CELEX: 32002D0160
Language: el
Date: 2002-02-21 00:00:00
Title: 2002/160/ΕΚ: Απόφαση της Επιτροπής, της 21ης Φεβρουαρίου 2002, για την τροποποίηση του παραρτήματος Δ της οδηγίας 90/426/EΟΚ του Συμβουλίου σχετικά με τις διαγνωστικές δοκιμασίες για την αφρικανική πανώλη των ιπποειδών (Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ) [κοινοποιηθείσα υπό τον αριθμό Ε(2002) 556]

Avis juridique important

|

32002D0160

2002/160/ΕΚ: Απόφαση της Επιτροπής, της 21ης Φεβρουαρίου 2002, για την τροποποίηση του παραρτήματος Δ της οδηγίας 90/426/EΟΚ του Συμβουλίου σχετικά με τις διαγνωστικές δοκιμασίες για την αφρικανική πανώλη των ιπποειδών (Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ) [κοινοποιηθείσα υπό τον αριθμό Ε(2002) 556]  

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 053 της 23/02/2002 σ. 0037 - 0042

Απόφαση της Επιτροπήςτης 21ης Φεβρουαρίου 2002για την τροποποίηση του παραρτήματος Δ της οδηγίας 90/426/EΟΚ του Συμβουλίου σχετικά με τις διαγνωστικές δοκιμασίες για την αφρικανική πανώλη των ιπποειδών[κοινοποιηθείσα υπό τον αριθμό Ε(2002) 556](Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ)(2002/160/ΕΚ)Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,Έχοντας υπόψη:τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας,την οδηγία 90/426/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 26ης Ιουνίου 1990, σχετικά με τους όρους υγειονομικού ελέγχου που διέπουν τη διακίνηση των ιπποειδών και τις εισαγωγές ιπποειδών προέλευσης τρίτων χωρών(1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την απόφαση 2001/298/EΚ(2), και ιδίως το άρθρο 23,Εκτιμώντας τα ακόλουθα:(1) Στο παράρτημα Δ της οδηγίας 90/426/EΟΚ περιγράφεται η δοκιμή σύνδεσης του συμπληρώματος, η οποία θα πρέπει να πραγματοποιείται για τη διάγνωση της αφρικανικής πανώλης των ιπποειδών.(2) Τον Νοέμβριο του 2000 το κοινοτικό εργαστήριο αναφοράς του Algete της Ισπανίας φιλοξένησε την ετήσια συνεδρίαση των εθνικών εργαστηρίων αναφοράς, στα κράτη μέλη της ΕΕ, για την αφρικανική πανώλη των ιπποειδών. Κατά την εν λόγω επιστημονική συνάντηση, παρασχέθηκαν επιστημονικές αποδείξεις, σύμφωνα με τις οποίες η δοκιμή σύνδεσης του συμπληρώματος, που περιγράφεται στο παράρτημα Δ της οδηγίας 90/426/EΟΚ, υπόκειται σε σοβαρούς περιορισμούς, ιδίως διότι είναι κατάλληλη για την ανίχνευση αντισωμάτων μόνο μετά από πρόσφατη μόλυνση ή εμβολιασμό. Επιπλέον, η δοκιμή αντικαθίσταται στην πράξη από σύγχρονες δοκιμές ELISA, σε όλα σχεδόν τα εργαστήρια, τόσο στην Κοινότητα όσο και στις κυριότερες χώρες εξαγωγής.(3) Οι διεθνώς αποδεκτές εργαστηριακές δοκιμές για την ανίχνευση αντισωμάτων κατά του ιού της αφρικανικής πανώλους των ιπποειδών, περιγράφονται στο εγχειρίδιο προτύπων για διαγνωστικές δοκιμές και εμβόλια(3) του Διεθνούς Γραφείου Επιζωοτιών (OIE). Εντούτοις, στην τρέχουσα έκδοση αναφέρεται μόνο μία από τις διαθέσιμες δοκιμές ELISA.(4) Κατά συνέπεια, είναι προφανώς σκόπιμο να τροποποιηθεί το παράρτημα Δ της οδηγίας 90/426/ΕΟΚ, έτσι ώστε να ληφθούν υπόψη οι τεχνικές εξελίξεις και τα διεθνώς εγκεκριμένα πρότυπα.(5) Τα μέτρα που προβλέπονται στην παρούσα απόφαση είναι σύμφωνα με τη γνώμη της μόνιμης κτηνιατρικής επιτροπής,ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΑΠΟΦΑΣΗ:Άρθρο 1Το παράρτημα Δ της οδηγίας 90/426/EΟΚ αντικαθίσταται από το παράρτημα της παρούσας απόφασης.Άρθρο 2Η παρούσα απόφαση απευθύνεται στα κράτη μέλη.Βρυξέλλες, 21 Φεβρουαρίου 2002.Για την ΕπιτροπήDavid ByrneΜέλος της Επιτροπής(1) ΕΕ L 224 της 18.8.1990, σ. 42.(2) ΕΕ L 102 της 12.4.2001, σ. 63.(3) Κεφάλαιο 2.1.11, τέταρτη έκδοση 2000.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ"ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΔΑΦΡΙΚΑΝΙΚΗ ΠΑΝΩΛΗ ΤΩΝ ΙΠΠΟΕΙΔΩΝΔΙΑΓΝΩΣΗΤα αντιδραστήρια για τις ενζυμικές δοκιμές ανοσοπροσρόφησης (ELISA), που περιγράφονται κατωτέρω, μπορούν να ληφθούν από το εργαστήριο αναφοράς της Ευρωπαϊκής Κοινότητας ή από τα εργαστήρια αναφοράς για την αφρικανική πανώλη των ιπποειδών, του Διεθνούς Γραφείου Επιζωοτιών (ΟΙΕ).1. ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΗ ELISA ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΚΑΤΑ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΑΦΡΙΚΑΝΙΚΗΣ ΠΑΝΩΛΗΣ ΤΩΝ ΙΠΠΟΕΙΔΩΝ (AHSV) (ΥΠΟΧΡΕΩΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΗ)Η ανταγωνιστική δοκιμή ELISA χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων κατά του AHSV, σε ορούς κάθε είδους ιπποειδών. Ο ευρέoς φάσματος, πολυκλωνικός, ορός ανοσοποιημένου έναντι του AHSV ινδικού χοιριδίου (αποκαλούμενος στη συνέχεια "αντιορός ινδικού χοιριδίου"), είναι εξειδικευμένος κατά οροομάδα και ικανός να ανιχνεύει όλους τους γνωστούς οροτύπους του ιού της αφρικανικής πανώλης των ιπποειδών.Η αρχή αυτής της μεθόδου δοκιμής συνίσταται στη διακοπή, από το δείγμα ορού δοκιμής, της αντίδρασης μεταξύ του αντιγόνου του AHSV και ενός αντιορού ινδικού χοιριδίου. Τα αντισώματα AHSV που περιέχονται στο δείγμα ορού δοκιμής, ανταγωνίζονται εκείνα του αντιορού ινδικού χοιριδίου, με αποτέλεσμα την εξασθένηση του αναμενόμενου χρώματος (μετά την προσθήκη σημασμένων με ένζυμο αντισωμάτων αντιορού ινδικού χοιριδίου και υποστρώματος). Οι οροί μπορούν να υποβληθούν σε δοκιμή μετά από μία μόνον αραίωση 1 προς 5 (μέθοδος δοκιμής της κηλίδας) ή να τιτλοδοτηθούν (μέθοδος της τιτλοδότησης του ορού), ώστε να ληφθούν τελικά σημεία αραίωσης. Οι τιμές αναστολής που είναι υψηλότερες από 50 % μπορούν να θεωρηθούν θετικές.Το πρωτόκολλο δοκιμής που περιγράφεται κατωτέρω χρησιμοποιείται στο Περιφερειακό Εργαστήριο Αναφοράς για την αφρικανική πανώλη των ιπποειδών, στο Pirbright του Ηνωμένου Βασιλείου.1.1. Διαδικασία δοκιμής1.1.1. Παρασκευή των πλακών1.1.1.1. Επιστρώνονται οι πλάκες ELISA με αντιγόνο AHSV που έχει εξαχθεί από μολυσμένες κυτταροκαλλιέργειες με AHSV, αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικών-διτανθρακικών ιόντων, pH 9,6. Οι πλάκες επωάζονται επί μία νύκτα στους 4 °C.1.1.1.2. Οι πλάκες εκπλύνονται τρεις φορές με υπερχείλιση και εκκένωση των κοιλοτήτων με τη βοήθεια φυσιολογικού ορού στον οποίο έχει προστεθεί ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων (PBS), pH 7,2 έως 7,4, και ακολουθεί ξήρανση με στράγγιση σε απορροφητικό χαρτί.1.1.2. Κοιλότητες μάρτυρες1.1.2.1. Στη στήλη 1 τιτλοδοτούνται οι θετικοί οροί μάρτυρες σε σειρά αραιώσεων στο διπλάσιο, από 1 προς 5 έως 1 προς 640, σε παρεμποδιστικό ρυθμιστικό διάλυμα [PBS που περιέχει Tween-20 σε αναλογία 0,05 % (v/v), αποκορυφωμένο γάλα σε αναλογία 5 % (Cadbury's Marvel TM) (w/v) και ορό ενήλικου βοοειδούς σε αναλογία 1 % (v/v)] ώστε να ληφθεί τελικός όγκος 50 μl ανά κοιλότητα.1.1.2.2. Στις κοιλότητες A και B της στήλης 2 προστίθενται 50 μl αρνητικού ορού μάρτυρα, αραιωμένου 1 προς 5 (10 μl ορού + 40 μl παρεμποδιστικού ρυθμιστικού διαλύματος).1.1.2.3. Στις κοιλότητες C και D της στήλης 2, προστίθενται 100 μl παρεμποδιστικού ρυθμιστικού διαλύματος (ΤΥΦΛΟ).1.1.2.4. Στις κοιλότητες E, F, G και H της στήλης 2 προστίθενται 50 μl παρεμποδιστικού ρυθμιστικού διαλύματος (μάρτυρας ινδικού χοιριδίου).1.1.3. Μέθοδος της δοκιμής κηλίδας1.1.3.1. Σε διπλή σειρά κοιλοτήτων των στηλών 3 έως 12 προστίθενται 50 μl από κάθε ορό δοκιμής αραιωμένο 1 προς 5 με παρεμποδιστικό ρυθμιστικό διάλυμα (10 μl ορού + 40 μl παρεμποδιστικού ρυθμιστικού διαλύματος).ή1.1.4. Μέθοδος της τιτλοδότησης ορού1.1.4.1. Από κάθε δείγμα δοκιμής παρασκευάζεται σειρά αραιώσεων στο διπλάσιο (1 προς 5 έως 1 προς 640) με παρεμποδιστικό ρυθμιστικό διάλυμα, μέσα σε οκτώ κοιλότητες χωριστών στηλών (3 έως 12).και στη συνέχεια1.1.5. Σε όλες τις κοιλότητες της πλάκας ELISA, πλην εκείνων που περιέχουν το ΤΥΦΛΟ διάλυμα, προστίθενται 50 μl αντιορού ινδικού χοιριδίου που έχει προηγουμένως αραιωθεί σε παρεμποδιστικό ρυθμιστικό διάλυμα (κάθε κοιλότητα περιέχει πλέον τελικό όγκο 100 μl).1.1.5.1. Οι πλάκες επωάζονται επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C σε περιστρεφόμενο αναδευτήρα.1.1.5.2. Οι πλάκες εκπλύνονται 3 φορές και ακολουθεί ξήρανση όπως στο σημείο 1.1.1.1.1.5.3. Σε κάθε κοιλότητα προστίθενται 50 μl αντιορού κουνελιού έναντι του ορού του ινδικού χοιριδίου συζευγμένου με υπεροξειδάση (HRP), αφού προηγουμένως αραιωθεί σε παρεμποδιστικό ρυθμιστικό διάλυμα.1.1.5.4. Οι πλάκες επωάζονται επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C σε περιστρεφόμενο αναδευτήρα.1.1.5.5. Οι πλάκες εκπλύνονται 3 φορές και ακολουθεί ξήρανση όπως προηγουμένως.1.1.6. ΧρωμογόνοΠαρασκευάζεται το διάλυμα χρωμογόνου OPD (OPD = ορθο-φαινυλοδιαμίνη) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (0,4 mg/ml σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό) αμέσως πριν χρησιμοποιηθεί. Προστίθεται υπόστρωμα (υπεροξείδιο του υδρογόνου = Η2Ο2) μέχρι να ληφθεί τελική συγκέντρωση 0,05 % (v/v) (1 μέρος προς 2000 μέρη διαλύματος 30 % H2O2). Κατόπιν προστίθενται σε κάθε κοιλότητα 50 μl του διαλύματος OPD και οι πλάκες αφήνονται στον πάγκο επί δέκα λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Διακόπτεται η αντίδραση με την προσθήκη, σε κάθε κοιλότητα, 50 μl θειικού οξέος (Η2SO4) 1M.1.1.7. Ανάγνωση των αποτελεσμάτωνΦασματοφωτομετρική ανάγνωση σε μήκος κύματος 492 nm.1.2. Έκφραση των αποτελεσμάτων1.2.1. Με τη βοήθεια κάποιου λογισμικού, εκτυπώνονται οι τιμές οπτικής πυκνότητας (OD), καθώς και το επί τοις εκατό ποσοστό αναστολής (PI) για τους ορούς δοκιμής και τους ορούς μάρτυρες, με βάση τη μέση τιμή που έχει καταγραφεί για τις τέσσερις κοιλότητες που αντιστοιχούν στους μάρτυρες ινδικού χοιριδίου. Τα εκφραζόμενα σε τιμές OD και PI δεδομένα χρησιμοποιούνται για να προσδιοριστεί αν τα αποτελέσματα της δοκιμής περικλείονται εντός αποδεκτών ορίων. Τα ανώτατα όρια ελέγχου (UCL) και τα κατώτατα όρια μάρτυρα (LCL) για το μάρτυρα ινδικού χοιριδίου βρίσκονται μεταξύ των τιμών OD 1,4 and 0,4 αντίστοιχα. Το τελικό σημείο της τιτλοδότησης του θετικού ορού μάρτυρα, με βάση PI 50 %, θα πρέπει να είναι 1 προς 240 (εντός πεδίου τιμών 1 προς 120 έως 1 προς 480). Οποιαδήποτε πλάκα δεν πληροί τα κριτήρια αυτά, πρέπει να απορρίπτεται. Ωστόσο, εάν ο τίτλος του θετικού ορού μάρτυρα υπερβαίνει το 1 προς 480, αλλά τα δείγματα δοκιμής είναι αρνητικά, τα τελευταία μπορούν να γίνουν δεκτά.Οι δύο κοιλότητες που περιέχουν αρνητικό ορό μάρτυρα και οι δύο κοιλότητες που περιέχουν το τυφλό διάλυμα, θα πρέπει να δίδουν τιμές PI μεταξύ + 25 % και -25 % και μεταξύ + 95 και + 105 %, αντίστοιχα. Η λήψη τιμών εκτός αυτών των ορίων δεν ακυρώνει την πλάκα, αλλά αποτελεί ένδειξη ανάπτυξης προϋπάρχοντος χρώματος.1.2.2. Το όριο διάγνωσης (διαχωριστικές τιμές) για τους ορούς δοκιμής είναι 50 % (PI 50 %). Τα δείγματα που εμφανίζουν τιμές PI άνω του 50 % καταγράφονται ως θετικά. Τα δείγματα που εμφανίζουν τιμές PI κάτω του 50 % καταγράφονται ως αρνητικά.Τα δείγματα που εμφανίζουν τιμές PI μεγαλύτερες ή μικρότερες από το όριο για τις διπλές κοιλότητες, θεωρούνται αμφίβολα. Τα εν λόγω δείγματα μπορούν να υποβάλλονται σε νέα δοκιμή κηλίδας και δοκιμή τιτλοδότησης. Τα θετικά δείγματα μπορούν επίσης να τιτλοδοτηθούν, για να παράσχουν μια ένδειξη του βαθμού θετικότητας.Διάταξη της δοκιμής κηλίδας>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>- μαρτ.= αρνητικός ορός μάρτυρας.+ μαρτ.= θειτκός ορός μάρτυραςΙΧ μαρτ.= μάρτυρας ινδικού χοιριδίου.Διάταξη της τιτλοδότησης ορού>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>- μαρτ.= αρνητικός ορός μάρτυρας.+ μαρτ.= θετικός ορός μάρτυρας.ΙΧ μαρτ.= μάρτυρας ινδικού χοιριδίου.2. ΕΜΜΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗ ELISA ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΚΑΤΑ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΑΦΡΙΚΑΝΙΚΗΣ ΠΑΝΩΛΗΣ ΤΩΝ ΙΠΠΟΕΙΔΩΝ (AHSV) (ΥΠΟΧΡΕΩΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΗ)Η δοκιμή που περιγράφεται κατωτέρω συμφωνεί με την περιγραφή δοκιμής που περιλαμβάνεται στο κεφάλαιο 2.1.11 του εγχειριδίου προτύπων για διαγνωστικές δοκιμές και εμβόλια, του Διεθνούς Γραφείου Επιζωοτιών (OIE), τέταρτη έκδοση, 2000.Η ανασυνδυασμένη πρωτείνη VP7 έχει χρησιμοποιηθεί ως αντιγόνο για τον προσδιορισμό αντισωμάτων κατά του ιού AHS, με υψηλό δείκτη ευαισθησίας και εξειδίκευσης. Άλλα πλεονεκτήματα είναι ότι είναι σταθερή και δεν είναι λοιμογόνος.2.1. Διαδικασία δοκιμής2.1.1. Στερεά φάση2.1.1.1. Επιστρώνονται οι πλάκες ELISA με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη VP7 από AHSV-4, αραιωμένη με ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικών- διτανθρακικών ιόντων, pH 9,6. Οι πλάκες επωάζονται επί μία νύκτα σε θερμοκρασία 4 °C.2.1.1.2. Οι πλάκες εκπλύνονται πέντε φορές με απεσταγμένο νερό που περιέχει Tween 20 σε αναλογία 0,01 % (v/v) (διάλυμα έκπλυσης) και κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα του διαλύματος έκπλυσης.2.1.1.3. Οι πλάκες παρεμποδίζονται (μπλοκάρονται ), με την προσθήκη, σε κάθε κοιλότητα, 200 μl φυσιολογικού ορού με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων (PBS) + αποκορυφωμένο γάλα (ξηράς μορφής αποκορυφωμένο γάλα NestléTM) σε αναλογία 5 % (w/v), επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.2.1.1.4. Απομακρύνεται το παρεμποδιστικό διάλυμα και οι πλάκες κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό.2.1.2. Δείγματα δοκιμής2.1.2.1. Τα δείγματα ορού που πρόκειται να ελεγχθούν, καθώς και οι θετικοί και αρνητικοί οροί μάρτυρες, αραιώνονται σε 1 προς 25 με PBS + αποκορυφωμένο γάλα σε αναλογία 5 % (w/v) + Tween 20 σε αναλογία 0,05 % (v/v), 100 μl ανά κοιλότητα. Επωάζονται επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.Για την τιτλοδότηση, δημιουργούνται σειρές αραιώσεων στο διπλάσιο, αρχίζοντας από 1 προς 25 (100 μl/κοιλότητα), ένας ορός ανά στήλη πλάκας, και επαναλαμβάνεται η ίδια διαδικασία με τους θετικούς και τους αρνητικούς μάρτυρες. Ακολουθεί επώαση επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.2.1.2.2. Οι πλάκες εκπλύνονται όπως περιγράφεται στο σημείο 2.1.1.2.2.1.3. Προϊόν σύζευξης2.1.3.1. Διανέμονται 100 μl/κοιλότητα γ-σφαιρίνης αντιορού αλόγου, συζευγμένης με υπεροξειδάση (HPR), αφού προηγουμένως αραιωθεί με PBS + γάλα σε αναλογία 5 % + Tween 20 σε αναλογία 0,05 %, pH 7,2. Ακολουθεί επώαση επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.2.1.3.2. Οι πλάκες εκπλύνονται όπως περιγράφεται στο σημείο 2.1.1.2.2.1.4. Χρωμογόνο/υπόστρωμα2.1.4.1. Προστίθενται 200 μl/κοιλότητα διαλύματος χρωμογόνου/υποστρώματος [10 ml από 80,6 mM DMAB (διμεθυλοαμινοβενζαλδεΰδη) + 10 ml από 1,56 mM MBTH (3-μεθυλο-2 βενζο-θειαζολινοϋδραζονοϋδροχλωρίδιο) + 5 μl H2O2].Μετά από 5-10 λεπτά περίπου (πριν αρχίζει να χρωματίζεται ο αρνητικός μάρτυρας), διακόπτεται η ανάπτυξη του χρώματος με την προσθήκη 50 μl H2SO4 3N.Επίσης είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν και άλλα χρωμογόνα, όπως ABTS (2,2'-αζινο-δισ-[3-εθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικό οξύ]), TMB (τετραμεθυλοβενζυδίνη) ή OPD (ορθο-φαινυλοδιαμίνη).2.1.4.2. Ανάγνωση των αποτελεσμάτων σε μήκος κύματος 600 nm (ή 620 nm).2.2. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων2.2.1. Υπολογίζεται η διαχωριστική τιμή, προσθέτοντας τον αριθμό 0,6 στην τιμή που αντιστοιχεί στον αρνητικό μάρτυρα (0,6 είναι η τυπική απόκλιση που προκύπτει από ομάδα 30 αρνητικών ορών).2.2.2. Τα δείγματα δοκιμής που δίνουν τιμές απορρόφησης χαμηλότερες από τη διαχωριστική τιμή θεωρούνται αρνητικά.2.2.3. Τα δείγματα της δοκιμής που δίνουν τιμές απορρόφησης υψηλότερες από τη διαχωριστική τιμή + 0,15 θεωρούνται θετικά.2.2.4. Τα δείγματα δοκιμής που δίνουν ενδιάμεσες τιμές απορρόφησης θεωρούνται αμφίβολα και πρέπει να χρησιμοποιείται δεύτερη μέθοδος για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων.3. ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΗ ELISA ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΚΑΤΑ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΑΦΡΙΚΑΝΙΚΗΣ ΠΑΝΩΛΗΣ ΤΩΝ ΙΠΠΟΕΙΔΩΝ (AHSV) (ΥΠΟΧΡΕΩΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΗ)Η παρεμποδιστική δοκιμή ELISA έχει σχεδιασθεί για την ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων κατά του AHSV σε ορούς από οποιαδήποτε ευπαθή είδη. Η VP7 είναι η κύρια αντιγονική πρωτενη ιού που περιέχει ο AHSV και διατηρείται στους εννέα ορότυπους. Δεδομένου ότι και το μονοκλωνικό αντίσωμα (Mab) κατευθύνεται προς τη VP7, η δοκιμασία χαρακτηρίζεται από υψηλό βαθμό ευαισθησίας και εξειδίκευσης. Επιπλέον, το ανασυνδυασμένο αντιγόνο VP7 είναι τελείως αβλαβές, με αποτέλεσμα να παρέχει μεγάλη ασφάλεια.Η αρχή αυτής της μεθόδου δοκιμής συνίσταται στη διακοπή της αντίδρασης μεταξύ της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης VP7 -το αντιγόνο που συνδέεται στην πλάκα ELISA- και του ειδικού για την εν λόγω πρωτεΐνη συζευγμένου μονοκλωνικού αντισώματος (Mab). Το αντίσωμα που περιέχει ο ορός δοκιμής θα παρεμποδίσει την αντίδραση αντιγόνου-Mab, προκαλώντας εξασθένηση του χρώματος.Η δοκιμή που περιγράφεται κατωτέρω, διεξάγεται στο Εργαστήριο Αναφοράς της Ευρωπαϊκής Κοινότητας για την αφρικανική πανώλη των ιπποειδών στο Algete της Ισπανίας.3.1. Διαδικασία δοκιμής3.1.1. Πλάκες ELISA3.1.1.1. Επιστρώνονται οι πλάκες με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη VP7 από AHSV-4, αραιωμένη σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικών-διτανθρακικών ιόντων, pH 9,6. Επωάζονται επί μία νύκτα σε θερμοκρασία 4 °C.3.1.1.2. Οι πλάκες εκπλύνονται πέντε φορές με φυσιολογικό ορό με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων (PBS) που περιέχει Tween 20 σε αναλογία 0,05 % (v/v) (PBST).3.1.1.3. Οι πλάκες σταθεροποιούνται με κατεργασία με σταθεροποιητικό διάλυμα (ώστε να μπορούν να αποθηκευθούν επί μεγάλο χρονικό διάστημα σε θερμοκρασία 4 °C χωρίς μείωση της δραστικότητάς τους), και ξηραίνονται σε απορροφητικό υλικό.3.1.2. Δείγματα δοκιμής και μάρτυρες3.1.2.1.>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>3.1.2.2.>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>3.1.3. Προϊόν σύζευξηςΣε κάθε κοιλότητα προστίθενται 50 μl υπεροξειδάσης (HRP), συζευγμένης με Mab (μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για την πρωτεΐνη VP7) που έχουν προηγουμένως αραιωθεί και το σύνολο αναμειγνύεται ήπια για να ομοιογενοποιηθεί. Ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία 37 °C.3.1.4. Οι πλάκες εκπλύνονται πέντε φορές με PBST και στεγνώνονται όπως παραπάνω.3.1.5. Χρωμογόνο/υπόστρωμαΠροστίθενται 100 μl/κοιλότητα διαλύματος χρωμογόνου/υποστρώματος [1 ml ABTS (2,2'-αζινο-δισ-[3-εθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικό οξύ]) συγκεντρώσεως 5 mg/ml + 9 ml ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος (ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών-κιτρικών ιόντων 0,1M με pH 4 που περιέχει H2O2 σε αναλογία 0,03 %)] και ακολουθεί επώαση επί δέκα λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η ανάπτυξη του χρώματος διακόπτεται με την προσθήκη, σε κάθε κοιλότητα, 100 μl SDS (θειικό νάτριο-δωδεκύλιο) συγκεντρώσεως 2 % (w/v).3.1.6. Ανάγνωση των αποτελεσμάτωνΑνάγνωση των αποτελεσμάτων σε μήκος κύματος 405 nm με συσκευή ανάγνωσης ELISA.3.2. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων3.2.1. Έλεγχος καταλληλότητας της δοκιμασίαςΗ δοκιμή είναι κατάλληλη, εφόσον η οπτική πυκνότητα (OD) του αρνητικού μάρτυρα (NC) είναι μεγαλύτερη από 1,0 και η OD του θετικού μάρτυρα (PC) μικρότερη από 0,2.3.2.2. Υπολογισμός των διαχωριστικών τιμώνΘετική διαχωριστική τιμή>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>Αρνητική διαχωριστική τιμή>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου NC είναι η OD του αρνητικού μάρτυρα και PC η OD του θετικού.3.2.3. Ερμηνεία των αποτελεσμάτωνΤα δείγματα των οποίων η OD είναι μικρότερη από τη θετική διαχωριστική τιμή θεωρούνται θετικά ως προς τα αντισώματα κατά του AHSV.Τα δείγματα των οποίων η OD είναι μεγαλύτερη από την αρνητική διαχωριστική τιμή θεωρούνται αρνητικά ως προς τα αντισώματα κατά του AHSV.Τα δείγματα των οποίων η OD κυμαίνεται μεταξύ των ανωτέρω δύο τιμών θεωρούνται αμφίβολα και τα ζώα από τα οποία προέρχονται θα πρέπει να υποβάλλονται σε νέα δειγματοληψία μετά από δύο έως τρεις εβδομάδες."