros rezultatų santrauka, įskaitant informaciją apie medžiagą, koncentraciją ir naudojamą nešiklį,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lygiagrečiai ir (arba) anksčiau bandymo laboratorijoje gauti teigiamo ir neigiamo poveikio kontroliniai duomenys.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              atskirų gyvūnų masė dozės gavimo ir numatyto nužudymo dieną,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vidutinių DPM verčių (jungtinio apdorojimo metodas) ir atskirų verčių (atskiro apdorojimo metodas) lentelės, taikant abu metodus gautų verčių intervalas ir dirginimo rodikliai kiekvienos dozės grupei (įskaitant nešiklio kontrolinę grupę),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinė analizė, jei tinka,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toksiškumo atsiradimo laikas ir požymiai, įskaitant kiekvieno gyvūno odos dirginimą medžiagos uždėjimo vietoje, jei yra.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas:
                  
                              —
                           
                           
                              trumpas rezultatų, dozės ir reakcijos santykio analizės ir statistinės analizės, jei tinka, aiškinimas, padarant išvadą, ar bandomoji medžiaga turėtų būti laikoma odą jautrinančia medžiaga.
                           
                        
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology 30, p. 165–169.
               
            
                  2)
               
               
                  Kimber, I, Derman, R.J., Scholes E.W, and Basketter, D.A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, p. 13–31.
               
            
                  3)
               
               
                  Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, p. 563-79.
               
            
                  4)
               
               
                  Testing Method B.6.
               
            
                  5)
               
               
                  Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food and Chemical Toxicology, 34, p. 999–1002.
               
            
                  6)
               
               
                  Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E (1996). The local lymph node assay- A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, 985-997.
               
            
                  7)
               
               
                  Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, p. 327–33.
               
            
                  8)
               
               
                  Van Och, F.M.M, Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, p. 49–59.
               
            
                  9)
               
               
                  Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281-4.
               
            
                  10)
               
               
                  National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).
               
            
                  11)
               
               
                  Testing method B.4.
               
            
                  12)
               
               
                  Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W. Lees, D. Kimber, I. and Botham, P.A. (1993) Results with OECD recommended positive control sensitisers in the maximisation, Buehler and local lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, p. 63–67.
               
            
                  13)
               
               
                  Basketter D.A., Lea L.J., Dickens A., Briggs D., Pate I., Dearman R.J., Kimber I. (1999). A comparison of statistical approaches to the derivation of EC3 values from local lymph node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, p. 261–266.
               
            
                  14)
               
               
                  Basketter DA, Blaikie L, Derman RJ, Kimber I, Ryan CA, Gerberick GF, Harvey P, Evans P, White IR and Rycroft RTG (2000). Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis 42 , p. 344–48.
               
            B.43.   NEUROTOKSIŠKO POVEIKIO GRAUŽIKAMS TYRIMAS
      1.   METODAS
      Šis metodas atitinka OECD TG 424 (1997).
      Šis bandymo metodas buvo sukurtas gauti informacijai, kuri yra būtina norint patvirtinti arba papildomai apibūdinti galimą cheminių medžiagų neurotoksišką poveikį suaugusiems gyvūnams. Šį metodą galima derinti su egzistuojančiais bandymo metodais, darant kartotinės dozės toksiškumo tyrimus, arba daryti atskirą tyrimą. Rekomenduojama susipažinti su OECD neurotoksiškumo tyrimo strategijos ir metodų vadovu (1), kuris padėtų planuoti tyrimus, pagrįstus šiuo bandymo metodu. Šis vadovas yra ypač reikalingas, kai rengiamasi daryti šiame metode rekomenduotų įprastų stebėjimų ir bandymo metodikų pakeitimus. Vadovas buvo parengtas norint palengvinti kitų bandymo metodikų, taikytinų konkrečiomis aplinkybėmis, pasirinkimą.
      Šis metodas neskirtas įvertinti neurotoksišką poveikį vystymuisi.
      1.1   ĮVADAS
      Vertinant cheminių medžiagų toksiškumo savybes, svarbu atsižvelgti į neurotoksiško poveikio galimybę. Jau kartotinės dozės bandymų metode sisteminiam toksiškumui nustatyti vykdomi galimo neurotoksiškumo stebėjimai. Šis bandymo metodas gali būti taikomas planuojant tyrimą, kuris leistų gauti papildomos informacijos arba patvirtinti neurotoksišką poveikį, pastebėtą kartotinės dozės sisteminio toksiškumo tyrimuose. Tačiau nagrinėjant galimą tam tikrų cheminių medžiagų klasių neurotoksiškumą, gali būti prieita prie išvados, kad šios medžiagos galėtų būti tinkamiau įvertintos taikant šį metodą, kai neturima išankstinių duomenų apie galimą neurotoksiškumą, kurie būtų gauti vykdant kartotinės dozės sisteminio toksiškumo tyrimus. Tai galėtų būti, pvz.:
      
                  —
               
               
                  neurologinių požymių arba neuropatologinių pažeidimų stebėjimas, darant kitus nei kartotinės dozės sisteminio toksiškumo tyrimus; arba
               
            
                  —
               
               
                  struktūros panašumų buvimas arba kita informacija, kuri leistų medžiagas susieti su kitomis neurotoksiškomis medžiagomis.
               
            Be to, gali būti kitų pavyzdžių, kai galėtų tikti šis bandymų metodas; daugiau informacijos pateikiama nuorodoje (1).
      Šis metodas buvo kuriamas taip, kad jį būtų galima pritaikyti konkretiems poreikiams, norint patvirtinti specifinį cheminės medžiagos histopatologinį neurotoksiškumą ir jos neurotoksiškumą, veikiantį elgseną, be to, apibūdinti ir kiekybiškai įvertinti neurotoksiškąį poveikį.
      Anksčiau neurotoksiškumas buvo prilyginamas neuropatijai, esant neuropatologiniams pažeidimams arba neurologiniams funkcijų sutrikimams, pvz., konvulsijos, paralyžius arba drebulys. Nors neuropatija yra svarbus neurotoksiškumo pasireiškimas, dabar paaiškėjo, kad yra daug kitų toksiško poveikio nervų sistemai požymių (pvz., motorinės koordinacijos netekimas, jutimo trūkumai, mokymosi ir atminties sutrikimai), kurių galima nepastebėti darant neuropatologinius arba kitų tipų tyrimus.
      Šis neurotoksiškumo bandymo metodas skirtas nustatyti pagrindinį neurobihevioristinį ir neuropatologinį poveikį suaugusiems graužikams. Nors poveikis elgesiui gali rodyti neigiamą įtaką organizmui ir tuo atveju, kai morfologinių pakitimų nėra, ne visi elgesio pakitimai yra būdingi nervų sistemai. Taigi visus pastebėtus pakitimus reikėtų įvertinti kartu su susijusiais histopatologiniais, hematologiniais arba biocheminiais duomenimis ir kitų sisteminio toksiškumo tipų duomenimis. Šiam metodui numatytus bandymus neurotoksiškam poveikiui apibūdinti ir kiekybiškai įvertinti sudaro specifinės histopatologinio ir elgesio įvertinimo metodikos, kurias papildomai gali patvirtinti elektrofiziologiniai ir (arba) biocheminiai tyrimai (1)(2)(3)(4).
      Neurotoksiškos medžiagos gali veikti įvairias nervų sistemos vietas ir įvairiais veikimo mechanizmais. Kadangi joks vienas bandymų rinkinys negali išsamiai įvertinti visų medžiagų neurotoksiškumo, gali tekti taikyti kitus in vivo arba in vitro bandymus, atitinkančius pastebėtą arba numatomą neurotoksiškumo tipą.
      Be to, šis bandymo metodas gali būti taikomas atsižvelgiant į rekomendacijas, pateiktas OECD neurotoksiškumo tyrimo strategijos ir metodų vadove (1), siekiant parengti tyrimus, skirtus papildomai apibūdinti dozės ir reakcijos santykį arba padidinti jo kiekybinio įvertinimo jautrumą, kad būtų galima geriau įvertinti nesančio neigiamo poveikio lygį arba pateikti neginčijamų įrodymų apie žinomus arba spėjamus cheminės medžiagos keliamus pavojus. Pvz., galima parengti tyrimus neurotoksiškumo mechanizmui (-ams) identifikuoti ir įvertinti arba papildyti duomenis, kurie jau buvo gauti taikant bazines elgesio ir neuropatologinių stebėjimų metodikas. Darant tokius tyrimus nereikia pakartotinai gauti duomenų, kurie gaunami taikant šiame metode rekomenduotas etalonines metodikas, jei tokie duomenys jau yra ir nėra laikomi būtinais tyrimo rezultatams aiškinti.
      Šis neurotoksiškumo tyrimas, daromas atskirai arba kartu su kitais tyrimais, suteikia informacijos, kuri leidžia:
      
                  —
               
               
                  identifikuoti, ar nervų sistema yra visam laikui arba grįžtamai veikiama bandomąja chemine medžiaga;
               
            
                  —
               
               
                  papildomai apibūdinti nervų sistemos pakitimus, susijusius su cheminės medžiagos veikimu, ir suprasti veikiančio mechanizmo esmę;
               
            
                  —
               
               
                  nustatyti dozės ir reakcijos bei laiko ir reakcijos santykius, kad būtų galima įvertinti nesančio neigiamo poveikio lygį (kuris gali būti naudojamas nustatant cheminės medžiagos saugos kriterijus).
               
            Taikant šį bandymo metodą, bandomoji medžiaga duodama per burną. Kiti medžiagos davimo būdai (pvz., per odą arba įkvepiant) gali būti tinkamesni ir gali tekti keisti rekomenduojamas metodikas. Davimo būdo pasirinkimas priklauso nuo žmonių veikimo aplinkybių ir turimos informacijos apie toksikologiją ir kinetiką.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Neigiamas poveikis – bet koks su apdorojimu susijęs pakitimas palyginti su etalonu, mažinantis organizmo gebą išgyventi, daugintis arba prisitaikyti prie aplinkos.
      
         Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg) arba kaip pastovios koncentracijos pašare vertės (ppm).
      
         Dozavimas – bendrasis terminas dozei, jos davimo dažnumui ir trukmei apibūdinti.
      
         Neurotoksiškumas – nervų sistemos struktūros arba funkcijos neigiamas pakitimas dėl veikimo chemine, biologine arba fizikine medžiaga.
      
         Neurotoksiška medžiaga – bet kuri cheminė, biologinė arba fizikinė medžiaga, galinti sukelti neurotoksiškumą.
      
         NOAEL – nesančio neigiamo poveikio lygio santrumpa, ir tai yra didžiausia dozė, kai nėra su apdorojimu susieto neigiamo poveikio.
      1.3   BANDYMO METODO ESMĖ
      Bandomoji cheminė medžiaga duodama kelioms laboratorinių graužikų grupėms per burną, naudojant kelias dozės koncentracijos vertes. Paprastai tenka duoti kartotines dozes ir dozavimo režimas gali būti 28 parų, pusiau lėtinis (90 parų) arba lėtinis (1 metai arba ilgiau). Be to, šiam bandymo metodui parengtos metodikos gali būti taikomos darant ūmaus neurotoksiškumo tyrimą. Gyvūnai bandomi siekiant aptikti arba apibūdinti elgesio ir (arba) neurologines anomalijas. Kiekvienu stebėjimo laikotarpiu įvertinami įvairūs elgesio, kuriam neurotoksiškos medžiagos galėtų daryti įtaką, aspektai. Pasibaigus bandymui, kiekvienos grupės kiekvienos lyties gyvūnų pogrupio gyvūnams daroma perfuzija in situ ir ruošiami bei tiriami galvos bei stuburo smegenų ir periferiniai nervų preparatai.
      Kai daromas atskiras (stand-alone) tyrimas neurotoksiškumui aptikti arba neurotoksiškam poveikiui apibūdinti, kiekvienos grupės gyvūnai, kurie nebuvo panaudoti perfuzijai ir vėlesniam histopatologiniam tyrimui (žr. 1 lentelę), gali būti naudojami darant specialius elgesio tyrimo, neuropatologinius, neurocheminius arba elektrofiziologinius tyrimus, kuriais galima būtų papildyti duomenis, gautus darant šiame bandymo metode numatytus tipinius tyrimus (1). Šie papildomi tyrimai gali būti ypač naudingi, kai praktiniai stebėjimai arba numatomas poveikis rodo specifinį cheminės medžiagos neurotoksiškumo tipą arba veikiamą organą. Be to, likusieji gyvūnai gali būti naudojami darant vertinimus, kurie yra numatyti taikant graužikų kartotinės dozės toksiškumo tyrimų metodus.
      Kai šis bandymo metodas vykdomas kartu su kitais bandymo metodais, reikia turėti pakankamą gyvūnų skaičių norint vykdyti abiem tyrimams reikalingus stebėjimus.
      1.4   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.4.1   Gyvūnų rūšies pasirinkimas
      Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti kitas graužikų rūšis, jei toks naudojimas būtų pagrįstas. Paprastai naudojamos laboratorinės jaunų, suaugusių ir sveikų gyvūnų veislės. Patelės turi būti be vados ir neapvaisintos. Dozė paprastai pradedama duoti kiek įmanoma greičiau po atjunkymo, ir būtų gerai, kad gyvūnui būtų ne daugiau kaip šešios savaitės, tačiau bet kuriuo atveju anksčiau nei gyvūnas sulaukia devynių savaičių. Vis dėl to kai tyrimas daromas kartu su kitais tyrimais, šį amžiaus reikalavimą gali tekti keisti. Naudojamų gyvūnų masė ir vidutinė kiekvienos lyties masė tyrimo pradžioje neturi skirtis daugiau kaip ± 20 %. Kai prieš ilgalaikį tyrimą daromas trumpalaikis kartotinės dozės tyrimas, abiem tyrimams turi būti naudojami tos pačios veislės ir šaltinio gyvūnai.
      1.4.2   Laikymo ir šėrimo sąlygos
      Eksperimentinių gyvūnų patalpos temperatūra turėtų būti 22 oC (± 3 oC). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Reikia kiek įmanoma mažinti didelį su pertrūkiais triukšmą. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė tinkamai įmaišyti bandomąją medžiagą, duodant ją šiuo būdu. Gyvūnai narveliuose gali būti laikomi atskirai arba mažomis tos pačios lyties grupėmis.
      1.4.3   Gyvūnų ruošimas
      Sveiki ir jauni gyvūnai atsitiktinai suskirstomi į apdorojimo ir kontrolines grupes. Narveliai išdėstomi taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks galimas poveikis dėl narvelio vietos. Gyvūnai paženklinami, kad juos būtų įmanoma identifikuoti, ir laikomi narveliuose mažiausiai penkias (5) paras prieš tyrimo pradžią, kad galėtų priprasti prie laboratorinių sąlygų.
      1.4.4   Davimo būdas ir dozių ruošimas
      Taikant šį bandymo metodą, bandomoji medžiaga duodama per burną. Duoti per burną galima naudojant zondą, su pašaru, su geriamuoju vandeniu arba duodant kapsules. Galima naudoti kitus davimo būdus (pvz., per odą arba įkvepiant), bet tada gali tekti keisti rekomenduojamas metodikas. Davimo būdo pasirinkimas priklauso nuo poveikio žmonėms aplinkybių ir turimos informacijos apie toksikologiją ar kinetiką. Reikia pagrįsti davimo būdo pasirinkimą ir nurodyti dėl to daromus šio bandymo metodo procedūrų pakeitimus.
      Prireikus bandomoji medžiaga ištirpinama arba suspenduojama tinkamame nešiklyje. Rekomenduojama iš pradžių tirti galimybę naudoti vandeninį tirpalą ar suspensiją, vėliau tirpalą ar emulsiją aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet galimybę tirpinti kitame nešiklyje. Turi būti žinomos nešiklio toksiškumo savybės. Be to, reikėtų atsižvelgti į šias nešiklio charakteristikas: poveikį absorbcijai, pasiskirstymui, medžiagų apykaitai ir bandomosios medžiagos sulaikymui, dėl ko gali keistis bandomosios medžiagos cheminės savybės; poveikį maisto ar vandens suvartojimui arba gyvūnų įmitimui.
      1.5   DARBO EIGA
      1.5.1   Gyvūnų skaičius ir lytis
      Darant atskirą tyrimą kiekvienos dozės grupei ir kontrolinei grupei turi būti naudojama mažiausiai 20 gyvūnų (10 patelių ir 10 patinų) norint išsamiai įvertinti klinikinių ir funkcinių stebėjimų rezultatus. Baigus tyrimą mažiausiai penkiems patinams ir penkioms patelėms iš šių 10 patinų ir 10 patelių daroma perfuzija in situ ir jie naudojami išsamiam neurohistopatologiniam tyrimui. Tais atvejais, kai neurotoksiško poveikio požymiai pasireiškia tik ribotam tam tikros dozės grupės gyvūnų skaičiui, reikėtų numatyti šiuos gyvūnus įtraukti į pasirinktųjų perfuzijai gyvūnų skaičių. Kai tyrimas daromas kartu su kartotinės dozės toksiškumo tyrimu, abiejų tyrimų tikslams pasiekti turi būti naudojamas atitinkamas gyvūnų skaičius. Įvairiems tyrimų deriniams reikalingas mažiausias gyvūnų skaičius grupėje pateiktas 1 lentelėje. Jei numatomi tarpiniai nužudymai arba planuojama sudaryti grupes poveikio grįžtamumui, jo išsilaikymui arba po apdorojimo vėluojančiam toksiškam poveikiui stebėti, arba kai numatoma daryti papildomus stebėjimus, gyvūnų skaičius turėtų būti padidintas siekiant užtikrinti, kad būtų gyvūnų, reikalingų stebėjimams ir histopatologiniam tyrimui.
      1.5.2   Apdorotos ir kontrolinės grupės
      Paprastai turi būti naudojamos mažiausiai trijų dozių grupės ir kontrolinė grupė, tačiau, jei įvertinus kitus duomenis nelaukiama poveikio esant kartotinei 1 000 mg/kg kūno masės/parą dozei, galima daryti ribinį bandymą. Jei atitinkamų duomenų nėra, galima daryti intervalo nustatymo tyrimą, siekiant palengvinti naudojamos dozės pasirinkimo kelią. Kontrolinės grupės gyvūnai prižiūrimi kaip ir medžiagą gaunančių grupių gyvūnai, išskyrus tai, kad jie neapdorojami bandomąja medžiaga. Jei duodant bandomąją medžiagą naudojamas nešiklis, kontrolinė grupė turi gauti didžiausią naudojamą nešiklio tūrį.
      1.5.3   Patikimumo tikrinimas
      Tyrimą daranti laboratorija turi pateikti duomenis, įrodančius jos kompetenciją atlikti tyrimą ir naudojamų metodikų jautrumą. Tokie duomenys turi patvirtinti įrodymus dėl sugebėjimo rasti ir prireikus kiekybiškai įvertinti stebėti skirtų skirtingų parametrų pakitimus, pvz., autonominių požymių, jutiminio aktyvumo, grybšnio jėgos ir motorinio aktyvumo. Informacija apie chemines medžiagas, kurios sukelia įvairių tipų nerotoksišką poveikį ir kurios galėtų būti naudojamos kaip teigiamo poveikio kontrolinės medžiagos, pateikta 2–9 nuorodose. Galima naudoti anksčiau gautus duomenis, jei nebus keičiami esminiai bandymo metodikų aspektai. Rekomenduojama periodiškai atnaujinti anksčiau gautus duomenis. Kiekvieną kartą kai bandymus daranti laboratorija keičia kurį nors bandymo arba jo metodikų esminį elementą, reikėtų gauti naujų duomenų, kurie rodytų nekintamą metodikų jautrumą.
      1.5.4   Dozės pasirinkimas
      Dozės koncentracijos vertes reikėtų pasirinkti atsižvelgiant į visus anksčiau gautus toksiškumo ir kinetinius duomenis apie bandomąją medžiagą arba giminingas medžiagas. Didžiausia dozė turėtų būti pasirinkta siekiant sukelti neurotoksišką poveikį arba aiškų sisteminį toksišką poveikį. Vėliau turėtų būti pasirinkta mažėjanti dozės koncentracijos seka siekiant parodyti kiekvieną su dozės dydžiu susietą reakciją ir nesančio neigiamo poveikio lygį (NOAEL), atitinkantį mažiausią dozę. Iš esmės turėtų būti nustatyti tokių dozių dydžiai, kad būtų įmanoma atskirti pirminį toksišką poveikį nervų sistemai ir su sisteminiu toksiškumu susietą poveikį. Paprastai pakanka nuo dviejų iki trijų dozių intervalų, ir dažnai gerai būtų naudoti ketvirtą bandymo grupę, norint naudoti labai didelius intervalus tarp dozių (pvz., daugiklis didesnis kaip 10). Jei yra patikimų poveikio žmonėms duomenų, į tai irgi reikia atsižvelgti.
      1.5.5   Ribinis bandymas
      Jei darant bandymą pagal šiame tyrime aprašytas metodikas su viena mažiausiai 1 000 mg/kg kūno masės/parą doze neurotoksiškas poveikis nepastebimas arba jei toksiško poveikio nelaukiama, atsižvelgiant į turimus duomenis apie giminingos struktūros junginius, nėra nebūtina daryti visą tyrimą, naudojant tris dozių koncentracijas. Atsižvelgiant į laukiamą poveikį žmonėms gali tekti naudoti didesnes per burną duodamas ribinio bandymo dozės. Kalbant apie kitus davimo būdus, pvz., įkvėpimą arba veikimą per odą, bandomosios medžiagos fizikocheminės savybės dažnai gali apibrėžti didžiausią pasiekiamą veikimo koncentraciją. Darant ūmaus poveikio per burną tyrimą ribinio bandymo dozė turi būti mažiausiai 2 000 mg/kg.
      1.5.6   Dozių davimas
      Gyvūnai gauna bandomosios medžiagos dozę kasdien, septynias dienas per savaitę, ne trumpiau kaip 28 paras; penkių parų dozės režimas arba trumpesnė veikimo trukmė turi būti pagrįsti. Kai bandomoji medžiaga duodama per zondą, naudojamas skrandžio zondas arba tinkamas intubacinis vamzdelis. Didžiausias gyvūnui duodamas vienkartinis skysčio tūris priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės. Tačiau vandeninių tirpalų atveju galima duoti 2 ml/100 g kūno masės. Išskyrus dirginančias arba ėsdinančias medžiagas, kurios esant didesnei koncentracijai turi sunkesnį poveikį, bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas, keičiant koncentraciją taip, kad visų dozių tūris būtų pastovus.
      Jei medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, svarbu užtikrinti, kad naudojami bandomosios medžiagos kiekiai netrukdytų įprastai mitybai arba vandens pusiausvyrai. Kai bandomoji medžiaga duodama su pašaru, galima naudoti pastovią koncentraciją (ppm) arba pastovią dozę pagal gyvūno kūno masę; naudotas variantas turi būti nurodytas. Jei medžiaga duodama per zondą, dozė turėtų būti duodama kiekvieną dieną panašiu laiku ir reguliuojama pastoviam dozės ir gyvūno kūno masės santykiui užtikrinti. Jei prieš ilgalaikį tyrimą daromas kartotinės dozės tyrimas, darant abu tyrimus turi būti naudojamas panašus pašaras. Jei darant ūmaus toksiškumo tyrimus neįmanoma duoti vienkartinę dozę, ji gali būti duodama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.
      1.6   STEBĖJIMAI
      1.6.1   Stebėjimų ir bandymų dažnumas
      Darant kartotinės dozės tyrimus, stebėjimo laikotarpis turi atitikti dozavimo laikotarpį. Darant ūmaus toksiškumo tyrimus, stebima 14 parų po medžiagos davimo. Pagalbinių grupių gyvūnai, kurie negauna bandomosios medžiagos pasibaigus apdorojimo laikotarpiui, irgi turi būti stebimi tokį laikotarpį.
      Stebėjimai turi būti daromi pakankamu dažniu siekiant kiek įmanoma padidinti tikimybę aptikti bet kokį elgesio ir (arba) neurologines anomalijas. Reikėtų stebėti kasdien vienodu laiku, atsižvelgiant į didžiausio laukiamo poveikio pasireiškimo laiką po medžiagos davimo. Klinikinių stebėjimų ir funkcinių bandymų dažnis apibendrintas 2 lentelėje. Jei ankstesniuose tyrimuose gauti kinetiniai duomenys rodo, kad stebėjimų, bandymų arba stebėjimų po bandymų laikas turi būti kitas, reikėtų patvirtinti kitą laiko grafiką didžiausiam informacijos kiekiui gauti. Padaryti grafiko pakeitimai turi būti pagrįsti.
      1.6.1.1   Bendrosios sveikatos būklės ir gaištamumo ar liguistumo stebėjimas
      Visi gyvūnai turi būti bent kartą per dieną apžiūrėti jų sveikatos būklei nustatyti ir bent du kartus per dieną liguistumui ir gaištamumui nustatyti.
      1.6.1.2   Išsamūs klinikiniai stebėjimai
      Nuodugniai turi būti apžiūrimi visi šiam tikslui atrinkti gyvūnai (žr. 1 lentelę) – kartą prieš pirmą veikimą medžiaga (kad būtų galima daryti to paties gyvūno palyginimus) ir vėliau skirtingais intervalais, atsižvelgiant į tyrimo trukmę (žr. 2 lentelę). Pagalbinių sveikstančių gyvūnų grupių nuodugni klinikinė apžiūra turi būti daroma baigiantis pasveikimo laikotarpiui. Nuodugni klinikinė apžiūra daroma ne narvelyje, bet standartiškai įrengtoje vietoje. Stebėjimų rezultatai turi būti kruopščiai užrašyti, naudojant įvertinimo balais sistemas, kurias sudaro kiekvienos apžiūros matavimų kriterijai arba įvertinimo balais skalės. Bandymų laboratorija turi aiškiai apibrėžti taikomus kriterijus arba balų skales. Reikia stengtis užtikrinti, kad bandymo sąlygų skirtumai būtų kiek įmanoma mažesni (išskyrus pagal metodiką susietas su apdorojimu) irapžiūras darytų patyrę specialistai, kurie nežinotų apie faktinį apdorojimą.
      Rekomenduojama apžiūras daryti struktūriniu būdu, kai darant kiekvieną apžiūrą kiekvienam gyvūnui sistemingai taikomi aiškiai apibrėžti kriterijai (įskaitant normalaus „intervalo“ apibrėžimą). „Normalus intervalas“ turi būti tinkamai dokumentuojamas. Turi būti užrašyti visi pastebėti požymiai. Be to, visais įmanomais atvejais turi būti užrašytas pasireiškiančių požymių dydis. Klinikiniai stebėjimai turi apimti odos, kailio, akių, gleivinių, sekrecijų ir ekskrecijų dažnį ir autonominį aktyvumą (pvz., ašarojimą, drebulį, vyzdžių dydį, neįprastą kvėpavimą ir (arba) kvėpavimą per burną, visus neįprastus šlapinimosi arba tuštinimosi požymius, šlapimo išblukimą), tačiau neapsiriboti vien tuo.
      Turi būti pažymėta bet kokia neįprasta reakcija dėl kūno padėties, aktyvumo lygio (pvz., naudojimosi tipiniu plotu sumažėjimas arba padidėjimas) ir judesių koordinacijos. Užrašomi eisenos (pvz., krypuojanti eisena, ataksija), laikysenos (pvz., kuprojimasis) ir reakcijos į priežiūrą, apgyvendinimą arba kitus aplinkos dirgiklius pakitimai, taip pat kloninių arba toninių judesių, traukulių arba drebulio buvimas, stereotipinis elgesys (per dažnas kūno prisižiūrėjimas, neįprasti galvos judesiai, nuolatinis sukimasis ratu) arba keistas elgesys (pvz., kandžiojimasis arba per didelis laižymasis, savęs žalojimas, vaikščiojimas atbulomis, vokalizacija) arba agresija.
      1.6.1.3   Funkciniai bandymai
      Visiems šiam tikslui atrinktiems gyvūnams dar daromi į nuodugnius klinikinius stebėjimus panašūs funkciniai bandymai vieną kartą prieš paveikimą bandomąja medžiaga ir dažnai vėliau (žr. 1 lentelę). Be to, funkcinių bandymų dažnumas priklauso nuo tyrimo trukmės (žr. 2 lentelę). Be 2 lentelėje nustatytų stebėjimo laikotarpių, turėtų būti daromi funkciniai pagalbinių grupių sveikimo stebėjimai kiek įmanoma prieš pat numatytą nužudymą. Funkcinius bandymus turi sudaryti jutiminio aktyvumo bandymai įvairių dirgiklių atžvilgiu [pvz., garsinių, regėjimo ir proprioceptinių dirgiklių (5) (6) (7)], galūnių grybšnio jėgos įvertinimas (8) ir motorinio aktyvumo įvertinimas (9). Motorinis aktyvumas matuojamas naudojant mechanizuotą įtaisą, kuriuo galima nustatyti aktyvumo didėjimą ir mažėjimą. Jei naudojama kita apibrėžta sistemą, ji turi būti kiekybinio įvertinimo sistema ir turi būti įrodytas jos jautrumas ir patikimumas. Kiekvienas įtaisas tikrinamas siekiant užtikrinti jų patikimumą bėgant laikui ir įtaisų tarpusavio suderinamumą. Kitos metodikų detalės pateiktos atitinkamose nuorodose. Jei nėra duomenų (pvz., informacijos apie struktūros ir aktyvumo santykį, epidemiologinių duomenų, kitų toksikologinių tyrimų), kurie rodytų galimą neurotoksiškąį poveikį, reikėtų numatyti įtraukti labiau specializuotus jutiminės ir motorinės funkcijos arba mokymo ir atminties bandymus šiam poveikiui išsamiau ištirti. Daugiau informacijos apie specializuotus bandymus pateikta (1).
      Išimtiniais atvejais funkcinių bandymų su gyvūnais galima nedaryti, jei gyvūnams pasireiškia tokio laipsnio toksiškumo požymiai, koks labai trukdytų tyrimui. Sprendimas neįtraukti gyvūnų į funkcinį bandymą turi būti pagrįstas.
      1.6.2   Kūno masė ir pašaro ar vandens suvartojimas
      Jei tyrimai vyksta mažiau kaip 90 parų, visi gyvūnai turi būti sveriami mažiausiai kartą per savaitę, be to, mažiausiai kas savaitę matuojamas pašaro suvartojimas (vandens suvartojimas, kai bandomoji medžiaga duodama su vandeniu). Darant ilgalaikius tyrimus, visi gyvūnai sveriami mažiausiai kartą per savaitę pirmąsias 13 savaičių ir vėliau mažiausiai kas 4 savaites. Pašaro suvartojimas matuojamas (vandens suvartojimas, kai bandomoji medžiaga duodama su vandeniu) mažiausiai kartą per savaitę pirmąsias 13 savaičių ir vėliau maždaug kas tris mėnesius, išskyrus kai sveikatos būklė arba kūno masės kitimas reikalauja daryti kitaip.
      1.6.3   Oftalmologiniai tyrimai
      Jei tyrimas trunka ilgiau kaip 28 paras, prieš bandomosios medžiagos davimą ir pasibaigus tyrimui būtina ištirti visų gyvūnų arba bent vieno didelės dozės grupės ir kontrolinės grupės gyvūno akis, naudojant oftalmoskopą arba lygiavertį tinkamą prietaisą. Jei nustatomi akių pakitimai arba jei klinikiniai požymiai rodo oftalmologinio tyrimo būtinumą, turi būti ištirti visi gyvūnai. Darant ilgalaikius tyrimus, akys tiriamos po 13 savaičių. Oftalmologinių tyrimų daryti nebūtina, jei šie duomenys yra gauti darant kitus panašios trukmės ir panašaus dydžio dozių tyrimus.
      1.6.4   Hematologiniai ir klinikiniai biocheminiai tyrimai
      Kai neurotoksiškumo tyrimas daromas kartu su kartotinės dozės sisteminio toksiškumo tyrimu, hematologiniai tyrimai ir klinikiniai biocheminės analizės daromos taip, kaip nurodyta atitinkamame sisteminio toksiškumo tyrimo metode. öminius reikia imti taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks neurologinis poveikis elgesiui.
      1.6.5   Histopatologiniai tyrimai
      Turi būti planuojamas neuropatologinis tyrimas, siekiant papildyti ir išplėsti stebėjimų rezultatus, gautus tyrimo in vivo stadijoje. Mažiausiai 5 kiekvienos lyties ar grupės gyvūnai (žr. 1 lentelę ir kitą pastraipą) fiksuojami in situ, taikant visuotinai pripažintus perfuzijos ir fiksavimo metodus (žr. 3 nuorodos 5 skyrių ir 4 nuorodos 50 skyrių). Turi būti užrašyti visi pastebėti dideli pakitimai. Kai tyrimas daromas kaip atskiras tyrimas neutoksiškoms medžiagoms atrinkti arba neurotoksiškam poveikiui apibūdinti, likusieji gyvūnai gali būti panaudoti specifiniams neurologinio elgesio (10) (11), neuropatologiniams (10) (11) (12) (13), neurocheminiams (10) (11) (14) (15) arba elektrofiziologiniams tyrimams (10) (11) (16) (17), kurie gali papildyti čia aprašytas metodikas ir tyrimus, arba padidinti histopatologiniuose tyrimuose naudojamų gyvūnų skaičių. Šie papildomi tyrimai yra ypač naudingi, kai praktiniai stebėjimai arba numatomas poveikis rodo specifinį neurotoksiškumo tipą arba veikiamą organą (2) (3). Be to, likusieji gyvūnai gali būti panaudoti įprastiems patologiniams įvertinimams, kaip aprašyta kartotinių dozių tyrimų metode.
      Visi į parafiną įlieti audinio mėginiai dažomi įprastu būdu, pvz., hematoksilinu ir eozinu (H&E), ir daromas mikroskopinis tyrimas. Jei pasireiškia arba įtariami periferinės neuropatijos požymiai, tiriami į plastiką įlieti periferinių nervų audinio ėminiai. Be to, klinikiniai požymiai gali nurodyti papildomas tyrimo vietas arba poreikį naudoti specialias dažymo metodikas. Papildomos vietos, kurias reikėtų ištirti, aprašytos nuorodose (3) (4). Be to, konkretiems patologinių pakitimų tipams parodyti gali būti naudojami atitinkami specialūs dažai (18).
      Tipiniai centrinės ir periferinės nervų sistemos pjūviai tiriami histologiškai (žr. 3 nuorodos 5 skyrių ir 4 nuorodos 50 skyrių). Tiriamas vietas paprastai sudaro: priekinės smegenys, didžiųjų smegenų pusrutulių vidurys, įskaitant hipokampo pjūvį, viduriniosios smegenys, smegenėlės, tiltas, pailgosios smegenys, akis su regos nervu ir tinklaine, stuburo smegenys kaklo ir juosmens sustorėjimų vietose, užpakalinės nugaros smegenų šaknelės mazgai, užpakalinės ir priekinės nugaros smegenų šaknelės pluoštai, proksimalinis sėdmens nervas, proksimalinis blauzdikaulio nervas (prie kelio) ir blauzdikaulio nervo šakos į blauzdos raumenį. Daromas stuburo smegenų ir periferinių nervų skersinis arba įstrižas ir išilginis pjūvis. Reikia atkreipti dėmesį į nervų sistemos vaskuliarizaciją. Be to, turi būti tiriamas raumenų ėminys, visų pirma, blauzdos raumuo. Ypatingą dėmesį reikia kreipti į centrinės ir periferinės nervų sistemų vietas su ląsteline ir pluoštine struktūra, kurios yra žinomos kaip ypač veikiamos neurotoksiškomis medžiagomis.
      Informacija apie neuropatologinius pakitimus, paprastai atsirandančius dėl veikimo toksiškomis medžiagomis, pateikta nuorodose (3) (4). Rekomenduojamas audinio ėminių tyrimas etapais, kai iš pradžių lyginami didelės dozės ir kontrolinės grupės gyvūnų audinių pjūviai. Jei lyginant šias grupes neuropatologinių pakitimų nenustatoma, toliau analizuoti nereikia. Jei didelės dozės grupėje pastebimi neuropatologiniai pakitimai, reikia koduoti ir nuosekliai tirti visų galbūt paveiktų audinių ėminius, gautus tarpinės ir mažos dozės grupėms.
      Jei kokie nors neuropatologinių pakitimų įrodymai gaunami darant kokybinį tyrimą, daromas antras visų pakitimus turinčių nervų sistemos sričių tyrimas. Visų dozių grupių galimai paveiktų sričių pjūviai koduojami ir atsitiktinai paskiriami tirti, nenurodant kodo. Turi būti užrašytas kiekvieno pažeidimo dažnumas ir sunkumas. Įvertinus visas visų dozių grupių sritis, kodą galima atskleisti ir daroma statistinė analizė dozės ir reakcijos santykiui įvertinti. Turi būti aprašyti kiekvieno pažeidimo įvairaus sunkumo laipsnio pavyzdžiai.
      Neuropatologinių tyrimų rezultatai įvertinami atsižvelgiant į elgesio stebėjimus ir matavimus, be to, į duomenis, gautus darant ankstesnius ir lygiagrečius bandomosios medžiagos sisteminio toksiškumo tyrimus.
      2.   DUOMENYS
      2.1   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Pateikiami atskirų gyvūnų duomenys. Papildomai visi duomenys apibendrinami ir suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo arba kontrolinei grupei nurodomas gyvūnų skaičius, darant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių nužudytų gyvūnų skaičius, toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius, stebimų toksiškumo požymių aprašymas, įskaitant bet kokio toksiško poveikio pradžios laiką, trukmę, tipą ir sunkumą, pažeidimų turinčių gyvūnų skaičius, įskaitant pažeidimo (-ų) tipą ir sunkumą.
      2.2   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS
      Tyrimo rezultatai įvertinami kaip neuropatologinio poveikio ir poveikio elgesiui (be to, neurocheminio arba elektrofiziologinio poveikio, jei vykdomi papildomi tyrimai) dažnumas, sunkumas ir jų koreliacija ir bet koks kitas pastebimas neigiamas poveikis. Jei įmanoma, skaitmeniniai rezultatai įvertinami taikant tinkamą ir visuotinai priimtą statistinį metodą. Statistiniai metodai pasirenkami rengiant tyrimo planą.
      3.   ATASKAITOS RENGIMAS
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
      
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              fizinė būsena (įskaitant izomerizavimą, grynumą ir fizikochemines savybes),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identifikavimo duomenys.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Nešiklis (jei naudojamas):
                  
                              —
                           
                           
                              nešiklio pasirinkimo pagrindimas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandomi gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              naudota rūšis ir veislė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šaltinis, laikymo sąlygos, aklimatizavimas, maistas ir t. t.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie bandomosios medžiagos ar preparato ruošimą, jo dėjimą į maistą, gautą koncentraciją, preparato stabilumą ir vienalytiškumą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              duodamos dozės specifikacija, įskaitant išsamią informaciją apie apie nešiklį, duodamos medžiagos turį ir fizikinį pavidalą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos davimo būdo detalės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pasirinkto dozės dydžio pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              veikimo būdo ir trukmės pasirinkimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos koncentracijos pašare ar geriamajame vandenyje (ppm) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg kūno masės/parą), jei tinka,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie maisto ir vandens kokybę.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Stebėjimo ir bandymo metodikos:
                  
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie kiekvienos grupės gyvūnų atranką į pogrupį perfuzijai daryti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie vertinimo balais sistemas, įskaitant kiekvieno matavimo vykdant nuodugnius klinikinius stebėjimus kriterijus ir balų skales,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie funkcinius bandymus nustatant jutiminį aktyvumą įvairių dirgiklių atžvilgiu (pvz., garsinių, regėjimo ir proprioceptinių dirgiklių); galūnių grybšnio jėgos įvertinimo, motorinio aktyvumo įvertinimo (įskaitant išsamią informaciją apie aktyvumui nustatyti naudojamus automatizuotus įtaisus) ir kitos taikytos metodikos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie oftalmologinius tyrimus ir, jei tinka, hematologiniai tyrimai ir klinikinės biochemijos bandymai, nurodant atitinkamas etalonines vertes,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie specifinius elgesio, neuropatologinių, neurocheminių arba elektrofiziologinių tyrimų metodikas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              kūno masė ar kūno masės pokyčiai, įskaitant kūno masę nužudant,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              maisto ir vandens suvartojimas, jei tinka,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              reakcijos į toksinį poveikį duomenys pagal lytį ir dozės dydį, įskaitant toksiškumo požymius arba gaištamumą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nuoduginių klinikinių stebėjimų tipas, sunkumas ir trukmė (pradžios laikas ir vėlesnė eiga) (nurodyti grįžtamumą arba negrįžtamumą),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visų funkcinio bandymo rezultatų išsamus aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              skrodimo rezultatai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsamus visų turimų elgesio, neuropatologinių, neurocheminių arba elektrofiziologinių rezultatų aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              absorbcijos ir medžiagos apykaitos duomenys, jei yra,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinis rezultatų apdorojimas, jei daromas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas:
                  
                              —
                           
                           
                              informacija apie dozės ir reakcijos santykį,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ryšys su bet kokiu kitu toksišku poveikiu ir išvada apie bandomosios cheminės medžiagos neurotoksiškumą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nestebimo neigiamo poveikio lygis.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Išvados:
                  
                              —
                           
                           
                              prašoma pateikti bandomosios cheminės medžiagos bendrojo neurotoksiškumo įvertinimą.
                           
                        
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.
               
            
                  2)
               
               
                  Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.
               
            
                  3)
               
               
                  World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.
               
            
                  4)
               
               
                  Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.
               
            
                  5)
               
               
                  Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, p. 999–1003.
               
            
                  6)
               
               
                  Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, p. 691–704.
               
            
                  7)
               
               
                  Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, p. 267–283.
               
            
                  8)
               
               
                  Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, p. 233–236.
               
            
                  9)
               
               
                  Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, p. 599–609.
               
            
                  10)
               
               
                  Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.
               
            
                  11)
               
               
                  Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York.
               
            
                  12)
               
               
                  Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, p. 689–695.
               
            
                  13)
               
               
                  Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. (1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, p. 343–352.
               
            
                  14)
               
               
                  O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, p. 445–452.
               
            
                  15)
               
               
                  O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, p. 368–378.
               
            
                  16)
               
               
                  Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, p. 299–335.
               
            
                  17)
               
               
                  Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co.,. Baltimore/London, p. 726–742.
               
            
                  18)
               
               
                  Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.
               
            1 lentelė
      Mažiausias gyvūnų skaičius vienoje grupėje darant neurotoksiškumo tyrimą atskirai arba kartu su kitais tyrimais
      
                   
               
               
                  NEUROTOKSIŠKUMO TYRIMAS, DARYTAS KAIP:
               
            
                  atskiras tyrimas
               
               
                  tyrimas, daromas kartu su 28 parų tyrimu
               
               
                  tyrimas, daromas kartu su 90 parų tyrimu
               
               
                  tyrimas, daromas kartu su lėtinio toksiškumo tyrimu
               
            
                  Bendras gyvūnų skaičius grupėje
               
               
                  10 patinų ir 10 patelių
               
               
                  10 patinų ir 10 patelių
               
               
                  15 patinų ir 15 patelių
               
               
                  25 patinai ir 25 patelės
               
            
                  Gyvūnų, atrinktų funkciniam bandymui, įskaitant nuodugnius klinikinius stebėjimus, skaičius
               
               
                  10 patinų ir 10 patelių
               
               
                  10 patinų ir 10 patelių
               
               
                  10 patinų ir 10 patelių
               
               
                  10 patinų ir 10 patelių
               
            
                  Gyvūnų, atrinktų perfuzijai in situ ir neurohistopatologiniam tyrimui, skaičius
               
               
                  5 patinai ir 5 patelės
               
               
                  5 patinai ir 5 patelės
               
               
                  5 patinai ir 5 patelės
               
               
                  5 patinai ir 5 patelės
               
            
                  Gyvūnų, atrinktų kartotinės dozės/pusiau lėtinio/lėtinio toksiškumo stebėjimui, hematologiniam, klinikiniam biocheminiam, histopatologiniam ir t. t. tyrimui, kaip nurodyta atitinkamose rekomendacijose, skaičius
               
               
                   
               
               
                  5 patinai ir 5 patelės
               
               
                  10 patinų (10) ir 10 patelių (10)
                  
               
               
                  20 patinų (10) ir 20 patelių (10)
                  
               
            
                  Papildomi stebėjimai, jei reikia
               
               
                  5 patinai ir 5 patelės
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
         
      2 lentelė
      Klinikinių stebėjimų ir funkcinių bandymų dažnumas
      
                  Stebėjimų tipas
               
               
                  Tyrimo trukmė
               
            
                  ūmus
               
               
                  28 parų
               
               
                  90 parų
               
               
                  lėtinis
               
            
                  Visi gyvūnai
               
               
                  Bendroji sveikatos būklė
               
               
                  kasdien
               
               
                  kasdien
               
               
                  kasdien
               
               
                  kasdien
               
            
                  Gaištamumas/lig uistumas
               
               
                  du kartus per dieną
               
               
                  du kartus per dieną
               
               
                  du kartus per dieną
               
               
                  du kartus per dieną
               
            
                  Gyvūnai, atrinkti funkciniams stenėjimams
               
               
                  Nuodugnūs klinikiniai stebėjimai
               
               
                  
                              —
                           
                           
                              prieš pirmą veikimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              po 8 h nuo dozės davimo, didžiausio numatomo poeikio momentu
                           
                        
                              —
                           
                           
                              7 ir 14 parą po dozės davimo
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              prieš pirmą veikimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vėliau kartą per savaitę
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              prieš pirmą veikimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kartą per pirmą arba antrą savaitę po veikimo
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vėliau kas mėnesį
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              prieš pirmą veikimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kartą, pasibaigus pirmam mėnesiui po veikimo
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vėliau kas tris mėnesius
                           
                        
            
                  Funkciniai bandymai
               
               
                  
                              —
                           
                           
                              prieš pirmą veikimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              po 8 h nuo dozės davimo, didžiausio numatomo poeikio momentu
                           
                        
                              —
                           
                           
                              7 ir 14 parą po dozės davimo
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              prieš pirmą veikimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ketvirtą apdorojimo savaitę, kuo arčiau veikimo laikotarpio pabaigos
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              prieš pirmą veikimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kartą per pirmą arba antrą savaitę po veikimo
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vėliau kas mėnesį
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              prieš pirmą veikimą
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kartą, pasibaigus pirmam mėnesiui po veikimo
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vėliau kas tris mėnesius
                           
                        
            B.44.   SUGERTIS PER ODĄ. IN VIVO METODAS
      1.   METODAS
      Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 427 (2004).
      1.1   ĮVADAS
      Dauguma cheminių medžiagų veikia iš esmės per odą, o atliekant didesnę dalį toksikologinių tyrimų su laboratoriniais gyvūnais, medžiagos dozė duodama oraliniu būdu. Šioje rekomendacijoje aprašytas in vivo sugerties per odą tyrimas užtikrina sąsają, kuri yra būtina tyrimų per burną duomenims ekstrapoliuoti, kai daromi veikimo per odą saugos įvertinimai.
      Medžiaga prieš pasiekdama apytaką turi kirsti daug odos ląstelių sluoksnių. Daugelio medžiagų greitį lemia iš negyvų ląstelių sudarytas stratum corneum. Skvarba per odą priklauso nuo cheminės medžiagos lipofiliškumo ir epidermio išorinio sluoksnio storio, be to, nuo kitų veiksnių, pavyzdžiui, medžiagos molekulinės masės ir koncentracijos. Apskritai, žiurkių ir triušių oda yra pralaidesnė palyginti su žmogaus oda, o jūros kiaulyčių ir beždžionių odos pralaidumas yra panašesnis į žmogaus odos pralaidumą.
      Sugerties per odą matavimo metodai gali būti suskirstyti į dvi kategorijas; in vivo ir in vitro. In vivo metodu galima gauti naudingos informacijos apie įvairių laboratorinių rūšių sugertį per odą. Neseniai buvo sukurti in vitro metodai. Juose taikoma medžiagos pernaša per visą gyvūnų arba žmogaus odos sluoksnio storį arba jo dalį į indą su skysčiu. In vitro metodas yra aprašytas kaip atskiras bandymo metodas (1). Rekomenduojama naudotis OECD rekomendaciniu dokumentu dėl sugerties per odą tyrimų vykdymo (2), kuris padėtų pasirinkti konkrečiam atvejui tinkamiausią metodą, kadangi šiame dokumente pateikta daugiau detalių apie abiejų in vivo ir in vitro metodų tinkamumą.
      Šiame dokumente aprašytu in vivo metodu galima nustatyti bandomosios medžiagos skvarbą per odą į sisteminę dalį. Metodas yra plačiai taikomas daug metų (3) (4) (5) (6) (7). Nors daugeliu atveju gali tikti in vitro sugerties per odą tyrimai, būna atvejų, kai reikiamus duomenis galima gauti tik atliekant in vivo tyrimą.
      Prie in vivo metodo pranašumų reikėtų priskirti tai, kad jame naudojama fiziologiniu ir medžiagų apykaitos požiūriu vientisa sistema, naudojamos daugumai toksiškumo tyrimų įprastos rūšys, be to, metodą galima modifikuoti pritaikant jį kitoms rūšims. Trūkumai: gyvų gyvūnų naudojimas, būtinybė naudoti žymėtąsias medžiagas, kad rezultatai būtų patikimi, sunkumai nustatant ankstyvąjį sugerties tarpsnį ir tinkamiausios rūšies (žiurkės) bei žmogaus odos pralaidumo skirtumai. Gyvūnų oda paprastai yra pralaidesnė, todėl sugertis per žmogaus odą gali būti pervertinta (6) (8) (9). Šarminių (ardančių) medžiagų nereikėtų tirti su gyvais gyvūnais.
      1.2   SĄVOKOS
      
         Nesugertoji dozė – atitinka dozę, nuplaunamą po veikimo nuo odos paviršiaus, ir visą dozę, esančią ant nesandaraus apdangalo, įskaitant visą dozę, kuri, kaip įrodoma, išgaravo nuo odos paviršiaus veikimo laikotarpiu.
      
         Sugertoji dozė (in vivo) – sudaro šlapime, narvelio plovimo vandenyje, išmatose, iškvėptame ore (jei matuojamas), kraujyje, audiniuose (jei imami) ir likusioje kūno dalyje esanti dozė, pašalinus uždėjimo vietos odą.
      
         Sugeriamoji dozė – atitinka ant odos arba odoje po plovimo esančią dozę.
      1.3   BANDYMO METODO PRINCIPAS
      Vienos arba kelių tinkamo dydžio dozių bandomoji medžiaga, geriau žymėtoji, dedama ant nuskustos gyvūnų odos tokiu pavidalu, kuris atitiktų tipinį preparato naudojimą. Nustatytą laiką bandomasis preparatas laikomas ant odos, uždengtas tinkamu apdangalu (nesandariu, pusiau sandariu arba sandariu), kad būtų išvengta bandomojo preparato nurijimo. Pasibaigus veikimo laikui, apdangalas nuimamas, oda plaunama atitinkamu plovikliu, apdangalas bei plovimo medžiagos paliekamos analizei ir uždedamas naujas apdangalas. Gyvūnai prieš veikimą, veikimo metu ir jam pasibaigus laikomi atskiruose medžiagų apykaitai matuoti skirtuose narveliuose ir visą šį laiką analizei renkamos išskyros ir iškvėptas oras. Iškvėpto oro galima nerinkti, kai yra pakankamai informacijos, kad lakiųjų radioaktyviųjų apytakos produktų susidaro mažai arba jų nesusidaro. Kiekviename tyrime paprastai naudojamos kelios gyvūnų grupės, veikiamos bandomuoju preparatu. Viena grupė nužudoma pasibaigus veikimo laikotarpiui. Kitos grupės nužudomos vėliau pagal nustatytą laiko grafiką (2). Pasibaigus bandinių ėmimo laikui, nužudomi likusieji gyvūnai, analizei surenkamas kraujas, medžiagos uždėjimo vieta išpjaunama analizei atlikti, o kūnas analizuojamas bet kokiai neišsiskyrusiai medžiagai nustatyti. Bandiniai tiriami tinkamais būdais ir įvertinamas sugerties per odą laipsnis (6) (8) (9).
      1.4   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.4.1   Gyvūnų rūšies parinkimas
      Dažniausiai naudojama gyvūnų rūšis yra žiurkės, tačiau galima naudoti beplaukes veisles ir rūšis, kurių sugerties per odą greitis būtų panašūs į sugerties per žmogaus odą greitį (3) (6) (7) (8) (9). Naudojami gerai žinomų laboratorinių rūšių sveiki jauni subrendę vienos lyties (paprastai vyriškos) gyvūnai. Bandymo pradžioje kiekvieno gyvūno masė neturi nukrypti daugiau kaip 20 % nuo vidutinės masės. Pvz., tinka vyriškos lyties 200 – 250 g masės žiurkės, ypač tos, kurių masė atitinka viršutinę šio intervalo dalį.
      1.4.2   Gyvūnų skaičius ir lytis
      Kiekvienas bandomasis preparatas tam tikrą nustatytą laikotarpį bandomas su atskira bent keturių vienos lyties gyvūnų grupe. Kiekviena gyvūnų grupė nužudoma, praėjus skirtingam laiko tarpui, pvz., pasibaigus veikimo laikotarpiui (paprastai 6 arba 24 h) ir vėliau (pvz., po 48 ir 72 h). Jei yra duomenų, kad patinų ir patelių toksiškumas per odą labai skiriasi, pasirenkama jautresnė lytis. Jei tokių duomenų nėra, galima naudoti bet kurią lytį.
      1.4.3   Laikymo ir šėrimo sąlygos
      Patalpos, kurioje bandomi gyvūnai, temperatūra turi būti 22 oC (± 3 oC). Nors santykinis oro drėgnumas turėtų būti bent 30 % ir neviršyti 70 %, reikėtų siekti, kad drėgnumas būtų 50–60 %, išskyrus patalpos plovimo metu. Apšvietimas turi būti dirbtinis – pakaitomis 12 h šviesos ir 12 h tamsos. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, kurio kiekis, kaip ir geriamo vandens kiekis, neribojamas. Bandymo ir, patartina, aklimatizavimo laikotarpiu gyvūnai turėtų būti laikomi atskiruose medžiagų apytakai tirti skirtuose narveliuose. Kadangi išbarstytas pašaras ir išlaistytas vanduo iškreiptų rezultatus, tokia tikimybė turi būti kiek įmanoma sumažinta.
      1.4.4   Gyvūnų ruošimas
      Gyvūnai ženklinami, kad kiekvieną iš jų būtų įmanoma atskirai identifikuoti, ir prieš bandymo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai penkias paras, per kurias jie galėtų aklimatizuotis laboratorinėmis sąlygomis.
      Pasibaigus aklimatizavimui ir maždaug 24 h iki dozavimo nuskutama visų gyvūnų oda pečių ir nugaros srityje. Pažeistos odos ir sveikos odos pralaidumo savybės skiriasi, todėl reikia stengtis nenutrinti odos. Po nuskutimo ir likus maždaug 24 h iki medžiagos uždėjimo ant odos (žr. 1.4.7 skirsnį) odos paviršius nuskustame plote plaunamas acetonu odos riebalams pašalinti. Papildomai plauti muilu ir vandeniu nerekomenduojama, kadangi bet koks muilo likutis galėtų skatinti bandomosios medžiagos sugertį. Plotas turi būti pakankamai didelis, kad būtų įmanoma patikimai apskaičiuoti sugertą bandomosios medžiagos kiekį vienam cm2 odos, pageidautina ne mažesnis kaip 10 cm2. Tokį plotą įmanoma paruošti 200 – 250 g masės žiurkėms. Po paruošimo gyvūnai grąžinami į apykaitos matavimo narvelius.
      1.4.5   Bandomoji medžiaga
      Bandomoji medžiaga – objektas, kurio skvarbos charakteristikas reikia tirti. Geriausia būtų naudoti žymėtąją bandomąją medžiagą.
      1.4.6   Bandomasis preparatas
      Bandomosios medžiagos preparatas (pvz., grynas, skiestas arba bandomosios cheminės medžiagos turintis preparatas, kuris bus dedamas ant odos) turi atitikti preparatą (arba būti tikroviškas jo pakaitalas), kuriuo gali būti veikiami žmonės arba kitos galimos tikslinės rūšys. Visi nukrypimai nuo preparato naudojimo sąlygų turi būti pagrįsti. Prireikus bandomoji medžiaga tirpinama arba suspenduojama tinkamame tirpiklyje. Jei tirpiklis – ne vanduo, turi būti žinomos jo sugerties charakteristikos ir sąveika su bandomąja medžiaga.
      1.4.7   Uždėjimas ant odos
      Odos paviršiuje apibrėžiama tam tikro paviršiaus ploto vieta medžiagai uždėti. Tuomet toje vietoje tolygiai uždedamas žinomas bandomo preparato kiekis. Šis kiekis paprastai turėtų būti panašus į potencialiai žmonėms naudojamą kiekį, dažniausiai 1– 5 mg/cm2 kietosios medžiagos arba mažiau kaip 10 μl/cm2 skysčio. Visas kitas dozes reikia pagrįsti numatomomis naudojimo sąlygomis, tyrimo tikslais arba bandomojo preparato fizikinėmis charakteristikomis. Po uždėjimo apdorota vieta turi būti apsaugota nuo laižymo. Tipinio įtaiso pavyzdys pavaizduotas 1 paveiksle. Paprastai uždėjimo vieta apsaugoma nesandariu apdangalu (pvz., pralaidžiu nailono marlės apdangalu). Tačiau neribotų dozių taikymo atvejais uždėjimo vieta turėtų būti sandarinama. Jei dėl pusiau lakių medžiagų garavimo nepriimtinai sumažėja regeneravimo laipsnis (žr. dar 1.4.10 skirsnio pirmą pastraipą), garuojančią medžiagą būtina sugauti uždėjimo įtaisą dengiančiu medžio anglių filtru (žr.1 paveikslą). Svarbu, kad nei vienas įtaisas nekenktų odai, nesugertų bandomojo preparato ir nereaguotu su juo. Gyvūnai grąžinami atgal į atskirus medžiagų apykaitos matavimo narvelius, kad būtų galima toliau rinkti jų išskyras.
      1.4.8   Veikimo trukmė ir bandinių ėmimas
      Veikimo trukmė – laiko tarpas nuo bandomojo preparato uždėjimo iki jo pašalinimo nuplaunant odą. Veikimo trukmė turėtų būti tinkama (paprastai 6 arba 24 h), pagrįsta numatoma žmonių veikimo trukme. Pasibaigus veikimo laikotarpiui, gyvūnai laikomi medžiagų apykaitos matavimo narveliuose iki jie nužudomi pagal grafiką. Visą tyrimo laikotarpį gyvūnai turi būti reguliariai stebimi siekiant nustatyti toksiškumo požymius ir (arba) neįprastas reakcijas. Pasibaigus veikimo laikotarpiui, apdorotoji oda turi būti apžiūrima siekiant nustatyti matomus dirginimo požymius.
      Visą tyrimo laikotarpį turi būti įmanoma medžiagų apykaitos matavimo narveliuose atskirai rinkti susikaupiančius šlapimą ir išmatas. Be to, turi būti įmanoma rinkti 14C žymėtą anglies dioksidą ir lakiuosius 14C žymėtus anglies junginius, kurie turi būti analizuojami, jei susidaro didelis jų kiekis (> 5 %). Šlapimas, išmatos ir sugerčiai (pvz., 14C žymėto anglies dioksido ir lakiųjų 14C junginių) naudoti skysčiai turėtų būti renkami atskirai iš kiekvienos grupės kiekvienu mėginio ėmimo laiku. Jei yra pakankamai informacijos apie tai, kad lakiųjų apykaitos produktų susidaro mažai arba jie išvis nesusidaro, galima naudoti atvirus narvelius.
      Išmatos renkamos visą veikimo laikotarpį, iki 24 h nuo pradinio sąlyčio su oda ir vėliau kasdien iki eksperimento pabaigos. Nors paprastai pakanka trijų išmatų rinkimo laikotarpių, atsižvelgiant į numatytą bandomojo preparato paskirtį arba į turimus kinetinius duomenis, tyrimui gali būti numatyti tinkamesni arba papildomi laiko taškai.
      Pasibaigus veikimo laikotarpiui, apsauginis įtaisas nuimamas nuo kiekvieno gyvūno ir laikomas atskirai analizei. Visų gyvūnų apdorotoji oda turi būti plaunama bent tris kartus plovimo priemone, naudojant tinkamus tamponus. Reikia stengtis neužteršti kitų kūno dalių. Plovimo priemonė turi atitikti įprastą higienai naudojamą priemonę, pvz., naudojamas vandeninis muilo tirpalas. Galiausiai oda išdžiovinama. Visi tamponai ir plovimo vandenys turi būti paliekami analizei. Prieš grąžinant gyvūnus, kurie priklauso grupėms, laikomoms vėlesniems tyrimo etapams, į atskirus narvelius, ant jų apdorotos vietos uždedamas naujas jai apsaugoti skirtas apdangalas.
      1.4.9   Baigiamosios procedūros
      Atskiri kiekvienos grupės gyvūnai nužudomi pagal grafiką numatytu laiku, jų kraujas surenkamas analizei. Analizei nuimamas apsauginis įtaisas arba apdangalas. Atskirai analizei pašalinama oda preparato uždėjimo vietoje ir panaši dozės nepaveikta nuskustos odos dalis. Uždėjimo vieta gali būti dalijama į sluoksnius ir stratum corneum atskiriamas nuo apačioje esančio epidermio, siekiant gauti daugiau informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos pasiskirstymą. Šios medžiagos pasiskirstymas bėgant laikui nuo veikimo laikotarpio pabaigos turėtų suteikti duomenų apie tai, kaip bet kuri bandomoji medžiaga įsiskverbia į stratum corneum. Odos dalijimui palengvinti (po paskutinio odos plovimo ir gyvūno nužudymo) nuimami visi apsauginiai apdangalai. Žiurkės oda uždėjimo vietoje ir aplink ją esančios odos žiedas išpjaunamas ir prismeigiamas prie lentos. Lengvai spaudžiant ant odos paviršiaus uždedamas lipniosios juostos gabaliukas, kuris vėliau nuimamas kartu su stratum corneum dalimi. Kiti juostos gabaliukai dedami tol, kol juosta nustoja lipti prie odos paviršiaus, kai pašalinamas visas stratum corneum. Kiekvieno gyvūno visi juostų gabaliukai sudedami į vieną indą, į kurį pridedama audinio tirpinimo priemonės stratum corneum ištirpinti. Prieš pradedant analizuoti visą likusią kūno dalį jo sugertai dozei nustatyti, galima pašalinti visus paveiktus audinius atskiriems matavimams atlikti. Atskirų gyvūnų kūnai paliekami analizei. Paprastai pakanka nustatyti suminį kiekį. Gali būti pašalinti konkretūs organai atskirai analizei (jei to reikia kitiems tyrimams). Šlapimas, rastas pūslėje po nužudymo pagal grafiką, turi būti supilamas kartu su anksčiau surinktu šlapimu. Iš medžiagų apykaitos tyrimo narvelių surinkus išmatas po nužudymo pagal grafiką, narvelius ir jų gaudykles reikia išplauti atitinkamu tirpikliu. Panašiu būdu turi būti analizuojama kita potencialiai užteršta įranga.
      1.4.10   Analizė
      Visuose tyrimuose turi būti pasiektas atitinkamas regeneravimo laipsnis (t. y. vidutiniškai 100 ± 10 % radioaktyvumo). Turi būti pagrįsti šio intervalo neatitinkantys regeneravimo laipsniai. Duodamos dozės kiekis kiekviename mėginyje turi būti analizuojamas taikant patvirtintas procedūras.
      Į statistinę analizę turi būti įtrauktas kiekvieno medžiagos uždėjimo kartotinių bandymų dispersijos įvertinimas.
      2.   DUOMENYS
      Kiekvieną kartą imant bandomosios medžiagos ir (arba) apykaitos produktų mėginius, kiekvienam gyvūnui atliekami toliau išvardyti matavimai. Be atskirų duomenų reikia pateikti pagal mėginio ėmimo laiką sugrupuotas vidutines vertes.
      
                  —
               
               
                  kiekis, susijęs su apsauginėmis priemonėmis,
               
            
                  —
               
               
                  kiekis, kuris gali būti pašalintas nuo odos,
               
            
                  —
               
               
                  kiekis odoje (ant odos), kurio neįmanoma nuplauti nuo odos,
               
            
                  —
               
               
                  kiekis kraujo mėginyje,
               
            
                  —
               
               
                  kiekis išskyrose ir iškvėptame ore (jei matuojamas),
               
            
                  —
               
               
                  kiekis, likęs kūne ir visuose atskirai analizei pašalintuose organuose.
               
            Bandomosios medžiagos ir (arba) apykaitos produktų kiekis išskyrose, iškvėptame ore, kraujyje ir kūne leis nustatyti suminį sugertos medžiagos kiekį kiekvienu laiko momentu. Be to, galima apskaičiuoti bandomosios cheminės medžiagos kiekį, kuris įsigėrė veikimo laikotarpiu kiekviename cm2 bandomąja medžiaga veikiamos odos.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      3.1   BANDYMO ATASKAITA
      Į bandymo ataskaitą turi būti įtraukti protokole nustatyti reikalavimai, įskaitant naudotos sistemos pagrindimą, ir ją turi sudaryti šie punktai:
      
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              identifikavimo duomenys [pvz., CAS numeris, jei žinomas; šaltinis; grynumas (radiocheminis grynumas); žinomos priemaišos; siuntos numeris],
                           
                        
                              —
                           
                           
                              fizikinė būsena ir fizikocheminės savybės (pvz., pH, lakumas, tirpumas, stabilumas, molekulinė masė ir log Pov.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandomasis preparatas:
                  
                              —
                           
                           
                              sudėtis ir naudojimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomojo preparato detalės, uždedamas kiekis, koncentracija, tirpiklis, stabilumas ir vienalytiškumas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo gyvūnai:
                  
                              —
                           
                           
                              naudota rūšis/veislė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              skaičius, amžius ir lytis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              atskirų gyvūnų kūno masė bandymo pradžioje.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              bandomojo preparato uždėjimo detalės (uždėjimo vieta, mėginių ėmimo metodai, sandarus/nesandarus apdangalas, tūris, ekstrahavimas, aptikimas),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pašaro ir vandens kokybės detalės.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              visi toksiškumo požymiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sugerties duomenys (išreikšti kaip greitis, kiekis arba procentinė dalis), pateikiami lentelėse,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              suminiai per bandymą regeneruoti kiekiai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultatų interpretavimas, lyginimas su visais turimais bandomojo junginio sugerties per odą duomenimis.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Testing Method B.45. Skin Absorption: In vitro Method.
               
            
                  2)
               
               
                  OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.
               
            
                  3)
               
               
                  ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20.
               
            
                  4)
               
               
                  Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for Environmental Protection Agency Requirements. J. Am. Coll. Toxicol. 8(5), p. 829–835.
               
            
                  5)
               
               
                  Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.
               
            
                  6)
               
               
                  EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Applications. Exposure Assessment Group, Office of Health and Environmental Assessment.
               
            
                  7)
               
               
                  EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic Substances.
               
            
                  8)
               
               
                  Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R (1990) In vivo percutaneous absorption of fragrance ingredients in reshus monkeys and humans. Fd. Chem. Toxic. 28, p. 369–373.
               
            
                  9)
               
               
                  Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic compounds through the skin in man. J. Invest Dermatol. 54, p. 399–404.
               
            1 paveikslas
      Tipinio įtaiso, naudojamo uždėjimo ant odos vietai apibrėžti ir apsaugoti, atliekant in vivo sugerties per odą tyrimus, konstrukcijos pavyzdys
      
         
      B.45.   SUGERTIS PER ODĄ. IN VITRO METODAS
      1.   METODAS
      Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 428 (2004).
      1.1   ĮVADAS
      Šis metodas skirtas informacijai apie bandomosios medžiagos, uždėtos ant išpjautos odos, sugertį gauti. Jį galima derinti su sugerties per odą in vivo metodu (1) arba taikyti atskirai. Rekomenduojama naudotis OECD rekomendaciniu dokumentu dėl sugerties per odą tyrimų vykdymo (2), kuris padėtų planuoti šiuo metodu pagrįstus tyrimus. Rekomendacinis dokumentas yra parengtas siekiant padėti pasirinkti tinkamas in vitro procedūras, skirtas taikyti konkrečiomis aplinkybėmis, kad būtų galima užtikrinti šiuo metodu gautų rezultatų patikimumą.
      Metodai sugerčiai ir pernašai per odą matuoti gali būti suskirstyti į dvi kategorijas: in vivo ir in vitro. In vivo sugerties per odą metodai yra gerai žinomi ir farmakokinetinė informacija gaunama įvairioms gyvūnų rūšims. In vivo metodas yra atskirai aprašytas 1 nuorodoje. Be to, in vitro metodai daug metų yra naudojami sugerčiai per odą matuoti. Nors oficialūs šiame bandymo metode aprašytų in vitro metodų tinkamumo patvirtinimo tyrimai nebuvo atlikti, 1999 m. OECD ekspertai sutarė, kad yra pakankamas kiekis įvertintų duomenų in vitro metodui patvirtinti (3). Papildomų išsamių duomenų, kurie konkrečiai pagrįstų šį patvirtinimą, įskaitant didelį tiesioginių in vitro ir in vivo metodų palyginamųjų duomenų skaičių, pateikta rekomendaciniame dokumente (2). Yra keletas monografijų, kuriose ši tema apžvelgiama ir išsamiai pagrindžiamas in vitro metodas (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12). In vitro metodais matuojama cheminių medžiagų difuzija į odą ir per odą į indą su skysčiu, kai galima naudoti negyvą odą tik difuzijai matuoti arba naudoti ką tik paruoštą, medžiagų apykaitos požiūriu veiklią odą difuzijai per odą ir medžiagų apykaitai matuoti. Tokie metodai visų pirma imti taikyti kaip atrankos metodai lyginant skirtinguose preparatuose esančių cheminių medžiagų tiekimą į odą ir per odą, be to, juos galima taikyti kaip naudingus modelius sugerčiai per žmonių odą įvertinti.
      
         In vitro metodas gali tikti ne visuomet ir ne visoms cheminių medžiagų klasėms. Galbūt in vitro bandymo metodas tiktų pradiniam kokybiniam skverbties per odą įvertinimui. Tam tikrais atvejais gali tekti papildyti tyrimą in vivo duomenimis. Reikėtų ieškoti informacijos rekomendaciniame dokumente (2) toliau tikslinti aplinkybes, kuriomis tiktų in vitro metodas. Papildoma detali informacija sprendimui paremti pateikta (3).
      Šiame metode pateikti bendrieji principai, kaip matuoti cheminės medžiagos sugertį ir pernašą per išpjautą odą. Galima naudoti daugelio žinduolių rūšių odą, įskaitant žmonių. Odos pralaidumo savybės nepakinta išpjovus ją iš kūno, kadangi pagrindinis difuzijos užtvaras yra negyvas stratum corneum; aktyvi cheminių medžiagų pernaša per odą nėra nustatyta. Yra įrodyta, kad, vykstant sugerčiai per odą, oda gali dalyvauti kai kurių cheminių medžiagų apykaitoje (6), tačiau šis procesas neapriboja faktinės sugertos dozės įsiskverbimo greičio, nors jis gali turėti įtakos į kraujo apytaką patenkančios medžiagos savybėms.
      1.2   APIBRĖŽTYS
      
         Nesugertoji dozė – atitinka dozę, nuplaunamą po veikimo nuo odos paviršiaus, ir visą dozę, esančią ant nesandaraus apdangalo, įskaitant visą dozę, kuri, kaip įrodoma, išgaravo nuo odos paviršiaus veikimo laikotarpiu.
      
         Sugertoji dozė (in vitro) –
          bandomosios medžiagos, per apibrėžtą laikotarpį pasiekusios rinktuvo skystį arba didįjį kraujo apytakos ratą masė.
      
         Sugeriamoji dozė
         (in vitro) – atitinka dozę, po plovimo esančią ant odos arba odoje.
      1.3   BANDYMO METODO PRINCIPAS
      Bandomoji medžiaga, kurioje gali būti žymėtųjų atomų, uždedama ant odos bandinio, skiriančio dvi difuzijos kameros skyrius, paviršiaus. Esant apibrėžtoms sąlygoms cheminė medžiaga laikoma ant odos apibrėžtą laiką ir vėliau nuplaunama taikant atitinkamą plovimo procedūrą. Visą bandymą tam tikrais laiko tarpais imami rinktuvo skysčio mėginiai ir analizuojami cheminei medžiagai ir (arba) jos medžiagų apykaitos produktams nustatyti.
      Kai naudojamos medžiagų apykaitos požiūriu aktyvios sistemos, bandomosios cheminės medžiagos medžiagų apykaitos produktai gali būti analizuojami taikant atitinkamus metodus. Prireikus po bandymo kiekybiškai nustatomas bandomosios cheminės medžiagos ir jos medžiagų apykaitos produktų pasiskirstymas.
      Atitinkamomis sąlygomis, aprašytomis šiame metode ir rekomendaciniame dokumente (2), nustatytą laikotarpį matuojama bandomosios medžiagos sugertis, atliekant rinktuvo skysčio ir apdorotos odos analizę. Odoje likusi bandomoji medžiaga turi būti laikoma sugerta, išskyrus atvejus, kai galima įrodyti, kad sugertį galima nustatyti vien tik pagal rinktuvo skysčio vertes. Kitų sudėtinių dalių (nuo odos nuplautos ir odos sluoksnių viduje likusios medžiagos) analizė leidžia detaliau įvertinti duomenis, įskaitant bandomosios medžiagos pasiskirstymą ir regeneravimo laipsnį.
      Norint įrodyti tyrimų laboratorijoje naudojamos bandymo sistemos veikimą ir patikimumą, reikia turėti su atitinkamomis etaloninėmis medžiagomis gautus rezultatus, kurie atitiktų literatūroje paskelbtus taikomo metodo rezultatus. Šį reikalavimą galima įvykdyti lygiagrečiai bandant atitinkamą etaloninę medžiagą (geriau tokią, kurios lipofilinės savybės mažai skiriasi nuo bandomosios medžiagos savybių) ir bandomąją medžiagą arba gauti anksčiau sukauptus tinkamus duomenis apie kelias skirtingų lipofilinių savybių etalonines medžiagas (pvz., kofeiną, benzenkarboksirūgštį ir testosteroną).
      1.4   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.4.1   Difuzijos kameros
      Difuzijos kamerą sudaro tiektuvo ir rinktuvo skyriai, tarp kurių dedama oda (tipinės konstrukcijos pavyzdys pateiktas 1 paveiksle). Kameroje oda turi būti įtvirtinama sandariai, turi būti užtikrinamos tinkamos sąlygos su odos apačia susiliečiančio rinktuvo tirpalui maišyti, imti jo mėginius ir kontroliuoti kameros bei jos turinio temperatūrą. Tinka nepratekamojo ir pratekamojo tipo difuzijos kameros. Paprastai tiektuvo skyriai ne sandarinami, jei naudojama ribota bandomojo preparato dozė. Tačiau naudojant neribotas dozes ir pagal tam tikrus ribotų dozių naudojimo scenarijus tiektuvo skyriai gali būti sandarinami.
      1.4.2.   Rinktuvo skystis
      Pirmenybė teikiama fiziologiniu požiūriu palankiam rinktuvo skysčiui, nors galima naudoti ir kitus skysčius, jei jų naudojimas būtų pagrįstas. Turi būti pateikta tiksli rinktuvo skysčio sudėtis. Turi būti įrodyta, kad bandomosios cheminės medžiagos tirpumas rinktuvo skystyje yra pakankamas, todėl šis veiksnys nebus kliūtis sugerčiai. Be to, rinktuvo skystis neturi daryti įtakos odos preparato vientisumui. Pratekamojo tirpalo sistemoje srautas turi nesudaryti kliūčių bandomajai medžiagai patekti į rinktuvo skystį. Skystis nepratekamojo tipo kameroje turi būti nepertraukiamai maišomas ir reguliariai imami jo mėginiai. Jei tiriama medžiagų apykaita, rinktuvo skystis turi užtikrinti odos gyvybingumą visą bandymo laiką.
      1.4.3   Odos preparatai
      Galima naudoti žmonių arba gyvūnų odą. Pripažįstama, kad naudojant žmonių odą būtina atsižvelgti į nacionalinius ir tarptautinius etinius aspektus bei sąlygas. Nors labiau tinka gyva oda, galima naudoti negyvą oda, jei galima įrodyti, kad oda yra nepažeista. Tinka epiderminės membranos (atskirtos fermentiniu, šiluminiu arba cheminiu būdu) arba į sluoksnius padalyta oda (paprastai 200-400 μm storio), paruošta dermatomu. Galima naudoti viso storio odą, tačiau reikėtų vengti per didelio storio (ca. > 1 mm), išskyrus kai specialiai reikia nustatyti bandomąją cheminę medžiagą odos sluoksniuose. Turi būti pagrįstas rūšies pasirinkimas, anatominė vieta ir paruošimo metodas. Vienam bandomajam preparatui reikia pateikti bent keturių kartotinių bandymų priimtinus duomenis.
      1.4.4   ODOS PREPARATŲ VIENTISUMAS
      Svarbu tinkamai paruošti odą. Netinkamai ruošiant galima pažeisti stratum corneum, todėl turi būti tikrinamas paruoštos odos vientisumas. Kai tiriama odos medžiagų apykaita, ką tik išpjauta oda turi būti naudojama kuo greičiau ir esant sąlygoms, apie kurias būtų žinoma, kad jos užtikrina medžiagų apykaitos aktyvumą. Pagal bendrai priimtas taisykles ką tik išpjauta oda turi būti panaudota per 24 h, tačiau priimtinas laikymo laikotarpis gali skirtis, atsižvelgiant į medžiagų apykaitoje dalyvaujančių fermentų sistemą ir laikymo temperatūrą (13). Kai odos preparatai naudojami ne iš karto, turi būti pateikti duomenys, kurie rodytų barjerinės funkcijos išsaugojimą.
      1.4.5   Bandomoji medžiaga
      Bandomoji medžiaga – objektas, kurio skvarbos charakteristikas reikia tirti. Geriausia būtų naudoti žymėtąją bandomąją medžiagą.
      1.4.6   Bandomasis preparatas
      Bandomosios medžiagos preparatas (pvz., grynas, skiestas arba bandomąją cheminę medžiagą turintis preparatas, dedamas ant odos) turi atitikti (arba būti tikrovišku pakaitalu) preparatą, kuriuo gali būti veikiami žmonės arba kitos galimos tikslinės rūšys. Visi nukrypimai nuo preparato naudojimo sąlygų turi būti pagrįsti.
      1.4.7   Bandomųjų medžiagų koncentracijos vertės ir preparatai
      Paprastai naudojamos kelios bandomosios medžiagos koncentracijos vertės, į kurių diapazoną patenka viršutinės galimo žmonių veikimo vertės. Be to, reikėtų numatyti tipinės sudėties preparatų bandymą.
      1.4.8   Uždėjimas ant odos
      Paprastai, kai žmonės veikiami cheminėmis medžiagomis, šių medžiagų dozės yra ribotos. Todėl naudojamas kiekis paprastai turėtų kartoti galimą žmones veikiantį kiekį, dažniausiai 1 – 5 mg/cm2 kietosios medžiagos arba mažiau kaip 10 μl/cm2 skysčio. Kiekį reikia pagrįsti numatomomis naudojimo sąlygomis, tyrimo tikslais arba bandomojo preparato fizikinėmis charakteristikomis. Pvz., dedamas ant odos kiekis gali būti neribotas, jei ploto vienetui tenka dideli kiekiai.
      1.4.9   Temperatūra
      Temperatūra daro įtaką cheminių medžiagų pasyviajai difuzijai (taigi jų sugerčiai per odą). Difuzijos skyriaus ir odos temperatūra turi būti stabili ir maždaug atitikti kūno temperatūrą 32 ± 1 oC. Skirtingos konstrukcijos kameroms reikalinga nevienoda vandens vonios arba kaitinamo bloko temperatūra, siekiant užtikrinti, kad rinktuvo/odos temperatūra atitiktų fiziologinę normą. Pageidautina, kad santykinė drėgmė būtų 30-70 %
      1.4.10   Veikimo trukmė ir mėginių ėmimas
      Oda gali būti veikiama bandomuoju preparatu visą bandymo trukmę arba trumpiau (t. y. kartoti konkretų žmonių veikimo tipą). Bandomojo preparato perteklius nuplaunamas atitinkama plovimo priemone, o plovimo skysčiai surenkami analizei. Bandomojo preparato šalinimo procedūra priklausys nuo numatomų naudojimo sąlygų ir turi būti pagrįsta. Paprastai reikalingas 24 h mėginių ėmimo laikotarpis sugerties kreivei tinkamai apibūdinti. Kadangi odos vientisumas gali pradėti blogėti anksčiau nei po 24 h, mėginių ėmimo trukmė paprastai neturi būti didesnė kaip 24 h. Jei bandomosios medžiagos skverbiasi per odą greitai, ši sąlyga gali būti nereikalinga, tačiau lėtai prasiskverbiančias medžiagas gali tekti bandyti ilgiau. Rinktuvo skysčio mėginių ėmimo dažnumas turi būti toks, kad būtų įmanoma gauti bandomosios medžiagos sugerties kreivės grafinį vaizdą.
      1.4.11   Baigiamosios procedūros
      Turi būti analizuojami visi bandymo sistemos komponentai ir nustatytas regeneravimo laipsnis. Šiuos komponentus sudaro tiektuvo skyrius, odos paviršiaus plovimo skysčiai, odos preparatas ir rinktuvo skystis ir skyrius. Kai kuriais atvejais oda gali būti padalyta į medžiagos veikiamą odos plotą ir į odą po kameros junge, bei į stratum corneum, epidermį ir odą atskirai analizei atlikti.
      1.4.12   Analizė
      Visuose tyrimuose turi būti pasiektas atitinkamas regeneravimo laipsnis (t. y. reikėtų siekti 100 ± 10 % radioaktyvumo vidurkio, o nukrypimai turi būti pagrįsti). Bandomosios medžiagos kiekis rinktuvo skystyje, odos preparate, odos paviršiaus ir aparatūros plovimo skysčiuose turi būti nustatytas, taikant tinkamą metodą.
      2.   DUOMENYS
      Turi būti pateikta rinktuvo skysčio analizė, bandomosios cheminės medžiagos pasiskirstymas bandymo sistemoje ir sugerties kaip laiko funkcijos kreivė. Kai oda veikiama ribota doze, turi būti apskaičiuojamas nuo odos nuplautas kiekis, odoje likęs kiekis (ir skirtingose odos sluoksniuose, jei daroma analizė) ir rinktuvo skystyje esantis kiekis (greitis ir naudotos dozės kiekis arba procentinė dalis). Kartais sugertį per odą galima išreikšti naudojant tik apie rinktuvo skystį gautus duomenis. Tačiau, kai pasibaigus tyrimui bandomoji medžiaga lieka odoje, šį kiekį gali tekti įtraukti į suminį sugertos medžiagos kiekį (žr. 3 nuorodos 66 skirsnį). Kai oda veikiama neribota doze, duomenų gali pakakti skvarbos konstantai (Kp) apskaičiuoti. Esant šioms sąlygoms, absorbuotos medžiagos procentinė dalis nėra svarbi.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      3.1   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje turi būti pateikiami protokole nustatyti reikalavimai, įskaitant naudotos sistemos pagrindimą, ir joje turi būti nurodoma tokia informacija:
      
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              fizinė būsena, fizikocheminės savybės (bent molekulinė masė ir log Pov), grynumas (radiocheminis grynumas),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identifikavimo informacija (pvz., siuntos numeris),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tirpumas rinktuvo skystyje.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandomasis preparatas:
                  
                              —
                           
                           
                              sudėtis ir naudojimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vienalytiškumas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              odos šaltiniai ir vieta, paruošimo metodas, laikymo prieš bandymą sąlygos, bet koks pradinis apdorojimas (plovimas, apdorojimas antibiotikais ir t. t.), odos vientisumo matavimai, medžiagų apykaitos būsena, naudojimo pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kameros konstrukcija, rinktuvo skysčio sudėtis, rinktuvo skysčio srautas arba mėginių ėmimo laikas ir procedūros,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomojo preparato uždėjimo detalės ir naudotos dozės kiekybinis nustatymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              veikimo trukmė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie bandomojo preparato šalinimą nuo odos, pvz., odos plovimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami odos analizė ir visos taikytos odos dalijimo procedūros siekiant parodyti pasiskirstymą odoje,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kameros ir įrangos plovimo procedūros,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mėginių ėmimo metodai, ekstrahavimo metodai, aptikimo ribinės vertės ir analizės metodo tinkamumo patvirtinimas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              atliekant bandymą regeneruoti suminiai kiekiai (taikyta dozė = odos plovimo skysčiai + oda + rinktuvo skystis + kameros plovimo skysčiai),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              į lenteles surašyti regeneravimo atskirų kamerų kiekvienoje sekcijoje laipsniai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sugerties kreivė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lentelėse pateikti sugerties duomenys (išreikšti kaip sugerties greitis, kiekis arba procentinė dalis).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatų aptarimas.
               
            
                   
               
               
                  Išvados.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Testing Method B.44. Skin Absorption: In vivo Method.
               
            
                  2)
               
               
                  OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD. Paris.
               
            
                  3)
               
               
                  OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.
               
            
                  4)
               
               
                  Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for skin absorption. CRC Press, Boca Raton.
               
            
                  5)
               
               
                  Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Studies, in In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications, RL Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, p. 237–241.
               
            
                  6)
               
               
                  Bronaugh RL and Maibach HI. (1991). In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications. CRC Press, Boca Raton.
               
            
                  7)
               
               
                  European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussels.
               
            
                  8)
               
               
                  Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, Dupuis J, Loveli W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). Test Guidelines for In Vitro Assessment of Dermal Absorption and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, p. 191–205.
               
            
                  9)
               
               
                  Recommended Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.
               
            
                  10)
               
               
                  Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR et al. (1996). Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM Workshop Report ATLA 24, 81 R10.
               
            
                  11)
               
               
                  Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles of percutaneous absorption. Karger, Basel.
               
            
                  12)
               
               
                  Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.
               
            
                  13)
               
               
                  Jewell, C, Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. (2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74: p. 356–365.
               
            1 paveikslas
      Nepratekamojo tipo difuzijos kameros in vitro sugerties per odą tyrimams atlikti konstrukcijos pavyzdys
      
         
      
         (1)  Turi būti nurodyta ragenos drumsties sritis.
      
         (2)  Kai kuriems serumo ir plazmos tyrimams, ypač gliukozės, ypač svarbus gyvūnų badavimas iš vakaro. Maistą gaunant, neišvengiami rodiklių svyravimai, o tai apsunkina duomenų interpretavimą. Tačiau iš kitos pusės šis badavimas gali pakeisti gyvūnų bendrą medžiagų apykaitą, o mitybos tyrimuose tai ypač gali pakeisti tiriamosios medžiagos poveikį. Klinikiniai biocheminiai tyrimai turi būti atliekami tik ketvirtą tyrimų savaitę atlikus funkcinius stebėjimus.
      
         (3)  Būtų geriau, jei prieš imant kraują kai kuriems serumo ir plazmos parametrams, ypač gliukozei, nustatyti gyvūnai nebūtų naktį maitinami. Pagrindinė priežastis – šeriant neišvengiamai padidėja rezultatų sklaida, dėl to galėtų būti užslėpti mažiau pastebimi poveikiai ir todėl pasunkėtų rezultatų interpretavimas. Tačiau, kita vertus, badavimas per visą naktį gali turėti įtakos bendrajai gyvūnų medžiagų apykaitai ir sutrikdyti, ypač darant davimo su maistu tyrimus, kasdienį veikimą bandomąja medžiaga. Jei pasirenkamas gyvūnų badavimas per naktį, klinikiniai biocheminiai nustatymai turi būti daromi po tyrimo funkcinių stebėjimų.
      
         (4)  Dabar žinoma kaip serumo alaninamino transferazė.
      
         (5)  Dabar žinoma kaip serumo aspartamino transferazė.
      
         (6)  Šie organai, paimti iš 10 kiekvienos lyties ir visų grupių graužikų bei visų negraužikų, taip pat visų negraužikų skydliaukė (su prieskydine liauka) turėtų būti pasverti.
      
         (7)  šie organai, paimti iš 10 kiekvienos lyties ir visų grupių graužikų, turėtų būti pasverti.
      
         (8)  Šiame metode: etaloninė grupė – tokia grupė, kurioje tiriamosios medžiagos duodamos kitokiu būdu siekiant užtikrinti dozės biologinį tinkamumą.
      
         (9)  Tirpiklis, naudotas sugerčiai matuoti.
      
         (10)  
      
                  †
               
               
                  įskaitant penkis gyvūnus, atrinktus funkciniam bandymui ir nuodugniems klinikiniams stebėjimams, kurie yra neurotoksiškumo tytimo dalis
               
            
   
      C DALIS. EKOTOKSIŠKUMO NUSTATYMO METODAI
      TURINYS
      
                  C.1.
               
               ŪMUS TOKSIŠKUMO POVEIKIS ŽUVIMS
            
                  C.2.
               
               
                  DAPHNIA SP. ŪMAUS JUDRUMO SLOPINIMO (IMOBILIZAVIMO) BANDYMAS
            
                  C.3.
               
               DUMBLIŲ INHIB AVIMO BANDYMAS
            
                  C.4.
               
               „LENGVO“ BIOLOGINIO SKAIDOMUMO MATAVIMAS
            
                  I DALIS.
               
               BENDRIEJI KLAUSIMAI
            
                  II DALIS.
               
               DOC IŠNYKIMO BANDYMAS (C.4 – A METODAS)
            
                  III DALIS.
               
               MODIFIKUOTAS OECD ATRANKOS BANDYMAS (C.4 – B METODAS)
            
                  IV DALIS.
               
               C02 IŠSISKYRIMO BANDYMAS (C.4 – C METODAS)
            
                  V DALIS.
               
               MANOMETRINIS RESPIROMETRINIS BANDYMAS (C.4 – D METODAS)....
            
                  VI DALIS.
               
               UŽDAROSIOS KOLBOS BANDYMAS (C.4 – E METODAS)
            
                  VII DALIS.
               
               M.I.T.I. BANDYMAS (C.4 -F METODAS)
            
                  C.5
               
               SKAIDYMAS. BIOCHEMINIS DEGUONIES POREIKIS
            
                  C.6.
               
               SKAIDYMAS – CHEMINIS DEGUONIES POREIKIS
            
                  C.7.
               
               SKAIDYMAS. ABIOTINIS SKAIDYMAS. HIDROLIZĖ KAIP pH FUNKCIJOS NUSTATYMAS
            
                  C.8.
               
               TOKSIŠKUMO SLIEKAMS MATAVIMAS
            
                  C.9.
               
               BIOLOGINIS SKAIDYMAS – ZAHN-WELLENS BANDYMAS
            
                  C.10.
               
               BIOLOGINIS SKAIDYMAS – AKTYVIOJO DUMBLO MODELIAVIMO BANDYMAS
            
                  C.11.
               
               BIOLOGINIS SKAIDYMAS – AKTYVIOJO DUMBLO KVĖPAVIMO INHIBAVIMO BANDYMAS
            
                  C.12.
               
               BIOLOGINIS SKAIDYMAS – MODIFIKUOTAS SCAS BANDYMAS
            
                  C.13
               
               BIOLOGINIS KONCENTRAVIMAS: BANDYMAS SU ŽUVIMIS PRATEKĖJIMO SĄLYGOMIS
            
                  C.14.
               
               ŽUVŲ MAILIAUS AUGIMO BANDYMAS
            
                  C.15.
               
               ŽUVYS, TRUMPALAIKIS TOKSIŠKUMO EMBRIONUI IR MAILIUI SU TRYNIO MAIŠELIU BANDYMAS
            
                  C.16.
               
               NAMINĖS BITĖS – ŪMAUS ORALINIO TOKSIŠKUMO BANDYMAS
            
                  C.17.
               
               NAMINĖS BITĖS – ŪMAUS TOKSIŠKUMO DĖL SĄLYČIO BANDYMAS
            
                  C.18.
               
               ADSORBCIJA/DESORBCIJA TAIKANT ĮKROVOS PUSIAUSVYROS METODĄ
            
                  C.19.
               
               DIRVOŽEMIO IR NUOTEKŲ DUMBLO ADSORBCIJOS KOEFICIENTO (Koc) VERTINIMAS TAIKANT DIDELIO EFEKTYVUMO SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJĄ (HPLC)
            
                  C.20
               
               
                  DAPHNIA MAGNA REPRODUKCIJOS BANDYMAS
            
                  C.21.
               
               DIRVOŽEMIO MIKROORGANIZMAI. AZOTO VIRSMO BANDYMAS
            
                  C.22.
               
               DIRVOŽEMIO MIKROORGANIZMAI. ANGLIES VIRSMO BANDYMAS
            
                  C.23.
               
               AEROBINIS IR ANAEROBINIS VIRSMAS DIRVOŽEMYJE
            
                  C.24.
               
               AEROBINIS IR ANAEROBINIS VIRSMAS VANDENS TELKINIŲ DUGNO NUOSĖDŲ SISTEMOSE
            C.1.   ŪMUS TOKSIŠKUMO POVEIKIS ŽUVIMS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Šio metodo tikslas yra nustatyti medžiagos ūmų mirtiną toksiškumą žuvims gėlame vandenyje. Norint padėti pasirinkti tinkamiausią bandymo metodą (stacionarų, pusiau stacionarų arba pratekėjimo sąlygomis), kad visą bandymo laiką būtų užtikrinta pakankamai pastovi bandomosios medžiagos koncentracija, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, cheminį patvarumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą.
      Planuojant bandymą ir interpretuojant jo rezultatus, turi būti atsižvelgta į papildomą informaciją (pvz., struktūrinė formulė, grynumo laipsnis, reikšmingesnių priemaišų prigimtis ir procentinis kiekis, priedų buvimas ir jų kiekis, pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas).
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Ūmus toksiškumas yra stebimas neigiamas poveikis, sukeltas organizme per trumpą medžiagos veikimo laiką (paros). Šiame bandyme ūmus toksiškumas išreikiamas medianine mirtina koncentracija (LC50), – tai medžiagos koncentracija vandenyje, kai per nepertraukiamo veikimo laikotarpį, kuris turi būti nurodytas, žūsta 50 % bandyme naudotos partijos žuvų.
      Kiekviena bandomosios medžiagos koncentracija yra skaičiuojama mase tūrio vienetui (mg/litre). Ją dar galima išreikšti mase masės vienetui (mg/kg).
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymo sąlygomis bandyme naudotų rūšių atsakas žymiai nepakito, gali būti daromas bandymas su etalonine medžiaga.
      Šiam bandymui etaloninės medžiagos nėra apibrėžtos.
      1.4.   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Galima atlikti ribinį bandymą su 100 mg/litre koncentracija, norint parodyti, kad LC50 yra didesnė nei ši koncentracija.
      Žuvys 96 valandas veikiamos bandomąja medžiaga, įdėta į vandenį esant tam tikram koncentracijos verčių intervalui. Mirtingumo duomenys užrašomi bent kas 24 valandas, ir, jei įmanoma, kiekvienai stebėjimo laiko atkarpai skaičiuojama koncentracija, kuriai esant žūsta 50 % žuvų (LC50).
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Kokybės kriterijai turi būti taikomi ir ribinio bandymo metodui, ir viso bandymo metodui.
      Mirtingumas kontroliniuose bandymuose bandymo pabaigoje neturi būti didesnis kaip 10 % (arba viena žuvis, jei naudojama mažiau kaip dešimt žuvų).
      Ištirpusio deguonies koncentracija visą laiką turi būti didesnė kaip 60 % soties ore vertės.
      Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti laikoma 80 % pradinės koncentracijos vertės ribose.
      Medžiagų, kurios lengvai tirpsta bandomojoje terpėje ir kurių tirpalai patvarūs, t.y., kuriuose ištirpinta medžiaga žymiai negaruoja, nesuyra, nesihidrolizuoja arba neadsorbuojama, pradine koncentracija galima laikyti vardinę medžiagos koncentracija. Turi būti pateikti įrodymai, kad koncentracijos buvo išlaikytos per visą bandymą ir kad kokybės kriterijai buvo įvykdyti.
      Medžiagų, kurios:
      
                  i)
               
               
                  mažai tirpsta bandymo terpėje, arba
               
            
                  ii)
               
               
                  gali sudaryti patvarias emulsijas arba suspensijas, arba
               
            
                  iii)
               
               
                  yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose,
               
            pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija, nustatyta tirpale (ar, jei techniškai tai neįmanoma, išmatuota vandens tūryje) bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra, tačiau prieš bandymų žuvų dėjimą.
      Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti daromi tolimesni matavimai.
      pH vertė neturi keistis daugiau kaip 1 pH vienetu.
      1.6.   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      Galima naudoti trijų tipų metodiką:
      
         Bandymas stacionariomis sąlygomis:
      
      Toksiškumo bandymas, kai bandomasis tirpalas neteka. (Tirpalai visą bandymą yra tie patys).
      
         Bandymas pusiau stacionariomis sąlygomis:
      
      Bandymas, kai bandomasis tirpalas neteka, tačiau per ilgesnį laiko tarpą (pvz., kas 24 valandas) daromas reguliarus dozuojamasis bandomojo tirpalo atnaujinimas.
      
         Bandymas pratekėjimo sąlygomis:
      
      Toksiškumo bandymas, kai vanduo bandymo kamerose atnaujinamas visą laiką, bandomąją medžiagą tiekiant su vandeniu, naudojamu bandymo terpei atnaujinti.
      1.6.1.   Reagentai
      1.6.1.1.   Bandomųįų medžiagų tirpalai
      Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2.
      Pasirinktos bandymo koncentracijos tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Jei bandomos didelės koncentracijos, medžiaga gali būti ištirpinta praskiedimo vandenyje tiesiogiai.
      Paprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Norint kai kurioms medžiagoms (pvz., vandenyje mažai tirpioms medžiagoms, arba kurių didelis Pow, arba toms, kurios sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) užtikrinti galimybę pasiekti soties/pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui, ir t. t.).
      Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba norint pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, į pagalbą galima pasitelkti dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius arba dispergatorius. Kai naudojamos tokios pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis, ir papildoma kontrolinė žuvis turi būti veikiama pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti kuo mažesnė ir jokiu būdu neturi būti didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės.
      Bandymas turi būti daromas nereguliuojant pH vertės. Jei yra įrodymų apie žymų pH vertės kitimą, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HC1 ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti daromas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei reguliuojant pH vyksta kokia nors cheminė reakcija arba bandomoji medžiaga fiziškai iškrenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje.
      1.6.1.2.   Laikymo ir skiedimo vanduo
      Galima naudoti geriamojo vandens vandentiekio vandenį (neužterštą potencialiai kenksmingos koncentracijos chloru, sunkiaisiais metalais arba kitomis medžiagomis), geros kokybės gamtinį vandenį arba atkurtąjį vandenį (žr. 1 papildymą). Geriausiai tinka vanduo, kurio bendrasis kietumas yra nuo 10 iki 250 mg/litre (skaičiuojant CaCO3) ir kurio pH yra nuo 6,0 iki 8,5.
      1.6.2.   Aparatūra
      Visa aparatūra turi būti pagaminta iš chemiškai inertiškų medžiagų.
      
                  —
               
               
                  automatinio skiedimo sistema (bandymui pratekėjimo sąlygomis),
               
            
                  —
               
               
                  deguonies matuoklis,
               
            
                  —
               
               
                  įranga vandens kietumui nustatyti,
               
            
                  —
               
               
                  atitinkama termostatavimo aparatūra,
               
            
                  —
               
               
                  pH-metras.
               
            1.6.3.   Bandymų žuvys
      Žuvys turi būti sveikos ir neturėti jokių matomų nenormalumo požymių.
      Žuvų rūšį reikia rinktis remiantis praktiniais kriterijais, pvz., lengvumas žuvis gauti ištisus metus ir lengvumas jas prižiūrėti, patogumas bandyti, santykinis jautrumas cheminėms medžiagoms, bei kiek nors susijusiais ekonominiais, biologiniais arba ekologiniais faktoriais. Be to, renkantis žuvų rūšis, reikia nepamiršti apie gautų duomenų palyginamumo būtinybę ir esamą tarptautinį derinimą (1 nuoroda).
      Žuvų, kurios rekomenduojamos naudoti šiame bandyme, sąrašas pateiktas 2 papildyme; tinkamiausios rūšys yra dryžuotasis danio ir margasis upėtakis.
      1.6.3.1.   Laikymas
      Geriausia, jei bandymų žuvys būtų vienos veislės ir panašaus ilgio bei amžiaus. Žuvys turi būti laikomos bent 12 parų tokiomis sąlygomis:
      
         įkrova:
      
      atitinkanti sistemą (su recirkuliavimu arba su pratekėjimu) ir žuvų rūšį,
      
         vanduo:
      
      žr. 1.6.1.2,
      
         šviesa:
      
      kasdienis apšvietimas nuo 12 iki 16 valandų,
      
         ištirpusio deguonies koncentracija:
      
      bent 80 % soties ore vertės,
      
         maitinimas:
      
      tris kartus per savaitę arba kas dieną, nutraukiant maitinimą prieš 24 valandas iki bandymo pradžios.
      1.6.3.2.   Mirtingumas
      Po 48 valandų stabilizavimo laikotarpio, užrašomi mirtingumo duomenys ir taikomi tokie kriterijai:
      
                  —
               
               
                  populiacijos mirtingumas per septynias paras didesnis kaip 10 %:
                  visa partija atmetama,
               
            
                  —
               
               
                  populiacijos mirtingumas 5–10 %:
                  laikoma dar septynias paras.
                  Jei mirtingumas nedidėja, partija priimama, priešingu atveju turi būti atmesta,
               
            
                  —
               
               
                  populiacijos mirtingumas mažesnis kaip 5 %:
                  partija priimama.
               
            1.6.4.   Adaptavimas
      Prieš tai kaip naudoti, visas žuvis bent septynias paras būtina laikyti vandenyje, kurio kokybė ir temperatūra atitinka bandymo sąlygas.
      1.6.5.   Bandymo eiga
      Norint gauti informacijos apie koncentracijų, kurias reikia naudoti pagrindiniame bandyme intervalą, prieš galutinį bandymą gali būti daromas intervalo nustatymo bandymas.
      Daromas vienas kontrolinis bandymas be bandomosios medžiagos ir, jei tinka, bandymų serija papildoma dar vienu kontroliniu bandymu, kuriame naudojama pagalbinė medžiaga.
      Pagal tai, kokios yra bandomosios medžiagos fizikines ir chemines savybes, turi būti pasirinktas bandymas stacionariomis, pusiau stacionariomis arba pratekėjimo sąlygomis, kad būtų įvykdyti kokybės kriterijai.
      Žuvys veikiamos medžiaga, kaip tai aprašyta toliau:
      
                  —
               
               
                  trukmė: 96 valandos,
               
            
                  —
               
               
                  gyvūnų skaičius: bent 7 vienai koncentracijai,
               
            
                  —
               
               
                  rezervuarai: tinkamo tūrio, atsižvelgiant į rekomenduotą įkrovą,
               
            
                  —
               
               
                  įkrova: didžiausia rekomenduota bandymo stacionariomis ir pusiau stacionariomis sąlygomis įkrova – 1 g/litre; sistemoms su pratekėjimu priimtina didesnė įkrova,
               
            
                  —
               
               
                  bandomoji koncentracija: bent penkios koncentracijos, kurios skiriasi pastoviu faktoriumi, ne didesniu kaip 2,2, bei kiek įmanoma apima mirtingumo intervalą nuo 0 iki 100 %,
               
            
                  —
               
               
                  vanduo: žr. 1.6.1.2,
               
            
                  —
               
               
                  šviesa: kasdienis apšvietimas, kurio trukmė nuo 12 iki 16 valandų,
               
            
                  —
               
               
                  temperatūra: tinkama rūšiai (2 priedėlis), tačiau konkrečiame bandyme palaikoma ±1 o C tikslumu,
               
            
                  —
               
               
                  ištirpusio deguonies koncentracija: ne mažesnė kaip 60 % soties ore vertės pasirinktos temperatūros sąlygomis,
               
            
                  —
               
               
                  maitinimas: jokio.
               
            Žuvys tikrinamos iš pradžių po 2–4 valandų, po to – bent kas 24 valandas. Žuvis laikoma negyva, jei liečiant uodeginį stiebelį (caudal peduncle) nėra jokios reakcijos ir jei nesimato jokių kvėpavimo judesių. Po apžiūros negyvos žuvys pašalinamos ir užrašomas negyvų žuvų skaičius. Užrašomi pastebimi nenormalumai (pvz., pusiausvyros netekimas, plaukimo manieros, kvėpavimo funkcijos, pigmentacijos pokyčiai ir t. t.).
      pH, ištirpęs deguonis ir temperatūra turi būti matuojami kasdieną.
      Ribinis bandymas
      Taikant šiame bandymo metode aprašytas metodikas, galima daryti ribinį bandymą su koncentracija 100 mg/litre, kai norima įrodyti, kad LC50 yra didesnė nei ši koncentracija.
      Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos bandymų vandenyje pasiekti negalima, ribinis bandymas turi būti daromas su koncentracija, lygia medžiagos tirpumui (arba su didžiausia koncentracija, kurioje susidaro patvari suspensija) naudojamoje terpėje (dar žr. 1.6.1.1 punktą).
      Ribinis bandymas turi būti daromas naudojant 7–10 žuvų, toks pat žuvų skaičius turi būti naudojamas kontroliniame (-iuose) bandyme (-uose). (Binominio skirstinio teorija sako, kad, jei bandyme su 10 žuvų mirtingumas yra nulinis, pasikliovimo tikimybė, kad LC50 yra didesnė nei ribiniame bandyme naudota koncentracija, yra 99,9 %. Mirtingumo nebuvimas, naudojant 7, 8 arba 9 žuvis, užtikrina bent 99 % pasikliovimo tikimybę, kad LC50 yra didesnė nei naudota koncentracija).
      Jei mirtingumo atvejai pasitaiko, turi būti daromas visas bandymas. Jei stebimi subletalūs padariniai, tai turi būti užrašyta ataskaitoje.
      2.   DUOMENYS IR VERTINIMAS
      Kiekvienam laikotarpiui, kuriam rezultatai buvo užrašyti (24, 48, 72 ir 96 valandos), logaritminiame tikimybiniame popieriuje braižykite mirtingumo, nustatyto kiekvienam rekomenduotam veikimo laikotarpiui, procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivę.
      Kai tai įmanoma, ir kiekvienam matavimo laikotarpiui reikia įvertinti LC50 ir pasikliovimo rėžius (p = 0,05), tam taikant standartines metodikas; šios vertės turi būti apvalinamos iki vieno ar, daugiausia, iki dviejų reikšmingų skaitmenų (apvalinimo iki dviejų skaitmenų pavyzdys: 170 vietoj 173,5; 0,13 vietoj 0,127; 1,2 vietoj 1,21).
      Tais atvejais, kai atsako procentinės vertės ir koncentracijos priklausomybės kreivės polinkis yra per status, kad būtų galima skaičiuoti LC50, pakanka grafinio šios vertės įverčio.
      Kai dviem gretimoms koncentracijoms, kurių santykis 2,2, gaunamos 0 ir 100 % mirtingumo vertės, šių dviejų verčių pakanka pažymėti intervalui, į kurį patenka LC50.
      Jei pastebėta, kad bandomosios medžiagos patvarumo arba homogeniškumo užtikrinti neįmanoma, tai turi būti pateikta ataskaitoje, o interpretuoti rezultatus reikia atsargiai.
      3.   ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  informacija apie bandymų žuvis (mokslinis pavadinimas, veislė, tiekėjas, bet koks išankstinis apdorojimas, dydis ir kiekvienai bandomajai koncentracijai naudotų žuvų skaičius),
               
            
                  —
               
               
                  skiedimo vandens šaltinis ir pagrindinės cheminės savybės (pH, kietumas, temperatūra),
               
            
                  —
               
               
                  mažai vandenyje tirpios medžiagos atveju, pradinio tirpalo ir bandomųjų tirpalų ruošimo metodas;
               
            
                  —
               
               
                  visų pagalbinių medžiagų koncentracija,
               
            
                  —
               
               
                  naudotų koncentracijų sąrašas ir visa turima informacija apie bandomosios medžiagos patvarumą naudotos koncentracijos bandomajame tirpale,
               
            
                  —
               
               
                  jei daroma cheminė analizė, taikyti metodai ir gauti rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  ribinio bandymo, jei jis buvo daromas, rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  taikytos bandymo metodikos pasirinkimo priežastys ir detalės (pvz., stacionariomis sąlygomis, pusiau stacionariomis sąlygomis, dozavimo srautas, pratekėjimo srautas, ar buvo naudojamas aeravimas, žuvų įkrovą ir t. t.),
               
            
                  —
               
               
                  bandymų įrangos aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  apšvietimo režimas,
               
            
                  —
               
               
                  ištirpusio deguonies koncentracija bandomuosiuose tirpaluose, jų pH vertė ir temperatūra kas 24 valandas,
               
            
                  —
               
               
                  įrodymas, kad kokybės kriterijai įvykdyti,
               
            
                  —
               
               
                  lentelė, kurioje kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui pateiktas bendras mirtingumas kiekvienai koncentracijai ir kontroliniame bandyme (ir kontroliniame bandyme su pagalbine medžiaga, jei reikia),
               
            
                  —
               
               
                  atsako procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivės grafikas bandymo pabaigoje,
               
            
                  —
               
               
                  jei įmanoma, LC50 vertes kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui (su 95 % pasikliovimo rėžiais),
               
            
                  —
               
               
                  statistinės metodikos, taikytos LC50 vertėms nustatyti,
               
            
                  —
               
               
                  gauti rezultatai, jei naudota etaloninė medžiaga,
               
            
                  —
               
               
                  didžiausia bandomoji koncentracija, kurią naudojant mirtingumas bandymo laikotarpiu yra nulinis,
               
            
                  —
               
               
                  mažiausia bandomoji koncentracija, bandymo laikotarpiu sukelianti 100 % mirtingumą.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.
               
            
                  2)
               
               
                  AFNOR-Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio -Static and Flow Through methods -NFT 90-303 June 1985.
               
            
                  3)
               
               
                  AFNOR- Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri -Static and Flow – Through methods -NFT 90-305 June 1985.
               
            
                  4)
               
               
                  ISO 7346/1, /2 and/3 -Water Quality -Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish {Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan -Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.
               
            
                  5)
               
               
                  Eidgenossisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden -Part II 1974.
               
            
                  6)
               
               
                  DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (11) und 1 (15).
               
            
                  7)
               
               
                  JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.
               
            
                  8)
               
               
                  NEN 6506- Water -Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.
               
            
                  9)
               
               
                  Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.
               
            
                  10)
               
               
                  Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.
               
            
                  11)
               
               
                  Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.
               
            
                  12)
               
               
                  Standard methods for the examination of water and wastewater, fourteen edition, APHA-AWW A-WPCF, 1975.
               
            
                  13)
               
               
                  Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicityof a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.
               
            
                  14)
               
               
                  Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grundlagen fur die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.
               
            
                  15)
               
               
                  Litchfield, J. T .and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm, tExp. Therap., 1949, vol. 96, 99.
               
            
                  16)
               
               
                  Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.
               
            
                  17)
               
               
                  Sprague, J .B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.
               
            
                  18)
               
               
                  Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32.
               
            
                  19)
               
               
                  Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.
               
            
                  20)
               
               
                  Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R.W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.
               
            
         1 Priedėlis
         Atkurtasis vanduo
         Skiedimui tinkamo vandens pavyzdys
         Visos cheminės medžiagos turi būti analiziškai grynos.
         Vanduo turi būti geros kokybės distiliuotas vanduo arba dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų mažesnis kaip 5μScm-1.
         Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių.
         Pradiniai tirpalai
         
                     CaCl2 × 2H2O (kalcio chloridas, dihidratas):
                     Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro.
                  
                  
                     11,76 g
                  
               
                     MgSO4 × 7H20 (magnio sulfatas, heptahidratas):
                     Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro.
                  
                  
                     4,93 g
                  
               
                     NaHCO3 (natrio hidrokarbonatas):
                     Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro.
                  
                  
                     2,59 g
                  
               
                     KCl (kalio chloridas):
                     Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro.
                  
                  
                     0,23 g
                  
               Atkurtasis skiedimo vanduo
         Sumaišykite 25 ml kiekvieno iš šių keturių tirpalų ir praskieskite vandeniu iki 1 litro.
         Aeruokite tol, kol ištirpusio deguonies koncentracija pasiekia soties ore lygį.
         pH turi būti 7,8 ± 0,2.
         Prireikus reguliuokite pH NaOH (natrio hidroksidu) arba HC1 (druskos rūgštimi).
         Taip paruoštą skiedimo vandenį padėkite į šalį 12 valandų, jo nereikia daugiau aeruoti.
         Ca ir Mg jonų koncentracijų suma šiame tirpale yra lygi 2,5 mmol/litre. Ca ir Mg jonų santykis lygus 4:1, o Na ir K jonų santykis lygus 10:1. Bendrasis šio tirpalo šarmingumas lygus 0,8 mmol/litre.
         Joks nukrypimas nuo skiedimo vandens ruošimo būdo neturi keisti vandens sudėties arba savybių.
      
      
         2 priedėlis
         Žuvų rūšys, rekomenduotos naudoti bandymuose
         
                     Rekomenduojamos rūšys
                  
                  
                     Rekomenduojamas bandymų temperatūros intervalas (o C)
                  
                  
                     Rekomenduojamas bandymų gyvūno bendras ilgis (cm)
                  
               
                     
                        Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) Hamilton-Buchanan) Dryžuotasis danio
                  
                  
                     nuo 20 iki 24
                  
                  
                     3,0 ± 0,5
                  
               
                     
                        Pimephalespromelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Rainė
                  
                  
                     nuo 20 iki 24
                  
                  
                     5,0 ± 2,5
                  
               
                     
                        Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758) Paprastasis karpis
                  
                  
                     nuo 20 iki 24
                  
                  
                     6,0 ± 2,0
                  
               
                     
                        Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) Cyprinodontidae (Tomminck and Schlege 1850) Red killifish
                  
                  
                     nuo 20 iki 24
                  
                  
                     3,0 ± 1,0
                  
               
                     
                        Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters 1859)Guppy
                  
                  
                     nuo 20 iki 24
                  
                  
                     3,0 ± 1,0
                  
               
                     
                        Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque Linneaus 1758) Bluegill
                  
                  
                     nuo 20 iki 24
                  
                  
                     5,0 ± 2,0
                  
               
                     
                        Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum 1988) Margasis upėtakis
                  
                  
                     nuo 12 iki 17
                  
                  
                     6,0 ± 2,0
                  
               
                     
                        Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus
                  
                  
                     nuo 20 iki 24
                  
                  
                     6,0 ± 2,0 1758) Golden Orfe
                  
               Rinkimas
         Lentelėje nurodytas žuvis lengva auginti ir (arba) jų galima gauti ištisus metus. Žuvis galima auginti ir veisti žuvų fermose arba laboratorijoje, ligų ir parazitų kontrolės sąlygomis, kad bandymų gyvūnai būtų sveiki ir būtų žinoma jų kilmė. Šių žuvų yra daugelyje pasaulio kraštų.
      
      
         3 priedėlis
         Koncentracijos pavyzdys: mirtingumo dalis procentais
         LC50 nustatymo pavyzdys, naudojant logaritminį-tikimybinį popierių
         
            
      
      C.2.   DAPHNIA SP. ŪMAUS JUDRUMO SLOPINIMO (IMOBILIZAVIMO) BANDYMAS
      1.   METODAS
      Šis ūmaus judrumo slopinimo bandymas atitinka OECD TG 202 (2004).
      1.1   ĮVADAS
      Šiame bandymo metode aprašomas ūmaus toksiškumo bandymas, skirtas įvertinti cheminių medžiagų poveikį dafnijoms. Kiek įmanoma buvo naudojami esami bandymo metodai (1)(2)(3).
      1.2   SĄVOKOS
      Šiame bandymo metode taikomos šios sąvokos:
      
                   
               
               
                  
                     EC
                     
                        50
                      – apskaičiuotoji koncentracija, kuriai esant 50 % dafnijų nustoja judėti per nustatytą veikimo laikotarpį. Jei vartojama kita apibrėžtis, ji ir jos nuoroda turi būti pateiktos ataskaitoje.
               
            
                   
               
               
                  
                     Judrumo slopinimas (imobilizavimas) – imobilizuotais laikomi tie gyvūnai, kurie negali plaukti, praėjus 15 s nuo švelnaus bandymų indo purtymo (net jei jie vis dar gali judinti čiulptukus).
               
            1.3   BANDYMO METODO PRINCIPAS
      Jaunos dafnijos, kurių amžius bandymo pradžioje mažesnis kaip 24 h, 48 h veikiamos įvairios koncentracijos bandomąja medžiaga. Judrumo slopinimo duomenys užrašomi po 24 h bei 48 h ir lyginami su kontrolinėmis vertėmis. Rezultatai analizuojami po 48 h siekiant apskaičiuoti EC50 (apibrėžtys pateiktos 1.2 skirsnyje). Papildomai galima nustatyti EC50 po 24 h.
      1.4   INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGA
      Turėtų būti žinomas bandomosios medžiagos tirpumas vandenyje ir garų slėgis, be to, reikėtų turėti patikimą analizės metodą medžiagos kiekiui bandomuosiuose tirpaluose nustatyti, kurio regeneravimo laipsnis ir nustatymo riba būtų žinomi. Naudinga žinoti medžiagos struktūrinę formulę, grynumą, patvarumą vandenyje arba veikiant šviesai, Pow ir lengvo biologinio skaidumo bandymo rezultatus (žr. C.4 metodą).
      Pastaba. Nurodymai, kaip bandyti medžiagas, kurių fizikocheminės savybės apsunkina jų tyrimą, pateikti (4).
      1.5   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Siekiant įsitikinti, kad bandymo sąlygos yra patikimos, galima atlikti bandymus etaloninės medžiagos EC50 nustatyti. Šiam tikslui rekomenduojama naudoti tarplaboratoriniuose tyrimuose naudotas toksines medžiagas (1)(5) (1). Bandymą (-us) su etalonine medžiaga būtų gerai kartoti kas mėnesį, bet ne rečiau kaip du kartus per metus.
      1.6   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Bandymas yra tinkamas, jei laikomasi šių kriterijų:
      
                  —
               
               
                  kontroliniuose ėminiuose, įskaitant ėminius, turinčius tirpinimo priemonę, imobilizuota ne daugiau kaip 10 % dafnijų;
               
            
                  —
               
               
                  pasibaigus bandymui, ištirpusio deguonies koncentracija kontroliniuose ir bandymo induose turėtų būti > 3 mg/l.
               
            Pastaba. Kalbant apie pirmą kriterijų, judrumo slopinimas arba kiti ligos arba įtampos požymiai, pvz., spalvos kitimas, neįprastas elgesys, pvz., iškilimas į vandens paviršių, turėtų pasireikšti ne daugiau kaip 10 % kontrolinių dafnijų.
      1.7   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.7.1   Aparatūra
      Bandymo indai ir kiti prietaisai, kurie liečiasi su bandomaisiais tirpalais, turi būti pagaminti vien tik iš stiklo arba kitos chemiškai inertinės medžiagos. Bandymui paprastai naudojami stikliniai mėgintuvėliai arba stiklinės; prieš kiekvieną naudojimą jos turėtų būti plaunamos taikant įprastas laboratorijos procedūras. Bandymo indai nesandariai uždaromi, kad būtų sumažinti vandens nuostoliai dėl garavimo ir dulkės nepatektų į tirpalus. Lakiosios medžiagos turėtų būti bandomos visiškai užpildytuose uždarytuose induose, kurie būtų pakankamai dideli, kad deguonies koncentracija nepasiektų ribinių arba per mažų verčių (žr. 1.6 skirsnį ir 1.8.3 skirsnio pirmą pastraipą).
      Be to, naudojama kai kuri arba visa toliau išvardyta įranga: deguonies matuoklis (su mikroelektrodu arba kitokiu įtaisu, tinkamu ištirpusiam deguoniui mažo tūrio ėminiuose matuoti); pH-metras; tinkamas įtaisas temperatūrai matuoti; įranga suminei organinės anglies koncentracijai (TOC) nustatyti; įranga cheminiam deguonies poreikiui (COD) nustatyti; įranga vandens kietumui nustatyti ir t. t.
      1.7.2   Bandymo organizmas
      
         Daphnia magna Straus yra labiausiai bandymui tinkama rūšis, nors leidžiama naudoti ir kitas rūšis (pvz., Daphniapulex). Pradedant bandymą, gyvūnai turi būti jaunesni kaip 24 h amžiaus ir, siekiant sumažinti kintamumą, labai rekomenduojama nenaudoti pirmosios dafnijų palikuonių vados. Jos turėtų būti gautos iš sveikos pradinės kultūros (t. y. nerodančios įtampos požymių, pvz., didelio žūstamumo, vyriškos lyties atstovų ir ephippia buvimo, pirmosios vados vėlavimo, gyvūnų spalvos pasikeitimo ir t. t.). Visų konkrečiam bandymui naudojamų organizmų kultūra turėtų būti gauta iš tos pačios pradinės dafnijų kultūros. Pradinės kultūros gyvūnus reikėtų laikyti tokiomis sąlygomis (šviesa, temperatūra, terpė), kurios būtų panašios į bandymo sąlygas. Jei bandymui reikalinga auginimo terpė skiriasi nuo įprastos dafnijų kultūros terpės, būtų gerai numatyti dafnijų aklimatizavimo laikotarpį. Todėl veislei naudojamos dafnijos bent 48 h laikomos skiedimo vandenyje esant bandymo temperatūrai.
      1.7.3   Laikymo ir skiedimo vanduo
      Dafnijoms laikyti ir skiesti tinka gamtinis vanduo (paviršinis arba gruntinis vanduo), atkurtasis arba vandentiekio vanduo, iš kurio pašalinamas chloras, jei dafnijos jame išgyvena kultūros veisimo, aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu, nerodydamos įtampos požymių. Bet koks vanduo, kuris atitinka 1 priedėlyje išvardytas priimtino skiedimo vandens charakteristikas, tinka bandymui. Jo kokybė turėtų būti stabili visą bandymo laiką. Atkurtasis vanduo gali būti gaminamas į dejonizuotą arba distiliuotą vandenį dedant tam tikrus pripažinto analizinio grynumo reagentų kiekius. Atkurtojo vandens pavyzdžiai pateikti (1) (6) ir 2 priedėlyje. Būtina atkreipti dėmesį, kad tiriant metalų turinčias medžiagas, reikia vengti naudoti terpes, turinčias žinomus chelantus, 2 priedėlyje nurodytas M4 ir M7 terpes. pH vertė turi būti nuo 6 iki 9. Daphnia Magna rekomenduojamas vandens kietumas – nuo 140 iki 250 mg/l (skaičiuojant CaCO3), o kitoms Daphnia rūšims gali tikti mažesnis kietumas. Prieš naudojant bandymui, skiedimo vandenį galima aeruoti, kad ištirpusio deguonies koncentracija pasiektų sotį.
      Jei naudojamas gamtinis vanduo, kokybės parametrus reikėtų matuoti bent du kartus per metus arba kilus įtarimui, kad šios charakteristikos galėjo reikšmingai pasikeisti (žr. pirmesnę pastraipą ir 1 priedėlį). Be to, reikėtų nustatyti sunkiųjų metalų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) kiekį. Jei naudojamas vandentiekio vanduo, iš kurio šalinamas chloras, pageidautina kasdien atlikti chloro analizę. Jei skiedimo vandens šaltinis yra paviršinis arba gruntinis vanduo, reikėtų matuoti laidį ir suminį organinės anglies kiekį (TOC) arba cheminį deguonies poreikį (COD).
      1.7.4   Bandomieji tirpalai
      Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai paprastai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradinius tirpalus geriau ruošti tirpinant medžiagą skiedimo vandenyje. Kiek įmanoma reikia vengti naudoti tirpiklius, emulsiklius arba dispergentus. Tačiau kartais tokių junginių gali prireikti tinkamos koncentracijos pradiniam tirpalui ruošti. Nurodymai dėl tinkamų tirpiklių, emulsiklių ir dispergentų pateikti (4). Bet kuriuo atveju bandomosios medžiagos koncentracija bandomuosiuose tirpaluose neturi būti didesnė kaip tirpumo skiedimo vandenyje ribinė vertė.
      Bandymas turėtų būti atliekamas nereguliuojant pH. Jei pH vertė yra ne 6 – 9 intervale, gali būti atliekamas antras bandymas, pradinio tirpalo pH nustatant pagal skiedimo vandens pH vertę, buvusią iki bandomosios medžiagos pridėjimo. pH reguliuojamas taip, kad pradinio tirpalo koncentracija reikšmingai nesikeistų ir nepradėtų vykti kokia nors cheminė reakcija arba susidarytų cheminės medžiagos nuosėdos. Labiausiai tinka HC1 ir NaOH.
      1.8   PROCEDŪRA
      1.8.1   Veikimo sąlygos
      1.8.1.1   Bandymo ir kontrolinės grupės
      Į bandymo indus įpilami reikalingi skiedimo vandens ir bandomosios medžiagos tūriai. Oro/vandens tūrio santykis inde turi būti vienodas bandymo ir kontrolinėms grupėms. Tuomet į bandymo indus dedamos dafnijos. Kiekvienai bandomajai koncentracijai ir kiekvienam kontroliniam ėminiui reikia naudoti bent 20 gyvūnų, kuriuos geriau būtų padalyti į keturias grupes po penkis gyvūnus. Kiekvienam gyvūnui turėtų tekti bent 2 ml bandomojo tirpalo (t. y. 10 ml tūris penkioms dafnijoms bandymo inde). Bandymą galima atlikti taikant pusiau statinį atnaujinimą arba pratekėjimo sistemą, kai bandomosios medžiagos koncentracija nėra pastovi.
      Be tirpalų grupės su bandomąja medžiaga bandymų turi būti atliekamas vienos kontrolinės skiedimo vandens ėminių grupės bandymas ir prireikus vienos kontrolinės ėminių grupės su tirpinimui naudojama medžiaga bandymas.
      1.8.1.2   Bandomosios koncentracijos vertės
      Jei nėra informacijos apie bandomosios medžiagos toksiškumą, galima atlikti intervalo nustatymo bandymą galutinio bandymo koncentracijos vertėms nustatyti. Šiuo tikslu dafnijos veikiamos bandomosios medžiagos tirpalais, kurių koncentracijos vertės labai skiriasi. Penkios dafnijos veikiamos kiekvienos koncentracijos tirpalu 48 h arba mažiau, kartotiniai ėminiai nebūtini. Veikimo laikotarpį galima sutrumpinti (pvz., 24 h arba mažiau), jei intervalo nustatymo bandymui tinkamus duomenis galima gauti per trumpesnį laiką.
      Turėtų būti naudojamos bent penkios koncentracijos vertės. Jos turi sudaryti geometrinės progresijos eilutę, kurios vardiklis geriausiu atveju neturėtų būti didesnis kaip 2,2. Jei naudojama mažiau koncentracijos verčių, tai būtina pagrįsti. Pageidautina, kad didžiausia koncentracija slopintų judrumą 100 %, o mažiausia bandomoji koncentracija turėtų nedaryti pastebimo poveikio.
      1.8.1.3   Inkubavimo sąlygos
      Temperatūra turi būti 18 oC–22 oC ir atliekant kiekvieną atskirą bandymą ji neturi nukrypti daugiau kaip ± 1 oC. Rekomenduojamas 16 h šviesos ir 8 h tamsos ciklas. Be to, priimtina visiška tamsa, ypač jei bandomosios medžiagos yra nestabilios veikiant šviesai.
      Atliekant bandymą indų turinys neaeruojamas. pH vertė nereguliuojama visą bandymą. Atliekant bandymą dafnijos pašaro negauna.
      1.8.1.4   Trukmė
      Bandymo trukmė 48 h.
      1.8.2   Stebėjimai
      Kiekvienas bandymo indas turi būti tikrinamas po 24 h ir 48 h nuo bandymo pradžios, siekiant nustatyti, ar yra nejudančių dafnijų (apibrėžtys pateiktos 1.2 skirsnyje). Be judrumo slopinimo ataskaitoje turi būti pateikti duomenys apie bet kokį neįprastą elgesį arba išvaizdą.
      1.8.3   Analiziniai matavimai
      Bandymo pradžioje ir pabaigoje matuojama ištirpusio deguonies koncentracija ir pH vertė kontrolinio (-ių) ėminio (-ių) ir didžiausios bandomosios medžiagos koncentracijos induose. Kontrolinių ėminių ištirpusio deguonies koncentracija turi atitikti bandymo tinkamumo kriterijų (žr. 1.6 skirsnį). pH vertė bet kuriame iš bandymo indų paprastai neturėtų keistis daugiau kaip 1,5 vieneto. Paprastai matuojama temperatūra kontrolinių ėminių induose arba aplinkos oro temperatūra ir būtų gerai, jei ji būtu užrašoma nepertraukiamai visą bandymą arba bent bandymo pradžioje ir pabaigoje.
      Bandomosios medžiagos koncentracija turi būti matuojama bandymo pradžioje ir pabaigoje bent tuose induose, kuriuose bandomoji koncentracija yra mažiausia ir didžiausia (4). Rekomenduojama rezultatus pagrįsti matuojamomis koncentracijos vertėmis. Tačiau jei yra duomenų, kurie leistų įrodyti, kad visą bandymą bandomosios medžiagos koncentracija nenukrypo daugiau kaip ± 20 % nuo vardinės arba išmatuotos pradinės koncentracijos vertės, rezultatai gali būti išreikšti naudojant vardines arba išmatuotas pradines vertes.
      1.9   RIBINIS BANDYMAS
      Taikant šiame bandymo metode aprašytas procedūras, galima atlikti ribinį bandymą su bandomosios medžiagos koncentracija 100 mg/l arba koncentracija, atitinkančia ribinio tirpumo vertę (iš šių dviejų pasirenkant mažesnę), jei norima įrodyti, kad EC50 yra didesnė už šią koncentraciją. Ribinis bandymas turi būti atliekamas su 20 dafnijų (padalintų į keturias grupes po penkias dafnijas), tas pat dafnijų skaičius turi būti naudojamas kontroliniam (-iams) bandymui (-ams). Jei vyksta koks nors judrumo slopinimas, turi būti atliekamas visas tyrimas. Turi būti užrašytas kiekvienas neįprasto elgesio atvejis.
      2.   DUOMENYS
      Duomenys turi būti apibendrinti lentelėse, nurodant kiekvienai apdorotai ir kontrolinei grupei naudotų dafnijų skaičių, judrumo slopinimą kiekvieno stebėjimo metu. Braižomas po 24 h ir 48 h nejudančių dafnijų procentinės dalies kaip bandomosios koncentracijos funkcijos grafikas. Duomenys analizuojami taikant atitinkamus statistinius metodus (pvz., probitų analizę ir t. t.) kreivių krypties koeficientams ir EC50 vertėms apskaičiuoti, esant 9 % pasikliovimo rėžiams (p = 0,95) (7) (8).
      Jei gautiems duomenims etaloniniai EC50 apskaičiavimo metodai netinka, turi būti naudojama didžiausia koncentracija, kuri dar nesukelia judrumo slopinimo, ir mažiausia koncentracija, sukelianti 100 % judrumo slopinimą, apytikrei EC50 vertei gauti (ja laikoma šių dviejų koncentracijos verčių geometrinis vidurkis).
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      3.1   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje turi būti ši informacija:
      Bandomoji medžiaga:
      
                  —
               
               
                  fizikinė būsena ir atitinkamos fizikocheminės savybės,
               
            
                  —
               
               
                  cheminės medžiagos identifikavimo duomenys, įskaitant grynumą.
               
            Bandymo gyvūnai:
      
                  —
               
               
                  
                     Daphnia šaltinis ir rūšis, tiekimo šaltinis (jei žinomas) ir naudotos kultūros auginimo sąlygos (įskaitant pašaro šaltinį, rūšį ir kiekį, šėrimo dažnumą).
               
            Bandymo sąlygos:
      
                  —
               
               
                  bandymo indų aprašymas: indų tipas, tirpalo tūris, dafnijų skaičius viename bandymo inde, bandymo indų (kartotinių) skaičius vienai koncentracijai,
               
            
                  —
               
               
                  pradinio ir bandomojo tirpalų ruošimo metodai, įskaitant kokio nors tirpiklio arba dispergento naudojimą, naudotos koncentracijos vertės,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys apie skiedimo vandenį: šaltinis ir vandens kokybės charakteristikos (pH, kietumas, Ca/Mg santykis, Na/K santykis, šarmingumas, laidis ir t. t.); atkurtojo vandens sudėtis, jei naudojamas,
               
            
                  —
               
               
                  inkubavimo sąlygos: temperatūra, šviesos intensyvumas ir periodiškumas, ištirpusio deguonies kiekis, pH ir t. t.
               
            Rezultatai:
      
                  —
               
               
                  kiekvieno stebėjimo metu imobilizuotų arba kitus neigiamus poveikius (įskaitant neįprastą elgesį) rodančių dafnijų skaičius ir procentinė dalis kontroliniuose ėminiuose ir kiekvienoje apdorotoje grupėje, stebimų poveikių tipo aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų su etalonine medžiaga rezultatai ir duomenys, jei yra,
               
            
                  —
               
               
                  vardinės bandomosios koncentracijos vertės ir visų analizių bandomosios medžiagos koncentracijai bandymo induose nustatyti rezultatai; be to, ataskaitoje turi būti pateiktas metodo regeneravimo laipsnis ir ribinė nustatymo vertė,
               
            
                  —
               
               
                  visi bandymo metu atlikti fizikocheminiai temperatūros, pH ir ištirpusio deguonies matavimai,
               
            
                  —
               
               
                  judrumo slopinimo EC50 po 48 h, nurodant pasikliovimo intervalus ir jų apskaičiavimui naudotus regresijos modelių grafikus, dozės ir atsako kreivių krypties koeficientai ir jų standartinis nuokrypis; statistinės procedūros, taikytos EC50 nustatyti; (be to, ataskaitoje turi būti nurodyti judrumo slopinimo duomenys, gauti po 24 h, jei jie buvo matuojami),
               
            
                  —
               
               
                  visų nukrypimų nuo bandymo metodo paaiškinimas ir nurodymas, ar nukrypimas turėjo įtakos bandymo rezultatams.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) – Acute toxicity test. Third edition,
               
            
                  2)
               
               
                  EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guidelines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater Daphnids.
               
            
                  3)
               
               
                  Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute Lethality Test Using Daphnia spp. EPS 1/RM/11. Environment Canada, Ottawa, Ontario, Canada.
               
            
                  4)
               
               
                  Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris 2000.
               
            
                  5)
               
               
                  Commission of the European Communities. Study D8369. (1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to Daphnia.
                  
               
            
                  6)
               
               
                  OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211: Daphnia magna Reproduction Test, adopted September 1998.
               
            
                  7)
               
               
                  Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 – American Society for Testing and Materials. p. 65–84
               
            
                  8)
               
               
                  Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3rd ed. London. Griffin, Weycombe, UK.
               
            
         1 PRIEDAS
         KAI KURIOS TINKAMO SKIEDIMO VANDENS CHEMINĖS CHARAKTERISTIKOS
         
                     Medžiaga
                  
                  
                     Koncentracija
                  
               
                     Kietosios dalelės
                  
                  
                     < 20 mg/l
                  
               
                     Suminė organinė anglis
                  
                  
                     < 2 mg/l
                  
               
                     Nejonizuotas amoniakas
                  
                  
                     < 1 μg/l
                  
               
                     Liekamasis chloras
                  
                  
                     < 10 μg/l
                  
               
                     Suminis organinių fosforo pesticidų kiekis
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     Suminis organinių fosforo pesticidų ir polichlorintų bifenilų kiekis
                  
                  
                     < 50 ng/1
                  
               
                     Suminis organinio chloro kiekis
                  
                  
                     < 25 ng/1
                  
               
      
         2 Priedas
         TINKAMO ATKURTOJO BANDYMŲ VANDENS PAVYZDŽIAI
         ISO bandymų vanduo (1)
         
                     Pradiniai tirpalai (atskiros medžiagos)
                  
                  
                     Atkurtajam vandeniui paruošti į 1 l vandens įpilamas šis pradinių tirpalų tūris (2)
                     
                  
               
                     Medžiaga
                  
                  
                     Kiekis, įdedamas į 1l vandens (2)
                     
                  
               
                     Kalcio chloridas
                     CaCl2 , 2H2O
                  
                  
                     11,76 g
                  
                  
                     25 ml
                  
               
                     Magnio sulfatas
                     MgSO4 , 7H2O
                  
                  
                     4,93 g
                  
                  
                     25 ml
                  
               
                     Natrio hidrokarbonatas
                     NaHCO3
                     
                  
                  
                     2,59 g
                  
                  
                     25 ml
                  
               
                     Kalio chloridas
                     KCl
                  
                  
                     0,23 g
                  
                  
                     25 ml
                  
               Elendt M7 ir M4 terpė
         Aklimatizavimas Elendt M7 ir M4 terpėje
         Kai kurios laboratorijos turėjo sunkumų, norėdamos dafnijas perkelti tiesiai į M4 ir M7 terpes. Tačiau labiau pasisekė jas aklimatizuojant laipsniškai, t. y. perkeliant dafnijas iš jų terpės į 30 % Elendt, paskui į 60 % Elendt ir pagaliau į 100 % Elendt. Aklimatizavimas gali trukti visą mėnesį.
         Ruošimas
         Mikroelementai
         Atskirų mikroelementų pradiniai tirpalai (I) iš pradžių ruošiami naudojant tinkamo grynumo vandenį, pvz., dejonizuotą, distiliuotą arba grįžtamojo osmoso būdu gautą vandenį. Iš šių skirtingų tirpalų (I) ruošiamas antras pradinis tirpalas (II), turintis visus mikroelementus (sudėtinis tirpalas), t. y.:
         
                     I pradinis (-iai) tirpalas (-ai) (atskira medžiaga)
                  
                  
                     Į vandenį įdėtas kiekis (mg/1)
                  
                  
                     Koncentracija (palyginti su M4 terpe) (kartų)
                  
                  
                     II pradiniam sudėtiniam tirpalui paruošti į vandenį įpilamas šis I pradinio tirpalo tūris (ml/1)
                  
               
                     M4
                  
                  
                     M7
                  
               
                     H3 BO3
                     
                  
                  
                     57 190
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     MnCl2.4H2O
                  
                  
                     7 210
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     LiCl
                  
                  
                     6 120
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     RbCl
                  
                  
                     1 420
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     SrCl2.6H2O
                  
                  
                     3 040
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     NaBr
                  
                  
                     320
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     Na2 MoO4.2H2O
                  
                  
                     1 230
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     CuCl2.2H2O
                  
                  
                     335
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     ZnCl2
                     
                  
                  
                     260
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     CoCl2.6H2O
                  
                  
                     200
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     KI
                  
                  
                     65
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2 SeO3
                     
                  
                  
                     43,8
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     NH4 VO3
                     
                  
                  
                     11,5
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2 EDTA.2H2O
                  
                  
                     5 000
                  
                  
                     2 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     FeSO4.7H2O
                  
                  
                     1 991
                  
                  
                     2 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Na2EDTA ir FeSO4 tirpalai ruošiami atskirai, supilami kartu ir iškart apdorojami autoklave.
                  
               
                     Taip gaunama:
                  
               
                     2 1 Fe-EDTA tirpalas
                  
                  
                      
                  
                  
                     1 000
                  
                  
                     20,0
                  
                  
                     5,0
                  
               M4 ir M7 terpės
         M4 ir M7 terpės, naudojant II pradinį tirpalą, makroelementus ir vitaminus, yra ruošiamos taip:
         
                      
                  
                  
                     Į vandenį įdėtas kiekis (mg/l)
                  
                  
                     Koncentracija (palyginti su M4 terpe) (kartų)
                  
                  
                     Terpei ruošti įpilto II pradinio tirpalo tūris (ml/1)
                  
               
                     M4
                  
                  
                     M7
                  
               
                     II pradinis tirpalas (mikroelementų mišinys)
                  
                  
                      
                  
                  
                     20
                  
                  
                     50
                  
                  
                     50
                  
               
                     Pradiniai mitybinių makroelementų tirpalai (atskira medžiaga)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     CaCl2 · 2H20
                  
                  
                     293 800
                  
                  
                     1 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     MgSO4 · 7H2O
                  
                  
                     246 600
                  
                  
                     2 000
                  
                  
                     0,5
                  
                  
                     0,5
                  
               
                     KCl
                  
                  
                     58 000
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     NaHCO3
                     
                  
                  
                     64 800
                  
                  
                     1 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2 SiO3 · 9H2O
                  
                  
                     50 000
                  
                  
                     5 000
                  
                  
                     0,2
                  
                  
                     0,2
                  
               
                     NaNO3
                     
                  
                  
                     2 740
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     KH2 PO4
                     
                  
                  
                     1 430
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     K2HPO4
                     
                  
                  
                     1 840
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     Vitaminų mišinio pradinis tirpalas
                  
                  
                     —
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     Vitaminų mišinio pradinis tirpalas ruošiamas į 1 litrą vandens įdedant tokį 3 vitaminų kiekį:
                  
               
                     Tiamino hidrochloridas
                  
                  
                     750
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Ciankobalaminas (B12)
                  
                  
                     10
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Biotinas
                  
                  
                     7,5
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Vitaminų mišinio pradinis tirpalas laikomas užšaldytas mažomis alikvotinėmis dalimis. Į terpę vitaminai dedami prieš pat naudojimą.
         
                     NB.
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Jei ruošiant galutinę terpę norima išvengti druskų nuosėdų susidarymo, alikvotinės pradinio tirpalo dalys pilamos į maždaug 500–800 ml dejonizuoto vandens ir skiedžiama iki 1 litro.
                  
               
                     NB.
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Pirmąją publikaciją apie M4 terpę galima rasti Elendt, B.P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, p. 25–33.
                  
               
      C.3.   DUMBLIŲ INHIBAVIMO BANDYMAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Šio bandymo tikslas yra nustatyti, kaip medžiagos veikia vienaląsčių žalių dumblių rūšių augimą. Per palyginti trumpai (72 valandas) trunkančius bandymus galima įvertinti poveikį kelioms kartoms. Šį metodą galima pertvarkyti taip, kad jį būtų galima taikyti kelioms vienaląsčių dumblių rūšims, tokiu atveju su bandymo ataskaita turi būti pateiktas metodo aprašymas.
      Šį metodą lengviausią taikyti vandenyje tirpioms medžiagoms, kurios bandymo sąlygomis greičiausiai lieka vandenyje.
      Metodą galima taikyti medžiagoms, kurios tiesiogiai netrukdo matuoti dumblių augimą.
      Prieš pradedant bandymą, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, cheminį patvarumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą.
      Planuojant bandymą ir interpretuojant jo rezultatus, turi būti atsižvelgta į papildomą informaciją (pvz., struktūrinė formulė, grynumo laipsnis, reikšmingesnių priemaišų prigimtis ir procentinis kiekis, priedų buvimas ir jų kiekis, pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas).
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Ląstelių tankis – ląstelių skaičius viename mililitre;
      Augimas – ląstelių tankio padidėjimas per bandymo laiką,
      Augimo greitis – ląstelių tankio didėjimas per laiko vienetą;
      EC50: šiame metode – tai bandomosios medžiagos koncentracija, kurioje augimas (EbC50) arba augimo greitis (ErC50) lyginant su kontroliniu bandymu mažėja 50 %;
      NOEC (stebimo poveikio nedaranti koncentracija): šiame metode – tai didžiausia bandomoji koncentracija, kurioje žymaus augimo inhibavimo lyginant su kontroliniu bandymu nepastebėta.
      Kiekviena bandomosios medžiagos koncentracija yra skaičiuojama mase tūrio vienetui (mg/litre). Ją dar galima išreikšti mase masės vienetui (mg/kg).
      1.3   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymų sąlygomis naudojamų rūšių jautrumas žymiai nepakito, gali būti daromas bandymas su etalonine medžiaga.
      Jei naudojama etaloninė medžiaga, rezultatai turi būti pateikti ataskaitoje. Etalonine medžiaga galima naudoti kalio dichromatą, tačiau jo spalva gali turėti įtakos šviesos, kurią gauna ląstelės, kokybei ir intensyvumui bei spektrofotometrinių nustatymų, jei jie daromi, rezultatams. Kalio dichromatas buvo naudojamas tarptautiniame tarplaboratoriniame bandyme (žr. 3 nuorodą ir 2 papildymą).
      1.4.   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Galima daryti ribinį bandymą su 100 mg/litre koncentracija, norint parodyti, kad EC50 yra didesnė nei ši koncentracija.
      Eksponentiškai augančios atrinktų žaliųjų dumblių kultūros apibrėžtomis sąlygomis per kelias kartas veikiamos įvairios koncentracijos bandomąja medžiaga.
      Bandomieji tirpalai inkubuojami 72 valandoms; per tą laiką bent kas 24 valandas kiekviename tirpale matuojamas ląstelių tankis. Nustatomas augimo inhibavimas lyginant su kultūros augimu kontroliniame bandyme.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Kokybės kriterijai turi būti taikomi ir ribinio bandymo metodui, ir viso bandymo metodui.
      Ląstelių tankis kontrolinių bandymų kultūrose per tris paras turi būti padidėjęs bent 16 kartų.
      Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti laikoma 80 % pradinės koncentracijos vertės ribose.
      Medžiagų, kurios lengvai tirpsta bandomojoje terpėje ir kurių tirpalai patvarūs, t.y., kuriuose ištirpinta medžiaga žymiai negaruoja, neskyla, nevyksta hidrolizė arba neadsorbuojama, pradine koncentracija galima laikyti vardinę medžiagos koncentracija. Turi būti pateikti įrodymai, kad koncentracijos buvo išlaikytos per visą bandymą ir kad kokybės kriterijai buvo įvykdyti.
      Medžiagų, kurios:
      
                  i)
               
               
                  mažai tirpsta bandymo terpėje, arba
               
            
                  ii)
               
               
                  gali sudaryti patvarias emulsijas arba suspensijas, arba
               
            
                  iii)
               
               
                  yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose,
               
            pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija nustatyta bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra.
      Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti daromi tolimesni matavimai.
      Yra pripažinta, kad per tą laiką, kol vyksta bandymas, žymus bandomosios medžiagos kiekis gali būti sulaikytas dumblių biomase. Taigi, siekiant parodyti, kad vykdomi aukščiau minėti kokybės kriterijai, turi būti atsižvelgta ir į medžiagos kiekį, kuris patenka į dumblių biomasę, ir į medžiagos kiekį tirpale (ar, jei tai techniškai neįmanoma, į vandens tūryje nustatytą medžiagos kiekį). Tačiau, kadangi medžiagos koncentracijos dumblių biomasėje nustatymas gali kelti esminių techninių problemų, atitikimas kokybės kriterijams gali būti parodytas, darant bandymą su didžiausia medžiagos koncentracija, bet be dumblių, ir išmatuojant jos koncentraciją tirpale (ar, jei tai techniškai neįmanoma, vandens tūryje) bandymo pradžioje ir pabaigoje.
      1.6.   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Reagentai
      1.6.1.1.   Bandomųjų medžiagų tirpalai
      Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2.
      Pasirinktos bandymo koncentracijos tirpalai ruošiami alikvotinę pradinio tirpalo dalį įpilant į dumblių pradinę kultūrą (žr. 1 priedėlį).
      Paprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Norint kai kurioms medžiagoms (pvz., vandenyje mažai tirpioms medžiagoms, arba kurių didelis Pow, arba toms, kurios sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) užtikrinti galimybę pasiekti soties/pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui, ir t. t).
      Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba norint pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, į pagalbą galima pasitelkti dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius arba dispergatorius. Kai naudojamos tokios pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis, ir papildomi kontroliniai bandiniai turi būti veikiami pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti kuo mažesnė ir jokiu būdu neturi būti didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės.
      Bandymas turi būti daromas nereguliuojant pH vertės. Jei yra įrodymų apie žymų pH vertės kitimą, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HC1 ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti daromas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei reguliuojant pH vyksta kokia nors cheminė reakcija arba bandomoji medžiaga fiziškai iškrenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje.
      1.6.1.2.   Bandymų terpė
      Vanduo turi būti geros kokybės distiliuotas vanduo arba dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų mažesnis kaip 5μScm-1. Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių.
      Rekomenduojama tokia terpė.
      Pagal čia pateiktą lentelę ruošiami keturi pradiniai tirpalai. Pradiniai tirpalai sterilizuojami filtravimu per membraną arba autoklave, ir laikomi tamsoje 4 oC temperatūroje. Pradinis tirpalas nr. 4 turi būti sterilizuojamas tik filtravimu per membraną. Šie pradiniai tirpalai skiedžiami, kad bandomuosiuose tirpaluose butų gautos galutinės mitybinių medžiagų koncentracijos.
      
                  Mitybinė terpė
               
               
                  Koncentracija pradiniame tirpale
               
               
                  Galutine koncentracija bandomajame tirpale
               
            
                  
                     1 pradinis tirpalas: mitybiniai makroelementai
                  
               
            
                  NH4Cl
               
               
                  1,5 g/l
               
               
                  15 mg/l
               
            
                  MgCl2.6H2O
               
               
                  1,2 g/l
               
               
                  12mg/l
               
            
                  CaCl2.2H2O
               
               
                  1,8 g/l
               
               
                  18 mg/1
               
            
                  MgSO47H2O
               
               
                  1,5 g/l
               
               
                  15 mg/1
               
            
                  KH2PO4
                  
               
               
                  0,16 g/l
               
               
                  1,6 mg/1
               
            
                  
                     2 pradinis tirpalas: Fe-EDTA
                  
               
            
                  FeCl3.6H2O
               
               
                  80 mg/l
               
               
                  0,08 mg/1
               
            
                  Na2EDTA.2H2O
               
               
                  100 mg/l
               
               
                  0,1 mg/1
               
            
                  
                     3 pradinis tirpalas: mikroelementai
                  
               
            
                  H3BO3
                  
               
               
                  185 mg/l
               
               
                  0,185 mg/1
               
            
                  MnCl2.4H2O
               
               
                  415 mg/l
               
               
                  0,415 mg/1
               
            
                  ZnCl2
                  
               
               
                  3 mg/l
               
               
                  3 × 10-3 mg/1
               
            
                  CoCl2.6H2O
               
               
                  1,5 mg/l
               
               
                  1,5 × 10-3 mg/1
               
            
                  CuCl2.2H2O
               
               
                  0,01 mg/l
               
               
                  10-5 mg/1
               
            
                  Na2MoO42H2O
               
               
                  7 mg/l
               
               
                  7 × 10-3mg/l
               
            
                  
                     4 pradinis tirpalas: NaHC03
                     
                  
               
            
                  NaHCO3
                  
               
               
                  50 g/l
               
               
                  50 mg/1
               
            Kai nusistovi pusiausvyra su oru, terpės pH vertė yra lygi maždaug 8.
      1.6.2.   Aparatūra
      
                  —
               
               
                  Įprastoji laboratorijos įranga,
               
            
                  —
               
               
                  Atitinkamo tūrio bandymų kolbos (pvz., jei bandomojo tirpalo tūris 100 ml, tinka 250 ml tūrio kūginės kolbos). Visos kolbos medžiagos ir matmenų atžvilgiu turi būti vienodos.
               
            
                  —
               
               
                  Kultūros auginimo aparatūra: spinta arba kamera, kurioje temperatūrą būtų galima palaikyti intervale nuo 21 oC iki 25 oC ± 2 oC tikslumu ir kurioje būtų nuolatinis tolygus apšvietimas intervale nuo 400 iki 700 nm. Jei dumblių kontrolinės kultūros pasiekė rekomenduotą augimo greitį, galima daryti prielaidą, kad augimo sąlygos, įskaitant šviesos intensyvumą, buvo tinkamos.
                  Rekomenduojama, kad šviesos intensyvumas bandomųjų tirpalų vidutiniame lygyje būtų intervale nuo 60 iki 120 μE.m-2.s-1 (nuo 35 iki 70 × 1018 fotonų.m-2.s-1), kai matuojama intervale nuo 400 iki 700 nm, naudojant tinkamą imtuvą. Jei naudojami apšvietos matavimo prietaisai kalibruoti liuksais, yra priimtinas lygiavertis intervalas nuo 6000 iki 10000 lx.
                  Tokį šviesos intensyvumą galimą gauti, jei 0,35 m atstumu nuo dumblių kultūros pastatyti nuo keturių iki septynių 30 W universalaus tipo baltų dienos šviesos lempų (spalvos temperatūra maždaug 4300 K).
               
            
                  —
               
               
                  Ląstelių tankio matavimai turi būti daromi naudojant tiesioginį gyvų ląstelių skaičiavimo metodą, pvz., mikroskopą su skaičiavimo kamera. Tačiau gali būti naudojami kiti metodai (fotometrija, turbidimetrija,...), jei jie yra pakankamai jautrūs ir jei būtų parodyta, kad jų rezultatai pakankamai gera koreliuoja su ląstelių tankiu.
               
            1.6.3.   Bandymų organizmai
      Patariama naudoti greitai augančių žaliųjų dumblių rūšis, nes jas patogu auginti ir bandyti. Geriausia naudoti šias rūšis:
      
                  —
               
               
                  
                     Selenastrum capricornutum, pvz., ATCC 22662 arba CCAP 278/4,
               
            
                  —
               
               
                  
                     Scenedesmus subspicatus, pvz., 86.81 SAG,
               
            
         Pastaba:
      
      
                  ATCC
               
               
                  =
               
               
                  American Type Culture Collection (U.S.A.)
               
            
                  CCAP
               
               
                  =
               
               
                  Culture Centre of Algae and Protozoa (U.K.)
               
            
                  SAG
               
               
                  =
               
               
                  Collection of algal culture (Gottingen, F.R.G.)
               
            Jei naudojamos kitos rūšys, turi būti nurodytas štamas.
      1.6.4.   Bandymų eiga
      Koncentracijos intervalas, kuriame medžiaga galėtų veikti, nustatomas remiantis intervalo nustatymo bandymų rezultatais.
      Du augimo matavimo būdai (biomasės kiekio ir augimo greičio nustatymas) gali duoti nesulyginamus augimo inhibavimo rezultatus; abu turi būti taikomi intervalo nustatymo bandyme, siekiant užtikrinti, kad geometrine progresija naudojamos koncentracijos leistų įvertinti EbC50 ir ErC50
      
      Pradinis ląstelių tankis
      Rekomenduojama, kad pradinis bandymo kultūrų Selenastrum capricornutum ir Scenedesmus subspicatus ląstelių tankis būtų apie 104 ląstelių/ml. Kai naudojamos kitos rūšys, biomasė turi būti panaši.
      Bandomosios medžiagos koncentracija
      Bandymui imamos bent penkios geometrine progresija didėjančios koncentracijos, kurių santykis ne didesnis kaip 2,2. Mažiausios koncentracijos bandomoji medžiaga turi neveikti dumblių augimo. Didžiausios koncentracijos bandomoji medžiaga turi inhibuoti augimą bent 50 %, lyginant su kontroliniu bandymu, ir būtų geriausia, jei augimas būtų visiškai sustabdytas.
      Lygiagrečių bandymų skaičius ir kontroliniai bandymai
      Pagal bandymo schemą su kiekviena bandomąja koncentracija turi būti daromi trys lygiagretūs bandymai. Daromi trys kontroliniai bandymai be bandomosios medžiagos, ir, jei tinka, dar daromi trys kontroliniai bandymai su pagalbine medžiaga. Jei pasiteisina, bandymo schemą galima keisti, didinant koncentracijų skaičių ir mažinant lygiagrečių bandymų vienai koncentracijai skaičių.
      Bandymų eiga
      Bandymų kultūros su reikiama koncentracija bandomosios medžiagos ir reikiamu dumblių kiekiu ruošiamos į tinkamą kiekį dumblių iš anksto paruoštos kultūros pilant alikvotinį bandomosios medžiagos pradinių tirpalų tūrį (žr. 1 priedėlį).
      Kolbos su kultūra supurtomos ir statomos į kultūros auginimo aparatą. Norint bandomuosiuose tirpaluose pagerinti dujų apykaitą ir sumažinti pH kitimą, dumblių ląstelės suspenduojamos tirpalus purtant, maišant arba barbotuojant per juos orą. Kultūros turi būti laikomos temperatūros intervale nuo 21 iki 25 oC, reguliuojant ± 2 oC tikslumu.
      Kiekvienoje kolboje ląstelių tankis nustatomas bent po 24, 48 ir 72 valandų nuo bandymo pradžios. Kai ląstelių tankis matuojamas kitu, nei tiesioginis skaičiavimas, metodu, fonui nustatyti naudojama filtruota dumblių terpė su atitinkama bandomosios medžiagos koncentracija.
      pH vertė nustatoma bandymo pradžioje ir po 72 valandų.
      pH vertė kontroliniuose bandiniuose per visą bandymo laiką paprastai neturi pasikeisti daugiau kaip 1,5 vieneto.
      Lakiųjų medžiagų bandymas
      Iki šiol nėra visuotinai priimto būdo bandyti lakiąsias medžiagas. Jei žinoma, kad medžiaga turi polinkį garuoti, galima naudoti uždaras bandymų kolbas su padidintu laisvu tūriu virš tirpalo. Skaičiuojant uždarų kolbų laisvąjį tūrį, turi būti atsižvelgta į CO2 trūkumo galimybę. Buvo pasiūlyti šio metodo variantai (žr. 4 nuorodą).
      Reikia stengtis nustatyti tirpale likusios medžiagos kiekį, ir patariama ypač atsargiai interpretuoti bandymų rezultatus, gautus su lakiosiomis medžiagomis uždaroje sistemoje.
      Ribinis bandymas
      Taikant šiame bandymo metode aprašytas metodikas, galima daryti ribinį bandymą su koncentracija 100 mg/litre, kai norima įrodyti, kad EC50 yra didesnė nei ši koncentracija.
      Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos bandymų vandenyje pasiekti negalima, ribinis bandymas turi būti daromas su koncentracija, lygia medžiagos tirpumui (arba su didžiausia koncentracija, kurioje susidaro patvari suspensija) naudojamoje terpėje (dar žr. 1.6.1.1 punktą).
      Turi būti daromas bent trigubas ribinis bandymas, toks pat turi būti ir kontrolinių bandymų skaičius. Ribiniame bandyme turi būti naudojami du augimo matavimo būdai (biomasės kiekis ir augimo greitis).
      Jei ribiniame bandyme, lyginant su kontroliniu bandymu, nustatomas 25 % arba didesnis vidutinis biomasės kiekio mažėjimas arba augimo greičio mažėjimas, turi būti daromas visas bandymas.
      2.   DUOMENYS IR VERTINIMAS
      Išmatuotas ląstelių tankis bandomosiose kultūrose ir kontroliniuose bandiniuose, kartu su bandomosios medžiagos koncentracijomis ir matavimo laikais pateikiamas lentelėje. Norint gauti augimo kreives, vidutinė ląstelių tankio vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai ir kontroliniuose bandiniuose vaizduojama grafiškai laiko atžvilgiu (0–72 h).
      Turi būti taikomi du žemiau pateikti būdai, kad būtų galima įvertinti koncentracijos ir jos poveikio priklausomybę. Kai kurios medžiagos, būdamos mažos koncentracijos, gali skatinti augimą. Turi būti įskaitomi tik tie duomenų taškai, kuriuose inhibavimas kinta nuo 0 iki 100 %.
      2.1.   PLOTŲ PO AUGIMO KREIVĖMIS LYGINIMAS
      Plotas tarp augimo kreivės ir horizontaliosios tiesės N = N0 gali būti apskaičiuotas taikant formulę:
      
         
      čia:
      
                  A
               
               
                  =
               
               
                  plotas,
               
            
                  No
                  
               
               
                  =
               
               
                  ląstelių skaičius laiku t0 (bandymo pradžia),
               
            
                  N1
                  
               
               
                  =
               
               
                  išmatuotas ląstelių skaičius/ml laiku tl,
               
            
                  Nn
                  
               
               
                  =
               
               
                  išmatuotas ląstelių skaičius/ml laiku tn,
               
            
                  t1
                  
               
               
                  =
               
               
                  pirmojo matavimo laikas nuo bandymo pradžios,
               
            
                  tn
                  
               
               
                  =
               
               
                  n-ojo matavimo laikas nuo bandymo pradžios,
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  nuo bandymo pradžios darytų matavimų skaičius.
               
            Ląstelių augimo inhibavimo procentinė vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai (LA) apskaičiuojama taikant formulę:
      
         
      čia:
      
                  Ac
                  
               
               
                  =
               
               
                  plotas tarp augimo kreivės, gautos kontroliniame bandyme, ir horizontaliosios tiesės N = N0.
               
            
                  At
                  
               
               
                  =
               
               
                  plotas tarp augimo kreivės, gautos koncentracijai t, ir horizontaliosios tiesės N = N0.
               
            
                  IA
                  
               
               
                  =
               
               
                  vertės atitinkamų koncentracijų atžvilgiu atidedamos pusiau logaritminiame arba pusiau logaritminiame tikimybiniame popieriuje. Jei vertės atidedamos tikimybiniame popieriuje, per taškus vedama tiesė, arba iš akies arba skaičiuojant iš regresijos lygties.
               
            EC50 įvertinama iš regresijos tiesės arba kaip koncentracijos rodmuo, kuris atitinka 50 % inhibavimą (IA = 50 %). Norint šią vertę pažymėti vienareikšmiai, kaip gautą šiuo skaičiavimo metodu, pasiūlyta vartoti simbolį EbC50. Svarbu, kad EbC50 būtų nurodomas kartu su atitinkamu veikimo laikotarpiu, pvz., EbC50 (0–72 h).
      2.2.   AUGIMO GREIČIŲ LYGINIMAS
      Vidutinis eksponentiškai augančių kultūrų savitasis augimo greitis (μ) gali būti apskaičiuotas pagal formulę:
      
         
      čia to bandymo pradžios laikas.
      Kitaip, vidutinis savitasis augimo greičio vertė gali būti gauta iš regresijos tiesės kampinio koeficiento N priklausomybės nuo laiko grafike.
      Savitojo augimo greičio mažėjimo procentinė vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai (Iμt) skaičiuojama pagal formulę:
      
         
      čia:
      
                  μc
                  
               
               
                  =
               
               
                  vidutinis savitasis augimo greitis kontroliniame bandyme
               
            
                  μt
                  
               
               
                  =
               
               
                  vidutinis savitasis augimo greitis, kai bandomoji koncentracija t
               
            Kiekvienai koncentracijai gautos savitojo augimo greičio mažėjimo vertės ir kontrolinės greičio vertės santykio procentinė vertė brėžiama koncentracijos logaritmo atžvilgiu. Iš gauto grafiko galima gauti EC50 vertę. Norint vienareikšmiai pažymėti šiuo metodu gautą EC50, pasiūlyta naudoti simbolį ErC50. Turi būti nurodytos matavimo laiko ribos, pvz., jei vertė gauta 0 ir 72 valandų laikotarpiui, simbolis užrašomas ErC50 (0–72 h).
      
         Pastaba. Savitasis augimo greitis yra logaritminis dydis, ir nedideli augimo greičio pokyčiai gali būti didelių biomasės pokyčių priežastimi. Taigi, EbC ir ErC skaitmeninės vertės nėra palyginamos.
      2.3.   NOEC SKAIČIAVIMAS
      (NOEC – No Observed Effect Concentration – stebimo poveikio nedaranti koncentracija) nustatoma pagal atitinkamą didelio skaičiaus bandinių lyginimo statistinę metodiką (pvz., dispersinė analizė ir Dunnetto testas), naudojant lygiagrečiuose bandymuose gautas atskiras ploto po augimo kreive vertes A (žr. 2.1 poskyrį) arba savituosius augimo greičius μ (žr. 2.2 poskyrį).
      3.   ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  bandomoji medžiaga: cheminio identifikavimo duomenys;
               
            
                  —
               
               
                  bandymų organizmai: kilmė, laboratorinė kultūra, štamo numeris, ir auginimo metodas;
               
            
                  —
               
               
                  bandymų sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              bandymo pradžios ir pabaigos data bei jo trukmė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatūra,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              terpės sudėtis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              auginimo aparatūra,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tirpalų pH bandymo pradžioje ir pabaigoje (turi būti pateiktas aiškinimas, jei stebimas pH vertės nukrypimas yra didesnis nei 1,5 vieneto),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nešiklis ir metodas, taikytas soliubilizuoti bandomąją medžiagą, bei nešiklio koncentracija bandomuosiuose tirpaluose,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              šviesos intensyvumas ir kokybė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios koncentracijos (matuotos arba vardinės).
                           
                        
            
                  —
               
               
                  rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              ląstelių tankis kiekvienoje kolboje bei kiekviename matavimo taške, taip pat ląstelių tankio nustatymo metodas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ląstelių tankio vidutinės vertės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              augimo kreivės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              koncentracijos poveikio priklausomybių grafinis vaizdavimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              EC vertės ir skaičiavimo metodas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              NOEC,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kiti pastebėti reiškiniai.
                           
                        
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.
               
            
                  2)
               
               
                  Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Hemmung der Zellvermehrung bei der Grunalge Scenedesmus subspicatus“, in: Rudolph/Boje: bkotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
               
            
                  3)
               
               
                  ISO 8692- Water quality -Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.
                  
               
            
                  4)
               
               
                  S.Galassi and M.Vighi -Chemosphere, 1981, vol.10, p. 1123–1126.
               
            
         1 Priedėlis:
         Dumblių auginimo metodikos pavyzdys
         Bendrosios pastabos
         Šio kultūros auginimo pagal pateikiamą metodiką tikslas yra gauti dumblių kultūras toksiškumo bandymams.
         Norint užtikrinti, kad dumblių kultūros nebūtų užkrėstos bakterijomis, turi būti naudojami tinkami metodai (ISO 4833). Pageidautina naudoti akseniškas kultūras, tačiau pagrindinės yra vienaląsčių dumblių kultūros.
         Visi veiksmai turi būti daromi steriliomis sąlygomis, kad nebūtų užkrėsta bakterijomis ir kitais dumbliais. Užkrėstų kultūrų turi būti atsisakyta.
         Dumblių kultūros auginimo metodikos
         Mitybinių tirpalų (terpės) ruošimas:
         terpė gali būti paruošta skiedžiant pradinius mitybinių medžiagų koncentruotus tirpalus. Kietai terpei gauti dedama 0,8 % agaro. Naudojama terpė turi būti sterili. Sterilizuojant autoklave, galima prarasti NH3.
         Pradinė kultūra:
         Pradinės kultūros yra mažos dumblių kultūros, kurios reguliariai pernešamos į šviežią terpę, kad jas būtų galima naudoti kaip pradinę bandymų medžiaga. Jei kultūros reguliariai nenaudojamos, jos užnešamos ant gulsčiojo agaro mėgintuvėliuose. Šios kultūros pernešamos į šviežią terpę bent kartą per du mėnesius.
         Pradinės kultūros auginamos kūginėse kolbose su atitinkama terpe (tūris apie 100 ml). Kai dumbliai inkubuojami 20 oC temperatūroje su nuolatiniu apšvietimu, pernešti reikia kas savaitę.
         Į kolba su šviežia terpe sterilia pipete pernešamas toks „senos“ kultūros kiekis, kad greitai augančių rūšių atveju pradinė koncentracija būtų maždaug 100 kartų mažesnė nei senos kultūros.
         Rūšių augimo greitis gali būti nustatytas iš augimo kreivės. Jei greitis žinomas, galima įvertinti, koks turi būti į naują terpę pernešamos kultūros tankis. Tai turi būti daroma prieš tai, kai kultūra pasiekia žūties tarpsnį.
         Iš anksto paruošta kultūra:
         Iš anksto paruošta kultūra skirta tam, kad būtų gautas bandomosioms kultūroms sėti reikalingas dumblių kiekis. Iš anksto paruošta kultūra inkubuojama bandymo sąlygomis ir naudojama tuomet, kai dar auga eksponentiškai, paprastai maždaug po trijų inkubavimo parų. Kai dumblių kultūroje pasitaiko deformuotos arba nenormalios ląstelės, jos turi būti pašalintos.
      
      
         2 Priedėlis:
         ISO 8692 – Vandens kokybė – Gėlojo vandens dumblių augimo inhibavimo bandymas su Scenedesmus subspicatus ir Selenastrum capricornutum pateikia šiuos tarplaboratorinio lyginimo bandymo rezultatus, gautus 16 laboratorijų, tyrusių kalio dichromatą:
         
                      
                  
                  
                     Vidutinė vertė (mg/l)
                  
                  
                     Intervalas (mg/l)
                  
               
                     ErC50 (0 – 72 h)
                  
                  
                     0,84
                  
                  
                     0,60 – 1,03
                  
               
                     HbC50 (0 – 72 h)
                  
                  
                     0,53
                  
                  
                     0,20 – 0,75
                  
               
      C.4.   „LENGVO“ BIOLOGINIO SKAIDOMUMO MATAVIMAS
      I DALIS.   BENDRIEJI KLAUSIMAI
      I.1.   ĮVADAS
      Aprašyti šeši metodai, kurie leidžia chemines medžiagas rūšiuoti pagal jų biologinio skaidomumo aerobinėje vandeninėje terpėje lengvumą:
      
                  a)
               
               
                  Ištirpusios organinės anglies (DOC) išnykimo (Die-Away) (C.4-A metodas)
               
            
                  b)
               
               
                  Modifikuotas OECD (Organization for Economic Cooperation and Development -Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacija) atrankos bandymas – DOC išnykimas (C.4-B metodas)
               
            
                  c)
               
               
                  Anglies dioksido (CO2) išsiskyrimas (modifikuotas Sturm bandymas) (C.4-C metodas)
               
            
                  d)
               
               
                  Manometrinė respirometrija (C.4-D)
               
            
                  e)
               
               
                  Uždarosios kolbos (Closed bottle) metodas (C.4-E metodas)
               
            
                  f)
               
               
                  MITI [Ministry of International Trade and Industry (Tarptautinės prekybos ir pramonės ministerija) – Japonija] (C.4-F metodas)
               
            Bendrieji ir įprastieji visų šešių bandymų klausimai pateikti metodo I dalyje. Atskiriems metodams specifiniai klausimai pateikti II–VII dalyse. Priedėliuose pateikiami apibrėžimai, formulės ir rekomendacijos.
      OECD tarplaboratorinio lyginimo bandymai, daryti 1988 m., parodė, kad šiais metodais gauti rezultatai yra suderinami. Tačiau priklausomai nuo fizikinių bandomosios medžiagos savybių, pirmenybė gali būti teikiama vienam arba kitam metodui.
      I.2.   TINKAMO METODO PARINKIMAS
      Norint parinkti tinkamiausią metodą, labai svarbi yra informacija apie cheminės medžiagos tirpumą, garų slėgį ir adsorbcijos charakteristikas. Turi būti žinoma cheminė medžiagos formulė, norint skaičiuoti teorines vertes ir (arba) tikrinti išmatuotas parametrų vertes, pvz., ThOD, ThCO2, DOC, TOC, COD (žr. 1 ir 2 priedėlius).
      Bandomosios cheminės medžiagos, kurių tirpumas vandenyje yra bent 100 mg/l, ir jei jos nėra lakios ir neadsorbuojamos, gali būti įvertintos visais metodais. Toms cheminėms medžiagoms, kurios mažai tirpsta vandenyje, yra lakios arba yra adsorbuojamos, tinkami metodai nurodyti 1 lentelėje. Būdas, kaip reikia elgtis su mažai vandenyje tirpiomis ir lakiomis medžiagomis, yra aprašytas III priede. Vidutiniškai lakios cheminės medžiagos gali būti bandomos DOC išnykimo metodu, jei bandymų induose (kurie turi būti tinkamai užkimšti) dujoms yra pakankamai vietos. Šiuo atveju turi būti įdiegta abiotinė kontrolė, kad butų galima atsižvelgti į bet kokius fizinius nuostolius.
      1 lentelė
      Bandymų metodų tinkamumas
      
                  Bandymas
               
               
                  Analizės metodas
               
               
                  Tinkamumas medžiagoms, kurios yra:
               
            
                  mažai tirpios
               
               
                  lakios
               
               
                  adsorbuojamos
               
            
                  DOC išnykimas
               
               
                  Ištirpusi organinė anglis
               
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                  +/-
               
            
                  Modifikuotas OECD atrankos bandymas – DOC išnykimas
               
               
                  Ištirpusi organinė anglis
               
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                  +/-.
               
            
                  CO2 išsiskyrimas
               
               
                  Respirometrija: CO2 išsiskyrimas
               
               
                  +
               
               
                  —
               
               
                  +
               
            
                  Manometrinė respirometrija
               
               
                  Manometrinė respirometrija: deguonies suvartojimas
               
               
                  +
               
               
                  +/-
               
               
                  +
               
            
                  Uždarosios kolbos
               
               
                  Respirometrija: ištirpęs deguonis
               
               
                  +/-
               
               
                  +
               
               
                  +
               
            
                  MIT1
               
               
                  Respirometrija: deguonies suvartojimas
               
               
                  +
               
               
                  +/-
               
               
                  +
               
            Norint interpretuoti gautus rezultatus, ypač kai rezultatai yra maži arba nežymūs, reikalinga informacija apie bandomosios medžiagos grynumą arba apie pagrindinių komponentų santykinę dalį.
      Informacija apie bandomųjų medžiagų toksiškumą bakterijoms (4 priedėlis) gali būti labai naudinga, kai reikia pasirinkti tinkamas bandomąsias koncentracijas, ir gali būti esminė, kai reikia teisingai paaiškinti, kodėl biologinio skaidymo vertės yra mažos.
      I.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Norint tikrinti metodiką, lygiagrečiai įprastiems bandymams tinkamai paruoštoje kolboje bandomos etaloninės medžiagos, kurios atitinka lengvo biologinio suskaidymo kriterijus.
      Tinkamos cheminės medžiagos yra anilinas (šviežiai distiliuotas), natrio acetatas ir natrio benzoatas. Visos šios etaloninės medžiagos skaidomos šių bandymų sąlygomis, net jei sėjimo kultūra ir nėra specialiai įdėta.
      Buvo padaryta prielaida, kad reikėtų rasti etaloninę medžiagą, kuri būtų lengvai biologiškai skaidoma, tačiau tik kai yra įdėta sėjimo kultūros. Buvo pasiūlytas kalio hidroftalatas, tačiau prieš tai kaip priimti jį kaip etaloninę medžiagą, reikia apie ją surinkti daugiau duomenų.
      Respirometriniuose bandymuose junginiai su azotu gali turėti įtakos deguonies vartojimui dėl nitrifikavimo (žr. 2 ir 5 priedėlius).
      I.4.   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Į bandomosios medžiagos tirpalą arba suspensiją mineralinėje terpėje dedama sėjimo kultūra ir tirpalas inkubuojamas aerobinėmis sąlygomis tamsoje arba išsklaidytoje šviesoje. DOC kiekis bandomosios medžiagos tirpale, kuris atitinka sėjimo kultūrą, turi būti kiek įmanoma mažesnis lyginant su bandomosios medžiagos DOC kiekiu. Atsižvelgiama į sėjimo kultūros endogeninį aktyvumą, lygiagrečiai darant tuščiuosius bandymus su sėjimo kultūra, bet be bandomosios medžiagos, nors ląstelių endogeninis aktyvumas, kai yra bandomosios medžiagos, nevisiškai tiksliai atitinka aktyvumą endogeninio aktyvumo kontroliniame bandyme. Metodikų veikimui tikrinti lygiagrečiai daromas bandymas su etalonine medžiaga.
      Bendruoju atveju, skaidymo eiga sekama nustatant parametrus, pvz., DOC, CO2 susidarymą ir deguonies suvartojimą; matavimai daromi pakankamai dažnai, kad galima būtų nustatyti biologinio skaidymo pradžią ir pabaigą. Jei naudojami automatiniai respirometrai, matavimas yra nepertraukiamas. Kai matuojamas kitas parametras, kartais papildomai matuojama DOC, tačiau tai paprastai daroma tik bandymo pradžioje ir pabaigoje. Galima naudoti specifinę cheminę analizę, kai norima įvertinti pradinį bandomosios medžiagos suskaidymą ir nustatyti bet kurios susidariusios tarpinės medžiagos koncentraciją (privaloma MITI bandyme).
      Paprastai bandymas tęsiamas 28 paras. Tačiau bandymą galima baigti anksčiau nei po 28 parų, t.y., kai biologinio skaidymo kreivė pasiekia gulsčiąją dalį bent po trijų matavimų. Bandymai gali būti pratęsti ir daromi ilgiau nei 28 paros, kai kreivė rodo, kad biologinis skaidymas prasidėjo, tačiau 28 parą gulsčioj i dalis dar nepasiekta.
      I.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      I.5.1.   Atkuriamumas
      Dėl biologinio skaidymo prigimties ir dėl sėjimo kultūros bakterijų populiacijos mišrios sudėties matavimai turi būti daromi bent du kartus.
      Yra bendras patyrimas, kad, kuo didesnė bandymo pradžioje į bandomąją terpę įdėtų mikroorganizmų koncentracija, tuo mažesnė bus lygiagrečių bandymų sklaida. Tarplaboratorinio lyginimo bandymai taip pat parodė, kad gali būti didelė sklaida tarp rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose, tačiau lengvai biologiškai skaidomų junginių atveju paprastai gaunamas geras sutapimas.
      I.5.2.   Bandymų tinkamumas
      Bandymas yra validus, jei skirtumas tarp bandomosios medžiagos šalinimo pakartotinai gautų kraštinių verčių gulsčioje kreivės dalyje, bandymo pabaigoje arba 10 parų lango pabaigoje, kas tinka, yra mažesnis kaip 20 %, ir jei etaloninės medžiagos skaidymo procentinė vertė iki 14 paros pasiekė lengvojo biologinio skaidymo lygį. Jei bet kuri iš šių sąlygų neįvykdyta, bandymas turi būti pakartotas. Dėl metodų tikslumo mažos vertės nebūtinai reiškia, kad bandomoji medžiaga aplinkos sąlygomis biologiškai neskaidoma, tačiau jos rodo, kad biologiniam skaidomumui nustatyti būtina dirbti toliau.
      Jei toksiškumo bandyme, kuriame yra ir bandomoji medžiaga, ir etaloninė cheminė medžiaga, skaidymas po 14 parų yra mažesnis kaip 35 % (pagal DOC) arba mažesnis kaip 25 % (pagal ThOD arba ThCO2), bandomosios cheminės medžiagos gali būti laikomos inhibuojančiomis (dar žr. 4 priedėlį). Bandymų serijos turi būti pakartotos, jei tai įmanoma, naudojant mažesnę bandomosios medžiagos koncentraciją ir (arba) didesnę sėjimo kultūros koncentraciją, tačiau ne didesnę kaip 30 mg kietųjų dalelių/litre.
      I.6.   BENDROSIOS METODIKOS IR PREPARATAI
      Bendrosios bandymų sąlygos apibendrintos 2 lentelėje. Aparatūra ir kitos eksperimento sąlygos, specifiškai siejamos su atskiru bandymu, aprašytos vėliau to bandymo aprašyme.
      2 lentelė
      Bandymų sąlygos
      
                  Bandymas
               
               
                  DOC išnykimas
               
               
                  CO2 išsiskyrimas
               
               
                  Manometrinė respirometrija
               
               
                  OECD antranos bandymas
               
               
                  Uždarosios kolbos bandymas
               
               
                  MITI (T)
               
            
                  Bandomosios medžiagos koncentracija
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  mg/l
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  100
               
               
                   
               
               
                  2-10
               
               
                  100
               
            
                  mg DOC/l
               
               
                  10-40
               
               
                  10-20
               
               
                   
               
               
                  10-40
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  mg ThOD/l
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  50-100
               
               
                   
               
               
                  5-10
               
               
                   
               
            
                  Sėjimo kultūros koncentracija (ląstelių/l). apytikriai)
               
               
                  ≤ 30 mg/l SS
                  arba ≤ 100 ml ištakio/l
                  (107-108)
               
               
                  0,5 ml antrinio ištakio/l
                  (105)
               
               
                  ≤ 5 ml antrinio ištakio/l
                  (104-106)
               
               
                  30 mg/l SS
                  (107-108)
               
            
                  Elementų koncentracija mineralinėje terpėje
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  P
               
               
                  116
               
               
                  11,6
               
               
                  29
               
            
                  N
               
               
                  1,3
               
               
                  0,13
               
               
                  1,3
               
            
                  Na
               
               
                  86
               
               
                  8,6
               
               
                  17,2
               
            
                  K
               
               
                  122
               
               
                  12,2
               
               
                  36,5
               
            
                  Mg
               
               
                  2,2
               
               
                  2,2
               
               
                  6,6
               
            
                  Ca
               
               
                  9,9
               
               
                  9,9
               
               
                  29,7
               
            
                  Fe
               
               
                  0,05-0,1
               
               
                  0,05-0,1
               
               
                  0,15
               
            
                  pH
               
               
                  7,4±0,2
               
               
                  geriau 7,0
               
            
                  Temperatūra
               
               
                  22 ± 2 oC
               
               
                  25 ± 1 oC
               
            
                  
                              DOC
                           
                           
                              =
                           
                           
                              ištirpusi organinė anglis
                           
                        
               
                  
                              ThOD
                           
                           
                              =
                           
                           
                              teorinis deguonies poreikis
                           
                        
               
                  
                              SS
                           
                           
                              =
                           
                           
                              Suspenduotos kietosios dalelės
                           
                        
            I.6.1.   Skiedimo vanduo
      Naudojamas dejonizuotas arba distiliuotas vanduo, kuriame nebūtų inhibuojančios koncentracijos nuodingųjų medžiagų (pvz., Cu2+ jonų). Vandenyje organinės anglies neturi būti daugiau kaip 10 % to kiekio, kuris yra bandomojoje medžiagoje. Didelis bandymo vandens grynumas reikalingas tam, kad būtų eliminuotos didelės tuščiųjų bandinių vertės. Užterštumas gali atsirasti dėl vandeniui būdingų priemaišų ir dar dėl jonitinių dervų bei bakterijų ir dumblių irimo produktų. Kiekvienoje bandymų serijoje naudokite tik vienos partijos vandenį, iš anksto patikrintą atliekant DOC analizę. Toks tikrinimas nėra būtinas uždarosios kolbos bandyme, tačiau deguonies suvartojimas vandeniu turi būti mažas.
      I.6.2.   Pradiniai mineralinių komponentų tirpalai
      Norint ruošti bandomuosius tirpalus, ruošiami atitinkamų koncentracijų mineralinių komponentų pradiniai tirpalai. DOC išnykimo, modifikuotos OECD atrankos, CO2 išsiskyrimo, manometrinės respirometrijos, uždarosios kolbos bandymuose galima naudoti tokius pradinius (su skirtingais skiedimo faktoriais) tirpalus.
      Skiedimo faktoriai ir specialios mineralinės terpės ruošimas MITI bandymui pateikti konkrečių metodų aprašymuose.
      Pradiniai tirpalai:
      Paruoškite šiuos pardinius tirpalus, naudodami analiziškai grynas medžiagas.
      
                  a)
               
               
                  kalio dihidrofosfatas, KH2PO4
                  
               
               
                  8,50 g
               
            
                  kalio hidrofosfatas, K2HPO4
                  
               
               
                  21,75 g
               
            
                  natrio hidrofosfatas, dihidratas, Na2HPO4. 2 H2O
               
               
                  33,40 g
               
            
                  natrio hidrofosfatas, dihidratas, Na2HPO4. 2 H2O
               
               
                  0,50 g
               
            
                  Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro. Tirpalo pH turi būti 7,4.
               
               
                   
               
            
                  b)
               
               
                  kalcio chloridas, bevandenis, CaCl2
                  
               
               
                  27,50 g
               
            
                  arba kalcio chloridas, dihidratas, CaCl2, 2 H2O
               
               
                  36,40 g
               
            
                  Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro
               
               
                   
               
            
                  c)
               
               
                  magnio sulfatas, heptahidratas, MgSO4. 7 H2O
               
               
                  22,50 g
               
            
                  Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro
               
               
                   
               
            
                  d)
               
               
                  geležies (III) chloridas, heksahidratas, FeC13. 6H2O
               
               
                  0,25 g
               
            
                  Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro
               
               
                   
               
            
         Pastaba: jei nenorite ruošti šį tirpalą prieš patį bandymą, vienam tirpalo litrui įlašinkite vieną lašą konc. HCl arba įdėkite 0,4 g etilendiamintetraacto rūgšties dinatrio druskos (EDTA).
      I.6.3.   Cheminių medžiagų pradiniai tirpalai
      Pavyzdžiui, dejonizuotame vandenyje ištirpinkite 1–10 g, kiek reikia, bandomosios arba etaloninės medžiagos ir skieskite iki 1 litro, jei tirpumas didesnis kaip 1 g/l. Pagal kitą būdą pradinius tirpalus ruošiate mineralinėje terpėje arba cheminę medžiagą dedate tiesiai į mineralinę terpę. Kaip ruošti mažiau tirpias chemines medžiagas, žr. 3 priedėlį, tačiau MITI bandyme (C.4-F metodas), nei tirpikliai, nei emulsikliai neturi būti naudojami.
      I.6.4.   Sėjimo kultūros
      Sėjimo kultūrą galima gauti iš įvairių šaltinių: aktyvusis dumblas, nuotekų ištakiai (nechloruoti), paviršiniai vandenys ir dirvožemiai, arba mišiniai iš šių šaltinių. Jei DOC išnykimo, CO2 išsiskyrimo ir manometrinės respirometrijos bandymams naudojamas aktyvusis dumblas, jis turi būti imamas iš nuotekų valymo įrenginių arba laboratorinių valymo įrenginių, į kuriuos daugiausia patenka buitinės nuotekos. Buvo nustatyta, kad naudojant sėjimo kultūras iš kitų šaltinių, rezultatų sklaida didesnė. Modifikuotam OECD atrankos ir uždarosios kolbos bandymams reikia labiau praskiestos sėjimo kultūros be dumblo dribsnių, todėl labiau pageidautinas šaltinis yra antrinis ištakis iš buitinių nuotekų valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio. MITI bandymui sėjimo kultūra daroma iš įvairių šaltinių gauto mišinio ir aprašyta šio specialaus bandymo skyriuje.
      I.6.4.1.   Sėjimo kultūra iš aktyviųjų dumblų
      Iš daugiausia buitines nuotekas valančio valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio aeravimo tanko surinkite šviežią aktyviojo dumblo bandinį. Prireikus stambias daleles šalinkite filtruodami per tankų tinklinį filtrą ir toliau dumblą laikykite aerobinėmis sąlygomis.
      Kitaip, pašalinę visas stambias daleles, leiskite dumblui nusistoti arba centrifuguokite (pvz., 10 min veikiant 1100 g). Skysti nuo dumblo pilkite lauk. Dumblą galite plauti mineraline terpe. Suspenduokite koncentruotą dumblą mineralinėje terpėje, kad suspenduotų kietų dalelių koncentracija būtų 3–5 g/l, ir aeruokite tol, kol dumblą panaudosite.
      Dumblas turi būti imamas iš gerai veikiančio standartinio įrenginio. Jei dumblą reikia imti iš didelio našumo valymo įrenginio, arba, jei manoma, kad dumble yra inhibitorių, jis turi būti plaunamas. Gerai sumaišytą, pakartotinai suspenduotą dumblą palikite nusistoti arba centrifuguokite, nupilkite nuo jo skystį ir išplautą dumblą dar kartą suspenduokite kitame mineralinės terpės tūryje. Šiuos veiksmus kartojate tol, kol bus galima manyti, kad substrato pertekliaus arba inhibitorių neliko.
      Prieš pat dumblo naudojimą, paimkite vėl visiškai suspenduoto arba neapdoroto dumblo bandinį sausų suspenduotų kietųjų dalelių masei nustatyti.
      Pagal kitą būdą homogenizuokite aktyvųjį dumblą (3–5 g/l suspenduotų kietųjų dalelių). Maišykite dumblą 2 min. vidutiniu greičiu mechaniniame maišiklyje. Palikite sumaišytą dumblą 30 min. arba ilgiau, jei to reikia, ir dekantuokite skystį, kurį naudosite kaip sėjimo kultūrą, pagal normą 10 ml/l mineralinės terpės.
      I.6.4.2.   Kiti sėjimo kultūros šaltiniai
      Ją galima gauti iš valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio, apdorojančių daugiausia buitines nuotekas, antrinio ištakio. Paimkite šviežia bandinį ir, kol gabenate, laikykite jį aerobinėmis sąlygomis. Palikite nusistoti 1 h arba filtruokite per stambų filtrinį popierių, ir dekantuotą ištakį arba filtratą laikykite aerobinėmis sąlygomis, kol naudosite. Vienam litrui mineralinės terpės galima naudoti iki 100 ml šios rūšies sėjimo kultūros.
      Kitas sėjimo terpės šaltinis yra paviršinis vanduo. Šiuo atveju paimkite tinkamo paviršinio vandens, pvz., upės, ežero, bandinį ir laikykite aerobinėmis sąlygomis, kol panaudosite. Prireikus sėjimo kultūrą koncentruokite filtravimo arba centrifugavimo būdu.
      I.6.5.   Sėjimo kultūrų pradinis kondicionavimas
      Sėjimo kultūros gali būti iš anksto kondicionuojamos eksperimento sąlygoms, tačiau iš anksto prie bandomosios cheminės medžiagos neadaptuojamos. Pradinis kondicionavimas susideda iš aktyviojo dumblo tirpalo mineralinėje terpėje arba antrinio ištakio 5–7 parų trukmės aeravimo bandymo temperatūroje. Kartais pradinis kondicionavimas gerina bandymo metodų preciziškumą, nes sumažina tuščiųjų bandinių vertes. Laikoma, kad MITI bandymo sėjimo kultūrai pradinis kondicionavimas yra būtinas.
      I.6.6.   Abiotinio skaidymo kontroliniai bandiniai
      Kai reikia, nustatykite galimą bandomosios medžiagos abiotinį skaidymą, matuodami DOC pašalinimą, deguonies suvartojimą arba anglies dioksido išsiskyrimą steriliuose kontroliniuose bandiniuose be pasėtos kultūros. Sterilizuokite filtravimu per membraną (0,2–0,45 μm) arba pridėkite reikiamos koncentracijos tinkamos nuodingos medžiagos. Jei naudojamas filtravimas per membraną, sterilumui užtikrinti bandinius imkite steriliai. Jei bandomosios medžiagos adsorbcija nebuvo iš anksto pašalinta, bandymai, kuriuose skaidymas nustatomas matuojant DOC šalinimą, ypač jei sėjimo kultūra iš aktyviojo dumblo, turi būti su abiotinio skaidymo kontroliniu bandiniu, į kurį dedama sėjimo kultūra ir nuodijama.
      I.6.7.   Kolbų skaičius
      Kolbų skaičius tipiškame bandyme nurodytas skyriuje su atitinkamo metodo aprašymu. Galima naudoti tokio tipo kolbas:
      bandomoji suspensija: su bandomąja medžiaga ir sėjimo kultūra,
      
                  —
               
               
                  sėjimo kultūros tuščiasis bandinys: tik su sėjimo kultūra,
               
            
                  —
               
               
                  metodikos tikrinimo bandinys: su etalonine medžiaga ir sėjimo kultūra,
               
            
                  —
               
               
                  abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandinys: sterilus, su bandomąja medžiaga (žr. I.6.6),
               
            
                  —
               
               
                  adsorbcijos kontrolinis bandinys: su bandomąja medžiaga, sėjimo kultūrą ir sterilizavimo agentą,
               
            
                  —
               
               
                  toksiškumo kontrolinis bandinys: su bandomąja medžiaga, etalonine medžiaga ir sėjimo
               
            
                  —
               
               
                  kultūra.
               
            Būtina, kad nustatymas bandomojoje suspensijoje ir sėjimo kultūros tuščiajame bandinyje būtų daromas lygiagrečiai. Patartina matavimus kitose kolbose taip pat daryti lygiagrečiai.
      Tačiau tai ne visuomet įmanoma. Užtikrinkite, kad būtų paimtas pakankamas skaičius bandinių arba padaryta matavimų, norint įvertinti pašalinimo procentinę vertę po 10 parų lango.
      I.7.   DUOMENYS IR VERTINIMAS
      Skaičiuojant skaidymo procentinę vertę, Dt, naudojamos vidutinės vertės dviejų parametro matavimų bandymų kolboje ir tuščiajame bandinyje su sėjimo kultūra. Formulės pateiktos kituose konkrečius bandymus aprašančiuose skyriuose. Skaidymo eiga vaizduojama grafiškai ir pažymimas 10 parų langas. Apskaičiuokite ir pateikite medžiagos šalinimo, baigiantis 10 parų langui, procentinę vertę ir gulsčiąją kreivės dalį atitinkančią vertę arba bandymo pabaigos vertę, kuri tinka.
      Respirometriniuose bandymuose junginiai turintys azoto gali veikti deguonies suvartojimą dėl nitrifikavimo (žr. 2 ir 5 priedėlius).
      I.7.1.   Skaidymas, nustatytas pagal DOC kiekio matavimą
      Skaidymo procentinė vertė Dt kiekvieną kartą, kai buvo paimtas bandinys, turi būti skaičiuojama atskirai kolboms su bandomąją medžiaga, naudojant dviejų DOC matavimu vidutines vertes, kad būtų galima įvertinti bandymo tinkamumą (žr. I.5.2.). Skaidymas skaičiuojamas pagal lygtį:
      
         
      čia:
      
                  Dt
                  
               
               
                  =
               
               
                  skaidymo % laiku t,
               
            
                  Co
                  
               
               
                  =
               
               
                  vidutinė pradinė DOC koncentracija terpėje su bandomąja medžiaga ir pasėta kultūra (DOC mg/l),
                  
               
            
                  Ct
                  
               
               
                  =
               
               
                  vidutinė DOC koncentracija terpėje su bandomąja medžiaga ir pasėta kultūra laiku t (DOC mg/l),
                  
               
            
                  Cbo
                  
               
               
                  =
               
               
                  vidutinė pradinė DOC koncentracija tuščiojo bandinio terpėje su pasėta kultūra (DOC mg/l),
                  
               
            
                  Cbt
                  
               
               
                  =
               
               
                  vidutinė DOC koncentracija tuščiojo bandinio terpėje su pasėta kultūra (DOC mg/l).
                  
               
            Visos koncentracijos nustatomos eksperimentiškai.
      I.7.2.   Skaidymas, nustatytas darant specifinę analizę
      Kai yra specifinės analizės duomenys, pradinis biologinis skaidymas skaičiuojamas pagal formulę:
      
         
      čia:
      
                  Dt
                  
               
               
                  =
               
               
                  skaidymo % laiku t, paprastai 28 paros,
               
            
                  Sa
                  
               
               
                  =
               
               
                  likutinis bandomosios medžiagos kiekis terpėje su sėjimo kultūra bandymo pabaigoje (mg),
               
            
                  Sb
                  
               
               
                  =
               
               
                  likutinis bandomosios medžiagos kiekis tuščiajame bandinyje su vandeniu (terpe), į kurį buvo įdėta tik bandomoji medžiaga (mg).
               
            1.7.3.   Abiotinis skaidymas
      Naudojant sterilų kontrolinį bandinį abiotiniam skaidymui nustatyti, abiotinio skaidymo procentinė vertė skaičiuojama pagal formulę:
      
         
      čia:
      
                  Cs(o)
                  
               
               
                  =
               
               
                  DOC koncentracija steriliame kontroliniame bandinyje 0 parą
               
            
                  C s(t)
                  
               
               
                  =
               
               
                  DOC koncentracija steriliame kontroliniame bandinyje t parą
               
            I.8.   ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  bandomoji ir etaloninė cheminė medžiaga, jų grynumas,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų sąlygos,
               
            
                  —
               
               
                  sėjimo kultūra: prigimtis ir ėmimo vieta (-os), koncentracija ir bet koks pradinis kondicionavimas,
               
            
                  —
               
               
                  nuotekose esančių pramoninių nuotekų dalis ir kiekis, jei tai žinoma,
               
            
                  —
               
               
                  bandymo trukmė ir temperatūra,
               
            
                  —
               
               
                  apdorojimo būdas mažai tirpių cheminių medžiagų atveju,
               
            
                  —
               
               
                  taikytas bandymų metodas; būtina moksliškai pagrįsti ir paaiškinti bet kokį metodikos keitimą,
               
            
                  —
               
               
                  specifikacija,
               
            
                  —
               
               
                  visi stebėti inhibavimo reiškiniai,
               
            
                  —
               
               
                  bet koks stebimas abiotinis skaidymas,
               
            
                  —
               
               
                  specifinės cheminės analizės duomenys, jei yra,
               
            
                  —
               
               
                  analiziniai duomenys apie tarpinius produktus, jei yra,
               
            
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos ir etaloninės medžiagos skaidymo procentinės dalies kitimo laike grafikas; turi būti aiškiai nurodyta vėlavimo fazė, skaidymo fazė, 10 parų langas ir kreivės krypties koeficientas (1 priedėlis). Jei bandymas atitinka tinkamumo kriterijus, grafikui sudaryti galima naudoti skaidymo procentinių verčių vidutines vertes, gautas kolbose su bandomąja medžiaga,
               
            
                  —
               
               
                  šalinimo procentinė dalis po 10 parų lango ir kreivės gulsčioje dalyje arba bandymo pabaigoje.
               
            II DALIS.   DOC IŠNYKIMO BANDYMAS (C.4-A metodas)
      
      II.1.   METODO ESMĖ
      Išmatuotas mineralinės terpės su sėjimo kultūra ir žinomos koncentracijos bandomąja medžiaga (nuo 10 iki 40 mg/l DOC), kuri nominaliai yra vienintelis organinės anglies šaltinis, tūris yra aeruojamas tamsoje arba išsklaidytoje šviesoje 22 ± 2 oC temperatūroje.
      Skaidymas sekamas, 28 paras trumpais intervalais darant DOC analizę. Biologinio skaidymo laipsnis skaičiuojamas, pašalintos DOC koncentraciją (pataisyta dėl DOC koncentracijos sėjimo kultūros tuščiajame kontroliniame bandinyje) reiškiant pradinės koncentracijos procentine dalimi. Pradinio biologinio skaidymo laipsnį galima skaičiuoti pagal papildomą cheminę analizę, daromą inkubavimo pradžioje ir pabaigoje.
      II.2.   METODO APRAŠYMAS
      II.2.1.   Aparatūra
      
                  a)
               
               
                  Kūginės kolbos, pvz., nuo 250 ml iki 2 litrų, tūris priklauso nuo DOC analizei reikalingo tūrio;
               
            
                  b)
               
               
                  Pustyklė, skirta kūginėms kolboms dėti, arba su automatiniu termostatavimu arba naudojama patalpoje su pastovia temperatūra, ir pakankamo galingumo, kad visose kolbose galima būtų palaikyti aerobines sąlygas;
               
            
                  c)
               
               
                  Filtravimo aparatas, su tinkamomis membranomis;
               
            
                  d)
               
               
                  DOC analizatorius;
               
            
                  e)
               
               
                  Ištirpusio deguonies nustatymo aparatūra;
               
            
                  f)
               
               
                  Centrifuga.
               
            II.2.2.   Mineralinės terpės ruošimas
      Apie pradinių tirpalų ruošimą, žr. I.6.2.
      Sumaišykite 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilkite po 1 ml (b) – (d) tirpalų ir praskieskite skiedimo vandeniu iki 1 litro.
      II.2.3.   Sėjimo kultūros ruošimas ir pradinis kondicionavimas
      Sėjimo kultūrą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyvusis dumblas; nuotekų ištakiai; paviršiniai vandenys; dirvožemiai arba mišiniai iš šių šaltinių.
      Žr. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. ir I.6.5.
      II.2.4.   Kolbų ruošimas
      Pavyzdžiui, į atskiras 2 l kūgines kolbas įpilkite po 800 ml mineralinės terpės ir pakankamą tūrį bandomosios ir etaloninės medžiagos pradinių tirpalų, kad ekvivalentinė DOC koncentracija būtų 10-40 mg/l. Patikrinkite pH vertę ir prireikus nustatykite lygią 7,4. Įdėkite į kolbas sėjimo kultūros iš aktyviojo dumblo arba kito šaltinio (žr. I.6.4.), kad galutinė suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija būtų ne didesnė kaip 30 mg/l. Taip pat paruoškite sėjimo kultūros tirpalo mineralinėje terpėje kontrolinį bandinį, kuriame nebūtų bandomosios arba etaloninės medžiagos.
      Jei reikia, vieną indą naudokite tikrinti galimam bandomosios medžiagos inhibuojamajam poveikiui, į panašios koncentracijos bandomosios ir etaloninės medžiagų tirpalą mineralinėje terpėje įdėję sėjimo kultūros.
      Be to, jei reikia, paruoškite dar vieną sterilią kolbą su bandomąja medžiaga be sėjimo kultūros, kad galėtumėte nustatyti, arba vyksta bandomosios medžiagos abiotinis skaidymas (žr. I.6.6.).
      Papildomai, jei kyla įtarimas, kad bandomąją medžiagą žymiai adsorbuoja stiklas, dumblas ir t. t., padarykite parengiamąjį įvertinimą galimam adsorbcijos laipsniui nustatyti ir, tuo pačiu, bandymo tinkamumui šiai bandomajai medžiagai (žr. 1 lentelę). Paruoškite kolbą su bandomąja medžiaga, sėjimo kultūra ir sterilizavimo agentu.
      Visus tirpalus kolbose skieskite mineraline terpe iki 1 l ir, tirpalus sumaišę, iš kiekvienos kolbos paimkite bandinį DOC pradinei koncentracijai nustatyti (žr. II.4 priedą). Uždenkite kolbų angas pvz., aliuminio folija taip, kad tarp kolbos ir ją supančios aplinkos būtų laisvi oro mainai. Tuomet bandymui pradėti įstatykite kolbas į purtyklę.
      II.2.5.   Kolbų skaičius tipiškame bandyme
      1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija
      3 ir 4 kolba: sėjimo kultūros tuščiasis bandinys
      5 kolba: metodikos tikrinimo bandinys
      ir pageidautina bei kai būtina:
      6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandinys
      7 kolba: adsorbcijos kontrolinis bandinys
      8 kolba: toksiškumo kontrolinis bandinys
      Žr. dar I.6.7.
      II.2.6.   Bandymų eiga
      Visą bandymo laiką žinomais laiko tarpais, bet pakankamai dažnai, kad galima būtų nustatyti 10 parų lango pradžią ir šalinimo procentinę vertę 10 parų lango pabaigoje, kiekvienoje kolboje po du kartus nustatykite DOC koncentraciją. Imkite tik mažiausią bandomosios suspensijos tūrį, reikalingą kiekvienam nustatymui.
      Jei būtina, prieš imdami bandinį, kompensuokite garavimo iš kolbų nuostolius, įpildami reikiamą kiekį skiedimo vandens (I.6.1). Prieš imdami bandinį, gerai sumaišykite kultūros terpę ir užtikrinkite, kad prieš bandinio ėmimą ant kolbos sienelių prilipusi medžiaga būtų ištirpinta arba suspenduota. Paėmę bandinį, jį iš karto filtruokite per membraninį filtrą arba centrifuguokite (žr. II.4 priedą). Nufiltruotus arba centrifuguotus bandinius analizuokite tą pačią dieną, arba laikykite 2-4 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 48 h, jei ilgiau – žemesnėje kaip - 18 oC temperatūroje.
      II.3.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      II.3.1.   Rezultatų apdorojimas
      Apskaičiuokite skaidymo procentinę vertę laiku t, kaip nurodyta I.7.1. (DOC nustatymas) ir, neprivalomai, kaip I.7.2. (specifinė analizė).
      Visus rezultatus užrašykite pateiktose specifikacijose.
      II.3.2.   Rezultatų tinkamumas
      Žr. I.5.2.
      II.3.3.   Ataskaita
      Žr. I.8.
      II.4.   SPECIFIKACIJA
      Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.
      DOC IŠNYKIMO BANDYMAS
      
                  1.
               
               
                  LABORATORIJA
               
            
                  2.
               
               
                  BANDYMŲ PRADŽIOS DATA
               
            3.   BANDOMOJI MEDŽIAGA
      Pavadinimas:
      Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l, kaip cheminės medžiagos
      Pradinė koncentracija terpėje, t0: mg/l, kaip cheminės medžiagos
      4.   SĖJIMO KULTŪRA
      Šaltinis:
      Kaip apdorota:
      Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:
      Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l.
      5.   ANGLIES NUSTATYMAS
      Anglies analizatorius:
      
                   
               
               
                  Kolba Nr.
               
               
                   
               
               
                  DOC (mg/l) po n parų
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                  nx
                  
               
            
                  Bandomoji cheminė medžiaga ir sėjimo kultūra
               
               
                  1
               
               
                  a1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a, vidutinė vertė
                  Ca(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  b1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b. vidutinė vertė
                  Cb(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Sėjimo kultūros tuščiasis bandinys be bandomosios medžiagos
               
               
                  3
               
               
                  C1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  C2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  C, vidutinė verte Cc(t),
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  4
               
               
                  d1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  d2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  d, vidutinė vertė
                  Cd(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            6.   NEAPDOROTŲ DUOMENŲ VERTINIMAS
      
                  Kolba Nr.
               
               
                   
               
               
                  % skaidymo po n parų
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                  nx
                  
               
            
                  1
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Vidutinė vertė (3)
                  
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
         Pastaba. Panašūs formatai gali būti taikomi etaloninei medžiagai ir toksiškumo kontroliniams handiniams.
      7.   ABIOTINIO SKAIDYMO KONTROLINIS BANDINYS (neprivalomas)
      
      
                   
               
               
                  Laikas (paros)
               
            
                  0
               
               
                  t
               
            
                  DOC koncentracija (mg/l) steriliame kontroliniame bandinyje
               
               
                  Cs(o)
                  
               
               
                  Cs(t)
                  
               
            
         
      8.   SPECIFINĖ CHEMINĖ ANALIZĖ (neprivaloma)
      
      
                   
               
               
                  Bandomosios medžiagos likutinis kiekis bandymo pabaigoje (mg/l)
               
               
                  % pirminio skaidymo
               
            
                  Sterilus kontrolinis bandinys
               
               
                  Sb
                  
               
               
                   
               
            
                  Bandymo terpė su sėjimo kultūra
               
               
                  sa
                  
               
               
                  
                     
               
            III DALIS.   MODIFIKUOTAS OECD ATRANKOS BANDYMAS (C.4-B metodas)
      
      III.1.   METODO ESMĖ
      Į išmatuotą mineralinės terpės tūrį su žinoma koncentracija bandomosios medžiagos (nuo 10 iki 40 mg/l DOC), kuri nominaliai yra vienintelis organinės anglies šaltinis, įpilama sėjimo kultūros 0,5 ml 1 l terpės. Mišinys yra aeruojamas tamsoje arba išsklaidytoje šviesoje 22 ± 2 oC temperatūroje.
      Skaidymas sekamas, 28 paras trumpais intervalais darant DOC analizę. Biologinio skaidymo laipsnis skaičiuojamas, pašalintos DOC koncentraciją (pataisyta dėl DOC koncentracijos sėjimo kultūros tuščiajame kontroliniame bandinyje) reiškiant pradinės koncentracijos procentine dalimi. Pradinio biologinio skaidymo laipsnį galima skaičiuoti pagal papildomą cheminę analizę, daromą inkubavimo pradžioje ir pabaigoje.
      III.2.   METODO APRAŠYMAS
      III.2.1.   Aparatūra
      
      
                  1)
               
               
                  Kūginės kolbos, pvz., nuo 250 ml iki 2 litrų, tūris priklauso nuo DOC analizei reikalingo tūrio;
               
            
                  2)
               
               
                  Purtyklė skirta kūginėms kolboms dėti, kuri būtų arba su automatiniu termostatavimu arba naudojama patalpoje su pastovia temperatūra, ir pakankamo galingumo, kad visose kolbose galima būtų palaikyti aerobines sąlygas;
               
            
                  3)
               
               
                  Filtravimo aparatas, su tinkamomis membranomis;
               
            
                  4)
               
               
                  DOC analizatorius;
               
            
                  5)
               
               
                  Ištirpusio deguonies nustatymo aparatūra;
               
            
                  6)
               
               
                  Centrifuga.
               
            III.2.2.   Mineralinės terpės ruošimas
      Apie pradinių tirpalų ruošimą, žr. I.6.2.
      Sumaišykite 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilkite po 1 ml (b) – (d) tirpalų ir praskieskite skiedimo vandeniu iki 1 litro.
      Šiame metode kaip sėjimo kultūra naudojama tik 0,5 ml ištakio/litre ir todėl gali tekti didinti terpės mikroelementų ir augimo faktorių koncentraciją. Tai daroma įpilant po 1 ml kiekvieno šių tirpalų vienam galutinio terpės tūrio litrui.
      Mikroelementų tirpalas:
      
                  Mangano sulfatas, tetrahidratas, MnSO4. 4H2O
               
               
                  39,9 mg
               
            
                  Boro rūgštis, H3BO3
                  
               
               
                  57,2 mg
               
            
                  Zinko sulfatas, heptahidratas, ZnSO4. 7H2O
               
               
                  42,8 mg
               
            
                  Amonio heptamolibdatas, (NH4)6 MO7O24
                  
               
               
                  34,7 mg
               
            
                  Fe-chelatas (FeCl3 ir etilendiamintetraacto rūgštis)
               
               
                  100,0 mg
               
            
                  Ištirpinkite skiedimo vandenyje ir praskieskite juo iki 1 000 ml.
               
               
                   
               
            
                  Vitaminų tirpalas:
               
               
                   
               
            
                  Mielių ekstraktas
               
               
                  15,0 mg
               
            Ištirpinkite mielių ekstraktą 100 ml vandens. Sterilizuokite filtruodami per 0,2 μm membraną arba pagaminkite šviežiai.
      III.2.3.   Sėjimo kultūros ruošimas ir pradinis kondicionavimas
      Sėjimo kultūrą ruošiama iš nuotekų valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio, valančių daugiausia buitines nuotekas, antrinio ištakio. Žr. I.6.4.2. ir I.6.5.
      Naudojama 0,5 ml vienam litrui mineralinės terpės.
      III.2.4.   Kolbų ruošimas
      Pavyzdžiui, į atskiras 2 l kūgines kolbas įpilkite po 800 ml mineralinės terpės ir pakankamą tūrį bandomosios ir etaloninės medžiagos pradinių tirpalų, kad ekvivalentinė DOC koncentracija būtų 10–40 mg/l. Patikrinkite pH vertę ir prireikus nustatykite lygią 7,4. Įdėkite į kolbas 0,5 ml/l sėjimo kultūros iš nuotekų ištakio (žr. I.6.4.2), kad galutinė suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija būtų ne didesnė kaip 30 mg/l. Taip pat paruoškite sėjimo kultūros tirpalo mineralinėje terpėje kontrolinį bandinį, kuriame nebūtų bandomosios arba etaloninės medžiagos.
      Jei reikia, vieną indą naudokite tikrinti galimam bandomosios medžiagos inhibuojamajam veikimui, į panašios koncentracijos bandomosios ir etaloninės medžiagų tirpalą mineralinėje terpėje įdėję sėjimo kultūros. Be to, jei reikia, paruoškite dar vieną sterilią kolbą su bandomąja medžiaga be sėjimo kultūros, kad galėtumėte nustatyti, arba vyksta bandomosios medžiagos abiotinis skaidymas (žr. I.6.6.).
      Papildomai, jei kyla įtarimas, kad bandomąją medžiagą žymiai adsorbuoja stiklas, dumblas ir t.t., padarykite parengiamąjį įvertinimą galimam adsorbcijos laipsniui nustatyti ir, tuo pačiu, bandymo tinkamumui šiai bandomajai medžiagai (žr. 1 lentelę). Paruoškite kolbą su bandomąja medžiaga, sėjimo kultūra ir sterilizavimo agentu.
      Visus tirpalus kolbose skieskite mineraline terpe iki 1 l ir, tirpalus sumaišę, iš kiekvienos kolbos paimkite bandinį DOC pradinei koncentracijai nustatyti (žr. II.4 priedą). Uždenkite kolbų angas
      pvz., aliuminio folija taip, kad tarp kolbos ir ją supančios aplinkos būtų laisvi oro mainai. Tuomet bandymui pradėti įstatykite kolbas į purtyklę.
      III.2.5.   Kolbų skaičius tipiškame bandyme
      1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija
      3 ir 4 kolba: sėjimo kultūros tuščiasis bandinys
      5 kolba: metodikos tikrinimo bandinys
      ir pageidautina bei kai būtina:
      6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandinys
      7 kolba: adsorbcijos kontrolinis bandinys
      8 kolba: toksiškumo kontrolinis bandinys
      Žr. dar I.6.7.
      III.2.6.   Bandymų eiga
      Visą bandymą žinomais laiko intervalais, bet pakankamai dažnai, kad galima būtų nustatyti 10 parų lango pradžią ir procentinę šalinimo vertę 10 parų lango pabaigoje, nustatykite po du kartus DOC koncentracijas kiekvienoje kolboje. Imkite tik minimalų kiekvienam nustatymui reikalingą bandomosios suspensijos tūrį.
      Jei būtina, prieš imdami bandinį kompensuokite garavimo iš kolbų nuostolius, įpildami reikiamą kiekį skiedimo vandens (I.6.1). Prieš imdami bandinį, gerai sumaišykite kultūros terpę ir užtikrinkite, kad prieš bandinio ėmimą ant kolbos sienelių prilipusi medžiaga būtų ištirpinta arba suspenduota. Paėmę bandinį, jį iš karto filtruokite per membraninį filtrą arba centrifuguokite (žr. II.4 priedą). Nufiltruotus arba centrifuguotus bandinius analizuokite tą pačią dieną, arba laikykite 2-4 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 48 h, jei ilgiau – žemesnėje kaip - 18 oC temperatūroje.
      III.3.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      III.3.1.   Rezultatų apdorojimas
      Apskaičiuokite skaidymo procentinę vertę laiku t, kaip nurodyta I.7.1. (DOC nustatymas) ir, neprivalomai, kaip I.7.2 (specifinė analizė).
      Visus rezultatus užrašykite pateiktose specifikacijose.
      III.3.2.   Rezultatų tinkamumas
      
      Žr. I.5.2.
      III.3.3.   Ataskaita
      
      Žr. I.8.
      III.4.   SPECIFIKACIJA
      Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.
      MODIFIKUOTAS OECD ATRANKOS BANDYMAS
      
                  1.
               
               
                  LABORATORIJA
               
            
                  2.
               
               
                  BANDYMO PRADŽIOS DATA
               
            3.   BANDOMOJI MEDŽIAGA
      Pavadinimas:
      Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l, kaip cheminės medžiagos
      Pradinė koncentracija terpėje: mg/l, kaip cheminės medžiagos
      4.   SĖJIMO KULTŪRA
      Šaltinis:
      Kaip apdorota:
      Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:
      Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l
      5.   ANGLIES NUSTATYMAS
      
      Anglies analizatorius:
      
                   
               
               
                  Kolba Nr.
               
               
                   
               
               
                  DOC (mg/l) po n parų
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                  nx
                  
               
            
                  Bandomoji cheminė medžiaga ir sėjimo kultūra
               
               
                  1
               
               
                  a1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a, vidutinė vertė
                  Ca(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  b1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b. vidutinė vertė
                  Cb(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Sėjimo kultūros tuščiasis bandinys be bandomosios medžiagos
               
               
                  3
               
               
                  C1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  C2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  C, vidutinė verte Cc(t),
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  4
               
               
                  d1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  d2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  d, vidutinė vertė
                  Cd(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            6.   NEAPDOROTŲ DUOMENŲ VERTINIMAS
      
                  Kolba nr
               
               
                   
               
               
                  skaidymo % po n parų
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                  nx
                  
               
            
                  1
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Vidutinė vertė (4)
                  
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
         Pastaba. Panašūs formatai gali būti taikomi etaloninei medžiagai ir toksiškumo kontroliniams handiniams.
      7.   ABIOTINIO SKAIDYMO KONTROLINIS BANDINYS (neprivalomas)
      
      
                   
               
               
                  Laikas (dienos)
               
            
                  0
               
               
                  t
               
            
                  DOC koncentracija (mg/l) steriliame kontroliniame bandyme
               
               
                  Cs(o)
                  
               
               
                  Cs(t)
                  
               
            
         
      8.   SPECIFINĖ CHEMlNĖ ANALIZĖ (neprivaloma)
      
      
                   
               
               
                  Bandomosios medžiagos likutis bandymo pabaigoje (mg/l)
               
               
                  Pirminis suirimas, %
               
            
                  Sterilus kontrolinis bandinys
               
               
                  Sb
                  
               
               
                   
               
            
                  Bandymu terpė su sėjimu kultūra
               
               
                  Sa
                  
               
               
                  
                     
               
            IV DALIS.   CO2 IŠSISKYRIMO BANDYMAS (C.4-C metodas)
      
      IV.1.   METODO ESMĖ
      Žinomas mineralinės terpės su sėjimo kultūra turis, kuriame kaip vienintelis nominalus organinės anglies šaltinis yra žinomos koncentracijos bandomoji cheminė medžiaga (10-20 mg DOC arba TOC/l), tamsoje arba išsklaidytoje šviesoje yra aeruojamas, reguliuojamu greičiu barbotuojant anglies dioksido neturintį orą. Skaidymas 28 paras stebimas, nustatant susidariusio anglies dioksido, sugeriamo bario arba natrio hidroksidu, kiekį, matuojamą likusio hidroksido titravimu arba kaip neorganinė anglis. Iš bandomosios cheminės medžiagos susidariusio anglies dioksido kiekis (pataisytas atimant anglies dioksido, susidarančio tuščiajame bandinyje su sėjimo kultūra, kiekį) yra skaičiuojamas kaip procentinė ThCO2 vertė. Kitaip biologinio skaidymo laipsnį galima skaičiuoti, nustatant papildomą DOC kiekį inkubavimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje.
      IV.2.   METODO APRAŠYMAS
      IV.2.1.   Aparatūra
      
                  a)
               
               
                  2-5 litrų talpos kolbos, kiekviena su aeravimo vamzdžiu, siekiančiu beveik indo dugną, ir išleidimo anga;
               
            
                  b)
               
               
                  magnetiniai maišikliai, kai vertinamos mažai tirpios cheminės medžiagos;
               
            
                  c)
               
               
                  dujų sugėrimo kolbos;
               
            
                  d)
               
               
                  įtaisas reguliuoti ir matuoti oro srautą;
               
            
                  e)
               
               
                  aparatas anglies dioksidui išplauti, kuriuo ruošiamas oras, neturintis anglies dioksido; pagal kitą būdą galima naudoti iš balionų tiekiamų CO2 neturinčio deguonies ir CO2 neturinčio azoto mišinį, dujas maišant teisingu santykiu (20 % O2: 80 % N2);
               
            
                  f)
               
               
                  įtaisas anglies dioksidui nustatyti titravimo būdu arba kokio nors tipo neorganinės anglies analizatorius;
               
            
                  g)
               
               
                  membraninio filtravimo įtaisas (neprivalomas);
               
            
                  h)
               
               
                  DOC analizatorius (neprivalomas).
               
            IV.2.2.   Mineralinės terpės ruošimas
      Apie pradinių tirpalų ruošimą, žr. I.6.2.
      Sumaišykite 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilkite po 1 ml (b) – (d) tirpalų ir praskieskite skiedimo vandeniu iki 1 litro.
      IV.2.3.   Sėjimo kultūros ruošimas ir pradinis kondicionavimas
      Sėjimo kultūrą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyvusis dumblas; nuotekų ištakiai; paviršiniai vandenys; dirvožemiai arba mišiniai iš šių šaltinių.
      Žr. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. ir I.6.5.
      IV.2.4.   Kolbų ruošimas
      Kaip pavyzdys, toliau nurodyti tūriai ir masės 5 litrų kolboms su 3 1 suspensijos. Jei naudojate mažesnius tūrius, kiekius atitinkamai keiskite, tačiau užtikrinkite, kad būtų galima tiksliai matuoti susidariusio anglies dioksido kiekį.
      Į kiekvieną 5 litrų kolbą įpilkite 2400 ml mineralinės terpės. Įpilkite atitinkam tūrį paruošto aktyviojo dumblo (žr. I.6.4.1. ir I.6.5.), kad suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija mišinio su sėjimo kultūra galutiniame 3 1 tūryje būtų ne didesnė kaip 30 mg/l. Kitas būdas, kai paruoštas dumblas iš pradžių skiedžiamas mineralinėje terpėje ruošiant 500 – 1000 mg/l suspensiją, po to alikvotinis šios suspensijos tūris pilamas į 5 litrų kolbos turinį, kad koncentracija būtų 30 mg/l; tai užtikrina didesnį preciziškumą. Galima naudoti kitus sėjimo kultūros šaltinius (žr. I.6.4.2).
      Per naktį šiuos mišinius su sėjimo kultūra aeruokite CO2 neturinčiu oru, kad iš sistemos būtų išvalytas anglies dioksidas.
      Į lygiagrečiam bandymui skirtas kolbas atskirai įpilkite bandomosios ir etaloninės medžiagų žinomus pradinių tirpalų tūrius, kad dėl įdėtų cheminių medžiagų būtų gautos nuo 10 iki 20 mg DOC arba TOC/l koncentracijos; į kai kurias kolbas cheminių medžiagų nedėkite, bet palikite jas kaip sėjimo kultūros kontrolinius bandinius. Mažai tirpias medžiagas dėkite tiesiai į kolbas, remdamiesi mase arba tūriu, arba darykite, kaip aprašyta III priede.
      Jei reikia, vieną kolbą naudokite bandomosios cheminės medžiagos galimam inhibuojamajam veikimui tikrinti, įdėdami į ją ir bandomosios, ir etaloninės cheminės medžiagos, kurių koncentracija būtų tokia pat, kaip ir kitose kolbose.
      Be to, jei reikia patikrinti, arba nevyksta bandomosios cheminės medžiagos abiotinis skaidymas, turėkite sterilią kolbą su bandomąja chemine medžiaga be sėjimo kultūros (žr. I.6.6.). Sterilizuokite įdėdami atitinkamos koncentracijos nuodingos medžiagos.
      Suspensijas visose kolbose skieskite iki 3 1, įpildami mineralinės terpės, prieš tai aeruojamos CO2 neturinčiu oru. Neprivaloma, bet galima siurbti bandinius DOC analizei (žr. II.4 priedą) ir specifinei analizei. Prie kolbų oro išleidimo angų prijunkite dujų sugėrimo kolbas.
      Jei naudojamas bario hidroksidas, prie kiekvienos 5 1 kolbos nuosekliai prijunkite po tris dujų sugėrimo kolbas, kurių kiekvienoje būtų 100 ml 0,0125 M bario hidroksido tirpalo. Tirpale neturi būti sulfato ir karbonato nuosėdų ir jo koncentracija turi būti nustatyta prieš pat tirpalo naudojimą. Jei naudojamas natrio hidroksidas, junkite dvi gaudykles, antroji būtų kontrolinė, siekiant parodyti, kad visas anglies dioksidas buvo absorbuotas pirmoje gaudyklėje. Tinka dujų sugėrimo kolbos, uždarytos serumo butelių dangčiais. Į kiekvieną kolbą įpilkite 200 ml 0,05 M natrio hidroksido tirpalo, kurio pakanka sugerti visą kiekį anglies dioksido, išsiskyrusio visiškai suskaldant bandomąją medžiagą. Natrio hidroksido tirpalas, net šviežiai paruoštas, turi karbonatų pėdsakus; pataisa padaroma, atimant tuščiajame bandinyje susidariusio karbonato kiekį.
      IV.2.5.   Kolbų skaičius tipiškame bandyme
      1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija
      3 ir 4 kolba: sėjimo kultūros tuščiasis bandinys
      5 kolba: metodikos tikrinimo bandinys ir pageidautina bei kai būtina:
      6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandinys
      7 kolba: toksiškumo kontrolinis bandinys
      8 kolba: toksiškumo kontrolinis bandinys
      Žr. dar I.6.7.
      IV.2.6.   Bandymų eiga
      Pradėkite bandymą, per suspensiją barbotuodami 30-100 ml/min oro be CO2srautą. CO2nustatyti periodiškai imkite anglies dioksido absorbento bandinius. Norint identifikuoti 10 parų lango periodą, rekomenduojama pirmąsias dešimt dienų analizę daryti kas antrą arba trečią dieną, o po to iki 28 paros – kas penktą dieną.
      28 parą paimkite bandinius (neprivalomai) DOC ir (arba) specifinei analizei, išmatuokite suspensijų pH vertes ir į kiekvieną kolbą įpilkite 1 ml koncentruotos druskos rūgšties; aeruokite kolbas per naktį, kad iš bandomųjų suspensijų būtų pašalintas anglies dioksidas. 29 parą darykite paskutinę išsiskyrusio anglies dioksido analizę.
      CO2 matavimo dieną atjunkite arčiausiai kolbos prijungtą absorberį su bario hidroksidu, ir titruokite bario hidroksido tirpalą 0,05 M HC1 tirpalu, indikatoriumi naudodami fenolftaleiną. Perkelkite likusius absorberius per vieną vietą arčiau kolbos ir kitame nuosekliai sujungtų absorberių gale prijunkite naują absorberį su 100 ml šviežio 0,0125 M bario hidroksido. Titruokite, kai tai būtina, pvz., kai pirmojoje gaudyklėje matyti daug nuosėdų, bet jų dar nėra antroje, arba bent kartą per savaitę. Iš kitos pusės, jei absorbentu naudojamas NaOH, švirkštu iš arčiau kolbos stovinčio absorberio paimkite mažą natrio hidroksido tirpalo bandinį (tai priklauso nuo naudojamo anglies analizatoriaus charakteristikų). Purkškite bandinį į anglies analizatoriaus IC dalį, kad galėtumėte tiesiogiai nustatyti išsiskyrusį anglies dioksidą.
      Antrosios gaudyklės turinį analizuokite tik bandymo pabaigoje, kad būtų galima padaryti pataisą dėl galimo anglies dioksido išnešimo.
      IV.3.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      IV.3.1.   Rezultatų apdorojimas
      Absorberyje sugerto CO2 kiekis nustatomas pagal tokią titravimo formulę:
      mg CO2 = (100 × CB-0,5 × V × CA) × 44
      čia:
      
                  V
               
               
                  =
               
               
                  100 ml absorberio turinio titruoti sunaudotos HC 1 tūris (ml),
               
            
                  CB
                  
               
               
                  =
               
               
                  bario hidroksido tirpalo koncentracija (M),
               
            
                  CA
                  
               
               
                  =
               
               
                  druskos rūgšties tirpalo koncentracija (M),
               
            jei CB lygi 0,0125 M ir CA lygi 0,05 M, 100 ml bario hidroksido tirpalui titruoti reikia 50 ml, ir CO2 masė nustatoma pagal lygtį:
      
         
      Taigi šiuo atveju, titravimui sunaudoto HC1 tūrio perskaičiavimo į susidariusio CO2 mg faktorius yra 1,1.
      Naudodami atitinkamas titravimo vertes, apskaičiuokite vien iš sėjimo kultūros bei iš sėjimo kultūros ir bandomosios cheminės medžiagos gauto CO2 mases, ir šių masių skirtumas yra masė CO2, susidariusio vien tik iš bandomosios cheminės medžiagos.
      Pavyzdžiui, jei vien tik sėjimo kultūros bandinio titravimas duoda 48 ml, o sėjimo terpės ir bandomosios cheminės medžiagos bandinio titravimas duoda 45 ml,
      CO2 iš sėjimo kultūros = 1,1 × (50-48) = 2,2 mg
      CO2 iš sėjimo kultūros ir bandomosios cheminės medžiagos = 1,1 x (50-45) = 5,5 mg
      taigi, iš bandomosios cheminės medžiagos susidariusio C02 masė lygi 3,3 mg.
      Procentine biologinio skaidymo vertė skaičiuojama pagal formulę:
      
         
      arba,
      
         
      3,67 yra anglies masės perskaičiavimo į anglies dvideginio masę (44/12) faktorius.
      Skaidymo po bet kurio laiko intervalo procentinę vertę gaukite, pridėdami procentines ThCO2 vertes, apskaičiuotas kiekvienai parai, iki to laiko, kuriuo jis buvo išmatuotas.
      Absorberiams su natrio hidroksidu susidariusio anglies dioksido kiekį, išreikštą IC (mg), skaičiuokite daugindami IC koncentraciją absorbente iš absorbento tūrio.
      Procentinę skaidymo vertė skaičiuokite pagal:
      
         
      Apskaičiuokite DOC šalinimą (neprivaloma), kaip aprašyta I.7. Užrašykite šiuos ir visus kitus rezultatus pridėtose specifikacijose.
      IV.3.2.   Rezultatų tinkamumas
      Bandomosios cheminės medžiagos suspensijos mineralinėje terpėje IC kiekis bandymo pradžioje turi būti mažesnis kaip 5 % TC, ir tuščiajame bandinyje bandymo pabaigoje viso išsiskyrusio CO2 kiekis paprastai neturi būti didesnis kaip 40 mg/l terpės. Jei gaunamos didesnės kaip 70 mg CO2/litre vertės, duomenys ir eksperimento metodika turi būti kritiškai ištirti.
      Žr. dar I.5.2.
      IV.3.3.   Ataskaita
      Žr. I.8.
      IV.4.   SPECIFIKACIJA
      ANGLIES DIOKSIDO IŠSISKYRIMO BANDYMAS
      
                  1.
               
               
                  LABORATORIJA
               
            
                  2.
               
               
                  BANDYMO PRADŽIOS DATA
               
            3.   BANDOMOJI MEDŽIAGA
      Pavadinimas:
      Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l, kaip cheminės medžiagos
      Pradinė koncentracija terpėje: mg/l, kaip cheminės medžiagos
      Bendrasis į kolbą įdėtos C kiekis: mg C
      Th CO2: mg CO2
      
      4.   SĖJIMO KULTŪRA
      Šaltinis:
      Kaip apdorota:
      Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:
      Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l
      
                  5.
               
               
                  ANGLIES DIOKSIKO SUSIKARYMAS IR SKAIDOMUMAS
                  Metodas: Ba(OH)2/NaOH/kitas
               
            
                  Laikas
                  (paros)
               
               
                  CO2 susidarę
                  bandinyje (mg)
               
               
                  CO2 susidaręs tuščiajame bandinyje
                  (mg)
               
               
                  CO2 susidaręs bendras (mg)
                  (bandinio vidutinė vertė minus tuščiojo bandinio vidutinė vertė)
               
               
                  ThCO2
                  
                  bendras 
               
            
                  1
                  2
               
               
                  vidutinė vertė
               
               
                  3
                  4
               
               
                  vidutinė vertė
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  vidutinė vertė
               
            
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  n1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  n2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  n3
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  28
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
         Pastaba. Panašūs formatai gali būti taikomi etaloninei medžiagai ir toksiškumo kontroliniams handiniams.
      6.   ANGLIES ANALIZĖ (neprivaloma)
      
      Anglies analizatorius:
      
                  Laikas (paros)
               
               
                  Tuščiasis bandinys, mg/l
               
               
                  Bandomoji cheminė medžiaga, mg/l
               
            
                  0
               
               
                  Cb(o)
                  
               
               
                  C0
                  
               
            
                  28 (5)
                  
               
               
                  Cb(t)
                  
               
               
                  Ct
                  
               
            
         
      7.   ABIOTINIS SKAIDYMAS (neprivalomas)
      
      
         
      V DALIS.   MANOMETRINIS RESPIROMETRINIS BANDYMAS (C.4-D metodas)
      
      V.1.   METODO ESMĖ
      Išmatuotas mineralinės terpės su sėjimo kultūra tūris, turintis žinomos koncentracijos bandomąją cheminę medžiagą (100 mg/litre bandomosios medžiagos, duodančios bent 50-100 mg ThOD/litre), kuri nominaliai yra vienintelis organinės anglies šaltinis, pastovioje temperatūroje (± 1 oC arba tiksliau) maišomas graduotoje kolboje iki 28 parų. Deguonies suvartojimas nustatomas arba matuojant deguonies (elektrolitiškai pagaminto) kiekį, kurio reikia pastoviam dujų tūriui respirometro kolboje palaikyti, arba pagal tūrio arba slėgio (arba abiejų kartu) kitimą aparate. Išsiskyręs anglies dioksidas sugeriamas kalio hidroksido tirpalu arba kitu tinkamu absorbentu. Bandomąja chemine medžiaga suvartoto deguonies kiekis (darant pataisą kiekiui deguonies, suvartotam lygiagrečiai daromame tuščiajame bandyme su sėjimo kultūra) yra reiškiamas procentine ThOD arba COD verte. Neprivalomai, iš papildomos specifinės analizės, daromos bandymo pradžioje ir pabaigoje, duomenų galima apskaičiuoti pirminį biologinį skaidymą, o darant DOC analizę – biologinį suskaidymą.
      V.2.   METODO APRAŠYMAS
      V.2.1.   Aparatūra
      
                  a)
               
               
                  tinkamas respirometras,
               
            
                  b)
               
               
                  termostatas, palaikantis temperatūra ± 1 oC tikslumu arba geriau,
               
            
                  c)
               
               
                  membraninio filtravimo įtaisas (neprivalomas),
               
            
                  d)
               
               
                  anglies analizatorius (neprivalomas).
               
            V.2.2.   Mineralinės terpės ruošimas
      Apie pradinių tirpalų ruošimą, žr. I.6.2.
      Sumaišykite 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilkite po 1 ml (b) – (d) tirpalų ir praskieskite skiedimo vandeniu iki 1 litro.
      V.2.3.   Sėjimo kultūros ruošimas ir pradinis kondicionavimas
      Sėjimo kultūrą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyvusis dumblas; nuotekų ištakiai; paviršiniai vandenys; dirvožemiai arba mišiniai iš šių šaltinių.
      Žr. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. ir I.6.5.
      V.2.4.   Kolbų ruošimas
      Mineraline terpe skiesdami pradinius tirpalus, ruoškite atskiras serijas bandomosios ir etaloninės cheminių medžiagų tirpalų, kuriuose cheminės medžiagos koncentracija paprastai būtų 100 mg/litre (gauti ThOD bent 50-100 mg/litre).
      ThOD skaičiuokite pagal amonio druskų susidarymą, jei nesitikite nitrifikavimo, kai skaičiuoti reikia pagal nitratų susidarymą (žr. II.2 priedą).
      Nustatykite pH vertes ir prireikus nustatykite 7,4±0,2.
      Mažai tirpios medžiagos turi būti pridedamos vėlesnėje pakopoje (žr. toliau).
      Jei reikia nustatyti bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą, ruoškite dar vieną tirpalą mineralinėje terpėje, kuriame būtų ir bandomoji ir etaloninė medžiagos tokios koncentracijos, kokios yra atskiruose tirpaluose.
      Jei reikia matuoti fizikocheminį deguonies suvartojimą, ruoškite bandomosios cheminės medžiagos tirpalą, paprastai 100 mg ThOD/litre, kuris buvo sterilizuotas pridedant tinkamos nuodingos medžiagos (žr. I.6.6.).
      Įpilkite reikiamus bandomosios ir etaloninės medžiagos tirpalų tūrius, atitinkamai, bent į dvi kolbas. Į kitas kolbas įpilkite tik mineralinės terpės (sėjimo kultūros kontroliniai bandiniai) ir, jei reikia, maišytą bandomosios ir etaloninės cheminių medžiagų tirpalą ir sterilų tirpalą.
      Jei bandomoji medžiaga mažai tirpi, dėkite jos pagal masę arba tūrį tiesiai šioje pakopoje arba apdorokite, kaip aprašyta III priede. Į CO2-absorberio sekcijas įpilkite kalio hidroksido, natrio kalkių granulių arba kito absorbento.
      V.2.5.   Kolbų skaičius tipiškame bandyme
      1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija
      3 ir 4 kolba: sėjimo kultūros tuščiasis bandinys
      5 kolba: metodikos tikrinimo bandinys pageidautina bei kai būtina:
      6 kolba: sterilus kontrolinis bandinys
      7 kolba: toksiškumo kontrolinis bandinys
      8 kolba: toksiškumo kontrolinis bandinys
      Žr. dar I.6.7.
      V.2.6.   Bandymų eiga
      Leiskite kolboms pasiekti tinkamą temperatūrą ir į atitinkamas kolbas įdėkite tiek sėjimo kultūros iš paruošto aktyviojo dumblo arba kitokio jos šaltinio, kad suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija būtų ne didesnė kaip 30 mg/litre. Surinkite įrangą, įjunkite purtyklę, patikrinkite hermetiškumą ir pradėkite matuoti deguonies suvartojimą. Paprastai toliau prižiūrėti nereikia, išskyrus tai, kad užrašote būtinus rodmenis ir darote kasdienius tikrinimus, norėdami įsitikinti, arba teisinga temperatūra ir atitinkamas maišymas.
      Pagal dažnai ir reguliariais tarpais užrašomus rodmenis skaičiuokite deguonies suvartojimą, taikydami įrangos gamintojo nurodytus metodus. Inkubavimo pabaigoje, paprastai po 28 parų, matuokite kolbų turinio pH, ypač jei deguonies suvartojimas yra mažas arba didesnis nei ThODNH4 (azoto turintiems junginiams).
      Jei reikia, bandymo pradžioje ir pabaigoje iš respirometrinių kolbų paimkite bandinius DOC analizei arba specifinei cheminei analizei (žr. II.4 priedą). Imdami bandymo pradžioje užtikrinkite, kad kolboje likusios bandomosios suspensijos tūris būtų žinomas. Kai deguonį vartoja azoto turinti bandomoji medžiaga, nustatykite nitrito ir nitrato koncentracijos didėjimą per 28 paras ir apskaičiuokite pataisą dėl deguonies, suvartoto nitrifikavimui (V priedas).
      V.3.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      V.3.1.   Rezultatų apdorojimas
      Padalinkite kiekį (mg) deguonies, suvartoto bandomąja chemine medžiaga per tam tikrą laiką (pataisytą kiekiu deguonies, suvartoto per tą patį laiką tuščiajame sėjimo kultūros bandinyje) iš paimtos bandomosios cheminės medžiagos masės. Taip gausite BOD, skaičiuojamą mg deguonies/mg bandomosios cheminės medžiagos, taigi:
      
         
      = mg O2 vienam mg bandomosios cheminės medžiagos
      biologinio skaidymo procentinę vertę skaičiuokite pagal:
      
         
      arba pagal:
      
         
      Reikia pažymėti, kad šie du metodai nebūtinai duoda tą pačią vertę; geriau naudoti pirmesnį metodą.
      Azoto turinčioms medžiagoms naudokite atitinkamas ThOD vertes (NH4 arba NO3) pagal tai, kas yra žinoma apie nitrifikavimo galimybę arba ko iš jo laukiama (II.2 priedas). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisas nitrifikuoti suvartotam deguoniui skaičiuokite pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (V priedas).
      Kai neprivalomai daroma organinės anglies ir (arba) specifinė analizė, apskaičiuokite skaidymo procentinę vertę, kaip tai aprašyta I.7.
      Visus rezultatus užrašykite į pridedamas specifikacijas.
      V.3.2.   Rezultatų tinkamumas
      Paprastai deguonies suvartojimas sėjimo kultūros tuščiajame bandinyje per 28 paras yra 20-30 mg O2/litre ir neturi būti didesnis kaip 60 mg/litre. Jei vertės didesnės kaip 60 mg/litre, būtina kritiškai ištirti duomenis ir eksperimento metodikas. Jei pH vertė nepatenka į 6-8,5 intervalą, o bandomoji medžiaga deguonies suvartoja mažiau kaip 60 %, bandymas turi būti pakartotas su mažesne bandomosios cheminės medžiagos koncentracija.
      Žr. dar I.5.2.
      V.3.3.   Ataskaita
      Žr. I.8.
      V.4.   SPECIFIKACIJA
      
      Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.
      MANOMETRINĖS RESPIROMETRIJOS BANDYMAS
      
                  1.
               
               
                  LABORATORIJA
               
            
                  2.
               
               
                  BANDYMO PRADŽIOS DATA
               
            3.   BANDOMOJI MEDŽIAGA
      Pavadinimas:
      Pradinio tirpalo koncentracija: mg/litre
      Pradinė koncentracija terpėje, C0: mg/litre
      Tūris bandymų kolboje (V): ml
      ThOD arba COD: mg O2/mg bandomosios medžiagos (NH4 or NO3)
      4.   SĖJIMO KULTŪRA
      Šaltinis:
      Kaip apdorota:
      Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:
      Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l
      5.   DEGUONIES SUVARTOJIMAS: BIOLOGINIS SKAIDOMUMAS
      
                   
               
               
                  Czas (dni)
               
            
                  0
               
               
                   
               
               
                  7
               
               
                   
               
               
                  14
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  21
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  28
               
               
                   
               
            
                  O2 suvartojimas. (mg) bandomoji cheminė medžiaga
               
               
                  1
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a, vidutinė vertė
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  O2 suvartojimas (mg) tuščiasis bandinys
               
               
                  3
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  4
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b, vidutinė vertė
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Pataisyta BOD vertė (mg)
               
               
                  (a1- bm)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  (a2- bm)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  BOD vienam mg bandomosios cheminės medžiagos
               
               
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  skaidymo %
                  
                     
               
               
                  D1 (a1)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  D2 (a2)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  vidutinė vertė (6)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  V = terpės tūris bandymų kolboje
               
            
         Pastaba. Panašūs formatai gali būti taikomi etaloninei medžiagai ir toksiškumo kontroliniams handiniams.
      6.   PATAISA DĖL NITRIFIKAVIMO (žr. 5 priedėlį)
      
      
                  Para
               
               
                  0
               
               
                  28
               
               
                  Skirtumas
               
            
                  
                              i)
                           
                           
                              Nitrato koncentracija (mg N/litre)
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                  (N)
               
            
                  
                              ii)
                           
                           
                              Deguonies ekvivalentas (4,57 × N × V) (mg)
                           
                        
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                   
               
            
                  
                              iii)
                           
                           
                              Nitrito koncentracija (mg N/litre)
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                  (N)
               
            
                  
                              iv)
                           
                           
                              Deguonies ekvivalentas (3,43 × N × V) (mg)
                           
                        
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                   
               
            
                  
                              ii + iv)
                           
                           
                              Bendrasis deguonies ekvivalentas
                           
                        
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                   
               
            7.   ANGLIES ANALIZĖ (neprivaloma)
      
      Anglies analizatorius:
      
                  Laikas (paros)
               
               
                  Tuščiasis bandinys, mg/litre
               
               
                  Bandomoji cheminė medžiaga, mg/litre
               
            
                  0
               
               
                  Cb(o)
                  
               
               
                  C0
                  
               
            
                  28 (7)
                  
               
               
                  Cb(t)
                  
               
               
                  Ct
                  
               
            
         
      8.   SPECIFINĖ CHEMINĖ ANALIZĖ (neprivaloma)
      
      
                  Sb
                  
               
               
                  =
               
               
                  koncentracija fizikocheminių procesų (steriliame) kontroliniame bandinyje po 28 parų
               
            
                  Sa
                  
               
               
                  =
               
               
                  koncentracija kolboje su sėjimo kultūra po 28 parų.
               
            
         
      9.   ABIOTINIS SKAIDYMAS (neprivalomas)
      
      
                  a
               
               
                  =
               
               
                  deguonies suvartojimas steriliose kolbose po 28 parų (mg)
               
            
         
      (žr. 1 ir 3 skyrius)
      
         
      VI DALIS.   UŽDAROSIOS KOLBOS BANDYMAS (C.4-E metodas)
      
      VI.1   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Į bandomosios cheminės medžiagos tirpalą mineralinėje terpėje, paprastai 2-5 mg/litre, dedama sėjimo kultūra, turinti palyginti mažai mikroorganizmų iš mišrios populiacijos, ir laikomas tamsoje visiškai pilnose ir uždarytose kolbose pastovios temperatūros sąlygomis. Skaidymas sekamas 28 paras analizuojant ištirpusį deguonį. Bandomąja medžiaga suvartotas deguonies kiekis, padarius pataisą deguoniui, suvartotam lygiagrečiai daromame tuščiajame bandyme su sėjimo kultūra, yra išreikiamas procentine ThOD arba COD verte.
      VI.2   METODO APRAŠYMAS
      VI.2.1.   Aparatūra
      
                  a)
               
               
                  BOD kolbos, su šlifo kamščiais, pvz., 250–300 ml;
               
            
                  b)
               
               
                  Vandens vonia arba inkubatorius, kolboms laikyti pastovioje temperatūroje (± 1 oC arba geriau) ir be apšvietimo;
               
            
                  c)
               
               
                  Didelės stiklinės kolbos (2-5 litrų) terpei ruošti ir BOD kolboms pildyti;
               
            
                  d)
               
               
                  Deguonies elektrodas ir matuoklis, arba įranga ir reagentai titruoti Winklerio metodu.
               
            VI.2.2.   Mineralinės terpės ruošimas
      Apie pradinių tirpalų ruošimą, žr. I.6.2.
      Sumaišykite po 1 (vieną) ml (a) – (d) tirpalų ir praskieskite skiedimo vandeniu iki 1 litro.
      VI.2.3.   Sėjimo kultūros ruošimas
      Sėjimo kultūra paprastai gaunama iš nuotekų valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio, į kuriuos daugiausia patenka buitinės nuotekos, antrinio ištakio. Alternatyvus sėjimo kultūros šaltinis yra paviršinis vanduo. Paprastai 1 litrui terpės naudokite nuo vieno lašo (0,05 ml) iki 5 ml filtrato; gali tekti daryti bandymus, kad galėtumėte nustatyti tam tikram ištakiui optimalų tūrį (žr. I.6.4.2 ir I.6.5).
      VI.2.4.   Kolbų ruošimas
      Stipriai aeruokite mineralinę terpę bent 20 min. Darykite kiekvieną bandymų grupę su mineraline terpe, pagaminta vienoje partijoje. Dažniausiai terpė yra tinkama naudoti po 20 h laikymo bandymo temperatūroje. Kontrolės tikslams nustatykite ištirpusio deguonies koncentraciją; jos vertė 20 oC temperatūroje turi būti apie 9 mg/litre. Visus oru prisotintos terpės pernešimo ir užpildymo veiksmus darykite, neleisdami susidaryti oro burbuliukams, pvz., naudodami sifonus.
      Paruoškite lygiagrečias BOD kolbų grupes bandomajai ir etaloninei cheminei medžiagai nustatyti tuo pat metu daromų eksperimentų serijose. Surinkite pakankamą skaičių BOD kolbų, įskaitant kolbas tuščiajam bandiniui su sėjama kultūra, kad galėtumėte daryti bent po du deguonies suvartojimo matavimus tinkamais laiko tarpais, pvz., po 0, 7, 14, 21 ir 28 parų. Norint užtikrinti galimybę identifikuoti 10 parų langą, kolbų gali reikėti daugiau.
      Į dideles kolbas įpilkite visiškai aeruotos mineralinės terpės, kad ji užimtų maždaug trečdalį kolbos tūrio. Tuomet į atskiras dideles kolbas įpilkite pakankamą kiekį bandomosios ir etaloninės cheminių medžiagų pradinių tirpalų, taip kad galutinė cheminių medžiagų koncentracija paprastai būtų ne didesnė kaip 10 mg/litre. Į vieną didelę kolbą su tuščiojo kontrolinio bandinio terpę cheminių medžiagų nedėkite.
      Norint užtikrinti, kad sėjimo kultūros aktyvumas nebūtų ribojamas, deguonies koncentracija BOD kolbose neturi sumažėti daugiau kaip iki 0,5 mg/litre. Tai nustato maždaug 2 mg/litre ribą bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai. Tačiau sunkiai skaidomų junginių ir tų junginių, kurių ThOD mažas, koncentracija gali būti 5–10 mg/litre. Kai kuriais atvejais būtų patartina daryti lygiagrečias bandymų serijas su dviem bandomosios cheminės medžiagos koncentracijomis, pvz., 2 ir 5 mg/litre. Paprastai ThOD skaičiuokite pagal amonio druskų susidarymą, tačiau, jei manoma arba žinoma, kad gali vykti nitrifikavimas, skaičiuokite remdamiesi nitrato susidarymu (ThODNO3: žr. 2 priedėlį). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisas nitrifikuoti suvartotam deguoniui skaičiuokite pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (5 priedėlis)
      Jei turi būti ištirtas bandomosios medžiagos toksiškumas (pvz., jei anksčiau buvo nustatytos mažos biologinio skaidomumo vertės), reiki turėti dar vieną kolbų seriją.
      Paruoškite dar vieną didelę kolbą, kurioje būtų aeruota mineralinė terpė (maždaug trečdalis kolbos tūrio) ir bandomoji bei etaloninė cheminės medžiagos, kurių galutinė koncentracija būtų tokia pati, kaip ir kitose didelėse kolbose.
      Į tirpalus didelėse kolbose įpilkite sėjimo kultūros iš antrinio ištakio (nuo vieno lašo arba apie 0,05 ml iki 5 ml/litre) arba iš kito šaltinio, pvz., upės vandens (žr. I.6.4.2). Pabaigoje tirpalus skieskite aeruota mineraline terpe iki žymės ant kolbos, naudodami į jos dugną nuleistą žarną, kad būtų atitinkamas maišymas.
      VI.2.5.   Kolbų skaičius tipiškame bandyme
      Tipiškame bandyme naudojamos tokios kolbos:
      
                  —
               
               
                  bent 10 su bandomąja chemine medžiaga ir sėjimo kultūra (bandomoji suspensija),
               
            
                  —
               
               
                  bent 10 tik su sėjimo kultūra (tuščiasis sėjimo kultūros bandinys),
               
            
                  —
               
               
                  bent 10 su etalonine chemine medžiaga ir sėjimo kultūra (metodikos tikrinimo bandinys),
               
            
                  —
               
               
                  ir, kai būtina, 6 kolbos su bandomąja chemine medžiaga, etalonine chemine medžiaga ir sėjimo kultūra (toksiškumo kontrolinis bandinys). Tačiau, norint užtikrinti galimybę identifikuoti 10 parų langą, kolbų reikėtų maždaug du kartus daugiau.
               
            VI.2.6.   Bandymų eiga
      
      Naudodami žarną, nuleistą į apatinį atitinkamos didelės kolbos ketvirtį (ne į dugną), iš karto išpilstykite kiekvieną paruoštą tirpalą į atitinkamą BOD kolbų grupę, taip kad visos BOD kolbos būtų visiškai užpildytos. Švelniai patapšnokite kolbas, kad būtų pašalinti visi oro burbuliukai. Neatidėliojant nustatykite pradinę deguonies koncentraciją kolbose, taikydami Winkler'io arba elektrodo metodą. Kolbų turinį galite išsaugoti analizei Winkler'io metodu vėliau, pridėdami mangano (II) sulfato ir natrio hidroksido (pirmasis Winkler'io reagentas). Gerai užkimštas kolbas su deguonimi, surištu į rudą mangano (III) hidratuotą oksidą, laikykite tamsoje 10-20 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas prieš darydami likusius veiksmus pagal Winkler'io metodą. Likusias lygiagrečiai paruoštas kolbas užkimškite taip, kad į jas nepatektų oro burbuliukų, ir inkubuokite tamsoje 20 oC temperatūroje. Kiekvieną seriją turi lydėti pilna lygiagreti serija, skirta tuščiojo bandinio terpės su sėjimo kultūra analizei. Paimkite iš kiekvienos serijos bent po dvi kolbas ištirpusio deguonies analizei tam tikrais laiko tarpais (bent kas savaitę) per 28 inkubavimo paras.
      Savaitiniai bandiniai turi leisti įvertinti šalinimo procentinę vertę 14 parų lange, tuo tarpu bandinių analizė kas 3–4 paras turi leisti identifikuoti 10 parų langą, o tam reikėtų maždaug du kartus daugiau kolbų.
      Azoto turinčioms medžiagoms turi būti daroma pataisa dėl deguonies suvartojimo bet kokiame nitrifikavimo procese. Tai padaryti taikykite O2-elektrodo metodą ištirpusio deguonies koncentracijai nustatyti, o po to iš BOD kolbos paimkite bandinį nitrito ir nitrato analizei. Pagal nitrito ir nitrato koncentracijos padidėjimą apskaičiuokite suvartotą deguonį (žr. 5 priedėlį).
      VI.3.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      VI.3.1.   Rezultatų apdorojimas
      Iš pradžių apskaičiuokite BOD, kuris pasireiškia per kiekvieną laiko periodą, atimdami deguonies suvartojimo tuščiajame bandinyje vertę (mg O2/litre) iš deguonies suvartojimo bandomąja medžiaga. Gauti savitajai BOD vertei, skaičiuojamai mg deguonies vienam mg bandomosios cheminės medžiagos, šią pataisytą suvartojimo vertę dalinkite iš bandomosios medžiagos koncentracijos (mg/litre). Biologinio skaidomumo procentinę vertę skaičiuokite dalindami savitąjį BOD iš savitojo ThOD (apskaičiuoto pagal II.2 priedą) arba COD (nustatyto analizės būdu, žr. II.3 priedą), taigi:
      
         
      = kiekis O2 (mg) vienam mg bandomosios cheminės medžiagos
      
         
      Arba
      
         
      Reikia pažymėti, kad šie du metodai nebūtinai duoda tą pačią vertę; geriau naudoti pirmesnį metodą.
      Azoto turinčioms medžiagoms naudokite atitinkamas ThOD vertes (NH4 arba NO3) pagal tai, kas yra žinoma apie nitrifikavimo galimybę arba ko iš jo laukiama (II.2 priedas). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisas nitrifikuoti suvartotam deguoniui skaičiuokite pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (V priedas).
      VI.3.2.   Rezultatų tinkamumas
      Deguonies suvartojimas tuščiajame bandinyje su sėjimo kultūra po 28 parų turi būti ne didesnis kaip 1,5 mg/litre ištirpusio deguonies. Jei vertės didesnės, reikia tikrinti eksperimento metodikas. Likutinė deguonies koncentracija bet kuriuo momentu bandymo kolbose neturi sumažėti daugiau kaip iki 0,5 mg/litre. Tokių mažų deguonies lygių nustatymas yra tinkamas tik tokiu atveju, jei ištirpusio deguonies nustatymo metodu įmanoma tiksliai juos matuoti.
      Žr. dar I.5.2.
      VI.3.3.   Ataskaita
      Žr. I.8.
      VI.4.   SPECIFIKACIJA
      Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.
      UŽDAROSIOS KOLBOS BANDYMAS
      
                  1.
               
               
                  LABORATORIJA
               
            
                  2.
               
               
                  BANDYMO PRADŽIOS DATA
               
            3.   BANDOMOJI MEDŽIAGA
      Pavadinimas:
      Pradinio tirpalo koncentracija: mg/litre
      Pradinė koncentracija kolboje: mg/litre
      ThOD arba COD: mg O2/mg bandomosios medžiagos
      4.   SĖJIMO KULTŪRA
      Šaltinis:
      Kaip apdorota:
      Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:
      Koncentracija reakcijos mišinyje: mg/litre
      5.   DO NUSTATYMAS
      Metodas: Winklerio elektrodas
      
         Kolbų turinio analizė
      
      
                  Inkubavimo trukmė (paros)
               
               
                  DO (mg/l)
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                   
               
            
                  Tuščiasis bandinys (be cheminės medžiagos)
               
               
                  1
               
               
                  C1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  C2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Vidutinė vertė
               
               
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Bandomoji cheminė medžiaga
               
               
                  1
               
               
                  a1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                   
               
               
                  2
               
               
                  a2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Vidutinė vertė
               
               
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
         Pastaba. Panašus formatas gali būti taikomas etaloninei medžiagai ir toksiškumo kontroliniam bandiniui.
      6.   PATAISA DĖL NITRIFIKAV1MO (žr. 5 priedėlį)
      
      
                  Inkubavimo trukmė (paros)
               
               
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
            
                  
                              i)
                           
                           
                              Nitrato koncentracija (mg N/litre)
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              ii)
                           
                           
                              Nitrato koncentracijos pokytis (mg N/litre)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              iii)
                           
                           
                              Deguonies ekvivalentas (mg/litre)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              iv)
                           
                           
                              Nitrito koncentracija (mg N/litre)
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              v)
                           
                           
                              Nitrato koncentracijos pokytis (mg N/litre)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              vi)
                           
                           
                              Deguonies ekvivalentas (mg/litre)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              iii + vi)
                           
                           
                              Bendrasis deguonies ekvivalentas (mg/litre)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            7.   DO SUVARTOJIMAS. % SKAIDYMO
      
                   
               
               
                  Suvartota per n parų (mg/litre)
               
            
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                   
               
            
                  KOLBA 1: (mto- mtx) – (mbo – mbx)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  KOLBA 2: (mto- mtx) – (mbo- mbx)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  KOLBA 1:
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  KOLBA 2:
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            D % vidutinė vertė (8) = 
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  mto
                  
               
               
                  =
               
               
                  vertė bandymo kolboje laiku 0
               
            
                  mtx
                  
               
               
                  =
               
               
                  vertė bandymo kolboje laiku x
               
            
                  mbo
                  
               
               
                  =
               
               
                  tuščiojo bandinio vidutinė vertė laiku 0
               
            
                  mbx
                  
               
               
                  =
               
               
                  tuščiojo bandinio vidutinė vertė laiku x
               
            Taip pat darykite pataisą dėl nitrifikavimo, naudodami 6 skyriaus iii + vi.
      8.   DO SUVARTOJIMAS TUŠČIAME BANDINYJE
      Deguonies suvartojimas tuščiajame bandinyje: (mbo – mb28) mg/litre. Šis suvartojimas svarbus bandymo tinkamumui. Suvartojimas turi būti mažesnis kaip 1,5 mg/litre.
      VII DALIS.   M.I.T.I. BANDYMAS (C.4-F metodas)
      
      VII.1.   METODO ESMĖ
      Deguonies suvartojimas maišomu bandomosios medžiagos tirpalu arba suspensija mineralinėje terpėje, į kurį dedama specialiai auginta neadaptuotų mikroorganizmų kultūra, 28 paras automatiškai matuojamas tamsoje ir 25 ± 1 oC temperatūroje laikomame uždarame respirometre. Išsiskyręs anglies dioksidas absorbuojamas natrio kalkėmis. Biologinis skaidomumas reiškiamas deguonies suvartojimo (pataisyto dėl suvartojimo tuščiajame bandinyje) procentine teorinio suvartojimo (ThOD) dalimi. Be to, pirminio biologinio skaidomumo procentinė vertė skaičiuojama pagal papildomos specifinės cheminės analizės, daromos inkubavimo pradžioje ir pabaigoje, duomenis ir, neprivalomai, pagal DOC analizės duomenis.
      VII.2.   METODO APRAŠYMAS
      VII.2.1.   Aparatūra
      
                  a)
               
               
                  Automatinis elektrolitinis BOD matuoklis arba respirometras. paprastai su 6 kolbomis, kurių kiekvienos tūris 300 ml, ir su indu CO2 absorbentui laikyti;
               
            
                  b)
               
               
                  Patalpa su pastovia temperatūra ir (arba) vandens vonia 25 oC ± 1 oC arba geriau;
               
            
                  c)
               
               
                  Membraninio filtravimo įtaisas (neprivalomas);
               
            
                  d)
               
               
                  Anglies analizatorius (neprivalomas).
               
            VII.2.2.   Mineralinės terpės ruošimas
      Paruoškite šiuos pradinius tirpalus, naudodami analiziškai grynus reagentus ir vandenį (I.6. 1.):
      
                  a)
               
               
                  Kalio dihidrofosfatas, KH2PO4
                  
               
               
                  8,50 g
               
            
                  Kalio hidrofosfatas, K2HPO4
                  
               
               
                  21,75 g
               
            
                  Natrio hidrofosfatas, dodekahidratas, Na2HPO4 12 H2O
               
               
                  44,60 g
               
            
                  Amonio chloridas, NH4Cl
               
               
                  1,70 g
               
            
                  Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro
               
               
                   
               
            
                  Tirpalo pH turi būti 7,2
               
               
                   
               
            
                  b)
               
               
                  Magnio sulfatas, heptahidratas, MgSO4 7 H2O
               
               
                  22,50 g
               
            
                  Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro
               
               
                   
               
            
                  (c)
               
               
                  Kalcio chloridas, bevandenis, CaCl2
                  
               
               
                  27,50 g
               
            
                  Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro
               
               
                   
               
            
                  (d)
               
               
                  Geležies (III) chloridas, heksahidratas, FeCl3 6 H2O
               
               
                  0,25 g
               
            
                  Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro
               
               
                   
               
            Imkite 3 ml kiekvieno (a), (b), (c) ir (d) tirpalo ir praskieskite iki 1 litro.
      VII.2.3.   Sėjimo kultūros ruošimas
      Surinkite šviežius bandinius iš ne mažiau kaip dešimties vietų, daugiausia iš tokių, kuriose naudojamos ir šalinamos įvairios cheminės medžiagos. Iš įvairiausių vietų, pvz., nuotekų valymo įrenginių, pramoninių nuotekų valymo įrenginių, upių, ežerų, jūrų, surinkite 1 l dumblo, paviršiaus dirvožemio, vandens ir t.t. bandinių ir gerai juos kartu sumaišykite. Pašalinkite paviršiuje plaukiojančias medžiagas ir palikite nusistoti, po to natrio hidroksidu arba fosforo rūgštimi nustatykite skysčio virš nuosėdų pH vertę 7 ± 1.
      Atitinkamą filtruoto skysčio virš nuosėdų tūrį naudokite užpildyti aktyviojo dumblo užpildymo ir išleidimo (fill-and-draw) indą ir aeruokite skystį maždaug 23½ h. Trisdešimt minučių po aeravimo pabaigos maždaug trečdalį viso skysčio virš nuosėdų išpilkite lauk ir ant nusodintos medžiagos užpilkite tokį pat tūrį tirpalo (pH 7), kuriame būtų po 0,1 % gliukozės, peptono ir kalio dihidrofosfato, ir vėl aeruokite. Kartokite šią procedūrą kartą per dieną. Dumblo įrenginys turi būti eksploatuojamas, laikantis geros praktikos: ištakiai turi būti skaidrūs, turi būti palaikoma 25 ± 2 oC temperatūra, pH turi būti 7 ± 1, dumblas turi gerai nusistoti, turi būti pakankamas aeravimas, kad mišinys visą laiką būtų aerobinis, turi būti paprasčiausių vienaląsčių ir dumblo aktyvumas turi būti tikrinamas pagal etaloninę medžiagą bent kas tris mėnesius. Dumblo kaip sėjamos kultūros nenaudokite anksčiau kaip po mėnesio nuo proceso pradžios, bet ne vėliau kaip po keturių mėnesių. Po to, imkite bandinius bent iš 10 vietų reguliariais laiko tarpais, kartą per tris mėnesius.
      Norint, kad senojo ir naujojo dumblo aktyvumas būtų toks pat, sumaišykite vienodus tūrius filtruoto skysčio virš naudojamo aktyviojo dumblo ir filtruoto skysčio virš šviežiai surinkto dešimties šaltinių mišinio ir auginkite mikroorganizmus supiltuose skysčiuose, kaip tai aprašyta aukščiau. Imkite dumblą naudoti kaip sėjimo kultūrą 18–24 h po to, kai įrenginys buvo įkrautas.
      VII.2.4.   Kolbų ruošimas
      Paruoškite tokias šešias kolbas:
      Nr. 1: bandomosios cheminės medžiagos tirpalas skiedimo vandenyje, 100 mg/l
      Nr. 2, 3 ir 4: bandomosios cheminės medžiagos tirpalas mineralinėje terpėje, 100 mg/l
      Nr. 5: etaloninės cheminės medžiagos (pvz., anilino) tirpalas mineralinėje terpėje, 100 mg/l
      Nr. 6: tik mineralinė terpė
      Mažai tirpias medžiagas dėkite pagal masę arba pagal tūrį arba apdorokite, kaip aprašyta 3 priedėlyje, išskyrus tai, kad neturi būti naudojami nei tirpikliai, nei emulsikliai. Į visas kolbas specialiuose induose įdėkite CO2 absorbento. Kolbose nr. 2, 3 ir 4 nustatykite pH vertę 7,0.
      VII.2.5.   Bandymų eiga
      Į kolbas nr. 2, 3 ir 4 (bandomosios suspensijos), nr. 5 (aktyvumo kontrolinis bandinys) ir nr. 6 (tuščiasis bandinys su sėjimo kultūra) įpilkite mažą tūrį sėjimo kultūros, kad suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija būtų 30 mg/l. Sėjimo kultūros nedėkite į kolbą nr. 1, kurioje yra abiotinio skaidymo kontrolinis bandinys. Surinkite įrangą, patikrinkite hermetiškumą, įjunkite purtykles ir pradėkite matuoti deguonies suvartojimą tamsoje. Kasdieną tikrinkite temperatūrą, purtyklę ir kulonometrinį deguonies suvartojimo registravimo įrenginį bei stebėkite bet kokius kolbų turinio spalvos kitimus. Deguonies suvartojimo rodmenis šešioms kolboms registruokite tiesiogiai tinkamu metodu, pvz., šešių taškų savirašiu, rašančiu BOD kreivę. Inkubavimo pabaigoje, kuris paprastai tęsiamas 28 paras, išmatuokite kolbų turinio pH ir nustatykite likusios bandomosios medžiagos ir kiekvieno tarpinio produkto koncentraciją, o vandenyje tirpios medžiagos – DOC koncentraciją (II.4 priedas). Imkitės ypatingų priemonių lakiųjų cheminių medžiagų atveju. Jei laukiate, kad gali vykti nitrifikavimas, nustatykite nitrito ir nitrato koncentraciją, jei tai įmanoma.
      VII.3.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      VII.3.1.   Rezultatų apdorojimas
      Padalinkite kiekį (mg) deguonies, suvartoto bandomąja chemine medžiaga per tam tikrą laiką ir pataisytą kiekiu deguonies, suvartoto per tą patį laiką tuščiajame sėjimo kultūros bandinyje, iš paimtos bandomosios cheminės medžiagos masės. Tai duoda BOD, skaičiuojamą mg deguonies/mg bandomosios medžiagos, taigi:
      
         
      = kiekis O2 (mg) vienam mg bandomosios cheminės medžiagos
      Tuomet biologinio skaidymo procentinė vertė gaunama pagal lygtį:
      
         
      Mišiniams ThOD skaičiuokite pagal elementinę analizę, kaip paprastam junginiui. Naudokite atitinkamas ThOD (ThODNH4, arba ThODNO3) vertes pagal tai, ar nitrifikavimas nevyksta, ar jis yra visiškas (II.2 priedas). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisas nitrifikuoti suvartotam deguoniui skaičiuokite pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (V priedas).
      Pirminio biologinio skaidymo procentinę vertę skaičiuokite pagal specifinės (pradinės) cheminės medžiagos kiekio mažėjimą (žr. I.7.2).
      
         
      Nurodykite ataskaitoje, jei sumažėjo bandomosios medžiagos koncentracija kolboje nr. 1, kurioje matuojamas fizikocheminis pašalinimas, o bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją (Sb,) šioje kolboje po 28 parų naudokite apskaičiuoti biologinio skaidymo procentinę vertę.
      Kai daromi DOC nustatymai (neprivalomi), apskaičiuokite biologinio suskaidymo procentinę vertę pagal:
      
         
      DOC kiekis sumažėjo, DOC koncentraciją šioje kolboje naudokite apskaičiuoti biologinio skaidymo procentinę vertę.
      Visus rezultatus užrašykite pateiktose specifikacijose.
      VII.3.2.   Rezultatų tinkamumas
      Paprastai deguonies suvartojimas sėjimo kultūros tuščiajame bandinyje per 28 paras yra 20-30 mg O2/litre ir neturi būti didesnis kaip 60 mg/litre. Jei vertės didesnės kaip 60 mg/litre, būtina kritiškai ištirti duomenis ir eksperimento metodikas. Jei pH vertė nepatenka į 6-8,5 intervalą, o bandomoji medžiaga deguonies suvartoja mažiau kaip 60 %, bandymas turi būti pakartotas su mažesne bandomosios cheminės medžiagos koncentracija.
      Žr. dar I.5.2.
      Jei anilino skaidymo procentinė vertė, apskaičiuota pagal deguonies suvartojimą, po 7 parų ne didesnė kaip 40 % ir po 14 parų ne didesnė kaip 65 %, laikoma, kad bandymas nevalidus..
      VII.3.3.   Ataskaita
      Žr. I.8.
      VII.4.   SPECIFIKACIJA
      Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.
      MITI (I) BANDYMAS
      
                  1.
               
               
                  LABORATORIJA
               
            
                  2.
               
               
                  BANDYMO PRADŽIOS DATA
               
            3.   BANDOMOJI MEDŽIAGA
      Pavadinimas:
      Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l kaip cheminės medžiagos
      Pradinė koncentracija terpėje, C0: mg/l kaip cheminės medžiagos
      Reakcijos mišinio tūris, V: ml
      ThOD: mg O2/1
      4.   SĖJIMO KULTŪRA
      Dumblo bandinių ėmimo vietos:
      
                  
                              (1)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              (6)
                           
                           
                              …
                           
                        
            
                  
                              (2)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              (7)
                           
                           
                              …
                           
                        
            
                  
                              (3)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              (8)
                           
                           
                              …
                           
                        
            
                  
                              (4)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              (9)
                           
                           
                              …
                           
                        
            
                  
                              (5)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              (10)
                           
                           
                              …
                           
                        
            Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija aktyviajame dumble po aklimatizavimo sintetinėmis nuotekomis =… mg/l
      Aktyviojo dumblo tūris vienam litrui galutinai paruoštos terpės =… ml.
      Dumblo koncentracija galutinai paruoštoje terpėje =… mg/l
      5.   DEGUONIES SUVARTOJIMAS. BIOLOGINIS SKAIDOMUMAS
      Naudoto respirometro tipas:
      
                   
               
               
                  Laikas (paros)
               
            
                  0
               
               
                  7
               
               
                  14
               
               
                  21
               
               
                  28
               
            
                  O2 suvartojimas (mg) bandomaja medžiaga
               
               
                  a1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a3
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  O2 suvartojimas (mg) tuščiajame bandyme
               
               
                  b
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Pataisyta O2 suvartojimo vertė (mg)
               
               
                  (a1-b1)
                  (a2-b1)
                  (a3-b1)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  BOD vienam mg bandomosios cheminės medžiagos
               
               
                  
                     
               
               
                  1 Kolba
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2 Kolba
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  3 Kolba
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  skaidymo %
                  
                     
               
               
                   
               
               
                  1
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  3
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  vidutinė vertė (9)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
         Pastaba. Panašūs formatai gali būti taikomi etaloninei medžiagai
      6.   ANGLIES ANALIZĖ (neprivaloma):
      Anglies analizatorius:
      
                  Kolba
               
               
                  DOC
               
               
                  pašalintos DOC %
               
               
                  Vidutinė vertė
               
            
                  Matuota
               
               
                  Pataisyta
               
            
                  Vanduo + bandomoji medžiaga
               
               
                  a
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  —
               
               
                  —
               
            
                  Dumblas + bandomoji medžiaga
               
               
                  b1
                  
               
               
                   
               
               
                  b1-c
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Dumblas + bandomoji medžiaga
               
               
                  b2
                  
               
               
                   
               
               
                  b2-c
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Dumblas + bandomoji medžiaga
               
               
                  b3
                  
               
               
                   
               
               
                  b3-c
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Kontrolinis tuščiasis bandinys
               
               
                  c
               
               
                   
               
               
                  —
               
               
                   
               
               
                  —
               
               
                  —
               
            
         
      7.   SPECIFINĖS CHEMINĖS ANALIZĖS DUOMENYS
      
                   
               
               
                  Likutinis bandomosios medžiagos kiekis bandymo pabaigoje
               
               
                  % degradacja
               
            
                  Tuščiasis bandinys su vandeniu
               
               
                  Sb
                  
               
               
                   
               
            
                  Terpė su sėjimo kultūra
               
               
                  Sa1
                  
               
               
                   
               
            
                  Sa2
                  
               
               
                   
               
            
                  Sa3
                  
               
               
                   
               
            
         
      Apskaičiuokite skaidymo %, atitinkamai kolbose a1, a2 ir a3. .
      8.   PASTABA
      Turi būti pridedama BOD kitimo laike kreivė, jei yra.
      
         1 Priedėlis
         SANTRUMPOS IR APIBRĖŽIMAI
         
                     DO
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Ištirpęs deguonis (mg/l) yra vandeniniame bandinyje ištirpusio deguonies koncentracija.
                  
               
                     BOD
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Biocheminis deguonies poreikis (g) yra deguonies kiekis, kurį suvartoja mikroorganizmai, įsisavindami bandomąją medžiagą taip pat skaičiuojamas g suvartoto deguonies g bandomosios medžiagos, (žr. C.5 metodą).
                  
               
                     COD
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Cheminis deguonies poreikis (g) yra deguonies kiekis, suvartotas bandomąją medžiagą oksiduojant karštu, rūgščiu dichromato tirpalu; COD yra turimo oksiduojamos medžiagos kiekio matas; taip pat skaičiuojamas g deguonies, suvartoto g bandomosios medžiagos, (žr. C.6 metodą).
                  
               
                     DOC
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Ištirpusi organinė anglis yra organinė anglis tirpale arba organinė anglis, kuri praeina per 0,45 μm filtrą arba lieka skystyje virš nuosėdų po 15 min centrifugavimo 40 000 m.s-2 (apie 4 000 g) pagreičiu.
                  
               
                     ThOD
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Teorinis deguonies poreikis (mg) yra bendras deguonies kiekis, kurio reikia visiškai oksiduoti cheminę medžiagą jis skaičiuojamas pagal molekulinę formulę (žr. II.2 priedą), dar kitaip skaičiuojamas mg deguonies, suvartojamo oksiduoti 1 mg bandomosios medžiagos.
                  
               
                     ThCO2
                     
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Teorinis anglies dioksido kiekis (mg) yra apskaičiuotas anglies dioksido, kuris susidaro iš žinomo arba išmatuoto anglies kiekio bandomojoje medžiagoje, kai ji visiškai mineralizuojama, kiekis; taip pat skaičiuojamas mg anglies dioksido, kuris susidaro iš 1 mg bandomosios medžiagos.
                  
               
                     TOC
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Bendroji bandinio organinė anglis yra ištirpusios ir suspenduotos organinės anglies kiekių suma.
                  
               
                     IC
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Neorganinės anglies kiekis.
                  
               
                     TC
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Bendrasis anglies kiekis yra bandinio organinės ir neorganinės anglies bendras kiekis.
                  
               Pirminis biologinis
         skaidymas yra biologiškai veikiamos medžiagos cheminės sandaros pokytis, kai ji netenka tai medžiagai būdingų savybių.
         Biologinis skaidymas (aerobinis):
         tai pasiektas skaidymo lygis, kai mikroorganizmai bandomąją medžiagą visiškai suvartoja, susidarant anglies dioksidui, vandeniui, mineralinėms druskoms ir naujoms mikrobiologinėms ląstelinėms sudedamosioms dalims (biomasei).
         Lengvai biologiškai skaidomas:
         cheminių medžiagų, kurioms buvo daromi kai kurie apibrėžti atrankos pagal biologinį skaidymą bandymai, sutartinis klasifikavimas; šie bandymai yra tokie tikslūs, kad laikoma, kad vandens terpėse aerobinėmis sąlygomis tokie junginiai greitai ir visiškai biologiškai suyra.
         Natūraliai biologiškai skaidomas:
         cheminių medžiagų, apie kurių biologinį suskaidymą (pirminį arba visišką) bet kokiame pripažintame biologinio skaidomumo bandyme yra neabejotinų duomenų, klasifikavimas.
         Apdorojamumas:
         yra galimybė medžiagas paversti šalinamais junginiais biologinio nuotekų valymo metu, neigiamai neveikiant normalios valymo procesų eigos. Dažniausiai lengvai biologiškai skaidomos medžiagos yra tinkamos apdoroti, bet ne visi junginiai iš prigimties yra biologiškai skaidomi. Gali vykti ir abiotiniai procesai.
         Vėlavimo trukmė
         yra laikas nuo sėjimo kultūros įdėjimo DOC išnykimo bandyme iki skaidymo procentinė vertė pasiekia bent 10 %. Vėlavimo trukmė dažnai yra labai kintamas dydis ir jo atkuriamumas blogas.
         Skaidymo trukmė
         yra laikas nuo vėlavimo laikotarpio pabaigos iki to laiko, kai skaidymas pasiekia 90 % didžiausios vertės lygį.
         10 parų langas
         10 parų iš karto po to, kai skaidymo vertė pasiekė 10 %.
      
      
         2 Priedėlis
         ATITINKAMŲ BENDRŲJŲ PARAMETRŲ SKAIČIAVIMAS IR NUSTATYMAS
         Nuo pasirinkto metodo priklauso, kokie bus reikalingi bendrieji parametrai. Siame skyriuje aprašomas šių dydžių išvedimas. Šių parametrų taikymas aprašomas skyriuose apie atskirus metodus.
         1.   Anglies kiekis
         Anglies kiekis skaičiuojamas pagal žinomą cheminę sudėtį arba nustatomas bandomosios medžiagos elementine analize.
         2.   Teorinis deguonies poreikis (ThOD)
         Teorinis deguonies poreikis (ThOD) gali būti apskaičiuotas, ji žinoma elementine sudėtis, arba jis gali būti nustatytas, darant elementinę analizę. Junginio:
         CcHhClClNnNanaOoPpSs
         
         jei nitrifikavimas nevyksta,
         
             mg/mg
         Kai nitrifikavimas vyksta
         
             mg/mg
         3.   Cheminis deguonies poreikis (COD)
         Cheminis deguonies poreikis (COD) nustatomas pagal C.6 metodą.
         4.   Ištirpusi organinė anglis (DOC)
         Ištirpusi organinė anglis (DOC) pagal apibrėžimą yra bet kurios cheminės medžiagos arba medžiagų mišiniovandenyje organinė anglis, praeinanti per 0,45 μm filtrą
         Bandiniai iš bandymo indų siurbiami ir iš karto filtruojami filtravimo įtaisu, naudojant atitinkamą membraninį filtrą Pirmuosius 20 ml (kiekis gali būti mažesnis, kai naudojami maži filtrai) filtrato pilama lauk. 10-20 ml tūrio arba mažesnius bandinius, jei jie įpurškiami (tūris priklauso nuo anglies analizatoriui reikalingo tūrio) paliekama anglies kiekiui analizuoti. DOC koncentracija nustatoma organinės anglies analizatoriumi, kuriuo būtų galima tiksliai nustatyti anglies koncentraciją atitinkančią 10 % bandyme naudotos pradinės DOC koncentracijos arba mažesnę.
         Filtruotus bandinius, kurių negalima analizuoti tą pačią darbo dieną 48 h galima laikyti šaldytuve 2-4 oC temperatūroje, arba žemiau - 18 oC, jei laikoma ilgiau.
         Pastabos
         Membraniniai filtrai, kad būtų hidrofiliški, dažnai impregnuojami paviršinio aktyvumo medžiagomis. Todėl filtre gali būti iki kelių mg ištirpusios organinės anglies, kuri trukdytų biologinio skaidomumo nustatymams. Paviršinio aktyvumo medžiagos ir kitos tirpios organinės medžiagos iš filtrų šalinamos juos virinant tris kartus po vieną valandą dejonizuotame vandenyje. Filtrai toliau gali būti savaitę laikomi vandenyje. Jei naudojamos vienkartės filtravimo tūtos, kiekviena partija turi būti patikrinta, norint įsitikinti, kad nesusidaro ištirpusi organinė anglis.
         Atsižvelgiant į membraninio filtro tipą bandomoji cheminę medžiaga gali būti sulaikyta dėl jos adsorbavimo. Todėl būtų patartiną tikrinti, ar filtras neadsorbuoja cheminės medžiagos.
         Kai norima lyginti TOC ir DOC, vietoje filtravimo gali būti taikomas 15 min centrifugavimas 40 000 mx sec-2 (4 000g) pagreičiu. Metodas nepatikimas, jei DOC pradinė koncentracija yra < 10 mg/l, nes arba pašalinamos ne visos bakterijos, arba anglis vėl ištirpsta kaip bakterijų plazmos dalis.
         NUORODOS
         
                     —
                  
                  
                     Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, p. 65.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Wagner, R, Von Wasser, 1976, vol. 46, p. 139.
                  
               
                     —
                  
                  
                     DIN-Entwurf 38409 Teil 41 – Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und StoffkenngroBen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), NonnenausschuB Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut fur Normung e. V.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol 13 1), p. 169.
                  
               
      
         3 Priedėlis
         MAŽAI TIRPIŲ MEDŽIAGŲ BIOLOGINIO SKAIDOMUMO VERTINIMAS
         Mažai tirpių medžiagų biologinio skaidomumo bandymuose ypatingas dėmesys turi būti kreipiamas į šiuos aspektus.
         Jei homogeniniai skysčiai retai kelia bandinio ėmimo problemų, tai kietąsias medžiagas rekomenduojama homogenizuoti tinkamu būdu, kad būtų išvengta paklaidų dėl nehomogeniškumo. Reikalingos specialios atsargumo priemonės, kai reikia paimti kelių miligramų reprezentatyvius cheminių medžiagų mišinių arba daug priemaišų turinčių medžiagų bandinius.
         Bandymuose galima taikyti įvairius maišymo būdus. Reikia stengtis užtikrinti tik tokį maišymą kad medžiaga būtų disperguotoje būsenoje, ir vengti perkaitinimo, per didelio putojimo ir per didelių šlyties jėgų.
         Galima naudoti emulsiklį, su kuriuo gaunama patvari cheminės medžiagos dispersiją. Jis neturi būti nuodingas bakterijoms ir neturi būti biologiškai skaidomas arba bandymo sąlygomis putoti.
         Emulsikliams taikomi kriterijai tinka ir tirpikliams.
         Kietosioms bandomosioms medžiagoms nerekomenduojama naudoti kietuosius nešiklius, tačiau jie gali tikti aliejingoms medžiagoms.
         Kai naudojamos pagalbinės medžiagos, pvz., emulsikliai, tirpikliai ir nešikliai, turi būti bandomas tuščiasis bandinys, kuriame būtų pagalbinė medžiaga.
         Bet kuris iš trijų respirometrinių bandymų, CO2 , BOD, MITI, gali būti taikomas tirti mažai tirpių junginių biologinį skaidomumą
         NUORODOS
         
                     —
                  
                  
                     de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, vol. 16, p. 833.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water-soluble compounds. Chemosphere. 1984, vol. 13, p. 169.
                  
               
      
         4 Priedėlis
         CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ, KURIOS GALI BŪTI NUODINGOS SĖJIMO KULTŪRAI, BIOLOGINIO SKAIDOMUMO VERTINIMAS
         Kai tiriant cheminę medžiagą lengvo biologinio skaidomumo bandymuose paaiškėja, kad ji biologiškai neskaidoma, tai, jei norima atskirti, ar tai inhibuojamasis veikimas ar medžiagos inertiškumas, rekomenduojama tokia procedūra (Reynolds et al., 1987).
         Toksiškumo ir biologinio skaidomumo bandymuose turi būti naudojama panaši arba identiška sėjimo kultūra.
         Norint įvertinti toksiškumą cheminių medžiagų, tiriamų lengvo biologinio skaidomumo bandymuose, tiktų, kaip manoma, atskirai arba kartu taikyti dumblo kvėpavimo intensyvumo inhibavimo (aktyviojo dumblo kvėpavimo inhibavimo bandymas – direktyva 88/302/EEC), BOD ir (arba) augimo inhibavimo metodus.
         Manoma, kad, jei reikia išvengti inhibavimo dėl medžiagos toksiškumo, bandomųjų medžiagų, naudojamų lengvo biologinio skaidomumo bandymuose, koncentracija turėtų būti mažesnė nei 1/10 EC50 vertės (arba mažesnė nei EC20 vertė), gautos toksiškumo bandymuose. Nepanašu, kad junginiai, kurių EC50 vertė yra didesnė kaip 300 mg/l, būtų toksiški biologinio skaidomumo bandymuose.
         Mažesnės kaip 20 mg/l EC50 vertės greičiausiai turėtų kelti problemų toliau atliekamiems bandymams. Turi būti naudojamos mažos bandymo koncentracijos, dėl ko reikia taikyti tikslų ir jautrų uždarosios kolbos metodą arba naudoti 14C žymėtas mežiagas. Kitaip dar būtų galima naudoti aklimatizuotą sėjimo kultūrą kuri, galbūt, leistų naudoti bandomąją medžiagą didesnės koncentracijos. Tačiau šiuo atveju prarandamas specifiškas lengvo biologinio skaidomumo bandymo kriterijus.
         NUORODOS
         Reynolds, L. et al.. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, p. 225.
      
      
         5 Priedėlis
         DEGUONIES SUVARTOJIMO PATAISA DĖL NITRIFIKAVIMO KELIAMŲ TRUKDŽIŲ
         Jei nekreipti dėmesio į nitrifikavimą kai biologinis skaidomumas vertinamas pagal deguonies suvartojimą bandomosiomis medžiagomis, tai paklaidos medžiagoms, kuriose nėra azoto, yra nežymios (ne didesnės kaip 5 %), net jei terpės amonio azoto oksidavimas bandomojo ir tuščiojo bandinio induose vyksta nevienodai. Tačiau, jei bandomosios medžiagos turi azoto, paklaidos gali būti didelės.
         Jei nitrifikavimas įvyko, tačiau nevisiškas, stebimas deguonies suvartojimas reakcijos mišiniu gali būti pataisytas deguonies kiekiu, suvartotu amonio jonui oksiduoti į nitritą ir nitratą jei nitrito ir nitrato koncentracijų pokytis inkubavimo metu nustatomas atsižvelgiant į tokias reakcijų lygtis:
         
                     2NH4Cl + 3O2 = 2HNO2 + 2HCl + 2 H2O
                  
                  
                     (1)
                  
               
                     2 HNO2 + O2 = 2 HNO3
                     
                  
                  
                     (2)
                  
               
                     Suminė reakcija:
                  
                  
                      
                  
               
                     2NH4Cl+4O2 = 2HNO3 + 2HCl + 2 H2O
                  
                  
                     (3)
                  
               Pagal 1) lygtį, 28 g azoto, kuris yra amonio chloride (NH4Cl), oksiduoti į nitritą, reikia 96 g deguonies, t.y. faktorius lygus 3,43 (96/28). Tokiu pat būdu pagal 3) lygtį 28 g azoto, kai jis oksiduojamas į nitratą, suvartoja 128 g deguonies, t.y. faktorius lygus 4,57 (128/28).
         Kadangi reakcijos yra nuoseklios ir vyksta dėl tam tikrų ir skirtingų bakterijų rūšių veiklos, įmanomas dalykas, kad nitrito koncentracija gali kaip didėti, taip ir mažėti; pastaruoju atveju susidarytų ekvivalentiškas kiekis nitrato. Taigi, deguonies, suvartoto nitratui susidaryti, kiekis lygus 4,57 ir nitrato koncentracijos padidėjimo sandaugai, o deguonies kiekis nitritui susidaryti lygus 3,43 ir nitrito koncentracijos padidėjimo sandaugai arba -3,43 ir nitrito koncentracijos sumažėjimo sandaugai, kai nitrito koncentracija mažėja.
         T. y.:
         
                     O2 suvartotas nitratui susidaryti = 4,57 × nitrato koncentracijos padidėjimo
                  
                  
                     (4)
                  
               
                     Ir
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 suvartota nitritui susidaryti = 3,43 × nitrito koncentracijos padidėjimo
                  
                  
                     (5)
                  
               
                     Ir
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 netenkama dėl nitrito išnykimo = -3,43 × nitrito koncentracijos padidėjimo
                  
                  
                     (6)
                  
               
                     Taigi
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 suvartojimas dėl nitrifikavimo = ±3,43 × nitrito konc. pokyčio. +4,57 × nitrato konc. Padidėjimo
                  
                  
                     (7)
                  
               
                     Ir todėl
                  
                  
                      
                  
               
                     O2, suvartotas C oksiduoti = bendrasis stebėtas suvartotas kiekis – nitrifikavimui suvartotas kiekis
                  
                  
                     (8)
                  
               Kitaip, jei nustatytas tik bendrasis oksiduoto azoto kiekis, tai kaip pirminė aproksimacija galima laikyti, kad deguonies suvartojimas dėl nitrifikavimo lygus 4,57 × oksiduoto N koncentracijos padidėjimo.
         Toliau angliai oksiduoti suvartoto deguonies kiekio pataisyta vertė lyginama su ThOD NH3 verte, kuri skaičiuojama 2 priedėlyje.
      
      C.5   SKAIDYMAS. BIOCHEMINIS DEGUONIES POREIKIS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Šio metodo tikslas yra išmatuoti kietųjų arba skystųjų organinių medžiagų biocheminį deguonies poreikį (BOD).
      Šiame bandyme gauti duomenys taikomi vandenyje tirpioms medžiagoms; tačiau taip pat galima bandyti, bent iš esmės, lakiąsias medžiagas arba medžiagas, kurios mažai tirpsta vandenyje.
      Metodas tinka tik toms bandomosioms organinėms medžiagoms, kurios, būdamos bandyme naudojamos koncentracijos, neinhibuotų bakterijų veiklos. Jei bandomoji medžiaga nėra tiek tirpi, kad galima būtų pasiekti bandymo koncentraciją, gerai bandomosios medžiagos dispersijai gauti galima taikyti specialias priemones, pvz., dispergavimą ultragarsu.
      Kai reikia aiškinti mažus rezultatus ir parinkti tinkamas bandomąsias koncentracijas, gali būti naudinga informacija apie cheminės medžiagos toksiškumą.
      1.2.   APIBRĖŽIMAS IR VIENETAI
      BOD apibrėžiamas kaip masė ištirpusio deguonies, suvartoto biocheminio oksidavimo procesui nustatytame tirpalo tūryje vykti apibrėžtomis sąlygomis.
      Rezultatai skaičiuojami BOD gramais vienam gramui bandomosios medžiagos.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Pageidautina naudoti atitinkamą etaloninę medžiagą, skirtą tikrinti sėjimo kultūros aktyvumą.
      1.4.   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Gerai aeruojamoje tinkamoje terpėje ištirpinta arba disperguota medžiaga, kurios kiekis žinomas, veikiama mikroorganizmų kultūra ir tamsoje inkubuojama apibrėžtos pastovios temperatūros sąlygomis.
      BOD yra nustatomas pagal ištirpusio deguonies kiekio skirtumą bandymo pradžioje ir pabaigoje. Bandymo trukmė turi būti ne mažesnė kaip penkios paros ir ne didesnė kaip 28 paros.
      Lygiagrečiai turi būti daromas nustatymas tuščiajame bandinyje, kuriame nebūtų bandomosios medžiagos.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Negalima laikyti, kad BOD nustatymas yra validus medžiagos biologinio skaidomumo nustatymas. Į šį bandymą galima žiūrėti tik kaip į atrankos bandymą.
      1.6.   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      Ruošiamas pradinis medžiagos tirpalas arba dispersija gauti BOD koncentracijai, atitinkančiai taikomą metodą. Tuomet pagal bet kurį atitinkamą nacionalinį arba tarptautinį standartizuotą metodą nustatomas BOD.
      2.   DUOMENYS IR ĮVERTINIMAS
      BOD pradiniame tirpale skaičiuojamas pagal parinktą standartinį metodą, ir verčiamas į BOD gramus vienam gramui bandomosios medžiagos.
      3.   ATASKAITA
      Turi būti nurodytas taikytas metodas.
      Biocheminis deguonies poreikis turi būti vidurkis bent trijų tinkamų matavimų.
      Turi būti pateikta visa rezultatams aiškinti reikalinga informacija ir pastabos, ypač apie priemaišas, fizinę būseną, toksiškumo įtaką ir medžiagai būdinga sudėtį, kuri turėtų įtakos rezultatams.
      Turi būti nurodyta, ar buvo naudotas biologinio nitrifikavimo inhibavimo priedas
      4.   NUORODOS
      
      Standartizuotų metodų sąrašas, pavyzdžiui:
      
                   
               
               
                  NF T 90 – 103: Determination of the biochemical oxygen demand.
               
            
                   
               
               
                  NBN 407: Biochemical oxygen demand.
               
            
                   
               
               
                  NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV).
               
            
                   
               
               
                  The determination of biochemical oxygen demand. Methods for the examination of water and associated materials, HMSO, London.
               
            
                   
               
               
                  ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.
               
            C.6.   SKAIDYMAS. CHEMINIS DEGUONIES POREIKIS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Šio metodo tikslas yra standartiniu sutartu būdu išmatuoti kietųjų arba skystųjų organinių medžiagų cheminį deguonies poreikį (COD) nustatytomis laboratorinėmis sąlygomis.
      Darant šį bandymą ir aiškinant gautus rezultatus, bus naudinga informacija apie medžiagos formulę (pvz., halogenų druskos, organinių junginių geležies (II) druskos, chloro organiniai junginiai).
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Cheminis deguonies poreikis yra medžiagos oksiduojamumo matas, reiškiamas oksidavimo agento, kurį suvartoja medžiaga nustatytomis laboratorinėmis sąlygomis, kiekiui ekvivalentiniu deguonies kiekiu.
      Rezultatas skaičiuojamas COD gramais vienam gramui bandomosios medžiagos.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nebūtina kiekvienu atveju, kai tiriama nauja medžiaga, naudoti etalonines medžiagas. Jas daugiausia reikia naudoti tuomet, kai kartkartėmis daroma metodo veiksmingumo patikrą ir norint lyginti rezultatus, kai taikomas kitas metodas.
      1.4.   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Iš anksto nustatytas vandenyje ištirpintos arba disperguotos medžiagos kiekis dvi valandas oksiduojamas su grįžtamuoju šaldytuvu kalio dichromatu stipriai rūgščioje sieros rūgšties terpėje, kai katalizatorius sidabro sulfatas. Likusio dichromato kiekis nustatomas titruojant standartizuotu geležies (II) amonio sulfato tirpalu.
      Jei medžiaga turi chloro, nustatymui trukdančio chlorido įtakai mažinti dedama gyvsidabrio (II) sulfato (10).
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Dėl to, kad tai sutartinis nustatymo būdas, COD yra „oksiduojamumo indikatorius“ ir naudojamas kaip praktinis organinės medžiagos kiekio nustatymo metodas.
      Bandyme gali trukdyti chloridas; taip pat nustatant COD gali trukdyti neorganinės redukuojančios arba oksiduojančios medžiagos.
      Kai kurie cikliniai junginiai ir didelis skaičius lakiųjų medžiagų (pvz., mažesnės molekulinės masės sočiosios rūgštys) šiame bandyme nėra visiškai oksiduojamos.
      1.6.   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      Ruošiamas pradinis medžiagos tirpalas arba suspensija COD vertei nuo 250 mg iki 600 mg litre gauti.
      
         Pastabos
      
      Mažai tirpių ir nedisperguojamų medžiagų atveju, galima pasverti tam tikrą kiekį į labai smulkius miltelius sumaltos medžiagos arba skystos medžiagos, atitinkančios maždaug 5 mg COD, ir įdėti ją į eksperimento indą su vandeniu.
      Dažnai, ir ypač mažai tirpių medžiagų atveju, cheminį deguonies poreikį (COD) geriau nustatyti taikant metodo pakeitimą, t.y., uždaroje sistemoje su slėgio lygintuvu (H. Kelkenberg, 1975). Taikant šį metodo keitimą, dažnai galima sėkmingai kiekybiškai nustatyti medžiagas, pvz., acto rūgštį, kurias standartiniu metodu nustatyti sunku. Tačiau ir šiuo metodu nepasiseka nustatyti piridino. Jei kalio dichromato koncentraciją, kaip nurodyta 1) nuorodoje, padidinti iki 0,25 N (0,0416 M), palengvėja tiesioginis 5–10 mg medžiagos svėrimas, kas yra svarbu nustatant mažai vandenyje tirpių medžiagų COD ((2) nuoroda).
      Šiaip COD nustatomas pagal bet kurį atitinkamą nacionalinį arba tarptautinį standartizuotą metodą.
      2.   DUOMENYS IR VERTINIMAS
      Bandymų kolboje turimas COD skaičiuojamas pagal pasirinktą standartizuotą metodą ir verčiamas į COD gramus vienam gramui bandomosios medžiagos.
      3.   ATASKAITA
      Turi būti nurodytas taikytas etaloninis metodas.
      Cheminis deguonies poreikis turi būti vidurkis bent trijų validžių matavimų. Turi būti pateikta visa rezultatams aiškinti reikalinga informacija ir pastabos, ypač apie priemaišas, fizinę būseną, ir medžiagai būdingas savybes (jei žinomos), kurios turėtų įtakos rezultatams.
      Ataskaitoje turi būti nurodyta apie gyvsidabrio (II) sulfato naudojimą nustatymui trukdančio chlorido įtakai mažinti.
      4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Kelkenberg, H.,Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, vol. 8, 146.
               
            
                  2)
               
               
                  Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.
                  Sąrašas standartizuotų metodų, pvz.:
                  
                               
                           
                           
                              NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen demand.
                           
                        
                               
                           
                           
                              ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate value) of polluted and waste waters.
                           
                        
                               
                           
                           
                              NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.
                           
                        
                               
                           
                           
                              DS 217 = Water analysis: Determination of the chemical oxygen demand.
                           
                        
                               
                           
                           
                              DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg per litre.
                           
                        
                               
                           
                           
                              NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.
                           
                        
                               
                           
                           
                              ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichromate methods.
                           
                        
            C.7.   SKAIDYMAS. ABIOTINIS SKAIDYMAS. HIDROLIZĖ KAIP pH FUNKCIJOS NUSTATYMAS
      1.   METODAS
      Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 111 (2004).
      1.1.   ĮVADAS
      Cheminės medžiagos gali patekti į paviršinius vandenis tiesiogiai jų pridedant, pasklidus purškiamoms medžiagoms, dėl nuotėkio, drenažo, atliekų šalinimo, pramoninių, buitinių arba žemės ūkio nuotekų ir nuosėdų iš atmosferos, o vandenyje gali pasikeisti vykstant cheminiams (pvz., hidrolizės, oksidacijos), fotocheminiams ir (arba) mikrobiologiniams procesams. Šioje rekomendacijoje aprašytas laboratorinis bandymo metodas, skirtas cheminių medžiagų abiotiniam hidroliziniam virsmui vandens sistemose įvertinti, esant aplinkoje dažniausiai pasitaikančioms pH vertėms (pH 4-9). Rekomendacija grindžiama jau priimtomis rekomendacijomis (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).
      Bandymai atliekami siekiant nustatyti: i) bandomosios medžiagos hidrolizės greitį kaip pH funkciją ir ii) konkrečius hidrolizės produktus, galinčius veikti organizmus, arba jų tipą ir susidarymo bei išnykimo greitį. Tokius tyrimus gali reikėti atlikti su cheminėmis medžiagomis, kurios tiesiogiai dedamos į vandenį arba kurios gali patekti į aplinką kitais pirmiau aprašytais būdais.
      1.2.   APIBRĖŽTYS IR VIENETAI
      Žr. 2 priedėlį.
      1.3.   METODO TINKAMUMAS
      Metodas iš esmės tinka visoms cheminėms medžiagoms (nežymėtosioms arba žymėtosioms), kurioms nustatyti yra sukurtas pakankamo tikslumo ir jautrio analizės metodas. Jis tinka mažai lakiems ir nelaki ems pakankamai tirpiems vandenyje junginiams. Bandymas neturėtų būti taikomas cheminėms medžiagoms, kurios labai greitai išgaruoja iš vandens (pvz., fumigantai, organiniai tirpikliai), todėl negali būti laikomos tirpale šio bandymo sąlygomis. Taikant šį bandymą gali būti sunku bandyti vandenyje labai mažai tirpias medžiagas (8).
      1.4.   BANDYMO METODO PRINCIPAS
      Sterilūs vandeniniai skirtingų pH verčių (pH 4, 7 ir 9) buferiniai tirpalai apdorojami bandomąja medžiaga ir inkubuojami tamsoje kontroliuojamomis laboratorijos sąlygomis (esant pastoviai temperatūrai). Kas tam tikrą laiko tarpą buferiniai tirpalai analizuojami bandomajai medžiagai ir hidrolizės produktams nustatyti. Naudojant žymėtąją bandomąją medžiagą (pvz., 14C), lengviau galima nustatyti masių balansą.
      Šis bandymo metodas yra pakopinis. Šios pakopos parodytos ir paaiškintos 1 priede. Kiekvieną pakopą lemia ankstesnės pakopos rezultatai.
      1.5.   INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ
      Hidrolizės greičiui matuoti gali būti naudojama nežymėtoji arba žymėtųjų atomų turinti bandomoji medžiaga. Paprastai geriau naudoti žymėtąją medžiagą, kai reikia tirti hidrolizės kelią ir nustatyti masių balansą; tačiau atskirais atvejais žymėjimas nėra būtinas. Rekomenduojama žymėti 14C, tačiau gali būti naudojami ir kiti izotopai, pvz., 13C, 15N, 3H. Jei įmanoma, žymėtasis atomas turėtų būti patvariausioje (-iose) molekulės dalyje (-yse). Pvz., jei bandomoji medžiaga turi vieną žiedą, žymėtasis atomas turi būti šiame žiede; jei bandomoji medžiaga turi du žiedus arba daugiau, gali tekti atlikti atskirus tyrimus kiekvieno žiedo su žymėtuoju atomu kitimui įvertinti ir atitinkamai informacijai apie hidrolizės produktų susidarymą gauti. Bandomosios medžiagos grynumas turi būti bent 95 %.
      Prieš atliekant hidrolizės bandymą, būtina turėti tokią informaciją apie bandomąją medžiagą:
      
                  a)
               
               
                  tirpumas vandenyje [A.6 bandymo metodas];
               
            
                  b)
               
               
                  tirpumas organiniuose tirpikliuose;
               
            
                  c)
               
               
                  garų slėgis [A.4 bandymo metodas] ir (arba) Henrio dėsnio konstanta;
               
            
                  d)
               
               
                  pasiskirstymo koeficientas n-oktanolis/vanduo [A.8 bandymo metodas];
               
            
                  e)
               
               
                  disociacijos konstanta (pKa) [112 OECD rekomendacija] (9);
               
            
                  f)
               
               
                  tiesioginio ir netiesioginio fotocheminio virsmo vandenyje greitis, jei tinka.
               
            Reikėtų turėti analizės metodus bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti ir, jei tinka, hidrolizės produktams ir jų kiekiui vandeniniuose tirpaluose nustatyti (žr. 1.7.2 skirsnį).
      1.6.   ETALONINIS MEDŽIAGOS
      Jei įmanoma, turėtų būti naudojamos etaloninės medžiagos hidrolizės produktams ir jų kiekiui nustatyti, taikant spektroskopinius ir chromatografijos metodus arba kitus tinkamo jautrio metodus.
      1.7.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      1.7.1.   Atgavimas
      Bent dviejų kartotinių buferinių tirpalų ėminių arba jų ekstraktų analizė iškart po bandomosios medžiagos pridėjimo yra pirmasis analizės metodo pakartojamumo ir bandomosios medžiagos įdėjimo metodikos tolygumo rodiklis. Vėlesnių bandymo etapų atgavimo laipsnis gaunamas atliekant masių balansą (kai naudojama žymėtoji medžiaga). Žymėtųjų ir nežymėtųjų cheminių medžiagų atgavimo laipsnis turi būti nuo 90 % iki 110 % (7). Jei šį intervalą techniškai sunku pasiekti, nežymėtosioms cheminėms medžiagoms leidžiamas 70 % atgavimo laipsnis, tačiau jį reikia pagrįsti.
      1.7.2.   Analizės metodo pakartojamumas ir jautris
      Vėliau analizės metodo (-ų), taikyto (-ų) bandomajai medžiagai ir hidrolizės produktams kiekybiškai nustatyti, pakartojamumas gali būti tikrinamas atliekant tų pačių buferinių tirpalų (arba jų ekstraktų) kartotinę analizę, kai susidaro kiekybiniam nustatymui pakankamas hidrolizės produktų kiekis.
      Analizės metodas turi būti pakankamai jautrus bandomajai medžiagai kiekybiškai nustatyti, kai jos koncentracija sumažėja iki 10 % arba mažesnės pradinės koncentracijos. Be to, prireikus analizės metodai turi būti pakankamai jautrūs visų hidrolizės produktų kiekiui nustatyti, kai jie sudaro 10 % arba daugiau įdėtos medžiagos koncentracijos (bet kuriuo tyrimo metu) iki 25 % arba mažiau jų didžiausios koncentracijos.
      1.7.3.   Hidrolizės kinetikos duomenų pasikliovimo intervalai
      Turėtų būti apskaičiuoti ir pateikti visų regresijos koeficientų, greičio konstantų, pusėjimo trukmės verčių ir visų kitų kinetinių parametrų (pvz., DT50) pasikliovimo intervalai.
      1.8.   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.8.1.   Įranga ir aparatūra
      Tyrimas turėtų būti atliekamas naudojant stiklinius indus (pvz., mėgintuvėlius, mažas kolbas), tamsoje ir steriliomis sąlygomis, jei būtina, išskyrus atvejus, kai išankstinė informacija (pvz., pasiskirstymo koeficientas n-oktanolis/vanduo) rodo, kad bandomoji medžiaga gali prilipti prie stiklo. Tokiu atveju reikėtų numatyti kitas medžiagas (pvz., tefloną). Bandomosios medžiagos sukibimo su stiklu problema gali būti iš dalies sumažinta, taikant viena iš šių metodų:
      
                  —
               
               
                  nustatyti bandymo indų stiklu sorbuotos bandomosios medžiagos ir hidrolizės produktų masę;
               
            
                  —
               
               
                  naudoti ultragarso vonią;
               
            
                  —
               
               
                  užtikrinti, kad kiekvienu bandinio ėmimo laikotarpiu visi stikliniai indai būtų plaunami tirpikliu;
               
            
                  —
               
               
                  naudoti produktų preparatus;
               
            
                  —
               
               
                  naudoti padidintą antrojo tirpiklio kiekį bandomajai medžiagai į sistemą įdėti; jei naudojamas antrasis tirpiklis, jis neturėtų sukelti bandomosios medžiagos hidrolizės.
               
            Paprastai reikia turėti purtykles su reguliuojamos temperatūros vandens vonia arba reguliuojamos temperatūros inkubatorius įvairiems bandomiesiems tirpalams inkubuoti.
      Reikia turėti tipinę laboratorinę įrangą, įskaitant, visų pirma, šią:
      
                  —
               
               
                  pH metrą;
               
            
                  —
               
               
                  analizės prietaisus, pvz., dujų chromatografijos (GC), efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC), plonasluoksnės chromatografijos (TLC) įrangą, įskaitant atitinkamas aptikimo sistemas žymėtosioms ir nežymėtosioms medžiagoms analizuoti, arba atvirkštinio izotopų skiedimo metodo įrangą;
               
            
                  —
               
               
                  nustatymo prietaisus (pvz., MS, GC-MS, HPLC-MS, MBR ir t. t.);
               
            
                  —
               
               
                  skysčių scintiliacinį skaitiklį;
               
            
                  —
               
               
                  dalijamuosius piltuvus, skirtus skysčius ekstrahuoti skysčiais;
               
            
                  —
               
               
                  įrangą tirpalams ir ekstraktams koncentruoti (pvz., sukamąjį garintuvą);
               
            
                  —
               
               
                  temperatūros reguliavimo įtaisą (pvz., vandens vonią).
               
            Cheminius reagentus sudaro, pvz.:
      
                  —
               
               
                  analiziškai gryni organiniai tirpikliai, pvz., heksanas, dichlormetanas ir kt.;
               
            
                  —
               
               
                  scintiliacinis skystis;
               
            
                  —
               
               
                  buferiniai tirpalai (detalės pateiktos 1.8.3 skirsnyje).
               
            Visi hidrolizės bandymams naudojami stikliniai indai, analiziškai grynas vanduo ir buferiniai tirpalai turėtų būti sterilizuoti.
      1.8.2.   Bandomosios medžiagos įdėjimas
      Bandomoji medžiaga turi būti įpilama kaip vandeninis tirpalas į skirtingus buferinius tirpalus (žr. 3 priedą). Jei būtina siekiant užtikrinti tinkamą ištirpinimą, bandomosios medžiagos įdėjimui ir paskirstymui leidžiama naudoti nedidelį su vandeniu maišių tirpiklių kiekį (pvz., acetonitrilo, acetono, etanolio), bet jis paprastai turi būti ne didesnis kaip 1 % V/V. Jei numatoma naudoti didesnę tirpiklių koncentraciją (pvz., labai blogai tirpių bandomųjų medžiagų atveju), tai leistina tik tais atvejais, kai galima įrodyti, kad tirpiklis neturi įtakos bandomųjų medžiagų hidrolizei.
      Preparatų paprastai nerekomenduojama naudoti, nes negalima atmesti galimybės, kad preparato ingredientai gali paveikti hidrolizės procesą. Tačiau jei bandomosios medžiagos yra mažai tirpios vandenyje arba limpa prie stiklo (ž. 1.8.1 skirsnį), preparato naudojimas gali būti tinkama išeitis.
      Naudojama tik viena bandomosios medžiagos koncentracija; ji neturi būti didesnė kaip 0,01 mol/l arba kaip viena antroji soties koncentracijos (žr. 1 priedėlį).
      1.8.3.   Buferiniai tirpalai
      Hidrolizės bandymas turi būti atliekamas, kai pH vertės yra 4, 7 ir 9. Todėl turi būti paruošiami buferiniai tirpalai, naudojant analiziškai grynus reagentus ir vandenį. Kai kurios tinkamos buferinės sistemos pateiktos 3 priede. Reikia pažymėti, kad naudojama buferinė sistema gali daryti įtaką hidrolizės greičiui, ir ten, kur tai stebima, reikia naudoti kitą buferinę sistemą (11).
      Visų buferinių tirpalų pH vertė turi būti tikrinama kalibruotu pH-metru, kurio tikslumas būtų bent 0,1, esant reikiamai temperatūrai.
      1.8.4.   Bandymo sąlygos
      1.8.4.1.   Bandymo temperatūra
      Hidrolizės bandymai turėtų būti atliekami esant pastoviai temperatūrai. Norint ekstrapoliuoti, svarbu užtikrinti temperatūros pastovumą bent ±0,5 oC tikslumu.
      Pradinis bandymas (1 pakopa) atliekamas 50 oC temperatūroje, jei nežinomos bandomosios medžiagos hidrolizės savybės. Aukštesnių pakopų kinetiniai bandymai atliekami esant bent trims skirtingoms temperatūros vertėms (įskaitant bandymą esant 50 oC), nebent atliekant 1 pakopos bandymą nustatoma, kad bandomoji medžiaga yra atspari hidrolizei. Siūlomas temperatūros intervalas – 10–70 oC (gerai būtų, kad viena iš temperatūros verčių būtų mažesnė kaip 25 oC), į kurį patektų ataskaitoje pateikiama 25 oC temperatūra ir didesnė dalis lauko sąlygomis pasitaikančios temperatūros verčių.
      1.8.4.2.   Šviesa ir deguonis
      Visi hidrolizės bandymai turėtų būti atliekami taikant bet kurį iš tinkamų metodų, kuris leistų išvengti fotolizės reiškinių. Būtina imtis visų tinkamų priemonių, kad nepatektų deguonis (pvz., prieš ruošiant tirpalą, 5 minutes barbotuoti helį, azotą arba argoną).
      1.8.4.3.   Bandymo trukmė
      Pradinis bandymas turėtų būti atliekamas 5 paras, o aukštesniųjų pakopų bandymai atliekami tol, kol hidrolizuojasi 90 % bandomosios medžiagos, bet ne ilgiau kaip 30 parų.
      1.8.5.   Bandymo eiga
      1.8.5.1.   Pradinis bandymas (1 pakopa)
      Pradinis bandymas atliekamas esant 50 ±0,5 oC ir pH 4,0, 7,0 ir 9,0. Jei po 5 parų hidrolizuojasi mažiau kaip 10 % (to,5, 25
         oc > 1 metai) medžiagos, bandomoji medžiaga priskiriama hidrolizei atsparioms medžiagoms ir paprastai daugiau bandyti nereikia. Jei žinoma, kad medžiaga yra nepatvari (12) aplinkos temperatūrą atitinkančiomis sąlygomis, pradinio bandymo atlikti nereikia. Analizės metodas turi būti pakankamai tikslus ir jautrus, kad juo būtų galima nustatyti pradinės koncentracijos sumažėjimą 10 %. Tokią informaciją galima gauti iš kitų šaltinių, pvz., giminingos struktūros junginių hidrolizės duomenys iš literatūros arba iš kitų
      1.8.5.2.   Nepatvarių medžiagų hidrolizė (2 pakopa)
      Aukštesnės pakopos (sudėtingesnis) bandymas turi būti atliekamas esant tokioms pH vertėms, kurioms esant pradinio bandymo metu buvo nustatytas medžiagos nepatvarumas. Pasirinkta bandomosios medžiagos buferuotų tirpalų temperatūra palaikoma naudojant termostatą. Pirmojo laipsnio hidrolizei patikrinti, kiekvienas reakcijos tirpalas turėtų būti analizuojamas tokiais laiko tarpais, kad būtų gauti bent šeši atskiri duomenų taškai – paprastai nuo 10 % iki 90 % pradinės medžiagos hidrolizės. Imami atskiri kartotiniai bandiniai (bent du bandiniai iš atskirų reakcijos indų) ir jų turinys analizuojamas bent šešis kartus (ne mažiau kaip dvylika kartotinių duomenų taškų). Laikoma, kad nepakanka naudoti vieną didelį ėminį, iš kurio būtų imamos atskiros alikvotinės bandomojo tirpalo dalys kiekvienu mėginio ėmimo momentu, kadangi toks būdas neleidžia analizuoti duomenų kintamumo ir galima užteršti bandomąjį tirpalą. Sterilumo patvirtinimo bandymai turėtų būti atliekami baigus aukštesnės pakopos bandymą (t. y. įvykus 90 % hidrolizei arba po 30 parų). Tačiau jei skaidymas (t. y. virsmas) nestebimas, sterilumo bandymų atlikti nebūtina.
      1.8.5.3.   Hidrolizės produktų nustatymas (3 pakopa)
      Visi pagrindiniai hidrolizės produktai, kurie sudaro bent > 10 % naudotos dozės, turėtų būti nustatomi taikant atitinkamus analizės metodus.
      1.8.5.4.   Neprivalomi bandymai
      Hidrolizei neatsparią bandomąją medžiagą gali tekti bandyti papildomai, esant kitoms nei 4, 7 ir 9 pH vertėms. Pvz., dėl fiziologinių priežasčių gali reikėti atlikti bandymą rūgštesnėje terpėje (pvz., kai pH yra 1,2) ir esant fiziologiškai artimai temperatūrai (37 oC).
      2.   DUOMENYS
      Bandomosios medžiagos ir hidrolizės produktų, jei jų yra, kiekis, nustatytas kiekvienu bandinio ėmimo etapu, kiekvienai pH vertei bei bandymo temperatūrai turėtų būti nurodytas pradinės koncentracijos % ir, prireikus, mg/l. Be to, naudojant žymėtąją bandomąją medžiagą, pateikiamas masių balansas, išreikštas pradinės medžiagos koncentracijos procentine dalimi.
      Ataskaitoje pateikiamas logaritminis bandomosios medžiagos koncentracijos kaip laiko funkcijos duomenų grafikas. Be to, turi būti nustatyti visi pagrindiniai hidrolizės produktai, bent tie, kurių kiekis sudaro > 10 % pradinės įdėtos dozės, ir jų susidarymo bei išnykimo greičiams parodyti turi būti gauti jų koncentracijos logaritmo kaip laiko funkcijos grafikai, kokie buvo gauti pradinės medžiagos atveju.
      2.1.   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Pusėjimo trukmės arba DT50 vertės nustatomos tiksliau, taikant atitinkamo kinetinio modelio apskaičiavimus. Pusėjimo trukmės ir (arba) DT50 vertės (įskaitant pasikliovimo ribas) pateikiamos kiekvienai pH ir temperatūros vertei, kartu aprašomas taikytas modelis, kinetikos laipsnis ir determinacijos koeficientas (r2). Be to, jei tinka, apskaičiavimai taikomi hidrolizės produktams.
      Atliekant greičio tyrimus, esant skirtingoms temperatūros vertėms, pseudopirmojo laipsnio hidrolizės greičio konstantos (kobs) turėtų būti aprašytos kaip temperatūros funkcija. Apskaičiavimas turėtų būti pagrįstas kobs konstantos padalijimu į hidrolizės, katalizuojamos rūgštine, neutralia ir šarmine terpe, konstantas (kH, kneutral ir kOH) ir Arenijaus lygtimi:
      
         
      kurioje Ai ir Bi yra geriausios atitikties tiesių, gautų naudojant tiesinę ln ki kaip atvirkštinės absoliučiosios temperatūros (T) funkcijos regresiją, atkarpa ir krypties koeficientas. Taikant Arenijaus lygtis hidrolizei, katalizuojamai rūgštine, neutralia ir šarmine terpe, gaunamos pseudopirmojo laipsnio greičio konstantos, taigi pusėjimo trukmės vertės gali būti apskaičiuotos kitoms temperatūros vertėms, kurioms tiesioginis greičio konstantos nustatymas bandymo keliu yra neįmanomas (10).
      2.2.   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS
      Didžioji dalis hidrolizės reakcijų vyksta pseudopirmojo laipsnio reakcijos greičiu, taigi pusėjimo trukmės vertės nepriklauso nuo koncentracijos (žr. 2 priedo 4 lygtį). Dėl šios priežasties laboratorinius rezultatus, gautus 10-2–10-3 mol/l, paprastai galima taikyti aplinkos sąlygoms (≤ 10-6 mol/1) (10). Kelis įvairių cheminių medžiagų hidrolizės greičių, išmatuotų švariame ir gamtiniame vandenyje, gero sutapimo pavyzdžius, jei buvo matuojamos pH ir temperatūros vertės, paskelbė Mabey ir Mill (11).
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti ši informacija:
      Bandomoji medžiaga:
      
                  —
               
               
                  įprastas pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, struktūrinė formulė (rodanti žymėtojo atomo padėtį, jei naudojama žymėtoji medžiaga) ir atitinkamos fizikocheminės savybės (žr. 1.5 skirsnį);
               
            
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos grynumas (priemaišos);
               
            
                  —
               
               
                  radiocheminis žymėtosios cheminės medžiagos grynumas ir molinis aktyvumas (jei tinka).
               
            
                  —
               
               
                  Buferiniai tirpalai:
               
            
                  —
               
               
                  ruošimo datos ir detalės;
               
            
                  —
               
               
                  naudoti buferiniai tirpalai ir vanduo;
               
            
                  —
               
               
                  buferinių tirpalų molinė koncentracija ir pH.
               
            Bandymo sąlygos:
      
                  —
               
               
                  tyrimų atlikimo datos,
               
            
                  —
               
               
                  įdėtos bandomosios medžiagos kiekis,
               
            
                  —
               
               
                  metodai ir tirpikliai (tipas ir kiekis), naudoti bandomajai medžiagai įdėti,
               
            
                  —
               
               
                  inkubuojamų buferuotų bandomosios medžiagos tirpalų tūris,
               
            
                  —
               
               
                  naudotos inkubavimo sistemos aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  pH ir temperatūra bandymo laikotarpiu,
               
            
                  —
               
               
                  mėginių ėmimo laikas,
               
            
                  —
               
               
                  ekstrahavimo metodas (-ai),
               
            
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos ir jos hidrolizės buferiniuose tirpaluose kiekybinio nustatymo ir nustatymo metodai,
               
            
                  —
               
               
                  kartotinių bandinių skaičius.
               
            Rezultatai:
      
                  —
               
               
                  taikytų analizės metodų pakartojamumas ir jautris;
               
            
                  —
               
               
                  atgavimo laipsnio vertės (tinkamu patvirtinto tyrimo % vertės yra pateiktos 1.7.1 skirsnyje);
               
            
                  —
               
               
                  kartotinių bandinių duomenys ir vidurkiai lentelių pavidalu;
               
            
                  —
               
               
                  masių balansas tyrimų eigoje ir jų pabaigoje (kai naudojama žymėtoji bandomoji medžiaga);
               
            
                  —
               
               
                  pradinio bandymo rezultatai;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatų aptarimas ir interpretavimas;
               
            
                  —
               
               
                  visi pradiniai duomenys ir skaičiai.
               
            Šią informaciją reikia pateikti tik nustačius hidrolizės greitį:
      
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos ir, jei tinka, hidrolizės produktų koncentracijos verčių kaip laiko funkcijos grafikus kiekvienai pH ir temperatūros vertei,
               
            
                  —
               
               
                  Arenijaus lygties rezultatų duomenis 20 oC/25 oC temperatūrai, pH vertes, greičio konstantą [h-1 arba para-1], pusėjimo trukmę arba DT50, temperatūros vertes [ oC], įskaitant pasikliovimo ribas ir determinacijos koeficientus (r2), arba palyginamąją informaciją;
               
            
                  —
               
               
                  siūlomą hidrolizės kelią.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guideline for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981.
               
            
                  2)
               
               
                  US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25 oC. Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
               
            
                  3)
               
               
                  Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate Guidelines for registration of pesticides in Canada.
               
            
                  4)
               
               
                  European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex V: Fate and Behaviour in the Environment.
               
            
                  5)
               
               
                  Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
               
            
                  6)
               
               
                  BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (October 1980).
               
            
                  7)
               
               
                  SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.
               
            
                  8)
               
               
                  OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment Nr. 23.
               
            
                  9)
               
               
                  OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994 – 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
               
            
                  10)
               
               
                  Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14th Annual Meeting of the Society of Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, November 1993).
               
            
                  11)
               
               
                  Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis of organic compounds in water under environmental conditions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.
               
            
         1 Priedas
         Pakopinio hidrolizės bandymo schema
         
            
      
      
         2 Priedas
         Apibrėžtys ir vienetai
         Visais atvejais turėtų būti naudojami Tarptautinės vienetų sistemos (SI) vienetai.
         
            Bandomoji medžiaga – visos medžiagos, ar jos būtų pradinis junginys ar atitinkami virsmo produktai.
         
            Virsmo produktai – visos medžiagos, susidarančios vykstant biotiniam arba abiotiniam bandomosios medžiagos virsmui.
         
            Hidrolizės produktai – visos medžiagos, susidarančios vykstant bandomosios medžiagos hidrolizinio virsmo reakcijoms.
         
            Hidrolizė – bandomosios medžiagos RX reakcija su vandeniu, kai reakcijos centro X grupė pakeičiama vien tik OH:
         
                     RX + HOH → ROH +HX
                  
                  
                     [1]
                  
               Pagal šią supaprastintą proceso lygtį RX koncentracijos mažėjimo greitis aprašomas lygtimi:
         
                     greitis = k [H2O] [RX]
                  
                  
                     antrojo laipsnio reakcija
                  
               
                     arba
                  
               
                     greitis = k [RX]
                  
                  
                     pirmojo laipsnio reakcija
                  
               atsižvelgiant į greitį ribojančią stadiją. Kadangi palyginti su bandomosios medžiagos koncentracija vandens perteklius yra didelis, šio tipo reakcija paprastai aprašoma pseudopirmojo laipsnio reakcija, kurios matuojama greičio konstanta aprašoma lygtimi:
         
                     kobs = k [H2O]
                  
                  
                     [2]
                  
               ir gali būti nustatyta taikant šią išraišką (13):
         
                     
                         ln 
                        
                  
                  
                     [3]
                  
               čia t– laikas,
         C0, Ct– RX koncentracija laike 0 ir t.
         Šios konstantos vienetų dimensija (laikas)-1, o reakcijos pusėjimo trukmė (laikas, per kurį sureaguoja 50 % RX) aprašoma lygtimi:
         
                     
                        
                  
                  
                     [4]
                  
               
            Pusėjimo trukmė (t0,5) – laikas, per kurį hidrolizuojasi 50 % bandomosios medžiagos, kai reakcija gali būti aprašyta pirmojo laipsnio kinetika; trukmė nepriklauso nuo koncentracijos.
         
            DT
            
               50
            
            (išnykimo trukmė 50) – laikas, per kurį bandomosios medžiagos koncentracija sumažėja 50 %; ši trukmė ir pusėjimo trukmė t0,5 skiriasi, kai reakcija neatitinka pirmojo laipsnio kinetikos.
         
            k įvertis esant skirtingoms temperatūros vertėms
         
         Kai reakcijos greičio konstantos žinomos dviem temperatūros vertėms, reakcijos greičio konstantos vertės kitai temperatūrai gali būti apskaičiuotos taikant Arenijaus lygtį:
         
             arba 
         ln k kaip l/T funkcijos grafikas yra tiesė, kurios krypties koeficientas – E/R
         čia:
         
                     k
                  
                  
                     =
                  
                  
                     greičio konstanta, išmatuota esant skirtingoms temperatūros vertėms,
                  
               
                     E
                  
                  
                     =
                  
                  
                     aktyvacijos energija [kJ/mol],
                  
               
                     T
                  
                  
                     =
                  
                  
                     absoliučioji temperatūra [K],
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     dujų konstanta [8,314 J/mol.K],
                  
               Aktyvacijos energija buvo apskaičiuota, taikant regresinę analizę arba šią lygtį:
         
            
         čia: T2 > T1.
      
      
         3 Priedas
         Buferinių tirpalų sistemos
         A.   CLARK IR LUBS:
         CLARK ir LUBS buferiniai mišiniai
                (14)
            
         
         
                     Sudetis
                  
                  
                     pH
                  
               
                     
                        0,2 mol/1 HCl ir 0,2 mol/l KCl esant 20 oC
                     
                  
               
                     47,5 ml HCl + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     32,25 ml HCl + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml
                  
                  
                     1,2
                  
               
                     20,75 ml HCl + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml
                  
                  
                     1,4
                  
               
                     13,15 ml HCl + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml
                  
                  
                     1,6
                  
               
                     8,3 ml HC1 + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml
                  
                  
                     1,8
                  
               
                     5,3 ml HCl + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml
                  
                  
                     2,0
                  
               
                     3,35 ml HCl + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml
                  
                  
                     2,2
                  
               
                     
                        0,1 mol/l kalio hidroftalato +0,1 mol/l HCl esant 20 oC
                     
                  
               
                     46,70 ml 0,1 mol/1 HCl + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     2,2
                  
               
                     39,60 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     2,4
                  
               
                     32,95 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     2,6
                  
               
                     26,42 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     2,8
                  
               
                     20,32 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     3,0
                  
               
                     14,70 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     3,2
                  
               
                     9,90 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     3,4
                  
               
                     97 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     3,6
                  
               
                     2,63 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     3,8
                  
               
                     
                        0,1 mol/l kalio hidroftalato +0,1 mol/l NaOH esant 20 oC
                     
                  
               
                     0,40 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     4,0
                  
               
                     3,70 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     4,2
                  
               
                     7,50 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     4,4
                  
               
                     12,15 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     4,6
                  
               
                     17,70 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     4,8
                  
               
                     23,85 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     5,0
                  
               
                     29,95 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     5,2
                  
               
                     35,45 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     5,4
                  
               
                     39,85 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     5,6
                  
               
                     43,00 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     5,8
                  
               
                     45,45 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml hidroftalato iki 100 ml
                  
                  
                     6,0
                  
               CLARK ir LUBS buferiniai mišiniai (tęsinys)
         
                     
                        0,1 mol/l kalio dihidrofosfato +0,1 mol/l NaOH esant 20 oC
                     
                  
               
                     5,70 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml
                  
                  
                     6,0
                  
               
                     8,60 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml
                  
                  
                     6,2
                  
               
                     12,60 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml
                  
                  
                     6,4
                  
               
                     17,80 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml
                  
                  
                     6,6
                  
               
                     23,45 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml
                  
                  
                     6,8
                  
               
                     29,63 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml
                  
                  
                     7,0
                  
               
                     35,00 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml
                  
                  
                     7,2
                  
               
                     39,50 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml
                  
                  
                     7,4
                  
               
                     42,80 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml
                  
                  
                     7,6
                  
               
                     45,20 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml
                  
                  
                     7,8
                  
               
                     46,80 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml
                  
                  
                     8,0
                  
               
                     
                        0,1 mol/l H 3BO3 + 0,1 mol/l KC1 +0,1 mol/l NaOH esant 20 oC
                     
                  
               
                     2,61 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml
                  
                  
                     7,8
                  
               
                     3,97 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml
                  
                  
                     8,0
                  
               
                     5,90 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml
                  
                  
                     8,2
                  
               
                     8,50 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml
                  
                  
                     8,4
                  
               
                     12,00 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml
                  
                  
                     8,6
                  
               
                     16,30 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml
                  
                  
                     8,8
                  
               
                     21,30 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml
                  
                  
                     9,0
                  
               
                     26,70 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml
                  
                  
                     9,2
                  
               
                     32,00 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml
                  
                  
                     9,4
                  
               
                     36,85 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml
                  
                  
                     9,6
                  
               
                     40,80 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml
                  
                  
                     9,8
                  
               
                     43,90 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml boro rūgšties iki 100 ml
                  
                  
                     10,0
                  
               B.   KOLTHOFF IR VLEESCHOUWER:
         KOLTHOFF ir VLEESCHOUWER citratiniai buferiniai tirpalai
         
                     Sudėtis
                  
                  
                     pH
                  
               
                     
                        0,1 mol/l kalio dihidrocitrato ir 0,1 mol/l HC1, esant 18 oC
                         (15)
                     
                  
               
                     49,7 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     2,2
                  
               
                     43,4 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     2,4
                  
               
                     36,8 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     2,6
                  
               
                     30,2 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     2,8
                  
               
                     23,6 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     3,0
                  
               
                     17,2 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     3,2
                  
               
                     10,7 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     3,4
                  
               
                     4,2 ml 0,1 mol/1 HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     3,6
                  
               
                     
                        0,1 mol/l kalio dihidrocitrato ir 0,1 mol/l NaOH, esant 18 oC
                         (15)
                     
                  
               
                     2,0 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     3,8
                  
               
                     9,0 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     4,0
                  
               
                     16,3 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     4,2
                  
               
                     23,7 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     4,4
                  
               
                     31,5 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     4,6
                  
               
                     39,2 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     4,8
                  
               
                     46,7 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     5,0
                  
               
                     54,2 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     5,2
                  
               
                     61,0 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     5,4
                  
               
                     68,0 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     5,6
                  
               
                     74,4 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     5,8
                  
               
                     81,2 ml 0,1 mol/1 NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml
                  
                  
                     6,0
                  
               C.   SÖRENSEN:
         SÖRENSEN boratiniai mišiniai
         
                     Sudetis
                  
                  
                     Sörensen
                     18 oC
                  
                  
                     Walbum, pH, esant
                  
               
                     ml borakso
                  
                  
                     ml HCl/NaOH
                  
                  
                     10 oC
                  
                  
                     40 oC
                  
                  
                     70 oC
                  
               
                     
                        0,05 mol/l borakso +0,1 mol/l HC1
                     
                  
               
                     5,25
                  
                  
                     4,75
                  
                  
                     7,62
                  
                  
                     7,64
                  
                  
                     7,55
                  
                  
                     7,47
                  
               
                     5,50
                  
                  
                     4,50
                  
                  
                     7,94
                  
                  
                     7,98
                  
                  
                     7,86
                  
                  
                     7,76
                  
               
                     5,75
                  
                  
                     4,25
                  
                  
                     8,14
                  
                  
                     8,17
                  
                  
                     8,06
                  
                  
                     7,95
                  
               
                     6,00
                  
                  
                     4,00
                  
                  
                     8,29
                  
                  
                     8,32
                  
                  
                     8,19
                  
                  
                     8,08
                  
               
                     6,50
                  
                  
                     3,50
                  
                  
                     8,51
                  
                  
                     8,54
                  
                  
                     8,40
                  
                  
                     8,28
                  
               
                     7,00
                  
                  
                     3,00
                  
                  
                     8,08
                  
                  
                     8,72
                  
                  
                     8,56
                  
                  
                     8,40
                  
               
                     7,50
                  
                  
                     2,50
                  
                  
                     8,80
                  
                  
                     8,84
                  
                  
                     8,67
                  
                  
                     8,50
                  
               
                     8,00
                  
                  
                     2,00
                  
                  
                     8,91
                  
                  
                     8,96
                  
                  
                     8,77
                  
                  
                     8,59
                  
               
                     8,50
                  
                  
                     1,50
                  
                  
                     9,01
                  
                  
                     9,06
                  
                  
                     8,86
                  
                  
                     8,67
                  
               
                     9,00
                  
                  
                     1,00
                  
                  
                     9,09
                  
                  
                     9,14
                  
                  
                     8,94
                  
                  
                     8,74
                  
               
                     9,50
                  
                  
                     0,50
                  
                  
                     9,17
                  
                  
                     9,22
                  
                  
                     9,01
                  
                  
                     8,80
                  
               
                     10,00
                  
                  
                     0,00
                  
                  
                     9,24
                  
                  
                     9,30
                  
                  
                     9,08
                  
                  
                     8,86
                  
               
                     
                        0,05 mol/1 borakso +0,1 mol/1 NaOH
                     
                  
               
                     10,0
                  
                  
                     0,0
                  
                  
                     9,24
                  
                  
                     9,30
                  
                  
                     9,08
                  
                  
                     8,86
                  
               
                     9,0
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     9,36
                  
                  
                     9,42
                  
                  
                     9,18
                  
                  
                     8,94
                  
               
                     8,0
                  
                  
                     2,0
                  
                  
                     9,50
                  
                  
                     9,57
                  
                  
                     9,30
                  
                  
                     9,02
                  
               
                     7,0
                  
                  
                     3,0
                  
                  
                     9,68
                  
                  
                     9,76
                  
                  
                     9,44
                  
                  
                     9,12
                  
               
                     6,0
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                     9,97
                  
                  
                     10,06
                  
                  
                     9,67
                  
                  
                     9,28
                  
               SÖRENSEN fosfatiniai mišiniai
         
                     Sudėtis
                  
                  
                     pH
                  
               
                     
                        0,0667 mol/l kalio dihidrofosfato + 0,0667 mol/l natrio hidrofosfato, esant 20 oC
                     
                  
               
                     99,2 ml KH2PO4 + 0,8 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,0
                  
               
                     98,4 ml KH2PO4 + 1,6 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,2
                  
               
                     97,3 ml KH2PO4 + 2,7 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,4
                  
               
                     95,5 ml KH2PO4 + 4,5 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,6
                  
               
                     92,8 ml KH2PO4 + 7,2 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,8
                  
               
                     88,9 ml KH2PO4 + 11,1 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,0
                  
               
                     83,0 ml KH2PO4 + 17,0 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,2
                  
               
                     75,4 ml KH2PO4 + 24,6 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,4
                  
               
                     65,3 ml KH2PO4 + 34,7 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,6
                  
               
                     53,4 ml KH2PO4 + 46,6 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,8
                  
               
                     41,3 ml KH2PO4 + 58,7 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,0
                  
               
                     29,6 ml KH2PO4 + 70,4 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,2
                  
               
                     19,7 ml KH2PO4 + 80,3 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,4
                  
               
                     12,8 ml KH2PO4 + 87,2 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,6
                  
               
                     7,4 ml KH2PO4 + 92,6 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,8
                  
               
                     3,7 ml KH2PO4 + 96,3 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     8,0
                  
               
      C.8.   TOKSIŠKUMO SLIEKAMS MATAVIMAS
      DIRBTINIO DIRVOŽEMIO BANDYMAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Šiame laboratoriniame bandyme bandomoji medžiaga maišoma su dirbtiniu dirvožemiu, į kurį 14 parų dedami sliekai. Kai baigiasi šis laikas (ir neprivalomai po septynių parų), tiriama medžiagos įtaka sliekų mirtingumui. Bandyme pateiktas metodas, kaip daryti palyginus greitą atranką medžiagų, kurios per odą ir virškinimo traktą veikia sliekus.
      1.2.   APIBRĖŽTIS IR VIENETAS
      LC50 – apytikriai apskaičiuota koncentracija medžiagos, kurią naudojant per bandymų laiką žūsta 50 % bandymų gyvūnų.
      1.3.   ETALONINĖ MEDŽIAGA
      Periodiškai naudojama etaloninė medžiaga, kaip priemonė parodyti, kad bandymų sistemos jautrumas žymiai nepakito.
      Etalonine medžiaga rekomenduojama naudoti analiziškai gryną chloracetamidą.
      1.4.   BANDYMO ESMĖ
      Dirvožemis yra nepastovi terpė, todėl šiame bandyme naudojamas tiksliai apibrėžtas dirbtinis priemolio dirvožemis. Suaugę Eisenia foetida rūšies sliekai (žr. papildymo pastabą) laikomi apibrėžtos sudėties dirbtiniame dirvožemyje, apdorotame įvairios koncentracijos bandomąja medžiaga. Indų turinys po 14 parų (ir neprivalomai po septynių parų) nuo bandymo pradžios yra pasklaidomas ant padėklo, ir kiekvienai naudotai koncentracijai skaičiuojami likę gyvi sliekai.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Bandymas projektuotas taip, kad atkuriamumas bandymo substrato ir organizmo atžvilgiu būtų kiek įmanoma geresnis. Mirtingumas kontroliniuose bandiniuose bandymo pabaigoje turi būti ne didesnis kaip 10 %, kitaip bandymas yra nevalidus.
      1.6.   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Medžiagos
      
      1.6.1.1.   Bandymo substratas
      
      Bandymo pagrindiniu substratu naudojamas apibrėžtas dirbtinis dirvožemis.
      
                  a)
               
               
                  Pagrindinis substratas (procentinė sudėtis skaičiuojama sausos medžiagos masei)
                  
                              —
                           
                           
                              10 % samanų durpių (pH reikšmė kiek įmanoma arčiau 5,5–6,0, be matomų augalų liekanų ir smulkiai maltų),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              20 % kaolinito molio; pageidautina, kad kaolinito jame būtų daugiau kaip 50 %,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              apie 69 % pramoninio kvarco smėlio (daugiausia tai turi būti smulkus smėlis, kurio daugiau kaip 50 % dalelių dydis būtų nuo 0,05 iki 0,2 mm). Jei medžiagos dispergavimas vandenyje nepakankamas, kiekvienam bandymų indui reikėtų turėti 10 g smėlio, kurį vėliau būtų galima maišyti su bandomąja medžiaga,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              apie 1 % kalcio karbonato (CaCO3), smulkiai malto, chemiškai gryno, dedamo padidinti pH vertę iki 6,0±0,5.
                           
                        
            
                  b)
               
               
                  Bandymų substratas
                  Bandymų substratas susideda iš pagrindinio substrato, bandomosios medžiagos ir dejonizuoto vandens.
                  Vanduo jame sudaro maždaug nuo 25 % iki 42 % sauso pagrindinio substrato masės. Vandens kiekis substrate nustatomas džiovinant bandinį 105 oC temperatūroje iki pastoviosios masės. Pagrindinis vertinimas, kiek reikia drėkinti dirbtinį dirvožemį, yra nesugerto vandens nebuvimas. Būtina rūpestingai maišyti, kad bandomoji medžiaga tolygiai būtų pasiskirstyta substrate. Bandomosios medžiagos įterpimo į substratą būdas turi būti nurodytas ataskaitoje.
               
            
                  c)
               
               
                  Kontrolinis substratas
                  Kontrolinį substratą sudaro pagrindinis substratas ir vanduo. Jei naudojamas priedas, papildomame kontroliniame bandinyje turi būti toks pat priedo kiekis.
               
            1.6.1.2.   Bandymų indai
      
      Maždaug vieno litro talpos stiklinis indas (tinkamai uždengtas plastiko dangčiu, lėkštele ar plastiko plėvele su ventiliacijos angomis), užpildytas tokiu kiekiu drėgno bandymų substrato ar kontrolinio substrato, kuris atitiktų 500 g sauso substrato masę.
      1.6.2.   Bandymų sąlygos
      
      Indai turi būti laikomi nuolat apšviestose klimato kamerose 20 ± 2 oC temperatūroje. Apšvieta turi būti nuo 400 iki 800 liuksų.
      Bandymo trukmė – 14 parų, tačiau mirtingumą dar neprivalomai galima vertinti po septynių parų nuo bandymo pradžios.
      1.6.3.   Bandymų eiga
      
      
         Bandomosios medžiagos koncentracijos vertės
      
      Bandomosios medžiagos koncentracija skaičiuojama medžiagos mase sauso pagrindinio substrato masei (mg/kg).
      
         Intervalo nustatymo bandymas
      
      Norint turėti informaciją, kokias koncentracijas naudoti galutiniame bandyme, intervalo nustatymo bandyme gali būti nustatyta koncentracija, dėl kurios mirtingumas kinta nuo 0 iki 100 %.
      Medžiaga turi būti išbandyta tokios koncentracijos: 1 000; 100; 10; 1; 0,1 mg medžiagos kilogramui bandymo substrato (sausos masės).
      Jei turi būti daromas visas galutinis bandymas, tai intervalo nustatymo bandyme kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam bandymui be medžiagos pakaktų po vieną bandymų partiją, kurioje būtų 10 sliekų.
      
         Galutinis bandymas
      
      Intervalo nustatymo rezultatai naudojami parinkti bent penkias, geometrine progresija sudarančias koncentracijas, kurios apima tik mirtingumo intervalą nuo 0 iki 100 % ir skiriasi pastoviu daugikliu, ne didesniu kaip 1,8.
      Bandymai, naudojant tokią koncentracijų seriją, turi leisti kiek įmanoma tiksliau įvertinti LC50 vertę ir jos pasikliovimo rėžius.
      Galutiniame bandyme kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam bandymui be medžiagos imamos bent keturios bandymų partijos, kurių kiekvienoje būtų 10 sliekų. Šių lygiagrečių bandymų rezultatai pateikiami vidutinės vertės ir standartinio nuokrypio pavidalu.
      Kai dvi gretimos koncentracijos, kurių santykis 1,8, duoda tik 0 % ir tik 100 % mirtingumą, šių dviejų verčių pakanka pažymėti intervalą, į kurį patenka LC50.
      
         Pagrindinio bandymų substrato ir bandomosios medžiagos maišymas
      
      Bandymų substratas turi būti gaminamas, kai tai įmanoma, be jokių priedų, išskyrus vandenį. Prieš pat bandymo pradžią bandomosios medžiagos emulsija ar dispersija dejonizuotame vandenyje ar kitame tirpiklyje sumaišoma su pagrindiniu bandymo substratu arba tolygiai ant jo užpurškiama plonu chromatografiniu ar panašios rūšies purkštuvu.
      Jei medžiaga netirpsta vandenyje, ji gali būti ištirpinta kuo mažesniame tinkamo organinio tirpiklio tūryje (pvz., heksane, acetone ar chloroforme).
      Bandomajai medžiagai soliubilizuoti, disperguoti ar emulguoti galima naudoti tik lengvai garuojančias medžiagas. Prieš naudojant bandymų substratas turi būti vėdinamas. Išgaravusio vandens kiekis turi būti papildytas. Kontroliniame bandinyje turi būti toks pat visų naudotų priedų kiekis.
      Jei bandomoji medžiaga netirpsta, ir negali būti disperguota ar emulguota organiniuose tirpikliuose, 10 g smulkaus malto kvarco ir bandomosios medžiagos, kiek jos reikia 500 g sauso dirbtinio dirvožemio apdoroti, mišinys maišomas su 490 g sauso bandomojo substrato.
      Kiekvienai bandymų partijai į stiklinį indą dedama šlapio bandymų substrato, atitinkančio 500 g sauso substrato, ir ant bandymų substrato viršaus dedama 10 sliekų, kurie prieš tai 24 valandas buvo kondicionuoti panašiame šlapiame pagrindiniame substrate, po to greitai nuplauti vandeniu, vandens perteklių sugeriant filtriniu popieriumi.
      Indai dengiami perforuotu plastikiniu dangčiu, lėkštelę ar plėvele, kad substratas nedžiūtų, ir 14 parų laikomi bandymų sąlygomis.
      Vertinimas turi būti daromas po 14 parų (ir neprivalomai po septynių parų) nuo bandymo pradžios. Substratas paskleidžiamas ant stiklinės ar nerūdijančio plieno plokštės. Sliekai apžiūrimi ir nustatomas gyvųjų sliekų skaičius. Sliekai laikomi negyvais, jei jie neatsako į švelnų mechaninį priekinio galo dirginimą.
      Kai tikrinimas daromas po septynių parų, indas vėl užpildomas substratu, ir likę gyvi sliekai dedami ant to paties bandymų substrato viršaus.
      1.6.4.   Bandymų organizmai
      
      Bandymų organizmai turi būti suaugę Eisenia foetida (žr. priedėlio pastabą) (bent dviejų mėnesių amžiaus su clitellum), drėgnų sliekų masė yra nuo 300 iki 600 mg. (Apie auginimo metodą žr. priedėlį.)
      2.   DUOMENYS
      2.1.   REZULTATŲ APDOROJIMAS IR VERTINIMAS
      Ataskaitoje pateikiamos bandomosios medžiagos koncentracijos, su nuoroda į atitinkamą procentinį kiekį žuvusių sliekų.
      Kai duomenys yra tinkami skaičiuoti, LC50 vertė ir pasikliovimo rėžiai (p = 0,05) turi būti nustatyti, taikant standartinius metodus (Litchfield and Wilcoxon, 1949, lygiaverčiam metodui). LC50 turi būti nurodyta mg bandomosios medžiagos vienam kilogramui (sauso) bandymų substrato.
      Tais atvejais, kai koncentracijos kreivė yra per stati, kad būtų galima skaičiuoti LC50, pakanka grafinio šios vertės įverčio.
      Kai dvi gretimos koncentracijos, kurių santykis 1,8, duoda tik 0 % ir tik 100 % mirtingumą, šių dviejų verčių pakanka pažymėti intervalą, į kurį patenka LC50.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  tvirtinimas, kad bandymas buvo daromas pagal aukščiau minėtus kokybės kriterijus,
               
            
                  —
               
               
                  darytas bandymas (intervalo nustatymo bandymas ir (ar) galutinis bandymas),
               
            
                  —
               
               
                  tikslus bandymo sąlygų aprašymas arba tvirtinimas, kad bandymas buvo darytas pagal metodą; turi būti nurodyti visi nukrypimai,
               
            
                  —
               
               
                  tikslus aprašymas, kaip bandomoji medžiaga buvo įmaišyta į pagrindinį bandymo substratą,
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie bandymų organizmus (rūšį, amžių, masės vidutinę vertę ir intervalą, laikymo ir auginimo sąlygos, tiekėjas),
               
            
                  —
               
               
                  metodas, taikytas nustatyti LC50,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų rezultatai, įskaitant visus naudotus duomenis,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų organizmų pastebėtų simptomų ar elgesio pokyčių aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  mirtingumas kontroliniuose bandiniuose,
               
            
                  —
               
               
                  LC50 ar didžiausia bandyta koncentracija, kurioje mirtingumas nulinis, ir mažiausia bandyta koncentracija, kurioje mirtingumas 100 %, 14 parų (ir neprivalomai septynios paros) nuo bandymo pradžios,
               
            
                  —
               
               
                  koncentracijos ir atsako kreivės brėžinys,
               
            
                  —
               
               
                  rezultatai, gauti su etalonine medžiaga, šiame bandyme ar iš ankstesniųjų kokybės kontrolės tyrimų.
               
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decision of the Council C(81)30 final.
               
            
                  2)
               
               
                  Edwards, C. A. and Lofty,]. R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and Hall, London, p. 331.
               
            
                  3)
               
               
                  Bouche. M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Systematique, Institut National de la Recherche Agronomique, p. 671.
               
            
                  4)
               
               
                  Litchfield, J. T. andWilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments. I. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99.
               
            
                  5)
               
               
                  Commission of the European Communities, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.
               
            
                  6)
               
               
                  Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Toxizitatstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden“, in: Rudolph/Boje, Okotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
               
            
         Priedėlis
         Sliekų auginimas ir laikymas prieš bandymus
         Norint auginti gyvūnus, į auginimo dėžę su šviežiai paruoštu substratu dedama nuo 30 iki 50 suaugusių sliekų, kurie išimami po 14 parų. Šiuos gyvūnus galima naudoti kitoms auginimo partijoms. Iš kokonų gauti sliekai bandymuose naudojami, kai subręsta (nurodytomis sąlygomis po dviejų ar trijų mėnesių).
         Laikymo ir auginimo sąlygos
         
                     Klimato kamera
                  
                  
                     :
                  
                  
                     temperatūra 20 ± 2 oC, geriau, jei nuolat apšviesta (apšvieta nuo 400 iki 800 liuksų).
                  
               
                     Auginimo dėžės
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Tinkami negilūs 10–20 1 tūrio indai.
                  
               
                     Substratas
                  
                  
                     :
                  
                  
                     
                        Eisenia foetida gali būti veisiami įvairių gyvulių išmatose. Rekomenduojama auginimo terpe naudoti mišinį, kurį sudaro 50 % pagal tūrį durpės ir 50 % karvių ar arklių mėšlas. Terpės pH vertė turi būti nuo 6 iki 7 (reguliuojama kalcio karbonatu), savitasis joninis laidumas mažas (mažesnis nei 6 mohm ar druskos 0,5 % koncentracijos tirpalo).
                     Substratas turi būti drėgnas, bet ne per šlapias.
                     Be aukščiau pateikto metodo galima naudoti kitus sėkmingus būdus.
                  
               
            Pastaba.
            Eisenia foetida yra dviejų veislių, kurias kai kurie taksonomijos specialistai išskyrė į rūšis (Bouche, 1972). Šios veislės morfologiškai yra panašios, tačiau viena jų – Eisenia foetida foetida – ant segmentų turi tipiškus skersus dryžius ar juostas, o kita – Eisenia foetida anderei -to neturi ir yra margos rausvos spalvos. Jei įmanoma, turi būti naudojama Eisenia foetida andrei. Galima naudoti ir kitas rūšis, jei yra reikiamos metodikos.
      
      C.9.   BIOLOGINIS SKAIDYMAS
      ZAHN-WELLENS BANDYMAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Metodo tikslas yra įvertinti vandenyje tirpių, nelakių organinių medžiagų galimą suskaidymą, kai jas statiniame bandyme veikia palyginti didelės koncentracijos mikroorganizmai.
      Ant suspenduotų kietųjų dalelių gali vykti fizikocheminė adsorbcija, ir į tai turi būti atsižvelgta interpretuojant rezultatus (žr. 3.2).
      Tiriamos medžiagos naudojamos tokios koncentracijos, kad ji atitiktų DOC vertes intervale nuo 50 iki 400 mg/litre ar COD vertes nuo 100 iki 1 000 mg/litre (DOC = ištirpusi organinė anglis; COD = cheminis deguonies poreikis). Šios palyginti didelės koncentracijos turi analizinio patikimumo pranašumą. Junginiai, kurie turi toksiškų savybių, gali lėtinti arba inhibuoti skaidymo procesą.
      Bandomosios medžiagos biologiniam suskaidymui įvertinti šiame bandyme taikomas ištirpusios organinės anglies koncentracijos arba cheminio deguonies poreikio matavimas.
      Jei lygiagrečiai taikyti specifinį analizės metodą, gali būti įmanoma įvertinti medžiagos pirminį biologinį skaidymą (pirminės cheminės sandaros išnykimas).
      Metodas tinka tik toms organinėms bandomosioms medžiagoms, kurios bandyme naudojamos koncentracijos:
      
                  —
               
               
                  tirpios vandenyje bandymų sąlygomis,
               
            
                  —
               
               
                  garų slėgis bandymo sąlygomis yra labai mažas,
               
            
                  —
               
               
                  neinhibuoja bakterijų,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų sistemoje adsorbuojamos tik ribotu laipsniu,
               
            
                  —
               
               
                  iš bandomojo tirpalo nepradingsta dėl putojimo.
               
            Norint paaiškinti gautus rezultatus, ypač kai rezultatai yra maži arba nežymūs, naudinga būtų turėti informacijos apie bandomosios medžiagos pagrindinių komponentų santykinę dalį.
      Kai reikia paaiškinti mažus rezultatus ir pasirinkti tinkamas bandomąsias koncentracijas, pageidautina turėti informacijos apie medžiagos toksiškumą mikroorganizmams.
      1.2.   APIBRĖŽTYS IR VIENETAI
      Bandymo pabaigoje pasiektas skaidymo lygis ataskaitoje pateikiamas kaip „Biologinis skaidomumas Zahn-Wellens bandyme“:
      
         
      čia:
      
                  DT
               
               
                  =
               
               
                  biologinis skaidymas ( %) laiku T,
               
            
                  CA
               
               
                  =
               
               
                  DOC (ar COD) vertės bandomajame mišinyje po trijų valandų nuo bandymo pradžios (mg/l) (DOC = ištirpusi organinė anglis, COD = cheminis deguonies poreikis),
               
            
                  CT
               
               
                  =
               
               
                  DOC ar COD vertės bandomajame mišinyje bandinio ėmimo metu (mg/l),
               
            
                  CB
               
               
                  =
               
               
                  DOC ar COD vertė tuščiajame bandinyje bandinio ėmimo metu (mg/l),
               
            
                  CBA
               
               
                  =
               
               
                  DOC ar COD vertė tuščiajame bandinyje, išmatuota po trijų valandų nuo bandymo pradžios (mg/l).
               
            Skaidymo laipsnis apvalinamas iki artimiausio sveikojo procentų skaičiaus.
      Skaidymo procentinė vertė nurodoma kaip bandomosios medžiagos DOC (ar COD) pašalinimo procentinė vertė.
      Skirtumas tarp skaidymo vertės, išmatuotos po trijų valandų, ir paskaičiuotos, bet geriau išmatuotos, pradinės vertės gali suteikti naudingos informacijos apie medžiagos šalinimą (žr. 3.2. Duomenų interpretavimas).
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Kai kuriais atvejais, kai tiriamos naujos medžiagos, etaloninės medžiagos gali būti naudingos, tačiau specifinės etaloninės medžiagos vis dar negali būti rekomenduotos.
      1.4.   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Aktyvusis dumblas, mineralinė mitybinė terpė ir bandomoji medžiaga, kaip vienintelis anglies šaltinis vandeniniame tirpale, dedami kartu į vieno keturių litrų tūrio stiklinį indą turinti maišiklį ir aeratorių. Mišinys ne ilgiau kaip 28 paras maišomas ir aeruojamas 20–25 oC temperatūroje išsklaidytoje šviesoje arba tamsioje patalpoje. Skaidymo procesas kontroliuojamas, nustatant DOC (ar COD) vertes filtruotame tirpale kasdieną ar per kitokį tinkamą vienodą laiko tarpą. Po kiekvieno matavimo nustatytos DOC (ar COD) pašalinimo vertės santykis su verte, gauta po trijų valandų nuo bandymo pradžios, reiškiamas procentine biologinio skaidymo verte ir yra naudojamas kaip tam momentui nustatytas skaidymo laipsnio matas. Rezultatas atidedamas kaip kitimas laike ir gaunama biologinio skaidymo kreivė.
      Kai taikomas specifinis analizės metodas, galima nustatyti pradinės medžiagos koncentracijos mažėjimą dėl jos molekulių biologinio skaidymo (pirminis biologinis skaidomumas).
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Tarplaboratorinio lyginimo bandymas parodė, kad šio metodo atkuriamumas yra patenkinamas.
      Metodo jautrumą dideliu laipsniu lemia tuščiojo bandinio kintamumas ir, kiek mažiau, ištirpusios anglies nustatymo preciziškumas ir bandomosios medžiagos kiekis skystyje..
      1.6.   BANDYMŲ METODIKOS APRAŠYMAS
      1.6.1.   Pasirengimas
      
      1.6.1.1.   Reagentai
      
      Bandymų vanduo: geriamasis vanduo, kuriame organinės anglies kiekis < 5 mg/litre. Bendra kalcio ir magnio jonų koncentracija neturi būti didesnė kaip 2,7 mmol/litre; priešingu atveju, reikia atitinkamai skiesti dejonizuotu arba distiliuotu vandeniu.
      
                  Sieros rūgštis, analizinis reagentas (A.R.):
               
               
                  50 g/l
               
            
                  Natrio hidroksido tirpalas A.R.:
               
               
                  40 g/l
               
            
                  Mineralinis mitybinis tirpalas: viename litre dejonizuoto vandens ištirpinkite:
               
               
                   
               
            
                  amonio chlorido, NH4Cl, A.R.:
               
               
                  38,5 g
               
            
                  natrio dihidrofosfato, NaH2PO4x2H2O, A.R.:
               
               
                  33,4 g,
               
            
                  kalio dihidrofosfato, KH2PO4, A.R.:
               
               
                  8,5 g,
               
            
                  kalio hidrofosfato, K2HPO4, A.R.:
               
               
                  21,75 g.
               
            Mišinys naudojamas ir kaip mitybinė, ir kaip buferuojanti terpė.
      1.6.1.2.   Aparatūra
      
      Nuo vieno iki keturių litrų talpos stikliniai indai (pvz., cilindriniai indai).
      Maišymo įtaisas su stikliniu ar metaliniu maišikliu ant tinkamo ilgio veleno (maišiklis turi suktis maždaug 5–10 cm virš indo dugno). Vietoj jo galima naudoti magnetinį maišiklį su 7–10 cm ilgio magnetu.
      Stiklinis vamzdis, kurio vidinis skersmuo 2–4 mm, orui tiekti. Vamzdžio anga turi būti maždaug 1 cm aukštyje virš indo dugno.
      Centrifuga (apie 3 550 g).
      pH-metras.
      Ištirpusio deguonies matuoklis.
      Popieriniai filtrai.
      Membraninio filtravimo aparatas.
      Membraniniai filtrai, akučių dydis 0,45 μm. Membraniniai filtrai tinka, jei užtikrinama, kad filtravimo pakopoje jie neišskiria anglies ir nesugeria medžiagos.
      Analizės įranga organinės anglies kiekiui ir cheminiam deguonies poreikiui nustatyti.
      1.6.1.3.   Sėjimo kultūros ruošimas
      
      Aktyvusis dumblas iš biologinio valymo įrenginio yra plaunamas (kelis kartus), centrifuguojant arba nusodinant iš bandymų vandens (anksčiau).
      Aktyvusis dumblas turi būti atitinkamos būsenos. Tokio dumblo yra tinkamai veikiančiame nuotekų valymo įrenginyje. Norint gauti kiek įmanoma daugiau įvairių bakterijų rūšių ar štamų, gali būti geriau maišyti skirtingų šaltinių sėjimo kultūras (pvz., skirtingų valymo įrenginių, dirvožemio ekstraktų, upės vandens ir t. t.). Mišinys turi būti apdorojamas, kaip aprašyta anksčiau.
      Kaip tikrinti aktyviojo dumblo aktyvumą, žr. „Funkcinė kontrolė“, toliau.
      1.6.1.4.   Bandomųjų tirpalų ruošimas
      
      Į bandymo indą įpilkite 500 ml bandymų vandens, 2,5 ml/litre mineralinio mitybinio tirpalo ir tiek aktyviojo dumblo, kad galutiniame mišinyje sausosios medžiagos būtų nuo 0,2 iki 1,0 g/litre. Įpilkite pakankamą kiekį pradinio bandomosios medžiagos tirpalo, kad DOC galutiniame mišinyje būtų nuo 50 iki 400 mg/litre. Atitinkamos COD vertės yra nuo 100 iki 1 000 mg/litre. Praskieskite bandymų vandeniu iki bendrojo tūrio nuo vieno iki keturių litrų. Tai, kokį bendrąjį tūrį pasirinkti, priklauso nuo bandinių skaičiaus, kurie bus imami DOC ar COD nustatyti, ir nuo analizės metodikai reikalingo tūrio.
      Paprastai galima laikyti, kad pakanka dviejų litrų tūrio. Kiekvienai bandymų serijai lygiagrečiai ruošiamas bent vienas kontrolinis indas (su tuščiuoju bandiniu); jame yra tik aktyviojo dumblo ir mineralinio mitybinio tirpalo, praskiestų su bandymų vandeniu iki to paties tūrio, kaip ir induose su bandomąja medžiaga.
      1.6.2.   Bandymo eiga
      
      Išsklaidytoje šviesoje ar tamsioje patalpoje 20–25 oC temperatūroje laikomų bandymo indų turinys maišomas magnetinėmis maišyklėmis ar sraigtiniais maišytuvais. Aeruojama suslėgtuoju oru, valomu leidžiant per medvilnės filtrą ir, jei būtina, per plovimo kolbą. Reikia užtikrinti, kad dumblas nenusistotų, o deguonies koncentracija būtų ne mažesnė kaip 2 mg/litre.
      pH vertė turi būti tikrinama vienodais laiko tarpais (pvz., kasdien) ir, jei būtina, pH vertė nustatoma nuo 7 iki 8.
      Garavimo nuostoliai reikiamais kiekiais kompensuojami dejonizuotu ar distiliuotu vandeniu prieš kiekvieną bandinio ėmimą. Gerai būtų pažymėti skysčio lygį ant indo sienelės prieš bandymo pradžią. Naujos žymės daromos po kiekvieno bandinio ėmimo (neaeruojant ir nemaišant). Norint aptikti bandomosios medžiagos adsorbciją aktyviuoju dumblu, pirmieji bandiniai, visuomet imami po trijų valandų nuo bandymo pradžios.
      Bandomosios medžiagos šalinimas sekamas, darant kasdien ar kitais vienodais laiko tarpais DOC ar COD nustatymą. Bandiniai iš bandymų ir tuščiojo bandymo indų filtruojami per kruopščiai išplautą popieriaus filtrą. Pirmieji bandomojo tirpalo filtrato 5 ml pilami lauk. Sunkiai filtruojamas dumblas gali būti prieš tai pašalintas 10 minučių centrifugavimu. DOC ir COD nustatymas daromas bent po du kartus. Bandymo trukmė ne daugiau kaip 28 paros.
      
         Pastaba. Jei bandiniai lieka drumsti, jie filtruojami per membraninius filtrus. Membraniniai filtrai neturi išskirti ar adsorbuoti jokių organinių medžiagų.
      
         Aktyviojo dumblo veikimo tikrinimas
      
      Norint patikrinti funkcinę aktyviojo dumblo gebą, lygiagrečiai kiekvienai bandymų serijai turi būti atliekamas bandymas su žinoma medžiaga. Buvo nustatyta, kad šiam tikslui tinka dietilenglikolis.
      
         Adaptavimas
      
      Jei analizė daroma palyginti dažnai (pvz., kasdien), adaptavimą galima aiškiai atpažinti iš skaidymo kreivės (žr. 2 paveikslą). Todėl bandymas neturi būti pradedamas prieš pat savaitgalį.
      Jei adaptavimas įvyksta laikotarpio pabaigoje, bandymą galima pratęsti, kol skaidymas bus baigtas.
      
         Pastaba. Jei reikia daugiau žinių apie adaptuoto dumblo elgesį, tas pats aktyvusis dumblas dar kartą naudojamas su ta pačia bandomąja medžiaga pagal tokią metodiką:
      Išjunkite maišytuvą ir aeratorių ir leiskite dumblui nusistoti. Skystį virš dumblo nusiurbkite, įpilkite ne daugiau kaip du litrus bandymų vandens, 15 minučių maišykite ir leiskite vėl nusistoti. Skystį virš dumblo nusiurbkite dar kartą likusį dumblą naudokite bandymui su ta pačia medžiaga pagal 1.6.1.4 ir 1.6.2 pakartoti. Vietoj nusodinimo, aktyvųjį dumblą galima atskirti centrifugavimu.
      Adaptuotas dumblas gali būti sumaišomas su šviežiu dumblu, kad sausos medžiagos koncentracija būtų nuo 0,2 iki 1 g/litre.
      
         Analizės priemonės
      
      Paprastai bandiniai filtruojami per kruopščiai išplautą filtrinį popierių (plaukite dejonizuotu vandeniu).
      Bandiniai, kurie lieka drumsti, filtruojami per membraninį filtrą (0,45 μm).
      DOC koncentracija bandinių filtratuose (pirmieji 5 ml pilami lauk) nustatoma du kartus naudojant TOC nustatymo aparatūra. Jei filtrato negalima analizuoti tą pačią dieną, iki kitos dienos jis turi būti laikomas šaldytuve. Ilgiau laikyti nerekomenduojama.
      COD koncentracija bandinio filtratuose nustatoma su COD analizės įranga, taikant toliau 2 nuorodoje aprašytą metodiką.
      2.   DUOMENYS IR VERTINIMAS
      DOC ir (ar) COD koncentracija bandiniuose, gautuose pagal 1.6.2, nustatoma bent po du kartus. Skaidymas laiku T apskaičiuojamas pagal formulę (su apibrėžimais), pateiktą 1.2 aukščiau.
      Skaidymo laipsnis apvalinamas iki artimiausio sveikojo procentų skaičiaus. Bandymo pabaigoje pasiekto skaidymo procentinė vertė ataskaitoje pateikiama kaip „Biologinis skaidomumas Zahn-Wellens bandyme“.
      
         Pastaba. Jei medžiaga visiškai suskaidoma dar nesibaigus bandymams skirtam laikui ir rezultatą patvirtina kitą dieną padaryta dar viena analizė, bandymą galima baigti.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  pradinė medžiagos koncentracija,
               
            
                  —
               
               
                  visa kita informacija ir bandymų rezultatai, susiję su bandomąja medžiaga, etalonine medžiaga, jei buvo naudota, ir tuščiuoju bandymu,
               
            
                  —
               
               
                  koncentracija po trijų valandų,
               
            
                  —
               
               
                  biologinio skaidymo kreivė su aprašymu,
               
            
                  —
               
               
                  data ir vieta, kur buvo imti bandymų organizmai, adaptavimo būsena, naudota koncentracija ir t. t.,
               
            
                  —
               
               
                  mokslinis bet kokių bandymų metodikos keitimų pagrindimas.
               
            3.2.   DUOMENŲ INTERPRETAVIMAS
      Dienas ar savaites vykstantis laipsniškas DOC (COD) šalinimas rodo, kad medžiaga biologiškai skaidoma.
      Tačiau kai kuriais atvejais gali vykti fizikocheminė adsorbcija ir tai matyti, kai nuo bandymo pradžios per pirmąsias tris valandas vyksta dalinis ar visiškas pašalinimas, o skirtumas tarp kontrolinio ir bandomojo skysčių virš dumblo išlieka netikėtai mažas.
      Jei reikia atskirti biologinį skaidymą (ar dalinį biologinį skaidymą) ir adsorbciją, būtina daryti tolesnius bandymus.
      Tai galima daryti įvairiais būdais, tačiau įtikinamiausias būdas yra pamatiniame bandyme (geriau, kad tai būtų respirometrinis bandymas) sėjimo kultūra naudoti skystį virš dumblo ar dumblą.
      Bandomosios medžiagos, kurių neadsorbcinio DOC (COD) šalinimo vertes bandyme yra didelės, turi būti laikomos potencialiai biologiškai skaidomomis. Dalinis neadsorbcinis šalinimas rodo, kad cheminė medžiaga bent kažkiek yra biologiškai skaidoma. Mažos ar nulinės DOC (COD) šalinimo vertės gali būti dėl mikroorganizmų inhibavimo bandomąja medžiaga, tai dar gali parodyti dumblo irimas ir jo praradimas, dėl ko skystis virš dumblo drumsčiasi. Bandymas turi būti pakartotas naudojant mažesnę bandomosios medžiagos koncentraciją.
      Naudojant specifinį junginio analizės metodą ar bandomąsias medžiagas su žymėtais 14C atomais, gali būti pasiektas didesnis jautrumas. Jei bandomasis junginys turi 14C,
         14C02 surinkimas patvirtintų, kad biologinis skilimas įvyko.
      Kai duomenys pateikiami, kaip pirminio biologinio skaidymo rezultatai, turi būti paaiškinta, jei tai įmanoma, kaip pakito cheminė sandara, kad neliko pradinės bandomosios medžiagos atsako.
      Turi būti pateiktas analizės metodo galiojimo patvirtinimas ir tuščiojo bandinio terpėje nustatyta skaidymo vertė.
      4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2)
               
               
                  Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC (OJ L 251, 1984 9 19, p. 1).
               
            
         Priedėlis
         VERTINIMO PAVYZDYS
         
                     Organinis junginys:
                  
                  
                     4-Etoksibenzenkarboninė rūgštis
                  
               
                     Teorinė bandomoji koncentracija:
                  
                  
                     600 mg/l
                  
               
                     Teorinis DOC kiekis:
                  
                  
                     390 mg/l
                  
               
                     Sėjimo kultūra
                  
                  
                     Nuotekų valymo įrenginys...
                  
               
                     Koncentracija:
                  
                  
                     1 gramas sausos medžiagos/litre
                  
               
                     Adaptavimo būsena:
                  
                  
                     neadaptuotas
                  
               
                     Analizė:
                  
                  
                     DOC nustatymas
                  
               
                     Bandinio kiekis:
                  
                  
                     3 ml
                  
               
                     Kontrolinė medžiaga:
                  
                  
                     Dietilenglikolis
                  
               
                     Junginio toksiškumas:
                  
                  
                     Nėra toksiškumo požymių, kai jo mažiau kaip 1 000 mg/l
                     Taikytas bandymas: fermentavimo mėgintuvėlių bandymas
                  
               
            
         
                     Bandymo trukmė
                  
                  
                     Kontrolinė medžīaga
                  
                  
                     Bandomoji medžiaga
                  
               
                     Tuščiojo bandinio DOC (16)
                     
                     mg/l
                  
                  
                     DOC (16)
                     
                     mg/l
                  
                  
                     DOC tikrasis kiekis
                     mg/l
                  
                  
                     Skaidymas
                     %
                  
                  
                     DOC (16)
                     
                     mg/l
                  
                  
                     DOC tikrasis kiekis
                     mg/l
                  
                  
                     Skaidymas
                     %
                  
               
                     0
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     300,0
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     390,0
                  
                  
                     —
                  
               
                     3 valandos
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                     298,0
                  
                  
                     294,0
                  
                  
                     2
                  
                  
                     371,6
                  
                  
                     367,6
                  
                  
                     6
                  
               
                     1 para
                  
                  
                     6,1
                  
                  
                     288,3
                  
                  
                     282,2
                  
                  
                     6
                  
                  
                     373,3
                  
                  
                     367,2
                  
                  
                     6
                  
               
                     2 paras
                  
                  
                     5,0
                  
                  
                     281,2
                  
                  
                     276,2
                  
                  
                     8
                  
                  
                     360,0
                  
                  
                     355,0
                  
                  
                     9
                  
               
                     5 paras
                  
                  
                     6,3
                  
                  
                     270,5
                  
                  
                     264,2
                  
                  
                     12
                  
                  
                     193,8
                  
                  
                     187,5
                  
                  
                     52
                  
               
                     6 paras
                  
                  
                     7,4
                  
                  
                     253,3
                  
                  
                     245,9
                  
                  
                     18
                  
                  
                     143,9
                  
                  
                     136,5
                  
                  
                     65
                  
               
                     7 paras
                  
                  
                     11,3
                  
                  
                     212,5
                  
                  
                     201,2
                  
                  
                     33
                  
                  
                     104,5
                  
                  
                     93,2
                  
                  
                     76
                  
               
                     8 paras
                  
                  
                     7,8
                  
                  
                     142,5
                  
                  
                     134,7
                  
                  
                     55
                  
                  
                     58,9
                  
                  
                     51,1
                  
                  
                     87
                  
               
                     9 paras
                  
                  
                     7,0
                  
                  
                     35,0
                  
                  
                     28,0
                  
                  
                     91
                  
                  
                     18,1
                  
                  
                     11,1
                  
                  
                     97
                  
               
                     10 parų
                  
                  
                     18,0
                  
                  
                     37,0
                  
                  
                     19,0
                  
                  
                     94
                  
                  
                     20,0
                  
                  
                     2,0
                  
                  
                     99
                  
               1 paveikslas
         Biologinio skaidymo kreivių pavyzdžiai
         
            
         2 paveikslas
         Dumblo adaptavimo pavyzdžiai
         
            
      
      C.10.   BIOLOGINIS SKAIDYMAS
      AKTYVIOJO DUMBLO MODELIAVIMO BANDYMAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      1.1.1.   Bendrosios pastabos
      
      Metodas tinka tik toms organinėms medžiagoms, kurios bandyme naudojamos koncentracijos:
      
                  —
               
               
                  vandenyje yra tirpios tiek, kad pakanka ruošti bandomuosius tirpalus,
               
            
                  —
               
               
                  garų slėgis bandymo sąlygomis yra labai mažas,
               
            
                  —
               
               
                  neinhibuoja bakterijų.
               
            Norint paaiškinti gautus rezultatus, ypač kai rezultatai yra maži arba nežymūs, naudinga būtų turėti informacijos apie bandomosios medžiagos pagrindinių komponentų santykinę dalį.
      Kai reikia paaiškinti mažus rezultatus ir pasirinkti tinkamas bandomąsias koncentracijas, pageidautina turėti informacijos apie medžiagos toksiškumą mikroorganizmams.
      1.1.2.   Biologinio suskaidomumo nustatymas (DOC/COD analizė)
      
      Metodo tikslas yra nustatyti biologinį suskaidomumą, matuojant medžiagos ir bet kurių jos metabolitų šalinimą aktyviojo dumblo įrenginio modelyje, kai medžiagos koncentracija didesnė kaip > 12 mg DOC/litre (ar maždaug 40 mg COD/litre); manoma, kad 20 mg DOC/litre koncentracija yra optimali (DOC = ištirpusi organinė anglis; COD = cheminis deguonies poreikis).
      Turi būti nustatytas organinės anglies kiekis bandomojoje medžiagoje (ar cheminis deguonies poreikis).
      1.1.3.   Pirminio biologinio skaidomumo nustatymas (specifinė analizė)
      
      Metodo tikslas yra nustatyti pirminį medžiagos biologinį skaidomumą aktyviojo dumblo įrenginio modelyje, taikant specifinį analizės metodą, kai medžiagos koncentracija yra apie 20 mg/litre (galima naudoti didesnę ar mažesnę koncentraciją, jei tai leidžia analizės metodas ir toksiškumo sumetimai). Tai leidžia įvertinti medžiagos pirminį biologinį skaidomumą (pradinės cheminės sandaros junginio išnykimą).
      Šio metodo tikslas nėra nustatyti bandomosios medžiagos mineralizavimą.
      Būtina turėti atitinkamą analizės metodą bandomajai medžiagai nustatyti.
      1.2.   APIBRĖŽTYS IR VIENETAI
      1.2.1.   DOC/COD analizė
      
      Medžiagos šalinimo laipsnis reiškiamas lygtimi:
      
                  
                     
               
               
                  [1(a)]
               
            kai:
      
                  DR
               
               
                  =
               
               
                  bandomosios medžiagos šalinimo laipsnis procentais DOC (ar COD) per duotą sulaikymo trukmę,
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  bandomosios medžiagos koncentracija intakyje, mg DOC/litre (ar mg COD/litre),
               
            
                  E
               
               
                  =
               
               
                  DOC (ar COD) koncentracija bandymų įrenginio ištakyje, mg DOC/litre (ar mg COD/litre),
               
            
                  Eo
                  
               
               
                  =
               
               
                  be medžiagos veikiančio bandymo įrenginio ištakio DOC (ar COD) koncentracija, mg DOC/litre (ar mg COD/litre).
               
            Skaidymas pateikiamas, nurodant bandomosios medžiagos DOC (ar COD) šalinimo per duotą sulaikymo trukmę procentinę vertę.
      1.2.2.   Specifinė analizė
      
      Bandomosios medžiagos šalinimo iš vandeninės fazės procentinė vertė (RW) duotos vidutinės sulaikymo trukmės ribose skaičiuojama pagal lygtį:
      
                  
                     
               
               
                  [1(b)]
               
            čia:
      
                  CI
                  
               
               
                  =
               
               
                  medžiagos koncentracija bandymo įrenginio intake (medžiagos kiekis mg/litre, nustatant specifinės analizės metodu),
               
            
                  Co
                  
               
               
                  =
               
               
                  medžiagos koncentracija bandymo įrenginio ištakyje (medžiagos kiekis mg/litre, nustatant specifinės analizės metodu).
               
            1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Kai kuriais atvejais, kai tiriamos naujos medžiagos, etaloninės medžiagos gali būti naudingos, tačiau specifinės etaloninės medžiagos vis dar negali būti rekomenduotos.
      1.4.   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Biologiniam suskaidomumui nustatyti lygiagrečiai atliekami bandymai dviejuose eksperimentiniuose aktyviojo dumblo įrenginiuose (OECD patvirtinamasis bandymas ar akytojo indo įrenginiai). Bandomoji medžiaga dedama į intaką vieno iš įrenginių (sintetinių ar buitinių nuotekų), tuo tarpu į antrąjį įrenginį tiekiamos tik nuotekos. Pirminiam biologiniam skaidymui nustatyti, darant specifinę medžiagos analizę intake ir ištakyje, naudojamas tik vienas įrenginys.
      DOC (ar COD) koncentracijos matuojamos ištakiuose, arba medžiagos koncentracija nustatoma darant specifinę analizę.
      DOC atsiradusi dėl bandomosios medžiagos nematuojama, bet paprasčiausiai konstatuojamas jos kiekis.
      Kai daromi DOC (ar COD) matavimai, vidutinių koncentracijų bandomajame ir kontroliniame ištakiuose skirtumas priskiriamas nesuskaldytai bandomajai medžiagai.
      Kai daroma specifinė analizė, galima išmatuoti pradinio junginio molekulių koncentracijos pokytį (pirminis biologinis skaidymas).
      Įrenginiai gali būti eksploatuojami „sudvejintų įrenginių režimu“, taikant persėjimo (transinokuliacijos) metodiką.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Pradinė medžiagos koncentracija priklauso nuo taikomo analizės metodo ir jo apribojimų.
      1.6.   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Pasirengimas
      
      1.6.1.1.   Aparatūra
      
      Reikia dviejų to paties tipo įrenginių, išskyrus tą atvejį, kai daroma specifinė analizė. Gali būti naudojami dviejų tipų įrenginiai.
      OECD patvirtinamasis bandymas
      Įrangą (1 papildymas) sudaro indas sintetinėms nuotekoms laikyti (A), dozavimo siurblys (B), aeravimo indas C, nusodintuvas D, aeroliftinis siurblys E, aktyviajam dumblui recirkuliuoti, ir apdoroto ištakio rinktuvas F.
      A ir F indai turi būti iš stiklo ar tinkamo plastiko ir jų talpa turi būti bent 24 litrai. B siurblys turi užtikrinti nuolatinį sintetinių nuotekų srautą į aeravimo indą; galima naudoti bet kurį tinkamą įrenginį, svarbu, kad būtų užtikrintas tiekimo srautas ir koncentracija. Normalaus darbo metu nustatomas toks D nusodintuvo aukštis, kad maišomo skysčio tūris aeravimo inde būtų trys litrai. Sukepinto stiklo aeravimo kubas G yra pakabintas C indo kūginėje viršūnėje. Per aeratorių pučiamo oro kiekį galima kontroliuoti debitmačiu.
      Aeroliftinis siurblys E reguliuojamas taip, kad aktyvusis dumblas iš nusodintuvo tolygiai ir nuolat grąžinamas į aeravimo indą C.
      „Akytasis indas“
      Akytasis indas yra pagamintas iš akytojo polietileno lakštų (2 mm storio, didžiausias akučių dydis 95 μm), kurie susukami į 14 cm skersmens cilindrą su kūginių 45o pagrindu (2 papildymo 1 ir 2 paveikslai). Akytas indas dedamas į iš tinkamo plastiko pagamintą 15 cm skersmens nepraleidžiantį indą, cilindrinėje dalyje 17,2 cm aukštyje turinčiame išleidžiamąją angą, kuri nustato skysčio tūrį inde (3 litrai). Vidinio indo viršutinė dalis apjuosta standžių laikančiuoju žiedu iš tinkamo plastiko, taip kad tarp vidinio ir išorinio indų yra 0,5 cm ištakiui skirta erdvė.
      Akytąjį indą galima įtaisyti ant termostatuojamos vandens vonios dugno. Per vidinio indo dugną, ant kurio uždėti tinkami difuzoriai, tiekiamas oras.
      A ir E indai turi būti iš stiklo ar tinkamo plastiko ir jų talpa turi būti bent 24 litrai. B siurblys turi užtikrinti nuolatinį sintetinių nuotekų srautą į aeravimo indą; galima naudoti bet kurį tinkamą įrenginį, svarbu, kad būtų užtikrintas tiekimo srautas ir koncentracija.
      Reikia turėti atsarginius vidinius akytuosius indus, kad būtų galima pakeisti bet kurį užkimštą indą; užkimšti indai 24 valandas plaunami hipochlorito tirpale, po to gerai išplaunami vandentiekio vandeniu.
      1.6.1.2.   Filtravimas
      
      Membraninio filtravimo aparatūra ir membraniniai filtrai, kurių akučių dydis 0,45 μm. Tinka tokie membraniniai filtrai, kurie neišskiria anglies ir filtravimo pakopoje neabsorbuoja medžiagos.
      1.6.1.3.   Nuotekos
      
      Galima naudoti atitinkamą sintetinę mitybinę terpę ar buitines nuotekas.
      Sintetinės mitybinės terpės pavyzdys
      Viename litre vandentiekio vandens ištirpinkite:
      
                  peptono:
               
               
                  160 mg,
               
            
                  mėsos ekstrakto:
               
               
                  10 mg,
               
            
                  karbamido:
               
               
                  30 mg,
               
            
                  NaCl:
               
               
                  7 mg,
               
            
                  CaCl2 x2H2O:
               
               
                  4 mg,
               
            
                  MgSO4 × 7H2O:
               
               
                  2 mg,
               
            
                  K2HPO4:
               
               
                  28 mg.
               
            Buitinės nuotekos
      Buitinės nuotekos turi būti kasdieną iš naujo imamos iš nuotekų valymo įrenginio, kuris daugiausia valo buitines nuotekas, pirminio nusodintuvo perpildos srauto.
      1.6.1.4.   Bandomosios medžiagos pradinis tirpalas
      
      Bandymo įrenginiui papildyti bandomąja medžiagą turi būti ruošiamas jos tirpalas, pvz., 1 %. Norint žinoti, kokį bandomosios medžiagos tirpalo tūrį reikia pilti į nuotekas ar tiesiai antruoju siurblių į įrenginį, kad būtų gauta reikiama bandomoji koncentracija, turi būti nustatyta bandomosios medžiagos koncentracija.
      1.6.1.5.   Sėjimo kultūra
      
      
         Pastaba. Naudojant buitines nuotekas, nėra prasmės naudoti sėjimo kultūrą su maža bakterijų koncentracija, bet galima naudoti aktyvųjį dumblą.
      Galima naudoti įvairias sėjimo kultūras.
      Pateikiami trys sėjimo kultūros pavyzdžiai:
      
                  a)
               
               
                  sėjimo kultūra iš antrinio ištakio
                  Sėjimo kultūra turi būti gauta iš geros kokybės antrinio ištakio, renkant ją valymo įrenginyje, į kurį daugiausia patenka buitinės nuotekos. Nuo bandinio ėmimo iki naudojimo ištakis turi būti laikomas aerobinėmis sąlygomis. Ruošiant sėjimo kultūrą, bandinys filtruojamas per stambų filtrą ir pirmieji 200 ml filtrato pilami lauk. Kol bus panaudotas, filtratas laikomas aerobinėmis sąlygomis. Sėjimo kultūra turi būti panaudota ėmimo dieną. Sėjimo kultūros dedama bent 3 ml.
               
            
                  b)
               
               
                  sudėtinė sėjimo kultūra
                  Sėjimo kultūra iš antrinio ištakio
                  žr. aprašymą aukščiau.
                  Sėjimo kultūra iš dirvožemio
                  100 g sodo dirvožemio (derlingo, nesterilaus) suspenduojama 1 000 ml geriamojo chloro neturinčio vandens. (Netinka dirvožemiai, kurių didelė dalis yra molis, smėlis ar juodžemis). Po sumaišymo suspensija 30 minučių paliekama nusistoti. Skystis virš nuosėdų filtruojamas per stambų filtrinį popierių, pirmuosius 200 ml pilant lauk. Filtratas aeruojamas iš karto ir visą laiką, kol bus panaudotas. Sėjimo kultūra turi būti panaudota ėmimo dieną.
                  Sėjimo kultūra iš paviršinio vandens
                  Dar viena sėjimo kultūros dalis imama, siurbiant mezosaprobinio paviršinio vandens bandinį. Bandinys filtruojamas per stambų filtrinį popierių, pirmuosius 200 ml pilant lauk. Kol bus panaudotas, filtratas laikomas aerobinėmis sąlygomis. Sėjimo kultūra turi būti panaudota ėmimo dieną.
                  Vienodi trijų dalinių sėjimo kultūrų bandinių tūriai sujungiami, gerai sumaišomi, ir iš šio mišinio imama galutinė sėjimo kultūra. Sėjimo kultūros dedama bent 3 ml.
               
            
                  c)
               
               
                  sėjimo kultūra iš aktyviojo dumblo
                  Sėjimo kultūrai galima naudoti aktyvųjį dumblą (suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija ne didesnė kaip 2,5 g/litre), kurio tam tikras tūris (ne didesnis kaip 3 litrai) imamas iš valymo įrenginio, kuris valo daugiausia buitines nuotekas, aeravimo tanko.
               
            1.6.2.   Darbo eiga
      
      Bandymas daromas kambario temperatūroje; pastaroji turi būti nuo 18 iki 25 oC.
      Jei tinka, bandymą galima daryti mažesnėje temperatūroje (iki 10 oC); jei medžiaga tokioje temperatūroje suiro, paprastai daugiau nereikia nieko daryti. Tačiau, jei medžiaga nesuiro, bandymas turi būti daromas pastovioje temperatūroje nuo 18 iki 25 oC.
      1.6.2.1.   Įdirbimo laikotarpis: dumblo formavimas/įrenginio stabilizavimas
      
      Dumblo augimo/stabilizavimo laikotarpis, per kurį aktyviojo dumblo suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija ir įrenginio veikimas naudojamomis darbo sąlygomis artėja prie pastoviosios būsenos.
      Įdirbimo laikotarpis tęsiasi nuo to momento, kai bandomoji medžiaga buvo įdėta pirmą kartą, iki tol, kol šalinimas pasiekia lygiagrečiąją kreivės dalį (palyginti pastovią vertę). Šis laikotarpio trukmė turi būti ne didesnė kaip šešios savaitės.
      Vertinimo laikotarpis trunka tris savaites, trys savaites nuo to laiko, kai bandomosios medžiagos šalinimas pasiekia palyginti pastovią ir, paprastai didelę, vertę. Toms medžiagoms, kurių skaidymas per pirmąsias šešias savaites yra mažas ar visai nevyksta, vertinimo laikotarpiu laikomos dar trys savaitės.
      Iš pradžių vienam bandymui skirtą įrenginį (-ius) užpildykite sėjimo kultūra, sumaišyta su intaku.
      Tuomet įjungiamas aeratorius (ir aeroliftinis siurblys E OECD patvirtinamojo bandymo įrenginių atveju) bei dozavimo įtaisas (B).
      Intako be bandomosios medžiagos srautas per aeravimo indą C turi būti arba litras per valandą ar pusė litro per valandą; taip vidutinė sulaikymo trukmė bus lygi trims arba šešioms valandoms.
      Aeravimo intensyvumas turi būti reguliuojamas taip, kad indo C turinys būtų visą laiką suspenduotas, o ištirpusio deguonies kiekis būtų bent 2 mg/litre.
      Atitinkamomis priemonėmis būtina išvengti putojimo. Neturi būti naudojami priešpučiai, kurie inhibuotų aktyvųjį dumblą.
      Dumblas, kuris kaupiasi aeravimo indo C viršuje, (OECD patvirtinamojo bandymo įrenginių atveju ir nusodintuvo D apačioje bei cirkuliacijos sistemoje), turi būti grąžinamas į maišomą skystį ne mažiau kaip kartą per parą, nuvalant šepečiu arba kokiu nors kitu tinkamu būdu.
      Jei dumblas nenusėda, nusodinimą galima paskatinti pridedant, jei reikia – ir pakartotinai, 2 ml 5 % geležies (III) chlorido tirpalo.
      Nuotekos nuo 20 iki 24 valandų leidžiamos į rinktuvą (E ar F), tuomet, mišinį sumaišius, paimamas bandinys. Po to rinktuvas (E ar F) turi būti kruopščiai išplautas.
      Proceso veiksmingumui tikrinti, bent du kartus per savaitę sukaupto ištakio filtrate matuojamas cheminis deguonies poreikis (COD) ar ištirpusi organinė anglis (DOC), tai daroma ir intako filtrate (naudojama membrana, kurios akučių dydis 0,45 ųm, pirmieji 20 ml (maždaug) filtrato pilami lauk).
      COD ar DOC mažėjimas turi išsilyginti, kai gaunamas maždaug tolygios paros skaidymo vertės.
      Sausos medžiagos kiekis aeravimo indo aktyviajame dumble turi būti nustatomas du kartus per savaitę (g/litre). Įrenginius galima eksploatuoti vienu iš dviejų būdų: sausos medžiagos kiekis aktyviajame dumble turi būti nustatomas du kartus per savaitę, ir, jei jis didesnis kaip 2,5 g/litre, perteklinis aktyvusis dumblas turi būti pašalintas, arba iš kiekvieno indo kasdieną išpilama lauk 500 ml nuotekų ir aktyviojo dumblo mišinio, kad vidutinė dumblo sulaikymo trukmė būtų šešios paros.
      Kai išmatuoti ir įvertinti dviejų įrenginių parametrai [(proceso veiksmingumas (COD ar DOC šalinimas), dumblo koncentracija, dumblo nusodinamumas, ištakių drumstumas ir t. t.] tampa gana stabilūs, į vieno iš įrenginių intaką galima dėti bandomosios medžiagos pagal 1.6.2.2.
      Kitu būdu bandomąją medžiagą galima dėti dumblo augimo laikotarpio pradžioje (1.6.2.1), ypač, kai dumblas yra dedamas kaip sėjimo kultūra.
      1.6.2.2.   Bandymų eiga
      
      Palaikomos įdirbimo laikotarpio darbinės sąlygos ir į bandymo įrenginio intaką dedamas pakankamas kiekis bandomosios medžiagos pradinio tirpalo (maždaug 1 %), kad nuotekose būtų norima bandomosios medžiagos koncentracija (maždaug nuo 10 iki 20 mg/litre DOC ar 40 mg/litre COD). Tai galima padaryti maišant pradinį tirpalą į nuotekas kasdieną ar naudojant atskirą pumpavimo įrenginį. Šią koncentraciją galima pasiekti laipsniškai. Jei bandomosios medžiagos toksiško poveikio aktyviajam dumblui nenustatyta, galima bandyti didesnes koncentracijas.
      Į tuščiojo bandymo įrenginį tiekiamas tik intakas, nededant medžiagos. Analizei imami atitinkamo tūrio bandiniai, kurie filtruojami per membraninį filtrą (0,45 ųm), pirmuosius 20 ml (maždaug) filtrato pilant lauk.
      Filtruoti bandiniai turi būti analizuojami tą pačią dieną, priešingu atveju jie turi būti konservuojami kokiu nors tinkamu būdu, pvz., 10 ml filtrato įpilti 0,05 ml 1 % gyvsidabrio (II) chlorido (HgCl2) tirpalo ar laikyti bandinius 2–4 oC temperatūroje, jei laikomai ne ilgiau kaip 24 valandas, ar mažesnėje nei - 18 oC temperatūroje, jei ilgesnį laiką.
      Įdirbimo laikas, pridedant bandomosios medžiagos, neturi užtrukti ilgiau kaip šešias savaites, o įvertinimo laikotarpis neturi būti trumpesnis kaip trys savaitės, t.y. galutiniam rezultatui skaičiuoti reikia turėti maždaug nuo 14 iki 20 nustatymų.
      Sudvejintų įrenginių režimas
      Įrenginių sudvejinimas daromas, kartą per dieną 1,5 litro nuotekų ir aktyviojo dumblo mišinio (įskaitant dumblą) iš aktyviojo dumblo aeravimo indų perpilant iš vieno į kitą. Jei bandomosios medžiagos yra labai absorbuojamos, iš nusodintuvų siurbiama po 1,5 litro skysčio virš dumblo ir supilama į kito įrenginio aktyviojo dumblo indą.
      1.6.2.3.   Analizė
      
      Norint sekti medžiagos elgesį, galima daryti dviejų rūšių analizę:
      DOC ir COD
      DOC koncentracijų nustatymas anglies analizatoriumi daromas po du kartus, ir (ar) COD vertės nustatomos pagal (2) nuorodą.
      Specifinė analizė
      Bandomosios medžiagos koncentracija nustatoma atitinkamu analizės metodu. Tais atvejais, kai tai įmanoma, turi būti daroma ant dumblo adsorbuotos medžiagos specifinė analizė.
      2.   DUOMENYS IR ĮVERTINIMAS
      2.1.   SUDVEJINTŲ ĮRENGINIŲ REŽIMAS
      Naudojant „sudvejintų įrenginių režimą“, kasdienis šalinimo laipsnis, DR skaičiuojamas pagal 1.2.1.
      Šioms kasdienio šalinimo laipsnių DR vertėms daroma pataisa dėl medžiagos pernešimo peršėjimo (transinokuliavimo) procese, į DRc vertes, taikant [2] lygtį trijų valandų ar [3] lygtį šešių valandų vidutinei sulaikymo trukmei.
      
                  
                     
               
               
                  [2]
               
            
                  
                     
               
               
                  [3]
               
            Skaičiuojama DRc verčių sekos vidutinė vertė ir papildomai pagal [4] lygtį skaičiuojamas standartinis nuokrypis
      
                  
                     
               
               
                  [4]
               
            čia:
      
                  
                     S
                     DRc
                  
               
               
                  =
               
               
                  DRc verčių sekos standartinis nuokrypi,
               
            
                  
                     c
               
                  =
               
               
                  DRc vidutinė vertė,
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  nustatymų skaičius.
               
            DRc sekos išskirtys (outliers) eliminuojamos, naudojant atitinkamą statistinę metodiką, pvz., Nalimov (6), 95 % pasikliovimo lygmeniui, ir DRc rinkinio be išskirčių vidutinė vertė ir standartinis nuokrypis skaičiuojami iš naujo.
      Galutinis rezultatas skaičiuojamas pagal lygtį [5] kaip
      
                  
                     
               
               
                  [5]
               
            čia:
      
                  tn-1 ;α
               
               
                  =
               
               
                  iš lentelės paimta t vertė n skaičiui E ir Eo verčių porų ir statistinis pasikliovimo lygmuo P (P = 1 – α), kai P užduotas 95 % (1).
               
            Rezultatas pateikiamas, nurodant vidutinę vertę su nuokrypio ribomis 95 % pasikliovimo lygmeniui, atitinkamą standartinį nuokrypį, DRc duomenų skaičių rinkinyje, atmetus išskirtis, ir išskirčių skaičių, pvz.
      
                  DRc
               
               
                  =
               
               
                  98,6±2,3 % DOC šalinimas,
               
            
                  s
               
               
                  =
               
               
                  4,65 % DOC šalinimas,
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  18,
               
            
                  x
               
               
                  =
               
               
                  išskirčių skaičius.
               
            2.2.   NESUPORUOTŲ ĮRENGINIŲ REŽIMAS
      Įrenginių veikimas gali būti patikrintas tokiu būdu:
      
         
      Šios kasdienio šalinimo vertės gali būti atidėtos grafiškai, kad butų galima atskleisti bet kokias tendencijas, pvz, aklimatizavimo.
      2.2.1.   Naudojant COD/DOC nustatymus
      
      Kasdienis šalinimo laipsnis DR yra skaičiuojamas pagal 1.2.1.
      Skaičiuojama DR verčių sekos vidutinė vertė; papildomai skaičiuojamas standartinis nuokrypis pagal:
      
                  
                     
               
               
                  [6]
               
            čia:
      
                  SDR
                  
               
               
                  =
               
               
                  DRi verčių sekos standartinis nuokrypis,
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  DRi vidutinė vertė,
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  nustatymų skaičius.
               
            DR sekos išskirtys eliminuojamos, naudojant atitinkamą statistinę metodiką, pvz., Nalimov (6), 95 % pasikliovimo lygmeniui, ir iš naujo skaičiuojami DR rinkinio be išskirties vidutinė vertė ir standartinis nuokrypis.
      Tuomet galutinis rezultatas skaičiuojamas pagal lygtį [7] kaip:
      
                  
                     
               
               
                  [7]
               
            čia:
      
                  tn-1;α
               
               
                  =
               
               
                  iš lentelės paimta t vertė n skaičiui E ir EO verčių porų ir statistinis pasikliovimo lygmuo P (P = 1-α), kai P užduotas 95 % (1).
               
            Rezultatas pateikiamas, nurodant vidutinę vertę su nuokrypio ribomis 95 % pasikliovimo lygmeniui, atitinkamą standartinį nuokrypį, DR duomenų skaičių rinkinyje, atmetus išskirtis, ir išskirčių skaičių, pvz.
      
                  DR
               
               
                  =
               
               
                  (98,6±2,3) % DOC šalinimo,
               
            
                  s
               
               
                  =
               
               
                  4,65) % DOC šalinimo,
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  18,
               
            
                  x
               
               
                  =
               
               
                  išskirčių skaičius.
               
            2.2.2.   Naudojant specifinę analizę
      
      Bandomosios medžiagos šalinimo iš vandeninės fazės procentinė vertė (Rw) yra skaičiuojama pagal 1.2.2.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  3 papildyme pateiktas blankas, kuriame nurodytos eksploatavimo sąlygos,
               
            
                  —
               
               
                  pasirinktas eksploatavimo režimas: sudvejintų įrenginių ar ne,
               
            
                  —
               
               
                  nuotekos: sintetinės ar buitinės – buitinių nuotekų atveju nurodyti bandinio vietą ir ėmimo datą,
               
            
                  —
               
               
                  sėjimo kultūra, su bandinio ėmimo vieta ir data,
               
            
                  —
               
               
                  trumpas išdėstymas su analizės metodo aprašymu, jei buvo daroma specifinė analizė,
               
            
                  —
               
               
                  COD ar DOC šalinimo kitimo laike grafikas, įskaitant įdirbimo ir įvertinimo laikotarpius,
               
            
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos pradiniame tirpale analizinis išgavimas COD ar DOC pavidalu,
               
            
                  —
               
               
                  jei buvo darytos specifinės analizės, bandomosios medžiagos šalinimo iš vandeninės terpės procentinės vertės kitimo laike grafikas (įdirbimo ir įvertinimo laikotarpis),
               
            
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos DOC ar COD šalinimo vidutinė vertė ir standartinis nuokrypis, skaičiuoti pagal įvertinimo laikotarpio rezultatus, t. y. kai vyksta pastovus bandomosios medžiagos šalinimas ar stabilaus veikimo laikotarpiu,
               
            
                  —
               
               
                  aktyviojo dumblo koncentracijos kitimo laike grafikas,
               
            
                  —
               
               
                  visos pastabos apie aktyvųjį dumblą (perteklinio dumblo šalinimas, tūrio didėjimas, FeCl3, ir t. t.),
               
            
                  —
               
               
                  bandyme naudota bandomosios medžiagos koncentracija,
               
            
                  —
               
               
                  visi rezultatai apie dumblo analizę,
               
            
                  —
               
               
                  visa informacija ir eksperimentiniai rezultatai, susiję su bandomąja medžiaga ir etalonine medžiaga, jei ji buvo naudota,
               
            
                  —
               
               
                  mokslinis bet kokių bandymų metodikos keitimų pagrindimas.
               
            3.2.   DUOMENŲ INTERPRETAVIMAS
      Mažų bandomosios medžiagos šalinimo iš vandeninės terpės verčių priežastimi gali būti mikroorganizmų inhibavimas bandomąja medžiaga. Tai dar galima nustatyti pagal dumblo irimą ir jo kiekio mažėjimą, dėl ko skystis virš dumblo pasidaro drumstas, ir pagal bandomojo įrenginio COD (ar DOC) šalinimo našumo mažėjimą.
      Kartais įtakos gali turėti fizikocheminė adsorbcija. Skirtumai tarp biologinio poveikio molekulei ir fizikocheminės adsorbcijos gali būti nustatyti, darant dumblo analizę po atitinkamos desorbcijos.
      Reikia toliau bandyti, jei reikia nubrėžti skirtumą tarp biologinio skaidymo (ar dalinio biologinio skaidymo) ir adsorbcijos.
      Tai galima daryti įvairiais būdais, tačiau įtikinamiausias būdas yra pamatiniame bandyme (geriau, kad tai būtų respirometrinis bandymas) sėjimo kultūra naudoti skystį virš dumblo.
      Jei stebimos didelės DOC ar COD šalinimo vertės, to priežastis yra biologinis skaidymas, tuo tarpu, jei šalinimo vertės mažos, biologinis skaidymas neatskiriamas nuo eliminavimo. Pvz., jei tirpus junginys turi didelę 98 % adsorbcijos konstantą, o perteklinio dumblo nuostolių laipsnis yra 10 % per parą, eliminavimas gali būti iki 40 %; jei perteklinio dumblo nuostolių laipsnis yra 30 %, eliminavimas dėl adsorbcijos ant perteklinio dumblo ir pašalinimo kartu su juo gali sudaryti iki 65 % (4).
      Taikant specifinę analizę, reikia kreipti dėmesį į ryšį tarp medžiagos sandaros ir taikomos specifinės analizės. Šiuo atveju stebimas reiškinys negali būti interpretuojamas kaip junginio mineralizacija.
      4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 303 A, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2)
               
               
                  Annex V C9 Degradation Test -Chemical Oxygen Demand, Commission Directive 84/449/EEC (OJ L 251, 1984 9 19, p. 1).
               
            
                  3)
               
               
                  Painter, H. A., King, E. F., WRC Porous-Pot method for assessing biodegradability, Technical Report TR70, June 1978, Water Research Centre, United Kingdom.
               
            
                  4)
               
               
                  Wierich, P., Gėrike, P., The fate of soluble, recalcitrant, and adsorbing compounds in activated sludge plants, Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 5, No 2, June 1981, pp. 161 to 171.
               
            
                  5)
               
               
                  Council Directives 82/242/EEC and 82/243/EEC, Official Journal of the European Communities, No L 109, 22. 4. 1982, amending Council Directives 7Y404/EEC and 73/405/EEC on biodegradability of detergents, Official Journal of the European Communities, No L 347, 17. 12. 1973.
               
            
                  6)
               
               
                  Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreßertests, insbesondere bei Ringversuchen zur Oberprufung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fresenius- Zeitschrift fur Analytische Chemie, 303 (1980), p. 406–408.
               
            
         1 priedėlis
         1 paveikslas
         
            
         2 paveikslas
         
            
      
      
         2 priedėlis
         1 paveikslas
         Įranga, naudota įvcrtinti biologinį skaidymą
         
            
         2 paveikslas
         Trijų litrų talpos akyto indo tipo aeratoriaus detalės
         
            
      
      
         3 priedėlis
         Veikimo sąlygos aktyviojo dumblo simuliacijos bandymui
         Pažymėti kiekvienoje grupėje
         Aparatas
         
                     OECD patvirtinimasis bandymas
                  
                  
                      
                  
               
                     Akytasis indas
                  
                  
                      
                  
               Veikimo būdas
         
                     Vienas įrenginys
                  
                  
                      
                  
               
                     Sudvejinti įrenginiai
                  
                  
                      
                  
               
                     Nesudvejinti įrenginiai
                  
                  
                      
                  
               Persėjimas
         
                     Nėra
                  
                  
                      
                  
               
                     Aktyvieji dumbliai
                  
                  
                      
                  
               
                     Supernatantinis
                  
                  
                      
                  
               Vidutinė sulaikymo trukmė
         
                     Trys valandos
                  
                  
                      
                  
               
                     Šešios valandos
                  
                  
                      
                  
               Bazinė maitinamoji medžiaga
         
                     Buitinės nuotekos
                  
                  
                      
                  
               
                     Sintetinės nuotekos
                  
                  
                      
                  
               Sėjimo kultūra
         
                     Biologiškai išvalytas vanduo
                  
                  
                      
                  
               
                     Kompostas
                  
                  
                      
                  
               
                     Aktyvieji dumbliai
                  
                  
                      
                  
               Bandinio medžiagos priedai
         
                     Nuo pradžios
                  
                  
                      
                  
               
                     Palaipsniui
                  
                  
                      
                  
               
                     Po dumblo susidarymo
                  
                  
                      
                  
               Analizė
         
                     Specifinė
                  
                  
                      
                  
               
                     COD
                  
                  
                      
                  
               
                     DOC
                  
                  
                      
                  
               
      C.11.   BIOLOGINIS SKAIDYMAS
      AKTYVIOJO DUMBLO KVĖPAVIMO INHIBAVIMO BANDYMAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Aprašytas metodas įvertina bandomosios medžiagos poveikį mikroorganizmams, kai apibrėžtomis sąlygomis ir naudojant skirtingas bandomosios medžiagos koncentracijas matuojamas kvėpavimo intensyvumas.
      Šio metodo tikslas yra duoti greitą atrankos metodą, kuriuo galima būtų identifikuoti medžiagas, galinčias neigiamai veikti aerobinius mikrobinio valymo įrenginius, ir nustatyti bandomųjų medžiagų koncentracijas, kurias naudojant nebūtų inhibavimo ir kurios būtų tinkamos naudoti biologinio skaidymo bandymuose.
      Prieš galutinį bandymą gali būti daromas intervalo nustatymo bandymas. Jis suteikia informacijos apie koncentracijų, kurias reikia naudoti pagrindiniame bandyme, intervalą.
      Į bandymo schemą įtraukti du kontroliniai bandymai be bandomosios medžiagos, vienas daromas bandymų serijos pradžioje, o kitas – pabaigoje. Be to" kiekviena aktyviojo dumblo partija turi būti patikrinta, naudojant etaloninę medžiagą.
      Šį metodą lengviausia taikyti medžiagoms, kurios dėl jų tirpumo vandenyje ir mažo lakumo greičiausiai lieka vandenyje.
      Medžiagoms, kurių tirpumas bandomojoje terpėje yra ribotas, gali būti neįmanoma nustatyti EC50.
      Išvados, padarytos pagal rezultatus, kurie remiasi deguonies suvartojimu, gali būti klaidingos, kai bandomoji medžiaga turi polinkį atskirti oksidavimą ir fosforilinimą oksidacinio fosforilinimo procese.
      Norint daryti bandymą, naudinga turėti tokia informaciją:
      
                  —
               
               
                  tirpumas vandenyje,
               
            
                  —
               
               
                  garų slėgis,
               
            
                  —
               
               
                  struktūrinė formulė,
               
            
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos grynumas.
               
            Patarimas
      Aktyviajame dumble gali būti potencialiai patogeninių organizmų, todėl elgtis su juo reikia atsargiai.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Kvėpavimo intensyvumas yra deguonies suvartojimas nuotekų aerobiniame dumble esančiais mikroorganizmais, paprastai reiškiamas mg O2 vienam mg dumblo per valandą.
      Norint skaičiuoti konkrečios koncentracijos bandomosios medžiagos inhibuojamąjį veikimą, kvėpavimo intensyvumas reiškiamas dviejų kontrolinių kvėpavimo intensyvumo verčių vidurkio procentine dalimi:
      
         
      inhibavimo procentinė vertė čia:
      
                  Rs
                  
               
               
                  =
               
               
                  deguonies suvartojimo intensyvumas, bandant konkrečią bandomosios medžiagos koncentraciją,
               
            
                  Rc1
               
               
                  =
               
               
                  deguonies suvartojimo intensyvumas 1 kontroliniame bandyme,
               
            
                  Rc2
               
               
                  =
               
               
                  deguonies suvartojimo intensyvumas 2 kontroliniame bandyme.
               
            EC50 šiame metode yra bandomosios medžiagos koncentracija, kurią naudojant kvėpavimo intensyvumas sudaro 50 % kvėpavimo intensyvumo kontroliniame kvėpavimo bandyme šiame metode aprašytomis sąlygomis.
      1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Rekomenduojama etalonine medžiaga naudoti 3,5-dichlorfenolį, kuris yra žinomas kvėpavimo inhibitorius, ir naudoti jį kaip priemonę patikrinti, ar dumblo jautrumas nėra nenormalus, nustatant medžiagos EC50 kiekvienai aktyviojo dumblo partijai.
      1.4.   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Aktyvusis dumblas maitinamas standartiniame kiekyje mitybinės terpės, kurią sudaro sintetinės nuotekos, ir po 30 min ar 3 valandų sąlyčio, arba abiem atvejais, matuojamas dumblo kvėpavimo intensyvumas. Be to, dar matuojamas to paties aktyviojo dumblo kvėpavimo intensyvumas, dedant įvairios koncentracijos bandomosios medžiagos, kai kitos sąlygos yra identiškos. Bandomosios medžiagos inhibuojamasis veikimas konkrečiai koncentracijai išreiškiamas dvejuose kontroliniuose bandymuose gautų verčių vidurkio procentine dalimi. Pagal matavimus skirtingose koncentracijose apskaičiuojama EC50 vertė.
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Bandymo rezultatai tinkami, jei:
      
                  —
               
               
                  kvėpavimo intensyvumo vertės abiejuose kontroliniuose bandymuose skiriasi mažiau kaip 15 %,
               
            
                  —
               
               
                  3,5-dichlorfenolio EC50 (30 minučių ir (ar) trijų valandų) yra priimtiname intervale nuo 5 mg/litre iki 30 mg/litre.
               
            1.6.   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Reagentai
      
      1.6.1.1.   Bandomosios medžiagos tirpalai
      
      Bandomosios medžiagos tirpalai ruošiami iš pradinio tirpalo prieš pat tyrimo pradžią. Jei daroma pagal toliau aprašytą rekomenduojamą metodiką, tinka 0,5 g/litre koncentracijos pradinis tirpalas.
      1.6.1.2.   Etaloninės medžiagos tirpalas
      
      3,5-dichlorfenolio tirpalą galima ruošti, pavyzdžiui taip: tirpinkite 0,5 g 3,5-dichlorfenolio 10 ml 1 M NaOH, skieskite distiliuotu vandeniu maždaug iki 30 ml, pilkite maišydami 0,5 M H2SO4, kol pradeda kristi nuosėdos, tam maždaug reikia 8 ml 0,5 M H2SO4, ir galiausiai distiliuotu vandeniu skieskite mišinį iki vieno litro. pH vertė turi būti intervale nuo 7 iki 8.
      1.6.1.3.   Sintetinės nuotekos
      
      Sintetinių nuotekų mitybinė terpė ruošiama tirpinant tokius šių medžiagų kiekius 1 litre vandens:
      
                  —
               
               
                  16 g peptono,
               
            
                  —
               
               
                  11 g mėsos ekstrakto,
               
            
                  —
               
               
                  3 g karbamido,
               
            
                  —
               
               
                  0,7 g NaCl,
               
            
                  —
               
               
                  0,4 g CaCl2x2H20,
               
            
                  —
               
               
                  0,2 g MgS04x7H20,
               
            
                  —
               
               
                  2,8 g K2HPO4.
               
            
         1 pastaba. Šios sintetinės nuotekos yra koncentratas, kurio koncentracija 100 kartų didesnė, nei nuotekų, aprašytų OECD techninėje ataskaitoje „Proposed metod for the determination of the biodegradability of surfactants used in synthetic detergents“ (Siūlomas paviršinio aktyvumo medžiagų, naudojamų sintetiniuose plovikliuose, biologinio skaidomumo nustatymo metodas) (1976 m. birželio 11 d.), ir pridedant kalio hidrofosfato.
      
         2pastaba. Jei paruošta terpė naudojama ne iš karto, ji turi būti laikoma tamsoje nuo 0 iki 4 oC ir ne ilgiau, kaip vieną savaitę sąlygomis, kurios nekeistų nuotekų sudėties. Prieš dedant saugoti, terpę galima sterilizuoti, arba peptonas ir mėsos ekstraktas dedami prieš pat bandymo pradžią. Prieš naudojant, terpė turi būti gerai sumaišoma ir nustatoma jos pH vertė.
      1.6.2.   Aparatūra
      
      Matavimo aparatas. Tiksli konstrukcija nėra svarbi. Tačiau kolboje turi likti neužimtos erdvės, o zondas turi sandariai uždaryti matavimo kolbą.
      Be įprastos laboratorijos įrangos dar reikalinga tokia speciali įranga:
      
                  —
               
               
                  matavimo aparatas,
               
            
                  —
               
               
                  aeravimo įtaisas,
               
            
                  —
               
               
                  pH-elektrodas ir pH matavimo įranga,
               
            
                  —
               
               
                  O2 elektrodas.
               
            1.6.3.   Sėjimo kultūros ruošimas
      
      Bandymuose mikrobine sėjimo kultūra naudojamas aktyvusis dumblas iš valymo įrenginio, valančio daugiausia buitines nuotekas.
      Jei būtina, grįžus į laboratoriją stambias daleles galima pašalinti, paliekant dumblą trumpą laiką, pvz., 15 minučių, nusistoti, ir viršutinį smulkesnių dalelių sluoksnį dekantuoti ir toliau naudoti. Kitu būdu dumblą galima sumaišyti, kelioms sekundėms įjungus maišytuvą.
      Be to, jei manoma, kad gali būti inhibuojančių medžiagų, dumblas turi būti išplautas vandentiekio vandeniu ar izotoniniu tirpalu. Po centrifugavimo skystis nuo nuosėdų dekantuojamas (plaunama tris kartus).
      Nedidelis dumblo kiekis sveriamas ir džiovinamas. Remiantis šiuo rezultatu galima apskaičiuoti, kiek šlapio dumblo reikia suspenduoti vandenyje, kad gautame aktyviojo dumblo ir vandens mišinyje suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija būtų nuo 2 g/litre iki 4 g/litre. Toks kiekis atitinka koncentraciją bandomojoje terpėje nuo 0,8 iki 1,6 g/litre, jei būtų taikoma toliau rekomenduota metodika.
      Jei nėra galimybės dumblą panaudoti rinkimo dieną, vienam litrui aktyviojo dumblo įpilama 50 ml sintetinių nuotekų mitybinės terpės, paruoštos, kaip aprašyta aukščiau; ir mišinys per naktį aeruojamas 20 ± 2 oC temperatūroje. Dieną jis ir toliau aeruojamas, kol bus panaudotas. Prieš naudojant dumblą, tikrinama pH vertė ir prireikus nustatoma intervale nuo 6 iki 8. Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija aktyviojo dumblo ir nuotekų mišinio bandinyje turi būti nustatyta, kaip tai aprašyta ankstesnėje pastraipoje.
      Jei ta pati dumblo partija turi būti naudojama kitomis dienomis (ne ilgiau kaip keturios paros), kiekvienos darbo dienos pabaigoje vienam litrui dumblo įpilama dar 50 ml sintetinių nuotekų mitybinės terpės.
      1.6.4.   Bandymo eiga
      
      
                  Trukmė/sąlyčio trukmė:
               
               
                  30 minučių ir (arba) trys valandos aeravimo sąlygomis
               
            
                  Vanduo
               
               
                  Geriamasis vanduo (prireikus dechloruotas)
               
            
                  Oro tiekimas
               
               
                  Švarus, be alyvos oras. Oro srautas nuo 0,5 iki 1 l/min.
               
            
                  Matavimo aparatūra
               
               
                  Plokščiadugnė kolba, pvz., BOD kolba
               
            
                  Deguonies matuoklis
               
               
                  Tinkamas deguonies elektrodas ir registravimo įrenginys
               
            
                  Mitybinis tirpalas
               
               
                  Sintetinės nuotekos (žr. aukščiau)
               
            
                  Bandomoji medžiaga
               
               
                  Bandomosios medžiagos tirpalas ruošiamas iš naujo bandymo pradžioje
               
            
                  Etaloninė medžiaga
               
               
                  pvz., 3,5-dichlorfenolis (bent trijų koncentracijų)
               
            
                  Kontroliniai bandymai
               
               
                  Sėjimo kultūros bandinys be bandomosios medžiagos
               
            
                  Temperatūra
               
               
                  20±2 oC.
               
            Toliau pateikiama siūloma eksperimento metodika, kurią galima taikyti ir bandomajai ir etaloninei medžiagai trijų valandų sąlyčio trukmės atvejui:
      Naudojami keli indai (pvz., vieno trijų litrų talpos laboratorinės stiklinės).
      Turi būti naudojamos bent penkios koncentracijos, besiskiriančios pastoviu santykiu, geriausiai ne didesniu kaip 3,2.
      Laiku „0“ 16 ml sintetinių nuotekų mitybinės terpės vandeniu skiedžiama iki 300 ml. Įpilama 200 ml mikrobinės sėjimo kultūros ir visas mišinys (500 ml) supilamas į pirmąjį indą (pirmasis kontrolinis bandinys C1).
      Bandymų indai turi būti visą laiką aeruojami tiek, kad ištirpusio O2 kiekis būtų ne mažesnis kaip 2,5 mg/litre ir kad prieš pat kvėpavimo intensyvumo matavimą O2 koncentracija būtų apie 6,5 mg/litre.
      Laiku „15 minučių“ (15 minučių trukmė yra laisvai pasirenkama, tačiau tai patogus laiko tarpas) kartojama, kas padaryta anksčiau, tik prieš tai, kaip skiesti vandeniu iki 300 ml ir pilti mikrobinės sėjimo kultūros iki 500 ml, į 16 ml sintetinių nuotekų įpilama 100 ml pradinio bandomosios medžiagos tirpalo. Šis mišinys supilamas į antrą indą ir aeruojamas, kaip nurodyta aukščiau. Kas 15 minučių veiksmų seka kartojama, imant skirtingus bandomosios medžiagos pradinio tirpalo tūrius, kad būtų gauta eilė indų su skirtingomis bandomosios medžiagos koncentracijomis. Paskutiniuoju ruošiamas antrasis kontrolinis bandinys (C2).
      Po trijų valandų fiksuojama pH vertė, ir gerai sumaišytas pirmojo indo turinio bandinys supilamas į matavimo aparatą, kuriuo ne ilgiau kaip 10 minučių matuojamas kvėpavimo intensyvumas.
      Šis nustatymas kas 15 minučių kartojamas su kiekvieno indo turiniu tokiu būdu, kad sąlyčio trukmė visuose induose būtų trys valandos.
      Tokiu pat būdu su kiekviena mikrobinės sėjimo terpės partija bandoma etaloninė medžiaga.
      Jei reikia matuoti 30 min sąlyčio sąlygomis, būtina taikyti kitokį matavimo režimą (pvz., turėti daugiau nei vieną deguonies matuoklį).
      Jei reikia nustatyti cheminį deguonies suvartojimą ruošiami papildomi indai su bandomąja medžiaga, sintetinių nuotekų mitybine terpe ir vandeniu, bet be aktyviojo dumblo. Deguonies suvartojimas matuojamas ir užrašomas po 30 minučių ir (ar) trijų valandų aeravimo (sąlyčio trukmė).
      2.   DUOMENYS IR VERTINIMAS
      Kvėpavimo intensyvumas skaičiuojamas pagal savirašio užrašą apytikriai tarp 6,5 mg/litre O2 ir 2,5 mg/litre O2, ar 10 minučių tuo laikotarpiu, kai kvėpavimo intensyvumas yra mažas. Kvėpavimo kreivės dalis, kurioje matuojamas kvėpavimo intensyvumas, turi būti tiesiška.
      Jei kvėpavimo intensyvumas dvejuose kontroliniuose bandiniuose vienas nuo kito skiriasi daugiau kaip 15 %, ar etaloninės medžiagos EC50 (30 minučių ir (ar) trijų valandų) nėra priimtiname intervale (nuo 5 iki 30 mg/litre 3,5-dichlorfenoliui), bandymas yra nevalidus ir turi būti pakartotas.
      Inhibavimo procentinė vertė skaičiuojama kiekvienai bandomajai koncentracijai (žr. 1.2). Procentinės inhibavimo vertės priklausomybė nuo koncentracijos brėžiama logaritminiame-normaliame (ar logaritminiame-tikimybiniame) popieriuje, ir gaunama EC50 vertė.
      95 % pasikliovimo rėžiai EC50 vertėms gali būti nustatyti, taikant standartines metodikas.
      3.   ATASKAITA
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  bandomoji medžiaga: cheminio identifikavimo duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų sistema: aktyviojo dumblo šaltinis, koncentracija ir bet koks pradinis kondicionavimas,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              reakcijos mišinio pH vertė prieš kvėpavimo intensyvumo matavimą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandymų temperatūra,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandymų trukmė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              etaloninė medžiaga ir jos išmatuota EC50 vertė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              abiotinis deguonies suvartojimas (jei tai vyko).
                           
                        
            
                  —
               
               
                  rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              visi matavimuose gauti duomenys,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inhibavimo kreivė ir metodas EC50 skaičiuoti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              EC50 ir, jei įmanoma, 95 % pasikliovimo rėžiai, EC20 ir EC80,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visi pastebėjimai ir bet kokie nukrypimai nuo šio bandymo metodo, kurie galėtų turėti įtakos rezultatui.
                           
                        
            3.2.   DUOMENŲ INTERPRETAVIMAS
      Į EC50 vertę turi būti žiūrima tiktai kaip į orientacinį bandomosios medžiagos toksiškumą nuotekų valymo aktyviuoju dumblu procesui ar nuotekų mikroorganizmams, kadangi aplinkos sudėtingų sąveikų laboratoriniame bandyme negalima tiksliai modeliuoti. Be to, bandomosios medžiagos, kurios gali inhibuoti amoniako oksidavimą, taip pat gali duoti atipiškas inhibavimo kreives. Taigi šios kreivės turi būti interpretuojamos atsargiai.
      4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  International Standard ISO 8192-1986.
               
            
                  2)
               
               
                  Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, p. 165.
               
            
                  3)
               
               
                  Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, p. 245.
               
            
                  4)
               
               
                  ETAD (Ecological and Tox.icological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries), Recommended Method No 103, also described by:
               
            
                  5)
               
               
                  Robra, B., Wasserl Abwasser 117, 1976, p. 80.
               
            
                  6)
               
               
                  Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, p. 247.
               
            
                  7)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C(84) 30 final.
               
            C.12.   BIOLOGINIS SKAIDYMAS
      MODIFIKUOTAS SCAS BANDYMAS
      1.   METODAS
      1.1.   ĮVADAS
      Metodo tikslas yra įvertinti vandenyje tirpių, nelakių organinių medžiagų galimą biologinį suskaidymą, kai jas ilgą laiką veikia palyginti didelės koncentracijos mikroorganizmai. Mikroorganizmų gyvybingumas tuo laikotarpiu palaikomas kasdien pridedant nusistojusių nuotekų mitybinės terpės. (Savaitgaliais nuotekas galima laikyti 4 oC temperatūroje. Dar galima naudoti sintetines nuotekas, kurios naudojamos OECD patvirtinamajame bandyme).
      Ant suspenduotų kietųjų dalelių gali vykti fizikocheminė adsorbcija, todėl į tai turi būti atsižvelgta interpretuojant rezultatus (žr. 3.2).
      Dėl skystosios fazės didelės sulaikymo trukmės (36 valandos), ir dėl nutrūkstamo mitybinių medžiagų pridėjimo, bandymas nemodeliuoja nuotekų valymo įrenginio sąlygų. Rezultatai, gauti įvairioms bandymų medžiagoms, rodo, kad bandymas turi didelį biologinio skaidymo potencialą.
      Bandyme sudarytos sąlygos yra labai palankios atrankai ir (ar) adaptavimui mikroorganizmų, galinčių suskaidyti bandomąją medžiagą. (Metodika gali būti taikoma ruošti aklimatizuotas sėjimo kultūras kitiems bandymams).
      Šiame bandyme bandomosios medžiagos biologiniam suskaidymui įvertinti naudojamas ištirpusios organinės anglies kiekio matavimas. Būtų geriau, jei DOC būtų nustatoma po parūgštinimo ir prapūtimo, nei kaip skirtumas Cbendroji – Cneorganinė.
      Jei lygiagrečiai taikyti specifinį analizės metodą, gali būti įmanoma įvertinti medžiagos pirminį biologinį skaidymą (pirminės cheminės sandaros išnykimas).
      Metodas tinka tik toms organinėms bandomosioms medžiagoms, kurios bandyme naudojamos koncentracijos:
      
                  —
               
               
                  tirpios vandenyje (bent 20 mg/litre ištirpusios organinės anglies),
               
            
                  —
               
               
                  garų slėgis yra labai mažas,
               
            
                  —
               
               
                  neinhibuoja bakterijų,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų sistemoje adsorbuojamos tik nežymiu laipsniu,
               
            
                  —
               
               
                  iš bandomojo tirpalo nepradingsta dėl putojimo.
               
            Turi būti nustatytas organinės anglies kiekis bandomoje medžiagoje.
      Norint paaiškinti gautus rezultatus, ypač kai rezultatai yra maži arba nežymus, naudinga butų turėti informacijos apie bandomosios medžiagos pagrindinių komponentų santykinę dalį.
      Kai reikia paaiškinti mažus rezultatus ir pasirinkti tinkamą bandomąją koncentraciją, pageidautina turėti informacijos apie medžiagos toksiškumą mikroorganizmams.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      
                  CT
                  
               
               
                  =
               
               
                  bandomosios medžiagos koncentracija, skaičiuojama organinės anglies kiekiu, kuris yra nusistovėjusiose nuotekose ar pridedamas į jas aeravimo laikotarpio pradžioje (mg/litre),
               
            
                  Ct
                  
               
               
                  =
               
               
                  ištirpusios organinės anglies koncentracija, nustatyta bandomajame skystyje virš nuosėdų aeravimo laikotarpio pabaigoje (mg/litre),
               
            
                  Cc
                  
               
               
                  =
               
               
                  ištirpusios organinės anglies koncentracija, nustatyta kontrolinio bandinio skystyje virš nuosėdų aeravimo laikotarpio pabaigoje (mg/litre).
               
            Šiame bandyme biologinis skaidymas nustatomas kaip organinės anglies išnykimas. Biologinį skaidymą galima išreikšti:
      
                  1.
               
               
                  Kasdien įdedamos medžiagos šalinimo procentine verte Dda:
                  
                              
                                 
                           
                           
                              [1]
                           
                        čia
                  
                              Dda
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              skaidymas/kasdienis pridėjimas.
                           
                        
            
                  2.
               
               
                  Kiekvienos dienos pradžioje turimo medžiagos kiekio šalinimo procentinė vertė Dssd :
                  
                              
                                 
                           
                           
                              [2 (a)]
                           
                        
                              
                                 
                           
                           
                              [2 (b)]
                           
                        čia
                  
                              Dssd
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              skaidymas/medžiagos kiekis dienos pradžioje;
                           
                        indeksai i ir (i + 1) nurodo matavimo dieną.
                  2(a) lygtį rekomenduojama taikyti, jei ištakio DOC kinta diena po dienos, o 2(b) lygtis gali būti taikoma, kai ištakio DOC diena po dienos palyginti nekinta.
               
            1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Kai kuriais atvejais, kai tiriamos naujos medžiagos, etaloninės medžiagos gali būti naudingos, tačiau nėra specifinės etaloninės medžiagos, kurią galima būtų rekomenduoti šiam bandymui.
      Visų pirma, yra pateikti duomenys apie kelis junginius, įvertintus tarplaboratorinio lyginimo bandymuose (žr. 1 papildymą), taigi retkarčiais galima metodą sutikrinti ir jo rezultatus lyginti su rezultatais, gautais kitais metodais.
      1.4.   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Aktyvusis dumblas iš nuotekų valymo įrenginio dedamas į pusiau nepertraukiamo veikimo aktyviojo dumblo įrenginį [Semi-Continuous Activated Sludge (SCAS)]. Įdedama bandomosios medžiagos ir nusistojusių butinių nuotekų, ir mišinys aeruojamas 23 valandas. Paskui aeravimas stabdomas, dumblas paliekamas nusistoti ir skystis virš dumblo pašalinamas.
      Aeravimo kameroje likęs dumblas maišomas su kita bandomosios medžiagos ir nuotekų dalimi ir ciklas kartojamas.
      Biologinio skaidymo buvimas įrodomas, nustatant ištirpusios organinės anglies kiekį skystyje virš dumblo. Ši vertė lyginama su verte, gauta skysčiui kontroliniame mėgintuvėlyje, kuriame buvo tik nuotekos.
      Kai taikomas specifinis analizės metodas, galima nustatyti pradinės medžiagos koncentracijos mažėjimą dėl jos molekulių biologinio skaidymo (pirminis biologinis skaidomumas).
      1.5.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      Šio metodo, kuris remiasi ištirpusios organinės medžiagos šalinimu, atkuriamumas dar nėra nustatytas. (Kai tiriamas pirminis biologinis skaidymas, labai tikslūs duomenis yra gauti medžiagoms, kurios skaidomos dideliu laipsniu).
      Metodo jautrumą dideliu laipsniu lemia tuščiojo bandinio kintamumas ir, kiek mažiau, ištirpusios anglies nustatymo preciziškumas ir bandomosios medžiagos kiekis skystyje kiekvieno ciklo pradžioje.
      1.6.   BANDYMŲ EIGOS APRAŠYMAS
      1.6.1.   Paruošiamieji darbai
      
      Oro tiekimo vamzdeliai (1 paveikslas) jungiami prie reikiamo skaičiaus švarių aeravimo įrenginių, skirtų kiekvienai bandymo medžiagai ir kontroliniams bandiniams, arba galima naudoti originalųjį 1,5 litro SCAS bandymo įrenginį. Į įrenginius per medvilnės filtrą tiekiamame suslėgtame ore turi nebūti organinės anglies ir, garavimo nuostoliams mažinti, oras turi būti prisotintas vandens garų.
      Aktyviojo dumblo ir nuotekų mišinio bandinys, kuriame būtų nuo 1 iki 4 g/litre suspenduotų kietųjų dalelių, gaunamas iš daugiausia buitines nuotekas valančio aktyviojo dumblo įrenginio. Kiekvienam aeravimo įrenginiui reikia maždaug 150 ml aktyviojo dumblo ir nuotekų mišinio.
      Pradiniams bandomosios medžiagos tirpalams ruošti naudojamas distiliuotas vanduo; paprastai reikia, kad organinės anglies koncentracija būtų 400 mg/litre, tokiu atveju bandomosios medžiagos koncentracija kiekvieno aeravimo ciklo pradžioje, kai nevyksta biologinis skaidymas, yra 20 mg/litre.
      Galima naudoti didesnes koncentracijas, jei tai įmanoma dėl medžiagos toksiškumo mikroorganizmams.
      Nustatomas organinės anglies kiekis pradiniuose tirpaluose.
      1.6.2.   Bandymų sąlygos
      
      Bandymas turi būti daromas 20–25 oC temperatūroje.
      Naudojama didelė aerobinių mikroorganizmų koncentracija (nuo 1 iki 4 g/litre suspenduotų kietųjų dalelių), ir tikroji sulaikymo trukmė yra 36 valandos. Anglingoji medžiaga nuotekų mitybinėje terpėje oksiduojama dideliu laipsniu, paprastai tai įvyksta per aštuonias valandas nuo kiekvieno aeravimo ciklo pradžios. Po to, iki aeravimo laikotarpio pabaigos dumblas kvėpuoja endogeniškai, tuo metu vienintelis substratas yra bandomoji medžiaga, jei ji pati nebuvo lengvai įsisavinta. Šios savybės, kartu su sėjimo kultūros kasdieniu keitimu, kai terpe naudojamos buitinės nuotekos, užtikrina labai palankias aklimatizavimo sąlygas ir galimybę biologiškai skaidyti dideliu laipsniu.
      1.6.3.   Bandymų eiga
      
      Iš tinkamo aktyviojo dumblo valymo įrenginio ar laboratorinio įrenginio, skirto valyti daugiausia buitines nuotekas, imamas nuotekų ir aktyviojo dumblo mišinys, kuris visą laiką, kol bus panaudotas laboratorijoje, laikomas aerobinėmis sąlygomis. Į kiekvieną aeravimo įrenginį ir į kontrolinį įrenginį įpilama po 150 ml šio mišinio (jei naudojamas originalus SCAS bandymo įtaisas, nurodytus tūrius reikia dauginti iš 10) ir pradedama aeruoti. Po 23 valandų aeravimas baigiamas ir dumblas 45 minutėms paliekamas nusistoti. Kiekvienas indas paeiliui atkemšamas, ir iš jo išsiurbiama 100 ml skysčio virš dumblo. Prieš pat naudojimą paimamas nusistojusių buitinių nuotekų bandinys, ir 100 ml nuotekų įpilama į kiekvieną aeravimo įrenginį su likusiu jame dumblu. Vėl pradedama aeruoti. Šioje pakopoje bandomoji medžiaga nededama, ir į įrenginius kasdieną pilama buitinių nuotekų tol, kol skystis virš nusistojusio dumblo tampa skaidrus. Tai dažniausiai trunka ne ilgiau kaip dvi savaites, per tą laiką ištirpusios organinės anglies kiekis skystyje virš dumblo kiekvieno aeravimo ciklo pabaigoje pasiekia pastovią vertę.
      Kai šis laikotarpis baigiasi, atskirieji nusistojusio dumblo bandiniai yra sumaišomi ir į kiekvieną įrenginį dedama po 50 ml gauto sudėtinio dumblo.
      Į kontrolinius įrenginius įpilama 95 ml nusistojusių nuotekų ir 5 ml vandens, į bandomuosius įrenginius įpilama 95 ml nusistojusių nuotekų ir 5 ml atitinkamos bandomosios medžiagos pradinio tirpalo (400 mg/litre). Aeruoti pradedama iš naujo ir aeravimas tęsiamas 23 valandas. Po to dumblas paliekamas 45 minutėms nusistoti, skystis virš dumblo nusiurbiamas ir jame nustatomas ištirpusios organinės anglies kiekis.
      Aukščiau aprašytas užpylimo ir siurbimo procesas kartojamas kasdien iki bandymo pabaigos.
      Prieš tai, kaip palikti dumblą nusistoti, gali jį tekti nuvalyti nuo įrenginio sienelių, kad kietosios dalelės nesikauptų virš skysčio. Norint išvengti kryžminio užkrėtimo, kiekvienas įrenginys turi turėti atskirą gremžtuką ar šepetį.
      Geriausia būtų, kad ištirpusi organinė anglis skystyje virš dumblo būtų nustatoma kasdieną, nors analizę leidžiama daryti rečiau. Prieš analizę skysčiai filtruojami per išplautus 0,45 μm membraninius filtrus ar centrifuguojami. Membraniniai filtrai tinka, jei užtikrinama, kad filtravimo pakopoje jie neišskiria anglies ir nesugeria medžiagos. Centrifuguojamo bandinio temperatūra neturi būti didesnė kaip 40 oC.
      Bandymo trukmė junginiams, kurie yra mažai skaidomi arba visiškai neskaidomi, nėra apibrėžta, tačiau patyrimas sako, kad dažniausiai tai turi trukti bent 12 savaičių, bet ne ilgiau kaip 26 savaitės.
      2.   DUOMENYS IR VERTINIMAS
      Ištirpusios anglies kiekio vertės, nustatytos bandomųjų ir kontrolinių įrenginių skysčiuose virš nuosėdų, atidedamos grafiškai kaip laiko funkcija.
      Baigus biologinį skaidymą, bandomajame įrenginyje nustatytas lygis artėja prie kontroliniame bandinyje rasto lygio. Kai skirtumas tarp abiejų lygių trijuose iš eilės matavimuose nekinta, dar daroma tiek matavimų, kiek jų pakanka duomenims statistiškai apdoroti, ir skaičiuojama bandomosios medžiagos biologinio skaidymo procentinė vertė (Dda ar Dssd, žr. 1.2).
      3.   ATASKAITA
      3.1.   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  visa informacija apie nuotekų prigimtį, naudoto įrenginio tipą ir eksperimentiniai rezultatai, gauti bandomajai medžiagai, etaloninei medžiagai, jei buvo naudojama, ir tuščiajam bandiniui,
               
            
                  —
               
               
                  temperatūra,
               
            
                  —
               
               
                  šalinimo kreivė su aprašymu, skaičiavimo būdu (žr. 1.2),
               
            
                  —
               
               
                  data ir vieta, kur buvo imti aktyviojo dumblo ir nuotekų bandiniai, adaptavimo būsena, koncentracija ir t. t.,
               
            
                  —
               
               
                  mokslinis bet kokių bandymų metodikos keitimų pagrindimas,
               
            
                  —
               
               
                  parašas ir data.
               
            3.2.   DUOMENŲ INTERPRETAVIMAS
      Kadangi medžiaga, skirta šiuo metodu bandyti, biologiškai nėra lengvai skaidoma, bet koks DOC šalinimas vien tik dėl biologinio skaidymo paprastai vyksta laipsniškai dienas ar savaites, išskyrus tuos atvejus, kai įvyksta staigus aklimatizavimas, apie kurį rodo staigus išnykimas, įvykstantis po kelių savaičių.
      Tačiau kartais svarbų vaidmenį gali vaidinti fizikocheminė adsorbcija; jos dalyvavimą rodo pridėtos DOC visiškas ar dalinis išnykimas bandymo pradžioje. Kas atsitinka vėliau, priklauso nuo kai kurių faktorių, pvz., adsorbcijos laipsnio, ir suspenduotų kietųjų dalelių koncentracijos išleidžiamajame ištakyje. Paprastai skirtumas tarp DOC koncentracijos kontrolinio bandinio ir bandomosios medžiagos skystyje virš nuosėdų laipsniškai didėja nuo pradinės mažos vertės ir toliau šis skirtumas pasiekęs naują vertę išlieka toks iki bandymo pabaigos, jei neįvyksta aklimatizavimas.
      Jei reikia atskirti biologinį skaidymą (ar dalinį biologinį skaidymą) ir adsorbciją, būtina daryti tolesnius bandymus. Tai galima daryti įvairiais būdais, tačiau įtikinamiausias būdas yra pamatiniame bandyme (geriau, kad tai būtų respirometrinis bandymas) sėjimo kultūra naudoti skystį virš dumblo ar dumblą.
      Bandomosios medžiagos, kurių neadsorbcinio DOC šalinimo vertes bandyme yra didelės, turi būti laikomos potencialiai biologiškai skaidomomis. Dalinis neadsorbcinis šalinimas rodo, kad cheminė medžiaga bent kažkiek yra biologiškai skaidoma.
      Mažos ar nulinės DOC (COD) šalinimo vertės gali būti dėl mikroorganizmų inhibavimo bandomąja medžiaga, tai dar gali parodyti dumblo irimas ir jo praradimas, dėl ko skystis virš dumblo drumsčiasi. Bandymas turi būti pakartotas naudojant mažesnę bandomosios medžiagos koncentraciją.
      Naudojant specifinį junginio analizės metodą ar bandomąsias medžiagas su žymėtais 14C atomais, gali būti pasiektas didesnis jautrumas. Jei bandomasis junginys turi 14C,
         14C02 surinkimas patvirtintų, kad biologinis skilimas įvyko.
      Kai duomenys pateikiami, kaip pirminio biologinio skaidymo rezultatai, turi būti paaiškinta, jei tai įmanoma, kaip pakito cheminė sandara, kad neliko pradinės bandomosios medžiagos atsako.
      Turi būti pateiktas analizės metodo galiojimo patvirtinimas ir tuščiojo bandinio terpėje nustatyta skaidymo vertė.
      4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 A, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
         1 priedėlis
         SCAS bandymas. Rezultatų pavyzdys
         
                     Medžiaga
                  
                  
                     CT
                     
                     (mg/l)
                  
                  
                     Ct – Cc
                     
                     (mg/l)
                  
                  
                     Biologinio suirimo procentas
                     Dda
                     
                  
                  
                     Bandymo trukmė
                     (dienomis)
                  
               
                     4-acetilaminobenzensulfunatas
                  
                  
                     17,2
                  
                  
                     2,0
                  
                  
                     85
                  
                  
                     40
                  
               
                     Tetrapropenbonzensulfonatas
                  
                  
                     17,3
                  
                  
                     8,4
                  
                  
                     51,4
                  
                  
                     40
                  
               
                     4-nitrofenolis
                  
                  
                     16,9
                  
                  
                     0,8
                  
                  
                     95,3
                  
                  
                     40
                  
               
                     Dietilenglikolis
                  
                  
                     16,5
                  
                  
                     0,2
                  
                  
                     98,8
                  
                  
                     40
                  
               
                     Anilinas
                  
                  
                     16,9
                  
                  
                     1,7
                  
                  
                     95,9
                  
                  
                     40
                  
               
                     Ciklopentano tetrakarboksilatas
                  
                  
                     17,9
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                     81,1
                  
                  
                     120
                  
               
      
         2 priedėlis
         Bandymo aparato pavyzdys
         
            
      
      C.13   BIOLOGINIS KONCENTRAVIMAS: BANDYMAS SU ŽUVIMIS PRATEKĖJIMO SĄLYGOMIS
      1.   METODAS
      Šis biologinio koncentravimo metodas yra OECD TG 305 (1996) kopija.
      1.1.   ĮVADAS
      Šis metodas aprašo pratekėjimo sąlygomis vykstančio medžiagų biologinio kaupimosi žuvyse gebos apibūdinimo metodiką. Nors kur kas geriau taikyti metodą pratekėjimo sąlygomis, leidžiama naudoti pusiau stacionarius režimus, jei jie atitinka patikimumo kriterijus.
      Metodas pateikia pakankamą kiekį bandymui atlikti reikalingų detalių, tačiau palieka atitinkamą laisvę eksperimento schemai pritaikyti konkrečių laboratorijų sąlygoms ir keisti bandymo medžiagų charakteristikas. Jis labiausiai tinka patvarioms organinėms medžiagoms, kurių log Pow vertės yra nuo 1,5 iki 6,0 (1), tačiau gali būti taikomas ir ypatingai lipofilinėms medžiagoms (kurių log Pow > 6,0). Tokių ypatingai lipofilinių medžiagų biologinio koncentravimo faktoriaus (BKF), kartais žymimo KB, išankstinis įvertis greičiausiai būtų didesnis, nei nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktoriaus (BKFNB) vertė, kurios reikėtų laukti laboratoriniuose bandymuose. Medžiagų, kurių log Pow vertės yra iki 9,0, išankstiniai biologinio koncentravimo faktoriaus įverčiai gali būti gauti naudojant Bintein ir kt. lygtį (2). Parametrams, kurie apibūdina biologinio koncentravimo gebą, priklauso sugerties greičio konstanta (k1), apsivalymo greičio konstanta (k2) ir BKFNB.
      Žymėtuosius atomus turinčios bandymo medžiagos gali palengvinti vandens ir žuvų bandinių analizę ir gali būti naudojamos norint nustatyti, ar reikia atlikti irimo produktų identifikavimą ir kiekybinį nustatymą. Jei matuojamas bendras radioaktyviųjų likučių kiekis (pvz., deginant arba tirpinant audinius), BKF remiasi pradinio junginio, visų sulaikytų metabolitų, o taip pat įsisavintos anglies kiekiu. Taigi, BKF vertės, besiremiančios bendruoju radioaktyviųjų likučių kiekių, negali būti tiesiogiai lyginamos su BKF vertėmis, gautomis atliekant tik pradinio junginio selektyviąją analizę.
      Norint nustatyti BKF, kuris remiasi tik pradinio junginio kiekiu, tyrimuose su žymėtaisiais atomais gali būti naudojamos gryninimo metodikos, o pagrindiniai irimo produktai gali būti apibūdinti, jei manoma, kad tai yra būtina. Analizuojant ir identifikuojant likučius audiniuose, galima sujungti medžiagų apykaitos žuvyse tyrimus su biologinio koncentravimo tyrimais.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      Biologinis koncentravimas (biologinis kaupimas) yra bandymo medžiagos koncentracijos didėjimas organizme (jo nustatytuose audiniuose) arba organizmo paviršiuje lyginant su bandymo medžiagos koncentracija aplinkinėje terpėje.
      Biologinio koncentravimo faktorius (BKF arba KB) yra bandymo medžiagos koncentracijos žuvies viduje (paviršiuje) arba jos nustatytuose audiniuose (Cf, μg/g (ppm)) ir cheminės medžiagos koncentracijos aplinkinėje terpėje (Cw kaip μg/ml (ppm)) santykis bet kuriuo šio koncentravimo bandymo sugerties tarpsnio metu.
      Nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius (BKFNB arba KB) žymiai nekinta ilgesnį laiko tarpą, bandymo medžiagos koncentracijai aplinkinėje terpėje šį laiko tarpą esant pastoviai.
      Horizontalioji dalis arba nuostovioji būsena pasiekiama tuomet, kai bandymo medžiagos koncentracijos žuvyje (Cf) priklausomybės nuo laiko kreivė tampa lygiagreti laiko ašiai, o trys Cf vertės, gautos paeiliui analizuojant bent kas dvi paras paimtus bandinius, viena nuo kitos nesiskiria daugiau kaip ± 20 %, ir nėra žymių skirtumų tarp trijų bandinių ėmimo periodų. Kai analizuojami sujungti bandiniai, reikia ne mažiau kaip keturių paeiliui padarytų analizių. Lėtai sugeriamoms bandymų medžiagoms labiau tiktų septynių parų tarpai.
      Biologinio koncentravimo faktorius, apskaičiuotas tiesiog iš kinetinių greičio konstantų (k1/k2), yra vadinamas kinetiniu koncentravimo faktoriumi, BKFK.
      Pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas (Pow) yra cheminės medžiagos pusiausvyroj o tirpumo n – oktanolyje ir vandenyje santykis (A.8 metodas), taip pat išreiškiamas Kow. Pow logaritmas naudojamas cheminės medžiagos biologinio koncentravimo vandens organizmuose gebos rodikliu.
      Veikimo arba sugerties tarpsnis yra laikas, kurį žuvis yra veikiama bandymo medžiagos.
      Sugerties greičio konstanta (k1) yra skaitinė vertė, apibūdinanti bandymo medžiagos koncentracijos žuvyje arba jos paviršiuje (arba nustatytuose jos audiniuose) didėjimo greitį, kai žuvis veikiama chemine medžiaga (k1 išreiškiama para-1).
      Tarpsnis po veikimo arba apsivalymo (netekimo) tarpsnis yra laikas, kai bandomoji žuvis buvo pernešta iš terpės su bandymo medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos nėra, kuomet tiriamas apsivalymas (arba bendras mažėjimas) nuo šios medžiagos žuvyje (arba nustatytuose jos audiniuose).
      Apsivalymo (netekimo) greičio konstanta (k2) yra skaitinė vertė, apibūdinanti bandymo medžiagos koncentracijos žuvyje arba jos paviršiuje (arba nustatytuose jos audiniuose) mažėjimo greitį po to, kai bandomoji žuvis buvo pernešta iš terpės su bandymo medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos nėra (k2 išreiškiama para-1).
      1.3.   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Bandymas susideda iš dviejų tarpsnių: veikimo (sugerties) ir tarpsnio po veikimo (apsivalymo). Sugerties tarpsnio metu atskiros vienos rūšies žuvų grupės veikiamos bent dviejų koncentracijų bandymo medžiaga. Vėliau apsivalymo tarpsniui jos pernešamos į terpę be bandymo medžiagos. Apsivalymo tarpsnis būtinas visuomet, išskyrus atvejus, kai medžiagos sugertis sugerties tarpsnio metu buvo nežymi (pvz., BKF yra mažesnis kaip 10). Bandymo medžiagos koncentracija žuvyje (jos paviršiuje) (arba nustatytuose jos audiniuose) matuojama abiejuose bandymo tarpsniuose. Be dviejų bandymo koncentracijų, kontrolinė žuvų grupė laikoma tokiomis pačiomis sąlygomis, bet be bandymo medžiagos, norint biologinio koncentravimo bandyme pastebėtas galimas neigiamas pasekmes palyginti su palyginamąja kontroline grupe ir gauti bandymo medžiagos fono koncentracijas.
      Sugerties tarpsnis vykdomas 28 paras, jei neįrodoma, kad pusiausvyra yra pasiekta anksčiau. Sugerties tarpsnio trukmės ir nuostoviosios būsenos laiko prognozė gali būti padaryta pagal 3 papildymo lygtį. Pernešus žuvis į kitą švarų indą su ta pačia terpe, bet be bandymo medžiagos, pradedamas apsivalymo periodas. Pageidautina, jei įmanoma, biologinio koncentravimo faktorių apskaičiuoti ir kaip santykį koncentracijos žuvyje (Cf) su koncentracija vandenyje (Cw) tariamosios nuostoviosios būsenos sąlygomis (BKFNB) ir kaip kinetinį biologinio koncentravimo faktorių (BKFK), išreiškiamą sugerties (k1) ir apsivalymo (k2) greičio konstantų santykiu, darant prielaidą apie pirmojo laipsnio kinetiką. Jei pirmojo laipsnio kinetikos akivaizdžiai nepaisoma, turi būti naudojami sudėtingesni modeliai (5 priedėlis).
      Jei nuostovioji būsena per 28 paras nepasiekiama, sugerties tarpsnis turi būti pratęstas, kol ji bus pasiekta, arba iki 60 parų, žiūrint, kas anksčiau; tuomet pradedamas apsivalymo tarpsnis.
      Sugerties greičio konstanta, apsivalymo (netekimo) greičio konstanta (ar konstantos, jei naudojami sudėtingesni modeliai), biologinio koncentravimo faktorius ir, jei įmanoma, kiekvieno šių parametrų pasikliovimo ribos apskaičiuojami pagal modelį, kuris geriausiai aprašo žuvyse ir vandenyje išmatuotas bandymo medžiagos koncentracijas.
      BKF yra išreiškiamas kaip žuvies bendrosios šlapios masės funkcija. Tačiau specialiems tikslams, jei žuvis yra pakankamai didelė, gali būti naudojami nustatyti audiniai arba organai (pvz., raumuo, kepenys) arba žuvis gali būti padalinta į valgomąją (filė) ir nevalgomą (viduriai) dalis. Kadangi daugeliui organinių medžiagų yra aiški priklausomybė tarp jų biologinio koncentravimo gebos ir lipofiliškumo, taip pat yra atitinkama priklausomybė tarp riebalų kiekio bandomosiose žuvyse ir stebimo tokių medžiagų biologinio koncentravimo. Tokiu būdu, norint sumažinti šį bandymo rezultatų kintamumo šaltinį, lipofiliškų (t. y. kurių log Pow >3) 3) medžiagų biologinis koncentravimas turi būti apskaičiuojamas ne tik viso kūno masei, bet ir riebalų kiekiui.
      Kai tai galima įgyvendinti, riebalų kiekis turi būti nustatomas toje pačioje biologinėje medžiagoje, kurioje nustatoma bandymų medžiaga.
      1.4.   INFORMACIJA APIE BANDYMŲ MEDŽIAGĄ
      Prieš atliekant biologinio koncentravimo bandymą apie bandymo medžiagą turi būti žinoma tokia informacija:
      
                  —
               
               
                  tirpumas vandenyje,
               
            
                  —
               
               
                  pasiskirstymo koeficientas oktanolio ir vandens mišinyje Pow (taip pat žymimas Kow, nustatomas HPLC metodu pagal A. 8),
               
            
                  —
               
               
                  hidrolizė,
               
            
                  —
               
               
                  fotocheminis virtimas vandenyje, nustatytas apšvietimo saulės arba modeliuota saulės spinduliuote sąlygomis ir biologinio koncentravimo bandyme naudoto apšvietimo sąlygomis (3),
               
            
                  —
               
               
                  paviršiaus įtempis (t. y. medžiagoms, kurioms log Pow negali būti nustatytas),
               
            
                  —
               
               
                  garų slėgis,
               
            
                  —
               
               
                  biologinio suardomumo lengvumas (jei reikia).
               
            Kita reikalinga informacija yra nuodingumas bandyme naudojamoms žuvų rūšims, geriausiai asimptotiška (t. y. nuo laiko nepriklausanti) LC50 vertė. Reikia turėti tinkamą žinomo tikslumo, preciziškumo ir jautrumo analizinį metodą bandymo medžiagai bandymo tirpaluose ir biologinėje medžiagoje kiekybiškai nustatyti, kartu su bandinių ruošimo ir laikymo detalėmis. Tai pat turi būti žinoma bandymo medžiagos analizinio nustatymo vandenyje ir žuvies audiniuose riba. Kai naudojama 14C žymėta bandymo medžiaga, turi būti žinoma radioaktyvumo dėl priemaišų buvimo procentinė dalis.
      1.5.   BANDYMŲ PATIKIMUMAS
      Turi būti taikomos tokios sąlygos, kad bandymas būtų patikimas:
      
                  —
               
               
                  temperatūros kitimas mažesnis kaip ± 2 oC;
               
            
                  —
               
               
                  ištirpusio deguonies koncentracija neturi sumažėti daugiau kaip iki 60 % soties koncentracijos;
               
            
                  —
               
               
                  sugerties tarpsnio metu bandymo medžiagos koncentracija kameroje palaikoma vidutinių išmatuotų verčių ribose su ± 20 % nuokrypiu;
               
            
                  —
               
               
                  bandymo pabaigoje kontrolinių ir veikiamų žuvų mirtingumas arba kiti neigiami veiksniai (liga) yra mažesnis kaip 10 %; jei bandymas vyksta kelias savaites arba mėnesius, mirtingumas arba kiti neigiami veiksniai abiejose žuvų grupėse turi būti mažesnis kaip 5 % per mėnesį, o bendras mirtingumas ne didesnis kaip 30 %.
               
            1.6.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Tikrinant eksperimento metodiką, prireikus būtų naudinga naudoti etalonines medžiagas su žinoma biologinio koncentravimo geba. Tačiau specialios medžiagos vis dar negali būti rekomenduotos.
      1.7.   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      1.7.1.   Aparatūra
      
      Reikia žiūrėti, kad visoms įrangos dalims gaminti būtų vengiama naudoti medžiagas, kurios gali tirpti, sugerti arba išsiplauti ir turėti neigiamą poveikį žuvims. Gali būti naudojami stačiakampio arba ritinio formos standartiniai rezervuarai, kurie būtų pagaminti iš chemiškai inertiškų medžiagų ir kurių tūris atitiktų įkrovos dydį. Minkšti plastikiniai vamzdžiai turi būti kuo mažiau naudojami. Geriausiai naudoti vamzdžius iš teflono (R), nerūdijančio plieno arba stiklo. Patyrimas parodė, kad medžiagoms su dideliu sugerties koeficientu, pvz., sintetiniams piretroidams, gali būti reikalingas silanizuotas stiklas. Tokiais atvejais įranga po naudojimo turėtų būti išmesta.
      1.7.2.   Vanduo
      
      Bandymuose dažniausiai naudojamas paprastas vanduo, jis turi būti imamas iš neužteršto ir vienodos kokybės šaltinio. Skiedimo vandens kokybė turi būti tokia, kad pasirinktų rūšių žuvys nežūtų per aklimatizavimo ir bandymo laiką, jų išvaizdoje arba elgesyje neatsirandant kažko neįprasto. Geriausiu atveju reikėtų pademonstruoti, kad bandomosios rūšys skiedimo vandenyje gali išlikti, augti ir daugintis (pvz., laboratoriniame bandyme su kultūra arba ilgaamžiškumo ciklo toksikologiniame bandyme). Apibūdinant vandenį turi būti nurodyta bent pH vertė, kietumas, bendras kietųjų dalelių kiekis, bendroji organinė anglis, taip pat pageidautina nurodyti amonio ir nitrito jonų kiekį bei šarmingumą, o jūros žuvų rūšims – sūrumą. Parametrai, kurie būtų svarbūs žuvų optimaliam gerbūviui, yra visiškai žinomi, tačiau 1 papildyme pateiktos rekomenduojamos bandymuose naudojamo gėlo ir jūros vandens eilės komponentų didžiausios koncentracijos.
      Vandens kokybė turi būti pastovi visą bandymo laiką. pH vertė turi būti 6,0-8,5 intervale, tačiau konkrečiame bandyme pH reikšmė turi būti ±0,5 pH vieneto ribose. Norint užtikrinti, kad skiedimo vanduo per daug neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pavyzdžiui, sudarydamas kompleksus su bandymo medžiaga) arba neigiamai veiktų žuvų būrio elgesį, bandiniai per tam tikrus laiko tarpus turi būti imami analizei. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidų (pvz., bendrojo fosforoorganinų ir chlororganinių pesticidų kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti daroma, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė yra gana pastovi. Jei butų parodyta, kad vandens kokybė yra pastovi bent metus, analizė gali būti daroma ne taip dažnai, o tarpai tarp jų padidinti (pvz., kas šešis mėnesius).
      Natūralus kietųjų dalelių kiekis, o taip pat bendrosios organinės anglies (BOA) kiekis skiedimo vandenyje turi būti kuo mažesnis, kad būtų išvengta bandymo medžiagos sugerties organine medžiaga, dėl ko gali sumažėti bandymo medžiagos biologinis prieinamumas (4). Didžiausias kietųjų dalelių leistinas kiekis yra 5 mg/l (sausos medžiagos, sulaikomos 0,45 μm filtru), o bendrosios organinės anglies – 2 mg/l (žr. 1 priedėlį). Jei reikia, vanduo prieš naudojimą turi būti filtruojamas. Bandomųjų žuvų (ekskrementų) ir maisto likučių indėlis į bendrosios organinės anglies kiekį turi būti kiek įmanoma mažesnis. Organinės anglies koncentracija bandymo rezervuare visą bandymo laiką neturi viršyti bandymo medžiagoje ir, jei naudojama, soliubiliavimo medžiagoje, esančios organinės anglies koncentracijos daugiau kaip 10 mg/l (± 20 %)
      1.7.3.   Bandymų tirpalai
      
      Ruošiamas reikiamos koncentracijos bandymo medžiagos pradinis tirpalas. Pradinį tirpalą geriausiai būtų ruošti bandymų medžiagą tiesiog maišant arba plakant skiedimo vandenyje. Naudoti tirpiklius arba disperguojančias medžiagas (solubilizavimo medžiagas) nerekomenduojama; tačiau jų gali prireikti kai kuriais atvejais, norint pagaminti pakankamai koncentruotą pradinį tirpalą. Tirpikliai, kuriuos būtų galima naudoti, yra etanolis, metanolis, etandiolio monometilis eteris, etandiolio dimetilis eteris, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Disperguojančios medžiagos, kurias galima naudoti, yra Cremophor RH40, Tween 80, metilceliuliozės 0,01 % tirpalas ir HCO-40. Naudojant biologiškai lengvai suardomas medžiagas reikia žiūrėti, kad neatsirastų problemų dėl bakterijų augimo bandymuose pratekančiame vandenyje. Bandymo medžiaga gali turėti žymėtuosius atomus ir turi būti aukščiausio grynumo (pvz., geriausiai > 98 %).
      Bandymuose su pratekančiu vandeniu bandymų koncentracijai bandymų kameroje užtikrinti reikalinga sistema, kuri nuolat dozuotų ir skiestų bandymų medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozuojantis siurblys, proporcingas skiestuvas, saturatoriaus sistema). Geriausiai būtų daryti bent penkis vandens tūrio keitimus per dieną kiekvienoje bandymų kameroje. Geriau naudoti pratekėjimo režimą, tačiau jei jis netinka (pvz., kai tai kenkia bandomiesiems organizmams), galima taikyti pusiau stacionariąją metodiką, jei ji atitinka patikimumo kriterijus. Pradinio tirpalo ir skiedimo vandens srautas turi būti tikrinamas 48 valandas prieš bandymą ir vėliau bent kasdieną visą bandymo laiką. Šio tikrinimo metu nustatomas srautas per kiekvieną kamerą ir užtikrinama, kad jis kameroje arba tarp kamerų nesikeistų daugiau kaip 20 %.
      1.7.4.   Žuvų rūšies parinkimas
      
      Pasirenkant rūšis svarbu yra tai, ar jas lengva gauti, ar galima gauti tinkamų dydžių žuvis ir ar galima žuvis patenkinamai prižiūrėti laboratorijoje. Kiti žuvų rūšies pasirinkimo kriterijai apima rekreacinę, komercinę, ekologinę svarbą, taip pat palyginamą jautrumą, sėkmingą naudojimą praeityje ir t. t.
      Rekomenduotos bandomosios rūšys pateiktos 2 priedėlyje. Galima naudoti kitas rūšis, tačiau tinkamoms bandymo sąlygoms užtikrinti gali tekti keisti bandymo metodiką. Šiuo atveju ataskaitoje turi būti pateikta rūšies pasirinkimo priežastis ir bandymų metodas.
      1.7.5.   Žuvų laikymas
      
      Laikomų žuvų populiacija bent dvi savaites aklimatizuojama vandenyje bandymo temperatūroje ir pakankamai maitinama tos pačios rūšies maistu, kuris bus naudojamas bandyme.
      Po 48 valandų stabilizacijos periodo, registruojamas mirtingumas ir taikomi tokie kriterijai:
      
                  —
               
               
                  populiacijos mirtingumas per septynias paras didesnis kaip 10 %: visa partija atmetama,
               
            
                  —
               
               
                  populiacijos mirtingumas per septynias paras 5-10 %: aklimatizuojama dar septynias papildomas paras,
               
            
                  —
               
               
                  populiacijos mirtingumas per septynias paras mažesnis kaip 5 %: partija priimama, jei mirtingumas per kitas septynias dienas didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama.
               
            Reikia žiūrėti, kad bandymuose naudojamos žuvys neturėtų pastebimų ligų ir nenormalumų. Pašalinamos visos ligotos žuvys. Žuvys dvi savaites prieš pradedant bandymą arba bandymo metu neturi būti gydomos nuo ligų.
      1.8.   BANDYMO ATLIKIMAS
      1.8.1.   Išankstinis bandymas
      
      Gali būti naudinga atlikti išankstinį bandymą, norint optimizuoti galutinio bandymo sąlygas, pvz., bandymo medžiagos koncentraciją (-as), sugerties ir apsivalymo tarpsnių trukmę.
      1.8.2.   Veikimo sąlygos
      
      1.8.2.1.   Sugerties tarpsnio trukmė
      
      Sugerties tarpsnio trukmės prognozavimas gali būti daromas remiantis praktiniu patyrimu (pvz., iš ankstesnio panašios cheminės medžiagos sugerties tyrimo) arba pagal tam tikras empirines priklausomybes, naudojant tirpumo vandenyje duomenis arba bandymo medžiagos pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą (žr. 3 priedėlį).
      Sugerties tarpsnis turi trukti 28 paras, jei negalima įrodyti, kad pusiausvyra pasiekta anksčiau. Jei nuostovioji būsena nepasiekiama per 28 paras, sugerties tarpsnis turi būti pratęstas, atliekant tolesnius matavimus, kol pasiekiama nuostovioji būsena arba, iki 60 parų, kas trumpiau.
      1.8.2.2.   Apsivalymo tarpsnio trukmė
      
      Pusės sugerties tarpsnio laiko paprastai pakanka, kad sugertos medžiagos kiekis sumažėtų iki atitinkamos vertės (pvz., 95 %) (žr. 3 papildymą dėl šio įverčio aiškinimo). Jei laikas, reikalingas 95 % netekimo vertei pasiekti yra neįvykdomai ilgas, pavyzdžiui, du kartus ilgesnis nei normali sugerties tarpsnio trukmė (t. y. daugiau kaip 56 paros) galima naudoti trumpesnį periodą (pvz., kol bandymo medžiagos koncentracija pasiekia mažiau nei 10 % nuostoviosios būsenos koncentracijos). Tačiau medžiagų, kurių sugerties ir apsivalymo modelis yra sudėtingesnis nei tas, kurį vaizduoja žuvų vienoje kameroje modelis, turintis pirmojo laipsnio kinetiką, netekimo greičio konstantoms nustatyti naudojami ilgesni apsivalymo tarpsniai. Tačiau šio periodo trukmę gali apspręsti laikas, kurį bandymo medžiagos koncentracija žuvyje yra vis dar didesnė nei analizinio aptikimo riba.
      1.8.2.3.   Bandomųjų žuvų skaičius
      
      Koncentracijai nustatyti parenkamas toks žuvų skaičius, kad kiekvieną bandinio ėmimą bandiniui tektų ne mažiau kaip keturios žuvys. Jei reikia didesnio statistinio reikšmingumo, vienam bandiniui žuvų reikės daugiau.
      Jei naudojamos suaugusios žuvys, nurodykite, kokios vienos lyties žuvys ar abiejų lyčių žuvys buvo naudojamos bandyme. Jei naudojamos abiejų lyčių žuvys, prieš veikimo pradžią turi būti dokumentuota, kad riebalų kiekio skirtumas tarp lyčių yra nereikšmingas; gali būti būtina sujungti visas vyriškos ir moteriškos lyties žuvis į vieną grupę.
      Kiekvienam atskiram bandymui parenkamos panašios masės žuvys, kad mažiausių žuvų masė nebūtų mažesnė kaip du trečdaliai didžiausios žuvies masės. Visos žuvys turi būti tų pačių metų ir iš to paties šaltinio. Kadangi kartais paaiškėja, kad žuvų masė ir amžius turi didelę įtaką BKF vertėms (1), šios detalės turi būti tiksliai registruojamos. Norint įvertinti vidutinę masę, rekomenduojama prieš bandymą pasverti turimų žuvų atsargų pobandinį.
      1.8.2.4.   Įkrova
      
      Norint mažinti Cw sumažėjimą dėl žuvų pridėjimo bandymo pradžioje ir išvengti ištirpusio deguonies koncentracijos mažėjimo, naudojami dideli vandens ir žuvų kiekio santykiai. Svarbu, kad įkrovos dydis atitiktų naudojamą bandomąją rūšį. Bet kuriuo atveju paprastai rekomenduojamas įkrovos dydis yra 0,1–1,0 g žuvies (šlapios masės) litrui vandens parai. Dideles įkrovas galima taikyti, jei įrodoma, kad reikiamą bandymo medžiagos koncentraciją įmanoma palaikyti ± 20 % ribose ir kad ištirpusio deguonies koncentracija nesumažėja daugiau kaip iki 60 % soties koncentracijos.
      Pasirenkant tinkamus įkrovos režimus, atsižvelgiama į žuvų rūšies įprastosios gyvenimo aplinkos sąlygas. Pavyzdžiui, dugne gyvenančioms žuvims tam pačiam vandens tūriui gali būti reikalingas didesnis akvariumo dugno plotas nei jūros žuvų rūšims.
      1.8.2.5.   Maitinimas
      
      Aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu žuvys maitinamos tinkamu maistu, kurio žinomas riebalų ir baltymų bendrasis kiekis ir kurio pakanka, kad žuvys būtų sveikos ir būtų palaikoma jų kūno masė. Žuvys aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu maitinamos kasdien, pašaro kiekis sudaro maždaug 1–2 % kūno masės per parą; taip bandymo metu riebalų koncentracija daugumoje žuvų rūšių palaikoma santykinai pastovi. Norint išlaikyti atitikimą tarp kūno masės ir riebalų kiekio, maisto kiekis turi būti perskaičiuotas, pvz., kartą per savaitę. Šiam apskaičiavimui atlikti žuvų masė kiekvienoje kameroje gali būti įvertinta pagal neseniai iš šios kameros bandiniui paimtų žuvų masę. Nesverkite žuvų, kurios lieka kameroje.
      Nesuvalgytas maistas ir išmatos kasdien iš kameros išsiurbiami neužilgo po maitinimo (nuo 30 minučių iki vienos valandos). Kameros visą bandymo laiką turi būti kuo švaresnės, kad būtų palaikoma kiek įmanoma mažesnė organinių medžiagų koncentracija, nes organinės anglies buvimas gali riboti bandymo medžiagos biologinį prieinamumą (1).
      Kadangi daugelis pašarų gaminama iš žuvies miltų, pašaras turi būti analizuojamas, ieškant bandymo medžiagos. Taip pat pageidautina analizuoti pašarą pesticidams ir sunkiesiems metalams nustatyti.
      1.8.2.6.   Šviesa ir temperatūra
      
      Apšvietimo periodo trukmė paprastai lygi 12-16 valandų, o temperatūra (± 2 oC) turi būti tinkama žuvų rūšims (žr. 2 papildymą). Turi būti žinomas apšvietimo tipas ir jo charakteristikos. Reikia atkreipti dėmesį į galimą bandymo medžiagos fotocheminį virsmą tyrimo metu naudoto apšvietimo sąlygomis. Turi būti naudojamas tinkamas apšvietimas, vengiant žuvis veikti gamtoje nesančiais fotocheminio irimo produktais. Kai kuriais atvejais gali būti reikalingas filtras, kuris nepraleistų trumpesnio nei 290 nm bangos ilgio UV spinduliuotę.
      1.8.2.7.   Bandymų koncentracija
      
      Žuvys pratekėjimo sąlygomis veikiamos vandenyje bent dvejų koncentracijų bandymo medžiaga. Paprastai didesnė (arba didžiausia) bandomosios medžiagos koncentracija parenkama taip, kad ji būtų lygi maždaug 1 % jos aštrios asimptotinės LC50 ir būtų bent dešimt kartų didesnė nei jos aptikimo riba vandenyje taikomu analizės metodu.
      Didžiausią bandymo medžiagos koncentraciją taip pat galima nustatyti padalinant aštrios 96 h LC50 vertė iš atitinkamo aštrios ir chroniškos koncentracijų santykio (kai kurių cheminių medžiagų atitinkamas santykis gali keistis maždaug nuo trijų iki 100). Jei galima, pasirinkite kitokią koncentraciją (-as), kuri būtų didesnė už nurodytąją 10 kartų. Jei tai neįmanoma dėl 1 % LC50 sąlygos ir analizinio nustatymo ribos, galima taikyti mažesnį nei 10 daugiklį arba turi būti atsižvelgta į galimybę naudoti 14C žymėtą bandymo medžiagą. Neturi būti naudojama koncentracija, kuri būtų didesnė nei bandymo medžiagos tirpumas.
      Jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, jos koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1 ml/l ir ji turi būti vienoda visuose bandymo induose. Turi būti žinoma, kokią bendrosios organinės anglies kiekio bandymo vandenyje dalį kartu sudaro ši medžiaga ir bandymo medžiaga. Tačiau reikia dėti visas pastangas, kad tokių medžiagų naudoti nereikėtų.
      1.8.2.8.   Kontroliniai bandymai
      
      Papildomai bandymo bandinių serijai turi būti atliekamas skiedimo vandens tikrinimas arba, jei tinka, vandens su soliubilizavimo medžiaga tikrinimas, jei buvo nustatyta, kad soliubilizavimo medžiaga neveikia žuvų. Jei taip nėra, turi būti atliekami abu tikrinimai.
      1.8.3.   Vandens kokybės matavimų dažnis
      
      Bandymo metu visuose induose būtina matuoti ištirpusį deguonį, BOA, pH ir temperatūrą. Bendrasis kietumas ir sūrumas, jei tinka, turi būti nustatyti kontroliniuose bandiniuose ir viename inde su didesne (arba didžiausia) koncentracija. Turi būti nustatomas bent jau ištirpęs deguonis ir sūrumas, jei tinka, ir tai daroma tris kartus – sugerties tarpsnio pradžioje, maždaug per vidurį ir pabaigoje, o apsivalymo laikotarpiu – kartą per savaitę. BOA turi būti nustatyta bandymo pradžioje (24 valandos ir 48 valandos prieš pradedant sugerties tarpsnį) prieš žuvų pridėjimą ir bent kartą per savaitę sugerties iš apsivalymo tarpsnių metu. Temperatūra turi būti matuojama kasdien, pH kiekvieno laikotarpio pradžioje ir pabaigoje, o kietumas kartą kiekviename bandyme. Temperatūrą bent viename inde būtų geriausiai kontroliuoti nuolat.
      1.8.4.   Bandinių ėmimas ir žuvų bei vandens analizė
      
      1.8.4.1.   Žuvies ir vandens bandinio ėmimo grafikas
      
      Vanduo iš bandymo kamerų bandymo medžiagos koncentracijai nustatyti imamas prieš žuvų pridėjimą ir sugerties bei apsivalymo tarpsnių metu. Mažiausiai vandens bandinys imamas tuo pačiu metu kaip ir žuvies bandinys ir dar prieš maitinimą. Sugerties tarpsnio metu bandymo medžiagos koncentracija nustatoma tikrinant atitikimą patikimumo kriterijams.
      Žuvų bandinys imamas bent penkis kartus sugerties tarpsnio metu ir bent keturis kartus apsivalymo tarpsnio metu. Kadangi, remiantis tokiu bandinių skaičiumi, kai kuriais atvejais bus sunku gauti pakankamai tikslų BKF vertės įvertį, ypač kai pasirodo, kad apsivalymo kinetika nėra pirmojo laipsnio, galima būtų patarti abu bandinius imti dažniau (žr. 4 priedėlį). Papildomi bandiniai dedami saugoti ir analizuojami tik tuo atveju, jei pasirodo, kas pirmosios eilės analizės duomenų nepakanka BKF apskaičiuoti norimu tikslumu.
      Tinkamo bandinių ėmimo grafiko pavyzdys pateiktas 4 papildyme. Naudojant kitas Pow numanomas vertes veikimo laikui, per kurį būtų pasiekta 95 % sugerties, apskaičiuoti, gali būti lengvai sudaryti kiti grafikai.
      Bandinių ėmimas sugerties tarpsnio metu tęsiamas tol, kol pasiekiama nuostovioji būsena, arba 28 paras, žiūrint, kas trumpiau. Jei nuostovioji būsena nebuvo pasiekta per 28 paras, bandinių ėmimas tęsiamas toliau, kol pasiekiama nuostovioji būsena, arba iki 60 parų, žiūrint, kas trumpiau. Prieš pradedant apsivalymo tarpsnį, žuvys pernešamos į švarius rezervuarus.
      1.8.4.2.   Bandinių ėmimas ir bandinio ruošimas
      
      Vandens bandiniai analizei gaunami, pvz., siurbiant juos vamzdžiais iš inertiškos medžiagos, įstatytais į bandymo kameros vidurį. Kadangi įrodyta, kad filtravimas ir centrifugavimas ne visuomet leidžia atskirti bandymo medžiagos biologiškai neįsisavinamą dalį nuo tos dalies, kuri yra biologiškai prieinama (ypač labai lipofilinių cheminių medžiagų, t. y. tokių medžiagų, kurių log Pow > 5) (1) (5), bandinių tokiais būdais galima neapdoroti.
      Vietoj to reikia imtis priemonių, kad rezervuarai būtų kiek įmanoma švaresni, o bendrosios organinės anglies kiekis sugerties ir apsivalymo tarpsnių metu turi būti nuolat kontroliuojamas.
      Per kiekvieną bandinio ėmimą iš bandymo kameros paimamas atitinkamas žuvų skaičius (paprastai ne mažiau kaip keturios žuvys). Bandinio žuvys iš karto nuplaunamos vandeniu, „sausinamos“ filtravimo popieriumi, tuojau pat užmušamos pačiu tinkamiausiu ir žmoniškiausiu būdu ir sveriamos.
      Vandenį ir žuvis geriausiai analizuoti iš karto po bandinio ėmimo, kad būtų išvengta irimo arba kitų nuostolių, ir apskaičiuoti apytikrius sugerties bei apsivalymo greičius bandymo eigoje. Iš karto atlikta analizė taip pat leidžia nevėluojant nustatyti, kada pasiekiama horizontalioji sugerties kreivės dalis.
      Jei iš karto analizė nedaroma, bandiniai tinkamu būdu laikomi. Prieš pradedant tyrimą gaunama informacija apie tinkamą konkrečios bandymo medžiagos laikymo metodą, pvz., šaldymą, laikymą 4 oC temperatūroje, laikymo trukmę, ekstrahavimą ir t.t.
      1.8.4.3.   Analizės metodo kokybė
      
      Kadangi visa bandymo eiga iš esmės priklauso nuo bandymo medžiagai nustatyti taikomo analizės metodo tikslumo, preciziškumo ir jautrumo, eksperimentiškai patikrinkite, ar konkretaus metodo cheminės analizės preciziškumas ir atkuriamumas, taip pat bandymo medžiagos regeneravimas iš vandens ir žuvies yra patenkinami. Taip pat patikrinkite, ar bandymo medžiagos negalima aptikti naudojamame skiedimo vandenyje.
      Jei būtina, bandyme gautoms Cw ir Cf vertėms daromos pataisos, atsižvelgiant į regeneravimo ir fono kontroliniuose bandiniuose gautas vertes. Su žuvies ir vandens bandiniais visą laiką elgiamasi taip, kad užteršimas ir nuostoliai (pvz., dėl bandinio ėmimo įtaiso sugerties) butų kuo mažesni.
      1.8.4.4.   Žuvies bandinio analizė
      
      Jei bandyme naudojamos žymėtuosius atomus turinčios medžiagos, galima nustatyti bendrą jų kiekį (t. y. pradinę medžiagą ir metabolitus) arba bandiniai gali būti gryninami, kad pradinę medžiagą galima būtų analizuoti atskirai. Taip pat pasiekus nuostoviąją būseną arba sugerties tarpsnio pabaigą, kas būtų anksčiau, galima apibūdinti pagrindinius metabolitus. Jei BKF, apskaičiuotas pagal bendrąjį žymėtuosius atomus turinčių likučių kiekį, yra ≥ 1 000 %, būtų patartina, o kai kurių cheminių medžiagų rūšių, pvz., pesticidų, atveju labai rekomenduotina, identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus, kurie sudaro daugiau kaip > 10 % bendrojo likučių kiekio žuvies audiniuose nuostoviosios būsenos sąlygomis. Jei yra identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktai, kurie atstovauja daugiau kaip ≥ 10 % bendrojo žymėtuosius atomus turinčių likučių kiekio, taip pat rekomenduojama identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus bandymo vandenyje.
      Bandymo medžiagos koncentracija paprastai turi būti nustatoma kiekvienoje pasvertoje atskiroje žuvyje. Jei tai neįmanoma, kiekvieno bandinio ėmimo bandinius galima jungti, tačiau bandinių jungimas riboja statistines metodikas, kurios galėtų būti taikomos duomenims apdoroti. Jei svarbi yra specifinė statistinė metodika ir jos statistinis reikšmingumas, tuomet bandyme turi būti naudojamas pakankamas žuvų skaičius, kuris atitiktų norimą jungimo metodiką ir statistinį reikšmingumą (6) (7).
      BKF turi būti išreikštas kaip visos šlapios masės funkcija, o labai lipofiliškoms medžiagoms – kaip riebalų kiekio funkcija. Riebalų kiekis žuvyje nustatomas kiekvieno bandinio ėmimo atveju, jei tai įmanoma. Riebalų kiekiui nustatyti turi būti taikomi atinkami metodai (3 priedėlio 8 ir 2 nuorodos). Etaloniniu metodu gali būti rekomenduota ekstrahavimo chloroformo ir metanolio mišiniu metodika (9). Įvairūs metodai neleidžia gauti vienodas vertes (10), todėl svarbu pateikti taikyto metodo detales. Kai tai įmanoma, riebalų analizė turi būti daroma tame pačiame ekstrakte, kuris buvo gautas bandymo medžiagai analizuoti, kadangi riebalus dažnai reikia pašalinti iš ekstrakto prieš tai, kai jį galima būtų analizuoti chromatografiškai. Riebalų kiekis žuvyje (mg/kg šlapios masės) bandymo pabaigoje turi nesiskirti nuo bandymo pradžioje nustatyto kiekio daugiau kaip ± 25 %. Taip pat reikia pateikti procentais apskaičiuotą sausos audinio medžiagos kiekį, kad riebalų koncentraciją būtų galima apskaičiuoti sausos medžiagos kiekiui.
      2.   REZULTATAI
      2.1.   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Bandymo medžiagos sugerties kreivė gaunama aritmetinėje skalėje brėžiant sugerties bandyme gautos koncentracijos žuvyje arba jos paviršiuje (arba nustatytuose audiniuose) kitimą laike. Jei kreivė pasiekė horizontaliąją dalį, t. y., pasidaro beveik asimptotiška laiko ašiai, nuostoviosios būsenos BKFNB apskaičiuojamas taip:
      
         
      Kai nuostovioji būsena nepasiekiama, BKFNB pakankamu pavojui įvertinti tikslumu gali būti įmanoma apskaičiuoti pagal 80 % (1,6/k2) arba 95 % (3,0/k2) „nuostoviosios būsenos“ pusiausvyros.
      Taip pat nustatomas koncentravimo faktorius (BKFk), kaip dviejų pirmojo laipsnio kinetinių konstantų k1/k2 santykis. Apsivalymo greičio konstanta (k2) paprastai nustatoma pagal apsivalymo kreivę (t. y., bandymo medžiagos žuvyje koncentracijos mažėjimo laike grafiką). Tuomet, turint k2 vertę ir Cf, kuri gaunama pagal sugerties kreivę, apskaičiuojama sugerties greičio konstanta (k1) (taip pat žr. 5 priedėlį). Tinkamiausias metodas BKFK ir greičio konstantoms k1 ir k2 apskaičiuoti yra netiesinių parametrų vertinimo metodų taikymas panaudojant kompiuterį (11). Kitaip k1 ir k2 apskaičiuoti gali būti naudojami grafiniai metodai. Jei apsivalymo kreivė akivaizdžiai yra ne pirmojo laipsnio, turi būti taikomi sudėtingesni modeliai (žr. 3 priedėlio nuorodas) ir prašoma biologinio statistiko patarimo.
      2.3.   REZULTATŲ INTERPRETAVIMAS
      Rezultatai turi būti interpretuojami atsargiai, jei išmatuotos bandymo tirpalų koncentracijos yra arti analizinio metodo aptikimo ribos.
      Aiškiai apibrėžtos sugerties ir apsivalymo kreivės yra biologinio koncentravimo duomenų geros kokybės ženklas. Dvejoms koncentracijoms nustatytų sugerties (apsivalymo) konstantų kitimas turi būti mažesnis kaip 20 %. Dvejoms bandymų koncentracijoms stebėti dideli sugerties (apsivalymo) greičių skirtumai turi būti registruojami ir pateikti galimi aiškinimai. Dažniausiai gero planavimo tyrimuose BKF verčių pasikliovimo rėžis artėja prie ± 20 %.
      3.   ATASKAITOS PATEIKIMAS
      Bandymų ataskaita turi apimti tokią informaciją:
      3.1.   BANDYMŲ MEDŽIAGA:
      
                  —
               
               
                  fizikinė prigimtis ir, jei tinka, fizikinės ir cheminės savybės,
               
            
                  —
               
               
                  cheminio identifikavimo duomenys (įskaitant organinės anglies kiekį, jei tinka),
               
            
                  —
               
               
                  jei turi žymėtųjų atomų, tiksli žymėtojo atomo (-ų) padėtis ir su priemaišomis siejamo radioaktyvumo procentinė dalis.
               
            3.2.   BANDOMOSIOS RŪŠYS
      
                  —
               
               
                  mokslinis pavadinimas, rūšis, šaltinis, bet koks išankstinis apdorojimas, aklimatizavimas, amžius, dydžio intervalas ir t. t.
               
            3.3.   BANDYMŲ SĄLYGOS:
      
                  —
               
               
                  naudota bandymų metodika (pvz., pratekėjimo arba pusiau stacionariomis sąlygomis),
               
            
                  —
               
               
                  naudoto apšvietimo tipas ir charakteristikos bei apšvietimo periodas (-ai),
               
            
                  —
               
               
                  bandymų schema (pvz., bandymo kamerų skaičius ir dydis, vandens tūrio pasikeitimo sparta, lygiagrečių bandymų skaičius, žuvų skaičius lygiagrečiame bandyme, bandyme naudotų koncentracijų skaičius, sugerties ir apsivalymo tarpsnių trukmė, žuvų ir vandens bandinių ėmimo dažnis),
               
            
                  —
               
               
                  pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų keitimo dažnis (jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija ir indelis į organinės anglies kiekį bandymo vandenyje),
               
            
                  —
               
               
                  norminės bandymų koncentracijos, bandymų rezervuaruose nustatytų koncentracijų vidutinės vertės ir jų standartiniai nuokrypiai bei metodas, kuriuo jie buvo nustatyti,
               
            
                  —
               
               
                  skiedimo vandens šaltinis, bet kokio jo apdorojimo aprašymas, bandomųjų žuvų galimybių gyventi vandenyje demonstravimo rezultatai ir vandens charakteristikos: pH, kietumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės, bandymo terpės sūrumas (jei tinka) ir visi kiti daryti matavimai,
               
            
                  —
               
               
                  vandens kokybė bandymų rezervuaruose, pH, kietumas, BOA, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija,
               
            
                  —
               
               
                  detali informacija apie maitinimą (pvz., maisto tipas, šaltinis, sudėtis, bent riebalų ir baltymų kiekis, jei įmanoma, duodamas kiekis ir maitinimo dažnis),
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie žuvų ir vandens bandinių apdorojimą įskaitant ruošimo, laikymo, ekstrahavimo detales ir bandymų medžiagos bei riebalų (jei nustatomi) analizės metodikas (ir preciziškumą).
               
            3.4.   REZULTATAI:
      
                  —
               
               
                  bet kokių atliktų išankstinių tyrimų rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  kontrolinių žuvų ir žuvų kiekvienoje veikimo kameroje mirtingumas bei bet koks jų neįprastas elgesys,
               
            
                  —
               
               
                  riebalų kiekis žuvyje (jei nustatymas daromas bandymo proga),
               
            
                  —
               
               
                  kreivės (įskaitant visus matavimuose gautus duomenis), rodančios bandymų medžiagos sugertį žuvimis ir jų apsivalymą laikas iki nuostoviosios būsenos,
               
            
                  —
               
               
                  Cf ir Cw (ir jų standartinis nuokrypis bei intrevalas, jei tinka) visiems bandinio ėmimo atvejams (Cf išreikšta ug/g viso kūno arba tam tikrų jo audinių, pvz., riebalų, šlapios masės (ppm), o Cw – μg/ml (ppm)). Cw vertės kontrolinėse serijose (taip pat turi būti nurodytas fonas),
               
            
                  —
               
               
                  nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius (BKFNB) ir (arba) kinetinis koncentravimo faktorius (BKFk) ir, jei taikytina, 95 % pasikliovimo ribos sugerties ir apsivalymo (netekimo) greičio konstantoms (viskas apskaičiuota viso gyvūno kūno ir bendro riebalų kiekio, jei nustatytas, arba tam tikrų jo audinių atžvilgiu), pasikliovimo ribos ir standartinis nuokrypis (kai yra) bei apskaičiavimo (duomenų analizės) metodai kiekvienai naudotos bandymo medžiagos koncentracijai,
               
            
                  —
               
               
                  jei naudojamos žymėtuosius atomus turinčios medžiagos ir jei to reikia, gali būti pateikti bet kokių aptiktų metabolitų kaupimosi rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  visa kas bandyme buvo neįprasto, bet koks nukrypimas nuo šių metodikų ir bet kuri kita tinkama informacija,
               
            Mažinkite rezultatų, kurie būtų „nenustatyti aptikimo riboje“, kiekį, kurdami išankstinio bandymo metodus ir vykdydami bandymų planavimą kadangi tokie rezultatai negali būti panaudoti greičio konstantoms apskaičiuoti..
      4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, p. 117-156.
               
            
                  2)
               
               
                  Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, 29-390.
               
            
                  3)
               
               
                  OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No. 3.
               
            
                  4)
               
               
                  Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: Comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
               
            
                  5)
               
               
                  US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.
               
            
                  6)
               
               
                  US FDA, (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.
               
            
                  7)
               
               
                  US EPA (1974). Section 5, A(l) Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.
               
            
                  8)
               
               
                  Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation“ Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, The Netherlands.
               
            
                  9)
               
               
                  Gardner et al, (1995) Limn. & Oceanogr. 30, 1099-1105.
               
            
                  10)
               
               
                  Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431-1436.
               
            
                  11)
               
               
                  CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method-Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm.
               
            
                  12)
               
               
                  ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988) Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
               
            
         1 PRIEDAS
         Skiedimui tinkamo vandens cheminės savybės
         
                      
                  
                  
                     Medžiaga
                  
                  
                     Didžiausia koncentracija
                  
               
                     1
                  
                  
                     Kietosios dalelės
                  
                  
                     5 mg/l
                  
               
                     2
                  
                  
                     Bendroji organinė anglis
                  
                  
                     2 mg/l
                  
               
                     3
                  
                  
                     Nejonizuotas amoniakas
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     4
                  
                  
                     Liekamasis chloras
                  
                  
                     10 μg/l
                  
               
                     5
                  
                  
                     Bendras fosforoorganinių pesticidų kiekis
                  
                  
                     50 ng/l
                  
               
                     6
                  
                  
                     Bendras chlororganinių pesticidų ir polichlorintų difenilų kiekis
                  
                  
                     50 ng/l
                  
               
                     7
                  
                  
                     Bendras organinis chloras
                  
                  
                     25 ng/l
                  
               
                     8
                  
                  
                     Aliuminis
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     9
                  
                  
                     Arsenas
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     10
                  
                  
                     Chromas
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     11
                  
                  
                     Kobaltas
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     12
                  
                  
                     Varis
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     13
                  
                  
                     Geležis
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     14
                  
                  
                     Švinas
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     15
                  
                  
                     Nikelis
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     16
                  
                  
                     Cinkas
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     17
                  
                  
                     Kadmis
                  
                  
                     100 ng/l
                  
               
                     18
                  
                  
                     Gyvsidabris
                  
                  
                     100 ng/l
                  
               
                     19
                  
                  
                     Sidabras
                  
                  
                     100 ng/l
                  
               
      
         2 PRIEDAS
         Bandyti rekomenduotos žuvų rūšys
         
                      
                  
                  
                     Rekomendmatos rūšys
                  
                  
                     Rekomenduotas bandymų temperatūros intervalas (°C)
                  
                  
                     Rekomenduotas bandomojo gyvūno bendras ilgis (cm)
                  
               
                     1
                  
                  
                     
                        Danio rerio
                         (17)
                        (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) Dryžuotasis danio
                  
                  
                     20–25
                  
                  
                     3,0±0,5
                  
               
                     2
                  
                  
                     Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Rainė (Phaxinus phoxinus)
                  
                  
                     20–25
                  
                  
                     5,0±2,0
                  
               
                     3
                  
                  
                     
                        Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) Paprastasis karpis
                  
                  
                     20–25
                  
                  
                     5,0±3,0
                  
               
                     4
                  
                  
                     
                        ORYZIA latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck ir Schlegel) Japūninė medaka, japoninė oryzija
                  
                  
                     20–25
                  
                  
                     4,0±1,0
                  
               
                     5
                  
                  
                     
                        Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciiidae) (Peters) Gupis
                  
                  
                     20–25
                  
                  
                     3,0±1,0
                  
               
                     6
                  
                  
                     
                        Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque) Ilgapelekis saulešeris, melsvažiaunis saulešeris
                  
                  
                     20–25
                  
                  
                     5,0±2,0
                  
               
                     7
                  
                  
                     
                        Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) Margasis upėtakis
                  
                  
                     13–17
                  
                  
                     8,0±4,0
                  
               
                     8
                  
                  
                     Gosterosteus aculeatus (Teleostei, Gusterosteidoe) (Linnaeus) Trispyglė dyglė
                  
                  
                     18–20
                  
                  
                     3,0±1,0
                  
               Skirtingose šalyse buvo naudojamos įvairios upių žiočių ir juros žuvų rūšys, pvz.
         
                     Dryžuotoji kupriukė
                  
                  
                     
                        Leiostomus xanthurus
                     
                  
               
                     Margasis dančiakarpis
                  
                  
                     
                        Cyprinodon variegatus
                     
                  
               
                     Priekrančių menidija
                  
                  
                     
                        Menidia beryllina
                     
                  
               
                     Tuntiniai gyvavedžiai ešeriai
                  
                  
                     
                        Cymatogaster aggregata
                     
                  
               
                     Plekšnė
                  
                  
                     
                        Parophrys vertulus
                     
                  
               
                     Siauragalvė plernė
                  
                  
                     
                        Leptocottus armatus
                     
                  
               
                     Trispyglė dyglė
                  
                  
                     
                        Gasterosteus aculeatus
                     
                  
               
                     Jūros ešerys
                  
                  
                     
                        Dicentracus labrax
                     
                  
               
                     Aukšlė
                  
                  
                     
                        Albumus albumus
                     
                  
               Rinkimas
         Lentelėje nurodytas gėlųjų vandenų žuvis lengva auginti ir (arba) jų galima gauti ištisus metus, tuo tarpu galimybė gauti jūros ir upių žiočių žuvų iš dalies ribota atitinkamomis šalimis. Žuvis galima auginti ir veisti žuvų fermose arba laboratorijoje ligų ir parazitų kontrolės sąlygomis, kad bandomieji gyvūnai būtų sveiki ir būtų žinoma jų kilmė. Šių žuvų yra daugelyje pasaulio kraštų.
      
      
         3 Priedas
         Sugerties ir apsivalymo tarpsnių trukmės prognozavimas
         1.   Sugerties tarpsnio trukmės prognozavimas
         Prieš atliekant bandymą, k2 įvertis, taigi, nuostoviajai būsenai pasiekti reikalingo laiko tam tikra procentinė dalis, gali būti gauta iš empirinių priklausomybių tarp k2 ir n – oktanolio/vandens pasiskirstymo koeficiento (Pow) arba k2 ir tirpumo vandenyje (s).
         k2 (para-1) įvertis gali būti gautas, pvz., pagal tokią empirinę priklausomybę (1):
         
                     log10 k2 = 0,414 log10(Pow) + 1,47 (r2 = 0,95)
                  
                  
                     (1 lygtis)
                  
               Kitos priklausomybės pateiktos 2 nuorodoje.
         Jei pasiskirstymo koeficientas (Pow) nežinomas, įvertis gali būti padarytas (3), jei žinomas medžiagos tirpumas vandenyje (s), taikant lygtį:
         
                     log10(Pow) = 0,862 log10 (s) + 0,710 (r2 = 0,994),
                  
                  
                     (2 lygtis)
                  
               kurioje
         s = tirpumas (mol/l): (n = 36).
         Šios priklausomybės tinka tik toms cheminėms medžiagoms, kurių log (Pow) vertės yra nuo 2 iki 6,5 (4).
         Nuostoviajai būsenai pasiekti reikalingo laiko tam tikra procentinė dalis, taikant k2 įvertį, gali būti nustatyta iš bendrosios kinetinės lygties, aprašančios sugertį ir apsivalymą (pirmojo laipsnio kinetika):
         
            
         arba, jei Cw yra pastovus dydis:
         
                     
                        
                  
                  
                     (3 lygtis)
                  
               Artėjant prie nuostoviosios būsenos (t→ ∞), 3 lygtis gali būti supaprastinta (5) (6) iki:
         
             arba Cf/Cw = k1/k2
             = BCF
         Tokiu atveju, kl/k2 × Cw yra arti koncentracijos žuvyje „nuostoviosios būsenos“ sąlygomis (Cf, s).
         3 lygtis gali būti pertvarkyta į
         
                     
                         arba 
                        
                  
                  
                     (4 lygtis)
                  
               Taikant 4 lygtį, galima prognozuoti laiką, reikalingą pasiekti tam tikrą nuostoviosios būsenos procentinę dalį, kai pagal 1 arba 2 lygtį iš anksto yra įvertinta k2.
         Statistiškai priimtiniems duomenims (BKFK) gauti statistiškai optimalios sugerties tarpsnio trukmės atskaitos tašku laikomas laikas, per kurį kreivė, vaizduojanti priklausomybę tarp bandymų medžiagos žuvyje koncentracijos logaritmo ir tiesinėje skalėje atidėto laiko, pasiektų jos vidurio tašką arba 1,6/k2, arba 80 % nuostoviosios būsenos, tačiau ne didesnis kaip 3,0/k2, arba 95 % nuostoviosios būsenos (7).
         Laikas 80 % nuostoviosios būsenos pasiekti yra lygus (4 lygtis):
         
                     
                         arba 
                        
                  
                  
                     (5 lygtis)
                  
               Panašiu budu, laikas 95 % nuostoviosios būsenos pasiekti yra lygus:
         
                     
                        
                  
                  
                     (6 lygtis)
                  
               Pvz., sugerties tarpsnio trukmė (sug) bandymų medžiagai, kurios log10 (Pow) = 4, būtų (taikant lygtis 1, 5 ir 6):
         
                     log10 k2 = -0,414.(4) + 1,47
                  
                  
                     k2 = 0,652 paros–1
                     
                  
               sug (80 %) = 1,6/0,652, t.y 2,45 paros (59 valandos)
         arba sug (95 %) = 3,0/0,652, t.y 4,60 paros (110 valandų)
         Panašiai, jei bandymų medžiagos s = 10-5 mol/l (log(s) = -5,0), sug trukmė būtų (taikant lygtis 1,2, 5 ir 6):
         log10 (Pow) = -0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02
         log10 k2 =-0,414 (5,02) + 1,47
         k2 =0,246 paros–1
         
         sug (80 %) = 1,6/0,246, t.y. 6,5 paros (156 valandos)
         arba sug (95 %) = 3,0/0,246, t.y. 12,2 paros (293 valandos)
         Kaip alternatyva, lygtis:
         Teq = 6,54 x 10-3 Pow + 55,31 (valandos)
         gali būti naudojama apskaičiuoti laiką, reikalingą tikrajai nuostoviajai būsenai pasiekti (4).
         2.   Apsivalymo tarpsnio trukmės prognozavimas
         Laikas, per kurį organizme sulaikytos medžiagos kiekis sumažėja iki tam tikros pradinės koncentracijos procentinės dalies, taip pat gali būti prognozuojamas, taikant bendrąja lygtį, kuri aprašo sugertį ir apsivalymą (pirmojo laipsnio kinetika) (1) (8).
         Apsivalymo tarpsnio atveju daroma prielaida, kad Cw lygi nuliui. Lygtis gali būti redukuota į lygtį:
         
             arba 
         kurioje Cf,
             o yra koncentracija apsivalymo tarpsnio pradžioje. Tuomet 50 % apsivalymas bus pasiektas per laiką (t50):
         
             arba 
         Panašiai, 95 % apsivalymas bus pasiektas per laiką:
         
            
         Jei pirmajam periodui naudojama sugerties trukmė sudaro 80 % (1,6/k2), o apsivalymo tarpsnyje sumažėjimas sudaro 95 % (3,0/k2), tuomet apsivalymo tarpsnis trunka maždaug du kartus ilgiau nei sugerties tarpsnis.
         Tačiau svarbu pažymėti, kad įverčiai remiasi prielaida, kad sugerties ir apsivalymo modeliai atitinka pirmojo laipsnio kinetiką. Jei pirmojo laipsnio kinetikos akivaizdžiai neklausoma, turi būti naudojami sudėtingesni modeliai (pvz., (1) nuoroda).
         Nuorodos (3 priedo)
         
         
                     1)
                  
                  
                     Spacie A. and Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, p. 309–320.
                  
               
                     2)
                  
                  
                     Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.
                  
               
                     3)
                  
                  
                     Chiou C. T. and Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4-10.
                  
               
                     4)
                  
                  
                     Hawker D. W. and Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentralion kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701–707.
                  
               
                     5)
                  
                  
                     Branson D. R, Blau G. E, Alexander H. C. and Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785-792.
                  
               
                     6)
                  
                  
                     Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte P., Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4.4, pp. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley &amp; Sons Ltd N. Y.
                  
               
                     7)
                  
                  
                     Reilly P. M, Bajramovic R., Blau G. E., Branson D. R. and Sauerhotf M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55. pp. 614-622.
                  
               
                     8)
                  
                  
                     Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, p. 3–19.
                  
               
      
         4 Priedas
         Bandinių ėmimo tiriant medžiagų, kurių log Pow = 4, Biologinį koncentravimą grafiko teorinis pavyzdys
         
                     Žuvų bandinių ėmimas
                  
                  
                     Bandinių ėmimo tvarkarštis
                  
                  
                     Vandens bandinių skaičius
                  
                  
                     Žuvų skaičius bandinyje
                  
               
                     Mažiausias reikalingas dažnis (paros)
                  
                  
                     Papīldomas bandinių ėmimas
                  
               
                     Sugerties tarpsnis
                  
                  
                     -1
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                     2 (18)
                     
                     2
                  
                  
                     Pridėti 45-80 žuvų
                  
               
                     1-asis
                  
                  
                     0,3
                  
                  
                     0,4
                  
                  
                     2
                     (2)
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     2-asis
                  
                  
                     0,6
                  
                  
                     0,9
                  
                  
                     2
                     (2)
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     3-asis
                  
                  
                     1,2
                  
                  
                     1,7
                  
                  
                     2
                     (2)
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     4-asis
                  
                  
                     2,4
                  
                  
                     3,3
                  
                  
                     2
                     (2)
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     5-asis
                  
                  
                     4,7
                  
                  
                      
                  
                  
                     2
                  
                  
                     6
                  
               
                     Apsivaly mo tarpsnis
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Pernešti žuvis į vandenį be bandymo medžiagos
                  
               
                     6-asis
                  
                  
                     5,0
                  
                  
                     5,3
                  
                  
                      
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     7-asis
                  
                  
                     5,9
                  
                  
                     7,0
                  
                  
                      
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     8-asis
                  
                  
                     9,3
                  
                  
                     11,2
                  
                  
                      
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     9-asis
                  
                  
                     14,0
                  
                  
                     17,5
                  
                  
                      
                  
                  
                     6
                     (4)
                  
               
                     
                                 
                                    NB
                                 
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 Prieš bandymą darytas k2 įvertis, kai log (Pow) = 4,0, yra 0,652 paros-1. Bendra bandymo trukmė nustatyta 3 × sug = 3 × 4,6 paros, t. y. 14 parų. Kaip vertinti „sug“ , žr. 3 papildymą.
                              
                           Vertės skliausteliuose rodo bandinių (vandens, žuvų) skaičių, kurį reikia paimti, jei daromas papildomas bandinių ėmimas.
                  
               
      
         5 Priedėlis
         Modelio pasirinkimas
         Buvo padaryta prielaida, kad biologinio koncentravimo duomenys „pakankamai“ gerai aprašomi paprasto dviejų kamerų ir dviejų parametrų modelio, ką rodo ištiesinta kreivė, aproksimuojanti koncentracijos žuvyje apsivalymo tarpsnio metu taškus, kai jie vaizduojami pusiau logaritminiame popieriuje. (Jei šie taškai negali būti aprašyti ištiesinta kreive, tuomet reikia naudoti sudėtingesnius modelius, žr. pvz., Spacie and Hamelink, 3 papildymo 1 nuoroda).
         Grafinis metodas apsivalymo (netekimo) greičio konstantai k2 nustatyti
         Pusiau logaritminiame popieriuje nubraižykite kiekviename žuvies bandinyje rastos bandymo medžiagos koncentracijos kitimo laike grafiką. Šios tiesės krypties koeficientas yra k2.
         
            
         
            
         Atkreipkite dėmesį, kad nukrypimai nuo tiesės gali reikšti, kad apsivalymo modelis yra sudėtingesnis, nei pirmojo laipsnio kinetika. Norint spręsti apie tai, ar apsivalymo tipas nukrypsta nuo pirmojo laipsnio kinetikos, galima taikyti grafinį metodą.
         Grafinis metodas sugerties greičio konstantai k1nustatyti
         Duotai k2 vertei k1 apskaičiuokite taip:
         
                     
                        
                  
                  
                     (1 lygtis)
                  
               Kompiuteriniai metodai sugerties ir apsivalymo (netekimo) greičio konstantoms apskaičiuoti
         Geriausia priemonė biologinio koncentravimo faktoriui ir k1 bei k2 greičio konstantoms apskaičiuoti yra netiesinių parametrų vertinimo metodų taikymas panaudojant kompiuterį. Jei duota koncentracijos kitimo laike duomenų aibė ir modelis, šios programos apskaičiuoja k1 ir k2 vertes:
         
                     
                         0 < t < tc
                  
                  
                     (2 lygtis)
                  
               
                     
                         t > tc
                  
                  
                     (3 lygtis)
                  
               čia: tc = sugerties tarpsnio pabaigos laikas.
         Šis metodas duoda k1 ir k2 standartinio nuokrypio įverčius.
         Kadangi k2 didesnei daliai atvejų pagal apsivalymo kreivę gali būti įvertinta palyginus labai tiksliai ir kadangi tarp dviejų parametrų k1 ir k2, jei juos vertinti vienu metu, yra stipri koreliacija, galima būtų patarti iš pradžių tik pagal apsivalymo duomenis apskaičiuoti k2, o vėliau pagal sugerties duomenis, taikant netiesinę regresiją apskaičiuoti k1.
      
      C.14.   ŽUVŲ MAILIAUS AUGIMO BANDYMAS
      1.   METODAS
      Šis toksiškumo augimui bandymo metodas yra OECD TG 215 (2000) kopija.
      1.1.   ĮVADAS
      Šis bandymas skirtas įvertinti cheminių medžiagų ilgo veikimo poveikius žuvų mailiaus augimui. Jis pagrįstas Europos Sąjungoje sukurtu ir tarplaboratoriniais bandymais patikrintu (1) (3) dinaminiu metodu, taikytu įvertinti cheminių medžiagų poveikius vaivorykštinio upėtakio (Oncorynchus mykiss) mailiaus augimui. Galima naudoti kitas dokumentais tinkamai patvirtintas rūšis. Pvz., įgyta patyrimo darant dryžuotojo danio {Danio rerio)
          (19) (3) (4) ir ricefish (medaka, Oryzias latipes) (5) (6) (7) augimo bandymus.
      Žr. taip pat C dalies bendrąjį įvadą.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI
      
         Mažiausia stebimo poveikio koncentracija LOEC – mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis yra statistiškai reikšmingas lyginant su kontroliniais bandiniais (p < 0,05). Tačiau visų didesnių kaip LOEC bandomųjų koncentracijų kenksmingas poveikis turi būti lygus ar didesnis už LOEC poveikis.
      
         Nestebimo poveikio koncentracija NOEC – bent kiek už LOEC mažesnė bandomoji koncentracija.
      
         EC
         
            X
          – šiam bandymui tai bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant žuvų augimo greičio pokytis lyginant su kontroliniais bandiniais yra x %.
      
         Įkrova – gyvų žuvų masė, tenkanti vandens tūrio vienetui.
      
         Žuvų tankis – žuvų skaičius, tenkantis vandens tūrio vienetui.
      
         Atskiros žuvies savitasis augimo greitis – išreiškia atskiros žuvies augimo greitį pagal jos pradinę masę.
      
         Vidutinis savitasis augimo greitis rezervuarui – išreiškia rezervuaro populiacijos vidutinį augimo greitį vienai koncentracijai.
      
         „Pseudo“ savitasis augimo greitis – išreiškia atskirų žuvų augimo greitį lyginant su rezervuaro populiacijos vidutine pradine mase.
      1.3.   BANDYMO METODO ESMĖ
      Eksponentinio augimo tarpsnio žuvų mailius pasveriamas, dedamas į bandymo kameras, kur jis geriau dinaminio bandymo sąlygomis ar, jei neįmanoma, atitinkamomis pusiau statinio bandymo (periodinio atnaujinimo) sąlygomis yra veikiamas bandomosios medžiagos subletalios koncentracijos diapazono vandeniniais tirpalais. Bandymo trukmė 28 paros. Žuvys maitinamos kasdien. Maisto norma nustatoma pagal pradinę žuvų masę ir po 14 parų gali būti apskaičiuojama iš naujo. Bandymo pabaigoje žuvys vėl sveriamos. Taikant regresijos modelį analizuojamas poveikis augimo greičiui norint nustatyti koncentraciją sukeliančią x % augimo greičio pokytį, t y. ECX (pvz., EC10, EC20 ar EC30). Be to, mažiausiai stebimo poveikio koncentracijai (LOEC), taigi ir nestebimo poveikio koncentracijai (NOEC) nustatyti duomenis galima lyginti su kontrolinių bandinių vertėmis.
      1.4.   INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ
      Reikėtų turėti ūmaus toksiškumo bandymo (žr. C.1 bandymo metodą), geriau daryto su šiam bandymui pasirinkta rūšimi, rezultatus. Tai reikštų, kad yra žinomas bandomosios medžiagos tirpumas vandenyje ir garų slėgis ir kad yra patikimas metodas ištirpintai bandomajai medžiagai kiekybiškai nustatyti žinomu tikslumu ir aptikimo riba, kurie nurodomi ataskaitoje.
      Naudingą informaciją sudaro struktūrinė formulė, medžiagos grynumas, stabilumas vandenyje ir veikiant šviesai, pKa, Pow ir lengvo biologinio skaidomumo bandymo rezultatai (žr. C.4 metodą).
      1.5.   BANDYMO VALIDUMAS
      Bandymas yra validus, jei galioja šios sąlygos:
      
                  —
               
               
                  baigiant bandymą kontrolinio (-ių) bandinio (ių) žuvų gaištamumas turi būti ne didesnis kaip 10 %;
               
            
                  —
               
               
                  kontrolinio (-ių) bandinio (-ių) vidutinė žuvų masė turi būti pakankamai padidėjusi, kad būtų galima aptikti mažiausią augimo greičio kitimą kuris dar laikomas reikšmingu. Tarplaboratorinio lyginimo bandymas (3) parodė, kad kontrolinių bandinių vaivorykštinio upėtakio vidutinė masė per 28 paras turi padidėti bent pusę jo pradinės vidutinės masės (t. y. 50 %); pvz., pradinė masė: 1 g/žuviai (= 100 %), galutinė masė po 28 parų: ≥ 1,5 g/žuviai (≥ 150 %);
               
            
                  —
               
               
                  ištirpusio deguonies koncentracija per visą bandymą turi sudaryti bent 60 % soties ore vertės (ASV);
               
            
                  —
               
               
                  kiekvienu bandymo momentu bandymo kamerų vandens temperatūra turi nesiskirti daugiau kaip ± 1 oC ir būti palaikoma 2 oC intervale bandymo rūšims nurodytame diapazone (1 priedėlis).
               
            1.6.   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Aparatūra
      Įprasta laboratorinė įranga ir ši speciali įranga:
      
                  —
               
               
                  deguonies ir pH matuokliai,
               
            
                  —
               
               
                  įranga vandens kietumui ir šarmingumui nustatyti,
               
            
                  —
               
               
                  atitinkama aparatūra temperatūrai kontroliuoti, geriau nuolatinės kontrolės aparatūra,
               
            
                  —
               
               
                  rezervuarai, pagaminti iš chemiškai inertiškos medžiagos ir rekomenduotą įkrovą bei žuvų tankį atitinkančios talpos (žr. 1.8.5 skirsnį ir 1 priedėlį),
               
            
                  —
               
               
                  reikiamo tikslumo svarstyklės (t. y. ±0,5 % tikslumo).
               
            1.6.2.   Vanduo
      Galima naudoti bet kokį vandenį, kuriame žuvys gali ilgai gyventi ir augti. Vandens kokybė turi būti pastovi visą bandymo laiką. pH vertė turi būti 6,5-8,5, tačiau darant konkretų bandymą pH reikšmė neturi kisti daugiau kaip ±0,5 pH vieneto. Rekomenduojamas didesnis kaip 140 mg/l (skaičiuojant CaCO3) kietumas. Norint užtikrinti, kad skiedimo vanduo per daug neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pvz., nesudarytų kompleksinių junginių su bandomąja medžiaga), bandiniai tam tikrais laiko tarpais turi būti analizuojami. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca, Mg, Na, K, C1, S04), pesticidų (pvz., fosforo organinių ir chloro organinių pesticidų bendro kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti daroma, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė yra gana pastovi. Jei buvo įrodyta, kad vandens kokybė yra pastovi bent metus, analizė gali būti daroma ne taip dažnai, o intervalai padidinti (pvz., kas šešis mėnesius). Kai kurios skiedimui tinkamo vandens charakteristikos yra pateiktos 2 priedėlyje.
      1.6.3.   Bandomieji tirpalai
      Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą.
      Pradinį tirpalą geriau ruošti bandomąją medžiagą maišant ar plakant skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ar ultragarsu). Pakankamai koncentruotam pradiniam tirpalui ruošti galima naudoti prisotinimo kolonėles (tirpumo kolonėles).
      Kartais norint gauti tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą gali tekti naudoti organinius tirpiklius ar dispergatorius. Tinkami tirpikliai yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilsulfoksidas, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Tinkami dispergatoriai yra Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metilceliuliozė ir HCO-40. Reikėtų atsargiai naudoti lengvai biologiškai suardomas medžiagas (pvz., acetoną) ir (ar) labai lakius junginius, nes, darant dinaminius bandymus, jie gali kelti problemų dėl bakterijų kaupimosi. Naudojama soliubilizavimo medžiaga neturi daryti reikšmingo poveikio žuvų augimui ir neigiamo poveikio mailiui, kaip kad nustatoma darant kontrolinį bandymą vien tik su tirpikliu.
      Bandomosios koncentracijos tirpalams į bandymo kameras tiekti dinaminių bandymų metu reikalinga sistema, kuri nepertraukiamai dozuotų ir skiestų bandomosios medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozavimo siurblys, proporcingasis skiestuvas, prisotinimo sistema). Pradinių tirpalų ir skiedimo vandens srautai turi būti kartais, geriau kasdien, tikrinami ir per visą bandymą neturėtų kisti daugiau kaip 10 %. Tarplaboratorinio palyginimo bandymas (3) parodė, kad, darant bandymą su vaivorykštiniu upėtakiu, yra priimtinas 6 litrų/g žuvies/parai vandens keitimo dažnis (žr. 1.8.2.2 skirsnį).
      Pusiau statiniams (atnaujinimo) bandymams terpės atnaujinimo dažnis priklausys nuo bandomosios medžiagos stabilumo, tačiau vandenį atnaujinti rekomenduojama kasdien. Jei pradiniai stabilumo bandymai (žr. 1.4 skirsnį) rodo, kad bandomosios medžiagos koncentracija laikotarpiu tarp atnaujinimų yra nestabili (t. y. yra už 80–120 % vardinės koncentracijos ribų ar mažesnė kaip 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), reikėtų numatyti dinaminį bandymą.
      1.6.4.   Rūšių parinkimas
      Šiam bandymui rekomenduojama rūšis yra vaivorykštinis upėtakis (Oncorhynchus mykiss), nes didžiausias tarplaboratorinio palyginimo bandymų patyrimas buvo sukauptas naudojant šią rūšį (1) (3). Galima naudoti ir kitas dokumentais tinkamai patvirtintas rūšis, bet tinkamoms bandymo sąlygoms gauti bandymo metodiką gali tekti pritaikyti. Pvz., įgyta patyrimo su dryžuotuoju danio (Danio rerio) (3) (4) ir ricefish (medaka, Oryzias latipes) (5) (6) (7). Tokiu atveju ataskaitoje reikia pateikti rūšies pasirinkimo priežastį ir bandymų metodą.
      1.6.5.   Žuvų laikymas
      Pasirenkamos vieno štamo populiacijos ir geriau to paties neršto bandymo žuvys, kurios prieš bandymą bent dvi savaites buvo laikomos tokios kokybės vandenyje ir tokiomis apšvietimo sąlygomis, kurios panašios į bandymo sąlygas. Jų dienos maisto davinys laikymo ir bandymo laikotarpiu turi sudaryti ne mažiau kaip 2 % kūno masės, bet geriau 4 % kūno masės.
      Po 48 valandų stabilizavimo laikotarpio užrašomi gaištamumo duomenys ir taikomi šie kriterijai:
      
                  —
               
               
                  populiacijos gaištamumas per septynias paras yra didesnis kaip 10 %: visa partija atmetama,
               
            
                  —
               
               
                  populiacijos gaištamumas 5-10 %: žuvys papildomai aklimatizuojamos dar septynias paras; jei per kitas septynias paras gaištamumas yra didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama,
               
            
                  —
               
               
                  populiacijos gaištamumas per septyniais paras yra mažesnis kaip 5 %: partija priimama.
               
            Dvi savaites prieš bandymą ir visą bandymo laiką žuvys neturėtų būti gydomos vaistais.
      1.7.   BANDYMO PLANAS
      „Bandymo planas“ bandomosios koncentracijos verčių ir tarpo tarp jų pasirinkimas, rezervuarų skaičiaus kiekvienai koncentracijai ir žuvų skaičiaus viename rezervuare parinkimas. Geriausia būtų, kad bandymo planas būtų pasirinktas atsižvelgiant į:
      
                  —
               
               
                  tyrimo tikslą
               
            
                  —
               
               
                  taikomą statistinės analizės metodą;
               
            
                  —
               
               
                  bandymų išteklių buvimą ir kainą.
               
            Jei įmanoma, išdėstant tikslą reikėtų nurodyti statistinę galią duoto dydžio (pvz., augimo greičio) skirtumui aptikti, arba kitaip, koks turi būti ECX (pvz., kai x = 10, 20 ar 30 ir geriau ne mažesnis kaip 10) įvertinimo preciziškumas. Be šito negalima tiksliai apibrėžti tyrimo apimties.
      Svarbu pripažinti, kad vienam statistinės analizės metodui taikytas optimalus (geriausiai panaudoja išteklius) planas nebūtinai yra optimalus kitam metodui. Taigi rekomenduotas planas LOEC/NOEC įvertinti nebus toks pat kaip regresinei analizei rekomenduotas planas.
      Dėl Stephan ir Rogers (9) svarstytų priežasčių regresinė analizė dažniausiai tinka geriau nei dispersinė analizė. Tačiau nerandant tinkamo regresijos modelio (r2 < 0,9), reikia taikyti NOEC/LOEC įvertinimą.
      1.7.1.   Regresinės analizės planas
      Svarbūs regresijos metodu analizuojamo bandymo plano nagrinėtini klausimai yra šie:
      
                  —
               
               
                  Bandymui naudotos koncentracijos būtinai turi aprėpti poveikio koncentraciją (pvz., EC10, 20, 30) ir dominančio medžiagos poveikio koncentracijos verčių diapazoną. Poveikio koncentracijos įverčių preciziškumas bus geriausias, kai poveikio koncentracijos bus per bandomųjų koncentracijos verčių diapazono vidurį. Tinkamoms bandomosioms koncentracijoms parinkti gali būti naudingas išankstinis diapazono nustatymo bandymas.
               
            
                  —
               
               
                  Norint turėti patenkinamą statistinį modelį, bandymui turi būti naudojamas vienas kontrolinis rezervuaras ir penki papildomi rezervuarai, skirti skirtingoms koncentracijos vertėms. Jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, be bandomosios serijos, turi būti dar vienas kontrolinis bandinys su didžiausios bandomosios koncentracijos soliubilizavimo medžiaga (žr. 1.8.3 ir 1.8.4 skirsnius).
               
            
                  —
               
               
                  Galima naudoti tinkamą geometrinės progresijos ar logaritminę eilutę (9) (žr. 3 priedėlį). Geriau naudoti logaritminę bandomųjų koncentracijų eilutę.
               
            
                  —
               
               
                  Jei yra daugiau kaip šeši rezervuarai, papildomi rezervuarai turi būti panaudoti lygiagretiems bandymams arba paskirstyti visam koncentracijos verčių diapazonui tarpams tarp jų sumažinti. Abi šios priemonės vienodai tinka.
               
            1.7.2.   NOEC/LOEC įvertinimo planas taikant dispersing analizę
      Kiekvienai koncentracijos vertei geriau būtų turėti dar vieną rezervuarą ir statistinė analizė turėtų būti daroma rezervuaro lygiu (11). Jei nėra rezervuarų lygiagrečiam bandymui, neįmanoma atsižvelgti į kintamumą tarp rezervuarų be to kintamumo, kuris atsiranda dėl atskirų žuvų. Tačiau patyrimas parodė (12), kad tiriamu atveju kintamumas tarp rezervuarų buvo labai mažas lyginant su kintamumu viename rezervuare (t. y. tarp žuvų). Taigi santykinai priimtina alternatyva yra statistinę analizę daryti kiekvienos žuvies lygiu.
      Paprastai naudojamos bent penkios koncentracijos vertės, sudarančios eilutę pagal geometrinę progresiją kurios koeficientas geriausiai turėtų būti ne didesnis kaip 3,2.
      Kai bandymai daromi turint rezervuarus lygiagretiems bandymams, lygiagrečių kontrolinių rezervuarų skaičius, taigi ir žuvų skaičius, turi būti dvigubai didesnis negu kiekvienai bandomajai koncentracijai pasirinktas skaičius, kuris turi būti vienodas (12) (13) (14). Kita vertus, jei rezervuarų lygiagretiems bandymams nėra, kontrolinės grupės žuvų skaičius turi būti lygus kiekvienai bandomajai koncentracijai naudojamam žuvų skaičiui.
      Jei dispersinė analizė (ANOVA) turi būti daroma rezervuarų lygiu, o ne kiekvienos žuvies lygiu (tam reikėtų kiekvieną žuvį paženklinti ar naudoti „pseudo“ savituosius augimo greičius (žr. 2.1.2 skirsnį)), reikia turėti pakankamą rezervuarų lygiagretiems bandymams skaičių, kad būtų galima nustatyti standartinį nuokrypį tarp „vienos koncentracijos rezervuarų“. Vadinasi, dispersinės analizės paklaidai reikėtų turėti bent 5 laisvės laipsnius (10). Jei daromi tik lygiagretūs kontroliniai bandymai, esama pavojaus, kad paklaidos kintamumas bus pasislinkęs, nes paklaida gali didėti didėjant tiriamo augimo greičio vidutinei vertei. Kadangi augimo greitis koncentracijai didėjant greičiausiai mažės, atsiranda tendencija per daug sureikšminti kintamumą.
      1.8.   DARBO EIGA
      1.8.1.   Bandymų žuvų atranka ir svėrimas
      Svarbu, kad žuvų masės skirtumas bandymo pradžioje būtų kuo mažesnis. Bandymams rekomenduotų skirtingų rūšių žuvų masės tinkami diapazonai yra pateikti 1 priedėlyje. Būtų geriausia, kad bandymo pradžioje visos partijos žuvų masės kitimo diapazonas būtų lygus žuvų masės aritmetiniam vidurkiui ± 10 % ir jokiu būdu nebūtų didesnis kaip 25 %. Vidutinei masei nustatyti rekomenduojama prieš bandymą pasverti žuvų ėminio dalį.
      Žuvys turi būti nustojamos maitinti prieš 24 h iki bandymo pradžios. Toliau jos turi būti atsitiktinai atrenkamos. Vartojant bendrąjį anestetiką (pvz., vandeninį 100 mg/l (3-aminobenzenkarboninės rūgšties etilesterio metansulfonato (MS 222) tirpalą neutralizuotą sumaišant dvi dalis natrio hidrokarbonato ir vieną dalį MS 222), žuvys turi būti atskirai pasveriamos gyvų žuvų (sausai nušluostytų filtro popieriumi) masei nustatyti 1 priedėlyje nurodytu tikslumu. Tos žuvys, kurių masė atitinka numatytą diapazoną paliekamos ir vėliau paskirstomos tarp bandymų indų. Turi būti registruojama bendra kiekvieno bandymų indo gyvų žuvų masė. Anestetiko vartojimas, taip pat apdorojimas (įskaitant šluostymą ir svėrimą) žuvų mailiui gali sukelti įtampą ir jį galima sužeisti, ypač jei tai mažų žuvų rūšys. Taigi apdoroti mailių reikia ypač atsargiai ir vengti bandymų gyvūnų įtampos ir sužeidimų.
      Žuvys vėl sveriamos 28 bandymo parą (žr. 1.8.6 skirsnį). Tačiau, jei manoma, kad būtina perskaičiuoti maisto davinį, žuvys gali būti sveriamos 14 bandymo parą (žr. 1.8.2.3 skirsnį). Galima taikyti kitus metodus, pvz., fotografavimą norint nustatyti žuvų dydžio pokytį, pagal kurį būtų galima reguliuoti maisto davinį.
      1.8.2.   Veikimo sąlygos
      1.8.2.1.   Trukmė
      Bandymo trukmė ≥28 paros.
      1.8.2.2.   Įkrova ir žuvų tankis
      Svarbu, kad įkrova ir žuvų tankis atitiktų naudotas žuvų rūšis (žr. 1 priedėlį). Jei žuvų tankis per didelis, dėl perpildymo sukeltos įtampos mažėja augimo greitis ir žuvys gali susirgti. Jei žuvų tankis per mažas, gali atsirasti teritorinis elgesys, kuris irgi gali veikti augimą. Bet kuriuo atveju įkrova turi būti gana maža, kad be aeravimo būtų palaikoma bent 60 % ASV ištirpusio deguonies koncentracija. Tarplaboratorinis bandymas (3) parodė, kad vaivorykštiniam upėtakiui priimtina įkrova, jei 40 1 tūrio vandenyje būtų 16 upėtakių po 3–5 g masės. Rekomenduojamas vandens keitimo darant bandymą dažnis yra 6 litrai/g žuvies/parai.
      1.8.2.3.   Maitinimas
      Žuvys turi būti šeriamos atitinkamu maistu (1 priedėlis) ir pakankamai dažnai, kad būtų garantuotas priimtinas augimo greitis. Reikėtų stengtis išvengti mikrobų dauginimosi ir vandens drumstumo. Vaivorykštiniam upėtakiui 4 % kūno masės davinys per parą turėtų atitikti šias sąlygas (3) (16) (17) (18). Paros davinys turi būti padalytas į dvi lygias dalis ir sušeriamas žuvims per du kartus darant bent penkių valandų pertrauką. Davinys grindžiamas kiekvieno bandymų indo bendra pradine žuvų mase. Jei žuvys vėl sveriamos 14 parą, davinys perskaičiuojamas. Prieš sveriant žuvys turi būti nemaitintos 24 h.
      Nesuėstas maistas ir išmatos iš bandymų indų turi būti šalinami kasdien rūpestingai išsiurbiant kiekvieno rezervuaro dugną.
      1.8.2.4.   Šviesa ir temperatūra
      Apšvietimo laikotarpis ir vandens temperatūra turi atitikti žuvų rūšį (1 priedėlis).
      1.8.3.   Bandomosios medžiagos koncentracijos
      Paprastai reikia naudoti penkias bandomosios medžiagos koncentracijas neatsižvelgiant į bandymo planą (žr. 1.7.2 skirsnį). Ankstesnės žinios apie bandomosios medžiagos toksiškumą (pvz., ūmaus toksiškumo bandymo ir (ar) koncentracijų diapazono nustatymo tyrimo duomenys) turėtų padėti renkantis tinkamas bandomąsias koncentracijas. Sprendimą naudoti mažiau kaip penkias koncentracijas reikia pagrįsti. Didžiausia išbandyta koncentracija neturėtų būti didesnė kaip medžiagos tirpumo vandenyje ribinė koncentracija.
      Jei pradinio tirpalo ruošimui lengvinti naudojama soliubilizavimo medžiaga, jos galutinė koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1 ml/l, ir geriau būtų, jei ji visuose bandymų induose būtų vienoda (žr. 1.6.3 skirsnį). Tačiau reikėtų kiek įmanoma stengtis vengti šias medžiagas naudoti.
      1.8.4.   Kontroliniai bandiniai
      Skiedimo vandens kontrolinių bandinių skaičius priklauso nuo bandymo plano (žr. 1.7-1.7.2 skirsnius). Jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, į bandymo planą turi būti įtrauktas toks soliubilizavimo medžiagos kontrolinių bandinių skaičius, kiek yra skiedimo vandens kontrolinių bandinių.
      1.8.5.   Kiekybinių analizių ir matavimų dažnis
      Darant bandymą bandomosios medžiagos koncentracijų vertės nustatomos reguliariais tarpais (žr. toliau).
      Darant dinaminius bandymus, skiediklio ir toksiškos medžiagos pradinio tirpalo srautai turi būti tikrinami tam tikrais laiko tarpais, geriau kasdien, ir visą bandymą neturi kisti daugiau kaip 10 %. Jei tikimasi, kad bandomosios medžiagos koncentracijos vertės bus lygios vardinei koncentracijai ± 20 % (t. y. 80-120 % diapazonu; žr. 1.6.2 ir 1.6.3 skirsnius), rekomenduojama bent didžiausią ir mažiausią bandomąją koncentraciją nustatyti bandymo pradžioje, o vėliau kas savaitę. Jei darant bandymus nesitikima, kad bandomosios medžiagos koncentracija gali likti vardinės koncentracijos ± 20 % vertės (pagal bandomosios medžiagos stabilumo duomenis), būtina nustatyti visas bandomąsias koncentracijas, bet pagal tą patį grafiką.
      Jei tikimasi, kad, darant pusiau statinius (atnaujinimo) bandymus, bandomosios medžiagos koncentracija liks vardinės koncentracijos ± 20 % vertės, rekomenduojama nustatyti bent didžiausią ir mažiausią bandomąją koncentraciją iš karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jo atnaujinimą tyrimo pradžioje ir kas savaitę vėliau. Jei tai bandymai, kuriuos darant nemanoma, kad koncentracija liks vardinės koncentracijos ± 20 % vertės, turi būti nustatomos visos koncentracijos vertės laikantis to paties kaip ir stabilioms medžiagoms analizės režimo.
      Rekomenduojama rezultatus pagrįsti išmatuotomis koncentracijos vertėmis. Tačiau jei yra įrodymų, leidžiančių parodyti, kad bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką buvo patenkinamai palaikoma vardinės koncentracijos ± 20 % vertės ar išmatuotos pradinės koncentracijos vertės, rezultatai gali būti grindžiami vardine ar išmatuota vertėmis.
      Bandinius gali tekti filtruoti (pvz., pro 0,45 μm akytumo filtrą) ar centrifuguoti. Rekomenduojama metodika būtų centrifugavimas. Tačiau, jei filtras bandomosios medžiagos neabsorbuoja, priimtinas būtų ir filtravimas.
      Darant bandymą visuose bandymų induose turi būti matuojama ištirpusio deguonies koncentracija, pH ir temperatūra. Turi būti matuojamas kontrolinių bandinių ir indo su didžiausios koncentracijos bandiniu bendras kietumas, šarmingumas ir sūrumas (jei tinka). Mažiausiai ištirpusio deguonies koncentracija ir sūrumas (jei tinka) turi būti matuojami tris kartus (bandymo pradžioje, viduryje ir pabaigoje). Darant pusiau statinius bandymus, ištirpusio deguonies koncentraciją rekomenduojama matuoti dažniau, geriau prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo ar bent kartą per savaitę. Darant statinius bandymus su atnaujinimu pH vertė turi būti matuojama prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, o darant dinaminius bandymus – bent kartą per savaitę. Vandens kietumas ir šarmingumas kiekvienam bandymui matuojami vieną kartą. Temperatūrą bent viename bandymų inde geriau kontroliuoti nuolatos.
      1.8.6.   Stebėjimai
      Masė: baigiant bandymą visos gyvos žuvys turi būti pasvertos gyvų žuvų (sausai nušluostytų filtro popieriumi) masei nustatyti grupėmis pagal bandymų indus ar atskirai kiekvienos žuvies. Labiau tinka svėrimas bandymų induose, nes, sveriant kiekvieną žuvį, jas reikėtų atskirai ženklinti. Nustatant atskirų žuvų masę kiekvienos žuvies savitajam augimo greičiui nustatyti, pasirinktoji ženklinimo metodika gyvūnams neturi kelti įtampos (gali tikti žuvų ženklinimo užšaldant alternatyvos, pvz., plonas spalvotas valas).
      Žuvys visą bandymo laiką turi būti tiriamos kasdien ir bet kokios išorės anomalijos (pvz., kraujavimas, spalvos pakeitimas) bei neįprastas elgesys turi būti pažymėti. Turi būti registruojami visi gaištamumo atvejai, o negyvos žuvys kuo greičiau pašalinamos. Jei įkrova ir žuvų tankis yra pakankami, negyvos žuvys kitomis nekeičiamos, kad būtų išvengta poveikio augimui dėl vienam rezervuarui tenkančio žuvų skaičiaus kitimo. Tačiau maitinimo normą reikia koreguoti.
      2.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      2.1.   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Rekomenduojama, kad, rengiant bandymo planą ir jį analizuojant, dalyvautų statistikas, nes šis bandymo metodas leidžia smarkiai keisti eksperimento planą, pvz., bandymo kamerų skaičių, bandomųjų koncentracijų skaičių, žuvų skaičių ir t. t. Atsižvelgiant į bandymo plano variantų įvairovę, jokių specialių nurodymų dėl statistinės metodikos čia nepateikiama.
      Augimo greitis neturėtų būti apskaičiuojamas bandymų indams, jei gaištamumas juose didesnis kaip 10 %. Tačiau gaištamumas turi būti nurodytas visoms bandomosioms koncentracijoms.
      Nesvarbu, koks metodas taikomas duomenims analizuoti, svarbiausia sąvoka yra savitasis augimo greitis r tarp laiko t1 ir t2. Jis gali būti nustatytas keliais būdais pagal tai, ar žuvys yra ženklinamos atskirai ar ne, arba pagal tai, ar reikia nustatyti rezervuarui vidutinį greitį.
      
         
      
         
      
         
      čia:
      
                  r1
                  
               
               
                  =
               
               
                  atskiros žuvies savitasis augimo greitis
               
            
                  r2
                  
               
               
                  =
               
               
                  vidutinis savitasis augimo greitis rezervuarui
               
            
                  r3
                  
               
               
                  =
               
               
                  „pseudo“ savitasis augimo greitis
               
            
                  w1, w2
                  
               
               
                  =
               
               
                  konkrečios žuvies masė, atitinkamai, laiku t1 ir t2
                  
               
            
                  loge w1
                  
               
               
                  =
               
               
                  atskiros žuvies masės tyrimo pradžioje logaritmas
               
            
                  loge w2
                  
               
               
                  =
               
               
                  atskiros žuvies masės tyrimo pabaigoje logaritmas
               
            
                  loge w1
                  
               
               
                  =
               
               
                  tyrimo pradžioje nustatytos rezervuaro žuvų masės w1 logaritmų verčių vidurkis
               
            
                  loge w2
                  
               
               
                  =
               
               
                  tyrimo pabaigoje nustatytos rezervuaro žuvų masės w2 logaritmų verčių vidurkis
               
            
                  t1, t2
                  
               
               
                  =
               
               
                  tyrimo laikotarpio pradžios ir pabaigos laikas (paros).
               
            r1, r2, r3 gali būti apskaičiuoti 0–28 parų laikotarpiui ir, jei tinka (t. y. kai buvo matuojama 14-tą parą), 0–14 ir 14–28 parų laikotarpiams.
      2.1.1.   Rezultatų analizė taikant regresiją (koncentracijos ir atsako santykio modeliavimas)
      Šis analizės metodas nustato atitinkamą savitojo augimo greičio ir koncentracijos matematiškai išreiškiamą santykį, taigi leidžia įvertinti ECx, t. y. kiekvieną reikiamą EC vertę. Taikant šį metodą atskiros žuvies r vertės (r1) apskaičiuoti nebūtina, vietoj to analizė gali būti pagrįsta vidutine r verte rezervuarui (r2). Geriau taikyti šį metodą. Jis taip pat labiau tinka naudojant mažiausių žuvų rūšis.
      Norint ištirti koncentracijos ir atsako santykį, vidutiniai savitieji augimo greičiai rezervuarui (r2) turi būti grafiškai pažymimi kaip koncentracijos funkcija.
      Santykiui tarp r2 ir koncentracijos išreikšti turi būti pasirinktas atitinkamas modelis ir jo pasirinkimas turi būti atitinkamai pagrįstas.
      Jei kiekviename rezervuare likusių gyvų žuvų skaičius yra nevienodas, modelio pritaikymo procese, paprastame ar netiesiniame, reikėtų naudoti svorinius koeficientus siekiant atsižvelgti į nevienodą grupių dydį.
      Modelio pritaikymo metodas turi leisti įvertinti, pvz., EC20 ir nustatyti jos sklaidą (standartinę paklaidą ar pasikliovimo intervalą). Pritaikyto modelio grafikas turėtų būti parodytas lyginant su duomenimis, kad būtų galima įvertinti pritaikyto modelio atitikimą (9) (19) (20) (21).
      2.1.2.   Rezultatų analizė LOEC įvertinti
      Jei darant bandymą rezervuarai lygiagrečiam bandymui yra visoms koncentracijos vertėms, LOEC įvertinimas gali būti grindžiamas vidutinio savitojo augimo greičio rezervuarui dispersine analize (ANOVA) (žr. 2.1 skirsnį), vėliau taikant tinkamą metodą (pvz., Dunnett ar Williams kriterijus (13) (14) (15) (22), kuriuo kiekvienos koncentracijos vidutinė r vertė lyginama su kontrolinių bandinių vidutine r verte norint nustatyti mažiausią koncentraciją, kuriai šis skirtumas yra reikšmingas esant 0,05 kriterijaus reikšmingumo lygmeniui. Jei parametriniams metodams reikiamos hipotezės (nenormalus pasiskirstymas (pvz., Shapiro—Wilk kriterijus) ar heterogeninė sklaida (Bartlett kriterijus)) nepasitvirtina, reikėtų numatyti duomenų pertvarkymą sklaidoms homogenizuoti prieš darant dispersinę analizę ar daryti svorinę dispersinę analizę.
      Jei darant bandymą rezervuarai lygiagrečiam bandymui yra ne visoms koncentracijos vertėms, rezervuarais pagrįsta dispersinė analizė bus nejautri ar neįmanoma. Šiuo atveju priimtinas vidurys yra dispersinei analizei panaudoti kiekvienos žuvies „pseudo“ savitąjį augimo greitį r3.
      Toliau vidutinė r3 vertė kiekvienai koncentracijai gali būti lyginama su vidutine r3 verte kontroliniams bandiniams. Tuomet LOEC gali būti nustatytas taip, kaip buvo daryta pirmiau. Būtina pripažinti, kad šis metodas neatsižvelgia į kintamumą tarp rezervuarų, išskyrus kintamumą tarp atskirų žuvų, ir šiuo požiūriu nesuteikia jokios apsaugos. Tačiau patyrimas parodė (9), kad kintamumas tarp rezervuarų buvo labai mažas lyginant su kintamumu rezervuare (t. y. tarp žuvų). Jei analizė neapima kiekvienos žuvies duomenų, būtina numatyti išskirčių identifikavimo metodą ir pagrįsti jo taikymą.
      2.2.   REZULTATŲ AIŠKINIMAS
      Rezultatai turi būti aiškinami atsargiai, jei išmatuotos bandomųjų tirpalų toksiškų medžiagų koncentracijos vertės yra arti analizės metodo aptikimo ribos arba jei darant pusiau statinius bandymus bandomosios medžiagos tirpalo prieš atnaujinimą koncentracija yra mažesnė kaip šviežiai paruošto tirpalo koncentracija.
      2.3.   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
      2.3.1.   Bandomoji medžiaga:
      
                  —
               
               
                  fizikinė būsena ir atitinkamos fizikocheminės savybės,
               
            
                  —
               
               
                  cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynumą, ir, jei tinka, analizės metodas bandomajai medžiagai kiekybiškai nustatyti.
               
            2.3.2.   Bandymų gyvūnai:
      
                  —
               
               
                  mokslinis pavadinimas, gali būti,
               
            
                  —
               
               
                  veislė, dydis, tiekėjas, bet koks išankstinis apdorojimas ir t. t.
               
            2.3.3.   Bandymo sąlygos:
      
                  —
               
               
                  taikytas bandymo metodas (pvz., pusiau statinis/su atnaujinimu, dinaminis, įkrova, žuvų tankis ir t.t.,
               
            
                  —
               
               
                  bandymo planas (pvz., bandymų indų skaičius, bandomosios koncentracijos ir lygiagrečių bandinių skaičius, žuvų skaičius viename inde),
               
            
                  —
               
               
                  pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų atnaujinimo dažnis (jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija),
               
            
                  —
               
               
                  vardinės bandymo koncentracijos, bandymų indų nustatytų koncentracijų vidutinės vertės ir jų standartiniai nuokrypiai bei nustatymo metodas ir įrodymai, kad buvo daromi tikrųjų bandomosios medžiagos tirpalų matavimai,
               
            
                  —
               
               
                  skiedimo vandens charakteristikos: pH, kietumas, šarmingumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės, bandymo terpės sūrumas (jei matuota) ir visi kiti daryti matavimai,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų indų vandens kokybė: pH, kietumas, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija,
               
            
                  —
               
               
                  išsami informacija apie šėrimą (pvz., davinio rūšis (-ys), šaltinis, duodamas kiekis ir šėrimo dažnumas).
               
            2.3.4.   Rezultatai:
      
                  —
               
               
                  duomenys, kad kontroliniai bandiniai atitinka išlikimo validumo kriterijų, ir duomenys apie gaištamumą visose bandomosiose koncentracijose;
               
            
                  —
               
               
                  taikytos statistinės analizės metodikos, statistika, pagrįsta lygiagrečiais bandymais ar žuvimis, duomenų apdorojimas ir naudotų metodikų pagrindimas;
               
            
                  —
               
               
                  lentelėse pateikti 0, 14 (jei matuota) ir 28 paros atskirų žuvų ir vidutinės žuvų masės duomenys rezervuarui vidutinio augimo greičio ar „pseudo“ savitojo augimo greičio (jei tinka) vertės 0-28 parų laikotarpiu ar galbūt 0–14 ir 14–28 parų laikotarpiu;
               
            
                  —
               
               
                  statistinės analizės (t. y. regresinės analizės ar dispersinės analizės) rezultatai, geriau lentelių ir grafikų pavidalu, LOEC (p = 0,05) bei NOEC ar ECx vertės, nurodant, kai įmanoma, atitinkamas standartines paklaidas;
               
            
                  —
               
               
                  visi pasitaikantys žuvų neįprasto elgesio atvejai ir visi matomi bandomosios medžiagos poveikiai.
               
            3.   NUORODOS
      
      
                  1)
               
               
                  Solbe J.F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth rate of Fish. WRc Report No. PRD 1388-M/2.
               
            
                  2)
               
               
                  Ashley S., Mallett M.J. and Grandy N.J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
               
            
                  3)
               
               
                  Crossland N.O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, PP 1855-1870.
               
            
                  4)
               
               
                  Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P.D., Market M., Munk R., Scholz N. and Höfte B.B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, p. 157–164.
               
            
                  5)
               
               
                  Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.
               
            
                  6)
               
               
                  Holcombe, G.W., Benoit D.A., Hammermeister, D.E., Leonard, E.N. and Johnson, R.D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes).Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, p. 287–297.
               
            
                  7)
               
               
                  Benoit, D.A., Holcombe, G.W. and Spehar, R.L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka {Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. U. S. Environmental Protection Agency, Duluth, Minesota.
               
            
                  8)
               
               
                  Stephan C.E. and Rogers J.W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R C Bahner and D J Hansen, Eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, p. 328–338.
               
            
                  9)
               
               
                  Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, p. 81.
               
            
                  10)
               
               
                  Cox D.R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.
               
            
                  11)
               
               
                  Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10-12 December 1991.
               
            
                  12)
               
               
                  Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc, 50, p. 1096–1121.
               
            
                  13)
               
               
                  Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, p. 482–491.
               
            
                  14)
               
               
                  Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, p. 103–117.
               
            
                  15)
               
               
                  Johnston, W.L., Atkinson, J.L., Glanville N.T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, 123–133.
               
            
                  16)
               
               
                  Quinton, J. C. and Blake, R.W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, 33–41.
               
            
                  17)
               
               
                  Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 P.
               
            
                  18)
               
               
                  Bruce, R.D. and Versteeg D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data . Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485-1494.
               
            
                  19)
               
               
                  DeGraeve, G.M., Cooney, J.M., Pollock, T.L., Reichenbach, J.H., Dean, Marcus, M.D. and McIntyre, D.O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, n. 4468). Electric Power Research Institute, Palo alto, CA.
               
            
                  20)
               
               
                  Norbert-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. p. 12.
               
            
                  21)
               
               
                  Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, p. 510–531.
               
            
         1 priedilis
         BANDYMAMS REKOMENDUOJAMOS ŽUVŲ RŪŠYS IR TINKAMOS BANDYMO SĄLYGOS
         
                     Rūšys
                  
                  
                     Rekomenduoj amas bandy mo temperaturos diapazonas
                     ( oC)
                  
                  
                     Apšvietimo trukme
                     (valandos)
                  
                  
                     Rekomenduoj amas žuvų pradines masės diapazonas
                     (g)
                  
                  
                     Butinas matavimo preciziskumas
                  
                  
                     Įkrova
                     (g/l)
                  
                  
                     Gyvūnų tankis
                     (litrui)
                  
                  
                     Maistas
                  
                  
                     Bandymo trukmė
                     (paros)
                  
               
                     
                        Rekomenduojamos rūšys:
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        Oncorhynchus mykiss
                     
                     Vaivorykštinis upėtakis
                  
                  
                     12,5 — 16,0
                  
                  
                     12 — 16
                  
                  
                     1 — 5
                  
                  
                     100 mg tikslumu
                  
                  
                     1,2 — 2,0
                  
                  
                     4
                  
                  
                     Sausas firminis lašišinių mailių maistas
                  
                  
                     ≥ 28
                  
               
                     
                        Kitos dokumentais tinkamai patvirtintos rūšys:
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        Danio rerio
                     
                     Dryžuotasis danio
                  
                  
                     21 — 25
                  
                  
                     12 — 16
                  
                  
                     0,050 — 0,100
                  
                  
                     1 mg tikslumu
                  
                  
                     0,2 — 1,0
                  
                  
                     5 — 10
                  
                  
                     Gyvas maistas (Brachionus Artemia)
                     
                  
                  
                     ≥ 28
                  
               
                     
                        Oryzias latipes
                     
                     ricefish (Medaka)
                  
                  
                     21 — 25
                  
                  
                     12 — 16
                  
                  
                     0,050 — 0,100
                  
                  
                     1 mg tikslumu
                  
                  
                     0,2 — 1,0
                  
                  
                     5 — 20
                  
                  
                     Gyvas maistas (Brachionus Artemia)
                     
                  
                  
                     ≥ 28
                  
               
      
         2 priedėlis
         KAI KURIOS TINKAMO SKIEDIMO VANDENS CHEMINĖS CHARAKTERISTIKOS
         
                     Medžiaga
                  
                  
                     Koncentracija
                  
               
                     Kietosios dalelės
                  
                  
                     < 20 mg/l
                  
               
                     Bendra organinė anglis
                  
                  
                     < 2 mg/l
                  
               
                     Nejonizuotas amoniakas
                  
                  
                     < 1 μg/l
                  
               
                     Liekamasis chloras
                  
                  
                     < 10 μg/l
                  
               
                     Bendras fosforo organinių pesticidų kiekis
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     Bendras chloro organinių pesticidų ir polichlorintų difenilų kiekis
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     Bendras organinis chloras
                  
                  
                     < 25 ng/l
                  
               
      
         3 Priedėlis
         Toksiškumo bandymui tinkamų koncentracijų logaritminė eilutė (9)
         
                     Stulpelis (koncentracijų tarp 100 ir 10 ar tarp 10 ir 1 skaičius) (20)
                     
                  
               
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     3
                  
                  
                     4
                  
                  
                     5
                  
                  
                     6
                  
                  
                     7
                  
               
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
               
                     32
                  
                  
                     46
                  
                  
                     56
                  
                  
                     63
                  
                  
                     68
                  
                  
                     72
                  
                  
                     75
                  
               
                     10
                  
                  
                     22
                  
                  
                     32
                  
                  
                     40
                  
                  
                     46
                  
                  
                     52
                  
                  
                     56
                  
               
                     3,2
                  
                  
                     10
                  
                  
                     18
                  
                  
                     25
                  
                  
                     32
                  
                  
                     37
                  
                  
                     42
                  
               
                     1,0
                  
                  
                     4,6
                  
                  
                     10
                  
                  
                     16
                  
                  
                     22
                  
                  
                     27
                  
                  
                     32
                  
               
                      
                  
                  
                     2,2
                  
                  
                     5,6
                  
                  
                     10
                  
                  
                     15
                  
                  
                     19
                  
                  
                     24
                  
               
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                     6,3
                  
                  
                     10
                  
                  
                     14
                  
                  
                     18
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                     6,8
                  
                  
                     10
                  
                  
                     13
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     2,5
                  
                  
                     4,6
                  
                  
                     7,2
                  
                  
                     10
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,6
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                     5,2
                  
                  
                     7,5
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     2,2
                  
                  
                     3,7
                  
                  
                     5,6
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     2,7
                  
                  
                     4,2
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                     3,2
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,4
                  
                  
                     2,4
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,8
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,3
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
               
      C.15.   ŽUVYS, TRUMPALAIKIS TOKSIŠKUMO EMBRIONUI IR MAILIUI SU TRYNIO MAIŠELIU BANDYMAS
      1.   METODAS
      Šis trumpalaikio toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 212 (1998) kopija.
      1.1.   ĮVADAS
      Šis trumpalaikio toksiškumo žuvų embrionui ir mailiui su trynio maišeliu bandymas yra trumpalaikis bandymas, kai ką tik apvaisinti žuvų ikrai yra veikiami nuo jų apvaisinimo iki mailiaus su trynio maišeliu stadijos pabaigos. Toksiškumas embrionui ir mailiui su trynio maišeliu bandomas be maitinimo, bandymas turi būti baigtas, kai mailius dar maitinamas iš trynio maišelio.
      Bandymo tikslas – nustatyti cheminių medžiagų letalius ir mažesniu laipsniu subletalius poveikius specifinėms vystymosi stadijoms ir bandytai rūšiai. Šis bandymas turėtų suteikti vertingos informacijos, nes jis galėtų: a) būti jungtimi tarp letalumo ir subletalumo bandymų; b) būti taikomas kaip atrankos bandymas numatant visą pradinio gyvenimo stadijų bandymą ar chroniško toksiškumo bandymus; ir c) būti taikomas bandyti rūšis, kurių auginimo metodai nėra pakankamai pažangūs, kad aprėptų perėjimo iš endogeninio į egzogeninį maitinimo laikotarpį.
      Žinotina, kad paprastai tik visas žuvies gyvenimo ciklo stadijas apimantys bandymai gali duoti tikslų chroniško toksiškumo žuvims įvertį ir kad bent kiek sutrumpinus veikimą neįtraukiant kurios nors gyvenimo stadijos, gali sumažėti jautrumas, taigi gali būti nepakankamai įvertintas chroniškas toksiškumas. Todėl manoma, kad embriono ir mailiaus su trynio maišeliu bandymas turėtų būti ne toks jautrus kaip visas pradinio gyvenimo stadijų bandymas, ypač turint galvoje labai lipofiliškas chemines medžiagas (log Pow > 4) ir specifinio toksiško veikimo chemines medžiagas. Tačiau mažesnių jautrumo skirtumų tarp dviejų bandymų reikėtų tikėtis nespecifinio narkotinio poveikio tipo cheminėms medžiagoms (1).
      Dar prieš šio bandymo paskelbimą daugiausia patyrimo darant embriono ir mailiaus su trynio maišeliu bandymą buvo sukaupta su gėlavandene žuvimi Danio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – įprastas danio pavadinimas). Taigi smulkesni nurodymai, kaip daryti šios žuvų rūšies bandymą pateikti 1 priedėlyje. Tačiau tai netrukdo naudoti kitas rūšis, su kuriomis yra sukaupta patyrimo (1 lentelė).
      1.2   APIBRĖŽIMAI
      
         Mažiausia stebimo poveikio koncentracija LOEC: mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis yra statistiškai reikšmingas lyginant su kontroliniais bandiniais (kai p < 0,05). Tačiau visų didesnių kaip LOEC bandomųjų koncentracijų kenksmingas poveikis turi būti lygus ar didesnis kaip LOEC poveikis.
      
         Nestebimo poveikio koncentracija NOEC: bent kiek už LOEC mažesnė bandomoji koncentracija.
      1.3.   BANDYMO ESMĖ
      Embriono ir mailiaus su trynio maišeliu augimo stadijų žuvys veikiamos vandeniniais kelių koncentracijos verčių bandomosios medžiagos tirpalais. Bandymo protokolas leidžia pasirinkti pusiau statinį ar dinaminį bandymą. Pasirinkimas priklauso nuo bandomosios medžiagos prigimties. Bandymas pradedamas sudėjus apvaisintus ikrus į bandymo kameras ir baigiamas prieš pat tą momentą kai kurioje nors kameroje lervos trynio maišelis yra visiškai absorbuotas ar kai iš bado pradeda gaišti kontrolinių bandinių žuvys. Įvertinami letalūs ir subletalūs poveikiai ir lyginami su kontrolinėmis vertėmis mažiausiai stebimo poveikio koncentracijai, taigi ir nestebimo poveikio koncentracijai nustatyti. Kitaip poveikiai gali būti analizuojami taikant regresijos modelį norint nustatyti koncentraciją kuri sukeltų x % pokytį (t. y., LC/ECx, čia x yra tam tikras % išreikštas poveikis).
      1.4.   INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ
      Reikėtų turėti ūmaus toksiškumo bandymo (žr. C.1 bandymo metodą), geriau daryto su šiam bandymui pasirinkta rūšimi, rezultatus. Rezultatai gali būti naudingi ankstyvųjų gyvenimo tarpsnių bandymui pasirenkant atitinkamą bandomųjų koncentracijų diapazoną. Turi būti žinomas medžiagos tirpumas vandenyje (įskaitant tirpumą bandymo vandenyje) ir bandomosios medžiagos garų slėgis. Turi būti patikimas metodas ištirpintai bandomajai medžiagai kiekybiškai nustatyti žinomu tikslumu ir aptikimo riba, kurie nurodomi ataskaitoje.
      Informaciją apie bandomąją medžiagą kuri yra vertinga bandymo sąlygoms nustatyti, sudaro struktūrinė formulė, medžiagos grynumas, stabilumas veikiant šviesai ir bandymo sąlygomis, pKa, Pow ir lengvo biologinio skaidomumo bandymo rezultatai (žr. C.4 metodą).
      1.5.   BANDYMO VALIDUMAS
      Bandymas yra validus, jei galioja šios sąlygos:
      
                  —
               
               
                  bendras apvaisintų ikrų išgyvenamumas kontroliniuose bandiniuose ir, jei tinka, induose vien tik su tirpikliu turi būti didesnis arba lygus ribinėms vertėms, apibrėžtoms 2 ir 3 priedėliuose,
               
            
                  —
               
               
                  ištirpusio deguonies koncentracija visą bandymą turi sudaryti 60–100 % soties ore vertės (ASV),
               
            
                  —
               
               
                  kiekvienu bandymo momentu temperatūros verčių bandymo kamerose ar skirtingomis bandymo dienomis skirtumas turi būti ne didesnis kaip ±1,5 oC ir temperatūra turėtų būti palaikoma bandymo rūšims nurodytu diapazonu (2 ir 3 priedėliai).
               
            1.6.   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Bandymų kameros
      Galima naudoti bet kokius stiklinius ar chemiškai inertiškos medžiagos indus. Indų matmenys turi būti gana dideli, kad atitiktų įkrovos sąlygas (žr. 1.7.1.2 skirsnį). Bandymų indus bandymo plote rekomenduojama išdėstyti atsitiktinai. Jei laboratorijoje yra sistemingi poveikiai, kuriuos būtų galima kontroliuoti suskirstant į blokus, indus geriau išdėstyti nevisiškai atsitiktinai, bet pagal randomizuotą blokinę schemą kiekviename bloke darant kiekvieną apdorojimą. Jei taikoma blokinė schema, į tai būtina atsižvelgti vėliau analizuojant duomenis. Bandymų kameros turi būti apsaugotos nuo nepageidautinų trikdžių.
      1.6.2.   Žuvų rūšių parinkimas
      Rekomenduotos žuvų rūšys nurodytos 1A lentelėje. Tai netrukdo naudoti kitą rūšį (pavyzdžiai pateikti 1B lentelėje), bet, norint sudaryti tinkamas bandymų sąlygas, gali tekti priderinti bandymų metodiką. Šiuo atveju ataskaitoje turi būti pagrįstas rūšies parinkimo motyvas ir tyrimo metodas.
      1.6.3.   Veislinių žuvų laikymas
      Detalių apie veislinių žuvų laikymą patenkinamomis sąlygomis galima rasti OECD TG 210 (21) ir nuorodose (2) (3) (4) (5) (6).
      1.6.4.   Embrionų ir lervų apdorojimas
      Embrionai ir lervos gali būti veikiami mažesniuose pagrindinį indą dalijančiuose induose, jų šonines ar galines sieneles pakeičiant tinklu, kad tirpalas galėtų tekėti per indą. Galima padaryti taip, kad per mažus indus tekėtų neturbulentinis srautas, tik reikia pakabinti juos ant svirties, kuri indus keltų ir nuleistų, bet visą laiką organizmai turi būti panardinti; taip pat galima naudoti sifoninę tekėjimo sistemą. Apvaisinti lašišinių žuvų ikrai gali būti laikomi dėžėse ar tinkluose su pakankamai didelėmis akutėmis, kad išsiritusios lervos galėtų pro jas iškristi. Lervoms pernešti darant pusiau statinius bandymus su visišku kasdieniu atnaujinimu tinka Pastero pipetės (žr. 1.6.6 skirsnį).
      Jei ikrų talpyklos, grotelės ar tinkleliai buvo naudojami ikrams pagrindiniame inde laikyti, šitos apribojimo priemonės turėtų būti pašalintos išsiritus lervoms, tačiau reikia palikti tinklelius, kurie neleistų ištrūkti žuvims. Jei lervas reikia pernešti, jų neturi veikti oras, o žuvims iš ikrų talpyklų pernešti neturi būti naudojami tinklai (tokia atsargumo priemonė gal ir nebūtina kai kurioms ne tokioms gležnoms rūšims, pvz., karpiui). Šio pernešimo laikas įvairioms rūšims skirtingas ir pernešti nėra visuomet būtina. Taikant pusiau statinį metodą galima naudoti chemines stiklines ar negilias talpyklas ir, jei būtina, turinčias tinklo ekraną truputį pakeltą virš stiklinės dugno. Jei šių talpyklų tūris yra pakankamas, kad atitiktų įkrovos reikalavimus (žr. 1.7.1.2 skirsnį), embrionų ar lervų pernešti nebūtina.
      1.6.5.   Vanduo
      Bandymams galima naudoti bet kokį vandenį, kuris atitinka priimtino praskiedimo vandens chemines charakteristikas, nurodytas 4 priedėlyje, ir kuriame bandymo rūšis rodo kontrolinį išgyvenamumą bent tokį, koks aprašytas 2 ir 3 priedėliuose. Vandens kokybė turėtų būti vienoda visą bandymo laiką. pH reikšmė neturėtų kisti daugiau kaip ±0,5 pH vieneto. Norint garantuoti, kad skiedimo vanduo per daug neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pvz., nesudarytų kompleksinių junginių su bandomąja medžiaga) ar nedarytų neigiamo poveikio neršiančių žuvų elgesiui, vandens bandiniai turi būti kartkarčiais analizuojami. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ir Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca, Mg, Na, K, Cl ir SO4), pesticidų (pvz., bendro fosforo organinių ir chloro organinių pesticidų kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti daroma, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė yra gana pastovi. Jei būtų parodyta, kad vandens kokybė yra pastovi bent metus, analizė gali būti daroma ne taip dažnai, o intervalai padidinti (pvz., kas šešis mėnesius).
      1.6.6.   Bandomieji tirpalai
      Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą.
      Pradinį tirpalą geriau ruošti bandomąją medžiagą tiesiog maišant ar purtant skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ar ultragarsu). Pakankamai koncentruotam pradiniam tirpalui ruošti galima naudoti prisotinimo kolonėles (tirpumo kolonėles). Kiek įmanoma, reikia vengti naudoti tirpiklius ar dispergatorius (soliubilizavimo medžiagas); tačiau kartais, norint gauti tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą tokias medžiagas gali tekti naudoti. Tinkami tirpikliai yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilsulfoksidas, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Tinkami dispergatoriai yra Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metilceliuliozė ir HCO-40. Reikėtų atsargiai naudoti lengvai biologiškai irstančias medžiagas (pvz., acetoną) ir (ar) labai lakius junginius, nes, darant dinaminius bandymus, jie gali kelti problemų dėl bakterijų kaupimosi. Naudojama soliubilizavimo medžiaga neturi daryti reikšmingo poveikio išgyvenamumui ir neigiamo poveikio ankstyvosioms stadijoms, kaip kad nustatoma darant kontrolinį bandymą vien tik su tirpikliu. Tačiau reikia kiek įmanoma stengtis tokių medžiagų nenaudoti.
      Pusiau statiniam metodui galima taikyti dvi atnaujinimo metodikas: 1) nauji bandomosios medžiagos tirpalai paruošiami švariuose induose ir gyvi likę ikrai bei lervos mažuose seno tirpalo tūriuose švelniai pernešami į naujus indus vengiant sąlyčio su oru; ar 2) bandymų organizmai paliekami senuose induose, tačiau pakeičiama dalis (bent trys ketvirčiai) jų vandens. Terpės atnaujinimo dažnis priklausys nuo bandomosios medžiagos stabilumo, tačiau vandenį atnaujinti rekomenduojama kasdien. Jei pradiniai stabilumo bandymai (žr. 1.4 skirsnį) rodo, kad bandomosios medžiagos koncentracija laikotarpiu tarp atnaujinimų yra nestabili (t. y. yra už 80-120 % vardinės koncentracijos ribų ar yra mažesnė kaip 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), reikėtų numatyti dinaminio bandymo taikymą. Bet kuriuo atveju reikėtų pasirūpinti, kad atnaujinant vandenį lervos nepatirtų įtampos.
      Bandomosios koncentracijos tirpalams į bandymo kameras tiekti darant dinaminius bandymus reikalinga sistema, kuri nepertraukiamai dozuotų ir skiestų bandomosios medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozavimo siurblys, proporcingasis skiestuvas, prisotinimo sistema). Pradinių tirpalų ir skiedimo vandens srautai turi būti kartais, geriau kasdien, tikrinami ir visą bandymą turi nekisti daugiau kaip 10 %. Tinkamas pasirodė esąs srautas, atitinkantis bent penkis bandymo kameros tūrius per 24 h (2).
      1.7.   BANDYMO EIGA
      Vertingos informacijos, kaip daryti žuvų embriono ir mailiaus su trynio maišeliu toksiškumo bandymus, yra literatūroje, kurios keli pavyzdžiai įtraukti į šio teksto nuorodų dalį (7) (8) (9).
      1.7.1.   Veikimo sąlygos
      1.7.1.1.   Trukmė
      Bandymą geriau pradėti per 30 min. nuo ikrų apvaisinimo. Embrionai į bandomąjį tirpalą dedami prieš prasidedant blastodisko segmentacijos stadijai ar kuo greičiau jai prasidėjus, bet būtinai prieš gastrulės stadijos pradžią. Jei ikrus tiekia prekybininkas, pradėti bandymą iš karto po apvaisinimo gali būti neįmanoma. Kadangi bandymo pradžios vėlavimas gali labai paveikti bandymo jautrumą bandymas turėtų būti pradėtas per aštuonias valandas po apvaisinimo. Dėl tos priežasties, kad lervos veikimo laikotarpiu nemaitinamos, bandymas turėtų būti baigtas prieš pat tą momentą kai kurioje nors bandymo kameroje kurios nors lervos trynio maišelis bus visiškai absorbuotas ar kai iš bado pradės gaišti kontrolinių bandinių gyvūnai. Trukmė priklauso nuo naudotos rūšies. Kai kurios rekomenduojamos trukmės yra nurodytos 2 ir 3 priedėliuose.
      1.7.1.2.   Įkrova
      Bandymo pradžioje turimų apvaisintų ikrų skaičiaus turi pakakti statistikos reikalavimams įvykdyti. Ikrai tarp veikimo koncentracijų turi būti paskirstyti atsitiktinai ir kiekvienai koncentracijai turi būti naudojama bent 30 apvaisintų ikrų, vienodai (ar kuo vienodžiau, nes kai kurias rūšis gali būti sunku gauti vienodas įkrovas) paskirstytų bent trims tos pačios koncentracijos bandymo kameroms. Įkrova (biomasė bandomojo tirpalo tūrio vienetui) turi būti pakankamai maža, kad be aeracijos ištirpusio deguonies koncentraciją būtų galima palaikyti bent 60 % soties ore koncentracijos. Dinaminiams bandymams yra rekomenduota (2) ne didesnė kaip 0,5 g/l per 24 h ir bet kuriuo momentu ne didesnė kaip 5 g/l tirpalo.
      1.7.1.3.   Šviesa ir temperatūra
      Apšvietimo laikotarpis ir vandens temperatūra turi atitikti žuvų rūšį (2 ir 3 priedėliai). Temperatūrai nuolatos kontroliuoti gali būti patogu turėti papildomą bandymų indą.
      1.7.2.   Bandomosios medžiagos koncentracijos
      Paprastai reikia naudoti penkias bandomosios medžiagos koncentracijas, besiskiriančias pastoviu santykiu, geriausiai ne didesniu kaip 3,2. Renkantis koncentracijos verčių diapazoną turi būti išnagrinėta ūmaus toksiškumo tyrimų kreivė, siejanti LC50 ir veikimo trukmę. Tam tikromis aplinkybėmis gali pasiteisinti mažiau kaip penkių koncentracijos verčių naudojimas, pvz., darant ribinės koncentracijos vertės nustatymo bandymus, ar siauresnio koncentracijos verčių diapazono naudojimas. Mažiau kaip penkių koncentracijos verčių naudojimas turi būti pagrįstas. Medžiagos koncentracijos verčių, didesnių kaip 96 h LC50 ar 100 mg/l, žiūrint, kuri mažesnė, bandyti nebūtina. Neturėtų būti daromi bandymai su koncentracijos vertėmis, didesnėmis kaip medžiagos tirpumo ribinė koncentracija.
      Jei pradinio tirpalo ruošimui lengvinti naudojama soliubilizavimo medžiaga, jos galutinė koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1 ml/l ir geriau, kai ji visuose bandymo induose būtų vienoda (žr. 1.6.6 skirsnį).
      1.7.3.   Kontroliniai bandiniai
      Be bandomosios serijos, turi būti vienas skiedimo vandens kontrolinis bandinys (su lygiagrečiais bandiniais, kai reikia) ir, jei tinka, vienas kontrolinis bandinys su soliubilizavimo medžiaga (su lygiagrečiais bandiniais, kai reikia).
      1.7.4.   Kiekybinių analizių ir matavimų dažnis
      Darant bandymą bandomosios medžiagos koncentracijų vertės nustatomos reguliariais tarpais.
      Jei manoma, kad darant pusiau statinius bandymus bandomosios medžiagos koncentracija lieka vardinės koncentracijos ± 20 % vertės (t. y. 80–120 % diapazono; žr. 1.4 ir 1.6.6 skirsnius), rekomenduojama mažiausiai tris kartus lygiais bandymo laiko tarpais nustatyti bent didžiausią ir mažiausią bandomąją koncentraciją iš karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jo atnaujinimą (t. y. reikia analizuoti tą patį tirpalą imant šviežio tirpalo bandinius ir prieš pat jo atnaujinimą).
      Jei tai bandymai, kuriuos darant nesitikima, kad koncentracija lieka lygi vardinei vertei ± 20 % (pagal medžiagos stabilumo duomenis), turi būti nustatomos visos šviežiai paruoštų tirpalų ir tirpalų prieš atnaujinimą koncentracijos vertės laikantis to paties analizės režimo (t. y. bent tris kartus lygiais bandymo laiko tarpais). Bandomosios medžiagos koncentraciją prieš atnaujinimą reikia nustatyti tik viename tos pačios koncentracijos inde. Tarp nustatymų turi būti ne ilgesnis kaip septynių parų tarpas. Rekomenduojama rezultatus pagrįsti išmatuotomis koncentracijos vertėmis. Tačiau jei yra įrodymų, leidžiančių parodyti, kad bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką buvo patenkinamai palaikoma vardinės koncentracijos ± 20 % vertės ar išmatuotos pradinės koncentracijos vertės, rezultatai gali būti grindžiami vardine ar išmatuota vertėmis.
      Darant dinaminius bandymus tinka bandinių ėmimo režimas, panašus į aprašytąjį pusiau statiniams bandymams (bet senų tirpalų koncentracijos matavimas šiuo atveju netinka). Tačiau jei šis bandymas trunka ilgiau kaip septynias paras, būtų pageidautina pirmą savaitę padidinti bandinių ėmimo dažnį (pvz., trys matavimų serijos) norint įsitikinti, kad bandomosios koncentracijos vertės nesikeičia.
      Bandinius gali tekti filtruoti (pvz., per 0,45 μm akytumo filtrą) ar centrifuguoti. Tačiau, kadangi nei centrifugavimu, nei filtravimu ne visuomet galima atskirti biologiškai neprieinamą bandomosios medžiagos dalį nuo biologiškai prieinamos dalies, bandinių apdorojimas šiais būdais gali būti netaikomas.
      Darant bandymą visuose bandymų induose turi būti matuojama ištirpusio deguonies koncentracija, pH ir temperatūra. Turi būti matuojamas kontrolinių bandinių ir vieno indo su didžiausios koncentracijos bandiniu bendras kietumas ir sūrumas (jei tinka). Mažiausiai ištirpusio deguonies koncentracija ir sūrumas (jei tinka) turi būti matuojami tris kartus (bandymo pradžioje, viduryje ir pabaigoje). Darant pusiau statinius bandymus ištirpusio deguonies koncentraciją rekomenduojama matuoti dažniau, geriau prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo ar bent kartą per savaitę. Darant pusiau statinius bandymus pH vertė turi būti matuojama prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, darant dinaminius bandymus – bent kartą per savaitę. Vandens kietumas kiekvienam bandymui matuojamas vieną kartą. Temperatūrą būtina matuoti kasdien, o bent viename inde būtų geriau ją kontroliuoti be perstojo visą laiką.
      1.7.5.   Stebėjimai
      1.7.5.1.   Embrioninio vystymosi stadija
      Embrioninė stadija (t. y. gastrulės stadija) veikimo bandomąja medžiaga pradžioje turi būti kiek įmanoma tiksliau verifikuota. Tai galima padaryti naudojant tinkamai išlaikytų ir nuvalytų ikrų reprezentatyvų bandinį. Embrioninių stadijų aprašymo ir iliustravimo pavyzdžių galima rasti literatūroje (2) (5) (10) (11).
      1.7.5.2.   Išsiritimas ir išgyvenamumas
      Išsiritimo ir išgyvenamumo stebėjimai turi būti daromi bent kasdien, o gauti skaičiai registruojami. Gali būti pageidautina bandymo pradžioje stebėti dažniau (pvz., pirmąsias tris valandas kas 30 minučių), nes kartais išgyvenamumo laikas gali būti svarbesnis nei vien tik žūčių skaičius (pvz., ūmaus toksiškumo poveikio atveju). Negyvi embrionai ir lervos turi būti pašalinti iš karto, kai tik bus pastebėti, nes jie greitai suyra. Šalinti reikėtų labai atsargiai, kad nebūtų užgauti ar fiziškai sužaloti šalia esantys ikrai/lervos, kadangi jie yra labai gležni ir jautrūs. Žūties kriterijai kinta pagal gyvenimo stadiją:
      
                  —
               
               
                  
                     ikrams: ypač ankstyvosiomis stadijomis, pastebimas permatomumo sumažėjimas ir spalvos pokytis dėl baltymo koaguliacijos ir (ar) nusėdimo, dėl to atsiranda baltas matinis atspalvis,
               
            
                  —
               
               
                  
                     embrionams: kūno judėjimo ir (ar) širdies plakimo nebuvimas ir (ar) matinio atspalvio atsiradimas rūšims, kurių embrionai yra normaliai permatomi,
               
            
                  —
               
               
                  
                     lervoms: nejudamumas ir (ar) kvėpavimo judėjimo, ir (ar) širdies plakimo nebuvimas, ir (ar) balta matinė centrinės nervų sistemos spalva ir (ar) reakcijos į mechaninius dirgiklius nebuvimas.
               
            1.7.5.3.   Nenormali išvaizda
      Kūno ir (ar) pigmentacijos anomalijų turinčių lervų skaičius ir trynio maišelio absorbcijos stadija turi būti registruojami atitinkamais laiko tarpais atsižvelgiant į bandymo trukmę ir į aprašytos anomalijos prigimtį. Pastebėtina, kad nenormalūs embrionai ir lervos pasitaiko natūraliai ir kai kurių rūšių gali sudaryti net kelis kontrolinio (-ių) bandinio (-ių) procentus. Iš bandymo indų turi būti pašalinami tik nugaišę nenormalūs gyvūnai.
      1.7.5.4.   Nenormalus elgesys
      Anomalijos, pvz., hiperventiliacija, nekoordinuotas plaukimas ir netipiškas nejudamumas, turi būti registruojamos atitinkamais laiko tarpais atsižvelgiant į bandymo trukmę. Šie pastebėti poveikiai, nors juos sunku įvertinti kiekybiškai, gali padėti aiškinti gaištamumo duomenis, t. y. suteikti informacijos apie medžiagos toksiško veikimo būdą.
      1.7.5.5.   Ilgis
      Baigiant bandymą rekomenduojama išmatuoti atskirų gyvūnų ilgį; galima matuoti standartinį, ilgį iki uodegos peleko išsišakojimo ar bendrą ilgį. Tačiau jei supuvo uodegos pelekas ar yra išėstas, turi būti imamas standartinis ilgis. Paprastai, jei bandymas daromas teisingai, ilgio variacijos koeficientas lygiagretiems kontroliniams bandiniams turi būti ≤ 20 %.
      1.7.5.6.   Masė
      Baigiant bandymą galima išmatuoti atskirų gyvūnų masę; geriau nustatyti sausų gyvūnų masę (po 24 h esant 60 oC temperatūrai), o ne gyvų (sausai nušluostytų filtro popieriumi). Paprastai jei bandymas daromas teisingai, masės variacijos koeficientas lygiagretiems kontroliniams bandiniams turi būti ≤ 20 %.
      Darant stebėjimus bus gauta dalis nurodytų duomenų ar visi duomenys, kuriems daroma statistinė analizė:
      
                  —
               
               
                  bendras gaištamumas,
               
            
                  —
               
               
                  sveikų lervų skaičius bandymo pabaigoje,
               
            
                  —
               
               
                  išsiritimo pradžia ir jo pabaiga (t. y. 90 % išsiritusių ikrų kiekviename vienodos koncentracijos inde),
               
            
                  —
               
               
                  kiekvieną parą išsiritančių lervų skaičius,
               
            
                  —
               
               
                  iki bandymo pabaigos išgyvenusių gyvūnų ilgis (ir masė),
               
            
                  —
               
               
                  deformuotų ar nenormalios išvaizdos lervų skaičius,
               
            
                  —
               
               
                  nenormalaus elgesio lervų skaičius.
               
            2.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      2.1   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Rekomenduojama, kad rengiant bandymo planą ir bandymą analizuojant dalyvautų statistikas, nes šis bandymų metodas leidžia smarkiai keisti eksperimento planą pvz., bandymo kamerų skaičių, bandomųjų koncentracijų skaičių, pradinį apvaisintų ikrų skaičių, matuojamų parametrų skaičių. Atsižvelgiant į bandymo plano variantų įvairovę, jokių specialių nurodymų dėl statistinės metodikos čia nepateikiama.
      Jei reikia įvertinti LOEC ar NOEC vertes, būtina analizuoti kiekvieno vienodos koncentracijos rinkinio duomenų sklaidą taikant dispersinę analizę (ANOVA) ar faktorinės analizės lenteles. Norint daryti atskiros koncentracijos ir kontrolinių bandinių gautų rezultatų visuotinį lyginimą, gali būti naudingas Dunnetto metodas (12) (13). Yra ir kitų naudingų metodų pavyzdžių (14) (15). Taikant dispersinę analizę ar kitas metodikas, aptinkamo poveikio dydis (t. y. kriterijaus galia) turi būti apskaičiuotas ir pateiktas ataskaitoje. Žinotina, kad ne visus 1.7.5.6 skirsnyje išvardytus stebėjimus galima statistiškai apdoroti taikant dispersinę analizę. Pvz., bendras gaištamumas ir gyvų lervų skaičius bandymo pabaigoje galėtų būti analizuojami taikant probito modelio metodus.
      Jei reikia įvertinti LC ar ECX vertes, tyrimo rezultatams taikant statistinį metodą, pvz., mažiausių kvadratų ar netiesinių mažiausių kvadratų metodą, turi būti pritaikyta tinkama (-os) kreivė (-ės), pvz., logistinė kreivė. Kreivė (-ės) turi būti parametrizuota (-os) taip, kad nustatomos LC ar ECX vertės ir jų standartinė paklaida galėtų būti įvertintos tiesiogiai. Tai labai palengvina pasikliovimo rėžių apie LC ar ECX apskaičiavimą. Jei nėra svarbių priežasčių pirmenybę teikti kitiems pasikliovimo lygmenims, turi būti nurodomas dvipusis 95 % pasikliovimo intervalas. Pageidautina, kad pritaikymo metodika turėtų priemonių įvertinti atitikimo stokos reikšmę. Galima taikyti grafinius kreivių pritaikymo metodus. Regresinė analizė tinka visiems 1.7.5.6 skirsnyje išvardytiems stebėjimams.
      2.2.   REZULTATŲ AIŠKINIMAS
      Rezultatai turi būti aiškinami atsargiai, jei matuojamos bandomųjų tirpalų toksiškų medžiagų koncentracijos vertės yra arti analizės metodo aptikimo ribos. Taip pat labai atsargiai reikėtų aiškinti rezultatus, gautus koncentracijos vertėms, didesnėms kaip medžiagos tirpumo vandenyje vertės.
      2.3   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
      2.3.1   Bandomoji medžiaga:
      
                  —
               
               
                  fizikinė būsena ir atitinkamos fizikocheminės savybės;
               
            
                  —
               
               
                  cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynumą, ir, jei tinka, analizės metodas bandomajai medžiagai kiekybiškai nustatyti.
               
            2.3.2   Bandymų gyvūnai:
      
                  —
               
               
                  mokslinis pavadinimas, veislė, motininių žuvų skaičius (t. y. kiek moteriškos lyties žuvų buvo naudojama bandymui reikalingų ikrų skaičiui gauti), apvaisintų ikrų surinkimo šaltinis ir metodas ir vėlesnis apdorojimas.
               
            2.3.3   Bandymo sąlygos:
      
                  —
               
               
                  taikytas bandymo metodas (pvz., pusiau statinis ar dinaminis, laikas nuo apvaisinimo iki bandymo pradžios, įkrova ir t.t.),
               
            
                  —
               
               
                  apšvietimo laikotarpio (-ių) trukmė,
               
            
                  —
               
               
                  bandymo planas (pvz., bandymų indų skaičius ir lygiagrečių bandinių skaičius, embrionų skaičius vienam lygiagrečiam bandiniui),
               
            
                  —
               
               
                  pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų atnaujinimo dažnis (jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija),
               
            
                  —
               
               
                  vardinės bandomosios koncentracijos, išmatuotos bandymų indų tirpalų koncentracijos vertės, jų vidutinės vertės, standartiniai nuokrypiai ir nustatymo metodas; jei bandomosios medžiagos tirpumas yra mažesnis kaip išmatuotos koncentracijos, įrodymai, kad buvo matuojama ištirpintos bandomosios medžiagos tirpalų koncentracija,
               
            
                  —
               
               
                  skiedimo vandens charakteristikos: pH, kietumas, šarmingumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės, bandymo terpės sūrumas (jei matuotas) ir visi kiti daryti matavimai,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų indų vandens kokybė: pH, kietumas, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija.
               
            2.3.4   Rezultatai:
      
                  —
               
               
                  visų parengiamųjų bandomosios medžiagos stabilumo tyrimų rezultatai,
               
            
                  —
               
               
                  įrodymai, kad kontroliniai bandiniai atitinka bendro bandymų rūšies išgyvenamumo priimtinumo standartą (2 ir 3 priedėliai),
               
            
                  —
               
               
                  embriono ir lervos stadijos žuvų gaištamumo/išgyvenamumo ir bendrogaištamumo/išgyvenamumo duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  ikrų inkubavimo parų skaičius ir išsiritusių lervų skaičius,
               
            
                  —
               
               
                  ilgio (ir masės) duomenys,
               
            
                  —
               
               
                  morfologinių anomalijų, jei yra, dažnis ir aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  poveikių elgesiui, jei yra, dažnumas ir aprašymas,
               
            
                  —
               
               
                  duomenų statistinė analizė ir apdorojimas,
               
            
                  —
               
               
                  jei bandymų duomenims buvo taikoma dispersinė analizė, kiekvieno įvertinto atsako mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC), kai p = 0,05, ir nestebimo poveikio koncentracija (NOEC), įskaitant taikytų statistinių metodikų aprašymą ir nuorodą, kokio dydžio poveikis gali būti aptiktas,
               
            
                  —
               
               
                  jei bandymo duomenims buvo taikomas regresinės analizės metodas, LC ir ECX, jų pasikliovimo intervalai ir šioms vertėms apskaičiuoti naudoto pritaikyto modelio grafikas,
               
            
                  —
               
               
                  visų nukrypimų nuo bandymo metodo paaiškinimai.
               
            3.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Kristensen P. (1990) Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, pp 60. June 1990.
               
            
                  2)
               
               
                  ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 pp.
               
            
                  3)
               
               
                  Brauhn J.L. and Schoettger R.A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
               
            
                  4)
               
               
                  Brungs W.A. and Jones B.R. (1977) Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
               
            
                  5)
               
               
                  Laale H.W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish {Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, 121-173.
               
            
                  6)
               
               
                  Legault R. (1958) A Technique for Controlling the Time of Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia,_4, pp 328-330.
               
            
                  7)
               
               
                  Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J.E., Rosander B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish {Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemistry,_6, pp 61-71.
               
            
                  8)
               
               
                  Birge J.W., Black J.A. and Westerman A.G. (1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp 807-821.
               
            
                  9)
               
               
                  Van Leeuwen C.J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986) Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, 129-145.
               
            
                  10)
               
               
                  Kirchen R.V. and W. R. West (1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company.
               
            
                  11)
               
               
                  Kirchen R.V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 pp.
               
            
                  12)
               
               
                  Dunnett C.W. (1955) A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp 1096-1121.
               
            
                  13)
               
               
                  Dunnett C.W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, 482-491.
               
            
                  14)
               
               
                  Mc Clave J.T., Sullivan J.H. and Pearson J.G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.
               
            
                  15)
               
               
                  Van Leeuwen C.J., Adema D.M.M. and Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp 321-334.
               
            
                  16)
               
               
                  Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS l/RM/28, December 1992, pp 81.
               
            
                  17)
               
               
                  Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 21, 126-134.
               
            
                  18)
               
               
                  Meyer A., Bierman C.H. and Orti G. (1993). The phylogenetic position of the Zebrafish {Danio rerio), a model system in developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 231-236.
               
            
                  19)
               
               
                  Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F. and Roubaud P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Environmental Safety 32, 19-28.
               
            
                  20)
               
               
                  US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.
               
            
                  21)
               
               
                  US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, {Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.
               
            
                  22)
               
               
                  De Graeve G.M., Cooney J.D., McIntyre DO., Poccocic T.L., Reichenbach N.G., Dean J.H. and Marcus M.D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow {Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, 1189-1203.
               
            
                  23)
               
               
                  Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.
               
            
                  24)
               
               
                  Balon E.K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 pp.
               
            
                  25)
               
               
                  Blaxter J.H.S. (1988). Pattern and variety in development, In: W.S. Hoar and D.J. Randall Eds., Fish Physiology, vol. XIA, Academic press, pp 1-58.
               
            1A lentelė
      BANDYMUI REKOMENDUOJAMOS ŽUVŲ RŪŠYS
      
                  GĖLAVANDENĖS
               
            
                  
                     Oncorhynchus mykiss
                  
                  Vaivorykštinis upėtakis (9)(16)
               
            
                  
                     Danio rerio
                  
                  Dryžuotasis danio (7)(17)(18)
               
            
                  
                     Cyprinus caprio
                  
                  Paprastasis karpis (8)(19)
               
            
                  
                     Oryzias latipes
                  
                  Japanese ricefish/Medaka (20)(21)
               
            
                  
                     Pimephales promelas
                  
                  Rainė (8)(22)
               
            
         
      1 B lentelė
      Kitų dokumentais tinkamai patvirtintų naudotų rūšių pavyzdžiai
      
                  GĖLAVANDENĖS
               
               
                  SŪRIAVANDENĖS (JŪRŲ)
               
            
                  
                     Carassius auratus
                  
                  Sidabrinis karosas (8)
               
               
                  
                     Menidia peninsulae
                  
                  Tidewater silverside (23)(24)(25)
               
            
                  
                     Lepomis macrochirus
                  
                  Bluegill (8)
               
               
                  
                     Clupea har engus
                  
                  Silkė (24)(25)
               
            
                  
                     Gadus morhua
                  
                  Menkė (24)(25)
               
            
                  
                     Cyprinodon variegatus
                  
                  Sheepshead minnow (23)(24)(25)
               
            
         1 Priedėlis
         TOKSIŠKUMO DANIO (BRACHYDANIO RERIO) EMBRIONUI IR MAILIUI SU TRYNIO MAIŠELIU BANDYMO REKOMENDACIJOS
         ĮVADAS
         Danio yra Indijos Coromandel pakrančių žuvis, gyvenanti srauniose upėse. Tai yra paplitusi karpių šeimos akvariumų žuvis, informacijos apie jos priežiūros ir auginimo būdus galima rasti standartiniuose žinynuose apie tropikų žuvis. Žuvies biologija ir naudojimas žuvininkystės tyrimams buvo apžvelgti Laale (1).
         Žuvis retai yra ilgesnė kaip 45 mm. Jos cilindro formos kūnas turi 7-9 tamsiai mėlynas horizontalias sidabriškas juostas. Šios juostos eina iki uodegos ir analinių pelekų. Nugara gelsvai žalsva. Patinai yra plonesni už pateles. Patelės yra labiau sidabriškos ir su labiau išpūstu pilvu, ypač prieš nerštą.
         Suaugusios žuvys gali pakęsti didelius temperatūros, pH ir kietumo svyravimus. Tačiau norint gauti sveikas žuvis, kurios nerštų geros kokybės ikrus, reikia sudaryti optimalias sąlygas.
         Neršto metu patinas persekioja patelę ir bado ją galva, ir kai tik ikrai yra išneršiami, jie iškart apvaisinami. Ikrai, būdami permatomi ir nelipnūs, krenta į dugną, kur juos gali suryti tėvai. Nerštui įtakos turi apšvietimas. Jei rytą šviesos pakanka, žuvis paprastai neršia anksti, kai tik išaušta.
         Patelė gali neršti kelių šimtų ikrų partijomis kas savaitę.
         MOTININIU ŽUVŲ BŪSENA. REPRODUKCIJA IR ANKSTYVOSIOS GYVENIMO STADIJOS
         Parinkite atitinkamą skaičių sveikų žuvų ir prieš numatytą neršto laiką bent dvi savaites laikykite tinkamame vandenyje (pvz., 4 priedėlis). Žuvų grupei turi būti leista bent kartą neršti prieš tai, kaip bus ruošiama bandymui skirtų ikrų partija. Žuvų tankis šiuo laikotarpiu turi būti ne didesnis kaip 1 gramas žuvų litrui vandens. Tankis gali būti didesnis, jei vanduo keičiamas reguliariai ar naudojamos valymo sistemos. Temperatūra rezervuaruose turi būti 25 ± 2 oC. Žuvys turėtų būti šeriamos įvairiu maistu, kurį gali sudaryti, pvz., atitinkamas parduodamas sausas maistas, gyvos ką tik išsiritusios artemijos, chironomidės, dafnijos, baltosios kirmėlės {Enchytraeids).
         
         Toliau bendrais bruožais išdėstytos dvi metodikos, kurias taikant bandymui galima gauti pakankamą skaičių sveikų apvaisintų ikrų:
         
                     i)
                  
                  
                     Į 50 1 skiedimo vandens pripildytą akvariumą, apsaugotą nuo tiesioginės šviesos, įleidžiama aštuonios patelės ir 16 patinų, kurie kiek įmanoma netrikdomi bent 48 valandas. Dienos prieš bandymo pradžią vidurdienį akvariumo dugne padedamas padėklas nerštui. Padėklą nerštui sudaro 5-7 cm aukščio rėmas (iš organinio stiklo ar kitos tinkamos medžiagos), jo viršuje tvirtinamas stambių 2-5 mm akučių tinklas, apačioje – smulkių 10-30 μm akučių tinklas. Prie rėmo stambaus tinklo pritvirtinami keli „medžiai“ nerštui, padaryti iš nesusuktos nailono virvutės. Žuvims 12 valandų pabuvus tamsoje, nerštui pradėti įjungiama silpna šviesa. Po neršto praėjus dviem keturioms valandoms, padėklas išimamas ir surenkami ikrai. Padėklas nerštui neleidžia žuvims suryti ikrų, be to, palengvina jų surinkimą. Žuvų grupei turi būti leista bent kartą neršti prieš tai, kaip bus ruošiama bandymui skirtų ikrų partija.
                  
               
                     ii)
                  
                  
                     Nuo penkių iki dešimties patinų ir patelių bent dvi savaites prieš numatytą nerštą laikomi atskirai. Po 5–10 parų patelių pilvai bus išsipūtę ir matyti jų genitaliniai speneliai. Patinai spenelių neturi. Neršiama nerštui skirtuose rezervuaruose, turinčiuose netikrą tinklinį dugną (kaip pirmiau). Rezervuaras pripildomas skiedimo vandens taip kad vandens virš tinklo būtų 5-10 cm. Parą prieš numatytą nerštą į rezervuarą įleidžiama viena patelė ir du patinai. Vandens temperatūra palaipsniui didinama kol pasiekiama vienu laipsniu didesnė negu aklimatizacijos temperatūra. Šviesa išjungiama ir stengiamasi kiek įmanoma netrikdyti rezervuare esančių žuvų. Rytą nerštui pradėti įjungiama silpna šviesa. Po 2-4 valandų žuvys išimamos ir surenkami ikrai. Jei ikrų reikia daugiau nei gali išneršti viena patelė, lygiagrečiai galima įrengti pakankamą skaičių rezervuarų. Jei prieš bandymą buvo registruota kiekvienos patelės reprodukcijos geba (partijos dydis ir kokybė), nerštui galima atrinkti geriausios reprodukcijos gebos pateles.
                  
               Ikrai turi būti pernešti į bandymo indus naudojant stiklinius vamzdelius (vidinis skersmuo ne mažesnis kaip 4 mm), turinčius lanksčias siurbimo kriaušes. Su ikrais pernešamo vandens turi būti kuo mažiau. Ikrai yra sunkesni kaip vanduo ir iškrenta iš vamzdelio. Reikia žiūrėti, kad ikrams (ir lervoms) nepatektų oro. Siekiant užtikrinti, kad pradinėse vystymosi stadijose nebūtų nukrypimų nuo normos, ikrų partijų ėminiai turi būti ištirti mikroskopu. Ikrų dezinfekuoti negalima.
         Ikrų daugiausia žūva per pirmąsias 24 h po apvaisinimo. Šiuo laikotarpiu dažnai jų žūva 5-40 % Ikrai išsigimsta dėl nesėkmingo apvaisinimo ar dėl nenormalaus vystymosi. Atrodo, kad ikrų partijos kokybė priklauso nuo patelių, nes kai kurios patelės visą laiką neršia geros kokybės ikrus, o kitoms tai niekuomet nepavyksta. Skiriasi ikrų partijų vystymosi greitis ir išsiritimo trukmė. Sėkmingai apvaisintų ikrų ir lervų su trynio maišeliu išliekamumas yra geras, paprastai didesnis kaip 90 %. Esant 25 oC temperatūrai lervos išsirita per 3-5 paras po apvaisinimo, o trynio maišelis absorbuojamas maždaug per 13 parų po apvaisinimo.
         Embrioninį vystymąsi gerai aprašė Hisaoka ir Battle (2). Dėl ikrų ir išsiritusių lervų permatomumo žuvies vystymąsi galima sekti ir pastebėti išsigimimus. Praėjus maždaug keturioms valandoms po neršto neapvaisintus ikrus galima atskirti nuo apvaisintų (3). Šiam tyrimui ikrai ir lervos dedami į mažo tūrio bandymo indus ir tiriami mikroskopu.
         Ankstyvosioms gyvenimo stadijoms taikomos bandymo sąlygos išvardytos 2 priedėlyje. Optimalios praskiedimo vandens pH ir kietumo vertės yra atitinkamai lygios 7,8 ir 250 mg CaC03/l.
         APSKAIČIAVIMAI IR STATISTIKA
         Siūlomas dviejų stadijų metodas. Iš pradžių statistiškai analizuojami gaištamumas, nenormalaus vystymosi ir išsiritimo trukmės duomenys. Vėliau toms koncentracijoms, kurioms esant neigiamo poveikio šiems parametrams nebuvo aptikta, statistiškai įvertinamas kūno ilgis. Siūloma taikyti šį metodą, nes nuo toksiškos medžiagos gali selektyviai žūti kai kurios mažesnės žuvys, vėluoti išsiritimo laikas ir atsirasti akivaizdžių išsigimimų, taigi dėl to gali būti netikslūs ilgio matavimai. Be to, kiekvienam veikimui reikės išmatuoti maždaug tokį pat skaičių žuvų, ir taip bus garantuotas bandymo statistikos validumas.
         LC50 IR EC50 NUSTATYMAS
         Išgyvenusių ikrų ir lervų procentinė dalis darant pataisą dėl gaištamumo kontroliniuose bandiniuose apskaičiuojama pagal Abbotto formulę (4):
         
            
         čia,
         
                     P
                  
                  
                     =
                  
                  
                     pataisyta
                  
               
                     P'
                  
                  
                     =
                  
                  
                     bandomajai koncentracijai stebėta išgyvenamumo vertė %
                  
               
                     C
                  
                  
                     =
                  
                  
                     kontroliniams bandiniams stebėta išgyvenamumo vertė
                  
               Jei įmanoma, bandymo pabaigoje tinkamu metodu nustatoma LC50.
         Jei vertinant EC50 į statistiką norima įtraukti morfologines anomalijas, rekomendacijų galima rasti Stephan darbe (5).
         LOEC IR NOEC ĮVERTINIMAS
         Ikrų ir mailiaus su trynio maišeliu bandymo tikslas – nenulines koncentracijos vertes palyginti su kontroliniais bandiniais, t. y. nustatyti LOEC. Taigi turi būti taikomos visuotinio palyginimo (multiple comparison) metodikos (6) (7) (8) (9) (10).
         NUORODOS
         
                     1)
                  
                  
                     Laale H.W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish {Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, p. 121–173.
                  
               
                     2)
                  
                  
                     Hisaoka K.K. and Battle H.I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, p. 311.
                  
               
                     3)
                  
                  
                     Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabarbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 2, p. 173–181.
                  
               
                     4)
                  
                  
                     Finney D.J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, p. 1–333.
                  
               
                     5)
                  
                  
                     Stephan C.E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J.G. Pearson, R.B. Foster and W.E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, p. 69–81.
                  
               
                     6)
                  
                  
                     Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, p. 1096–1121.
                  
               
                     7)
                  
                  
                     Dunnett C.W. (1964) New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, p. 482–491.
                  
               
                     8)
                  
                  
                     Williams D.A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, p. 103–117.
                  
               
                     9)
                  
                  
                     Williams D.A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. Biometrics 28, p. 519–531.
                  
               
                     10)
                  
                  
                     Sokal R.R. and Rohlf F.J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W.H. Freeman and Co., San Francisco.
                  
               
      
         2 Priedėlis
         REKOMENDUOJAMŲ RŪŠIŲ BANDYMŲ SĄLYGOS, TRUKMĖ IR IŠGYVENAMUMO KRITERIJAI
         
                     Rūšis
                  
                  
                     Temp eratūr a
                     ( °C)
                  
                  
                     Sūrumas
                     (0/00)
                  
                  
                     Apšviet imo trukmė
                     (valandos)
                  
                  
                     Stadijų trukmė
                     (paros)
                  
                  
                     Tipiška bandymo trukmė
                  
                  
                     Isgyvenamumas kontroliniuose bandiniuose
                     (ne mažesnis kaip %)
                  
               
                     Embrion as
                  
                  
                     Mailius su trynio maišeliu
                  
                  
                     Išsiritimo sėkmė
                  
                  
                     Po išsiritimo
                  
               
                     GĖLAVANDENĖS
                  
               
                     
                        Brachydanio rerio
                     
                     Dryžuotasis danio
                  
                  
                     25 ± 1
                  
                  
                     —
                  
                  
                     12 – 16
                  
                  
                     3 – 5
                  
                  
                     8 – 10
                  
                  
                     Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 5 parų po išsiritimo (8-10 parų)
                  
                  
                     80
                  
                  
                     90
                  
               
                     
                        Oncorhynchus mykiss
                     
                     Vaivorykštinis upėtakis
                  
                  
                     10 ± 1 (22)
                     
                     12 ± 1 (23)
                     
                  
                  
                     —
                  
                  
                     0 (24)
                     
                  
                  
                     30 – 35
                  
                  
                     25 – 30
                  
                  
                     Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 20 parų po išsiritimo (50-55 paros)
                  
                  
                     66
                  
                  
                     70
                  
               
                     
                        Cyprinus carpio
                     
                     Paprastasis karpis
                  
                  
                     21 – 25
                  
                  
                     —
                  
                  
                     12 – 16
                  
                  
                     5
                  
                  
                     > 4
                  
                  
                     Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 parų po išsiritimo (8-9 paros)
                  
                  
                     80
                  
                  
                     75
                  
               
                     
                        Oryzias latipes
                     
                     Japanese ricefish/Medaka
                  
                  
                     24 ± 1 (22)
                     
                     23 ± 1 (23)
                     
                  
                  
                     —
                  
                  
                     12 – 16
                  
                  
                     8 – 11
                  
                  
                     4 – 8
                  
                  
                     Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 5 parų po išsiritimo (13-16 parų)
                  
                  
                     80
                  
                  
                     80
                  
               
                     
                        Pimephales promelas
                     
                     Raine
                  
                  
                     25 ± 2
                  
                  
                     —
                  
                  
                     16
                  
                  
                     4 – 5
                  
                  
                     5
                  
                  
                     Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 parų po išsiritimo (8-9 paros)
                  
                  
                     60
                  
                  
                     70
                  
               
      
         3 Priedėlis
         Kitų dokumentais tinkamai patvirtintų rūšių bandymų sąlygos, trukmė ir išgyvenamumo kriterijai
         
                     Rūšis
                  
                  
                     Tem perat ūra ( oC)
                  
                  
                     Sūrumas (0/00)
                  
                  
                     Apšvietimo trukmė (valandos)
                  
                  
                     Stadijų trukmė (paros)
                  
                  
                     Tipiška embriono ir mailiaus su trynio maišelių bandymo trukmė
                  
                  
                     Kontrolinių bandinių išgyvenamumas (ne mažesnis kaip %)
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Embrio nas
                  
                  
                     Mailiaus su trynio maišeliu bandym as
                  
                  
                     Išsiritimo sėkmė
                  
                  
                     Po išsiritimo
                  
               
                     GĖLAVANDEN ES
                  
               
                     
                        Carassius auratus
                     
                     Sidabrinis karosas
                  
                  
                     24 ± 1
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     3 – 4
                  
                  
                     > 4
                  
                  
                     Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 parų po išsiritimo (7 paros)
                  
                  
                     —
                  
                  
                     80
                  
               
                     
                        Leopomis macrochirus
                     
                     Blugill sunfish
                  
                  
                     21 ± 1
                  
                  
                     —
                  
                  
                     16
                  
                  
                     3
                  
                  
                     > 4
                  
                  
                     Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4 parų po išsiritimo (7 paros)
                  
                  
                     —
                  
                  
                     75
                  
               
                     JŪROS
                  
               
                     
                        Menidia peninsulae
                     
                     Tidewater silverside
                  
                  
                     22 –25
                  
                  
                     15 – 22
                  
                  
                     12
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     10
                  
                  
                     Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 5 parų po išsiritimo (6-7 paros)
                  
                  
                     80
                  
                  
                     60
                  
               
                     
                        Clupea harengus
                     
                     Silkė
                  
                  
                     10 ± 1
                  
                  
                     8 – 15
                  
                  
                     12
                  
                  
                     20 – 25
                  
                  
                     3 – 5
                  
                  
                     Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 3 parų po išsiritimo (23-27 paros)
                  
                  
                     60
                  
                  
                     80
                  
               
                     
                        Gadus morhua
                     
                     Menke
                  
                  
                     5 ± 1
                  
                  
                     5 – 30
                  
                  
                     12
                  
                  
                     14 – 16
                  
                  
                     3 – 5
                  
                  
                     Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 3 parų po išsiritimo (18 parų)
                  
                  
                     60
                  
                  
                     80
                  
               
                     
                        Cyprinodon variegatus
                     
                     Sheepshead minnow
                  
                  
                     25 ± 1
                  
                  
                     15 – 30
                  
                  
                     12
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     Kiek įmanoma greičiau po apvaisinimo (ankstyvoji gastrulės stadija) iki 4/7 parų po išsiritimo (28 paros)
                  
                  
                     > 75
                  
                  
                     80
                  
               
      
         4 PRIEDAS
         KAI KURIOS TINKAMO SKIEDIMO VANDENS CHEMINĖS CHARAKTERISTIKOS
         
                     Medžiaga
                  
                  
                     Koncentracija
                  
               
                     Kietosios daleles
                  
                  
                     < 20 mg/l
                  
               
                     Bendra organine anglis
                  
                  
                     < 2 mg/l
                  
               
                     Nejonizuotas amoniakas
                  
                  
                     < 1 μg/l
                  
               
                     Liekamasis chloras
                  
                  
                     < 10 μg/l
                  
               
                     Bendras fosforo organinių pesticidų kiekis
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     Bendras chloro organinių pesticidų ir polichlorintų difenilų kiekis
                  
                  
                     < 50 ng/1
                  
               
                     Bendras organinis chloras
                  
                  
                     < 25 ng/1
                  
               
      C.16.   NAMINĖS BITĖS. ŪMAUS ORALINIO TOKSIŠKUMO BANDYMAS
      1.   METODAS
      Šis ūmaus toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 213 (1998) kopija.
      1.1.   ĮVADAS
      Šis toksiškumo bandymas yra laboratorinis metodas, skirtas įvertinti augalų apsaugos priemonių ir kitų cheminių medžiagų ūmų oralinį toksiškumą suaugusioms naminėms bitėms darbininkėms.
      Vertinant ir nustatant cheminių medžiagų toksiškumo charakteristikas, gali būti reikalinga nustatyti ūmų oralinį toksiškumą naminėms bitėms, pvz., kai galimas naminių bičių veikimas chemine medžiaga. Ūmaus oralinio toksiškumo bandymas daromas norint nustatyti pesticidų ir kitų cheminių medžiagų būdingą toksiškumą bitėms. Šio bandymo rezultatai turėtų būti naudojami pesticidų pavojaus bitėms vertinimo programose pagal seką nuo laboratorinių toksiškumo bandymų iki bandymų pusiau lauko ir lauko sąlygomis (1). Pesticidai gali būti bandomi kaip aktyviosios medžiagos (a. m.) ar kaip preparatai.
      Turi būti vartojamas toksiškumo etalonas bičių jautrumui ir bandymo metodo preciziškumui tikrinti.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI
      
         Ūmus oralinis toksiškumas – neigiami poveikiai, kurie pasireiškia ne vėliau kaip po 96 valandų (h) davus vienkartinę bandomosios medžiagos dozę.
      
         Dozė – suvartotos medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama kaip bandomosios medžiagos masė (ųg) vienam bandomajam gyvūnui (ųg/bitei). Tikroji dozė kiekvienai bitei negali būti apskaičiuota, nes bitės šeriamos kartu, tačiau galima įvertinti vidutinę dozę (bendras bandomosios medžiagos suvartotas kiekis/bandomųjų bičių skaičius viename narvelyje).
      
         Oralinė LD
         
            50
         
         (medianinė letali dozė) – yra statistiškai apskaičiuota vienkartinė medžiagos dozė, kurią duodant per burną gali žūti 50 % gyvūnų. LD50 vertė yra išreiškiama (ųg) bandomosios medžiagos vienai bitei. Jei tai pesticidai, bandomoji medžiaga gali būti aktyvioji medžiaga (a. m.) ar preparatas, kuriame yra viena ar daugiau kaip viena aktyvioji medžiaga.
      
         Gaištamumas – gyvūnas registruojamas kaip žuvęs, kai jis visiškai nejuda.
      1.3.   BANDYMO METODO ESMĖ
      Taikant tam tikrą dozių diapazoną, suaugusios naminės bitės darbininkės (Apis mellifera) yra veikiamos sacharozės tirpale ištirpinta bandomąja medžiaga. Toliau bitės maitinamos tuo pačiu maistu be bandomosios medžiagos. Gaištamumas registruojamas kasdien bent 48 h ir lyginamas su gaištamumo kontroliniuose bandiniuose vertėmis. Jei gaištamumas didėja 24-48 h laikotarpiu, o gaištamumas kontroliniuose bandiniuose lieka priimto lygio, t. y. < 10 %, bandymą reikia tęsti ne ilgiau kaip iki 96 h. Rezultatai analizuojami LD50 po 24 h ir 48 h, o jei bandymas tęsiamas, po 72 h ir 96 h apskaičiuoti.
      1.4.   BANDYMO VALIDUMAS
      Bandymas yra validus, jei galioja šios sąlygos:
      
                  —
               
               
                  baigiant bandymą vidutinis gaištamumas visuose kontroliniuose bandiniuose turi būti ne didesnis kaip 10 %;
               
            
                  —
               
               
                  toksiškumo etalono LD50 atitinka apibrėžtą diapazoną.
               
            1.5.   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.5.1.   Bičių rinkimas
      Turi būti naudojamos jaunos suaugusios tos pačios veislės bitės darbininkės, t. y. to paties amžiaus, vienodai maitinamos ir t. t. Bitės turi būti gaunamos iš tinkamai maitinamų, sveikų, kiek įmanoma be ligų ir vienos motinėlės kolonijų, kurių istorija ir fiziologinė būsena yra žinoma. Jos gali būti renkamos tą rytą, kai numatoma naudoti, ar vakare prieš bandymą ir laikomos bandymo sąlygomis iki kitos dienos. Tinka iš rėmų surinktos bitės be perų. Reikia vengti rinkti bites ankstyvą pavasarį ar vėlyvą rudenį, nes tokiu metu keičiasi bičių fiziologija. Jei bandymai turi būti daromi anksti pavasarį ar vėlai rudenį, bitės gali būti užaugintos inkubatoriuje ir vieną savaitę maitinamos bičių duonele (nuo korio surinktomis žiedadulkėmis) ir sacharozės tirpalu. Bitės, apdorotos cheminėmis medžiagomis, pvz., antibiotikais, preparatais varaozei gydyti ir t. t., toksiškumo bandymams neturėtų būti naudojamos, jei po apdorojimo paskutinį kartą dar nėra praėję keturių savaičių.
      1.5.2.   Laikymo ir maitinimo sąlygos
      Naudojami lengvai plaunami ir gerai vėdinami narveliai. Galima naudoti bet kurios tinkamos medžiagos, pvz., nerūdijančio plieno, vielos tinklelio, plastiko, vienkartinius medinius narvelius ir t. t. Geriau naudoti 10 bičių vienam narveliui grupes. Narvelių dydis turi atitikti bičių skaičių, t. y. joms reikia palikti pakankamai vietos.
      Bitės bandymų patalpoje turi būti laikomos tamsoje esant 25 ± 2 oC temperatūrai. Santykinis drėgnis, paprastai apie 50–70 %, turi būti registruojamas per visą bandymą. Bičių tvarkymo procedūras, įskaitant apdorojimą ir stebėjimus, galima daryti (dienos) šviesoje. Maistą sudaro sacharozės vandeninis tirpalas, kurio galutinė koncentracija yra 500 g/l (50 % w/v). Sudavus bandymo dozes maitinama pasirinktinu laiku. Maitinimo įtaisas turi leisti registruoti maisto tiekimą į kiekvieną narvelį. Galima naudoti stiklinį mėgintuvėlį (maždaug 50 mm ilgio ir 10 mm pločio, kurio atviras galas susiaurinamas maždaug iki 2 mm skersmens).
      1.5.3.   Bičių ruošimas
      Surinktos bitės yra atsitiktinai paskirstomos į bandymo narvelius, kurie atsitiktinai išdėstomi bandymų patalpoje.
      Prieš bandymo pradžią bitės gali būti nemaitintos ne daugiau kaip 2 h. Rekomenduojama prieš apdorojimą bičių nemaitinti, kad bandymo pradžioje visų bičių virškinimo traktas būtų vienodai apkrautas. Prieš pradedant bandymą gaištančios bitės turi būti pašalintos ir pakeistos sveikomis.
      1.5.4.   Dozių ruošimas
      Jei bandomoji medžiaga yra su vandeniu maišomas junginys, ją galima tiesiogiai disperguoti 50 % sacharozės tirpale. Vandenyje blogai tirpiems techninės paskirties produktams ir medžiagoms galima naudoti bitėms mažai toksiškus nešiklius, pvz., organinį tirpiklį, emulsiklius ar dispergatorius (pvz., acetoną, dimetilformamidą, dimetilsulfoksidą). Nešiklio koncentracija priklauso nuo bandomosios medžiagos tirpumo ir turi būti vienoda visoms bandytoms koncentracijoms. Tačiau paprastai nešiklio koncentracija yra apie 1 % ir didesnės naudoti nereikėtų.
      Turi būti paruošti atitinkami kontroliniai tirpalai, t. y., jei bandomajai medžiagai soliubilizuoti naudojamas tirpiklis ar dispergatorius, turi būti naudojamos dvi atskiros kontrolinių bandinių grupės: vienas dozavimo tirpalų koncentracijos tirpiklio/nešiklio tirpalas vandenyje ir vienas sacharozės tirpale.
      1.6.   BANDYMO EIGA
      1.6.1.   Bandymų ir kontrolinės grupės
      Dozių ir lygiagrečių bandinių skaičius turi atitikti statistinius LD50 nustatymo reikalavimus esant 95 % pasikliovimo rėžiams. Paprastai bandymui reikia penkių LD50 diapazono dozių, išdėstytų pagal geometrinę progresiją, kurios koeficientas būtų ne didesnis kaip 2,2. Tačiau skiedimo faktorius ir dozavimui naudojamų koncentracijų skaičius turi būti nustatyti pagal toksiškumo kreivės (gaištamumas kaip dozės funkcija) krypties koeficientą ir atsižvelgiant į rezultatams analizuoti pasirinktą statistinį metodą. Dozavimui tinkamas koncentracijas galima pasirinkti pagal diapazono nustatymo bandymo rezultatus.
      Kiekvienos bandymo koncentracijos dozę turi gauti ne mažiau kaip trys bandymų grupės po 10 bičių. Be bandomosios serijos, turi būti bandomos ne mažiau kaip trys kontrolinės grupės po 10 bičių. Kontrolinės grupės taip pat turi būti įtrauktos ir naudojamiems tirpikliams/nešikliams (žr. 1.5.4 skirsnį).
      1.6.2.   Toksiškumo etalonas
      Į bandymų seriją turi būti įtrauktas toksiškumo etalonas. Kiekvienai bandomajai dozei turėtų būti bent trys narveliai su 10 bičių kiekviename narvelyje. Kaip toksiškumo etaloną geriau naudoti dimetoatą, kuriam literatūroje nurodytas oralinės LD50 24 h vertės diapazonas yra 0,10-0,35 ųg aktyviosios medžiagos vienai bitei (2). Tačiau būtų priimtini ir kiti toksiškumo etalonai, jei būtų pateikta pakankamai duomenų laukiamam atsakui į dozės poveikį patikrinti (pvz., parationas).
      1.6.3.   Veikimas
      1.6.3.1.   Dozių davimas
      Kiekvienai bičių bandymo grupei turi būti duodama 100-200 μl 50 % sacharozės vandeninio tirpalo, kuriame būtų reikiamos koncentracijos bandomoji medžiaga. Blogai tirpiems, mažo toksiškumo produktams ar mažos koncentracijos preparatams reikalingas didesnis tūris, nes turi būti sunaudota didesnė sacharozės tirpalo dalis. Turi būti kontroliuojamas grupės suvartotas apdoroto maisto kiekis. Maistą suvartojus (paprastai per 3–4 h), maitinimo įtaisas turi būti pašalintas iš narvelio ir pakeistas maitinimo įtaisu vien tik su sacharozės tirpalu. Toliau sacharozės tirpalai duodami pasirinktinu laiku. Esant kai kurių junginių didesnei koncentracijai, maisto gali būti suvartota mažai arba bitės gali jį visiškai atmesti. Ne vėliau kaip po 6 h nesuvartotas apdorotas maistas turi būti pakeistas vien tik sacharozės tirpalu. Turi būti įvertintas nesuvartoto apdoroto maisto kiekis (pvz., matuojant nesuvartoto apdoroto maisto tūrį arba masę).
      1.6.3.2.   Trukmė
      Geriausia bandymo trukmė po to, kai bandomasis tirpalas pakeičiamas vien tik sacharozės tirpalu, yra 48 h. Jei gaištamumas po pirmųjų 24 h vis dar didėja daugiau kaip 10 %, bandymo trukmė turi būti prailginta ne daugiau kaip iki 96 h, jei gaištamumas kontroliniuose bandiniuose yra ne didesnis kaip 10 %.
      1.6.4.   Stebėjimai
      Gaištamumas registruojamas po 4 h nuo bandymo pradžios, o vėliau po 24 h ir 48 h (t. y. po dozės davimo). Jei reikalingas prailgintas stebėjimo laikotarpis, tolesni vertinimai turi būti daromi kas 24 h ne ilgiau kaip iki 96 h, jei gaištamumas kontroliniuose bandiniuose yra ne didesnis kaip 10 %.
      Turi būti įvertintas grupės suvartoto maisto kiekis. Apdoroto ir neapdoroto maisto vartojimo greičio per 6 h lyginimas gali suteikti informacijos apie apdoroto maisto priimtinumą.
      Turi būti registruojami visi bandymo metu pastebėti neįprasto elgesio reiškiniai.
      1.6.5.   Ribinis bandymas
      Kartais (pvz., kai manoma, kad bandomosios medžiagos toksiškumas turėtų būti mažas) galima daryti ribinį bandymą naudojant 100 μg aktyviosios medžiagos vienai bitei, taip norint parodyti, kad LD50 yra didesnė už šią vertę. Turi būti naudojama ta pati metodika, įskaitant tris lygiagrečias bandymų grupes bandomajai dozei, atitinkamus kontrolinius bandinius ir toksiškumo etaloną. Jei pasitaiko gaišimo atvejų, turi būti daromas visas tyrimas. Jei pastebimi subletalūs poveikiai (žr. 1.6.4 skirsnį), jie turi būti užregistruoti.
      2.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      2.1.   DUOMENYS
      Duomenys turėtų būti apibendrinti lentelių pavidalu, kiekvienos dozės grupei, taip pat kontrolinių bandinių ir toksiškumo etalono grupėms nurodant naudotų bičių skaičių, gaištamumą kiekvienu stebėjimo momentu ir neįprastai besielgiančių bičių skaičių. Gaištamumo duomenis analizuokite atitinkamais analizės metodais (pvz., probito funkcijos analizė, slenkamasis vidurkis, binominio skirstinio tikimybė) (3) (4). Nubraižykite atsako, kaip dozės funkcijos, kreives kiekvienam rekomenduotam stebėjimo momentui (t. y. 24 h, 48 h ir, jei tinka, 72 h, 96 h) ir apskaičiuokite kreivių krypties koeficientus ir medianines letalias dozes (LD50) su 95 % pasikliovimo rėžiais. Galima padaryti pataisas dėl gaištamumo kontroliniuose bandiniuose naudojant Abbotto pataisą (4) (5). Jei apdorotas maistas suvartojamas nevisiškai, turi būti nustatyta grupės suvartota bandomosios medžiagos dozė. LD50 turi būti išreikšta μg bandomosios medžiagos vienai bitei.
      2.2.   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje turi būti ši informacija:
      2.2.1.   Bandomoji medžiaga:
      
                  —
               
               
                  fizikinė būsena ir atitinkamos fizikocheminės savybės (pvz., stabilumas vandenyje, garų slėgis),
               
            
                  —
               
               
                  cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant struktūrinę formulę, grynumą (t. y., pesticidams – identiškumas ir aktyviosios (-ųjų) medžiagos (-ų) koncentracija).
               
            2.2.2.   Bandymų gyvūnai:
      
                  —
               
               
                  mokslinis pavadinimas, veislė, apytikris amžius (savaitėmis), rinkimo būdas, rinkimo data;
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie bandymų bičių rinkimui naudotas kolonijas, įskaitant sveikatą, visas suaugusių bičių ligas, prieš tai taikytą apdorojimą ir t.t.
               
            2.2.3.   Bandymo sąlygos:
      
                  —
               
               
                  bandymo patalpos temperatūra ir santykinis drėgnis;
               
            
                  —
               
               
                  laikymo sąlygos, įskaitant narvelių tipą, dydį ir medžiagą;
               
            
                  —
               
               
                  pradinių ir bandomųjų tirpalų ruošimo būdai (turi būti nurodytas tirpiklis, jei naudojamas, ir jo koncentracija);
               
            
                  —
               
               
                  bandymo planas, pvz., naudotos bandomosios koncentracijos ir jų skaičius, kontrolinių bandinių skaičius; kiekvienai bandomajai koncentracijai ir kontroliniam bandiniui naudotų narvelių skaičius ir bičių skaičius viename narvelyje;
               
            
                  —
               
               
                  bandymo data.
               
            2.2.4.   Rezultatai:
      
                  —
               
               
                  parengtinio diapazono nustatymo tyrimo, jei darytas, rezultatai;
               
            
                  —
               
               
                  neapdoroti duomenys: gaištamumas po kiekvienos bandytos dozės ir kiekvienu stebėjimo momentu;
               
            
                  —
               
               
                  dozės ir atsako kreivių brėžinys baigiant bandymą;
               
            
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos ir toksiškumo etalono LD50 vertės su 95 % pasikliovimo rėžiais, nustatytos kiekvienu rekomenduotu stebėjimo momentu;
               
            
                  —
               
               
                  LD50 nustatymui taikyti statistiniai metodai;
               
            
                  —
               
               
                  gaištamumas kontroliniuose bandiniuose;
               
            
                  —
               
               
                  kiti stebėti ar išmatuoti biologiniai poveikiai, pvz., bičių neįprastas elgesys (įskaitant bandomosios dozės atmetimą), maisto vartojimo greitis apdorotų ir neapdorotų bičių grupėse;
               
            
                  —
               
               
                  visi nukrypimai nuo čia aprašytų bandymo metodikų ir visa kita reikalinga informacija.
               
            3.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151-165. March 1993.
               
            
                  2)
               
               
                  Gough, H. J., Mclndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal of Apicultural Research ,22, 119-125.
               
            
                  3)
               
               
                  Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol, and Exper. Then, 96, 99-113.
               
            
                  4)
               
               
                  Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
               
            
                  5)
               
               
                  Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol.,18, 265-267.
               
            C.17.   NAMINĖS BITĖS – ŪMAUS TOKSIŠKUMO DĖL SĄLYČIO BANDYMAS
      1.   METODAS
      Sis ūmaus toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 214 (1998) kopija.
      1.1.   ĮVADAS
      Šis toksiškumo bandymas yra laboratorinis metodas, skirtas įvertinti augalų apsaugos priemonių ir kitų cheminių medžiagų ūmų toksiškumą dėl sąlyčio suaugusioms naminėms bitėms darbininkėms.
      Vertinant ir nustatant cheminių medžiagų toksiškumo charakteristikas, gali būti reikalinga nustatyti ūmų toksiškumą dėl sąlyčio naminėms bitėms, pvz., kai yra galimas naminių bičių veikimas chemine medžiaga. Ūmaus oralinio toksiškumo bandymas daromas norint nustatyti pesticidų ir kitų cheminių medžiagų būdingą toksiškumą bitėms. Šio bandymo rezultatai turėtų būti naudojami pesticidų pavojaus bitėms vertinimo programose pagal seką nuo laboratorinių toksiškumo bandymų iki bandymų pusiau lauko ir lauko sąlygomis (1). Pesticidai gali būti bandomi kaip aktyviosios medžiagos (a. m.) ar kaip preparatai.
      Turi būti vartojamas toksiškumo etalonas bičių jautrumui ir bandymo metodo preciziškumui tikrinti
      1.2.   APIBRĖŽIMAI
      
         Ūmus toksiškumas dėl sąlyčio – neigiami poveikiai, kurie pasireiškia ne vėliau kaip per 96 h po vienkartinės bandomosios medžiagos dozės vietinio uždėjimo.
      
         Dozė – uždėtos medžiagos kiekis. Dozė yra išreiškiama kaip bandomosios medžiagos masė (ug) vienam bandymų gyvūnui (μg/bitei).
      
         Sąlyčio LD
         
            50
         
         (medianinė letali dozė) – yra statistiškai apskaičiuota vienkartinė medžiagos dozė, kurią naudojant gali žūti 50 % gyvūnų. LD50 vertė yra išreiškiama (ug) bandomosios medžiagos vienai bitei. Jei tai pesticidai, bandomoji medžiaga gali būti aktyvioji medžiaga (a. m.) ar preparatas, kuriame yra viena ar daugiau kaip viena aktyvioji medžiaga.
      
         Gaištamumas – gyvūnas registruojamas kaip žuvęs, kai jis visiškai nejuda.
      1.3.   BANDYMO METODO ESMĖ
      Taikant tam tikrą dozių diapazoną, suaugusios naminės bitės darbininkės (Apis mellifera) yra veikiamos tinkamame nešiklyje ištirpinta bandomąja medžiaga ją tiesiogiai užlašinant ant torakso (lašeliais). Bandymo trukmė yra 48 h. Jei gaištamumas per 24-48 h didėja, o gaištamumas kontroliniuose bandiniuose lieka priimto lygio, t. y. < 10 %, bandymą reikia tęsti ne ilgiau kaip iki 96 h. Gaištamumas registruojamas kasdien ir lyginamas su gaištamumo kontroliniuose bandiniuose vertėmis. Rezultatai yra analizuojami LD50 po 24 h ir 48 h, o jei bandymas yra tęsiamas, po 72 h ir 96 h apskaičiuoti.
      1.4.   BANDYMO VALIDUMAS
      Bandymas yra validus, jei galioja šios sąlygos:
      
                  —
               
               
                  baigiant bandymą vidutinis gaištamumas visuose kontroliniuose bandiniuose turi būti ne didesnis kaip 10 %;
               
            
                  —
               
               
                  toksiškumo etalono LD50 atitinka apibrėžtą diapazoną.
               
            1.5.   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.5.1.   Bičių rinkimas
      Turi būti naudojamos jaunos suaugusios bitės darbininkės, t. y. to paties amžiaus, vienodai maitinamos, tos pačios veislės ir t. t. Bitės turi būti gaunamos iš tinkamai maitinamų, sveikų, kiek įmanoma be ligų ir vienos motinėlės kolonijų, kurių istorija ir fiziologinė būsena yra žinoma. Jos gali būti renkamos tą rytą, kai numatomos naudoti, ar vakare prieš bandymą ir laikomos bandymo sąlygomis iki kitos dienos. Tinka iš rėmų surinktos bitės be perų. Reikėtų vengti rinkti bites ankstyvą pavasarį ar vėlyvą rudenį, nes tokiu metu keičiasi bičių fiziologija. Jei bandymai turi būti daromi anksti pavasarį ar vėlai rudenį, bitės gali būti užaugintos inkubatoriuje ir vieną savaitę maitinamos bičių duonele (nuo korio surinktomis žiedadulkėmis) ir sacharozės tirpalu. Bitės, apdorotos cheminėmis medžiagomis, pvz., antibiotikais, preparatais varaozei gydyti ir t. t., toksiškumo bandymams neturėtų būti naudojamos, jei po apdorojimo paskutinį kartą dar nėra praėję keturių savaičių.
      1.5.2.   Laikymo ir maitinimo sąlygos
      Naudojami lengvai plaunami ir gerai vėdinami narveliai. Galima naudoti bet kurios tinkamos medžiagos, pvz., nerūdijančio plieno, vielos tinklelio, plastiko, vienkartinius medinius narvelius ir t. t. Narvelių dydis turi atitikti bičių skaičių, t. y. joms reikia palikti pakankamai vietos. Geriau naudoti dešimties bičių vienam narveliui grupes.
      Bitės bandymų patalpoje turi būti laikomos tamsoje esant 25 ± 2 oC temperatūrai. Santykinis drėgnis, paprastai apie 50–70 %, turi būti registruojamas per visą bandymą. Bičių tvarkymo procedūras, įskaitant apdorojimą ir stebėjimus, galima daryti (dienos) šviesoje. Maistą sudaro sacharozės vandeninis tirpalas, kurio galutinė koncentracija yra 500 g/l (50 % w/v), duodamas pasirinktinu laiku per visą bandymą naudojant bičių maitinimo įtaisą. Tai gali būti stiklinis mėgintuvėlis (maždaug 50 mm ilgio ir 10 mm pločio, kurio atviras galas susiaurinamas maždaug iki 2 mm skersmens)
      1.5.3.   Bičių ruošimas
      Surinktos bitės gali būti apmarintos anglies dioksidu ar azotu, kad būtų galima uždėti bandomąją medžiagą. Anestezuojančios medžiagos kiekis ir veikimo trukmė turi būti kiek įmanoma mažesni. Prieš pradedant bandymą gaištančios bitės turi būti pašalintos ir pakeistos sveikomis.
      1.5.4.   Dozių ruošimas
      Bandomoji medžiaga turi būti užlašinama tirpalo nešiklyje pavidalu, t. y. ištirpinta organiniame tirpiklyje ar vandenyje, turinčiame drėkiklio. Kaip organinį tirpiklį geriau būtų naudoti acetoną, tačiau galima naudoti kitus bitėms mažai toksiškus tirpiklius (pvz., dimetilformamidą, dimetilsulfoksidą). Jei tai vandenyje disperguoti cheminiai preparatai ir organiniuose tirpikliuose netirpios labai polinės organinės medžiagos, būtų lengviau užlašinti nedidelės koncentracijos prekybiniame drėkiklyje (pvz., Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween) paruoštus tirpalus.
      Turi būti paruošti atitinkami kontroliniai tirpalai, t. y., jei bandomajai medžiagai soliubilizuoti naudojamas tirpiklis ar dispergatorius, turi būti naudojamos dvi atskiros kontrolinių bandinių grupės: vienos grupės bitės apdorojamos vandeniu, kitos grupės bitės tirpikliu/nešikliu
      1.6.   BANDYMO EIGA
      1.6.1.   Bandymų ir kontrolinės grupės
      Dozių ir lygiagrečių bandinių skaičius turi atitikti statistinius LD50 nustatymo reikalavimus esant 95 % pasikliovimo rėžiams. Paprastai bandymui reikia penkių LD50 diapazono dozių, išdėstytų geometrine progresija, kurios koeficientas būtų ne didesnis kaip 2,2. Tačiau skiedimo faktorius ir dozavimui naudojamų koncentracijų skaičius turi būti nustatyti pagal toksiškumo kreivės (gaištamumas kaip dozės funkcija) krypties koeficientą ir atsižvelgiant į rezultatams analizuoti pasirinktą statistinį metodą. Dozavimui tinkamas koncentracijas galima pasirinkti pagal diapazono nustatymo bandymo rezultatus.
      Kiekvienai bandymo koncentracijai dozę turi gauti ne mažiau kaip trys bandymų grupės po 10 bičių.
      Be bandomosios serijos, turi būti bandomos trys kontrolinės grupės po 10 bičių. Jei naudojamas organinis tirpiklis ar drėkiklis, tirpikliui ar drėkikliui turi būti naudojamos papildomos trys kontrolinės grupės, kurių kiekvienoje būtų po 10 bičių
      1.6.2.   Toksiškumo etalonas
      Į bandymų seriją turi būti įtrauktas toksiškumo etalonas. Laukiamai LD50 dozei apimti turi būti pasirenkamos bent trys dozės. Kiekvienai bandomajai dozei turi būti bent trys narveliai su 10 bičių kiekviename narvelyje. Kaip toksiškumo etaloną geriau naudoti dimetoatą, kuriam literatūroje nurodytas sąlyčio LD50 24 h vertės diapazonas yra 0,10-0,30 μg aktyviosios medžiagos vienai bitei (2). Tačiau būtų priimtini ir kiti toksiškumo etalonai, jei būtų pateikta pakankamai duomenų laukiamam atsakui į dozės poveikį patikrinti (pvz., parationas).
      1.6.3.   Veikimas
      1.6.3.1.   Dozių davimas
      Apmarintos bitės apdorojamos atskirai darant vietinį užlašinimą. Bitės skirtingoms bandomosioms dozėms ir kontroliniams bandiniams paskirstomos atsitiktinai. Ant kiekvienos bitės torakso dorsalinės pusės mikropipete užlašinamas 1 μl tinkamos koncentracijos bandomosios medžiagos tirpalo. Galima naudoti kitokius tūrius, jei tai bus pagrįsta. Po užlašinimo bitės paskirstomos po narvelius ir joms duodama sacharozės tirpalo.
      1.6.3.2.   Trukmė
      Geriausia bandymo trukmė yra 48 h. Jei gaištamumas 24-48 h laikotarpiu didėja daugiau kaip 10 %, bandymo trukmė turi būti prailginta ne daugiau kaip iki 96 h, jei gaištamumas kontroliniuose bandiniuose yra ne didesnis kaip 10 %.
      1.6.4.   Stebėjimai
      Gaištamumas registruojamas po 4 h nuo dozės davimo, o vėliau po 24 h ir 48 h. Jei reikalingas prailgintas stebėjimo laikotarpis, tolesni vertinimai turi būti daromi kas 24 h ne ilgiau kaip iki 96 h, jei mirtingumgaištamumas kontroliniuose bandiniuose yra ne didesnis kaip 10 %.
      Turėtų būti registruojami visi bandymo metu pastebėti neįprasto elgesio reiškiniai
      1.6.5.   Ribinis bandymas
      Kartais (pvz., kai manoma, kad bandomosios medžiagos toksiškumas turėtų būti mažas) galima daryti ribinį bandymą naudojant 100 μg aktyviosios medžiagos vienai bitei, taip norint parodyti, kad LD50 yra didesnė už šią vertę. Turėtų būti naudojama ta pati metodika, įskaitant tris lygiagrečias bandymų grupes bandomajai dozei, atitinkamus kontrolinius bandinius ir toksiškumo etaloną. Jei pasitaiko gaištamumo atvejų, turi būti daromas visas tyrimas. Jei pastebimi subletalūs poveikiai (žr. 1.6.4 skirsnį), jie turi būti užregistruoti.
      2.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      2.1   DUOMENYS
      Duomenys turi būti apibendrinti lentelių pavidalu, kiekvienos dozės grupei, taip pat kontrolinių bandinių ir toksiškumo etalono grupėms nurodant naudotų bičių skaičių, gaištamumą kiekvienu stebėjimo momentu ir neįprastai besielgiančių bičių skaičių. Gaištamumo duomenis analizuokite atitinkamais analizės metodais (pvz., probito funkcijos analizė, slenkamasis vidurkis, binominio skirstinio tikimybė) (3) (4). Nubraižykite atsako, kaip dozės funkcijos, kreives kiekvienam rekomenduotam stebėjimo momentui (t. y. 24 h, 48 h ir, jei tinka, 72 h, 96 h) ir apskaičiuokite kreivių krypties koeficientus ir medianines letalias dozes (LD50) su 95 % pasikliovimo rėžiais. Galima padaryti pataisas dėl gaištamumo kontroliniuose bandiniuose naudojant Abbotto pataisą (4) (5). LD50 turi būti išreikšta ųg bandomosios medžiagos vienai bitei.
      2.2   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje turi būti tokia informacija:
      2.2.1   Bandomoji medžiaga:
      
                  —
               
               
                  fizikinė būsena ir atitinkamos fizikocheminės savybės (pvz., stabilumas vandenyje, garų slėgis);
               
            
                  —
               
               
                  cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant struktūrinę formulę, grynumą (t. y., pesticidams – identiškumas ir aktyviosios (-ųjų) medžiagos (-ų) koncentracija).
               
            2.2.2   Bandymų gyvūnai:
      
                  —
               
               
                  mokslinis pavadinimas, veislė, apytikris amžius (savaitėmis), rinkimo būdas, rinkimo data;
               
            
                  —
               
               
                  informacija apie bandymų bičių rinkimui naudotas kolonijas, įskaitant sveikatą, visas suaugusių bičių ligas, prieš tai taikytą apdorojimą ir t. t.
               
            2.2.3   Bandymo sąlygos:
      
                  —
               
               
                  bandymo patalpos temperatūra ir santykinis drėgnis;
               
            
                  —
               
               
                  laikymo sąlygos, įskaitant narvelių tipą, dydį ir medžiagą;
               
            
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos davimo būdai, pvz., naudojamas tirpiklis, užlašinamo bandomojo tirpalo tūris, naudotos anestezuojančios medžiagos;
               
            
                  —
               
               
                  bandymo planas, pvz., naudotos bandomosios dozės ir jų skaičius, kontrolinių bandinių skaičius; kiekvienai bandomajai koncentracijai ir kontroliniam bandiniui naudotų narvelių skaičius ir bičių skaičius viename narvelyje;
               
            
                  —
               
               
                  bandymo data.
               
            2.2.4   Rezultatai:
      
                  —
               
               
                  parengtinio diapazono nustatymo tyrimo, jei darytas, rezultatai;
               
            
                  —
               
               
                  neapdoroti duomenys: gaištamumas po kiekvienos bandytos dozės ir kiekvienu stebėjimo momentu;
               
            
                  —
               
               
                  dozės ir atsako kreivių brėžinys bandymo pabaigoje;
               
            
                  —
               
               
                  bandomosios medžiagos ir toksiškumo etalono LD50 vertės su 95 % pasikliovimo rėžiais, nustatytos kiekvienu rekomenduotu stebėjimo momentu;
               
            
                  —
               
               
                  LD50 nustatymui taikyti statistiniai metodai;
               
            
                  —
               
               
                  gaištamumas kontroliniuose bandiniuose;
               
            
                  —
               
               
                  kiti pastebėti ar išmatuoti biologiniai poveikiai ir bet koks bičių neįprastas elgesys;
               
            
                  —
               
               
                  visi nukrypimai nuo čia aprašytų bandymo metodikų ir visa kita reikalinga informacija.
               
            3.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151-165. March, 1993.
               
            
                  2)
               
               
                  Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981-1992. Journal of Apicultural Research 22 119-125.
               
            
                  3)
               
               
                  Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol, and Exper. Then, 96, p. 99–113.
               
            
                  4)
               
               
                  Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
               
            
                  5)
               
               
                  Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, p. 265–267.
               
            C.18.   ADSORBCIJA/DESORBCIJA TAIKANT ĮKROVOS PUSIAUSVYROS METODĄ
      1.   METODAS
      Šis metodas yra OECD (Organization for Economic Cooperation and Development – Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos) TG (Test Guidlines – Bandymų rekomendacijų) 106 dėl dirvožemio adsorbcijos/desorbcijos taikant įkrovos pusiausvyros metodą kopija (2000).
      1.1.   ĮVADAS
      Metodas atsižvelgia į tarplaboratorinio lyginimo bandymą ir į seminaro apie dirvožemio atranką tobulinant adsorbcijos metodą medžiagą (1) (2) (3) (4), taip pat į nacionaliniu lygiu taikomas rekomendacijas (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).
      Adsorbcijos/desorbcijos tyrimai yra naudingi kuriant svarbią informaciją apie cheminių medžiagų judrumą ir jų pasiskirstymą biosferos dirvožemio, vandens ir oro dalyse (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Informacija gali būti naudojama prognozuojant ar įvertinant, pvz., cheminės medžiagos skaidymą (22) (23), kitimą ir paėmimą organizmais (24); jos išplovimą per dirvos sluoksnius (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28); lakumą nuo dirvožemio (21) (29) (30); nuotėkį nuo žemės paviršiaus į natūraliuosius vandenis (18) (31) (32). Adsorbcijos duomenys gali būti naudojami palyginimo ir modeliavimo tikslais (19) (33) (34) (35).
      Cheminės medžiagos pasiskirstymas tarp dirvožemio ir vandeninių fazių yra sudėtingas procesas, kuris priklauso nuo daugelio skirtingų veiksnių: medžiagos cheminės prigimties (12) (36) (37) (38) (39) (40), dirvožemio charakteristikų (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) ir klimato veiksnių, pvz., lietaus, temperatūros, saulės šviesos ir vėjo. Čia pateiktas metodas yra supaprastintas laboratorinis modelis, kuris negali iki galo išaiškinti cheminės medžiagos adsorbcijos dirvožemiu reiškinių ir mechanizmų. Ir nors šis metodas negali apimti visų aplinkoje pasitaikančių atvejų, jis suteikia vertingos informacijos apie aplinkai svarbią cheminės medžiagos adsorbciją.
      Žr. taip pat bendrąjį įvadą.
      1.2.   TAIKYMO SRITIS
      Metodu siekiama įvertinti, kaip medžiagos dirvožemyje elgiasi adsorbcijos/desorbcijos požiūriu. Tikslas yra gauti sorbcijos vertę, kuri galėtų būti naudojama pasiskirstymui įvairiomis aplinkos sąlygomis prognozuoti; šiuo tikslu nustatomi cheminių medžiagų adsorbcijos pusiausvyros koeficientai kaip dirvožemio charakteristikų (pvz., organinės anglies kiekio, molio kiekio, dirvožemio struktūros bei pH) funkcija. Turi būti naudojamas įvairių tipų dirvožemis, kad būtų galima kiek įmanoma plačiau apimti konkrečios medžiagos sąveiką su natūraliai pasitaikančiu dirvožemiu.
      Pagal šį metodą adsorbcija yra cheminės medžiagos susijungimo su dirvožemio paviršiumi procesas; metodas neskiria skirtingų adsorbcijos procesų (fizikocheminės adsorbcijos) ir kitų procesų, pvz., paviršiumi katalizuojamo skaidymo, tūrio adsorbcijos ar cheminės reakcijos. Neatsižvelgiama į adsorbciją, kuri vyksta ant dirvožemyje susidarančių koloidinių dalelių (skersmuo < 0,2 μm).
      Adsorbcijai svarbiausi dirvožemio parametrai yra: organinės anglies kiekis (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) (45) (46) (47) (48), molio kiekis, dirvožemio struktūra (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) ir, jei tai jonizuojami junginiai, pH vertė (3) (4) (42). Kiti dirvožemio parametrai, kurie galėtų veikti konkrečios medžiagos adsorbciją/desorbciją, yra efektyvioji katijonų mainų talpa (ECEC), amorfinių geležies ir aliuminio oksidų kiekis, ypač vulkaninės kilmės ir tropikų dirvožemiui (4), taip pat savitasis paviršius (49).
      Bandymas skirtas cheminės medžiagos adsorbcijai ant skirtingų dirvožemio tipų su kintamu organinės anglies kiekiu, molio kiekiu ir dirvožemio struktūra bei pH įvertinti. Jį sudaro trys tarpsniai:
      
                  
                     1 tarpsnis:
                  
               
               
                  Padinis tyrimas norint nustatyti:
                  
                              —
                           
                           
                              dirvožemio/tirpalo santykį;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              adsorbcijos pusiausvyros nusistovėjimo trukmę ir pusiausvyros sąlygomis adsorbuotos medžiagos kiekį;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              medžiagos adsorbciją ant bandymų indų paviršių ir bandomosios medžiagos stabilumą bandymo laikotarpiu.
                           
                        
            
                  
                     2 tarpsnis:
                  
               
               
                  Atrankos bandymas: tiriama penkių skirtingų tipų dirvožemio adsorbcija matuojant adsorbcijos kinetiką vienai koncentracijai ir nustatant pasiskirstymo koeficientus Kd ir Koc.
               
            
                  
                     3 tarpsnis:
                  
               
               
                  Freundlicho adsorbcijos izotermių apskaičiavimas norint nustatyti koncentracijos įtaką adsorbcijos dirvožemiu laipsniui.
                  Desorbcijos tyrimas taikant desorbcijos kinetiką/Freundlicho desorbcijos izotermes (1 priedėlis).
               
            1.3.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      
                  Simbolis
               
               
                  Apibrėžimas
               
               
                  Vienetai
               
            
                  
                     
               
               
                  adsorbcijos procentinė dalis laiku ti;
               
               
                  %
               
            
                  Aeq
                  
               
               
                  adsorbcijos procentinė dalis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis
               
               
                  %
               
            
                  
                     
               
               
                  bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu laiku Δti, masė
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu per laiką Δti, masė
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis, masė
               
               
                  μg
               
            
                  m0
                  
               
               
                  adsorbcijos bandymo pradžioje mėgintuvėlyje esančios bandomosios medžiagos masė
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               bandomosios medžiagos masė, nustatyta tirpalo alikvotinėje dalyje (
                     ) laiku ti
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  medžiagos tirpale masė adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis
               
               
                  μg
               
            
                  msoil
                  
               
               
                  dirvožemio fazės kiekis, išreikštas sauso dirvožemio mase
               
               
                  g
               
            
                  Cst
                  
               
               
                  medžiagos pradinio tirpalo masės koncentracija
               
               
                  μg cm-3
                  
               
            
                  Co
                  
               
               
                  sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomojo tirpalo pradinė masės koncentracija
               
               
                  μg cm-3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  medžiagos vandeninės fazės masės koncentracija laiku ti, kai buvo daroma analizė
               
               
                  μg cm-3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  dirvožemiu adsorbuotos medžiagos kiekis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis
               
               
                  μg -1-1/n (cm3) 1/n g -1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  medžiagos vandeninės fazės masės koncentracija adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis
               
               
                  μg cm-3
                  
               
            
                  V0
                  
               
               
                  sąlytyje su dirvožemiu esančios vandeninės fazės pradinis tūris darant adsorbcijos bandymą
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  alikvotinės tirpalo dalies tūris, kuriame matuojama bandomoji medžiaga
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  Kd
                  
               
               
                  adsorbcijos pasiskirstymo koeficientas
               
               
                  cm3 g-1
                  
               
            
                  Koc
                  
               
               
                  pagal organinę anglį normalizuotas adsorbcijos koeficientas
               
               
                  cm3 g-1
                  
               
            
                  kom
                  
               
               
                  pagal organinę medžiagą normalizuotas pasiskirstymo koeficientas
               
               
                  cm3 g-1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  Freundlicho adsorbcijos koeficientas
               
               
                  μg -1-1/n (cm3) 1/n g -1
                  
               
            
                  1/n
               
               
                  Freundlicho lygties laipsnio rodiklis
               
               
                   
               
            
                  
                     
               
               
                  desorbcijos procentinė dalis laiku ti
                  
               
               
                  %
               
            
                  
                     
               
               
                  desorbcijos procentinė dalis, atitinkanti laiko intervalą Δti
                  
               
               
                  %
               
            
                  Kdes
                  
               
               
                  tariamasis desorbcijos koeficientas
               
               
                  cm3 g-1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  Freundlicho desorbcijos koeficientas
               
               
                  μg-1-1/n (cm3) 1/n g -1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  bandomosios medžiagos, desorbuotos nuo dirvožemio laiku ti masė
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  bandomosios medžiagos, desorbuotos nuo dirvožemio per laiką Δti, masė
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  medžiagos masė, analiziškai nustatyta vandeninėje fazėje desorbcijos pusiausvyros sąlygomis
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  bandomosios medžiagos, desorbuotos desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, bendroji masė
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  medžiagos, kuri liko adsorbuota dirvožemiu praėjus laiko tarpui Ati, masė
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl nevisiško tūrio pakeitimo, masė
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  bandomosios medžiagos, kuri liko adsorbuota dirvožemiu desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, kiekis
               
               
                  μg g-1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  bandomosios medžiagos vandeninės fazės masės koncentracija desorbcijos pusiausvyros sąlygomis
               
               
                  μg cm-3
                  
               
            
                  VT
                  
               
               
                  vandeninės fazės, esančios sąlytyje su dirvožemiu darant desorbcijos kinetikos bandymą nuosekliuoju metodu, bendras tūris
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  VR
                  
               
               
                  tirpalo virš nuosėdų, pašalinto iš mėgintuvėlio pasiekus adsorbcijos pusiausvyrą ir pakeisto tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo, tūris
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti darant desorbcijos kinetikos bandymą nuosekliuoju metodu, alikvotinės dalies tūris
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti darant desorbcijos kinetikos bandymą (lygiagretusis metodas), tūris
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, tūris
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  MB
               
               
                  masių balansas
               
               
                  %
               
            
                  mE
                  
               
               
                  bandomosios medžiagos, dviem pakopomis ekstrahuotos iš dirvožemio ir nuo sienelių, bendroji masė
               
               
                  μg
               
            
                  Vrec
                  
               
               
                  adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis regeneruoto tirpalo virš nuosėdų tūris
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  pow
                  
               
               
                  oktanolio/vandens pasiskirstymo koeficientas
               
               
                   
               
            
                  pKa
               
               
                  disociacijos konstanta
               
               
                   
               
            
                  Sw
                  
               
               
                  tirpumas vandenyje
               
               
                  g 1-1
                  
               
            1.4.   BANDYMŲ METODO ESME
      Žinomi bandomosios medžiagos, neturinčios ar turinčios žymėtųjų atomų, tirpalo 0,01 M CaCl2 tūriai yra sumaišomi su žinomos sauso dirvožemio masės bandiniais, prieš tai laikytais pusiausvyrai nusistovėti 0,01 M CaCl2. Mišinys tam tikrą laiką maišomas. Paskui dirvožemio suspensija atskiriama centrifugavimu ir, jei to pageidaujama, filtravimu, o vandeninė fazė analizuojama. Dirvožemio bandiniu adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis apskaičiuojamas kaip skirtumas tarp pradinio bandomosios medžiagos kiekio tirpale ir jos kiekio bandymo pabaigoje (netiesioginis metodas).
      Pagal kitą metodą daroma dirvožemio analizė ir tiesiogiai nustatomas adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis (tiesioginis metodas). Šis metodas, kurį sudaro pakopinis dirvožemio ekstrahavimas atitinkamu tirpikliu, rekomeduojamas tais atvejais, kai negalima tiksliai nustatyti bandomosios medžiagos tirpalo koncentracijos skirtumo. Tokių atvejų pavyzdžiai yra: bandomosios medžiagos adsorbcija ant bandymų indų paviršiaus; bandomosios medžiagos nestabilumas bandymo metu; silpna adsorbcija, todėl tirpalo koncentracijos pokytis yra labai mažas; stipri adsorbcija, todėl tirpalo koncentracija labai sumažėja ir negali būti tiksliai nustatyta. Naudojant medžiagą su žymėtaisiais atomais, dirvožemio galima ir neekstrahuoti, jei dir vožemio fazės analizei taikomas sudeginimo ir skysčių scintiliacijos skaičiavimo metodas. Tačiau skysčių scintiliacijos skaičiavimas nėra specifinis metodas ir juo negalima atskirti pradinių produktų nuo jų kitimo produktų; taigi jis turi būti taikomas tik tokiu atveju, jei cheminė medžiaga yra stabili tyrimo metu.
      1.5.   INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ
      Cheminiai reagentai turi būti analiziškai gryni. Rekomenduojama naudoti bent 95 % grynumo žinomos sudėties žymėtųjų atomų neturinčias bandomąsias medžiagas ar žinomos sudėties radioaktyviai grynas medžiagas su žymėtaisiais atomais. Jei radioaktyviųjų indikatorių pusamžis yra trumpas, turi būti taikomos skilimo pataisos.
      Prieš darant adsorbcijos/desorbcijos bandymą apie bandomąją medžiagą turi būti žinoma ši informacija:
      
                  a)
               
               
                  tirpumas vandenyje (A.6);
               
            
                  b)
               
               
                  garų slėgis (A.4) ir (ar) Henry'o dėsnio konstanta;
               
            
                  c)
               
               
                  abiotinis skaidymas: hidrolizė, kaip pH funkcija (C.7);
               
            
                  d)
               
               
                  pasiskirstymo koeficientas (A.8);
               
            
                  e)
               
               
                  lengvas biologinis skaidomumas (C.4) ar aerobinis ir anaerobinis kitimas dirvožemyje;
               
            
                  f)
               
               
                  jonizuojamų medžiagų pKa;
               
            
                  g)
               
               
                  tiesioginė fotolizė vandenyje (t.y. vandeninio tirpalo UV-VIS absorbcijos spektras, kvantinė išeiga) ir fotocheminis skaidymas ant dirvožemio.
               
            1.6.   BANDYMO TAIKOMUMAS
      Bandymas tinka cheminėms medžiagoms, kurioms nustatyti yra pakankamo tikslumo analizės metodas. Svarbus parametras, kuris gali turėti įtakos rezultatų patikimumui, ypač taikant netiesioginį metodą, yra bandomosios medžiagos stabilumas bandymo metu. Taigi stabilumą būtina tikrinti darant pradinį tyrimą; jei bandymo metu stebimas medžiagos kitimas, darant pagrindinį tyrimą rekomenduojama analizuoti dirvožemio ir vandeninę fazes.
      Gali kilti sunkumų darant bandymą su bandomosiomis medžiagomis, kurių tirpumas vandenyje yra mažas (Sw < 10-4 g l-1), taip pat esant dideliam bandomųjų medžiagų kiekiui, nes medžiagos koncentracija vandeninėje fazėje negali būti analiziškai nustatyta gana tiksliai. Šiais atvejais būtina imtis papildomų priemonių. Nurodymai, kaip spręsti šias problemas, pateikti atitinkamuose šio metodo aprašymo skirsniuose.
      Bandant lakiąsias medžiagas reikia imtis atsargumo priemonių nuostoliams bandymo metu išvengti.
      1.7.   METODO APRAŠYMAS
      1.7.1.   Aparatūra ir cheminiai reagentai
      Reikalinga ši standartinė laboratorijos įranga:
      
                  a)
               
               
                  mėgintuvėliai ar indai bandymams daryti. Svarbu, kad šie mėgintuvėliai ar indai:
                  
                              —
                           
                           
                              būtų pritaikyti centrifugavimo aparatui, norint sumažinti manipuliavimo ir pernešimo paklaidas;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              būtų pagaminti iš inertinės medžiagos, kurios paviršiuje bandomosios medžiagos adsorbcija būtų kuo mažesnė.
                           
                        
            
                  b)
               
               
                  maišymo įtaisas: vertikalioji purtyklė ar lygiavertė įranga; maišant maišymo įtaisu dirvožemis turi sudaryti suspensija;
               
            
                  c)
               
               
                  centrifuga: geriau didelio apsisukimų dažnio, pvz., centrifugavimo jėga > 3 000 g, su termostatu, iš vandeninio tirpalo galinti pašalinti daleles, kurių skersmuo didesnis kaip 0,2 um. Maišant ir centrifuguojant konteineriai turi būti uždengti dangčiais, kad būtų išvengta nuostolių dėl medžiagų lakumo ir vandens nugaravimo; adsorbcijai ant dangčių sumažinti turi būti naudojami dezaktyvuoti dangčiai, pvz., užsukami teflonu iškloti dangčiai;
               
            
                  d)
               
               
                  neprivalomas: filtravimo įtaisas; filtrų poringumas – 0,2 μm, sterilūs, vienkartiniai. Ypatingą dėmesį reikia kreipti parenkant filtro medžiagą, kad būtų išvengta bet kokių bandomosios medžiagos nuostolių ant filtro; mažai tirpioms medžiagoms nerekomenduojama naudoti filtrų iš organinės medžiagos;
               
            
                  e)
               
               
                  analizės aparatūra, tinkama bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai nustatyti;
               
            
                  f)
               
               
                  laboratorinė krosnis 103–110 oC temperatūrai palaikyti.
               
            1.7.2.   Dirvožemio tipo apibūdinimas ir parinkimas
      Dirvožemio tipą turėtų apibūdinti trys parametrai, kurie laikomi darančiais didžiausią įtaką adsorbcijos gebai: organinė anglis, molio kiekis ir dirvožemio struktūra bei pH. Kaip minėta (žr. poskyrį „Taikymo sritis“), konkrečios medžiagos adsorbcijai/desorbcijai įtakos gali turėti kitos fizikocheminės dirvožemio savybės, ir tokiais atvejais į jas turi būti atsižvelgta.
      Metodai, taikyti dirvožemiui apibūdinti, yra labai svarbūs ir daro didelę įtaką rezultatams. Taigi atitinkamu ISO metodu (ISO-10390-1) rekomenduojama išmatuoti dirvožemio 0,01 M CaCl2 tirpale (t. y. tirpale, naudojamame adsorbcijos/desorbcijos bandymuose) pH vertę. Taip pat rekomenduojama, kad standartiniais metodais (pvz., ISO „Handbook of Soil Angly sis“) būtų nustatytos kitos reikalingos dirvožemio savybės; tai leidžia sorbcijos duomenis analizuoti pagal visam pasauliui standartizuotus dirvožemio parametrus. Kai kurie duomenys apie esamus standartinius dirvožemio analizės ir apibūdinimo metodus pateikti nuorodose (50-52). Dirvožemio bandymo metodams kalibruoti rekomenduojama naudoti etaloninius dirvožemius.
      Nurodymai, kaip parinkti dirvą adsorbcijos/desorbcijos bandymams, pateikti 1 lentelėje. Parinkti septyni dirvožemio tipai apima vidutinėse geografinėse zonose pasitaikančius dirvožemio tipus. Jei bandomosios medžiagos yra joninės, parinkti dirvožemio tipai turi apimti platų pH verčių diapazoną, kad būtų galima įvertinti jonizuotos ir nejonizuotos medžiagos adsorbciją. Nurodymai, kiek skirtingų dirvožemio tipų naudoti įvairiose bandymo pakopose, pateikti 1.9 poskyryje „Bandymo eiga“.
      Jei labiau tinka kitų tipų dirvožemis, jis turi būti apibūdintas tais pačiais parametrais ir jo savybės turi įvairuoti panašiai kaip 1 lentelėje aprašytos savybės, net jei tiksliai kriterijų ir neatitinka.
      1 lentelė
      Nurodymai, kaip parinkti dirvožemio bandinius adsorbcijos ir desorbcijos bandymams
      
                  Dirvožemio tipas
               
               
                  pH diapazonas (0,01 M CaCl2)
               
               
                  Organinės anglies kiekis ( %)
               
               
                  Molio kiekis ( %)
               
               
                  Dirvožemio struktūra (25)
                  
               
            
                  1
               
               
                  4,5-5,5
               
               
                  1,0-2,0
               
               
                  65-80
               
               
                  Molis
               
            
                  2
               
               
                  >7,5
               
               
                  3,5-5,0
               
               
                  20-40
               
               
                  sunkus priemolis
               
            
                  3
               
               
                  5,5-7,0
               
               
                  1,5-3,0
               
               
                  15-25
               
               
                  dulkiškas priemolis
               
            
                  4
               
               
                  4,0-5,5
               
               
                  3,0-4,0
               
               
                  15-30
               
               
                  Priemolis
               
            
                  5
               
               
                  < 4,0-6,0 (26)
                  
               
               
                  <0,5-1,5 (26)
                      (27)
                  
               
               
                  < 10- 15 (26)
                  
               
               
                  rišlus smėlis
               
            
                  6
               
               
                  >7,0
               
               
                  < 0,5-1,0 (26)
                      (27)
                  
               
               
                  40-65
               
               
                  sunkus priemolis/molis
               
            
                  7
               
               
                  <4,5
               
               
                  > 10
               
               
                  < 10
               
               
                  smėlis/rišlus smėlis
               
            1.7.3.   Dirvožemio bandinių rinkimas ir laikymas
      1.7.3.1.   Rinkimas
      Specialių bandinių ėmimo metodų arba priemonių rekomenduoti negalima; bandinių ėmimo metodas priklauso nuo tyrimo tikslo (53) (54) (55) (56) (57) (58).
      Reikia atsižvelgti į šiuos dalykus:
      
                  a)
               
               
                  būtina turėti išsamią informaciją apie lauko sklypo istoriją; informaciją sudaro vieta, augmenijos danga, apdorojimas pesticidais ir (ar) trąšomis, biologiniai priedai ar atsitiktinis užteršimas. Reikia laikytis dirvožemio bandinių ėmimo ISO standarto (ISO 10381-6) rekomendacijų atsižvelgiant į bandinio ėmimo vietos aprašymą;
               
            
                  b)
               
               
                  bandinių ėmimo vieta turi būti apibrėžta UTM (Universal Transversal Mercator-Projection/European Horizontal Datum – Universalioji skersinė Merkatoriaus projekcija/Europos horizontalusis atskaitos lygis) ar geografinių koordinačių; tai leistų ateityje vėl paimti konkretų dirvožemį ar padėtų apibūdinti dirvožemį pagal įvairias klasifikavimo sistemas, taikomas skirtingose šalyse. Be to, reikia rinkti tik A horizonte, ne giliau kaip 20 cm. Jei konkrečiai 7 tipo dirvožemio dalį sudaro Oh horizontas, jis turi būti įtrauktas į bandinį.
               
            Dirvožemio bandiniai turi būti gabenami konteineriuose esant tokiai temperatūrai, kuri garantuotų pradines dirvožemio savybes ir jų labai nepakeistų.
      1.7.3.2.   Laikymas
      Geriau naudoti ką tik iš lauko paimtą dirvožemį. Jei tai neįmanoma, išdžiovintas ore dirvožemis gali būti laikomas kambario temperatūros sąlygomis. Rekomendacijų apie laikymo trukmės ribas nepateikiama, tačiau daugiau kaip trejus metus laikytas dirvožemis prieš naudojant turi būti vėl analizuojamas organinės anglies kiekiui, pH ir katijonų mainų talpai (CEC) nustatyti.
      1.7.3.3.   Dirvožemio bandinių apdorojimas ir paruošimas bandymui
      Dirvožemis džiovinamas ore kambario temperatūros sąlygomis (geriau 20-25 oC). Smulkinti reikia kuo mažesne jėga, kad pradinė dirvožemio sandara pasikeistų kuo mažiau. Dirvožemis sijojamas, kol lieka < 2 mm dydžio dalelės; sijoj ant reikėtų laikytis ISO standarto dirvožemio bandinių ėmimo rekomendacijų (ISO 10381-6). Rekomenduojama dirvožemį kruopščiai homogenizuoti, nes tai pagerina rezultatų atkuriamumą. Kiekvieno dirvožemio bandinio drėgmės kiekis nustatomas tris alikvotines dalis kaitinant 105 oC temperatūroje tol, kol masė daugiau nesikeičia (maždaug 12 h). Visiems skaičiavimams nurodoma krosnyje išdžiovinto dirvožemio masė, t. y. dirvožemio, atėmus drėgmės kiekį, masė.
      1.7.4.   Bandomosios medžiagos paruošimas maišymui su dirvožemiu
      Bandomoji medžiaga ištirpinama 0,01 M CaCl2 tirpale, kuriam ruošti naudojamas distiliuotas ar dejonizuotas vanduo; kaip vandeninis tirpiklis CaCl2 tirpalas yra naudojamas centrifugavimui palengvinti ir katijonų mainams kiek įmanoma sumažinti. Pradinio tirpalo koncentracija turi būti trimis dydžio eilėmis didesnė nei taikomo metodo aptikimo riba. Ši riba garantuoja tikslius matavimus taikant šį metodą; be to, pradinio tirpalo koncentracija turi būti mažesnė nei bandomosios medžiagos tirpumo vandenyje vertė.
      Pradinį tirpalą geriau gaminti prieš pat maišymą su dirvožemio bandiniais, tirpalas turi būti uždengtas ir laikomas tamsoje esant 4 oC. Laikymo trukmė priklauso nuo bandomosios medžiagos stabilumo ir nuo tirpalo koncentracijos.
      Atitinkamas soliubilizavimo agentas gali būti reikalingas tik mažai tirpioms medžiagoms (Sw < 10-4 g × 1-1), kai bandomąją medžiagą sunku ištirpinti. Šis soliubilizavimo agentas: a) turi maišytis su vandeniu, pvz., metanolis ar acetonitrilas; b) jo koncentracija neturi būti didesnė kaip 1 % bendrojo pradinio tirpalo tūrio ir turi būti mažesnė nei sąlytyje su dirvožemiu esančios bandomosios medžiagos koncentracija (geriau, jei mažesnė kaip 0,1 %); c) neturi būti paviršiaus aktyvioji medžiaga arba dalyvauti solvolizės reakcijoje su bandomąja medžiaga. Duomenų ataskaitoje turi būti nurodytas ir pagrįstas tokio soliubilizavimo agento naudojimas.
      Kitas mažai tirpioms medžiagoms taikomas būdas yra pridėti bandomosios medžiagos į bandymo sistemą naudojant pagalbinį tirpiklį: bandomoji medžiaga ištirpinama organiniame tirpiklyje, alikvotinė šio tirpalo dalis pridedama į dirvožemio ir 0,01 M CaCl2 tirpalo distiliuotame ar dejonizuotame vandenyje sistemą. Organinio tirpiklio kiekis vandeninėje fazėje turi būti kuo mažesnis, paprastai ne didesnis kaip 0,1 %. Medžiagos pridėjimas naudojant tirpalą organiniame tirpiklyje gali pabloginti tūrio atkuriamumą. Taigi gali atsirasti papildoma paklaida, nes bandomosios medžiagos ir pagalbinio tirpiklio koncentracija visuose bandymuose gali būti nevienoda.
      1.8.   ADSORBCIJOS/DESORBCIJOS BANDYMO BŪTINOSIOS SĄLYGOS
      1.8.1.   Analizės metodas
      Pagrindiniai parametrai, galintys turėti įtakos sorbcijos matavimams, yra tirpalui ir adsorbuotoms fazėms analizuoti taikomo analizės metodo tikslumas, bandomosios medžiagos stabilumas ir grynumas, sorbcijos pusiausvyros pasiekimas, tirpalo koncentracijos pokyčio dydis, dirvožemio/tirpalo santykis ir dirvožemio struktūros pokyčiai nusistovint pusiausvyrai (35) (59-62). Keletas pavyzdžių, susijusių su tikslumo problemomis, pateikta 2 priedėlyje.
      Taikomo analizės metodo patikimumas turi būti patikrintas pagal koncentracijų diapazoną, kuris greičiausiai bus taikomas darant bandymą. Bandytojas gali laisvai tobulinti atitinkamą metodą, turintį reikiamą tikslumą, preciziškumą, atkuriamumą, aptikimo ribas ir regeneravimo lygį. Toliau pateikti nurodymai, kaip tokį bandymą daryti.
      Atitinkamas 0,01 M CaCl2 tirpalo tūris, pvz., 100 cm3, 4 h purtomas su tam tikra labai adsorbuojančio, t. y. turinčio didelį organinės anglies ir molio kiekį, dirvožemio mase, pvz., 20 g; ši masė ir tūris gali skirtis priklausomai nuo analizės poreikių, tačiau dirvožemio/tirpalo santykis 1:5 yra patogus pradžios taškas. Mišinys centrifuguojamas ir vandeninė fazė gali būti filtruojama. Į vandeninę fazę įpilamas tam tikras tūris bandomosios medžiagos pradinio tirpalo vardinei koncentracijai pasiekti koncentracijos diapazone, kuris greičiausiai bus taikomas darant bandymą. Šis tūris turi sudaryti ne daugiau kaip 10 % galutinio vandeninės fazės tūrio, kad kuo mažiau pasikeistų pradinio pusiausvyros nusistovėjimo tirpalo savybės. Tirpalas analizuojamas.
      Norint patikrinti analizės metodo artefaktus ir dėl dirvožemio atsiradusius matricos efektus, turi būti įtrauktas vienas tuščiasis bandinys, kurį sudaro sistema dirvožemis + CaCl2 tirpalas (be bandomosios medžiagos).
      Analizės metodus, kurie gali būti taikomi sorbcijai matuoti, sudaro dujų ir skysčių chromatografija (Gas-Liquid Chromatography, GLC), didelio efektyvumo skysčių chromatografija (high—performance liquid chromatography, UPLC), spektrometrų a (pvz., GC/masių spektrometrija, HPLC/masių spektrometrija) ir skysčių scintiliacijos skaičiavimas (medžiagų su žymėtaisiais atomais). Nesvarbu, koks analizės metodas taikomas, patenkinamu laikomas regeneravimo lygis, kuris sudaro 90–110 % vardinės vertės. Norint medžiagą aptikti ir įvertinti po įvykdyto atskyrimo, analizės metodo aptikimo riba turi būti bent dviem dydžio eilėmis mažesnė nei vardinė koncentracija.
      Adsorbcijos tyrimams taikomo analizės metodo charakteristikos ir aptikimo riba yra labai svarbios apibrėžiant bandymo sąlygas ir gautus tyrimų rezultatus. Šis metodas nekeičia bendrosios bandymo eigos ir numato alternatyvius sprendimus, jei galimybes riboja analizės metodas ir laboratorijos įranga.
      1.8.2.   Optimalaus dirvožemio/tirpalo santykio parinkimas
      Tinkamo dirvožemio ir tirpalo santykio parinkimas sorbcijos tyrimams priklauso nuo pasiskirstymo koeficiento Kd ir nuo pageidaujamo santykinio adsorbcijos laipsnio. Matavimo, pagrįsto adsorbcijos lygties forma ir analizės metodo riba, statistinį tikslumą nustatant medžiagos tirpalo koncentraciją lemia šios koncentracijos pokytis. Taigi naudinga pasirinkti kelias pastovias santykio vertes, kurioms adsorbuotos medžiagos procentinė dalis yra didesnė kaip 20 %, geriau > 50 % (62), ir pasirūpinti, kad bandomosios medžiagos tirpalo koncentracija norint ją tiksliai nustatyti būtų pakankamai didelė. Tai ypač svarbu, kai yra didelė adsorbcijos procentinė dalis.
      Patogus būdas parinkti tinkamą dirvožemio/vandens santykį pagrįstas Kd vertės įverčiu darant išankstinius tyrimus arba taikant sukurtus vertinimo metodus (3 priedėlis). Tinkamą santykį galima pasirinkti pagal dirvožemio/tirpalo santykio ir Kd grafiką nustatytai adsorbcijos procentinei daliai (1 pav.). Šiam grafikui nubrėžti daroma prielaida, kad adsorbcijos lygtis yra tiesiška (28). Tinkamas sąryšis gaunamas Kd 4 lygtį pertvarkant į 1 lygtį:
      
                  
                     
               
               
                  (1)
               
            ar į jos logaritminęišraišką, darant prielaidą, kad R = msoil/V0 and Aeq %/100 = :
      
                  
                     
               
               
                  (2)
               
            
         
      1 pav. reikiamas dirvožemio/tirpalo santykis pateiktas kaip Kd funkcija esant įvairiems adsorbcijos lygiams. Pvz., jei dirvožemio/tirpalo santykis yra 1:5 ir Kd 20, adsorbcijos laipsnis maždaug 80 %. 50 % adsorbcijai gauti esant tam pačiam Kd turi būti taikomas santykis 1:25. Šis tinkamo dirvožemio/tirpalo santykio pasirinkimo būdas leidžia bandytojui lanksčiai prisitaikyti prie bandymo poreikių.
      Sunkiau yra panaudoti tas sritis, kuriose medžiaga adsorbuojama labai stipriai arba labai silpnai. Jei adsorbcija vyksta silpnai, rekomenduojamas 1:1 dirvožemio/tirpalo santykis, nors kai kuriems dirvožemiams su dideliu organinės medžiagos kiekiu šį santykį būtina padidinti norint gauti suspensiją. Reikia pasirūpinti analizės metodu mažiems tirpalo koncentracijos pokyčiams matuoti; kitaip adsorbcijos matavimas bus netikslus. Kita vertus, esant labai dideliems pasiskirstymo koeficientams Kd , dirvožemio/tirpalo santykį galima mažinti iki 1:100, kad cheminės medžiagos tirpale liktų daug. Tačiau reikia stengtis gerai sumaišyti ir būtina duoti pakankamai laiko sistemai pasiekti pusiausvyrą. Alternatyvus šių ribinių atvejų naudojimo būdas, kai nėra tinkamo analizės metodo, yra Kd vertės prognozė taikant vertinimo metodikas, pagrįstas, pvz, Pow vertėmis (3 priedėlis). Tai gali būti naudinga ypač silpnai adsorbuojamoms ar polinėms medžiagoms, kurių Pow < 20, ir lipofilinėms ar stipriai sorbuojamoms cheminėms medžiagoms, kurių Pow > 104.
      1.9.   BANDYMO EIGA
      1.9.1.   Bandymų sąlygos
      Visi bandymai daromi aplinkos temperatūros ir, jei įmanoma, pastovios temperatūros nuo 20 oC iki 25 oC sąlygomis.
      Centrifugavimo sąlygos turi būti tokios, kad būtų galima pašalinti iš tirpalo didesnes kaip 0,2 ųm daleles. Ši vertė atitinka mažiausią dydį, iki kurio dalelė dar laikoma kietąja dalele, ir tai yra riba tarp kietųjų ir koloidinių dalelių. Kaip nustatyti centrifugavimo sąlygas, nurodyta 4 priedėlyje.
      Jei negalima garantuoti, kad centrifugavimo priemonės pašalins didesnes kaip 0,2 μm daleles, būtų galima taikyti centrifugavimo ir filtravimo pro 0,2 μm filtrus derinį. Norint išvengti ant filtrų bet kokių bandomosios medžiagos nuostolių, indai turi būti pagaminti iš tinkamos inertinės medžiagos. Bet kuriuo atveju turi būti įrodyta, kad filtruojant nepatiriama jokių bamdomosios medžiagos nuostolių.
      1.9.2.   1 tarpsnis. Pradinis tyrimas
      Pradinio tyrimo vykdymo tikslas jau buvo nurodytas poskyryje „Taikymo sritis“. Toliau pateikiamos rekomendacijos, kaip daryti tokį bandymą.
      1.9.2.1.   Optimalaus dirvožemio/tirpalo santykio verčių parinkimas
      Naudojami du dirvožemio tipai ir trys dirvožemio/tirpalo santykio vertės (šeši bandymai). Vieno tipo dirvožemyje yra didelis organinės anglies ir mažas molio kiekis, kito tipo dirvožemyje – mažas organinės anglies ir didelis molio kiekis. Siūloma naudoti tokius dirvožemio ir tirpalo santykius:
      
                  —
               
               
                  50 g dirvožemio 50 cm3 bandomosios medžiagos vandeninio tirpalo (santykis 1/1);
               
            
                  —
               
               
                  10 g dirvožemio ir 50 cm3 bandomosios medžiagos vandeninio tirpalo (santykis 1/5);
               
            
                  —
               
               
                  2 g dirvožemio ir 50 cm3 bandomosios medžiagos vandeninio tirpalo (santykis 1/25).
               
            Mažiausias dirvožemio kiekis, su kuriuo gali būti daromas bandymas, priklauso nuo laboratorijos įrangos ir taikomų analizės metodų charakteristikų. Tačiau norint gauti patikimus bandymo rezultatus, rekomenduojama naudoti bent 1 g, o geriau 2 g dirvožemio.
      Bandomosios medžiagos stabilumui CaCl2 tirpale ir jos galimai adsorbcijai ant bandymų indų paviršių patikrinti vienas kontrolinis bandinys, kurį sudaro 0,01 M CaCl2 tirpale ištirpinta bandomoji medžiaga (be dirvožemio), pereina tiksliai tas pačias pakopas kaip ir bandomosios sistemos.
      Tuščiasis bandinys kiekvienam dirvožemiui su tuo pačiu dirvožemio kiekiu ir bendru 50 cm30,01 M CaCl2 tirpalo tūriu (be bandomosios medžiagos) bandomas pagal tą pačią bandymo metodiką. Darant analizę šis bandinys yra fono kontrolės priemonė trukdančioms medžiagoms ar užterštiems dirvožemiams aptikti.
      Visi bandymai, įskaitant kontrolinius ir tuščiuosius, turi būti daromi bent po du kartus. Bendras tyrimui paruoštų bandinių skaičius gali būti apskaičiuotas atsižvelgiant į taikomą metodą.
      Pradinio tyrimo ir pagrindinio tyrimo metodai paprastai yra tie patys, būtinos daryti išimtys nurodomos.
      Pusiausvyrai pasiekti ore išdžiovinti dirvožemio bandiniai sumaišomi su ne mažesnio kaip 45 cm3 tūrio 0,01 M CaCl2 tirpalu ir mišinys purtomas per naktį (12 h) prieš bandymo dieną. Po to galutiniam 50 cm3 tūriui gauti įpilamas tam tikras tūris bandomosios medžiagos pradinio tirpalo. Šis įpilamo pradinio tirpalo tūris: a) neturi sudaryti daugiau kaip 10 % galutinio 50 cm3 vandeninės fazės tūrio, kad kuo mažiau pasikeistų pradinei pusiausvyrai nusistovėti naudoto tirpalo savybės; b) būtų toks, kad sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomosios medžiagos pradinio tirpalo koncentracija (C0) būtų bent dviem dydžio eilėmis didesnė nei analizės metodo aptikimo ribos vertė; šis ribinis dydis leidžia daryti tikslius matavimus esant didelio laipsnio adsorbcijai (> 90 %) ir vėliau apskaičiuoti adsorbcijos izotermes. Be to, rekomenduojama, kad pradinė medžiagos koncentracija (C0), jei tai įmanoma, būtų ne didesnė kaip pusė tirpumo vertės.
      Toliau pateikiamas pavyzdys, kaip apskaičiuoti pradinio tirpalo koncentraciją (Cst). Tarkime, kad aptikimo riba yra 0,01 μg × cm-3 ir adsorbcijos laipsnis 90 %; taigi sąlytyje su dirvožemiu esančios bandomosios medžiagos pradinė koncentracija turi būti 1 μg x cm-3 (dviem dydžio eilėmis didesnė kaip aptikimo ribos vertė). Darant prielaidą, kad įpilamo pradinio tirpalo tūris yra didžiausias, koks buvo rekomenduotas, t. y. 5 cm3 į 45 cm30,01 M CaCl2 pusiausvyros nusistovėjimo tirpalo (pradinis tirpalas sudaro 10 % 50 cm3 bendrojo vandeninės fazės tūrio), pradinio tirpalo koncentracija turi būti 10 μg × cm-3; ji yra trimis dydžio eilėmis didesnė kaip analizės metodo aptikimo ribinė vertė.
      Vandeninės fazės pH vertė turi būti matuojama prieš sąlytį su dirvožemiu ir po jo, kadangi jos vaidmuo visame adsorbcijos procese yra svarbus, ypač jei tai jonizuojamosios medžiagos.
      Mišinys purtomas tol, kol pasiekiama adsorbcijos pusiausvyra. Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė dirvožemiams yra labai nevienoda, atsižvelgiant į cheminę medžiagą ir dirvožemį; paprastai pakanka 24 h (77). Darant pradinį tyrimą, bandinius 48 h maišymo laikotarpiu galima imti nuosekliai (pvz., 4, 8, 24, 48 h). Tačiau rinktis analizės laiką reikėtų lanksčiai ir atsižvelgus į laboratorijos darbo grafiką.
      Yra du būdai bandomosios medžiagos vandeniniam tirpalui analizuoti: a) lygiagretusis metodas ir b) nuoseklusis metodas. Pabrėžtina, kad, nors eksperimentinio darbo lygiagrečiuoju metodu yra daugiau, matematinis rezultatų apdorojimas yra paprastesnis (5 priedėlis). Tačiau metodą pasirinkti leidžiama pačiam bandytojui, kuris turės atsižvelgti į laboratorijos įrangą ir lėšas.
      
                  (a)
               
               
                  Lygiagretusis metodas: paruošiami bandiniai su vienodu dirvožemio/tirpalo santykiu, bandinių reikia tiek, kiek laiko tarpų pasirinkta adsorbcijos kinetikai tirti. Po centrifugavimo ir, jei pageidaujama, filtravimo vandeninė fazė kiek įmanoma visa regeneruojama ir analizuojama, pvz., pirmojo mėgintuvėlio po 4 h, antrojo mėgintuvėlio – po 8 h, trečiojo mėgintuvėlio – po 24, ir t. t.
               
            
                  (b)
               
               
                  Nuoseklusis metodas: kiekvienam dirvožemio/tirpalo santykiui paruošiama tik po du bandinius. Nustatytais laiko tarpais mišinys centrifuguojamas fazėms atskirti. Maža alikvotinė tirpalo dalis tuojau pat analizuojama bandomajai medžiagai nustatyti; bandymas tęsiamas su pradiniu mišiniu. Jei po centrifugavimo taikomas filtravimas, laboratorijoje turi būti priemonių mažiems alikvotinių dalių tūriams filtruoti. Rekomenduojama bendrą alikvotinių dalių tūrį imti ne didesnį kaip 1 % bendrojo tirpalo tūrio, kad darant bandymą labai nepakistų dirvožemio/tirpalo santykis ir nesumažėtų adsorbuojamos medžiagos masė.
               
            Pagal vardinę pradinę koncentraciją ir bandinio ėmimo momentui (ti) išmatuotą koncentraciją, pataisytą tuščiojo bandymo verte, kiekvienam laiko momentui (ti) apskaičiuojama adsorbcijos  procentinė dalis. Braižomi  kitimo laike grafikai (5 priedėlis, 1 pav.), kad būtų galima nustatyti, ar jau pasiekta pusiausvyros horizontalioji kreivės dalis (29) Bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracijos kitimo laike grafikai taip pat gali būti panaudoti nustatant, ar pasiekta pusiausvyros horizontalioji kreivės dalis (žr. 5 priedėlis, 2 pav.). Taip pat apskaičiuojama Kd vertė pusiausvyros sąlygomis. Pagal šią Kd vertę 1 pav. pasirenkamas tinkamas dirvožemio/tirpalo santykis, kad adsorbcijos procentinė dalis būtų didesnė kaip 20 %, o geriau, jei > 50 % (61). Visos taikomos lygtys ir grafikų sudarymo principai pateikti poskyryje „Duomenys ir ataskaita“ ir 5 priedėlyje.
      1.9.2.2.   Adsorbcijos pusiausvyros nusistovėjimo trukmės ir pusiausvyros sąlygomis adsorbuotos medžiagos kiekio nustatymas
      Kaip jau sakyta,  ar  kitimo laike grafikai leidžia įvertinti, ar pasiekta adsorbcijos pusiausvyra ir koks yra pusiausvyros sąlygomis adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis. Tokių grafikų pavyzdžiai pateikti 5 priedėlyje. Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė – tai laikas, per kurį sistema pasiekia kreivės horizontaliąją dalį.
      Jei konkrečiai medžiagai kreivės lygiagrečioji dalis nepasiekiama, bet adsorbcija visą laiką didėja, gali būti padėtį sunkinančių veiksnių, pvz., biologinis skaidymas ar lėta difuzija. Biologinį skaidymą galima įrodyti bandymą pakartojant su steriliu dirvožemio bandiniu. Jei ir dabar lygiagrečios kreivės dalies nėra, bandytojas turi ieškoti kitų reiškinių, trukdančių vykdyti specifinį tyrimą; tai galima padaryti atitinkamai pakeitus bandymo sąlygas (temperatūrą, purtymo trukmę, dirvožemio/tirpalo santykį). Bandytojas pats turi spręsti, ar tęsti bandymą, nepaisant to, kad gali ir nepavykti pasiekti pusiausvyrą.
      1.9.2.3.   Adsorbcija ant bandymų indų paviršiaus ir bandomosios medžiagos stabilumas
      Tam tikros informacijos apie bandomosios medžiagos adsorbciją ant bandymų indų paviršiaus, taip pat apie jos stabilumą galima gauti analizuojant kontrolinius bandinius. Jei pastebimas medžiagos išeikvojimas yra didesnis nei analizės metodo standartinė paklaida, gali vykti abiotinis skaidymas ir (ar) adsorbcija ant bandymų indų paviršiaus. Šiuos du reiškinius galima atskirti, jei indų sienelės gerai nuplaunamos žinomu kiekiu atitinkamo tirpiklio ir plovimui naudotas tirpalas analizuojamas ieškant bandomosios medžiagos. Jei adsorbcija ant indų paviršiaus nevyksta, medžiagos išeikvojimas rodo abiotinį bandomosios medžiagos nestabilumą. Jei adsorbcija įrodoma, būtina keisti medžiagas, iš kurių pagaminti bandymų indai. Tačiau šiuo bandymu surinkti duomenys apie adsorbciją ant bandymų indų sienelių negali būti tiesiogiai ekstrapoliuoti dirvožemio/tirpalo bandymui. Šiai adsorbcijai įtakos gali turėti dirvožemis.
      Papildomos informacijos apie bandomosios medžiagos stabilumą galima gauti nustatant pradinės medžiagos masės balansą per tam tikrą laiką. Tokiu atveju daroma vandeninės fazės, dirvožemio ekstraktų ir bandymų indų sienelių analizė ieškant bandomosios medžiagos. Skirtumas tarp pridėtos bandomosios medžiagos masės ir bandomosios medžiagos vandeninėje fazėje, ekstraktuose ir ant bandymų indų sienelių masių sumos yra lygus masei medžiagos, kuri buvo suardyta ir (ar) išgaravo, ir (ar) nebuvo ekstrahuota. Norint nustatyti masių balansą, darant bandymą turi būti pasiekta adsorbcijos pusiausvyra.
      Masių balansas daromas dviem dirvožemiams ir kiekvieno dirvožemio vienam dirvožemio/tirpalo santykiui, kuriam pusiausvyros sąlygomis gaunamas didesnis kaip 20 %, o geriau > 50 % išeikvojimas. Baigus santykio nustatymo bandymą, kai po 48 h padaroma paskutinė vandeninės fazės bandinio analizė, fazės yra atskiriamos centrifugavimu ir, jei pageidaujama, filtravimu. Vandeninė fazė regeneruojama kuo didesniu laipsniu, paskui bandomajai medžiagai iš dirvožemio ekstrahuoti į jį įpilama tinkamo ekstrahavimo tirpiklio (ekstrahavimo faktorius bent 95 %). Rekomenduojama nuosekliai ekstrahuoti bent du kartus. Nustatomas medžiagos kiekis dirvožemio ir bandymų indų ekstraktuose ir apskaičiuojamas masių balansas (10 lygtis, „Duomenys ir ataskaita“). Jei jis yra mažesnis kaip 90 %, laikoma, kad bandomoji medžiaga bandymo metu yra nestabili. Tačiau tyrimus galima tęsti toliau, atsižvelgiant į bandomosios medžiagos nestabilumą; šiuo atveju rekomenduojama darant pagrindinį tyrimą analizuoti abi fazes.
      1.9.2.4.   2 tarpsnis. Adsorbcijos kinetika vienai bandomosios medžiagos koncentracijai
      Naudojamas iš 1 lentelės pasirinktų penkių tipų dirvožemis. Jei tinka, tarp šių penkių tipų naudinga turėti kai kuriuos dirvožemio tipus, naudotus darant pradinį tyrimą. Tuomet pradiniam tyrimui naudotiems dirvožemio tipams 2 tarpsnio bandymų daryti nereikia.
      Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė, dirvožemio/tirpalo santykis, dirvožemio bandinio masė, sąlytyje su dirvožemiu esančios vandeninės fazės tūris ir bandomosios medžiagos tirpalo koncentracija pasirenkami pagal pradinio tyrimo rezultatus. Analizę būtų geriau daryti maždaug po 2, 4, 6, 8 (galbūt dar po 10 h) ir po 24 h sąlyčio; maišymo trukmė gali būti padidinta ne daugiau kaip iki 48 h, jei cheminei medžiagai pagal santykio nustatymo rezultatus reikalinga didesnė pusiausvyros nusistovėjimo trukmė. Tačiau analizės laiką reikėtų rinktis lanksčiai.
      Kiekvienas bandymas (vienas dirvožemis ir vienas tirpalas) daromas bent du kartus, kad būtų galima įvertinti rezultatų sklaidą. Darant kiekvieną bandymą imamas tuščiasis bandinys. Jį sudaro dirvožemis ir 0,01 M CaCl2 tirpalas be bandomosios medžiagos, kurių masė ir tūris yra atitinkamai tokie pat kaip ir bandinio su bandomąja medžiaga. Norint išvengti netikėtumų, pagal tą pačią bandymo metodiką tiriamas kontrolinis bandinys tik su bandomąja medžiaga, ištirpinta 0,01 M CaCl2 tirpale (be dirvožemio).
      Adsorbcijos procentinė dalis apskaičiuojama kiekvienam laiko momentui  ir (ar) laiko tarpui  (pagal poreikį) ir pateikiamas adsorbcijos kitimo laike grafikas. Apskaičiuojamas pasiskirstymo koeficientas Kd pusiausvyros sąlygomis, taip pat pagal organinę anglį normalizuotas adsorbcijos koeficientas Koc (nepolinių organinių medžiagų).
      Adsorbcijos kinetikos bandymo rezultatai
      Tiesinė Kd vertė paprastai tiksliai aprašo dirvožemio sorbcinį elgesį (35) (78) ir yra cheminių medžiagų būdingo judrumo dirvožemyje išraiška. Pvz., paprastai cheminės medžiagos, kurių Kd ≤ 1 cm3 × g-1, kokybiškai laikomos judriomis. Panašiai MacCall et al. (16) buvo sukurta judrumo klasifikavimo schema, pagrįsta Koc vertėmis. Be to, yra išplovimo klasifikavimo schemos, pagrįstos Koc ir DT-50 (30) santykiu (32) (79).
      Pagal paklaidų analizės tyrimus (61) mažesnės kaip 0,3 cm3 × g-1 Kd vertės negali būti tiksliai įvertintos pagal vandeninės fazės koncentracijos mažėjimą, netgi taikant palankiausią (tikslumo požiūriu) dirvožemio/tirpalo santykį, t. y. 1:1. Šiuo atveju rekomenduojama analizuoti abi fazes, dirvožemį ir tirpalą.
      Atsižvelgiant į šias pastabas, rekomenduojama tęsti adsorbcinį cheminės medžiagos dirvoje elgesio ir jos potencialaus judrumo tyrimą nustatant Freundlicho adsorbcijos izotermes toms sistemoms, kurioms pagal šio metodo aprašymą galima tiksliai nustatyti Kd vertes. Tiksliai nustatyti galima, jei Kd ir dirvožemio/tirpalo santykio sandaugos vertė yra > 0,3 matuojant vandeninės fazės koncentracijos mažėjimą (netiesioginis metodas) ar > 0,1, kai analizuojamos abi fazės (tiesioginis metodas) (61).
      1.9.2.5.   3 tarpsnis. Adsorbcijos izotermės ir desorbcijos kinetika/desorbcijos izotermės
      1.9.2.5.1.   Adsorbcijos izotermės
      
      Taikomos penkios bandomosios medžiagos koncentracijos, ir būtų gerai, jei jų vertė apimtų dvi dydžio eiles; pasirenkant šias koncentracijas reikia atsižvelgti į tirpumą vandenyje ir gaunamą vandeninės fazės pusiausvyros koncentraciją. Tas pats dirvožemio/tirpalo santykis turi būti taikomas per visą tyrimą. Adsorbcijos bandymas daromas taip, kaip aprašyta pirmiau, skirtumas tik toks, kad vandeninė fazė analizuojama vieną kartą pusiausvyros nusistovėjimo momentu, nustatytu pagal 2 tarpsnio rezultatus. Nustatoma tirpalų pusiausvyros koncentracija ir pagal medžiagos kiekio tirpale sumažėjimą arba tiesioginiu metodu apskaičiuojamas adsorbuotos medžiagos kiekis. Adsorbuotos medžiagos masė, tenkanti dirvožemio masės vienetui, grafiškai pateikiama kaip bandomosios medžiagos pusiausvyros koncentracijos funkcija (žr. „Duomenys ir ataskaita“).
      Bandymo adsorbcijos izotermei gauti rezultatai
      Iš ligi šiol pasiūlytų matematinių adsorbcijos modelių dažniausiai adsorbcijos procesams apibūdinti taikoma Freundlicho izotermė. Smulkesnė informacija aiškinant adsorbcijos modelius ir jų svarbą pateikta nuorodose (41) (45) (80) (81) (82).
      
         Pastaba. Reikėtų paminėti, kad skirtingų medžiagų KF (Freundlicho adsorbcijos koeficiento) vertes galima lyginti, jei šios KF vertės yra išreikštos tais pačiais vienetais (83).
      1.9.2.5.2.   Desorbcijos kinetika
      
      Šio bandymo tikslas yra ištirti, ar cheminę medžiagą dirvožemis adsorbuoja grįžtamai ar negrįžtamai. Ši informacija yra svarbi, kadangi, cheminei medžiagai esant lauko dirvožemyje, desorbcij os procesas taip pat vaidina varbų vaidmenį. Be to, desorbcij os duomenys yra naudingi kaip įvesties duomenys kompiuteriu modeliuojant išplovimą ir ištirpusių medžiagų nuotėkį. Jei norima vykdyti desorbcij os tyrimą, rekomenduojama, kad kiekvienai sistemai, kuriai ankstesniame adsorbcijos kinetikos bandyme buvo galima tiksliai nustatyti Kd, būtų daromas toliau aprašytas tyrimas.
      Panašiai kaip darant adsorbcijos kinetikos tyrimą, yra du desorbcij os kinetikos bandymo metodai: a) lygiagretusis metodas ir b) nuoseklusis metodas. Pasirinkti metodą leidžiama bandytojui, kuris turi atsižvelgti į laboratorijos įrangą ir lėšas.
      
                  (a)
               
               
                  Lygiagretusis metodas: kiekvienam desorbcijai tirti pasirinktam dirvožemio tipui paruošiami bandiniai, kurių dirvožemio/tirpalo santykis būtų vienodas ir kurių būtų tiek, kiek laiko tarpų pasirinkta desorbcij os kinetikai tirti. Geriau naudoti laiko tarpus, pasirinktus adsorbcijos kinetikai tirti; tačiau bendras laikas gali būti atitinkamai padidintas, kad sistema galėtų pasiekti desorbcijos pusiausvyrą. Darant kiekvieną bandymą (vienas dirvožemis, vienas tirpalas) imamas vienas tuščiasis bandinys. Jį sudaro dirvožemis ir 0,01 M CaCl2 tirpalas be bandomosios medžiagos, kurių masė ir tūris atitinkamai yra tokie pat kaip ir bandinio su bandomąja medžiaga. Pagal tą pačią bandymo metodiką tiriamas kontrolinis bandinys tik su bandomąja medžiaga, ištirpinta 0,01 M CaCl2 tirpale (be dirvožemio). Visi dirvožemio ir tirpalo mišiniai purtomi, kol pasiekiama adsorbcijos pusiausvyra (kaip nustatyta pirmiau pagal 2 tarpsnį). Toliau fazės atskiriamos centrifugavimu ir vandeninės fazės yra kuo daugiau pašalinamos. Pašalinti tirpalai pakeičiami tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo be bandomosios medžiagos ir nauji mišiniai vėl purtomi. Pirmojo mėgintuvėlio vandeninė fazė kuo geriau regeneruojama ir analizuojama, pvz., po 2 h, antrojo mėgintuvėlio – po 4 h, trečiojo mėgintuvėlio – po 6 h ir t. t., kol pasiekiama desorbcijos pusiausvyra.
               
            
                  b)
               
               
                  Nuoseklusis metodas: baigus adsorbcijos kinetikos bandymą, mišinys centrifuguojamas ir vandeninė fazė kiek įmanoma daugiau pašalinama. Pašalintas tirpalas pakeičiamas tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo be bandomosios medžiagos. Naujas mišinys purtomas tol, kol pasiekiama desorbcijos pusiausvyra. Per tą laiką tam tikrais laiko tarpais mišinys yra centrifuguojamas fazėms atskirti. Maža alikvotinė tirpalo dalis tuojau pat analizuojama bandomajai medžiagai nustatyti; toliau bandymas tęsiamas su pradiniu mišiniu. Kiekvienos atskiros alikvotinės dalies tūris turi sudaryti mažiau kaip 1 % bendro tūrio. Dirvožemio ir tirpalo santykiui palaikyti įpilamas toks pat kiekis šviežio 0,01 M CaCl2 tirpalo ir purtoma iki kito laiko tarpo.
               
            Apskaičiuojama desorbcijos procentinė dalis kiekvienam laiko momentui () ir (ar) laiko tarpui () (pagal tyrimo poreikius) ir braižomas kitimo laike grafikas. Taip pat apskaičiuojamas desorbcijos koeficientas Kdes pusiausvyros sąlygomis. Visos taikomos lygtys pateiktos poskyryje „Duomenys ir ataskaita“ ir 5 priedėlyje.
      Desorbcijos kinetikos bandymo rezultatai
      Bendri desorbcijos procentinės dalies  ir adsorbcijos  kitimo laike grafikai leidžia įvertinti adsorbcijos proceso grįžtamumą. Adsorbcija laikoma grįžtama, jei laikas desorbcijos pusiausvyrai pasiekti yra trumpesnis nei dvigubas laikas adsorbcijos pusiausvyrai pasiekti ir bendra desorbcija sudaro daugiau kaip 75 % adsorbuoto kiekio.
      1.9.2.5.3.   Desorbcijos izotermės
      
      Freundlicho desorbcijos izotermės apskaičiuojamos dirvožemiams, kuriems buvo apskaičiuojamos adsorbcijos izotermės. Desorbcijos bandymas daromas, kaip aprašyta skirsnyje „Desorbcijos kinetika“, išskyrus tai, kad vandeninė fazė analizuojama tik vieną kartą, kai nusistovi desorbcijos pusiausvyra. Apskaičiuojamas desorbuotos bandomosios medžiagos kiekis. Desorbcijos pusiausvyros sąlygomis likęs dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis grafiškai pateikiamas kaip bandomosios medžiagos tirpalo pusiausvyros koncentracijos funkcija (žr. „Duomenys ir ataskaita“ ir 5 priedėlį).
      2.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      Analizės duomenys pateikiami lentelėse (žr. 6 priedėlį). Pateikiami atskiri matavimai ir apskaičiuotos vidutinės vertės. Adsorbcijos izotermės pateikiamos grafiškai. Apskaičiavimai daromi, kaip nurodyta toliau.
      Darant šį bandymą laikoma, kad 1 cm3 vandeninio tirpalo masė yra 1 g. Dirvožemio/tirpalo santykis gali būti išreikštas m/m ar m/V, skaitmeninė šių dydžių vertė yra vienoda.
      2.1.   ADSORBCIJA
      Adsorbcija  yra apibrėžiama bandymo sąlygomis dirvožemiu adsorbuotos medžiagos procentine dalimi nuo jos kiekio bandymo pradžioje. Jei bandomoji medžiaga yra stabili ir indo sienelės jos žymiai neadsorbuoja,  kiekvienu laiko momentu ti apskaičiuojama pagal lygtį:
      
                  
                     
               
               
                  (3)
               
            čia:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  adsorbcijos procentinė dalis laiko momentu ti ( %),
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  laiku ti dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg),
               
            
                  m0
                  
               
               
                  =
               
               
                  bandymo pradžioje mėgintuvėlyje esančios bandomosios medžiagos masė (μg).
               
            Informacija, kaip apskaičiuoti adsorbciją  lygiagrečiuoju ir nuosekliuoju metodu, išsamiai aprašyta 5 priedėlyje.
      Pasiskirstymo koeficientas Kd yra medžiagos kiekio dirvožemio fazėje ir vandeninio tirpalo masės koncentracijos santykis bandymo sąlygomis, pasiekus adsorbcijos pusiausvyrą.
      
                  
                     (cm3 g-1)
               
                  (4)
               
            čia:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  dirvožemiu adsorbuotos medžiagos kiekis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg × g-1),
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  medžiagos vandeninės fazės masės koncentracija adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg × g-3). Ši koncentracija nustatoma analizės būdu atsižvelgiant į vertes, gautas tuščiaisiais bandymais;
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  dirvožemiu adsorbuotos medžiagos masė adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  tirpale esančios medžiagos masė adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg);
               
            
                  msoil
                  
               
               
                  =
               
               
                  dirvožemio fazės kiekis, išreikštas sauso dirvožemio mase (g);
               
            
                  Vo
                  
               
               
                  =
               
               
                  sąlytyje su dirvožemiu esančios vandeninės fazės pradinis tūris (cm3).
               
            Aeq ir Kd santykis aprašomas lygtimi:
      
                  
                     (cm3 g-1)
               
                  (5)
               
            čia:
      
                  Aeq
                  
               
               
                  =
               
               
                  adsorbcijos procentinė dalis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis %
               
            Pagal organinę anglį normalizuotas adsorbcijos koeficientas Koc susieja pasiskirstymo koeficientą Kd ir dirvožemio bandinio organinės anglies kiekį:
      
                  
                     (cm3 g-1)
               
                  (6)
               
            čia:
      
                  %OC
               
               
                  =
               
               
                  organinės anglies dirvožemio bandinyje procentinė dalis (g x g-1).
               
            Koc koeficientas rodo vienintelę vertę, kuri apibūdina daugiausia nepolinių organinių cheminių medžiagų pasiskirstymą tarp dirvožemio organinės anglies ar nuosėdų ir vandens. Šių cheminių medžiagų adsorbcija susiejama su organinės medžiagos kiekiu adsorbuojančioje kietojoje medžiagoje (7); taigi Koc vertės priklauso nuo humusinių dalių, kurių sorbcijos galia labai skiriasi dėl kilmės, genezės ir t.t. specifinių charakteristikų.
      2.1.1.   Adsorbcijos izotermės
      Freundlicho adsorbcijos izotermių lygtis susieja adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekį ir bandomosios medžiagos tirpalo koncentraciją pusiausvyros sąlygomis (8 lygtis).
      Duomenys apdorojami, kaip nurodyta „Adsorbcijos“ poskyryje, ir kiekvienam mėgintuvėliui po adsorbcijos bandymo apskaičiuojamas dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis (, kitur žymimas x/m). Daroma prielaida, kad pusiausvyra yra pasiekta ir kad  rodo pusiausvyros vertę:
      
                  
                     (μg g-1)
               
                  (7)
               
            Freundlicho adsorbcijos lygtis pateikta (8):
      
                  
                     (μg g-1)
               
                  (8)
               
            ar tiesės pavidalu:
      
                  
                     
               
               
                  (9)
               
            čia:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  Freundlicho adsorbcijos koeficientas; jo dimensija yra cm3 × g-1, tik jei l/n = 1; visais kitais atvejais į  (μg1-1/n (cm3)1/n g-1);
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  regresijos konstanta; l/n dažniausiai kinta 0,7-1,0 intervale, ir tai rodo, kad sorbcijos duomenys dažnai yra šiek tiek netiesiški.
               
            Gali būti nubrėžti 8 ir 9 lygčių grafikai ir taikant 9 lygtį regresijos analizės metodu apskaičiuojami  ir l/n. Taip pat apskaičiuojamas logaritminės lygties koreliacijos koeficientas r2 . Tokių grafikų pavyzdys pateiktas 2 pav.
      
         
      2.1.2.   Masių balansas
      Masių balansas (MB) apibrėžiamas kaip medžiagos, galinčios būti analiziškai regeneruotos po adsorbcijos bandymo, procentinė dalis nuo medžiagos vardinio kiekio bandymo pradžioje.
      Duomenų apdorojimas skirsis, jei tirpiklis visiškai maišosi su vandeniu. Jei tirpiklis maišosi su vandeniu, ekstrahuojant tirpikliu regeneruojamos medžiagos kiekiui nustatyti galima taikyti duomenų apdorojimo būdą, aprašytą „Desorbcijos“ poskyryje. Jei tirpiklis su vandeniu maišosi blogiau, reikia nustatyti regeneruotos medžiagos kiekį.
      Adsorbcijos atveju masių balansas MB apskaičiuojamas, kaip nurodyta toliau. Daroma prielaida, kad narys (mE) atitinka bandomosios cheminės medžiagos, organiniu tirpikliu ekstrahuojamos iš dirvožemio ir nuo bandymų indo sienelių, masių sumą:
      
                  
                     
               
               
                  (10)
               
            čia:
      
                  MB
               
               
                  =
               
               
                  masių balansas ( %),
               
            
                  mE
                  
               
               
                  =
               
               
                  bandomosios medžiagos, dviem pakopomis ekstrahuotos iš dirvožemio ir nuo sienelių, bendroji masė (μg);
               
            
                  Co
                  
               
               
                  =
               
               
                  sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomojo tirpalo pradinė masės koncentracija (μg cm -3),
               
            
                  Vrec
                  
               
               
                  =
               
               
                  adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis regeneruoto tirpalo virš nuosėdų tūris (cm-3).
               
            2.2.   DESORBCIJA
      Desorbeija (D) apibrėžiama kaip desorbuotos bandomosios medžiagos procentinė dalis nuo medžiagos kiekio, prieš tai adsorbuotos bandymo sąlygomis:
      
                  
                     
               
               
                  (11)
               
            čia:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  desorbcijos procentinė dalis laiko momentu ti ( %),
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  laiko momentu ti (μg) nuo dirvožemio desorbuotos bandomosios medžiagos masė,
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg).
               
            Informacija, kaip apskaičiuoti desorbcijos procentinę dalį  lygiagrečiuoju ir nuosekliuoju metodu, išsamiai aprašyta 5 priedėlyje.
      Tariamasis desorbcijos koeficientas (Kdes) bandymo sąlygomis yra dirvožemio fazėje likusios medžiagos kiekio ir desorbuotos medžiagos vandeninio tirpalo masės koncentracijos santykis pasiekus desorbcijos pusiausvyrą:
      
                  
                     (cm3 g-1)
               
                  (12)
               
            čia:
      
                  Kdes
                  
               
               
                  =
               
               
                  desorbcijos koeficientas (cm3 x g-1);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  nuo dirvožemio desorbuotos bandomosios medžiagos bendroji masė desorbcijos pusiausvyros sąlygomis (ug);
               
            
                  VT
                  
               
               
                  =
               
               
                  darant desorbcijos kinetikos bandymą sąlytyje su dirvožemiu esančios vandeninės fazės bendrasis tūris (cm3).
               
            Kaip apskaičiuoti nurodyta 5 priedėlio poskyryje „Desorbcija“.
      Pastaba.
      Jei prieš tai darant adsorbcijos bandymą buvo taikomas lygiagretusis metodas, laikoma, kad tūris VT 12 lygtyje yra lygus Vo.
      2.2.1.   Desorbcijos izotermės
      Freundlicho desorbcijos izotermių lygtis susieja desorbcijos pusiausvyros sąlygomis likusios dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekį ir bandomosios medžiagos tirpalo koncentraciją (16 lygtis).
      Desorbcijos pusiausvyros sąlygomis likusios dirvožemiu adsorbuotos medžiagos kiekis kiekvienam mėgintuvėliui apskaičiuojamas taip:
      
                  
                      (µg g-1)
               
                  (13)
               
            
          yra apibrėžiama taip:
      
                  
                     (μg)
               
                  (14)
               
            čia:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  bandomosios medžiagos, kuri liko adsorbuota dirvožemiu desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, kiekis (μg x g-1);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  medžiagos, analiziškai nustatytos vandeninėje terpėje desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, masė (μg);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl nevisiško tūrio pakeitimo, masė (μg);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  medžiagos, esančios tirpale adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis, masė (μg);
               
            
                  
                     
               
               
                  (15)
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti desorbcijos pusiausvyros sąlygomis, tūris (cm3)
               
            
                  VR
                  
               
               
                  =
               
               
                  tirpalo virš nuosėdų, pašalinto iš mėgintuvėlio pasiekus adsorbcijos pusiausvyrą ir pakeisto tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo, tūris (cm3);
               
            Freundlicho desorbcijos lygtis pateikta (16):
      
                  
                     (μg g-1)
               
                  (16)
               
            ar tiesės pavidalu:
      
                  
                     
               
               
                  (17)
               
            čia:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  Freundlicho desorbcijos koeficientas;
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  regresijos konstanta;
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  medžiagos vandeninėje fazėje masės koncentracija desorbcijos pusiausvyros sąlygomis (μg x cm-3).
               
            Gali būti nubrėžti 16 ir 17 lygčių grafikai ir taikant 17 lygtį regresijos analizės metodu apskaičiuojami ir l/n.
      Pastaba:
      Jei Freundlicho adsorbcijos ar desorbcijos laipsnio rodiklis l/n yra lygus 1, Freundlicho lygčių adsorbcijos ar desorbcijos konstantos ( ir ) bus lygios atitinkamai adsorbcijos ar desorbcijos pusiausvyros konstantoms (Kd ir Kdes), ir Cs priklausomybės nuo Caq grafikas bus tiesė. Jei laipsnių rodikliai nėra lygūs 1, Cs priklausomybės nuo Caq grafikai nebus tiesės ir adsorbcijos bei desorbcijos konstantos keisis išilgai izotermių.
      2.2.2.   Bandymų ataskaita
      Bandymų ataskaitoje turi būti ši informacija:
      
                  —
               
               
                  išsamus naudotų dirvožemio bandinių identifikavimas, įskaitant:
               
            
                  —
               
               
                  geografinį vietos nurodymą (platuma, ilguma),
               
            
                  —
               
               
                  bandinio ėmimo datą,
               
            
                  —
               
               
                  kilmę (pvz., žemės ūkio paskirties dirvožemis, miškas ir t. t.),
               
            
                  —
               
               
                  bandinio ėmimo gylį,
               
            
                  —
               
               
                  smėlio/dumblo/molio kiekį,
               
            
                  —
               
               
                  pH vertes (0,01 M CaCl2),
               
            
                  —
               
               
                  organinės anglies kiekį,
               
            
                  —
               
               
                  organinės medžiagos kiekį,
               
            
                  —
               
               
                  azoto kiekį,
               
            
                  —
               
               
                  C/N santykį,
               
            
                  —
               
               
                  katijonų mainų talpą (mmol/kg),
               
            
                  —
               
               
                  visą informaciją apie dirvožemio bandinių rinkimą ir laikymą,
               
            
                  —
               
               
                  jei tinka, visą informaciją, reikalingą bandomosios medžiagos adsorbcijai/desorbcijai aiškinti,
               
            
                  —
               
               
                  metodus, taikomus kiekvienam parametrui nustatyti,
               
            
                  —
               
               
                  atitinkama informacija apie bandomąją medžiagą,
               
            
                  —
               
               
                  bandymų temperatūra,
               
            
                  —
               
               
                  centrifugavimo sąlygos,
               
            
                  —
               
               
                  analizės metodika, taikyta bandomajai medžiagai analizuoti,
               
            
                  —
               
               
                  priežastys, kurios pagrįstų soliubilizavimo agento naudojimą pradiniam bandomosios medžiagos tirpalui ruošti,
               
            
                  —
               
               
                  apskaičiavimuose darytų pataisų aiškinimai, jei tinka,
               
            
                  —
               
               
                  duomenys pagal formą (6 priedėlis) ir grafikai,
               
            
                  —
               
               
                  visa informacija ir pastebėjimai, padedantys aiškinti bandymų rezultatus.
               
            3.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  Kukowski H. and Brūmmer G., (1987). Investigations on the Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02 045, Part II.
               
            
                  2)
               
               
                  Franzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02 045, Part I.
               
            
                  3)
               
               
                  Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication no. 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.
               
            
                  4)
               
               
                  OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995 (June 1995).
               
            
                  5)
               
               
                  US-Environment Protection Agency: Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.
               
            
                  6)
               
               
                  US-Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.
               
            
                  7)
               
               
                  ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Determining a Sorption Constant (Koc) for an Organic Chemical in Soil and Sediments.
               
            
                  8)
               
               
                  Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.
               
            
                  9)
               
               
                  Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Application for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
               
            
                  10)
               
               
                  Danish National Agency of Environmental Protection (October 1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment.
               
            
                  11)
               
               
                  BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany.
               
            
                  12)
               
               
                  Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and the prediction of the mobilities of pesticides in soils“, in Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
               
            
                  13)
               
               
                  Calvet R., (1980) „Adsorption-Desorption Phenomena“ in Interactions between herbicides and the soil. (RJ. Hance ed.), Academic Press, London, pp. 83-122.
               
            
                  14)
               
               
                  Hasset J.J., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of nonpolar organics by soils and sediments“ in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, pp 31-44.
               
            
                  15)
               
               
                  van Genuchten M. Th., Davidson J.M., and Wierenga P.J., (1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media“. Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), 29-35.
               
            
                  16)
               
               
                  McCall P.J., Laskowski D.A., Swann R.L., and Dishburger H.J., (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis“, in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.
               
            
                  17)
               
               
                  Lambert S.M., Porter P.E., and Schieferrstein R.H., (1965), „Movement and sorption of chemicals applied to the soil“. Weeds, 13, 185-190.
               
            
                  18)
               
               
                  Rhodes R.C., Belasco I.J., and Pease H.L., (1970) „Determination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils“. J.Agric.Food Chem., 18, 524-528.
               
            
                  19)
               
               
                  Russell M.H., (1995), „Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil“ in Environmental Behavior of Agrochemicals (ed. T.R. Roberts and P.C. Kearney). John Wiley & Sons Ltd.
               
            
                  20)
               
               
                  Esser H.O., Hemingway R.J., Klein W., Sharp D.B., Vonk J.W. and Holland P.T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides“, IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 901-932.
               
            
                  21)
               
               
                  Guth J.A., Burkhard N., and D.O. Eberle, (1976), „Experimental models for studying the persistence of pesticides in soils“. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp 137-157, BCPC, Surrey, UK.
               
            
                  22)
               
               
                  Furminge C.G.L., and Osgerby J.M., (1967), „Persistence of herbicides in soil“. J. Sci. Fd Agric, 18, 269-273.
               
            
                  23)
               
               
                  Burkhard N., and Guth J.A., (1981), „Chemical hydrolysis of 2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-l,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption“. Pestic. Sci. 12, 45-52.
               
            
                  24)
               
               
                  Guth J.A., Gerber H.R., and Schlaepfer T., (1977). „Effect of adsorption, movement and persistence on the biological availability of soil-applied pesticides“. Proc. Br. Crop Prot. Conf, 3, 961-971.
               
            
                  25)
               
               
                  Osgerby J.M., (1973), „Process affecting herbicide action in soil“. Pestic. Sci., 4, 247-258.
               
            
                  26)
               
               
                  Guth J.A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von Pflanzenschutzmitteln in Boden“. Schr. Reihe Ver. Wass. -Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, 143-154.
               
            
                  27)
               
               
                  Hamaker J.W., (1975), „The interpretation of soil leaching experiments“, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R Haque and V.H. freed), pp. 135-172, Plenum Press, NY.
               
            
                  28)
               
               
                  Helling C.S., (1971), „Pesticide mobility in soils“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc, 35, 732-210.
               
            
                  29)
               
               
                  Hamaker J.W., (1972), „Diffusion and volatilization“ in Organic chemicals in the soil environment (CAT. Goring and J.W. Hamaker eds), Vol. I, 49-143.
               
            
                  30)
               
               
                  Burkhard N. and Guth J.A., (1981), „Rate of volatilisation of pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results with those determined in a laboratory model system“. Pestic. Sci. 12, 37-44.
               
            
                  31)
               
               
                  Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G., (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
               
            
                  32)
               
               
                  Gustafson D.I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple method for assessing pesticide teachability“. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), 339-357.
               
            
                  33)
               
               
                  Leistra M., and Dekkers W.A., (1976). „Computed effects of adsorption kinetics on pesticide movement in soils“. J. of Soil Sci., 28, 340-350.
               
            
                  34)
               
               
                  Bromilov R.H., and Leistra M., (1980), „Measured and simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils“. Pest. Sci., 11, 389-395.
               
            
                  35)
               
               
                  Green R.E., and Karickoff S.W., (1990), „Sorption estimates for modeling“, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., Book Series no. 2, pp.80-101,
               
            
                  36)
               
               
                  Lambert S.M., (1967), „Functional relationship between sorption in soil and chemical structure“. J. Agri. Food Chem., 15, 572-576.
               
            
                  37)
               
               
                  Hance R.J., (1969), „An empirical relationship between chemical structure and the sorption of some herbicides by soils“. J. Agri. Food Chem., 17, 667-668.
               
            
                  38)
               
               
                  Briggs G.G (1969), „Molecular structure of herbicides and their sorption by soils“. Nature, 223, 1288.
               
            
                  39)
               
               
                  Briggs G.G. (1981). „Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor“. J. Agric. Food Chem., 29, 1050-1059.
               
            
                  40)
               
               
                  Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of soil sorption of organic polutance by molecular topology“. J. Agric. Food Chem., 32, 243-246.
               
            
                  41)
               
               
                  Bailey G.W., and White J.L., (1970), „Factors influencing the adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil“. Residue Rev., 32, 29-92.
               
            
                  42)
               
               
                  Bailey G.W., J.L. White and Y. Romberg., (1968), „Adsorption of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 32:222-234.
               
            
                  43)
               
               
                  Karickhoff S.W., (1981) „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. Chemosphere 10, 833-846.
               
            
                  44)
               
               
                  Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners“. Environ. Toxicol. Safety 21, 1-17.
               
            
                  45)
               
               
                  Hamaker J.W., and Thompson J.M., (1972). „Adsorption in organic chemicals“ in Organic Chemicals in the Soil Environment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, pp. 49-143.
               
            
                  46)
               
               
                  Deli J., and Warren G.F., 1971, „Adsorption, desorption and leaching of diphenamid in soils“. Weed Sci. 19:67-69.
               
            
                  47)
               
               
                  Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J.M. and Santelmann, (1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils“. Weed Science, Vol. 23, 454-457.
               
            
                  48)
               
               
                  Haues M.H.B., Stacey M., and Thompson J.M., (1968) „Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations“ in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p. 75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
               
            
                  49)
               
               
                  Pionke H.B., and Deangelis R.J., (1980), „Methods for distributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase“, CREAMS, in A Field Scale Model for Chemicals, Runoff and Erosion from Agricultural Management Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.
               
            
                  50)
               
               
                  ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition (1994).
               
            
                  51)
               
               
                  Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.
               
            
                  52)
               
               
                  Black, Evans D.D., White J.L., Ensminger L.E., and Clark F.E., eds. „Methods of Soil Analysis“, Vol 1 and 2, American Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.
               
            
                  53)
               
               
                  ISO/DIS 10381-1 Soil Quality – Sampling – Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.
               
            
                  54)
               
               
                  ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance on sampling techniques.
               
            
                  55)
               
               
                  ISO/DIS 10381-3 Soil Quality – Sampling – Part 3: Guidance on safety of sampling.
               
            
                  56)
               
               
                  ISO/DIS 10381-4 Soil Quality – Sampling – Part 4: Guidance on the investigation of natural and cultivated soils.
               
            
                  57)
               
               
                  ISO/DIS 10381-5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.
               
            
                  58)
               
               
                  ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
               
            
                  59)
               
               
                  Green R.E., and Yamane V.K., (1970) „Precision in pesticide adsorption measurements“. Soil Sci. Am. Proc., 34, 353-354.
               
            
                  60)
               
               
                  Grover R., and Hance R.J. (1970), „Effect of ratio of soil to water on adsorption of linuron and atrazine“. Soil Sci., 109-138.
               
            
                  61)
               
               
                  Boesten, J.J.T.I, „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system“. Pest. Sci. 1990, 30, 31-41.
               
            
                  62)
               
               
                  Boesten, J.J.T.I. „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106“ Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.
               
            
                  63)
               
               
                  Bastide J., Cantier J.M., et Coste C, (1980), „Comportement de substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique“. Weed Res. 21, 227-231.
               
            
                  64)
               
               
                  Brown D.S., and Flagg E.W., (1981), „Empirical prediction of organic pollutants sorption in natural sediments“. J. Environ.Qual., 10(3), 382-386.
               
            
                  65)
               
               
                  Chiou C.T., Porter P.E., and Schmedding D.W., (1983), „Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water“. Environ. Sci. Technol., 17(4), 227-2311.
               
            
                  66)
               
               
                  Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic substances by soils and sediments“. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), 297-312.
               
            
                  67)
               
               
                  Vowles P.D., and Mantoura R.F.C., (1987), „Sediment-water partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons“. Chemosphere, 16(1), 109-116.
               
            
                  68)
               
               
                  Lyman W.J. , Reehl W.F.and Rosenblatt D.H. (1990). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
               
            
                  69)
               
               
                  Keniga E.E., and Goring, C.A.I. (1980). „Relationship between water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota“ in Aquatic Toxicology (eds J.G Eaton, et al.), pp.78-115, ASTM STP 707, Philadelphia.
               
            
                  70)
               
               
                  Chiou C.T., Peters L.J., and Freed V.H., (1979), „A physical concept of soil-water equilibria for non-ionic organic compounds“. Science, Vol. 206, 831-832.
               
            
                  71)
               
               
                  Hassett J.J., Banwart W.I., Wood S.G., and Means J.C., (1981), „Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption“. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, 38-42.
               
            
                  72)
               
               
                  Karickhoff S.W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. Chemosphere, Vol. 10(8), 833-846.
               
            
                  73)
               
               
                  Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilité – reactivité. Revue de l'Agric, 34 (4), 319-322.
               
            
                  74)
               
               
                  Müller M., Kordel W. (1996), „Comparison of screening methods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil“. Chemosphere, 32(12), 2493-2504.
               
            
                  75)
               
               
                  Kordel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), „HPLC – screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil – results of a ring test“. Chemosphere 30 (7), 1373-1384.
               
            
                  76)
               
               
                  Kordel W., Stutte J., Kotthoff G (1993), „HPLC – screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil – comparison of different stationary phases. Chemosphere 27 (12), 2341-2352.
               
            
                  77)
               
               
                  Hance, R.J., (1967), „The speed of Attainment of Sorption Equilibria in Some Systems Involving Herbicides“. Weed Research, Vol. 7, pp. 29-36.
               
            
                  78)
               
               
                  Koskinen W.C., and Harper S.S., (1990), „The retention processes: mechanisms“ in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
               
            
                  79)
               
               
                  Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp.297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
               
            
                  80)
               
               
                  Giles C.H., (1970), „Interpretation and use of sorption isotherms“ in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, 14-32.
               
            
                  81)
               
               
                  Giles, C.H.; McEwan J.H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, (1960), „Studies in adsorption: XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils“. J. Chem. Soc, 3973-93.
               
            
                  82)
               
               
                  Calvet R., Tercé M., and Arvien J.C., (1980), „Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caracteristiques gėnėrales de 1'adsorption“. Ann. Agron. 31: 239-251.
               
            
                  83)
               
               
                  Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equation“, Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, U.K.
               
            
                  84)
               
               
                  Guth, J.A., (1985), „Adsorption/desorption“, in Joint International Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.
               
            
                  85)
               
               
                  Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
               
            
         1 PRIEDELIS
         Bandymo planas
         
            
      
      
         2 priedėlis
         ANALIZĖS METODO IR KONCENTRACIJOS POKYČIO ĮTAKA ADSORBCIJOS REZULTATŲ TIKSLUMUI
         15 toliau pateiklamos lentelės (84) matyti, kad, jei tirpale esančios bandomosios medžiagos pradinis masės (m0 = 110 μg) ir pusiausvyros masės ( = 100 μg) skirtumas labai mažas, dėl 5 % paklaidos matuojant pusiausvyros koncentracija, susidaro 50 % paklaida apskaičiuojant dirvožemiu adsorbuotos medžiagos masę () ir 52,4 % paklaida apskaičiuojant Kd
         
         
                     Dirvožemio kiekis
                  
                  
                     msoil
                     
                  
                  
                     = 10 g
                  
               
                     Tirpalo tūris
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     = 100 cm3
                     
                  
               
            
         
                      
                  
                  FOR-L_2008142LT.01044401.notes.0187.xml.jpg(μg)
                  
                  FOR-L_2008142LT.01044401.notes.0188.xml.jpg(μg cm-3)
                  
                  
                     R
                  
                  FOR-L_2008142LT.01044401.notes.0189.xml.jpg(μg)
                  
                  FOR-L_2008142LT.01044401.notes.0190.xml.jpg(μg g-1)
                  
                  
                     R‡
                  
                  
                     Kd*
                  
                  
                     R‡
                  
               
                      
                  
                  
                     
                        FOR A = 9 %
                     
                  
               
                     m0 = 110 μg ar C0=1,100 μg/cm3
                     
                  
                  
                     100
                  
                  
                     1,000
                  
                  
                     Tikroji vertė
                  
                  
                     10
                  
                  
                     1,00
                  
                  
                     Tikroji vertė
                  
                  
                     1
                  
                  
                      
                  
               
                     101
                  
                  
                     1,010
                  
                  
                     1 %
                  
                  
                     9
                  
                  
                     0,90
                  
                  
                     10 %
                  
                  
                     0,891
                  
                  
                     10,9 %
                  
               
                     105
                  
                  
                     1,050
                  
                  
                     5 %
                  
                  
                     5
                  
                  
                     0,50
                  
                  
                     50 %
                  
                  
                     0,476
                  
                  
                     52,4 %
                  
               
                     109
                  
                  
                     1,090
                  
                  
                     9 %
                  
                  
                     1
                  
                  
                     0,10
                  
                  
                     90 %
                  
                  
                     0,092
                  
                  
                     90,8 %
                  
               
                      
                  
                  
                     
                        FOR A = 55 %
                     
                  
               
                     m0= 110 μg ar C0=1,100μg/cm3
                     
                  
                  
                     50,0
                  
                  
                     0,500
                  
                  
                     Tikroji vertė
                  
                  
                     60,0
                  
                  
                     6,00
                  
                  
                     Tikroji vertė
                  
                  
                     12,00
                  
                  
                      
                  
               
                     50,5
                  
                  
                     0,505
                  
                  
                     1 %
                  
                  
                     59,5
                  
                  
                     5,95
                  
                  
                     0,8 %
                  
                  
                     11,78
                  
                  
                     1,8 %
                  
               
                     52,5
                  
                  
                     0,525
                  
                  
                     5 %
                  
                  
                     57,5
                  
                  
                     5,75
                  
                  
                     4,0 %
                  
                  
                     10,95
                  
                  
                     8,8 %
                  
               
                     55,0
                  
                  
                     0,550
                  
                  
                     10 %
                  
                  
                     55,0
                  
                  
                     5,50
                  
                  
                     8,3 %
                  
                  
                     10,00
                  
                  
                     16,7 %
                  
               
                      
                  
                  
                     
                        FOR A = 99 %
                     
                  
               
                     m0 = 110 μg ar C0=1,100 μg/cm3
                     
                  
                  
                     1,100
                  
                  
                     0,011
                  
                  
                     Tikroji vertė
                  
                  
                     108,9
                  
                  
                     10,89
                  
                  
                     Tikroji vertė
                  
                  
                     990
                  
                  
                      
                  
               
                     1,111
                  
                  
                     0,01111
                  
                  
                     1 %
                  
                  
                     108,889
                  
                  
                     10,8889
                  
                  
                     0,01 %
                  
                  
                     980
                  
                  
                     1,0 %
                  
               
                     1,155
                  
                  
                     0,01155
                  
                  
                     5 %
                  
                  
                     108,845
                  
                  
                     10,8845
                  
                  
                     0,05 %
                  
                  
                     942
                  
                  
                     4,8 %
                  
               
                     1,21
                  
                  
                     0,0121
                  
                  
                     10 %
                  
                  
                     108,790
                  
                  
                     10,8790
                  
                  
                     0,10 %
                  
                  
                     899
                  
                  
                     9,2 %
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     
                        
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     bandomosios medžiagos dirvožemio fazėje masė pusiausvyros sąlygomis, μg;
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     bandomosios medžiagos vandeninėje fazėje masė pusiausvyros sąlygomis, μg;
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     bandomosios medžiagos dirvožemio fazėje kiekis pusiausvyros sąlygomis, μg g-1;
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija pusiausvyros sąlygomis, μg cm-3;
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     analizinė paklaida nustatant;
                  
               
                     R‡
                  
                  
                     =
                  
                  
                     apskaičiuota paklaida dėl analizinės paklaidos R.
                  
               
      
         3 Priedėlis
         KD VERTINIMO METODAI
         
                     1.
                  
                  
                     Vertinimo metodai leidžia daryti Kd vertės prognozę, pagrįstą koreliacija, su, pvz., Pow vertėmis (12) (39) (63-68), tirpumo vandenyje duomenimis (12) (19) (21) (39) (68-73) ar poliškumo duomenimis, gautais taikant atvirkštinių fazių HPLC metodą (74-76). Kaip parodyta 1 ir 2 lentelėse, pagal tas lygtis apskaičiuojamos K
                           OC
                         ar Kom vertės ir po to netiesiogiai pagal šias lygtis apskaičiuojama Kd:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 
                                    
                              
                           
               
                     2.
                  
                  
                     Šių koreliacijų koncepcija pagrįsta dviem prielaidomis: 1) tai dirvožemio organinė medžiaga, kuri iš esmės daro įtaką medžiagos adsorbcijai; ir 2) vykstančios sąveikos yra daugiausia nepolinės. Todėl šios koreliacijos: 1) netinka arba tik iš dalies tinka polinėms medžiagoms, ir 2) netinka tais atvejais, kai organinės medžiagos dirvožemyje kiekis yra labai mažas (12). Be to, nors tarp Pow ir adsorbcijos buvo nustatytos patenkinamos koreliacijos (19), to negalima pasakyti apie tirpumo vandenyje ir adsorbcijos laipsnio priklausomybę (19) (21); taigi tyrimai yra labai prieštaringi.
                  
               
                     3.
                  
                  
                     Kai kurie adsorbcijos koeficiento ir oktanolio-vandens pasiskirstymo koeficiento bei tirpumo vandenyje koreliacijų pavyzdžiai pateikti atitinkamai 1 ir 2 lentelėje.
                     1 lentelė
                     Koreliacijos tarp adsorbcijos pasiskirstymo koeficiento ir oktanolio-vandens pasiskirstymo koeficiento pavyzdžiai; kiti pavyzdžiai pateikti (12) (68)
                     
                                 Medžiagos
                              
                              
                                 Koreliacijos lygtys
                              
                              
                                 Autoriai
                              
                           
                                 Pavaduoto karbamido dariniai
                              
                              
                                 log Kom = 0,69 + 0,52 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Briggs(1981)(39)
                              
                           
                                 Chlorinti aromatiniai junginiai
                              
                              
                                 log Koc = -0,779 + 0,904 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Chiou et al. (1983) (65)
                              
                           
                                 Įvairūs pesticidai
                              
                              
                                 log Kom = 4,4 + 0,72 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Gerstl ir Mingelgrin (1984) (66)
                              
                           
                                 Aromatiniai angliavandeniliai
                              
                              
                                 log Koc = -2,53 + 1,15 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Vowles ir Mantoura (1987) (67)
                              
                           
                        
                     2 lentelė
                     Koreliacijos tarp adsorbcijos pasiskirstymo koeficiento ir tirpumo vandenyje pavyzdžiai; kiti pavyzdžiai pateikti (68) (69)
                     
                                 Junginiai
                              
                              
                                 Koreliacijos lygtys
                              
                              
                                 Autoriai
                              
                           
                                 Įvairūs pesticidai
                              
                              
                                 log Kom= 3,8 - 0,561 log Sw
                                 
                              
                              
                                 Gerstl ir Mingelgrin (1984) (66)
                              
                           
                                 Alifatinės, aromatinės chlorintos medžiagos
                              
                              
                                 log Kom = (4,040 +/- 0,038) – (0,557 +/- 0,012) log Sw
                                 
                              
                              
                                 Chiou et al. (1979) (70)
                              
                           
                                 α-naftolis
                              
                              
                                 logKoc = 4,273 - 0,686 log Sw
                                 
                              
                              
                                 Hassetetal. (1981) (71)
                              
                           
                                 Ciklinės, alifatinės aromatinės medžiagos
                              
                              
                                 logKoc = -1,405 - 0,921 log Sw-0,00953 (mp-25)
                              
                              
                                 Karickhoff (1981) (72)
                              
                           
                                 Įvairūs junginiai
                              
                              
                                 log Kom = 2,75 - 0,45 log
                              
                              
                                 Moreale van Blade (1982)
                              
                           
               
      
         4 Priedėlis
         SKAIČIAVIMAI CENTRIFUGAVIMO SĄLYGOMS APIBRĖŽTI
         
                     1.
                  
                  
                     Centrifugavimo trukmė nustatoma pagal šią formulę darant prielaidą, kad dalelės yra rutulio formos:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (1)
                              
                           Siekiant supaprastinti, visi paramerai yra išreikšti ne SI vienetais (g, cm).
                     Čia:
                     
                                 ω
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 sukimosi greitis (=2 π rpm/60), rad × s-1,
                              
                           
                                 rp
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 apsisukimų dažnis, min-1, m
                              
                           
                                 η
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 tirpalo klampis, g × s-1 × cm-1,
                              
                           
                                 rp
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 dalelių spindulys, cm,
                              
                           
                                 ρs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 dirvožemio tankis, g × cm-3,
                              
                           
                                 ρaq
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 tirpalo tankis, g × cm-3,
                              
                           
                                 Rt
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 nuotolis nuo centrifugos rotoriaus centro iki tirpalo centrifugavimo mėgintuvėlyje viršaus, cm,
                              
                           
                                 Rb
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 nuotolis nuo centrifugos rotoriaus centro iki tirpalo centrifugavimo mėgintuvėlyje apačios, cm,
                              
                           
                                 Rb-Rt
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 dirvožemio ir tirpalo mišinio stulpelio centrifugavimo mėgintuvėlyje ilgis.
                              
                           Kad būtų garantuotas visiškas atskyrimas, praktikoje dažniausiai vartojama trukmė yra lygi dvigubai apskaičiuotai trukmei.
                  
               
                     2.
                  
                  
                     1 lygtis gali būti dar supaprastinta darant prielaidą, kad tirpalo klampis (η) ir tankis (ρaq) yra lygūs vandens 25 oC klampiui ir tankiui; taigi, η = 8,95 × 10-3g × s-1 × cm-1 and ρaq = 1,0 g × cm-3.
                     Tuomet centrifugavimo trukmė išreiškiama 2 lygtimi:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (2)
                              
                           
               
                     3.
                  
                  
                     Iš 2 lygties aišku, kad norint pasiekti tam tikro dydžio dalelių atsiskyrimą (mūsų atveju 0,1 μm spindulio) centrifugavimo režimui, t. y. laikui (t) ir apsisukimų dažniui (min-1), apibrėžti yra svarbūs du parametrai: 1) dirvožemio tankis ir 2) mišinio stulpelio centrifugavimo mėgintuvėlyje ilgis (Rb – Rt), t. y. nuotolis, kurį dirvožemio dalelė įveikia nuo tirpalo viršaus iki mėgintuvėlio dugno; akivaizdu, kad tam tikro tūrio mišinio stulpelio mėgintuvėlyje ilgis priklauso nuo mėgintuvėlio spindulio kvadratu.
                  
               
                     4.
                  
                  
                     1 pav. pavaizduotas centrifugavimo trukmės (t) kitimas pagal centrifugos apsisukimų dažnį (min-1) esant skirtingiems dirvožemių tankiams (ρs) (1a pav.) ir skirtingiems mišinio stulpelio centrifugavimo mėgintuvėlyje ilgiams (1b pav.). Iš 1a pav. matyti, kad dirvožemio tankio įtaka yra akivaizdi; pvz., tradicinis centrifugavimas 3000 min-1 dažniu trunka maždaug 240 min, kai dirvožemio tankis 1,2 g × cm-3, tuo tarpu ši trukmė yra tik 50 min, jei tankis 2,0 g × cm-3. Panašiai, pagal 1b pav. centrifuguojant tradiciniu 3000 min-1 dažniu, centrifugavimo trukmė yra maždaug 50 min, jei mišinio stulpelio ilgis lygus 10 cm, ir tik 7 min, jei ilgis lygus 1 cm. Tačiau svarbu rasti optimalų santykį tarp centrifugavimo režimo, kai turi būti kuo mažesnis ilgis, ir galimybės bandymą darančiajam lengvai atskirti fazes po centrifugavimo.
                  
               
                     5.
                  
                  
                     Be to, apibrėžiant bandymų sąlygas dirvožemio/tirpalo fazėms atskirti, svarbu atsižvelgti į galimą trečios „pseudofazės“, koloidinių dalelių buvimą. Šios dalelės, kurios yra mažesnės kaip 0,2 μm, gali daryti didelę įtaką visam medžiagos adsorbcijos dirvožemio suspensija mechanizmui. Centrifuguojant, kaip aprašyta pirmiau, koloidinės dalelės lieka vandeninėje fazėje ir analizuojamos kartu su ja. Taigi prarandama informacija apie jų poveikį.
                     Jei bandymus daranti laboratorija turi ultracentrifugavimo ar ultrafiltravimo priemones, medžiagos adsorbcija/desorbcija dirvožemiu galėtų būti ištirta išsamiau, įskaitant informaciją apie medžiagos adsorbciją koloidinėmis dalelėmis. Šiuo atveju norint atskirti tris fazes: dirvožemį, koloidines daleles ir tirpalą, turi būti taikomas ultracentrifugavimas 60 000 min-1 apsisukimų dažniu ar ultrafiltravimas pro filtrą, kurio akytumas 100 000 Daltonų. Atitinkamai turi būti pakeistas bandymų protokolas, kad visos trys fazės būtų išanalizuotos.
                  
               1a pav.
         
            
         1b pav.
         
            
      
      
         5 Priedas
         ADSORBCIJOS A (%) IR DESORBCIJOS D (%) APSKAIČIAVIMAS
         Metodikai taikyta laiko schema yra tokia:
         
            
         Darant visus skaičiavimus daroma prielaida, kad bandomoji medžiaga yra stabili, ir jos žymiai neadsorbuoja indo sienelės.
         ADSORBCIJA A (A %)
         a)   Lygiagretusis metodas
         Kiekvienam mėgintuvėliui (i) kiekvienu laiko momentu (ti) adsorbcijos procentinė dalis apskaičiuojama pagal lygtį:
         
                     
                         (%)
                  
                     (1)
                  
               Šios lygties nariai gali būti apskaičiuoti taip:
         
                     m0 = C0 · V0 (μg)
                  
                  
                     (2)
                  
               
                     
                         (μg)
                  
                     (3)
                  
               kai:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     adsorbcijos procentinė dalis (%) laiko momentu ti;
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė laiko momentu ti, kai buvo daroma analizė (μg);
                  
               
                     m0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     bandymo pradžioje mėgintuvėlyje buvusios bandomosios medžiagos masė (μg);
                  
               
                     C0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomojo tirpalo pradinė masės koncentracija (μg cm-3);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     medžiagos vandeninės fazės masės koncentracija laiko momentu ti, kai daroma analizė (μg × cm-3); ši koncentracija nustatoma analizės būdu atsižvelgiant į tuščiuosiuose bandymuose gautas vertės,
                  
               
                     V0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     sąlytyje su dirvožemiu esančio bandomojo tirpalo pradinis tūris (cm3).
                  
               Adsorbcijos procentinės dalies  ar  vertės pažymimos grafike pagal laiką ir nustatomas sorbcijos pusiausvyros pasiekimo laikas. Tokių grafikų pavyzdžiai pateikti atitinkamai 1 pav. ir 2 pav.
         
            
         
            
         b)   Nuoseklusis metodas
         Toliau pateiktose lygtyse atsižvelgiama į tai, kad pagal adsorbcijos matavimo metodiką bandomosios medžiagos kiekis tam tikrais laiko tarpais nustatomas mažose vandeninės fazės alikvotinėse dalyse.
         
                     —
                  
                  
                     Kiekvienam laiko tarpui dirvožemiu adsorbuotos medžiagos kiekis apskaičiuojamas taip:
                     
                                 —
                              
                              
                                 pirmajam laiko tarpui Δt1 = t1- t0
                                 
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (4)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 antrajam laiko tarpui At2 = t2- t1
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (5)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 trečiajam laiko tarpui At3 = t3-t2
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (6)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 n-ajam laiko tarpui Δtn = tn- tn-l
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (7)
                                          
                                       
                           
               
                     —
                  
                  
                     Kiekvienam laiko tarpui procentinė adsorbcijos  dalis, apskaičiuojama pagal šią lygtį:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (8)
                              
                           tuo tarpu procentinė adsorbcijos dalis  laiko momentu ti apskaičiuojama pagal lygtį:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (9)
                              
                           Adsorbicijos vertės  ar  (žiūrint, kuri reikalinga tyrimui) pažymimos grafike pagal laiką ir nustatomas sorbcijos pusiausvyros pasiekimo laikas.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Pusiausvyros pasiekimo laiku teq:
                     
                                 —
                              
                              
                                 dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė lygi:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (10)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 bandomosios medžiagos tirpale masė yra lygi:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (11)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 ir adsorbcijos procentinė dalis pusiausvyros sąlygomis yra lygi:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (12)
                                          
                                       
                           
               Pirmiau naudoti parametrai apibrėžiami kaip:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu atitinkamai per laiko tarpus Δt1, Δt2,..., Δtn masė (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     atitinkamai laiko momentu t1, t2,tn nustatyta bandomosios medžiagos masė t1, t2,tn atitinkamai (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis dirvožemiu adsorbuotos medžiagos masė (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis tirpale esančios medžiagos masė (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     alikvotinės dalies, kurioje nustatoma bandomoji medžiaga, tūris (cm3);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     adsorbcijos, atitinkančios laiko tarpą Δti, procentinė dalis ( %);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     adsorbcijos procentinė dalis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis ( %).
                  
               DESORBCIJA D ( %)
         Laikas t0, kuris laikomas desorbcijos kinetikos bandymo pradžia, yra tas momentas, kai kuo didesnis regeneruoto bandomosios medžiagos tirpalo tūris (kai pasiekiama adsorbcijos pusiausvyra) yra pakeičiamas tokiu pat 0,01 M CaCl2 tirpalo tūriu.
         a)   Lygiagretusis metodas
         Laiko momentu ti matuojama masė bandomosios medžiagos, esančios iš mėgintuvėlio i paimtame vandeninės terpės tūryje (), ir desorbuotos medžiagos masė apskaičiuojama pagal lygtį:
         
                     
                        
                  
                  
                     (13)
                  
               Desorbcijos pusiausvyros sąlygomis ti = teq todėl  = 
         Per laiko tarpą (Δti) desorbuotos medžiagos masė nustatoma pagal lygtį:
         
                     
                        
                  
                  
                     (14)
                  
               Desorbcijos procentinė dalis apskaičiuojama:
         laiko momentu ti pagal lygtį:
         
                     
                        
                  
                  
                     (15)
                  
               ir per laiko tarpą (Δti) pagal lygtį:
         
                     
                        
                  
                  
                     (16)
                  
               čia:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     desorbcijos procentinė dalis laiko momentu ti ( %),
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     desorbcijos procentinė dalis, atitinkanti laiko tarpą Δti ( %),
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     laiko momentu ti desorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg),
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     per laiko tarpą Δti desorbuotos bandomosios medžiagos masė (μg),
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     bandomosios medžiagos, analizės būdu nustatytos laiko momentu ti analizei paimtame tirpalo tūryje  masė (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl nevisiško tūrio pakeitimo, masė (μg);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     (17)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     tirpale esančios bandomosios medžiagos masė adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis (µg);
                  
               
                     VR
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     tirpalo virš nuosėdų, pašalinto iš mėgintuvėlio pasiekus adsorbcijos pusiausvyrą ir pakeisto tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo, tūris (cm3);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti darant desorbcijos kinetikos bandymą, tūris (cm3).
                  
               Desorbcijos vertės  ar  (žiūrint, kuri reikalinga tyrimui) pažymimos pagal laiką grafike ir nustatomas desorbcijos pusiausvyros pasiekimo laikas.
         b)   Nuoseklusis metodas
         Šiose lygtyse atsižvelgta į tai, kad anksčiau taikytoje adsorbcijos metodikoje bandomoji medžiaga buvo nustatinėjama nedidelėse vandeninės fazės alikvotinėse dalyse  (nuoseklusis metodas pagal 1.9 poskyrį „Bandymo eiga“). Daroma prielaida, kad: a) po adsorbcijos kinetikos bandymo iš mėgintuvėlio pašalintas tirpalas virš nuosėdų buvo pakeistas tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo (vR) ir b) sąlytyje su dirvožemiu esančios vandeninės fazės bendras tūris (VT) darant desorbcijos kinetikos bandymą yra pastovus ir apibrėžiamas lygtimi:
         
                     
                        
                  
                  
                     (18)
                  
               Laiko momentu ti:
         
                     —
                  
                  
                     bandomosios medžiagos masė matuojama mažame alikvotinės dalies tūryje  ir desorbouotos medžiagos masė apskaičiuojama pagal lygtį:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (19)
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     desorbcijos procentinė dalis sąlygomis ti = teq todėl  = .
                  
               
                     —
                  
                  
                     desorbcijos procentinė dalis  apskaičiuojama pagal šią lygtį:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (20)
                              
                           
               Per laiko tarpą (Δti):
         Per kiekvieną laiko tarpą desorbuotos medžiagos kiekis apskaičiuojamas taip:
         
                     —
                  
                  
                     pirmajam laiko tarpui Δt1 = t1-t0
                     
                     
                                 
                                     and 
                                    
                              
                              
                                 (21)
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     antrajam laiko tarpui Δt2 = t2-t1
                     
                     
                                 
                                    
                                 
                                    
                              
                              
                                 (22)
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     n-ajam laiko tarpui Δtn = tn-tn-1
                     
                     
                                 
                                    
                                 
                                    
                              
                              
                                 (23)
                              
                           
               Galiausiai desorbcijos procentinė dalis kiekvienam laikotarpio  apskaičiuojama pagal šią lygtį:
         
                     
                        
                  
                  
                     (24)
                  
               tuo tarpu desorbcijos procentinė dalis  laiko momentu ti; nustatoma pagal lygtį:
         
                     
                        
                  
                  
                     (25)
                  
               Šiose lygtyse naudoti parametrai apibrėžiami kaip:
         
                     
                        , 
                        ,... , 
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     medžiagos, kuri dar liko adsorbuota dirvožemiu pasibaigus atitinkamai laiko tarpams At1, At2,..., Δtn masė (μg);
                  
               
                     
                        , 
                        ,... , 
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     bandomosios medžiagos desorbuotos atititinkamai per laiko tarpus At1, At2,..., Δtn masė (μg);
                  
               
                     
                        , 
                        ,... , 
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     Medžiagos masė, nustatyta alikvotinės dalies tūryje  atitinkamai laiko momentais t1,t2,..., tn, (μg);
                  
               
                     VT
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     vandeninės fazės, esančios sąlytyje su dirvožemiu darant desorbcijos kinetikos bandymą pagal nuoseklųjį metodą, bendras tūris (cm3);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl nevisiško tūrio pakeitimo, masė (μg);
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (26)
                              
                           
               
                     VR
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     tirpalo virš nuosėdų, pašalinto iš mėgintuvėlio pasiekus adsorbcijos pusiausvyrą ir pakeisto tokiu pat tūriu 0,01 M CaCl2 tirpalo, tūris (cm3);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     tirpalo, paimto iš mėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos kiekiui nustatyti darant desorbcijos kinetikos bandymą, alikvotinės dalies tūris (cm3);
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (27)
                              
                           
               
      
         6 PRIEDAS
         DIRVOŽEMIŲ ADSORBCIJA IR DESORBCIJA: DUOMENŲ PATEIKIMO LENTELĖS
         Bandyta medžiaga:
         Bandytas dirvožemis:
         Sauso dirvožemio masės dalis (105 oC, 12h): … %
         Temperatūra: … oC
         Analizės metodo tinkamumas
         
                     Pasverta dirvožemio
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
               
                     Sauso dirvožemio masė
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
               
                     CaCl2 tiipalo tūris
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Galutinio tirpalo vardinė koncentracija
                  
                  
                     μg cm3
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Galutinio tirpalo analizinė koncentracija
                  
                  
                     μg cm3
                     
                  
                  
                      
                  
               Taikyto analizės metodo esmė:
         Analizės metodo kalibravimas:
         Bandyta medžiaga:
         Bandytas dirvožemis:
         Sauso dirvožemio masės dalis (105 oC, 12h): … %
         Temperatūra: … oC
         
                     Taikytas analizės metodas:
                  
                  
                     Netiesioginis
                  
                  
                     
                  
                  
                     Lygiagretusis
                  
                  
                     
                  
                  
                     Nuoseklusis
                  
                  
                     
                  
               
                      
                  
                  
                     Tiesioginis
                  
                  
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Adsorbcijos bandymas: bandiniai
         
                      
                  
                  
                     Simbolis
                  
                  
                     Vienetai
                  
                  
                     Pusiausvyros nusistovėjimo laikas
                  
                  
                     Pusiausvyros nusistovėjimo laikas
                  
                  
                     Pusiausvyros nusistovėjimo laikas
                  
                  
                     Pusiausvyros nusistovėjimo laikas
                  
               
                     Mégintuvélio Nr.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pasverta dirvožemio
                  
                  
                     —
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Sauso dirvožeio masé
                  
                  
                     msoil
                     
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Vandens pasvertame dirvožemyje tūris (apskaičiuotas)
                  
                  
                     VWS
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     0,01 M CaCl2 tirpalo tūris pusiausvyrai su dirvožemiu pasiekti
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pradinio tirpalo tūris
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Su dirvožemiu sąlytyje esančios vandeninės fazės bendras tūris
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Bandomosios medžiagos tirpalo pradinė koncentracija
                  
                  
                     C0
                     
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Bandomosios medžiagos masė bandymo pradžioje
                  
                  
                     m0
                     
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Po sumaišymo ir centrifugavimo
                  
               
                     Netiesioginis metodas
                  
               
                     Lygiagretusis metodas
                  
               
                     Bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija, įskaitant tuščiojo bandymo pataisą
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Nuoseklusis metodas
                  
               
                     Alikvotinės tirpalo dalies tūryje Va
                        A išmatuota medžiagos masė
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Tiesioginis metodas
                  
               
                     Dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos masė
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Adsorbcijos apskaičiavimas
                  
               
                     Adsorbcija
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Vidutinės vertės
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Adsorbcijos koeficientas
                  
                  
                     Kd
                     
                  
                  
                     cm3 g-1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Vidutinės vertės
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Adsorbcijos koeficientas
                  
                  
                     Koc
                     
                  
                  
                     cm3 g-1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Vidutinės vertės
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Bandyta medžiaga:
         Bandytas dirvožemis:
         Sauso dirvožemio masės dalis (105 oC, 12h): … %
         Temperatūra: … oC
         Adsorbcijos bandymas: tuštieji ir kontroliniai bandymai
         
                      
                  
                  
                     Simbolis
                  
                  
                     Vienetai
                  
                  
                     Tusciasis bandymas
                  
                  
                     Tuščiasis bandymas
                  
                  
                     Kontrolinis bandymas
                  
               
                     Mėgintuvėlio Nr.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pasverta dirvožemio
                  
                  
                      
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     0
                  
                  
                     0
                  
               
                     Vandens pasvertame dirvožemyje tūris (apskaičiuotas)
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     įpilto 0,01 M
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     įpiltas bandomosios medžiagos pradinio tirpalo tūris
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                     0
                  
                  
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Bendras vendeninės fazės tūris (apskaičiuotas)
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Pradinė bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija
                  
                  
                      
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Po sumaišymo ir centrifugavimo
                  
               
                     Vandeninės fazės koncentracija
                  
                  
                      
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Pastaba. Prireikus stulpelių galima pridėti.
         Bandyta medžiaga:
         Bandytas dirvožemis:
         Sauso dirvožemio masės dalis (105 oC, 12h): … %
         Temperatūra: … oC
         Masių balansas
         
                      
                  
                  
                     Simbolis
                  
                  
                     Vienetai
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mėgintuvėlio Nr.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pasverta dirvožemio
                  
                  
                     —
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Sauso dirvožemio masė
                  
                  
                     msoil
                     
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Vandens pasvertame dirvožemyje tūris (apskaiciutas)
                  
                  
                     VWS
                     
                  
                  
                     ml
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     0,01 M CaCl2 tirpalo tūris pusiausvyrai su dirvozemiu pasiekti
                  
                  
                      
                  
                  
                     ml
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pradinio tirpalo tūris
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Su dirvožemiu sąlytyje esančios vandeninės fazės bendras tūris
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Bandomosios medžiagos tirpalo pradinė koncentracija
                  
                  
                     C0
                     
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė
                  
                  
                     —
                  
                  
                     h
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Po sumaišymo ir centrifugavimo
                  
               
                     Bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija, iskaitant tuščiojo bandymo pataisą
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pusiausvyros nusistovejimo trukmė
                  
                  
                     teq
                     
                  
                  
                     h
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     1-asis praskiedimas tirpikliu
                  
               
                     Nupiltos vandeninės fazės tūris
                  
                  
                     Vrec
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     įpilto tirpiklio tūris
                  
                  
                     ΔV
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     1-asis ekstrahavimas tirpikliu
                  
               
                     Tirpiklio fazėje analizuojamos medžiagos signalas
                  
                  
                     SE1
                     
                  
                  
                     var.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Tirpiklyje ištirpusios bandomosios medžiagos koncentracija
                  
                  
                     CE1
                     
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     medžiagos, ekstrahuotos iš dirvožemio ir nuo indo sieneliu.masė
                  
                  
                     mE1
                     
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     2-asis praskiedimas tirpikliu
                  
               
                     Nupilto tirpiklio tūris
                  
                  
                     ΔVs
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     įpilto tirpiklio tūris
                  
                  
                     ΔV'
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     2-asis ekstrahavimas tirpikliu
                  
               
                     Tirpiklio fazėje analizuojamos medžiagos signalas
                  
                  
                     SE2
                     
                  
                  
                     var.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Tirpiklyje ištirpusios bandomosios medžiagos koncentracija
                  
                  
                     CE2
                     
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Medžiagos, ekstrahuotos is dirvožemio ir nuo indo sienelių, masė
                  
                  
                     mE2
                     
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Per dvi pakopas ekstrahuotos bandomosios medžiagos bendra masė
                  
                  
                     mE
                     
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Masių balansas
                  
                  
                     MB
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Bandyta medžiaga:
         Bandytas dirvožemis:
         Sauso dirvožemio masės dalis (105 oC, 12h): … %
         Temperatūra: … oC
         Adsorbcijos izotermės
         
                      
                  
                  
                     Simbolis
                  
                  
                     Vienetai
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mėgintuvėlio Nr.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pasverta dirvožemio
                  
                  
                     —
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Sauso dirvožemio masė
                  
                  
                     E
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Vandens pasvertame dirvožemyje tūris (apskaičiuotas)
                  
                  
                     VWS
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     0,01 M CaCl2 tirpalo tūris pusiausvyrai su dirvožemiu pasiekti
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     įpilto pradinio tirpalo tūris
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Su dirvožemiu sąlytyje esančios vandeninės fazės bendras tūris (apskaičiuotas)
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Tirpalo koncentracija
                  
                  
                     C0
                     
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pusiausvyros nusistovejimo trukmė
                  
                  
                     —
                  
                  
                     h
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Po sumaisymo ir centrifugavimo
                  
               
                     Bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija, įskaitant tuščiojo bandymo pataisą
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg cm-3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Temperatūra
                  
                  
                      
                  
                  
                     
                        oC
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Adsorbuotos medžiagos masė, tenkanti dirvožemio masės vienetui
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg g-1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Regresijos analizė:
         KF
            ads vertė:
         l/n vertė:
         regresijos koeficientas r2:
         Bandyta medžiaga:
         Bandytas dirvožemis:
         Sauso dirvožemio masės dalis (105 oC, 12h): … %
         Temperatūra: … oC
         
                     Taikytas analizės metodas:
                  
                  
                     Netiesioginis
                  
                  
                     
                  
                  
                     Lygiagretusis
                  
                  
                     
                  
                  
                     Nuoseklusis
                  
                  
                     
                  
               Desorbcijos bandymas
         
                      
                  
                  
                     Simbolis
                  
                  
                     Vienetai
                  
                  
                     Laiko tarpas
                  
                  
                     Laiko tarpas
                  
                  
                     Laiko tarpas
                  
                  
                     Laiko tarpas
                  
               
                     Mėgintuvėlio, gauto iš adsorbcijos pakopos tarpsnio, Nr.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Adsorbcijos pustausvyros sąlygomis dirvožemio adsrobuotos medžiagos masė
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Pašalintos vandeninės fazės tūris, pakeistas 0,01 M CaCl2
                     
                  
                  
                     VR
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Su dirvožemiu sąlytyje esančios vandeninės fazės bendras tūris (apskaičiutas)
                  
                  
                     PM
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     SM
                  
                  
                     VT
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo dėl nevisiško tūrio pakeitimo, masė
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        Desorbcijos kinetika
                     
                  
               
                     Laiko momentu ti nuo dirvožemio desorbuotos medžiagos išmatuota masė
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Tirpalo, palmto iš mėgintuvėlio (i) bandomajai medziagai nustatyti, tūris
                  
                  
                     PM
                  
                  
                     Vf
                        i
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     SM
                  
                  
                     va
                        D
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Laiko momentu ti nuo dirvožemio desorbuotos medžiagos masė (apskaičiuota)
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Per laiko tarpą Δti nuo dirvožemio desorbuotos medžiagos masė (apskaičiuota)
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Desorbcijos procentinė dalis
                  
               
                     Desorbcija laiko momentu ti
                     
                  
                  
                     Dti
                        
                     
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Desorbcija per laiko tarpą Δti
                     
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Tariamas desorbcijos koeficientas
                  
                  
                     Kdes
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               PM: lygiagretusis metodas
         SM: nuoseklusis metodas
      
      C.19.   DIRVOŽEMIO IR NUOTEKŲ DUMBLO ADSORBCIJOS KOEFICIENTO (Koc) VERTINIMAS TAIKANT DIDELIO EFEKTYVUMO SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJĄ (HPLC)
      1.   METODAS
      Šis metodas yra OECD TG121 (2001) kopija.
      1.1.   ĮVADAS
      Medžiagų sorbciją dirvožemiu ar nuotekų dumblu gali apibūdinti parametrai, bandymais nustatyti taikant C. 18 bandymų metodą. Svarbus parametras yra adsorbcijos koeficientas, kuris apibrėžiamas kaip medžiagos dirvožemyje/dumble koncentracijos ir medžiagos vandeninės fazės koncentracijos santykis adsorbcijos pusiausvyros sąlygomis. Adsorbcijos koeficientas, normalizuotas pagal dirvožemio organinės anglies kiekį, Koc yra naudingas cheminės medžiagos ir dirvožemio bei nuotekų dumblo organinės medžiagos surišimo gebos rodiklis ir leidžia lyginti įvairias chemines medžiagas. Šis parametras gali būti įvertintas taikant koreliacijas su tirpumu vandenyje ir n – oktanolio/vandens pasiskirstymo koeficientu (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
      Pagal aprašytą šio bandymo metodą adsorbcijos dirvožemiu ir nuotekų dumblu koeficientui Koc nustatyti taikomas HPLC (8). Įverčiai yra patikimesni nei gauti pagal QSAR {Quantitative Structure-Activity Relationships – Kiekybiniai struktūros ir aktyvumo ryšiai) apskaičiavimus (9). Kaip vertinimo metodas, jis negali visiškai pakeisti įkrovos pusiausvyros bandymų, daromų pagal C. 18 bandymų metodą. Tačiau įvertintas Koc gali būti naudingas tinkamiems bandymų parametrams pasirinkti adsorbcijai/desorbcijai tirti pagal C. 18 bandymų metodą apskaičiuojant Kd (pasiskirstymo koeficientą) ar Kf (Freundlicho adsorbcijos koeficientą) pagal 3 lygtį (žr. 1.2 skirsnį).
      1.2.   APIBRĖŽIMAI
      KD – pasiskirstymo koeficientas apibrėžiamas kaip dviejų fazių sistemoje, sudarytoje iš sorbento (dirvožemio ar nuotekų dumblo) ir vandeninės fazės, ištirpintos bandomosios medžiagos pusiausvyros koncentracijos C santykis; jis yra bematis dydis, jei abiejų fazių koncentracija išreikšta masės/masės koncentracija. Jei vandeninės fazės koncentracija išreiškta masės/tūrio koncentracija, vienetas yra ml × g-1. Kd gali keistis keičiantis sorbento savybėms ir gali priklausyti nuo koncentracijos.
      
                  
                     
               
               
                  (1)
               
            čia:
      
                  Csoil
                  
               
               
                  =
               
               
                  bandomosios medžiagos dirvožemyje koncentracija pusiausvyros sąlygomis (μg x g-1)
               
            
                  Csludge
                  
               
               
                  =
               
               
                  bandomosios medžiagos dumble koncentracija pusiausvyros sąlygomis (μg xg-1)
               
            
                  Caq
                  
               
               
                  =
               
               
                  bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija pusiausvyros sąlygomis (μg x g-1, ug x ml-1).
               
            Kf: Freundlicho adsorbcijos koeficientas yra apibrėžiamas kaip bandomosios medžiagos dirvožemyje ar nuotekų dumble koncentracija (x/m), kai vandeninės fazės pusiausvyros koncentracija Caq lygi vienetui; vienetai yra ug x g-1 sorbento. Vertė gali keistis keičiantis sorbento savybėms.
      
                  
                     
               
               
                  (2)
               
            čia:
      
                  x/m
               
               
                  =
               
               
                  kiekis x (ug) bandomosios medžiagos, pusiausvyros sąlygomis adsorbuotos sorbentu, kurio kiekis m (g)
               
            
                  l/n
               
               
                  =
               
               
                  Freundlicho adsorbcijos izotermės lygties krypties koeficientas
               
            
                  Caq
                  
               
               
                  =
               
               
                  bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracija pusiausvyros sąlygomis (μg x ml-1)
               
            At
      Koc: pasiskirstymo koeficientas (Kd) ar Freundlicho adsorbcijos koeficientas (Kf), normalizuoti pagal sorbento organinės anglies kiekį (foc); ypač nejoninėms cheminėms medžiagoms jis yra apytikris medžiagos ir sorbento adsorbcijos laipsnio rodiklis ir leidžia lyginti skirtingas chemines medžiagas. Pagal tai, kokios yra Kd ir Kf dimensijos, Koc gali būti bematis arba jo vienetai yra ml x g-l ar μg × g-1 organinės medžiagos.
      
                  
                     
               
               
                  (3)
               
            Koc ir Kd santykis nėra visuomet tiesiškas, taigi įvairių dirvožemių Koc vertės gali būti skirtingos, tačiau jų kintamumas yra daug mažesnis lyginant su Kd ar Kf verčių kintamumu.
      Adsorbcijos koeficientas (Koc) nustatomas iš sulaikymo faktoriaus (k') naudojant pasirinktų etaloninių medžiagų log k' pagal log Koc kalibracinį grafiką.
      
                  
                     
               
               
                  (4)
               
            čia:
      
                  tR
                  
               
               
                  =
               
               
                  bandomosios ir etaloninės medžiagos sulaikymo trukmė HPLC metodu (minutės),
               
            
                  t0
                  
               
               
                  =
               
               
                  eliuento sulaikymo trukmė (dead time) FIPLC metodu (minutės) (žr. 1.8.2 skirsnį).
               
            Pow = oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficientas apibrėžiamas kaip medžiagos n – oktanolio tirpalo ir vandens tirpalo koncentracijos santykis; jis yra bematis dydis.
      
                  
                     
               
               
                  (5)
               
            1.3.   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Prieš taikant metodą reikia žinoti struktūrinę formulę, grynumą ir disociacijos konstantą (jei tinka). Vertinga yra informacija apie tirpumą vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, apie pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą ir apie hidrolizės charakteristikas.
      Išmatuotiems bandomosios medžiagos HPLC sulaikymo duomenims ir jos adsorbcijos koeficientui Koc susieti turi būti gauta log Koc pagal log k kalibracinė kreivė. Turi būti panaudoti ne mažiau kaip šeši etaloniniai taškai, bent vienas jų žemiau laukiamos bandomosios medžiagos vertės ir vienas aukščiau šios vertės. Metodo tikslumas labai padidėja, jei naudojamos etaloninės medžiagos struktūra yra panaši į bandomosios medžiagos. Jei tokių duomenų nėra, vartotojas gali pats pasirinkti atitinkamas kalibravimo medžiagas. Tokiu atveju reikėtų pasirinkti bendresnį rinkinį struktūriškai nevienalyčių medžiagų. Rekomenduotos naudoti medžiagos ir nuotekų dumblo Koc vertės yra pateiktos 1 priedėlio 1 lentelėje ir dirvožemio – 3 lentelėje. Kitų kalibravimo medžiagų pasirinkimą būtina pagrįsti.
      1.4.   BANDYMO METODO ESMĖ
      Bandymas HPLC metodu daromas analizės kolonėlėse, kurių kietąją fazę sudaro pramoninės gamybos cianpropilo derva, turinti lipofilines ir polines dalis. Naudojama vidutinio poliškumo nejudama fazė, nešiklis – silicio dioksidas:
      
                  – O –Si
               
               
                  – CH2 – CH2 –CH2
                  
               
               
                  – CN
               
            
                  silicio dioksidas
               
               
                  nepolinė tarpinė dalis
               
               
                  polinė dalis
               
            Bandymo metodo esmė yra panaši į A.8 bandymo metodo (pasiskirstymo koeficientas, HPLC metodas) esmę. Bandomajai medžiagai einant per kolonėlę kartu su judamąja faze, vyksta medžiagos ir nejudamosios fazės sąveika. Dėl pasidalijimo tarp judamosios ir nejudamosios fazių bandomoji medžiaga sulaikoma. Kadangi nejudamoji fazė susideda iš polinės ir nepolinės dalies, vyksta jos sąveika su molekulės polinėmis ir nepolinėmis grupėmis, panašiai kaip ant organinės medžiagos, kurios nešiklis yra dirvožemis ar nuotekų valymo dumblas. Taip galima nustatyti santykį tarp kolonėlės sulaikymo trukmės ir adsorbcijos ant organinės medžiagos koeficiento.
      Didelę įtaką sorbcijai turi pH vertė, ypač polinių medžiagų sorbcijai. Žemės ūkio paskirties dirvožemio ar nuotekų valymo įrenginių talpyklų pH paprastai yra 5,5 – 7,5. Jei medžiagos gali jonizuotis, naudojant tinkamus buferinius tirpalus turi būti daromi du bandymai medžiagai esant joninio ir nejoninio pavidalo, tačiau tik tais atvejais, kai bandomosios medžiagos disociacijos laipsnis pH 5,5 – 7,5 diapazone yra bent 10 %.
      Kadangi vertinimui naudojamas santykis tarp HPLC kolonėlės sulaikymo trukmės ir adsorbcijos koeficiento, nereikia jokio kiekybinio analizės metodo, būtina nustatyti tik sulaikymo trukmę. Jei yra tinkamas etaloninių medžiagų rinkinys ir galima naudoti standartines bandymo sąlygas, metodas leidžia greitai ir veiksmingai įvertinti adsorbcijos koeficientą Koc.
      1.5.   METODO TAIKOMUMAS
      HPLC metodas taikomas cheminėms medžiagoms (nežymėtoms ar su žymėtaisiais atomais), kurioms galima pritaikyti tinkamą aptikimo sistemą (pvz., spektrofotometrą, radioaktivumo detektorių) ir kurios yra gana stabilios vykstant bandymui. Jis gali būti ypač naudingas cheminėms medžiagoms, sunkiai tiriamoms kitomis bandymų sistemomis (t. y. lakioms medžiagoms; medžiagoms, kurių tirpumas yra mažesnis nei analiziškai nustatoma koncentracija; medžiagoms, kurių giminingumas inkubavimo sistemų paviršiams yra didelis). Metodas gali būti taikomas mišiniams, kurių išplovimo juostos neatsiskiria. Tokiu atveju turi būti nurodyta mišinio junginių viršutinė ir apatinė log Koc verčių riba.
      Kartais priemaišos gali trukdyti aiškinant HPLC rezultatus, tačiau jos nėra tokios svarbios, jei bandomoji medžiaga gali būti aiškiai identifikuota analiziškai ir atskirta nuo priemaišų.
      Metodas patikrintas naudojant medžiagas, išvardytas priedėlio 1 lentelėje, taip pat juo buvo tiriamos įvairios šių klasių medžiagos:
      
                  —
               
               
                  aromatiniai aminai (pvz., trifluralinas, 4-chloranilinas, 3,5-dinitroanilinas, 4-metilanilinas, N-metilanilinas, 1-naftilaminas),
               
            
                  —
               
               
                  aromatinių karboninių rūgščių esteriai (pvz., benzenkarboninės rūgšties metilesteris, 3,5-dinitrobenzenkarboninės rūgšties etilesteris),
               
            
                  —
               
               
                  aromatiniai angliavandeniliai (pvz., toluenas, ksilenas, etilbenzenas, nitrobenzenas),
               
            
                  —
               
               
                  ariloksifenoksipropano rūgšties esteriai (pvz., diklofopmetilas, fenoksapropetilas, fenoksaprop-P-etilas),
               
            
                  —
               
               
                  fungicidai benzimidazolo ir imidazolo pagrindu (pvz., karbendazimas, fuberidazolas, triazoksidas),
               
            
                  —
               
               
                  karboninių rūgščių amidai (pvz., 2-chlorbenzamidas, N, N-dimetilbenzamidas, 3,5-dinitrobenzamidas, N-metilbenzamidas, 2-nitrobenzamidas, 3-nitrobenzamidas),
               
            
                  —
               
               
                  chlorinti angliavandeniliai (pvz., endosulfanas, DDT, heksachlorbenzenas, kvintozenas, 1,2,3-trichlorbenzenas),
               
            
                  —
               
               
                  fosforo organiniai insekticidai (pvz., azinfosmetilas, disulfotonas, fenamifosas, izofenfosas, pirazofosas, sulprofosas, triazofosas),
               
            
                  —
               
               
                  fenoliai (pvz., fenolis, 2-nitrofenolis, 4-nitrofenolis, pentachlorfenolis, 2,4,6-trichlorfenolis, 1-naftolis),
               
            
                  —
               
               
                  fenilkarbamido dariniai (pvz., izoproturonas, monolinuronas, pencikuronas),
               
            
                  —
               
               
                  pigmentiniai dažai (pvz., rūgštusis geltonas 219, bazinis mėlynas 41, tiesioginis raudonas 81),
               
            
                  —
               
               
                  poliaromatiniai angliavandeniliai (pvz., acenaftenas, naftalenas),
               
            
                  —
               
               
                  herbicidai 1,3,5-triazino pagrindu (pvz., prometrinas, propazinas, simazinas, terbutrinas),
               
            
                  —
               
               
                  triazolo dariniai (pvz., tebukonazolas, triadimefonas, tradimenolis, triapentenolis).
               
            Metodas netinka medžiagoms, reaguojančioms su eliuentu ar su nejudamąja faze. Jis taip pat netinka medžiagoms, kurios su neorganiniais komponentais reaguoja specifiniu būdu (pvz., su molio mineralais sudaro klasterinius kompleksinius junginius). Metodas gali netikti paviršiaus aktyviosioms medžiagoms, neorganiniams junginiams ir vidutinio stiprumo ar stiprioms organinėms rūgštims ir bazėms. Galima nustatyti log Koc vertes 1,5 – 5,0 diapazone. Jonizuojamos medžiagos turi būti matuojamos naudojant buferinę judamąją fazę, tačiau reikia žiūrėti, kad nesusidarytų buferinio tirpalo komponentų ar bandomosios medžiagos nuosėdų.
      1.6.   KOKYBĖS KRITERIJAI
      1.6.1   Tikslumas
      Paprastai bandomosios medžiagos adsorbcijos koeficientas gali būti įvertintas ±0,5 log vieneto tikslumu lyginant su verte, nustatyta įkrovos pusiausvyros metodu (žr. priedėlio 1 lentelę). Galima pasiekti didesnį tikslumą, jei naudota etaloninė medžiaga ir bandomoji medžiaga yra panašios struktūros.
      1.6.2   Pakartojamumas
      Nustatymas turi būti daromas bent du kartus. Atskirų matavimų log Koc turi skirtis mažiau kaip 0,25 log vieneto.
      1.6.3   Atkuriamumas
      Iki šiol sukauptas patyrimas taikant metodą patvirtina jo validumą. Tiriant HPLC metodą pagal 48 medžiagas (daugiausia pesticidus), kurioms yra patikimi adsorbcijos dirvožemiu Koc duomenys, gautas koreliacijos koeficientas R = 0,95 (10) (11).
      Metodui tobulinti ir jo validumui patvirtinti buvo daromas tarplaboratorinio palyginimo bandymas dalyvaujant 11 laboratorijų (12). Rezultatai pateikti priedėlio 2 lentelėje.
      1.7.   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.7.1   Adsorbcijos koeficiento pradinis įvertinimas
      Adsorbcijos laipsnio rodikliu, ypač nejonizuotų medžiagų atveju, gali būti naudojamas oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficientas Pow (= Kow) ir tam tikru laipsniu tirpumas vandenyje, taigi jie gali būti naudojami pradiniam diapazonui nustatyti. Kelioms cheminių medžiagų grupėms buvo paskelbta nemažai naudingų koreliacijų (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
      1.7.2   Aparatūra
      Būtina turėti skysčių chromatografą su nepulsuojančiu siurbliu ir atitinkamu detektavimo įtaisu. Rekomenduojama naudoti injekcijos vožtuvą ir injekcijos kilpą. Naudojamos pramoninės gamybos cianpropilo dervos, chemiškai surištos su silicio dioksido nešikliu (pvz., Hypersil ir Zorbax CN). Tarp injekcijos sistemos ir analizės kolonėlės galima įtaisyti tos pačios medžiagos apsauginę kolonėlę. Skirtingų tiekėjų kolonėlių skiriamoji galia gali labai skirtis. Vadovautis reikėtų šiomis sulaikymo faktorių k' vertėmis: log k' > 0,0, jei log Koc = 3,0, ir log k' > 0,4, jei log Koc = 2,0, jei judamąja faze naudojamas metanolio/vandens 55/45 % mišinys.
      1.7.3   Judamosios fazės
      Buvo bandytos kelios judamosios fazės, rekomenduoti galima šias dvi:
      
                  —
               
               
                  metanolio/vandens (55/45 % v/v) mišinį,
               
            
                  —
               
               
                  metanolio/0,01 M citratinio buferio pH 6,0 (55/45 % v/v) mišinį.
               
            Eliuavimo tirpikliui ruošti naudojamas HPLC grynumo metanolis ir distiliuotas vanduo ar citratinis buferinis tirpalas. Prieš naudojant mišinys nudujinamas. Turi būti taikomas izokratinis eliuavimas. Jei metanolio/vandens mišiniai netinka, galima išmėginti kitus organinio tirpiklio/vandens mišinius, pvz., etanolio/vandens ar acetonitrilo/vandens mišinius. Tiriant jonizuojamas medžiagas pH vertei stabilizuoti, rekomenduojama naudoti buferinį tirpalą. Reikia vengti druskų nuosėdų susidarymo ir nesugadinti kolonėlės, o taip gali atsitikti su kai kuriais organinės fazės/buferinio tirpalo mišiniais.
      Negalima naudoti priedų, pvz., jonų porų reagentų, nes jie gali veikti nejudamosios fazės sorbcines savybes. Tokie nejudamosios fazės pokyčiai gali būti negrįžtami. Dėl šios priežasties privaloma, kad bandymai naudojant priedus būtų daromi atskirose kolonėlėse.
      1.7.4   Tirpiniai
      Bandomoji ir etaloninė medžiagos turi būti ištirpintos judamojoje fazėje.
      1.8.   BANDYMO EIGA
      1.8.1   Bandymo sąlygos
      Darant matavimus turi būti registruojama temperatūra. Sąlygų pastovumui užtikrinti labai rekomenduojama kolonėlę laikyti termostatuojamoje kameroje, kai daromi kalibravimo, vertinimo ir bandomosios medžiagos matavimai.
      1.8.2   Eliuento sulaikymo trukmės to nustatymas
      Eliuento sulaikymo trukmei nustatyti galima taikyti du skirtingus metodus (žr. taip pat 1.2 skirsnį).
      1.8.2.1   Eliuento sulaikymo trukmės nustatymas naudojant homologines serijas
      Įrodyta, kad šiuo metodu gaunamos patikimos ir etaloninės to vertės. Detalės pateiktos bandymo metodo A.8: „Pasiskirstymo koeficientas (n – oktanolis/vanduo), HPLC metodas“ aprašyme.
      1.8.2.2   Eliuento sulaikymo trukmės nustatymas naudojant inertiškas medžiagas, kurių nesulaiko kolonėlė
      Metodas pagrįstas formamido, karbamido ar natrio nitrato tirpalų injekcija. Matavimai turi būti daromi bent du kartus.
      1.8.3   Sulaikymo trukmės tR nustatymas
      Etaloninės medžiagos turi būti parinktos, kaip aprašyta 1.3 skirsnyje. Jų sulaikymo trukmei nustatyti medžiagos gali būti įšvirkštos kaip mišrusis etalonas, jei būtų patvirtinta, kad kiekvieno etaloninio standarto sulaikymo trukmei kiti esantys etaloniniai standartai įtakos neturi. Kalibruoti būtina lygiais tarpais bent du kartus per dieną, kad būtų galima atsižvelgti į netikėtus kolonėlės veikimo pokyčius. Gera praktika reikalauja, kad kalibravimo injekcijos būtų daromos prieš ir po bandomosios medžiagos injekcijos, norint patikrinti, ar neįvyko sulaikymo trukmės poslinkis. Bandomosios medžiagos kuo mažesniais kiekiais (kad būtų išvengta kolonėlės perkrovos) įšvirkščiamos atskirai ir nustatoma jų sulaikymo trukmė.
      Matavimo patikimumui padidinti turi būti daromi bent du matavimai. Atskirų matavimų log Koc turi skirtis mažiau kaip 0,25 log vieneto.
      1.8.4   Įvertinimas
      Pagal eliuento sulaikymo trukmę to ir pasirinktų etaloninių medžiagų tR taikant 4 lygtį apskaičiuojami sulaikymo faktoriai k' (žr. 1.2 skirsnį). Etaloninių medžiagų log k' duomenys brėžiami grafike pagal jų log Koc vertes, gautas įkrovos pusiausvyros bandymuose ir pateiktas priedėlio 1 ir 3 lentelėse. Toliau pagal šį grafiką gauta bandomosios medžiagos log k' vertė yra naudojama jos log Koc vertei nustatyti. Jei gauti rezultatai rodo, kad bandomosios medžiagos log Koc yra už kalibravimo intervalo ribų, bandymą reikia pakartoti naudojant kitas labiau tinkamas etalonines medžiagas.
      2.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      Ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
      
                  —
               
               
                  bandomosios ir etaloninės medžiagos identifikavimas bei jų grynumas ir, jei tinka, pKa vertės,
               
            
                  —
               
               
                  įrangos ir darbo sąlygų aprašymas, pvz., analizės (ir apsauginės) kolonėlės tipas bei matmenys, detektavimo būdas, judamoji fazė (komponentų santykis ir pH), bandymų temperatūros diapazonas,
               
            
                  —
               
               
                  eliuento sulaikymo trukmė ir jos nustatymo metodas,
               
            
                  —
               
               
                  į kolonėlę įšvirkštos bandomosios ir etaloninės medžiagos kiekiai,
               
            
                  —
               
               
                  kalibravimui naudotų etaloninių medžiagų sulaikymo trukmė,
               
            
                  —
               
               
                  regresijos kreivės detalės (log k' pagal log Koc) ir šios kreivės grafikas,
               
            
                  —
               
               
                  vidutiniai sulaikymo duomenys ir įvertinta bandomosios medžiagos log Koc vertė,
               
            
                  —
               
               
                  chromatogramos.
               
            3.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt (ed). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, chapt. 4, McGraw-Hill, New York.
               
            
                  2)
               
               
                  J. Hodson, N.A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Koc) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67.
               
            
                  3)
               
               
                  G.G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, 1050-1059.
               
            
                  4)
               
               
                  C.T. Chiou, P.E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, 227-231.
               
            
                  5)
               
               
                  Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, 297-312.
               
            
                  6)
               
               
                  C.T. Chiou, L.J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, 831-832.
               
            
                  7)
               
               
                  S.W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, 833-846.
               
            
                  8)
               
               
                  W. Kordel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121-128.
               
            
                  9)
               
               
                  M. Mueller, W. Kordel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), 2493-2504.
               
            
                  10)
               
               
                  W. Kordel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), 2341-2352.
               
            
                  11)
               
               
                  B. von Oepen, W. Kordel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, 285-304.
               
            
                  12)
               
               
                  W. Kordel, G. Kotthoff, J. Muller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373-1384.
               
            
         Priedas
         1 lentelė
         Dirvožemių ir nuotekų dumblų Koc verčių ir HPLC atrankos metodu apskaičiuotų verčių palyginimas (31), (32)
         
         
                     Medžiaga
                  
                  
                     CAS Nr.
                  
                  
                     Nuotek ų dumblii log Koc
                     
                  
                  
                     log Koc HPLC
                  
                  
                     A
                  
                  
                     Dirvo žemių log Koc
                     
                  
                  
                     log Koc HPLC
                  
                  
                     A
                  
               
                     Atrazinas
                  
                  
                     1912-24-9
                  
                  
                     1,66
                  
                  
                     2,14
                  
                  
                     0,48
                  
                  
                     1,81
                  
                  
                     2,20
                  
                  
                     0,39
                  
               
                     Linuronas
                  
                  
                     330-55-2
                  
                  
                     2,43
                  
                  
                     2,96
                  
                  
                     0,53
                  
                  
                     2,59
                  
                  
                     2,89
                  
                  
                     0,30
                  
               
                     Fentionas
                  
                  
                     55-38-9
                  
                  
                     3,75
                  
                  
                     3,58
                  
                  
                     0,17
                  
                  
                     3,31
                  
                  
                     3,40
                  
                  
                     0,09
                  
               
                     Monuronas
                  
                  
                     150-68-5
                  
                  
                     1,46
                  
                  
                     2,21
                  
                  
                     0,75
                  
                  
                     1,99
                  
                  
                     2,26
                  
                  
                     0,27
                  
               
                     Fenantrenas
                  
                  
                     85-01-8
                  
                  
                     4,35
                  
                  
                     3,72
                  
                  
                     0,63
                  
                  
                     4,09
                  
                  
                     3,52
                  
                  
                     0,57
                  
               
                     Fenilbenzoatas
                  
                  
                     93-99-2
                  
                  
                     3,26
                  
                  
                     3,03
                  
                  
                     0,23
                  
                  
                     2,87
                  
                  
                     2,94
                  
                  
                     0,07
                  
               
                     Benzamidas
                  
                  
                     55-21-0
                  
                  
                     1,60
                  
                  
                     1,00
                  
                  
                     0,60
                  
                  
                     1,26
                  
                  
                     1,25
                  
                  
                     0,01
                  
               
                     4-nitrob enzami das
                  
                  
                     619-80-7
                  
                  
                     1,52
                  
                  
                     1,49
                  
                  
                     0,03
                  
                  
                     1,93
                  
                  
                     1,66
                  
                  
                     0,27
                  
               
                     Acetanilidas
                  
                  
                     103-84-4
                  
                  
                     1,52
                  
                  
                     1,53
                  
                  
                     0,01
                  
                  
                     1,26
                  
                  
                     1,69
                  
                  
                     0,08
                  
               
                     Anilinas
                  
                  
                     62-53-3
                  
                  
                     1,74
                  
                  
                     1,47
                  
                  
                     0,27
                  
                  
                     2,07
                  
                  
                     1,64
                  
                  
                     0,43
                  
               
                     2,5-dichloranilinas
                  
                  
                     95-82-9
                  
                  
                     2,45
                  
                  
                     2,59
                  
                  
                     0,14
                  
                  
                     2,55
                  
                  
                     2,58
                  
                  
                     0,03
                  
               
            
         2 lentelė
         Tarplaboratorinio palyginimo bandymo (11 dalyvaujančių laboratorijų), daryto HPLC metodui patobulinti ir validum ui patvirtinti, rezultatai (33)
         
         
                     Medžiaga
                  
                  
                     CAS-Nr.
                  
                  
                     log Koc
                     
                  
                  
                     Koc
                     
                  
                  
                     log Koc
                     
                  
               
                     (OECD 106)
                  
                  
                     (HPLC-metodas)
                  
               
                     Atrazinas
                  
                  
                     1912-24-9
                  
                  
                     1,81
                  
                  
                     78 + 16
                  
                  
                     1,89
                  
               
                     Monuronas
                  
                  
                     150-68-5
                  
                  
                     1,99
                  
                  
                     100 + 8
                  
                  
                     2,00
                  
               
                     Triapentenolis
                  
                  
                     77608-88-3
                  
                  
                     2,37
                  
                  
                     292 + 58
                  
                  
                     2,47
                  
               
                     Linuronas
                  
                  
                     330-55-2
                  
                  
                     2,59
                  
                  
                     465 + 62
                  
                  
                     2,67
                  
               
                     Fentionas
                  
                  
                     55-38-9
                  
                  
                     3,31
                  
                  
                     2 062 + 648
                  
                  
                     3,31
                  
               
            
         3 lentelė
         Rekomenduojamos etaloninės medžiagos HPLC atrankos metodui, taikančiam adsorbciją dirvožemiu
         
                     Etaloninė medžiaga
                  
                  
                     CAS-Nr.
                  
                  
                     log Koc vidutines vertes pagal įkrovos pusiausvyrą
                  
                  
                     Koc duomenų skaicius
                  
                  
                     log S.D.
                  
                  
                     Saltinis
                  
               
                     Acetanilidas
                  
                  
                     103-84-4
                  
                  
                     1,25
                  
                  
                     4
                  
                  
                     0,48
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Fenolis
                  
                  
                     108-95-2
                  
                  
                     1,32
                  
                  
                     4
                  
                  
                     0,70
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     2-Nitrobenzamidas
                  
                  
                     610-15-1
                  
                  
                     1,45
                  
                  
                     3
                  
                  
                     0,90
                  
                  
                     
                         (35)
                     
                  
               
                     N, N-dimetilbenzamidas
                  
                  
                     611-74-5
                  
                  
                     1,52
                  
                  
                     2
                  
                  
                     0,45
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     4-Metilbenzamidas
                  
                  
                     619-55-6
                  
                  
                     1,78
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,76
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Metilbenzoatas
                  
                  
                     93-58-3
                  
                  
                     1,80
                  
                  
                     4
                  
                  
                     1,08
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Atrazinas
                  
                  
                     1912-24-9
                  
                  
                     1,81
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,08
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Izoproturonas
                  
                  
                     34123-59-6
                  
                  
                     1,86
                  
                  
                     5
                  
                  
                     1,53
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     3 -Nitrobenzamidas
                  
                  
                     645-09-0
                  
                  
                     1,95
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,31
                  
                  
                     
                         (35)
                     
                  
               
                     Anilinas
                  
                  
                     62-53-3
                  
                  
                     2,07
                  
                  
                     4
                  
                  
                     1,73
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     3,5-dinitrobenzamidas
                  
                  
                     121-81-3
                  
                  
                     2,31
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,27
                  
                  
                     
                         (35)
                     
                  
               
                     Karbendazimas
                  
                  
                     10605-21-
                  
                  
                     2,35
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,37
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Triadimenolis
                  
                  
                     55219-65-3
                  
                  
                     2,40
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,85
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Triazoksidas
                  
                  
                     72459-58-6
                  
                  
                     2,44
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,66
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Triazofosas
                  
                  
                     24017-47-4017-47-8
                  
                  
                     2,55
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,78
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Linuronas
                  
                  
                     330-55-2
                  
                  
                     2,59
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,97
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Naftalenas
                  
                  
                     91-20-3
                  
                  
                     2,75
                  
                  
                     4
                  
                  
                     2,20
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Endosulfandiolis
                  
                  
                     2157-19-9
                  
                  
                     3,02
                  
                  
                     5
                  
                  
                     2,29
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Metiokarbas
                  
                  
                     2032-65-7
                  
                  
                     3,10
                  
                  
                     4
                  
                  
                     2,39
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Rūgštusis geltonas 219
                  
                  
                     63405-85-6
                  
                  
                     3,16
                  
                  
                     4
                  
                  
                     2,83
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     1,2,3-trichlorobenzenastri
                  
                  
                     87-61-6
                  
                  
                     3,16
                  
                  
                     4
                  
                  
                     1,40
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     y-HCH
                  
                  
                     58-89-9
                  
                  
                     3,23
                  
                  
                     5
                  
                  
                     2,94
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Fentionas
                  
                  
                     55-38-9
                  
                  
                     3,31
                  
                  
                     3
                  
                  
                     2,49
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Tiesioginis raudonasis 81
                  
                  
                     2610-11-9
                  
                  
                     3,43
                  
                  
                     4
                  
                  
                     2,68
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Pirazofosas
                  
                  
                     13457-18-6
                  
                  
                     3,65
                  
                  
                     3
                  
                  
                     2,70
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     a-Endosulfanas
                  
                  
                     959-98-8
                  
                  
                     4,09
                  
                  
                     5
                  
                  
                     3,74
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Dichlofopmetilas
                  
                  
                     51338-27-3
                  
                  
                     4,20
                  
                  
                     3
                  
                  
                     3,77
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Fenantrenas
                  
                  
                     85-01-8
                  
                  
                     4,09
                  
                  
                     4
                  
                  
                     3,83
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Bazinis mėlynasis 41 (mišinys)
                  
                  
                     26850-47- 5
                     12270-13- 2
                  
                  
                     4,89
                  
                  
                     4
                  
                  
                     4,46
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     DDT
                  
                  
                     50-29-3
                  
                  
                     5,63
                  
                  
                      
                  
                  
                     —
                  
                  
                     
                         (35)
                     
                  
               
      C.20   DAPHNIA MAGNA REPRODUKCIJOS BANDYMAS
      1.   METODAS
      Šis toksiškumo reprodukcijai bandymo metodas yra OECD TG 211 (1998) kopija.
      1.1.   ĮVADAS
      Pagrindinis šio bandymo tikslas – įvertinti cheminių medžiagų poveikį Daphnia magna reprodukcijos našumui.
      1.2.   APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI
      
         Motininiai gyvūnai – nuo bandymo pradžios naudojamos moteriškos lyties dafnijos, kurių yra tiriamas reprodukcijos našumas.
      
         Palikuonys – darant bandymą produkuotos dafnijos.
      
         Mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC) – mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiaga per nustatytą veikimo laikotarpį daro statistiškai reikšmingą poveikį, lyginant su kontroliniais bandiniais, reprodukcijai ir motininių gyvūnų gaištamumui (p < 0,05). Tačiau visų didesnių kaip LOEC bandomųjų koncentracijų kenksmingas poveikis turi būti lygus ar didesnis kaip LOEC koncentracijos bandomosios medžiagos poveikis. Jei šios dvi sąlygos negali būti įvykdytos, turi būti pateiktas išsamus paaiškinimas, kodėl buvo pasirinkta LOEC (taigi ir NOEC).
      
         Nestebimo poveikio koncentracija (NOEC) – bandomoji koncentracija bent kiek mažesnė už LOEC, kuri per nustatytą veikimo laikotarpį nedaro statistiškai reikšmingo poveikio (p < 0,05) lyginant su kontroliniais bandiniais.
      
         ECx
          – vandenyje ištirpintos bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant Daphnia magna reprodukcija per nustatytą veikimo laikotarpį sumažėja x %.
      
         Būdingasis prieaugio greitis – yra populiacijos augimo matas, apimantis reprodukcijos našumą ir amžiui specifišką gaištamumą (20) (21) (22). Stacionarios būsenos populiacijų jis lygus nuliui. Augančių populiacijų yra teigiamas, o nykstančių populiacijų – neigiamas. Aišku, kad pastarosios yra neilgaamžės ir galiausiai išnyksta.
      
         Aptikimo riba – mažiausia koncentracija, kai medžiagą galima aptikti, bet nenustatyti kiekybiškai.
      
         Nustatymo riba – mažiausia kiekybiškai nustatoma koncentracija.
      
         Gaištamumas – gyvūnas registruojamas nugaišęs, kai jis nejuda, t. y. kai negali plaukti arba kai, 15 s lengvai papurčius bandymų indą, nepastebima judant galūnių ar pilvelio. (Jei taikomas kitas apibrėžimas, jis turi būti pateiktas kartu su jo nuoroda.).
      1.3.   BANDYMO METODO ESMĖ
      Jaunos moteriškos lyties dafnijos (motininiai gyvūnai), kurių amžius bandymo pradžioje mažesnis kaip 24 h, yra veikiamos bandomąja medžiaga, ištirpinta vandenyje tam tikram koncentracijos verčių diapazonui gauti. Bandymo trukmė 21 para. Baigiant bandymą įvertinamas vienam gyvam motininiam gyvūnui tenkančių gyvų palikuonių bendras skaičius. Suaugusiųjų produkuoti jaunikliai, kurie žūva darant bandymą, į skaičiavimus neįtraukiami. Motininių gyvūnų reprodukcijos našumą galima išreikšti kitais būdais (pvz., gyvų palikuonių, produkuotų vieno gyvūno per parą nuo pirmos palikuonių pastebėjimo dienos, skaičiumi), tačiau ataskaitoje šie skaičiai turi būti pateikiami papildomai prie bendro gyvų jauniklių skaičiaus, bandymo pabaigoje tenkančio vienam motininiam gyvūnui. Mažiausiai stebimo poveikio koncentracijai (LOEC), kartu ir nestebimo poveikio koncentracijai, nustatyti (NOEC) bandomąja medžiaga veikiamų gyvūnų reprodukcijos našumas lyginamas su kontrolinio (-ių) bandinio (-ių) našumu. Be to, duomenys analizuojami taikant, kiek įmanoma, regresijos modelį, kad būtų galima įvertinti koncentraciją, kuriai esant reprodukcijos našumas sumažėtų x % (t.y. the EC50, EC20, ar EC 10).
      Ataskaitoje taip pat turi būti nurodytas motininių gyvūnų išlikimo laipsnis ir pirmosios vados atsiradimo laikas. Gali būti ištirti kiti medžiagos veikiami parametrai, pvz., augimas (pvz., ilgis) ir galbūt būdingasis prieaugio greitis.
      1.4.   INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ
      Reikėtų turėti su Daphnia magna daryto trumpalaikio toksiškumo bandymo (žr. C.2 metodą, I dalį) rezultatus. Rezultatas gali būti naudingas pasirenkant atitinkamą reprodukcijos bandymų bandomosios koncentracijos diapazoną. Turi būti žinomas bandomosios medžiagos tirpumas vandenyje ir garų slėgis, be to, bandomosios medžiagos tirpalų koncentracijai kiekybiškai nustatyti turi būti prieinamas patikimas analizės metodas, kurio žinomi regeneravimo efektyvumas ir nustatymo riba.
      Informacija apie bandomąją medžiagą, galinti būti vertinga nustatant bandymo sąlygas, apima struktūrinę formulę, medžiagos grynumą, stabilumą šviesoje, stabilumą bandymo sąlygomis, pKa, Pow ir lengvo biolologinio skaidomumo bandymo rezultatus (žr. C.4 metodą).
      1.5.   BANDYMO VALIDUMAS
      Metodas yra validus, jei, darant kontrolinį (-ius) bandymą (-us), įvykdomi šie veiksmingumo kriterijai:
      
                  —
               
               
                  bandymo pabaigoje motininių gyvūnų gaištamumas (moteriškos lyties dafnijų) yra ne didesnis kaip 20 %;
               
            
                  —
               
               
                  iš vieno iki bandymo pabaigos išgyvenusio motininio gyvūno gautų gyvų palikuonių vidutinis skaičius yra ≥ 60.
               
            1.6.   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.6.1.   Aparatūra
      Bandymų indai ir kita aparatūra, su kuria liečiasi bandomieji tirpalai, turi būti pagaminti vien tik iš stiklo ar kitos chemiškai inertinės medžiagos. Bandymams paprastai naudojamos laboratorinės stiklinės.
      Be to, yra reikalinga ši aparatūra arba jos dalis:
      
                  —
               
               
                  deguonies matuoklis (su mikroelektrodu ar kita tinkama įranga ištirpusiam deguoniui mažo tūrio bandiniuose matuoti);
               
            
                  —
               
               
                  atitinkama aparatūra pastoviai temperatūrai palaikyti,
               
            
                  —
               
               
                  pH-metras,
               
            
                  —
               
               
                  įranga vandens kietumui nustatyti,
               
            
                  —
               
               
                  įranga bendrosios organinės anglies vandenyje koncentracijai (TOC) ar įranga cheminiam deguonies suvartojimui (COD) nustatyti,
               
            
                  —
               
               
                  tinkama aparatūra apšvietimo režimui kontroliuoti ir šviesos intensyvumui matuoti.
               
            1.6.2.   Bandymų organizmai
      Bandymui reikėtų naudoti Daphnia magna Straus. Galima naudoti kitas dafnijų rūšis, jei jos atitinka nustatytus validumo kriterijus (dafnijų rūšiai turi būti taikomas su kontrolinių bandinių reprodukcijos našumu susijęs validumo kriterijus). Jei naudojamos kitos dafnijų rūšys, jos turi būti aiškiai apibrėžtos ir jų naudojimas turi būti pagrįstas.
      Kloną geriau būtų identifikuoti pagal genotipą. Tyrimas (1) parodė, kad A klono (jo kilmė – IRCHA (Institut de Recherche en Chimie Appliquee), Prancūzija) (3) reprodukcijos našumas visą laiką atitinka validumo kriterijų, pagal kurį vieno motininio gyvūno, išlikusio gyvo auginant šiame metode aprašytomis sąlygomis, vidutinis palikuonių skaičius > 60. Tačiau priimtini ir kiti klonai, jei parodoma, kad dafnijų kultūra atitinka bandymo validumo kriterijus.
      Bandymo pradžioje gyvūnai turi būti jaunesni kaip 24 h ir neturi būti pirmoji palikuonių karta. Jie turi būti gauti iš sveiko kamieno (t. y. be streso požymių, pvz., didelis mirtingumas, vyriškos lyties atstovų ir ephippia buvimas, vėlavimas produkuoti pirmąją vadą, pasikeitusi gyvūnų spalva ir t. t.). Kamieno gyvūnai turi būti laikomi tokiomis sąlygomis (šviesa, temperatūra, terpė, maitinimas ir gyvūnų skaičius tūrio vienetui), kurios būtų panašios į bandymo sąlygas. Jei bandymui naudota auginimo terpė skiriasi nuo įprastos dafnijų auginimo terpės, motininių gyvūnų stresui išvengti gera praktika reikalauja leisti dafnijoms paprastai maždaug per tris savaites (t. y. vienos kartos laikotarpiu) aklimatizuotis.
      1.6.3.   Bandymų terpė
      Rekomenduojama šiems bandymams naudoti visiškai apibrėžtą terpę. Taip galima išvengti sunkiai apibūdinamų priedų naudojimo (pvz., jūros dumblių, dirvožemio ekstrakto ir t. t.), taigi pagerėja tarplaboratorinio standartizavimo galimybės. Buvo nustatyta, kad geriausiai tinka Elendt M4 (4) ir M7 terpės (žr. 1 priedėlį). Tačiau yra priimtinos ir kitos terpės (pvz., (5) (6)), jei jose išauginta dafnijų kultūra atitinka bandymui nustatytus validumo kriterijus.
      Jei naudojamos terpės su neapibrėžtais priedais, šie priedai turi būti aiškiai apibūdinti ir bandymų ataskaitoje turi būti informacija apie jų sudėtį, ypač apie organinės anglies kiekį, nes ji gali būti tiekiamo maisto dalis. Rekomenduojama nustatyti organinio priedo pradinio tirpalo bendrąją organinę anglį (TOC) ir (ar) cheminį deguonies suvartojimą (COD) ir įvertinti jų indėlį į paruoštos terpės TOC/COD. Rekomenduojama, kad terpės (t.y. prieš pridedant dumblių) TOC lygis būtų mažesnis kaip 2 mg/l (7).
      Bandant metalų turinčias medžiagas, svarbu suprasti, kad bandomosios terpės savybės (pvz., kietumas, chelatavimo geba) gali turėti įtakos bandomosios medžiagos toksiškumui. Dėl šios priežasties pageidautina turėti visiškai apibrėžtą terpę. Tačiau vienintelės visiškai apibrėžtos terpės, kurios, kiek šiandien žinoma, tiktų ilgą laiką auginti Daphnia magna, yra Elendt M4 ir M7. Abiejose terpėse esama chelatavimo agento EDTA. Darbas (2) parodė, kad, reprodukcijos bandymą darant M4 ir M7 terpėje, kadmio „tariamasis toksiškumas“ paprastai yra mažesnis lyginant su EDTA neturinčia terpe. Taigi M4 ir M7 nerekomenduojama naudoti bandant metalų turinčias medžiagas, taip pat reikėtų vengti naudoti terpes, turinčias žinomus chelatavimo agentus. Metalų turinčioms medžiagoms patartina naudoti kitą terpę, pvz., ASTM {American Society for Testing and Materials) atkurtąjį kietą gėlą vandenį (7) be EDTA, į kurį pridėta jūros dumblių ekstrakto (8). Šis ASTM atkurtojo kieto gėlo vandens ir jūros dumblių ekstrakto derinys taip pat tinka ilgą laiką auginti ir bandyti Daphnia magna (2), nors dėl jūros dumblių ekstrakto organinio komponento vis dar pasireiškia nedidelis chelatuojantis veikimas.
      Bandymo pradžioje ir toliau per visą bandymą ištirpusio deguonies koncentracija turi būti didesnė kaip 3 mg/l. pH vertė turi būti 6–9 ir darant bet kurį bandymą ji paprastai neturi kisti daugiau kaip 1,5 vieneto. Rekomenduojamas 140 mg/l (pagal CaCO3) kietumas. Bandymai, daryti esant šiam ar aukštesniam lygiui, parodė, kad reprodukcijos našumas atitinka validumo kriterijus (9) (10).
      1.6.4.   Bandomieji tirpalai
      Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai paprastai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradinius tirpalus geriau ruošti tirpinant medžiagą bandymų terpėje.
      Kartais, norint gauti tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą, gali tekti naudoti organinius tirpiklius ar dispergatorius, tačiau reikia kiek įmanoma stengtis šių medžiagų nenaudoti. Tinkami tirpikliai yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Tinkami dispergatoriai yra Cremophor RH40, 0,01 % metilceliuliozė ir HCO-40. Bet kuriuo atveju bandomosios medžiagos bandomojo tirpalo koncentracija neturi būti didesnė kaip tirpumo bandymų terpėje riba.
      Tirpikliai naudojami pradiniam tirpalui ruošti, kuris gali būti tiksliai dozuojamas vandeniu. Kai pirmiau išvardyti tirpikliai galutinėje bandymų terpėje bus rekomenduojamos koncentracijos (t. y. < 0,1 ml/l), jie nebus toksiški ir nepadidins medžiagos tirpumo vandenyje.
      Dispergatoriai gali padėti tiksliai dozuoti ir disperguoti. Kai pirmiau išvardyti dispergatoriai galutinėje bandymų terpėje bus rekomenduojamos koncentracijos (≤ 0,1 ml/1), jie nebus toksiški ir nepadidins medžiagos tirpumo vandenyje.
      1.7.   BANDYMO PLANAS
      Bandymų indai paskirstomi pagal apdorojimo būdus, o toliau visi bandymų indai turi būti tvarkomi atsitiktiniu būdu. Taip nedarant, gali atsirasti nukrypimas, kuris galėtų būti aiškinamas koncentracijos poveikiu. Ypač jei bandymo vienetai tvarkomi tokia seka, kokia jie buvo apdoroti, arba atsižvelgiant į koncentraciją, kai kurie su laiku susiję veiksniai, pvz., operatoriaus nuovargis ar kita klaida esant didesnėms koncentracijos vertėms gali turėti rimtesnių padarinių. Be to, jei bandymo rezultatus gali veikti bandymo pradinės ar aplinkos, pvz., padėties laboratorijoje, sąlygos, reikėtų svarstyti blokinį bandymo planą.
      1.8.   BANDYMO EIGA
      1.8.1.   Veikimo sąlygos
      1.8.1.1.   Trukmė
      Bandymo trukmė – 21 para.
      1.8.1.2.   Įkrova
      Motininiai gyvūnai laikomi atskirai po vieną bandymų inde su 50–100 ml terpės.
      Kartais, atsižvelgiant į analizės metodikos bandomajai medžiagai nustatyti reikalavimus, gali būti reikalingas didesnis tūris, nors cheminei analizei daryti leidžiama kartu supilti tos pačios koncentracijos bandinius. Jei naudojamas didesnis kaip 100 ml tūris, gali tekti padidinti dafnijų maisto davinį, kad turimo maisto pakaktų ir būtų garantuota validumo kriterijų atitiktis. Dinaminiams bandymams dėl techninių priežasčių galima numatyti alternatyvius bandymo planus (pvz., keturias grupes po 10 gyvūnų didesniame bandymo tūryje), tačiau visi bandymo plano pakeitimai turi būti nurodyti ataskaitoje.
      1.8.1.3.   Gyvūnų skaičius
      Pusiau statiniams bandymams kiekvienai koncentracijai imama bent 10 atskirai laikomų gyvūnų ir bent 10 atskirai laikomų gyvūnų kontrolinės serijos bandiniams.
      Buvo parodyta, kad dinaminiams bandymams kiekvienai koncentracijai tinka naudoti 40 gyvūnų, padalytų į keturias grupes po 10 gyvūnų (1). Galima naudoti mažiau bandomųjų organizmų, bet kiekvienai koncentracijai rekomenduojama naudoti ne mažiau kaip po 20 gyvūnų, padalytų į du ar daugiau bandinių su vienodu gyvūnų skaičiumi (pvz., į keturis bandinius su 5 dafnijomis kiekvienam bandiniui). Atkreiptinas dėmesys, kad, jei darant bandymus su grupėmis laikomais gyvūnais, motininiai gyvūnai žūva, reprodukcijos našumo bus neįmanoma išreikšti kaip bendro gyvų palikuonių skaičiaus, tenkančio vienam bandymo pabaigoje gyvam motininiam gyvūnui. Tokiais atvejais reprodukcijos našumas išreiškiamas kaip „bendras skaičius gyvų palikuonių, tenkantis vienam bandymo pradžioje buvusiam gyvūnui“.
      1.8.1.4.   Maitinimas
      Darant pusiau statinius bandymus geriau maitinti kasdien, tačiau ne mažiau kaip tris kartus per savaitę (tai atititinka terpės keitimą). Nukrypimai nuo šių sąlygų (pvz., dinaminių bandymų) nurodomi ataskaitoje.
      Darant bandymą motininių gyvūnų maistą turėtų sudaryti šių gyvų dumblių ląstelės: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (dabar Pseudokirchneriella subcapitata (11)) ir Scenedesmus subspicatus. Tiekiamas maistas turėtų būti apskaičiuotas pagal organinės anglies (C) kiekį, duodamą kiekvienam motininiam gyvūnui. Tyrimas (12) parodė, kad Daphnia magna pakanka gauti 0,1-0,2 mg C/dafnijai/parai, kad būtų pasiektas bandymo validumo kriterijus, atitinkantis palikuonių skaičių. Maistą galima tiekti vienodai visą bandymo laiką ar, jei norima, mažiau bandymo pradžioje ir daugiau bandymo eigoje, atsižvelgiant į motininių gyvūnų augimą. Šiuo atveju visą laiką davinys turi atitikti rekomenduotą diapazoną 0,1-0,2 mg C/dafnijai/parai.
      Jei maitinimo lygiui nustatyti naudojami pakeitimo parametrai, pvz., dumblių ląstelių skaičius ar šviesos absorbcija (t. y. kad būtų patogiau, nes anglies kiekiui nustatyti reikia daug laiko), kiekviena laboratorija turi daryti savo nomogramą, kuri pakeitimo parametrą susietų su anglies kiekiu dumbliuose (žr. 2 priedėlį apie nomogramos darymą). Nomogramas būtina tikrinti bent kartą per metus ir dažniau, jei kinta dumblių auginimo sąlygos. Buvo nustatyta, kad šviesos absorbcija yra geresnis anglies kiekio pakeitimo parametras negu ląstelių skaičius (13).
      Dafnijos maitinamos koncentruota dumblių suspensija, kad į bandymų indus pilamos kultūros terpės tūris būtų kiek įmanoma mažesnis. Dumbliams koncentruoti galima naudoti centrifugavimą ir pakartotinį suspendavimą distiliuotame vandenyje, dejonizuotame vandenyje ar dafnijų kultūros terpėje.
      1.8.1.5.   Šviesa
      16 h trukmės apšvietimas, kurio intensyvumas ne didesnis kaip 15-20 μE.-m-2.s-1.
      1.8.1.6.   Temperatūra
      Bandymų terpės temperatūra turi būti 18-22 oC. Tačiau, jei įmanoma, darant visus bandymus temperatūra neturėtų kisti daugiau kaip 2 oC taikant šiuos intervalus (pvz., 18-20, 19-21 ar 20-22 oC). Temperatūrai kontroliuoti gali būti naudingas papildomas bandymų indas.
      1.8.1.7.   Aeravimas
      Darant bandymą bandomieji tirpalai neaeruojami.
      1.8.2.   Bandomoji koncentracija
      Paprastai naudojamos bent penkios bandomosios koncentracijos vertės, sudarančios geometrinę progresiją, kurios daugiklis būtų ne didesnis kaip 3,2, ir kiekvienai bandomosios koncentracijos vertei daromas atitinkamas skaičius lygiagrečiųjų bandymų (žr. 1.8.1.3 skirsnį). Jei naudojamos mažiau kaip penkios koncentracijos vertės, tai reikia pagrįsti. Neturi būti bandomos medžiagos, jei jų koncentracija yra didesnė nei tirpumo bandymų terpėje riba.
      Nustatant koncentracijų diapazoną būtina žinoti:
      
                  i)
               
               
                  jei tikslas – nustatyti LOEC/NOEC, mažiausia bandomoji koncentracija turi būti gana maža, kad ją naudojant vaisingumas lyginant su kontroliniu bandiniu nebūtų pastebimai mažesnis. Jei taip nėra, bandymą reikia pakartoti su dar mažesne mažiausia koncentracija;
               
            
                  ii)
               
               
                  jei tikslas – nustatyti LOEC/NOEC, didžiausia bandomoji koncentracija turi būti gana didelė, kad ją naudojant vaisingumas lyginant su kontroliniu bandiniu būtų daug mažesnis. Jei taip nėra, bandymą reikia pakartoti su dar didesne didžiausia koncentracija;
               
            
                  iii)
               
               
                  jei vertinama reprodukciją veikianti ECx, jai apibrėžti atitinkamu pasikliovimo lygiu patartina naudoti pakankamą koncentracijos verčių skaičių. Jei vertinama reprodukciją veikianti EC50, patartina, kad didžiausia bandomoji koncentracija būtų didesnė kaip ši EC50. Priešingu atveju, nors EC50 vis dar galima įvertinti, EC50 pasikliovimo intervalas būtų labai platus, ir gali būti neįmanoma patenkinamai įvertinti parinkto modelio tinkamumo.
               
            
                  iv)
               
               
                  Reikėtų vengti į bandomosios koncentracijos verčių diapazoną įtraukti koncentracijos vertes, kurios būtų statistiškai reikšmingos suaugusių gyvūnų išlikimui, nes taip pasikeistų bandymo esmė, ir jis iš paprasto reprodukcijos bandymo taptų sudėtinio reprodukcijos ir gaištamumo bandymu, kuriam reikalinga daug sudėtingesnė statistinė analizė.
               
            Tinkamas bandomąsias koncentracijas parinkti turėtų padėti anksčiau gautos žinios apie bandomąją medžiagą (pvz., trumpalaikio toksiškumo ir (ar) diapazono nustatymo tyrimų duomenys).
      Jei bandomiesiems tirpalams ruošti naudojamas tirpiklis ar dispergatorius (žr. 1.6.4 skirsnį), jų galutinė koncentracija visuose bandymų induose turi būti vienoda ir ne didesnė kaip 0,1 ml/l.
      1.8.3.   Kontroliniai bandiniai
      Be bandomosios medžiagos bandinių serijos, bandoma viena bandymų terpės kontrolinių bandinių serija ir, jei tinka, viena tirpiklio ar dispergatoriaus kontrolinių bandinių serija. Naudojamo tirpiklio ar dispergatoriaus koncentracija turi būti tokia, kokia yra induose su bandomąja medžiaga. Turi būti daromas atitinkamas skaičius lygiagrečiųjų bandymų (žr. 1.8.1.3 skirsnį).
      Paprastai jei bandymas daromas tinkamai, kontrolinio (-ių) bandinio (-ių) variacijos apie vidutinę motininio gyvūno produkuotų palikuonių vertę koeficientas turi būti < 25 %, ir jis turi būti nurodomas bandymo planams su atskirai laikomais gyvūnais.
      1.8.4.   Bandymų terpės atnaujinimas
      Bandymų terpės atnaujinimo dažnis priklauso nuo bandomosios medžiagos, tačiau ji turėtų būti atnaujinama tris kartus per savaitę. Jei pagal išankstinius stabilumo bandymus (žr. 1.4 skirsnį) bandomosios medžiagos koncentracija ilgiausiu (t. y. trijų parų) atnaujinimo laikotarpiu yra nestabili (t. y. yra už 80–120 % vardinės koncentracijos ribų ar yra mažesnė kaip 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), reikėtų numatyti dažnesnį terpės atnaujinimą arba taikyti dinaminį bandymą.
      Kai atnaujinama pusiau statinių bandymų terpė, paruošiama antra bandymų indų serija, ir į juos pernešami motininiai gyvūnai naudojant, pvz., tinkamo skersmens stiklinę pipetę. Su Daphnia pernešamos terpės tūris turi būti kuo mažesnis.
      1.8.5.   Matavimai
      Stebėjimų rezultatai, gauti darant bandymą, registruojami duomenų lentelėse (žr. 3 ir 4 priedėlio pavyzdžius). Jei reikia daryti kitus matavimus (žr. 1.3 ir 1.8.8), gali būti atliekami papildomi stebėjimai.
      1.8.6.   Palikuonys
      Kiekvieno motininio gyvūno produkuotus palikuonis geriau atskirti ir skaičiuoti kasdien nuo pirmosios vados atsiradimo, kad jie nevartotų suaugusiems gyvūnams skirto maisto. Pagal šį metodą reikia skaičiuoti tik gyvus palikuonis, tačiau reikia registruoti neapvaisintų kiaušinių ar negyvų palikuonių skaičių.
      1.8.7.   Gaištamumas
      Motininių gyvūnų gaištamumą geriau registruoti kasdien, bent jau tuomet, kai skaičiuojami palikuonys.
      1.8.8.   Kiti parametrai
      Nors šis metodas iš esmės yra skirtas reprodukcijos rezultatams vertinti, galima kiekybiškai įvertinti ir kitus rezultatus, kad būtų įmanoma jų statistinė analizė. Labai pageidautina, kad būtų daromi augimo matavimai, nes jie suteikia informacijos apie galimus subletalius rezultatus, kurie gali būti naudingesni nei vien tik reprodukcijos matavimas; baigiant bandymą rekomenduojama išmatuoti motininių gyvūnų ilgį (t. y. kūno ilgį, išskyrus analinį dyglį). Kiti parametrai, kuriuos galima išmatuoti ar apskaičiuoti, yra pirmosios vados (ir vėlesnių vadų) atsiradimo laikas, vieno gyvūno vadų skaičius ir dydis, neapvaisintų kiaušinių skaičius, vyriškos lyties atstovų ar ephippia buvimas ir populiacijos prieaugio būdingasis greitis.
      1.8.9.   Analizinių nustatymų ir matavimų dažnis
      Deguonies koncentracija, temperatūra, kietumas ir pH vertės turi būti matuojamos bent kartą per savaitę prieš ir po terpės atnaujinimo kontroliniame (-iuose) bandinyje (-iuose) ir induose su didžiausia bandomosios medžiagos koncentracija.
      Darant bandymą bandomosios medžiagos koncentracijos vertės nustatomos reguliariais laiko tarpais.
      Jei pusiau statiniuose bandymuose daroma prielaida, kad bandomosios medžiagos koncentracija lieka vardinės koncentracijos ± 20 % vertės (t. y. 80-120 % diapazono, žr. 1.4 ir 1.8.4), rekomenduojama nustatyti bent didžiausią ir mažiausią bandomąją koncentraciją iš karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jo atnaujinimą pirmąją bandymo savaitę (t. y. turi būti daroma to paties tirpalo mėginių analizė iš karto po tirpalo paruošimo ir jį atnaujinant). Vėliau šis nustatymas turi būti kartojamas bent kas savaitę.
      Jei tai yra bandymai, kuriuos darant nesitikima, kad koncentracija liks vardinės koncentracijos ± 20 % vertės, būtina analizuoti visų koncentracijos verčių bandomuosius tirpalus iš karto po jų paruošimo ir prieš pat atnaujinimą. Tačiau bandymuose, kur išmatuota pradinė bandomosios medžiagos koncentracija nesudaro ± 20 % vardinės vertės, bet galima gauti pakankamai įrodymų, kad pradinės koncentracijos vertės yra pakartojamos ir stabilios (t. y. 80-120 % pradinės koncentracijos verčių diapazono), bandymo antrą ar trečią savaitę cheminių analizių skaičių galima sumažinti ir apsiriboti didžiausios ir mažiausios bandomosios koncentracijos nustatymu. Visais atvejais prieš atnaujinimą turi būti daromas tik vieno lygiagretaus kiekvienos koncentracijos bandinio bandomosios koncentracijos nustatymas.
      Jei taikomas dinaminis bandymas, tinka pusiau statinių bandymų bandinių ėmimo režimas (bet „senų“ tirpalų analizė šiuo atveju netinka). Tačiau, norint patikrinti bandomosios koncentracijos verčių stabilumą, patartina pirmąją savaitę bandinius imti dažniau (pvz., trys matavimų serijos). Šio tipo bandymuose skiediklio srautas ir bandomoji medžiaga turi būti kontroliuojami kasdien.
      Jei yra įrodymų, kad bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymą gali būti išlaikyta vardinės koncentracijos ar išmatuotos pradinės koncentracijos vertės ± 20 %, rezultatai gali būti išreikšti vardinėmis ar išmatuotomis pradinėmis vertėmis. Jei vardinės ar išmatuotos pradinės koncentracijos nuokrypis yra didesnis kaip ± 20 %, rezultatai turėtų būti išreiškiami kaip laiko svorinis vidurkis (žr. 5 priedėlį).
      2.   DUOMENYS IR ATASKAITA
      2.1.   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Šio bandymo tikslas – nustatyti, kokį poveikį daro bandomoji medžiaga bendram kiekiui palikuonių, kuriuos produkuoja kiekvienas iki bandymo pabaigos gyvas išlikęs motininis gyvūnas. Bendras vieno motininio gyvūno palikuonių skaičius apskaičiuojamas kiekvienam bandymų indui (t. y. lygiagretusis bandinys). Jei kuriame nors inde motininis gyvūnas darant bandymą žūva arba pasirodo, kad yra vyriškos lyties, lygiagretusis bandinys iš analizės pašalinamas. Tuomet analizė bus pagrįsta mažesniu skaičiumi lygiagrečiųjų bandinių.
      Norint įvertinti LOEC, taigi ir NOEC, susijusią su cheminės medžiagos poveikiu reprodukcijos našumui, būtina apskaičiuoti vidutinį reprodukcijos našumą visiems kiekvienos koncentracijos lygiagretiesiems bandiniams ir grupinį liekamąjį standartinį nuokrypį, o tai galima padaryti taikant dispersinę analizę. Toliau kiekvienos koncentracijos vidutinė vertė turi būti palyginta su kontrolinio bandinio vidutine verte taikant atitinkamą daugybinio lyginimo metodą. Gali būti naudingi Dunnetto ar Williamso kriterijai (14) (15) (16) (17). Būtina patikrinti, ar taikant dispersinę analizę galioja sklaidos homogeniškumo prielaida. Rekomenduojama tai daryti grafiškai, o ne taikant formalų reikšmingumo kriterijų (18); tinkama alternatyva būtų Bartletto kriterijus. Jei ši prielaida negalioja, reikėtų numatyti duomenų transformavimą sklaidoms homogenizuoti prieš darant dispersinę analizę ar daryti svorinę dispersinę analizę. Taikant dispersinę analizę aptinkamo poveikio dydis (t. y. mažiausias reikšmingas skirtumas) turi būti apskaičiuotas ir pateiktas ataskaitoje.
      Koncentracijai, kuri sukeltų reprodukcijos našumo sumažėjimą 50 % (t. y. EC50), įvertinti pagal duomenis turi būti pritaikyta tinkama kreivė, pvz., logistinė kreivė taikant statistinį, pvz., mažiausių kvadratų, metodą. Kreivė galėtų būti parametrizuota taip, kad EC50 ir jos standartinė paklaida būtų įvertinta tiesiogiai. Tai labai palengvintų EC50 pasikliovimo rėžių apskaičiavimą. Jei nėra svarbių priežasčių, kodėl turėtų būti naudojami kiti pasikliovimo lygiai, turi būti nurodyti dvipusiai 95 % pasikliovimo rėžiai. Pritaikymo metodika geriau turėtų numatyti būdą atitikties nebuvimo reikšmingumui įvertinti. Tai galima padaryti grafiškai arba liekamąją kvadratų sumą padalijus į „atitikties nebuvimo“ dalį ir „grynos paklaidos komponentų“ dalį ir daryti atitikties nebuvimo reikšmingumo tikrinimą. Kadangi po apdorojimų, po kurių vaisingumas būna didelis, gali būti didesnė jauniklių skaičiaus sklaida negu po apdorojimų, po kurių vaisingumas būna mažas, reikėtų atsižvelgti į galimybę stebėtoms vertėms taikyti svorinius koeficientus, kad būtų galima atspindėti skirtingą sklaidą skirtingose apdorojimo grupėse (žr. (18) nuorodą, kurioje yra teoriniai pagrindai).
      Analizuojant galutinio tarplaboratorinio bandymo duomenis (2), logistinė kreivė buvo pritaikyta naudojant šį modelį, nors galima naudoti kitus tinkamus modelius:
      
         
      Čia:
      
                  Y
               
               
                  =
               
               
                  bendras jauniklių skaičius, tenkantis vienam gyvam motininiam gyvūnui bandymo pabaigoje (apskaičiuotas kiekvienam indui),
               
            
                  x
               
               
                  =
               
               
                  medžiagos koncentracija,
               
            
                  c
               
               
                  =
               
               
                  laukiamas jauniklių skaičius, kai x = 0,
               
            
                  x0
                  
               
               
                  =
               
               
                  populiacijos EC50,
               
            
                  b
               
               
                  =
               
               
                  krypties koeficiento parametras.
               
            Šis modelis turėtų tikti daugeliui situacijų, tačiau pasitaikys bandymų, kuriems jis netinka. Reikėtų patikrinti modelio validumą, kaip užsiminta pirmiau. Kai kuriais atvejais gali tikti hormesis modelis, kurį taikant būna didesnis mažų koncentracijos verčių poveikis (19).
      Gali būti įvertintos kitos poveikio koncentracijos vertės, pvz., EC10 ar EC20, bet modelio parametrams nustatyti geresnis gali pasirodyti kitas būdas, nei buvo naudotas EC50 įvertinti.
      2.2.   BANDYMO ATASKAITA
      Bandymo ataskaitoje turi būti:
      2.2.1.   Bandomoji medžiaga:
      
                  —
               
               
                  fizikinė būsena ir atitinkamos fizikocheminės savybės;
               
            
                  —
               
               
                  cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynumą.
               
            2.2.2.   Bandymo gyvūnai:
      
                  —
               
               
                  klonas (jei nustatytas jo genotipas), tiekėjas ar šaltinis (jei žinomas) ir taikytos auginimo sąlygos. Jei naudojama ne Daphnia magna rūšis, tai turi būti nurodyta ataskaitoje ir pagrįsta.
               
            2.2.3.   Bandymo sąlygos:
      
                  —
               
               
                  taikyta bandymo metodika (pvz., pusiau statinis ar dinaminis bandymas, tūris, įkrova ir Daphnia skaičius litrui),
               
            
                  —
               
               
                  apšvietimo trukmė ir šviesos intensyvumas,
               
            
                  —
               
               
                  bandymo planas (pvz., lygiagrečiųjų bandinių skaičius, vieno lygiagrečiojo bandinio motininių gyvūnų skaičius),
               
            
                  —
               
               
                  naudotos auginimo terpės detalės,
               
            
                  —
               
               
                  organinės medžiagos priedai, jei naudoti, įskaitant sudėtį, šaltinį, ruošimo metodą, pradinių tirpalų TOC/COD, gautų bandymo terpės TOC/COD verčių įvertinimas,
               
            
                  —
               
               
                  išsami informacija apie maitinimą, įskaitant kiekį (mg C/Daphnia/parai) ir programa (pvz., maisto rūšies (-ių) tipas, įskaitant, jei tai dumbliai, specifinį pavadinimą (rūšį) ir, jei žinomas, štamą, auginimo sąlygas),
               
            
                  —
               
               
                  pradinių tirpalų paruošimo metodas ir atnaujinimo dažnumas (tirpiklis ar dispergatorius, jei naudojami, ir jų koncentracija).
               
            2.2.4.   Rezultatai:
      
                  —
               
               
                  visų išankstinių bandomosios medžiagos stabilumo tyrimų rezultatai;
               
            
                  —
               
               
                  bandomosios koncentracijos vardinės vertės ir medžiagos kiekiui bandymų induose nustatyti analizių rezultatai (žr. 4 priedėlio duomenų lentelių pavyzdžius); taip pat ataskaitoje pateikiamas metodo regeneravimo našumas ir nustatymo riba,
               
            
                  —
               
               
                  vandens kokybė bandymų induose (t. y. pH, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, TOC ir (ar) COD bei kietumas, jei tinka) (žr. 3 priedėlio duomenų lentelės pavyzdį),
               
            
                  —
               
               
                  išsamus kiekvieno motininio gyvūno gyvų palikuonių registravimas (žr. 3 priedėlio duomenų lentelės pavyzdį),
               
            
                  —
               
               
                  nugaišusių motininių gyvūnų skaičius ir nugaišimo diena (žr. 3 priedėlio duomenų lentelės pavyzdį),
               
            
                  —
               
               
                  kontrolinių bandinių vaisingumo variacijos koeficientas (pagrįstas bendru gyvų palikuonių skaičiumi, tenkančiu vienam iki bandymo pabaigos gyvam išlikusiam motininiam gyvūnui),
               
            
                  —
               
               
                  vienam iki bandymo pabaigos gyvam išlikusiam motininiam gyvūnui tenkančio gyvų palikuonių bendro skaičiaus (kiekvienam lygiagrečiajam bandiniui) ir bandomosios medžiagos koncentracijos grafikas,
               
            
                  —
               
               
                  mažiausia stebimo poveikio reprodukcijai koncentracija (LOEC), įskaitant taikytų statistinių metodikų aprašymą ir nurodymą, kokio dydžio poveikis gali būti aptiktas, ir nestebimo poveikio reprodukcijai koncentracija (NOEC); jei tinka, taip pat turi būti pateikta motininių gyvūnų gaištamumo LOEC/NOEC,
               
            
                  —
               
               
                  jei tinka, reprodukcijos ECx ir pasikliovimo intervalai bei jai apskaičiuoti taikyto modelio grafikas, dozės ir atsako kreivės krypties koeficientas ir jos standartinė paklaida,
               
            
                  —
               
               
                  kiti stebėti biologiniai rezultatai ar matavimai: pateikiami visi kiti pastebėti ar matuoti biologiniai rezultatai (pvz., motininių gyvūnų augimas), įskaitant bet kurį tinkamą pagrindimą,
               
            
                  —
               
               
                  bet kokio nukrypimo nuo bandymo metodo pagrindimas.
               
            3.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20-21 March 1993.
               
            
                  2)
               
               
                  OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No.6. Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.
               
            
                  3)
               
               
                  Baird D.J., Barber J., Bradley M.C., Soares A.M.V.M. and Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, 257-265.
               
            
                  4)
               
               
                  Elendt B.P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
               
            
                  5)
               
               
                  EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
               
            
                  6)
               
               
                  Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol. ,47, 775-782.
               
            
                  7)
               
               
                  ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 pp.
               
            
                  8)
               
               
                  Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley M.C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.L0kke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.) pp 144-148.
               
            
                  9)
               
               
                  Parkhurst B.R., Forte J.L. and Wright G.P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, 1-8.
               
            
                  10)
               
               
                  Cowgill U.M. and Milazzo D.P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), 185-196.
               
            
                  11)
               
               
                  Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, 209.
               
            
                  12)
               
               
                  Sims I.R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 2053-2058.
               
            
                  13)
               
               
                  Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459-466.
               
            
                  14)
               
               
                  Dunnett C.W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, 1096-1121.
               
            
                  15)
               
               
                  Dunnett C.W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.
               
            
                  16)
               
               
                  Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117.
               
            
                  17)
               
               
                  Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, 510-531.
               
            
                  18)
               
               
                  Draper N.R. and Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.
               
            
                  19)
               
               
                  Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
               
            
                  20)
               
               
                  Wilson E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
               
            
                  21)
               
               
                  Poole R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, p 532.
               
            
                  22)
               
               
                  Meyer J.S., Ingersoll C.G., McDonald L.L. and Boyce M.S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, 1156-1166.
               
            
         1 Priedas
         VISIŠKAI APIBRĖŽTŲ ELENDT M7 IR M4 TERPIŲ RUOŠIMAS
         Aklimatizavimas Elendt M7 ir M4 terpėje
         Kai kurios laboratorijos turėjo sunkumų norėdamos dafnijas pernešti tiesiai į M4 (1) ir M7 terpes. Tačiau šiek tiek pasisekė aklimatizuojant laipsniškai, t. y. perkeliant dafnijas iš jų terpės į 30 % Elendt, paskui į 60 % Elendt ir pagaliau į 100 % Elendt. Aklimatizavimas gali trukti visą mėnesį.
         RUOŠIMAS
         Mikroelementai
         Atskirų mikroelementų pradiniai tirpalai (I) iš pradžių ruošiami naudojant tinkamo grynumo vandenį, pvz., dejonizuotą, distiliuotą arba grįžtamosios osmozės būdu gautą vandenį. Iš šių skirtingų tirpalų (I) ruošiamas antras pradinis tirpalas (II), kuriame yra visi mikroelementai (bendras tirpalas), t. y.:
         
                     I pradinis tirpalas
                     (atskira medžiaga)
                  
                  
                     Į vandenį įdėtas kiekis
                     mg/l
                  
                  
                     Koncentracija (lyginant su M4 terpe)
                     (kartų)
                  
                  
                     Ruošiant bendrą II pradini tirpalą, į vandenį įpilto I pradinio tirpalo tūris
                     ml/l
                  
               
                     M4
                  
                  
                     M7
                  
               
                     H3BO3
                     
                  
                  
                     57 190
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     MnCl2 * 4H2O
                  
                  
                     7 210
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     LiCl
                  
                  
                     6 120
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     RbCl
                  
                  
                     1 420
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     SrCl2 * 6H2O
                  
                  
                     3 040
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     NaBr
                  
                  
                     320
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     Na2MoO4 * 2H2O
                  
                  
                     1 260
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     CuCl2 * 2H2O
                  
                  
                     335
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     ZnCl2
                     
                  
                  
                     260
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     CuCl2 * 6H2O
                  
                  
                     200
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     KI
                  
                  
                     65
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2SeO3
                     
                  
                  
                     43,8
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     NH4VO3
                     
                  
                  
                     11,5
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2EDTA * 2H2O
                  
                  
                     5 000
                  
                  
                     2 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     FeSO4 * 7H2O
                  
                  
                     1 991
                  
                  
                     2 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Na2EDTA ir FeSO4 tirpalai ruošiami atskirai, vėliau supilami kartu ir iškart apdorojami autoklave. Taip gaunamas:
                  
               
                     21 Fe-EDTA tirpalas
                  
                  
                      
                  
                  
                     1 000 kartų
                  
                  
                     20,0
                  
                  
                     5,0
                  
               M4 ir M7 terpės
         M4 ir M7 terpės naudojant II pradinį tirpalą, makroelementus ir vitaminus yra ruošiamos taip:
         
                      
                  
                  
                     Į vandenį įdėtas kiekis
                     mg/l
                  
                  
                     Koncentracija (lyginant su M4 terpe)
                     (kartų)
                  
                  
                     Terpei paruošti įpilto pradinio tirpalo tūris
                     ml/l
                  
               
                     M4
                  
                  
                     M7
                  
               
                     II pradinis visų mikroelementų tirpalas
                  
                  
                      
                  
                  
                     20
                  
                  
                     50
                  
                  
                     50
                  
               
                     Mitybinių makroelementų pradiniai tirpalai (atskira medžiaga)
                  
               
                     CaCl2 * 2H2O
                  
                  
                     293 800
                  
                  
                     1 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     MgSO4 * 7H2O
                  
                  
                     246 600
                  
                  
                     2 000
                  
                  
                     0,5
                  
                  
                     0,5
                  
               
                     KCl
                  
                  
                     58 000
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     NaHCO3
                     
                  
                  
                     64 800
                  
                  
                     1 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2SiO3 * 9H2O
                  
                  
                     50 000
                  
                  
                     5 000
                  
                  
                     0,2
                  
                  
                     0,2
                  
               
                     NaNO3
                     
                  
                  
                     2 740
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     KH2PO4
                     
                  
                  
                     1 430
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     K2HPO4
                     
                  
                  
                     1 840
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     Vitaminų mišinio pradinis tirpalas
                  
                  
                     —
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     Vitaminų mišinio pradinis tirpalas ruošiamas į 1 litrą įdedant tokių šių vitaminų kiekį:
                  
               
                     Tiamino hidrochloridas
                  
                  
                     750
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Ciankobalaminas (B12)
                  
                  
                     10
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Biotinas
                  
                  
                     7,5
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Vitaminų mišinio pradinis tirpalas laikomas užšaldytas mažomis alikvotinėmis dalimis. Į terpę vitaminai dedami prieš pat naudojimą.
                     
                                 
                                    N.B.
                                 
                              
                              
                                 Jei ruošdami galutinę terpę norite išvengti druskų nuosėdų susidarymo, įpilkite alikvotines pradinio tirpalo dalis į maždaug 500–800 ml dejonizuoto vandens ir praskieskite iki 1 litro.
                              
                           
                                 
                                    N.N.B.
                                 
                              
                              
                                 Pirmąją publikaciją apie M4 terpę galima rasti Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, p. 25–33.
                              
                           
               
      
         2 priedėlis
         BENDROS ORGANINĖS ANGLIES (TOC) ANALIZĖ IR DUMBLIŲ MAISTO TOC KIEKIO NOMOGRAMŲ GAVIMAS
         Pripažinta, kad dumblių maisto anglies kiekis tiesioginiu metodu paprastai nematuojamas, bet taikoma jo koreliacija (t. y. nomogramos) su pakeitimo parametrais, pvz., dumblių ląstelių skaičiumi ar šviesos absorbcija.
         TOC reikėtų matuoti taikant oksidavimo aukštos temperatūros sąlygomis metodą, bet ne UV ar persulfatinį metodą (žr. The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
         Nomogramai gauti dumbliai ir auginimo terpė atskiriami centrifuguojant, paskui dumbliai vėl suspenduojami distiliuotame vandenyje. Kiekvieno bandinio pakeitimo parametras ir TOC koncentracija matuojami tris kartus. Analizuojami distiliuoto vandens tuštieji bandiniai ir jų TOC koncentracija atimama iš dumblių bandinio TOC koncentracijos.
         Nomograma nustatytam anglies koncentracijų diapazonui turėtų būti tiesinė. Pavyzdžiai pateikti toliau.
         N.B. Jų negalima naudoti perskaičiavimams; svarbu, kad laboratorijos turėtų savo darytas nomogramas.
         
            
         
            
         
            
      
      
         3 priedėlis
         TERPĖS ATNAUJINIMO, FIZIKOCHEMINIO MONITORINGO, MAITINIMO, DAFNIJŲ REPRODUKCIJOS IR SUAUGUSIŲ GYVŪNŲ GAIŠTAMUMO DUOMENŲ REGISTRAVIMO LENTELĖS PAVYZDYS
         
                     Bandymas Nr.:
                  
                  
                     Pradžios data:
                  
                  
                     Klonas:
                  
                  
                     Terpė:
                  
                  
                     Maisto tipas:
                  
                  
                     Bandomoji medžiaga:
                  
                  
                     Vardinė konc.:
                  
               
                     Para
                  
                  
                     0
                  
                  
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     3
                  
                  
                     4
                  
                  
                     5
                  
                  
                     6
                  
                  
                     7
                  
                  
                     8
                  
                  
                     9
                  
                  
                     10
                  
                  
                     11
                  
                  
                     12
                  
                  
                     13
                  
                  
                     14
                  
                  
                     15
                  
                  
                     16
                  
                  
                     17
                  
                  
                     18
                  
                  
                     19
                  
                  
                     20
                  
                  
                     21
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Terpės atnaujinimas (dėti varnelę)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     pH (37)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     naujos
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     senos
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 mg/l (37)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     naujos
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     senos
                  
                  
                      
                  
               
                     Temperatūra oC (37)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     naujos
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     senos
                  
                  
                      
                  
               
                     Duota maisto (dėti varnelę)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Niėra gyvų palikuonių (38)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Bendras
                  
               
                     1 indas
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     2
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     3
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     4
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     5
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     6
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     7
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     8
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     9
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     10
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Bendras
                  
                  
                      
                  
               
                     Bendras suaugusių gyvūnų gaištamumas (39)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
      
         4 priedėlis
         CHEMINĖS ANALIZĖS REZULTATŲ REGISTRAVIMO LENTELĖS PAVYZDYS
         (a)   Išmatuotos koncentracijos vertės
         
                     Vardinė konc.
                  
                  
                     1 savaitės bandinys
                  
                  
                     2 savaičių bandinys
                  
                  
                     3 savaičių bandinys
                  
               
                     Šviežias
                  
                  
                     Senas
                  
                  
                     Šviežias
                  
                  
                     Senas
                  
                  
                     Šviežias
                  
                  
                     Senas
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               (b)   Išmatuotos koncentracijos vertės, išreikštos vardinės koncentracijos procentine dalimi
         
                     Vardinė konc.
                  
                  
                     1 savaitės bandinys
                  
                  
                     2 savaičių bandinys
                  
                  
                     3 savaičių bandinys
                  
               
                     Šviežias
                  
                  
                     Senas
                  
                  
                     Šviežias
                  
                  
                     Senas
                  
                  
                     Šviežias
                  
                  
                     Senas
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
      
         5 priedėlis
         LAIKO SVORINIO VIDURKIO APSKAIČIAVIMAS
         Laiko svorinis vidurkis
         Darant prielaidą, kad bandomosios medžiagos koncentracija laikotarpy tarp terpės atnaujinimų gali mažėti, būtina nustatyti koncentracijos vertę, kuri atspindėtų motinines dafnijas veikiančios medžiagos koncentracijos verčių diapazoną. Pasirinkimas turi būti pagrįstas biologiniais ir statistiniais sumetimais. Pvz., jei manoma, kad reprodukciją labiausiai veikia didžiausia koncentracija, reikia naudoti didžiausios koncentracijos vertę. Tačiau jei svarbesniu laikomas kaupiamasis ar ilgalaikis toksiškos medžiagos poveikis, labiau tinka koncentracijos vidurkis. Šiuo atveju tinkamas naudoti vidurkis yra laiko svorinė vidutinė koncentracijos vertė, nes ją nustatant atsižvelgiama į momentinį koncentracijos kitimą laike.
         1 paveikslas
         Laiko svorinio vidurkio pavyzdys
         
            
         1 paveiksle pateiktas septynių parų trukmės (supaprastinto) bandymo pavyzdys, terpę atnaujinant 0, 2 ir 4 parą.
         
                      
                  
                  
                     Zigzagas rodo koncentracijos vertę bet kuriuo matavimo momentu. Daroma prielaida, kad koncentracijos mažėjimas atitinka irimo pagal eksponentę procesą.
                  
               
                      
                  
                  
                     Šeši pažymėti taškai rodo stebimas koncentracijų vertes, išmatuotas kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje.
                  
               
                      
                  
                  
                     Stora linija rodo laiko svorinio vidurkio padėtį.
                  
               Laiko svorinis vidurkis apskaičiuojamas taip, kad plotas po laiko svorinio vidurkio tiese yra lygus plotui po koncentracijos kitimo kreive. Pirmiau pateikto pavyzdžio apskaičiavimas parodytas 1 lentelėje.
         1 lentelė
         Laiko svorinio vidurkio apskaičiavimas
         
                     Atnaujinimas Nr.
                  
                  
                     Paros
                  
                  
                     Conc0
                  
                  
                     Conc1
                  
                  
                     Ln(Conc0)
                  
                  
                     Ln(Conc1)
                  
                  
                     Plotas
                  
               
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     10,000
                  
                  
                     4,493
                  
                  
                     2,303
                  
                  
                     1,503
                  
                  
                     13,767
                  
               
                     2
                  
                  
                     2
                  
                  
                     11,000
                  
                  
                     6,037
                  
                  
                     2,398
                  
                  
                     1,798
                  
                  
                     16,544
                  
               
                     3
                  
                  
                     3
                  
                  
                     10,000
                  
                  
                     4,066
                  
                  
                     2,303
                  
                  
                     1,403
                  
                  
                     19,781
                  
               
                     Bendras parų skaičius: 7
                  
                  
                     Bendras plotas
                  
                  
                     50,091
                  
               
                     LS vidurkis
                  
                  
                     7,156
                  
               
                     „Paros“ – atnaujinimo laikotarpio parų skaičius,
                     „Conc0“ – kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje išmatuota koncentracija,
                     „Conc1“ – kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pabaigoje išmatuota koncentracija,
                     „ln(Conc0)“ – Conc0 natūralusis logaritmas,
                     „ln(Conc1)“ – Conc1 natūralusis logaritmas,
                     „Plotas“ – plotas po eksponentės kreive kiekvienam atnaujinimo laikotarpiui. Jis apskaičiuojamas:
                     
                        
                  
               Laiko svorinis vidurkis („LS vidurkis“) yra „bendro ploto“ ir „bendro parų skaičiaus“ dalmuo.
         Savaime aišku, kad darant dafnijų reprodukcijos bandymą lentelė turėtų būti išplėsta iki 21 paros.
         Aišku, kad matuojant tik kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje neįmanoma patvirtinti, kad irimo procesas iš tikrųjų vyksta eksponentiškai. Kitokiai kreivei būtų gautas kitas „ploto“ apskaičiavimo rezultatas. Tačiau irimo pagal eksponentinę kreivę procesas nėra neįmanomas ir, kai nėra kitos informacijos, tai turbūt labiausiai naudoti tinkama kreivė.
         Tačiau reikia būti atsargiems, jei, atnaujinimo laikotarpio pabaigoje darant cheminę analizę, nerandama jokios medžiagos. Jei negalima įvertinti, kaip greitai medžiaga išnyko iš tirpalo, neįmanoma gauti tikrojo ploto po kreive, taigi neįmanoma gauti priimtiną laiko svorinį vidurkį.
      
      C.21.   DIRVOŽEMIO MIKROORGANIZMAI. AZOTO VIRSMO BANDYMAS
      1.   METODAS
      Šis bandymų metodas atitinka OECD TG 216 (2000).
      1.1   ĮVADAS
      Šiame bandymo metode aprašytas laboratorinis metodas, skirtas ilgalaikiam poveikiui azoto virsme dalyvaujančių dirvožemio mikroorganizmų aktyvumui tirti, kai chemine medžiaga paveikiama vieną kartą. Bandymas iš esmės pagrįstas Europos ir Viduržemio jūros augalų apsaugos organizacijos {European and Mediterranean Plant Protection Organization) rekomendacijomis (1). Tačiau buvo atsižvelgta į kitus nurodymus, įskaitant Vokietijos Biologische Bundesanstalt (2), JAV Aplinkos apsaugos agentūros (3) SETAC (4) ir Tarptautinės standartizacijos organizacijos (5) rekomendacijas. Belgirate, Italijoje, 1995 m. vykusiame OECD seminare dėl dirvožemių ir nuosėdinių uolienų atrankos (6) buvo susitarta dėl šiame bandyme naudojamų dirvožemių skaičiaus ir tipo. Dirvožemio ėminių ėmimo, tvarkymo ir laikymo rekomendacijos pagrįstos ISO vadovu (7) ir Belgirate seminaro rekomendacijomis. Įvertinant bandomųjų medžiagų toksiškumo charakteristikas, gali tekti nustatyti jų poveikį dirvožemio mikrobiniam aktyvumui, pvz., kai reikia turėti duomenų apie galimą šalutinį augalų apsaugos produktų poveikį dirvožemio mikroflorai arba kai tikimasi kitų nei augalų apsaugos produktai cheminių medžiagų poveikio dirvožemio mikroorganizmams. Azoto virsmo bandymas daromas siekiant nustatyti tokių cheminių medžiagų poveikį dirvožemio mikroflorai. Jei bandomos agrocheminės medžiagos (pvz., augalų apsaugos produktai, trąšos, miškininkystėje naudojamos cheminės medžiagos), daromi azoto virsmo ir anglies virsmo bandymai. Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, pakanka azoto virsmo bandymo. Tačiau jei darant tokių cheminių medžiagų azoto virsmo bandymą jų EB50 vertės patenka į intervalą, nustatytą prekyboje esantiems nitrifikacijos inhibitoriams (pvz., nitrapirinui), papildomai informacijai gauti gali būti daromas anglies v irsmo bandymas.
      Dirvožemį sudaro gyvieji ir negyvieji komponentai, esantys sudėtinuose ir heterogeniniuose mišiniuose. Mikroorganizmai vaidina svarbų vaidmenį vykstant derlingų dirvožemių organinių medžiagų skaidymui ir virsmui, kai didelis rūšių skaičius prisideda prie įvairių dirvožemio derlingumo aspektų. Visi ilgalaikiai tokių biocheminių procesų trukdžiai gali pažeisti mitybinių elementų ciklą, o tai gali pakeisti dirvožemio derlingumą. Anglies ir azoto virsmas vyksta visuose derlinguose dirvožemiuose. Nors už šiuos procesus atsakingos mikrobiologinės kolonijos įvairiuose dirvožemiuose yra skirtingos, virsmo keliai iš esmės yra tokie patys.
      Aprašytas bandymo metodas skirtas ilgalaikiam neigiamam medžiagos poveikiui azoto virsmui aerobiniuose paviršiniuose dirvožemiuose nustatyti. Be to, taikant šį bandymų metodą galima įvertinti medžiagų poveikį dirvožemio mikroflora sukeliamam anglies virsmui. Nutrūkus anglies ir azoto jungtims, vyksta nitratų susidarymas. Taigi jei nustatoma, kad apdorotame ir kontroliniame dirvožemyje nitratų susidarymo greitis yra vienodas, yra didelė tikimybė, kad pagrindiniai anglies skaidymo keliai yra nepaliesti ir funkcionuoja. Bandymui pasirinktas substratas (liucernos milteliai) turi palankų anglies ir azoto santykį (paprastai nuo 12/1 iki 16/1). Dėl šios priežasties anglies trukumas darant bandymą sumažėja ir jei cheminė medžiaga pažeistų mikrobiologines kolonijas, jos galėtų atsistatyti per 100 parų.
      Bandymai, naudoti šiam bandymo metodui parengti, iš pradžių buvo skirti medžiagoms, kurių kiekį, pasiekiantį dirvožemį, buvo galima numatyti. Taip pasitaiko, pvz., naudojant augalų apsaugos produktus, kurių laukuose barstomos medžiagos norma yra žinoma. Bandant agrochemines medžiagas, pakanka dviejų dozių, atitinkančių numatomą arba prognozuojamą naudojimo normą. Agrochemines medžiagas galima bandyti kaip veikliuosius ingredientus (a. i. – active ingredients) arba kaip preparatus. Tačiau bandymas neapsiriboja agrocheminėmis medžiagomis. Keičiant į dirvožemį dedamos bandomosios medžiagos kiekį ir duomenų įvertinimo būdą, bandymą dar galima naudoti cheminėms medžiagoms, kurių kiekis, tikėtinai patenkantis į dirvožemį, yra nežinomas. Taigi jei tai ne agrocheminės medžiagos, nustatomas medžiagos kelių koncentracijos verčių poveikis azoto virsmui. Šių bandymų duomenys yra naudojami dozės ir reakcijos santykio kreivei gauti ir EB× vertėms apskaičiuoti, kai x yra apibrėžiamas kaip poveikio %.
      1.2   APIBRĖŽTYS
      
         Azoto virsmas – azoto turinčios organinės medžiagos skaidymas mikroorganizmais iki atitinkamo galutinio produkto, neorganinio nitrato, vykstant amonifikacijos ir nitrifikacijos procesams.
      
         EBx (efektyvioji koncentracija) – bandomosios medžiagos koncentracija dirvožemyje, kai azoto virsmas į nitratą inhibuojamas x procentų.
      
         EB50 (medianinė efektyvioji koncentracija) – bandomosios medžiagos koncentracija dirvožemyje, kai azoto virsmas į nitratą inhibuojamas 50 procentų (50 %).
      1.3   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4   BANDYMO METODO ESMĖ
      Sijotas dirvožemis apdorojamas bandomąja medžiaga arba paliekamas neapdorotas (kontrolinis). Jei bandomos agrocheminės medžiagos, rekomenduojama naudoti mažiausiai dvi bandymo koncentracijas, kurios pasirenkamos pagal didžiausią lauke numatomą koncentraciją. Po 0, 7, 14 ir 28 inkubavimo parų apdoroti ir kontroliniai dirvožemio ėminiai ekstrahuojami atitinkamu tirpikliu ir ekstraktuose nustatomas nitrato kiekis. Lyginamas nitrato susidarymo greitis apdorotuose ir kontroliniuose ėminiuose ir apskaičiuojamas apdorotojo ėminio procentinis nuokrypis nuo kontrolinio ėminio. Visi bandymai daromi mažiausiai 28 paras. Jei 28 parą apdoroto ir neapdoroto dirvožemio skirtumas yra lygus arba didesnis kaip 25 %, matavimai tęsiami ne ilgiau kaip iki 100 parų. Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, į dirvožemio ėminius dedama kelių koncentracijos verčių bandomoji medžiaga, o susidariusio nitrato kiekis apdorotuose ir kontroliniuose ėminiuose matuojamas po 28 inkubavimo parų. Dauginių koncentracijos verčių bandymų rezultatai analizuojami taikant regresijos modelį ir apskaičiuojamos EB× vertės (t. y. EB50, EB25 ir (arba) EB10). Žr. apibrėžtis.
      1.5   BANDYMO TINKAMUMAS
      Bandymų su agrocheminėmis medžiagomis rezultatai pagrįsti palyginti mažu (t. y. vidutinė vertė ± 25 %) nitrato koncentracijos kontroliniame ir apdorotame dirvožemio ėminyje skirtumu, taigi didelė kontrolinių ėminių duomenų sklaida gali būti klaidingų rezultatų priežastimi. Todėl kartotinių kontrolinių ėminių rezultatai neturi skirtis daugiau kaip ±15 %.
      1.6   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.6.1   Aparatūra
      Naudojami bandymo indai, pagaminti iš chemiškai inertinės medžiagos. Jie turi būti reikiamos talpos atsižvelgiant į dirvožemio inkubavimui taikomą metodiką, t. y. viso vieno ėminio arba kelių atskirų dirvožemio dalinių ėminių inkubavimą (žr. 1.7.1.2 skirsnį). Reikia stengtis kiek įmanoma sumažinti vandens nuostolius, bet tuo pačiu užtikrinti dujų mainus darant bandymą (pvz., indai gali būti uždengiami polietileno plėvele su skylutėmis). Bandant lakiąsias medžiagas, reikia naudoti uždaromus ir sandarius dujoms indus. Jų dydis pasirenkamas taip, kad dirvožemio ėminys sudarytų maždaug vieną ketvirtąją indo tūrio.
      Naudojama tipinė laboratorinė įranga, įskaitant šią:
      
                  —
               
               
                  maišymo įtaisas: mechaninė purtyklė arba lygiavertė įranga,
               
            
                  —
               
               
                  centrifuga (3 000 g) arba filtravimo įtaisas (filtravimo popierius be nitratų),
               
            
                  —
               
               
                  atitinkamo jautrio ir atkuriamumo nitratų analizės prietaisas.
               
            1.6.2   Dirvožemių pasirinkimas ir skaičius
      Naudojamas vienos rūšies dirvožemis. Rekomenduojamas dirvožemis, kurio charakteristikos:
      
                  —
               
               
                  smėlio kiekis: ne mažesnis kaip 50 % ir ne didesnis kaip 75 %;
               
            
                  —
               
               
                  pH: 5,5-7,5;
               
            
                  —
               
               
                  organinės anglies kiekis: 0,5–1,5 %;
               
            
                  —
               
               
                  matuojama mikrobinė biomasė (8)(9) ir jos anglies kiekis turi sudaryti ne mažiau kaip 1 % suminės dirvožemio organinės anglies.
               
            Dirvožemis, kurio tokios charakteristikos, dažniausiai atitinka blogiausią atvejį, kadangi cheminės medžiagos absorbcija yra mažiausia, o mikrofloros galimybė jos gauti yra didžiausia. Taigi bandymų su kitais dirvožemiais paprastai nereikia daryti. Tačiau tam tikromis aplinkybėmis, pvz., jei medžiagą iš esmės numatoma naudoti konkrečiame dirvožemyje, pvz., rūgščiajame miško dirvožemyje, arba jei naudojamos elektrostatinį krūvį turinčios cheminės medžiagos, gali tekti naudoti papildomą dirvožemį.
      1.6.3   Dirvožemio ėminių rinkimas ir laikymas
      1.6.3.1   Rinkimas
      Reikia turėti išsamios informacijos apie lauko vietą, iš kurios imamas bandymo dirvožemis. Nurodoma tiksli padėtis, augalų danga, apdorojimo augalų apsaugos produktais datos, apdorojimas organinėmis ir neorganinėmis trąšomis, biologinių priedų dėjimas arba atsitiktiniai teršalai. Dirvožemio ėmimui pasirinkta vieta turėtų užtikrinti ilgalaikį naudojimą. Tinka nuolatinės ganyklos, laukai su kasmetiniais grūdiniais augalais (išskyrus kukurūzus) arba tankiai pasėtų žaliųjų trąšų laukai. Pasirinkta ėminio ėmimo vieta neturi būti apdorota augalų apsaugos produktais mažiausiai vienerius metus prieš ėminių ėmimą. Be to, mažiausiai šešis mėnesius neturi būti dedama organinių trąšų. Mineralines trąšas galima naudoti tik tuo atveju, jei to reikia pasėliams, o dirvožemio ėminiai imami ne anksčiau kaip trys mėnesiai po tręšimo. Reikia vengti naudoti dirvožemį, apdorotą trąšomis, turinčiomis žinomų biocidinių savybių (pvz., kalcio cianamidu).
      Reikia vengti imti ėminius esant ilgalaikiam (ilgiau kaip 30 parų) sausros arba potvynio laikotarpiui arba iš karto jam pasibaigus. Ariamų dirvožemių ėminiai imami iš 0-20 cm gylio. Pievose (ganyklose) arba kitame ilgą laiką (bent vieną auginimo sezoną) neariamuose dirvožemiuose didžiausias ėminio ėmimo gylis gali būti šiek tiek didesnis kaip 20 cm (pvz., iki 25 cm).
      Dirvožemio ėminiai vežami tokiuose induose ir esant tokioms temperatūros sąlygoms, kurios neleistų reikšmingai pakisti pradinėms dirvožemio savybėms.
      1.6.3.2   Laikymas
      Pageidautina naudoti neseniai lauke paimtus dirvožemius. Jei laikymo laboratorijoje neįmanoma išvengti, dirvožemis gali būti ne ilgiau kaip tris mėnesius laikomas tamsoje, esant 4 ± 2 oC. Lakant dirvožemius, turi būti užtikrintos aerobinės sąlygos. Jei dirvožemis imamas iš vietovių, kuriose jis būna įšalęs mažiausiai tris mėnesius per metus, jį galima laikyti šešis mėnesius, esant nuo - 18 oC iki - 22 oC. Laikomo dirvožemio mikrobinė biomasė matuojama prieš kiekvieną bandymą ir biomasės anglis turi sudaryti mažiausiai 1 % viso dirvožemio organinės anglies kiekio (žr. 1.6.2 skirsnį).
      1.6.4   Dirvožemio tvarkymas ir ruošimas bandymui
      1.6.4.1   Pradinis inkubavimas
      Jei dirvožemis buvo laikomas saugykloje (žr. 1.6.3.2 skirsnį), rekomenduojamas pradinis inkubavimas, kurio trukmė būtų nuo 2 iki 28 parų. Temperatūra ir dirvožemio drėgmės kiekis pradinio inkubavimo laikotarpiu turi atitikti bandymo sąlygas (žr. 1.6.4.2 ir 1.7.1.3 skirsnius)..
      1.6.4.2   Fizikocheminės charakteristikos
      Iš dirvožemio rankiniu būdu pašalinami dideli daiktai (pvz., akmenys, augalų dalys ir t. t.), tuomet drėgnas dirvožemis sijojamas iki 2 mm arba mažesnių dalelių, neleidžiant jam perdaug išdžiūti. Drėgmės kiekis dirvožemio ėminyje reguliuojamas distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu iki vertės, sudarančios 40–60 % didžiausios vandens sulaikymo gebos.
      1.6.4.3   Gerinimas pridedant organinio substrato
      Dirvožemį reikėtų pagerinti atitinkamu organiniu substratu, pvz., žaliosios liucernos masės milteliais (pagrindinis komponentas: Medicago sativa), kurių C/N santykis yra nuo 12/1 iki 16/1. Rekomenduojamas liucernos ir dirvožemio santykis yra 5 g liucernos vienam kilogramui dirvožemio (sausos medžiagos masės).
      1.6.5   Bandomosios medžiagos ruošimas įterpti į dirvožemį
      Bandomoji medžiaga paprastai įterpiama naudojant nešiklį. Nešikliu gali būti vanduo (vandenyje tirpių medžiagų) arba inertinė kietoji medžiaga, pvz., smulkus kvarcinis smėlis (dalelių dydis: 0,1–0,5 mm). Kitų nei vanduo skystųjų nešiklių (pvz., organinių tirpiklių, pvz., acetono, chloroformo) reikėtų vengti, kadangi jie gali pakenkti mikroflorai. Jei kaip nešiklis naudojamas smėlis, jo daleles galima padengti bandomąja medžiaga, ištirpinta arba suspenduota atitinkamame tirpiklyje. Tokiais atvejais prieš maišant su dirvožemiu tirpiklis išgarinamas. Siekiant optimaliai paskirstyti bandomąją medžiagą dirvožemyje, rekomenduojama naudoti 10 g smėlio vienam kilogramui dirvožemio (sausos medžiagos masės). Kontroliniai ėminiai apdorojami tik lygiaverčiu vandens ir (arba) kvarcinio smėlio kiekiu.
      Jei bandomos lakiosios chemines medžiagos, apdorojant reikia kiek įmanoma vengti nuostolių ir stengtis užtikrinti tolygų pasiskirstymą dirvožemyje (pvz., bandomąją medžiagą reikėtų įšvirkšti keliose dirvožemio vietose).
      1.6.6   Bandymo koncentracijos vertės
      Jei bandomos agrocheminės medžiagos, naudojamos mažiausiai dvejopa koncentracija. Mažesnė koncentracija turėtų rodyti bent didžiausią kiekį, kuris tikėtinai pasiektų dirvožemį praktinėmis sąlygomis, tuo tarpu didesnė koncentracija turėtų būti mažesnės koncentracijos kartotinis dydis. Į dirvožemį įterpiamos bandomosios medžiagos koncentracijos vertės apskaičiuojamos darant prielaidą apie tolygų įterpimą į 5 cm gylį ir dirvožemio santykinį tankį 1,5. Agrocheminių medžiagų, tiesiogiai įterpiamų į dirvožemį, arba cheminių medžiagų, kurių dirvožemį pasiekiantis kiekis gali būti numatytas, rekomenduojamos bandymo koncentracijos vertės yra didžiausia numatoma aplinkos koncentracija (Predicted Environmental Concentration - PEC) ir penkis kartus didesnė koncentracija. Medžiagos, kurias numatoma įterpti į dirvožemį kelis kartus per vieną sezoną, bandomos esant koncentracijos vertėms, gautoms PEC vertę padauginus iš didžiausio numatomo įterpimų skaičiaus. Tačiau viršutinė bandymo koncentracijos vertė neturi būti daugiau kaip dešimt kartų didesnė už didžiausią vienkartinio įterpimo normą. Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, naudojama mažiausiai penkių koncentracijos verčių eilė pagal geometrinę progresiją. Bandymo koncentracijos vertės turi atitikti intervalą, reikalingą EB× vertėms nustatyti.
      1.7   BANDYMO EIGA
      1.7.1   Veikimo sąlygos
      1.7.1.1   Apdorojami ir kontroliniai ėminiai
      Jei bandomos agrocheminės medžiagos, dirvožemis dalijamas į tris vienodos masės dalis. Dvi dalys maišomos su produkto turinčiu nešikliu, o trečioji maišoma su nešikliu be produkto (kontrolinis bandymas). Rekomenduojama paruošti mažiausiai tris kartotinius apdorotų dalių ir neapdorotos dalies dirvožemio ėminius. Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, dirvožemis dalijamas į šešias vienodos masės dalis. Penki ėminiai maišomi su bandomosios medžiagos turinčiu nešikliu, o šeštasis ėminys sumaišomas su nešikliu be cheminės medžiagos. Rekomenduojama paruošti bent tris apdorotų dirvožemio dalių ir neapdorotos dirvožemio dalies kartotinius ėminius. Reikia stengtis užtikrinti tolygų bandomosios medžiagos pasiskirstymą apdorotuose dirvožemio ėminiuose. Maišant reikėtų vengti dirvožemio sutankinimo ir grumstų susidarymo.
      1.7.1.2   Dirvožemio ėminių inkubavimas
      Dirvožemio ėminius galima inkubuoti dviem būdais: kaip vientisus kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio ėminius arba kaip seriją atskirų ir vienodo dydžio kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio mėginių. Tačiau bandant lakiąsias medžiagas bandymas daromas tik vienu būdu, naudojant atskirų mėginių seriją. Kai dirvožemis inkubuojamas kaip vientisas ėminys, ruošiamas didelis kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio kiekis ir prireikus imami jo mėginiai analizei darant bandymą. Kiekvienam apdorotam ir kontroliniam ėminiui iš pradžių paruoštas kiekis priklauso nuo mėginių dydžio, analizei naudojamų kartotinių mėginių skaičiaus ir nuo numatomo didžiausio mėginių ėmimo kartų skaičiaus. Dirvožemiai, inkubuojami kaip vientisas ėminys, prieš imant mėginius turi būti gerai sumaišomi. Kai dirvožemiai inkubuojami kaip serija atskirų dirvožemio mėginių, kiekvienas apdorotas ir neapdorotas vientisas dirvožemio ėminys dalijamas į reikiamą mėginių skaičių, kurie prireikus yra naudojami. Darant bandymus, kuriuose gali būti numatyta mėginius imti daugiau kaip du kartus, reikia paruošti pakankamą skaičių mėginių, kad būtų galima atsižvelgti į visus kartotinius mėginius ir mėginių ėmimo kartų skaičių. Mažiausiai trys bandymo dirvožemio kartotiniai ėminiai inkubuojami aerobinėmis sąlygomis (žr. 1.7.1.1 skirsnį). Darant visus bandymus turi būti naudojami atitinkami indai su pakankamo tūrio laisvąja erdve, kad būtų išvengta anaerobinių sąlygų. Kai bandomos lakiosios medžiagos, bandymas turi būti daromas naudojant seriją atskirų mėginių.
      1.7.1.3   Bandymo sąlygos ir trukmė
      Bandymas daromas tamsoje, esant 20 ± 2 oC temperatūrai. Drėgmės kiekis dirvožemio ėminiuose visą bandymo laiką turi būti palaikomas ± 5 % tikslumu ir turi sudaryti nuo 40 % iki 60 % dirvožemio didžiausios vandens sulaikymo gebos (žr. 1.6.4.2 skirsnį). Prireikus galima įpilti distiliuoto arba dejonizuoto vandens.
      Mažiausia bandymų trukmė – 28 dienos. Jei bandomos agrocheminės medžiagos, lyginamas nitratų susidarymo greitis apdorotuose ir kontroliniuose ėminiuose. Jei 28 parą jis skiriasi daugiau kaip 25 %, bandymas tęsiamas tol, kol gaunamas 25 % arba mažesnis skirtumas, bet ne ilgiau kaip 100 parų. Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, bandymas baigiamas po 28 parų. 28 parą nustatomas nitratų kiekis apdorotuose ir kontroliniuose dirvožemio ėminiuose ir apskaičiuojamos EBx vertės.
      1.7.2   Dirvožemių ėminių ėmimas ir analizė
      1.7.2.1   Dirvožemio ėminių ėmimo grafikas
      Jei bandomos agrocheminės medžiagos, dirvožemio ėminiai nitratui nustatyti analizuojami 0, 7, 14 ir 28 parą. Jei bandymą reikia tęsti, papildomi matavimai po 28 dienos daromi kas 14 parų.
      Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, naudojamos mažiausiai penkios bandymo koncentracijos vertės ir dirvožemio ėminiai nitratui nustatyti analizuojami prieš bandymo pradžią (0 parų) ir veikimo laikotarpiui pasibaigus (28 parą). Jei manoma, kad būtinas tarpinis matavimas, jį galima daryti, pvz., 7 parą. Duomenys, gauti 28 parą, naudojami cheminės medžiagos EB× vertei nustatyti. Jei pageidaujama, 0 dienos kontrolinių ėminių duomenys gali būti naudojami pradinei nitrato koncentracijai dirvožemyje pateikti.
      1.7.2.2   Dirvožemio ėminių analizė
      Kiekvieną kartą paėmus ėminius, nustatomas nitrato kiekis, kuris susidaro kiekviename apdorotame ir kontroliniame kartotiniame ėminyje. Nitratas ekstrahuojamas iš dirvožemio ėminius purtant atitinkamame ekstrahavimo tirpiklyje, pvz., 0,1 mol/l kalio chlorido tirpale. Rekomenduojamas santykis 5 ml KC1 tirpalo vienam gramui dirvožemio, skaičiuojant sauso dirvožemio masei. Ekstrahavimui optimizuoti, dirvožemio ir ekstrahavimo tirpalo tūris neturi būti didesnis kaip pusė indo tūrio. Mišiniai purtomi 60 min. esant 150 min-1 apsisukimų dažniui. Mišiniai centrifuguojami arba filtruojami ir skystoji fazė analizuojama nitratui nustatyti. Dalelių neturinčius skystuosius ekstraktus galima laikyti prieš analizę ne ilgiau kaip šešis mėnesius, esant - 20 ± 5 oC.
      2.   DUOMENYS
      2.1   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Jei bandomos agrocheminės medžiagos, užrašomas kiekviename kartotiniame dirvožemio ėminyje susidariusio nitrato kiekis ir visų kartotinių ėminių vidutinės vertės pateikiamos lentelėse. Azoto virsmo greitis įvertinamas taikant atitinkamus visuotinai priimtus statistinius metodus (pvz., F kriterijų, 5 % reikšmingumo lygmuo). Susidariusio nitrato kiekis išreiškiamas mg nitrato/kg sauso dirvožemio/parą. Nitrato susidarymo kiekviename apdorotame ėminyje greitis lyginamas su greičiu, gautu kontroliniam ėminiui, ir apskaičiuojama procentais išreikšta nuokrypio nuo kontrolinio ėminio vertė.
      Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, nustatomas kiekviename kartotiniame ėminyje susidariusio nitrato kiekis, ir EB× vertėms įvertinti braižoma dozės ir reakcijos santykio kreivė. Nitrato kiekis (t. y. mg nitrato/kg sauso dirvožemio), nustatytas apdorotuose ėminiuose po 28 parų, lyginamas su kontroliniuose ėminiuose nustatytu kiekiu. Pagal šiuos duomenis kiekvienai bandymo koncentracijai apskaičiuojamos inhibavimo % vertės. Šios procentinės vertės pateikiamos grafike kaip koncentracijos funkcija, ir EB× vertėms apskaičiuoti taikomos statistinės metodikos. Be to, taikant tipines metodikas (10) (11) (12), nustatomi apskaičiuotos EB× vertės pasikliautinieji rėžiai (p = 0,95).
      Didelį azoto kiekį turinčios bandomosios medžiagos gali prisidėti prie susidariusio nitrato kiekio padidėjimo darant bandymą. Jei šios medžiagos bandomos esant jų didelei koncentracijai (pvz., cheminės medžiagos, kurias numatoma naudoti dedant kelis kartus), į bandymo schemą turi būti įtraukti atitinkami kontroliniai ėminiai (t. y. dirvožemis su bandomąja medžiaga, bet be augalinių miltų). Į šių kontrolinių ėminių duomenis turi būti atsižvelgta apskaičiuojant EB× vertes.
      2.2   REZULTATŲ AIŠKINIMAS
      Jei vertinant agrocheminių medžiagų bandymų rezultatus, ėminyje, turinčiame mažesnę koncentraciją (t. y. didžiausią numatomą koncentraciją), ir kontroliniame ėminyje nitrato susidarymo greičio skirtumas yra lygus 25 % arba mažesnis bet kuriuo mėginio ėmimo metu po 28 paros, produktą galima įvertinti kaip nedarantį ilgalaikio poveikio azoto virsmui dirvožemiuose. Kai įvertinami kitų nei agrocheminės medžiagos cheminių medžiagų bandymo rezultatai, naudojamos EB50, EB25 ir (arba) EB10 vertės.
      3.   ATASKAITOS RENGIMAS
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
      
                   
               
               
                  Išsamus naudojamo dirvožemio identifikavimas, įskaitant:
                  
                              —
                           
                           
                              geografinę vietos nuorodą (platuma, ilguma),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              informacija apie vietos istoriją (t. y. augalinė danga, apdorojimas augalų apsaugos produktais, apdorojimas trąšomis, atsitiktiniai teršalai ir t. t.),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              naudojimo tipas (pvz., žemės ūkio paskirties žemė, miškas ir t.t.),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ėminio ėmimo gylis (cm),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              smėlio/dumblo/molio kiekis ( % sausos medžiagos masės),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pH vertė (vandenyje),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              organinės anglies kiekis ( % sausos medžiagos masės),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              azoto kiekis ( % sausos medžiagos masės),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pradinė nitrato koncentracija (mg nitrato/kg sausos medžiagos masės),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              jonų mainų talpa (mmol/kg),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mikrobinė biomasė, išreikšta suminio organinės anglies kiekio procentine dalimi,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodų, taikytų kiekvienam parametrui nustatyti, nuorodos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visa informacija apie dirvožemio ėminių ėmimą ir laikymą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie pradinį dirvožemio inkubavimą, jei daromas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              fizikinė būsena ir, jei tinka, fizikocheminės savybės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              cheminio identifikavimo duomenys, jei tinka, įskaitant struktūrinę formulę, grynumą (t. y. augalų apsaugos produktų atveju veikliojo ingrediento procentinę dalį), azoto kiekį.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Substratas:
                  
                              —
                           
                           
                              substrato šaltinis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sudėtis (t. y. liucernos miltai, žaliosios liucernos masės miltai),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              anglies, azoto kiekis ( % sausos medžiagos masės),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sieto akučių dydis (mm).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie dirvožemio gerinimą organiniu substratu,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              naudotų bandomosios medžiagos koncentracijos verčių skaičius ir, jei tinka, pasirinktų koncentracijos verčių pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie bandomosios medžiagos įterpimą į dirvožemį,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubavimo temperatūra,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              drėgmės kiekis dirvožemyje pradedant bandymą ir jį darant,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              taikytas dirvožemio inkubavimo metodas (t. y. kaip vientisas ėminys arba kaip keli mėginiai),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kartotinių ėminių skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ėminių ėmimo skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodas, taikomas nitratui iš dirvožemio ekstrahuoti.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              analizės metodika ir įranga, naudota nitratui analizuoti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lentelių duomenys, įskaitant atskiras ir vidutines nitrato analizės vertes,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              apdorotų ir kontrolinių kartotinių ėminių rezultatų nuokrypis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              apskaičiavimams daromų pataisų aiškinimai, jei tinka,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              procentais išreikštas nitrato susidarymo greičio nuokrypis kiekvieną kartą imant mėginį, arba, jei tinka, EB50 vertė esant 95 procentų pasikliautinajam rėžiui, kitos EBx vertės (t. y. EB25 arba EB10) ir pasikliautinieji rėžiai, dozės ir reakcijos santykio kreivės grafikas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinis rezultatų apdorojimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visa informacija ir stebėjimai, kurie padėtų aiškinti rezultatus.
                           
                        
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
               
            
                  2)
               
               
                  BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
               
            
                  3)
               
               
                  EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
               
            
                  4)
               
               
                  SET AC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.
               
            
                  5)
               
               
                  ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality – BiologicalMethods.
                  
               
            
                  6)
               
               
                  OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
               
            
                  7)
               
               
                  ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
               
            
                  8)
               
               
                  ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.
               
            
                  9)
               
               
                  ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
               
            
                  10)
               
               
                  Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
               
            
                  11)
               
               
                  Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
               
            
                  12)
               
               
                  Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.
               
            C.22.   DIRVOŽEMIO MIKROORGANIZMAI. ANGLIES VIRSMO BANDYMAS
      1.   METODAS
      Šis bandymų metodas atitinka OECD TG 217 (2000).
      1.1   ĮVADAS
      Šiame bandymo metode aprašytas laboratorinis metodas, skirtas ilgalaikiam poveikiui azoto virsme dalyvaujančių dirvožemio mikroorganizmų aktyvumui tirti, kai chemine medžiaga paveikiama vieną kartą. Bandymas iš esmės pagrįstas Europos ir Viduržemio jūros augalų apsaugos organizacijos rekomendacijomis (1). Tačiau buvo atsižvelgta į kitus nurodymus, įskaitant Vokietijos Biologische Bundesanstalt (2), JAV Aplinkos apsaugos agentūros (3) SET AC (4) rekomendacijas. Belgirate, Italijoje, 1995 m. vykusiame OECD seminare dėl dirvožemių ir nuosėdinių uolienų atrankos (5) buvo susitarta dėl šiame bandyme naudojamų dirvožemių skaičiaus ir tipo. Dirvožemio ėminių ėmimo, tvarkymo ir laikymo rekomendacijos pagrįstos ISO vadovu (6) ir Belgirate seminaro rekomendacijomis.
      Vertinant bandomųjų medžiagų toksiškumo charakteristikas, gali tekti nustatyti jų poveikį dirvožemio mikrobiniam aktyvumui, pvz., kai reikia turėti duomenų apie galimą šalutinį augalų apsaugos produktų poveikį dirvožemio mikroflorai arba kai tikimasi kitų nei augalų apsaugos produktai cheminių medžiagų poveikio dirvožemio mikroorganizmams. Anglies virsmo bandymas daromas siekiant nustatyti tokių cheminių medžiagų poveikį dirvožemio mikroflorai. Jei bandomos agrocheminės medžiagos (pvz., augalų apsaugos produktai, trąšos, miškininkystėje naudojamos cheminės medžiagos), daromi anglies ir azoto virsmo bandymai. Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, pakanka azoto virsmo bandymo. Tačiau jei darant tokių cheminių medžiagų azoto virsmo bandymą, jų EB50 vertės patenka į intervalą, nustatytą prekyboje esantiems nitrifikacijos inhibitoriams (pvz., nitrapirinui), papildomai informacijai gauti gali būti daromas anglies virsmo bandymas.
      Dirvožemį sudaro gyvieji ir negyvieji komponentai, esantys sudėtinuose ir heterogeniniuose mišiniuose. Mikroorganizmai vaidina svarbų vaidmenį vykstant derlingų dirvožemių organinių medžiagų skaidymui ir virsmui, kai didelis rūšių skaičius prisideda prie įvairių dirvožemio derlingumo aspektų. Visi ilgalaikiai tokių biocheminių procesų trukdžiai gali pažeisti mitybinių elementų ciklą, o tai gali pakeisti dirvožemio derlingumą. Anglies ir azoto virsmas vyksta visuose derlinguose dirvožemiuose. Nors už šiuos procesus atsakingos mikrobiologinės kolonijos įvairiuose dirvožemiuose yra skirtingos, virsmo keliai iš esmės yra tokie patys.
      Šis bandymo metodas skirtas nustatyti ilgalaikį neigiamą medžiagos poveikį anglies virsmui aerobiniuose paviršiniuose dirvožemiuose. Šis bandymas yra jautrus už anglies virsmą atsakingų mikrobinių kolonijų dydžio ir aktyvumo pokyčiams, kadangi darant šį bandymą, kolonijos patiria cheminio poveikio įtampą ir anglies badą. Naudojamas smėlėtas dirvožemis, turintis mažai organinių medžiagų. Šis dirvožemis apdorojamas bandomąja medžiaga ir inkubuojamas sąlygomis, kurios užtikrina greitą mikrobinę medžiagų apykaitą. Šiomis sąlygomis greitai išsenka lengvai iš dirvožemio įsisavinamos anglies šaltiniai. Tai sukelia anglies trūkumą, dėl kurio žūsta mikrobų ląstelės ir atsiranda neveiklumo būsena ir (arba) sporuliacija. Jei bandymas trunka ilgiau kaip 28 paras, galima išmatuoti šių reakcijų sumą (neapdoroto dirvožemio) kontroliniuose ėminiuose, kaip laipsnišką veikliosios mikrobinės biomasės, dalyvaujančios medžiagų apykaitoje, mažėjimą (7). Jei dirvožemyje su anglies trūkumu biomasė bandymo sąlygomis yra veikiama dirvožemyje esančios cheminės medžiagos, biomasės kiekis gali neatsistatyti iki kontroliniame ėminyje esančio kiekio. Todėl bet kuriuo bandymo metu bandomosios medžiagos sukelti trukdžiai dažnai tęsiasi iki bandymo pabaigos.
      Bandymai, naudoti šiam bandymo metodui parengti, iš pradžių buvo skirti medžiagoms, kurių kiekį, pasiekiantį dirvožemį, buvo galima numatyti. Taip pasitaiko, pvz., naudojant augalų apsaugos produktus, kurių laukuose barstomos medžiagos norma yra žinoma. Bandant agrochemines medžiagas, pakanka dviejų dozių, atitinkančių numatomą arba prognozuojamą naudojimo normą. Agrochemines medžiagas galima bandyti kaip veikliuosius ingredientus (a.i.) arba kaip preparatus. Tačiau bandymas neapsiriboja cheminėmis medžiagomis, turinčiomis prognozuojamas aplinkos koncentracijos vertes. Keičiant į dirvožemį dedamos bandomosios medžiagos kiekį ir duomenų įvertinimo būdą, bandymą dar galima naudoti cheminėms medžiagoms, kurių kiekis, tikėtinai patenkantis į dirvožemį, yra nežinomas. Taigi jei tai ne agrocheminės medžiagos, nustatomas medžiagos kelių koncentracijos verčių poveikis anglies virsmui. Šių bandymų duomenys yra naudojami dozės ir reakcijos santykio kreivei gauti ir EBx vertėms apskaičiuoti, kai x yra apibrėžiamas kaip poveikio %.
      1.2   APIBRĖŽTYS
      
         Anglies virsmas – organinės medžiagos skaidymas mikroorganizmais iki atitinkamo galutinio produkto, anglies dioksido.
      
         EB
         
            x
         
         (efektyvioji koncentracija) – bandomosios medžiagos koncentracija dirvožemyje, kai anglies virsmas į anglies dioksidą inhibuoj amas x procentų.
      
         EB
         
            50
         
         (medianinė efektyvioji koncentracija) – bandomosios medžiagos koncentracija dirvožemyje, kai anglies virsmas į anglies dioksidą inhibuojamas 50 procentų.
      1.3   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Nėra.
      1.4   BANDYMŲ METODO ESMĖ
      Sijotas dirvožemis apdorojamas bandomąja medžiaga arba paliekamas neapdorotas (kontrolinis). Jei bandomos agrocheminės medžiagos, rekomenduojama naudoti mažiausiai dvejopą bandymo koncentraciją, kuri pasirenkama pagal didžiausią lauke numatomą koncentraciją. Po 0, 7, 14 ir 28 inkubavimo parų apdoroti ir kontroliniai dirvožemio ėminiai maišomi su gliukoze ir 12 h nepertraukiamai matuojamas gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis. Kvėpavimo greitis yra išreiškiamas kaip išsiskyrusio anglies dioksido (mg anglies dioksido/kg sauso dirvožemio/h) arba suvartoto deguonies (mg deguonies/kg dirvožemio/h) kiekis. Vidutinis kvėpavimo greitis apdorotame dirvožemyje lyginamas su kvėpavimo greičiu kontroliniame ėminyje ir apskaičiuojamas apdorotojo ėminio procentinis nuokrypis nuo kontrolinio ėminio. Visi bandymai daromi mažiausiai 28 paras. Jei 28 parą apdoroto ir neapdoroto dirvožemio skirtumas yra lygus arba didesnis kaip 25 %, matavimai tęsiami kas 14 parų ne daugiau kaip iki 100 parų. Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, į dirvožemio ėminius dedama kelių koncentracijos verčių bandomoji medžiaga, ir po 28 parų matuojamas gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis (t. y. susidariusio anglies dioksido arba suvartoto deguonies vidutinis kiekis). Koncentracijos verčių serijos bandymų rezultatai analizuojami taikant regresijos modelį ir apskaičiuojamos EBx vertės (t. y. EB50, EB25 ir (arba) EB10). Žr. apibrėžtis.
      1.5   BANDYMO TINKAMUMAS
      Bandymų su agrocheminėmis medžiagomis rezultatai pagrįsti palyginti mažu (t. y. vidutinė vertė ± 25 %) išsiskyrusio anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekio kontroliniame ir apdorotame dirvožemio ėminyje skirtumu, taigi didelė kontrolinių ėminių duomenų sklaida gali būti klaidingų rezultatų priežastimi. Todėl kartotinių kontrolinių ėminių rezultatų skirtumas turi būti mažesnis kaip ± 15 %.
      1.6   BANDYMŲ METODO APRAŠYMAS
      1.6.1   Aparatūra
      Naudojami bandymo indai, pagaminti iš chemiškai inertinės medžiagos. Jie turi būti reikiamos talpos atsižvelgiant į dirvožemių inkubavimui taikomą metodiką, t. y. viso vieno ėminio arba kelių atskirų dirvožemio dalinių ėminių inkubavimą (žr. 1.7.1.2 skirsnį). Reikia stengtis kiek įmanoma sumažinti vandens nuostolius, bet tuo pačiu užtikrinti dujų mainus darant bandymą (pvz., indai gali būti uždengiami polietileno plėvele su skylutėmis). Bandant lakiąsias medžiagas, reikia naudoti uždaromus ir sandarius dujoms indus. Jų dydis pasirenkamas taip, kad dirvožemio ėminys sudarytų maždaug vieną ketvirtąją indo tūrio.
      Gliukozės sukeliamam kvėpavimui nustatyti reikia turėti inkubavimo sistemas ir prietaisus anglies dioksido susidarymui arba deguonies suvartojimui matuoti. Tokių sistemų pavyzdžiai ir prietaisai aprašyti literatūroje (8) (9) (10) (11).
      1.6.2   Dirvožemių pasirinkimas ir skaičius
      Naudojamas vienos rūšies dirvožemis. Rekomenduojamas dirvožemis, kurio charakteristikos:
      
                  —
               
               
                  smėlio kiekis: ne mažesnis kaip 50 % ir ne didesnis kaip 75 %,
               
            
                  —
               
               
                  pH: 5,5-7,5,
               
            
                  —
               
               
                  organinės anglies kiekis: 0,5-1,5 %,
               
            
                  —
               
               
                  matuojama mikrobinė biomasė (12)(13) ir jos anglies kiekis turi sudaryti ne mažiau kaip 1 % suminės dirvožemio organinės anglies.
               
            Dirvožemis, kurio tokios charakteristikos, dažniausiai atitinka blogiausią atvejį, kadangi cheminės medžiagos absorbcija yra mažiausia, o mikrofloros galimybė jos gauti yra didžiausia. Taigi bandymų su kitais dirvožemiais paprastai nereikia daryti. Tačiau tam tikromis aplinkybėmis, pvz., jei medžiagą iš esmės numatoma naudoti konkrečiame dirvožemyje, pvz., rūgščiajame miško dirvožemyje, arba naudojamos elektrostatinį krūvį turinčios cheminės medžiagos, gali tekti naudoti papildomą dirvožemį.
      1.6.3   Dirvožemio ėminių rinkimas ir laikymas
      1.6.3.1   Rinkimas
      Reikia turėti išsamios informacijos apie lauko vietą, iš kurios imamas bandymo dirvožemis. Nurodoma tiksli padėtis, augalų danga, apdorojimo augalų apsaugos produktais datos, apdorojimas organinėmis ir neorganinėmis trąšomis, biologinių priedų dėjimas arba atsitiktiniai teršalai. Dirvožemio ėmimui pasirinkta vieta turėtų užtikrinti ilgalaikį naudojimą. Tinka nuolatinės ganyklos, laukai su kasmetiniais grūdiniais augalais (išskyrus kukurūzus) arba tankiai pasėtų žaliųjų trąšų laukai. Pasirinkta ėminio ėmimo vieta neturi būti apdorojama augalų apsaugos produktais mažiausiai vienerius metus iki ėminių ėmimą. Be to, mažiausiai šešis mėnesius neturėjo būti dedama organinių trąšų. Mineralines trąšas galima naudoti tik tuo atveju, jei to reikia pasėliams, o dirvožemio ėminiai imami ne anksčiau kaip trys mėnesiai po tręšimo. Reikia vengti naudoti dirvožemį, apdorotą trąšomis, turinčiomis žinomų biocidinių savybių (pvz., kalcio cianamidas).
      Reikia vengti imti ėminius esant ilgalaikiam (ilgiau kaip 30 parų) sausros arba potvynio laikotarpiui arba iš karto jam pasibaigus. Ariamų dirvožemių ėminiai imami iš 0-20 cm gylio. Pievose (ganyklose) arba kituose ilgą laiką (bent vieną auginimo sezoną) neariamuose dirvožemiuose didžiausias ėminio ėmimo gylis gali būti šiek tiek didesnis kaip 20 cm (pvz., iki 25 cm). Dirvožemio ėminiai vežami tokiuose induose ir esant tokioms temperatūros sąlygoms, kurios neleistų reikšmingai pakisti pradinėms dirvožemio savybėms.
      1.6.3.2   Laikymas
      Pageidautina naudoti neseniai lauke paimtus dirvožemius. Jei laikymo laboratorijoje neįmanoma išvengti, dirvožemiai gali būti ne ilgiau kaip tris mėnesius laikomi tamsoje, esant 4 ± 2 oC. Laikant dirvožemį, turi būti užtikrintos aerobinės sąlygos. Jei dirvožemis imamas iš vietovių, kuriose jis būna įšalęs mažiausiai tris mėnesius per metus, jį galima laikyti šešis mėnesius, esant nuo – 18 oC iki – 22 oC. Laikomo dirvožemio mikrobinė biomasė matuojama prieš kiekvieną bandymą ir biomasės anglis turi sudaryti mažiausiai 1 % viso dirvožemio organinės anglies kiekio (žr. 1.6.2 skirsnį).
      1.6.4   Dirvožemio tvarkymas ir ruošimas bandymui
      1.6.4.1   Pradinis inkubavimas
      Jei dirvožemis buvo laikomas saugykloje (žr. 1.6.4.2 ir 1.7.1.3 skirsnius), rekomenduojama daryti pradinį inkubavimą, kurio trukmė būtų nuo 2 iki 28 parų. Temperatūra ir dirvožemio drėgmės kiekis pradinio inkubavimo laikotarpiu turi atitikti bandymo sąlygas (žr. 1.6.4.2 ir 1.7.1.3 skirsnius).
      1.6.4.2   Fizikocheminės charakteristikos
      Iš dirvožemio rankiniu būdu pašalinami dideli daiktai (pvz., akmenys, augalų dalys ir t. t.), tuomet drėgnas dirvožemis sijojamas iki 2 mm arba mažesnių dalelių. Drėgmės kiekis dirvožemio ėminyje reguliuojamas distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu iki vertės, sudarančios 40–60 % didžiausios vandens sulaikymo gebos.
      1.6.5   Bandomosios medžiagos ruošimas įterpti į dirvožemį
      Bandomoji medžiaga paprastai įterpiama naudojant nešiklį. Kaip nešiklis gali būti naudojamas vanduo (vandenyje tirpių medžiagų) arba inertinė kietoji medžiaga, pvz., smulkus kvarcinis smėlis (dalelių dydis: 0,1-0,5 mm). Kitų nei vanduo skystųjų nešiklių (pvz., organinių tirpiklių, pvz., acetono, chloroformo) reikėtų vengti, kadangi jie gali kenkti mikroflorai. Jei kaip nešiklis naudojamas smėlis, jo daleles galima padengti bandomąja medžiaga, ištirpinta arba suspenduota atitinkamame tirpiklyje. Tokiais atvejais prieš maišant su dirvožemiu tirpiklis išgarinamas. Siekiant optimaliai paskirstyti bandomąją medžiagą dirvožemyje, rekomenduojama naudoti 10 g smėlio vienam kilogramui dirvožemio (sausos medžiagos masės). Kontroliniai ėminiai apdorojami tik lygiaverčiu vandens ir (arba) kvarcinio smėlio kiekiu.
      Jei bandomos lakiosios cheminės medžiagos, apdorojant reikia kiek įmanoma vengti nuostolių ir stengtis užtikrinti tolygų pasiskirstymą dirvožemyje (pvz., bandomąją medžiagą reikėtų įšvirkšti keliose dirvožemio vietose).
      1.6.6   Bandymo koncentracijos vertės
      Jei bandomi augalų apsaugos produktai arba kitos numatomos aplinkos koncentracijos medžiagos, turi būti bandoma mažiausiai dvejopa koncentracija. Mažesnė koncentracija turėtų rodyti bent didžiausią kiekį, kuris tikėtinai pasiektų dirvožemį praktinėmis sąlygomis, tuo tarpu didesnė koncentracija turėtų būti mažesnės koncentracijos kartotinis dydis. Į dirvožemį įterpiamos bandomosios medžiagos koncentracijos vertės apskaičiuojamos darant prielaidą apie tolygų įterpimą į 5 cm gylį ir dirvožemio santykinį tankį 1,5. Agrocheminių medžiagų, tiesiogiai įterpiamų į dirvožemį, arba cheminių medžiagų, kurių dirvožemį pasiekiantis kiekis gali būti numatytas, rekomenduojamos bandymo koncentracijos vertės yra didžiausia numatoma aplinkos koncentracija (PredictedEnvironmental Concentration – PEC) ir penkis kartus didesnė koncentracija. Medžiagos, kurias numatoma įterpti į dirvožemį kelis kartus per vieną sezoną, bandomos esant koncentracijos vertėms, gautoms PEC vertę padauginus iš didžiausio numatomo įterpimų skaičiaus. Tačiau viršutinė bandymo koncentracijos vertė neturi būti daugiau kaip dešimt kartų didesnė už didžiausią vienkartinio įterpimo normą.
      Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, naudojama mažiausiai penkių koncentracijos verčių eilė pagal geometrinę progresiją. Bandymo koncentracijos vertės turi atitikti intervalą, reikalingą EBx vertėms nustatyti.
      1.7   BANDYMO EIGA
      1.7.1   Veikimo sąlygos
      1.7.1.1   Apdorojami ir kontroliniai ėminiai
      Jei bandomos agrocheminės medžiagos, dirvožemis dalijamas į tris vienodos masės dalis. Dvi dalys maišomos su produkto turinčiu nešikliu, o trečioji maišoma su nešikliu be produkto (kontrolinis bandymas). Rekomenduojama paruošti mažiausiai tris kartotinius apdorotų dalių ir neapdorotos dalies dirvožemio ėminius. Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, dirvožemis dalijamas į šešias vienodos masės dalis. Penki ėminiai maišomi su bandomosios medžiagos turinčiu nešikliu, o šeštasis ėminys sumaišomas su nešikliu be cheminės medžiagos. Rekomenduojama paruošti mažiausiai tris apdorotų dirvožemio dalių ir neapdorotos dirvožemio dalies kartotinius ėminius. Reikia stengtis užtikrinti tolygų bandomosios medžiagos pasiskirstymą apdorotuose dirvožemio ėminiuose. Maišant reikėtų vengti dirvožemio sutankinimo ir grumstų susidarymo.
      1.7.1.2   Dirvožemio ėminių inkubavimas
      Dirvožemio ėminius galima inkubuoti dviem būdais: kaip vientisus kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio ėminius arba kaip seriją atskirų ir vienodo dydžio kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio mėginių. Tačiau bandant lakiąsias medžiagas, bandymas daromas tik vienu būdu, naudojant atskirų mėginių seriją. Kai dirvožemis inkubuojamas kaip vientisas ėminys, ruošiamas didelis kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio ėminio kiekis ir prireikus imami jo mėginiai analizei darant bandymą. Kiekvienam apdorojimui ir kontroliniams ėminiams iš pradžių paruoštas kiekis priklauso nuo mėginių dydžio, analizei naudojamų kartotinių mėginių skaičiaus ir nuo numatomo didžiausio mėginių ėmimo kartų skaičiaus. Dirvožemis, inkubuojamas kaip vientisas ėminys, prieš imant mėginius turi būti gerai sumaišomas. Kai dirvožemis inkubuojamas kaip serija atskirų dirvožemio mėginių, kiekvienas apdorotas ir neapdorotas vientisas dirvožemio ėminys dalijamas į reikiamą mėginių skaičių, kurie prireikus yra naudojami. Darant bandymus, kuriuose gali būti numatyta mėginius imti daugiau kaip du kartus, reikia paruošti pakankamą skaičių mėginių, kad būtų galima atsižvelgti į visus kartotinius mėginius ir mėginių ėmimo kartų skaičių. Mažiausiai trys bandymo dirvožemio kartotiniai ėminiai inkubuojami aerobinėmis sąlygomis (žr. 1.7.1.1 skirsnį). Darant visus bandymus turi būti naudojami atitinkami indai su pakankamo tūrio laisvąja erdve, kad būtų išvengta anaerobinių sąlygų. Kai bandomos lakiosios medžiagos, bandymas turi būti daromas naudojant seriją atskirų mėginių.
      1.7.1.3   Bandymo sąlygos ir trukmė
      Bandymas daromas tamsoje, esant 20 ± 2 oC temperatūrai. Drėgmės kiekis dirvožemio ėminiuose visą bandymo laiką turi būti palaikomas ± 5 % tikslumu ir turi sudaryti nuo 40 % iki 60 % dirvožemio didžiausios vandens sulaikymo gebos (žr. 1.6.4.2 skirsnį). Prireikus galima įpilti distiliuoto arba dejonizuoto vandens.
      Mažiausia bandymų trukmė – 28 dienos. Jei bandomos agrocheminės medžiagos, lyginami išsiskyrusio anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekiai apdorotuose ir kontroliniuose ėminiuose. Jei 28 parą jie skiriasi daugiau kaip 25 %, bandymas tęsiamas tol, kol gaunamas 25 % arba mažesnis skirtumas, bet ne ilgiau kaip 100 parų. Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, bandymas baigiamas po 28 parų. 28 parą nustatomas išsiskyrusio anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis apdorotuose ir kontroliniuose dirvožemio ėminiuose ir apskaičiuojamos EBx vertės.
      1.7.2   Dirvožemių ėminių ėmimas ir analizė
      1.7.2.1   Dirvožemio ėminių ėmimo grafikas
      Jei bandomos agrocheminės medžiagos, dirvožemio ėminiai gliukozės sukeliamo kvėpavimo greičiui nustatyti analizuojami 0, 7, 14 ir 28 parą. Jei bandymą reikia tęsti, papildomi matavimai po 28 paros daromi kas 14 parų.
      Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, naudojamos mažiausiai penkios bandymo koncentracijos vertės ir dirvožemio ėminiai gliukozės sukeliamo kvėpavimo greičiui nustatyti analizuojami prieš bandymo pradžią (0 parų) ir veikimo laikotarpiui pasibaigus (28 parą). Jei manoma, kad būtinas tarpinis matavimas, jį galima daryti, pvz., 7 parą. Duomenys, gauti 28 parą, naudojami cheminės medžiagos EBx vertei nustatyti. Jei pageidaujama, 0 dienos kontrolinių ėminių duomenys gali būti naudojami pradiniam veikliosios mikrobinės biomasės, dalyvaujančios medžiagų apykaitoje, kiekiui dirvožemyje įvertinti (12).
      1.7.2.2   Gliukozės sukeliamo kvėpavimo greičio matavimas
      Gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis kiekviename apdorotame ir kontroliniame kartotiniame ėminyje nustatomas kiekvieną kartą paėmus mėginius. Dirvožemio mėginiai maišomi su pakankamu gliukozės kiekiu didžiausiai betarpiškai kvėpavimo reakcijai nustatyti. Gliukozės kiekis, reikalingas konkretaus dirvožemio didžiausiai kvėpavimo reakcijai nustatyti, gali būti įvertintas, darant pradinį bandymą su keliomis gliukozės koncentracijos vertėmis (14). Tačiau smėlio dirvožemiui, turinčiam 0,5–1,5 % organinės anglies, paprastai pakanka 2 000–4 000 mg gliukozės vienam kg sauso dirvožemio. Gliukozę galima sumalti į miltelius su švariu kvarciniu smėliu (10 g smėlio/kg sauso dirvožemio) ir paruošti vienalytį mišinį su dirvožemiu.
      Gliukoze pagerinto dirvožemio ėminiai inkubuojami tinkamame aparate kvėpavimo greičiui matuoti nepertraukiamai, kas valandą arba kas dvi valandas (žr. 1.6.1 skirsnį), esant 20 ± 2 oC. Išsiskyrusio anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis matuojamas 12 h iš eilės, matavimus pradedant kiek įmanoma anksčiau, t. y. 1–2 h po gliukozės pridėjimo. Išmatuojamas suminis per 12 h išsiskyrusio anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis ir nustatomas vidutinis kvėpavimo greitis.
      2.   DUOMENYS
      2.1   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Jei bandomos agrocheminės medžiagos, užrašomas kiekviename kartotiniame dirvožemio ėminyje susidariusio anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis ir visų kartotinių ėminių vidutinės vertės pateikiamos lentelėse. Rezultatai įvertinami taikant atitinkamus visuotinai priimtus statistinius metodus (pvz., F kriterijų, 5 % reikšmingumo lygmuo). Gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis išreiškiamas mg anglies dioksido/kg sauso dirvožemio/h. Vidutinis anglies dioksido išsiskyrimo arba deguonies suvartojimo greitis kiekviename apdorotame ėminyje lyginamas su greičiu, gautu kontroliniam ėminiui, ir apskaičiuojama procentais išreikšta nuokrypio nuo kontrolinio ėminio vertė.
      Jei bandomos ne agrocheminės medžiagos, nustatomas kiekviename kartotiniame ėminyje išsiskyrusio anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis, ir EBx vertėms įvertinti braižoma dozės ir reakcijos santykio kreivė. Gliukozės sukeliamas kvėpavimo greitis (t. y. mg anglies dioksido arba mg deguonies/kg sauso dirvožemio/h), nustatytas apdorotuose ėminiuose po 28 parų, lyginamas su kontroliniams ėminiams nustatytu greičiu. Pagal šiuos duomenis kiekvienai bandymo koncentracijai apskaičiuojamos inhibavimo % vertės. Šios procentinės vertės pateikiamos grafike kaip koncentracijos funkcija, o EBx vertėms apskaičiuoti taikomos statistinės metodikos. Be to, taikant tipines metodikas (15) (16) (17), nustatomi apskaičiuotos EBx vertės pasikliautinieji rėžiai (p = 0,95).
      2.2   REZULTATŲ AIŠKINIMAS
      Jei vertinant agrocheminių medžiagų bandymų rezultatus, ėminyje, turinčiame mažesnę koncentraciją (t. y. didžiausią numatomą koncentraciją), bei kontroliniame ėminyje kvėpavimo greičio skirtumas bet kuriuo mėginio ėmimo metu po 28 paros yra lygus 25 % arba mažesnis, produktą galima įvertinti kaip nedarantį ilgalaikio poveikio anglies virsmui dirvožemiuose. Kai įvertinami kitų nei agrocheminės medžiagos cheminių medžiagų bandymo rezultatai, naudojamos EB50, EB25 ir (arba) EB10 vertės.
      3.   ATASKAITOS RENGIMAS
      BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
      
                   
               
               
                  Išsamus naudojamo dirvožemio identifikavimas, įskaitant:
                  
                              —
                           
                           
                              geografinę vietos nuorodą (platuma, ilguma),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              informaciją apie vietos istoriją (t. y. augalinė danga, apdorojimas augalų apsaugos produktais, apdorojimas trąšomis, atsitiktiniai teršalai ir t. t.),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              naudojimo tipą (pvz., žemės ūkio paskirties žemė, miškas ir t.t.),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ėminio ėmimo gylį (cm),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              smėlio/dumblo/molio kiekį ( % sausos medžiagos masės),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pH vertę (vandenyje),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              organinės anglies kiekį ( % sausos medžiagos masės),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              azoto kiekį ( % sausos medžiagos masės),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              jonų mainų talpą (mmol/kg),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pradinę mikrobinę biomasę, išreikštą suminio organinės anglies kiekio procentine dalimi,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodų, taikytų kiekvienam parametrui nustatyti, nuorodas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visą informaciją apie dirvožemio ėminių ėmimą ir laikymą,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visą informacij ą apie pradinio dirvožemio inkubavimą, jei daromas.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              fizikinė būsena ir, jei tinka, fizikocheminės savybės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              cheminio identifikavimo duomenys, jei tinka, įskaitant struktūrinę formulę, grynumą (t. y. augalų apsaugos produktų atveju veikliojo ingrediento procentinę dalį), azoto kiekį.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie dirvožemio gerinimą organiniu substratu,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              naudotų bandomosios medžiagos koncentracijos verčių skaičius ir, jei tinka, pasirinktų koncentracijos verčių pagrindimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsami informacija apie bandomosios medžiagos įterpimą į dirvožemį,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubavimo temperatūra,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              drėgmės kiekis dirvožemyje pradedant bandymą ir jį darant,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              taikytas dirvožemio inkubavimo metodas (t. y. kaip vientisas ėminys arba kaip eilė mėginių),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kartotinių ėminių skaičius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ėmimo skaičius.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              metodas ir įranga kvėpavimo greičiui matuoti,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lentelių duomenys, įskaitant atskiras ir vidutines anglies dioksido arba deguonies vertes,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              apdorotų ir kontrolinių kartotinių ėminių rezultatų nuokrypis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              apskaičiavimams daromų pataisų aiškinimai, jei tinka,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              procentais išreikštas gliukozės sukeliamo kvėpavimo greičio nuokrypis kiekvieną kartą imant mėginį, arba, jei tinka, EB50 vertė esant 95 procentų pasikliautinajam rėžiui, kitos EBx vertės (t. y. EB25 arba EB 10) ir pasikliautinieji rėžiai, dozės ir reakcijos santykio kreivės grafikas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statistinis rezultatų apdorojimas, jei tinka,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visa informacija ir stebėjimai, kurie padėtų aiškinti rezultatus.
                           
                        
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
               
            
                  2)
               
               
                  BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Pl ant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
               
            
                  3)
               
               
                  EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
               
            
                  4)
               
               
                  SET AC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.
               
            
                  5)
               
               
                  OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
               
            
                  6)
               
               
                  ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
               
            
                  7)
               
               
                  Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflora“. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.
               
            
                  8)
               
               
                  Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties“. Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831- 871.
               
            
                  9)
               
               
                  ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.
               
            
                  10)
               
               
                  ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
               
            
                  11)
               
               
                  Heinemeye, r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
               
            
                  12)
               
               
                  ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.
               
            
                  13)
               
               
                  ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
               
            
                  14)
               
               
                  Malkomes, H.-P. (1986). Einfluβ von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenūber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120.
               
            
                  15)
               
               
                  Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Then, 96, 99-113.
               
            
                  16)
               
               
                  Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
               
            
                  17)
               
               
                  Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.
               
            C.23.   AEROBINIS IR ANAEROBINIS VIRSMAS DIRVOŽEMYJE
      1.   METODAS
      Šis bandymų metodas atitinka OECD TG 307 (2002)
      1.1   ĮVADAS
      Šis bandymų metodas pagrįstas esamomis rekomendacijomis (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Šiame bandymų metode aprašytas metodas skirtas cheminių medžiagų aerobiniam ir anaerobiniam virsmui dirvožemyje įvertinti. Bandymai yra daromi siekiant nustatyti: i) bandomosios medžiagos virsmo greitį ir ii) virsmo produktų, kurie gali veikti augalus bei dirvožemio organizmus, tipą ir susidarymo bei išnykimo greitį. Taip turi būti tiriamos cheminės medžiagos, kurios tiesiogiai įterpiamos į dirvožemį arba kurios gali pasiekti dirvožemio aplinką. Be to, tokių laboratorinių tyrimų rezultatai gali būti naudojami atitinkamų lauko tyrimų ėminių ėmimo ir analizės protokolams kurti.
      Aerobinių ir anaerobinių tyrimų vieno tipo dirvožemiui paprastai pakanka virsmo keliams vertinti (8) (10) (11). Virsmo greitis turėtų būti įvertinamas bent trims papildomiems dirvožemio tipams (8) (10).
      Belgirate, Italijoje, 1995 m. vykusiame OECD seminare dėl dirvožemių ir nuosėdinių uolienų atrankos (10) buvo konkrečiai sutarta dėl šiame bandyme naudojamų dirvožemių skaičiaus ir tipo. Bandomų dirvožemių tipas turėtų atitikti aplinkos sąlygas, kuriose medžiaga bus naudojama arba išmetama. Pvz., cheminės medžiagos, kurios gali būti išmetamos subtropinio arba tropinio klimato sąlygomis, turėtų būti bandomos Ferrasol arba Nitosol tipo dirvožemiuose (Maisto ir žemės ūkio organizacijos sistema) (FAO sistema). Be to, seminare buvo pateiktos dirvožemio ėminių ėmimo, tvarkymo ir laikymo rekomendacijos, pagrįstos ISO vadovu (15). Be to, šiame metode nagrinėjami ryžių laukų dirvožemiai.
      1.2   APIBRĖŽTYS
      
         Bandomoji medžiaga – bet kuri medžiaga (tai gali būti pradinis junginys arba medžiagos virsmo produktai).
      
         Virsmo produktai – visos medžiagos, susidarančios vykstant bandomosios medžiagos biotinio arba abiotinio virsmo reakcijoms, įskaitant CO2 ir surištuosius likučius.
      
         Surištieji likučiai – dirvožemyje, augale arba gyvūne esantys junginiai, kurie po ekstrahavimo lieka matricoje pradinės medžiagos arba jos metabolito (-ų) ar virsmo produktų pavidalu. Ekstrahavimo metodas iš esmės turi nekeisti pačių junginių arba matricos struktūros. Ryšio prigimtį galima iš dalies išaiškinti, taikant matricą keičiančius ekstrahavimo metodus ir sudėtingus analizės metodus. Pvz., tokiu būdu šiandien yra identifikuotos kovalentinės, joninės ir sorbcinio tipo jungtys, be to, pagautieji junginiai. Apskritai, surištųjų likučių susidarymas labai mažina biologinį įsisavinamumą ir biologinį kaupimąsi (12) [modifikuotas IUPAC 1984 (13) apibrėžimas].
      
         Aerobinis virsmas – reakcijos, vykstančios esant molekuliniam deguoniui (14).
      
         Anaerobinis virsmas – reakcijos, vykstančios nesant molekulinio deguonies (14).
      
         Dirvožemis – mineralinių ir organinių cheminių sudedamųjų dalių mišinys, kuriame organinius komponentus sudaro didelį anglies ir azoto kiekį turintys ir didelės molekulinės masės junginiai ir kurio gyvieji organizmai yra maži (daugiausia mikro-) organizmai. Galima apdoroti dviejų būsenų dirvožemį:
      
                  a)
               
               
                  nepaliestą, koks susidaro per laiką, esantį tipiškuose įvairių dirvožemio tipų sluoksniuose;
               
            
                  b)
               
               
                  paliestą, koks jis paprastai yra ariamuose laukuose arba koks jis imamas kasant ir panaudojamas šiame bandymų metode (14).
               
            
         Mineralizacija – yra visiškas organinio junginio skilimas į CO2 ir H2O aerobinėmis sąlygomis, ir į CH4, CO2 bei H2O anaerobinėmis sąlygomis. Šiame bandymo metode, kai naudojamas 14C žymėtas junginys, mineralizacija yra didelio laipsnio skilimas, kai žymėtasis anglies atomas oksiduojamas, susidarant atitinkamam 14CO2 kiekiui (14).
      
         Pusėjimo trukmė: t0,5, laikas, per kurį bandomosios medžiagos koncentracija sumažėja 50 %, kai virsmui aprašyti tinka pirmojo laipsnio kinetika; ji nepriklauso nuo koncentracijos.
      
         DT
         
            50
         
         (išnykimo trukmė 50): laikas, per kurį bandomosios medžiagos koncentracija sumažėja 50 %; ši trukmė ir pusėjimo trukmė t0,5 skiriasi, kai virsmas neatitinka pirmojo laipsnio kinetikos.
      
         DT
         
            75
         
         (išnykimo trukmė 75): laikas, per kurį bandomosios medžiagos koncentracija sumažėja 75 %.
      
         DT
         
            90
         
         (išnykimo trukmė 90): laikas, per kurį bandomosios medžiagos koncentracija sumažėja 90 %.
      1.3   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Etaloninės medžiagos naudojamos, jei virsmo produktams apibūdinti ir (arba) identifikuoti taikomi spektroskopiniai ir chromatografijos metodai.
      1.4   BANDYMO TINKAMUMAS
      Metodas tinka visoms cheminėms medžiagoms (nepažymėtoms arba pažymėtoms kaip radioktyvios), kurioms nustatyti yra sukurtas pakankamo tikslumo ir jautrio analizės metodas. Jis tinka mažai lakiems, nelaki ems, vandenyje tirpiems arba netirpiems junginiams. Bandymas neturi būti taikomas cheminėms medžiagoms, kurios labai greit išgaruoja iš dirvožemio (pvz., fumigantai, organiniai tirpikliai), todėl negali būti laikomos dirvožemyje šio bandymo sąlygomis.
      1.5   INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ
      Virsmo greičiui matuoti gali būti naudojama pažymėtoji arba žymėtoji bandomoji medžiaga. Žymėtoji medžiaga reikalinga virsmo keliui tirti ir masių balansui nustatyti. Rekomenduojama žymėti 14C, bet gali būti naudingi kiti izotopai, pvz., 13C, 15N, 3H, 32P. Kiek tai įmanoma, žymėtasis atomas turi būti patvariausioje (-iose) molekulės dalyje (-yse) (40). Bandomosios medžiagos grynumas turi būti mažiausiai 95 %.
      Prieš pradedant daryti aerobinio ir anaerobinio virsmo dirvožemyje bandymą, turi būti gauta ši informacija apie bandomąją medžiagą:
      
                  a)
               
               
                  tirpumas vandenyje (A.6 metodas);
               
            
                  b)
               
               
                  tirpumas organiniuose tirpikliuose;
               
            
                  c)
               
               
                  garų slėgis (A.4 metodas) ir Henrio dėsnio konstanta;
               
            
                  d)
               
               
                  pasiskirstymo koeficientas n-oktanolis/vanduo (A.8 metodas);
               
            
                  e)
               
               
                  cheminis patvarumas tamsoje (hidrolizė) (C.7 metodas);
               
            
                  f)
               
               
                  pKa jei molekulė gali atiduoti arba prisijungti protonus [OECD rekomendacija 112] (16).
               
            Kitą naudingą informaciją gali sudaryti duomenys apie bandomosios medžiagos toksišką poveikį dirvožemio mikroorganizmams [bandymo metodai C.21 ir C.22] (16).
      Reikia turėti analizės metodus (įskaitant ekstrahavimo ir gryninimo metodus) bandomajai medžiagai ir jos virsmo produktams identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti.
      1.6   BANDYMO METODO ESMĖ
      Dirvožemio ėminiai apdorojami bandomąja medžiaga ir inkubuojami tamsoje, naudojant biometrines kolbas arba pratekėjimo sistemas kontroliuojamomis laboratorinėmis sąlygomis (esant pastoviai temperatūrai ir dirvožemio drėgmei). Po tam tikro intervalo dirvožemio ėminiai ekstrahuojami ir analizuojami pradinei medžiagai ir jos virsmo produktams nustatyti. Be to, naudojant atitinkamus absorbcijos įtaisus, renkami ir analizuojami lakieji produktai. Naudojant 14C žymėtą medžiagą ir surenkant išsiskyrusį 14CO2, galima išmatuoti įvairias bandomosios medžiagos mineralizacijos greičio vertes ir nustatyti masių balansą, įskaitant dirvožemiu surištus likučius.
      1.7   KOKYBĖS KRITERIJAI
      1.7.1   Regeneravimas
      Mažiausiai dviejų kartotinių dirvožemio ėminių ekstrahavimas ir analizė iškart po bandomosios medžiagos pridėjimo yra pirmasis analizės metodo pakartojamumo ir bandomosios medžiagos įterpimo metodikos tolygumo rodiklis. Vėlesnių bandymo stadijų regeneravimo laipsnis gaunamas matuojant atitinkamų masės verčių balansą. Žymėtųjų cheminių medžiagų regeneravimo laipsnis turi būti nuo 90 % iki 110 % (8), nežymėtųjų cheminių medžiagų – nuo 70 % iki 110 % (3).
      1.7.2   Analizės metodo pakartojamumas ir jautris
      Bandomosios medžiagos ir virsmo produktų kiekybinės analizės metodo pakartojamumas (išskyrus pradinį ekstrahavimo efektyvumą) gali būti patikrintas darant kartotinę to paties dirvožemio, inkubuoto pakankamai ilgai, kad galėtų susidaryti virsmo produktai, ekstrakto analizę.
      Bandomosios medžiagos ir virsmo produktų analizės metodo aptikimo riba (LOD) turi būti mažiausiai 0,01 mg × kg-1 dirvožemio (kaip bandomosios medžiagos) arba 1 % įterpiamos dozės, imant mažesniąją vertę. Turi būti apibrėžta kiekybinio nustatymo riba (LOQ).
      1.7.3   Virsmo duomenų tikslumas
      Darant bandomosios medžiagos koncentracijos verčių kaip laiko funkcijos regresinę analizę gaunama atitinkama informacija apie virsmo kreivės patikimumą ir leidžia apskaičiuoti pusėjimo trukmės verčių pasikliautinuosius rėžius (jei reakcija atitinka pseudopirmojo laipsnio kinetiką) arba DT50 vertes ir, jei tinka, DT75 ir DT90 vertes.
      1.8   BANDYMO METODO APRAŠYMAS
      1.8.1   Įranga ir cheminiai reagentai
      Inkubavimo sistemas sudaro statinės uždaros sistemos arba tinkamos pratekėjimo sistemos (7) (17). Tinkami pratekėjimo ir biometrinio tipo dirvožemio inkubavimo aparatai pavaizduoti 1 ir 2 paveiksluose. Kiekviena iš inkubavimo sistemų turi savo pranašumų ir trūkumų (7) (17).
      Reikalinga tipinė laboratorinė įranga, visų pirma ši:
      
                  —
               
               
                  analizės prietaisai, pvz., dujų ir skysčių chromatografijos (GLC), efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC), plonasluoksnės chromatografijos (TLC) įranga, įskaitant atitinkamas detektavimo sistemas pažymėtosioms arba nepažymėtosioms medžiagoms analizuoti, arba atvirkštinio izotopų skiedimo metodas,
               
            
                  —
               
               
                  identifikavimui skirti prietaisai (pvz., MS, GC-MS, HPLC-MS, MBR ir t.t.),
               
            
                  —
               
               
                  skysčių scintiliacinis skaitiklis,
               
            
                  —
               
               
                  aparatūra radioaktyviosioms medžiagoms oksiduoti,
               
            
                  —
               
               
                  centrifuga,
               
            
                  —
               
               
                  ekstrahavimo aparatūra (pvz., centrifugos mėgintuvėliai žematemperatūriam ekstrahavimui ir Soksleto aparatas nepertraukiamam ekstrahavimui su grįžtamuoju šaldytuvu),
               
            
                  —
               
               
                  įranga tirpalams ir ekstraktams koncentruoti (pvz., sukamasis garintuvas),
               
            
                  —
               
               
                  vandens vonia,
               
            
                  —
               
               
                  mechaninio maišymo įtaisas (pvz., tešlos maišytuvas, sukamasis maišytuvas).
               
            Naudojami cheminiai reagentai, pvz.:
      
                  —
               
               
                  NaOH, analiziškai grynas, 2 mol x dm-3, arba kitas tinkamas šarmas (pvz., KOH, etanolaminas),
               
            
                  —
               
               
                  H2SO4, analiziškai gryna, 0,05 mol x dm-3,
               
            
                  —
               
               
                  etilenglikolis, analiziškai grynas,
               
            
                  —
               
               
                  kietosios sugeriančios medžiagos, pvz., natrio kalkės ir poliuretano kamščiai,
               
            
                  —
               
               
                  organiniai tirpikliai, analiziškai gryni, pvz., acetonas, metanolis ir t. t.,
               
            
                  —
               
               
                  scintiliacinis skystis.
               
            1.8.2   Bandomosios medžiagos įterpimas
      Norint bandomosios medžiagos įterpti į dirvožemį ir paskirstyti jame, ji gali būti ištirpinta vandenyje (dejonizuotame arba distiliuotame) arba prireikus kiek įmanoma mažesniame kiekyje acetono arba kitų organinių tirpiklių (6), kuriuose bandomoji medžiaga būtų pakankamai tirpi ir patvari. Tačiau pasirinkto tirpiklio kiekis neturi daryti reikšmingos įtakos dirvožemio mikrobiniam aktyvumui (žr. 1.5 ir 1.9.2–1.9.3 skirsnius). Reikia vengti naudoti tirpiklius, kurie inhibuoja mikrobinį aktyvumą, pvz., chloroformą, dichlormetaną ir kitus halogenintus tirpiklius.
      Be to, bandomoji medžiaga gali būti įterpiama kaip kietoji medžiaga, pvz., sumaišyta su kvarciniu smėliu (6) arba su mažu bandymo dirvožemio mėginiu, kuris išdžiovinamas ore ir sterilizuojamas. Jei bandomoji medžiaga pridedama naudojant tirpiklį, tirpikliui leidžiama išgaruoti prieš tai kaip sodrintas mėginys yra įterpiamas į pradinį nesterilų dirvožemio ėminį.
      Įprastoms cheminėms medžiagoms, kurios į dirvožemį iš esmės patenka su nuotekų dumblu arba dirbant žemės ūkio darbus, bandomoji medžiaga iš pradžių turi būti dedama į dumblą, kuris vėliau įterpiamas į dirvožemio ėminį (žr. 1.9.2 ir 1.9.3 skirsnius).
      Nerekomenduojama sistemingai naudoti preparatus. Tačiau, pvz., jei bandomoji medžiaga mažai tirpi, preparatų naudojimas gali būti tinkamas pakaitinis būdas.
      1.8.3   Dirvožemiai
      1.8.3.1   Dirvožemio atranka
      Virsmo keliui nustatyti galima naudoti tipinį dirvožemį; rekomenduojama naudoti smėlingą priemolį, dulkišką priemolį, priemolį arba priesmėlį [pagal FAO ir USD A klasifikaciją (18)], kurio pH vertė 5,5-8,0, organinės anglies kiekis 0,5-2,5 % ir mikrobinė biomasė sudaro bent 1 % suminės organinės anglies (10).
      Virsmo greičiui tirti turi būti naudojami mažiausiai trys papildomi dirvožemiai, sudarantys atitinkamų dirvožemių intervalą. Dirvožemiai turi skirtis organinės anglies kiekiu, pH, molio ir mikrobinės biomasės kiekiu (10).
      Visi dirvožemiai apibūdinami, nurodant bent tekstūrą ( % smėlio, % dumblo, % molio) [pagal FAO ir USDA klasifikaciją (18)], pH, katijonų mainų talpą, organinės anglies kiekį, piltinį tankį, vandens sulaikymo charakteristikas (41) ir mikrobinę biomasę (tik aerobiniams tyrimams). Rezultatams interpretuoti gali būti naudinga papildoma informacija apie dirvožemio savybes. Dirvožemio charakteristikoms nustatyti gali būti taikomi metodai, rekomenduojami nuorodose (19)(20)(21)(22)(23). Mikrobinė biomasė turi būti nustatoma taikant substrato sukeliamo kvėpavimo (SIR) metodą (25)(26) arba pakaitinius metodus (20).
      1.8.3.2   Dirvožemių ėminių ėmimas, tvarkymas ir laikymas
      Reikia turėti detalios informacijos apie lauko vietą, iš kurios imamas bandymo dirvožemis. Nurodoma tiksli padėtis, augalų danga, apdorojimas cheminėmis medžiagomis, apdorojimas organinėmis ir neorganinėmis trąšomis, biologinių priedų dėjimas arba kiti teršalai. Jei per paskutinius ketverius metus dirvožemiai buvo apdorojami bandomąja medžiaga arba jos struktūriniais analogais, tokie dirvožemiai neturi būti naudojami virsmo tyrimams (10) (15).
      Dirvožemis turi būti tik ką paimtas iš lauko (iš A horizonto arba viršutinio 20 cm sluoksnio), dirvožemiui turint tokį vandens kiekį, kuris lengvintų sijojimą. Reikia vengti imti dirvožemių, išskyrus ryžių laukų dirvožemių, ėminius esant ilgalaikiam (ilgiau kaip 30 parų) sausros, šalčių arba patvinimo laikotarpiui arba iš karto jam pasibaigus (14). Ėminiai turi būti transportuojami tokiu būdu, kad kiek įmanoma mažiau pasikeistų vandens kiekis dirvožemyje, ėminiai turi būti laikomi tamsoje, esant kiek įmanoma didesniam gryno oro kiekiui. Paprastai šiam tikslui tinka nesandariai užrištas polietileninis maišas.
      Dirvožemis, paėmus jo ėminius, turi būti apdorotas kiek įmanoma greičiau. Augmenija, didesnė dirvožemio fauna ir akmenys turi būti pašalinti prieš sijoj ant dirvožemį per 2 mm sietą, ant kurio lieka maži akmenys, fauna ir augalų likučiai. Prieš sijoj ant reikia vengti per didelio dirvožemio džiūvimo ir smulkinimo (15).
      Kai žiemą imti ėminius lauke sunku (dirvožemis įšąla arba yra padengtas sniego sluoksniu), jį galima imti iš dirvožemio krūvos, laikomos šiltnamyje po augaline danga (pvz., žolės arba žolės ir dobilų mišinio danga). Labiau pageidautina tirti dirvožemius, tik ką paimtus iš lauko, tačiau jei surinktą ir apdorotą dirvožemį tenka laikyti prieš tyrimo pradžią, turi būti tinkamos laikymo sąlygos mikrobiniam aktyvumui užtikrinti ir laikyti galima tik ribotą laiką (ne ilgiau kaip tris mėnesius, esant 4 ± 2 oC) (42) Išsamios instrukcijos, kaip imti, tvarkyti ir laikyti biologinio virsmo bandymams skirtus dirvožemių ėminius, pateiktos (8) (10) (15) (26) (27).
      Prieš apdorotą dirvožemį naudojant šiam bandymui, jam taikomas pradinis inkubavimas, kad galėtų sudygti ir būtų pašalintos sėklos ir būtų atkurta mikrobinės medžiagų apykaitos pusiausvyra, kai ėminių ėmimo arba laikymo sąlygas pakeičia inkubavimo sąlygos. Paprastai pakanka 2–28 parų trukmės pradinio inkubavimo laikotarpio, siekiant temperatūros ir drėgmės sąlygas priartinti prie tikrojo bandymo sąlygų (15). Laikymo ir pradinio inkubavimo trukmė kartu neturi būti ilgesnė kaip trys mėnesiai.
      1.9   BANDYMO EIGA
      1.9.1   Bandymo sąlygos
      1.9.1.1   Bandymo temperatūra
      Visą bandymo laikotarpį dirvožemiai inkubuojami tamsoje esant pastoviai temperatūrai, kuri atitiktų klimatines naudojimo arba išmetimo sąlygas. Rekomenduojama 20 ± 2 oC temperatūra visoms bandomosioms medžiagoms, kurios gali pasiekti dirvožemį vidutinio klimato sąlygomis. Temperatūra turi būti kontroliuojama.
      Jei cheminės medžiagos naudojamos arba išmetamos šaltesnio klimato sąlygomis (pvz., šiaurės šalyse, rudens ir žiemos laikotarpiu), inkubuojami papildomi dirvožemio ėminiai esant žemesnei temperatūrai (pvz., 10 ± 2 oC).
      1.9.1.2   Drėgmės kiekis
      Darant virsmo bandymus aerobinėmis sąlygomis, turi būti nustatomas ir palaikomas dirvožemio drėgmės kiekis (43), atitinkantis pF nuo 2,0 iki 2,5 (3). Dirvožemio drėgmės kiekis išreiškiamas vandens mase sauso dirvožemio masės vienetui, ir turi būti reguliariai tikrinamas (pvz., kas 2 savaites) pasveriant inkubavimo kolbas, o vandens nuostoliai kompensuojami įpilant vandens (pageidautina filtravimu sterilizuoto vandentiekio vandens). Reikia imtis atsargumo priemonių, kad pilant vandenį būtų išvengta bandomosios medžiagos ir (arba) virsmo produktų nuostolių dėl garavimo ir (arba) fotodestrukcijos (jei vyksta) arba jie būtų kiek įmanoma sumažinti.
      Darant virsmo bandymus anaerobinėmis ir ryžių lauko sąlygomis, dirvožemis yra prisotintas vandeniu užtvindant.
      1.9.1.3   Aerobinės inkubavimo sąlygos
      Pratekėjimo sistemose aerobinės sąlygos užtikrinamos tarpais pučiant arba ištisai per sistemą ventiliuojant sudrėkintą orą. Biometrinėse kolbose oro mainai užtikrinami difuzijos būdu.
      1.9.1.4   Sterilios aerobinės sąlygos
      Informacijai apie abiotinio bandomosios medžiagos virsmo svarbą gauti, dirvožemio ėminiai gali būti sterilizuojami (sterilizavimo metodai pateikti 16 ir 29 nuorodose), apdorojami sterilia bandomąja medžiaga (pvz., tirpalas pilamas per sterilų filtrą) ir aeruojami sudrėkintu steriliu oru, kaip aprašyta 1.9.1.3 skirsnyje. Jei tiriamas ryžių laukų dirvožemis, dirvožemis ir vanduo sterilizuojami ir inkubavimas vykdomas kaip aprašyta 1.9.1.6 skirsnyje.
      1.9.1.5   Anaerobinės inkubavimo sąlygos
      Anaerobinėms sąlygoms sudaryti ir palaikyti, dirvožemis apdorojamas bandomąja medžiaga ir aerobinėmis sąlygomis 30 parų arba pusėjimo trukmės ar DT50 laikotarpį (atsižvelgiant į tai, kuris trumpesnis), inkubuotas dirvožemis užpilamas vandeniu (1–3 cm vandens sluoksniu), o per inkubavimo sistemą prapučiamos inertinės dujos (pvz., azotas arba argonas) (44) Bandymų sistema turi užtikrinti sąlygas matuoti pvz., pH vertę, deguonies koncentraciją ir oksidacijos-redukcijos potencialą, ir turėti lakiųjų produktų gaudykles. Sistema turi būti uždara, kad būtų išvengta oro patekimo difuzijos būdu.
      1.9.1.6   Ryžių laukų dirvožemio inkubavimo sąlygos
      Virsmui ryžių laukų dirvožemiuose tirti dirvožemis užpilamas maždaug 1-5 cm vandens sluoksniu ir bandomoji medžiaga dedama į vandeninę fazę (9). Rekomenduojama naudoti mažiausiai 5 cm gylio dirvožemio sluoksnį. Sistema vėdinama oru, kaip aerobinėmis sąlygomis. Turi būti kontroliuojama ir pateikiama ataskaitoje vandeninio sluoksnio pH vertė, deguonies koncentracija ir oksidacijos-redukcijos potencialas. Prieš pradedant virsmo tyrimus būtinas mažiausiai dviejų savaičių pradinio inkubavimo laikotarpis (žr. 1.8.3.2 skirsnį).
      1.9.1.7   Bandymo trukmė
      Virsmo greičio ir kelio tyrimai paprastai neturėtų trukti ilgiau kaip 120 parų (45) (3) (6) (8), kadangi po šio termino tikėtinas dirvožemio mikrobinio aktyvumo mažėjimas dirbtinėje, nuo natūralaus papildymo atskirtoje laboratorinėje sistemoje. Jei būtina apibūdinti bandomosios medžiagos išnykimą ir pagrindinių virsmo produktų susidarymą ir išnykimą, tyrimai gali būti tęsiami ilgesnį laiką (pvz., 6 arba 12 mėnesių) (8). Ilgesni inkubavimo laikotarpiai turi būti pagrįsti bandymų ataskaitoje, be to, papildyti biomasės matavimais šiais laikotarpiais ir jiems pasibaigus.
      1.9.2   Bandymo eiga
      Maždaug 50–200 g dirvožemio (kaip sauso dirvožemio) dedama į kiekvieną inkubavimo kolbą (žr. 3 priedo 1 ir 2 paveikslus) ir dirvožemis apdorojamas bandomąja medžiaga vienu iš metodų, aprašytų 1.8.2 skirsnyje. Jei bandomajai medžiagai įterpti naudojami organiniai tirpikliai, jie turi būti išgarinti iš dirvožemio. Tuomet dirvožemis gerai sumaišomas mentele ir (arba) purtant kolbą. Jei tyrimas daromas ryžių lauko sąlygomis, dirvožemis ir vanduo turi būti gerai sumaišyti po bandomosios medžiagos įterpimo. Daroma mažų alikvotinių apdoroto dirvožemio dalių (pvz., 1 g) analizė bandomajai medžiagai nustatyti ir taip patikrinti pasiskirstymo tolygumą. Pakaitiniai metodai pateikti toliau.
      Apdorojimo norma turi atitikti didžiausią augalų apsaugos produkto normą, rekomenduojamą naudojimo instrukcijose, ir atitinkamą tolygaus įterpimo lauke gylį (pvz., į viršutinį 10 cm dirvožemio sluoksnį (46). Pvz., jei cheminės medžiagos skirtos lapams arba dirvožemiui be įterpimo, atitinkamas gylis, pagal kurį apskaičiuojamas į kiekvieną kolbą dedamos cheminės medžiagos kiekis, lygus 2,5 cm. Jei cheminės medžiagos įterpiamos į dirvožemį, taikomas gylis yra naudojimo instrukcijose apibrėžtas įterpimo gylis. Jei tai bendrosios paskirties cheminės medžiagos, įterpimo norma turi būti įvertinta atsižvelgiant į patį tipiškiausią patekimo būdą; pvz., kai pagrindinis patekimo į dirvožemį būdas yra nuotekų dumblas, cheminė medžiaga turi būti dozuojama su dumblu, esant koncentracijai, kuri rodytų tikėtiną medžiagos koncentraciją dumble, o į dirvožemį dedamo dumblo kiekis turi atitikti įprastą dumblo įkrovą į žemės ūkio paskirties dirvožemius. Jei šios koncentracijos nepakanka pagrindiniams virsmo produktams identifikuoti, gali būti naudingas atskirų dirvožemio ėminių, turinčių didesnes medžiagos normas, inkubavimas, tačiau reikėtų vengti per didelių normų, darančių įtaką dirvožemio mikrobinėms funkcijoms (žr. 1.5 ir 1.8.2 skirsnius).
      Taikant kitą būdą, bandomąja medžiaga galima apdoroti didesnę dirvožemio įkrovą (t. y. 1-2 kg), kruopščiai sumaišyti, naudojant atitinkamą maišymo įtaisą, ir mažomis 50-200 g dalimis padalyti į inkubavimo kolbas (pvz., naudojant ėminio dalytuvus). Mažos apdoroto dirvožemio įkrovos alikvotinės dalys (pvz., 1 g) analizuojamos bandomosios medžiagos tolygiam pasiskirstymui patikrinti. Tokia metodika yra geresnė, kadangi bandomąją medžiagą galima tolygiau paskirstyti dirvožemyje.
      Be to, tomis pačiomis sąlygomis (aerobinėmis), kaip ir bandomąja medžiaga apdoroti ėminiai, inkubuojami neapdoroto dirvožemio ėminiai. Šie ėminiai yra naudojami biomasei matuoti vykstant bandymui ir j am pasibaigus.
      Kai į dirvožemį įterpiama organiniame (-iuose) tirpiklyje (-iuose) ištirpinta bandomoji medžiaga, dirvožemio ėminiai, apdoroti tokiu pačiu tirpiklio (-ų) kiekiu, inkubuojami tokiomis pačiomis sąlygomis (aerobinėmis), kaip ir bandomąja medžiaga apdoroti ėminiai. Šie ėminiai naudojami biomasei nustatyti tyrimo pradžioje, tyrimų metu ir juos užbaigus, kad būtų galima patikrinti tirpiklio (-ų) poveikį mikrobinei biomasei.
      Kolbos su apdorotu dirvožemiu prijungiamos prie matavimo pratekėjimo sąlygomis sistemos, aprašytos 1 paveiksle, arba uždaromos, naudojant 2 paveiksle pavaizduotą sugėrimo kolonėlė (žr. 3 priedą).
      1.9.3   Mėginių ėmimas ir matavimas
      Praėjus tam tikram laiko tarpui, paimamos dvi inkubavimo kolbos, dirvožemio mėginiai ekstrahuojami skirtingo poliškumo tirpikliais ir analizuojami bandomajai medžiagai ir (arba) virsmo produktams nustatyti. Darant gerai suplanuotą tyrimą, naudojamas pakankamas kolbų skaičius, kad kiekvienam mėginio ėmimui būtų galima paaukoti dvi kolbas. Be to, visą kiekvieno dirvožemio inkubavimo laikotarpį ir jam pasibaigus įvairiais laiko intervalais imami sugėrimui naudotų tirpalų arba kietųjų medžiagų mėginiai (pirmąjį mėnesį 7 parų intervalai ir vėliau 17 parų intervalai) ir daroma jų analizė lakiesiems produktams nustatyti. Be dirvožemio mėginio, imamo iš karto po medžiagos įterpimo (0 paros mėginio), būtina papildomai imti mėginį mažiausiai 5 kartus. Laiko intervalai turi būti pasirinkti taip, kad būtų galima gauti bandomosios medžiagos išnykimo ir virsmo produktų susidarymo bei išnykimo kreives (pvz., 0, 1, 3, 7 para (-os); 2, 3 savaitės; 1, 2, 3 mėnesiai ir t. t.).
      Kai naudojama 14C žymėta bandomoji medžiaga, neekstrahuojamos medžiagos radioaktyvumas kiekybiškai nustatomas sudeginant, ir kiekvienam mėginio ėmimo intervalui apskaičiuojamas masių balansas.
      Jei inkubuojama anaerobinėmis ir ryžių lauko sąlygomis, dirvožemis ir vandeninės fazės analizuojamos kartu bandomajai medžiagai ir virsmo produktams nustatyti arba prieš ekstrahavimą ir analizę atskiriamos filtravimu ar centrifugavimu.
      1.9.4   Neprivalomi bandymai
      Norint įvertinti temperatūros ir dirvožemio drėgmės įtaką bandomosios medžiagos ir (arba)jos virsmo produktų virsmo dirvožemyje greičiams, gali būti naudingi aerobiniai tyrimai nesteriliomis sąlygomis, esant papildomoms temperatūros ir dirvožemio drėgmės vertėms.
      Galima papildomai pamėginti apibūdinti neekstrahuojamų medžiagų radioaktyvumą, pvz., ekstrahavimui naudojant virškritinę takiąją terpę.
      2.   DUOMENYS
      2.1   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Bandomosios medžiagos, virsmo produktų, lakiųjų medžiagų (tik %) ir neekstrahuojamų medžiagų kiekiai pateikiami kaip pradinės koncentracijos procentinė dalis ir, jei tinka, mg × kg-1 dirvožemio (sausojo dirvožemio masei) kiekvienam mėginio ėmimo intervalui. Masių balansas kiekvienam mėginio ėmimo intervalui turi būti pateiktas kaip naudotos pradinės koncentracijos procentinė dalis. Grafiškai pavaizdavus bandomosios medžiagos koncentracijos verčių ir laiko santykį, bus galima įvertinti jos virsmo pusėjimo trukmę arba DT50. Turi būti identifikuoti pagrindiniai virsmo produktai ir brėžiamas jų koncentracijos verčių kitimo laike grafikas susidarymo ir išnykimo greičiams parodyti. Pagrindiniu virsmo produktu laikomas kiekvienas produktas, kuris bet kuriuo tyrimo metu sudaro ≥ 10 % naudotos dozės.
      Absorbuoti lakieji produktai tam tikru laipsniu rodo dirvožemyje esančios bandomosios medžiagos ir jos virsmo produktų lakumą.
      Tiksliau pusėjimo trukmės arba DT50 vertės ir, jei tinka, DT75 ir DT90 vertės nustatomos taikant atitinkamus kinetinių modelių apskaičiavimus. Pusėjimo trukmės ir DT50 vertės pateikiamos ataskaitoje kartu su taikyto modelio aprašymu, kinetikos laipsniu ir determinacijos koeficientu (r2). Geriau taikyti pirmojo laipsnio kinetiką, išskyrus kai r2 < 0,7. Be to, jei reikia, atliekami pagrindinių virsmo produktų apskaičiavimai. Atitinkami modelių pavyzdžiai aprašyti 31–35 nuorodose.
      Darant virsmo greičio tyrimus, esant įvairioms temperatūros vertėms, virsmo greičiai turi būti aprašyti kaip temperatūros funkcija bandymo temperatūros verčių intervale, taikant tokią Arenijaus lygtį:
      
          or 
      kurioje ln A ir B yra regresijos tiesės, gautos naudojant tiesinę lnk kaip l/T funkcijos regresiją, atkarpa ir krypties koeficientas, k yra greičio konstanta, esant temperatūrai T, ir T yra temperatūra Kelvino laipsniais. Reikia atkreipti dėmesį į ribotą temperatūros intervalą, kuriame Arenijaus lygtis galioja, kai virsmą valdo mikrobų veikimas.
      2.2   REZULTATŲ ĮVERTINIMAS IR INTERPRETAVIMAS
      Nors tyrimas daromas dirbtinėje laboratorinėje sistemoje, rezultatai leis įvertinti bandomosios medžiagos virsmo greitį ir virsmo produktų susidarymo bei išnykimo greitį lauko sąlygomis (36)(37).
      Bandomosios medžiagos virsmo kelio tyrimas suteikia informacijos apie tai, kaip dirvožemyje pasikeičia įterptosios medžiagos struktūra, vykstant cheminėms ir mikrobinėms reakcijoms.
      3.   ATASKAITOS RENGIMAS
      BANDYMO ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti ši informacija:
      
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              įprastas pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, struktūrinė formulė (rodanti žymėtojo (-ųjų) atomo (-ų) padėtį, jei naudojama žymėtoji medžiaga) ir atitinkamos fizikocheminės savybės (žr. 1.5 skirsnį),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos grynumas (priemaišos),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              radiocheminis žymėtosios cheminės medžiagos grynumas ir savitasis aktyvumas (jei tinka).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Etaloninės medžiagos:
                  
                              —
                           
                           
                              etaloninių medžiagų, naudojamų virsmo produktui apibūdinti ir (arba) identifikuoti, cheminis pavadinimas ir struktūra.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandomi dirvožemiai:
                  
                              —
                           
                           
                              ėmimo vietos detalės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dirvožemių ėmimo data ir metodika,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dirvožemių savybės, pvz., pH vertė, organinės anglies kiekis, tekstūra ( % smėlio, % dulkių, % molio), katijonų mainų talpa, piltinis tankis, vandens sulaikymo charakteristika ir mikrobinė biomasė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dirvožemio laikymo trukmė ir sąlygos (jei laikomas).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              tyrimų datos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              įterptos bandomosios medžiagos kiekis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              naudoti tirpikliai ir bandomosios medžiagos įterpimo būdas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iš pradžių apdoroto dirvožemio ir kiekvienai analizei imamo dirvožemio masė,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              naudotos inkubavimo sistemos aprašymas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              oro srauto vertės (tik pratekėjimo sistemoms),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatūra bandymo pradžioje,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dirvožemio drėgmės kiekis inkubavimo metu,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mikrobinė masė aerobinių tyrimų pradžioje, jų eigoje ir pabaigoje,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pH vertė, deguonies koncentracija ir oksidacijos-redukcijos potencialas anaerobinių ir ryžių laukų tyrimų pradžioje, jų eigoje ir pabaigoje,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ekstrahavimo metodas (-ai),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos, pagrindinių jos virsmo dirvožemyje produktų bei sugertų medžiagų kiekybinio nustatymo ir identifikavimo metodai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              kartotinių ir kontrolinių ėminių skaičius.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              mikrobinio aktyvumo nustatymo rezultatai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              taikytų analizės metodų pakartojamumas ir jautris,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              regeneravimo laipsnio vertės (tinkamu patvirtinto tyrimo % vertės yra pateiktos 1.7.1 skirsnyje),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultatų, išreiškiamų kaip įterptos pradinės dozės procentinė dalis ir, jei tinka, kaip mg × kg-1 dirvožemio (sauso dirvožemio), lentelės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              masių balansas tyrimų eigoje ir juos užbaigus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dirvožemio neekstrahuojamo (surištojo) radioaktyvumo arba likučių apibūdinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              išsiskyrusio CO2 ir kitų lakiųjų medžiagų kiekybinis apskaičiavimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindinių virsmo produktų koncentracijos dirvožemyje kaip laiko funkcijos kreivės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindinių virsmo produktų pusėjimo arba DT50, DT75 ir DT90 vertės, įskaitant pasikliautinuosius rėžius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              abiotinio skilimo steriliomis sąlygomis greičio įvertis,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindinių virsmo produktų virsmo kinetikos įvertinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pasiūlyti virsmo keliai, jei tinka,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultatų aptarimas ir aiškinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              neapdoroti duomenys (t. y. ėminių chromatogramos, virsmo greičio apskaičiavimų pavyzdžiai ir virsmo produktams identifikuoti naudotos priemonės).
                           
                        
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
               
            
                  2)
               
               
                  Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.
               
            
                  3)
               
               
                  European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex II, Part A and Annex III, Part A: Fate and Behaviour in the Environment.
               
            
                  4)
               
               
                  Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
               
            
                  5)
               
               
                  BBA (1986). Richtlinie fur die amtliche Prufung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.
               
            
                  6)
               
               
                  ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: Aerobic conditions.
               
            
                  7)
               
               
                  ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
               
            
                  8)
               
               
                  SET AC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.
               
            
                  9)
               
               
                  MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil -Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).
               
            
                  10)
               
               
                  OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
               
            
                  11)
               
               
                  Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.
               
            
                  12)
               
               
                  DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).
               
            
                  13)
               
               
                  T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984)
               
            
                  14)
               
               
                  OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981)
               
            
                  15)
               
               
                  ISO 10381-6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
               
            
                  16)
               
               
                  Annex V to Dir. 67/548/EEC
               
            
                  17)
               
               
                  Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.
               
            
                  18)
               
               
                  Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
               
            
                  19)
               
               
                  Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
               
            
                  20)
               
               
                  Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
               
            
                  21)
               
               
                  ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
               
            
                  22)
               
               
                  Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
               
            
                  23)
               
               
                  Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.
               
            
                  24)
               
               
                  Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221.
               
            
                  25)
               
               
                  ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of soil microbial biomass -Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.
               
            
                  26)
               
               
                  Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.
               
            
                  27)
               
               
                  Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105-120.
               
            
                  28)
               
               
                  Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).
               
            
                  29)
               
               
                  Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjodahl-Svensson K., Stenstrom J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).
               
            
                  30)
               
               
                  Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197-200.
               
            
                  31)
               
               
                  Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
               
            
                  32)
               
               
                  Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.
               
            
                  33)
               
               
                  Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In „Environmental Dynamics of Pesticides“. R. Haque and V.H. Freed, Eds., 135-172.
               
            
                  34)
               
               
                  Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz -Nachrichten Bayer 39, 188-204.
               
            
                  35)
               
               
                  Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 47-60.
               
            
                  36)
               
               
                  Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.
               
            
                  37)
               
               
                  Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 83-122.
               
            
         1 priedėlis
         VANDENS ĮTEMPTIS (HIDRAULINIS POTENCIALAS), LAUKO DRĖGMĖS IMLUMAS (FC) IR VANDENS SULAIKYMO GEBA (WHC) (47)
         
         
                     Vandens stulpelio aukštis
                     (cm)
                  
                  
                     pF (48)
                     
                  
                  
                     bar (49)
                     
                  
                  
                     Pastabos
                  
               
                     107
                     
                  
                  
                     7
                  
                  
                     104
                     
                  
                  
                     Sausas dirvožemis
                  
               
                     1,6 × 104
                     
                  
                  
                     4,2
                  
                  
                     16
                  
                  
                     Augalų vytinimo drėgmės vertė
                  
               
                     104
                     
                  
                  
                     4
                  
                  
                     10
                  
                  
                      
                  
               
                     103
                     
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1
                  
                  
                      
                  
               
                     6 × 102
                     
                  
                  
                     2,8
                  
                  
                     0,6
                  
                  
                      
                  
               
                     3,3 × 102
                     
                  
                  
                     2,5
                  
                  
                     0,33 (50)
                     
                  
                  
                     Lauko drėgmės imlumo
                     intervalas (51)
                     
                  
               
                     102
                     
                  
                  
                     2
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     60
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     0,06
                  
               
                     33
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     0,033
                  
               
                     10
                  
                  
                     1
                  
                  
                     0,01
                  
                  
                     WHC (apytikrė vertė
                  
               
                     1
                  
                  
                     0
                  
                  
                     0,001
                  
                  
                     Vandeniu prisotintas dirvožemis
                  
               
            Vandens įtemptis matuojama vandens stulpelio aukščio cm arba bar. Dėl didelio siurbimo įtempties intervalo ji išreiškiama tiesiog kaip pF vertė, kuri atitinka vandens stulpelio aukščio, išreikšto cm, logaritmą.
         
            Lauko drėgmės imlumas apibrėžiamas kaip vandens kiekis, kurį veikiant sunkio jėgai gali sulaikyti natūralus dirvožemis 2 paras po ilgesnio lietaus laikotarpio arba po pakankamo drėkinimo. Jis nustatomas nepaliestam dirvožemiui in situ lauke. Taigi matavimas netaikomas paliesto dirvožemio laboratoriniams ėminiams. FC vertės, nustatytos paliestam dirvožemiui, gali turėti didelių sistemingų nuokrypių.
         
            Vandens sulaikymo geba (WHC) nustatoma laboratorijoje nepaliestam ir paliestam dirvožemiui, dirvožemį kolonėlėje sotinant kapiliarais kylančiu vandeniu. Ji yra ypač naudinga apibrėžiant paliestą dirvožemį ir gali būti iki 30 % didesnė už lauko drėgmės imlumą (1). Be to, ją bandymo keliu lengviau nustatyti nei patikimas FC vertes.
         Pastabos
      
      
         2 priedėlis
         DRĖGMĖS KIEKIS (g vandens 100 g sauso dirvožemio) ĮVAIRIŲ ŠALIŲ ĮVAIRAUS TIPO DIRVOŽEMYJE
         
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Drėgmės kiekis, kai
                  
               
                     Dirvožemio tipas
                  
                  
                     Šalis
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     WHC (52)
                     
                  
                  
                     pF = 1,8
                  
                  
                     pF = 2,5
                  
               
                     Smėlis
                  
                  
                     Vokietija
                  
                  
                     28,7
                  
                  
                     8,8
                  
                  
                     3,9
                  
               
                     Rišlus smėlis
                  
                  
                     Vokietija
                  
                  
                     50,4
                  
                  
                     17,9
                  
                  
                     12,1
                  
               
                     Rišlus smėlis
                  
                  
                     Šveicarija
                  
                  
                     44,0
                  
                  
                     35,3
                  
                  
                     9,2
                  
               
                     Dulkiškas priemolis
                  
                  
                     Šveicarija
                  
                  
                     72,8
                  
                  
                     56,6
                  
                  
                     28,4
                  
               
                     Sunkus priemolis
                  
                  
                     Brazilija
                  
                  
                     69,7
                  
                  
                     38,4
                  
                  
                     27,3
                  
               
                     Sunkus priemolis
                  
                  
                     Japonija
                  
                  
                     74,4
                  
                  
                     57,8
                  
                  
                     31,4
                  
               
                     Priesmėlis
                  
                  
                     Japonija
                  
                  
                     82,4
                  
                  
                     59,2
                  
                  
                     36,0
                  
               
                     Dulkiškas priemolis
                  
                  
                     JAV
                  
                  
                     47,2
                  
                  
                     33,2
                  
                  
                     18,8
                  
               
                     Priesmėlis
                  
                  
                     JAV
                  
                  
                     40,4
                  
                  
                     25,2
                  
                  
                     13,3
                  
               
      
         3 priedėlis
         1 paveikslas
         Pratekėjimo aparato cheminių medžiagų virsmui dirvožemyje tirti pavyzdys
                (53)
                (54)
            
         
         
            
         2 paveikslas
         Biometrinio tipo kolbos cheminių medžiagų virsmui dirvožemyje tirti pavyzdys
                (55)
            
         
         
            
      
      C.24.   AEROBINIS IR ANAEROBINIS VIRSMAS VANDENS TELKINIŲ DUGNO NUOSĖDŲ SISTEMOSE
      1.   METODAS
      Šis bandymų metodas atitinka OECD TG 308 (2002).
      1.1   ĮVADAS
      Cheminės medžiagos gali patekti į negilius arba gilius paviršinius vandenis pvz., šiais būdais: tiesioginio pridėjimo, purškiamų medžiagų sklaidos, nuotėkio, drenažo, atliekų šalinimo, pramoninių, buitinių arba žemės ūkio nuotekų ir nusėdimo iš atmosferos. Šiame bandymų metode aprašytas laboratorinis metodas skirtas įvertinti organinių cheminių medžiagų aerobinį ir anaerobinį virsmą vandens telkinių dugno nuosėdų sistemose. Jis yra pagrįstas turimomis rekomendacijomis (1) (2) (3) (4) (5) (6). Belgirate, Italijoje, 1995 m. vykusiame OECD seminare dėl dirvožemių ir nuosėdinių uolienų atrankos (7) buvo konkrečiai sutarta dėl šiame bandyme naudojamų dirvožemių skaičiaus ir tipo. Be to, seminare buvo pateiktos dirvožemio ėminių ėmimo, tvarkymo ir laikymo rekomendacijos, pagrįstos ISO vadovu (8). Tokie tyrimai skirti cheminėms medžiagoms, kurios tiesiogiai dedamos į vandenį arba kurios gali pasiekti vandeninę aplinką pirmiau aprašytais būdais.
      Gamtinių vandens telkinių dugno nuosėdų sistemų sąlygos dažnai yra aerobinės viršutinėje vandeninėje fazėje. Nuosėdų paviršiniame sluoksnyje sąlygos gali būti aerobinės arba anaerobinės, o giliau esančiose nuosėdose jos paprastai yra anaerobinės. Siekiant aprėpti visas šias galimybes, šiame dokumente aprašyti aerobiniai ir anaerobiniai bandymai. Darant aerobinį bandymą, modeliuojamas aerobinio vandens stulpas virš aerobinių nuosėdų, po kuriomis yra sluoksnis su anaerobinių sąlygų gradientu. Darant anaerobinį bandymą modeliuojama visiškai anaerobinė vandens ir nuosėdų sistema. Jei aplinkybės rodo, kad būtina labai nukrypti nuo šių rekomendacijų, pvz., naudojant nepaliestų nuosėdų kernus arba nuosėdas, kurios galėjo būti veikiamos bandomąja medžiaga, šiam tikslui yra kiti skirti metodai (9).
      1.1   APIBRĖŽTYS
      Visai atvejais turi būti naudojami tarptautinės vienetų sistemos (SI) vienetai.
      
         Bandomoji medžiaga – bet kuri medžiaga (tai gali būti pradinis junginys ar medžiagos virsmo produktai)
      
         Virsmo produktai – visos medžiagos, susidarančios vykstant bandomosios medžiagos biotinio arba abiotinio virsmo reakcijoms, įskaitant CO2 ir surištuosiuos likučius.
      
         Surištieji likučiai – dirvožemyje, augale arba gyvūne esantys junginiai, kurie po ekstrahavimo lieka matricoje pradinės medžiagos arba jos metabolito (-ų) pavidalu. Ekstrahavimo metodas iš esmės turi nekeisti pačių junginių arba matricos struktūros. Ryšio prigimtį galima iš dalies išaiškinti, taikant matricą keičiančius ekstrahavimo metodus ir sudėtingus analizės metodus. Pvz., tokiu būdu šiandien yra identifikuotos kovalentinės, joninės ir sorbcinio tipo jungtys, be to, pagautieji junginiai. Apskritai, surištųjų likučių susidarymas labai mažina biologinį įsisavinamumą ir biologinį kaupimąsi (10) [modifikuotas IUPAC 1984 (11) apibrėžimas].
      
         Aerobinis virsmas (oksidavimas) –: reakcijos, vykstančios esant molekuliniam deguoniui (12).
      
         Anaerobinis virsmas (dezoksidavimas) – reakcijos, vykstančios nesant molekulinio deguonies (12).
      
         Gamtiniai vandenys – paviršiniai vandenys, paimti iš tvenkinių, upių, upelių ir t.t.
      
         Nuosėdos – mineralinių ir organinių komponentų mišinys, kurio organinius komponentus sudaro didelės molekulinės masės junginiai, turintys didelį anglies ir azoto kiekį. Jas nusodina gamtinis vanduo, su kuriuo nuosėdos sudaro sąlyčio paviršių.
      
         Mineralizacija – visiškas organinio junginio skilimas į CO2 ir H2O aerobinėmis sąlygomis, ir į CH4, CO2 ir H2O anaerobinėmis sąlygomis. Šiame bandymo metode, kai naudojamas žymėtasis junginys, mineralizacija yra didelio laipsnio molekulės skilimas, kai žymėtasis anglies atomas kiekybiškai oksiduojamas arba redukuojamas, susidarant atitinkamam 14CO2 arba 14CH4 kiekiui.
      
         Pusėjimo trukmė – t 0,5, laikas, per kurį bandomosios medžiagos koncentracija sumažėja 50 %, kai virsmui aprašyti tinka pirmojo laipsnio kinetika; ji nepriklauso nuo pradinės koncentracijos.
      
         DT
         
            50
         
         (išnykimo trukmė 50) – laikas, per kurį bandomosios medžiagos koncentracija sumažėja 50 %.
      
         DT
         
            75
         
         (išnykimo trukmė 75) – laikas, per kurį bandomosios medžiagos koncentracija sumažėja 75 %.
      
         DT90
         
         (išnykimo trukmė 90) – laikas, per kurį bandomosios medžiagos koncentracija sumažėja 90 %.
      1.3   ETALONINĖS MEDŽIAGOS
      Etaloninės medžiagos naudojamos, jei virsmo produktams identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti taikomi spektroskopiniai ir chromatografijos metodai.
      1.4   INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ
      Virsmo greičiui matuoti gali būti naudojama nežymėtoji arba žymėtųjų atomų turinti bandomoji medžiaga, bet geriau naudoti žymėtąją medžiagą. Žymėtoji medžiaga reikalinga virsmo keliui tirti ir masių balansui nustatyti. Rekomenduojama žymėti 14C, bet gali būti naudingi kiti izotopai, pvz., 13C, 15N, 3H, 32P. Kiek tai įmanoma, žymėtasis atomas turi būti patvariausioje (-iose) molekulės dalyje (-yse) (56). Bandomosios medžiagos cheminis ir (arba) radiocheminis grynumas turi būti mažiausiai 95 %.
      Prieš pradedant daryti bandymą, turi būti gauta ši informacija apie bandomąją medžiagą:
      
                  a)
               
               
                  tirpumas vandenyje (A.6 metodas);
               
            
                  b)
               
               
                  tirpumas organiniuose tirpikliuose;
               
            
                  c)
               
               
                  garų slėgis (A.4 metodas) ir Henrio dėsnio konstanta;
               
            
                  d)
               
               
                  pasiskirstymo koeficientas n-oktanolis/vanduo (A.8 metodas);
               
            
                  e)
               
               
                  adsorbcijos koeficientas(Kd, Kf, Koc, jei tinka) (C. 18 metodas);
               
            
                  f)
               
               
                  hidrolizė (C.7 metodas);
               
            
                  g)
               
               
                  disociacijos konstanta (pKa), [OECD rekomendacija 112] (13);
               
            
                  h)
               
               
                  bandomosios medžiagos cheminė struktūra ir žymėtųjų izotopų padėtis, jei taikomi.
               
            
         Pastaba. Ataskaitoje turi būti nurodyta matavimų temperatūra.
      Kitą naudingą informaciją gali sudaryti duomenys apie bandomosios medžiagos toksišką poveikį mikroorganizmams, duomenys apie lengvą ir (arba) būdingąjį biologinį skaidumą, duomenys apie aerobinį arba anaerobinį virsmą dirvožemyje.
      Reikia turėti analizės metodus (įskaitant ekstrahavimo ir gryninimo metodus) bandomajai medžiagai ir jos virsmo vandenyje bei nuosėdose produktams identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti (žr. 1.7.2 skirsnį).
      1.5   BANDYMO METODO ESMĖ
      Pagal šiame bandyme aprašytą metodą naudojamos aerobinė ir anaerobinė vandeninių nuosėdų (žr. 1 priedėlį) sistema, kurioje galima:
      
                  i)
               
               
                  matuoti bandomosios medžiagos virsmo vandens ir nuosėdų sistemoje greitį,
               
            
                  ii)
               
               
                  matuoti bandomosios medžiagos virsmo nuosėdose greitį,
               
            
                  iii)
               
               
                  matuoti bandomosios medžiagos ir (arba) virsmo produktų mineralizacijos greitį (kai naudojama 14C žymėtoji bandomoji medžiaga),
               
            
                  iv)
               
               
                  identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti virsmo vandeninėje ir nuosėdų fazėse produktus, įskaitant masių balansą (kai naudojama žymėtoji bandomoji medžiaga),
               
            
                  v)
               
               
                  matuoti bandomosios medžiagos ir jos virsmo produktų pasiskirstymą tarp dviejų fazių inkubavimo tamsoje laikotarpiu (siekiant išvengti, pvz., dumblių žydėjimo), esant pastoviai temperatūrai. Nustatomos pusėjimo trukmės, DT50, DT75 ir DT90 vertės, kai tai leidžia daryti turimi duomenys, bet jų nereikėtų ekstrapoliuoti gerokai ilgesnei nei bandymo laikotarpis trukmei (žr. 1.2 skirsnį).
               
            Aerobiniams ir anaerobiniams tyrimams reikia turėtų mažiausiai dviejų tipų nuosėdas ir jas atitinkančias vandenines fazes (7). Tačiau gali pasitaikyti atvejų, kai reikia naudoti daugiau kaip dviejų tipų vandenines nuosėdas, pvz., norint tirti cheminę medžiagą, kuri gali būti gėlame ir (arba) jūros vandenyje.
      1.6   BANDYMO TINKAMUMAS
      Metodas iš esmės tinka visoms cheminėms medžiagoms (nežymėtosioms arba žymėtosioms), kurioms nustatyti yra sukurtas pakankamo tikslumo ir jautrio analizės metodas. Jis tinka mažai lakiems, nelakiems, vandenyje tirpiems arba netirpiems junginiams. Bandymas neturi būti taikomas cheminėms medžiagoms, kurios labai greit išgaruoja iš vandens (pvz., fumigantai, organiniai tirpikliai), todėl negali būti laikomos vandenyje ir (arba) nuosėdose šio bandymo sąlygomis.
      Iki šiol metodas buvo taikomas cheminių medžiagų virsmui gėlame vandenyje ir nuosėdose tirti, bet iš esmės jį dar galima taikyti upių žiočių ar jūros sistemoms. Jis netinka tekančio vandens (pvz., upių) arba atvirosios jūros sąlygoms modeliuoti.
      1.7   KOKYBĖS KRITERIJAI
      1.7.1   Regeneravimas
      Mažiausiai dviejų kartotinių vandens ir nuosėdų ėminių ekstrahavimas ir analizė iškart po bandomosios medžiagos pridėjimo yra pirmasis analizės metodo pakartojamumo ir bandomosios medžiagos įterpimo metodikos tolygumo rodiklis. Vėlesnių bandymo stadijų regeneravimo laipsnis gaunamas matuojant atitinkamų masės verčių balansą (kai naudojama žymėtoji medžiaga). Žymėtųjų cheminių medžiagų regeneravimo laipsnis turi būti nuo 90 % iki 110 % (6), nežymėtųjų cheminių medžiagų – nuo 70 % iki 110 %.
      1.7.2   Analizės metodo pakartojamumas ir jautris
      Bandomosios medžiagos ir virsmo produktų kiekybinės analizės metodo pakartojamumas (išskyrus pradinį ekstrahavimo efektyvumą) gali būti patikrintas darant kartotinę to paties vandens arba nuosėdų ėminių, inkubuotų pakankamai ilgai, kad galėtų susidaryti virsmo produktai, ekstrakto analizę.
      Bandomosios medžiagos ir virsmo produktų analizės metodo radimo riba (LOD) turi būti mažiausiai 0,01 mg × kg-1 vandens arba nuosėdų (kaip bandomosios medžiagos) arba 1 % į bandymo sistemą dedamos pradinės dozės, imant mažesniąją vertę. Turi būti apibrėžta kiekybinio nustatymo riba (LOQ).
      1.7.3   Virsmo duomenų tikslumas
      Darant bandomosios medžiagos koncentracijos verčių kaip laiko funkcijos regresinę analizę gaunama atitinkama informacija apie virsmo kreivės tikslumą ir leidžia apskaičiuoti pusėjimo trukmės verčių pasikliautinuosius rėžius (jei reakcija atitinka pseudopirmojo laipsnio kinetiką) arba DT50 vertes ir, jei tinka, DT75 ir DT90 vertes.
      1.8   METODO APRAŠYMAS
      1.8.1   Bandymo sistema ir aparatūra
      Tyrimas turi būti daromas naudojant stiklinius indus (pvz., butelius, centrifugavimo mėgintuvėlius), išskyrus kai išankstinė informacija (pvz., pasiskirstymo koeficientas n-oktanolis/vanduo, sorbcijos duomenys ir t. t.) rodo, kad bandomoji medžiaga gali sukibti su stiklu; šiam atvejui reikėtų numatyti pakaitinę medžiagą (pvz., tefloną). Jei žinoma, kad bandomoji medžiaga gali sukibti su stiklu, šią problemą būtų galima iš dalies sumažinti, taikant vieną iš šių metodų:
      
                  —
               
               
                  nustatyti stiklu sorbuotos bandomosios medžiagos ir virsmo produktų masę,
               
            
                  —
               
               
                  užtikrinti, kad baigus bandymą visi stikliniai indai būtų plaunami tirpikliu,
               
            
                  —
               
               
                  naudoti produktų preparatus (žr. dar 1.9.2 skirsnį),
               
            
                  —
               
               
                  naudoti padidintą antrojo tirpiklio kiekį bandomajai medžiagai į sistemą įdėti; jei naudojamas antrasis tirpiklis, jame neturi vykti bandomosios medžiagos solvolizė.
               
            Tipinės bandymo aparatūros pavyzdžiai, t. y. dujų pratekėjimo ir biometrinio tipo sistemos, pavaizduoti 2 ir 3 priedėliuose (14). Kitos tinkamos inkubavimo sistemos aprašytos 15 nuorodoje. Bandymo aparatūros konstrukcija turi užtikrinti oro ir azoto mainų ir lakiųjų produktų sugavimo sąlygas. Aparatūros matmenys turi atitikti bandymo reikalavimus (žr. 1.9.1 skirsnį). Ventiliaciją galima užtikrinti nestipriai barbotuojant orą arba azotą arba juos leidžiant virš vandens paviršiaus. Pataruoju atveju galima patarti nestipriai maišyti viršutinį vandens sluoksnį, kad deguonis ir azotas geriau pasklistų vandenyje. Neturi būti naudojamas CO2 neturintis oras, kadangi dėl to gali padidėti vandens pH vertė. Bet kuriuo atveju drumsti nuosėdas nepageidautina ir to turi būti kiek įmanoma vengiama. Mažai lakios cheminės medžiagos turi būti bandomos biometrinio tipo sistemoje, nestipriai maišant vandens paviršinį sluoksnį. Be to, galima naudoti uždarus indus su atmosferiniu oru arba azotu užpildyta laisvąja erdve ir buteliukus viduje lakiesiems produktams sugauti (16). Darant aerobinį bandymą reikia reguliariai keisti laisvojoje erdvėje esančias dujas biomasės suvartotam deguoniui kompensuoti.
      Tinkamos priemonės lakiems virsmo produktams sugerti, kurių gali būti ir daugiau, yra 1 mol x dm-3 kalio arba natrio hidroksido tirpalas anglies dioksidui sugerti (57) ir etilenglikolis, etanolaminas arba 2 % parafino ksilene tirpalas organiniams junginiams sugerti. Anaerobinėmis sąlygomis susidariusius lakiuosius produktus, pvz., metaną, galima rinkti, pvz., molekuliniais sietais. Tokie lakieji produktai gali būti sudeginti, pvz., iki CO2, leidžiant dujas CuO užpildytu kvarciniu vamzdeliu, kaitinamu iki 900 oC temperatūros, o susidariusį CO2 sugerti absorberyje šarmo tirpalu (17).
      Reikia turėti laboratorinius bandomosios medžiagos ir virsmo produktų analizės prietaisus (pvz., dujų ir skysčių chromatografijos (GLC), efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC), plonasluoksnės chromatografijos (TLC), masių spektroskopijos (MS), dujų chromatografijos-masių spektroskopijos (GC-MS), skysčių chromatografijos-masių spektroskopijos (LC-MS), magnetinio branduolių rezonanso (MBR) ir t. t. įrangą), atitinkamas detektavimo sistemas žymėtosioms arba nežymėtosioms medžiagoms analizuoti. Be to, reikia turėti skysčių scintiliacinį skaitiklį ir oksidacinio sudeginimo aparatūrą (nuosėdų ėminiams sudeginti prieš radioaktyvumo analizę) žymėtosioms medžiagoms analizuoti.
      Būtina turėti kita tipinę laboratorinę įrangą fizikocheminei ir biologinei analizei daryti (žr. 1.8.2.2 skirsnio lentelę), stiklinius indus, atitinkamas chemines medžiagas ir reagentus.
      1.8.2   Vandens telkinių dugno nuosėdų atranka ir skaičius
      Kiekvienu atveju ėminių ėmimo vietos pasirenkamos atsižvelgiant į bandymo tikslą. Pasirenkant ėminių ėmimo vietas, turi būti atsižvelgta į galimo žemės ūkio, pramonės arba buitinių nuotekų patekimo į vandens baseiną ir į prieš srovę esančius vandens šaltinius istoriją. Nuosėdos neturi būti naudojamos, jei per ankstesnius 4 metus jos buvo teršiamos bandomąja medžiaga arba jos struktūriniais analogais.
      1.8.2.1   Nuosėdų atranka
      Aerobiniams tyrimams paprastai naudojamos dviejų rūšių nuosėdos (7). Pasirinktos dviejų rūšių nuosėdos turi skirtis organinės anglies kiekiu ir tekstūra. Vienos rūšies nuosėdos turi turėti didelį organinės anglies kiekį (2,5-7,5 %) ir būti smulkios tekstūros, kitos rūšies nuosėdos turi turėti mažą organinės anglies kiekį (0,5-2,5 %) ir būti stambios tekstūros. Organinės anglies kiekio skirtumas paprastai turi būti ne mažesnis kaip 2 %. „Smulki tekstūra“ apibrėžiama kaip turinti [molio + dumblo] (58) kiekį > 50 %, o „stambi tekstūra“ apibrėžiama kaip turinti [molio + dumblo] kiekį < 50 %. Dviejų rūšių nuosėdų [molio + dumblo] kiekio skirtumas paprastai turi būti ne mažesnis kaip 20 %. Tais atvejais, kai cheminė medžiaga gali pasiekti jūros vandenį, mažiausiai viena iš vandens ir dumblo sistemų turi būti jūrinės kilmės.
      Norint daryti griežtai anaerobinį tyrimą, dviejų rūšių nuosėdos (įskaitant virš jų esantį vandenį) turi būti imamos iš anaerobinių paviršinio vandens tūrio zonų (7). Nuosėdos ir virš jų esančios vandeninės fazės turi būti tvarkomos ir vežamos atsargiai, apsaugant nuo deguonies patekimo.
      Pasirenkant nuosėdas gali būti svarbūs kiti parametrai, į kuriuos turi būti atsižvelgta kiekvienu konkrečiu atveju. Pvz., nuosėdų pH verčių intervalas turėtų būti svarbus bandant chemines medžiagas, kurių virsmas ir (arba) sorbcija gali priklausyti nuo pH vertės. Sorbcijos priklausomybę nuo pH vertės gali rodyti bandomosios medžiagos pKa vertė.
      1.8.2.2   Vandens ir nuosėdų ėminių apibūdinimas
      Pagrindiniai vandens ir nuosėdų parametrai, kurie turi būti išmatuoti ir pateikti ataskaitoje (su taikyto metodo nuoroda), ir bandymo stadija, kurioje tie parametrai turi būti nustatyti, yra apibendrinti toliau pateiktoje lentelėje. Informacija apie tų parametrų nustatymo metodus pateikta nuorodose (18)(19)(20)(21).
      Be to, kiekvienu konkrečiu atveju gali tekti matuoti ir pateikti ataskaitoje kitus parametrus (pvz., gėlo vandens: daleles, šarmingumą, kietumą, laidį, NO3/PO4 (santykį ir atskiras vertes); nuosėdų: katijonų mainų talpą, vandens sulaikymo gebą, karbonatų kiekį, suminį azoto ir fosforo kiekį; jūros sistemoms: druskingumą). Be to, gali būti naudinga nuosėdų ir vandens analizė nitratams, sulfatams, biologiškai kaupiamos geležies ir kitiems galimiems elektronų akceptoriams nustatyti įvertinant oksidacijos-redukcijos sąlygas, ypač anaerobinio virsmo atveju.
      
         Vandenį ir nuosėdas apibūdinančių parametrų matavimas (7)(22)(23)
      
      
                  Parametras
               
               
                  Bandymo stadija
               
            
                  Ėminio ėmimas-lauke
               
               
                  Vėlesnis tvarky mas
               
               
                  Aklimati zacijos pradžia
               
               
                  Bandymo pradžia
               
               
                  Bandymo eiga
               
               
                  Bandymo pabaiga
               
            
                  
                     Vanduo
                  
               
            
                  Kilmė/Šaltinis
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Temperatūra
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  pH
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
            
                  Suminė organinė anglis (TOC)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                  x
               
            
                  O2 koncentracija (59)
                  
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
            
                  Oksidacijos redukcijos potencialas (59)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
            
                  
                     Nuosėdos
                  
               
            
                  Kilmė/Šaltinis
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Sluoksnio gylis
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  pH
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
            
                  Dalelių dydžio skirstinys
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  TOC
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                  x
               
            
                  Mikrobinė biomasė (60)
                  
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                  x
               
            
                  Oksidacijos redukcijos potencialas (59)
                  
               
               
                  Stebėjimas (spalva/kvapas)
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
            1.8.3   Ėminių ėmimas, tvarkymas ir laikymas
      1.8.3.1   Ėminių ėmimas
      Imant nuosėdas būtina vadovautis ISO vadovo projektu dėl dugno nuosėdų ėminių ėmimo (8). Nuosėdų ėminiai turi būti imami iš viso viršutinio 5-10 cm storio nuosėdų sluoksnio. Nuosėdas atitinkantis vanduo turi būti imamas iš tos pačios vietos arba vietovės ir tuo pačiu metu, kaip ir nuosėdos. Darant anaerobinį tyrimą, nuosėdos ir jas atitinkantis vanduo turi būti imami, apsaugant nuo deguonies patekimo (28) (žr. 1.8.2.1 skirsnį). Kai kurie ėminių ėmimo įtaisai aprašyti literatūroje (8) (23).
      1.8.3.2   Tvarkymas
      Nuosėdos atskiriamos nuo vandens filtravimu ir šlapios sijojamos per 2 mm sietą, naudojant toje pat vietoje buvusio vandens perteklių, kuris vėliau išpilamas. Tuomet žinomas nuosėdų ir vandens kiekis sumaišomas norimu santykiu (žr. 1.9.1 skirsnį) inkubavimo kolbose ir ruošiamas aklimatizacijai (žr. 1.8.4 skirsnį). Darant anaerobinį tyrimą, visos ruošimo operacijos turi būti vykdomos neleidžiant patekti deguoniui (29) (30) (31) (32) (33).
      1.8.3.3   Laikymas
      Rekomenduojama naudoti ką tik paruoštas nuosėdas ir vandenį, tačiau jei būtina ėminius laikyti, nuosėdos su vandeniu sijojamos, kaip pirmiau aprašyta, užpilamos vandeniu (6-10 cm vandens sluoksniu) ir laikomos kartu su juo tamsoje ne ilgiau kaip 4 savaites, esant 4 ± 2 oC4 [13] (7) (8) (23). Ėminiai, skirti aerobiniams tyrimams, turi būti laikomi leidžiant laisvai patekti orui (pvz., atviruose induose), ėminiai, skiri anaerobiniams tyrimams, laikomi neleidžiant patekti deguoniui. Nuosėdos su vandeniu neturi užšalti arba nuosėdos neturi išdžiūti.
      1.8.4   Nuosėdų ar vandens ėminių ruošimas bandymui
      Prieš pridedant bandomosios medžiagos reikia aklimatizacijos laikotarpio, kai kiekvienas nuosėdų ar vandens ėminys supilamas į pagrindiniame bandyme naudojamą inkubavimo indą ir aklimatizuojamas esant tiksliai tokioms pačioms kaip ir bandymo inkubavimo sąlygoms (žr. 1.9.1 skirsnį). Aklimatizacijos laikotarpis reikalingas reikiamam sistemos stabilumui pasiekti, kurį rodo pH vertė, deguonies koncentracija vandenyje, nuosėdų ir vandens oksidacijos-redukcijos potencialas ir makroskopinis fazių atsiskyrimas. Paprastai aklimatizacijos laikotarpis turi trukti nuo vienos iki dviejų savaičių, bet neturi būti ilgesnis kaip keturios savaitės. Ataskaitoje turi būti pateikti šiuo laikotarpiu daromų matavimų rezultatai.
      1.9   BANDYMO EIGA
      1.9.1   Bandymo sąlygos
      Bandymas turi būti daromas inkubavimo aparate (žr. 1.8.1 skirsnį), esant vandens ir nuosėdų tūrio santykiui nuo 3: 1 iki 4: 1, ir 2,5 cm (±0,5 cm) nuosėdų sluoksnio storiui. (61) Rekomenduojama naudoti ne mažiau kaip 50 g nuosėdų (skaičiuojant sausai medžiagai) vienam inkubavimo indui.
      Bandymas turi būti daromas tamsoje esant pastoviai 10-30 oC temperatūrai. Tikslinga naudoti (20 ± 2) oC temperatūrą. Prireikus kiekvienam konkrečiam atvejui galima numatyti papildomą mažesnę temperatūrą (pvz., 10 oC), atsižvelgiant į informaciją, kurios turi suteikti bandymas. Inkubavimo temperatūra turi būti kontroliuojama ir nurodoma ataskaitoje.
      1.9.2   Bandomosios medžiagos apdorojimas ir įdėjimas
      Naudojama viena cheminės medžiagos bandymo koncentracija (62). Augalų apsaugai skirtoms cheminėms medžiagoms, kurios tiesiogiai pilamos į vandens telkinius, didžiausia etiketėje nurodyta dozavimo koncentracija turi būti laikoma didžiausia taikoma norma, apskaičiuojama pagal bandymo indo vandens paviršiaus plotą. Visais kitais atvejais naudojama koncentracija turi būti pagrįsta į aplinką išmetamo kiekio įverčiais. Būtina užtikrinti, kad būtų naudojama atitinkama bandomosios medžiagos koncentracija, siekiant apibūdinti virsmo kelią ir virsmo produktų susidarymą ir išnykimą. Gali tekti naudoti didesnes dozes (pvz., 10 kartų) tais atvejais, kai bandomosios medžiagos koncentracijos vertės bandymo pradžioje yra arti aptikimo ribos ir (arba) jei pagrindiniai virsmo produktai negali būti lengvai rasti, kai jie sudaro 10 % bandomosios medžiagos įdėjimo normos. Tačiau, jei naudojamos didesnės bandymo koncentracijos vertės, medžiaga neturi daryti reikšmingo neigiamo poveikio vandens ir nuosėdų sistemos mikrobiniam aktyvumui. Siekiant gauti pastovią bandomosios medžiagos koncentraciją skirtingų matmenų induose, gali būti naudinga reguliuoti įdedamos medžiagos kiekį pagal vandens sluoksnio gylį inde ir jo gylį lauko sąlygomis (laikant, kad jis yra lygus 100 cm, bet galima naudoti ir kitas gylio vertes). Apskaičiavimo pavyzdys pateiktas 4 priedėlyje.
      Būtų geriausia bandomąją medžiagą pilti į bandymo sistemos vandeninę fazę kaip vandeninį tirpalą. Jei kitaip neįmanoma, bandomajai medžiagai įpilti ir paskirstyti leidžiama naudoti nedidelius kiekius su vandeniu maišių tirpiklių (pvz., acetono, etanolio), tačiau jie neturi sudaryti daugiau kaip 1 % V/V ir neturi neigiamai veikti bandymo sistemos mikrobinio aktyvumo. Bandomosios medžiagos vandeninius tirpalus reikia ruošti kruopščiai, visiškam vienalytiškumui užtikrinti gali būti naudinga naudoti generavimo kolonėles ir išankstinį maišymą. Po vandeninio tirpalo įpylimo į bandymo sistemą vandeninę fazę rekomenduojama nestipriai maišyti, stengiantis kiek įmanoma mažiau liesti nuosėdas.
      Preparatų paprastai nerekomenduojama naudoti, nes preparato ingredientai gali veikti bandomosios medžiagos ir (arba) virsmo produktų pasiskirstymą tarp vandens ir nuosėdų fazių. Tačiau jei bandomoji medžiaga yra mažai tirpi vandenyje, preparatas gali būti tinkamas pasirinkimas.
      Inkubavimo indų skaičius priklauso nuo mėginių ėmimo kartų skaičiaus (žr. 1.9.3 skirsnį). Turi būti naudojamas pakankamas bandymo sistemų skaičius, kad kiekvieną kartą imant mėginį būtų galima paaukoti dvi sistemas. Jei naudojami kiekvienos vandens ir nuosėdų sistemos kontroliniai ėminiai, jie neturi būti apdorojami bandomąja medžiaga. Kontroliniai įrenginiai gali būti naudojami nuosėdų mikrobinei biomasei ir vandens bei nuosėdų suminiam organinės anglies kiekiui nustatyti tyrimo pabaigoje. Du iš kontrolinių įrenginių (t. y. po vieną kontrolinį įrenginį kiekvienoms vandeninėms nuosėdoms) gali būti naudojami reikiamiems nuosėdų ir vandens parametrams kontroliuoti aklimatizacijos laikotarpiu (žr. 1.8.2.2 skirsnio lentelę). Du papildomi kontroliniai įrenginiai turi būti įtraukti tuo atveju, kai bandomoji medžiaga įpilama naudojant tirpiklį, kad būtų galima matuoti jo neigiamą poveikį bandymo sistemos mikrobiniam aktyvumui.
      1.9.3   Bandymo trukmė ir mėginių ėmimas
      Tyrimas paprastai neturi būti ilgesnis kaip 100 parų (6), ir turi vykti tol, kol nustatomas skilimo kelias ir pasiskirstymo tarp vandens ir nuosėdų charakteristika arba 90 % bandomosios medžiagos išsisklaido virsmo keliu ir (arba) išgaruoja. Mėginiai turi būti imami bent šešis kartus (įskaitant nulinį laiką), naudojant neprivalomą pradinį tyrimą (žr. 1.9.4 skirsnį) tinkamam mėginių ėmimo režimui ir bandymo trukmei nustatyti, išskyrus kai apie bandomąją medžiagą yra pakankamas kiekis duomenų iš ankstesnių tyrimų. Jei tiriamos hidrofobinės bandomosios medžiagos, pradiniu tyrimo laikotarpiu gali būti reikalingi papildomi mėginių ėmimo taškai pasiskirstymo tarp vandens ir nuosėdų fazių greičiui nustatyti.
      Atitinkamu mėginio ėmimo laiku inkubavimo indai su visu turiniu (kartotiniai mėginiai) imami analizei daryti. Nuosėdos ir virš jų esantis vanduo analizuojami atskirai (63). Paviršinis vanduo atsargiai nupilamas, kiek įmanoma mažiau liečiant nuosėdas. Bandomosios medžiagos ir virsmo produktų ekstrahavimas ir apibūdinimas turi būti daromas taikant atitinkamas analizės metodikas. Reikia imtis priemonių pašalinti medžiagą, kuri galėjo adsorbuotis ant inkubavimo indo arba jungiamuosiuose vamzdeliuose, naudojamuose lakiosioms medžiagoms sugauti..
      1.9.4   Neprivalomas pradinis bandymas
      Jei trukmė ir mėginių ėmimo režimas negali būti įvertinti pagal ankstesnius atitinkamus bandomosios medžiagos tyrimus, gali būti tikslinga daryti išankstinį bandymą, kuris turi būti daromas tomis pačiomis bandymo sąlygomis, kurios yra numatytos galutiniam tyrimui. Ataskaitoje turi būti trumpai nurodytos išankstinio bandymo, jei daromas, sąlygos ir rezultatai.
      1.9.5   Matavimai ir analizė
      Kiekvieną kartą imant mėginį matuojama ir ataskaitoje nurodoma bandomosios medžiagos ir virsmo produktų koncentracija vandenyje ir nuosėdose (kaip koncentracija ir įdėto kiekio procentinė dalis). Paprastai galioja taisyklė, kad virsmo produktai, kurių randama > 10 % nuo suminio vandens ir nuosėdų sistemos pradinio radioaktyvumo, turi būti identifikuoti, išskyrus kai galima pagrįsti, kad tai neįmanoma. Be to, turi būti identifikuoti virsmo produktai, kurių koncentracija visą tyrimo laiką didėja, netgi jei jų koncentracija nėra didesnė už pirmiau pateiktas ribines vertes, kadangi toks reiškinys gali rodyti jų išsilaikymą. Tai turi būti nagrinėjama kiekvienu konkrečiu atveju, ataskaitoje pateikiant pagrįstus paaiškinimus.
      Ataskaitoje turi būti pateikti rezultatai, kiekvienu mėginio ėmimo metu gauti dujų ar lakiųjų medžiagų sugavimo sistemose (CO2 ir kiti produktai, t. y. lakieji organiniai junginiai). Turi būti pateiktos mineralizacijos greičio vertės. Kiekvienam mėginio ėmimo laikui pateikiamas neekstrahuojamų (surištųjų) likučių kiekis.
      2.   DUOMENYS
      2.1   REZULTATŲ APDOROJIMAS
      Kiekvieną kartą imant mėginį turi būti apskaičiuojamas įdėto radioaktyvumo bendras masių balansas arba regeneravimo laipsnis (žr. 1.7.1 skirsnį). Rezultatai turi būti pateikiami kaip pridėto radioaktyvumo procentinė dalis. Ataskaitoje turi būti pateiktas radioaktyvumo pasiskirstymas tarp vandens ir nuosėdų kiekvieną kartą imant mėginį, išreikštas kaip koncentracija ir kaip procentinės dalys.
      Turi būti apskaičiuota bandomosios medžiagos pusėjimo trukmė, DT50 ir, jei tinka, DT75 ir DT90 kartu nurodant pasikliautinuosius rėžius (žr. 1.7.3 skirsnį). Informacijos apie bandomosios medžiagos išsisklaidymo vandenyje ir nuosėdose greitį galima gauti naudojant atitinkamus įvertinimo būdus. Tai gali būti pseudopirmojo laipsnio kinetikos taikymas, empirinės geriausio kreivių atitikimo metodikos, kuriose taikomi grafinis arba skaitmeninis sprendimai, ir sudėtingesni įvertinimo būdai, taikantys, pvz., vieno arba kelių skyrių modelius. Daugiau informacijos galima rasti atitinkamuose paskelbtuose literatūros šaltiniuose (35) (36) (37).
      Visi būdai turi savo privalumų ir silpnųjų vietų ir labai skiriasi sudėtingumu. Prielaida apie pirmojo laipsnio kinetiką gali būti per didelis skilimo ir pasiskirstymo procesų supaprastinimas, tačiau esant galimybei gaunamas dydis (greičio konstanta arba pusėjimo trukmė), kurį lengva suprasti ir kuris yra labai naudingas kuriant imitacinį modelį ir apskaičiuojant numatomas aplinkos koncentracijos vertes. Taikant empirinius metodus arba tiesines transformacijas, galima gauti geresnį kreivių ir duomenų atitikimą, taigi geriau įvertinti pusėjimo trukmę, DT50 ir, jei tinka, DT75 ir DT90 vertes. Tačiau gautųjų konstantų taikymas yra ribotas. Taikant modelius su skyriais galima gauti kelias rizikos įvertinimui naudingas konstantas, kurios aprašo skilimo skirtinguose skyriuose greitį ir cheminės medžiagos pasiskirstymą. Be to, tokie modeliai turėtų būti naudojami pagrindinių virsmo produktų susidarymo ir skilimo greičio konstantoms įvertinti. Visais atvejais pasirinktas metodas turi būti pagrįstas ir tyrėjas turi grafiškai ir (arba) statistiškai parodyti gerą atitikimo kokybę.
      3.   ATASKAITOS RENGIMAS
      3.1   BANDYMŲ ATASKAITA
      Bandymų ataskaitoje turi būti ši informacija:
      
                   
               
               
                  Bandomoji medžiaga:
                  
                              —
                           
                           
                              įprastas pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, struktūrinė formulė (rodanti žymėtojo (-ųjų) atomo (-ų) padėtį, jei naudojama žymėtoji medžiaga) ir atitinkamos fizikocheminės savybės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos grynumas (priemaišos),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              radiocheminis žymėtosios cheminės medžiagos grynumas ir molinis aktyvumas (jei tinka).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Etaloninės medžiagos:
                  
                              —
                           
                           
                              etaloninių medžiagų, naudojamų virsmo produktams apibūdinti ir (arba) identifikuoti, cheminis pavadinimas ir struktūra
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandomos nuosėdos ir vanduo:
                  
                              —
                           
                           
                              vandens telkinių dugno nuosėdų ėmimo vieta (-os), įskaitant, jei įmanoma, užteršimo istoriją;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              visa informacija apie vandens ir nuosėdų sistemų ėminių ėmimą, laikyma. (jei taikomas) ir aklimatizavimą;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vandens ir nuosėdų ėminių charakteristikos, išvardytos 1.8.2.2 skirsnio lentelėje.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Bandymo sąlygos:
                  
                              —
                           
                           
                              naudota bandymo sistema (pvz., taikanti pratekėjimą, biometrinė, ventiliavimo būdas, maišymo būdas, vandens tūris, nuosėdų masė, vandens ir nuosėdų sluoksnių storis, bandymo indų matmenys ir t. t.)
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos dėjimas į bandymo sistemą: naudota bandymo koncentracija, kartotinių ir kontrolinių ėminių skaičius, bandomosios medžiagos įdėjimo būdas (pvz., tirpiklis, jei naudojamas), ir t. t.,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              inkubavimo temperatūra,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mėginių ėmimo laikas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ekstrahavimo metodai ir jų efektyvumas, be to, analizės metodai ir radimo ribos,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              virsmo produktų apibūdinimo ar identifikavimo metodai,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nukrypimai bandymo metu nuo bandymo protokolo arba bandymo sąlygų.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatai:
                  
                              —
                           
                           
                              tipinių analizių neapdorotų duomenų skaičiai (visi neapdoroti duomenys turi būti saugomi GLP archyve);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              taikytų analizės metodų pakartojamumas ir jautris,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              regeneravimo laipsnio vertės (tinkamu patvirtinto tyrimo % vertės yra pateiktos 1.7.1 skirsnyje),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos ir, jei tinka, virsmo produktų ir neekstrahuojamo radioaktyvumo rezultatų, išreiškiamų kaip naudotos dozės % ir mg × kg-1, gautų vandenyje, nuosėdose ir visoje sistemoje (tik %), lentelės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              masių balansas tyrimų eigoje ir juos užbaigus,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              virsmo vandens bei nuosėdų dalyse ir visoje sistemoje (įskaitant mineralizaciją) grafinis vaizdas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mineralizacijos greičio vertės,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindinių virsmo produktų virsmo vandenyje, nuosėdose ir visoje sistemoje pusėjimo arba DT50, ir, jei tinka DT75 ir DT90 vertės, įskaitant pasikliautinuosius rėžius,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bandomosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindinių virsmo produktų virsmo kinetikos įvertinimas,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pasiūlytas virsmo kelias, jei tinka,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultatų aptarimas.
                           
                        
            4.   NUORODOS
      
                  1)
               
               
                  BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.
               
            
                  2)
               
               
                  Commission for registration of pesticides: Application for registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.
               
            
                  3)
               
               
                  MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United-Kingdom.
               
            
                  4)
               
               
                  Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada, pp 35-37.
               
            
                  5)
               
               
                  US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism.
               
            
                  6)
               
               
                  SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.
               
            
                  7)
               
               
                  OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
               
            
                  8)
               
               
                  ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality – Sampling – Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments.
               
            
                  9)
               
               
                  US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080.
               
            
                  10)
               
               
                  DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).
               
            
                  11)
               
               
                  T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).
               
            
                  12)
               
               
                  OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).
               
            
                  13)
               
               
                  OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
               
            
                  14)
               
               
                  Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149-158.
               
            
                  15)
               
               
                  Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.
               
            
                  16)
               
               
                  Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631-637.
               
            
                  17)
               
               
                  Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C-labelled model surfactants. Water Research 21, 661-667.
               
            
                  18)
               
               
                  Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.
               
            
                  19)
               
               
                  APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (17th edition). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
               
            
                  20)
               
               
                  Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. Longman.
               
            
                  21)
               
               
                  Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chemistry 44, 1038-1039.
               
            
                  22)
               
               
                  SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests“, 3-4 July 1991.
               
            
                  23)
               
               
                  SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
               
            
                  24)
               
               
                  Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858-2868.
               
            
                  25)
               
               
                  Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329-338.
               
            
                  26)
               
               
                  Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203.
               
            
                  27)
               
               
                  ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
               
            
                  28)
               
               
                  Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13-21.
               
            
                  29)
               
               
                  Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857.
               
            
                  30)
               
               
                  Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550.
               
            
                  31)
               
               
                  Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegradation tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499-1509.
               
            
                  32)
               
               
                  Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597-3603.
               
            
                  33)
               
               
                  US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090.
               
            
                  34)
               
               
                  Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961-968.
               
            
                  35)
               
               
                  Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, 187 – 203.
               
            
                  36)
               
               
                  Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47 – 60.
               
            
                  37)
               
               
                  Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Diseases, pp. 1349-1354.
               
            
         1 priedėlis
         NURODYMAI DĖL AEROBINIŲ IR ANAEROBINIŲ BANDYMO SISTEMŲ
         Aerobinė bandymų sistema
         Šiame bandymo metode aprašytą aerobinę bandymo sistemą sudaro aerobinis vandens slupksnis (tipinė deguonies koncentracijos verčių intervalas nuo 7 iki 10 mg x 1-1) ir nuosėdų sluoksnis, aerobinis oaviršiuje ir anaerobinis giliau po paviršiniu sluoksniu (tipinės vidutinės oksidacijos-redukcijos potencialo (Eh) vertės anaerobinėje nuosėdų zonoje yra nuo -80 iki -190 mV). Drėgnas oras leidžiamas virš vandens paviršiaus kiekviename inkubavimo įrenginyje pakankamam deguonies kiekiui erdvėje virš skysčio užtikrinti.
         Anaerobinė bandymų sistema
         Bandymo naudojant anaerobinę bandymo sistemą metodika iš esmės atitinka metodiką, aprašytą aerobinei sistemai, išskyrus tai, kad vandens paviršiaus leidžiamas drėgnas azotas kiekviename inkubavimo įrenginyje pakankamam azoto kiekiui erdvėje virš skysčio užtikrinti. Nuosėdos ir vanduo laikomi anaerobiniais, kai oksidacijos-redukcijos potencialas (Eh) yra mažesnis kaip -100 mV.
         Darant anaerobinį bandymą, mineralizaijos įvertinimą sudaro ir išsiskyrusio anglies dioksido bei metano kiekio matavimas.
      
      
         2 priedėlis
         DUJŲ PRATEKĖJIMO APARATŪROS PAVYZDYS
         
            
      
      
         3 priedėlis
         BIOMETRINĖS APARATŪROS PAVYZDYS
         
            
      
      
         4 priedėlis
         Į BANDYMO INDUS DEDAMOS DOZĖS APSKAIČIAVIMO PAVYZDYS
         
                     Cilindro vidinis skersmuo:
                  
                  
                     = 8 cm
                  
               
                     Vandens stulpelio gylis, išskyrus nuosėdas:
                  
                  
                     = 12 cm
                  
               
                     Paviršiaus plotas: 3,142 × 42
                     
                  
                  
                     = 50,3 cm2
                     
                  
               
                     Įterpimo norma: 500 g bandomosios medžiagos/ha atitinka 5 μg/cm2
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Suminis kiekis μg: 5 × 50,3
                  
                  
                     =251,5 μg
                  
               
                     Kiekis nustatomas pagal 100 cm stulpelio gylį:
                     12 x 251,5 ÷ 100
                  
                  
                     = 30,18 μg
                  
               
                     Vandens stulpelio tūris: 50,3 x 12
                  
                  
                     = 603 ml
                  
               
                     Koncentracija vandenyje: 30,18÷603
                  
                  
                     = 0,050 μg/ml arba 50μg/l
                  
               
      
         (1)  Pagal šiuos tarplaboratorinių bandymų rezultatus ir ISO 6341 techninę pataisą kalio dichromato (K2Cr2O7) EC50 vertė po 24 h yra nuo 0,6 mg/l iki 1,7 mg/l.
      
         (2)  Tinkamo grynumo vanduo, pvz., dejonizuotas, distiliuotas arba atvirkštinio osmoso būdu gautas vanduo, kurio laidis būtų ne didesnis kaip 10 μS.cm-1.
      
         (3)  D1 ir D2 vidutinė vertė neturi būti skaičiuojamas, jei tarp jų yra didelis skirtumas.
      
         (4)  D1 ir D2 vidutinė vertė neturi būti skaičiuojamas, jei tarp jų yra didelis skirtumas.
      
         (5)  arba inkubavimo pabaigoje
      
         (6)  D1 ir D2 vidutinė vertė neturi būti skaičiuojamas, jei tarp verčių yra didelis skirtumas.
      
         (7)  arba inkubavimo pabaigoje
      
         (8)  Jei tarp lygiagrečių nustatymų yra didelis skirtumas, vidutinės vertės neskaičiuokite.
      
         (9)  Vidutinių verčių neskaičiuokite, jei tarp lygiagrečių nustatymų yra didelis skirtumai.
      
         (10)  Norint išvengti gyvsidabrio išsisklaidymo aplinkoje, panaudoti tirpalai su gyvsidabrio druskomis turi būti apdoroti.
      
         (11)  Mabey ir Mill rekomenduoja vietoj fosfatinio naudoti boratinį arba acetatinį buferinį tirpalą (11).
      
         (12)  Tokią informaciją galima gauti iš kitą šaltinių, pvz., giminingos struktūros junginių hidrolizės duomenys iš literatūros arba iš kitų pradinių, pusiau kiekybinių bandomosios medžiagos hidrolizės bandymų ankstesnėje parengtinėje stadijoje.
      
         (13)  Jei logaritminis duomenų kaip laiko funkcijos grafikas nėra tiesė (aprašanti pirmojo laipsnio reakcijos greitį), [3] lygtis netinka bandomojo junginio hidrolizės greičio konstantai nustatyti.
      
         (14)  Šiose lentelėse pateiktos pH vertės buvo apskaičiuotos pagal potencialo matavimus, taikant Sorensen standartines lygtis (1909 m.). Atitinkamos pH vertės yra 0,04 vieneto didesnės nei nurodytos lentelėje.
      
         (15)  Apsaugai nuo pelėsių augimo įdedamas nedidelis timolio arba panašios medžiagos kristalas.
      
         (16)  Trijų matavimu vidutinė vertė.
      
         (17)  Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., VoL 252, p. 231
      
         (18)  Vandens bandįnys imamas po to, kai buvo patiekti mažiausiai trys „kameros tūriai“.
      
                  
                     NB
                  
               
               
                  :
               
               
                  Prieš bandymą darytas k2 įvertis, kai log (Pow) = 4,0, yra 0,652 paros-1. Bendra bandymo trukmė nustatyta 3 × sug = 3 × 4,6 paros, t. y. 14 parų. Kaip vertinti „sug“ , žr. 3 papildymą.
               
            Vertės skliausteliuose rodo bandinių (vandens, žuvų) skaičių, kurį reikia paimti, jei daromas papildomas bandinių ėmimas.
      
         (19)  Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, p. 231–236.
      
         (20)  Stulpelyje galima pasirinkti penkių (ar daugiau) viena po kitos einančių koncentracijų eilutę. Stulpelio (x) koncentracijų vidurio taškai randami stulpelyje (2x + 1). Sąraše nurodytos vertės gali būti išreikštos procentine tūrio dalimi ar masės koncentracija (mg/l ar μg/l). Vertės gali būti padaugintos ar padalytos iš 10, pakelto bet kuriuo tinkamu laipsniu. 1 stulpelį galima būtų naudoti, jei toksiškumo lygio neapibrėžtis yra didelė.
      
         (21)  OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, Fish, Early-life Stage Toxicity Test
      
         (22)  Embrionams
      
         (23)  Lervoms
      
         (24)  Embrionas ir lerva vieną savaitę po išsiritimo laikomi tamsoje, išskyrus kai jie yra tikrinami. Toliau susilpnintas apšvietimas visą bandymo laiką.
      
         (25)  Pagal FAO {Food and Agricultural Organization – Maisto ir žemės ūkio organizacija) ir JAV sistemą (85).
      
         (26)  Būtų geriau, jei atitinkamų kintamųjų vertės būtų nurodytame diapazone. Tačiau, jei kyla sunkumų rasti tinkamą dirvožemį, priimtinos mažesnės nei nurodytos mažiausios vertės.
      
         (27)  Dirvožemis, kuriame organinės anglies yra mažiau kaip 0,3 %, gali sugriauti koreliaciją tarp organinės anglies kiekio ir adsorbcijos. Taigi rekomenduojama naudoti dirvožemį, kuriame organinės anglies būtų ne mažiau kaip 0,3 %.
      
         (28)  
      
         (29)  Bandomosios medžiagos vandeninės fazės koncentracijos  kitimo laike grafikai taip pat gali būti panaudoti nustatant, ar pasiekta pusiausvyros horizontalioji kreivės dalis (žr. 5 priedo 2 pav.).
      
         (30)  DT-50: laikas, per kurį suskaidoma 50 % bandomosios medžiagos.
      
         (31)  W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121 — 128.
      
         (32)  W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), 107 — 119.
      
         (33)  W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373-1384.
      
         (34)  W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D Report No. 106 01 044 (1994).
      
         (35)  B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein. (1991). Chemosphere, 22, 285-304
      
         (36)  Pramonės pateikti duomenys.
      
         (37)  Nurodomas bandymui naudotas indas.
      
         (38)  Registraojamas visų suaugusių gyvūnų giaštamumas, atitinkamame langelyje įrašant „M“
      
         (39)  Registraojami neapvaisinti kiaušiniai, aitinkamame langelyje įrašant „AB“
      
         (40)  Pvz., jei bandomoji medžiaga turi vieną žiedą, žymėtasis atomas turi būti šiame žiede; jei bandomoji medžiaga turi du žiedus arba daugiau, gali tekti daryti atskirus tyrimus kiekvieno žiedo su žymėtuoju atomu likimui įvertinti ir atitinkamai informacijai apie virsmo produktą susidarymą gauti.
      
         (41)  Vandens sulaikymo charakteristikos gali būti matuojamos, kaip lauko drėgmės imlumas, kaip vandens sulaikymo geba arba kaip vandens siurbimo įtemptis (hidraulinis potencialas) (pF). Aiškinimai pateikti 1 priede. Bandymų ataskaitoje turi būti nurodyta, ar dirvožemių vandens sulaikymo charakteristikos ir piltiniai tankiai buvo matuojami nepaliestuose lauko ėminiuose, ar paliestuose (apdorotuose) ėminiuose.
      
         (42)  Naujų tyrimų rezultatai rodo, kad vidutinio klimato zonų dirvožemiai irgi gali būti laikomi esant minus 20 oC ilgiau kaip tris mėnesius (28)(29) ir perdaug neprarasti mikrobinio aktyvumo.
      
         (43)  Dirvožemis neturi būti per drėgnas arba per sausas, kad būtų galima užtikrinti tinkamą dirvožemio mikrofloros aeravimą ir mitybą. Optimaliam mikrobų augimui rekomenduojamas drėgmės kiekis sudaro 40-60 % vandens sulaikymo gebos (WHC) ir 0,1-0,33 bar (6). Pastarasis intervalas atitinka pF intervalą 2,0-2,5. Tipinis įvairių tipų dirvožemių drėgmės kiekis pateiktas 2 priede.
      
         (44)  Aerobinės sąlygos vyrauja paviršiniame dirvožemiuose ir net popaviršiniuose dirvožemiuose, kaip buvo parodyta ES organizuotame tyrimų projekte [K. Takagi et al. (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internal Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, Sweden]. Anaerobinės sąlygos gali pasitaikyti tik atsitiktinai, kai dirvožemiai užliejami po didelių liūčių arba kai sudaromos ryžių laukų sąlygos.
      
         (45)  Aerobinius tyrimus galima būtų baigti daug anksčiau nei po 120 parų, jei tuo metu jau būtų žinomas galutinis virsmo kelias ir aiškiai pasiekta galutinė mineralizacija. Bandymas gali būti baigtas po 120 parų arba kai produktais virsta mažiausiai 90 % bandomosios medžiagos, tačiau turi susidaryti mažiausiai 5 % C02.
      
         (46)  Pradinė koncentracija pagal plotą apskaičiuojama taikant šią lygtį:
      
         
      
                  Csoil
                  
               
               
                  =
               
               
                  pradinė koncentracija dirvožemyje [mg × kg-1]
               
            
                  A
               
               
                  =
               
               
                  įterpimo norma [kg × ha-1]; 1 = lauko dirvožemio sluoksnio storis [m]; d = sauso dirvožemio piltinis tankis [kg × m-3].
               
            Paprastai, esant 1 kg × ha-1 įterpimo normai, koncentracija 10 cm dirvožemio sluoksnyje maždaug lygi 1 mg × kg-1 (darant prielaidą, kad piltinis tankis yra lygus 1 g × cm-3).
      
         (47)  Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
      
         (48)  pF = vandens stulpelio aukščio, išreikšto cm, logaritmas.
      
         (49)  1 bar = 105 Pa.
      
         (50)  Atitinka apytikrį vandens kiekį 10 % smėlyje, 35 % priemolyje ir 45 % molyje.
      
         (51)  Lauko drėgmės imlumas nėra pastovus dydis, bet atsižvelgiant į dirvožemio tipą kinta nuo F 1,5 iki 2,5.
      
         (52)  Vandens laikymo geba (WHC – Water Holding Capacity)
      
         (53)  Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123–157.
      
         (54)  Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85–114.
      
         (55)  Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.
      
         (56)  Pvz., jei bandomoji medžiaga turi vieną žiedą, žymėtasis atomas turi būti šiame žiede; jei bandomoji medžiaga turi du žiedus arba daugiau, gali tekti daryti atskirus tyrimus kiekvieno žiedo su žymėtuoju atomu likimui įvertinti ir atitinkamai informacijai apie virsmo produktų susidarymą gauti.
      
         (57)  Kadangi šie šarminiai sugėrimo tirpalai sugeria anglies dioksidą, esantį ventiliuojamame ore ir susidariusį dėl kvėpavimo darant aerobinius bandymus, jie reguliariai turi būti keičiami, kad būtą išvengta soties, taigi absorbcijos gebos praradimo
      
         (58)  [Molis + dumblas] yra mineralinė dalis nuosėdų, kurių dalelių dydis < 50 μm
      
         (59)  Mikrobinio kvėpavimo greičio nustatymo metodas (26), fumigacijos metodas (27) arba mikroorganizmų skaičiavimo metodai (pvz., bakterijų, aktinomicečių, grybelių ir suminio kolonijų skaičiaus), darant aerobinius tyrimus; metano susidarymo greitis, darant anaerobinius tyrimus.
      
         (60)  Naujų tyrimų rezultatai parodė, kad vandens deguonies ir oksidacijos-redukcijos potencialo matavimai neturi mechanizmo nustatymo ir prognozavimo vertės, kai kalbama apie mikrobų populiacijos paviršiniuose vandenyse augimą ir vystymąsi (24)(25). Biocheminio deguonies poreikio (BOD, imant ėminį lauke, bandymo pradžioje ir pabaigoje) ir mitybinių mikroelementų/makroelementų Ca, Mg ir Mn vandenyje nustatymas (bandymo pradžioje ir pabaigoje) ir suminio N bei suminio P kiekio nuosėdose matavimas (imant ėminį lauke ir bandymo pabaigoje) gali būti geresnė priemonė aerobinio biologinio virsmo greičiams ir keliams interpretuoti bei įvertinti.
      
         (61)  Naujausi tyrimai parodė, kad, jei laikoma esant 4 oC, gali sumažėti nuosėdų organinės anglies kiekis, dėl ko gali sumažėti mikrobinis aktyvumas.
      
         (62)  Toms cheminėms medžiagoms, kurios į paviršinius vandenis patenka skirtingais budais, kai dėl to gaunamos labai skirtingos koncentracijos vertės, gali būti naudingas bandymas naudojant antrą koncentraciją, jei mažesniąją koncentraciją galima nustatyti pakankamai tiksliai.
      
         (63)  Tais atvejais, kai gali vykti greitas anaerobinio virsmo produktą pakartotinis oksidavimas, imant mėginius ir analizuojant turi būti užtikrinamos anaerobinės sąlygos.