CELEX: 31976L0372
Language: es
Date: 1976-03-01 00:00:00
Title: Séptima Directiva 76/372/CEE de la Comisión, de 1 de marzo de 1976, sobre determinación de métodos de análisis comunitarios para el control oficial de la alimentación animal

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31976L0372

Séptima Directiva 76/372/CEE de la Comisión, de 1 de marzo de 1976, sobre determinación de métodos de análisis comunitarios para el control oficial de la alimentación animal  

Diario Oficial n° L 102 de 15/04/1976 p. 0008 - 0018 Edición especial en finés : Capítulo 3 Tomo 7 p. 0048  Edición especial griega: Capítulo 03 Tomo 15 p. 0031  Edición especial sueca: Capítulo 3 Tomo 7 p. 0048  Edición especial en español: Capítulo 03 Tomo 10 p. 0044  Edición especial en portugués: Capítulo 03 Tomo 10 p. 0044 

 SÉPTIMA DIRECTIVA DE LA COMISIÓN    de 1 de marzo de 1976    sobre determinación de métodos de análisis   comunitarios para el control oficial de la alimentación   animal     ( 76/372/CEE )    LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,    Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad   Económica Europea ,    Vista la Directiva del Consejo , de 20 de julio de 1970 ,   referente a la introducción de modos de tomas de muestras   y de métodos de análisis comunitarios para el control   oficial de la alimentación animal (1) , modificada en   último lugar por el Acta de adhesión (2) y , en   particular , su artículo 2 ,    Considerando que la Directiva arriba contemplada prevé   que los controles oficiales de la alimentación animal   dirigidos a comprobar que se respetan las condiciones   prescritas en virtud de las disposiciones legales ,   reglamentarias y administrativas referentes a la calidad y   a la composición de la alimentación animal , se llevan   a cabo según los modos de tomas de muestras y los   métodos de análisis comunitarios ,    Considerando que las Directivas 71/250/CEE ,   71/393/CEE , 72/199/CEE , 73/46/CEE , 74/203/CEE y   75/84/CEE de la Comisión , de 15 de junio de 1971 (3) ,   18 de noviembre de 1971 (4) , 27 de abril de 1972 (5) ,   5 de diciembre de 1972 (6) , 25 de marzo de 1974 (7) y   20 de diciembre de 1974 (8) , establecieron ya un   determinado número de métodos de análisis   comunitarios ; que habida cuenta del avanzado estado de los   trabajos llevados a cabo desde entonces , conviene   adoptar una séptima serie de métodos ,    Considerando que las medidas previstas en la presente   Directiva concuerdan con el dictamen del Comité   permanente de la alimentación animal .    HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :    Artículo 1    Los Estados miembros dispondrán que los análisis   para los controles oficiales de alimentación animal , en   lo referente a su contenido en aflatoxina B1 se llevarán   a cabo según los métodos descritos en el Anexo de   la presente Directiva .    Las disposiciones generales que figuren en la parte I   ( introducción ) del Anexo de la primera Directiva   71/250/CEE de la Comisión , de 15 de junio de 1971 ,   excepto la parte referente a la preparación de la muestra   que debe analizarse , serán aplicables a los métodos   descritos en el Anexo de la presente Directiva .    Artículo 2    Los Estados miembros aplicarán , a más tardar , el   1 de octubre de 1976 , las disposiciones legales ,   reglamentarias y administrativas necesarias para cumplir la   presente Directiva e informarán de ello inmediatamente   a la Comisión .    Artículo 3    Los destinatarios de la presente Directiva serán los   Estados miembros .    Hecho en Bruselas , el 1 de marzo de 1976 .    Por la Comisión    P. J. LARDINOIS    Miembro de la Comisión    (1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .    (2) DO n º L 73 de 27 . 3 . 1972 , p. 14 .    (3) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .    (4) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .    (5) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .    (6) DO n º L 83 de 30 . 3 . 1973 , p. 21 .    (7) DO n º L 108 de 22 . 4 . 1974 , p. 7 .    (8) DO n º L 32 de 5 . 2 . 1975 , p. 26 .    ANEXO    DOSIFICACIÓN DE LA AFLATOXINA B1    A . MÉTODO POR CROMATOGRAFÍA MONODIMENSIONAL EN   CAPA FINA    1 . Objeto y ámbito de aplicación    El método permite determinar el contenido de   aflatoxina B1 de los alimentos siguientes : tortas de   cacahuetes , de copra , de lino , de soja ,   de sésamo de babasú y de gérmenes de maíz ,   cereales y derivados , harina de guisantes , pulpa y   fécula de patatas . El límite inferior de la   dosificación es de 0,01 mg/kg ( 10 ppb ) .    En presencia de sustancias interferentes que   obstaculicen las determinaciones , conviene recomenzar   el análisis según el método B ( por cromatografía   bidimensional en capa fina ) .    2 . Principio    La muestra se somete a la extracción mediante   cloroformo . Se filtra el extracto y se toma del   mismo una parte alicuota que es purificada mediante   cromatografía en columna de gel de sílice . El   eluido se evapora y el residuo se vuelve a tomar   mediante un volumen determinado de cloroformo o de   una mezcla de benceno y acetonitrilo . Una parte   alicuota de dicha solución se somete a la   cromatografía en capa fina . La cantidad de   aflatoxina B1 se determina bajo irradiación ultravioleta   del cromatograma bien sea visualmente , o a través   de fluordensitometría , mediante comparación con   cantidades conocidas de aflatoxina B1-tipo .   La identidad de la aflatoxina B1 extraida del alimento   debe confirmarse mediante los procedimientos indicados .    3 . Reactivos    NB : Todos los reactivos deben ser de calidad   « para el análisis » en la medida en que no se ha   dado ninguna otra indicación .    3.1 . Acetona .    3.2 . Cloroformo , estabilizado del 0,5 al   1,0 por ciento de etanol de 96 ° ( v/v ) .    3.3 . n-Hexano .    3.4 . Metanol .    3.5 . Eter dietílico anhídrido , exento de   peróxidos .    3.6 . Mezcla de benceno y de acetonitrilo :   98/2 ( v/v ) .    3.7 . Mezcla de cloroformo ( 3.2 ) y de metanol   ( 3.4 ) : 97/3 ( v/v ) .    3.8 . Gel de sílice , para cromatografía en   columna , granulometría : de 0,05 a 0,20 mm .    3.9 . Algodón hidrófilo , previamente desengrasado   mediante cloroformo , o lana de vidrio .    3.10 . Sulfato de sodio , anhidro , granulado .    3.11 . Gas inerte , por ejemplo : ázoe .    3.12 . Acido clorhídrico 1 N .    3.13 . Acidó sulfúrico al 50 por ciento ( v/v ) .    3.14 . Tierra de diatomeas ( Hiflosupercel ) lavada   con ácido .    3.15 . Gel de sílice G-HR o equivalente , para   cromatografía en capa fina .    3.16 . Solución tipo de 0,1 mgr. aproximadamente   de aflatoxina B1 por milímetro en el cloroformo   ( 3.2 ) o en la mezcla de benceno/acetonitrilo ( 3.6 ) ,   preparada y controlada como se indica en el punto 7 .    3.17 . Solución tipo cualitativa de 0,1 mgr.   aproximadamente de aflatoxina B1 y B2 por ml en el   cloroformo ( 3.2 ) o en la mezcla benceno/acetonitrilo   ( 3.6 ) . Estas concentraciones se dan a título   indicativo y deben ajustarse con objeto de obtener la   misma intensidad de fluorescencia para las dos aflatoxinas .    3.18 . Disolventes de revelado :    3.18.1 . Cloroformo ( 3.2 ) /acetona ( 3.1 ) : 9/1   ( v/v ) , cubeta no saturada ;    3.18.2 . Eter dietílico ( 3.5 ) /metanol   ( 3.4 ) /agua : 96/3/1 ( v/v/v ) , cubeta no saturada ;    3.18.3 . Eter dietílico ( 3.5 ) /metanol   ( 3.4 ) /agua : 94/4,5/1,5 ( v/v/v ) , cubeta   saturada ;    3.18.4 . Cloroformo ( 3.2 ) /metanol ( 3.4 ) :   94/6 ( v/v ) , cubeta saturada ;    3.18.5 . Cloroformo ( 3.2 ) /metanol ( 3.4 ) :   97/3 ( v/v ) , cubeta saturada .    4 . Equipo    4.1 . Triturador-mezclador .    4.2 . Aparato para agitar o agitador magnético .    4.3 . Filtros plegados , Schleicher y Schuell   n º 588 o equivalente , diámetro : 24 cm .    4.4 . Tubos para cromatografía , de cristal   ( diámetro interior : 22 mm , longitud 300 mm ) ,   con grifo de teflón y depósito de 250 ml .    4.5 . Aparato rotativo de evaporación en vacío ,   con matraz de 500 ml .    4.6 . Frascos cónicos de 500 ml , con tapón   esmerilado .    4.7 . Equipo para cromatografía en capa fina .    4.8 . Placas de vidrio para cromatografía en capa   fina , 200 por 200 mm , preparadas de la siguiente   manera ( con las cantidades indicadas se pueden   recubrir cinco placas ) : introducir 30 grs. de   gel de sílice G-HR ( 3.15 ) en un frasco cónico ,   añadir 60 ml de agua , tapar y agitar durante un   minuto . Extender la suspensión en las placas con   objeto de obtener una capa uniforme de 0,25 mm de   espesor . Dejar secar al aire y conservar después   en un desecador provisto de gel de sílice . En el   momento de su utilización , activar las placas   manteniéndolas durante una hora en la estufa a   110 n º C .    Las placas ya listas para su utilización son   prácticas en la medida en que dan resultados   parecidos a los de las placas preparadas según se ha   indicado más arriba .    4.9 . Lámpara ultravioleta de ondas largas   ( 360 nm ) . La intensidad de irradiación debe   permitir distinguir , incluso con claridad , una mancha   de 1,0 ngr. de aflatoxina B1 en una placa para   cromatografía en capa fina , a una distancia de   10 cm de la lámpara .    4.10 . Tubos de 10 ml , graduados , con tapones   de polietileno .    4.11 . Espectrofotómetro ultravioleta .    4.12 . Fluordensitómetro ( eventualmente ) .    5 . Modo de operar    5.1 . Preparación de la muestra ( ver las   observaciones del punto 1 de la parte C )    Triturar la muestra de manera que pase completamente   a través de un tamiz de mallas del mm ( conforme a   la recomendación ISO R 565 ) .    5.2 . Extracción    Introducir 50,0 g de la muestra molida y   homogeneizada en un frasco cónico de 500 ml ( 4.6 ) .   Añadir 25 g de tierra de diatomeas ( 3.14 ) , 25 ml de   agua y 250 ml de cloroformo ( 3.2 ) . Tapar el frasco ,   sacudir o agitar durante 30 minutos con ayuda del   aparato ( 4.2 ) y filtrar mediante el filtro plegado   ( 4.3 ) . Eliminar los 10 primeros ml del resultado   de la filtración y recoger a continuación 50 ml .    5.3 . Purificación en columna    Proveer la extremidad inferior de un tubo para   cromatografía ( 4.4 ) de un tapón de algodón o de   lana de vidrio ( 3.9 ) , llenar los dos tercios del   tubo de cloroformo ( 3.2 ) y añadir 5 g de sulfato   de sodio ( 3.10 ) .    Comprobar que la superficie superior de la capa   de sulfato de sodio está plana ; añadir a   continuación , en pequeñas porciones , 10 g de   gel de sílice ( 3.8 ) . Remover con precaución   después de cada adición con el fin de eliminar   las burbujas de aire . Dejar que se pose durante   15 minutos y añadir seguidamente , con precaución ,   15 g de sulfato de sodio ( 3.10 ) . Dejar descender el   líquido hasta la proximidad inmediata de la   superficie superior de la capa de sulfato de sodio .    Mezclar los 50 ml de extracto recogidos en 5.2   con 100 ml de n-hexano ( 3.3 ) y transvasar   cuantitativamente la mezcla en la columna . Dejar   descender el líquido hasta la superficie superior   de la capa de sulfato de sodio . Eliminar el   líquido derramado . Añadir a continuación 100 ml   de éter dietílico ( 3.5 ) y dejar descender de   nuevo el líquido hasta la superficie superior de la   capa de sulfato de sodio . Durante estas operaciones ,   procurar que el líquido derramado sea de 8 a 12 ml   por minuto y que la columna no se vacíe . Eliminar   los líquidos derramados . Eluir después mediante   150 ml de la mezcla cloroformo/metanol ( 3.7 ) y   recoger la totalidad del eluido .    Evaporar éste casi hasta vaciarlo , bajo una   corriente de gas inerte ( 3.11 ) y a una temperatura   que no supere los 50 n ° C , mediante el aparato   rotativo de evaporación en vacío ( 4.5 ) .   Introducir cuantitativamente el residuo por medio de   cloroformo ( 3.2 ) o de la mezcla benceno/acetonitrilo   ( 3.6 ) en un tubo de 10 ml ( 4.10 ) . Concentrar la   solución bajo una corriente de gas inerte ( 3.11 )   y llevar después el volumen a 2,0 ml por medio de   cloroformo ( 3.2 ) o de la mezcla benceno/acetonitrilo   ( 3.6 ) .    5.4 . Cromatografía en capa fina    Depositar puntualmente en una placa para cromatografía   en capa fina ( 4.8 ) , a 2 cm del borde inferior y a   intervalos de 2 cm , los volúmenes de la solución   tipo y del extracto indicados a continuación :     - 10 , 15 , 20 , 30 y 40 ml de la solución tipo   de aflatoxina B1 ( 3.16 ) ;     - 10 ml del extracto obtenido en 5.3 y , en   superposición en el mismo punto , 20 ml de la   solución tipo ( 3.16 ) ;     - 10 y 20 ml del extracto obtenido en 5.3 .    Revelar el cromatograma fuera del alcance de la   luz , con ayuda de uno de los disolventes de revelado   ( 3.18 ) . La elección del disolvente debe   determinarse previamente depositado en la placa 25 ml   de la solución tipo cualitativa ( 3.17 ) y   asegurándose de que , durante el revelado , las   aflatoxinas B1 y B2 están completamente separadas .    Dejar evaporar los disolventes fuera del alcance de   la luz e irradiar a continuación mediante luz   ultravioleta , colocando la placa a 10 cm de la   lámpara ( 4.9 ) . Las manchas de aflatoxina B1 dan   una fluorescencia azul .    5.5 . Determinaciones cuantitativas    Proceder a las determinaciones bien sea visualmente ,   o mediante fluordensitometría según se indica en lo   sucesivo :    5.5.1 . Medidas visuales    Determinar la cantidad de aflatoxina B1 del extracto   comparando la intensidad de fluorescencia de las   manchas del extracto con la de las manchas de la   solución tipo . Interpolar si es necesario . La   fluorescencia obtenida por superposición del extracto   a la solución tipo debe ser más fuerte que la de   los 10 ml de extracto y únicamente debe dar lugar a   la percepción de una sóla mancha . Si la   intensidad de fluorescencia dada por los 10 ml de   extracto es más fuerte que la de los 40 ml de   solución tipo , diluir el extracto 10 o 100 veces   mediante cloroformo ( 3.2 ) o mediante la mezcla de   benceno/acetonitrilo ( 3.6 ) antes de someterlo a una   nueva cromatografía en capa fina .    5.5.2 . Medidas por fluordensitometría    Medir la intensidad de fluorescencia de las   manchas de aflatoxina B1 en el fluordensitómetro   ( 4.12 ) utilizando una longitud de onda de   excitación de 365 nm y una longitud de onda de   emisión de 443 nm . Determinar la cantidad de   aflatoxina B1 de los depósitos del extracto y de la   solución tipo .    5.6 . Confirmación de la identidad de aflatoxina B1    Confirmar la identidad de la aflatoxina B1 del   extracto mediante los siguientes procedimientos :    5.6.1 . Tratamiento por ácido sulfúrico .    Pulverizar ácido sulfúrico ( 3.13 ) sobre el   cromatograma obtenido en 5.4 . La fluorescencia de   las manchas de aflatoxina B1 debe virar del azul   al amarillo bajo irradiación ultravioleta .    5.6.2 . Cromatografía bidimensional que implique   la formación de aflatoxina B1 - semiacetal   ( aflatoxina B2a )    NB : Las operaciones descritas en lo sucesivo deben   llevarse a cabo siguiendo el esquema que aparece en   la figura 3 .    5.6.2.1 . Aplicación de las soluciones    Trazar en una placa ( 4.8 ) dos rectas paralelas a   dos lados contiguos ( distantes 6 cm de esos lados ) ,   destinadas a delimitar el desplazamiento de los frentes   de disolventes . Depositar en una placa , con ayuda de   pipetas capilares o de microjeringas , las soluciones   indicadas en lo sucesivo :     - en el punto A : un volumen de extracto purificado   de la muestra obtenida en 5.3 , que contenga   2,5 nanogramos aproximadamente de aflatoxina B1 ;     - en los puntos B y C : 25 ml de la solución   tipo ( 3.16 ) .    5.6.2.2 . Revelado    Revelar el cromatograma en la dirección I con   ayuda del disolvente de revelado ( 3.18.1 )   [ capa de 1 cm en una cubeta no saturada ] ,   fuera del alcance de la luz , hasta que el frente de   disolvente alcance la línea de delimitación .   Retirar la placa de la cubeta y dejar secar durante   cinco minutos fuera del alcance de la luz y a la   temperatura ambiente . Pulverizar a continuación   ácido clorhídrico ( 3.12 ) en una banda de 2,5 cm   de altura que abarque los puntos A y B ( indicada con   trazos rayados en la figura 3 ) , hasta su   oscurecimiento , protegiendo el resto de la placa   mediante una hoja de vidrio . Dejar reaccionar   durante diez minutos en la obscuridad y secar con   ayuda de una corriente de aire a la temperatura   ambiente .    Revelar a continuación el cromatograma en la   dirección II con ayuda del disolvente de revelado   ( 3.18.1 ) [ capa de 1 cm en una cubeta no   saturada ] , fuera del alcance de la luz , hasta   que el frente del disolvente alcance la línea de   delimitación . Retirar la placa de la cubeta y dejar   secar a la temperatura ambiente .    5.6.2.3 . Interpretación del cromatograma    Examinar el cromatograma con luz ultravioleta   ( 4.9 ) y comprobar las observaciones indicadas en lo   sucesivo :    a ) Aparición de una mancha fluorescente azul de   aflatoxina B1 procedente de la solución tipo   depositada en C ( desplazamiento en la dirección I ) .    b ) Aparición de una mancha fluorescente azul de   aflatoxina B1 ( que no ha reaccionado con el ácido   clorhídrico ) y de una mancha fluorescente azul   más intensa de aflatoxina B1 - semiacetal ,   procedente de la solución tipo depositada en B   ( desplazamiento en la dirección II ) .    c ) Aparición de manchas similares a las   indicadas en la letra b ) , procedentes del   extracto de la muestra depositado en A . El   emplazamiento de estas manchas está definido por la   distancia de desplazamiento de la aflatoxina B1 a   partir del punto A en la dirección I ( la misma   distancia que la recorrida por la solución tipo   depositada en C ) seguida de las distancias de   desplazamiento recorridas en la dirección II por   la aflatoxina B1 ( que no ha reaccionado con el   ácido clorhídrico ) y por la aflatoxina B1 -   semiacetal ( las mismas distancias que las recorridas   por la solución tipo depositada en B ) . Las   intensidades de fluorescencia de las manchas de   semiacetal procedentes del extracto y de la solución   tipo deberían corresponderse .    6 . Cálculo de resultados    6.1 . A partir de medidas visuales    El contenido en microgramos de aflatoxina B1 por   kilogramo de muestra ( ppb ) viene dado por la   fórmula    S · Y · V/W · X    en la cual :    X e Y son respectivamente los volúmenes en   microlitros de solución tipo de aflatoxina B1 ( 3.16 )   y del extracto , que tienen una intensidad de   fluorescencia semejante ;    S = concentración en microgramos de aflatoxina B1   por ml de la solución tipo ( 3.16 ) ;    V = volumen final del extracto en microlitros ,   habida cuenta de las eventuales diluciones ;    W = peso en gramos de la toma de prueba   correspondiente al volumen de extracto sometido   a la purificación en columna .    6.2 . A partir de medidas fluordensitométricas    El contenido en microgramos de aflatoxina B1   por kilogramo de muestra ( ppb ) viene dado   por la fórmula    S · V/W · Y    en la cual :    Y = volumen en microlitros del extracto depositado   en la placa ( 10 ó 20 ml ) ;    S = cantidad en nanogramos de aflatoxina B1   del depósito del extracto ( habida cuenta del   volumen Y ) , deducida de las determinaciones ;    V = volumen final del extracto en microlitros ,   habida cuenta de las eventuales diluciones ;    W = peso en gramos de la toma de prueba , correspondiente   al volumen de extracto sometido a la purificación   en columna .    7 . Preparación y control de la solución   tipo ( 3.16 )    7.1 . Determinación de la concentración   en aflatoxina B1    Preparar una solución tipo de aflatoxina B1   en el cloroformo ( 3.2 ) o en la mezcla   benceno/-acetonitrilo ( 3.6 ) cuya concentración   es de 8 a 10 mgrs por milílitro . Determinar   el espectro de absorción entre 330 y 370 nm   con ayuda de un espectrofotómetro ( 4.11 ) .    Elevar la densidad óptica ( A ) a 363 nm   en el caso de la solución clorofórmica y a 348 nm   en el caso de la solución en la mezcla   benceno/acetonitrilo .    Calcular la concentración de microgramos de   aflatoxina B1 por milílitro de solución a partir   de las siguientes fórmulas :    312 · A · 1000/20600 para la solución   clorofórmica ;    312 · A · 1000/19800 para la solución en la   mezcla benceno/acetonitrilo .    Fuera del alcance de la luz , efectuar las diluciones   convenientes para obtener una solución tipo de trabajo   cuya concentración en aflatoxina B1 es de 0,1 mg   aproximadamente por milílitro . Conservada en el   refrigerador , dicha solución permanece estable durante   dos semanas .    7.2 . Control de la pureza cromatográfica    Depositar en una placa ( 4.8 ) 5 ml de la solución   tipo en 8-10 mg de aflatoxina B1 por milílitro   ( ver 7.1 ) . Revelar el cromatograma según se ha   indicado en 5.4 . Con la luz ultravioleta , la   fluorescencia sólo debe dar lugar a la percepción   de una sola mancha y no debe percibirse ninguna   fluorescencia en la zona del depósito de origen .    8 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de las dos   determinaciones paralelas efectuadas en la misma muestra   por el mismo analista no debería superar :     - el 25 por ciento del resultado más elevado para   los contenidos en aflatoxina B1 de 10 a 20 mg/kg ,     - 5 mg , en valor absoluto , para los contenidos   de 20 a 50 mg/kg ,     - el 10 por ciento del resultado más elevado para   los contenidos superiores a 50 mg/kg .    9 . Reproductibilidad    Ver las observaciones del punto 2 de la parte C .    B . MÉTODO POR CROMATOGRAFÍA BIDIMENSIONAL EN   CAPA FINA    1 . Objeto y ámbito de aplicación    El método permite determinar el contenido en   aflatoxina B1 de la alimentación animal que no entra   dentro del ámbito de aplicación del método A .   El límite inferior de la dosificación es de   0,01 mg/kg ( 10 ppb ) . El método no se aplica a   alimentos que contengan pulpas de agrios .    2 . Principio    La muestra se somete a la extracción mediante   cloroformo . Se filtra el extracto y se toma del mismo   una parte alicuota que es purificada mediante   cromatografía en columna de gel de sílice . El eluido   evapora y el residuo se vuelve a tomar mediante un volumen   determinado de cloroformo o de una mezcla de benceno y   acetonitrilo . Una parte alicuota de dicha solución   se somete a la cromatografía bidimensional en capa fina .   La cantidad de aflatoxina B1 se determina bajo   irradiación ultravioleta del cromatograma , bien sea   visualmente , o a través de fluordensitometría ,   mediante comparación con cantidades conocidas de   aflatoxina B1 extraida del alimento debe confirmarse   mediante el procedimiento indicado .    3 . Reactivos    NB : Todos los reactivos deben ser de calidad « para   el análisis » en la medida en que no se ha dado   ninguna otra indicación .    3.1 . Acetona .    3.2 . Cloroformo , estabilizado por el del 0,5 al   1,0 por ciento de etanol de 96 ° ( v/V ) .    3.3 . n-Hexano .    3.4 . Metanol .    3.5 . Eter dietílico anhídrido , exento de   peróxidos .    3.6 . Mezcla de benceno y de acetonitrilo : 98/2 ( v/v ) .    3.7 . Mezcla de cloroformo ( 3.2 ) y de metanol ( 3.4 ) :   97/3 ( v/v ) .    3.8 . Gel de sílice , para cromatografía en   columna , granulometría : de 0,05 a 0,20 mm .    3.9 . Algodón hidrófilo , previamente extraído   mediante el cloroformo , o lana de vidrio .    3.10 . Sulfato de sodio , anhídrido , granulado .    3.11 . Gas inerte , por ejemplo : ázoe .    3.12 . Ácido clorhídrico 1 N .    3.13 . Tierra de diatomeas ( Hiflosupercel ) lavada   con ácido .    3.14 . Gel de sílice G-HR o equivalente , para   cromatografía en capa fina .    3.15 . Disolventes de revelado .    3.15.1 . Eter dietílico ( 3.5 ) /metanol   ( 3.4 ) /agua : 94/4 , 5/1,5 ( v/v/v ) , cubeta   saturada .    3.15.2 . Cloroformo ( 3.2 ) /acetona ( 3.1 ) : 9/1 ( v/v )   cubeta no saturada .    3.16 . Solución tipo de 0,1 mgr. aproximadamente de   aflotoxina B1 por milímetro en el cloroformo ( 3.2 )   o en la mezcla benceno/acetonitrilo ( 3.6 ) , preparada   y controlada como se indica en el punto 7 del método A .    4 . Equipo    Ver punto 4 del método A .    5 . Modo de operar    5.1 . Preparación de la muestra ver puntos 5.1 ,   5.2 y 5.3 del método A .    5.2 . Extracción ver puntos 5.1 , 5.2 y 5.3 del   método A .    5.3 . Purificación en columna ver puntos 5.1 , 5.2   y 5.3 del método A .    5.4 . Cromatografía bidimensional en capa fina .    5.4.1 . Aplicación de las soluciones ( seguir   el esquema que aparece en la figura 1 )    Trazar en una placa ( 4.8 ) dos rectas paralelas   a dos lados contiguos ( a 5 y 6 cm de distancia   respectivamente de estos lados ) , destinadas a delimitar   el desplazamiento de los frentes de disolventes . Depositar   en la placa con ayuda de pipetas capilares o de   microjeringas las soluciones indicadas en lo sucesivo :     - en el punto A , 20 ml del extracto purificado   de la muestra , obtenido en 5.3 ,     - en el punto B , 20 ml de la solución tipo ( 3.16 ) ,     - en el punto C , 10 ml de la solución tipo ( 3.16 ) ,     - en el punto D , 20 ml de la solución tipo ( 3.16 ) ,     - en el punto E , 40 ml de la solución tipo ( 3.16 ) .    Secar con ayuda de una ligera corriente de aire o con   gas inerte ( 3.11 ) . Las manchas obtenidas deben tener   un diámetro de alrededor de 5 mm .    5.4.2 . Revelado ( seguir el esquema que aparece en   la figura 1 ) .    Revelar el cromatograma en la dirección I con ayuda   del disolvente de revelado ( 3.15.1 ) [ capa de 1 cm   en una cubeta saturada ] , fuera del alcance de la luz ,   hasta que el frente del disolvente alcance la línea   de delimitación . Retirar la placa de la cubeta y   dejar secar , al menos durante quince minutos , fuera   del alcance de la luz y a temperatura ambiente .    Revelar a continuación el cromatograma en la   dirección II con ayuda del disolvente de revelado   ( 3.15.2 ) [ capa de 1 cm en una cubeta no saturada ] ,   fuera del alcance de la luz , hasta que el frente del   disolvente alcance la línea de delimitación . Retirar   la placa de la cubeta y dejar secar , fuera del alcance   de la luz y a temperatura ambiente .    5.4.3 . Interpretación del cromatograma ( seguir el   esquema que aparece en la figura 2 )    Irradiar el cromatograma mediante luz ultravioleta   colocando la placa a 10 cm de la lámpara ( 4.9 ) .   Localizar el emplazamiento de las manchas de fluorescencia   azul B , C , D y E de aflatoxina B1 procedentes de la   solución tipo y trazar dos rectas imaginarias que   pasen por estas manchas y perpendiculares a las direcciones   de revelado . El punto de intersección P de estas   rectas es el emplazamiento en donde debería encontrarse   la mancha de aflatoxina B1 procedente del extracto   de la muestra depositada en A ( figura 1 ) . No obstante ,   el emplazamiento en donde debería encontrarse la   mancha de aflatoxina B1 procedente del extracto de   la muestra depositado en A ( figura 1 ) . No obstante ,   el emplazamiento real de esta mancha puede encontrarse   en un punto Q situado en la intersección de dos rectas   imaginarias que formen entre sí un ángulo de   aproximadamente 100 grados y que pase respectivamente   por las manchas B y C . Determinar la cantidad de   aflatoxina B1 del extracto de la muestra según se   indica en 5.5 .    5.4.4 . Cromatografía complementaria    Trazar en una nueva placa ( 4.8 ) dos rectas paralelas   a dos lados contiguos , según se indica en el esquema   de la figura 1 , y depositar en el punto A ( ver figura 1 )   20 ml del extracto purificado de la muestra obtenida   en 5.3 y , en superposición , 20 ml de la solución   tipo ( 3.16 ) . Revelar según se indica en 5.4.2 .   Irradiar el cromatograma mediante luz ultravioleta ( 4.9 )   y comprobar que :     - las manchas de aflatoxina B1 del extracto y de la   solución tipo se superponen ,     - la fluorescencia de esta mancha es más intensa   que la de la mancha de aflatoxina B1 revelada en el   punto Q de la primera placa .     - la fluorescencia de esta mancha es más intensa   que la de la mancha de aflatoxina B1 revelada en el   punto Q de la primera placa .    5.5 . Determinaciones cuantitativas    Proceder a las determinaciones , bien sea visualmente   o mediante fluordensitometría , según se indica   en lo sucesivo :    5.5.1 . Medidas visuales    Determinar la cantidad de aflatoxina B1 del extracto   comparando la intensidad de fluorescencia de la mancha   del extracto con la de las manchas C , D y E de la   solución tipo . Interpolar si es necesario . Si la   intensidad de la fluorescencia dada por los 20 ml del   extracto es más fuerte que la de los 40 ml de solución   tipo , diluir el extracto 10 ó 100 veces mediante   cloroformo ( 3.2 ) o mediante la mezcla de   benceno/acetonitrilo ( 3.6 ) antes de someterlo a   una nueva cromatografía en capa fina .    5.5.2 . Medidas por fluordensitometría    Medir la intensidad de fluorescencia de las manchas   de aflatoxina B1 con el fluordensitómetro ( 4.12 )   utilizando una longitud de onda de excitación de 365 nm   y una longitud de emisión de 443 nm .    Determinar la cantidad de aflatoxina B1 del depósito   del extracto comparando la intensidad de fluorescencia   de la mancha del extracto con la de las manchas C , D   y E de la solución tipo .    5.6 . Confirmación de la identidad de la aflatoxina B1    Ver punto 5.6 del método A .    6 . Cálculo de los resultados    Ver punto 6 del método A .    7 . Repetibilidad    Ver punto B del método A .    8 . Reproductibilidad    Ver las observaciones del punto 2 de la parte C .    C . OBSERVACIONES REFERENTES A LOS MÉTODOS A Y B    1 . Desengrasado    Las muestras que contengan más del 5 por ciento   de materias grasas deben desengrasarse mediante éter   de petróleo ( éb. 40-60 ° C ) tras la preparación   indicada en 5.1 . En dichos casos , los resultados   del análisis deben atribuirse al peso de la muestra   no desengrasada .    2 . Reproductibilidad de los resultados    La reproductibilidad de los resultados , es decir la   variación entre los resultados obtenidos por dos o   más laboratorios sobre la misma muestra , se ha   calculado en :    más o menos 50 por ciento del valor medio de los   resultados para los valores medios en aflatoxina B1   de 10 a 20 mg/kg ,    más o menos 10 mg/kg a partir del valor medio para   los valores medios de 20 a 50 mg/kg ,    más o menos 20 por ciento del valor medio para los   valores medios superiores a 50 mg/kg .    ANEXO : ver D.O.