CELEX: 32001R0213
Language: cs
Date: 2001-01-09 00:00:00
Title: Nařízení Komise (ES) č. 213/2001 ze dne 9. ledna 2001, kterým se stanoví prováděcí pravidla k nařízení Rady (ES) č. 1255/1999, pokud jde o metody analýzy a hodnocení jakosti mléka a mléčných výrobků, a kterým se mění nařízení (ES) č. 2771/1999 a (ES) č. 2799/1999

Důležité právní upozornění

|

32001R0213

Nařízení Komise (ES) č. 213/2001 ze dne 9. ledna 2001, kterým se stanoví prováděcí pravidla k nařízení Rady (ES) č. 1255/1999, pokud jde o metody analýzy a hodnocení jakosti mléka a mléčných výrobků, a kterým se mění nařízení (ES) č. 2771/1999 a (ES) č. 2799/1999  

Úřední věstník L 037 , 07/02/2001 S. 0001 - 0099 CS.ES Kapitola 3 Svazek 31 S. 240  - 338 ET.ES Kapitola 3 Svazek 31 S. 240  - 338 HU.ES Kapitola 3 Svazek 31 S. 240  - 338 LT.ES Kapitola 3 Svazek 31 S. 240  - 338 LV.ES Kapitola 3 Svazek 31 S. 240  - 338 MT.ES Kapitola 3 Svazek 31 S. 240  - 338 PL.ES Kapitola 3 Svazek 31 S. 240  - 338 SK.ES Kapitola 3 Svazek 31 S. 240  - 338 SL.ES Kapitola 3 Svazek 31 S. 240  - 338

		Nařízení Komise (ES) č. 213/2001ze dne 9. ledna 2001,kterým se stanoví prováděcí pravidla k nařízení Rady (ES) č. 1255/1999, pokud jde o metody analýzy a hodnocení jakosti mléka a mléčných výrobků, a kterým se mění nařízení (ES) č. 2771/1999 a (ES) č. 2799/1999KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství,s ohledem na nařízení Rady (ES) č. 1255/1999 ze dne 17. května 1999 o společné organizaci trhu s mlékem a mléčnými výrobky [1], a zejména na články 10 a 15 a čl. 26 odst. 3, čl. 29 odst. 1 a čl. 31 odst. 14 uvedeného nařízení,vzhledem k těmto důvodům:(1) nařízení Komise (EHS) č. 1216/68, (EHS) č. 3942/92, (ES) č. 86/94, (ES) č. 2721/95, (ES) č. 1080/96, (ES) č. 1081/96, (ES) č. 1082/96, (ES) č. 1854/96, (ES) č. 880/98 a (ES) č. 1459/98, jejichž plné názvy jsou uvedeny v příloze XXVI tohoto nařízení, stanoví referenční a rutinní metody pro analýzu a hodnocení jakosti mléka a mléčných výrobků, jakož i předmět těchto metod a pravidla jejich používání. Z důvodu přehlednosti a ve snaze poskytnout hospodářským subjektům v tomto odvětví jednotný soubor uvedených metod a pravidel pro jejich používání je třeba výše uvedená nařízení přepracovat a sloučit do jediného znění. Z téhož důvodu je nezbytné změnit nařízení Komise (ES) č. 2771/1999 ze dne 16. prosince 1999, kterým se stanoví prováděcí pravidla k nařízení Rady (ES) č. 1255/1999, pokud jde o intervenční opatření na trhu s máslem a smetanou [2], a nařízení Komise (ES) č. 2799/1999 ze dne 17. prosince 1999, kterým se stanoví prováděcí pravidla k nařízení (ES) č. 1255/1999, pokud jde o poskytování podpory pro odstředěné mléko a sušené odstředěné mléko určené k použití jako krmivo a pokud jde o prodej tohoto odstředěného sušeného mléka [3], a to tak, že jejich přílohy týkající se metod analýzy se začlení do tohoto nařízení;(2) složení a jakostní znaky mléka a mléčných výrobků stanovené v rámci režimů zavedených nařízením (ES) č. 1255/1999 musí být validovány, neboť je nutné zajistit, aby plně odpovídaly stanoveným požadavkům;(3) často se uvádí, že referenčními metodami, jež se mají pro uvedenou validaci používat, jsou metody, které zveřejňují mezinárodní organizace jako jsou CEN, IDF, ISO a AOAC International a které tyto organizace pravidelně aktualizují. V některých případech se stanoví referenční metoda Společenství, zatímco v jiných případech právní předpisy Společenství žádnou referenční metodu nestanoví. Má-li být zajištěno jednotné používání referenčních metod, je nezbytné každý rok vypracovat seznam referenčních metod a stanovit, že lze používat pouze metody uvedené v tomto seznamu;(4) používání rutinních metod nesmí být vyloučeno, a proto je třeba stanovit podmínky pro jejich používání;(5) rovněž je třeba stanovit společné metody s cílem zavést jednotnou praxi při hodnocení výsledků analýz. Totéž platí pro organoleptické hodnocení dotyčných produktů a pro přezkoumávání výsledků, které byly napadeny;(6) pro některé analýzy v současnosti neexistují žádné mezinárodně uznávané referenční metody, jež byly validovány; z tohoto důvodu nejsou k dispozici žádné informace o tom, že by jednotlivé laboratoře dosahovaly při analýzách odlišných výsledků. Proto je třeba stanovit v rámci Společenství metody, které byly validovány podle pravidel stanovených na mezinárodní úrovni a které by se používaly jako metody referenční;(7) nařízení Komise (ES) č. 2571/97 ze dne 15. prosince 1997 o prodeji másla za snížené ceny a o poskytování podpory pro smetanu, máslo a zahuštěné máslo určené k použití při výrobě jemného pečiva, zmrzliny a jiných potravin [4], naposledy pozměněné nařízením (ES) č. 635/2000 [5], stanoví, že za určitých okolností se do smetany, másla a zahuštěného másla přidávají stopovací látky, aby bylo zajištěno správné konečné použití těchto produktů. Vzhledem k tomu, že používání stopovacích látek je pro řádné fungování režimu důležité a že všechny hospodářské subjekty, na které se daný režim vztahuje, musí mít zajištěno rovné zacházení, je třeba v rámci možností zavést obecné metody pro zjišťování některých z těchto stopovacích látek;(8) do zahuštěného másla musí být stopovací látky přidávány pod dohledem, a to podle nařízení Komise (EHS) č. 3143/85 ze dne 11. listopadu 1985 o prodeji intervenčního másla, které je určeno k přímé spotřebě ve formě zahuštěného másla, za snížené ceny [6], naposledy pozměněného nařízením (ES) č. 101/1999 [7], podle nařízení Komise (EHS) č. 429/90 ze dne 20. února 1990 o poskytování podpory prostřednictvím nabídkového řízení pro zahuštěné máslo určené k přímé spotřebě ve Společenství [8], naposledy pozměněného nařízením (ES) č. 124/1999 [9], a podle nařízení (ES) č. 2571/97. Bezvýhradné plnění požadavků týkajících se přidávání stopovacích látek do zahuštěného másla je nezbytné proto, aby se zabránilo využívání tohoto produktu k jiným účelům. Proto je třeba stanovit obecnou metodu pro zjišťování těchto stopovacích látek;(9) podle článku 9 nařízení (ES) č. 1255/1999 může být poskytnuta podpora pro soukromé skladování sýrů vyráběných z ovčího mléka. Podle článku 31 téhož nařízení lze pro tyto produkty poskytnout zvláštní náhradu. Sýry vyráběné z ovčího mléka, kozího mléka, buvolího mléka a ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka mohou být do Společenství dováženy z některých třetích zemí za preferenčních podmínek. Vzhledem k výše uvedeným ustanovením je třeba vhodnými kontrolními postupy ověřit, zda se do dotyčných produktů nepřidává kravské mléko. Z tohoto důvodu je nezbytné stanovit referenční metodu Společenství ke zjištění kravského mléka, aniž je dotčeno použití rutinních metod, pakliže splňují určitá kritéria;(10) podle nařízení Komise (EHS) č. 2921/90 ze dne 10. října 1990 o podpoře výroby kaseinu a kaseinátů z odstředěného mléka [10], naposledy pozměněného nařízením (ES) č. 2654/1999 [11], musí být stanovena nepřítomnost koliformních bakterií. Mezinárodně uznávanou referenční metodou pro zjišťování koliformních bakterií v mléce a mléčných výrobcích je mezinárodní norma IDF 73A:1985. Tato norma je však použitelná pouze v upravené podobě na zjišťování koliformních bakterií v určitém množství produktu.. Proto se pro zjišťování koliformních bakterií stanoví referenční metoda Společenství založená na uvedené normě;(11) nařízení Rady (EHS) č. 2658/87 ze dne 23. července 1987 o celní a statistické nomenklatuře a o společném celním sazebníku [12], naposledy pozměněné nařízením (ES) č. 254/2000 [13], stanoví různé celní sazby pro krmné směsi čísla 2309 celního sazebníku podle obsahu mléčných výrobků. Má-li být zajištěno jednotné používání příslušných pravidel, je třeba stanovit metodu analýzy ke zjištění obsahu laktosy, která bude povinná pro všechny členské státy, a za tímto účelem zvolit určitou obecně uznávanou metodu;(12) nařízení (ES) č. 1255/1999 stanoví, že máslo a sušené odstředěné mléko určené k intervenci, jakož i sušené odstředěné mléko určené k použití jako krmivo musí splňovat určité požadavky na jakost. Proto je třeba stanovit referenční metody, které umožní zjistit, zda jsou tyto požadavky plněny;(13) provádění některých metod zavedených poprvé tímto nařízením vyžaduje určitou dobu na přizpůsobení; proto je třeba jejich používání odložit;(14) Řídící výbor pro mléko a mléčné výrobky nezaujal stanovisko ve lhůtě stanovené předsedou,PŘIJALA TOTO NAŘÍZENÍ:KAPITOLA IOBECNÁ USTANOVENÍČlánek 1Předmět a oblast použitíToto nařízení stanoví pravidla pro používání metod chemické, fyzikální a mikrobiologické analýzy a pro organoleptické hodnocení mléka a mléčných výrobků v rámci režimů stanovených ve společné organizaci trhu s mlékem a mléčnými výrobky, kterou zavádí nařízení (ES) č. 1255/1999. Některé z těchto metod toto nařízení stanoví.Článek 2Seznam metod1. Seznam referenčních metod použitelných pro analýzy uvedené v článku 1 je uveden v příloze I tohoto nařízení.2. Komise aktualizuje uvedený seznam nejméně jednou za rok postupem podle článku 42 nařízení (ES) č. 1255/1999.Článek 3Rutinní metodyPro analýzy stanovené právními předpisy Společenství lze používat rutinní metody za předpokladu, že jsou patřičně kalibrovány a pravidelně kontrolovány porovnáním s referenční metodou.Postup popsaný v příloze II lze použít k ověření výsledků získaných rutinními metodami, jež jsou blízké mezním hodnotám stanoveným v dotyčných nařízeních.V případě sporu jsou rozhodující výsledky získané referenční metodou.Článek 4Validace referenčních metod1. Referenční metody jsou validovány za přepokladu, že splňují předem stanovená kritéria přesnosti, pokud jde o mezní hodnotu opakovatelnosti a reprodukovatelnosti.2. Jestliže referenční metody stanovené v dotyčných nařízeních nejsou validovány, členské státy stanoví prozatímní mezní hodnotu reprodukovatelnosti.Tato mezní hodnota se zjistí postupem stanoveným v příloze III písm. b). Po dobu 18 měsíců následujících po vstupu tohoto nařízení v platnost však mohou členské státy používat jiný rovnocenný postup.Dodržování mezní hodnoty se ověřuje nejméně jednou za rok.3. Pokud výsledky používání validovaných referenčních metod nebo metod s prozatímními hodnotami přesnosti ukáží, že některá mezní hodnota byla překročena, pro stanovení kritické odchylky od dotyčné mezní hodnoty se použije metoda hodnocení výsledků analýzy popsaná v příloze IV.Článek 5Přípustnost výsledků analýz1. Analýzy se provádějí v laboratořích, které používají metodu vnitřní kontroly jakosti v souladu s metodou popsanou v příloze V písm. a) nebo rovnocennou metodou splňující stejné požadavky.V laboratoři musí být k dispozici k nahlédnutí podrobný popis používané metody..2. Laboratoře stanoví vlastní vnitřní normy přesnosti v rámci jedné zkoušky pro všechny metody podle:a) metody popsané v příloze V písm. b), nebob) metody, která byla validována a zveřejněna,se stanovenou opakovatelností.Dodržování mezní hodnoty reprodukovatelnosti musí být ověřováno nejméně jednou za rok postupem uvedeným v příloze III, písm. a).Druhý pododstavec se nepoužije, pokud se laboratoř během dotyčného roku účastnila programu zkoušek odborné způsobilosti.3. Laboratorní zprávy o výsledcích analýz musí obsahovat dostatečné údaje, které umožní hodnocení výsledků podle přílohy IV a přílohy VIII.4. Výsledky analýzy se považují za přípustné, pokud byly získány v souladu s kritérii přijatelnosti popsanými v metodě interní kontroly jakosti uvedené v odstavci 1 a s interními normami přesnosti uvedenými v odstavci 2.Článek 6Organoleptické hodnocení1. Pokud jde o máslo, práce posuzovatelů a spolehlivost výsledků se ověřují pomocí metod uvedených v příloze VI. posuzovatel. Metoda popsaná v příloze VII se použije jako referenční metoda pro organoleptické hodnocení..2. Pokud jde o mléko a mléčné výrobky jiné než máslo, členské státy použijí jako referenční metodu pro organoleptické hodnocení buď normu IDF 99C/1997 nebo jiné srovnatelné metody, které sdělí Komisi.Metody popsané v příloze VI mohou být použity pro ověření práce posuzovatelů a spolehlivosti výsledků.Článek 7Odběr vzorků a námitky proti výsledkům analýz1. Pro analýzy stanovené v právních předpisech Společenství se musí odebírat duplicitní vzorky.2. V případě, že hospodářský subjekt nesouhlasí s výsledky určité analýzy, použije se postup popsaný v příloze VIII.KAPITOLA IIMETODY ANALÝZYČlánek 8Obsah vody, tukuprosté sušiny a tuku v másle1. Ke stanovení obsahu vody v másle se jako referenční metoda použije metoda analýzy popsaná v příloze IX.2. Ke stanovení obsahu tukuprosté sušiny v másle se jako referenční metoda použije metoda analýzy popsaná v příloze X.3. Ke stanovení obsahu tuku v másle se jako referenční metoda použije metoda analýzy popsaná v příloze XI.Článek 9Stopovací látky1. Ke stanovení obsahu vanilinu v zahuštěném másle, másle a smetaně se jako referenční metoda použije metoda analýzy popsaná v příloze XII.2. Ke stanovení obsahu etylesteru beta-apo-8’karotenové kyseliny v zahuštěném másle a másle se jako referenční metoda použije metoda analýzy popsaná v příloze XIII.3. Ke stanovení obsahu β-sitosterolu nebo stigmasterolu v zahuštěném másle a másle se jako referenční metoda použije metoda analýzy popsaná v příloze XIV.4. Pokud získané výsledky odpovídají technickým specifikacím bodu 8 příloh uvedených v odstavcích 1, 2 a 3, pak stopovací látky byly do zahuštěného másla, másla a smetany přidány v souladu s příslušnými právními předpisy Společenství.Článek 10Zjišťování kaseinu z kravského mléka1. Je nutné zaručit, že sýry, které musí být vyráběny výhradně z ovčího mléka, kozího mléka či buvolího mléka, nebo ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka, neobsahují kasein z kravského mléka, a za tímto účelem se použije referenční metoda analýzy popsaná v příloze XV.Přítomnost kaseinu z kravského mléka se považuje za prokázanou, pokud zřejmý obsah kaseinu z kravského mléka ve vzorku určeném k analýze je stejný nebo vyšší v porovnání s obsahem v referenčním vzorku obsahujícím 1 % kravského mléka, který je popsán v příloze XV.2. Rutinní metody ke zjišťování kaseinu z kravského mléka v sýrech uvedených v odstavci 1 mohou být používány za těchto podmínek:a) jejich detekční limit musí být nejvýše 0,5 %;b) jejich výsledky nesmí být falešně pozitivní;c) musí umožňovat detekci kaseinu z kravského mléka s požadovanou citlivostí i po dlouhé době zrání, k čemuž může za běžných obchodních podmínek docházet.Jestliže není splněna podmínka stanovená v písmenu b), pak všechny vzorky vykazující pozitivní výsledek musí být analyzovány pomocí referenční metody.Jestliže není u jednoho z druhů sýrů uvedených v odstavci 1 splněn požadavek stanovený v písmenu c), musí být tento sýr analyzován pomocí referenční metody.Článek 11Zjišťování koliformních bakterií1. Ke zjišťování přítomnosti koliformních bakterií v másle, sušeném odstředěném mléku, kaseinu a kaseinátech se použije referenční metoda analýzy popsaná v příloze XVI.2. Rutinní metody pro zjišťování přítomnosti koliformních bakterií lze používat za předpokladu, že jejich výsledky jsou srovnatelné s výsledky získanými referenční metodou, která je v uvedené příloze popsána. Rutinní metody musí mít zejména dostatečný detekční limit. Nesmí se vyskytovat falešně negativní výsledky. Nelze-li vyloučit výskyt falešně pozitivních výsledků, musí být všechny pozitivní výsledky potvrzeny pomocí referenční metody.Článek 12Obsah laktosyMetoda stanovení obsahu laktosy v produktech kódu KN 2309 je popsána v příloze XVII.Článek 13Zjišťování syřidlové syrovátky1. Metoda zjišťování syřidlové syrovátky v sušeném odstředěném mléce určeném pro veřejné skladování je popsána v příloze XVIII.2. Metoda zjišťování syřidlové syrovátky v sušeném odstředěném mléce a směsích určených k použití jako krmivo je popsána v příloze XIX.Článek 14Zjišťování podmáslíMetoda zjišťování podmáslí v sušeném odstředěném mléce je popsána v příloze XX.Článek 15Zbytky antimikrobiálních látekMetoda zjišťování zbytků antibiotik a sulfonamidů/dapsonu v sušeném odstředěném mléce je popsána v příloze XXI.Článek 16Obsah sušeného odstředěného mlékaMetoda stanovení obsahu sušeného odstředěného mléka v krmných směsích je popsána v příloze XXII.Článek 17Zjišťování škrobuMetoda zjišťování škrobu v sušeném odstředěném mléku, denaturovaném sušeném mléku a krmných směsích je popsána v příloze XXIII.Článek 18Obsah vlhkosti v sušeném kysaném podmáslíMetoda stanovení obsahu vlhkosti v sušeném kysaném podmáslí určeném k použití v krmných směsích je popsána v příloze XXIV.Článek 19Zjišťování cizích tukůMetoda zjišťování cizích tuků v mléčných tucích je popsána v příloze XXV.KAPITOLA IIIZÁVĚREČNÁ USTANOVENÍČlánek 20Změny nařízení (ES) č. 2771/1999Nařízení (ES) č. 2771/1999 se mění takto:1. v čl. 4 odst. 1 se první věta nahrazuje tímto: "Příslušné orgány kontrolují jakost másla s použitím metod uvedených v příloze I a s použitím vzorků odebraných podle pravidel uvedených v příloze IV".;2. v příloze I se poznámka pod čarou č. 2 nahrazuje tímto: "Viz přílohu I nařízení (ES) č. 213/2001".;3. zrušují se přílohy II a III;4. v příloze IV bodu 2 se v předposlední větě slova "podle přílohy III" nahrazují slovy "podle přílohy VII nařízení (ES) č. 213/2001".Článek 21Změny nařízení (ES) č. 2799/1999Nařízení (ES) č. 2799/1999 se mění takto:1. v čl. 20 se odstavce 1, 2, 3 a 4 nahrazují tímto:"1. Obsah sušeného odstředěného mléka ve směsích a krmných směsích je stanoven na základě analýzy každého vzorku provedené nejméně dvakrát podle metody popsané v příloze XXII nařízení (ES) č. 213/2001, a současně na základě kontrolních opatření uvedených v čl. 17 odst. 3 tohoto nařízení. V případě nesrovnalostí mezi výsledky těchto kontrol je rozhodující výsledek kontrol provedených na místě.2. Nepřítomnost syřidlové syrovátky se stanoví metodou uvedenou v příloze XIX nařízení (ES) č. 213/2001.3. Obsah škrobu v krmných směsích se stanoví na základě kontrolních opatření uvedených v čl. 17 odst. 3 tohoto nařízení, které musí být doplněny metodou analýzy popsanou v příloze XXIII nařízení (ES) č. 213/2001.4. Obsah vlhkosti v sušeném kysaném podmáslí se stanoví pomocí metody analýzy popsané v příloze XXIV nařízení (ES) č. 213/2001."2. Zrušují se přílohy III, IV, V a VI.Článek 22Zrušující ustanoveníZrušují se nařízení (EHS) č. 1216/68, (EHS) č. 3942/92, (ES) č. 86/94, (ES) č. 2721/95, (ES) č. 1854/96, (ES) č. 1080/96, (ES) č. 1081/96, (ES) č. 1082/96, (ES) č. 880/98 a (ES) č. 1459/98.Odkazy na zrušená nařízení se považují za odkazy na toto nařízení.Článek 23Vstup v platnostToto nařízení vstupuje v platnost sedmým dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství.Metody stanovené v přílohách III, IV bod 4, V, VI a VIII se však použijí po uplynutí 18 měsíců od vstupu tohoto nařízení v platnost.Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.V Bruselu dne 9. ledna 2001.Za KomisiFranz Fischlerčlen Komise[1] Úř. věst. L 160, 26.6.1999, s. 48.[2] Úř. věst. L 333, 24.12.1999, s. 11.[3] Úř. věst. L 340, 31.12.1999, s. 3.[4] Úř. věst. L 350, 20.12.1997, s. 3.[5] Úř. věst. L 76, 25.3.2000, s. 9.[6] Úř. věst. L 298, 12.11.1985, s. 9.[7] Úř. věst. L 11, 16.1.1999, s. 14.[8] Úř. věst. L 45, 21.2.1990, s. 8.[9] Úř. věst. L 16, 21.1.1999, s. 19.[10] Úř. věst. L 279, 11.10.1990, s. 22.[11] Úř. věst. L 325, 17.12.1999, s. 10.[12] Úř. věst. č. L256, 7.9.1987, s. 1.[13] Úř. věst. L 28, 3.2.2000, s. 16.--------------------------------------------------PŘÍLOHA I(Článek 2)SEZNAM REFERENČNÍCH METODSeznam zkratek:min. = minimummax. = maximumpříloha = příloha citovaného nařízeníTPS = tukuprostá sušinaVMK = volné mastné kyselinyPČ = peroxidové čísloV = vzhledCH = chuťK = konsistenceCPB = celkový počet bakteriíTerm. = počet termofilních bakteriíČS = členský státIDF = Mezinárodní mlékařská federaceISO = Mezinárodní organizace pro normalizaciIUPAC = Mezinárodní unie čisté a aplikované chemieADPI = Americký ústav mléčných výrobkůSKM = slazené kondenzované mlékoZMS = zahuštěné mléko nebo smetanaMTPS = mléčná tukuprostá sušina.Poznámka 1 : Izolace mléčného tuku dle popisu v normě IDF 6B:1989 (ochrana před světlem).Poznámka 2 : Nebyla stanovena žádná referenční metoda.Poznámka 3 : Vzorek je nutno připravit podle normy IDF 122C:1996 nebo normy IDF 73A:1985.Poznámka 4 : Inkubace po dobu 48 hodin při teplotě 55 °C; je třeba zabránit vyschnutí živné půdy kultury.Poznámka 5 : %TPS = % sušiny - % tukuPoznámka 6 : Máslo musí odpovídat jakostní třídě členského státu výroby uvedené v příloze V Nařízení Komise (ES) č. 2771/1999Poznámka 7 : Směrnice Komise 84/4/EHSPoznámka 8 : Nařízení Komise (ES) č. 1758/94 (Úř. věst. L 183, 19.7.1994, s. 14).Poznámka 9 : Směrnice Komise 78/633/EHS.ČĮST ANařízení Komise | Produkt | Parametr | Mezní hodnota | Referenční metoda | Poznámka |Nařízení (ES) č. 2771/1999 Veřejné skladování (Úř. věst. L 333, 24.12.1999, s. 11) | Nesolené máslo | Mléčný tuk | Min. 82 % | Příloha XI | |Voda | Max. 16 % | Příloha IX | |TPS | Max. 2 % | Příloha X | |VMK (max.) | 1,2 mmol/100 g tuku | Norma IDF 6B:1989 | |PČ (max.) | 0,3 mekv. O2/1000 g tuku | Norma IDF 74A:1991 (anglická verze) | Poznámka 1 |Koliformní bakterie | Nezjistitelné v 1 g | Příloha XVII | Poznámka 3 |Jiný než mléčný tuk | Nezjistitelný analýzou triglyceridů | Příloha XXVI | |Stopovací látky: steroly | Nezjistitelné | Příloha XIV | |Jiné stopovací látky | | | |—vanilin | Nezjistitelný | Příloha XII | |—ethylester karotenové kyseliny | Nezjistitelný | Příloha XIII | |—triglyceridy enanthové kyseliny | Nezjistitelné | IUPAC 2 301 sub 5 | |Organoleptické vlastnosti | Nejméně 4 body z 5 pro A, G a C | Příloha VII | |Vodní disperze | Nejméně 4 body | Norma IDF 112A:1989 | |Nařízení (ES) č. 2771/1999 Soukromé skladování | Nesolené máslo | Mléčný tuk | Min. 82 % | Příloha XI | Poznámka 6 |Voda | Max. 16 % | Příloha IX | |Nařízení (ES) č. 2771/1999 Soukromé skladování | Solené máslo | Mléčný tuk | Min. 80 % | Příloha XI | Poznámka 6 |Voda | Max. 16 % | Příloha IX | |Sůl | Max. 2 % | Norma IDF 12B:1988 | |Nařízení (ES) 2571/97 (Úř. věst č. L 350, 20.12.1997, s. 3) | Nesolené máslo | Mléčný tuk | Min. 82 % | Příloha XI | |Voda | Max. 16 % | Příloha IX | |Stopovací látky | | | |—steroly | | Příloha XIV | |—vanilin | | Příloha XII | |—ethylester karotenové kyseliny | | Příloha XIII | |—triglyceridy enanthové kyseliny | | IUPAC 2 301 sub 5 | |Nařízení (ES) 2571/97 | Solené máslo | Mléčný tuk | Min. 80 % | Příloha XI | |Voda | Max. 16 % | Příloha IX | |Sůl | Max. 2 % | Norma IDF 12B:1988 | |Stopovací látky: | | | |steroly | | Příloha XIV | |vanilin | | Příloha XII | |ethylester karotenové kyseliny | | Příloha XIII | |triglyceridy enanthové kyseliny | | IUPAC 2 301 sub 5 | |Nařízení (ES) č. 2571/97 | Zahuštěné máslo | Mléčný tuk | Min. 99,8 % | Norma IDF 24:1964 | |Vlhkost a MTPS | Max. 0,2 % | Norma IDF 23A:1988 (vlhkost) Norma IDF 24:1964 (MSNF) | |VMK (max.) | Max. 0,35 % (kyselina olejová) | Norma IDF 6B:1989 | |PČ (max.) | 0,5 mekv. O2/1000 g tuku | Norma IDF 74A:1991 (anglická verze) | Poznámka 1 |Jiný než mléčný tuk | Nepřítomen | Příloha XXV | |Chuť | Čistá | | |Vůně | Bez cizích vůní | | |Ostatní | Nepřítomnost neutralizačních činidel, antioxidantů a konzervačních látek | | |Stopovací látky | | | |—steroly | | Příloha XIV | |—vanilin | | Příloha XII | |—ethylester karotenové kyseliny | | Příloha XIII | |—triglyceridy enanthové kyseliny | | IUPAC 2 301 sub 5 | |Nařízení (ES) č. 2571/97 | Smetana | Tuk | 35 % | Norma IDF 16C:1987 | |Stopovací látky: | | | |—steroly | | Metody schválené příslušným orgánem | Poznámka 2 |—vanilin | | Příloha XII | |—ethylester karotenové kyseliny | | Metody schválené příslušným orgánem | Poznámka 2 |—triglyceridy enanthové kyseliny | | IUPAC 2 301 sub 5 | |Nařízení (EHS) č. 429/90 (Úř. věst. L 45, 21.2.1990, s. 8) | Zahuštěné máslo | Mléčný tuk | Min. 96 % | Metody schválené příslušným orgánem | Poznámka 2 |TPS | Max. 2 % | Metody schválené příslušným orgánem | Poznámka 2 |Stopovací látky: | | | |—stigmasterol (95 %) | 15 g/100 kg zahuštěného másla | Příloha XIV | |—stigmasterol (85 %) | 17 g/100 kg zahuštěného másla | Příloha XIV | |—triglyceridy enanthové kyseliny | 1,1 kg/100 kg zahuštěného másla | IUPAC 2 301 sub 5 | |—ethylester kyseliny máselné a stigmasterol | Viz přílohu, bod 1 písm.c) | Příloha XIV | Poznámka 2 |—lecithin (E 322) | Max. 0,5 % | Metody schválené příslušným orgánem | Poznámka 2 |NaCl | Max. 0,75 % | Norma IDF 12B:1988 | |FFA | Max. 0,35 % (olejová)) | Norma IDF 6B:1989 | |PV (max.) | Až 0,5 mekv. O2/1000 g tuku | Norma IDF 74A:1991 (anglická verze) | Poznámka 1 |Chuť | Čistá | | |Vůně | Nepřítomnost cizích vůní | | |Jiné | Nepřítomnost neutralizačních činidel, antioxidantů a konzervačních činidel | | |Nařízení (EHS) č. 2191/81 (Úř. věst. L 213, 1.8.1981, s. 20) | Nesolené máslo | Mléčný tuk | Min. 82 % | Příloha XI | |Voda | Max. 16 % | Příloha IX | |Nařízení (ES) č. 2191/81 | Solené máslo | Mléčný tuk | Min. 80 % | Příloha XI | |Voda | Max.16 % | Příloha IX | |Sůl | Max. 2 % | Norma IDF 12B:1988 | |Článek 9 a hlava II nařízení (ES) č. 1255/1999 | Sýry vyráběné z ovčího a/nebo kozího mléka | Kravské mléko | < 1 % | Příloha XV | |Nařízení (EHS) č. 2921/90 | Příloha I - Kyselý kasein | Voda | Max. 2,00 % | Norma IDF 78C:1991 | |Tuk | Max. 1,75 % | Norma IDF 127A:1988 | |Volné kyseliny | Max. 0,30 % (jako kyselina mléčná) | Norma IDF 91:1979 | |Nařízení (EHS) č. 2921/90 | Příloha I - Syřidlový kasein | Voda | Max. 12 % | Norma IDF 78C:1991 | |Tuk | Max. 1 % | Norma IDF 127A:1998 | |Popeloviny | Min. 7,50 % | Norma IDF 90:1979 | |Nařízení (EHS) č. 2921/90 | Příloha I - Kaseináty | Voda | Max. 6,00 % | Norma IDF 78C:1991 | |Mléčná bílkovina | Min. 88,00 % | Norma IDF 92/1979 | |Tuk a popeloviny | Max. 6,00 % | Norma IDF 127A:1988 Norma IDF 89:1979 nebo | |Nařízení (EHS) č. 2921/90 | Příloha II - Kyselý kasein | Voda | Max. 10,00 % | Norma IDF 78C:1991 | |Tuk | Max. 1,50 % | Norma IDF 127A:1988 | |Volné kyseliny | Max. 0,20 % (jako kyselina mléčná) | Norma IDF 91:1979 | |CPB (max.) | 30000 1/g | Norma IDF 100B:1991 | Poznámka 3 |Koliformní bakterie | Nepřítomnost v 0,1 g | Příloha XVI | Poznámka 3 |Term. (max.) | 5000 1/g | Norma IDF 100B:1991 | Poznámky 3 a 4 |Nařízení (EHS) č. 2921/90 | Příloha II - Syřidlový kasein | Voda | Max. 8,00 % | Norma IDF 78C:1991 | |Tuk | Max. 1,00 % | Norma IDF 127A:1988 | |Popeloviny | Min. 7,50 % | Norma IDF 90:1979 | |CPB (max.) | 30000 1/g | Norma IDF 100B:1991 | Poznámka 3 |Koliformní bakterie | Nepřítomnost v 0,1 g | Příloha XVI | Poznámka 3 |Term. (max.) | 5000 1/g | Norma IDF 100B:1991 | Poznámky 3 a 4 |Nařízení (EHS) č. 2921/90 | Příloha II - Kaseináty | Voda | Max. 6,00 % | Norma IDF 78C:1991 | |Mléčná bílkovina | Min. 88,00 % | Norma IDF 92:1979 | |Tuk a popeloviny | Až 6,00 % | Norma IDF 127A:1988 Norma IDF 89:1979 nebo 90:1979 | |CPB (max.) | 30000 1/g | Norma IDF 100B:1991 | Poznámka 3 |Koliformní bakterie | Nepřítomnost v 0,1 g | Příloha XVI | Poznámka 3 |Term. (max.) | 5000 1/g | Norma IDF 100B:1991 | Poznámky 3 a 4 |Nařízení (EHS) č. 2921/90 | Příloha III - Kaseináty | Voda | Max. 6,00 % | Norma IDF 78C:1991 | |Mléčná bílkovina | Min. 85,00 % | Norma IDF 92:1979 | |Tuk | Max. 1,50 % | Norma IDF 127A:1988 | |Laktosa | Max. 1,00 % | Norma IDF 106:1982 | |Popeloviny | Max. 6,50 % | Norma IDF 89:1979 nebo 90:1979 | |CPB (max.) | 30000 1/g | Norma IDF 100B:1991 | Poznámka 3 |Koliformní bakterie | Nepřítomnost v 0,1 g | Příloha XVI | Poznámka 3 |Term. (max.) | 5000 1/g | Norma IDF 100B:1991 | Poznámky 3 a 4 |Nařízení (ES) č. 2799/1999 (Úř. věst. L 340, 31.12.1999, s. 3) | Krmné směsi a sušené odstředěné mléko (SOM) (pro použití v krmivech) | Voda (sušené kysané podmáslí) | Max. 5 % | | |Bílkoviny | 31,4 % (min.) v tukuprosté sušině | Norma IDF 20B:1993 | |Voda (SOM) | Max. 5 % | Norma IDF 26A:1993 | |Tuky (SOM) | Max. 11 % | Norma IDF 9C:1987 | |Syřidlová syrovátka (SOM) | Nepřítomna | Příloha XIX | Poznámka 7 |Škrob (SOM) | Nepřítomen | Příloha XXIII | |Voda (směsi) | Max. 5 % v tukuprosté sušině | Norma IDF 26A:1993 | |Tuky (směsi) | - | Směrnice Komise 84/4/EHS (Úř. věst. L 15, 18.1.1984, s. 28) | |Syřidlová syrovátka (směsi) | Nepřítomna | Příloha XIX | |Obsah SOM (v konečném výrobku) | Min. 50 % | Příloha XXII | Poznámka 7 |Tuky (v konečném výrobku) | Min. 2,5 % nebo 5 % | Směrnice Komise 84/4/EHS | Poznámka 8 |Škrob (v konečném výrobku) | Min. 2 % | Příloha XXIII | Poznámka 9 |Měď (v konečném výrobku) | 25 ppm | Směrnice Komise 78/633/EHS (Úř. věst. L 206, 26.7.1987, s. 43) | |Nařízení (ES) č. 322/96 (Úř. věst. L 45, 23.2.1996, s. 5) | SOM (sušené rozprašováním) | Tuk | Max. 1 % | Norma IDF 9C:1987 | |Bílkoviny | 31,4 % (min.) v tukuprosté sušině | Norma IDF 20B:1993 | |Voda | Max. 3,5 % | Norma IDF 26A:1993 | |Kyselost (N/10 NaOH) | Max. 19,5 ml | Norma IDF 86:1981 | |Mléčnany | Max. 150 mg/100 g | Norma IDF 69B:1987 | |Fosforečnany | Negativní | Norma ISO 3356:1975 | |Rozpustnost | Max. 0,5 ml při 24 °C | Norma IDF 129A:1988 | |Připálené částice | Filtr B min. (15,0 mg) | ADPI: 1990 | |CPB | 40000/1 g | Norma IDF 100B:1991 | Poznámka 3 |Koliformní bakterie | Negativní v 0,1 g | Příloha XVI | Poznámka 3 |Podmáslí | Negativní | Příloha XX | |Syřidlová syrovátka | Negativní | Příloha XVIII | |Kyselá syrovátka | Negativní | Metoda schválená příslušným orgánem | Poznámka 2 |Antimikrobiální látky | | Příloha XXI | |ČÁST BReferenční metody uvedené v části B mohou být používány pro analýzu produktů, na které se vztahuje jakéhokoliv z nařízení uvedených ve sloupci 1.Nařízení Komise | Produkt | Kód KN | Parametr | Mezní hodnota | Referenční metoda | Poznámka |Nařízení (EHS) č. 2658/87 (Úř. věst. L 256, 7.9.1987, s. 1) Nařízení (ES) č. L 2414/98 (Úř. věst. L 299, 10.11.1998, s. 7) Nařízení (ES) č. 1374/98 (Úř. věst. L 185, 30. 6. 1998 s. 21) Nařízení (ES) č. 2508/97 (Úř. věst. L 345, 16.12.1997, s. 31) Nařízení (ES) č. 174/1999 (Úř. věst. L 20, 27.1.1999, s. 8) | Mléko a smetana, nezahuštěné, neobsahující přidaný cukr ani jiná sladidla | 0401 | Tuk (£6 %) | Mezní hodnoty jsou hodnoty stanovené v popisu kódu KN pro konkrétní produkt, případně ještě blíže určené v nařízení Komise (EHS) č. 3846/87 (Úř. věst. L 366, 24.12.1987, s. 1), část 9 vývozní nomenklatury, nebo v nařízení (ES) č. 1374/98 (Úř. věst. L 185, 30.6.1998, s. 21). | Norma IDF 1D:1996 | |Tuk (> 6 %) | Norma IDF 16C:1987 | |Mléko a smetana, zahuštěné nebo obsahující přidaný cukr nebo jiná sladidla | 0402 | Tuky (v tekuté formě) | Norma IDF 13C:1987 | |Tuky (v tuhé formě) | Norma IDF 9C:1987 | |Bílkoviny | Norma IDF 20B:1993 | |Sacharosa (normální obsah) | Norma IDF 35A:1992 | |Sacharosa (nízký obsah) | Metody schválené příslušným orgánem | Poznámka 2 |Sušina (SKM) | Norma IDF 15B:1991 | |Sušina (ZMS) | Norma IDF 21B:1987 | |Voda (mléko a sušená smetana) | Norma IDF 26A:1993 | |Podmáslí, fermentované nebo okyselené mléko a smetana, zahuštěné nebo nezahuštěné, obsahující přidaný cukr nebo jiná sladidla. | 0403 | Tuk | Normy IDF 1D:1996, 9C:1987, 16C:1987,22B:1987,126A:1988 | |Bílkoviny | Norma IDF 20B:1993 | |Sacharosa (normální obsah) | Norma IDF 35A:1992 | |Sacharosa (nízký obsah) | Metody schválené příslušným orgánem | Poznámka 2 |Voda (sušené kysané podmáslí) | Příloha XXIV | |Voda (sušené sladké podmáslí) | Norma IDF 26A:1993 | |Sušina (ostatní produkty) | Metody schválené příslušným orgánem | |Syrovátka, též zahuštěná, nebo obsahující přidaný cukr nebo jiná sladidla; produkty složené z přírodních složek mléka | 0404 | Tuk | Normy IDF 9C:1987, 16C:1987, 22B:1987, | |Bílkoviny | Norma IDF 20B:1993 | |Sacharosa (normální obsah) | Norma IDF 35A:1992 | |Sacharosa (nízký obsah) | Metody schválené příslušným orgánem | Poznámka 2 |040490 | Bílkoviny | Norma IDF 20B:1993 | |Voda | Norma IDF 26A:1993 | |Sušina | Norma IDF 15B:1991 | |(Zahuštěné výrobky) | Norma IDF 21B:1987 | |Máslo a jiné tuky a oleje získané z mléka; mléčné pomazánky | 0405 | Tuk (je-li £ 85 %) | Příloha XI | |Voda | Příloha IX | |Máslo | TPS | Příloha X | |NaCl | Norma IDF 12B:1998 | |Máselný olej | Tuk (je-li > 99 %) | Norma IDF 24:1964 | |Voda (je-li tuk <99 %) | Norma 23A:1988 | |Sýry a tvaroh | 0406 | Tuk | Norma IDF 5B:1986 | |Sušina | Norma IDF 4A:1982 | |Sušina (Ricotta) | Norma IDF 58:1970 | |NaCl | Norma IDF 88A:1988 | |Laktosa | Norma IDF 79B:1991 | |Nařízení (EHS) č. 2658/87 | Krmné směsi | 2309 | Laktosa | | Příloha XVII | |--------------------------------------------------PŘÍLOHA II(Článek 3)KONTROLA VÝSLEDKŮ, KTERÉ BYLY ZÍSKÁNY RUTINNÍMI METODAMI A KTERÉ SE BLÍŽÍ MEZNÍM HODNOTÁM STANOVENÝM V JEDNOTLIVÝCH NAŘÍZENÍCH, POKUD JDE O SLOŽENÍ A JAKOSTJestliže mo je mezní hodnota pro složení a jakostní znaky stanovené v nařízení, pak rozhodovací mezní hodnota (L) je:L = mojestliže RRout/Rref ≤1R Rout : mezní hodnota reprodukovatelnosti rutinní metodyRref : mezní hodnota reprodukovatelnosti referenční metodyJe-li mo horní mezní hodnota a RRout/Rref > 1, pak rozhodovací mezní hodnota se vypočte pomocí vzorceL = m-R/R·CrD95Pokud za stejných podmínek je mo dolní mezní hodnota, rozhodovací mezní hodnota se vypočte pomocí vzorce:L = m+R/R·CrD95kde CrD95 je kritický rozdíl referenční metody (viz přílohu IV).Pokud je mo horní mezní hodnota, pak konečný výsledek, který byl získán při použití rutinní metodya který je vyšší než rozhodovací mezní hodnota, musí být nahrazen konečným výsledkem získaným při použití referenční metody. Tento konečný výsledek musí být podložen nejméně stejným počtem analýz a vzorků jako konečný výsledek získaný rutinní metodou.Pokud je mo dolní mezní hodnota, pak v případě konečného výsledku, který byl získán rutinní metodou a je nižší než rozhodovací mezní hodnota, musí být použit stejný postup.PoznámkaVýše uvedený postup lze použít, jestliže neexistuje žádný zjistitelný matricový efekt.Matricový efekt lze zjistit takto: pro každý vzorek použitý pro kalibraci se vypočte rozdíl (w) mezi výsledky získanými při použití referenční metody a při použití rutinní metody.Směrodatná odchylka vypočtená podle vzorces=∑ wi2/2mm : kde m je počet vzorků použitých pro kalibraci, se porovná s aritmetickým průměrem směrodatné odchylky opakovatelnosti referenční a rutinní metody:ss+srrout2/2Matricový efekt nelze vyloučit, jestliže+++++ TIFF +++++kdef = m (f: počet stupňů volnosti)α = pravděpodobnost chyby; α = 0,05.V tomto případě je nutné další šetření, aby bylo možné stanovit rozhodovací mezní hodnotu.--------------------------------------------------PŘÍLOHA III(Články 4 a 5)a) Postup, kterým se ověřuje dodržování stanovené mezní hodnoty reprodukovatelnosti (chemická analýza)Dodržování mezní hodnoty reprodukovatelnosti se ověřuje porovnáním laboratorních výsledků s výsledky zkušené laboratoře [1], které byly získány u stejného vzorku. Obě laboratoře provádějí stanovení dvakrát a výsledky se vyhodnocují pomocí vzorce:CrD|yy=r2kde:CrD95 : kritický rozdíl (P = 0,95)y-1 : aritmetický průměr dvou výsledků získaných v laboratoři 1y-2 : aritmetický průměr dvou výsledků získaných v laboratoři 2R : mezní hodnota reprodukovatelnosti: nutno stanovit interpolacír : mezní hodnota opakovatelnosti: pokud se přesnost mění podle koncentrace.Pokud je překročen kritický rozdíl, musí být do dvou měsíců provedena jiná zkouška. Pokud výsledky tohoto druhého pokusu ukáží, že mezní hodnota reprodukovatelnosti není dodržena, příslušné orgány musí přijmout nezbytná opatření.b) Postup, kterým se stanoví prozatímní mezní hodnota reprodukovatelnosti (chemická analýza)Prozatímní mezní hodnota reprodukovatelnosti (Rprov) se stanoví pomocí této rovnice:R=Y+r22kde:Y-1 : průměr dvou výsledků získaných v laboratoři 1y-2 : průměr dvou výsledků získaných v laboratoři 2 (viz přílohu IIIa)r : mezní hodnota opakovatelnosti nebo prozatímní mezní hodnota opakovatelnosti.Poznámky:1. Rprov lze použít pro výpočet kritických rozdílů (viz přílohu VI).2. Rprov se stanoví na 2r, jestliže je vypočtená hodnota Rprov menší než 2r.3. RSDR c [2], potom je hodnota Rprov nepřijatelně vysoká a nelze ji pro výpočet kritického rozdílu použít.4. Rprov je třeba vypočítávat nejméně jednou za rok na základě výsledků získaných ve dvou laboratořích (viz přílohu IV).5. Pro výpočet kritického rozdílu musí být používána střední hodnota Rprov. Pro střední hodnotu Rprov platí pravidla uvedená v bodech 2 a 3.Mezní hodnota reprodukovatelnosti (hodnota R) se získá z vypočtené hodnoty RSDR takto:R = 0,0283RSDRx- : aritmetický průměr získaných výsledků.Některé vypočtené hodnoty RSDR (příklady):Koncentrace | RSDR (%) |1 g/100 g | 4 |0,01 g/100 g | 8 |1 mg/1000 g | 16 |Při koncentraci analytu 1 g/100 g se získá:R = 0,0283*1*4 = 0,11 g/100 g.[1] Obecně lze říci, že zkušenou laboratoří musí být laboratoř, která uspěla při validaci zkušební metody nebo při zkoušce odborné způsobilosti.[2] koncentrace vyjádřená jako desetinný zlomek (příklad: 10 g/100 g = 0,1).Literatura:Peeler, J. T, Horwitz, W. a Albert R.J. Ass. Off. Anal. Chem.72(5), 784-806 (1989).--------------------------------------------------PŘÍLOHA IV(Článek 4)HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ ANALÝZY ZÍSKANÝCH PŘI POUŽITÍ VALIDOVANÝCH METODPokud výsledek analýzy ukáže, že byla překročena určitá mezní hodnota, vypočte se aritmetický průměr dvou nebo více výsledků. Použije se tento postup:1. V případě, že výsledek analýzy představuje jediný výsledek, musí být za podmínek opakovatelnosti provedena druhá analýza. Jestliže nelze obě analýzy provést za podmínek opakovatelnosti, je nutné provést další duplicitní analýzu za podmínek opakovatelnosti a použít těchto výsledků pro posouzení, zda byl dodržen kritický rozdíl.2. Vypočte se absolutní hodnota rozdílu mezi aritmetickým průměrem výsledků získaných za podmínek opakovatelnosti a mezní hodnotou. Je-li absolutní hodnota tohoto rozdílu větší než kritický rozdíl, znamená to, že analyzovaný vzorek nesplňuje požadavky.Kritický rozdíl se vypočte podle tohoto vzorce:CrDy- m=2nkde:y- : aritmetický průměr získaných výsledkůmo : mezní hodnotan : počet analýz/vzorkůPokud se přesnost mění podle koncentrace, může být nutné stanovit hodnoty r a R interpolací.Konečný výsledek udávaný pro určitý vzorek musí za normálních okolnostíukázat, že mezní hodnota byla dodržena.Konečné výsledky- v rozmezí ma m+ CrD, jestliže je mezní hodnota maximem;- v rozmezí ma m+ CrD, jestliže je mezní hodnota minimem,by se měly tudíž vyskytovat pouze výjimečně.Konečné výsledky, jejichž hodnoty se nacházejí v uvedeném rozmezí, jsou přijatelné pouze tehdy, pokud se vyskytnou nejvýše jednou u každých pěti vzorků analyzovaných v rámci jedné šarže. Pokud se z každé šarže analyzuje méně než pět vzorků, je přijatelný jeden výsledek nacházející se ve zmíněném rozmezí. Pokud však jde o šarže dodávané opakovaně od určitého výrobce, musí být použito pravidlo, podle kterého se získá jen jeden výsledek v rámci uvedeného rozmezí na každých pět analyzovaných vzorků.3. Jestliže se konečný výsledek x vypočte podle vzorce x = y1 ± y2 (příklad: voda a obsah sušiny v másle pro výpočet obsahu tuku), kde y1 a y2 jsou konečné výsledky jednoho druhu analýzy, potom se celkové mezní hodnoty opakovatelnosti a reprodukovatelnosti rx a Rx konečných výsledků x vypočítají takto:r=2r12+r22R=2R12+R22kde r1 a r2 jsou mezní hodnoty opakovatelnosti a R1 a R2 mezní hodnoty reprodukovatelnosti y1 a y2.Hodnota x se porovnává s mezní hodnotou mo podle pravidel stanovených v bodech 1 a 2. Kritický rozdíl se vypočte podle vzorce:CrDx -m=2nkde x je aritmetický průměr získaných výsledků x1.4. Je-li konečný výsledek vypočítáván podle vzorce ve tvarux =yy2(příklad: obsah tuku v sušině sýra)kde y1 a y2 jsou konečné výsledky jednoho druhu analýzy, potom lze celkové mezní hodnoty opakovatelnosti a reprodukovatelnosti rx a Rx vypočítat takto:r= μx2r*12+ r*22R= μx2R*12+ R*22μ=l μ2μ1 : mezní či cílová hodnota pro y1 (příklad: tuk)μ2 : mezní či cílová hodnota pro y2 (příklad: sušina)r=rμ≤ 0,15r=rμ≤0,15kder1 : mezní hodnota opakovatelnosti, y1r2 : mezní hodnota opakovatelnosti, y2R=Rμ≤ 0,15r=Rμ≤ 0,15kdeR1 : mezní hodnota reprodukovatelnosti, y1R2 : mezní hodnota reprodukovatelnosti, y2Postupy výpočtu rx a Rx jsou použitelné pouze tehdy, pokud relativní mezní hodnoty opakovatelnosti a reprodukovatelnosti (r1*, r2*, R1*, R2) se rovnají 0,15 nebo jsou menší než 0,15.Hodnota x se porovnává s mezní hodnotou μx podle pravidel stanovených v bodech 1 a 2. Kritický rozdíl se stanoví podle vzorce:CrDx-μ=2nkde-je aritmetický průměr výsledků x získaných chronologicky [1].[1] Poznámka:Jestliže se například získají výsledky y11, y12, y21 a y22, musí být vypočten aritmetický průměr y11/y21 a y12/y22.--------------------------------------------------PŘÍLOHA VVNITŘNÍ KONTROLA(Článek 5)a) Metoda vnitřní kontroly jakosti (VKJ) (chemická analýza)Definice kontrolního materiáluMateriál používaný pro účely VKJ musí projít stejným procesem, případně částí stejného procesu jako materiály, u nichž se provádí zkouška.Kontrolním materiálem může být:- certifikovaný referenční materiál,- interní referenční materiál,- materiál schválený na základě mezilaboratorních zkoušek,- obohacený materiál.Postup pro zavedení VKJLaboratoř musí zavést VKJ postupem popsaným v dokumentu IUPAC "Harmonizované pokyny pro vnitřní kontrolu jakosti v analytických laboratořích" [1].V rámci VKJ se do analytických postupů zařazují kontrolní materiály nebo se zopakuje analýza zkušebního vzorku. Kontrolní materiály musí být svým chemickým složením podobné zkušebním vzorkům a dostatečně stabilní po nezbytnou dobu. Musí být doloženo, že pro analýzu mohou být vhodným způsobem rozděleny na stejné stejndíly a že analyzovanou látku obsahují v takové koncentraci, která je vhodná pro požadované rozmezí.Kontrolní materiál musí být vložen nejméně jednou do každého analytického pokusu a získanou hodnotu je nutné zanést do kontrolního grafu za účelem dlouhodobého měření chyb. Laboratoř musí kromě toho v pravidelných intervalech prokazovat, že splňuje podmínky opakovatelnosti během analytického pokusu, což lze provést zopakováním analýzy kontrolního materiálu a/nebo zkušebního materiálu. Výsledky těchto analýz je třeba porovnat se všemi zveřejněnými mezními hodnotami opakovatelnosti a s existujícími údaji týkajícími se přesnosti dosahované v dané laboratoři.Pokud se používají kontrolní materiály, hodnoty získané pro analýzy kontrolního materiálu mezi jednotlivými pokusy se vynesou do Shewhartova grafu (ISO 8258 (1991)) s patřičnými kontrolními limity. Akční limity se nastaví nax ± 3s,kde st je celková směrodatná odchylka,a varovné limity nax ± 2st.Celková směrodatná odchylka:s=2sb2+ sw2/nkdesb : směrodatná odchylka mezi pokusysw : směrodatná odchylka v rámci pokusun : počet stanovení.V případě, že se kontrolní materiál nepoužije (např. kvůli nedostatečné stabilitě), musí být v každém pokusu nejméně jeden zkušební materiál analyzován duplicitně.Absolutní rozdíly získané z duplicitních analýz provedených v rámci jednoho pokusu (viz přílohu III) se zakreslí do grafu. Střední čára je na úrovni 1,128 sw, dolní mezní hodnota je 0 a horní mezní hodnota (akční limit) je 3,686 sw; sw je směrodatná odchylka v daném pokusu.Je-li rozsah koncentrací veliký, musí kontrolní metoda používat materiály o malém i velkém obsahu. Pokud u zkušebních materiálů existuje široký rozsah koncentrací analyzované látky, laboratoř musí stanovit poměr mezi přesností a stupněm koncentrace.Je-li přesnost úměrná stupni koncentrace, následující kontrola musí být provedena na základě relativní přesnosti (tj. absolutního rozdílu vyjádřeného jako procentní podíl ze střední hodnoty).Analytický systém přestává být spolehlivý, pokud nastane některá z těchto situací:A. aktuální hodnota grafického znázornění je mimo akční limity,B. aktuální i předchozí hodnota je mimo varovné limity, avšak uvnitř akčních limitů,C. v případě použití kontrolních materiálů se devět po sobě jdoucích hodnot nachází na stejné straně střední čáry.Za této situace laboratoř musí:A. zastavit analýzu a počkat na výsledky diagnostických zkoušek a výsledky opatření přijatých k nápravě situace aB. vyloučit výsledky daného pokusu a provést novou analýzu zkušebních materiálů.b) Postup pro výběr kontrolního materiálu v rámci laboratoře a stanovení vnitřních mezních hodnot přesnosti (chemická analýza)Údaje o přesnosti laboratorních zkoušek lze získat opakovanou analýzou kontrolních materiálů a/nebo opakovanou analýzou zkušebních vzorků.Laboratoře použijí následující postup pro stanovení parametrů přesnosti týkajících se odchylek v rámci jednoho pokusu a mezi jednotlivými pokusy; tyto parametry následně použijí k sestavení kontrolních grafů. Laboratoře mohou použít alternativní postupy za předpokladu, že mohou patřičně doložit, že získané údaje týkající se přesnosti jsou spolehlivé.1. Výběr kontrolních materiálůJe-li vhodné, aby laboratoř použila kontrolní materiál, musí být nejprve shromážděny údaje za účelem stanovení mezních hodnot. Pokud je to možné, je třeba používat certifikované referenční materiály (CRM). Navržené kontrolní materiály musí být analyzovány za podmínek opakovatelnosti v rámci jednoho pokusu, za použití příslušných CRM, a musí u nich být provedeny opakované analýzy a namátkové zkoušky. Pokud tuto metodu nelze použít, laboratoře musí usilovat o to, aby se zúčastnily zkoušek odborné způsobilosti a musí stanovit konsensuální střední hodnoty (přidělené hodnoty), které lze považovat za skutečnou konvenční střední hodnotu spojenou s významnou nejistotou. Jiné postupy spočívají zejména v tom, že reálná hodnota je přidělena při přípravě nebo použití kontrolních materiálů, do nichž byla přidána stopovací látka.Kromě toho v případě, že laboratoř provádí analýzu tohoto druhu pravidelně a má již zavedenou statistickou kontrolu, každý nový kontrolní materiál (např. materiál potřebný z důvodu vyčerpání zásob) musí být získán na základě analýz u nichž je prováděna kontrola pomocí stávajících materiálů.2. Stanovení limitních hodnotPo výběru kontrolního materiálu laboratoř pomocí tohoto materiálu stanoví hodnoty týkající se přesnosti v rámci jednoho pokusu a mezi jednotlivými pokusy.Pro stanovení hodnot přesnosti v rámci jednoho pokusu se minimálně požaduje, aby kontrolní materiál byl dvanáctkrát duplicitně analyzován. Duplicitní analýzu je třeba provádět za podmínek opakovatelnosti, tj. musí ji provádět stejný pracovník se stejnými chemikáliemi, atd. Duplicitní analýza kontrolního materiálu musí být prováděna namátkově v rámci jednoho analytického pokusu. Mají-li se projevit přiměřené odchylky mezi jednotlivými pokusy, s přihlédnutím k běžným odchylkám týkajícím se např. chemikálií, nové kalibrace přístrojů, případně výměny analytických pracovníků, je třeba každou duplicitní analýzu provést v jiný den během určitého období.Poznámka:Je nutné zdůraznit, že použití údajů, které nejsou plně reprezentativní pro odchylky mezi jednotlivými pokusy, může vést ke zbytečnému opakování analýzy, protože byly stanoveny příliš úzké mezní hodnoty. A naopak, laboratoř uvádějící příliš nepřesné údaje týkající se přesnosti nemusí být schopna splnit mezní hodnoty stanovené v referenčních metodách, její výsledky budou pravděpodobně méně uspokojivé než výsledky srovnatelných laboratoří a kromě toho se jí zřejmě nepodaří poskytnout údaje potřebné pro zamýšlený účel.2.1 Stanovení přesnosti v rámci jednoho pokusu2.1.1 Přesnost v rámci pokusu, je-li k dispozici kontrolní materiálU duplicitních údajů (nejméně u 12 duplikátů) je třeba nejprve provést Cochranovův test maximální odchylky, který spočívá v porovnání maximální hodnoty rozsahu duplikátů umocněné na druhou se součtem hodnoty rozsahů umocněné na druhou:c =dmax∑di2kdedi = rozdíl mezi duplikáty.Hodnota Cochranova parametru C se porovná s tabulkovými hodnotami [ISO 5725 (1994)]. Pokud lze hodnotu označit za podezřelou nebo odlehlou, výsledek musí být analyzován s cílem najít vysvětlení, např. technickou nebo počítačovou chybu, chybu při provádění zkoušky nebo analýzy nesprávného vzorku. Je-li vysvětlení technické chyby takové, že znemožňuje pochybný výsledek nahradit, je nutné tento výsledek vyloučit jako skutečně odlehlou hodnotu. Pokud přetrvávají podezřelé nebo odlehlé hodnoty, které není možné vysvětlit, pak podezřelé hodnoty se uchovají jako správné a statisticky odlehlé hodnoty se vyloučí. Laboratoř se musí snažit získat náhradní hodnoty.Když si je laboratoř jista, že údaje již neobsahují odlehlé hodnoty, pak směrodatná odchylka v rámci pokusu sw se získá takto:pro každou dvojici xi1, xi2 z duplicitních dat p se vypočte součet duplikátůs= x+ xi2a rozdíl duplikátůd= x- xi1a vypočtou se jejich součtyA=∑siB = ∑di2C = ∑si2Odhad směrodatné odchylky v rámci pokusu jes=2B2pInterní mezní hodnota přesnosti je 2,8.sw.Jestliže se použije referenční metoda, interní mezní hodnota přesnosti se porovná se zveřejněnou mezní hodnotou opakovatelnosti. Laboratoř musí splňovat požadavek referenční metody. Nesplnění tohoto požadavku vede k příslušnému šetření.Stanovené mezní hodnoty je třeba považovat za prozatímní hodnoty, které mohou být přezkoumány.2.1.2 Přesnost v rámci pokusu, není-li k dispozici kontrolní materiálLaboratoř se může rozhodnout, že přesnost v rámci jednoho pokusu stanoví duplicitní analýzou reprezentativních zkušebních vzorků (nejméně 12 duplicitními analýzami). Pokud není možné použít kontrolní materiály, např. pro jejich nestabilitu, musí být duplicitní údaje shromážděny touto metodou.Poznámka:Předpokládá se, že analýzy se týkají poměrně úzkého rozmezí hodnot, a proto lze na všechny vzorky použít jedinou hodnotu. Pokud je rozsah výsledků širší, tj. překročí-li např. jeden stupeň velikosti, a pokud přesnost závisí na koncentraci, pak se laboratoře musí snažit používat relativních směrodatných odchylek.U údajů je nutné provést Cochranovův test, podobně jako v bodu 2.1.1. Jakmile si je laboratoř jista, že údaje neobsahují odlehlé hodnoty, je možné vypočítat směrodatnou odchylku v rámci jednoho pokusu a interní mezní hodnotu přesnosti, jak je uvedeno v bodu 2.1.1.Směrodatnou odchylku v rámci jednoho pokusu sw lze použít pro sestavení kontrolních grafů (viz přílohu II). Stanovené mezní hodnoty je třeba považovat za prozatímní hodnoty, které mohou být přezkoumány.2.2 Stanovení přesnosti mezi jednotlivými pokusyPro každou dvojici se vypočte střední hodnota (s1/2) a se získanými hodnotami se provede Grubbsův test ka[(ISO 5725 (1994)]. Kritéria pro vyloučení nebo přijetí odlehlých nebo podezřelých hodnot jsou kritéria popsaná v bodu 2.1.1. Laboratoř se musí snažit získat náhradní hodnotu za každý vyloučený výsledek. Jakmile si je laboratoř jista, že údaje neobsahují odlehlé hodnoty, směrodatná odchylka mezi jednotlivými pokusy sb se vypočte takto:s=1C -BA2pnebo se předpokládá, že se rovná 0, je-li výraz pod znakem druhé odmocniny záporný.Celková směrodatná odchylka st se používá pro sestavení kontrolních grafů pro střední hodnotu z n stanovení (viz přílohu II). Stanovené mezní hodnoty je třeba považovat za prozatímní hodnoty, které mohou být přezkoumány.3. Přezkoumání počátečních mezních hodnotKontrolní mezní hodnoty stanovené výše uvedeným způsobem musí být považovány za předběžné výpočty.Za účelem aktualizace mezních hodnot stanovených na základě přijatelné přesnosti v rámci jednoho pokusu (bod 2.1.2) je třeba shromáždit dodatečné duplicitní údaje týkající se zkušebních vzorků. Četnost přezkoumání údajů závisí na četnosti analýz. Obecně lze uvést, že by údaje měly být přezkoumány po získání dalších deseti duplicitních hodnot. U všech údajů je pak nutné provést Cochranův test a znovu stanovit mezní hodnoty na základě nové hodnoty směrodatné odchylky. Následná rozhodnutí o platnosti kontrolních mezních hodnot musí být prováděna na základě dodatečných údajů.Přezkoumání počátečních údajů získaných z důvodu přesnosti v rámci jednoho pokusu závisí také na četnosti analýz. Obecně lze uvést, že původně stanovené hodnoty týkající se směrodatné odchylky a střední odchylky musí být přezkoumány poté, co se analýzami kontrolního materiálu získá dalších deset údajů, při četnosti jedné analýzy na šarži.U všech údajů je třeba provést Grubbsů test s cílem zjistit extrémní odlehlé hodnoty. Na základě nových údajů je pak třeba znovu vypočítat střední odchylku i směrodatnou odchylku.Kromě toho musí laboratoř v této fázi použít Cusumův graf [(BS S700:1984) a novelu 5480 (1987)], aby analyzovala všechny problémy, které mohou souviset např. se stárnutím chemikálií. Musí být analyzován každý výsledek, který je mimo mezní hodnoty Cusumovy "masky V".Tyto nové mezní hodnoty (střední odchylka a směrodatná odchylka) musí být pravidelně kontrolovány pomocí Cusumovy metodiky. Jakákoliv pochybnost ohledně validity kontrolního materiálu musí být důkladně prověřena.4. Hlášení údajů o přesnostiLaboratoře musí příslušným vnitrostátním orgánům poskytovat údaje o:- použité metodě,- směrodatné odchylce v rámci jednoho pokusu sw a interní mezní hodnotě přesnosti,- směrodatné odchylce mezi jednotlivými pokusy sb,- celkové směrodatné odchylce s1,- počtu analýz nezbytných pro získání údajů o přesnosti.[1] M. Thompson a R. Wood: Pure and Applied Chemistry“ 67 (4), 649-666 (1995).--------------------------------------------------PŘÍLOHA VI(Článek 6)HODNOCENÍ POSUZOVATELŮ A SPOLEHLIVOST VÝSLEDKŮ ORGANOLEPTICKÝCH ANALÝZV případě použití bodovacích metod (norma IDF 99C/1997) se použijí tyto postupy:a) Stanovení "ukazatele opakovatelnosti"Jeden posuzovatel musí během 12 měsíců analyzovat nejméně deset vzorků jako slepé duplikáty. Jednotlivé analýzy obvykle provádí v odlišných termínech. Výsledky týkající se charakteristických znaků jednotlivých produktů se vyhodnotí pomocí tohoto vzorce:w=∑nkde:w1 : ukazatel opakovatelnostixi1 : počet bodů pro první hodnocení vzorku xixi2 : počet bodů pro druhé hodnocení vzorku xin : počet vzorkůHodnocené vzorky musí představovat široký rozsah jakosti. Hodnota w1 nesmí překročit 1,5 bodu (na pětibodové stupnici).b) Stanovení "ukazatele odchylek"Tento ukazatel se musí používat pro kontrolu, zda posuzovatel používá pro hodnocení jakosti stejnou stupnici jako zkušená skupina posuzovatelů.Počet bodů přidělených posuzovatelem se porovnává s průměrným počtem bodů, které přidělila skupina posuzovatelů.D= 1 +∑x-xx-x-i222nkde:xi1; xi2 : viz písm.a);x-i2 : průměrný počet bodůskupiny posuzovatelů pro první a druhé hodnocení vzorku xin : počet vzorků (nejméně 12 za měsíc).Hodnocené vzorky musí představovat široký rozsah jakosti. Hodnota D1 nesmí překročit 1,5 bodu (na pětibodové stupnici).Členské státy musí informovat o všech potížích vyplývajících z používání tohoto postupu.c) Porovnání výsledků získaných v různých regionech členského státu a v různých členských státechV případě potřeby musí být nejméně jednou za rok zorganizována zkouška, která umožní porovnat výsledky získané posuzovateli z různých regionů. Pokud se zjistí významné rozdíly, je třeba přijmout nezbytná opatření, aby byly zjištěny důvody těchto rozdílů a dosaženy srovnatelné výsledky.Členské státy mohou organizovat zkoušky, které umožní porovnat výsledky získané jejich vlastními posuzovateli a posuzovateli ze sousedních členských států. V případě zjištění významných rozdílů je nutné provést důkladné šetření, aby byly dosaženy srovnatelné výsledky.Členské státy sdělí výsledky těchto porovnání Komisi.--------------------------------------------------PŘÍLOHA VII(Článek 6)ORGANOLEPTICKÉ HODNOCENÍ MÁSLA1. Oblast použitíCílem tohoto postupu organoleptického hodnocení másla je stanovit jednotnou metodu použitelnou ve všech členských státech.2. Definice"Organoleptickým hodnocením" se rozumí posuzování vlastností produktů smyslovými orgány."Komisí" se rozumí skupina vybraných posuzovatelů, kteří během hodnocení pracují, aniž by mezi sebou komunikovali nebo se vzájemně ovlivňovali."Bodovým hodnocením" se rozumí organoleptické hodnocení, které vypracuje komise za použití číselné řady. Musí být používána nomenklatura vad."Tříděním" se rozumí třídění podle jakosti prováděné na základě bodového hodnocení."Kontrolními dokumenty" se rozumí dokumenty používané k zaznamenávání bodového ohodnocení každé vlastnosti a konečné jakostní třídy produktu (v těchto dokumentech může být rovněž zapsáno chemické složení).3. Zkušební místnost3.1 Musí být přijata opatření, aby ve zkušební místnosti nepůsobily na posuzovatele vnější faktory.3.2 Zkušební místnost musí být prosta cizích pachů a musí být snadné ji udržovat v čistotě. Stěny musí mít světlou barvu.3.3 Zkušební místnost a její osvětlení nesmějí ovlivňovat vlastnosti hodnocených produktů. Místnost musí být vybavena vhodnou regulací teploty.4. Výběr posuzovatelůPosuzovatel musí být dobře obeznámen s výrobky z másla a musí být způsobilý provádět organoleptické jakostní třídění. Jeho způsobilost musí pravidelně (nejméně jednou ročně) posuzovat příslušný orgán.5. Požadavky kladené na komisiKomise se musí skládat z lichého počtu posuzovatelů, nejméně tří. Většinu z nich musí tvořit zaměstnanci příslušného orgánu nebo schválené osoby, které nejsou zaměstnány v mlékárenském průmyslu.Před hodnocením je třeba vzít v úvahu řadu faktorů, aby členové komise podali posuzovateloptimální výkon:- členové komise nesmějí trpět žádnou chorobou, která by ovlivnila jejich výkon. Pokud taková okolnost nastane, je třeba začlenit do komise nového posuzovatele;- členové komise se k hodnocení musí dostavit včas a vyhradit si dostatek času na provedení hodnocení;- členové komise nesmějí používat silně vonící látky jako parfémy, vodu po holení, deodoranty, atd., ani jíst silně aromatizovaná (kořeněná) jídla, atd.;- členové komise nesmějí poslední půl hodinu před hodnocením kouřit, jíst ani pít, s výjimkou vody.6. Posouzení hodnoty každé vlastnosti6.1 Organoleptické hodnocení musí být provedeno u třech následujících vlastností: vzhledu, konzistence a aroma.Vzhled se týká těchto znaků: barvy, zjevné čistoty, tvorby plísní a vodní disperze. Vodní disperze se testuje podle normy IDF 112A/1989.Konzistence se týká těchto znaků: pevnosti a roztíratelnosti.K hodnocení konzistence másla lze použít fyzikální metody. Komise předpokládá, že tyto metody budou v budoucnu harmonizovány.Aroma se týká těchto znaků: chuti a vůně.Významná odchylka od doporučené teploty brání tomu, aby konzistence a aroma byly spolehlivě ohodnoceny. Teplota má klíčový význam.6.2 Organoleptické hodnocení každé vlastnosti musí být prováděno samostatně. Bodové hodnocení se musí provádět podle tabulky 1.6.3 Může být žádoucí, aby v zájmu jednotnosti posuzovatelé před zahájením hodnocení přidělili body jednomu nebo více referenčním vzorkům za vzhled, konzistenci a aroma.6.4 Počet bodů nutných pro přijetí je stanoven takto:| Maximum | Požadovaný počet |Vzhled | 5 | 4 |Konzistence | 5 | 4 |Aroma | 5 | 4 |Pokud není dosažen požadovaný počet bodů, musí být uveden popis vady. Počet bodů od každého posuzovatele pro každou vlastnost musí být zapsán do kontrolního dokumentu. Produkt je přijat nebo zamítnut na základě rozhodnutí většiny. Případy, kdy jsou rozdíly mezi jednotlivými bodovými hodnoceními každé vlastnosti větší než jeden bod, by se neměly vyskytovat často (nejvýše jednou u 20 vzorků). V opačném případě musí předseda komise prověřit způsobilost komise.7. DozorPředseda komise, jenž musí být řádným zaměstnancem příslušného orgánu a může být členem komise, musí nést obecnou odpovědnost za celý postup. Je povinen zapisovat bodové hodnocení každé vlastnosti do kontrolního dokumentu a potvrdit, zda je produkt přijat nebo zamítnut.8. Odběr a příprava vzorků8.1 - Je žádoucí, aby během hodnocení nebyla známa totožnost vzorků a aby se tak zabránilo případné zaujatosti.- Odběr a přípravu vzorků musí zorganizovat předseda komise před začátkem hodnocení, v nepřítomnosti ostatních členů komise.8.2 Pokud se organoleptické hodnocení provádí v chladírenském skladu, vzorek se odebírá pomocí máslové sondy. Pokud se organoleptické hodnocení provádí na jiném místě než v chladírenském skladu, je třeba odebrat vzorek nejméně o hmotnosti 500 g.8.3 Během hodnocení by mělo mít máslo teplotu mezi 10 až 12 °C. Větším odchylkám od této teploty je nutno za každou cenu zabránit.9. NomenklaturaViz tabulka č. 2 uvedená v příloze.Tabulka 1: Bodové hodnocení máslaVzhled | Konzistence | Chuť a vůně |Body | Č. [1] | Poznámky | Body (jakostní třída) | Č. [1] | Poznámky | Body (Jakostní třída) | Č. [1] | Poznámky |5 | | Velmi dobrý ideální druh nejvyšší jakost (rovnoměrný suchý) | 5 | | Velmi dobrá ideální druh nejvyšší jakost (dobře roztíratelné) | 5 | | Velmi dobré ideální druh nejvyšší jakost (absolutně čisté nejjemnější aroma) |4 | | Dobrý [2] | 4 | | Dobrá [2] | 4 | | Dobré [2] || Bez zjevných vad | 17 | tvrdá | | Bez zjevných vad. || | 18 | měkká | | |3 | | Uspokojivý (drobné vady) | 3 | | Uspokojivá (drobné vady) | 3 | | Uspokojivé (drobné vady) |1 | vodnatý, se zřetelnými kapičkami vody | 14 | drobivá, křehká, hrudky | 21 | nevýrazné |2 | nejednotné barvy | 15 | pastovitá, těstovitá, mazlavá | 22 | cizí chuť a vůně |3 | pruhovaný | 16 | lepivá | 25 | kyselé |4 | žilkovaný, mramorovaný | 17 | tvrdá | 27 | chuť po vaření, připálená chuť a vůně |5 | skvrnitý | 18 | měkká | 33 | chuť a vůně krmiva |6 | oddělování oleje | | | 34 | trpké, hořké |7 | nadměrné vybarvení | | | 35 | přesolené |8 | porézní textura | | | | |2 | | Špatný (zjevné vady) | 2 | | Špatná (zjevné vady) | 2 | | Špatné (zjevné vady) |1 | Vodnatý, se zřetelnými kapičkami vody | 14 | drobivá, křehká, hrudky | 21 | nevýrazné |3 | pruhovaný | 15 | pastovitá, těstovitá, mazlavá | 22 | cizí chuť a vůně |4 | žilkovaný, mramorovaný | 16 | lepivá | 23 | zvětralé kyselé |5 | skvrnitý | 17 | tvrdá | 25 | oxidované, kovová |6 | oddělování oleje | 18 | měkká | 32 | chuť a vůně |10 | cizí látky | | | 33 | chuť a vůně krmiva |11 | plesnivý | | | 34 | trpké, hořké |12 | nerozpuštěná sůl | | | 35 | přesolené || | | | 36 | zatuchlé, hnilobné || | | | 38 | po chemikáliích |1 | | Velmi špatný (závažné vady) | 1 | | Velmi špatná(závažné vady) | 1 | | Velmi špatné(závažné vady) |1 | Vodnatý, se zřetelnými kapičkami vody | 14 | drobivá, křehká, hrudky | 22 | cizí chuť a vůně |3 | pruhovaný | 15 | pastovitá, těstovitá, mazlavá | 24 | sýrovité, mléčně sýrové |4 | žilkovaný, mramorovaný | 16 | lepivá | 25 | kyselé |5 | skvrnitý | 17 | tvrdá | 26 | po kvasnicích |6 | oddělování oleje | 18 | měkká | 28 | po plísni |7 | nadměrné vybarvení | | | 29 | žluklé |9 | zrnitý | | | 30 | olejovité, rybina |10 | cizí látky | | | 31 | lojovité |11 | plesnivý | | | 32 | oxidované, kovová chuť a vůně |12 | nerozpuštěná sůl | | | 34 | trpké, hořké || | | | 36 | zatuchlé, hnilobné || | | | 37 | po sladu || | | | 38 | po chemikáliích |Tabulka 2: Tabulka vad máslaI. Vzhled1. vodnatż, se zųetelnżmi kapičkami vody2. nejednotné barvy, dvojbarevný3. pruhovaný4. ilkovaný, mramorovaný5. skvrnitý6. oddělování oleje7. nadměrné vybarvení8. porézní textura9. zrnitý10. cizí látky11. plesnivý12. nerozputěná sůlII. Konzistence14. drobivá, křehká, hrudky15. pastovitá, těstovitá, mazlavá16. lepivá17. tvrdá18. měkkáIII. Chut' a vůně20. bez chuti a vůně21. nevýrazné22. cizí a vůně23. zvětralé, vypěčlé24. sýrovité, mléčně sýrové25. kyselé26. po kvasnicích27. a) chut' po vařeníb) připálená chut' a vůně28. po plísni29. uklé30. olejovité, rybina31. lojovité32. a) oxidovaná chut' a vůněb) kovová chut' a vůně33. chut' a vůně krmiva34. trpké, hořké35. přesolené36. zatuchlé, hnilobné37. po sladu38. po chemikáliích[1] Tabulka 2[2] Vady uvedené v jakosti „dobrý" vykazují jen velmi malé odchylky od ideálního druhu.--------------------------------------------------PŘÍLOHA VIII(Článek 7)POSTUP POUŽITELNÝ V PŘÍPADĚ ZPOCHYBNĚNÍ VÝSLEDKŮ ANALÝZY (CHEMICKÁ ANALÝZA)1. Na žádost hospodářského subjektu předloženou do sedmi pracovních dnů od sdělení výsledků první analýzy se provede nová analýza za předpokladu, že jsou k dispozici zapečetěné duplicitní vzorky produktu, které byly řádně uloženy u příslušných orgánů.2. Na žádost hospodářského subjektu a na jeho náklady zašle příslušný orgán tyto vzorky druhé laboratoři. Tato laboratoř musí být oprávněna provádět úřední analýzy a musí mít prokázanou kvalifikaci pro dotyčné analýzy. Tato kvalifikace musí být doložena úspěšnou účastí na společných studiích, zkouškách odbornosti nebo mezilaboratorních porovnávacích zkouškách. Druhá laboratoř musí použít referenční metodu. Výsledkyobou laboratoří se vyhodnotí takto:a) V případě, že obě laboratoře splňují požadavek opakovatelnosti a reprodukovatelnostiJako konečný výsledek se uvede aritmetický průměr výsledků zkoušek, které získaly obě laboratoře. Tento konečný výsledek se vyhodnotí na základě kritického rozdílu podle tohoto vzorce:CrDy-m=212n-2n2kdey- : aritmetický průměr všech výsledků získaných oběma laboratořemimo : mezní hodnotaR : reprodukovatelnostr : opakovatelnostn1 : počet výsledků získaných laboratoří 1n2 : počet výsledků získaných laboratoří 2Poznámka:Pokud je konečný výsledek vypočten podle vzorcex = y± ynebox = y/y(viz přílohu IV body 3 a 4), namísto hodnot R2 a r2 je třeba do vzorce dosadit hodnoty R2x a r2x.b) V případě, že obě laboratoře splňují požadavek opakovatelnosti, avšak nesplňují požadavek reprodukovatelnostiPokud druhá analýza potvrdí první analýzu, pak analyzované množstvíse odmítne jako nevyhovující. V opačném případě se toto množství přijme.c) V případě, že požadavek opakovatelnosti splní pouze jedna laboratořRozhodnutí o tom, zda je analyzované množství přijatelné, záleží na konečném výsledku laboratoře, která požadavek opakovatelnosti splňuje.d) V případě, že žádná z laboratoří nesplňuje požadavek opakovatelnosti, avšak splňuje požadavek reprodukovatelnostiPoužije se postup podle písmene a).e) V případě, že žádná z laboratoří nesplňuje požadavek opakovatelnosti ani požadavek reprodukovatelnostiAnalyzované množství se přijme, pokud k tomuto závěru vedou výsledky jedné z laboratoří.f) V případě, že výsledky byly získány pomocí nevalidovaných metodAnalyzované množství se přijme, pokud k tomuto závěru vedou výsledky jedné z laboratoří.3. Příslušný orgán sdělí hospodářskému subjektu výsledky druhé analýzy co nejdříve. Pokud je analyzované množství odmítnuto, náklady na druhou analýzu nese hospodářský subjekt.4. Jestliže do pěti pracovních dnů po odběru vzorků hospodářský subjekt prokáže, že postup při odběru vzorků nebyl správný, odběr vzorků se musí v rámci možností zopakovat. Pokud není možné odběr vzorků zopakovat, analyzované množství se přijme.--------------------------------------------------PŘÍLOHA IX(Článek 8)STANOVENÍ OBSAHU VODY V MÁSLE1. Předmět a oblast použitíTato referenční metoda je určena ke stanovení obsahu vody v másle.2. Normativní odkazNorma IDF 50C:1995 - Mléko a mléčné výrobky - Metody odběru vzorků3. DefiniceObsah vody v másle: ztráta hmotnosti po dokončení procesu ohřevu uvedeného v této normě. Vyjadřuje se v gramech na 100 gramů.4. Podstata metodyOdpaření vody ze zkušební dávky s použitím pemzy při teplotě 102 °C v sušárně.5. Přístroje, pomůcky a materiálObvyklé laboratorní vybavení, zejména:5.1 Analytické váhy s přesností 1 mg.5.2 Exsikátor, obsahující účinné vysoušecí činidlo (např. čerstvě vysušený silikagel s indikátorem vlhkosti).5.3 Sušárna, odvětraná, řízená termostatem, fungující při teplotě 102 ± 2 °C v celém pracovním prostoru.5.4 Skleněné, porcelánové nebo nerezové kovové misky o výšce cca 20 mm a průměru od 60 do 80 mm.5.5 Pemza, granulovaná, praná, o zrnitosti 0,8 až 10 mm.6. Odběr vzorkůViz normu IDF 50C: 1995.7. Pracovní postup7.1 Příprava zkušebního vzorkuLaboratorní vzorek se zahřeje v uzavřené skleněné nebo vhodné plastové nádobce naplněné nejméně z poloviny a nejvíce ze dvou třetin na teplotu, při níž bude vzorek dostatečně měkký, aby umožnil důkladné promíchání a homogenizaci (buď na mechanické třepačce nebo manuálně). Míchání se musí za normálních okolností provádět za teploty nejvýše 35 °C. Vzorek se ochladí na teplotu okolí. Co nejdříve po ochlazení se nádoba se vzorkem otevře a před zvážením se vzorek krátce promíchá (nejdéle 10 sekund) vhodným nástrojem, např. lžičkou nebo špachtlí.7.2 Stanovení obsahu vody7.2.1 Do misky se vloží cca 10 g pemzy (5.4).7.2.2 Miska s pemzou se suší v sušárně (5.3) při teplotě 102 ± 2 °C nejméně po dobu jedné hodiny.Poznámka:Doba sušení uvedená v bodech 7.2.2, 7.2.5 a 7.2.7 začíná v okamžiku, kdy teplota v sušárně dosáhne 102 ± 2 °C.7.2.3 Miska se nechá vychladnout v exsikátoru (5.2) na teplotu váhovny a zváží se s přesností na 1 mg.7.2.4 S přesností na 1 mg se do misky naváží část zkušebního vzorku o hmotnosti přibližně 5 g.7.2.5 Miska se vloží do sušárny při teplotě 102 ± 2 °C a ponechá se tam po dobu tří hodin.7.2.6 Miska se nechá vychladnout v exsikátoru na teplotu váhovny a zváží se s přesností na 1 mg.7.2.7 Sušení se několikrát opakuje po dobu jedné hodiny a miska se po každém sušení ochladí a zváží podle bodu. 7.2.6, dokud není dosažena konstantní hmotnost (dokud rozdíl v hmotnosti nepřesáhne 1 mg).Dojde-li ke zvýšení hmotnosti, pro výpočet se použije nejnižší zjištěná hmotnost.8. Vyjádření výsledků8.1 Způsob výpočtu a vzorecObsah vody W se vypočte jako hmotnostní procento pomocí tohoto vzorce:w =m- mm-mx 100kdemo  je hmotnost misky s pemzou v gramech (7.2.3)m1  je hmotnost navážky, misky a pemzy v gramech před sušením(7.2.4)m2  je hmotnost navážky, misky a pemzy v gramech po vysušení (7.2.7).Výsledky se uvádí na jedno desetinné místo.8.2 OpakovatelnostAbsolutní rozdíl mezi výsledky dvou jednotlivých stanovení, které u stejného zkušebního materiálu a za stejných podmínek provedl stejný pracovník současně nebo v co nejkratším časovém odstupu, nesmí překročit 0,2 %.8.3 ReprodukovatelnostAbsolutní rozdíl mezi dvěma výsledky, které u stejného zkušebního materiálu získali dvapracovníci pracující v různých laboratořích, nesmí překročit 0,3 %.9. Protokol o zkoušceV protokolu o zkoušce musí být uvedena použitá metoda a získané výsledky. Rovněž v něm musí být uvedeny všechny údaje týkající se pracovního postupu, které tato mezinárodní norma neobsahuje nebo které jsou považovány za volitelné, jakož i údaje o všech skutečnostech, jež mohly ovlivnit výsledky. Protokol o zkoušce musí obsahovat všechny údaje nezbytné pro úplnou identifikaci vzorku.--------------------------------------------------PŘÍLOHA X(Článek 8)MÁSLO: STANOVENÍ OBSAHU TUKUPROSTÉ SUŠINY1. Předmět a oblast použitíTato norma určuje způsob stanovení obsahu tukuprosté sušiny v másle.2. Normativní odkazNorma IDF 50C:1995 - Mléko a mléčné výrobky - Metody odběru vzorků3. DefiniceObsah tukuprosté sušiny v másle: obsah látek v hmotnostních procentech stanovený určeným postupem. Vyjadřuje se v gramech na 100 gramů.4. Podstata metodyOdpaření vody ze známé hmotnosti másla, extrakce tuku petroletherem a zvážení zbytku.5. ChemikáliePetrolether s rozmezím varu od 30 °C do 60 °C. Po odpaření 100 ml nesmí po tomto činidle zbýt více než 1 mg.6. Přístroje, pomůcky a materiál6.1 Analytické váhy s přesností 1 mg.6.2 Exsikátor, obsahující účinné vysoušecí činidlo (např. čerstvě vysušený silikagel s indikátorem vlhkosti).6.3 Sušárna, odvětraná, řízená termostatem, fungující při teplotě 102 ± 2 °C v celém pracovním prostoru.6.4 Skleněné, porcelánové nebo nerezové kovové misky o výšce hubičky asi 20 mm a průměru od 60 do 80 mm, opatřené skleněnou míchací tyčinkou.6.5 Filtrační kelímek se skleněnou fritou s průměrem pórů 16 až 40 μm a odsávací baňka.7. Odběr vzorkůViz normu IDF 50C:1995.8. Pracovní postup8.1 Příprava zkušebního vzorkuLaboratorní vzorek se zahřeje v uzavřené skleněné nebo vhodné plastové nádobce naplněné nejméně z poloviny a nejvíce ze dvou třetin na teplotu, při níž bude vzorek dostatečně měkký, aby umožnil důkladné promíchání a homogenizaci (buď na mechanické třepačce nebo manuálně). Míchání se musí za normálních okolností provádět za teploty nejvýše 35 °C. Vzorek se ochladí na teplotu okolí. Co nejdříve po ochlazení se nádoba se vzorkem otevře a před zvážením se vzorek krátce promíchá (nejdéle 10 sekund) vhodným nástrojem, např. lžičkou nebo špachtlí.8.2 Stanovení8.2.1 Miska s tyčinkou (6.4) a filtračním kelímkem (6.5) se suší v sušárně (6.3) nejméně po dobu 1 hodiny. Tyto předměty se nechají vychladnout v exsikátoru a zvážíse dohromady (tj. miska, tyčinka i filtrační kelímek) s přesností na 1 mg (mo).Poznámky:- Doba ochlazování 45 minut je zpravidla postačující.- Jestliže se v šarži analyzuje více než jedna zkušební dávka, je důležité, aby pro každou tuto dávku (navážku) byla použita stejná sada misky, tyčinky a filtračního kelímku.8.2.2 Filtrační kelímek se vyjme a zaznamená se hmotnost misky s tyčinkou s přesností na 1 mg (m1).8.2.3 Do misky se s přesností na 1 mg naváží dávka zkušebního vzorku (8.1) o hmotnosti asi 5 g (m2).8.2.4 Miska (s tyčinkou a máslem) se vloží do sušárny s teplotou 102 ± 2 °C a ponechá se v ní přes noc.8.2.5 Miska (8.2.3) se nechá vychladnout na teplotu místnosti.8.2.6 Do misky se přidá 15 ml teplého (asi 25 °C) petroletheru a skleněnou tyčinkou se co nejvíce uvolní usazenina ulpívající na misce. Rozpouštědlo se převede do filtračního kelímku a přefiltruje se do odsávací baňky.8.2.7 Postup popsaný v 8.2.6 se zopakuje ještě čtyřikrát. Pokud na povrchu misky již nejsou žádné stopy tuku, při čtvrtém promývání se kvantitativně převede co možná nejvíce usazeniny do filtračního kelímku. V opačném případě se postup uvedený v 8.2.6 opakuje, dokud nebudou odstraněny všechny stopy tuku.8.2.8 Usazenina ve filtračním kelímku se promyje 25 ml horkého petroletheru.8.2.9 Miska, tyčinka a filtrační kelímek se suší společně v sušárně o teplotě 102 ± 2 °C po dobu 30 minut.8.2.10 Nechají se vychladnout v exsikátoru, dokud nedosáhnou teploty místnosti, a zvaží se s přesností na 1 mg.8.2.11 Postup uvedený v 8.2.9 a 8.2.10 se opakuje, dokud nebude u misky, tyčinky a filtračního kelímku (m3) dosaženo konstantní hmotnosti (tj. dokud rozdíly v hmotnosti nebudou větší než 1 mg).9. Vyjádření výsledků9.1. Výpočet obsahu tukuprosté sušinyObsah tukuprosté sušiny (SNF) se vypočte jako procento hmotnostní podle tohoto vzorce:SNF =m- mm- mx 100kde:m0  je hmotnost v gramech prázdné misky se skleněnou tyčinkou a filtračním kelímkem (8.2.1)m1  je hmotnost v gramech prázdné misky se skleněnou tyčinkou (8.2.2)m2  je hmotnost v gramech dílčího zkušebního vzorku a zkušební misky se skleněnou tyčinkou (8.2.3)m3  je konečná hmotnost v gramech zkušební misky se skleněnou tyčinkou a filtračním kelímkem s usazeninou (8.2.11).Výsledek se zaokrouhlí na jedno desetinné místo.9.2 OpakovatelnostAbsolutní rozdíl mezi výsledky dvou jednotlivých stanovení, která u stejného zkušebního materiálu a za stejných podmínek provedl současně nebo v těsném sledu jeden pracovník, nesmí překročit 0,1 %.9.3 ReprodukovatelnostAbsolutní rozdíl mezi dvěma jednotlivými a nezávislými výsledky, které u stejného zkušebního materiálu získali dva pracovníci pracující v různých laboratořích, stejnnesmí překročit 0,2 %.10. Protokol o zkoušceV protokolu o zkoušce musí být uvedena použitá metoda a získané výsledky. Rovněž v něm musí být uvedeny všechny údaje týkající se pracovního postupu, které tato mezinárodní norma neobsahuje nebo které jsou považovány za volitelné, jakož i údaje o všech skutečnostech, jež mohly ovlivnit výsledky. Protokol o zkoušce musí obsahovat všechny údaje nezbytné pro úplnou identifikaci vzorku.Poznámka:Pokud se analyzuje solené máslo, přidaná sůl se stanoví jako tukuprostá sušina. Ke stanovení obsahu mléčné tukuprosté sušiny je nutné odečíst obsah přidané soli od obsahu tukuprosté sušiny. Výsledky výpočtů provedených ke zjištění přesnosti stanovení mléčné tukuprosté sušiny jsou následující:Opakovatelnost : r = 0,104 %Reprodukovatelnost : R = 0,206 %Lze dojít k závěru, že výsledky týkající se přesnosti a získané ke stanovení tukuprosté sušiny jsou platné rovněž pro stanovení obsahu mléčné tukuprosté sušiny.--------------------------------------------------PŘÍLOHA XI(Článek 8)STANOVENÍ OBSAHU TUKU V MÁSLEObsah tuku se získává nepřímo stanovením obsahu vody a tukuprosté sušiny podle přílohy IX a přílohy X. Obsah tuku v hmotnostních procentech se rovná:100 -W + TPSkdeW : je hmotnostní procento vodyTPS : je hmotnostníprocento tukuprosté sušinyVypočtené hodnoty přesnosti pro stanovení obsahu tuku jsou:Opakovatelnost: | r = 0,22 % |Reprodukovatelnost: | R = 0,36 % |--------------------------------------------------PŘÍLOHA XII(Článek 9)STANOVENÍ OBSAHU VANILINU V ZAHUŠTĚNÉM MÁSLE, MÁSLE NEBO SMETANĚ VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ1. Předmět a oblast použitíTato metoda popisuje postup pro kvantitativní stanovení vanilinu v zahuštěném másle, másle nebo smetaně.2. Podstata metodyExtrakce známého množství vzorku směsí isopropanol/ethanol/acetonitril (1:1:2). Vysrážení většiny tuku ochlazením na teplotu mezi –15 °C a –20 °C a následným odstředěním.Po zředění vodou se stanoví obsah vanilinu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).3. Přístroje a pomůckyObvyklé laboratorní vybavení, zejména:3.1 mrazící box určený pro teploty v rozmezí od -15 °C do -20 °C;3.2 injekční stříkačky na jedno použití o objemu 2 ml;3.3 membránové mikrofiltry o velikosti pórů 0,45 μm, odolné roztoku obsahujícímu 5 % extrakčního roztoku (4.4);3.4 systém pro kapalinovou chromatografii sestávající z čerpadla (s průtokem 1,0 ml/min), vstřikovacího zařízení (automatického nebo manuálního, vstřikovaný objem 20 μl) a UV detektoru (fungujícího při 306 nm, 0,01 AU rozsahu stupnice), zapisovače nebo integrátoru a termostatu kolony fungujícího při 25 °C;3.5 analytická kolona (250 mm x 4,6 mm/vnitřní průměr/), naplněná fází LiChrosper RP 18 (Merck, 5 μm) nebo jinou rovnocennou fází;3.6 ochranná kolona (cca 20 mm x 3 mm/vnitřní průměr/), naplněná za sucha fází Perisorb RP 18 (30 až 40 μm) nebo jinou rovnocennou fází.4. ChemikáliePoužívají se pouze chemikálie čistoty p.a.4.1 Isopropanol4.2 Ethanol, 96 % obj.4.3 Acetonitril4.4 Extrakční roztokIsopropanol (4.1), ethanol (4.2) a acetonitril (4.3) se smíchají v poměru 1:1:2 (obj.).4.5 Vanilin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd)4.5.1 Zásobní roztok vanilinu (500 μg/ml)S přesností na 0,1 mg se naváží asi 50 mg (CM mg) vanilinu (4.5) do odměrné baňky na 100 ml, přidá se 25 ml extrakčního roztoku (4.4) a doplní se po značku vodou.4.5.2 Standardní roztok vanilinu (10 μg/ml)Do odměrné baňky na 250 ml se pipetou přenese 5 ml zásobního roztoku vanilinu (4.5.1) a doplní se po značku vodou.4.6 Methanol jakosti pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC)4.7 Kyselina octová, ledová4.8 Voda jakosti pro HPLC4.9 Mobilní fáze HPLCV odměrné baňce na 1000 ml se smíchá 300 ml methanolu (4.6), cca 500 ml vody a 20 ml kyseliny octové (4.7) a doplní se po značku vodou (4.8). Přefiltruje se přes filtr 0,45 μm (3.3).5. Pracovní postup5.1 Příprava zkušebního vzorku5.1.1 MásloVzorek se zahřívá, dokud nezačne tát. Je nutné zabránit místnímu přehřátí nad 40 °C. Jakmile je vzorek dostatečně plastický, homogenizuje se protřepáním. Před odběrem vzorku se máslo po dobu 15 sekund míchá. Do odměrné baňky na 100 ml se naváží s přesností na 1 mg asi 5 g (SM g) másla.,5.1.2 Zahuštěné másloBezprostředně před odběrem vzorku se nádoba se zahuštěným máslem vloží do sušárny o teplotě 40 °C až 50 °C, aby máslo zcela roztálo. Vzorek se promíchá protřepáním nebo mícháním, které však nesmí být energické, aby nevznikly vzduchové bubliny. Do odměrné baňky na 100 ml se s přesností na 1 mg naváží asi 4 g (SM g) zahuštěného másla.5.1.3 SmetanaVzorek se zahřeje ve vodní lázni nebo termostatu na teplotu 35 °C až 40 °C. Tuk se rovnoměrně rozprostře třepáním a, pokud je to nutné, i promícháním. Vzorek se rychle ochladí na 20 ± 2 °C. Vzorek musí být na pohled homogenní, v opačném případě je třeba postup opakovat. Do odměrné baňky na 100 ml se s přesností na 1 mg naváží asi 10 g (SM g) smetany.5.2 Příprava zkušebního roztokuAsi 75 ml extrakčního roztoku (4.4) se přidá ke zkušebnímu vzorku (5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3), důkladně se promíchá nebo protřepe po dobu asi 15 minut a doplní se po značku extrakčním roztokem (4.4). Asi 10 ml tohoto extraktu se převede do zkumavky opatřené zátkou. Zkumavka se uloží do mrazicího boxu (3.1) a nechá se v něm stát asi 30 minut. Vychlazený extrakt se odstřeďuje po dobu 5 minut asi při 2000 otáčkách za minutu a okamžitě se dekantuje. Dekantovaný roztok se nechá ochladit na teplotu místnosti. Do odměrné baňky na 100 ml se pipetou zavede 5 ml dekantovaného roztoku a doplní se vodou. Alikvotní díl se přefiltruje přes membránový mikrofiltr (3.3). Filtrát je připraven ke stanovení pomocí HPLC.5.3 KalibraceDo odměrné baňky na 100 ml se pipetou zavede 5 ml standardního roztoku vanilinu (4.5.2). Přidá se 5 ml extrakčního roztoku (4.4) a doplňte se po značku vodou. Tento roztok obsahuje 0,5 μg/ml vanilinu.5.4 Stanovení pomocí HPLCChromatografický systém se nechá asi 30 minut stabilizovat. Vstříkne se standardní roztok (5.3). Tento postup se opakuje, dokud rozdíl v ploše píků nebo výšce píků mezi dvěma po sobě jdoucími vstřiky nebude menší než 2 %. Za popsaných podmínek je retenční čas vanilinu asi 9 minut. Standardní roztok (5.3) se duplicitně analyzuje vstřikováním 20 μl. Vstřikuje se 20 μl zkušebních roztoků (5.2). Stanoví se plocha nebo výška získaného píku vanilinu. Po provedení 10 vstřiků zkušebních vzorků (5.2). se opakuje duplicitní vstříknutí standardního roztoku (5.3).6. Výpočet výsledkůVypočte se průměrná plocha (nebo výška) (AC) píků vanilinu odpovídajících duplicitním vstřikům u každé šarže zkušebních roztoků (čtyři plochy nebo výšky).Vypočítá se faktor odezvy (R):R = AC/CMkde CM je hmotnost vanilinu v mg (4.5.1).Obsah (mg/kg) vanilinu (C) ve zkušebním vzorku je dán vzorcem:C =AS × 20 × 0,96SM × RkdeAS = plocha píku vanilinu zkušebního vzorku;SM = hmotnost zkušebního vzorku v g (5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3).Pokud se za účelem stanovení vanilinu analyzuje smetana, koncentrace stopovací látky musí být vyjádřena v miligramech stopovací látky na kilogram mléčného tuku. Tento výpočet se provede vynásobením hodnoty C výrazem 100/f, kde f je obsah tuku ve smetaně v hmotnostních procentech (m/m).20 = koeficient, kterým se berou v úvahu zředění srovnávacího a zkušebního vzorku0,96 = opravný faktor pro obsah tuku v prvním zředění zkušebního vzorku.Poznámka:Místo plochy píků lze použít výšku píků (viz 8.3).7. Přesnost metody7.1 Opakovatelnost (r)Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, stejnnesmí překročit 16 mg/kg.7.2 Reprodukovatelnost (R)Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, nesmí překročit 27 mg/kg.8. Meze tolerance8.1 Pro účely posouzení homogenity musí být z produktu obsahujícího stopovací látku odebrány tři vzorky.8.2 Stopovací látka získaná z vanilky nebo ze syntetického vanilinu.8.2.1 Dávkování 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehydu je250 g na tunu zahuštěného másla nebo másla. Jsou-li stopovací látky přidávány do smetany, pak je dávkování 250 g látky na tunu mléčného tuku.8.2.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přídané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami (s přihlédnutím ke kritickému rozdílu u 95 % pravděpodobnosti (DCr95):- 221,0 mg/kg (95 % minimálního dávkování přidané látky)- 159,0 mg/kg (70 % minimálního dávkování přidané látky)Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije na základě interpolace mezi 221,0 mg/kg a 159,0 mg/kg.8.3 Stopovací látka získaná výhradně z vanilkových bobů nebo z jejich komplexních extraktů:8.3.1 Dávkování 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehydu je100 g na tunu zahuštěného másla nebo másla. Jsou-li stopovací látky přidávány do smetany, pak je dávkování 100 g látky na tunu mléčného tuku.8.3.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami (s přihlédnutím ke kritickému rozdílu u 95 % pravděpodobnosti (DCr95):- 79,0 mg/kg (95 % minimálního dávkování přidané látky)- 54,0 mg/kg (70 % minimálního dávkování přidané látky)Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije na základě interpolace mezi 79,0 mg/kg a 54,0 mg/kg.9. Poznámky9.1 Opakovatelnost r je hodnota, u které lze se stanovenou pravděpodobností očekávat, že absolutní rozdíl mezi výsledky dvou jednotlivých zkoušek provedených stejnou metodou u stejného zkušebního materiálu a za stejných podmínek (stejné přístroje, stejná laboratoř, krátký časový odstup), bude nižší než tato hodnota. Není-li uvedeno jinak, tato pravděpodobnost je 95 %.9.2 Reprodukovatelnost R je hodnota, o které lze se stanovenou pravděpodobností očekávat, že absolutní rozdíl mezi výsledky dvou jednotlivých zkoušek získaných stejnou metodou u stejného zkušebního materiálu za různých podmínek (různí pracovníci, různé přístroje, různé laboratoře a/nebo různé termíny zkoušek), bude nižší než tato hodnota. Není-li uvedeno jinak, tato pravděpodobnost je 95 %.9.3 Rekuperace přidaného vanilinu na úrovni 250 mg/kg máselného oleje kolísá v rozmezí od 97,0 do 103,8. Průměrný zjištěný obsah byl 99,9 % se směrodatnou odchylkou 2,7 %.9.4 Standardní roztok obsahuje 5 % extrakčního roztoku z důvodu kompenzace rozšiřování píků, způsobeného přítomností 5 % extrakčního roztoku ve zkušebních vzorcích. To umožňuje kvantifikaci na základě výšky píků.9.5 Analýza je založena na lineární kalibrační křivce (intercept nula).Linearitu je třeba ověřit nejprve při prvním provedení analýzy pomocí vhodných ředění standardního roztoku (4.5.2) a potom v pravidelných intervalech a po každé změně či opravě zařízení HPLC.--------------------------------------------------PŘÍLOHA XIII(Článek 9)SPEKTROMETRICKÉ KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ ETHYLESTERU BETA-APO-8’-KAROTENOVÉ KYSELINY V ZAHUŠTĚNÉM MÁSLE A MÁSLE1. Předmět a oblast použitíTato metoda popisuje postup pro kvantitativní stanovení ethylesteru beta-apo-8’-karotenové kyseliny v zahuštěném másle a másle. Apokarotenový ester je souhrn všech látek přítomných v extraktu vzorků získáného za podmínek popsaných v této metodě, které absorbují světlo při 440 nm.2. Podstata metodyMáselný tuk se rozpustí v petroletheru a změří se jeho absorbance při 440 nm. Obsah apokarotenového esteru se stanoví porovnáním s vnějším standardem.3. Přístroje a pomůcky3.1 Pipety - dělené, o objemu 0,25, 0,50, 0,75 a 1,0 ml3.2 Spektrofotometr - vhodný pro používání při 440 nm (a 447-449 nm) a vybavený kyvetami s délkou optické dráhy 1 cm3.3 Odměrné baňky na 20 ml a 100 ml3.4 Analytické váhy s přesností 0,1 mg.4. ChemikáliePoužívají se pouze chemikálie čistoty p.a.4.1 Suspenze apokarotenového esteru (přibližně 20 %)4.1.1 Obsah látky v suspenzi se stanoví takto:Do odměrné baňky na 100 ml se naváží 400 mg, rozpustí se ve 20 ml chloroformu (4.4) a doplní se po značku cyklohexanem (4.5). 5 ml tohoto roztoku se zředí cyklohexanem na 100 ml (roztok A). 5 ml roztoku A se zředí cyklohexanem na 100 ml. Změří se absorbance při 447-449 nm (měří se maximum vztažené k cyklohexanu jako referenční hodnotě pomocí kyvet s délkou optické dráhy 1 cm).Obsah apokaroten ového esteru=A max 40000A 2550A max = absorbance měrného roztoku při maximuA = hmotnost vzorku (g)2550 = referenční hodnota A (1 %, 1 cm)Čistota suspenze je P (%).Poznámka:Suspenze apokarotenového esteru je citlivá na vzduch, teplo a světlo. V neotevřené původní nádobě (těsně uzavřené v dusíkové atmosféře) a v chladu ji lze skladovat po dobu asi 12 měsíců. Po otevření je třeba obsah v krátké době spotřebovat.4.1.2 Standardní roztok apokarotenového esteru, přibližně 0,2 mg/ml.S přesností na 0,1 mg se naváží asi 0,100 g suspenze apokarotenového esteru (4.1.1) (Wg), rozpustí se v petroletheru, kvantitativně se převede do odměrné baňky na 100 ml pomocí petroletheru (4.2) a doplní se po značku petroletherem.Tento roztok obsahuje (W.P)/10 mg/ml apokarotenového esteru.Poznámka:Roztok musí být uložen na chladném a tmavém místě. Nepoužitý roztok se po měsíci vyřadí.4.2 Petrolether (40 - 60 °C)4.3 Síran sodný, bezvodý, granulovaný, předem vysoušený po dobu dvou hodin při 102 °C.4.4 Chloroform4.5 Cyklohexan5. Pracovní postup5.1 Příprava zkušebního vzorku5.1.1 Zahuštěné másloVzorek se roztaví v sušárně při teplotě asi 45 °C.5.1.2 MásloVzorek se roztaví v sušárně při teplotě asi 45 °C a část se přefiltruje přes filtr obsahující asi 10 g bezvodého síranu sodného (4.3) v prostředí, které je chráněné před silným přirozeným nebo umělým světlem a udržované při teplotě 45 °C. Odebere se patřičné množství máselného tuku.5.2 StanoveníS přesností na 1 mg se naváží asi 1g zahuštěného másla nebo extrahovaného máselného tuku (5.1.2), (Mg). Kvantitativně se převede do odměrné baňky na 20 ml (Vml), doplní se po značku petroletherem (4.2) a důkladně se promíchá.Alikvótní díl této směsi se přenese do kyvety 1 cm dlouhé a změří se absorbance při 440 nm ve vztahu k petroletheru jako referenční hodnotě.. Koncentrace apokarotenového esteru v roztoku se zjistí pomocí kalibračního grafu (C μ/ml).5.3 Kalibrační grafPipetou na 0, 0,25, 0,5, 0,75 a 1,0 ml standardního roztoku apokarotenového esteru (4.1.2) se převede do pěti odměrných baněk na 100 ml. Zředí se doplněním ke značce petroletherem (4.2) a promíchá se.Koncentrace roztoků se pohybují od 0 do 2 ųg/ml a přesně se vypočítají ve vztahu ke koncentraci standardního roztoku (4.1.2) (W. P)/10 mg/ml. Změří se absorbance při 440 nm vztažená k petroletheru jako referenční hodnotě.Hodnoty absorbance se vynesou do grafu na osu pořadnic ("y") a koncentrace apokarotenového esteru na ose úseček ("x").6. Výpočet výsledků6.1 Obsah apokarotenového esteru vyjádřený v mg/kg produktuje dán:u zahuštěného másla výrazem: (C. V)/Mu másla výrazem: 0,82 (C. V)/Mkde:C = obsah apokarotenového esteru v μg/ml odečtený z kalibračního grafu (5.3)V = objem zkušebního roztoku v ml (5.2)M = hmotnost (v g) dílčího zkušebního vzorku (5.2)0,82 = opravný koeficient pro obsah máselného tuku v másle.7. Přesnost metody7.1 Opakovatelnost7.1.1 Analýza máslaRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji,, nesmí překročit 1,4 mg/kg.7.1.2 Analýza zahuštěného máslaRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji,, nesmí překročit 1,6 mg/kg.7.2 Reprodukovatelnost7.2.1 Analýza máslaRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, nesmí překročit 4,7 mg/kg.7.2.2 Analýza zahuštěného máslaRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, nesmí překročit 5,3 mg/kg.7.3 Zdroj technických údajůTechnické údaje byly získány na základě pokusu z roku 1995, kterého se zúčastnilo 11 laboratoří a v kterém bylo v případě másla použito 12 vzorků obsahujících stopovací látku (šest slepých duplikátů) a v případě zahuštěného másla 12 vzorků obsahujících stopovací látku (šest slepých duplikátů).8. Meze tolerance8.1 Z produktu musí být odebrány tři vzorky pro ověření, zda stopovací látka byla do produktu přidána stanoveným způsobem.8.2 Máslo8.2.1 S přihlédnutím k absorbanci pozadí se stopovací látka přidává do másla v poměru 22 mg/kg.8.2.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami (s přihlédnutím ke kritickému rozdílu u 95 % pravděpodobnosti (DCr95):- 18,0 mg/kg (95 % minimálního dávkování přidané látky)- 13,0 mg/kg (70 % minimálního dávkování přidané látky)Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije na základě interpolace mezi 18,0 mg/kg a 13,0 mg/kg.8.3 Zahuštěné máslo8.3.1 S přihlédnutím k absorbanci pozadí se stopovací látka přidává do zahuštěného másla v poměru 24 mg/kg.8.3.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami (s přihlédnutím ke kritickému rozdílu u 95 % pravděpodobnosti (DCr95):- 20,0 mg/kg (95 % minimálního dávkování přidané látky)- 14,0 mg/kg (70 % minimálního dávkování přidané látky)Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije na základě interpolace mezi 20,0 mg/kg a 14,0 mg/kg.--------------------------------------------------PŘÍLOHA XIV(Článek 9)STANOVENÍ OBSAHU SITOSTEROLU NEBO STIGMASTEROLU V MÁSLE NEBO ZAHUŠTĚNÉM MÁSLE PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ V KAPILÁRNÍ KOLONĚ1. Předmět a oblast použitíTato metoda popisuje postup pro kvantitativní stanovení sitosterolu nebo stigmasterolu v másle nebo zahuštěném másle. Sitosterol je považován za látku složenou zejména z β-sitosterolu a 2,2-dihydro-β-sitosterolu, zatímco ostatní sitosteroly jsou považovány za bezvýznamné.2. Podstata metodyMáslo nebo zahuštěné máslo se zmýdelní hydroxidem draselným v ethanolovém roztoku a nezmýdelnitelný podíl se extrahuje diethyletherem.Steroly se přemění na trimetylsilylethery a analyzují se plynovou chromatografií v kapilární koloně při použití betulinu jako vnitřního standardu.3. Přístroje a pomůcky3.1 Saponifikační baňka na 150 ml opatřená zpětným chladičem se zabroušenými spoji3.2 Dělicí nálevky na 500 ml3.3 Baňky na 250 ml3.4 Nálevky o objemu přibližně 250 ml s vyrovnáváním tlaku pro zachycování odpadního diethyletheru3.5 Skleněná kolona, 350 mm x 20 mm, opatřená zátkou se skleněným sintrem.3.6 Vodní lázeň nebo izotermní plášť3.7 Reakční nádobky na 2 ml3.8 Plynový chromatograf, který lze používat s kapilární kolonou, opatřený dělícím systémem, který tvoří:3.8.1 termostatická komora pro kolony schopná udržovat požadovanou teplotu s přesností ± 1 °C;3.8.2 injektor s termoregulací;3.8.3 plamenový ionizační detektor a převodník/zesilovač;3.8.4 integrátor-zapisovač, který lze použít s převodníkem/zesilovačem (3.8.3).3.9 Kapilární kolona z křemenného skla zcela potažená BP1 nebo rovnocenným materiálem ve stejnoměrné tloušťce 0,25 μm; kolona musí být schopna rozložit trimethylsilylderiváty lanosterolu a sitosterolu. Vhodná je BP1 o délce 12 m a vnitřním průměru 0,2 mm.3.10 1 μl injekční mikrostříkačka pro plynovou chromatografii s tvrzenou jehlou.4. ChemikáliePoužívají se pouze chemikálie čistoty p.a., destilovaná voda nebo voda nejméně rovnocenné čistoty.4.1 Ethanol o čistotě nejméně 95 %4.2 Hydroxid draselný, 60 % roztok. Rozpustí se 600 g hydroxidu draselného (nejméně 85 %) ve vodě a doplní se vodou do 1 litru.4.3 Betulin o čistotě nejméně 99 %4.3.1 Roztoky betulinu v diethyletheru (4.4)4.3.1.1 Koncentrace roztoku betulinu pro stanovení sitosterolu musí být 1,0 mg/ml.4.3.1.2 Koncentrace roztoku betulinu pro stanovení stigmasterolu musí být 0,4 mg/ml.4.4 Diethylether čistoty p.a. (zbavený peroxidů a zbytků)4.5 Síran sodný bezvodý, granulovaný, předem sušený dvě hodiny při teplotě 102 °C.4.6 Silylační činidlo, např. TRI-SIL (dodávané firmou Pierce Chemical Co., katalogové číslo 49001) nebo rovnocenné. (Důležité: TRI-SIL je hořlavý, toxický, korosivní a pravděpodobně karcinogenní. Laboratorní personál musí být seznámen se zásadami bezpečnosti práce s TRI-SILem a přijímat nezbytná bezpečnostní opatření).4.7 Lanosterol4.8 Sitosterol známé čistoty nejméně 90 % (P).Poznámka 1:Čistota standardních materiálů používaných pro kalibraci musí být zjištěna standardizační metodou. Vychází se z předpokladu, že všechny steroly ve vzorku jsou znázorněny na chromatogramu, že celková plocha píků představuje 100 % sterolových složek a že steroly reagují na detektor stejně. Linearita systému musí být ověřena v celém dotčeném rozsahu koncentrací.4.8.1 Standardní roztok sitosterolu s přesností na 0,001 mg/ml se připraví roztok obsahující přibližně 0,5 mg/ml (W1) sitosterolu (4.8) v diethyletheru (4.4).4.9 Stigmasterol známé čistotynejméně 90 %4.9.1 Standardní roztok stigmasterolu s přesností na 0,001 mg/ml se připraví roztok obsahující přibližně 0,2 mg/ml (W1) stigmasterolu (4.9) v diethyletheru (4.4).4.10 Směs pro rozlišovací zkoušku: připraví se roztok obsahující 0,05 mg/ml lanosterolu (4.7) a 0,5 mg/ml sitosterolu (4.8) v diethyletheru (4.4).5. Pracovní postup5.1 Příprava standardních roztoků pro chromatografii. Roztok vnitřního standardu (4.3.1) se přidá do odpovídajícího standardního roztoku sterolu současně s přidáním do zmýdelněného vzorku (viz 5.2.2).5.1.1 Standardní chromatografický roztok sitosterolu: 1 ml standardního roztoku sitosterolu (4.8.1) se přenese do každé ze dvou reakčních nádobek (3.7) a proudem dusíku se odstraní diethylether. Přidá se 1 ml roztoku vnitřního standardu (4.3.1.1) a proudem dusíku se odstraní diethylether.5.1.2 Standardní chromatografický roztok stigmasterolu: 1 ml standardního roztoku stigmasterolu (4.9.1) se přenese do každé ze dvou reakčních nádobek (3.7) a proudem dusíku se odstraní diethylether. Přidá se 1 ml roztoku vnitřního standardu (4.3.1.2) a proudem dusíku se odstraní diethylether.5.2 Příprava nezmýdelnitelného podílu5.2.1 Vzorek másla se roztaví při teplotě nepřesahující 35 °C; vzorek se důkladně promíchá mícháním.S přesností na 1 mg se naváží přibližně 1 g másla (W2) nebo zahuštěného másla (W2) do baňky na 150 ml (3.1). Přidá se 50 ml ethanolu (4.1) a 10 ml roztoku hydroxidu draselného (4.2). Nasadí se zpětný chladič a obsah se zahřívá asi na 75 °C po dobu 30 minut. Chladič se sejme a baňka se ochladí přibližně na teplotu místnosti.5.2.2 Přidá se 1 ml roztoku vnitřního standardu (4.3.1.1, má-li být stanoven sitosterol, nebo 4.3.1.2, má-li být stanoven stigmasterol). Důkladně se promíchá. Obsah baňky se kvantitativně převede do dělící nálevky na 500 ml (3.2). Baňka se postupně vypláchne 50 ml vody a 250 ml diethyletheru (4.4). Obsah dělící nálevky se důkladně protřepává po dobu 2 minut a počká se, dokud se neoddělí jednotlivé fáze. Spodní vodná vrstva se vypustí a etherová vrstva se promyje čtyřmi alikvótnímí 100 ml díly vody.Poznámka 2:Má-li se zabránit tvorbě emulze, je nezbytně nutné provádět první dvě promývání vodou jemně (10 převrácení nálevky). Třetí promývání lze provést důkladným protřepáním po dobu 30 vteřin. Pokud se vytvoří emulze, je možné ji rozpustit přidáním 5-10 ml ethanolu. V případě, že se přidá ethanol, je nutné provést další dvě důkladná promytí vodou.5.2.3 Čirá, mýdla zbavená etherová vrstva se nechá projít přes skleněnou kolonu (3.5), naplněnou 30 g bezvodého síranu sodného (4.5). Ether se shromáždí v baňce na 250 ml (3.3). Přidá se jeden varný kamínek a obsah se nechá odpařit téměř do sucha ve vodní lázni nebo v izotermním plášti. Všechna odpadní rozpouštědla musí být zachycena.Poznámka 3:Jestliže se extrakty vzorků odpařují do sucha při příliš vysoké teplotě, může dojít ke ztrátám na sterolu.5.3 Příprava trimethylsilyletherů5.3.1 Etherový roztok zbývající v baňce se přenese do reakční nádobky na 2 ml (3.7) se 2 ml diethyletheru a ether se odstraní proudem dusíku. Baňka se promyje dvěma dalšími 2 ml alikvótními dávkami diethyletheru, tekutina se vždy převede do reakční nádobky a ether se odstraní proudem dusíku.5.3.2 Provede se silylace vzorku přidáním 1 ml TRI-SILu (4.6). Nádobka se zavře a důkladně se protřepe, aby se obsahrozpustil. Pokud se nerozpustí úplně, nádobka se zahřeje na 65-70 °C. Nechá se nejméně 5 minut odstát než se obsah vstříkne do plynového chromatografu. Standardy se silylují stejným způsobem jako vzorky. Směs pro rozlišovací zkoušku se silyluje stejným způsobem jako vzorky.Poznámka 4:Silylace musí být provedena v bezvodém prostředí. Neúplná silylace betulinu je indikována druhým píkem v blízkosti píku betulinu.Pokud je během silylace přítomen ethanol, pak tuto sylilaci ruší. Ethanol může být přítomen v důsledku nedostatečného promývání ve fázi extrakce. Pokud tento problém přetrvává, může být během fáze extrakce provedeno páté promytí s důkladným třepáním po dobu třiceti vteřin.5.4 Analýza plynovou chromatografií5.4.1 Volba provozních podmínekPlynový chromatograf se připraví podle návodu výrobce.Směrné provozní podmínky jsou tyto:- teplota kolony: 265 °C- teplota injektoru: 265 °C- teplota detektoru: 300 °C- průtok nosného plynu: 0,6 ml/min- tlak vodíku: 84 kPa- tlak vzduchu: 155 kPa- rozdělení vstřiku: 10:1 až 50:1; poměr rozdělení musí být optimalizován podle návodu výrobce a linearity odezvy detektoru a poté validován v rozmezí dotčených koncentrací.Poznámka 5:Je nesmírně důležité pravidelně čistit vstřikovací komoru.- množství nastřikované látky: 1 μl roztoku TMSE.Je třeba počkat, dokud systém nedosáhne rovnováhy a zahájit analýzu až po dostatečně stabilní reakci.Tyto podmínky se mohou měnit podle charakteristických vlastností kolony a plynového chromatografu tak, aby získané chromatogramy splňovaly tyto požadavky:- pík sitosterolu musí být dostatečně odlišen od píku lanosterolu. Obrázek 1 znázorňje typický chromatogram, který je třeba získat ze silylované směsi pro rozlišovací zkoušku (4.10),- relativní retenční časy následujících sterolů se musí blížit těmto hodnotám:cholesterol. 1,0stigmasterol: 1,3sitosterol: 1,5betulin: 2,5- retenční čas betulinu musí být přibližně 24 minut.5.4.2 Analytický postupVstříkne se 1 μl roztoku silylovaného standardu (stigmasterolu nebo sitosterolu) a upraví se kalibrační parametry integrátoru.Vstříkne se další 1 μl roztoku silylovaného standardu, aby bylo možné stanovit faktory odezvy ve vztahu k betulinu.Vstříkne se 1 μl roztoku silylovaného vzorku a změří se plochy píků. Před každým chromatografickým cyklem, jakož i po každém takovém cyklu musí dojít k nástřiku standardů.Za normálních okolností může být provedeno šest vstříknutí vzorku v každém pokusu.Poznámka 6:Do integrace píku stigmasterolu je třeba zahrnout chvosty uvedené v bodech 1, 2 a 3 na obr. 2b.Integrace píku sitosterolu by měla zahrnovat plochu píku 22 dihydro-β-sitosterolu (stigmastanolu), který se vymývá okamžitě po sitosterolu (viz obr. 3b) při vyhodnocení celkového sitosterolu.6. Výpočet výsledků6.1 Stanoví se plocha píků sterolu a píků betulinu v obou standardech na začátku a na konci každého pokusu a vypočte se R1:R=průměrná plocha píku sterolu ve standarduprůměrná plocha píku betulinu ve e standarduStanoví se plocha píku sterolu (stigmasterolu a sitosterolu) a píku betulinu ve vzorku a vypočte se R2:R=plocha píku sterolu ve vzorkuplocha píku betulinu ve e vzorkuW1 = obsah sterolu ve standardu (mg), obsažený v 1 ml standardního roztoku (4.8.1 nebo 4.9.1)W2 = hmotnost vzorku (g) (5.2.1)P = čistota standardního sterolu (4.9 nebo 4.9)Obsah sterolu ve vzorku=RR×WWP × 107. Přesnost metody7.1 Máslo7.1.1 Opakovatelnost7.1.1.1 StigmasterolRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, nesmí překročit 19,3 mg/kg.7.1.1.2 SitosterolRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, nesmí překročit 23,0 mg/kg.7.1.2 Reprodukovatelnost7.1.2.1 StigmasterolRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, nesmí překročit 31,9 mg/kg.7.1.2.2 SitosterolRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, nesmí překročit 8,7 %, vztaženo ke střední hodnotě stanovení.7.1.3 Zdroj údajů o přesnostiÚdaje o přesnosti byly získány na základě pokusuz roku 1992, kterého se zúčastnilo osm laboratoří a v kterém bylo v případě stigmasterolu použito šest vzorků (tří slepých duplikátů) a v případě sitosterolu šest vzorků (tří slepých duplikátů).7.2 Zahuštěné máslo7.2.1 Opakovatelnost7.2.1.1 StigmasterolRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, nesmí překročit 10,2 mg/kg.7.2.1.2 SitosterolRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jede pracovník na stejném přístroji, nesmí překročit 3,6 %, vztaženo ke střední hodnotě stanovení.7.2.2 Reprodukovatelnost7.2.2.1 StigmasterolRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, nesmí překročit 25,3 mg/kg.7.2.2.2 SitosterolRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, nesmí překročit 8,9 %, vztaženo ke střední hodnotě stanovení.7.2.3 Zdroj údajů o přesnostiÚdaje o přesnosti byly získány na základě pokusu z roku 1991, kterého se zúčastnilo devět laboratoří a v kterém bylo v případě stigmasterolu použito šest vzorků (tří slepých duplikátů) a v případě sitosterolu šest vzorků (tří slepých duplikátů.8. Meze tolerance8.1 Z produktu obsahujícího stopovací látku musí být odebrány tři vzorky pro ověření, zda zavedení této látky do produktu bylo provedeno správně.8.2 Máslo8.2.1 Stigmasterol8.2.1.1 Dávkování stigmasterolu je 150 g stigmasterolunejméně 95 % čistoty na tunu másla, tj. 142,5 mg/kg, nebo 170 g stigmasterolu nejméně 85 % čistoty na tunu másla, tj. 144,5 mg/kg.8.2.1.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávky a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami (s přihlédnutím ke kritickému rozdílu u 95 % pravděpodobnosti (DCr95):- 116,0 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu 95 % čistoty)- 118,0 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu 85 % čistoty)- 81,0 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu 95 % čistoty)- 82,0 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu 85 % čistoty).Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 116,0 mg/kg a 81,0 mg/kg nebo 118,0 mg/kg a 82,0 mg/kg.8.2.2 Sitosterol8.2.2.1 Dávkování sitosterolu je 600 g sitosterolu nejméně 90 % čistoty na tunu másla, tj. 540 mg/kg.8.2.2.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledků s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami (s přihlédnutím ke kritickému rozdílu u 95 % pravděpodobnosti (DCr95):- 486,0 mg/kg (95 % minimálního dávkování sitosterolu 90 % čistoty)- 358,0 mg/kg (70 % minimálního dávkování sitosterolu 90 % čistoty).Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 486,0 mg/kg a 358,0 mg/kg.8.3 Zahuštěné máslo8.3.1 Stigmasterol8.3.1.1 Dávkování stigmasterolu je 150 g stigmasterolu nejméně 95 % čistoty na tunu zahuštěného másla, tj. 142,5 mg/kg, nebo 170 g stigmasterolu nejméně 85 % čistoty na tunu zahuštěného másla, tj. 144,5 mg/kg.8.3.1.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami (s přihlédnutím ke kritickému rozdílu u 95 % pravděpodobnosti (DCr95):- 120,0 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu 95 % čistoty)- 122,0 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu 85 % čistoty)- 84,0 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu 95 % čistoty)- 86,0 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu 85 % čistoty)Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 120,0 mg/kg a 840 mg/kg nebo 122,0 mg/kg a 86,0 mg/kg.8.3.2 Sitosterol8.3.2.1 Dávkování sitosterolu je 600 g sitosterolu nejméně 90 % čistoty na tunu másla, tj. 540 mg/kg.8.3.2.2 Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami (s přihlédnutím ke kritickému rozdílu u 95 % pravděpodobnosti (DCr95):- 486,0 mg/kg (95 % minimálního dávkování sitosterolu 90 % čistoty)- 358,0 mg/kg (70 % minimálního dávkování sitosterolu 90 % čistoty).Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 486,0 mg/kg a 358,0 mg/kg.+++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++--------------------------------------------------PŘÍLOHA XV(Článek 10)REFERENČNÍ METODA PRO ZJIŠŤOVÁNÍ KRAVSKÉHO MLÉKA A KASEINÁTŮ V SÝRECH Z OVČÍHO MLÉKA, KOZÍHO MLÉKA NEBO BUVOLÍHO MLÉKA, NEBO SMĚSÍ OVČÍHO, KOZÍHO A BUVOLÍHO MLÉKA1. PředmětZjišťování kravského mléka a kaseinátů v sýrech vyrobených z ovčího mléka, kozího mléka, buvolího mléka anebo ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka izoelektrickou fokusací γ-kaseinů po plasminolýze.2. Oblast použitíMetoda je vhodná pro citlivé a specifické zjišťování mléka a kaseinátu, též tepelně ošetřených, v čerstvých a zralých sýrech vyrobených z ovčího mléka, kozího mléka, buvolího mléka nebo ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka. Není vhodná k odhalení falšování mléka a sýrů tepelně ošetřenými bílkovinnými koncentráty z hovězí syrovátky.3. Podstata metody3.1 Izolace kaseinů ze sýra a referenčních standardů.3.2 Rozpuštění izolovaných kaseinů a proteolýza plasminem (EC.3.4.21.7).3.3 Izoelektrická fokusace plasminem ošetřených kaseinů za přítomnosti močoviny a vybarvení bílkovin.3.4 Vyhodnocení vybarvených obrazců kaseinu γ3 a γ2 (důkaz přítomnosti kravského mléka) na základě porovnání obrazce získaného ze vzorku s obrazci získanými u téhož gelu z referenčních standardů obsahujících 0 % a 1 % kravského mléka.4. ChemikálieNení-li stanoveno jinak, používají se pouze chemikálie čistoty p.a., redestilovaná voda nebo voda rovnocenné čistoty.Poznámka:Následující údaje se vztahují na laboratorně připravované polyakrylamidové gely s obsahem močoviny o rozměrech 265 × 125 × 0,25 mm. Pokud se použijí jiné rozměry nebo druhy gelu, může být nutné upravit podmínky separace.Isoelektrická fokusace4.1 Chemikálie pro přípravu polyakrylamidových gelů s obsahem močoviny4.1.1 Zásobní roztok geluVe vodě se rozpustí:4,85 g akrylamidu0,15 g N, N’-methylen-bis-akrylamidu (BIS)48,05 g močoviny15,00 g glycerolu (87 % hmot.),doplní se do 100 ml a uloží do chladničky v hnědé skleněné lahvi.Poznámka:Místo uvedených množství neurotoxického akrylamidu lze použít komerčně dostupný, předem namíchaný roztok akrylamidu a bisakrylamidu. V případě, že koncentrace komerčního roztoku je 30 % akrylamidu a 0,8 % bis-akrylamidu, pak uvedená množství v daném přípravku (4,85 g akrylamidu a 0,15 g BIS) musí být nahrazena komerčním roztokem o objemu 16,2 ml. Zásobní roztok lze skladovat nejdéle 10 dnů. Pokud je jeho vodivost vyšší než 5 μS, je nutné provést jeho deionizaci promícháním s 2 g Amberlitu MB-3 po dobu 30 minut a poté jej přefiltrovat přes 0,45 μm membránu.4.1.2 Roztok geluPřipraví se roztok gelu smícháním přísad a amfolytů se zásobním roztokem gelu (viz 4.1.1).9,0 ml zásobního roztoku24 mg β-alaninu500 μl amfolytu pH 3,5 - 9,5 [1]250 μl amfolytu pH 5-7 [2]250 μl amfolytu pH 6-8 [3].Gelový roztok se promíchá a odplyní po dobu 2 až 3 minut v ultrazvukové lázni nebo ve vakuu.Poznámka:Gelový roztok se musí připravit bezprostředně před naléváním (viz 6.2).4.1.3 Roztoky katalyzátorů4.1.3.1 N, N, N’, N’-tetramethylendiamin (Temed).4.1.3.2 400 g/l roztoku persíranu amonného (PER)800 mg PER se rozpustí ve vodě a doplní se do 2 ml.Poznámka:Vždy je nutné používat čerstvě připravený roztok PER.4.2 Kontaktní tekutinaKerosin nebo kapalný parafin.4.3 Anodový roztok5,77 g kyseliny fosforečné (85 % hm.) se rozpustí ve vodě a doplní se vodou do 100 ml.4.4 Katodový roztok2,00 g hydroxidu sodného se rozpustí ve vodě a doplní se vodou do 100 ml.Příprava vzorku4.5 Chemikálie určené k izolaci bílkovin4.5.1 Zředěná kyselina octová (25,0 ml ledové kyseliny octové doplněné vodou do 100 ml).4.5.2 Dichlormethan4.5.3 Aceton4.6 Tlumivý roztok pro rozpuštění bílkovinVe vodě se rozpustí5,75 g glycerolu (87 % hm.)24,03 g močoviny250 mg dithithreitolua doplní se na objem 50 ml.Poznámka:Skladuje se v chladničce, maximální doba uskladnění jeden týden.4.7 Chemikálie určené k plasminovému štěpení kaseinů4.7.1 Tlumivý roztok uhličitanu amonnnéhoMolární roztok hydrogenuhličitanu amonného 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml vody) obsahující 0,05 mol/l kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA, 1,46 g/100 ml) se roztokem uhličitanu amonného (1,92 g/100 ml vody) obsahujícího 0,05 mol/l EDTA ztitruje na pH 8.4.7.2 Hovězí plasmin (EC. 3.4.21.7), s aktivitou nejméně 5 U/ml.4.7.3 Roztok kyseliny ε-aminokapronové určené k inhibici enzymu.2,624 g kyseliny ε-aminokapronové (6-amino-n-hexankyseliny) se rozpustí ve 100 ml 40 % (obj.) ethanolu.4.8 Referenční standardy4.8.1 Certifikované referenční standardy směsi ovčího a kozího odstředěného mléka vysráženého pomocí syřidla a s obsahem 0 % a 1 % kravského mléka lze získat od Ústavu pro referenční materiály a měření působícího při Komisi, B–2440, Geel, Belgie.4.8.2 Příprava laboratorních prozatímních standardů buvolího mléka vysráženého pomocí syřidla a s obsahem 0 % a 1 % kravského mlékaOdstředěné mléko se připraví odstředěním syrového buvolího nebo kravského mléka při teplotě 37 °C (2500 g, 20 minut). Po rychlém ochlazení zkumavky a jejího obsahu na 6 až 8 °C se úplně odstraní horní tuková vrstva. Pro přípravu 1 % standardu se 5,00 ml odstředěného kravského mléka přidá do 495 ml odstředěného buvolího mléka v kádince o obsahu 1 l. Hodnota pH se upraví na 6,4 přídavkem zředěné kyseliny mléčné (10 %, hm./obj.). Teplota se upraví na 35 °C, přidá se 100 μl telecího syřidla (aktivita syřidla 1:10000, cca 3000 U/ml) a míchá se po dobu 1 minuty. Kádinka se potom zakryje hliníkovou fólií a nechá se hodinu stát při teplotě 35 °C k utvoření sýřeniny. Po utvoření sýřeniny se veškeré mléko vysrážené pomocí syřidla lyofilizuje, aniž by předtím byla provedena homogenizace nebo odebrání syrovátky. Lyofilizované mléko se jemně rozemele na homogenní prášek. Při přípravě referenčního standardu 0 % se u čistého odstředěného buvolího mléka použije stejný postup. Referenční standardy musí být skladovány při teplotě –20 °C.Poznámka:Před přípravou referenčních standardů se doporučuje zkontrolovat čistotu buvolího mléka izoelektrickou fokusací kaseinů vystavených působení plasminu.Chemikálie určené kbarvení bílkovin4.9 FixativVe vodě se rozpustí 150 g kyseliny trichloroctové a doplní se vodou do 1000 ml.4.10 Odbarvovací roztok500 ml methanolu a 200 ml ledové kyseliny octové se zředí destilovanou vodou na 2000 ml.Poznámka:Odbarvovací roztok se připravuje každý den čerstvý; lze jej připravit smícháním stejných objemů zásobního roztoku 50 % (obj.) methanolu a zásobního roztoku 20 % (obj.) ledové kyseliny octové.4.11 Barvicí roztoky4.11.1 Barvicí roztok (zásobní roztok 1)V 1000 ml 90 % methanolu se rozpustí 3,0 g brilantní modři Coomassie G-250 (C. I. 42655) pomocí magnetické míchačky (asi 45 min.) a roztok se přefiltruje přes dva středně husté skládané filtry.4.11.2 Barvicí roztok (zásobní roztok 2)V 1000 ml 20 % (obj.) kyseliny octové se rozpustí 5,0 g síranu měďnatého, pentahydrátu.4.11.3 Barvicí roztok (pracovní roztok)Bezprostředně před barvením se smíchá 125 ml obou zásobních roztoků (4.11.1 a 4.11.2).Poznámka:Barvicí roztok je třeba použít v den přípravy.5. Přístroje a pomůcky5.1 Skleněné desky (265 × 125 × 4 mm), pryžový váleček (o šířce 15 cm), nivelační stolek.5.2 Nosná fólie gelu (265 × 125 mm)5.3 Krycí fólie (280 × 125 mm). Na každý dlouhý okraj se nalepí pruh lepící pásky (280 × 6 × 0,25 mm, viz obr. 1).5.4 Elektrofokusační komora s chladící deskou (např. 265 × 125 mm) a vhodný napájecí zdroj (≥ 2,5 kV) nebo automatické elektroforetické zařízení.5.5 Cirkulační kryostat, s regulací teploty ve výši 12 ± 0,5 °C.5.6 Odstředivka nastavitelná na 3000 g.5.7 Elektrodové proužky (o délce ≥ 265 mm).5.8 Plastové kapací nádobky na anodový a katodový roztok.5.9 Aplikátory vzorku (10 x 5 mm, z viskózy nebo filtračního papíru s nízkou adsorpcí bílkovin).5.10 Nůžky, skalpely a pinzety z nerezové oceli.5.11 Odbarvovací a barvicí misky (např. misky na nástroje 280 × 150 mm) z nerezové oceli nebo skleněné.5.12 Nastavitelný tyčový homogenizátor s průměrem tyče 10 mm a rychlostí 8000 až 20000 otáček za minutu.5.13 Magnetická míchačka.5.14 Ultrazvuková lázeň.5.15 Svářečka fólií.5.16 Mikropipety na 25 μl5.17 Vakuová odstředivka nebo lyofilizátor.5.18 Termostatem řízená vodní lázeň, nastavitelná na 35 a 40 ± 1 °C s třepačkou.5.19 Densitometrické zařízení umožňující měření na vlnové délce λ = 634 nm.6. Pracovní postup6.1 Příprava vzorku6.1.1 Izolace kaseinůDo odstředivkové kyvety na 100 ml se naváží množství sýra nebo referenčního standardu odpovídající 5 g sušiny, přidá se 60 ml destilované vody a obsah se zhomogenizuje tyčovým homogenizátorem (8000 až 10000 ot/min.). Upraví se pH na 4,6 zředěnou kyselinou octovou (4.5.1) a odstřeďuje se (5 minut, 3000 g). Dekantuje se tuk a syrovátka, a zbytek se homogenizuje při 20000 otáčkách za minutu se 40 ml destilované vody s hodnotou pH upravenou na 4,5 zředěnou kyselinou octovou. Přidá se 20 ml dichlormethanu (4.5.2) a znovu se homogenizuje a odstřeďuje (5 minut, 3000 g). Špachtlí se vyjme kaseinová vrstva, která se nachází mezi vodnou a organickou fází (viz obr. 2) a obě fáze se dekantují. Kasein se znovu homogenizuje se 40 ml destilované vody (viz výše) a 20 ml dichlormethanu (4.5.2) a odstředí se. Tento postup se opakuje, dokud obě extrakční fáze nejsou bezbarvé (dvakrát až třikrát). Bílkovinný zbytek se homogenizuje s 50 ml acetonu (4.5.3) a přefiltruje se přes středně hustý skládaný papírový filtr. Zbytek se promyje dvěma samostatnými 25 ml dávkami acetonu a nechá se vysušit na vzduchu nebo v proudu dusíku. Potom se jemně rozmělní v třecí misce.Poznámka:Suché bílkovinné extrakty se musí uchovávat při teplotě -20 °C.6.1.2 Přeměna β-kaseinů na γ-kaseiny působením plasminu25 mg izolovaných kaseinů (6.1.1) se rozptýlí v 0,5 ml tlumivého roztoku uhličitanu amonného (4.7.1) a směs se 20 minut homogenizuje, např. ultrazvukem. Směs se zahřeje na 40 °C a přidá se 10 μl plasminu (4.7.2), promíchá se a inkubuje 1 hodinu při teplotě 40 °C za stálého třepání. Pro inhibici enzymu se přidá 20 μl roztoku kyseliny ε-aminokapronové (4.7.3). Potom se přidá 200 mg pevné močoviny a 2 mg dithiothreitolu.Poznámka:Pro získání lepší symetrie fokusovaných kaseinových pásů se doporučuje po přidání kyseliny ε-aminokapronové roztok lyofilizovat a potom zbytky rozpustit ve 0,5 ml tlumícího roztoku pro rozpouštění bílkovin (4.6).6.2 Příprava polyakrylamidových gelů s obsahem močovinyNa skleněnou desku (5.1) se válečkem nanese nosná fólie gelu (5.2) s pomocí několika kapek vody a přebytečná voda se odsaje papírovým ubrouskem nebo kapesníčkem. Stejným způsobem se válečkem nanese druhá, krycí fólie (5.3) s distančními vložkami (0,25 mm) na jinou skleněnou desku. Tato druhá deska se uloží vodorovně na nivelační stolek.K připravenému odplyněnému roztoku gelu (4.1.2) se přidá 10 μl Temedu (4.1.3.1), protřepe se a přidá 10 μl roztoku PER (4.1.3.2); důkladně se promíchá a okamžitě nalije rovnoměrně na střed krycí fólie. Jeden okraj nosné desky gelu (stranou s fólií směrem dolů) se přiloží k desce s krycí fólií a pomalu se pokládá tak, aby se mezi fóliemi vytvořila pravidelně rozprostřená tenká vrstva gelu bez bublin (obr. 3). Pomocí tenké špachtle se nosná deska gelu opatrně přitiskne po celé délce a položí se na ni tři další skleněné desky, aby ji zatížily. Po skončení polymerace (asi po 60 minutách) se spolu s krycí fólií sejme gel zpolymerovaný na nosné fólii gelu tak, že se skleněné desky nakloní. Zadní strana nosné fólie se pečlivě očistí, aby se odstranily zbytky gelu a močoviny. "Gelový sendvič" se zavaří do tenké fólie a uloží do chladničky (nejdéle na šest týdnů).Poznámka:Krycí fólii s distančními vložkami lze použít znovu. Polyakrylamidový gel může být rozřezán na menší části; je to vhodné v případě omezeného počtu vzorků nebo v případě použití automatického elektroforetického zařízení (dva gely o rozměrech 4,5 x 5 cm).6.3 Izoelektrická fokusaceKryostat se nastaví na 12 °C. Zadní strana nosné fólie gelu se otře kerosinem a potom se na střed chladícího bloku kápne několik kapek kerosinu (4.2). Opatrně se přiloží "gelový sendvič" nosnou fólií obrácený dolů, aby se vytlačily všechny vzduchové bubliny. Přebytečný kerosin se otře a sejme se krycí fólie. Elektrodové proužky se napustí elektrodovými roztoky (4.3, 4.4), seříznou se na délku gelu a uloží se na místo (vzdálenost elektrod 9,5 cm).Podmínky izoelektrické fokusace6.3.1 Rozměry gelu 265 × 125 × 0,25 mmFáze | Doba (min.) | Napětí (V) | Proud (mA) | Příkon (W) | Volty/hodiny (Vh) |1. Předběžná fokusace | 30 | max. 2500 | max. 15 | konstantní 4 | cca 300 |2. Fokusace vzorku [4] | 60 | max. 2500 | max. 15 | konstantní 4 | cca 1000 |3. Konečná fokusace | 60 | max. 2500 | max. 5 | maximální 20 | cca 3000 |40 | max. 2500 | max. 6 | maximální 20 | cca 3000 |30 | max. 2500 | max. 7 | maximální 25 | cca 3000 |Poznámka:Jestliže se změní tloušťka nebo šířka gelů, hodnoty proudu a příkonu musí být odpovídajícím způsobem upraveny (např. hodnoty proudu a příkonu se zdvojnásobí, použije-li se gel o rozměrech 265 × 125 × 0,5 mm).6.3.2 Příklad programování napětí u automatického elektroforetického zařízení (2 gely 5,0 × 4,5 cm, elektrody bez proužků se přikládají přímo na gel.Fáze | Napětí | Proud | Příkon | Teplota | Volty/hodiny |1. Předběžná fokusace | 1000 V | 10,0 mA | 3,5 W | 8 °C | 85 Vh |2. Fokusace vzorku | 250 V | 5,0 mA | 2,5 W | 8 °C | 30 Vh |3. Fokusace | 1200 V | 10,0 mA | 3,5 W | 8 °C | 80 Vh |4. Fokusace | 1500 V | 5,0 mA | 7,0 W | 8 °C | 570 Vh |Aplikátor vzorku ve fázi 2 se vkládá při 0 Vh.Aplikátor vzorku ve fázi 2 se odstraňuje při 30 Vh.6.4 Barvení bílkovin6.4.1 Fixace bílkovinOkamžitě po vypnutí napájení se odstraní elektrodové proužky a gel se ihned vloží do barvicí/odbarvovací misky naplněné 200 ml fixatéru (4.9). Ponechá se v něm 15 minut za stálého třepání.6.4.2 Praní a barvení gelové deskyFixatér se beze zbytku dekantuje a gelová deska se dvakrát promyje po dobu 30 sekund vždy ve 100 ml odbarvovacího roztoku (4.10). Odbarvovací roztok se dekantuje, miska se naplní 250 ml barvicího roztoku (4.11.3) a gel se po dobu 45 minut nechá za mírného třepání zbarvovat.6.4.3 Odbarvení gelové deskyBarvicí roztok se dekantuje a gelová deska se dvakrát promyje po dobu 30 sekund vždy ve 100 ml odbarvovacího roztoku (4.10). Potom se 15 minut protřepává s 200 ml odbarvovacího roztoku; fáze odbarvování se opakuje nejméně dvakrát až třikrát, dokud není pozadí čiré a bezbarvé. Gelová deska se potom promyje destilovanou vodou (2 x 2 minuty) a nechá se uschnout na vzduchu (2 až 3 hodiny) nebo se usuší vysoušečem vlasů (10 až 15 minut).Poznámka 1:Fixace, promývání, barvení a odbarvování se provádí při teplotě 20 °C. Vyšší teploty se nesmí používat.Poznámka 2:Pokud se upřednostňuje citlivější obarvení stříbrem (např. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No 17-1150-01), pak musí být kaseinové vzorky ošetřené plasminem zředěny v poměru 5 mg/ml.7. HodnoceníHodnocení se provádí porovnáním proteinových obrazců zkoumaného vzorku s obrazci referenčních standardů u stejného gelu. Zjišťování kravského mléka v sýrech vyrobených z ovčího mléka, kozího mléka, buvolího mléka nebo ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka se provádí prostřednictvím γ3- a γ2-kaseinů, jejichž izoelektrické body se nacházejí v rozmezí mezi pH 6,5 a pH 7,5 (obr. 4a, b, obr. 5). Detekční mez je nižší než 0,5 %.7.1 Vizuální hodnoceníPro vizuální hodnocení množství kravského mléka se doporučuje upravit koncentraci vzorků a referenčních standardů s cílem dosáhnout u hovězích, kozích a/nebo buvolích γ3- a γ2-kaseinů (viz "γ2E,G,B" a "γ3 E,G,B" na obrázcích 4a, b a obrázku 5) stejné úrovně intenzity. Pouze za těchto podmínek lze přímo posoudit množství kravského mléka (menší nebo větší než 1 % nebo ve výši 1 %) v analyzovaném vzorku porovnáním intenzity hovězích γ3- a γ2-kaseinů (viz "γ3 C" a "γ2 C" na obrázcích 4a, b a obrázku 5) s intenzitami kaseinů v referenčních standardech s obsahy 0 % a 1 % (ovčích, kozích), nebo prozatímních laboratorních standardech (buvolích).7.2 Denzitometrické hodnoceníPokud je to možné, použije se pro stanovení poměru mezi plochami píků hovězích γ3- a γ2-kaseinů a plochami píků ovčích, kozích a/nebo buvolích γ3- a γ2-kaseinů (viz obr. 5) denzitometrie (5.19). Tato hodnota se porovná s poměrem ploch píků γ3- a γ2-kaseinů v 1 % referenčním standardu (ovčím, kozím) nebo prozatímním laboratorním standardu (buvolím) analyzovaných u téhož gelu.Poznámka:Tato metoda funguje uspokojivě, pokud existuje jasný pozitivní signál obou hovězích γ3- a γ2-kaseinů v 1 % referenčním standardu, avšak nikoli v 0 % referenčním standardu. V opačném případě je nutné postup optimalizovat při přesném dodržení pokynů stanovených v dané metodě.Vzorek je považován za pozitivní, jestliže hodnoty obou hovězích γ3- a γ2-kaseinů nebo příslušných poměrů ploch píků jsou stejné nebo větší než hodnoty odpovídající 1 % referenčnímu standardu.8. Literatura1. Addeo F., Moio L, Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Lucca A., Bocca A.: Use of plasmin to incerase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L, Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrierapholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin a. s. signal amplifier. v: Electrophoresis-Forum 89 (red. B.J. Radola), s. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhlmilch in Schaf und Ziegenmilch bzw. - käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).+++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++[1] Jako zvláště vhodné pro dosažení žádoucího rozdělení (-kaseinů se ukázaly výrobky Ampholine(pH 3,5-9,5 (Pharmacia) a Resolyte (pH 5-7 pH 6-8 (BDH, Merck).[2] Jako zvláště vhodné pro dosažení žádoucího rozdělení (-kaseinů se ukázaly výrobky Ampholine(pH 3,5-9,5 (Pharmacia) a Resolyte (pH 5-7 pH 6-8 (BDH, Merck).[3] Jako zvláště vhodné pro dosažení žádoucího rozdělení (-kaseinů se ukázaly výrobky Ampholine(pH 3,5-9,5 (Pharmacia) a Resolyte (pH 5-7 pH 6-8 (BDH, Merck).[4] Nanášení vzorku: Po předběžné fokusaci (fáze 1) se odpipetuje 18 μl roztoků vzorku a standardních roztoků na aplikátory vzorků (10 x 5 mm), nanesou se na gel ve vzdálenosti 1 mm od sebe a 5 mm podélně od anody a lehce se přitlačí. Provede se fokusace za výše uvedených podmínek. Po 60 minutách fokusace vzorků opatrně vyjměte aplikátory vzorků.--------------------------------------------------PŘÍLOHA XVI(Článek 11)REFERENČNÍ METODA PRO ZJIŠŤOVÁNÍ KOLIFORMNÍCH BAKTERIÍ V MÁSLE, SUŠENÉM ODSTŘEDĚNÉM MLÉCE, KASEINU A KASEINÁTECHPokud se zjišťuje přítomnost koliformních bakterií v másle, naočkují se do kultivační půdy vzorky odpovídající 1 g másla.Pokud se zjišťuje přítomnost koliformních bakterií v sušeném odstředěném mléce, kaseinu nebo kaseinátech, naočkují se do kultivační půdy vzorky o hmotnosti 0,1 g.Použije se norma IDF 73A: 1985, metoda B s těmito změnami:1. Vzorek se připraví podle normy IDF 122B:1992. Pro kyselý kasein lze případně použít postup přípravy vzorku popsaný v normě IDF 73A:1985.2. Inkubují a vyhodnocují se pouze zkumavky naočkované 1 g vzorky (másla) nebo 0,1 g vzorky (sušeného odstředěného mléka, kaseinu/kaseinátů). Desetinná ředění se neprovádějí.Hodnocení výsledkůTři negativní výsledky: | Požadavek je splněn |Dva nebo tři pozitivní výsledky: | Požadavek není splněn |Dva negativní výsledky: | Je třeba analyzovat další vzorky o hmotnosti 1 g (másla) a 0,1 g (sušeného odstředěného mléka nebo kaseinu/kaseinátů). Požadavek je splněn, jsou-li poslední dva výsledky negativní;. v opačném případě požadavek splněn není. |PoznámkaObsah koliformních bakterií: v průměru 1/10 g u másla, 1/g u sušeného odstředěného mléka, kaseinu a kaseinátů.Výsledky, které představují splnění požadavku, se získávají s pravděpodobností 93 %.Obsah koliformních bakterií: v průměru 1/10 g u másla, 1/g u sušeného odstředěného mléka, kaseinu a kaseinátů.Výsledky, které představují nesplnění požadavku, se získávají s pravděpodobností 91 %.(Předpoklad: Poissonova distribuce)--------------------------------------------------PŘÍLOHA XVII(Článek 12)METODA ANALÝZY PRO STANOVENÍ OBSAHU LAKTOSY V PRODUKTECH KÓDU KN 2309 [1]ČÁST I1. Oblast použitíMetoda se použije v případech, kdy obsah laktosy překračuje 0,5 %.2. Podstata metodyCukry se rozpustí ve vodě. Nechají se působit kvasinky (Sacharomyces cerevisiae), které na laktosu nemají žádný vliv. Po vyčiření a filtraci se obsah laktosy v tomto roztoku stanoví Luff-Schoorlovou metodou.3. ChemikálieThiosíran sodný 0,1 N.Indikátor: roztok škrobu. Směs 5 g rozpustného škrobu (jako konzervační činidlo lze popřípadě přidat 10 mg jodidu rtuťnatého) a 30 ml vody se přidá do 1 litru vroucí vody; tato směs se udržuje ve varu po dobu tří minut a pak se nechá vychladnout.Roztok jodidu draselného p.a. 30 % (hm./obj.).Roztok kyseliny sírové 6 N.Luff-Schoorlovo činidlo:a) 25 g síranu měďnatého p.a. (CuSO4.5H2O) prostého železa se rozpustí ve 100 ml vody;b) 50 g kyseliny citronové p.a. (C6H8O7.H2O) se rozpustí v 50 ml vody;c) 143,8 g bezvodého uhličitanu sodného p.a. (Na2CO3) se rozpustí asi ve 300 ml horké vody a nechá se vychladnout.Roztok b) se nalije do c) za mírného třepání a potom se přidá roztok a). Doplní se do 1 litru, nechá se stát přes noc a přefiltruje se. U takto získaného činidla (Cu 0,1 N, Na2CO3 2 N) se zkontroluje normalita. Hodnota pH musí být přibližně 9,4.Carrezův roztok I: 23,8 g Zn (C2H3O2)2. 2H2O a 3 g ledové kyseliny octové se rozpustí ve vodě a doplní do 100 ml.Carrezův roztok II: 10,6 g ferokyanidu draselného K4Fe2(CN)6.3H2O se rozpustí ve vodě a doplní do 100 ml.Pemzová zrna vyvařená v kyselině chlorovodíkové, promytá ve vodě a vysušená. Suspenze kvasinek Sacharomyces cerevisiae: 25 g čerstvých kvasinek ve 100 ml vody (skladuje se v chladničcenejdéle po dobu jednoho týdne).4. Pracovní postupS přesností na 1 mg se naváží 1 g vzorku pro analýzu do kalibrované baňky na 100 ml. Přidá se 25 až 30 ml vody. Baňka se na třicet minut vloží do vroucí vodní lázně a pak se ochladí asi na 35 °C.Přidá se 5 ml suspenze kvasinek [2] a protřepe se. Kalibrovaná baňka a její obsah se ponechá ve vodní lázni po dobu dvou hodin při teplotě 38 až 40!!! error character !!! Β!!! error character !!! ΊC.Po fermentaci se baňka ochladí na teplotu přibližně 20 °C. Přidá se 2,5 ml Carrezova roztoku I a třicet sekund se protřepává. Potom se přidá 2,5 ml Carrezova roztoku II a opět se třicet sekund protřepává. Doplní se vodou do 100 ml, zamíchá se a přefiltruje. Odpipetuje se určité množství filtrátu, nejvýše 25 ml a nejlépe s obsahem 40 až 80 mg laktosy; v případě potřeby se doplní vodou do 25 ml a obsah bezvodé laktosy se stanoví Luff-Schoorlovou metodou.Provede se kompletní slepý pokus pouze s kvasnicemi.ČÁST II1. Stanovení obsahu laktosy Luff-Schoorlovou metodou25 ml Luff-Schoorlova činidla se pipetou přenese do Erlenmeyerovy baňky na 300 ml a přidá se přesně odměřených 25 ml čirého roztoku.Po přidání dvou zrn pemzy se baňka zahřívá přímo nad plamenem střední intenzity za stálého potřepávání rukou. Tekutina se uvede do varu na dobu asi dvou minut. Erlenmeyerova baňka se okamžitě postaví na drátěnou síťku s asbestovou výplní, pod níž byl již předem zapálen plamen. Plamen je regulován tak, aby Erlenmeyerova baňka byla zahřívána pouze na dně. Potom se na ni nasadí zpětný chladič. Od této chvíle se nechá obsah vařit přesně deset minut. Okamžitě se ochladí ve studené vodě a asi po pěti minutách se ztitruje takto:Ke kapalině se přidá 10 ml jodidu draselného a ihned poté se opatrně (může dojít k prudkému pěnění) přidá 25 ml kyseliny sírové 6 N.Potom se obsah ztitruje thiosíranem sodným do tmavě žlutého zbarvení a ke konci titrace se přidá škrobový indikátor.Stejná titrace se provede s přesně odměřenou směsí 25 ml Luff-Schoorlova činidla a 25 ml vody, po přidání 10 ml jodidu draselného a 25 ml kyseliny sírové 6 N, tentokrát bez uvedení do varu.Pomocí následující tabulky se stanoví množství laktosy v miligramech, které odpovídá rozdílu mezi výsledky obou titrací (vyjádřenými v ml thiosíranu sodného 0,1 N).TABULKATabulka pro 25 ml Luff-Schoorlova činidla(podmínky viz v textu)1. Thiosíran sodný 0, N2. Laktosa C12H22O111 | 2 |ml | mg | Rozdíl |1 | 3,6 | || | 3,7 |2 | 7,3 | || | 3,7 |3 | 11,0 | || | 3,7 |4 | 14,7 | || | 3,7 |5 | 18,4 | || | 3,7 |6 | 22,1 | || | 3,7 |7 | 25,8 | || | 3,7 |8 | 29,5 | || | 3,7 |9 | 33,2 | || | 3,8 |10 | 37,0 | || | 3,8 |11 | 40,8 | || | 3,8 |12 | 44,6 | || | 3,8 |13 | 48,4 | || | 3,8 |14 | 52,2 | || | 3,8 |15 | 56,0 | || | 3,9 |16 | 59,9 | || | 3,9 |17 | 63,8 | || | 3,9 |18 | 67,7 | || | 4,0 |19 | 71,7 | || | 4,0 |20 | 75,7 | || | 4,1 |21 | 79,8 | || | 4,1 |22 | 83,9 | || | 4,1 |23 | 88,0 | |[1] Nařízení (EHS) č. 222/88.[2] U produktů, jež obsahují více nže 40 % fermentovatelných cukrů, se množství suspenze zvětší.--------------------------------------------------PŘÍLOHA XVIII(Článek 13)ZJIŠŤOVÁNÍ SYŘIDLOVÉ SYROVÁTKY V SUŠENÉM ODSTŘEDĚNÉM MLÉCE URČENÉM PRO VEŘEJNÉ SKLADOVÁNÍ NA ZÁKLADĚ STANOVENÍ GLYKOMAKROPEPTIDŮ VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ (HPLC)1. Předmět a oblast použitíTato metoda umožňuje zjistit přítomnost syřidlové syrovátky v sušeném odstředěném mléce určeném k veřejnému skladování na základě stanovení glykomakropeptidů.2. Normativní odkazMezinárodní norma ISO 707 - Mléko a mléčné výrobky - Metody odběru vzorků, podle pokynů obsažených v příloze I odst. 2 písm. c) posledním pododstavci.3. DefiniceObsah glykomakropeptidů v sušeném odstředěném mléce: obsah látek stanovený níže popsanou metodou a vyjádřený jako hmotnostní procento.4. Podstata metody- Rekonstituce sušeného odstředěného mléka, odstranění tuku a bílkovin kyselinou trichloroctovou a následným odstředěním;- Stanovení množství glykomakropeptidů (GMP) přítomných v supernatantu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC);- Vyhodnocení výsledku získaného u vzorků porovnáním se srovnávacími vzorky, které tvoří sušené odstředěné mléko, též s přídavkem známého procenta sušené syrovátky.5. ChemikáliePoužívají se pouze chemikálie čistoty p.a. a destilovaná voda nebo voda nejméně rovnocenné jakosti.5.1 Roztok kyseliny trichloroctové240 g kyseliny trichloroctové (Cl3CCOOH) se rozpustí ve vodě a doplní do 1000 ml.5.2 Eluční roztok, pH 6,01,74 g fosforečnanu draselného sekundárního (K2HPO4), 12,37 g hydrogenfosforečnanu draselného (KH2PO4) a 21,41 g síranu sodného (Na2SO4) se rozpustí asi v 700 ml vody. V případě potřeby se upraví pH na 6,0 roztokem kyseliny fosforečné nebo hydroxidu draselného.Doplní se vodou do 1000 ml a zhomogenizuje.Před použitím se eluční roztok přefiltruje přes membránový filtr o velikosti pórů 0,45 μm.5.3 Promývací roztok a uchování kolonJeden objem acetonitrilu (CH3CN) se smíchá s devíti objemy vody. Před použitím se směs přefiltruje přes membránový filtr o velikosti pórů 0,45 μm.Poznámka:Lze použít jakýkoliv jiný promývací roztok, který má baktericidní účinek a který nezhoršuje rozlišovací účinnost kolony.5.4 Srovnávací vzorky5.4.1 Sušené odstředěné mléko splňující požadavky tohoto nařízení (tj.[0]).5.4.2 Totéž sušené odstředěné mléko zfalšované přídavkem 5 % (hm.) sušené syrovátky syřidlového typu standardního složení (tj.[5]).6. Přístroje a pomůcky6.1 Analytické váhy.6.2 Odstředivka schopná dosáhnout odstředivé síly 2200 g a vybavená odstředivými zkumavkami se zátkou o objemu asi 25 ml.6.3 Mechanická třepačka.6.4 Magnetická míchačka.6.5 Skleněné nálevky o průměru asi 7 cm.6.6 Filtrační papíry střední hustoty, o průměru asi 12,5 cm.6.7. Skleněné filtrační zařízení s membránovým filtrem o velikosti pórů 0,45 μm.6.8 Dělená pipeta umožňující dávkovat 10 ml (ISO 648, třída A, nebo ISO/R 835).6.9 Termostatická vodní lázeň nastavená na teplotu 25 ± 0,5 °C.6.10 Zařízení na HPLC, obsahující:6.10.1 čerpadlo,6.10.2 vstřikovací zařízení - ruční nebo automatické, o objemu 15 až 30 μl,6.10.3 dvě kolony TSK 2000-SW za sebou (délka 30 cm, vnitřní průměr 0,75 cm), nebo kolony s rovnocennou účinností a jednu předkolonu (3 cm x 0,3 cm) naplněnou materiálem I 125 nebo jiným materiálem s rovnocennou účinností,6.10.4 termostatickou sušárnu na kolony nastavenou na teplotu 35 ± 1 °C,6.10.5 UV detektor s proměnnou vlnovou délkou umožňující měřit při 205 nm s citlivostí 0,008 A,6.10.6 integrátor schopný integrace mezi sedly.Poznámka:Lze pracovat s kolonami udržovanými při teplotě místnosti, avšak jejich rozlišovací schopnost je poněkud nižší. V tomto případě je třeba, aby výkyvy teploty v průběhu jednoho analytického pokusu byly menší než přibližně 5 °C.7. Odběr vzorků7.1 Mezinárodní norma ISO 707 - "Mléko a mléčné výrobky - Metody odběru vzorků" odpovídající pokynům obsaženým v příloze I odst. 2 písm. c) posledním pododstavci.7.2 Vzorek se skladuje za takových podmínek, aby nedošlo k jeho poškození nebo změně složení.8. Pracovní postup8.1 Příprava zkušebního vzorkuSušené mléko se přenese do nádobky, jejíž objem je asi dvakrát větší než je objem prášku a která je opatřena vzduchotěsným víčkem. Nádobka se ihned uzavře. Sušené mléko se důkladně promíchá opakovaným převrácením nádobky.8.2 Zkušební dávkaNaváží se 2,000 ± 0,001 g zkušebního vzorku do odstředivé zkumavky (6.2).8.3 Odstranění tuku a bílkovin8.3.1 Ke zkušební dávce se přidá 20 g teplé vody (50 °C). Prášek se rozpustí třepáním po dobu pěti minut na mechanické třepačce (6.3). Zkumavka se ochladí na teplotu 25 °C.8.3.2 Během dvou minut se za stálého míchání magnetickou míchačkou (6.4) přidá 10,0 ml roztoku kyseliny trichloroctové (5.1). Zkumavka se vloží do vodní lázně (6.9) a ponechá se tam po dobu 60 minut.8.3.3 2200 g se odstřeďuje (6.2) po dobu 10 minut; nebo se přefiltruje přes papír (6.6)a prvních 5 ml filtrátu se vyhodí.8.4 Chromatografické stanovení8.4.1 15 až 30 μl supernatantu nebo filtrátu (8.3.3) přesně odměřených se vstříkne do zařízení na HPLC (6.10) s průtokem 1,0 ml elučního roztoku (5.2) za minutu.Poznámky:1. V průběhu chromatografické analýzy se eluční roztok (5.2) uchovává při teplotě 85 °C, aby eluent zůstal odplyněný a aby se zabránilo množení bakterií. Lze použít jakékoliv jiné opatření se stejným preventivním účinkem.2. Při každém přerušení se kolony promyjí vodou. Nikdy se v nich nenechává eluční roztok (5.2).Před každým přerušením na více než 24 hodin se kolony propláchnou vodou a potom se promývají roztokem (5.3) nejméně po dobu tří hodin při průtoku 0,2 ml za minutu.8.4.2 Výsledky chromatografické analýzy zkušebního vzorku (E) se získají ve formě chromatogramu, v němž je každý pík určen svým retenčním časem RT takto:Pík II: | Druhý pík chromatogramu s RT cca 12,5 minuty. |Pík III: | Třetí pík chromatogramu, odpovídající GMP, s RT 15,5 ± 1,0 minuta. |Pík IV: | Čtvrtý pík chromatogramu s RT cca 17,5 minuty. |Retenční časy jednotlivých píků mohou být ovlivněny jakostí kolon.Integrátor (6.10.6) automaticky vypočítává plochu A každého píku:AII | plocha píku II, |AIII | plocha píku III, |AIV | plocha píku IV. |Před kvantitativní interpretací je nezbytné prozkoumat vzhled každého chromatogramu za účelem zjištění případných anomálií způsobených buď nesprávnou funkcí zařízení nebo kolon, nebo původem a povahou analyzovaného vzorku.V případě pochybností se analýza zopakuje.8.5. Kalibrace8.5.1 U srovnávacích vzorků (5.4) se přesně použije postup popsaný v bodech 8.2 až 8.4.2.Použijí se čerstvě připravené roztoky, protože se GMP v prostředí 8 % kyseliny trichloroctové odbourávají. Jejich obsah se při teplotě 30 °C ve skutečnosti snižuje o 0,2 % za hodinu.8.5.2 Před chromatografickým stanovením vzorků se stabilizují kolony opakovanými nástřiky roztoku (8.5.1) srovnávacího vzorku (5.4.2), dokud se plocha a retenční čas píku odpovídajícího GMP neustálí na konstantních hodnotách.8.5.3 Stanoví se faktory odezvy R nastříknutím stejného objemu filtrátů (8.5.1), jakého bylo použito pro vzorky.9. Vyjádření výsledků9.1 Metoda výpočtu a vzorce9.1.1 Výpočet faktorů odezvy R:Pík II: | RII=100AII0 |Pík IV: | RIV=100AIV0 |kde:RII a RIV = faktory odezvy píků II a IV,AII[0] a AIV[0] = plochy píků II a IV srovnávacího vzorku [0] získané v 8.5.3.Pík III: | RIII=WAIII5- AIII0 |kde:RIII = faktor odezvy píku III,AIII[0] a AIII[5] = plochy píku III srovnávacích vzorků [0] a [5] získané v 8.5.3.W = množství syrovátky ve srovnávacím vzorku [5], tj. 5.9.1.2 Výpočet relativní plochy píků ve vzorku [E]:S= Rx AIIESIIIIIIES= Rx AIVEkde:SII[E], SIII[E], SIV[E] = relativní plochy píků II, III a IV ve vzorku [E],AII[E], AIII[E], AIV[E] = plochy píků II, III a IV ve vzorku [E] získané v 8.4.2,RII, RIII, RIV = faktory odezvy vypočtené v 9.1.1.9.1.3 Výpočet relativního retenčního času píku III ve vzorku [E]:RRT=RTRTIII5kde:RRTIII[E] = relativní retenční čas píku III ve vzorku [E],RTIII[E] = relativní retenční čas píku III ve vzorku [E] získaný v 8.4.2RTIII[5] = relativní retenční čas píku III v kontrolním vzorku [5] získaný v 8.5.3.9.1.4 Experimenty ukazují, že mezi relativním retenčním časem píku III, tj. RRTIII[E] a procentem přidané sušené syrovátky až do přídavku 10 % existuje lineární vztah:- při obsahu syrovátky > 5 % je RRTIII[E] < 1,000;- při obsahu syrovátky ≤ 5 % je RRTIII[E]≥ 1,000.Přípustná neurčitost pro hodnoty RRTIII je ± 0,002.Za normálních okolností se hodnota RRTIII[0] jen málo liší od 1,034. Podle stavu kolon se může hodnota blížit 1,000, avšak vždy musí být vyšší než 1,000.9.2 Výpočet procenta sušené syřidlové syrovátky obsažené ve vzorku:W = S-S- 0,9kde:W = hmotnostní procento sušené syřidlové syrovátky ve vzorku [E];SIII [E] = relativní plocha píku III zkušebního vzorku [E] získaná v 9.1.2;1,3 = relativní průměrná plocha píku III vyjádřená v gramech na 100 g syřidlové syrovátky stanovené v nezfalšovaném sušeném odstředěném mléce různého původu. Tato hodnota byla získána experimentálně;SIII[0] = relativní plocha píku III, která se rovná RIII x AIII[0]. Tyto hodnoty se získávají v 9.1.1 a 8.5.3;(SIII[0]-0,9) = korekce, kterou je nutno uplatnit na relativní průměrnou plochu 1,3, pokud hodnota SIII[0] se nerovná 0,9. Z experimentů vyplývá, že relativní průměrná plocha píku III kontrolního vzorku [0] je 0,9.9.3 Přesnost metody9.3.1 OpakovatelnostRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního vzorku provedl současně nebo v těsném sledu jeden pracovník na stejném přístroji, nesmí překročit 0,2 % m/m.9.3.2 ReprodukovatelnostRozdíl mezi dvěma jednotlivými a nezávislými výsledky získanými ve dvou různých laboratořích u stejného zkušebního vzorku nesmí překročit 0,4 % m/m.9.4 Interpretace9.4.1 Lze předpokládat, že syrovátka není přítomna, je-li relativní plocha píku III, SIII[E], vyjádřená v gramech syřidlové syrovátky na 100 g produktu, ≤2,0 +kde:2,0 = je maximální hodnota přípustná pro relativní plochu píku III, s přihlédnutím k relativní ploše píku III, tj. 1,3, neurčitosti způsobené proměnlivostí složení sušeného odstředěného mléka a reprodukovatelnosti metody (9.3.2),SIII[0] - 0,9 = je korekce, kterou je nutno provést, je li plocha SIII[0] odlišná od 0,9 (viz bod 9.2).9.4.2 Pokud se relativní plocha píku IIISrovná > 2,0 +a relativní plocha píku II SII[E] ≤ 160, obsah syřidlové syrovátky se vypočítá podle bodu 9.2.9.4.3 Pokud se relativní plocha píku IIISrovná > 2,0 +a relativní plocha píku II SII[E] ≤ 160, stanoví se celkový obsah bílkovin (P %) a poté se prostudují grafy 1 a 2.9.4.3.1 Data získaná po analýze vzorků nezfalšovaného sušeného odstředěného mléka s vysokým obsahem bílkovin jsou zanesena do grafů 1 a 2.Plná přímka představuje lineární regresi, jejíž koeficienty se vypočítají metodou nejmenších čtverců.Čárkovaná přímka určuje horní mez relativní plochy píku III, a to s pravděpodobností, že nebude překročena v 90 % případů.Rovnice čárkovaných přímek v grafech 1 a 2 jsou:SIII= 0,376 P % - 10,7 | (graf 1) |SIII= 0,0123 SIIE+ 0,93 | (graf 2) |kde:SIII  je relativní plocha píku III vypočtená buď podle celkového obsahu bílkovin nebo podle relativní plochy píku SII[E],P %  je celkový obsah bílkovin vyjádřený v hmotnostních procentech,SII[E]  je relativní plocha vzorku vypočtená v bodu 9.1.2.Tyto rovnice jsou rovnocenné číslu 1,3 uvedenému v bodu 9.2.Rozdíl (T1 a T2) mezi zjištěnou relativní plochou SIII[E] a relativní plochou SIII je dán těmito vztahy:T= S-S- 0,9T= S-0,0123 S+ 0,93S- 0,99.4.3.2 Jsou li T1 a/nebo T2  rovné nule nebo mení, nelze přítomnost syřidlové syrovátky zjistit.Jsou li T1 a T2  větší než nula, syřidlová syrovátka je přítomna.Obsah syřidlové syrovátky se vypočítá podle vzorce:W = T+ 0,91kde:0.91 je vzdálenost na svislé ose mezi plnou a přerušovanou přímkou.+++++ TIFF +++++--------------------------------------------------PŘÍLOHA XIX(Článek 13)STANOVENÍ SUŠINY ZE SYŘIDLOVÉ SYROVÁTKY V SUŠENÉM ODSTŘEDĚNÉM MLÉCE A VE SMĚSÍCH UVEDENÝCH V NAŘÍZENÍ (ES) Č. 2799/19991. Předmět: stanovení přídavku sušiny ze syřidlové syrovátky do těchto produktů:a) sušeného odstředěného mléka podle definice v článku 2 nařízení (ES) č. 2799/1999 ab) směsí podle definice v článku 4 nařízení (ES) č. 2799/1999.2. Normativní odkaz: Mezinárodní norma ISO 7073. DefiniceObsah sušiny ze syřidlové syrovátky je definován jako hmotnostní procento stanovené popsaným postupem.4. Podstata metodyObsah glykomakropeptidu A se stanoví podle přílohy XVIII. Vzorky s pozitivními výsledky jsou analyzovány na glykomakropeptidy A (GMPA) vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi (metodou HPLC). Vyhodnocení výsledků se provádí porovnáním se srovnávacími vzorky, které tvoří sušené odstředěné mléko bez přídavku nebo s přídavkem známého procenta sušené syrovátky. Pokud je výsledek vyšší než 1 % hmotnostní (m/m), je prokázána přítomnost sušiny ze syřidlové syrovátky.5. ChemikáliePoužívají se pouze chemikálie čistoty p.a. a destilovaná voda nebo voda nejméně rovnocenné jakosti. Acetonitril musí mít spektroskopickou jakost nebo jakost vhodnou pro metodu HPLC. Chemikálie potřebné pro tuto metodu jsou chemikálie uvedené v příloze XVIII tohoto nařízení.Chemikálie pro HPLC s obrácenými fázemi.Roztok kyseliny trichloroctové5.1 240 g kyseliny trichloroctové (Cl3CCOOH) se rozpustí ve vodě a doplňte do 1000 ml.Eluenty A a B5.2 Eluent A: 150 ml acetonitrilu (CH3CN), 20 ml isopropanolu (CH3CHOHCH3) a 1 ml kyseliny trifluoroctové (TFA, CF3COOH) se vnese do odměrné baňky na 1000 ml a doplní se po značku vodou.Eluent B: 550 ml acetonitrilu (CH3CN), 20 ml isopropanolu (CH3CHOHCH3) a 1 ml kyseliny trifluoroctové (TFA, CF3COOH) se vnese do odměrné baňky na 1000 ml a doplní po značku 1000 ml vodou. Eluční roztok se před použitím přefiltruje přes membránový filtr o velikosti pórů 0,45 μm.5.3 Uchování kolonyPo analýzách se kolona promyje eluentem B (spádem) a potom se propláchne acetonitrilem (spádem po dobu 30 minut). Kolona se uchovává v acetonitrilu.5.4 Srovnávací vzorky5.4.1 Sušené odstředěné mléko splňující požadavky stanovené pro veřejné skladování (tj.[0]).5.4.2 Totéž sušené odstředěné mléko zfalšované přídavkem 5 % (m/m) sušené syřidlové syrovátky standardního složení (tj.[5]).5.4.3 Totéž sušené odstředěné mléko zfalšované přídavkem 50 % (m/m) sušené syřidlové syrovátky standardního složení (tj.[50]) [1].6. Přístroje a pomůckyPřístroje a pomůcky potřebné pro popsaný postup jsou uvedeny v příloze XVIII tohoto nařízení.6.1 Analytické váhy.6.2 Odstředivka schopná dosáhnout odstředivé síly 2200 g a vybavená odstředivkovými zkumavkami se zátkou o objemu asi 50 ml.6.3 Mechanická třepačka umožňující třepání za teploty 50 °C.6.4 Magnetická míchačka.6.5 Skleněné nálevky o průměru asi 7 cm.6.6 Filtrační papíry střední hustoty o průměru asi 12,5 cm.6.7 Skleněné filtrační zařízení s membránovým filtrem o velikosti pórů 0,45 μm.6.8 Dělené pipety umožňující dávkovat 10 ml (ISO 648, třída A, nebo ISO/R 835), nebo systém schopný dodávat 10,0 ml za dvě minuty.6.9 Termostatická vodní lázeň nastavená na 25 ± 0,5 °C.6.10 Zařízení na HPLC, které tvoří:6.10.1 Čerpadlo s binárním gradientem6.10.2 Vstřikovací zařízení - ruční nebo automatické, o objemu 100 μl.6.10.3 Kolona Dupont Protein Plus (délka 25 cm, vnitřní průměr 0,46 cm), nebo jiná rovnocenná kolona pro obrácené fáze s velkými póry na bázi křemene.6.10.4 Termostatická sušárna na kolony nastavená na 35 ± 1 °C.6.10.5 UV detektor s proměnnou vlnovou délkou, který umožňuje provádět měření při 210 nm (v případě potřeby lze použít větší vlnové délky až do 220 nm), s citlivostí 0,02 A.6.10.6 Integrátor schopný integrovat mezi sedly.Poznámka:Práce s kolonami udržovanými při teplotě místnosti je možná za předpokladu, že tato teplota nekolísá více než o 1 °C; v opačném případě dochází k příliš velkým změnám retenčního času GMPA.7. Odběr vzorků7.1 Vzorky musí být odebírány postupem stanoveným v Mezinárodní normě ISO 707. Členské státy však mohou používat jinou metodu odběru vzorků za předpokladu, že tato metoda odpovídá zásadám uvedené normy.7.2 Vzorek se skladuje takovým způsobem, aby nemohlo dojít ke znehodnocení nebo změně složení.8. Pracovní postup8.1 Příprava zkušebního vzorkuSušené mléko se přenese do nádobky, jejíž objem je asi dvakrát větším než je objem prášku, a která je opatřena vzduchotěsným víčkem. Nádobka se ihned uzavře. Sušené mléko se důkladně promíchá opakovaným převracením nádobky.8.2 Zkušební dávkaNaváží se 2,00 ± 0,001 g zkušebního vzorku do odstředivkové zkumavky (6.2) nebo vhodné baňky se zátkou na 50 ml.8.3 Odstranění tuku a bílkovin8.3.1 Ke zkušební dávce se přidá 20 ml teplé vody (50 °C). Pětiminutovým třepáním nebo v případě kysaného podmáslí třicetiminutovým třepáním na mechanické třepačce (6.3) se prášek rozpustí. Zkumavka se vloží do vodní lázně (6.9) na tak dlouhou, dokud se její teplota neustálí na 25 °C.8.3.2 Během dvou minut se za stálého rázného míchání magnetickou míchačkou (6.4) přidá 10,0 ml roztoku kyseliny trichloroctové při teplotě 25oC (5.1). Zkumavka se na 60 minut vloží do vodní lázně (6.9).8.3.3 Odstřeďuje se (6.2) 2200 g po dobu 10 minut nebo se přefiltruje přes papírový filtr (6.6). V tom případě se prvních 5 ml filtrátu vyhodí.8.4 Chromatografické stanovení8.4.1 Provede se analýza HPLC podle popisu v příloze XVIII. Je-li výsledek negativní, analyzovaný vzorek neobsahuje sušinu ze syřidlové syrovátky ve zjistitelném množství. Je-li výsledek pozitivní, musí být použit níže popsaný postup HPLC s obrácenými fázemi. Přítomnost sušeného kysaného podmáslí může vyvolat falešný pozitivní výsledek. Metoda HPLC s obrácenými fázemi však tuto možnost vyloučí.8.4.2 Před provedením analýzy HPLC s obrácenými fázemi je třeba optimalizovat podmínky gradientu. Pro gradientové systémy s mrtvým objemem asi 6 ml (objem od bodu, kde se stékají rozpouštědla, k objemu nástřikové smyčky včetně) je optimální retenční čas v délce 26 minut ± 2 minuty pro GMPA. Pro gradientové systémy s menším mrtvým objemem (např. 2 ml) je optimální retenční čas 22 minut.Připraví se roztoky srovnávacích vzorků (5.4) bez syřidlové syrovátky a s 50 %syřidlové syrovátky.100 μl supernatantu nebo filtrátu (8.3.3) se vstříkne do zařízení na HPLC, které musí fungovat za podmínek referenčního gradientu uvedených v tabulce 1.Tabulka IPodmínky referenčního gradientu pro optimalizaci chromatografieČas (v minutách) | Průtok (ml/min) | % A | % B | Křivka |Počátek | 1,0 | 90 | 10 | * |27 | 1,0 | 60 | 40 | přímka |32 | 1,0 | 10 | 90 | přímka |37 | 1,0 | 10 | 90 | přímka |42 | 1,0 | 90 | 10 | přímka |Porovnáním obou chromatogramů by měla být zjištěna poloha píku GMPA.Počáteční složení rozpouštědla, které je nutno použít pro normální gradient (viz 8.4.3), lze vypočítat podle tohoto vzorce:% B = 10 - 2,5 +*30/27% B = 7,5 +*1,11kde:RTgmpA : retenční čas GMPA v referenčním gradientu10 : počáteční % B v referenčním gradientu2,5 : % B ve středním bodu minus počáteční % B v normálním gradientu13,5 : čas odpovídající střednímu bodu referenčního gradientu26 : požadovaný retenční čas GMPA6 : poměr směrnic referenčního a normálního gradientu30 : % B v počátečním bodu minus % B po 27 minutách v referenčním gradientu27 : doba běhu referenčního gradientu8.4.3 Nástřik roztoků zkušebních vzorků.100 μl přesně odměřeného supernatantu nebo filtrátu (8.3.3) se vstříkne do zařízení na HPLC, které musí fungovat při průtoku 1,0 ml elučního roztoku (5.2) za minutu.Složení eluentu na začátku analýzy se získá z 8.4.2. Za normálních okolností se blíží poměru A:B = 76:24 (5.2). Okamžitě po nástřiku se spustí lineární gradient, což způsobí, že procento B se za 27 minut zvětší o 5 %. Potom se spustí lineární gradient, kterým složení eluentu dosáhne v pěti minutách 90 % B. Toto složení se udržuje po dobu pěti minut a po jejím uplynutí se pomocí lineárního gradientu složení opět změní během pěti minut na složení počáteční. V závislosti na vnitřním objemu čerpacího systému může být další nástřik proveden 15 minut po dosažení původních podmínek.Poznámky:1. Retenční čas glykomakropeptidů má být 26 minut ± 2 minuty. Toho lze dosáhnout změnou počátečních a konečných podmínek prvního gradientu. Rozdíl v % B mezi počátečními a konečnými podmínkami prvního gradientu však musí zůstat ve výši 5 % B.2. Eluenty je třeba dostatečně odplynit a uchovávat je odplyněné. Je to nezbytně nutné pro to, aby gradientový čerpací systém správně fungoval. Směrodatná odchylka retenčního času píku GMP musí být menší než 0,1 minuty (n = 10).3. Na každých pět vzorků je třeba nastříknout referenční vzorek (5) a použít jej pro výpočet nového faktoru odezvy R (9.1.1).8.4.4 Výsledky chromatografických analýz zkušebního vzorku (E) se získávají ve formě chromatogramu, na němž je pík GMP určen svým retenčním časem přibližně v délce 26 minut.Výšku H píku GMP automaticky vypočítává integrátor (6.10.6). Polohu základní linie je třeba kontrolovat na každém chromatogramu. Jestliže je základní linie nesprávně umístěna, analýzu nebo integraci je třeba zopakovat.Před kvantitativní interpretací je nezbytné prozkoumat vzhled každého chromatogramu za účelem zjištění případných anomálií způsobených buď nesprávnou funkcí zařízení nebo kolony, nebo původem a povahou analyzovaného vzorku. V případě pochybností se analýza zopakuje.8.5 Kalibrace8.5.1 U srovnávacích vzorků (5.4.1 až 5.4.2) se přesně použije postup popsaný v bodech 8.2 až 8.4.4. Použijí se čerstvě připravené roztoky, protože se GMP v prostředí 8 % kyseliny trichloroctové odbourává. Při teplotě 4 °C zůstává roztok stálý po dobu 24 hodin. V případě dlouhých analytických pokusů je žádoucí používat v automatickém nastřikovacím zařízení chlazenou misku na vzorek.Poznámka:Fáze 8.4.2 může být vynechána, jestliže je % B v počátečních podmínkách známo z předchozích analýz.Chromatogram referenčního vzorku (5) má být obdobný chromatogramu znázorněnému na obrázku 1. Na tomto obrázku jsou před píkem GMPA dva malé píky. Je nezbytně nutné dosáhnout podobné separace.8.5.2 Před chromatografickým stanovením vzorků se vstříkne 100 μl srovnávacího vzorku bez syřidlové syrovátky (0) (5.4.1).Chromatogram nesmí vykazovat pík v retenčním čase GMPA píku.8.5.3 Faktory odezvy R se stanoví vstříknutím stejného objemu filtrátů (8.5.1), jakého bylo použito pro vzorky.9. Vyjádření výsledků9.1 Metoda výpočtu a vzorce9.1.1 Výpočet faktoru odezvy R:Pík GMP: R = W/Hkde:R = faktor odezvy píku GMPH = výška píku GMPW = množství syrovátky ve srovnávacím vzorku (5).9.2 Výpočet procenta sušené syřidlové syrovátky ve vzorkuW[E] = R × H[E]kde:W[E] = hmotnostní procento (m/m) syřidlové syrovátky ve vzorku [E]R = faktor odezvy píku GMP (9.1.1)H[E] = výška píku GMP vzorku [E].Pokud je W(E) vyšší než 1 % a rozdíl mezi retenčním časem a časem srovnávacího vzorku (5) menší než 0,2 minuty, potom je prokázána přítomnost sušiny ze syřidlové syrovátky.9.3 Přesnost metody9.3.1 OpakovatelnostRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního vzorku provedl současně nebo v krátkém časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, nesmí překročit 0,2 %.9.3.2 ReprodukovatelnostDosud nezjištěna.9.3.3 LinearitaPro hodnoty od 0 % do 16 % syřidlové syrovátky je třeba získat lineární vztah s korelačním koeficientem > 0,99.9.4 Interpretace9.4.1 Přítomnost syrovátky se považuje za prokázanou, je-li výsledek získaný v 9.2 vyšší než 1 % hmotnostní a retenční čas píku GMP se liší o méně něž 0,2 minuty od retenčního času srovnávacího vzorku (5). Mezní hodnota 1 % je stanovena v souladu s ustanoveními bodů 9.2 a 9.4.1 přílohy V nařízení (EHS) č. 625/78.+++++ TIFF +++++[1] Sušená syřidlová syrovátka standardního složení a rovně zfalšované sušené odstředěné mléko lze získat od firmy NIZO, Kernhemseweg 2, PO Box 20 - NL-6710 BA Ede. Lze však také používat sušené výrobky, u nichž se dosahuje rovnocenných výsledků jako v případě sušených výrobků NIZO.--------------------------------------------------PŘÍLOHA XX(Článek 14)KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ FOSFATIDYLSERINU A FOSFATIDYLETHANOLAMINU V SUŠENÉM ODSTŘEDĚNÉM MLÉCEMetoda: HPLC s obrácenými fázemi1. Předmět a oblast použitíTato metoda popisuje postup kvantitativního stanovení fosfatidylserinu (PS) a fosfatidylethanolaminu (PE) v sušeném odstředěném mléce (SOM) a je vhodná pro zjišťování sušiny podmáslí v SOM.2. DefiniceObsah PS + PE: hmotnostní zlomek látky stanovené popisovaným postupem. Výsledek se vyjadřuje v miligramech dipalmitoyl-fosfatidylethanolaminu (PEDP) na 100 g prášku.3. Podstata metodyExtrakce aminofosfolipidů methanolem z rekonstituovaného sušeného mléka. Stanovení obsahu PS a PE jako derivátů oftaldialdehydu (OPA) metodou HPLC s obrácenými fázemi (RP) a fluorescenční detekcí. Kvantitativní stanovení obsahu PS a PE ve zkušebním vzorku porovnáním se srovnávacím vzorkem, který obsahuje známé množství PEDP.4. ChemikáliePoužívají se pouze chemikálie čistoty p.a. Pokud není uvedeno jinak, používá se pouze destilovaná voda nebo voda nejméně rovnocenné jakosti.4.1 Referenční materiál: PEDP, nejméně 99 % čistotyPoznámka:Referenční materiál musí být skladován při teplotě -18 °C.4.2 Chemikálie pro přípravu srovnávacích a zkušebních vzorků4.2.1 Methanol pro HPLC4.2.2 Chloroform pro HPLC4.2.3 Monohydrochlorid tryptaminu4.3 Chemikálie pro přípravu o-ftaldialdehydových derivátů4.3.1 Hydroxid sodný, 12 M vodný roztok4.3.2 Kyselina boritá, 0,4 M vodný roztok s hodnotu pH upravenou hydroxidem sodným (4.3.1) na 10,04.3.3 2-merkaptoethanol4.3.4 o-ftaldialdehyd (OPA)4.4 Eluční rozpouštědla pro HPLCEluční rozpouštědla musí být připravena pomocí chemikálií jakosti pro HPLC.4.4.1 Voda pro HPLC4.4.2 Methanol fluorometricky zjištěné čistoty4.4.3 Tetrahydrofuran4.4.4 Natrium dihydrogenfosforečnan 4.4.54.4.5 Octan sodný4.4.6 Kyselina octová5. Přístroje a pomůcky5.1 Analytické váhy5.2 Kádinky na 25 ml a 100 ml5.3 Pipety schopné dávkovat od 1 ml do 10 ml5.4 Magnetická míchačka5.5 Dělené pipety schopné dávkovat 0,2 ml, 0,5 ml a 5 ml5.6 Odměrné baňky na 10, 50 a 100 ml5.7 Injekční stříkačky na 20 a 100 μl5.8 Ultrazvuková lázeň5.9 Odstředivka fungující při 27000 x g5.10 Skleněné nádobky asi na 5 ml5.11 Odměrný válec na 25 ml5.12 pH metr5.13 Zařízení pro HPLC5.13.1 Gradientový čerpací systém schopný fungovat při průtoku 1,0 ml/min při 200 barech5.13.2 Automatický dávkovač vzorků s možností derivatizace5.13.3 Kolonový termostat nastavený na 30 °C5.13.4 Fluorescenční detektor s excitační vlnovou délkou 330 nm a emisní vlnovou délkou 440 nm5.13.5 Integrátor nebo programové vybavení pro zpracování dat schopné měřit plochy píků5.13.6 Kolona Lichrosphere-100 (250 x 4,6 mm) nebo rovnocenná kolona naplněná oktadecylsilanem (C 18), velikost částic 5 μm.6. Odběr vzorkůVzorky musí být odebírány v souladu s normou IDF 50B:1985.7. Pracovní postup7.1 Příprava roztoku vnitřního standarduOdváží se 30,0 ± 0,1 mg tryptaminhydrochloridu (4.2.3) do odměrné baňky na 100 ml (5.6) a doplní se po značku methanolem (4.2.1). 1 ml (5.3) tohoto roztoku se přenese pipetou do odměrné baňky na 10 ml (5.6) a doplní se po značku methanolem (4.2.1) s cílem získat koncentraci tryptaminu 0,15 mM.7.2 Příprava roztoku zkušebního vzorkuOdváží se 1,000 ± 0,001 g vzorku SOM do kádinky na 25 ml (5.2). Pipetou (5.3) se přidá 10 ml destilované vody o teplotě 40 °C a po dobu 30 minut se míchá magnetickou míchačkou (5.4), aby se rozpustily všechny kousky. Pipetou se přenese 0,2 ml (5.5) rekonstituovaného mléka do odměrné baňky na 10 ml (5.6), injekční stříkačkou (5.7) se přidá 100 μl 0,15 mM roztoku tryptaminu (7.1) a doplní se po značku methanolem (4.2.1). Převracením se opatrně promíchá a vloží na 15 minut do ultrazvukové lázně (5.8). Odstřeďuje se (5.9) při 27000 x g po dobu 10 minut a supernatant se převede do skleněné nádobky (5.10).Poznámka:Do provedení analýzy HPLC musí být roztok vzorku skladován při teplotě 4 °C.7.3 Příprava roztoku vnějšího standarduOdváží se 55,4 mg PEDP (4.1) do odměrné baňky na 50 ml (5.6) a odměrným válcem (5.11) se přidá asi 25 ml chloroformu (4.2.2). Zazátkovaná baňka se zahřeje na 50 °C a její obsah se opatrně promíchává, dokud se PEDP nerozpustí. Baňka se ochladí na 20 °C, doplní se po značku methanolem (4.2.1) a promíchá se převracením. 1 ml (5.3) tohoto roztoku se přenese pipetou do odměrné baňky na 100 ml (5.6) a doplní se po značku methanolem (4.2.1). 1 ml tohoto roztoku se přenese pipetou (5.3) do odměrné baňky na 10 ml (5.6), přidá se 100 μl (5.7) 0,15 mM roztoku tryptaminu (7.1) a doplní se po značku methanolem (4.2.1). Promíchá se převracením.Poznámka:Do provedení analýzy HPLC musí být roztok referenčního vzorku skladován při teplotě 4 °C.7.4 Příprava derivatizačního činidlaDo odměrné baňky na 10 ml (5.6) se odváží 25,0 ± 0,1 mg OPA (4.3.4), přidá se 0,5 ml (5.5) methanolu (4.2.1) a pečlivě se promíchá, aby se rozpustil OPA. Doplní se po značku roztokem kyseliny borité (4.3.2) a injekční stříkačkou (5.7) se přidá 20 μl 2-merkaptoethanolu (4.3.3).Poznámka:Derivatizační činidlo musí být skladováno v tmavé nádobě při teplotě 4 °C; činidlo zůstává stálé po dobu jednoho týdne.7.5 Stanovení pomocí HPLC7.5.1 Eluční rozpouštědla (4.4).Rozpouštědlo A:Roztok 0,3 mM natria dihydrogenfosforečnanu a roztok 3 mM octanu sodného (s hodnotou pH upravenou na 6,5 kyselinou octovou): methanol: tetrahydrofuran = 558:440:2 (obj.).Rozpouštědlo B:Methanol7.5.2 Doporučený eluční gradientČas (min) | Rozpouštědlo A (%) | Rozpouštědlo B (%) | Průtok (ml/min) |Počáteční | 40 | 60 | 0 |0,1 | 40 | 60 | 0,1 |5,0 | 40 | 60 | 01 |6,0 | 40 | 60 | 0,1 |6,5 | 40 | 60 | 1,0 |9,0 | 36 | 64 | 1,0 |10,0 | 20 | 80 | 1,0 |11,5 | 16 | 84 | 1,0 |12,0 | 16 | 84 | 1,0 |16,0 | 10 | 90 | 1,0 |19,0 | 0 | 100 | 1,0 |20,0 | 0 | 100 | 1,0 |21,0 | 40 | 60 | 1,0 |29,0 | 40 | 60 | 1,0 |30,0 | 40 | 60 | 0 |Poznámka:Může se stát, že eluční gradient bude muset být mírně upraven, aby bylo dosaženo rozlišení znázorněné na obrázku 1.Teplota kolony: 30 °C.7.5.3 Objem nástřiku: 50 μl derivatizačního činidla a 50 μl roztoku vzorku.7.5.4 Ekvilibrace kolonyPři každodenním provádění pokusůse kolona promývá 100 % rozpouštědlem B po dobu 15 minut, potom se připraví poměr A:B = 40:60 a provádí se ekvilibrace po dobu 15 minut při průtoku 1 ml/min. Provede se slepý pokus nástřikem methanolu (4.2.1).Poznámka:Před uskladněním kolony na delší dobu se kolona promyje po dobu 30 minut směsí methanolu s chloroformem v poměru 80:20 (obj.).7.5.5 Stanovení obsahu PS + PE ve zkušebním vzorku7.5.6 Provede se série chromatografických analýz při zachování stejných časových odstupů mezi jednotlivými pokusy, aby se získaly konstantní retenční časy. Pro vyhodnocení faktoru odezvy se nastřikuje roztok vnějšího standardu (7.3) na každých 5-10 roztoků zkušebních vzorků.Poznámka:Kolonu je nutné vyčistit nejméně 30 minutovým promýváním 100 % rozpouštědlem B (7.5.1) po každých 20 až 25 pokusech.7.6 Integrační režim7.6.1 Pík PEDPPEDP se vymývá v podobě jediného píku. Plocha píku se stanoví integrací mezi sedly.7.6.2 Pík tryptaminuTryptamin se vymývá v podobě jediného píku (obr. 1). Plocha píku se stanoví integrací mezi sedly.7.6.3 Skupiny píků PS a PEZa podmínek popsaných výše (obr. 1) se PS vymývá v podobě dvou hlavních, částečně nerozlišených píků, před nimiž se nachází jeden menší pík. PE se vymývá v podobě tří hlavních, částečně nerozlišených píků. Celá plocha každé skupiny píků se stanoví nastavením základní linie tak, jak je znázorněno na obrázku 1.8. Výpočet a vyjadřování výsledkůObsah PS + PE ve zkušebním vzorku se vypočte takto:C = 55,36 xxT1T2kde:C = obsah PS nebo PE (v mg/100 g prášku) ve zkušebním vzorkuA1 = plocha píku PEDP roztoku srovnávacího vzorku (7.3)A2 = plocha píku PS nebo PE roztoku zkušebního vzorku (7.2)T1 = plocha píku tryptaminu roztoku srovnávacího vzorku (7.3)T2 = plocha píku tryptaminu roztoku zkušebního vzorku (7.2)9. PřesnostPoznámka:Hodnoty pro opakovatelnost byly vypočteny podle Mezinárodní normy IDF [1]. Prozatímní mezní hodnota reprodukovatelnosti byla vypočtena postupem stanoveným v příloze III písm. b) tohoto nařízení.9.1 OpakovatelnostRelativní směrodatná odchylka opakovatelnosti, která vyjadřuje proměnlivost nezávislých analytických výsledků, které u stejného zkušebního vzorku získá stejný pracovník na stejném přístroji v krátkém časovém odstupu, nesmí překročit relativní 2 %. Jestliže se za těchto podmínek získají dvě stanovení, relativní rozdíl mezi jejich výsledky nesmí být větší než 6 % aritmetického průměru výsledků.9.2 ReprodukovatelnostJestliže dva pracovníci provedou v různých laboratořích na různých přístrojích a za různých podmínek analýzu téhož zkušebního vzorku, relativní rozdíl mezi oběma výsledky nesmí být větší než 11 % aritmetického průměru výsledků.10. Literatura10.1 Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M.: "Detection of buttermilk solids in skim milk powder by HPLC quantification of aminophospholipids" Sci. Tecn. Latt-Cas., 39, 395 (1988).+++++ TIFF +++++[1] Mezinárodní norma IDF 135B/1991. Mléko a mléčné výrobky. Přesnostní charakteristiky analytických metod. Stručný popis práce na společné studii.--------------------------------------------------PŘÍLOHA XXI(Článek 15)ZJIŠŤOVÁNÍ ZBYTKŮ ANTIBIOTIK A SULFONAMIDŮ/DAPSONU V SUŠENÉM ODSTŘEDĚNÉM MLÉCEProvede se screenigová zkouška na mikrobiální inhibitory, při které se použije jako zkušební mikroorganismus Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C 953 a která je dostatečně citlivá, aby detekovala 4 μg benzylpenicilinu v 1 litru mléka a 100 μg sulfadimidinu v 1 litru mléka. K dispozici jsou komerční zkušební soupravy, které lze používat, mají-li požadovanou citlivost na benzylpenicilin a sulfadimidin [1].Ke zkoušce se použije rekonstituované sušené odstředěné mléko (1 g prášku + 9 ml destilované vody). Zkouška se provádí podle popisu v IDF, ve věstníku č. 258/1991 části 1 kapitole 2, nebo podle návodu výrobce zkušební soupravy.Pozitivní výsledky se interpretují takto:1. Zkouška se opakuje přidáním penicilinázy do zkušebního systému:Pozitivní výsledek: Inhibující látku nelze tímto postupem identifikovat.Negativní výsledek: Inhibující látkou je antibiotikum β-laktam.2. Zkouška se opakuje přidáním kyseliny p-aminobenzoové do zkušebního systému:Pozitivní výsledek: Inhibující látku nelze tímto postupem identifikovat.Negativní výsledek: Inhibující látkou je sulfonamid/dapson.3. Zkouška se opakuje přidáním penicilinázy a kyseliny p-aminobenzoové do zkušebního systému:Pozitivní výsledek: Inhibující látku nelze tímto postupem identifikovat.Negativní výsledek: Inhibující látky jsou antibiotikum β-laktam a sulfonamid/dapson.[1] Důležité upozornění:Při analýze sušeného odstředěného mléka mohou být získány falešně pozitivní výsledky. Proto je důležité si ověžit, zda použití zkušební systém falešně pozitivní výsledky neposkytuje.--------------------------------------------------PŘÍLOHA XXII(Článek 16)KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ SUŠENÉHO ODSTŘEDĚNÉHO MLÉKA V KRMNÝCH SMĚSÍCH ENZYMATICKOU KOAGULACÍ PARAKASEINU1. PředmětKvantitativní stanovení sušeného odstředěného mléka v krmných směsích enzymatickou koagulací parakaseinu.2. Oblast použitíTato metoda se používá pro krmné směsi obsahující nejméně 10 % sušeného odstředěného mléka. Velká množství podmáslí a/nebo některých jiných než mléčných bílkovin mohou analýzu rušit.3. Podstata metody3.1 Rozpuštění kaseinu obsaženého v krmných směsích extrakcí roztokem citranu sodného.3.2 Úprava koncentrace vápenatých iontů na úroveň potřebnou pro vysrážení parakaseinu; z kaseinu se parakasein získá přidáním syřidla.3.3 Obsah dusíku ve sraženině parakaseinu se stanoví Kjeldahlovou metodou uvedenou v normě IDF 20A:1986; množství sušeného odstředěného mléka se vypočítá na základě minimálního obsahu kaseinu 27,5 % (viz 9.1).4. ChemikáliePoužívají se pouze chemikálie čistoty p.a. a destilovaná voda nebo voda rovnocenné jakosti. S výjimkou syřidla (4.5) musí být všechny chemikálie a roztoky prosté dusíkatých látek.4.1 Citran trojsodný, dihydrát (roztok 1 % hm.)4.2 Chlorid vápenatý (roztok2 M). Do porcelánové nádobky vhodné velikosti (150-200 ml) nebo kádinky se naváží 20,018 g CaCO3 (p.a.). Navážka se zalije destilovanou vodou a nádoba se přenese do vroucí vodní lázně. Pomalu se přidá 50 až 60 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové (1:1), aby se uhličitan zcela rozpustil. Zahřívá se ve vodní lázni, dokud se CaCl2 nevysuší, aby se odstranil HCl, který nezreagoval. S destilovanou vodou se převede do odměrné baňky na 100 ml a doplní po značku. Změří se hodnota pH, jež nesmí být nižší než 4,0. Roztok se uchovává v chladničce.4.3 Hydroxid sodný 0,1 N.4.4 Kyselina chlorovodíková 0,1 N.4.5 Kapalné telecí syřidlo (standardní síly1:10000). Skladuje se v chladničce při teplotě 4-6 °C.4.6 Chemikálie pro kvantitativní stanovení dusíku Kjeldahlovou metodou podle popisu v normě IDF 20A 1986.5. Přístroje a pomůckyObvyklé laboratorní vybavení a zejména:5.1 Třecí miska nebo homogenizátor5.2 Analytické váhy5.3 Stolní odstředivka (2000 až 3000 ot/min) s 50 ml kyvetami.5.4 Magnetická míchačka s míchacími tyčinkami (délky 10-15 mm)5.5 Kádinky na 150 až 200 ml5.6 Baňky na 250 až 500 ml5.7 Skleněné nálevky o průměru 60 až 80 mm5.8 Rychlofiltrační bezpopelné filtry o průměru 150 mm (S.S. 5892, S.S. 595 1/2)5.9 Pipety o různém jmenovitém objemu5.10 Vodní lázeň s termostatickou regulací na 37 °C5.11 pH-metr5.12 Kjeldahlova digesční a destilační aparatura se spojovacím materiálem5.13 Dělená byreta na 25 ml5.14 Plastová promývačka s destilovanou vodou5.15 Špachtle z nerezové oceli5.16 Teploměry5.17 Sušárna s regulací teploty.6. Pracovní postup6.1 Příprava vzorku10 až 20 g vzorku se rozetře v třecí misce nebo se zhomogenizuje v mlýnku, aby se vytvořila homogenní směs.6.2 Rozpuštění sušeného mléka a oddělení nerozpustného zbytku6.2.1 Naváží se 1,000 ± 0,002 g dobře zhomogenizované krmné směsi (6.1) přímo do odstředivkové kyvety na 50 ml. Přidá se 30 ml roztoku citranu sodného (4.1) předem zahřátého na 45 °C. Pomocí magnetické míchačky se obsah míchánejméně 5 minut.6.2.2 Po dobu 10 minut se odstřeďuje při 500 g (2000 až 3000 otáček/min) a čirý vodný supernatant se dekantuje do kádinky na 150 ml až 200 ml. Přitom je nutné dbát na to, aby spolu se supernatantem nebyly převedeny nerozpustitelné částice.6.2.3 Stejným způsobem se provedou další dvě extrakce zbytku. Všechny tři vodné extrakty se smíchají.6.2.4 Jestliže se na povrchu utvoří olejová vrstva, obsah se ochladív chladničce, dokud tuk neztuhne a tuková vrstva se odstraní špachtlí.6.3 Koagulace kaseinu enzymy syřidla6.3.1 Za stálého míchání se k celkovému vodnému extraktu (asi 100 ml) přidá po kapkách 3,4 ml nasyceného roztoku chloridu vápenatého (4.2). Roztokem NaOH (4.3) nebo HCl (4.4) se upraví pH na 6,4 až 6,5. Nádoba se uloží na 15 až 20 minut do termostatem regulované vodní lázně o teplotě 37 °C k dosažení solné rovnováhy. Projeví se tvorbou lehkého zákalu.6.3.2 Kapalina se přenese do jedné či dvou odstředivkových kyvet a odstřeďuje se 10 minut při 2000 g, aby se odstranil vysrážený materiál. Supernatant se převede do jedné či dvou odstředivkových kyvet, aniž by se promývala usazenina.6.3.3 Teplota supernatantu se opět musí dostat na úroveň 37 °C. Za míchání se do extraktu přidává po kapkách 0,5 ml kapalného syřidla (4.5). Během jedné až dvou minut proběhne koagulace.6.3.4 Vzorek se vrátí do vodní lázně a ponechá se v ní 15 minut při teplotě 37 °C. Vzorek se vyjme z vodní lázně a koagulát se rozruší mícháním. Potom se směs odstřeďuje po dobu 10 minut při 2000 g. Supernatant se přefiltruje přes vhodný filtr [1] (Whatman č. 541 nebo rovnocenný filtr) a filtr se uchová. Mícháním se sraženina v odstředivkové kyvetě promyje 50 ml vody při teplotě asi 35 °C.Obsah se znovu odstřeďuje po dobu 10 minut při 2000 g. Supernatant se přefiltruje přes filtr z předchozí filtrace.6.4 Stanovení kaseinového dusíku6.4.1 Po promytí se sraženina kvantitativně převede pomocí destilované vodyna filtrační papíruschovaný z 6.3.4. Filtrační papír se přenese do Kjeldahlovy baňky. Dusík se stanoví Kjeldahlovou metodou popsanou v normě IDF 20A 1986.7. Slepý pokus7.1 Pravidelně se provádí slepý pokus s bezpopelným filtračním papírem (5.8) navlhčeným směsí 90 ml roztoku citranu sodného (4.1), 1 ml nasyceného roztoku chloridu vápenatého (4.2) a 0,5 ml kapalného syřidla (4.5), a promytým 3 x 15 ml destilované vody před mineralizací Kjeldahlovou metodou popsanou v normě IDF 20A 1986.7.2 Objem kyseliny použité na slepý pokus musí být odečten od objemu kyseliny (4.4) použité na titraci vzorku.8. Kontrolní pokus8.1 Za účelem kontroly výše uvedeného analytického postupu a chemikálií se provede stanovení na některé standardní krmné směsi se známým obsahem sušeného odstředěného mléka, jak byl stanoven ve společné studii. Průměrný výsledek duplicitního stanovení se nesmí lišit od výsledku ze společné studie o více než 1 %.9. Vyjádření výsledků9.1 Procento sušeného odstředěného mléka v krmné směsi se vypočte podle tohoto vzorce:% MMP =27,5- 2,810,908kde N je procento parakaseinového dusíku, 27,5 je koeficient pro převod stanoveného kaseinu na procento sušeného odstředěného mléka a 2,81 a 0,908 jsou opravné koeficienty získané regresní analýzou.10. Přesnost metody10.1 OpakovatelnostNejméně v 95 % posuzovaných případů nesmí být rozdíl mezi dvěma samostatnými výsledky duplicitní analýzy téhož vzorku provedené týmž pracovníkem v téže laboratoři větší než 2,3 g sušeného odstředěného mléka na 100 g krmné směsi.10.2 ReprodukovatelnostNejméně v 95 % posuzovaných případů nesmí být rozdíl mezi dvěma samostatnými výsledky duplicitní analýzy téhož vzorku provedené týmž pracovníkem v téže laboratoři větší než 6,5 g sušeného odstředěného mléka na 100 g krmné směsi.11. Mez toleranceHodnota CrD95 (kritický rozdíl: mez spolehlivosti 95 %) se vypočte podle tohoto vzorce (ISO 5725):CrD=n(R: reprodukovatelnost; r: opakovatelnost)Dvojí stanovení: CrD95 = 4,5 gPokud se výsledek chemické analýzy liší od deklarovaného obsahu sušeného odstředěného mléka nejvýše o 4,5 g (dvojístanovení), pak se má za to, že daná šarže krmné směsi splňuje požadavky tohoto nařízení.12. Poznámky12.1 Přídavek velkých množství některých nemléčných bílkovin, zejména sojových bílkovin, může při zahřívání spolu se sušeným odstředěným mlékemvést k příliš vysokým výsledkůmv důsledku společného srážení s mléčným parakaseinem.12.2 V důsledku přídavku podmáslí mohou být získány poněkud nižší hodnoty, protože se stanoví pouze tukuprostá složka. Přídavek určitého kysaného podmáslí může znamenat značně nižší hodnoty v důsledku neúplného rozpuštění v citrátovém roztoku.12.3 Přídavky lecithinu v množství 0,5 % a větším mohou rovněž být příčinou nižších výsledných hodnot.12.4 Přidání sušeného odstředěného mléka zahřívaného na vyšší teploty může být příčinou příliš vysokých výsledných hodnot, což je způsobeno společným vysrážením některých bílkovin ze syrovátky s mléčným parakaseinem.[1] Je třeba použít bezpopelný rychlofiltrační papír.--------------------------------------------------PŘÍLOHA XXIII(Článek 17)KVALITATIVNÍ STANOVENÍ ŠKROBU V SUŠENÉM ODSTŘEDĚNÉM MLÉCE, DENATUROVANÉM SUŠENÉM MLÉCE A KRMNÝCH SMĚSÍCH1. Oblast použitíTato metoda je určena pro stanovení škrobu, který se používá jako stopovací látka v denaturovaném sušeném mléce.Detekční mez metody je přibližně 0,05 g škrobu na 100 g vzorku.2. Podstata metodyReakce je založena na reakci používané v jodometrii:- vazbě volného jodu koloidy ve vodném roztoku,- absorpci micelami škrobu a barevnou formací.3. Chemikálie3.1 Roztok jodu- jod: 1 g- jodid draselný: 2 g- destilovaná voda: 100 ml.4. Přístroje a pomůcky4.1 Analytické váhy4.2 Vodní lázeň4.3 Zkumavky 25 mm × 200 mm.5. Pracovní postupNaváží se 1 g vzorku a přenese do zkumavky (4.3).Přidá se 20 ml destilované vody a promíchá se, aby se vzorek rozptýlil.Zkumavka se vloží na 5 minut do vroucí vodní lázně (4.2).Vyjme se z lázně a ochladí na teplotu místnosti.Přidá se 0,5 ml roztoku jodu (3.1), protřepe se a pozoruje se výsledné zbarvení.6. Vyjádření výsledkůModré zabarvení ukazuje na přítomnost přírodního škrobu ve vzorku.Jestliže vzorek obsahuje modifikovaný škrob, zbarvení nemusí být nutně modré.7. PoznámkyBarva, intenzita zbarvení a mikroskopický vzhled škrobu se liší podle původu přírodního škrobu (např. z kukuřice nebo z brambor) a podle druhu modifikovaného škrobu přítomného ve vzorku.Pokud jsou přítomny modifikované škroby, vyvolané zbarvení se mění na fialové, červené nebo hnědé podle míry modifikace krystalické struktury přírodího škrobu.--------------------------------------------------PŘÍLOHA XXIV(Článek 18)STANOVENÍ VLHKOSTI V SUŠENÉM KYSANÉM PODMÁSLÍ1. PředmětStanovení obsahu vlhkosti v sušeném kysaném podmáslí určeném k použití jako krmivo.2. Podstata metodyVzorek se vysuší ve vakuu. Ztráta hmotnosti se stanoví vážením.3. Přístroje a pomůcky3.1 Analytické váhy3.2 Suché nádobky z nerezového kovu nebo skla, s víčky zajišťujícími vzduchotěsnost; pracovní povrch umožňující rozprostření vzorku asi na hustotu 0,3 g/cm2.3.3 Nastavitelná, elektricky vyhřívaná vakuová sušárna opatřená olejovou vývěvou a mechanismem na vhánění horkého suchého vzduchu nebo vysoušecím činidlem (např. oxidem vápenatým).3.4 Exsikátor s účinným vysoušecím činidlem.3.5 Sušárna s větráním, regulovaná termostatem na teplotu 102 ± 2 °C.4. Pracovní postupNádobka (3.2) i s víčkem se zahřívá v sušárně (3.5) nejméně po dobu jedné hodiny. Nádobka se přikryje víčkema okamžitě se přenese do exsikátoru (3.4). Nechá se vychladnout na teplotu místnosti a zváží se s přesností na 0,5 mg.Nádobka (3.2) s víčkem se zváží s přesností na 0,5 mg. Do zvážené nádobky se s přesností na 1 mg naváží 5 gramů vzorku a rovnoměrně se rozestře. Nádobka bez víčka se vloží do vakuové sušárny (3.3) předehřáté na teplotu 83 °C. Nádobka se do sušárny vloží co nejrychleji, aby nedošlo k nežádoucímu poklesu teploty sušárny.Zvýší se tlak na 100 torrů (13,3 kPa) a nechá sevysychat za tohoto tlaku po dobu čtyř hodin, buď v proudu suchého horkého vzduchu nebo působením vysoušecího činidla (asi 300 g na 20 vzorků). V tomto druhém případě se po dosažení předepsaného tlaku odpojí vývěva. Doba sušení se počítá od okamžiku, kdy se teplota sušárny vrátí na 83 °C. Potom se opatrně tlak v sušárně upraví zpět na atmosferický tlak. Sušárna se otevře, nádobka se okamžitě uzavře víčkem, vyjme se ze sušárny, nechá se vychladnout po dobu 30 až 45 minut v exsikátoru (3.4) a pak se zváží s přesností na 1 mg. Potom se suší dalších 30 minut ve vakuové sušárně (3.3) při teplotě 83 °C a znovu se zváží. Rozdíl mezi výsledky obou vážení nesmí být větší než 0,1 % vlhkosti.5. Výpočet výsledků×100EkdeE = původní hmotnost zkušebního vzorku v gramechm = hmotnost vysušeného zkušebního vzorku v gramech6. Přesnost6.1 Mezní hodnota opakovatelnostiRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník za stejných podmínek na stejném zařízení, nesmí překročit 0,4 g vody/100 g sušeného kysaného podmáslí.6.2 Mezní hodnota reprodukovatelnostiRozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých zařízeních,nesmí překročit 0,6 g vody/100 g sušeného kysaného podmáslí.6.3 Zdroj údajů o přesnostiTyto údaje o přesnosti byly získány na základě pokusu z roku 1995, kterého se zúčastnilo osm laboratoří a v kterém bylo použito dvanáct vzorků (6 slepých duplikátů).--------------------------------------------------PŘÍLOHA XXV(Článek 19)REFERENČNÍ METODA PRO ZJIŠŤOVÁNÍ CIZÍCH TUKŮ V MLÉČNÉM TUKU PLYNOVOU CHROMATOGRAFICKOU ANALÝZOU TRIGLYCERIDŮ - 1. REVIZE1. Předmět a oblast použitíTato norma stanoví metodu zjišťování cizích tuků, rostlinnýchi živočišných, jako je hovězí lůj a vepřové sádlo, v mléčném tuku mléka a mléčných výrobků pomocí plynové chromatografické analýzy triglyceridů.Pomocí stanovených vzorců triglyceridů lze kvalitativně i kvantitativně zjistit a stanovit rostlinné a živočišné tuky v čistém mléčném tuku, bez ohledu na podmínky krmení nebo laktace.Poznámka 1:Ačkoliv kyselina máselná (C4), která se vyskytuje výlučně v mléčném tuku, umožňuje kvantitativní odhady nízkého až středního obsahu mléčného tuku v rostlinných tucích, v případě přídavku nejméně 20 % (hm.) cizího tuku do čistého mléčného tuku nemůže zaručit kvalitativní a kvantitativní informace z důvodu velkých rozdílů v obsahu C4, který kolísá mezi 3,5 a 4,5 % (hm.).Poznámka 2:Kvantitativní výsledky lze získávat prakticky pouze na základě analýz triglyceridů, protože obsah sterolů v rostlinných tucích se liší podle podmínek výroby a zpracování.2. DefiniceCizí tuky v mléčném tuku: v tomto předpisu se cizími tuky rozumí všechny rostlinné a živočišné tuky s výjimkou mléčného tuku.3. Podstata metodyPo extrakci mléčného tuku se připraví zásobní roztok. Z tohoto roztoku se plynovou chromatografií na plněných kolonách stanoví triglyceridy (celkové počty uhlíků). Vložením hmotnostního % tukových molekul o různé velikosti (C24-C54 - pouze sudá čísla) do vzorce triglyceridů se cizí tuky zjišťují kvalitativně nebo stanoví kvantitativně.Poznámka:Při dodržení zde popsaného postupu lze použít plynovou chromatografii s kapilárními kolonami, pokud jsou zaručeny srovnatelné výsledky [1].4. ChemikáliePoužívají se pouze chemikálie čistoty p.a.4.1 Nosný plyn: dusík, čistota 99,996 %4.2 Referenční triglyceridy [2], nasycené a cholesterol pro standardizaci referenčního mléčného tuku podle bodu 6.5.4.4.3 Methanol, bezvodý4.4 n-hexan4.5 n-heptan4.6 Toluen4.7 Roztok dimethylchlorsilanu: 50 ml dimethylchlorsilanu se rozpustí v 283 ml toluenu.4.8 Hořlavý plyn: vodík a syntetický vzduch4.9 Stacionární fáze, 3 % OV-1 na 125/150 μm (zrnitost 100/120) Gas ChromQ [3].4.10 10 % roztok kakaového másla.5. Přístroje a pomůckyObvyklé laboratorní vybavení a zejména:5.1 Vysokoteplotní plynový chromatograf, vhodný pro teploty nejméně 400 až 450 °C, opatřený plamenovým ionizačním detektorem (FID) a regulátorem konstantního hmotového toku nosného plynu. Hořlavý plyn: 30 ml/min H2, 270 ml/min syntetického vzduchu.Vzhledem k vysokému průtoku nosného plynu je třeba, aby byl plamen zvláště velký.Poznámka:Vzhledem k vysokým teplotám, kterých se dosahuje během analýzy triglyceridů, je nutné často mýt skleněné vložky v FID nebo v systému nástřiku.Plynový chromatograf musí být opatřen septy, které jsou odolné proti vysokým teplotám, které mohou být opakovaně používány a vykazují obecně velmi nízký stupeň propustnosti.Poznámka:Vhodná jsou septa Chromblue™ (Chrompack).Tato septa musí být pravidelně vyměňována, např. zhruba po 100 nástřicích, nebo jakmile se zhorší rozlišení (viz obr. 4).5.2 Chromatografická kolonaSkleněná kolona ve tvaru písmene U (vnitřní průměr 2 mm, délka 500 mm), která se nejprve silanizuje podle bodu 6.1 dimethylchlorsilanem za účelem deaktivace skleněného povrchu.Poznámka:Vhodné jsou také poněkud delší plněné kolony (80 až 200 mm dlouhé), s nimiž lze dosahovat mírně lepší reprodukovatelnosti výsledků. Na druhé straně stacionární fáze občas jeví po provozu praskliny, jež mohou pak působit zhoršení kvantitativních výsledků. Kromě toho plamen FID snadno zhasíná následkem potřebného neobyčejně vysokého průtoku nosného plynu (75 až 85 ml/min).5.3 Zařízení pro plnění kolony (viz obr. 1)+++++ TIFF +++++5.3.1 Plastová kolona opatřená koncovými šroubovými uzávěry a značkou, k níž lze doplnit potřebné množství stacionární fáze.5.3.2 Jemné síto (s velikostí ok přibližně 100 μM) se šroubovým uzávěrem, vhodným pro utěsnění skleněné kolony podle obrázku 1.5.3.3 Deaktivovaná silanizovaná skleněná vata.5.3.4 Vibrátor pro rovnoměrné ukládání stacionární fáze během plnění.5.4 Kolona Extrelut [4], 1 až 3 ml, naplněná silikagelem. Tuto kolonu lze případně použít při extrakci pro získání mléčného tuku.5.5 Grafitové těsnění 6,4 mm (1/4“) s vnitřním průměrem 6 mm.5.6 Zařízení pro silanizaci skleněného povrchu kolon podle bodu 6.15.6.1 Woulffova láhev5.6.2 Vodní vývěva5.7 Vodní lázeň s regulací (50 ± 2)°C5.8 Sušárna s regulací (50 ± 2)°C a (100 ± 2)°C5.9 Mikrolitrová pipeta5.10 Dělená 5 ml pipeta pro dávkování 1,5 ml methanolu5.11 Baňka na 50 ml s kulatým dnem 5.125.12 Erlenmeyerova baňka s jmenovitým objemem 50 ml5.13 Nálevka5.14 Filtr s mikropóry5.15 Rotační odparka5.16 Ampulky o jmenovitém objemu 1 ml, uzavíratelné hliníkovým víčkem se septem uvnitř.5.17 Injekční stříkačka; píst použité stříkačky nesmí sahat až k hrotu jehly.Poznámka:Tyto stříkačky umožňují získat lepší reprodukovatelnost výsledků.Hrot jehly musí být pravidelně kontrolován (např. stereomikroskopem), aby se zabránilo porušení septa.6. Pracovní postup6.1 Příprava kolony (silanizace)Po připojení Woulffovy láhve na vodní vývěvu, jak je znázorněno na obrázku 2, se trubička 2 ponoří do roztoku podle bodu 4.7. Po zavření kohoutu se kolona naplní a obě trubičky se poté odstraní.+++++ TIFF +++++Kolona se upevní na stojan a zcela naplní roztokem dimethyldichlorsilanu pomocí pipety.Po 20-30 minutách se Woulffova láhev vymění za odsávací láhev a kolona se vyprázdní připojením na vodní vývěvu (viz obr. 3).6.2 Plnění kolonyPotom následuje proplachování dávkami 75 ml toluenu a 50 ml methanolu. Vyprázdněná kolona se vysuší v sušárně při teplotě 100 °C (asi 30 minut).+++++ TIFF +++++Pro plnění kolony se použije zařízení znázorněné na obrázku 1. Stacionární fáze podle 4.9 se naplní do plastové kolony po značku. Spodní konec skleněné kolony, kterou je nutno naplnit, se uzavře přibližně 1 cm dlouhou zátkou z předem silanizované skleněné vaty, stlačené ocelovou tyčinkou. Potom se konec kolony uzavře sítkem podle bodu 5.3.2.Kolona se naplní pod tlakem (3 bary, N2) stacionární fází. Pro dosažení stejnoměrné, souvislé a pevné náplně se po skleněné koloně během plnění posunuje vibrátor.Po naplnění se do druhého konce naplněné kolony zatlačí pevná zátka ze silanizované skleněné vaty, vyčnívající konce se seříznou a zátka se zatlačí o několik milimetrů dovnitř kolony špachtlí.6.3 Příprava vzorkůPro přípravu vzorků se použije jedna ze tří následujících metod:6.3.1 Izolace mléčného tuku z másla5 až 10 g másla se roztaví ve vhodné nádobě ve vodní lázni (5.7) při teplotě 50 °C.V sušárně se ohřeje na 50 °C Erlenmeyerova baňka na 50 ml s nálevkou a vloženým filtrem(5.14). Tuková vrstva roztaveného vzorku másla se na předehřáté aparatuře přefiltruje.Takový mléčný tuk je téměř zbavený fosfolipidů.6.3.2 Extrakce tukového podílu metodou Röse-GottliebovouExtrakci lze provést podle normy IDF 1C:1987, 16C:1987, 11A:1987 nebo 22B:1987.U tohotomléčného tuku umožňují fosfolipidy získat pík cholesterolu, který je zvýšen asi o 0,1 %.Vliv na spektrum triglyceridů normalizované cholesterolem na 100 je tudíž zanedbatelný.6.3.3 Extrakce z mléka s použitím silikagelových kolon0,7 ml vzorku mléka temperovaných na 20 °C se vnese do 1 až 3 mililitrové kolony Extrelut mikrolitrovou pipetou (5.4) a po dobu asi 5 minut se nechá rovnoměrně rozprostíratt na silikagelu.Pro denaturaci protein-lipidových komplexů se pipetou přidá 1,5 ml methanolu. Potom se vzorek extrahuje 20 ml n-hexanu. N-hexan se přidává pomalu v malých dávkách a vytékající rozpouštědlo se shromažďuje do baňky s kulatým dnem na 50 ml, předem vysušené do známé konstantní hmotnosti.Po extrakci se kolona zcela vypustí.Z eluátu se destilací odstraní rozpouštědla na rotační odparce ve vodní lázni za teploty od 40 do 50 °C.Baňka se vysuší a výtěžek tuku se stanoví vážením.Poznámka:Extrakce tuku podle Gerbera, Weibulla a Berntropa, Schmida, Bondzynského a Ratzlaffa nebo izolace mléčného tuku detergenty (metodou BDI) není pro analýzu triglyceridů vhodná, protože při těchto metodách může do tukové fáze přecházet větší či menší množství parciálních glyceridů nebo fosfolipidů.6.4 Příprava roztoku vzorkuPro plynovou chromatografii se použije 5 % roztok tuku v n-heptanu (6.3). Pro přípravu tohoto roztoku vzorku se naváží odpovídající množství materiálu vzorku, získaná podle bodů 6.3.1 a 6.3.2, a rozpustí se v příslušných množstvích n-heptanu.Při přípravě vzorku podle bodu 6.3.3 se množství n-heptanu, které je třeba přidat k vzorku v baňce, vypočítá na základě zvážení a zbytek se v něm rozpustí.Do ampulky (5.16.) se naplní přibližně 1 ml roztoku vzorku.6.5 Chromatografické stanovení triglyceridůZa vysokých teplot až 350 °C pro vymývání triglyceridů s dlouhým řetězcem C52-C56 snadno dochází ke stoupání základní linie, zejména tehdy, když kolony nebyly na začátku dostatečně kondicionovány. Tomuto vzestupu základní linie za vysokých teplot lze zcela zabránit buď spojením dvou kolon nebo odčítáním základní linie.Při kompenzačním režimu či práci s jednoduchými kolonami, stejně jako u skleněných vložek ve vstřikovacím zařízení a v detektoru musí být použita grafitová těsnění (5.5).6.5.1 Korekce základní linieVzestupu základní linie lze zabránit použitím jedné z těchto čtyř metod:6.5.1.1 Kombinace kolonV kompenzačním režimu se použijí dvě plněné kolony.6.5.1.2 Korekce základní linie plynovým chromatografemProvedením pokusu na plynovém chromatografu bez nástřiku roztoku tuku a následným odečtením uložené základní linie lze vzestupu základní linie zabránit.6.5.1.3 Korekce základní linie integračním programovým vybavenímProvedením pokusu s integračním systémem bez nástřiku roztoku tuku a následným odečtením uložené základní linie lze vzestupu základní linie zabránit.6.5.1.4 Korekce základní linie přiměřeným kondicionovánímPo přiměřeném počátečním kondicionování kolony a přibližně po 20 nástřicích roztoku tuku je vzestup základní linie obvykle tak malý, že není nutné provádět žádnou korekci.6.5.2 Technika nástřikuAby nedocházelo k diskriminačním jevům, používá se u vysokovroucích triglyceridových složek technika "horkého nástřiku" pro dosažení lepších kvantitativních výsledků. Roztok tuku se nasaje do stříkačky a studená jehla stříkačky se před nastříknutím asi tři sekundy předehřívá v hlavě vstřikovacího zařízení. Potom se obsah stříkačky rychle nastříkne.Poznámka:Při této technice nástřiku se snižuje riziko frakcionačních jevů uvnitř stříkačky či ve vstřikovacím bloku. Přímé nastřikování "na kolonu" do horní, prodloužené vyhřívané části kolony se nepoužívá, protože úlomky septa a nečistoty, které se zde hromadí, se při používané technice snadno eliminují pravidelnou výměnou vložky vstřikovacího zařízení, aniž je nutné kolonu rozebírat.Je absolutně nezbytné zabránit ohnutí hrotu jehly tím, že by se dotkl dna kádinky se vzorkem (i když je ohnutí pouhým okem obtížně viditelné), aby nedošlo k poškození septa.+++++ TIFF +++++6.5.3 Kondicionování náplňové kolonyBěhem fází a) až c) není horní část kolony připojena k detektoru, aby nedošlo ke kontaminaci.Kolony naplněné podle bodu 6.2 se kondicionují takto:a) 15 minut, průtok N2 40 ml/min při 50 °C;b) ohřev rychlostí 1°K/min až na 355 °C při průtoku N2 10 ml/min;c) udržování teploty 355 °C po dobu 12 až 15 hodin;d) dva nástřiky po 1 μl roztoku kakaového másla (4.10) a příslušný teplotní program;e) 20 nástřiků po 0,5 μl roztoku mléčného tuku provedených během dvou až tří dnů (6.4).Poznámka:Kakaové máslo se skládá téměř výlučně z vysokovroucích triglyceridů C50 až C56. Účelem nástřiku kakaového másla je zvláštní kondicionování v tomto intervalu dlouhých řetězců. U vysokovroucích triglyceridů C50 až C54 se mohou částečně vyskytnout faktory odezvy až přibližně ve výši 1,20. Při opakovaném nástřiku roztoku mléčného tuku je obvykle nutné očekávat pokles těchto zpočátku vysokých faktorů odezvy pro C50 až C54. U triglyceridů s nízkým počtem uhlíků v acylu se koeficienty blíží 1. Připraví se tři dvojice kolon naplněných podle bodu 6.2. Kondicionované dvojice se zkontrolují v rámci rutinních zkoušek prostřednictvím analýzy mléčného tuku.Zvolí se dvojice s nejlepšími kvantitativními výsledky (s faktory odezvy téměř 1). Kolony s faktory odezvy vyššími než 1,20 se nepoužijí.6.5.4 KalibracePro kalibraci se stanoví faktory odezvy odpovídajících triglyceridů a cholesterolu mléčného tuku (standardizovaného tuku) pomocí referenčních triglyceridů (přinejmenším nasycených triglyceridů C24, C30, C36, C42, C48 a C54 a cholesterolu, pokud možno se přidá ještě C50 a C52). Přechodné faktory odezvy lze získat matematickou interpolací.Každý den musí být prováděny dvě nebo tři kalibrace pomocí referenčního tuku. Jestliže jsou výsledky téměř shodné, při analýze triglyceridů vzorků se dosáhne dobře reprodukovatelných kvantitativních výsledků.Referenční mléčný tuk může být skladován po dobu několika měsíců při maximální teplotě -18 °C, a proto může být používán jako referenční látka.Poznámka:Faktor odezvy každé složky může být rovněž stanoven pomocí referenčního tuku s ověřeným složením triglyceridů, jako je CRM 519 (bezvodý mléčný tuk), který lze získat z Ústavu referenčních materiálů a měr v Geelu v Belgii.6.5.5 Teplotní program, nosný plyn a další podmínky analýzy triglyceridůTeplotní program: počáteční teplota kolony 210 °C, udrží se po dobu 1 minuty, potom se naprogramuje růst 6 °C/min až do 350 °C a tato konečná teplota se udrží po dobu pěti minut.Teplota detektoru a vstřikovacího zařízení: 370 °CPoznámka:Teplotu detektoru, vstřikovacího zařízení a sušárny (počáteční teplotu) je třeba udržovat na konstantní úrovni (i během noci, víkendů a svátků).Nosný plyn: dusík, průtok 40 ml/minPoznámka:Používají-li se 80 cm dlouhé kolony, musí být průtok N2 nejméně 75 ml/min. Průtok nosného plynu musí být udržován na konstatní úrovni (i během noci, víkendů a svátků). Přesný průtok nosného plynu je třeba seřídit tak, aby C54 byl vymýván při teplotě 341 °C bez ohledu na délku kolony.Doba trvání analýzy: 29,3 minutyObjem nástřiku: 0,5 μl.Poznámka:Injekční stříkačku je po každém nástřiku nutné několikrát propláchnout čistým heptanem.Podmínky FID: viz bod 5.1Poznámka:Plamenový ionizační detektor se zapaluje na začátku každého pracovního dne.7. Integrace, vyhodnocení a kontrola podmínek měřeníTriglyceridy s lichým počtem uhlíků v acylech (2n + 1) se slučují s předcházejícím triglyceridem se sudým počtem (2n). Hůře reprodukovatelné nízké obsahy C56 se neberou v úvahu. Zbývající triglyceridy (plocha píků) v chromatogramu, včetně cholesterolu (pík v blízkosti C24), se násobí příslušnými faktory odezvy referenčního tuku (poslední kalibrace) a společně se normalizují na 100. Vedle volného cholesterolu jsou takto vyhodnoceny triglyceridy C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52 a C54. Výsledky se uvádí v hmotnostních procentech (g/100 g).Vyhodnocení píků chromatogramu je třeba provádět integrátorem, kterým lze vynést základní linii. Musí být možné provést reintegraci s optimalizovanými integračními parametry.Obrázky 5 a 6 znázorňují dva příklady chromatogramů triglyceridů. Na obrázku 5 je chromatogram, který lze dobře vyhodnotit, zatímco na obrázku 6 je znázorněna sporadická chyba v oblasti C50 až C54 a nesprávný průběh základní linie v porovnání s obrázkem 5. Takovéto typické chyby lze zjistit s vysokou mírou jistoty a lze se jim vyhnout pouze použitím integrátoru, kterým se zakresluje základní linie.+++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++Pro kontrolu podmínek měření je možné použít relativní směrodatné odchylky (RSD: variační koeficient x 100), uvedené v tabulce 1 pro různé triglyceridy. Byly vypočteny z 19 po sobě následujících analýz téhož mléčného tuku.Tabulka 1Relativní standardní odchylky (RSD) obsahu triglyceridů (n = 19)Triglycerid | RSD (%) |C24 | 10,00 |C26 | 2,69 |C28 | 3,03 |C30 | 1,76 |C32 | 1,03 |C34 | 0,79 |C36 | 0,25 |C38 | 0,42 |C40 | 0,20 |C42 | 0,26 |C44 | 0,34 |C46 | 0,37 |C48 | 0,53 |C50 | 0,38 |C52 | 0,54 |C54 | 0,60 |Jsou-li hodnoty RSD značně vyšší než hodnoty v tabulce 1, nejsou chromatografické podmínky vhodné a je nutné zkontrolovat septa nebo průtok nosného plynu. Dále malé částice septa mohou tvořit usazeniny na skleněné vatě ve vstupu do kolony nebo kolona přestane být vhodná k použití v důsledku stárnutí, účinků teploty atd. (viz obr. 3).Poznámka:Hodnoty uvedené v tabulce 1 nejsou závazné, jsou pouze orientační pro účely kontroly jakosti. Pokud se však akceptují vyšší hodnoty RSD, musí být splněny mezní hodnoty opakovatelnosti a reprodukovatelnosti uvedené v bodu 11.8. Kvalitativní zjišťování cizích tukůPro zjišťování cizích tuků byly vypracovány vzorce triglyceridů (tabulka 2) a stanoveny mezní hodnoty S (tabulka 3), jichž mohou hodnoty S čistého mléčného tuku dosahovat. Pokud jsou tyto mezní hodnoty překročeny, lze předpokládat přítomnost cizího tuku.Nejúčinnější vzorec pro zjišťování přídavku vepřového sádla je např.:6,5125. C26 + 1,2052. C32 + 1,7336. C34 + 1,7557. C36 + 2,2325. C42 + 2,8006. C46 + 2,5432. C52 + 0,9892. C54 = SPoznámka:Na základě použití 755 různých vzorků mléčného tuku byl stanoven 99 % interval spolehlivosti S = 97,96 - 102,04 pro vzorky čistého mléčného tuku se směrodatnou odchylkou pro všechny hodnoty S: SD = 0,39897.Vyjdeme-li ze složení triglyceridů vzorku neznámého tuku, tento vzorec umožní bez použití počítače jednoduše zjistit, zda se souhrnný obsah triglyceridů uvedený s odpovídajícími koeficienty nachází vně intervalu 97,06 - 102,04. Pokud ano, jde velmi pravděpodobně o přídavek cizího tuku.V tabulce 2 jsou uvedeny různé triglyceridové vzorce pro zjišťování různých cizích tuků. Pro zjišťování cizích tuků jako je sojový olej, slunečnicový olej, olivový olej, řepkový olej, lněný olej, olej z pšeničných klíčků, olej z kukuřičných klíčků, bavlníkový olej a hydrogenovaný rybí tuk, dále pro kokosový a palmojádrový tuk, stejně jako pro palmový olej a hovězí lůj, lze použít společný vzorec.Vzhledem k tomu, že složení triglyceridů cizích tuků může také kolísat, byla použita až čtyři odlišná data zjištěná experimentálně u triglyceridů cizích tuků téhož druhu. [Pro stejné druhy cizích tuků se vzala v úvahu nejméně příznivá mezní hodnota (viz tabulku 4)].S následujícím "univerzálním vzorcem" lze dosáhnout taktéž dobrých výsledků u všech cizích tuků:- 2,7575. C26 + 6,4077. C28 + 5,5437. C30 - 15,3247. C32 + 6,2600. C34 + 8,0108. C40. - 5,0336. C42 + 0,6356. C44 + 6,0171. C46 = SVýpočty pro zjišťování různých kombinací cizích tuků v mléčném tuku ukazují, že např. u vzorce pro vepřové sádlo uvedeného v tabulce 2 je mezní hodnota pro tento cizí tuk nízká, pouze 2,7 %, avšak jiné tuky jako kokosový tuk, palmový olej nebo palmojádrový tuk s detekčními limity 26,8, 12,5 a 19,3 % lze zjistit pomocí tohoto vzorce jen tehdy, pokud byly do mléčného tuku přidány ve velmi velkém množství. Pro ostatní vzorce z tabulky 2 platí totéž.Tabulka 2Triglyceridové vzorce pro zjišťování různých cizích tuků v mléčném tuku, s uvedením směrodatných odchylek SD pro hodnoty SVzorec pro sojový, slunečnicový, olivový, řepkový, lněný olej, olej z pšeničných klíčků, olej z kukuřičných klíčků, bavlníkový olej a rybí tuk2,0983. C30 + 0,7288. C34 + 0,6927. C36 + 0,6353. C38 + 3,7452. C40 - 1,2929. C42. + 1,3544. C44 + 1,7013. C44 + 1,7013. C46 + 2,5283. C50 = S; SD = 0,38157Vzorec pro kokosový a palmojádrový tuk3,7453. C32 + 1,1134. C36 + 1,3648. C38 + 2,1544. C42 + 0,4273. C44 + 0,5809. C46 + 1,1226. C48 + 1,0306. C50 + 0,9953. C52 + 1,2396. C54 = S; SD = 0,11323Vzorec pro palmový olej a hovězí lůj3,6644. C28 + 5,2297. C30 - 12,5073. C32 + 4,4285. C34 - 0,2010.C36 + 1,2791. C38 + 6,7433. C40 - 4,2714. C42 + 6,3739. C46 = S; SD = 0,81094Vzorec pro vepřové sádlo6,5125. C26 + 1,2052. C32 + 1,7336. C34 + 1,7557. C36 + 2,2325. C42 + 2,8006. C46 + 2,5432. C52 + 0,9892. C54 = S; SD = 0,39897Je-li pravděpodobné, že vzorek je směsí mléčného tuku a jednoho ze 14 různých cizích tuků nebo kombinace těchto cizích tuků, musí být pro kontrolu neznámého vzorku tuku použity všechny vzorce uvedené v tabulce 2 a univerzální vzorec (2). Jestliže se dosazením triglyceridů ze vzorku tuků k analýze získá hodnota S, která se nachází mimo intervaly jen jediného z pěti vzorců z tabulky 3, je vzorek s největší pravděpodobností určitým modifikovaným mléčným tukem. Zjišťování cizího tuku v mléčném tuku pomocí jednoho ze čtyř vzorců v tabulce 2 neumožňuje jednoznačně určit druh příměsi cizího tuku.Tabulka 3Mezní hodnoty S pro mléčné tukyZjišťováné tuky | Interval S |Sojový, slunečnicový, olivový, řepkový, lněný olej, olej z pšeničných klíčků, olej z kukuřičných klíčků a bavlníkový olej, rybí tuk | 98,05 – 101,95 |Kokosový a palmojádrový tuk | 99,42 – 100,58 |Palmový olej a hovězí lůj | 95,90 – 104,10 |Vepřové sádlo | 97,96 – 102,04 |Univerzální vzorec | 95,68 – 104,32 |V tabulce 4 jsou uvedeny detekční limity pro různé cizí tuky s 99 % spolehlivostí. V prvním sloupci jsou uvedeny minimální detekční limity pro nejlepší vzorce mléčného tuku z tabulky 2. Ve druhém sloupci jsou uvedeny detekční limity použitelné pro univerzální vzorec. Ačkoliv jsou uvedené limity poněkud vyšší, pro zjišťování mírně vyšších množství cizích tuků je nezbytný pouze tento vzorec. Pomocí všech vzorců je také možné zjistit kombinace různých cizích tuků. Intervaly kolísání triglyceridů různých cizích tuků jednoho druhu nemají na detekční limity větší vliv.Tabulka 4Detekční limity stanovené v intervalu spolehlivosti 99 % přidáním cizího tuku do mléčného tuku v %| Individuální vzorec | Univerzální vzorec |Sojový olej | 2,1 | 4,4 |Slunečnicový olej | 2,3 | 4,8 |Olivový olej | 2,4 | 4,7 |Kokosový tuk | 3,5 | 4,3 |Palmový olej | 4,4 | 4,7 |Palmojádrový tuk | 4,6 | 5,9 |Řepkový olej | 2,0 | 4,4 |Lněný olej | 2,0 | 4,0 |Olej z pšeničných klíčků | 2,7 | 6,4 |Olej z kukuřičných klíčků | 2,2 | 4,5 |Bavlníkový olej | 3,3 | 4,4 |Vepřové sádlo | 2,7 | 4,7 |Hovězí lůj | 5,2 | 5,4 |Hydrogenovaný rybí tuk | 5,4 | 6,1 |Poznámka:Intervaly S se vypočítají tak, že se předpokládá přítomnost pouze jednoho cizího tuku, pokud jsou překročeny limity individuálních vzorců (viz tabulku 4).9. Kvantitativní stanovení cizích tukůPro získání kvantitativních údajů o koncentraci cizích tuků ve vzorku mléčného tuku se použije tento vzorec:X= 100.100 - S,kde X je množství neznámého cizího tuku nebo neznámé směsi tuků v neznámém mléčném tuku. Hodnota S je výsledkem přídavku neznámého cizího tuku získaného dosazením triglyceridů směsi cizího tuku a mléčného tuku do výše uvedeného univerzálního triglyceridového vzorce. Jestliže se k mléčnému tuku přidá neznámý cizí tuk, pro SF v celkovém vzorci se zvolí průměrná hodnota S různých cizích tuků. Tato průměrná hodnota S se získá dosazením dat triglyceridů čistých cizích tuků do tohoto vzorce a vypočtením průměrné hodnoty (SF = 7,46). Dobré kvantitativní výsledky u přídavků jakéhokoliv cizího tuku se získají také použitím vzorce pro palmový olej a hovězí lůj (tabulka 2) a střední hodnoty SF 10,57.Pokud jsou druhy cizích tuků známy, musí se do výše uvedeného vzorce dosadit následující hodnoty SF a z tabulky 2 zvolit příslušný vzorec pro cizí tuk:Tabulka 5Hodnoty SF různých cizích tukůCizí tuk | SF |Sojový olej | 8,18 |Slunečnicový olej | 9,43 |Olivový olej | 12,75 |Kokosový tuk | 118,13 |Palmový olej | 7,55 |Palmojádrový tuk | 112,32 |Řepkový olej | 3,30 |Lněný olej | 4,44 |Olej z pšeničných klíčků | 27,45 |Olej z kukuřičných klíčků | 9,29 |Bavlníkový olej | 41,18 |Vepřové sádlo | 177,55 |Hovězí lůj | 17,56 |Hydrogenovaný rybí tuk | 64,12 |10. Oblast použití detekční metodyPopsaná metoda se použije na mléko ve velkých objemech a je založena na reprezentativnosti vzorků mléčného tuku.Bylo by možné provádět velmi specifická zjišťování, pokud by na základě reprezentativního počtu mléčných tuků byly pro jednotlivé země odvozeny vzorce jako jsou ty, které byly popsány výše.Mohly by se využívat zvláště vhodné způsoby zjišťování, pokud by ve vzorcích jednotlivých zemí byl stanoven reprezentativní počet vzorků mléčného tuku. V takovém případě není nutné používat složité počítačové programy, použijí-li se kombinace triglyceridů uvedené v tabulce 2 a pokud se znovu stanoví faktory metodou nejmenších čtverců.Při použití intervalů S uvedených v tabulce 3 a za určitých podmínek krmení, jako je například nedostatečné krmení nebo krmení krav krmným droždím nebo Ca-mýdly, jsou uvedené vzorce obecně použitelné.. Tyto vzorce částečně indikují modifikovaný mléčný tuk pouze v případě extrémních podmínek krmení (např. velkého příjmu čistých krmných olejů, podávání velkých množství vápenatých mýdel kombinovaných s krmným tukem, atd.).Poznámka:Frakcionovaný mléčný tuk je obecně považován za nemodifikovaný mléčný tuk. Modifikace se předpokládá pouze tehdy, jsou-li překročeny mezní hodnoty. Vzorce ukazují na modifikaci jen u frakcionovaných mléčných tuků s neobvyklým složením tuku, jak tomu je např. v případě tvrdé frakce získané frakcionací fyzikálními metodami za vysokých teplot asi 30 °C s nízkými výtěžky několika procent, nebo frakcionací nadkritickým oxidem uhličitým.Frakcionace mléčného tuku však může být zjištěna jinými postupy, např. diferenciální skenovací kalorimetrií.11. Přesnost metodyUrčuje se pomocí mléčného tuku na základě vzorců z tabulky 2 a intervalů S z tabulky 3.11.1 OpakovatelnostStanovena jako rozdíl mezi hodnotami S dvou stanovení, která u stejného materiálu vzorku provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník stejným postupem za stejných podmínek (stejná osoba, stejné přístroje/stejné zařízení, stejná laboratoř):Tabulka 6Mezní hodnoty opakovatelnosti (r) pro různé vzorceZjišťováné tuky | r |Sojový, slunečnicový, olivový, řepkový, lněný olej, olej z pšeničných klíčků, olej z kukuřičných klíčků, bavlníkový olej, rybí tuk | 0,67 |Kokosový a palmojádrový tuk | 0,12 |Palmový olej a hovězí lůj | 1,20 |Vepřové sádlo | 0,58 |Univerzální vzorec | 1,49 |11.2 ReprodukovatelnostStanovena jako rozdíl mezi hodnotami S dvou stanovení, která u stejného materiálu vzorku provedli dva pracovníci stejným postupem za různých podmínek (různé osoby, různé přístroje) v různé době.Tabulka 7Mezní hodnoty reprodukovatelnosti (R) pro různé vzorceZjišťováné tuky | R |Sojový, slunečnicový, olivový, řepkový, lněný olej, olej z pšeničných klíčků, olej z kukuřičných klíčků, bavlníkový olej, rybí tuk | 1,08 |Kokosový a palmojádrový tuk | 0,40 |Palmový olej a hovězí lůj | 1,81 |Vepřové sádlo | 0,60 |Univerzální vzorec | 2,07 |11.3 Kritický rozdílPři známých mezích hodnotách opakovatelnosti (r) a reprodukovatelnosti (R) lze vypočítat kritické rozdíly pro všechny intervaly S z tabulky 3 (duplicitní analýza). Příslušné hodnoty jsou uvedeny v tabulce 8.Tabulka 8Kritické rozdíly pro všechny triglyceridové vzorceZjišťováné tuky | Interval |Sojový, slunečnicový, olivový, řepkový, lněný olej, olej z pšeničných klíčků, olej z kukuřičných klíčků, bavlníkový olej, rybí tuk | 97,43 – 102,57 |Kokosový a palmojádrový tuk | 99,14 – 100,86 |Palmový olej a hovězí lůj | 94,91 – 105,09 |Vepřové sádlo | 97,65 – 102,35 |Univerzální vzorec | 94,58 – 105,42 |11.4 Přijatelnost výsledkůVšechny kalibrované, na dvě desetinná místa zaokrouhlené obsahy triglyceridů C24, C26, C28 až C54, včetně cholesterolu, musí být přesně normalizovány na 100.Výsledky duplicitní analýzy se používají ke kontrole opakovatelnosti. Jestliže absolutní rozdíl mezi oběma výsledky S u všech pěti triglyceridových vzorců nepřesáhne mezní hodnoty opakovatelnosti r z tabulky 6, pak je požadavek na opakovatelnost splněn.Pro zajištění optimálních podmínek plynové chromatografie, a zejména jakosti kolony je třeba dbát na to, aby při 10 opakovaných pokusech rozdíl mezi maximálními a minimálními hodnotami S u všech pěti triglyceridových vzorců nepřesáhl inteval x. r, kde x = 1,58 (pro 10 pokusů, viz literaturu [16]) a mezní hodnoty opakovatelnosti r pro jednotlivé vzorce z tabulky 6.12. Citované normyDIN 10 336:1994 | Nachweis und bestimmung von Fremdfetten in Milchfett anhand einer gaschromatographischen Triglyceridanalyse |Norma IDF 1C:1987 | Milk. Determination of Fat Content - Röse-Gottlieb Gravimetric Method |Norma IDF 16C: 1987 | Cream. Determination of Fat Content - Röse-Gottlieb Gravimetric Method |Norma IDF 116A:1987 | Milk-Based Edible Ices and Ice Mixes. Determination of Fat Content - Röse-Gottlieb Gravimetric Method |IDF Standard 22B:1987 | Skimmed Milk, Whey & Buttermilk. Determination of Fat Content - Röse-Gottlieb Gravimetric Method |13. Literatura1. Komise Evropských společenství: Detection of foreign fats in milk fat by means of gas chromatographic triglyceride analysis; Dok. č. VI/5202/90-EN, VI/2645/91.2. Komise Evropských společenství: Control of butter fat purity of 100 different samples of different feeding periods from 11 EEC countries;. Dok. 4. VI/4577/93.3. Komise Evropských společenství: Consideration of results from the first, second, third, fourth, fifth and sixth EEC collaborative trial: Determination of triglycerides in milk fat; Dok. č. VI/2644/91, VI/8.11.91, VI/1919/92, VI/3842/92, VI5317/92? VI/4604/93.4. Timms, R.E.: Detection and quantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47, 295-303 (1980).5. Precht, D., Heine, K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen, 41406-410 (1986).6. Luf, W., Stock, A., Brandl, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett über die triglyceridanalyse, Österr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 29-35 (1987).7. Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierische Depotfetten in Milchfett, Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 42143-157 (1989).8. Precht, D.: Schnelle Extraktion von Milchfett., Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 42119-128 (1990).9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 42139-154 (1900).10. Precht, D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchwirtsch. Forschungber. 43 (3) 219-242 (1991.11. Precht, D.: Detection of adulterated milk fat by fatty acid and triglyceride analysis. Fat Sci. Technol. 93538-544 (1991).12. Precht, D: Detection for foreign fat in milk fat. I. Qualitative detection by triacylglycerol formulae. II Quantitative evaluation of foreign fat mixtures. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 194 1-8, 107-114 (1992).13. Precht D.: Gas chromatography of triacylglycerols and other lipids on packed columns in CRC Handbook of Chromatography: Analysis of lipids, p. 123-138, Ed. K.D. Mukherjee, N. Weber, J. Sherma, CRC Press, Boca Raton (1993).14. Precht, D., Molkentin, J.: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns. Chrompack News 4 16-17 (1993).15. Molkentin, J., Precht, D.: Comparison of packed and capillary columns for quantitative gas chromatography of triglycerides in milk fat. Chromatographia 39 (5/6) 265-270 (1994).16. Stange, K.: Angewandte Statistik, Erster Teil, Eindimensionale Probleme. Springer Verlag, berlin, P. 378 (1970).[1] Vhodné metody ji byly popsány, viz D. Precht, J. Molkentin: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4, 16-17 (1993).[2] Vhodné výrobky jsou komerčně dostupné.[3] Obchodní názvy jako jsou např. Extrelut, Gas ChromQ, Chrompack jsou příklady vhodných výrobků, které lze získat ve specializované obchodní síti. Tato informace je určena uživateli, aby mu usnadnila práci s normou, a nepředstavuje požadavek na konkrétní výrobek. Označení zrnitosti bylo převedeno na jednotky SI (m) podle BS 410:1988 "British Standard Specification for test sieves".[4] Viz předchozí poznámku pod čarou.--------------------------------------------------PŘÍLOHA XXVISEZNAM NAŘÍZENÍ UVEDENÝCH V PRVNÍM BODU ODŮVODNĚNÍ- Nařízení Komise (EHS) č. 1216/68 ze dne 9. srpna 1968, kterým se stanoví metoda pro zjišťování obsahu laktosy v krmných směsích dovážených ze třetích zemí [1], ve znění nařízení Komise (EHS) č. 222/88 ze dne 22. prosince 1987, kterým se v důsledku zavedení kombinované nomenklatury mění některépředpisy v odvětví mléka a mléčných výrobků [2];- Nařízení Komise (EHS) č. 3942/92 ze dne 22. prosince 1992, kterým se stanoví referenční metoda pro stanovení sitosterolu a stigmasterolu v máselném oleji [3], naposledy pozměněné nařízením Komise (ES) č. 175/1999, kterým se mění nařízení (EHS) č. 3942/92, (ES) č. 86/94, (ES) č. 1082/96 a (ES) č. 1459/98, kterým se zavádí referenční metody pro stanovení některých stopovacích látek v másle, máselném oleji a smetaně [4];- Nařízení Komise (ES) č. 86/94 ze dne 19. ledna 1994, kterým se stanoví referenční metoda pro stanovení sitosterolu a stigmasterolu v másle [5], ve znění nařízení (ES) č. 175/1999;- Nařízení Komise (ES) č. 2721/95 ze dne 24. listopadu 1995, kterým se stanoví pravidla pro používání referenčních a rutinních metod analýzy a hodnocení jakosti mléka a mléčných výrobků v rámci společné organizace trhu [6];- Nařízení Komise (ES) č. 1080/96 ze dne 14. června 1996, kterým se stanoví referenční metoda pro zjišťování koliformních bakterií v másle, odstředěném sušeném mléku a kaseinu/kaseinátech [7];- Nařízení Komise (ES) č. 1081/96 ze dne 14. června 1996, kterým se stanoví referenční metoda pro zjišťování kravského mléka a kaseinátu v sýrech vyráběných z ovčího mléka, kozího mléka nebo buvolího mléka nebo směsí ovčího, kozího a buvolího mléka a kterým se zrušuje nařízení (EHS) č. 690/92 [8];- Nařízení Komise (ES) č. 1082/96 ze dne 14. června 1996, kterým se stanoví referenční metoda pro stanovení ethylesteru kyseliny beta-apo-8karotenové v zahuštěném másle a másle [9], ve znění nařízení (ES) č. 175/1999;- Nařízení Komise (ES) č. 1854/96 ze dne 26. září 1996, kterým se stanoví seznam referenčních metod určených pro analýzu a hodnocení jakosti mléka a mléčných výrobků v rámci společné organizace trhu [10], ve znění nařízení (ES) č. 881/1999 [11];- Nařízení Komise (ES) č. 880/98 ze dne 24. dubna 1998, kterým se stanoví referenční metody pro stanovení obsahu vody, tukuprosté sušiny a tuku v másle [12];- Nařízení Komise (ES) č. 1459/98 ze dne 8. července 1998, kterým se stanoví referenční metoda pro stanovení vanilinu v zahuštěném másle, másle nebo smetaně [13], ve znění nařízení (ES) č. 175/1999.[1] Úř. věst. L 198, 10.8.1968, s. 13.[2] Úř. věst. L 28, 1.2.1988, s. 1.[3] Úř. věst. L 399, 31.12.1992, s. 29.[4] Úř. věst. L 20, 27.1.1999, s. 22.[5] Úř. věst. L 17, 20.1.1994, s. 7.[6] Úř. věst. L 283, 25.11.1995, s. 7.[7] Úř. věst. L 142, 15.6.1996, s. 13.[8] Úř. věst. L 142, 15.6.1996, s. 15.[9] Úř. věst. L 142, 15.6.1996, s. 26.[10] Úř. věst. L 246, 27.9.1996, s. 5.[11] Úř. věst. L 111, 29.4.1999, s. 24.[12] Úř. věst. L 124, 25. 4. 1998, s. 16.[13] Úř. věst. L 193, 9.7.1998, s. 16.--------------------------------------------------