CELEX: 32017R0735
Language: et
Date: 2017-02-14
Title: Komisjoni määrus (EL) 2017/735, 14. veebruar 2017, millega muudetakse tehnika arenguga kohandamise eesmärgil määruse (EÜ) nr 440/2008 (millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH)) lisa (EMPs kohaldatav tekst )

28.4.2017   
               
               
                  ET
               
               
                  Euroopa Liidu Teataja
               
               
                  L 112/1
               
            KOMISJONI MÄÄRUS (EL) 2017/735,
      14. veebruar 2017,
      millega muudetakse tehnika arenguga kohandamise eesmärgil määruse (EÜ) nr 440/2008 (millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH)) lisa
      (EMPs kohaldatav tekst)
      EUROOPA KOMISJON,
      võttes arvesse Euroopa Liidu toimimise lepingut,
      võttes arvesse Euroopa Parlamendi ja nõukogu 18. detsembri 2006. aasta määrust (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93 ja komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ, (1) eriti selle artikli 13 lõiget 2,
      ning arvestades järgmist:
      
                  (1)
               
               
                  Komisjoni määruses (EÜ) nr 440/2008 (2) on esitatud katsemeetodid, mida kasutatakse kemikaalide füüsikalis-keemiliste omaduste, toksilisuse ja ökotoksilisuse määramiseks määruse (EÜ) nr 1907/2006 kohaldamisel.
               
            
                  (2)
               
               
                  Määrust (EÜ) nr 440/2008 on vaja ajakohastada, et lisada sellele tehnika arengu arvesse võtmiseks uued ja ajakohastatud katsemeetodid, mille on hiljuti vastu võtnud Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsiooni (OECD), ja et tagada kooskõlas Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiviga 2010/63/EL (3) katseteks kasutatavate loomade arvu vähenemine. Käesoleva eelnõuga seoses on konsulteeritud sidusrühmadega.
               
            
                  (3)
               
               
                  Käesolev tehnika arenguga kohandamine hõlmab kahtekümmend katsemeetodit: üks uus meetod füüsikalis-keemilise omaduse määramiseks, viis uut meetodit ja üks ajakohastatud meetod ökotoksilisuse määramiseks, kaks ajakohastatud katsemeetodit keskkonnas muundumise ja käitumise hindamiseks ning neli uut ja seitse ajakohastatud meetodit inimeste tervisele avalduva mõju hindamiseks.
               
            
                  (4)
               
               
                  OECD vaatab oma suuniseid korrapäraselt läbi, et tuvastada selliseid katsemeetodeid, mis on teaduslikult aegunud. Käesoleva kohandamisega tehnika arengule jäetakse välja kuus katsemeetodit, millele vastavad OECD katsesuunised on tühistatud.
               
            
                  (5)
               
               
                  Seepärast tuleks määrust (EÜ) nr 440/2008 vastavalt muuta.
               
            
                  (6)
               
               
                  Käesoleva määrusega ettenähtud meetmed on kooskõlas määruse (EÜ) nr 1907/2006 artikli 133 kohaselt asutatud komitee arvamusega,
               
            ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA MÄÄRUSE:
      Artikkel 1
      Määruse (EÜ) nr 440/2008 lisa muudetakse vastavalt käesoleva määruse lisale.
      Artikkel 2
      Käesolev määrus jõustub kahekümnendal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.
      
         Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides.
         Brüssel, 14. veebruar 2017
         
            
               Komisjoni nimel
            
            
               president
            
            Jean-Claude JUNCKER
         
      
      
         (1)  ELT L 396, 30.12.2006, lk 1.
      
         (2)  Komisjoni 30. mai 2008. aasta määrus (EÜ) nr 440/2008, millega kehtestatakse katsemeetodid vastavalt Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrusele (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) (ELT L 142, 31.5.2008, lk 1).
      
         (3)  Euroopa Parlamendi ja nõukogu 22. septembri 2010. aasta direktiiv 2010/63/EL teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta (ELT L 276, 20.10.2010, lk 33).
      
         LISA
         Määruse (EÜ) nr 440/2008 lisa muudetakse järgmiselt.
         
                     1)
                  
                  
                     A osasse lisatakse järgmine peatükk:
                     „A.25.   DISSOTSIATSIOONIKONSTANDID VEES (TIITRIMISMEETOD, SPEKTROFOTOMEETRILINE MEETOD, KONDUKTOMEETRILINE MEETOD)
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 112 (1981).
                     
                        Eeltingimused
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Sobiv analüüsimeetod
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Lahustuvus vees
                              
                           
                        Juhendteave
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Struktuurivalem
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Konduktomeetrilise meetodi puhul elektrijuhtivus
                              
                           
                        Erinõuded
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Kõigi katsemeetodite puhul tuleb kasutada puhtaid või kaubandusliku puhtusklassiga aineid. Tuleb kaaluda, millist mõju võivad tulemustele avaldada lisandid.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Tiitrimismeetod ei sobi vähelahustuva uuritava aine puhul (vt allpool, katselahused).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Spektrofotomeetriline meetod on kohaldatav ainult juhul, kui aine dissotsieerunud ja dissotsieerumata vormi UV või nähtava valguse neeldumisspektrid on oluliselt erinevad. See meetod võib samuti sobida vähese lahustuvusega ainete ja muu kui happe-aluse dissotsiatsiooni, st kompleksimoodustumise puhul.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Kui Onsageri võrrand kehtib, võib konduktomeetrilist meetodit kasutada isegi mõõdukalt väikse kontsentratsioon ja isegi muu kui happe-aluse tasakaalu puhul.
                              
                           
                        Alusdokumendid
                     
                     Käesolev katsemeetod põhineb meetoditel, mis on esitatud osas „Kirjandus“ loetletud dokumentides, samuti 18. augusti 1978. a EPA tootmiseelse teatise suuniste esialgsel kavandil (Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA).
                     MEETOD: SISSEJUHATUS, EESMÄRK, KASUTUSALA, ASJAKOHASUS, KASUTAMINE JA KATSEMEETODI PIIRANGUD
                     Aine keskkonnamõju hindamisel on oluline teada tema dissotsieerumist vees. Dissotsieerumisest oleneb, millisel kujul aine esineb; see omakorda määrab aine käitumise ja edasikandumise. See võib mõjutada kemikaali adsorptsiooni pinnasel ja setetes, samuti neeldumist rakkudes.
                     
                        Mõisted ja mõõtühikud
                     
                     
                        Dissotsieerumine on pöörduv jagunemine kaheks või enamaks keemiliseks üksuseks, mis võivad olla ioonsed. Seda protsessi kirjeldatakse üldiselt võrrandiga
                     
                        RX ⇌ R
                        ++ X
                        –
                     
                     ning kontsentratsioonide kaudu väljendatud reaktsiooni tasakaaluolekut kirjeldab tasakaalukonstant
                     
                        
                     Näiteks erijuhul, kui R on vesinik (aine on hape), kirjeldab konstanti võrrand
                     
                        
                     või
                     
                        
                     
                        Võrdlusained
                     
                     Järgmisi võrdlusaineid ei ole uue aine uurimisel alati vaja kasutada. Need on esitatud peamiselt selleks, et kaliibrida aeg-ajalt meetodit ja võimaldada tulemuste võrdlemist muu meetodi abil saadud tulemusega.
                     
                                  
                              
                              
                                 pKa
                                     (1)
                                 
                              
                              
                                 Temperatuur, °C
                              
                           
                                 
                                    p-nitrofenool
                              
                              
                                 7,15
                              
                              
                                 25 (1)
                                 
                              
                           
                                 Bensoehape
                              
                              
                                 4,12
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 
                                    p-kloroaniliin
                              
                              
                                 3,93
                              
                              
                                 20
                              
                           Kasulik oleks kasutada ainet, millel on mitu pK-d, nagu on näidatud allpool meetodi põhimõtte selgitamisel. Selline aine saaks olla:
                     
                                 sidrunhape
                              
                              
                                 pKa (8)
                              
                              
                                 Temperatuur, °C
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1) 3,14
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 2) 4,77
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 3) 6,39
                              
                              
                                 20
                              
                           
                        Katsemeetodi põhimõte
                     
                     Kirjeldatav keemiline protsess sõltub keskkonnatemperatuurile vastavas vahemikus üldiselt vaid vähe temperatuurist. Dissotsiatsioonikonstandi määramiseks on vaja mõõta kemikaali dissotsieerunud ja dissotsieerumata vormi kontsentratsioonid. Teades eespool mõistete ja mõõtühikute osas kirjeldatud stöhhiomeetriat, saab määrata asjakohase konstandi. Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud erijuhtumi korral käitub aine happe või alusena ja määramist on kõige parem teha aine ioniseeritud ja ioniseerimata vormi suhteliste kontsentratsioonide ja lahuse pH määramisega. Nende terminite vaheline seos on esitatud pKa valemiga, vt eespool osa „Mõisted ja mõõtühikud“. Mõnel ainel on rohkem kui üks dissotsiatsioonikonstant ja nende jaoks saab tuletada sarnased valemid. Mõned kirjeldatud meetoditest sobivad kasutamiseks ka muu kui happe-aluse dissotsiatsiooni puhul.
                     
                        Kvaliteedinõuded
                     
                     
                        Korduvus
                     
                     Dissotsiatsioonikonstandi väärtused (vähemalt kolmest paralleelmääramisest) peavad olema vahemikus ± 0,1 logaritmilist ühikut.
                     KATSEMEETODI KIRJELDUS
                     pKa määramisele on kaks peamist lähenemisviisi. Ühe meetodi puhul tiitritakse aine teadaolevat kogust vastavalt vajadusele happe või aluse standardlahusega; teise meetodi puhul määratakse ioniseeritud ja ioniseerimata vormide suhteline kontsentratsioon ja selle pH-sõltuvus.
                     
                        Ettevalmistused
                     
                     Neile põhimõtetele tuginevad meetodid võib jaotada tiitrimiseks, spektrofotomeetriliseks ja konduktomeetriliseks määramiseks.
                     
                        Katselahused
                     
                     Tiitrimismeetodi ja konduktomeetrilise meetodi kasutamiseks tuleb kemikaal lahustada destilleeritud vees. Spektrofotomeetrilise meetodi ja muude meetodite puhul kasutatakse puhverlahuseid. Uuritava aine kontsentratsioon ei tohi ületada väiksemat järgmistest – 0,01 M või pool küllastuskontsentratsiooni – ning lahuste valmistamiseks tuleks kasutada aine kõige puhtamat kättesaadavat vormi. Kui aine on vees halvasti lahustuv, võib selle lahustada väheses koguses veega segunevas lahustis enne eespool osutatud kontsentratsioonide saavutamiseks vajaliku koguse lisamist.
                     Lahuseid tuleb kontrollida emulsiooni esinemise suhtes; selleks kasutatakse Tyndalli efekti; see on eriti oluline siis, kui lahustuvuse suurendamiseks lisati kaaslahustit. Puhverlahuse kasutamise korral ei tohi puhvri kontsentratsioon ületada 0,05 M.
                     
                        Katsetingimused
                     
                     
                        Temperatuur
                     
                     Temperatuuri tuleb reguleerida täpsusega vähemalt ± 1 °C. Mõõtmised tuleks eelistatult teha 20 °C juures.
                     Kui kahtlustatakse tugevat sõltuvust temperatuurist, tuleb määramised teha veel vähemalt kahel temperatuuril. Sellisel juhul peaksid temperatuuri intervallid olema 10 °C ja temperatuuri reguleerimise täpsus ± 0,1 °C.
                     
                        Analüüsid
                     
                     Meetodi valimine sõltub uuritava aine omadustest. Meetod peab olema piisavalt tundlik, et võimaldada aine eri vormide määramist igal uuritava lahuse kontsentratsioonil.
                     
                        Katse käik
                     
                     
                        Tiitrimismeetod
                     
                     Uuritavat lahust tiitritakse, vastavalt vajadusele kas aluse või happe standardlahusega, ning pH määratakse pärast iga titrandikoguse lisamist. Enne ekvivalentsuspunkti saavutamist tuleb lisada vähemalt 10 titrandikogust. Kui tasakaal saavutatakse piisavalt kiiresti, võib kasutada registreerivat potentsiomeetrit. Selle meetodi puhul peavad nii aine üldkogus kui ka kontsentratsioon olema täpselt teada. Tuleb kasutada ettevaatusabinõusid, et välistada süsinikdioksiidi juurdepääs. Katse läbiviimise üksikasjad, ettevaatusabinõud ja arvutused on esitatud standardkatsete kirjeldustes (vt näiteks viited 1–4).
                     
                        Spektrofotomeetriline meetod
                     
                     Määratakse lainepikkus, mille juures ioniseeritud ja ioniseerimata vormi ekstinktsioonikoefitsiendid on märgatavalt erinevad. Määratakse muutumatu kontsentratsiooniga lahuste UV- või nähtava valguse neeldumisspekter pH eri väärtustel, millel aine on peamiselt ioniseerimata, on täielikult ioniseeritud, ning veel mitmel vahepealsel pH väärtusel. Seda võib teha kas kontsentreeritud happe (aluse) väikeste ruumalaliste koguste lisamisega uuritava aine lahuse suhteliselt suurele ruumalalisele kogusele paljukomponendilises puhvris, mis on algul väikese (suure) pH-ga (viide 5), või uuritava aine põhilahuse (nt vees, metanoolis) võrdses ruumalas lisamisega muutumatu ruumalaga eri puhverlahustele, mille pH väärtused katavad kogu soovitud pH-vahemiku. pH väärtustest ja neeldumise väärtustest valitud lainepikkusel arvutatakse piisav arv pKa väärtusi, kasutades andmeid, mis on saadud vähemalt viiel pH väärtusel, millel aine on vähemalt 10 % ja vähem kui 90 % ioniseeritud. Katse täiendavad üksikasjad ja arvutamismeetod on esitatud viites 1.
                     
                        Konduktomeetriline meetod
                     
                     Kasutades väikese ja teadaoleva konstandiga juhtivusandurit, mõõdetakse konduktomeetriaks sobivas vees lahustatud uuritava aine ligikaudu 0,1 M lahuse juhtivus. Mõõdetakse ka rea sellest lahusest täpselt valmistatud lahjenduste juhtivuse väärtused. Iga lahjendusega vähendatakse kontsentratsiooni poole võrra ja seeria peaks hõlmama vähemalt üht kontsentratsiooni suurusjärku. Määratakse ka juhtivuse piirväärtus lõpmatul lahjendusel; selleks tehakse samasugune katse naatriumisoolaga ja ekstrapoleeritakse. Seejärel võib iga lahuse juhtivusest arvutada Onsageri võrrandi abil dissotsiatsiooniastme ja selle alusel arvutada Ostwaldi lahjendusseaduse abil dissotsiatsioonikonstandi K = α2C/(1 – α), kus C on molaarne kontsentratsioon (mol/l) ja α on aine dissotsieerunud fraktsioon. Tuleb kasutada ettevaatusabinõusid, et välistada CO2 juurdepääs. Täiendavad katse üksikasjad ja arvutamismeetod on esitatud alustekstides ning viidetes 1, 6 ja 7.
                     ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                     
                        Tulemuste töötlemine
                     
                     
                        Tiitrimismeetod
                     
                     pKa arvutatakse tiitrimiskõvera 10 mõõdetud punkti järgi. Arvutatakse selliste pKa-de keskväärtus ja standardhälve. Andmed esitatakse tabelina ja koostatakse graafik pH sõltuvuse kohta aluse või happe standardlahuse lisatud ruumalast.
                     
                        Spektrofotomeetrilised meetodid
                     
                     Iga spektri kohta esitatakse tabelis neelduvus ja pH. Arvutatakse vähemalt viis väärtust pKa jaoks vahepealsetest spektriandmepunktidest; nendest väärtustest arvutatakse veel keskväärtus ja standardhälve.
                     
                        Konduktomeetriline meetod
                     
                     Arvutatakse ekvivalentjuhtivus Λ happe iga kontsentratsiooni jaoks ja sellise segu iga kontsentratsiooni jaoks, mille saamiseks segatakse üks ekvivalent hapet ja 0,98 ekvivalenti karbonaadivaba naatriumhüdroksiidi. Hape on liias, et vältida hüdrolüüsi tõttu tekkivat OH– liiga. Tehakse graafik teljestikus 1/Λ ja Ö_C ning soola Λo saab sellest leida ekstrapoleerimisega kontsentratsioonile 0.
                     Happe Λo saab arvutada kirjanduses esitatud H+ and Na+ väärtustest. pKa saab arvutada tulemustest α = Λi/Λo ja iga kontsentratsiooni Ka = α2C/(1 – α). Ka täpsemad väärtused saadakse siis, kui viiakse sisse ka liikuvust ja aktiivsust arvestavad parandid. Tuleb arvutada ka pKa väärtuste keskväärtus ja standardhälve.
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Kõik saadud töötlemata andmed ja arvutatud pKa väärtused tuleb esitada koos arvutamismeetodiga eelistatult tabelina, nagu on soovitatud viites 1, samuti tuleb esitada eespool kirjeldatud statistilised parameetrid. Tiitrimismeetodite puhul tuleb esitada titrantide standardimise üksikasjad.
                     Spektrofotomeetrilise meetodi puhul tuleb esitada kõik spektrid. Konduktomeetrilise meetodi puhul tuleb esitada konduktomeetri konstandi määramise üksikasjalik kirjeldus. Esitada tuleb ka kasutatud meetodit, analüüsimeetodeid ja kõiki kasutatud puhvreid käsitlev teave.
                     Tuleb esitada katse temperatuur(id).
                     KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, pp. 1186-1188 (1969).
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ASTM D 1293 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973).
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 ASTM D 1125 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Standard Method 205 – APHA/AWWA/NPCF (vt eespool (4)).
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 
                                    Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).“
                              
                           
               
                     2)
                  
                  
                     B osas asendatakse peatükk B.5 järgmisega:
                     „B.5.   SILMADE ÄGE ÄRRITUS/SÖÖVITUS
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 405 (2012). Kemikaalidega katsete tegemise OECD katsejuhendeid vaadatakse perioodiliselt läbi tagamaks, et need kajastaksid parimaid olemasolevaid teadusandmeid. Käesoleva meetodi eelnevates läbivaatamistes on pööratud erilist tähelepanu meetodi võimalikule täiustamisele kogu uuritavast kemikaalist olemasoleva teabe hindamise kaudu, et vältida tarbetuid loomkatseid, võttes seega arvesse loomade heaolu probleeme. Katsejuhendis nr 405 (vastu võetud 1981 ning ajakohastatud 1987, 2002 ja 2012) on soovitatud, et enne silmade ägeda ärrituse/söövituse jaoks kirjeldatud in vivo katse tegemist tuleb olemasolevate asjakohaste andmete alusel analüüsida tõendite kaalukust (1). Kui olemasolevad andmed on puudulikud, soovitatakse nende täiendamiseks kohaldada järjestikuste katsete tegemist (2, 3). See katsestrateegia hõlmab käesoleva katsemeetodi täiendmaterjalis esitatud valideeritud ja heakskiidetud in vitro katsete tegemist. Määruse (EÜ) nr 1907/2006 (mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) (2)) kohaldamiseks lisatakse integreeritud katsestrateegia ka asjakohastesse Euroopa Kemikaaliameti (ECHA, edaspidi – „kemikaaliamet“) juhenditesse (21). Loomkatseid võib teha ainult juhul, kui pärast olemasolevate alternatiivsete meetodite kaalumist on kindlaks tehtud selliste katsete vajalikkus, ning teha võib ainult neid katseid, mille kohta on kindlaks tehtud, et need on asjakohased. Käesoleva ajakohastatud katsemeetodi koostamise ajal on siiski veel olukordi, kui selle meetodi kasutamine on vajalik või nõutav teatavates õigusraamistikes.
                     Viimane ajakohastamine oli peamiselt keskendatud analgeetikumide ja anesteetikumide kasutamisele, ilma et see oleks mõjutanud katsejuhendi üldpõhimõtet ja ülesehitust. Alternatiivmeetodite valideerimise ametitevaheline koordineerimiskomitee (ICCVAM) (3) ja rahvusvaheline sõltumatu teaduslik eksperthindamise komisjon vaatasid läbi pinnaanesteetikumide, süsteemsete valuvaigistite ja humaansete näitajate rutiinse kasutamise kasulikkuse ja piirangud silma ärrituse in vivo ohutuskatsetes (12). Läbivaatamise alusel järeldati, et pinnaanesteetikumide ja süsteemsete valuvaigistite kasutamisega välditaks suurt osa valust ja kannatusest või välditaks neid täielikult, ilma et see mõjutaks katse tulemust, ning soovitati, et neid aineid tuleks alati kasutada. Käesolevas katsemeetodis võetakse seda läbivaatamist arvesse. Silmade ägeda ärrituse ja söövituse in vivo katsete tegemisel tuleb tavapraktika korras kasutada pinnaanesteetikume, süsteemseid valuvaigisteid ja humaanseid näitajaid. Erandeid nende kasutamise suhtes tuleb põhjendada. Käesolevas meetodis kirjeldatud täiustamine vähendab oluliselt või aitab vältida loomade valu ja kannatusi enamikus katseolukordades, kui in vivo katsetamine on siiski vajalik, et teha kindlaks kemikaali ohutus silmadele.
                     Tasakaalustatud ennetav valuravi peab hõlmama: i) tavapärast premedikatsiooni pinnaanesteetikumiga (nt proparakaiin või tetrakaiin) ja süsteemse valuvaigistiga (nt buprenorfiin), ii) tavapärast käitlusjärgset süsteemse analgeesia skeemi (nt buprenorfiin ja meloksikaam), iii) loomade valu ja kannatuse kliiniliste sümptomite vaatluse, seire ja registreerimise ajakava ning iv) kõigi silmakahjustuste iseloomulike avalduste, raskusastme ja kulu vaatlust, seiret ja registreerimist. Täiendavad üksikasjad on esitatud allpool kirjeldatud ajakohastatud katsejuhendites. Pärast uuritava kemikaali manustamist ei tohiks täiendavat pinnaanesteetikumi või valuvaigistit kasutada, et vältida uuringut segavat mõju. Põletikuvastase toimega valuvaigisteid (nt meloksikaam) ei tohi kasutada pindmiselt ning süsteemse toime annused ei tohi moonutada toimet silmadele.
                     Mõisted on esitatud käesoleva katsemeetodi liites.
                     LÄHTEKAALUTLUSED
                     Nii teadusandmete õigsuse kui ka loomade heaolu huvides ei nähta in vivo katsete tegemist ette enne, kui tõendite kaalukuse analüüsi alusel on hinnatud kõiki olemasolevaid asjakohaseid andmeid uuritava kemikaali puhul silmi söövitava/ärritava toime võimalikkuse kohta. Sellised andmed hõlmavad tõendeid varem inimeste ja/või katseloomadega tehtud uuringutest, tõendeid ühe või mitme struktuuriliselt samalaadse aine või selliste ainete segude põhjustatud söövituse/ärrituse kohta, andmeid aine tugevast happelisusest või aluselisusest (4, 5) ning valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete tulemusi silmade söövituse/ärrituse kohta (6, 13–17). Uuringud võivad olla tehtud enne tõendite kaalukuse analüüsi või selle tulemusena.
                     Teatavate kemikaalide puhul võib selline analüüs viidata vajadusele uurida kemikaali silmi söövitava/ärritava toime võimalikkust in vivo. Kõigil sellistel juhtudel tuleb enne in vivo silmakatsete tegemise kaalumist teha sellise kemikaali suhtes kõigepealt nahka söövitava toime in vitro ja/või in vivo uuring ning hinnata seda vastavalt katsemeetodi B.4 (7) järjestikuste katsete tegemise strateegiale või kemikaaliameti juhendis kirjeldatud integreeritud katsestrateegiale (21).
                     Järjestikuste katsete tegemise strateegia, mis hõlmab silmade söövituse/ärrituse valideeritud in vitro või ex vivo katsete tegemist, on esitatud käesoleva katsemeetodi täiendmaterjalis ning lisatud kemikaaliameti juhenditesse kemikaalide registreerimise, hindamise ja autoriseerimise (REACH) (21) eesmärgil. Seda katsestrateegiat soovitatakse järgida enne in vivo katsete tegemist. Uute kemikaalide puhul soovitatakse kemikaali söövitava/ärritava toime kohta teaduspõhiste andmete saamiseks etapiti katsetamist. Olemasolevate kemikaalide jaoks, mille puhul andmed nahka ja silmi söövitava/ärritava toime kohta ei ole piisavad, saab seda strateegiat kasutada puuduvate andmete hankimiseks. Muu katsestrateegia või -korra kasutamist või otsust loobuda etapiviisi katsetamisest tuleb põhjendada.
                     
                        IN VIVO KATSE PÕHIMÕTE
                     Pärast premedikatsiooni süsteemse valuvaigistiga ja sobiva pinnaanesteesia esile kutsumist pannakse uuritav kemikaal ühekordse annusena katselooma ühte silma; kemikaaliga töötlemata silma kasutatakse kontrollina. Silma ärrituse/söövituse astet hinnatakse sidekesta, sarvkesta ja vikerkesta kahjustuste punktiskaala alusel teatud ajavahemike tagant. Kirjeldatakse ka muid toimeid silmale ning kahjulikke süsteemseid toimeid, et hinnata kogu toimet täielikult. Katse kestus peab olema piisav, et saaks hinnata vaadeldud toimete pöörduvust või pöördumatust.
                     Loomad, kellel mis tahes katseetapis avalduvad raske kannatuse ja/või valu sümptomid, mis vastavad selles katsemeetodis kirjeldatud humaansetele näitajatele (vt punkt 26), tuleb humaanselt hukata ning hinnata kemikaali sellele vastavalt. Otsustamiskriteeriumid surmaeelses seisundis või raskelt kannatavate loomade humaanseks hukkamiseks on esitatud OECD juhendis (8).
                     
                        IN VIVO KATSE ETTEVALMISTAMINE
                     
                        Loomaliigi valik
                     
                     Eelistatud katseloom on albiinoküülik, kasutatakse terveid noori täiskasvanud loomi. Muu liigi või liini kasutamist tuleb põhjendada.
                     
                        Loomade ettevalmistamine
                     
                     Iga esialgu katseks valitud katselooma mõlemat silma tuleb uurida 24 tunni sees enne katse algust. Loomi, kellel esineb silmade ärritust, silmadefekte või juba olemasolevaid sarvkesta vigastusi, ei kasutata.
                     
                        Pidamis- ja söötmistingimused
                     
                     Loomi peetakse ühekaupa. Küülikute jaoks peab katseloomade ruumi temperatuur olema 20 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peab olema vähemalt 30 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal, on sobivaim vahemik 50–60 %. Kasutatakse tehisvalgustust, valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Liiga eredat valgust tuleb vältida. Söötmiseks võib kasutada labori tavapärast söödavalikut koos piiramatus koguses joogiveega.
                     KATSE KÄIK
                     
                        Pinnaanesteetikumide ja süsteemsete valuvaigistite kasutamine
                     
                     Silmadele ohutuse hindamisel soovitatakse katsete tegemisel kasutada valu ja kannatuste vältimiseks ja minimeerimiseks järgmisi meetodeid. Nende asemel võib kasutada ka muid meetodeid, mis tõendatult ning samaväärselt või paremini aitavad vältida või leevendada valu ja kannatusi.
                     
                                 —
                              
                              
                                 60 minutit enne uuritava kemikaali silma panemist süstitakse subkutaanselt 0,01 mg/kg buprenorfiini, mis tagab süsteemse analgeesia piisava terapeutilise taseme. Buprenorfiinist ja teistest sarnastest süsteemselt manustatavatest opioidsetest valuvaigistitest ei ole ei teada ega põhjust eeldada, et need moonutaksid silma reaktsioone (12).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Viis minutit enne uuritava kemikaali silma panemist tilgutatakse mõlemasse silma üks või kaks tilka silma pinnaanesteetikumi (nt 0,5 % proparakaiinhüdrokloriidi või 0,5 % tetrakaiinhüdrokloriidi). Soovitatakse kasutada säilitusainetevaba pinnaanesteetikumi, et vältida võimalikku uuringut segavat mõju. Iga looma puhul on kontrolliks see silm, kuhu ei ole pandud uuritavat kemikaali, vaid ainult pinnaanesteetikumi. Kui uuritav kemikaal põhjustab eeldatavasti olulist valu või kannatusi, ei tohiks seda üldjuhul in vivo katsetes kasutada. Juhul kui on kahtlusi või kui katse tegemine on siiski vajalik, tuleb enne uuritava kemikaali silma panemist ette näha täiendav pinnaanesteetikumi manustamine 5minutiliste intervallidega. Kasutajad peaksid arvestama, et mitu korda pinnaanesteetikumi manustamine võib põhjustada keemilise kahjustuse raskusastme vähest suurenemist ja/või selle paranemiseks kuluva aja pikenemist.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Kaheksa tundi pärast uuritava kemikaali silma panemist süstitakse naha alla 0,01 mg/kg buprenorfiini ja 0,5 mg/kg meloksikaami, et tagada süsteemse analgeesia püsiv terapeutiline tase. Kuigi puuduvad andmed, mille alusel võiks eeldada, et meloksikaam avaldab kord päevas subkutaanselt manustatuna silmale põletikuvastast toimet, võib meloksikaami manustada mitte varem kui 8 tundi pärast uuritava kemikaali silma panemist, et vältida mis tahes võimalikku uuringut segavat mõju (12).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Pärast 8 tunni möödumist uuritava kemikaali silma panemise järel tehtud esimesest süstimisest tuleb iga 12 tunni möödumisel süstida subkutaanselt buprenorfiini annuses 0,01 mg/kg ja lisaks iga 24 tunni järel 0,5 mg/kg meloksikaami kuni silmakahjustuste paranemiseni ning valu ja kannatustega seotud kliiniliste sümptomite kadumiseni. On olemas valuvaigisteid aeglaselt vabastavad ravimivormid, mille kasutamisega võiks arvestada, et vähendada valuvaigisti annustamise sagedust.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Kui pärast uuritava kemikaali silma panemist selgub, et ennetav analgeesia ja pinnaanesteesia on ebapiisavad, tuleb kohe rakendada erakorralist analgeesiat. Kui loomal avalduvad uuringu käigus valu ja kannatusega seotud sümptomid, tuleb kohe subkutaanselt manustada buprenorfiini erakorralises annuses 0,03 mg/kg ning manustamist korratakse vajaduse korral sagedusega üks kord iga 8 tunni järel (selle asemel, et manustada ravimit subkutaanselt annuses 0,01 mg/kg kord iga 12 tunni järel). Meloksikaami manustatakse subkutaanselt annuses 0,5 mg/kg kord iga 24 tunni kohta koos buprenorfiini erakorralise annusega, kuid mitte varem kui 8 tundi pärast uuritava kemikaali silma panemist.
                              
                           
                        Uuritava kemikaali silma panemine
                     
                     Uuritav kemikaal tuleb panna iga looma ühe silma sidekestakotti, milleks tuleb alumist laugu õrnalt silmamunast eemale tõmmata. Seejärel pigistatakse laud umbes üheks sekundiks õrnalt kinni, et vältida aine silmast väljavalgumist. Teine silm, kuhu uuritavat kemikaali ei kanta, toimib kontrollina.
                     
                        Silmade loputus
                     
                     Katseloomade silmi ei tohi loputada enne, kui on möödunud vähemalt 24 tundi uuritava kemikaali manustamisest, välja arvatud tahkiste kasutamise puhul (vt punkt 18) ning viivitamatult avaldunud söövitava või ärritava toime korral. 24 tunni pärast võib silmi loputada, kui see on vajalik.
                     Täiendava loomade rühma (nn satelliitrühma) kasutamine loputamise mõju uurimiseks ei ole soovitatav, välja arvatud juhul, kui see on teaduslikult põhjendatud. Kui satelliitrühma on vaja, kasutatakse kahte küülikut. Loputustingimused tuleb üksikasjalikult dokumenteerida, nt selleks kulunud aeg; loputuslahuse koostis ja temperatuur; loputuse kestus, vedeliku kogus ja voolukiirus.
                     
                        Annustamine
                     
                     1)   Vedelike uurimine
                     
                     Vedelike uurimiseks kasutatakse annust 0,1 ml. Pumppihustit ei tohi kemikaali otse silmale kandmiseks kasutada. 0,1 ml silma tilgutamiseks tuleb pihustatav vedelik enne väljutada ja koguda proovinõusse.
                     2)   Tahkiste uurimine
                     
                     Tahkiste, pastade ja peenosakestest koosnevate kemikaalide uurimisel kasutatav kogus on ruumalaga 0,1 ml või massiga kuni 100 mg. Uuritav kemikaal peab olema jahvatatud peentolmuks. Tahke materjali kogust tuleb mõõta pärast selle ettevaatlikku tihendamist, nt mõõteanuma raputamisega. Kui esimese vaatluse ajal (üks tund pärast kemikaali silma panemist) ei ole tahke kemikaal katselooma silmast füsioloogiliste mehhanismide abil eemaldatud, võib silma loputada füsioloogilise lahuse või destilleeritud veega.
                     3)   Aerosoolide uurimine
                     
                     Iga pumppihustis olev kemikaal (pihus või aerosool) on soovitatav silma tilgutamiseks eelnevalt koguda. Üks erand on aerosoolmahutites rõhu all olevad kemikaalid, mida ei saa koguda aurustumise tõttu. Sellisel juhul tuleks hoida looma silm lahti ja pihustada uuritav kemikaal otse sellesse 10 cm kauguselt silma eest ligikaudu üks sekund kestva purskega. Kaugus silmast võib varieeruda sõltuvalt kemikaalist pihustis ja selle rõhust. Tuleb olla ettevaatlik, et pihusejoa rõhk ei kahjustaks silma. Vajaduse korral tuleb hinnata võimalust, kas pihustatava kemikaali avaldatav rõhk ei tekita mehaanilist silmakahjustust.
                     Aerosooli annust võib hinnata järgmise mudelkatsega. Kemikaali pihustatakse kaalupaberile läbi otse selle ees oleva avause, mis on küüliku silma suurune. Paberi kaalu suurenemise järgi hinnatakse ligikaudne silma pihustatav kogus. Lenduvate kemikaalide puhul võib annust hinnata, kui kaaluda kogumisnõu enne ja pärast uuritava kemikaali eemaldamist.
                     
                        Eelkatse (silma ärrituse/söövituse in vivo katse ühe loomaga)
                     
                     
                        In vivo eelkatses on väga soovitatav kasutada vaid üht looma (vt käesoleva katsemeetodi täiendmaterjali: „Järjestikuste katsete tegemise strateegia silmade ärrituse ja söövituse uurimiseks“). Vaatlused peavad võimaldama määrata silmakahjustuse raskusastet ja pöörduvust enne kinnitava katse tegemist teisel katseloomal.
                     Kui selle katse tulemustest nähtub, et kemikaal on kirjeldatud meetodi järgi tehtud katse põhjal silma söövitav või tugevalt ärritav, ei ole vaja täiendavaid silma ärrituse katseid teha.
                     
                        Kinnitav katse (silma ärrituse in vivo katse täiendavate katseloomadega)
                     
                     Kui söövitavat või tugevalt ärritavat toimet ei ole eelkatses täheldatud, tuleb ärritava või negatiivse reaktsiooni kinnitamiseks teha lisakatse veel kahe katseloomaga. Kui ärritav toime sedastatakse eelkatses, siis on soovitatav, et kinnitav katse tehtaks katsete järjestikuse tegemise põhimõtte kohaselt, s.o kasutada katse kohta korraga pigem üht looma kui teha katse samaaegselt mõlema lisaloomaga. Kui teisel loomal avaldub söövitavaid või tugevalt ärritavaid toimeid, siis katset enam ei jätkata. Kui teise loomaga tehtud katse tulemused on piisavad ohuklassifikatsiooni määramiseks, siis täiendavaid katseid ei tehta.
                     
                        Vaatlusperiood
                     
                     Vaatlusperioodi kestus peab olema piisav, et hinnata täielikult vaadeldava toime ulatust ja pöörduvust. Katse tuleb siiski lõpetada kohe, kui loomal avalduvad tugeva valu või kannatuse sümptomid (8). Toime pöörduvuse üle otsustamiseks tuleb loomi üldjuhul pärast uuritava kemikaali manustamist jälgida 21 päeva jooksul. Kui toime pöörduvus ilmneb enne 21 päeva möödumist, tuleb katse lõpetada sel ajal.
                     
                        Kliiniline vaatlus ja silma reaktsioonide raskusastme hindamine
                     
                     Silmi tuleb silmakahjustuse esinemise või puudumise suhtes üks tund pärast uuritava kemikaali silma panemist põhjalikult hinnata, pärast seda tuleb nende seisundit hinnata vähemalt kord päevas. Loomade seisundit tuleb esimese kolme päeva jooksul hinnata mitu korda päevas, et õigeaegselt otsustada katse lõpetamise üle. Katseloomi tuleb tavapraktika korras hinnata kogu uuringu jooksul vähemalt kaks korda päevas valu ja/või kannatuse kliiniliste sümptomite esinemise suhtes (nt silma korduv kraapimine või hõõrumine, liigne pilgutamine, liigne pisaravool) (9–11), vaatlustevaheline ajavahemik on vähemalt 6 tundi (vajaduse korral hinnatakse sagedamini). See on vajalik, et i) hinnata katseloomadel valu ja kannatuse avaldumise tõendeid piisavalt, otsustamaks tõenduspõhiselt valuvaigistite annuse suurendamise vajaduse üle, ja ii) hinnata katseloomi kindlaksmääratud humaansete näitajate alusel, et otsustada tõenduspõhiselt, kas loomade humaanne eutanaasia on asjakohane, ning et tagada selliste otsuste õigeaegsus. Selleks et hinnata ja mõõta silmakahjustust ning otsustada kehtestatud humaansete näitajate alusel humaanse eutanaasia vajaduse üle, kasutatakse rutiinse abivahendina fluorestseiiniga värvimist ja vajaduse korral biomikroskoopi (nt sarvkesta haavandumise korral kahjustuse sügavuse hindamiseks). Sedastatud silmakahjustuste digifotod võib koguda tõendusmaterjaliks ja silmakahjustuse ulatuse dünaamika pidevaks dokumenteerimiseks. Loomi tohib pidada katses vaid nii kaua, kuni lõplikud andmed on saadud. Loomad, kel avalduvad tugeva valu või kannatuse nähud, tuleb viivitamata humaanselt hukata, ning kemikaali tuleb hinnata vastavalt sellele.
                     Loomad, kel on pärast kemikaali silma tilgutamist tekkinud järgmised silmakahjustused, tuleb humaanselt hukata (kahjustuste raskusastme kirjeldus on esitatud tabelis 1): sarvkesta perforatsioon või sarvkesta oluline haavand, sealhulgas stafüloom; veri silma eeskambris; sarvkesta 4. astme hägustumine; valgusrefleksi puudumine (2. astme pupillireaktsioon), mis püsib 72 tunni jooksul; sidekesta haavandumine; sidekesta või pilkkile nekroos; või niiske kärbus. Seda seetõttu, et sellised kahjustused üldiselt on pöördumatud. Peale selle soovitatakse selleks, et lõpetada katse enne 21päevase vaatlusperioodi lõppu, kasutada humaansete näitajatena järgmisi silmakahjustusi. Neid kahjustusi peetakse prognostilisteks silma tugeva ärrituse või selliste söövitusvigastuste puhul, mis on 21päevase vaatlusperioodi jooksul pöördumatud: väga sügav vigastus (nt sarvkesta haavand, mis ulatub pealmistest strooma kihtidest sügavamale), limbuse lagunemine > 50 % (mida tõendab sidekesta koe kahvatuks ja värvusetuks muutumine) ning raske silmainfektsioon (mädane eritis). Koos esinevaid sarvkesta pinna vaskularisatsiooni (st pannus), fluorestseiiniga värvunud pindala suuruse muutumatust (st igapäevase hindamise alusel see ei vähene) ja/või viie päeva möödumisel pärast kemikaali silma panekut reepiteliseerumise puudumist võib samuti pidada võimalikeks kasulikeks kriteeriumideks, mis võivad mõjutada kliinilist otsust uuringu varasema lõpetamise suhtes. Eraldi esinevatena ei ole need leiud siiski piisavad, et põhjendada uuringu varasemat lõpetamist. Kui on tuvastatud raske toime silmale, tuleb kliinilise läbivaatuse jaoks konsulteerida raviva veterinaararsti või katseloomadele spetsialiseerunud veterinaararstiga või kliiniliste kahjustuste diagnostika valdkonnas koolitatud töötajaga, et otsustada, kas nende nähtude koosesinemine on aluseks uuringu varasemale lõpetamisele. Silma (side-, sarv- ja vikerkesta) reaktsiooni astet tuleb hinnata ja dokumenteerida 1, 24, 48 ja 72 tunni möödumisel uuritava kemikaali silma panekust. Loomad, kellel ei teki silmakahjustusi, võib hukata mitte varem kui kolm päeva pärast kemikaali silma tilgutamist. Loomi, kelle silmakahjustused ei ole rasked, tuleb jälgida seni, kuni kahjustused paranevad või 21 päeva, misjärel katse lõpetatakse. Selleks et määrata kahjustuste seisund ja otsustada nende pöörduvuse või pöördumatuse üle tuleb vaatlusi teha ja nähtu dokumenteerida vähemalt 1 tunni, 24 tunni, 48 tunni, 72 tunni, 7 päeva, 14 päeva ja 21 päeva järel. Vaatluste sagedust tuleb vajaduse korral suurendada, et otsustada, kas katseloom tuleb humaansetest kaalutlustest lähtudes hukata või eemaldada uuringust negatiivsete tulemuste tõttu.
                     Silmakahjustuste astmed (tabel 1) tuleb registreerida iga läbivaatuse ajal. Kõigist muudest silmakahjustustest (nt pannus, värvumine, eeskambri muutused) või kahjulikust süsteemsest toimest tuleb samuti teatada.
                     Reaktsioonide uurimist lihtsustab binokulaarluubi, käsi-pilulambi, biomikroskoobi või muu sobiva seadme kasutamine. Pärast 24 tunni vaatluste registreerimist võib silmi edasi uurida fluorestseiini abil.
                     Silma reaktsioonide hindamine on vältimatult subjektiivne. Silma reaktsiooni hindamise ühtlustamiseks ning selleks, et aidata katselaboreid ja neid, kes vaatlusi läbi viivad või tõlgendavad, tuleb personali, kes vaatlusi teeb ja tõlgendab, kasutatava hindamissüsteemi mõistmiseks piisavalt koolitada.
                     ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                     
                        Tulemuste hindamine
                     
                     Silma ärrituse punktisummasid tuleks hinnata vastavalt kahjustuste iseloomulikele omadustele ja raskusastmele ning nende pöörduvusele või pöördumatusele. Üksikud punktisummad ei ole kemikaali hindamisel silmi ärritavate omaduste absoluutne standard, sest hinnatakse ka uuritava kemikaali muid toimeid. Selle asemel tuleks üksikuid punktisummasid käsitada võrdlusväärtustena ja need on tähenduslikud üksnes siis, kui neid täiendavad kõigi vaatlusandmete täielik kirjeldamine ja hindamine.
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet.
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    In vivo katse tegemise põhjendus – tõendite kaalukuse analüüs varasemate katseandmete, sealhulgas järjestikuste katsete tegemise strateegiaga saadud tulemuste põhjal:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             varasematest katsetest saadud asjakohaste andmete kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             katsestrateegia igal etapil saadud andmed;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tehtud in vitro katsete kirjeldus, sealhulgas katse korralduse üksikasjad, uuritavate kemikaalide / võrdluskemikaalidega saadud tulemused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tehtud nahaärrituse/-söövituse in vivo uuringu kirjeldus, sealhulgas saadud tulemuste kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tõendite kaalukuse analüüs in vivo uuringu tegemiseks.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritav kemikaal:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             identifitseerimisandmed (nt kemikaali nimetus ja võimaluse korral CASi number, puhtus, teadaolevad lisandid, allikas, partiinumber);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             iseloomulikud füüsikalised ja füüsikalis-keemilised omadused (nt pH, lenduvus, lahustuvus, stabiilsus, reageerimine veega);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             segu korral tuleb nimetada koostisosad, sealhulgas koostisainete identifitseerimisandmed (nt keemilised nimetused ja võimaluse korral CASi numbrid) ning kontsentratsioonid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud annus.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Vehiikul:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             nimetus, kontsentratsioon (vajaduse korral), kasutatud kogus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vehiikuli valiku põhjendus.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katseloomad:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud loomaliik/-liin, põhjendus muu loomaliigi kui albiinoküüliku kasutamiseks;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             iga looma vanus uuringu alguses;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             eri soost loomade arv katse- ja kontrollrühmas (kui vajalik);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             iga looma mass katse alguses ja lõpus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             päritolu, pidamistingimused, söötmine jne.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Anesteetikumid ja valuvaigistid:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             manustatud pinnaanesteetikumide ja süsteemsete valuvaigistite annused ja manustamiskorrad;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kui kasutatakse lokaalanesteetikumi, selle identifitseerimisandmed, puhtus, liik, annus ja võimalik interaktsioon uuritava kemikaaliga.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             iga vaatluse ajal punktiskaala alusel ärrituse hindamiseks kasutatud meetodi kirjeldus (nt käsi-pilulamp, biomikroskoop, fluorestseiin);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kuni katseloomade kõrvaldamiseni katsest iga vaatluse ajal igal loomal avaldunud ärritus-/söövitusreaktsioonide andmed tabelina;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             täheldatud ärrituse või söövituse raskusastme ja iseloomulike omaduste kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             muude täheldatud silmakahjustuste kirjeldus (nt vaskularisatsioon, pannuse teke, liited, värvumine);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             silmaväliste lokaalsete ja süsteemsete kahjulike toimete kirjeldus, valu ja kannatusega seotud kliiniliste sümptomite kirjeldus, digifotod ja histopatoloogilised leiud nende olemasolu korral.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemuste arutelu
                                 
                              
                           
                        Tulemuste tõlgendamine
                     
                     Silma ärrituse uuringute loomkatsetest saadud tulemuste ekstrapolatsioon inimesele kehtib üksnes piiratud ulatuses. Paljudel juhtudel on albiinoküülikud silma ärritavate või söövitavate ainete suhtes tundlikumad kui inimesed.
                     Andmete tõlgendamisel tuleb olla hoolikas, et välistada sekundaarsest infektsioonist tingitud ärritus.
                     KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Barratt, M.D.et al. (1995), „The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard, ECVAM Workshop Report 8“, ATLA 23, 410–429.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 de Silva, O. et al. (1997), „Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies“, Food Chem. Toxicol 35, 159–164.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Worth A. P. and Fentem J. H. (1999), „A general approach for evaluating stepwise testing strategies“, ATLA 27, 161–177.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Young, J.R. et al. (1988), „Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals“, Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Neun, D.J. (1993), „Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH“, J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Fentem, J.H. et al. (1998), „The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team“, Toxicology in vitro 12, pp. 483–524.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.4, „Äge nahaärritus/-söövitus“.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 OECD (2000). „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 19, (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Wright EM, Marcella KL, Woodson JF. (1985), „Animal pain: evaluation and control“, Lab Animal, May/June, 20–36.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 National Research Council (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 National Research Council (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010), „ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or
                                 Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing“, NIH Publication No. 10-7514, Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.40, „Nahasöövituskatse in vitro: transkutaanse elektritakistuse (TER) mõõtmine“.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.40bis, „Nahasöövituskatse in vitro: katse inimnaha mudeliga“.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 OECD (2006), „Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion“, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.47, „Veise sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse katsemeetod selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, i) mis tekitavad raskeid silmakahjustusi, ja ii) mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega“.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.48, „Isoleeritud kanasilma katsemeetod selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, i) mis tekitavad raskeid silmakahjustusi, ja ii) mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega“.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 U.S. EPA (2003), „Label Review Manual: 3rd Edition“, EPA737-B-96-001, Washington, DC: U.S., Environmental Protection Agency.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 UN (2011), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), 4. läbivaadatud väljaanne, New York & Geneva: United Nations Publications.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 „ECHA Guidance on information requirements and chemical safety assessment, Chapter R.7a: Endpoint specific guidance“,
                                 http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf
                              
                           
                        Tabel 1
                     
                     
                        Silmakahjustuste hindamise skaala
                     
                     
                                 Sarvkest
                              
                              
                                 Aste
                              
                           
                                 Hägusus: tihedusaste (mõõta tuleb kõige läbipaistmatumast kohast) (*1)
                                 
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Haavandumist või hägusust ei esine.
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Üksikud hajutatud või difuussed hägususalad (v.a tavapärase läike kerge tuhmumine); vikerkesta ehituse üksikasjad on selgelt näha
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Selgelt eristuv läbikumav ala; vikerkesta detailid on veidi ebaselged
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Pärlmutrine ala; vikerkesta detailid ei eristu, pupilli suurus on vaevu eristatav
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Läbipaistmatu sarvkest; vikerkest ei eristu hägususe tõttu
                              
                              
                                 4
                              
                           
                                 Suurim võimalik punktide arv: 4
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Vikerkest
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Normaalne
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Selgesti süvenenud kurrud, kongestsioon, turse, sarvkesta ümber mõõdukas hüpereemia; või injektsioon; vikerkest reageerib valgusele (reaktsiooni hilinemist käsitatakse toimena)
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Verejooks, ulatuslik vikerkesta hävimine või puudub reaktsioon valgusele
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Suurim võimalik punktide arv: 2
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Sidekest
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Punetav (laugude ja silmamuna sidekest; välja arvatud sarv- ja vikerkest)
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Normaalne
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Mõned hüpereemilised veresooned (injektsioon)
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Difuusne sügavpunane värvus; üksikud veresooned ei eristu selgesti
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Difuusne tumepunane
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Suurim võimalik punktide arv: 3
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Kemoos
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Turse (laugude ja/või pilkkile turse)
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Normaalne
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Normist suurem turse
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Väljendunud turse, lau osaline väljapöördumine
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Turse, laud poolsuletud
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Turse, laud rohkem kui poolsuletud
                              
                              
                                 4
                              
                           
                                 Suurim võimalik punktide arv: 4
                              
                              
                                  
                              
                           
                        Liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Astmeline lähenemisviis
                           – etapiviisi katsete tegemise strateegia, milles enne järgmise etapiga alustamist vaadatakse uuritava kemikaali kohta kindlaksmääratud korras läbi kogu olemasolev teave, kasutades igas etapis tõendite kaalukuse menetlust, et otsustada, kas teave on piisav ohuklassi määramiseks. Kui olemasoleva teabe põhjal saab otsustada uuritava kemikaali ärritavate omaduste üle, ei ole täiendavaid katseid vaja teha. Kui olemasoleva teabe põhjal ei saa otsustada uuritava kemikaali ärritava toime võimalikkuse üle, jätkatakse järjestikuste loomkatsete etapiti tegemist, kuni kemikaali saab üheselt klassifitseerida.
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Mitteärritava toimega kemikaal
                           – aine, mida ei klassifitseerita silma ärritavana EPA I, II või III kategooriasse; või silmi ärritavana GHSi kategooriasse 1, 2, 2A või 2B; või ELi 1. või 2. kategooriasse (17–19).
                        
                           
                              Puhvermahtuvus
                           – happeliste valmististe puhul on see naatriumhüdroksiidi kogus 100 g valmistise kohta (g), mida on vaja konkreetse pH saavutamiseks; aluseliste valmististe puhul on see naatriumhüdroksiidi kogus 100 g valmistise kohta (g), mis on ekvivalentne väävelhappe kogusega 100 g valmistise kohta (g), mida on vaja konkreetse pH saavutamiseks (Young jt, 1988).
                        
                           
                              Silma söövitava toimega kemikaal
                           – a) kemikaal, mis põhjustab silma pöördumatut koekahjustust; b) kemikaal, mis klassifitseeritakse silma ärritavana GHSi 1. kategooriasse või EPA I kategooriasse või ELi 1. kategooriasse (17–19).
                        
                           
                              Silma tugevalt ärritava toimega kemikaal
                           – a) kemikaal, mis põhjustab silma koekahjustuse, mis ei parane 21 päeva jooksul pärast kemikaali silma panekut, või põhjustab tugeva füüsilise nägemislanguse; b) kemikaal, mis klassifitseeritakse silma ärritavana GHSi 1. kategooriasse või EPA I kategooriasse või ELi 1. kategooriasse (17–19).
                        
                           
                              Silma ärritava toimega kemikaal
                           – a) kemikaal, mis põhjustab silma pöörduvat koekahjustust; b) kemikaal, mis klassifitseeritakse silma ärritavana EPA II või III kategooriasse; või GHSi kategooriasse 2, 2A või 2B; või ELi 2. kategooriasse (17–19).
                        
                           
                              Tõendite kaalukus (protsess)
                           – kogu teabe kogumise tugevate ja nõrkade külgede analüüsi kasutatakse selleks, et teha selle alusel järeldus, mida ei ole võimalik üksikandmete põhjal tõenduspõhiselt teha.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                     
                     
                        KATSEMEETODI B.5 TÄIENDMATERJAL
                         (4)
                     
                     JÄRJESTIKUSTE KATSETE TEGEMISE STRATEEGIA SILMA ÄRRITUSE JA SÖÖVITUSE UURIMISEKS
                     
                        Üldkaalutlused
                     
                     Teadusandmete õigsuse ja loomade heaolu huvides on oluline vältida loomade tarbetut kasutamist ja minimeerida selliste katsete tegemist, mis tõenäoliselt tekitavad loomadel raskeid reaktsioone. Kogu teavet kemikaali võimaliku silmi ärritava/söövitava toime kohta tuleb hinnata enne in vivo katsete tegemise kaalumist. Piisav tõendusmaterjal uuritava kemikaali klassifitseerimiseks selle võimaliku silmi ärritava või söövitava toime suhtes võib juba olemas olla, ilma et oleks vaja teha loomkatseid. Seega minimeerivad tõendite kaalukuse analüüs ja järjestikuste katsete tegemise strateegia in vivo katsetamise vajadust, eriti juhul, kui kemikaal põhjustab tõenäoliselt raskeid reaktsioone.
                     Tõendite kaalukuse analüüsi on soovitatav kasutada kemikaali silmi ärritava ja söövitava toime kohta olemas oleva teabe hindamiseks, et otsustada, kas selle toime iseloomustamiseks saaks täiendavalt teha muid kui in vivo silmauuringuid. Kui on vaja teha täiendavaid uuringuid, on soovitatav asjakohaste katseandmete saamiseks kasutada järjestikuste katsete tegemise strateegiat. Kui aine kohta ei ole katseandmeid, tuleb kasutada järjestikuste katsete strateegiat, et saada andmeid, mida on vaja silmi ärritava/söövitava toime hindamiseks. Käesolevas täiendmaterjalis kirjeldatud eelkatsete tegemise strateegia on välja töötatud OECD töörühma poolt (1). Strateegia kinnitati ja seda laiendati hiljem keemiliste ainete mõju inimeste tervisele ja keskkonnale käsitleva ohtude integreeritud ja harmoneeritud klassifitseerimise süsteemis, mis kiideti heaks kemikaalikomitee ja kemikaalitöörühma 28. ühisistungil 1998. aasta novembris (2) ja ajakohastati OECD eksperdirühma poolt 2011. aastal.
                     Kuigi see strateegia ei ole B.5 katsemeetodi lahutamatu osa, väljendab see soovitatavat lähenemisviisi silmi ärritavate/söövitavate omaduste kindlaks tegemiseks. See lähenemisviis esindab nii hea tava kui ka eetikapõhist võrdlusalust silmi ärritava/söövitava toime in vivo katsete tegemisel. Selles katsemeetodis on esitatud in vivo katse tegemise juhised ning kokkuvõte teguritest, mida tuleb käsitleda enne sellise katse kaalumist. Järjestikuste katsete tegemise strateegiaga nähakse ette tõendite kaalukusel põhinev lähenemisviis uuritava kemikaali silmi ärritavate/söövitavate omaduste hindamiseks ja astmelisel katsete tegemise strateegial põhinev lähenemisviis asjakohaste andmete saamiseks kemikaali kohta, mille suhtes on vaja teha täiendavaid uuringuid või millega ei ole veel katseid tehtud. Strateegia hõlmab kõigepealt valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo katsete tegemist ning seejärel erandlikel asjaoludel katsemeetodi B.4 uuringute tegemist (3, 4).
                     
                        Etapiviisi katsetamise strateegia kirjeldus
                     
                     Enne katsete tegemist tuleb järjestikuste katsete tegemise strateegia (joonis) osana hinnata kogu olemasolevat teavet in vivo silmakatsete vajaduse määramiseks. Kuigi üksikute parameetrite hindamisel võib saada olulist teavet (nt äärmuslik pH-väärtus), tuleb olemasolevat teavet hinnata terviklikult. Tõendite kaalukuse alusel otsustamiseks tuleb hinnata kõiki asjakohaseid andmeid uuritava kemikaali ja selle struktuurianaloogide toime kohta ja tehtud otsuse kohta tuleb esitada põhjendus. Peamine rõhuasetus tuleks teha inimeste või loomade kohta seoses kemikaaliga juba olemas olevatele andmetele ning seejärel kemikaali in vitro või ex vivo uurimise tulemustele. Kui vähegi võimalik, tuleb söövitavate kemikaalide puhul in vivo uuringuid vältida. Katsete tegemise strateegias võetakse arvesse järgmisi tegureid.
                     
                                  
                              
                              
                                 Olemasolevate inim- ja/või loomuuringutest saadud andmete ja/või valideeritud ja rahvusvaheliselt tunnustatud meetoditega tehtud in vitro katsetest saadud andmete hindamine (1. etapp).
                                 Kõigepealt tuleb arvesse võtta olemasolevaid andmeid inimese kohta, nt kliinilisi ja töötervishoiu uuringuid või ravijuhtusid, ja/või silmauuringute loomkatsete andmeid ja/või valideeritud ja rahvusvaheliselt tunnustatud meetoditega tehtud in vitro silma ärrituse/söövituse katsete andmeid, sest nendest saab teavet, mis on otseselt seotud kemikaali toimega silmadele. Seejärel tuleb hinnata andmeid, mis on saadud nahaärrituse/-söövituse inim- ja/või loomuuringutest ja/või valideeritud ja rahvusvaheliselt tunnustatud meetoditega tehtud nahasöövituse in vitro uuringutest. Teadaolevalt silmi ärritava või söövitava toimega kemikaale ning kemikaale, millel on nahka söövitav või tugevasti ärritav toime, ei tohi loomadele silma tilgutada; sellised kemikaalid tuleb lugeda ka silmi söövitavateks ja/või ärritavateks. Samuti ei tohi in vivo silmauuringuid teha kemikaalidega, mille kohta on varasematest silmauuringutest saadud piisavad tõendid, et need ei ole söövitavad ega ärritavad.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Struktuuri-aktiivsuse seose (structure activity relationship, SAR) analüüs (2. etapp).
                                 
                                 Arvesse tuleb võtta samalaadse struktuuriga kemikaalidega tehtud katsete tulemusi, kui selliseid katseid on tehtud. Kui samalaadse struktuuriga ainete või selliste ainete segude kohta on olemas piisavad inimeste ja/või loomadega saadud andmed, mis võimaldavad määrata silmi söövitava/ärritava toime, siis võib eeldada, et uuritav kemikaal põhjustab samasuguseid reaktsioone. Sellistel juhtudel võib puududa vajadus kemikaaliga katseid teha. Järjestikuste katsete tegemise strateegia puhul ei ole negatiivsed tulemused, mis on saadud samalaadse struktuuriga ainete või selliste ainete segudega tehtud katsetest, piisav tõend kemikaali ärritava/söövitava toime puudumise kohta. Kemikaali võimaliku nahka ja silmi söövitava/ärritava toime määramiseks tuleb kasutada valideeritud ja heakskiidetud struktuuri-aktiivsuse seose analüüsi.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Füüsikalis-keemilised omadused ja keemiline reaktsioonivõime (3. etapp).
                                 
                                 Kemikaalidel, millel on äärmuslik pH-väärtus, nagu ≤ 2,0 või ≥ 11,5, võib olla tugev paikne toime. Kui äärmuslik pH-väärtus on aluseks kemikaali määramisel silma söövitavaks või ärritavaks, siis võib arvesse võtta ka kemikaali puhvermahtuvust (puhverdusvõimet) (5–7). Kui puhverdusvõimest nähtub, et kemikaal ei saa olla silma söövitav (st kemikaal on äärmusliku pH-väärtuse ja väikese puhvermahtuvusega), tuleb selle kinnitamiseks teha täiendavaid katseid, kasutades eelistatult valideeritud ja heakskiidetud in vitro ja ex vivo katseid (vt punkt 10).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Muu olemasoleva teabe arvesse võtmine (4. etapp).
                                 
                                 Selles etapis tuleb hinnata kogu olemasolevat teavet süsteemse nahakaudse toksilisuse kohta. Samuti tuleb arvesse võtta uuritava kemikaali ägedat nahakaudset toksilisust. Kui on tõendatud, et uuritav kemikaal on naha kaudu kokkupuutel väga toksiline, siis võib puududa sellega silmakatsete tegemise vajadus. Kuigi ägeda nahakaudse toksilisuse ja silmade ärrituse/söövituse vahel ei ole tingimata seost, võib eeldada, et kui mõjur on kokkupuutel nahaga väga toksiline, on see väga toksiline ka silma sattumisel. Selliseid andmeid võib samuti arvesse võtta 2. ja 3. etapil.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kemikaali nahka söövitava toime hindamine, kui see on nõutav ka regulatiivsel eesmärgil (5. etapp).
                                 
                                 Nahka söövitava ja tugevalt ärritava toime võimalikkust tuleb kõigepealt hinnata kooskõlas katsemeetodiga B.4 (4) ja sellele lisatud täiendmaterjaliga (8), mis hõlmavad valideeritud ja rahvusvaheliselt heakskiidetud in vitro nahasöövituse katsemeetodite kasutamist (9–11). Kui kemikaali suhtes tehakse kindlaks, et see põhjustab nahasöövitust või tugevat nahaärritust, siis võib seda pidada ka silmi söövitavaks või tugevalt ärritavaks. Seega ei ole täiendavaid katseid vaja teha. Kui kemikaal ei ole nahka söövitav ega tugevalt ärritav, tuleb teha in vitro või ex vivo silmakatse.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    
                                       In vitro
                                    
                                    või
                                    
                                       ex vivo
                                    
                                    katsete tulemused (6. etapp).
                                 
                                 Kemikaali, millel on tuvastatud söövitavaid või tugevalt ärritavaid omadusi in vitro või ex vivo katses (12, 13), mis on spetsiaalselt valideeritud ja heakskiidetud silma ärrituse/söövituse hindamiseks, ei ole vaja katsetada loomadel. Võib eeldada, et sellistel kemikaalidel on sarnane raske toime in vivo. Kui valideeritud ja heakskiidetud in vitro / ex vivo katsed ei ole kättesaadavad, tuleks 6. etapp vahele jätta ning jätkata vahetult 7. etapiga.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    
                                       In vivo
                                    
                                    katse küülikutega (7. ja 8. etapp).
                                 
                                    In vivo silmakatseid alustatakse eelkatsega, milles kasutatakse ühte looma. Kui selle katse tulemustest nähtub, et kemikaal on silma söövitav või tugevalt ärritav, siis täiendavaid katseid ei tehta. Kui sellest katsest ei nähtu ühtki söövitavat ega tugevalt ärritavat toimet, tehakse kinnitav katse kahe lisaloomaga. Sõltuvalt kinnitava katse tulemustest võib vajalikuks osutuda täiendavate katsete tegemine. [vt katsemeetod B.5]
                              
                           
                        KATSETE TEGEMISE JA HINDAMISE STRATEEGIA SILMA ÄRRITUSE/SÖÖVITUSE JAOKS
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tegevus
                                 
                              
                              
                                 
                                    Tulemus
                                 
                              
                              
                                 
                                    Järeldus
                                 
                              
                           
                                 
                                    1
                                 
                              
                              
                                 Olemasolevad andmed inimese ja/või loomade kohta ja/või valideeritud ja rahvusvaheliselt heakskiidetud meetoditega saadud in vitro andmed, millest nähtub toime silmadele
                              
                              
                                 Raske silmakahjustus
                              
                              
                                 Lõppnäitaja; käsitatakse silmi söövitavana. Katseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 Silmi ärritav toime
                              
                              
                                 Lõppnäitaja; käsitatakse silmi ärritavana. Katseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 Silmi söövitav/ärritav toime puudub
                              
                              
                                 Lõppnäitaja; käsitatakse silmi mittesöövitava ja mitteärritavana. Katseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 Olemasolevad andmed inimese ja/või loomade kohta ja/või valideeritud ja rahvusvaheliselt heakskiidetud meetoditega saadud in vitro andmed, millest nähtub nahka söövitav toime
                              
                              
                                 Nahka söövitav toime
                              
                              
                                 Eeldatakse, et on silmi söövitav. Katseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 Olemasolevad andmed inimese ja/või loomade kohta ja/või valideeritud ja rahvusvaheliselt heakskiidetud meetoditega saadud in vitro andmed, millest nähtub nahka tugevalt ärritav toime
                              
                              
                                 Tugev nahka ärritav toime
                              
                              
                                 Eeldatakse, et on silmi ärritav. Katseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Teave puudub või olemasolev teave ei ole lõplik.
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    2
                                 
                              
                              
                                 Silma söövituse/ärrituse uurimiseks tehakse struktuuri-aktiivsuse seose analüüs (SAR).
                              
                              
                                 Prognoositav raske silmakahjustus
                              
                              
                                 Eeldatakse, et on silmi söövitav. Katseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 Prognoositav silmi ärritav toime
                              
                              
                                 Eeldatakse, et on silmi ärritav. Katseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 Võetakse arvesse nahasöövituse uurimise SARi.
                              
                              
                                 Prognoositav nahka söövitav toime
                              
                              
                                 Eeldatakse, et on silmi söövitav. Katseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Toime ei ole prognoositav või prognoos ei võimalda lõplikke järeldusi või on negatiivne.
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    3
                                 
                              
                              
                                 Mõõta pH (puhvermahtuvus, kui asjakohane)
                              
                              
                                 pH ≤ 2 või ≥ 11,5 (suure puhvermahtuvusega, kui asjakohane)
                              
                              
                                 Eeldatakse, et on silmi söövitav. Katseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    2< pH < 11,5 või pH ≤ 2,0 või ≥11,5 (puhvermahtuvus on väike või puudub, kui asjakohane)
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    4
                                 
                              
                              
                                 Arvestatakse nahakaudse süsteemse toksilisuse olemasolevaid andmeid.
                              
                              
                                 Väga toksiline kontsentratsioonides, mida kasutatakse silmakatsetes.
                              
                              
                                 Kemikaal oleks katsetamiseks liiga toksiline. Katseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Selline teave ei ole kättesaadav või ei ole kemikaal väga toksiline.
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    5
                                 
                              
                              
                                 Kui see on nõutav ka regulatiivsel eesmärgil, hinnatakse nahka söövitava toime võimalikkust käesoleva lisa peatükis B.4 esitatud katsetamisstrateegia alusel.
                              
                              
                                 Söövitus või tugev ärritusreaktsioon
                              
                              
                                 Eeldatakse, et on silmi ärritav. Lisakatseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Kemikaal ei ole nahka söövitav või tugevalt ärritav.
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    6
                                 
                              
                              
                                 Tehakse valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo silmakatsed.
                              
                              
                                 Söövitus või tugev ärritusreaktsioon
                              
                              
                                 Eeldatakse, et on silmi söövitav või tugevalt ärritav, kui tehtud katse on kasutatav söövitava / tugevalt ärritava toimega kemikaalide tuvastamiseks ja kui uuritav kemikaal on katse kohaldamise valdkonnas. Lisakatseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 Ärritusreaktsioon
                              
                              
                                 Eeldatakse, et on silmi ärritav, eeldusel et tehtud katse(d) on kasutatav(ad) söövitavate kemikaalide, tugevalt ärritava toimega ja ärritava toimega kemikaalide nõuetekohaseks tuvastamiseks ja et uuritav kemikaal on katse(te) kohaldamise valdkonnas. Lisakatseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 Ärrituseta kulgev reaktsioon
                              
                              
                                 Eeldatakse, et ei ole silmi ärritav, kui tehtud katse(d) on kasutatav(ad) ärritava toimega ja tugevalt ärritava toimega kemikaalide ning silmi söövitavate kemikaalide nõuetekohaseks tuvastamiseks ja kui uuritav kemikaal on katse(te) kohaldamise valdkonnas. Lisakatseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Valideeritud ja heakskiidetud in vitro või ex vivo silmakatset/-katseid ei saa järelduse tegemiseks kasutada.
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    7
                                 
                              
                              
                                 Eelkatse tehakse in vivo silmakatsena ühel küülikul.
                              
                              
                                 Raske silmakahjustus
                              
                              
                                 Käsitatakse silmi söövitavana. Lisakatseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Rasket kahjustust ei esine või reaktsioon puudub.
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    8
                                 
                              
                              
                                 Tehakse kinnitav katse, kasutades ühte või kahte lisalooma.
                              
                              
                                 Söövitav või ärritav
                              
                              
                                 Käsitatakse silmi söövitava või ärritavana. Lisakatseid ei ole vaja teha.
                              
                           
                                 Ei ole söövitav ega ärritav
                              
                              
                                 Käsitatakse silmi mitte ärritava ja mitte söövitavana. Lisakatseid ei ole vaja teha.
                              
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (1996), OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, Solna, Rootsi, 22.–24. jaanuar 1996, (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (1998), Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998, (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Worth, A.P. and Fentem J.H., (1999), „A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies“. ATLA 27, 161–177.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.4, „Äge nahaärritus/-söövitus“.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988), „Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals“, Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K, Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M., (1998), „The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team“. Toxicol. in vitro 12, 483–524.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Neun, D.J. (1993), „Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH“. J.Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatüki B.4 täiendmaterjal, „Järjestikuste katsete tegemise strateegia nahaärrituse ja -söövituse uurimiseks“.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.40, „Nahasöövituskatse in vitro: transkutaanse elektritakistuse (TER) mõõtmine“.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.40bis, „Nahasöövituskatse in vitro: katse inimnaha mudeliga“.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2006), „Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion“, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.47, „Veise sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse katsemeetod selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, i) mis tekitavad raskeid silmakahjustusi, ja ii) mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega“.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.48, „Isoleeritud kanasilma katsemeetod selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, i) mis tekitavad raskeid silmakahjustusi, ja ii) mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega“.“
                              
                           
               
                     3)
                  
                  
                     B osas asendatakse peatükk B.10 järgmisega:
                     „B.10.   
                           In vitro kromosoomaberratsioonkatse imetajarakkudega
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 473 (2016). See kuulub geneetilise toksikoloogia katsemeetodite seeriasse. Välja on töötatud OECD dokument, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia katsetest ning ülevaade nende katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (1).
                     
                        In vitro kromosoomaberratsioonkatse eesmärk on teha kindlaks kemikaalid, mis põhjustavad struktuurseid kromosoomaberratsioone kultiveeritud imetajarakkudes (2–4). Struktuursed aberratsioonid võivad olla kahte tüüpi: kromosoom- või kromatiidaberratsioonid. In vitro kromosoomaberratsioonkatsetes võib esineda polüploidsust (sealhulgas endoreduplikatsiooni). Kuigi aneugeenid võivad põhjustada polüploidsust, ei tõenda polüploidsus üksi aneugeenset potentsiaali ja võib lihtsalt viidata rakutsükli häirumisele või tsütotoksilisusele (5). Käesolev katse ei ole ette nähtud aneuploidsuse mõõtmiseks. Aneuploidsuse määramiseks on soovitatav kasutada mikrotuumade tekke in vitro katset (6).
                     
                        In vitro kromosoomaberratsioonkatses võib kasutada inimrakkude või näriliste rakkude püsirakuliine või primaarseid rakukultuure. Kasutatavad rakud valitakse rakukultuuris kasvamise võime, karüotüübi (sh kromosoomiarvu) stabiilsuse ja spontaansete kromosoomaberratsioonide sageduse alusel (7). Praegu olemasolevad andmed ei võimalda anda kindlaid soovitusi, kuid nende alusel võib eeldada, et keemiliste ohutegurite hindamisel on oluline võtta arvesse katseks valitud rakkude p53 staatust, geneetilist (karüotüübi) stabiilsust, DNA reparatsiooni võimet ja päritolu (näriliste või inimpäritolu rakud). Seega soovitatakse käesoleva katsemeetodi kasutajatel indutseeritud kromosoomaberratsioonide tekke määramiseks võtta arvesse neid ja – valdkonna teadmiste lisandumisel – muid rakuliini toimimist mõjutavaid rakulisi näitajaid.
                     Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.
                     LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD
                     
                        In vitro katsete puhul tuleb üldjuhul kasutada eksogeenset metaboolse aktivatsiooni allikat, välja arvatud juhul, kui rakud metaboliseerivad uuritavaid kemikaale. Eksogeenne metaboolse aktivatsiooni süsteem ei ole täielikult samastatav in vivo tingimustega. Hoolikalt tuleb vältida tingimusi, mis võivad põhjustada valepositiivseid tulemusi, st neid kromosoomikahjustusi, mida ei põhjusta uuritavate kemikaalide ja kromosoomide vaheline vahetu interaktsioon; sellised tingimused hõlmavad pH või osmolaalsuse muutusi (8–10), söötme koostisosadega reageerimist (11, 12) või liiga suurt tsütotoksilisust (13–16).
                     Käesolevat katsemeetodit kasutatakse selliste kromosoomaberratsioonide määramiseks, mida võivad põhjustada klastogeensed protsessid. Kromosoomaberratsioonide teket tuleb analüüsida metafaasi rakkudes. Seega on oluline, et nii kemikaaliga töödeldud kui ka töötlemata rakkude puhul oleksid rakud jõudnud mitoosi. Käesoleva katsemeetodi kohandamiseks tehislike nanomaterjalide uurimiseks võib vaja minna erimeetmeid, kuid neid ei ole käesolevas katsemeetodis kirjeldatud.
                     Enne kui kasutada seda meetodit segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi jaoks, tuleb kaaluda, kas see katse annab selle eesmärgi jaoks piisavaid tulemusi ja kui annab, siis miks. Sellist kaalumist ei ole vaja, kui regulatiivne nõue eeldabki segu katsetamist.
                     KATSE PÕHIMÕTE
                     Inimrakkude või muud päritolu imetajarakkude kultuurid lastakse uuritava kemikaaliga kokku puutuda nii metaboolse aktivatsiooni eksogeense allika juuresolekul kui ka ilma selleta, välja arvatud juhul, kui kasutatakse piisava metaboliseerimisvõimega rakke (vt punkt 13). Asjakohaste ettenähtud ajavahemike järel pärast rakkude kokkupuudet uuritava kemikaaliga töödeldakse neid rakutsüklit metafaasis peatava kemikaaliga (nt koltsemiid või kolhitsiin), rakud kogutakse, värvitakse ning metafaasis rakke analüüsitakse mikroskoopiliselt kromatiid- või kromosoomaberratsioonide esinemise suhtes.
                     MEETODI KIRJELDUS
                     
                        Ettevalmistus
                     
                     
                        Rakud
                     
                     On võimalik kasutada mitmeid rakuliine (nt hiina hamstri munasarjarakuliin (CHO), hiina hamstri kopsurakuliin V79, hiina hamstri kopsurakuliin (CHL/IU), rakuliin TK6) või primaarkultuuri, sh inimese või teiste imetajate perifeerse vere lümfotsüüte (7). Rakuliinide valikut tuleb teaduslikult põhjendada. Kui kasutatakse primaarseid rakke, tuleb loomade heaolu huvides kaaluda inimpäritolu rakukultuuride kasutamist kõigil juhtudel, kui rakkude kättesaadavus on probleemitu ja proovivõtt on kooskõlas inimuuringute eetika põhimõtete ja nõuetega. Inimese perifeerse vere lümfotsüüte tuleks võtta noortelt (umbes 18–35aastastelt) mittesuitsetavatelt isikutelt, kellel ei ole teadaolevaid haigusi ning kes ei ole hiljuti kokku puutunud genotoksiliste teguritega (nt kemikaalid, ioniseeriv kiirgus) koguses, mis võiks suurendada kromosoomaberratsioonide esinemist katse foonis. See tagaks, et kromosoomaberratsioonide esinemissagedus foonis on väike ja püsiv. Kromosoomaberratsioonide esinemissageduse lähtetase suureneb vanusega ja see trend on rohkem väljendunud naistel kui meestel (17, 18). Kui eri doonoritelt kogutud rakud ühendatakse üheks prooviks, tuleb esitada doonorite arv. On vaja tõendada, et rakud on pärast uuritava kemikaaliga töötlemise alustamist kuni proovi võtmiseni jagunenud. Rakukultuure hoitakse eksponentsiaalse kasvu faasis (rakuliinid) või stimuleeritakse rakkude jagunemist (lümfotsüütide primaarkultuurid), et saada rakke rakutsükli eri faasidest, sest eri faasides olevate rakkude tundlikkus uuritava kemikaali suhtes võib olla teadmata. Primaarsed rakud, mida tuleb jagunemiseks stimuleerida mitogeenidega, ei ole uuritava kemikaaliga kokkupuute ajal tavaliselt enam sünkroniseeritud (nt inimese lümfotsüüdid pärast 48tunnist stimulatsiooni mitogeeniga). Kemikaaliga töötluse ajal ei soovitata sünkroniseeritud rakkude kasutamist, kuid see võib olla aktsepteeritav, kui see on põhjendatud.
                     
                        Söötmed ja kultiveerimistingimused
                     
                     Rakukultuuride jaoks tuleb kasutada asjakohast söödet ja asjakohaseid inkubeerimistingimusi (kasvunõud, sobiva õhuniiskuse juures 5 % CO2 atmosfääris (kui asjakohane), inkubeerimistemperatuur 37 °C). Rakuliine tuleb tavapraktika korras kontrollida modaalse kromosoomiarvu stabiilsuse ning mükoplasmaga saastumise puudumise suhtes (7, 19); saastunud rakke või rakke, mille modaalne kromosoomiarv on muutunud, ei kasutata. Katselaboris kasutatavate rakuliinide ja primaarkultuuride puhul tuleb teha kindlaks normaalne rakutsükliks kuluv aeg ja see peab vastama rakkude kohta avaldatud iseloomulikele näitajatele (20).
                     
                        Rakukultuuride ettevalmistamine
                     
                     Rakuliinid: rakke kasvatatakse tüvikultuurist, külvates neid söötmesse sellise tihedusega, et rakud jätkaksid nii suspensioonis kui ka monokihina eksponentsiaalset kasvamist kuni nende kogumiseni (nt monokihina kasvavate rakkude puhul tuleb konfluentsust vältida).
                     Lümfotsüüdid: antikoagulandiga (nt hepariin) töödeldud täisverest eraldatud lümfotsüüte kasvatatakse (nt 48 tundi inimese lümfotsüütide puhul) mitogeeni juuresolekul (nt fütohemaglutiniin (PHA) inimese lümfotsüütide puhul)), et indutseerida rakkude jagunemist enne nende töötlemist uuritava kemikaaliga.
                     
                        Metaboolne aktivatsioon
                     
                     Eksogeenseid metaboliseerivaid süsteeme tuleb kasutada juhul, kui kasutatavate rakkude endogeenne metaboliseerimisvõime on ebapiisav. Kui ei ole teisiti põhjendatud, soovitatakse vaikevalikuna kõige sagedamini kasutatavat süsteemi, milleks on näriliste (tavaliselt roti) maksast valmistatud postmitokondriline fraktsioon S9, millele on lisatud kofaktor ning mida on töödeldud ensüümide induktoritega, nagu Aroclor 1254 (21–23) või fenobarbitaali ja β-naftoflavooni kombinatsiooniga (24–29). Viimane ei ole vastuolus püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsiooniga (Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants) (30) ning on mitme funktsiooniga oksüdaaside induktorina osutunud sama tõhusaks kui Aroclor 1254 (24–28). S9-fraktsiooni kasutatakse tavaliselt kontsentratsioonivahemikus 1–2 % (mahuprotsent), kuid kontsentratsiooni võib suurendada 10 %-ni (mahuprotsent) katse lõplikus söötmes. Tooteid, mis vähendavad mitoosiindeksit, eriti kaltsiumiga komplekse moodustavaid tooteid (31) tuleb vältida töötlemise ajal. Uuritavate kemikaalide klass võib mõjutada kasutatava eksogeense metaboolse aktivatsiooni süsteemi või ensüümi induktori tüübi ja kontsentratsiooni valikut.
                     
                        Uuritava kemikaali preparaadi valmistamine
                     
                     Enne rakkude töötlemist tuleb tahke uuritav kemikaal lahustada sobivas lahustis ja vajaduse korral lahjendada (vt punkt 23). Uuritavat kemikaali, mis on vedelik, võib lisada katsesüsteemile vahetult ja/või lahjendada enne katsesüsteemile lisamist. Gaasi või lenduva kemikaali kasutamiseks katsetes tuleb katse-eeskirja asjakohaselt muuta, näiteks teha kemikaaliga töötlemine suletud anumas (32–34). Uuritava kemikaali preparaadid tuleb valmistada vahetult enne kasutamist, välja arvatud juhul, kui nende stabiilsuse andmetest nähtub, et neid võib säilitada.
                     
                        Katsetingimused
                     
                     
                        Lahustid
                     
                     Lahusti tuleb valida nii, et uuritavate kemikaalide lahustuvust saaks parandada, ilma et see moonutaks katse käiku (nt muudaks rakkude kasvukiirust, muudaks uuritavat kemikaali, reageeriks rakkude kasvunõuga, kahjustaks metaboolse aktivatsiooni süsteemi). Kui see on vähegi võimalik, on esimese võimalusena soovitatav kaaluda vesilahustuva lahusti (või söötme) kasutamist. Tavalised lahustid on näiteks vesi või dimetüülsulfoksiid. Üldjuhul ei tohiks töötlusetapis kasutatavas lõppsöötmes orgaanilise lahusti sisaldus ületada 1 % (mahuprotsent) ja vesilahustuva lahusti (füsioloogiline lahus või vesi) sisaldus ei tohiks ületada 10 % (mahuprotsent). Kui kasutatakse muid kui tavaliselt kasutatavaid lahusteid (nt etanooli või atsetooni), tuleb esitada andmed, millest nähtuks nende kokkusobivus uuritava kemikaali ja katsesüsteemiga ning genotoksilise toime puudumine kasutatud kontsentratsioonis. Nende tugiandmete puudumisel on oluline lisada lahustiga töötlemata kontrollid (vt 1. liide), et tõendada valitud lahustil kahjuliku või klastogeense toime puudumist.
                     
                        Rakkude paljunemise ja tsütotoksilisuse mõõtmine ning uuritava kemikaali kontsentratsioonide valimine
                     
                     Uuritava kemikaali suurimat kontsentratsiooni määrates tuleb vältida kontsentratsioone, mis võivad põhjustada valepositiivseid tulemusi, nagu kontsentratsioonid, millel avaldub liiga suur tsütotoksilisus (vt punkt 22), söötmes sadestumine (vt punkt 23) või oluline pH või osmolaalsuse muutus (vt punkt 5). Kui kemikaal muudab lisamise hetkel oluliselt söötme pH-d, võib pH-d reguleerida töötlusetapis kasutatavat lõppsöödet puhverdades, et vältida valepositiivseid tulemusi ja säilitada asjakohased rakkude kasvutingimused.
                     Mõõdetakse rakkude paljunemist, et veenduda selles, et piisav arv töödeldud rakke on katse ajal jõudnud mitoosi ja et töötlused tehakse asjakohasel tsütotoksilisuse tasemel (vt punktid 18 ja 22). Tsütotoksilisust tuleb põhikatses määrata nii metaboolse aktivatsiooni süsteemi juuresolekul kui ka ilma selleta, kasutades asjakohaseid meetodeid raku surma ja kasvu tuvastamiseks. Kuigi tsütotoksilisuse hindamine eelkatses võib osutuda kasulikuks, et paremini määrata põhikatses kasutatavad kontsentratsioonid, ei ole eelkatse tegemine kohustuslik. Kui tsütotoksilisust hinnatakse eelkatses, ei asenda need tulemused tsütotoksilisuse mõõtmist põhikatses.
                     Asjakohased meetodid tsütotoksilisuse hindamiseks tsütogeneetilistes katsetes on rakupopulatsiooni suhteline kahekordistumine (relative population doubling, RPD) või rakkude arvu suhteline suurenemine (relative increase in cell count, RICC) (13, 15, 35, 36, 55) (vt arvutusvalemid, 2. liide). Pikaajalise töötluse korral ja juhul, kui proovide võtmise aeg pärast kemikaaliga töötlemise algust ületab 1,5 korda rakutsükli kestust (st on pikem kui 3 rakutsüklit kokku), võib RPD kaudu tsütotoksilisust alahinnata (37). Neil tingimustel võib RICC olla parem mõõtmisvahend; RPD abil saaks tsütotoksilisuse kasuliku hinnang pärast 1,5 normaalse rakutsükli pikkusele vastava aja möödumist.
                     Lümfotsüütide primaarkultuuri puhul on tsütotoksilise/tsütostaatilise toime mõõduks mitoosiindeks (MI), kuigi seda mõjutavad kemikaaliga töötluse järel möödunud aeg, kasutatud mitogeen ja rakutsükli võimalik katkestus. Mitoosiindeks on sellele vaatamata aktsepteeritav, sest muud tsütotoksilisuse mõõtmised võivad osutuda töömahukateks ja ebapraktiliseks ning neid ei saa kohaldada PHA-stimulatsiooni tagajärjel kasvavale lümfotsüütide populatsioonile.
                     Kuigi rakuliinide puhul on RICC ning RPD ja primaarse rakukultuuri puhul mitoosiindeks soovitatavad tsütotoksilisuse näitajad, võib kasulikku lisateavet saada ka muude näitajate (nt rakkude terviklikkus, apoptoos, nekroos, rakutsükkel) põhjal.
                     Lahusti kontrolli ja positiivset kontrolli kaasa arvamata tuleb hinnata vähemalt kolme katsekontsentratsiooni, mis vastavad nõuetekohasuse kriteeriumidele (asjakohane tsütotoksilisus, rakkude arv jne). Sõltumata rakuliigist (rakuliinid või lümfotsüütide primaarkultuur) võib iga kontsentratsiooniga töödelda kas paralleelselt mitut või ainult ühte rakukultuuri. Kuigi soovitatav on kasutada paralleelkultuure, võib ka üksikkultuuride kasutamist aktsepteerida eeldusel, et nii ühe kui ka paralleelkultuuride puhul hinnatakse kokku ühesugune arv rakke. Üksikkultuuride kasutamine on eriti asjakohane, kui hinnatakse rohkem kui 3 kontsentratsiooni (vt punkt 31). Konkreetse kontsentratsiooniga sõltumatutest paralleelkultuuridest saadud tulemused võib andmeanalüüsiks kokku arvestada (38). Uuritavate kemikaalide puhul, mille tsütotoksilisus on väike või millel see puudub, on tavaliselt sobivad kahe- kuni kolmekordsed kontsentratsiooniintervallid. Tsütotoksilisuse avaldumise korral peavad katseks valitud kontsentratsioonid katma vahemiku alates kontsentratsioonist, millel avaldub tsütotoksilisus (nagu on kirjeldatud punktis 22), ja hõlmama kontsentratsioonid, millel esineb mõõdukas ja väike (või olematu) tsütotoksilisus. Paljudel uuritavatel kemikaalidel on kontsentratsiooni-toime sõltuvuse kõver järsu tõusuga ja selleks, et saada andmeid vähese või mõõduka tsütotoksilisuse kohta või et uurida doosi-toime seost üksikasjalikult, tuleb kasutada väiksema intervalliga kontsentratsioone ja/või enam kui kolme kontsentratsiooni (üks kultuur või mitu paralleelkultuuri), eriti olukorras, kui vajatakse korduskatset (vt punkt 47).
                     Kui maksimumkontsentratsioon põhineb tsütotoksilisusel, on suurima kontsentratsiooni puhul eesmärk saavutada 55 ± 5 % tsütotoksilisust, soovitatavate tsütotoksilisuse näitajate (st RICC ja RPD vähenemine rakuliinide puhul ning mitoosiindeksi vähenemine lümfotsüütide primaarkultuurides kuni 45 ± 5 % võrreldes samaaegse negatiivse kontrolliga) põhjal. Hoolikas tuleb olla nende positiivsete tulemuste tõlgendamisel, mis esinevad ainult selle 55 ± 5 % tsütotoksilisuse vahemiku ülemises osas (13).
                     Halvasti lahustuva uuritava kemikaali puhul, mis ei ole tsütotoksiline kontsentratsioonidel, mis on väiksemad kui kõige väiksem kontsentratsioon, millel kemikaal ei lahustu, peab suurim analüüsitav kontsentratsioon kemikaaliga töötluse lõpus alati tekitama hägususe või silma või invertmikroskoobiga nähtava sademe. Isegi kui tsütotoksilisus avaldub suuremal kontsentratsioonil kui vähim kontsentratsioon, millel kemikaal ei lahustu, on soovitatav teha katse ainult ühe sellise kontsentratsiooniga, millel tekib hägusus või nähtav sade, sest sade võib toimet moonutada. Sademe moodustumise kontsentratsioonil tuleb hoolikalt veenduda, et sade ei mõjuta katse tegemist (nt värvimist või hindamist). Kasulikuks võib osutuda kemikaali lahustuvuse määramine söötmes enne katsega alustamist.
                     Kui ei sadet ega piiravat tsütotoksilisust ei täheldata, peab suurim kontsentratsioon katses vastama vähimale kontsentratsioonile järgmistest: 10 mM, 2 mg/ml või 2 μl/ml (39-41). Kui uuritava kemikaali koostis ei ole määratav, nt tundmatu või muutuva koostisega aine, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogiline materjal (UVCB) (42), keskkonnast saadud ekstrakt vms, võib iga koostisosa kontsentratsiooni suurendamiseks olla vajalik kasutada suuremat maksimaalset kontsentratsiooni (nt 5 mg/ml), kui sellega ei kaasne olulist tsütotoksilisust. Tuleb siiski märkida, et inimravimite suhtes võivad need nõuded olla teistsugused (43).
                     
                        Kontrollid
                     
                     Iga kogumise kohta tuleb ette näha ka samaaegsed negatiivsed kontrollid (vt punkt 15), milles kemikaaliga töötluseks kasutatavale söötmele lisatakse vaid lahusti ja mille rakke käideldakse muus osas samamoodi kui uuritava kemikaaliga töödeldud kultuure.
                     Samaaegseid positiivseid kontrolle on vaja, et tõendada labori pädevust kasutatud katsemetoodika tingimustel tuvastada klastogeene ning (vajaduse korral) eksogeense metaboolse aktivatsiooni süsteemi tõhusust. Positiivsete kontrollide näited on esitatud allpool tabelis 1. Kui see on põhjendatud, võib kasutada alternatiivseid positiivse kontrolli kemikaale. Kuna in vitro genotoksilisuse katsed imetajarakkudega on piisavalt standarditud, võib positiivsete kontrollide osas piirduda metaboolset aktivatsiooni vajava klastogeeni kasutamisega. Eeldusel, et kontroll tehakse samaaegselt aktiveerimata katsega, kasutades töötluseks sama kestust, nähtub sellest ainsast reaktsioonist positiivsele kontrollile nii metaboolse aktivatsiooni süsteemi aktiivsus kui ka katsesüsteemi tundlikkus. Pikaajalise töötluse jaoks (ilma S9-fraktsioonita) peab siiski olema oma positiivne kontroll, sest töötluse kestus erineb sellest, mida kasutatakse metaboolse aktivatsiooniga katses. Iga positiivse kontrolli kemikaali tuleb kasutada ühel või enamal kontsentratsioonil, mis eelduse kohaselt põhjustab fooniga võrreldes korratava ja määratava suurenemise, et näidata katsesüsteemi tundlikkust (st toime on selge, kuid ei paljasta hindajale kohe, millise proovi või kontrolliga on kodeeritud kromosoomipreparaatide puhul tegemist), ning vastusreaktsiooni ei tohi moonutada tsütotoksilisus, mis ületab selles katsemeetodis ettenähtud piire.
                     
                        Tabel 1.
                     
                     
                        Labori pädevuse hindamiseks ja positiivsete kontrollide valikuks soovitatavad võrdluskemikaalid
                     
                     
                                 Kategooria
                              
                              
                                 Kemikaal
                              
                              
                                 CASi nr
                              
                           1.   Metaboolse aktivatsioonita toimivad klastogeenid
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Metüülmetaansulfonaat
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Mitomütsiin C
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 4-nitrokinoliin-N-oksiid
                              
                              
                                 56-57-5
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Tsütosiinarabinosiid
                              
                              
                                 147-94-4
                              
                           2.   Metaboolset aktivatsiooni vajavad klastogeenid
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Benso[a]püreen
                              
                              
                                 50-32-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Tsüklofosfamiid
                              
                              
                                 50-18-0
                              
                           KATSE KÄIK
                     
                        Uuritava kemikaaliga töötlemine
                     
                     Paljunevaid rakke töödeldakse uuritava kemikaaliga nii metaboolse aktivatsiooni süsteemi juuresolekul kui ka ilma selleta.
                     
                        Rakkude kogumise aeg
                     
                     Negatiivse tulemuse kohta järelduse tegemiseks võib vaja minna põhjalikku hindamist, milleks tuleb katsed läbi viia, kasutades kõiki kolme eri katsetingimustega olukorda: lühiajaline töötlemine kemikaaliga koos metaboolse aktivatsiooniga ja ilma selleta ning pikaajaline töötlemine kemikaaliga ilma metaboolse aktivatsioonita (vt punktid 43–45).
                     
                                 —
                              
                              
                                 Rakud tuleb 3–6 tunniks viia kokkupuutesse uuritava kemikaaliga ilma metaboolse aktivatsioonita ja koguda need prooviks ajapunktis, mis vastab umbes 1,5 normaalsele rakutsükli kestusele töötlemise algusest arvates (18).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Rakud tuleb 3–6 tunniks viia kokkupuutesse uuritava kemikaaliga metaboolse aktivatsiooni tingimustes ja koguda need prooviks ajapunktis, mis vastab umbes 1,5 normaalsele rakutsükli kestusele töötlemise algusest arvates (18).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Rakud tuleb viia kemikaaliga pidevasse kokkupuutesse ilma metaboolse aktivatsioonita kuni proovi kogumise ajani, mis vastab umbes 1,5 normaalsele rakutsükli kestusele. Teatavate kemikaalide (nt nukleosiidi analoogid) toimet võib olla lihtsam määrata, kui töötlus/proovivõtuaeg on pikem kui 1,5 normaalset rakutsükli kestust (24).
                              
                           Juhul kui üks eespool esitatud katsetingimustest andis positiivse tulemuse, võib muude katsetingimuste kasutamine osutuda ebavajalikuks.
                     
                        Kromosoomipreparaatide valmistamine
                     
                     Rakukultuure töödeldakse koltsemiidi või kolhitsiiniga tavaliselt 1–3 tunni jooksul enne kogumist. Iga rakukultuur kogutakse ja töödeldakse kromosoomipreparaatide tegemiseks eraldi. Kromosoomipreparaatide valmistamiseks töödeldakse rakud hüpotoonilise lahusega, fikseeritakse ja värvitakse. Monokihtides võib 3–6 tundi kestnud töötlemise lõpus olla mitootilisi rakke (tuvastatavad selle järgi, et on ümmargused ja irduvad kasvunõu pinnalt). Kuna mitootilised rakud irduvad kergesti, võib neid uuritavat kemikaali sisaldava söötme eemaldamisel kaotsi minna. Kui on tõendeid, et mitootiliste rakkude arv on kontrolliga võrreldes oluliselt suurem, mis viitab rakutsükli tõenäolisele peatumisele mitoosifaasis, tuleb rakud koguda tsentrifuugimisega ja külvata tagasi rakukultuuri, et vältida kogumise ajal kromosoomaberratsiooni tekke riskiga mitoosis olevate rakkude kaotamist.
                     
                        Analüüs
                     
                     Kõik mikroskoobipreparaadid, sealhulgas need, millel on positiivsed ja negatiivsed kontrollid, tuleb sõltumatult kodeerida enne kromosoomaberratsioonide esinemise mikroskoopilist analüüsi. Fikseerimine põhjustab sageli osal metafaasis rakkudest kromosoomide kadu, seetõttu tuleb hinnata vaid rakke, milles olevate tsentromeeride arv vastab modaalsele kromosoomiarvule ± 2.
                     Iga kontsentratsiooni ja kontrolli kohta tuleb hinnata vähemalt 300 hästi eristuvat metafaasi, et käsitada uuritavat kemikaali selgelt negatiivsena (vt punkt 45). Kui kasutatakse paralleelkultuure, peavad 300 rakku olema paralleelide vahel võrdselt jagatud. Kui kontsentratsiooni kohta kasutatakse üht rakukultuuri (vt punkt 21), tuleb selles ühes kultuuris loendada vähemalt 300 hästi eristuvat metafaasi. 300 raku loendamise eelis on, et see lisab katsele statistilist võimsust ja lisaks on tulemuseks harva nullväärtus (eeldatavasti vaid 5 %) (44). Hinnatavate metafaaside arvu vähendatakse, kui tuvastatakse suur arv kromosoomaberratsioonidega rakke ja uuritavat kemikaali käsitatakse selgelt positiivsena.
                     Tuleb hinnata struktuursete kromosoomaberratsioonidega, sh tühikutega ja ilma, rakke. Kromosoomikatked ja tühikud määratletakse 1. liites kooskõlas kirjandusviidetega (45, 46). Kromatiid- ja kromosoomaberratsioonid tuleb eraldi dokumenteerida ja klassifitseerida alatüüpide alusel (katked, vahetused). Labori eeskirjadega peab olema tagatud, et kromosoomaberratsioonianalüüsi teevad selleks koolitatud hindajad ning vajaduse korral kasutatakse vastastikust hindamist.
                     Kuigi katse eesmärk on tuvastada struktuursed kromosoomaberratsioonid, on tähtis registreerida ka polüploidsuse ja endoreduplikatsiooni sagedus juhul, kui neid täheldatakse. (Vt punkt 2.)
                     
                        Labori pädevus
                     
                     Katsemeetodiga piisava kogemuse saamiseks enne selle rutiinset kasutamist peab labor olema teinud katsesarju positiivse kontrolli kemikaalidega, mis toimivad teistsuguste mehhanismide kaudu, ja mitmesuguste negatiivse kontrolli kemikaalidega (kasutades erinevaid lahusteid/vehiikuleid). Nende positiivse ja negatiivse kontrolli kemikaalidega saadud reaktsioonid peavad olema kooskõlas teaduskirjanduse andmetega. Seda nõuet ei kohaldata asjakohase kogemusega laborite puhul, kui on olemas varasemate katsete põhine andmebaas, nagu on määratletud punktis 37.
                     Positiivseks kontrolliks valitud kemikaale (vt tabel 1, punkt 26) tuleb uurida lühi- ja pikaajalise töötlusega ilma metaboolse aktivatsioonita ning ka lühiajalise töötlusega metaboolse aktivatsiooni juuresolekul, et tõendada klastogeensete kemikaalide tuvastamiseks ja metaboolse aktivatsiooni süsteemi tõhususe määramiseks vajalikku pädevust. Valitud kemikaalide puhul tuleb katsesüsteemi tundlikkuse ja dünaamilise vahemiku tõendamiseks valida kontsentratsioonivahemikud nii, et oleks võimalik saada foonist suuremaid ning korratavaid ja kontsentratsioonist sõltuvaid väärtusi.
                     
                        Varasemad kontrolli andmed
                     
                     Labor peab määrama:
                     
                                 —
                              
                              
                                 varasemate katsete alusel positiivse kontrolli tulemuste vahemiku ja jaotuse,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 varasemate katsete alusel negatiivse kontrolli (töötlemata proov, lahusti) tulemuste vahemiku ja jaotuse.
                              
                           Kui esmakordselt hangitakse andmeid varasemate negatiivse kontrolli tulemuste jaotuse määramiseks, peavad paralleelsed negatiivse kontrolli andmed olema kooskõlas kontrolli kohta avaldatud andmetega (kui need on olemas). Kui kontrolli väärtuste jaotusele lisatakse uusi katseandmeid, peaksid negatiivse kontrolli paralleelid ideaaljuhul olema selle jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 % (44, 47). Labori varasemate negatiivsete kontrollide andmebaasi koostamisel tuleb alguses kasutada vähemalt 10 katse andmeid, kuid eelistatavalt peaks andmebaas sisaldama vähemalt 20 võrreldavatel tingimustel tehtud katse andmeid. Laboritel tuleb kasutada kvaliteedikontrolli meetodeid, selliseid nagu kontrollkaardid (nt vastavuse kontrollkaardid või X-tüüpi kontrollkaardid (48)), et määrata, kui suures ulatuses positiivse ja negatiivse kontrolli andmed varieeruvad, ja tõendada, et metoodika on laboris „kontrolli all“ (44). Täiendavaid soovitusi selle kohta, kuidas koguda ja kasutada varasemate katsete andmeid (st tulemuste varasemate andmete andmebaasi võtmise või sellest väljajätmise kriteeriumid ja konkreetse katse nõuetekohasuse kriteeriumid), võib leida kirjandusest (47).
                     Katse-eeskirja muudatuste puhul tuleb arvestada, kas need mõjutavad andmete vastavust neile andmetele, mis on labori varem tehtud kontrollide andmebaasis olemas. Oluliste mittevastavuste korral tuleb koostada uus varasemate kontrolli andmete andmebaas.
                     Negatiivse kontrolli andmed peaksid hõlmama kromosoomaberratsioonidega rakkude esinemust ühes rakukultuuris või nende summat paralleelkultuuridest, nagu on kirjeldatud punktis 21. Negatiivse kontrolli paralleelide tulemused peaksid ideaaljuhul olema labori varasemate kontrolli andmete jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 % (44, 47). Kui negatiivse kontrolli paralleelide tulemused jäävad väljapoole usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %, võivad need olla varasemate kontrolli andmete jaotuses arvessevõtmiseks vastuvõetavad juhul, kui tegemist ei ole äärmusliku võõrväärtusega ning on tõendatud, et katsesüsteem on „kontrolli all“ (vt punkt 37) ja ei ole tõendeid, et tegemist on tehnilise vea või inimliku eksitusega.
                     ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                     
                        TULEMUSTE ESITAMINE
                     
                     Struktuurse(te) kromosoomaberratsiooni(de)ga rakkude osakaalu hinnatakse protsentides. Alatüüpideks klassifitseeritud kromatiid- ja kromosoomaberratsioonid (murrud, vahetused) loetletakse eraldi, esitades nende arvu ja sageduse uuritava kemikaali ja kontrolli kultuuride puhul. Tühikud registreeritakse ja nende andmed esitatakse eraldi, kuid neid ei võeta arvesse aberratsioonide üldsageduses. Polüploidsete ja/või endoreduplikatsiooniga rakkude (kui neid täheldatakse) osakaal esitatakse protsentides.
                     Aberratsiooni põhikatses/-katsetes tuleb registreerida kõikide uuritava kemikaaliga töödeldud, negatiivse ja positiivse kontrolli kultuuride tsütotoksilisuse paralleelmõõtmiste tulemused.
                     Andmed tuleb esitada iga kultuuri kohta eraldi. Lisaks tuleb tabelina esitada kõikide andmete kokkuvõte.
                     
                        Katse nõuetekohasuse kriteeriumid
                     
                     Katse nõuetekohasus põhineb järgmistel kriteeriumidel:
                     
                                 —
                              
                              
                                 paralleelse negatiivse kontrolli tulemused on vastuvõetavad, et lisada need labori varasemate negatiivse kontrolli tulemuste andmebaasi, nagu on kirjeldatud punktis 39;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 paralleelsed positiivsed kontrollid (vt punkt 26) peavad tekitama reaktsioone, mis on võrreldavad nendega, mis on olemas varasemate positiivse kontrolli tulemuste andmebaasis, ning põhjustama statistiliselt olulist suurenemist, võrreldes paralleelse negatiivse kontrolliga;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 lahustiga kontrollis peab olema täidetud rakkude paljunemise kriteerium (punktid 17 ja 18);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 katsed on tehtud kõigis kolme olukorra katsetingimustes, välja arvatud juhul, kui ühes neist on saadud positiivsed tulemused (vt punkt 28);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 rakkude arv on piisav ja kontsentratsioonid on analüüsitavad (punktid 31 ja 21);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 suurima kontsentratsiooni valimise kriteeriumid on kooskõlas kriteeriumidega, mis on kirjeldatud punktides 22–24.
                              
                           
                        Tulemuste hindamine ja tõlgendamine
                     
                     Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritavat kemikaali selgelt positiivsena, kui mis tahes uuritud katsetingimustes (vt punkt 28):
                     
                                 a)
                              
                              
                                 vähemalt ühel uuritud kontsentratsioonil esineb statistiliselt oluline suurenemine paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 asjakohase trenditestiga hinnates nähtub, et see suurenemine sõltub annusest;
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 ükski nendest tulemustest ei ole väljaspool labori varasemate negatiivse kontrolli tulemuste jaotust (nt väljaspool Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %; vt punkt 39).
                              
                           Kui kõik need kriteeriumid on täidetud, järeldatakse, et kemikaal põhjustab selles katsesüsteemis kromosoomaberratsioone kultiveeritud imetajarakkudes. Soovitusi kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta leiab kirjandusest (49–51).
                     Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritavat kemikaali selgelt negatiivsena, kui kõikides uuritud katsetingimustes (vt punkt 28):
                     
                                 a)
                              
                              
                                 mitte ühelgi uuritaval kontsentratsioonil ei esine statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 asjakohase trenditesti meetodiga hinnates ei esine annusest sõltuvat suurenemist;
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 kõik need tulemused on labori varasemate negatiivse kontrolli tulemuste jaotuse vahemikus (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 %; vt punkt 39).
                              
                           Sel juhul järeldatakse, et kemikaal ei saa selles katsesüsteemis põhjustada kromosoomaberratsioone kultiveeritud imetajarakkudes.
                     Selget positiivset või selget negatiivset reaktsiooni ei ole vaja kinnitada.
                     Juhul, kui reaktsioon ei ole selgelt negatiivne ega selgelt positiivne, nagu eespool kirjeldatud, või selleks, et teha kindlaks tulemuse bioloogiline olulisus, hinnatakse andmeid eksperdihinnangu ja/või täiendavate uuringute abil. Kasulikuks võib osutuda lisarakkude hindamine (kui see on asjakohane) või korduskatse tegemine, võimaluse korral muudetud tingimustes (nt kontsentratsioonivahemik, teistsugused metaboolse aktivatsiooni tingimused (nt S9-fraktsiooni kontsentratsioon või S9 päritolu).
                     Harvadel juhtudel võivad andmed isegi pärast täiendavaid uuringuid olla positiivse või negatiivse tulemuse suhtes järelduse tegemist välistavad ning seetõttu järeldatakse, et uuritava kemikaali toime on ebaselge.
                     Polüploidsete rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et uuritav kemikaal võib inhibeerida mitoosi protsesse ja põhjustada kromosoomide arvu muutusi (52). Endoreduplitseeritud kromosoomidega rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et uuritav kemikaal võib inhibeerida rakutsükli edenemist (53, 54) (vt punkt 2). Seepärast tuleb polüploidsed rakud ja endoreduplitseeritud kromosoomidega rakud eraldi registreerida.
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet.
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritav kemikaal:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             allikas, partii number, aegumise kuupäev, kui olemas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali stabiilsus, kui teada.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali lahustuvus ja stabiilsus lahustis, kui teada;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             lisatud uuritava kemikaaliga rakusöötme pH mõõtmine, söötme osmolaalsus ja sademe teke selles.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ühe koostisosaga aine:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             välimus, lahustuvus vees ja täiendavad asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             keemilised identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus ja CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, lisandite keemilised nimetused vastavalt vajadusele ja praktilisele teostatavusele jne.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid ja segud:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             iseloomustatakse nii palju kui võimalik, lähtudes koostisosade keemilistest identifitseerimisandmetest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Lahusti:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             lahusti valiku põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             samuti tuleb esitada lahusti protsendiline sisaldus lõppsöötmes.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rakud:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             rakkude tüüp ja päritolu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             karüotüübi omadused ja kasutatava rakutüübi sobivus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakuliinide puhul: mükoplasma puudumine;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakuliinide puhul: teave rakutsükli kestuse, rakupopulatsiooni kahekordistumise aja või proliferatsiooniindeksi kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             veredoonorite sugu, vanus ja muu asjakohane teave doonori, täisvere või eraldatud lümfotsüütide kohta, kasutatud mitogeen;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakuliinide puhul: passaažide arv, kui see on kättesaadav;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakuliinide puhul: rakukultuuride säilitamise meetodid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakuliinide puhul: modaalne kromosoomiarv.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsetingimused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             metafaasi peatava kemikaali nimetus, kontsentratsioon ja rakkudega kokkupuute kestus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali kontsentratsioon, väljendatuna lõppkontsentratsioonina söötmes (nt μg või mg/ml või mM söötmes);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kontsentratsioonide ja rakukultuuride arvu valimise põhjendus, sealhulgas nt tsütotoksilisuse andmed ja lahustuvuse piirangud;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             söötme koostis; CO2 kontsentratsioon, kui asjakohane, niiskusesisaldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             söötmele lisatud lahusti ja uuritava kemikaali kontsentratsioon (ja/või ruumala);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             inkubatsioonitemperatuur;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             inkubatsiooniaeg;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaaliga töötlemise kestus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pärast töötlemist rakkude kogumise aeg;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakkude külvitihedus, vajaduse korral;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metaboolse aktivatsiooni süsteemi tüüp ja koostis (S9-fraktsiooni allikas, S9-fraktsiooni segu valmistamise meetod, S9-fraktsiooni segu ja S9-fraktsiooni kontsentratsioon ja ruumala lõppsöötmes, S9-fraktsiooni kvaliteedikontrollid);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             positiivseks ja negatiivseks kontrolliks kasutatud kemikaalid, nende lõppkontsentratsioonid iga töötluse tingimuste puhul;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mikroskoobipreparaatide valmistamise meetodid ja kasutatud värvimismeetodid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             katsete nõuetekohasuse kriteeriumid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aberratsioonide hindamise kriteeriumid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analüüsitud metafaaside arv;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tsütotoksilisuse mõõtmise meetodid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             muu täiendav asjakohane teave tsütotoksilisuse ja kasutatud meetodi kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kriteeriumid, mille alusel uuringutulemust käsitatakse positiivse, negatiivse või ebaselgena;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pH, osmolaalsuse ja sadenemise määramiseks kasutatud meetodid.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             töödeldud rakkude arv ja kogutud rakkude arv iga rakukultuuri kohta, kui kasutatakse rakuliine;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tsütotoksilisuse mõõtmise tulemused, nt RPD, RICC, MI või muud vaatlusandmed, kui on olemas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakutsükli kestuse, rakupopulatsiooni kahekordistumise aja või proliferatsiooniindeksi andmed rakuliinide puhul;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             sademe tekke tunnused ja määramise aeg;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aberratsioonide, sh tühikute määratlemine;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             loendatud rakkude arv, kromosoomaberratsioonidega rakkude arv ning kromosoomaberratsioonide arv tüübiti eraldi iga töödeldud või kontrolli kultuuri kohta, tühikuid arvestades või välja jättes;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ploidsuse muutused (polüploidsed rakud ja endoreduplitseeritud kromosoomidega rakud esitada eraldi), kui neid täheldati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kontsentratsiooni-toime vaheline seos, kui võimalik;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             paralleelse negatiivse (lahusti) ja positiivse kontrolli andmed (kontsentratsioonid ja lahustid);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             varasemad negatiivse ja positiivse kontrolli andmed, sh vahemik, keskväärtused, standardhälbed ja jaotuse usaldusvahemik usaldatavustasemel 95 %, samuti selliste andmete arv;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             statistiline analüüs; p-väärtused, kui olemas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemuste arutelu.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Järeldused.
                                 
                              
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016), „Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015.“ ENV Publications. Series on Testing and Assessment No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Evans, H.J. (1976), „Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens“, in Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed.), Plenum Press, New York ja London, pp. 1–29.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), „The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture“, in Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al. (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-NewYork-Oxford, pp. 427–432.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987), „Chromosomal aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals“, Environmental and Molecular Mutagenesis, kd 10/suppl. 10, pp. 1–175.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Muehlbauer, P.A. et al. (2008), „Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/4, pp. 318–327.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.49, „Mikrotuumade tekke in vitro katse imetajarakkudega“.
                                 
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 ILSI paper (draft), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, „Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing“.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1991), „Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9“, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 257/2, pp. 147–204.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Morita, T. et al. (1992), „Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 268/2, pp. 297–305.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Brusick, D. (1986), „Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789–886.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Long, L.H. et al. (2007), „Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/1–2, pp. 177–183.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Nesslany, F. et al. (2008), „Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/6, pp. 439–452.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Galloway, S. (2000), „Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 191–201.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Kirkland, D. et al. (2005), „Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, kd 584/1–2, pp. 1–256.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Greenwood, S. et al. (2004), „Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 43/1, pp. 36–44.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Hilliard, C.A. et al. (1998), „Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 31/4, pp. 316–326.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Hedner K. et al. (1982), „Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex“, Human Genetics, Vol. 62, pp. 305–309.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Ramsey M.J. et al. (1995), „The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting“, Mutation Research, Vol. 338, pp. 95–106.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Coecke S. et al. (2005), „Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice“, ATLA, Vol. 33/3, pp. 261–287.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Henderson, L. et al. (1997), „Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies“, Mutagenesis, Vol.12/3, pp. 163–167.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), „Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test“, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 31/6, pp. 347–363.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Maron, D.M., B.N. Ames (1983), „Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test“, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 113/3–4, pp. 173–215.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Natarajan, A.T. et al. (1976), „Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes“, Mutation Research, Vol. 37/1, pp. 83–90.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), „Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro“, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 66/3, pp. 277–290.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Ong, T.-M. et al. (1980), „Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver“, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55–65.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Elliot, B.M. et al. (1992), „Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays“, Mutagenesis, Vol. 7/3, pp. 175–177.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1976), „A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems“, väljaandes In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (eds.), Elsevier, North-Holland, pp. 85–88.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1994), „Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations“, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 241–261.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), „Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9“, Environmental and Molecular Mutagenesis, kd 28/1, pp. 51–59.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP) (Püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsioon, ÜRO keskkonnaprogramm (UNEP)). Kättesaadav aadressil: http://www.pops.int/.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), „Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes“, Mutation Research, Vol. 190/3, pp. 225–8.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), „CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids“, väljaandes Genotoxic Effects of Airborne Agents, Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91–103.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Zamora, P.O. et al. (1983), „Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795–801.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Asakura, M. et al. (2008), „An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay“, Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122–130.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2008), „Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 655/1–2, pp. 1–3.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Galloway, S. et al. (2011), „Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus)“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 77–83.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Honma, M. (2011), „Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test“, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 724/1–2, pp. 86–87.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989), „Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays“, In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141–154.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 OECD (2014), „Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487)“, ENV/JM/TG(2014)17. Nõude esitamisel kättesaadav.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), „Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 741/1–2, pp. 32–56.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), „Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay“, Environmental and Molecular Muagenesis, Vol. 54/1, pp. 36–43.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. Kättesaadav aadressil: https://federalregister.gov/a/2012-13774.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 OECD (2014), „Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment No. 198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (eds.), Karger Publishers Inc., Connecticut.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1990), „Metaphase chromosome aberration assays in vitro“, Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 62–86.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), „Compilation and use of genetic toxicity historical control Data“, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 87–90.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed., John Wiley & Sons, New York.
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987), „Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1–175.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989), „Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays“, Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141–154.
                              
                           
                                 (52)
                              
                              
                                 Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), „A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens“, Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 29–46.
                              
                           
                                 (53)
                              
                              
                                 Locke-Huhle, C. (1983), „Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest“, Mutation Research, Vol. 119/3, pp. 403–413.
                              
                           
                                 (54)
                              
                              
                                 Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), „Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells“, Cancer Research, Vol. 43/3, pp. 1362–1364.
                              
                           
                                 (55)
                              
                              
                                 Soper, K.A., S.M. Galloway (1994), „Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test“, Mutation Research, Vol. 312, pp. 139–149.
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Aneuploidsus
                           – iga kõrvalekalle normaalsest diploidsest (või haploidsest) kromosoomiarvust ühe või enama kromosoomi võrra, kuid mitte terve(te) kromosoomikomplekti(de) võrra (polüploidsus).
                        
                           
                              Apoptoos
                           – programmeeritud rakusurm, mida iseloomustab rida etappe, mis viivad raku lagunemiseni membraaniga seotud osakesteks, mis kõrvaldatakse fagotsütoosiga või osakeste raku membraanilt koorumise teel (shedding).
                        
                           
                              Endoreduplikatsioon
                           – protsess, milles pärast DNA replikatsiooni S-perioodi ei käivitu rakutuumas mitoos, vaid algab uus S-periood. Selle tulemusena tekivad kromosoomid, milles on 4, 8, 16, … kromatiidi.
                        
                           
                              Genoommutatsioon
                           – kasutatud rakkude normaalse kromosoomiarvu muutus.
                        
                           
                              Genotoksiline
                           – üldtermin, mis hõlmab kõiki DNA või kromosoomi kahjustuse tüüpe, sealhulgas murde, deletsioone, adukte, nukleotiidide modifikatsioone ja sidemete teket, ümberpaigutusi, geenimutatsioone, kromosoomaberratsioone ja aneuploidsust. Mitte kõik genotoksiliste toimete tüübid ei põhjusta mutatsioone või püsivat kromosoomikahjustust.
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Klastogeen
                           – iga kemikaal, mis tekitab rakkude või eukarüootsete organismide populatsioonides struktuurseid kromosoomaberratsioone.
                        
                           
                              Kontsentratsioonid
                           – tähendavad uuritava kemikaali lõppkontsentratsioone söötmes.
                        
                           
                              Kromatiidaberratsioon
                           – struktuurne kromosoomikahjustus, mis väljendub üksikkromatiidide katkemisena või kromatiidide katkemise ja nendevahelise taasühinemisena.
                        
                           
                              Kromatiidi tühik
                           – üksikkromatiidi värvumata (akromaatiline) piirkond, mille puhul kromatiidi lineaarses struktuuris tekkinud nihe on minimaalne.
                        
                           
                              Kromatiidimurd
                           – üksikkromatiidi terviklikkuse selline katkemine, millega kaasneb ühe kromatiidi lineaarses struktuuris selge nihe.
                        
                           
                              Kromosoomaberratsioon
                           – struktuurne kromosoomikahjustus, mis väljendub mõlema kromatiidi katkemisena või katkemise ja taasühinemisena samas kohas.
                        
                           
                              Lahusti kontroll
                           – üldtermin, millega tähistatakse kontrollikultuure, millele lisatakse ainult uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatud lahusti.
                        
                           
                              Maksa S9-fraktsioon
                           – maksa homogenaadi supernatant, mis on eraldatud pärast tsentrifuugimist 9000g juures, st maksa toorekstrakt.
                        
                           
                              Mitoos
                           – rakutuuma jagunemine, mis tavaliselt jagatakse profaasiks, prometafaasiks, metafaasiks, anafaasiks ja telofaasiks.
                        
                           
                              Mitoosiindeks (MI)
                           – suhtarv, mis saadakse, kui vaatlusaluse rakupopulatsiooni metafaasis olevate rakkude arv jagatakse rakkude koguarvuga; on selle rakupopulatsiooni proliferatsioonitaseme näitaja.
                        
                           
                              Mutageenne
                           – tekitab päriliku muutuse geenide DNA aluspaaride järjestuses või kromosoomide struktuuris (kromosoomaberratsioonid).
                        
                           
                              p53 staatus
                           – p53 on valk, mis on seotud rakutsükli, apoptoosi ja DNA reparatsiooni reguleerimisega. Teoreetiliselt peaksid geenimutatsioonid või kromosoomaberratsioonid kergemini tekkima rakkudes, milles puudub funktsionaalne p53-valk ja mis seetõttu ei ole võimelised rakutsüklit peatama või kõrvaldama kahjustunud rakke apoptoosi või muude mehhanismide, nt DNA reparatsiooni indutseerimise kaudu, mille käivitab DNA kahjustus ja mis on seotud p53 funktsioonidega.
                        
                           
                              Polüploidsus
                           – rakkude või organismi selline genoommutatsioon, mis hõlmab terveid kromosoomistikke, erinevalt aneuploidsusest, mille puhul on muutunud üksikute kromosoomide arv.
                        
                           
                              Rakkude arvu suhteline suurenemine (Relative Increase in Cell Count, RICC)
                           – kemikaaliga kokku puutunud rakukultuuris rakkude arvu suurenemine, võrreldes töötlemata kultuuriga; suhtarv väljendatakse protsentides.
                        
                           
                              Rakkude paljunemine
                           – rakkude arvu suurenemine mitootilise rakujagunemise tagajärjel.
                        
                           
                              Rakupopulatsiooni suhteline kahekordistumine (Relative Population Doubling, RPD)
                           – kemikaaliga kokku puutunud rakukultuuris rakupopulatsiooni kahekordistumise kordade suurenemine, võrreldes töötlemata kultuuriga; suhtarv väljendatakse protsentides.
                        
                           
                              S9-fraktsiooni segu
                           – S9-fraktsiooni ja metaboolsete ensüümide aktiivsuse jaoks vajalike kofaktorite segu.
                        
                           
                              Struktuurne aberratsioon
                           – raku jagunemise metafaasi etapis mikroskoopiliselt tuvastatav kromosoomi struktuuri muutus, mida nähakse deletsioonide ja fragmentidena, inversioonide või kromosoomivaheliste translokatsioonidena.
                        
                           
                              Tsütotoksilisus
                           – käesoleva katsemeetodi kohaselt rakuliinidega tehtud katsetes määratletakse tsütotoksilisus rakupopulatsiooni suhtelise kahekordistumise (RPD) või rakkude arvu suhtelise suurenemise (RICC) vähenemisena töödeldud rakkudes negatiivse kontrolliga võrreldes (vt punkt 17 ja 2. liide). Käesoleva katsemeetodi kohaselt lümfotsüütide primaarkultuuridega tehtud katsetes määratletakse tsütotoksilisus töödeldud rakkude mitoosiindeksi vähenemisena negatiivse kontrolliga võrreldes (vt punkt 18 ja 2. liide).
                        
                           
                              Töötlemata kontroll
                           – paralleelsed rakukultuurid, mida ei ole töödeldud (st ei uuritava kemikaali ega lahustiga), kuid mida on käideldud samaaegselt samal viisil kui uuritava kemikaaliga töödeldud rakukultuure.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                     
                     
                        2. liide
                        
                           TSÜTOTOKSILISUSE HINDAMISE VALEMID
                        
                        
                           Mitoosiindeks (MI) –
                        
                        
                           
                        Soovitatakse kasutada rakkude arvu suhtelist suurenemist (Relative Increase in Cell Count, RICC) või rakupopulatsiooni suhtelist kahekordistumist (Relative Population Doubling, RPD), sest mõlema puhul võetakse arvesse jagunenud rakkude osakaalu rakupopulatsioonis.
                        
                           
                        
                           
                        kus:
                        
                           populatsiooni kahekordistumine = [log (rakkude arv pärast töötlust ÷ rakkude algarv)] ÷ log 2
                        Näiteks tähendab RICC või RPD 53 %, et tsütotoksilisus/tsütostaatilisus on 47 %, ning MI kaudu määratud tsütotoksilisus/tsütostaatilisus 55 %, et tegelik MI on kontrolli väärtusest 45 %.
                        
                        Igal juhul tuleb määrata rakkude arv enne töötlust ja see peab olema sama kui rakkude arv töödeldud ja negatiivse kontrolli kultuurides.
                        Kuigi varem on tsütotoksilisuse näitajana kasutatud RCC-d (st rakkude arv töödeldud kultuuris / rakkude arv kontrollkultuuris), ei ole see enam soovitatav, sest sellega võib tsütotoksilisust alahinnata.
                        Negatiivse kontrolli kultuurides peab rakupopulatsiooni kahekordistumine olema vastavuses nõudega koguda rakud pärast töötlust ajal, mis vastab ligikaudu 1,5 normaalse rakutsükli kestusele, ja mitoosiindeks peab olema piisavalt palju suurem, et mitoosis olevate rakkude arv oleks piisav 50 % vähenemise usaldusväärseks arvutamiseks.
                     “
               
                     4)
                  
                  
                     B osas asendatakse peatükk B.11 järgmisega:
                     „B.11.   Kromosoomaberratsioonkatse imetajate luuüdiga
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 475 (2014). See kuulub geneetilise toksikoloogia katsemeetodite seeriasse. Välja on töötatud OECD dokument, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia katsetest ning ülevaade nende katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (1).
                     
                        In vivo kromosoomaberratsioonkatse imetajate luuüdiga on genotoksilisuse hindamiseks eriti oluline, sest kuigi metabolismi, farmakokineetika ja DNA reparatsiooniprotsesside in vivo tegurid võivad liigiti erineda, on need aktiivsed ja annavad oma panuse organismi reageerimisse. Samuti võib in vivo katse olla kasulik in vitro süsteemis kindlaks tehtud genotoksilisuse täiendavaks uurimiseks.
                     
                        In vivo kromosoomaberratsioonkatset imetajarakkudega kasutatakse uuritava kemikaali põhjustatud struktuursete kromosoomaberratsioonide tuvastamiseks imetajate (tavaliselt näriliste) luuüdirakkudes (2–5). Struktuursed kromosoomaberratsioonid võivad olla kahte tüüpi: kromosoom- või kromatiidaberratsioonid. Kuigi enamik genotoksiliste kemikaalide põhjustatud aberratsioone on kromatiidaberratsioonid, esineb ka kromosoomaberratsioone. Kromosoomikahjustused ja nende tagajärjed põhjustavad mitmeid inimeste geneetilisi haigusi ning on olulisi tõendeid selle kohta, et need kahjustused ja nende tagajärjed põhjustavad muutusi onkogeenides ja tuumorsupressorgeenides ning on seotud vähktõve tekkega inimestel ja katsesüsteemides. Kromosoomaberratsiooni katsetes in vivo võib esineda polüploidsust (sealhulgas endoreduplikatsiooni). Polüploidsuse suurenemine ei viita siiski iseenesest aneugeensele potentsiaalile ja võib lihtsalt viidata rakutsükli häirumisele või tsütotoksilisusele. Käesolev katsemeetod ei ole ette nähtud aneuploidsuse mõõtmiseks. Mikrotuumade tekke in vivo katse imetajate erütrotsüütidega (käesoleva lisa peatükk B.12) või mikrotuumade tekke in vitro katse imetajarakkudega (käesoleva lisa peatükk B.49) oleksid vastavalt in vivo ja in vitro katsed, mis on soovitatavad aneuploidsuse määramiseks.
                     Kasutatud terminitega seotud mõisted on esitatud 1. liites.
                     LÄHTEKAALUTLUSED
                     Kõnealuses katses kasutatakse tavaliselt närilisi, kuid mõnel juhul võib asjakohane olla teiste liikide kasutamine, kui see on põhjendatud. Selle katse sihtkude on luuüdi, sest see on väga veresoonterikas kude, milles on populatsioon kiire rakutsükliga rakke, mida on kerge eraldada ja käidelda. Katseprotokollis tuleb esitada teaduslik põhjendus, miks kasutatakse muud loomaliiki kui rott või hiir. Kui kasutatakse muud loomaliiki kui närilisi, on soovitatav, et luuüdi kromosoomaberratsioonide mõõtmine oleks integreeritud muusse asjakohasesse toksilisuse katsesse.
                     Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav kemikaal või selle metaboliit/metaboliidid ei jõua sihtkoeni, võib käesoleva katse kasutamine olla asjakohatu.
                     Enne kui kasutada seda meetodit segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi jaoks, tuleb kaaluda, kas see katse annab selle eesmärgi jaoks piisavaid tulemusi ja kui annab, siis miks. Sellist kaalumist ei ole vaja, kui regulatiivne nõue eeldabki segu katsetamist.
                     KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
                     Loomade viiakse kokkupuutesse uuritava kemikaaliga, kasutades asjakohast kokkupuuteviisi, ning loomad hukatakse pärast kemikaaliga töötlemist humaanselt ja õigel ajal. Enne hukkamist manustatakse loomadele mitoosi metafaasis peatavat ainet (nt kolhitsiini või koltsemiidi). Seejärel tehakse luuüdirakkudest kromosoomipreparaadid, need värvitakse ja analüüsitakse metafaasis olevate rakkude kromosoomaberratsioone.
                     LABORI PÄDEVUSE TÕENDAMINE
                     
                        Pädevuse tõendamise katsed
                     
                     Kinnitamaks, et laboril on enne katse rutiinset kasutamist katse tegemise piisav kogemus, peab labor olema tõendanud, et ta suudab korrata avaldatud tööde (nt (6)) põhjal eeldatavaid tulemusi kromosoomaberratsioonide sageduse määramisel vähemalt kahe positiivse kontrolli kemikaaliga (kaasa arvatud positiivse kontrolli kemikaalide väikeste annustega põhjustatud nõrgad reaktsioonid), vt tabel 1, ja vastava vehiikuli/lahusti kontrolliga (vt punkt 22). Nendes katsetes tuleks kasutada annuseid, mis põhjustavad reprodutseeritavaid ja annusest sõltuvaid suurenemisi ning tõendavad katsesüsteemi tundlikkust huvipakkuva koe (luuüdi) puhul, mõõtmispiirkonna ja laboris kasutatava hindamismeetodi sobivust. Seda nõuet ei kohaldata kogemusega labori puhul, see tähendab, kui laboril on varasemate katsete põhine andmebaas, nagu on määratletud punktides 10–14.
                     
                        Varasemad kontrolli andmed
                     
                     Pädevuse tõendamise ajal peab labor kindlaks tegema:
                     
                                 —
                              
                              
                                 varasemate katsete alusel positiivse kontrolli tulemuste vahemiku ja jaotuse ning
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 varasemate katsete alusel negatiivse kontrolli tulemuste vahemiku ja jaotuse.
                              
                           Kui esmakordselt hangitakse andmeid varasemate negatiivse kontrolli tulemuste jaotuse määramiseks, peavad paralleelsed negatiivse kontrolli andmed olema kooskõlas kontrolli kohta avaldatud andmetega (kui need on olemas). Kui kontrolli väärtuste jaotusele lisatakse uusi katseandmeid, peaksid negatiivse kontrolli paralleelid ideaaljuhul olema selle jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 %. Labori varasemate negatiivse kontrolli katsete andmebaas peaks olema statistiliselt usaldusväärne, et laboril oleks võimalik hinnata oma negatiivse kontrolli andmete jaotust. Kirjanduse põhjal läheb vaja vähemalt kümmet katset, kuid parem oleks, kui andmebaasis oleksid vähemalt 20 võrreldavates tingimustes tehtud katse tulemused. Laboritel tuleb kasutada kvaliteedikontrolli meetodeid, selliseid nagu kontrollkaardid (nt vastavuse kontrollkaardid või X-tüüpi kontrollkaardid (7)), et määrata, kui suures ulatuses andmed varieeruvad, ja tõendada, et metoodika on laboris „kontrolli all“. Täiendavaid soovitusi selle kohta, kuidas koguda ja kasutada varasemate katsete andmeid (st varasemate andmete andmebaasi võtmise või sellest väljajätmise kriteeriumid ja konkreetse katse vastuvõetavuse kriteeriumid), võib leida kirjandusest (8).
                     Kui labor ei tee piisavat arvu katseid, et saada statistiliselt usaldusväärne negatiivse kontrolli jaotus (vt punkt 11) pädevuskontrolli katsete käigus (kirjeldatud punktis 9), siis on lubatud selle jaotuse kindlakstegemine esimeste rutiinsete katsetega. Sellise lähenemisviisi kasutamisel tuleks järgida kirjanduses (8) esitatud soovitusi ja nendes katsetes saadud negatiivse kontrolli tulemused peaksid olema kooskõlas negatiivse kontrolli kohta avaldatud andmetega.
                     Katse-eeskirja kõigi muudatuste puhul tuleb arvestada, kas need mõjutavad saadavate andmete kooskõla andmetega, mis on labori varem tehtud kontrollide andmebaasis olemas. Ainult väga vastuoluliste andmete puhul tuleks koostada uus varasemate kontrolli tulemuste andmebaas, kui eksperdihinnangu alusel tuvastatakse, et uus jaotus erineb varasemast jaotusest (vt punkt 11). Uue andmebaasi koostamise ajal ei ole konkreetse katse tegemise lubamiseks negatiivsete kontrollide täielikku andmebaasi vaja, kui labor suudab tõendada, et nende paralleelse negatiivse kontrolli väärtused on kooskõlas nende varasema andmebaasiga või vastavate avaldatud andmetega.
                     Negatiivse kontrolli andmetes peab iga looma kohta esitama kromosoomaberratsioonide (välja arvatud tühikute) esinemissageduse. Negatiivse kontrolli paralleelide tulemused peaksid ideaaljuhul olema labori varasemate kontrolli tulemuste jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 %. Kui negatiivse kontrolli paralleelide tulemused jäävad väljapoole usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %, võivad need olla varasemate kontrolli tulemuste jaotuses arvessevõtmiseks vastuvõetavad juhul, kui tegemist ei ole äärmusliku võõrväärtusega ning on tõendatud, et katsesüsteem on „kontrolli all“ (vt punkt 11) ja ei ole tõendeid, et tegemist on tehnilise vea või inimliku eksitusega.
                     MEETODI KIRJELDUS
                     
                        Ettevalmistused
                     
                     
                        Loomaliigi valimine
                     
                     Kasutada tuleb tavapärastest laboriliinidest pärit terveid noori täiskasvanud isendeid. Tavaliselt kasutatakse rotte, kuigi ka hiired võivad katseks sobida. Ka mis tahes muid katseks sobivaid loomaliike võib kasutada, kui selle kohta esitatakse katseprotokollis teaduslik põhjendus.
                     
                        Loomade pidamis- ja söötmistingimused
                     
                     Näriliste puhul peab loomade pidamisruumi temperatuur olema 22 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks ideaaltingimustes olema 50–60 %, peab see olema vähemalt 40 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal. Kasutatakse tehisvalgustust, valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmiseks võib kasutada labori tavapärast söödavalikut koos piiramatus koguses joogiveega. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada uuritava kemikaali sobiv lisamine söödasse, kui kemikaali manustatakse sellisel viisil. Närilisi tuleb pidada väikestes rühmades (kuni viis looma puuris), igas puuris on samast soost ja sama katserühma loomad, kui ei eeldata agressiivset käitumist; eelistatud on kõva põrandaga ja asjakohaselt mitmekesistatud keskkonnaga puurid. Loomi võib ühekaupa pidada ainult siis, kui see on teaduslikult põhjendatud.
                     
                        Loomade ettevalmistamine
                     
                     Tavaliselt kasutatakse terveid noori täiskasvanud loomi (näriliste puhul ideaaljuhul katse alguses 6–10nädalased loomad, kuigi lubatud on ka veidi vanemad loomad), kes jagatakse juhuvaliku alusel katse- ja kontrollirühmadesse. Iga loom saab kordumatu identimismärgistuse, mille tegemiseks kasutatakse humaanset võimalikult vähe invasiivset meetodit (nt rõngastamine, märgistamine, mikrokiipimine või biomeetriline tuvastamine, kuid mitte kõrva sälkamine või varba köndistamine) ning loomadel lastakse vähemalt viis päeva laboritingimustega kohaneda. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud mõju on võimalikult väike. Tuleb vältida ristsaastumist positiivse kontrolli ja uuritava kemikaaliga. Katse alguses peavad loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ning mitte erinema üle ±20 % kummagi soo keskmisest massist.
                     
                        Annuste valmistamine
                     
                     Tahke uuritav kemikaal tuleb lahustada või suspendeerida sobivas lahustis või vehiikulis ja segada sööda sisse või joogivette enne loomadele andmist. Vedelat uuritavat kemikaali võib manustada vahetult või lahjendada enne manustamist. Sissehingamise kaudu toimuva kokkupuute korral manustatakse uuritavat kemikaali gaasi, auru või tahke/vedela dispersse faasiga aerosoolina, sõltuvalt kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest. Kasutada tuleks uuritava kemikaali värskeid preparaate, välja arvatud juhul, kui püsivuse andmetest nähtub, et säilitamine on aktsepteeritav ja on määratletud asjakohased säilitamistingimused.
                     
                        Lahusti/vehiikul
                     
                     Kasutatavates annustes ei tohi lahusti/vehiikul avaldada toksilist toimet ega keemiliselt reageerida uuritava kemikaaliga. Kui kasutatakse muid kui kirjeldatud omadustega lahusteid/vehiikuleid, peab võrdlusandmetest nähtuma nende sobivus. Kui vähegi võimalik, on kõigepealt soovitatav kaaluda vesilahustuva lahusti/vehiikuli kasutamist. Tavaliselt kasutatavad lahustid/vehiikulid on näiteks vesi, füsioloogiline keedusoolalahus, metüültselluloosi lahus, karboksümetüültselluloosi naatriumsoola lahus, oliiviõli ja maisiõli. Kui puuduvad varasemad või avaldatud kontrolli andmed, millest nähtub, et valitud ebatüüpiline lahusti/vehiikul ei põhjusta kromosoomaberratsioonide teket ega muid kahjulikke tagajärgi, tuleb kõigepealt teha eelkatse, et tõendada lahusti/vehiikuli kontrolliks kasutamise sobivust.
                     
                        Kontrollid
                     
                     
                        Positiivsed kontrollid
                     
                     Igasse katsesse peab tavaliselt kavandama positiivse kontrolli kemikaaliga kokku puutuva loomade rühma. Sellest võib loobuda juhul, kui katselabor on tõendanud kõnealuse katse läbiviimise pädevust ja on kindlaks teinud varasemate katsete positiivse kontrolli vahemiku. Kui paralleelset positiivse kontrolli rühma ei kasutata, tuleb igas katses teha hindamise kontrolle (fikseeritud ja värvimata mikropreparaadid). Neid saadakse, kui katse hindamisel lisatakse asjakohased võrdlusstandardid, mis on saadud ja säilitatud eraldi tehtud positiivse kontrolli katsest, mida tehakse uuringukatset läbiviivas laboris korrapäraselt (nt iga 6–18 kuu tagant), näiteks tasemekatsete käigus ja seejärel korrapäraselt vastavalt vajadusele.
                     Positiivse kontrolli kemikaalid peavad usaldusväärselt põhjustama struktuursete kromosoomaberratsioonidega rakkude esinemissageduse määratava suurenemise, võrreldes spontaanse esinemissagedusega. Positiivse kontrolli annused valitakse nii, et nende toime on selge, kuid see ei paljasta hindajale kohe kodeeritud proovide identiteeti. Positiivse kontrolli kemikaali manustamiseks võib kasutada ka muud manustamisteed kui uuritava kemikaali puhul, muu manustamisskeemi kasutamine ja proovide võtmine võib toimuda ka ainult ühel ajahetkel. Kui see on asjakohane, võib lisaks kaaluda selliste positiivse kontrolli kemikaalide kasutamist, mis kuuluvad uuritava kemikaaliga samasse kemikaalide rühma. Tabelis 1 on esitatud mõned positiivse kontrolli kemikaalide näited.
                     
                        Tabel 1
                     
                     
                        Positiivse kontrolli kemikaalide näited
                     
                     
                                 Kemikaal
                              
                              
                                 CASi nr
                              
                           
                                 Etüülmetaansulfonaat
                              
                              
                                 62-50-0
                              
                           
                                 Metüülmetaansulfonaat
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                 
                                    N-etüül-N-nitrosokarbamiid
                              
                              
                                 759-73-9
                              
                           
                                 Mitomütsiin C
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                 Tsüklofosfamiid (monohüdraat)
                              
                              
                                 50-18-0 (6055-19-2)
                              
                           
                                 Trietüleenmelamiin
                              
                              
                                 51-18-3
                              
                           
                        Negatiivsed kontrollid
                     
                     Igal proovivõtukorral tuleb võtta proovid ka negatiivse kontrolli rühma loomadelt, keda muidu tuleb käidelda samamoodi nagu katserühma loomi, selle erinevusega, et neile ei manustata uuritavat kemikaali. Kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse lahustit/vehiikulit, tuleb kontrollrühmale manustada sedasama lahustit/vehiikulit. Kui igal proovivõtu korral on saadud negatiivse kontrolli andmed kromosoomaberratsioonidega rakkude esinemissageduse kohta olnud kooskõlas katselabori varasemates katsetes saadud negatiivse kontrolli andmetega, arvestades loomadevahelist varieeruvust, võib negatiivse kontrolli jaoks vaja minna ainult ühte proovivõttu. Kui negatiivse kontrolli puhul kasutatakse ainult ühte proovivõttu, tuleb see teha uuringu esimese proovivõtu ajal.
                     KATSE KÄIK
                     
                        Loomade arv ja sugu
                     
                     Üldjuhul on mikrotuumade tekke reaktsioon isas- ja emasloomadel ühesugune (9) ning eeldatakse, et see kehtib ka kromosoomaberratsioonide kohta; seepärast võib enamiku katseid teha ükskõik kummast soost loomadega. Andmed, millest nähtuks isas- ja emasloomade vaheline erinevus (nt süsteemse toksilisuse, metabolismi, biosaadavuse, luuüdi suhtes avalduva toksilisuse jne erinevus, sealhulgas nt annusevahemiku uuringu sellekohased andmed), toetaksid kummastki soost loomade kasutamist. Sel juhul võib olla asjakohane teha uuring kummastki soost loomadega, näiteks osana korduvannuse toksilisuse uuringust. Kui kasutatakse kummastki soost loomi, võib olla asjakohane kasutada mitme faktori määramist võimaldavat katseplaani. Üksikasjad, kuidas sellise katseplaani puhul andmeid analüüsida, on esitatud 2. liites.
                     Uuringu alguses tuleb määrata rühmade suurused, nii et rühmas oleks vähemalt viis analüüsitavat samast või kummastki soost looma (kui kasutatakse mõlemast soost loomi). Kui inimese kokkupuude kemikaalidega võib olla soospetsiifiline, nagu näiteks mõnede ravimite puhul, tehakse katse vastavast soost loomadega. Kahe proovivõtuajaga luuüdiuuringuks, milles on kolm eri annusega katserühma, paralleelne negatiivse kontrolli rühm ning positiivse kontrolli rühm (igas rühmas on viis samasoolist looma), on vastavalt maksimaalsele tüüpvajadusele vaja 45 looma.
                     
                        Annused
                     
                     Kui tehakse annusevahemiku eeluuring, sest puuduvad sobivad andmed annusevahemiku valimiseks, tuleb see teha samas laboris ning kasutada sama loomaliiki, -liini, sugu ja manustamiskava, mida kasutatakse põhiuuringus (10). Uuringu eesmärk on kindlaks määrata maksimaalne talutav doos (maximum tolerated dose, MTD), mis on suurim annus, mida loomad uuringuperioodil taluvad, ilma et neil avalduks uuringut piirava toksilisuse nähte (näiteks väheneb neil kehamass või avaldub tsütotoksilisus vereloomesüsteemi suhtes, kuid see ei kutsu esile surmajuhte ega sellist valu, piinlemist või kannatusi, mis nõuaksid loomade humaanset hukkamist (11)).
                     Suurimat annust võib määratleda ka doosina, mille korral esineb teatavaid luuüdi suhtes avalduva toksilisusega seotud nähte.
                     Kemikaalid, mille toksiko-kineetilistes omadustes esineb küllastumine või mis põhjustavad selliseid detoksifitseerimisprotsesse, mille tõttu kokkupuude võib väheneda pärast nende pikaajalist manustamist, võivad olla doosi määramise kriteeriumide seisukohast erandlikud ning iga üksikjuhtumit tuleks hinnata eraldi.
                     Teabe saamiseks annuse ja toime seose kohta peab täielikus uuringus olema negatiivne kontrollrühm ja vähemalt kolm eri annust, mis tavaliselt erinevad üksteisest kaks korda, kuid mitte enam kui neli korda. Kui kemikaal ei ole doosivahemiku eelkatse või olemasolevate andmete põhjal toksiline, on suurim ühekordselt manustatav annus 2 000 mg kehamassi kg kohta. Kui uuritav kemikaal siiski on toksiline, peab suurim manustatav annus olema maksimaalne talutav doos (MTD) ning muud kasutatavad annused peaksid eelistatavalt olema vahemikus sellest maksimaalselt talutavast doosist kuni vähetoksilise või üldse mitte toksilise annuseni. Kui toksilisust sihtkoe (luuüdi) suhtes täheldatakse kõigi katses kasutatud annuste puhul, on soovitatav teha katse ka mittetoksilise annusega. Uuringutes, milles tahetakse täielikult iseloomustada kvantitatiivset annuse ja toime seost, võib vaja minna täiendavaid annuserühmi. Teatavat tüüpi uuritavate kemikaalide (näiteks inimravimite) puhul, millele kohaldatakse erinõudeid, võivad need piirmäärad olla teistsugused.
                     
                        Piirsisalduskatse
                     
                     Kui annusevahemiku leidmise katsetest või lähedasi loomaliine käsitlevatest andmetest on saadud tõendeid, et piirannuse manustamise katses (kirjeldatud allpool) ei ole uuritaval kemikaalil sedastatavat toksilist toimet (sealhulgas luuüdirakkude paljunemise vähenemist ega muid tõendeid tsütotoksilisusest sihtkoes), ja kui genotoksilisust ei ole alust eeldada in vitro genotoksilisuse uuringute või sarnase struktuuriga kemikaalide andmete põhjal, võib täielikku kolme annusetasemega uuringut käsitada ebavajalikuna, kui on tõendatud, et uuritav kemikaal jõuab / uuritavad kemikaalid jõuavad sihtkoeni (luuüdisse). Sellistel juhtudel võib olla piisav teha katse ühe annusega, mis on piirannus. Kui manustamisperiood on rohkem kui 14 päeva, on piirannus 1 000 mg kehamassi kg kohta päevas. Kui manustamisperiood on 14 päeva või vähem, on piirannus 2 000 mg kehamassi kg kohta päevas.
                     
                        Annuste manustamine
                     
                     Katse kavandamisel tuleks silmas pidada inimese võimalikku kokkupuuteviisi. Seega võib valida selliste kokkupuuteviiside seast, nagu manustamine sööda või joogiveega, paikselt naha alla, veenisiseselt, suu kaudu (toitmissondiga), inhalatsiooniga, intratrahheaalselt või implantatsiooniga, kui see on põhjendatud. Igal juhul tuleb kokkupuuteviisi valikuga tagada kemikaali adekvaatne kokkupuude sihtkoega/-kudedega. Tavaliselt ei soovitata intraperitoneaalset süstimist, sest see ei ole inimese puhul ette nähtud kokkupuuteviis, ning seda võib kasutada ainult konkreetse teadusliku põhjenduse alusel. Kui uuritav kemikaal segatakse sööda sisse või joogivette, eriti ühekordse annuse manustamise korral, tuleb jälgida, et ajavahemik sööda ja vee tarbimise ning proovide võtmise vahel oleks piisav, et võimaldada toime tuvastamist (vt punktid 33–34). Vedeliku suurim kogus, mida saab toitmissondi kaudu või süstimisel ühe korraga manustada, sõltub katselooma suurusest. Tavaliselt ei tohi kogus ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, kus võib kasutada kogust 2 ml 100 g kehamassi kohta. Suurema koguse kasutamise korral tuleb seda põhjendada. Kui jätta välja ärritavad või söövitavad kemikaalid, mille toime on suurema kontsentratsiooni korral tavaliselt tugevam, tuleb katses vedelikukoguse varieeruvust minimeerida ja reguleerida kontsentratsioone nii, et kõiki annuseid manustataks kehamassi suhtes ühesuguse lahusekogusega.
                     
                        Manustamiskava
                     
                     Tavaliselt manustatakse uuritavaid kemikaale ühekordse annusena, kuid neid võib manustada ka jagatud annustena (näiteks kaks manustamist ühel päeval mitte rohkem kui 2–3tunnise vahega), et kergendada suure lahusekoguse manustamist. Selles olukorras või kui uuritavat kemikaali manustatakse inhalatsiooniga, tuleb proovide võtmise aeg kavandada viimase manustamise või kokkupuute lõppemise aja põhjal.
                     Korduvannuse eeskirja kasutamise kohta seoses käesoleva katsega on vähe andmeid. Olukorras, kui on siiski soovitatav ühendada see katse korduvannuse toksilisuse katsega, tuleb jälgida, et välditaks kromosoomikahjustustega mitoosirakkude kadu, mis võib tekkida toksiliste annuste juures. Selline katsete ühendamine on vastuvõetav ainult siis, kui suurim annus on suurem piirannusest (vt punkt 29) või sellega võrdne ja annuserühmale manustatakse piirannust kogu töötlemise perioodi ajal. Mikrotuumade tekke katset (katsemeetod B.12) tuleb käsitada valikmeetodina kromosoomaberratsioonkatseks in vivo, kui seda soovitakse ühendada teiste uuringutega.
                     Luuüdiproovid tuleb võtta kahel korral pärast ühekordset manustamist. Näriliste puhul peab esimene proovivõtuvahemik võrduma ajaliselt 1,5 normaalse rakustükli läbimiseks kuluva ajaga (tavaliselt 12–18 tundi pärast manustamist). Kuna uuritava kemikaali / uuritavate kemikaalide omastamiseks ja metabolismiks vajalik aeg ja ka kemikaali toime rakutsükli kineetikale võivad mõjutada optimaalset aega kromosoomaberratsioonide tuvastamiseks, on soovitatav võtta teine proov 24 tundi pärast esimese proovi võtmist. Esimese proovivõtu ajal peab uuritav kemikaal olema manustatud kõigile annuserühmadele ning kõigilt rühmadelt kogutakse proovid analüüsimiseks; järgmistel proovivõtukordadel tuleb manustada üksnes suurimat annust. Kui teadusliku põhjenduse alusel kasutatakse üle ühe päeva pikkust annustusskeemi, kasutatakse pärast lõppannuse manustamist ligikaudu 1,5 normaalse rakutsükli kestuse möödumise järel tavaliselt ühte proovivõtu korda.
                     Pärast manustamist ja enne proovi võtmist süstitakse loomadele intraperitoneaalselt asjakohases annuses rakke metafaasis peatavat ainet (nt koltsemiidi või kolhitsiini) ning proovid võetakse pärast asjakohase ajavahemiku möödumist. Hiirte puhul on see ajavahemik ligikaudu 3–5 tundi enne proovi võtmist ja rottide puhul 2–5 tundi. Luuüdi rakud kogutakse, töödeldakse nende pundumiseks, fikseeritakse ja värvitakse ning neis analüüsitakse kromosoomaberratsioonid (12).
                     
                        Vaatlus
                     
                     Vähemalt üks kord päevas, eelistatult igal päeval samal ajal ning võttes arvesse ajavahemikku, kui eeldatav toime avaldub pärast annuse manustamist kõige intensiivsemalt, tuleb teha katseloomade üldine kliiniline vaatlus ja registreerida kõik kliinilised sümptomid. Haigestumise ja surmajuhtude tuvastamiseks tuleb kemikaali manustamise perioodil kõik loomad vähemalt kaks korda päevas üle vaadata. Kõik loomad tuleb kaaluda uuringu alguses, korduvannuse uuringute ajal vähemalt kord nädalas ja pärast eutanaasiat. Kui uuring kestab vähemalt ühe nädala, tuleb vähemalt kord nädalas mõõta tarbitud sööda kogust. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleb vee tarbimist mõõta pärast iga veevahetust ja vähemalt üks kord nädalas. Loomad, kellel avalduvad äärmusliku, kuigi mitte letaalse toksilisuse rasked nähud, tuleb enne katse lõppu humaanselt hukata (11).
                     
                        Sihtkoe kokkupuude
                     
                     Kui muid andmeid uuritava kemikaali ja luuüdi kokkupuute tõendamiseks ei ole, tuleb asjakohasel ajal (asjakohastel aegadel) võtta vereproov(id) ja analüüsida neist kemikaali sisaldust plasmas, et selle kaudu tõendada luuüdi ja kemikaali kokkupuute toimumist (vt punkt 44).
                     
                        Luuüdi- ja kromosoomipreparaadid
                     
                     Kohe pärast humaanset eutanaasiat eraldatakse luuüdi rakud loomade reie- või sääreluust, pannakse hüpotoonilisse lahusesse ja fikseeritakse. Seejärel tehakse metafaasis olevatest rakkudest äigepreparaat ning värvitakse see kindlaks määratud meetoditel (vt 3, 12).
                     
                        Analüüs
                     
                     Kõik mikroskoobipreparaadid, sh positiivse ja negatiivse kontrolliga, tuleb enne analüüsi sõltumatult kodeerida ja randomiseerida, nii et hindaja ei teaks, millise rühma loomalt proov on saadud.
                     Kõikide katseloomade (sh positiivse kontrolli loomade) ning kemikaaliga mitte kokku puutunud või vehiikuli/lahustiga kokku puutunud negatiivse kontrolli rühma loomade puhul tuleb tsütotoksilisuse mõõtmiseks määrata mitoosiindeks, kasutades vähemalt 1 000 rakku iga looma kohta.
                     Iga looma kohta tuleb analüüsida 200 metafaasis rakku struktuursete kromosoomaberratsioonide (nii koos tühikutega kui ka ilma tühikuid arvestamata) esinemise suhtes (6). Kui varasemate katsete negatiivse kontrolli andmebaasi alusel nähtub, et struktuursete kromosoomaberratsioonide keskmine esinemissagedus katselaboris on < 1 %, tuleb kaaluda täiendavate rakkude hindamist. Kromatiid- ja kromosoomaberratsioonid tuleb eraldi registreerida ja klassifitseerida alatüüpide alusel (murrud, vahetused). Labori eeskirjad peavad tagama, et kromosoomaberratsioonianalüüsi teevad pädevad hindajad ning vajaduse korral kasutatakse vastastikust hindamist. Arvestades, et mikroskoobipreparaadi valmistamise meetodid põhjustavad sageli osa metafaasis olevate rakkude purunemise, mille tõttu kaotatakse kromosoome, peab hinnatavates rakkudes tsentromeeride arv olema mitte väiksem kui 2n ± 2, kus n on liigiomane haploidne kromosoomiarv.
                     ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                     
                        Andmete töötlemine
                     
                     Iga looma andmed esitatakse tabelina. Iga looma kohta tuleb esitada mitoosiindeks, hinnatud metafaasirakkude arv, kromosoomaberratsioonide arv metafaasis raku kohta ja kromosoomaberratsioonidega rakkude osakaal (protsent). Eri tüüpi struktuursed kromosoomaberratsioonid tuleb esitada koos nende esinemise absoluutarvu ja sagedusega katse- ja kontrollirühmades. Tühikud, nagu ka polüploidsed rakud ja endoreduplitseeritud kromosoomid registreeritakse eraldi. Tühikute sagedus esitatakse, kuid üldjuhul ei arvestada seda struktuursete aberratsioonide üldsageduse analüüsis. Kui reaktsiooni puhul puudub tõendus sugudevahelise erinevuse kohta, võib andmed statistilise analüüsi jaoks ühendada. Samuti tuleb esitada andmed loomadel avaldunud toksilisuse kohta ja kliinilised sümptomid.
                     
                        Katse nõuetekohasuse kriteeriumid
                     
                     Katse nõuetekohasuse kriteeriumid on järgmised:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 paralleelse negatiivse kontrolli tulemused on vastuvõetavad, et lisada need labori varasemate tulemuste andmebaasi (vt punktid 11–14);
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 paralleelsed positiivsed kontrollid või hindamise kontrollid peavad tekitama reaktsioone, mis on võrreldavad nendega, mis on saadud varasemate positiivse kontrolli katsete andmebaasist, ning positiivse kontrolli kemikaal peab põhjustama statistiliselt olulise suurenemise negatiivse kontrolliga võrreldes (vt punktid 20–21);
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 analüüsitud on asjakohane arv annuseid ja rakke;
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 suurima annuse valimise kriteeriumid on kooskõlas kriteeriumidega, mida on kirjeldatud punktides 25–28.
                              
                           
                        Tulemuste hindamine ja tõlgendamine
                     
                     Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritavat kemikaali selgelt positiivsena, kui:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 vähemalt ühes annuserühmas esineb struktuursete kromosoomaberratsioonidega (välja arvatud tühikud) rakkude esinemissageduse statistiliselt oluline suurenemine paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 see suurenemine on vähemalt ühel proovivõtu ajal annusest sõltuv, kui seda hinnatakse asjakohase trenditestiga, ning
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 ükski nendest tulemustest ei ole väljaspool labori varasemate negatiivse kontrolli katsete jaotust (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %).
                              
                           Kui teataval proovivõtu ajal uuritakse üksnes suurimat annust, käsitatakse uuritavat kemikaali selgelt positiivsena, kui võrreldes paralleelse negatiivse kontrolliga tuvastatakse statistiliselt oluline suurenemine ja tulemused on väljaspool labori varasemate negatiivse kontrolli andmete jaotust (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %). Soovitusi asjakohaste statistiliste meetodite kohta leiab kirjandusest (13). Annuse-reaktsiooni analüüsi korral tuleb analüüsida vähemalt kolme annuse katserühma. Statistiliste testide puhul tuleb ühte looma lugeda katseühikuks. Kromosoomaberratsioonikatses saadud positiivsed tulemused tähendavad, et uuritav kemikaal põhjustab kromosoomaberratsioone katses kasutatud loomaliigi luuüdis.
                     Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritavat kemikaali selgelt negatiivsena, kui kõikides uuritud katsetingimustes:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 mitte üheski annuserühmas ei esine struktuursete kromosoomaberratsioonidega (välja arvatud tühikud) rakkude esinemissageduse statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 ühelgi proovivõtu ajal ei esine annusest sõltuvat suurenemist, kui seda hinnatakse asjakohase trenditestiga;
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 kõik tulemused on labori varasemate katsete negatiivse kontrolli jaotuse vahemikus (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 %), ning
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 luuüdi kokkupuude uuritava kemikaaliga on toimunud.
                              
                           Soovitusi kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta leiab kirjandusest (13). Uuritava kemikaali luuüdiga kokkupuute tõendus võib olla mitoosiindeksi vähenemine või uuritava kemikaali / uuritavate kemikaalide kontsentratsiooni mõõtmine plasmas või täisveres. Intravenoosse manustamise puhul ei ole kokkupuudet vaja tõendada. Teise võimalusena võib luuüdi kokkupuute tõendamiseks kasutada uuritava kemikaali imendumise, jaotumise, metabolismi ja eritumise (ADME) andmeid, mis on saadud sõltumatu uuringuga, milles on kasutatud sama manustamisviisi ja loomaliiki. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et kemikaal ei põhjusta nendel katsetingimustel kromosoomaberratsioone kasutatud loomaliigi luuüdis.
                     Selget positiivset või selget negatiivset vastust ei ole vaja kinnitada.
                     Juhul kui vastus ei ole selgelt negatiivne ega positiivne ning selleks, et aidata mõista tulemuse (nt väikse või piiripealse suurenemise) bioloogilist olulisust, tuleb andmetele anda eksperdihinnang ja/või täiendavalt uurida olemasolevaid lõpetatud katseid. Mõnel juhul võib kasulikuks osutatud suurema arvu rakkude analüüsimine või muudetud katsetingimustega korduskatse.
                     Harvadel juhtudel ei võimalda isegi täiendavate uuringute tulemused teha järeldust, kas uuritava kemikaaliga saadud tulemus on positiivne või negatiivne; sel juhul loetakse uuringu tulemus ebaselgeks.
                     Polüploidsuse ja endoreduplikatsiooniga metafaaside arv tuleb registreerida eraldi metafaaside koguarvust. Polüploidsete/endoreduplikatsiooniga rakkude arvu suurenemine võib viidata sellele, et uuritaval kemikaalil on võime inhibeerida mitoosi protsesse või rakutsükli edenemist (vt punkt 3).
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet.
                     
                        Kokkuvõte
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritav kemikaal:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             allikas, partii number, aegumise kuupäev, kui olemas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali stabiilsus, kui teada.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ühe koostisosaga aine:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             välimus, lahustuvus vees ja täiendavad asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             keemilised identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus ja CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, lisandite nimetused vastavalt vajadusele ja praktilisele teostatavusele jne.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid ja segud:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             iseloomustatakse nii palju kui võimalik, lähtudes koostisosade keemilistest identifitseerimisandmetest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritava kemikaali preparaat:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             vehiikuli valiku põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis/vehiikulis, kui teada;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             sööda, joogivee või sissehingamise kaudu manustamiseks sobiva preparaadi valmistamine;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             preparaadi analüüsi andmed (nt stabiilsus, homogeensus, nominaalsed kontsentratsioonid), kui neid on määratud.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katseloomad:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud liik/liin ja selle kasutamise põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             loomade arv, vanus ja sugu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             meetod loomade üheseks identifitseerimiseks;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             lühiajaliste uuringute puhul: iga looma kehamass katse alguses ja lõpus; ühest nädalast pikemate uuringute puhul: iga looma kehamass uuringu vältel ja sööda tarbimine. Iga rühma kohta tuleb esitada kehamassi vahemik, keskväärtus ja standardhälve.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsetingimused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             positiivsed ja negatiivsed (vehiikul/lahusti) kontrollid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             annusevahemiku määramise katse tulemused, kui tehtud;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             annuse valimise põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali preparaadi valmistamise üksikasjad;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             manustamisviisi põhjendus ja manustamise kestus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             meetodid, millega kontrolliti, et uuritav kemikaal jõudis (uuritavad kemikaalid jõudsid) üldvereringesse või luuüdini;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tegelik doos (mg kehamassi kg kohta päevas), mis arvutatakse sööda/joogivee tarbimise ja selles oleva uuritava kemikaali kontsentratsiooni (ppm) järgi, kui asjakohane;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             eutanaasiameetod;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analgeesiameetod (kui kasutati);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             manustamis- ja proovivõtukavade üksikasjalik kirjeldus ja nende valiku põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mikroskoobipreparaadi valmistamise meetodid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             toksilisuse mõõtmise meetodid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakutsüklit metafaasis peatava kemikaali identifitseerimisandmed, kontsentratsioon, annus ja manustamise aeg enne proovivõttu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             proovide eraldamise ja säilitamise kord;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aberratsioonide hindamise kriteeriumid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             looma kohta analüüsitud metafaasis rakkude arv ja mitoosiindeksi määramiseks analüüsitud rakkude arv;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             katse nõuetekohasuse kriteeriumid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kriteeriumid, mille alusel uuringud klassifitseeritakse positiivseks, negatiivseks või ebaselgeks.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             loomade seisund enne katset ja kogu katse ajal, sealhulgas toksilisuse sümptomid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mitoosiindeks iga looma kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aberratsioonide tüüp ning arv ja aberratsioonidega rakkude arv iga looma kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aberratsioonide üldarv rühma kohta ning keskväärtused ja standardhälbed;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aberratsioonidega rakkude arv rühma kohta ning keskväärtused ja standardhälbed;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tuvastatud ploidsuse muutused, kaasa arvatud polüploidsete ja/või endoreduplikatsiooniga rakkude esinemissagedus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             annuse-reaktsiooni seos, kui võimalik;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kohaldatud statistilised analüüsid ja meetodid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             andmed, mis kinnitavad luuüdi kokkupuudet uuritava kemikaaliga;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             paralleelsed negatiivse ja positiivse kontrolli andmed, sh vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             varasemad negatiivse ja positiivse kontrolli andmed, sh vahemik, keskväärtused, standardhälbed ja jaotuse usaldusvahemik usaldatavustasemel 95 %, samuti hõlmatud ajavahemik ja vaatluste arv;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             positiivsuse või negatiivsuse täidetud kriteeriumid.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemuste arutelu.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Järeldused.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Viited.
                                 
                              
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016), „Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015.“ ENV Publications. Series on Testing and Assessment No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Adler, I.D. (1984), „Cytogenetic Tests in Mammals“, väljaandes Mutagenicity Testing: A Practical Approach, Venittand, S., J.M. Parry (eds.), IRL Press, Washington, DC, pp. 275–306.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Preston, R.J. et al. (1987), „Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells“, Mutation Research, Vol. 189/2, pp. 157–165.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Richold, M. jt (1990), „In Vivo Cytogenetics Assays“, väljaandes Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115–141.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Tice, R.R. et al. (1994), „Report from the working group on the in vivo mammalian bone marrow chromosomal aberration test“, Mutation Research, Vol. 312/3, pp. 305–312.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Adler, I.D. et al. (1998), „Recommendations for statistical designs of in vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 417/1, pp. 19–30.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), „Compilation and use of genetic toxicity historical control data“, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87–90.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), „In vivo rodent erythrocyte micronucleus assay“, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293–304.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Fielder, R.J. et al. (1992), „Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays“, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313–319.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2000), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, N°19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), „Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse“, Methods in Molecular Biology, Vol. 1044, pp. 147–163.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Lovell, D.P. et al. (1989), „Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays“, väljaandes Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184–232.
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Aneuploidsus
                           – iga kõrvalekalle normaalsest diploidsest (või haploidsest) kromosoomiarvust ühe või enama kromosoomi võrra, kuid mitte terve kromosoomistiku / tervete kromosoomistike võrra (polüploidsus).
                        
                           
                              Endoreduplikatsioon
                           – protsess, milles pärast DNA replikatsiooni S-perioodi ei käivitu rakutuumas mitoos, vaid algab uus S-periood. Selle tulemusena tekivad kromosoomid, milles on 4, 8, 16,..., kromatiidi.
                        
                           
                              Genoommutatsioon
                           – kasutatud rakkude normaalse kromosoomiarvu muutus (aneuploidsus).
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Kromatiidaberratsioon
                           – struktuurne kromosoomikahjustus, mis väljendub üksikkromatiidide katkemisena või kromatiidide katkemise ja nendevahelise taasühinemisena.
                        
                           
                              Kromosoomaberratsioon
                           – struktuurne kromosoomikahjustus, mis väljendub mõlema kromatiidi katkemise või katkemise ja taasühinemisena samas kohas.
                        
                           
                              Mitoosiindeks
                           – rakupopulatsiooni mitoosis olevate rakkude arvu ja rakkude koguarvu suhe; selle näitaja järgi hinnatakse vaadeldava rakupopulatsiooni paljunemist.
                        
                           
                              Polüploidsus
                           – kromosoomiarvu muutus, mille puhul erinevalt kromosoomistiku üksikkromosoomide arvu muutusest (aneuploidsus) muutub kromosoomiarv terve kromosoomistiku / tervete kromosoomistike võrra.
                        
                           
                              Struktuurne aberratsioon
                           – raku jagunemise metafaasi etapis mikroskoopiliselt tuvastatav kromosoomi struktuuri muutus, mida nähakse deletsioonide ja fragmentidena, inversioonide või kromosoomivaheliste translokatsioonidena.
                        
                           
                              Tsentromeer
                           – kromosoomi ala(d), mille külge kinnituvad kääviniidid raku jagunemise ajal ja võimaldavad tütarkromosoomide korrapärast liikumist tütarrakkude poolustele.
                        
                           
                              Tühik
                           – akromaatiline kahjustus, mis on väiksem kui kromatiidi laius ja mille puhul kromatiidi lineaarse struktuuri muutusega kaasnev nihe on minimaalne.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                     
                     
                        2. liide
                        
                           MITME FAKTORI MÄÄRAMIST VÕIMALDAV KATSEPLAAN SUGUDEVAHELISTE ERINEVUSTE KINDLAKSTEGEMISEKS IN VIVO KROMOSOOMABERRATSIOONIKATSES
                        
                        
                           Mitme faktori määramist võimaldav katseplaan ja selle analüüs
                        
                        Selle katseplaani korral tehakse katse vähemalt viie isas- ja viie emasloomaga igal kontsentratsioonitasemel, milleks on vaja vähemalt 40 looma (20 isas- ja 20 emaslooma, lisaks veel asjakohased positiivse kontrolli katsed).
                        Sellise katseplaani analüüs, mis on üks lihtsamaid mitme teguri määramise analüüse, on samaväärne kahefaktorilise dispersioonanalüüsiga, milles peamised tegurid on sugu ja kontsentratsiooni väärtus. Andmete analüüsimiseks võib kasutada mitmeid statistikatarkvara standardpakette, nagu SPSS, SAS, STATA, Genstat, samuti võib kasutada R-keskkonda.
                        Analüüsiga jagatakse andmete dispersioon osadeks: sooga seotud, kontsentratsiooniga seotud ning soo ja kontsentratsiooni interaktsiooniga seotud dispersiooniks. Igaühte nendest komponentidest võrreldakse dispersiooni hinnanguga, mis iseloomustab sama katserühma loomade (samast soost loomad ja sama kontsentratsiooni väärtus) kohta saadud tulemusi. Aluseks oleva metoodika üksikasjalik kirjeldus on esitatud standardsetes statistikaõpikutes (vt viited) ja statistikapakettide help-funktsiooni juhendites.
                        Edasi analüüsitakse kahe faktori (sugu × kontsentratsioon) interaktsiooni ANOVA tabelis (5). Olulise interaktsiooniliikme puudumise korral tagavad eri sugude või eri kontsentratsioonide koondväärtused valiidsed statistilised testid ANOVA rühmasisese dispersiooni liikmel põhinevate väärtuste vahel.
                        Edasiseks analüüsiks jaotatakse kontsentratsioonidevahelise dispersiooni hinnang kontrastideks, millega saab kontrollida reaktsioonide lineaarseid kontraste ja ruutkontraste kõikidel kontsentratsioonitasemetel. Kui esineb muutujate (sugu × kontsentratsiooni) oluline interaktsioon, saab ka selle liikme jaotada interaktsiooni kontrastideks (lineaarne kontrast × sugu ja ruutkontrast × sugu). Need muutujad võimaldavad teha kindlaks, kas eri sugude puhul on reaktsioonid kemikaalile võrreldavad või erinev.
                        Rühmasisese dispersiooni hinnangut võib kasutada keskväärtuste erinevuste paariviisilisel võrdlemisel. Neid võrdlusi võib teha kahe soo keskväärtuste vahel ja eri kontsentratsiooniväärtuste keskväärtuste vahel, näiteks võrrelda neid negatiivse kontrolli väärtustega. Juhul, kui esineb oluline interaktsioon, võib võrrelda samast soost loomade puhul eri kontsentratsioonidega saadud tulemuste keskväärtusi või eri sugudest loomade puhul sama kontsentratsiooniga saadud tulemuste keskväärtusi.
                        
                           Viited
                        
                        Paljudes statistikaõpikutes käsitletakse lihtsast kahe faktori analüüsist kuni katsemetoodika mudelite keerukamate vormideni ulatuvat mitmefaktoriliste mudelite teooriat, katseplaane, metoodikat, analüüsi ja tõlgendamist. Järgmiseks on esitatud mittetäielik loetelu. Mõnes raamatus esitatakse võrreldavate mudelite praktilisi näiteid, mõnel juhul koos koodiga, mis võimaldab analüüsida tulemusi mitmesuguste tarkvarapakettide abil.
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. ja Hunter, J.S. (1978), Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York, John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. and Draper, N.R. (1987), Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. and Davey, A.J.H. (2007), Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990), The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997), Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971), Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J ja Hamada, M.S. (2009), Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              “
               
                     5)
                  
                  
                     B osas asendatakse peatükk B.12 järgmisega:
                     „B.12.   Mikrotuumade tekke katse imetajate erütrotsüütidega
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 474 (2014). See kuulub geneetilise toksikoloogia katsemeetodite seeriasse. Välja on töötatud OECD dokument, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia katsetest ning ülevaade nende katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (1).
                     Mikrotuumade tekke in vivo katse imetajarakkudega on genotoksilisuse hindamiseks eriti oluline, sest kuigi in vivo metabolismi, farmakokineetika ja DNA reparatsiooni protsessid võivad erineda liigiti, on need aktiivsed ja annavad oma panuse reaktsioonidesse. In vivo katse on kasulik ka täiendavateks uuringuteks, kui genotoksilisus on tuvastatud in vitro süsteemiga.
                     Mikrotuumade tekke in vivo katset imetajarakkudega kasutatakse, et teha kindlaks erütroblastide kromosoomide või mitoosiaparaadi kahjustus, mille on põhjustanud uuritav kemikaal. Katsega hinnatakse mikrotuumade moodustumist erütrotsüütides, mis saadakse loomadelt, tavaliselt närilistelt, võetud luuüdi või perifeerse vere rakkude proovidest.
                     Mikrotuumade tekke katse eesmärk on teha kindlaks kemikaalid, mis põhjustavad tsütogeneetilist kahjustust, mille tulemus on kas kromosoomiloivest mahajäänud fragmente või terveid kromosoome sisaldava mikrotuumade moodustumine.
                     Kui luuüdi erütroblast areneb ebaküpseks erütrotsüüdiks (mõnikord nimetatakse seda ka polükroomseks erütrotsüüdiks või retikulotsüüdiks), siis põhituum lükatakse välja; moodustunud mikrotuumad võivad jääda tsütoplasmasse. Põhituuma puudumine hõlbustab mikrotuumade visualiseerimist või määramist nendes rakkudes. Mikrotuumsete ebaküpsete erütrotsüütide esinemissageduse suurenemine kemikaaliga kokkupuutunud loomades näitab, et kemikaal on tekitanud struktuurseid kromosoomaberratsioone või kromosoomiarvu muutusi.
                     Uudismoodustisena tekkinud mikrotuumadega erütrotsüüte määratakse ja loendatakse värvimise abil, millele järgneb kas visuaalne hindamine mikroskoobiga või automaatanalüüs. Piisava arvu ebaküpsete erütrotsüütide loendamist täiskasvanud loomade perifeerses veres või luuüdis hõlbustab oluliselt automaatse hindamisplatvormi kasutamine. Sellised platvormid on vastuvõetav alternatiiv käsitsi hindamisele (2). Võrdlevate uuringutega on näidatud, et selliste meetoditega, milles kasutatakse asjakohaseid kaliibrimisstandardeid, saab tagada parema laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ja tundlikkuse kui mikroskoobi abil käsitsi hindamisega (3, 4). Automatiseeritud süsteemid, millega saab mõõta mikrotuumadega erütrotsüütide sagedust, on läbivoolutsütomeetrid (5), kujutiste analüüsi platvormid (6, 7) ja laserskaneerimisega tsütomeetrid (8), kuid neid on veel muidki.
                     Kuigi seda kõnealuse katse raames tavaliselt ei tehta, saab kromosoomifragmente eristada terviklikest kromosoomidest rea kriteeriumide alusel. Need hõlmavad kinetohoori või tsentromeerse DNA olemasolu või puudumise kindlakstegemist; mõlemad on iseloomulikud terviklikele kromosoomidele. Kinetohoori või tsentromeerse DNA puudumine näitab, et mikrotuum sisaldab üksnes kromosoomifragmente; kui need on olemas, näitab see kromosoomide kaotsiminekut.
                     Kasutatud terminite määratlused on esitatud 1. liites.
                     LÄHTEKAALUTLUSED
                     Selle katse puhul on geneetilise kahjustuse sihtkoeks noorte täiskasvanud näriliste luuüdi, kuna erütrotsüüdid tekivad selles koes. Mikrotuumade määramiseks perifeerse vere ebaküpsetes erütrotsüütides võib kasutada ka muid imetajaliike, kui nende puhul on tõendatud piisav tundlikkus, mis võimaldab kindlaks teha kemikaale, mis põhjustavad struktuurseid kromosoomaberratsioone või kromosoomiarvu muutusi nendes rakkudes (tekitades mikrotuumasid ebaküpsetes erütrotsüütides), ja esitatakse teaduslik põhjendus. Mikrotuumadega ebaküpsete erütrotsüütide sagedus on peamine uuritav näitaja. Uuritava näitajana võib kasutada ka mikrotuumi sisaldavate perifeerse vere küpsete erütrotsüütide sagedust liigis, mille põrnas ei esine tugevat selektsiooni mikrotuumadega erütrotsüütide vastu ja kui loomadel on pidev kokkupuude kemikaaliga ajavahemiku jooksul, mis on pikem kui erütrotsüüdi eluiga asjaomases liigis (hiirte puhul näiteks neli nädalat või rohkem).
                     Kui on tõendeid selle kohta, et uuritav(ad) kemikaal(id) või metaboliit(metaboliidid) ei jõua sihtkoeni, ei pruugi käesoleva katse kasutamine olla asjakohane.
                     Enne kui meetodit hakatakse kasutama segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi saavutamiseks, tuleb kaaluda, kas sel viisil üldse saadakse sobivaid tulemusi selle eesmärgi jaoks, ja kui, siis miks. Sellist kaalumist ei ole vaja, kui regulatiivne nõue eeldabki segu katsetamist.
                     KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
                     Loomadele manustatakse uuritavat kemikaali sobiva manustamistee kaudu. Luuüdi kasutamise korral hukatakse loomad humaanselt sobival ajal pärast kemikaali manustamist; eraldatakse luuüdi, valmistatakse preparaadid ning värvitakse need (9–15). Kui kasutatakse perifeerset verd, võetakse veri sobival ajal pärast manustamist, valmistatakse preparaadid ja värvitakse need (12, 16–18). Kui kemikaal manustatakse lühikese aja jooksul, on oluline valida luuüdi või perifeerse vere proovide võtmiseks selline aeg, kus kemikaali toimel tekkinud mikrotuumsete ebaküpsete erütrotsüütide määramine on võimalik. Proovide võtmisel perifeersest verest peab olema möödunud piisavalt aega, et sellised ebaküpsed erütrotsüüdid oleksid jõudnud vereringesse. Preparaate analüüsitakse mikrotuumade esinemise määramiseks kas mikroskopeerides, läbivoolutsütomeetriaga või laserskaneeriva tsütomeetriaga.
                     LABORI PÄDEVUSE KONTROLLIMINE
                     
                        Pädevuse tõendamise katsed
                     
                     Enne katsete rutiinset tegemist peab labor tõendama, et tal on piisavalt kogemusi selle katse tegemiseks; selleks peab ta näitama, et suudab korrata mikrotuumade sageduse määramise kohta avaldatud töödes (17, 19–22) saadud tulemusi vähemalt kahe positiivse kontrolli kemikaaliga (kaasa arvatud positiivse kontrolli kemikaalide väikeste doosidega saadud nõrk toime), vt tabel 1, ja vastava vehiikuli/lahusti kontrolli katsega (vt punkt 26). Nendes katsetes tuleks kasutada doose, mis annavad reprodutseeritavaid ja doosist sõltuvaid suurenemisi ning tõendavad labori kasutatava hindamismeetodi puhul katsesüsteemi tundlikkust ja dünaamilist ulatust huvipakkuvas koes (luuüdi või perifeerne veri). Seda nõuet ei kohaldata kogemusega laborite puhul, see tähendab, kui on olemas varasemate katsete andmebaas, mis on määratletud punktides 14–18.
                     
                        Varasemad kontrolli andmed
                     
                     Pädevuse tõendamise katsete käigus peab labor kindlaks tegema:
                     
                                 —
                              
                              
                                 varasemate positiivse kontrolli katsete väärtuste vahemiku ja jaotuse ning
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 varasemate negatiivse kontrolli katsete väärtuste vahemiku ja jaotuse.
                              
                           Kui hakatakse saama tulemusi varasemate negatiivse kontrolli andmete jaotuse kohta, peaksid negatiivse kontrolli paralleelide väärtused olema kooskõlas kontrolli katsete avaldatud andmetega (kus need on avaldatud). Kui varasemate kontrolli katsete jaotusele lisatakse uusi eksperimendiandmeid, peaksid paralleelsete negatiivse kontrolli katsete tulemused ideaaljuhul olema selle jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 %. Labori varasemate negatiivse kontrolli katsete andmebaas peaks olema statistiliselt usaldusväärne, et laboril oleks võimalik hinnata oma negatiivse kontrolli andmete jaotust. Kirjanduse põhjal läheb vaja vähemalt kümmet katset, kuid parem oleks, kui andmebaasis oleksid vähemalt 20 võrreldavates tingimustes tehtud katse tulemused. Laboritel tuleb kasutada kvaliteedikontrolli meetodeid, selliseid nagu kontrollkaardid (nt vastavuse kontrollkaardid või X-tüüpi kontrollkaardid (23)), et määrata, kui suures ulatuses nende andmed varieeruvad, ja tõendada, et metoodika on laboris „kontrolli all“. Täiendavaid soovitusi selle kohta, kuidas koguda ja kasutada varasemaid andmeid (st varasemate andmete andmebaasi võtmise või sellest väljajätmise kriteeriumid ja konkreetse katse vastuvõetavuse kriteeriumid), võib leida kirjandusest (24).
                     Kui labor ei tee piisavat arvu katseid, et saada statistiliselt usaldusväärne negatiivse kontrolli jaotus (vt punkt 15) pädevuskontrolli katsete käigus (kirjeldatud punktis 13), siis on lubatud selle jaotuse kindlakstegemine esimeste rutiinsete katsetega. Sellise lähenemisviisi kasutamisel tuleks järgida kirjanduses (24) esitatud soovitusi ja negatiivse kontrolli katsetes saadud tulemused peaksid olema kooskõlas avaldatud negatiivse kontrolli andmetega.
                     Katse-eeskirja igasuguse muutmise puhul tuleks arvestada, kuidas see võib mõjutada saadavate andmete kooskõla labori varasemate kontrolli katsete tulemuste andmebaasiga. Ainult suurte vastuolude tekkimise puhul tuleks koostada uus varasemate kontrolli katsete tulemuste andmebaas, kui ekspertteadmiste alusel tehakse kindlaks, et uus jaotus erineb varasemast jaotusest (vt punkt 15). Uue andmebaasi koostamise ajal ei ole ühe konkreetse katse tegemiseks täielikku negatiivsete kontrolli katsete tulemuste andmebaasi vaja siis, kui labor suudab tõendada, et nende negatiivse kontrolli paralleelkatsete väärtused on kooskõlas kas nende varasema andmebaasiga või vastavate avaldatud andmetega.
                     Negatiivse kontrolli andmed peaksid sisaldama mikrotuumsete ebaküpsete erütrotsüütide esinemise sagedust iga looma puhul. Negatiivse kontrolli paralleelide tulemused peaksid ideaaljuhul olema labori varasemate kontrolli katsete jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 %. Kui negatiivse kontrolli paralleelkatsete tulemused jäävad väljapoole usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %, võivad need olla varasemate kontrolli katsete jaotuses arvessevõtmiseks vastuvõetavad juhul, kui tegemist ei ole äärmusliku võõrväärtusega ning on tõendatud, et katsesüsteem on „kontrolli all“ (vt punkt 15), ja ei ole tõendeid, et tegemist on tehnilise vea või inimliku eksitusega.
                     MEETODI KIRJELDUS
                     
                        Ettevalmistus
                     
                     
                        Loomaliigi valimine
                     
                     Kasutada tuleks tavapärastest laboriliinidest pärit terveid noori loomi. Kasutada võib hiiri, rotte või muid sobivaid imetajaliike. Kui kasutatakse perifeerset verd, tuleb kindlaks teha, et valitud loomaliigi puhul ei takista mikrotuumsete rakkude vereringest eemaldamine põrna poolt tekkinud mikrotuumsete rakkude kindlakstegemist. See on kindlalt tõendatud roti ja hiire perifeerse vere puhul (2). Katseprotokollis tuleb esitada teaduslik põhjendus, miks kasutati muud liiki kui rott või hiir. Kui kasutatakse muud loomaliiki kui närilisi, on soovitatav, et kemikaali põhjustatud mikrotuumade mõõtmine oleks integreeritud muusse sobivasse toksilisuskatsesse.
                     
                        Loomade pidamis- ja söötmistingimused
                     
                     Näriliste puhul peaks pidamisruumi temperatuur olema 22 °C (± 3 °C). Kuigi suhteline niiskus peaks ideaaljuhul olema 50–60 %, peaks see olema vähemalt 40 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, v.a ruumi koristamise ajal. Kasutatakse tehisvalgustust, valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada uuritava kemikaali sobiv lisamine söödasse, kui kemikaali manustatakse sellisel viisil. Närilisi tuleb pidada väikestes rühmades (kuni viis looma puuris), igas puuris on samast soost ja sama katserühma loomad, kui ei eeldata agressiivset käitumist; eelistatavalt peaksid puurid olema kõva põrandaga, sobivalt mitmekesistatud keskkonnaga. Loomi võib üksikult pidada ainult siis, kui see on teaduslikult põhjendatud.
                     
                        Loomade ettevalmistamine
                     
                     Tavaliselt kasutatakse terveid noori täiskasvanud loomi (näriliste puhul ideaaljuhul soovitatavalt 6–10nädalased, kuigi lubatud on ka veidi vanemad loomad), kes jagatakse juhuvaliku alusel kontrolli- ja katserühmadesse. Iga loom saab kordumatu identimismärgistuse, mille tegemiseks kasutatakse humaanset võimalikult vähe invasiivset meetodit (nt rõngastamine, märgistamine, mikrokiipimine või biomeetriline tuvastamine, kuid mitte kõrva sälkamine või varba köndistamine) ning loomadel lastakse vähemalt viis päeva laboritingimustega kohaneda. Puurid paigutatakse nii, et puuri asukohast tingitud mõju on võimalikult väike. Positiivse kontrolli ja uuritava kemikaali omavahelist ristsaastumist tuleks vältida. Katse alguses peavad loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ning mitte erinema üle ± 20 % kummagi soo keskmisest massist.
                     
                        Dooside valmistamine
                     
                     Tahke uuritav kemikaal tuleb lahustada või suspendeerida sobivas lahustis või vehiikulis või segada sööda sisse või joogivette enne loomadele andmist. Vedelat uuritavat kemikaali võib manustada vahetult või lahjendada enne manustamist. Sissehingamise kaudu toimuva kokkupuute korral manustatakse uuritavat kemikaali gaasi, auru või tahke/vedela disperse faasiga aerosoolina, sõltuvalt kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest. Kasutada tuleks uuritava kemikaali värskeid valmistisi, välja arvatud juhul, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav ja on määratletud sobivad säilitamistingimused.
                     
                        Katsetingimused
                     
                     
                        Lahusti/vehiikul
                     
                     Lahusti/vehiikul avaldada toksilist toimet korral kasutatavate dooside korral ega keemiliselt reageerida uuritava kemikaaliga. Kui kasutatakse tuntud lahustist/vehiikulist erinevat lahustit või ainet, peab olema võrdlusandmetega näidatud, et see on sobiv. Kui vähegi võimalik, on kõigepealt soovitatav kaaluda vesilahustuva lahusti/vehiikuli kasutamist. Tavaliselt kasutatavad lahustid/kandeained on näiteks vesi, füsioloogiline keedusoolalahus, metüültselluloosi lahus, karboksümetüültselluloosi naatriumsoola lahus, oliiviõli ja maisiõli. Kui ei ole varasemaid või kirjanduses avaldatud kontrolli andmeid, mis näitaksid, et valitud ebatüüpiline lahusti/vehiikul ei põhjusta mikrotuumade moodustumist ega muid kahjulikke tagajärgi, tuleks kõigepealt teha esialgne katse, et näidata lahusti/vehiikuli sobivust lahusti/vehiikuli kontrolli katses.
                     
                        Kontrollid
                     
                     
                        Positiivsed kontrollid
                     
                     Igasse katsesse peab tavaliselt lisama positiivse kontrolli kemikaaliga kokku puutuva loomade rühma. Sellest võib loobuda juhul, kui katselabor on tõendanud kõnealuse katse läbiviimise pädevust ja on kindlaks teinud varasemate katsete positiivse kontrolli väärtuste vahemiku. Kui paralleelset positiivse kontrolli rühma ei kasutata, tuleb igas katses teha hindamise kontrolli katseid (fikseeritud ja värvimata mikroskoobipreparaadid või rakususpensioonide proovid, sõltuvalt sellest, mis on hindamismeetodi asjakohane). Neid võib saada sobivate võrdlusstandardite hindamise lisamisega uuringu hindamistesse; selliseid võrdlusstandardeid saadakse eraldi positiivse kontrolli katsega, mida tehakse korrapäraselt (nt iga 6–18 kuu tagant) ja millega saadud materjale selleks alles hoitakse; näiteks kasutatakse tasemekatsete materjale ja seejärel tehakse selleks katseid korrapäraselt vastavalt vajadusele.
                     Positiivse kontrolli kemikaalid peavad usaldusväärselt põhjustama mikrotuumade sageduse määratava suurenemise, võrreldes mikrotuumade spontaanse esinemissagedusega. Mikroskoobiga hindamise korral tuleks positiivse kontrolli doosid valida nii, et nende toime oleks selge, kuid hindaja ei tohiks kodeeritud preparaatide hulgas kontrolli katset siiski kohe ära tunda. Positiivse kontrolli kemikaali manustamiseks on lubatud kasutada ka muud manustamisteed kui uuritava kemikaali puhul, muu manustamisskeemi kasutamine ja proovide võtmine võib toimuda ka ainult ühel ajahetkel. Võimaluse korral tuleks kaaluda selliste positiivse kontrolli kemikaalide kasutamist, mis kuuluvad samasse kemikaalide rühma kui uuritav kemikaal. Tabelis 1 on esitatud mõned positiivse kontrolli kemikaalide näited.
                     
                        Tabel 1
                     
                     
                        Positiivse kontrolli kemikaalide näited.
                     
                     Kemikaal ja CASi nr
                     Etüülmetaansulfonaat [CASi nr 62-50-0]
                     Metüülmetaansulfonaat [CASi nr 66-27-3]
                     Etüülnitrosokarbamiid [CASi nr 759-73-9]
                     Mitomütsiin C [CASi nr 50-07-7]
                     Tsüklofosfamiid (monohüdraat) [CASi nr 50-18-0 (CASi nr 6055-19-2)]
                     Trietüleenmelamiin [CASi nr 51-18-3]
                     Kolhitsiin [CASi nr 64-86-8] või vinblastiin [CASi nr 865-21-4] kui aneugeenid
                     
                        Negatiivsed kontrollid
                     
                     Igal proovivõtukorral tuleks võtta proovid ka negatiivse kontrolli rühma loomadelt, keda muidu tuleks käidelda kui katserühma kuuluvaid loomi, selle erinevusega, et neile ei manustata uuritavat kemikaali. Kui uuritava kemikaali manustamisel kasutatakse lahustit/vehiikulit, tuleb kontrollrühmale manustada sedasama lahustit/vehiikulit. Kui igal proovivõtu korral on loomadevahelise varieeruvuse ja mikrotuumadega rakkude esinemissagedus andmed siiski olnud tõendatult kooskõlas katselabori varasemates katsetes saadud negatiivse kontrolli andmetega, võib negatiivse kontrolli jaoks vaja minna ainult ühte proovivõttu. Kui negatiivse kontrolli puhul kasutatakse ainult ühte proovivõttu, peab see toimuma katse esimese proovivõtu ajal.
                     Kui kasutatakse perifeerset verd, võib lühiajalise uuringu korral enne kemikaali manustamist võetud proovi kasutada paralleelse negatiivse kontrollina, kui saadud tulemused on kooskõlas sama labori varasemate kontrollikatsete tulemuste andmebaasiga. Rottide puhul on näidatud, et väikese ruumalaga proovide (nt alla 100 μl päevas) võtmisel on minimaalne mõju mikrotuumade taustsagedusele (25).
                     KATSE KÄIK
                     
                        Loomade arv ja sugu
                     
                     Üldiselt on mikrotuumade tekke reaktsioon isas- ja emasloomadel sarnane ja seepärast võib enamiku uuringuid teha ükskõik kummast soost loomadega (26). Andmed, millest nähtuks isas- ja emasloomade vaheline erinevus (nt süsteemse toksilisuse, metabolismi, biosaadavuse, luuüdi suhtes avalduva toksilisuse jne erinevus, sealhulgas nt annusevahemiku uuringu andmed), toetaksid kummastki soost loomade kasutamist. Sellisel juhul võib olla asjakohane teha uuring kummastki soost loomadega, näiteks osana korduvdoosi toksilisuse uuringust. Kui kasutatakse mõlemast soost loomi, võib olla asjakohane kasutada mitme faktori määramist võimaldavat katseplaani. Üksikasjad selle kohta, kuidas sellise katseplaani puhul andmeid analüüsida, on esitatud 2. liites.
                     Uuringu alguses tuleks moodustada nii suured rühmad, et igas rühmas oleks viis analüüsitavat looma ühest soost või kummastki soost, kui kasutatakse mõlemast soost loomi. Kui inimese kokkupuude kemikaalidega võib olla soospetsiifiline, nagu näiteks mõnede ravimite puhul, tehakse katse vastavast soost loomadega. Luuüdi uuringuks, mis viiakse läbi punktis 37 sätestatud näitajate määramiseks kolme doosirühma ning paralleelsete negatiivse ja positiivse kontrolli rühmadega (millest igaühesse kuuluvad viis samast soost looma), kulub loomadega seotud kõige tüüpilisemate nõuete kohaselt 25–35 looma.
                     
                        Doosid
                     
                     Kui tehakse vahemiku leidmise eeluuring, sest sobivaid andmeid doosi valimiseks ei ole, tuleb see teha samas laboris, kasutades sama loomaliiki, -liini, sugu ja manustamiskava, mida kasutatakse põhiuuringus (27). Uuringu eesmärk on kindlaks määrata maksimaalne talutav doos (maximum tolerated dose, MTD), mis on suurim doos, mida loomad suudavad taluda uuringu ajavahemiku jooksul ilma, et neil avalduks uuringut piirava toksilisuse nähte (näiteks väheneb neil kehamass või avaldub tsütotoksiline mõju vereloomesüsteemi suhtes, kuid see ei kutsu veel esile surma ega selliseid valu, piinlemist või kannatusi, mis nõuaksid loomade humaanset hukkamist (28)).
                     Suurima doosi võib samuti määratleda kui doosi, mis avaldab toksilist toimet luuüdile (näiteks vähendab ebaküpsete erütrotsüütide osakaalu luuüdis või perifeerses veres rohkem kui 50 % erütrotsüütide üldarvust, kuid mitte väiksema väärtuseni kui 20 % kontrolli väärtusest). Kui analüüsitakse CD71-positiivseidrakke perifeerses vereringes (läbivoolutsütomeetria abil), reageerib see väga noorte ebaküpsete erütrotsüütide fraktsioon toksilise kemikaaliga mõjutamisele siiski kiiremini kui ebaküpsete erütrotsüütide RNA-positiivne suurem fraktsioon. Seetõttu võib akuutset kokkupuudet hõlmava katsekorralduse korral avalduda suurem näiline toksilisus, kui mõõdetakse CD71-positiivsete ebaküpsete erütrotsüütide fraktsiooni, võrreldes sellise katsekorraldusega, kus ebaküpseid erütrotsüüte määratakse RNA-sisalduse järgi. Kui katses kasutatakse sellist kokkupuudet kemikaaliga, mis kestab viis päeva või vähem, võib toksilise toimega uuritavate kemikaalide suurima doosi määratleda kui doosi, mis põhjustab CD71-positiivsete ebaküpsete erütrotsüütide osakaalu statistiliselt olulise vähenemise erütrotsüütide üldarvus, kuid mitte väiksema väärtuseni kui 5 % kontrolli väärtusest (29).
                     Kemikaalid, mille toksiko-kineetilistes omadustes esineb küllastumine, või mis põhjustavad selliseid detoksifitseerimisprotsesse, mille tõttu kokkupuude võib väheneda pärast pikaajalist manustamist, võivad olla doosi määramise kriteeriumide seisukohast erandlikud ning neid tuleks hinnata iga üksikjuhtumi puhul eraldi.
                     Selleks et saada teavet doosi ja toime seose kohta, peaks täielik uuring hõlmama negatiivse kontrolli rühma ja vähemalt kolme doositaset, mis tavaliselt erinevad üksteisest kaks korda, kuid mitte rohkem kui neli korda. Kui doosivahemiku leidmise uuringus või olemasolevate andmete põhjal ei põhjusta uuritav kemikaal toksilisust, tuleks 14-päevase või pikema manustamisperioodi puhul kasutada suurimat doosi 1 000 mg kehamassi kg kohta päevas, 14 päevast lühema manustamisperioodi puhul aga 2 000 mg kehamassi kg kohta päevas. Kui uuritava kemikaali puhul avaldub toksiline toime, peaks suurim manustatav doos olema MTD ning muud kasutatavad doositasemed peaksid eelistatult hõlmama vahemikku MTD-st kuni vähese toksilisusega või ilma toksilise toimeta doosini. Kui toksilisust sihtkoe (luuüdi) suhtes täheldatakse kõikide katses kasutatud dooside korral, on soovitatav teha katse ka mittetoksilise doosiga. Uuringute puhul, millega tahetakse täielikult iseloomustada kvantitatiivset doosi-toime sõltuvust, võib vaja minna täiendavaid doosirühmasid. Teatavat tüüpi uuritavate kemikaalide (näiteks inimtervishoius kasutatavate ravimite) puhul, millele kohaldatakse erinõudeid, võivad need piirmäärad olla teistsugused.
                     
                        Piirsisalduskatse
                     
                     Kui doosipiirkonna leidmise katsetega või lähedasi loomaliine käsitlevatest andmetest on saadud tõendeid, et piirdoosi manustamise katses (kirjeldatud allpool) ei ole uuritaval kemikaalil sedastatavat toksilist toimet (sealhulgas luuüdirakkude paljunemise vähenemist ega muid tõendeid sihtkoe suhtes avalduva tsütotoksilisuse suhtes), ja kui genotoksilisust ei ole alust eeldada in vitro genotoksilisuse uuringute või sarnase struktuuriga kemikaalide andmete põhjal, võib täielikku kolme doositasemega uuringut pidada ebavajalikuks, kui on tõendatud, et uuritav kemikaal jõuab (uuritavad kemikaalid jõuavad) sihtkoesse (luuüdisse). Sellistel juhtudel võib olla piisav ühe doosiga nn piirsisalduskatse. Kui manustamine kestab 14 päeva või rohkem, on piirdoos 1 000 mg kehakaalu kg kohta päevas. Kui manustamisperiood on vähem kui 14 päeva, on piirdoos 2 000 mg kehakaalu kg kohta päevas.
                     
                        Dooside manustamine
                     
                     Katse kavandamisel tuleks silmas pidada inimese võimalikku kokkupuuteviisi. Seepärast võib vastavalt põhjendatusele kasutada selliseid manustamisviise nagu manustamine söödaga, joogiveega, paikselt naha alla, veenisiseselt, suu kaudu (toitmissondiga), inhalatsiooniga, intratrahheaalselt või implantatsiooniga. Igal juhul tuleb manustamistee valikuga tagada kemikaali adekvaatne kokkupuude sihtkoega (-kudedega). Tavaliselt ei soovitata intraperitoneaalset süstimist, kuna see ei ole inimese puhul ette nähtud kokkupuute viis, ning seda tuleks kasutada ainult konkreetse teadusliku põhjendatuse korral. Kui uuritav kemikaal segatakse sööda sisse või joogivette, eriti üheainsa doosi manustamise korral, tuleks jälgida, et sööda ja vee tarbimise ning proovide võtmise vahel oleks ajavahemik, mis oleks piisav, et võimaldada toime tuvastamist (vt punkt 37). Vedeliku suurim kogus, mida saab toitmissondi kaudu või süstides ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Tavaliselt ei tohiks kogus ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, kus võib kasutada kogust 2 ml 100 g kehamassi kohta. Suurema koguse kasutamise korral tuleb seda põhjendada. Kui jätta kõrvale ärritavad või söövitavad kemikaalid, mille toime on suurema kontsentratsiooni korral tavaliselt tugevam, tuleks katses vedeliku ruumala varieeruvust minimeerida ja reguleerida kontsentratsioone nii, et kõiki doose manustataks kehamassi suhtes ühesuguse lahusekogusega.
                     
                        Manustamiskava
                     
                     Eelistatavalt tuleks kemikaali manustada kaks või rohkem korda, 24-tunniste vahedega, eriti kui katse ühendatakse muude toksilisuse uuringutega. Alternatiivina võib kemikaali manustada ühe korraga, kui see on teaduslikult põhjendatud (nt kui uuritav kemikaal teadaolevalt blokeerib rakutsükli). Uuritavaid kemikaale võib manustada ka jagatud doosina, näiteks kaks manustamist ühel päeval mitte rohkem kui 2–3-tunnise vahega, et hõlbustada lahuse suure ruumala manustamist. Sellistel asjaoludel, või kui uuritavat kemikaali manustatakse sissehingamisega, tuleks proovide võtmise aeg kavandada selle põhjal, millal toimus viimane manustamine või lõpetati kokkupuude.
                     Katse võib teha hiirte või rottidega ühel viisil järgmistest kolmest:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 Loomi mõjutatakse uuritava kemikaaliga ühel korral. Luuüdi proovid võetakse vähemalt kahel korral (sõltumatutest loomarühmadest), alustades mitte varem kui 24 tundi pärast manustamist, kuid mitte hiljem kui 48 tundi pärast manustamist, ning jäetakse sobivad ajavahemikud proovide vahele, kui ei ole teada, et uuritava kemikaali poolestusaeg on erakordselt pikk. Proovide võtmist varem kui 24 tundi pärast manustamist tuleb põhjendada. Perifeerse vere proovid võetakse vähemalt kahel korral (ühest ja samast loomarühmast), alustades mitte varem kui 36 tundi pärast manustamist ning jättes esimese proovivõtu järele sobiva(d) ajavahemiku(d); viimane proov võetakse mitte hiljem kui 72 tundi pärast manustamist. Esimese proovivõtu ajal tuleb kõigile doosirühmadele manustada uuritav kemikaal ja kõigilt kogutakse proovid analüüsimiseks; järgmistel proovivõtukordadel tuleb manustada üksnes suurimat doosi. Kui positiivne tulemus on tuvastatud ühel proovivõtukorral, siis lisaproove ei ole vaja võtta, kui ei vajata kvantitatiivset teavet doosi-toime seosest. Kirjeldatud proovivõtuajad tulenevad mikrotuumade ilmumise ja kadumise kineetikast nendes kahes koekompartmendis.
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 Kui kasutatakse kahte või enamat manustamist sagedusega üks kord päevas (nt kaks manustamist 24-tunnise intervalliga), võetakse luuüdi proovid üks kord 18–24 tundi pärast viimast manustamist ja perifeerse vere proovid üks kord 36–48 tundi pärast viimast manustamist (30). Kirjeldatud proovivõtuajad tulenevad mikrotuumade ilmumise ja kadumise kineetikast nendes kahes koekompartmendis.
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 Kui kasutatakse kolme või enamat manustamist sagedusega üks kord päevas (nt kolm või enam manustamist ligikaudu 24 tunni järel), tuleb luuüdi proovid võtta hiljemalt 24 tundi pärast viimast manustamist ja perifeerse vere proovid tuleb võtta hiljemalt 40 tundi pärast viimast manustamist (31). Selline manustamisviis võimaldab kombineerida nn komeedikatse (nt proovide võtmine 2–6 tundi pärast viimast manustamist) ja mikrotuumade tekke katse ning siduda mikrotuumade tekke katse korduvdoosi toksilisuse uuringutega. Kogutud andmed on näidanud, et mikrotuumade tekke indutseerimist võib jälgida nende pikemate ajavahemike jooksul, kui kemikaali on manustatud kolm või enam korda (15).
                              
                           Võib kasutada ka muid dooside manustamise ja proovide võtmise ajakavasid, kui need on asjakohased ja teaduslikult põhjendatud ning hõlbustavad katsete ühendamist muude toksilisuse määramise katsetega.
                     
                        Vaatlus
                     
                     Vähemalt üks kord päevas, eelistatult igal päeval samal ajal ning võttes arvesse ajavahemikku, kui eeldatav toime avaldub pärast manustamist kõige intensiivsemalt, tuleb teha katseloomade üldisi kliiniline vaatlus ja registreerida kõik kliinilised sümptomid. Haigestumise ja surmajuhtude tuvastamiseks tuleb kemikaali manustamise perioodil kõik loomad vähemalt kaks korda päevas üle vaadata. Kõik loomad tuleb kaaluda uuringu alguses, vähemalt kord nädalas korduvdoosi uuringute ajal ja pärast eutanaasiat. Kui uuring kestab vähemalt ühe nädala, tuleb vähemalt kord nädalas mõõta sööda tarbimist. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleb vee tarbimist mõõta pärast iga veevahetust ja vähemalt üks kord nädalas. Loomad, kellel avalduvad surmavaga mitte lõppeva raske toksilisuse nähud, tuleb humaanselt hukata enne katse lõppu (28). Teatavate asjaolude puhul võiks jälgida loomade kehatemperatuuri, kuna kemikaali manustamisest tingitud hüper- või hüpotermiat on seostatud ekslike tulemuste põhjustamisega (32–34).
                     
                        Sihtkoe kokkupuude
                     
                     Sobival ajal (sobivatel aegadel) tuleb võtta vereproov, et mõõta uuritava kemikaali sisaldust vereplasmas, selleks et tõendada, et luuüdi kokkupuude on tõesti toimunud, kui muid andmeid kokkupuute kohta ei ole olemas (vt punkt 48).
                     
                        Luuüdi-/verepreparaat
                     
                     Luuüdirakud eraldatakse tavaliselt loomade reie- või sääreluudest vahetult pärast humaanset eutanaasiat. Rakud eraldatakse, prepareeritakse ja värvitakse enamasti kindlakskujunenud meetoditega. Loomade heaolu standarditega kooskõlas võib perifeerse vere väikse ruumalaga proove võtta, kas meetodiga, mis võimaldab katselooma ellu jätta, näiteks vere võtmine sabaveenist või muust sobivast veresoonest, või südamepunktsiooniga või proovi võtmisega suurest veresoonest looma eutanaasia ajal. Luuüdist või perifeersest verest saadud erütrotsüütide puhul võib, olenevalt analüüsimeetodist, rakud kohe värvida supravitaalvärvide abil (16–18), teha äigepreparaadid ja seejärel värvida mikroskoopia jaoks või fikseerida ja värvida rakud sobivalt läbivoolutsütomeetria analüüsi jaoks. DNA-spetsiifilise värvaine kasutamisega (nt akridiinoranž (35) või Hoechst 33258 pluss püroniin-Y (36)) võib vältida mõne muu kui DNA-spetsiifilise värvaine kasutamisega seotud artefakte. See eelis ei välista aga tavaliste värvainete kasutamist (nt Giemsa mikroskoopiliseks analüüsiks). Täiendavaid süsteeme (nt tsellulooskolonne tuumaga rakkude eemaldamiseks (37, 38)) saab samuti kasutada tingimusel, et laboris on tõendatud kõnealuste süsteemide ühildatavus preparaatide valmistamisega.
                     Kui kõnealused meetodid on kohaldatavad, võib kinetohoorivastaseid antikehi (39), in situ fluorestsentshübriidimist pantsentromeersete DNA proovidega (40) või praimerite põhist in situ märgistamist pantsentromeersete praimeritega koos DNA asjakohase kontrastvärvimisega (41) kasutada, et määrata, mida mikrotuumad sisaldavad (kromosoom/kromosoomifragment), et teha kindlaks, kas mikrotuumade tekke põhjus on klastogeenne või aneugeenne protsess. Klastogeenide ja aneugeenide eristamiseks võib kasutada muid meetodeid, mille kohta on tõendatud, et need on tõhusad.
                     
                        Analüüs (manuaalne ja automaatne)
                     
                     Kõik analüüsitavad mikroskoobipreparaadid või proovid, sh positiivsete ja negatiivsete kontrollide omad, kodeeritakse sõltumatult enne analüüsi ja need tuleb randomiseerida, et käsitsi hindaja ei teaks, millise kokkupuutetasemega on proovi puhul tegemist; selline kodeerimine ei ole vajalik, kui kasutatakse automaatsüsteeme, mis ei põhine visuaalsel vaatlusel ja mida hindaja kallutatus ei saa mõjutada. Iga looma kohta määratakse ebaküpsete erütrotsüütide osakaal erütrotsüütide koguhulgast (ebaküpsed + küpsed), loendades kokku vähemalt 500 erütrotsüüti luuüdist ja 2 000 erütrotsüüti perifeersest verest (42). Ebaküpsete mikrotuumsete erütrotsüütide esinemissageduse määramiseks hinnatakse looma kohta vähemalt 4 000 ebaküpset erütrotsüüti (43). Kui varasemad negatiivse kontrolli andmed andmebaasis näitavad, et mikrotuumsete erütrotsüütide esinemise keskmine taustsagedus asjaomases laboris on < 0,1 %, tuleks kaaluda täiendavate rakkude hindamist. Proovide analüüsimisel ei tohiks ebaküpsete erütrotsüütide osakaal erütrotsüütide üldarvust olla väiksem kui 20 % vastavast osakaalust lahusti/vehiikuli kontrolli katsetes mikroskoobi abil hindamise puhul ja mitte väiksem kui ligikaudu 5 % vastavast osakaalust lahusti/vehiikuli kontrolli katsetes, kui näitajat CD 71+ ebaküpsed erütrotsüüdid hinnatakse tsütomeetriliste meetoditega (vt punkt 31) (29). Näiteks kui luuüdi katset hinnatakse mikroskoobi abil ja kui kontrolli katses on ebaküpsete erütrotsüütide osakaal luuüdis 50 %, oleks toksilisuse ülempiir 10 % ebaküpseid erütrotsüüte.
                     Kuna roti põrn peab kinni ja hävitab mikrotuumseid erütrotsüüte, oleks analüüsi suure tundlikkuse säilitamiseks roti perifeerse vere analüüsimise puhul soovitatav piirduda mikrotuumsete ebaküpsete erütrotsüütide kõige noorema fraktsiooni analüüsimisega. Automatiseeritud analüüsimeetodite kasutamise korral võib neid kõige ebaküpsemaid erütrotsüüte teha kindlaks nende suure RNA-sisalduse järgi või nende pinnal ekspresseeritud transferriiniretseptorite (CD71+) suure arvu järgi (31). Erinevate värvimismeetodite otsene võrdlus on siiski näidanud, et häid tulemusi on võimalik saada mitmesuguste meetoditega, sealhulgas tavapärase akridiinoranžiga värvimise abil (3, 4).
                     ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                     
                        Andmete töötlemine
                     
                     Andmed üksikute loomade kohta esitatakse tabelina. Iga analüüsitava looma kohta tuleb eraldi esitada ebaküpsete erütrotsüütide arv, mikrotuumadega ebaküpsete erütrotsüütide arv ja ebaküpsete erütrotsüütide osakaal erütrotsüütide üldarvust. Kui uuritavat kemikaali manustatakse hiirtele järjest neli nädalat või rohkem, tuleb esitada andmed ka mikrotuumsete küpsete erütrotsüütide arvu ja osakaalu kohta, kui neid on kogutud. Samuti tuleb esitada andmed toksilisuse kohta ja kliinilised sümptomid.
                     
                        Katse nõuetekohasuse kriteeriumid
                     
                     Katse nõuetekohasuse kriteeriumid on järgmised:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 paralleelse negatiivse kontrolli tulemused loetakse sobivaks selleks, et need lisada labori varasemate tulemuste andmebaasi (vt punktid 15–18);
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 paralleelse positiivse kontrolli tulemused või hindamise kontrolli tulemused peaksid näitama toimet, mis on võrreldav varem laboris saadud positiivse kontrolli tulemustega, ning põhjustama statistiliselt olulist suurenemist, võrreldes paralleelse negatiivse kontrolli tulemustega (vt punktid 24–25);
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 analüüsitud peab olema vajalik arv doose ja rakkusid;
                              
                           
                                 d.
                              
                              
                                 suurima doosi valimise kriteeriumid on kooskõlas kriteeriumidega, mida on kirjeldatud punktides 30–33.
                              
                           
                        Tulemuste hindamine ja tõlgendamine
                     
                     Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritav kemikaal selgelt positiivseks, kui:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 vähemalt ühes doosirühmas esineb ebaküpsete mikrotuumsete erütrotsüütide esinemissageduse statistiliselt oluline suurenemine, võrreldes paralleelse negatiivse kontrolliga;
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 see suurenemine sõltub doosist vähemalt ühel proovide võtmise ajal, kui seda hinnatakse sobiva trenditestiga, ning
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 ükski nendest tulemustest ei ole väljaspool labori varasemate negatiivse kontrolli katsete jaotust (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %).
                              
                           Kui teataval proovivõtuajal uuritakse üksnes suurimat doosi, loetakse konkreetne uuritav kemikaal selgelt positiivseks, kui tuvastatakse statistiliselt oluline suurenemine, võrreldes paralleelse negatiivse kontrolliga, ja tulemused on väljaspool labori varasemate negatiivse kontrolli andmete jaotust (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %). Soovitusi kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta võib leida kirjandusest (44–47). Doosi-toime analüüsi tegemise korral tuleks analüüsida vähemalt kolme doosirühma. Statistiliste testide puhul tuleb ühte looma lugeda katseühikuks. Mikrotuumade tekke katse positiivsed tulemused viitavad sellele, et uuritav kemikaal indutseerib mikrotuumade teket; mikrotuumad tekivad katsealuse loomaliigi erütroblastide kromosoomide või mitoosiaparaadi kahjustuse tagajärjel. Kui tehakse katse, et kindlaks teha tsentromeeride olemasolu mikrotuumades, on uuritav kemikaal, mis tekitab tsentromeeri sisaldavaid mikrotuumasid (tsentromeerne DNA või kinetohoor, mis viitab terve kromosoomi kaotusele), tõendiks, et uuritav kemikaal on aneugeen.
                     Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritav kemikaal selgelt negatiivseks, kui kõikides uuritud katsetingimustes:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 mitte üheski doosirühmas ei esine ebaküpsete mikrotuumsete erütrotsüütide esinemissageduse statistiliselt olulist suurenemist, võrreldes paralleelse negatiivse kontrolliga;
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 doosist sõltuvat suurenemist ei esine ühelgi proovivõtuajal, kui selle hindamiseks kasutatakse sobivat trenditesti;
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 kõik need tulemused on labori varasemate negatiivse kontrolli katsete jaotuse vahemikus (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 %), ning
                              
                           
                                 d.
                              
                              
                                 toimus luuüdi kokkupuude uuritava kemikaaliga.
                              
                           Soovitusi kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta võib leida kirjandusest (44–47). Tõend luuüdi kokkupuutest uuritava kemikaaliga võib olla ebaküpsete ja küpsete erütrotsüütide proportsiooni vähenemine või uuritava kemikaali kontsentratsiooni mõõtmine vereplasmas või veres. Intravenoosse manustamise puhul ei ole tõendeid kokkupuute kohta vaja esitada. Teise võimalusena võib luuüdi kokkupuute tõendamiseks kasutada uuritava kemikaali imendumise, jaotumise, metabolismi ja eritumise (ADME) andmeid, mis on saadud sõltumatu uuringuga, milles on kasutatud sama manustamisviisi ja loomaliiki. Negatiivsed tulemused viitavad sellele, et antud katsetingimustes ei põhjusta kemikaal katsealuse loomaliigi ebaküpsetes erütrotsüütides mikrotuumade teket.
                     Selget positiivset või selget negatiivset vastust ei ole vaja kinnitada.
                     Juhul kui vastus ei ole negatiivne ega positiivne ning selleks, et aidata mõista tulemuse (nt vähese või piiripealse suurenemise) bioloogilist olulisust, tuleb andmetele anda eksperdihinnang ja/või uurida lõpetatud katsest saadud tulemusi edasi. Mõnel juhul võib olla kasulik analüüsida rohkem rakke või teha korduskatse, kasutades muudetud katsetingimusi.
                     Harvadel juhtudel ei võimalda isegi edasiste uuringutega saadud andmed teha järeldust, kas uuritava kemikaaliga saadi positiivne või negatiivne tulemus, sel juhul loetakse, et tulemus on ebaselge.
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kokkuvõte
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritav kemikaal:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             allikas, partii number, aegumise kuupäev, kui see on teada;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali stabiilsus, kui see on teada.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ühest koostisosaga aine:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             välimus, lahustuvus vees ja täiendavad asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             keemilised identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus ja CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, lisandite keemiline laad vajaduse ja praktilise teostatavuse korral jne.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid ja segud:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             iseloomustatakse võimaluste piires keemiliste identifitseerimisandmete (vt eespool), kvantitatiivse sisalduse ja asjakohaste füüsikalis-keemiliste omaduste kaudu.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritava kemikaali preparaadi valmistamine:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             vehiikuli valiku põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis/vehiikulis, kui on teada;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             sööda, joogivee või sissehingamise kaudu manustamiseks sobiva koostisega preparaadivormi valmistamine;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             osutatud koostiste analüüsid (nt, stabiilsus, homogeensus, nominaalsed kontsentratsioonid), kui neid on tehtud.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katseloomad:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud liik/liin ja selle kasutamise põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             loomade arv, vanus ja sugu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             meetod loomade üheseks identifitseerimiseks;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             lühiajaliste uuringute puhul: iga looma kehamass katse alguses ja lõpus; ühest nädalast kauem kestva uuringu korral: iga looma kehamass uuringu vältel ja toidu tarbimine. Tuleks lisada kehamassi vahemik, keskväärtus ja standardhälve iga rühma kohta.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsetingimused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             positiivse ja negatiivse (lahus/vehiikuli) kontrolli andmed;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             doosivahemiku määramise katse tulemused, kui see katse tehti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             doositaseme valimise põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali preparaadi valmistamise üksikasjad;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             manustamistee ja manustamise kestuse põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             meetodid, millega kontrolliti, et uuritav kemikaal jõudis (uuritavad kemikaalid jõudsid) üldvereringesse või sihtkoesse;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tegelik doos (mg kehakaalu kg kohta päevas), mis arvutatakse sööda/joogivee tarbimise ja uuritava kemikaali kontsentratsiooni (ppm) järgi selles, kui see on kohaldatav;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             eutanaasia meetod;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analgeesiameetod (kui kasutati);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             manustamis- ja proovivõtukavade detailne kirjeldus ja nende valiku põhjendused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mikroskoobipreparaadi valmistamise meetodid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             proovide eraldamise ja säilitamise kord;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             toksilisuse mõõtmise meetodid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ebaküpsete mikrotuumsete erütrotsüütide hindamise kriteeriumid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analüüsitud rakkude arv looma kohta mikrotuumsete erütrotsüütide esinemissageduse kindlaksmääramisel ning ebaküpsete ja küpsete erütrotsüütide suhte määramisel;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             katse nõuetekohasuse kriteeriumid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vajaduse korral meetodid, millega uuriti, kas mikrotuum sisaldab terveid kromosoome või nende fragmente, näiteks kinetohoorivastaste antikehade või tsentromeerispetsiifiliste DNA-proovide kasutamine.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsetulemused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             loomade seisund enne katset ja kogu katse ajal, sealhulgas toksilisuse avaldumise sümptomid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ebaküpsete erütrotsüütide osakaal erütrotsüütide üldarvust;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ebaküpsete mikrotuumsete erütrotsüütide arv, esitatakse iga looma kohta eraldi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mikrotuumsete ebaküpsete erütrotsüütide arvu keskväärtus ± standardhälve rühma kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             doosi ja toime suhe, võimaluse korral;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud statistilised analüüsid ja meetodid.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             paralleelsete negatiivse ja positiivse kontrolli katsete andmed, sh vahemikud, keskväärtused ja standardhälbed;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             varasemad negatiivse ja positiivse kontrolli andmed, sh vahemik, keskväärtused, standardhälbed ja jaotuse usaldusvahemik usaldatavustasemel 95 %, samuti hõlmatud ajavahemik ja mõõtepunktide arv;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             andmed, mis kinnitavad luuüdi kokkupuudet uuritava kemikaaliga;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             andmed selle kohta, kas mikrotuumad sisaldavad terveid kromosoome või kromosoomifragmente, kui see on asjakohane;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             positiivset või negatiivset toimet kinnitavad kriteeriumid, mis on täidetud.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemuste arutelu.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Järeldused.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Viited.
                                 
                              
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD, OECD (2016), „Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015.“ ENV Publications. Series on Testing and Assessment No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2007), „in vivo erythrocyte micronucleus assay III. Validation and regulatory acceptance of automated scoring and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target cells and a single dose-level limit test“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, pp. 10–30.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (2006), „Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: II. An efficient method of monitoring chromosomal damage in the rat“, Toxicology Sciences, Vol. 94/1, pp. 92–107.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Dertinger, S.D. et al. (2006), „Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: I. Intra- and interlaboratory comparison with microscopic scoring“, Toxicological Sciences, Vol. 94/1, pp. 83–91.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Dertinger, S.D. et al. (2011), „Flow cytometric scoring of micronucleated erythrocytes: an efficient platform for assessing in vivo cytogenetic damage“, Mutagenesis, Vol. 26/1, pp. 139–145.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Parton, J.W., W.P. Hoffman, M.L. Garriott (1996), „Validation of an automated image analysis micronucleus scoring system“, Mutation Research, Vol. 370/1, pp. 65–73.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Asano, N. et al. (1998), „An automated new technique for scoring the rodent micronucleus assay: computerized image analysis of acridine orange supravitally stained peripheral blood cells“, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 404/1-2, pp. 149–154.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Styles, J.A. et al. (2001), „Automation of mouse micronucleus genotoxicity assay by laser scanning cytometry“, Cytometry, Vol. 44/2, pp. 153–155.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Heddle, J.A. (1973), „A rapid in vivo test for chromosomal damage“, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 187–190.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Schmid, W. (1975), „The micronucleus test“, Mutation Research, Vol. 31/1, pp. 9–15.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Heddle, J.A. et al. (1983), „The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program“, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 123/1, pp. 61–118.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Mavournin, K.H. et al. (1990), „The in vivo micronucleus assay in mammalian bone marrow and peripheral blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program“, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 239/1, pp. 29-80.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1983), „Micronuclei in circulating erythrocytes: a rapid screen for chromosomal damage during routine toxicity testing in mice“, Developments in Toxicology Environmental Science, Vol. 11, pp. 555–558.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1987), „Guidelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erythrocytes“, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 189/2, pp. 103–112.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1990), „The in vivo erythrocyte micronucleus test: measurement at steady state increases assay efficiency and permits integration with toxicity studies“, Fundamental and Applied Toxicology, Vol. 14/3, pp. 513–522.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1990), „The micronucleus assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides“, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 245/4, pp. 245–249.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 CSGMT/JEMS.MMS – The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), „Micronucleus test with mouse peripheral blood erythrocytes by acridine orange supravital staining: the summary report of the 5th collaborative study“, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 278/2-3, pp. 83–98.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 CSGMT/JEMS.MMS – The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan (1995), „Protocol recommended by the CSGMT/JEMS.MMS for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test“. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT) (CSGMT/JEMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), Mutagenesis, Vol. 10/3, pp. 153–159.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Salamone, M.F., K.H. Mavournin (1994), „Bone marrow micronucleus assay: a review of the mouse stocks used and their published mean spontaneous micronucleus frequencies“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 23/4, pp. 239–273.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Krishna, G., G. Urda, J. Paulissen (2000), „Historical vehicle and positive control micronucleus data in mice and rats“, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 453/1, pp. 45–50.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Hayes, J. et al. (2009), „The rat bone marrow micronucleus test--study design and statistical power“, Mutagenesis, Vol. 24/5, pp. 419–424.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Wakata, A.et al. (1998), „Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood: summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS.“ MMS. Collaborative Study Group for the Micronucleus Test. Environmental Mutagen Society of Japan. Mammalian Mutagenicity Study Group, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 32/1, pp. 84–100.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), „Compilation and use of genetic toxicity historical control data“, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87–90.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2011), „Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 108–120.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), „in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay“, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293–304.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Fielder, R.J. et al. (1992), „Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays“, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313–319.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2000), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 LeBaron, M.J. et al. (2013), „Influence of counting methodology on erythrocyte ratios in the mouse micronucleus test“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/3, pp. 222–228.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Higashikuni, N., S. Sutou (1995), „An optimal, generalized sampling time of 30 +/- 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test“, Mutagenesis, Vol. 10/4, pp. 313–319.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2000), „in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. II. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated scoring“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 234–252.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Asanami, S., K. Shimono (1997), „High body temperature induces micronuclei in mouse bone marrow“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 390/1-2, pp. 79–83.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Asanami, S., K. Shimono, S. Kaneda (1998), „Transient hypothermia induces micronuclei in mice“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 413/1, pp. 7–14.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Spencer, P.J. et al. (2007), „Induction of micronuclei by phenol in the mouse bone marrow: I. Association with chemically induced hypothermia“, Toxicological Sciences, Vol. 97/1, pp. 120–127.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983), „An application of Acridine Orange fluorescent staining to the micronucleus test“, Mutation Research Letters, Vol. 120/4, pp. 241–247.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983), „A simple fluorescent staining procedure for micronuclei and RNA in erythrocytes using Hoechst 33258 and pyronin Y“, Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269–275.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Romagna, F., C.D. Staniforth (1989), „The automated bone marrow micronucleus test“, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 213/1, pp. 91–104.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Sun, J.T., M.J. Armstrong, S.M. Galloway (1999), „Rapid method for improving slide quality in the bone marrow micronucleus assay; an adapted cellulose column procedure“, Mutation Research, Vol. 439/1, pp. 121–126.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Miller, B.M., I.D. Adler (1990), „Application of antikinetochore antibody staining (CREST staining) to micronuclei in erythrocytes induced in vivo“, Mutagenesis, Vol. 5/4, pp. 411–415.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Miller, B.M. et al. (1991), „Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA“, Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297–302.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Russo, A. (2002), „PRINS tandem labeling of satellite DNA in the study of chromosome damage“, American Journal of Medical Genetics, Vol. 107/2, pp. 99–104.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Gollapudi, B.B., L.G. McFadden (1995), „Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test“, Mutation Research, Vol. 347/2, pp. 97–99.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 OECD (2014), „Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Richold, M. et al. (1990), „In Vivo Cytogenetics Assays“, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115–141.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Lovell, D.P. et al. (1989), „Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184–232.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), „Statistical analysis of data in mutagenicity assays: rodent micronucleus assay“, Environmental Health Perspectives, Vol. 102/Suppl 1, pp. 49–52.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Kim, B.S., M. Cho, H.J. Kim (2000), „Statistical analysis of in vivo rodent micronucleus assay“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 469/2, pp. 233–241.
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Erütroblast
                           – varajane staadium erütrotsüütide arengus, mis vahetult eelneb ebaküpse erütrotsüüdi staadiumile, milles rakul on veel olemas tuum.
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Kinetohoor
                           – valguline struktuur, mis moodustub eukarüootse raku tsentromeeril, ühendab mitoosi ja meioosi ajal kromosoomi mitoosikäävi mikrotuubulite polümeeridega ning toimib raku jagunemise ajal, tõmmates õdekromatiidid teineteisest eemale.
                        
                           
                              Mikrotuumad
                           – rakus põhituumast eraldi ja lisaks sellele esinevad väikesed tuumad, mis on tekkinud mitoosi või meioosi telofaasi ajal mahajäänud kromosoomifragmentidest või tervetest kromosoomidest.
                        
                           
                              Normokroomne ehk küps erütrotsüüt
                           – täielikult valminud erütrotsüüt, mis on kaotanud jääk-RNA, mis jääb alles pärast tuuma väljatõukamist ja/või mis on kaotanud muud lühiealised rakumarkerid, mis tavaliselt kaovad pärast erütroblasti viimasele jagunemisele järgnenud enukleatsiooni.
                        
                           
                              Polükroomne ehk ebaküps erütrotsüüt
                           – hiljuti moodustunud erütrotsüüt oma arengu vahepealses staadiumis; selline erütrotsüüt värvub vere klassikalise värvaine, näiteks Wrighti Giemsa nii sinise kui ka punase komponendiga, kuna sellises hiljuti moodustunud rakus on olemas jääk-RNA. Sellised äsja moodustunud rakud on ligikaudu samad mis retikulotsüüdid, mida muudetakse nähtavaks vitaalvärvidega, mis põhjustavad jääk-RNA kämpude teket retiikulumis. Tänapäeval kasutatakse hiljuti moodustunud punaste vereliblede kindlakstegemiseks sageli muid meetodeid, sealhulgas RNA monokroomset värvimist fluorestseeruvate värvainetega või lühiealiste pinnamarkerite nagu CD71 märgistamist fluorestseeruvate antikehadega. Polükroomsed erütrotsüüdid, retikulotsüüdid ja CD71-positiivsed erütrotsüüdid on kõik ebaküpsed erütrotsüüdid, kuigi igaühel on mõnevõrra erinev vanuseline jaotus.
                        
                           
                              Retikulotsüüt
                           – hiljuti moodustunud erütrotsüüt, mis on värvitud vitaalvärviga, mis põhjustab raku jääk-RNA kämpude koondumist iseloomulikku retiikulumi. Retikulotsüütidel ja polükroomsetel erütrotsüütidel on sarnane rakkude vanuseline jaotus.
                        
                           
                              Tsentromeer
                           – kromosoomi ala(d), millele kääviniidid kinnituvad raku jagunemise ajal, võimaldades tütarkromosoomide korrapärast liikumist tütarrakkude poolustele.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                     
                     
                        2. liide
                        
                           MITME FAKTORI MÄÄRAMIST VÕIMALDAV KATSEPLAAN SUGUDEVAHELISTE ERINEVUSTE KINDLAKSTEGEMISEKS MIKROTUUMADE TEKKE IN VIVO KATSES
                        
                        
                           Mitme faktori määramist võimaldav katseplaan mudel ja selle analüüs
                        
                        Selle katseplaani korral tehakse katse vähemalt viie isas- ja viie emasloomaga igal kontsentratsioonitasemel, milleks on vaja vähemalt 40 looma (20 isas- ja 20 emaslooma, lisaks veel asjakohased positiivse kontrolli katsed).
                        See katseplaan, mis on üks lihtsamaid mitme teguri määramise analüüse, on samaväärne kahefaktorilise dispersioonanalüüsiga, milles peamised tegurid on sugu ja kontsentratsiooni väärtus. Andmete analüüsimiseks võib kasutada mitmeid statistikatarkvara standardpakette, nagu SPSS, SAS, STATA, Genstat; samuti võib kasutada R-keskkonda.
                        Analüüsiga jagatakse andmete dispersioon osadeks: sooga seotud, kontsentratsiooniga seotud ning soo ja kontsentratsiooni interaktsiooniga seotud dispersiooniks. Igaühte nendest liikmetest testitakse võrdluses dispersiooni hinnanguga, mis iseloomustab katses paralleelselt käideldud loomi, kes on samast soost ja kes puutuvad kokku samasuguse kontsentratsiooniga. Aluseks oleva metoodika üksikasjalik kirjeldus on esitatud paljudes standardsetes statistikaõpikutes (vt viited) ja statistikapakettide help-funktsiooni juhendites.
                        Analüüs toimub interaktsiooniliikme (sugu × kontsentratsioon) uurimise kaudu ANOVA tabelis (6). Olulise interaktsiooniliikme puudumise korral saab eri sugude või eri kontsentratsioonitasemete ühendatud väärtusi kasutada kontsentratsioonitasemete vaheliste informatiivsete statistiliste testidena, mis põhinevad rühma piires ühendatud ANOVA dispersiooniliikmel.
                        Edasiseks analüüsiks jaotatakse kontsentratsioonidevahelise dispersiooni hinnang kontrastideks, millega saab kontrollida mõjude lineaarseid kontraste ja ruutkontraste kõikidel kontsentratsioonidel. Kui on olemas märkimisväärne sugu × kontsentratsiooni interaktsiooni liige, saab ka selle liikme jaotada interaktsiooni kontrastideks lineaarse interaktsiooni kontrast × sugu ja ruutinteraktsiooni kontrast × sugu. Need liikmed võimaldavad teha kindlaks, kas kummagi soo reageerimine kemikaalile on paralleelne või on sugude reageerimine kemikaalile erinev.
                        Rühma piires koondatud dispersiooni hinnangut võib kasutada keskväärtuste erinevuse paariviisilisel võrdlemisel. Selliseid võrdlusi võib teha kahe soo keskväärtuste vahel ja eri kontsentratsioonitasemete keskväärtuste vahel, näiteks võrdlusteks negatiivse kontrolli väärtustega. Juhul, kui esineb oluline interaktsioon, võib võrrelda samasooliste loomade puhul eri kontsentratsioonidega saadud tulemuste keskväärtusi või erisooliste loomade puhul sama kontsentratsiooniga saadud tulemuste keskväärtusi.
                        
                           Viited
                        
                        Paljudes statistikaõpikutes käsitletakse lihtsast kahe faktori analüüsist kuni katsemetoodika mudelite keerukamate vormideni ulatuvat mitmefaktoriliste mudelite teooriat, katseplaane, metoodikat, analüüsi ja tõlgendamist. Järgnevalt on esitatud mittetäielik loetelu. Mõnes raamatus esitatakse võrreldavate katseplaanide praktilisi näiteid, mõnel juhul koos üksikasjalike eeskirjadega, kuidas analüüsida tulemusi mitmesuguste tarkvarapakettide abil.
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York, John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J ja Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              “
               
                     6)
                  
                  
                     B osast jäetakse peatükk B.15 välja.
                  
               
                     7)
                  
                  
                     B osast jäetakse peatükk B.16 välja.
                  
               
                     8)
                  
                  
                     B osast jäetakse peatükk B.18 välja.
                  
               
                     9)
                  
                  
                     B osast jäetakse peatükk B.19 välja.
                  
               
                     10)
                  
                  
                     B osast jäetakse peatükk B.20 välja.
                  
               
                     11)
                  
                  
                     B osast jäetakse peatükk B.24 välja.
                  
               
                     12)
                  
                  
                     B osas asendatakse peatükk B.47 järgmisega:
                     „B.47.   Veise sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse katsemeetod selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, i) mis tekitavad raskeid silmakahjustusi, ja ii) mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 437 (2013). Veise sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse (Bovine Corneal Opacity and Permeability, BCOP) katsemeetodit hinnati alternatiivmeetodite valideerimise ametitevahelise koordineerimiskomitee (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) poolt koostöös alternatiivmeetodite valideerimise Euroopa keskuse (ECVAM) ja alternatiivmeetodite valideerimise Jaapani keskusega (JaCVAM) 2006. ja 2010. aastal (1, 2). Esimesel hindamisel hinnati BCOP-katsemeetodi kasulikkust selliste kemikaalide (ainete ja segude) kindlakstegemisel, mis tekitavad rasket silmakahjustust (1). Teisel hindamisel hinnati BCOP-katsemeetodi kasulikkust selliste kemikaalide (ainete ja segude) kindlakstegemisel, mida ei klassifitseerita seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega (2). BCOP-katsemeetodi valideerimise andmebaas sisaldas 113 ainet ja 100 segu (2, 3). Nendest hindamistest ja eksperdiarvamustest tehti järeldus, et kõnealuse katsemeetodiga on võimalik õigesti kindlaks teha kemikaale (nii aineid kui ka segusid), mis tekitavad rasket silmakahjustust (1. kategooria), ja ka kemikaale, mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega, nagu need on määratletud Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (GHS) (4) ja määruses (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (CLP) (7); sellepärast on kõnealune meetod tunnistatud teaduslikult põhjendatuks mõlemaks eesmärgiks. Raske silmakahjustus on koekahjustuse tekkimine silmas või tugev füüsiline nägemise langus pärast uuritava kemikaali silma eespinnale manustamist, kui kahjustus ei ole 21 päeva jooksul pärast uuritava kemikaali manustamist täielikult taandunud. Uuritav kemikaal, mis põhjustab rasket silmakahjustust, klassifitseeritakse vastavalt ÜRO GHSile 1. kategooriasse. Kemikaal, mida ei klassifitseerita seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega, on määratletud kui kemikaal, mis ei vasta ÜRO GHSi 1. või 2. (2A või 2B) kategooriasse klassifitseerimise nõuetele, see tähendab, et sellele viidatakse kui ÜRO GHSi kategooriata kemikaalile. Käesolevas katsemeetodis on esitatud BCOP-katse soovitatav kasutusala ja piirangud, mis põhinevad hindamistel. Peamised erinevused OECD katsejuhendi 2009. aasta originaalversiooni ja ajakohastatud 2013. aasta versiooniga on järgmised, kuid ei piirdu nendega: BCOP-katsemeetodit kasutatakse selliste kemikaalide tuvastamiseks, mis ei vaja klassifitseerimist vastavalt ÜRO GHSile (punktid 2 ja 7); selgitatud on BCOP-katsemeetodi kohaldatavust alkoholide, ketoonide ja tahkete kemikaalide (punktid 6 ja 7) ning ainete ja segude (punkt 8) uurimiseks; selgitatud on pindaktiivsete ainete või selliseid aineid sisaldavate segude uurimist (punkt 28); selgitatud ja ajakohastatud on positiivse kontrolli küsimusi (punktid 39 ja 40); ajakohastatud on BCOP-katsemeetodi alusel otsuse tegemise kriteeriume (punkt 47); ajakohastatud on katse nõuetekohasuse kriteeriume (punkt 48); ajakohastatud on katseprotokollis esitatavaid andmeelemente (punkt 49); ajakohastatud on 1. liidet mõistete kohta; lisatud on 2. liide BCOP-katsemeetodi prognoosivõime kohta eri klassifitseerimissüsteemide kasutamisel; ajakohastatud on 3. liites esitatud pädevuse tõendamise kemikaalide loetelu; ning ajakohastatud on 4. liidet BCOP-katses kasutatava sarvkestahoidiku (punkt 1) ja hägususmõõtja kohta (punktid 2 ja 3).
                     Praegu ollakse üldiselt arvamusel, et lähitulevikus ei ole võimalik ärritava toime kogu ulatuse prognoosimisel eri kemikaaliklasside puhul ühegi in vitro silmaärrituse katsega asendada Draize'i in vivo silmakatset. Kuid mitme alternatiivse testi strateegilise (astmelise) kombineerimisega võib siiski olla võimalik asendada Draize'i silmakatset (5). Ülalt-alla lähenemisviisi (5) tuleks kasutada siis, kui olemasoleva teabe põhjal võib eeldada, et kemikaal võib silma tugevasti ärritada; alt-üles lähenemisviisi (5) tuleks kasutada siis, kui olemasoleva teabe põhjal ei eeldata, et kemikaal põhjustab piisavat silma ärritust, mis nõuaks klassifitseerimist. BCOP-meetod on in vitro katsemeetod, mida võib kasutada teatavatel asjaoludel ja teatavate konkreetsete piirangutega, et klassifitseerida ja märgistada silmade jaoks ohtlike kemikaale. Seda ei peeta katsemeetodiks, mis üksinda võiks asendada küüliku in vivo silma katset, kuid BCOP-katsemeetodit soovitatakse kasutada lähtepunktina ülalt-alla katsetamisstrateegias, mida soovitasid Scott jt (5) sellise kemikaali kindlakstegemiseks, mis tekitab rasket silmakahjustust, st mis tuleb ÜRO ühtse ülemaailmse süsteemi kohaselt klassifitseerida 1. kategooriasse ilma edasiste uuringuteta (4). BCOP-meetodit soovitatakse kasutada ka selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, mis ei vaja klassifitseerimist seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega, nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses süsteemis (ÜRO GHSi kategooriata kemikaal) (4) katsestrateegias, milles kasutatakse alt-üles lähenemisviisi (5). Kemikaal, mille puhul BCOP-katsega ei prognoosita raske silmakahjustuse tekitamist või kuulumist silmaärrituse või raske silmakahjustuse seisukohast klassifitseerimist vajavaks kemikaaliks, vajab siiski täiendavat (in vitro ja/või in vivo) uurimist, mille alusel saaks määrata lõpliku klassifikatsiooni.
                     Käesoleva katsemeetodi eesmärk on kirjeldada protseduure, millega hinnatakse uuritava kemikaali võimalikku ohtlikkust silmale selle võime kaudu põhjustada veiselt isoleeritud sarvkesta hägustumist või suurenenud läbilaskvust. Toksilist toimet sarvkestale mõõdetakse: i) valgusläbilaskvuse vähenemise (hägususe tekke) ja ii) naatriumfluorestseiini läbilaskvuse suurenemise järgi. Sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse hinnangud, mis on tehtud pärast sarvkesta kokkupuudet uuritava kemikaaliga, kombineeritakse, et saada in vitro ärritava toime punktisumma (In Vitro Irritancy Score, IVIS), mida kasutatakse kemikaali ärritava toime taseme hindamiseks.
                     Mõisted on esitatud 1. liites.
                     LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD
                     Käesolev katsemeetod põhineb ICCVAMi BCOP-katsemeetodi eeskirjal (6, 7), mis töötati algselt välja teabe alusel, mis saadi In Vitro Teaduste Instituudi (IIVS) ja INVITTOXi metoodikatest124 (8). Viimast kasutati Euroopa Ühenduse rahastatud eelvalideerimisuuringus aastatel 1997–1998. Mõlemad eeskirjad põhinevad BCOP-katse metoodikal, mille esimesena avaldasid Gautheron ja kaasautorid (9).
                     BCOP-katsemeetodit saab kasutada selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, mis tekitavad rasket silmakahjustust, nagu on määratletud ÜRO GHSis, ja mis tuleb klassifitseerida ÜRO GHSi 1. kategooriasse (4). Kui BCOP-katsemeetodit kasutatakse sellel eesmärgil, on katse kogutäpsus 79 % (150/191), valepositiivsete tulemuste määr on 25 % (32/126) ja valenegatiivsete tulemuste määr 14 % (9/65), võrreldes küüliku silma in vivo katsemeetodi andmetega, mis on klassifitseeritud ÜRO GHSi klassifitseerimise süsteemi järgi (3) (vt 2. liide, tabel 1). Kui andmebaasist jäetakse välja teatavad uuritavate kemikaalide klassid (st alkoholid, ketoonid) või füüsikalised klassid (st tahked kemikaalid), on katse kogutäpsus 85 % (111/131), valepositiivsete tulemuste määr on 20 % (16/81) ja valenegatiivsete tulemuste määr 8 % (4/50) ÜRO GHSi klassifikatsiooni süsteemi korral (3). BCOP-katsemeetodi võimalikud puudused rasket silmakahjustust põhjustavate (st ÜRO GHSi 1. kategooria) kemikaalide kindlakstegemisel on seotud valideerimise andmebaasis täheldatud rohkete valepositiivsete tulemustega alkoholide ja ketoonide määramisel ning rohkete valenegatiivsete tulemustega tahkete kemikaalide määramisel (1–3). Kuna BCOP-katsemeetodiga ei määratud siiski mitte kõiki alkohole ja ketoone asjatult positiivseks ja mõned neist määrati õigesti ÜRO GHSi 1. kategooriasse, ei peeta neid kahte orgaaniliste kemikaalide funktsionaalset rühma olevaks väljaspool kõnealuse katsemeetodi kasutusala. Katsemeetodi kasutaja peab ise otsustama, kas ta võib lubada mõne alkoholi või ketooni liigset määramist positiivseks või tuleks tõendite kaalukuse lähenemisviisi alusel teha edasisi katseid. Valenegatiivsete tulemuste kohta tahkete kemikaalide puhul tuleks märkida, et tahke kemikaal võib põhjustada erinevaid ja äärmuslikke kokkupuutetingimusi Draize'i in vivo silmaärrituskatses, mis võib segada tegeliku ärritava toime õigesti hindamist (10). Samuti tuleks märkida, et ükski valenegatiivne kemikaal ICCVAMi valideerimise andmebaasis (2, 3) ei andnud rasket silmakahjustust põhjustavate kemikaalide (ÜRO GHSi 1. kategooria) kindlakstegemisel tulemuseks väärtust IVIS ≤ 3; see on kriteerium, mille alusel tuleks kemikaal määrata ÜRO GHSi kategooriata kemikaaliks. Peale selle, BCOP-katse valenegatiivsed tulemused ei ole kriitilise tähtsusega, kuna kõiki uuritavaid kemikaale, mille puhul 3 < IVIS ≥ 55, uuritakse hiljem muude asjakohaselt valideeritud in vitro testidega või viimase võimalusena, sõltuvalt regulatiivsetest nõuetest, katsetes küülikutega, kasutades järjestikuste katsete tegemise strateegiat ja tõendite kaalukuse lähenemisviisi. Võttes arvesse asjaolu, et mõned tahked kemikaalid on BCOP-katsemeetodiga õigesti määratud ÜRO GHSi 1. kategooriasse, ei ole ka see füüsikaline olek väljaspool kõnealuse meetodi kasutusala. Teadlased võiksid kaaluda kõnealuse meetodi kasutamist iga tüüpi kemikaalide puhul, kusjuures IVIS > 55 tuleks lugeda tõendiks, et kemikaal põhjustab rasket silmakahjustust ja tuleks liigitada ÜRO GHSi 1. kategooriasse ilma edasise katsete tegemiseta. Nagu juba märgitud, tuleb alkoholide või ketoonidega saadud positiivsetesse tulemustesse suhtuda ettevaatusega, kuna nende puhul on oht toimet üle hinnata.
                     BCOP-katsemeetodit saab kasutada ka selleks, et teha kindlaks kemikaale, mida ÜRO GHSi järgi ei ole vaja klassifitseerida silmade ärrituse või raske silmakahjustuse tekitajatena (4). Kui BCOP-katsemeetodit kasutatakse sellel eesmärgil, on katse kogutäpsus 69 % (135/196), valepositiivsete tulemuste määr on 69 % (61/89) ja valenegatiivsete tulemuste määr 0 % (0/107), võrreldes küüliku silma in vivo katsemeetodi andmetaga ÜRO GHSis klassifitseerimise süsteemi järgi (3) (vt 2. liide, tabel 2). Saadud valepositiivsete tulemuste määr (ÜRO GHSi kategooriata kemikaalide puhul, mille IVIS > 3, vt punkt 47) on küllaltki suur, kuid kõnealuses kontekstis mitte kriitiline, kuna kõiki uuritavaid kemikaale, mille puhul 3 < IVIS ≤ 55, uuritakse hiljem muude asjakohaselt valideeritud in vitro testidega või viimase võimalusena, sõltuvalt regulatiivsetest nõuetest, katsetes küülikutega, kasutades järjestikuste katsete tegemise strateegiat ja tõendite kaalukuse lähenemisviisi. BCOP-katsemeetodil ei ole spetsiifilisi vajakajäämisi alkoholide, ketoonide ja tahkete ainete uurimisel, kui eesmärk on teha kindlaks kemikaalid, mis ei vaja klassifitseerimist seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega (ÜRO GHSi kategooriata kemikaal) (3). Teadlased võiksid kaaluda kõnealuse meetodi kasutamist iga tüüpi kemikaalide puhul, kusjuures negatiivne tulemus (IVIS ≤ 3) tuleks lugeda tõendiks, et kemikaal ei vaja klassifitseerimist (ÜRO GHSi kategooriata kemikaal). Kuna BCOP-katsemeetodiga saab õigesti määrata vaid 31 % kemikaalidest, mis ei vaja klassifitseerimist silmi ärritava või rasket silmakahjustust tekitavana, ei tohiks seda meetodit kasutada esimese valikuna nn alt-üles lähenemisviisi (5) puhul, kui on olemas muid valideeritud ja heakskiidetud in vitro meetodeid, millel on sarnane suur tundlikkus, aga suurem spetsiifilisus.
                     BCOP-katsemeetodi valideerimise andmebaas sisaldas 113 ainet ja 100 segu (2, 3). BCOP-katsemeetodit peetakse seepärast kohaldatavaks nii ainete kui ka segude uurimiseks.
                     BCOP-katsemeetodit ei soovitata kasutada sellise uuritava kemikaali kindlakstegemiseks, mis tuleks klassifitseerida silmi ärritavaks (ÜRO GHSi 2. või 2A kategooria) või silmi nõrgalt ärritavaks (ÜRO GHSi 2B kategooria), kuna sellega on palju ÜRO GHSi 1. kategooria kemikaale klassifitseeritud liiga madalasse kategooriasse, nagu ÜRO GHSi 2., 2A või 2B kategooria; samuti on ÜRO GHSi kategooriata kemikaale klassifitseeritud liiga kõrgesse kategooriasse, nagu ÜRO GHSi 2., 2A või 2B kategooria (2, 3). Selleks võib vaja minna täiendavaid uuringuid muu sobiva meetodiga.
                     Veiste silmade ja sarvkestadega tehtavate kõigi toimingute puhul tuleb järgida katselaboris kohaldatavaid loomsete materjalide, kaasa arvatud (kuid mitte ainult) kudede ja koevedelike käsitsemise eeskirju ja korda. Soovitatakse järgida üldisi laboratoorseid ohutusnõudeid (11).
                     BCOP-katsemeetodiga ei uurita sidekesta ega vikerkesta vigastusi; sellega uuritakse toimet sarvkestale, mis on põhiline alus in vivo klassifitseerimisel, kui kaalutakse klassifitseerimist vastavalt ÜRO GHSile. Iseenesest ei saa BCOP-katsemeetodiga hinnata sarvkestakahjustuste pöörduvust. Küüliku silma uuringute põhjal on tehtud ettepanek, et sarvkestavigastuse algsügavuse hindamist võib kasutada pöördumatu toime mõne tüübi kindlaks tegemiseks (12). Siiski on vaja rohkem teaduslikult põhjendatud teadmisi, et mõista, kuidas tekib pöördumatu mõju, mis ei ole seotud esialgse raske vigastusega. Lõpuks ei võimalda BCOP-katsemeetod hinnata silma kokkupuutega kaasneva süsteemse toksilisuse võimalikkust.
                     
                     Kõnealust meetodit ajakohastatakse korrapäraselt uue teabe ja andmete põhjal. Näiteks võib olla kasulik histopatoloogiline uuring, kui sarvkesta kahjustust on vaja täielikumalt kirjeldada. Nagu on selgitatud OECD juhenddokumendis nr 160 (13), innustatakse meetodi kasutajaid sarvkesti säilitama ja valmistama histopatoloogilisi preparaate, mida saab kasutada andmebaasi ja otsustamiskriteeriumide väljatöötamiseks, mille abil võib selle meetodi täpsust veelgi parandada.
                     Igal laboril, kes alustab käesoleva katsemeetodi kasutamist, tuleks oma pädevuse kontrollimiseks kasutada 3. liites esitatud pädevuse kontrolli kemikaale. Labor võib osutatud kemikaale kasutada selleks, et tõendada oma tehnilist pädevust BCOP-katse läbiviimisel, enne kui ta esitab BCOP-katsemeetodiga saadud andmed regulatiivseks ohu klassifitseerimiseks.
                     KATSE PÕHIMÕTE
                     BCOP-katsemeetod on organotüüpne mudel, mille abil on lühiajaliselt võimalik säilitada veise sarvkesta normaalset füsioloogilist ja biokeemilist talitlust in vitro. Katsemeetodis hinnatakse uuritava kemikaali põhjustatud kahjustust sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse muutuste mõõtmisega hägususmõõtja ja nähtava valguse spektrofotomeetri abil. Mõlema suuruse alusel arvutatakse IVIS, mille alusel uuritavale kemikaalile määratakse in vitro ärritava toime klassifikatsiooni kategooria, et prognoosida uuritava kemikaali silmi ärritava toime potentsiaali in vivo (vt otsustuskriteeriumid, punkt 48).
                     BCOP-katsemeetodi puhul kasutatakse värskelt tapetud veise silmast eraldatud sarvkesta. Sarvkesta hägusust mõõdetakse kvantitatiivselt sarvkesta läbinud valgushulga alusel. Läbilaskvust mõõdetakse kvantitatiivselt värvaine naatriumfluorestseiini kogusena, mis on läbinud kogu sarvkesta paksuse ja jõudnud tagumises kambris olevasse söötmesse. Uuritavad kemikaalid kantakse sarvkesta epiteliaalsele pinnale sel teel, et need lisatakse sarvkestahoidiku eesmisesse kambrisse. 4. liites on esitatud BCOP-katsemeetodi sarvkestahoidiku kirjeldus ja skeem. Sarvkestahoidikuid võib osta mitmelt firmalt või ehitada ise.
                     
                        Veisesilmade hankimine, loomade vanus ja valimine
                     
                     Tapamajja saadetavad veised tapetakse harilikult kas inimtoiduks või muul kaubanduslikul eesmärgil. BCOP-katseks sobib üksnes sarvkest, mis on võetud tervelt loomalt, keda peetakse sobivaks inimtoidus kasutamiseks. Kuna veised on tõust, vanusest ja soost olenevalt väga erineva kaaluga, ei ole looma soovitatavat kaalu tapmise ajal määratletud.
                     Eri vanuses loomade silmade kasutamise korral võivad sarvkesta mõõtmed olla erinevad. Sarvkestad, mille horisontaalläbimõõt on üle 30,5 mm ja paksus keskosas vähemalt 1 100 μm, on tavaliselt pärit üle kaheksa aasta vanustelt veistelt, samas kui sarvkestad horisontaalläbimõõduga alla 28,5 mm ja paksusega keskosas alla 900 μm on tavaliselt veistelt, kelle vanus on alla viie aasta (14). Seepärast ei kasutata tavaliselt üle 60 kuu vanuste veiste silmi. Alla 12 kuu vanuste veiste silmi ei ole tavaliselt kasutatud, sest nende silmad alles arenevad ning sarvkesta paksus ja läbimõõt on oluliselt väiksemad kui täiskasvanud veistel. Noorloomade (vanus 6–12 kuud) sarvkestade kasutamine on siiski lubatav, sest on ka teatavaid eeliseid, nagu suurem kättesaadavus, kitsas vanusevahemik ja väiksem oht, et töötajad võivad kokku puutuda veiste spongiformse entsefalopaatiaga (15). Kuna oleks kasulik hinnata söövitavate või ärritavate kemikaalide suhtes avalduva sarvkesta tundlikkuse sõltuvust sarvkesta suurusest või paksusest, palutakse kasutajatel teatada, mis vanuses ja/või millise kaaluga loomadelt pärinesid uuringus kasutatud sarvkestad.
                     
                        Silmade eemaldamine ja transport laborisse
                     
                     Silmad eemaldatakse tapamaja töötajate poolt. Selleks et viia miinimumini silmade mehaanilised ja muud tüüpi vigastused, tuleb silmad eemaldada võimalikult kiiresti pärast looma surma, jahutada kohe pärast eemaldamist ning hoida jahutatult transpordi ajal. Et vältida silmade kokkupuudet ärritust põhjustada võivate kemikaalidega, ei tohi tapamaja töötajad looma pea loputamisel kasutada detergente.
                     Silmad tuleks paigutada sobiva suurusega anumasse nii, et need oleksid üleni kaetud Hanki tasakaalustatud soolalahusega (Hank's Balanced Salt Solution, HBSS), ja transportida laborisse nii, et nende kahjustumise või bakteriaalse saastumise oht oleks minimaalne. Kuna silmad võetakse tapmisprotsessi ajal, võivad need kokku puutuda vere ja muude bioloogiliste materjalidega, sealhulgas bakterite ja muude mikroorganismidega. Seepärast on oluline tagada, et silmade saastumise risk viidaks miinimumini (näiteks silmi sisaldava anuma hoidmisega jääl silmade võtmise ja transportimise ajal ning antibiootikumide lisamisega HBSS-le, milles silmi säilitatakse transportimise ajal [näiteks penitsilliin kontsentratsioonis 100 IU/ml ja streptomütsiin kontsentratsioonis 100 μg/ml]).
                     Ajavahemik silmade eemaldamise ja sarvkestade BCOP-katses kasutamise vahel peaks olema võimalikult lühike (tavaliselt eemaldatakse ja kasutatakse samal päeval), kusjuures tuleks tõendada, et see ei mõjuta katsetulemusi. Nende tulemuste aluseks on silmade valimise kriteeriumid ning positiivse ja negatiivse kontrolliga saadud tulemused. Kõik katses kasutatud silmad peavad olema ühest ja samast silmade rühmast, mis on võetud ühel konkreetsel päeval.
                     
                        Silmade valimise kriteeriumid BCOP-katsemeetodi puhul
                     
                     Silmi uuritakse pärast laborisse saabumist hoolikalt, et neil ei esineks defekte, sealhulgas suurenenud hägusust, kriimustusi ega neovaskularisatsiooni. Kasutatakse ainult sellistest silmadest pärit sarvkesti, milles selliseid defekte ei ole.
                     Iga sarvkesta kvaliteeti hinnatakse ka katse hilisematel etappidel. Sarvkestad, mille hägusus on suurem kui seitse hägususe ühikut või selle ekvivalenti katses kasutatud hägususmõõtja ja sarvkestahoidikute puhul pärast esialgset ühe tunni pikkust tasakaalustumisperioodi, visatakse ära (MÄRKUS: hägususmõõtja tuleks kaliibrida hägususe standardiga, mida kasutatakse hägususe ühikute kindlaks tegemiseks, vt 4. liide).
                     Igas katserühmas (uuritav kemikaal, sellega paralleelselt läbiviidavad positiivse ja negatiivse kontrolli katsed) kasutatakse vähemalt kolme silma. BCOP-katsemeetodi puhul kasutatakse negatiivse kontrolli katses kolme sarvkesta. Kuna kõik sarvkestad eemaldatakse kogu silmamunalt ja paigutatakse sarvkestakambrisse, võivad üksiku sarvkesta, sealhulgas negatiivse kontrolli katses kasutatud sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse väärtusi mõjutada käsitsemisest tekkinud artefaktid. Lisaks kasutatakse negatiivse kontrolliga töödeldud sarvkestadega saadud väärtusi, et korrigeerida uuritava kemikaali ja positiivse kontrolliga töödeldud sarvkestade hägususe ja läbilaskvuse väärtusi IVIS-tulemuste arvutustes.
                     KATSE KÄIK
                     
                        Silmade ettevalmistamine
                     
                     Defektitud sarvkestad eemaldatakse koos 2–3 mm laiuse kõvakestaäärega, mis hõlbustab edasist käsitsemist, kusjuures tuleb vältida sarvkesta epiteeli ja endoteeli kahjustamist. Eraldatud sarvkestad kinnitatakse spetsiaalsesse sarvkestahoidikusse, millel on eesmine kamber – selle poole on sarvkesta epiteliaalne külg –, ja tagumine kamber, mille poole on endoteliaalne külg. Mõlemad kambrid täidetakse kuni ülevoolamiseni eelsoojendatud EMEM-söötmega (Eagle's Minimum Essential Medium), mis ei sisalda fenoolpunast, alustades tagumisest kambrist ja jälgides, et ei tekiks mulle. Seadet tasakaalustatakse seejärel temperatuuril 32 ± 1 °C vähemalt üks tund, et sarvkestad tasakaalustuksid söötmega ja saavutaksid võimalikus ulatuses normaalse metaboolse aktiivsuse (sarvkesta pinna ligikaudne temperatuur in vivo on 32 °C).
                     Pärast tasakaalustumisperioodi lisatakse mõlemasse kambrisse värsket eelsoojendatud EMEMi, mis ei sisalda fenoolpunast, ja registreeritakse iga sarvkesta hägususe lähteväärtus. Katsest jäetakse välja kõik sarvkestad, millel esineb makroskoopilisi koekahjustusi (näiteks kriimustusi, pigmentatsiooni, neovaskularisatsiooni) või mille hägusus on suurem kui seitse hägususe ühikut või selle ekvivalenti katses kasutatud hägususmõõtja ja sarvkestahoidikute puhul. Negatiivse (või lahusti) kontrolli rühma valitakse vähemalt kolm sarvkesta. Ülejäänud sarvkestad jagatakse seejärel kahte rühma: uuritava kemikaali töödeldavad ja positiivse kontrolli katse sarvkestad.
                     Kuna vee soojusmahtuvus on suurem kui õhul, on inkubeerimise ajal võimalik veega saavutada püsivamaid temperatuuritingimusi. Seepärast soovitatakse sarvkestahoidikute ja nende sisu säilitamiseks temperatuuril 32 ± 1 °C kasutada vesivanni. Kuid kasutada võib ka õhktermostaate, võttes vajalikud meetmed temperatuuri stabiilsuse säilitamiseks (näiteks sarvkestahoidikute ja söötmete eelsoojendamine).
                     
                        Uuritava kemikaaliga töötlemine
                     
                     Kasutatakse kaht töötlemismeetodit, millest üks on vedelike ja (tahkete või vedelate) pindaktiivsete ainete jaoks ning teine on selliste tahkete kemikaalide jaoks, mis ei ole pindaktiivsed.
                     Vedelikke katsetatakse ilma lahjendamata. Pooltahkeid kemikaale, kreeme ja vahasid uuritakse tavaliselt nagu vedelikke. Puhtaid pindaktiivseid aineid katsetatakse kontsentratsioonis 10 % (w/v) 0,9 % naatriumkloriidi lahuses, destilleeritud vees või muus lahustis, mille kohta on tõendatud, et sel ei ole kahjulikku toimet katsesüsteemile. Muude lahjenduskontsentratsioonide kasutamist tuleb asjakohaselt põhjendada. Pindaktiivseid aineid sisaldavaid segusid võib katsetada kas lahjendamata või sobiva kontsentratsioonini lahjendatult, olenevalt vastavast kokkupuutestsenaariumist in vivo. Muu uuritud lahjenduskontsentratsiooni kasutamist tuleb asjakohaselt põhjendada. Sarvkestadel lastakse vedelike ja pindaktiivsete ainetega kokku puutuda 10 minutit. Muu kokkupuuteaja kasutamise korral tuleb esitada piisav teaduslik põhjendus. Pindaktiivse aine ja sellist ainet sisaldava segu mõisted on esitatud 1. liites.
                     Tahkeid kemikaale, mis ei ole pindaktiivsed, katsetatakse lahuste või suspensioonidena kontsentratsioonis 20 % (w/v) 0,9 % naatriumkloriidi lahuses, destilleeritud vees või muus lahustis, mille kohta on tõendatud, et sel ei ole kahjulikku toimet katsesüsteemile. Teatavatel puhkudel ja asjakohase teadusliku põhjendusega võib tahkeid kemikaale katsetada ka puhtal kujul, kui uuritav kemikaal kantakse otse sarvkesta pinnale, kasutades lahtise kambri meetodit (vt punkt 32). Sarvkestad jäetakse tahke kemikaaliga kokkupuutesse neljaks tunniks, kuid nagu ka vedelike ja pindaktiivsete ainete puhul võib asjakohase teadusliku põhjendusega kasutada ka muid kokkupuuteaegu.
                     Pealekandmiseks võib kasutada mitmesuguseid meetodeid, olenevalt uuritava kemikaali füüsikalisest olekust ja keemilistest omadustest (näiteks tahke kemikaal, vedelik, viskoosne või mitteviskoosne vedelik). Oluline on tagada, et uuritav kemikaal kataks korralikult epiteliaalse pinna ja eemaldataks täielikult loputamistega. Mitteviskoosse või väheviskoosse uuritava vedela kemikaali puhul kasutatakse tavaliselt suletud kambri meetodit, samas kui poolviskoosse ja viskoosse vedela uuritava kemikaali või tahke puhta kemikaali uurimiseks kasutatakse tavaliselt lahtise kambri meetodit.
                     Suletud kambri meetodis viiakse eesmisesse kambrisse kambri ülaosas asuvate annustamisavade kaudu piisav kogus uuritavat kemikaali (750 μl), et see kataks sarvkesta epiteliaalse külje; seejärel suletakse avad kokkupuute ajaks korgiga. Oluline on tagada, et iga sarvkest oleks uuritava kemikaaliga kokkupuutes vajaliku ajavahemiku jooksul.
                     Lahtise kambri meetodis võetakse eesmise kambri akna kinnitusrõngas ja klaasaken enne pealekandmist ära. Kontrolli kemikaal või uuritav kemikaal (750 μl või sarvkesta täielikuks katmiseks piisav kogus) kantakse mikropipetiga otse sarvkesta epiteliaalsele pinnale. Kui uuritavat kemikaali on raske pipeteerida, võib kemikaali doseerimise hõlbustamiseks viia rõhu all kolbpipetti. Kolbpipeti otsik sisestatakse süstla dosaatorotsikusse, nii et materjali saab rõhu all viia kolbpipeti otsikusse. Samaaegselt pipetikolvi tagasitõmbamisega lastakse süstla kolb vabaks. Kui pipetiotsikusse ilmuvad õhumullid, surutakse uuritav kemikaal välja ja võtet korratakse, kuni otsik on täidetud ja selles ei ole õhumulle. Vajaduse korral võib kasutada tavalist (ilma nõelata) süstalt, kuna sellega saab uuritava kemikaali ruumala täpselt mõõta, samuti on sellega võimalik kemikaali hõlpsamini kanda sarvkesta epiteliaalsele pinnale. Pärast uuritava kemikaali pealekandmist pannakse eesmise kambri klaasaken tagasi, et taas tekiks suletud süsteem.
                     
                        Kokkupuutejärgne inkubeerimine
                     
                     Pärast kokkupuuteaja lõppu eemaldatakse uuritav kemikaal, negatiivne kontroll või positiivse kontrolli kemikaal eesmisest kambrist ja epiteeli pestakse vähemalt kolm korda (või nii kaua, kuni kemikaali jääke ei ole enam võimalik näha) EMEMiga (millesse on lisatud fenoolpunast). Loputamiseks kasutatakse fenoolpunast sisaldavat lahust, kuna fenoolpunase värvuse muutust võib kasutada happelise või aluselise uuritava kemikaali väljapesemise täielikkuse hindamiseks. Sarvkesti pestakse rohkem kui kolm korda, kui fenoolpunane muudab veel oma värvi (kollane või punakaslilla) või kuni uuritavat kemikaali on veel näha. Kui söötmes ei ole enam uuritavat kemikaali, loputatakse sarvkesti viimast korda (fenoolpunast mittesisaldava) EMEMiga. Fenoolpunast mittesisaldavat EMEMi kasutatakse viimaseks loputuseks, et tagada fenoolpunase eemaldamine eesmisest kambrist enne hägususe mõõtmist. Seejärel täidetakse eesmine kamber värske (fenoolpunast mittesisaldava) EMEMiga.
                     Vedelike ja pindaktiivsete kemikaalide puhul inkubeeritakse sarvkesti pärast loputamist veel kaks tundi temperatuuril 32 ± 1 °C. Mõnes olukorras on pikem kokkupuutejärgne ajavahemik kasulik ja seda tuleks juhupõhiselt kaaluda. Tahke kemikaaliga töödeldud sarvkesti loputatakse põhjalikult pärast neljatunnilist kokkupuuteaega, kuid täiendavat inkubeerimist ei ole nende puhul vaja.
                     Vedeliku ja pindaktiivse kemikaali puhul kokkupuutejärgse inkubatsiooniaja lõpus ning tahke kemikaali puhul, mis ei ole pindaktiivne, registreeritakse neljatunnise kokkupuuteaja lõpus iga sarvkesta hägusus ja läbilaskvus. Samuti vaadeldakse iga sarvkesta visuaalselt ja dokumenteeritakse kõik asjakohased tähelepanekud (näiteks koe irdumine, uuritava kemikaali jäägid, ebaühtlaselt jaotunud hägususe mustrid). Sellised tähelepanekud võivad olla olulised, kuna need erisused võivad mõjutada hägususmõõt näitu.
                     
                        Kontrolli kemikaalid
                     
                     Igas katses kasutatakse ka paralleelseid negatiivset või lahusti/vehiikuli kontrolli ja positiivseid kontrolle.
                     BCOP-katse läbiviimisel 100-protsendilise vedela ainega tehakse paralleelselt negatiivse kontrolli katse (näiteks 0,9 % naatriumkloriidi lahuse või destilleeritud veega), et kindlaks teha mittespetsiifiliste muutuste esinemine testsüsteemis ja saada katse näitajate lähteväärtused. Sellega tõendatakse ka, et katsetingimused ise ei põhjusta muutusi, mida ekslikult võiks ärrituseks pidada.
                     Lahjendatud vedeliku, pindaktiivse aine või tahkise testimisel lisatakse BCOP-katsesse paralleelne lahusti/vehiikuli kontrolli rühm, nii et oleks võimalik tuvastada testsüsteemi ebaspetsiifilisi muutusi ning saada katse näitajate lähteväärtused. Katses võib kasutada ainult sellist lahustit/vehiikulit, mille kohta on tõendatud, et sel ei ole kahjulikku toimet katsesüsteemile.
                     Igasse katsesse lisatakse positiivse kontrollina teadaolevalt positiivset reaktsiooni põhjustav kemikaal, veendumaks, et katsesüsteem on teviklik ja toimib õigesti. Kuid selleks, et oleks võimalik hinnata ka positiivse kontrolli kemikaali mõju sõltuvust ajast, ei tohiks ärritusreaktsioon olla ülemäära suur.
                     Vedelate positiivse kontrolli kemikaalide näited on 100-protsendiline etanool või 100-protsendiline dimetüülformamiid. Tahke positiivse kontrolli kemikaali näide on 20 % (w/v) imidasooli suspensioon 0,9 % naatriumkloriidi lahuses.
                     Võrdluskemikaalid võimaldavad hinnata teatavasse kemikaali- või tooteklassi kuuluva tundmatu kemikaali omadust põhjustada silmade ärritust või hinnata teatava silmi ärritava kemikaali toime võimalikkust ärritusreaktsiooni teatavas vahemikus.
                     
                        Mõõdetavad näitajad
                     
                     Hägusus määratakse sarvkesta läbinud valgushulga mõõtmisega. Sarvkesta hägusust mõõdetakse hägususmõõtja abil, millega saadakse hägususe väärtused pidevas skaalas.
                     Läbilaskvust määratakse värvaine naatriumfluorestseiini koguse järgi, mis tungib läbi kõigi sarvkesta kihtide (st sarvkesta välispinnal asuvast epiteelist kuni sisepinnal asuva endoteelini). Sarvkestahoidiku eesmisesse kambrisse, mille poole on sarvkesta epiteliaalne külg, lisatakse 1 ml naatriumfluorestseiini lahust (4 mg/ml, kui uuritav kemikaal on vedelik või pindaktiivne aine, ja 5 mg/ml, kui see on pindaktiivsete omadusteta tahkis), samas kui tagumine kamber, mille poole on endoteliaalne külg, täidetakse värske EMEMiga. Seejärel inkubeeritakse sarvkestahoidikut horisontaalasendis 90 ± 5 minutit temperatuuril 32 ± 1 °C. UV/VIS-spektrofotomeetriaga mõõdetakse tagumisse kambrisse tunginud naatriumfluorestseiini kogus. Lainepikkusel 490 nm läbiviidavate spektrofotomeetriliste mõõtmiste tulemused registreeritakse optilise tiheduse (OD490) või valguse neeldumise ühikutes pidevas skaalas. Fluorestseiini läbilaskvuse väärtused määratakse OD490 väärtustest, mis määratakse nähtava valguse spektrofotomeetriga, kasutades standardset optilise tee pikkust 1 cm.
                     Selle asemel võib kasutada 96-kannulise mikrotiiterplaadi lugejat, kui: i) on võimalik näidata, et fluorestseiini määramisel on OD490 väärtused plaadilugeja lineaarses piirkonnas, ja ii) 96-kannulisel mikrotiiterplaadil kasutatakse õiget fluorestseiiniproovi ruumala, nii et saadakse samad OD490 väärtused kui tavalise 1 cm optilise tee pikkusega mõõtmisel (selleks võib olla vaja täita kann täielikult (tavaliselt 360 μl)).
                     ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                     
                        Andmete hindamine
                     
                     Kui hägususe ja keskmise läbilaskvuse (OD490) väärtused on korrigeeritud tausthägususe ja negatiivse kontrolli läbilaskvuse OD490 väärtuste suhtes, tuleb iga katserühma keskmised hägususe ja läbilaskvuse OD490 väärtused asendada empiiriliselt tuletatud valemisse, et arvutada in vitro-ärritava toime hinne (IVIS) iga katserühma jaoks:
                     IVIS = keskmine hägususe väärtus + (15 × keskmine läbilaskvuse OD490 väärtus)
                     Sina jt (16) avaldasid, et see valem tuletati laborisiseste ja laboritevaheliste uuringutega. 36 ühendiga läbiviidud laboritevahelise uuringu andmeid analüüsiti mitmese korrelatsioonanalüüsiga, et leida in vivo ja in vitro saadud tulemuste seost kõige paremini kirjeldav võrrand. Kahe eri firma teadlased tegid selle analüüsi ja said peaaegu ühesugused võrrandid.
                     Hägususe ja läbilaskvuse väärtusi tuleks ka sõltumatult hinnata, et teha kindlaks, kas uuritav kemikaal põhjustas söövitust või tugevat ärritust ainult ühe kaudu kahest näitajast (vt Otsustamiskriteeriumid).
                     
                        Otsustamiskriteeriumid
                     
                     Selleks, et teha kindlaks IVISe läviväärtused, mille järgi uuritavaid kemikaale, mis põhjustavad rasket silmakahjustust (ÜRO GHSi 1. kategooria), eristatakse uuritavatest kemikaalidest, mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega (ÜRO GHSi kategooriata kemikaal), on järgmised:
                     
                                 IVIS
                              
                              
                                 ÜRO GHS
                              
                           
                                 ≤ 3
                              
                              
                                 kategooriata
                              
                           
                                 > 3; ≤ 55
                              
                              
                                 ei ole võimalik prognoosida
                              
                           
                                 > 55
                              
                              
                                 1. kategooria
                              
                           
                        Uuringu nõuetekohasuse kriteeriumid
                     
                     Katse loetakse nõuetekohaseks, kui positiivne kontroll annab IVISe väärtuse, mis erineb kuni kahe standardhälbe võrra varasemate uuringute jooksvast keskväärtusest, mida ajakohastatakse vähemalt iga kolme kuu järel või iga nõuetekohase katse läbiviimise järel laboris, kus katseid tehakse harva (harvem kui kord kuus). Negatiivse kontrolli või lahusti/vehiikuli kontrolli katses saadud hägususe ja läbilaskvuse väärtused peavad olema väiksemad kui tausthägususe ja -läbilaskvuse väärtuse ülempiirid, mis on varem kindlaks tehtud veise sarvkestadega, mida on töödeldud negatiivse kontrolli või lahusti/vehiikuli kontrolli kemikaalidega. Üksainus uuring vähemalt kolme sarvkestaga peaks olema piisav uuritava kemikaali kohta, kui klassifitseerimise tulemus on ühene. Kuid kui esimene uuring annab piiripealsed tulemused, tuleb kaaluda teise uuringu tegemist (mis ei ole tingimata nõutav), samuti kolmanda uuringu tegemist, kui esimese kahe uuringu IVISe keskmised väärtused ei ole kooskõlas. Selles kontekstis loetakse esimese uuringu tulemus piiripealseks, kui kolme sarvkestaga saadud tulemused ei ole kooskõlas, näiteks:
                     
                                 —
                              
                              
                                 kolmest sarvkestast kahega saadi tulemuseks prognoos, mis erines kõigi kolme sarvkestaga saadud keskväärtuse prognoosist, VÕI
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ühega kolmest sarvkestast saadi prognoos, mis erines kõigi kolme sarvkesta keskväärtusega saadud prognoosist, NING see hälbiv väärtus oli >10 IVIS ühikut erinev läviväärtusest 55.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Kui kordusuuring kinnitab esialgse uuringu prognoosi (mis põhineb IVISe keskväärtusel), võib lõpliku otsuse teha ilma edasiste katseteta. Juhul kui kordusuuring tulemus on prognoos, mis on vastuolus esialgse uuringu IVISe keskväärtuse põhjal tehtud ennustusega, tuleb teha kolmas ja viimane katse, et lahendada nende prognooside vasturääkivus ja klassifitseerida uuritav kemikaal. Edasiste klassifitseerimise ja märgistamise katsete tegemisest võib olla lubatav loobuda, kui kas või üks katse näitab, et kemikaal kuulub ÜRO GHSi 1. kategooria kemikaalide hulka.
                              
                           
                        Katseprotokoll
                     
                     Katseprotokollis tuleb esitada järgmine teave, kui see on uuringu läbiviimise seisukohast asjakohane:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritavad ja kontrolli kemikaalid
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             keemiline nimetus või keemilised nimetused, nagu struktuurikohane nimetus, mida kasutab Chemical Abstracts Service (CAS), seejärel muud nimetused, kui need on teada; CASi registreerimisnumber, kui on teada;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kemikaali puhtus või segu koostis (massiprotsendina), kättesaadavas ulatuses;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             füüsikalis-keemilised omadused nagu füüsikaline olek, lenduvus, pH, püsivus, kemikaaliklass, lahustuvus vees, mis on olulised katse läbiviimiseks;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali / kontrolli kemikaali töötlemine enne katset, kui see on asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             püsivus, kui on teada.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Teave sponsori ja uurimisasutuse kohta
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             sponsori, katselabori ja uuringu juhi nimi ja aadress;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsemeetodi tingimused
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud hägususmõõtja (nt mudel ja spetsifikatsioonid) ning selle seadistused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             teave hägususe ja läbilaskvuse mõõtmiseks kasutatud mõõteriista (näiteks hägususmõõtja ja spektrofotomeetri) kaliibrimise kohta, et tagada mõõtmiste lineaarsus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud sarvkestahoidiku tüüp (näiteks mudel ja spetsifikatsioonid);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             muude kasutatud seadmete kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             meetodid, mida kasutati katsemeetodi tervikluse (st täpsuse ja usaldusväärsuse tagamiseks ajas (nt pädevuse kontrolli kemikaalide perioodiline mõõtmine).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katse nõuetekohasuse kriteeriumid
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             varasematel andmetel põhinevad paralleelse positiivse ja negatiivse kontrolli vastuvõetavad vahemikud;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             võimaluse korral varasematel andmetel põhinevad paralleelsete võrdluskontrollide vastuvõetavad vahemikud.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Silmade hankimine ja ettevalmistamine
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             silmade päritolu kirjeldus (asutus, millest need saadi);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             sarvkesta läbimõõt kui loomade vanuse ja katseks sobivuse näitaja;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             silmade säilitamis- ja transporditingimused (näiteks silmade eemaldamise aeg, ajavahemik katse alguseni, transpordisööde ja temperatuuritingimused, kasutatud antibiootikumid);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             veise sarvkestade ettevalmistamine ja hoidikusse paigaldamine, sealhulgas nende kvaliteetsuse, sarvkestahoidiku temperatuuri ja sarvkestade katsesse valiku kriteeriumide kirjeldus.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katse käik
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             paralleelide arv;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud negatiivse ja positiivse kontrolli kemikaalid (vajaduse korral ka lahusti ja võrdluskemikaalid);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali kontsentratsioon(id), pealekandmine, kokkupuute kestus ja kokkupuutejärgsed inkubatsiooniaja kestus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud hindamis- ja otsustamiskriteeriumide kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud katse nõuetekohasuse kriteeriumide kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kõikide katse-eeskirjas tehtud muudatuste kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud otsustamiskriteeriumide kirjeldus.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemused
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Iga katseprooviga saadud andmete tabel (näiteks hägususe ja OD490 väärtused ning uuritava kemikaali ja positiivse kontrolli, negatiivse kontrolli ning [võimaluse korral] võrdluskemikaali kontrolli jaoks arvutatud IVISe väärtused tabelina, sealhulgas vajaduse korral paralleelkorduskatsete tulemused, iga katse keskväärtused ± standardhälve);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             muude täheldatud toimete kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             
                                                in vitro määratud ÜRO GHSi klassifikatsioon, kui see on asjakohane.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemuste arutelu
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kokkuvõte
                                 
                              
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). „Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives“. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) ja the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Kättesaadav aadressil: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). „ICCVAM Test Method Evaluation Report. Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products“. NIH Publication No.10-7553. Research Triangle Park, NC:National Institute of Environmental Health Sciences. Kättesaadav aadressil: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 OECD (2013). „Streamlined Summary Document supporting the Test Guideline 437 for eye irritation/corrosion“. Series on Testing and Assessment, No.189, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 UN (2011). „United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS)“, ST/SG/AC.10/30 Rev 4, New York and Geneva: United Nations. Kättesaadav aadressil: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P. and Zuang, V. (2010). „A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches“. Toxicol. in Vitro 24: 1–9.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). „ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol“. In: „Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives“. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) ja the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Kättesaadav aadressil: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). „ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol“. In: „Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products“. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) ja the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Kättesaadav aadressil: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 INVITTOX (1999). „Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd.“ Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). „Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy“. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442–449.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (2006). „The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage?“Toxicol. in Vitro 20: 78–81.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L. and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). „Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings“. Kättesaadav aadressil: [http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). „Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays“. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 OECD (2011). „Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-severe Irritants“. Series on Testing and Assessment, No.160. Adopted October 25, 2011. Paris: Organisation for Economic Co-operation and Development.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). „Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse“. Can. J. Zool. 73: 2159–2165.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Collee, J. and Bradley, R. (1997). „BSE: A decade on – Part I“. The Lancet 349: 636–641.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D. and Miller, K. (1995). „A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates“. Fundam. Appl. Toxicol. 26:20-31.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.5 „Äge mürgisus: silmade ärritus/söövitus“.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). „Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method“. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Kättesaadav aadressil: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 OECD (1998). Series on Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring. No. 1: „OECD Principles on Good Laboratory Practice“ (läbi vaadatud 1997. a).
                                 Kättesaadav aadressil: http://www.oecd.org/document/63/0,3343,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Aine
                           – ooduslikud või mis tahes meetodi abil toodetud keemilised elemendid ja nende ühendid, mis võivad sisaldada toote stabiliseerimiseks vajalikke lisaaineid või tootmismeetodist tingitud lisandeid, kuid ei tohi sisaldada ühtki lahustit, mida on võimalik kemikaali stabiilsust vähendamata ja selle koostist muutmata eraldada (4);
                        
                           
                              Alt-üles lähenemisviis
                           – astmeline lähenemisviis, kasutatakse kemikaali puhul, mille kohta võib oletada, et seda ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega; alustatakse klassifitseerimist mitte vajavate kemikaalide (negatiivne tulemus) eraldamisega muudest kemikaalidest (positiivne tulemus).
                        
                           
                              Astmelise katsetamise strateegia
                           – etapiviisi katsetamise strateegia, milles enne järgmise etapiga alustamist vaadatakse uuritava kemikaali kohta kindlaksmääratud korras läbi kogu olemasolev teave, kasutades igas etapis tõendite kaalukuse analüüsi, et otsustada, kas teave on piisav ohuklassi määramiseks. Kui olemasoleva teabe põhjal saab uuritava kemikaali ärritava toime potentsiaali kohta otsuse teha, ei ole edasisi katseid vaja teha. Kui olemasoleva teabe põhjal ei saa otsustada uuritava kemikaali ärritava toime potentsiaali üle, jätkatakse järjestikuste loomkatsete etapiti tegemist, kuni kemikaali saab üheselt klassifitseerida.
                        
                           
                              Hägususmõõtja
                           – seade sarvkesta hägususe mõõtmiseks sarvkesta läbinud valguse hulga kvantitatiivse hindamise alusel. Tüüpilisel seadmel on kaks mõõtmisruumi, millest kummalgi on oma valgusallikas ja fotoelement. Üht ruumi kasutatakse töödeldud sarvkesta mõõtmiseks; teine on seadme kaliibrimiseks ja nulliviimiseks. Halogeenlambi valgus suunatakse läbi võrdlusruumi (tühi kamber, millel ei ole aknaid ja milles ei ole vedelikku) fotoelemendile ja võrreldakse valgusega, mis on fotoelemendile suunatud läbi uuritava sarvkestaga ruumi. Fotoelementide andmete võrdlemisest saadakse valgusläbilaskvuse erinevus ja hägususe numbriline väärtus esitatakse digitaalsel näidikul.
                        
                           
                              
                                 In vitro
                              
                              ärritava toime hinne (
                              
                                 In Vitro
                              
                              Irritancy Score, IVIS)
                           – BCOP-katses kasutatav empiiriliselt tuletatud valem, millega iga katserühma keskmise hägususe ja keskmise läbilaskvuse väärtused ühendatakse üheks kõnealusele katserühmale avaldatud mõju iseloomustavaks in vitro-hindeks (punktisummaks). IVIS = keskmine hägususe väärtus + (15 × keskmine läbilaskvuse väärtus)
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Klassifitseerimata
                           – kemikaalid, mida ei klassifitseerita seoses silmaärritusega (ÜRO GHSi 2., 2A või 2B kategooria) või raske silmakahjustusega (ÜRO GHSi 1. kategooria). Samatähenduslik mõistega „ÜRO GHSi kategooriata“.
                        
                           
                              Lahusti/vehiikuli kontroll
                           – uuritava kemikaaliga töötlemata proov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente, sealhulgas lahustit või vehiikulit; sellist proovi töödeldakse sarnaselt uuritava kemikaaliga töödeldud proovile ja muudele kontrolli proovidele, et määrata kindlaks samas lahustis või vehiikulis lahustatud uuritava kemikaaliga töödeldud proovide tekitatud reaktsiooni lähtetase. Kui paralleelselt uuritakse negatiivse kontrolli proovi, siis näitab lahusti/vehiikuli proov ka seda, kas lahusti või vehiikul mõjutab katsesüsteemi.
                        
                           
                              Negatiivne kontroll
                           – uuritava ainega töötlemata paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente. Sellist proovi töödeldakse koos proovidega, mida mõjutatakse uuritava kemikaaliga, ja koos muude kontrolli proovidega, et kontrollida, ega lahusti ei mõjuta katsesüsteemi.
                        
                           
                              Ohtlikkus
                           – mõjuri või olukorra iseloomulik omadus, millel võib olla kahjulik toime, kui organism, süsteem või (ala-)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub.
                        
                           
                              Pindaktiivne aine
                           – see on aine, näiteks detergent, mis võib vähendada vedeliku pindpinevust ja võimaldab sellel vahutada või tungida tahketesse ainetesse; sama mis märgav aine.
                        
                           
                              Pindaktiivset ainet sisaldav segu
                           – käesoleva katsemeetodi kontekstis segu, mis sisaldab ühte või mitut pindaktiivset ainet lõplikus kontsentratsioonis > 5 %.
                        
                           
                              Positiivne kontroll
                           – paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente ja mida töödeldakse kemikaaliga, mis teadaolevalt põhjustab positiivse tulemuse. Selleks et oleks võimalik hinnata ka positiivse kontrolli kemikaali mõju sõltuvust ajast, ei tohiks mõju olla ülemäära suur.
                        
                           
                              Pöördumatu toime silmale
                           – vt „Raske silmakahjustus“.
                        
                           
                              Pöörduv toime silmale
                           – vt „Silmade ärritus“.
                        
                           
                              Raske silmakahjustus
                           – koekahjustuse tekkimine silmas või tugev füüsiline nägemislangus pärast seda, kui uuritavat kemikaali on kantud silma eespoolsele pinnale ja mõju ei ole täielikult pöörduv 21 päeva jooksul pärast aine pealekandmist. Samatähenduslik mõistetega „Pöördumatu toime silmale“ ja „ÜRO GHSi 1. kategooria“ (4).
                        
                           
                              Sarvkest
                           – silmamuna eesmise osa läbipaistev kest, mis katab vikerkesta ja pupilli ning laseb valgusel tungida silma sisse.
                        
                           
                              Sarvkesta hägusus
                           – suurus, millega väljendatakse pärast kokkupuudet uuritava kemikaaliga toimunud sarvkesta hägustumise ulatust. Sarvkesta suurenenud hägusus näitab sarvkesta kahjustust. Hägusust võib hinnata subjektiivselt, nagu tehakse Draize'i katses küülikusilmaga, või objektiivselt aparaadiga, näiteks hägususmõõtjaga.
                        
                           
                              Sarvkesta läbilaskvus
                           – sarvkesta epiteeli kahjustuse kvantitatiivne mõõtmine värvaine naatriumfluorestseiini koguse järgi, mis tungib läbi kõigi sarvkesta kihtide.
                        
                           
                              Segu
                           – segu või lahus, mis koosneb kahest või enamast ainest, mis omavahel ei reageeri (4).
                        
                           
                              Silmade ärritus
                           – selliste muutuste tekkimine silmas pärast seda, kui uuritavat kemikaali on manustatud silma eespinnale, mis on täielikult pöörduvad 21 päeva jooksul pärast manustamist. Mõiste on samatähenduslik mõistetega „Pöörduv toime silmale“ ja „ÜRO GHSi 2. kategooria“ (4).
                        
                           
                              Tõendusmaterjali kaalukuse hindamine
                           – protsess, milles kaalutakse mitmesuguste andmete tugevaid ja nõrku külgi, et jõuda otsuseni kemikaali võimaliku ohtlikkuse kohta ja toetada sellist otsust.
                        
                           
                              Täpsus
                           – katsemeetodi tulemuste lähedus kokkulangemisele kinnitatud võrdlusväärtustega. Täpsusega mõõdetakse katsemeetodi toimivust ja see on üks asjakohasuse aspektidest. Seda terminit kasutatakse ka kordustäpsuse tähenduses ja see näitab, kui sageli annab katsemeetod õige tulemuse.
                        
                           
                              Usaldusväärsus
                           – katsemeetodiga aja jooksul saadud tulemuste laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ulatuse mõõt, kui katset tehakse sama katse-eeskirja alusel. Seda hinnatakse laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ja laborisisese korduvuse arvutamisega.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                        
                           
                              Valenegatiivsete tulemuste määr
                           – kõikide selliste positiivsete kemikaalide osakaal, mis on katsemeetodi alusel ekslikult tunnistatud negatiivseks. See on katsemeetodi toimivuse üks näitajaid.
                        
                           
                              Valepositiivsete tulemuste määr
                           – kõikide selliste negatiivsete kemikaalide osakaal, mis katsemeetodi alusel on ekslikult tunnistatud positiivseks. See on katsemeetodi toimivuse üks näitajaid.
                        
                           
                              Valideeritud katsemeetod
                           – katsemeetod, mille valideerimisuuringud on lõpule viidud, st on määratud selle asjakohasus (sealhulgas täpsus) ja usaldusväärsus konkreetse eesmärgi suhtes. Oluline on märkida, et valideeritud katsemeetod ei tarvitse olla piisavalt kasutuskõlblik täpsuse ja usaldusväärsuse poolest, et seda saaks lugeda vastuvõetavaks konkreetse eesmärgi saavutamise seisukohast.
                        
                           
                              Võrdluskemikaal
                           – kemikaal, mida kasutatakse uuritava kemikaali võrdlusstandardina. Võrdluskemikaalil peaksid olema järgmised omadused: i) pidev ja usaldusväärne tarnija; ii) struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuritavate kemikaalidega; iii) teadaolevad füüsikalised ja keemilised omadused; iv) täiendavad andmed teadaolevate toimete kohta ja v) teadaolev mõjusus soovitavas mõjuvahemikus.
                        
                           
                              Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem (ÜRO GHS (Globally Harmonized System))
                           – süsteem, milles kemikaalid (ained ja segud) on klassifitseeritud vastavalt nende füüsilise ohtlikkuse ning kahjuliku tervise- ja keskkonnamõju standarditud tüübile ja -tasemele ning mis hõlmab asjaomaseid teavitustähiseid, nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, et anda edasi inimeste (sealhulgas tööandjate, töötajate, vedajate, tarbijate ja päästetöötajate) ja keskkonna kaitsmiseks vajalikku teavet kõnealuste kemikaalide kahjuliku mõju kohta (4).
                        
                           
                              Ülalt-alla lähenemisviis
                           – astmeline lähenemisviis, kasutatakse kemikaali puhul, mille kohta võib oletada, et see tekitab rasket silmakahjustust; alustatakse rasket silmakahjustust tekitavate kemikaalide (positiivne tulemus) eraldamisega muudest kemikaalidest (negatiivne tulemus).
                        
                           
                              ÜRO GHSi 1. kategooria
                           – vt „Raske silmakahjustus“.
                        
                           
                              ÜRO GHSi 2. kategooria
                           – vt „Silmade ärritus“.
                        
                           
                              ÜRO GHSi kategooriata
                           – kemikaalid, mis ei vasta ÜRO GHSi 1. kategooria või 2. (2A või 2B) kategooria nõuetele. Sama mis „Klassifitseerimata“.
                     
                     
                        2. liide
                        
                           BCOP-KATSEMEETODI PROGNOOSIVÕIME
                        
                        
                           Tabel 1
                        
                        
                           Veise sarvkesta hägususe ja läbilaskvuse (Bovine Corneal Opacity and Permeability, BCOP) katsemeetodi prognoosivõime rasket silmakahjustust tekitavate kemikaalide kindlakstegemisel [ÜRO GHSi / ELi CLP-määruse 1. kategooria vs. mitte 1. kategooria (2. kat. + kategooriata); US EPA I kategooria vs. mitte I kategooria (II kat. + III kat. + IV kat.)]
                        
                        
                                    Klassifitseerimis süsteem
                                 
                                 
                                    nr
                                 
                                 
                                    Täpsus
                                 
                                 
                                    Tundlikkus
                                 
                                 
                                    Valenegatiivsed
                                 
                                 
                                    Spetsiifilisus
                                 
                                 
                                    Valepositiivsed
                                 
                              
                                    %
                                 
                                 
                                    nr
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    nr
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    nr
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    nr
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    nr
                                 
                              
                                    ÜRO GHS
                                    ELi CLP
                                 
                                 
                                    191
                                 
                                 
                                    78,53
                                 
                                 
                                    150/191
                                 
                                 
                                    86,15
                                 
                                 
                                    56/65
                                 
                                 
                                    13,85
                                 
                                 
                                    9/65
                                 
                                 
                                    74,60
                                 
                                 
                                    94/126
                                 
                                 
                                    25,40
                                 
                                 
                                    32/126
                                 
                              
                                    USA Keskkonnakaitseamet (US EPA)
                                 
                                 
                                    190
                                 
                                 
                                    78,95
                                 
                                 
                                    150/190
                                 
                                 
                                    85,71
                                 
                                 
                                    54/63
                                 
                                 
                                    14,29
                                 
                                 
                                    9/63
                                 
                                 
                                    75,59
                                 
                                 
                                    96/127
                                 
                                 
                                    24,41
                                 
                                 
                                    31/127
                                 
                              
                           
                        
                           Tabel 2
                        
                        
                           BCOP-katse prognoosivõime selliste kemikaalide kindlakstegemisel, mis ei vaja klassifitseerimist seoses silmaärrituse või raske silmakahjustusega („mitte ärritavad kemikaalid“) [ÜRO GHSi / ELi CLP-määruse kategooriata kemikaal vs. mitte kategooriata kemikaal (1. kat. + 2. kat.); US EPA IV kategooria vs. mitte IV kategooria (I kat. + II kat. + III kat.)]
                        
                        
                                    Klassifitseerimis süsteem
                                 
                                 
                                    nr
                                 
                                 
                                    Täpsus
                                 
                                 
                                    Tundlikkus
                                 
                                 
                                    Valenegatiivsed
                                 
                                 
                                    Spetsiifilisus
                                 
                                 
                                    Valepositiivsed
                                 
                              
                                    %
                                 
                                 
                                    nr
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    nr
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    nr
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    nr
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    nr
                                 
                              
                                    ÜRO GHS
                                    ELi CLP
                                 
                                 
                                    196
                                 
                                 
                                    68,88
                                 
                                 
                                    135/196
                                 
                                 
                                    100
                                 
                                 
                                    107/107
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    0/107
                                 
                                 
                                    31,46
                                 
                                 
                                    28/89
                                 
                                 
                                    68,54
                                 
                                 
                                    61/89
                                 
                              
                                    USA Keskkonnakaitseamet (US EPA)
                                 
                                 
                                    190
                                 
                                 
                                    82,11
                                 
                                 
                                    156/190
                                 
                                 
                                    93,15
                                 
                                 
                                    136/146
                                 
                                 
                                    6,85
                                 
                                 
                                    10/146
                                 
                                 
                                    45,45
                                 
                                 
                                    20/44
                                 
                                 
                                    54,55
                                 
                                 
                                    24/44
                                 
                              
                     
                        3. liide
                        
                           BCOP-KATSEMEETODI PÄDEVUSE KONTROLLI KEMIKAALID
                        
                        Enne käesoleva katsemeetodi tavakasutusse võtmist peaks labor tõendama tehnilist pädevust ja selleks õigesti klassifitseerima tabelis 1 soovitatud 13 silmadele ohtlikku kemikaali. Kõnealused kemikaalid on valitud nii, et need esindaksid silma ohutegurite põhjustatud reaktsioonide vahemikku, mis põhineb in vivo küüliku silma katse (katsemeetod 405) (17) ja ÜRO GHSi klassifitseerimise süsteemi (see tähendab 1. kategooria, 2A, 2B kategooria või klassifitseerimata) tulemustel (4). Peale selle arvestati kemikaalide valimisel järgmisi kriteeriume: kaubanduslik kättesaadavus, kvaliteetsete in vivo võrdlusandmete olemasolu ja BCOP-katsemeetodiga saadud kvaliteetsete in vitro andmete olemasolu. Võrdlusandmed on esitatud lihtsustatud kokkuvõtlikus dokumendis 3 ja ICCVAMi taustaülevaates BCOP-katsemeetodi kasutamise kohta (2, 18).
                        
                           Tabel 1
                        
                        
                           Soovitatavad tehnilise pädevuse tõendamise kemikaalid BCOP-katsemeetodi jaoks
                        
                        
                                    Kemikaal
                                 
                                 
                                    CASi nr
                                 
                                 
                                    Keemiliste ainete klass (8)
                                    
                                 
                                 
                                    Füüsikaline olek
                                 
                                 
                                    
                                       In vivo klassifikatsioon (9)
                                    
                                 
                                 
                                    Klassifikatsioon BCOP-katse alusel
                                 
                              
                                    bensalkooniumkloriid (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    ooniumühend
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                              
                                    kloorheksidiin
                                 
                                 
                                    55-56-1
                                 
                                 
                                    amiin, amidiin
                                 
                                 
                                    tahke
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                              
                                    dibensoüül-L-viinhape
                                 
                                 
                                    2743-38-6
                                 
                                 
                                    karboksüülhape, ester
                                 
                                 
                                    tahke
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                              
                                    imidasool
                                 
                                 
                                    288-32-4
                                 
                                 
                                    heterotsükkel
                                 
                                 
                                    tahke
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                              
                                    trikloroäädikhape (30 %)
                                 
                                 
                                    76-03-9
                                 
                                 
                                    karboksüülhape
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                              
                                    2,6-diklorobensoüülkloriid
                                 
                                 
                                    4659-45-4
                                 
                                 
                                    atsüülhaliid
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    2A kategooria
                                 
                                 
                                    täpne/usaldusväärne prognoos ei ole võimalik
                                 
                              
                                    etüül-2-metüülatsetoatsetaat
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    ketoon, ester
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    2 B kategooria
                                 
                                 
                                    täpne/usaldusväärne prognoos ei ole võimalik
                                 
                              
                                    ammooniumnitraat
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    anorgaaniline sool
                                 
                                 
                                    tahke
                                 
                                 
                                    2. kategooria (10)
                                    
                                 
                                 
                                    täpne/usaldusväärne prognoos ei ole võimalik
                                 
                              
                                    EDTA dikaaliumsool
                                 
                                 
                                    25102-12-9
                                 
                                 
                                    amiin, karboksüülhape (sool)
                                 
                                 
                                    tahke
                                 
                                 
                                    klassifitseerimata
                                 
                                 
                                    klassifitseerimata
                                 
                              
                                    Tween 20
                                 
                                 
                                    9005-64-5
                                 
                                 
                                    ester, polüeeter
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    klassifitseerimata
                                 
                                 
                                    klassifitseerimata
                                 
                              
                                    2-merkaptopürimidiin
                                 
                                 
                                    1450-85-7
                                 
                                 
                                    atsüülhaliid
                                 
                                 
                                    tahke
                                 
                                 
                                    klassifitseerimata
                                 
                                 
                                    klassifitseerimata
                                 
                              
                                    fenüülbutasoon
                                 
                                 
                                    50-33-9
                                 
                                 
                                    heterotsükkel
                                 
                                 
                                    tahke
                                 
                                 
                                    klassifitseerimata
                                 
                                 
                                    klassifitseerimata
                                 
                              
                                    polüoksüetüleen-23-laurüüleeter (BRIJ-35) (10 %)
                                 
                                 
                                    9002-92-0
                                 
                                 
                                    alkohol
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    klassifitseerimata
                                 
                                 
                                    klassifitseerimata
                                 
                              
                                    Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service'i number.
                                 
                              
                     
                        4. liide
                        BCOP-KATSE SARVKESTAHOIDIK
                        BCOP-katses kasutatav sarvkestahoidik valmistatakse inertsest materjalist (näiteks polüpropüleenist). Sarvkestahoidikul on kaks poolt (eesmine ja tagumine kamber) ja nendes on sarnased silindrilised sisekambrid. Kummagi kambri maht on umbes 5 ml ja kumbki kamber lõpeb klaasist aknaga, läbi mille mõõdetakse hägusust. Kummagi sisekambri diameeter on 1,7 cm ja sügavus 2,2 cm (11). Tagumise kambri rõngastihendit kasutatakse lekete ärahoidmiseks. Sarvkest paigutatakse endoteliaalse küljega tagumise kambri rõngastihendile ja eesmine kamber paigutatakse sarvkesta epiteliaalsele küljele. Kambreid hoiavad paigal kolm roostevabast terasest kruvi, mis asuvad kambri välisservadel. Kummagi kambri otsas on eemaldatav klaasaken, mis võimaldab hõlpsat juurdepääsu sarvkestale. Üks rõngastihend on ka klaasakna ja kambri vahel, et vältida lekkimist. Kaks ava kummagi kambri ülemisel küljel võimaldavad lisada ja eemaldada lahustit ja uuritavat kemikaali. Kemikaaliga kokkupuute ja inkubeerimise ajal on avad suletud kummikorkidega. Sarvkestahoidikute valgusläbilaskvus võib muutuda hoidikute kulumise tõttu või teatavate kemikaalijääkide kogunemise tõttu sisekambrisse või klaasakendele, mis võib mõjutada valguse hajumist või peegeldumist. Tagajärjeks võib olla sarvkestahoidikute valgusläbilaskvuse lähtetaseme suurenemine või vähenemine (ja hägususe lähtetaseme lugemite vastupidised muutused) ning need võivad avalduda iga kambri sarvkesta hägususe lugemite eeldatavate lähteväärtuste oluliste muutustena (st sarvkesta hägususe lähteväärtuse lugem konkreetses sarvkestahoidikus võib tavaliselt erineda üle 2 või 3 hägususe ühiku eeldatavast lähteväärtusest). Iga labor peaks kaaluma võimalust koostada kava sarvkestahoidiku valgusläbilaskvuse muutuste hindamiseks, sõltuvalt uuritava kemikaali keemilisest koostisest ja kambrite kasutussagedusest. Lähteväärtuste kindlakstegemiseks võib sarvkestahoidikuid kontrollida enne tavakasutust; selleks mõõdetakse täissöötmega täidetud kambrite hägususe lähteväärtusi (või valgusläbilaskvust) ilma sarvkestadeta. Edasiste kasutusperioodide ajal kontrollitakse sarvkestahoidikuid regulaarselt, et teha kindlaks valgusläbilaskvuse muutusi. Iga labor võib ise määrata sarvkestahoidikute kontrollimise sageduse, arvestades uuritavate kemikaalide keemilist koostist, kasutussagedust ja sarvkesta hägususe lähteväärtuste täheldatud muutumist. Kui täheldatakse sarvkestahoidikute valgusläbilaskvuse olulisi muutusi, tuleb kaaluda sarvkestahoidikute sisepindade asjakohast puhastamist ja/või poleerimist või hoidjate asendamist.
                        
                           Sarvkestahoidik – Koostejoonis
                        
                        
                     
                        5. liide
                        HÄGUSUSMÕÕTJA
                        Hägususmõõtja on seade valgusläbilaskvuse mõõtmiseks. Näiteks seadme OP-KIT (Riom, Prantsusmaa) puhul, mida kasutati BCOP-katsemeetodi valideerimisel, suunatakse halogeenlambi valgus läbi võrdlusruumi (tühi kamber, millel ei ole aknaid ja milles ei ole vedelikku) fotoelemendile ja võrreldakse valgusega, mis on fotoelemendile suunatud läbi uuritava sarvkestaga ruumi. Fotoelementide andmete võrdlemisest saadakse valgusläbilaskvuse erinevus ja hägususe numbriline väärtus esitatakse digitaalsel näidikul. Tehakse kindlaks hägususühikud. Võib kasutada ka muud tüüpi hägususmõõtjat (näiteks sellist, mille puhul ei ole vaja mõõta paralleelselt kontrollruumi ja uuritava sarvkestaga ruumi läbivat valgust), kui on tõendatud, et seade annab valideeritud seadmega sarnaseid tulemusi.
                        Hägususmõõtja peaks tagama lineaarse sõltuvuse kogu hägususe lugemite vahemikus, mis ulatub prognoosimudelis kirjeldatud eri klassifikatsioonides kasutatavate läviväärtusteni (st kuni läviväärtusteni, mille alusel aine tunnistatakse söövitavaks või tugevasti ärritavaks). Lineaarsete ja täpsete lugemite saamiseks kuni 75–80 hägususühikuni on hägususmõõtja vaja kaliibrida, kasutades kalibraatorite seeriat. Kalibraatorid pannakse kaliibrimiskambrisse (sarvkestahoidik, millesse saab panna kalibraatori) ja võetakse hägususmõõtja lugem. Kaliibrimiskamber on projekteeritud nii, et see hoiaks kalibraatoreid ligikaudu samal kaugusel valgusallikast ja fotoelemendist, nagu oleksid sarvkestad hägususe mõõtmise ajal. Võrdlusväärtused ja lähteväärtus sõltuvad kasutatavast seadmest. Hägususe mõõtmiste lineaarsus tuleb tagada asjakohaste (konkreetsest seadmest sõltuvate) meetmetega. Näiteks Electro Design'i (Riom, Prantsusmaa) seadme OP-KIT puhul kaliibritakse hägususmõõtja esmalt lugemile 0, milleks kasutatakse kaliibrimiskambrit ilma kalibraatorita. Seejärel paigutatakse kaliibrimiskambrisse ükshaaval kolm eri kalibraatorit ja mõõdetakse nende hägusus. Kalibraatoritega 1, 2 ja 3 tuleb saada nende ettenähtud hägususväärtuste lugemid, vastavalt 75, 150 ja 225 hägususe ühikut ± 5 %.
                     “
               
                     13)
                  
                  
                     B osas asendatakse peatükk B.48 järgmisega:
                     „B.48.   Isoleeritud kanasilma katsemeetod selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, i) mis tekitavad raskeid silmakahjustusi, ja ii) mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 438 (2013). Isoleeritud kanasilma (Isolated Chicken Eye, ICE) katsemeetodit hinnati alternatiivmeetodite valideerimise ametitevahelise koordineerimiskomitee (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) poolt koostöös alternatiivmeetodite valideerimise Euroopa keskuse (ECVAM) ja alternatiivmeetodite valideerimise Jaapani keskusega (JaCVAM) 2006. ja 2010. aastal (1–3). Esimesel hindamisel toetati ICE-meetodit kui teaduslikult põhjendatud sõeluuringukatset selleks, et teha kindlaks kemikaale (aineid ja segusid), mis põhjustavad rasket silmakahjustust (1. kategooria), nagu need on määratletud Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni (ÜRO) ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (GHS) (1, 2, 4) ja määruses (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (CLP) (12). Teisel hindamisel hinnati ICE-katsemeetodi kasulikkust sõeluuringumeetodina selliste kemikaalide kindlakstegemisel, mida ÜRO GHSi kohaselt ei klassifitseerita seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega (3, 4). Valideerimisuuringu tulemuste ja ekspertide hindamiskomisjoni soovituste kohaselt jäeti kehtima esialgne soovitus kasutada ICE-katset rasket silmakahjustust tekitavate kemikaalide klassifitseerimiseks (ÜRO GHSi 1. kategooria), kuna olemasolev andmebaas jäi pärast esialgset ICCVAMi-poolset valideerimist muutumatuks. Sellel etapil ei esitatud täiendavat soovitust laiendada ICE-katsemeetodi kohaldamisala muudesse kategooriatesse kuuluvate kemikaalide kindlakstegemisele. Selleks et kindlaks teha, kas ICE-katsemeetodit saab kasutada selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, mida ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustuse tekitamisega, tehti valideerimisuuringus kasutatud in vitro ja in vivo andmete ümberhindamine (5). Sellel ümberhindamisel tehti järeldus, et ICE-katsemeetodit saab kasutada ka selliste kemikaalide väljaselgitamiseks, mida ÜRO GHSi järgi ei ole vaja klassifitseerida silmade ärrituse või raske silmakahjustuse tekitajaks (4, 5). Käesolevas katsemeetodis on esitatud ICE-katsemeetodi soovitatav kasutusala ja piirangud, mis põhinevad nimetatud hindamistel. Peamised erinevused (neid on veel muidki) 2009. aasta esialgse OECD katsejuhendi ja 2013. aasta ajakohastatud versiooni vahel seisnevad selles, et uues versioonis kasutatakse ICE-meetodit selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, mida ei ole vaja klassifitseerida ÜRO GHSi kohaselt, uuendatud on katseprotokollis esitatava teabe elemente, mõisteid 1. liites ja pädevuse kontrolli kemikaale 2. liites.
                     Praegu ollakse üldiselt arvamusel, et lähitulevikus ei ole võimalik ärritava toime kogu ulatuse prognoosimisel eri kemikaaliklasside puhul ühegi in vitro silmaärrituse katsega asendada Draize'i in vivo silmakatset. Kuid mitme alternatiivse testi strateegilise (astmelise) kombineerimisega võib siiski olla võimalik asendada Draize'i silmakatset (6). Ülalt-alla lähenemisviisi (7) tuleks kasutada siis, kui olemasoleva teabe põhjal võib eeldada, et kemikaal võib silma tugevasti ärritada; alt-üles lähenemisviisi (7) tuleks kasutada siis, kui olemasoleva teabe põhjal ei peaks kemikaal põhjustama piisavat silma ärritust, mis nõuaks klassifikatsiooni. ICE-meetod on in vitro katsemeetod, mida võib kasutada teatavatel asjaoludel ja teatavate konkreetsete piirangutega, mida on selgitatud punktides 8–10, silmade jaoks ohtlike kemikaalide klassifitseerimiseks ja märgistamiseks. Seda ei peeta katsemeetodiks, mis üksinda võiks asendada küüliku in vivo silmakatset, kuid ICE-katsemeetodit soovitatakse kasutada esimese etapina ülalt-alla katsetamisstrateegias, mida soovitasid Scott jt (7) sellise kemikaali kindlakstegemiseks, mis tekitab rasket silmakahjustust, st mis tuleb ÜRO ühtse ülemaailmse süsteemi kohaselt klassifitseerida 1. kategooriasse ilma edasiste uuringuteta (4). ICE-meetodit soovitatakse ka selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, mis ei vaja klassifitseerimist seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega, nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses süsteemis (ÜRO GHSi kategooriata kemikaal) (4), ja seepärast võib seda kasutada esimese etapina alt-üles strateegilise lähenemisviisi puhul (7). Kemikaal, mille puhul ICE-katsemeetodiga ei prognoosita raske silmakahjustuse tekitamist või kuulumist silmaärrituse või raske silmakahjustuse seisukohast klassifitseerimist vajavaks kemikaaliks, vajab siiski täiendavat (in vitro ja/või in vivo) uurimist, et saaks määrata lõpliku klassifikatsiooni. Peale selle tuleks konsulteerida asjakohaste reguleerivate asutustega, enne kui ICE-katset hakatakse muu klassifitseerimisskeemi kui ÜRO GHS korral kasutama alt-üles lähenemisviisi rakendamiseks.
                     Käesoleva katsemeetodi eesmärk on kirjeldada protseduure, millega hinnatakse uuritava kemikaali võimalikku ohtlikkust silmale selle võime kaudu põhjustada toksilisi reaktsioone enukleeritud kanasilmas. Toksilist mõju sarvkestale mõõdetakse: i) hägususe kvalitatiivse hindamisega, ii) epiteelikahjustuse kvalitatiivse hindamisega, kasutades fluorestseiini kandmist silma (fluorestseiini peetumine silmas), iii) sarvkesta paksuse suurenemise (turse) mõõtmisega ja iv) makroskoopilise morfoloogilise pinnakahjustuse kvalitatiivse hindamisega. Sarvkesta hägusust, turset ja kahjustust hinnatakse pärast uuritava kemikaaliga kokkupuutumist individuaalselt ja seejärel andmed koondatakse silma ärritava toime klassifitseerimiseks.
                     Mõisted on esitatud 1. liites.
                     LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD
                     Käesolev katsemeetod põhineb alternatiivmeetodite valideerimise ametitevahelise koordineerimiskomitee (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) juhenddokumendis 160 (8) soovitatud metoodikal, mis töötati välja pärast ICCVAMi rahvusvahelist valideerimisuuringut (1, 3, 9), millesse andsid oma panuse alternatiivmeetodite valideerimise Euroopa keskus (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM), alternatiivmeetodite valideerimise Jaapani keskus (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods) ja Madalmaade uurimisinstituudi TNO toksikoloogia ja rakendusfarmakoloogia elukvaliteedi osakond (TNO Quality of Life Department of Toxicology and Applied Pharmacology). Eeskirja aluseks on avaldatud andmetest saadud teave, samuti TNOs praegu kasutatav eeskiri (10–14).
                     Käesoleva katsemeetodi valideerimiseks uuriti paljusid kemikaale; valideerimise empiirilises andmebaasis on 152 kemikaali, sealhulgas 72 ainet ja 80 segu (5). Meetodit saab kasutada tahkete ainete, vedelike, emulsioonide ja geelide korral. Vedelikud võivad olla vesilahused või muud vedelikud; tahked ained võivad olla vees lahustuvad või lahustumatud. Gaase ja aerosoole ei ole valideerimisuuringuga veel hinnatud.
                     ICE-meetodit saab kasutada selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, mis tekitavad rasket silmakahjustust ja mis tuleb klassifitseerida ÜRO GHSi 1. kategooriasse (4). Selleks otstarbeks kasutamise korral on leitud järgmised ICE-katsemeetodi piirangud: alkoholide puhul saadakse sageli valepositiivseid tulemusi ning tahkete ja pindaktiivsete ainete korral valenegatiivseid tulemusi (1, 3, 9). Saadud valenegatiivsete tulemuste määr (ÜRO GHSi 1. kategooria kemikaale ei määrata ÜRO GHSi 1. kategooriasse) ei ole kõnealuses kontekstis siiski kriitiline, kuna kõiki uuritavaid kemikaale, mis tunnistatakse negatiivseks, uuritakse hiljem muude asjakohaselt valideeritud in vitro testi(dega) või viimase võimalusena, sõltuvalt regulatiivsetest nõuetest, katsetes küülikutega, kasutades järjestikuste katsete tegemise strateegiat ja tõendite kaalukuse lähenemisviisi. Tuleks märkida, et tahke kemikaal võib põhjustada erinevaid ja päris äärmuslikke kokkupuutetingimusi in vivo Draize'i silmade ärrituse katses, mis ei tarvitse võimaldada õigesti prognoosida aine tegelikku ärritavat toimet (15). Teadlased võiksid kaaluda kõnealuse meetodi kasutamist iga tüüpi kemikaalide puhul, kusjuures positiivne tulemus tuleks lugeda tõendiks, et kemikaal põhjustab rasket silmakahjustust ja tuleks liigitada ÜRO GHSi 1. kategooriasse ilma edasiste katseteta. Alkoholidega saadud positiivseid tulemusi tuleks tõlgendada ettevaatusega, kuna nende puhul on oht mõju üle hinnata.
                     Kui ICE-katsemeetodit kasutatakse selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, mis tekitavad rasket silmakahjustust (ÜRO GHSi 1. kategooria), on ICE-katsemeetodi kogutäpsus 86 % (120/140), valepositiivsete tulemuste määr on 6 % (7/113) ja valenegatiivsete tulemuste määr 48 % (13/27), võrreldes küüliku silma in vivo katsemeetodi andmetega, mis on klassifitseeritud ÜRO GHSi klassifitseerimise süsteemi järgi (4, 5).
                     ICE-meetodit saab kasutada ka selleks, et selgitada välja kemikaale, mida ÜRO GHSi järgi ei ole vaja klassifitseerida silmade ärrituse või raske silmakahjustuse tekitajaks (4). Tuleks konsulteerida asjakohaste reguleerivate asutustega, enne kui ICE-katset hakatakse muu klassifitseerimisskeemi kui ÜRO GHS korral kasutama alt-üles lähenemisviisi rakendamiseks. Kõnealust katsemeetodit võib kasutada iga tüüpi kemikaalide puhul, kusjuures negatiivse tulemuse võib aktsepteerida kui tõendi, et kemikaali ei ole vaja klassifitseerida seoses silmaärrituse või raske silmakahjustuse tekitamisega. Ühe valideerimise andmebaasis oleva tulemuse põhjal tuleb siiski arvestada, et orgaanilist lahustit sisaldavate kattumisvastaste värvide puhul võidakse raske silmakahjustuse tekitamise võimet alahinnata (5).
                     Kui ICE-katsemeetodit kasutatakse selliste kemikaalide kindlakstegemiseks, mis ei vaja klassifitseerimist seoses silmaärrituse või raske silmakahjustuse tekitamisega, on ICE-katsemeetodi kogutäpsus 82 % (125/152), valepositiivsete tulemuste määr on 33 % (26/79) ja valenegatiivsete tulemuste määr 1 % (1/73), võrreldes küüliku silma in vivo katsemeetodi andmetega, mis on klassifitseeritud ÜRO GHSi järgi (4, 5). Kui andmebaasist jäetakse välja teatavad kemikaalide klassid (st orgaanilist lahustit sisaldavad kattumisvastased värvid), on ICE-katsemeetodi täpsus 83 % (123/149), valepositiivsete tulemuste määr on 33 % (26/78) ja valenegatiivsete tulemuste määr 0 % (0/71) ÜRO GHSi klassifikatsiooni süsteemi korral (4, 5).
                     ICE-meetodit ei soovitata kasutada sellise uuritava kemikaali kindlakstegemiseks, mis tuleks klassifitseerida silmi ärritavaks (ÜRO GHSi 2. või 2A kategooria) või silmi nõrgalt ärritavaks (ÜRO GHSi 2B kategooria), kuna sellega on palju ÜRO GHSi 1. kategooria kemikaale klassifitseeritud liiga madalasse kategooriasse, nagu ÜRO GHSi 2., 2A või 2B kategooria; samuti on ÜRO GHSi kategooriata kemikaale klassifitseeritud liiga kõrgesse kategooriasse, nagu ÜRO GHSi 2., 2A või 2B kategooria. Selleks võib vaja minna täiendavaid uuringuid muu sobiva meetodiga.
                     Kanasilmadega tehtavate kõigi toimingute puhul tuleb järgida katselabori kohaldatavaid inim- või loomset päritolu materjalide, kaasa arvatud (kuid mitte ainult) kudede ja koevedelike käsitsemise eeskirju ja korda. Soovitatakse järgida üldisi laboratoorseid ohutusnõudeid (16).
                     ICE-katsemeetodiga ei uurita sidekesta ega vikerkesta vigastusi, mida uuritakse küüliku silmaärrituse tekitamise katsega; sellega uuritakse toimet sarvkestale, mis on põhiline alus in vivo klassifitseerimisel, kui kaalutakse klassifitseerimist vastavalt ÜRO GHSile. Kuigi ICE-katsemeetodiga ei saa iseenesest hinnata sarvkestakahjustuste pöörduvust, on küüliku silma uuringute alusel soovitatud kasutada sarvkestakahjustuse esialgse sügavuse hindamist mõne tüübi pöördumatu mõju kindlakstegemiseks (17). Eelkõige on vaja täiendavaid teaduslikult põhjendatud teadmisi, et mõista, kuidas tekib pöördumatu mõju, mis ei ole seotud esialgse raske vigastusega. Lõpuks ei võimalda ICE-katsemeetod hinnata silma kokkupuutega kaasneva süsteemse toksilisuse võimalikkust.
                     
                     Kõnealust meetodit ajakohastatakse korrapäraselt uue teabe ja andmete põhjal. Näiteks võib olla kasulik histopatoloogiline uuring, kui sarvkesta kahjustust on vaja täielikumalt kirjeldada. Selle võimaluse hindamiseks innustatakse meetodi kasutajaid silmi säilitama ja valmistama histopatoloogilisi preparaate, mida saab kasutada andmebaasi ja otsustamiskriteeriumide väljatöötamiseks, mille abil võib selle meetodi täpsust parandada. OECD on välja töötanud juhised in vitro katsemeetodite kasutamise kohta silmatoksilisuse määramiseks, milles on esitatud üksikasjalikud juhendid histopatoloogiliste proovide võtmise kohta, samuti teave, kuhu tuleks saata proovid ja/või histopatoloogia andmed (8).
                     Iga labor, kes alustab katsemeetodi kasutamist, peaks pädevuse tõendamiseks kasutama 2. liites esitatud kemikaale. Labor võib osutatud kemikaale kasutada selleks, et tõendada oma tehnilist pädevust ICE-katse läbiviimisel, enne kui ta esitab ICE-katsemeetodiga saadud andmed regulatiivseks ohu klassifitseerimiseks.
                     KATSE PÕHIMÕTE
                     ICE-meetod on organotüüpne mudel, mille abil on lühiajaliselt võimalik säilitada kanasilma in vitro. Katsemeetodis hinnatakse uuritava kemikaali põhjustatud kahjustust, määrates sarvkesta turset, hägusust ja fluorestseiini peetumist. Viimase kahe näitaja puhul on tegemist kvalitatiivse hindamisega, sarvkesta turse analüüsi puhul on ette nähtud kvantitatiivne hindamine. Iga mõõtmise tulemus teisendatakse kas kvantitatiivseks punktisummaks (hindeks), mida kasutatakse ärritava toime üldnäitaja arvutamiseks, või omistatakse sellele kvalitatiivne kategooria, mida kasutatakse silma suhtes in vitro ohuklassi määramiseks, st kemikaali määramiseks kas ÜRO GHSi 1. kategooriasse või ÜRO GHSi kategooriata kemikaaliks. Kumbagi neist tulemustest võib kasutada selleks, et prognoosida raske silmakahjustuse tekitamist in vivo või vajaduse puudumist klassifitseerida kemikaali seoses ohtlikkusega silmadele (vt otsustamise kriteeriumid). ICE-meetodiga ei saa siiski klassifitseerida kemikaale, mille puhul ei prognoosita raske silmakahjustuse tekitamist või mis ICE-katse põhjal ei vaja klassifitseerimist (vt punkt 11).
                     
                        Kanasilmade hankimine ja kasutatavate kanade vanus
                     
                     Kõnealuseks katseks on hakatud kasutama kanasilmi, mis saadakse tapamajadest, kus kanad tapetakse inimtoiduks; see kõrvaldab katseloomade kasutamise vajaduse. Kasutatakse üksnes silmi, mis on võetud tervetelt lindudelt, keda peetakse sobivaks inimtoidus kasutamiseks.
                     Kuigi kanade sobivaima vanuse hindamiseks ei ole läbi viidud kontrollitud uuringut, on tavaliselt kasutatud kõnealuseks katseks tapamajas tapetud kevadisi kanu (st vanus umbes 7 nädalat, kehamass 1,5–2,5 kg).
                     
                        Silmade hankimine ja transport laborisse
                     
                     Pead tuleb eemaldada kohe pärast kanade uimastamist, tavaliselt elektrivooluga, ja veretustamist kaelale tehtava lõikega. Tuleb leida lähim kohalik tapamaja labori lähedal, nii et kanade pead saaks piisavalt kiiresti viia tapamajast laborisse, et minimeerida lagunemist ja/või bakteritega saastumist. Ajavahemik kanapeade saamisest kuni silmade paigutamiseni pärast nende enukleatsiooni superfusioonikambrisse peaks olema võimalikult lühike (tavaliselt kuni kaks tundi), et tagada katse nõuetekohasuse kriteeriumide täitmine. Kõik katses kasutatavad silmad peavad olema ühest ja samast silmade rühmast, mis on võetud ühel konkreetsel päeval.
                     Kuna silmad prepareeritakse laboris, tuuakse kanade pead tervelt tapamajast laborisse toatemperatuuril (tavaliselt 18–25 °C) plastkastides, milles niiskuse suurendamiseks on isotoonilise keedusoolalahusega niisutatud paberrätid.
                     
                        Valikukriteeriumid ja ICE-katses kasutatavate silmade arv
                     
                     Silmi, millel pärast silmakoopast eemaldamist on kõrge fluorestseiiniga värvumise lähtetase (üle 0,5) või sarvkesta hägususe hinne (üle 0,5), katses ei kasutata.
                     Igas katserühmas ja paralleelses positiivse kontrolli rühmas kasutatakse vähemalt kolme silma. Negatiivse kontrolli rühmas või lahusti kontrollis (kui kasutatakse muud lahustit kui keedusoolalahust) kasutatakse vähemalt ühte silma.
                     Tahkete ainete puhul, mille tulemus GHSi süsteemi järgi on „kategooriata kemikaal“, soovitatakse teha teine katse (kolme silmaga) selle negatiivse tulemuse kinnitamiseks või tagasilükkamiseks.
                     KATSE KÄIK
                     
                        Silmade ettevalmistamine
                     
                     Silmalaud lõigatakse hoolikalt ära, vältides sarvkesta vigastamist. Sarvkesta kvaliteeti kontrollitakse kiiresti ühe tilga 2 % (mass/ruumala) naatriumfluorestseiini lahusega, mis kantakse sarvkesta pinnale mõneks sekundiks ja loputatakse siis maha isotoonilise keedusoolalahusega. Fluorestseiiniga töödeldud silmi vaadeldakse seejärel biomikroskoobiga, et teha kindlaks, et sarvkest on vigastamata (st fluorestseiini peetumine ja sarvkesta hägususe hinne on ≤ 0,5).
                     Kui sarvkest on vigastamata, jätkatakse ettevaatlikult silma koljust eemaldamist, vältides sarvkesta vigastamist. Silmamuna tõmmatakse silmakoopast välja, hoides pilkkilet kindlalt kirurgitangidega, ja silmalihased lõigatakse läbi painutatud nüriotsaliste kääridega. Oluline on vältida sarvkesta vigastust liigse rõhu tõttu (st vältida tuleb kompressioonist tingitud artefakte).
                     Silma eemaldamisel silmakoopast tuleb silmamuna külge jätta nähtav osa silmanärvi. Kui silm on silmakoopast eemaldatud, pannakse see filterpaberile ning lõigatakse ära pilkkile ja muud sidekoelised osad.
                     Eemaldatud silm paigutatakse roostevabast terasest klambri vahele, nii et sarvkest on vertikaalasendis. Klamber pannakse seejärel superfusiooniaparaadi kambrisse (18). Klambrid tuleb superfusiooniaparaadis paigutada nii, et kogu sarvkesta niisutataks isotoonilise keedusoolalahusega (3-4 tilka/min või 0,1–0,15 ml/min). Superfusiooniaparaadi kambrite temperatuuri tuleb hoida 32 ± 1,5 °C. 3. liites on esitatud tüüpilise superfusiooniaparaadi ja silmaklambrite skeem; sellise aparaadi võib osta või valmistada ise. Aparaati võib muuta vastavalt konkreetse labori vajadustele (näiteks vajaliku arvu silmade paigutamiseks aparaati).
                     Pärast superfusiooniaparaati paigutamist kontrollitakse silmi uuesti biomikroskoobiga, et nende hulgas ei oleks prepareerimisega vigastatud silmi. Samal ajal mõõdetakse sarvkesta tipus sarvkesta paksus, kasutades biomikroskoobi sügavusmõõtmisseadet. Asendatakse kõik järgmiste tunnustega silmad: i) milles fluorestseiini peetumise hinne > 0,5; ii) mille sarvkesta hägusus > 0,5; või iii) millel on muid kahjustuse tunnuseid. Osutatud kriteeriumide põhjal katsest välja jätmata silmade hulgast kõrvaldatakse veel silmad, mille sarvkesta paksus erineb üle 10 % kõikide silmade kohta arvutatud keskväärtusest. Kasutajad peaksid arvestama, et pilu erineva laiuse korral võib biomikroskoobiga saada erinevaid sarvkesta paksuse väärtuse tulemusi. Pilu laiuseks tuleb seada 0,095 mm.
                     Kui kõik silmad on üle vaadatud ja kõlblikuks tunnistatud, inkubeeritakse neid umbes 45–60 minutit, et need saavutaksid katsesüsteemiga tasakaalu, enne kui neile uuritav aine peale kantakse. Pärast tasakaalustumist mõõdetakse sarvkesta paksuse ja hägususe võrdlustase (0-tase), mis jääb lähtetasemeks (väärtused ajahetkel 0). Prepareerimise ajal määratud fluorestseiini peetumise hinnet kasutatakse kõnealuse näitaja lähtetaseme väärtusena.
                     
                        Uuritava kemikaaliga töötlemine
                     
                     Kohe pärast võrdlustaseme (0-taseme) mõõtmist võetakse silm (silmahoidikus) superfusiooniaparaadist välja, pannakse horisontaalasendisse ja uuritav kemikaal kantakse sarvkestale.
                     Vedelaid uuritavaid kemikaale testitakse tavaliselt lahjendamata, kuid neid võib ka lahjendada, kui seda peetakse vajalikuks (näiteks kui see on osa katse korraldusest). Eelistatud lahusti kemikaalide lahjendamiseks on füsioloogiline keedusoolalahus. Kontrollitud tingimustes võib kasutada ka muid lahusteid, kuid muude lahustite kui füsioloogilise keedusoolalahuse sobivust on vaja tõendada.
                     Vedelad uuritavad kemikaalid kantakse sarvkestale nii, et kogu sarvkesta pind on uuritava kemikaaliga ühtlaselt kaetud; tavaline ruumala on 0,03 ml.
                     Tahked uuritavad kemikaalid tuleks hõõruda võimalikult peeneks uhmris uhmrinuiaga või muu peenestamisvahendiga. Pulber kantakse sarvkestale niimoodi, et pind oleks uuritava kemikaaliga ühtlaselt kaetud; tavaline kogus on 0,03 g.
                     Uuritav (vedel või tahke) kemikaal kantakse 10 sekundiks peale ja loputatakse siis silma pealt maha toatemperatuuril oleva isotoonilise keedusoolalahusega (umbes 20 ml). Silm (silmahoidikus) pannakse seejärel tagasi superfusiooniaparaati esialgsesse vertikaalasendisse. Vajaduse korral võib kasutada täiendavat loputamist pärast 10-sekundilist pealekandmist ja ka hiljem (näiteks kui sarvkestal leitakse uuritava kemikaali jääke). Üldiselt ei ole loputamiseks kasutatud soolalahuse kogus otsustava tähtsusega, kuid oluline on jälgida, kas kemikaal on jäänud sarvkestale.
                     
                        Kontrolli kemikaalid
                     
                     Igas katses tuleks teha paralleelseid mõõtmisi ka negatiivse või lahusti/vehiikuli kontrolli ja positiivse kontrolli kemikaalidega.
                     100-protsendilise vedeliku või tahke aine uurimise korral kasutatakse ICE-katsemeetodis paralleelse negatiivse kontrollina füsioloogilist keedusoolalahust, et teha kindlaks katsesüsteemi mittespetsiifilisi muutusi ning tõendada, et katsetingimused ise ei tekita eksitavaid ärritusnähtusid.
                     Lahjendatud vedeliku uurimise korral tehakse ICE-katsemeetodiss paralleelselt lahusti/vehiikuli kontrolli rühm, et teha kindlaks katsesüsteemi mittespetsiifilisi muutusi ning tõendada, et katsetingimused ise ei tekita eksitavaid ärritusnähtusid. Nagu öeldud punktis 31, võib katses kasutada ainult sellist lahustit/vehiikulit, mille kohta on tõendatud, et see ei avalda kahjulikku toimet katsesüsteemile.
                     Igasse katsesse lisatakse positiivse kontrollina paralleelselt ka silmi teadaolevalt ärritav aine, et veenduda asjakohase tulemuse saamises. Kuna käesolevas katsemeetodis kasutatakse ICE-katsemeetodit söövitavate või tugevasti ärritavate kemikaalide kindlakstegemiseks, peaks positiivse kontrolli kemikaal olema selline võrdluskemikaal, mis selle katsemeetodi puhul põhjustab tugeva reaktsiooni. Selleks et oleks võimalik hinnata ka reaktsiooni positiivsele kontrollile ja selle muutumist ajas, ei tohiks raske reaktsioon olla ülemäära tugev. Positiivse kontrolli kohta tuleks saada piisaval hulgal in vitro-andmeid, et saaks arvutada positiivse kontrolli väärtuste statistiliselt määratletud sobiva vahemiku. Kui konkreetse positiivse kontrolli jaoks ei ole piisavalt varasemaid korralikke ICE-katse andmeid, võib selle teabe saamiseks olla vaja teha eraldi uuringuid.
                     Vedelate uuritavate kemikaalide positiivse kontrolli näited on 10 % äädikhape või 5 % bensalkooniumkloriid; tahkete uuritavate kemikaalide positiivse kontrolli näited on naatriumhüdroksiid või imidasool.
                     Võrdluskemikaalid võimaldavad hinnata teatavasse kemikaali- või tooteklassi kuuluva tundmatu kemikaali potentsiaali põhjustada silmade ärritust või hinnata silmi ärritava toimega konkreetse kemikaali potentsiaali ärritusreaktsiooni konkreetses vahemikus.
                     
                        Mõõdetavad näitajad
                     
                     Sarvkesti hinnatakse enne uuritava ainega töötlemist ning 30, 75, 120, 180 ja 240 minutit (± 5 minutit) pärast töötlemisjärgset loputamist. Nende mõõtmise ajapunktidega saadakse piisav arv mõõtmisi töötlemisele järgneva neljatunnilise ajavahemiku jooksul; samas jääb mõõtmiste vahele piisavalt aega, et nõutavad vaatlused tehtaks kõikide silmade puhul.
                     Mõõdetakse järgmisi näitajaid: sarvkesta hägusus, turse, fluorestseiini peetumine ja morfoloogilised muutused (näiteks epiteeli punktsöövitus või irdumine). Kõiki näitajaid peale fluorestseiini peetumise (mida määratakse ainult enne kokkupuudet kemikaaliga ja 30 minutit pärast kokkupuudet uuritava kemikaaliga) määratakse igal eespool osutatud vaatlusajal.
                     Sarvkesta hägusust, fluorestseiini peetumist, morfoloogilisi muutusi ja histopatoloogiat (kui seda uuritakse) on soovitatav dokumenteerida fotodega.
                     Pärast viimast vaatlust neljanda tunni järel on soovitatav säilitada silmad sobivas fiksaatoris (näiteks puhverdatud neutraalses formaliinis) võimaliku histopatoloogilise uuringu jaoks (vt täpsemalt punkt 14 ja viide 8).
                     Sarvkesta turse määratakse sarvkesta paksuse mõõtmisega, milleks kasutatakse biomikroskoobi optilist pahhümeetrit. Sarvkesta turse väljendatakse protsendina ja arvutatakse sarvkesta paksuse mõõtmisandmetest järgmise valemiga:
                     
                        
                     Arvutatakse kõikide katses kasutatud silmade keskmine sarvkesta turse protsent iga vaatlusaja jaoks. Igal vaatlusajal registreeritud sarvkesta turse kõige suurema keskmise hinde põhjal määratakse iga uuritava kemikaali üldine kategooriahinne (vt punkt 51).
                     Sarvkesta hägususe hindamiseks kasutatakse kõige rohkem hägustunud sarvkestaosa pindala, nagu on näidatud tabelis 1. Arvutatakse kõikide katses kasutatud silmade keskmine sarvkesta hägususe väärtus iga vaatlusaja jaoks. Igal vaatlusajal registreeritud sarvkesta hägususe kõige suurema keskmise hinde põhjal määratakse iga uuritava kemikaali üldine kategooriahinne (vt punkt 51).
                     
                        Tabel 1
                     
                     
                        Sarvkesta hägususe hinne punktides
                     
                     
                                 Hinne punktides
                              
                              
                                 Täheldatud nähud
                              
                           
                                 0
                              
                              
                                 hägusust ei ole
                              
                           
                                 0,5
                              
                              
                                 väga nõrk hägusus
                              
                           
                                 1
                              
                              
                                 hajutatud või difuussed hägususalad; vikerkesta detailid on selgelt nähtavad
                              
                           
                                 2
                              
                              
                                 kergesti märgatav läbipaistev ala; vikerkesta detailid on veidi ebaselged
                              
                           
                                 3
                              
                              
                                 sarvkest on tugevalt hägune; vikerkesta konkreetsed detailid ei ole nähtavad; pupilli suurus on vaevueristuv
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 sarvkest on täielikult hägune; vikerkesta ei ole näha
                              
                           Fluorestseiini peetumist hinnatakse ainult ajahetkel 30 minutit pärast kokkupuudet, nagu on näidatud tabelis 2. Keskmine fluorestseiini peetumise väärtus arvutatakse seejärel kõikide katses kasutatavate silmade jaoks ainult ajahetke 30 minutit jaoks; osutatud väärtust kasutatakse igale uuritavale kemikaalile üldise kategooriahinde omistamisel (vt punkt 51).
                     
                        Tabel 2
                     
                     
                        Fluorestseiini peetumise hinne punktides
                     
                     
                                 Hinne punktides
                              
                              
                                 Täheldatud nähud
                              
                           
                                 0
                              
                              
                                 fluorestseiini peetumist ei ole
                              
                           
                                 0,5
                              
                              
                                 üksikud rakud on väga nõrgalt värvunud
                              
                           
                                 1
                              
                              
                                 üksikuid värvunud rakke on hajusalt kogu töödeldud sarvkesta alal
                              
                           
                                 2
                              
                              
                                 värvunud üksikrakkude kolded või tihedalt laatunud alad
                              
                           
                                 3
                              
                              
                                 peetunud fluorestseiiniga sarvkestaalad moodustavad ulatuslikke laatunud laike
                              
                           Morfoloogiline mõju hõlmab järgmist: sarvkesta epiteelirakkude „punktsöövitus“, epiteeli irdumine, sarvkesta pinna karestumine ning uuritava aine „kleepumine“ sarvkestale. Sellised nähud võivad olla erineva raskusastmega ja esineda samaaegselt. Nende nähtude klassifitseerimine on subjektiivne ja sõltub uurija tõlgendusest.
                     ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                     
                        Andmete hindamine
                     
                     Sarvkesta hägususe ja turse ning fluorestseiini peetumise tulemusi tuleb hinnata eraldi, et leida ICE-klass iga näitaja jaoks. Iga näitaja ICE-klassid koondatakse seejärel iga uuritava kemikaali puhul ärritava toime klassifikatsiooni saamiseks.
                     
                        Otsustamiskriteeriumid
                     
                     Kui iga näitaja on hinnatud, saab eelnevalt määratud vahemiku alusel määrata ICE-klassid. Sarvkesta turse (tabel 3), hägususe (tabel 4) ja fluorestseiini peetumise (tabel 5) tõlgendamine nelja ICE-klassi kasutamisega toimub järgmiste skaalaastmete alusel. Oluline on märkida, et sarvkesta turse hindeid tabelis 3 saab kasutada ainult siis, kui sarvkesta paksus on mõõdetud biomikroskoobiga (näiteks Haag-Streit BP 900), kasutades sügavusmõõtmisseadet nr 1 ja pilulaiust 9, mis võrdub 0,095 mm-ga. Kasutajad peavad arvestama, et biomikroskoobiga võib erineva pilulaiuse korral saada sarvkesta paksuse erineva väärtuse.
                     
                        Tabel 3
                     
                     
                        Sarvkesta turse ICE-klassifitseerimise kriteeriumid
                     
                     
                                 Keskmine sarvkesta turse (%) (*2)
                                 
                              
                              
                                 ICE-klass
                              
                           
                                 0 kuni 5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 > 5 kuni 12
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 > 12 kuni 18 (> 75 minutit pärast töötlemist)
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 > 12 kuni 18 (≤ 75 minutit pärast töötlemist)
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 > 18 kuni 26
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 > 26 kuni 32 (> 75 minutit pärast töötlemist)
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 > 26 kuni 32 (≤ 75 minutit pärast töötlemist)
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                                 > 32
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                        
                     
                        Tabel 4
                     
                     
                        Sarvkesta hägususe ICE-klassifitseerimise kriteeriumid
                     
                     
                                 Maksimaalne keskmise hägususe hinne (*3)
                                 
                              
                              
                                 ICE-klass
                              
                           
                                 0,0 kuni 0,5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 0,6 kuni 1,5
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 1,6 kuni 2,5
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 2,6 kuni 4,0
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                        
                     
                        Tabel 5
                     
                     
                        Fluorestseiini peetumise ICE-klassifitseerimise kriteeriumid
                     
                     
                                 Keskmine fluorestseiini peetumise hinne 30 minutit pärast töötlust (*4)
                                 
                              
                              
                                 ICE-klass
                              
                           
                                 0,0 kuni 0,5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 0,6 kuni 1,5
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 1,6 kuni 2,5
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 2,6 kuni 3,0
                              
                              
                                 IV
                              
                           Uuritava kemikaali in vitro klassifikatsioon hinnatakse GHSi klassifikatsioooni järgi; selle leidmiseks ühendatakse kategooriad, mis on saadud sarvkesta turse, sarvkesta hägususe ja fluorestseiini peetumise järgi, nagu on kirjeldatud tabelis 6.
                     
                        Tabel 6
                     
                     
                        Ühendatud in vitro klassifikatsioon
                     
                     
                                 ÜRO GHSi klassifikatsioon
                              
                              
                                 Kolme näitaja kombinatsioonid
                              
                           
                                 Kategooriata
                              
                              
                                 3 × I
                                 2 × I, 1 × II
                              
                           
                                 Prognoosi ei saa teha
                              
                              
                                 Muud kombinatsioonid
                              
                           
                                 1. kategooria
                              
                              
                                 3 × IV
                                 2 × IV, 1 × III
                                 2 × IV, 1 × II (*5)
                                 
                                 2 × IV, 1 × I (*5)
                                 
                                 30 minuti pärast sarvkesta hägusus ≥ 3 (vähemalt kahes silmas)
                                 mis tahes vaatlusajal sarvkesta hägusus = 4 (vähemalt kahes silmas)
                                 Epiteeli tugev irdumine (vähemalt ühes silmas)
                              
                           
                        Uuringu nõuetekohasuse kriteeriumid
                     
                     Katse loetakse nõuetekohaseks, kui paralleelne negatiivne kontroll või vehiikuli/lahusti kontrollid on kindlaks tehtud kui GHSi kategooriata ained ning paralleelsed positiivsed kontrollid on määratud kui GHSi 1. kategooria.
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Katseprotokollis tuleb esitada järgmine teave, kui see on uuringu läbiviimise seisukohast asjakohane:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritav kemikaal ja kontrolli kemikaalid
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             keemiline nimetus või keemilised nimetused, nagu struktuurikohane nimetus, mida kasutab Chemical Abstracts Service (CAS), seejärel muud nimetused, kui need on teada;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             CASi registreerimisnumber, kui on teada;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali ja kontrolli kemikaalide puhtus või segu koostis (massiprotsendina), teadaolevas ulatuses;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             füüsikalis-keemilised omadused nagu füüsikaline olek, lenduvus, pH, stabiilsus, kemikaaliklass, lahustuvus vees, mis on olulised katse läbiviimise seisukohast;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali / kontrolli kemikaali töötlemine enne katset, kui see on asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             stabiilsus, kui on teada.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Teave sponsori ja uurimisasutuse kohta
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             sponsori, katselabori ja uuringu juhi nimi ja aadress;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             silmade päritolu kirjeldus (näiteks asutus, kust need saadi);
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsemeetodi tingimused
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud katsesüsteemi kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud biomikroskoop (näiteks mudel) ja kasutatud biomikroskoobi seaded;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             viide varasematele negatiivse ja positiivse kontrolli tulemustele ja, kui see on asjakohane, varasematele andmetele, mis tõendavad, et paralleelsete võrdluskontrollide tulemuste vahemikud on vastuvõetavad;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             meetodid, mida kasutati katsemeetodi tervikluse (st täpsuse ja usaldusväärsuse) tagamiseks ajas (nt perioodiline testimine pädevuse kontrolli kemikaalidega).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Silmade hankimine ja ettevalmistamine
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             doonorloomade, kellelt silmad eemaldati, vanus ja mass, ning kättesaadavuse korral muud eriomadused (nt sugu, tõug);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             silmade säilitamise ja transpordi tingimused (näiteks silmade võtmise aeg, ajavahemik kanapeade eemaldamisest kuni neist eemaldatud silmade superfusiooni kambrisse panekuni);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             silmade prepareerimine ja hoidikusse paigaldamine, seejuures nende kvaliteetsus, silmahoidikukambri temperatuur ja valikukriteeriumid, mida kasutati silmade katsesse valimiseks.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katse käik
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             paralleelide arv;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud negatiivse ja positiivse kontrolli kemikaalid (vajaduse korral ka lahusti ja võrdluskemikaalid);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali doos, kasutatud pealekandmisviis ja kokkupuuteaeg;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vaatluste ajapunktid (enne ja pärast töötlemist);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud hindamis- ja otsustamiskriteeriumide kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud katse nõuetekohasuse kriteeriumide kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kõikide katse-eeskirjas tehtud muudatuste kirjeldus.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemused
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             tabelitena sarvkesta turse, hägususe ja fluorestseiini peetumise hinded, mis on saadud iga silma kohta eraldi ja igal vaatlusajal, sealhulgas iga vaatlusaja keskmised tulemused kõigi katses kasutatud silmade kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             sarvkesta turse, hägususe ja fluorestseiini peetumise kõige suurem keskmine hinne (mis tahes vaatlusajal) ja selle vastav ICE-klass;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mis tahes muude täheldatud toimete kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             
                                                in vitro määratud GHSi klassifikatsioon;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vajaduse korral silmade fotod.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemuste arutelu
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kokkuvõte
                                 
                              
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) ja the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Kättesaadav aadressil: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Kättesaadav aadressil: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report – Current Status of in vitro Test Methods for Identifying Mild/Moderate Ocular Irritants: The Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) ja the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Kättesaadav aadressil: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2011). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, UN New York and Geneva, 2011. Kättesaadav aadressil: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 
                                    Streamlined Summary Document Supporting OECD Test Guideline 438 on the Isolated Chicken Eye for Eye Irritation/Corrosion. Series on Testing and Assessment no. 188 (Part 1 and Part 2), OECD, Paris.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.5 „Äge mürgisus: silmade ärritus/söövitus“.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Scott L, Eskes C, Hoffman S, Adriaens E, Alepee N, Bufo M, Clothier R, Facchini D, Faller C, Guest R, Hamernik K, Harbell J, Hartung T, Kamp H, Le Varlet B, Meloni M, Mcnamee P, Osborn R, Pape W, Pfannenbecker U, Prinsen M, Seaman C, Spielmann H, Stokes W, Trouba K, Vassallo M, Van den Berghe C, Van Goethem F, Vinardell P, Zuang V (2010). „A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-up and Top-down Approaches“. Toxicology in Vitro 24, 1–9.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 OECD (2011) „Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-severe Irritants“. Series on Testing and Assessment no. 160, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 ICCVAM. (2006). Background review document: „Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method“. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Kättesaadav aadressil: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). „Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits“. Fd. Chem. Toxicol. 31:69–76.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) (2009), Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET) / Isolated Chicken Eye Test, 13pp. Kättesaadav aadressil: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995), „The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test“. Toxicol. In Vitro 9:871–929.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (1996). „The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials“. Food Chem. Toxicol. 34:291–296.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: „Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation“. Food Chem. Toxicol. 35:23–37.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (2006). „The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage?“Toxicology in Vitro 20, 78–81.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L. and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). „Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings“. Kättesaadav aadressil: http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). „Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays“. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106–117.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). „The in vitro assessment of severe irritants“. Fd. Cosmet.- Toxicol. 19, 471–480.
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Aine
                           – looduslikud või mis tahes meetodi abil toodetud keemilised elemendid ja nende ühendid, mis võivad sisaldada toote stabiliseerimiseks vajalikke lisaaineid või tootmismeetodist tingitud lisandeid, kuid ei tohi sisaldada ühtki lahustit, mida on võimalik kemikaali stabiilsust vähendamata ja selle koostist muutmata eraldada (4);
                        
                           
                              Alt-üles lähenemisviis
                           – astmeline lähenemisviis, kasutatakse kemikaali puhul, mille kohta võib oletada, et seda ei ole vaja klassifitseerida seoses silmade ärrituse või raske silmakahjustusega; alustatakse klassifitseerimist mitte vajavate kemikaalide (negatiivne tulemus) eraldamisega muudest kemikaalidest (positiivne tulemus).
                        
                           
                              Astmelise katsetamise strateegia
                           – etapiviisi katsetamise strateegia, milles enne järgmise etapiga alustamist vaadatakse uuritava kemikaali kohta kindlaksmääratud korras läbi kogu olemasolev teave, kasutades igas etapis tõendite kaalukuse analüüsi, et otsustada, kas teave on piisav ohuklassi määramiseks. Kui olemasoleva teabe põhjal saab uuritava kemikaali ärritava toime potentsiaali kohta otsuse teha, ei ole edasisi katseid vaja teha. Kui olemasoleva teabe põhjal ei saa otsustada uuritava kemikaali ärritava toime potentsiaali üle, jätkatakse järjestikuste loomkatsete etapiti tegemist, kuni kemikaali saab üheselt klassifitseerida.
                        
                           
                              Biomikroskoop
                           – seade, mida kasutatakse silma vahetuks uurimiseks- binokulaarmikroskoobiga, mille abil saadakse suurendatud vertikaalne stereoskoopiline kujutis. ICE-katses kasutatakse seda seadet kanasilma eesmiste struktuuride vaatlemiseks, samuti sarvkesta paksuse objektiivseks mõõtmiseks, kasutades lisaseadet – pahhümeetrit.
                        
                           
                              Fluorestseiini peetumine
                           – ICE-katses subjektiivselt hinnatav suurus, millega väljendatakse pärast sarvkesta kokkupuudet uuritava ainega sarvkesta epiteelirakkudes peetunud naatriumfluorestseiini määra. Fluorestseiini peetumise määr näitab sarvkesta epiteeli kahjustuse suurust.
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Klassifitseerimata
                           – kemikaalid, mida ei klassifitseerita seoses silmaärritusega (ÜRO GHSi 2. kategooria) või raske silmakahjustusega (ÜRO GHSi 1. kategooria). Samatähenduslik mõistega „ÜRO GHSi kategooriata“.
                        
                           
                              Lahusti/vehiikuli kontroll
                           – uuritava kemikaaliga töötlemata proov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente, sealhulgas lahustit või vehiikulit; sellist proovi töödeldakse samamoodi uuritava kemikaaliga töödeldud proovidele ja muudele kontrolli proovidele, et määrata kindlaks samas lahustis või vehiikulis lahustatud uuritava kemikaaliga töödeldud proovide tekitatud reaktsiooni lähtetase. Kui paralleelselt uuritakse negatiivse kontrolli proovi, siis näitab lahusti/vehiikuli proov ka seda, kas lahusti või vehiikul reageerib katsesüsteemiga.
                        
                           
                              Negatiivne kontroll
                           – uuritava ainega töötlemata paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente. Sellist proovi töödeldakse koos proovidega, mida mõjutatakse uuritava kemikaaliga, ja koos muude kontrolli proovidega, et kontrollida, kas lahusti reageerib katsesüsteemiga.
                        
                           
                              Ohtlikkus
                           – mõjuri või olukorra iseloomulik omadus, millel võib olla kahjulik toime, kui organism, süsteem või (ala-)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub.
                        
                           
                              Pindaktiivne aine
                           – see on aine, näiteks detergent, mis võib vähendada vedeliku pindpinevust ja võimaldab sellel vahutada või tungida tahketesse ainetesse; sama mis märgav aine.
                        
                           
                              Positiivne kontroll
                           – paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente ja mida töödeldakse kemikaaliga, mis teadaolevalt põhjustab positiivse tulemuse. Selleks et oleks võimalik hinnata ka reaktsiooni positiivse kontrolli ainele ja selle muutumist ajas, ei tohiks raske reaktsioon olla ülemäära tugev.
                        
                           
                              Pöördumatu toime silmale
                           – vt „raske silmakahjustus“ ja „ÜRO GHSi 1. kategooria“.
                        
                           
                              Pöörduv toime silmale
                           – vt „raske silmakahjustus“ ja „ÜRO GHSi 2. kategooria“.
                        
                           
                              Raske silmakahjustus
                           – koekahjustuse tekkimine silmas või tugev füüsiline nägemislangus pärast seda, kui uuritavat kemikaali on kantud silma eespoolsele pinnale ja mõju ei ole täielikult pöörduv 21 päeva jooksul pärast aine pealekandmist. Samatähenduslik mõistetega „Pöördumatu mõju silmale“ ja „ÜRO GHSi 1. kategooria“ (4).
                        
                           
                              Sarvkest
                           – silmamuna eesmise osa läbipaistev kest, mis katab vikerkesta ja pupilli ning laseb valgusel tungida silma sisse.
                        
                           
                              Sarvkesta hägusus
                           – suurus, millega väljendatakse pärast kokkupuudet uuritava kemikaaliga toimunud sarvkesta hägustumise ulatust. Sarvkesta suurenenud hägusus näitab sarvkesta kahjustust.
                        
                           
                              Sarvkesta turse
                           – ICE-katses objektiivselt mõõdetav suurus, millega väljendatakse pärast sarvkesta kokkupuudet uuritava kemikaaliga tekkinud tursumuse ulatust. See väljendatakse protsendina ja arvutatakse ICE-katses enne töötlemist mõõdetud sarvkesta paksuse lähtetaseme ja pärast uuritava kemikaaliga kokkupuudet korrapäraste ajavahemike järel mõõdetud sarvkesta paksuse andmetest. Sarvkesta turse raskusaste näitab sarvkesta kahjustuse suurust.
                        
                           
                              Segu
                           – segu või lahus, mis koosneb kahest või enamast ainest, mis omavahel ei reageeri (4).
                        
                           
                              Silmade ärritus
                           – selliste muutuste tekkimine silmas pärast seda, kui uuritavat kemikaali on manustatud silma eespinnale, mis on täielikult pöörduvad 21 päeva jooksul pärast manustamist. Mõiste on samatähenduslik mõistetega „Pöörduv mõju silmale“ ja „ÜRO GHSi 2. kategooria“ (4).
                        
                           
                              Tõendusmaterjali kaalukuse hindamine
                           – protsess, milles kaalutakse mitmesuguste andmete tugevaid ja nõrku külgi, et jõuda otsuseni kemikaali võimaliku ohtlikkuse kohta ja toetada sellist otsust.
                        
                           
                              Täpsus
                           – katsemeetodi tulemuste lähedus kokkulangemisele kinnitatud võrdlusväärtustega. Täpsusega mõõdetakse katsemeetodi toimivust ja see on üks asjakohasuse aspektidest. Seda terminit kasutatakse ka kordustäpsuse tähenduses ja see näitab, kui sageli annab katsemeetod õige tulemuse.
                        
                           
                              Usaldusväärsus
                           – katsemeetodiga aja jooksul saadud tulemuste laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ulatuse mõõt, kui katset tehakse sama katse-eeskirja alusel. Seda hinnatakse laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ja laborisisese korduvuse arvutamisega.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                        
                           
                              Valenegatiivsete tulemuste määr
                           – kõikide selliste positiivsete kemikaalide osakaal, mis on katsemeetodi alusel ekslikult tunnistatud negatiivseks. See on katsemeetodi toimivuse üks näitajaid.
                        
                           
                              Valepositiivsete tulemuste määr
                           – kõikide selliste negatiivsete kemikaalide osakaal, mis katsemeetodi alusel on ekslikult tunnistatud positiivseks. See on katsemeetodi toimivuse üks näitajaid.
                        
                           
                              Valideeritud katsemeetod
                           – katsemeetod, mille valideerimisuuringud on lõpule viidud, st on määratud selle asjakohasus (sealhulgas täpsus) ja usaldusväärsus konkreetse eesmärgi suhtes. Oluline on märkida, et valideeritud katsemeetod ei tarvitse olla piisavalt kasutuskõlblik täpsuse ja usaldusväärsuse poolest, et seda saaks lugeda vastuvõetavaks konkreetse eesmärgi saavutamise seisukohast.
                        
                           
                              Võrdluskemikaal
                           – kemikaal, mida kasutatakse uuritava kemikaali võrdlusstandardina. Võrdluskemikaalil peaksid olema järgmised omadused: i) pidev ja usaldusväärne tarnija; ii) struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuritavate kemikaalidega; iii) teadaolevad füüsikalised ja keemilised omadused; iv) teadaolevaid toimeid tõendavad andmed; ja v) teadaolev tugevus soovitavas vastusreaktsiooni vahemikus.
                        
                           
                              Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem (ÜRO GHS (Globally Harmonized System))
                           – süsteem, milles kemikaalid (ained ja segud) on klassifitseeritud vastavalt nende füüsilise ohtlikkuse ning kahjuliku tervise- ja keskkonnamõju standarditud tüübile ja -tasemele ning mis hõlmab asjaomaseid teavitustähiseid, nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, et anda edasi inimeste (sealhulgas tööandjate, töötajate, vedajate, tarbijate ja päästetöötajate) ja keskkonna kaitsmiseks vajalikku teavet kõnealuste kemikaalide kahjuliku mõju kohta (4).
                        
                           
                              Ülalt-alla lähenemisviis
                           – astmeline lähenemisviis, kasutatakse kemikaali puhul, mille kohta võib oletada, et see tekitab rasket silmakahjustust; alustatakse rasket silmakahjustust tekitavate kemikaalide (positiivne tulemus) eraldamisega muudest kemikaalidest (negatiivne tulemus).
                        
                           
                              ÜRO GHSi 1. kategooria
                           – vt „raske silmakahjustus“ ja/või „pöördumatu mõju silmale“.
                        
                           
                              ÜRO GHSi 2. kategooria
                           – vt „silmaärritus“ ja/või „pöörduv mõju silmale“.
                        
                           
                              ÜRO GHSi kategooriata
                           – kemikaalid, mis ei vasta ÜRO GHSi 1. kategooria või 2. (2A või 2B) kategooria nõuetele. Sama mis „klassifitseerimata“.
                     
                     
                        2. liide
                        
                           ICE-KATSEMEETODI PÄDEVUSE KONTROLLI KEMIKAALID
                        
                        Enne käesoleval katsemeetodil põhineva määramise tavakasutusse võtmist peaks labor tõendama tehnilist pädevust ja selleks õigesti klassifitseerima tabelis 1 soovitatud 13 silmadele ohtlikku kemikaali. Kõnealused kemikaalid on valitud nii, et need esindavad silma ohutegurite põhjustatud reaktsioonide vahemikku, mis põhineb küüliku silma in vivo katse (katsemeetod 405) ja ÜRO GHSi klassifitseerimise süsteemi (see tähendab ÜRO GHSi 1. kategooria, 2A või 2B kategooria või klassifitseerimata) tulemustel (4, 6). Peale selle arvestati kemikaalide valimisel järgmisi kriteeriume: kaubanduslik kättesaadavus, kvaliteetsete in vivo võrdlusandmete olemasolu ja ICE-katsega saadud kvaliteetsete in vitro andmete olemasolu. Võrdlusandmed on esitatud lihtsustatud kokkuvõttedokumendis (5) ja ICCVAMi taustaülevaates ICE-meetodi kasutamise kohta (9).
                        
                           Tabel 1
                        
                        
                           Soovitatavad tehnilise pädevuse tõendamise kemikaalid ICE-meetodi jaoks
                        
                        
                                    Kemikaal
                                 
                                 
                                    CASi nr
                                 
                                 
                                    Kemikaaliklass (13)
                                    
                                 
                                 
                                    Füüsikaline olek
                                 
                                 
                                    
                                       In vivo-klassifikatsioon (14)
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       In vitro klassifikatsioon (15)
                                    
                                 
                              
                                    bensalkooniumkloriid (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    ooniumühend
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                              
                                    kloorheksidiin
                                 
                                 
                                    55-56-1
                                 
                                 
                                    amiin, amidiin
                                 
                                 
                                    tahke
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                              
                                    dibensoüül-L-viinhape
                                 
                                 
                                    2743-38-6
                                 
                                 
                                    karboksüülhape, ester
                                 
                                 
                                    tahke
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                              
                                    imidasool
                                 
                                 
                                    288-32-4
                                 
                                 
                                    heterotsükkel
                                 
                                 
                                    tahke
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                              
                                    trikloroäädikhape (30 %)
                                 
                                 
                                    76-03-9
                                 
                                 
                                    karboksüülhape
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                              
                                    2,6-diklorobensoüülkloriid
                                 
                                 
                                    4659-45-4
                                 
                                 
                                    atsüülhaliid
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    2A kategooria
                                 
                                 
                                    ei ole võimalik prognoosida (16)
                                    
                                 
                              
                                    ammooniumnitraat
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    anorgaaniline sool
                                 
                                 
                                    tahke
                                 
                                 
                                    2A kategooria (17)
                                    
                                 
                                 
                                    ei ole võimalik prognoosida (16)
                                    
                                 
                              
                                    etüül-2-metüülatseto-atsetaat
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    ketoon, ester
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    2 B kategooria
                                 
                                 
                                    ei ole võimalik prognoosida (16)
                                    
                                 
                              
                                    dimetüülsulfoksiid
                                 
                                 
                                    67-68-5
                                 
                                 
                                    orgaaniline väävliühend
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    kategooriata
                                 
                                 
                                    kategooriata
                                 
                              
                                    glütserool
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    alkohol
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    kategooriata
                                 
                                 
                                    kategooriata (piiripealne)
                                 
                              
                                    metüültsüklopentaan
                                 
                                 
                                    96-37-7
                                 
                                 
                                    süsivesinik (tsükliline)
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    kategooriata
                                 
                                 
                                    kategooriata
                                 
                              
                                    
                                       n-heksaan
                                 
                                 
                                    110-54-3
                                 
                                 
                                    süsivesinik (atsükliline)
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    kategooriata
                                 
                                 
                                    kategooriata
                                 
                              
                                    triatsetiin
                                 
                                 
                                    102-76-1
                                 
                                 
                                    lipiid
                                 
                                 
                                    vedelik
                                 
                                 
                                    klassifitseerimata
                                 
                                 
                                    kategooriata
                                 
                              
                                    Lühendid: CASi nr – Chemical Abstracts Service'i number.
                                 
                              
                     
                        3. liide
                        
                           ICE-KATSES KASUTATAVA SUPERFUSIOONIPARAADI JA SILMAHOIDIKU SKEEM
                        
                        
                           (Vt superfusiooniaparaadi ja silmaklambri täiendav üldine kirjeldus, Burton jt (18).)
                        
                        
                                    Punkt nr
                                 
                                 
                                    Kirjeldus
                                 
                                 
                                    Punkt nr
                                 
                                 
                                    Kirjeldus
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    Sooja vee väljalasketoru
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    Kamber
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    Lükanduks
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    Silmahoidik
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    Superfusiooniaparaat
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    Kanasilm
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    Optilise mõõtmise seade
                                 
                                 
                                    12
                                 
                                 
                                    Soolalahuse väljalasketoru
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    Sooja vee sisselasketoru
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    Fikseerimiskruvi
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    Soolalahus
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                    Reguleeritav ülemine hoidik
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    Soe vesi
                                 
                                 
                                    15
                                 
                                 
                                    Fikseeritud alumine hoidik
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    Soolalahuse sisselasketoru
                                 
                                 
                                     
                                 
                              “
               
                     14)
                  
                  
                     B osas asendatakse peatükk B.49 järgmisega:
                     „B.49.   Mikrotuumade tekke in vitro katse imetajarakkudega
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 487 (2016). See on osa geneetilise toksikoloogia katsemeetodite sarjast Välja on töötatud OECD dokument, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia katsetest ning ülevaade nende katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (1).
                     Mikrotuumade tekke in vitro katse on genotoksilisuse katse, milles määratakse mikrotuumade esinemist interfaasis olevate rakkude tsütoplasmas. Mikrotuumad võivad tekkida atsentrilistest kromosoomifragmentidest (st tsentromeerita fragmendid) või tervetest kromosoomidest, mis ei suuda liikuda poolustele raku jagunemise anafaasi etapis. Seega on mikrotuumade katse in vitro meetod, mis võimaldab in vitro terviklikult uurida kromosoomide kahjustamise potentsiaali, sest sellega saab määrata nii aneugeene kui ka klastogeene (2, 3) rakkudes, mis on jagunenud pärast kemikaaliga kokkupuudet või selle ajal (vt üksikasjalikumalt punkt 13). Mikrotuumad on tütarrakkudesse edasi kanduv kahjustus, samal ajal kui metafaasis olevates rakkudes sedastatavad kromosoomaberratsioonid tütarrakkudesse ei kandu. Mõlemal juhul võivad muutused olla raku elutegevusega kokkusobimatud.
                     Käesolev katsemeetod võimaldab kasutada nii selliseid metoodikaid, milles kasutatakse aktiini polümerisatsiooni inhibiitorit tsütohalasiin B (cytochalasin B, cytoB), kui ka selliseid, milles seda ei kasutata. CytoB lisamine enne mitoosi põhjustab kahetuumaliste rakkude teket ning võimaldab seega mikrotuumi määrata ja analüüsida vaid nendes rakkudes, mis on ühe mitoosi täielikult lõpetanud (4, 5). Käesolev katsemeetod võimaldab kasutada ka ilma tsütokineesi blokeerimiseta katsemetoodikaid, kui on tõendatav, et analüüsitav rakupopulatsioon on läbinud mitoosi.
                     Lisaks sellele, et kasutada mikrotuumade tekke in vitro katset mikrotuumade teket indutseerivate kemikaalide kindlaks tegemiseks, võib kinetohooride immunokeemilise märgistamise või tsentromeeri/telomeeri piirkonna proovidega hübriidimise kaudu (in situ fluorestsentshübriidimine, FISH) saada lisateavet kromosoomikahjustuse ja mikrotuumade tekke mehhanismide kohta (6–17). Märgistamise ja hübriidimise meetodeid võib kasutada, kui mikrotuumade teke on suurenenud ning uurija tahab kindlaks teha, kas nende suurenenud tekke põhjus on klastogeenne ja/või aneugeenne protsess.
                     Kuna interfaasis olevates rakkudes saab mikrotuumi hinnata suhteliselt objektiivselt, piisab, kui laboripersonal määrab cytoB kasutamise korral kahe tuumaga rakkude arvu ning kõigil juhtudel mikrotuumadega rakkude esinemuse. Seepärast saab mikroskoobipreparaate hinnata suhteliselt kiiresti ja analüüsi saab automatiseerida. Seepärast on asjakohane iga töötlemise kohta hinnata sadade rakkude asemel tuhandeid rakke; see suurendab katse statistilist võimsust. Peale selle, kuna mikrotuumad võivad tekkida kromosoomiloive tõttu, on võimalik tuvastada aneuploidsust põhjustavaid kemikaale, mida on keeruline kindlaks teha tavaliste kromosoomaberratsioonkatsetega, nt käesoleva lisa peatükk B.10 (18). Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud mikrotuumade tekke in vitro katse ei võimalda siiski ilma punktis 4 nimetatud erimeetoditeta (nt FISH), eristada kemikaale, mis põhjustavad kromosoomiarvu ja/või ploidsuse muutusi, klastogeensust tekitavatest kemikaalidest.
                     Mikrotuumade tekke in vitro katse on töökindel ning teostatav paljude rakutüüpidega, nii cytoB manulusel kui ka selleta. Väga paljud andmed toetavad mikrotuumade tekke in vitro katse kasutatavust eri rakutüüpide puhul (rakuliinid või primaarkultuurid) (19–36). Need hõlmavad eelkõige rahvusvahelisi valideerimisuuringuid, mida koordineeris Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (19–23), ja genotoksilisuse uuringuid käsitleval rahvusvahelisel seminaril International Workshop on Genotoxicity Testing esitatud materjale (5, 17). Euroopa Alternatiivsete Meetodite Tõestamise Keskus (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) on tõendite kaalukusel põhineva retrospektiivse valideerimisuuringuga olemasolevaid andmeid ka uuesti hinnanud ning katsemeetodi teaduslikku usaldusväärsust on kinnitanud ECVAMi teaduslik nõuandekomitee (ESAC) (37–39).
                     Mikrotuumade tekke in vitro katses võib kasutada inimese või näriliste rakuliine või primaarseid rakukultuure. Kuna mikrotuumade foonis esinemise sagedus mõjutab katse tundlikkust, soovitatakse kasutada rakutüüpe, mille puhul mikrotuumade tekke sagedus foonis on stabiilne ja kindlaks määratud. Kasutatavad rakud valitakse rakukultuuris hea kasvuvõime, karüotüübi (sealhulgas kromosoomiarvu) stabiilsuse ja mikrotuumade spontaanse esinemissageduse alusel (40). Praegu olemasolevad andmed ei võimalda anda kindlaid soovitusi, kuid nende alusel võib eeldada, et keemiliste ohutegurite hindamisel on oluline võtta arvesse katseks valitud rakkude p53 staatust, geneetilist (karüotüübi) stabiilsust, DNA reparatsiooni võimet ja päritolu (näriliste või inimese rakud). Seega soovitatakse käesoleva katsemeetodi kasutajatel indutseeritud mikrotuumade tekke määramiseks võtta arvesse neid ja – valdkonna teadmiste lisandumisel – muid rakuliini toimimist mõjutavaid rakulisi näitajaid.
                     Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.
                     LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD
                     
                        In vitro katsete puhul tuleb üldjuhul kasutada eksogeenset metaboolse aktivatsiooni allikat, välja arvatud juhul, kui rakud metaboliseerivad uuritavaid kemikaale. Eksogeenne metaboolse aktivatsiooni süsteem ei ole täielikult samastatav in vivo tingimustega. Hoolikalt tuleb vältida tingimusi, mis võivad põhjustada valepositiivseid tulemusi, mis ei peegelda uuritavate kemikaalide genotoksilisust. Sellised tingimused hõlmavad pH (41–43) või osmolaalsuse muutusi, söötme koostisosadega reageerimist (44, 45) või liiga suurt tsütotoksilisust (vt punkt 29).
                     Mikrotuumade tekke induktsiooni analüüsimiseks on väga tähtis, et mitoos oleks toimunud nii uuritava kemikaaliga töödeldud kultuurides kui ka töötlemata kultuurides. Mikrotuumade hindamiseks on kõige informatiivsemad sellises faasis rakud, mis on uuritava kemikaaliga töötlemise ajal või pärast seda läbinud täielikult ühe mitoosi. Tehislike nanomaterjalide uurimiseks on käesolevat katsemeetodit vaja eraldi kohandada, kuid seda ei ole käesolevas katsemeetodis kirjeldatud.
                     Enne kui kasutada seda meetodit segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi jaoks, tuleb kaaluda, kas see katse annab selle eesmärgi jaoks piisavaid tulemusi ja kui annab, siis miks. Sellist kaalumist ei ole vaja, kui regulatiivne nõue eeldabki segu katsetamist.
                     KATSE PÕHIMÕTE
                     Inimrakkude või muud päritolu imetajarakkude kultuurid lastakse uuritava kemikaaliga kokku puutuda nii metaboolse aktivatsiooni eksogeense allika juuresolekul kui ka ilma selleta, välja arvatud juhul, kui kasutatakse piisava metaboliseerimisvõimega rakke (vt punkt 19).
                     Uuritava kemikaaliga kokkupuute ajal või pärast seda kasvatatakse rakke piisava ajavahemiku jooksul, et interfaasis olevates rakkudes saaksid kromosoomikahjustuse või muude toimete tõttu rakutsükli/rakujagunemise protsessidele tekkida mikrotuumad. Aneuploidsuse põhjustamiseks peaks kokkupuude uuritava kemikaaliga tavaliselt toimuma mitoosi ajal. Kogutud ja värvitud interfaasirakke uuritakse mikrotuumade esinemise suhtes. Ideaaljuhul tuleks mikrotuumi hinnata üksnes sellistes rakkudes, mis on täielikult läbinud mitoosi kas uuritava kemikaaliga kokkupuute ajal või kokkupuutejärgses perioodis, kui seda kasutatakse. Tsütokineesi blokaatoriga töödeldud kultuurides saavutatakse see lihtsalt, selleks hinnatakse vaid kahetuumalisi rakke. Tsütokineesi blokaatori puudumisel on tähtis tõendada, et analüüsitavad rakud on tõenäoliselt jagunenud; seejuures toetutakse rakupopulatsiooni suurenemisele uuritava kemikaaliga kokkupuute ajal või pärast seda. Kõigi katsemetoodikate puhul on oluline tõendada, et rakkude paljunemine on toimunud nii kontrolli kultuurides kui ka töödeldud kultuurides, ning tuleb hinnata uuritava kemikaali põhjustatud tsütotoksilisuse või tsütostaasi ulatust kõigis kultuurides, mida hinnatakse mikrotuumade esinemise suhtes.
                     MEETODI KIRJELDUS
                     
                        Rakud
                     
                     Kasutada võib rakukultuuris kasvatatud primaarseid inimese või muude imetajate perifeerse vere lümfotsüüte (7, 20, 46, 47) ja mitmeid näriliste rakuliine, nt CHO, V79, CHL/IU ja L5178Y, või inimese rakuliine, nt TK6 (19–23, 26–29, 31, 33–36) (vt punkt 6). Mikrotuumade tekke katses on kasutatud ka muid rakuliine, nagu HT29 (48), Caco-2 (49), HepaRG (50, 51), HepG2 rakud (52) (53), A549 ja süüria hamstri primaarseid embrüorakke (54), kuid nendega saadud andmeid ei ole praegu põhjalikult valideeritud. Seepärast tuleb muude rakuliinide ja -tüüpide kasutamist põhjendada nendega saadud tõendatud katsetulemuste põhjal, nagu on kirjeldatud katse nõuetekohasuse kriteeriumide punktis. CytoB kohta on teatatud, et see võib mõjutada L5178Y rakkude kasvu, ning seetõttu ei soovitata selle kasutamist nimetatud rakuliiniga (23). Kui kasutatakse primaarseid rakke, tuleb loomade heaolu huvides kaaluda inimrakkude kasutamist kõigil juhtudel, kui rakkude saamine ei tekita probleeme ja proovid võetakse kooskõlas inimuuringute eetika põhimõtete ja nõuetega.
                     Inimese perifeerse vere lümfotsüüte tuleks võtta noortelt (umbes 18–35aastastelt) mittesuitsetavatelt isikutelt, kellel ei ole teadaolevaid haigusi ning kes ei ole hiljuti kokku puutunud genotoksiliste teguritega (nt kemikaalid, ioniseeriv kiirgus) koguses, mis võiks suurendada mikrotuumadega rakkude esinemist katse foonis. See tagaks, et mikrotuumadega rakkude esinemus foonis on väike ja püsiv. Mikrotuumadega rakkude esinemissageduse lähtetase suureneb vanusega ja see trend on rohkem väljendunud naistel kui meestel (55). Kui eri doonoritelt kogutud rakud kasutamiseks ühendatakse, tuleb esitada doonorite arv. On vaja tõendada, et rakud on pärast uuritava kemikaaliga töötlemise alustamist kuni proovi võtmiseni jagunenud. Rakukultuure hoitakse eksponentsiaalse kasvu faasis (rakuliinid) või stimuleeritakse rakkude jagunemist (lümfotsüütide primaarkultuurid), et saada rakke rakutsükli eri faasidest, sest eri faasides olevate rakkude tundlikkus uuritavate kemikaalide suhtes võib olla teadmata. Primaarsed rakud, mida tuleb jagunemiseks stimuleerida mitogeenidega, ei ole uuritava kemikaaliga kokkupuute ajal tavaliselt enam sünkroniseeritud (nt inimese lümfotsüüdid pärast 48tunnist stimulatsiooni mitogeeniga). Uuritava kemikaaliga töötluse ajal ei soovitata sünkroniseeritud rakkude kasutamist, kuid see võib olla aktsepteeritav, kui on põhjendatud.
                     
                        Söötmed ja kultiveerimistingimused
                     
                     Rakukultuuride jaoks tuleb kasutada asjakohast söödet ja asjakohaseid inkubeerimistingimusi (kasvunõud, sobiva niiskusesisaldusega 5 % CO2 atmosfäär (kui asjakohane), temperatuur 37 °C). Rakuliine tuleb tavapraktika korras kontrollida modaalse kromosoomiarvu stabiilsuse ja mükoplasmaga saastumise puudumise suhtes, ning saastunud rakke või rakke, mille modaalne kromosoomiarv on muutunud, ei kasutata. Rakuliinide ja primaarsete rakukultuuride puhul tuleb saavutada normaalne rakutsükliks kuluv aeg ja see peab vastama rakkude kohta avaldatud iseloomulikele näitajatele.
                     
                        Rakukultuuride ettevalmistamine
                     
                     Rakuliinid: rakke kasvatatakse tüvikultuurist, külvates neid söötmesse sellise tihedusega, et rakud jätkaksid nii suspensioonis kui ka monokihina eksponentsiaalset kasvamist kuni nende kogumiseni (nt monokihina kasvavate rakkude puhul tuleb konfluentsust vältida).
                     Lümfotsüüdid: antikoagulandiga (nt hepariin) töödeldud täisverd või eraldatud lümfotsüüte kasvatatakse (nt 48 tundi inimese lümfotsüütide puhul) mitogeeni juuresolekul (nt fütohemaglutiniin (PHA) inimese lümfotsüütide puhul), et indutseerida raku jagunemine enne töötlemist uuritava kemikaali ja cytoB-ga.
                     
                        Metaboolne aktivatsioon
                     
                     Eksogeenseid metaboliseerivaid süsteeme tuleb kasutada juhul, kui kasutatavate rakkude endogeenne metaboliseerimisvõime on ebapiisav. Kui ei ole põhjendatud muu süsteemi kasutamist, soovitatakse vaikevalikuna kõige sagedamini kasutatavat süsteemi, milleks on näriliste (tavaliselt roti) maksast valmistatud postmitokondriline fraktsioon S9, millele on lisatud kofaktor ning mida on töödeldud ensüümide induktoritega, nagu Aroclor 1254 (56, 57) või fenobarbitaali ja b-naftoflavooni kombinatsiooniga (58–60). Viimane kombinatsioon ei ole vastuolus püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsiooniga (Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants (61)) ning on mitme funktsiooniga oksüdaaside induktorina osutunud sama tõhusaks kui Aroclor 1254 (58–60). S9-fraktsiooni kasutatakse tavaliselt kontsentratsioonivahemikus 1–2 % (mahuprotsent), kuid kontsentratsiooni võib suurendada kuni 10 %-ni (mahuprotsent) katse lõplikus söötmes. Ühendeid, mis vähendavad mitoosiindeksit, eriti kaltsiumiga komplekse moodustavaid ühendeid (62), tuleb vältida töötlemise ajal. Uuritavate kemikaalide klass võib mõjutada kasutatava eksogeense metaboolse aktivatsiooni süsteemi või ensüümi induktori tüübi ja kontsentratsiooni valikut.
                     
                        Uuritava kemikaali preparaatide valmistamine
                     
                     Enne rakkude töötlemist tuleb tahke uuritav kemikaal lahustada sobivas lahustis ja vajaduse korral lahjendada. Vedelat uuritavat kemikaali võib lisada katsesüsteemile vahetult ja/või lahjendada seda enne katsesüsteemile lisamist. Gaasi või lenduva kemikaalide kasutamiseks katsetes tuleb katsemetoodikat asjakohaselt muuta, näiteks teha töötlusetapp suletud anumas (63–65). Uuritava kemikaali preparaadid tuleb valmistada vahetult enne kasutamist, välja arvatud juhul, kui nende stabiilsuse andmetest nähtub, et neid võib säilitada.
                     
                        Katsetingimused
                     
                     
                        Lahustid
                     
                     Lahusti tuleb valida nii, et uuritava kemikaali lahustuvust saaks parandada, ilma et see moonutaks katse käiku (nt muudaks rakkude kasvukiirust, muudaks uuritavat kemikaali, reageeriks rakkude kasvunõuga, kahjustaks metaboolse aktivatsiooni süsteemi). Kui see on vähegi võimalik, on esimese võimalusena soovitatav kaaluda vesilahustuva lahusti (või söötme) kasutamist. Tavalised lahustid on näiteks vesi või dimetüülsulfoksiid (DMSO). Üldiselt ei tohiks orgaanilise lahusti sisaldus ületada 1 % (mahuprotsent). Kui cytoB lahustatakse DMSO-s, ei tohiks uuritava kemikaali ja cytoB puhul mõlema lahustamiseks kasutatud orgaanilise lahusti kogus kokku ületada 1 % (mahuprotsent); vastasel juhul tuleb teha lahusti kontrolli katsed ja näidata, et orgaanilise lahusti sisaldusel ei ole kahjulikku toimet. Üldjuhul ei tohiks töötlusetapis kasutatavas lõppsöötmes vesilahustuva lahusti (füsioloogiline lahus või vesi) sisaldus ületada 10 % (mahuprotsent). Kui kasutatakse muid kui tavaliselt kasutatavaid lahusteid (nt etanooli või atsetooni), tuleb nende kasutamiseks esitada andmed, millest nähtub nende kokkusobivus uuritava kemikaali ja katsesüsteemiga ning genotoksilise toime puudumine kasutatud kontsentratsioonil. Tugiandmete puudumisel on oluline lisada lahustiga töötlemata kontrollid (vt 1. liide) ja lahusti kontrollid, et tõendada valitud lahustil kahjuliku või kromosoome mõjutava (nt aneuploidse või klastogeense) toime puudumist.
                     
                        CytoB kasutamine tsütokineesi blokaatorina
                     
                     Üks olulisemaid probleeme mikrotuumade in vitro katse tegemisel on tagada, et hinnatavad rakud oleksid töötlemise ajal või töötlemisjärgses inkubeerimisperioodis (kui seda kasutatakse) lõpetanud mitoosi. Mikrotuumade hindamisel tuleb seega piirduda üksnes selliste rakkudega, mis on töötlemise ajal või pärast seda läbinud mitoosi. Tsütokineesi blokeerimiseks on enim kasutatud ühendit cytoB, sest see inhibeerib aktiini polümerisatsiooni ja takistab sellega tütarrakkude lahknemist pärast mitoosi, mistõttu tekivad kahetuumalised rakud (6, 66, 67). Uuritava kemikaali toimet raku paljunemise kineetikale võib mõõta samal ajal cytoB kasutamisega. Kui kasutatakse inimese lümfotsüüte, tuleb cytoB-ga tsütokinees blokeerida, sest rakutsükli kestus on doonoriti erinev ning kõik lümfotsüüdid ei reageeri stimulatsioonile fütohemaglutiniiniga. CytoB kasutamine teiste rakutüüpide puhul ei ole kohustuslik, kui tõendatakse, et need on jagunenud, nagu on kirjeldatud punktis 27. Peale selle ei kasutata cytoB-d üldiselt juhul, kui mikrotuumade esinemist proovides hinnatakse läbivoolutsütomeetria meetoditega.
                     Laboril tuleb iga rakutüübi puhul määrata asjakohane cytoB kontsentratsioon, millega saavutatakse optimaalne kahetuumaliste rakkude sagedus lahusti kontrolli kultuurides, ning tõendada, et see tagab hindamiseks vajaliku kahetuumaliste rakkude arvu. CytoB sobiv kontsentratsioon on tavaliselt vahemikus 3–6 μg/ml (19).
                     
                        Rakkude paljunemise ja tsütotoksilisuse mõõtmine ning uuritava kemikaali kontsentratsioonide valimine
                     
                     Uuritava kemikaali suurimat kontsentratsiooni määrates tuleb vältida kontsentratsioone, mis võivad põhjustada valepositiivseid tulemusi, nagu kontsentratsioonid, mis põhjustavad liiga suurt tsütotoksilisust (vt punkt 29), söötmes sadestumist (vt punkt 30) või olulisi pH või osmolaalsuse muutusi (vt punkt 9). Kui uuritav kemikaal muudab lisamise hetkel oluliselt söötme pH-d, võib pH reguleerimiseks töötlusetapis kasutatavasse lõppsöötmesse lisada puhvrit, et vältida valepositiivseid tulemusi ja säilitada asjakohased rakkude kasvutingimused.
                     Rakkude paljunemise mõõtmisega veendutakse, et piisav arv uuritava kemikaaliga töödeldud rakke on katse ajal läbinud mitoosi ja et töötlusi tehakse tsütotoksilisuse sobival tasemel (vt punkt 29). Tsütotoksilisus tuleb määrata põhikatses nii metaboolse aktivatsiooniga kui ka ilma selleta, kasutades asjakohaseid rakusurma ja rakupopulatsiooni kasvu näitajaid (vt punkte 26 ja 27). Kuigi tsütotoksilisuse hindamine esialgses eelkatses võib osutuda kasulikuks, et paremini määrata põhikatses kasutatavad kontsentratsioonid, ei ole eelkatse tegemine kohustuslik. Kui tsütotoksilisust hinnatakse eelkatses, ei asenda need tulemused tsütotoksilisuse mõõtmist põhikatses.
                     Rakukultuuride töötlemine cytoB-ga ning ühe-, kahe- ja mitmetuumaliste rakkude suhtelise esinemissageduse määramine kultuuris on täpne meetod, millega saab mõõta, kuidas töötlemine mõjutab rakkude paljunemist ning milline on töötlemise tsütotoksiline või tsütostaatiline toime (6); sellega tagatakse, et mikroskoopiliselt hinnatakse ainult töötlemise ajal või pärast seda jagunenud rakke. Rakukultuuri kohta soovitatakse kasutada vähemalt 500 rakku, et määrata proliferatsiooniindeks blokeeritud tsütokineesi korral (cytokinesis-block proliferation index, CBPI) (6, 27, 68) või replikatsiooniindeks (replication index, RI) (vt valemid, 2. liide) ning hinnata töötluse tsütotoksilist ja tsütostaatilist toimet, võrreldes nende väärtusi töödeldud ja kontrolli kultuurides. Muude tsütotoksilisuse näitajate kaudu (nt raku terviklikkus, apoptoos, nekroos, metafaasis rakkude arv, rakutsükkel) võib saada kasulikku teavet, kuid neid ei saa kasutada CBPI või RI asemel.
                     Uuringute puhul, milles cytoB-d ei kasutata, on vaja tõendada, et rakud on kultuuris jagunenud, nii et suurem osa hinnatud rakkudest on jagunenud kemikaaliga töötluse ajal või pärast seda, vastasel juhul võib saada valenegatiivseid tulemusi. Soovitatakse mõõta rakupopulatsiooni suhtelist kahekordistumist (relative population doubling, RPD) või rakkude arvu suhtelist suurenemist (relative increase in cell count, RICC), et hinnata töötluse tsütotoksilist ja tsütostaatilist toimet (17, 68–71) (vt valemid, 2. liide). Proovivõtule eelneva ajavahemiku pikendamise korral (nt kokkupuude kemikaaliga 1,5–2 normaalse rakutsükli kestuse jooksul, mille järel kogutakse rakud täiendava 1,5–2 normaalse rakutsükli möödumisel, millega proovid võetakse normaalse rakutsükli kestusest kokku 3–4 korda pikema aja möödumisel, nagu on kirjeldatud punktis 38 ja 39) võib RPD-ga tsütotoksilisust alahinnata (71). Neil tingimustel võib RICC olla parem mõõdetav näitaja või võib õigema hinnangu anda tsütotoksilisuse hindamine pärast 1,5–2 normaalse rakutsükli kestuse möödumist. Muude tsütotoksilisuse või tsütostaasi näitajate kaudu (nt raku terviklikkus, apoptoos, nekroos, metafaasis rakkude arv, proliferatsiooniindeks, rakutsükkel, nukleoplasmasillad või tuumasopised) võib saada kasulikku teavet, kuid neid ei saa kasutada RPD või RICC asemel.
                     Lahusti kontrolli ja positiivseid kontrolle kaasa arvamata tuleb hinnata vähemalt kolme katsekontsentratsiooni, mis vastavad nõuetekohasuse kriteeriumidele (asjakohane tsütotoksilisus, rakkude arv jne). Sõltumata rakutüübist (rakuliinid või lümfotsüütide primaarkultuur) võib iga kontsentratsiooniga töödelda kas paralleelselt mitut või ainult ühte rakukultuuri. Kuigi soovitatav on kasutada paralleelkultuure, võib ka üksikkultuuride kasutamist aktsepteerida eeldusel, et nii ühe kui ka paralleelkultuuride puhul hinnatakse kokku ühesugune arv rakke. Üksikkultuuride kasutamine on eriti asjakohane, kui hinnatakse rohkem kui kolme kontsentratsiooni (vt punktid 44–45). Konkreetse kontsentratsiooniga sõltumatutest paralleelkultuuridest saadud tulemusi võib andmeanalüüsiks kokku arvestada. Uuritavate kemikaalide puhul, mille tsütotoksilisus on väike või millel see puudub, on tavaliselt sobivad kahe- kuni kolmekordsed kontsentratsiooniintervallid. Tsütotoksilisuse avaldumise korral peavad katseks valitud kontsentratsioonid katma vahemiku alates kontsentratsioonist, millel avaldub tsütotoksilisus (nagu on kirjeldatud punktis 29), ja hõlmama kontsentratsioonid, millel esineb mõõdukas ja väike (või olematu) tsütotoksilisus. Paljudel uuritavatel kemikaalidel on kontsentratsiooni-toime sõltuvuse kõver järsu tõusuga ja selleks, et saada andmeid väikese või mõõduka tsütotoksilisuse kohta või et uurida annuse-toime seost üksikasjalikult, tuleb kasutada väiksema intervalliga kontsentratsioone ja/või enam kui kolme kontsentratsiooni (üks kultuur või mitu paralleelkultuuri), eriti olukorras, kui vajatakse korduskatset (vt punkt 60).
                     Kui maksimumkontsentratsioon põhineb tsütotoksilisusel, on suurima kontsentratsiooni puhul eesmärk saavutada 55 ± 5 % tsütotoksilisusest soovitatavate tsütotoksilisuse näitajate (st RICC ja RPD vähenemine rakuliinide puhul, kui cytoB-d ei kasutata, ning CBPI või RI vähenemine kuni 45 ± 5 %, kui cytoB-d kasutatakse, võrreldes samaaegse negatiivse kontrolliga) põhjal (72). Hoolikas tuleb olla positiivsete tulemuste tõlgendamisel, kui need esinevad vaid selle 55 ± 5 % tsütotoksilisuse vahemiku ülemises osas (71).
                     Halvasti lahustuva uuritava kemikaali puhul, mis ei ole tsütotoksiline kontsentratsioonidel, mis on väiksemad kui kõige väiksem kontsentratsioon, millel kemikaal enam ei lahustu, peab suurim analüüsitav kontsentratsioon kemikaaliga töötluse lõpus alati tekitama hägususe või silma või invertmikroskoobiga nähtav sademe. Isegi kui tsütotoksilisus avaldub suuremal kontsentratsioonil kui vähim kontsentratsioon, millel kemikaal enam ei lahustu, on soovitatav teha katse ainult ühe sellise kontsentratsiooniga, millel tekib hägusus või nähtav sade, sest sade võib toimet moonutada. Sademe moodustumise kontsentratsioonil tuleb hoolikalt veenduda, et sade ei mõjuta katse tegemist (nt värvimist või hindamist). Kasulikuks võib osutuda kemikaali lahustuvuse määramine söötmes enne katsega alustamist.
                     Kui ei sadet ega piiravat tsütotoksilisust ei täheldata, peab suurim kontsentratsioon katses vastama vähimale kontsentratsioonile järgmistest: 10 mM, 2 mg/ml või 2 μl/ml (73–75). Kui uuritava kemikaali koostis ei ole määratav, nt on see tundmatu või muutuva koostisega aine, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogiline materjal (UVCB) (76), keskkonnast saadud ekstrakt jne, võib iga koostisosa kontsentratsiooni suurendamiseks olla vajalik kasutada suuremat maksimaalset kontsentratsiooni (nt 5 mg/ml), kui sellega ei kaasne olulist tsütotoksilisust. Tuleb siiski märkida, et inimravimite suhtes võivad need nõuded olla teistsugused (93).
                     
                        Kontrollid
                     
                     Iga kogumise kohta tuleb ette näha ka samaaegsed negatiivsed kontrollid (vt punkt 21), milles töötluseks kasutatavale söötmele lisatakse vaid lahusti ja mille rakke käideldakse muus osas samamoodi kui uuritava kemikaaliga töödeldud kultuure.
                     Samaaegseid positiivseid kontrolle on vaja, et tõendada labori pädevust kasutatud katsemetoodika tingimustel määrata klastogeene ja aneugeene ning (kui asjakohane) eksogeense metaboolse aktivatsiooni süsteemi tõhusust. Positiivsete kontrollide näited on esitatud allpool tabelis 1. Kui see on põhjendatud, võib kasutada alternatiivseid positiivseid kontrollkemikaale.
                     Praegu ei teata ühtegi aneugeeni, mille genotoksilisuse avaldumiseks oleks vaja metaboolset aktivatsiooni (17). Kuna in vitro genotoksilisuse katsed imetajarakkudega on piisavalt standarditud lühiajaliste töötluste puhul, mis tehakse paralleelkatsetena metaboolse aktivatsiooniga või ilma selleta, kasutades sama kestusega töötlust, võib positiivse kontrolli osas piirduda metaboolset aktiveerimist vajava klastogeeniga. Sel juhul tõendab üksainus klastogeenne positiivse kontrolli reaktsioon nii metaboolse aktivatsiooni süsteemi aktiivsust kui ka selle toimivust katsesüsteemis. Pikaajalise töötluse puhul (ilma S9-fraktsioonita) peab siiski olema oma positiivne kontroll, sest töötluse kestus erineb sellest, mida kasutatakse metaboolse aktivatsiooniga katses. Kui klastogeen valitakse ainsaks positiivseks kontrolliks lühiajalise töötluse korral, mis tehakse nii metaboolse aktivatsiooniga kui ka ilma selleta, tuleb metaboolse aktivatsioonita pikaajalise töötluse puhul selleks valida aneugeen. Nii klastogeensuse kui ka aneugeensuse positiivseid kontrolle tuleks kasutada metaboolselt kompetentsetes rakkudes, mis ei vaja S9-fraktsiooni.
                     Iga positiivse kontrolli puhul kasutatakse üht või enamat kontsentratsiooni, mis eelduse kohaselt põhjustab fooniga võrreldes korratavaid ja määratavaid suurenemisi, et näidata katsesüsteemi tundlikkust (st toime on selge, kuid ei paljasta kodeeritud mikroskoobipreparaatide identsust hindajale kohe), ning reaktsiooni ei tohi moonutada tsütotoksilisus, mis ületab selles katsemeetodis ette nähtud piire.
                     
                        Tabel 1
                     
                     
                        Labori pädevuse hindamiseks ja positiivsete kontrollide valimiseks soovitatavad võrdluskemikaalid
                     
                     
                                 Kategooria
                              
                              
                                 Kemikaal
                              
                              
                                 CASi nr
                              
                           
                                 1.   Metaboolse aktivatsioonita toimivad klastogeenid
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Metüülmetaansulfonaat
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Mitomütsiin C
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 4-nitrokinoliin-N-oksiid
                              
                              
                                 56-57-5
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Tsütosiinarabinosiid
                              
                              
                                 147-94-4
                              
                           
                                 2.   Metaboolset aktivatsiooni vajavad klastogeenid
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Benso[a]püreen
                              
                              
                                 50-32-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Tsüklofosfamiid
                              
                              
                                 50-18-0
                              
                           
                                 3.   Aneugeenid
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Kolhitsiin
                              
                              
                                 64-86-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Vinblastiin
                              
                              
                                 143-67-9
                              
                           KATSE KÄIK
                     
                        Töötlemisskeem
                     
                     Konkreetsel rakutsükli etapil toimiva aneugeeni või klastogeeni kindlakstegemise tõenäosuse maksimeerimiseks on väga oluline, et rakutsükli igal etapil töödeldaks uuritava kemikaaliga piisav arv rakke. Kõik töötlused tuleb alustada ja lõpetada rakkude eksponentsiaalse kasvu faasis ja rakupopulatsioon peab jätkama kasvamist kuni proovivõtuni. Seepärast võib töötlemisskeem rakuliinide ja primaarsete rakukultuuride puhul mõnevõrra erineda sellest, mida kasutatakse mitogeenset stimulatsiooni vajavate lümfotsüütide puhul nende rakutsükli käivitamiseks (17). Lümfotsüütide puhul on kõige tõhusam lähenemisviis alustada töötlemist uuritava kemikaaliga 44–48 tundi pärast stimulatsiooni fütohemaglutiniiniga, kui rakud jagunevad asünkroonselt (6).
                     Avaldatud andmetest (19) nähtub, et enamik aneugeene ja klastogeene tuvastatakse pärast 3–6 tundi kestvat lühiajalist töötlust, kas S9-fraktsiooni juuresolekul või ilma selleta, misjärel uuritav kemikaal eemaldatakse ja proovid võetakse ajahetkel, kui töötluse algusest on möödunud ligikaudu 1,5–2,0 normaalse rakutsükli kestust (7).
                     Negatiivse tulemuse kohta järelduse tegemiseks võib vaja minna põhjalikku hindamist, milleks tuleb läbi viia katsed kõigis kolmes eri katsetingimustega olukorras: kasutades lühiajalist töötlust kemikaaliga metaboolse aktivatsiooniga ja ilma selleta ning pikaajalist töötlust kemikaaliga ilma metaboolse aktivatsioonita (vt punktid 56–58).
                     
                                 —
                              
                              
                                 Rakud tuleb 3–6 tunniks viia kokkupuutesse uuritava kemikaaliga ilma metaboolse aktivatsioonita ja koguda need prooviks ajapunktis, mis vastab umbes 1,5–2,0 normaalsele rakutsükli kestusele töötlemise algusest arvates (19).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Rakud tuleb 3–6 tunniks viia kokkupuutesse uuritava kemikaaliga metaboolse aktivatsiooni tingimustes ja koguda need prooviks ajapunktis, mis vastab umbes 1,5–2,0 normaalsele rakutsükli kestusele töötlemise algusest arvates (19).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Rakud tuleb viia kemikaaliga pidevasse kokkupuutesse ilma metaboolse aktivatsioonita kuni proovi kogumise ajani, mis vastab umbes 1,5–2,0 normaalsele rakutsükli kestusele.
                              
                           Juhul kui üks eespool esitatud katsetingimustest andis positiivse tulemuse, võib muude katsetingimuste kohaldamine osutuda ebavajalikuks.
                     Kui on teada või tekib kahtlus, et uuritav kemikaal mõjutab rakutsükli kestust (nt nukleosiidi analoogide puhul), eriti p53-kompetentsete rakkude puhul (35, 36, 77), võib proovivõtuaega nihutada või taastusaega pikendada täiendava 1,5–2,0 normaalse rakutsükli kestuse võrra (kokku 3,0–4,0 rakutsüklit pärast lühiajalise ja pikaajalise töötluse algust). Need valikud on ette nähtud olukordade jaoks, kui võib tekkida uuritava kemikaali ja cytoB interaktsiooni probleem. Kui kasutatakse proovi võtmist pikema aja järel (nt kokku 3,0–4,0 rakutsükli kestust kultiveerimiseks), tuleb tagada, et rakud ikka veel aktiivselt jaguneksid. Näiteks võib 96 tunni möödumisel stimulatsioonist lümfotsüütide eksponentsiaalne kasv väheneda ning monokihtrakukultuurid võivad saavutada konfluentsuse.
                     Võimalikud rakkude töötlemise skeemid on esitatud tabelis 2. Sõltuvalt uuritava kemikaali stabiilsusest või reaktsioonivõimest või kasutatavate rakkude konkreetsest kasvunäitajatest võib üldisi töötlemisskeeme muuta, kuid seda tuleb põhjendada.
                     
                        Tabel 2
                     
                     
                        Rakkude töötlemise ja kogumise ajad mikrotuumade tekke in vitro katses
                     
                     
                                 
                                    CytoB-ga töödeldavad lümfotsüüdid, primaarsed rakud ja rakuliinid
                              
                              
                                 + S9
                                 Lühiajaline töötlus
                              
                              
                                 Töödeldakse 3–6 tundi S9-fraktsiooni juuresolekul;
                                 eemaldatakse S9-fraktsioon ja töötlemiseks kasutatud sööde;
                                 lisatakse värske sööde ja cytoB;
                                 kogutakse 1,5–2,0 normaalse rakutsükli kestuse möödumisel töötluse algusest.
                              
                           
                                 – S9
                                 Lühiajaline töötlus
                              
                              
                                 Töödeldakse 3–6 tundi;
                                 eemaldatakse töötlemiseks kasutatud sööde;
                                 lisatakse värske sööde ja cytoB;
                                 kogutakse 1,5–2,0 normaalse rakutsükli kestuse möödumisel töötluse algusest.
                              
                           
                                 – S9
                                 Pikaajaline töötlus
                              
                              
                                 Töödeldakse cytoB juuresolekul 1,5–2,0 normaalse rakutsükli kestuse jooksul;
                                 rakud kogutakse töötlusaja lõpus.
                              
                           
                                 Ilma cytoB-ta töödeldavad rakuliinid
                                 (Kõik toimub eespool esitatud skeemide kohaselt, ainult cytoB-d ei lisata.)
                              
                           Monokihtkultuurides võib 3–6 tundi kestnud töötlemise lõpus olla mitootilisi rakke (eristatavad selle järgi, et on ümmargused ja irduvad kasvunõu pinnalt). Kuna mitootilised rakud irduvad kergesti, võib neid uuritavat kemikaali sisaldava söötme eemaldamisel kaotsi minna. Kui on tõendeid, et mitootiliste rakkude arv on kontrolliga võrreldes oluliselt suurem, mis viitab rakutsükli tõenäolisele peatumisele mitoosifaasis, tuleb rakud koguda tsentrifuugimisega ja külvata tagasi rakukultuuri, et vältida kogumise ajal mikrotuumade/kromosoomaberratsiooni tekke riskiga mitoosis olevate rakkude kaotamist.
                     
                        Rakkude kogumine ja mikroskoobipreparaadi valmistamine
                     
                     Iga rakukultuur tuleb koguda ja käidelda eraldi. Rakkude ettevalmistamine võib hõlmata hüpotoonilist töötlust, kuid see etapp ei ole vajalik, kui rakkude piisav laotumine preparaadis saadakse muul viisil. Mikroskoobipreparaadi valmistamiseks võib kasutada muid meetodeid tingimusel, et hindamiseks saadakse kvaliteetsed rakupreparaadid. Tervikliku rakumembraani ja tsütoplasmaga rakud tuleb säilitada mikrotuumade määramiseks ja tsütokineesi blokeerimisega meetodi puhul kahetuumaliste rakkude usaldusväärseks määramiseks.
                     Mikroskoobipreparaate võib värvida mitmesuguste meetoditega, nagu näiteks Giemsa meetodiga või kasutades DNA-spetsiifilisi fluorestsentsvärvaineid. Sobiva fluorestsentsvärvaine kasutamisega (nt akridiinoranž (78) või Hoechst 33258 koos püroniin-Y-ga (79)) võib välistada mõned väärtulemused, mis on seotud muude kui DNA-spetsiifiliste värvainete kasutamisega. Kinetohoorivastaseid antikehi, nii klastogeensete kui ka aneugeensete protsesside suhtes tundlike (pantsentromeersete) DNA-proovidega tehtud FISH-i või praimerite põhist in situ märgistamist pantsentromeersete praimeritega koos DNA asjakohase kontrastvärvimisega võib kasutada, et teha kindlaks mikrotuumade sisaldus (tervikkromosoomid värvuvad, samal ajal kui atsentrilised kromosoomifragmendid ei värvu), kui pakub huvi mehhanistlik teave nende tekke kohta (16, 17). Klastogeenide ja aneugeenide eristamiseks võib kasutada muid meetodeid, kui nende tõhusus on tõendatud ja kui nad on valideeritud. Näiteks teatavate rakuliinide puhul võib väiksema kui 2n-ploidsusega tuumade kui hüpodiploidsete juhtude mõõtmise kaudu selliste meetoditega, nagu pildianalüüs, laserskaneeriv või läbivoolutsütomeetria, saada kasulikku teavet (80–82). Tuumade morfoloogia vaatlusel võib samuti leida viiteid võimaliku aneuploidsuse kohta. Peale selle võib kasulikuks osutuda kromosoomaberratsioonide metafaasis määramise katse, soovitatavalt sama tüüpi rakkude ja katsemetoodika võrreldava tundlikkusega, et teha kindlaks, kas mikrotuumad on põhjustatud kromosoomimurdudest (arvestades, et kromosoomide kadu ei ole kromosoomaberratsioonkatsega määratav).
                     
                        Analüüs
                     
                     Kõik mikroskoobipreparaadid, sealhulgas lahustiga töödeldud või töötlemata rakkude omad (kui neid kasutati) ning positiivsed kontrollid, tuleb enne mikrotuumade esinemissageduse mikroskoopilist analüüsi sõltumatult kodeerida. Kui kasutatakse automatiseeritud hindamist, näiteks läbivoolutsütomeetriat, laserskaneerivat tsütomeetriat või pildianalüüsi, tuleb kasutada asjakohaseid meetodeid süstemaatilise hälbe või triivi ohjamiseks. Sõltumata sellest, kas mikrotuumade loendamiseks kasutatakse automaatsüsteemi, tuleb samaaegselt hinnata selliseid näitajaid nagu CBPI, RI, RPD või RICC.
                     
                        CytoB-ga töödeldud kultuurides tuleb iga kontsentratsiooni või kontrolli kohta mikrotuumade esinemissageduse hindamiseks analüüsida vähemalt 2 000 kahetuumalist rakku (83), mis paralleelproovide kasutamise korral jagatakse nende vahel võrdselt. Juhul kui annuse kohta kasutatakse ühte kultuuri (vt punkt 28), tuleb kultuuri kohta hinnata 2 000 kahetuumalist rakku sellest ainsast kultuurist (83). Kui iga kontsentratsiooni kohta on hindamiseks olemas oluliselt vähem kui 1 000 kahetuumalist rakku kahe paralleelkultuuri puhul või üheainsa kultuuri kasutamise korral oluliselt vähem kui 2 000 rakku ja kui olulist mikrotuumade esinemissageduse suurenemist ei täheldata, tuleb katset korrata suurema rakkude arvuga või vähem tsütotoksiliste kontsentratsioonidega, sõltuvalt sellest, mis on asjakohasem. Tuleb hoolega jälgida, et ei hinnataks ebakorrapärase kujuga kahetuumalisi rakke või rakke, mille kaks tuuma on väga erineva suurusega. Peale selle ei tohi kahetuumalisi rakke segi ajada preparaadis halvasti laotunud paljutuumaliste rakkudega. Rakke, mis sisaldavad rohkem kui kahte põhituuma, ei saa mikrotuumade analüüsimisel arvesse võtta, sest neis rakkudes võib mikrotuumade esinemissageduse lähtetase olla kõrgem (84). Ühetuumaliste rakkude hindamine on aktsepteeritav, kui uuritav kemikaal tõendatult segab cytoB toimimist. Sellisel juhul võib kasulik olla korduskatse, milles cytoB-d ei kasutata. Kasulikku teavet võib saada, kui hinnata lisaks kahetuumalistele rakkudele ka ühetuumalisi rakke (85, 86), kuid see ei ole kohustuslik.
                     Katsetes, milles rakuliine ei töödelda cytoB-ga, tuleb iga katsekontsentratsiooni või kontrolli kohta mikrotuumade esinemissageduse hindamiseks analüüsida vähemalt 2 000 kahetuumalist rakku (83), mis paralleelproovide kasutamise korral jagatakse nende vahel võrdselt. Kui iga kontsentratsiooni kohta kasutatakse ühte rakukultuuri (vt punkt 28), tuleb sellest ühest kultuurist hinnata vähemalt 2 000 rakku. Kui iga kontsentratsiooni kohta on hindamiseks olemas oluliselt vähem kui 1 000 kahetuumalist rakku kahe paralleelkultuuri kasutamise korral või üheainsa kultuuri kasutamise korral oluliselt vähem kui 2 000 rakku ja kui olulist mikrotuumade esinemissageduse suurenemist ei täheldata, tuleb katset korrata suurema rakkude arvuga või vähem tsütotoksiliste kontsentratsioonidega, sõltuvalt sellest, mis on asjakohasem.
                     Kui cytoB-d kasutatakse, tuleb määrata CBPI või RI (vt 2. liide), kasutades vähemalt 500 rakku kultuuri kohta. Kui töötlemine toimub cytoB manuluseta, on oluline tõendada, et rakud on kultuuris jagunenud, nagu on kirjeldatud punktides 24–28.
                     
                        Labori pädevus
                     
                     Labor peab piisava kogemuse saamiseks enne katse rutiinset kasutamist olema teinud katsesarja positiivsete kemikaalidega, mis toimivad eri mehhanismide kaudu (vähemalt üks metaboolse aktivatsiooniga kemikaal ja üks ilma ning üks, mis toimib aneugeense mehhanismi kaudu, ja mis on valitud tabelis 1 loetletud kemikaalide seast), ning erinevate negatiivsete kontrollidega (sealhulgas töötlemata kultuurid ja eri lahustid/vehiikulid). Nende positiivsete ja negatiivsete kontrollidega saadud toimed peavad olema kooskõlas teaduskirjanduse andmetega. Seda nõuet ei kohaldata kogemusega laborite puhul, kui on olemas varasemate katsete põhine andmebaas, nagu on määratletud punktides 49–52.
                     Positiivseks kontrolliks valitud kemikaale (vt tabel 1) tuleb uurida lühi- ja pikaajalise töötlusega ilma metaboolse aktivatsioonita ning samuti lühiajalise töötlusega metaboolse aktivatsiooni juuresolekul, et tõendada klastogeensete ja aneugeensete kemikaalide tuvastamiseks ja metaboolse aktivatsiooni süsteemi tõhususe määramiseks vajalikku pädevust ja kasutatud hindamismeetodi (mikroskoopiline analüüs, läbivoolutsütomeetria, laserskaneeriv tsütomeetria või kujutise analüüs) asjakohasust. Välja valitud kemikaalide puhul tuleb katsesüsteemi tundlikkuse ja dünaamilise vahemiku tõendamiseks valida kontsentratsioonivahemikud nii, et oleks võimalik saada foonist suuremaid ning korratavaid ja kontsentratsioonist sõltuvaid väärtusi.
                     
                        Varasemad kontrolli andmed
                     
                     Labor peab määrama:
                     
                                 —
                              
                              
                                 varasemate katsete alusel positiivse kontrolli tulemuste vahemiku ja jaotuse,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 varasemate katsete alusel negatiivse kontrolli (töötlemata proov, lahusti) tulemuste vahemiku ja jaotuse.
                              
                           Kui hangitakse algandmeid varasemate negatiivse kontrolli tulemuste jaotuse määramiseks, peavad paralleelsed negatiivse kontrolli andmed olema kooskõlas kontrolli kohta avaldatud andmetega (kui olemas). Kui kontrolli väärtuste jaotusele lisatakse uusi katseandmeid, peaksid negatiivse kontrolli paralleelid ideaaljuhul olema selle jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 % (87, 88). Labori varasemate negatiivse kontrolli tulemuste andmebaasi koostamisel tuleb alguses kasutada vähemalt 10 katse andmeid, kuid eelistatavalt peaks andmebaas sisaldama vähemalt 20 võrreldavatel tingimustel tehtud katse andmeid. Laboritel tuleb kasutada kvaliteedikontrolli meetodeid, selliseid nagu kontrollkaardid (nt vastavuskontrollkaardid või X-tüüpi kontrollkaardid (88)), et määrata, kui suures ulatuses positiivse ja negatiivse kontrolli andmed varieeruvad, ja tõendada, et metoodika on laboris „kontrolli all“ (83). Täiendavaid soovitusi selle kohta, kuidas koguda ja kasutada varasemate katsete andmeid (st tulemuste varasemate andmete andmebaasi võtmise või sellest väljajätmise kriteeriumid ja konkreetse katse nõuetekohasuse kriteeriumid), võib leida kirjandusest (87).
                     Katse-eeskirja muudatuste puhul tuleb arvestada, kas need mõjutavad andmete vastavust neile andmetele, mis on labori varem tehtud kontrollide andmebaasis olemas. Oluliste mittevastavuste korral tuleb koostada uus varasemate kontrolli andmete andmebaas.
                     Negatiivse kontrolli andmed peaksid hõlmama mikrotuumadega rakkude esinemust ühes rakukultuuris või nende summat paralleelkultuuridest, nagu on kirjeldatud punktis 28. Negatiivse kontrolli paralleelide tulemused peaksid ideaaljuhul olema labori varasemate kontrolli tulemuste jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 % (87, 88). Kui negatiivse kontrolli paralleelide tulemused jäävad väljapoole usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %, võivad need olla varasemate kontrolli andmete jaotuses arvessevõtmiseks vastuvõetavad juhul, kui tegemist ei ole äärmusliku võõrväärtusega ning on tõendatud, et katsesüsteem on „kontrolli all“ (vt punkt 50), ja ei ole tõendeid, et tegemist on tehnilise vea või inimliku eksitusega.
                     ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                     
                        Tulemuste esitamine
                     
                     Kui kasutatakse tsütokineesi blokeerimise meetodit, võetakse mikrotuumade teket indutseeriva toime hindamisel arvesse mikrotuumade esinemise sagedust ainult kahetuumalistes rakkudes (sõltumatult mikrotuumade arvust ühe raku kohta). Hindamisel tuvastatud ühe, kahe või enama mikrotuumaga rakkude arvud võib esitada eraldi ja sellest võib saada kasulikku teavet, kuid see ei ole kohustuslik.
                     Paralleelselt tuleb mõõta kõikides kemikaaliga töödeldud, samuti negatiivse ja positiivse kontrolli kultuurides avalduva tsütotoksilise ja/või tsütostaatilise toime näitajad (16). Kui kasutatakse tsütokineesi blokeerimise meetodit, tuleb kõikide töödeldud ja kontrolli kultuuride puhul rakutsükli hilinemist mõõtvate näitajatena arvutada CBPI ja RI. Ilma cytoB juuresolekuta katse puhul tuleb kasutada kas RPD-d või RICC-id (vt 2. liide).
                     Andmed tuleb esitada iga kultuuri kohta eraldi. Lisaks tuleb tabelina esitada kõikide andmete kokkuvõte.
                     
                        Katse nõuetekohasuse kriteeriumid
                     
                     Katse nõuetekohasus põhineb järgmistel kriteeriumidel:
                     
                                 —
                              
                              
                                 paralleelse negatiivse kontrolli tulemused on vastuvõetavad, et lisada need labori varasemate negatiivse kontrolli tulemuste andmebaasi, nagu on kirjeldatud punktis 50;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 paralleelsed positiivsed kontrollid (vt punkt 50) peavad tekitama reaktsioone, mis on võrreldavad labori varasemate positiivse kontrolli tulemuste andmebaasi andmetega ning põhjustama statistiliselt olulist suurenemist, võrreldes paralleelse negatiivse kontrolliga;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 lahustiga kontrollis peab olema täidetud rakkude paljunemise kriteerium (punktid 25–27);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 katsed on tehtud kõigi katsetingimustega, välja arvatud juhul, kui ühes neist on saadud positiivseid tulemusi (punktid 36–40);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 rakkude arv on piisav ja kontsentratsioonid on analüüsitavad (punktid 28 ja 44–46);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 suurima annuse valimise kriteeriumid on kooskõlas kriteeriumidega, mis on kirjeldatud punktides 24–31.
                              
                           
                        Tulemuste hindamine ja tõlgendamine
                     
                     Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritavat kemikaali selgelt positiivsena, kui uuritud katsetingimustes (vt punktid 36-39):
                     
                                 —
                              
                              
                                 vähemalt ühel katsekontsentratsioonil esineb statistiliselt oluline suurenemine paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes (89);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 vähemalt ühe katse tingimustes on see suurenemine asjakohase trenditesti meetodiga hinnatuna annusest sõltuv (vt punkt 28);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ükski nendest tulemustest ei ole väljaspool labori varasemate negatiivse kontrolli tulemuste jaotust (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikku usaldatavustasemel 95 %; vt punkt 52).
                              
                           Kui kõik need kriteeriumid on täidetud, järeldatakse, et kemikaal põhjustab sellel katsemeetodil kromosoomimurde ja/või kromosoomide lisandumist või kadu. Soovitusi kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta leiab ka kirjandusest (90–92).
                     Tingimusel, et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, käsitatakse uuritavat kemikaali selgelt negatiivsena, kui kõikides uuritud katsetingimustes (vt punktid 36–39):
                     
                                 —
                              
                              
                                 mitte ühelgi katsekontsentratsioonil ei esine statistiliselt olulist suurenemist paralleelse negatiivse kontrolliga võrreldes;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 asjakohase trenditestiga hinnates ei esine annusest sõltuvat suurenemist;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kõik need tulemused on labori varasemate negatiivse kontrolli tulemuste jaotuse vahemikus (nt Poissoni jaotuse usaldusvahemikus usaldatavustasemel 95 %; vt punkt 52).
                              
                           Sel juhul järeldatakse, et kemikaal ei saa sellel katsemeetodil põhjustada kromosoomimurde ja/või kromosoomide lisandumist või kadu. Soovitusi kõige asjakohasemate statistiliste meetodite kohta leiab ka kirjandusest (90–92).
                     Selget positiivset või selget negatiivset toimet ei ole vaja kinnitada.
                     Juhul, kui kemikaali toime ei ole selgelt negatiivne ega selgelt positiivne, nagu eespool kirjeldatud, või selleks, et teha kindlaks tulemuse bioloogiline olulisus, hinnatakse andmeid eksperdihinnangu ja/või täiendavate uuringute abil. Kasulikuks võib osutuda lisarakkude hindamine (kui see on asjakohane) või korduskatse tegemine võimaluse korral muudetud tingimustel (nt kontsentratsioonivahemik, teistsugused metaboolse aktivatsiooni tingimused (nt S9-fraktsiooni kontsentratsioon või päritolu)).
                     Harvadel juhtudel ei võimalda andmestik isegi pärast täiendavaid uuringuid positiivsuse või negatiivsuse üle otsustamist ning seetõttu järeldatakse, et tulemus on ebaselge.
                     Mikrotuumade tekke in vitro katses põhjustavad kemikaalid mikrotuumade teket kromosoomide katkemise, kao või nende mõlema kaudu. Täiendavaks analüüsiks võib kasutada kinetohoorivastaseid antikehi, tsentromeerispetsiifilisi in situ proove või muid meetodeid, et teha kindlaks, kas mikrotuumade tekkemehhanism on seotud klastogeense ja/või aneugeense toimega.
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritav kemikaal:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             allikas, partii number, aegumise kuupäev, kui olemas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali stabiilsus, kui teada.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava aine võime reageerida lahusti/vehiikuliga või rakukultuuri söötmega.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali lahustuvus ja püsivus lahustis, kui teada;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pH, söötme osmolaalsuse ja sademe tekke mõõtmine rakusöötmes, millesse uuritavat kemikaali lisati.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ühe koostisosaga aine:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             keemilised identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus ja CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, lisandite keemilised nimetused vastavalt vajadusele ja praktilise teostatavusele jne.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid ja segud:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             iseloomustatakse nii palju kui võimalik, lähtudes keemilistest identifitseerimisandmetest (vt eespool), kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Lahusti:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             lahusti valiku põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             lahusti protsendiline sisaldus rakukultuuri lõplikus söötmes.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rakud:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud rakkude tüüp ja päritolu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud rakutüübi sobivus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakuliinide puhul: mükoplasma puudumine;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakuliinide puhul: teave rakutsükli kestuse või proliferatsiooniindeksi kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kui kasutatakse lümfotsüüte, siis veredoonorite sugu, vanus ja muu asjakohane teave doonori, täisvere või eraldatud lümfotsüütide kohta, kasutatud mitogeen;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             normaalse (negatiivse kontrolli) rakutsükli kestus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakuliinide puhul: passaažide arv, kui olemas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakuliinide puhul: rakukultuuride säilitamise meetodid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakuliinide puhul: modaalne kromosoomiarv.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsetingimused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kui kasutatakse, siis tsütokineesi blokeeriva aine (nt cytoB) identifitseerimisandmed, selle kontsentratsioon ja rakkude kokkupuute kestus sellega;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali kontsentratsioon, väljendatuna lõppkontsentratsioonina söötmes (nt μg või mg/ml või mM söötmes);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kontsentratsioonide ja rakukultuuride arvu valimise põhimõtted, sealhulgas tsütotoksilisuse andmed ja lahustuvuse piirangud;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             söötme koostis, CO2 kontsentratsioon, kui asjakohane, niiskusesisaldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             söötmele lisatud lahusti ja uuritava kemikaali kontsentratsioon (ja/või ruumala);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             inkubeerimise temperatuur ja kestus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             töötluse kestus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pärast töötlemist rakkude kogumise aeg;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rakkude tihedus külvamisel, kui asjakohane;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metaboolse aktivatsiooni süsteemi tüüp ja koostis (S9-fraktsiooni allikas, S9-fraktsiooni segu valmistamise meetod, S9-fraktsiooni segu ja S9-fraktsiooni kontsentratsioon või ruumala lõppsöötmes, S9-fraktsiooni kvaliteedikontrollid (nt ensümaatiline aktiivsus, steriilsus, metaboliseerimisvõime);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             positiivse ja negatiivse kontrolli kemikaalid, lõppkontsentratsioonid, töötlus- ja taastusaja tingimused ja kestus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mikroskoobipreparaatide valmistamise meetodid ja kasutatud värvimismeetodid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mikrotuumadega rakkude hindamise kriteeriumid (analüüsitavate rakkude valimine ja mikrotuumade tuvastamine);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analüüsitud rakkude arv;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tsütotoksilisuse mõõtmise meetodid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             muu täiendav asjakohane teave tsütotoksilisuse ja kasutatud meetodi kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kriteeriumid, mille alusel uuringutulemus klassifitseeritakse positiivseks, negatiivseks või ebaselgeks;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud statistilise analüüsi meetod(id);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vajaduse korral meetodid, millega uuriti, kas mikrotuum sisaldab terveid kromosoome või nende fragmente, näiteks kinetohoorivastaste antikehade või pantsentromeersete DNA-proovide kasutamine.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pH, osmolaalsuse ja sademe määramiseks kasutatud meetodid.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             analüüsi jaoks sobivate rakkude määratlus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             
                                                cytoB juuresolekuta katse puhul töödeldud rakkude arv ja kogutud rakkude arv iga rakukultuuri kohta, kui kasutatakse rakuliine;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tsütokineesi blokeerimise meetodi kasutamise korral määratud tsütotoksilisuse näitaja, näiteks CBPI või RI; kui tsütokineesi blokeerimise meetodeid ei kasutatud, siis RICC või RPD; muud vaatlustulemused (näiteks rakkude konfluentsus, apoptoos, nekroos, metafaaside arv, kahetuumaliste rakkude esinemissagedus);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             sademe tekke tunnused ja määramise aeg;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             andmed söötme pH ja osmolaalsuse kohta, kui need on määratud;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ühe-, kahe- ja paljutuumaliste rakkude jaotus, kui kasutatakse tsütokineesi blokeerimise meetodit;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mikrotuumadega rakkude arv iga töödeldud ja kontrollkultuuri kohta eraldi; vajaduse korral tuleb määratleda, kas see on määratud kahe- või ühetuumalistest rakkudest;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kontsentratsiooni-toime vaheline seos, kui võimalik;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             paralleelse negatiivse (lahusti) ja positiivse kontrolli andmed (kontsentratsioonid ja lahustid);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             varasemate negatiivse ja positiivse kontrolli katsete andmed, sh vahemik, keskväärtused, standardhälbed ja jaotuse usaldusvahemik usaldatavustasemel 95 %, samuti mõõtepunktide arv;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             statistiline analüüs; p-väärtused, kui need on asjakohased.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemuste arutelu.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Järeldused.
                                 
                              
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016), „Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015.“ ENV Publications. Series on Testing and Assessment No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. (1997), „Towards a validation of the micronucleus test“, Mutation Research, Vol. 392/1–2, pp. 1–4.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Parry, J.M., A. Sors (1993), „The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project“, Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 3–15.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1985), „Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay“, Cytobios, Vol. 43/172–173, pp. 233–246.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2000), „Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group“, Environmental and Molecular Mutagenesis, 35/3, pp. 167–172.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Fenech, M. (2007), „Cytokinesis-block micronucleus cytome assay“, Nature Protocols, Vol. 2/5, pp. 1084–1104.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1986), „Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation“, Mutation Research, Vol. 161/2, pp. 193–198.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Eastmond, D.A., J.D. Tucker (1989), „Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 13/1, pp. 34–43.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Eastmond, D.A., D. Pinkel (1990), „Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probe“, Mutation Research, Vol. 234/5, pp. 9–20.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Miller, B.M. et al. (1991), „Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA“, Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297–302.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Farooqi, Z., F. Darroudi, A. T. Natarajan (1993), „The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes“, Mutagenesis, Vol. 8/4, pp. 329–334.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Migliore, L. et al. (1993), „Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe“, Mutation Research, Vol. 319/3, pp. 205–213.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Norppa, H., L. Renzi, C. Lindholm (1993), „Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization“, Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 519–525.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Eastmond, D.A, D.S. Rupa, L.S. Hasegawa (1994), „Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes“, Mutation Research, Vol. 322/1, pp. 9–20.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Marshall, R.R. et al. (1996), „Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy“, Mutation Research, Vol. 372/2, pp. 233–245.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Zijno, P. et al. (1996), „Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes“, Mutation Research, Vol. 372/2, pp. 211–219.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders et al. (2003), „Report from the in vitro micronucleus assay working group“, Mutation Research, Vol. 540/2, pp. 153–163.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.10, „In vitro kromosoomaberratsioonkatse imetajarakkudega“.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2006), „SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study“, Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 13–36.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Clare, G. et al. (2006), „SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes“, Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 37-60.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Aardema, M.J. et al. (2006), „SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells“, Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 61–87.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Wakata, A. et al. (2006), „SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells“, Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 88–124.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Oliver, J. et al. (2006), „SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells“, Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 125–152.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Albertini, S. et al. (1997), „Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience“, Mutation Research, Vol. 392/1–2, pp. 187–208.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Miller, B. et al. (1997), „Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience“, Mutation Research, Vol. 392/1–2, pp. 45–59.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Miller, B. et al. (1998), „Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test“, Gesellschaft für Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Research, Vol. 410, pp. 81–116.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Kalweit, S.et al. (1999), „Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches“, Mutation Research, Vol. 439/2, pp. 183–190.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 Kersten, B. et al. (1999), „The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity“, Mutation Research, Vol. 445/1, pp. 55–71.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 von der Hude, W. et al. (2000), „In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells – results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances“, Mutation Research, Vol. 468/2, pp. 137–163.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Garriott, M.L., J.B. Phelps, W.P. Hoffman (2002), „A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity“, Mutation Research, Vol. 517/1–2, pp. 123–134.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1999), „Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU)“, Mutagenesis, Vol. 14/6, pp. 569–580.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Elhajouji, A., E. Lorge (2006), „Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test“, Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 1–152.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Kirkland, D. (2010), „Evaluation of different cytotoxic and cytostatic measures for the in vitro micronucleus test (MNVit): Introduction to the collaborative trial“, Mutation Research, Vol. 702/2, pp. 139–147.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Hashimoto K. et al. (2011), „Comparison of four different treatment conditions of extended exposure in the in vitro micronucleus assay using TK6 lymphoblastoid cells“, Regulatory Toxicology and Pharmacology, Vol. 59/1, pp. 28–36.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Honma, M., M. Hayashi (2011), „Comparison of in vitro micronucleus and gene mutation assay results for p53-competent versus p53-deficient human lymphoblastoid cells“, Environmental and Molecular Mutagenesis, 52/5, pp. 373–384.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Zhang, L.S. et al. (1995), „A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test“, Mutation Research Letters, Vol. 347/3–4, pp. 105–115.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 ECVAM (2006), „Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing“, ESAC 25th meeting, 16.–17. november 2006. Kättesaadav aadressil: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, „Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel“. Kättesaadav aadressil: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Corvi, R. jt (2008), „ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT)“, Mutagenesis, Vol 23/4, lk 271–283.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 ILSI paper (käsikiri), Lorge, E., M.M. Moore, J. Clements, M. O'Donovan, M. Honma, A. Kohara, J. van Benthem, S. Galloway, M.J. Armstrong, A. Sutter, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Young-Tannir. „Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing“, Mutation Research.
                                 
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1991), „International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9“, Mutation Research, Vol. 257/2, pp. 147–205.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Morita, T. et al. (1992), „Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells“, Mutation Research, Vol. 268/2, pp. 297–305.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 Brusick, D. (1986), „Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations“, Environmental Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789–886.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Long, L.H. et al. (2007), „Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium“, Mutation Research, Vol. 634/1–2, pp. 177–183.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Nesslany, F. et al. (2008), „Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid“, Environmental and Molecular Mutation., Vol. 49, pp. 439–452.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1985), „Measurement of micronuclei in lymphocytes“, Mutation Research, Vol. 147/1–2, pp. 29–36.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Fenech, M. (1997), „The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method“, Mutation Research, Vol. 392, pp. 11–18.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 Payne, C.M. et al. (2010), „Hydrophobic bile acid-induced micronuclei formation, mitotic perturbations, and decreases in spindle checkpoint proteins: relevance to genomic instability in colon carcinogenesis“, Nutrition and Cancer, Vol. 62/6, pp. 825–840.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Bazin, E. et al. (2010), „Genotoxicity of a Freshwater Cyanotoxin,Cylindrospermopsin, in Two Human Cell Lines: Caco-2 and HepaRG“. Environmental and Molecular Mutagenesis, 51/3, pp. 251–259.
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 Le Hegarat, L. et al. (2010), „Assessment of the genotoxic potential of indirect chemical mutagens in HepaRG cells by the comet and the cytokinesis-block micronucleus assays“, Mutagenesis, Vol. 25/6, pp. 555–560.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 Josse, R. et al. (2012), „An adaptation of the human HepaRG cells to the in vitro micronucleus assay“, Mutagenesis, Vol. 27/3, pp. 295–304.
                              
                           
                                 (52)
                              
                              
                                 Ehrlich, V. et al. (2002), „Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells“, Mutagenesis, Vol. 17/3, pp. 257–260.
                              
                           
                                 (53)
                              
                              
                                 Knasmüller, S. et al. (2004), „Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge“, Toxicology, Vol. 198/1–3, pp. 315–328.
                              
                           
                                 (54)
                              
                              
                                 Gibson, D.P. et al. (1997), „Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals“, Mutation Research, Vol. 392/1–2, pp. 61–70.
                              
                           
                                 (55)
                              
                              
                                 Bonassi, S. et al. (2001), „HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 37/1, pp. 31–45.
                              
                           
                                 (56)
                              
                              
                                 Maron, D.M., B.N. Ames (1983), „Revised methods for the Salmonella mutagenicity test“, Mutation Research, Vol. 113/3-4, pp. 173–215.
                              
                           
                                 (57)
                              
                              
                                 Ong, T.-M. et al. (1980), „Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver“, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55–65.
                              
                           
                                 (58)
                              
                              
                                 Elliot, B.M. et al. (1992), „Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays“, Mutagenesis, Vol. 7, pp. 175–177.
                              
                           
                                 (59)
                              
                              
                                 Matsushima, T. jt (1976), „A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems“, väljaandes In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (eds.), Elsevier, North-Holland, pp. 85–88.
                              
                           
                                 (60)
                              
                              
                                 Johnson, T.E., D. R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), „Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28, pp. 51–59.
                              
                           
                                 (61)
                              
                              
                                 UNEP (2001), „Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP)“ (Püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsioon, ÜRO keskkonnaprogramm (UNEP)). Kättesaadav aadressil: http://www.pops.int/
                              
                           
                                 (62)
                              
                              
                                 Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), „Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes“, Mutation Research, Vol.190/3, pp. 225–8.
                              
                           
                                 (63)
                              
                              
                                 Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), „CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids“, in Genotoxic Effects of Airborne Agents. Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91–103.
                              
                           
                                 (64)
                              
                              
                                 Zamora, P.O. jt (1983), „Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay“, Environmental Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795–801.
                              
                           
                                 (65)
                              
                              
                                 Asakura, M. et al. (2008), „An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay“, Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122–130.
                              
                           
                                 (66)
                              
                              
                                 Fenech, M. (1993), „The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations“, Mutation Research, Vol. 285/1, pp. 35–44.
                              
                           
                                 (67)
                              
                              
                                 Phelps, J.B., M.L. Garriott, W.P. Hoffman (2002), „A protocol for the in vitro micronucleus test. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity“, Mutation Research, Vol. 521/1-2, pp. 103–112.
                              
                           
                                 (68)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2004), „Report from the in vitro micronucleus assay working group“. Mutation Research, Vol. 564, pp. 97–100.
                              
                           
                                 (69)
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2008), „Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects“, Mutation Research, Vol. 655/1-2, pp. 1–3.
                              
                           
                                 (70)
                              
                              
                                 Surralles, J. et al. (1995), „Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures“, Mutation Research, Vol. 341/3, pp. 169–184.
                              
                           
                                 (71)
                              
                              
                                 Honma, M. (2011), „Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test“, Mutation Research, Vol. 724, pp. 86–87.
                              
                           
                                 (72)
                              
                              
                                 Pfuhler, S. et al. (2011), „In vitro genotoxicity test approaches with better predictivity: Summary of an IWGT workshop“, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 101–107.
                              
                           
                                 (73)
                              
                              
                                 OECD (2014), „Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487)“, ENV/JM/TG(2014)17. Nõude esitamisel kättesaadav.
                              
                           
                                 (74)
                              
                              
                                 Morita T., M. Honma, K. Morikawa (2012), „Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity“, Mutation Research, Vol. 741, pp. 32–56.
                              
                           
                                 (75)
                              
                              
                                 Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013)., „Evaluation of the Highest Concentrations Used in the in vitro Chromosome Aberrations Assay“, Environmental and Molecular Mutagenesis, 54/1, pp. 36–43.
                              
                           
                                 (76)
                              
                              
                                 EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), „Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances“, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.
                              
                           
                                 (77)
                              
                              
                                 Sobol, Z. et al. (2012), „Development and validation of an in vitro micronucleus assay platform in TK6 cells“, Mutation Research, Vol. 746/1, pp. 29–34.
                              
                           
                                 (78)
                              
                              
                                 Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983), „An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test“, Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 241–247.
                              
                           
                                 (79)
                              
                              
                                 MacGregor, J. T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983), „A simple fluorescent staining procedure for micronuclei and RNA in erythrocytes using Hoechst 33258 and pyronin Y“, Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269–275.
                              
                           
                                 (80)
                              
                              
                                 Bryce, S.M. et al. (2011), „Miniaturized flow cytometry-based CHO-K1 micronucleus assay discriminates aneugenic and clastogenic modes of action“, Environmental and Molecular Mutagenesis, 52/4, pp. 280–286.
                              
                           
                                 (81)
                              
                              
                                 Nicolette, J. et al. (2011), „In vitro micronucleus screening of pharmaceutical candidates by flow cytometry in Chinese hamster V79 cells“, Environmental and Molecular Mutagenesis, 52/5, pp. 355–362.
                              
                           
                                 (82)
                              
                              
                                 Shi, J., R. Bezabhie, A. Szkudlinska (2010), „Further evaluation of a flow cytometric in vitro micronucleus assay in CHO-K1 cells: a reliable platform that detects micronuclei and discriminates apoptotic bodies“, Mutagenesis, Vol. 25/1, pp. 33–40.
                              
                           
                                 (83)
                              
                              
                                 OECD (2014), „Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS),Series on testing and assessment, nr 198, OECD Publishing, Pariis.
                              
                           
                                 (84)
                              
                              
                                 Fenech, M. et al. (2003), „HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures“, Mutation Research, Vol. 534/1–2, pp. 65–75.
                              
                           
                                 (85)
                              
                              
                                 Elhajouji, A., M. Cunha, M. Kirsch-Volders (1998), „Spindle poisons can induce polyploidy by mitotic slippage and micronucleate mononucleates in the cytokinesis-block assay“, Mutagenesis, Vol. 13/2, pp. 193–8.
                              
                           
                                 (86)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2011), „The in vitro MN assay in 2011: origin and fate, biological significance, protocols, high throughput methodologies and toxicological relevance“, Archives of Toxicology, Vol. 85/8, pp. 873–99.
                              
                           
                                 (87)
                              
                              
                                 Hayashi, M. jt (2010), „Compilation and use of genetic toxicity historical control Data“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol.723/2, pp. 87–90.
                              
                           
                                 (88)
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement. 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (89)
                              
                              
                                 Hoffman, W.P., M.L. Garriott, C. Lee (2003), „In vitro micronucleus test“, väljaandes Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, 2nd ed. Chow, S. (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, pp. 463–467.
                              
                           
                                 (90)
                              
                              
                                 Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed. John Wiley & Sons, New York.
                              
                           
                                 (91)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987), „Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1–175.
                              
                           
                                 (92)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989), „Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays“, väljaandes Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141–154.
                              
                           
                                 (93)
                              
                              
                                 USFDA, „International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use“.
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Aneugeen
                           – iga kemikaal või protsess, mis põhjustab interaktsiooni kaudu mitootilise või meiootilise rakujagunemise tsükli komponentidega rakkude või organismide aneuploidsust.
                        
                           
                              Aneuploidsus
                           – iga kõrvalekalle normaalsest diploidsest (või haploidsest) kromosoomiarvust ühe või enama kromosoomi võrra, kuid mitte terve(te) kromosoomikomplekti(de) võrra (polüploidsus).
                        
                           
                              Apoptoos
                           – programmeeritud rakusurm, mida iseloomustab rida etappe, mis viivad raku lagunemiseni membraaniga seotud osakesteks, mis kõrvaldatakse fagotsütoosiga või osakeste raku membraanilt koorumise teel (shedding).
                        
                           
                              Genotoksiline
                           – üldtermin, mis hõlmab kõiki DNA- või kromosoomikahjustuse tüüpe, sealhulgas murde, deletsioone, adukte, nukleotiidide modifikatsioone ja sidemete teket, ümberpaigutusi, geenimutatsioone, kromosoomaberratsioone ja aneuploidsust. Kõik genotoksiliste toimete tüübid ei põhjusta mutatsioone või püsivat kromosoomikahjustust.
                        
                           
                              Interfaasirakud
                           – rakud, mis ei ole mitoosifaasis.
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Kinetohoor
                           – valguline struktuur, mis moodustub kromosoomi tsentromeersel piirkonnal ja millele kinnituvad raku jagunemise ajal kääviniidid, võimaldades tütarkromosoomide korrastatud liikumist tütarrakkude poolustele.
                        
                           
                              Klastogeen
                           – iga aine või protsess, mis tekitab rakkude või eukarüootsete organismide populatsioonides struktuurseid kromosoomaberratsioone.
                        
                           
                              Kontsentratsioonid
                           – tähendavad uuritava kemikaali lõppkontsentratsioone söötmes.
                        
                           
                              Kromatiidide lahknematus
                           – paardunud kromatiidid ei eraldu teineteisest ega jaotu normaalselt tekkivate tütarrakkude vahel, mille tulemusena on tütarrakkude kromosoomiarvud ebanormaalsed.
                        Käesoleva katsemeetodiga ilma cytoB juuresolekuta tehtud katsetes määratletakse tsütotoksilisus töödeldud rakkude RPD (rakupopulatsiooni suhteline kahekordistumine) või RICC (rakkude arvu suhteline suurenemine) vähenemisena negatiivse kontrolliga võrreldes (vt punkt 27 ja 2. liide).
                        
                           
                              Lahusti kontroll
                           – üldtermin, millega tähistatakse kontrollikultuure, kuhu lisatakse ainult uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatud lahusti.
                        
                           
                              Maksa S9-fraktsioon
                           – maksa homogenaadi supernatant, mis on eraldatud pärast tsentrifuugimist 9 000 g juures, st maksa toorekstrakt.
                        
                           
                              Mikrotuumad
                           – rakus põhituumast eraldi ja lisaks sellele esinevad väikesed tuumad, mis on tekkinud mitoosi või meioosi telofaasi ajal mahajäänud kromosoomifragmentidest või tervetest kromosoomidest.
                        
                           
                              Mitoos
                           – rakutuuma jagunemine, mis tavaliselt jagatakse profaasiks, prometafaasiks, metafaasiks, anafaasiks ja telofaasiks.
                        
                           
                              Mitoosiindeks
                           – suhtarv, mis saadakse, kui vaatlusaluse rakupopulatsiooni metafaasis olevate rakkude arv jagatakse rakkude koguarvuga; näitab rakkude proliferatsioonitaset kõnealuses populatsioonis.
                        
                           
                              Mutageenne
                           – tekitab päriliku muutuse geenide DNA aluspaaride järjestuses või kromosoomide struktuuris (kromosoomaberratsioonid).
                        
                           
                              p53 staatus
                           – p53 on valk, mis on seotud rakutsükli, apoptoosi ja DNA reparatsiooni reguleerimisega. Teoreetiliselt peaksid geenimutatsioonid või kromosoomaberratsioonid kergemini tekkima rakkudes, milles puudub funktsionaalne p53 valk ja mis seetõttu ei ole võimelised rakutsüklit peatama või kõrvaldama kahjustunud rakke apoptoosi või teiste DNA kahjustuse vallandatud ja p53 funktsioonidega seotud mehhanismide kaudu (nt DNA reparatsiooni indutseerimine).
                        
                           
                              Polüploidsus
                           – rakkude või organismi genoommutatsioon, mis hõlmab terveid kromosoomistikke, erinevalt sellisest genoommutatsioonist, mis hõlmab üksikute kromosoomide arvu muutust (aneuploidsus).
                        
                           
                              Proliferatsiooniindeks (Proliferation Index, PI)
                           – tsütotoksilisuse mõõtmise meetod, kui cytoB-d ei kasutata (vt valem, 2. liide).
                        
                           
                              Proliferatsiooniindeks blokeeritud tsütokineesi korral (cytokinesis-block proliferation index, CBPI)
                           – teise rakujagunemise rakkude osakaal töödeldud rakupopulatsioonis, võrreldes töötlemata kontrolliga (vt valem, 2. liide).
                        
                           
                              Rakkude arvu suhteline suurenemine (Relative Increase in Cell Count, RICC)
                           – tsütotoksilisuse mõõtmise meetod, kui cytoB-d ei kasutata (vt valem, 2. liide).
                        
                           
                              Rakkude paljunemine
                           – rakkude arvu suurenemine mitootilise rakujagunemise tagajärjel.
                        
                           
                              Rakupopulatsiooni suhteline kahekordistumine (Relative Population Doubling, RPD)
                           – tsütotoksilisuse mõõtmise meetod, kui cytoB-d ei kasutata (vt valem, 2. liide).
                        
                           
                              Replikatsiooniindeks (Replication Index, RI)
                           – täielikult läbitud rakujagunemistsüklite osakaal töödeldud rakukultuuris kemikaaliga kokkupuute ja taastumise ajal, võrreldes töötlemata kontrolliga (vt valem, 2. liide).
                        
                           
                              S9-fraktsiooni segu
                           – S9-fraktsiooni ja metaboolsete ensüümide aktiivsuse jaoks vajalike kofaktorite segu.
                        
                           
                              Tsentromeer
                           – kromosoomi DNA-piirkond, kus mõlemad kromatiidid on teineteisega seotud ja mille külge kinnituvad kõrvuti mõlemad kinetohoorid.
                        
                           
                              Tsütokinees
                           – mitoosile vahetult järgnev rakujagunemise protsess, mille tulemusel tekivad kaks tütarrakku, milles mõlemas on üksainus tuum.
                        
                           
                              Tsütostaas
                           – rakkude kasvu inhibeerumine (vt valem, 2. liide).
                        
                           
                              Tsütotoksilisus
                           – käesoleva katsemeetodiga cytoB juuresolekul tehtud katsetes määratletakse tsütotoksilisus kui töödeldud rakkude CBPI (proliferatsiooniindeks blokeeritud tsütokineesi korral) või RI (replikatsiooniindeks) vähenemine negatiivse kontrolliga võrreldes (vt punkt 26 ja 2. liide).
                        
                           
                              Töötlemata kontroll
                           – paralleelsed rakukultuurid, mida ei ole töödeldud (st ei uuritava kemikaali ega lahustiga), kuid mida on käideldud samaaegselt samal viisil kui uuritava kemikaaliga töödeldud rakukultuure.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                     
                     
                        2. liide
                        
                           TSÜTOTOKSILISUSE HINDAMISE VALEMID
                        
                        
                           
                              
                                 Kui kasutatakse cytoB-d
                              
                           , tuleb tsütotoksilisust hinnata CBPI (proliferatsiooniindeks blokeeritud tsütokineesi korral) või RI (replikatsiooniindeks) alusel (17, 69). CBPI näitab tuumade keskmist arvu raku kohta ja seda võib kasutada rakkude paljunemise arvutamiseks. RI näitab rakutsüklite keskmist arvu raku kohta cytoB-ga kokkupuute ajavahemiku jooksul töödeldud kultuurides kontrollkultuuridega võrreldes ning seda saab kasutada tsütostaasi osakaalu ( %) arvutamiseks.
                        tsütostaasi % = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}
                        ning:
                        
                                    T
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    uuritava kemikaaliga töödeldud kultuur
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kontrollkultuur
                                 
                              kus:
                        
                           
                        Seega vastab CBPI väärtus 1 (kõik rakud on ühetuumalised) 100 % tsütostaasile.
                        Tsütostaas = 100 – RI
                        
                           
                        
                                    T
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    töödeldud kultuurid
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kontrollkultuurid
                                 
                              RI = 53 % tähendab seega, et võrreldes kontrollkultuuris jagunenud rakkude arvuga, mille puhul moodustusid kahe- ja enamatuumalised rakud, on töödeldud kultuuris jagunenud kõigest 53 % sellest arvust, see tähendab 47 % rakke on tsütostaasis.
                        
                           
                              
                                 Kui cytoB-d ei kasutata
                              
                           , soovitatakse (69) tsütotoksilisust hinnata RICC (rakkude arvu suhteline suurenemine) või RPD (rakupopulatsiooni suhteline kahekordistumine) alusel, sest mõlema näitaja puhul võetakse arvesse jagunenud rakkude osakaalu rakupopulatsioonis.
                        
                           
                        
                           
                        kus:
                        
                           populatsiooni kahekordistumine = [log (rakkude arv pärast töötlust ÷ rakkude algarv)] ÷ log 2
                        Seega tähendab 53 % RICC või RPD, et 47 % esines tsütotoksilisust/tsütostaasi.
                        Kasutades proliferatsiooniindeksit (PI), võib tsütotoksilisust hinnata ühest rakust koosnevate kloonide (cl1), kahest rakust koosnevate kloonide (cl2), 3–4 rakust koosnevate kloonide (cl4) ja 5–8 rakust koosnevate kloonide (cl8) arvu loendamise abil.
                        
                           
                        Proliferatsiooniindeksit (PI) on kasutatud tsütotoksilisuse väärtusliku ja usaldusväärse näitajana in vitro cytoB juuresolekuta kultiveeritud rakuliinides (35–38) ja seda võib käsitada kasuliku lisaparameetrina.
                        Igal juhul peab rakkude arv enne töötlust olema töödeldud kultuurides ja negatiivse kontrolli kultuurides ühesugune.
                        Kuigi varem on tsütotoksilisuse näitajana kasutatud RCC-d (st rakkude arv töödeldud kultuuris / rakkude arv kontrollikultuuris), ei ole see enam soovitatav, sest sellega võib tsütotoksilisust alahinnata.
                        Kui kasutatakse automatiseeritud hindamissüsteemi, näiteks läbivoolutsütomeetriat, laserskaneerivat tsütomeetriat või pildianalüüsi, võib valemis rakkude arvu asendada tuumade arvuga.
                        Negatiivse kontrolli kultuurides peab rakupopulatsiooni kahekordistumine või replikatsiooniindeks olema kooskõlas nõudega võtta rakukultuurist proov ajahetkel, mis vastab ligikaudu 1,5–2,0 normaalse rakutsükli kestuse möödumisele.
                     “
               
                     15)
                  
                  
                     B osasse lisatakse järgmised peatükid:
                     „B.59.   Naha sensibiliseerimine in chemico: otsene reaktsioonivõime katse peptiididega (Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA)
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 442C (2015). Naha sensibilisaator on aine, mis põhjustab nahaga kokkupuutel allergilise reaktsiooni, nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (ÜRO GHS) (1) ja Euroopa Liidu määruses (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (CLP-määrus) (18). Käesolevas katsemeetodis kirjeldatakse in chemico meetodit (otsene reaktsioonivõime katse peptiididega, Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA), mida tuleb kasutada, et eristada naha sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest ainetest kooskõlas ÜRO GHSi ja CLP-määrusega.
                     Naha sensibiliseerumise oluliste bioloogiliste etappide suhtes on olemas ühisarusaam. Olemasolev teave naha sensibiliseerimisega seotud keemiliste ja bioloogiliste mehhanismide kohta on kokku võetud kahjuliku toime raja (Adverse Outcome Pathway, AOP) käsitluses (2), milles kirjeldatakse kõiki etappe alates protsessi käivitavast molekulaarsest etapist vahestaadiumide kaudu kuni kahjuliku toimeni, nimelt allergilise kontaktdermatiidini inimeste puhul või kontakthüpersensitiivsuseni närilistel. Naha sensibiliseerimise kahjuliku toime rajas on käivitavaks molekulaarse tasandi etapiks elektrofiilsete ainete kovalentne sidumine naha valkude nukleofiilsete tsentritega.
                     Nahka sensibiliseeriva toime hindamiseks on tavaliselt kasutatud katseloomi. Merisigu kasutatakse klassikalistes meetodites, nagu Magnussoni ja Kligmani meetodil merisea maksimeeritud nahaärritustest (Guinea Pig Maximisation Test, GMPT) ja Buehleri katse (katsemeetod B.6 (3)), millega uuritakse nii naha sensibiliseerimise induktsiooni- kui ka avaldumisfaasi. Kõigi hiirtega läbiviidavate katsetega, s.o lokaalsete lümfisõlmede katse (Local Lymph Node Assay, LLNA, katsemeetod B.42 (4)) ja selle kahe radioaktiivse märgistuseta modifikatsiooni puhul (LLNA: DA (katsemeetod B.50 (5)) ja LLNA: BrdU-ELISA (katsemeetod B.51 (6)), hinnatakse ainult induktsioonina avalduvat toimet, kuid need on samuti heaks kiidetud, sest loomade heaolu seisukohast on neil eeliseid, võrreldes merisigade kasutamisega katsetes, ja nendega saab naha sensibiliseerimise induktsioonifaasi objektiivselt mõõta.
                     Hiljuti on mehhanistlikul käsitlusel põhinevad in chemico ja in vitro katsemeetodid arvatud teaduslikult põhjendatuks kemikaalidest tuleneva naha sensibiliseerimise ohu hindamiseks. Kuna igas loomadeta tehtavas katses (in silico, in chemico, in vitro) on kahjuliku toime raja käsitlus piiratud ja mehhanistlik (2, 7), on vaja katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi (Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA, edaspidi „ühtne lähenemisviis“) raames katseid kombineerida, et saaks täielikult loobuda praegu kasutatavatest loomkatsetest.
                     DPRA on ette nähtud naha sensibiliseerimise kahjuliku raja käivitamise molekulaarse etapi, nimelt valkudega reageerimise hindamiseks, ning sellega mõõdetakse kvantitatiivselt uuritavate kemikaalide võimet reageerida lüsiini või tsüsteiini sisaldavate sünteetiliste tehispeptiididega (8). Seejärel kasutatakse tsüsteiini ja lüsiini sisaldavate peptiidide sisalduse vähenemise protsendilisi väärtusi, et klassifitseerida aine ühte neljast reaktsioonivõime klassist, mis aitab eristada naha sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest (9).
                     DPRA meetodit on hinnatud Euroopa Liidu Alternatiivsete Meetodite Tõestamise Keskuse referentlabori (European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing, EURL ECVAM) juhitud valideerimisuuringus, misjärel on selle sõltumatult läbi vaadanud EURL ECVAM-i teaduslik nõuandekomitee (EURL ECVAM Scientific Advisory Committee, ESAC) ning selle kasutamist peeti teaduslikult põhjendatuks ühtse lähenemisviisi osana, et aidata eristada naha sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest nende ohukategooriatesse klassifitseerimise ja märgistamise eesmärgil. Näited DPRA andmete kasutamisest kombinatsioonis muu teabega on avaldatud teaduskirjanduses (11–14).
                     Mõisted on esitatud 1. liites.
                     LÄHTEKAALUTLUSED, KASUTATAVUS JA PIIRANGUD
                     Valkudega reageerimise võime ja nahka sensibiliseeriva toime vaheline korrelatsioon on kindlalt tõendatud (15–17). Kuigi valguga seondumine on etapp, mis molekulaarsel tasandil käivitab naha sensibiliseerimise kahjuliku toime raja, on see siiski vaid üks olulistest etappidest, ning valkudega reageerimise võime kohta nii katsetega kui ka muude kui katsemeetoditega saadav teave ei pruugi iseendast olla piisav järelduse tegemiseks, et kemikaal ei sensibiliseeri nahka. Seepärast tuleks käesoleva meetodiga saadud andmeid käsitada ainult seoses selliste ühtsete lähenemisviisidega nagu IATA ja kombineerida neid täiendava teabega, näiteks sellisega, mis on saadud naha sensibiliseerimise kahjuliku toime raja teisi olulisi etappe käsitlevatest in vitro katsetest, ning kasutada peale katsemeetodite ka muid meetodeid, sealhulgas võrdlemist kemikaali analoogidega.
                     Käesolevat katsemeetodit saab kasutada kombinatsioonis muu täiendava teabega, et aidata eristada naha sensibilisaatoreid (st ÜRO GHSi / CLP-määruse 1. kategooria) nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest ühtse lähenemisviisi kontekstis. Seda meetodit ei saa kasutada eraldivõetuna, sellega ei saa kategoriseerida naha sensibilisaatoreid ÜRO GHSis / CLP-määruses määratletud alamkategooriatesse 1A ja 1B ega prognoosida toime tugevust ohutushindamisega seotud otsuste tegemiseks. Sõltuvalt õigusraamistikust võib eraldivõetuna siiski kasutada DPRA positiivset tulemust kemikaali klassifitseerimiseks ÜRO GHSi / CLP-määruse 1. kategooriasse.
                     DPRA katsemeetod on osutunud ülekantavaks laboritesse, kes on kogenud kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (high-performance liquid chromatography, HPLC) analüüsi alal. Prognooside korratavuse tase, mida võib selle katsemeetodi puhul eeldada, on ligikaudu 85 % laborisisese ja 80 % laboritevahelise korratavuse puhul (10). Sellest valideerimisuuringust saadud (18) ja kõigist avaldatud uuringute tulemustest kokku (19) nähtub, et LLNA tulemustega võrreldes on DPRA puhul sensibilisaatorite (st ÜRO GHSi /CLP-määruse 1. kategooria kemikaalide) mittesensibiliseerivatest kemikaalidest eristamise täpsus 80 % (N = 157), tundlikkus 80 % (88/109-st) ja spetsiifilisus 77 % (37/48-st). DPRA meetodiga on tõenäosem alaprognoosida nõrga kuni mõõduka nahasensibiliseerimise potentsiaaliga kemikaale (st ÜRO GHSi / CLP-määruse alamkategooria 1B) kui kemikaale, millel on tugev nahka sensibiliseeriv toime (st ÜRO GHSi/CLP-määruse alamkategooria 1A) (18, 19). Ainsa katsemeetodina kasutatava DPRA täpsuse väärtused on siinkohal siiski vaid näitlikud, sest katsemeetodit tuleb kohaldada ühtse lähenemisviisi kontekstis kombinatsioonis muudest allikatest pärit teabega ja kooskõlas eespool punktis 9 esitatud nõuetega. Kui hinnatakse naha sensibiliseerimise katsemeetodeid, milles ei kasutata katseloomi, tuleb lisaks arvestada sellega, et LLNA nagu ka muud loomkatsed ei pruugi täielikult peegeldada kemikaali tegelikku toimet huvipakkuva liigi, s.o inimese puhul. Kogu olemasoleva teabe põhjal on tõendatud, et DPRA on kohaldatav paljude uuritavate kemikaalide puhul, millel on erinevad orgaanilised funktsionaalrühmad, toimemehhanismid, erinev nahka sensibiliseeriva toime tugevus (in vivo katsetes määratuna) ja erinevad füüsikalis-keemilised omadused (8–10, 19). Kokkuvõttes nähtub sellest teabest, et DPRA on kasulik meetod, mis aitab kindlaks teha naha sensibiliseerimise ohtu.
                     Käesolevas katsemeetodis kasutatakse terminit „uuritav kemikaal“ uurimisobjektile viitava terminina ja see ei ole seotud DPRA kohaldatavusega ainete ja/või segude uurimiseks. See katsemeetod ei ole kohaldatav metalliühendite testimiseks, sest teadaolevalt reageerivad need valkudega muude mehhanismide kaudu kui kovalentne sidumine. Uuritav kemikaal peab olema lahustuv asjakohases lahustis lõppkontsentratsioonini 100 mM (vt punkt 18). Uuritavaid kemikaale, mis ei ole sellel kontsentratsioonil lahustuvad, võib siiski uurida väiksemal kontsentratsioonil, millel kemikaal lahustub. Sel juhul võib positiivset tulemust siiski kasutada, et määrata uuritav kemikaal naha sensibilisaatoriks, kuid negatiivse tulemuse korral ei saa teha kindlaid järeldusi reaktsioonivõime puudumise kohta. DPRA kohaldatavusest teadaoleva koostisega segudele on praegu vähe andmeid (18, 19). DPRA meetodit käsitatakse sellele vaatamata meetodina, mis on tehniliselt kohaldatav mitme koostisosaga ainete ja teadaoleva koostisega segude testimiseks (vt punkt 18). Enne kui kasutada käesolevat meetodit segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi jaoks, tuleb kaaluda, kas see katse annab selle eesmärgi jaoks piisavaid tulemusi ja kui annab, siis miks. Sellist kaalumist ei ole vaja, kui regulatiivne nõue eeldabki segu katsetamist. Praegust prognoosimudelit ei saa kasutada tundmatu koostisega komplekssete segude või tundmatu või muutuva koostisega ainete, komplekssete reaktsioonisaaduste või bioloogilist päritolu materjalide (st unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials, UCVB) puhul, sest selles katses peab uuritava kemikaali ja peptiidi molaarne suhe olema määratud. Selleks tuleks välja töötada uus gravimeetrilisel meetodil põhinev prognoosimudel. Kui on võimalik tõendada, et katsemeetodit ei saa kasutada muude konkreetsete kemikaalirühmade puhul, ei tohi seda nende konkreetsete kemikaalirühmade puhul kasutada.
                     Käesolev katsemeetod on in chemico meetod, milles ei kasutata metaboolset süsteemi. Selle meetodiga ei ole võimalik määrata kemikaale, mille nahka sensibiliseeriva potentsiaali avaldumiseks on vaja bioaktivatsiooni (st prohapteenid). On näidatud, et mõnel juhul on käesoleva katsemeetodiga õigesti määratud kemikaale, mis muutuvad sensibilisaatoriks pärast abiootilist transformatsiooni (st prehapteenid) (18). Lähtudes eespool kirjeldatust, tuleb selle katsemeetodiga saadud negatiivseid tulemusi tõlgendada esitatud piirangute kontekstis ja seoses ühtse lähenemisviisi raamistiku muudest allikatest pärit teabega. Uuritavad kemikaalid, mis ei seondu peptiidiga kovalentselt, kuid soodustavad selle oksüdeerumist (st tsüsteiini dimerisatsiooni), võivad põhjustada peptiidi sisalduse vähenemise võimalikku ülehindamist, mis võib põhjustada valepositiivseid prognoose ja/või kemikaali määramist suurema reaktsioonivõimega klassi (vt punktid 29 ja 30).
                     Nagu eespool kirjeldatud, aitab DPRA eristada naha sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest. Kasutatuna sellistes ühtsetes lähenemisviisides nagu IATA, võib see siiski aidata hinnata ka sensibiliseeriva toime tugevust (11). DPRA tulemuste kasutamiseks toime tugevuse hindamisel on vaja siiski veel täiendavat analüüsi, eelistatavalt inimuuringutest saadud andmetega.
                     KATSE PÕHIMÕTE
                     DPRA on in chemico meetod, millega määratakse kvantitatiivselt tsüsteiini või lüsiini sisaldavate peptiidide kontsentratsioon pärast 24-tunnilist inkubeerimist uuritava kemikaaliga temperatuuril 25 ± 2,5 °C. Määramise lihtsustamiseks sisaldavad sünteetilised peptiidid fenüülalaniini. Peptiidi suhtelist kontsentratsiooni mõõdetakse kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades gradientelueerimist ja määramist UV-detektoriga 220 nm juures. Seejärel arvutatakse tsüsteiini ja lüsiini sisaldavate peptiidide sisalduse vähenemise protsendilised väärtused ja kasutatakse neid prognoosimudelis (vt punkt 29), mille alusel on võimalik määrata uuritav kemikaal ühte neljast reaktsioonivõime klassist, mida kasutatakse abivahendina, et eristada sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest.
                     Enne käesoleval katsemeetodil põhineva meetodi rutiinset kasutamist tuleb laboril tõendada oma tehnilist pädevust, kasutades 2. liites esitatud pädevuse kontrolli aineid.
                     KATSE KÄIK
                     Käesolev katsemeetod põhineb loomkatsetele alternatiivsete meetodite andmebaasi (DataBase on ALternative Methods, DB-ALM) DPRA katsemeetodil nr°154 (20), mis vastab EURL ECVAMi koordineeritud valideerimisuuringus kasutatud metoodikale. Käesolevat metoodikat soovitatakse kasutada selle meetodi juurutamisel ja kasutamisel laboris. Järgmiseks kirjeldatakse DPRA põhikomponente ja katse käiku. Kui kasutatakse alternatiivset HLPC süsteemi, tuleb tõendada selle samaväärsust DB-ALM metoodikas kirjeldatud süsteemiga (nt kasutades 2. liites esitatud pädevuse kontrolli aineid).
                     
                        Tsüsteiini või lüsiini sisaldavate peptiidipreparaatide valmistamine
                     
                     Põhilahused, milles on tsüsteiini (Ac-RFAACAA-COOH) ja lüsiini (Ac-RFAAKAA-COOH) sisaldavad sünteetilised peptiidid, mille puhtus on suurem kui 85 % ja eelistatavalt vahemikus 90–95 %, tuleb valmistada ex tempore, vahetult enne uuritava kemikaaliga inkubeerimist. Tsüsteiini sisaldava peptiidi lõppkontsentratsioon fosfaatpuhvris (pH 7,5) peab olema 0,667 mM, samas kui lüsiini sisaldava peptiidi lõppkontsentratsioon peab olema 0,667 mM ammooniumatsetaatpuhvris (pH 10,2). HPLC katseseeria tuleb järjestada nii, et HPLC analüüsi kestus oleks lühem kui 30 tundi. Valideerimisuuringus kasutatud ja käesolevas katsemeetodis kirjeldatud HLPC süsteemi puhul kasutati kuni 26 proovi (mis hõlmavad uuritavat kemikaali, positiivset kontrolli ja asjakohast arvu lahusti kontrolle sõltuvalt katses kasutatud eri lahustitest, iga proovi kohta kasutati kolme paralleelproovi), mis on võimalik analüüsida ühes HLPC katseseerias. Kõikide samas katseseerias analüüsitud paralleelproovide puhul tuleb kasutada tsüsteiini ja lüsiini peptiidide samu põhilahuseid. Enne kasutamist on iga peptiidide partii puhul soovitatav kindlaks teha, et see lahustub korralikult.
                     
                        Uuritava kemikaali preparaadi valmistamine
                     
                     Uuritava kemikaali lahustuvust asjakohases lahustis tuleb hinnata enne katse tegemist, järgides lahustamismeetodit, mis on kirjeldatud DB-ALM-i DPRA metoodikas (20). Sobivas lahustis lahustub uuritav kemikaal täielikult. Kuna DPRA meetodis inkubeeritakse uuritavat kemikaali tsüsteiini või lüsiini peptiidide suures ülehulgas, siis peetakse selge lahuse tekke sedastamiseks piisavaks visuaalset kontrolli, veendumaks, et uuritav kemikaal ja kõik selle koostisosad (kui uuritav kemikaal on mitme koostisosaga aine või segu) on lahustunud. Sobivad lahustid on atsetonitriil, vesi, vee ja atsetonitriili segu suhtes 1:1, isopropanool, atsetoon või atsetooni ja atsetonitriili segu suhtes 1:1. Muid lahusteid võib kasutada, kui need ei mõjuta peptiidi stabiilsust, mida jälgitakse võrdluskontrollidega C (st proovid, mis sisaldavad ainult asjakohases lahustis lahustatud peptiidi; vt 3. liide). Kui uuritav kemikaal ei ole üheski neist lahustitest lahustuv, siis tuleb viimase võimalusena üritada lahustada seda 300 μl DMSO-s ja lahjendada saadud lahus 2 700 μl atsetonitriiliga. Kui uuritav kemikaal ei ole ka selles segus lahustuv, tuleb üritada lahustada sama kogus uuritavat kemikaali 1 500 μl DMSO-s ja lahjendada saadud lahus 1 500 μl atsetonitriiliga. Vahetult enne katse tegemist tuleb uuritav kemikaal, mis on valmis kaalutuna klaasnõus, lahustada 100 mM lahuse valmistamiseks sobivas lahustis. Segude ja mitme koostisosaga teadaoleva koostisega ainete puhul tuleb puhtus määrata kogu segu või aine kohta, liites selle koostisosade (välja arvatud vesi) osakaalud, et määrata kogu segu/aine näiline molekulmass, võttes arvesse segu iga koostisosa (välja arvatud vesi) molekulmassi ning konkreetset osakaalu. Sel viisil määratud puhtust ja näilist molekulmassi kasutatakse seejärel, et arvutada 100 mM lahuse valmistamiseks vajalik uuritava kemikaali mass. Polümeeride puhul, kui valdavalt esinevat molekulmassi on võimatu määrata, võib 100 mM lahuse valmistamiseks arvesse võtta monomeeri molekulmassi (või polümeeri moodustanud mitmesuguste monomeeride molekulmassist koosnevat näilist molekulmassi). Teadaoleva koostisega segude, mitme koostisosaga ainete või polümeeride uurimisel tuleks kaaluda ka lahjendamata uuritava kemikaali testimist. Vedelike puhul tuleb lahjendamata kemikaali testida sellisena, s.o ilma eelneva lahjenduseta, inkubeerides seda moolisuhtes 1:10 ja 1:50 vastavalt tsüsteiini ja lüsiini peptiididega. Tahke uuritav kemikaal tuleb lahustada maksimaalse lahustatava kontsentratsioonini samas lahustis, mida kasutatakse näiliselt 100 mM lahuse valmistamiseks. Seejärel tuleb seda testida sellisena, s.o ilma täiendava lahjenduseta, inkubeerides seda moolisuhtes 1:10 ja 1:50 vastavalt tsüsteiini ja lüsiini peptiididega. Kooskõlalised tulemused (reageeriv või mittereageeriv) näilise 100 mM lahuse ja lahjendamata kemikaali vahel peaksid võimaldama tulemuse kohta kindla järelduse tegemist.
                     
                        Positiivse kontrolli, võrdluskontrollide ja koelueerimise kontrollide valmistamine
                     
                     Kaneelaldehüüdi (CASi nr 104-55-2; toiduainele vastava puhtusastmega ≥ 95 %) kasutatakse positiivse kontrollina (PC) kontsentratsioonis 100 mM, lahustatuna atsetonitriilis. Muid sobivaid positiivseid kontrolle, millega eelistatavalt saavutatakse sisalduse vähenemise keskmise vahemiku väärtused, võib kasutada, kui on olemas varasemate katsete andmed, et tuletada võrreldavad HPLC-seeria nõuetekohasuse kriteeriumid. Lisaks tuleb HPLC-seeriasse lisada võrdluskontrollid (st proovid, milles on ainult asjakohases lahustis lahustatud peptiid) ja neid tuleb kasutada enne analüüsi, et teha kindlaks HPLC süsteemi sobivus (võrdluskontrollid A), võrdluskontrollide stabiilsus ajas (võrdluskontrollid B) ning veendumaks, et uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatav lahusti ei mõjuta peptiidi sisalduse protsendilist vähenemist (võrdluskontrollid C) (vt 3. liide). Iga kemikaali jaoks kasutatakse sobivat võrdluskontrolli, et arvutada peptiidi sisalduse vähenemine selle kemikaali puhul (vt punkt 26). Lisaks peab HPLC-seerias olema koelueerimise kontroll, mis koosneb iga analüüsitava kemikaali puhul ainult uuritavast kemikaalist, et teha kindlaks, kas uuritav kemikaal võib elueeruda koos lüsiini või tsüsteiini sisaldava peptiidiga.
                     
                        Uuritava kemikaali inkubeerimine tsüsteiini ja lüsiini sisaldavate peptiidide lahustega
                     
                     Tsüsteiini ja lüsiini sisaldavate peptiidide lahuseid tuleb inkubeerida uuritava kemikaaliga suhtes vastavalt 1:10 ja 1:50 proovi automaatsisestaja klaasist viaalides. Kui kohe pärast uuritava kemikaali lisamist peptiidilahusele täheldatakse sademe teket uuritava kemikaali vähese vesilahustuvuse tõttu, ei saa enam olla kindel, kui palju uuritavat kemikaali jäi peptiidiga reageerimiseks lahusesse. Seepärast võib sellisel juhul positiivset tulemust siiski kasutada, kuid negatiivne tulemus on ebaselge ja seda tuleb tõlgendada asjakohase ettevaatusega (vt punktis 11 esitatud katse tegemise nõuded kemikaali puhul, mis ei lahustu 100 mM kontsentratsioonini). Reaktsioonilahus tuleb jätta pimedasse 25 ± 2,5 °C juurde 24 ± 2 tunniks enne HPLC analüüsi tegemist. Iga uuritavat kemikaali tuleb analüüsida kolme paralleelprooviga mõlema peptiidi kohta. Proove peab enne HPLC analüüsi visuaalselt kontrollima. Kui täheldatakse sadet või faaside eraldumist, võib ettevaatusabinõuna proovida väikesel kiirusel (100–400 g) tsentrifuugimist, et sade jääks viaali põhja, sest suures koguses võib sade HPLC torud või kolonnid ummistada. Kui sademe teket või faaside eraldumist täheldatakse pärast inkubeerimisaja lõppu, võib peptiidide sisalduse vähenemist alahinnata ning negatiivse tulemuse puhul ei saa piisava kindlusega järeldada reaktsioonivõime puudumist.
                     
                        HPLC standardse kalibreerimiskõvera koostamine
                     
                     Standardne kalibreerimiskõver tuleb koostada nii tsüsteiini kui ka lüsiini sisaldavate peptiidide jaoks. Peptiidide standardlahused valmistatakse 20 % või 25 % atsetonitriili puhverlahuses; tsüsteiini sisaldava peptiidi jaoks kasutatakse fosfaatpuhvrit (pH 7,5) ja lüsiini sisaldava peptiidi jaoks ammooniumatsetaatpuhvrit (pH 10,2). Kasutades peptiidi põhilahuse (0,667 mM) standardlahjenduste sarja, valmistatakse 6 kalibreerimislahust, et katta vahemik 0,534–0,0617 mM. Samuti tuleb standardse kalibreerimiskõvera jaoks lisada ainult lahjenduspuhvrit sisaldav tühiproov. Sobiva kalibreerimiskõvera r2>0,99.
                     
                        HPLC ettevalmistus ja analüüs
                     
                     HPLC süsteemi sobivust tuleb kontrollida enne analüüsi tegemist. Peptiidi sisalduse vähenemist jälgitakse HPLC süsteemiga, mis on ühendatud UV neelduvuse detektoriga (fotodioodrividetektor või fikseeritud lainepikkusega neelduvuse detektor signaaliga lainepikkusel 220 nm). Sobiv kolonn paigaldatakse HPLC süsteemi. Valideeritud metoodikas kirjeldatud HPLC süsteemis kasutatakse eelistatult kolonni Zorbax SB-C-18 2,1 mm × 100 mm × 3,5 mikronit. Selle pöördfaasi-HPLC kolonni kasutamisel tuleb kogu süsteemi tasakaalustada 30 °C juures 50 % faasiga A (0,1 % (mahuprotsent) trifluoroäädikhappe vesilahus) ja 50 % faasiga B (0,085 % (mahuprotsent) trifluoroäädikhappe lahus atsetonitriilis) vähemalt 2 tundi enne analüüsietapi alustamist. HPLC analüüsiks kasutatakse voolukiirust 0,35 ml/min ja lineaarset gradienti 10 %–25 % atsetonitriili 10 minuti jooksul, misjärel suurendatakse muu materjali eemaldamiseks atsetonitriili sisaldus kiiresti 90 %-ni. Iga standardi, proovi ja kontrolli sissesüstimisel tuleb kasutada ühesugust ruumala. Kolonn tuleb iga süstimise vahel algtingimustel 7 minuti jooksul uuesti tasakaalustada. Kui kasutatakse teistsugust pöördfaasi-HPLC kolonni, võib tsüsteiini ja lüsiini sisaldavate peptiidide sobiva elueerimise ning integreerimise tagamiseks olla vajalik kohandada eespool kirjeldatud süsteemi parameetreid, sealhulgas süstitava lahuse ruumala, mis võib sõltuvalt kasutatavast süsteemist erineda (tavaliselt vahemikus 3–10 μl). Kui kasutatakse alternatiivset HLPC süsteemi, on oluline tõendada selle samaväärsust eespool kirjeldatud süsteemiga (nt kasutades 2. liites esitatud pädevuse kontrolli aineid). Neelduvust jälgitakse lainepikkusel 220 nm. Kui kasutatakse fotodioodrivi tüüpi detektorit, määratakse neelduvus lainepikkusel 258 nm. Tuleb märkida, et mõnel atsetonitriili partiil võib olla negatiivne mõju peptiidi stabiilsusele ning seda peab enne uue partii kasutusele võtmist hindama. Koelueerimise näitajana võib kasutada 220 nm ja 258 nm piigialuste pindalade suhet. Kui kontrollproovide suhte keskväärtus (19) jääb vahemikku 90–100 %, on see iga proovi puhul usaldusväärne näitaja, et koelueerumist ei ole toimunud.
                     Mõned uuritavad kemikaalid võivad soodustada tsüsteiini sisaldavate peptiidide oksüdeerumist. Dimeerset tsüsteiini sisaldava peptiidi piik võib olla visuaalselt eristatav. Kui selgub, et on toimunud dimeriseerumine, tuleb silmas pidada, et peptiidi sisalduse vähenemist võib sel juhul ülehinnata, mis põhjustab valepositiivseid prognoose ja/või kemikaali määramist suurema reaktsioonivõimega klassi (vt punktid 29 ja 30).
                     Tsüsteiini sisaldavate ja lüsiini sisaldavate peptiidide HPLC analüüsi võib läbi viia kas samaaegselt (kui on olemas kaks HPLC süsteemi) või eri päevadel. Kui analüüs tehakse eri päevadel, tuleb kõik uuritava kemikaali lahused mõlema katse jaoks igal päeval värskelt valmistada. Analüüs tuleb ajastada nii, et tagada esimese proovi sisestamine 22–26 tundi pärast uuritava kemikaali segamist peptiidilahusega. HPLC-seeria tuleb järjestada nii, et HPLC analüüsi kestus oleks lühem kui 30 tundi. Valideerimisuuringus kasutatud ja käesolevas meetodis kirjeldatud HPLC süsteemi puhul saab ühe HPLC-seeria kohta kasutada 26 analüüsitavat proovi (vt ka punkt 17). HPLC analüüsi seeria näide on esitatud 3. liites.
                     ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                     
                        Andmete hindamine
                     
                     Tsüsteiini või lüsiini sisaldavate peptiidide kontsentratsioon igas proovis määratakse fotomeetriliselt lainepikkusel 220 nm, mõõtes asjakohaste piikide piigialust pindala (area under the curve, AUC) ning arvutades peptiidi kontsentratsiooni, kasutades selleks standarditega saadud lineaarset kalibreerimiskõverat.
                     Iga proovi kohta määratakse peptiidi sisalduse vähenemine protsentides, selleks mõõdetakse piigialune pindala ja jagatakse see asjakohase võrdluskontrolli C piigialuse pindala keskväärtusega (vt 3. liide) vastavalt allpool kirjeldatud valemile.
                     
                        
                     
                        Katse nõuetekohasuse kriteeriumid
                     
                     Analüüs loetakse nõuetekohaseks, kui on täidetud järgmised kriteeriumid:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 standardse kalibreerimiskõvera r2>0,99;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 kolme paralleelproovi peptiidide sisalduse vähenemise protsendi keskväärtus positiivse kontrollina kasutatava kaneelaldehüüdi puhul peab olema vahemikus 60,8–100 % tsüsteiini sisaldava peptiidi puhul ja vahemikus 40,2–69,0 % lüsiini sisaldava peptiidi puhul ning positiivse kontrolli paralleelproovide maksimaalne standardhälve (standard deviation, SD) on tsüsteiini sisaldava peptiidi sisalduse vähenemise protsendi puhul <14,9 % ja lüsiini sisaldava peptiidi sisalduse vähenemise protsendi puhul <11,6 %;
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 võrdluskontrollide (A) peptiidi kontsentratsiooni keskväärtus peab jääma vahemikku 0,50 ± 0,05 mM ning atsetonitriili lahuses oleva üheksa kontrolli (B ja C) piigialuste pindalade variatsioonikordaja (coefficient of variation, CV) peab olema < 15,0 %.
                              
                           Kui üks nendest kriteeriumidest on täitmata, tuleb analüüsi korrata.
                     Järgmised kriteeriumid peavad olema täidetud, et uuritava kemikaaliga saadud tulemusi saaks käsitada kehtivana:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 uuritava kemikaali paralleelproovide maksimaalne standardhälve peab olema tsüsteiini sisalduse protsendilise vähenemise korral < 14,9 % ja lüsiini sisalduse protsendilise vähenemise korral < 11,6 %;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 kolme võrdluskontrolli C peptiidi kontsentratsiooni keskväärtus peab olema 0,50 ± 0,05 mM. Kui need kriteeriumid ei ole täidetud, tuleb saadud tulemused lugeda kehtetuks ning selle konkreetse kemikaali analüüsi uuesti korrata.
                              
                           
                        Prognoosimudel
                     
                     Iga uuritava kemikaali kohta arvutatakse tsüsteiini sisalduse ja lüsiini sisalduse protsendilise vähenemise keskväärtus. Negatiivset vähenemise tulemust käsitatakse keskväärtuse arvutamisel nullina. Kasutades prognoosimudelit tsüsteiin 1:10 / lüsiin 1:50, mis on esitatud tabelis 1, tuleb ühtse lähenemisviisi raamistikus naha sensibilisaatorite ja nahka mitte sensibiliseerivate kemikaalide eristamiseks kasutada läviväärtusena peptiidi sisalduse vähenemise keskmist protsenti 6,38 %. Ühtse lähenemisviisi raamistikus võib uuritava kemikaali reaktsioonivõime klassi (st nõrk, mõõdukas ja tugev reaktsioonivõime) määramisel osutuda kasulikuks prognoosimudeli rakendamine. Prognoosimudeli rakendamisel uuritava kemikaali reaktsioonivõime klassi (st nõrk, mõõdukas, tugev reaktsioonivõime) määramiseks võib saada kasulikku teavet, millest juhinduda reaktsioonivõime hindamisel ühtse lähenemisviisi raamistikus.
                     
                        Tabel 1
                     
                     
                        Prognoosimudel tsüsteiin 1:10 / lüsiin 1:50
                         (20)
                     
                     
                                 Tsüsteiini ja lüsiini sisalduse vähenemise % keskväärtus
                              
                              
                                 Reaktsioonivõime klass
                              
                              
                                 DPRA prognoos (21)
                                 
                              
                           
                                 0 % ≤ sisalduse vähenemise % keskväärtus ≤ 6,38 %
                              
                              
                                 Puuduv või minimaalne reaktsioonivõime
                              
                              
                                 Negatiivne
                              
                           
                                 6,38 % < sisalduse vähenemise % keskväärtus ≤ 22,62 %
                              
                              
                                 Nõrk reaktsioonivõime
                              
                              
                                 Positiivne
                              
                           
                                 22,62 % < sisalduse vähenemise % keskväärtus ≤ 42,47 %
                              
                              
                                 Mõõdukas reaktsioonivõime
                              
                           
                                 42,47 % < sisalduse vähenemise % keskväärtus ≤ 100 %
                              
                              
                                 Tugev reaktsioonivõime
                              
                           Võib esineda juhte, kus uuritaval kemikaalil (ainel või ühest või mitmest koostisosast koosneva aine või segu mõnel koostisosal) on lainepikkusel 220 nm oluline neelduvus ning peptiidiga ühesugune retentsiooniaeg (elueeruvad koos). Koelueerumise võib kõrvaldada, kui vähesel määral kohandada HPLC süsteemi nii, et paremini lahutada uuritava kemikaali elueerimise aega peptiidi elueerimise ajast. Kui koelueerimise vältimiseks kasutatakse alternatiivset HLPC süsteemi, tuleb tõendada selle samaväärsust valideeritud süsteemiga (nt kasutades 2. liites esitatud pädevuse kontrolli aineid). Kui esineb koelueerimine, ei saa peptiidi piiki integreerida ning on võimatu arvutada peptiidi sisalduse vähenemise protsenti. Kui sellised uuritavad kemikaalid elueeruvad koos nii tsüsteiini sisaldavate kui ka lüsiini sisaldavate peptiididega, tuleb analüüsi tulemus lugeda ebaselgeks. Kui uuritav kemikaal elueerub ainult koos lüsiini sisaldava peptiidiga, siis võib kasutada tabelis 2 esitatud prognoosimudelit tsüsteiin 1:10.
                     
                        Tabel 2
                     
                     
                        Prognoosimudel tsüsteiin 1:10
                         (22)
                     
                     
                                 Tsüsteiini (Cys) sisalduse vähenemise %
                              
                              
                                 Reaktsioonivõime klass
                              
                              
                                 DPRA prognoos (23)
                                 
                              
                           
                                 0 % ≤ tsüsteiini sisalduse vähenemise % ≤ 13,89 %
                              
                              
                                 Puuduv või minimaalne reaktsioonivõime
                              
                              
                                 Negatiivne
                              
                           
                                 13,89 % < tsüsteiini sisalduse vähenemise % ≤ 23,09 %
                              
                              
                                 Nõrk reaktsioonivõime
                              
                              
                                 Positiivne
                              
                           
                                 23,09 % < tsüsteiini sisalduse vähenemise % ≤ 98,24 %
                              
                              
                                 Mõõdukas reaktsioonivõime
                              
                           
                                 98,24 % < tsüsteiini sisalduse vähenemise % ≤ 100 %
                              
                              
                                 Tugev reaktsioonivõime
                              
                           Võib esineda muid juhte, kui uuritava kemikaali ja emma-kumma peptiidi retentsiooniaja kattumine ei ole täielik. Sellistel juhtudel võib peptiidi protsendilise sisalduse vähenemise väärtusi hinnata ning kasutada prognoosimudelit tsüsteiin 1:10 / lüsiin 1:50, kuid uuritava kemikaali reaktsioonivõime klassi ei saa täpselt määrata.
                     Nii lüsiini kui ka tsüsteiini puhul peaks uuritava kemikaali kohta piisama ühest HPLC analüüsist, kui tulemus on selge. Kui tulemused on lähedal läviväärtusele, millega eristatakse positiivseid tulemusi negatiivsetest (st piiripealsed tulemused), võib siiski vaja minna täiendavat testimist. Kui esineb olukordi, milles prognoosimudeli tsüsteiin 1:10 / lüsiin 1:50 korral jääb keskmine sisalduse vähenemise protsent vahemikku 3–10 % või prognoosimudeli tsüsteiin 1:10 korral jääb tsüsteiini sisalduse vähenemise protsent vahemikku 9–17 %, kaalutakse teise katseseeria tegemist, ning juhul, kui selle tulemused erinevad esimesest seeriast, tuleb teha ka kolmas seeria.
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritav kemikaal
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Ühe koostisosaga aine
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muud identifikaatorid;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         füüsiline välimus, lahustuvus vees, molekulmass ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritava kemikaali töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritud kontsentratsioon(id);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid ja segud:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kirjeldatakse nii palju kui võimalik, lähtudes koostisosade keemilistest identifitseerimisandmetest (vt eespool), puhtusest, kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         molekulmass või näiline molekulmass teadaoleva koostisega segude/polümeeride korral või muu uuringu tegemiseks asjakohane teave;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritava kemikaali töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritud kontsentratsioon(id);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kontrollid
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Positiivne kontroll
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muud identifikaatorid;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         füüsiline välimus, lahustuvus vees, molekulmass ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kontrolli kemikaali töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritud kontsentratsioon(id);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         viide varasematele positiivse kontrolli tulemustele, mis tõendavad sobivaid analüüsitsükli nõuetekohasuse kriteeriume, kui asjakohane.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Lahusti/vehiikul
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Kasutatud lahusti/vehiikul ja selle koostisosade suhe, kui asjakohane;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid ja/või muud identifikaatorid;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         füüsiline välimus, molekulmass ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused juhul, kui kasutatakse muid lahusteid/vehiikuleid kui need, mida on katsemeetodis nimetatud, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         iga uuritava kemikaali puhul lahusti valimise põhjendus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         atsetonitriili puhul uuring, kuidas see mõjub peptiidi stabiilsusele.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Peptiidide, positiivsete kontrollide ja uuritava kemikaali preparaatide valmistamine
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Peptiidilahuste kirjeldus (tarnija, partii, peptiidi täpne mass, põhilahusele lisatud ruumala);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             positiivse kontrolli lahuse kirjeldus (positiivse kontrolli aine täpne mass, katselahusele lisatud ruumala);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali lahuste kirjeldus (uuritava kemikaali täpne mass, katselahusele lisatud ruumala);
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    HPLC seadmed ja analüüs
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             HPLC seadme tüüp, HPLC analüütiline kolonn ja eelkolonn, detektor, proovi automaatsisestaja;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             HPLC analüüsi jaoks asjakohased parameetrid, nagu kolonni temperatuur, süstimisruumala, voolukiirus ja gradient.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Süsteemi sobivus
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Iga standardproovi ja võrdluskontrolli A paralleelproovi korral peptiidipiigi alune pindala lainepikkusel 220 nm;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             lineaarse kalibreerimiskõvera graafik ja r2 väärtus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             peptiidi kontsentratsioon iga võrdluskontrolli A paralleelproovi korral;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kolme võrdluskontrolli A korral peptiidi kontsentratsiooni keskväärtus (mM), SD ja CV;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             peptiidi kontsentratsioon võrdluskontrollide A ja C korral.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Analüüsiseeria
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Võrdluskontrolli kohta:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         iga võrdluskontrolli B ja C paralleelproovi peptiidipiigi alune pindala lainepikkusel 220 nm;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         atsetonitriilis lahustatud üheksa võrdluskontrolli B ja C korral peptiidipiigi aluse pindala keskväärtus lainepikkusel 220 nm, SD ja CV (selleks, et tõendada võrdluskontrollide stabiilsust analüüsi jooksul);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         iga kasutatud lahusti kohta kolme asjakohase võrdluskontrolli C korral peptiidipiigi aluse pindala keskväärtus lainepikkusel 220 nm (peptiidi sisalduse vähenemise protsendi arvutamiseks);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         iga kasutatud lahusti kohta kolme asjakohase võrdluskontrolli C korral peptiidi kontsentratsioon (mM);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         iga kasutatud lahusti kohta kolme asjakohase võrdluskontrolli C korral peptiidi kontsentratsiooni keskväärtus (mM), SD ja CV.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Positiivse kontrolli kohta:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         iga paralleelproovi peptiidipiigi alune pindala lainepikkusel 220 nm;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         iga paralleelproovi peptiidi sisalduse vähenemise protsent;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kolme paralleelproovi peptiidi sisalduse vähenemise protsendi keskväärtus, SD ja CV.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Iga uuritava kemikaali kohta:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         sademe tekkimine reaktsioonisegus inkubeerimisaja lõpus, kui täheldatakse; kas sade lahustati uuesti või tsentrifuugiti;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         koelueerimise esinemine;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         muude asjakohaste vaatlusandmete kirjeldus, kui asjakohane;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         iga paralleelproovi peptiidipiigi alune pindala lainepikkusel 220 nm;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         iga paralleelproovi peptiidi sisalduse vähenemise protsent;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kolme paralleelproovi peptiidi sisalduse vähenemise protsendi keskväärtus, SD ja CV;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         tsüsteiini ja lüsiini sisalduse vähenemise protsendi keskväärtused;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kasutatud prognoosimudel ja DPRA prognoos.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tasemekatsed
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kui see on asjakohane, esitage labori katsemeetodi tegemise pädevuse tõendamiseks kasutatud meetod (nt pädevuse kontrolli ainetega katsetamine) või meetod, millega tõendatakse katsemeetodi toimivuse korratavust ajas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemuste arutelu
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             DPRA katsega saadud tulemuste arutelu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             katsemeetodiga saadud tulemuste arutelu ühtse lähenemisviisi kontekstis, kui on olemas muud asjakohast teavet.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Järeldus
                                 
                              
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2013), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Kättesaadav aadressil: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2012), „The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence“, Series on Testing and Assessment, No. 168, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.6, „Naha sensibiliseerimine“,
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.42, „Lokaalsete lümfisõlmede katse“
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.50: „Naha sensibiliseerimine: lokaalsete lümfisõlmede katse: DA“.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.51, „Naha sensibiliseerimine: lokaalsete lümfisõlmede katse BrdU-ELISA meetodil“.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Adler et al. (2011), „Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010“, Archives of Toxicology, Vol. 85: 367–485.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Gerberick et al. (2004), „Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens“, Toxicological Sciences 81: 332–343.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Gerberick et al. (2007), „Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens: A classification tree model approach“, Toxicological Sciences 97: 417–427.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 EC EURL-ECVAM (2013), „Recommendation on the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) for skin sensitisation testing“. Kättesaadav aadressil: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Jaworska et al. (2013), „Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice“, Journal of Applied Toxicology, avaldatud internetis, 14. mai 2013, DOI: 10.1002/jat.2869.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Bauch et al. (2012), „Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potential“, Regulatory Toxicology and Pharmacology 63: 489–504.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Nukada et al. (2013), „Data integration of non-animal tests for the development of a test battery to predict the skin sensitizing potential and potency of chemicals“, Toxicology in Vitro 27: 609-618.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Ball et al. (2011), „Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach“, Regulatory Toxicology and Pharmacology 60: 389–400.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Landsteiner and Jacobs (1936), „Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds“, Journal of Immunological Methods 64: 625–639.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Dupuis and Benezra (1982), Allergic contact dermatitis to simple chemicals: a molecular approach, New York & Basel: Marcel Dekker Inc.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Lepoittevin et al. (1998), Allergic contact dermatitis: the molecular basis. Springer, Berlin.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 EC EURL ECVAM (2012), „Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) Validation Study Report“, 74 pp. Kättesaadav aadressil: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Natsch et al. (2013), „A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation“, Journal of Applied Toxicology, avaldatud internetis, 9. aprill 2013, DOI:10.1002/jat.2868.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 „DB-ALM (INVITTOX) Protocol 154: Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing“, 17 pp. Kättesaadav aadressil: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 OECD (2005), „Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment“, Series on Testing and Assessment No. 34, Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, France.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 FDA (Food and Drug Administration (2001), „Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation“, 22 pp. Kättesaadav aadressil: www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidance/ucm070107.pdf – 138
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 ICCVAM (2003), „Contact sensitization: Classification according to potency“, European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87).
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              
                                 Aine –
                              
                            keemilised elemendid ja nende ühendid, kas looduslikud või tootmisprotsessiga saadud, sealhulgas neis sisalduvad toote stabiliseerimiseks vajalikud lisaained või tootmisprotsessist tulenevad lisandid, välja arvatud lahusti, mida on võimalik eraldada aine stabiilsust mõjutamata ja selle koostist muutmata (1).
                        
                           
                              
                                 Asjakohasus –
                              
                            huvipakkuva toime ja katse vahelise seose kirjeldus, millest nähtub, kas see seos on tähenduslik ning kasulik konkreetse eesmärgi puhul. See on ulatus, mille piires saab katsemeetodiga õigesti mõõta või prognoosida huvipakkuvat bioloogilist toimet. Asjakohasusega seoses võetakse arvesse ka katsemeetodi täpsust (kordustäpsust) (21).
                        
                           
                              
                                 Kahjuliku toime rada (Adverse Outcome Pathway, AOP) –
                              
                            sündmuste ahel alates sihtkemikaali või sarnaste kemikaalide rühma keemilisest struktuurist molekulaarse initsieerimisetapi kaudu vaadeldava toime kliinilise avaldumiseni in vivo (2).
                        
                           
                              
                                 Kalibreerimiskõver –
                              
                            seos katses saadud toime väärtuse ja aine teadaoleva analüütilise kontsentratsiooni vahel (nimetatakse ka standardkõveraks).
                        
                           
                              
                                 Katsete tegemist ja hindamist käsitlev ühtne lähenemisviis (Integrated Approach to Testing and Assessment, IATA; lühendatult „ühtne lähenemisviis“) –
                              
                            struktureeritud lähenemisviis, mida kasutatakse kemikaali või kemikaalide rühma ohutegurite tuvastamiseks (võimalikkus), selle kirjeldamiseks (toime tugevus) ja/või ohutuse hindamiseks (võimalikkus / toime tugevus ja kokkupuude) ja millega ühendatakse strateegiliselt ning analüüsitakse kõik asjakohased andmed, et oleks olemas vajalik teave regulatiivse meetme võtmiseks seoses võimaliku ohu ja/või riskiga ja/või täiendavaks sihipäraseks (ja seega minimaalseks) katsetamiseks.
                        
                           
                              
                                 Kemikaal –
                            aine või segu.
                        
                           
                              
                                 Korratavus –
                              
                            sama kemikaali sama metoodikaga uurimisel saadud tulemuste kokkulangevus (vt usaldusväärsus) (21).
                        
                           
                              
                                 Mitme koostisosaga aine –
                              
                            aine, mis on määratletud oma kvantitatiivse koostisega, milles on rohkem kui üks põhikoostisosa, mille kontsentratsioon on vahemikus 10 %–80 % (massiprotsent). Mitme koostisosaga aine saadakse tootmisprotsessi käigus. Erinevus segu ja mitme koostisosaga aine vahel seisneb selles, et segu saadakse kahe või enama aine kokku segamisel, ilma et toimuks keemilist reaktsiooni. Mitme koostisosaga aine saadakse keemilise reaktsiooni tulemusel.
                        
                           
                              
                                 Molekulaarne initsieerimisetapp –
                              
                            bioloogilise süsteemi molekulaarsel tasandil häirumine, mis on tekitatud kemikaali poolt ja mis on tuvastatud kui kahjuliku toime raja algetapp.
                        
                           
                              
                                 Ohtlikkus –
                              
                            mõjuri või olukorra iseloomulik omadus, mis võib põhjustada kahjulikku toimet, kui organism, süsteem või (alam-)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub.
                        
                           
                              
                                 Positiivne kontroll –
                              
                            paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente ja mida töödeldakse ainega, mis teadaolevalt kutsub esile positiivse toime. Selleks et oleks võimalik hinnata positiivse kontrolli kemikaali tekitatud toime muutumist ajas, ei tohi positiivne toime olla liiga tugev.
                        
                           
                              
                                 Segu –
                              
                            ainete segu või lahus, mis koosneb kahest või enamast ainest, mis omavahel ei reageeri (1).
                        
                           
                              
                                 Spetsiifilisus –
                              
                            kõikide negatiivsete/inaktiivsete kemikaalide osakaal, mis katsemeetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Spetsiifilisusega mõõdetakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (21).
                        
                           
                              
                                 Süsteemi sobivus –
                            etalonainega enne katseseeria analüüside tegemist kindlaks määratud seadme toimivus (nt tundlikkus) (22).
                        
                           
                              
                                 Tundlikkus –
                              
                            kõigi positiivsete/reaktsioonivõimeliste kemikaalide osakaal, mis katsemeetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Tundlikkusega mõõdetakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (21).
                        
                           
                              
                                 Täpsus –
                              
                            näitab katsemeetodi tulemuste lähedust kokkulangemisele kinnitatud võrdlusväärtustega (mõõtetäpsus). Täpsusega mõõdetakse katsemeetodi toimivust ja see on üks asjakohasuse aspektidest. Terminit kasutatakse ka kordustäpsuse tähenduses, mis näitab, kui sageli annab katsemeetod õige tulemuse (21).
                        
                           
                              
                                 Usaldusväärsus –
                              
                            katsemeetodiga aja jooksul saadud tulemuste laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ulatuse mõõt, kui katset tehakse sama metoodikaga. Seda hinnatakse laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ja laborisisese korduvuse arvutamisega (21).
                        
                           
                              
                                 Uuritav kemikaal –
                              
                            terminit „uuritav kemikaal“ kasutatakse katseobjekti kohta.
                        
                           
                              
                                 UVCB –
                              
                            tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid.
                        
                           
                              
                                 Valiidne katsemeetod:
                              
                            katsemeetod, mille asjakohasust ja usaldusväärsust konkreetse eesmärgi puhul käsitatakse piisavana ning mis põhineb teaduslikult tõendatud põhimõtetel. Katsemeetod ei ole kunagi valiidne absoluutses tähenduses, vaid ainult seoses määratud eesmärgiga (21).
                        
                           
                              
                                 Variatsioonikordaja –
                              
                            hajuvuse mõõt, mis arvutatakse paralleelandmete rühma kohta; selleks jagatakse standardhälve keskväärtusega. Seda saab väljendada protsentides, kui korrutada tulemus sajaga.
                        
                           
                              
                                 Võrdluskontroll –
                              
                            uuritava kemikaaliga töötlemata proov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente, sealhulgas lahustit või vehiikulit, ja mida käideldakse samamoodi kui uuritava kemikaaliga töödeldud proovi ja muude kontrollide proove, et määrata lähtetase, mille suhtes tuleb arvutada samas lahustis või vehiikulis lahustatud uuritava kemikaaliga töödeldud proovide tekitatud reaktsiooni lähtetaseme väärtus. Kui seda proovi uuritakse paralleelselt negatiivse kontrolli prooviga, siis näitab see, kas lahusti või vehiikul interakteerub katsesüsteemiga.
                        
                           
                              
                                 Ühe koostisosaga aine –
                              
                            aine, mis on määratletud oma kvantitatiivse koostisega, milles on üks põhikoostisosa, mille kontsentratsioon on vähemalt 80 % (massiprotsent).
                        
                           
                              
                                 Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem (ÜRO GHS (United Nations Globally Harmonized System, UN GHS)) –
                              
                            süsteem, millega nähakse ette kemikaalide (ained ja segud) klassifitseerimine füüsikaliste ohutegurite ning tervise- ja keskkonnaohu standarditud tüübi ja -taseme alusel ning mis hõlmab asjaomaseid teavitustähiseid, nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, mille eesmärk on edastada teavet kemikaalide kahjulikest toimetest, et kaitsta inimesi (sealhulgas tööandjaid, töötajaid, vedajaid, tarbijaid ja päästetöötajaid) ning keskkonda (1).
                     
                     
                        2. liide
                        PÄDEVUSE KONTROLLI AINED
                        
                           Naha sensibiliseerimine in chemico: otsene reaktsioonivõime katse peptiididega
                        
                        Enne käesoleva katsemeetodi rutiinset kasutamist tuleb laboritel tõendada oma tehnilist pädevust, kasutades selleks kümmet tabelis 1 soovitatud pädevuse kontrolli ainet, et saada nendega õige eeldatav DPRA prognoos ning tsüsteiini ja lüsiini sisalduse vähenemise väärtused, mis kummagi peptiidi puhul jäävad asjakohasesse võrdlusvahemikku kaheksa pädevuse kontrolli aine puhul kümnest. Pädevuse kontrolli ained on valitud nii, et need esindaksid naha sensibiliseerimise ohuga seotud eri reaktsioone. Muud valiku kriteeriumid olid, et need ained on kaubanduslikult kättesaadavad, on olemas kõrgekvaliteedilised in vivo võrdlusandmed ning kõrgekvaliteedilised DPRA katsemeetodiga in vitro saadud andmed, mida on kasutatud EURL ECVAM-i koordineeritud valideerimisuuringus, et tõendada katsemeetodi edukat rakendamist selles uuringus osalenud laborites.
                        
                           Tabel 1
                        
                        
                           Soovitatavad pädevuse kontrolli ained DPRA katse tegemise tehnilise pädevuse tõendamiseks
                        
                        
                                    Pädevuse kontrolli ained
                                 
                                 
                                    CASi nr
                                 
                                 
                                    Füüsikaline olek
                                 
                                 
                                    
                                       In vivo toime prognoos (24)
                                    
                                 
                                 
                                    DPRA prognoos (25)
                                    
                                 
                                 
                                    Tsüsteiini sisalduse vähenemise protsendiline vahemik (26)
                                    
                                 
                                 
                                    Lüsiini sisalduse vähenemise protsendiline vahemik (26)
                                    
                                 
                              
                                    2,4-dinitroklorobenseen
                                 
                                 
                                    97-00-7
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    Sensibilisaator
                                    (äärmiselt tugev)
                                 
                                 
                                    Positiivne
                                 
                                 
                                    90–100
                                 
                                 
                                    15–45
                                 
                              
                                    Oksasoloon
                                 
                                 
                                    15646-46-5
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    Sensibilisaator
                                    (äärmiselt tugev)
                                 
                                 
                                    Positiivne
                                 
                                 
                                    60–80
                                 
                                 
                                    10–55
                                 
                              
                                    Formaldehüüd
                                 
                                 
                                    50-00-0
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    Sensibilisaator
                                    (tugev)
                                 
                                 
                                    Positiivne
                                 
                                 
                                    30–60
                                 
                                 
                                    0–24
                                 
                              
                                    Bensülideenatsetoon
                                 
                                 
                                    122-57-6
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    Sensibilisaator
                                    (mõõdukas)
                                 
                                 
                                    Positiivne
                                 
                                 
                                    80–100
                                 
                                 
                                    0–7
                                 
                              
                                    Farnesaal
                                 
                                 
                                    19317-11-4
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    Sensibilisaator
                                    (nõrk)
                                 
                                 
                                    Positiivne
                                 
                                 
                                    15–55
                                 
                                 
                                    0–25
                                 
                              
                                    2,3-butaandioon
                                 
                                 
                                    431-03-8
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    Sensibilisaator
                                    (nõrk)
                                 
                                 
                                    Positiivne
                                 
                                 
                                    60–100
                                 
                                 
                                    10–45
                                 
                              
                                    1-butanool
                                 
                                 
                                    71-36-3
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    Sensibiliseeriva toimeta
                                 
                                 
                                    Negatiivne
                                 
                                 
                                    0–7
                                 
                                 
                                    0-5,5
                                 
                              
                                    6-metüülkumariin
                                 
                                 
                                    92-48-8
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    Sensibiliseeriva toimeta
                                 
                                 
                                    Negatiivne
                                 
                                 
                                    0–7
                                 
                                 
                                    0-5,5
                                 
                              
                                    Piimhape
                                 
                                 
                                    50-21-5
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    Sensibiliseeriva toimeta
                                 
                                 
                                    Negatiivne
                                 
                                 
                                    0–7
                                 
                                 
                                    0–5,5
                                 
                              
                                    4-metoksüatsetofenoon
                                 
                                 
                                    100-06-1
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    Sensibiliseeriva toimeta
                                 
                                 
                                    Negatiivne
                                 
                                 
                                    0–7
                                 
                                 
                                    0–5,5
                                 
                              
                     
                        3. liide
                        
                           HPLC ANALÜÜSI JÄRJESTUSE NÄIDE
                        
                        
                                    
                                       Kalibreerimisstandardid ja võrdluskontrollid
                                    
                                 
                                 
                                    STD1
                                    STD2
                                    STD3
                                    STD4
                                    STD5
                                    STD6
                                    Lahjenduspuhver
                                    Võrdluskontroll A, 1. paralleelproov
                                    Võrdluskontroll A, 2. paralleelproov
                                    Võrdluskontroll A, 3. paralleelproov
                                 
                              
                                    
                                       Koelueerumise kontrollid
                                    
                                 
                                 
                                    Koelueerumise 1. kontroll, esimene uuritav kemikaal
                                    Koelueerumise 2. kontroll, teine uuritav kemikaal
                                 
                              
                                    
                                       Võrdluskontrollid:
                                    
                                 
                                 
                                    Võrdluskontroll B, 1. paralleelproov
                                    Võrdluskontroll B, 2. paralleelproov
                                    Võrdluskontroll B, 3. paralleelproov
                                 
                              
                                    
                                       Esimene paralleelproovide komplekt:
                                    
                                 
                                 
                                    Võrdluskontroll C, 1. paralleelproov
                                    Kaneelaldehüüd, 1. paralleelproov
                                    1. proov, 1. paralleelproov
                                    2. proov, 1. paralleelproov
                                 
                              
                                    
                                       Teine paralleelproovide komplekt:
                                    
                                 
                                 
                                    Võrdluskontroll C, 2. paralleelproov
                                    Kaneelaldehüüd, 2. paralleelproov
                                    1. proov, 2. paralleelproov
                                    2. proov, 2. paralleelproov
                                 
                              
                                    
                                       Kolmas paralleelproovide komplekt:
                                    
                                 
                                 
                                    Võrdluskontroll C, 3. paralleelproov
                                    Kaneelaldehüüd, 3. paralleelproov
                                    1. proov, 3. paralleelproov
                                    2. proov, 3. paralleelproov
                                 
                              
                                    
                                       Võrdluskontrollid:
                                    
                                 
                                 
                                    Võrdluskontroll B, 4. paralleelproov
                                    Võrdluskontroll B, 5. paralleelproov
                                    Võrdluskontroll B, 6. paralleelproov
                                 
                              
                                    Analüüsi järjestuses tuleb kasutada kolme võrdluskontrollide (st proovid, mis koosnevad ainult asjakohases lahustis lahustatud peptiidist) komplekti.
                                    
                                                 
                                             
                                             
                                                Võrdluskontroll A: kasutatakse, et kontrollida HPLC süsteemi sobivust.
                                             
                                          
                                                 
                                             
                                             
                                                Võrdluskontroll B: lisatakse analüüside seeria alguses ja lõpus, et kontrollida võrdluskontrollide stabiilsust analüüsiks kulunud aja jooksul.
                                             
                                          
                                                 
                                             
                                             
                                                Võrdluskontroll C: lisatakse analüüside seeriasse eesmärgiga kontrollida, et uuritava kemikaali lahustamiseks kasutatud lahusti ei mõjuta peptiidi sisalduse vähenemise protsenti.
                                             
                                          
                              
                     B.60.   Naha sensibiliseerimine in vitro: ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetod
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 442D (2015). Naha sensibilisaator on aine, mis põhjustab nahaga kokkupuutel allergilise reaktsiooni, nagu on määratletud ÜRO ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (ÜRO GHS) (1) ja Euroopa Liidu määruses (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (CLP-määrus) (27). Käesolevas katsemee todis kirjeldatakse in vitro meetodit (ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetod, ARE-Nrf2 luciferase assay)), mis aitab eristada naha sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest ainetest kooskõlas ÜRO GHSi (1) ja CLP-määrusega.
                     Naha sensibiliseerumise oluliste bioloogiliste etappide suhtes on olemas ühisarusaam. Olemasolev teave naha sensibiliseerimisega seotud keemiliste ja bioloogiliste mehhanismide kohta on kokku võetud kahjuliku toime raja (Adverse Outcome Pathway, AOP) käsitluses (2), milles kirjeldatakse kõiki etappe alates protsessi käivitavast molekulaarsest etapist vahestaadiumide kaudu kuni tervisele kahjuliku toimeni, st allergilise kontaktdermatiidini inimeste puhul või kontakthüpersensitiivsuseni närilistel (2, 3). Käivitavaks molekulaarse tasandi etapiks on elektrofiilsete ainete kovalentne sidumine naha valkude nukleofiilsete tsentritega. Kahjuliku toime raja teine oluline etapp toimub keratinotsüütides ning hõlmab nii põletikureaktsioone kui ka selliste geenide avaldumist, mis on seotud spetsiifiliste signaaliülekanderadadega, nagu antioksüdatiivse/elektrofiilse reaktsiooni elemendist (antioxidant/electrophile response element, ARE) sõltuvad rajad. Kolmas oluline etapp on dendriitrakkude aktiveerimine, mida hinnatakse tavaliselt spetsiifiliste raku pinnamarkerite kemokiinide ja tsütokiinide avaldumise alusel. Neljas oluline etapp on T-rakkude paljunemine, mida hinnatakse kaudselt hiire lokaalsete lümfisõlmede katses (4).
                     Nahka sensibiliseeriva toime hindamiseks on tavaliselt kasutatud katseloomi. Merisigu kasutatakse klassikalistes meetodites, nagu Magnussoni ja Kligmani meetodil merisea maksimeeritud nahaärritustest (Guinea Pig Maximisation Test, GMPT) ja Buehleri katse (katsemeetod B.6 (5)), millega uuritakse nii naha sensibiliseerimise induktsiooni- kui ka avaldumisfaasi. Kõigi hiirtega läbiviidavate katsetega, s.o lokaalsete lümfisõlmede katse (Local Lymph Node Assay, LLNA, katsemeetod B.42 (4)) ja selle kahe radioaktiivse märgistuseta modifikatsiooni puhul (LLNA: DA (katsemeetod B.50 (6)) ja LLNA: BrdU-ELISA (katsemeetod B.51 (7)), hinnatakse ainult induktsioonina avalduvat toime, kuid need on samuti heaks kiidetud, sest loomade heaolu seisukohast on neil eeliseid võrreldes merisigade kasutamisega katsetes, ja nende kaudu saab naha sensibiliseerimise induktsioonifaasi objektiivselt mõõta.
                     Hiljuti on mehhanistlikul käsitlusel põhinevad in chemico ja in vitro katsemeetodid arvatud teaduslikult põhjendatuiks kemikaalidest tuleneva naha sensibiliseerimise ohu hindamiseks. Kuna igas loomadeta tehtavas katses (in silico, in chemico, in vitro) on kahjuliku toime raja käsitlus piiratud ja mehhanistlik (2, 3), on vaja katsete tegemist ja hindamist käsitleva ühtse lähenemisviisi (Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA, edaspidi „ühtne lähenemisviis“) raames katseid kombineerida, et saaks täielikult loobuda praegu kasutatavatest loomkatsetest.
                     Käesolev katsemeetod (ARE-Nrf2 lutsiferaasi katse) on ette nähtud 2. punktis selgitatud teise olulise etapi uurimiseks. Naha sensibilisaatorite kohta on avaldatud, et nad käivitavad geene, mida reguleerib antioksüdatiivse reaktsiooni element (ARE) (8, 9). Väikesed elektrofiilsed ained nagu naha sensibilisaatorid võivad mõjutada sensorvalku KEAP1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), näiteks selle tsüsteiinijäägi kovalentse modifitseerimise kaudu, mistõttu valk ja transkriptsioonifaktor Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2) dissotsieeruvad. Dissotsieerunud Nrf2 võib seejärel aktiveerida ARE-sõltuvaid geene, näiteks neid, mis kodeerivad II faasi detoksifitseerivaid ensüüme (8, 10, 11).
                     Praegu on KeratinoSensTM test ainuke käesoleval meetodil põhinev in vitro ARE-Nrf2 lutsiferaasi katse, mille valideerimisuuringud on lõpetatud (9, 12, 13), misjärel on sõltumatu vastastikuse hindamise läbi viinud Euroopa Alternatiivsete Meetodite Tõestamise Keskuse Euroopa Liidu referentlabor (EURL ECVAM) (14). Teaduslikult põhjendatuks loeti KeratinoSensTM testi kasutamine ühtse lähenemisviisi osana, et aidata eristada naha sensibilisaatoreid nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest ohu klassifitseerimise ja märgistamise eesmärgil (14). Laborid, kes soovivad seda katsemeetodit rakendada, võivad saada KeratinoSensTM testis kasutatud rekombinantse rakuliini, sõlmides litsentsilepingu selle katsemeetodi väljatöötajaga (15).
                     Mõisted on esitatud 1. liites.
                     LÄHTEKAALUTLUSED, KASUTATAVUS JA PIIRANGUD
                     Kuna Keap1-Nrf2-ARE raja aktiveerimine on seotud ainult naha sensibiliseerimise kahjuliku toime raja teise olulise etapiga, on ebatõenäoline, et andmed, mis on saadud selle raja aktiveerimisel põhinevate katsemeetoditega, oleksid piisavad eraldi kasutamiseks, et teha järeldus kemikaali võime kohta nahka sensibiliseerida. Seepärast tuleks käesoleva meetodiga saadud andmeid käsitada ainult seoses selliste ühtsete lähenemisviisidega nagu IATA ja kombineerida neid täiendava teabega, näiteks sellisega, mis on saadud naha sensibiliseerimise kahjuliku toime raja teisi olulisi etappe käsitlevatest in vitro katsetest, ning kasutada peale katsemeetodite ka muid meetodeid, sealhulgas võrdlemist kemikaali analoogidega. Näited, kuidas ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetodit kombinatsioonis muu teabega kasutada, on avaldatud teaduskirjanduses (13, 16–19).
                     Käesolevat katsemeetodit kasutatakse selleks, et aidata eristada naha sensibilisaatoreid (st ÜRO GHSi / CLP-määruse 1. kategooria) nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest ühtse lähenemisviisi kontekstis. Seda meetodit ei saa kasutada eraldivõetuna, sellega ei saa kategoriseerida naha sensibilisaatoreid ÜRO GHSis / CLP-määruses määratletud alamkategooriatesse 1A ja 1B ega prognoosida toime tugevust ohutushindamisega seotud otsuste tegemiseks. Sõltuvalt õigusraamistikust võib eraldivõetuna siiski kasutada positiivset tulemust kemikaali klassifitseerimiseks ÜRO GHSi / CLP-määruse 1. kategooriasse.
                     Valideerimisuuringu andmete ning katsemeetodi sõltumatuks vastastikuseks hindamiseks kasutatud in-house testimise alusel osutus KeratinoSensTM test tõendatult ülevõetavaks rakukultuurimeetodites kogenud laborite poolt. Prognooside korratavuse tase, mida võib selle katsemeetodi puhul eeldada, on ligikaudu 85 % nii laborisisese kui ka laboritevahelise korratavuse puhul (14). KeratinoSensTM testi täpsus (77 %, 155/201), tundlikkus (78 %, 71/91) ja spetsiifilisus (76 %, 84/110) naha sensibilisaatorite (st ÜRO GHSi/CLP-määruse 1. kategooria) eristamisel nahka mitte sensibiliseerivatest ainetest, võrreldes LLNA tulemustega, arvutati kõigi andmete põhjal mis esitati EURL ECVAMile katsemeetodi hindamiseks ja vastastikuseks hindamiseks (14). Need arvulised väärtused on sarnased hiljuti avaldatud ligikaudu 145 aine in-house testimise tulemustega (täpsus 77 %, tundlikkus 79 %, spetsiifilisus 72 %) (13). KeratinoSensTM testiga on tõenäosem alaprognoosida väikese kuni mõõduka naha sensibiliseerimise potentsiaaliga kemikaale (st ÜRO GHSi / CLP-määruse alamkategooria 1B) kui kemikaale, millel on tugev nahka sensibiliseeriv toime (st ÜRO GHSi/CLP-määruse alamkategooria 1A) (13, 14). Kokkuvõttes nähtub sellest teabest, et KeratinoSensTM test on kasulik meetod, mis aitab kindlaks teha naha sensibiliseerimise ohtu. Ainsa katsemeetodina kasutatava KeratinoSensTM testi täpsuse väärtused on siinkohal siiski vaid näitlikud, sest katsemeetodit tuleb kohaldada ühtse lähenemisviisi kontekstis kombinatsioonis muudest allikatest pärit teabega ja kooskõlas eespool punktis 9 esitatud nõuetega. Kui hinnatakse naha sensibiliseerimise katsemeetodeid, milles ei kasutata katseloomi, tuleb lisaks arvestada sellega, et LLNA nagu ka muud loomkatsed ei pruugi täielikult peegeldada kemikaali tegelikku toimet huvipakkuvas liigi, s.o inimese puhul.
                     Käesolevas katsemeetodis kasutatakse terminit „uuritav kemikaal“ uurimisobjektile viitava terminina ja see ei ole seotud ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetodi kohaldatavusega ainete ja/või segude uurimiseks. Praegu olemasolevast teabest nähtub, et KeratinoSensTM test on kohaldatav paljude uuritavate kemikaalide puhul, millel on erinevad orgaanilised funktsionaalrühmad, toimemehhanismid, erinev nahka sensibiliseeriva toime tugevus (in vivo katsetes määratuna) ja erinevad füüsikalis-keemilised omadused (9, 12–14). Põhiliselt uuriti ühe koostisosaga aineid, kuigi piiratud kogus andmeid on olemas ka katsetest segudega (20). See katsemeetod on siiski tehniliselt kohaldatav mitme koostisosaga ainete ja segude uurimiseks. Enne kui kasutada seda meetodit segu korral, et saada andmeid kavandatud regulatiivse eesmärgi jaoks, tuleb siiski kaaluda, kas see katse annab selle eesmärgi jaoks piisavaid tulemusi ja kui annab, siis miks. Sellist kaalumist ei ole vaja, kui regulatiivne nõue eeldabki segu katsetamist. Peale selle, kui uuritakse mitme koostisosaga aineid või segusid, tuleb võtta arvesse tsütotoksiliste koostisosade võimalikku segavat mõju vaadeldavatele toimetele. See katsemeetod on kohaldatav lahustuvatele uuritavatele kemikaalidele või kemikaalidele, mis moodustavad kas vees või DMSOs stabiilse dispersiooni (st kolloidi või suspensiooni, milles uuritav kemikaal ei sadestu ega eraldu lahustist eri faasideks; kui uuritakse mitme koostisosaga ainet või segu, kehtib see tingimus uuritava kemikaali kõikide koostisosade kohta). Uuritavaid kemikaale, mis ei vasta neile tingimustele suurimas nõutavas lõppkontsentratsioonis 2 000 μM (vt punkt 22), võib siiski testida väiksemates kontsentratsioonides. Sellisel juhul võib positiivsuse kriteeriumidele vastavaid tulemusi, mis on kirjeldatud punktis 39, siiski kasutada selleks, et toetada kemikaali määramist naha sensibilisaatoriks, samas kui negatiivset tulemust, mis on saadud kontsentratsioonidega < 1 000 μM, tuleb käsitada ebaselgena (vt prognoosimudel punkt 39). Üldiselt on aineid, mille log P-väärtus on kuni 5, edukalt uuritud, samas kui äärmiselt hüdrofoobsed ained, mille log P on üle 7, jäävad välja katsemeetodi teadaolevast kohaldamisalast (14). Ainete kohta, mille log P on 5–7, on olemas vaid piiratud teavet.
                     Negatiivseid tulemusi tuleb tõlgendada ettevaatusega, sest ained, mis reageerivad vaid lüsiinijääkidega, võidakse selle katsemeetodiga määrata negatiivseks. Peale selle võivad prohapteenid (st kemikaalid, mis vajavad ensümaatilist aktiveerimist, nt P450 ensüümide abil) ja prehapteenid (st kemikaalid, mis aktiveeruvad autooksüdeerumisel), eriti need, mis on aeglase oksüdeerumiskiirusega, anda negatiivseid tulemusi kasutatava rakuliini (21) piiratud metaboliseeriva võime ja katsetingimuste tõttu. Teisalt võivad uuritavad kemikaalid, mis ei toimi sensibilisaatorina, kuid on siiski keemilised mõjurid, põhjustada valepositiivseid tulemusi (14). Peale selle ei saa alati usaldusväärselt hinnata uuritavaid kemikaale, mis on väga tsütotoksilised. Lõpuks võivad uuritavad kemikaalid, mis toimivad lutsiferaasile, moonutada lutsiferaasi aktiivsust rakupõhistes katsetes, mis põhjustab kas näilist inhibitsiooni või suurenenud luminestsentsi (22). Näiteks on teatatud, et fütoöstrogeenid suuremas kontsentratsioonis kui 1 μM segavad lutsiferaasi signaale teistes lutsiferaasipõhistes reportergeeni katsetes, sest esineb lutsiferaasi reportergeeni üleaktiveerimine. Seetõttu tuleb hoolikalt uurida lutsiferaasi ekspressiooni, mis on saadud suurtes kontsentratsioonides fütoöstrogeenide või sarnaste kemikaalidega, mille suhtes kahtlustatakse, et neil on fütoöstrogeenilaadne lutsiferaasi reportergeeni üleaktiveeriv toime (23). Kui on võimalik tõendada, et katsemeetodit ei saa kasutada muude konkreetsete kemikaalirühmade puhul, ei tohi seda nende konkreetsete kemikaalirühmade puhul kasutada.
                     Lisaks naha sensibilisaatorite eristamisele nahka mitte sensibiliseerivatest kemikaalidest, saab KeratinoSensTM testiga teavet ka kontsentratsiooni-toime seose kohta, mis võib aidata hinnata kemikaali sensibiliseerimise potentsiaali, kui kasutada seda selliste ühtsete lähenemisviiside puhul nagu IATA (19). Vaja on täiendavaid uuringuid, mis eelistatult põhinevad usaldusväärsetel inimpõhistel andmetel, et teha kindlaks, kuidas saab KeratinoSensTM testi tulemusi kasutada toime tugevuse hindamiseks (24) ning sensibilisaatorite jagamiseks alamkategooriatesse vastavalt ÜRO GHSile/CLP-määrusele.
                     KATSE PÕHIMÕTE
                     ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetodis kasutatakse kasvunõu pinnale kinnituvat immortaliseeritud rakuliini, mis on saadud selektiivse plasmiidiga stabiilselt transfekteeritud inimese keratinotsüütidest HaCaT. Selles rakuliinis reguleerib lutsiferaasi geeni transkriptsiooni konstitutiivne promootor, mis on liitunud ARE-elemendiga geenist, mida teadaolevalt aktiveerivad kontaktsensibilisaatorid (25, 26). Lutsiferaasi signaal kajastab endogeensest transkriptsioonifaktorist Nrf2 sõltuvate geenide aktiveerimist sensibilisaatorite poolt ning on tõendatud, et rekombinantse rakuliini lutsiferaasi signaal sõltub transkriptsioonifaktorist Nrf2 (27). See võimaldab pärast rakkude kokkupuudet elektrofiilsete substraatidega kvantitatiivselt mõõta lutsiferaasi geeni induktsiooni Nrf2-transkriptsioonifaktori aktiivsuse näitajana (luminestsentsi määramise kaudu), kasutades üldkasutatavaid valgust tekitavaid lutsiferaasi substraate.
                     KeratinoSens™ testis käsitatakse uuritavad kemikaale positiivsena, kui nad põhjustavad lutsiferaasi aktiivsuse induktsiooni statistiliselt olulise ja läviväärtust ületava suurenemise (st üle 1,5kordse või üle 50 % suurenemise) kontsentratsioonis, mis on väiksem kui kindlaks tehtud kontsentratsioon, mis ei mõjuta oluliselt rakkude eluvõimelisust (st alla 1 000 μM ja kontsentratsioonis, mille korral rakkude eluvõimelisus on üle 70 % (9, 12)). Selleks määratakse maksimaalne lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon (Imax) kordades, võrreldes lahusti (negatiivse) kontrolliga. Kuna uuritavat kemikaali lisatakse rakkudele eri kontsentratsioonide sarjana, tuleb annuse-toime kõvera alusel peale selle interpoleerida kontsentratsioon, mida on vaja, et tekitada lutsiferaasi aktiivsuse induktsiooni statistiliselt oluline läviväärtust ületav suurenemine (st EC1,5 väärtus) (arvutamiseks vt punkt 32). Lisaks tuleb teha paralleelsed tsütotoksilisuse mõõtmised, et hinnata, kas lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon tekib subtsütotoksilistel kontsentratsioonidel.
                     Enne käesoleval katsemeetodil põhineva ARE-Nrf2 lutsiferaasi testi rutiinset kasutamist tuleb laboril tõendada oma tehnilist pädevust, kasutades 2. liites esitatud pädevuse kontrolli aineid.
                     Uute või muudetud in vitro ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetodite valideerimise lihtsustamiseks on olemas toimivusnõuded, mis on sarnased KeratinoSens™ testiga ning võimaldavad nende lisamisega selle katsemeetodi õigeaegset muutmist (28). Vastastikune andmete tunnustamine vastavalt OECD kokkuleppele tagatakse vaid nende katsemeetodite puhul, mis on valideeritud kooskõlas toimivusnõuetega, kui need katsemeetodid on läbi vaadatud ja lisatud OECD poolt vastavasse juhendisse.
                     KATSE KÄIK
                     Praegu on ainus selle katsemeetodiga hõlmatud teaduslikult põhjendatud katsesüsteem KeratinoSensTM test (9, 12–14). KeratinoSensTM testi standardne töökord on kättesaadav ja seda tuleb järgida testi juurutamisel ja kasutamisel laboris (15). Labor, kes soovib seda katsemeetodit rakendada, võib saada KeratinoSensTM testis kasutatud rekombinantse rakuliini, sõlmides litsentsilepingu selle katsemeetodi väljatöötajaga. Järgmistes punktides esitatakse ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetodi põhikomponendid ja katse käik.
                     
                        Keratinotsüütide kultuuri valmistamine
                     
                     Kasutada tuleb transgeenset rakuliini, mille genoomis on stabiilne lutsiferaasi geeni insertsioon, mida reguleerib ARE-element (nt KeratinoSens™ rakuliin). Pärast rakkude saamist kasvatatakse neid (nt 2–4 passaaži) ja säilitatakse külmutatult homogeense lähterakuvaruna. Sellest lähtevarust võetud rakke võib ümber külvata kuni passaaži maksimumarvuni (mis on KeratinoSensTM rakkude puhul 25) ja teha tavapäraselt katseid, kasutades asjakohast kultiveerimissöödet (KeratinoSensTM rakkude puhul DMEM, millele on lisatud seerum ja Geneticin).
                     Katse tegemiseks peavad rakud olema saavutanud konfluentsuse 80–90 % ning tuleb tagada, et rakud ei saavutaks kunagi täielikku konfluentsust. Üks päev enne katse tegemist tuleb rakud koguda ja kanda 96-kannulisse mikrotiiterplaati (KeratinoSensTM testi puhul 10 000 rakku kannu kohta). Rakusademe teket külvi ajal tuleb hoolikalt vältida, et tagada rakkude ühetaoline arvuline jaotumine kannude vahel. Kui seda ei tehta, võib tulemuseks olla kannudevaheline suur varieeruvus. Iga korduse jaoks kasutatakse lutsiferaasi aktiivsuse mõõtmiseks kolme paralleelproovi ja ühte paralleelproovi kasutatakse rakkude eluvõimelisuse hindamiseks.
                     
                        Uuritava kemikaali ja kontrolli ainete preparaatide valmistamine
                     
                     Uuritava kemikaali ja kontrolli ainete preparaadid valmistatakse katse tegemise päeval. KeratinoSensTM testi puhul lahustatakse uuritavad kemikaalid dimetüülsulfoksiidis (DMSO) soovitava lõppkontsentratsioonini (nt 200 mM). DMSO lahuseid käsitatakse isesteriliseeruvana, seepärast ei ole steriilset filtrimist vaja. Uuritav kemikaal, mis ei lahustu DMSOs, lahustatakse steriilses vees või rakusöötmes ning lahused steriliseeritakse, nt filtrimisega. Määramata molekulmassiga uuritava kemikaali puhul tehakse KeratinoSensTM testi korral põhilahus vaikimisi valitud kontsentratsioonil (40 mg/ml või 4 % (mass/ruumala)). Muude lahustite kui DMSO puhul kasutatakse vett või rakusöödet ning selle kohta tuleb esitada piisav teaduslik põhjendus.
                     DMSOs lahustatud uuritava kemikaali põhilahusest tehakse DMSOga lahjenduste sari, et saada katse jaoks kemikaali 12 põhikontsentratsiooni (0,098 kuni 200 mM KeratinoSensTM testis). DMSOs mittelahustuva uuritava kemikaali lahjendused põhikontsentratsioonide saamiseks tehakse steriilse vee või steriilse rakusöötmega. Sõltumata kasutatud lahustist lahjendatakse põhikontsentratsioone täiendavalt 25 korda seerumit sisaldavasse rakusöötmesse ja kasutatakse lõpuks töötluseks täiendava neljakordse lahjendusteguriga, nii et uuritava kemikaali lõppkontsentratsioonid on KeratinoSensTM testi puhul vahemikus 0,98–2 000 μM. Muid kontsentratsioone võib põhjendatult kasutada (nt tsütotoksilisuse või halva lahustuvuse tõttu).
                     KeratinoSensTM testis kasutatav negatiivne (lahusti) kontroll on DMSO (CASi nr 67-68-5,≥ puhtus 99 %), milleks valmistatakse ette kuus kannu plaadi kohta. See lahjendatakse samamoodi nagu põhikontsentratsioonid punktis 22, nii et negatiivse kontrolli (lahusti) lõppkontsentratsioon on 1 %, mis teadaolevalt ei mõjuta rakkude eluvõimelisust ja vastab sellele samale DMSO kontsentratsioonile, mida on kasutatud uuritava kemikaali ja positiivse kontrolli proovides. DMSOs mitte lahustuva uuritava kemikaali korral, mille lahjendused tehti vees, peab DMSO sisaldus lõpplahuses kõigis kannudes olema kohandatud 1 %-ni, nagu muude uuritavate kemikaalide ja kontrollainete puhul.
                     KeratinoSensTM testi puhul kasutatav positiivne kontroll on kaneelaldehüüd (CASi nr 14371-10-9, puhtus ≥ 98 %), millest on tehtud viie põhikontsentratsiooniga lahjenduste sari DMSOs, vahemikus 0,4–6,4 mM (6,4 mM põhilahusest), ja mis on lahjendatud katse põhikontsentratsioonideks, nagu on kirjeldatud punktis 22, nii et positiivse kontrolli lõppkontsentratsioonid on vahemikus 4–64 μM. Muid sobivaid positiivseid kontrolle, millega on eelistatavalt võimalik saavutada kontsentratsiooni EC1,5 keskvahemiku väärtusi, võib kasutada, kui on olemas varasematest katsetest saadud andmed, mille alusel saab tuletada katseseeria nõuetekohasuse kriteeriumid.
                     
                        Uuritavate kemikaalide ja kontrollainete kasutamine
                     
                     Iga uuritava kemikaali ja positiivse kontrolli aine kohta on vaja (positiivsuse või negatiivsuse) prognoosimiseks teha üks katse, mis koosneks vähemalt kahest sõltumatust korduskatsest, milles mõlemas oleks vähemalt kolm paralleelproovi (st n = 6). Kui sõltumatute korduskatsete vahel saadakse lahknevad tulemused, tuleb teha kolmas korduskatse, milles on kolm paralleelproovi (st n = 9). Iga sõltumatu korduskatse tehakse eri päeval, kasutades uuritava kemikaali värskeid põhilahuseid ning sõltumatult kogutud rakke. Rakud võivad olla siiski samast passaažist.
                     Pärast punktis 20 kirjeldatud külvi kasvatatakse rakke 24 tundi 96-kannulistel mikrotiiterplaatidel. Sööde eemaldatakse ja asendatakse värske söötmega (KeratinoSensTM testi puhul 150 μl seerumiga söödet, milles ei ole antibiootikumi Geneticin), millele lisatakse 50 μl 25kordse lahjendusega uuritava kemikaali või kontrollainete lahust. Taustaväärtuste hindamiseks tuleb vähemalt üks kann mikrotiiterplaadi kohta jätta tühjaks (selles ei ole rakke ja seda ei töödelda kuidagi).
                     Mikrotiiterplaate inkubeeritakse ligikaudu 48 tundi temperatuuril 37 ± 1 °C 5 % CO2 keskkonnas KeratinoSensTM testi puhul. Tuleb jälgida, et lenduvad uuritavad kemikaalid ei aurustuks ning vältida kannudevahelist uuritava kemikaaliga ristsaastumist, kattes näiteks enne uuritava kemikaaliga inkubeerimist plaadid fooliumiga.
                     
                        Lutsiferaasi aktiivsuse mõõtmine
                     
                     Asjakohaste luminestsentsi näitude tagamiseks on kriitilise tähtsusega kolm tegurit:
                     
                                 —
                              
                              
                                 tundliku luminomeetri valimine,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 valgusega ristsaastumise vältimiseks piisavalt sügavate kannudega mikrotiiterplaatide kasutamine ja
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 piisava tundlikkuse ja väikese varieeruvuse tagamiseks piisavalt tugeva valgussignaaliga lutsiferaasi substraadi kasutamine.
                              
                           Enne katse tegemist tuleb teha 3. liites kirjeldatud kontrollkatse, et tagada nende kolme nõude täitmine.
                     Pärast 48 tundi uuritava kemikaali ja kontrollainetega inkubeerimist KeratinoSensTM testis pestakse rakud fosfaatpuhvrit sisaldava keedusoolalahusega ja igasse kannu lisatakse 20 minutiks toatemperatuuril luminestsentsi määramiseks asjakohast rakkude lüüsimise puhvrit.
                     Mikrotiiterplaadid rakulüsaadiga asetatakse seejärel näitude lugemiseks luminomeetrisse, mis KeratinoSensTM testi jaoks on järgmise seadistusega: i) igasse kannu lutsiferaasi substraadi (st 50 μl) lisamine, ii) 1 sekund inkubeerimist ja iii) 2 sekundit lutsiferaasi aktiivsuse integreerimine. Juhul kui kasutatakse muid seadeid, näiteks kasutatava luminomeetri mudelist sõltuvaid, tuleb neid põhjendada. Peale selle võib kasutada ka helendavat substraati, eeldusel et 3. liites esitatud kontrollkatse on õnnestunud.
                     
                        Tsütotoksilisuse hindamine
                     
                     Rakkude eluvõimelisuse määramiseks KeratinoSensTM testis vahetatakse sööde pärast 48 tundi kestnud kokkupuuteaega värske söötmega, milles on ka MTT ([3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid, tiasolüülsinise tetrasooliumbromiid; CASi nr 298-93-1) ja rakke inkubeeritakse 4 tundi temperatuuril 37° C 5 % CO2 keskkonnas. Seejärel eemaldatakse MTTd sisaldav sööde ning rakud lüüsitakse üleöö (nt lisatakse igasse kannu 10 % naatriumdodetsüülsulfaati (SDS)). Pärast loksutamist mõõdetakse fotomeetriga neelduvust lainepikkusel 600 nm.
                     ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                     
                        Andmete hindamine
                     
                     KeratinoSensTM testis arvutatakse järgmised näitajad:
                     
                                 —
                              
                              
                                 uuritud kemikaali ja positiivse kontrolli lutsiferaasi aktiivsuse maksimaalse induktsiooni keskmine väärtus kordades (Imax);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kontsentratsiooni EC1,5 väärtus, mis on kontsentratsioon, mille korral lutsiferaasi aktiivsuse saadud induktsioon on suurem kui läviväärtus 1,5 korda (st lutsiferaasi aktiivsus on suurenenud 50 %); ja
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kontsentratsioonide IC50 ja IC30 väärtused, mille korral rakkude eluvõimelisus on vähenenud vastavalt 50 % ja 30 %.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Lutsiferaasi aktiivsuse induktsiooni arv kordades arvutatakse valemi 1 alusel ja üldine maksimaalne induktsiooni arv kordades ((Imax) arvutatakse kõigi korduste keskmisena.
                              
                           
                        Valem 1:
                     
                     
                        
                     kus:
                     
                                 Lproov
                                 
                              
                              
                                 on uuritava kemikaaliga kannu luminestsentsi näit
                              
                           
                                 Ltühikatse
                                 
                              
                              
                                 on tühja, ilma rakkude ja töötlemisaineteta, kannu luminestsentsi näit
                              
                           
                                 Llahusti
                                 
                              
                              
                                 on rakke ja lahusti (negatiivset) kontrolli sisaldavate kannude keskmine luminestsentsi näit
                              
                           EC1,5 arvutatakse lineaarse interpoleerimise abil võrrandi 2 järgi ja üldine EC1,5 arvutatakse üksikkorduste geomeetrilise keskmisena.
                     
                        Valem 2:
                     
                     
                        
                     kus:
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 on vähim kontsentratsioon μM-des, mille korral induktsioon on suurem kui 1,5 korda
                              
                           
                                 Cb
                                 
                              
                              
                                 on suurim kontsentratsioon μM-des, mille korral induktsioon on väiksem kui 1,5 korda
                              
                           
                                 Ia
                                 
                              
                              
                                 induktsiooni suurenemine kordades, mis on mõõdetud vähimal kontsentratsioonil, millel induktsioon on suurem kui 1,5 korda (paralleelproovi kolme kannu keskmine)
                              
                           
                                 Ib
                                 
                              
                              
                                 induktsiooni suurenemine kordades, mis on mõõdetud suurimal kontsentratsioonil, millel induktsioon on väiksem kui 1,5 korda (paralleelproovi kolme kannu keskmine)
                              
                           Rakkude eluvõimelisus arvutatakse võrrandi 3 järgi.
                     
                        Valem 3:
                     
                     
                        
                     kus:
                     
                                 Vproov
                                 
                              
                              
                                 on uuritava kemikaaliga kannu MTT-absorptsiooni näit
                              
                           
                                 Vtühikatse
                                 
                              
                              
                                 on tühja, ilma rakkude ja töötlemisaineteta, kannu MTT-absorptsiooni näit
                              
                           
                                 Vlahusti
                                 
                              
                              
                                 on rakke ja lahusti (negatiivset) kontrolli sisaldavate kannude keskmine MTT-absorptsiooni näit
                              
                           IC50 ja IC30 arvutatakse lineaarse interpoleerimise abil võrrandi 4 järgi ning üldine IC50 ja üldine IC30 arvutatakse üksikkorduste geomeetriliste keskmistena.
                     
                        Valem 4:
                     
                     
                        
                     kus:
                     
                                 X
                              
                              
                                 on rakkude eluvõimelisuse vähenemise % arvutataval kontsentratsioonil (50 ja 30 vastavalt IC50 ja IC30 korral)
                              
                           
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 on vähim kontsentratsioon μM-des, mille korral rakkude eluvõimelisuse vähenemine on > x %
                              
                           
                                 Cb
                                 
                              
                              
                                 on suurim kontsentratsioon μM-des, mille korral rakkude eluvõimelisuse vähenemine on < x %
                              
                           
                                 Va
                                 
                              
                              
                                 on rakkude eluvõimelisuse % vähimal kontsentratsioonil, mille korral eluvõimelisuse vähenemine on > x %
                              
                           
                                 Vb
                                 
                              
                              
                                 on rakkude eluvõimelisuse % suurimal kontsentratsioonil, mille korral rakkude eluvõimelisuse vähenemine on < x %
                              
                           Iga kontsentratsiooni kohta, mille korral esineb > 1,5kordne lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon, arvutatakse statistiline olulisus (nt kahesuunalise Studenti t-testiga), võrreldes kolme paralleelproovi luminestsentsi väärtusi lahusti (negatiivse) kontrolliga kannudes, et määrata, kas lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon on statistiliselt oluline (p < 0.05). Vähim kontsentratsioon, millel lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon on suurem kui 1,5 korda, on väärtus, mis määrab EC1,5 väärtuse. Igal juhul kontrollitakse, kas see väärtus on väiksem IC30 väärtusest, millest nähtub, et EC1,5 määraval kontsentratsioonil on rakkude eluvõimelisuse vähenemine väiksem kui 30 %.
                     Andmeid soovitatakse kontrollida graafikute abil. Kui selget annuse-toime kõverat ei täheldata või kui saadakse kahefaasiline annuse-toime kõver (st ületab läviväärtust 1,5 kahes kohas), tuleb katset korrata, et kontrollida, kas see on uuritavale kemikaalile iseloomulik või on seotud katse veaga. Kui kahefaasiline reaktsioon on sõltumatus katses korratav, tuleb esitada EC1,5 väiksem väärtus (esimene kontsentratsioon, millel läviväärtus 1,5 ületatakse).
                     Harvadel juhtudel, kui täheldatakse statistiliselt ebaolulist rohkem kui 1,5kordset induktsiooni, millele järgneb statistiliselt oluline induktsioon suuremal kontsentratsioonil, tuleb selle korduskatse tulemusi käsitada kehtiva ja positiivsena vaid juhul, kui 1,5kordset läviväärtust ületav induktsioon saadi mittetsütotoksilise kontsentratsiooniga.
                     Uuritavate kemikaalide puhul, mis põhjustavad 1,5kordse või suurema induktsiooni juba kõige väiksemal kontsentratsioonil 0,98 μM, määratakse EC1,5 väärtus < 0,98 annuse-toime kõvera visuaalse kontrollimise alusel.
                     
                        Katse nõuetekohasuse kriteeriumid
                     
                     KeratinoSensTM testi kasutamisel tuleb täita järgmised katse nõuetekohasuse kriteeriumid. Esiteks peab positiivne kontroll, kaneelaldehüüd, vähemalt ühes katsekontsentratsioonis (4–64 μM) põhjustama statistiliselt olulise (nt t-testi põhjal) läviväärtust 1,5 ületava lutsiferaasi aktiivsuse induktsiooni.
                     Teiseks peab EC1,5 väärtus olema katset tegeva labori varasemate katsete keskväärtuse suhtes vahemikus, mis jääb kahe standardhälbe piiridesse (nt valideerimise andmete põhjal 7–30 μM) ning seda vahemikku tuleb korrapäraselt ajakohastada. Lisaks peab kaneelaldehüüdi kontsentratsiooni 64 μM kolme paralleelproovi keskmine induktsioon jääma vahemikku 2–8. Kui viimane kriteerium ei ole täidetud, tuleb hoolikalt kontrollida kaneelaldehüüdi annuse-toime seost ning katse tulemused võib aktsepteerida ainult juhul, kui on olemas selge annuse-toime seos, mille alusel lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon suureneb positiivse kontrolli kontsentratsiooni suurenedes.
                     Negatiivse kontrolli (lahusti) DMSO luminestsentsi näidu variatsioonikordaja peab olema alla 20 % igas korduses, mis koosneb 6 kannust testituna kolme paralleelproovina. Kui varieeruvus on suurem, tuleb tulemused lugeda kehtetuks.
                     
                        Tulemuste tõlgendamine ja prognoosimudel
                     
                     KeratinoSensTM testi prognoosi käsitatakse positiivsena, kui kahel juhul kahest või sama korduse puhul kahel juhul kolmest on täidetud kõik järgmised neli tingimust, muidu loetakse KeratinoSensTM testi põhine prognoos negatiivseks (joonis 1):
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Imax on suurem kui (>) 1,5 korda ning erineb statistiliselt oluliselt (määratuna kahesuunalise Studenti t-testiga) lahusti (negatiivsest) kontrollist;
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 rakkude eluvõimelisus on suurem kui (>) 70 % kõige väiksemal kontsentratsioonil, millel lutsiferaasi aktiivsuse induktsioon on suurem kui 1,5 korda (st kontsentratsioonil, mis määrab EC1,5);
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 EC1,5 väärtus on väiksem kui (<) 1 000 μM (või < 200 μg/ml uuritavate kemikaalide puhul, millel puudub kindlaks määratud molekulmass);
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 jälgitav on lutsiferaasi induktsiooni üldine annuse-toime sõltuvus (või bifaasiline toime, nagu on selgitatud punktis 33).
                              
                           Kui konkreetses korduses on täidetud kolm esimest tingimust, kuid lutsiferaasi induktsiooni selget annuse-toime sõltuvust ei ole võimalik sedastada, tuleb selle korduse tulemused lugeda ebaselgeks ning võib vaja minna täiendavaid katseid (joonis 1). Lisaks tuleb ebaselgena käsitada negatiivset tulemust kontsentratsioonidel < 1 000 μM (või <200 μg/ml uuritavate kemikaalide puhul, millel puudub kindlaks määratud molekulmass) (vt punkt 11).
                     
                        Joonis 1
                     
                     
                        KeratinoSensTM testi prognoosimudel. KeratinoSensTM testi prognoosi tuleb arvesse võtta ühtse lähenemisviisi raamistikus ning kooskõlas punkti 9 ja 11 nõuetega
                     
                     
                        
                     Harvadel juhtudel võib uuritav kemikaal, mis tsütotoksilisele tasemele lähedasel kontsentratsioonil indutseerib lutsiferaasi aktiivsust, olla positiivne mõnes mittetsütotoksilise tasemega korduskatses (st EC1,5 määrav kontsentratsioon on väiksem kui (<) IC30) ning on muudes korduskatsetes positiivne ainult tsütotoksilisel tasemel (st EC1,5 määrav kontsentratsioon on suurem kui (>) IC30). Sellise uuritava kemikaaliga tuleb teha uus katseseeria kitsama annuse-toime analüüsiga, kasutades väiksemat lahjendustegurit (nt 1,33 või Ö2 (= 1,41) kordset kannudevahelist lahjendust), et teha kindlaks, kas induktsioon esines tsütotoksilisel tasemel või mitte (9).
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet.
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritav kemikaal
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Ühe koostisosaga aine
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muud identifikaatorid;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         füüsiline välimus, lahustuvus vees, lahustuvus DMSOs, molekulmass ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritava kemikaali töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritud kontsentratsioon(id);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid ja segud:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kirjeldatakse nii palju kui võimalik, lähtudes koostisosade keemilistest identifitseerimisandmetest (vt eespool), puhtusest, kvantitatiivsest sisaldusest ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest omadustest;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         füüsiline välimus, lahustuvus vees, lahustuvus DMSOs ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         molekulmass või näiline molekulmass teadaoleva koostisega segude/polümeeride korral või muu uuringu tegemiseks asjakohane teave;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritava kemikaali töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritud kontsentratsioon(id);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kontrollid
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Positiivne kontroll
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem ja/või muud identifikaatorid;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         füüsiline välimus, lahustuvus vees, molekulmass ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused, kättesaadavas ulatuses ja kui see on asjakohane;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kontrollkemikaali töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritud kontsentratsioon(id);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         viide varasematele positiivse kontrolli tulemustele, mis tõendavad sobivaid analüüsitsükli nõuetekohasuse kriteeriume, kui asjakohane.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Negatiivne (vehiikuli) kontroll
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kemikaali identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus(ed) ja CASi number/numbrid ja/või muud identifikaatorid;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         puhtus, lisandite keemiline määratlus, kui see on asjakohane ja praktiliselt teostatav jne;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         füüsiline välimus, molekulmass ja muud füüsikalis-keemilised omadused, nii palju kui võimalik, juhul, kui kasutatakse muid negatiivseid kontrolle / vehiikuleid kui need, mida on käesolevas katsemeetodis nimetatud, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         säilitamise tingimused ja stabiilsus säilitamisel, kättesaadavas ulatuses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         iga uuritava kemikaali puhul lahusti valimise põhjendus.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsemeetodi tingimused
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             sponsori, katselabori ja uuringu juhi nimi ja aadress;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud katsemeetodi kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud rakuliin, selle säilitamistingimused ning allikas (nt asutus, kellelt rakud saadi);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             katsetes kasutatud rakkude passaažide arv ning konfluentsuse tase;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             enne testimist rakkude külvamiseks kasutatud rakuloendusmeetod ning võetud meetmed, millega tagati rakkude arvu homogeenne jaotus (vt punkt 20);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud luminomeeter (nt mudel), sealhulgas seadme seadistused, kasutatud lutsiferaasi substraat ja asjakohaste luminestsentsi mõõtmiste tõendus, mis põhineb 3. liites kirjeldatud kontrollkatsel;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             labori kasutatud meetod, millega tõendatakse katsemeetodi tegemise pädevust (nt pädevuse kontrolli ainetega katsetamine) või meetod, millega tõendatakse katsemeetodi korratavat toimivust ajas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katse käik
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kordus- ja paralleelproovide arv;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali kontsentratsioonid, kasutamise kord ning kasutatud kokkupuuteaeg (kui erineb soovitatust);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud hindamis- ja otsustamiskriteeriumide kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud katse nõuetekohasuse kriteeriumide kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kõikide katse-eeskirjas tehtud muudatuste kirjeldus.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemused
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Iga korduskatse kohta esitatakse tabelina uuritava kemikaali ja positiivse kontrolli korral saadud Imax, EC1,5 ja rakkude eluvõimelisuse tulemused (st IC50, IC30), nagu ka keskväärtused (Imax: keskmine; EC1,5 ja rakkude eluvõimelisuse väärtused: geomeetriline keskmine) ning SD, mis on arvutatud kõigi konkreetsete korduskatsete andmetest, ja prognoosimudelil põhinev uuritava kemikaali kohta antud hinnangu põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             iga katse negatiivse kontrolli luminestsentsi näitudega saadud variatsioonikordaja;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             graafik, millel on lutsiferaasi aktiivsuse induktsiooni ja rakkude eluvõimelisuse annuse-toime seose kõverad;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mis tahes muude asjakohaste vaatlusandmete kirjeldus, kui kohaldatav.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemuste arutelu
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             KeratinoSensTM testiga saadud tulemuste arutelu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             katsemeetodiga saadud tulemuste arvesse võtmine ühtse lähenemisviisi kontekstis, kui muu asjakohane teave on kättesaadav.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Järeldus
                                 
                              
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2013), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Kättesaadav aadressil: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2012), „The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence“, OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 168, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Adler S., Basketter D., Creton S., Pelkonen O., van Benthem J., Zuang V., Andersen K.E., Angers-Loustau A., Aptula A., Bal-Price A., Benfenati E., Bernauer U., Bessems J., Bois F.Y., Boobis A., Brandon E., Bremer S., Broschard T., Casati S., Coecke S., Corvi R., Cronin M., Daston G., Dekant W., Felter S., Grignard E., Gundert-Remy U., Heinonen T., Kimber I., Kleinjans J., Komulainen H., Kreiling R., Kreysa J., Leite S.B., Loizou G., Maxwell G., Mazzatorta P., Munn S., Pfuhler S., Phrakonkham P., Piersma A., Poth A., Prieto P., Repetto G., Rogiers V., Schoeters G., Schwarz M., Serafimova R., Tähti H., Testai E., van Delft J., van Loveren H., Vinken M., Worth A., Zaldivar J.M. (2011), „Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010“, Archives of Toxicology 85, 367–485.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.42, „Naha sensibiliseerimine: lokaalsete lümfisõlmede katse“.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.6, „Naha sensibiliseerimine“.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.50: „Naha sensibiliseerimine: lokaalsete lümfisõlmede katse: DA“.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.51, „Naha sensibiliseerimine: lokaalsete lümfisõlmede katse: BrdU-ELISA“.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Natsch A. (2010), „The Nrf2-Keap1-ARE Toxicity Pathway as a Cellular Sensor for Skin Sensitizers-Functional Relevance and Hypothesis on Innate Reactions to Skin Sensitizers“, Toxicological Sciences 113, 284–292.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Emter R., Ellis G., Natsch A. (2010), „Performance of a novel keratinocyte-based reporter cell line to screen skin sensitizers in vitro“, Toxicology and Applied Pharmacology 245, 281–290.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D., Kensler T.W. (2005), „The role of Keap1 in cellular protective responses“, Chem. Res. Toxicol., 18, 1779–1791.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Kansanen E., Kuosmanen S.M., Leinonen H., Levonen A.L. (2013), „The Keap1-Nrf2 pathway: Mechanisms of activation and dysregulation in cancer“, Redox Biol. 1(1), 45–49.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Natsch A., Bauch C., Foertsch L., Gerberick F., Normann K., Hilberer A., Inglis H., Landsiedel R., Onken S., Reuter H., Schepky A., Emter R. (2011), „The intra- and inter-laboratory reproducibility and predictivity of the KeratinoSens assay to predict skin sensitizers in vitro: results of a ring-study in five laboratories“. Toxicol. in Vitro 25, 733–744.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Natsch A., Ryan C.A., Foertsch L., Emter R., Jaworska J., Gerberick G.F., Kern P. (2013), „A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation“, Journal of Applied Toxicology 33, 1337–1352.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 EC EURL-ECVAM (2014), „Recommendation on the KeratinoSensTM assay for skin sensitisation testing“, 42 pp. Kättesaadav aadressil: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/recommendation-keratinosens-skin-sensitisation.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) (2013), „Protocol 155: KeratinoSensTM.“, 17 pp. Kättesaadav aadressil: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Natsch A., Emter R., Ellis G. (2009), „Filling the concept with data: integrating data from different in vitro and in silico assays on skin sensitizers to explore the battery approach for animal-free skin sensitization testing“, Toxicol. Sci. 107, 106–121.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Ball N., Cagen S., Carrillo J.C., Certa H., Eigler D., Emter R., Faulhammer F., Garcia C., Graham C., Haux C., Kolle S.N., Kreiling R., Natsch A., Mehling A. (2011), „Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach“, Regul. Toxicol. Pharmacol. 60, 389–400.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Bauch C., Kolle S.N., Ramirez T., Eltze T., Fabian E., Mehling A., Teubner W., van Ravenzwaay B., Landsiedel R. (2012), „Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potential“, Regul. Toxicol. Pharmacol. 63, 489–504.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Jaworska J., Dancik Y., Kern P., Gerberick F., Natsch A. (2013), „Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice“, J Appl Toxicol. 33, 1353–1364.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Andres E., Sa-Rocha V.M., Barrichello C., Haupt T., Ellis G., Natsch A. (2013), „The sensitivity of the KeratinoSensTM assay to evaluate plant extracts: A pilot study“, Toxicology in Vitro 27, 1220–1225.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez T., Kolle S., Eltze T., van Ravenzwaay B., Oesch F., Landsiedel R. (2013), „Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro“, Arch. Toxicol. 87, 1683–1969.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Thorne N., Inglese J., Auld D.S. (2010), „Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology“, Chemistry and Biology 17, 646–657.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 OECD (2012), „BG1Luc Estrogen Receptor Transactivation Test Method for Identifying Estrogen Receptor Agonists and Antagonists“, OECD Guidelines for Chemical Testing No. 457, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 ECETOC (2003), „Contact sensitization: Classification according to potency“, European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals, (Technical Report No. 87).
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Gildea L.A., Ryan C.A., Foertsch L.M., Kennedy J.M., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2006), „Identification of gene expression changes induced by chemical allergens in dendritic cells: opportunities for skin sensitization testing“, J. Invest. Assoc., 126, 1813–1822.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Ryan C.A., Gildea L.A., Hulette B.C., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2004), „Gene expressing changes in peripheral blood-derived dendritic cells following exposure to a contact allergen“, Toxicol. Lett. 150, 301–316.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Emter R., van der Veen J.W., Adamson G., Ezendam J., van Loveren H., Natsch A. (2013), „Gene expression changes induced by skin sensitizers in the KeratinoSens™ cell line: Discriminating Nrf2-dependent and Nrf2-independent events“, Toxicol. in Vitro 27, 2225–2232.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2015), „Performance Standards for assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation ARE-Nrf2 luciferase test methods“, OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.213, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 OECD (2005), „Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment“, OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23, OECD, Paris, France.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 NAFTA (North American Free Trade Agreement) (2012). Technical Working Group on Pesticides – (Quantitative) Structure Activity Relationship ((Q)SAR) Guidance Document. 186 pp. http://www.epa.gov/oppfead1/international/naftatwg/guidance/qsar-guidance.pdf
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Aine
                           – keemilised elemendid ja nende ühendid, kas looduslikud või tootmisprotsessiga saadud, välja arvatud lahusti, mida on võimalik eraldada aine stabiilsust mõjutamata ja selle koostist muutmata (1).
                        
                           
                              ARE
                           – ehk antioksüdatiivse reaktsiooni element (kasutatakse ka lühendit EpRE (electrophile response element, elektrofiilse reaktsiooni element) on reaktsioonielement, mis esineb mitme tsütoprotektiivse ja II faasi geeni promootori ülesvoolujärjestuse piirkonnas. Kui seda aktiveerib Nrf2, vahendab ARE nende geenide transkriptsiooni signaali.
                        
                           
                              Asjakohasus
                           – huvipakkuva toime ja katse vahelise seose kirjeldus, millest nähtub, kas see seos on tähenduslik ning kasulik konkreetse eesmärgi puhul. See on ulatus, mille piires saab katsemeetodiga õigesti mõõta või prognoosida huvipakkuvat bioloogilist toimet. Asjakohasusega seoses võetakse arvesse ka katsemeetodi täpsust (kordustäpsust) (29).
                        
                           
                              EC1,5
                              
                           – interpoleeritud kontsentratsioon, millele vastab 1,5kordne lutsiferaasi induktsioon.
                        
                           
                              IC30
                              
                           – kontsentratsioon, mis põhjustab rakkude eluvõimelisuse 30 % vähenemise.
                        
                           
                              IC50
                              
                           – kontsentratsioon, mis põhjustab rakkude eluvõimelisuse 50 % vähenemise.
                        
                           
                              Imax
                              
                           – lutsiferaasi aktiivsuse maksimaalne induktsioonitegur, võrreldes lahusti (negatiivse) kontrolliga ja mõõdetuna ükskõik millisel uuritava kemikaali kontsentratsioonil.
                        
                           
                              Kahjuliku toime rada (Adverse Outcome Pathway, AOP)
                           – sündmuste ahel alates sihtkemikaali või sarnaste kemikaalide rühma keemilisest struktuurist molekulaarse initsieerimisetapi kaudu vaadeldava toime kliinilise avaldumiseni in vivo (2).
                        
                           
                              Katsete tegemist ja hindamist käsitlev ühtne lähenemisviis (Integrated Approach to Testing and Assessment, IATA; lühendatult „ühtne lähenemisviis“)
                           – struktureeritud lähenemisviis, mida kasutatakse kemikaali või kemikaalide rühma ohutegurite tuvastamiseks (võimalikkus), selle kirjeldamiseks (toime tugevus) ja/või ohutuse hindamiseks (võimalikkus / toime tugevus ja kokkupuude) ja millega ühendatakse strateegiliselt ning analüüsitakse kõik asjakohased andmed, et oleks olemas vajalik teave regulatiivse meetme võtmiseks seoses võimaliku ohu ja/või riskiga ja/või täiendavaks sihipäraseks (ja seega minimaalseks) katsetamiseks.
                        
                           
                              Keap1
                           – Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1) on sensorvalk, mis reguleerib Nrf2 aktiivsust. Induktsiooni puudumisel on sensorvalgu Keap1 sihtmärk transkriptsioonifaktor Nrf2; sensorvalk põhjustab selle ubikvitinüleerimise ja proteolüütilise lõhustamise proteasoomis. Kui väiksed molekulid seovad end kovalentselt sensorvalgu Keap1 reaktsioonivõimeliste tsüsteiinijääkidega, võib see põhjustada Nrf2 dissotsieerumist sensorvalgust Keap1 (8) (10) (11).
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Korratavus
                           – sama kemikaali sama metoodikaga uurimisel saadud tulemuste kokkulangevus (vt usaldusväärsus) (29).
                        
                           
                              Lahusti/vehiikuli kontroll
                           – paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente peale uuritava kemikaali ning millele on lisatud kasutatav lahusti. Seda kasutatakse, et määrata lähtetaseme reaktsioon samas lahustis lahustatud uuritava kemikaaliga töödeldud proovides.
                        
                           
                              Mitme koostisosaga aine
                           – aine, mis on määratletud oma kvantitatiivse koostisega, milles on rohkem kui üks põhikoostisosa, mille kontsentratsioon on vahemikus 10 %–80 % (massiprotsent). Mitme koostisosaga aine saadakse tootmisprotsessi käigus. Erinevus segu ja mitme koostisosaga aine vahel seisneb selles, et segu saadakse kahe või enama aine kokku segamisel, ilma et toimuks keemilist reaktsiooni. Mitme koostisosaga aine saadakse keemilise reaktsiooni tulemusel.
                        
                           
                              Nrf2
                           – Nrf2 (Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2) on transkriptsioonifaktor, mis on seotud antioksüdatiivse reaktsiooni rajaga. Kui Nrf2 ei ubikvitinüleerita, siis tema kogus tsütoplasmas suureneb ning ta translotseerub tuuma, kus seondub paljude tsütoprotektiivsete geenide promootori ülesvoolujärjestuse piirkonnas asuva sensorvalguga ARE ja käivitab sellega nende transkriptsiooni (8, 10, 11).
                        
                           
                              Ohtlikkus
                           – mõjuri või olukorra iseloomulik omadus, mis võib põhjustada kahjulikku toimet, kui organism, süsteem või (alam-)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub.
                        
                           
                              Positiivne kontroll
                           – paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente ja mida töödeldakse ainega, mis teadaolevalt kutsub esile positiivse reaktsiooni. Selleks et oleks võimalik hinnata positiivse kemikaali tekitatud reaktsiooni muutumist ajas, ei tohi positiivne reaktsioon olla liiga tugev.
                        
                           
                              Segu
                           – ainete segu või lahus, mis koosneb kahest või enamast ainest, mis omavahel ei reageeri (1).
                        
                           
                              Spetsiifilisus
                           – kõikide negatiivsete / inaktiivsete kemikaalide osakaal, mis katsemeetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Spetsiifilisusega mõõdetakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (29).
                        
                           
                              Tundlikkus
                           – kõikide positiivsete / reaktsioonivõimeliste kemikaalide osakaal, mis katsemeetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Tundlikkusega mõõdetakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (29).
                        
                           
                              Täpsus
                           – näitab katsemeetodi tulemuste lähedust kokkulangemisele kinnitatud võrdlusväärtustega (mõõtetäpsus). Täpsusega mõõdetakse katsemeetodi toimivust ja see on üks asjakohasuse aspektidest. Seda terminit kasutatakse ka kordustäpsuse tähenduses, mis näitab, kui sageli annab katsemeetod õige tulemuse (29).
                        
                           
                              Usaldusväärsus
                           – katsemeetodiga aja jooksul saadud tulemuste laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ulatuse mõõt, kui katset tehakse sama metoodikaga. Seda hinnatakse laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ja laborisisese korduvuse arvutamisega (29).
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – terminit „uuritav kemikaal“ kasutatakse katsealuse kemikaali kohta.
                        
                           
                              UVCB
                           – tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid.
                        
                           
                              Valiidne katsemeetod
                           – katsemeetod, mille asjakohasust ja usaldusväärsust konkreetse eesmärgi puhul käsitatakse piisavana ning mis põhineb teaduslikult tõendatud põhimõtetel. Katsemeetod ei ole kunagi valiidne absoluutses tähenduses, vaid ainult seoses määratud eesmärgiga (29).
                        
                           
                              Variatsioonikordaja
                           – hajuvuse mõõt, mis arvutatakse paralleelandmete rühma kohta; selleks jagatakse standardhälve keskväärtusega. Seda saab väljendada protsentides, kui korrutada tulemus sajaga.
                        
                           
                              Ühe koostisosaga aine
                           – aine, mis on määratletud oma kvantitatiivse koostisega, milles on üks põhikoostisosa, mille kontsentratsioon on vähemalt 80 % (massiprotsent).
                        
                           
                              Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteem (ÜRO GHS (United Nations Globally Harmonized System, UN GHS))
                           – süsteem, millega nähakse ette kemikaalide (ained ja segud) klassifitseerimine füüsikaliste ohutegurite ning tervise- ja keskkonnaohu standarditud tüübi ja -taseme alusel ning mis hõlmab asjaomaseid teavitustähiseid, nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, mille eesmärk on edastada teavet kemikaalide kahjulikest toimetest, et kaitsta inimesi (sealhulgas tööandjaid, töötajaid, vedajaid, tarbijaid ja päästetöötajaid) ning keskkonda (1).
                     
                     
                        2. liide
                        PÄDEVUSE KONTROLLI AINED
                        
                           Naha sensibiliseerimine in vitro: ARE-Nrf2 lutsiferaasi katsemeetod
                        
                        Enne käesoleva katsemeetodi rutiinset kasutamist tuleb laboril tõendada oma tehnilist pädevust, kasutades selleks tabelis 1 soovitatud pädevuse kontrolli aineid, et saada nendega õige eeldatav KeratinoSens™ testil põhinev prognoos ning EC1.5 ja IC50 väärtused, mis jäävad asjakohasesse võrdlusvahemikku vähemalt kaheksa pädevuse kontrolli aine puhul kümnest. Pädevuse kontrolli ained on valitud nii, et need esindaksid naha sensibiliseerimise ohuga seotud eri reaktsioone. Muud valiku kriteeriumid olid kaubanduslik saadavus, kvaliteetse in vivo võrdluse olemasolu ning KeratinoSensTM testiga saadud kvaliteetsete in vitro andmete kättesaadavus.
                        
                           Tabel 1
                        
                        
                           KeratinoSens™ testi kasutamise tehnilise pädevuse tõendamiseks soovitatavad ained
                        
                        
                                    Pädevuse kontrolli ained
                                 
                                 
                                    CASi nr
                                 
                                 
                                    Füüsikaline olek
                                 
                                 
                                    
                                       In vivo prognoos (28)
                                    
                                 
                                 
                                    KeratinoSens™ testi prognoos (29)
                                    
                                 
                                 
                                    EC1,5 (μM ) võrdlusvahemik (30)
                                    
                                 
                                 
                                    IC50 (μM ) võrdlusvahemik (30)
                                    
                                 
                              
                                    Isopropanool
                                 
                                 
                                    67-63-0
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    Sensibiliseeriva toimeta
                                 
                                 
                                    Negatiivne
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Salitsüülhape
                                 
                                 
                                    69-72-7
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    Sensibiliseeriva toimeta
                                 
                                 
                                    Negatiivne
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Piimhape
                                 
                                 
                                    50-21-5
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    Sensibiliseeriva toimeta
                                 
                                 
                                    Negatiivne
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Glütserool
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    Sensibiliseeriva toimeta
                                 
                                 
                                    Negatiivne
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Tsinnamüülalkohol
                                 
                                 
                                    104-54-1
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    Sensibilisaator (nõrk)
                                 
                                 
                                    Positiivne
                                 
                                 
                                    25–175
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Etüleenglükooldimetakrülaat
                                 
                                 
                                    97-90-5
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    Sensibilisaator (nõrk)
                                 
                                 
                                    Positiivne
                                 
                                 
                                    5–125
                                 
                                 
                                    > 500
                                 
                              
                                    2-merkaptobensotiasool
                                 
                                 
                                    149-30-4
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    Sensibilisaator (mõõdukas)
                                 
                                 
                                    Positiivne
                                 
                                 
                                    25–250
                                 
                                 
                                    > 500
                                 
                              
                                    Metüüldibromoglutaronitriil
                                 
                                 
                                    35691-65-7
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    Sensibilisaator (tugev)
                                 
                                 
                                    Positiivne
                                 
                                 
                                    < 20
                                 
                                 
                                    20–100
                                 
                              
                                    4-metüülaminofenoolsulfaat
                                 
                                 
                                    55-55-0
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    Sensibilisaator (tugev)
                                 
                                 
                                    Positiivne
                                 
                                 
                                    < 12,5
                                 
                                 
                                    20–200
                                 
                              
                                    2,4-dinitroklorobenseen
                                 
                                 
                                    97-00-7
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    Sensibilisaator (ülitugev)
                                 
                                 
                                    Positiivne
                                 
                                 
                                    < 12,5
                                 
                                 
                                    5–20
                                 
                              
                     
                        3. liide
                        
                           LUMINESTSENTSI MÕÕTMISE KVALITEEDIKONTROLL
                        
                        
                           Põhikatse luminestsentsi mõõtmise optimeerimiseks KeratinoSensTM testis
                        
                        Järgmised kolm näitajat on kriitilised, et tagada luminomeetriga mõõtmise usaldusväärsed tulemused:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    piisav tundlikkus, et kontrolliga kannude foon oleks stabiilne;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    pikast mõõtmisajast tingitud gradiendi puudumine kogu mikrotiiterplaadi ulatuses ja
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    valgussaaste puudumine kannudes, mis asuvad tugeva aktiivsusega kannude kõrval.
                                 
                              Enne katse tegemist on soovitatav tagada asjakohaste luminestsentsi mõõtetulemuste saamine, testides kontrollplaati allpool kirjeldatud proovide paigutusega (kolme paralleelprooviga analüüs).
                        
                           Esimese õppekatse mikrotiiterplaadi proovide järjestus
                        
                        
                                     
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                    5
                                 
                                 
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    8
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    12
                                 
                              
                                    A
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    B
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    
                                       D
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 0.98
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 1.95
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 3.9
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 7.8
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 15.6
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 31.25
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 62.5
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 125
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 250
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 500
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 1000
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 2000
                                    
                                 
                              
                                    E
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    F
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    G
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    H
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    
                                       CA 4
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 8
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 16
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 32
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 64
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       Tühikatse
                                    
                                 
                              
                           EGDMA= etüleenglükooldimetakrülaat (CASi nr 97-90-5), tugev indutseerija
                        
                           CA= kaneelaldehüüd, positiivne võrdlusproov (CASi nr 104-55-2)
                        
                           Kvaliteedikontrolli analüüs peab tõendama järgmist:
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    D reas on selge annuse-reaktsiooni seos, mille korral Imax ületab fooni 20 korda (enamikul juhtudel on Imax väärtused vahemikus 100–300);
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    C ja E reas puudub seos annuse-reaktsiooni vahel (induktsiooni väärtus ei ületa 1,5 (ideaaljuhul mitte üle 1,3)), mille võiks olla põhjustanud EGDMA rea tugeva aktiivsusega kannude võimalik valgussaaste;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    puudub oluline statistiline erinevus A, B, C, E, F ja G ridade vahel (st mikrotiiterplaadi ulatuses ei esine gradienti); ning
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    A, B, C, E, F ja G ridadest igaühe ning H rea DMSOd sisaldavate kannude tulemuste hajuvusvarieeruvus ei ületa 20 % (st foon on stabiilne).
                                 
                              
                     B.61.   Fluorestseiini lekke katsemeetod silmi söövitavate ja tugevalt ärritavate kemikaalide tuvastamiseks
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 460 (2012). Fluorestseiini lekke (FL) katsemeetod on in vitro katsemeetod, mida saab teatavatel tingimustel ja konkreetsete piirangutega kasutada kemikaalide (ainete ja segude) klassifitseerimiseks silmi söövitavateks ja tugevalt ärritavateks, nagu on määratletud Ühinenud Rahvaste Organisatsiooni (ÜRO) ühtse ülemaailmse kemikaalide klassifitseerimise ja märgistamise süsteemis (GHS) (1. kategooria), määruses (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist (CLP-määrus) (31) (1. kategooria) ning Ameerika Ühendriikide Keskkonnakaitseametis (U.S. Environmental Protection Agency, EPA) (1. kategooria) (1, 2). Selle katsemeetodi jaoks määratletakse silmi tugevalt ärritava toimega kemikaalid kui kemikaalid, mis põhjustavad pärast silma panemist koekahjustuse, mis ei ole pöörduv 21 päeva jooksul, või füüsilise nägemisteravuse suure languse, samas kui silma söövitavad kemikaalid tekitavad silmas pöördumatu koekahjustuse. Sellised kemikaalid klassifitseeritakse vastavalt ÜRO GHSi 1. kategooriasse, ELi CLP-määruse 1. kategooriasse ning U.S. EPA I kategooriasse.
                     Kuigi FL-katsemeetodit ei käsitata valiidse meetodina, mis asendab täielikult küüliku silma katse in vivo, soovitatakse FL-katsemeetodit kasutada astmelise katsetamise strateegia osana kemikaalide regulatiivse klassifitseerimise ja märgistamise jaoks. Seega soovitatakse FL-katsemeetodit ülevalt-alla lähenemisviisi algetapina, millega tehakse kindlaks silmi söövitavad / tugevalt ärritavad kemikaalid, eriti piiratud kemikaalitüüpide puhul (st vees lahustuvad ained ja segud) (3, 4).
                     Praegu ollakse üldiselt arvamusel, et lähitulevikus ei saa ühegi silmaärrituse in vitro katsega asendada in vivo silmakatset (katsemeetod B.5 (5)), et prognoosida eri kemikaalirühmade ärritavat toimet kogu ulatuses. Mitme alternatiivse katsemeetodi kombineerimisega (astmelise) katsetamise strateegia raames võib siiski olla võimalik asendada in vivo silmakatset (4). Ülevalt-alla lähenemisviisi (4) kasutamist kavandatakse siis, kui olemasoleva teabe alusel on põhjust eeldada, et kemikaalil võib olla tugev ärritav toime.
                     Punktis 35 üksikasjalikult kirjeldatud prognoosimudeli alusel võib piiratud kohaldatavuse piirkonnas FL-katsemeetodiga kindlaks teha silmi söövitavaid / tugevalt ärritavaid kemikaale (ÜRO GHSi 1. kategooria; ELi CLP-määruse 1. kategooria; U.S. EPA I kategooria), ilma et oleks vaja teha täiendavaid katseid. Sama eeldatakse segude kohta, kuigi segusid ei valideeritud. Seega võib FL-katsemeetodit kasutada selleks, et määrata kemikaalide silmi ärritavat / söövitavat toimet, järgides katsemeetodis B.5 (5) kirjeldatud järjestikuste katsete tegemise strateegiat. Kemikaali, mida ei ole FL-katsemeetodi põhjal prognoositud silmi söövitavaks või tugevalt ärritavaks, tuleks siiski uurida ühe või enama täiendava (in vitro ja/või in vivo) katsemeetodiga, millega on võimalik õigesti määrata i) kemikaalid, mis on in vitro FL-katses silmi söövitava / tugevalt ärritava toime suhtes valenegatiivsed (ÜRO GHSi 1. kategooria; ELi CLP-määruse 1. kategooria; U.S. EPA I kategooria); ii) kemikaalid, mida ei ole klassifitseeritud silmi söövitavaks/ärritavaks (ÜRO GHSi kategooriata; ELi CLP-määruse kategooriata; U.S. EPA IV kategooria); ja/või iii) kemikaalid, mis on mõõduka/nõrga silmi ärritava toimega (ÜRO GHSi kategooriad 2A ja 2B; ELi CLP-määruse 2. kategooria; U.S. EPA kategooriad II ja III).
                     Käesoleva katsemeetodi eesmärk on kirjeldada katsemeetodeid, mida kasutatakse uuritava kemikaali võimaliku silmi söövitava või tugevalt ärritava toime hindamiseks, mõõtes kemikaali võimet tekitada läbilaskmatu konfluentse ühekordse epiteelikihi kahjustust. Normaalse epiteelikaudse läbilaskvuse tagamine on epiteeli, sh side- ja sarvkesta epiteeli peamine funktsioon. Epiteelikaudset läbilaskvust reguleerivad erinevad tiheliidused. Sarvkesta epiteeli läbilaskvuse suurenemise kohta in vivo on tõendatud, et see korreleerub silmaärrituse progresseerumisel põletiku taseme ja sedastatava pinnakahjustuse ulatusega.
                     FL-katsemeetodis kasutatakse Madin-Darby koeraneeru (Madin-Darby Canine Kidney, MDCK) rakuliini, mille rakud läbilaskval vahemembraanil kasvatamise korral moodustavad epiteeli monokihi; lühiajaline kokkupuude uuritava kemikaaliga võib suurendada epiteelikihi läbilaskvust naatriumfluorestseiini suhtes; selle suurenemise järgi mõõdetakse toksilist toimet. Lekkinud fluorestseiini kogus on proportsionaalne tiheliiduste, desmosoomiliiduste ja rakumembraani kahjustustega kemikaali toimel ning seda saab kasutada selleks, et hinnata uuritava kemikaali toksilisust silmade suhtes. 1. liites on esitatud joonis, millel on kujutatud vahemembraanil kasvatatavate MDCK rakkudega kambrit, mida kasutatakse fluorestseiini katsemeetodis.
                     Mõisted on esitatud 2. liites.
                     LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD
                     Käesolev katsemeetod põhineb INVITTOXi katsemeetodil nr 71 (6), mida on hinnanud rahvusvahelises valideerimisuuringus Euroopa Alternatiivsete Meetodite Tõestamise Keskus (European Centre for the Validation of Alternative Methods, EVCAM) koostöös USA alternatiivmeetodite valideerimise ametitevahelise koordineerimiskomiteega (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) ja alternatiivmeetodite valideerimise Jaapani keskusega (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM).
                     FL-katsemeetodit ei soovitata nende kemikaalide tuvastamiseks, mis tuleb klassifitseerida nõrga/mõõduka ärritava toimega kemikaalideks, või nende kemikaalide puhul, mida ei pea silmaärrituse suhtes klassifitseerima (ained ja segud) (st GHSi kategooria 2A/2B, kategooriata; ELi CLP-määruse 2. kategooria, kategooriata; US EPA II/III/IV kategooria), nagu on tõendatud valideerimisuuringu alusel (3, 7).
                     See katsemeetod on kohaldatav ainult vees lahustuvate kemikaalide (ained ja segud) uurimiseks. FL-katsemeetodiga saab tavaliselt õigesti prognoosida kemikaalide potentsiaali silmi ärritada, kui nad on vees lahustuvad ja/või kui toksiline toime ei sõltu lahjendusest (7). Selleks, et liigitada kemikaal katsetingimustes vesilahustuvaks, peab see lahustuma steriilses kaltsiumit (kontsentratsioonis 1,0–1,8 mM) sisaldavas fenoolpunaseta Hanki tasakaalustatud soolalahuses (HBSS) kontsentratsioonis ≥ 250 mg/ml (järgmine annus pärast läviväärtust 100 mg/ml). Kui uuritav kemikaal lahustub siiski väiksemas kontsentratsioonis kui 100 mg/ml, aga põhjustab fluorestseiini lekke üle 20 % juba sellel kontsentratsioonil (see tähendab, et FL20 < 100 mg/ml), võib kemikaali siiski klassifitseerida GHSi 1. kategooriasse või EPA 1. kategooriasse.
                     Selle katsemeetodi jaoks määratletud piirangutega on kohaldamisvaldkonnast välja arvatud tugevad happed ja alused, rakkude fiksaatorid ja väga lenduvad kemikaalid. Nende kemikaalide toimemehhanisme, näiteks ulatuslikku koagulatsiooni, leeliselist hüdrolüüsi ega spetsiifilisi keemilisi reaktsioone ei saa mõõta FL-katsemeetodiga. Muud selle katsemeetodi kindlaks tehtud piirangud on seotud raskustega prognooside tegemisel värvilise ja viskoosse uuritava kemikaali puhul. Arvatakse, et mõlemat tüüpi kemikaale on pärast lühiajalist kokkupuudet raske rakkude monokihist eemaldada ja et katsemeetodi prognoosivõimet saaks suurendada, kui kasutada suuremat arvu pesemisetappe. Vedelikus suspendeeritud tahketel kemikaalidel on kalduvus sadestuda ning rakkude kokkupuute lõplikku kontsentratsiooni võib olla keeruline määrata. Kui nende keemiliste ja füüsikaliste klasside kemikaalid andmebaasist välja jätta, suureneb FL-meetodi täpsus ELi, EPA ja GHSi klassifitseerimissüsteemide suhtes oluliselt (7).
                     Selle katsemeetodi eesmärgi (st teha kindlaks ainult silmi söövitavaid / tugevalt ärritavaid kemikaale) suhtes ei ole valenegatiivsete tulemuste osakaal kriitilise tähtsusega, sest selliseid kemikaale uuritakse järgmiseks muude piisavalt valideeritud in vitro meetoditega või katsetes küülikutega, sõltuvalt regulatiivsetest nõuetest (vt punkt 13), kasutades järjestikuste katsete tegemise strateegiat koos tõendite kaalukuse lähenemisviisiga (5) (vt ka punktid 3 ja 4).
                     Muud FL-katsemeetodi kindlaks tehtud piirangud on seotud valenegatiivsete ja valepositiivsete tulemuste osakaaluga. Kui seda katsemeetodit kasutatakse ülevalt-alla lähenemisviisi algetapina, et tuvastada vesilahustuvad silmi söövitavad / tugevalt ärritavad ained ja segud (ÜRO GHSi 1. kategooria; ELi CLP-määruse 1. kategooria; US EPA I kategooria), siis on valepositiivsete osakaal FL-katsemeetodi puhul vahemikus 7 % (7/103; ÜRO GHS ja ELi CLP-määrus) kuni 9 % (9/99; US EPA) ning valenegatiivsete osakaal on vahemikus 54 % (15/28; US EPA) kuni 56 % (27/48; ÜRO GHS ja ELi CLP-määrus), võrreldes in vivo tulemustega. FL-katsemeetodiga valepositiivseid ja/või valenegatiivseid tulemusi põhjustanud kemikaalirühmad ei ole siinkohal määratletud.
                     Teatavad tehnilised piirangud on seotud MDCK rakuliiniga. Värvaine naatriumfluorestseiini läbiminekut monokihist takistavaid tiheliiduseid mõjutab negatiivselt suurenev rakupassaažide arv. Tiheliiduste ebatäielik moodustumine põhjustab fluorestseiini lekke suurenemist töötlemata kontrollis. Seepärast on tähtis kindlaks määratud lubatav maksimaalne leke töötlemata kontrollis (vt punkt 38: leke 0 %). Nagu kõigi in vitro katsete puhul on olemas võimalus, et rakud transformeeruvad aja jooksul, seega on ülioluline, et katsete kohta esitataks passaažiarvu vahemikud.
                     Praegust katse kohaldamisvaldkonda võiks teatud juhtudel laiendada, kuid ainult pärast uuritud kemikaalide suurendatud ning eelistatavalt katsepõhise andmekogumi analüüsimist (3). Kõnealust meetodit ajakohastatakse kooskõlas uue teabe ja andmetega.
                     Iga käesolevat katsemeetodit juurutav labor peab kasutama 3. liites esitatud pädevuse kontrolli kemikaale. Laborid võivad neid kemikaale kasutada selleks, et tõendada FL-katse tegemise tehnilist pädevust enne FL-katsega saadud andmete esitamist ohu regulatiivseks klassifitseerimiseks.
                     KATSE PÕHIMÕTE
                     FL-katsemeetod on tsütotoksilisusel ja rakutalitlusel põhinev in vitro katsemeetod, mille tegemiseks kasutatakse konfluentset MDCK CB997 tubulaarse epiteeli rakkude monokihti, mida kasvatatakse poolläbilaskval membraanil ja mis on mitte paljunemisfaasis oleva in vivosarvkesta epiteeli mudel. MDCK rakuliin on tavaliselt kasutatav ning moodustab tiheliiduseid ja desmosoomiliiduseid, mis sarnanevad nendega, mida esineb side- ja sarvkesta epiteeli pealmisel (apikaalsel) poolel. In vivo takistavad tihe- ja desmosoomiliidused lahustunud ainetel ja võõrmaterjalil sarvkesta epiteeli läbimist. Tiheliiduste ja desmosoomiliiduste kahjustumisega kaasnev epiteelikaudse läbilaskmatuse kadu on kemikaali põhjustatud silmaärrituse üks esimesi etappe.
                     Uuritav kemikaal lisatakse konfluentsele rakukihile, mida kasvatatakse membraani pealmisel poolel. Tavaliselt kasutatakse lühikest (1 min) kokkupuudet, mis peegeldab kemikaalist puhastumise normaalset kiirust inimese kokkupuute korral. Lühiajalise kokkupuute eelis on see, et vees lahustunud aineid ja segusid saab uurida lahjendamata, kui neid on võimalik pärast kokkupuuteperioodi kergesti eemaldada. See võimaldab tulemuste vahetumat võrdlemist inimese puhul avalduvate keemiliste toimetega. Seejärel eemaldatakse uuritav kemikaal ning lisatakse mittetoksiline intensiivselt fluorestseeruv värvaine naatriumfluorestseiin rakkude monokihi pealmisele poolele 30 minutiks. Uuritava kemikaali põhjustatud tiheliiduste kahjustus määratakse kindlaks rakukihist teatava aja jooksul lekkinud fluorestseiini koguse järgi.
                     Värvaine naatriumfluorestseiini kogus, mis monokihti ja membraani läbides jõuab kannus olevasse kindla ruumalaga lahusesse (millesse naatriumfluorestseiin lekib), määratakse kannus oleva fluorestseiini kontsentratsiooni spektrofotomeetrilise mõõtmisega. Fluorestseiini leke (FL) arvutatakse võrdlusest fluorestsentsi intensiivsuse kahe kontrolli näitudega – tühikatse ja maksimumlekke kontrolliga. Tiheliiduste kahjustus väljendatakse seega lekke protsendi kaudu võrdlusest nende kontrollidega ja arvutatakse uuritud kemikaali iga ettenähtud kontsentratsiooni kohta. Seejärel arvutatakse FL20 (st kontsentratsioon, mis põhjustab fluorestseiini 20protsendilise lekke, võrreldes töötlemata rakkude konfluentse monokihi puhul ja rakkudeta membraani puhul saadud väärtusega). FL20 (mg/ml) väärtust kasutatakse prognoosimudelis silmi söövitavate ja tugevalt ärritavate kemikaalide kindlaks tegemiseks (vt punkt 35).
                     Oluline osa uuritava kemikaali toksilisuse profiilist on rakkude taastumine, mida määratakse ka in vivo silmaärrituse katses. Esialgsed analüüsid nähtus, et taastumise andmed (kuni 72 tunnini pärast kokkupuudet kemikaaliga) võiksid suurendada INVITTOXi katsemeetodi nr 71 prognoosivõimet, kuid see vajab täiendavat hindamist ning selleks oleksid kasulikud ka täiendavad andmed, mis eelistatavalt saadakse edasiste katsetega (6). Kõnealust meetodit ajakohastatakse kooskõlas uue teabe ja andmetega.
                     KATSE KÄIK
                     
                        Rakkude monokihi valmistamine
                     
                     MDCK CB997 rakkude monokiht saadakse, kasutades subkonfluentseid rakke, mida kasvatatakse rakukultuuripudelites söötmes DMEM / Nutrient Mix F12 (toitainete segu F12: L-glutamiini, 15 mM HEPESi, kaltsiumi (kontsentratsioonis 1,0–1,8 mM) ja 10 % kuumutamisega inaktiveeritud FCS/FBS (veise loote seerumi) 1 × kontsentraat). Tähtis on, et FL-katses kasutatud sööde / kõik lahused sisaldaksid kaltsiumi kontsentratsioonivahemikus 1,8 mM (200 mg/l) ja 1,0 mM (111 mg/l), et tagada tiheliiduste moodustumine ja terviklikkus. Tuleb reguleerida rakupassaažide arvu vahemikku, et tagada tiheliiduste ühtlane ja korratav moodustumine. Eelistatavalt tuleks kasutada rakke passaažide vahemikus 3–30 pärast sulatamist, sest selle vahemiku rakkude toimivus on sarnane, mis soodustab katsetulemuste korratavust.
                     Enne FL-katsega alustamist trüpsineeritakse rakud pudeli pinnalt lahti, tsentrifuugitakse ja külvatakse asjakohane arv rakke 24-kannulistesse plaatidesse asetatud membraanidele (vt 1. liide). Rakud tuleb külvata tselluloosi estrite segust tehtud 12mm läbimõõduga membraanile, mille paksus on 80–150 μm ja poori läbimõõt 0,45 μm. Valideerimisuuringus kasutati Millicell-HA 12 mm membraane. Vahemembraani ja membraani tüübi omadused on tähtsad, sest nad võivad mõjutada rakkude kasvu ja keemilist sidumist. Teatavat tüüpi kemikaalid võivad seonduda Millicell-HA vahemembraanile, mis võib mõjutada tulemuste tõlgendamist. Muude kasutatud membraanide samaväärsuse tõendamiseks tuleb kasutada pädevuse kontrolli kemikaale (vt 3. liide).
                     Keemiline seondumine vahemembraaniga on tavalisem katioonsete kemikaalide puhul, nagu bensalkooniumkloriid, mis tõmbuvad laetud membraani poole (7). Keemiline seondumine vahemembraaniga võib pikendada kemikaaliga kokkupuute aega, mis põhjustab selle kemikaali toksilise toime ülehindamist, kuid võib ka füüsiliselt vähendada fluorestseiini leket vahemembraani kaudu, kui värvaine seondub vahemembraaniga, mis põhjustab kemikaali toksilise potentsiaali alahindamist. Seda saab lihtsalt kindlaks teha, kui lisada suurimas kontsentratsioonis uuritavat kemikaali ja seejärel normaalses kontsentratsioonis naatriumfluorestseiini standardajaks ainult vahemembraanile (ilma rakkudeta kontrollproov). Kui värvaine naatriumfluorestseiini seondumine tekib, siis on vahemembraan pärast uuritava materjali mahapesemist kollane. Seega on oluline teada uuritava kemikaali seondumise omadusi, et oleks võimalik tõlgendada selle kemikaali toimet rakkudele.
                     Rakkude külvamine vahemembraanile peab tagama rakkude konfluentse monokihi kemikaaliga kokkupuute ajal. Vahemembraani kohta tuleb lisada rakke koguses 1,6 × 105 (400 μl rakkude suspensiooni tihedusega 4 × 105 rakku/ml). Nendes tingimustes saavutatakse konfluentse monokihi teke tavaliselt pärast rakkude 96-tunnilist kultiveerimist. Vahemembraane tuleb enne rakkude külvi visuaalselt kontrollida, et olla veendunud, et punktis 30 kirjeldatud visuaalse kontrolliga leitavad kahjustused on tekkinud käsitsemise tõttu.
                     MDCK rakukultuure tuleb kasvatada inkubaatoris CO2 sisaldusega 5 % ± 1 % ja sobiva niiskusesisaldusega atmosfääris temperatuuril 37 ± 1 °C. Rakud ei tohi olla saastunud bakterite, viiruste, mükoplasma ega seentega.
                     
                        Uuritavate ja kontrollkemikaalide pealekandmine
                     
                     Uuritava kemikaali värske põhilahus tuleb valmistada iga katseseeria jaoks ning kasutada 30 minuti jooksul pärast valmistamist. Uuritavad kemikaalid tuleb valmistada kaltsiumit (kontsentratsioonis 1,0–1,8 mM) sisaldavas fenoolpunaseta HBSSi söötmes, et vältida seerumi valkude seondumist. Enne katse tegemist tuleb hinnata kemikaali lahustuvust HBSSi söötmes kontsentratsioonil 250 mg/ml. Kui sellel kontsentratsioonil moodustab kemikaal 30 minuti jooksul stabiilse suspensiooni või emulsiooni (st lahus säilitab ühetaolisuse ja ei sadestumise ega eraldumise tõttu ei teki täiendavaid faase), võib HBSSi lahustina siiski kasutada. Kui kemikaal osutub HBSSis sellel kontsentratsioonil siiski lahustumatuks, tuleb kaaluda FL-katsemeetodi asemel muu katsemeetodi kasutamist. Kerge mineraalõli kasutamisesse lahustina juhul, kui kemikaal osutub HBSSis lahustumatuks, tuleb suhtuda ettevaatusega, sest ei ole piisavalt andmeid, et teha järeldus FL-katse toimivusest sellistel tingimustel.
                     Kõik uuritavad kemikaalid valmistatakse põhilahusest võetud steriilses kaltsiumit (kontsentratsioonis 1,0–1,8 mM) sisaldavas fenoolpunaseta HBSSis viies kindlaks määratud kontsentratsioonis, mis saadakse kemikaali lahjendamisel, võttes aluseks massi ruumala kohta: 1, 25, 100, 250 mg/ml ja lahjendamata kemikaal või küllastunud lahus. Kui uuritav kemikaal on tahkis, tuleb lisada ka üks ülisuur kontsentratsioon 750 mg/ml. Selles kontsentratsioonis kemikaali pipeteerimisel rakkudele tuleb võib-olla kasutada kolbpipetti. Kui toksilisus esineb vahemikus 25–100 mg/ml, tuleb järgmisi täiendavaid kontsentratsioone testida kaks korda: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml. FL20 väärtus tuleb tuletada nendest kontsentratsioonidest eeldusel, et katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud.
                     Uuritavad kemikaalid kantakse konfluentsele rakkude monokihile pärast rakusöötme eemaldamist ja kahekordset pesemist steriilse sooja (37 °C) kaltsiumit (kontsentratsioonis 1,0–1,8 mM) sisaldava fenoolpunaseta HBSSga. Enne seda on filtreid visuaalselt kontrollitud mis tahes eelnevalt olemasoleva kahjustuse suhtes, mida võiks ekslikult pidada uuritava kemikaaliga kokkusobimatuseks. Uuritava kemikaali iga kontsentratsiooni ja positiivse kontrolli kohta tuleb igas katseseerias kasutada vähemalt kolme paralleelproovi. Pärast 1minutilist kokkupuudet toatemperatuuril tuleb uuritav kemikaal aspireerides ettevaatlikult eemaldada ning monokihti tuleb kaks korda pesta steriilse sooja (37 °C) kaltsiumit (kontsentratsioonis 1,0–1,8 mM) sisaldava fenoolpunaseta HBSSiga ning kohe mõõta fluorestseiini leket.
                     Iga katseseeria kohta tuleb kasutada negatiivse kontrolli ja positiivse kontrolli paralleelproove, tõendamaks, et monokihi terviklikkus (negatiivne kontroll) ja rakkude tundlikkus (positiivne kontroll) on varem tehtud katsete alusel kindlaks määratud aktsepteeritavas vahemikus. Soovitatav positiivse kontrolli kemikaal on Brij 35 (CASi nr 9002-92-0) kontsentratsioonis 100 mg/ml. Selle kontsentratsiooniga peaks saama ligikaudu 30protsendilise fluorestseiini lekke (fluorestseiini lekke ehk rakkude kihi kahjustuse aktsepteeritav vahemik on 20–40 %). Soovitatav negatiivse kontrolli kemikaal on kaltsiumit (kontsentratsioonis 1,0–1,8 mM) sisaldav fenoolpunaseta HBSS (ilma uuritava kemikaalita, tühikatse kontroll). Igasse katseseeriasse peab samuti olema lisatud maksimumlekke kontroll, et oleks võimalik arvutada FL20 väärtusi. Maksimumleke määratakse, kasutades kontrollina rakkudeta vahemembraani.
                     
                        Fluorestseiini suhtes läbilaskvuse määramine
                     
                     Kohe pärast uuritava kemikaali ja kontrolli kemikaalide eemaldamist lisatakse vahemembraanidele (nt Millicell-HA) 400 μl naatriumfluorestseiini lahust kontsentratsioonis 0,1 mg/ml (0,01 %, mass/ruumala) kaltsiumit (kontsentratsioonis 1,0–1,8 mM) sisaldavas fenoolpunaseta HBSSis. Rakukultuure hoitakse 30 minutit toatemperatuuril. Pärast fluorestseiiniga inkubeerimise lõppu eemaldatakse igast kannust ettevaatlikult vahemembraanid. Iga filtrit kontrollitakse visuaalselt ja registreeritakse iga kahjustus, mis võib olla tekkinud käsitsemise ajal.
                     Läbi monokihi ja vahemembraani lekkinud fluorestseiini kogus mõõdetakse lahusest, mis jääb kannudesse pärast vahemembraani eemaldamist. Mõõdetakse spektrofluoromeetriga ergastuse ja emissiooni lainepikkustel vastavalt 485 nm ja 530 nm. Spektrofluoromeetri tundlikkus tuleb reguleerida nii, et tekiks suurim arvuline erinevus fluorestseiini maksimumlekke (rakkudeta membraan) ja miinimumlekke (negatiivse kontrolliga töödeldud rakkude konfluentse monokihiga membraan) vahel. Kuna kasutatavate spektrofluoromeetrite vahel on erinevusi, soovitatakse kasutada tundlikkust, mille korral fluorestseiini maksimumlekke kontrollis on tekkiva fluorestsentsi intensiivsus > 4 000. Fluorestseiini maksimumlekke väärtus ei tohi olla suurem kui 9 999. Fluorestseiini maksimumlekke intensiivsus peab jääma kasutatava spektrofluoromeetri lineaarsusvahemikku.
                     
                        Tulemuste tõlgendamine ja prognoosimudel
                     
                     Fluorestseiini lekke kogus on proportsionaalne kemikaali põhjustatud tiheliiduste kahjustusega. Kemikaali iga uuritud kontsentratsiooni kohta arvutatakse fluorestseiini lekke protsent, lähtudes fluorestseiini lekke väärtustest, mis saadakse uuritava kemikaaliga mõõdetud väärtuse võrdlemisel negatiivse kontrolli fluorestseiini lekke väärtusega (negatiivse kontrolliga töödeldud rakkude konfluentse monokihiga proovi näit) ja maksimumlekke kontrolli väärtusega (rakkudeta vahemembraani kaudu lekkinud fluorestseiini näit).
                     Maksimumlekke fluorestsentsi intensiivsuse keskväärtus = x
                     0 % lekke (negatiivne kontroll) fluorestsentsi intensiivsuse keskväärtus = y
                     100 % lekke keskväärtus saadakse, kui 0 % lekke keskväärtus lahutatakse maksimumlekke keskväärtusest:
                     x – y = z
                     Iga fikseeritud annuse kohta arvutatakse lekke protsent, lahutades 0 % lekke väärtuse kolme paralleelproovi fluorestsentsi intensiivsuse näitude keskväärtusest (m) ning jagades tulemuse 100 % lekke väärtusega: % FL = [(m – y) / z] × 100 %, kus:
                     
                                 M
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 konkreetse kontsentratsiooni puhul kolmest paralleelproovist mõõdetud fluorestsentsi intensiivsuste keskväärtus
                              
                           
                                 % FL
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 fluorestseiini protsent, mis lekib läbi rakukihi
                              
                           Järgmist võrrandit kasutatakse 20 % FL leket põhjustava kontsentratsiooni arvutamiseks:
                     FLD = [(A–B) / (C–B)] x (MC –MB) + MB
                     
                     Siin:
                     
                                 D
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 inhibitsiooni %
                              
                           
                                 A
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 kahjustuse % (20 % fluorestseiini leket)
                              
                           
                                 B
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 fluorestseiini lekke % < A
                              
                           
                                 C
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 fluorestseiini lekke % > A
                              
                           
                                 MC
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 C kontsentratsioon (mg/ml)
                              
                           
                                 MB
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 B kontsentratsioon (mg/ml)
                              
                           FL20 läviväärtus silmi söövitavate / tugevalt ärritavate kemikaalide prognoosimiseks on esitatud allpool:
                     
                                 FL20 (mg/ml)
                              
                              
                                 ÜRO GHSi C&L
                              
                              
                                 ELi CLP-määruse C&L
                              
                              
                                 U.S. EPA C&L
                              
                           
                                 ≤ 100
                              
                              
                                 1. kategooria
                              
                              
                                 1. kategooria
                              
                              
                                 I kategooria
                              
                           
                                 C&L: klassifitseerimine ja märgistamine
                              
                           FL-katsemeetodit soovitatakse ainult vesilahustuvate silmi söövitavate ja tugevalt ärritavate (ÜRO GHSi 1. kategooria, ELi CLP-määruse 1. kategooria, US EPA I kategooria) kindlaks tegemiseks (vt punktid 1 ja 10).
                     Selleks, et määrata vesilahustuv kemikaal (aine või segu) (3, 6, 7) rasket silmakahjustust tekitavaks (ÜRO GHSi / ELi CLP-määruse 1. kategooria) või silmi söövitavaks või tugevalt ärritavaks (US EPA I kategooria), peab uuritava kemikaaliga tekitatud FL20 väärtus olema ≤ 100 mg/ml.
                     
                        Tulemuste aktsepteerimine
                     
                     Fluorestseiini maksimumlekke keskväärtus (x) peab olema suurem kui 4 000 (vt punkt 31), 0 % lekke keskväärtus (y) peab võrduma 300-ga või olema sellest väiksem ning 100 % lekke keskväärtus (z) peab jääma vahemikku 3 700–6 000.
                     Katse loetakse nõuetekohaseks, kui positiivne kontroll tekitab rakukihi 20 %–40 % kahjustuse (mõõdetud fluorestseiini lekke protsendina).
                     ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                     
                        Andmed
                     
                     Iga katseseeria kohta tuleb tabelina esitada konkreetsete paralleelproovidega kannude andmed (nt fluorestsentsi intensiivsuse väärtused ja arvutatud fluorestseiini lekke protsent iga uuritava kemikaali kohta, sealhulgas klassifikatsioon). Peale selle tuleb esitada iga katseseeria kohta konkreetsete paralleelsete mõõtetulemuste keskväärtused ± SD.
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritavad kemikaalid ja kontrolli kemikaalid
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             keemiline nimetus või keemilised nimetused, nagu struktuuripõhine nimetus, mida kasutab Chemical Abstracts Service (CAS), seejärel muud nimetused, kui teada;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kemikaali CASi number, kui teada;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aine või segu puhtus ja koostis (massiprotsendina/-protsentidena), selle teabe kättesaadavas ulatuses;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuringu läbiviimise seisukohast olulised füüsikalis-keemilised omadused (nt füüsikaline olek, lenduvus, pH, stabiilsus, lahustuvus vees, keemiliste ainete klass, kui teada);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali / kontrolli kemikaali töötlemine enne katset, kui asjakohane (nt soojendamine, peenestamine);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             säilitamistingimused.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kasutatud meetodi ja metoodika põhjendus
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Peab hõlmama katsemeetodi kohaldamisvaldkonna ja piirangutega seotud kaalutlusi.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsetingimused
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Kasutatud rakusüsteemi kirjeldus, sealhulgas autentsussertifikaat ja mükoplasma staatus rakuliinis;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud katse-eeskirja üksikasjad;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali kasutatud kontsentratsioon(id);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaaliga kokkupuute kestus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             fluorestseiiniga inkubeerimise kestus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kõikide katse-eeskirjas tehtud muudatuste kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud hindamiskriteeriumide kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             viide mudeli varasemate katsete andmete kohta (st negatiivsed ja positiivsed kontrollid, võrdluskemikaalid, kui asjakohane);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tõendid labori tehnilise pädevuse kohta.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemused
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Iga katseseeria konkreetse uuritava kemikaali ja kontrollide ning paralleelmõõtmiste tulemused tabelina (sealhulgas konkreetsed mõõtmistulemused, keskväärtused ja SD väärtused);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tuletatud klassifikatsioon(id) viitega prognoosimudelile ja/või kasutatud otsustamiskriteeriumidele;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             muude täheldatud toimete kirjeldus.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemuste arutelu
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Peab sisaldama kaalutlusi, mis on seotud ebaselge tulemuse (punkt 35: FL20 > 100 mg/ml) ja täiendavate katsete tegemisega.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Järeldused
                                 
                              
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications. ISBN: 978-92-1-117006-1. Kättesaadav aadressil: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 U.S. EPA (1996), Label Review Manual: 2nd Edition, EPA737-B-96-001, Washington DC, U.S. Environmental Protection Agency.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 EC-ECVAM (2009), „Statement on the scientific validity of cytotoxicity/cell-function based in vitro assays for eye irritation testing“.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Scott, L. et al. (2010), „A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches“, Toxicol. in Vitro 24, 1–9.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.5 „Äge mürgisus: silmade ärritus/söövitus“.
                                 
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 EC-ECVAM (1999), „INVITOX Protocol 71: Fluorescein Leakage Test“, Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM). Kättesaadav aadressil: [http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 EC-ECVAM (2008), „Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing“.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 OECD (2005), „Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment“, OECD Series on Testing and Assessment No. 34. OECD, Paris.
                              
                           
                        1. liide
                        
                           JOONIS. VAHEMEMBRAANIL KASVATATUD MCDK RAKKUDE KASUTAMINE FLUORESTSEIINI LEKKE KATSES
                        
                        Poolläbilaskval vahemembraanil kasvatatakse MCDK-rakkude konfluentne kiht. Vahemembraan pannakse 24-kannulise plaadi kannu.
                        Joonise allikas: Wilkinson, P.J. (2006), „Development of an in vitro model to investigate repeat ocular exposure“, Ph.D. Thesis, University of Nottingham, Ühendkunigriik.
                     
                     
                        2. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Aine
                           – ÜRO GHSi kontekstis kasutatuna keemilised elemendid ja nende ühendid, kas looduslikud või tootmisprotsessiga saadud, sealhulgas neis sisalduvad toote stabiliseerimiseks vajalikud lisaained või tootmisprotsessist tulenevad lisandid, välja arvatud lahusti, mida on võimalik eraldada aine stabiilsust mõjutamata ja selle koostist muutmata.
                        
                           
                              Asendusmeetod
                           – katsemeetod, mis on kavandatud tavakasutuses oleva ohtude tuvastamiseks ja/või riskide hindamiseks heakskiidetud meetodi asendamiseks, ning millega saab tõendatult tagada inimeste või loomade tervise või keskkonna samaväärse või parema kaitse, võrreldes kehtestatud katsemeetodiga kõikide võimalike testimisolukordade ja kemikaalide puhul.
                        
                           
                              Asjakohasus
                           – huvipakkuva toime ja katse vahelise seose kirjeldus, millest nähtub, kas see seos on tähenduslik ning kasulik konkreetse eesmärgi puhul. See on ulatus, mille piires saab katsemeetodiga õigesti mõõta või prognoosida huvipakkuvat bioloogilist toimet. Asjakohasusega seoses võetakse arvesse ka katsemeetodi täpsust (kordustäpsust) (8).
                        
                           
                              Astmelise katsetamise strateegia
                           – etapiviisi katsetamise strateegia, milles enne järgmise etapiga alustamist vaadatakse uuritava kemikaali kohta kindlaksmääratud korras läbi kogu olemasolev teave, kasutades igas etapis tõendite kaalukuse analüüsi, et otsustada, kas teave on piisav ohuklassi määramiseks. Kui olemasoleva teabe põhjal saab otsustada uuritava kemikaali ärritavate omaduste üle, ei ole täiendavaid katseid vaja teha. Kui olemasoleva teabe põhjal ei saa otsustada uuritava kemikaali ärritava toime võimalikkuse üle, jätkatakse järjestikuste loomkatsete etapiti tegemist, kuni kemikaali saab üheselt klassifitseerida.
                        
                           
                              ELi CLP-määrus (määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist)
                           – selle määrusega rakendatakse Euroopa Liidus (ELis) kemikaalide (ainete ja segude) klassifitseerimise ja märgistamise ÜRO süsteem GHS.
                        
                           
                              EPA I kategooria
                           – EPA I kategooria söövitus (silma kudede pöördumatu kahjustus) või sarvkesta enam kui 21 päeva kestev haaratus või ärritus (2).
                        
                           
                              FL20
                              
                           – väärtust saab hinnata, kui määrata uuritava kemikaali kontsentratsioon, millel kemikaal põhjustab fluorestseiini lekke 20 % läbi rakkude monokihi.
                        
                           
                              Fluorestseiini leke
                           – spektrofluoromeetriliselt mõõdetav rakukihti läbinud fluorestseiini kogus.
                        
                           
                              GHSi 1. kategooria
                           – silma eesmisele pinnale uuritava kemikaali kandmise järel silma sellise koekahjustuse või tugeva füüsilise nägemislanguse tekkimine, mis ei parane täielikult 21 päeva jooksul pärast kemikaali silmale kandmist.
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Klassifitseerimata
                           – kemikaalid, mida ei ole klassifitseeritud ÜRO GHSi kategooriatesse 1, 2A või 2B; ELi CLP-määruse 1. või 2. kategooriasse; või US EPA silmi ärritava toimega kemikaalide I, II või III kategooriasse.
                        
                           
                              Lahusti/vehiikuli kontroll
                           – uuritava kemikaaliga töötlemata proov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente, sealhulgas lahustit või vehiikulit, ja mida töödeldakse samamoodi kui uuritava kemikaaliga töödeldud proovi ja muude kontrollide proove, et määrata samas lahustis või vehiikulis lahustatud uuritava kemikaaliga töödeldud proovide tekitatud reaktsiooni lähtetaseme väärtus. Kui seda proovi uuritakse paralleelselt negatiivse kontrolli prooviga, siis näitab see, kas lahusti või vehiikul reageerib katsesüsteemiga.
                        
                           
                              Negatiivne kontroll
                           – uuritava ainega töötlemata paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente. Seda proovi käideldakse samaaegselt uuritava kemikaaliga töödeldud proovidega ja muude kontrollide proovidega, et teha kindlaks, kas lahusti reageerib katsesüsteemiga.
                        
                           
                              Ohtlikkus
                           – mõjuri või olukorra iseloomulik omadus, mis võib põhjustada kahjulikku toimet, kui organism, süsteem või (alam-)populatsioon selle mõjuriga kokku puutub.
                        
                           
                              Positiivne kontroll
                           – paralleelproov, mis sisaldab kõiki katsesüsteemi komponente ja mida töödeldakse kemikaaliga, mis teadaolevalt kutsub esile positiivse reaktsiooni. Selleks, et oleks võimalik hinnata ka positiivse kontrolli kemikaali toime sõltuvust ajast, ei tohiks toime olla äärmuslik.
                        
                           
                              Pädevuse kontrolli kemikaalid
                           – võrdluskemikaalide loetelu põhine valik kemikaale, mida katsemeetodit seni mitte kasutanud labor võib kasutada pädevuse tõendamiseks valideeritud võrdlusmeetodiga.
                        
                           
                              Raske silmakahjustus
                           – pärast uuritava kemikaali kandmist silma eesmisele pinnale silma koekahjustuse või tugeva füüsilise nägemislanguse teke, mis ei parane täielikult 21 päeva jooksul pärast kemikaali silmale kandmist.
                        
                           
                              Segu
                           – kahe või enama omavahel mitte reageeriva aine segu või lahus ÜRO GHSi kontekstis kasutatuna.
                        
                           
                              Silmi söövitav aine
                           – a) kemikaal, mis põhjustab silma pöördumatut koekahjustust; b) kemikaalid, mis klassifitseeritakse ÜRO GHSi 1. kategooriasse; ELi CLP-määruse 1. kategooriasse; või US EPA silmi ärritava toimega kemikaalide I kategooriasse.
                        
                           
                              Silmi tugevalt ärritava toimega kemikaal
                           – a) kemikaal, mis pärast silma eesmisele pinnale kandmist põhjustab silmakoe kahjustuse, mis ei parane 21 päeva jooksul pärast kemikaali silmale kandmist, või põhjustab tugeva füüsilise nägemislanguse; b) kemikaal, mis klassifitseeritakse ÜRO GHSi 1. kategooriasse; ELi CLP-määruse 1. kategooriasse; või US EPA silmi ärritava toimega kemikaalide I kategooriasse.
                        
                           
                              Silmi ärritava toimega kemikaal
                           – a) kemikaal, mis pärast silma eesmisele pinnale kandmist põhjustab selle pöörduva muutuse; b) kemikaal, mis klassifitseeritakse ÜRO GHSi kategooriasse 2A või 2B; ELi CLP-määruse 2. kategooriasse; või US EPA silmi ärritava toimega kemikaalide II või III kategooriasse.
                        
                           
                              Spetsiifilisus
                           – kõikide negatiivsete / inaktiivsete kemikaalide osakaal, mis katsemeetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Sellega mõõdetakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel.
                        
                           
                              Tundlikkus
                           – kõikide positiivsete / toimet avaldavate kemikaalide osakaal, mis katsemeetodi alusel klassifitseeritakse õigesti. Tundlikkusega mõõdetakse katsemeetodi täpsust, kui saadud tulemusi saab kategoriseerida, ning see on oluline aspekt katsemeetodi asjakohasuse hindamisel (8).
                        
                           
                              Tõendite kaalukuse analüüs
                           – protsess, milles kemikaali võimaliku ohtlikkuse üle otsustamisel ja sellise otsuse toetamisel võetakse arvesse mitmesuguste andmete tugevaid ja nõrku külgi.
                        
                           
                              Täpsus
                           – näitab katsemeetodi tulemuste lähedust kokkulangemisele kinnitatud võrdlusväärtustega (mõõtetäpsus). Täpsusega mõõdetakse katsemeetodi toimivust ja see on üks asjakohasuse aspektidest. Seda terminit kasutatakse ka kordustäpsuse tähenduses, mis näitab, kui sageli annab katsemeetod õige tulemuse.
                        
                           
                              Usaldusväärsus
                           – katsemeetodiga aja jooksul saadud tulemuste laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ulatuse mõõt, kui katset tehakse sama metoodikaga. Seda hinnatakse laborisisese ja laboritevahelise korratavuse ja laborisisese korduvuse arvutamisega.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                        
                           
                              Valenegatiivsete tulemuste osakaal
                           – kõikide positiivsete kemikaalide osakaal, mis on katsemeetodiga ekslikult määratud negatiivseks. See on katsemeetodi toimivuse üks näitajaid.
                        
                           
                              Valepositiivsete tulemuste osakaal
                           – kõikide negatiivsete kemikaalide osakaal, mis on katsemeetodiga ekslikult määratud positiivseks. See on katsemeetodi toimivuse üks näitajaid.
                        
                           
                              Valideeritud katsemeetod
                           – katsemeetod, mille valideerimisuuringud on lõpule viidud, st on määratud selle asjakohasus (sealhulgas täpsus) ja usaldusväärsus konkreetse eesmärgi suhtes. Oluline on märkida, et valideeritud katsemeetod ei pruugi olla täpsuse ja usaldusväärsuse suhtes piisava toimivusega, et seda saaks aktsepteerida konkreetse eesmärgi puhul (8).
                        
                           
                              ÜRO GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals) ehk ÜRO ühtne ülemaailmne kemikaalide klassifitseerimis- ja märgistamissüsteem
                           – süsteem, millega nähakse ette kemikaalide (ained ja segud) klassifitseerimine füüsikaliste ohutegurite ning tervise- ja keskkonnaohu standarditud tüübi ja -taseme alusel ning mis hõlmab asjaomaseid teavitustähiseid, nagu piktogrammid, märksõnad, ohulaused, hoiatuslaused ja ohutuskaardid, mille eesmärk on edastada teavet kemikaalide kahjulikest toimetest, et kaitsta inimesi (sealhulgas tööandjaid, töötajaid, vedajaid, tarbijaid ja päästetöötajaid) ning keskkonda (1).
                     
                     
                        3. liide
                        
                           FL-KATSEMEETODI PÄDEVUSE KONTROLLI KEMIKAALID
                        
                        Enne käesoleva katsemeetodi tavakasutamist peab labor tõendama tehnilist pädevust ning määrama õigesti tabelis 1 soovitatud kemikaalidest 8 kemikaali kohta silmi söövitava toime klassifikatsiooni. Need kemikaalid on valitud nii, et nad esindaksid silma paikse söövituse / ärritava toime reaktsioonide vahemikku, mis põhineb in vivo küüliku silma katsega (katsejuhend nr 405, katsemeetod B.5 (5)) (st ÜRO GHSi 1. kategooria; 2A, 2B kategooria või klassifitseerimata). Võttes arvesse FL-katse valideeritud kasulikkust (st ainult silmi söövitavate / tugevalt ärritavate kemikaalide määramine), on klassifitseerimise seisukohast siiski pädevuse tõendamiseks olemas vaid kaks katse tulemust (söövitava / tugevalt ärritava toimega kemikaal või mittesöövitav/mitteärritav kemikaal). Kemikaalide valiku muud kriteeriumid olid kaubanduslik kättesaadavus, kvaliteetsete in vivo võrdlusandmete olemasolu ja FL-katsega saadud kvaliteetsete andmete olemasolu. Sel põhjusel valiti pädevuse kontrolli kemikaalid artikli „Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing“ (8) alusel, mida kasutati FL-katsemeetodi retrospektiivseks valideerimiseks.
                        
                           Tabel 1
                        
                        
                           FL-katsemeetodi jaoks tehnilise pädevuse tõendamiseks soovitatavad kemikaalid
                        
                        
                                    Kemikaal
                                 
                                 
                                    CASi nr
                                 
                                 
                                    Kemikaaliklass (32)
                                    
                                 
                                 
                                    Füüsikaline olek
                                 
                                 
                                    
                                       In vivo klassifikatsioon (33)
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       In vitro klassifikatsioon (34)
                                    
                                 
                              
                                    Bensalkooniumkloriid (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    Ooniumühend
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    Söövitav / tugevalt ärritav
                                 
                              
                                    Prometasiinvesinikkloriid
                                 
                                 
                                    58-33-3
                                 
                                 
                                    Amiin/amidiin, heterotsükliline, orgaaniline väävliühend
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    Söövitav / tugevalt ärritav
                                 
                              
                                    Naatriumhüdroksiid (10 %)
                                 
                                 
                                    1310-73-2
                                 
                                 
                                    Leeline
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    Söövitav / tugevalt ärritav
                                 
                              
                                    Naatriumlaurüülsulfaat (15 %)
                                 
                                 
                                    151-21-3
                                 
                                 
                                    Karboksüülhape (sool)
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    1. kategooria
                                 
                                 
                                    Söövitav / tugevalt ärritav
                                 
                              
                                    4-karboksübensaldehüüd
                                 
                                 
                                    619-66-9
                                 
                                 
                                    Karboksüülhape, aldehüüd
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    Kategooria 2 (A)
                                 
                                 
                                    Mittesöövitav / mitte tugevalt ärritav
                                 
                              
                                    Ammooniumnitraat
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    Anorgaaniline sool
                                 
                                 
                                    Tahke
                                 
                                 
                                    Kategooria 2 (A)
                                 
                                 
                                    Mittesöövitav / mitte tugevalt ärritav
                                 
                              
                                    Etüül-2-metüülatseto-atsetaat
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    ketoon, ester
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    Kategooria 2 (B)
                                 
                                 
                                    Mittesöövitav / mitte tugevalt ärritav
                                 
                              
                                    Glütserool
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    alkohol
                                 
                                 
                                    Vedelik
                                 
                                 
                                    Kategooriata
                                 
                                 
                                    Mittesöövitav / mitte tugevalt ärritav
                                 
                              
                                    Lühendid: CASi nr = Chemical Abstracts Service'i number
                                 
                              
                     B.62.   Leeliseline in vivo komeedikatse imetajarakkudega
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 489 (2016). Leeliselist in vivo komeedikatset (üksikraku geelelektroforeesi, edaspidi lihtsalt „komeedikatse“) kasutatakse võimalike genotoksiliste materjalidega kokkupuutunud loomade, tavaliselt näriliste eri kudedest eraldatud rakkudes või rakutuumades DNA-ahelate katkemiste määramiseks. Paljud eksperdirühmad on komeedikatse läbi vaadanud ja avaldanud oma soovitused (1–10). Käesolev katsemeetod on üks osa geneetilise toksikoloogia katsemeetodite seerias. Välja on töötatud OECD dokument, milles on esitatud kokkuvõtlik teave geneetilise toksikoloogia katsetest ning ülevaade nende katsejuhendites tehtud viimastest muudatustest (11).
                     Komeedikatse eesmärk on teha kindlaks kemikaalid, mis põhjustavad DNA kahjustusi. Leeliselises keskkonnas (pH > 13) saab komeedikatse abil avastada DNA üksikahelalisi või kaksikahelalisi katkemisi, mis tulenevad näiteks kemikaali otsesest toimest DNA-le, leelise suhtes tundlikest kohtadest või ajutistest DNA katkemistest, mis on seotud DNA väljalõikereparatsiooniga. Need ahelate katkemised võidakse parandada, ilma et neist jääks püsimõju, need võivad olla raku jaoks surmavad või võib nende reparatsioon põhjustada mutatsiooni, mille tulemusel tekib elusrakus säiliv püsimuutus. Need võivad põhjustada ka kromosoomikahjustust, mis on seotud mitmete inimhaigustega, sealhulgas vähiga.
                     Närilistega tehtava in vivo komeedikatse ametliku valideerimise katsed tehti aastatel 2006–2012, neid koordineeris alternatiivmeetodite valideerimise Jaapani keskus (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM) koostöös alternatiivmeetodite valideerimise Euroopa keskusega (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM), alternatiivmeetodite valideerimise ametitevahelise koordineerimiskomiteega (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) ja (Ameerika Ühendriikide) riikliku toksikoloogiaprogrammi (NTP) alternatiivsete toksikoloogiameetodite ametitevahelise keskusega (National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, NICEATM) (12). Käesolevas katsemeetodis on esitatud komeedikatse soovituslik kasutusala ja piirangud, ning selle aluseks on valideerimiskatsetes kasutatud lõplik eeskiri (12) koos täiendavate asjakohaste avaldatud ja avaldamata (laboritele kuuluvate) andmetega.
                     Peamiste terminite määratlused on esitatud 1. liites. Tuleb märkida, et käesoleva katse tegemiseks on palju erinevaid tehnilisi lahendusi (mikroskoobi alusklaasid, geelilaigud, 96-kannulised plaadid jne). Mugavuse mõttes kasutatakse käesolevas dokumendis edaspidi mõistet „alusklaas“, kuid see hõlmab ka kõiki muid lahendusi.
                     LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD
                     Komeedikatse on meetod, millega mõõdetakse DNA ahelate katkemisi eukarüootsetes rakkudes. Üksikrakud/-rakutuumad pannakse alusklaasile agaroosi sisse ja lüüsitakse detergendi ning suure kontsentratsiooniga soolalahusega. Selle lüüsietapiga lõhutakse raku- ja tuumamembraanid ning vabastatakse spiraalselt keerdunud DNA-lingud, mida üldiselt kutsutakse nukleoidideks, ja DNA-fragmendid. Elektroforeesil suure pH tingimustes tekivad komeete meenutavad struktuurid, mida saab sobiva fluorestseeruva värvainega värvitult vaadelda fluorestsentsmikroskoopia abil; DNA-fragmendid liiguvad vastavalt oma suurusele komeedi „peast“ eemale „sabasse“ ning komeedi saba suhteline intensiivsus, võrreldes summaarse intensiivsusega (pea pluss saba), iseloomustab DNA katkemiste määra (13–15).
                     Leeliseline in vivo komeedikatse on eriti asjakohane genotoksilise ohtlikkuse hindamisel, kuna selle katse tulemused sõltuvad in vivo imendumisest, jaotumisest, metabolismist ja eritumisest ning ka DNA reparatsiooni protsessidest. Need omadused võivad eri liikidel ja kudedel olla erinevad ja sõltuda ka DNA kahjustuse tüübist.
                     Loomade heaolu nõuete täitmiseks, eelkõige loomade kasutamise vähendamiseks (nn 3Ri – Replacement, Reduction, Refinement – ehk loomkatsete asendamise, vähendamise ja täiustamise põhimõtted) võib selle katse ühendada muude toksikoloogiauuringutega, näiteks korduvdoosi toksilisuse uuringutega (10, 16, 17); samuti võib mõõdetavaid näitajaid kombineerida muude genotoksilisuse näitajatega nagu mikrotuumade tekke in vivo katse imetajate erütrotsüütidega (18–20). Kõige sagedamini tehakse komeedikatset närilistega, kuigi seda on kasutatud ka muude imetajate ja mitteimetajate liikide puhul. Muude liikide kui närilised kasutamine peab olema teaduslikult ja eetiliselt igal üksikjuhtumil põhjendatud ning soovitatakse tungivalt, et komeedikatset ei kasutataks muudel loomaliikidel kui närilised eraldi katsena, vaid ainult kombineeritult muu toksilisuse uuringuga.
                     Kokkupuuteviisi ning uuritava koe valik peaks olema määratud kogu uuritava kemikaali kohta olemasoleva teabe põhjal, näiteks inimese kavandatav või oletatav kokkupuude, kemikaali metabolism ja jaotumine, toime võimalikkus kokkupuutekohas, struktuuriga seotud hoiatused, muud genotoksilisuse või toksilisuse andmed ning uuringu eesmärk. Seega võib vajaduse korral hinnata uuritava kemikaali genotoksilisust kantserogeense või muu toksilise toime sihtkoe suhtes. Seda peetakse kasulikuks ka in vitro katsega kindlaks tehtud mutageense mõju täiendaval uurimisel. In vivo komeedikatse tegemine huvipakkuva sihtkoega on asjakohane, kui võib põhjendatult eeldada, et huvipakkuv kude puutub piisavalt kemikaaliga kokku.
                     Katset on kõige põhjalikumalt valideeritud isaste rottide somaatilistes kudedes sellistes uuringutes nagu JaCVAMi uuring (12) ning Rothfussi jt artikkel aastast 2010 (10). JaCVAMi rahvusvahelises valideerimisuuringus kasutati maksa ja magu. Maksa kasutati seepärast, et see on kõige aktiivsemalt kemikaali metabolismis osalev elund ning sageli ka kantserogeenide sihtelund. Magu kasutati seepärast, et see on tavaliselt esimene kemikaaliga kokkupuutekoht pärast suukaudset manustamist, kuigi muid seedetrakti osi nagu kaksteistsõrmiksoolt või tühisoolt tuleks samuti pidada kemikaaliga kokkupuutekoha kudedeks, mis inimese seisukohast on vahest asjakohasemad kui näriliste näärmemagu. Tuleks jälgida, et koed ei puutuks kokku uuritava kemikaali ülemäära suure kontsentratsiooniga (21). Meetod on üldiselt kohaldatav igale koele, millest saab teha analüüsitavaid üksikrakkude või tuumade suspensioone. Mitme labori puhul nähtub intellektuaalse omandi õigusega kaitstud andmetest, et katset saab edukalt kasutada paljude eri kudede puhul; samuti on palju avaldatud töid selle kohta, et see meetod töötab ka muude elundite ja kudede kui maks ja magu puhul, näiteks tühisoole (22), neeru (23, 24), naha (25, 26) või kusepõie (27, 28) rakud, kopsude ja bronhoalveolaarse lavaaži rakud (mis on asjakohased sissehingatavate kemikaalide puhul) (29, 30); katseid on tehtud korraga ka mitme elundi rakkudega (31, 32).
                     Kuigi võib olla huvitav uurida genotoksilist mõju sugurakkudele, tuleb siiski märkida, et käesolevas katsemeetodis kirjeldatud standardset leeliselist komeedikatset ei peeta sobivaks DNA katkete uurimiseks küpsetes sugurakkudes. Kuna kirjanduse ülevaates avaldati DNA-kahjustuste suured ja muutuvad tausttaseme väärtused komeedikatse kasutamise puhul sugurakkude genotoksilisuse uurimiseks (33), peetakse vajalikuks, et enne komeedikatse kasutamist küpsete sugurakkude (nt spermide) puhul tuleks katse-eeskirja selleks kohandada ning teha tõhusamaid standardimise ja valideerimise uuringuid. Peale selle ei ole käesolevas katsemeetodis kirjeldatud ja soovitatud kokkupuuterežiim optimaalne, sest spermide DNA-ahelate katkete tähenduslikuks analüüsiks oleks vaja pikemat kokkupuudet või pikemaid proovivõtuaegu. Kirjanduses (34, 35) on kirjeldatud munandirakkudele diferentseerumise eri staadiumides avalduva genotoksilise toimet, mida on uuritud komeedikatse abil. Tuleks siiski märkida, et sugunäärmed sisaldavad somaatiliste ja sugurakkude segu. Seetõttu ei peegelda terviksugunäärme (munandi) positiivsed tulemused tingimata sugurakkude kahjustust; siiski näitavad need, et uuritav kemikaal ja/või selle metaboliidid on jõudnud sugunäärmesse.
                     Komeedikatse tavapärastes tingimustes ei ole usaldusväärselt võimalik kindlaks teha ristsidemeid. Teatavates muudetud katsetingimustes võib tuvastada DNA-DNA ja DNA-valgu ristsidemeid ning muid aluste muutusi nagu oksüdeeritud alused (23, 36–39). Kuid on vaja täiendavaid uuringuid, et piisavalt hästi kirjeldada, mis muudatusi tuleks metoodikas teha. Ristsidemeid põhjustavate ainete tuvastamine ei ole seega siinkirjeldatud katse peamine eesmärk. Katse, isegi muudatustega, ei sobi aneugeenide kindlakstegemiseks.
                     Praeguse teadmiste tasemega seoses on in vivo komeedikatsega seotud veel täiendavaid piiranguid (vt 3. liide). Eeldatakse, et katsemeetod vaadatakse tulevikus läbi ja seda muudetakse vajaduse korral, et võtta arvesse saadud kogemusi.
                     Enne meetodi kasutamist kavandatud regulatiivsel eesmärgil segu kohta andmete saamiseks tuleks kaaluda, kas, ja kui jah, siis miks võib see anda adekvaatseid tulemusi sellisel juhul. Selliseid kaalutlusi ei ole vaja, kui regulatiivse nõudega nähaksegi ette segu katsetamine.
                     MEETODI PÕHIMÕTE
                     Loomadele viiakse uuritava kemikaaliga kokkupuutesse asjakohase manustamistee kaudu. Doosi valimise ja proovide võtmise üksikasjalik kirjeldus on esitatud punktides 36–40. Valitud proovivõtuajal (-aegadel) prepareeritakse huvipakkuv kude ja valmistatakse üksikrakkude/-rakutuumade suspensioonid (vajaduse korral võib kaaluda näiteks maksa in situ perfusiooni) ning alusklaasidel immobiliseerimiseks viiakse need pehmesse agarisse. Rakke/tuumi töödeldakse lüüsipuhvriga, et kõrvaldada raku- ja või tuumamembraanid, ning tugevalt leelise pH-ga, st ≥ 13, et DNA keerduks lahti ning vabaneksid relakseerunud DNA-lingud ja -fragmendid. Tuuma DNA-le agaris tehakse seejärel elektroforees. Normaalsed fragmenteerumata DNA-molekulid jäävad agaris samale kohale, kus oli tuuma DNA, samas kui DNA-fragmendid ja relakseerunud DNA-lingud hakkavad liikuma anoodi poole. Pärast elektroforeesi muudetakse DNA nähtavaks sobiva fluorestseeruva värviga. Preparaate tuleb analüüsida mikroskoobi abil, kasutades kas kujutise analüüsi pool- või täisautomaatset süsteemi. Elektroforeesi ajal migreerunud DNA määr ja liikumistee pikkus näitavad tekkinud DNA-fragmentide kogust ja suurust. Komeedikatse puhul määratakse mitut näitajat. DNA-kahjustuse hindamiseks on soovitatud kasutada sabas oleva DNA kogust (sabas oleva DNA % ehk saba intensiivsuse %) (12, 40–42). Pärast piisava arvu tuumade analüüsimist analüüsitakse andmeid asjakohaste meetoditega, et hinnata katse tulemusi.
                     Tuleks märkida, et meetodi eri aspektide muutmist, sealhulgas proovi ettevalmistamise, elektroforeesi tingimuste, visuaalse analüüsi parameetrite (nt värvimise intensiivsuse, mikroskoobilambi valguse intensiivsus, samuti mikroskoobifiltrite ja kaamera liikumise) ning keskkonnatingimuste (nt taustavalgustuse) muutmist on uuritud ja näidatud, et see võib mõjutada DNA migreerumist (43–46).
                     LABORI PÄDEVUSE KONTROLLIMINE
                     Iga labor peaks tõendama komeedikatse tegemise eksperimentaalset pädevust, milleks on vaja tõendada, et ta suudab iga kasutatava loomaliigi puhul saada iga sihtkoe üksikrakkude või -tuumade piisava kvaliteediga suspensioone. Preparaatide kvaliteeti hinnatakse eelkõige sabas oleva DNA % järgi vehiikuliga kokkupuutesse viidud loomade puhul – see % peab jääma reprodutseeritavalt väiksesse vahemikku. Praegused andmed näitavad, et rotimaksa rühma keskmine sabas oleva DNA % (põhineb mediaanide keskväärtusel – vt nende terminite üksikasjalik selgitus punkt 57) ei tohiks ületada 6 %, mis on kooskõlas JaCVAMi valideerimiskatse (12) ning muude avaldatud ja intellektuaalse omandi õigusega kaitstud andmetega. Praegu ei ole piisavalt andmeid soovituste andmiseks selle kohta, milline peaks olema parim või vastuvõetav vahemik muude kudede puhul. See ei välista muude kudede kasutamist, kui see on põhjendatud. Katseprotokollis tuleks esitada asjakohane ülevaade komeedikatse toimivusest nende kudede puhul seoses kirjanduses avaldatud andmete või intellektuaalse omandi õigusega kaitstud andmetega. Esiteks on sabas oleva DNA % väike vahemik kontrollide puhul soovitav sellepärast, et sellega jääb piisav dünaamiline vahemik positiivse mõju avastamiseks. Teiseks peab iga labor suutma korrata eeldatavaid vastuseid erineva toimemehhanismiga otseste mutageenide ja pro-mutageenidega, nagu on soovitatud tabelis 1 (punkt 29).
                     Positiivseid aineid võib valida näiteks JaCVAMi valideerimiskatsest (12) või muudest avaldatud andmetest (vt punkt 9) ja kui asjakohane, lisada põhjendus ning näidata, et on saadud selged positiivsed vastused huvipakkuvate kudede puhul. Samuti tuleks näidata, et labor suudab määrata tuntud mutageeni, näiteks EMSi, väikese doosi põhjustatud nõrka toimet, milleks määratakse näiteks doosi-reaktsiooni seos vajaliku arvu ja sobivate intervallidega dooside põhjal. Esialgu tuleks keskenduda pädevuse tõendamisele kõige sagedamini kasutatavate kudede, nt näriliste maksa puhul, kus eeldatavaid tulemusi võib võrrelda olemasolevate andmetega (12). Samal ajal tuleks koguda andmeid muude kudede, näiteks mao/kaksteistsõrmiku/tühisoole, vere jne kohta. Labori pädevust tuleb tõendada eraldi iga loomaliigi iga koe puhul, mida kavatsetakse uurida, ning tuleb tõendada, et teadaoleva mutageeniga (näiteks EMSiga) saadakse kõnealuses koes aktsepteeritav positiivne reaktsioon.
                     Tuleb koguda vehiikuli/negatiivse kontrolli andmeid, et näidata negatiivse mõju korratavust ning tagada, et katse tehnilisi aspekte on nõuetekohaselt kontrollitud, või et saada teada vajadusest koostada uued varasemate kontrolli katsete vahemikud (vt punkt 22).
                     Tuleks märkida, et kuigi lahangu ajal võib võtta mitmeid kudesid ja töödelda neid komeedikatse tegemiseks, peab labor olema pädev mitmetest kudedest proovide võtmises samalt loomalt; sellega tagatakse, et ükski võimalik DNA-kahjustus ei lähe kaduma ja komeedikatse annab usaldusväärseid tulemusi. Ajavahemik eutanaasiast kuni kudede eemaldamiseni töötlemiseks võib olla kriitilise tähtsusega (vt punkt 44).
                     Käesoleva katsega seotud pädevuse arendamisel tuleb pidada silmas loomade heaolu ja seepärast võib katse mitmesuguste aspektides pädevuse saavutamiseks kasutada muudes katsetes kasutatud loomadelt saadud kudesid. Lisaks sellele ei pruugi olla vajalik viia läbi täielikku uuringut sel ajal, kui labor juurutab uut katsemeetodit; vajalike oskuste arendamiseks võib kasutada vähem loomi või uuritava kemikaali kontsentratsioone.
                     
                        Varasemad kontrolli andmed
                     
                     Pädevuse tõendamise uuringute ajal peab labor koostama varasemate tulemuste andmebaasi, et kehtestada positiivse ja negatiivse kontrolli tulemuste vahemikud ning jaotused asjakohaste kudede ja liikide puhul. Soovitused selle kohta, kuidas koostada ja kasutada varasemaid andmeid (st varasemate andmete andmebaasi lisamise või sealt väljajätmise kriteeriumid, varasemate andmete ja konkreetse katse nõuetekohasuse kriteeriumid) võib leida kirjandusest (47). Eri kudede, eri liikide, samuti eri vehiikulite ja manustamisviiside korral võib sabas oleva DNA % negatiivse kontrolli katses olla erinev. Seepärast on oluline määrata iga koe ja iga loomaliigi puhul negatiivse kontrolli väärtuste vahemik. Labor peab kasutama kvaliteedikontrolli meetodeid, nagu kontrollkaardid (näiteks vastavuskontrollkaardid või X-tüüpi kontrollkaardid (48)), et näha, kui varieeruvad on labori andmed, ja näidata, et meetod on laboris „kontrolli all“. Sobivate positiivse kontrolli ainete, doosivahemike ja eksperimendi tingimuste (näiteks elektroforeesi jaoks) valimist võib olla vaja ka optimeerida, et määrata nõrka toimet (vt punkt 17).
                     Iga muutust katse-eeskirjas tuleb kaaluda seoses nende ja labori olemasolevate varasemate kontrolli tulemuste andmebaasi kooskõlaga. Iga suurema vastuolu tekkimisel tuleb koostada uus varasemate kontrolli tulemuste andmebaas.
                     MEETODI KIRJELDUS
                     
                        Ettevalmistused
                     
                     
                        Loomaliigi valimine
                     
                     Harilikult kasutatakse tavaliste näriliste laboriliinide noori terveid täiskasvanud loomi (vanus 6–10 nädalat katse alguses, kuigi lubatud on ka veidi vanemad loomad). Näriliseliigi valikul tuleks eelistada järgmisi liike: i) liik, mida kasutatakse muudes toksilisuse uuringutes (et andmeid saaks võrrelda ja uuringuid omavahel kombineerida), ii) liik, millel kantserogeensuse uuringus tekivad kasvajad (kantserogeensuse mehhanismi uurimisel), või iii) liik, mille puhul uuritava kemikaali metabolism on kõige asjakohasem inimese metabolismi seisukohast, kui see on teada. Käesolevas katses kasutatakse tavaliselt rotte. Siiski võib kasutada ka muid liike, kui see on eetiliselt ja teaduslikult põhjendatud.
                     
                        Loomade pidamise ja söötmise tingimused
                     
                     Temperatuur katseloomade ruumis peab olema 22 ± 3 °C. Suhteline õhuniiskus peaks ideaaljuhul olema vähemalt 50–60 %, seejuures vähemalt 30 % ja eelistatavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi koristamise ajal. Kasutatakse tehisvalgustust, valgusrežiimiga 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut koos piiramatus koguses joogiveega. Söödavalikut võib mõjutada vajadus tagada uuritava kemikaali sobiv lisamine söödasse, kui kemikaali manustatakse sellisel viisil. Närilisi tuleb pidada väikestes rühmades, kuni viis samast soost looma, kui ei eeldata agressiivset käitumist. Loomi võib ühekaupa pidada ainult siis, kui see on teaduslikult põhjendatud. Võimaluse korral tuleks alati kasutada kõva pinnaga põrandat, kuna metallvõrgust puuripõrand võib põhjustada raskeid vigastusi (49). Tuleb tagada sobivad keskkonna mitmekesistamise vahendid.
                     
                        Loomade ettevalmistamine
                     
                     Loomad jaotatakse kontroll- ja katserühmadesse juhuslikkuse alusel. Loomad märgistatakse kordumatu tähisega ja lastakse neid enne kemikaaliga kokkupuutumist vähemalt viis päeva laboritingimustega kohaneda. Kordumatuks tähistamiseks tuleb kasutada kõige vähem invasiivset meetodit. Sobivad meetodid on rõngastamine, märgise kinnitamine, mikrokiipimine ja biomeetriline identifitseerimine. Varba köndistamine ja kõrva sälkamine ei ole teaduslikult põhjendatud nende katsete puhul. Puurid paigutatakse nii, et nende asukohast tingitud võimalikud mõjud oleksid minimaalsed. Uuringu alguses peaksid loomade kehamassi erinevused olema minimaalsed ja ei tohiks ületada ± 20 %.
                     
                        Dooside valmistamine
                     
                     Tahke uuritav kemikaal tuleb lahustada või suspendeerida sobivas vehiikulis ja segada sööda sisse või joogivette enne loomadele andmist. Vedelat uuritavat kemikaali võib manustada vahetult või lahjendada enne manustamist. Sissehingamise kaudu toimuva kokkupuute korral manustatakse uuritavat kemikaali gaasi, auru või tahke/vedela dispersse faasiga aerosoolina, sõltuvalt kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest (50, 51).
                     Tuleks kasutada uuritava kemikaali värskeid valmistisi, kui kemikaali stabiilsuse andmetest ei ilmne, et säilitamine on aktsepteeritav ja on määratletud asjakohased säilitamistingimused.
                     
                        Katsetingimused
                     
                     
                        Vehiikul
                     
                     Vehiikul ei tohiks avaldada toksilist toimet kasutatava doosi ruumala korral ega keemiliselt reageerida uuritava kemikaaliga. Kui kasutatakse tuntud vehiikulist erinevat ainet, peab võrdlusandmetega olema näidatud, et see on sobiv nii katseloomade, manustamistee kui ka määratava näitaja seisukohast. Kui vähegi võimalik, on kõigepealt soovitatav kaaluda vesilahustuva lahusti/vehiikuli kasutamist. Tuleks märkida, et mõned (eriti viskoossed) vehiikulid võivad tekitada põletikku ja suurendada DNA-ahela katkete taustnivood kokkupuutekohas, eriti mitmekordse manustamise puhul.
                     
                        Kontrollid
                     
                     
                        Positiivsed kontrollid
                     
                     Praegusel ajal tuleks igas katses kasutada positiivse kontrolli rühma, milles on vähemalt 3 ühest soost analüüsitavat looma või 3 looma kummastki soost, kui kasutatakse mõlemast soost loomi (vt punkt 32), kes viiakse kokkupuutesse positiivse kontrolli ainega. Tulevikus võib olla võimalik tõendada piisavat tehnilist pädevust ja vähendada vajadust positiivse kontrolli järele. Kui kasutatakse mitut proovivõtuaega (nt ühekordse manustamise eeskirja puhul), on vaja teha positiivse kontrolli katse ainult ühel proovivõtuajal, kuid tuleb tagada, et katseplaan oleks tasakaalus (vt punkt 48). Paralleelse positiivse kontrolli aineid ei ole tingimata vaja manustada samal viisil kui uuritavat kemikaali, kuid kui uuritakse paikset toimet kokkupuutekohas, siis on oluline kasutada sama manustamisviisi. Tuleb näidata, et positiivse kontrolli aine põhjustab DNA-ahela katkemist kõikides kudedes, mis on uuritava kemikaali puhul huvipakkuvad, ja kuna EMS põhjustab DNA-katkeid kõikides uuritud kudedes, on EMS tõenäoliselt hea positiivse kontrolli aine. Positiivse kontrolli doosid tuleks valida nii, et toime oleks mõõdukas, mis võimaldab kriitiliselt hinnata katse toimivust ja tundlikkust, ning dooside valik võiks põhineda doosi-toime kõveratel, mis labor on koostanud pädevuse tõendamise ajal. Positiivse kontrolli loomade puhul peaks sabas oleva DNA % olema kooskõlas varem laboris iga koe ja iga proovivõtuaja jaoks kindlaks määratud vahemikuga (vt punkt 16). Positiivse kontrolli ained ja mõned näited nende sihtkudede kohta (näriliste puhul) on esitatud tabelis 1. Muid aineid kui tabelis 1 esitatud ained võib valida siis, kui see on teaduslikult põhjendatud.
                     
                        Tabel 1
                     
                     
                        Positiivse kontrolli ainete ja mõnede nende sihtkudede näited
                     
                     Aine ja CASi nr
                     Etüülmetaansulfonaat (CASi nr 62-50-0) – kõik koed
                     Etüülnitrosokarbamiid (CASi nr 759-73-9) – maks, magu, kaksteistsõrmik või tühisool
                     Metüülmetaansulfonaat (CASi nr 66-27-3) – maks, magu, kaksteistsõrmik või tühisool, kopsude ja bronhoalveolaarse lavaaži (BAL) rakud, neerud, kusepõis, kopsud, munandid ja luuüdi/veri
                     
                        N-metüül-N'-nitro-N-nitrosoguanidiin (CASi nr 70-25-7) – magu, kaksteistsõrmik, tühisool
                     1,2-dimetüülhüdrasiin·2HCl (CASi nr 306-37-6) – maks ja sool
                     
                        N-metüül-N-nitrosokarbamiid (CASi nr 684-93-5) – maks, luuüdi, veri, neerud, magu, tühisool ja aju.
                     
                        Negatiivsed kontrollid
                     
                     Negatiivse kontrolli loomade rühm, kellele manustatakse üksnes vehiikulit ja keda muus suhtes koheldakse samamoodi kui katserühmi, peab olema igas katses iga proovivõtuaja ja iga koe puhul. Negatiivse kontrolli loomade puhul peaks sabas oleva DNA % olema varem laboris selle loomaliigi iga koe jaoks ja iga proovivõtuaja jaoks kindlaks määratud vahemikus (vt punkt 16). Kui ei ole varasemaid või kirjanduses avaldatud kontrolli andmeid, mis näitavad, et valitud vehiikulil ei ole kahjulikku ega genotoksilist toimet samasuguse manustamiskordade arvu või manustamistee korral, tuleb vehiikuliga teha eelkatsed enne täieliku uuringu tegemist, et tõendada vehiikuli kontrolli vastuvõetavust.
                     KATSE KÄIK
                     
                        Loomade arv ja sugu
                     
                     Kuigi emasloomade kohta on olemas vähe andmeid selleks, et võrrelda komeedikatse tulemuste põhjal omavahel sugusid, on muud genotoksilisuse in vivo toimed isas-ja emasloomadel üldiselt sarnased ja seepärast võiks enamiku katseid teha ükskõik kummast soost loomadega. Kui andmetest, sealhulgas doosivahemiku määramise katse andmetest nähtuvad asjakohased erinevused isas- ja emasloomade vahel (nt süsteemse toksilisuse, metabolismi, biokättesaadavuse jne erinevused), tuleb katsetes kasutada kummastki soost loomi. Sellisel juhul võib olla asjakohane viia uuring läbi kummastki soost loomadega, näiteks korduvdoosi toksilisuse uuringu osana. Kui kasutatakse kummastki soost loomi, võib olla asjakohane teha katse mitut faktorit määrata võimaldava katseplaani järgi. Üksikasjad selle kohta, kuidas sellise katse andmeid analüüsida, on esitatud 2. liites.
                     Rühmade suurus uuringu alguses (ja pädevuse tõendamise ajal) tuleks seada eesmärgiga tagada igas rühmas vähemalt 5 analüüsitava ühest soost looma olemasolu või 5 kummastki soost looma olemasolu, kui kasutatakse kummastki soost loomi (paralleelses positiivse kontrolli rühmas võib olla vähem loomi, vt punkt 29). Kui inimese kokkupuude kemikaaliga on soospetsiifiline, nagu näiteks mõnede ravimite puhul, tehakse katse vastavast soost loomadega. Kui esitada mingi juhis loomadega seotud võimalikult tüüpiliste maksimumnõuete kohta katses, mis tehakse vastavalt punktis 33 esitatud parameetritele kolme doosirühma ning paralleelsete negatiivse ja positiivse kontrolli rühmadega (igas rühmas on viis samast soost looma), siis kulub selleks 25–35 looma.
                     MANUSTAMISKAVA
                     Loomadele tuleks kemikaali manustada iga päev kahe või enama päeva jooksul (st kaks või enam manustamist ligikaudu 24 tunniste vaheaegadega); proovid võetakse üks kord pärast 2–6 tunni möödumist viimasest manustamisest (või ajal Tmax) (12). Lubatav on kasutada dooside pikaajalise manustamise (näiteks iga päev 28 päeva jooksul) režiimi korral saadavaid proove. On tõendatud, et komeedikatset saab edukalt kombineerida erütrotsüütides mikrotuumade tekke katsega (10, 19). Hoolikalt tuleb siiski kaaluda komeedikatse jaoks koeproovide võtmise logistika kokkusobivust muude toksikoloogiliste hindamiste jaoks koeproovide võtmise nõuetega. Proovide võtmine 24 tundi pärast viimase doosi manustamist, mis on tüüpiline üldise toksilisuse uuringute puhul, ei ole komeedikatse puhul enamikul juhtudest vastuvõetav (vt punkt 40 proovivõtuaegade kohta). Muude annustamis- ja proovivõtukavade kasutamine peab olema põhjendatud (vt 3. liide). Näiteks ühekordset manustamist koos mitme proovi võtmisega võib kasutada, kuid tuleb siiski märkida, et ühekordse manustamisega uuringu jaoks on vaja rohkem loomi, kuna proove tuleb võtta eri ajavahemike tagant; mõnikord võib see olla eelistatav, nt siis, kui uuritav kemikaal on korduval manustamisel ülemäära toksiline.
                     Olenemata katse tegemise viisist on see vastuvõetav, kui uuritav kemikaal põhjustab positiivse reaktsiooni, või negatiivse uuringu puhul, kui on otsesed või kaudsed tõendid sihtkoe või -kudede kokkupuutest, sihtkoele avalduvast toksilisusest või kui saavutatakse piirdoos (vt punkt 36).
                     Uuritavaid kemikaale võib manustada ka jagatud doosina, näiteks kaks doosi ühel päeval kuni 2–3-tunnise vahega, et hõlbustada suure ruumalaga koguse manustamist. Nimetatud asjaoludel peaks kavandatud proovide võtmise kord põhinema viimase doosi manustamise ajal (vt punkt 40).
                     
                        Doosid
                     
                     Vastavalt praegusele arusaamale doosivahemiku määramise uuringu tegemise kohta tuleks sellisel juhul, kui tehakse vahemiku määramise eeluuring, sest muude uuringutega ei ole saadud sobivaid andmeid vahemiku valimise hõlbustamiseks, teha uuring samas laboris, kasutades sama liiki, liini, samast soost loomi ja manustamiskava, mida kasutatakse põhiuuringus. Uuringu eesmärk on kindlaks määrata maksimaalne talutav doos (maximum tolerated dose, MTD), mis määratletakse doosina, mis põhjustab uuringu ajal vähest toksilist toimet (näiteks selgeid kliinilisi sümptomeid nagu ebaharilik käitumine või reaktsioonid, väike kehamassi langus või tsütotoksilisus sihtkoe suhtes), kuid mitte surma või sellist valu, piinlemist või kannatusi, mille puhul läheks vaja eutanaasiat. Mittetoksilise uuritava kemikaali puhul, kui manustamisaeg on 14 päeva või rohkem, on suurim (piir-) doos 1 000 mg / kehamassi kg kohta päevas. Kui manustamisaeg on lühem kui 14 päeva, on suurim (piir-) doos 2 000 mg / kehamassi kg kohta päevas. Teatud tüüpi uuritavate kemikaalide (näiteks inimravimid) puhul, millele kohaldatakse eripiiranguid, võivad need piirid olla teistsugused.
                     Kemikaalide puhul, mille toksiko-kineetilistes omadustes esineb küllastumist, või mis põhjustavad selliseid detoksifitseerimisprotsesse, mis võivad vähendada kokkupuudet pärast pikaajalist manustamist, võib olla vajalik teha erandeid doosi määramise kriteeriumidest ja neid tuleks hinnata iga üksikjuhtumi puhul eraldi.
                     Komeedikatse nii akuutse kui ka subakuutse toksilisuse versiooni puhul tuleb lisaks suurimale doosile (maximum feasible dose, MTD, maksimaalne kokkupuude või piirdoos) valida iga proovivõtuaja jaoks kahanevas järjekorras veel vähemalt kaks doosiväärtust (mis eelistatavalt erinevad üksteisest vähem kui 10), et tõendada doosist sõltuvuse olemasolu. Kasutatavate doosidega tuleb siiski katta vahemik suurimast talutavast doosist kuni doosini, mis on vähetoksiline või mittetoksiline. Kui kõikide katses kasutatud dooside korral täheldatakse toksilisust sihtkoe suhtes, on soovitatav uurida veel mittetoksilisi doose (vt punktid 54–55). Kui uuringuga tahetakse põhjalikumalt uurida doosi-toime sõltuvuse kuju, võib olla vajalik lisada täiendavaid doosirühma(sid).
                     
                        Dooside manustamine
                     
                     Katse kavandamisel tuleks silmas pidada inimese võimalikku kokkupuuteviisi. Seepärast võib lugeda põhjendatuks selliste kokkupuuteviiside valimist nagu toidu, joogivee või paikse pealekandmise kaudu, samuti nahaaluse, veenisisese, suukaudse (toitmissondiga), inhalatsiooniga, intratrahheaalselt või implanteerimisega manustamise kaudu. Igal juhul tuleb manustamisviis valida nii, et tagada sihtkoe (-kudede) piisav kokkupuude uuritava kemikaaliga. Intraperitoneaalset süstimist tavaliselt ei soovitata, kuna see ei ole inimese puhul tüüpiline kokkupuuteviis; seda võib kasutada ainult konkreetse põhjenduse olemasolul (nt mõned positiivse kontrolli ained, uurimiseesmärkidel või mõne ravimi korral, mida manustatakse intraperitoneaalselt). Vedeliku suurim kogus, mida saab toitmissondi kaudu või süstides ühel korral manustada, sõltub katselooma suurusest. Ruumala ei tohiks ületada 1 ml 100 g kehamassi kohta, välja arvatud vesilahuste puhul, kui võib kasutada ruumala 2 ml 100 g kehamassi kohta. Suurema ruumala kasutamise korral (kui see on lubatud loomade heaolu käsitlevate õigusaktidega) tuleb seda põhjendada. Alati kui võimalik tuleks eri doositasemed saavutada uuritava kemikaali kontsentratsiooni muutmisega manustatava lahuse koostises, et tagada kõikide dooside puhul lahuse ruumala ja kehamassi ühesugune suhe.
                     
                        Proovivõtuaeg
                     
                     Proovivõtuaeg on kriitilise tähtsusega muutuja, kuna see on määratud ajavahemikuga, mis on vajalik uuritava kemikaali maksimaalse sisalduse saavutamiseks sihtkoes ja DNA-ahela katkete tekkeks; samas tuleb proov võtta enne, kui katked kõrvaldatakse, parandatakse või kui rakk nende tõttu sureb. Mõned kahjustused, mis põhjustavad DNA-ahela selliseid katkemisi, mida saab määrata komeedikatsega, võivad olla väga lühiealised, vähemalt mõne kemikaali testimisel in vitro (52, 53). Kui kahtlustatakse selliseid ajutisi DNA-kahjustusi, tuleks võtta meetmed nende kaotsimineku vähendamiseks; selleks tuleb kudedest proovid võtta piisavalt varakult, võib-olla varem kui pärast allpool esitatud vaikimisi ajavahemike möödumist. Optimaalne proovivõtuaeg võib sõltuda kemikaalist või manustamisteest; näiteks võib sihtkoe kokkupuude alata kiiresti pärast veenikaudset manustamist või kokkupuudet sissehingamise kaudu. Seega tuleks proovivõtuajad määrata kineetiliste andmete alusel (nt aeg (Tmax), kui saavutatakse maksimaalne kontsentratsioon veres või koes (Cmax) või statsionaarse oleku saabumisel mitmekordse manustamise korral), kui kineetilised andmed on olemas. Kineetiliste andmete puudumisel on sobiv kompromiss võtta genotoksilisuse mõõtmiseks proovid 2–6 tundi pärast viimast manustamist kahe või enama manustamise korral või nii 2–6 tundi kui ka 16–26 tundi pärast ühekordset manustamist, kuigi tuleb jälgida, et kõik loomad lahataks ühel ja samal ajal pärast viimase (või ainsa) doosi manustamist. Sobiva proovivõtuaja määramiseks võib kasutada (selle olemasolul) ka teavet sihtorganitele avalduva toksilise toime avaldumise kohta.
                     
                        Vaatlus
                     
                     Loomade tervise kliinilisi üldvaatlusi tuleb teha ja registreerida vähemalt üks kord päevas, soovitatavalt iga päev samal ajal, võttes arvesse pärast annustamist eeldatavate toimete kõrgperioodi (54). Haigestumise ja surmajuhtude tuvastamiseks tuleb kemikaali manustamise perioodil kõik loomad vähemalt kaks korda päevas üle vaadata. Pikema kestusega uuringute puhul tuleb kõiki loomi kaaluda vähemalt kord nädalas ja katse lõpus. Sööda tarbimist tuleb mõõta igal sööda vahetamisel ja vähemalt kord nädalas. Kui uuritavat kemikaali manustatakse joogiveega, tuleb vee tarbimist mõõta pärast iga veevahetust ja vähemalt üks kord nädalas. Loomad, kellel avalduvad ülemäärase toksilisuse sümptomid, mis ei ole surmavad, tuleb humaanselt hukata enne katse lõppu; selliseid loomi komeedikatses tavaliselt ei kasutata.
                     
                        Uuritavate kudede valimine
                     
                     Kuna DNA-ahelate katkemisi (komeete) on võimalik uurida praktiliselt iga koe puhul, peaks koe (kudede) valiku põhjendus olema selgelt määratletud ning põhinema uuringu tegemise eesmärgil, võttes arvesse ka kõiki olemasolevaid andmeid uuritava kemikaali imendumise, jaotumise, metabolismi ja eritumise, genotoksilisuse, kantserogeensuse ja muu toksilise toime kohta. Olulised tegurid, mida tuleks kaaluda, peaksid hõlmama vähemalt järgmist: uuritava kemikaali manustamisviis (põhineb inimeste tõenäolisel kokkupuuteviisil), eeldatav jaotumine kudedes ja imendumine, metabolismi osatähtsus ja võimalik toimemehhanism. Kõige sagedamini on uuritud maksa ja selle organi kohta on kõige rohkem andmeid. Seepärast, kui ei ole taustteavet ja ei ole määratletud konkreetset huvipakkuvat kude, on põhjendatud maksaproovide võtmine, kuna see on peamine ksenobiootikumide metaboliseerimise koht ning intensiivses kokkupuutes nii lähteaine(te) kui ka metaboliidi(metaboliitidega). Mõnel juhul võib kõige asjakohasem olla uurida otsese kokkupuute kohta (nt kemikaali suukaudse manustamise korral näärmemagu, kaksteistsõrmik või tühisool; sissehingamise teel manustamise korral kopsud). Täiendavate või alternatiivsete kudede valimisel tuleks lähtuda katse tegemise konkreetsetest põhjustest, kuid kasulik võib olla ka sama looma mitme koe uurimine, kui labor on tõendanud pädevust uurida neid kudesid ja pädevust uurida neid samaaegselt.
                     
                        Proovide valmistamine
                     
                     Järgmistes punktides (44–49) kirjeldatud protsesside puhul on oluline, et kõiki lahuseid või stabiilseid suspensioone kasutataks enne nende kasutustähtaja lõppu või need oleksid vajaduse korral värskelt valmistatud. Järgmistes punktides on ajad, mis kuluvad i) iga koe eemaldamiseks pärast lahkamist, ii) igast koest raku/tuumade suspensiooni valmistamiseks ja iii) suspensiooni töötlemiseks ja alusklaaside valmistamiseks, kõik samuti kriitilise tähtsusega muutujad (vt mõisted, 1. liide) ja iga etapi läbimiseks vastuvõetav ajavahemik tuleb määrata katsemeetodi juurutamise ja pädevuse tõendamise katsete ajal.
                     Loomad hukatakse humaansel viisil, mis on kooskõlas loomade heaolu käsitlevate kehtivate õigusaktidega ning loomkatsete asendamise, vähendamise ja täiustamise põhimõtetega, sobival ajal pärast uuritava kemikaali viimast manustamist. Valitud kude (koed) eemaldatakse ning osa võetakse komeedikatse jaoks; samal ajal ja samast kohast tuleb lõigata samasugune osa koest ja panna formaldehüüdi lahusesse või muusse sobivasse fiksatiivi võimaliku histopatoloogilise analüüsi jaoks (vt punkt 55) vastavalt standardmeetodile (12). Komeedikatseks võetud kude pannakse peenestamispuhvrisse, loputatakse piisava põhjalikkusega külma peenestamispuhvriga, et eemaldada verejäägid ja hoitakse jääkülmas peenestamispuhvris kuni töötlemiseni. Võib kasutada ka in situ perfusiooni, nt maksa või neeru korral.
                     Rakkude/tuumade isoleerimise kohta on avaldatud palju meetodeid. Nende hulka kuuluvad maksa ja neerude puhul kasutatav peenestamine, mao-soolestiku puhul limaskesta kaapimine, homogeenimine ja ensüümidega lõhustamine. JaCVAMi valideerimisuuringus uuriti ainult isoleeritud rakke ja seepärast on seoses meetodi juurutamisega ja võimalikkusega viidata ja pädevuse tõendamise ajal JaCVAMi uuringule eelistatav kasutada isoleeritud rakke. Siiski on näidatud, et katse tulemustes ei olnud olulist erinevust, kui isoleeritud rakkude asemel kasutati tuumasid (8). Võrreldavad tulemused saadi ka siis, kui rakkude/tuumade isoleerimiseks kasutati eri meetodeid (nt homogeenimine, peenestamine, ensümaatiline lõhustamine või filtrimine läbi võrgu) (55). Järelikult võib kasutada kas isoleeritud rakke või isoleeritud tuumasid. Laboril tuleb põhjalikult hinnata ja valideerida üksikrakkude/-tuumade isoleerimise koespetsiifilised meetodid. Nagu on arutatud punktis 40, võivad mõned kahjustused, mis viivad DNA-ahela selliste katkemisteni, mida saab määrata komeedikatsega, olla väga lühiealised (52, 53). Seepärast on oluline, et olenemata üksikrakkude/-tuumade suspensiooni valmistamiseks kasutatavast meetodist töödeldaks koed pärast loomade eutanaasiat võimalikult kiiresti ning säilitataks neid tingimustes, milles kahjustuste kõrvaldamine väheneks (nt koe hoidmine madalal temperatuuril). Rakususpensioone tuleks hoida jääkülmana kuni kasutamiseni, nii et eri proovide vahelised erinevused oleksid minimaalsed ja et positiivse ja negatiivse kontrolli katsetes saadaks asjakohased tulemused.
                     MIKROSKOOBIPREPARAATIDE VALMISTAMINE
                     Mikroskoobipreparaadid tuleb valmistada võimalikult kiiresti (soovitatavalt ühe tunni jooksul) pärast üksikrakkude/-tuumade proovi valmistamist, kuid loomade surma ja mikroskoobipreparaadi valmistamise vaheline aeg peab olema rangelt kontrollitud ja valideeritud iga labori tingimustes. Mikroskoobipreparaatide valmistamisel ei tohiks rakususpensiooni ruumala, mis lisatakse madala sulamispunktiga agaroosile (tavaliselt 0,5–1,0 %), vähendada madala sulamistemperatuuriga agaroosi osakaalu alla 0,45 %. Optimaalne rakkude tihedus määratakse kujutise analüüsi süsteemi abil, mida kasutatakse komeetide hindamisel.
                     
                        Lüüsimine
                     
                     Ka lüüsimistingimused on kriitilise tähtsusega muutuja ja võivad takistada selliseid ahelakatkemisi, mis tulenevad teatud tüüpi DNA-muutustest (teatavad DNA alküülimised ja aluseaduktid). Seepärast on soovitatav, et lüüsimistingimused oleksid võimalikult ühesugused katse kõikide preparaatide valmistamisel. Kui preparaadid on valmis, tuleb alusklaasid panna jahutatud lüüsimislahusesse vähemalt üheks tunniks (või järgmise hommikuni) temperatuuril ligikaudu 2–8 °C nõrga valgustuse (nt kollane valgus) tingimustes (või täielikus pimeduses), et vältida kokkupuudet valge valgusega, mis võib sisaldada UV-komponente. Pärast seda inkubatsiooniperioodi tuleks alusklaasid loputada, et eemaldada detergendi jäägid ja soolad, enne kui alustatakse leeliselise lahtikeerdumise etappi. Seda võib teha puhastatud vee, neutraliseerimispuhvri või fosfaatpuhvri abil. Kasutada võib ka elektroforeesipuhvrit. See säilitaks leeliselised tingimused elektroforeesikambris.
                     
                        Lahtikeerdumine ja elektroforees
                     
                     Alusklaasid tuleks panna juhuslikus järjestuses elektroforeesiseadme platvormile, mis on täielikult kaetud elektroforeesilahusega ja milles lahust on nii palju, et alusklaasid oleksid kogu aeg täielikult lahusega kaetud (ka katva kihi paksus peaks eri katsetes olema ühesugune). Komeedikatse tegemisel teist tüüpi elektroforeesiseadmetes, st aktiivse jahutamise, jahutusvee tsirkulatsiooni ja suure võimsusega toiteallika abil, põhjustab paksem lahusekiht suurema voolutugevuse, kui pinge hoitakse samasugune. Alusklaaside panemisel elektrolüüsivanni tuleks kasutada tasakaalustatud lahendust, et leevendada igasuguste trendide või ääreefektide mõju ühes elektrolüüsivannis ja vähendada ka eri vannide kasutamisest tulenevat varieeruvust; see tähendab, et igas elektrolüüsikatses peab olema ühesugune arv alusklaase igalt uuringus kasutatud loomalt ja ühesugune arv proove igast doosirühmast, negatiivse ja positiivse kontrolli rühmast. Alusklaasid tuleks jätta vähemalt 20 minutiks lahusesse, et DNA keerduks lahti ning seejärel tehakse elektroforees kontrollitud tingimustes, millega katse tundlikkus ja dünaamiline vahemik viiakse maksimumini (et saavutada negatiivse ja positiivse kontrolli puhul sabas oleva DNA protsendi vastuvõetav tundlikkust maksimeeriv tase). DNA migreerumise tase on lineaarselt seotud elektroforeesi kestusega ja ka pingepotentsiaaliga (V/cm). JaCVAMi uuringu põhjal võiks pingepotentsiaal olla 0,7 V/cm vähemalt 20 minuti jooksul. Elektroforeesi kestust loetakse kriitilise tähtsusega muutujaks ja elektroforeesi aeg tuleks valida nii, et dünaamiline vahemik oleks optimaalne. Pikem elektroforeesi aeg (nt 30 või 40 minutit, et saavutada maksimaalset tundlikkust) põhjustab tavaliselt tugevama positiivse toime teadaolevate mutageenide puhul. Kuid pikk elektroforeesiaeg võib põhjustada ka kontrolli proovide ülemäärast migreerumist. Iga katse puhul tuleks kasutada ühesugust pinget ning muude näitajate varieerumine peaks olema teadaolevas kitsas vahemikus; näiteks JaCVAMi uuringus põhjustas pingepotentsiaal 0,7 V/cm lähtevoolutugevuse 300 mA. Puhverlahusekihi paksust tuleks kohandada, et saavutada vajalikud tingimused ja hoida neid kogu katse vältel. Voolutugevus elektroforeesi alguses ja lõpus tuleb registreerida. Seepärast tuleb labori algsete pädevuse tõendamise katsete ajal määrata iga uuritava koeliigi jaoks optimaalsed tingimused. Elektroforeesilahuse temperatuur kogu lahtikeerdumise ja elektroforeesi ajal peab olema madal, tavaliselt 2–10 °C (10). Elektroforeesilahuse temperatuur lahtikeerdumise alguses, elektroforeesi alguses ja lõpus tuleb registreerida.
                     Pärast elektroforeesi lõppu tuleb alusklaasid panna neutraliseerimispuhvrisse või neid sellega loputada vähemalt 5 minutit. Geele võib värvida ja hinnata „värskelt“ (nt 1–2 päeva jooksul) või need võib veetustada hilisemaks hindamiseks (nt 1–2 nädalat pärast värvimist) (56). Need tingimused peavad siiski olema valideeritud pädevuse tõendamise ajal; samuti tuleb koguda varasemaid andmeid ning säilitada need eraldi iga tingimuste komplekti jaoks. Viimasel juhul tuleks alusklaasid dehüdrateerida paigutamisega absoluutsesse etanooli vähemalt 5 minutiks, lasta kuivada õhu käes ja hoida seejärel kas toatemperatuuril või külmikus kuni hindamiseni.
                     
                        Mõõtmismeetodid
                     
                     Komeete tuleb hinnata kvantitatiivselt, kasutades automaatset või poolautomaatset kujutiseanalüüsi süsteemi. Mikroskoobipreparaadid värvitakse sobiva fluoresteeruva värvainega, nagu SYBR Gold, Green I, propiidiumjodiid või etiidiumbromiid ja mõõdetakse sobiva suurendusega (nt 200 korda) epifluorestsentsmikroskoobiga, mis on varustatud vajalike detektoritega või digikaameraga (nt CCD).
                     Rakud võib liigitada kolme kategooriasse, nagu on kirjeldatud komeedikujutiste atlases (57), nimelt hindamiskõlblik komeet, hindamist mitte võimaldav ja „siil“ (hedgehog,vt edasine arutelu, punkt 56). Artefaktide vältimiseks tuleb sabas oleva DNA % määramiseks hinnata ainult hindamiskõlblikke rakke (millel on selgelt määratletud pea ja saba ning mida ei mõjuta segavalt naaberrakud). Katseprotokollis ei ole vaja esitada andmeid selle kohta, kui palju oli hindamist mitte võimaldavaid rakke. Nn siilide sagedus tuleks kindlaks määrata nende visuaalse hindamise põhjal (kuna selgelt määratletud pea puudumine tähendab, et kujutise analüüsiga võivad need jääda tuvastamata) vähemalt 150 raku hulgas ühe proovi kohta) (vt edasine arutelu, punkt 56) ja registreerida eraldi.
                     Kõik alusklaasid, sh positiivsete ja negatiivsete kontrollide omad, kodeeritakse sõltumatult ja neid hinnatakse „pimesi“, nii et hindaja ei tea proovi töötlemise tingimusi. Iga proovi kohta (ühe looma ühe koe kohta) tuleb analüüsida vähemalt 150 rakku (välja arvatud nn siilid, vt punkt 56). Smithi jt (2008) (5) analüüsi kohaselt annab piisava statistilise võimsuse 150 raku hindamine vähemalt 5 looma puhul igas doosirühmas (väiksema loomade arvu juures samaaegse positiivse kontrolli rühmas, vt punkt 29). Kui kasutatakse alusklaase, tuleks hinnata 2–3 alusklaasi proovi kohta, kui kasutatakse viiest loomast koosnevaid doosirühmi. Alusklaasil tuleb vaadelda mitut piirkonda, kus rakkude tihedus tagab selle, et sabad ei kattu. Alusklaasi serval asuvate alade hindamist tuleb vältida.
                     DNA-ahelate katkemisi komeedikatses võib mõõta erinevate sõltumatute näitajate järgi, sabas oleva DNA %, saba pikkus ja saba moment. Sobiva kujutiste analüüsi tarkvarasüsteemi abil võib mõõta kõik kolm näitajat. Siiski soovitatakse hindamiseks ja tulemuste tõlgendamiseks kasutada sabas oleva DNA protsenti (nimetatakse ka saba intensiivsuse protsendiks) (12, 40–42), mis määratakse sabas olevate DNA-fragmentide intensiivsuse järgi ja väljendatakse protsendina raku summaarsest intensiivsusest (13).
                     
                        Koekahjustus ja tsütotoksilisus
                     
                     Komeedikatse positiivsed tulemused ei pruugi olla tingitud üksnes genotoksilisusest; DNA migreerumise suurenemist võib põhjustada ka sihtkoe suhtes avalduv toksilisus (12, 41). Ja vastupidi, teadaolevate genotoksiinide korral võidakse täheldada madalat või mõõdukat tsütotoksilisust (12), mis tõendab, et komeedikatse üksinda ei võimalda eristada genotoksilisusest tingitud DNA migreerumise sellisest DNA migreerumisest, mille põhjustab tsütotoksilisus. Ent sellisel juhul, kui täheldatakse DNA migreerumise suurenemist, on soovitatav, et määrataks ka tsütotoksilisuse üks või mitu näitajat, kuna see võib aidata tulemusi tõlgendada. Kui koos DNA migreerumise suurenemisega esinevad selged tõendid tsütotoksilisusest tuleks suurenemise tõlgendamisel olla ettevaatlik.
                     Tsütotoksilisuse mõõtmiseks on soovitatud palju meetodeid ja nendest peetakse histopatoloogiliste muutuste uurimist koe suhtes avalduva toksilisuse määramise asjakohaseks meetodiks. DNA suurenenud migreerumisega seostatakse selliseid leide nagu põletik, rakkude infiltratsioon, apoptootilised või nekrootilised muutused, kuid nagu näitas JaCVAMi valideerimisuuring (12), ei ole olemas selliste histopatoloogiliste muutuste kindlat loendit, mis oleksid alati seotud DNA migreerumise suurenemisega. Muutused kliinilise keemia näitajates (nt AST, ALT) võivad samuti anda kasulikku teavet koekahjustuste kohta ning kaaluda võib ka täiendavaid näitajaid, nagu kaspaasi aktiveerumine, värvumine TUNELiga, värvumine anneksiin V-ga jne. Vähe andmeid on avaldatud siiski viimaste kasutamise kohta in vivo uuringutes ja mõned neist võivad olla vähem usaldusväärsed kui teised.
                     Nn siilid (või „pilved“ (clouds), „kummitusrakud“ (ghost cells)) on rakud, mille mikroskoobikujutisel on väike pea või seda ei olegi ning suured hägusad sabad; neid peetakse tugevasti kahjustatud rakkudeks, kuigi „siilide“ tekkimise põhjused on ebaselged (vt 3. liide). Nende välimuse tõttu ei ole sabas oleva DNA % mõõtmised kujutise analüüsi abil usaldusväärsed ja seetõttu tuleks „siile“ hinnata eraldi. „Siilide“ esinemine tuleb märkida ja esitada protokollis ning kõiki asjakohaseid suurenemisi, mida seostatakse uuritava kemikaali mõjuga, tuleks analüüsida ja tõlgendada ettevaatlikult. Teadmised uuritava kemikaali võimaliku toimemehhanismi kohta võivad aidata selliseid tulemusi tõlgendada.
                     KATSEANDMED JA NENDE ESITAMINE
                     
                        Andmete töötlemine
                     
                     Katseühik on üks loom ja seepärast tuleb tabelitena esitada nii andmed iga üksiku looma kohta kui ka koondandmed. Andmete hierarhilise olemuse tõttu soovitatakse iga alusklaasi puhul määrata sabas oleva DNA protsendi mediaanväärtus ja iga looma puhul arvutada mediaanväärtuste keskväärtus (12). Seejärel leitakse üksikloomade keskväärtuste keskmine iga doosirühma jaoks. Kõik need väärtused tuleb esitada katseprotokollis. Võib kasutada ka alternatiivseid lähenemisviise (vt punkt 53), kui see on teaduslikult ja statistiliselt põhjendatud. Statistilise analüüsi võib teha mitmesuguste lähenemisviiside abil (58–61). Kasutatava statistilise meetodi valimisel tuleb kaaluda, kas andmeid on vaja teisendada (näiteks logaritmimine või ruutjuurteisendus) ja/või kas on vaja liita kõikidele (ka nullist erinevatele) arvudele mingi väike arv (nt 0,001), et leevendada nulliga võrduvate rakuväärtuste mõju, nagu on kirjeldatud eespool nimetatud viidetes. Üksikasjalikud juhendid, kuidas analüüsida töötlusega seotud ja soospetsiifilise muutujate interaktsioone, kui katses kasutatakse mõlemast soost loomi, ning saadud andmete edasist analüüsi, kui neis leitakse või ei leita erinevusi, on esitatud 2. liites. Protokollis tuleks esitada ka andmed toksilisuse kohta ja kliinilised sümptomid.
                     
                        Katse nõuetekohasuse kriteeriumid
                     
                     Katse nõuetekohaseks tunnistamine põhineb järgmistel kriteeriumidel:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 Samaaegne negatiivse kontrolli katse loetakse nõuetekohaseks ja vastuvõetavaks labori varasemate negatiivse kontrolli katsete andmebaasi kandmiseks vastavalt punktis 16 kirjeldatud kriteeriumidele.
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 Samaaegne positiivse kontrolli katse (vt punkt 29) peab kutsuma esile sellise mõju, mis on kooskõlas varasemate positiivse kontrolli katsete andmebaasi kohase mõjuga ja peaks endast kujutama statistiliselt olulist suurenemist, võrreldes samaaegse negatiivse kontrolli katse tulemusega.
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 Analüüsitud on piisav arv rakke ja doose (vt punktid 52 ja 36–38).
                              
                           
                                 d.
                              
                              
                                 Suurima doosi valiku kriteeriumid vastavad punktis 36 kirjeldatutele.
                              
                           
                        Tulemuste hindamine ja tõlgendamine
                     
                     Tingimusel et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritav kemikaal selgelt positiivseks, kui:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 vähemalt ühe uuritud doosi korral on leitud statistiliselt oluline suurenemine võrreldes samaaegse negatiivse kontrolliga,
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 suurenemine sõltub doosist, kui seda hinnatakse sobiva trendikatsega,
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 kõik tulemused on väljaspool varasemate katsete negatiivse kontrolli tulemuste jaotusvahemikku konkreetse liigi, vehiikuli, manustamisviisi, koe ja manustamiskordade arvu puhul.
                              
                           Kui kõik need tingimused on täidetud, loetakse uuritav kemikaal võimeliseks põhjustama DNA-ahelate katkemisi kudedes, mida uuriti kõnealuses katsesüsteemis. Kui ainult üks või kaks neist kriteeriumidest on täidetud, vt punkt 62.
                     Tingimusel et kõik katse nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud, loetakse uuritav kemikaal selgelt negatiivseks, kui:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 mitte ühegi uuritud kontsentratsiooni juures ei leitud statistiliselt olulist suurenemist võrreldes samaaegse negatiivse kontrolliga,
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 ei esine kontsentratsioonist sõltuvat suurenemist, kui seda hinnatakse sobiva trendikatsega,
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 kõik tulemused on varasemate katsete negatiivse kontrolli tulemuste jaotusvahemikus konkreetse liigi, vehiikuli, manustamisviisi, koe ja manustamiskordade arvu puhul,
                              
                           
                                 d.
                              
                              
                                 on esitatud otsesed või kaudsed tõendid, mis tõendavad sihtkoe kokkupuudet uuritava kemikaaliga või selle toksilisust sihtkoe suhtes.
                              
                           Uuritav kemikaal loetakse sellisel juhul võimetuks põhjustama DNA-ahelate katkemisi kudedes, mida uuriti kõnealuses katsesüsteemis.
                     Selgelt positiivset või negatiivset vastust ei ole vaja kinnitada.
                     Kui vastus ei olnud selgelt negatiivne ega selgelt positiivne (s.t mitte kõik punktides 59 või 60 loetletud kriteeriumid ei olnud täidetud) ning selleks, et aidata kindlaks teha tulemuste bioloogilist olulisust, tuleb andmeid hinnata eksperdihinnanguga ja/või teha täiendavaid uuringuid, kui see on teaduslikult põhjendatud. Kasulik võib olla täiendavate rakkude hindamine (vajaduse korral) või korduskatse tegemine optimeeritud tingimuste kasutamisega (nt doosiintervallid, muud manustamisviisid, muud proovivõtuajad või muud koed).
                     Harvadel juhtudel ei võimalda andmed isegi pärast täiendavaid uuringuid teha järeldust positiivse või negatiivse tulemuse kohta; sel juhul loetakse tulemus ebaselgeks.
                     Positiivse või ebaselge tulemuse bioloogilise olulisuse hindamiseks on vaja teavet tsütotoksilisuse kohta sihtkoe suhtes (vt punktid 54–55). Kui positiivseid või ebaselgeid tulemusi täheldatakse üksnes selgete tsütotoksilisuse tõendite esinemise puhul, tuleb uuring lõpetada järeldusega, et teave genotoksilisuse kohta on ebaselge, välja arvatud juhul, kui on olemas piisav teave, mis toetaks lõplikku järeldust. Kui uuringu tulemus on negatiivne, kuid iga uuritud doosi korral avalduvad toksilisuse tunnused, võib olla soovitatav teha täiendav uuring mittetoksilise doosiga.
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritav kemikaal:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             allikas, partii number, kui on olemas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali stabiilsus, kasutamise lõpptähtaeg või kordusanalüüsi tegemise tähtaeg, kui see on teada.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ühe koostisosaga aine:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             füüsiline välimus, lahustuvus vees ja asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             keemilised identifitseerimisandmed, nagu IUPACi või CASi nimetus ja CASi number, SMILES või InChi kood, struktuurivalem, puhtus, lisandite keemiline määratlus vajaduse ja praktilise teostatavuse korral jne.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Mitme koostisosaga aine, tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid (UVCB) ja segud:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             iseloomustatakse võimaluse korral koostisainete keemiliste nimetuste kaudu (vt eespool), kvantitatiivse sisalduse ja asjakohaste füüsikalis-keemiliste omaduste kaudu.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Lahusti/vehiikul:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             lahusti/vehiikuli valiku põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali lahustuvus ja stabiilsus lahustis/vehiikulis, kui on teada;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             teatava koostisega dooside valmistamine;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             osutatud koostisega doosidega tehtud analüüsid (nt stabiilsus, homogeensus, nominaalsed kontsentratsioonid).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katseloomad:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud liik/liin ja selle valimise teaduslik ja eetiline põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             loomade arv, vanus ja sugu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             päritolu, pidamistingimused, söötmine, keskkonna rikastamine jne;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             iga looma mass katse alguses ja lõpus, sh kehamassi vahemik, keskväärtus ja standardhälve iga rühma kohta.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsetingimused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             positiivse ja negatiivse (vehiikuli/lahusti) kontrolli andmed;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             doosivahemiku määramise uuringu tulemused, kui see tehti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             doositaseme valimise põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritud kemikaali preparaadi valmistamise üksikasjad;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali manustamise üksikasjad;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             manustamistee põhjendus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             süstimiskoht (subkutaanse ja intravenoosse uuringu puhul);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             proovide valmistamise meetodid, kui kasutati, histopatoloogiliste analüüside meetodid, eriti kemikaali puhul, mis põhjustas komeedikatses positiivse tulemuse;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koe valimise põhjendused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             meetodid, millega kontrolliti, et uuritav kemikaal jõudis sihtkoesse või üldvereringesse, kui saadi negatiivsed tulemused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tegelik doos (mg kehamassi kg kohta päevas), mis arvutatakse sööda/joogivee tarbimise ja selles uuritava kemikaali kontsentratsiooni (ppm) järgi, kui asjakohane;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             sööda ja vee kvaliteedi üksikasjad;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             manustamis- ja proovivõtukavade detailne kirjeldus ja nende valiku põhjendused (nt toksiko-kineetilised andmed, kui kättesaadavad);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             valu leevendamise meetod, analgeesia;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             eutanaasia meetod;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kudede eraldamise ja säilitamise kord;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             üksikrakkude/-tuumade suspensiooni valmistamise meetodid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kõikide reaktiivide allikad ja partiinumbrid (võimaluse korral);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tsütotoksilisuse hindamise meetodid;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             elektroforeesi tingimused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud värvimismeetodid; ning
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             komeetide hindamise ja mõõtmise meetodid.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             iga looma üldkliiniline vaatlus enne katset ja kogu katse ajal;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tõendid tsütotoksilisuse kohta, kui selliseid katseid tehti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rohkem kui üks nädal kestnud uuringu puhul: iga looma kehamass kogu katse ajal, sh iga rühma kohta kehamassi vahemik, keskväärtus ja standardhälve; sööda tarbimine;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             doosi-toime seos, kui esineb;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             iga koe ja looma kohta, sabas oleva DNA % (või muud valitud näitajad) ja mediaanväärtused iga alusklaasi puhul, keskväärtused iga looma puhul ja rühma keskväärtus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             paralleelsed ja varasemad negatiivse kontrolli andmed, nende vahemikud, keskväärtused/mediaanväärtused ja standardhälbed iga hinnatud koe puhul;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             paralleelsed ja varasemad positiivse kontrolli andmed;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             muu koe kui maksa puhul doosi-toime vahelise sõltuvuse kõver positiivse kontrolli kemikaaliga. Selle võib võtta pädevuse tõendamise uuringuga kogutud andmetest (vt punktid 16–17) ja sellega koos peab olema esitatud põhjendus, koos viidetega olemasolevale kirjandusele, selle kohta, kas toime ulatus ja tulemuste hajuvus sobivad kontrollide tulemuste puhul kõnealuse koe jaoks;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud statistilised analüüsid ja meetodid; ning kriteeriumid, mille alusel uuringutulemus klassifitseeriti positiivseks, negatiivseks või ebaselgeks;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             „siilide“ sagedus iga rühma ja iga looma kohta.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemuste arutelu
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kokkuvõte
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Viited
                                 
                              
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Kirkland, D., G. Speit (2008), „Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens III. Appropriate follow-up testing in vivo“, Mutation Research, Vol. 654/2, pp. 114–32.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Brendler-Schwaab, S. et al. (2005), „The in vivo Comet assay: use and status in genotoxicity testing“, Mutagenesis, Vol. 20/4, pp. 245–54.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), „Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing: result of the in vivo Comet assay workgroup“, Mutation Research, Vol. 627/1, pp. 31–5.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Burlinson, B. (2012), „The in vitro and in vivo Comet assays“, Methods in Molecular Biology, Vol. 817, pp. 143–63.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Smith, C.C. et al. (2008), „Recommendations for design of the rat Comet assay“, Mutagenesis,Vol. 23/3, pp. 233–40.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Hartmann, A. et al. (2003), „Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay“, Mutagenesis, Vol. 18/1, pp. 45–51.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 McKelvey-Martin, V.J. et al. (1993), „The single cell gel electrophoresis assay (Comet assay): a European review“, Mutation Research, Vol. 288/1, pp. 47–63.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Tice, R.R. et al. (2000), „Single cell gel/Comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 206–21.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Singh, N.P. et al. (1988), „A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells“, Experimental Cell Research, Vol. 175/1, pp. 184–91.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2010), „Collaborative study on fifteen compounds in the rat-liver Comet assay integrated into 2- and 4-week repeat-dose studies“, Mutation Research, Vol., 702/1, pp. 40–69.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2016), „Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015.“ ENV Publications. Series on Testing and Assessment No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 OECD (2014), „Reports of the JaCVAM initiative international pre-validation and validation studies of the in vivo rodent alkaline comet assay for the detection of genotoxic carcinogens“, Series on Testing and Assessment, Nos. 195 and 196, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Olive, P.L., J.P. Banath, R.E. Durand (1990), „Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells using the „Comet“ assay“, Radiation Research, Vol. 122/1, pp. 86–94.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Tice, R.R., G.H. Strauss (1995), „The single cell gel electrophoresis/Comet assay: a potential tool for detecting radiation-induced DNA damage in humans“, Stem Cells, Vol. 13/1, pp. 207–14.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Collins, A.R (2004), „The Comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations“, Molecular Biotechnology, Vol. 26/3, pp. 249–61.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2011), „Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 108–20.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Kushwaha, S. et al. (2010), „Evaluation of multi-organ DNA damage by Comet assay from 28 days repeated dose oral toxicity test in mice: A practical approach for test integration in regulatory toxicity testing“, Regulatory Toxicology and Pharmacology, Vol. 58/1, pp. 145–54.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Vasquez, M.Z. (2010), „Combining the in vivo Comet and micronucleus assays: a practical approach to genotoxicity testing and data interpretation“, 
                                       Mutagenesis
                                    
                                    , Vol. 25/2, pp. 187–99.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Bowen, D.E. (2011), „Evaluation of a multi-endpoint assay in rats, combining the bone-marrow micronucleus test, the Comet assay and the flow-cytometric peripheral blood micronucleus test“, Mutation Research, Vol. 722/1, pp. 7–19.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Recio, L. et al. (2010), „Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus (MN) and Comet assay protocol“, The Journal of Toxicological Science, Vol. 35/2, pp. 149–62.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 O'Donovan, M., B. Burlinson (2013), „Maximum dose levels for the rodent comet assay to examine damage at the site of contact or to the gastrointestinal tract“, Mutagenesis, Vol. 28/6, pp. 621–3.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Hartmann, A. (2004), „Use of the alkaline in vivo Comet assay for mechanistic genotoxicity investigations“, Mutagenesis, Vol. 19/1, pp. 51–9.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Nesslany, F. (2007), „In vivo Comet assay on isolated kidney cells to distinguish genotoxic carcinogens from epigenetic carcinogens or cytotoxic compounds“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 630/1, pp. 28–41.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Brendler-Schwaab, S.Y., B.A. Herbold (1997), „A new method for the enrichment of single renal proximal tubular cells and their first use in the Comet assay“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 393/1-2, pp. 175–8.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Toyoizumi, T. et al. (2011), „Use of the in vivo skin Comet assay to evaluate the DNA-damaging potential of chemicals applied to the skin“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 726/2, pp. 175–80.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Struwe, M. et al. (2008), „Detection of photogenotoxicity in skin and eye in rat with the photo Comet assay“, Photochemical and Photobiological Sciences, Vol. 7/2, pp. 240–9.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Wada, K. et al. (2012), „A comparison of cell-collecting methods for the Comet assay in urinary bladders of rats“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 742/1-2, pp. 26–30.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 Wang, A. et al. (2007), „Measurement of DNA damage in rat urinary bladder transitional cells: improved selective harvest of transitional cells and detailed Comet assay protocols“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/ 1-2, pp. 51–9.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), „In Vivo Comet Assay Workgroup, part of the Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing. Fourth International Workgroup on Genotoxicity testing: results of the in vivo Comet assay workgroup“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, pp. 31–5.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Jackson, P. et al. (2012), „Pulmonary exposure to carbon black by inhalation or instillation in pregnant mice: effects on liver DNA strand breaks in dams and offspring“, Nanotoxicology, Vol. 6/5, pp. 486–500.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Sasaki, Y.F. et al. (2000), „The comet assay with multiple mouse organs: comparison of Comet assay results and carcinogenicity with 208 chemicals selected from the IARC monographs and U.S. NTP Carcinogenicity Database“, Critical Reviews in Toxicology, Vol. 30/6, pp. 629–799.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Sekihashi, K. et al. (2002), „Comparative investigations of multiple organs of mice and rats in the Comet assay“, Mutation Research, Vol. 517/1-2, pp. 53–74.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Speit, G, M. Vasquez, A. Hartmann (2009), „The comet assay as an indicator test for germ cell genotoxicity“, Mutation Research, Vol. 681/1, pp. 3–12.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Zheng, H., P.L. Olive (1997), „Influence of oxygen on radiation-induced DNA damage in testicular cells of C3H mice“, International Journal of Radiation Biology, Vol. 71/3, pp. 275–282.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Cordelli, E. et al. (2003), „Evaluation of DNA damage in different stages of mouse spermatogenesis after testicular X irradiation“, Journal of Radiation Research, Vol. 160/4, pp. 443–451.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Merk, O., G. Speit (1999), „Detection of crosslinks with the Comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 33/2, pp. 167–72.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Pfuhler, S., H.U. Wolf (1996), „Detection of DNA-crosslinking agents with the alkaline Comet assay“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 27/3, pp. 196–201.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Wu, J.H., N.J. Jones (2012), „Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline Comet assay“, Methods in Molecular Biology, Vol. 817, pp. 165–81.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Spanswick, V.J., J.M. Hartley, J.A. Hartley (2010), „Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay“, Methods in Molecular Biology, Vol. 613, pp. 267–282.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Kumaravel, T.S., A.N. Jha (2006), „Reliable Comet assay measurements for detecting DNA damage induced by ionizing radiation and chemicals“, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 605(1-2), pp. 7–16.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), „Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing: result of the in vivo Comet assay workgroup“, Mutation Research, Vol.627/1, pp. 31–5.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Kumaravel, T.S. et al. (2009), „Comet Assay measurements: a perspective“, Cell Biology and Toxicology, Vol. 25/1, pp. 53–64.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 Ersson, C., L. Möller (2011), „The effects on DNA migration of altering parameters in the Comet assay protocol such as agarose density, electrophoresis conditions and durations of the enzyme or the alkaline treatments“, Mutagenesis, Vol. 26/6, pp. 689–95.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Møller, P. et al. (2010), „Assessment and reduction of Comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group“, Mutagenesis, Vol. 25/2, pp. 109–11.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Forchhammer, L. et al. (2010), „Variation in the measurement of DNA damage by Comet assay measured by the ECVAG inter-laboratory validation trial“, Mutagenesis, Vol. 25/2, pp. 113–23.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Azqueta, A. et al. (2011), „Towards a more reliable comet assay: Optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions“, Mutation Research, Vol. 724/1-2, pp. 41–45.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), „Compilation and use of genetic toxicity historical control data“, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 87–90.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, John Wiley and Sons, New York 2nd ed.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 
                                    Appendix A of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS No. 123)
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.8. Subakuutne mürgisus sissehingamisel: 28-päevane uuring.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk B.29. Subkrooniline mürgisus sissehingamisel: 90-päevane uuring.
                              
                           
                                 (52)
                              
                              
                                 Blakey, D.H., G.R. Douglas (1984), „Transient DNA lesions induced by benzo[a]pyrene in Chinese hamster ovary cells“, Mutation Research, Vol. 140/2-3, pp. 141–45.
                              
                           
                                 (53)
                              
                              
                                 Blakey, D.H., G.R. Douglas (1990), „The role of excision repair in the removal of transient benzo[a]pyrene-induced DNA lesions in Chinese hamster ovary cells“, Mutation Research, Vol. 236/1, pp. 35–41.
                              
                           
                                 (54)
                              
                              
                                 OECD (2002), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (55)
                              
                              
                                 Nakajima, M. (2012), „Tissue sample preparation for in vivo rodent alkaline Comet assay“, Genes and Environment, Vol. 34/1, pp. 50–4.
                              
                           
                                 (56)
                              
                              
                                 Hartmann, A. et al. (2003), „Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay“, Mutagenesis, Vol.18/1, pp. 45–51.
                              
                           
                                 (57)
                              
                              
                                 
                                    Atlas of Comet Assay Images, Scientist Press Co., Ltd., Tokyo, Japan.
                              
                           
                                 (58)
                              
                              
                                 Lovell, D.P., G. Thomas, R. Dubow (1999), „Issues related to the experimental design and subsequent statistical analysis of in vivo and in vitro Comet studies“, Teratogenesis Carcinogenesis Mutagenesis, Vol. 19/2, pp. 109–19.
                              
                           
                                 (59)
                              
                              
                                 Wiklund, S.J., E. Agurell (2003), „Aspects of design and statistical analysis in the Comet assay“, Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 167–75.
                              
                           
                                 (60)
                              
                              
                                 Bright, J. et al. (2011), „Recommendations on the statistical analysis of the Comet assay“, Pharmaceutical Statistics, Vol. 10/6, pp. 485–93.
                              
                           
                                 (61)
                              
                              
                                 Lovell, D.P., T. Omori (2008), „Statistical issues in the use of the Comet assay“, Mutagenesis, Vol. 23/3, pp. 171–82.
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Komeet
                           – nukleoidide kuju pärast elektroforeesi, sarnasuse põhjal komeetidega: pea on tuum ja saba koosneb DNAst, mis on migreerunud tuumast välja elektrivälja toimel.
                        
                           
                              Kriitilise tähtsusega muutuja/näitaja
                           – see on metoodikapõhine muutuja, mille väike muutus võib avaldada suurt mõju katse lõppjäreldusele. Kriitilise tähtsusega muutujad võivad olla koespetsiifilised. Kriitilise tähtsusega muutujaid ei tohiks muuta, eriti ühe katse piires, võtmata arvesse, kuidas nende muutmine mõjutab katses uuritavat reaktsiooni, näiteks positiivse ja negatiivse kontrolliga saadud reaktsiooni ulatust ja varieeruvust. Katseprotokollis tuleks loetleda kõik kriitilise tähtsusega muutujate muutmised katse käigus või võrreldes labori tavalise katse-eeskirjaga ning esitada iga muutmise põhjendus.
                        
                           
                              Leeliseline üksikrakkude geelelektroforees
                           – tundlik meetod esmase DNA-kahjustuse määramiseks üksikraku/-rakutuuma tasandil.
                        
                           
                              Saba intensiivsus või sabas oleva DNA protsent ( %)
                           – see kujutab endast komeedi saba suhtelist intensiivsust, võrreldes summaarse intensiivsusega (pea ja saba kokku). See peegeldab DNA-ahela katkete hulka, mis on väljendatud protsendina.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                        
                           
                              UVCB
                           – tundmatu või muutuva koostisega ained, komplekssed reaktsioonisaadused või bioloogilist päritolu materjalid.
                     
                     
                        2. liide
                        
                           MITME FAKTORI MÄÄRAMIST VÕIMALDAV KATSEPLAAN SUGUDEVAHELISTE ERINEVUSTE KINDLAKSTEGEMISEKS IN VIVO KOMEEDIKATSES
                        
                        
                           Mitme faktori määramist võimaldav katseplaan ja selle analüüs
                        
                        Selle katseplaani korral kasutatakse vähemalt 5 isas- ja 5 emaslooma igal kontsentratsioonitasemel, seega vähemalt 40 looma (20 isas- ja 20 emaslooma, millele lisatakse asjakohased positiivse kontrolli katsed).
                        Kõnealune katseplaan on üks lihtsamaid mitme faktori analüüsi katseplaane ja see on samaväärne kahefaktorilise dispersioonanalüüsiga, milles peamised faktorid on sugu ja kontsentratsioonitase. Andmete analüüsimiseks võib kasutada paljusid statistikatarkvara standardpakette, nt SPSS, SAS, STATA, Genstat, samuti võib kasutada R-keskkonda.
                        Analüüsiga jagatakse andmete dispersioon osadeks: sooga seotud dispersiooniks, kontsentratsiooniga seotud dispersiooniks ja dispersiooniks, mis on seotud soo ja kontsentratsiooni interaktsiooniga. Igaühte nendest liikmetest võrreldakse dispersiooni hinnanguga katses kasutatud samasooliste loomade rühmades samal kontsentratsioonil. Aluseks oleva metoodika täielikud üksikasjad on esitatud paljudes standardsetes statistikaõpikutes (vt viited) ja statistikapakettide help-funktsiooni juhendites.
                        Analüüsis uuritakse edasi interaktsiooniliiget (sugu × kontsentratsion) ANOVA tabelis (35). Olulise interaktsiooniliikme puudumise korral annavad sugudevahelised või kontsentratsioonitasemete vahelised kombineeritud väärtused tasemete vahel kehtivad statistilised testid, mis põhinevad ANOVA rühmasisesel koondatud dispersiooni liikmel.
                        Analüüsi järgmises etapis jaotatakse kontsentratsioonidevahelise dispersiooni hinnang kontrastideks, millega saab testida kemikaali mõju tulemuste lineaarseid kontraste ja ruutkontraste kõigil kontsentratsioonitasemetel. Kui on olemas oluline interaktsioon (sugu × kontsentratsioon), võib ka selle liikme eraldada lineaarse interaktsiooni × sugu kontrastiks ja ruutinteraktsiooni × sugu kontrastiks. Need liikmed kujutavad endast statistilisi teste selle kohta, kas kemikaali mõju on mõlema soo puhul paralleelne või on kemikaalil eri sugudele erinev mõju.
                        Ühe rühma piires koondatud dispersiooni hinnangut saab kasutada keskväärtuste erinevuse paariviisilisteks testideks. Neid võrdlusi võiks teha kahe soo keskväärtuste vahel ja eri kontsentratsioonitasemete keskväärtuste vahel, näiteks võrrelda eri kontsentratsioonitasemete keskväärtusi negatiivse kontrolli väärtustega. Juhul, kui esineb oluline interaktsioon, võib võrrelda samast soost loomade puhul eri kontsentratsioonidega saadud tulemuste keskväärtusi või eri sugudest loomade puhul sama kontsentratsiooniga saadud tulemuste keskväärtusi.
                        
                           Viited
                        
                        Paljudes statistikaõpikutes käsitletakse lihtsast kahe faktori analüüsist kuni katsemetoodika mudelite keerukamate vormideni ulatuvat mitmefaktoriliste mudelite teooriat, katseplaane, metoodikat, analüüsi ja tõlgendamist, mida on kasutatud katsemetoodika kavandamisel. Järgmine loetelu ei ole ammendav. Mõnes raamatus esitatakse võrreldavate katseplaanide praktilised näited, mõnel juhul koos koodiga, kuidas analüüsida tulemusi mitmesuguste tarkvarapakettide abil.
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. ja Hunter, J.S. (1978), Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York; John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. ja Draper, N.R. (1987), Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. ja Davey, A.J.H. (2007), Analysis of Variance and Covariance: How to choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990), The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997), Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971), Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J ja Hamada, M.S. (2009), Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons.
                                 
                              
                     
                        3. liide
                        
                           KATSEMEETODI PRAEGUSED PIIRANGUD
                        
                        Praeguse teadmiste seisu juures on in vivo komeedikatsega seotud mitmed piirangud. Loodetakse, et need piirangud vähenevad või neid saab kitsamalt määratleda, kui meetodi rakendamisega saadakse rohkem kogemusi selle kohta, kuidas katse võimaldab õiguslikus kontekstis anda vastuseid ohutusega seotud küsimustele.
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Mõnda tüüpi DNA-kahjustused võivad olla lühiajalised, st need võidakse parandada liiga kiiresti selleks, et neid saaks vaadelda veel 24 tundi või rohkem pärast viimase doosi manustamist. Ei ole kindlaks tehtud lühiajaliste kahjustuste tüüpide loetelu, samuti ei ole selliste kemikaalide loetelu, mis võivad põhjustada selliseid kahjustusi, samuti ei ole teada, millise aja jooksul seda tüüpi kahjustusi saab tuvastada. Optimaalne proovivõtuaeg võib oleneda kemikaalist või kokkupuuteviisist ja proovivõtuajad tuleks määrata kineetilistest andmetest (näiteks aeg Tmax, millel saavutatakse suurim kontsentratsioon vereplasmas või koes), kui sellised andmed on kättesaadavad. Enamikus käesoleva katsemeetodi aluseks olnud valideerimisuuringutes on kasutatud lahkamisaega 2 või 3 tundi pärast viimase doosi manustamist. Enamikus kirjanduses avaldatud uuringutest on viimane doos manustatud 2–6 tundi enne surmamist. Nende kogemuste põhjal soovitati seepärast katsemeetodis, et kui ei ole andmeid muude aegade kasuks, tuleks viimane doos manustada kindlaksmääratud ajahetkel vahemikus 2–6 tundi enne lahkamist.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Ei ole konkreetseid uuringuandmeid selle kohta, kas katse tundlikkus lühiajaliste DNA-kahjustuste kindlakstegemisel sõltub sööda või joogiveega manustamisest, võrreldes manustamisega toitmissondi abil. Kindlaks on tehtud DNA-kahjustused pärast sööda ja joogiveega manustamist, kuid teateid selliste katsete kohta on suhteliselt vähe; palju rohkem on kogemusi toitmissondiga ja intraperitoneaalse manustamise kohta. Seega võib katse tundlikkus olla vähenenud sööda või joogivee kaudu manustatavate kemikaalide puhul, mis tekitavad lühiajalisi kahjustusi.
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Laboritevahelisi võrdlusuuringuid ei ole tehtud muude kudede kui maksa ja mao puhul, seepärast ei ole koostatud soovitusi, kuidas saavutada tundlikkust ja reprodutseeritavaid tulemusi muude kudede kui maksa puhul, nagu eeldatavaid positiivse ja negatiivse kontrolli vahemiku väärtusi. Ka maksa puhul ei saavutatud kokkulepet, milline peaks olema negatiivse kontrolli väärtuse alampiir.
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Kuigi on olemas hulk avaldatud artikleid, milles näidatakse, et in vitro tsütotoksilisus avaldab segavat toimet, on olemas väga vähe in vivo andmeid ja seepärast ei saa soovitada ühtainsat tsütotoksilisuse näitajat. DNA suurenenud migreerumisega seostatakse selliseid histopatoloogilisi muutusi nagu põletik, rakkude infiltratsioon, apoptootilised või nekrootilised muutused, kuid nagu nähtus JaCVAMi valideerimisuuringust (OECD, 2014), ei põhjusta need muutused alati komeedikatse positiivseid tulemusi ja seega ei ole olemas selliste histopatoloogiliste muutuste kindlat loendit, mis oleksid alati seotud DNA migreerumise suurenemisega. Nn siile (või „pilvi“, „kummitusrakke“) on varem välja pakutud tsütotoksilisuse näitajatena, kuid nn siilide tekkimise etioloogia on ebaselge. On andmeid, mis viitavad sellele, et need võivad olla tingitud kemikaaliga seotud tsütotoksilisusest, mehhaanilisest/ensümaatilisest kahjustusest proovi valmistamise ajal (Guerard jt, 2014) ja/või uuritava kemikaali mingist äärmuslikumast genotoksilisest toimest. Teistest andmetest nähtub, et need tulenevad ulatuslikest, kuid võib-olla parandatavatest DNA-kahjustustest (Lorenzo jt, 2013).
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Kudesid või rakkude tuumasid on edukalt külmutatud hilisemaks analüüsiks. Tavaliselt põhjustab see mõõdetava toime vehiikuli ja positiivse kontrolli katses (Recio jt, 2010; Recio jt, 2012; Jackson jt, 2013). Kui seda kasutatakse, peaks labor tõendama kompetentsust külmutamismeetodite suhtes ja kinnitama, et selliste katseloomade sihtkoes, kellele on manustatud vehiikulit, saavutatakse vastuvõetavalt madal sabas oleva DNA protsent ja et võib siiski veel määrata ka positiivseid vastuseid. Kirjanduses on kirjeldatud kudede külmutamise eri meetodeid. Paraku puudub praegu kokkulepe selle kohta, kuidas kudesid kõige paremini külmutada või sulatada ja kuidas hinnata, kas kemikaali toime võimalik muutumine võib mõjutada katse tundlikkust.
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Üks hiljutine töö näitab, et kriitilise tähtsusega muutujate loetelu eeldatavasti lüheneb ja kriitiliste muutujate parameetreid saab täpsemini määratleda (Guerard jt, 2014).
                                 
                              
                           Viited
                        
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Guerard, M., C. Marchand, U. Plappert-Helbig (2014), „Influence of Experimental Conditions on Data Variability in the Liver Comet Assay“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 55/2, pp. 114–21.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Jackson, P. et al. (2013), „Validation of use of frozen tissues in high-throughput comet assay with fully-automatic scoring“, Mutagenesis, Vol. 28/6, pp. 699–707.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Lorenzo, Y. et al. (2013), „The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead“, Mutagenesis, Vol. 28/4, pp. 427–32.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    OECD (2014), „Reports of the JaCVAM initiative international pre-validation and validation studies of the in vivo rodent alkaline comet assay for the detection of genotoxic carcinogens“, Series on Testing and Assessment, Nos. 195 and 196, OECD Publishing, Paris.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Recio L, Hobbs C, Caspary W, Witt KL, (2010), „Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus (MN) and Comet assay protocol“, J. Toxicol. Sci. 35:149–62.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Recio, L. et al. (2012), „Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues“, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 53/2, pp. 101–13.
                                 
                              “
               
                     16)
                  
                  
                     C osas asendatakse peatükk C.13 järgmisega:
                     „C.13.   Bioakumuleerumine kalades: kokkupuude vee ja toidu kaudu
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 305 (2012). Katsemeetodi muutmisel on kaks põhieesmärki. Esiteks soovitakse seda täiendada toidu kaudu bioakumuleerumist (36) käsitleva meetodiga, mis sobib vees väga vähe lahustuvate ainete võimaliku bioakumuleerumise tuvastamiseks. Teiseks soovitakse välja töötada katsemeetod, mille puhul loomade heaolu huvides kasutatakse võimaluse korral vähem kalu ja mis on kulutõhusam.
                     Konsolideeritud katsemeetodi C.13 (1) vastuvõtmisele järgnenud aastatel on tehtud katseid paljude ainetega ja saadud märkimisväärseid kogemusi nii laborites kui ka reguleerivates asutustes. See on viinud veendumusele, et meetodi keerukust saab konkreetsetele kriteeriumidele vastavuse korral (vt punkt 88) vähendada ning on võimalik kasutada astmelist lähenemisviisi. Samuti ilmneb kogemustest, et sellised bioloogilised tegurid nagu kalade kasv ja lipiidisisaldus võivad tulemustele tugevat mõju avaldada ja neid võib olla vaja arvesse võtta. Peale selle on jõutud arusaamisele, et vees väga raskesti lahustuvate ainetega katsete tegemine ei pruugi olla tehniliselt teostatav. Lisaks võib vees väga vähe lahustuvate ainete puhul olla veekaudne kokkupuude veekeskkonnas väiksema tähtsusega kui kokkupuude toidu kaudu. Sellest tulenevalt on välja töötatud katsemeetod, mille puhul kalade kokkupuude toimub toidu kaudu (vt punktid 7–14 ja alates punktist 97). Toidu kaudu kokkupuudet käsitleva katsemeetodi valideerimine (laboritevaheline võrdlusuuring) viidi läbi 2010. aastal (51).
                     Peamised muudatused hõlmavad järgmist.
                     
                                 —
                              
                              
                                 Kui on tõenäoline, et biokontsentratsioonitegur (BCF) on katsekontsentratsioonist sõltumatu, võib ainult ühe katsekontsentratsiooni kasutamist katses lugeda piisavaks.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Teatavatele kriteeriumidele vastavuse korral on võimalik kasutada veekaudse kokkupuute määramiseks minimeeritud katseplaani, mille puhul proovivõtupunktide arv on väiksem.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Tuleks määrata kalade lipiidisisaldus, et biokontsentratsioonitegurit oleks võimalik väljendada lähtuvalt lipiidisisaldusest 5 %.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Statsionaarset olekut iseloomustava biokontsentratsiooniteguri hindamise kõrval on pandud suuremat rõhku biokontsentratsiooniteguri kineetika hindamisele (kui see on võimalik).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Teatava rühma ainete puhul nähakse ette toidukaudse kokkupuute katse juhtudel, mil seda peetakse asjakohasemaks kui veekaudse kokkupuute katset.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Tuleks määrata kalade mass, et BCFk-d oleks võimalik korrigeerida kasvust tingitud lahjenemise suhtes.
                              
                           Enne mis tahes bioakumuleerumiskatse alustamist peaksid uuritava aine kohta olema teada järgmised andmed:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 analüüsimeetodi tundlikkus uuritava aine ja selle võimalike metaboliitide sisalduse määramisel kudedes, samuti vees või toidus (vt punkt 65);
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 lahustuvus vees (katsemeetod A.6; (2)); see tuleks määrata vastavalt meetodile, mis on asjaomase (hinnangulise) lahustuvusvahemiku jaoks sobiv ja tagab usaldusväärse tulemuse. Hüdrofoobsete ainete puhul kasutatakse üldjuhul kolonnist elueerimisel põhinevat meetodit;
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 süsteemi n-oktanool/vesi iseloomustav jaotuskoefitsient K
                                    OW
                                     (37) (katsemeetodid A.8 (4), A.24 (5) ja A.23 (6)) või muu asjakohane teave jaotumisega seotud omaduste kohta (näiteks sorbeerumine lipiididele – K
                                    OC); see tuleks määrata vastavalt meetodile, mis on K
                                    OW asjaomase (hinnangulise) vahemiku jaoks sobiv ja tagab usaldusväärse tulemuse. Hüdrofoobsete ainete puhul kasutatakse üldjuhul aeglasel segamisel põhinevat meetodit (katsemeetod A.23 (6));
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 aine püsivus vees (hüdrolüüs – katsemeetod C.7 (7));
                              
                           
                                 e)
                              
                              
                                 aine püsivus toidus (kui konkreetselt on valitud lähenemisviis, mis põhineb toidukaudse kokkupuute hindamise meetodil);
                              
                           
                                 f)
                              
                              
                                 fotokeemilist muundumist käsitlevad andmed, mis on katses kasutatavaid kiirgustingimusi silmas pidades asjakohased (8);
                              
                           
                                 g)
                              
                              
                                 pindpinevus (ainete puhul, mille log K
                                    OW-d ei ole võimalik määrata) (katsemeetod A.5 (9));
                              
                           
                                 h)
                              
                              
                                 aururõhk (katsemeetod A.4 (10));
                              
                           
                                 i)
                              
                              
                                 vajaduse korral kõik andmed aine biootilise ja abiootilise vees lagunemise kohta, näiteks (kuid mitte ainult) kiire biolagundatavuse kohta (katsemeetod C.4, II–VII osa (11), ja katsemeetod C.29 (12));
                              
                           
                                 j)
                              
                              
                                 vajaduse korral teave metaboliitide kohta: struktuur, log K
                                    OW, teke ja lagundatavus;
                              
                           
                                 k)
                              
                              
                                 happe dissotsiatsioonikonstant (pK
                                    a) ainete puhul, mis võivad ioniseeruda. Kui see on katsealuse kalaliigi puhul vastuvõetav, tuleks vajaduse korral katses kasutatava vee pH-d reguleerida, et tagada katses aine esinemine ioniseerimata kujul.
                              
                           Käesolevas katsemeetodis kirjeldatakse valitud kokkupuuteviisist ja proovivõtukorrast sõltumatut korda aine võimaliku kalades bioakumuleerumise hindamiseks. Ehkki kindlasti tuleks eelistada läbivoolurežiimi, on katses lubatud kasutada ka poolstaatilist režiimi, kui nõuetekohasuse kriteeriumid (vt punktid 24 ja 113) on täidetud. Toidukaudse kokkupuute hindamisel ei pea kasutama läbivoolusüsteemi, et säilitada uuritava aine sisaldust vees, kuid see hõlbustab lahustunud hapniku sisalduse hoidmist vajalikul tasemel ning aitab tagada vee puhtust ja kõrvaldada näiteks eritiste mõju.
                     Käesolevas katsemeetodis esitatakse valitud konkreetsest meetodist sõltumatu piisavalt üksikasjalik katse läbiviimise kirjeldus, ent jäetakse samas piisavalt vabadust katseplaani kohandamiseks vastavalt konkreetse labori tingimustele ja konkreetse uuritava aine omadustele. Veekaudse kokkupuute katset on kõige asjakohasem kasutada püsivate orgaaniliste ainete puhul, mille log K
                        OW väärtus on vahemikus 1,5–6,0 (13), kuid seda võib kasutada ka väga hüdrofoobsete ainete puhul, mille log K
                        OW > 6,0, kui on võimalik tõendada, et uuritav aine on teataval kontsentratsioonil vees täielikult lahustunud ja selline kontsentratsioon on püsiv. Kui ei ole võimalik tõendada, et uuritava aine sisaldus vees on püsiv, ei ole veekaudse kokkupuute katse asjakohane ning oleks vaja kasutada lähenemisviisi, mis põhineb kalade kokkupuutel ainega toidu kaudu (ehkki toidukaudse kokkupuute katse tulemuste tõlgendamine ja kasutamine võib sõltuda konkreetsest õigusraamistikust). Orgaaniliste ainete puhul, mille log K
                        OW on kuni umbes 9,0, võib biokontsentratsiooniteguri (BCF, vahel tähistatud ka kui K
                        B) hinnangulise väärtuse leidmiseks kasutada võrrandit, mille on avaldanud Bintein et al. (14). Selliste väga hüdrofoobsete ainete biokontsentratsiooniteguri hinnanguline väärtus võib olla suurem kui laborikatsetes eeldatavalt saadav biokontsentratsioonitegur statsionaarses olekus (BCFSS), eriti juhul, kui kõnealuse hinnangulise väärtuse leidmiseks kasutatakse lihtsat lineaarset mudelit. Võimalikku bioakumuleerumist iseloomustavad parameetrid hõlmavad aine omastamise kiiruskonstanti (k
                        1), aine kao kiiruskonstante, sealhulgas puhastumise kiiruskonstanti (k
                        2), biokontsentratsioonitegurit statsionaarses olekus (BCFSS), kineetilist biokontsentratsioonitegurit (BCFK) ja toidu kaudu biokuhjumise tegurit (BMF) (38).
                     Uuritava aine radioaktiivne märgistamine võib hõlbustada vee-, toidu- ja kalaproovide analüüsimist ja selle abil võib kindlaks teha, kas metaboliitide tuvastamine ja kvantifitseerimine on vajalik. Kui mõõdetakse üksnes radioaktiivsete jääkide üldsisaldust (näiteks põletamise või kudede solubiliseerimise abil), leitakse BCF või BMF lähteaine, kõikide allesjäänud metaboliitide ja assimileerunud süsiniku summaarse sisalduse põhjal. Radioaktiivsete jääkide üldsisaldusel põhinevad BCFi või BMFi väärtused ei pruugi seepärast olla otseselt võrreldavad üksnes lähteaine suhtes spetsiifilise keemilise analüüsi põhjal saadud BCFi või BMFi väärtustega. Radioaktiivse märgistamise uuringutes võib enne analüüsimist kasutada selliseid lahutamismeetodeid nagu õhekihikromatograafia, HPLC (39) või gaaskromatograafia, et määrata BCF või BMF lähteaine põhjal. Lahutamismeetodi kasutamise korral tuleks tuvastada ja kvantifitseerida nii lähteaine kui ka asjakohased metaboliidid (40) (vt punkt 65), kui BCFi või BMFi arvutamisel soovitakse aluseks võtta mitte radioaktiivselt märgistatud jääkide üldsisaldus, vaid lähteaine sisaldus kalas. Samuti on võimalik ühendada bioakumuleerumise uuring kala metabolismi või aine in vivo jaotumise uuringuga ning tuvastada ja analüüsida kudedes esinevaid jääke. Võimaliku metabolismi prognoosimiseks võib kasutada sobivaid vahendeid (nt OECD QSAR-meetodite pakett (15) ja omandiõigusega kaitstud QSAR-programmid).
                     Selle üle otsustamisel, kas teha veekaudse või toidukaudse kokkupuute katse ja millise katseplaani alusel, tuleks lähtuda punktis 3 kirjeldatud aspektidest ja kaaluda neid asjaomase õigusraamistiku kontekstis. Näiteks tuleks ainete puhul, mille log K
                        OW on suur, kuid mille lahustuvus vees on olemasolevate analüüsimeetodite tundlikkust silmas pidades siiski arvestatav, kaaluda kõigepealt veekaudse kokkupuute katse tegemist. On siiski võimalik, et teave selliste hüdrofoobsete ainete vees lahustuvuse kohta ei ole põhjalik, mistõttu enne konkreetse katsemeetodi kasutamise üle otsuse langetamist tuleks uurida, kas on võimalik valmistada asjaomase aine püsiva, mõõdetava sisaldusega vesilahus (püsiv emulsioon ei ole lubatud), mida saaks kasutada veekaudse kokkupuute katses (16). Ei ole võimalik anda täpseid suuniseid sobiva katsemeetodi valimiseks lähtuvalt vees lahustuvuse ja süsteemis oktanool/vesi täheldatava jaotuskoefitsiendi piirkriteeriumidest, kuna eespool kirjeldatud põhjustel võivad muud tegurid (analüüsimeetod, lagunemine, adsorptsioon jne) avaldada märkimisväärset mõju katsemeetodi kohaldatavusele. Siiski võib öelda, et selliste ainete puhul, mille log K
                        OW väärtus on üle 5 ja vees lahustuvus alla ~ 0,01–0,1 mg/l, võib veekaudse kokkupuute hindamine muutuda üha raskemaks.
                     Tuleks kaaluda ka muid tegureid, mis võivad mõjutada katsemeetodi valikut, sealhulgas aine võimalikku adsorbeerumist katsenõudele ja -seadmetele, selle püsivust vesilahuses, võrrelduna püsivusega kalasöödas (17, 18), jne.
                     Teave selliste praktiliste aspektide kohta võib olla kättesaadav muudest veekaudset kokkupuudet käsitlevatest lõpuleviidud uuringutest. Täiendavat teavet bioakumuleerumise uuringute teostamisega seotud aspektide hindamise kohta võib leida kirjandusest (nt viide 19).
                     Ainete puhul, mille lahustuvus või kontsentratsiooni püsivus vees ja sellise kontsentratsiooni mõõtmine ei sea mingeid piiranguid veekaudse kokkupuute meetodi kasutamisele, tuleb aine võimaliku biokontsentreerumise hindamisel eelistada seda meetodit. Igal juhul tuleks veenduda, et veekaudsel kokkupuutel kasutatav(ad) kontsentratsioon(id) on aine katsekeskkonnas lahustuvuse vahemikus. Lahustunud uuritava aine püsiva sisalduse tagamiseks võib kasutada eri meetodeid, mis põhinevad näiteks põhilahuste kasutamisel või passiivsel doseerimissüsteemil (nt kolonnist elueerimise meetod), tingimusel, et on võimalik tõendada, et sealjuures säilitatakse püsiv kontsentratsioon ja punktis 27 esitatud soovituste kohane katsekeskkond ei muutu.
                     Väga hüdrofoobsete ainete puhul (log K
                        OW > 5 ja lahustuvus alla ~ 0,01–0,1 mg/l) võib veekaudse kokkupuute hindamine muutuda üha raskemaks. Sellega seotud piirangud võivad tuleneda asjaolust, et aine sisaldust vees ei ole võimalik hoida piisavalt püsivana (nt kokkupuutekatses kasutatavate nõude klaaspinnale sorbeerumise või kiire kalades omastamise tõttu), või sellest, et vesilahuses kasutatavad kontsentratsioonid on nii väikesed, et on võrreldavad analüütilise määmispiiriga või jäävad sellest allapoole (41). Selliste väga hüdrofoobsete ainete puhul soovitatakse kasutada toidukaudse kokkupuute meetodit, kui see on kooskõlas asjaomase õigusraamistikuga ja riskihindamise aluseks olevate vajadustega.
                     Pindaktiivsete ainete puhul tuleks kaaluda, kas veekaudse biokontsentreerumise katse on aine omadustest lähtuvalt teostatav; toidukaudse kokkupuute katse on selliste ainete puhul tõenäoliselt asjakohasem. Pindaktiivsed ained vähendavad pindpinevust kahe vedeliku piirpinnal. Tänu nende amfifiilsusele (st nad sisaldavad nii hüdrofiilset kui ka hüdrofoobset osa) kogunevad need ained piirpinnale, näiteks vee ja õhu või vee ja toidu piirpinnale või klaasseinale, see aga takistab nende sisalduse määramist vees.
                     Toidukaudse kokkupuute katse võimaldab hoiduda mõnest kokkupuutega seotud probleemist keerukate segude puhul, mille koostisainete lahustuvus vees on erinev, kuna võrreldaval tasemel kokkupuute saavutamine kõikide segu koostisainetega on sellises katses tõenäolisem kui veekaudse kokkupuute meetodi puhul (vt viide 20).
                     Tuleks märkida, et toidukaudse kokkupuute puhul leitakse biokontsentratsiooniteguri (BCF) asemel biokuhjumistegur (BMF) (42) On välja töötatud lähenemisviisid kineetilise biokontsentratsiooniteguri (BCFK) hinnangulise väärtuse leidmiseks toidukaudse kokkupuute katses saadud andmete põhjal (nagu on kirjeldatud 8. liites), kuid selliste lähenemisviiside kasutamisel tuleks olla ettevaatlik. Kõnealuste lähenemisviiside puhul lähtutakse üldjuhul esimest järku reaktsiooni kineetikast ja need on kohaldatavad üksnes teatud kindlatesse rühmadesse kuuluvate ühendite puhul. On ebatõenäoline, et selliseid lähenemisviise on võimalik kohaldada pindaktiivsete ainete puhul (vt punkt 12).
                     Veekaudse kokkupuute määramisel tuleks loomade arvu ja/või ressursside vähendamiseks ette nähtud minimeeritud katseplaani, mille puhul proovivõtupunktide arv on väiksem (vt alates punktist 83), kohaldada üksnes juhul, kui on põhjust eeldada, et asjaomase aine omastamine ja sellest puhastumine toimub ligikaudu vastavalt esimest järku reaktsiooni kineetikale (st üldjuhul on tegu ioniseerumata orgaaniliste ainetega; vt punkt 88).
                     C.13 – I:   Veekaudsel kokkupuutel biokontsentreerumise katse kaladega
                     
                     KATSE PÕHIMÕTE
                     Katse hõlmab kahte etappi: kokkupuutumise (omastamise) etapp ja kokkupuutejärgne (puhastumise) etapp. Omastamisetapis viiakse rühm ühe liigi kalu kokkupuutesse uuritava ainega, mis esineb aine omadustest sõltuvalt ühel või mitmel valitud kontsentratsioonil (vt punkt 49). Seejärel viiakse kalad puhastumisetapiks keskkonda, mis ei sisalda uuritavat ainet. Puhastumisetapp on alati vajalik, välja arvatud juhul, kui omastamisetapis omastatakse ainet tühises koguses. Uuritava aine kontsentratsiooni kalas või kala pinnal (või kala teatavates kudedes) jälgitakse katse kummagi etapi kestel. Peale ainega kokkupuutuva rühma kasutatakse kontrollrühma, milles kalu hoitakse identsetes tingimustes, kuid ilma uuritava aineta, et oleks võimalik võrrelda biokontsentreerumise katses täheldatud võimalikku ebasoodsat mõju vastava kontrollrühma näitajatega ja teha kindlaks uuritava aine taustsisaldus (43).
                     Veekaudse kokkupuute katses on omastamisetapi kestus tavaliselt 28 päeva. Seda kestust võib vajaduse korral pikendada (vt punkt 18) või ka lühendada, kui on tõendatud, et statsionaarne olek saavutatakse varem (mõisted ja ühikud on määratletud 1. liites). Omastamisetapi kestust ja statsionaarse oleku saavutamiseks vajalikku aega saab hinnata 5. liites esitatud võrrandite abil. Seejärel algab puhastumisetapp, mille vältel kalad ei puutu enam kokku uuritava ainega; selleks viiakse kalad üle puhtasse nõusse, mis sisaldab sama katselahust, kuid ilma uuritava aineta. Võimaluse korral arvutatakse biokontsentratsioonitegur, soovitatavalt nii kalades mõõdetud kontsentratsiooni (C
                        f) ja vees mõõdetud kontsentratsiooni (C
                        w) suhtarvuna statsionaarses olekus (BCFSS; mõiste määratlus on esitatud 1. liites) kui ka kineetilise biokontsentratsioonitegurina (BCFK; mõisted ja ühikud on määratletud 1. liites), mis väljendab omastamise kiiruskonstandi (k
                        1) ja puhastumise kiiruskonstandi (k
                        2) suhet ning mille puhul eeldatakse esimest järku reaktsiooni kineetikat (44).
                     Kui 28 päeva jooksul ei saavutata statsionaarset olekut, võib arvutada BCFi kineetilise lähenemisviisi abil (vt punkt 38) või pikendada omastamisetappi. Kui statsionaarse oleku saavutamiseks vajalik omastamisetapp on ebamõistlikult pikk (vt punktid 37 ja 38 ning 5. liide), tuleks eelistada kineetilist lähenemisviisi. Teise võimalusena tuleks väga hüdrofoobsete ainete puhul kaaluda toidukaudse kokkupuute katse tegemist (45), kui see on kooskõlas asjaomase õigusraamistikuga.
                     Omastamise kiiruskonstant, puhastumise (kao) kiiruskonstant (või keerulisemate mudelite puhul konstandid), biokontsentratsioonitegur (statsionaarses olekus ja/või kineetiline) ja võimaluse korral iga nimetatud parameetri usalduspiirid arvutatakse mudelist, mis kirjeldab kõige paremini uuritava aine mõõdetud kontsentratsioone kalades ja vees (vt 5. liide).
                     Kalade kehamassi suurenemine katse vältel põhjustab uuritava aine sisalduse vähenemise kasvavates kalades (nn kasvust tingitud lahjenemine), mistõttu kineetilise BCFi väärtust alahinnatakse juhul, kui seda ei korrigeerita kasvu suhtes (vt punktid 72 ja 73).
                     BCF põhineb aine üldsisaldusel kalades (st kalade summaarsel märgmassil). Eriotstarbel võib siiski kasutada ka kindlaksmääratud kudesid või organeid (näiteks lihaskude, maks), kui kalad on piisavalt suured, või jagada kala söödavaks (filee) ja mittesöödavaks (sisikond) osaks. Kuna paljude orgaaniliste ainete biokontsentreerumise määra ja hüdrofoobsuse vahel on selge seos, on vastav seos ka uuritavate kalade lipiidisisalduse ja selliste ainete täheldatava biokontsentreerumise vahel. Seega tuleks kõnealuste väga lipofiilsete ainetega (log K
                        OW > 3) tehtavates katsetes sellest asjaolust tuleneva tulemuste varieeruvuse vähendamiseks kasutada biokontsentreerumise väljendamiseks peale katses otseselt saadud väärtuse ka normaliseeritud väärtust, mille aluseks on võetud kala lipiidisisaldus 5 % (terve kala märgmassist). See on vajalik selleks, et eri ainete ja/või katsealuste liikidega saadud tulemusi oleks võimalik omavahel võrrelda. Valitud lipiidisisaldus 5 % on laialdaselt kasutusel, kuna see väljendab käesolevas katsemeetodis tavapäraselt kasutatavate kalade keskmist lipiidisisaldust (21).
                     TEAVE UURITAVA AINE KOHTA
                     Peale sissejuhatuses punktis 3 kirjeldatud uuritava aine omaduste hõlmab nõutav teave ka aine mürgisust katses kasutatavale kalaliigile, soovitatavalt asümptootilist (st ajast sõltumatut) LC50, ja/või kaladega tehtud pikaajaliste katsete põhjal hinnatud mürgisust (nt katsemeetodid C.47 (22), C.15 (23) ja C.14 (24)).
                     Uuritava aine kvantitatiivse sisalduse määramiseks katselahustes ja bioloogilises materjalis peaks olema kättesaadav teadaoleva mõõtetäpsusega, kordustäpsusega ja tundlikkusega asjakohane meetod koos üksikasjaliku kirjeldusega proovi ettevalmistamise ja säilitamise kohta. Samuti peaks olema teada uuritava aine analüütiline määramispiir vees ja kalakudedes. Radioaktiivselt märgistatud uuritava aine kasutamise korral peaks see olema võimalikult puhas (soovitatavalt puhtusega > 98 %) ja peaks olema teada lisanditega seotud radioaktiivsuse protsentuaalne osakaal.
                     KATSE NÕUETEKOHASUS
                     Katse vastab nõuetele, kui on täidetud järgmised tingimused:
                     
                                  
                              
                              
                                 veetemperatuuri varieeruvus on väiksem kui ± 2 °C, kuna suured kõrvalekalded võivad mõjutada omastamise ja puhastumise puhul olulisi bioloogilisi parameetreid ning põhjustada loomadele stressi;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 lahustunud hapniku sisaldus ei lange alla 60 % küllastuskontsentratsioonist;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 uuritava aine kontsentratsiooni hoitakse omastamisetapi vältel kambrites vahemikus ± 20 % mõõtmistulemuste keskväärtusest;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 uuritava aine sisaldus on väiksem kui selle lahustuvus vees; seejuures võetakse arvesse katses kasutatava vee võimalikku mõju tegelikule lahustuvusele (46)
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 suremus või kahjuliku mõju või haiguse osakaal kontroll- ja katserühma kalade hulgas on katse lõpus väiksem kui 10 %; kui katset pikendatakse mitme nädala või kuu võrra, peaks suremus või kahjuliku mõju osakaal kummaski kalade rühmas olema väiksem kui 5 % kuus ja kokku maksimaalselt 30 %. Oluline erinevus katserühma(de)st ja kontrollrühmast analüüsimiseks võetud kalade kasvukiiruses võib viidata uuritava aine mürgisele toimele.
                              
                           VÕRDLUSAINED
                     Teadaoleva biokontsentreerumise määraga ja aeglaselt metaboliseeruvate võrdlusainete kasutamine hõlbustab katsemeetodi kontrollimist, kui see on nõutav (näiteks kui laboris ei ole sellist katset varem läbi viidud või kui katsetingimused on muutunud).
                     MEETODI KIRJELDUS
                     
                        Seadmed
                     
                     Tuleks jälgida, et katseseadmete mis tahes osade puhul ei kasutata materjale, mis võivad lahustuda, sorbeerida või leostuda ning avaldada kaladele kahjulikku mõju. Võib kasutada keemiliselt inertsest materjalist standardseid ristkülikukujulisi või silindrikujulisi mahuteid, mille mahutavus on kooskõlas biomassisisaldusega (vt punkt 43). Pehmeid plasttorusid tuleks kasutada võimalikult vähe. Kasutada tuleks polütetrafluoroetüleenist, roostevabast terasest ja/või klaasist torusid. Kogemustest nähtub, et suure adsorptsiooniteguriga ainete, näiteks sünteetiliste püretroidide puhul võib olla vaja kasutada silaanitud klaasi. Sellisel juhul tuleks seadmed pärast kasutamist ära visata. Enne katseorganismide viimist katsesüsteemi on soovitatav lasta süsteemil puutuda kokku katses kasutatavatel kontsentratsioonidel esineva uuritava ainega nii kaua, kui on vaja kokkupuutekontsentratsioonide püsivuse tõendamiseks.
                     
                        Vesi
                     
                     Üldjuhul kasutatakse katses looduslikku vett, mis peaks pärinema saastumata ja ühtlase kvaliteediga allikast. Püsiva ühtlase kvaliteedi tagamiseks võib siiski olla otstarbekam kasutada taastatud vett (st demineraliseeritud vett, millele on lisatud teadaolev kogus teatud kindlaid toitaineid). Lahjendusvesi – st vesi, millesse segatakse uuritav aine enne katsenõusse viimist (vt punkt 30) – peaks olema sellise kvaliteediga, mis võimaldab valitud liigi kaladel kohanemis- ja katseperioodi vältel ellu jääda, ilma et neil täheldataks mingeid ebanormaalse välimuse või käitumise ilminguid. Ideaaljuhul tuleks tõendada, et katses kasutatava liigi kalad jäävad lahjendusvees ellu, kasvavad ja paljunevad (näiteks laborikultuuris või elutsüklit hõlmavas mürgisuskatses). Lahjendusvee kohta peaks teada olema vähemalt selle pH, karedus, tahkete osakeste üldsisaldus ja orgaanilise süsiniku üldsisaldus (47) ning soovitatavalt ka ammooniumisisaldus, nitritisisaldus ja mereliikide puhul soolsus. Kalade heaolu seisukohalt olulised parameetrid ei ole lõpuni teada, kuid 2. liites on esitatud mitme koostisaine soovitatav maksimumkontsentratsioon mageda ja soolase katsevee puhul.
                     Lahjendusvesi peaks olema katseperioodi kestel püsiva kvaliteediga. Vee pH peaks olema katses alguses vahemikus 6,0–8,5 ning ei tohiks konkreetse katse ajal varieeruda rohkem kui ± 0,5 ühikut. Selle tagamiseks, et lahjendusvesi ei mõjutaks liigselt katsetulemusi ega põhjustaks näiteks uuritava ainega komplekside moodustumist või avaldaks negatiivset mõju kalade seisundile, tuleks kindlate ajavahemike järel, ent vähemalt katse alguses ja lõpus võtta analüüsimiseks veeproove. Kui lahjendusvesi on teadaolevalt suhteliselt püsiva kvaliteediga, tuleks raskmetallide (näiteks Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ja Ni), peamiste anioonide ja katioonide (näiteks Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– ja SO42–) ning pestitsiidide sisaldus (näiteks fosfororgaaniliste ja kloororgaaniliste pestitsiidide üldsisaldus), orgaanilise süsiniku üldsisaldus ja hõljuvaine sisaldus määrata näiteks iga kolme kuu järel. Kui on tõendatud, et vee kvaliteet on vähemalt ühe aasta jooksul püsiv, võib neid määramisi teha harvem (nt iga kuue kuu järel).
                     Lahjendusvee looduslik tahkete osakeste sisaldus ja orgaanilise süsiniku üldsisaldus peaks olema võimalikult väike, et hoida ära uuritava aine adsorbeerumist orgaanilisele ainele, kuna see võib vähendada uuritava aine biosaadavust ja põhjustada BCFi väärtuse alahindamist. Vastuvõetav tahkete osakeste maksimumsisaldus on 5 mg/l (kuivaine, mis ei läbi 0,45 μm filtrit) ja orgaanilise süsiniku üldsisaldus 2 mg/l (vt 2. liide). Vajaduse korral tuleks lahjendusvett enne kasutamist filtrida. Katsealuste kalade (väljaheited) ja toidujääkide põhjustatud orgaanilise süsiniku sisalduse suurenemine peaks olema võimalikult väike (vt punkt 46).
                     
                        Katselahused
                     
                     Valmistatakse uuritava aine sobiva kontsentratsiooniga põhilahus. Põhilahus tuleks soovitatavalt valmistada lihtsalt uuritava aine segamise või loksutamisega lahjendusvees. Teise võimalusena on mõnel juhul asjakohane kasutada tahkest faasist desorbeerumisel põhinevat doseerimissüsteemi. Lahusti või dispergeeriva aine kasutamine ei ole üldjuhul soovitatav (vt viide 25); sellise aine kasutamine sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse valmistamiseks võib siiski olla vastuvõetav, kuid tuleks tagada, et seda kasutatakse võimalikult väikeses koguses ning ei ületata kriitilist mitsellitekke kontsentratsiooni (kui see on asjakohane). Lahustina võib kasutada atsetooni, etanooli, metanooli, dimetüülformamiidi ja trietüleenglükooli; dispergeeriva ainena on kasutatud Tween 80, metüültselluloosi kontsentratsioonis 0,01 % ja HCO-40. Lahusti kontsentratsioon lõplikus katsekeskkonnas peaks olema kõikides uuritava ainega rühmades sama (st uuritava aine kontsentratsioonist sõltumatu) ning ei tohiks ületada asjaomase lahusti puhul konkreetsetes katsetingimustes määratud mürgisusläve. Suurim lubatud sisaldus on 100 mg/l (või 0,1 ml/l). On ebatõenäoline, et kontsentratsioonis 100 mg/l esinev lahusti muudab oluliselt katsekeskkonnas saavutatavat uuritava aine lahustuvust (25). Lahustist ja uuritavast ainest tulenev muutus katses kasutatavas vees esineva orgaanilise süsiniku üldsisalduses peaks olema teada. Orgaanilise süsiniku üldsisaldus ei tohiks katsenõudes kogu katse kestel ületada uuritavast ainest ja lahusti või dispergeeriva aine kasutamise korral (48) sellisest ainest pärineva orgaanilise süsiniku sisaldust rohkem kui 10 mg/l (± 20 %) võrra. Orgaanilise aine sisaldus võib kaladega tehtavas läbivoolukatses oluliselt mõjutada lahuses vabalt esineva uuritava aine kogust, eelkõige väga lipofiilsete ainete puhul. Tahke faasi abil mikroekstraheerimine (vt punkt 60) võib anda olulist teavet ühendi seondunud fraktsiooni ja lahuses vabalt esineva fraktsiooni suhtarvu kohta; lahuses vabalt esinevat fraktsiooni käsitletakse biosaadava fraktsioonina. Uuritava aine sisaldus peaks lahusti või dispergeeriva aine kasutamisest olenemata olema väiksem kui uuritava aine lahustuvus katsekeskkonnas. Kergesti biolagundatavate lahustite kasutamisel tuleks olla ettevaatlik, kuna need võivad läbivoolukatses põhjustada bakterite kasvuga seotud probleeme. Kui põhilahuse valmistamine ilma lahusti või dispergeeriva aineta ei ole võimalik, tuleks kaaluda veekaudse kokkupuute katse asjakohasust toidukaudse kokkupuute katsega võrreldes.
                     Läbivoolukatsete puhul on katsekambrites rea eri kontsentratsioonide tekitamiseks vaja kasutada süsteemi, kus uuritava aine põhilahust lisatakse ja lahjendatakse pidevalt (nt dosaatorpumba, proportsionaalse lahjendamise seadme või küllastamissüsteemiga), või tahkest faasist desorbeerumisel põhinevat doseerimissüsteemi. Igas katsekambris olev lahus peaks soovitatavalt vahetuma päevas vähemalt viiekordses mahus. Soovitatakse kasutada läbivoolurežiimi, kuid kui see ei ole võimalik (näiteks kui see mõjub katseorganismidele kahjulikult), võib kasutada poolstaatilist meetodit, eeldusel, et nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud (vt punkt 24). Põhilahuste ja lahjendusvee voolukiirust tuleks kontrollida 48 tundi enne katset ja seejärel katse vältel vähemalt kord päevas. Kõnealuse kontrollimise käigus määratakse igas katsekambris ka seda läbiva lahuse voolukiirus ja veendutakse, et see ei varieeru ühes katsekambris ja katsekambrite vahel rohkem kui 20 %.
                     
                        Liigi valimine
                     
                     Liigi valimisel on olulised kriteeriumid kättesaadavus, sobiv suurus ja võimalus kalu laboritingimustes rahuldavalt pidada. Muud kriteeriumid kalaliigi valimisel on muuhulgas liigi tähtsus majanduslikust, ökoloogilisest ja vaba aja veetmise seisukohast, samuti võrdluseks sobiv tundlikkus, varasemad eduka kasutamise kogemused jne. Soovitatavad katseliigid on esitatud 3. liites. Võib kasutada ka muid liike, kuid selleks võib olla vaja kohandada katsemenetlust, et luua sobivad katsetingimused. Sellisel juhul tuleb liigi ja katsemeetodi valikut põhjendada. Üldiselt lühendab väiksema kalaliigi kasutamine statsionaarse oleku saavutamise aega, kuid lipiidisisalduse ja uuritava aine sisalduse nõuetekohaseks analüüsimiseks kalades võib olla vaja rohkem kalu (proove). Peale selle on võimalik, et eri katsetes ja eri liikidega saadud tulemuste võrdlemist raskendavad erinevused noorte ja vanemate kalade hingamiskiiruses ja metabolismis. Tuleks silmas pidada, et kui katse tehakse kalade arengujärgus, kus kasv on kiire (noorjärk), võib see raskendada andmete tõlgendamist.
                     
                        Kalade pidamine (nii veekaudse kui ka toidukaudse kokkupuute jaoks)
                     
                     Kalade lähtepopulatsioonil tuleks lasta kohaneda vähemalt kaks nädalat katsetemperatuuril olevas vees (vt punkt 28) ja neile tuleks anda kogu selle aja vältel piisavalt sööta (vt punkt 45). Vesi ja sööt peavad olema sama tüüpi kui katses kasutatavad vesi ja sööt.
                     Pärast 48 tunni pikkust harjumisperioodi registreeritakse surmajuhtumid ja kohaldatakse järgmisi kriteeriume:
                     
                                 —
                              
                              
                                 kui suremus on populatsioonis seitsme päeva jooksul suurem kui 10 %, jäetakse kogu partii kõrvale;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kui suremus populatsioonis on seitsme päeva jooksul 5–10 %, lastakse kaladel kohaneda veel seitse päeva; kui kõnealuse järgmise seitsme päeva jooksul on suremus suurem kui 5 %, jäetakse kogu partii kõrvale;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kui suremus populatsioonis on seitsme päeva jooksul väiksem kui 5 %, loetakse partii vastuvõetavaks.
                              
                           Katses kasutatavatel kaladel ei tohi esineda nähtavaid haigusi ega kõrvalekaldeid. Kõik haiged kalad tuleks kõrvale jätta. Katsele eelneva kahe nädala vältel ja katse ajal ei tohiks kaladel haigusi ravida.
                     KATSE KÄIK
                     
                        Eelkatse
                     
                     Katse tingimuste optimeerimiseks võib olla kasulik teha eelkatse, et valida näiteks uuritava aine kontsentratsioon(id) ning omastamisetapi ja puhastumisetapi kestus või teha kindlaks, kas katse tegemine täismahus on vajalik. Eelkatse plaan peaks võimaldama saada eelkatsest vajalikud andmed. Võib kaaluda, kas BCFi leidmiseks võib piisata miinimumkatsest või on vaja teha täismahus uuring (miinimumkatse kohta vt punktid 83–95).
                     
                        Kokkupuutetingimused
                     
                     
                        Omastamisetapi kestus
                     
                     Omastamisetapi eeldatava kestuse võib leida lähtuvalt praktilisest kogemusest (nt varasema uuringu või struktuurilt sarnase ainega tehtud akumuleerumiskatse põhjal) või teatud kindlatest empiirilistest seostest, mis põhinevad uuritava aine teadaoleval vees lahustuvuse või süsteemis oktanool/vesi täheldataval jaotuskoefitsiendil (eeldusel, et omastamine toimub vastavalt esimest järku reaktsiooni kineetikale; vt 5. liide).
                     Omastamisetapp peaks vältama 28 päeva, välja arvatud juhul, kui on võimalik tõendada, et statsionaarne olek saavutatakse varem (mõisted ja ühikud on määratletud 1. liites). Kõveral, mis väljendab kalades sisalduva uuritava aine kontsentratsiooni (C
                        f) sõltuvust ajast, saavutatakse statsionaarne olek siis, kui kõver muutub ajateljega paralleelseks ja vähemalt kahepäevaste intervallidega võetud kolmes järjestikuses proovis mõõdetud C
                        f väärtused ei erine üksteisest rohkem kui ± 20 % ning esimese ja viimase järjestikuse analüüsi vahelisel perioodil ei täheldata C
                        f olulist suurenemist. Koondproovide analüüsimise puhul on vaja teha vähemalt neli järjestikust analüüsi. Aeglaselt omastatavate ainete puhul on sobivam intervall seitse päeva. Kui 28 päeva jooksul ei saavutata statsionaarset olekut, kasutatakse BCFi arvutamiseks üksnes kineetilist lähenemisviisi, mille puhul ei eeldata statsionaarse oleku saavutamist, või pikendatakse omastamisetapi kestust ja tehakse täiendavaid mõõtmisi kuni statsionaarse oleku saavutamiseni või 60 päeva vältel, olenevalt sellest, kumb periood on lühem. Samuti peab uuritava aine sisaldus kalas olema omastamisetapi lõpus piisavalt suur, et võimaldada usaldusväärselt hinnata k
                        2 väärtust puhastumisetapis. Kui 28 päeva jooksul ei täheldata aine olulisel määral omastamist, võib katse lõpetada.
                     
                        Puhastumisetapi kestus
                     
                     Ainete puhul, mida saab kirjeldada esimest järku reaktsiooni kineetika abil, piisab aine sisalduse sobivaks vähenemiseks organismis (nt 95 % võrra) tavaliselt ajavahemikust, mis on poole lühem kui omastamisetapp (seda hinnangut on selgitatud 5. liites). Kui 95 % suuruse kao saavutamiseks vajalik ajavahemik on ebamõistlikult pikk ja ületab näiteks kaks korda omastamisetapi tavapärase kestuse (st on üle 56 päeva), võib kasutada lühemat perioodi (nt perioodi, mille lõpus on uuritava aine sisaldus alla 10 % statsionaarsele olekule vastavast sisaldusest). Ainete puhul, mille omastamise ja millest puhastumise mudel on keerukam kui esimest järku reaktsiooni kineetikaga kirjeldatav üheosalise kala mudel, võib olla vaja kasutada pikemat puhastumisperioodi. Kui täheldatakse ja/või eeldatakse vastavust sellisele keerukale mudelile, soovitatakse kasutada biostatistiku ja/või farmakokineetika spetsialisti abi, et tagada koostatava katseplaani sobivus. Puhastumisetapi pikendamise korral võib proovivõtmiseks kasutatavate kalade arv osutuda piiravaks teguriks ja tulemusi võivad mõjutada kaladevahelised kasvuerinevused. Puhastumisetapi kestust mõjutab ka see, millise ajavahemiku jooksul on uuritava aine sisaldus kalas suurem kui aine analüütiline määramispiir.
                     
                        Katsealuste kalade arv
                     
                     Kalade arv katsekontsentratsiooni kohta valitakse nii, et igas proovivõtupunktis on võimalik võtta vähemalt neljast kalast koosnev proov. Kalad tuleks koondproovi koondada üksnes juhul, kui üksikute kalade analüüs ei ole teostatav. Kui kõvera lähendamisel (ja selle põhjal arvutatud parameetrite puhul) soovitakse saavutada suuremat täpsust või kui on vaja läbi viia metabolismiuuringud (näiteks lähteaine ja metaboliitide eristamiseks radioaktiivselt märgistatud uuritava aine puhul), peab kalade arv proovivõtupunkti kohta olema suurem. Lipiidisisaldus tuleks määrata samast bioloogilisest materjalist, mida kasutatakse uuritava aine sisalduse määramiseks. Kui see ei ole teostatav, võib olla vaja rohkem kalu (vt punktid 56 ja 57).
                     Kui kasutatakse täiskasvanud (st suguküpseid) kalu, ei tohiks need olla enne katset jõudnud kudemisetappi või hiljuti kudenud ega teha seda katse vältel. Ühtlasi tuleks märkida, kas katses kasutatakse isas- või emaskalu või kummastki soost kalu. Kummastki soost kalade kasutamise korral tuleks tagada, et dokumenteeritud sugudevahelised erinevused kasvus ja lipiidisisalduses on ebaolulised, eriti juhul, kui isas- ja emaskalad on eeldatavalt vaja koondada ühte proovi, et võimaldada aine ja/või lipiidisisalduse määramist.
                     Iga katse jaoks valitakse sarnase kehamassiga kalad, nii et kõige väiksemate kalade mass oleks vähemalt kaks kolmandikku kõige suuremate kalade massist. Kõik kalad peaksid olema ühevanused ja pärinema ühest allikast. Kuna kalade mass ja vanus võivad BCFi väärtust oluliselt mõjutada (12), tuleks sellekohased üksikasjad täpselt registreerida. Soovitatavalt tuleks vahetult enne katse alustamist mõõta kalaparvest võetud osaproovi mass, et hinnata kalade keskmist massi (vt punkt 61).
                     
                        Biomassisisaldus
                     
                     Tuleks kasutada suurt veekogust ühe kala kohta, et katse alguses kalade lisamisest tingitud uuritava aine sisalduse vähenemine vees oleks minimaalne ja et hoida ära lahustunud hapniku sisalduse vähenemist. On oluline jälgida, et biomassisisaldus oleks katses kasutatava liigi jaoks sobiv. Kõikidel tavapärastel juhtudel on soovituslik lisatav kalade kogus 0,1–1,0 g (märgmass) liitri vee kohta päevas. Kui uuritava aine sisaldust on võimalik hoida vahemikus ± 20 % nõutavast sisaldusest ja lahustunud hapniku sisaldus ei lange alla 60 % küllastuskontsentratsioonist, võib kasutada ka suuremat biomassisisaldust (vt punkt 24).
                     Sobiva biomassisisalduse valimisel võetakse arvesse asjaomase kalaliigi tavapärast elupaika. Näiteks võivad veekogu põhjas elavad kalad vajada sama veekoguse juures suuremat akvaariumi põhjapinda kui pelaagilised liigid.
                     
                        Söötmine
                     
                     Kohanemis- ja katseperioodi vältel antakse kaladele sobivat teadaoleva lipiidisisalduse ja valkude üldsisaldusega sööta piisavas koguses, et hoida neid tervena ja säilitada nende kehamassi (teatav kasv on lubatud). Kaladele antakse kohanemis- ja katseperioodi jooksul sööta iga päev kindlaksmääratud koguses, mis sõltub kasutatavast liigist, katsetingimustest ja sööda kalorsusest (näiteks vikerforelli puhul umbes 1–2 % kehamassist päevas). Sööda kogus valitakse nii, et ei toimuks kiiret kasvu ega lipiidisisalduse olulist suurenemist. Söötmismäära samal tasemel hoidmiseks tuleks sööda kogus sobiva sagedusega, näiteks kord nädalas ümber arvutada. Sellise arvutuse jaoks võib kalade massi igas katsekambris hinnata asjaomasest kambrist viimati võetud proovis mõõdetud kalade massi põhjal. Kambrisse jäänud kalu ei kaaluta.
                     Toidujäägid ja väljaheited tuleks sifooni abil kõrvaldada katsekambrist iga päev varsti pärast söötmist (30 minuti kuni ühe tunni möödudes). Kambreid tuleks hoida kogu katse vältel võimalikult puhtana, et orgaanilise aine sisaldus oleks võimalikult väike (vt punkt 29), kuna orgaaniline süsinik võib piirata uuritava aine biosaadavust (12).
                     Kuna sööt valmistatakse tihti kalajahust, tuleks tagada, et sööt ei mõjuta katsetulemusi ega avalda kahjulikku mõju, näiteks tingituna selles sisalduvatest pestitsiidi(jääki)dest, raskmetallidest ja/või uuritavast ainest.
                     
                        Valgus ja temperatuur
                     
                     Soovitatav valgustusperiood on 12–16 tundi ja veetemperatuur (± 2 °C) peaks olema katseliigi jaoks sobiv (vt 3. liide). Kasutatava valguse liik ja omadused peaksid olema teada. Tuleks olla ettevaatlik, et hoida ära uuritava aine võimalikku fotokeemilist muundumist katses kasutatavates valgustustingimustes. Tuleks kasutada sobivat valgusallikat, mille puhul hoitakse ära kalade kokkupuude mittelooduslike fotokeemilise muundumise saadustega. Mõnel juhul võib olla asjakohane kasutada filtrit, mis peab kinni ultraviolettkiirguse lainepikkusega alla 290 nm.
                     
                        Katsekontsentratsioonid
                     
                     Käesolev katsemeetod töötati algselt välja mittepolaarsete orgaaniliste ainete jaoks. Selliste ainete puhul eeldatakse, et kalade kokkupuute hindamiseks piisab ühest kontsentratsioonist, kuna kontsentratsioonist sõltuvus eeldatavalt puudub; asjaomase õigusraamistikuga võidakse siiski ette näha aine kasutamine kahel kontsentratsioonil. Muud liiki ainete uurimisel või juhul, kui on teada võimalikule kontsentratsioonist sõltuvusele viitavad asjaolud, tuleks katses kasutada vähemalt kahte kontsentratsiooni. Kui kasutatakse ainult ühte kontsentratsiooni, tuleks esitada selle kohta põhjendus (vt punkt 79). Samuti peaks katses kasutatav kontsentratsioon olema nii väike, kui on mõistlik ja tehniliselt võimalik (st mitte väga lähedal lahustuvust iseloomustavale kontsentratsioonile).
                     Mõnel juhul võib eeldada, et aine biokontsentreerumine sõltub aine sisaldusest vees (nt metallide puhul, mille omastamine kalades võib olla vähemalt osaliselt kontrollitud). Sellisel juhul on vaja kasutada katses vähemalt kahte, kuid soovitatavalt suuremat arvu keskkonna seisukohast asjakohaseid kontsentratsioone (vt punkt 49). Ainete puhul, mille kontsentratsioonid katses peavad praktilistel põhjustel olema lahustuvust iseloomustava kontsentratsiooni lähedal, on samuti soovitatav kasutada vähemalt kahte kontsentratsiooni, kuna see võib anda teavet kokkupuutekontsentratsioonide usaldusväärsuse kohta. Valitud katsekontsentratsioonid peaksid hõlmama keskkonnas reaalselt esineda võivat kontsentratsiooni ja konkreetse hindamise puhul asjakohast kontsentratsiooni.
                     Uuritava aine kontsentratsioon(id) tuleks valida nii, et see või need oleks(id) allpool aine kroonilise mõju avaldumise taset või alla 1 % akuutse mõju asümptootilise LC50 väärtusest, keskkonna seisukohast asjakohases vahemikus ja vähemalt ühe suurusjärgu võrra suurem(ad) kui kasutatava analüüsimeetodiga saavutatav aine määramispiir vees. Suurima lubatud katsekontsentratsiooni saab kindlaks teha ka nii, et aine 96 tunni jooksul avalduva akuutse mõju LC50 jagatakse akuutse ja kroonilise mõju suhet väljendava asjaomase suhtarvuga (näiteks on see suhtarv mõne aine puhul umbes kolm, ent mõne üksiku aine puhul üle 100). Kahe kontsentratsiooni kasutamise korral peaksid need erinema teineteisest 10 korda. Kui mürgisuse kriteerium (mis seab piirid suuremale katsekontsentratsioonile) ja analüütiline määramispiir (mis seab piirid väiksemale katsekontsentratsioonile) seda ei võimalda, võib erinevus olla väiksem ning tuleks kaaluda võimalikult puhta (soovitatavalt puhtusega > 98 %) radioaktiivselt märgistatud uuritava aine kasutamist. Tuleks jälgida, et ühegi kasutatava kontsentratsiooni puhul ei ületataks uuritava aine lahustuvust katsekeskkonnas.
                     
                        Kontrollid
                     
                     Peale uuritava ainega rühma(de) tuleks vastavalt vajadusele (vt punktid 30 ja 31) kasutada ühte lahjendusveega kontrolli või ühte lahustiga kontrolli.
                     
                        Vee kvaliteediga seotud mõõtmiste sagedus
                     
                     Katse ajal tuleks kõikides katse- ja kontrollnõudes mõõta lahustunud hapniku sisaldust, orgaanilise süsiniku üldsisaldust, pH-d ja temperatuuri. Üldkaredust ja vajaduse korral soolsust tuleks mõõta kontrollnõu(de)s ja ühes katsenõus. Kahe või enama kontsentratsiooni kasutamise korral mõõdetakse nimetatud näitajaid suuremal (või suurimal) kontsentratsioonil. Lahustunud hapnikku ja vajaduse korral soolsust tuleks mõõta omastamisperioodi jooksul vähemalt kolm korda – perioodi alguses, keskel ja lõpus – ning puhastumisperioodi jooksul vähemalt kord nädalas. Orgaanilise süsiniku üldsisaldust tuleks mõõta katse alguses (24 tundi ja 48 tundi enne omastamisetapi algust), enne kalade lisamist ning omastamis- ja puhastumisetapi vältel kord nädalas. Temperatuuri mõõtmine ja registreerimine peaks toimuma iga päev, pH mõõtmine iga perioodi alguses ja lõpus ning kareduse mõõtmine üks kord igas katses. Temperatuuri tuleks soovitatavalt jälgida pidevalt vähemalt ühes katsenõus.
                     
                        Kala- ja veeproovide võtmine ja analüüs
                     
                     
                        Kala- ja veeproovide võtmise ajakava
                     
                     Katsekambritest tuleks uuritava aine sisalduse määramiseks võtta veeproov enne kalade lisamist ning omastamis- ja puhastumisetapi kestel. Veeproov tuleks võtta enne söötmist, kalaprooviga samaaegselt. Proove võib olla kasulik võtta sagedamini, et veenduda kontsentratsiooni püsivuses pärast kalade lisamist. Omastamisetapi ajal tuleks määrata uuritava aine kontsentratsioon, et kontrollida vastavust nõuetekohasuse kriteeriumidele (punkt 24). Kui puhastumisetapi alguses võetud proovide analüüsimisel ei tuvastata uuritavat ainet, võib sellisest põhjendusest lähtuvalt jätta uuritava aine puhastumisetapi jooksul edaspidi katse- ja kontrollrühma vees määramata.
                     Kalaproove tuleks uuritava aine määramiseks võtta omastamisetapis vähemalt viiel korral ja puhastumisetapis vähemalt neljal korral. Kuna mõnel juhul on sellise arvu proovide põhjal keeruline arvutada BCFi hinnangulist väärtust rahuldava täpsusega, eriti kui tegemist ei ole esimest järku reaktsiooni kineetikale vastava omastamise ja puhastumisega, võib olla soovitatav võtta kummagi perioodi vältel proove suurema sagedusega (vt 4. liide).
                     Lipiidisisaldus tuleks määrata vähemalt omastamisetapi alguses ja lõpus ning puhastumisetapi lõpus samast bioloogilisest materjalist, mida kasutatakse uuritava aine sisalduse määramiseks. Kui see ei ole teostatav, tuleks kõigil kolmel nimetatud ajahetkel võtta lipiidisisalduse määramiseks vähemalt kolmest muust kalast koosnev proov. Kalade arvu katsenõu kohta tuleks katse alguses sellele vastavalt suurendada (49). Teise võimalusena võib juhul, kui kontrollina kasutatavates kalades (st lähtepopulatsiooni kalades) ei tuvastata märkimisväärses koguses uuritavat ainet, määrata katse ajal kontrollrühma kalades üksnes lipiidisisalduse ja korrigeerida katserühma(de) kalades määratud uuritava aine sisaldust (ja sellest lähtuvalt omastamise kiiruskonstandi, puhastumise kiiruskonstandi ja BCFi väärtust) vastavalt katse vältel täheldatud muutustele kontrollrühma kalade lipiidisisalduses (50).
                     Surnud ja haigeid kalu ei tohiks uuritava aine sisalduse ega lipiidisisalduse suhtes analüüsida.
                     Vastuvõetava proovivõtukava näide on esitatud 4. liites. Teistsuguse ajakava võib hõlpsalt koostada lähtuvalt K
                        OW teistsugusest eeldatavast väärtusest, mille põhjal arvutatakse kokkupuuteperioodi pikkus, mis on vajalik aine omastamiseks 95 % ulatuses (arvutuskäik on esitatud 5. liites).
                     Proovivõtmist tuleks omastamisetapi vältel jätkata seni, kuni saavutatakse statsionaarne olek (mõisted ja ühikud on esitatud 1. liites) või kuni omastamisetapp loetakse muul põhjusel lõppenuks (pärast 28 või 60 päeva möödumist; vt punktid 37 ja 38). Enne puhastumisetapi algust tuleks kalad üle viia puhastesse nõudesse.
                     
                        Proovivõtmine ja proovi ettevalmistamine
                     
                     Analüüsitav veeproov tuleks võtta näiteks inertsest materjalist sifoontoruga katsekambri keskosast. Uuritava aine biosaadavat fraktsiooni ei pruugi alati olla võimalik filtrimise või tsentrifuugimise teel mittebiosaadavast fraktsioonist eraldada. Biosaadavusega seotud raskustest tulenevalt tuleks eraldamismeetodi kasutamise korral esitada katseprotokollis alati asjaomase meetodi kasutamise põhjendus või meetodi valideerimisandmed (25). Proovide sel viisil töötlemisest tuleks hoiduda, eriti väga hüdrofoobsete ainete puhul (st ainete puhul, mille log K
                        OW > 5) (12, 26), mis võivad filtrile või tsentrifuuginõu seinale adsorbeeruda. Selle asemel tuleks võtta meetmed katsenõude võimalikult puhtana hoidmiseks (vt punkt 46) ja jälgida orgaanilise süsiniku üldsisaldust nii omastamis- kui ka puhastumisetapis (vt punkt 53). Biosaadavuse vähenemisest tingitud võimalike probleemide ärahoidmiseks võib raskesti lahustuvate ja väga hüdrofoobsete ainete puhul kasutada proovivõtmiseks tahke faasi abil mikroekstraheerimise meetodit.
                     Proovivõtmiseks valitud kalad surmatakse viivitamata kõige sobivamal ja humaansemal viisil (terve kalaga tehtavate mõõtmiste jaoks ei tohiks teha muud kui kala veega loputada (vt punkt 28) ja paberiga kuivatada). Mõõdetakse kalade mass ja üldpikkus (51). Iga üksiku proovivõtmiseks valitud kala puhul tuleks mõõdetud mass ja pikkus kokku viia määratud uuritava aine sisaldusega (ja vajaduse korral lipiidisisaldusega), näiteks kordumatu tunnuskoodi abil.
                     Kalu ja vett soovitatakse analüüsida kohe pärast proovivõtmist, et hoida ära lagunemist ja muul viisil tekkivaid kadusid ning arvutada katse jätkudes ligikaudsed omastamise ja puhastumise kiiruskonstandid. Kohese analüüsiga hoitakse ära ka viivitus platoo (statsionaarse oleku) saavutamise kindlakstegemisel.
                     Kui proove ei analüüsita kohe, tuleks kasutada sobivat meetodit nende säilitamiseks. Enne katse algust tuleks koguda teavet asjaomase uuritava aine jaoks sobiva säilitusmeetodi kohta – selleks võib olla näiteks sügavkülmutamine, säilitamine 4 °C juures, ekstraheerimine vms. Säilitamisaeg tuleks valida nii, et oleks välistatud aine lagunemine säilitamise ajal.
                     
                        Analüüsimeetodi kvaliteet
                     
                     Kuna uuritava aine määramiseks kasutatava analüüsimeetodi usaldusväärsus sõltub peamiselt meetodi mõõtetäpsusest, kordustäpsusest ja tundlikkusest, tuleb katseliselt kontrollida, kas aine analüüsi mõõtetäpsus, kordustäpsus ja reprodutseeritavus ning uuritava aine tuvastamise tõhusus vee- ja kalaproovides on asjaomase meetodi puhul rahuldavad. Seda tuleks teha eelkatsete raames. Peale selle kontrollitakse, et uuritav aine ei oleks tuvastatav lahjendusvees. Vajaduse korral korrigeeritakse katse käigus vees ja kalades mõõdetud uuritava aine kontsentratsiooni väärtusi lähtuvalt tuvastamise tõhususest ja kontrollrühmas määratud taustväärtustest. Kala- ja veeproove käsitsetakse kogu analüüsi vältel nii, et saastumine ja kaod (näiteks proovivõtuseadmele adsorbeerumise tõttu) oleksid võimalikult väikesed.
                     
                        Kalaproovide analüüs
                     
                     Kui katses kasutatakse radioaktiivselt märgistatud ainet, on võimalik analüüsida üldradioaktiivsust (st lähteaine ja metaboliitide summaarset radioaktiivsust) või puhastada proovi nii, et lähteainet saab analüüsida eraldi. Kui BCFi arvutamisel soovitakse aluseks võtta lähteaine, tuleks iseloomustada ka peamisi metaboliite vähemalt omastamisetapi lõpus (vt punkt 6). Peamised metaboliidid on metaboliidid, mille osakaal ainejääkide üldsisaldusest kalakudedes on ≥ 10 % või mille osakaal kahes järjestikuses proovivõtupunktis on ≥ 5 % või mille tase omastamisetapi jooksul tõuseb või mis on teadaolevalt mürgised. Kui radioaktiivselt märgistatud jääkide üldsisalduse põhjal terve kala kohta arvutatud BCF on ≥ 500, võib olla kasulik peamised metaboliidid kindlaks teha ja kvantifitseerida; teatud liiki ainete, näiteks pestitsiidide puhul on see tungivalt soovitatav. Selliste metaboliitide kvantifitseerimist võivad nõuda mõned reguleerivad asutused. Kõikidest kalakudedes esinevatest radioaktiivselt märgistatud jääkidest ≥ 10 % moodustavate lagunemissaaduste tuvastamise ja kvantifitseerimise korral on soovitatav tuvastada ja kvantifitseerida need ka katsevees. Kui see ei ole teostatav, tuleks katseprotokollis esitada sellekohane selgitus.
                     Uuritava aine sisaldus tuleks üldjuhul määrata igas kaalutud kalas eraldi. Kui see ei ole võimalik, võib proovid igal proovivõtmisel ühte koondada, ent kuna proovide koondamine piirab andmete analüüsimiseks sobivate statistikameetodite valikut, peaks katses kasutatavate kalade arv olema piisav, et võimaldada kasutada soovitud koondproove ja statistikameetodit ning saavutada soovitud statistiline võimsus. Asjakohastest proovide koondamise meetoditest ülevaate saamiseks võib kasutada viiteid 27 ja 28.
                     BCFi puhul tuleks peale katses otseselt saadud väärtuse esitada ka normaliseeritud väärtus, mille aluseks on võetud kala lipiidisisaldus 5 % (märgmassist) (vt punkt 21), välja arvatud juhul, kui on võimalik tõendada, et uuritav aine akumuleerub peamiselt mujal kui rasvas. Võimaluse korral tuleks kalade lipiidisisaldus määrata igas proovivõtupunktis, soovitatavalt samas ekstraktis, mida kasutatakse uuritava aine määramiseks, sest sageli tuleb lipiidid ekstraktist eemaldada, enne kui seda saab kromatograafiliselt analüüsida. Uuritava aine määramine nõuab siiski sageli spetsiifilise ekstraheerimismeetodi kasutamist, mis ei pruugi kokku sobida lipiidide määramiseks kasutatava meetodiga. Sellisel juhul soovitatakse kuni sobiva mittepurustava instrumentaalanalüüsi meetodi kättesaadavaks muutumiseni kasutada kalade lipiidisisalduse määramiseks teistsugust strateegiat (vt punkt 56). Lipiidisisalduse määramiseks tuleks kasutada sobivat meetodit (20). Standardse meetodina võib soovitada kloroformi ja metanooliga ekstraheerimist (29, 30), teise võimalusena aga Smedesi meetodit (31). Viimati nimetatud meetodile on iseloomulik võrreldav ekstraheerimise tõhusus, suur täpsus ja vähem mürgiste orgaaniliste lahustite kasutamine ning seda on lihtne kasutada. Piisava põhjenduse esitamise korral võib kasutada ka muid meetodeid, mille täpsus on soovitatavate meetoditega võrreldes suurem. On oluline esitada kasutatud meetodi üksikasjalik kirjeldus.
                     
                        Kalade kasvu mõõtmine
                     
                     Katse alguses tuleb ükshaaval määrata viie kuni kümne lähtepopulatsioonist pärit kala mass ja üldpikkus. Samu kalu võib kasutada ka lipiidisisalduse määramiseks (vt punkt 56). Igal proovivõtmisel kontrollrühmast ja katserühma(de)st valitud kalad tuleks enne uuritava aine või lipiidide sisalduse määramist kaaluda ja mõõta nende pikkus. Kõnealustel valitud kaladel mõõdetud väärtusi saab kasutada katse- ja kontrollnõudesse jäänud kalade massi ja pikkuse hindamiseks (vt punkt 45).
                     ANDMED JA ARUANDLUS
                     
                        Andmete töötlemine
                     
                     Uuritava aine omastamise kõvera saamiseks tuleks graafikule kanda kalas või kala pinnal (või konkreetsetes kudedes) omastamisetapi käigus mõõdetud aine kontsentratsiooni sõltuvus ajast aritmeetilisel skaalal. Kui kõver on jõudnud platoole ehk muutunud ajatelje suhtes ligikaudu asümptootiliseks, tuleks statsionaarse oleku BCF (BCFSS) arvutada järgmise valemiga:
                     
                        
                     
                        C
                        f muutumist mõjutab kalade kasv (vt punktid 72 ja 73). Keskmise kokkupuutekontsentratsiooni (Cw
                        ) väärtus sõltub kontsentratsiooni varieeruvusest. Võib eeldada, et bioakumuleerumise katsete puhul on asjakohasem ja täpsem ajaga kaalutud keskmise kontsentratsioon, seda ka juhul, kui varieeruvus jääb asjakohasesse nõutavasse vahemikku (vt punkt 24). Ajaga kaalutud keskmise kontsentratsiooni vees võib arvutada vastavalt 5. liite jaotisele 1.
                     Kineetiline biokontsentratsioonitegur (BCFK) tuleks leida kahe esimest järku reaktsiooni kiiruskonstandi k
                        1 ja k
                        2 suhtarvuna. Kiiruskonstantide k
                        1 ja k
                        2 ning BCFK arvutamiseks võib kasutada mudeli üheaegset sobitamist omastamis- ja puhastumisetapi andmetega. Teise võimalusena võib k
                        1 ja k
                        2 leida üksteise järel (nende meetodite kirjeldus ja võrdlus on esitatud 5. liites). Puhastumise kiiruskonstanti (k
                        2) võib olla vaja korrigeerida, et võtta arvesse kasvust tingitud lahjenemist (vt punktid 72 ja 73). Kui omastamiskõver ja/või puhastumiskõver ei vasta ilmselgelt esimest järku reaktsioonile, tuleks rakendada keerukamaid mudeleid (vt viited 5. liites) ning kasutada biostatistiku ja/või farmakokineetika spetsialisti abi.
                     
                        Kalade massi- ja pikkuse andmed
                     
                     Iga kala märgmass ja üldpikkus kõikides proovivõtupunktides omastamisetapi vältel (sealhulgas lähtepopulatsiooni andmed omastamisetapi alguses) ja puhastumisetapi vältel kantakse tabelisse kontrollrühma ja katserühma(de) puhul eraldi. Iga üksiku proovivõtmiseks valitud kala puhul tuleks mõõdetud mass ja pikkus kokku viia määratud uuritava aine sisaldusega, näiteks kordumatu tunnuskoodi abil. Kineetilise BCFi väärtuse korrigeerimisel kasvust tingitud lahjenemise suhtes on soovitatav kasutada kasvunäitajana massi (meetodit, mida kasutatakse andmete korrigeerimiseks kasvust tingitud lahjenemise suhtes, on kirjeldatud punktis 73 ja 5. liites).
                     
                        Korrigeerimine kasvust tingitud lahjenemise suhtes ja normaliseerimine lipiidisisalduse suhtes
                     
                     Kalade kasv puhastumisetapi jooksul võib vähendada kalades mõõdetud aine sisaldust, mistõttu puhastumise üldise kiiruskonstandi (k
                        2) väärtus võib olla suurem kui väärtus, mis tuleneb üksnes aine kõrvaldamisest (nt hingamise, metabolismi ja roojamise käigus). Kineetilist biokontsentratsioonitegurit tuleks korrigeerida kasvust tingitud lahjenemise suhtes. Kasv mõjutab ka BCFSS-i väärtust, kuid BCFSS-i korrigeerimiseks kasvu suhtes puudub kokkulepitud metoodika. Märkimisväärse kasvu korral tuleks leida ka kasvu suhtes korrigeeritud BCFK (BCFKg), kuna see võib olla biokontsentratsioonitegurina asjakohasem. Katsealuste kalade lipiidisisaldus (millel on tugev seos hüdrofoobsete ainete bioakumuleerumisega) võib praktikas nii palju varieeruda, et nii kineetilise kui ka statsionaarset olekut iseloomustava biokontsentratsiooniteguri mõtestatud väärtuse leidmiseks on vaja läbi viia normaliseerimine, mille aluseks on võetud teatud kindel kala lipiidisisaldus (5 massiprotsenti), välja arvatud juhul, kui on võimalik tõendada, et uuritav aine akumuleerub peamiselt mujal kui rasvas (näiteks võib mõni perfluoritud aine seonduda valkudega). Selliste arvutuste jaoks kasutatavad võrrandid ja asjakohased näited on esitatud 5. liites.
                     Kineetilise BCFi korrigeerimiseks kasvust tuleneva lahjenemise suhtes tuleks kasvu suhtes korrigeerida puhastumise kiiruskonstanti. Kõnealuse kasvu suhtes korrigeeritud puhastumise kiiruskonstandi k
                        2g arvutamiseks lahutatakse üldisest puhastumise kiiruskonstandist k
                        2 kasvu kiiruskonstant k
                        g, mis on leitud mõõdetud kehamassi põhjal. Seejärel jagatakse omastamise kiiruskonstant k
                        1 kasvu suhtes korrigeeritud puhastumise kiiruskonstandiga k
                        2g (vt 5. liide), et leida kasvu suhtes korrigeeritud biokontsentratsioonitegur. Mõnel juhul on sellise lähenemisviisi kasutamine raskendatud. Näiteks võib arvutatud k
                        2g ainete puhul, millest puhastumine on väga aeglane ja mida analüüsitakse kiirelt kasvavatel kaladel, olla väga väike ja selle leidmiseks kasutatud kahe kiiruskonstandiga seotud viga muutub väga oluliseks, ning mõnel juhul võib k
                        g hinnanguline väärtus olla suurem kui k
                        2 väärtus. Teise lähenemisviisina, mis ei nõua korrigeerimist kasvust tingitud lahjenemise suhtes, kasutatakse puhastumisandmetena mitte tavapärast uuritava aine massi kala massiühiku kohta (kontsentratsioon), vaid uuritava aine massi kala kohta (terve kala alusel). See peaks olema hõlpsalt teostatav, kuna käesoleva katsemeetodi kohaste katsete puhul peaks aine registreeritud sisaldus iga üksiku kala kudedes olema seostatav asjaomase kala massiga. Lihtsat meetodit selle lähenemisviisi kasutamiseks on tutvustatud 5. liites. Tuleb meeles pidada, et ka kõnealuse alternatiivse lähenemisviisi puhul tuleks esitada k
                        2 väärtus.
                     Samuti tuleks kineetilise ja statsionaarset olekut iseloomustava biokontsentratsiooniteguri väärtus esitada lähtuvalt standardsest kala lipiidisisaldusest 5 massiprotsenti, välja arvatud juhul, kui on võimalik tõendada, et uuritav aine akumuleerub peamiselt mujal kui rasvas. Kalas esineva kontsentratsiooni andmed ja BCF normaliseeritakse suhtarvu põhjal, mis saadakse 5 % jagamisel tegeliku keskmise (või konkreetsel kala mõõdetud) lipiidisisaldusega (protsentides märgmassist) (vt 5. liide).
                     Kui aine ja lipiidide sisaldus on määratud samal kalal, tuleks lipiidisisalduse suhtes normaliseeritud BCFi arvutamiseks kasutada konkreetse asjaomase kala lipiidisisalduse alusel normaliseeritud andmeid. Teise võimalusena võib juhul, kui kalade kasv kontrollrühmas ja ainega kokku puutunud rühmas on sarnane, kasutada lipiidisisalduse suhtes korrigeerimiseks üksnes kontrollrühma kalade lipiidisisaldust (vt punkt 56). Lipiidisisalduse suhtes normaliseeritud BCFi arvutamise meetodit on kirjeldatud 5. liites.
                     
                        Tulemuste tõlgendamine
                     
                     Tulemuste tõlgendamisel tuleks olla ettevaatlik, kui uuritava aine lahuses mõõdetud kontsentratsioon on analüüsimeetodi määramispiiri lähedal.
                     Mürgise toime välistamiseks ei tohiks keskmine kasvukiirus kontrollrühmas ja katserühma(de)s olla märkimisväärselt erinev. Kõnealuse kahe rühma kalade kasvu kiiruskonstantide või kasvukõverate võrdlemiseks tuleks kasutada sobivat meetodit (52).
                     Selgelt väljendunud omastamis- ja puhastumiskõverad viitavad kvaliteetsetele biokontsentreerumise andmetele. Kiiruskonstantide puhul peaks bioakumuleerumise mudeli sobivuse hindamiseks tehtava χ2-testi tulemustest nähtuma hea sobivus andmetega (st protsentides väljendatav mõõtmisviga peaks olema väike (32)), et neid konstante saaks lugeda usaldusväärseks (vt 5. liide). Kui kasutatakse mitut katsekontsentratsiooni, peaks eri kontsentratsioonide vaheline omastamise/puhastumise kiiruskonstantide varieeruvus olema väiksem kui 20 % (53). Suurem varieeruvus võib viidata kontsentratsioonist sõltuvusele. Kui omastamise/puhastumise kiiruskonstantide puhul täheldatakse eri kontsentratsioonide vahelisi märkimisväärseid erinevusi, tuleks need registreerida ja esitada sellekohased võimalikud seletused. Üldjuhul on hästi kavandatud uuringutest saadud BCFide puhul usaldusvahemik usaldusnivool 95 % ligikaudu ± 20 % asjaomase BCFi väärtusest.
                     Kahe või enama kontsentratsiooni kasutamisel vaadeldakse kõikidel kontsentratsioonidel saadud tulemusi, et hinnata tulemuste omavahelist kooskõla ja teha kindlaks, kas esineb kontsentratsioonist sõltuvust. Kui loomade arvu ja/või ressursikulu vähendamise eesmärgil kasutatakse ainult ühte kontsentratsiooni, tuleks esitada sellekohane põhjendus.
                     Kui BCFK on oluliselt suurem kui BCFSS, on BCFSS-i väärtus kaheldav, kuna see võib viidata asjaolule, et statsionaarset olekut ei saavutatud või ei ole võetud arvesse kasvust tingitud lahjenemist ega kadu põhjustavaid protsesse. Kui BCFSS on väga palju suurem kui BCFK, tuleks kontrollida, kas omastamise ja puhastumise kiiruskonstantide arvutamisel on tehtud vigu, ning neid näitajaid uuesti hinnata. BCFK hindamise tulemust võib parandada teistsuguse lähendamismeetodi kasutamine (vt 5. liide).
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Peale punktis 3 nimetatud teabe uuritava aine kohta tuleb katseprotokollis esitada järgmine teave.
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritav aine:
                                 
                                 füüsikalised ja vajaduse korral füüsikalis-keemilised omadused;
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne, sealhulgas vajaduse korral orgaanilise süsiniku sisaldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mitut koostisosa sisaldava aine või UVCB (tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal) puhul võimalikult täpne kirjeldus iga koostisosa keemilise määratluse kohta ja protsentuaalse osakaalu kohta aine üldmassist; tuleks anda ülevaade, kuidas katses kasutatud analüüsimeetodiga kajastatakse aine kontsentratsiooni; tuleks kirjeldada kõiki analüüsimeetodeid, sealhulgas nende täpsust, avastamispiiri ja määramispiiri;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             radioaktiivselt märgistatud ainete puhul märgistatud aatomi(te) täpne asukoht ja lisanditega seotud radioaktiivsuse protsentuaalne osakaal;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             teave uuritava aine mürgisuse kohta kaladel (soovitatavalt katseliigil); mürgisuse näitajatena tuleks esitada 96 tunni jooksul avalduva akuutse mõju LC50 ning kroonilise mõju uuringust (st varast arengujärku või kogu elutsüklit hõlmavast katsest) saadud täheldatava kahjuliku toime puudumise kontsentratsioon (NOAEC) ja vähima täheldatava kahjuliku toime avaldumise kontsentratsioon (LOAEC);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutamisele eelneva säilitamise korral uuritava kemikaali või aine säilitustingimused ja püsivus sellistes säilitustingimustes.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katseliik:
                                 
                                 teaduslik nimetus, liin, päritolu, kõik eeltöötlused, kohandamine, vanus, sugu (vajaduse korral), suurusevahemik (mass ja pikkus) jne.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsetingimused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud katsemeetod (nt läbivoolumeetod või poolstaatiline meetod); standardne või minimeeritud katseplaan (koos põhjendusega);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud valguse liik ja omadused ning valgustusperiood(id);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             katseplaan (näiteks katsekambrite arv ja suurus, veekoguse vahetumise kiirus, biomassisisaldus, paralleelproovide arv, kalade arv paralleelproovi kohta, katsekontsentratsioonide arv, omastamis- ja puhastumisetapi kestus, vee- ja kalaproovide võtmise sagedus);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             põhilahuse valmistamise meetod ja uuendamise sagedus (lahusti kasutamise korral tuleks esitada lahusti kirjeldus, kontsentratsioon ja osakaal katsevee orgaanilise süsiniku sisaldusest) või alternatiivse doseerimissüsteemi kirjeldus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nominaalsed katsekontsentratsioonid, katsenõudes saadud mõõtmistulemuste keskväärtused ja standardhälbed ning mõõtmismeetod ja -sagedus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             lahjendusvee päritolu, kõikide eeltöötluste kirjeldus, kõik tõendid selle kohta, et kalad suudavad selles vees elada, ning vee omadused: pH, karedus, temperatuur, lahustunud hapniku sisaldus, kloorijääkide sisaldus (kui on mõõdetud), orgaanilise süsiniku üldsisaldus, hõljuvaine sisaldus, katsekeskkonna soolsus (vajaduse korral) ja kõikide muude mõõtmiste tulemused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vee kvaliteet katsenõudes, selle pH, karedus, orgaanilise süsiniku üldsisaldus, temperatuur ja lahustunud hapniku sisaldus; kasutatud mõõtmismeetod ja mõõtesagedus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             üksikasjalik teave söötmise kohta, näiteks sööda liik, päritolu, koostis (võimaluse korral vähemalt lipiidi- ja valgusisaldus), valitud söötmisrežiim, sööda kogus ja söötmissagedus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             andmed kala- ja veeproovide töötlemise kohta, sealhulgas üksikasjad proovide ettevalmistamise ja säilitamise ning uuritava aine ja lipiidide ekstraheerimise ja nende sisalduse määramiseks kasutatud analüüsimeetodite (ja nende täpsuse) kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             meetodid, mida kasutati kokkupuute suhtes randomiseerimiseks ja kalade jaotamiseks katsenõude vahel;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             katseorganismide katselahusesse viimise kuupäev ja katse kestus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             võimaluse korral kontsentratsioonivahemiku leidmise katsete kirjeldus ja tulemused.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kõikide tehtud eeluuringute tulemused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kalade suremus kontrollrühmas ja igas uuritava ainega katsekambris ning kõik täheldatud ebanormaalse käitumise ilmingud;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             teave mis tahes täheldatud kahjuliku mõju kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kemikaali analüüsimise meetodite täielik kirjeldus, sealhulgas avastamis- ja määramispiir, meetodist tulenev varieeruvus ning tuvastamise tõhusus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kalade lipiidisisaldus ja selle määramiseks kasutatud meetod ning lipiidisisalduse suhtes normaliseerimise tegur L
                                                n, mille abil väljendatakse tulemusi lähtuvalt kala lipiidisisaldusest 5 %;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tabeli kujul esitatud andmed nii kontrollrühma kui ka katserühma(de) kalade massi (ja pikkuse) kohta, mis on seostatud kemikaali (ja vajaduse korral lipiidide) sisaldusega igas üksikus kalas (näiteks igale proovivõtmiseks kasutatud kalale antud kordumatu tunnuskoodi abil), ning kasvu kiiruskonstandi leidmiseks kasutatud arvutuskäik;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tabeli kujul esitatud andmed igal proovivõtmisel määratud aine sisalduse kohta kalades (iga üksikut kala iseloomustav C
                                                f) ja vees (C
                                                w) ning vajaduse korral asjaomane keskväärtus, standardhälve ja vahemik kontrollrühmas ja katserühma(de)s (C
                                                f-i väljendatakse milligrammides terve kala või konkreetsete kudede, näiteks rasvkoe märgmassi kilogrammi kohta ja C
                                                w-d milligrammides liitri kohta); C
                                                w väärtus kontrollrühmas (tuleks esitada ka taustsisaldus);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kõverad, mis hõlmavad kõiki mõõtmisandmeid ja väljendavad järgmisi näitajaid (vajaduse korral võib kontsentratsiooni väljendada terve keha massi alusel ja lipiidisisalduse suhtes normaliseerituna lähtuvalt kala või selle konkreetsete kudede lipiidisisaldusest 5 %):
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kasv, st kalade massi muutus ajas või naturaallogaritmitud massiandmete muutus ajas (sealhulgas arvutatud kasvu kiiruskonstant k
                                                            g);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritava aine omastamine ja sellest puhastumine kalades (samal graafikul);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         statsionaarse oleku saavutamiseks kulunud aeg (selle saavutamise korral);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         naturaallogaritmitud kontsentratsiooniandmete muutus omastamisetapi vältel (sealhulgas arvutatud omastamise kiiruskonstant k
                                                            1);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         naturaallogaritmitud kontsentratsiooniandmete muutus puhastumisetapi vältel (sealhulgas arvutatud puhastumise kiiruskonstant k
                                                            2) ning
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         omastamisetapi ja puhastumisetapi andmed koos lähendamiseks kasutatud mudelit iseloomustava kõveraga;
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kui graafiku visuaalsel hindamisel täheldatakse selgelt võõrväärtuste esinemist, võib kahtlaste andmepunktide väljajätmiseks kasutada statistiliselt usaldusväärset võõrväärtuste testi ja esitada dokumenteeritud põhjenduse selliste andmepunktide väljajätmise kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             biokontsentratsioonitegur statsionaarses olekus (BCFSS), kui see (peaaegu) saavutati;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kineetiline biokontsentratsioonitegur (BCFK) ning arvutatud omastamise ja puhastumise kiiruskonstandid k
                                                1 ja k
                                                2, järjestikuse lähendamise korral koos k
                                                2 iseloomustava hajuvusega (tõus ja algordinaat);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             iga parameetrit igal kasutatud uuritava aine kontsentratsioonil iseloomustavad usalduspiirid ja standardhälve (vastavalt võimalusele) ning asjaomased arvutus- ja andmeanalüüsi meetodid;
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kõik andmed radioaktiivselt märgistatud aine metaboliitide ja nende akumuleerumise kohta;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kasvu kiiruskonstant või -konstandid koos usaldusvahemikuga usaldusnivool 95 % ning arvutuslik kasvu suhtes korrigeeritud puhastumise kiiruskonstant (k
                                                            2g), poolväärtusaeg ja BCF (BCFKg);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kõik katsega seotud ebatavalised asjaolud, kõik kõrvalekalded käesolevast katsemeetodist ja mis tahes muu asjakohane teave;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         allpool esitatud koondtabel asjakohaste mõõtmis- ja arvutustulemustega.
                                                         
                                                                     Aine omastamise ja ainest puhastumise kiiruskonstandid ning biokontsentratsioonitegurid (BCF)
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        g (kasvu kiiruskonstant; päeva kohta):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus (UV (54) nivool 95 %)
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        1 (üldine omastamise kiiruskonstant; l/kg päevas):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus (UV (54) nivool 95 %)
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        2 (üldine puhastumise kiiruskonstant; päeva kohta):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus (UV (54) nivool 95 %)
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        2g (kasvu suhtes korrigeeritud puhastumise kiiruskonstant; päeva kohta):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus (UV (54) nivool 95 %)
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        C
                                                                        f (kemikaali kontsentratsioon kalas statsionaarses olekus; mg/kg):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus ± SH (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        C
                                                                        w (kemikaali kontsentratsioon vees; mg/l):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus ± SH (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        L
                                                                        n (lipiidisisalduse suhtes normaliseerimise tegur):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus (3)
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFSS (BCF statsionaarses olekus; l/kg):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus ± SH (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFSSL (lipiidisisalduse suhtes normaliseeritud BCF statsionaarses olekus; l/kg):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus (3) ± SH (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFK (kineetiline BCF; l/kg):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus (UV (54) nivool 95 %)
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKg (kasvu suhtes korrigeeritud kineetiline BCF; l/kg):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus (UV (54) nivool 95 %)
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        t
                                                                        1/2g (kasvu suhtes korrigeeritud poolväärtusaeg; päevades):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus (UV (54) nivool 95 %)
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKL (lipiidisisalduse suhtes normaliseeritud kineetiline BCF; l/kg):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKLg (lipiidisisalduse suhtes normaliseeritud, kasvu suhtes korrigeeritud kineetiline BCF; l/kg):
                                                                  
                                                                  
                                                                     märkida väärtus
                                                                  
                                                               Tuleks jälgida, et kasutatava meetodi katse-eelse väljatöötamise ja katseplaani koostamise käigus ei saadaks tulemusi, mille kohta tuleb märkida „Ei olnud avastamis-/määramispiiril avastatav/määratav“, kuna selliseid tulemusi ei saa kasutada kiiruskonstantide arvutamiseks.
                                                      
                                                   
                                       
                           C.13 – II:   Kalade veekaudse kokkupuute katse minimeeritud kujul
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Täismahus katse läbiviimisel ja katsetulemuste tõlgendamisel laborites ja reguleerivates asutustes saadud üha suurematest kogemustest ilmneb, et omastamise ja puhastumise kiiruskonstandi hindamisel saab kohaldada esimest järku reaktsiooni kineetikat, välja arvatud mõnel erandjuhul. Seega on omastamise ja puhastumise kiiruskonstanti ning kineetilist BCFi võimalik leida minimaalse arvu proovivõtupunktide põhjal.
                     Biokontsentreerumise uuringute jaoks alternatiivse katseplaani väljatöötamise algeesmärk oli võimaldada viia vaheastmena läbi väikesemahuline katse, millega saaks K
                        OW-l ja QSAR-meetoditel põhinevaid hinnangulisi BCFi väärtusi kinnitada või need ümber lükata ja mille teostamisega langeks paljude ainete puhul ära vajadus teha täismahus katse; samuti sooviti proovivõtmiste ja analüüsietappide arvu vähendamisega minimeerida kulusid ja kasutatavate loomade arvu. Seejuures järgiti varasema katsemeetodi ülesehituse põhiaspekte, et võimaldada katsetulemuste ühildamist olemasolevate BCFi andmetega ning hõlbustada katsete tegemist ja andmete tõlgendamist; eesmärgiks võeti saavutada selline hinnanguline BCFi väärtus, mille puhul mõõtetäpsus ja kordustäpsus on riskihinnanguga seotud otsuste tegemiseks piisav. Minimeeritud katseplaani puhul kehtivad suures osas samad kaalutlused kui täismahus katse puhul, näiteks nõuetekohasuse kriteeriumid (vt punkt 24) ja võimalus katse lõpetada, kui omastamisetapi lõpus ei täheldata märkimisväärset aine omastamist (vt punktid 16 ja 38).
                     Ained, mida võib uurida minimeeritud katseplaani alusel, peaksid kuuluma sellesse üldkategooriasse, mille jaoks kõnealune katseplaan välja töötati, st mittepolaarsete orgaaniliste ainete klassi (vt punkt 49). Kui on tähelepanekuid selle kohta, et uuritav aine võib käituda teisiti (näiteks ei ole selgelt tegemist esimest järku reaktsiooni kineetikaga), tuleks regulatiivsetel põhjustel teha täismahus katse.
                     Tavaliselt ei ole minimeeritud kujul tehtav katse lühem kui standardne BCFi määramise katse, kuid hõlmab väiksemat arvu kalaproove (seda on selgitatud 6. liites). Ainete puhul, millest puhastumine on kiire, võib puhastumisetapi kestust siiski lühendada, et hoida ära kalas sisalduva aine kontsentratsiooni langemist allapoole avastamis-/määramispiiri enne katse lõppu. Täismahus katse läbiviimise vajaduse kindlakstegemiseks võib kaladega teha minimeeritud kujul kokkupuutekatse ühel kontsentratsioonil ning kui saadud andmed, mille põhjal arvutatakse kiiruskonstandid ja BCF, on usaldusväärsed (vt punkt 93), võib täismahus katse jätta tegemata juhul, kui leitud BCF erineb märkimisväärselt õiguslikult reguleeritavatest väärtustest.
                     Mõnel juhul võib eelkatsena olla kasulik teha minimeeritud plaani kohane katse mitmel kontsentratsioonil, et teha kindlaks, kas aine hinnanguline BCF on sõltuv kontsentratsioonist. Kui minimeeritud kujul tehtud katsest saadud hinnangulise BCFi puhul täheldatakse kontsentratsioonist sõltuvust, tuleb viia läbi täismahus katse. Kui sellisest minimeeritud kujul katsest leitud hinnanguline BCF ei ole kontsentratsioonist sõltuv, kuid tulemusi ei saa pidada lõplikeks, võib järgnevas täismahus katses kasutada kahe (või enama) kontsentratsiooni asemel ühte kontsentratsiooni, et vähendada katsealuste loomade arvu.
                     Aine, mis võib sobida minimeeritud kujul katse tegemiseks, peaks vastama järgmistele kriteeriumidele:
                     
                                 —
                              
                              
                                 selle omastamise ja sellest puhastumise kineetika peaks näiteks sarnaste ainetega saadud tulemustest lähtuvalt suure tõenäosusega ligikaudselt vastama esimest järku reaktsiooni kineetikale;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 selle log K
                                    OW peaks olema alla 6, välja arvatud juhul, kui eeldatakse kiiret metaboliseerumist (56);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 selle lahustuvus vees peaks olema asjaomast analüüsimeetodit silmas pidades piisav (vt punkt 24);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 see peaks olema nii kalades kui ka vees hästi mõõdetav (st selle kontsentratsioon peaks olema vähemalt ühe suurusjärgu võrra suurem kui meetodi määramispiir) – soovitatakse kasutada radioaktiivset märgistamist (vt punkt 23) – ning
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 selle puhul eeldatav puhastumisetapi kestus peaks olema pikem kui aine eeldatav poolväärtusaeg (arvutuskäik on esitatud 5. liites); vastasel juhul tuleks puhastumisetapi kestust vastavalt muuta (vt punkt 91). Sellest reeglist võib teha erandi, kui aine on eeldatavalt kiirelt metaboliseeruv.
                              
                           PROOVIVÕTU AJAKAVA MINIMEERITUD KATSEPLAANI ALUSEL TEHTAVAS KATSES
                     
                        Kalaproovide võtmine
                     
                     Kalaproove võetakse vaid neljas proovivõtupunktis:
                     
                                 —
                              
                              
                                 omastamisetapi keskel ja lõpus (viimane tähistab ühtlasi puhastumisetapi algust), näiteks 14 ja 28 päeva möödudes (33);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 puhastumisetapi keskel ja katse lõpus (mil aine sisaldus on < 10 % maksimumsisaldusest või vähemalt selgelt väiksem kui aine poolväärtusajale vastav sisaldus), näiteks 7 ja 14 päeva pärast puhastumisetapi algust (33). Kui eeldatakse või täheldatakse kiiret puhastumist, võib olla vaja lühendada puhastumisetapi kestust, et aine sisaldus kalas ei langeks määramispiirist allapoole.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Lipiidisisaldust mõõdetakse samal viisil kui täismahus katses.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Kasvu suhtes korrigeerimine toimub samal viisil kui täismahus katses.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 BCF arvutatakse kineetilise BCFina.
                              
                           
                        Veeproovide võtmine
                     
                     Minimeeritud katseplaani puhul võetakse veeproove sama sagedusega kui täismahus katses (vt punkt 54) või omastamisetapis vähemalt viis korda võrdsete ajavahemike järel ja puhastumisetapis kord nädalas.
                     
                        Katseplaani muudatused
                     
                     Lähtuvalt uuritava aine omadustest, usaldusväärsest QSAR-meetodil põhinevast hinnangust ja uuringu konkreetsest eesmärgist võib kaaluda katseplaanis järgmiste muudatuste tegemist.
                     
                                 —
                              
                              
                                 Kui on vaja saavutada suuremat täpsust, võib suurendada kalade arvu omastamisetapi lõpus võetavas proovis (4 asemel 6 või 8).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Kui puhastumine ei ole 14 päeva jooksul (või puhastumisetapi eeldatava lõppemise ajaks) olnud piisav (st > 50 %), võib kasutada ühte täiendavat kalade rühma. Kui puhastumisetapi eeldatav kestus on lühem või pikem kui 14 päeva, tuleks proovivõtu ajakava vastavalt kohandada (st valida üks rühm kalu puhastumisetapi eeldatava lõppemise ajal ja üks rühm ajal, mil on möödunud pool etapi kestusest).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Võimaliku kontsentratsioonist sõltuvuse kindlakstegemiseks võib kasutada kahte katsekontsentratsiooni. Kui minimeeritud plaani kohase kahel kontsentratsioonil tehtud katse tulemustest nähtub, et BCF ei ole kontsentratsioonist sõltuv (st erinevus on väiksem kui 20 %), võib täismahus katse tegemise korral lugeda ühe katsekontsentratsiooni kasutamise piisavaks.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Näib, et bioakumuleerumise protsesse kirjeldavaid mudeleid, näiteks neid, mille on välja pakkunud Arnot et al. (35), on võimalik kasutada omastamis- ja puhastumisetapi kestuse hõlpsamaks kavandamiseks (vt ka 5. liide).
                              
                           
                        Arvutused
                     
                     Siin kirjeldatud lähenemisviisi puhul lähtutakse põhimõttest, et biokontsentratsiooniteguri võib täismahus katse tulemuste põhjal leida kas biokontsentratsioonitegurina statsionaarses olekus (BCFSS), mis väljendab kalakudedes esineva uuritava aine kontsentratsiooni ja vees esineva uuritava aine kontsentratsiooni suhet, või kineetilise biokontsentratsioonitegurina (BCFK), mis väljendab omastamise kiiruskonstandi k
                        1 ja puhastumise kiiruskonstandi k
                        2 suhet. BCFK on kehtiv ka olukorras, kus omastamisetapis ei saavutata aine sisalduse puhul statsionaarset olekut, eeldusel, et omastamine ja puhastumine toimuvad ligikaudu vastavalt esimest järku reaktsiooni kineetikale. Omastamise ja puhastumise kiiruskonstandi hindamiseks on vaja minimaalselt kahte andmepunkti, üks neist omastamisetapi lõpus (st puhastumisetapi alguses) ja teine puhastumisetapi lõpus (või punktis, kus oluline osa puhastumisetapist on möödas). Omastamise ja puhastumise kineetika kontrollimiseks on soovitatav lisada vahepealne proovivõtupunkt (57). Arvutuskäik on esitatud 5. ja 6. liites.
                     
                        Tulemuste tõlgendamine
                     
                     Katse nõuetekohasuse ja tulemuste teabeväärtuse tagamiseks veendutakse, et puhastumisperioodi kestus on pikem kui üks poolväärtusaeg. Samuti tuleks BCFKm-i (minimeeritud kujul katsest saadud kineetiline BCF) võrrelda minimeeritud katseplaani kohase BCFSS-i väärtusega, mis on arvutatud omastamisetapi lõpus lähtuvalt eeldusest, et on saavutatud statsionaarne olek. Viimast on võimalik üksnes eeldada, sest proovivõtupunktide arv ei ole selle tõendamiseks piisav. Kui BCFKm on väiksem kui minimeeritud kujul katse kohane BCFSS, tuleks eelistada viimast. Kui BCFKm on alla 70 % minimeeritud kujul katse kohasest BCFSS-st, ei ole tulemused kehtivad ja tuleks läbi viia täismahus katse.
                     Kui minimeeritud kujul katsest saadud BCFKm-i väärtus jääb õiguslikult reguleeritavasse vahemikku, tuleks teha täismahus katse. Kui saadud väärtus erineb märkimisväärselt kõikidest õiguslikult reguleeritavatest väärtustest (on neist oluliselt suurem või väiksem), ei pruugi täismahus katse tegemine olla vajalik või võib selle teha ühel kontsentratsioonil, kui asjaomases õigusraamistikus seda nõutakse.
                     Kui pärast minimeeritud kujul ühel kontsentratsioonil tehtud katset leitakse olevat vajalik viia läbi täismahus katse, võib selle teha ühel muul kontsentratsioonil. Kui tulemused on omavahel kooskõlas, võib täiendava täismahus katse veel ühel kontsentratsioonil ära jätta, kuna aine biokontsentreerumine ei ole eeldatavalt kontsentratsioonist sõltuv. Kui minimeeritud kujul katse on tehtud kahel kontsentratsioonil ja tulemustest ei nähtu kontsentratsioonist sõltuvust, võib täismahus katse teha ainult ühel kontsentratsioonil (vt punkt 87).
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Minimeeritud kujul tehtud katse protokoll peaks sisaldama kõiki täismahus katse puhul nõutavaid andmeid (vt punkt 81), välja arvatud andmed, mida ei ole võimalik esitada (st kõver, mis väljendab aega statsionaarse oleku saavutamiseni, ning biokontsentratsioonitegur statsionaarses olekus; viimase asemel tuleks esitada minimeeritud kujul katse kohane BCFss). Peale selle tuleks katseprotokollis esitada minimeeritud katsemeetodi kasutamise põhjendus ja leitud BCFKm.
                     C.13 – III:   Toidukaudsel kokkupuutel biokontsentreerumise katse kaladega
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolevas osas kirjeldatud meetodit tuleks kasutada ainete puhul, mille uurimine veekaudse kokkupuute meetodiga ei ole teostatav (näiteks seetõttu, et aine sisaldust vees ei suudeta hoida püsiva ja mõõdetavana või et 60 päeva pikkuse kokkupuuteperioodi jooksul ei ole võimalik saavutada aine piisaval määral kontsentreerumist organismis; veekaudse kokkupuute meetodit on kirjeldatud eespool olevates osades). Tuleks siiski silmas pidada, et käesoleva meetodi puhul leitav lõppnäitaja on biokontsentratsiooniteguri (BCF) asemel toidukaudse biokuhjumise tegur (BMF) (58).
                     2001. aasta mais Madridis toimunud Keskkonnatoksikoloogia ja -keemia Ühingu (SETAC) Euroopa üksuse konverentsil tutvustati uut meetodit vees raskesti lahustuvate orgaaniliste ainete bioakumuleerumise hindamiseks (36). Selle meetodi väljatöötamisel lähtuti mitmest varem avaldatud bioakumuleerumise uuringust, kus kasutati söödasse uuritava aine lisamisel põhinevat doseerimismeetodit (nt viide 37). 2004. aasta alguses esitati püsivate, bioakumuleeruvate ja mürgiste kemikaalide ELi töörühmale sellise meetodi kavand (38), mis oli ette nähtud võimaliku bioakumuleerumise tuvastamiseks selliste vees raskesti lahustuvate orgaaniliste ainete puhul, mida ei saa uurida veekaudsel kokkupuutel toimuva biokontsentreerumise hindamise standardmeetodiga; nimetatud kavandiga koos esitati ka seda toetav taustdokument (39). Kõnealuse meetodi vajalikkust põhjendati ka sellega, et võimalik kokkupuude selliste raskesti lahustuvate ainetega (st ained, mille log K
                        OW > 5) võib keskkonnas toimuda suures osas toidu kaudu (vt viited 40–44). Sel põhjusel on mõnes kemikaale käsitlevas avaldatud määruses viidatud toidukaudse kokkupuute katsetele (59). Tuleks siiski meeles pidada, et siin kirjeldatud meetodi puhul hoidutakse hoolikalt veefaasi kaudu kokkupuute loomisest, mistõttu sel viisil leitud BMFi väärtus ei ole otseselt võrreldav väliuuringust saadud BMFi väärtusega (mille puhul kokkupuude võib üheaegselt toimuda nii vee kui ka toidu kaudu).
                     Käesoleva katsemeetodi käesolev osa põhineb eespool nimetatud meetodil (38) ning selles kirjeldatakse uut meetodit, mis puudus katsemeetodi C.13 eelmises versioonis. Kõnealune alternatiivne meetod võimaldab uurida otsest toidukaudset kokkupuudet kontrollitud laboritingimustes.
                     Selliste uuringute võimalikel läbiviijatel tuleks tutvuda kõnealuse katsemeetodi punktidega 1–14, mis sisaldavad teavet selle koha, millal võib olla parem kasutada veekaudse kokkupuute katse asemel toidukaudse kokkupuute katset. Seal on esitatud uuritavate ainetega seotud eri kaalutlused, mida tuleks enne katse tegemist arvesse võtta.
                     Radioaktiivselt märgistatud uuritavate ainete kasutamist tuleks kaaluda sarnasel viisil kui veekaudse kokkupuute meetodi puhul (vt punktid 6 ja 65).
                     Toidukaudse kokkupuute meetodit võib kasutada rohkem kui ühe aine hindamiseks samas katses, kui on täidetud teatavad kriteeriumid, mida on põhjalikumalt käsitletud punktis 112. Lihtsuse huvides on siin kirjeldatud ainult ühe uuritava ainega tehtava katse metoodikat.
                     Toidukaudse ja veekaudse kokkupuute meetodid on paljuski sarnased, välja arvatud muidugi kokkupuuteviisi poolest. Seega kattuvad paljud siin kirjeldatud meetodi üksikasjad eelmistes osades kirjeldatud veekaudse kokkupuute meetodi omadega. On esitatud võimalikult palju viiteid eelmiste osade asjakohastele punktidele, ent loetavuse ja arusaadavuse huvides on teataval määral kordamine paratamatu.
                     KATSE PÕHIMÕTE
                     Võib kasutada läbivoolurežiimi või poolstaatilist režiimi (vt punkt 4); soovitatavalt tuleks kasutada läbivoolurežiimi, et piirata võimalikku veekaudset kokkupuudet uuritava ainega tulenevalt selle desorbeerumisest rikastatud söödast või väljaheidetest. Katse hõlmab kahte etappi: omastamine (uuritava ainega rikastatud sööt) ja puhastumine (puhas töötlemata sööt) (vt punkt 16). Omastamisetapis söödetakse katserühma(de) kalu iga päev kindlaksmääratud kaubandusliku kalasöödaga, mille koostis on teada ja millesse on lisatud uuritavat ainet. Ideaaljuhul peaksid kalad ära tarbima kogu pakutava sööda (vt punkt 141). Seejärel söödetakse kalu puhastumisetapi vältel puhta töötlemata kaubandusliku kalasöödaga. Nagu veekaudse kokkupuute meetodi puhul, võib ka siin kasutada vajaduse korral rohkem kui ühte katserühma, kellele antav sööt sisaldab rikastamiseks kasutatavat uuritavat ainet eri kontsentratsioonides, kuid enamiku väga hüdrofoobsete orgaaniliste ainete puhul piisab ühest katserühmast (vt punktid 49 ja 107). Poolstaatilise režiimi kasutamise korral tuleks kalad viia omastamisetapi lõpus üle uude katsekeskkonda ja/või katsekambrisse (kui omastamisetapi ajal kasutatud katsekeskkond ja/või seadmed on leostumise tagajärjel uuritava ainega saastunud). Uuritava aine kontsentratsiooni kalas mõõdetakse katse kummagi etapi kestel. Peale rikastatud sööta saavate kalade rühma (katserühm) kasutatakse kontrollrühma, mille kalu hoitakse identsetes tingimustes ja söödetakse täpselt samal viisil kaubandusliku kalasöödaga, mis ainsa erinevusena ei ole rikastatud uuritava ainega. Kõnealune kontrollrühm võimaldab kvantitatiivselt määrata uuritava aine taustsisalduse ainega mitte kokku puutunud kalades ja kasutada seda võrdlusalusena ainega kokkupuutumisest tuleneva mis tahes kahjuliku toime hindamisel katserühma(de)s (60). Ühtlasi võimaldab see võrrelda kasvu kiiruskonstante eri rühmades ja seeläbi veenduda, et pakutud sööta on tarbitud sarnases koguses (kasvu kiiruskonstandi väärtuste erinevuse põhjendamisel tuleks kaaluda ka söötade võimalikke maitseerinevusi; vt punkt 138). Nii omastamis- kui ka puhastumisetapis on oluline anda katserühma(de) ja kontrollrühma kaladele sama toiteväärtusega sööta.
                     Meetodi väljatöötajate kogemuste põhjal piisab üldjuhul 7–14 päeva pikkusest omastamisetapist (38, 39). See vahemik peaks võimaldama minimeerida katse läbiviimise kulusid ja tagada samas enamiku ainete puhul piisava kokkupuutemäära. Mõnel juhul võib omastamisetapi kestust siiski pikendada (vt punkt 127). Aine sisaldus kalas ei pruugi omastamisetapi jooksul saavutada statsionaarsele olekule vastavat väärtust, mistõttu käesoleva meetodi puhul põhinevad andmetöötlus ja tulemused üldjuhul kudedes leiduvate jääkide kineetilisel analüüsil. (Märkus: statsionaarse oleku saavutamiseks kuluva aja hindamise võrrandeid võib siin kasutada samamoodi kui veekaudse kokkupuute katse puhul – vt 5. liide.) Puhastumisetapp algab hetkel, mil kaladele antakse esmakordselt rikastamata sööta, ning kestab tavaliselt kuni 28 päeva või seni, kuni uuritav aine ei ole terves kalas enam tuvastatav, kui selline hetk saabub varem. Puhastumisetappi võib sõltuvalt kemikaali mõõdetud sisalduse muutumisest ajas ja olenevalt kalade suurusest lühendada või muuta selle 28 päevast pikemaks.
                     Käesolev meetod võimaldab määrata kalas esineva konkreetse uuritava aine poolväärtusaja (t
                        1/2, puhastumise kiiruskonstandi k
                        2 alusel), imendumistõhususe (absorbeerumine soolestikus; a), kineetilise toidukaudse biokuhjumise teguri (BMFK), kasvu suhtes korrigeeritud kineetilise toidukaudse biokuhjumise teguri (BMFKg) ja lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud (61) kineetilise toidukaudse biokuhjumise teguri (BMFKL) (ja/või nii kasvu kui ka lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud kineetilise toidukaudse biokuhjumise teguri BMFKgL). Nagu ka veekaudse kokkupuute meetodi puhul, nii põhjustab kalade kehamassi suurenemine katse vältel siingi uuritava aine lahjenemise kasvavates kalades, mistõttu (kineetilise) BMFi väärtust alahinnatakse juhul, kui seda ei korrigeerita kasvu suhtes (vt punktid 162 ja 163). Peale selle saab juhul, kui omastamisetapis saavutati eelduste kohaselt statsionaarne olek, arvutada statsionaarsele olekule vastava BMFi hinnangulise väärtuse. On välja töötatud lähenemisviisid, mis võimaldavad hinnata kineetilise biokontsentratsiooniteguri (BCFK) väärtust lähtuvalt toidukaudse kokkupuute uuringu andmetest (nt viited 44–48). Selliste lähenemisviiside positiivseid ja negatiivseid külgi on käsitletud 8. liites.
                     Käesolev meetod töötati välja peamiselt raskesti lahustuvate mittepolaarsete orgaaniliste ainete jaoks, mille omastamine ja millest puhastumine toimub kalades ligikaudu vastavalt esimest järku reaktsiooni kineetikale. Kui katses kasutatakse ainet, mille omastamine ja millest puhastumine ei toimu ligikaudu vastavalt esimest järku reaktsiooni kineetikale, tuleks rakendada keerukamaid mudeleid (vt viited 5. liites) ning kasutada biostatistiku ja/või farmakokineetika spetsialisti abi.
                     BMFi määramiseks analüüsitakse uuritavat ainet üldjuhul terves kalas (lähtuvalt märgmassist). Kui see on uuringu eesmärkide saavutamiseks asjakohane, võib proovi võtta konkreetsest koest (nt lihaskude, maks), kui kala on jagatud söödavaks ja mittesöödavaks osaks (vt punkt 21). Peale selle võib eemaldada seedekulgla ja seda eraldi analüüsida kas massibilansil põhineva lähenemisviisi raames või selleks, et teha kindlaks selles leiduva ainekoguse osakaal terves kalas leiduvas ainekoguses omastamisetapi lõpus ja veidi pärast puhastumisetapi algust võetud proovides.
                     Tuleks mõõta proovivõtmiseks valitud tervete kalade lipiidisisaldus, et aine kontsentratsiooni saaks korrigeerida nii kalade kui ka sööda lipiidisisalduse suhtes (vt punktid 56 ja 57 ning 7. liide).
                     Katse jooksul toimuda võiva kasvu kindlakstegemiseks tuleks iga proovivõtmiseks valitud kala kaaluda ning massiandmed registreerida ja seostada konkreetses kalas mõõdetud kemikaali kontsentratsiooniga (näiteks sel viisil, et registreerimisel kasutatakse igale analüüsitud kalale antud kordumatut tunnuskoodi). Samuti tuleks võimaluse korral mõõta kala üldpikkus (62). Massiandmed on vajalikud ka BCFi hinnangulise väärtuse leidmiseks toidukaudse kokkupuute katsest saadud puhastumisandmete põhjal.
                     TEAVE UURITAVA AINE KOHTA
                     Uuritava aine kohta peaks olema kättesaadav punktides 3 ja 22 kirjeldatud teave. Andmed analüüsimeetodi kohta, mis võimaldab määrata uuritava aine sisaldust vees, ei ole üldjuhul vajalikud, ent tuleb esitada teave meetodite kohta, mis võimaldavad sobiva tundlikkusega mõõta aine sisaldust kalasöödas ja kalakudedes.
                     Käesolevat meetodit võib kasutada rohkem kui ühe aine hindamiseks samas katses. Sel juhul peavad uuritavad ained sobima koos kasutamiseks: need ei tohi kalasöödale lisatuna üksteist vastastikku mõjutada ega oma keemilisi omadusi muuta. Eesmärk on tagada, et iga uuritava aine puhul saadud mõõtmistulemused ei erineks ainete koos kasutamisel oluliselt tulemustest, mis saadaks iga ainega eraldi katse tegemise korral. Eelanalüüsi käigus tuleks veenduda, et iga asjaomane aine on mitme ainega rikastatud söödast ja kala koeproovist tuvastatav i) suure tõhususega (nt > 85 % ulatuses nominaalsest sisaldusest) ja ii) katse läbiviimiseks vajaliku tundlikkusega. Koos analüüsitavate ainete summaarne sisaldus peaks olema väiksem kui võimaliku mürgise toime avaldumise summaarne kontsentratsioon (vt punkt 51). Peale selle tuleks katseplaani koostamisel arvesse võtta mitme aine üheaegsest katses kasutamisest tuleneda võivat kahjulikku mõju kaladele ja ainete võimalikku vastastikust toimet (nt metaboolne toime). Ioniseeruvate ainete koos kasutamisest tuleks hoiduda. Käesolev meetod sobib ka keerukate segudega kokkupuute hindamiseks (vt punkt 13; sellise analüüsi puhul kehtivad siiski samad piirangud kui kõikide muude meetodite puhul).
                     KATSE NÕUETEKOHASUS
                     Katse vastab nõuetele, kui on täidetud järgmised tingimused (vt punkt 24):
                     
                                 —
                              
                              
                                 veetemperatuuri varieeruvus katserühma(de)s ja kontrollrühmas on väiksem kui ± 2 °C;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 lahustunud hapniku sisaldus ei lange alla 60 % õhu küllastuskontsentratsioonist;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 uuritava aine sisaldus kalasöödas enne omastamisetapi algust ja selle lõpus ei erine rohkem kui ± 20 % (kummalgi ajahetkel võetud vähemalt kolme proovi andmete alusel);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 rikastatud söödaga tehtava eelanalüüsi käigus tuleks tõendada, et aine sisaldus söödas on väga homogeenne; see ei tohiks katse alguses võetud vähemalt kolmes proovis erineda keskväärtusest rohkem kui ± 15 %;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 uuritav aine peaks rikastamata söödas ja kontrollkalade kudedes olema tuvastamatu või esinema uuritava ainega proovidega võrreldes vaid tüüpilises mikrokoguses;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 suremus või kahjuliku mõju või haiguse osakaal kontroll- ja katserühma kalade hulgas peaks katse lõpus olema ≤ 10 %; kui katset mingil põhjusel pikendatakse, peab kahjuliku mõju osakaal kummaski rühmas olema ≤ 5 % kuus ja kokku ≤ 30 %. Oluline erinevus katserühma(de)st ja kontrollrühmast analüüsimiseks võetud kalade kasvukiiruses võib viidata uuritava aine mürgisele toimele.
                              
                           VÕRDLUSAINED
                     Kui laboris ei ole asjaomast katset varem läbi viidud või seal on tehtud olulisi muudatusi (nt on muutunud kalaliik, kalade liin või tarnija, toimunud olulisi muudatusi seoses kalade suuruse, kalasööda või rikastamismeetodiga vms), on soovitatav teha tehnilise pädevuse katse võrdlusainega. Võrdlusainet kasutatakse eelkõige selle kindlakstegemiseks, kas sööda rikastamise meetod sobib uuritava aine maksimaalse homogeensuse ja biosaadavuse tagamiseks. Ühe näitena võib tuua mittepolaarsete hüdrofoobsete ainete puhul võrdlusainena kasutatud heksaklorobenseeni, kuid selle aine ohtlike omaduste tõttu (63) tuleks kaaluda mõne muu aine kasutamist, mille kohta on olemas usaldusväärsed omastamist ja biokuhjumist käsitlevad andmed. Võrdlusaine kasutamise korral tuleks katseprotokollis esitada asjaomase aine kohta sama põhiteave kui uuritavate ainete kohta, sealhulgas aine nimetus, puhtus, CASi number, struktuur ja võimaluse korral mürgisust käsitlevad andmed (vt punktid 3 ja 22).
                     MEETODI KIRJELDUS
                     
                        Seadmed
                     
                     Tuleks kasutada veekaudse kokkupuute meetodis kirjeldatud materjale ja seadmeid (vt punkt 26). Tuleks kasutada läbivoolusüsteemi või staatilist uuendamisega süsteemi, millega tagatakse lahjendusvee piisava koguse lisamine katsenõudesse. Voolukiirus tuleks registreerida.
                     
                        Vesi
                     
                     Katses tuleks kasutada sellist vett, nagu on kirjeldatud veekaudse kokkupuute meetodis (vt punktid 27–29). Katsekeskkond peaks olema kirjeldatud viisil iseloomustatud ja selle kvaliteet peaks olema katse vältel püsiv. Selle looduslik tahkete osakeste sisaldus ja orgaanilise süsiniku üldsisaldus peaks enne katse algust olema võimalikult väike (tahkeid osakesi ≤ 5 mg/l; orgaanilise süsiniku üldsisaldus ≤ 2 mg/l). Orgaanilise süsiniku üldsisaldust on vaja mõõta üksnes katsevee iseloomustamise käigus enne katse algust (vt punkt 53).
                     
                        Toit
                     
                     Soovitatakse kasutada müügilolevat kalasööta (ujuvsööt ja/või aeglaselt põhja vajuv granuleeritud sööt), mille puhul on teada vähemalt selle valgu- ja rasvasisaldus. Söödagraanulid peaksid olema ühesuurused, et kokkupuude söödaga oleks tõhusam, st et kalad sööksid rohkem graanuleid, selle asemel et süüa suuremaid tükke ja jätta väikesed tükid alles. Graanulite mõõtmed peaksid vastama kalade suurusele katse alguses (näiteks võib kalade jaoks, kelle üldpikkus on 3–7 cm, kasutada graanuleid läbimõõduga umbes 0,6–0,85 mm ning kalade jaoks, kelle üldpikkus on 6–12 cm, graanuleid läbimõõduga 0,85–1,2 mm). Graanulite suurust võib sõltuvalt kalade kasvust puhastumisetapi alguses muuta. Müügiloleva sööda sobiva koostise näide on esitatud 7. liites. Käesoleva meetodi väljatöötamisel on tavapäraselt kasutatud katsesööta, milles lipiidide üldsisaldus on 15–20 massiprotsenti. Mõnes piirkonnas ei pruugi nii suure lipiidisisaldusega kalasööt olla kättesaadav. Sellisel juhul võib uuringus kasutada väiksema lipiidisisaldusega sööta ja kohandada vajaduse korral söötmisrežiimi, et tagada kalade püsimine tervena (lähtuvalt eelkatsete tulemustest). Lipiidide üldsisaldus tuleb katserühma(de) ja kontrollrühma söödas mõõta ja registreerida enne katse algust ja omastamisetapi lõpus. Katseprotokollis tuleks esitada sööda kaubanduslikult tarnijalt pärit analüüsiandmed toitaine-, niiskuse-, kiudaine- ja tuhasisalduse ning võimaluse korral mineraalainete ja pestitsiidijääkide (nt „standardsete“ prioriteetsete saasteainete) sisalduse kohta.
                     Sööda rikastamisel uuritava ainega tuleks teha kõik, et tagada aine homogeensus katsesöödas. Uuritava aine kontsentratsioon katserühma(de) söödas tuleks valida lähtuvalt analüüsimeetodi tundlikkusest, uuritava aine mürgisusest (täheldatava toime puudumise kontsentratsioonist, kui see on teada) ja asjakohastest füüsikalis-keemilistest näitajatest. Võrdlusaine kasutamise korral peaks selle kontsentratsioon olema soovitatavalt umbes 10 % uuritava aine kontsentratsioonist (või igatahes võimalikult väike); seejuures tuleks arvesse võtta analüüsimeetodi tundlikkust (nt heksaklorobenseeni puhul on vastuvõetav sisaldus söödas leitud olevat 1–100 μg/g; lisateave heksaklorobenseeni imendumise tõhususe kohta on esitatud viites 47).
                     Kalasööta võib uuritava ainega rikastada aine füüsikalistest omadustest ja lahustuvusest sõltuvalt mitmel eri viisil (rikastamismeetodeid on üksikasjalikumalt kirjeldatud 7. liites):
                     
                                 —
                              
                              
                                 kui aine on triglütseriidides lahustuv ja püsiv, tuleks see enne kalasöödaga segamist lahustada väikeses koguses kalaõlis või taimses toiduõlis. Sel juhul tuleks jälgida, et valmistatav sööt ei sisaldaks rikastamiseks kasutatava sööda tavapärase lipiidisisaldusega võrreldes liiga palju lipiide; seepärast lisatakse söödale teadaolev minimaalne õlikogus, mis on vajalik uuritava aine jaotumise ja homogeensuse saavutamiseks söödas; või
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 sööda rikastamisel tuleks kasutada sobivat orgaanilist lahustit, kui sellega ei vähendata homogeensust ja biosaadavust (on võimalik, et lahusti aurustumise tagajärjel tekivad söödas uuritava aine (mikro)kristallid, ning ei ole hõlbus tõendada, et seda ei ole toimunud; vt viide 49); või
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 mitteviskoossed vedelikud tuleks lisada otse kalasööta, kuid neid tuleks hästi segada, et hõlbustada homogeensuse saavutamist ja aine tõhusat imendumist. Tuleks kasutada segamismeetodit, millega tagatakse rikastatud sööda homogeensus.
                              
                           Mõnel üksikul juhul, näiteks vähem hüdrofoobsete ainete puhul, mis söödast suurema tõenäosusega desorbeeruvad, võib olla vaja kasutada valmistatud söödagraanulite katmiseks väikest kogust maisi- või kalaõli (vt punkt 142). Sel juhul tuleks kontrollrühma sööta töödelda samal viisil ja kasutada lipiidisisalduse mõõtmiseks lõplikult ette valmistatud sööta.
                     Võrdlusaine kasutamise korral peaksid sellega saadud tulemused olema võrreldavad varem avaldatud andmetega sarnastes tingimustes ja sarnasel söötmisrežiimil tehtud uuringutest (vt punkt 45) ning asjaomase võrdlusainega seotud näitajad peaksid vastama punktis 113 (loetelu kolmas, neljas ja viies taane) esitatud asjakohastele kriteeriumidele.
                     Kui uuritava aine puhul kasutatakse kandeainena õli või lahustit, tuleks võrreldav kogus sama kandeainet (ilma uuritava aineta) segada ka kontrollrühma söödaga, et tagada selle samaväärsus rikastatud söödaga. Nii omastamis- kui ka puhastumisetapis on oluline anda katserühma(de) ja kontrollrühma kaladele sama toiteväärtusega sööta.
                     Rikastatud sööta tuleks säilitada tingimustes, milles uuritav aine on söödaga segatuna püsiv (nt jahutatult), ja märkida need tingimused katseprotokolli.
                     
                        Kalaliigi valimine
                     
                     Võib kasutada veekaudse kokkupuute meetodis määratletud kalaliike (vt punkt 32 ja 3. liide). Enne käesoleva katsemeetodi avaldamist on orgaaniliste ainetega tehtud toidukaudse bioakumuleerumise uuringutes kasutatud tavaliselt vikerforelli (Oncorhynchus mykiss), karpkala (Cyprinus carpio) ja tüsedat tömpnina (Pimephales promelas). Katsealuse liigi toitumiskäitumine peaks olema selline, et lisatud söödakogus tarbitakse kiirelt ära; sellega tagatakse, et kõikide söödas esineva uuritava aine sisaldust muuta võivate tegurite mõju (nt leostumine vette ja veekaudse kokkupuude võimalus) on minimaalne. Tuleks kasutada soovitatavasse suuruse-/massivahemikku jäävaid kalu (vt 3. liide). Kalad ei tohiks olla nii väikesed, et see takistaks iga kala eraldi analüüsimist. Kiire kasvamise etapis olevate kalade kasutamisel võib andmete tõlgendamine olla raskendatud, samuti võib suur kasvukiirus mõjutada aine imendumistõhususe arvutamist (64)
                     
                     
                        Kalade pidamine
                     
                     Katse eel kohaldatavad kalade kohanemise, suremuse ja haigustega seotud vastuvõetavuse kriteeriumid on samad kui veekaudse kokkupuute meetodi puhul (vt punktid 33–35).
                     KATSE KÄIK
                     
                        Katse-eelne analüüs ja kontsentratsioonivahemiku leidmise katse
                     
                     Enne katse läbiviimist on vaja teha analüüs, millega tõendatakse aine tuvastatavust rikastatud söödast või rikastatud kalakudedest. Kontsentratsioonivahemiku leidmise katse sobiva kontsentratsiooni valimiseks ei ole alati vajalik. Võib teha söötmise eelkatseid, et tõendada täheldatava kahjuliku mõju puudumist, hinnata rikastatud sööda maitse sobivust ja analüüsimeetodi tundlikkust kalakudede ja sööda puhul, valida sobiv söötmisrežiim ja proovivõtuintervall puhastumisetapis jne; sellised eelkatsed ei ole siiski kohustuslikud. Väärtuslikku teavet võib anda puhastumisetapis võetavate proovide jaoks vajaliku kalade arvu hindamiseks tehtav eeluuring. See võib oluliselt vähendada katses kasutatavate kalade arvu, eriti selliste uuritavate ainete puhul, mis on iseäranis kergesti metaboliseeruvad.
                     
                        Kokkupuutetingimused
                     
                     
                        Omastamisetapi kestus
                     
                     Tavaliselt on omastamisetapi piisav kestus 7–14 päeva, mille jooksul ühele kalade rühmale antakse iga päev kontrollsööta ja teisele katsesööta kindlaksmääratud koguses, mis sõltub katsealusest liigist ja katsetingimustest; näiteks vikerforelli puhul on see 1–2 % kehamassist (märgmassi alusel). Sööda kogus valitakse nii, et ei toimuks kiiret kasvu ega lipiidisisalduse olulist suurenemist. Vajaduse korral võib omastamisetapi kestust pikendada lähtuvalt varasemate uuringutega saadud praktilisest kogemusest või andmetest uuritava aine (või selle analoogi) omastamise või sellest puhastumise kohta kalades. Katse algushetkeks loetakse rikastatud sööda esmakordse lisamise hetke. Katsepäev kestab söötmise ajast kuni ajani veidi (nt üks tund) enne järgmist söötmist. Seega algab esimene katsepäev rikastatud sööda esmakordse lisamise hetkest ja lõpeb veidi enne rikastatud sööda teistkordse lisamise hetke. Praktikas lõpeb omastamisetapp veidi (nt üks tund) enne uuritava ainega rikastamata sööda esmakordset lisamist, kuna sellele eelneva 24 tunni jooksul jätkavad kalad rikastatud sööda seedimist ja uuritava aine absorbeerimist. On oluline tagada, et organismis saavutatakse uuritava aine piisavalt suur sisaldus (mürgisuse ilmnemiseta), et kasutatava analüüsimeetodiga oleks puhastumisetapis võimalik mõõta ka vähemalt ühe suurusjärgu võrra väiksemat aine sisaldust. Erandjuhul võib omastamisetappi pikendada (kuni 28 päevani) ja võtta omastamiskineetika kirjeldamiseks lisaproove. Aine sisaldus kalas ei pruugi omastamisetapi vältel saavutada statsionaarsele olekule vastavat väärtust. Käesoleva meetodi puhul võib statsionaarse oleku saavutamiseks kuluva aja hindamiseks kasutada samu võrrandeid kui veekaudse kokkupuute meetodi puhul, et teha kindlaks eeldatav ajavahemik, mille jooksul aine sisaldus kalas jõuab piisavale tasemele (vt 5. liide).
                     Mõnel juhul võib olla teada, et analüüsimeetodi vähesest tundlikkusest või väikesest aine imendumise tõhususest tulenevalt ei omasta kalad asjaomase söödas kasutatava kontsentratsiooni puhul ainet 7–14 päeva jooksul piisavalt, et selle sisaldus kalas oleks puhastumisetapis toimuva vähemalt ühe suurusjärgu võrra vähenemise järel määratav. Sellisel juhul võib olla kasulik muuta söötmisetapi algset kestust nii, et see oleks pikem kui 14 päeva; teise võimalusena tuleks kaaluda aine sisalduse suurendamist söödas, eelkõige kiirelt metaboliseeruvate ainete puhul. Tuleks siiski jälgida, et omastamisetapis jääks aine sisaldus kalakudedes väiksemaks kui (eeldatav) täheldatava kroonilise toime puudumise kontsentratsioon (vt punkt 138).
                     
                        Puhastumisetapi kestus
                     
                     Puhastumine kestab üldjuhul kuni 28 päeva ja algab hetkel, mil katserühma(de) kaladele hakatakse omastamisetapi järel andma puhast töötlemata sööta. Puhastumine ei alga kohe pärast viimast söötmist rikastatud söödaga, vaid esimesel rikastamata söödaga söötmisel, kuna sellele eelneva 24 tunni jooksul jätkavad kalad sööda seedimist ja uuritava aine absorbeerimist, nagu on märgitud punktis 126. Seepärast võetakse puhastumisetapis esimene proov veidi enne teistkordset söötmist rikastamata söödaga. Nimetatud puhastumisperiood on ette nähtud selliste ainete uurimiseks, mille eeldatav poolväärtusaeg on kuni 14 päeva – nagu see on bioakumuleeruvatel ainetel (65) – ja mille puhul 28 päeva sisse mahub kaks poolväärtusaega. Väga bioakumuleeruvate ainete puhul võib olla kasulik puhastumisetapi kestust pikendada (kui see on eelkatsete põhjal vajalik).
                     Kui ainest puhastumine on väga aeglane ja täpset poolväärtusaega ei saa puhastumisetapis kindlaks teha, võib saadav teave olla hindamiseks siiski piisav ja viidata ulatuslikule bioakumuleerumisele. Kui aga ainest puhastumine on nii kiire, et ei ole võimalik usaldusväärselt leida aine sisaldust alghetkel (C
                        0,d – kontsentratsioon omastamisetapi lõpus / puhastumisetapi alguses) ja k
                        2 väärtust, võib arvutada konservatiivse hinnangu kohase k
                        2 väärtuse (vt 7. liide).
                     Kui kalade analüüsimisest mõnel varasemal ajahetkel (nt 7 või 14 päeva järel) nähtub, et aine sisaldus on langenud enne täispika 28-päevase puhastumisetapi lõppu määramispiirist allapoole, võib järgnevad proovid võtmata jätta ja katse lõpetada.
                     Mõnel üksikul juhul ei pruugi omastamisperioodi lõpuks (või puhastumisetapis teise proovi võtmise ajaks) olla toimunud aine omastamist mõõdetavas koguses. Kui on võimalik tõendada, et i) punktis 113 esitatud nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud ja ii) mitteomastamine ei tulene katsemeetodiga seotud muudest puudustest (nt omastamisetapi ebapiisav kestus, sööda rikastamise meetodi puudulikkusest põhjustatud vähene biosaadavus, analüüsimeetodi liiga väike tundlikkus, asjaolu, et kalad ei tarbi sööta, vms), võib olla võimalik katse lõpetada, ilma et oleks vaja teha pikema omastamisperioodiga korduskatset. Kui eelanalüüsist nähtub, et tegemist võib olla sellise juhuga, võib olla soovitatav võimaluse korral analüüsida massibilansil põhineva lähenemisviisi raames väljaheiteid seedimata uuritava aine suhtes.
                     
                        Katsealuste kalade arv
                     
                     Nagu veekaudse kokkupuute katse puhul, tuleks siingi valida katsesse sarnase massi ja pikkusega kalad, nii et kõige väiksemate kalade mass oleks vähemalt kaks kolmandikku kõige suuremate kalade massist (vt punktid 40–42).
                     Uuringus kasutatavate kalade üldarvu kindlaksmääramisel tuleks lähtuda proovivõtukavast (vähemalt üks proov omastamisetapi lõpus ja neli kuni kuus proovi puhastumisetapi vältel, ent sõltuvalt nende etappide kestusest) ning võtta arvesse analüüsimeetodi tundlikkust, omastamisetapi lõpuks eelduste kohaselt saavutatavat sisaldust (varasemate andmete alusel) ja puhastumisetapi kestust (kui varasemad andmed võimaldavad seda hinnata). Igal proovivõtmisel tuleks valida viis kuni kümme kala ning mõõta enne kemikaali või lipiidide sisalduse määramist kasvu iseloomustavad näitajad (mass ja üldpikkus).
                     Tulenevalt suuruse, kasvukiiruse ja füsioloogiliste näitajate loomulikust varieeruvusest kalade hulgas ning iga kala tarbitava söödakoguse tõenäolisest varieeruvusest tuleks igal proovivõtmisel valida katserühmast vähemalt viis kala ja kontrollrühmast samuti vähemalt viis kala, et oleks võimalik teha nõuetekohaselt kindlaks aine sisalduse keskväärtus ja varieeruvus. Kasutatavate kalade hulgas täheldatav varieeruvus moodustab katses esinevast üldisest kontrollimatust varieeruvusest tõenäoliselt suurema osa kui kohaldatavatele analüüsimeetoditele omane varieeruvus, mistõttu mõnel juhul on põhjendatud kuni kümne kala kasutamine igas proovivõtupunktis. Kui uuritava aine taustsisaldus kontrollrühma kalades ei ole puhastumisetapi alguses tuvastatav, võib piisata kemikaali määramisest vaid kahes-kolmes kontrollrühma kalas üksnes viimases proovivõtupunktis, eeldusel, et kontrollrühma ülejäänud kaladel mõõdetakse kõikides proovivõtupunktides mass ja üldpikkus (nii et kasvu hindamiseks valitakse katserühma(de)s ja kontrollrühmas proovi sama arv kalu). Kalu tuleks säilitada ning mõõta eraldi iga kala mass ja üldpikkus (ka juhul, kui proovide andmed on vaja hiljem ühte koondada).
                     See tähendab, et standardkatse puhul, kus kasutatakse näiteks 28 päeva pikkust puhastumisetappi ja selle aja jooksul võetakse viis proovi, valitakse katserühmast kokku 59–120 kala ja kontrollrühmast 50–110 kala, kui aine analüüsimise meetod võimaldab määrata samal kalal ka lipiidisisalduse. Kui samal kalal ei ole võimalik määrata korraga nii lipiidide kui ka kemikaali sisaldust ja lipiidisisalduse määramine üksnes kontrollrühma kaladel ei ole samuti teostatav (vt punkt 56), läheb vaja veel 15 kala (kolm kala lähtepopulatsioonist katse alguses ning kontrollrühmast ja katserühmast kummastki kolm kala nii puhastumisetapi alguses kui ka katse lõpus). Proovivõtmise näidisajakava koos kalade arvuga on esitatud 4. liites.
                     
                        Biomassisisaldus
                     
                     Ühe kala kohta tuleks kasutada samasugust suurt veekogust nagu veekaudse kokkupuute meetodi puhul (vt punktid 43 ja 44). Ehkki käesoleva katsemeetodi puhul ei sõltu kokkupuutekontsentratsioon ühe kala kohta kasutatavast veekogusest, on lahustunud hapniku nõuetekohase sisalduse säilitamise ja katseorganismide stressi minimeerimise huvides soovitatav lisatav kalade kogus 0,1–1,0 g (märgmass) liitri vee kohta päevas.
                     
                        Katsesööt ja söötmine
                     
                     Kohanemisperioodi jooksul tuleks kalu sööta eespool kirjeldatud sobiva söödaga (punkt 117). Kui katse tehakse läbivoolurežiimis, tuleks veevool kalade söötmise ajaks peatada.
                     Katse ajal tuleks katserühma(de)s kasutada eespool kirjeldatud sööta (punktid 116–121). Soovitud rikastamisjärgse kontsentratsiooni valimisel tuleks peale konkreetse uuritava ainega seotud tegurite, analüüsimeetodi tundlikkuse, asjaomaste keskkonnatingimuste juures söödas saavutatava eeldatava sisalduse ja organismis kroonilise mürgisuse avaldumise kontsentratsiooni võtta arvesse ka sööda maitseomadusi (et kalad ei hoiduks seda söömast). Rikastamisel saavutatav uuritava aine nominaalne kontsentratsioon tuleks esitada katseprotokollis. Kogemustest ilmneb, et selliste uuritavate ainete puhul, millel puudub konkreetne mürgisuse avaldumise mehhanism, jääb praktikas kasutatav rikastamisjärgne kontsentratsioon vahemikku 1–1 000 μg/g. Mittespetsiifilise toimemehhanismiga ainete puhul ei tohiks ainejääkide sisaldus kudedes olla suurem kui 5 μmol grammi lipiidide kohta, kuna on tõenäoline, et sellest suurema jääkide sisalduse juures ilmneb aine krooniline mõju (19, 48, 50) (66). Muude ainete puhul tuleks jälgida, et kumulatiivne kokkupuude ei põhjustaks mingit kahjulikku mõju (vt punkt 127). Seda tuleb eriti silmas pidada juhul, kui katses kasutatakse üheaegselt mitut ainet (vt punkt 112).
                     Kalasööda rikastamiseks sobiva koguse uuritava ainega võib kasutada ühte kolmest meetodist, mida on kirjeldatud punktis 119 ja 7. liites. Sööda rikastamiseks kasutatud meetodid tuleks esitada katseprotokollis. Kontrollrühma kalu söödetakse töötlemata söödaga, mis sisaldab sobivas koguses õli, kui seda kasutatakse kandeainena omastamisetapis antavas rikastatud söödas, või uuritava aineta lahustit, kui katserühma sööda valmistamisel kasutatakse kandeainena lahustit. Töödeldud ja töötlemata söödas tuleks uuritava aine sisaldus määrata analüütiliselt enne omastamisetapi algust ja selle lõpus vähemalt kolmes paralleelis. Pärast kokkupuudet töödeldud söödaga (omastamisetapp) söödetakse kummagi rühma kalu töötlemata söödaga (puhastumisetapp).
                     Kalade söötmisel kasutatakse kindlaksmääratud söödakogust (sõltuvalt liigist; näiteks vikerforelli puhul on see umbes 1–2 % kala märgmassist päevas). Sööda kogus valitakse nii, et ei toimuks kiiret kasvu ega lipiidisisalduse olulist suurenemist. Katses kasutatud täpne söötmisrežiim tuleks registreerida. Algselt tuleks söötmisel aluseks võtta lähtepopulatsioonis vahetult enne katse algust tehtud plaanilise kaalumise tulemused. Sööda kogust tuleks muuta lähtuvalt igal proovivõtmisel valitud kalade märgmassist, et võtta arvesse kalade kasvu katse vältel. Katse- ja kontrollnõudes olevate kalade massi ja pikkust saab hinnata igal proovivõtmisel valitud kalade massi ja üldpikkuse põhjal; katse- ja kontrollnõudesse jäänud kalu ei kaaluta ega mõõdeta. On oluline kasutada kogu katse vältel sama kindlaksmääratud söötmisrežiimi.
                     Söömist tuleks vaadelda, et olla kindel, et kalad tarbivad nähtavalt ära kogu lisatud sööda ja et sellest tulenevalt kasutatakse arvutustes õiget sööda tarbimise määra. Sellise söötmisrežiimi valimisel, mille puhul on tagatud kord päevas antava sööda täielik äratarbimine, tuleks tugineda söötmise eelkatsete tulemustele või varasemale kogemusele. Kui sööt jäetakse pidevalt söömata, võib olla soovitatav hajutada iga katsepäeva söödakogust ühe söötmiskorra lisamisega (näiteks asendada kord päevas toimuv söötmine kaks korda päevas toimuva poole väiksema koguse söötmisega). Sellise vajaduse korral peaks teine söötmine toimuma kindlal kellaajal ja olema ajastatud nii, et ajavahemik söötmisest kalaproovi võtmiseni on võimalikult pikk (näiteks toimub teine söötmine katsepäeva esimeses pooles).
                     Ehkki üldjuhul tarbivad kalad sööda kiiresti ära, on oluline tagada, et aine jääks söödale adsorbeerunuks. Tuleks teha jõupingutusi, et hoida ära uuritava aine dispergeerumist söödast vette ja sellest tulenevat kalade veekaudset kokkupuudet uuritava ainega lisaks toidukaudsele kokkupuutele. Seda on võimalik saavutada nii, et kogu söömata jäänud sööt (ja väljaheited) eemaldatakse katse- ja kontrollnõudest ühe tunni, kuid soovitatavalt 30 minuti jooksul pärast söötmist. Peale selle võib kasutada süsteemi, mille puhul vett puhastatakse pidevalt aktiivsöefiltri abil, mis absorbeerib kõik „lahustunud“ saasteained. Abi võib olla ka läbivoolusüsteemist, kus toiduosakesed ja lahustunud ained uhutakse kiiresti välja (67). Mõnel juhul võivad aidata seda probleemi leevendada väikesed muudatused rikastatud sööda valmistamise meetodis (vt punkt 119).
                     
                        Valgus ja temperatuur
                     
                     Nagu veekaudse kokkupuute meetodis (vt punkt 48), soovitatakse siingi kasutada 12–16 tunni pikkust valgustusperioodi ja katsealuse liigi jaoks sobivat temperatuuri (± 2 °C) (vt 3. liide). Kasutatava valguse liik ja omadused peaksid olema teada ja need tuleks registreerida.
                     
                        Kontrollid
                     
                     Tuleks kasutada ühte kontrollrühma, mille kaladele antakse sama kogus sööta kui katserühma kaladele, kuid mille söödas puudub uuritav aine. Kui katserühma sööda rikastamisel kasutatakse kandeainena lahustit, tuleks kontrollrühma sööta töödelda täpselt samal viisil, kuid ilma uuritava aineta, nii et nende rühmade sööt oleks võrreldava koostisega (vt punktid 121 ja 139).
                     
                        Vee kvaliteediga seotud mõõtmiste sagedus
                     
                     Veekaudse kokkupuute meetodis kirjeldatud tingimusi kohaldatakse ka siin; ainsa erinevusena on orgaanilise süsiniku üldsisaldust vaja mõõta üksnes katse eel katsevee iseloomustamise käigus (vt punkt 53).
                     
                        Kala- ja söödaproovide võtmine ja analüüs
                     
                     
                        Söödaproovide analüüs
                     
                     Katse- ja kontrollsööda proovides tuleks uuritava aine ja lipiidide sisaldus määrata vähemalt enne omastamisetapi algust ja selle lõpus vähemalt kolmes paralleelis. Sööda homogeensuse tagamiseks kasutatud analüüsimeetodid tuleks esitada katseprotokollis.
                     Uuritava aine analüüsimiseks proovis tuleks kasutada üldlevinud valideeritud meetodit. Enne katse alustamist tuleks teha eeluuringud, et selgitada välja määramispiir, protsentuaalne tuvastamise tõhusus, segavad tegurid ja analüütiliselt tuvastatav varieeruvus kavandatavas proovi materjalis. Kui katses kasutatakse radioaktiivselt märgistatud ainet, tuleks lähtuda samadest kaalutlustest kui veekaudse kokkupuute meetodis, ainult et vee analüüsimise asemel analüüsitakse sööta (vt punkt 65).
                     
                        Kalaproovide analüüs
                     
                     Igal kalaproovide võtmisel valitakse uuritava ainega kokku puutuvast rühmast ja kontrollrühmast 5–10 isendit (mõnel juhul võib kontrollrühma kalade arv olla väiksem; vt punkt 134).
                     Proovivõtmine peaks igal katsepäeval toimuma samal ajal (söötmisajaga võrreldes) ja olema ajastatud nii, et omastamisetapi ajal ja puhastumisetapi algusjärgus oleks soolestikku jäänud toidu esinemise tõenäosus võimalikult väike ning uuritava aine üldsisalduse andmetes ei oleks seepärast vaja kahelda (st proovivõtmiseks valitud kalad tuleks eemaldada katsepäeva lõpus; seejuures tuleks meeles pidada, et katsepäev algab söötmise hetkel ja lõpeb järgmise söötmise hetkel umbes 24 tundi hiljem; puhastumine algab rikastamata sööda esmakordse lisamise hetkel; vt punkt 128). Puhastumisetapi esimene proov, mis võetakse veidi enne teistkordset rikastamata söödaga söötmist, on oluline põhjusel, et sellest mõõtmisest ühe päeva võrra tagasi ekstrapoleerimise teel leitakse aine eeldatav sisaldus alghetkel (C
                        0,d – kontsentratsioon kalas omastamisetapi lõpus / puhastumisetapi alguses). Soovi korral võib omastamisetapi lõpus ning puhastumisetapi esimesel ja kolmandal päeval eemaldada kala seedekulgla ja seda eraldi analüüsida.
                     Kalad tuleks igal proovivõtmisel kummagi rühma nõudest eemaldada ja käidelda neid samal viisil, nagu on kirjeldatud veekaudse kokkupuute meetodis (vt punktid 61–63).
                     Nii katse- kui ka kontrollrühmas mõõdetakse uuritava aine sisaldust terves kalas (märgmassi alusel) vähemalt omastamisetapi lõpus ja puhastumisetapi kestel. Puhastumisetapis soovitatakse võtta proove neljal kuni kuuel korral (nt 1, 3, 7, 14 ja 28 päeva möödudes). Soovi korral võib 1–3 päeva kestnud omastamise järel võtta ühe lisaproovi, et hinnata imendumistõhusust kokkupuute algusjärgu põhjal, mil aine omastamine kalades on lineaarne. Kaks peamist võimalikku kõrvalekaldumist proovivõtukavast on järgmised: i) kui omastamisetappi pikendatakse, et analüüsida omastamiskineetikat, võetakse omastamisetapis proove sagedamini ja seega tuleb katses kasutada suuremat arvu kalu (vt punkt 126); ii) katse lõpetatakse omastamisetapi lõpus, kuna ainet ei ole mõõdetavas koguses omastatud (vt punkt 131). Kasvu kiiruskonstandi leidmiseks tuleks mõõta iga proovivõtmiseks valitud kala mass (ja üldpikkus). Omastamisetapi lõpus ja puhastumisetapi valitud aegadel võib määrata ka aine sisalduse konkreetsetes kalakudedes (söödav ja mittesöödav osa). Kui katses kasutatakse radioaktiivselt märgistatud ainet, tuleks lähtuda samadest kaalutlustest kui veekaudse kokkupuute meetodis, ainult et vee analüüsimise asemel analüüsitakse sööta (vt punkt 65).
                     Kui aeg-ajalt kasutatakse võrdlusainet (vt punkt 25), on katserühmas soovitatav määrata selle sisaldus omastamisetapi lõpus ja kõikides uuritava aine puhul kasutatavates puhastumisetapi proovivõtupunktides (terve kala alusel); kontrollrühmas on võrdlusaine sisaldus vaja määrata üksnes omastamisetapi lõpus (terve kala alusel). Teatavas olukorras (näiteks kui uuritava aine ja võrdlusaine puhul kasutatavad analüüsimeetodid on omavahel sobimatud ja proovivõtukavast kinni pidamiseks tuleks kasutada suuremat arvu kalu) võib täiendavalt vaja minevate kalade arvu minimeerimiseks kasutada teistsugust lähenemisviisi: võrdlusaine sisaldust mõõdetakse üksnes puhastumisetapis selle esimesel ja kolmandal päeval ning veel kahes proovivõtupunktis, mis on valitud nii, et oleks võimalik usaldusväärselt hinnata võrdlusaine sisaldust alghetkel (C
                        0,d) ja võrdlusaine k
                        2.
                     Võimaluse korral tuleks igal proovivõtmisel või vähemalt omastamisetapi alguses ja lõpus ning puhastumisetapi lõpus määrata iga kala lipiidisisaldus (vt punktid 56 ja 67). Kasutatavast analüüsimeetodist sõltuvalt (vt punkt 67 ja 4. liide) võib olla võimalik kasutada lipiidisisalduse ja uuritava aine sisalduse määramiseks sama kala. See on kalade arvu minimeerimise seisukohast soovitatav. Kui see ei ole aga võimalik, võib kasutada lähenemisviisi, mida on kirjeldatud veekaudse kokkupuute meetodis (kõnealuseid alternatiivseid võimalusi lipiidisisalduse mõõtmiseks on käsitletud punktis 56). Lipiidisisalduse kvantifitseerimiseks kasutatud meetod tuleks esitada katseprotokollis.
                     
                        Analüüsimeetodi kvaliteet
                     
                     Tuleks katseliselt veenduda, et konkreetse aine analüüsimise meetodi spetsiifilisus, mõõtetäpsus ja kordustäpsus ning tulemuste reprodutseeritavus, samuti uuritava aine tuvastamise tõhusus sööda- ja kalaproovides on piisavad.
                     
                        Kalade kasvu mõõtmine
                     
                     Katse alguses tuleb määrata lähtepopulatsioonist võetud proovis olevate kalade mass ja üldpikkus. Kõnealune proov tuleks võtta veidi (nt üks tund) enne esmakordset rikastatud söödaga söötmist ja lugeda see võetuks katse nullpäeval. Kalade arv selles proovis peaks olema vähemalt sama suur kui katse vältel võetavates proovides. Mõni neist kaladest võib olla seesama, keda kasutatakse lipiidisisalduse määramiseks enne omastamisetapi algust (vt punkt 153). Igal proovivõtmisel mõõdetakse kõigepealt kalade mass ja pikkus. Iga üksiku proovivõtmiseks valitud kala puhul tuleks mõõdetud mass ja pikkus kokku viia määratud uuritava kemikaali sisaldusega (ja vajaduse korral lipiidisisaldusega), näiteks kordumatu tunnuskoodi abil. Kõnealustel valitud kaladel mõõdetud väärtusi saab kasutada katse- ja kontrollnõudesse jäänud kalade massi ja pikkuse hindamiseks.
                     
                        Vaatlused katse ajal
                     
                     Iga päev tuleks vaadelda suremust ja andmed registreerida. Tuleks teha lisavaatlusi kahjuliku mõju, näiteks ebanormaalse käitumise või pigmenteerumise tuvastamiseks ning tulemused registreerida. Kala loetakse surnuks, kui tal ei täheldata hingamisliigutusi ja ta ei reageeri nõrgale mehaanilisele ärritajale. Kõik surnud või selgelt surmaeelses seisundis kalad tuleks eemaldada.
                     ANDMED JA ARUANDLUS
                     
                        Andmete töötlemine
                     
                     Katse tulemusi kasutatakse puhastumise kiiruskonstandi (k
                        2) leidmiseks kalade märgmassi põhjal. Kalade massi suurenemise keskmisest määrast lähtuvalt arvutatakse kasvu kiiruskonstant k
                        g, mida vajaduse korral kasutatakse kasvu suhtes korrigeeritud puhastumise kiiruskonstandi k
                        2g leidmiseks. Peale selle tuleks esitada imendumistõhusus (absorbeerumine soolestikus; a), kineetiline biokuhjumistegur (BMFK) (vajaduse korral kasvu suhtes korrigeerituna – BMFKg), selle väärtus lipiidisisalduse suhtes korrigeerituna (BMFKL) või nii kasvu kui ka lipiidisisalduse suhtes korrigeerituna (BMFKgL) ning söödatarbimise kiirus. Samuti võib juhul, kui on võimalik hinnata statsionaarse oleku saavutamiseks kuluvat aega (nt 95 % statsionaarsele olekule vastavast väärtusest ehk t
                        95 = 3,0 / k
                        2), esitada ka statsionaarsele olekule vastava BMFi (BMFSS) hinnangulise väärtuse (vt punktid 105 ja 106 ning 5. liide), kui t
                        95 väärtusest nähtub, et katses võidi saavutada statsionaarne olek. Kõnealuse BMFSS-i puhul tuleks lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud väärtuse (BMFSSL) saamiseks korrigeerida seda lipiidisisalduse suhtes samal viisil kui kineetilist BMF-i (BMFK) (tuleb märkida, et statsionaarsele olekule vastava BMF-i korrigeerimiseks kasvust tingitud lahjenemise suhtes puudub kokkulepitud metoodika). Valemid ja näidisarvutused on esitatud 7. liites. On välja töötatud lähenemisviisid, mis võimaldavad hinnata kineetilise biokontsentratsiooniteguri (BCFK) väärtust lähtuvalt toidukaudse kokkupuute uuringu andmetest. Seda on käsitletud 8. liites.
                     
                        Kalade massi- ja pikkuse andmed
                     
                     Igal perioodil mõõdetud iga kala märgmass ja pikkus kantakse tabelisse iga omastamisetapi proovivõtupäeva ning katserühma(de) ja kontrollrühma kohta eraldi (lähtepopulatsiooni andmed omastamisetapi alguses; kontrollrühma ja katserühma(de) andmed omastamisetapi lõpus ning vastavate proovide olemasolu korral omastamisetapi algusjärgus (nt 1.–3. päeval) ja puhastumisetapis (nt 1., 2., 4., 7., 14. ja 28. päeval)). Kasvust tingitud lahjenemise suhtes korrigeerimisel tuleks kasvunäitajana eelistatavalt kasutada massi. Meetod(id), mida kasutatakse andmete korrigeerimiseks kasvust tingitud lahjenemise suhtes, on esitatud allpool punktides 162 ja 163 ning 5. liites.
                     
                        Andmed uuritava aine sisalduse kohta kalas
                     
                     Katserühma(de) ja kontrollrühma igas kalas (või kui igas kalas eraldi määramine ei ole võimalik, siis kalade koondproovis) tehtud uuritava aine jääkide mõõtmise tulemused, mis on väljendatud sisaldusena massiühikutes märgmassi ühiku kohta, kantakse tabelisse iga proovivõtukorra kohta. Kui iga proovivõtmiseks valitud kala on analüüsitud lipiidisisalduse suhtes, saab iga kala kohta leida ja tabelisse kanda lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud sisalduse, mis arvutatakse lähtuvalt lipiidide massiosast.
                     
                                 —
                              
                              
                                 Igas kalas (või kui igas kalas eraldi määramine ei ole võimalik, siis kalade koondproovis; vt punkt 66) tehtud uuritava aine jääkide mõõtmise tulemused puhastumisperioodi kohta naturaallogaritmitakse ja kantakse graafikule päevades väljendatud aja funktsioonina. Kui graafiku visuaalsel hindamisel täheldatakse selgelt võõrväärtuste esinemist, võib kahtlaste andmepunktide väljajätmiseks kasutada statistiliselt usaldusväärset võõrväärtuste testi ja esitada dokumenteeritud põhjenduse selliste andmepunktide väljajätmise kohta.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Vähimruutude meetodil arvutatakse naturaallogaritmitud kontsentratsiooni ja päevades väljendatud puhastumisaja lineaarne korrelatsioon. Saadud sirge tõus ja algordinaat esitatakse puhastumise üldise kiiruskonstandina (k
                                    2) ja naturaallogaritmitud eeldatava sisaldusena alghetkel (C
                                    0,d) (üksikasjalikum teave on esitatud 5. ja 7. liites). Kui see ei ole võimalik, sest aine sisaldus on puhastumisetapi teises proovis langenud määramispiirist allapoole, võib leida k
                                    2 konservatiivse hinnangulise väärtuse (vt 7. liide).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Standardsete statistiliste meetoditega arvutatakse sirge tõusu ja algordinaadi väärtuste hajuvus ning leitakse ja esitatakse tulemuste usaldusvahemik usaldusnivool 90 % (või 95 %).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Samuti arvutatakse omastamisetapi viimasel päeval kalades mõõdetud aine sisalduse (C
                                    0,m – mõõdetud sisaldus alghetkel) keskväärtus ja võrreldakse seda eeldatava väärtusega C
                                    0,d. Kui eeldatav väärtus on väiksem kui mõõdetud väärtus, võib see viidata seedimata jäänud rikastatud sööda esinemisele soolestikus. Kui eeldatav väärtus on mõõdetud väärtusest väga palju suurem, võib see viidata asjaolule, et puhastumisandmete lineaarse regressiooni teel leitud väärtus ei ole õige ja seda tuleks uuesti hinnata (vt 7. liide).
                              
                           
                        Puhastumiskiirus ja biokuhjumistegur
                     
                     Katseandmete alusel biokuhjumisteguri arvutamiseks tuleks kõigepealt leida imendumistõhusus (uuritava aine absorbeerumine soolestikus; α). Selleks tuleks kasutada 7. liites esitatud võrrandit A7.1, mille puhul on vaja teada aine eeldatavat sisaldust kalades puhastumisetapi alghetkel (C
                        0,d), (üldist) puhastumise kiiruskonstanti (k
                        2), aine sisaldust söödas (C
                        sööt), söödatarbimise kiiruskonstanti (I) ja omastamisetapi kestust (t). Nagu eespool kirjeldatud, esitatakse naturaallogaritmitud kontsentratsiooni ja puhastumisaja lineaarse korrelatsiooni sirge tõus ja algordinaat puhastumise üldise kiiruskonstandina (k
                        2 = tõus) ja sisaldusena alghetkel (C
                        0,d = ealgordinaat). Tuleks kontrollida saadud väärtuste bioloogilist usutavust (näiteks ei tohiks osakaaluna väljendatav imendumistõhusus olla suurem kui 1). I leidmiseks jagatakse iga päev kaladele antava sööda mass kalade summaarse massiga (kui sööda kogus on 2 % kehamassist, on I väärtus 0,02). Arvutamisel kasutatavat söötmismäära võib siiski olla vaja kohandada, et võtta arvesse kalade kasvu (kalade massi hindamiseks omastamisetapi igal ajahetkel võib kasutada teadaolevat kasvu kiiruskonstanti; vt 7. liide). Kui k
                        2 ja C
                        0,d leidmine ei ole võimalik, näiteks seetõttu, et aine sisaldus on puhastumisetapi teises proovis langenud määramispiirist allapoole, võib arvutada k
                        2 ja maksimaalse BMFk konservatiivse hinnangulise väärtuse (vt 7. liide).
                     Pärast imendumistõhususe (α) leidmist saab biokuhjumisteguri arvutamiseks korrutada α söödatarbimise kiiruskonstandiga (I) ja jagada puhastumise (üldise) kiiruskonstandiga (k
                        2). Kasvu suhtes korrigeeritud biokuhjumistegur arvutatakse samal viisil, ent sel juhul kasutatakse kasvu suhtes korrigeeritud puhastumise kiiruskonstanti (k
                        2g; vt punktid 162 ja 163). Teise võimalusena saab imendumistõhusust hinnata omastamisetapi varases, lineaarse omastamise järgus võetud kalakudede analüüsi põhjal; vt punkt 151 ja 7. liide. Nii saadakse sõltumatu hinnanguline imendumistõhususe väärtus, mis iseloomustab organismi, kes ei ole sisuliselt ainega veel kokku puutunud (st kaladel on omastamisetapi algusest möödunud vähe aega). BMFi leidmiseks kasutatakse tavaliselt puhastumisandmete põhjal hinnatud imendumistõhusust.
                     
                        Lipiidisisalduse ja kasvust tingitud lahjenemise suhtes korrigeerimine
                     
                     Kalade kasv puhastumisetapi jooksul võib vähendada kalades mõõdetavat aine sisaldust, mistõttu puhastumise üldise kiiruskonstandi k2
                         väärtus võib olla suurem kui väärtus, mis tuleneb üksnes aine kõrvaldamisest näiteks metabolismi ja roojamise käigus (vt punkt 72). Katserühma kalade lipiidisisaldus (millel on tugev seos hüdrofoobsete ainete bioakumuleerumisega) ja sööda lipiidisisaldus võib praktikas nii palju varieeruda, et biokuhjumisteguri esitamiseks mõtestatud kujul on vaja seda korrigeerida. Biokuhjumistegurit tuleks korrigeerida kasvust tingitud lahjenemise suhtes (samuti kui veekaudse kokkupuute meetodi puhul korrigeeritakse kineetilist BCFi) ning lipiidisisalduse suhtes lähtuvalt sööda ja kalade lipiidisisalduse suhtarvust (lipiidisisalduse suhtes korrigeerimise tegur). Selliste arvutuste jaoks kasutatavad võrrandid ja asjakohased näited on esitatud vastavalt 5. ja 7. liites.
                     Kasvust tingitud lahjenemise suhtes korrigeerimiseks tuleks arvutada kasvu suhtes korrigeeritud puhastumise kiiruskonstant (k
                        2g; võrrandid on esitatud 5. liites). Seejärel leitakse kõnealuse konstandi k
                        2g abil kasvu suhtes korrigeeritud biokuhjumistegur samal viisil, nagu on kirjeldatud punktis 73. Mõnel juhul ei ole sellise lähenemisviisi kasutamine võimalik. Teise lähenemisviisina, mis ei nõua korrigeerimist kasvust tingitud lahjenemise suhtes, kasutatakse puhastumisandmetena mitte tavapärast uuritava aine massi kala massiühiku kohta (kontsentratsioon), vaid uuritava aine massi kala kohta (terve kala alusel). See peaks olema hõlpsalt teostatav, kuna käesoleva katsemeetodi kohaste katsete puhul peaks aine registreeritud sisaldus iga üksiku kala kudedes olema seostatav asjaomase kala massiga. Lihtsat meetodit selle lähenemisviisi kasutamiseks on tutvustatud 5. liites. Tuleb meeles pidada, et ka kõnealuse alternatiivse lähenemisviisi puhul tuleks leida ja esitada k
                        2 väärtus.
                     Kui lipiidisisaldust ei ole määratud kõikides proovivõtmiseks valitud kalades, arvutatakse sööda ja kalade lipiidisisalduse suhtes korrigeerimiseks lipiidide keskmine massiosa kalades ja söödas (68). Seejärel leitakse lipiidisisalduse suhtes korrigeerimise tegur (Lc
                        ) kalas sisalduvate lipiidide keskmise osakaalu jagamisel söödas sisalduvate lipiidide keskmise osakaaluga. Lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud biokuhjumisteguri arvutamiseks jagatakse korrigeerimata või vajaduse korral kasvu suhtes korrigeeritud biokuhjumistegur lipiidisisalduse suhtes korrigeerimise teguriga.
                     Kui igas proovivõtupunktis on nii kemikaali kui ka lipiidide sisaldus määratud samal kalal, võib lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud BMFi arvutada otse asjaomase kala lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud koeandmete põhjal (vt viide 37). Lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud kontsentratsiooniandmete graafik võimaldab leida k
                        2 ja lipiidisisaldusest lähtuva C
                        0,d. Sellele järgnevas matemaatilises analüüsis võib kasutada 7. liites esitatud võrrandeid selle erinevusega, et imendumistõhususe (a) arvutamiseks kasutatakse lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud söödatarbimise kiiruskonstanti (I
                        lipiid) ja lipiidisisaldusest lähtuvat aine sisaldust söödas (C
                        sööt-lipiid). Seejärel kasutatakse lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud väärtusi samal viisil, et leida BMF (tuleb meeles pidada, et nii lipiidisisalduse kui ka kasvu suhtes korrigeeritud BMFKgL arvutamiseks tuleks kasvu kiiruskonstandiga korrigeerimisel samuti lähtuda kala märgmassi asemel lipiidide osakaalust).
                     
                        Tulemuste tõlgendamine
                     
                     Mürgise toime välistamiseks ei tohiks keskmine kasvukiirus kontrollrühmas ja katserühma(de)s olla märkimisväärselt erinev. Kõnealuse kahe rühma kalade kasvu kiiruskonstantide või kasvukõverate võrdlemiseks tuleks kasutada sobivat meetodit (69).
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Pärast katse lõppemist koostatakse katse lõpp-protokoll, mis sisaldab punktis 81 loetletud teavet uuritava aine, katsealuse liigi ja katsetingimuste kohta (nagu veekaudse kokkupuute meetodi puhul). Peale selle on nõutav järgmine teave.
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritav aine:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kõik andmed uuritava aine püsivuse kohta valmistatud söödas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsetingimused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             aine nominaalne sisaldus söödas, rikastamismeetod, sööda rikastamisel kasutatud (lipiidse) kandeaine kogus (kui on kasutatud), uuritava aine mõõdetud sisaldus rikastatud söödas igal mõõtmiskorral (vähemalt kolm paralleeli enne katse algust ja omastamisetapi lõpus) ja vastavad keskväärtused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             sööda rikastamise juures kandeainena õli või lahusti kasutamise korral selle liik ja kvaliteet (puhtusaste, tarnija jne);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud sööda liik (Weende analüüsi (70) andmed, klass või kvaliteet, tarnija jne), söötmisrežiim omastamisetapis, antud sööda kogus ja söötmissagedus (sealhulgas kõik muudatused lähtuvalt proovivõtmiseks valitud kalade massist);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kemikaali analüüsimiseks kalade kogumise ja humaanse surmamise aeg igas proovivõtupunktis (näiteks üks tund enne järgmise päeva söötmiskorda).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tulemused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kõikide tehtud eeluuringute tulemused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             teave mis tahes täheldatud kahjuliku mõju kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kemikaali analüüsimise meetodite täielik kirjeldus, sealhulgas avastamis- ja määramispiir, meetodist tulenev varieeruvus ning tuvastamise tõhusus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             söödas (rikastatud ja kontrollsöödas) mõõdetud lipiidisisalduse üksikväärtused, keskväärtus ja standardhälve;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tabeli kujul esitatud andmed nii kontrollrühma kui ka katserühma(de) kalade massi (ja pikkuse) kohta, mis on seostatud konkreetse kalaga (näiteks igale kalale antud kordumatu tunnuskoodi abil), ning arvutuskäik kasvu kiiruskonstandi ja usaldusnivoole 95 % vastava usaldusvahemiku leidmiseks;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tabeli kujul esitatud andmed uuritava aine sisalduse kohta kalas, omastamisetapi lõpus mõõdetud sisalduse keskväärtus (C
                                                0,m), leitud (üldine) puhastumise kiiruskonstant (k
                                                2), sisaldus kalas puhastumisetapi alguses (C
                                                0,d) ja nende väärtuste hajuvus (tõus ja algordinaat);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tabeli kujul esitatud andmed kalade lipiidisisalduse kohta (vajaduse korral kõrvutatuna aine sisaldusega asjaomases kalas) ning vastavad keskväärtused katserühma(de)s ja kontrollrühmas katse alguses, omastamisetapi lõpus ja puhastumisetapi lõpus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kõverad, mis hõlmavad kõiki mõõtmisandmeid ja väljendavad järgmisi näitajaid (vajaduse korral võib kontsentratsiooni väljendada kala terve keha või selle konkreetsete kudede massi alusel):
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kasv, st kalade massi (ja pikkuse) muutus ajas või naturaallogaritmitud massiandmete muutus ajas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritavast ainest puhastumine kalades; ning
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         naturaallogaritmitud kontsentratsiooniandmete muutus ajas puhastumisetapi vältel (sealhulgas leitud puhastumise kiiruskonstant k
                                                            2 ja aine naturaallogaritmitud eeldatav sisaldus kalas puhastumisetapi alguses – C
                                                            0,d);
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kui graafiku visuaalsel hindamisel täheldatakse selgelt võõrväärtuste esinemist, võib kahtlaste andmepunktide väljajätmiseks kasutada statistiliselt usaldusväärset võõrväärtuste testi ja esitada dokumenteeritud põhjenduse selliste andmepunktide väljajätmise kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             arvutuslik kasvu suhtes korrigeeritud puhastumise kiiruskonstant ja kasvu suhtes korrigeeritud poolväärtusaeg;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             arvutatud imendumistõhusus (α);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             toidukaudse biokuhjumise tegur korrigeerimata kujul, lipiidisisalduse ja kasvust tingitud lahjenemise suhtes korrigeeritud kineetiline BMF (korrigeerimata ja lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud väärtus lähtuvalt terve kala märgmassist) ja vajaduse korral koespetsiifiline BMF;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kõik andmed radioaktiivselt märgistatud aine metaboliitide ja nende akumuleerumise kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kõik katsega seotud ebatavalised asjaolud, kõik kõrvalekalded käesolevast katsemeetodist ja mis tahes muu asjakohane teave;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             allpool esitatud koondtabel asjakohaste mõõtmis- ja arvutustulemustega.
                                             
                                                         Ainest puhastumise kiiruskonstandid ja biokuhjumistegurid (BMFK)
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            g (kasvu kiiruskonstant; päeva kohta):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus (UV (71) nivool 95 %)
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            2 (üldine puhastumise kiiruskonstant; päeva kohta):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus (UV (71) nivool 95 %)
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            2g (kasvu suhtes korrigeeritud puhastumise kiiruskonstant; päeva kohta):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus (UV (71) nivool 95 %)
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            0,m (mõõdetud sisaldus alghetkel – sisaldus kalas omastamisetapi lõpus; μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus ± SH (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            0,d (eeldatav sisaldus puhastumisetapi alghetkel; μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus ± SH (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            I (kindlaksmääratud söödatarbimise kiirus sööda grammides grammi kala kohta päevas):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            I
                                                            g (kasvu suhtes korrigeeritud tegelik söödatarbimise kiirus sööda grammides grammi kala kohta päevas):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus ± SH (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            sööt (kemikaali kontsentratsioon söödas; μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus ± SH (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            α (aine imendumistõhusus):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus ± SH (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         BMFK (kineetiline toidukaudse biokuhjumise tegur):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus (UV (71) nivool 95 %)
                                                      
                                                   
                                                         BMFKg (kasvu suhtes korrigeeritud kineetiline toidukaudse biokuhjumise tegur):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus (UV (71) nivool 95 %)
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            t
                                                            1/2g (kasvu suhtes korrigeeritud poolväärtusaeg päevades):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus ± SH (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            Lc (lipiidisisalduse suhtes korrigeerimise tegur):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus
                                                      
                                                   
                                                         BMFKgL (lipiidisisalduse ja kasvu suhtes korrigeeritud kineetiline BMF):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus
                                                      
                                                   
                                                         BMFSSL (hinnanguline lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud BMF statsionaarses olekus):
                                                      
                                                      
                                                         märkida väärtus ± SH (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                       
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.13 varem kehtinud kujul („Biokontsentratsioon: kaladega läbivoolukatse“).
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk A.6 „Lahustuvus vees“.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Li, A., ja Doucette, W. J. (1993). The effect of cosolutes on the aqueous solubilities and octanol/water partition coefficients of selected polychlorinated biphenyl congeners. Environ. Toxicol. Chem. 12: 2031–2035.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk A.8 „Jaotustegur“.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk A.24 „Jaotuskoefitsient (n-oktanool/vesi): kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) meetod“.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk A.23 „Jaotuskoefitsient (süsteemis 1-oktanool-vesi): aeglase segamise meetod“.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.7 „Lagunemine – abiootiline lagunemine: hüdrolüüsi sõltuvus pHst“.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 OECD (1997). Guidance Document on Direct Phototransformation of Chemicals in Water (OCDE/GD(97)21). OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 7. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon (OECD), Pariis, Prantsusmaa.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk A.5 „Pindpinevus“.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk A.4 „Aururõhk“.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.4 „Kohese biolagunduvuse määramine“.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.29 „Kiire biolagundatavus – CO2 suletud nõudes (vabaruumi katse)“.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Connell, D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. T. 102: 117–156.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Bintein, S., Devillers, J., ja Karcher, W. (1993). Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR QSAR Environ. Res. 1: 29–39.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 OECD (2011). QSAR Toolbox 2.1. Veebruar 2011. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/document/54/0,3746,en_2649_34379_42923638_1_1_1_1,00.html.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Brown, R. S., Akhtar, P., Åkerman, J., Hampel, L., Kozin, I. S., Villerius, L. A., ja Klamer, H. J. C. (2001). Partition controlled delivery of hydrophobic substances in toxicity tests using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) films. Environ. Sci. Technol. 35: 4097–4102.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Fernandez, J. D., Denny, J. S., ja Tietge, J. E. (1998). A simple apparatus for administering 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin to commercially available pelletized fish food. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2058–2062.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Nichols, J. W., Fitzsimmons, P. N., Whiteman, F. W., ja Dawson, T. D. (2004). A physiologically based toxicokinetic model for dietary uptake of hydrophobic organic compounds by fish: I. Feeding studies with 2,2′, 5,5′-tetrachlorobiphenyl. Toxicol. Sci. 77: 206–218.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Parkerton, T. F., Arnot, J. A., Weisbrod, A. V., Russom, C., Hoke, R. A., Woodburn, K., Traas, T., Bonnell, M., Burkhard, L. P., ja Lampi, M. A. (2008). Guidance for evaluating in vivo fish bioaccumulation data. Integr. Environ. Assess. Manag. 4: 139–155.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Verbruggen, E. M. J., Beek, M., Pijnenburg, J., ja Traas, T. P. (2008). Ecotoxicological environmental risk limits for total petroleum hydrocarbons on the basis of internal lipid concentrations. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2436–2448.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Schlechtriem, C., Fliedner, A., ja Schäfers, C. (2012). Determination of lipid content in fish samples from bioaccumulation studies: Contributions to the revision of OECD Test Guideline 305. Env. Sci. Eur. 24: 13.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.47 „Varases arengujärgus kaladele avalduva mürgisuse katse“.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.15 „Kala embrüo ja rebukotiga vastsetega tehtav lühiajaline toksilisuse katse“.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.14 „Noorkalade kasvukatse“.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures (ENV/JM/MONO(2000)6). OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon (OECD), Pariis, Prantsusmaa.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 USA Keskkonnakaitseamet (1994). Great Lake water quality initiative technical support document for the procedure to determine bioaccumulation factors (822-R-94-002). USA Keskkonnakaitseamet, Office of Water, Office of Science and Technology, Washington, DC, USA.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 USA Toidu- ja Ravimiamet (1999). Pesticide analytical manual (PAM). 1. kd. USA Toidu- ja Ravimiamet, Rockville, MD, USA.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 USA Toidu- ja Ravimiamet (1974). Jaotis 5, A (1) „Analysis of Human or Animal Adipose Tissue“. Väljaandes: Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples. Toim. Thompson, J. F. USA Toidu- ja Ravimiamet, Research Triangle Park, NC, USA.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Bligh, E. G., ja Dyer, W. J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Phys. 37: 911–917.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Gardner, W. S., Frez, W. A., Cichocki, E. A., ja Parrish, C. C. (1985). Micromethod for lipids in aquatic invertebrates. Limnol. Oceanogr. 30: 1099–1105.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Smedes, F. (1999) Determination of total lipid using non-chlorinated solvents. Analyst 124: 1711–1718.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application (ENV/JM/MONO(2006)18). OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 54. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon (OECD), Pariis, Prantsusmaa.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Springer, T. A., Guiney, P. D., Krueger, H. O., ja Jaber, M. J. (2008). Assessment of an approach to estimating aquatic bioconcentration factors using reduced sampling. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2271–2280.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Springer, T. A. (2009). Statistical Research Related to Update of OECD Guideline 305. Wildlife International, Ltd, Easton, MD, USA.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Arnot, J. A., Meylan, W., Tunkel, J., Howard, P. H., Mackay, D., Bonnell, M., ja Boethling, R. S. (2009). A quantitative structure-activity relationship for predicting metabolic biotransformation rates for organic chemicals in fish. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1168–1177.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Parkerton, T., Letinski, D., Febbo, E., Davi, R., Dzambia, C., Connelly, M., Christensen, K., ja Peterson, D. (2001). A practical testing approach for assessing bioaccumulation potential of poorly water soluble organic chemicals (ettekanne). SETAC Europe 12th Annual Meeting, Madrid, Hispaania.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Fisk, A. T., Cymbalisty, C. D., Bergman, Ã., ja Muir, D. C. G. (1996). Dietary accumulation of C12- and C16-chlorinated alkanes by juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Environ. Toxicol. Chem. 15: 1775–1782.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Anonüümne autor (2004). Fish, dietary bioaccumulation study – Basic protocol. Uute ja olemasolevate kemikaalide tehnilise komitee püsivate, bioakumuleeruvate ja toksiliste ainete töörühmale esitatud dokument.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Anonüümne autor (2004). Background document to the fish dietary study protocol. Uute ja olemasolevate kemikaalide tehnilise komitee püsivate, bioakumuleeruvate ja toksiliste ainete töörühmale esitatud dokument.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Bruggeman, W. A., Opperhuizen, A., Wijbenga, A., ja Hutzinger, O. (1984). Bioaccumulation of super-lipophilic chemicals in fish. Toxicol. Environ. Chem. 7: 173–189.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Muir, D. C. G., Marshall, W. K., ja Webster, G. R. B. (1985). Bioconcentration of PCDDs by fish: effects of molecular structure and water chemistry. Chemosphere 14: 829–833.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Thomann, R. V. (1989). Bioaccumulation model of organic chemical distribution in aquatic food chains. Environ. Sci. Technol. 23: 699–707.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 Nichols, J. W., Fitzsimmons, P. N., ja Whiteman, F. W. (2004). A physiologically based toxicokinetic model for dietary uptake of hydrophobic organic compounds by fish: II. Stimulation of chronic exposure scenarios. Toxicol. Sci. 77: 219–229.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Gobas, F. A. P. C., de Wolf, W., Burkhard, L. P., Verbruggen, E., ja Plotzke, K. (2009). Revisiting bioaccumulation criteria for POPs and PBT assessments. Integr. Environ. Assess. Manag. 5: 624–637.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Sijm, D. T. H. M., ja van der Linde, A. (1995). Size-dependent bioconcentration kinetics of hydrophobic organic chemicals in fish based on diffusive mass transfer and allometric relationships. Environ. Sci. Technol. 29: 2769–2777.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Sijm, D. T. H. M., Verberne, M. E., de Jonge, W. J., Pärt, P., ja Opperhuizen, A. (1995). Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharm. 131: 130–135.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Fisk, A. T., Norstrom, R. J., Cymbalisty, C. D., ja Muir, D. G. G. (1998). Dietary accumulation and depuration of hydrophobic organochlorines: Bioaccumulation parameters and their relationship with the octanol/water partition coefficient. Environ. Toxicol. Chem. 17: 951–961.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 McGrath, J. A., Parkerton, T. F., ja Di Toro, D. M. (2004). Application of the narcosis target lipid model to algal toxicity and deriving predicted-no-effect concentrations. Environ. Toxicol. Chem. 23: 2503–2517.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Poppendieck, D. G. (2002). Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Desorption Mechanisms from Manufactured Gas Plant Site Samples. Väitekiri. Department of Civil, Architectural and Environmental Engineering, University of Texas, Austin, TX, USA.
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 McCarty, L. S., ja Mackay, D. (1993). Enhancing ecotoxicological modelling and assessment: body residues and modes of toxic action. Environ. Sci. Technol. 27: 1718–1728.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 OECD (2012). Part I – Validation Report of a ring test for the OECD TG 305 dietary exposure bioaccumulation fish test. Part II – Additional Report including comparative analysis of trout and carp results (ENV/JM/MONO(2012)20). OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 175. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon (OECD), Pariis, Prantsusmaa.
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED JA ÜHIKUD
                        
                           
                              Bioakumuleerumine
                           – üldjuhul mõistetakse selle all protsessi, mille käigus aine sisaldus organismis saavutab taseme, mis on kõrgem kui hingamiskeskkonnas (nt vesi kala puhul või õhk imetaja puhul), toidus või nii ühes kui ka teises (1).
                        
                           
                              Biokontsentratsioonitegur (BCF või K
                              B)– käesoleva meetodi kohases akumuleerumiskatses omastamisetapi mis tahes ajahetkel kalas, kala pinnal või teatavates kalakudedes esineva uuritava aine kontsentratsiooni (C
                           f, mg/kg) ja ümbritsevas keskkonnas esineva uuritava aine kontsentratsiooni (C
                           w, mg/l) jagatis. BCFi väljendatakse liitrites kilogrammi kohta. Tuleb tähele panna, et kasvu ja/või standardse lipiidisisalduse suhtes korrigeerimist ei ole arvesse võetud.
                        
                           
                              Biokontsentratsioonitegur statsionaarses olekus (BCFSS)– tegur, mille väärtus ei muutu pikema aja jooksul märkimisväärselt, kui uuritava aine kontsentratsioon ümbritsevas keskkonnas on asjaomase ajavahemiku vältel püsiv (vt statsionaarse oleku määratlus).
                        
                           
                              Biokontsentreerumine
                           – uuritava aine kontsentratsiooni suurenemine organismis või selle pinnal (või selle teatavates kudedes) võrdluses uuritava aine kontsentratsiooniga ümbritsevas keskkonnas.
                        
                           
                              Biokuhjumine
                           – uuritava aine kontsentratsiooni suurenemine organismis või selle pinnal (või selle teatavates kudedes) võrdluses uuritava aine kontsentratsiooniga toidus.
                        
                           
                              Biokuhjumistegur (BMF)– statsionaarses olekus täheldatav aine kontsentratsioon röövloomas võrdluses aine kontsentratsiooniga tema saakloomas (või toidus). Käesoleva katsemeetodi puhul hoidutakse hoolikalt veefaasi kaudu kokkupuute loomisest, mistõttu sel viisil leitud BMFi väärtus ei ole otseselt võrreldav väliuuringust saadud BMFi väärtusega (mille puhul kokkupuude võib üheaegselt toimuda nii vee kui ka toidu kaudu).
                        
                           
                              Imendumistõhusus (α)– soolestikust organismi imendunud aine suhtelise koguse näitaja (α on ühikuta suurus, kuid seda väljendatakse lihtosakaalu asemel sageli protsentuaalse osakaaluna).
                        
                           
                              Jaotuskoefitsient süsteemis oktanool/vesi (K
                              OW)– suhtarv, mis väljendab n-oktanoolis ja vees lahustunud aine tasakaalukontsentratsioonide suhet (katsemeetodid A.8 (2), A.24 (3) ja A.23 (4)); kasutatakse ka tähist P
                           OW. K
                           OW logaritmi kasutatakse aine veeorganismides biokontsentreerumise määra hindamiseks.
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Kineetiline biokontsentratsioonitegur (BCFK)– omastamise kiiruskonstandi k
                           1 ja puhastumise kiiruskonstandi k
                           2 suhtarv (st k
                           1/k
                           2; nimetatud mõisted on määratletud käesolevas liites). Üldiselt peaks selle näitaja väärtus olema võrreldav BCFSS-i väärtusega (vt määratlust allpool), kuid kõrvalekaldeid võib esineda juhul, kui statsionaarse oleku saavutamises ei saa olla kindel või kui kineetilist BCFi on korrigeeritud kasvu suhtes.
                        
                           
                              Lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldus (DOC)– katsekeskkonnas lahustunud orgaanilisest ainest pärit süsiniku sisaldust väljendav suurus.
                        
                           
                              Lipiidisisalduse suhtes normaliseeritud biokontsentratsioonitegur statsionaarses olekus (BCFSSL)– tegur, mis on normaliseeritud lähtuvalt kala lipiidisisaldusest 5 %.
                        
                           
                              Lipiidisisalduse suhtes normaliseeritud, kasvu suhtes korrigeeritud kineetiline biokontsentratsioonitegur (BCFKLg)– tegur, mis on normaliseeritud lähtuvalt kala lipiidisisaldusest 5 % ja mida on korrigeeritud katse vältel toimunud kasvu suhtes, nagu on kirjeldatud 5. liites.
                        
                           
                              Lipiidisisalduse suhtes normaliseeritud kineetiline biokontsentratsioonitegur (BCFKL)– tegur, mis on normaliseeritud lähtuvalt kala lipiidisisaldusest 5 %.
                        
                           
                              Mitut koostisosa sisaldav aine
                           – aine, mis on REACH-määruse kontekstis määratletud ainena, mille rohkem kui ühe koostisosa osakaal on 10–80 massiprotsenti.
                        
                           
                              Omastamise kiiruskonstant (k
                              1)– arvväärtus, mis iseloomustab uuritava aine kontsentratsiooni suurenemise kiirust katsealuses kalas või kala pinnal (või teatavates kalakudedes) kala kokkupuutumisel selle ainega (k
                           1 väljendatakse liitrites kilogrammi kohta päevas).
                        
                           
                              Omastamisetapp või kokkupuuteetapp
                           – aeg, mille jooksul kala puutub kokku uuritava ainega.
                        
                           
                              Orgaanilise süsiniku üldsisaldus (TOC)– katsekeskkonna kõikidest orgaanilise aine allikatest, sealhulgas tahketest osakestest ja lahustunud orgaanilisest ainest pärit süsiniku sisaldust väljendav suurus.
                        
                           
                              Puhastumise (kao) kiiruskonstant (k
                              2)– arvväärtus, mis iseloomustab uuritava aine kontsentratsiooni vähenemise kiirust katsealuses kalas (või teatavates kalakudedes) pärast kala viimist uuritavat ainet sisaldavast keskkonnast seda ainet mittesisaldavasse keskkonda (k
                           2 väljendatakse päeva kohta).
                        
                           
                              Puhastumisetapp või kokkupuutejärgne (kao) etapp
                           – aeg, mis järgneb katsealuse kala viimisele uuritavat ainet sisaldavast keskkonnast seda ainet mittesisaldavasse keskkonda ja mille jooksul uuritakse ainest puhastumist (või aine summaarset kadu) kalas (või teatavates kalakudedes).
                        
                           
                              Statsionaarne olek
                           – olek, mis saavutatakse kalades sisalduva uuritava aine kontsentratsiooni (C
                           f) ajas muutumist väljendaval kõveral siis, kui kõver muutub ajateljega paralleelseks ja vähemalt kahepäevaste intervallidega võetud kolmes järjestikuses proovis mõõdetud C
                           f väärtused ei erine üksteisest rohkem kui ± 20 % ning esimese ja viimase järjestikuse analüüsi vahelisel perioodil ei täheldata C
                           f olulist suurenemist. Koondproovide analüüsimise puhul on vaja teha vähemalt neli järjestikust analüüsi. Aeglaselt omastatavate ainete puhul on sobivam intervall seitse päeva.
                        
                           
                              Söödatarbimise kiirus (I)– iga kala tarbitav keskmine päevane söödakogus terve kala eeldatava keskmise kehamassi ühiku kohta (väljendatakse sööda grammides grammi kala kohta päevas).
                        
                           
                              Tahke faasi abil mikroekstraheerimine
                           – lahjade lahuste jaoks välja töötatud lahustivaba analüüsimeetod. Selle meetodi puhul viiakse polümeeriga kaetud kiud kokkupuutesse huvipakkuvat ainet sisaldava gaasifaasi või vedelfaasiga. Üldjuhul kohaldatakse kõnealuse analüüsi puhul miinimumaega, et võimaldada uuritaval ainel saavutada tasakaaluolek tahke ja voolava faasi vahel. Seejärel saab määrata huvipakkuva aine kontsentratsiooni määramismeetodist sõltuvalt kas otse kiul või pärast aine ekstraheerimist kiult lahustisse.
                        
                           
                              Tahketes osakestes esineva orgaanilise süsiniku sisaldus (POC)– katsekeskkonna orgaanilise hõljuvaine süsinikusisaldust väljendav suurus.
                        
                           
                              Toidukaudse biokuhjumise tegur
                           – käesolevas katsemeetodis kasutatav mõiste, mille abil kirjeldatakse sellise toidukaudse kokkupuute katse tulemusi, kus hoidutakse hoolikalt veefaasi kaudu kokkupuute loomisest, mistõttu sel viisil leitud toidukaudse biokuhjumise teguri väärtus ei ole otseselt võrreldav väliuuringust saadud BMFi väärtusega (mille puhul kokkupuude võib üheaegselt toimuda nii vee kui ka toidu kaudu).
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                        
                           
                              UVCB
                           – tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.
                        KIRJANDUS
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Gobas, F. A. P. C., de Wolf, W., Burkhard, L. P., Verbruggen, E., ja Plotzke, K. (2009). Revisiting bioaccumulation criteria for POPs and PBT assessments. Integr. Environ. Assess. Manag. 5: 624–637.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Käesoleva lisa peatükk A.8 „Jaotustegur“.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Käesoleva lisa peatükk A.24 „Jaotuskoefitsient (n-oktanool/vesi): kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) meetod“.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Käesoleva lisa peatükk A.23 „Jaotuskoefitsient (süsteemis 1-oktanool-vesi): aeglase segamise meetod“.
                                 
                              
                     
                        2. liide
                        
                           MÕNED NÕUETEKOHASE LAHJENDUSVEE KEEMILISED OMADUSED
                        
                        
                                    Koostisosa
                                 
                                 
                                    Piirsisaldus
                                 
                              
                                    Tahked osakesed
                                 
                                 
                                    5 mg/l
                                 
                              
                                    Orgaanilise süsiniku üldsisaldus
                                 
                                 
                                    2 mg/l
                                 
                              
                                    Ioniseerimata ammoniaak
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kloorijäägid
                                 
                                 
                                    10 μg/l
                                 
                              
                                    Fosfororgaaniliste pestitsiidide üldsisaldus
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüülide summaarne üldsisaldus
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Orgaanilistes ühendites sisalduva kloori üldsisaldus
                                 
                                 
                                    25 ng/l
                                 
                              
                                    Alumiinium
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Arseen
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kroom
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Koobalt
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Vask
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Raud
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Plii
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Nikkel
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Tsink
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kaadmium
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Elavhõbe
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Hõbe
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                     
                        3. liide
                        
                           KATSE JAOKS SOOVITATAVAD KALALIIGID
                        
                        
                                    Soovitatav liik
                                 
                                 
                                    Soovitatav katsetemperatuuride vahemik (°C)
                                 
                                 
                                    Soovitatav katselooma üldpikkus (cm) (74)
                                    
                                 
                              
                                    
                                       Danio rerio
                                        (73)
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Hamilton-Buchanan) – vöödiline daanio
                                 
                                 
                                    20–25
                                 
                                 
                                    3,0 ± 0,5
                                 
                              
                                    
                                       Pimephales promelas
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Rafinesque) – tüse tömpnina
                                 
                                 
                                    20–25
                                 
                                 
                                    5,0 ± 2,0
                                 
                              
                                    
                                       Cyprinus carpio
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Linnaeus) – harilik karpkala
                                 
                                 
                                    20–25
                                 
                                 
                                    8,0 ± 4,0 (75)
                                    
                                 
                              
                                    
                                       Oryzias latipes
                                    
                                    (Teleostei, Poecilliidae)
                                    (Temminck & Schlegel) – jaapani riisikala
                                 
                                 
                                    20–25
                                 
                                 
                                    4,0 ± 1,0
                                 
                              
                                    
                                       Poecilia reticulata
                                    
                                    (Teleostei, Poecilliidae)
                                    (Peters) – gupi
                                 
                                 
                                    20–25
                                 
                                 
                                    3,0 ± 1,0
                                 
                              
                                    
                                       Lepomis macrochirus
                                    
                                    (Teleostei, Centrarchidae)
                                    (Rafinesque) – sinilõpuseline päikeseahven
                                 
                                 
                                    20–25
                                 
                                 
                                    5,0 ± 2,0
                                 
                              
                                    
                                       Oncorhynchus mykiss
                                    
                                    (Teleostei, Salmonidae)
                                    (Walbaum) – vikerforell
                                 
                                 
                                    13–17
                                 
                                 
                                    8,0 ± 4,0
                                 
                              
                                    
                                       Gasterosteus aculeatus
                                    
                                    (Teleostei, Gasterosteidae)
                                    (Linnaeus) – harilik ogalik
                                 
                                 
                                    18–20
                                 
                                 
                                    3,0 ± 1,0
                                 
                              
                           Harvemini on kasutatud näiteks järgmisi suudmeala- ja merekalu.
                        
                        
                                    Kotkaskalalane
                                 
                                 
                                    (Leiostomus xanthurus)
                                 
                              
                                    Hammaskarp
                                 
                                 
                                    (Cyprinodon variegatus)
                                 
                              
                                    Hõbeateriin
                                 
                                 
                                    (Menidia beryllina)
                                 
                              
                                    Punnkõht
                                 
                                 
                                    (Cymatogaster aggregata)
                                 
                              
                                    Inglise merikeel
                                 
                                 
                                    (Parophrys vetulus)
                                 
                              
                                    Sarvikvõldas
                                 
                                 
                                    (Leptocottus armatus)
                                 
                              
                                    Harilik ogalik
                                 
                                 
                                    (Gasterosteus aculeatus)
                                 
                              
                                    Harilik huntahven
                                 
                                 
                                    (Dicentracus labrax)
                                 
                              
                                    Harilik viidikas
                                 
                                 
                                    (Alburnus alburnus)
                                 
                              Eespool tabelis loetletud mageveekalu on lihtne kasvatada ja/või nad on aastaringselt laialdaselt kättesaadavad, ent suudmeala- ja mereliikide kättesaadavus on osaliselt piiratud konkreetsete riikidega. Nimetatud kalu saab kasvatada ja kultiveerida kalakasvanduses või laboris haiguste ja parasiitide suhtes kontrollitud tingimustes nii, et katseloomad on terved ja nende põlvnemine on teada. Need kalad on kättesaadavad paljudes maailma piirkondades.
                        KIRJANDUS
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Meyer, A., Biermann, C. H., ja Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: An invitation to the comparative method. P. Roy. Soc. Lond. B Bio. 252: 231–236.
                                 
                              
                     
                        4. liide
                        
                           VEEKAUDSE JA TOIDUKAUDSE KOKKUPUUTE KATSETES KASUTATAVAD PROOVIVÕTUKAVAD
                        
                        1.   Teoreetiline näide proovivõtukavast täismahus tehtavas veekaudsel kokkupuutel biokontsentreerumise katses, milles uuritava aine log K
                              OW = 4.
                        
                        
                                    Võetav kalaproov
                                 
                                 
                                    Proovivõtu ajakava
                                 
                                 
                                    Veeproovide arv (76)
                                    
                                 
                                 
                                    Kalade arv proovi kohta (76)
                                    
                                 
                              
                                    Minimaalselt nõutavate proovide võtmise aeg (päevades) (77)
                                    
                                 
                                 
                                    Lisaproovide võtmise aeg (päevades) (77)
                                    
                                 
                              
                                    Omastamisetapp
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    – 1
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2 (78)
                                    
                                 
                                 
                                    4 (79)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (3 (81))
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    0,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    0,4
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    0,6
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    0,9
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    1,2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    1,7
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    2,4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    3,3
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    4,7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4–8 (80)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (3 (81))
                                 
                              
                                    Puhastumisetapp
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Kalad viiakse uuritavat ainet mittesisaldavasse vette
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    5,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    5,9
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    7,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                    9,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    11,2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    10
                                 
                                 
                                    14,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4–8 (80)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    17,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4 + 3 (81))
                                 
                              
                                    KOKKU
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    40 –72
                                    (48–80) (80)
                                    
                                 
                              2.   Teoreetiline näide proovivõtukavast aine toidukaudse bioakumuleerumise katses, kus omastamisetapi kestus on 10 päeva ja puhastumisetapi kestus 42 päeva.
                        
                        
                                    Võetav proov
                                 
                                 
                                    Proovivõtu ajakava
                                 
                                 
                                    Söödaproovide arv
                                 
                                 
                                    Kalade arv proovi kohta
                                 
                              
                                    Etapi päev
                                 
                                 
                                    Täiendav kalaproov?
                                 
                                 
                                    Katserühm
                                 
                                 
                                    Kontrollrühm
                                 
                              
                                    Omastamisetapp
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    Võimalik (82)
                                        (83)
                                    
                                 
                                 
                                    3 – katserühmast
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                              
                                    3 – kontrollrühmast (82)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (8–13) (83)
                                    
                                 
                              
                                    1A (84)
                                    
                                 
                                 
                                    1–3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    Jah (85)
                                    
                                 
                                 
                                    3 – katserühmast
                                 
                                 
                                    10–15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                              
                                    3 – kontrollrühmast (82)
                                    
                                 
                                 
                                    (13–18) (86)
                                    
                                 
                                 
                                    8–13 (86)
                                    
                                 
                              
                                    Puhastumisetapp
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    Jah (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10–15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    Jah (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10–15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    28
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                                 
                                    5–10
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                    42
                                 
                                 
                                    Jah (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10–15 (85)
                                    
                                    (13–18) (86)
                                    
                                 
                                 
                                    5–10
                                    (8–13) (86)
                                    
                                 
                              
                                    KOKKU
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    59–120
                                    (63–126) (85)
                                        (86)
                                    
                                 
                                 
                                    50–110
                                    (56–116) (85)
                                        (86)
                                    
                                 
                              
                           Märkus etappide kestuse ja proovivõtuaegade kohta: omastamisetapp algab rikastatud sööda esmakordse andmise hetkel. Katsepäev kestab ühest söötmiskorrast kuni hetkeni veidi enne järgmist söötmiskorda 24 tundi hiljem. Esimene proov (tabelis tähistatud numbriga 1) tuleks võtta veidi (nt üks tund) enne esmakordset söötmist. Proovid tuleks kogu katse vältel ideaaljuhul võtta veidi enne järgmise päeva söötmiskorda (st umbes 23 tundi pärast proovivõtupäeva söötmiskorda). Omastamisetapp lõpeb veidi enne esmakordset rikastamata söödaga söötmist, mis tähistab puhastumisetapi algust (eeldatavalt jätkavad katserühma kalad 24 tunni jooksul pärast viimast rikastatud söödaga söötmist rikastatud sööda seedimist). Seepärast tuleks omastamisetapi lõpus võetav proov võtta veidi enne esmakordset rikastatud söödaga söötmist ja puhastumisetapi esimene proov umbes 23 tundi pärast esmakordset rikastatud söödaga söötmist.
                     
                     
                        5. liide
                        
                           ÜLDISED ARVUTUSED
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Sissejuhatus
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Omastamisetapi kestuse hindamine
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Puhastumisetapi kestuse hindamine
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Järjestikuse analüüsi meetod: puhastumise (kao) kiiruskonstandi k2 määramine
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Järjestikuse analüüsi meetod: omastamise kiiruskonstandi k1 määramine (üksnes veekaudse kokkupuute meetodi puhul)
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Omastamise ja puhastumise (kao) kiiruskonstantide üheaegse arvutamise meetod (üksnes veekaudse kokkupuute meetodi puhul)
                                 
                              
                                 
                                    7.
                                 
                                 
                                    Kineetilise BCF-i ja BMF-i korrigeerimine kasvust tingitud lahjenemise suhtes
                                 
                              
                                 
                                    8.
                                 
                                 
                                    Lipiidisisalduse suhtes normaliseerimine lähtuvalt lipiidisisaldusest 5 % (üksnes veekaudse kokkupuute meetodi puhul)
                                 
                              1.   SISSEJUHATUS
                        Veekaudse kalades bioakumuleerumise üldmudel on kirjeldatav omastamise ja kaoga seotud protsesside kaudu; sealjuures ei võeta arvesse toidu kaudu omastamist. Diferentsiaalvõrrand (dC
                           f/dt), millega kirjeldatakse aine sisalduse muutumise kiirust kalas (mg/kg– 1 päevas– 1), on järgmine (1):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.1],
                                 
                              kus
                        
                                    
                                       k
                                       1
                                    
                                 
                                 
                                    on aine kalas omastamist iseloomustav esimest järku reaktsiooni kiiruskonstant (l/kg päevas),
                                 
                              
                                    
                                       k
                                       2
                                    
                                 
                                 
                                    on kalas toimuvat ainest puhastumist iseloomustav esimest järku reaktsiooni kiiruskonstant (päeva kohta),
                                 
                              
                                    
                                       kg
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    on kala kasvu (kasvust tingitud lahjenemist) iseloomustav esimest järku reaktsiooni kiiruskonstant (päeva kohta),
                                 
                              
                                    
                                       km
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    on metaboliseerumist iseloomustav esimest järku reaktsiooni kiiruskonstant (päeva kohta),
                                 
                              
                                    
                                       ke
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    on roojamist iseloomustav esimest järku reaktsiooni kiiruskonstant (päeva kohta),
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       w
                                    
                                 
                                 
                                    on kontsentratsioon vees (mg/l) ja
                                 
                              
                                    
                                       Cf
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    on kontsentratsioon kalas (mg/kg märgmassi alusel).
                                 
                              Bioakumuleeruvate ainete puhul võib eeldada, et kõige asjakohasem lubatud kõikumise (vt punkt 24) piiresse jääv kokkupuutekontsentratsioon vees (Cw
                           ) on ajaga kaalutud keskmine kontsentratsioon. Selle arvutamiseks vees soovitatakse järgida katsemeetodi C.20 (2) 6. liites sätestatud korda. Tuleks tähele panna, et vees täheldatava kontsentratsiooni naturaallogaritmimine on sobiv juhul, kui uuendamiste vahelisel perioodil toimub eeldatavalt kontsentratsiooni eksponentsiaalne vähenemine, näiteks poolstaatilise katserežiimi puhul. Läbivoolusüsteemi puhul ei pruugi kokkupuutekontsentratsiooni naturaallogaritmimine olla vajalik. Kui leitakse ajaga kaalutud keskmine kontsentratsioon vees, tuleks esitada see katseprotokollis ja kasutada seda järgnevates arvutustes.
                        Standardses kaladega tehtavas BCFi leidmise katses võib omastamist ja puhastumist kirjeldada kui kahte esimese järgu reaktsiooni kineetikat järgivat protsessi.
                        
                                    
                                       Omastamiskiirus = k
                                       1 × C
                                       w
                                    
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.2]
                                 
                              
                                    
                                       Üldine puhastumiskiirus = (k
                                       2 + k
                                       g + k
                                       m + k
                                       e) × C
                                       f
                                    
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.3]
                                 
                              Statsionaarses olekus on omastamiskiirus eeldusel, et kasvu ja metabolismi mõju on tühine (st k
                           g ja k
                           m väärtust ei saa eristada nullist), võrdne puhastumiskiirusega ning seega tekib võrrandite A5.2 ja A5.3 kombineerimisel järgmine seos:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.4],
                                 
                              kus
                        
                                    
                                       C
                                       f-SS
                                    
                                 
                                 
                                    on kontsentratsioon kalas statsionaarses olekus (mg/kg märgmassi alusel) ja
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       w-SS
                                    
                                 
                                 
                                    on kontsentratsioon vees statsionaarses olekus (mg/l).
                                 
                              Suhtarvu k
                           1/k
                           2 näol on tegemist kineetilise BCFga (BCFK), mis peaks olema võrdne statsionaarset olekut iseloomustava BCFga (BCFSS), mis väljendab kalades ja vees täheldatavate statsionaarsele olekule vastavate kontsentratsioonide suhet, kuid kõrvalekaldeid võib esineda juhul, kui statsionaarse oleku saavutamises ei saa olla kindel või kui kineetilist BCFi on korrigeeritud kasvu suhtes. Kuna k
                           1 ja k
                           2 on konstandid, ei ole statsionaarse oleku saavutamine BCFK leidmiseks siiski vajalik.
                        Kirjeldatud esimest järku reaktsiooni võrranditest lähtuvalt on käesolevas 5. liites esitatud üldised arvutused, mida läheb vaja nii veekaudset kui ka toidukaudset kokkupuudet käsitlevate bioakumuleerumise hindamise meetodite puhul. Jaotised 5, 6 ja 8 on siiski asjakohased üksnes veekaudse kokkupuute meetodi puhul, kuid on lisatud siia põhjusel, et tegemist on üldkasutatavate meetoditega. Järjestikuse (jaotised 4 ja 5) ja üheaegse (jaotis 6) analüüsi meetodid võimaldavad arvutada omastamise ja puhastumise kiiruskonstandid, mida kasutatakse kineetilise BCFi leidmiseks. Järjestikuse analüüsi meetod k
                           2 määramiseks (jaotis 4) on oluline toidukaudse kokkupuute meetodi puhul, kuna saadud väärtust on vaja nii imendumistõhususe kui ka BMFi arvutamiseks. Üksnes toidukaudse kokkupuute meetodi puhul kasutatavaid arvutusi on üksikasjalikult käsitletud 7. liites.
                        2.   OMASTAMISETAPI KESTUSE HINDAMINE
                        Enne katse tegemist saab k
                           2 ja seeläbi aega, mis kulub statsionaarsele olekule vastavast sisaldusest teatava protsentuaalse osakaalu saavutamiseks, hinnata lähtuvalt empiirilisest seosest k
                           2 ja süsteemi n-oktanool/vesi iseloomustava jaotuskoefitsiendi (K
                           OW) vahel või k
                           2 ning k
                           1 ja BCFi vahel. Tuleks siiski meeles pidada, et käesolevas jaotises esitatud võrrandid kehtivad üksnes juhul, kui omastamine ja puhastumine toimuvad vastavalt esimest järku reaktsiooni kineetikale. Kui see ei ole ilmselgelt nii, soovitatakse omastamisetapi kestuse hindamise vajaduse korral kasutada biostatistiku ja/või farmakokineetika spetsialisti abi.
                        Hinnangulist k
                           2 väärtust (päeva kohta) saab arvutada mitme meetodiga. Näiteks võib esmalt kasutada järgmisi empiirilisi seoseid (87):
                        
                                    log k
                                       2 = 1,47 – 0,414logKOW
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    (r2 = 0,95) [(3); võrrand A5.5]
                                 
                              või
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.6],
                                 
                              
                                    kus k
                                       1 = 520 × W
                                       – 0,32 (ainete puhul, mille K
                                       OW > 3)
                                 
                                 
                                    (r
                                       2 = 0,85) [(4); võrrand A5.7]
                                 
                              ja
                                       
                                 
                                 
                                    (r
                                       2 = 0,90) [(5); võrrand A5.8];
                                 
                              
                           W on uuritava ainega kokku puutuvate kalade keskmine mass (märgmassi grammides) omastamisetapi lõpus / puhastumisetapi alguses (88).
                        Muid seoseid on kirjeldatud viites 6. Konstandi k
                           2 hindamiseks võib olla kasulik rakendada keerukamat mudelit juhul, kui on näiteks tõenäoline, et aine metaboliseerumine on märkimisväärne (7, 8). Mudeli keerukuse suurenedes tuleks aga olla saadud hinnangute tõlgendamisel ettevaatlikum. Näiteks võib nitrorühmade esinemine viidata kiirele metaboliseerumisele, kuid see ei ole alati nii. Seepärast peaks hindamismeetodi kasutaja katse ajakava koostamisel kaaluma saadud tulemusi keemilise struktuuri ja kõikide muude asjakohaste andmete (näiteks eelkatsete tulemuste) valguses.
                        Statsionaarsele olekule vastavast sisaldusest teatava protsentuaalse osakaalu saavutamiseks kuluva aja võib k
                           2 hinnangulise väärtuse põhjal leida omastamise ja puhastumise kineetikat (esimest järku reaktsiooni) kirjeldava üldvõrrandi abil, eeldusel, et kasvu ja metaboliseerumise määr on tühine. Kui katse jooksul täheldatakse märkimisväärset kasvu, ei ole allpool kirjeldatud hindamismeetodid usaldusväärsed. Sellisel juhul on parem kasutada kasvu suhtes korrigeeritud konstanti k
                           2g, nagu on kirjeldatud mujal (vt käesoleva liite jaotis 7).
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.9]
                                 
                              või püsiva C
                           w korral
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.10]
                                 
                              Statsionaarsele olekule lähenemisel (t → ∞) võib võrrandi A5.10 taandada (vt viited 9 ja 10) kujule
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.11]
                                 
                              või
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.12].
                                 
                              Sellest lähtuvalt väljendab BCF × C
                           w ligikaudselt aine sisaldust kalas statsionaarses olekus (C
                           f-SS). [Märkus: sama lähenemisviisi võib kasutada statsionaarsele olekule vastava BMFi hindamiseks toidukaudse kokkupuute katse puhul. Sel juhul asendatakse BCF eespool esitatud võrrandites BMFga ja C
                           w aine sisaldusega söödas (C
                           sööt).]
                        Võrrandi A5.10 võib teisendada kujule
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.13]
                                 
                              või
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.14].
                                 
                              Võrrandist A5.14 saab leida statsionaarsele olekule vastavast sisaldusest teatava protsentuaalse osakaalu saavutamiseks kuluva hinnangulise aja, kui võrrandite A5.5 ja A5.6 põhjal on eelnevalt arvutatud k
                           2 hinnanguline väärtus.
                        Omastamisetapi statistiliselt optimaalne kestus statistiliselt vastuvõetavate andmete (BCFK) saamiseks vastab üldiselt ajavahemikule, mille jooksul kõver, mis väljendab kalas sisalduva uuritava aine kontsentratsiooni logaritmi muutust lineaarsel skaalal esitatud ajas, saavutab väärtuse, mis on vähemalt 50 % statsionaarsele olekule vastavast sisaldusest (st 0,69/k
                           2), kuid mitte rohkem kui 95 % sellisest sisaldusest (st 3,0/k
                           2) (11). Kui akumuleerumise määr ületab 95 % statsionaarsele olekule vastavast sisaldusest, on võimalik arvutada BCFSS.
                        Aeg, mille jooksul saavutatakse 80 % statsionaarsele olekule vastavast sisaldusest, arvutatakse (lähtuvalt võrrandist A5.14) järgmiselt:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.15]
                                 
                              ehk
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.16].
                                 
                              Samal viisil võib leida aja, mille jooksul saavutatakse 95 % statsionaarsele olekule vastavast sisaldusest:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.17].
                                 
                              Näiteks on omastamisetapi kestus (st aeg, mille jooksul saavutatakse teatav protsentuaalne osakaal statsionaarsele olekule vastavast sisaldusest, nt t
                           80 või t
                           95) sellise uuritava aine puhul, mille log K
                           OW = 4, järgmine (võrrandite A5.5, A5.16 ja A5.17 põhjal):
                        
                           logk
                           2 = 1,47 – 0,414 · 4
                        
                           k
                           2 = 0,652 päeva kohta
                        
                           
                        või 
                        Teise võimalusena võib kasutada võrrandit:
                        
                                    
                                       teSS
                                        = 6,54 · 10 – 3 · KOW
                                        + 55,31 (tundi)
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.18],
                                 
                              et arvutada tegeliku statsionaarse oleku saavutamiseks vajalik aeg (t
                           eSS) (12). Uuritava aine puhul, mille log K
                           OW = 4, on see järgmine:
                        
                           teSS
                            = 6,54 · 10 – 3 · 104 + 55,31 = 121 tundi.
                        3.   PUHASTUMISETAPI KESTUSE HINDAMINE
                        Ajavahemikku, mille jooksul aine sisaldus organismis väheneb teatava protsendini algsisaldusest, võib samuti hinnata omastamist ja puhastumist kirjeldava üldvõrrandi abil (eeldusel, et tegemist on esimest järku reaktsiooni kineetikaga; vt võrrand A5.9) (1, 13).
                        Puhastumisetapi puhul eeldatakse, et C
                           w (toidukaudse kokkupuute katses C
                           sööt) väärtus on null. Kõnealuse võrrandi võib seega taandada kujule
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.19]
                                 
                              või
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.20],
                                 
                              kus C
                           f,0 on kontsentratsioon puhastumisperioodi alguses.
                        Sellest lähtuvalt arvutatakse 50 % ulatuses puhastumiseks kuluv aeg (t
                           50) järgmiselt:
                        
                           
                        ehk
                        
                           
                        Samamoodi leitakse 95 % ulatuses puhastumiseks kuluv aeg:
                        
                           
                        Kui omastamisetapis soovitakse saavutada 80 % statsionaarsele olekule vastavast sisaldusest (kestus 1,6/k
                           2) ja puhastumisetapis kao määr 95 % (kestus 3,0/k
                           2), siis on puhastumisetapp umbes kaks korda pikem kui omastamisetapp.
                        Tuleb meeles pidada, et kõnealuste hinnangute puhul lähtutakse eeldusest, et omastamine ja puhastumine toimuvad vastavalt esimest järku reaktsiooni kineetikale. Need hinnangud ei kehti juhul, kui tegemist on selgelt muu kui esimest järku reaktsiooni kineetikaga.
                        4.   JÄRJESTIKUSE ANALÜÜSI MEETOD: PUHASTUMISE (KAO) KIIRUSKONSTANDI K
                           2 MÄÄRAMINE
                        Enamiku biokontsentreerumise andmete puhul on eeldatud, et neid saab piisavalt hästi kirjeldada lihtsa kaheosalise/kaheparameetrilise mudeliga, mida väljendab sirgjoon, mis läheneb kalas puhastumisetapi ajal esineva kontsentratsiooni naturaallogaritmitud väärtustele.
                        
                           
                        Tekst pildi
                        
                           In(concentration)
                           Cf2
                           Cf1
                           t2
                           t1
                           time
                        
                        Tuleb silmas pidada, et kõrvalekalded sirgjoonest võivad viidata esimest järku reaktsiooni kineetikast keerukamale puhastumiskineetikale. Kui puhastumine ei toimu vastavalt esimest järku reaktsiooni kineetikale, võib selle kirjeldamiseks kasutada graafikupõhist meetodit.
                        Konstant k
                           2 arvutatakse eri ajahetkedel võetud mitme proovi andmete põhjal lineaarse regressiooni teel, mis väljendab kontsentratsiooni naturaallogaritmi sõltuvust ajast. Regressioonisirge tõus vastab puhastumise kiiruskonstandi k
                           2 hinnangulisele väärtusele (89) Algordinaadi põhjal saab hõlpsalt leida keskmise kontsentratsiooni kalas puhastumisetapi alguses (C
                           0,d; see on võrdne keskmise kontsentratsiooniga kalas omastamisetapi lõpus) ning selle näitaja veamäära (89):
                        
                                    
                                       C
                                       0,
                                       
                                          d
                                        = ealgordinaat
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.21].
                                 
                              Kui on olemas ainult kahel eri ajahetkel võetud proovide andmed (näiteks minimeeritud katseplaani puhul), sisestatakse kõnealuse kahe kontsentratsiooni keskväärtused järgmisse võrrandisse:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.22],
                                 
                              kus ln(C
                           f1) ja ln(C
                           f2) on vastavalt ajahetkel t
                           1 ja t
                           2 mõõdetud kontsentratsiooni naturaallogaritmid ning t
                           1 ja t
                           2 tähistavad ajavahemikku puhastumisetapi algusest kuni kõnealuse kahe proovi võtmiseni (90).
                        5.   JÄRJESTIKUSE ANALÜÜSI MEETOD: OMASTAMISE KIIRUSKONSTANDI K
                           1 MÄÄRAMINE (ÜKSNES VEEKAUDSE KOKKUPUUTE MEETODI PUHUL)
                        Konstandi k
                           1 arvutamisel järjestikuste kontsentratsiooni ajas muutumist väljendavate omastamisetapi andmete alusel kasutatakse arvutiprogrammi järgmise mudeli lähendamiseks:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.23],
                                 
                              kus k
                           2 on teada varasematest arvutustest ning C
                           f(t) ja C
                           w(t) on vastavalt kalades ja vees ajahetkel t täheldatud kontsentratsioon.
                        Kui on olemas ainult kahel eri ajahetkel võetud proovide andmed (näiteks minimeeritud katseplaani puhul), kasutatakse k
                           1 leidmiseks järgmist võrrandit:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.24],
                                 
                              kus k
                           2 on teada varasematest arvutustest, C
                           f on kontsentratsioon kalas puhastumisetapi alguses ja C
                           w on keskmine kontsentratsioon vees omastamisetapi ajal (91).
                        Mudeli sobivust andmetega saab visuaalselt hinnata, kui kanda tõusudega k
                           1 and k
                           2 sirged koos proovivõtupunktide andmetega graafikule. Kui selgub, et järjestikuse analüüsi meetodiga saadud hinnanguline k
                           1 väärtus on ebausaldusväärne, tuleks k
                           1 ja k
                           2 arvutamiseks kasutada üheaegse analüüsi meetodit. Seejärel tuleks uuesti visuaalselt kontrollida saadud tõusude sobivust graafikule kantud mõõtmistulemustega. Kui sobivus on endiselt väike, võib see viidata asjaolule, et tegemist ei ole esimest järku reaktsiooni kineetikaga ja tuleks kasutada keerukamat mudelit.
                        6.   OMASTAMISE JA PUHASTUMISE (KAO) KIIRUSKONSTANTIDE ÜHEAEGSE ARVUTAMISE MEETOD (ÜKSNES VEEKAUDSE KOKKUPUUTE MEETODI PUHUL)
                        Konstantide k
                           1 ja k
                           2 väärtuse arvutamisel järjestikuste kontsentratsiooni ajas muutumist väljendavate andmete alusel võib kasutada arvutiprogramme ja järgmist mudelit:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    (0 < t < t
                                       c)
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.25];
                                 
                              
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    (t > t
                                       c)
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.26],
                                 
                              kus
                        
                                    
                                       t
                                       c
                                    
                                 
                                 
                                    on aeg omastamisetapi lõpus.
                                 
                              See lähenemisviis võimaldab vahetult leida hinnangulise k
                           1 ja k
                           2 standardvea. Kui k
                           1/k
                           2 asendatakse võrrandis A5.25 või A5.26 BCFga (vt võrrand 5.4), saab leida ka BCFi standardvea ja usaldusvahemiku usaldusnivool 95 %. See on eriti kasulik juhul, kui võrreldakse eri hinnangulisi väärtusi, mis on saadud teisendatud andmete põhjal. Mudeli lähendamisel võib kasutada sõltuva muutuja (kalades täheldatav kontsentratsioon) nii logaritmimata kui ka naturaallogaritmitud väärtusi ning hinnata leitud BCFi usaldusväärsust.
                        Kuna k
                           1 and k
                           2 üheaegse hindamise korral on need näitajad omavahel tugevalt korreleeritud, võib olla soovitatav arvutada esmalt k
                           2 üksnes puhastumisandmete põhjal (vt eespool); enamikul juhtudel saab k
                           2 hinnata puhastumiskõvera alusel suhteliselt suure täpsusega. Seejärel saab omastamisandmete põhjal arvutada k
                           1 mittelineaarse regressiooni teel (92). Järjestikuse lähendamise korral soovitatakse kasutada sama andmeteisendust.
                        Mudeli sobivust andmetega saab visuaalselt hinnata, kui kanda leitud tõusudega sirged koos proovivõtupunktide andmetega graafikule. Kui selgub, et selle meetodiga saadud hinnanguline k
                           1 väärtus on ebausaldusväärne, tuleks k
                           1 ja k
                           2 arvutamiseks kasutada üheaegse analüüsi meetodit. Seejärel tuleks uuesti visuaalselt kontrollida lähendatud mudeli sobivust graafikule kantud mõõtmistulemustega ning võrrelda omavahel eri tüüpi mudelitega saadud k
                           1, k
                           2 ja neil põhineva BCFi hinnangulisi väärtusi ja nende standardvigu ja/või usaldusvahemikke.
                        Kui sobivus on endiselt väike, võib see viidata asjaolule, et tegemist ei ole esimest järku reaktsiooni kineetikaga ja tuleks kasutada keerukamat mudelit. Üks kõige sagedasem segav asjaolu on kalade kasv katse ajal.
                        7.   KINEETILISE BCF-I JA BMF-I KORRIGEERIMINE KASVUST TINGITUD LAHJENEMISE SUHTES
                        Käesolevas jaotises kirjeldatakse katse ajal toimuva kalade kasvu (st kasvust tingitud lahjenemise) suhtes korrigeerimise standardmeetodit, mis on kohaldatav üksnes esimest järku reaktsiooni kineetika puhul. Kui on viiteid sellele, et tegemist ei ole esimest järku reaktsiooni kineetikaga, soovitatakse kasutada kasvust tingitud lahjenemise asjakohasel viisil arvessevõtmiseks biostatistiku abi või rakendada allpool kirjeldatud massipõhist lähenemisviisi.
                        Mõnel juhul on käesolev meetod kasvust tingitud lahjenemise arvessevõtmiseks ebatäpne või ei ole kasutatav (näiteks ainete puhul, millest puhastumine on väga aeglane ja mille uurimiseks kasutatakse kiire kasvuga kalu, võib kasvust tingitud lahjenemise suhtes korrigeeritud puhastumise kiiruskonstandi k
                           2g leitud väärtus olla väga väike; seega omandab selle arvutamiseks kasutatud kahe kiiruskonstandiga seotud viga kriitilise tähtsuse ja mõnel juhul võib hinnanguline k
                           g olla suurem kui k
                           2). Sellisel juhul võib kasutada alternatiivset lähenemisviisi (st massipõhist meetodit), mis on rakendatav ka juhul, kui kasv ei toimu vastavalt esimest järku reaktsiooni kineetikale, ja mille puhul korrigeerimine ei ole vajalik. Seda lähenemisviisi on tutvustatud käesoleva jaotise lõpus.
                        
                           Kasvu suhtes korrigeerimine kasvu kiiruskonstandi mahalahutamisel põhineva meetodiga
                        
                        Käesoleva standardmeetodi puhul naturaallogaritmitakse iga kala massi- ja pikkuse andmed ning massi või selle pöördväärtuse naturaallogaritm kantakse graafikule, mis väljendab kasvu sõltuvust ajast (päevades); katserühma(de) ja kontrollrühma andmeid käsitletakse eraldi. Omastamis- ja puhastumisetapi andmeid töödeldakse eraldi samal viisil. Üldjuhul on kasvust tingitud lahjenemise suhtes korrigeerimisel asjakohasem kasutada kasvu kiiruskonstandi (k
                           g) leidmiseks kogu katse vältel kogutud massiandmeid, kuid statistiliselt olulised erinevused omastamisetappi ja puhastumisetappi iseloomustavate kasvu kiiruskonstantide vahel võivad viidata sellele, et tuleks kasutada puhastumisetapi kohta leitud kiiruskonstanti. Kokkupuutest tuleneva võimaliku mõju tuvastamiseks saab võrrelda veekaudse kokkupuute katses täheldatud üldist kasvukiirust katserühma(de)s ja kontrollrühmas.
                        Igas rühmas (katserühm(ad) ja kontrollrühm) arvutatakse vähimruutude meetodil iga üksiku kala andmetest, mitte päevastest keskväärtustest lähtuvalt standardsete statistikameetodite abil kalade massi (ja massi pöördväärtuse) naturaallogaritmi ja aja (päevades) lineaarne korrelatsioon nii kogu katse vältel kui ka omastamisetapis ja puhastumisetapis. Arvutatakse saadud sirgete tõusu iseloomustavate väärtuste hajuvus ja hinnatakse selle kaudu Studenti t-testi (või mitme kontsentratsiooni kasutamisel dispersioonanalüüsi) abil tõusude (kasvu kiiruskonstantide) erinevuse statistilist olulisust (p = 0,05). Üldjuhul kasutatakse kasvu suhtes korrigeerimiseks eelistatavalt massiandmeid. Samal viisil töödeldud andmetest pikkuse kohta võib olla kasu kontrollrühma ja katserühma(de) võrdlemisel kokkupuutest tuleneva mõju suhtes. Kui massiandmete analüüsi käigus ei täheldata statistiliselt olulisi erinevusi, võib katserühma(de) ja kontrollrühma andmed ühte koondada ning arvutada üldisele lineaarsele korrelatsioonile vastava sirge tõusu näol kalade kasvu üldise kiiruskonstandi katses tervikuna (k
                           g). Statistiliselt oluliste erinevuste ilmnemisel esitatakse kasvu kiiruskonstandi väärtus eraldi iga kalade rühma ja/või katseetapi kohta. Sel juhul tuleks igas rühmas leitud kiiruskonstanti kasutada asjaomase konkreetse rühma andmete korrigeerimiseks kasvust tingitud lahjenemise suhtes. Kui täheldatakse statistiliselt olulisi erinevusi omastamis- ja puhastumisetapi kiiruskonstantide vahel, tuleks kasutada puhastumisetapi andmete põhjal leitud kiiruskonstanti.
                        Arvutatud kasvu kiiruskonstandi (k
                           g, väljendatud päeva kohta) saab üldisest puhastumise kiiruskonstandist (k
                           2) maha lahutada, et saada puhastumise kiiruskonstant k
                           2g.
                        
                                    
                                       k
                                       2
                                       
                                          g
                                        = k
                                       2 – kg
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.27]
                                 
                              Omastamise kiiruskonstandi jagamisel kasvu suhtes korrigeeritud puhastumise kiiruskonstandiga saadakse kasvu suhtes korrigeeritud kineetiline BCF, mille tähis on BCFKg (või leitakse BMFKg).
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.28]
                                 
                              Kasvu suhtes korrigeeritud teguri BMFKg leidmiseks kasutatakse toidukaudse kokkupuute katses saadud kasvu kiiruskonstanti võrrandis A7.5 (vt 7. liide).
                        
                           Kasvu suhtes korrigeerimine massipõhise meetodiga
                        
                        Eespool kirjeldatud kasvu kiiruskonstandi mahalahutamise meetodi asemel võib kasutada järgmist alternatiivset meetodit, mille puhul kasvu suhtes korrigeerimine ei ole vajalik. See meetod tugineb puhastumisandmete massipõhisele kasutamisele lähtuvalt terve kala massist, mitte kontsentratsioonist.
                        Puhastumisetapis täheldatud kontsentratsioon kudedes (uuritava aine mass kala massiühiku kohta) teisendatakse uuritava aine massiks kala kohta: kontsentratsioon igas kalas viiakse tabelis (nt arvutipõhises tabelis) kokku asjaomase kala massiga ja iga kontsentratsioon korrutatakse vastava terve kala massiga, et saada uuritava aine mass kala kohta kõikides puhastumisetapi proovides.
                        Aine massi naturaallogaritmitud väärtused kantakse tavapärasel viisil graafikule katse (puhastumisetapi) kulgu väljendava aja funktsioonina.
                        Veekaudse kokkupuute meetodi puhul leitakse omastamise kiiruskonstant tavapärasel viisil (vt jaotised 4 ja 6; tuleb tähele panna, et k
                           1 arvutamisel tuleks kõvera lähendamise võrrandites kasutada „tavapärast“k
                           2 väärtust) ja puhastumise kiiruskonstant eespool kirjeldatud andmete põhjal. Kuna saadud puhastumise kiiruskonstant põhineb aine massil terve kala kohta ega sõltu seega kasvust, tuleks selle tähisena kasutada k
                           2 asemel k
                           2g-d.
                        8.   LIPIIDISISALDUSE SUHTES NORMALISEERIMINE LÄHTUVALT LIPIIDISISALDUSEST 5 % (ÜKSNES VEEKAUDSE KOKKUPUUTE MEETODI PUHUL)
                        Veekaudse kokkupuute katsest leitud kineetilise ja statsionaarset olekut iseloomustava BCFi väärtus tuleks lisaks esitada lähtuvalt standardsest kala lipiidisisaldusest 5 % märgmassist, välja arvatud juhul, kui on võimalik tõendada, et uuritav aine akumuleerub peamiselt mujal kui rasvas (näiteks võib mõni perfluoritud aine seonduda valkudega). Kalades esinev kontsentratsioon või BCF tuleb ümber arvutada lähtuvalt lipiidisisaldusest 5 % märgmassist. Kui igas proovivõtupunktis on nii uuritava aine kui ka lipiidide sisalduse mõõtmiseks kasutatud sama kala, tuleb iga mõõdetud kontsentratsiooni korrigeerida asjaomase konkreetse kala lipiidisisalduse suhtes.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.29],
                                 
                              kus
                        
                                    
                                       C
                                       f,L
                                    
                                 
                                 
                                    on lipiidisisalduse suhtes normaliseeritud kontsentratsioon kalas (mg/kg märgmassi alusel),
                                 
                              
                                    
                                       L
                                    
                                 
                                 
                                    on lipiidide osakaal (märgmassi alusel) ja
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       f
                                    
                                 
                                 
                                    on uuritava aine kontsentratsioon kalas (mg/kg märgmassi alusel).
                                 
                              Kui lipiidisisaldust ei ole määratud kõikidel proovivõtmiseks valitud kaladel, kasutatakse BCFi normaliseerimiseks keskmist lipiidisisaldust. Statsionaarsele olekule vastava BCFi puhul tuleks kasutada omastamisetapi lõpus uuritava ainega rühmas saadud tulemuste keskväärtust. Kineetilise BCFi normaliseerimise puhul on mõnel juhul õigustatud teistsuguse lähenemisviisi kasutamine, näiteks olukorras, kus lipiidisisaldus on omastamis- või puhastumisetapi jooksul märkimisväärselt muutunud. Samas tuleks siiski alati kasutada söötmisrežiimi, millega hoitakse ära lipiidisisalduse muutumine suurel määral.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A5.30],
                                 
                              kus
                        
                                    BCFKL
                                    
                                 
                                 
                                    on lipiidisisalduse suhtes normaliseeritud kineetiline BCF (l/kg),
                                 
                              
                                    
                                       L
                                       n
                                    
                                 
                                 
                                    on lipiidide keskmine osakaal (märgmassi alusel) ja
                                 
                              
                                    BCFK
                                    
                                 
                                 
                                    on kineetiline BCF (l/kg).
                                 
                              KIRJANDUS
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Arnot, J. A., ja Gobas, F. A. P. C. (2004). A food web bioaccumulation model for organic chemicals in aquatic ecosystems. Environ. Toxicol. Chem. 23: 2343–2355.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Käesoleva lisa peatükk C.20 „Hiidkiivriku (Daphnia magna) sigivuse katse“.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Spacie, A., ja Hamelink, J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1: 309–320.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Sijm, D. T. H. M., Verberne M. E., de Jonge, W. J., Pärt, P., ja Opperhuizen, A. (1995). Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharm. 131: 130–135.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Bintein, S., Devillers, J., ja Karcher, W. (1993). Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR QSAR Environ. Res. 1: 29–39.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Kristensen, P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Taani Veekvaliteedi Instituut, Hørsholm, Taani.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Arnot, J. A., Meylan, W., Tunkel, J., Howard, P. H., Mackay, D., Bonnell, M., ja Boethling, R. S. (2009). A quantitative structure-activity relationship for predicting metabolic biotransformation rates for organic chemicals in fish. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1168–1177.
                                 
                              
                                    (8)
                                 
                                 
                                    OECD (2011). QSAR Toolbox 2.1. Veebruar 2011. Kättesaadav aadressil http://www.oecd.org/document/54/0,3746,en_2649_34379_42923638_1_1_1_1,00.html.
                                 
                              
                                    (9)
                                 
                                 
                                    Branson, D. R., Blau, G. E., Alexander, H. C., ja Neely, W. B. (1975). Bioconcentration of 2,2',4,4' tetrachlorobiphenyl in rainbow trout as measured by an accelerated test. T. Am. Fish. Soc. 104: 785–792.
                                 
                              
                                    (10)
                                 
                                 
                                    Ernst, W. (1985). Accumulation in aquatic organisms. Väljaandes: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Sheeman, P., et al. (toim.), John Wiley & Sons Ltd, New York, NY, USA, lk 243–255.
                                 
                              
                                    (11)
                                 
                                 
                                    Reilly, P. M., Bajramovic, R., Blau, G. E., Branson, D. R., ja Sauerhoff, M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models. Can. J. Chem. Eng. 55: 614–622.
                                 
                              
                                    (12)
                                 
                                 
                                    Hawker, D. W., ja Connell, D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Water Res. 22: 701–707.
                                 
                              
                                    (13)
                                 
                                 
                                    Konemann, H., ja van Leeuwen, K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and elimination of six chlorobenzenes by guppies. Chemosphere 9: 3–19.
                                 
                              
                     
                        6. liide
                        
                           VEEKAUDSE KOKKUPUUTE MEETODI VÕRRANDITE OSA: MINIMEERITUD KATSEPLAAN
                        
                        Siin kirjeldatud lähenemisviisi puhul on lähtutud põhimõttest, et biokontsentratsiooniteguri võib täismahus katse tulemuste põhjal leida kas biokontsentratsioonitegurina statsionaarses olekus (BCFSS), mis väljendab kalakudedes esineva uuritava aine kontsentratsiooni ja vees esineva uuritava aine kontsentratsiooni suhet, või kineetilise biokontsentratsioonitegurina (BCFK), mis väljendab omastamise kiiruskonstandi k
                           1 ja puhastumise kiiruskonstandi k
                           2 suhet. BCFK on kehtiv ka olukorras, kus omastamisetapis ei saavutata aine sisalduse puhul statsionaarset olekut, eeldusel, et omastamine ja puhastumine toimuvad ligikaudu vastavalt esimest järku reaktsiooni kineetikale.
                        Kui aine sisaldust kudedes (C
                           f1) mõõdetakse kokkupuute lõpus (t
                           1) ja uuesti (C
                           f2) pärast teatava ajavahemiku möödumist (t
                           2), võib puhastumise kiiruskonstandi (k
                           2) hindamiseks kasutada 5. liites esitatud võrrandit A5.22.
                        Omastamise kiiruskonstandi k
                           1 võib seejärel algebraliste tehete abil arvutada 5. liites esitatud võrrandist A5.23 (kus C
                           f on võrdne C
                           f1-ga ja t on võrdne t
                           1-ga) (1). Minimeeritud katseplaani alusel saadud kineetiline biokontsentratsioonitegur (selle tähis on BCFKm, et eristada seda mõne muu meetodi kohaselt leitud kineetilisest biokontsentratsioonitegurist) on seega:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A6.1].
                                 
                              Kontsentratsiooniandmeid või saadud tulemusi tuleks korrigeerida kasvust tingitud lahjenemise suhtes ja normaliseerida need lähtuvalt kala lipiidisisaldusest 5 %, nagu on kirjeldatud 5. liites.
                        Minimeeritud katseplaani alusel saadud BCFSS on BCF, mis on arvutatud omastamisetapi lõpus lähtuvalt eeldusest, et on saavutatud statsionaarne olek. Viimast on võimalik üksnes eeldada, sest proovivõtupunktide arv ei ole selle tõendamiseks piisav.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A6.2],
                                 
                              kus
                        
                           
                              
                                 C
                                 f-minSS
                              
                            on kontsentratsioon kalas omastamisetapi lõpus eeldatavalt saavutatud statsionaarses olekus (mg/kg märgmassi alusel) ja
                        
                           
                              
                                 C
                                 w-minSS
                              
                            on kontsentratsioon vees omastamisetapi lõpus eeldatavalt saavutatud statsionaarses olekus (mg/l).
                        KIRJANDUS
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Springer, T. A., Guiney, P. D., Krueger, H. O., ja Jaber, M. J. (2008). Assessment of an approach to estimating aquatic bioconcentration factors using reduced sampling. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2271–2280.
                                 
                              
                     
                        7. liide
                        
                           TOIDUKAUDSE KOKKUPUUTE MEETODI VÕRRANDITE OSA
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Näide sobiva kaubandusliku kalasööda koostisosade sisalduse kohta
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Sööda rikastamise meetodite näited
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Imendumistõhususe ja biokuhjumisteguri arvutamine
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Lipiidisisalduse suhtes korrigeerimine
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Alghetke iseloomustava mõõdetud sisalduse (C0,m) ja eeldatava sisalduse (C0,d) vahelise erinevuse hindamine
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Juhised uuritavate ainete kohta, millest puhastumine on väga kiire
                                 
                              1.   NÄIDE SOBIVA KAUBANDUSLIKU KALASÖÖDA KOOSTISOSADE SISALDUSE KOHTA
                        
                                    Peamine koostisosa
                                 
                                 
                                    Sisaldus kalajahus
                                 
                              
                                    Toorvalk
                                 
                                 
                                    ≤ 55,0 %
                                 
                              
                                    Toorrasv
                                 
                                 
                                    ≤ 15,0 % (93)
                                    
                                 
                              
                                    Toorkiud
                                 
                                 
                                    ≥ 2,0 %
                                 
                              
                                    Niiskus
                                 
                                 
                                    ≥ 12 %
                                 
                              
                                    Tuhk
                                 
                                 
                                    ≥ 8 %
                                 
                              2.   SÖÖDA RIKASTAMISE MEETODITE NÄITED
                        
                           Üldnõuded
                        
                        Kontrollrühma sööt tuleks valmistada täpselt samal viisil kui rikastatud sööt, kuid ilma uuritava aineta.
                        Töödeldud söödas aine sisalduse kontrollimiseks tuleks rikastatud söödast võtta sobiva meetodiga kolm paralleelproovi ja mõõta saadud proovides uuritava aine sisaldus või radioaktiivsus. Tuleks tõendada, et analüütilise tuvastamise tõhusus on suur (> 85 %) ja proovidevaheline varieeruvus väike (aine sisaldus katse alguses võetud kolmes proovis ei tohiks keskväärtuse suhtes varieeruda rohkem kui ± 15 %).
                        Toidukaudse kokkupuute katses tuleks uuritava aine sisalduse määramiseks söödas võtta kolm söödaproovi katse nullpäeval ja omastamisetapi lõpus.
                        
                           Kalasööda valmistamine puhta vedela uuritava ainega
                        
                        Määratakse kindlaks soovitud nominaalne katsekontsentratsioon töödeldud kalasöödas, näiteks 500 μg uuritavat ainet grammi sööda kohta. Sobiv kogus (molaarmassi või eriradioaktiivsuse alusel) puhast uuritavat ainet lisatakse klaaspurgis või pöördaurusti kolvis teadaolevale kogusele kalasöödale. Kalasööda kogusest peaks jätkuma omastamisetapi lõpuni (tuleb võtta arvesse ka vajadust suurendada söödakogust igal söötmiskorral, tulenevalt kalade kasvamisest). Uuritavat ainet ja kalasööta tuleks omavahel aeglase pööritamise teel öö läbi segada (näiteks pöörleva segisti abil või pöördaurusti kolvis). Rikastatud sööta tuleks kuni kasutamiseni säilitada tingimustes, milles uuritav aine on söödaga segatuna püsiv (nt jahutatult).
                        
                           Kalasööda valmistamine kandeainena kasutatava maisi- või kalaõliga
                        
                        Tahke uuritav aine tuleks uhmris peeneks pulbriks hõõruda. Vedela uuritava aine võib lisada otse maisi- või kalaõlile. Uuritav aine lahustatakse teadaolevas koguses (nt 5–15 ml) maisi- või kalaõlis. Ainet sisaldav õli viiakse kadudeta sobiva suurusega pöördaurusti kolbi. Õlile aine lisamiseks kasutatud kolbi tuleks loputada kahe väikese alikvoodi õliga ja lisada need pöördaurusti kolbi, et tagada kogu lahustunud uuritava aine ülekandmine. Aine täieliku õlis lahustumise/dispergeerumise tagamiseks (või juhul, kui katses kasutatakse mitut uuritavat ainet) lisatakse kolbi mikrosegisti, kolb suletakse korgiga ja segu segatakse öö läbi suurel kiirusel. Kolbi lisatakse katse jaoks sobiv kogus kalasööta (tavaliselt graanulite kujul) ja kolvi sisu ühtlaseks segamiseks pööratakse kolbi pidevalt vähemalt 30 minutit, kuid soovitatavalt öö läbi. Seejärel säilitatakse rikastatud sööta sobivates tingimustes (nt jahutatult), et tagada uuritava aine püsivus söödas kuni selle kasutamiseni.
                        
                           Kalasööda valmistamine orgaanilise lahustiga
                        
                        Sobiv kogus uuritavat ainet (molaarmassi või eriradioaktiivsuse alusel), millest piisab soovitud sisalduse saavutamiseks, lahustatakse sobivas orgaanilises lahustis (nt tsükloheksaan või atsetoon; 10–40 ml või ka suurem kogus, kui seda nõuab rikastatava sööda kogus). Üks alikvoot selles lahusest või kogu lahus (osakaupa lisatuna) segatakse katse jaoks piisava koguse kalasöödaga, et saavutada vajalik aine nominaalne sisaldus. Sööda segamiseks uuritava ainega võib kasutada roostevabast terasest segamisnõud, mis jäetakse koos äsja rikastatud kalasöödaga kaheks ööpäevaks laboratoorsesse tõmbekappi (sööta segatakse aeg-ajalt), et liigne lahusti saaks aurustuda, või pidevalt pöörlevat pöördaurusti kolbi. Liigse lahusti „ärapuhumiseks“ võib vajaduse korral kasutada õhu- või lämmastikujuga. Tuleks jälgida, et uuritav aine lahusti eemaldamise käigus ei kristalliseeruks. Rikastatud sööta tuleks kuni kasutamiseni säilitada tingimustes, milles uuritav aine on söödaga segatuna püsiv (nt jahutatult).
                        3.   IMENDUMISTÕHUSUSE JA BIOKUHJUMISTEGURI ARVUTAMINE
                        Imendumistõhususe arvutamiseks tuleks esmalt leida puhastumisetapi proovides mõõdetud kontsentratsioonide keskväärtuste põhjal üldise puhastumise kiiruskonstandi hinnanguline väärtus vastavalt 5. liite jaotisele 4 (tuleks kasutada järjestikuse analüüsi meetodit, st standardset lineaarset regressiooni). Söödatarbimise kiiruskonstant I ja omastamisetapi kestus t on teadaolevad katseparameetrid. Söödas määratud uuritava aine keskmine sisaldus C
                           sööt on katse käigus mõõdetav muutuja. Uuritava aine sisaldus kalas omastamisetapi lõpus (C
                           0,d) leitakse tavaliselt naturaallogaritmitud kontsentratsiooni ja puhastumisetapi kulgu päevades väljendava aja vahelist sõltuvust kirjeldava sirge algordinaadi põhjal.
                        Aine imendumistõhusus (uuritava aine absorbeerumine soolestikus; a) arvutatakse järgmiselt:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A7.1],
                                 
                              kus
                        
                           
                              
                                 C
                                 0,d
                              
                            on aine eeldatav sisaldus kalas puhastumisetapi alghetkel (mg/kg),
                        
                           
                              
                                 k
                                 2
                              
                            on üldine (kasvu suhtes korrigeerimata) puhastumise kiiruskonstant (päeva kohta), mis on arvutatud vastavalt 5. liite jaotises 3 esitatud võrranditele,
                        
                           
                              
                                 I
                              
                            on söödatarbimise kiiruskonstant (sööda grammides grammi kala kohta päevas),
                        
                           
                              
                                 C
                                 sööt
                              
                            on aine sisaldus söödas (milligrammides sööda kilogrammi kohta) ja
                        
                           
                              t
                            on söötmisperioodi kestus (päevades).
                        Imendumistõhususe a täpse väärtuse leidmiseks võib siiski olla vaja korrigeerida arvutustes kasutatavat söödatarbimise kiirust I kalade kasvu suhtes. Katses, kus kalade kasv omastamisetapis (mille vältel söödakogust ei muudeta, et pidada kinni kindlaksmääratud söötmismäärast) on märkimisväärne, muutub tegelik söödatarbimise kiirus omastamisetapi käigus väiksemaks kui kindlaksmääratud söötmismäär ning tegelik imendumistõhusus on sellest tulenevalt suurem. (Tuleb tähele panna, et BMFi arvutamise puhul ei ole see oluline, kuna võrrandite A7.1 ja A7.4 kombineerimisel taandub liige I välja.) Kasvust tingitud lahjenemise suhtes korrigeeritud keskmise söödatarbimise kiiruse I
                           g võib leida mitmel viisil, kuid üks otsene ja range viis on kasutada teadaolevat kasvu kiiruskonstanti (k
                           g) katsealuste kalade massi hindamiseks omastamisetapi konkreetsel ajahetkel:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A7.2],
                                 
                              kus
                        
                           
                              
                                 W
                                 f(t)
                            on kalade keskmine mass omastamisetapi t-ndal päeval ja
                        
                           
                              
                                 W
                                 f,0
                              
                            on kalade keskmine mass katse alguses.
                        Sel viisil saab hinnata kalade keskmist massi (vähemalt) viimasel kokkupuutepäeval (W
                           f,omastamise-lõpp). Kuna söötmismäär on määratud kindlaks W
                           f,0 alusel, saab kõnealuse kahe kehamassi väärtuse abil arvutada tegeliku söödatarbimise kiiruse igal omastamispäeval. Kasvu suhtes korrigeeritud keskmise söödatarbimise kiiruse I
                           g (sööda grammides grammi kala kohta päevas), mida kasutatakse omastamisetapis toimuva kiire kasvu puhul I asemel, saab seega arvutada järgmiselt:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A7.3].
                                 
                              Pärast imendumistõhususe leidmist saab arvutada BMFi; selleks korrutatakse imendumistõhusus söödatarbimise kiiruskonstandiga I (või I
                           g, kui α arvutamiseks on kasutatud seda konstanti) ning jagatakse saadud väärtus üldise puhastumise kiiruskonstandiga k
                           2:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A7.4].
                                 
                              Samal viisil tuleks arvutada ka kasvu suhtes korrigeeritud biokuhjumistegur, mille puhul lähtutakse kasvu suhtes korrigeeritud puhastumise kiiruskonstandist (see leitakse vastavalt 5. liite jaotisele 7). Kui α leidmiseks on kasutatud I
                           g-d, tuleks siingi kasutada I asemel seda konstanti:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A7.5],
                                 
                              kus
                        
                           
                              
                                 α
                              
                            on imendumistõhusus (uuritava aine absorbeerumine soolestikus),
                        
                           
                              
                                 k
                                 2
                              
                            on üldine (kasvu suhtes korrigeerimata) puhastumise kiiruskonstant (päeva kohta), mis on arvutatud vastavalt 5. liite jaotises 3 esitatud võrranditele,
                        
                           
                              
                                 k
                                 2g
                              
                            on kasvu suhtes korrigeeritud puhastumise kiiruskonstant (päeva kohta) ja
                        
                           
                              
                                 I
                              
                            on söödatarbimise kiiruskonstant (sööda grammides grammi kala kohta päevas).
                        Kasvu suhtes korrigeeritud poolväärtusaeg (t
                           1/2) arvutatakse järgmiselt:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A7.6].
                                 
                              Aine toidust imendumise tõhusust saab hinnata ka aine jääkide määramisega omastamisetapi lineaarses osas (1.–3. omastamispäeval). Sel juhul leitakse aine imendumistõhusus (α) järgmiselt:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A7.7],
                                 
                              kus
                        
                           
                              
                                 C
                                 f
                                 (t)
                              
                            on uuritava aine kontsentratsioon kalas ajahetkel t (mg/kg märgmassi alusel).
                        4.   LIPIIDISISALDUSE SUHTES KORRIGEERIMINE
                        Kui kõikides proovivõtupunktides on nii lipiidisisaldus kui ka kemikaali sisaldus määratud samal kalal, tuleks igas kalas mõõdetud aine sisaldust korrigeerida asjaomase kala lipiidisisalduse alusel ja kanda lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud naturaallogaritmitud kontsentratsiooniandmed graafikule päevades väljendatud puhastumisaja funktsioonina, et leida C
                           0,d ja k
                           2. Seejärel saab arvutada imendumistõhususe (võrrand A7.1) lipiidisisalduse alusel; selleks kasutatakse näitaja C
                           sööt puhul lipiidisisaldusest lähtuvat väärtust (st C
                           sööt korrutatakse lipiidide keskmise osakaaluga söödas). Järgnevalt saab võrrandite A7.4 ja A7.5 abil otse arvutada lipiidisisalduse (ja kasvust tingitud lahjenemise) suhtes korrigeeritud BMFi.
                        Muul juhul leitakse lipiidide keskmine massiosa kalades ja söödas nii katserühmas kui ka kontrollrühmas (sööda ja kontrollrühma kalade puhul kasutatakse tavaliselt kokkupuute alguses ja lõpus saadud andmeid, katserühma kalade puhul aga üksnes kokkupuute lõpus saadud andmeid). Mõne katse vältel võib kalade lipiidisisaldus oluliselt suureneda; sel juhul on asjakohasem kasutada katsealuste kalade keskmist lipiidisisaldust, mis on arvutatud kokkupuute lõpus ja puhastumise lõpus mõõdetud väärtuste põhjal. Üldjuhul tuleks kummagi lipiidide osakaalu näitaja leidmiseks kasutada üksnes katserühma andmeid.
                        Lipiidisisalduse suhtes korrigeerimise tegur (Lc
                           ) arvutatakse järgmiselt:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A7.8],
                                 
                              kus L
                           f ja L
                           sööt on lipiidide keskmine osakaal vastavalt kalades ja söödas.
                        Lipiidisisalduse suhtes korrigeerimise teguri abil leitakse lipiidisisalduse suhtes korrigeeritud biokuhjumistegur (BMFL):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [võrrand A7.9].
                                 
                              5.   ALGHETKE ISELOOMUSTAVA MÕÕDETUD SISALDUSE (C
                           0,M) JA EELDATAVA SISALDUSE (C
                           0,D) VAHELISE ERINEVUSE HINDAMINE
                        Alghetke iseloomustavat mõõdetud sisaldust (C
                           0,m) ja eeldatavat sisaldust (C
                           0,d) tuleks omavahel võrrelda. Nende näitajate suur omavaheline sarnasus viitab puhastumisparameetrite leidmiseks kasutatud esimest järku reaktsiooni mudeli sobivusele.
                        Mõnes katses võidakse täheldada märkimisväärset erinevust alghetke iseloomustava eeldatava väärtuse C
                           0,d ja mõõtmistulemuste keskväärtuse C
                           0,m vahel (vt käesoleva katsemeetodi punkti 159 viimane alapunkt). Kui C
                           0,d on väga palju väiksem kui C
                           0,m (C
                           0,d << C
                           0,m), võib see erinevus viidata seedimata rikastatud sööda esinemisele soolestikus. Seda võib katseliselt kontrollida väljalõigatud seedekulgla eraldi analüüsimise teel, kui omastamisetapi lõpus on proovide jaoks võetud ja säilitatud täiendav arv terveid kalu. Vastasel juhul ning kui puhastumisetapi andmete lineaarse regressiooni puhul kasutatud statistiliselt usaldusväärsest võõrväärtuste testist nähtub, et puhastumisetapi esimeses proovis mõõdetud sisaldus on ekslikult suur, võib olla asjakohane viia lineaarne regressioon k
                           2 leidmiseks läbi ilma puhastumisetapi esimese kontsentratsioonipunktita. Kui sellise lineaarse regressiooni määramatus on oluliselt väiksem ja on selge, et puhastumiskineetika vastab ligikaudselt esimest järku reaktsiooni kineetikale, võib olla sobiv kasutada saadud C
                           0,d ja k
                           2 väärtust imendumistõhususe arvutamiseks. Katseprotokollis tuleks esitada sellekohane ammendav põhjendus. Samuti on võimalik, et puhastumine ei toimu vastavalt esimest järku reaktsiooni kineetikale. Kui see on tõenäoline (st naturaallogaritmitud andmed näivad järgivat lineaarse regressiooni sirge asemel kõverjoont), on k
                           2 ja C
                           0,d arvutuslik väärtus ilmselt vale ning tuleks kasutada biostatistiku abi.
                        Kui C
                           0,d on väga palju suurem kui mõõdetud väärtus (C
                           0,d >> C
                           0,m), võib see viidata sellele, et ainest puhastumine on väga kiire (st proovivõtupunktide andmete puhul toimub lähenemine analüüsimeetodi määramispiirile puhastumisetapi väga varases järgus; vt allpool jaotis 6), et puhastumiskineetika kaldub kõrvale esimest järku reaktsiooni kineetikast, et k
                           2 ja C
                           0,d leidmiseks kasutatud lineaarne regressioon ei ole läbi viidud õigesti või et katse mõnes proovivõtupunktis esines sisalduse mõõtmisel probleeme. Sellisel juhul tuleks lineaarse regressiooni graafiku lähemal uurimisel kindlaks teha, kas mõni kontsentratsioonipunkt on määramispiiril või selle lähedal, kas esineb võõrväärtusi ja kas andmepunktid järgivad selgelt kõverjoont (see viitab muud kui esimest järku reaktsiooni kineetikale), ning tuua see katseprotokollis esile. Iga järgnevat hinnanguliste väärtuste täpsuse suurendamiseks uuesti läbi viidavat lineaarset regressiooni tuleks kirjeldada ja põhjendada. Kui täheldatakse olulist kõrvalekaldumist esimest järku reaktsiooni kineetikast, on k
                           2 ja C
                           0,d arvutuslik väärtus ilmselt vale ning tuleks kasutada biostatistiku abi.
                        6.   JUHISED UURITAVATE AINETE KOHTA, MILLEST PUHASTUMINE ON VÄGA KIIRE
                        Nagu on selgitatud käesoleva katsemeetodi punktis 129, võib mõnest ainest puhastumine olla nii kiire, et usaldusväärse k
                           2 ja alghetke iseloomustava kontsentratsiooni C
                           0,d leidmine ei ole võimalik, kuna aine ei ole puhastumisetapi väga varases järgus võetud proovides (st alates puhastumisetapi teisest proovist) praktiliselt enam määratav (selle sisalduseks märgitakse määramispiir). Kõnealust olukorda täheldati käesoleva katsemeetodi kontrollimiseks tehtud laboritevahelises võrdlusuuringus benso[a]püreeni puhul ning see on dokumenteeritud meetodi valideerimisaruandes. Sellisel juhul ei ole lineaarne regressioon usaldusväärne ja selle abil saadav C
                           0,d hinnanguline väärtus on ebareaalselt suur ning sellest tulenevalt on näilik imendumistõhusus palju suurem kui 1. Sellises olukorras on võimalik arvutada k
                           2 ja maksimaalse BMFi konservatiivne hinnanguline väärtus.
                        Konstandi k
                           2 väärtuse hindamiseks lineaarse regressiooni teel (lähtuvalt naturaallogaritmitud kontsentratsiooniandmete sõltuvusest ajast) kasutatakse puhastumisetapi neid andmepunkte, kus sisaldus oli mõõdetav, ja esimest sellist punkti, millest alates aine ei olnud enam määratav (selle sisalduseks loeti määramispiir). Sellisel juhul kasutatakse tõenäoliselt üksnes kahte (nt puhastumisetapi 1. ja 2. proovivõtupäeva) andmepunkti, mille alusel saab hinnata k
                           2 väärtust vastavalt 5. liites esitatud võrrandile A5.22. Leitud hinnangulist k
                           2 väärtust saab kasutada imendumistõhususe hindamiseks vastavalt võrrandile A7.1, kus C0,d väärtus asendatakse mõõdetud sisaldusega alghetkel (C0,m), juhul kui hinnanguline C0,d on ilmselgelt palju suurem kui katses olnuks võimalik saavutada. Kui C0,m ei ole mõõdetav, tuleks kasutada määramispiiri kalakudedes. Kui mõnel juhul leitakse sellise arvutuse tulemusena, et α > 1, loetakse imendumistõhususe väärtuseks 1 ehk halvimale olukorrale vastav väärtus.
                        Seejärel võib võrrandi A7.4 alusel arvutada BMFK maksimaalse hinnangulise väärtuse, mille esitamisel tuleks kasutada tähist „palju väiksem kui“ (<<). Näiteks katse puhul, kus söötmismäär on 3 %, puhastumise poolväärtusaeg on lühem kui 3 päeva ja α väärtus on vastavalt halvimale olukorrale 1, on BMFK tõenäoline väärtus väiksem kui umbes 0,13. Tulenevalt sellise hinnangulise näitaja otstarbest ja asjaolust, et kõnealune väärtus on oma olemuselt konservatiivne, ei ole vaja seda kasvust tingitud lahjenemise ega kalade ja sööda lipiidisisalduse suhtes korrigeerida.
                     
                     
                        8. liide
                        
                           LÄHENEMISVIISID BCF-DE EELDATAVA HINNANGULISE VÄÄRTUSE LEIDMISEKS TOIDUKAUDSE KOKKUPUUTE KATSEST SAADUD ANDMETE PÕHJAL
                        
                        Käesolev katsemeetod hõlmab toidukaudse kokkupuute meetodit selliste ainete bioakumuleerumise uurimiseks, mille puhul ei saa praktikas kasutada veekaudse kokkupuute meetodit. Veekaudse kokkupuute meetodiga leitakse biokontsentratsioonitegur, toidukaudse kokkupuute meetodiga aga saadakse otseselt teavet söömisest tuleneva võimaliku biokuhjumise kohta. Paljudes kemikaalide ohutust käsitlevates süsteemides (näiteks riskihindamisel ja ühtses ülemaailmses kemikaalide klassifitseerimise süsteemis) nõutakse veekaudse biokontsentreerumise andmete esitamist. Seega on vaja leida toidukaudse kokkupuute katsest saadud andmete põhjal hinnanguline biokontsentratsioonitegur, mis on võrreldav veekaudse kokkupuute meetodi kohases katses leitud näitajaga (94). Käesolevas liites on vaadeldud lähenemisviise selle saavutamiseks; samal ajal ollakse teadlikud sellistele hinnangutele omastest puudustest.
                        Toidukaudses katses mõõdetakse ainest puhastumist, et leida puhastumise kiiruskonstant k
                           2. Kui olemasolevate andmete põhjal saab leida omastamise kiiruskonstandi, mis kirjeldab olukorda, kus kalad on puutunud uuritava ainega kokku vee kaudu, on võimalik arvutada hinnanguline kineetiline BCF.
                        Uuritava ainega vee kaudu kokkupuutumist iseloomustava omastamise kiiruskonstandi hinnanguline väärtus sõltub paljudest eeldustest, mis kõik mõjutavad kõnealuse hinnanguga seotud määramatust. Peale selle eeldatakse sellisel viisil BCFi hindamise puhul, et üldine puhastumiskiirus (mida muu hulgas mõjutavad sellised tegurid nagu jaotumine organismis ja konkreetsed puhastumisprotsessid) ei sõltu kokkupuutemeetodist, millega saavutatakse uuritava aine akumuleerumine organismis.
                        Kõnealuse hindamist võimaldava lähenemisviisi puhul vajalikud põhieeldused võib kokku võtta järgmiselt.
                        Toidukaudsele omastamisele järgnev puhastumine toimub asjaomase aine puhul samal viisil kui veekaudsele kokkupuutele järgnev puhastumine.
                        Omastamine veest toimub vastavalt esimest järku reaktsiooni kineetikale.
                        Sõltuvalt omastamise hindamiseks kasutatavast meetodist:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    on omastamine korreleeritav ainult kalade massiga,
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    on omastamine korreleeritav ainult aine jaotuskoefitsiendiga süsteemis oktanool/vesi,
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    on omastamine korreleeritav nii kalade massi kui ka süsteemis oktanool/vesi täheldatavat aine jaotuskoefitsienti hõlmavate kombineeritud andmetega,
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    on tegelikus veekaudse kokkupuute katses omastamist mõjutada võivate tegurite, näiteks aine biosaadavuse, seadmetele adsorbeerumise, molekuli suuruse
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    jms mõju väike.
                                 
                              Kõige olulisem aga on eeldus, et omastamise hindamise meetodi väljatöötamiseks kasutatav andmebaas (õppeandmestik) on asjaomase aine suhtes representatiivne.
                        Mitmes avalikest allikatest kättesaadavas artiklis on kirjeldatud võrrandeid, mis väljendavad kalas lõpuste kaudu toimuva veest omastamise seost aine jaotuskoefitsiendiga süsteemis oktanool/vesi, kala massiga (1–4), mahuga ja/või lipiidisisaldusega, membraani läbimise / imendumise tõhususega (5, 6) või kala hingamismahuga minutis (7), või mille puhul kasutatakse aine lenduvusel/massibilansil põhinevat lähenemisviisi (8–10). Selliseid meetodeid on kõnealuses kontekstis üksikasjalikult hinnanud Crookes ja Brooke (11). Selles kontekstis sisaldab kasulikku teavet ka toidu kaudu omastamisest tuleneva bioakumuleerumise modelleerimist käsitlev Barberi artikkel (12), kuna see hõlmab ka lõpuste kaudu omastamise kiirust käsitlevatest mudelitest tulenevaid täiendusi. Nimetatud aspektile on keskendutud ka 2004. aasta toidukaudse kokkupuute katsemeetodi taustdokumendi (13) ühes osas.
                        Enamik kõnealustest mudelitest näivad olevat välja töötatud piiratud mahuga andmebaaside põhjal. Mudelite puhul, mille väljatöötamisel aluseks võetud andmebaaside kohta on olemas üksikasjalik teave, näib olevat kasutatud selliseid aineid, mis on sageli sarnase struktuuriga või kuuluvad sarnasesse funktsionaalrühma (nt kloororgaanilised ühendid). See suurendab katsespetsiifiliste tegurite, näiteks katseliigi, temperatuuri jms kõrval veelgi määramatust asjaomase mudeli kasutamisel kõnealustest ainetest erinevat liiki ainete omastamise kiiruskonstandi hindamiseks.
                        Olemasolevaid meetodeid käsitlevas ülevaates (11) on esile toodud, et ükski meetod ei ole „õigem“ kui mõni teine. Seepärast tuleks kasutatava mudeli valimist selgelt põhjendada. Kui on olemas mitu meetodit, mille kasutamist saab põhjendada, võib olla mõistlik esitada omastamise hindamise eri meetoditega saadud mitu k
                           1 (ja sellest tulenevalt BCFi) hinnangulist väärtust või k
                           1 (ja BCFi) väärtuste vahemik. Eri tüüpi mudelite ja nende väljatöötamiseks kasutatud andmestike vahelistest erinevustest tulenevalt ei ole eri viisil saadud hindamistulemuste keskväärtuse arvutamine siiski kohane.
                        Mõni teadlane on seisukohal, et selliseid hinnangulisi BCFi väärtusi on vaja korrigeerida biosaadavuse suhtes, et võtta arvesse aine adsorbeerumist lahustunud orgaanilisele süsinikule veekaudse kokkupuute tingimustes ning viia sellega asjaomane hinnanguline väärtus vastavusse veekaudse kokkupuute katsete tulemustega (nt viited 13 ja 14). Selline korrigeerimine ei pruugi aga olla asjakohane, kui võtta arvesse, et veekaudse kokkupuute katses halvimale olukorrale vastava (st aine biosaadava ja lahuses mõõdetud fraktsiooni suhet kajastava) hinnangulise väärtuse saamiseks vajalik lahustunud orgaanilise süsiniku sisaldus on väike. Väga hüdrofoobsete ainete puhul võib lõpuste kaudu omastamist piirata passiivse difusiooni kiirus lõpusepinna lähedal; sellisel juhul on võimalik, et kõnealuse korrigeerimisega kajastatakse seda mõju, mitte olukorda, mille jaoks nimetatud korrigeerimine on ette nähtud.
                        Soovitatakse keskenduda meetoditele, mille sisendandmed on siin kirjeldatud toidukaudse kokkupuute meetodi kohaselt uuritavate ainete puhul hõlpsalt kättesaadavad (st log K
                           OW, kalade mass). Võib kasutada muid meetodeid, mis nõuavad keerukamaid sisendandmeid, kuid selleks võib olla vaja teha katses lisamõõtmisi või hankida uuritava aine või asjaomase kalaliigi kohta üksikasjalikku teavet, mis ei pruugi olla laialdaselt kättesaadav. Peale selle võib mudeli valimist mõjutada mudeli valideerituse tase ja kasutusvaldkond (eri meetodite võrdlev ülevaade on esitatud viites 11).
                        Tuleks meeles pidada, et saadud hinnanguline k
                           1 ja BCFi väärtus on ebatäpsed ning aine bioakumuleerumise määrast ülevaate saamiseks võib olla vaja vaadelda neid tõendite kaalukusel põhineva lähenemisviisi raames koos leitud BMFi ja ainet iseloomustavate parameetritega (nt molekuli suurus). Kõnealuste parameetrite tõlgendamine ja kasutamine võib sõltuda asjaomasest õigusraamistikust.
                        KIRJANDUS
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Sijm, D. T. H. M., Pärt, P., ja Opperhuizen, A. (1993). The influence of temperature on the uptake rate constants of hydrophobic compounds determined by the isolated perfused gills of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquat. Toxicol. 25: 1–14.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Sijm, D. T. H. M., Verberne, M. E., Pärt, P., ja Opperhuizen, A. (1994). Experimentally determined blood and water flow limitations for uptake of hydrophobic compounds using perfused gills of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Allometric applications. Aquat. Toxicol. 30: 325–341.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Sijm, D. T. H. M., Verberne, M. E., de Jonge, W. J., Pärt P., ja Opperhuizen, A. (1995). Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharm. 131: 130–135.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Barber, M. C. (2003). A review and comparison of models for predicting dynamic chemical bioconcentration in fish. Environ. Toxicol. Chem. 22: 1963–1992.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Opperhuizen, A. (1986). Bioconcentration of hydrophobic chemicals in fish. Väljaandes: Aquatic Toxicology and Environmental Fate. STP 921, Poston, T. M., ja Purdy, R. (toim.), USA Materjalide Katsetamise Ühing, Philadelphia, PA, USA, lk 304–315.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Arnot, J. A., ja Gobas, F. A. P. C. (2004). A food web bioaccumulation model for organic chemicals in aquatic ecosystems. Environ. Toxicol. Chem. 23: 2343–2355.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Thomann, R. V. (1989). Bioaccumulation model of organic chemical distribution in aquatic food chains. Environ. Sci. Technol. 23: 699–707.
                                 
                              
                                    (8)
                                 
                                 
                                    Hendriks, A. J., van der Linde, A., Cornelissen, G., ja Sijm, D. T. H. M. (2001). The power of size. 1. Rate constants and equilibrium ratios for accumulation of organic substances related to octanol-water partition ratio and species weight. Environ. Toxicol. Chem. 20: 1399–1420.
                                 
                              
                                    (9)
                                 
                                 
                                    Campfens, J., ja Mackay, D. (1997). Fugacity-based model of PCB bioaccumulation in complex aquatic food webs. Environ. Sci. Technol. 31: 577–583.
                                 
                              
                                    (10)
                                 
                                 
                                    Arnot, J. A., ja Gobas, F. A. P. C. (2003). A generic QSAR for assessing the bioaccumulation potential of organic chemicals in aquatic food webs. QSAR Comb. Sci. 22: 337–345.
                                 
                              
                                    (11)
                                 
                                 
                                    Crookes, M., ja Brooke, D. (2010). Estimation of fish bioconcentration factor (BCF) from depuration data. Aruande kavand. Environment Agency, Bristol, UK.
                                 
                              
                                    (12)
                                 
                                 
                                    Barber, M. C. (2008). Dietary uptake models used for modelling the bioaccumulation of organic contaminants in fish. Environ. Toxicol. Chem. 27: 755–777.
                                 
                              
                                    (13)
                                 
                                 
                                    Anonüümne autor (2004). Background document to the fish dietary study protocol. Uute ja olemasolevate kemikaalide tehnilise komitee püsivate, bioakumuleeruvate ja toksiliste ainete töörühmale esitatud dokument.
                                 
                              
                                    (14)
                                 
                                 
                                    Gobas, F., ja Morrison, H. (2000). Bioconcentration and biomagnification in the aquatic environment. Väljaandes: Handbook of property estimation methods for chemicals. Boethling, R. S., ja Mackay, D. (toim.), Lewis Publishers, Boca Racton, FL, USA, lk 189–231.
                                 
                              “
               
                     17)
                  
                  
                     C osas asendatakse peatükk C.20 järgmisega:
                     „C.20.   Hiidkiivriku (Daphnia magna) sigivuse katse
                     
                     SISSEJUHATUS
                     Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 211 (2012). OECD katsejuhendeid vaadatakse teaduse arengut arvestades korrapäraselt läbi. Sigivuse katsejuhend 211 pärineb katsejuhendi 202 II osast „Daphnia sp. sigivuse katse“ (1984). Oli üldiselt teada, et katsejuhendi nr 202 kohaselt läbiviidud katsete andmed võivad olla muutlikud. Seepärast tehti suuri jõupingutusi, et leida selle muutlikkuse põhjused ja luua parem katsemeetod. Katsejuhendi 211 aluseks on teadusuuringute tulemused, laboritevahelised võrdluskatsed ja valideerimisuuringud, mis tehti 1992. (1), 1994. (2) ja 2008. aastal (3).
                     Peamised erinevused sigivuskatse esialgsest versioonist (nr 202, 1984) ja teisest versioonist (nr 211, 1998) on järgmised:
                     
                                 —
                              
                              
                                 soovitatud kasutatav liik on Daphnia magna;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 katse kestab 21 päeva;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 poolstaatiliste katsete puhul kasutatavate loomade arvu on iga uuritava kontsentratsiooni puhul vähendatud vähemalt 40-lt, kes olid eelistatult jaotatud neljaks kümneloomaliseks rühmaks, 10 loomale, keda hoitakse eraldi (kuigi läbivoolukatsete puhul võib kasutada erinevaid katseplaane);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 katses kasutatava söötme ja söötmistingimuste kohta on esitatud konkreetsemaid soovitusi.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Peamised erinevused sigivuskatse teise versiooni (nr 211, 1998) ja käesoleva versiooni vahel on järgmised:
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 on lisatud liide 7, et kirjeldada meetodit vastsündinute soo määramiseks, kui seda nõutakse. Kooskõlas käesoleva katsemeetodi varasemate versioonidega on sooline jagunemine üks võimalikke määratavaid näitajaid;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Sõltuvat muutujat „elusate järglaste arv ellujäänud vanema kohta“ on täiendatud veel ühe kiivrike paljunemist iseloomustava sõltuva muutujaga, nimelt „elusate järglaste üldarv katse lõpul ühe vanema kohta katse alguses“, kusjuures analüüsil ei võeta arvesse vanemate juhuslikku või seletamatut suremust. Sellise sõltuva muutuja lisamise eesmärk on viia see sõltuv muutuja kooskõlla muudes selgrootutega tehtavates sigivuskatsetes kasutatavate muutujatega. Peale selle on käesolevas katsemeetodis selle sõltuva muutuja puhul võimalik kõrvaldada üks veaallikatest, nimelt vanemloomade juhuslik või seletamatu suremus, kui see toimub kokkupuuteperioodi ajal;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 lisatud on täiendavaid statistilisi juhiseid katsete kavandamise ja andmete töötlemise kohta nii seoses ECx (nt EC10 või EC50) kui ka NOEC/LOEC (täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon / vähim täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon) lähenemisviisiga;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 lisatud on piirsisalduskatse.
                              
                           Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.
                     KATSE PÕHIMÕTE
                     Katse põhieesmärk on hinnata kemikaalide mõju Daphnia magna sigivusele. Selleks viiakse noored emased kiivrikud (vanemloomad), kes on katse alguses alla 24 tunni vanad, kokkupuutesse veele eri kontsentratsioonides lisatud uuritava kemikaaliga. Katse kestab 21 päeva. Katse lõpus hinnatakse elusate lisandunud järglaste koguarv. Vanemloomade sigivust saab väljendada ka muul viisil (nt looma kohta päevas saadud elusate järglaste arv alates esimesest päevast, mil järglaste olemasolu märgati), kuid need tuleb esitada lisaks katse lõpus elus olevate noorloomade koguarvule. Tänu muude selgrootutega tehtavate sigivuskatsetega võrreldes erilisele poolstaatilise katseplaanile, on võimalik määrata ka igalt üksikisendilt saadud elusate järglaste arv. See võimaldab, vastupidi muudele selgrootutega tehtavatele sigivuskatsetele, jätta analüüsist välja andmed sellise vanemlooma sigivuse kohta, kes katse ajal juhuslikel või seletamatutel põhjustel sureb. Seega, kui kemikaaliga kokkupuute paralleelkatsetes esineb vanemate suremust, tuleks kaaluda, kas suremuses on märgata kontsentratsiooni-toime sõltuvust, näiteks, kas esineb toime oluline regressioon, võrreldes uuritava kemikaali kontsentratsiooni positiivse tõusuga (selle määramiseks võib kasutada Cochran-Armitage'i trenditesti). Kui suremusega seoses ei esine kontsentratsiooni-toime sõltuvust, tuleb need paralleelkatsed, milles esineb vanemate suremust, katsetulemuste analüüsist välja jätta. Kui suremuses on näha kontsentratsiooni-toime sõltuvust, tuleks vanemloomade suremust hinnata kui uuritava kemikaali toimet ja selliseid paralleelkatseid ei tohiks analüüsist välja jätta. Kui vanem sureb katse ajal, st juhusliku (mingi käsitsemisvea või juhuse tõttu) või seletamatu vahejuhtumi tõttu, mis ei ole seotud uuritava kemikaali toimega, või kui vanem osutub isasloomaks, jäetakse see paralleelkatse analüüsist välja (vt lähemalt punkt 51). Uuritava kemikaali toksilised mõjud sigivusele väljendatakse ECx kujul, mille leidmiseks lähendatakse andmeid sobivale mudelile mittelineaarse regressiooniga, et leida kontsentratsioon, mis põhjustab loomade sigivuse vähenemise x %, või et alternatiivina leida NOEC/LOEC väärtus (4). Eelistatavalt peaks uuritavate kontsentratsioonide vahemik asuma mõlemal pool toimet avaldavat väikseimat kasutatud kontsentratsiooni (nt EC10), mis tähendab, et see väärtus arvutatakse interpoleerimisega, mitte ekstrapoleerimisega.
                     
                     Andmed tuleb esitada ka vanemate ellujäämise ja esimeste järglaste saamise aja kohta. Uurida võib ka muid kemikaaliga seotud toimeid sellistele näitajatele, nagu kasv (pikkus), ja võimaluse korral ka populatsiooni kasvu omakiirusele (vt punkt 44).
                     TEAVE UURITAVA KEMIKAALI KOHTA
                     Akuutse toksilisuse katse tulemused (vt käesoleva lisa peatükk C.2. Daphnia sp. liikumisvõime akuutse pärssimise katse), kui katse on tehtud Daphnia magna'ga, võivad olla kasulikud sigivuskatse tegemiseks sobiva uuritavate kontsentratsioonide vahemiku valimiseks. Teada peavad olema uuritava kemikaali lahustuvus vees ja aururõhk ning olemas peab olema usaldusväärne analüütiline meetod, mille abil määrata kemikaali kogust uuritavas lahuses ning mille kohta on teada tulemuslikkus ja määramispiir.
                     Katsetingimuste kindlaksmääramisel võib olla kasulik järgmine uuritavat kemikaali käsitlev teave: struktuurivalem, kemikaali puhtus, stabiilsus valguse käes, stabiilsus katsetingimustes, pKa, Pow ja biolagunduvuse katse tulemused (vt käesolevas lisas meetod C.4, kohese biolagunduvuse määramine, ja C.29, kiire biolagundatavus – CO2 suletud nõudes).
                     KATSE NÕUETEKOHASUS
                     Katse nõuetekohasuse jaoks peavad kontrolli rühma(de)s olema täidetud järgmised kvaliteedikriteeriumid:
                     
                                 —
                              
                              
                                 vanemate (emaste kiivrike) suremus ei ületa katse lõpus 20 %;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 katse lõpus elus oleva vanema kohta saadud elusate järglaste keskmine arv on ≥ 60.
                              
                           Märkus: sama kriteeriumi (20 %) võib kasutada ka juhusliku ja seletamatu vanemate suremuse kohta nii kontrolli katsetes kui ka iga uuritava kontsentratsiooni puhul.
                     MEETODI KIRJELDUS
                     
                        Seadmed
                     
                     Katsenõud ja muud seadmed, mis puutuvad kokku uuritavate lahustega, peavad olema üleni klaasist või muust keemiliselt inertsest materjalist. Katsenõud on tavaliselt klaasist keeduklaasid.
                     Lisaks võib vaja minna veel järgmisi vahendeid:
                     
                                 —
                              
                              
                                 hapnikumõõtur (mikroelektroodi või muu sobiva seadmega, mis võimaldaks mõõta lahustunud hapnikku väikese ruumalaga proovides);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 temperatuuri reguleerimiseks vajalikud seadmed;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pH-meeter;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 seadmed vee kareduse määramiseks;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 seadmed vee orgaanilise süsiniku kogusisalduse määramiseks või seadmed keemilise hapnikutarbe määramiseks;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 sobivad seadmed valgusrežiimi reguleerimiseks ja valgustugevuse mõõtmiseks.
                              
                           
                        Katseorganism
                     
                     Katses kasutatav liik on Daphnia magna Straus (95).
                     Eelistatavalt tuleks kloon identifitseerida genotüübi määramisega. Teadusuuringud (1) on näidanud, et klooni A (pärit IRCHAst Prantsusmaalt) (5) sigivuse puhul on nõuetekohasuse kriteerium – keskmiselt ≥ 60 järglast ellujäänud vanema kohta – järjekindlalt täidetud, kui kasvatamine toimub käesoleva meetodi tingimuste kohaselt. Vastuvõetav on ka muude kloonide kasutamine, kui tõendatakse, et kiivrike kultuur vastab katse nõuetekohasuse kriteeriumidele.
                     Katse alguses ei tohiks loomad olla üle 24 tunni vanad ning nad ei tohiks olla esimese haudme järglased. Nad peavad olema pärit tervest põhikultuurist (st neil ei tohi esineda selliseid stressi tunnuseid nagu suur suremus, isaste ja talimunade esinemine, esimese haudme hilinemine, värvimuutusega loomad jne). Põhikultuuri loomi tuleks säilitada katsetingimustega sarnastes kasvatamistingimustes (valgus, temperatuur, sööde, söötmine ja loomade arv ruumalaühiku kohta). Kui katses kasutatav kiivrikute kasvatamise sööde erineb söötmest, mida tavaliselt kasutatakse kiivrikute kasvatamiseks, on hea tava kasutada vanemate stressi vältimiseks katse-eelset tavaliselt umbes kolme nädala pikkust (st üks põlvkond) aklimatiseerimisperioodi.
                     
                        Katses kasutatav sööde
                     
                     Kõnealuses katses on soovitatav kasutada täielikult määratletud koostisega söödet. See aitab vältida raskesti iseloomustatavate lisaainete (nt merevetikad, mullaekstraktid) kasutamist ja parandab seega laboritevahelise standardimise võimalusi. On leitud, et selleks otstarbeks sobivad söötmed on Elendti M4 (6) ja M7 söötmed (vt 2. liide). Eeldusel, et kiivrikukultuur tõendatult vastab katse nõuetekohasuse kriteeriumidele, on vastuvõetavad siiski ka muud söötmed (nt 7, 8).
                     Kui kasutatakse määratlemata lisaaineid sisaldavat söödet, tuleb need lisaained selgelt määratleda ning katseprotokollis tuleb esitada teave koostise ja eriti süsinikusisalduse kohta, sest see võib täiendada pakutavat söödavalikut. Soovitatav on määrata orgaanilise lisaaine põhilahuse orgaanilise süsiniku kogusisaldus ja/või keemiline hapnikutarve ning hinnata sellest tulenev panus katseks valmistatud söötme orgaanilise süsiniku kogusisaldusse või keemilisse hapnikutarbesse. Soovitatakse veel, et söötme orgaanilise süsiniku kogusisalduse väärtused (enne vetikate lisamist) oleksid väiksemad kui 2 mg/l (9).
                     Kui uuringud tehakse metalle sisaldavate kemikaalidega, on oluline arvestada, et katseks kasutatud söötme omadused (nt karedus, kelaatimisvõime) võivad mõjutada uuritava kemikaali toksilisust. Seepärast on soovitav kasutada täpselt määratletud koostisega söödet. Praegu on ainsad täielikult määratletud koostisega söötmed, mis teadaolevalt sobivad Daphnia magna pikaajaliseks kultiveerimiseks, Elendti M4 ja M7 söötmed. Mõlemad söötmed sisaldavad kelaativat ainet EDTA. On näidatud (2), et kui sigivuskatse tehakse M4 ja M7 söötmes, on kaadmiumi „näiline toksilisus“ üldiselt väiksem kui söötme puhul, milles puudub EDTA. Seepärast ei soovitata M4 ja M7 kasutada uuringute tegemiseks metalle sisaldavate kemikaalidega ning vältida tuleks ka muid söötmeid, mis sisaldavad teadaolevaid kelaadimoodustajaid. Metalli sisaldavate kemikaalide puhul on soovitatav kasutada alternatiivset söödet, näiteks ASTMi taastatud karedat magevett (9), mis ei sisalda EDTA-d. Kõnealune ASTMi taastatud kareda magevee ja vetikaekstrakti (10) kombinatsioon sobib Daphnia magna pikaajaliseks kasvatamiseks (2).
                     Lahustunud hapniku kontsentratsioon peab olema üle 3 mg/l katse alguses ja kestel. pH peaks olema vahemikus 6–9 ning see ei tohiks ühe katse jooksul muutuda rohkem kui 1,5 ühikut. Soovitatav karedus on üle 140 mg/l (väljendatud CaCO3-na). Kõnealusel tasemel tehtud katsete puhul on sigivus olnud vastavuses katse nõuetekohasuse kriteeriumidega (11, 12).
                     
                        Katselahused
                     
                     Valitud kontsentratsiooniga katselahused valmistatakse tavaliselt põhilahuse lahjendamise teel. Põhilahused tuleks eelistatavalt valmistada lahusteid või dispergente kasutamata, kui see on võimalik, uuritava kemikaali segamise või loksutamisega katses kasutatavas söötmes, kasutades selleks mehaanilisi vahendeid, nagu loksutamine, segamine või töötlemine ultraheliga või muid sobivaid meetodeid. On soovitatav, et enne katseloomade lisamist viiakse katsesüsteem kokkupuutesse uuritava kemikaali kontsentratsiooniga, mida katses kasutatakse, nii kauaks, kui on vaja selleks, et tõendada stabiilse kokkupuutekontsentratsiooni püsimist keskkonnas. Kui uuritav kemikaal on vees raskesti lahustuv, tuleb kasutada meetodeid, mida on kirjeldatud OECD juhenddokumendis raskesti uuritavate ainetega katsete tegemise kohta (13). Lahusti või dispergendi kasutamist tuleks vältida, kuid mõnel juhul võib see olla vajalik annustamiseks sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse valmistamiseks.
                     Lisaks uuritava kemikaali eri kontsentratsioonidega tehtavatele katsetele tuleb vajaliku arvu paralleelidega teha ka lahjendusvee kontrolli katse ja, kui lahusti kasutamist ei õnnestu vältida, siis vajaliku arvu paralleelidega ka lahusti kontrolli katse. Katses tuleks kasutada vaid selliseid lahusteid või dispergente, mida on uuritud ja mille kohta on näidatud, et neil ei ole olulist toimet või on vaid minimaalne toime sõltuvale muutujale. Sobivate lahustite (nt atsetoon, etanool, metanool, dimetüülformamiid ja trietüleenglükool) ja dispergentide (näiteks Cremophor RH40, 0,01 % metüültselluloos ja HCO-40) näited on esitatud publikatsioonis (13). Kui kasutatakse lahustit või dispergenti, ei tohiks selle lõppkontsentratsioon ületada 0,1 ml/l (13) ning see kontsentratsioon peab olema ühesugune kõikides katsenõudes, välja arvatud lahjendusvee kontroll. Siiski tuleks teha kõik selleks, et lahusti kontsentratsioon oleks minimaalne.
                     KATSE KÄIK
                     
                        Kokkupuutetingimused
                     
                     
                        Katse kestus
                     
                     Katse kestab 21 päeva.
                     
                        Katseloomade asustamistihedus
                     
                     Vanemloomad asustatakse katsenõudesse ühekaupa; tavaliselt on katsenõus 50–100 ml söödet (Daphnia magna puhul; eriti väiksemate kiivrike, nt Ceriodaphnia dubia puhul võib olla võimalik kasutada ka väiksemat ruumala), välja arvatud juhul, kui katse on vaja korraldada läbivoolukatsena.
                     Vahel võib uuritava kemikaali kontsentratsiooni määramiseks kasutatava analüüsimeetodi nõuete täitmiseks kasutada suuremat ruumala, kuid lubatud on ka paralleelkatsete koondamine keemilise analüüsi tegemiseks. Kui kasutatava katsevedeliku ruumala on üle 100 ml, võib kiivrikutele antava sööda kogust suurendada, et tagada piisava sööda olemasolu ja vastavus katse nõuetekohasuse kriteeriumidele.
                     
                        Katseloomad
                     
                     Poolstaatiliste katsete puhul vähemalt 10 eraldi peetavat looma iga uuritava kontsentratsiooni kohta ja vähemalt 10 eraldi peetavat looma kontrolli rühmas.
                     Läbivoolukatsete korral on osutunud sobivaks 40 looma kasutamine, kes on jagatud nelja kümneliikmelisse rühma iga uuritava kontsentratsiooni kohta (1). Kasutada võib ka väiksemat katsealuste organismide hulka ning soovitatav on kasutada kontsentratsiooni kohta vähemalt 20 looma, kes on jagatud kaheks või enamaks võrdse loomade arvuga paralleelkatseks (nt neli paralleelkatset, igas neist viis kiivrikut). Pange tähele, et kui loomi peetakse rühmadena, ei ole statistilisest analüüsist võimalik välja jätta ühtki järglast, kui seletamatu/juhuslik vanemate suremus esineb pärast sigimise algust; seepärast tuleb järglaste arv sellisel juhul avaldada elusate järglaste üldarvuna katse alguses olemas olnud vanemlooma kohta.
                     Uuritava aine jaotamine katsenõudesse ja katsenõude hilisem käitlemine peaks toimuma juhuslikul alusel. Kui nii ei tehta, võib see põhjustada tulemustes nihke, mida võib tõlgendada kontsentratsiooni mõjuna. Eelkõige juhul, kui katseühikuid käideldakse uuritava kemikaali manustamise või kontsentratsiooni järjekorras, võib mõni ajaga seotud tegur, näiteks uuringu läbiviija väsimus või muu viga, põhjustada suurema kontsentratsiooni korral tugevamat mõju. Kui katse tulemusi võivad mõjutada tingimused katse alguses või keskkonnatingimused, näiteks asukoht laboris, tuleks kaaluda katse katkestamist.
                     
                        Söötmine
                     
                     Poolstaatiliste katsete puhul peaks kiivrikke söötma iga päev ning soovitatavalt vähemalt kolm korda nädalas (st vastavalt söötme vahetustele). Arvesse tuleks võtta kokkupuutekontsentratsiooni võimalikku lahjenemist sööda lisamise tõttu; seda tuleks vältida niipalju kui võimalik ja selleks peab lisatav vetikate suspensioon olema hästi kontsentreeritud. Kõrvalekalletest (nt läbivoolukatsete korral) tuleb teatada.
                     Katse jooksul peaksid vanemate söödavaliku moodustama peamiselt ühe või mitme järgmise vetikaliigi elusad rakud: Chlorella sp., Pseudokirchneriella subcapitata (varasem nimetus Selenastrum capricornutum) ja Desmodesmus subspicatus (varasem nimetus Scenedesmus subspicatus). Söödavaliku aluseks on igale vanemale pakutava orgaanilise süsiniku (C) kogus. Teadusuuringud (14) on näidanud, et hiidkiivrikute puhul on söödaratsioon 0,1–0,2 mg süsinikku kiivriku kohta päevas piisav, et saada katse nõuetekohasuse kriteeriumide täitmiseks vajalik arv järglasi. Sööta võib anda püsikogusena kogu katseperioodi jooksul või soovi korral võib alguses kasutada väiksemat kogust, mida siis katse käigus suurendatakse, et võtta arvesse vanemloomade kasvamist. Sellisel juhul peaks sööda kogus jääma siiski soovitatavasse vahemikku 0,1–0,2 mg süsinikku kiivriku kohta päevas kogu katse vältel.
                     Kui nõutava koguse söötmisel kasutatakse asendusnäitajaid, näiteks vetikarakkude arvu või valguse neeldumist (näiteks lihtsustamise huvides, kuna süsinikusisalduse mõõtmine on aeganõudev), peab iga labor koostama oma nomogrammi, millelt oleks näha asendusnäitaja ja vetikakultuuri süsinikusisalduse seos (vt nõuanded nomogrammi koostamise kohta, 3. liide). Nomogramme tuleks kontrollida vähemalt kord aastas ja juhul, kui vetikakultuuri tingimused on muutunud, siis sagedamini. On leitud, et süsinikusisalduse puhul on parem kasutada valguse neeldumist kui rakkude arvu (15).
                     Selleks, et minimeerida vetikakultuuri söötme sattumine katsenõudesse, tuleks kiivrikuid sööta kontsentreeritud vetikasuspensiooniga. Vetikaid saab kontsentreerida tsentrifuugimisega, millele järgneb resuspendeerimine kiivrikute söötmes.
                     
                        Valgus
                     
                     16 tundi valgust, mille intensiivsus ei ole suurem kui 15–20 μE·m– 2·s– 1, mõõdetuna katsenõu veepinnal. Luksides kaliibritud fotomeetri puhul vastab külmvalge valguse intensiivsuse vahemikule 15–20 μE·m-2·s-1 vahemik 1 000–1 500 luksi.
                     
                        Temperatuur
                     
                     Katses kasutatava söötme temperatuur peab olema vahemikus 18–22 °C. Ühe individuaalse katse puhul ei tohiks temperatuur ühe päeva jooksul nimetatud piirides võimaluse korral siiski kõikuda rohkem kui 2 °C (st 18–20, 19–21 või 20–22 °C). Temperatuuri jälgimiseks võib olla otstarbekas kasutada täiendavat katsenõu.
                     
                        Aereerimine
                     
                     Katsenõusid ei aereerita katse käigus.
                     
                        Katseplaan
                     
                     
                        Vahemiku määramise katse
                     
                     Vajaduse korral tehakse doosivahemiku leidmise katse, näiteks uuritava kemikaali viie kontsentratsiooniga ja kahe paralleeliga iga kokkupuutekatse või kontrolli katse kohta. Täiendav teave kiivrike ja/või muude veeorganismide suremuse või paljunemise kohta kas sarnaste kemikaalidega tehtud akuutse toksilisuse katsetest või kirjandusest võib aidata teha otsust doosivahemiku määramise katses kasutatava kontsentratsioonivahemiku kohta.
                     Doosivahemiku määramise katse kestab 21 päeva või nii kaua, kuni toime tugevust saab prognoosida piisava usaldusväärsusega. Katse lõpus hinnatakse kiivrike sigivust. Tuleb registreerida vanemate arv ja järglaste esinemine.
                     
                        Lõplik katse
                     
                     Tavaliselt tuleks kasutada vähemalt viit uuritavat kontsentratsiooni geomeetrilises jadas, mille eraldustegur ei tohiks soovitatavalt olla suurem kui 3,2 ja mis asuksid mõlemal pool toimet avaldavat kontsentratsiooni (nt ECx). Iga uuritava kontsentratsiooniga tuleks teha asjakohane arv paralleelkatseid (vt punktid 24–25). Vähem kui viie kontsentratsiooni kasutamist tuleb põhjendada. Kemikaale ei tohiks uurida kontsentratsioonil, mis on suurem kui nende lahustuvus katsekeskkonnas. Enne katse tegemist soovitatakse kaaluda katseplaani statistilist võimsust ja sobivate statistiliste meetodite kasutamist (4). Kontsentratsioonivahemike valimisel tuleks meeles pidada järgmist:
                     
                                 i)
                              
                              
                                 kui hinnatakse sigivusega seotud ECx väärtust, on soovitatav kasutada kontsentratsioone, mis oleksid piisavad, et määratleda ECx vajalikul usaldusväärsuse tasemel. Katses kasutatavad kontsentratsioonid peaksid soovitatavalt asuma mõlemal pool hinnangulist ECx väärtust, nii et ECx leitaks interpoleerimisega, mitte ekstrapoleerimisega. Edasise statistilise analüüsi seisukohast on eeliseks, kui on kasutatud suuremat arvu kontsentratsioone (nt kümmet) ja vähem paralleelkatseid igal kontsentratsioonil (nt viit, millega katsenõude üldarv hoitakse konstantsena) ning kümmet kontrolli;
                              
                           
                                 ii)
                              
                              
                                 LOEC ja NOEC määramisel peaks vähim kontsentratsioon olema piisavalt väike, et sigivus sellel kontsentratsioonil ei oleks oluliselt väiksem kui kontrolli rühmas. Vastupidisel juhul tuleb katset korrata vähendatud vähima kontsentratsiooniga;
                              
                           
                                 iii)
                              
                              
                                 LOEC ja NOEC määramisel peaks suurim uuritav kontsentratsioon olema piisavalt suur, et sigivus sellel kontsentratsioonil oleks oluliselt väiksem kui kontrolli rühmas. Vastupidisel juhul tuleb katset korrata suurendatud suurima kontsentratsiooniga, välja arvatud juhul, kui esialgses katses kasutati suurima uuritava kontsentratsioonina suurimat kroonilise mõju uurimisel nõutavat uuritavat kontsentratsiooni (s.t 10 mg/l).
                              
                           Kui doosivahemiku määramise katses ei täheldata (nt kontsentratsioonil 10 mg/l) mitte mingit mõju või kui on väga tõenäoline, et uuritav kemikaal on vähese toksilisusega või üldse mitte toksiline, arvestades toksilise mõju puudumist muudele organismidele ja/või vähest omastamist (või ei omastata seda üldse), võib sigivuskatse teha piirsisalduskatsena, kasutades näiteks uuritava kemikaali kontsentratsiooni 10 mg/l ja kontrolli. Nii kokkupuuterühmas kui ka kontrolli rühmas on vaja teha kümme paralleelkatset. Kui piirsisalduskatse tuleb teha läbivoolusüsteemis, siis piisab väiksemast arvust paralleelidest. Piirsisalduskatse võimaldab tõendada, et piirsisalduse juures puudub kemikaalil statistiliselt oluline toime; samas, kui täheldatakse mingit toimet, on tavaliselt vaja teha täielik katse.
                     
                        Kontrollid
                     
                     Lisaks katseseeriatele tuleb teha üks katses kasutatud söötme kontrolli katsete seeria ja vajaduse korral ka üks lahustit või dispergenti sisaldava kontrolli katsete seeria. Lahusti või dispergendi kasutamise korral peab nende kontsentratsioon olema sama kui uuritavat kemikaali sisaldavates nõudes. Kasutada tuleks asjakohast arvu paralleelkatseid (vt punktid 23–24).
                     Tavaliselt peaks korralikult läbiviidud katse puhul olema kontrolli rühmas (rühmades) vanema kohta saadud elus järglaste keskmise arvu variatsioonikordaja ≤ 25 % ning see tuleb esitada katseplaani puhul, milles kasutatakse üksikult peetavaid loomi.
                     
                        Söötme uuendamine
                     
                     Söötme uuendamise sagedus sõltub uuritava kemikaali stabiilsusest, kuid see sagedus peaks olema vähemalt kolm korda nädalas. Kui stabiilsuse eelkatses (vt punkt 7) ilmneb, et maksimaalse uuendamisperioodi (st kolme päeva) jooksul ei ole uuritava kemikaali kontsentratsioon püsiv (st väljaspool vahemikku 80–120 % või väiksem kui 80 % esialgsest mõõdetud kontsentratsioonist), tuleks kaaluda katses kasutatava söötme sagedamat uuendamist või kasutada läbivoolukatset.
                     Kui söödet uuendatakse poolstaatiliste katsete puhul, valmistatakse ette teine seeria katsenõusid ning vanemad teisaldatakse nendesse näiteks sobiva läbimõõduga klaaspipeti abil. Koos kiivrikuga teisaldatava söötme kogus peaks olema minimaalne.
                     
                        Vaatlus
                     
                     Katse jooksul tehtud vaatluste tulemused tuleb registreerida andmelehtedele (vt näidised, 4. ja 5. liide). Kui on vaja teha muid määramisi (vt punkt 44), võib vajalikuks osutuda täiendavate vaatluste tegemine.
                     
                        Järglased
                     
                     Iga vanema järglased tuleb pärast esimese haudme ilmumist eelistatavalt iga päev eemaldada ja üle lugeda, et nad ei saaks ära süüa vanemloomale ettenähtud sööta. Käesoleva katsemeetodi puhul tuleb üle lugeda ainult elusad järglased, kuid registreerida tuleb ka aborteerunud munad ja surnud järglased.
                     
                        Suremus
                     
                     Vanemate suremus tuleks registreerida soovitatavalt kord päevas või vähemalt niisama sageli kui loendatakse järglasi.
                     
                        Muud parameetrid
                     
                     Kuigi selle meetodi põhieesmärk on hinnata mõju järglaste arvule, on võimalik, et ka muid toimeid õnnestub piisavalt hästi kvantitatiivselt mõõta, selleks et neid statistiliselt analüüsida. Katses võib registreerida järglaste arvu iga ellujäänud vanema kohta, st kogu katseperioodi jooksul ellujäänud vanemalt saadud elusate järglaste arvu. Seda võib võrrelda peamise sõltuva muutujaga (järglaste arv iga sellise vanema kohta katse alguses, kes ei ole juhuslikult või seletamatult surnud katse ajal). Kui kemikaaliga kokkupuute paralleelkatsetes esineb vanemate suremust, tuleks kaaluda, kas suremuses on märgata kontsentratsiooni-toime sõltuvust, näiteks, kas esineb toime oluline regressioon, võrreldes uuritava kemikaali kontsentratsiooni positiivse tõusuga (selle määramiseks võib kasutada Cochran-Armitage'i trenditesti). Kui suremusega seoses ei esine kontsentratsiooni-toime sõltuvust, tuleb need paralleelkatsed, milles esineb vanemate suremust, katsetulemuste analüüsist välja jätta. Kui suremuses esineb kontsentratsiooni-toime sõltuvust, tuleks vanemloomade surma pidada uuritava kemikaali toimeks ja selliseid paralleelkatseid ei tohiks katsetulemuste analüüsist välja jätta. Väga soovitatav on kasvu iseloomustavate andmete kogumine, sest see annaks teavet võimalike subletaalsete mõjude kohta, mis võivad olla kasulikud ja täiendada ainult sigivust käsitlevate mõõtmiste tulemusi; katse lõpus on soovitatav mõõta vanemate pikkus (st kehapikkus, v.a anaaloga). Lisaks sellele võib mõõta või arvutada veel järgmised parameetrid: aeg esimese haudme (ja sellele järgnevate haudmete) saamiseni, haudmete arv ja suurus looma kohta, aborteerunud haudmete arv, isaste noorjärkude (OECD, 2008) ja talimunade esinemine ning võimaluse korral populatsiooni kasvu omakiirus (vt mõisted, 1. liide, ja noorjärkude soo määramine, 7. liide).
                     
                        Analüütiliste määramiste ja mõõtmiste sagedus
                     
                     Värske ja vana söötme hapnikusisaldust, temperatuuri, vee karedust ja pH-väärtusi tuleb mõõta vähemalt kord nädalas, kontrolli rühmas (rühmades) ja uuritava kemikaali suurima kontsentratsiooniga katsenõus.
                     Katse käigus määratakse uuritava kemikaali kontsentratsiooni korrapäraste ajavahemike järel.
                     Poolstaatiliste katsete puhul, kui võib eeldada, et uuritava kemikaali kontsentratsioon jääb vahemikku ± 20 % nimiväärtusest (st vahemikku 80–120 %; vt punktid 6, 7 ja 39), on soovitatav analüüsida vähemalt vähimat ja suurimat uuritavat kontsentratsiooni vahetult pärast valmistamist ja uuendamise ajal üks kord esimese nädala jooksul (st analüüsida tuleb proovi, mis on võetud samast lahusest – kohe pärast valmistamist ja uuendamise ajal). Hiljem tuleks nimetatud määramisi korrata vähemalt iga nädala järel.
                     Kui katsete puhul ei eeldata, et uuritava kemikaali kontsentratsioon jääb vahemikku ± 20 % nimiväärtusest, tuleb analüüsida kõiki uuritavaid kontsentratsioone vahetult pärast valmistamist ja uuendamise ajal. Kui tegemist on katsega, mille puhul esialgne mõõdetud uuritava kemikaali kontsentratsioon ei jää vahemikku ± 20 % nimiväärtusest, kuid esitatakse piisavalt tõendeid selle kohta, et esialgsed kontsentratsioonid on korratavad ja püsivad (st jäävad vahemikku 80–120 % esialgsest kontsentratsioonist), võib katse teisel ja kolmandal nädalal keemilisi määramisi siiski vähendada ja piirduda vaid suurima ja vähima uuritava kontsentratsiooni analüüsimisega. Igal juhul tuleb enne uuendamist määrata uuritava kemikaali kontsentratsioon ainult ühes paralleelkatset sisaldavas nõus iga uuritava kontsentratsiooni kohta.
                     Kui kasutatakse läbivoolukatset, on otstarbekas kasutada samasugust proovivõtukorda nagu poolstaatiliste katsete puhul kirjeldatud (kuid sellisel juhul ei ole võimalik mõõta „vanu“ lahuseid). Siiski võib olla soovitatav suurendada proovivõttude arvu esimesel nädalal (nt kolm mõõtmist), et veenduda uuritava kontsentratsiooni püsivuses. Seda tüüpi katsete puhul tuleks lahjendusvedeliku ja uuritava kemikaali voolukiirust kontrollida iga päev.
                     Kui on tõendeid selle kohta, et uuritava kemikaali kontsentratsioon on kogu katse vältel püsinud rahuldavalt vahemikus ± 20 % nimiväärtusest või esialgu mõõdetud kontsentratsioonist, võivad tulemused põhineda nimiväärtusel või esialgu mõõdetud väärtusel. Kui kõrvalekaldumine nimiväärtusest või esialgu mõõdetud kontsentratsioonist on suurem kui ± 20 %, tuleks tulemused esitada ajaga kaalutud keskmistena (vt arvutamisjuhendid, 6. liide).
                     ANDMED JA KATSEPROTOKOLLI KOOSTAMINE
                     
                        Andmete töötlemine
                     
                     Katse eesmärk on teha kindlaks uuritava kemikaali mõju sigivusele. Iga katsenõu (st iga paralleelkatse) kohta tuleb arvutada vanema kohta saadud järglaste koguarv. Lisaks võib sigivuse arvutada ellujäänud vanemalt saadud elusate järglaste arvu järgi. Ökoloogiliselt kõige asjakohasem mõju näitaja on siiski selliselt vanemalt saadud elusate järglaste üldarv, kes ei sure katse ajal juhuslikult (96) või seletamatult (97). Kui vanem sureb katse ajal juhuslikult või seletamatult või osutub isasloomaks, jäetakse see paralleelkatse analüüsist välja. Analüüsi aluseks võetakse sel juhul väiksem arv paralleelkatseid. Kui kemikaaliga kokkupuute paralleelkatsetes esineb vanemate suremust, tuleks kaaluda, kas suremuses on märgata kontsentratsiooni-toime sõltuvust, näiteks, kas esineb toime oluline regressioon, võrreldes uuritava kemikaali kontsentratsiooni positiivse tõusuga (selle määramiseks võib kasutada Cochran-Armitage'i trenditesti). Kui suremusega seoses ei esine kontsentratsiooni-toime sõltuvust, tuleb need paralleelkatsed, milles esineb vanemate suremust, katsetulemuste analüüsist välja jätta. Kui suremuses esineb kontsentratsiooni-toime sõltuvust, tuleks vanemloomade surma pidada uuritava kemikaali toimeks ja selliseid paralleelkatseid ei tohiks katsetulemuste analüüsist välja jätta.
                     Lühidalt, kui mõju väljendamiseks kasutatakse LOEC, NOEC või ECx väärtusi, on soovitatav arvutada mõju sigivusele, kasutades mõlemat eespool nimetatud sõltuvat muutujat, nimelt
                     
                                 —
                              
                              
                                 selliselt vanemalt saadud elusate järglaste üldarv, kes ei ole katse ajal surnud juhuslikult või seletamatult, ja
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 elusate järglaste arv ellujäänud vanemlooma kohta,
                              
                           ning kasutada seejärel lõpptulemusena väikseimat LOEC ja NOEC või ECx väärtust, mis on arvutatud nendest kahest sõltuvast muutujast ühe põhjal.
                     Enne statistilist analüüsi, nt ANOVA analüüsi, kokkupuutekatsete võrdlemist kontrolli katsetega Studenti t-testi, Dunnetti testi või Williamsi testi abil või sammuviisilise muutujate elimineerimise Jonckheere'i-Terpstra testi astmelise rakendamisega, soovitatakse kaaluda andmete teisendamist, kui see on vajalik konkreetse statistilise testi nõuete täitmiseks. Mitteparameetriliste alternatiividena võib kaaluda Dunni või Manni-Whitney testi kasutamist. Üksikute kontsentratsioonitasemete keskväärtuste jaoks arvutatakse 95 % usaldusvahemikud.
                     Ellujäänud vanemloomade arv kemikaaliga mõjutamata kontrolli rühmades on üks peamisi katse nõuetekohasuse kriteeriume; see tuleb dokumenteerida ja esitada katseprotokollis. Lõpparuandes tuleb esitada ka kõik muud ilmnenud kahjulikud mõjud, nagu ebaharilik käitumine ja olulised toksikoloogilised nähud.
                     
                        ECx
                     
                     ECx väärtused koos nende 95 % usaldusvahemiku ülemise ja alumise piiriga arvutatakse asjakohaste statistiliste meetoditega (nt logistiline või Weibulli funktsioon, Spearmani-Kärberi kohendatud meetod või lihtne interpolatsioon). EC10, EC50 või mõne muu ECx arvutamiseks tuleb kõiki andmeid töödelda regressioonanalüüsiga.
                     
                        Täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC) / vähim täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC)
                     
                     Kui statistilise analüüsi eesmärk on määrata täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon / vähim täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon, tuleb kasutada sobivaid statistilisi meetodeid vastavalt OECD dokumendile 54, vt „Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application“ („Praegused meetodid ökotoksilisuse andmete statistiliseks analüüsiks: rakendamissuunised“) (4). Üldiselt otsitakse andmetest uuritava kemikaali negatiivset mõju, võrreldes kontrolli rühmaga, kasutades selleks ühepoolse hüpoteesi testimist p ≤ 0,05 juures.
                     Normaaljaotuse olemasolu ja dispersiooni homogeensust võib kontrollida asjakohase statistilise testiga, nt Shapiro-Wilki testi ja Levene'i testiga (p ≤ 0,05). Võib teha ühepoolse dispersioonanalüüsi (ANOVA) ja seejärel mitmese võrdluse teste. Mitmeseid võrdlusi (nt Dunnetti test) või sammuviisilise muutujate elimineerimise trendi teste (nt Williamsi test või astmeline Jonckheere'i-Terpstra test) saab kasutada selleks, et arvutada, kas esineb olulisi erinevusi (p ≤ 0,05) kontrolli rühmade ja uuritava kemikaali eri kontsentratsioonide vahel (soovitatav test valitakse vastavalt OECD dokumendile nr 54 (4)). Teiselt poolt võib NOEC ja LOEC määramiseks kasutada mitteparameetrilisi meetodeid (nt Bonferroni U-testi vastavalt Holmi või Jonckheere'i-Terpstra trenditestile).
                     
                        Piirsisalduskatse
                     
                     Kui on tehtud piirsisalduskatse (kontrolli rühma võrdlemine ainult ühe kontsentratsiooni katserühmaga) ja parameetrilise testi eeldused (normaaljaotus, homogeensus) on täidetud, võib arvulise tulemuse analüüsimiseks kasutada Studenti t-testi. Kui need nõuded ei ole täidetud, võib kasutada ebavõrdse hajuvuse suhtes kohandatud t-testi (Welchi t-test) või mitteparameetrilist testi, näiteks Manni-Whitney U-testi.
                     Kontrolli rühmade (lahustita ja lahustiga või dispergendiga kontrolli katsete) vaheliste oluliste erinevuste kindlakstegemiseks võib kummagi kontrollirühma paralleelkatseid analüüsida piirsisalduskatse puhul kirjeldatud viisil. Kui kõnealuste testidega ei tuvastata olulisi erinevusi, võib kõikide lahustita ja lahustiga kontrolli paralleelkatsete andmed ühte koondada. Vastasel juhul tuleks kõikide katserühmade andmeid võrrelda lahustiga kontrolli katsete andmetega.
                     
                        Katseprotokoll
                     
                     Katseprotokoll peab sisaldama järgmist teavet.
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Uuritav kemikaal:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             füüsikaline olemus ja asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             keemiline iseloomustus, kaasa arvatud puhtusaste.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katseorganismi liik:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kloon (kas genotüüp on määratud), tarnija või päritolu (kui on teada) ja kasutatud kultiveerimistingimused. Kui kasutatakse muud hiidkiivriku liiki, tuleks see ära märkida ja seda põhjendada.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsetingimused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kasutatud katsemeetod (nt poolstaatiline või läbivoolukatse, ruumala, kiivrikute arv liitri kohta);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             fotoperiood ja valgustugevus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             katseplaan (nt paralleelkatsete arv, vanemate arv paralleelkatse kohta);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             andmed kasutatud söötme kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vajaduse korral kasutatud orgaanilised lisaained, sh koostis, päritolu, valmistusmeetod, põhilahuse orgaanilise süsiniku kogusisaldus / keemiline hapnikutarve, sellest tulenev söötme orgaanilise süsiniku kogusisalduse / keemilise hapnikutarbe hinnang;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             üksikasjalikud andmed söötmise kohta, sealhulgas kogus (mg C kiivriku kohta päevas) ja ajakava (nt sööda (söötade) liik, sh vetikate puhul konkreetne (liigi) nimi ja võimaluse korral ka liin, kasvatamistingimused);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             põhilahuse valmistamise meetod ja uuendamissagedus (kui kasutatakse lahustit või dispergenti, tuleks esitada selle nimi ja kontsentratsioon).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Katsetulemused:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             uuritava kemikaali stabiilsuse esialgsete uuringute tulemused;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nominaalsed uuritavad kontsentratsioonid ja kõigi analüüside tulemused, mis on tehtud katsenõudes oleva uuritava kemikaali kontsentratsiooni määramiseks (vt andmelehtede näidised, 5. liide); esitada tuleks ka meetodi tulemuslikkus ja määramispiir;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             katsenõudes oleva vee kvaliteet (st pH, temperatuur ja lahustunud hapniku sisaldus, orgaanilise süsiniku kogusisaldus ja/või keemiline hapnikutarve ja vajaduse korral vee karedus) (vt andmelehe näidis, 4. liide);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             täielikud andmed katse käigus igalt vanemalt saadud elusate järglaste kohta (vt andmelehe näidis, 4. liide);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vanemate surmajuhtude arv ja surmapäev (vt andmelehe näidis, 4. liide);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kontrolli rühma järglaste arvu variatsioonikordaja (katse lõpus elus oleva vanema kohta saadud elus järglaste koguarvu põhjal);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             graafik elusate järglaste arvu kohta igas paralleelkatses, välja arvatud emasloomad, kes on katse ajal surnud juhuslikult või seletamatult, võrreldes uuritava kemikaali kontsentratsiooniga;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             sobivas teljestikus graafik elusate järglaste üldarvu kohta igas paralleelproovis ellujäänud emaslooma kohta, võrreldes uuritava kemikaali kontsentratsiooniga;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             võimaluse korral vähim sigivusele täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC), sh kasutatud statistiliste meetodite kirjeldus ja märge selle kohta, kui suurt mõju võis eeldada (enne selle määramiseks korraldatavat katset võib teha statistilise võimsuse analüüsi), ning sigivusele täheldatavat toimet mitteavaldav kontsentratsioon (NOEC); teave selle kohta, millist sõltuvat muutujat kasutati LOEC ja NOEC väärtuste arvutamiseks (kas elusate järglaste arv emaslooma kohta, kes ei surnud juhuslikult või seletamatult, või elusate järglaste üldarv iga elusoleva emaslooma kohta); kui asjakohane, tuleb esitada ka emasloomade suremuse LOEC ja NOEC;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vajaduse korral sigivuse ECx ja usaldusvahemikud (näiteks 90 % ja 95 %) ning graafik, millele on kantud andmetega sobitatud mudel, mida kasutati selle arvutamiseks, kontsentratsiooni-reaktsiooni sõltuvuse kõvera tõus ja selle standardviga;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             muud täheldatud bioloogilised mõjud või mõõtmised; tuleb esitada andmed kõigi täheldatud või mõõdetud bioloogiliste mõjude kohta (nt vanemate kasv) koos võimalike asjakohaste põhjendustega;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             selgitused kõigi katsemeetodist kõrvalekaldumiste kohta.
                                          
                                       
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD Test Guidelines Programme. „Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test“, Sheffield University, U.K., 20.–21. märts 1993.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (1997). „Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test“. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.6. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 OECD (2008). „Validation report for an enhancement of OECD TG 211 Daphnia magna reproduction test“. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.88. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 OECD (2006). „Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application“. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment Number 54. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Baird, D.J. et al. (1991). „A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Straus“. Ecotox. Environ. Safety, 21, 257–265.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Elendt, B.-P. (1990). „Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus“. Protoplasma 154: 25–33.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 EPA (2002). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. Fifth Edition. EPA/821/R-02/012. U.S. Environmental Protection Agency, Office of Water, Washington, DC. www.epa.gov/waterscience/methods
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Vigano, L. (1991). „Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna“. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, 775–782.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 ASTM, (2008), „Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians“. In: Annual Book of ASTM Standards; Water and Environmental Technology, vol. 11.04; ASTM E729 – 96 (2007) American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Baird, D.J. et al. (1989). „The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects“. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988. (H. Løkke, H. Tyle and F. Bro-Rasmussen Eds.) pp 144–148.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Parkhurst, B.R., J.L. Forte, and G.P. Wright (1981) „Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna“. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26: 1–8.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Cowgill, U.M. and Milazzo, D.P. (1990), „The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness“, Arch. Hydrobiol., 120(2): 185-196.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 OECD (2000), „Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures“, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Sims, I.R., S. Watson and D. Holmes (1993), „Toward a standard Daphnia juvenile production test“. Environ. Toxicol. and Chem., 12, 2053–2058.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Sims, I. (1993). „Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth“. Arch. Hydrobiol., 128, 459–466.
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED
                        Käesoleva katsemeetodi puhul kasutatakse järgmisi mõisteid.
                        
                           
                              Avastamispiir
                           – vähim kontsentratsioon, mille olemasolu on võimalik määrata, kuid mille suurust ei saa kvantitatiivselt mõõta.
                        
                           
                              Ecx
                           – vees lahustatud uuritava aine kontsentratsioon, mille juures kiivrike sigivus väheneb kokkupuuteaja jooksul x %.
                        
                           
                              Juhuslik suremus
                           – suremus kemikaaliga mitte seotud juhuste tõttu (st põhjus on teada).
                        
                           
                              Järglane
                           – noor kiivrik, kes on saadud vanemloomalt katse jooksul.
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Määramispiir
                           – vähim kontsentratsioon, mille suuruse saab kvantitatiivselt mõõta.
                        
                           
                              Populatsiooni kasvu omakiirus
                           – populatsiooni kasvu määr, milles on ühendatud sigivus ja east tingitud suremus (1–3). Stabiilsetes populatsioonides on see null. Kasvavate populatsioonide puhul on see positiivne ja kahanevate populatsioonide puhul negatiivne. Kahanevad populatsioonid ei ole ilmselt jätkusuutlikud ja surevad lõpuks välja.
                        
                           
                              Seletamatu suremus
                           – kemikaaliga mitte seotud suremus, mille põhjus ei ole teada.
                        
                           
                              Sigivus
                           – vanemloomadelt katse ajal saadud elusate järglaste arv.
                        
                           
                              Suremus
                           – loom registreeritakse surnuna, kui ta ei liiguta, st ei suuda ujuda, või kui 15 sekundit pärast katsenõu ettevaatlikku loksutamist ei ole võimalik täheldada tundlate ja tagakeha liikumist. (Kui kasutatakse teistsugust määratlust, tuleb see esitada koos vajalike viidetega.)
                        
                           
                              Täheldatavat toimet mitte avaldav kontsentratsioon (NOEC)
                           – esimene LOECst väiksem uuritud kontsentratsioon, millel teatatud kokkupuuteaja jooksul ei avaldu kontrolli rühmaga võrreldes statistiliselt olulist mõju (p < 0,05 juures).
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                        
                           
                              Vanemloom
                           – katse alguses katses olnud emane kiivrik, kelle sigivuse uurimine on katse eesmärk.
                        
                           
                              Vähim täheldatavat toimet avaldav kontsentratsioon (LOEC)
                           – vähim uuritud kontsentratsioon, mille puhul ainel on teatatud kokkupuuteaja jooksul kontrolli rühmaga võrreldes statistiliselt oluline (p < 0,05 juures) mõju sigivusele ja vanemate suremusele. Kõikidel LOECst suurematel uuritavatel kontsentratsioonidel peaks avalduma kahjulik mõju, mis on võrdne või suurem kui LOECi korral täheldatav mõju. Kui neid kaht tingimust ei ole võimalik täita, tuleb esitada täielik selgitus, kuidas LOEC (ja sellest tulenevalt ka NOEC) on valitud.
                        Kirjandus
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Wilson, E.O. ja Bossert, W.H. (1971), A Primer of Population Biology. A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Poole, R.W. (1974), „An Introduction to quantitative Ecology“. McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, p 532.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Meyer, J. S., Ingersoll, C. G., McDonald, L.L. ja Boyce, M.S. (1986), „Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques“. Ecology, 67, 1156–1166.
                                 
                              
                     
                        2. liide
                        
                           TÄIELIKULT MÄÄRATLETUD ELENDTI M7 JA M4 SÖÖTMETE VALMISTAMINE
                        
                        
                           Kohanemine Elendti söötmetega M7 ja M4
                        
                        Mõnes laboris on olnud raskusi kiivrike üleviimisega otse söötmesse M4 (1) ja M7. Teatavat edu on siiski saavutatud järkjärgulise aklimatiseerimisega, st viimisega oma söötmest 30 % Elendti söödet sisaldavasse söötmesse, seejärel 60 % ja siis 100 % Elendti söödet sisaldavasse söötmesse. Kohanemisaeg võib kesta kuni kuu aega.
                        
                           Valmistamine
                        
                        
                           Mikroelemendid
                        
                        Kõigepealt valmistatakse sobiva puhtusastmega vees, nt deioniseeritud, destilleeritud või pöördosmoosi teel puhastatud vees, individuaalsete mikroelementide eraldi põhilahused (I). Nendest eri põhilahustest (I) valmistatakse üks põhilahus (II), mis sisaldab kõiki mikroelemente (kombineeritud lahus), st:
                        
                                    Põhilahused I
                                    (üks aine)
                                 
                                 
                                    Vette lisatav kogus
                                 
                                 
                                    Kontsentratsioon (söötmes M4)
                                 
                                 
                                    Kombineeritud põhilahuse II valmistamiseks lisada veele järgmine kogus põhilahust I
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    ml/l
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    M4
                                 
                                 
                                    M7
                                 
                              
                                    H3BO3
                                    
                                 
                                 
                                    57 190 
                                 
                                 
                                    20 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    MnCl2 · 4H2O
                                 
                                 
                                    7 210 -kordne
                                 
                                 
                                    20 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    LiCl
                                 
                                 
                                    6 120 
                                 
                                 
                                    20 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    RbCl
                                 
                                 
                                    1 420 
                                 
                                 
                                    20 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    SrCl2 · 6H2O
                                 
                                 
                                    3 040 
                                 
                                 
                                    20 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    NaBr
                                 
                                 
                                    320
                                 
                                 
                                    20 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    MoNa2O4 · 2H2O
                                 
                                 
                                    1 260 
                                 
                                 
                                    20 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    CuCl2 · 2H2O
                                 
                                 
                                    335
                                 
                                 
                                    20 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    ZnCl2
                                    
                                 
                                 
                                    260
                                 
                                 
                                    20 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    CoCl2 · 6H2O
                                 
                                 
                                    200
                                 
                                 
                                    20 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Kl
                                 
                                 
                                    65
                                 
                                 
                                    20 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2SeO3
                                    
                                 
                                 
                                    43,8
                                 
                                 
                                    20 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    NH4VO3
                                    
                                 
                                 
                                    11,5
                                 
                                 
                                    20 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2EDTA · 2H2O
                                 
                                 
                                    5 000 
                                 
                                 
                                    2 000 -kordne
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    —
                                 
                              
                                    FeSO4 · 7H2O
                                 
                                 
                                    1 991 
                                 
                                 
                                    2 000 -kordne
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    —
                                 
                              
                                    Nii Na2EDTA kui ka FeSO4 lahused valmistatakse eraldi, valatakse kokku ja autoklaavitakse kohe. Tulemuseks saadakse:
                                 
                              
                                    Fe-EDTA lahus
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    1 000 -kordne
                                 
                                 
                                    20,0
                                 
                                 
                                    5,0
                                 
                              
                           Söötmed M4 ja M7
                        
                        Söötmete M4 ja M7 valmistamiseks kasutatakse põhilahust II, makroelemente ja vitamiine järgmiselt:
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Vette lisatav kogus
                                 
                                 
                                    Kontsentratsioon (söötmes M4)
                                 
                                 
                                    Söötme valmistamiseks lisatud põhilahuse kogus
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    ml/l
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    M4
                                 
                                 
                                    M7
                                 
                              
                                    Põhilahus II
                                    (ühendatud mikroelemendid)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20-kordne
                                 
                                 
                                    50
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    Makrotoitainete põhilahused (üks aine)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    CaCl2 · 2H2O
                                 
                                 
                                    293 800 
                                 
                                 
                                    1 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    MgSO4 · 7H2O
                                 
                                 
                                    246 600 
                                 
                                 
                                    2 000 -kordne
                                 
                                 
                                    0,5
                                 
                                 
                                    0,5
                                 
                              
                                    KC1
                                 
                                 
                                    58 000 
                                 
                                 
                                    10 000 -kordne
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    NaHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    64 800 
                                 
                                 
                                    1 000 -kordne
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2SiO3 · 9H2O
                                 
                                 
                                    50 000 
                                 
                                 
                                    5 000 -kordne
                                 
                                 
                                    0,2
                                 
                                 
                                    0,2
                                 
                              
                                    NaNO3
                                    
                                 
                                 
                                    2 740 
                                 
                                 
                                    10 000 -kordne
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    KH2PO4
                                    
                                 
                                 
                                    1 430 
                                 
                                 
                                    10 000 -kordne
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    K2HPO4
                                    
                                 
                                 
                                    1 840 
                                 
                                 
                                    10 000 -kordne
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    Vitamiinide ühendatud põhilahus
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    10 000 -kordne
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    Vitamiinide ühendatud põhilahuse valmistamiseks lisatakse 3 vitamiini 1 liitrile veele järgmiselt:
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Tiamiinvesinikkloriid
                                 
                                 
                                    750
                                 
                                 
                                    10 000 -kordne
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Tsüanokobalamiin (B12)
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    10 000 -kordne
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Biotiin
                                 
                                 
                                    7,5
                                 
                                 
                                    10 000 -kordne
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              Vitamiinide ühendatud põhilahust säilitatakse külmutatuna väikestes alikvootides. Vitamiinid lisatakse söötmele vahetult enne kasutamist.
                        
                                    
                                       N.B.:
                                    
                                 
                                 
                                    Soolade sadestumise vältimiseks lisatakse täieliku söötme valmistamisel põhilahuste alikvoodid umbes 500–800 ml deioniseeritud veele ja seejärel lisatakse vett kuni 1 liitrini.
                                 
                              
                                    
                                       N.N.B.
                                    
                                 
                                 
                                    Esimese söödet M4 käsitleva uuringu võib leida artiklist Elendt, B.P. (1990), „Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus“. Protoplasma 154: 25–33.
                                 
                              
                     
                        3. liide
                        
                           ORGAANILISE SÜSINIKU KOGUSISALDUSE ANALÜÜS JA VETIKATEL PÕHINEVA SÖÖDA JAOKS ORGAANILISE SÜSINIKU KOGUSISALDUSE NOMOGRAMMI KOOSTAMINE
                        
                        On teada, et vetikatel põhineva sööda süsinikusisaldust ei mõõdeta tavaliselt otse, vaid asendusparameetrite mõõtmistest (nt vetikarakkude arv või valguse neelduvus) tulenevate korrelatsioonide (st nomogrammi) põhjal.
                        Orgaanilise süsiniku kogusisaldust tuleks mõõta pigem kõrgel temperatuuril toimuva oksüdatsiooni kui UV- või persulfaatmeetodiga. (Nõuanded vt: „The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands“ 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
                        Nomogrammi koostamiseks tuleks vetikad eraldada söötmest tsentrifuugimisega, millele järgneb resuspendeerimine destilleeritud vees. Asendusparameeter ja orgaanilise süsiniku kogusisaldus tuleb mõõta igas proovis kolm korda. Analüüsida tuleb destilleeritud vett sisaldavaid tühiproove ning orgaanilise süsiniku kogusisaldus määratakse saadud sisalduse lahutamisel vetikaproovi orgaanilise süsiniku kogusisaldusest.
                        Nomogramm peab nõutava süsinikusisalduse vahemikus olema lineaarne. Näited on esitatud allpool.
                        
                                    
                                       N.B.
                                    
                                 
                                 
                                    Siin esitatud nomogramme ei tohi kasutada teisendamiseks; on oluline, et iga labor koostaks oma nomogrammid ise.
                                 
                              
                           Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).
                        Seos kuivmassi (mg/l) ja orgaanilise süsiniku sisalduse (mg C/l) vahel. Andmed on saadud poolpideva partiiviisilise rakukultuuri kontsentreeritud suspensiooni kohta, pärast resuspendeerimist destilleeritud vees.
                        x-telg: kontsentreeritud vetikasööda orgaanilise süsiniku sisaldus, mg C/l.
                        y-telg: kontsentreeritud vetikasööda kuivmass, mg/l.
                        Parandustegur – 0,980
                        
                           Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).
                        Seos rakkude arvu ja orgaanilise süsiniku sisalduse (mg C/l) vahel. Andmed on saadud poolpideva partiiviisilise rakukultuuri kontsentreeritud suspensiooni kohta, pärast resuspendeerimist destilleeritud vees.
                        x-telg: kontsentreeritud vetikasööda orgaanilise süsiniku sisaldus, mg C/l.
                        y-telg: kontsentreeritud vetikasööda rakkude arv/l
                        Parandustegur – 0,926
                        
                           Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).
                        Neelduvuse ja mg C/l vaheline seos (optilise tee pikkus 1 cm). Andmed on saadud poolpideva partiiviisilise rakukultuuri kontsentreeritud suspensiooni kohta, pärast resuspendeerimist destilleeritud vees.
                        x-telg: kontsentreeritud vetikasööda orgaanilise süsiniku sisaldus, mg C/l.
                        y-telg: Määratakse kontsentreeritud vetikasööda optiline neeldumine lainepikkusel 440 nm ja lahjendusel 1/10.
                        Parandustegur – 0,998
                     
                     
                        4. liide
                        
                           NÄIDISANDMELEHT KESKKONNA UUENDAMISE, FÜÜSIKALISE/KEEMILISE SEIRE ANDMETE, SÖÖTMISE, KIIVRIKE SIGIVUSE JA TÄISKASVANUD ISENDITE SUREMUSE REGISTREERIMISEKS
                        
                        
                                    Katse nr:
                                 
                                 
                                    Alguskuupäev:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Kloon:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Sööde:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Sööda liik:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Uuritav kemikaal:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Nimikontsentratsioon:
                                 
                              
                                    Päev
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                    5
                                 
                                 
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    8
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    12
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                    15
                                 
                                 
                                    16
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    18
                                 
                                 
                                    19
                                 
                                 
                                    20
                                 
                                 
                                    21
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Söötme uuendamine (märkida „linnukesega“)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    pH (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    uus
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    vana
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    O2 (mg/l) (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    uus
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    vana
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Temp (°C) (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    uus
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    vana
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Söötmine (märkida „linnukesega“)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Elus järglaste arv (*7)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Kokku
                                 
                              
                                    Katsenõu 1
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    10
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Kokku
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Kumulatiivne vanemate suremus (*8)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                     
                        5. liide
                        
                           NÄIDISANDMELEHT KEEMILISE ANALÜÜSI TULEMUSTE REGISTREERIMISEKS
                        
                        a)   Mõõdetud kontsentratsioonid
                        
                        
                                    Nimikontsentratsioon
                                 
                                 
                                    1. nädala proov
                                 
                                 
                                    2. nädala proov
                                 
                                 
                                    3. nädala proov
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Värske
                                 
                                 
                                    Vana
                                 
                                 
                                    Värske
                                 
                                 
                                    Vana
                                 
                                 
                                    Värske
                                 
                                 
                                    Vana
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              b)   Mõõdetud kontsentratsioon protsendina nimiväärtusest
                        
                        
                                    Nimikontsentratsioon
                                 
                                 
                                    1. nädala proov
                                 
                                 
                                    2. nädala proov
                                 
                                 
                                    3. nädala proov
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Värske
                                 
                                 
                                    Vana
                                 
                                 
                                    Värske
                                 
                                 
                                    Vana
                                 
                                 
                                    Värske
                                 
                                 
                                    Vana
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                     
                        6. liide
                        
                           AJAGA KAALUTUD KESKMISE ARVUTAMINE
                        
                        
                           Ajaga kaalutud keskmine
                        
                        Arvestades, et uuritava kemikaali kontsentratsioon võib söötme uuendamiste vahel väheneda, tuleb kaaluda, milline kontsentratsioon on kiivrike emasloomade söötme esinenud kontsentratsioonide suhtes esindav. Valiku tegemisel tuleks lähtuda nii bioloogilistest kui ka statistilistest teguritest. Näiteks kui arvatakse, et sigivust mõjutab kõige enam suurim kontsentratsioon, siis tuleks kasutada maksimaalset kontsentratsiooni. Kui aga arvatakse, et olulisem on toksilise kemikaali elusorganismi kogunemisest tulenev või pikaajaline mõju, siis on otstarbekam kasutada keskmist kontsentratsiooni. Sellisel juhul on sobiv keskmisena kasutada ajaga kaalutud keskmist kontsentratsiooni, kuna selle puhul võetakse arvesse hetkekontsentratsioonide varieerumist aja jooksul.
                        
                           Joonis 1
                        
                        
                           Ajaga kaalutud keskmise näide
                        
                        Joonisel 1 on näide (lihtsustatud) katse kohta, mis kestis seitse päeva ja mille puhul vahetati söödet 0., 2. ja 4. päeval.
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Peenike sakiline joon väljendab kontsentratsiooni igal ajahetkel. Oletatakse, et kontsentratsiooni vähenemine vastab eksponentsiaalsele lagunemisprotsessile.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Kuus joonisele märgitud punkti kujutavad iga uuendamisperioodi alguses ja lõpus mõõdetud kontsentratsioone.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Jäme pidevjoon näitab ajaga kaalutud keskmise asukohta.
                                 
                              Ajaga kaalutud keskmine arvutatakse selliselt, et ajaga kaalutud keskmise joonest allapoole jääva ala pindala on võrdne kontsentratsioonikõverast allapoole jääva ala pindalaga. Eespool toodud näidet käsitlevad arvutused on esitatud tabelis 1.
                        
                           Tabel 1
                        
                        
                           Ajaga kaalutud keskmise („AK kesk“) arvutamine
                        
                        
                                    Uuendamine nr
                                 
                                 
                                    Days
                                 
                                 
                                    Conc 0
                                 
                                 
                                    Conc 1
                                 
                                 
                                    Ln (Conc 0)
                                 
                                 
                                    Ln (Conc 1)
                                 
                                 
                                    Area
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    10,000
                                 
                                 
                                    4,493
                                 
                                 
                                    2,303
                                 
                                 
                                    1,503
                                 
                                 
                                    13,767
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    11,000
                                 
                                 
                                    6,037
                                 
                                 
                                    2,398
                                 
                                 
                                    1,798
                                 
                                 
                                    16,544
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    10,000
                                 
                                 
                                    4,066
                                 
                                 
                                    2,303
                                 
                                 
                                    1,403
                                 
                                 
                                    19,781
                                 
                              
                                    Päevad kokku:
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Üldpindala:
                                 
                                 
                                    50,092
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    AK kesk:
                                 
                                 
                                    7,156
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Days tähistab uuendamisperioodi päevade arvu.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Conc 0 tähistab iga uuendamisperioodi alguses mõõdetud kontsentratsiooni.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Conc 1 tähistab iga uuendamisperioodi lõpus mõõdetud kontsentratsiooni.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Ln (Conc 0) tähistab Conc 0 naturaallogaritmi.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Ln (Conc 1) tähistab Conc 1 naturaallogaritmi.
                                 
                              
                           Area on selle ala pindala, mis igal uuendamisperioodil asub allpool eksponentsiaalset kõverat. See arvutatakse järgmise valemi kohaselt:
                        
                           
                        Ajaga kaalutud keskmine (AK kesk) on üldpindala, mis on jagatud päevade üldarvuga.
                        Kiivriku sigivuse katse puhul tuleks tabelit loomulikult pikendada selliselt, et see hõlmaks 21 päeva.
                        On selge, et kui vaatlusi tehakse ainult iga uuendamisperioodi alguses ja lõpus, ei ole võimalik kinnitada, et lagunemisprotsess on tegelikult eksponentsiaalne. Teistsuguse kõvera puhul oleks pindala (Area) arvutamine teistsugune. Eksponentsiaalse lagunemisprotsessi olemasolu ei ole siiski ebatõenäoline ning seega on seda kirjeldava kõvera kasutamine muu teabe puudumise korral kõige otstarbekam.
                        Juhul, kui keemilise analüüsiga ei leita uuendamisperioodi lõpus jälgi uuritavast kemikaalist, tuleb siiski olla ettevaatlik. Kui kemikaali lahusest kadumise kiirust ei ole võimalik hinnata, on võimatu saada kõvera alla tõelevastavat pindala ja seega ei ole võimalik saada mõistlikku ajaga kaalutud keskmist.
                     
                     
                        7. liide
                        
                           JUHISED VASTKOORUNUD KIIVRIKU SOO MÄÄRAMISEKS
                        
                        Muutuvates keskkonnatingimustes, nagu lühenev valge aeg, langev temperatuur, toidu kontsentratsiooni vähenemine ja suurenev asustustihedus võivad hakata kooruma isased noorloomad (Hobaek ja Larson, 1990; Kleiven jt, 1992). Isasloomade ilmumine on samuti üks teadaolevaid vastuseid teatavatele putukate kasvuregulaatoritele (Oda jt, 2005). Tingimustes, kus keemilised mõjurid vähendavad partenogeensete emasloomade sigivust, võiks eeldada isasloomade arvu suurenemist (OECD, 2008). Olemasoleva teabe põhjal ei ole võimalik prognoosida, milline sugude vahekorra või sigivuse näitaja on tundlikum; siiski on tõendeid (vt valideerimisaruanne, 1. osa), et see isasloomade arvu suurenemine järglaste hulgas võib olla vähem tundlik näitaja kui järglaste arvu vähenemine. Kuna katsemeetodi peamine eesmärk on hinnata saadud järglaste arvu, on isasloomade ilmumise jälgimine vabatahtlik. Kui uuringus vabatahtlikult hinnatakse seda näitajat, tuleb kasutada täiendavat katse nõuetekohasuse kriteeriumi; nimelt ei tohiks kontrolli katsetes ilmuda isasloomi üle 5 %.
                        Kõige praktilisem ja lihtsam viis kiivrike sooliseks eristamiseks on kasutada nende fenotüübilisi tunnuseid, kuna isas- ja emasloomad on geneetiliselt identsed ning nende soo määrab keskkond. Isas- ja emasloomad on erineva pikkusega ja nende esimeste tundlate välimus on erinev; isasloomadel on need pikemad kui emasloomadel (joonis 1). See erinevus on äratuntav kohe pärast koorumist, samas kui muud teisesed sugutunnused arenevad välja kiivrike täiskasvanuks saamisel (vt nt joonis 2, Olmstead ja LeBlanc, 2000).
                        Morfoloogilise soo hindamiseks tuleks iga vanema munadest koorunud vastsed võtta pipetti ja panna sellega Petri tassile, millel on katses kasutatav sööde. Söötme kogus peab olema minimaalne, et piirata loomade liikumist. Esimeste tundlate vaatlemiseks võib kasutada stereomikroskoopi (10–60).
                        
                           Joonis 1
                        
                        
                           
                              D. magna 24-tunnine isasloom (vasakul) ja emasloom (paremal). Isasloomi võib emasloomadest eristada esimeste tundlate pikkuse ja kuju järgi, nagu on osutatud ringidega (Tatarazako jt 2004).
                        
                        VIITED
                        Hobaek A. ja Larson P. 1990, „Sex determination in Daphnia magna“. Ecology 71: 2255–2268.
                        Kleiven O.T., Larsson P., Hobaek A. 1992, „Sexual reproduction in Daphnia magna requires three stimuli“. Oikos 65, 197–206.
                        Oda S., Tatarazako N, Watanabe H., Morita M. ja Iguchi T. 2005, „Production of male neonates in Daphnia magna (Cladocera, Crustacea) exposed to juvenile hormones and their analogs“. Chemosphere 61: 1168–1174.
                        OECD (2008), „Validation report for an enhancement of OECD TG 211 Daphnia magna reproduction test“. OECD Series on Testing and Assessment, Number 88. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.
                        Olmstead, A.W., LeBlanc, G.A., 2000, „Effects of endocrine-active chemicals on the development characteristics of Daphnia magna“. Environmental Toxicology and Chemistry 19: 2107–2113.
                        Tatarazako, N., Oda, S., Abe, R., Morita M. and Iguchi T., 2004, „Development of a screening method for endocrine disruptors in crustaceans using Daphnia magna (Cladocera, Crustacea)“. Environmental Science 17, 439–449.
                     “
               
                     18)
                  
                  
                     C osa peatükis C.29 asendatakse punkt 66 järgmisega:
                     
                                 „66.
                              
                              
                                 Katset peetakse nõuetekohaseks, kui:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             võrdluskemikaali sisaldavates nõudes FC on keskmine lagunemise protsent > 60 % inkubatsiooni 14. päevaks ja ning
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             kontrolli nõudes FB on anorgaanilise süsiniku kogusisalduse keskmine kogus katse lõpus < 3 mg C/l.
                                          
                                       Kui need piirmäärad ei ole täidetud, tuleks katset korrata muust allikast pärit inokulumiga ja/või kasutatud meetodid tuleks läbi vaadata. Näiteks kui probleem on rohke anorgaanilise süsiniku tekkimine kontrolli nõudes, tuleks kasutada punktides 27–32 kirjeldatud meetodit.“
                              
                           
               
                     19)
                  
                  
                     C osasse lisatakse järgmised peatükid:
                     „C.47.   Varases arengujärgus kaladele avalduva mürgisuse katse
                     
                     SISSEJUHATUS
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 210 (2013). Varases arengujärgus kaladega tehtavad katsed on ette nähtud kemikaalide surmava ja subletaalse mõju kindlakstegemiseks katses kasutatavate liikide eri arengujärgus kaladele. Nendest saadakse väärtuslikku teavet asjaomase kemikaali kroonilise, surmava ja subletaalse mõju hindamiseks ka muude kalaliikide puhul.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Katsejuhend nr 210 põhineb Ühendkuningriigi ettepanekul, mida arutati OECD ekspertide kohtumisel 1988. aasta novembris Medmenhamis (Ühendkuningriik) ja ajakohastati 2013. aastal, et võtta arvesse katse kasutuselevõtmisega saadud kogemusi ja kaladele avalduva mürgisuse katset käsitleval, 2010. aasta septembris toimunud OECD seminaril koostatud soovitusi (1).
                              
                           KATSE PÕHIMÕTE
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Varases arengujärgus kalad viiakse kokkupuutesse eri kontsentratsioonides esineva vees lahustunud uuritava kemikaaliga. Soovitatakse kasutada läbivoolutingimusi, ent kui see ei ole võimalik, on vastuvõetavad ka poolstaatilised tingimused. Sellekohaseid üksikasju tuleks vaadata OECD juhenddokumendist raskesti uuritavate ainete ja segude veekeskkonnas avalduva mürgisuse uurimise kohta (2). Katse alustamiseks pannakse viljastatud marjaterad katsekambrisse ja katset jätkatakse liigist sõltuva pikkusega ajavahemiku vältel, mis on vajalik kontrollrühma kalade jõudmiseks noorjärku. Surmavat ja subletaalset mõju võrreldakse kontrollrühma väärtustega, et teha kindlaks vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsioon ning: i) täheldatava toime puudumise kontsentratsioon ja/või ii) ECx (nt EC10, EC20); viimasel juhul kasutatakse regressioonimudelit sellise hinnangulise kontsentratsiooni leidmiseks, mille puhul mõõdetav näitaja muutub x % võrra. Konkreetsetest toime avaldumise kontsentratsioonidest ja näitajatest aru andmine võib sõltuda asjaomasest õigusraamistikust. Katses kasutatav kontsentratsioonivahemik peaks hõlmama ECx väärtust, nii et ECx leitakse interpoleerimise, mitte ekstrapoleerimise teel (mõisted on määratletud 1. liites).
                              
                           TEAVE UURITAVA KEMIKAALI KOHTA
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Uuritava kemikaali all peetakse silmas katses kasutatavat kemikaali. On vaja teada uuritava kemikaali lahustuvust vees (vt käesoleva lisa peatükk A.6) ja aururõhku (vt käesoleva lisa peatükk A.4) ning kemikaali sisalduse määramiseks katselahuses peaks olemas olema usaldusväärne analüüsimeetod, mille täpsus ja määramispiir on teada ja avaldatud. Ehkki need ei ole katse läbiviimiseks vajalikud, võivad kasulikku teavet pakkuda tulemused, mis on saadud ägeda mürgisuse hindamise katsest (vt käesoleva lisa peatükk C.1 või C.49) – soovitatavalt sellisest, kus on kasutatud siin kirjeldatud katse jaoks valitud liike.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Kui käesolevat katsemeetodit kasutatakse segu analüüsimiseks, peaks selline segu olema võimalikult hästi iseloomustatud, näiteks selle koostisainete keemilise määratluse, kvantitatiivse sisalduse ja iga koostisaine omaduste (näiteks eespool nimetatud omaduste) suhtes. Enne katsemeetodi kasutamist segu analüüsimiseks regulatiivsel eesmärgil tuleks kaaluda, kas meetodiga saadakse taotletava eesmärgi jaoks vastuvõetavad tulemused.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Asjakohane kasulik teave hõlmab aine struktuurivalemit, puhtust, lahustuvust vees, püsivust vees ja valguse käes, pKa-d, Pow-d ning kiire biolagundatavuse katse tulemusi (nt käesoleva lisa peatükk C.4 või C.29).
                              
                           KATSE NÕUETEKOHASUS
                     
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Katse vastab nõuetele, kui on täidetud järgmised tingimused:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             lahustunud hapniku kontsentratsioon peaks kogu katse vältel olema suurem kui 60 % õhu küllastuskontsentratsioonist;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vee temperatuur ei tohiks kogu katse vältel eri katsekambrites ja järjestikustel päevadel erineda rohkem kui ± 1,5 °C ning see tuleks hoida katsealuse liigi jaoks ette nähtud temperatuurivahemikus (2. liide);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             katsekontsentratsioonide analüütiline mõõtmine on kohustuslik;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             viljastatud marjaterade üldine elulemus ja koorumisjärgne edukus kontrollrühmas ja vajaduse korral ka lahustiga kontrollrühmas ei tohiks olla väiksem kui 2. liites määratletud alampiir.
                                          
                                       
                           
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Kui leitakse väikseid kõrvalekaldeid katse nõuetekohasuse kriteeriumidest, tuleks kaaluda selliste kõrvalekallete mõju katseandmete usaldusväärsusele ja esitada need kaalutlused katseprotokollis. Katseandmete usaldusväärsuse kontekstis tuleks välja tuua lahustiga kontrollrühmas täheldatav mõju elulemusele, koorumisele ja kasvule, võrrelduna negatiivse kontrolliga, ning sellise mõju üle arutleda.
                              
                           MEETODI KIRJELDUS
                     
                        Katsekambrid
                     
                     
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Võib kasutada ükskõik milliseid klaasist, roostevabast terasest või muust keemiliselt inertsest materjalist nõusid. Kuna on teada, et silikoon on võimeline tugevalt absorbeerima lipofiilseid aineid, tuleks kasutada läbivoolukatsetes võimalikult vähe silikoonvoolikuid ja minimeerida veega kokku puutuvate silikoontihendite kasutamist, näiteks liitekohtadeta klaasakvaariumi kasutamisega. Nõude mõõtmed peaksid olema piisavalt suured, et oleks tagatud nõuetekohane kasv kontrollrühmas, lahustunud hapniku sisalduse säilimine (nt väikese kalaliigi puhul piisab nõust mahuga 7 l) ja punktis 19 esitatud biomassisisalduse kriteeriumide järgimine. Katsekambrid soovitatakse paigutada katse läbiviimise alal juhuslikult. Eelistatav on selline plokkide randomiseeritud paigutus, kus igas plokis on esindatud iga kontsentratsioon; see on parem kui täielikult randomiseeritud paigutus. Katsekambrid peaksid olema kaitstud soovimatu häirimise eest. Katsesüsteemil on soovitatav enne katseorganismide sisseviimist lasta uuritava kemikaaliga eri kontsentratsioonidel piisavalt kohaneda, et veenduda kokkupuutekontsentratsioonide püsivuses.
                              
                           
                        Liigi valimine
                     
                     
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Soovitatavad kalaliigid on esitatud tabelis 1. Võib kasutada ka muid liike, kuid selleks võib olla vaja kohandada katsekorda, et luua sobivad katsetingimused. Sellisel juhul tuleb liigi ja katsemeetodi valikut põhjendada.
                              
                           
                        Sugukalade pidamine
                     
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Sugukarja kalade rahuldavates tingimustes pidamise üksikasjad on esitatud 3. liites ja viidetes 3–5.
                              
                           
                        Viljastatud marja, embrüote ja vastsete hoidmine
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Esialgu võib viljastatud marja, embrüoid ja vastseid hoida põhinõu sees väiksemates klaasist või roostevabast terasest nõudes, mille küljed või otsad on kaetud võrguga, et katselahus saaks nõust läbi voolata. Keeristeta voolu tekitamiseks läbi nende väikeste nõude võib riputada nõud hoova külge, mis võimaldab neid üles ja alla liigutada, kuid hoiab organismid kogu aeg lahuses. Lõhelaste viljastatud marjaterad võib asetada raamile või võrgule, mille avad on piisavalt suured, et vastsed pärast koorumist sealt läbi mahuksid.
                              
                           
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Kui katse põhinõus kasutatakse marjaterade hoidmiseks marjaterade anumaid, reste või võrke, tuleks need 3. liites esitatud juhendi kohaselt pärast vastsete koorumist eemaldada, välja arvatud vastsete põgenemist takistavad võrgud. Kui vastseid on vaja ümber paigutada, ei tohiks lasta neil õhuga kokku puutuda ega kasutada võrke vastsete väljatõstmiseks marjaterade anumast. Ümberpaigutamise aeg varieerub liigiti ja see tuleks märkida katseprotokolli. Ümberpaigutamine ei pruugi alati olla vajalik.
                              
                           
                        Vesi
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Katses võib kasutada sellist vett, milles katsealune liik kasvab ja milles tal on piisavalt pikk eluiga (vt 4. liide). Vesi peab olema kogu katse jooksul püsiva kvaliteediga. Selle tagamiseks, et lahjendamiseks kasutatav vesi ei mõjutaks liigselt katsetulemusi ega põhjustaks näiteks uuritava kemikaaliga komplekside moodustumist või avaldaks negatiivset mõju sugukarja jõudlusele, tuleks kindlate ajavahemike järel võtta analüüsimiseks veeproove. Kui lahjendusvesi on teadaolevalt suhteliselt püsiva kvaliteediga, tuleks raskmetallide (näiteks Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), peamiste anioonide ja katioonide (näiteks Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO4
                                    2–) ning ammoniaagi sisaldus, kloori sisaldavate pestitsiidijääkide üldsisaldus, orgaanilise süsiniku üldsisaldus ja hõljuvaine sisaldus määrata näiteks kaks korda aastas. Kui vesi on teadaolevalt varieeruva kvaliteediga, tuleb mõõtmisi teha sagedamini; nende sagedus sõltub kvaliteedi varieerumise ulatusest. Nõuetekohase lahjendusvee mõned keemilised omadused on loetletud 4. liites.
                              
                           
                        Katselahused
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Läbivoolukatsete puhul tuleb kasutada süsteemi, kus uuritava kemikaali põhilahust lisatakse ja lahjendatakse pidevalt (nt dosaatorpump, proportsionaalse lahjendamise seade, küllastusseade), et saavutada katsekambrites rida eri kontsentratsioone. Põhilahuste ja lahjendusvee voolukiirust tuleks katse jooksul kindlate ajavahemike järel kontrollida ja see ei tohiks kogu katse vältel varieeruda rohkem kui 10 %. Sobivaks peetakse voolukiirust, millega tagatakse 24 tunni jooksul lahuse vahetumine vähemalt viiekordses katsekambri mahus (3). Punktis 19 sätestatud asutustiheduse järgimise korral võib sööda kiire kõrvaldamise ärahoidmiseks siiski kasutada väiksemat voolukiirust, mille puhul lahus vahetub näiteks kahe- või kolmekordses katsekambri mahus.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Valitud kontsentratsiooniga katselahused valmistatakse põhilahuse lahjendamise teel. Põhilahuse valmistamiseks tuleks uuritavat kemikaali lahjendusvees mehaanilisel teel (nt segamine ja/või ultrahelitöötlus) soovitatavalt lihtsalt segada või loksutada. Sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse saamiseks võib kasutada küllastuskolonne (lahustuvuskolonne) või passiivse doseerimise meetodeid (6). Lahusti kasutamine ei ole soovitatav. Kui lahusti on siiski vajalik, tuleks katses paralleelselt kasutada lahustiga kontrollrühma, mille puhul lahusti kontsentratsioon on sama kui uuritava kemikaaliga rühmades, st lahusti sisaldus peaks soovitatavalt olema kemikaali iga kontsentratsiooni ja lahustiga kontrollrühma puhul sama. Mõnes lahjendussüsteemis võib seda olla tehniliselt raske saavutada; sellisel juhul peaks lahusti sisaldus lahustiga kontrollrühmas olema võrdne lahusti suurima sisaldusega uuritava kemikaaliga rühmades. Raskesti uuritavate ainete puhul tuleks tutvuda OECD juhenddokumendiga nr 23 raskesti uuritavate ainete ja segude veekeskkonnas avalduva mürgisuse uurimise kohta (2). Lahusti kasutamisel määravad lahusti valiku aine keemilised omadused. OECD juhenddokumendi nr 23 kohaselt on suurim soovitatav lahusti kontsentratsioon 100 μl/l. Et hoida ära lahusti võimalikku mõju mõõdetavatele lõppnäitajatele (7), soovitatakse kasutada võimalikult madalat lahusti kontsentratsiooni.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Poolstaatilise katse puhul võib järgida kahte eri uuendamismeetodit. Puhastesse nõudesse võib valmistada uued katselahused ning allesjäänud marjaterad ja vastsed ettevaatlikult uutesse nõudesse üle viia; teise võimalusena jäetakse katseorganismid samasse katsekambrisse ja uuendatakse osa (vähemalt kaks kolmandikku) katselahusest/kontroll-lahusest.
                              
                           KATSE KÄIK
                     
                        Kokkupuutetingimused
                     
                     
                        Kestus
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Katset tuleks alustada võimalikult kiiresti pärast marjaterade viljastamist ning viia marjaterad katselahusesse soovitatavalt enne blastodiski lõigustumise algust või võimalikult kiiresti pärast seda. Katse kestus sõltub kasutatavast liigist. Mõnel puhul soovitatav kestus on esitatud 2. liites.
                              
                           
                        Biomassisisaldus
                     
                     
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Viljastatud marjaterade arv katse alguses peaks olema statistikanõuetele vastavuse tagamiseks piisav. Marjaterad tuleks jagada katserühmadesse juhuslikkuse alusel ning iga kontsentratsiooni puhul tuleks kasutada vähemalt 80 marjatera, mis jagatakse võrdselt vähemalt nelja paralleelse katsekambri vahel. Biomassisisaldus (biomass katselahuse ruumalaühiku kohta) peaks olema piisavalt väike, et marjaterade ja vastsete staadiumis püsiks lahustunud hapniku sisaldus aereerimiseta tasemel vähemalt 60 % õhu küllastuskontsentratsioonist. Läbivoolukatsete puhul soovitatakse biomassisisaldust, mille puhul märgmass ei ole 24 tunni ja liitri lahuse kohta suurem kui 0,5 g ega ühelgi hetkel suurem kui 5 g/l (3).
                              
                           
                        Valgus ja temperatuur
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Valgustusperiood ja veetemperatuur peaksid olema katseliigile sobivad (vt 2. liide).
                              
                           
                        Söötmine
                     
                     
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Sööt ja söötmine on otsustava tähtsusega ning on oluline, et igal arenguetapil antaks sobivast ajast alates normaalse kasvu tagamiseks piisavas koguses õiget sööta. Sööda kogus peaks olema paralleelrühmades enam-vähem võrdne, kui seda ei kohandata suremuse suhtes. Sööda ülejäägid ja väljaheited tuleks vastavalt vajadusele eemaldada, et hoida ära jäätmete kogunemist. Üksikasjalikud söötmisrežiimid on esitatud 3. liites, ent sööda ja söötmisrežiimide üksikasju täpsustatakse kogemuste varal pidevalt, et elulemust suurendada ja kasvu optimeerida. Elussööt rikastab keskkonda ja seepärast tuleks seda sobiva liigi ja arengujärgu puhul alati kasutada kuivsööda ja külmutatud sööda asemel või nende täiendamiseks.
                              
                           
                        Uuritava kemikaali kontsentratsioonid
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Tavaliselt on vaja kasutada uuritavat kemikaali viiel kontsentratsioonil, mille jada konstantne tegur ei ole suurem kui 3,2, ning igal kontsentratsioonil vähemalt nelja paralleeli. Katsekontsentratsioonide vahemiku valimisel tuleks võimaluse korral arvesse võtta soovitatavalt sama liigiga läbi viidud ägeda mürgisuse hindamise katse ja/või kontsentratsioonivahemiku leidmise katse andmeid (1). Kontsentratsioonivahemiku valimisel tuleks siiski kaaluda kõikidest allikatest pärit teavet, sealhulgas näiteks kalaembrüotele avalduva ägeda mürgisuse hindamise katse ülekantavaid tulemusi. Kui nõutakse üksnes täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni empiirilist määramist, võib lõpliku katsena olla vastuvõetav piirsisalduskatse või laiendatud piirsisalduskatse, kus kasutatakse vähem kui viit kontsentratsiooni. Kui kasutatakse vähem kui viit kontsentratsiooni, tuleks seda põhjendada. Uuritavat kemikaali ei ole vaja kasutada kontsentratsioonis, mis on suurem kui 96 tunni puhul täheldatav LC50 või 10 mg/l, olenevalt sellest, kumb on väiksem.
                              
                           
                        Kontrollid
                     
                     
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Lisaks uuritava kemikaali kontsentratsioonide jadale tuleks kasutada paralleelselt ka lahjendusveega kontrolli ja vajaduse korral lahustiga kontrolli, mis sisaldab üksnes lahustit (vt punkt 16).
                              
                           
                        Analüütiliste määramiste ja mõõtmiste sagedus
                     
                     
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Enne kokkupuuteperioodi algust tuleks tagada kemikaali lisamise süsteemi nõuetekohane toimimine kõikides paralleelides (näiteks katsekontsentratsioonide mõõtmise teel). Tuleks kindlaks teha nõutavad analüüsimeetodid, sealhulgas asjakohane määramispiir ja piisav teave aine püsivuse kohta katsesüsteemis. Kokkupuute kirjeldamiseks määratakse katse vältel uuritava kemikaali kontsentratsioonid korrapäraste ajavahemike järel. Tehakse vähemalt viis määramist. Läbivoolusüsteemis tuleks uuritavat kemikaali analüütiliselt määrata vähemalt kord nädalas ühes paralleelrühmas iga kontsentratsiooni kohta ning vahetada paralleele süstemaatiliselt. Täiendavad analüütilised määramised parandavad sageli katsetulemuste kvaliteeti. Proovid võib olla vaja tahkete osakeste kõrvaldamiseks filtrida (nt läbi filtri, mille pooride läbimõõt on 0,45 μm) või tsentrifuugida, et veenduda, et kemikaali määramine toimub tõelises lahuses. Uuritava kemikaali adsorbeerumise vähendamiseks tuleks filter enne kasutamist küllastada. Kui mõõdetud kontsentratsioon ei ole vahemikus 80–120 % nominaalväärtusest, tuleks toime avaldumise kontsentratsioonide määramisel ja väljendamisel võtta läbivoolukatse puhul aluseks mõõdetud kontsentratsioonide aritmeetiline keskmine (aritmeetilise keskmise arvutamist on kirjeldatud katsemeetodi C.20 (8) 6. liites) ja poolstaatilise katse puhul kontsentratsioonide geomeetriline keskmine (vt raskesti uuritavate ainete ja segude veekeskkonnas avalduva mürgisuse uurimist käsitlev OECD juhenddokument (2), 5. peatükk).
                              
                           
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Katse vältel tuleks kõikides katsenõudes mõõta vähemalt kord nädalas lahustunud hapniku sisaldus, pH ja temperatuur ning vajaduse korral katse alguses ja lõpus soolsus ja karedus. Temperatuuri tuleks soovitatavalt jälgida pidevalt vähemalt ühes katsenõus.
                              
                           
                        Vaatlused
                     
                     26.   
                           Embrüonaalse arengu staadium
                        : embrüonaalse arengu staadium uuritava kemikaaliga kokkupuute alguses tuleks teha kindlaks nii täpselt kui võimalik. Selleks võib kasutada sobivalt säilitatud ja puhastatud representatiivset marjaterade proovi.
                     27.   
                           Koorumine ja ellujäämine
                        : koorumise ja ellujäämise vaatlust tuleks teha vähemalt kord päevas ja tulemused üles märkida. Kui varase embrüonaalse arengu ajal (nt esimesel või teisel katsepäeval) täheldatakse marjaterade pinnal seente kasvu, tuleks sellised marjaterad loendada ja eemaldada. Surnud embrüod, vastsed ja noorkalad tuleks eemaldada kohe, kui neid märgatakse, kuna need võivad kiiresti laguneda ja teised kalad võivad need tükkideks kiskuda. Surnud organismide eemaldamisel tuleks olla väga tähelepanelik, et kõrvalolevaid marjateri/vastseid füüsiliselt mitte kahjustada. Surmale viitavad märgid varieeruvad sõltuvalt liigist ja arenguetapist. Näited:
                     
                                 —
                              
                              
                                 viljastatud marjaterad: eelkõige varastes etappides märkimisväärne läbipaistvuse kadu ja värvuse muutus, mis on põhjustatud valkude koaguleerumisest ja/või sadenemisest ja mille tulemusena marjaterad muutuvad valgeks ja läbipaistmatuks;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 embrüod, vastsed ja noorkalad: liikumatus ja/või hingamisliigutuste puudumine ja/või südamelöökide puudumine ja/või võimetus reageerida mehaanilisele ärritusele.
                              
                           28.   
                           Kõrvalekalded välimuses
                        : ebanormaalse kehakujuga vastsete ja noorkalade arv tuleks registreerida piisava sagedusega, olenevalt katse kestusest ja kirjeldatavast kõrvalekaldest. Tuleks silmas pidada, et kõrvalekaldega vastseid ja noorkalu esineb looduslikult ning nende osakaal võib mõnel liigil olla kontrollrühma(de)s mitu protsenti. Kui väärarengut ja sellega seotud ebanormaalset käitumist peetakse nii tõsiseks, et see põhjustab asjaomasele organismile märkimisväärseid kannatusi ja organism ei ole võimeline sellisest seisundist enam taastuma, võib sellise organismi katsest kõrvaldada. Asjaomase looma puhul tuleks rakendada halastussurma ja seda tuleks hilisemal andmeanalüüsil käsitleda osana suremusest. Käesoleva katsemeetodi puhul soovitatavatest liikidest enamiku puhul on tavapärane embrüonaalne areng dokumenteeritud (9–12).
                     29.   
                           Kõrvalekalded käitumises
                        : käitumuslikud kõrvalekalded, näiteks hüperventileerimine, koordineerimatus ujumisel, ebatüüpiline loidus või ebaharilik toitumine tuleks katse kestusest olenevalt registreerida piisava sagedusega (nt soojaveekalade puhul kord päevas). Ehkki sellist mõju on raske kvantifitseerida, võivad kõnealused tähelepanekud aidata tõlgendada suremuse andmeid.
                     30.   
                           Kehamass
                        : katse lõpus kaalutakse kõik ellujäänud kalad vähemalt paralleelrühma tasandil (registreeritakse kalade arv paralleelrühmas ja nende keskmine mass): soovitatavalt leitakse märgmass (kalad kuivatatakse kuivatuspaberiga), ent võib registreerida ka kuivmassi (13).
                     31.   
                           Pikkus
                        : katse lõpus mõõdetakse iga kala pikkus. Soovitatavalt mõõdetakse üldpikkus, kuid sabauime mädaniku või uimede erosiooni korral võib mõõta ka standardpikkuse. Kõikide ühes katses kasutatavate kalade puhul tuleks rakendada sama meetodit. Iga kala pikkuse võib mõõta näiteks nihiku, digitaalse fotoaparaadi või kaliibritud okulaarmikromeetri abil. Tüüpilised miinimumpikkused on määratletud 2. liites.
                     ANDMED JA ARUANDLUS
                     
                        Andmete töötlemine
                     
                     
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Katseplaan ja valitud statistiline test peaksid soovitatavalt tagama piisava usaldusväärsuse (vähemalt 80 %), et võimaldada tuvastada bioloogiliselt olulisi lõppnäitaja muutusi katses, mille puhul tuleb esitada täheldatava toime puudumise kontsentratsioon. Konkreetsetest toime avaldumise kontsentratsioonidest aru andmine võib sõltuda asjaomasest õigusraamistikust. ECx esitamise vajaduse korral peaks katseplaan ja valitud regressioonimudel võimaldama hinnata ECx väärtust nii, et i) ECx puhul leitud usaldusvahemik usaldusnivool 95 % ei hõlma nulli ega ole ülemäära lai, ii) ECx-le vastava hinnangulise keskväärtuse usaldusvahemik usaldusnivool 95 % ei hõlma kontrollrühma keskväärtust ning iii) ei esine märkimisväärset lahknevust regressioonimudeli ja andmete vahel. Kummagi lähenemisviisi puhul on vaja teha kindlaks iga olulise tuvastatava või hinnatava lõppnäitaja protsentuaalne muutus. Katseplaani tuleks sellest lähtuvalt kohandada. Kui eespool esitatud tingimused ECx määramiseks ei ole täidetud, tuleks kasutada lähenemisviisi, mille puhul määratakse täheldatava toime puudumise kontsentratsioon. On vähetõenäoline, et kõikide lõppnäitajate puhul täheldatakse sama protsentuaalset muutust ning et on võimalik koostada selline katseplaan, kus kõnealused kriteeriumid on täidetud kõikide lõppnäitajate puhul; seepärast on tähtis keskenduda nõuetekohase katse kavandamisel lõppnäitajatele, mis on asjaomase katse puhul olulised. Statistilised vooskeemid ja juhendid kummagi lähenemisviisi jaoks on esitatud 5. ja 6. liites, et pakkuda juhiseid andmete töötlemiseks ja sobivaima statistilise testi või mudeli valimiseks. Võib kasutada ka muid statistilisi lähenemisviise, kui need on teaduslikult põhjendatud.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Igas paralleelide rühmas on vaja analüüsida varieeruvust dispersioonanalüüsi või sagedustabeli abil ning kasutada selle analüüsi alusel valitud asjakohaseid statistilisi analüüsimeetodeid. Igal eraldi kontsentratsioonil ja kontrollrühmas saadud tulemuste mitmeseks võrdlemiseks soovitatakse pideva tunnuse puhul kasutada muutujate sammuviisilise elimineerimisega Jonckheere'i-Terpstra või Williamsi testi ning binaarse tunnuse puhul, millel täheldatakse monotoonset kontsentratsioonist sõltuvust ja mille puhul ei esine binoomjaotuse ülehajuvust, muutujate sammuviisilise elimineerimisega Cochrani-Armitage'i testi (14). Binoomjaotuse ülehajuvuse korral soovitatakse kasutada Cochrani-Armitage'i testi Rao-Scotti modifikatsiooni (15, 16) või Williamsi või Dunnetti (nurkteisenduse järgselt) või Jonckheere'i-Terpstra testi paralleelide osakaalude suhtes. Kui andmed ei väljenda monotoonset kontsentratsioonist sõltuvust, võib pideva tunnuse puhul olla kasu Dunnetti, Dunni või Manni-Whitney meetodist ning binaarse tunnuse puhul Fisheri-Yatesi testist (14, 17, 18). Iga statistilise meetodi või mudeli kohaldamisel tuleks olla ettevaatlik ja veenduda, et asjaomasest meetodist või mudelist tulenevad nõuded on täidetud (nt kasutatava katseplaani ja testi või mudeli puhul on hinnatud ja arvesse võetud kambritevahelist varieeruvust). Andmeid hinnatakse normaaljaotuse suhtes ja 5. liites on kirjeldatud, mida tuleks teha dispersioonanalüüsil saadud hälvetega. Regressioonanalüüsiga seotud lisakaalutlused on esitatud 6. liites. Asjakohase statistilise testi nõuetele vastavuse saavutamiseks tuleks kaaluda teisendamist. Regressioonimudeli kohandamist võimaldaval teisendamisel tuleb siiski olla väga hoolikas, kuna näiteks 25 % suurune muutus teisendamata andmete puhul ei vasta 25 % suurusele muutusele teisendatud andmete puhul. Iga analüüsi puhul on analüüsitav üksus ja katseüksus katsekamber, mitte üksikud kalad, ning see peaks kajastuma nii hüpoteesi kontrollimise testides kui ka regressioonanalüüsis (3, 14, 19, 20).
                              
                           
                        Katseprotokoll
                     
                     
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Uuritav kemikaal:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         ühest koostisosast koosnev aine:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne, sealhulgas vajaduse korral orgaanilise süsiniku sisaldus;
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     võimalikult täpne omaduste kirjeldus, nt koostisosade keemiline määratlus (vt eespool), kvantitatiivne sisaldus ja asjakohased füüsikalis-keemilised omadused.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Katsealune liik:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         teaduslik nimetus, liin, päritolu ning viljastatud marjaterade kogumise ja järgneva käitlemise meetod.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Katsetingimused:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kasutatud katserežiim (nt poolstaatiline või läbivoolurežiim, biomassisisaldus);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         valgustusperiood(id);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katseplaan (nt katsekambrite ja paralleelrühmade arv, marjaterade arv paralleelrühma kohta, katsekambri materjal ja suurus (kõrgus, laius, ruumala), vee kogus katsekambri kohta);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         põhilahuste valmistamise meetod ja uuendamise sagedus (lahusti kasutamise korral tuleks esitada selle sisaldus);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritava kemikaali annustamismeetod (nt pump, lahjendussüsteem);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         meetodiga saavutatav tuvastamise tõhusus ja nominaalsed katsekontsentratsioonid, määramispiir, katsenõudes mõõdetud väärtuste keskmised ja standardhälbed ja nende arvutamise meetod ning tõendid selle kohta, et mõõtmistulemused kajastavad uuritava kemikaali sisaldust tõelises lahuses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         lahjendusvee omadused: pH, karedus, temperatuur, lahustunud hapniku sisaldus, kloorijääkide sisaldus (kui on mõõdetud), orgaanilise süsiniku üldsisaldus (kui on mõõdetud), hõljuvaine sisaldus (kui on mõõdetud), katselahuse soolsus (kui on mõõdetud) ja kõik muud mõõdetud näitajad;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vee kvaliteet katsenõudes: pH, karedus, temperatuur ja lahustunud hapniku sisaldus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         üksikasjalik teave söötmise kohta (nt sööda liik, päritolu, lisatud kogus ja söötmissagedus).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Vastavalt vajadusele iga kala kohta (või paralleelrühma tasandil) ning keskväärtuse ja variatsioonikordajana esitatavad andmed järgmiste lõppnäitajate kohta:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         tõendid selle kohta, et kontrollrühmades vastas elulemus katsealuse liigi puhul üldiselt aktsepteeritavale normile (2. liide);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         andmed suremuse kohta igas staadiumis (embrüo, vastne ja noorkala) ning kumulatiivse suremuse kohta;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         koorumiseni kulunud päevade arv, koorunud vastsete arv igal päeval ja koorumise lõppemise aeg;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         tervete kalade arv katse lõpus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ellujäänud kalade pikkuse (täpsustada, kas standardpikkus või üldpikkus) ja massi andmed;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         võimalike morfoloogiliste kõrvalekallete esinemissagedus, kirjeldus ja arv;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         võimalike käitumuslike kõrvalekallete esinemissagedus, kirjeldus ja arv;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         statistilise analüüsi puhul kasutatud lähenemisviis (regressioonanalüüs või dispersioonanalüüs) ja andmetöötlusviis (kasutatud statistiline test või mudel);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         täheldatava toime puudumise kontsentratsioon iga hinnatud näitaja puhul;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsioon (p = 0,05) iga hinnatud näitaja puhul;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vajaduse korral ECx iga hinnatud näitaja puhul koos usaldusvahemikuga (nt usaldusnivool 90 % või 95 %) ja graafik selle arvutamiseks kasutatud lähendatud kõveraga, kontsentratsioonist sõltuvuse kõvera tõus, regressioonimudeli võrrand ning mudeli hinnangulised parameetrid ja nende standardviga.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Kõik kõrvalekalded käesolevast katsemeetodist.
                                             
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Tulemuste arutelu, milles muu hulgas käsitletakse võimaliku käesolevast katsemeetodist kõrvalekaldumise mõju katsetulemustele.
                                             
                                          
                                       
                                    Tabel 1
                                 
                                 
                                    Katse jaoks soovitatavad kalaliigid
                                 
                                 
                                             MAGEVEEKALAD
                                          
                                          
                                             SUUDMEALA- ja MEREKALAD
                                          
                                       
                                             
                                                Oncorhynchus mykiss
                                             
                                             Vikerforell
                                          
                                          
                                             
                                                Cyprinodon variegatus
                                             
                                             Hammaskarp
                                          
                                       
                                             
                                                Pimephales promelas
                                             
                                             Tüse tömpnina
                                          
                                          
                                             
                                                Menidia sp.
                                             Hõbeateriin
                                          
                                       
                                             
                                                Danio rerio
                                             
                                             Vöödiline daanio
                                          
                                          
                                              
                                          
                                       
                                             
                                                Oryzias latipes
                                             
                                             Jaapani riisikala
                                          
                                          
                                              
                                          
                                       
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2012). Fish Toxicity Testing Framework. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 171. OECD, Pariis.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. OECD, Pariis.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. USA Materjalide Katsetamise Ühing, E 1241-88. 26 lk.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Brauhn, J. L., ja Schoettger, R. A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills. Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Brungs, W. A. ja Jones, B. R. (1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. Ecological Research Series, EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Adolfsson-Erici et al. (2012). A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests. Chemosphere 86: 593–599.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Hutchinson, T. H., et al. (2006). Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76: 69–92.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.20 „Hiidkiivriku (Daphnia magna) sigivuse katse“.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Hansen, D. J., ja Parrish, P. R. (1977). Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests. Väljaandes: Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (toim. Mayer, F. L., ja Hamelink, J. L.). ASTM STP 634.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Kimmel, H. B., et al. (1995). Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dynam. 203: 253–310.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Gonzalez-Doncel, M., et al (2005). A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae). J. Appl. Ichthyol. 20: 1–14.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Devlin, E. W., et al. (1996). Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USA Keskkonnakaitseamet, teadus- ja arendustegevuse büroo, Washington, D. C.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Oris, J. T., Belanger, S. C., ja Bailer, A. J. (2012). Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test. Environ. Toxicol. Chem. 31 (2): 370–376.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 54. OECD, Pariis.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Rao, J. N. K., ja Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Rao, J. N. K., ja Scott, A. J. (1999). A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data. Stat. Med. 18: 1373–1385.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Am. Stat. Assoc. 50: 1096–1121.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Rand, G. M., ja Petrocelli, S. R. (1985). Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 McClave, J. T., Sullivan, J. H., ja Pearson, J. G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Pikkus sabauime hargnemiskohani
                           – kala pikkus ninamiku tipust kui sabauime keskmiste kiirte otsani; kasutatakse kalade puhul, kelle selgroo lõppemiskohta on keeruline kindlaks teha (www.fishbase.org).
                        
                           
                              Standardpikkus
                           – kala pikkus ninamiku tipust viimase selgroolüli tagaotsani või hüpuraalplaadi külje keskosa tagaotsani. Lihtsamalt öeldes ei hõlma see pikkus sabauime pikkust (www.fishbase.org).
                        
                           
                              Üldpikkus
                           – kala pikkus ninamiku tipust sabauime pikema hõlma tipuni; tavaliselt surutakse hõlmad mõõtmiseks keskjoonele kokku. Seda pikkust mõõdetakse sirgjooneliselt, mitte keha kumeruse järgi (www.fishbase.org).
                        
                           Joonis 1
                        
                        
                           Kasutatavate eri pikkuste kirjeldus
                        
                        Standardpikkus
                        Pikkus sabauime hargnemiskohani
                        Üldpikkus
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              ECx
                               (kontsentratsioon, mille puhul mõju ulatus on x %)– kontsentratsioon, mille juures teatava kokkupuuteperioodi vältel katseorganismidele avalduva mõju ulatus on x % kontrollrühma asjaomase näitaja väärtusest. Näiteks EC50 on kontsentratsioon, mille puhul kindlaksmääratud kokkupuuteperioodi vältel avaldub kemikaali mõju katses uuritavale näitajale 50 protsendil kemikaaliga kokku puutuvast populatsioonist.
                        
                           
                              Vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsioon
                           – uuritava kemikaali väikseim kasutatud kontsentratsioon, mille puhul täheldatakse kemikaali statistiliselt olulist (p < 0,05) mõju võrdluses kontrolliga. Kemikaal peaks kõikidel kõnealusest kontsentratsioonist kõrgematel kontsentratsioonidel avaldama vähemalt sama tugevat kahjulikku mõju kui kõnealusel kontsentratsioonil. Kui nimetatud kahte tingimust ei ole võimalik täita, tuleks lisada ammendav selgitus, kuidas kõnealune kontsentratsioon (ja sellest lähtuvalt ka täheldatava toime puudumise kontsentratsioon) on valitud. Sellekohased juhised on esitatud 5. ja 6. liites.
                        
                           
                              Täheldatava toime puudumise kontsentratsioon
                           – uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille juures ei täheldata kindlaksmääratud kokkupuuteperioodi jooksul kontrolliga võrreldes statistiliselt olulist (p < 0,05) mõju ja mis on kasutatud kontsentratsioonide jadas vahetult allpool vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsiooni.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                        
                           
                              UVCB
                           – tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.
                        
                           
                              IUPAC
                           – International Union of Pure and Applied Chemistry (Rahvusvaheline Puhta Keemia ja Rakenduskeemia Liit).
                        
                           
                              SMILES
                           – Simplified Molecular Input Line Entry Specification (lihtsustatud molekulaarse sisendrea sisestamissüsteem).
                     
                     
                        2. liide
                        
                           KATSETINGIMUSED, KATSE KESTUS JA ELULEMUSKRITEERIUMID SOOVITATAVATE LIIKIDE JAOKS
                        
                        
                                    LIIK
                                 
                                 
                                    KATSETINGIMUSED
                                 
                                 
                                    SOOVITATAV KATSE KESTUS
                                 
                                 
                                    Kontrollrühma kalade tavapärane minimaalne keskmine üldpikkus katse lõpus (mm) (98)
                                    
                                 
                                 
                                    ELULEMUS KONTROLLRÜHMAS (minimaalne)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Temperatuur (°C)
                                 
                                 
                                    Soolsus (0/00)
                                 
                                 
                                    Valgustusperiood (tundides)
                                 
                                 
                                    Koorumise edukus
                                 
                                 
                                    Koorumisjärgne elulemus
                                 
                              
                                    
                                       Mageveekalad
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oncorhynchus mykiss
                                       
                                    
                                    Vikerforell
                                 
                                 
                                    10 ± 1,5 (99)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12–16 (100)
                                    
                                 
                                 
                                    2 nädalat alates hetkest, mil kontrollrühma kalad hakkavad vabalt toituma (või koorumisjärgselt 60 päeva)
                                 
                                 
                                    40
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Pimephales promelas
                                       
                                    
                                    Tüse tömpnina
                                 
                                 
                                    25 ± 1,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    16
                                 
                                 
                                    32 päeva katse algusest (või koorumisjärgselt 28 päeva)
                                 
                                 
                                    18
                                 
                                 
                                    70 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Danio rerio
                                       
                                    
                                    Vöödiline daanio
                                 
                                 
                                    26 ± 1,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12–16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    Koorumisjärgselt 30 päeva
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    70 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oryzias latipes
                                       
                                    
                                    Jaapani riisikala
                                 
                                 
                                    25 ± 2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12–16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    Koorumisjärgselt 30 päeva
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                              
                                    
                                       Suudmeala- ja merekalad
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Cyprinodon variegatus
                                       
                                    
                                    Hammaskarp
                                 
                                 
                                    25 ± 1,5
                                 
                                 
                                    15–35 (102)
                                    
                                 
                                 
                                    12–16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    32 päeva katse algusest (või koorumisjärgselt 28 päeva)
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Menidia sp.
                                    
                                    Hõbeateriin
                                 
                                 
                                    22–25
                                 
                                 
                                    15–35 (102)
                                    
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    28 päeva
                                 
                                 
                                    20
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                                 
                                    60 %
                                 
                              
                              
                     
                        3. liide
                        
                           SOOVITATAVATE LIIKIDE SUGUKALADE JA KATSEALUSTE ISENDITE SÖÖTMISE JA KÄITLEMISE JUHISED
                        
                        
                                    LIIK
                                 
                                 
                                    SÖÖT (*9)
                                    
                                 
                                 
                                    KOORUMISJÄRGSE ÜLEVIIMISE AEG
                                 
                                 
                                    ESIMESE SÖÖTMISE AEG
                                 
                              
                                    Sugukalad
                                 
                                 
                                    Äsja koorunud vastsed
                                 
                                 
                                    Noorkalad
                                 
                              
                                    Sööda liik
                                 
                                 
                                    Sagedus
                                 
                              
                                    
                                       Mageveekalad
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oncorhynchus mykiss
                                       
                                    
                                    Vikerforell
                                 
                                 
                                    Forellisööt
                                 
                                 
                                    Puudub (1)
                                    
                                 
                                 
                                    Forelli noorkalade sööt, BSN
                                 
                                 
                                    2–4 söötmiskorda päevas
                                 
                                 
                                    14–16 päeva pärast koorumist või pinnale ujumisel (ei ole vajalik)
                                 
                                 
                                    19 päeva pärast koorumist või pinnale ujumisel
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Pimephales promelas
                                       
                                    
                                    Tüse tömpnina
                                 
                                 
                                    BSN, helvessööt, FBS
                                 
                                 
                                    BSN
                                 
                                 
                                    BSN48, helvessööt
                                 
                                 
                                    2–3 korda päevas
                                 
                                 
                                    Kui koorumise määr on 90 %
                                 
                                 
                                    2 päeva pärast koorumist
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Danio rerio
                                       
                                    
                                    Vöödiline daanio
                                 
                                 
                                    BSN, helvessööt
                                 
                                 
                                    Kaubanduslik vastsesööt, algloomad (2), valk (3)
                                    
                                 
                                 
                                    BSN48, helvessööt
                                 
                                 
                                    BSN – kord päevas; helvessööt – kaks korda päevas
                                 
                                 
                                    Kui koorumise määr on 90 %
                                 
                                 
                                    2 päeva pärast koorumist
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oryzias latipes
                                       
                                    
                                    Jaapani riisikala
                                 
                                 
                                    Helvessööt
                                 
                                 
                                    BSN, helvessööt (või algloomad või keriloomad)
                                 
                                 
                                    BSN48, helvessööt (või keriloomad)
                                 
                                 
                                    BSN – kord päevas; helvessööt – kaks korda päevas või helvessööt ja keriloomad – kord päevas
                                 
                                 
                                    Ei kohaldata
                                 
                                 
                                    6–7 päeva pärast kudemist
                                 
                              
                                    
                                       Suudmeala- ja merekalad
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Cyprinodon variegatus
                                       
                                    
                                    Hammaskarp
                                 
                                 
                                    BSN, helvessööt, FBS
                                 
                                 
                                    BSN
                                 
                                 
                                    BSN48
                                 
                                 
                                    2–3 söötmiskorda päevas
                                 
                                 
                                    Ei kohaldata
                                 
                                 
                                    1 päev pärast koorumist või pinnale ujumist
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Menidia sp.
                                    
                                    Hõbeateriin
                                 
                                 
                                    BSN48, helvessööt
                                 
                                 
                                    BSN
                                 
                                 
                                    BSN48
                                 
                                 
                                    2–3 söötmiskorda päevas
                                 
                                 
                                    Ei kohaldata
                                 
                                 
                                    1 päev pärast koorumist või pinnale ujumist
                                 
                              
                              
                     
                        4. liide
                        
                           MÕNED NÕUETEKOHASE LAHJENDUSVEE KEEMILISED OMADUSED
                        
                        
                                    Koostisosa
                                 
                                 
                                    Piirsisaldus
                                 
                              
                                    Tahked osakesed
                                 
                                 
                                    5 mg/l
                                 
                              
                                    Orgaanilise süsiniku üldsisaldus
                                 
                                 
                                    2 mg/l
                                 
                              
                                    Ioniseerimata ammoniaak
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kloorijäägid
                                 
                                 
                                    10 μg/l
                                 
                              
                                    Fosfororgaaniliste pestitsiidide üldsisaldus
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüülide summaarne üldsisaldus
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Orgaanilistes ühendites sisalduva kloori üldsisaldus
                                 
                                 
                                    25 ng/l
                                 
                              
                                    Alumiinium
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Arseen
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kroom
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Koobalt
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Vask
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Raud
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Plii
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Nikkel
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Tsink
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kaadmium
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Elavhõbe
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Hõbe
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                     
                        5. liide
                        
                           STATISTIKAJUHISED TÄHELDATAVA TOIME PUUDUMISE KONTSENTRATSIOONI MÄÄRAMISEKS
                        
                        
                           Üldosa
                        
                        Analüüsiüksus on paralleelnõu. Seega tuleks pideva tunnuse, näiteks suuruse puhul arvutada paralleelrühma keskväärtus või mediaanväärtus ja kasutada analüüsimiseks seda paralleelrühma väärtust. Kasutatava testi võimsus peaks olema tõendatud, soovitatavalt igas laboris varem saadud piisavate andmete varal. Iga lõppnäitaja puhul tuleks esitada selline suurusele avalduva mõju väärtus, mida on võimalik tuvastada tõenäosusega 75–80 %, ning teave kasutatava statistilise testi kohta.
                        Soovitatava statistilise meetodi puhul saavutatav võimsus põhineb andmebaasidel, mis olid käesoleva katsemeetodi väljatöötamise ajal kättesaadavad. Igas laboris tuleks tõendada sellise nõutava võimsuse saavutamise võimekust kas laboris tehtava võimsusanalüüsi kaudu või selle kaudu, et tõendatakse, et ühegi näitaja variatsioonikordaja ei ole suurem kui katsejuhendi koostamisel kasutatud variatsioonikordajate 90. protsentiil. Kõnealused variatsioonikordajad on esitatud tabelis 1. Kui on teada üksnes paralleelrühma keskväärtus või mediaanväärtus, võib paralleelrühma sisese variatsioonikordaja kõrvale jätta.
                        
                           Tabel 1
                        
                        
                           Valitud mageveeliikide variatsioonikordajate 90. protsentiilid
                        
                        
                                    Liik
                                 
                                 
                                    Näitaja
                                 
                                 
                                    Paralleelrühmade vaheline variatsioonikordaja
                                 
                                 
                                    Paralleelrühma sisene variatsioonikordaja
                                 
                              
                                    Vikerforell
                                 
                                 
                                    Pikkus
                                 
                                 
                                    17,4
                                 
                                 
                                    9,8
                                 
                              
                                    Kehamass
                                 
                                 
                                    10,1
                                 
                                 
                                    28
                                 
                              
                                    Tüse tömpnina
                                 
                                 
                                    Pikkus
                                 
                                 
                                    16,9
                                 
                                 
                                    13,5
                                 
                              
                                    Kehamass
                                 
                                 
                                    11,7
                                 
                                 
                                    38,7
                                 
                              
                                    Vöödiline daanio
                                 
                                 
                                    Pikkus
                                 
                                 
                                    43,7
                                 
                                 
                                    11,7
                                 
                              
                                    Kehamass
                                 
                                 
                                    11,9
                                 
                                 
                                    32,8
                                 
                              Peaaegu kõikide statistiliste testide puhul, mida kasutatakse laboris tehtavate toksikoloogiliste uuringute hindamiseks, soovitakse võrrelda katserühmasid kontrollrühmaga. Seepärast ei ole asjakohane nõuda olulisuse tuvastamisel dispersioonanalüüsi F-testi kasutamist enne Dunnetti või Williamsi testi või Kruskali-Wallise testi kasutamist enne Jonckheere'i-Terpstra, Manni-Whitney või Dunni testi (Hochberg ja Tamhane, 1987; Hsu, 1996; Dunnett, 1955, 1964; Williams, 1971, 1972, 1975, 1977; Robertson et al., 1988; Jonckheere, 1954; Dunn, 1964).
                        Dunnetti test hõlmab kohandust mitmese võrdluse suhtes ning F-testi eelnev kasutamine kontrolltestina mõjutab negatiivselt Dunnetti testiga saadavate valepositiivsete ja valenegatiivsete tulemuste määra. Samamoodi säilib muutujate sammuviisilise elimineerimisega Williamsi või Jonckheere'i-Terpstra testis olulisusnivool 0,05 igas etapis valepositiivsete tulemuste üldmäär 5 % ning F-testi või Kruskali-Wallise testi eelnev kasutamine kontrolltestina mõjutab seda määra ja asjaomase testi võimsust negatiivselt. Manni-Whitney ja Dunni testi on vaja kohandada mitmese võrdluse jaoks ning selleks soovitatakse kasutada Bonferroni-Holmi kohandust.
                        Valdavat osa kõnealuste testide aluseks olevate eelduste kontrollimist ja hüpoteesi testimist käsitlevatest soovitustest on põhjalikult kirjeldatud viidatud dokumendis OECD (2006), mis sisaldab ka ulatuslikku kirjanduse loetelu.
                        
                           Kontrollrühmade andmete töötlemine lahusti kasutamise korral
                        
                        Lahusti kasutamise korral tuleks katses kasutada nii lahjendusveega kontrolli kui ka lahustiga kontrolli. Nimetatud kahte kontrollrühma tuleks iga näitaja puhul võrrelda ja kui nende vahel olulist erinevust ei tuvastata, siis nende andmed statistilise analüüsi jaoks ühte koondada. Vastasel juhul tuleks täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni määramiseks või ECx hindamiseks kasutada lahustiga kontrolli ning lahjendusveega kontroll kõrvale jätta. Tutvuge nõuetekohasuse kriteeriumidest (punkt 7) tuleneva piiranguga.
                        Pikkuse, kehamassi, koorumiseni jõudnud marjaterade osakaalu, vastsete suremuse, kõrvalekaldega vastsete osakaalu ning esimese ja viimase koorumispäeva ja pinnale ujumise päeva puhul tuleks lahjendusveega kontrolli ja lahustiga kontrolli võrdlemiseks olulisusnivool 0,05 kasutada T-testi või Manni-Whitney testi ning kõik uuritava kemikaaliga rühmad kõrvale jätta. Sellise testi tulemused tuleks esitada katseprotokollis.
                        
                           Suurust (pikkus ja kehamass) käsitlevad andmed
                        
                        Iga kala puhul mõõdetud pikkuse ja massi andmed võivad olla normaaljaotusega või lognormaalse jaotusega. Kummalgi juhul on paralleelrühmade keskväärtused üldjuhul normaaljaotusega, nagu nähtub tsentraalsest piirteoreemist ja nagu kinnitavad kolme mageveeliigi varases arengujärgus isenditega tehtud enam kui 100 uuringu andmed. Teise võimalusena võib juhul, kui katseandmed või andmebaasides olevad varasemad andmed viitavad iga kala puhul mõõdetud suuruseandmete lognormaalsele jaotusele, arvutada iga üksiku kala andmete põhjal paralleelrühma keskväärtuse logaritmi ja võtta analüüsitavateks andmeteks nende paralleelrühma keskväärtuse logaritmide antilogaritmid.
                        Tuleks hinnata andmete vastavust normaaljaotusele ja andmete hajuvuse homogeensust. Selleks tuleks kasutada sellise dispersioonanalüüsi mudeliga saadud hälbeid, milles ainus sõltumatu muutuja on kontsentratsioon. Võib kasutada hajuvusdiagrammi, tulpdiagrammi või tüvi-leht-diagrammi visuaalset hindamist. Teise võimalusena võib kasutada formaalset testi, näiteks Shapiro-Wilki või Andersoni-Darlingi testi. Hajuvuse homogeensuse hindamiseks võib kasutada hajuvusdiagrammi visuaalset analüüsi või formaalset Levene'i testi. Normaaljaotust ja hajuvuse homogeensust on vaja hinnata üksnes parameetrilise (nt Williamsi või Dunnetti) testi puhul.
                        Tuleks pöörata tähelepanu võimalikele võõrväärtustele ja nende mõjule analüüsitulemustele. Võib kasutada Tukey võõrväärtuste testi ja eespool kirjeldatud hälbediagrammide visuaalset hindamist. Tuleks silmas pidada, et vaatlused põhinevad paralleelrühmal tervikuna, mistõttu võõrväärtus tuleks analüüsist välja jätta üksnes pärast hoolikat kaalumist.
                        Katseplaani eripära ja bioloogiliste eeldustega sobivad statistilised testid on muutujate sammuviisilise elimineerimisega trenditestid, näiteks Williamsi või Jonckheere'i-Terpstra test. Nende testid eeldavad monotoonset kontsentratsioonist sõltuvust ning tuleks hinnata andmete vastavust sellele eeldusele. Seda võib teha visuaalselt hajuvusdiagrammi alusel, mis väljendab paralleelrühmade keskväärtuste sõltuvust katsekontsentratsioonidest. On kasulik kanda sellise hajuvusdiagrammi peale sirgjoon segmentidena, mis ühendavad omavahel igale kontsentratsioonile vastavaid keskväärtusi, mida on kaalutud paralleelrühma suurusega. Sellise segmentidest koosneva sirgjoone suur kõrvalekalle monotoonsusest võib osutada muu testi kui trenditesti kasutamise vajadusele. Teise võimalusena võib kasutada formaalset testi. Lihtsa formaalse testina võib arvutada igale kontsentratsioonile vastavate keskväärtuste lineaarsed ja ruutkontrastid. Kui ruutkontrast on statistiliselt oluline, ent lineaarne kontrast mitte, viitab see võimalikule monotoonsusega seotud probleemile, mida tuleks diagrammide alusel täiendavalt analüüsida. Normaaljaotuse või hajuvuse homogeensusega seotud võimalike probleemide korral võib kõnealused kontrastid leida astakteisendatud andmete põhjal. Võib kasutada muid meetodeid, näiteks Bartholomew' testi monotoonsuse suhtes, kuid need muudavad analüüsi keerukamaks.
                        
                           Joonis 2
                        
                        
                           Täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni määramise vooskeem suurust (pikkus ja kehamass) käsitlevate andmete puhul
                        
                        Täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni määramiseks kasutatakse Williamsi või Jonckheere'i-Terpstra testi astmelist rakendamist, välja arvatud juhul, kui andmed ei vasta sellise testi nõuetele. Neid meetodeid on üksikasjalikult kirjeldatud viites OECD (2006). Andmete puhul, mis ei vasta muutujate sammuviisilise elimineerimisega trenditesti nõuetele, võib kasutada Dunnetti või Tamhane'i-Dunnetti (T3) testi; kumbki neist hõlmab kohandust mitmese võrdluse võimaldamiseks. Nende testide puhul eeldatakse normaaljaotust ning Dunnetti testi puhul ka hajuvuse homogeensust. Kui need tingimused ei ole täidetud, võib kasutada Dunni mitteparameetrilist testi. Kõiki nimetatud teste on üksikasjalikult kirjeldatud viites OECD (2006). Joonisel 2 on esitatud ülevaade sellest, kuidas valida sobiv test.
                        
                           Marjaterast koorumine ja vastsete elulemus
                        
                        Analüüsitavad andmed väljendavad koorumiseni jõudnud marjaterade või ellujäänud vastsete osakaalu igas paralleelrühmas. Kõnealust osakaalu tuleks hinnata binoomjaotuse ülehajuvuse suhtes, mis on selliste mõõtmiste puhul tavaline, kuid mitte universaalne. Sobiva testi valimise juhised on esitatud joonisel 3 vooskeemina; vastav üksikasjalik kirjeldus on esitatud tekstis.
                        Tavaliselt kasutatakse kahte testi. Need on Tarone'i C(α)-test (Tarone, 1979) ja hii-ruut-test; kumbagi neist rakendatakse eraldi iga katsekontsentratsiooni puhul. Kui isegi vaid ühe katsekontsentratsiooni puhul täheldatakse binoomjaotuse ülehajuvust, tuleks kasutada meetodeid, mis võimaldavad seda arvesse võtta.
                        
                           Valem 1
                        
                        
                           Tarone'i C(α)-test (Tarone, 1979)
                        
                        
                           
                        Selles valemis on konkreetsel kontsentratsioonil saadud keskmine osakaal, m on paralleelnõude arv, nj
                            on isendite arv paralleelrühmas j ja xj
                            on selles paralleelrühmas kemikaalist mõjutatud, st koorumata jäänud või surnud isendite arv. Testi rakendatakse eraldi iga kontsentratsiooni puhul. Seda testi võib vaadelda kohandatud hii-ruut-testina, kuid testi võimsust käsitlevatest Tarone'i tehtud piiratud simulatsioonidest nähtub, et selle võimsus ületab hii-ruut-testi oma.
                        
                           Joonis 3
                        
                        
                           Täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni määramise vooskeem marjaterast koorumise ja vastsete suremuse andmete puhul
                        
                        Kui ei leita olulisi tõendeid binoomjaotuse ülehajuvuse kohta, võib kasutada muutujate sammuviisilise elimineerimisega Cochrani-Armitage'i testi. Selle testi puhul ei võeta arvesse paralleelide olemasolu, mistõttu kõnealuste tõendite esinemise korral soovitatakse kasutada Rao-Scotti kohandusega Cochrani-Armitage'i testi, mille puhul võetakse arvesse nii paralleelide olemasolu, paralleelrühmade suurust kui ka binoomjaotuse ülehajuvust. Muu võimaliku testina võib kasutada näiteks muutujate sammuviisilise elimineerimisega Williamsi või Jonckheere'i-Terpstra testi või Dunnetti testi, nagu on kirjeldatud suurust käsitlevate andmete puhul. Neid teste võib rakendada sõltumata sellest, kas binoomjaotuse ülehajuvust täheldatakse või mitte, kuid nende võimsus on mõnevõrra väiksem (Agresti, 2002; Morgan, 1992; Rao ja Scott, 1992, 1999; Fung et al., 1994, 1996).
                        
                           Esimene ja viimane koorumispäev ja pinnale ujumise päev
                        
                        Asjaomane näitaja on täisarv, mis väljendab päevade arvu katse algusest kuni konkreetses paralleelnõus asjaomase vaatluse tegemise päevani. Sellise näitaja väärtused on üldjuhul väga piiratud ulatusega ja seotud väärtuste osakaal on sageli suur, näiteks täheldatakse, et esimene koorumispäev on kõikides kontrollrühma paralleelides ja võib-olla ühel või kahel väikesel katsekontsentratsioonil sama. Selliste andmete puhul ei ole parameetriline test, näiteks Williamsi või Dunnetti test asjakohane. Kui ei ole tõendeid olulise monotoonsusest kõrvalekaldumise kohta, võib kasutada muutujate sammuviisilise elimineerimisega Jonckheere'i-Terpstra testi, mille võimsus uuritava kemikaali mõju tuvastamisel on väga suur. Muul juhul võib kasutada Dunni testi.
                        
                           Kõrvalekaldega vastsed
                        
                        Asjaomane näitaja on selliste vastsete arv, kellel leitakse mõni kõrvalekalle. Seda näitajat iseloomustab sageli madal esinemissagedus ja mõned sellega seotud probleemid on samad kui esimese koorumispäeva puhul; peale selle täheldatakse mõnikord selle näitaja korrapäratut kontsentratsioonist sõltuvust. Kui andmed väljendavad vähemalt ligikaudselt monotoonset kontsentratsioonist sõltuvust, võib kasutada muutujate sammuviisilise elimineerimisega Jonckheere'i-Terpstra testi, mille võimsus mõju tuvastamisel on suur. Muul juhul võib kasutada Dunni testi.
                        VIITED
                        Agresti, A. (2002). Categorical Data Analysis. Teine väljaanne. Wiley, Hoboken.
                        Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Am. Stat. Assoc. 50: 1096–1121.
                        Dunn, O. J. (1964). Multiple Comparisons Using Rank Sums. Technometrics 6: 241–252.
                        Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491.
                        Fung, K. Y., Krewski, D., Rao, J. N. K., ja Scott, A. J. (1994). Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data. Risk Anal. 14: 639–648.
                        Fung, K. Y., Krewski, D., ja Smythe, R. T. (1996). A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay. Can. J. Stat. 24: 431–454.
                        Hochberg, Y., ja Tamhane, A. C. (1987). Multiple Comparison Procedures. Wiley, New York.
                        Hsu, J. C. (1996). Multiple Comparisons: Theory and Methods. Chapman and Hall / CRC Press, Boca Raton.
                        Jonckheere, A. R. (1954). A distribution-free k-sample test against ordered alternatives. Biometrika 41: 133.
                        Morgan, B. J. T. (1992). Analysis of Quantal Response Data. Chapman and Hall, London.
                        OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No. 54. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.
                        Rao, J. N. K., ja Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585.
                        Rao, J. N. K., ja Scott, A. J. (1999). A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data. Stat. Med. 18: 1373–1385.
                        Robertson, T., Wright, F. T., ja Dykstra, R. L. (1988). Order restricted statistical inference. Wiley.
                        Tarone, R. E. (1979). Testing the goodness of fit of the Binomial distribution. Biometrika 66: 585–590.
                        Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.
                        Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519–531.
                        Williams D. A. (1975). The analysis of binary responses from toxicological experiments involving reproduction and teratogenicity. Biometrics 31: 949–952.
                        Williams, D. A. (1977). Some inference procedures for monotonically ordered normal means. Biometrika 64: 9–14.
                     
                     
                        6. liide
                        
                           STATISTIKAJUHISED ANDMETE HINDAMISEKS REGRESSIOONI TEEL
                        
                        
                           Üldosa
                        
                        Mudeli sobitamisel vaatlusandmetega kasutatakse paralleelrühma keskväärtust (pikkuse ja massi puhul) või osakaalu paralleelrühmas (marjaterast koorumise ja vastsete suremuse puhul) (OECD, 2006).
                        Üldjuhul on soovitatav kasutada paralleelrühma suurusega kaalutud regressioonanalüüsi. On võimalik kasutada ka muud kaalumismeetodit, näiteks kaalumist hinnangulise keskväärtusega või nii sellega kui ka paralleelrühma suurusega. Kaalumine sama kontsentratsiooniga proovide andmete hajuvuse pöördväärtusega ei ole soovitatav (Bunke et al., 1999; Seber ja Wild, 2003; Motulsky ja Christopoulos, 2004; Huet et al., 2003).
                        Analüüsile eelneval andmete teisendamisel tuleks alati säilitada vaatluste sõltumatus ning ECx ja selle usaldusvahemikku tuleks väljendada algsetes, mitte teisendatud mõõtühikutes. Näiteks ei ole pikkuse logaritmi 20 % suurune muutus sama kui pikkuse 20 % suurune muutus (Lyles et al., 2008; Draper ja Smith, 1999).
                        Joonisel 4 kujutatud vooskeem annab ülevaate ECx hindamisest. Üksikasjalik kirjeldus on esitatud allpool tekstis.
                        
                           Joonis 4
                        
                        
                           Vooskeem ECx hindamiseks paralleelrühmas täheldatava keskmise pikkuse või massi või koorumiseni jõudnud marjaterade osakaalu või vastsete suremuse puhul (üksikasjad on esitatud tekstis)
                        
                        
                           Kaalutlused marjaterast koorumise ja vastsete suremuse andmete puhul
                        
                        Marjaterast koorumise ja vastsete suremuse andmete puhul saadakse üldjuhul parim tulemus väärtuse vähenemisel põhineva mudeli sobitamisega, juhul kui ei kasutata probitmudelit, nagu on kirjeldatud allpool. See tähendab, et mudelis ei tohiks kasutada koorumata jäänud marjaterade või surnud vastsete osakaalu. Selle põhjuseks on asjaolu, et ECx väljendab kontsentratsiooni, mille juures täheldatakse x % suurust muutust kontrollrühma keskväärtusega võrreldes. Kui kontrollrühmas jääb koorumata 5 % marjateradest ja mudeliga hinnatakse koorumata jäänud marjaterade osakaalu, väljendab EC20 kontsentratsiooni, mille juures täheldatakse 20 % suurust muutust koorumata jäänud marjaterade osakaalus, mis on kontrollrühmas 5 %, see tähendab muutust väärtusega 0,2 × 0,05 = 0,01 ehk 1 protsendipunkt, mis vastab koorumata jäänud marjaterade osakaalu suurenemisele 6 protsendini. Nii väikest muutust ei ole võimalik olemasolevate andmete alusel mõistlikult hinnata ja see ei ole bioloogiliselt oluline. Kui aga mudelis kasutatakse koorumiseni jõudnud marjaterade osakaalu, on see kirjeldatud näite puhul kontrollrühmas 95 % ning selle vähenemine 20 % kontrollrühma keskväärtusega võrreldes tähendab muutust väärtusega 0,95 × 0,2 = 0,18 ehk koorumise edukuse vähenemist 95 protsendilt 77 protsendini (= 95 – 18); sellisel juhul on toime avaldumise kontsentratsiooni võimalik hinnata ja see pakub eeldatavalt suuremat huvi. Kõnealust probleemi ei teki suurust väljendavate mõõtmisandmete puhul, ehkki negatiivne mõju suurusele tähendab tavaliselt suuruse vähenemist.
                        
                           Mudelid suuruse (pikkus ja kehamass) ning marjaterast koorumise edukuse ja vastsete elulemuse hindamiseks
                        
                        Kõiki käsitletud mudeleid, välja arvatud Braini-Cousensi hormeetiline mudel, on kirjeldatud ja soovitatud viites OECD (2006). OECD mudeleid 2–5 on seoses ökotoksilisuse katsetega käsitletud ka viites Slob (2002). Loomulikult on palju muidki mudeleid, mis võivad kasulikud olla. Bunke et al. (1999) esitavad rea mudeleid, mida ei ole siin käsitletud, samuti leidub palju viiteid muudele mudelitele. Allpool loetletud mudeleid soovitatakse kui ökotoksilisuse katsete puhul iseäranis sobivaid mudeleid ning need on laialdaselt kasutusel.
                        
                           5 katsekontsentratsiooni lisaks kontrollrühmale
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Bruce'i-Versteegi mudel
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Lihtne eksponentsiaalne mudel (OECD 2)
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Kujuparameetriga eksponentsiaalne mudel (OECD 3)
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Alampiiriga lihtne eksponentsiaalne mudel (OECD 4)
                                 
                              
                           6 katsekontsentratsiooni lisaks kontrollrühmale
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Kujuparameetri ja alampiiriga eksponentsiaalne mudel (OECD 5)
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Michaelise-Menteni mudel
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Hilli mudel
                                 
                              Hormeesile viitavate visuaalsete tõendite olemasolu korral (marjaterast koorumise edukuse ja vastsete elulemuse puhul ebatõenäoline, kuid suurusega seotud vaatlusandmete puhul mõnikord täheldatav):
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Braini-Cousensi hormeetiline mudel (Brain ja Cousens, 1989).
                                 
                              
                           Alternatiivsed mudelid koorumata jäänud marjaterade osakaalu ja vastsete suremuse hindamiseks
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Nende näitajate puhul võib suurenemisel põhinevate mudelite sobitamisel kasutada probit- või logistilisi mudeleid, kui ei ole tõendeid binoomjaotuse ülehajuvuse kohta ja mudeli sobitamisel hinnatakse kontrollrühma asjaomast näitajat. See meetod ei ole eelistatud, kuna selle puhul käsitletakse analüüsiüksusena mitte paralleelnõud, vaid üksikisendit (Morgan, 1992; O'Hara Hines ja Lawless, 1993; Collett, 2002, 2003).
                                 
                              
                           Konkreetse mudeli sobivus andmetega
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Vaatlusandmete kohast ja mudelile vastavat hinnangulist protsentuaalset vähenemist igal katsekontsentratsioonil võrreldakse visuaalselt (Motulsky ja Christopoulos, 2004; Draper ja Smith, 1999).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    F-testi abil võrreldakse regressioonanalüüsi kohast vea ruutkeskmist puhta vea ruutkeskmisega (Draper ja Smith, 1999).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Veendutakse, et mudeli kõik argumendid erinevad oluliselt nullist (st tehakse kindlaks, kas mudeli kõik argumendid on olulised) (Motulsky ja Christopoulos, 2004).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Koostatakse diagramm, mis väljendab regressioonanalüüsi teel saadud hälvete sõltuvust katsekontsentratsioonist ja kus kontsentratsiooni puhul võib kasutada logaritmskaalat. Sellest diagrammist ei tohiks nähtuda mingit sõltuvust; punktid peaksid olema nullkõrgusel asuva horisontaaljoone suhtes juhuslikult hajutatud.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Andmete vastavust normaaljaotusele ja nende hajuvuse homogeensust tuleks hinnata samal viisil, nagu on kirjeldatud 5. liites.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Peale selle tuleks regressioonimudeli kohaste hälvete vastavust normaaljaotusele hinnata samade meetoditega, mida on kirjeldatud 5. liites seoses dispersioonanalüüsil saadavate hälvetega.
                                 
                              
                           Mudelite võrdlemine
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Kasutatakse Akaike informatsioonikriteeriumi (AICc). Väiksem AICc väärtus tähistab paremat sobivust ning kui AICc(B) – AICc(A) ≥ 10, siis on mudel A peaaegu kindlalt parem kui mudel B (Motulsky ja Christopoulos, 2004).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Kahte mudelit võrreldakse omavahel visuaalselt; hinnatakse, kui hästi kumbki mudel vastab eespool kirjeldatud sobivuse kriteeriumidele.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Soovitatakse rakendada parsimoonia põhimõtet, mille kohaselt kasutatakse lihtsaimat mudelit, mis sobib andmetega piisavalt hästi (Ratkowsky, 1993; Lyles et al., 2008).
                                 
                              
                           Hinnangulise ECx usaldusväärsus
                        
                        ECx usaldusvahemik ei tohiks olla liiga lai. Kasutuskõlbliku ECx usaldusvahemiku suurima laiuse üle otsustamiseks tuleb kasutada statistilist hindamist. Simulatsioonidest regressioonimudelite sobitamiseks marjaterast koorumise ja suuruse andmetega nähtub, et ECx (x = 10, 20 või 30) usaldusvahemikest umbes 75 % ei hõlma üle kahe katsekontsentratsiooni. See annab üldise ettekujutuse sellest, milline väärtus on aktsepteeritav, ning praktilise ettekujutuse sellest, mis on saavutatav. Paljud autorid kinnitavad vajadust esitada usaldusvahemik mudeli kõikide parameetrite puhul ning toonitavad, et mudeli parameetri lai usaldusvahemik viitab vastuvõetamatule mudelile (Ott ja Longnecker, 2008; Alvord ja Rossio, 1993; Motulsky ja Christopoulos, 2004; Lyles et al., 2008; Seber ja Wild, 2003; Bunke et al., 1999; Environment Canada, 2005).
                        ECx (või mudeli mõne muu parameetri) usaldusvahemik ei tohiks hõlmata nulli (Motulsky ja Christopoulos, 2004). See on regressioonanalüüsis samaväärne minimaalse olulise erinevusega, millele hüpoteesi kontrollimiseks kasutatavate lähenemisviiside puhul tihti viidatakse (nt Wang et al., 2000). Ühtlasi vastab see vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsioonil saadud keskväärtuse usaldusvahemikule, mis ei hõlma kontrollrühma keskväärtust. Tuleks hinnata, kas parameetri hinnanguline väärtus on teaduslikult usutav. Näiteks kui usaldusvahemik väärtusel y = 0 on ± 20 %, ei ole EC10 hinnanguline väärtus usutav. Kui mudeli põhjal peaks kontsentratsioonil C avalduva mõju ulatus olema 20 % ning sellel ja madalamal kontsentratsioonil täheldatav suurim mõju on 10 %, ei ole EC20 väärtus usutav (Motulsky ja Christopoulos, 2004; Wang et al., 2000; Environment Canada, 2005).
                        ECx puhul ei tohiks olla vajadust rakendada ekstrapoleerimist kasutatud kontsentratsioonide vahemikust väljapoole (Draper ja Smith, 1999; OECD, 2006). Näiteks võiks ECx väärtus olla üldjuhul kõige rohkem umbes 25 % väiksem kui madalaim katses kasutatud kontsentratsioon või umbes 25 % suurem kui kõrgeim kasutatud kontsentratsioon.
                        VIITED
                        Alvord, W. G., ja Rossio, J. L. (1993). Determining confidence limits for drug potency in immunoassay. J. Immunol. Methods 157: 155–163.
                        Brain, P., ja Cousens, R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Res. 29: 93–96.
                        Bunke, O., Droge, B., ja Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33: 197–240.
                        Collett, D. (2002). Modelling Binary Data. Teine väljaanne. Chapman and Hall, London.
                        Collett, D. (2003). Modelling Survival Data in Medical Research. Teine väljaanne. Chapman and Hall, London.
                        Draper, N. R., ja Smith, H. (1999). Applied Regression Analysis. Kolmas väljaanne. New York: John Wiley & Sons.
                        Environment Canada (2005). Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests; aruanne EPS 1/RM/46.
                        Huet, S., Bouvier, A., Poursat, M.-A., ja Jolivet, E. (2003). Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples. Springer Series in Statistics, New York.
                        Lyles, R. H., Poindexter, C., Evans, A., Brown, M., ja Cooper, C. R. (2008). Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data. Contemp. Clin. Trials 29 (6): 878–886.
                        Morgan, B. J. T. (1992). Analysis of Quantal Response Data. Chapman and Hall, London.
                        Motulsky, H., ja Christopoulos, A. (2004). Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting. Oxford University Press, USA.
                        O'Hara Hines, R. J., ja Lawless, J. F. (1993). Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time. Biometrics 49: 107–121.
                        OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No. 54. Majanduskoostöö ja Arengu Organisatsioon, Pariis.
                        Ott, R. L., ja Longnecker, M. T. (2008). An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis. Kuues väljaanne. Brooks-Cole, Belmont, CA.
                        Ratkowsky, D. A. (1993). Principles of nonlinear regression. J. Ind. Microbiol. 12: 195–199.
                        Seber, G. A. F., ja Wild, C. J. (2003). Nonlinear Regression. Wiley.
                        Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312.
                        Wang, Q., Denton, D. L., ja Shukla, R. (2000). Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program. Environ. Toxicol. Chem. 19: 113–117.
                     
                     C.48.   Lühiajaline kalade paljunemise katse
                     
                     SISSEJUHATUS
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 229 (2012). Vajadus töötada välja ja valideerida kaladega tehtav katse, millega saab välja selgitada endokriinsüsteemi mõjutavaid kemikaale, tuleneb murest, et kemikaalid võivad keskkonnas esinevas kontsentratsioonis avaldada kahjulikku mõju nii inimesele kui ka loomadele, kuna nad mõjutavad endokriinsüsteemi. OECD algatas 1998. aastal prioriteetse tegevussuunana olemasolevate juhendite läbivaatamise ja uute väljatöötamise, et selgitada sõeluuringutega välja võimalikud endokriinsüsteemi kahjustajad ja teha nendega katseid. Üks selle tegevuse eesmärk oli töötada välja katsejuhend sõeluuringu tegemiseks, et selgitada välja kalade endokriinsüsteemi mõjutavad kemikaalid. Lühiajaline kalade paljunemise katse on läbinud ulatusliku valideerimisprogrammi, mis hõlmas teatavate kemikaalide laboritevahelisi uuringuid ja millega tõendati, et katse annab asjakohaseid ja usaldusväärseid tulemusi selliste kemikaalide kindlakstegemisel, mis eri mehhanismide, sealhulgas endokriinse toime kaudu mõjutavad kalade paljunemist (1–5). Kõik OECD katsejuhendi kohased lõppnäitajad on valideeritud tüseda tömpnina puhul ning osa lõppnäitajatest on valideeritud ka Jaapani riisikala puhul (vitellogeniin ja teisesed sootunnused) ja vöödilise daanio puhul (vitellogeniin). Valideerimise on vastastikuse eksperdihinnangu korras osaliselt läbi vaadanud OECD katsejuhendite programmi riiklike koordinaatorite määratud eksperdirühm (6), samuti on selle läbi vaadanud Ameerika Ühendriikide Keskkonnakaitseameti volitatud sõltumatu eksperdirühm (29). Katse eesmärk ei ole kindlaks teha konkreetset hormonaalse häire mehhanismi, kuna katseloomadel on töökorras hüpotalamuse-ajuripatsi-sugunäärmete telg, mis võib reageerida seda telge mõjutavatele kemikaalidele eri tasanditel.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud in vivo sõeluuringus hoitakse suguküpseid isaskalu ja marja heitvaid emaskalu üheskoos ning nende elutsükli piiratud perioodi (21 päeva) jooksul kokkupuutes uuritava kemikaaliga. Kõnealuse 21-päevase kokkupuuteperioodi lõpus mõõdetakse isas- ja emaskaladel kahte bioloogilist lõppnäitajat, mille põhjal tehakse järeldused uuritava kemikaali endokriinse toime kohta; need lõppnäitajad on vitellogeniin ja teisesed sootunnused. Vitellogeniini määratakse nii tüseda tömpnina, jaapani riisikala kui ka vöödilise daanio puhul, ent teiseseid sootunnuseid mõõdetakse üksnes tüseda tömpnina ja jaapani riisikala puhul. Peale selle jälgitakse katse vältel iga päev kvantitatiivselt sigivust. Samuti säilitatakse sugunäärmed, mille histopatoloogilise analüüsi alusel saab hinnata katseloomade paljunemisvõimet ja koguda seeläbi tõendusmaterjali muudel lõppnäitajatel põhinevate järelduste toetuseks.
                              
                           
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Käesolevat bioloogilist katsemeetodit kasutatakse in vivo paljunemise sõeluuringuks ja selle rakendamist tuleks vaadelda endokriinsüsteemi kahjustavate kemikaalide kontrollimise ja hindamise OECD kontseptuaalse raamistiku (30) osana. Lühiajalist kalade paljunemise katset käsitletakse selles kontseptuaalses raamistikus 3. tasandi in vivo katsena, millest saadakse teavet teatud kindla(te) endokriinse(te) mehhanismi(de) või raja/radade kohta.
                              
                           LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Vitellogeniini sünteesitakse tavaliselt ovipaarsete selgroogsete emasloomade maksas vastuseks veres ringlevale endogeensele östrogeenile. See on munarebu valkude eelkäija ja pärast sünteesimist maksas liigub see vere kaudu munasarjadesse, kus arenevad munarakud seda seovad ja modifitseerivad. Vitellogeniin on peaaegu tuvastamatu isaskalade ja ebaküpsete emaskalade vereplasmas, kuna sellistel kaladel ei ole vereringes piisavalt östrogeeni, kuid eksogeense östrogeeniga stimuleerimise korral on nende maks võimeline vitellogeniini sünteesima ja verre eritama.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Vitellogeniini mõõtmise kaudu tehakse kindlaks kemikaalid, millel on eri viisidel avalduv östrogeenne mõju. Östrogeense mõjuga kemikaale on võimalik tuvastada vitellogeniini mõõtmisega isaskaladel ja see on eelretsenseeritud teaduskirjanduses hästi tõendatud (nt viide 7). Samuti on tõendatud, et vitellogeniini toodetakse pärast kokkupuudet aromatiseeritavate androgeenidega (8, 9). Kui emaskalade veres langeb östrogeeni tase, näiteks seepärast, et inhibeeritakse ensüüm aromataasi, mis muundab endogeense androgeeni looduslikuks östrogeeniks 17β-östradiooliks, põhjustab see vitellogeniini kontsentratsiooni vähenemise; seda kasutatakse aromataasi inhibeerivate kemikaalide tuvastamiseks (10, 11). Östrogeense mõjuga kemikaaliga või aromataasi inhibiitoriga kokkupuutele järgneva vitellogeniinitaseme muutumise bioloogiline olulisus on hästi tõendatud. Siiski on võimalik, et vitellogeniini sünteesi emaskalades võib mõjutada ka kemikaali üldine mürgisus ja muu kui endokriinse mehhanismi kaudu avalduv mürgisus, näiteks hepatotoksilisus.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Välja on töötatud ja tavakasutamiseks edukalt standarditud mitu mõõtmismeetodit. Nende hulgas on liigispetsiifilised ensüümimmuunsorptsioonanalüüsi (ELISA) meetodid, mille puhul kasutatakse immunokeemiat vitellogeniini mõõtmiseks üksikisenditelt saadud väikestes vere- või maksaproovides (12–18). Vitellogeniini mõõtmiseks võetakse tüseda tömpnina vereproov, vöödilise daanio vereproov või pea-saba homogenaat ja jaapani riisikala maks. Jaapani riisikala puhul on vitellogeniini verest ja maksast määramise tulemused omavahel heas korrelatsioonis (19). Soovitatavad proovivõtumeetodid vitellogeniini määramiseks on esitatud 6. liites. Vitellogeniini mõõtmise komplektid on laialdaselt kättesaadavad; sellised komplektid peaksid põhinema valideeritud liigispetsiifilisel ELISA meetodil.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Teatavate liikide isaskalade teisesed sootunnused on väliselt nähtavad ja mõõdetavad ning sõltuvad endogeensete androgeenide tasemest vereringes; see on nii tüseda tömpnina ja jaapani riisikala puhul, kuid mitte vöödilise daanio puhul, kellel ei ole mõõdetavaid teiseseid sootunnuseid. Emaskaladel säilib võime omandada isaskalale iseloomulikud teisesed sootunnused, kui nad puutuvad kokku vees olevate androgeensete kemikaalidega. Teaduskirjandusest võib leida mitu uuringut, milles on tõendatud tüseda tömpnina (20) ja jaapani riisikala (21) selline reageerimine androgeensetele kemikaalidele. Teiseste sootunnuste vähenemist isaskaladel tuleks tõlgendada ettevaatusega, kuna selliste andmete statistiline võimsus on väike; tõlgendamisel tuleks toetuda eksperdiarvamusele ja võtta arvesse tõendite kaalukust. Vöödilise daanio kasutamisele selles katses on piiranguid, kuna sellel kalal puuduvad mõõdetavad teisesed sootunnused, mille kaudu hinnata reaktsiooni androgeense mõjuga kemikaalidele.
                              
                           
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Tüseda tömpnina puhul on eksogeensete androgeenidega kokkupuute peamine näitaja pulmarüü köbrukeste arv emaskala ninamikul. Jaapani riisikala puhul on nn papillaarjätkete arv peamine tunnus, mis viitab emaskala kokkupuutele eksogeensete androgeensete kemikaalidega. Soovitatavad meetodid tüseda tömpnina ja jaapani riisikala sootunnuste hindamiseks on esitatud vastavalt 5A ja 5B liites.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Kõnealuse 21-päevase kaladega tehtava katse käigus hinnatakse kvantitatiivselt marja tootmist ning säilitatakse sugunäärmed, et teha neile vajaduse korral histopatoloogiline analüüs. Mõni reguleeriv asutus võib nõuda selle täiendava lõppnäitaja hindamist katseloomade paljunemisvõimest täielikuma ülevaate saamiseks või juhul, kui kokkupuude kemikaaliga ei mõjuta vitellogeniinitaset ja teiseseid sootunnuseid. Ehkki mõni lõppnäitaja (nt vitellogeniini süntees isaskalades ja köbrukeste moodustumine emaskaladel) võib olla suure diagnostilise väärtusega, ei ole muude lõppnäitajate puhul (nt sigivus ja sugunäärmete histopatoloogilise analüüsi tulemused) eesmärk teha üheselt kindlaks konkreetsed toimemehhanismid raku tasandil. Pigem võimaldavad kasutatavad lõppnäitajad koos teha järeldusi võimalike endokriinsete häirete kohta ja kavandada selle põhjal täiendavaid katseid. Ehkki sigivus ei sõltu üksnes endokriinsest toimest, on selle lõppnäitaja kasutamine oluline, kuna selle tundlikkus teadaoleva endokriinse toimega kemikaalide suhtes on tõendatud (5) ning kui mõju sellele ja muudele lõppnäitajatele puudub, võib suurema kindlusega väita, et asjaomane kemikaal ei ole tõenäoliselt endokriinselt aktiivne. Kui aga mõju sigivusele on olemas, on see kaalukas lisatõend endokriinse toime kohta. Juhised andmete tõlgendamiseks ja katsetulemuste vastuvõetavaks lugemise kohta on esitatud allpool käesoleva katsemeetodi kirjelduses.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted on määratletud 1. liites.
                              
                           KATSE PÕHIMÕTE
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Katses viiakse paljunemisvõimelised isas- ja emaskalad katsenõudes kokkupuutesse uuritava kemikaaliga. Kuna kalad on täiskasvanud ja paljunemiseas, on kumbagi sugu kerge eristada; seega on võimalik iga lõppnäitaja määramisel sugu arvesse võtta ning on tagatud kalade tundlikkus eksogeensete kemikaalide suhtes. Katse lõpus määratakse kala sugu sugunäärmete makroskoopilise vaatlusega pärast seda, kui kõht on kääridega lahti lõigatud. Vastavate biokatse tingimuste ülevaade on esitatud 2. liites. Katset alustatakse tavaliselt kaladega, kes on võetud kudemisvalmis populatsioonist; vanu kalu ei tohiks kasutada. Juhised seoses kalade vanuse ja paljunemisvõimega on esitatud kalade valimist käsitlevas jaotises. Katses kasutatakse kemikaali kolmes kokkupuutekontsentratsioonis ning veega kontrollrühma ja vajaduse korral ka lahustiga kontrollrühma. Vöödilise daanio puhul kasutatakse iga kontsentratsioonipunkti kohta paralleelselt kahte nõud, millest kummaski on 5 isaskala ja 5 emaskala. Tüseda tömpnina puhul kasutatakse iga kontsentratsioonipunkti kohta paralleelselt nelja nõud, igas nõus 2 isaskala ja 4 emaskala. Sellega võetakse arvesse isase tüseda tömpnina territoriaalset käitumist, kuid säilitatakse samal ajal katse piisav statistiline võimsus. Jaapani riisikala puhul kasutatakse iga kontsentratsioonipunkti kohta paralleelselt nelja nõud, igas nõus 3 isaskala ja 3 emaskala. Kalu hoitakse kemikaaliga kokkupuutes 21 päeva ja kalade proovid võetakse kokkupuute 21. päeval. Sigivust hinnatakse iga päev kvantitatiivselt.
                              
                           
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Proovivõtmisel 21. päeval surmatakse kõik kalad humaanselt. Tüseda tömpnina ja jaapani riisikala puhul mõõdetakse teisesed sootunnused (vt 5A ja 5B liide); vöödiliselt daaniolt ja tüsedalt tömpninalt võetakse vereproovid vitellogeniini määramiseks; vöödiliselt daaniolt võib selle asemel koguda vitellogeniini määramiseks pea ja saba (6. liide); jaapani riisikalalt võetakse vitellogeniini määramiseks maks (6. liide); sugunäärmed fikseeritakse koos terve organismiga või eraldi, et neid vajaduse korral histopatoloogiliselt analüüsida (22).
                              
                           KATSE NÕUETEKOHASUSE KRITEERIUMID
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Katsetulemused on nõuetekohased, kui on täidetud järgmised tingimused:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             suremus veega (või lahustiga) kontrollrühmas ei tohiks kokkupuuteperioodi lõpuks olla suurem kui 10 %;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             lahustunud hapniku kontsentratsioon peaks kogu kokkupuuteperioodi jooksul olema vähemalt 60 % õhu küllastuskontsentratsioonist;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vee temperatuur ei tohiks kogu kokkupuuteperioodi jooksul katsenõudes erineda rohkem kui ± 1,5 °C ja see tuleks hoida vahemikus ± 2 °C katsealuse liigi puhul ette nähtud temperatuurist (2. liide);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tuleks esitada tõendid selle kohta, et uuritava kemikaali kontsentratsiooni lahuses on suudetud hoida rahuldavalt vahemikus ± 20 % mõõtmistulemuste keskväärtusest;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tuleks esitada tõendid selle kohta, et kalad koevad katse vältel enne kemikaaliga kokkupuudet aktiivselt kõikides paralleelnõudes, sealhulgas kontrollrühmas.
                                          
                                       
                           MEETODI KIRJELDUS
                     
                        Seadmed
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Tavapärased laboriseadmed, eeskätt järgmised seadmed:
                                 
                                             a.
                                          
                                          
                                             hapnikumõõtur ja pH-meeter;
                                          
                                       
                                             b.
                                          
                                          
                                             seadmed vee kareduse ja leelisuse määramiseks;
                                          
                                       
                                             c.
                                          
                                          
                                             asjakohased temperatuuri reguleerimise ja soovitatavalt selle pideva jälgimise seadmed;
                                          
                                       
                                             d.
                                          
                                          
                                             soovitatava biomassisisalduse ja asustustiheduse jaoks piisava suurusega keemiliselt inertsest materjalist mahutid (vt 2. liide);
                                          
                                       
                                             e.
                                          
                                          
                                             tüseda tömpnina ja vöödilise daanio kudemissubstraat; vajalikud üksikasjad on esitatud 4. liites;
                                          
                                       
                                             f.
                                          
                                          
                                             sobiva täpsusega kaal (st täpsusega ± 0,5 mg).
                                          
                                       
                           
                        Vesi
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Katses võib kasutada sellist vett, milles katsealune liik kasvab ja milles tal on piisavalt pikk eluiga. Vesi peab olema kogu katse jooksul püsiva kvaliteediga. Vee pH peaks olema vahemikus 6,5–8,5, kuid ei tohiks ühe katse jooksul muutuda rohkem kui ± 0,5 pH-ühikut. Selle tagamiseks, et lahjendusvesi ei mõjutaks liigselt katsetulemusi (näiteks põhjustades uuritava kemikaali komplekseerumise), tuleks kindlate ajavahemike järel võtta analüüsimiseks veeproov. Kui lahjendusvesi on teadaolevalt suhteliselt püsiva kvaliteediga, tuleks raskmetallide (näiteks Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ja Ni), peamiste anioonide ja katioonide (näiteks Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– ja SO4
                                    2–) ning pestitsiidide sisaldus (näiteks fosfororgaaniliste ja kloororgaaniliste pestitsiidide üldsisaldus), orgaanilise süsiniku üldsisaldus ja hõljuvaine sisaldus määrata näiteks iga kolme kuu järel. Kui on tõendatud, et vee kvaliteet on vähemalt ühe aasta jooksul püsiv, võib sellist määramist teha harvem (näiteks iga kuue kuu järel). Lahjendusvee mõned nõutavad keemilised omadused on esitatud 3. liites.
                              
                           
                        Katselahused
                     
                     
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Valitud kontsentratsiooniga katselahused valmistatakse põhilahuse lahjendamise teel. Põhilahus tuleks soovitatavalt valmistada lihtsalt uuritava kemikaali segamise või loksutamisega lahjendusvees; selleks tuleks kasutada mehaanilist töötlust (nt segamist või ultraheli). Sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse saamiseks võib kasutada küllastuskolonne (lahustuvuskolonne). Lahusti kasutamine ei ole soovitatav. Kui lahusti on siiski vajalik, tuleks katses paralleelselt kasutada lahustiga kontrolli, milles lahusti kontsentratsioon on sama kui uuritava kemikaaliga nõudes. Raskesti uuritava kemikaali puhul võib lahusti olla tehniliselt parim lahendus; sel juhul tuleks tutvuda OECD juhenddokumendiga (23) raskesti uuritavate ainete ja segude veekeskkonnas avalduva mürgisuse uurimise kohta. Lahusti valiku määravad aine või segu keemilised omadused. OECD juhenddokumendis soovitatakse kontsentratsiooni kuni 100 μl/l, millest tuleks kinni pidada. Ühes hiljutises ülevaates (24) on aga esile tõstetud täiendavad probleemid, mis tekivad, kui endokriinse toime uurimisel kasutatakse lahustit. Seepärast soovitatakse, et kui lahusti on vajalik, peaks selle kontsentratsioon olema tehnilisest teostatavusest lähtuvalt minimaalne (sõltuvalt uuritava kemikaali füüsikalis-keemilistest omadustest).
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Katses kasutatakse läbivoolusüsteemi. Sellises süsteemis lisatakse ja lahjendatakse uuritava kemikaali põhilahust pidevalt (nt dosaatorpumba, proportsionaalse lahjendamise seadme või küllastamissüsteemiga), et tekitada katsekambrites rida eri kontsentratsioone. Põhilahuste ja lahjendusvee voolukiirust tuleks kontrollida katse jooksul kindlate ajavahemike järel, soovitatavalt iga päev, ja see ei tohiks kogu katse vältel varieeruda rohkem kui 10 %. Tuleks hoiduda kasutamast ebakvaliteetseid plasttorusid või muid materjale, mis võivad sisaldada bioloogiliselt aktiivseid kemikaale. Materjali valimisel läbivoolusüsteemi jaoks tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali võimalikku adsorbeerumist.
                              
                           
                        Kalade pidamine
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Katsealused kalad tuleks valida ühest laboripopulatsioonist, soovitatavalt samast parvest, mida on vähemalt kahe nädala vältel enne katset kohandatud selliste veekvaliteedi ja valgustustingimustega, mis sarnanevad katses kasutatavatele tingimustele. On oluline, et biomassisisaldus ja asustustihedus (mõisted on määratletud 1. liites) oleksid katses kasutatavale liigile sobivad (vt 2. liide).
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Pärast 48-tunnist harjumisperioodi registreeritakse surmajuhtumid ja kohaldatakse järgmisi kriteeriume:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kui suremus on populatsioonis seitsme päeva jooksul suurem kui 10 %, jäetakse kogu partii kõrvale;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kui suremus populatsioonis on 5–10 %, lastakse kaladel kohaneda veel seitse päeva; kui kõnealuse järgmise seitsme päeva jooksul on suremus suurem kui 5 %, jäetakse kogu partii kõrvale;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kui suremus populatsioonis on seitsme päeva jooksul väiksem kui 5 %, loetakse partii vastuvõetavaks.
                                          
                                       
                           
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Kohanemise ajal, kokkupuutele eelneval perioodil ja kokkupuute ajal ei tohiks kaladel haigusi ravida.
                              
                           
                        Kokkupuute-eelne periood ja kalade valimine
                     
                     
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Soovitatakse kasutada ühe kuni kahe nädala pikkust kokkupuute-eelset perioodi, mille vältel kalad on paigutatud tegelikus katses kasutatavatega sarnastesse nõudesse. Kalu tuleks sööta kogu pidamisperioodi ja kokkupuuteperioodi vältel ad libitum. Kokkupuuteperioodi tuleks alustada eristatavate sootunnustega kummastki soost täiskasvanud kaladega (nt nende teisesed sootunnused peaksid olema tüseda tömpnina ja jaapani riisikala puhul selgelt nähtavad), kes pärinevad labori suguküpsete kalade varudest ja koevad aktiivselt. Üksnes üldise ettekujutuse loomiseks tuleb öelda (ja seejuures ei tohi jätta arvestamata konkreetse kalapartii tegelikku paljunemisvõimet), et tüseda tömpnina vanus peaks olema ligikaudu 20 (± 2) nädalat eeldusel, et neid kalu on kogu nende elu jooksul peetud temperatuuril 25 ± 2 °C. Jaapani riisikala vanus peaks olema ligikaudu 16 (± 2) nädalat eeldusel, et neid kalu on kogu nende elu jooksul peetud temperatuuril 25 ± 2 °C. Vöödilise daanio vanus peaks olema ligikaudu 16 (± 2) nädalat eeldusel, et neid kalu on kogu nende elu jooksul peetud temperatuuril 26 ± 2 °C. Kokkupuute-eelsel perioodil tuleks marja tootmist hinnata iga päev. Soovitatavalt peaks kudemine olema enne kokkupuuteperioodi algust täheldatav kõikides paralleelnõudes. Siinkohal ei ole võimalik esitada soovitatavat marjaterade arvu päevas, kuid iga kõnealuse liigi puhul on üsna tavaline, et emaskala kohta koetakse päevas keskmiselt üle 10 marjatera. Et tagada paralleelnõude tasakaalustatud jaotus eri katsekontsentratsioonide vahel, tuleks kasutada sellist plokkide randomiseeritud paigutust, mille aluseks on marja tootmise tase.
                              
                           KATSEPLAAN
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Katses kasutatakse uuritavat kemikaali kolmes kontsentratsioonis, ühte (veega) kontrollrühma ja vajaduse korral ühte lahustiga kontrollrühma. Andmeid võib analüüsida, et teha kindlaks statistiliselt olulised erinevused kemikaaliga kokku puutunud rühma ja kontrollrühma näitajate vahel. Kõnealusest analüüsist ilmneb, kas uuritava kemikaaliga saadud andmeid võib kasutada riskihindamisel või oleks vaja teha täiendav pikemaajaline katse kemikaali kahjuliku mõju (st elulemusele, arengule, kasvule ja paljunemisele avalduv mõju) väljaselgitamiseks (25).
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Vöödilise daanio puhul võetakse katse 21. päeval isas- ja emaskalad igale kontsentratsioonile vastavast rühmast (5 isas- ja 5 emaskala kummastki paralleelnõust) ja kontrollrühma(de)st, et mõõta vitellogeniini tase. Jaapani riisikala puhul võetakse katse 21. päeval isas- ja emaskalad igale kontsentratsioonile vastavast rühmast (3 isas- ja 3 emaskala igast paralleelnõust, mida on kokku neli) ja kontrollrühma(de)st, et mõõta vitellogeniini tase ja teisesed sootunnused. Tüseda tömpnina puhul võetakse kokkupuute 21. päeval isas- ja emaskalad igale kontsentratsioonile vastavast rühmast (2 isas- ja 4 emaskala igast paralleelnõust, mida on kokku neli) ja kontrollrühma(de)st, et mõõta vitellogeniini tase ja teisesed sootunnused. Tuleb hinnata kvantitatiivselt sigivust ning sugunäärmed tuleks koos terve organismiga või eraldi fikseerida, et neid saaks vajaduse korral histopatoloogiliselt hinnata.
                              
                           
                        Katsekontsentratsioonide valimine
                     
                     
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Käesoleva katsemeetodi puhul peaks suurim katsekontsentratsioon olema maksimaalne talutav kontsentratsioon, mis tehakse kindlaks kontsentratsioonivahemiku leidmise katsega või muude mürgisuse andmete põhjal, 10 mg/l või vees lahustuvuse piirkontsentratsioon, olenevalt sellest, milline neist on väikseim. Uuritava kemikaali maksimaalne talutav kontsentratsioon on suurim kontsentratsioon, mille puhul suremus on väiksem kui 10 %. Sellise lähenemisviisi puhul eeldatakse, et on olemas empiirilised andmed ägeda mürgisuse kohta või muud mürgisuse andmed, mille põhjal saab tuletada maksimaalse talutava kontsentratsiooni. Sellise kontsentratsiooni hindamine võib olla ebatäpne ja nõuab tavaliselt erialateadmisi.
                              
                           
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Katses tuleb kasutada kolme kontsentratsiooni, mille jada konstantne tegur ei ole suurem kui 10, ning lahjendusveega kontrolli (ja vajaduse korral ka lahustiga kontrolli). Kontsentratsioonide jada teguri puhul soovitatav vahemik on 3,2–10.
                              
                           KATSE KÄIK
                     
                        Katsealuste kalade valimine ja kaalumine
                     
                     
                              
                                 26.
                              
                              
                                 On tähtis tagada, et kalade kehamassi erinevused katse alguses oleksid minimaalsed. Käesolevas katsemeetodis eri liikide puhul soovitatavad suurusevahemikud on esitatud 2. liites. Katses kasutatavas kalade partiis peaks kõikide isas- ja emaskalade kehamass jääma katse alguses võimaluse korral vahemikku ± 20 % samasooliste kalade massi aritmeetilisest keskmisest. Soovitatav on kaaluda enne katset samast kalade populatsioonist osaproov, et leida hinnanguline keskmine kehamass.
                              
                           
                        Kokkupuutetingimused
                     
                     
                        Kestus
                     
                     
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Katse algab kokkupuute-eelse perioodi lõppemisel ja kestab 21 päeva. Soovitatav kokkupuute-eelne periood on üks kuni kaks nädalat.
                              
                           
                        Söötmine
                     
                     
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Kalu tuleks sööta sobiva söödaga (2. liide) ad libitum ja piisavalt tihti, et tagada nende organismi hea seisund. Tuleb kanda hoolt mikroobide kasvu ja vee hägustumise ärahoidmise eest. Üldreeglina võib päevaratsiooni jagada kaheks või kolmeks võrdseks osaks ja sööta kalu mitu korda päevas vähemalt kolmetunniste vaheaegadega. Suurem ühekordne söödakogus on samuti lubatav, eelkõige nädalalõpul. Kalu ei tohiks sööta 12 tunni jooksul enne proovivõtmist/lahkamist.
                              
                           
                              
                                 29.
                              
                              
                                 Kalasööda kohta peaks olema teada saasteainete, näiteks kloororgaaniliste pestitsiidide, polütsükliliste aromaatsete süsivesinike ja polüklooritud bifenüülide sisaldus. Suure fütoöstrogeenisisaldusega sööta, mis maskeeriks kalade reaktsiooni teadaolevale östrogeeni agonistile (nt 17β-östradiool), ei tohiks kasutada.
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 Sööda ülejäägid ja väljaheited tuleks eemaldada katsenõudest vähemalt kaks korda nädalas, näiteks iga nõu põhja ettevaatliku puhastamisega sifooni abil.
                              
                           
                        Valgus ja temperatuur
                     
                     
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Valgustusperiood ja veetemperatuur peaksid olema katseliigile sobivad (vt 2. liide).
                              
                           
                        Analüütiliste määramiste ja mõõtmiste sagedus
                     
                     
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Enne kokkupuuteperioodi algust tuleks tagada kemikaali lisamise süsteemi nõuetekohane toimimine. Tuleks kindlaks teha kõik vajalikud analüüsimeetodid, sealhulgas peaks olema piisavalt teavet uuritava kemikaali püsivuse kohta katsesüsteemis. Katse ajal määratakse uuritava kemikaali kontsentratsioonid korrapäraste ajavahemike järel järgmiselt: lahjendusvee ja kemikaali põhilahuse voolukiirust tuleks katse jooksul kontrollida soovitatavalt iga päev, kuid vähemalt kaks korda nädalas, ja see ei tohiks kogu katse vältel varieeruda rohkem kui 10 %. Uuritava kemikaali tegelik kontsentratsioon soovitatakse määrata kõikides nõudes katse alguses ja seejärel nädalaste vaheaegadega.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Tulemused peaksid soovitatavalt põhinema mõõdetud kontsentratsioonidel. Kui uuritava kemikaali kontsentratsiooni lahuses on suudetud kogu katse jooksul säilitada rahuldavalt vahemikus ± 20 % nominaalsest kontsentratsioonist, võivad tulemused põhineda kas nominaalsetel või mõõdetud väärtustel.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Proove võib olla vaja filtrida (nt läbi 0,45 μm suuruste pooridega filtri) või tsentrifuugida. Sellise vajaduse korral tuleks eelistada tsentrifuugimist. Kui uuritav aine ei adsorbeeru filtril, võib siiski olla vastuvõetav ka filtrimine.
                              
                           
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Katse ajal mõõdetakse lahustunud hapniku sisaldust, temperatuuri ja pH-d kõigis katsenõudes vähemalt kord nädalas. Üldkaredust ja leelisust tuleks mõõta kontrollnõudes ja ühes kemikaali suurima kontsentratsiooniga katsenõus vähemalt kord nädalas. Temperatuuri tuleks soovitatavalt jälgida pidevalt vähemalt ühes katsenõus.
                              
                           
                        Vaatlused
                     
                     
                              
                                 36.
                              
                              
                                 Katse käigus või katse lõpus hinnatakse mitut üldist näitajat (nt elulemus) ja bioloogilist näitajat (nt vitellogeniini tase). Sigivust on vaja hinnata kvantitatiivselt iga päev. Allpool on kirjeldatud nende lõppnäitajate mõõtmist ja hindamist ning nende kasulikkust.
                              
                           
                        Elulemus
                     
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Kalad tuleks katseperioodi jooksul iga päev üle vaadata; kõik surmajuhtumid tuleks registreerida ja surnud kalad võimalikult kiiresti eemaldada. Surnud kalu ei tohiks asendada ei kontrollnõudes ega ka kemikaaliga nõudes. Katse kestel surnud kalade sugu tuleks määrata sugunäärmete makroskoopilise hindamise teel.
                              
                           
                        Käitumine ja välimus
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Igasugune ebatavaline käitumine (võrreldes kontrollrühmaga) tuleks registreerida; see võib hõlmata üldise mürgisuse ilminguid, sealhulgas hingeldamist, koordineerimata ujumist, tasakaalu kaotamist ja ebatüüpilist liikumatust või söömist. Lisaks tuleks registreerida välised anomaaliad (näiteks veritsus, värvimuutus). Selliseid mürgisuse nähte tuleks andmete tõlgendamisel hoolikalt kaaluda, kuna need võivad ilmneda kemikaali sellisel kontsentratsioonil, mille juures endokriinse toime biomarkerid ei ole usaldusväärsed. Kõnealune käitumise vaatlemine võib samuti anda kasulikku kvalitatiivset teavet selle kohta, milliseid nõudeid tuleks kaladega tehtavate katsete puhul edaspidi kohaldada. Näiteks on tüseda tömpnina puhul täheldatud normaalsetel isaskaladel ja maskuliniseerunud emaskaladel androgeense kemikaaliga kokkupuute tagajärjel territooriumiga seotud agressiivsust; vöödilise daanio puhul on tavaline paaritumis- ja kudemiskäitumine koidikul pärast valgeks minemist östrogeense või antiandrogeense kemikaaliga kokkupuute tagajärjel takistatud või ilmneb vähem.
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Kuna mõned välistunnused (eelkõige värvus) võivad kala käsitsemise käigus kiiresti muutuda, on oluline registreerida kvalitatiivsed tähelepanekud enne kalade katsesüsteemist eemaldamist. Tüseda tömpninaga saadud seniste kogemuste kohaselt võivad mõned endokriinse toimega kemikaalid esialgu tekitada muutusi järgmistes välistes tunnustes: keha värvus (hele või tume), värvimuster (vertikaalsete vöötide olemasolu) ja kehakuju (pea ja rinnaosa). Seepärast tuleks kogu katse jooksul ja katse lõpus vaadelda kalade füüsilist välimust.
                              
                           
                        Sigivus
                     
                     
                              
                                 40.
                              
                              
                                 Kudemist käsitlevad igapäevased vaatlusandmed tuleks registreerida paralleelrühma tasandil. Marja tootmise andmete puhul tuleks paralleelrühma tasandil registreerida marjaterade arv elus emaskala kohta päevas. Marjaterad eemaldatakse iga päev katsekambrist. Tüseda tömpnina ja vöödilise daanio puhul tuleks paigutada katsekambrisse kudemissubstraat, et kalad saaksid kudeda tavapärastes tingimustes. Soovitatavaid kudemissubstraate on üksikasjalikumalt kirjeldatud 4. liites (vöödilise daanio puhul 4A liites ja tüseda tömpnina puhul 4B liites). Jaapani riisikala puhul ei peeta kudemissubstraadi lisamist vajalikuks.
                              
                           
                        Kalade humaanne surmamine
                     
                     
                              
                                 41.
                              
                              
                                 Kalad tuleks 21. päeval, st kemikaaliga kokkupuute lõpetamisel humaanselt surmata vajaliku koguse trikaiiniga (trikaiinmetaansulfonaat, metakaiin, MS-222 (CASi nr 886-86-2), 100–500 mg/l), mis on limaskesta ärrituse vähendamiseks puhverdatud NaHCO3-ga (naatriumvesinikkarbonaat (CASi nr 144-55-8), 300 mg/l); seejärel võetakse vere- või koeproov vitellogeniini määramiseks, nagu on selgitatud jaotises „Vitellogeniin“.
                              
                           
                        Teiseste sootunnuste vaatlemine
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Mõned endokriinse toimega kemikaalid võivad põhjustada muutusi spetsiifilistes teisestes sootunnustes (pulmarüü köbrukeste arv isasel tüsedal tömpninal, papillaarjätkete arv isasel jaapani riisikalal). Teatava toimemehhanismiga kemikaalid võivad põhjustada teiseste sootunnuste ebanormaalset ilmumist vastassoost isenditel; näiteks võivad sellised androgeeniretseptori agonistid nagu trenboloon, metüültestosteroon ja dihüdrotestosteroon põhjustada silmapaistvate pulmarüü köbrukeste tekkimise emasel tüsedal tömpninal või papillaarjätkete väljaarenemise emasel jaapani riisikalal (11, 20, 21). Samuti on leitud, et östrogeeniretseptori agonistid võivad vähendada täiskasvanud isase tüseda tömpnina pulmarüü köbrukeste arvu ja turjapadjandi suurust (26, 27). Sellised üldised morfoloogilised vaatlused võivad samuti anda kasulikku kvalitatiivset ja kvantitatiivset teavet selle kohta, milliseid nõudeid tuleks kaladega tehtavate katsete puhul edaspidi järgida. Tüseda tömpnina pulmarüü köbrukeste ning jaapani riisikala papillaarjätkete arvu ja suurust saab mõõta kas otse või fikseeritud isenditel; viimane variant on mugavam. Tüseda tömpnina ja jaapani riisikala teiseste sootunnuste hindamise soovitatav kord on esitatud vastavalt 5A ja 5B liites.
                              
                           
                        Vitellogeniin
                     
                     
                              
                                 43.
                              
                              
                                 Veri võetakse sabaarterist või -veenist hematokriti määramiseks ette nähtud hepariniseeritud mikrokapillaartoruga või teise võimalusena süstla abil tehtava südamepunktsiooniga. Sõltuvalt kala suurusest on kogutava vere kogus tüseda tömpnina isendi puhul üldiselt vahemikus 5–60 μl ja vöödilise daanio isendi puhul 5–15 μl. Plasma eraldatakse verest tsentrifuugimisega ja seda hoitakse koos proteaasiinhibiitoritega – 80 °C juures kuni vitellogeniini määramiseni. Teise võimalusena kasutatakse vitellogeniini määramiseks kudede allikana jaapani riisikala maksa või vöödilise daanio pea-saba homogenaati (6. liide). Vitellogeniin tuleks määrata valideeritud homoloogse ELISA meetodiga, kasutades homoloogset vitellogeniini standardit ja homoloogseid antikehi. Soovitatav on kasutada meetodit, millega on võimalik tuvastada vitellogeniini nii väikeses koguses kui mõni nanogramm plasma milliliitri (või koe milligrammi) kohta, mis on taustsisaldus isaskalas, kes ei ole kemikaaliga kokku puutunud.
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Vitellogeniini määramise kvaliteedi kontrollimiseks kasutatakse standardeid ja negatiivseid kontrolle ning tehakse vähemalt kaks paralleelmõõtmist. Iga ELISA meetodi puhul tuleks teha maatriksiefekti (proovi lahjendamise mõju) hindamise katse, et määrata proovi minimaalne lahjendustegur. Iga ELISA plaat, mida kasutatakse vitellogeniini määramiseks, peaks sisaldama järgmisi kvaliteedikontrolli proove: vähemalt 6 kaliibrimisstandardit, mille kontsentratsioonivahemik hõlmab vitellogeniini kontsentratsiooni eeldatavat vahemikku, ja vähemalt üks negatiivne kontroll mittespetsiifilise seondumise hindamiseks (kaks paralleelproovi). Nende negatiivsete kontrollide puhul peaks neeldumine olema väiksem kui 5 % kaliibrimisstandardi puhul täheldatavast maksimaalsest neeldumisest. Igast proovi lahjendusest analüüsitakse vähemalt kahte alikvooti (paralleelkannudes). Kui tulemused paralleelkannudes erinevad rohkem kui 20 %, tuleks teha kordusanalüüs.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 Kaliibrimiskõvera korrelatsioonikordaja (R2) peaks olema suurem kui 0,99. Hea korrelatsioon ei ole siiski piisav, et tagada ennustatavate väärtuste õigsus kõigis kontsentratsioonivahemikes. Lisaks kaliibrimiskõvera piisavalt heale korrelatsioonile peab ka standardi iga kontsentratsioon, mis arvutatakse kaliibrimiskõvera põhjal, jääma vahemikku 70–120 % vastavast nominaalsest kontsentratsioonist. Kui nominaalsed kontsentratsioonid kalduvad kaliibrimise regressioonisirgest eemale (nt madalatel kontsentratsioonidel), võib olla vajalik jagada kaliibrimiskõver madalale ja kõrgele kontsentratsioonile vastavateks osadeks või kasutada neeldumisandmetele lähendamiseks mittelineaarset mudelit, mis neid õigesti kirjeldaks. Kui sirge jagatakse kaheks osaks, peaks kummaski osas olema R2 > 0,99.
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Avastamispiir on määratletud kui madalaim analüüsistandardi kontsentratsioon ning määramispiir on määratletud kui madalaim analüüsistandardi kontsentratsioon, mis on korrutatud väikseima lahjendusteguriga.
                              
                           
                              
                                 47.
                              
                              
                                 Igal vitellogeniini määramise päeval analüüsitakse ka rikastatud proovi, mis on valmistatud eri katsetes kasutatava võrdlusstandardiga (7. liide). Selle standardi eeldatava kontsentratsiooni ja mõõdetud kontsentratsiooni suhtarv esitatakse koos samal päeval tehtud määramiste tulemustega.
                              
                           
                        Sugunäärmete histopatoloogiline hindamine
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Reguleerivad asutused võivad nõuda sugunäärmete kui hüpotalamuse-ajuripatsi-sugunäärmete teljel paikneva sihtorgani histopatoloogilist hindamist pärast kokkupuudet kemikaaliga. Sel põhjusel fikseeritakse sugunäärmed koos terve organismiga või eraldi. Kui histopatoloogiline analüüs on nõutav, vaadeldakse uuritava kemikaali endokriinse toime hindamisel spetsiifilist endokriinsüsteemiga seotud mõju sugunäärmetele. Kõnealuste diagnostiliste näitajatena tuleb muu hulgas hinnata munarakkude esinemist seemnesarjas, Leydigi rakkude hüperplaasiat, rebutootmise vähenemist, spermatogoonide arvu suurenemist ja perifollikulaarset hüperplaasiat. Muudel sugunäärmete kahjustustel, näiteks munarakkude atreesial, seemnesarja taandarengul ja sugurakkude arenguga seotud muutustel võib olla mitu tekkepõhjust. Kalade sugunäärmete histopatoloogilist analüüsi käsitlevas juhenddokumendis on sätestatud kord, mida tuleb järgida sugunäärmete eraldamisel, fikseerimisel, koelõikude valmistamisel ja histopatoloogilisel hindamisel (22).
                              
                           ANDMED JA ARUANDLUS
                     
                        Biomarkerite põhjal mõju hindamine dispersioonanalüüsiga
                     
                     
                              
                                 49.
                              
                              
                                 Kemikaali võimaliku endokriinse toime tuvastamiseks võrreldakse kemikaaliga rühmades saadud näitajaid kontrollrühmade vastavate näitajatega; selleks kasutatakse dispersioonanalüüsi. Lahustiga kontrolli kasutamise korral tuleks iga lõppnäitaja puhul teha asjakohane statistiline test lahjendusveega kontrolli ja lahustiga kontrolli võrdlemiseks. Juhised lahjendusveega kontrolli ja lahustiga kontrolli andmete kasutamise kohta edasises statistilises analüüsis on esitatud viites OECD (2006c) (28). Kõikide bioloogiliste näitajate andmeid tuleks analüüsida ja need esitada kummagi soo puhul eraldi. Kui parameetriliste meetodite vajalikud eeldused ei ole täidetud – tegemist on normaaljaotusest erineva jaotusega (nt Shapiro-Wilki test) või heterogeense hajuvusega (Bartletti test või Levene'i test) –, tuleks kaaluda andmete teisendamist, et muuta hajuvus enne dispersioonanalüüsi tegemist homogeenseks, või kaalutud dispersioonanalüüsi kasutamist. Kui toime sõltuvus kontsentratsioonist ei ole monotoonne, võib kasutada Dunnetti testi (parameetriline) mitmeseks paariviisiliseks võrdlemiseks või Manni-Whitney testi Bonferroni parandusega (mitteparameetriline). Kui toime sõltuvus kontsentratsioonist on ligikaudu monotoonne, võib kasutada muid statistilisi teste (nt Jonckheere'i-Terpstra või Williamsi test). Sobivaima statistilise testi leidmist hõlbustav statistilise analüüsi valimise vooskeem on esitatud 8. liites. Täiendav teave on kättesaadav ka OECD dokumendis, milles käsitletakse praegusi meetodeid ökotoksilisuse andmete statistiliseks analüüsiks (28).
                              
                           
                        Katsetulemuste esitamine
                     
                     
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Uuringu andmed peavad hõlmama järgmist.
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Uurimislabor:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vastutavad töötajad ja nende kohustused uuringus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         iga labori pädevus peaks olema mitmesuguste representatiivsete kemikaalide kasutamise kaudu tõendatud.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Uuritav kemikaal:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritava kemikaali iseloomustus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         füüsikalised ja asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katses kasutatud kontsentratsiooniga lahuste valmistamise meetod ja sagedus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         teave püsivuse ja biolagundatavuse kohta.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Lahusti:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         lahusti iseloomustus (kirjeldus, kasutatud kontsentratsioon);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         lahusti valimise põhjendus (kui see on muu kui vesi).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Katseloomad:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         liik ja liin;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         tarnija ja tema konkreetne käitis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kalade vanus katse alguses ja nende paljunemisvõime/kudemisseisund;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kalade kohandamise meetodi üksikasjad;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kalade kehamass kemikaaliga kokkupuute alguses (kalaparvest võetud osaproovi põhjal).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Katsetingimused:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kasutatud katsemeetod (katse tüüp, biomassisisaldus, asustustihedus jne);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         põhilahuse valmistamise meetod ja voolukiirus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         nominaalsed katsekontsentratsioonid, igal nädalal mõõdetud katselahuste kontsentratsioonid ja kasutatud analüüsimeetod, katsenõudes mõõdetud väärtuste keskmised ja nende standardhälbed ning tõendid selle kohta, et mõõtmistulemused kajastavad uuritava kemikaali sisaldust tõelises lahuses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         lahjendusvee omadused (pH, karedus, leelisus, temperatuur, lahustunud hapniku sisaldus, kloorijääkide sisaldus, orgaanilise süsiniku üldsisaldus, hõljuvaine sisaldus ja kõik muud mõõdetud näitajad);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vee kvaliteet katsenõudes: pH, karedus, temperatuur ja lahustunud hapniku sisaldus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         üksikasjalik teave söötmise kohta (nt sööda liik, päritolu, lisatud kogus ja söötmissagedus ning asjakohaste saasteainete (nt polüklooritud bifenüülid, polütsüklilised aromaatsed süsivesinikud ja kloororgaanilised pestitsiidid) määramise korral sellise analüüsi tulemused).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Tulemused:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         tõendid selle kohta, et kontrollid vastasid nõuetekohasuse kriteeriumidele;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         andmed suremuse kohta iga katsekontsentratsiooni ja kontrolli puhul;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kasutatud statistilise analüüsi meetodid, teave andmete töötlemise kohta ja selleks kasutatud meetodite valimise põhjendus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bioloogiliste vaatluste andmed üldiste morfoloogiliste muutuste, sealhulgas teiseste sootunnuste kohta, samuti marja tootmise ja vitellogeniini kohta;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         andmete analüüsi tulemused, soovitatavalt tabelite ja graafikute kujul;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kalade ebatavaliste reaktsioonide esinemissagedus ja kõik uuritava kemikaali põhjustatud nähtavad ilmingud.
                                                      
                                                   
                                       
                           KATSETULEMUSTE TÕLGENDAMISE JA KEHTIVAKS TUNNISTAMISE JUHISED
                     
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Käesolevas jaotises on esitatud mõned kaalutlused, mida tuleb arvesse võtta katses mõõdetavate eri lõppnäitajate puhul saadud tulemuste tõlgendamisel. Kui uuritav kemikaal näib põhjustavat ilmset mürgistust või mõjutavat katseloomade üldist seisundit, tuleks tulemuste tõlgendamisel olla ettevaatlik.
                              
                           
                              
                                 52.
                              
                              
                                 Katsekontsentratsioonide vahemiku valimisel tuleks jälgida, et ei ületataks maksimaalset talutavat kontsentratsiooni; vastasel juhul ei ole võimalik andmeid mõistlikult tõlgendada. On oluline, et vähemalt ühe kontsentratsiooni juures ei täheldataks mingeid mürgisuse nähte. Haiguse ja mürgise toime ilminguid tuleks põhjalikult hinnata ja esitada need katseprotokollis. Näiteks on võimalik, et vitellogeniini sünteesi emaskalades võib mõjutada ka kemikaali üldine mürgisus ja muu kui endokriinse mehhanismi kaudu avalduv mürgisus, näiteks hepatotoksilisus. Mõju tõlgendamist võivad hõlbustada sellistel kontsentratsioonidel saadud andmed, mille juures tulemusi ei moonuta süsteemne mürgisus.
                              
                           
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Katsetulemuste kehtivaks tunnistamisel tuleb arvesse võtta mitut aspekti. Tuleks juhinduda sellest, et vitellogeniini tase kontrollrühmades peaks isas- ja emaskaladel olema erinev ning see erinevus peaks olema tüseda tömpnina ja vöödilise daanio puhul umbes kolm suurusjärku ning jaapani riisikala puhul umbes üks suurusjärk. Näited kontrollrühmades ja uuritava kemikaaliga rühmades saadud väärtuste vahemiku kohta on esitatud valideerimisaruannetes (1–4). Kõrge vitellogeniinitase kontrollrühma isaskaladel võib negatiivselt mõjutada meetodi tundlikkust ja nõrkade östrogeeni agonistide tuvastamise võimet. Madal vitellogeniinitase kontrollrühma emaskaladel võib negatiivselt mõjutada meetodi tundlikkust ning aromataasi inhibiitorite ja östrogeeni antagonistide tuvastamise võimet. Kõnealuseid valideerimisuuringuid kasutati käesolevate juhiste väljatöötamiseks.
                              
                           
                              
                                 54.
                              
                              
                                 Marja tootmise kvantitatiivse hindamise puhul tuleb silmas pidada, et see varieerub suurel määral (vastav variatsioonikordaja võib olla 20–60 %); see piirab võimalust tuvastada katses marja tootmise olulist vähenemist, kui see jääb alla 70 % ja variatsioonikordaja on ligi 50 % või suurem. Kui variatsioonikordaja väärtus on väiksem (umbes 20–30 %), on meetodi võimsus piisav (80 %), et tuvastada marja tootmise vähenemine 40–50 % võrra. Tüseda tömpnina puhul kasutatav katseplaan, millega nähakse muu hulgas ette neli paralleeli iga kontsentratsiooni kohta, peaks võimaldama määrata kõnealuse sigivust iseloomustava lõppnäitaja suurema võimsusega kui üksnes kahe paralleeliga katseplaan.
                              
                           
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Kui laboris ei ole asjaomast katset varem läbi viidud või seal on tehtud olulisi muudatusi (nt on muutunud kalade liin või tarnija), on soovitatav teha tehnilise pädevuse katse. Soovitatavalt tuleks kasutada kemikaale, mille puhul täheldatakse kõigi kemikaalide lõikes rida eri toimemehhanisme või mõju mitmele katses kasutatavale lõppnäitajale. Praktikas kutsutakse iga laborit üles looma varasemate kontrollrühmi käsitlevate andmete põhjal oma andmestikku isas- ja emaskalade kohta ning tegema positiivse kontrolli katse östrogeense toimega kemikaaliga (nt 17β-östradiool kontsentratsioonis 100 ng/l või mõni teadaolev nõrk agonist), mille mõjul tõuseb vitellogeniini tase isaskalades, positiivse kontrolli katse aromataasi pärssiva kemikaaliga (nt fadrosool või prokloraas kontsentratsioonis 300 μg/l), mille toimel väheneb vitellogeniinisisaldus emaskalades, ning positiivse kontrolli katse androgeense toimega kemikaaliga (nt 17β-trenboloon kontsentratsioonis 5 μg/l), mis põhjustab emastel tüsedatel tömpninadel ja jaapani riisikaladel isaskalade teiseste sootunnuste ilmumist. Labori pädevuses veendumiseks võib kõiki neid andmeid võrrelda valideerimisuuringute (1–3) kättesaadavate andmetega.
                              
                           
                              
                                 56.
                              
                              
                                 Üldiselt tuleks vitellogeniini määramise tulemused lugeda positiivseks, kui vähemalt suurimal katses kasutatud kontsentratsioonil tuvastatakse kontrollrühmaga võrreldes vitellogeniinitaseme statistiliselt oluline (p < 0,05) tõus isaskalades või statistiliselt oluline (p < 0,05) langus emaskalades, kui samas ei ilmne üldise mürgisuse nähte. Positiivset tulemust toetab täiendavalt kontsentratsiooni ja toime vahelise bioloogiliselt usutava sõltuvuse tuvastamine. Nagu eespool märgitud, ei pruugi vitellogeniinisisalduse vähenemine olla tingitud üksnes endokriinsest toimest, kuid positiivset tulemust tuleks üldjuhul tõlgendada tõendina endokriinse toime kohta in vivo ja sellist toimet tuleks selguse saamiseks tavaliselt täiendavalt uurida.
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Reguleerivad asutused võivad nõuda sugunäärmete histopatoloogilist hindamist, mis võimaldab teha kindlaks katseloomade paljunemisvõime ja hinnata katsetulemuste kaalukust. Sugunäärmete histopatoloogiline analüüs ei pruugi olla vajalik juhul, kui vitellogeniini või teiseste sootunnuste määramise tulemused on positiivsed (st täheldatakse vitellogeniinisisalduse suurenemist või vähenemist või vastassoo teiseste sootunnuste ilmumist).
                              
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2006a). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances (Phase 1A). Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 60. Pariis.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2006b). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances (Phase 1B). Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 61. Pariis.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 OECD (2007). Final Report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances. Phase 2: Testing Negative Substances. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 78. Pariis.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Owens, J. W. (2007). Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay. Endokriinset toimet käsitlev CEFIC LRI projekt. http://www.cefic-lri.org/index.php?page=projects (vaadatud 18.9.2008).
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 USA Keskkonnakaitseamet (2007). Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report. 15. detsember 2007. USA Keskkonnakaitseamet, Washington, D. C. 104 lk.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 OECD (2008). Report of the Validation Peer Review for the 21-Day Fish Endocrine Screening Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 94. Pariis.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Sumpter, J. P., ja Jobling, S. (1995). Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environ. Health Persp. 103, Suppl. 7: 173–178 (ülevaateartikkel).
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Pawlowski, S., et al. (2004). Androgenic and estrogenic effects of the synthetic androgen 17α-methyltestosterone on sexual development and reproductive performance in the fathead minnow (Pimephales promelas) determined using the gonadal recrudescence assay. Aquat. Toxicol. 68 (3): 277–291.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Andersen, L., et al. (2006). Short-term exposure to low concentrations of the synthetic androgen methyltestosterone affects vitellogenin and steroid levels in adult male zebrafish (Danio rerio). Aquat. Toxicol. 76 (3–4): 343–352.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Ankley, G. T., et al. (2002). Evaluation of the aromatase inhibitor fadrozole in a short-term reproduction assay with the fathead minnow (Pimephales promelas). Toxicol. Sci. 67 (1): 121–130.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Panter, G. H., et al. (2004). Successful detection of (anti-)androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development. Aquat. Toxicol. 70 (1): 11–21.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Parks, L. G., et al. (1999). Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds. Comp. Biochem. Phys. C 123 (2): 113–125.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Panter, G. H., et al. (1999). Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to endocrine disrupting chemicals. CEFIC-EMSG uuringuaruanne AQ001. CEFIC, Brüssel, Belgia.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Fenske, M., et al. (2001). Development and validation of a homologous zebrafish (Danio rerio Hamilton-Buchanan) vitellogenin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its application for studies on estrogenic chemicals. Comp. Biochem. Phys. C 129 (3): 217–232.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Holbech, H., et al. (2001). Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Phys. C 130: 119–131.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Rose, J., et al. (2002). Vitellogenin induction by 17b-estradiol and 17a-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C 131: 531–539.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Brion, F., et al. (2002). Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio). Environ. Toxicol. Chem. 21: 1699–1708.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Yokota, H., et al. (2001). Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in medaka (Oryzias latipes). Jpn. J. Environ. Toxicol. 4: 87–98.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Tatarazako, N., et al. (2004). Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the Medaka. J. Health Sci. 50: 301–308.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Ankley, G. T., et al. (2003). Effects of the androgenic growth promoter 17β-trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environ. Toxicol. Chem. 22 (6): 1350–1360.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Seki, M., et al. (2004). Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes). Environ. Toxicol. Chem. 23 (3): 774–781.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 OECD (2010). Guidance Document on Fish Gonadal Histopathology. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 123. Pariis.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. Pariis.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Hutchinson, T. H., et al. (2006a). Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76: 69–92.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Hutchinson, T. H., et al. (2006b). Screening and testing for endocrine disruption in fish – biomarkers as „signposts,“ not „traffic lights,“ in risk assessment. Environ. Health Persp. 114, Suppl. 1: 106–114.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Miles-Richardson, S. R., et al. (1999). Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas). Aquat. Toxicol. 47: 129–145.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Martinovic, D., et al. (2008). Characterization of reproductive toxicity of vinclozolin in the fathead minnow and co-treatment with an androgen to confirm an anti-androgenic mode of action. Environ. Toxicol. Chem. 27: 478–488.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2006c). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 54. OECD, Pariis.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 USA Keskkonnakaitseamet (2008). Peer-Review Results for the Fish Short-Term Reproduction Assay. 30. jaanuar 2008. USA Keskkonnakaitseamet, Washington, D. C. 110 lk.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 OECD (2012). OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupters. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 150. OECD, Pariis.
                              
                           
                        1. liide
                        LÜHENDID JA MÕISTED
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              ELISA
                           – ensüümimmuunsorptsioonanalüüs.
                        
                           
                              Biomassisisaldus
                           – kalade märgmass vee ruumalaühiku kohta.
                        
                           
                              Maksimaalne talutav kontsentratsioon
                           – kontsentratsioon, mis on ligikaudu 10 % LC50 väärtusest.
                        
                           
                              Asustustihedus
                           – kalade arv vee ruumalaühiku kohta.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                        
                           
                              Vitellogeniin
                           – fosfolipoglükoproteiin, mis on munarebu valkude eelkäija ja mida tavaliselt leidub kõikide ovipaarsete liikide seksuaalselt aktiivsetes emasloomades.
                     
                     
                        2. liide
                        
                           KALADE ENDOKRIINSÜSTEEMI MÕJUTAVATE KEMIKAALIDE SÕELUURINGU TINGIMUSED
                        
                        
                                    
                                                1.
                                             
                                             
                                                Soovitatav liik
                                             
                                          
                                 
                                    Tüse tömpnina
                                    (Pimephales promelas)
                                 
                                 
                                    Jaapani riisikala
                                    (Oryzias latipes)
                                 
                                 
                                    Vöödiline daanio
                                    (Danio rerio)
                                 
                              
                                    
                                                2.
                                             
                                             
                                                Katse tüüp
                                             
                                          
                                 
                                    Läbivoolukatse
                                 
                                 
                                    Läbivoolukatse
                                 
                                 
                                    Läbivoolukatse
                                 
                              
                                    
                                                3.
                                             
                                             
                                                Vee temperatuur
                                             
                                          
                                 
                                    25 ± 2 °C
                                 
                                 
                                    25 ± 2 °C
                                 
                                 
                                    26 ± 2 °C
                                 
                              
                                    
                                                4.
                                             
                                             
                                                Valgustuse kvaliteet
                                             
                                          
                                 
                                    Luminofoorlambid (laia spektriga)
                                 
                                 
                                    Luminofoorlambid (laia spektriga)
                                 
                                 
                                    Luminofoorlambid (laia spektriga)
                                 
                              
                                    
                                                5.
                                             
                                             
                                                Valgustihedus
                                             
                                          
                                 
                                    10–20 μE/m2/s, 540–1 000  luksi või 50–100 ft-c (labori üldvalgustus)
                                 
                                 
                                    10–20 μE/m2/s, 540–1 000  luksi või 50–100 ft-c (labori üldvalgustus)
                                 
                                 
                                    10–20 μE/m2/s, 540–1 000  luksi või 50–100 ft-c (labori üldvalgustus)
                                 
                              
                                    
                                                6.
                                             
                                             
                                                Valgustusperiood (koidu/hämariku üleminekuid võib korraldada, kuid neid ei peeta vajalikuks)
                                             
                                          
                                 
                                    16 tundi valgust, 8 tundi pimedust
                                 
                                 
                                    12–16 tundi valgust, 12–8 tundi pimedust
                                 
                                 
                                    12–16 tundi valgust, 12–8 tundi pimedust
                                 
                              
                                    
                                                7.
                                             
                                             
                                                Biomassisisaldus
                                             
                                          
                                 
                                    < 5 g/l
                                 
                                 
                                    < 5 g/l
                                 
                                 
                                    < 5 g/l
                                 
                              
                                    
                                                8.
                                             
                                             
                                                Katsekambri suurus
                                             
                                          
                                 
                                    10 l (miinimum)
                                 
                                 
                                    2 l (miinimum)
                                 
                                 
                                    5 l (miinimum)
                                 
                              
                                    
                                                9.
                                             
                                             
                                                Katselahuse ruumala
                                             
                                          
                                 
                                    8 l (miinimum)
                                 
                                 
                                    1,5 l (miinimum)
                                 
                                 
                                    4 l (miinimum)
                                 
                              
                                    
                                                10.
                                             
                                             
                                                Katselahuse uuendamine kogu ruumala ulatuses
                                             
                                          
                                 
                                    Vähemalt 6 korda päevas
                                 
                                 
                                    Vähemalt 5 korda päevas
                                 
                                 
                                    Vähemalt 5 korda päevas
                                 
                              
                                    
                                                11.
                                             
                                             
                                                Katseloomade vanus
                                             
                                          
                                 
                                    Vt punkt 21
                                 
                                 
                                    Vt punkt 21
                                 
                                 
                                    Vt punkt 21
                                 
                              
                                    
                                                12.
                                             
                                             
                                                Täiskasvanud kala ligikaudne märgmass (g)
                                             
                                          
                                 
                                    Emased: 1,5 ± 20 %
                                    Isased: 2,5 ± 20 %
                                 
                                 
                                    Emased: 0,35 ± 20 %
                                    Isased: 0,35 ± 20 %
                                 
                                 
                                    Emased: 0,65 ± 20 %
                                    Isased: 0,4 ± 20 %
                                 
                              
                                    
                                                13.
                                             
                                             
                                                Kalade arv katsenõu kohta
                                             
                                          
                                 
                                    6 (2 isaskala ja 4 emaskala)
                                 
                                 
                                    6 (3 isaskala ja 3 emaskala)
                                 
                                 
                                    10 (5 isaskala ja 5 emaskala)
                                 
                              
                                    
                                                14.
                                             
                                             
                                                Kontsentratsioonipunktide arv
                                             
                                          
                                 
                                    = 3 (pluss vajalikud kontrollid)
                                 
                                 
                                    = 3 (pluss vajalikud kontrollid)
                                 
                                 
                                    = 3 (pluss vajalikud kontrollid)
                                 
                              
                                    
                                                15.
                                             
                                             
                                                Nõude arv kontsentratsioonipunkti kohta
                                             
                                          
                                 
                                    Vähemalt 4
                                 
                                 
                                    Vähemalt 4
                                 
                                 
                                    Vähemalt 2
                                 
                              
                                    
                                                16.
                                             
                                             
                                                Kalade arv katsekontsentratsiooni kohta
                                             
                                          
                                 
                                    16 täiskasvanud emast ja 8 isast (4 emast ja 2 isast igas paralleelnõus)
                                 
                                 
                                    12 täiskasvanud emast ja 12 isast (3 emast ja 3 isast igas paralleelnõus)
                                 
                                 
                                    10 täiskasvanud emast ja 10 isast (5 emast ja 5 isast igas paralleelnõus)
                                 
                              
                                    
                                                17.
                                             
                                             
                                                Söötmisrežiim
                                             
                                          
                                 
                                    Elus või külmutatud soolase vee krevettide täiskasvanud või noorjärgus isendid 2–3 korda päevas (ad libitum), müügilolev kalasööt või nende kombinatsioon
                                 
                                 
                                    Soolase vee krevettide noorjärgus isendid 2–3 korda päevas (ad libitum), müügilolev kalasööt või nende kombinatsioon
                                 
                                 
                                    Soolase vee krevettide noorjärgus isendid 2–3 korda päevas (ad libitum), müügilolev kalasööt või nende kombinatsioon
                                 
                              
                                    
                                                18.
                                             
                                             
                                                Aereerimine
                                             
                                          
                                 
                                    Üksnes siis, kui lahustunud hapnikku on alla 60 % küllastuskontsentratsioonist
                                 
                                 
                                    Üksnes siis, kui lahustunud hapnikku on alla 60 % küllastuskontsentratsioonist
                                 
                                 
                                    Üksnes siis, kui lahustunud hapnikku on alla 60 % küllastuskontsentratsioonist
                                 
                              
                                    
                                                19.
                                             
                                             
                                                Lahjendusvesi
                                             
                                          
                                 
                                    Puhas pinnavesi, kaevuvesi, taastatud vesi või deklooritud kraanivesi
                                 
                                 
                                    Puhas pinnavesi, kaevuvesi, taastatud vesi või deklooritud kraanivesi
                                 
                                 
                                    Puhas pinnavesi, kaevuvesi, taastatud vesi või deklooritud kraanivesi
                                 
                              
                                    
                                                20.
                                             
                                             
                                                Kokkupuute-eelne periood
                                             
                                          
                                 
                                    Soovitatavalt 7–14 päeva
                                 
                                 
                                    Soovitatavalt 7–14 päeva
                                 
                                 
                                    Soovitatavalt 7–14 päeva
                                 
                              
                                    
                                                21.
                                             
                                             
                                                Kemikaaliga kokkupuute kestus
                                             
                                          
                                 
                                    21 päeva
                                 
                                 
                                    21 päeva
                                 
                                 
                                    21 päeva
                                 
                              
                                    
                                                22.
                                             
                                             
                                                Bioloogilised lõppnäitajad
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                Elulemus
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Käitumine
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Sigivus
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Teisesed sootunnused
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Vitellogeniin
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Vajaduse korral sugunäärmete histopatoloogiline hinnang
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                Elulemus
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Käitumine
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Sigivus
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Teisesed sootunnused
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Vitellogeniin
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Vajaduse korral sugunäärmete histopatoloogiline hinnang
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                Elulemus
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Käitumine
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Sigivus
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Vitellogeniin
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                Vajaduse korral sugunäärmete histopatoloogiline hinnang
                                             
                                          
                              
                                    
                                                23.
                                             
                                             
                                                Katse nõuetekohasus
                                             
                                          
                                 
                                    Lahustunud hapniku sisaldus > 60 % küllastuskontsentratsioonist; keskmine temperatuur 25 ± 2 °C; kalade elulemus kontrollrühma(de)s vähemalt 90 %; mõõdetud katsekontsentratsioonid vahemikus ± 20 % mõõtmistulemuste keskväärtusest igal kontsentratsioonil
                                 
                                 
                                    Lahustunud hapniku sisaldus > 60 % küllastuskontsentratsioonist; keskmine temperatuur 25 ± 2 °C; kalade elulemus kontrollrühma(de)s vähemalt 90 %; mõõdetud katsekontsentratsioonid vahemikus ± 20 % mõõtmistulemuste keskväärtusest igal kontsentratsioonil
                                 
                                 
                                    Lahustunud hapniku sisaldus > 60 % küllastuskontsentratsioonist; keskmine temperatuur 26 ± 2 °C; kalade elulemus kontrollrühma(de)s vähemalt 90 %; mõõdetud katsekontsentratsioonid vahemikus ± 20 % mõõtmistulemuste keskväärtusest igal kontsentratsioonil
                                 
                              
                     
                        3. liide
                        
                           MÕNED LAHJENDUSVEE NÕUTAVAD KEEMILISED OMADUSED
                        
                        
                                    KOOSTISOSA
                                 
                                 
                                    KONTSENTRATSIOON
                                 
                              
                                    Tahked osakesed
                                 
                                 
                                    < 20 mg/l
                                 
                              
                                    Orgaanilise süsiniku üldsisaldus
                                 
                                 
                                    < 2 mg/l
                                 
                              
                                    Ioniseerimata ammoniaak
                                 
                                 
                                    < 1 μg/l
                                 
                              
                                    Kloorijäägid
                                 
                                 
                                    < 10 μg/l
                                 
                              
                                    Fosfororgaaniliste pestitsiidide üldsisaldus
                                 
                                 
                                    < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüülide summaarne üldsisaldus
                                 
                                 
                                    < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Orgaanilistes ühendites sisalduva kloori üldsisaldus
                                 
                                 
                                    < 25 ng/l
                                 
                              
                     
                        4A liide
                        
                           VÖÖDILISE DAANIO KUDEMISSUBSTRAAT
                        
                        
                           
                              Kudemisalus
                           : üleni klaasist instrumendinõu, näiteks mõõtmetega 22 × 15 × 5,5 cm (pikkus × laius × sügavus), mis on kaetud eemaldatava roostevabast terastraadist võrega (võresilma suurus 2 mm). Võre peaks katma instrumendinõu valendiku allpool nõu äärt.
                        Võre peale tuleks kinnitada kudemissubstraat. Selle struktuur peaks olema selline, et kalad saavad substraati siseneda. Sobivad näiteks rohelisest plastmaterjalist kunstlikud akvaariumitaimed (NB: tuleks arvesse võtta uuritava kemikaali võimalikku adsorbeerumist plastmaterjalile). Plastmaterjali tuleb leostada piisava koguse sooja veega piisavalt kaua, et hoida ära kemikaalide leostumine vette katse ajal. Klaasmaterjali kasutamisel tuleks tagada, et kalad ei saaks vigastusi ega peaks oma aktiivse tegevuse käigus taluma ruumikitsikust.
                        Vahemaa aluse ja kambri klaasseinte vahel peaks olema vähemalt 3 cm, et kudemist ei toimuks väljaspool alust. Alusele koetud marjaterad langevad läbi võre ja need võib koguda 45–60 minutit pärast valgustuse sisselülitamist. Läbipaistvad marjaterad ei ole kleepuvad ja on külgvalguses kergesti loendatavad. Kui ühe nõu kohta kasutatakse viit emaskala, võib marjaterade arvu kuni 20 ühe päeva kohta pidada väikeseks, kuni 100 – keskmiseks ja üle 100 – rikkalikuks saagiseks. Kudemisalus tuleks eemaldada, marjaterad kokku koguda ja kudemisalus uuesti katsenõusse tagasi panna kas võimalikult hilja õhtul või väga vara hommikul. Aeg kudemisaluse tagasipanekuni ei tohiks olla pikem kui üks tund, sest vastasel juhul võib kudemissubstraadi ilmumine mõjutada kalu ebatavalisel ajal individuaalselt paarituma ja kudema. Kui olukord tingib kudemisaluse hilisema tagasipaneku, tuleks seda teha vähemalt 9 tundi pärast valgustuse sisselülitamist. Sellisel hilisel kellaajal kudemist enam ei toimu.
                     
                     
                        4B liide
                        
                           TÜSEDA TÖMPNINA KUDEMISSUBSTRAAT
                        
                        Igasse katsekambrisse pannakse kaks või kolm plastist, klaasist, roostevabast terasest või keraamilist kudemisvõlvi ja alust (nt 80 mm pikkune hall poolkaarekujulise ristlõikega vihmaveerenni jupp, mis asub 130 mm pikkusel servadega alusel) (vt joonis). Korralikult vanandatud polüvinüülkloriidist või keraamilised võlvid on tõendatult sobiv kudemissubstraat (Thorpe et al., 2007).
                        Võlvid on soovitatav nakkuvuse parandamiseks karestada. Alus tuleks ühtlasi varustada kaitsevõrega, et takistada kalade juurdepääsu koetud marjale, välja arvatud juhul, kui marjaterade tõhus nakkuvus kasutatava kudemissubstraadiga on tõendatud.
                        Aluse ülesanne on pidada kinni kõik marjaterad, mis ei nakku kudemisvõlvi pinnaga ja kukuksid aluse puudumisel kambri põhja, samuti marjaterad, mis on koetud otse lamedale plastalusele. Kõiki kudemissubstraate tuleks enne kasutamist vähemalt 12 tundi lahjendusveega leostada.
                        Thorpe, K. L., Benstead, R., Hutchinson, T. H., ja Tyler, C. R. (2007). An optimised experimental test procedure for measuring chemical effects on reproduction in the fathead minnow, Pimephales promelas. Aquat. Toxicol. 81: 90–98.
                     
                     
                        5A liide
                        
                           TÜSEDA TÖMPNINA TEISESTE SOOTUNNUSTE HINDAMINE ENDOKRIINSE TOIMEGA KEMIKAALIDE TUVASTAMISEKS
                        
                        
                           Ülevaade
                        
                        Täiskasvanud tüseda tömpnina välistunnused, mis võivad olla endokriinse toimega kemikaalide tuvastamiseks olulised, hõlmavad järgmist: värvus (st hele/tume), värvimuster (st vertikaalsete vöötide olemasolu või puudumine), kehakuju (st pea ja rinnaosa kuju, kõhu laienemine) ja spetsiifilised teisesed sootunnused (st pulmarüü köbrukeste arv ja suurus, turjapadjandi ja muneti suurus).
                        Pulmarüü köbrukesed asuvad tüseda tömpnina suguliselt aktiivse isaskala pea peal (turjapadjandil) ja paiknevad tavaliselt bilateraalsümmeetriliselt (Jensen et al., 2001). Kontrollrühma emaskaladel ning noortel isas- ja emaskaladel köbrukesi ei ole (Jensen et al., 2001). Isaskala silmade ümber ja sõõrmete vahel võib olla kuni kaheksa eraldi köbrukest. Suurim arv köbrukesi ja suurimad köbrukesed asuvad kahel paralleelsel joonel vahetult sõõrmete all ja suu kohal. Paljudel kaladel esinevad köbrukeste rühmad alalõua all; suule kõige lähemaid köbrukesi on tavaliselt üks paar, kõhupoolsemas rühmas võib neid aga olla kuni neli. Köbrukeste tegelik arv on harva suurem kui 30 (vahemik 18–28; Jensen et al., 2001). Suurem osa köbrukesi kujutab endast võrdlemisi ümmargust eraldi moodustist, mille kõrgus on ligikaudu võrdne selle raadiusega. Enamikul suguliselt aktiivsetel isaskaladel on vähemalt mõned köbrukesed sedavõrd suurenenud ja silmapaistvad, et neid ei ole võimalik eraldiseisvana eristada.
                        Endokriinsüsteemi mõjutavate kemikaalide hulgas võivad teatavat liiki kemikaalid põhjustada teatavate vastassoo teiseste sootunnuste ebanormaalse ilmumise. Näiteks võivad sellised androgeeniretseptori agonistid nagu 17α-metüültestosteroon ja 17β-trenboloon põhjustada emasel tüsedal tömpninal pulmarüü köbrukeste ilmumise (Smith, 1974; Ankley et al., 2001, 2003), samal ajal kui östrogeeniretseptori agonistid võivad vähendada isaskaladel pulmarüü köbrukeste arvu või suurust (Miles-Richardson et al., 1999; Harries et al., 2000).
                        Allpool on esitatud tüseda tömpnina pulmarüü köbrukeste kirjeldamise meetod, mida kasutatakse Minnesota osariigis Duluthis asuvas USA Keskkonnakaitseameti laboris. Konkreetsed tooted ja/või seadmed võib asendada võrreldavate kättesaadavate materjalidega.
                        Köbrukesi on kõige parem vaadelda valgustusega suurendusklaasi või valgustusega (3X) anatoomilise mikroskoobiga. Kala vaadeldakse selja poolt ja esiotsast (peaga vaatleja poole).
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Kala pannakse väikesele Petri tassile (läbimõõduga nt 100 mm) esiotsaga vaatleja poole ja kõhuga allapoole. Suurendusklaasi või objektiivi fookus seatakse nii, et oleks võimalik vaadelda köbrukesi. Kala pööratakse ettevaatlikult ja aeglaselt küljelt küljele, et tuvastada köbrukeste piirkonnad. Köbrukesed loendatakse ja neid hinnatakse.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Vaatlust korratakse pea kõhupoolel; selleks pannakse kala Petri tassil selili esiotsaga vaatleja poole.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Iga kala vaatlus tuleks viia lõpule kahe minutiga.
                                 
                              
                           Köbrukeste arv ja hindamine
                        
                        Täiskasvanud tüseda tömpnina köbrukeste olemasolu ja suuruse hindamiseks on määratletud kuus konkreetset piirkonda. Olemasolevate köbrukeste asukoha ja arvu kaardistamiseks on välja töötatud vorm (vt käesoleva liite lõpus). Registreeritakse iga kala köbrukeste arv ja hinnatakse kvantitatiivselt nende suurust järgmiselt: 0 – puudub, 1– olemas, 2 – suurenenud ja 3 – silmapaistev (joonis 1).
                        0 punkti – köbruke puudub. 1 punkt – köbruke on olemas ja sellel on üks kõrgeim tipp, mille kõrgus on ligikaudu võrdne köbrukese raadiusega. 2 punkti – suurenenud köbruke, mille kude meenutab kujult tärni ja millel on tavaliselt lai alus keskelt algavate radiaalsete vagudega. Köbrukese tipp on sageli ebakorrapärasem, kuid võib vahel olla veidi ümardunud. 3 punkti – silmapaistev köbruke, tavaliselt üsna suur ja ümmargune, ebaselgema struktuuriga. Sellised köbrukesed on mõnikord kokku kasvanud ja moodustavad ühtse massi, mis paikneb ühel või mitmel köbrukeste alal (allpool kirjeldatud piirkonnad B, C ja D). Värvus ja muster on sarnased 2 punktile vastava köbrukese omaga, kuid on mõnikord raskesti eristatavad. Selle hindamissüsteemi kasutamise korral on normaalsel kontrollrühma isasel, kelle köbrukeste arv on 18–20, köbrukeste punktide üldsumma tavaliselt < 50 (Jensen et al., 2001).
                        
                           Joonis 1
                        
                        Tegelik köbrukeste arv võib mõnel kalal olla suurem, kui on vormil asjaomases hindamispiirkonnas lahtreid. Sellisel juhul võib täiendavad hinded märkida lahtri sisse või lahtrist paremale või vasakule. Vormi täitmisel ei pea seega järgima sümmeetriat. Selliste köbrukeste kaardistamiseks, mis paiknevad piki suu horisontaaltasapinda vertikaalselt paaris või ühendatuna, võib kummagi köbrukese hinde märkida samasse lahtrisse.
                        
                           Kaardistamispiirkonnad
                        
                        
                                     
                                 
                                 
                                    A – silmade ümber paiknevad köbrukesed. Kaardistatakse selja poolt kõhu poole piki silma eesmist äärt. Tavaliselt on kontrollrühma isaskaladel neid mitu, kontrollrühma emaskaladel need puuduvad; androgeense kemikaaliga kokku puutunud emaskaladel esinevad need üldjuhul paaris (üks kummagi silma juures) või ka üksikult.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    B-sõõrmete (haistmiselundi avade) vahel paiknevad köbrukesed. Kontrollrühma isaskaladel esinevad need tavaliselt paaris ja on rohkem välja arenenud (2 – suurenenud või 3 – silmapaistvad). Kontrollrühma emaskaladel need puuduvad; androgeense kemikaaliga kokku puutunud emaskaladel võib neid esineda ja need võivad olla teataval määral arenenud.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    C – sõõrmetest vahetult eespool suuga paralleelselt paiknevad köbrukesed. Kontrollrühma suguküpsetel isaskaladel on need tavaliselt suurenenud või silmapaistvad. Vähem arenenud isaskaladel ja androgeense kemikaaliga kokku puutunud emaskaladel on need olemas või suurenenud.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    D – köbrukesed, mis paiknevad paralleelselt piki suujoont. Kontrollrühma isaskaladel hinnatakse need üldjuhul väljaarenenuks. Kontrollrühma emaskaladel need puuduvad, kuid androgeense kemikaaliga kokku puutunud emaskaladel on need olemas.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    E – alalõual suu kõrval paiknevad köbrukesed, tavaliselt väikesed ja paarikaupa. Kontrollrühma isaskaladel ning kemikaaliga kokku puutunud isaskaladel ja emaskaladel võivad need olla mitmesugused.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    F – köbrukesed, mis paiknevad piirkonnast E kõhu pool. Tavaliselt väikesed ja paaris. Need on olemas kontrollrühma isaskaladel ja androgeense kemikaaliga kokku puutunud emaskaladel.
                                 
                              VIITED
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Ankley, G. T., Jensen, K. M., Kahl, M. D., Korte, J. J., Makynen, M. E. (2001). Description and evaluation of a short-term reproduction test with the fathead minnow (Pimephales promelas). Environ. Toxicol. Chem. 20: 1276–1290.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Ankley, G. T., Jensen, K. M., Makynen, E. A., Kahl, M. D., Korte, J. J., Hornung, M. W., Henry, T. R., Denny, J. S., Leino, R. L., Wilson, V. S., Cardon, M. C., Hartig, P. C., ja Gray, E. L. (2003). Effects of the androgenic growth promoter 17β-trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environ. Toxicol. Chem. 22: 1350–1360.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Harries, J. E., Runnalls, T., Hill, E., Harris, C. A., Maddix, S., Sumpter, J. P., ja Tyler, C. R. (2000). Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas). Environ. Sci. Technol. 34: 3003–3011.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Jensen, K. M., Korte, J. J., Kahl, M. D., Pasha, M. S., ja Ankley, G. T. (2001). Aspects of basic reproductive biology and endocrinology in the fathead minnow (Pimephales promelas). Comp. Biochem. Physiol. C 128: 127–141.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Kahl, M. D., Jensen, K. M., Korte, J. J., ja Ankley, G. T. (2001). Effects of handling on endocrinology and reproductive performance of the fathead minnow. J. Fish Biol. 59: 515–523.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Miles-Richardson, S. R., Kramer, V. J., Fitzgerald, S. D., Render, J. A., Yamini, B., Barbee, S. J., ja Giesy, J. P. (1999). Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas). Aquat. Toxicol. 47: 129–145.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Smith, R. J. F. (1974). Effects of 17α-methyltestosterone on the dorsal pad and tubercles of fathead minnows (Pimephales promelas). Can. J. Zool. 52: 1031–1038.
                                 
                              
                           
                        Tekst pildi
                        
                           Köbrukeste hindamise vorm
                           Identimistunnus
                           Numbriline hinnang
                           Kuupäev
                           1 – olemas
                           Üldsumma
                           2 – suurenenud
                           3 – silmapaistev
                           A
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           B
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           C
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           D
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           E
                           X1
                           X1
                           F
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                        
                     
                     
                        5B liide
                        
                           JAAPANI RIISIKALA TEISESTE SOOTUNNUSTE HINDAMINE ENDOKRIINSE TOIMEGA KEMIKAALIDE TUVASTAMISEKS
                        
                        Allpool on kirjeldatud papillaarjätkete (*10) mõõtmist; nimetatud jätked on jaapani riisikala (Oryzias latipes) teisesed sootunnused.
                        
                                 
                                    1)
                                 
                                 
                                    Pärast maksa väljalõikamist (6. liide) pannakse rümp (pea ülespoole, saba allapoole) koonilisse katseklaasi, mis sisaldab umbes 10 ml neutraalset puhverdatud 10 % formaliinilahust. Kui sugunäärmed fikseeritakse muu lahusega kui neutraalne puhverdatud 10 % formaliinilahus, tehakse pärakuuime eesosa ja päraku vahelt žiletiteraga ristilõige läbi rümba; seejuures jälgitakse, et suguava ja sugunäärmed ise ei saaks viga (joonis 3). Kala keha peapoolne osa pannakse sugunäärmete fikseerimiseks fikseerimislahusesse ja sabapoolne osa neutraalsesse puhverdatud 10 % formaliinilahusesse, nagu on kirjeldatud eespool.
                                 
                              
                                 
                                    2)
                                 
                                 
                                    Pärast seda, kui kala keha on pandud neutraalsesse puhverdatud 10 % formaliinilahusesse, võetakse pärakuuime eesosast pintsettidega kinni ja tõmmatakse seda umbes 30 sekundit, et pärakuuime lahti hoida. Pärakuuimest kinnivõtmisel võetakse pintsettide vahele mõned uimekiired uime eesosas ja jälgitakse, et papillaarjätked ei saaks kriimustada.
                                 
                              
                                 
                                    3)
                                 
                                 
                                    Pärast seda, kui pärakuuime on umbes 30 sekundit lahti hoitud, säilitatakse kala keha kuni papillaarjätkete mõõtmiseni neutraalses puhverdatud 10 % formaliinilahuses toatemperatuuril (jätkeid tuleks mõõta pärast vähemalt 24 tunni pikkust fikseerimist).
                                 
                              Mõõtmine
                        
                                 
                                    1)
                                 
                                 
                                    Pärast kala keha fikseerimist neutraalses puhverdatud 10 % formaliinilahuses vähemalt 24 tundi võetakse kala rümp koonilisest katseklaasist välja ja pühitakse formaliin filterpaberisse (või paberrätikusse).
                                 
                              
                                 
                                    2)
                                 
                                 
                                    Kala asetatakse kõhuga ülespoole. Seejärel lõigatakse väikeste lahkamiskääridega pärakuuim ettevaatlikult ära (parem on lõigata uim ära koos väikese koguse seda toestava koega).
                                 
                              
                                 
                                    3)
                                 
                                 
                                    Äralõigatud pärakuuime eesosast võetakse pintsettidega kinni ja see pannakse alusklaasile, millel on mõni tilk vett. Seejärel kaetakse pärakuuim katteklaasiga. Tuleb olla ettevaatlik, et pintsettidega pärakuuimest kinni võtmisel ei saaks papillaarjätked kriimustada.
                                 
                              
                                 
                                    4)
                                 
                                 
                                    Bioloogilise mikroskoobi (tavaline või invertmikroskoop) ja loenduri abil loendatakse papillaarjätketega kiirelülide arv. Papillaarjätketeks loetakse väikest rühma jätkeid kiirelüli tagumisel serval. Iga uimekiire papillaarjätketega lülide arv kirjutatakse töölehele (nt esimene uimekiir: 0, teine uimekiir: 10, kolmas uimekiir: 12 jne) ning nende arvude summa iga kala kohta sisestatakse Exceli tabelisse. Vajaduse korral tehakse pärakuuimest pilt ja loendatakse papillaarjätketega kiirelülide arv fotolt.
                                 
                              
                                 
                                    5)
                                 
                                 
                                    Pärast mõõtmist pannakse pärakuuim punktis 1 kirjeldatud koonilisse katseklaasi ja hoitakse see alles.
                                 
                              
                           Joonis 1.
                        
                        
                           Pärakuuime kuju ja suuruse soolised erinevused. A. Isaskala. B. Emaskala. Oka, T. B. (1931). On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Univ. Tokyo, IV, 2: 209–218.
                        
                        
                           Joonis 2. A.
                        
                        
                           Jätked pärakuuime kiire lülidel. J. P. (joint plate) – kiirelüli; A. S. (axial space) – telgedevaheline ruum; P. (process) – jätke. B. Uimekiire distaalne ots. Otsas paiknevad aktinotrihhiumid (Act.). Oka, T. B. (1931). On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Univ. Tokyo, IV, 2: 209–218.
                        
                        
                           Joonis 3.
                        
                        
                           Foto kala kehast, millel on näidatud lõikamiskoht, kui sugunäärmed fikseeritakse muus lahuses kui neutraalne puhverdatud 10 % formaliinilahus. Sellisel juhul lõigatakse keha pärakuuime eesosa ja päraku vahelt žiletiteraga läbi (punane joon); peapoolne osa pannakse sugunäärmete fikseerimiseks ette nähtud lahusesse ja sabapoolne osa neutraalsesse puhverdatud 10 % formaliinilahusesse.
                        
                        
                     
                        6. liide
                        
                           SOOVITATAV PROOVIVÕTMISE KORD VITELLOGENIINI MÄÄRAMISE PUHUL
                        
                        Tuleks olla hoolikas, et hoida ära isas- ja emaskalade vitellogeniiniproovide ristsaastumist.
                        
                           
                              Meetod 1A:   tüseda tömpnina vere võtmine sabaveenist/-arterist
                        
                        Pärast tuimastamist lõigatakse sabavars skalpelliteraga osaliselt läbi ja veri kogutakse sabaveenist/-arterist hematokriti määramiseks ette nähtud hepariniseeritud mikrokapillaartorusse. Kui veri on kogutud, eraldatakse kiiresti plasma tsentrifuugimisega 3 minuti jooksul 15 000g juures (või selle asemel 10 minuti jooksul 15 000g ja 4 °C juures). Soovi korral võib määrata pärast tsentrifuugimist hematokriti. Plasmaosa eemaldatakse seejärel hematokriti määramiseks ette nähtud mikrokapillaartorust ja säilitatakse tsentrifuugitopsis 0,13 ühiku aprotiniini (proteaasiinhibiitor) juuresolekul – 80 °C juures, kuni on võimalik määrata vitellogeniin. Olenevalt tüseda tömpnina suurusest (see sõltub soost), on ühelt kalalt kogutava plasma maht tavaliselt vahemikus 5–60 mikroliitrit (Jensen et al., 2001).
                        
                           
                              Meetod 1B:   tüseda tömpnina vere võtmine südamest
                        
                        Teise võimalusena võib vere koguda südamepunktsiooniga; selleks kasutatakse hepariniseeritud süstalt (1 000 ühikut hepariini ml kohta). Veri viiakse jääl hoitavasse Eppendorfi katsutisse ja seejärel tsentrifuugitakse (5 minutit 7 000 g juures toatemperatuuril). Plasma kantakse üle puhastesse Eppendorfi katsutitesse (alikvootidena, kui plasma maht seda võimaldab) ja külmutatakse viivitamata – 80 °C juures, kus seda säilitatakse kuni analüüsimiseni (Panter et al., 1998).
                        
                           
                              Meetod 2A:   jaapani riisikala maksa väljalõikamine
                        
                        
                           Katses kasutatavate kalade eemaldamine katsekambrist
                        
                        
                                 
                                    1)
                                 
                                 
                                    Katses kasutatavad kalad tuleks katsekambrist eemaldada väikese kahvaga. Tuleb olla hoolikas, et mitte pillata kalu teise katsekambrisse.
                                 
                              
                                 
                                    2)
                                 
                                 
                                    Üldjuhul tuleks katses kasutatavad kalad eemaldada järgmises järjekorras: kontrollrühm, lahustiga kontrollrühm (vajaduse korral), madalaima kontsentratsiooniga rühm, keskmise kontsentratsiooniga rühm, kõrgeima kontsentratsiooniga rühm ja positiivne kontroll. Peale selle tuleks ühest katsekambrist eemaldada kõigepealt kõik isaskalad ja seejärel allesjäänud emaskalad.
                                 
                              
                                 
                                    3)
                                 
                                 
                                    Iga kala sugu tehakse kindlaks väliste teiseste sootunnuste (nt pärakuuime kuju) järgi.
                                 
                              
                                 
                                    4)
                                 
                                 
                                    Uuritavad kalad paigutatakse transpordimahutisse ja viiakse maksa väljalõikamiseks töölauale. Kontrollitakse katsekambri ja transpordimahuti märgistuse õigsust ning veendutakse, et katsekambrist võetud kalade arv ja katsekambrisse jäänud kalade arv vastavad eeldustele.
                                 
                              
                                 
                                    5)
                                 
                                 
                                    Kui kalade sugu ei ole võimalik tuvastada välise vaatlusega, eemaldatakse katsekambrist kõik kalad. Sellisel juhul tuleks nende sugu määrata sugunäärmete või teiseste sootunnuste vaatlemisega stereomikroskoobi abil.
                                 
                              
                           Maksa väljalõikamine
                        
                        
                                 
                                    1)
                                 
                                 
                                    Kala viiakse väikese kahvaga transpordimahutist üle tuimastilahusesse.
                                 
                              
                                 
                                    2)
                                 
                                 
                                    Pärast tuimastamist tõstetakse kala tavaliste pintsettidega filterpaberile (või paberrätikule). Kala haaratakse pintsettidega pea külgedelt, et saba ära ei murduks.
                                 
                              
                                 
                                    3)
                                 
                                 
                                    Vesi pühitakse kala pealt filterpaberisse (või paberrätikusse).
                                 
                              
                                 
                                    4)
                                 
                                 
                                    Kala asetatakse kõhuga ülespoole. Seejärel tehakse lahkamiskääridega kõhupoolse kaelaosa ja kõhu keskosa vahele väike ristilõige.
                                 
                              
                                 
                                    5)
                                 
                                 
                                    Lahkamiskäärid viiakse väikesesse sisselõikesse ja kõht lõigatakse piki keskjoont lahti lõpusekattest saba pool asuvast punktist kuni päraku peapoolse servani. Tuleb jälgida, et kääre ei viidaks liiga sügavale ning maks ja sugunäärmed ei saaks viga.
                                 
                              
                                 
                                    6)
                                 
                                 
                                    Järgmised toimingud tehakse stereomikroskoobi all.
                                 
                              
                                 
                                    7)
                                 
                                 
                                    Kala asetatakse paberrätikule (või klaasist Petri tassile või alusklaasile) kõhuga ülespoole.
                                 
                              
                                 
                                    8)
                                 
                                 
                                    Kõhuõõne seinad venitatakse täppispintsettidega laiali ja siseelundid tõmmatakse välja. Vajaduse korral võib siseelundite väljatõmbamiseks eemaldada kõhuõõne ühe seina.
                                 
                              
                                 
                                    9)
                                 
                                 
                                    Teise paari täppispintsettide abil tuuakse esile maksa ja sapipõie ühenduskoht. Haaratakse kinni sapijuhast ja lõigatakse sapipõis ära. Tuleb olla ettevaatlik, et sapipõis ei läheks katki.
                                 
                              
                                 
                                    10)
                                 
                                 
                                    Haaratakse kinni söögitorust ja lõigatakse seedekulgla samal viisil maksast lahti. Tuleb jälgida, et seedekulgla sisu ei voolaks välja. Seedekulgla sabapoolne osa lõigatakse päraku küljest lahti ja seedekulgla eemaldatakse kõhuõõnest.
                                 
                              
                                 
                                    11)
                                 
                                 
                                    Kärbitakse maksaga külgnevat rasvkude ja muid kudesid. Tuleb olla ettevaatlik, et maks ei saaks kriimustada.
                                 
                              
                                 
                                    12)
                                 
                                 
                                    Täppispintsettidega haaratakse kinni maksa väratipiirkonnast ja maks eemaldatakse kõhuõõnest.
                                 
                              
                                 
                                    13)
                                 
                                 
                                    Maks asetatakse alusklaasile. Vajaduse korral eemaldatakse täppispintsettidega maksa pinnalt kogu rasv ja muu kude (nt kõhukelme).
                                 
                              
                                 
                                    14)
                                 
                                 
                                    Maks kaalutakse elektroonilise analüütilise kaaluga; taarana kasutatakse 1,5 ml mikrokatsutit. Maksa mass märgitakse töölehele (täpsusega 0,1 mg). Kontrollitakse mikrokatsuti etiketil oleva identimisteabe õigsust.
                                 
                              
                                 
                                    15)
                                 
                                 
                                    Maksa sisaldav mikrokatsuti suletakse korgiga. Mikrokatsuti paigutatakse jahutavasse (või jääl olevasse) hoidjasse.
                                 
                              
                                 
                                    16)
                                 
                                 
                                    Pärast ühe maksa väljalõikamist puhastatakse lahkamisriistad või asendatakse need puhastega.
                                 
                              
                                 
                                    17)
                                 
                                 
                                    Eespool kirjeldatud viisil eemaldatakse maks kõikidelt transpordimahutis olevatelt kaladelt.
                                 
                              
                                 
                                    18)
                                 
                                 
                                    Pärast seda, kui maks on kõikidelt transpordimahutis olnud kaladelt (st kõigilt katsekambris olnud isas- ja emaskaladelt) eemaldatud, pannakse kõik maksaproovid katsutihoidjasse, mis on varustatud identimisandmetega etiketiga, ja säilitatakse seda sügavkülmikus. Kui maksa hakatakse eeltöötlema varsti pärast väljalõikamist, viiakse proovid jahutavas (või jääl olevas) katsutihoidjas järgmisele töölauale.
                                 
                              Pärast kalalt maksa väljalõikamist on rümp valmis sugunäärmete histoloogiliseks uurimiseks ja teiseste sootunnuste mõõtmiseks.
                        
                           Proov
                        
                        Kui maksaproove ei hakata eeltöötlema vahetult pärast väljalõikamist, säilitatakse neid temperatuuril ≤ – 70 °C.
                        
                           Joonis 1
                        
                        
                           Lõige kääridega tehakse vahetult rinnauimedest eespool.
                        
                        
                           Joonis 2
                        
                        
                           Kõht lõigatakse kääridega keskjoont mööda lahti punktini, mis asub umbes 2 mm pärakust pea pool.
                        
                        
                           Joonis 3
                        
                        
                           Kõhuõõne seinad tõmmatakse pintsettidega laiali, et paljastada maks ja muud siseelundid.
                        
                        (Teise võimalusena võib kõhuõõne seinad küljele lahti tõmmatult kinnitada nõeltega.)
                        Nool näitab maksa.
                        
                           Joonis 4
                        
                        
                           Maks eraldatakse pintsettide abil ümbritsevatest kudedest ja lõigatakse välja.
                        
                        
                           Joonis 5
                        
                        
                           Sooled tõmmatakse pintsettidega ettevaatlikult eemale.
                        
                        
                           Joonis 6
                        
                        
                           Soolestiku kumbki ots ja soolekinnistid lõigatakse kääridega lahti.
                        
                        
                           Joonis 7 (emaskala)
                        
                        
                           Emaskala puhul toimitakse samal viisil.
                        
                        
                           Joonis 8
                        
                        
                           Lõpule viidud lahkamine.
                        
                        
                           
                              Meetod 2B:   jaapani riisikala (Oryzias latipes) maksa eeltöötlemine vitellogeniini määramiseks
                        
                        ELISA komplekti kuuluv pudel homogeniseerimispuhvriga jahutatakse purustatud jää abil maha (lahuse temperatuurini ≤ 4 °C). Kui kasutatakse EnBio ELISA süsteemi homogeniseerimispuhvrit, sulatatakse lahus toatemperatuuril ja jahutatakse seejärel purustatud jääga maha.
                        Maksa massi põhjal arvutatakse vajalik homogeniseerimispuhvri kogus (maksa mg kohta võetakse 50 μl homogeniseerimispuhvrit). Kui maksa mass on näiteks 4,5 mg, on vaja 225 μl homogeniseerimispuhvrit. Koostatakse homogeniseerimispuhvri koguste loetelu kõikide maksade jaoks.
                        
                           Maksa ettevalmistamine eeltöötlemiseks
                        
                        
                                 
                                    1)
                                 
                                 
                                    Maksa sisaldav 1,5 ml mikrokatsuti võetakse sügavkülmikust välja vahetult enne eeltöötlemist.
                                 
                              
                                 
                                    2)
                                 
                                 
                                    Isaskalade maksa eeltöötlus peaks toimuma enne emaskalade maksa eeltöötlust, et hoida ära vitellogeniiniga saastumist. Peale selle peaks katses kasutatavate rühmade maksade eeltöötlemine toimuma järgmises järjekorras: kontrollrühm, lahustiga kontrollrühm (vajaduse korral), madalaima kontsentratsiooniga rühm, keskmise kontsentratsiooniga rühm, kõrgeima kontsentratsiooniga rühm ja positiivne kontroll.
                                 
                              
                                 
                                    3)
                                 
                                 
                                    Sügavkülmikust ei tohiks korraga välja võtta rohkem maksaprooviga 1,5 ml mikrokatsuteid, kui on võimalik üheaegselt tsentrifuugida.
                                 
                              
                                 
                                    4)
                                 
                                 
                                    Maksaprooviga 1,5 ml mikrokatsutid asetatakse jääl olevasse hoidjasse proovi numbril põhinevas järjekorras (maksa ei ole vaja üles sulatada).
                                 
                              
                           Eeltöötluse tegemine
                        
                        1)   Homogeniseerimispuhvri lisamine
                        Homogeniseerimispuhvri koguste loetelust vaadatakse, milline kogus puhvrit tuleb konkreetsele maksaproovile lisada, ning mikropipett (mahuvahemikuga 100–1 000 μl) seatakse vajalikule mahule. Mikropipeti otsa kinnitatakse puhas otsik.
                        Reaktiivipudelist võetakse vajalik kogus homogeniseerimispuhvrit ja lisatakse maksa sisaldavasse 1,5 ml mikrokatsutisse.
                        Homogeniseerimispuhver lisatakse samal viisil kõikidesse maksa sisaldavatesse 1,5 ml mikrokatsutitesse. Mikropipeti otsikut ei ole seejuures vaja vahetada. Kui otsik saastub või tekib saastumise kahtlus, tuleks otsik siiski välja vahetada.
                        2)   Maksa homogeniseerimine
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Mikrokatsutis homogeniseerimise seadmele pannakse uus nui.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Nui viiakse 1,5 ml mikrokatsutisse. Mikrokatsutis homogeniseerimise seadet hoitakse nii, et maks oleks pressitud nuia ja 1,5 ml mikrokatsuti seina vahele.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Homogenisaatoril lastakse töötada 10–20 sekundit. Homogeniseerimise ajal jahutatakse 1,5 ml mikrokatsutit purustatud jääga.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Nui tõstetakse 1,5 ml mikrokatsutist välja ja segul lastakse umbes 10 sekundit seista. Seejärel vaadeldakse suspensiooni.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Kui suspensioonis on näha maksatükikesi, korratakse kolmandat ja neljandat toimingut, et saada rahuldav maksahomogenaat.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Maksasuspensiooni hoitakse jahutatult jääl olevas katsutihoidjas kuni tsentrifuugimiseni.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Enne iga homogeniseerimist vahetatakse homogenisaatori nui uue vastu.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Kõik maksad homogeniseeritakse homogeniseerimispuhvriga vastavalt eespool kirjeldatud korrale.
                                 
                              3)   Homogeniseeritud maksasuspensiooni tsentrifuugimine
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Kontrollitakse, et jahutatud tsentrifuugikambri temperatuur on ≤ 5 °C.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Homogeniseeritud maksasuspensiooniga 1,5 ml mikrokatsutid pannakse jahutatud tsentrifuugi (vajaduse korral tsentrifuug tasakaalustatakse).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Homogeniseeritud maksasuspensiooni tsentrifuugitakse 13 000g juures 10 minutit temperatuuril ≤ 5 °C. Kui supernatant eraldub korralikult, võib tsentrifugaaljõudu ja kestust vastavalt vajadusele muuta.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Pärast tsentrifuugimist kontrollitakse, et supernatant on piisaval määral eraldunud (pinnal – lipiidid, keskel – supernatant, põhjakihis – maksakude). Kui eraldumine ei ole piisav, tsentrifuugitakse suspensiooni samades tingimustes uuesti.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Kõik proovid võetakse jahutatud tsentrifuugist välja ja pannakse proovi numbril põhinevas järjekorras jääl olevasse katsutihoidjasse. Tuleb olla ettevaatlik, et tsentrifuugimisel eraldunud kihte mitte uuesti suspendeerida.
                                 
                              4)   Supernatandi kogumine
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Katsutihoidjasse pannakse neli supernatandi säilitamiseks ette nähtud 0,5 ml mikrokatsutit.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Mikropipetiga võetakse 30 μl supernatanti (keskmine kiht) ja viiakse see ühte 0,5 ml mikrokatsutisse. Tuleb jälgida, et ei võetaks pinnakihist lipiide ega põhjakihist maksakude.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Eespool kirjeldatud viisil võetakse veel supernatanti ja viiakse see kahte teise 0,5 ml mikrokatsutisse.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Mikropipetiga kogutakse ka ülejäänud supernatant (võimaluse korral ≥ 100 μl), mis pannakse viimasesse 0,5 ml mikrokatsutisse. Tuleb jälgida, et ei võetaks pinnakihist lipiide ega põhjakihist maksakude.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    0,5 ml mikrokatsuti suletakse korgiga ja supernatandi maht märgitakse etiketile. Seejärel jahutatakse mikrokatsutid jääl olevas katsutihoidjas viivitamata maha.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Iga kord enne uue supernatandi võtmist vahetatakse mikropipeti otsik uue vastu. Kui otsiku külge kleepub suur kogus lipiide, vahetatakse see kohe uue vastu, et hoida ära maksaekstrakti saastumist rasvaga.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Kõikide tsentrifuugitud proovide supernatant viiakse eespool kirjeldatud korra kohaselt nelja 0,5 ml mikrokatsutisse.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Pärast supernatandi viimist 0,5 ml mikrokatsutitesse pannakse kõik katsutid identimisetiketiga katsutihoidjasse ja külmutatakse seejärel viivitamata sügavkülmikus. Kui vitellogeniini kontsentratsiooni mõõdetakse kohe pärast eeltöötlemist, hoitakse ühte 30 μl supernatanti sisaldavat 0,5 ml mikrokatsutit jahutatult katsutihoidjas ja viiakse see töölauale, kus tehakse ELISA. Sellisel juhul pannakse ülejäänud mikrokatsutid katsutihoidjatesse ja külmutatakse need sügavkülmikus.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Pärast supernatandi kogumist kõrvaldatakse ülejäänud materjal nõuetekohaselt.
                                 
                              
                           Proovide säilitamine
                        
                        Maksahomogenaadi supernatandiga 0,5 ml mikrokatsuteid säilitatakse temperatuuril ≤ – 70 °C kuni ELISA tegemiseni.
                        
                           
                              Meetod 3A:   vöödilise daanio vere võtmine sabaveenist/-arterist
                        
                        Kohe pärast tuimastamist lõigatakse sabavars risti läbi ja veri kogutakse sabaveenist/-arterist hematokriti määramiseks ette nähtud hepariniseeritud mikrokapillaartorusse. Võetava vere kogus on kala suurusest sõltuvalt 5–15 μl. Mikrokapillaartorusse lisatakse võrdne kogus aprotiniiniga puhvrit (6 μg/ml fosfaadiga puhverdatud soolalahuses (PBS)) ja plasma eraldatakse verest tsentrifuugimise teel (5 minutit 600 g juures). Plasma kogutakse katsutitesse ja säilitatakse temperatuuril – 20 °C kuni vitellogeniini või muude huvipakkuvate valkude määramiseni.
                        
                           
                              Meetod 3B:   vöödilise daanio vere võtmine südamepunktsiooniga
                        
                        Vere hüübimise ja valkude lagunemise takistamiseks võetakse proovid PBSi, mis sisaldab hepariini (1 000 ühikut/ml) ja proteaasiinhibiitorit aprotiniini (2 trüpsiiniinhibiitori ühikut (TIU) / ml). Puhvri koostisainetena soovitatakse kasutada hepariini ammooniumisoola ja lüofiliseeritud aprotiniini. Vereproovi võtmiseks soovitatakse kasutada fikseeritud peene nõelaga 1 ml süstalt (nt Braun Omnikan-F). Süstlasse tuleks eelnevalt võtta puhverlahust (ligikaudu 100 μl), et iga kala väike verekogus süstlast täielikult kätte saada. Vereproovid võetakse südamepunktsiooniga. Kõigepealt tuleks kala tuimastada MS-222-ga (100 mg/l). Nõuetekohane tuimastus võimaldab proovivõtjal eristada vöödilise daanio südamelööke. Südame punkteerimisel hoitakse süstla kolbi nõrga tõmbe all. Kogutava vere maht on vahemikus 20–40 mikroliitrit. Pärast südamepunktsiooni tuleks vere ja puhvri segu viia katsutisse. Plasma eraldatakse verest tsentrifuugimise teel (20 minutit 5 000 g juures) ja seda tuleks säilitada –80 °C juures kuni analüüsi tegemiseni.
                        
                           
                              Meetod 3C:   standardne töökord vöödilise daanio pea ja saba homogeniseerimiseks
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Kalad tuimastatakse ja surmatakse humaansel viisil vastavalt katsemeetodi kirjeldusele.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Kala pea ja saba lõigatakse ära nii, nagu on näidatud joonisel 1.
                                    Oluline märkus: kõik lõikeriistad ja lõikelaud tuleks enne iga kala lõikamist loputada ja korralikult puhastada (näiteks 96 % etanooliga), et hoida ära kemikaaliga mitte kokku puutunud isaskalade saastumist emaskalade ja kemikaaliga kokku puutunud isaskalade vitellogeniiniga.
                                    
                                    
                                       Joonis 1
                                    
                                    
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Iga kala pea ja saba kaalutakse koos ja nende summaarne mass määratakse milligrammi täpsusega.
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Pärast kaalumist pannakse need kehaosad sobivasse katsutisse (nt 1,5 ml Eppendorfi katsuti) ja säilitatakse külmutatult – 80 °C juures kuni homogeniseerimiseni või homogeniseeritakse kohe jää peal kahe plastvarda abil. (Võib kasutada ka muid meetodeid, kui homogeniseerimine toimub jää peal ja saadakse homogeenne mass.) Oluline märkus: katsutid peavad olema korralikult nummerdatud, nii et kala pea ja saba on seostatavad kala sugunäärmete histoloogiliseks uurimiseks kasutatava kehatükiga.
                                    
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Pärast ühtlase massi saavutamist lisatakse koe massi neljakordselt ületav kogus jääkülma homogeniseerimispuhvrit
                                        (*11). Jätkatakse varrastega töötlemist, kuni segu on homogeenne. Oluline märkus: iga kala puhul kasutatakse uusi vardaid.
                                    
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Proovid pannakse jääle kuni tsentrifuugimiseni (30 minutit 4 °C ja 50 000g juures).
                                 
                              
                                 
                                    7.
                                 
                                 
                                    Pipetiga pannakse vähemalt kahte katsutisse 20 μl supernatanti; pipeti ots viiakse allapoole pindmist rasvakihti ja supernatant eemaldatakse nii, et rasva- ja sademefraktsioon kaasa ei tuleks.
                                 
                              
                                 
                                    8.
                                 
                                 
                                    Katsuteid säilitatakse temperatuuril – 80 °C kuni proovide kasutamiseni.
                                 
                              
                     
                        7. liide
                        
                           VITELLOGENIINIGA RIKASTATUD PROOVID JA ERI KATSETES KASUTATAV VÕRDLUSSTANDARD
                        
                        Igal vitellogeniinianalüüsi tegemise päeval mõõdetakse ka rikastatud proovi, mis on valmistatud eri katsetes kasutatava võrdlusstandardiga. Vitellogeniin, millest valmistatakse eri katsetes kasutatav võrdlusstandard, peab olema muust partiist kui see, mida kasutatakse asjaomase katse kaliibrimisstandardite tegemiseks.
                        Rikastud proovi valmistamiseks lisatakse teadaolev kogus võrdlusstandardit kontrollrühma isaskalade plasmaproovile. Proovi rikastatakse nii, et saavutatav vitellogeniini kontsentratsioon on 10–100 korda suurem kui kontrollrühma isaskalade plasma eeldatav vitellogeniinisisaldus. Rikastatav kontrollrühma isaskalade plasma võib pärineda kas ühelt või mitmelt kalalt.
                        Kontrollrühma isaskalade rikastamata plasma osaproovi analüüsitakse vähemalt kahes paralleelkannus. Rikastatud plasmat analüüsitakse samuti vähemalt kahes paralleelkannus. Eeldatava kontsentratsiooni arvutamiseks liidetakse plasma rikastamiseks lisatud arvutuslikule vitellogeniinikogusele kontrollrühma isaskalade kahes rikastamata proovis mõõdetud vitellogeniinikoguste keskväärtus. Saadud eeldatava kontsentratsiooni ja mõõdetud kontsentratsiooni suhtarv esitatakse koos iga samal päeval tehtud katse tulemustega.
                     
                     
                        8. liide
                        
                           STATISTILISE ANALÜÜSI VALIMISE VOOSKEEM
                        
                        
                     C.49.   Ägeda mürgisuse katse kalaembrüotega
                     
                     SISSEJUHATUS
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 236 (2013). Selles kirjeldatakse vöödilise daanio (Danio rerio) embrüotele avalduva ägeda mürgisuse katset. Käesolev meetod on ette nähtud kemikaalide ägeda mürgisuse määramiseks embrüonaalses arengujärgus kaladel. See põhineb vöödilise daanioga tehtud uuringutel ja valideerimistel (1–14). Käesolevat katsemeetodit on edukalt kasutatud paljude eri kemikaalide puhul, millel on erinev toimemehhanism, lahustuvus, lenduvus ja hüdrofoobsus (vastav ülevaade on esitatud viidetes 15 ja 16).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Käesolevas katsemeetodis kasutatud mõisted on määratletud 1. liites.
                              
                           KATSE PÕHIMÕTE
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Vöödilise daanio äsja viljastatud marjaterad viiakse 96 tunniks kokkupuutesse uuritava kemikaaliga. Iga 24 tunni järel registreeritakse letaalsuse näitajatena kuni nelja järgmise lõppnäitaja vaatluse tulemused (6): i) viljastatud marjaterade koaguleerumine, ii) somiitide moodustumata jäämine, iii) sabaalgme rebukotist eraldumata jäämine ja iv) südamelöökide puudumine. Kokkupuuteperioodi lõpus määratakse äge mürgisus positiivsete tulemuste alusel, mis saadakse ükskõik millises nimetatud neljast lõppnäitaja vaatlusest, ning arvutatakse LC50.
                              
                           LÄHTEKAALUTLUSED
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Iga aine kohta on muu hulgas kasulik teada selle struktuurivalemit, molekulmassi, puhtust, püsivust vees ja valguse käes, pKa-d, Kow-d, lahustuvust vees ja aururõhku, samuti kiire biolagundatavuse katse tulemusi (katsemeetod C.4 (17) või C.29 (18)). Lahustuvuse ja aururõhu põhjal võib arvutada Henry konstandi, mis võimaldab hinnata, kas katse ajal võib esineda uuritava kemikaali kadu aurustumise tõttu. Aine kvantifitseerimiseks katselahuses peaks olemas olema usaldusväärne teadaoleva dokumenteeritud täpsuse ja avastamispiiriga analüüsimeetod.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Kui käesolevat katsemeetodit kasutatakse segu analüüsimiseks, peaks selline segu olema võimalikult hästi iseloomustatud, näiteks selle koostisainete keemilise määratluse, kvantitatiivse sisalduse ja iga koostisaine omaduste kaudu (vt punkt 4). Enne katsemeetodi kasutamist segu analüüsimiseks kohustuslikus korras tuleks kaaluda, kas meetodiga saadakse taotletava regulatiivse eesmärgi jaoks vastuvõetavad tulemused.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Ainete puhul, mis võidakse aktiveerida metabolismi teel, on leitud tõendeid selle kohta, et vöödilise daanio embrüod on võimelised neid biomuundama (19–22). Metabolism kalaembrüos ei ole siiski alati sarnane noorjärgus või täiskasvanud kalade metabolismiga. Näiteks ei ole kalaembrüotega tehtud ägeda mürgisuse katses suudetud tuvastada mürkaine lähteaine allüülalkoholi (9) mürgisust. Seepärast soovitatakse juhul, kui on alust arvata, et kemikaali metaboliidid või muud asjakohased muundamissaadused võivad olla lähteühendist mürgisemad, vaadelda katses ka selliseid metaboliite/muundamissaadusi ja võtta saadud tulemusi uuritava kemikaali mürgisuse üle otsustamisel arvesse või teha teise võimalusena eraldi katse metabolismi täiendavaks arvessevõtmiseks.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Ainete puhul, mille molekulmass on ≥ 3 kDa, millel on väga ulatuslik molekulaarstruktuur või mis põhjustavad koorumise hilinemist, nii et koorumisjärgne kokkupuude ainega võib puududa või toimuda väiksemal määral, ei eeldata embrüote tundlikkust neile, kuna sellise aine biosaadavus on piiratud; sel juhul võib olla sobivam kasutada mõnda muud mürgisuse hindamise meetodit.
                              
                           KATSE NÕUETEKOHASUS
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Katsetulemused on nõuetekohased, kui on täidetud järgmised kriteeriumid:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             viljastamise üldmäär kõikide kogutud marjaterade seas peaks katsealuses partiis olema ≥ 70 %;
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             veetemperatuur katsekambrites peaks katse mis tahes hetkel olema 26 ± 1 °C;
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             embrüote üldine elulemus peaks negatiivse (lahjendusveega) kontrolli ja vajaduse korral lahustiga kontrolli puhul olema 96 tunni pikkuse kokkupuute lõpuks ≥ 90 %;
                                          
                                       
                                             d)
                                          
                                          
                                             kokkupuutel positiivse kontrolliga (nt vöödilise daanio puhul 3,4-dikloroaniliin kontsentratsioonis 4,0 mg/l) peaks suremus olema 96 tunni pikkuse kokkupuute lõpuks vähemalt 30 %;
                                          
                                       
                                             e)
                                          
                                          
                                             koorumise määr negatiivse kontrolli (ja vajaduse korral lahustiga kontrolli) puhul peaks olema 96 tunni pikkuse kokkupuute lõpuks ≥ 80 %;
                                          
                                       
                                             f)
                                          
                                          
                                             lahustunud hapniku sisaldus negatiivse kontrolli ja suurima katses kasutatud kontsentratsiooni puhul peaks 96 tunni pikkuse kokkupuute lõpuks olema ≥ 80 % küllastuskontsentratsioonist.
                                          
                                       
                           MEETODI KIRJELDUS
                     
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Soovitatavate pidamis- ja katsetingimuste ülevaade on esitatud 2. liites.
                              
                           
                        Seadmed
                     
                     
                              
                                 10.
                              
                              
                                 On vaja järgmisi seadmeid:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             soovitatava biomassisisalduse jaoks piisava suurusega keemiliselt inertsest materjalist (nt klaasist) akvaariumid (vt punkt 14 „Sugukalade pidamine“);
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             invertmikroskoop ja/või binokulaarmikroskoop suurendusvõimega vähemalt 80 korda. Kui vaatluste registreerimise ruumis ei ole võimalik saavutada temperatuuri 26 ± 1 °C, on vaja kasutada reguleeritava temperatuuriga liigutatavat preparaadihoidjat või mõnda muud temperatuuri hoidmiseks sobivat meetodit;
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             katsekambrid, nt standardsed 24 kannuga plaadid sügavusega umbes 20 mm (vt punkt 11 „Katsekambrid“);
                                          
                                       
                                             d)
                                          
                                          
                                             materjal 24-kannulise plaadi katmiseks, nt isekleepuv foolium;
                                          
                                       
                                             e)
                                          
                                          
                                             reguleeritava temperatuuriga inkubaator või kliimaseadmega ruum, mis võimaldab hoida plaadi kannudes (või katsekambrites) temperatuuri 26 ± 1 °C;
                                          
                                       
                                             f)
                                          
                                          
                                             pH-meeter;
                                          
                                       
                                             g)
                                          
                                          
                                             hapnikumõõtur;
                                          
                                       
                                             h)
                                          
                                          
                                             seadmed vee kareduse ja juhtivuse määramiseks;
                                          
                                       
                                             i)
                                          
                                          
                                             kudemisalus: klaasist, roostevabast terasest või muust inertsest materjalist instrumendinõu; roostevabast terasest või muust inertsest materjalist traatvõrk (silma suurus 2 ± 0,5 mm) koetud marjaterade kaitseks; kudemissubstraat (nt inertsest materjalist kunsttaimed) (katsemeetodi C.48 4A liide (23));
                                          
                                       
                                             j)
                                          
                                          
                                             laia otsaga pipetid marjaterade kogumiseks;
                                          
                                       
                                             k)
                                          
                                          
                                             klaasnõud eri kontsentratsiooniga katselahuste ja lahjendusvee valmistamiseks (keeduklaasid, mõõtekolvid, -silindrid ja -pipetid) ja vöödilise daanio marjaterade kogumiseks (nt keeduklaasid, kristalliseerimisnõud);
                                          
                                       
                                             l)
                                          
                                          
                                             kui katse läbiviimiseks kasutatakse teistsugust kokkupuutesüsteemi, näiteks läbivoolusüsteemi (24) või passiivset doseerimissüsteemi (25), on vaja selleks sobivaid ruume ja seadmeid.
                                          
                                       
                           
                        Katsekambrid
                     
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Tuleks kasutada klaasist või polüstüreenist katsekambreid (nt 24-kannulised plaadid kannu mahutavusega 2,5–5 ml). Kui kahtlustatakse adsorbeerumist polüstüreenile (nt mittepolaarsete, tasapinnalise struktuuri ja suure KOW-ga ainete puhul), tuleks adsorbeerumisest tingitud kao vähendamiseks kasutada inertset materjali (klaas) (26). Katsekambrite paigutus inkubaatoris peaks olema juhuslik.
                              
                           
                        Vesi ja katsetingimused
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Kalade pidamise vett soovitatakse lahjendada, et saavutada pinnavee paljude eri tüüpide puhul tavapärane karedus. Lahjendusvesi tuleks valmistada taastatud veest (27). Lõppkaredus peaks vastama CaCO3 sisaldusele 100–300 mg/l, et ei toimuks kaltsiumkarbonaadi ulatuslikku väljasadenemist. Võib kasutada ka põhjalikult iseloomustatud pinna- või kaevuvett. Taastatud vett võib kalade pidamise vee väikese kareduse arvessevõtmiseks lahjendada deioniseeritud veega suhtes kuni 1:5, nii et saavutatav karedus vastaks CaCO3 sisaldusele vähemalt 30–35 mg/l. Enne uuritava kemikaali lisamist aereeritakse vett hapnikuga küllastumiseni. Kannudes tuleks kogu katse vältel hoida temperatuuri 26 ± 1 °C. Lahuse pH peaks olema vahemikus 6,5–8,5 ning ei tohiks katse kestel varieeruda selles vahemikus rohkem kui 1,5 ühikut. Kui pH ei püsi eeldatavalt selles vahemikus, tuleks enne katse algust pH-d reguleerida. Seda tuleks teha nii, et põhilahuse kontsentratsioon sellest märkimisväärselt ei muutuks ning uuritav kemikaal ei sadeneks ega osaleks üheski keemilises reaktsioonis. Uuritavat kemikaali sisaldava lahuse pH reguleerimiseks soovitatakse kasutada vesinikkloriidi (HCl) või naatriumhüdroksiidi (NaOH).
                              
                           
                        Katselahused
                     
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Valitud kontsentratsiooniga katselahused võib valmistada näiteks põhilahuse lahjendamise teel. Põhilahuse valmistamiseks tuleks uuritavat kemikaali lahjendusvees mehaanilisel teel (nt segamine ja/või ultrahelitöötlus) soovitatavalt lihtsalt segada või loksutada. Kui uuritav kemikaal on vees raskesti lahustuv, tuleks järgida raskesti uuritavaid aineid ja segusid käsitlevas OECD juhenddokumendis nr 23 kirjeldatud korda (28). Lahusti kasutamisest tuleks hoiduda, kuid mõnel juhul võib see olla sobiva kontsentratsiooniga põhilahuse valmistamiseks vajalik. Kui põhilahuse valmistamise hõlbustamiseks kasutatakse lahustit, ei tohiks selle lõppsisaldus olla suurem kui 100 μl/l ja peaks kõikides katsenõudes olema sama. Lahusti kasutamise korral on vaja kasutada täiendavat lahustiga kontrolli.
                              
                           
                        Sugukalade pidamine
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Marja saamiseks kasutatakse kemikaaliga mitte kokku puutunud looduslikku vöödilise daanio sugukarja, kus marjaterade viljastamise määr on korralikult dokumenteeritud. Kaladel ei tohiks ilmneda mingeid makroskoopiliselt tuvastatavaid nakatumis- ega haigusnähte ning neile ei tohiks kudemisele eelneva 2 kuu jooksul olla antud aktiiv- või profülaktilise ravi eesmärgil mingeid ravimeid. Sugukarja kalu peetakse akvaariumis soovitatavalt tihedusel üks kala liitri vee kohta ning valgustusperioodi kindlaksmääratud pikkus on 12–16 tundi (29–33). Filtrimiskiirus peaks olema optimaalne; tuleks hoiduda vee ulatuslikku liikumist põhjustava liiga suure filtrimiskiiruse kasutamisest. Söötmistingimusi on kirjeldatud 2. liites. Tuleks jälgida, et sööta ei jääks üle, ning kontrollida korrapäraselt vee kvaliteeti ja akvaariumi puhtust ning vajaduse korral taastada algseisund.
                              
                           
                        Pädevuse tõendamise katsed
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Kasutatava kalaliini tundlikkuse kontrollimiseks tuleks soovitatavalt kaks korda aastas teha kogu kontsentratsioonist sõltuvuse vahemikku hõlmav katse võrdluskemikaali 3,4-dikloroaniliiniga, mida kasutati valideerimiskatsetes (1, 2). Nimetatud võrdluskemikaali tuleks kasutada igas laboris, kus käesolev katsemeetod esmakordselt kasutusele võetakse. Seda kemikaali võib laboris kasutada katse tegemiseks vajaliku tehnilise pädevuse tõendamiseks enne regulatiivsel eesmärgil andmete esitamist.
                              
                           
                        Marja saamine
                     
                     
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Vöödilise daanio marjaterad võib saada kudemisrühmadest (eraldi kudemisnõudes) või masskudemise teel (kalade pidamise nõudes). Kudemisrühmade puhul viiakse sugukarja isas- ja emaskalad (nt suhtes 2:1) katsele eelneval päeval mõni tund enne pimeduse saabumist kudemisnõudesse. Kuna vöödilise daanio puhul võib kudemine mõnes kudemisrühmas ebaõnnestuda, soovitatakse kasutada paralleelselt vähemalt kolme kudemisnõu. Geneetilise representatiivsuse tagamiseks kogutakse marjaterad vähemalt kolmest kudemisrühmast, segatakse omavahel ja tehakse juhuslik valik.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Kudemisalus pannakse marjaterade kogumiseks kudemisnõusse või kalade pidamise nõusse katsele eelneval päeval enne pimeduse saabumist või katse alguspäeval enne valguse saabumist. Kudemisalus kaetakse inertse traatvõrguga, millel on sobiv silma suurus (umbes 2 ± 0,5 mm), et vöödilise daanio täiskasvanud isendid marjateri ära ei sööks. Vajaduse korral võib kudemise soodustamiseks kinnitada võrgu külge inertsest materjalist (nt plastist või klaasist) kunsttaimi (3–5, 23, 35). Tuleks kasutada kulunud plastmaterjali, mille puhul ei toimu (nt ftalaatide) leostumist. Paaritumine, kudemine ja viljastamine leiavad aset 30 minuti jooksul pärast valguse saabumist ja seejärel võib kudemisalused koos marjateradega ettevaatlikult eemaldada. Kudemisaluselt kogutud marjateri soovitatakse loputada taastatud veega.
                              
                           
                        Marjaterade eristamine
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Temperatuuril 26 °C toimub umbes 15 minuti pärast viljastatud marjaterade esimene lõigustumine ning järgnevate sünkroonsete lõigustumiste tulemusena tekib 4, 8, 16 ja 32 blastomeeri (vt 3. liide) (35). Selles etapis on viljastatud marjaterad blastula väljakujunemise järgi selgelt eristatavad.
                              
                           KATSE KÄIK
                     
                        Kokkupuutetingimused
                     
                     
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Uuritava kemikaaliga viiakse kokkupuutesse 20 embrüot ühe kontsentratsioonipunkti kohta (üks embrüo kannu kohta). Kokkupuutekontsentratsioon ei tohi kogu katse vältel erineda kemikaali nominaalsest kontsentratsioonist rohkem kui ± 20 %. Kui see ei ole staatilises süsteemis võimalik, tuleks lahust poolstaatilise režiimi kohaselt sobiva sagedusega uuendada (nt iga 24 tunni järel). Sel juhul tuleb kokkupuutekontsentratsioone kontrollida iga sellise kokkupuuteperioodi alguses ja lõpus vähemalt suurimal ja väikseimal katsekontsentratsioonil (vt punkt 36). Kui kokkupuutekontsentratsiooni ei suudeta hoida vahemikus ± 20 % nominaalsest kontsentratsioonist, tuleb iga kokkupuuteperioodi alguses ja lõpus mõõta kõik kontsentratsioonid (vt punkt 36). Lahuse uuendamise ajal tuleks jälgida, et embrüod oleksid kaetud väikese koguse vana katselahusega ega jääks kuivale. Katseplaani võib kohandada vastavalt konkreetse ainega seotud katsenõuetele (nt läbivoolusüsteemi (24) või passiivse doseerimissüsteemi (25) kasutamine hõlpsalt lagundatava või väga adsorbeeruva aine jaoks (29) või mõne muu süsteemi kasutamine lenduva aine jaoks (36, 37)). Igal juhul tuleks hoolitseda selle eest, et embrüotele põhjustataks võimalikult vähe stressi. Katselahust tuleks enne katse alustamist vähemalt 24 tundi katsekambris hoida. Katsetingimuste ülevaade on esitatud 2. liites.
                              
                           
                        Katsekontsentratsioonid
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Tavaliselt piisab statistikanõuete täitmiseks viiest uuritava kemikaali kontsentratsioonist, mille jada konstantne tegur ei ole suurem kui 2,2. Kui kasutatakse vähem kui viit kontsentratsiooni, tuleks seda põhjendada. Katses kasutataval suurimal kontsentratsioonil peaks suremus olema soovitatavalt 100 % ning väikseimal katses kasutataval kontsentratsioonil peaks punktis 28 kirjeldatud täheldatav mõju soovitatavalt puuduma. Kontsentratsioonivahemiku leidmise katse läbiviimine enne lõplikku katset võimaldab valida sobiva kontsentratsioonivahemiku. See viiakse tavaliselt läbi kümne embrüoga kontsentratsioonipunkti kohta. Allpool esitatud juhiste puhul on eeldatud, et katse tehakse 24-kannuliste plaatidega. Teistsuguste katsekambrite (nt väikeste Petri tasside) või suurema arvu kontsentratsioonide kasutamise korral tuleb neid juhiseid vastavalt kohandada.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Üksikasjalik teave ja visuaalsed juhised kontsentratsioonipunktide jaotamise kohta 24-kannulistel plaatidel on esitatud punktis 27 ja 4. liites joonisel 1.
                              
                           
                        Kontrollid
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Lahjendusveega kontrolle on vaja kasutada nii negatiivse kontrollina kui ka plaadisisese kontrollina. Kui plaadisisese kontrolli puhul täheldatakse üle 1 surnud embrüo, jäetakse asjaomane plaat kõrvale ning seega väheneb LC50 leidmiseks kasutatavate kontsentratsioonide arv. Terve plaadi kõrvalejätmine võib raskendada täheldatud mõju hindamist ja eristamist, eriti juhul, kui kõrvale jäetakse lahustiga kontrollplaat või plaat, kus mõju on avaldunud ka kemikaaliga kokku puutunud embrüotele. Esimesel juhul tuleb katset korrata. Teisel juhul võib terve(te) katserühma(de) kõrvaldamine sisemises kontrollis täheldatud suremuse tõttu piirata mõju hindamise ja LC50 määramise võimet.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Iga katses kasutatava marjaterade partii puhul kasutatakse positiivse kontrollina 3,4-dikloroaniliini kindlaksmääratud kontsentratsioonil 4 mg/l.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Lahusti kasutamise korral viiakse täiendav 20 embrüost koosnev rühm eraldi 24-kannulisel plaadil kokkupuutesse lahustiga – seda vaadeldakse lahustiga kontrollrühmana. Katse võib lugeda nõuetekohaseks, kui on tõendatud, et lahusti ei mõjuta märkimisväärselt koorumiseni kuluvat ajavahemikku ega elulemust ega avalda embrüotele muud negatiivset mõju (vt punkti 8 alapunkt c).
                              
                           
                        Kokkupuute algus ja katse kestus
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Katset alustatakse võimalikult kiiresti pärast marjaterade viljastamist ja see lõpetatakse 96 tunni pikkuse kokkupuuteperioodi lõppedes. Embrüod peaksid olema ümbritsetud katselahusest enne blastodiski lõigustumise algust või hiljemalt 16-rakulisse staadiumisse jõudmise ajaks. Kokkupuute alustamiseks võimalikult väikese viivitusega valitakse juhuslikult vähemalt kaks korda suurem arv marjateri, kui on vajalik kõikide katserühmade jaoks, ja viiakse need hiljemalt 90 minutit pärast viljastamist eri kontsentratsiooniga lahustesse ja kontroll-lahustesse (nt 100 ml kristalliseerimisnõusse; marjaterad peaksid olema täielikult kaetud).
                              
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Elujõulised viljastatud marjaterad tuleks eraldada viljastamata marjateradest ja viia 24-kannulistele plaatidele, mida on eelnevalt 24 tundi katsetingimustes hoitud ja mille kannud on 180 minuti jooksul pärast viljastamist uuesti täidetud 2 ml värskelt valmistatud katselahusega. Stereomikroskoobi abil (soovitatavalt ≥ 30-kordse suurendusega) valitakse välja lõigustuvad viljastatud marjaterad, millel ei täheldata nähtavaid lõigustumishäireid (nt asümmeetriat, vesiikulite moodustumist) ega koorioni kahjustusi. Marjaterade kogumist ja eraldamist on kirjeldatud 3. liites joonistel 1 ja 3 ning 4. liites joonisel 2.
                              
                           
                        Marjaterade jaotamine 24-kannulistele plaatidele
                     
                     
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Marjaterad jaotatakse kannudega plaatidele järgmiselt (vt ka 4. liite joonis 1):
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             20 marjatera ühele plaadile iga katsekontsentratsiooni kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             20 marjatera ühele lahustiga kontrollplaadile (vajaduse korral);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             20 marjatera ühele positiivse kontrolli plaadile;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             4 marjatera lahjendusvees plaadisisese kontrollina igale eespool nimetatud plaadile;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             24 marjatera lahjendusvees ühele negatiivse kontrolli plaadile.
                                          
                                       
                           
                        Vaatlused
                     
                     
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Iga katses kasutatava embrüo puhul tehtavad lõppnäitajate vaatlused hõlmavad järgmist: embrüo koaguleerumine, somiitide moodustumata jäämine, saba eraldumata jäämine ja südamelöökide puudumine (tabel 1). Nende vaatluste tulemusi kasutatakse letaalsuse kindlakstegemiseks: ükskõik millise kõnealuse vaatluse positiivne tulemus tähendab seda, et asjaomane vöödilise daanio embrüo on surnud. Peale selle registreeritakse katse- ja kontrollrühmades alates esimese 48 tunni möödumisest iga päev koorumise määr. Vaatlustulemused registreeritakse iga 24 tunni järel, kuni katse on lõppenud.
                                 
                                    Tabel 1
                                 
                                 
                                    Lõppnäitajate vaatlused ägeda mürgisuse hindamiseks vöödilise daanio embrüotel 24–96 tundi pärast viljastamist
                                 
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Kokkupuuteaeg
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             24 tundi
                                          
                                          
                                             48 tundi
                                          
                                          
                                             72 tundi
                                          
                                          
                                             96 tundi
                                          
                                       
                                             Embrüote koaguleerumine
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Somiitide moodustumata jäämine
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Saba eraldumata jäämine
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Südamelöökide puudumine
                                          
                                          
                                              
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                           
                              
                                 29.
                              
                              
                                 
                                    Embrüote koaguleerumine: koaguleerunud embrüod on piimjasvalged ja näevad mikroskoobi all välja tumedad (vt 5. liite joonis 1). Koaguleerunud embrüote arv tehakse kindlaks pärast 24, 48, 72 ja 96 tunni möödumist.
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 
                                    Somiitide moodustumata jäämine: normaalselt arenevas vöödilise daanio embrüos moodustub esimese 24 tunni jooksul temperatuuril 26 ± 1 °C umbes 20 somiiti (vt 5. liite joonis 2). Normaalselt arenenud embrüo liigutab end spontaanselt (kokkutõmbed küljelt küljele). Spontaansed liigutused annavad tunnistust somiitide moodustumisest. Somiitide puudumine registreeritakse pärast 24, 48, 72 ja 96 tunni möödumist. Somiitide moodustumata jäämine esimese 24 tunni jooksul võib olla tingitud arengu üldisest pidurdumisest. Somiidid peaksid olema tekkinud hiljemalt 48 tunni jooksul. Vastasel juhul loetakse asjaomane embrüo surnuks.
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 
                                    Saba eraldumata jäämine: normaalselt arenevas vöödilise daanio embrüos täheldatakse saba eraldumist rebukotist (vt 5. liite joonis 3) pärast embrüo keha tagaosa pikenemist. Saba eraldumata jäämine registreeritakse pärast 24, 48, 72 ja 96 tunni möödumist.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 
                                    Südamelöökide puudumine: normaalselt arenevas vöödilise daanio embrüos on südamelöögid temperatuuril 26 ± 1 °C vaadeldavad pärast 48 tunni möödumist (vt 5. liite joonis 4). Selle lõppnäitaja registreerimisel tuleb olla eriti hoolikas, kuna ebakorrapäraseid südamelööke ei tohiks registreerida letaalsuse ilminguna. Peale selle ei peeta letaalseks ilminguks nähtavaid südamelööke ilma ringluseta kõhuaordis. Selle lõppnäitaja registreerimiseks tuleks embrüoid, kellel südamelöögid puuduvad, jälgida vähemalt 80-kordsel suurendusel vähemalt ühe minuti vältel. Südamelöökide puudumine registreeritakse pärast 48, 72 ja 96 tunni möödumist.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Koorumise määr nii katse- kui ka kontrollrühmades tuleks registreerida alates esimese 48 tunni möödumisest ja esitada see katseprotokollis. Ehkki koorumist ei kasutata lõppnäitajana LC50 arvutamiseks, võib see näitaja aidata andmeid tõlgendada, kuna koorumisega tagatakse embrüo kokkupuude kemikaaliga, ilma et koorioni võimalik kaitsefunktsioon seda takistaks.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Vöödilise daanio embrüo normaalset arengut (35) ja ebanormaalse arengu näiteid on üksikasjalikult kirjeldatud ja kujutatud 3. ja 5. liites.
                              
                           
                        Analüütilised mõõtmised
                     
                     
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Katse alguses ja lõpus mõõdetakse kontrollrühma(de)s ja uuritava kemikaali suurima kontsentratsiooniga rühmas pH, üldkaredus ja juhtivus. Uuendamisel põhinevas poolstaatilises süsteemis tuleks pH mõõta enne ja pärast vee vahetamist. Lahustunud hapniku sisaldus mõõdetakse katse lõpus negatiivses kontrollis ja suurimal katses kasutatud kontsentratsioonil, mille juures embrüod on elujõulised; nendes rühmades peab see olema vastavuses katse nõuetekohasuse kriteeriumidega (vt punkti 8 alapunkt f). Kui on kahtlus, et temperatuur 24-kannuliste plaatide lõikes kõigub, mõõdetakse temperatuur kolmes juhuslikult valitud nõus. Soovitatavalt tuleks temperatuuri katse vältel registreerida pidevalt või vähemalt kord päevas.
                              
                           
                              
                                 36.
                              
                              
                                 Staatilises süsteemis tuleks uuritava kemikaali sisaldus mõõta katse alguses ja lõpus vähemalt väikseimal ja suurimal katses kasutataval kontsentratsioonil, kuid soovitatavalt igal katsekontsentratsioonil. Poolstaatilises (uuendamisega) katses, kus uuritava kemikaali sisaldus püsib eeldatavalt vahemikus ± 20 % nominaalväärtusest, soovitatakse seda analüüsida vähemalt suurimal ja väikseimal katsekontsentratsioonil pärast värske lahuse valmistamist ja vahetult enne lahuse uuendamist. Katsete puhul, kus uuritava kemikaali sisaldus ei püsi eeldatavalt vahemikus ± 20 % nominaalväärtusest, tuleb seda analüüsida kõikidel katsekontsentratsioonidel pärast värske lahuse valmistamist ja vahetult enne lahuse uuendamist. Kui lahust ei ole analüüsimiseks piisavalt, võib olla kasu katselahuste ühtekoondamisest või selliste asenduskambrite kasutamisest, mis on samast materjalist kui 24-kannulised plaadid ja millel on sama ruumala ja pindala suhe. On tungivalt soovitatav, et tulemused põhineksid mõõdetud kontsentratsioonidel. Kui kontsentratsioonid ei püsi vahemikus 80–120 % nominaalväärtusest, tuleks mõju avaldumise kontsentratsioone väljendada kontsentratsiooni mõõdetud väärtuste geomeetrilise keskmise suhtes; seda on üksikasjalikumalt kirjeldatud OECD juhenddokumendi „Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures“ („Raskesti uuritavate ainete ja segude veekeskkonnas avalduva mürgisuse uurimine“) (28) 5. peatükis.
                              
                           PIIRSISALDUSKATSE
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud korra alusel võib teha piirsisalduskatse uuritava kemikaali kontsentratsioonil 100 mg/l või katsekeskkonnas lahustuvuse piirkontsentratsioonil (olenevalt sellest, kumb neist on väiksem) ja selle abil tõendada, et kemikaali LC50 on sellest kontsentratsioonist suurem. Piirsisalduskatses tuleks kasutada nii katserühma kui ka positiivse kontrolli ja vajaduse korral lahustiga kontrolli puhul 20 embrüot ning negatiivse kontrolli puhul 24 embrüot. Kui suremuse määr katses kasutatud kontsentratsioonil on vähemalt 10 % suurem kui negatiivse (või lahustiga) kontrolli puhul, tuleks läbi viia täismahus uuring. Mis tahes täheldatud mõju tuleks registreerida. Kui negatiivse (või lahustiga) kontrolli puhul on suremus suurem kui 10 %, loetakse katsetulemused kehtetuks ja katset tuleks korrata.
                              
                           ANDMED JA ARUANDLUS
                     
                        Andmete töötlemine
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Käesoleva katsemeetodi puhul käsitletakse iga üksikut kannu statistilises analüüsis sõltumatu paralleelproovina. Selliste embrüote protsentuaalne osakaal, mille puhul vähemalt ühe lõppnäitaja vaatluse tulemus on 48 ja/või 96 tunni möödudes positiivne, kantakse graafikule sõltuvuses katsekontsentratsioonist. Saadud kõvera tõusude, LC50 ja usaldusnivoole 95 % vastavate usalduspiiride arvutamiseks tuleks kasutada sobivaid statistikameetodeid (38) ja tutvuda OECD juhenddokumendiga „Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data“ („Praegused meetodid ökotoksilisuse andmete statistiliseks analüüsiks“) (39).
                              
                           
                        Katseprotokoll
                     
                     
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Katseprotokoll peaks sisaldama järgmist teavet.
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Uuritav kemikaal:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         ühest koostisosast koosnev aine:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne, sealhulgas vajaduse korral orgaanilise süsiniku sisaldus;
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     võimalikult täpne omaduste kirjeldus, nt koostisosade keemiline määratlus (vt eespool), kvantitatiivne sisaldus ja asjakohased füüsikalis-keemilised omadused.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Katseorganismid:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         teaduslik nimetus, liin, päritolu ning viljastatud marjaterade kogumise ja järgneva käitlemise meetod.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Katsetingimused:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kasutatud katserežiim (nt uuendamisega poolstaatiline režiim);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         valgustusperiood;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katseplaan (nt katsekambrite arv, kontrollide liigid);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vee kvaliteedinäitajad kalade pidamisel (nt pH, karedus, temperatuur, juhtivus, lahustunud hapniku sisaldus);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         lahustunud hapniku sisaldus, pH, üldkaredus, temperatuur ja juhtivus katselahustes katse alguses ja 96 tundi hiljem;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         põhilahuste ja katselahuste valmistamise meetod ning lahuse uuendamise sagedus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         lahusti kasutamise põhjendus ja lahusti valiku põhjendus, kui lahustina ei kasutata vett;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         nominaalsed katsekontsentratsioonid ja kõik katsenõudes oleva uuritava kemikaali sisalduse määramise tulemused; tuleks esitada ka meetodiga saavutatav tuvastamise tõhusus ja määramispiir;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         tõendid selle kohta, et üldist elulemust käsitlevad nõuetekohasuse kriteeriumid on kontrollrühmades täidetud;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         marjaterade viljastamise määr;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         koorumise määr katse- ja kontrollrühmades.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Tulemused:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         suurim kontsentratsioon, mille puhul katse vältel ei täheldata suremust;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         väikseim kontsentratsioon, mille puhul suremus katse vältel on 100 %;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kumulatiivne suremus soovitatavatel vaatlusaegadel iga kontsentratsiooni juures;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         suremuse näitajana LC50 väärtus 96 tunni (ja soovi korral 48 tunni) möödudes, võimaluse korral koos usalduspiiridega usaldusnivool 95 %;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kontsentratsiooni ja katse lõpuks täheldatava suremuse vahelise sõltuvuse graafik;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         suremus kontrollrühmades (negatiivne kontroll, plaadisisesed kontrollid, positiivne kontroll ja lahusti kasutamisel lahustiga kontroll);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kõigi nelja lõppnäitaja vaatluse tulemusi kajastavad andmed;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         võimalike morfoloogiliste ja füsioloogiliste kõrvalekallete esinemissagedus ja kirjeldus (näited on esitatud 5. liite joonisel 2);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katse käigus esinenud vahejuhtumid, mis võisid mõjutada tulemusi;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         andmete statistiline analüüs ja töötlemine (probitanalüüs, logistilise regressiooni mudel ja geomeetriline keskmine seoses LC50-ga);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse (teisendatud) kõvera regressioonisirge tõus ja usalduspiirid.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Kõik kõrvalekalded käesolevast katsemeetodist ja sellekohased selgitused.
                                             
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Tulemuste arutelu ja tõlgendamine.
                                             
                                          
                                       
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2011). Validation Report (Phase 1) for the Zebrafish Embryo Toxicity Test: Part I and Part II. Series on Testing and Assessment No. 157. OECD, Pariis.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2012). Validation Report (Phase 2) for the Zebrafish Embryo Toxicity Test: Part I and Part II (Annexes). Series on Testing and Assessment No. 179. OECD, Pariis.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Braunbeck, T., Böttcher, M., Hollert, H., Kosmehl, T., Lammer, E., Leist, E., Rudolf, M., ja Seitz, N. (2005). Towards an alternative for the acute fish LC50 test in chemical assessment: The fish embryo toxicity test goes multi-species – an update. ALTEX 22: 87–102.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 ISO (2007). International Standard. Water quality – Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs (Danio rerio). ISO 15088:2007(E). Rahvusvaheline Standardiorganisatsioon.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Nagel, R. (2002). DarT: The embryo test with the zebrafish (Danio rerio) – a general model in ecotoxicology and toxicology. ALTEX 19: 38–48.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Schulte, C., ja Nagel, R. (1994). Testing acute toxicity in embryo of zebrafish, Brachydanio rerio as alternative to the acute fish test – preliminary results. ATLA 22: 12–19.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Bachmann, J. (2002). Development and validation of a teratogenicity screening test with embryos of the zebrafish (Danio rerio). Doktoritöö. Dresdeni Tehnikaülikool, Saksamaa.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Lange, M., Gebauer, W., Markl, J., ja Nagel, R. (1995). Comparison of testing acute toxicity on embryo of zebrafish (Brachydanio rerio), and RTG-2 cytotoxicity as possible alternatives to the acute fish test. Chemosphere 30 (11): 2087–2102.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Knöbel, M., Busser, F. J. M., Rico-Rico, A., Kramer, N. I., Hermens, J. L. M., Hafner, C., Tanneberger, K., Schirmer, K., ja Scholz, S. (2012). Predicting adult fish acute lethality with the zebrafish embryo: relevance of test duration, endpoints, compound properties, and exposure concentration analysis. Environ. Sci. Technol. 46: 9690–9700.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Kammann, U., Vobach, M., ja Wosniok, W. (2006). Toxic effects of brominated indoles and phenols on zebrafish embryos. Arch. Environ. Con. Tox. 51: 97–102.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Groth, G., Kronauer, K., ja Freundt, K. J. (1994). Effects of N,N-diemethylformamide and its degradation products in zebrafish embryos. Toxicol. In Vitro 8: 401–406.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Groth, G., Schreeb, K., Herdt, V., ja Freundt, K. J. (1993). Toxicity studies in fertilized zebrafish fish eggs treated with N-methylamine, N,N-dimethylamine, 2-aminoethanol, isopropylamine, aniline, N-methylaniline, N,N-dimethylaniline, quinone, chloroacetaldehyde, or cyclohexanol. B. Environ. Contam. Tox. 50: 878–882.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Nguyen, L. T., ja Janssen, C. R. (2001). Comparative sensitivity of embryo-larval toxicity assays with African catfish (Clarias gariepinus) and zebra fish (Danio rerio). Environ. Toxicol. 16: 566–571.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Cheng, S. H., Wai, A. W. K., So, C. H., ja Wu, R. S. S. (2000). Cellular and molecular basis of cadmium-induced deformities in zebrafish embryos. Environ. Toxicol. Chem. 19: 3024–3031.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Belanger, S. E., Rawlings, J. M., ja Carr, G. J. (2013). Use of Fish Embryo Toxicity Tests for the Prediction of Acute Fish Toxicity to Chemicals. Environ. Toxicol. Chem. 32: 1768-1783.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Lammer, E., Carr, G. J., Wendler, K., Rawlings, J. M., Belanger, S. E., ja Braunbeck, T. (2009). Is the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio) a potential alternative for the fish acute toxicity test? Comp. Biochem. Phys. C 149 (2): 196–209.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.4 „Kohese biolagunduvuse määramine“.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.29 „Kiire biolagundatavus – CO2 suletud nõudes (vabaruumi katse)“.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Weigt, S., Huebler, N., Strecker, R., Braunbeck, T., ja Broschard, T. H. (2011). Zebrafish (Danio rerio) embryos as a model for testing proteratogens. Toxicology 281: 25–36.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Weigt, S., Huebler, N., Strecker, R., Braunbeck, T., ja Broschard, T. H. (2012) Developmental effects of coumarin and the anticoagulant coumarin derivative warfarin on zebrafish (Danio rerio) embryos. Reprod. Toxicol. 33: 133–141.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Incardona, J. P, Linbo, T. L., ja Scholz, N. L. (2011). Cardiac toxicity of 5-ring polycyclic aromatic hydrocarbons is differentially dependent on the aryl hydrocarbon receptor 2 isoform during zebrafish development. Toxicol. Appl. Pharm. 257: 242–249.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Kubota, A., Stegeman, J. J., Woodin, B. R., Iwanaga, T., Harano, R., Peterson, R. E., Hiraga, T., ja Teraoka, H. (2011). Role of zebrafish cytochrome P450 CYP1C genes in the reduced mesencephalic vein blood flow caused by activation of AHR2. Toxicol. Appl. Pharm. 253: 244–252.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.48 „Lühiajaline kalade paljunemise katse“. Vt 4A liide.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Lammer, E., Kamp, H. G., Hisgen, V., Koch, M., Reinhard, D., Salinas, E. R., Wendlar, K., Zok, S., ja Braunbeck, T. (2009). Development of a flow-through system for the fish embryo toxicity test (FET) with zebrafish (Danio rerio). Toxicol. In Vitro 23: 1436–1442.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Brown, R. S., Akhtar, P., Åkerman, J., Hampel, L., Kozin, I. S., Villerius, L. A., ja Klamer, H. J. C. (2001). Partition controlled delivery of hydrophobic substances in toxicity tests using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) ﬁlms. Environ. Sci. Technol. 35: 4097–4102.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Schreiber, R., Altenburger, R., Paschke, A., ja Küster, E. (2008). How to deal with lipophilic and volatile organic substances in microtiter plate assays. Environ. Toxicol. Chem. 27: 1676–1682.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 ISO (1996). International Standard. Water quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)]. ISO 7346-3: Flow-through method. Kättesaadav aadressil http://www.iso.org.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Series on Testing and Assessment No. 23. OECD, Pariis.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Laale, H. W. (1977). The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio, in fisheries research. A literature review. J. Fish Biol. 10: 121–173.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Westerfield, M. (2007). The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). 5. väljaanne. Neuroteaduste instituut, Oregoni Ülikool. University of Oregon Press, Eugene, USA.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Canadian Council on Animal Care (2005). Guidelines on: the Care and Use of Fish in Research, Teaching and Testing. ISBN: 0-919087-43-4. http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Fish.pdf
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Euroopa Komisjon (2007). Komisjoni soovitus 2007/526/EÜ, 18. juuni 2007, teaduslikes katsetes ja muudel teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade pidamise ja hooldamise suuniste kohta (teatavaks tehtud numbri K(2007) 2525 all) (http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2007:197:0001:0089:ET:PDF).
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Euroopa Liit (2010). Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiiv 2010/63/EL, 22. september 2010, teaduslikel eesmärkidel kasutatavate loomade kaitse kohta. 
                                       Euroopa Liidu Teataja L 276, 20.10.2010, lk 33.
                                 http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:ET:PDF
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Nagel, R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling (Brachydanio rerio, Ham.-Buch.). J. Appl. Ichthyol. 2: 173–181.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., ja Schilling, T. F. (1995). Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dynam. 203: 253–310.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.2 „Daphnia sp. liikumisvõime akuutse pärssimise katse“.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Weil, M., Scholz, S., Zimmer, M., Sacher, F., ja Duis, K. (2009). Gene expression analysis in zebrafish embryos: a potential approach to predict effect conentrations in the fish early life stage test. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1970–1978.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 ISO (2006). International Standard. Water quality – Guidance on statistical interpretation of ecotoxicity data. ISO TS 20281. Kättesaadav aadressil http://www.iso.org.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 OECD (2006). Guidance Document on Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No. 54. OECD, Pariis.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Braunbeck, T., ja Lammer, E. (2006). Põhjalik ülevaateartikkel „Fish embryo toxicity assays“. UBA aruanne lepingu nr 20385422 raames. Saksamaa Keskkonnaamet, Berliin. 298 lk.
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Lõppnäitaja
                           – näitaja, mis iseloomustab mõju populatsiooni tasandil.
                        
                           
                              Blastula
                           – animaalsel poolusel paiknev rakukogum, mis katab teatava osa rebust.
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Epiboolia
                           – peamiselt epidermaalsete rakkude massiline paljunemine embrüo arengu gastrulatsioonietapis ja nende rakkude liikumine dorsaalselt küljelt ventraalsele; selle käigus sopistub endodermaalne rakukiht invaginatsiooni meenutava protsessi tagajärjel sisse ja rebu haaratakse embrüo koosseisu.
                        
                           
                              Läbivoolukatse
                           – katse, mille puhul katselahused voolavad kokkupuuteperioodi vältel pidevalt läbi katsesüsteemi.
                        
                           
                              Plaadisisene kontroll
                           – sisemine kontroll, mis hõlmab 24-kannulisel plaadil lahjendusveega täidetud 4 kannu ning võimaldab tuvastada plaadi võimalikku saastumist tootja või katset tegeva teadlase süül ja plaadiga seotud mis tahes võimalikku mõju katsetulemustele (nt temperatuurigradient).
                        
                           
                              IUPAC
                           – Rahvusvaheline Puhta Keemia ja Rakenduskeemia Liit.
                        
                           
                              Kalade pidamise vesi
                           – vesi, mida kasutatakse täiskasvanud kalade pidamiseks.
                        
                           
                              Letaalne mediaankontsentratsioon (LC50)
                           – uuritava kemikaali hinnanguline kontsentratsioon, mille juures kemikaal on katse vältel letaalne 50 protsendile katseorganismidest.
                        
                           
                              Poolstaatiline uuendamisega katse
                           – katse, mille käigus katselahuseid uuendatakse korrapäraselt kindlaksmääratud ajavahemike (nt iga 24 tunni) järel.
                        
                           
                              SMILES
                           – Simplified Molecular Input Line Entry Specification (lihtsustatud molekulaarse sisendrea sisestamissüsteem).
                        
                           
                              Somiit
                           – selgroogsete embrüo arengus on somiidid neuraaltoru külgedel paiknevad mesodermaalsed rakumassid, millest lõpuks arenevad pärisnahk (dermatoom), skeletilihased (müotoom) ja selgroolülid (sklerotoom).
                        
                           
                              Staatiline katse
                           – katse, mille puhul katselahuseid katse käigus ei uuendata.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                        
                           
                              UVCB
                           – tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.
                     
                     
                        2. liide
                        
                           KALADE PIDAMINE JA KASVATAMINE NING VÖÖDILISE DAANIO EMBRÜOTEGA TEHTAVA ÄGEDA MÜRGISUSE KATSE TAVAPÄRASED TINGIMUSED
                        
                        
                                    
                                       Vöödiline daanio (Danio rerio)
                                    
                                 
                              
                                    Liigi päritolu
                                 
                                 
                                    India, Birma, Malaka, Sumatra
                                 
                              
                                    Sooline dimorfism
                                 
                                 
                                    Emased: esileulatuv kõht marja kandmise ajal
                                    Isased: saledamad, oranži värvusega siniste pikitriipude vahel (eriti selgelt nähtav pärakuuime juures)
                                 
                              
                                    Söötmisrežiim
                                 
                                 
                                    Kuiv helvessööt 3–5 korda päevas (maksimaalselt 3 % kala kehamassist päevas); täiendavalt soolase vee krevettide (Artemia sp.) noorjärgus isendid ja/või saastumata allikast pärit sobiva suurusega väikesed kiivrikud. Elussööt on keskkonda rikastav ja seepärast tuleks seda võimaluse korral alati anda. Optimaalse veekvaliteedi tagamiseks tuleks sööda ülejääk ja väljaheited eemaldada umbes üks tund pärast söötmist.
                                 
                              
                                    Täiskasvanud kala ligikaudne mass
                                 
                                 
                                    Emased: 0,65 ± 0,13 g
                                    Isased: 0,5 ± 0,1 g
                                 
                              
                                    Sugukalade pidamine
                                 
                                 
                                    Valgustus
                                 
                                 
                                    Luminofoorlambid (laia spektriga); 10–20 μE/m2/s, 540–1080 luksi või 50-100 ft-c (labori üldvalgustus); valgustusperiood 12–16 tundi
                                 
                              
                                    Vee temperatuur
                                 
                                 
                                    26 ± 1 °C
                                 
                              
                                    Vee kvaliteet
                                 
                                 
                                    O2 sisaldus: ≥ 80 % küllastuskontsentratsioonist; karedus: nt ~ 30–300 mg CaCO3 liitri kohta; NO3
                                       – sisaldus: ≤ 48 mg/l; NH4
                                       + ja NO2
                                       – sisaldus: < 0,001 mg/l; kloorijääkide sisaldus: < 10 μg/l; orgaanilistes ühendites sisalduva kloori üldsisaldus: < 25 ng/l; pH: 6,5–8,5
                                 
                              
                                    Täiendavad vee kvaliteedi kriteeriumid
                                 
                                 
                                    Tahkete osakeste sisaldus < 20 mg/l, orgaanilise süsiniku üldsisaldus < 2 mg/l, fosfororgaaniliste pestitsiidide üldsisaldus <50 ng/l, kloororgaaniliste pestitsiidide ja polüklooritud bifenüülide üldsisaldus < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Kalade pidamiseks kasutatava akvaariumi suurus
                                 
                                 
                                    Nt 180 liitrit; 1 kala liitri kohta
                                 
                              
                                    Veepuhastus
                                 
                                 
                                    Pidev (söefiltri abil); muu võimalusena võib seda kombineerida perioodilisel uuendamisel põhineva poolstaatilise süsteemi või vee pideval uuendamisel põhineva läbivoolusüsteemiga
                                 
                              
                                    Soovitatav isas- ja emaskalade suhtarv kudemisel
                                 
                                 
                                    2:1 (või masskudemine)
                                 
                              
                                    Kudemisnõud
                                 
                                 
                                    Nt 4-liitrised nõud, mille põhjas on terasvõrk ja mis sisaldavad kudemise soodustamiseks kunsttaimi; välised soojendusmatid või masskudemine kalade pidamiseks kasutatavates akvaariumides
                                 
                              
                                    Marjaterade struktuur ja välimus
                                 
                                 
                                    Stabiilne koorion (st väga läbipaistev, mittekleepuv, läbimõõduga ~ 0,8–1,5 mm)
                                 
                              
                                    Kudemismäär
                                 
                                 
                                    Üks suguküps emaskala koeb vähemalt 50–80 marjatera päevas. Kalaliinist sõltuvalt võib kudemismäär olla oluliselt suurem. Viljastamismäär peaks olema ≥ 70 %. Esmakordselt kudevate kalade puhul võib marjaterade viljastamise määr paaril esimesel kudemisel olla väiksem.
                                 
                              
                                    Katse tüüp
                                 
                                 
                                    Staatiline, uuendamisega poolstaatiline või läbivoolukatse, 26 ± 1 °C, 24 tunni vältel katsetingimustega kohandatud katsekambrid (nt 24-kannulised plaadid, 2,5–5 ml lahust kannu kohta)
                                 
                              
                     
                        3. liide
                        
                           VÖÖDILISE DAANIO NORMAALNE ARENG TEMPERATUURIL 26 oC
                        
                        
                     
                        4. liide
                        
                           Joonis 1
                        
                        
                           Jaotusskeem 24-kannulisel plaadil
                        
                        
                                    1–5
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    viis katsekontsentratsiooni kemikaali kohta;
                                 
                              
                                    nC
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    negatiivne kontroll (lahjendusvesi);
                                 
                              
                                    iC
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    plaadisisene kontroll (lahjendusvesi);
                                 
                              
                                    pC
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    positiivne kontroll (3,4-dikloroaniliin, 4 mg/l);
                                 
                              
                                    sC
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    lahustiga kontroll
                                 
                              
                           Joonis 2
                        
                        
                           Vöödilise daanio embrüotega tehtava ägeda mürgisuse katse skeem (vasakult paremale): marja heitmine, marjaterade kogumine, kokkupuute-eelne periood klaasnõudes vahetult pärast viljastamist, viljastatud marjaterade valimine invertmikroskoobi või binokulaarmikroskoobi abil ja nende jaotamine 24-kannulistele plaatidele, kuhu on eelnevalt lisatud asjakohase kontsentratsiooniga katselahus või kontroll-lahus; n – vajalik marjaterade arv katsekontsentratsiooni/kontrolli kohta (siin 20), tpv – tundi pärast viljastamist.
                        
                     
                        5. liide
                        
                           VÖÖDILISE DAANIO EMBRÜOTEGA TEHTAVAS ÄGEDA MÜRGISUSE KATSES TÄHELDATAVA LETAALSE MÕJU LÕPPNÄITAJATE ATLAS
                        
                        Ägedale mürgisusele ja sellest tulenevale embrüo surmale viitavad järgmised lõppnäitajad: embrüo koaguleerumine, saba eraldumata jäämine, somiitide moodustumata jäämine ja südamelöökide puudumine. Nende lõppnäitajate illustreerimiseks on valitud järgmised mikrograafid.
                        
                           Joonis 1
                        
                        
                           Embrüo koaguleerumine:
                        
                        vöödilise daanio koaguleerunud embrüotel täheldatakse helevälja meetodil valgustamisel mitmesuguseid läbipaistmatuid inklusioone.
                        
                           Joonis 2
                        
                        
                           Somiitide moodustumata jäämine:
                        
                        ehkki pildil a kujutatud 24 tunni vanune vöödilise daanio embrüo on arengus umbes 10 tundi maha jäänud, on sellel näha hästi välja kujunenud somiidid (→), kuid pildil b kujutatud embrüo puhul ei esine mingeid märke somiitide moodustumisest (→). Ehkki pildil c kujutatud 48 tunni vanusel vöödilise daanio embrüol võib täheldada silmatorkavat rebukoti turset (*), on sellel moodustunud selgelt eristatavad somiidid (→), kuid pildil d kujutatud 96 tunni vanuse embrüo puhul ei esine mingeid märke somiitide moodustumisest (→). Samuti tuleks tähele panna pildil d kujutatud embrüo selgroo kõverust (skolioos) ja perikardi turset (*).
                        
                           Joonis 3
                        
                        
                           Sabaalgme eraldumata jäämine külgvaates
                        
                        
                           Joonis 4
                        
                        
                           Südamelöökide puudumist
                        
                        Südamelöökide puudumist on määratlusest tulenevalt keeruline mikrograafil kujutada. Südamelöökide puudumisele viitab südame (topeltnool) kokkutõmmete puudumine. Vererakkude liikumatus näiteks kõhuaordis (→ suurendatud pildil) ei ole südamelöökide puudumise näitaja. Samuti tuleks tähele panna somiitide puudumist kujutatud embrüol (*; lihaskude on homogeenne, mitte segmenteerunud). Südamelöökide puudumise registreerimiseks tuleks embrüot vaadelda vähemalt 80-kordsel suurendusel vähemalt ühe minuti vältel.
                     
                     C.50.   Settevaba mürgisuskatse Myriophyllum spicatum'iga
                     
                     SISSEJUHATUS
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 238 (2014). Selle abil on võimalik hinnata kemikaalide mürgisust perekonda vesikuusk kuuluvale kaheidulehelisele veesisesele liigile Myriophyllum spicatum. Meetod põhineb olemasoleval ASTMi katsemeetodil (1), mida on kohandatud settevabas katsesüsteemis kasutamiseks (2), et võimaldada hinnata uuritava kemikaali tegelikku ökotoksilisust (olenemata kemikaali vee ja sette vahel jaotumise näitajatest). Setteta katsesüsteemis on analüüsimine hõlbus (üksnes veefaasis) ja tulemusi on võimalik vaadelda paralleelselt ja/või võrdluses Lemna sp. põhise katse tulemustega (3); peale selle võimaldavad nõutavad steriilsed tingimused tagada, et mikroorganismide ja vetikate mõju (kemikaali omastamine/lagundamine jne) on võimalikult väike. Käesolev katsemeetod ei asenda muid veekeskkonnas avalduva mürgisuse hindamise meetodeid, vaid pigem täiendab neid ja võimaldab täielikumalt hinnata ohte ja riske veetaimedele. Käesolev meetod on valideeritud võrdlusuuringuga (4).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Meetodis kirjeldatakse katse üksikasju uuendatava katselahuse (poolstaatiline režiim) ja mitteuuendatava katselahuse (staatiline režiim) kasutamisel. Olenevalt katse eesmärgist ja regulatiivsetest nõuetest on soovitatav kasutada poolstaatilist režiimi näiteks selliste ainete puhul, mis kaovad lahusest kiiresti lendumise, adsorbeerumise, fotolagunemise, hüdrolüüsumise, sadenemise või biolagunemise tõttu. Täiendavad juhised on esitatud viites 5. Käesolevat katsemeetodit kohaldatakse ainete puhul, mille jaoks see on valideeritud (üksikasjalik teave on esitatud võrdlusuuringu aruandes (4)), ning valmististe ja teadaolevate segude puhul; segu analüüsimisel peaksid selle koostisosad olema võimalikult suures ulatuses määratletud ja kvantifitseeritud. Käesolev Myriophyllum spicatum'il põhinev settevaba katsemeetod täiendab Myriophyllum spicatum'ile süsteemis vesi/sete avalduva mürgisuse hindamise meetodit (6). Enne katsemeetodi kasutamist segu analüüsimiseks regulatiivsel eesmärgil tuleks kaaluda, kas ja kuidas see meetod võimaldab saada taotletava eesmärgi jaoks vastuvõetavad tulemused. Seda ei ole vaja kaaluda, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud.
                              
                           KATSE PÕHIMÕTE
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Pidevalt kasvavatel Myriophyllum spicatum'i taimedel (kasutatakse üksnes muudetud Andrewsi söödet; vt 2. liide) lastakse kasvada settevabas katsesüsteemis monokultuurina 14 päeva eri kontsentratsioonides esineva uuritava kemikaali juuresolekul. Katse eesmärk on kirjeldada valitud mõõdetava muutuja alusel kvantitatiivselt kemikaali mõju vegetatiivsele kasvule nimetatud perioodi jooksul. Mõõdetavad muutujad on võrsete, külgharude ja juurte pikkus, samuti märgmass ja kuivmass ning männaste arv. Peale selle võetakse arvesse katseorganismidel täheldatavaid spetsiifilisi kvalitatiivseid muutusi, näiteks väliseid moonutusi, kloroosi ja nekroosi, millele viitab kolletumine või valge-pruunikirju värvus. Kemikaali mõju kvantitatiivseks hindamiseks võrreldakse kasvu katselahuses kasvuga kontrollrühmas ning tehakse kindlaks kontsentratsioon, mille juures kasv pidurdub teatud kindla protsendi x võrra; seda kontsentratsiooni väljendatakse kujul ECx, kus x võib olla regulatiivsetest nõuetest sõltuvalt mis tahes väärtusega – nt EC10, EC20 või EC50. Tuleks tähele panna, et EC10 ja EC20 hinnanguline väärtus on usaldusväärne ja asjakohane üksnes sellise katse puhul, kus kontrolltaimi iseloomustav variatsioonikordaja on hinnatava mõju ulatusest väiksem; see tähendab, et EC20 usaldusväärseks hindamiseks peaks variatsioonikordaja olema < 20 %.
                              
                           
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Töödeldud ja töötlemata taimedel tuleks määrata nii keskmine kasvu erikiirus kui ka saagis (kumbagi näitajat hinnatakse peavõrse pikkuse ja kolme täiendava mõõdetava muutuja alusel). Leitud kasvu erikiirust (r) ja saagist (y) kasutatakse vastavalt ErCx (nt ErC10, ErC20, ErC50) ja EyCx (nt EyC10, EyC20, EyC50) määramiseks.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Peale selle võib statistiliselt kindlaks teha vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsiooni ja täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni.
                              
                           TEAVE UURITAVA KEMIKAALI KOHTA
                     
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Analüüsimeetod uuritava kemikaali sisalduse määramiseks katsesöötmes peaks olema piisava tundlikkusega. Katsetingimuste kindlaksmääramiseks võib uuritava kemikaali kohta olla kasulik teada muu hulgas järgmisi andmeid: struktuurivalem, puhtus ja lisandid, lahustuvus vees, püsivus vees ja valguse käes, happe dissotsiatsioonikonstant (pKa), jaotuskoefitsient süsteemis oktanool/vesi (Kow), aururõhk ja biolagundatavus. Vees lahustuvuse ja aururõhu põhjal võib arvutada Henry konstandi, mis võimaldab hinnata, kas uuritava kemikaali märkimisväärne kadu katse ajal on tõenäoline. See aitab kindlaks teha, kas sellise kao ärahoidmiseks tuleks võtta konkreetseid meetmeid. Kui puuduvad kindlad andmed uuritava kemikaali lahustuvuse ja püsivuse kohta, soovitatakse hinnata neid omadusi katses kasutatavates tingimustes, st samas söötmes ning sama temperatuuri ja valgusrežiimi juures.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Katsesöötme pH reguleerimine on eriti oluline näiteks juhul, kui analüüsitakse metalle või kergesti hüdrolüüsuvaid aineid. Täiendavad juhised selliste kemikaalide mõju hindamiseks, mille füüsikalis-keemilised omadused raskendavad nende uurimist, on esitatud asjaomases OECD juhenddokumendis (5).
                              
                           KATSE NÕUETEKOHASUS
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Katse vastab nõuetele, kui peavõrse pikkuse kahekordistumise aeg kontrollrühmas on lühem kui 14 päeva. Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud söötmete ja katsetingimuste kasutamisel on see kriteerium täidetav nii staatilise kui ka poolstaatilise katserežiimi puhul.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Võrsete märgmassi (st katse alguses ja katse lõpus saadud väärtuste) ja täiendavate mõõdetud näitajate (vt punkt 37) alusel arvutatud saagise keskmine paralleelkultuuride vaheline variatsioonikordaja ei tohi kontrollrühmas olla suurem kui 35 %.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Kontrollrühmas peavad üle 50 % paralleelkultuuridest püsima 14 päeva pikkuse kokkupuuteperioodi vältel steriilsena, st need ei tohi olla nähtavalt saastunud muude organismidega, näiteks vetikate, seente või bakteritega (selge lahus). Märkus: steriilsuse hindamise juhised on esitatud võrdlusuuringu aruandes (4).
                              
                           VÕRDLUSKEMIKAAL
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Katsemeetodi kontrollimiseks võib kasutada ühte või mitut võrdluskemikaali, näiteks võrdlusuuringus (4) kasutatud 3,5-diklorofenooli; võrdlusuuringu andmete põhjal jäävad 3,5-diklorofenooli EC50 keskväärtused eri uuritavate muutujate puhul (vt käesoleva katsemeetodi punktid 37–41) vahemikku 3,2–6,9 mg/l (üksikasjalik teave nende väärtuste usaldusvahemiku kohta on esitatud võrdlusuuringu aruandes). Võrdluskemikaaliga kontrollimist soovitatakse teha vähemalt kaks korda aastas või kui katseid tehakse harvem, siis uuritava kemikaali mürgisuse määramisega samaaegselt.
                              
                           MEETODI KIRJELDUS
                     
                        Seadmed
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Kõik katsesöötmega kokku puutuvad seadmed peaksid olema klaasist või muust keemiliselt inertsest materjalist. Kultuuride kasvatamiseks ja katseteks kasutatavad klaasnõud peaksid olema steriilsed ja katsesöötmesse leostuda võivatest keemilistest saasteainetest puhastatud. Katsenõud peavad olema piisavalt kõrged, et kontrollnõudes olevad võrsed saaksid kasvada veefaasis ega jõuaks katse lõpuks katsesöötme pinnale. Soovitatakse kasutada servarandita ja alumiiniumkorgiga paksuseinalisi boorsilikaatklaasist katseklaase siseläbimõõduga umbes 20 mm ja pikkusega umbes 250 mm.
                              
                           
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Kuna muudetud Andrewsi sööde sisaldab sahharoosi (mis soodustab seente ja bakterite kasvu), tuleb katselahused valmistada steriilsetes tingimustes. Enne kasutamist steriliseeritakse kõik vedelikud ja seadmed. Selleks töödeldakse neid 4 tunni vältel kuuma õhuga (210 °C) või autoklaavitakse 20 minutit 121 °C juures. Peale selle töödeldakse kõiki kolbe, nõusid, kausse jms ning muid seadmeid vahetult enne kasutamist steriilsel töölaual leegiga.
                              
                           
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Kultuure ja katsenõusid ei tohiks hoida koos. Seepärast on kõige parem kasutada eraldi kasvukambreid, inkubaatoreid või ruume. Valgustihedus ja temperatuur peaksid olema reguleeritavad ja neid tuleks hoida konstantsena.
                              
                           
                        Katseorganism
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 
                                    Myriophyllum spicatum – veesisene kaheiduleheline liik – kuulub perekonda vesikuusk. Ajavahemikul juunist augustini ilmuvad veepinna kohale silmatorkamatud roosakasvalged õied. Taimed on juurdunud tugevate risoomide süsteemi abil ja neid võib leida kogu põhjapoolkeral eutroofsetes, kuid saastumata ja lubjarikkamates mudase põhjaga seisuveekogudes. Myriophyllum spicatum eelistab magevett, kuid võib esineda ka riimvees.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Settevaba mürgisuskatse jaoks on vaja steriilseid taimi. Kui laboris, kus katset tehakse, ei kultiveerita tavaliselt Myriophyllum spicatum'it, võib steriilse taimse materjali saada mõnest muust laborist või hankida (mittesteriilsed) taimed loodusest või kaubandusliku tarnija käest; kui taimed saadakse loodusest, tuleks ette näha liigilise kuuluvuse kontrollimine. Loodusest kogutud või kaubanduslikult tarnijalt saadud taimed tuleks enne kasutamist steriliseerida (1) ja kultiveerida neid vähemalt kaheksa nädalat katses kasutatavas söötmes. Loodusliku lähtekultuuri kogumiskohas ei tohi esineda ilmseid saasteallikaid. Myriophyllum spicatum'i kogumisel loodusest tuleks hoolega jälgida, et võetakse õige liigi taimed, eriti piirkonnas, kus see liik võib hübridiseeruda teiste Myriophyllum'i liikidega. Teisest laborist saadud taimi tuleks enne kasutamist kultiveerida samal viisil vähemalt kolm nädalat. Taimse materjali allikas ning katses kasutatud liik tuleks alati märkida katseprotokolli.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Katses kasutatavate taimede kvaliteet ja ühetaolisus mõjutavad märkimisväärselt katsetulemust ning seepärast tuleks taimi hoolikalt valida. Tuleks kasutada kiirelt kasvavaid noori taimi, millel pole nähtavaid kahjustusi ega värvimuutusi (kloroos). Katseorganismi ettevalmistamist on üksikasjalikult kirjeldatud 4. liites.
                              
                           
                        Kultiveerimine
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Kultuuride hooldamissageduse vähendamiseks (nt kui teatava aja jooksul ei kavandata katseid vesikuusega) võib kultuure hoida vähendatud valgustiheduse ja madalama temperatuuri juures (50 μE m– 2 s– 1, 20 ± 2 °C). Kultiveerimist on üksikasjalikult kirjeldatud 3. liites.
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Vähemalt 14–21 päeva enne katset viiakse piisav arv katseorganisme aseptiliselt värskesse steriilsesse söötmesse ja neid kasvatatakse katsetingimustes eelkultuurina 14–21 ööpäeva. Eelkultuuri loomist on üksikasjalikult kirjeldatud 4. liites.
                              
                           
                        Katsesööde
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Settevabas katsesüsteemis soovitatakse kasutada Myriophyllum spicatum'i jaoks ainult ühte söödet, nagu on kirjeldatud 2. liites. Myriophyllum spicatum'i kultiveerimiseks ja sellega katsete tegemiseks on soovitatav kasutada muudetud Andrewsi söödet, nagu on kirjeldatud viites 1. Muudetud Andrewsi sööde saadakse viiest eraldi valmistatud toitainete põhilahusest, millele lisatakse 3 % sahharoosi. Söötme valmistamist on üksikasjalikult kirjeldatud 2. liites.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Katselahuste valmistamiseks (asjakohase lahjendamise teel) on vajalik kümnekordselt kontsentreeritud muudetud Andrewsi sööde. Selle söötme koostis on esitatud 2. liites.
                              
                           
                        Katselahused
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Katselahused valmistatakse tavaliselt põhilahuse lahjendamise teel. Uuritava kemikaali põhilahuse valmistamiseks lahustatakse kemikaal tavaliselt demineraliseeritud (st destilleeritud või deioniseeritud) vees. Toitainete lisamiseks kasutatakse kümnekordselt kontsentreeritud muudetud Andrewsi söödet.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Uuritava kemikaali põhilahuse võib steriliseerida autoklaavimisega 20 minuti jooksul 121 °C juures või filtrimise teel, eeldusel, et uuritav kemikaal kasutatava steriliseerimismeetodi puhul ei denatureeru. Katselahused võib valmistada ka steriilse demineraliseeritud vee või söötmega steriilsetes tingimustes. Uuritava kemikaali põhilahuse steriliseerimise meetodi valikul tuleks arvesse võtta kemikaali termilist püsivust ja adsorbeerumist eri pindadele. Seepärast on soovitatav valmistada põhilahus steriilsetes tingimustes, st lahustada uuritav kemikaal steriilsete materjalide abil steriilsetes tingimustes (nt leegis steriliseerimine, laminaarkapp vms) steriilses vees. Kõnealune steriilse põhilahuse valmistamise meetod on rakendatav nii ainete kui ka segude puhul.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Üldjuhul ei tohiks uuritava kemikaali suurim kasutatav kontsentratsioon ületada kemikaali vees lahustuvuse piirkontsentratsiooni katsetingimustes. Vees raskesti lahustuva kemikaali puhul võib olla vaja kasutada selle kemikaali kontsentreeritud põhilahuse või dispersiooni valmistamiseks orgaanilist lahustit või dispergeerivat ainet, et hõlbustada uuritava kemikaali täpse koguse lisamist katsesöötmesse ja soodustada kemikaali lahustumist või dispergeerumist. Tuleks teha kõik selleks, et selliseid aineid ei oleks vaja kasutada. Lisatav lahusti või dispergeeriv aine ei tohiks olla fütotoksiline. Tavaliselt kasutatavad lahustid, mis kuni kontsentratsioonini 100 μl/l ei ole fütotoksilised, on näiteks atsetoon ja dimetüülformamiid. Lahusti või dispergeeriva aine kasutamisel peaks selle lõppsisaldus olema võimalikult väike (≤ 100 μl/l) ja tuleks märkida katseprotokolli ning kõigi katse- ja kontrollkultuuride puhul tuleks kasutada lahusti või dispergeeriva aine ühesugust kontsentratsiooni. Täiendavad juhised dispergeeriva aine kasutamise kohta on esitatud viites 5.
                              
                           
                        Katse- ja kontrollrühmad
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Uuritava kemikaali sobivate kontsentratsioonide valimine on hõlpsam, kui kemikaali mürgisus Myriophyllum spicatum'ile on kontsentratsioonivahemiku leidmise katsega eelnevalt kindlaks tehtud. Lõplikus mürgisuse hindamise katses tuleks üldjuhul kasutada viit (nagu käesoleva lisa peatükis C.26 kirjeldatud Lemna kasvu pidurdumise katses) kuni seitset katsekontsentratsiooni geomeetrilises jadas; kõnealune kontsentratsioonivahemik tuleks valida nii, et see hõlmaks täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni ja EC50. Katsekontsentratsioonide jada tegur ei tohiks soovitatavalt olla suurem kui 3,2; kontsentratsiooni ja mõju vahelise nõrga sõltuvuse puhul võib siiski kasutada suuremat tegurit. Kui kasutatakse vähem kui viit kontsentratsiooni, tuleks seda põhjendada. Uuritava kemikaali iga kontsentratsiooni puhul tuleks kasutada vähemalt viit paralleelkultuuri.
                              
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Kontsentratsioonivahemiku leidmise katses ja/või mürgisuse hindamise lõplikus katses kasutatavate kontsentratsioonide valimisel tuleks arvesse võtta järgmist.
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             ECx määramisel peaks ECx väärtus jääma kasutatavasse kontsentratsioonivahemikku, et tagada tulemuste piisav usaldusväärsus. Näiteks peaks EC50 määramisel suurim katsekontsentratsioon olema suurem kui EC50 väärtus. Kui EC50 väärtus jääb kasutatavast kontsentratsioonivahemikust väljapoole, on asjaomane usaldusvahemik lai ja lähendatud mudeli sobivust katseandmetega ei pruugi olla võimalik statistiliselt hinnata.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Kui eesmärk on leida vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsioon või täheldatava toime puudumise kontsentratsioon, peaks väikseim katsekontsentratsioon olema piisavalt väike, et kasv ei oleks selle kontsentratsiooni juures oluliselt aeglasem kui kontrollrühmas. Peale selle peaks suurim katsekontsentratsioon olema piisavalt suur, et kasv oleks selle kontsentratsiooni juures oluliselt aeglasem kui kontrollrühmas. Vastasel juhul tuleb katset korrata ning kasutada seejuures teistsugust kontsentratsioonivahemikku (kui suurim kasutatav kontsentratsioon ei ole juba võrdne lahustuvuse piirkontsentratsiooniga või suurima nõutava kontsentratsiooniga, näiteks 100 mg/l).
                                          
                                       
                           
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Iga katse peaks hõlmama kontrolle, mille puhul kasutatakse sama söödet ja katseorganismi (eelkultuurist valitakse võimalikult homogeenne taimne materjal: noored külgharud, mis lühendatakse otsast mõõtes 2,5 sentimeetrini) ning samu keskkonnatingimusi ja meetodeid kui katsenõude puhul, kuid uuritav kemikaal jäetakse lisamata. Lahusti või dispergeeriva aine kasutamise korral tuleks lisaks valmistada kontrollkultuur, milles lahusti või dispergeeriva aine kontsentratsioon on sama kui uuritavat kemikaali sisaldavates nõudes. Paralleelseid kontrollnõusid (ja vajaduse korral lahustiga nõusid) peaks olema vähemalt kümme.
                              
                           
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Kui ei ole vaja määrata täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni, võib katseplaani muuta nii, et suurendatakse uuritava kemikaali kontsentratsioonide arvu ja vähendatakse paralleelide arvu iga kontsentratsiooni kohta. Paralleelseid kontrollkultuure peab siiski olema vähemalt kümme.
                              
                           
                        Kokkupuude
                     
                     
                              
                                 29.
                              
                              
                                 Eelkultuurist võetud noored külgharud, mis on lõigatud otsast mõõdetuna 2,5 cm pikkuseks, jaotatakse aseptilistes tingimustes juhuslikkuse alusel katsenõudesse; iga katsenõu peaks sisaldama ühte 2,5 cm pikkust külgharu, mille ühes otsas asub tipmine meristeem. Valitud taimne materjal peaks olema kõikides katsenõudes sama kvaliteediga.
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 Katsenõude paigutus inkubaatoris peab olema juhuslik, et vähendada asukohast tingitud valgustiheduse ja temperatuuri erinevuste mõju. Samuti on vaja katsenõusid vaatluste tegemise ajal või suurema sagedusega kas kindla skeemi alusel või juhuslikult ümber paigutada.
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Kui kemikaali püsivuse määramise eelkatsest nähtub, et uuritava kemikaali kontsentratsiooni ei ole võimalik katse vältel (14 päeva jooksul) püsivana hoida, st kemikaali mõõdetud sisaldus langeb alla 80 % mõõdetud algsisaldusest, soovitatakse kasutada poolstaatilist katserežiimi. Sel juhul tuleks taimed katse jooksul vähemalt ühel korral (nt seitsmendal katsepäeval) üle viia värskelt valmistatud katse- ja kontroll-lahustesse. Värskesse söötmesse üleviimise sagedus sõltub uuritava kemikaali püsivusest; väga ebapüsiva või lenduva kemikaali puhul võib selle sisalduse peaaegu püsivana hoidmiseks olla vaja tagada sagedasem üleviimine värskesse söötmesse.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Käesolevas katsemeetodis ei käsitleta kokkupuudet taimelehtedele pritsimise teel.
                              
                           
                        Katsetingimused
                     
                     
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Tuleks kasutada päevavalguse spektriga ja/või külmvalget fluorestsentsvalgust, mille valgustihedus jääb vahemikku umbes 100–150 μE m– 2 s– 1 (vastab umbes 6 000–9 000 luksile), mõõdetuna fotosünteesiks sobivas lainepikkuste vahemikus 400–700 nm punktides, mis on valgusallikast sama kaugel kui katsenõude põhi. Tuleks kasutada valgustusrežiimi 16 tundi valgust ja 8 tundi pimedust. Valgustiheduse mõõdetav väärtus sõltub mõõtmismeetodist ja eelkõige anduri tüübist. Ühest suunast saabuvale valgusele reageeriva anduri asemel soovitatakse kasutada kerakujulist andurit, mis reageerib nii ülalt- kui ka altpoolt mõõtetasapinda mis tahes nurga all saabuvale valgusele, või koosinusandurit, mis reageerib ülaltpoolt mõõtetasapinda mis tahes nurga all saabuvale valgusele; sellise anduriga saadakse käesolevas meetodis kirjeldatud mitmepunktilise valgusallika puhul suuremad väärtused.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Temperatuur katsenõudes peaks olema 23 ± 2 °C. Erijuhul, nt ebapüsiva kemikaali või metalli mõju uurimisel tuleb pöörata erilist tähelepanu pH muutumisele; pH peaks püsima vahemikus 6–9. Täiendavad juhised on esitatud viites 5.
                              
                           
                        Kestus
                     
                     
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Katse lõpetatakse, kui taimede viimisest katsenõudesse on möödunud 14 päeva.
                              
                           
                        Mõõtmised ja analüüsid
                     
                     
                              
                                 36.
                              
                              
                                 Katse alguses on katseorganismi peavõrse pikkus 2,5 cm (vt punkt 29); selle mõõtmiseks kasutatakse joonlauda (vt 4. liide) või fotot ja pildianalüüsi. Tavapärase või ebanormaalse välimusega katseorganismi peavõrse pikkus tuleb mõõta katse alguses, vähemalt üks kord 14 päeva pikkuse kokkupuuteperioodi jooksul ning katse lõpus. Märkus: pildianalüüsi võimaluse puudumise korral võib teise võimalusena kasutada peavõrse pikkuse mõõtmiseks katse alguses ja katse kestel ka steriilset joonlauda, kui töölaud on enne katsenõudesse taimede lisamist steriliseeritud. Tuleks registreerida muutused taimede arengus, näiteks võrsete moondumine, muutused välimuses, nekroosi või kloroosi ilmingud, taimede lagunemine või ujuvuse vähenemine ning muutused juurte pikkuses ja välimuses. Samuti tuleks registreerida olulised muutused katsesöötmes (nt lahustumatu aine esinemine, vetikate, seente ja bakterite kasv katsenõus).
                              
                           
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Lisaks peavõrse pikkuse määramisele katse jooksul tuleks hinnata uuritava kemikaali mõju ka vähemalt kolmele järgmistest mõõdetavatest muutujatest:
                                 
                                             i.
                                          
                                          
                                             külgharude summaarne pikkus,
                                          
                                       
                                             ii.
                                          
                                          
                                             võrsete summaarne pikkus,
                                          
                                       
                                             iii.
                                          
                                          
                                             juurte summaarne pikkus,
                                          
                                       
                                             iv.
                                          
                                          
                                             märgmass,
                                          
                                       
                                             v.
                                          
                                          
                                             kuivmass,
                                          
                                       
                                             vi.
                                          
                                          
                                             männaste arv.
                                          
                                       
                                             
                                                Märkus 1:
                                             
                                          
                                          
                                             kontsentratsioonivahemiku leidmise katses tehtud vaatlused võivad hõlbustada asjakohaste lisanäitajate valimist eespool loetletud kuue muutuja hulgast.
                                          
                                       
                                             
                                                Märkus 2:
                                             
                                          
                                          
                                             märg- ja kuivmassi (parameetrid iv ja v) määramine on tungivalt soovitatav.
                                          
                                       
                                             
                                                Märkus 3
                                             
                                          
                                          
                                             Kuna sahharoos ja valgus (juurte sattumine valguse kätte katse vältel) võivad mõjutada auksiini (taimede kasvuhormoon) transporti vahendavaid kandevalke ja kuna mõne kemikaali toimemehhanism võib sarnaneda auksiini omale, on juurte pikkuse (parameeter iii) kasutamine lõppnäitajana küsitav.
                                          
                                       
                                             
                                                Märkus 4:
                                             
                                          
                                          
                                             Võrdlusuuringu tulemustest nähtub, et külgharude summaarse pikkuse (parameeter i) variatsioonikordaja on suur (> 60 %). Võrsete summaarne pikkus (parameeter ii) hõlmab niikuinii ka külgharude summaarset pikkust ja selle näitaja variatsioonikordaja on vastuvõetavama väärtusega: < 30 %.
                                          
                                       
                                             
                                                Märkus 5:
                                             
                                          
                                          
                                             Eespool esitatud kaalutlustest lähtuvalt soovitatakse kasutada järgmisi mõõdetavaid lõppnäitajaid: võrsete summaarne pikkus, märgmass ja kuivmass (parameetrid ii, iv ja v); parameetri vi – männaste arvu – kasutamine jäetakse katse läbiviija otsustada.
                                          
                                       
                           
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Peavõrse pikkuse ja männaste arvu kindlakstegemise eelis seisneb selles, et seda saab katse alguses, kestel ja lõpus iga katse- ja kontrollnõu puhul teha pildistamise ja pildianalüüsi teel, ehkki võib kasutada ka (steriilset) joonlauda.
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Külgharude summaarset pikkust, juurte summaarset pikkust (kõikide külgharude või juurte pikkus kokku) ja võrsete summaarset pikkust (peavõrse pikkus ja külgharude summaarne pikkus kokku) saab mõõta joonlauaga kokkupuute lõpus.
                              
                           
                              
                                 40.
                              
                              
                                 Märg- ja/või kuivmass tuleks määrata katse alguses eelkultuuri representatiivse proovi alusel ning katse lõpus igast katse- ja kontrollnõust saadud taimse materjali alusel.
                              
                           
                              
                                 41.
                              
                              
                                 Külgharude summaarse pikkuse, võrsete summaarse pikkuse, juurte summaarse pikkuse, märgmassi, kuivmassi ja männaste arvu saab kindlaks teha järgmiselt.
                                 i.   
                                       Külgharude summaarne pikkus
                                    – külgharude pikkuse kindlakstegemiseks saab kokkupuute lõpus mõõta joonlauaga ära kõik külgharud. Külgharude summaarne pikkus on igas katse- ja kontrollnõus mõõdetud kõikide külgharude pikkus kokku.
                                 ii.   
                                       Võrsete summaarne pikkus
                                    – peavõrse pikkuse võib kindlaks teha pildianalüüsi abil või joonlauaga. Võrsete summaarne pikkus on kokkupuute lõpus igas katse- ja kontrollnõus mõõdetud külgharude summaarne pikkus ja peavõrse pikkus kokku.
                                 iii.   
                                       Juurte summaarne pikkus
                                    – juurte pikkuse kindlakstegemiseks saab kokkupuute lõpus mõõta joonlauaga ära kõik juured. Juurte summaarne pikkus on igas katse- ja kontrollnõus mõõdetud kõikide juurte pikkus kokku.
                                 iv.   
                                       Märgmass
                                    – märgmassi määramiseks saab katseorganismid kokkupuute lõpus ära kaaluda. Igast katse- ja kontrollnõust pärit kogu taimne materjal loputatakse destilleeritud veega läbi ja kuivatatakse kergelt tselluloospaberiga. Pärast sellist ettevalmistust määratakse kaalumise teel märgmass. Biomassi (märgmassi) algväärtus määratakse katseorganismide proovi alusel, mis võetakse katsenõude inokuleerimiseks kasutatavast partiist.
                                 v.   
                                       Kuivmass
                                    – pärast märgmassi määramiseks tehtud ettevalmistusi kuivatatakse katseorganisme 60 °C juures, kuni nende mass enam ei muutu. See mass on taimede kuivmass. Biomassi (kuivmassi) algväärtus määratakse katseorganismide proovi alusel, mis võetakse katsenõude inokuleerimiseks kasutatavast partiist.
                                 vi.   
                                       Männaste arv
                                    – loetakse ära kõik peavõrsel paiknevad männased.
                              
                           
                        Mõõtmiste ja analüüside sagedus
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Staatilise katserežiimi puhul tuleks mõõta pH igas katsenõus katse alguses ja lõpus. Poolstaatilise katserežiimi puhul tuleks mõõta värske katselahuse pH enne iga lahusevahetust ja määrata ka iga äratarvitatud lahuse pH.
                              
                           
                              
                                 43.
                              
                              
                                 Valgustihedust tuleks mõõta kasvukambri, inkubaatori või ruumi punktides, mis on valgusallikast samal kaugusel kui katseorganismid. Valgustihedust tuleks katse jooksul mõõta vähemalt üks kord. Söötme temperatuur kasvukambris, inkubaatoris või ruumis samades tingimustes hoitavas jäljendusnõus tuleks registreerida vähemalt üks kord päevas (või teha seda andmeregistraatori abil pidevalt).
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Uuritava kemikaali sisaldus määratakse katse ajal sobivate ajavahemike järel. Staatilise katse puhul tuleb uuritava kemikaali sisaldus määrata vähemalt katse alguses ja lõpus.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 Poolstaatilise katse puhul, kus uuritava kemikaali sisaldus ei püsi eeldatavalt ± 20 % piires nominaalväärtusest, tuleb selle sisaldus määrata kõigis värskelt valmistatud katselahustes ja samades lahustes nende väljavahetamise ajal. Kui uuritava kemikaali mõõdetud algsisaldus erineb nominaalväärtusest enam kui 20 % võrra, kuid on olemas piisavad tõendid selle kohta, et algsisaldus on korratav ja püsiv (st jääb vahemikku 80–120 % algsisaldusest), võib kemikaali sisalduse määrata ainult suurimal ja väikseimal katses kasutataval kontsentratsioonil. Kõigil juhtudel on kemikaali sisaldus igal katses kasutataval kontsentratsioonil vaja enne katselahuse väljavahetamist määrata ainult ühes paralleelnõus (või paralleelnõude sisu koondproovis).
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Kui on tõendatud, et uuritava kemikaali sisaldus ei kõigu katse vältel nominaalväärtuse või mõõdetud algväärtusega võrreldes rohkem kui ± 20 %, võib tulemuste analüüsimisel võtta aluseks nominaalväärtuse või mõõdetud algväärtuse. Kui kõrvalekalle sisalduse nominaalväärtusest või mõõdetud algväärtusest on suurem kui ± 20 %, tuleks tulemuste analüüsimisel võtta aluseks katse vältel esinenud väärtuste geomeetriline keskmine või mõni uuritava kemikaali sisalduse vähenemist kirjeldav mudel (5).
                              
                           
                        Piirsisalduskatse
                     
                     
                              
                                 47.
                              
                              
                                 Teatavatel juhtudel, näiteks kui eelkatsest selgub, et uuritav kemikaal ei avalda kontsentratsioonil kuni 100 mg/l või katsesöötmes lahustuvuse piirkontsentratsioonil või valmistise puhul dispergeeruvuse piirkontsentratsioonil mürgist mõju, võib teha piirsisalduskatse, milles võrreldakse kasvu kontrollrühmas ja ühes katserühmas, kus kemikaal esineb kontsentratsioonis 100 mg/l või lahustuvuse piirkontsentratsioonis. Piirsisalduskatse tegemisel soovitatakse tungivalt määrata ka kokkupuutekontsentratsioon. Piirsisalduskatse puhul kohaldatakse kõiki eespool kirjeldatud katsetingimusi ja nõuetele vastavuse kriteeriume; ainsa erandina nähakse ette, et uuritava kemikaaliga paralleelkultuure peaks olema kaks korda rohkem. Kasvu analüüsimiseks kontrollrühmas ja katserühmades võib keskväärtusi võrrelda statistilise testi (nt Studenti t-testi) abil.
                              
                           ANDMED JA ARUANDLUS
                     
                        Uuritavad muutujad
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Katse eesmärk on teha kindlaks uuritava kemikaali mõju Myriophyllum spicatum'i vegetatiivsele kasvule. Käesolevas katsemeetodis on kirjeldatud kahte uuritavat muutujat.
                                 a)   
                                       Keskmine kasvu erikiirus
                                    : see uuritav muutuja arvutatakse lähtuvalt peavõrse pikkuse logaritmi ja teiste mõõdetavate muutujate, st võrsete summaarse pikkuse, märgmassi, kuivmassi ja männaste arvu logaritmitud väärtuse ööpäevasest muutusest kontrollkultuurides ja igas uuritava kemikaaliga rühmas. Märkus: mõõdetavad parameetrid külgharude summaarne pikkus ja juurte summaarne pikkus ei võimalda arvutada keskmist kasvu erikiirust. Katse alguses ei ole katseorganismil külgharusid ega juuri (tulenevalt eelkultuuri taimede ettevalmistamise viisist); kasvu keskmise erikiiruse arvutamisel ei saa lähtuda algväärtusest null.
                                 b)   
                                       Saagis
                                    : see uuritav muutuja arvutatakse lähtuvalt katse lõpuks toimunud peavõrse pikkuse ja teiste mõõdetavate muutujate – st soovitatavalt võrsete summaarse pikkuse, märgmassi ja kuivmassi või männaste arvu ning soovi korral ka muude parameetrite – väärtuse muutusest kontrollkultuurides ja igas uuritava kemikaaliga rühmas.
                              
                           
                              
                                 49.
                              
                              
                                 Mürgisuse hindamisel tuleks lähtuda peavõrse pikkusest ja veel kolmest mõõdetavast muutujast (st soovitatavalt võrsete summaarsest pikkusest, märgmassist ja kuivmassist või männaste arvust; vt punkt 37 ning selle punkti märkused 2, 4 ja 5), sest mõni kemikaal võib mõjutada muid mõõdetavaid muutujaid palju enam kui peavõrse pikkust. Ainult peavõrse pikkuse vaatlemisel jääks selline mõju avastamata.
                              
                           
                        Keskmine kasvu erikiirus
                     
                     
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Iga kontrollkultuuri ja uuritava kemikaaliga kultuuri puhul arvutatakse teatava ajavahemiku keskmine kasvu erikiirus kasvu iseloomustavate muutujate – peavõrse pikkuse ja veel kolme mõõdetava muutuja (st võrsete summaarse pikkuse, märgmassi ja kuivmassi või männaste arvu) – logaritmitud väärtuse suurenemise alusel järgmise valemi abil:
                                 
                                    
                                 kus
                                 
                                    
                                       μi-j
                                       
                                     on keskmine kasvu erikiirus ajavahemikul i–j,
                                 
                                    
                                       Ni
                                       
                                     on mõõdetava muutuja väärtus katse- või kontrollnõus ajahetkel i,
                                 
                                    
                                       Nj
                                       
                                     on mõõdetava muutuja väärtus katse- või kontrollnõus ajahetkel j ja
                                 
                                    
                                       t
                                     on ajavahemik i–j.
                                 Kontrollrühma ja iga katserühma puhul arvutatakse kasvukiiruse keskmine väärtus ja tulemuste hajuvus.
                              
                           
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Keskmine kasvu erikiirus tuleks arvutada kogu katseperioodi kohta (eespool esitatud valemis vastab katse algusele ajahetk i ja katse lõpule ajahetk j). Kontrollrühma ja uuritava kemikaali iga kontsentratsiooni puhul arvutatakse kasvu keskmise erikiiruse keskväärtus ja tulemuste hajuvus. Peale selle hinnatakse kasvukiirust ka ajavahemike kaupa, näiteks logaritmitud kasvukõverate uurimise teel, et hinnata uuritava kemikaali mõju kokkupuuteaja jooksul.
                              
                           
                              
                                 52.
                              
                              
                                 Seejärel võib iga katses kasutatava kontsentratsiooni (katserühma) puhul arvutada kasvukiiruse vähenemise Ir protsentides järgmise valemi abil:
                                 
                                    
                                 kus
                                 
                                    
                                       % Ir
                                       
                                     on kasvu keskmise erikiiruse vähenemise määr protsentides,
                                 
                                    
                                       μC
                                       
                                     on μ keskväärtus kontrollrühmas ja
                                 
                                    
                                       μT
                                       
                                     on μ keskväärtus katserühmas.
                              
                           
                        Saagis
                     
                     
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Kemikaali mõju saagisele määratakse lähtuvalt peavõrse pikkusest ja veel kolmest mõõdetavast muutujast (st soovitatavalt võrsete summaarsest pikkusest, märgmassist ja kuivmassist või männaste arvust), mis määratakse igas katsekultuuris katse alguses ja lõpus. Märgmassi ja kuivmassi algväärtus määratakse katseorganismide proovi alusel, mis võetakse katsenõude inokuleerimiseks kasutatavast partiist. Kontrollrühmas ja uuritava kemikaali iga kontsentratsiooni puhul arvutatakse keskmine saagis ning tulemuste hajuvus. Saagise vähenemise määra protsentides ( % Iy) võib iga katserühma puhul arvutada järgmiselt:
                                 
                                    
                                 kus
                                 
                                    
                                       % Iy
                                       
                                     on saagise vähenemise määr protsentides,
                                 
                                    
                                       bC
                                       
                                     on biomassi lõppväärtuse ja algväärtuse vahe kontrollrühmas ja
                                 
                                    
                                       bT
                                       
                                     on biomassi lõppväärtuse ja algväärtuse vahe katserühmas.
                              
                           
                        Peavõrse pikkuse kahekordistumise aeg
                     
                     
                              
                                 54.
                              
                              
                                 Peavõrse pikkuse kahekordistumise aja Td leidmiseks ja katse sellekohase nõuetele vastavuse kriteeriumi täitmise kindlakstegemiseks (vt punkt 8) kasutatakse kontrollkultuuridest saadud andmeid ja järgmist valemit:
                                 Td = ln 2 / μ,
                                 kus μ on punktides 50–52 kirjeldatud viisil määratud keskmine kasvu erikiirus.
                              
                           
                        Kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõverate koostamine
                     
                     
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Tuleks koostada kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõverad, mis väljendavad uuritava muutuja väärtuse vähenemise keskmise protsentuaalse määra (punkti 53 kohaselt arvutatud % Ir või % Iy) sõltuvust uuritava kemikaali kontsentratsiooni logaritmitud väärtusest.
                              
                           
                        ECx leidmine
                     
                     
                              
                                 56.
                              
                              
                                 ECx hinnanguliste väärtuste leidmisel tuleks lähtuda nii keskmisest kasvu erikiirusest (ErCx) kui ka saagisest (EyCx), mis peaksid kumbki omakorda põhinema peavõrse pikkusel ja võimaluse korral täiendavatel mõõdetavatel muutujatel (st soovitatavalt võrsete summaarsel pikkusel, märgmassil ja kuivmassil või männaste arvul). Selle põhjuseks on asjaolu, et teatavad kemikaalid mõjutavad peavõrse pikkust ja muid mõõdetavaid muutujaid erinevalt. Määratavad mürgisuse näitajad igal arvutataval kasvu pidurdumise tasemel x on seega neli ECx väärtust: ErCx (peavõrse pikkus), ErCx (soovitatavalt võrsete summaarne pikkus, märgmass, kuivmass või männaste arv), EyCx (peavõrse pikkus), EyCx (soovitatavalt võrsete summaarne pikkus, märgmass, kuivmass või männaste arv).
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Tuleks silmas pidada, et nende kahe uuritava muutuja puhul arvutatud ECx väärtused ei ole võrreldavad, ning seda erinevust võetakse katsetulemuste kasutamisel arvesse. Käesolevas katsemeetodis sätestatud tingimuste kohase katse puhul on keskmisel kasvu erikiirusel põhinevad ECx väärtused (ErCx) enamikul juhtudel suuremad kui saagisel põhinevad väärtused (EyCx), kuna asjaomaste lähenemisviiside matemaatiline alus on erinev. Seda erinevust ei tohiks tõlgendada kahe kõnealuse uuritava muutuja tundlikkuse erinevusena; asjaomased väärtused on lihtsalt matemaatiliselt erinevad.
                              
                           
                        Statistilised meetodid
                     
                     
                              
                                 58.
                              
                              
                                 Eesmärk on leida regressioonanalüüsi abil kvantitatiivne seos kontsentratsiooni ja mõju vahel. On võimalik kasutada kaalutud lineaarset regressiooni pärast mõjuandmete lineariseerivat teisendamist näiteks vastavalt probit-, logit- või Weibulli mudelile (7), kuid tuleks siiski eelistada mittelineaarse regressiooni meetodeid, mis sobivad paremini vältimatute andmevigade ja sujuvast jaotusest kõrvalekallete puhul. Kasvu täielikule pidurdumisele või pidurdumise täielikule puudumisele lähedases olukorras võib kõnealune teisendamine andmevigu võimendada ja analüüsi segada (7). Tuleks silmas pidada, et probit-, logit- või Weibulli teisendusel põhinevad standardsed analüüsimeetodid on ette nähtud binaarsete tunnuste (nt suremus või elulemus) analüüsimiseks ning neid tuleks kasvukiiruse või saagise andmete analüüsimiseks kohandada. Konkreetsed meetodid ECx väärtuste leidmiseks pidevate andmete alusel on esitatud viidetes 8–10.
                              
                           
                              
                                 59.
                              
                              
                                 Iga uuritava muutuja puhul arvutatakse kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõvera põhjal ECx hinnanguline väärtus. Võimaluse korral tuleks määrata iga hinnangulise väärtuse usalduspiirid usaldusnivool 95 %. Mõjuandmete sobivust regressioonimudeliga tuleks hinnata graafiliselt või statistiliselt. Regressioonanalüüsi tegemisel tuleks kasutada mitte katserühmade andmete keskväärtusi, vaid igas üksikus paralleelkultuuris saadud väärtusi.
                              
                           
                              
                                 60.
                              
                              
                                 Kui olemasolevad regressioonimudelid ja -meetodid ei ole katseandmete jaoks sobivad, võib EC50 hinnangulise väärtuse ja usalduspiiride leidmiseks kasutada ka lineaarset interpoleerimist koos andmete usaldusväärsuse iteratiivse kontrollimisega (bootstrapping) (10).
                              
                           
                              
                                 61.
                              
                              
                                 Et teha kindlaks vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsioon ja selle alusel ka täheldatava toime puudumise kontsentratsioon, on vaja võrrelda katserühmade keskväärtusi dispersioonanalüüsi (ANOVA) meetoditega. Iga kontsentratsiooni puhul leitud keskväärtust võrreldakse seejärel sobiva mitmese võrdluse või trenditesti meetodi abil kontrollrühma keskväärtusega. Selleks võib sobida Dunnetti või Williamsi test (12–16). Tuleb hinnata, kas kehtib dispersioonanalüüsi eeldus, et hajuvus on homogeenne. Seda võib teha graafiku alusel või formaalse testi (15), näiteks Levene'i või Bartletti testi abil. Kui hajuvuse homogeensuse eeldus ei kehti, võib mõnikord homogeensuse saavutada andmete logaritmilise teisendamisega. Kui hajuvuse heterogeensus on väga suur ja seda ei saa teisendamisega korrigeerida, tuleks kaaluda mõne muu meetodi, näiteks muutujate sammuviisilise elimineerimisega Jonckheere'i trenditesti kasutamist. Lisajuhised täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni määramiseks on esitatud viites 10.
                              
                           
                              
                                 62.
                              
                              
                                 Uute teadussaavutuste põhjal on soovitatud loobuda täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni mõistest ja asendada see regressiooni teel leitud hinnangulise näitajaga ECx. Käesoleva Myriophyllum'it käsitleva katsemeetodi jaoks ei ole sobivat x väärtust veel kindlaks määratud. Sobiv väärtuste vahemik näib olevat 10–20 % (olenevalt uuritavast muutujast) ning soovitatavalt tuleks esitada nii EC10 kui ka EC20 koos vastavate usalduspiiridega.
                              
                           
                        Katseprotokoll
                     
                     
                              
                                 63.
                              
                              
                                 Katseprotokollis esitatakse järgmine teave.
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Uuritav kemikaal:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         ühest koostisosast koosnev aine:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne, sealhulgas vajaduse korral orgaanilise süsiniku sisaldus;
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     võimalikult täpne omaduste kirjeldus, nt koostisosade keemiline määratlus (vt eespool), kvantitatiivne sisaldus ja asjakohased füüsikalis-keemilised omadused.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Katseliik:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         teaduslik nimetus ja päritolu.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Katsetingimused:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kasutatud katsemeetod (staatiline või poolstaatiline meetod);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katse alustamise kuupäev ja katse kestus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katsesööde;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katseplaani kirjeldus: katsenõud ja nende katted, lahuste ruumala, peavõrse pikkus katsenõudes katse alguses;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kasutatud kontsentratsioonid (nominaalne ja vajaduse korral mõõdetud sisaldus) ja paralleelkultuuride arv kontsentratsiooni kohta;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         põhi- ja katselahuste valmistamise meetodid, sh lahustite või dispergeerivate ainete kasutamise kirjeldus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katsetemperatuur;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         valgusallikas, valgustihedus ja valguse ühtlus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katse- ja kontrollsöötmete pH väärtused;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritava kemikaali määramise meetod ja asjakohased kvaliteedihindamise andmed (valideerimisuuringud, analüüsiandmete standardhälbed või usalduspiirid);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         peavõrse pikkuse ja muude mõõdetavate muutujate, näiteks külgharude summaarse pikkuse, võrsete summaarse pikkuse, juurte summaarse pikkuse, märgmassi, kuivmassi või männaste arvu määramise meetodid;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kultuuri staatus (steriilne või mittesteriilne) igas katse- ja kontrollnõus iga vaatluse ajal;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kõik kõrvalekalded käesolevast katsemeetodist.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Tulemused:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         töötlemata andmed: peavõrse pikkus ja muude mõõdetavate muutujate väärtus igas uuritava kemikaaliga kultuuris ja kontrollkultuuris iga vaatluse ja analüüsi ajal;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         iga mõõdetava muutuja keskväärtused ja standardhälbed;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         igale mõõdetavale muutujale vastavad kasvukõverad;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritavate muutujate arvutatud väärtused igas uuritava kemikaaliga paralleelkultuuris ning paralleelkultuuride andmete keskväärtused ja variatsioonikordajad;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse graafik;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritavate muutujate puhul määratud mürgisuse lõppnäitajad – nt EC50, EC10, EC20 – ja vastavad usaldusvahemikud; asjaomaste andmete olemasolu korral vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsioon ja/või täheldatava toime puudumise kontsentratsioon ning nende määramiseks kasutatud statistilised meetodid;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         dispersioonanalüüsi (ANOVA) kasutamise korral mõju määr, mida on võimalik tuvastada (nt väikseim oluline erinevus);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katserühma mis tahes kultuuris täheldatud stimuleeriv mõju kasvule;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kõik nähtavad fütotoksilisuse ilmingud ja tähelepanekud katselahuste kohta;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         tulemuste arutelu, milles muu hulgas käsitletakse võimaliku käesolevast katsemeetodist kõrvalekaldumise mõju katsetulemustele.
                                                      
                                                   
                                       
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 ASTM. Standard E 1913-04. Standard Guide for Conducting Static, Axenic, 14-Day Phytotoxicity Tests in Test Tubes with the Submersed Aquatic Macrophyte, Myriophyllum sibiricum Komarov.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Maletzki, D., et al. (2010). Myriophyllum spicatum als ökotoxikologischer Testorganismus: Methodenentwicklung eines sedimentfreien Testsystems und erste Ergebnisse mit 3,5-Dichlorphenol. Umweltwiss. Schadst. Forsch. 22: 702–710.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.26 „Perekonna Lemna taimede kasvu pidurdumise katse“.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 OECD (2014). Myriophyllum spicatum Toxicity Test: Results of an inter-laboratory ring test using a sediment-free test system. OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment No. 205. OECD Publishing, Pariis.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment No. 23. OECD Publishing, Pariis.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.51 „Mürgisuse hindamise katse Myriophyllum spicatum'iga süsteemis vesi/sete“.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Christensen, E. R., ja Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Environ. Sci. Technol. 18 (9): 713–718.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Nyholm, N., et al. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11 (2): 157–167.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Bruce, R. D., ja Versteeg, D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11 (10): 1485–1494.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment No. 54. OECD Publishing, Pariis.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Norberg-King, T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. USA Keskkonnakaitseamet, Duluth, MN.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Am. Stat. Assoc. 50 (272): 1096–1121.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20 (3): 482–491.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27 (1): 103–117.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28 (2): 519–531.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Brain, P., ja Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Res. 29 (2): 93–96.
                              
                           
                        1. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Biomass
                           – populatsiooni elusaine märgmass ja/või kuivmass. Käesoleva katsemeetodi puhul on biomass peavõrse, kõikide külgharude ja kõikide juurte summaarne mass.
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Kloroos
                           – katseorganismi, eriti männaste rohelise värvuse muutumine kollakaks.
                        
                           
                              ECx
                              
                           – katsesöötmes lahustatud uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille puhul Myriophyllum spicatum'i kasv pidurdub kindlaksmääratud kokkupuuteaja jooksul x % (nt 50 %) võrra (kui kokkupuuteaeg erineb katse tavapärasest või täiskestusest, tuleb täpselt märkida selle kestus). Kasvukiiruse või saagise alusel arvutatava EC väärtuse üheselt arusaadavaks tähistamiseks kasutatakse kasvukiiruse puhul tähist „ErC“ ja saagise puhul tähist „EyC“, mille järel märgitakse kasutatud mõõdetav muutuja, nt „ErC (peavõrse pikkus)“.
                        
                           
                              Kasv
                           – mõõdetava muutuja (nt peavõrse pikkuse, külgharude summaarse pikkuse, võrsete summaarse pikkuse, juurte summaarse pikkuse, märgmassi, kuivmassi või männaste arvu) väärtuse suurenemine katse vältel.
                        
                           
                              Kasvukiirus (keskmine kasvu erikiirus)– mõõdetava muutuja väärtuse logaritmiline suurenemine kokkupuuteperioodi jooksul. Märkus: kasvukiirusega seotud uuritavad muutujad ei sõltu katse kestusest, kuni kemikaaliga mitte kokku puutuvate kontrollorganismide kasv on eksponentsiaalne.
                        
                           
                              Vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsioon
                           – väikseim kasutatud kontsentratsioon, mille puhul kindlaksmääratud kokkupuuteaja jooksul täheldatakse kemikaali statistiliselt olulist (p < 0,05) kasvu pidurdavat mõju võrdluses kontrolliga. Kemikaal peaks kõikidel kõnealusest kontsentratsioonist suurematel kontsentratsioonidel avaldama vähemalt sama tugevat kahjulikku mõju kui kõnealusel kontsentratsioonil. Kui nimetatud kahte tingimust ei ole võimalik täita, tuleks lisada ammendav selgitus, kuidas kõnealune kontsentratsioon (ja sellest lähtuvalt ka täheldatava toime puudumise kontsentratsioon) on valitud.
                        
                           
                              Mõõdetav muutuja
                           – mis tahes liiki muutuja, mida mõõdetakse katse lõppnäitaja väljendamiseks ühe või mitme eri uuritava muutuja kaudu. Käesoleva katsemeetodi puhul on mõõdetavad muutujad peavõrse pikkus, külgharude summaarne pikkus, võrsete summaarne pikkus, juurte summaarne pikkus, märgmass, kuivmass ja männaste arv.
                        
                           
                              Monokultuur
                           – ühe liigi taimede kultuur.
                        
                           
                              Nekroos
                           – protsess, mille tagajärjel tekib katseorganismi surnud (st valge või tumepruun) kude.
                        
                           
                              Täheldatava toime puudumise kontsentratsioon
                           – kontsentratsioon, mis on kasutatud kontsentratsioonide jadas vahetult allpool vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsiooni.
                        
                           
                              Uuritav muutuja
                           – mürgisuse hindamiseks kasutatav muutuja, mis on leitud biomassi kirjeldava mõõdetud muutuja alusel vastavalt asjakohasele arvutusmeetodile. Käesoleva katsemeetodi puhul on uuritavad muutujad kasvukiirus ja saagis, mis on leitud selliste mõõdetavate muutujate alusel nagu peavõrse pikkus, võrsete summaarne pikkus, märgmass, kuivmass või männaste arv.
                        
                           
                              Poolstaatiline (lahusevahetusega) katse
                           – katse, mille käigus katselahus teatavate ajavahemike järel perioodiliselt välja vahetatakse.
                        
                           
                              Staatiline katse
                           – katse, mille käigus katselahust ei uuendata.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                        
                           
                              Katse lõppnäitaja
                           – katse eesmärgile vastav üldine näitaja, mis muutub uuritava kemikaali mõjul kontrollrühma asjaomase näitajaga võrreldes. Käesoleva katsemeetodi puhul on katse lõppnäitaja kasvu pidurdumine, mida võib väljendada ühel või mitmel mõõdetaval muutujal põhinevate uuritavate muutujate abil.
                        
                           
                              Katsesööde
                           – täielik sünteetiline kasvukeskkond, milles katsetaimi kasvatatakse uuritava kemikaaliga kokkupuutumise ajal. Tavaliselt lahustatakse uuritav kemikaal katsesöötmes.
                        
                           
                              UVCB
                           – tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.
                        
                           
                              Saagis
                           – kokkupuuteperioodi lõpus ja alguses määratud mõõdetava muutuja väärtuste vahe, mille kaudu väljendatakse biomassi suurenemist katse vältel. Märkus: kui kemikaaliga mitte kokku puutuvate organismide kasv on eksponentsiaalne, muutub saagisel põhinevate uuritavate muutujate väärtus katse vältel väiksemaks.
                     
                     
                        2. liide
                        
                           MUUDETUD ANDREWSI SÖÖDE TÜVIKULTUURI JA EELKULTUURI JAOKS
                        
                        Tüvikultuuri ja eelkultuuri jaoks vajalik muudetud Andrewsi sööde valmistatakse viiest eraldi valmistatud toitainete põhilahusest, millele lisatakse 3 % sahharoosi.
                        
                           Tabel 1
                        
                        
                           Andrewsi söötme koostis (ASTMi standard E 1913-04)
                        
                        
                                    Toitainete põhilahuste valmistamine
                                 
                                 
                                    Söötme valmistamine
                                 
                              
                                    Põhilahus
                                 
                                 
                                    Kemikaal
                                 
                                 
                                    Algkogus 1 000  ml kohta
                                 
                                 
                                    Milliliitrit 5 l söötme kohta
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    KCl
                                 
                                 
                                    74,6 mg
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    KNO3
                                    
                                 
                                 
                                    8,08 g
                                 
                              
                                    Ca(NO3)2 × 4H2O
                                 
                                 
                                    18,88 g
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    MgSO4 × 7H2O
                                 
                                 
                                    9,86 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    Vt põhilahus 3.1 allpool
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    KH2PO4
                                    
                                 
                                 
                                    2,72 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    FeSO4 × 7H2O
                                 
                                 
                                    0,278 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    Na2EDTA × 2H2O
                                 
                                 
                                    0,372 g
                                 
                              Põhilahuseid võib hoida külmikus (5–10 °C juures) 6 kuud. Üksnes põhilahuse nr 5 säilivusaeg on lühem (kaks kuud).
                        
                           Tabel 2
                        
                        
                           Põhilahuse nr 3.1 valmistamine põhilahuse nr 3 jaoks
                        
                        
                                    Kemikaal
                                 
                                 
                                    Algkogus grammides 100 ml kohta
                                 
                              
                                    MnSO4 × 4H2O
                                 
                                 
                                    0,223
                                 
                              
                                    ZnSO4 × 7H2O
                                 
                                 
                                    0,115
                                 
                              
                                    H3BO3
                                    
                                 
                                 
                                    0,155
                                 
                              
                                    CuSO4 × 5H2O
                                 
                                 
                                    0,0125
                                 
                              
                                    (NH4)6Mo7O24 × 4H2O
                                 
                                 
                                    0,0037
                                 
                              Pärast põhilahuse nr 3.1 valmistamist (tabel 2) sügavkülmutatakse see umbes 11 ml suuruste alikvootidena (vähemalt –18 °C juures). Sügavkülmutatuna säilib lahus viis aastat.
                        Põhilahuse nr 3 valmistamiseks sulatatakse põhilahus nr 3.1, viiakse 10 ml sellest 1-liitrisesse mõõtekolbi ja lisatakse ultrapuhast vett kuni kolvi mõõtemärgini.
                        Muudetud Andrewsi söötme valmistamiseks lisatakse 5-liitrisesse mõõtekolbi umbes 2 500 ml ultrapuhast vett. Pärast 50 ml iga põhilahuse lisamist täidetakse mõõtekolb 90 % ulatuses ultrapuhta veega ja reguleeritakse pH väärtusele 5,8.
                        Seejärel lisatakse 150 g lahustatud sahharoosi (3 protsenti 5 liitris lahuses) ja mõõtekolb täidetakse mõõtemärgini ultrapuhta veega. Lõpuks viiakse sööde 1-liitristesse Schotti kolbidesse ja seda autoklaavitakse 20 minutit 121 °C juures.
                        Nii saadud söödet saab säilitada külmikus (5–10 °C juures) steriilsena kolm kuud.
                        
                           Muudetud Andrewsi sööde settevaba mürgisuskatse jaoks
                        
                        Tabelites 1 ja 2 nimetatud viiest toitainete põhilahusest valmistatakse katselahuste saamiseks vajalik kümnekordselt kontsentreeritud muudetud Andrewsi sööde, mis sisaldab täiendavalt 30 % sahharoosi. Selleks lisatakse 1-liitrisesse mõõtekolbi umbes 100 ml ultrapuhast vett. Pärast 100 ml iga põhilahuse lisamist reguleeritakse pH väärtusele 5,8. Seejärel lisatakse 30 % lahustatud sahharoosi (300 grammi 1 000 ml kohta) ja mõõtekolb täidetakse mõõtemärgini ultrapuhta veega.
                        Lõpuks viiakse sööde 0,5-liitristesse Schotti kolbidesse ja seda autoklaavitakse 20 minutit 121 °C juures.
                        Nii saadud kümnekordselt kontsentreeritud muudetud söödet saab säilitada külmikus (5–10 °C juures) steriilsena kolm kuud.
                     
                     
                        3. liide
                        
                           TÜVIKULTUURI SÄILITAMINE
                        
                        Käesolevas 3. liites on kirjeldatud perekonda vesikuusk kuuluva kaheidulehelise veesisese liigi Myriophyllum spicatum L. (103) tüvikultuuri. Ajavahemikul juunist augustini ilmuvad veepinna kohale silmatorkamatud roosakasvalged õied. Taimed on juurdunud tugevate risoomide süsteemi abil ja neid võib leida kogu põhjapoolkeral eutroofsetes, kuid saastumata ja lubjarikkamates mudase põhjaga seisuveekogudes. Myriophyllum spicatum eelistab magevett, kuid võib esineda ka riimvees.
                        Settevaba katse puhul laboritingimustes kasutatava tüvikultuuri jaoks on vaja steriilseid taimi. Steriilsed taimed on kättesaadavad Saksamaa Keskkonnaameti (Umweltbundesamt) ökotoksikoloogialaborist.
                        Teise võimalusena võib katseorganismid saada mittesteriilsetest taimedest vastavalt ASTMi standardile E 1913-04. Allpool on esitatud väljavõte ASTMi standardjuhendist, milles käsitletakse loodusest kogutud Myriophyllum sibiricum'i kultiveerimise meetodit.
                        
                           „Kui kultiveerimist alustatakse loodusest kogutud mittesteriilsete taimedega, kogutakse sügisel M. sibiricum'i sigipungad. Sigipungad viiakse 20-liitrisesse akvaariumi, milles on 5 cm paksune steriilse sette kiht, mis on kaetud räniliivaga või näiteks tootega Turface® ja 18 liitri analüütilise puhtusastmega veega. Akvaariumi aereeritakse ja hoitakse temperatuuril 15 °C ning valguse vootihedust hoitakse 16 tunni vältel päevas väärtusel 200–300 μmol m– 2 s– 1. Taimekultuuri võib akvaariumis säilitada taimede varuallikana, mida saab kasutada juhul, kui steriilsed taimekultuurid hävivad kasvukambri mehaanilise rikke või saastuse tõttu või mõnel muul põhjusel. Akvaariumis kasvatatavad taimed ei ole steriilsed ja steriilseid kultuure ei saa säilitada mittepidevas kultiveerimissüsteemis. Kultuuri steriliseerimiseks eemaldatakse taimed akvaariumist ja loputatakse neid umbes 0,5 tundi voolava deioniseeritud vee all. Taimede desinfitseerimiseks hoitakse neid laminaarkapis aseptilistes tingimustes vähem kui 20 minuti vältel (kuni enamik taimekudedest on pleekinud ja ainult kasvukuhik on veel roheline) lahuses, mis sisaldab 3 % (massiühikutes mahuühiku kohta) naatriumhüpokloritit ja 0,01 % sobivat pindaktiivset ainet. Desinfitseerimisvahendit ja taimset materjali loksutatakse. Mitut varresõlme sisaldavad segmendid viiakse steriilsetesse kultiveerimiseks kasutatavatesse katseklaasidesse, mis sisaldavad 45 ml steriliseeritud muudetud Andrewsi söödet ja on kaetud tavalise katseklaasikorgiga. Igasse katsekambrisse viiakse ainult üks taimesegment. Kultiveerimisnõu korgi kinnitamiseks kasutatakse laboratoorset tihenduskilet. Pärast steriilse kultuuri loomist tuleks mitut varresõlme sisaldavad taimesegmendid viia iga kümne kuni kaheteistkümne päeva järel üle uutesse värsket vedelsöödet sisaldavatesse katsekambritesse. Katse alustamiseks peavad taimed püsima katsele eelneva kaheksa nädala vältel steriilsed; seda tõendatakse agariga tassidel kultiveerimise teel.“
                        
                        Kuna muudetud Andrewsi sööde sisaldab sahharoosi (mis soodustab seente ja bakterite kasvu), tuleb kõiki materjale ja lahuseid hoida steriilsena ning viia kultiveerimine läbi steriilsetes tingimustes. Enne kasutamist steriliseeritakse kõik vedelikud ja seadmed. Selleks töödeldakse neid 4 tunni vältel kuuma õhuga (210 °C) või autoklaavitakse 20 minutit 121 °C juures. Peale selle töödeldakse kõiki kolbe, nõusid, kausse jms ning muid seadmeid vahetult enne kasutamist steriilsel töölaual leegiga.
                        Tüvikultuure võib säilitada pikemat aega vähendatud valgustiheduse ja madalama temperatuuri juures (50 μE m– 2 s– 1, 20 ± 2 °C), ilma et neid oleks vaja uuendada. Myriophyllum'i tüvikultuuride sööde peaks olema sama, mida kasutatakse katsetes; võib siiski kasutada ka muid toitainerikkaid söötmeid.
                        Taimesegmendid jaotatakse puhaskultuurina mitmesse 500 ml Erlenmeyeri kolbi ja/või 2 000 ml Fernbachi kolbi, milles on vastavalt umbes 450 või 1 000 ml muudetud Andrewsi söödet. Seejärel suletakse kolvid steriilselt tsellulooskorgiga.
                        Peale selle on vältimatult vajalik töödelda seadmeid vahetult enne kasutamist steriilsel töölaual põhjalikult leegiga. Taimed tuleb nende arvust ja suurusest olenevalt viia umbes iga kolme nädala järel üle värskesse söötmesse.
                        Sel viisil kultuuri uuendamiseks võib kasutada nii võrse tippu kui ka varre keskosa segmente. Üle viidavate taimede (või taimesegmentide) arv ja suurus sõltub vajaminevate taimede arvust. Näiteks võib ühte Fernbachi kolbi viia viis võrsesegmenti ja ühte Erlenmeyeri kolbi kolm võrsesegmenti pikkusega 5 cm. Juurtega, õitsevad, surnud või muidu silmatorkavad osad kõrvaldatakse.
                        
                           Joonis 1
                        
                        
                           Taimede lõikamine tüvikultuuri ja eelkultuuri jaoks pärast 3 nädala pikkust kultiveerimist
                        
                        Taimi kultiveeritakse 500 ml Erlenmeyeri kolbides ja 2 000 ml Fernbachi kolbides jahutusega inkubaatoris 20 ± 2 °C juures muutumatul valgustihedusel umbes 100–150 μE m–2 s–1 (6 000–9 000 luksi); kambri valguse värvustemperatuur peaks vastama soevalge valguse spektrile.
                        
                           Joonis 2
                        
                        
                           Taimede kultiveerimine valgustuse ja jahutusega inkubaatoris
                        
                        Tuleks kasutada keemiliselt puhtaid (happega pestud) steriilseid klaasist kultiveerimisnõusid ja aseptilisi käitlemismeetodeid. Tüvikultuuri saastumisel näiteks vetikate, seente ja/või bakteritega tuleks luua uus kultuur või kasutada kultuuri uuendamiseks mõne muu labori tüvikultuuri.
                     
                     
                        4. liide
                        
                           EELKULTUURI KASVATAMINE JA KATSEORGANISMIDE ETTEVALMISTAMINE KATSEKS
                        
                        Eelkultuuri saamiseks lõigatakse tüvikultuuri võrsed kahe männasega segmentideks ning segmendid viiakse Fernbachi kolbidesse, mis on täidetud muudetud Andrewsi söötmega (sisaldab 3 % sahharoosi). Igasse kolbi võib viia kuni 50 võrsesegmenti. Tuleks siiski jälgida, et kõnealused segmendid oleksid elujõulised ja neil ei esineks juuri, külgharusid ega nende pungasid (vt 3. liite joonis 1).
                        Eelkultuuri organisme kasvatatakse 14–21 päeva kasvukambris steriilsetes tingimustes valgustusrežiimil 16 tundi valgust ja 8 tundi pimedust. Valitud valgustihedus peaks jääma vahemikku 100–150 μE m– 2 s– 1. Temperatuur katsenõudes peaks olema 23 ± 2 °C.
                        Kuna muudetud Andrewsi sööde sisaldab sahharoosi (mis soodustab vetikate, seente ja bakterite kasvu), tuleks kasutada uuritava kemikaaliga lahuste valmistamisel ja kultiveerimise ajal steriilseid tingimusi. Enne kasutamist steriliseeritakse kõik vedelikud ja seadmed. Selleks töödeldakse neid 4 tunni vältel kuuma õhuga (210 °C) või autoklaavitakse 20 minutit 121 °C juures. Peale selle töödeldakse kõiki kolbe, nõusid, kausse jms ning muid seadmeid vahetult enne kasutamist steriilsel töölaual leegiga.
                        Võrsed eemaldatakse puhaskultuurina eelkultiveerimiskolbidest; valitav materjal peaks olema võimalikult homogeenne. Iga katse jaoks on vaja vähemalt 60 katseorganismi (kaheksal uuritava kemikaali kontsentratsioonil tehtava katse puhul). Eelkultuurist võetakse katse jaoks noored külgharud, lõigatakse need otsast joonlauaga mõõdetuna 2,5 cm pikkuseks ja viiakse steriilset muudetud Andrewsi söödet sisaldavasse keeduklaasi. Neid noori külgharusid võib kasutada settevabas mürgisuskatses Myriophyllum spicatum'iga.
                        
                           Joonis 2
                        
                        
                           Eelkultuuri taimede lõikamine Myriophyllum spicatum'iga tehtava settevaba mürgisuskatse jaoks
                        
                        
                     C.51.   Mürgisuse hindamise katse Myriophyllum spicatum'iga süsteemis vesi/sete
                     
                     SISSEJUHATUS
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Käesolev katsemeetod on samaväärne OECD katsejuhendiga nr 239 (2014). On olemas katsemeetodid üheiduleheliste ujutaimede perekonna Lemna liikide jaoks (1) ja vetikaliikide jaoks (2). Neid meetodeid kasutatakse igapäevaselt selliste andmete saamiseks, mis võimaldavad hinnata uuritavatest kemikaalidest, eriti herbitsiidse toimega kemikaalidest tulenevat riski muudele veetaimedele kui sihtliigid. Mõnel juhul võib siiski olla vaja andmeid teistegi makrofüüdiliikide kohta. Keskkonnatoksikoloogia ja -keemia Ühingu (SETAC) seminari põhjal, kus käsitleti pestitsiididest tuleneva makrofüütidele avalduva riski hindamist, avaldati hiljuti suunised, mille kohaselt võib olla vaja esitada mõnda juurdunud makrofüüdiliiki käsitlevad andmed selliste kemikaalide kohta, mille toimemehhanismi suhtes Lemna ja vetikad ei ole teadaolevalt tundlikud või mille puhul teeb muret kemikaali kogunemine settesse ja sellest tulenev kokkupuude juurte kaudu omastamisel (3). Praeguste teadmiste ja kogemuste põhjal valiti eelistatud liikideks Myriophyllum'i liigid, mida tuleks kasutada juhul, kui on vaja andmeid juurdunud veesisese kaheidulehelise liigi kohta (4–6). Käesolev katsemeetod ei asenda muid veekeskkonnas avalduva mürgisuse hindamise meetodeid, vaid pigem täiendab neid ja võimaldab täielikumalt hinnata ohte ja riske veetaimedele. Käesolev süsteemis vesi/sete kasutatav Myriophyllum spicatum'il põhinev katsemeetod täiendab settevabas süsteemis Myriophyllum spicatum'ile avalduva mürgisuse hindamise meetodit (7).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Käesolevas dokumendis on kirjeldatud katsemeetodit, mis võimaldab hinnata uuritava kemikaali mõju juurdunud veetaimele Myriophyllum spicatum, mis kasvab süsteemis vesi/sete. Meetod põhineb osaliselt olemasolevatel meetoditel (1, 2, 8) ja selles võetakse arvesse veetaimedele avalduva riski hindamisega seotud hiljutisi teadusuuringuid (3). Süsteemile vesi/sete tuginev meetod on valideeritud rahvusvahelise võrdlusuuringuga, kus staatilistes tingimustes kasvatatud Myriophyllum'i liigid viidi uuritava kemikaaliga kokkupuutesse kemikaali veesambasse lisamise teel (9). Seda katsesüsteemi saab aga hõlpsalt kohandada rikastatud sette kaudu kokkupuute jaoks, samuti veefaasi kaudu kokkupuute jaoks poolstaatilises või impulssdoseerimise režiimis, ehkki nende režiimide puhul ei ole tehtud ametlikku võrdlusuuringut. Peale selle võib kõnealust üldmeetodit kasutada muude juurdunud veesiseste ja üle veepinna ulatuvate liikide, sealhulgas teiste Myriophyllum'i liikide (nt Myriophyllum aquaticum'i) ja Glyceria maxima puhul (10). Muude liikide kasutamise korral võib olla vaja muuta katsetingimusi, katseplaani ja katse kestust. Eelkõige on vaja teha tööd asjakohase metoodika määratlemiseks Myriophyllum aquaticum'i jaoks. Käesolevas katsemeetodis ei käsitleta üksikasjalikult neid lisavõimalusi, vaid kirjeldatakse standardset lähenemisviisi, mis põhineb Myriophyllum spicatum'i kokkupuutel staatilises süsteemis veefaasi kaudu.
                              
                           
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Käesolevat katsemeetodit kohaldatakse ainete puhul, mille jaoks see on valideeritud (üksikasjalik teave on esitatud võrdlusuuringu aruandes (9)), ning valmististe ja teadaolevate segude puhul. Myriophyllum'iga katse võib teha esimese taseme andmenõuete täitmiseks tulenevalt võimalikest probleemidest seoses uuritava kemikaali kogunemisega settesse või selle toimemehhanismiga/selektiivsusega. Samuti võib laborikatse Myriophyllum'iga olla nõutav osana kõrgema taseme strateegiast, milles käsitletakse veetaimedele avalduva riskiga seotud küsimusi. Kokkupuuteviis (st vee kaudu või sette kaudu) valitakse lähtuvalt katse tegemise konkreetsest eesmärgist. Enne katsemeetodi kasutamist segu analüüsimiseks regulatiivsel eesmärgil tuleks kaaluda, kas ja kuidas see meetod võimaldab saada taotletava eesmärgi jaoks vastuvõetavad tulemused. Seda ei ole vaja kaaluda, kui asjaomase segu hindamine on regulatiivse nõudega ette nähtud.
                              
                           KATSE PÕHIMÕTE
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Katses hinnatakse kemikaaliga seotud mõju standardses keskkonnas (vesi, sete ja toitained) kasvavate Myriophyllum'i isendite vegetatiivsele kasvule. Selleks istutatakse tervete mitteõitsevate taimede võrsetipud standarditud kunstlikku settesse, millele on taimede piisava kasvu tagamiseks lisatud täiendavad toitained, ja kasvatatakse neid Smarti ja Barko söötmes (1. liide). Pärast juurte tekkeks vajalikku kohanemisperioodi viiakse taimed kokkupuutesse veesambasse eri kontsentratsioonides lisatud uuritava kemikaaliga. Teise võimalusena võib settekaudse kokkupuute jäljendamiseks rikastada uuritava kemikaaliga kunstlikku setet ja istutada taimed ümber rikastatud settesse. Kummalgi juhul kasvatatakse taimi seejärel kontrollitud keskkonnatingimustes 14 päeva. Kasvule avalduva mõju kindlakstegemiseks hinnatakse kvantitatiivselt võrsete pikkust, märgmassi ja kuivmassi ning tehakse kvalitatiivseid vaatlusi selliste sümptomite nagu kloroosi, nekroosi ja väärarengute tuvastamiseks.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Kemikaali mõju kvantitatiivseks hindamiseks võrreldakse kasvu katselahuses kontrolltaimede kasvuga ning tehakse kindlaks kontsentratsioon, mille juures kasv pidurdub teatud kindla protsendi x võrra; seda kontsentratsiooni väljendatakse kujul ECx, kus x võib olla regulatiivsetest nõuetest sõltuvalt mis tahes väärtusega – nt EC10, EC20 või EC50. Tuleks tähele panna, et EC10 ja EC20 hinnanguline väärtus on usaldusväärne ja asjakohane üksnes sellise katse puhul, kus kontrolltaimi iseloomustav variatsioonikordaja on hinnatava mõju ulatusest väiksem; see tähendab, et EC20 usaldusväärseks hindamiseks peaks variatsioonikordaja olema < 20 %.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Töödeldud ja töötlemata taimedel tuleks määrata nii keskmine kasvu erikiirus kui ka saagis (kumbagi näitajat hinnatakse võrsete pikkuse, võrsete märgmassi ja võrsete kuivmassi alusel). Leitud kasvu erikiirust (r) ja saagist (y) kasutatakse vastavalt ErCx (nt ErC10, ErC20, ErC50) ja EyCx (nt EyC10, EyC20, EyC50) määramiseks.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Vajaduse korral võib kasvu keskmise erikiiruse ja saagise hinnangulise väärtuse põhjal teha statistiliselt kindlaks vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsiooni ja täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni.
                              
                           TEAVE UURITAVA KEMIKAALI KOHTA
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Analüüsimeetod uuritava kemikaali sisalduse määramiseks katsesöötmes peaks olema piisava tundlikkusega.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Katsetingimuste kindlaksmääramiseks võib uuritava kemikaali kohta olla kasulik teada muu hulgas järgmisi andmeid: struktuurivalem, mitut koostisosa sisaldava aine, UVCB, segu või valmistise puhul koostis, puhtus, lahustuvus vees, püsivus vees ja valguse käes, happe dissotsiatsioonikonstant (pKa), jaotuskoefitsient süsteemis oktanool/vesi (Kow), võimaluse korral settesse kogunemist iseloomustav Kd, aururõhk ja biolagundatavus. Vees lahustuvuse ja aururõhu põhjal võib arvutada Henry konstandi, mis võimaldab hinnata, kas uuritava kemikaali märkimisväärne kadu katse ajal on tõenäoline. Kui kemikaali kadu on tõenäoline, tuleks kadu kvantifitseerida ja dokumenteerida järgnevad sammud kao vähendamiseks. Kui puuduvad kindlad andmed uuritava kemikaali lahustuvuse ja püsivuse kohta, soovitatakse hinnata neid omadusi katses kasutatavates tingimustes, st samas söötmes ning sama temperatuuri ja valgusrežiimi juures. Märkus: kui katses uuritakse valguse toimel peroksüdeerivat herbitsiidi, peaks laboris kasutatava valguse spekter hõlmama ultraviolettkiirgust samal määral, nagu seda esineb looduslikus päikesekiirguses.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Tuleks mõõta katsesöötme pH ja seda vastavalt vajadusele reguleerida. Katsesöötme pH reguleerimine on eriti oluline näiteks juhul, kui analüüsitakse metalle või kergesti hüdrolüüsuvaid kemikaale. Täiendavad juhised selliste kemikaalide mõju hindamiseks, mille füüsikalis-keemilised omadused raskendavad nende uurimist, on esitatud asjaomases OECD juhenddokumendis (11).
                              
                           KATSE NÕUETEKOHASUS
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Katsetulemused vastavad nõuetele, kui kontrolltaimede võrsete keskmine summaarne pikkus ja keskmine summaarne märgmass suurenevad katse kokkupuuteperioodi jooksul vähemalt kaks korda. Peale selle ei tohi kontrolltaimedel olla näha mingeid kloroosi sümptomeid ning taimed, sette pind ja katsesööde ei tohi olla nähtavalt saastunud muude organismidega, näiteks vetikatega ja/või bakterite kihiga.
                              
                           
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Võrsete märgmassi (st katse alguses ja katse lõpus saadud väärtuste) alusel arvutatud saagise keskmine paralleelkultuuride vaheline variatsioonikordaja ei tohi kontrollrühmas olla suurem kui 35 %.
                              
                           VÕRDLUSKEMIKAAL
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Katsemeetodi töökindluse perioodiliseks kontrollimiseks tuleks kasutada ühte või mitut võrdluskemikaali, näiteks võrdlusuuringus (9) kasutatud 3,5-diklorofenooli. Võrdlusuuringu andmete põhjal jäävad 3,5-diklorofenooli EC50 keskväärtused eri uuritavate muutujate puhul vahemikku 4,7–6,1 mg/l (üksikasjalik teave nende väärtuste eeldatava usaldusvahemiku kohta on esitatud võrdlusuuringu aruandes). Võrdluskemikaaliga kontrollimist soovitatakse teha vähemalt kaks korda aastas või kui katseid tehakse harva, siis mürgisuse hindamise lõpliku katsega samaaegselt. Juhised seoses 3,5-diklorofenooli eeldatavate EC50 väärtustega on esitatud rahvusvahelise võrdlusuuringu statistikaaruandes (9).
                              
                           MEETODI KIRJELDUS
                     
                        Katseseadmed
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Katse tuleks läbi viia kontrollitavates keskkonnatingimustes, st reguleeritava valgustuse, päeva pikkuse ja temperatuuriga kasvukambris, kasvatusruumis või laboris (vt jaotis „Katsetingimused“: punktid 56–58). Tüvikultuure tuleks hoida katsenõudest eraldi.
                              
                           
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Katses tuleks kasutada klaasist katsenõusid, näiteks akvaariume või keeduklaase; tavapäraselt kasutatakse 2-liitriseid keeduklaase (kõrgusega umbes 24 cm ja läbimõõduga umbes 11 cm). Võivad sobida ka muud (st suuremad) nõud, kui vesi on neis piisavalt sügav, et võimaldada taimedel katse vältel piiramatult kasvada, ilma et need veest välja ulatuksid.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Taimede settesse istutamise jaoks võib kasutada plastist või klaasist taimepotte (kõrgusega umbes 9 cm, läbimõõduga umbes 8 cm ja mahuga umbes 500 ml). Teise võimalusena võib kasutada keeduklaase, mis on mõnel juhul (nt hüdrofoobsete või suure Kow-ga kemikaalide puhul) soovitatavad.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Katsenõude ja eelistatud katseplaani (vt allpool) valimise kõrval on vaja pöörata tähelepanu ka õige suurusega poti või keeduklaasi valimisele. Katseplaani A puhul (üks võrse poti kohta ja kolm potti nõu kohta) võib olla vaja kasutada väiksemaid potte. Katseplaani B puhul (kolm võrset poti kohta ja üks pott nõu kohta) peaksid sobima eespool nimetatud suurusega potid ja nõud. Sette kohal oleva vee minimaalne sügavus peaks kõikidel juhtudel olema 12 cm ning tuleks registreerida sette pindala/ruumala ja vee pindala/ruumala suhe.
                              
                           
                        Katseorganism
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud üldist lähenemisviisi saab kasutada mitme eri veetaimede liigi puhul. Meetodis sätestatud tingimused on aga välja töötatud vesikuuse liigi Myriophyllum spicatum'i jaoks. Nimetatud liik kuulub kaheiduleheliste taimede sugukonda Haloragaceae.
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 
                                    Myriophyllum spicatum (tähk-vesikuusk) on veesisene juurdunud liik, mis talub väga erinevaid tingimusi ja mida leidub nii staatilistes kui ka voolava veega veekogudes. M. spicatum on mitmeaastane taim, millest säilivad ületalve vaid juured. Taimed õitsevad ja nende seemned valmivad vabalt, kuid sageli toimub levimine eelkõige vegetatiivse paljunemise teel kaenlapungade abil või varretükkidega, mis eralduvad loomulikul teel või häirimise järgselt.
                              
                           
                        Katseorganismi kultiveerimine
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Taimed võib saada looduslikust populatsioonist või veetaimede tarnija kaudu. Kummalgi juhul tuleks taimede päritolu dokumenteerida ja viia läbi liigi kinnitav määramine. Myriophyllum spicatum'i kogumisel loodusest tuleks hoolega jälgida, et võetakse õige liigi taimed, eriti piirkonnas, kus see liik võib hübridiseeruda teiste Myriophyllum'i liikidega. Kahtluse korral soovitatakse kasutada teadaoleva päritolu ja tõendatud liigilise kuuluvusega laborikultuure. Katses ei tohiks kasutada taimi, mis on olnud kokkupuutes mis tahes keemilise saasteainega või mille kogumiskoht on teadaolevalt saastunud.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Piirkonnas, kus M. spicatum ei ole talvekuudel hõlpsalt kättesaadav, võib olla vaja säilitada tüvikultuuri pikaajaliselt kasvuhoones või laboritingimustes. Tüvikultuure tuleks säilitada tingimustes, mis sarnanevad katsetingimustele, kuid kiirgustihedus võib olla väiksem ja temperatuur madalam, et vähendada kultuuri hooldamissagedust (nt kui teatava perioodi jooksul ei ole kavandatud katseid Myriophyllum'iga). Kasvuruumi jätmiseks soovitatakse kasutada suuremaid akvaariume ja taimepotte kui katses. Sette ja veekeskkonna koostis peaks olema sama kui katses, kuid sette väetamiseks võib rakendada teistsugust meetodit (nt kasutada kaubanduslikku aeglase vabanemisega väetist).
                              
                           
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Tüvikultuuri taimed ei tohiks olla nähtavalt saastunud ühegi muu organismiga, sealhulgas tigude, niitvetikate, seente või putukatega, näiteks ööliblika Paraponyx stratiotata munade või vastsetega või kärsaklase Eubrychius velutus'e täiskasvanud isenditega. Nähtava saastuse kõrvaldamiseks võib olla vaja taimset materjali puhta veega loputada. Peale selle tuleks teha jõupingutusi üherakuliste vetikate ja bakteritega saastumise ulatuse minimeerimiseks, ehkki taimne materjal ei pea olema täielikult steriilne. Tüvikultuuri tuleks jälgida ja seda vastavalt vajadusele ümber istutada, et hoida ära vetikatest ja bakteritest põhjustatud saastuse levikut. Kui vetikate või bakteritega saastumine muutub probleemiks, võib olla kasulik tüvikultuuri aereerida.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Kõikidel juhtudel kultiveeritakse/kohandatakse taimi enne katses kasutamist piisava ajavahemiku vältel (st üle 2 nädala) tingimustes, mis on sarnased, kuid mitte tingimata identsed katses kasutatavate tingimustega.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Katse jaoks ei tohiks kasutada õitsevat tüvikultuuri, kuna vegetatiivse kasvu kiirus on õitsemise ajal ja järel üldjuhul väiksem.
                              
                           
                        Sete
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Käesoleva meetodi kohases katses soovitatakse kasutada järgmist valmistatud setet, mis põhineb käesoleva lisa peatükis C.28 (8) kirjeldatud kunstlikul settel. Sete valmistatakse katsemeetodis C.28 kirjeldatud viisil; ainsa erinevusena lisatakse toitained järgmiselt:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             4–5 % (kuivmass) turvast (orgaanilise süsiniku lõppsisaldus 2 ± 0,5 %), mille pH on võimalikult lähedal vahemikule 5,5–6,0; on oluline kasutada üksnes õhu käes kuivatatud peeneks jahvatatud pulbrilist turvast, mille osakeste suurus on soovitatavalt < 1 mm;
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             20 % (kuivmass) kaoliinsavi (soovitatav kaoliniidisisaldus üle 30 %);
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             75–76 % (kuivmass) kvartsliiva (peamiselt peen liiv; > 50 % osakestest peaksid olema vahemikus 50–200 μm);
                                          
                                       
                                             d)
                                          
                                          
                                             lisatakse selline kogus toitainete vesilahust, et nii ammooniumkloriidi kui ka naatriumfosfaadi sisaldus valmis settepartiis oleks 200 mg sette kuivmassi kilogrammi kohta ja lõpliku segu niiskusesisaldus oleks 30–50 %;
                                          
                                       
                                             e)
                                          
                                          
                                             lõpliku settesegu pH reguleerimiseks väärtusele 7,0 ± 0,5 lisatakse keemiliselt puhast kaltsiumkarbonaati (CaCO3).
                                          
                                       
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Turba, kaoliinsavi ja liiva päritolu peaks olema teada ja dokumenteeritud. Kui mõne nimetatud koostisosa päritolu ei ole teada või teeb teataval määral muret, tuleks veenduda, et asjaomane koostisosa ei ole saastunud kemikaalidega (nt raskmetallide, kloororgaaniliste ühendite või fosfororgaaniliste ühenditega).
                              
                           
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Sette kuivad koostisosad tuleks esmalt segada homogeensuse saavutamiseks omavahel ja alles siis tuleks settesse hoolikalt segada toitainete vesilahus. Niiske sete tuleks teha valmis vähemalt kaks päeva enne kasutamist, et turvas jõuaks põhjalikult veest läbi imbuda ja hüdrofoobsed turbaosakesed ei kerkiks settele söötme lisamisel veepinnale; niisket setet võib enne kasutamist säilitada pimedas.
                              
                           
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Katse jaoks viiakse sete sobiva suurusega mahutitesse, näiteks sellise läbimõõduga taimepottidesse, mis võimaldab paigutada potid klaasnõudesse (sette pindala peaks olema minimaalselt umbes 70 % nõu pindalast). Kui mahuti põhjas on augud, aitab mahuti põhja paigutatud filterpaberi tükk setet mahutis hoida. Potid täidetakse settega nii, et sette pind oleks tasane, ja seejärel kaetakse sete selle paigalhoidmiseks inertse materjali, näiteks liiva või peene aianduskruusa (või purustatud korallide) õhukese kihiga (~ 2–3 mm).
                              
                           
                        Katsesööde
                     
                     
                              
                                 29.
                              
                              
                                 
                                    Myriophyllum spicatum'i kultiveerimiseks ja sellega katsete tegemiseks soovitatakse kasutada Smarti ja Barko söödet (12). Selle söötme valmistamist on kirjeldatud 1. liites. Katsekeskkonna (veefaasi) pH peaks optimaalse taimekasvu tagamiseks olema katse alguses vahemikus 7,5–8,0.
                              
                           
                        Katseplaan
                     
                     
                              
                                 30.
                              
                              
                                 Katses tuleks kasutada kemikaaliga töötlemata kontrolli puhul vähemalt kuut paralleelnõu ja minimaalselt viiest katsekontsentratsioonist iga kontsentratsiooni puhul vähemalt nelja paralleelnõu.
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Kui ei ole vaja määrata täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni, võib katseplaani muuta nii, et suurendatakse uuritava kemikaali kontsentratsioonide arvu ja vähendatakse paralleelide arvu iga kontsentratsiooni kohta.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Iga katsenõu näol on tegemist kolme võrset sisaldava paralleelkultuuriga. Igas katsenõus kolme võrse kasvatamiseks on kaks võimalust:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             katseplaan A: üks võrse poti kohta ja kolm potti nõu kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             katseplaan B: kolm võrset poti kohta ja üks pott nõu kohta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             alternatiivse katseplaanina on lubatud kasutada ühte võrset poti ja nõu kohta, kui seejuures kohandatakse vastavalt vajadusele paralleelide arvu, et saavutada vastavus nõuetekohasuse kriteeriumidele.
                                          
                                       
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Katsenõud tuleks jaotada katserühmadesse juhuslikkuse alusel. Katsenõude paigutus katsealal peab olema juhuslik, et vähendada asukohast tingitud valgustiheduse ja temperatuuri erinevuste mõju.
                              
                           
                        Uuritava kemikaali kontsentratsioonid ja kontrollrühmad
                     
                     
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Katsekontsentratsioonid peaksid üldjuhul moodustama geomeetrilise jada, mille tegur ei tohiks olla suurem kui 3,2. Uuritava kemikaali sobivate kontsentratsioonide valimine on hõlpsam, kui kemikaali mürgisus on kontsentratsioonivahemiku leidmise katsega eelnevalt kindlaks tehtud.
                              
                           
                              
                                 35.
                              
                              
                                 ECx määramisel peaks ECx väärtus jääma kasutatavasse kontsentratsioonivahemikku, et tagada tulemuste piisav usaldusväärsus. Näiteks peaks EC50 määramisel suurim katsekontsentratsioon olema suurem kui EC50 väärtus. Kui EC50 väärtus jääb kasutatavast kontsentratsioonivahemikust väljapoole, on asjaomane usaldusvahemik lai ja lähendatud mudeli sobivust katseandmetega ei pruugi olla võimalik statistiliselt hinnata. Leitud ECx väärtusega seotud kitsama usaldusvahemiku saamiseks tuleks kasutada suuremat arvu katsekontsentratsioone.
                              
                           
                              
                                 36.
                              
                              
                                 Valikulise lõppnäitajana vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsiooni või täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni määramiseks peaks väikseim katsekontsentratsioon olema piisavalt väike, et kasv ei erineks selle kontsentratsiooni juures oluliselt kontrolltaimede kasvust. Peale selle peaks suurim katsekontsentratsioon olema piisavalt suur, et kasv oleks selle kontsentratsiooni juures oluliselt aeglasem kui kontrollrühmas. Suurema arvu paralleelide kasutamine suurendab täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni määramiseks kasutatava dispersioonanalüüsi (ANOVA) statistilist võimsust.
                              
                           
                        Piirsisalduskatse
                     
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Kui kontsentratsioonivahemiku leidmise katsest selgub, et uuritav kemikaal ei avalda kontsentratsioonil kuni 100 mg/l või katsesöötmes lahustuvuse piirkontsentratsioonil või valmistise puhul dispergeeruvuse piirkontsentratsioonil kahjulikku mõju, võib teha piirsisalduskatse, mille abil on hõlbus võrrelda kasvu kontrollrühmas ja ühes katserühmas, kus kemikaal esineb kontsentratsioonis 100 mg/l või lahustuvuse piirkontsentratsioonis või kontsentratsioonis 1 000 mg kuiva sette kilogrammi kohta. Kõnealuse katse puhul tuleks järgida standardse kontsentratsioonist sõltuvuse katse üldpõhimõtteid; ainsa erinevusena soovitatakse suurendada minimaalset paralleelide arvu kuue katsenõuni kontrollrühma ja katserühma kohta. Kasvu analüüsimiseks kontroll- ja katserühmas võib keskväärtusi võrrelda statistilise testi (nt Studenti t-testi) abil.
                              
                           
                        Katselahused
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Katselahused valmistatakse tavaliselt põhilahuse lahjendamise teel; viimane saadakse uuritava kemikaali lahustamisel või dispergeerimisel Smarti ja Barko söötmes, mille valmistamiseks on kasutatud demineraliseeritud (st destilleeritud või deioniseeritud) vett (vt 1. liide).
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Suurim katsekontsentratsioon ei tohiks üldjuhul olla suurem kui uuritava kemikaali vees lahustuvuse piirkontsentratsioon või valmistise puhul dispergeeruvuse piirkontsentratsioon katsetingimustes.
                              
                           
                              
                                 40.
                              
                              
                                 Vees raskesti lahustuva kemikaali puhul võib olla vaja kasutada selle kemikaali kontsentreeritud põhilahuse või dispersiooni valmistamiseks orgaanilist lahustit või dispergeerivat ainet, et hõlbustada uuritava kemikaali täpse koguse lisamist katsesöötmesse ja soodustada kemikaali lahustumist või dispergeerumist. Tuleks teha kõik selleks, et selliseid lahusteid või dispergeerivaid aineid ei oleks vaja kasutada. Lisatav lahusti või dispergeeriv aine ei tohiks olla fütotoksiline. Tavaliselt kasutatavad lahustid, mis kuni kontsentratsioonini 100 μl/l ei ole fütotoksilised, on näiteks atsetoon ja dimetüülformamiid. Lahusti või dispergeeriva aine kasutamise korral tuleks esitada selle lõppkontsentratsioon, mis peaks olema võimalikult väike (≤ 100 μl/l). Sellisel juhul peaks lahusti või dispergeeriva aine sisaldus olema kõikides katsenõudes ja (lahustiga) kontrollnõudes ühesugune. Katseplaaniga nähakse ette ka lahustit või dispergeerivat ainet mittesisaldavate kemikaaliga töötlemata kontrollrühma paralleelide kasutamine. Täiendavad juhised dispergeeriva aine kasutamise kohta on esitatud asjaomases OECD juhenddokumendis (11).
                              
                           KATSE KÄIK
                     
                              
                                 41.
                              
                              
                                 Katse käik varieerub sõltuvalt uuritava kemikaaliga kokkupuutumise viisist (st veefaasi või settefaasi kaudu). Katses kasutatava kokkupuuterežiimi valimisel (st staatiline või uuendamisega poolstaatiline, rikastatud vesi või rikastatud sete) tuleks kaaluda uuritava kemikaali eeldatavat käitumist süsteemis vesi/sete. Mõnel juhul, kui kemikaal koguneb eeldatavalt olulisel määral settesse, võib olla soovitatav teha katse rikastatud settega.
                              
                           
                        Ettevalmistusetapp
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Kultiveeritud taimede küljest lõigatakse terved võrsetipud ilma külgharudeta, et saada 6 ± 1 cm pikkused võrsed. Katseplaani A puhul (üks võrse poti kohta ja kolm potti nõu kohta) istutatakse igasse potti üks võrsetipp. Katseplaani B puhul (kolm võrset poti kohta ja üks pott nõu kohta) istutatakse igasse setet sisaldavasse potti neli kuni viis võrsetippu.
                              
                           
                              
                                 43.
                              
                              
                                 Kummalgi juhul tuleks istutada taimed suuremasse arvu pottidesse kui katse jaoks vajalik, et katse alguses oleks võimalik valida ühesugused taimed ning et ülejäävaid taimi saaks kasutada juurte kasvu kontrollimiseks vahetult enne kemikaaliga kokkupuudet ja võrsete biomassi ja pikkuse määramiseks katse nullpäeval.
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Võrsed istutatakse nii, et võrsest umbes kolme sentimeetri pikkune osa, mis sisaldab vähemalt kahte sõlme, jääb sette pinnast allapoole.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 Seejärel viiakse potid katsenõudesse, milles valitsevad keskkonnatingimused on samad kui kokkupuuteetapi ajal, ning hoitakse neid juurekasvu esilekutsumiseks seitse päeva Smarti ja Barko söötmes.
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Pärast seda tuleks varupottidest eemaldada mitu taime juurte kasvu kontrollimiseks. Kui nähtav juurekasv puudub (st juuretipud ei ole näha), tuleks ettevalmistusetappi pikendada, kuni täheldatakse nähtavat juurekasvu. Selle soovitatava sammuga tagatakse, et taimed kasvavad katse alustamise ajal aktiivselt.
                              
                           
                        Ühetaolise taimse materjali valimine
                     
                     
                              
                                 47.
                              
                              
                                 Katseplaani A puhul (üks võrse poti kohta ja kolm potti nõu kohta) valitakse enne katse algust välja ühesuguste taimedega potid. Katseplaani B puhul (kolm võrset poti kohta ja üks pott nõu kohta) eemaldatakse üleliigsed taimed nii, et kolm allesjäävat taime oleksid ühesuguse suuruse ja välimusega.
                              
                           
                        Kokkupuude veefaasi kaudu
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Ühesuguste taimede alusel välja valitud potid paigutatakse konkreetsest katseplaanist lähtuvalt katsenõudesse. Seejärel lisatakse katsenõudesse Smarti ja Barko sööde. Tuleks jälgida, et selle käigus ei häiritaks settekihti. Selleks võib söötme lisamisel kasutada lehtrit või katta sette söötme katsenõudesse valamise ajal plastkettaga, mis eemaldatakse kohe pärast söötme lisamist. Teise võimalusena võib taimepotid panna katsenõudesse pärast söötme lisamist. Kummalgi juhul võib kokkupuuteetapi alguses kasutada värsket söödet, kui see on vajalik võimaliku vetikate ja bakterite kogunemise minimeerimiseks või selleks, et võimaldada valmistada katselahuse partii korraga kõikide paralleelide jaoks.
                              
                           
                              
                                 49.
                              
                              
                                 Sette kohal oleva võrse pikkus mõõdetakse kas enne või pärast söötme lisamist.
                              
                           
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Katsesöötmesse võib sobiva koguse uuritavat kemikaali lisada enne söötme viimist katsenõudesse. Teise võimalusena võib uuritava kemikaali lisada pärast seda, kui sööde on lisatud katsenõudesse. Viimasel juhul tuleks tagada uuritava kemikaali ühtlane jaotumine katsesüsteemis ilma setet häirimata.
                              
                           
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Kõikidel juhtudel registreeritakse katse alguses katsesöötme välimus (nt selge, hägune vmt).
                              
                           
                        Kokkupuude sette kaudu
                     
                     
                              
                                 52.
                              
                              
                                 Valitud kontsentratsiooniga rikastatud sete valmistatakse uuritava kemikaali lahuse otse värskesse settesse lisamise teel. Deioniseeritud vees lahustatud uuritava kemikaali põhilahus segatakse valmistatud settega rullimisseadme või söödasegaja abil või käsitsi. Vees raskesti lahustuva uuritava kemikaali võib lahustada võimalikult väikeses koguses sobivas orgaanilises lahustis (nt heksaanis, atsetoonis või kloroformis). Seejärel segatakse saadud lahus umbes 10 g peene kvartsliivaga ühe katsenõu kohta. Lahustil lastakse aurustuda ja seejärel segatakse liiv sobiva koguse settega katses kasutatava keeduklaasi kohta. Uuritava kemikaali lahustuvaks muutmiseks, dispergeerimiseks või emulgeerimiseks võib kasutada üksnes kergesti lenduvat kemikaali. Tuleks meeles pidada, et lõpliku sette valmistamisel on vaja arvesse võtta ka uuritava kemikaaliga rikastatud liiva ruumala/massi (seega tuleks sette valmistamisel kasutada vähem liiva). Tuleks jälgida, et settele lisatav uuritav kemikaal seguneks settega põhjalikult ja jaotuks selles ühtlaselt.
                              
                           
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Rikastatud sete lisatakse pottidesse (nagu on kirjeldatud eespool). Välja valitud ühesugused piisava juurestikuga taimed eemaldatakse ettevalmistusetapis kasutatud pottidest ja istutatakse eespool kirjeldatud viisil ümber rikastatud settesse.
                              
                           
                              
                                 54.
                              
                              
                                 Potid paigutatakse konkreetsest katseplaanist lähtuvalt katsenõudesse. Seejärel lisatakse ettevaatlikult Smarti ja Barko sööde (nt lehtri abil), häirimata seejuures setet. Sette kohal oleva võrse pikkus mõõdetakse kas enne või pärast söötme lisamist.
                              
                           
                        Veetaseme säilitamine katse vältel
                     
                     
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Igas katsenõus tuleb registreerida vee lõplik ruumala ja märkida nõule veetase. Kui katse vältel aurustub üle 10 % veest, tuleks veetaset destilleeritud veega reguleerida. Vajaduse korral võib keeduklaasid katta lahtise läbipaistva kattega, näiteks läbipaistvast plastist kaanega, et minimeerida aurustumist ja vetikate spooridega saastumist.
                              
                           
                        Katsetingimused
                     
                     
                              
                                 56.
                              
                              
                                 Kasutatakse päevavalguse spektriga ja/või külmvalget fluorestsentsvalgust, mille valgustihedus on umbes 140 (± 20) μE m– 2 s– 1, mõõdetuna fotosünteesiks sobivas lainepikkuste vahemikus (400–700 nm) veepinnal. Kohaldatakse valgustusrežiimi 16 tundi valgust ja 8 tundi pimedust. Kõrvalekalle valitud valgustihedusest ei tohi katseala üheski punktis olla suurem kui ± 15 %.
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Temperatuur katsenõudes on 20 ± 2 °C.
                              
                           
                              
                                 58.
                              
                              
                                 Kontrollsöötme pH väärtus ei tohiks katse ajal suureneda rohkem kui 1,5 ühiku võrra. Kui pH väärtus suureneb üle 1,5 ühiku võrra, ei loeta katset siiski nõuetele mittevastavaks, kui on võimalik tõendada, et eespool sätestatud nõuetekohasuse kriteeriumid on täidetud.
                              
                           
                        Katse kestus
                     
                     
                              
                                 59.
                              
                              
                                 Kokkupuuteperiood kestab 14 päeva.
                              
                           
                        Mõõtmised ja analüüsid
                     
                     
                              
                                 60.
                              
                              
                                 Ettevalmistusetapi järel ja vahetult enne kemikaaliga kokkupuudet (st katse nullpäeval) kogutakse varutaimed viiest juhuslikult valitud potist, kui potis on katseplaani kohaselt kolm taime, või 15 potist, kui potis on üks taim, ning tehakse kindlaks võrsete pikkus, märgmass ja kuivmass, nagu on kirjeldatud allpool.
                              
                           
                              
                                 61.
                              
                              
                                 Kokkupuuteetapi jaoks kasutavate taimede puhul määratakse järgmised tabelis 1 esitatud näitajad:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             peavõrse pikkus, külgharude arv ja külgharude pikkus registreeritakse vähemalt kokkupuuteperioodi lõpus (st 14. katsepäeval);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             taimede tervise visuaalse hindamise tulemused registreeritakse kokkupuuteperioodi jooksul vähemalt kolmel korral (nt nullpäeval ning 7. ja 14. päeval);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             võrsete märgmass ja kuivmass määratakse katse lõpus (st 14. päeval).
                                          
                                       
                           
                              
                                 62.
                              
                              
                                 Võrsete pikkust mõõdetakse joonlauaga. Külgharude esinemise korral tuleks kindlaks teha ka nende arv ja pikkus.
                              
                           
                              
                                 63.
                              
                              
                                 Taimede tervise visuaalseks hindamiseks registreeritakse nende väljanägemine ja katsesöötme üldseisund. Vaatlused hõlmavad järgmist:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             nekroos, kloroos või muu värvimuutus, näiteks liigne punaseks värvumine kontrolltaimedega võrreldes;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bakteritest või vetikatest põhjustatud saastuse teke;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kasvuhäired, näiteks kängumine, sõlmedevahelise pikkuse muutumine, võrsete/lehtede moondumine, külgharude juurdekasv, lehtede langemine, turgori kadu või varre fragmenteerumine;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             juurte tervist hinnatakse visuaalselt katse lõpus; selleks pestakse sete juurtelt ettevaatlikult maha ja vaadeldakse seejärel juurestikku. On välja pakutud järgmine hindamisskaala võrdluses kontrolltaimedega:
                                             
                                                         1)
                                                      
                                                      
                                                         juured puuduvad,
                                                      
                                                   
                                                         2)
                                                      
                                                      
                                                         mõned juured,
                                                      
                                                   
                                                         3)
                                                      
                                                      
                                                         mõõdukalt arenenud juurestik,
                                                      
                                                   
                                                         4)
                                                      
                                                      
                                                         väga hästi välja kujunenud juurestik, mis sarnaneb kontrolltaimede omale.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                              
                                 64.
                              
                              
                                 Märgmass määratakse katse alguses ja lõpus; selleks lõigatakse sette pinna kohal olev võrse osa ära ja kuivatatakse see enne kaalumist kuivatuspaberiga. Tuleks jälgida, et võrse alumise otsa külge kleepuda võivad setteosakesed saaksid eemaldatud. Seejärel pannakse võrse kuivatuskappi temperatuurile umbes 60 °C ja kuivatatakse seda, kuni selle mass enam ei muutu, ning kaalutakse siis võrse uuesti ja registreeritakse selle kuivmass.
                              
                           
                              
                                 65.
                              
                              
                                 Katse vältel minimaalselt nõutavate bioloogiliste hindamiste kokkuvõte on esitatud tabelis 1.
                                 
                                    Tabel 1
                                 
                                 
                                    Hindamiste ajakava
                                 
                                 
                                             Päevade arv
                                             kokkupuute algusest
                                          
                                          
                                             
                                                Myriophyllum spicatum
                                             
                                          
                                       
                                             Võrse pikkus, külgharude pikkus ja arv
                                          
                                          
                                             Võrsete visuaalne hindamine
                                          
                                          
                                             Võrsete märgmass ja kuivmass
                                             Juurte visuaalne hindamine
                                          
                                          
                                             pH
                                             O2
                                             
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             H
                                          
                                          
                                             H
                                          
                                          
                                             H
                                          
                                          
                                             H
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             H
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             H
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             H
                                          
                                          
                                             H
                                          
                                          
                                             H
                                          
                                          
                                             H
                                          
                                       
                                             
                                                         „H“
                                                      
                                                      
                                                         tähistab asjaomase hindamise vajalikkust
                                                      
                                                   
                                                         „—“
                                                      
                                                      
                                                         tähistab hindamisvajaduse puudumist
                                                      
                                                   
                                       
                           
                        Mõõtmiste ja analüüside sagedus
                     
                     
                              
                                 66.
                              
                              
                                 Söötme temperatuur kasvukambris, inkubaatoris või ruumis samades tingimustes hoitavas lisanõus tuleks registreerida vähemalt üks kord päevas (või teha seda andmeregistraatori abil pidevalt).
                              
                           
                              
                                 67.
                              
                              
                                 Katsesöötme pH-d ja lahustunud hapniku sisaldust kontrollitakse katse alguses, vähemalt üks kord katse vältel ja katse lõpus kõikides paralleelnõudes. Mõõtmised tuleks iga kord teha samal kellaajal. Kui iga katsekontsentratsiooni puhul valmistatakse katselahus korraga kõikide paralleelide jaoks, piisab iga sellise lahuse puhul ühekordsest mõõtmisest katse nullpäeval.
                              
                           
                              
                                 68.
                              
                              
                                 Valgustihedust tuleks mõõta kasvukambri, inkubaatori või ruumi punktides, mis on valgusallikast samal kaugusel kui veepind. Valgustihedus tuleks kindlaks teha vähemalt üks kord katse alguses või katse jooksul. Valgustugevuse mõõdetav väärtus sõltub mõõtmismeetodist ja eelkõige anduri tüübist. Ühest suunast saabuvale valgusele reageeriva anduri asemel soovitatakse kasutada kerakujulist andurit, mis reageerib nii ülalt- kui ka altpoolt mõõtetasapinda mis tahes nurga all saabuvale valgusele, või koosinusandurit, mis reageerib ülaltpoolt mõõtetasapinda mis tahes nurga all saabuvale valgusele; sellise anduriga saadakse käesolevas meetodis kirjeldatud mitmepunktilise valgusallika puhul suuremad väärtused.
                              
                           
                        Uuritava kemikaali sisalduse analüütiline mõõtmine
                     
                     
                              
                                 69.
                              
                              
                                 Uuritava kemikaali õige koguse lisamises veendumiseks tuleks läbi viia kemikaali sisalduse analüütiline mõõtmine.
                              
                           
                              
                                 70.
                              
                              
                                 Veeproovid uuritava kemikaali analüüsimiseks kõikidel katsekontsentratsioonidel tuleks koguda veidi aega pärast katse algust (st püsiva uuritava kemikaali puhul selle lisamise päeval ja ebapüsiva kemikaali puhul üks tund pärast lisamist) ja katse lõpus.
                              
                           
                              
                                 71.
                              
                              
                                 Kemikaali sisaldus settes ja settepoorides olevas vees tuleks määrata katse alguses ja katse lõpus vähemalt suurimal katsekontsentratsioonil, välja arvatud juhul, kui uuritav kemikaal on vees teadaolevalt püsiv (sisaldus > 80 % nominaalväärtusest). Mõõtmised settes ja settepoorides olevas vees ei pruugi olla vajalikud, kui uuritava kemikaali jaotumine vee ja sette vahel on näiteks sette ja vee suhte, kemikaali lisamise meetodi ja sette tüübi poolest võrreldavates tingimustes süsteemis vesi/sete läbi viidud uuringu käigus täpselt kindlaks tehtud.
                              
                           
                              
                                 72.
                              
                              
                                 Setteproovi võtmisega katse alguses kaasneb tõenäoliselt katsesüsteemi häirumine. Seepärast võib olla vaja kasutada täiendavaid kemikaaliga katsenõusid, et hõlbustada analüütilist määramist katse alguses ja lõpus. Kui peetakse vajalikuks teha vahehindamisi näiteks 7. katsepäeval ja analüüsiks vaja mineva proovi kogus on nii suur, et seda ei ole lihtne katsesüsteemist eemaldada, tuleks samuti kasutada analüütiliseks määramiseks täiendavaid katsenõusid, mida on käideldud samal viisil kui bioloogiliste hindamiste jaoks kasutatavaid nõusid.
                              
                           
                              
                                 73.
                              
                              
                                 Poorivee eraldamiseks soovitatakse kasutada tsentrifuugimist näiteks 30 minuti vältel 10 000 g ja 4 °C juures. Kui on tõendatud, et uuritav kemikaal ei adsorbeeru filtril, võib siiski olla vastuvõetav ka filtrimine. Mõnel juhul ei pruugi kemikaali sisalduse määramine poorivees proovi liiga väikese mahu tõttu võimalik olla.
                              
                           
                              
                                 74.
                              
                              
                                 Poolstaatilise katse puhul (st veefaasi kaudu kokkupuutel), kus asjaomase uuritava kemikaali sisaldus ei püsi katse vältel katselahust uuendamata eeldatavalt vahemikus ± 20 % nominaalsest kontsentratsioonist, tuleks igal uuendamisel võtta uuritava kemikaali sisalduse määramiseks proov nii ärakasutatud kui ka värskelt valmistatud katselahusest.
                              
                           
                              
                                 75.
                              
                              
                                 Kui uuritava kemikaali mõõdetud algsisaldus erineb nominaalväärtusest enam kui 20 % võrra, kuid on olemas piisavad tõendid selle kohta, et algsisaldus on korratav ja asjaomane väärtus on püsiv (st püsib vahemikus 80–120 % algsisaldusest), võib kemikaali sisalduse määrata ainult suurimal ja väikseimal katses kasutataval kontsentratsioonil.
                              
                           
                              
                                 76.
                              
                              
                                 Kõikidel juhtudel on uuritava kemikaali sisaldus igal katsekontsentratsioonil vaja määrata ainult ühes paralleelnõus. Teise võimalusena võib igal kontsentratsioonil kõikide paralleelide katselahused analüüsimiseks ühte koondada.
                              
                           
                              
                                 77.
                              
                              
                                 Kui on tõendatud, et uuritava kemikaali sisaldus ei kõigu katse vältel nominaalväärtuse või mõõdetud algväärtusega võrreldes rohkem kui ± 20 %, võib tulemuste analüüsimisel ja järgneval lõppnäitajate arvutamisel võtta aluseks nominaalväärtuse või mõõdetud algväärtuse.
                              
                           
                              
                                 78.
                              
                              
                                 Sellisel juhul peaksid mõju avaldumise kontsentratsioonid põhinema nominaalsetel või katse alguses vees mõõdetud kontsentratsioonidel.
                              
                           
                              
                                 79.
                              
                              
                                 Kui aga on tõendeid selle kohta, et kontsentratsioon on katse vältel vähenenud (st ei ole püsinud uuritava kemikaaliga töödeldud faasis vahemikus ± 20 % nominaalväärtusest või mõõdetud algväärtusest), tuleks võtta tulemuste analüüsimisel aluseks kokkupuute vältel esinenud väärtuste geomeetriline keskmine või mõni mudel, millega saab kirjeldada uuritava kemikaali sisalduse vähenemist töödeldud faasis (11).
                              
                           ANDMETE HINDAMINE
                     
                              
                                 80.
                              
                              
                                 Kui katses on vaja kasutada lahustit või dispergeerivat ainet, võib lahustiga kontrolli ja töötlemata kontrolli andmed statistilise analüüsi jaoks ühte koondada, eeldusel, et kõnealuste rühmade näitajate vahel ei täheldata statistiliselt olulisi erinevusi.
                              
                           
                        Uuritavad muutujad
                     
                     
                              
                                 81.
                              
                              
                                 Katse eesmärk on teha kindlaks uuritava kemikaali mõju katseliigi vegetatiivsele kasvule kahe uuritava muutuja – kasvu keskmise erikiiruse ja saagise – põhjal järgmisel viisil.
                              
                           
                        Keskmine kasvu erikiirus
                     
                     
                              
                                 82.
                              
                              
                                 See uuritav muutuja põhineb kontrollrühma(de)s ja igas katserühmas mõõdetud võrsete summaarse pikkuse, summaarse märgmassi ja summaarse kuivmassi logaritmitud väärtuste muutumisel ajas. Kõnealune muutuja arvutatakse iga kontroll- ja katserühma iga paralleeli kohta. Igas katsenõus (paralleelnõus) oleva kolme taime keskmine pikkus ja mass ning sellest lähtuvalt kasvukiirus iga paralleelis tuleks arvutada järgmise valemi abil:
                                 
                                    
                                 kus
                                 
                                             μi-j
                                             
                                          
                                          
                                             on keskmine kasvu erikiirus ajavahemikul i–j,
                                          
                                       
                                             Ni
                                             
                                          
                                          
                                             on mõõdetava muutuja väärtus katse- või kontrollnõus ajahetkel i,
                                          
                                       
                                             Nj
                                             
                                          
                                          
                                             on mõõdetava muutuja väärtus katse- või kontrollnõus ajahetkel j ja
                                          
                                       
                                             t
                                          
                                          
                                             on ajavahemik i–j.
                                          
                                       
                           
                              
                                 83.
                              
                              
                                 Paralleelnõude andmete põhjal tuleks iga katserühma ja kontrollrühma puhul arvutada kasvukiiruse keskväärtus ja tulemuste hajuvus.
                              
                           
                              
                                 84.
                              
                              
                                 Keskmine kasvu erikiirus tuleks arvutada kogu katseperioodi kohta (eespool esitatud valemis vastab katse algusele ajahetk i ja katse lõpule ajahetk j). Kontrollrühma ja uuritava kemikaali iga kontsentratsiooni puhul arvutatakse kasvu keskmise erikiiruse keskväärtus ja tulemuste hajuvus.
                              
                           
                              
                                 85.
                              
                              
                                 Seejärel võib iga katses kasutatava kontsentratsiooni (katserühma) puhul arvutada kasvukiiruse vähenemise Ir protsentides järgmise valemi abil:
                                 
                                    
                                 kus
                                 
                                             % Ir
                                             
                                          
                                          
                                             on kasvu keskmise erikiiruse vähenemise määr protsentides,
                                          
                                       
                                             μC
                                             
                                          
                                          
                                             on μ keskväärtus kontrollrühmas ja
                                          
                                       
                                             μT
                                             
                                          
                                          
                                             on μ keskväärtus katserühmas.
                                          
                                       
                           
                        Saagis
                     
                     
                              
                                 86.
                              
                              
                                 See uuritav muutuja põhineb kontrollrühma(de)s ja igas katserühmas mõõdetud võrsete summaarse pikkuse, summaarse märgmassi ja summaarse kuivmassi muutumisel ajas. Saagise vähenemise määra protsentides ( % Iy) võib iga katserühma puhul arvutada järgmiselt:
                                 
                                    
                                 kus
                                 
                                             % Iy
                                             
                                          
                                          
                                             on saagise vähenemise määr protsentides,
                                          
                                       
                                             bC
                                             
                                          
                                          
                                             on biomassi lõppväärtuse ja algväärtuse vahe kontrollrühmas ja
                                          
                                       
                                             bT
                                             
                                          
                                          
                                             on biomassi lõppväärtuse ja algväärtuse vahe katserühmas.
                                          
                                       
                           
                        Kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõverate koostamine
                     
                     
                              
                                 87.
                              
                              
                                 Tuleks koostada kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõverad, mis väljendavad uuritava muutuja väärtuse vähenemise keskmise protsentuaalse määra (eespool kirjeldatud viisil arvutatud % Ir või % Iy) sõltuvust uuritava kemikaali kontsentratsiooni logaritmitud väärtusest.
                              
                           
                        ECx leidmine
                     
                     
                              
                                 88.
                              
                              
                                 ECx (nt EC50) hinnanguliste väärtuste leidmisel tuleks lähtuda nii keskmisest kasvu erikiirusest (ErCx) kui ka saagisest (EyCx), mis peaksid kumbki omakorda põhinema võrsete summaarsel märgmassil, summaarsel kuivmassil ja summaarsel pikkusel.
                              
                           
                              
                                 89.
                              
                              
                                 Tuleks silmas pidada, et nende kahe uuritava muutuja puhul arvutatud ECx väärtused ei ole võrreldavad, ning seda erinevust võetakse katsetulemuste kasutamisel arvesse. Käesolevas katsemeetodis sätestatud tingimuste kohase katse puhul on keskmisel kasvu erikiirusel põhinevad ECx väärtused (ErCx) enamikul juhtudel suuremad kui saagisel põhinevad väärtused (EyCx), kuna asjaomaste lähenemisviiside matemaatiline alus on erinev. Seda erinevust ei tohiks tõlgendada kahe kõnealuse uuritava muutuja tundlikkuse erinevusena; asjaomased väärtused on lihtsalt matemaatiliselt erinevad.
                              
                           
                        Statistilised meetodid
                     
                     
                              
                                 90.
                              
                              
                                 Eesmärk on leida regressioonanalüüsi abil kvantitatiivne seos kontsentratsiooni ja mõju vahel. On võimalik kasutada kaalutud lineaarset regressiooni pärast mõjuandmete lineariseerivat teisendamist näiteks vastavalt probit-, logit- või Weibulli mudelile (13), kuid tuleks siiski eelistada mittelineaarse regressiooni meetodeid, mis sobivad paremini vältimatute andmevigade ja sujuvast jaotusest kõrvalekallete puhul. Kasvu täielikule pidurdumisele või pidurdumise täielikule puudumisele lähedases olukorras võib kõnealune teisendamine andmevigu võimendada ja analüüsi segada (13). Tuleks silmas pidada, et probit-, logit- või Weibulli teisendusel põhinevad standardsed analüüsimeetodid on ette nähtud binaarsete tunnuste (nt suremus või elulemus) analüüsimiseks ning neid tuleks kasvukiiruse või saagise andmete analüüsimiseks kohandada. Konkreetsed meetodid ECx väärtuste leidmiseks pidevate andmete alusel on esitatud viidetes 14–17.
                              
                           
                              
                                 91.
                              
                              
                                 Iga uuritava muutuja puhul arvutatakse kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse kõvera põhjal ECx hinnanguline väärtus. Määratakse iga hinnangulise väärtuse usalduspiirid usaldusnivool 95 %. Mõjuandmete sobivust regressioonimudeliga tuleks hinnata graafiliselt või statistiliselt. Regressioonanalüüsi tegemisel tuleks kasutada mitte katserühmade andmete keskväärtusi, vaid igas üksikus paralleelkultuuris saadud väärtusi.
                              
                           
                              
                                 92.
                              
                              
                                 Kui olemasolevad regressioonimudelid ja -meetodid ei ole katseandmete jaoks sobivad, võib EC50 hinnangulise väärtuse ja usalduspiiride leidmiseks kasutada ka lineaarset interpoleerimist koos andmete usaldusväärsuse iteratiivse kontrollimisega (bootstrapping) (18).
                              
                           
                              
                                 93.
                              
                              
                                 Et teha kindlaks vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsioon ja selle alusel ka täheldatava toime puudumise kontsentratsioon, on vaja võrrelda katserühmade keskväärtusi dispersioonanalüüsi (ANOVA) meetoditega. Iga kontsentratsiooni puhul leitud keskväärtust võrreldakse seejärel sobiva meetodi (nt Dunnetti või Williamsi testi) abil kontrollrühma keskväärtusega (19–22). Tuleb hinnata, kas kehtivad dispersioonanalüüsi eeldused, et tegemist on normaaljaotusega ja hajuvus on homogeenne. Selleks tuleks kasutada Shapiro-Wilksi testi (normaaljaotus) ja Levene'i testi (hajuvuse homogeensus). Kui normaaljaotuse ja hajuvuse homogeensuse eeldused ei kehti, võib mõnikord olla abi andmete logaritmilisest teisendamisest. Kui hajuvuse heterogeensus ja/või kõrvalekalle normaaljaotusest on väga suur(ed) ja teisendamise abil korrigeerimine ei ole võimalik, tuleks kaaluda mõne muu meetodi, näiteks Bonferroni-Welchi t-testi, muutujate sammuviisilise elimineerimisega Jonckheere'i-Terpstra testi või Bonferroni mediaantesti kasutamist. Lisajuhised täheldatava toime puudumise kontsentratsiooni määramiseks on esitatud viites 16.
                              
                           
                        ARUANDLUS
                     
                     
                              
                                 94.
                              
                              
                                 Katseprotokollis esitatakse järgmine üksikasjalik teave.
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Uuritav kemikaal:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         ühest koostisosast koosnev aine:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     füüsiline välimus, lahustuvus vees ja muud asjakohased füüsikalis-keemilised omadused;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     kemikaali identimisandmed, näiteks IUPACi või CASi nimetus, CASi number, SMILESi või InChI kood, struktuurivalem, puhtus, võimaluse ja vajaduse korral lisandite keemiline määratlus jne;
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         mitut koostisosa sisaldav aine, UVCB või segu:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     võimalikult täpne omaduste kirjeldus, nt koostisosade keemiline määratlus (vt eespool), kvantitatiivne sisaldus ja asjakohased füüsikalis-keemilised omadused.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Katseliik:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         teaduslik nimetus ja päritolu.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Katsetingimused:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ettevalmistusetapi kestus ja tingimused;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kasutatud katserežiim (staatiline, poolstaatiline või impulssdoseerimise režiim);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katse alustamise kuupäev ja katse kestus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katsekeskkonna, st sette ja vedelsöötme kirjeldus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katseplaani kirjeldus: kasvukamber, ruum või labor, katsenõud ja nende katted, lahuste ruumala, katsetaimede pikkus ja mass igas katsenõus katse alguses, sette pindala ja vee pindala suhe, sette ruumala ja vee ruumala suhe;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kasutatud kontsentratsioonid (nominaalne ja vajaduse korral mõõdetud sisaldus) ja paralleelkultuuride arv kontsentratsiooni kohta;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         põhi- ja katselahuste valmistamise meetodid, sh lahustite või dispergeerivate ainete kasutamise kirjeldus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katsetemperatuur;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         valgusallikas ja valgustihedus (μE m– 2 s– 1);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katsesöötme ja kontrollsöötme pH ning katsesöötme välimus katse alguses ja lõpus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         hapnikusisaldus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kemikaali määramise meetod ja asjakohased kvaliteedihindamise andmed (valideerimisuuringud, analüüsiandmete standardhälbed või usalduspiirid);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         mõõdetavate muutujate, näiteks pikkuse, kuivmassi ja märgmassi määramise meetodid;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kõik kõrvalekalded käesolevast katsemeetodist.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Tulemused:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         töötlemata andmed: taimede võrsete pikkus ja mass poti kohta ning muude mõõdetavate muutujate väärtus igas uuritava kemikaaliga kultuuris ja kontrollkultuuris iga tabelis 1 esitatud ajakava kohase vaatluse ja analüüsi ajal;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         iga mõõdetava muutuja keskväärtused ja standardhälbed;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kasvukõver igal kontsentratsioonil;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         võrsete pikkuse ja märgmassi alusel arvutatud biomassi kahekordistumise aeg ja kasvukiirus kontrollrühmas, sealhulgas märgmassil põhineva saagise variatsioonikordaja;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritavate muutujate arvutatud väärtused igas uuritava kemikaaliga paralleelkultuuris ning paralleelkultuuride andmete keskväärtused ja variatsioonikordajad;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kontsentratsiooni ja mõju vahelise sõltuvuse graafik;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uuritavate muutujate põhjal leitud mürgisuse lõppnäitajate, näiteks EC50 hinnangulised väärtused ja vastavad usaldusvahemikud; asjaomaste andmete olemasolu korral vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsioon ja/või täheldatava toime puudumise kontsentratsioon ning nende määramiseks kasutatud statistilised meetodid;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         dispersioonanalüüsi (ANOVA) kasutamise korral mõju määr, mida on võimalik tuvastada (nt väikseim oluline erinevus);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         katserühma mis tahes kultuuris täheldatud stimuleeriv mõju kasvule;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kõik nähtavad fütotoksilisuse ilmingud ja tähelepanekud katselahuste kohta;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         tulemuste arutelu, milles muu hulgas käsitletakse võimaliku käesolevast katsemeetodist kõrvalekaldumise mõju katsetulemustele.
                                                      
                                                   
                                       
                           KIRJANDUS
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.26 „Perekonna Lemna taimede kasvu pidurdumise katse“.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.3 „Mageveevetikate ja tsüanobakterite kasvu pidurdumise katse“.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Maltby, L., et al. (2010). Aquatic Macrophyte Risk Assessment for Pesticides. Suunised AMRAPi seminarilt Wageningenis (NL), 14.–16. jaanuar 2008.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Arts, G. H. P., et al. (2008). Sensitivity of submersed freshwater macrophytes and endpoints in laboratory toxicity tests. Environ. Pollut. 153: 199–206.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 ISO 16191:2013. Water quality – Determination of the toxic effect of sediment on the growth behaviour of Myriophyllum aquaticum.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Knauer, K., et al. (2006). Methods for assessing the toxicity of herbicides to submersed aquatic plants. Pest Manag. Sci. 62 (8): 715–722.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.50 „Settevaba mürgisuskatse Myriophyllum spicatum'iga“.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Käesoleva lisa peatükk C.28 „Sette-vee mürgisuskatse surusääsklastel rikastatud vee kasutamisega“.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Ratte, M., ja Ratte, H. (2014). Myriophyllum Toxicity Test: Result of a ring test using M. aquaticum and M. spicatum grown in a water-sediment system. OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment No. 206. OECD Publishing, Pariis.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Davies, J., et al. (2003). Herbicide risk assessment for non-target aquatic plants: sulfosulfuron – a case study. Pest Manag. Sci. 59 (2): 231–237.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment No. 23. OECD Publishing, Pariis.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Smart, R. M., ja Barko, J. W. (1985). Laboratory culture of submersed freshwater macrophytes on natural sediments. Aquat. Bot. 21 (3): 251–263.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Christensen, E. R., ja Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Environ. Sci. Technol. 18 (9): 713–718.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Nyholm, N., et al. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11 (2): 157–167.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Bruce, R. D., ja Versteeg, D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11 (10): 1485–1494.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment No. 54. OECD Publishing, Pariis.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Brain, P., ja Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Res. 29 (2): 93–96.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Norberg-King, T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. USA Keskkonnakaitseamet, Duluth, MN.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Dunnett, C. W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Am. Stat. Assoc. 50 (272): 1096–1121.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20 (3): 482–491.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27 (1): 103–117.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28 (2): 519–531.
                              
                           
                        1. liide
                        
                           SMARTI JA BARKO SÖÖTME KOOSTIS
                        
                        
                                    Koostisaine
                                 
                                 
                                    Veele (*12) lisatava reaktiivi kogus (mg/l)
                                 
                              
                                    CaCl2 · 2H2O
                                 
                                 
                                    91,7
                                 
                              
                                    MgSO4 · 7H2O
                                 
                                 
                                    69,0
                                 
                              
                                    NaHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    58,4
                                 
                              
                                    KHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    15,4
                                 
                              
                                    pH (õhuga tasakaalus lahus)
                                 
                                 
                                    7,9
                                 
                              
                     
                        2. liide
                        MÕISTED
                        
                           
                              Biomass
                           – populatsiooni elusaine märgmass ja/või kuivmass. Käesoleva katsemeetodi puhul on biomass peavõrse, kõikide külgharude ja kõikide juurte summaarne mass.
                        
                           
                              Kemikaal
                           – aine või segu.
                        
                           
                              Kloroos
                           – katseorganismi, eriti männaste rohelise värvuse muutumine kollakaks.
                        
                           
                              ECx
                              
                           – katsesöötmes lahustatud uuritava kemikaali kontsentratsioon, mille puhul Myriophyllum spicatum'i kasv pidurdub kindlaksmääratud kokkupuuteaja jooksul x % (nt 50 %) võrra (kui kokkupuuteaeg erineb katse tavapärasest või täiskestusest, tuleb täpselt märkida selle kestus). Kasvukiiruse või saagise alusel arvutatava EC väärtuse üheselt arusaadavaks tähistamiseks kasutatakse kasvukiiruse puhul tähist „ErC“ ja saagise puhul tähist „EyC“, mille järel märgitakse kasutatud mõõdetav muutuja, nt „ErC (peavõrse pikkus)“.
                        
                           
                              Kasv
                           – mõõdetava muutuja (nt peavõrse pikkuse, külgharude summaarse pikkuse, võrsete summaarse pikkuse, juurte summaarse pikkuse, märgmassi, kuivmassi või männaste arvu) väärtuse suurenemine katse vältel.
                        
                           
                              Kasvukiirus (keskmine kasvu erikiirus)– mõõdetava muutuja väärtuse logaritmiline suurenemine kokkupuuteperioodi jooksul. Märkus: kasvukiirusega seotud uuritavad muutujad ei sõltu katse kestusest, kuni kemikaaliga mitte kokku puutuvate kontrollorganismide kasv on eksponentsiaalne.
                        
                           
                              Vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsioon
                           – väikseim kasutatud kontsentratsioon, mille puhul kindlaksmääratud kokkupuuteaja jooksul täheldatakse kemikaali statistiliselt olulist (p < 0,05) kasvu pidurdavat mõju võrdluses kontrolliga. Kemikaal peaks kõikidel kõnealusest kontsentratsioonist suurematel kontsentratsioonidel avaldama vähemalt sama tugevat kahjulikku mõju kui kõnealusel kontsentratsioonil. Kui nimetatud kahte tingimust ei ole võimalik täita, tuleks lisada ammendav selgitus, kuidas kõnealune kontsentratsioon (ja sellest lähtuvalt ka täheldatava toime puudumise kontsentratsioon) on valitud.
                        
                           
                              Mõõdetav muutuja
                           – mis tahes liiki muutuja, mida mõõdetakse katse lõppnäitaja väljendamiseks ühe või mitme eri uuritava muutuja kaudu. Käesoleva katsemeetodi puhul on mõõdetavad muutujad peavõrse pikkus, külgharude summaarne pikkus, võrsete summaarne pikkus, juurte summaarne pikkus, märgmass, kuivmass ja männaste arv.
                        
                           
                              Monokultuur
                           – ühe liigi taimede kultuur.
                        
                           
                              Nekroos
                           – protsess, mille tagajärjel tekib katseorganismi surnud (st valge või tumepruun) kude.
                        
                           
                              Täheldatava toime puudumise kontsentratsioon
                           – kontsentratsioon, mis on kasutatud kontsentratsioonide jadas vahetult allpool vähima täheldatava toime avaldumise kontsentratsiooni.
                        
                           
                              Uuritav muutuja
                           – mürgisuse hindamiseks kasutatav muutuja, mis on leitud biomassi kirjeldava mõõdetud muutuja alusel vastavalt asjakohasele arvutusmeetodile. Käesoleva katsemeetodi puhul on uuritavad muutujad kasvukiirus ja saagis, mis on leitud selliste mõõdetavate muutujate alusel nagu peavõrse pikkus, võrsete summaarne pikkus, märgmass, kuivmass või männaste arv.
                        
                           
                              Poolstaatiline (lahusevahetusega) katse
                           – katse, mille käigus katselahus teatavate ajavahemike järel perioodiliselt välja vahetatakse.
                        
                           
                              Staatiline katse
                           – katse, mille käigus katselahust ei uuendata.
                        
                           
                              Uuritav kemikaal
                           – iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
                        
                           
                              Katse lõppnäitaja
                           – katse eesmärgile vastav üldine näitaja, mis muutub uuritava kemikaali mõjul kontrollrühma asjaomase näitajaga võrreldes. Käesoleva katsemeetodi puhul on katse lõppnäitaja kasvu pidurdumine, mida võib väljendada ühel või mitmel mõõdetaval muutujal põhinevate uuritavate muutujate abil.
                        
                           
                              Katsesööde
                           – täielik sünteetiline kasvukeskkond, milles katsetaimi kasvatatakse uuritava kemikaaliga kokkupuutumise ajal. Tavaliselt lahustatakse uuritav kemikaal katsesöötmes.
                        
                           
                              UVCB
                           – tundmatu või muutuva koostisega aine, kompleksne reaktsioonisaadus või bioloogilist päritolu materjal.
                        
                           
                              Saagis
                           – kokkupuuteperioodi lõpus ja alguses määratud mõõdetava muutuja väärtuste vahe, mille kaudu väljendatakse biomassi suurenemist katse vältel. Märkus: kui kemikaaliga mitte kokku puutuvate organismide kasv on eksponentsiaalne, muutub saagisel põhinevate uuritavate muutujate väärtus katse vältel väiksemaks.
                     “
               
            (1)  Väärtus 20 °C juures ei ole teada, kuid võib eeldada, et mõõtmistulemuste varieeruvus on suurem kui eeldatav temperatuurisõltuvus.
         
            (2)  Euroopa Parlamendi ja nõukogu 18. detsembri 2006. aasta määrus (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) ning millega asutatakse Euroopa Kemikaaliamet, muudetakse direktiivi 1999/45/EÜ ja tunnistatakse kehtetuks nõukogu määrus (EMÜ) nr 793/93 ja komisjoni määrus (EÜ) nr 1488/94 ning samuti nõukogu direktiiv 76/769/EMÜ ja komisjoni direktiivid 91/155/EMÜ, 93/67/EMÜ, 93/105/EÜ ja 2000/21/EÜ. ELT L 304, 22.11.2007, lk 1.
         
            (3)  The US Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods
         
            (*1)  Sarvkesta hägususala tuleb registreerida.
         
            (4)  REACH-määruse alusel integreeritud katsestrateegia kasutamiseks silma ärrituse puhul vt ka kemikaaliameti juhendit „Guidance on information requirements and chemical safety assessment, Chapter R.7a Endpoint specific guidance“ (Teabele esitatavate nõuete ja kemikaaliohutuse hindamine, peatükk R.7a: näitajate põhine juhend) http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf
         
            (5)  Statistikud, kes kasutavad modelleerimist, näiteks üldisi lineaarseid mudeleid (General Linear Models, GLM), võivad analüüsiks kasutada erinevat, ent võrreldavat lähenemisviisi, kuid ei pruugi tingimata tuletada tavalist ANOVA tabelit, mis põhineb arvutieelse ajastu statistiliste näitajate arvutamiseks kasutatud algoritmidel.
         
            (6)  Statistikud, kes kasutavad modelleerimist, näiteks üldisi lineaarseid mudeleid (General Linear Models, GLM), võivad analüüsiks kasutada erinevat, ent võrreldavat lähenemisviisi, kuid ei pruugi tingimata tuletada tavalist ANOVA tabelit, mis põhineb arvutieelse ajastu statistiliste näitajate arvutamiseks kasutatud algoritmidel.
         
            (7)  Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).
         
            (8)  Kemikaaliklass on igale uuritavale ainele omistatud standardse klassifitseerimisskeemi kohaselt, mis põhineb USA meditsiiniraamatukogu meditsiiniteemade klassifitseerimissüsteemil (vt http//www.nlm.nih.gov/mesh).
         
            (9)  Põhineb küüliku silma in vivo katse (OECD TG 405) (17) tulemustel ja selles kasutatakse ÜRO GHSi (4).
         
            (10)  Klassifitseerimine 2A või 2B kategooriasse sõltub ÜRO GHSi kriteeriumi tõlgendusest, mille alusel eristatakse neid kahte kategooriat, st üks kolmest või kaks kolmest loomast, kellel 7. päeval avaldub veel mõju, on vajalik(ud) selleks, et klassifitseerida kemikaal 2A kategooriasse. In vivo uuringus kasutati kolme looma. Kõik näitajad peale sidekesta punetuse ühel loomal paranesid hindeni 0 seitsmendaks päevaks või varem. Ühel loomal, kes ei paranenud täielikult 7. päevaks, oli 7. päeval sidekesta punetuse hinne 1, kuid sidekest oli täielikult paranenud 10. päevaks.
         
            (11)  Esitatud mõõtmetega sarvkestahoidikut kasutatakse 12–60 kuu vanuse lehma sarvkesta puhul. Kui kasutatakse 6–12 kuu vanuse looma sarvkesta, peab sarvkestahoidik olema projekteeritud nii, et kummagi kambri ruumala on 4 ml ning kummagi sisekambri diameeter on 1,5 cm ja sügavus 2,2 cm. Uue konstruktsiooniga sarvkestahoidiku puhul on väga oluline, et ainega kokkupuutuva sarvkestaosa pindala ja tagumise kambri ruumala suhe oleks samasugune kui tavalise sarvkestahoidiku puhul. Selle tagamine on oluline selleks, et määrata õigesti läbilaskvuse väärtused, mida kasutatakse IVISe väärtuse arvutamiseks esitatud valemi järgi.
         
            (12)  Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).
         
            (*2)  Suurim registreeritud keskmine väärtus kõikidel vaatlusaegadel
         
            (*3)  Maksimaalsed kõikidel vaatlusaegadel registreeritud hägususe väärtuse keskmised hinded (põhinevad tabelis 1 esitatud hägususe hindepunktide põhjal).
         
            (*4)  Põhineb tabelis 2 määratletud hinnetel.
         
            (*5)  Ebatõenäolisemad kombinatsioonid
         
            (13)  Kemikaaliklass on igale uuritavale ainele omistatud standardse klassifitseerimisskeemi kohaselt, mis põhineb USA meditsiiniraamatukogu meditsiiniteemade klassifitseerimise süsteemil (vt http//www.nlm.nih.gov/mesh).
         
            (14)  Põhineb küüliku in vivo silmakatse (OECD katsejuhend nr 405) tulemustel ning selles kasutatakse ÜRO GHSi (4, 6).
         
            (15)  Põhineb tabelis 6 esitatud ICE-tulemustel
         
            (16)  Muude kui tabelis 6 kirjeldatud ICE tulemuste kombinatsioonid „GHSi kategooriata“ ja „GHSi 1. kategooria“ (vt tabel 6).
         
            (17)  Klassifitseerimine 2A või 2B kategooriasse sõltub ÜRO GHSi kriteeriumi tõlgendusest, mille alusel eristatakse neid kahte kategooriat, st üks kolmest või kaks kolmest loomast, kellel 7. päeval avaldub veel mõju, on vajalik(ud) selleks, et klassifitseerida kemikaal 2A kategooriasse. In vivo uuringus kasutati kolme looma. Kõik näitajad peale sidekesta punetuse ühel loomal paranesid hindeni 0 seitsmendaks päevaks või varem. Ühel loomal, kes ei paranenud täielikult 7. päevaks, oli 7. päeval sidekesta punetuse hinne 1, kuid sidekest oli täielikult paranenud 10. päevaks.
         
            (18)  Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).
         
            (19)  Keskväärtusena mõistetakse kogu dokumendi ulatuses aritmeetilist keskmist.
         
            (20)  Arvud viitavad statistiliselt tuletatud läviväärtustele ja ei ole seotud mõõtmise täpsusega.
         
            (21)  DPRA prognoosi tuleb arvesse võtta ühtse lähenemisviisi raamistikus ning kooskõlas punkti 9 ja 12 nõuetega.
         
            (22)  Arvud viitavad statistiliselt tuletatud läviväärtustele ja ei ole seotud mõõtmise täpsusega.
         
            (23)  DPRA prognoosi tuleb arvesse võtta ühtse lähenemisviisi raamistikus ning kooskõlas punkti 9 ja 12 nõuetega.
         
            (24)  In vivo ohu ja (toime tugevuse) prognoosid põhinevad LLNA andmetel (19). Toime tugevus in vivo on tuletatud, kasutades ECETOC-i ette nähtud kriteeriume (23).
         
            (25)  DPRA prognoosi tuleb arvesse võtta ühtse lähenemisviisi raamistiku kontekstis ja kooskõlas punktide 9 ja 11 nõuetega.
         
            (26)  Vahemikud, mis on määratud kuues sõltumatus laboris saadud vähemalt kümne sisalduse vähenemise väärtuse alusel.
         
            (27)  Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).
         
            (28)  (In vivo ohtlikkuse (ja toime tugevuse) prognoos põhineb LLNA andmetel (13). Toime tugevus in vivo on tuletatud, kasutades ECETOC-i ette nähtud kriteeriume (24).
         
            (29)  KeratinoSens™ testil põhinevat prognoosi tuleb arvesse võtta ühtse lähenemisviisi raamistikus ning kooskõlas selle katsemeetodi punkti 9 ja 11 nõuetega.
         
            (30)  Põhineb varasemate katsete andmetel (12).
         
            (31)  Euroopa Parlamendi ja nõukogu 16. detsembri 2008. aasta määrus (EÜ) nr 1272/2008, mis käsitleb ainete ja segude klassifitseerimist, märgistamist ja pakendamist ning millega muudetakse direktiive 67/548/EMÜ ja 1999/45/EÜ ja tunnistatakse need kehtetuks ning muudetakse määrust (EÜ) nr 1907/2006 (ELT L 353, 31.12.2008, lk 1).
         
            (32)  Iga uuritava aine kemikaaliklass määrati standardse klassifitseerimisskeemi alusel, mis põhineb USA riikliku meditsiiniraamatukogu (National Library of Medicine) tesauruse MeSH ( Medical Subject Headings) klassifikatsioonisüsteemil (vt http//www.nlm.nih.gov/mesh).
         
            (33)  Põhineb küüliku in vivo silmakatse (OECD katsejuhend nr 405, katsemeetod B.5) tulemustel ning selles kasutatakse ÜRO GHSi ja ELi CLP-määrust (4, 6).
         
            (34)  Põhineb FL-katsemeetodiga saadud tulemustel (INVITTOX Protocol No. 71).
         
            (35)  Statistikud, kes kasutavad modelleerimist, näiteks üldisi lineaarseid mudeleid (General Linear Models, GLM), võivad samale analüüsile läheneda teisel, kuid võrreldaval viisil; seejuures ei tarvitse nad tingimata tuletada traditsioonilist ANOVA tabelit, mis pärineb veel arvutieelsest ajastust, kui statistilisi näitajaid arvutati algoritmiliste lähenemisviiside abil.
         
            (36)  Mõisted ja ühikud on määratletud 1. liites.
         
            (37)  Mõnikord kasutatakse tähist P
            OW; selle määramiseks kasutatakse peatükis A.8 (4) kirjeldatud loksutamismeetodit, peatükis A.24 (5) kirjeldatud HPLC-põhist meetodit või peatükis A.23 (6) kirjeldatud aeglasel segamisel põhinevat meetodit. Mõnikord kasutatakse log K
            OW määramiseks generaatorkolonnil põhinevat meetodit. Selle meetodi kasutamist kirjeldavate uuringute arv on piiratud; seda on peamiselt kasutatud klooritud bifenüülide ja dibensodioksiinide puhul (nt Li ja Doucette, 1993) (3). Ainete puhul, mis võivad ioniseeruda, peaks log K
            OW väärtus viitama ioniseerumata vormile.
         
            (38)  Mõisted ja ühikud on määratletud 1. liites.
         
            (39)  HPLC – kõrgsurvevedelikkromatograafia.
         
            (40)  Mõnes õigusraamistikus võib metaboliitide analüüsimine olla kohustuslik, kui on täidetud teatavad tingimused (vt punkt 65).
         
            (41)  Üldjuhul peaks omastamisetapis mõõdetav aine sisaldus vees olema vähemalt ühe suurusjärgu võrra suurem kui määramispiir, et katse puhastumisetapis oleks võimalik teha mõõtmisi mitme organismist kõrvaldamise poolväärtusaja vältel.
         
            (42)  Mõisted ja ühikud on määratletud 1. liites.
         
            (43)  Enamiku uuritavate ainete puhul ei tohiks aine ideaaljuhul olla kontrollrühma vees tuvastatav. Taustsisaldus peaks olema asjakohane üksnes looduslikult esinevate materjalide (nt mõned metallid) ja keskkonnas laialdaselt levinud ainete puhul.
         
            (44)  Kui on selge, et tegemist ei ole esimest järku reaktsiooni kineetikaga, tuleks kasutusele võtta keerukamad mudelid (vt viited 5. liites) ja küsida nõu biostatistikult.
         
            (45)  Aine omastamist võib piirata väike kokkupuutekontsentratsioon, mis tuleneb vähesest vees lahustuvusest biokontsentreerumise katses, samas kui toidukaudse kokkupuute katses on võimalik saavutada oluliselt suurem kokkupuutekontsentratsioon.
         
            (46)  Mitut koostisosa sisaldava aine, UVCB või segu puhul tuleks sobivate kokkupuutekontsentratsioonide kindlaksmääramisel lähtuda iga asjakohase koostisosa lahustuvusest vees.
         
            (47)  Orgaanilise süsiniku üldsisaldus (TOC) hõlmab nii tahketes osakestes esinevat orgaanilist süsinikku (POC) kui ka lahustunud orgaanilist süsinikku (DOC), st TOC = POC + DOC.
         
            (48)  Ehkki lahusti või dispergeeriva aine kasutamine ei ole üldiselt soovitatav, tuleks sellise aine kasutamisel lisada sellest pärineva orgaanilise süsiniku kogus uuritavast ainest pärineva orgaanilise süsiniku kogusele, et hinnata orgaanilise süsiniku sisaldust katsenõudes.
         
            (49)  Kui lipiidisisalduse ja uuritava aine sisalduse määramiseks ei kasutata sama kala, peavad asjaomased kalad olema vähemalt sarnase kehamassiga ja vajaduse korral samast soost.
         
            (50)  Seda võimalust on lubatud kasutada üksnes juhul, kui kõik katses kasutatavad rühmad on sarnase suurusega ning kalad eemaldatakse ja neid söödetakse sama režiimi alusel. Sellega tagatakse, et kalade kasv on kõikides rühmades sarnane, kui katses kasutatav kontsentratsioon on mürgisuse avaldumise kontsentratsioonist väiksem. Sarnase kasvu korral on ka lipiidisisaldus eeldatavalt sarnane. Kasvuerinevus kontrollrühmas viitab aine mõjule ja muudab katse kehtetuks.
         
            (51)  Peale massi tuleks registreerida ka üldpikkus, kuna katse vältel toimunud pikkuse suurenemise määrade võrdlemine annab hea ettekujutuse kahjuliku mõju esinemisest või puudumisest.
         
            (52)  Kasvu kiiruskonstantide puhul võib kohaldada t-testi, et kontrollida, kas kasv kontroll- ja katserühma(de)s on erinev; dispersioonanalüüsi puhul võib kasutada F-testi. Vajaduse korral võib sobiva kasvumudeli valimise hõlbustamiseks kasutada F-testi või tõepärasuhte testi (OECD monograafia 54 (32)).
         
            (53)  Selle väärtuse puhul eeldatakse, et analüüsimeetodid on usaldusväärsed ja poolväärtusaeg on < 14 päeva. Kui analüüsimeetodid ei ole nii usaldusväärsed või poolväärtusaeg on (oluliselt) pikem, on varieeruvus suurem.
         
            (54)  
         
            UV– usaldusvahemik (esitatakse juhul, kui seda on võimalik hinnata).
         
            (55)  
         
            SH– standardhälve (esitatakse juhul, kui seda on võimalik hinnata).
         
            (56)  Minimeeritud katseplaani võibki kasutada kiire metaboliseerumise tõendamiseks, kui on teada, et kiire metaboliseerumine on tõenäoline.
         
            (57)  Kui mõõtmisi tehakse ainult kahes andmepunktis, võib BCFKm-i usalduspiiride hindamiseks kasutada andmete usaldusväärsuse iteratiivse kontrollimise meetodit (bootstrapping). Kui kasutatakse ka vahepealseid andmepunkte, võib BCFKm-i usalduspiirid arvutada samal viisil kui täismahus katses.
         
            (58)  Mõisted ja ühikud on määratletud 1. liites.
         
            (59)  Seda küsimust on seoses määrusega (EÜ) nr 1907/2006, mis käsitleb kemikaalide registreerimist, hindamist, autoriseerimist ja piiramist (REACH) (ELT L 396, 30.12.2006, lk 1), käsitletud dokumendi „Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment“ („Teabenõudeid ja kemikaalide ohutuse hindamist käsitlevad suunised“) peatüki R.7c punktis R.7.10.3.1, punktis R.7.10.4.1 ja joonisel R7.10–2.
         
            (60)  Enamiku uuritavate ainete puhul ei tohiks aine ideaaljuhul olla kontrollrühma vees tuvastatav. Taustsisaldus peaks olema asjakohane üksnes looduslikult esinevate materjalide (nt mõned metallid) ja keskkonnas laialdaselt levinud ainete puhul.
         
            (61)  Kuna BMF on määratletud kui suhtarv, mis väljendab organismis esineva aine kontsentratsiooni ja organismi toidus esineva aine kontsentratsiooni suhet statsionaarses olekus, korrigeeritakse seda lipiidisisalduse arvessevõtmiseks nii organismi kui ka toidu lipiidisisalduse suhtes ning seega on täpsem nimetada seda korrigeerimiseks. See lähenemisviis erineb veekaudsel kokkupuutel toimuva biokontsentreerumise katses tehtavast normaliseerimisest organismi teatud kindla lipiidisisalduse alusel.
         
            (62)  Katse käigus tuleks registreerida ka üldpikkus, kuna selle näitaja alusel saab hästi hinnata, kas aine on avaldanud kahjulikku toimet.
         
            (63)  Heksaklorobenseen on loetletud Stockholmi konventsiooni A ja C lisas ning püsivaid orgaanilisi saasteaineid käsitleva määruse (EÜ) nr 850/2004 (ELT L 158, 30.4.2004, lk 7) I ja III lisas.
         
            (64)  Omastamisetapis toimuva kiire kasvu korral langeb söötmismäär kokkupuute alguses kehtestatud määrast allapoole.
         
            (65)  Veekaudse kokkupuute katses on 14 päeva pikkusele poolväärtusajale vastav BCFi väärtus 1 g kaaluvate kalade kasutamisel umbes 10 000 l/kg ja vastav omastamiskiirus umbes 500 l/kg päevas (vastavalt võrrandile, mille on avaldanud Sijm et al. (46)).
         
            (66)  Kuna aine tegelikku sisaldust organismis on võimalik mõõta alles pärast katse läbiviimist, on vaja leida aine hinnanguline eeldatav sisaldus organismis (näiteks lähtuvalt eeldatavast BMFst ja aine sisaldusest söödas; vt 5. liide, võrrand A5.8).
         
            (67)  Uuritava aine esinemist katselahuses kaladest eritumise või söödast leostumise tõttu ei pruugi olla võimalik täielikult ära hoida. Seepärast on üks võimalus määrata aine sisaldus vees omastamisetapi lõpus, eriti poolstaatilise režiimi kasutamise korral, et aidata kindlaks teha, kas veekaudne kokkupuude on aset leidnud.
         
            (68)  Seda lähenemisviisi kasutatakse üksnes toidukaudse kokkupuute puhul ja see erineb veekaudse kokkupuute puhul järgitavast meetodist, mistõttu segaduse vältimiseks on mõiste „normaliseerimine“ asemel kasutatud mõistet „korrigeerimine“ – vt ka joonealune märkus punktis 106.
         
            (69)  Kasvu kiiruskonstantide puhul võib kohaldada t-testi, et kontrollida, kas kasv kontroll- ja katserühma(de)s on erinev; dispersioonanalüüsi puhul võib kasutada F-testi. Vajaduse korral võib sobiva kasvumudeli valimise hõlbustamiseks kasutada F-testi või tõepärasuhte testi (OECD monograafia 54 (32)).
         
            (70)  Sööda analüüsimise meetod valgu-, lipiidi-, toorkiu- ja tuhasisalduse määramiseks; see teave saadakse tavaliselt sööda tarnija käest.
         
            (71)  
         
            UV– usaldusvahemik (esitatakse juhul, kui seda on võimalik hinnata).
         
            (72)  
         
            SH– standardhälve (esitatakse juhul, kui seda on võimalik hinnata).
         
            (73)  Meyer et al. (1).
         
            (74)  Tuleks silmas pidada, et katses kasutatakse suuruse näitajana ja kasvu kiiruskonstandi leidmiseks soovitatavalt massi. Samas mööndakse, et praktikas on hõlpsam kasutada pikkust, kui kalu tuleb katse alguses (st lähtepopulatsioonist) valida silma järgi.
         
            (75)  See pikkusevahemik on esitatud Jaapanis kehtival kemikaalide kontrollimise seadusel põhinevates katsemeetodites uute kemikaalide jmt jaoks.
         
            (76)  Sulgudes on esitatud lisaproovide võtmise korral analüüsitavate veeproovide või kalade arv.
         
            (77)  Katse eel arvutatud hinnanguline k
            2 väärtus log K
            OW väärtusel 4,0 on 0,652 päeva kohta. Katse kavandatud üldkestus on 3 × t
            SS = 3 × 4,6 päeva, s.o 14 päeva. Näitaja t
            SS-i hindamist on käsitletud 5. liites.
         
            (78)  Veeproov võetakse pärast seda, kui vesi on vahetunud vähemalt kolmekordses kambri mahus.
         
            (79)  Need kalad võetakse lähtepopulatsioonist.
         
            (80)  Kui suurema täpsuse saavutamiseks või metabolismiuuringute tegemiseks on vaja suuremat arvu kalu, tuleks täiendavalt vajaminevad kalad võtta omastamisetapi ja puhastumisetapi lõpus (vt punkt 40).
         
            (81)  Lipiidisisalduse analüüsimiseks võib olla täiendavalt vaja vähemalt 3 kala, kui selleks ei ole võimalik kasutada kalu, kes valiti aine sisalduse määramiseks katse alguses, omastamisetapi lõpus ja puhastumisetapi lõpus. Tuleb silmas pidada, et paljudel juhtudel peaks olema võimalik kasutada selleks otstarbeks üksnes 3 kontrollrühmast võetud kala (vt punkt 56).
         
            (82)  Uuritava aine ja lipiidide sisalduse suhtes analüüsitakse nii kontrollrühmast kui ka katserühmast 3 söödaproovi.
         
            (83)  Kalaproov võetakse lähtepopulatsioonist uuringu algushetkele võimalikult lähedasel hetkel; lähtepopulatsioonist tuleks lipiidisisalduse suhtes analüüsimiseks võtta katse alguses vähemalt 3 kala.
         
            (84)  Omastamisetapi algusjärgus (soovi korral) võetavatest proovidest saadud andmed võimaldavad arvutada uuritava aine toidust imendumise määra, mida saab võrrelda puhastumisetapi andmete põhjal arvutatud imendumistõhususe väärtusega.
         
            (85)  Koespetsiifilise analüüsi jaoks võib võtta veel 5 kala.
         
            (86)  Lipiidisisalduse analüüsimiseks võib olla täiendavalt vaja vähemalt 3 kala, kui selleks ei ole võimalik kasutada kalu, kes valiti aine sisalduse määramiseks katse alguses, omastamisetapi lõpus ja puhastumisetapi lõpus. Tuleb silmas pidada, et paljudel juhtudel peaks olema võimalik kasutada selleks otstarbeks üksnes 3 kontrollrühmast võetud kala (vt punktid 56 ja 153).
         
            (87)  Nagu kõikide muudegi empiiriliste seoste puhul, tuleks enne veenduda, et asjaomane seos on kohaldatav ka uuritava aine puhul.
         
            (88)  Kalade massi omastamisetapi lõpus saab hinnata lähtuvalt varasematest uuringuandmetest või teadmistest katseliigi kalade massi eeldatava suurenemise kohta omastamisetapi tüüpilise kestuse (nt 28 päeva) jooksul võrdluses kalade tavapärase massiga katse alguses.
         
            (89)  Enamiku programmide puhul, mis võimaldavad kasutada lineaarset regressiooni (nt andmeanalüüsi mooduliga Microsoft Excel), arvutatakse ka asjaomase hinnangulise väärtuse standardviga ja usaldusvahemik.
         
            (90)  Erinevalt lineaarse regressiooni meetodist ei võimalda see valem arvutada k2 standardviga.
         
            (91)  Erinevalt lineaarse regressiooni meetodist ei võimalda see valem tavaliselt arvutada hinnangulise k1 standardviga ega usaldusvahemikku.
         
            (92)  Tuleks tähele panna, et hinnangulisek2 usaldusväärsust ei kasutata bioakumuleerumise mudelis õigel viisil, kui seda näitajat vaadeldakse järjestikuse lähendamise meetodi kohasel k1 lähendamisel konstantsena. Sellest tulenevalt on BCFi usaldusväärsus üheaegse ja järjestikuse lähendamise mudeli puhul erinev.
         
            (93)  Mõnes piirkonnas võib kättesaadav olla üksnes selline kalasööt, mille lipiidisisaldus on esitatud ülemmäärast oluliselt väiksem. Sellisel juhul tuleks uuringus kasutada kättesaadavat väiksema lipiidisisaldusega sööta ja kohandada söötmisrežiimi, et tagada kalade püsimine tervena. Sööda lipiidisisaldust ei tohiks õli lisamisega kunstlikult suurendada.
         
            (94)  Looduslikus veekeskkonnas toimub kokkupuude väga hüdrofoobsete ainetega kõige suuremal määral tõenäoliselt toidu tarbimise kaudu, mistõttu hinnanguline BCF ei kajasta täielikult sellise aine võimaliku bioakumuleerumise määra.
         
            (95)  Muid kiivrike liike võib kasutada tingimusel, et nad vastavad vajalikele katse nõuetekohasuse kriteeriumidele (kontrolli rühma sigivusega seotud nõuetekohasuse kriteerium peaks olema asjakohane kõikide kiivrikuliikide puhul). Kui kasutatakse muid kiivrike liike, tuleb nad selgelt identifitseerida ja nende kasutamine põhjendada.
         
            (96)  Juhuslik suremus: suremus kemikaaliga mitte seotud juhuste tõttu (st põhjus on teada).
         
            (97)  Seletamatu suremus: kemikaaliga mitte seotud suremus, mille põhjus ei ole teada.
         
            (*6)  Märkige, millist nõu katseks kasutati.
         
            (*7)  Märkige asjaomases lahtris aborteerunud haudmed tähisega „AB“ (aborted brood).
         
            (*8)  Märkige asjaomases lahtris vanemloomade suremus tähisega „M“ (mortality).
         
            (98)  Tavapärast minimaalset keskmist üldpikkust ei käsitata nõuetekohasuse kriteeriumina, kuid esitatud väärtusest väiksema näitaja korral tuleks seda asjaolu katses vaadeldavast tundlikkusest lähtuvalt põhjalikult uurida. Minimaalne keskmine üldpikkus põhineb valikul praegu kättesaadavatest andmetest.
         
            (99)  Katses kasutatava konkreetse vikerforelliliini puhul võib olla vaja kasutada muud temperatuuri. Sugukarja tuleb hoida samal temperatuuril kui marja saamiseks kasutatavaid kalu. Pärast marjaterade saamist marja tootvast ettevõttest on vaja kohandada neid saabumise järel lühiajaliselt (nt 1–2 tundi) katsetemperatuuriga.
         
            (100)  Vastseid hoitakse koorumisjärgselt nädal aega pimedas, välja arvatud nende kontrollimise ajal, ning seejärel kasutatakse kogu katse vältel vähest valgustust (valgustusperiood 12–16 tundi) (4).
         
            (101)  Konkreetsete katsetingimuste puhul peaks valgustusrežiim olema muutumatu.
         
            (102)  Seda näitajat järgitakse igas konkreetses katses täpsusega ± 2 0/00.
         
            (*9)  Sööta tuleks anda küllastumiseni. Sööda ülejäägid ja väljaheited tuleks vajaduse korral kõrvaldada, et vältida jäätmete kogunemist.
         
                     FBS
                  
                  
                     külmutatud soolase vee krevetid; Artemia sp. täiskasvanud isendid.
                  
               
                     BSN
                  
                  
                     soolase vee krevettide noorjärgus isendid, äsja koorunud.
                  
               
                     BSN48
                  
                  
                     soolase vee krevettide noorjärgus isendid, 48 tunni vanused.
                  
               
            (1)  Rebukotiga vastsed ei vaja toitu.
         
            (2)  Segakultuurist filtritud.
         
            (3)  Käärimisprotsessist saadavad graanulid.
         
            (*10)  Papillaarjätked esinevad tavaliselt ainult täiskasvanud isaskaladel ja paiknevad pärakuuime tagumisest otsast lugedes teisel kuni seitsmendal või kaheksandal uimekiirel (joonised 1 ja 2). Mõnikord harva esineb selliseid jätkeid siiski ka pärakuuime tagumisest otsast lugedes esimesel uimekiirel. Käesolev standardne töökord hõlmab jätkete mõõtmist ka esimesel uimekiirel (käesoleva töökorra puhul saadakse uimekiire järjekorranumber pärakuuime tagumisest otsast loendades).
         
            (*11)  Homogeniseerimispuhver:
         
                     —
                  
                  
                     50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 % proteaasiinhibiitorite segu (Sigma): 12 ml Tris-HCl, pH 7,4 + 120 μl proteaasiinhibiitorite segu;
                  
               
                     —
                  
                  
                     TRIS: TRIS-ULTRA PURE (ICN), näiteks Taani firmalt Bie & Berntsen;
                  
               
                     —
                  
                  
                     proteaasiinhibiitorite segu: Sigma, tootenumber P8340 (imetajate kudede jaoks).
                  
               
            MÄRKUS: homogeniseerimispuhver peaks olema valmistatud proovide töötlemise päeval. Puhvrit hoitakse kasutamise ajal jää peal.
         
            (103)  Carl von Linné (sünd. 23. mail 1707 Råshultis/Älmhultis, surn. 10. jaanuaril 1778 Uppsalas).
         
            (*12)  Demineraliseeritud (st destilleeritud või deioniseeritud) vesi