CELEX: 32000L0045
Language: ro
Date: 2000-07-06 00:00:00
Title: Directiva 2000/45/CE a Comisiei din 6 iulie 2000 de stabilire a metodelor comunitare de analiză pentru determinarea vitaminei A, a vitaminei E și a triptofanului din furajeText cu relevanță pentru SEE.

03/Volumul 34
            
            
               RO
            
            
               Jurnalul Ofícial al Uniunii Europene
            
            
               7
            
         32000L0045
   
               L 174/32
            
            
               JURNALUL OFÍCIAL AL UNIUNII EUROPENE
            
            
               
            
         
      DIRECTIVA 2000/45/CE A COMISIEI
   
   din 6 iulie 2000
   de stabilire a metodelor comunitare de analiză pentru determinarea vitaminei A, a vitaminei E și a triptofanului din furaje
   (Text cu relevanță pentru SEE)
   COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,
   având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene,
   având în vedere Directiva 70/373/CEE a Consiliului din 20 iulie 1970 privind introducerea modalităților de prelevare de probe și a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor (1), astfel cum a fost modificată ultima dată prin actul de aderare a Austriei, Finlandei și Suediei (2), în special articolul 2,
   întrucât:
   
               (1)
            
            
               Directiva 70/373/CEE prevede că, pentru a se constata respectarea condițiilor prevăzute în temeiul actelor cu putere de lege și actelor administrative privind calitatea și compoziția furajelor, controalele oficiale privind furajele trebuie să se efectueze în conformitate cu modalitățile de prelevare de probe și a metodelor comunitare de analiză.
            
         
               (2)
            
            
               Directiva 70/524/CEE a Consiliului din 23 noiembrie 1970 privind aditivii din nutriția animalelor (3), modificată ultima dată prin Regulamentul (CE) nr. 2439/1999 (4) al Comisiei prevede că, atunci când aceste substanțe sunt incluse în preamestecuri și în furaje, trebuie să se menționeze pe etichetă conținutul de vitamina A și E.
            
         
               (3)
            
            
               Directiva 79/373/CEE a Consiliului din 2 aprilie 1979 privind comercializarea furajelor combinate (5), astfel cum a fost modificată ultima dată prin Directiva 2000/16/CE (6), și Directiva 93/74/CEE a Consiliului din 13 septembrie 1993 privind furaje cu un rol nutrițional special (7), astfel cum a fost modificată ultima dată prin Directiva 96/25/CE (8), prevăd că trebuie să se menționeze pe eticheta furajelor prezența aminoacizilor.
            
         
               (4)
            
            
               Trebuie instituite metode comunitare de analiză pentru verificarea acestor substanțe.
            
         
               (5)
            
            
               Măsurile prevăzute în prezenta directivă sunt în conformitate cu avizul Comitetului permanent pentru hrana animalelor,
            
         ADOPTĂ PREZENTA DIRECTIVĂ:
   Articolul 1
   Statele membre se asigură că analizele efectuate în cadrul controalelor oficiale privind conținutul de vitamina A, vitamina E și triptofan din furaje și din preamestecuri respectă metoda descrisă în anexă.
   Articolul 2
   Statele membre pun în aplicare, înainte de 31 august 2000, actele cu putere de lege și actele administrative necesare pentru a se conforma prezentei directive. Statele membre informează de îndată Comisia cu privire la aceasta.
   Statele membre aplică aceste dispoziții începând cu 1 septembrie 2000.
   Atunci când statele membre adoptă aceste dispoziții, ele conțin o trimitere la prezenta directivă sau sunt însoțite de o asemenea trimitere la data publicării lor oficiale. Statele membre stabilesc modalitatea de efectuare a acestei trimiteri.
   Articolul 3
   Prezenta directivă intră în vigoare în a douăzecea zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Comunităților Europene.
   
   Articolul 4
   Prezenta directivă se adresează statelor membre.
   
      Adoptată la Bruxelles, la 6 iulie 2000.
      
         
            Pentru Comisie
         
         David BYRNE
         
         
            Membru al Comisiei
         
      
   
   
      (1)  JO L 170, 3.8.1970, p. 2.
   
      (2)  JO C 241, 29.8.1994, p. 1.
   
      (3)  JO L 270, 14.12.1970, p. 1.
   
      (4)  JO L 297, 18.11.1999, p. 8.
   
      (5)  JO L 86, 6.4.1979, p. 30.
   
      (6)  JO L 105, 3.5.2000, p. 36.
   
      (7)  JO L 237, 22.9.1993, p. 23.
   
      (8)  JO L 125, 23.5.1996, p. 35.
   ANEXĂ
   PARTEA A
   DOZAREA VITAMINEI A
   1.   Obiect și domeniu de aplicare
   Metoda permite determinarea vitaminei A (retinol) în furaje și preamestecuri. Vitamina A include all-trans retinol și izomerii săi –cis, care se determină prin această metodă. Conținutul de vitamina A se exprimă în unități internaționale (UI) per kg. O UI corespunde activității a 0,300 μg de vitamina A alcool all-trans, a 0,334 μg de acetat de vitamina A all-trans sau a 0,550 μg de palmitat de vitamina A all-trans.
   Limita de determinare este de 2 000 UI de vitamina A/kg
   2.   Principiu
   Eșantionul se hidrolizează cu o soluție de hidroxid de potasiu etanolic, iar vitamina A se extrage în eterul de petrol. Solventul se îndepărtează prin evaporare; reziduul se dizolvă în metanol și, dacă este cazul, se diluează până la concentrația necesară. Conținutul de vitamina A se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță în fază inversă (CLHP-PI) cu ajutorul unui detector UV sau fluorimetric. Parametrii cromatografiei se aleg astfel încât să nu existe separație între vitamina A alcool all-transși izomerii săi -cis.
   3.   Reactivi
   3.1.   Etanol, σ = 96 %
   3.2.   Eter de petrol, interval de fierbere 40 °C–60 °C
   3.3.   Metanol
   3.4.   Soluție de hidroxid de potasiu, β = 50 g/100 ml
   3.5.   Soluție de ascorbat de sodiu, β = 10 g/100 ml (a se vedea observația de la punctul 7.7)
   Sulfură de sodiu, Na2S · x H2O (x = 7-9)
   3.6.1.   Soluție de sulfură de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, β = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observația de la punctul 7.8)
   3.7.   Soluție de fenolftaleină, β = 2 g/100 ml în etanol (3.1)
   3.8.   Propanol-2
   3.9.   Fază mobilă pentru CLHP: amestec de metanol (3.3) și apă; de exemplu: 980 + 20 (v + v). Proporțiile exacte sunt determinate de caracteristicile coloanei folosite
   3.10.   Azot, liber de oxigen
   Acetat de vitamina A all-trans, extra pur, cu activitate garantată, de exemplu: 2,80 × 106 UI/g
   3.11.1.   Soluția mamă de acetat de vitamina A all-trans: se cântăresc, cu o precizie de 0,1 mg, 50 mg de acetat de vitamina A (3.11) într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în propanol-2 (3.8) și se completează până la gradație cu același solvent. Concentrația nominală a acestei soluții este de 1 400 UI de vitamina A per ml. Conținutul exact trebuie să fie determinat conform punctului 5.6.3.1.
   Palmitat de vitamina A all-trans, extra pur, cu activitate garantată, de exemplu: 1,80 × 106 UI/g
   3.12.1.   Soluția mamă de palmitat de vitamina A all-trans: se cântăresc, cu o precizie de 0,1 mg, 80 mg de palmitat de vitamina A (3.12) într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în propanol-2 (3.8.) și se completează până la gradație cu același solvent. Concentrația nominală a acestei soluții este de 1 400 UI de vitamina A per ml. Conținutul exact trebuie să fie determinat conform punctului 5.6.3.2.
   3.13.   BHT (di-tert-butil-2,6-metil-4-fenol) (a se vedea observația de la punctul 7.5)
   4.   Aparatură
   4.1.   Evaporator rotativ sub vid
   Sticlărie opacă de laborator
   4.2.1.   Baloane sferice sau conice, 500 ml, cu gât de sticlă rodată
   4.2.2.   Baloane gradate cu dop de sticlă rodată, gât îngust, de 10, 25, 100 și 500 ml
   4.2.3.   Pâlnii conice de decantare, de 1 000 ml, cu dop de sticlă rodată
   4.2.4.   Baloane piriforme, de 250 ml, cu gât de sticlă rodată
   4.3.   Răcitor Allihn, cu lungime utilă de 300 mm, cu îmbinare de sticlă rodată și adaptor pentru conductă de alimentare cu gaz
   4.4.   Hârtie de filtru plisată pentru separarea fazelor, cu diametru de 185 mm (de exemplu Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)
   Echipament CLHP cu sistem de injecție
   4.5.1.   Coloană pentru cromatografie lichidă de 250 mm x 4 mm, C18, particule de 5 sau 10 μm, sau echivalent (criteriul de performanță: un singur vârf pentru toți izomerii de retinol în condițiile CLHP)
   4.5.2.   Detector UV sau fluriometric, cu lungime de undă variabilă
   4.6.   Spectrofotometru cu celule de cuarț de 10 mm
   4.7.   Bain- marie cu agitator magnetic
   Aparat de extracție (a se vedea figura 1) compus din:
   4.8.1.   Cilindru de sticlă cu o capacitate de 1 l, cu gât și dop de sticlă rodată
   4.8.2.   Piesă rodată de tip „tată” echipată cu o tijă laterală și un tub reglabil ce trece prin centrul ei. Acest tub trebuie să aibă partea inferioară în „U” și un jiclor la extremitatea opusă, astfel încât stratul lichid superior din eprubetă să poată fi transferat într-o pâlnie de decantare.
   5.   Procedura
   
      Notă: Vitamina A este sensibilă la lumină (UV) și la oxidare. Toate operațiunile trebuie efectuate în absența luminii (în recipiente de sticlă opacă sau protejate cu o folie de aluminiu) și în absența oxigenului (eliminat cu azot). În timpul extracției, aerul de deasupra lichidului trebuie înlocuit cu azot (a se evita excesul de presiune, desfăcând din când în când dopul).
   5.1.   Prepararea eșantionului
   Se macină eșantionul pentru a trece printr-o sită cu ochiuri de 1 mm, evitându-se producerea de căldură. Măcinarea trebuie efectuată imediat înainte de cântărire și saponificare, în caz contrar putând fi pierderi de vitamina A.
   5.2.   Saponificarea
   În funcție de conținutul de vitamina A din greutate, se cântăresc, cu o precizie de 0,01 g, 2-25 g din eșantion într-un balon sferic sau conic de 500 ml (4.2.1). Se adaugă succesiv, amestecând continuu, 130 ml de etanol (3.1), cca 100 mg de BHT (3.13), 2 ml de soluție de ascorbat de sodiu (3.5) și 2 ml de soluție de sulfură de sodiu (3.6). Se montează un răcitor (4.3) la balon și se scufundă în bain-marie cu agitator magnetic (4.7). Se încălzește până la fierbere și se lasă să-și revină timp de 5 min. Apoi se adaugă 25 ml de soluție de hidroxid de potasiu (3.4) prin răcitor (4.3.) și se lasă să-și revină timp de 25 min, agitând continuu sub un curent slab de azot. Se clătește apoi răcitorul cu cca 20 ml de apă și conținutul balonului se lasă să se răcească la temperatura camerei.
   5.3.   Extracția
   Se transferă cantitativ prin decantare soluția de saponificare clătind cu un volum total de 250 ml de apă într-o pâlnie de decantare de 1 000 ml (4.2.3) sau într-un aparat de extracție (4.8). Se clătește succesiv balonul de saponificare cu 25 ml de etanol (3.1) și 100 ml de eter de petrol (3.2) și se transferă lichidul de clătire în pâlnia de decantare sau în aparatul de extracție. Proporția de apă și etanol în soluțiile combinate trebuie să fie de cca 2:1. Se agită energic timp de 2 min și se lasă să se așeze timp de 2 min.
   5.3.1.   Extracția cu ajutorul unei pâlnii de decantare (4.2.3)
   Când straturile sunt separate (a se vedea observația de la punctul 7.3), se transferă stratul de eter de petrol într-o altă pâlnie de decantare (4.2.3). Se repetă de două ori această operație cu 100 ml de eter de petrol (3.2), apoi de două ori cu 50 ml de eter de petrol (3.2).
   Se spală de două ori extractele combinate în pâlnia de decantare amestecând încet (pentru a se evita formarea de emulsii) cu cantități de 100 ml de apă și, din nou, agitând cu alte cantități de apă de 100 ml până ce apa rămâne incoloră după adăugarea unei soluții de fenolftaleină (3.7) (patru spălări sunt în general suficiente). Se filtrează extractul spălat cu un filtru plisat uscat pentru separarea fazelor (4.4) pentru a se elimina apa reziduală și se transferă într-un balon gradat de 500 ml (4.2.2). Se clătesc pâlnia de decantare și filtrul cu 50 ml de eter de petrol (3.2), se completează până la gradație cu eter de petrol (3.2) și se amestecă bine.
   5.3.2.   Extracția cu ajutorul aparatului de extracție (4.8)
   Când straturile sunt separate (a se vedeaobservația de la punctul 7.3), se pune din nou dopul eprubetei (4.8.1) pe piesa rodată tip „tată” (4.8.2) și se amplasează extremitatea inferioară în formă de „U” a tubului reglabil astfel încât să se afle exact deasupra nivelului interfeței. Aplicând o presiune de azot prin tija laterală, se transferă stratul superior de eter de petrol într-o pâlnie de decantare de 1 000 ml (4.2.3). Se adaugă 100 ml de eter de petrol (3.2) în cilindrul de sticlă, se pune dopul și se agită energic. Apoi, se lasă straturile să se separe și se transferă stratul superior în pâlnia de decantare, la fel ca înainte. Se repetă procedura de extracție cu 100 ml de eter de petrol (3.2), apoi de două ori cu 50 ml de eter de petrol (3.2) și se adaugă straturile de eter de petrol în pâlnia de decantare.
   Se spală extractele combinate de eter de petrol conform procedurii descrise la punctul 5.3.1 și se procedează conform punctului menționat.
   5.4.   Prepararea soluției eșantion pentru CLHP
   Se pune cu pipeta o parte alicotă din soluția de eter de petrol (provenită de la punctul 5.3.1 sau 5.3.2) într-un balon piriform de 250 ml (4.2.4). Se lasă să se evapore aproape în totalitate solventul în evaporatorul rotativ (4.1) la o presiune redusă, la o temperatură de baie de maximum 40 °C. Se restabilește presiunea atmosferică prin admisie de azot (3.10) și se separă balonul de evaporator. Se elimină restul de solvent într-un curent de azot (3.10) și se dizolvă imediat reziduul într-un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (3.3) (concentrația de vitamina A trebuie să fie de ordinul a 5-30 UI/ml).
   Dozarea prin CLHP
   Vitamina A se separă pe o coloană C18 cu fază inversă (4.5.1), iar concentrația se măsoară cu un detector UV (325 nm) sau un detector fluorimetric (excitație 325 nm; emisie: 475 nm) (4.5.2).
   Se injectează o parte alicotă (de exemplu 20 μl) din soluția metanolică obținută la punctul 5.4 și se face o eluție cu faza mobilă (3.9). Se calculează înălțimea medie a vârfului (suprafața) mai multor injectări ale aceleiași soluții eșantion și înălțimile medii ale vârfurilor (suprafețelor) mai multor injectări ale soluțiilor de calibrare (5.6.2).
   Condiții CLHP
   Condițiile următoare sunt propuse orientativ; pot fi aplicate alte condiții dacă se obțin rezultate echivalente.
   
               Coloana pentru cromatografie lichidă (4.5.1):
            
            
               250 mm × 4 mm, C18, particule de 5 sau 10 μm, sau echivalent
            
         
               Faza mobilă (3.9):
            
            
               amestec de metanol (3.3) și apă, de exemplu: 980 + 20 (v + v)
            
         
               Debit:
            
            
               1 – 2 ml/min
            
         
               Detector (4.5.2):
            
            
               Detector UV (325 nm) sau detector fluorimetric (excitație: 325 nm/emisie 475 nm)
            
         5.6   Calibrarea
   5.6.1.   Prepararea soluțiilor etalon de lucru
   Se pun cu pipeta 20 ml din soluția mamă de acetat de vitamina A (3.11.1) sau 20 ml de soluție mamă de palmitat de vitamina A (3.12.1) într-un balon cu fundul plat sau conic de 500 ml (4.2.1) și se hidrolizează conform procedurii descrise la punctul 5.2, dar fără a se adăuga BHT. Se realizează apoi extracția cu eter de petrol (3.2) conform punctului 5.3 și se completează până la 500 ml cu eter de petrol (3.2). Se lasă să se evapore 100 ml din acest extract aproape în totalitate pe evaporatorul rotativ (a se vedeapunctul 5.4), se îndepărtează solventul rezidual într-un curent de azot (3.10) și se dizolvă din nou reziduul în 10,0 ml de metanol (3.3). Concentrația nominală a acestei soluții este de 560 UI de vitamina A per ml. Conținutul exact trebuie determinat conform punctului 5.6.3.3. Soluția etalon de lucru trebuie preparată pentru fiecare folosire.
   Se pun cu pipeta 2,0 ml din această soluție etalon de lucru într-un balon gradat de 20 ml, se completează până la gradație cu metanol (3.3) și se amestecă. Concentrația nominală a acestei soluții etalon de lucru diluate este de 56 UI de vitamina A per ml.
   5.6.2.   Prepararea soluțiilor de calibrare și curba de calibrare
   Se transferă 1,0, 2,0, 5,0 și 10,0 ml din soluția etalon de lucru diluată într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completează până la gradație cu metanol (3.3) și se amestecă. Concentrațiile nominale ale acestor soluții sunt de 2,8, 5,6, 14,0 și respectiv 28,0 UI de vitamina A per ml.
   Se injectează de mai multe ori câte 20 μl din fiecare soluție de calibrare și se determină înălțimile medii ale vârfurilor (suprafețelor). În funcție de înălțimile medii ale vârfurilor (suprafețelor), se trasează o curbă de calibrare ținând cont de rezultatele controlului UV (5.6.3.3).
   5.6.3.   Calibrarea prin UV a soluțiilor etalon
   5.6.3.1.   Soluția mamă de acetat de vitamina A
   Se pun cu pipeta 2,0 ml din soluția mamă de acetat de vitamina A (3.11.1) într-un balon gradat de 50 ml (4.2.2) și se completează până la gradație cu propanol-2 (3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 56 UI de vitamina A per ml. Se pun cu pipeta 3,0 ml din această soluție de acetat de vitamina A diluată într-un balon gradat de 25 ml și se completează până la gradație cu propanol-2 (3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 6,72 UI de vitamina A per ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluții față de propanol-2 (3.8) în spectrofotometru (4.6) între 300 nm și 400 nm. Extincția maximă trebuie să fie cuprinsă între 325 nm și 327 nm.
   Calculul conținutului de vitamina A:
   
      
   5.6.3.2.   Soluția mamă de palmitat de vitamina A
   Se pun cu pipeta 2,0 ml din soluția mamă de palmitat de vitamina A (3.12.1) într-un balon gradat de 50 ml (4.2.2) și se completează până la gradație cu propanol-2 (3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 56 UI de vitamina A per ml. Se pun cu pipeta 3,0 ml din această soluție diluată de palmitat de vitamina A într-un balon gradat de 25 ml și se completează până la gradație cu propanol-2 (3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 6,72 UI de vitamina A per ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluții față de propanol-2 (3.8) în spectrofotometru (4.6) între 300 nm și 400 nm. Extincția maximă trebuie să fie cuprinsă între 325 nm și 327 nm.
   Calculul conținutului de vitamina A:
   
      
   5.6.3.3.   Soluția etalon de lucru de vitamina A
   Se pun cu pipeta 3,0 ml din soluția etalon de lucru nediluată de vitamina A, preparată conform punctului 5.6.1, într-un balon gradat de 50 ml (4.2.2) și se completează până la gradație cu propanol-2 (3.8). Se pun cu pipeta 5,0 ml din această soluție într-un balon gradat de 25 ml și se completează până la gradație cu propanol-2 (3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 6,72 UI de vitamina A per ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluții față de propanol-2 (3.8) în spectrofotometru (4.6) între 300 nm și 400 nm. Extincția maximă trebuie să fie cuprinsă între 325 nm și 327 nm.
   Calculul conținutului de vitamina A:
   
      
   6.   Calculul rezultatelor
   Plecând de la înălțimea medie (suprafața) a vârfurilor de vitamina A ale soluției eșantion, se determină concentrația acestei soluții în UI/ml prin trimitere la curba de calibrare (5.6.2).
   Conținutul w de vitamina A al eșantionului, exprimat în UI/kg, este dat de următoarea formulă:
   
      
   unde:
   
               β
            
            
               =
            
            
               conținutul de vitamina A al soluției eșantion (5.4) în UI/ml
            
         
               V1
               
            
            
               =
            
            
               volumul soluției eșantion (5.4) în ml
            
         
               V2
               
            
            
               =
            
            
               volumul părți alicote prelevate la punctul 5.4 în ml
            
         
               m
            
            
               =
            
            
               masa părții testate în g
            
         7.   Observații
   7.1.   Pentru eșantioanele cu un conținut redus de vitamina A, poate fi utilă combinarea extractelor în eter de petrol provenite din două saponificări (cantitate cântărită: 25 g) într-o soluție eșantion pentru dozarea prin CLHP.
   7.2.   Eșantionul prelevat pentru analiză nu trebuie să conțină peste 2 g de substanțe grase.
   7.3.   Dacă nu are loc separația fazelor, se adaugă cca 10 ml de etanol (3.1) pentru a sparge emulsia.
   7.4.   Cu untură de pește sau alte substanțe grase pure, timpul de saponificare trebuie adus la 45–60 min.
   7.5.   BHT poate fi înlocuit cu hidrochinonă.
   7.6.   Utilizându-se o coloană în fază directă este posibilă separarea izomerilor de retinol.
   7.7.   Soluția de ascorbat de sodiu poate fi înlocuită cu cca 150 mg de acid ascorbic.
   7.8.   Soluția de sulfură de sodiu poate fi înlocuită cu cca 50 mg de EDTA.
   8.   Repetabilitatea
   Diferența dintre rezultatele a două dozări paralele realizate pe același eșantion nu trebuie să depășească 15 % din rezultatul superior.
   9.   Rezultatele unui studiu efectuat prin colaborare între laboratoare (1)
   
   
                
            
            
               Preamestec
            
            
               Concentrat mineral
            
            
               Hrană proteică
            
            
               Furaje pentru purcei
            
         
               L
            
            
               13
            
            
               12
            
            
               13
            
            
               12
            
            
               13
            
         
               n
            
            
               48
            
            
               45
            
            
               47
            
            
               46
            
            
               49
            
         
               media [UI/kg]
            
            
               17,02 × 106
               
            
            
               1,21 × 106
               
            
            
               537 100
            
            
               151 800
            
            
               18 070
            
         
               sr [UI/kg]
            
            
               0,51 × 106
               
            
            
               0,039 × 106
               
            
            
               22 080
            
            
               12 280
            
            
               682
            
         
               r [UI/kg]
            
            
               1,43 × 106
               
            
            
               0,109 × 106
               
            
            
               61 824
            
            
               34 384
            
            
               1 910
            
         
               CVr [%]
            
            
               3,0
            
            
               3,5
            
            
               4,1
            
            
               8,1
            
            
               3,8
            
         
               sR [UI/kg]
            
            
               1,36 × 106
               
            
            
               0,069 × 106
               
            
            
               46 300
            
            
               23 060
            
            
               3 614
            
         
               R [UI/kg]
            
            
               3,81 × 106
               
            
            
               0,193 × 106
               
            
            
               129 640
            
            
               64 568
            
            
               10 119
            
         
               CVR [%]
            
            
               8,0
            
            
               6,2
            
            
               8,6
            
            
               15
            
            
               20
            
         
         
      Figura 1: Aparat de extracție (4.8)
   
      
   PARTEA B
   DOZAREA VITAMINEI E
   1.   Obiect și domeniu de aplicare
   Metoda permite determinarea vitaminei E în furaje și preamestecuri. Conținutul de vitamina E se exprimă în mg de acetat de DL-α-tocoferol per kg. 1 mg de acetat de DL-α-tocoferol corespunde la 0,91 mg de DL-α-tocoferol (vitamina E).
   Limita de determinare este de 2 mg de vitamina E/kg.
   2.   Principiu
   Eșantionul se hidrolizează cu o soluție de hidroxid de potasiu etanolic, iar vitamina E se extrage în eterul de petrol. Solventul se îndepărtează prin evaporare; reziduul se dizolvă în metanol și, dacă este cazul, se diluează până la concentrația necesară. Conținutul de vitamina E se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță în fază inversă (CLHP-PI) cu ajutorul unui detector UV sau fluorimetric.
   3.   Reactivi
   3.1.   Etanol, σ = 96 %
   3.2.   Eter de petrol, interval de fierbere 40 °C-60 °C
   3.3.   Metanol
   3.4.   Soluție de hidroxid de potasiu, β = 50 g/100 ml
   3.5.   Soluție de ascorbat de sodiu, β = 10 g/100 ml (a se vedea observația de la punctul 7.7)
   Sulfură de sodiu, Na2S · x H2O (x = 7-9)
   3.6.1.   Soluție de sulfură de sodiu, c = 0,5 moli/l în glicerol, β = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observația de la punctul 7.8)
   3.7.   Soluție de fenolftaleină, β = 2 g/100 ml în etanol (3.1)
   3.8.   Fază mobilă pentru CLHP: amestec de metanol (3.3) și apă, de exemplu 980 + 20 (v + v). Proporțiile exacte sunt determinate de caracteristicile coloanei folosite.
   3.9.   Azot, liber de oxigen
   Acetat de DL-α-tocoferol, extra pur, cu activitate garantată
   3.10.1.   Soluție mamă de acetat de DL-α-tocoferol: se cântăresc, cu o precizie de 0,1 mg, 100 mg de acetat de DL-α-tocoferol (3.10) într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în etanol (3.1) și se completează până la gradație cu același solvent. 1 ml din această soluție conține 1 mg de acetat de DL-α-tocoferol (pentru controlul UV: a se vedea 5.6.1.3; pentru stabilizare: a se vedea observația de la punctul 7.4).
   DL-α-tocoferol, extra pur, cu activitate garantată
   3.11.1.   Se cântăresc, cu o precizie de 0,1 mg, 100 mg de DL-α-tocoferol (3.10) într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în etanol (3.1.) și se completează până la gradație cu același solvent. 1 ml din această soluție conține 1 mg de DL-α-tocoferol (pentru controlul UV: a se vedea5.6.2.3; pentru stabilizare: a se vedea observația de la punctul 7.4).
   3.12.   BHT (di-tert-butil-2,6-metil-4-fenol) (a se vedea observația de la punctul 7.5)
   4.   Aparatură
   4.1.   Evaporator rotativ sub vid
   Sticlărie opacă de laborator
   4.2.1.   Baloane sferice sau conice, 500 ml, cu gât de sticlă rodată
   4.2.2.   Baloane gradate cu dop de sticlă rodată, gât îngust, de 10, 25, 100 și 500 ml
   4.2.3.   Pâlnii conice de decantare, de 1 000 ml, cu dop de sticlă rodată
   4.2.4.   Baloane piriforme, de 250 ml, cu gât de sticlă rodată
   4.3.   Răcitor Allihn, cu lungime utilă de 300 mm, cu îmbinare de sticlă rodată și adaptor pentru conductă de alimentare cu gaz
   4.4.   Hârtie de filtru plisată pentru separarea fazelor, cu diametru de 185 mm (de exemplu Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)
   Echipament CLHP cu sistem de injecție
   4.5.1.   Coloană pentru cromatografie lichidă de 250 mm x 4 mm, C18, particule de 5 sau 10 μm, sau echivalent
   4.5.2.   Detector UV sau fluriometric, cu lungime de undă variabilă
   4.6.   Spectrofotometru cu celule de cuarț de 10 mm
   4.7.   Bain-marie cu agitator magnetic
   Aparat de extracție (a se vedea figura 1) compus din:
   4.8.1.   Cilindru de sticlă cu o capacitate de 1 l, cu gât și dop de sticlă rodată
   4.8.2.   Piesă rodată de tip „tată” echipată cu o tijă laterală și un tub reglabil ce trece prin centrul ei. Acest tub trebuie să aibă partea inferioară în „U” și un jiclor la extremitatea opusă, astfel încât stratul lichid superior din eprubetă să poată fi transferat într-o pâlnie de decantare.
   5.   Procedura
   
      Notă: Vitamina E este sensibilă la lumină (UV) și la oxidare. Toate operațiunile trebuie efectuate în absența luminii (în recipiente de sticlă opacă sau protejate cu o folie de aluminiu) și în absența oxigenului (eliminat cu azot). În timpul extracției, aerul de deasupra lichidului trebuie înlocuit cu azot (a se evita excesul de presiune, desfăcând din când în când dopul).
   5.1.   Prepararea eșantionului
   Se macină eșantionul pentru a trece printr-o sită cu ochiuri de 1 mm, evitându-se producerea de căldură. Măcinarea trebuie efectuată imediat înainte de cântărire și saponificare, în caz contrar putând fi pierderi de vitamina E.
   5.2.   Saponificarea
   În funcție de conținutul de vitamina E din greutate, se cântăresc, cu o precizie de 0,01 g, 2-25 g din eșantion într-un balon sferic sau conic de 500 ml (4.2.1). Se adaugă succesiv, amestecând continuu, 130 ml de etanol (3.1), cca 100 mg de BHT (3.12), 2 ml de soluție de ascorbat de sodiu (3.5) și 2 ml de soluție de sulfură de sodiu (3.6). Se montează un răcitor (4.3) la balon și se scufundă într-o baie marină cu agitator magnetic (4.7). Se încălzește până la fierbere și se lasă să-și revină timp de 5 min. Apoi se adaugă 25 ml de soluție de hidroxid de potasiu (3.4) prin răcitor (4.3.) și se lasă să-și revină timp de 25 min, agitând continuu sub un curent slab de azot. Se clătește apoi răcitorul cu cca 20 ml de apă și conținutul balonului se lasă să se răcească la temperatura camerei.
   5.3.   Extracția
   Se transferă cantitativ prin decantare soluția de saponificare clătind cu un volum total de 250 ml de apă într-o pâlnie de decantare de 1 000 ml (4.2.3) sau într-un aparat de extracție (4.8). Se clătește succesiv balonul de saponificare cu 25 ml de etanol (3.1) și 100 ml de eter de petrol (3.2) și se transferă lichidul de clătire în pâlnia de decantare sau în aparatul de extracție. Proporția de apă și etanol în soluțiile combinate trebuie să fie de cca 2:1. Se agită energic timp de 2 min și se lasă să se așeze timp de 2 min.
   5.3.1.   Extracția cu ajutorul unei pâlnii de decantare (4.2.3)
   Când straturile sunt separate (a se vedea observația de la punctul 7.3), se transferă stratul de eter de petrol într-o altă pâlnie de decantare (4.2.3). Se repetă de două ori această operație cu 100 ml de eter de petrol (3.2), apoi de două ori cu 50 ml de eter de petrol (3.2).
   Se spală de două ori extractele combinate în pâlnia de decantare amestecând încet (pentru a se evita formarea de emulsii) cu cantități de 100 ml de apă și din nou, agitând cu alte cantități de apă de 100 ml până ce apa rămâne incoloră după adăugarea unei soluții de fenolftaleină (3.7.) (patru spălări sunt în general suficiente). Se filtrează extractul spălat cu un filtru plisat uscat pentru separarea fazelor (4.4) pentru a se elimina apa reziduală și se transferă într-un balon gradat de 500 ml (4.2.2.). Se clătește pâlnia de decantare și filtrul cu 50 ml de eter de petrol (3.2), se completează până la gradație cu eter de petrol (3.2) și se amestecă bine.
   5.3.2.   Extracția cu ajutorul aparatului de extracție (4.8)
   Când straturile sunt separate (a se vedea observația de la punctul 7.3), se pune din nou dopul cilindrului de sticlă (4.8.1) pe piesa rodată tip „tată” (4.8.2) și se amplasează extremitatea inferioară în formă de „U” a tubului reglabil astfel încât să se afle exact deasupra nivelului interfeței. Aplicând o presiune de azot prin tija laterală, se transferă stratul superior de eter de petrol într-o pâlnie de decantare de 1 000 ml (4.2.3). Se adaugă 100 ml de eter de petrol (3.2) în cilindrul de sticlă, se pune dopul și se agită energic. Apoi, se lasă straturile să se separe și se transferă stratul superior în pâlnia de decantare la fel ca înainte. Se repetă procedura de extracție de două ori cu 100 ml de eter de petrol (3.2), apoi de două ori cu 50 ml de eter de petrol (3.2) și se adaugă straturile de eter de petrol în pâlnia de decantare.
   Se spală extractele combinate de eter de petrol conform procedurii descrise la punctul 5.3.1 și se procedează conform punctului menționat.
   5.4.   Prepararea soluției eșantion pentru CLHP
   Se pune cu pipeta o parte alicotă din soluția de eter de petrol (de la punctele 5.3.1 sau 5.3.2) într-un balon piriform de 250 ml (4.2.4). Se lasă să se evapore aproape în totalitate solventul în evaporatorul rotativ (4.1) la o presiune redusă, la o temperatură de baie de maximum 40 °C. Se restabilește presiunea atmosferică prin admisie de azot (3.9) și se separă balonul de evaporator. Se elimină restul de solvent într-un curent de azot (3.9) și se dizolvă imediat reziduul într-un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (3.3) (concentrația de DL-α-tocoferol trebuie să fie de ordinul a 5-30 μg/ml).
   Dozarea prin CLHP
   Vitamina E se separă pe o coloană C18 cu fază inversă (4.5.1), iar concentrația se măsoară cu un detector fluorimetric (excitație 295 nm; emisie: 330 nm) sau un detector UV (292 nm) (4.5.2).
   Se injectează o parte alicotă (de exemplu 20 μl) din soluția metanolică obținută la punctul 5.4 și se face o eluție cu faza mobilă (3.8). Se calculează înălțimea medie a vârfurilor (suprafețelor) mai multor injectări ale aceleiași soluții eșantion și înălțimile medii ale vârfurilor (suprafețelor) mai multor injectări ale soluțiilor de calibrare (5.6.2).
   Condiții CLHP
   Condițiile următoare sunt propuse orientativ; pot fi aplicate alte condiții dacă se obțin rezultate echivalente.
   
               Coloana pentru cromatografie lichidă (4.5.1):
            
            
               250 mm × 4 mm, C18, particule de 5 sau 10 μm sau echivalent
            
         
               Faza mobilă (3.8):
            
            
               amestec de metanol (3.3) și apă, de exemplu: 980 + 20 (v + v)
            
         
               Debit:
            
            
               1–2 ml/min
            
         
               Detector (4.5.2):
            
            
               detector fluorimetric (excitație: 295 nm/emisie 330 nm) sau detector UV (292 nm)
            
         5.6.   Calibrare (acetat de DL-α-tocoferol sau DL-α-tocoferol)
   5.6.1.   Soluție etalon de acetat de DL-α-tocoferol
   5.6.1.1.   Prepararea soluției etalon de lucru
   Se pun cu pipeta 25 ml din soluția mamă de acetat DL-α-tocoferol (3.10.1) într-un balon cu fundul plat sau conic de 500 ml (4.2.1) și se hidrolizează conform procedurii descrise la punctul 5.2. Se realizează apoi extracția cu eter de petrol (3.2) conform punctului 5.3 și se completează până la 500 ml cu eter de petrol. Se lasă să se evapore 25 ml din acest extract aproape în totalitate pe evaporatorul rotativ (a se vedea punctul 5.4), se îndepărtează solventul rezidual într-un curent de azot (3.9) și se dizolvă din nou reziduul în 25,0 ml de metanol (3.3). Concentrația nominală a acestei soluții este de 45,5 μg de DL-α-tocoferol per ml, echivalent cu 50 μg de acetat de DL-α-tocoferol per ml. Soluția etalon de lucru trebuie preparată pentru fiecare folosire.
   5.6.1.2.   Prepararea soluțiilor de calibrare și curba de calibrare
   Se transferă 1,0, 2,0, 4,0 și 10,0 ml din soluția etalon de lucru într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completează până la gradație cu metanol (3.3) și se amestecă. Concentrațiile nominale ale acestor soluții sunt de 2,5, 5,0, 10,0 și respectiv 25,0 μg de acetat de DL-α-tocoferol per ml, adică 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml și 22,8 μg/ml de DL-α-tocoferol.
   Se injectează de mai multe ori câte 20 μl din fiecare soluție de calibrare și se determină înălțimile medii ale vârfurilor (suprafețele). În funcție de înălțimile medii ale vârfurilor (suprafețelor), se trasează o curbă de calibrare.
   5.6.1.3   Calibrarea prin UV a soluției mamă de acetat de DL-α-tocoferol (3.10.1)
   Se diluează 5,0 ml din soluția mamă de acetat de DL-α-tocoferol (3.10.1), se completează până la 25,0 ml cu etanol și se măsoară spectrul UV al acestei soluții față de etanol (3.1) în spectrofotometru (4.6) între 250 nm și 320 nm.
   Absorbția maximă trebuie să fie de 284 nm:
   
      
   La această diluție, ar trebui să se obțină o valoare de extincție între 0,84 și 0,88.
   5.6.2.   Soluția etalon de DL-α-tocoferol
   5.6.2.1.   Prepararea soluției etalon de lucru
   Se pun cu pipeta 2,0 ml din soluția etalon de DL-α-tocoferol (3.11.1) într-un balon gradat de 50 ml, se dizolvă în metanol (3.3) și se completează până la gradație cu metanol. Concentrația nominală a acestei soluții este de 40 μg de DL-α-tocoferol per ml, echivalent cu 44,0 μg de acetat de DL-α-tocoferol. Soluția etalon de lucru trebuie preparată pentru fiecare utilizare.
   5.6.2.2.   Prepararea soluției de calibrare și curba de calibrare
   Se transferă 1,0, 2,0, 4,0 și 10,0 ml din soluția etalon de lucru în baloane gradate de 20 ml, se completează până la gradație cu metanol (3.3) și se amestecă. Concentrațiile nominale ale acestor soluții sunt de 2,0, 4,0, 8,0 și 20,0 μg/ml de DL-α-tocoferol, adică 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml și 22,0 μg/ml de acetat de DL-α-tocoferol.
   Se injectează de mai multe ori câte 20 μl din fiecare soluție de calibrare și se determină înălțimile medii ale vârfurilor (suprafețelor). În funcție de înălțimile medii ale vârfurilor (suprafețelor), se trasează o curbă de calibrare.
   5.6.2.3.   Calibrarea prin UV a soluției mamă de DL-α-tocoferol (3.11.1)
   Se diluează 2,0 ml din soluția mamă de DL-α-tocoferol (3.11.1), se completează până la 25,0 ml cu etanol și se măsoară spectrul UV al acestei soluții față de etanol (3.1) în spectrofotometru (4.6) între 250 nm și 320 nm. Absorbția maximă trebuie să fie de 292 nm:
   
      
   La această diluție, ar trebui să se obțină o valoare de extincție de 0,6.
   6.   Calculul rezultatelor
   Plecând de la înălțimea medie (suprafața) a vârfurilor de vitamina E a soluției eșantion, se determină concentrația acestei soluții în μg/ml (exprimată în acetat de DL-α-tocoferol) prin trimitere la curba de calibrare (punctele 5.6.1.2 sau 5.6.2.2).
   Conținutul w de vitamina E al eșantionului, exprimat în mg/kg, este dat de următoarea formulă:
   
      
   unde:
   
               β
            
            
               =
            
            
               conținutul de vitamina E al soluției eșantion (5.4) în μg/ml
            
         
               V1
               
            
            
               =
            
            
               volumul soluției eșantion (5.4) în ml
            
         
               V2
               
            
            
               =
            
            
               volumul părții alicote prelevate la punctul 5.4 în ml
            
         
               m
            
            
               =
            
            
               masa părții testate în g
            
         7.   Observații
   7.1.   Pentru eșantioanele cu un conținut redus de vitamina E, poate fi utilă combinarea extractelor în eter de petrol provenite din două saponificări (cantitate cântărită: 25 g) într-o soluție eșantion pentru dozarea prin CLHP
   7.2.   Eșantionul prelevat pentru analiză nu trebuie să conțină peste 2 g de substanțe grase.
   7.3.   Dacă nu are loc separația fazelor, se adaugă cca 10 ml de etanol (3.1) pentru a sparge emulsia.
   7.4.   Odată efectuată măsurătoarea spectrofotometrică a soluției de acetat de DL-α-tocoferol sau de DL-α-tocoferol, conform punctelor 5.6.1.3, respectiv 5.6.2.3, se adaugă cca 10 mg de BHT (3.12) la soluție (3.10.1 sau 3.10.2) și se conservă această soluție la congelator (durata maximă de stocare: patru săptămâni).
   7.5.   BHT poate fi înlocuit cu hidrochinonă.
   7.6.   Utilizându-se o coloană în fază directă este posibilă separarea tocoferolilor α-, β-, χ-, și δ-.
   7.7.   Soluția de ascorbat de sodiu poate fi înlocuită cu cca 150 mg de acid ascorbic.
   7.8.   Soluția de sulfură de sodiu poate fi înlocuită cu cca 50 mg de EDTA.
   8.   Repetabilitate
   Diferența dintre rezultatele a două dozări paralele realizate pe același eșantion nu trebuie să depășească 15 % din rezultatul superior.
   9.   Rezultatele unui studiu efectuat prin colaborare între laboratoare (2)
   
   
                
            
            
               Preamestec
            
            
               Concentrat mineral
            
            
               Hrană proteică
            
            
               Furaj pentru purcei
            
         
               L
            
            
               12
            
            
               12
            
            
               12
            
            
               12
            
            
               12
            
         
               n
            
            
               48
            
            
               48
            
            
               48
            
            
               48
            
            
               48
            
         
               media [mg/kg]
            
            
               17 380
            
            
               1 187
            
            
               926
            
            
               315
            
            
               61,3
            
         
               sr [mg/kg]
            
            
               384
            
            
               45,3
            
            
               25,2
            
            
               13,0
            
            
               2,3
            
         
               r [mg/kg]
            
            
               1 075
            
            
               126,8
            
            
               70,6
            
            
               36,4
            
            
               6,4
            
         
               CVr [%]
            
            
               2,2
            
            
               3,8
            
            
               2,7
            
            
               4,1
            
            
               3,8
            
         
               sR [mg/kg]
            
            
               830
            
            
               65,0
            
            
               55,5
            
            
               18,9
            
            
               7,8
            
         
               R [mg/kg]
            
            
               2 324
            
            
               182,0
            
            
               155,4
            
            
               52,9
            
            
               21,8
            
         
               CVR [%]
            
            
               4,8
            
            
               5,5
            
            
               6,0
            
            
               6,0
            
            
               12,7
            
         
         
      Figura 1: Aparat de extracție (4.8)
   
      
   PARTEA C
   DOZAREA TRIPTOFANULUI
   1.   Obiectul și domeniul de aplicare
   Metoda permite determinarea triptofanului total și liber din furaje. Ea nu face distincție între formele D și L.
   2.   Principiul
   Pentru determinarea triptofanului total, eșantionul se hidrolizează în mediu bazic cu o soluție de hidroxid de bariu saturată și se încălzește la 110 °C timp de douăzeci de ore. După hidroliză, se adaugă etalonul intern.
   Pentru determinarea triptofanului liber, eșantionul se extrage în mediu slab acid în prezența etalonului intern.
   Triptofanul și etalonul din hidrolizat și extract se determină prin CLHP cu ajutorul unui detector fluorimetric.
   3.   Reactivi
   3.1.   Se utilizează apă dublu distilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate < 10 μS/cm)
   3.2.   Substanța-etalon: triptofan (puritate/conținut ≥ 99 %) uscat sub vid pe pentoxid difosforic
   3.3.   Etalon intern propriu-zis: α-metil-triptofan (puritate/conținut ≥ 99 %) uscat sub vid pe pentoxid difosforic
   3.4.   Hidroxid de bariu octahidratat (ar trebui să se evite expunerea excesivă a Ba(OH)2·8H2O la aer, pentru a se evita formarea de BaCO3, care ar putea perturba dozarea) (a se vedea observația de la punctul 9.3).
   3.5.   Hidroxid de sodiu
   3.6.   Acid ortofosforic, w = 85 %
   3.7.   Acid clorhidric, ρ20 = 1,19 g/ml
   3.8.   Metanol, de calitate CLHP
   3.9.   Eter de petrol, interval de fierbere: 40–60 °C
   3.10.   Soluție de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l:
   se dizolvă 40,0 g de NaOH (3.5) în apă și se completează până la un litru cu apă (3.1).
   3.11.   Acid clorhidric, c = 6 mol/l:
   se iau 492 ml HCl (3.7) și se completează până la un litru cu apă.
   3.12.   Acid clorhidric, c = 1 mol/l:
   se iau 82 ml HCl (3.7) și se completează până la un litru cu apă.
   3.13.   Acid clorhidric, c = 0,1 mol/l:
   se iau 8,2 ml HCl (3.7) și se completează până la un litru cu apă.
   3.14.   Acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l:
   se iau 34 ml de acid ortofosforic (3.6) și se completează până la un litru cu apă (3.1).
   3.15.   Soluție mamă de triptofan (3.2), c = 2,50 μmol/ml
   Într-un balon gradat de 500 ml, se dizolvă 0,2553 g de triptofan (3.2) în acid clorhidric (3.13) și se completează până la gradație cu acid clorhidric (3.13). Se depozitează la -1 °C cel mult patru săptămâni.
   3.16.   Soluție-etalon intern concentrată, c = 2,50 μmol/ml
   Într-un balon gradat de 500 ml, se dizolvă 0,2728 g de α-metil-triptofan (3.3) în acid clorhidric (3.13) și se completează până la gradație cu acid clorhidric (3.13). Se depozitează la -1 °C cel mult patru săptămâni.
   3.17.   Soluție etalon de calibrare a triptofanului și etalonului intern
   Se iau 2,00 ml din soluția mamă de triptofan (3.15) și 2,00 ml din soluția mamă etalon intern (de α-metil-triptofan) (3.16). Se diluează cu apă (3.1) și metanol (3.8), la un volum aproximativ egal și cu aproximativ aceeași concentrație de metanol (10-30 %) ca și hidrolizatul final.
   Această soluție trebuie preparată pentru fiecare utilizare.
   A se proteja de lumina solară directă în timpul preparării.
   3.18.   Acid acetic
   3.19.   Tricloro-1,1,1-metil-2-propanol-2
   3.20.   Etanolamină > 98 %
   3.21.   Soluție de 1 g de tricloro-1,1,1-metil-2-propanol-2 (3.19) în 100 ml de metanol (3.8)
   3.22.   Fază mobilă pentru CLHP: 3,00 g de acid acetic (3.18) + 900 ml apă (3.1) + 50,0 ml soluție (3.21) de tricloro-1,1,1-metil-2-propanol-2 (3.19) în metanol (3.8) (1 g/100 ml). Se aduce pH-ul la 5,00 cu etanolamină (3.20). Se completează până la 1 000 ml cu apă (3.1).
   4.   Aparatură
   4.1.   Echipament pentru CLHP cu detectare spectrofluorimetrică
   4.2.   Coloană pentru cromatografie lichidă, 125 mm × 4 mm, C18, particule de 3 μm sau echivalent
   4.3.   pH-metru
   4.4.   Balon de polipropilenă, capacitate 125 ml, cu gât larg și dop cu filet
   4.5.   Filtru membrană, 0,45 μm
   4.6   Autoclavă, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar
   4.7   Agitator mecanic sau magnetic
   4.8.   Agitator Vortex
   5.   Procedura
   5.1.   Prepararea eșantioanelor
   Se macină eșantionul pentru a trece printr-o sită cu ochiuri de 0,5 mm. Eșantioanele cu un conținut ridicat de umiditate trebuie uscate la aer, la o temperatură de maximum 50 °C, sau prin liofilizare înainte de măcinare. Eșantioanele cu un conținut ridicat de substanțe grase trebuie extrase prin eter de petrol (3.9) înainte de măcinare.
   5.2.   Determinarea triptofanului liber (extract)
   Se cântărește cu o precizie de 1 mg o cantitate adecvată (1-5 g) din eșantionul preparat (5.1) într-un balon conic. Se adaugă 100,0 ml de acid clorhidric, c = 0,1 mol/l (3.13) și 5,00 ml din soluția mamă etalon intern (3.16). Se agită sau se amestecă timp de 60 min cu ajutorul agitatorului mecanic sau magnetic (4.7). Se lasă să se decanteze sedimentul și se pun cu pipeta 10,0 ml din soluția supranatantă într-un pahar de laborator. Se adaugă 5 ml de acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l (3.14). Se aduce pH-ul la 3 cu hidroxid de sodiu, c = 1,0 mol/l (3.10). Se adaugă metanol (3.8) în cantitate suficientă pentru a obține o concentrație de 10-30 % metanol în volumul final. Se transferă într-un balon gradat cu capacitate corespunzătoare și se diluează cu apă la volumul necesar pentru cromatografie [aproximativ același volum ca și soluția etalon de calibrare (3.17)].
   Se filtrează câțiva mililitri din soluție printr-un filtru membrană de 0,45 μm (4.5) înainte de se injecta pe o coloană CLHP. Se trece la etapa cromatografiei conform punctului 5.4.
   A se proteja soluția-etalon și extractele de lumina solară directă. Dacă nu este posibilă analizarea extractelor în ziua preparării, ele trebuie depozitate la 5 °C cel mult trei zile.
   5.3.   Dozarea triptofanului total (hidrolizat)
   Se cântăresc cu o precizie de 0,2 mg între 0,1 și 1 g din eșantionul preparat (5.1) într-un balon de polipropilenă (4.4). Cantitatea de eșantion cântărită trebuie să aibă un conținut de azot de cca 10 mg. Se adaugă 8,4 g de hidroxid de bariu octahidratat (3.4) și 10 ml de apă. Se amestecă cu un agitator Vortex (4.8) sau un agitator magnetic (4.7). Se lasă magnetul acoperit cu teflon în amestec. Se spală pereții recipientului cu 4 ml de apă. Se pune dopul cu filet și se închide balonul fără a strânge. Se transferă într-o autoclavă (4.6) cu apă clocotită și vapori de apă timp de 30-60 min. Se închide autoclava și se pune în funcțiune la 110 (± 2) °C timp de douăzeci de ore.
   Înainte de a deschide autoclava, se reduce temperatura la puțin sub 100 °C. Pentru a se evita cristalizarea Ba(OH)2·8H2O, se adaugă la amestecul cald 30 ml apă la temperatura ambiantă. Se agită sau se amestecă ușor. Se adaugă 2,00 ml din soluția mamă (de α-metil-triptofan) etalon intern (3.16). Se răcesc recipientele într-o baie de apă/gheață timp de 15 min.
   Se adaugă apoi 5 ml de acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l (3.14). Se menține recipientul în baia de răcire și se neutralizează cu acid clorhidric, c = 6 mol/l (3.11) amestecând continuu, apoi se aduce pH-ul la 3,0 cu HCl, c = 1 mol/l (3.12). Se adaugă suficient metanol pentru a obține o concentrație cuprinsă între 10 și 30 % metanol în volumul final. Se transferă într-un balon gradat cu capacitate corespunzătoare și se diluează cu apă la volumul necesar pentru cromatografie (de exemplu 100 ml). Adaosul de metanol nu trebuie să provoace precipitarea.
   Se filtrează câțiva mililitri din soluție printr-un filtru membrană de 0,45 μm (4.5) înainte de se injecta pe o coloană CLHP. Se trece la etapa de cromatografie conform punctului 5.4.
   A se proteja soluția-etalon și hidrolizații de lumina solară directă. Dacă nu este posibilă analizarea hidrolizaților în ziua preparării, ei trebuie depozitați la 5 °C cel mult trei zile.
   5.4.   Dozarea prin CLHP
   Următoarele condiții pentru eluția izocratică sunt propuse doar orientativ; pot fi aplicate alte condiții, dacă se obțin rezultate echivalente (a se vedea, de asemenea, observațiile de la punctele 9.1 și 9.2):
   
               Coloană pentru cromatografie (4.2):
            
            
               125 mm × 4 mm, C18, particule de 3 μm sau echivalent
            
         
               Temperatura coloanei:
            
            
               temperatura camerei
            
         
               Faza mobilă (3.22):
            
            
               3,00 g de acid acetic (3.18) + 900 ml de apă (3.1) + 50,0 ml de soluție (3.21) de tricloro-1,1,1-metil-2-propanol-2 (3.19) în metanol (3.8) (1 g/100 ml). Se aduce pH-ul la 5,00 cu etanolamină (3.20). Se completează până la 1 000 ml cu apă (3.1).
            
         
               Debit:
            
            
               1 ml/min
            
         
               Timp total de emulsie:
            
            
               cca 34 min
            
         
               Lungimea undei de detectare:
            
            
               excitație: 280 nm; emisie 356 nm
            
         
               Volum de injecție:
            
            
               20 μl.
            
         6.   Calculul rezultatelor
   
      
   
               A
            
            
               =
            
            
               suprafața vârfului etalonului intern, soluția etalon de calibrare (3.17)
            
         
               B
            
            
               =
            
            
               suprafața vârfului de triptofan, extras (5.2) sau hidrolizat (5.3)
            
         
               C
            
            
               =
            
            
               volumul în ml (2 ml) al soluției mamă de triptofan (3.15) adăugată la soluția de calibrare (3.17)
            
         
               D
            
            
               =
            
            
               concentrația în μmol/ml (= 2,50) a soluției mamă de triptofan (3.15) adăugată la soluția de calibrare (3.17)
            
         
               E
            
            
               =
            
            
               volumul în ml al soluției mamă etalon intern (3.16) adăugată la extract (5.2) (= 5,00 ml) sau la hidrolizat (5.3) (= 2,00 ml)
            
         
               F
            
            
               =
            
            
               suprafața vârfului etalonului intern, extras (5.2) sau hidrolizat (5.3)
            
         
               G
            
            
               =
            
            
               suprafața vârfului de triptofan, soluția-etalon de calibrare (3.17)
            
         
               H
            
            
               =
            
            
               volumul în ml (= 2,00 ml) al soluției mamă etalon intern (3.16) adăugată la soluția etalon de calibrare (3.17)
            
         
               W
            
            
               =
            
            
               greutatea eșantionului în g (corectată pentru a obține greutatea inițială dacă produsul este uscat și/sau degresat)
            
         
               MW
            
            
               =
            
            
               greutatea moleculară a triptofanului (= 204,23)
            
         7.   Repetabilitatea
   Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele realizate pe același eșantion nu poate depăși 10 % din rezultatul superior.
   8.   Rezultatele unui studiu efectuat prin colaborare între laboratoare
   S-a efectuat un studiu comunitar prin colaborare între laboratoare (a patra comparație între laboratoare); au fost analizate trei eșantioane de către 12 laboratoare pentru certificarea metodei prin hidroliză. Fiecare eșantion a fost supus la 5 analize. Rezultatele obținute se regăsesc în tabelul următor:
   
                
            
            
               Eșantion 1
               Furaje pentru porcine
            
            
               Eșantion 2
               Furaje pentru porcine completate cu L-triptofan
            
            
               Eșantion 3
               Furaje concentrate pentru porcine
            
         
               L
            
            
               12
            
            
               12
            
            
               12
            
         
               n
            
            
               50
            
            
               55
            
            
               50
            
         
               Media [g/kg]
            
            
               2,42
            
            
               3,40
            
            
               4,22
            
         
               sr [g/kg]
            
            
               0,05
            
            
               0,05
            
            
               0,08
            
         
               r [g/kg]
            
            
               0,14
            
            
               0,14
            
            
               0,22
            
         
               CVr [%]
            
            
               1,9
            
            
               1,6
            
            
               1,9
            
         
               sR [g/kg]
            
            
               0,15
            
            
               0,20
            
            
               0,09
            
         
               R [g/kg]
            
            
               0,42
            
            
               0,56
            
            
               0,25
            
         
               CVR [%]
            
            
               6,3
            
            
               6,0
            
            
               2,2
            
         
         A fost realizat un alt studiu inter-laboratoare (a treia inter-comparație); au fost analizate două eșantioane de către treisprezece laboratoare pentru certificarea metodei prin extracția triptofanului liber. Fiecare eșantion a fost supus la cinci analize. Rezultatele se regăsesc în tabelul următor:
   
                
            
            
               Eșantion 4
               Amestec de grâu și soia
            
            
               Eșantion 5
               Amestec de grâu și soia (= eșantion 4) cu adaos de triptofan (0,457 g/kg)
            
         
               L
            
            
               12
            
            
               12
            
         
               n
            
            
               55
            
            
               60
            
         
               Media [g/kg]
            
            
               0,391
            
            
               0,931
            
         
               sr [g/kg]
            
            
               0,005
            
            
               0,012
            
         
               r [g/kg]
            
            
               0,014
            
            
               0,034
            
         
               CVr [%]
            
            
               1,34
            
            
               1,34
            
         
               sR [g/kg]
            
            
               0,018
            
            
               0,048
            
         
               R [g/kg]
            
            
               0,050
            
            
               0,134
            
         
               CVR [%]
            
            
               4,71
            
            
               5,11
            
         
         S-a efectuat un alt studiu comunitar prin colaborare între laboratoare: au fost analizate patru eșantioane de către șapte laboratoare pentru certificarea metodei prin hidroliză. Fiecare eșantion a fost supus la cinci analize. Rezultatele se regăsesc în tabelul următor:
   
                
            
            
               Eșantion 1
               Furaje compuse pentru porcine
               (CRM 117)
            
            
               Eșantion 2
               Făină de pește cu conținut redus de substanțe grase
               (CRM 118)
            
            
               Eșantion 3
               Făină de soia
               (CRM 119)
            
            
               Eșantion 4
               Lapte praf degresat
               (CRM 120)
            
         
               L
            
            
               7
            
            
               7
            
            
               7
            
            
               7
            
         
               n
            
            
               25
            
            
               30
            
            
               30
            
            
               30
            
         
               Media [g/kg]
            
            
               2,064
            
            
               8,801
            
            
               6,882
            
            
               5,236
            
         
               sr [g/kg]
            
            
               0,021
            
            
               0,101
            
            
               0,089
            
            
               0,040
            
         
               r [g/kg]
            
            
               0,059
            
            
               0,283
            
            
               0,249
            
            
               0,112
            
         
               CVr [%]
            
            
               1,04
            
            
               1,15
            
            
               1,30
            
            
               0,76
            
         
               sR [g/kg]
            
            
               0,031
            
            
               0,413
            
            
               0,283
            
            
               0,221
            
         
               R [g/kg]
            
            
               0,087
            
            
               1,156
            
            
               0,792
            
            
               0,619
            
         
               CVR [%]
            
            
               1,48
            
            
               4,69
            
            
               4,11
            
            
               4,22
            
         
         9.   Observații
   9.1.   Condițiile speciale de cromatografie prezentate mai jos pot conduce la o mai bună separare între triptofan și α-metil-triptofan.
   Eluție izocratică urmată de o curățare a coloanei pe gradient:
   
      
   
               Coloana pentru cromatografie lichidă:
            
            
               125 mm × 4 mm, C18, particule de 5 μm sau echivalent
            
         
               Temperatura coloanei:
            
            
               32 °C
            
         
               Faza mobilă:
            
            
               A: amestec 95/5 de KH2PO4, la 0,01 mol/l/metanol (V + V)
            
         
               B: metanol
            
         
               Programul gradientului:
            
            
               0 min
            
            
               100 % A
            
            
               0 %B
            
         
               15 min
            
            
               100 % A
            
            
               0 % B
            
         
               17 min
            
            
               60 % A
            
            
               40 % B
            
         
               19 min
            
            
               60 % A
            
            
               40 % B
            
         
               21 min
            
            
               100 % A
            
            
               0 % B
            
         
               33 min
            
            
               100 % A
            
            
               0 % B
            
         
               Debit:
            
            
               1,2 ml/min
            
         
               Timp total de eluție:
            
            
               cca 33 min.
            
         9.2.   Cromatografia variază în funcție de tipul de CLHP și de umplerea coloanei. Sistemul reținut trebuie conducă la o întoarcere la linia de bază între vârfurile triptofanului și ale etalonului intern. În plus, este important ca produșii de descompunere să fie bine separați de triptofan și etalonul intern. Trebuie realizată o probă fără etalon intern, astfel încât să se verifice absența impurităților pe linia de bază la nivelul etalonului intern. Este important ca timpul de eluție să fie suficient de lung pentru a permite eluția tuturor produșilor de descompunere, în lipsa căreia vârfurile întârziate de eluție pot interfera cu operațiile ulterioare de cromatografie.
   În gama operațiilor, sistemul cromatografic trebuie să dea un răspuns linear. Acest răspuns trebuie să fie măsurat la o concentrație constantă (concentrația normală) a etalonului intern și la diverse concentrații de triptofan. Este important ca înălțimea vârfurilor triptofanului și ale etalonului intern să se situeze în gama lineară a sistemului CLHP/fluorescență. Dacă vârfurile triptofanului și/sau ale etalonului intern sunt prea mici sau prea înalte, analiza trebuie reprodusă, cu un eșantion de o altă dimensiune și/sau un volum final modificat.
   9.3.   Hidroxid de bariu
   Cu timpul, hidroxidul de bariu devine mai dificil de dizolvat. Aceasta dă o soluție tulbure pentru determinarea prin CLHP, ceea ce poate conduce la rezultate slabe pentru triptofan.
   
      (1)  Studiu realizat de grupul de lucru pentru hrana animalelor al Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).
   
      (2)  Studiu realizat de grupul de lucru pentru furaje Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).