CELEX: 32008R0440
Language: ro
Date: 2008-05-30 00:00:00
Title: Regulamentul (ce) nr. 440/2008 Al comisiei din 30 mai 2008 de stabilire a metodelor de testare în temeiul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH) ((Text cu relevanță pentru SEE))

31.5.2008   
            
            
               RO
            
            
               Jurnalul Oficial al Uniunii Europene
            
            
               L 142/1
            
         
      REGULAMENTUL (CE) NR. 440/2008 AL COMISIEI
   
   din 30 mai 2008
   de stabilire a metodelor de testare în temeiul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH)
   (Text cu relevanță pentru SEE)
   COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,
   având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene,
   având în vedere Regulamentul (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului din 18 decembrie 2006 privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH), de înființare a Agenției Europene pentru Produse Chimice, de modificare a Directivei 1999/45/CE și de abrogare a Regulamentului (CEE) nr. 793/93 al Consiliului și a Regulamentului (CE) nr. 1488/94 al Comisiei, precum și a Directivei 76/769/CEE a Consiliului și a Directivelor 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE și 2000/21/CE ale Comisiei (1), în special articolul 13 alineatul (3),
   întrucât:
   
               (1)
            
            
               În conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 1907/2006, se adoptă metode de testare la nivel comunitar în vederea testării substanțelor, atunci când astfel de teste sunt necesare pentru a obține informații privind proprietățile intrinsece ale substanțelor.
            
         
               (2)
            
            
               Directiva 67/548/CEE a Consiliului din 27 iunie 1967 privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative referitoare la clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoase (2) a stabilit, în anexa V, metodele de determinare a proprietăților fizico-chimice, a toxicității și a ecotoxicității substanțelor și preparatelor. Anexa V la Directiva 67/548/CEE a fost eliminată prin Directiva 2006/121/CE a Parlamentului European și a Consiliului cu începere de la 1 iunie 2008.
            
         
               (3)
            
            
               Metodele de testare prezentate în anexa V la Directiva 67/548/CEE trebuie incluse în prezentul regulament.
            
         
               (4)
            
            
               Prezentul regulament nu exclude utilizarea altor metode de testare, cu condiția ca aceasta să fie conformă cu articolul 13 alineatul (3) din Regulamentul 1907/2006.
            
         
               (5)
            
            
               La elaborarea metodelor de testare trebuie luate în considerare pe deplin principiile de înlocuire, de reducere și de perfecționare a utilizării animalelor în cadrul procedurilor, în special atunci când sunt disponibile metode corespunzătoare și validate de înlocuire, reducere sau perfecționare a testării pe animale.
            
         
               (6)
            
            
               Dispozițiile prezentului regulament sunt conforme cu avizul comitetului instituit în temeiul articolului 133 din Regulamentul (CE) nr. 1907/2006,
            
         ADOPTĂ PREZENTUL REGULAMENT:
   Articolul 1
   Metodele de testare care urmează să fie aplicate în sensul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 sunt prezentate în anexa la prezentul regulament.
   Articolul 2
   Comisia revizuiește, atunci când este cazul, metodele de testare incluse în prezentul regulament în vederea înlocuirii, reducerii sau perfecționării testelor efectuate pe animale vertebrate.
   Articolul 3
   Toate trimiterile la anexa V la Directiva 67/548/CEE se interpretează ca trimiteri la prezentul regulament.
   Articolul 4
   Prezentul regulament intră în vigoare în ziua următoare publicării în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene.
   
      Se aplică de la 1 iunie 2008.
      Prezentul regulament este obligatoriu în toate elementele sale și se aplică direct în toate statele membre.
      Adoptat la Bruxelles, 30 mai 2008.
      
         
            Pentru Comisie
         
         Stavros DIMAS
         
         
            Membru al Comisiei
         
      
   
   
      (1)  JO L 396, 30.12.2006, p. 1.
   
      (2)  JO  196, 16.8.1967, p. 1. Directivă modificată ultima dată prin Directiva 2006/121/CE a Parlamentului European și a Consiliului (JO L 396, 30.12.2006, p. 850) – a se actualiza cu trimiterile corespunzătoare după publicarea celei de-a treizecea ATP.
   
   
      ANEXĂ
      PARTEA A: METODE PENTRU DETERMINAREA PROPRIETĂŢILOR FIZICO-CHIMICE
      CUPRINS
      
                  A.1.
               
               PUNCTUL DE TOPIRE/CONGELARE
            
                  A.2.
               
               PUNCTUL DE FIERBERE
            
                  A.3.
               
               DENSITATEA RELATIVĂ
            
                  A.4.
               
               PRESIUNEA DE VAPORI
            
                  A.5.
               
               TENSIUNEA SUPERFICIALĂ
            
                  A.6.
               
               SOLUBILITATEA ÎN APĂ
            
                  A.8.
               
               COEFICIENTUL DE PARTIŢIE
            
                  A.9.
               
               PUNCTUL DE INFLAMABILITATE
            
                  A.10.
               
               INFALMABILITATE (SOLIDE)
            
                  A.11.
               
               INFLAMABILITATE (GAZE)
            
                  A.12.
               
               INFLAMABILITATE (CONTACTUL CU APA)
            
                  A.13.
               
               PROPRIETĂŢI PIROFORICE ALE SOLIDELOR ŞI ALE LICHIDELOR
            
                  A.14.
               
               PROPRIETĂŢI EXPLOZIVE
            
                  A.15.
               
               PUNCTUL DE AUTOAPRINDERE (LICHIDE ŞI GAZE)
            
                  A.16.
               
               TEMPERATURA RELATIVĂ DE AUTOAPRINDERE PENTRU SUBSTANŢELE SOLIDE
            
                  A.17.
               
               PROPRIETĂŢI OXIDANTE (SOLIDE)
            
                  A.18.
               
               DETERMINAREA MASEI MOLECULARE NUMERICE MEDII ŞI A DISTRIBUŢIEI MASELOR MOLECULARE A POLIMERILOR
            
                  A.19.
               
               DETERMINAREA CONŢINUTULUI ÎN POLIMERI CU MASĂ MOLECULARĂ MICĂ
            
                  A.20.
               
               COMPORTAMENTUL DE DIZOLVARE/EXTRACŢIE AL POLIMERILOR ÎN APĂ
            
                  A.21.
               
               PROPRIETĂŢI OXIDANTE (LICHIDE)
            A.1.   PUNCTUL DE TOPIRE/CONGELARE
      1.   METODĂ
      Majoritatea metodelor descrise se bazează pe orientările OCDE privind testele (1). Principiile fundamentale sunt descrise în referinţele bibliografice 2 şi 3.
      1.1.   INTRODUCERE
      Metodele şi dispozitivele descrise se aplică pentru determinarea punctului de topire a substanţelor, oricare ar fi gradul de puritate a acestora.
      Alegerea metodei depinde de natura substanţei de testat. În consecinţă, factorul limitativ depinde direct de calitatea substanţei de a fi uşor pulverizabilă, greu pulverizabilă sau nepulverizabilă.
      Pentru anumite substanţe este preferabil să se determine punctul de congelare sau de solidificare. Acesta este motivul pentru care normele acestor determinări figurează şi în prezenta metodă.
      Atunci când, datorită proprietăţilor specifice ale substanţei, niciun parametru nu poate fi măsurat într-un mod satisfăcător, se poate determina punctul de curgere.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Punctul de topire se defineşte ca temperatura la care are loc tranziţia de fază din stare solidă în stare lichidă, la presiunea atmosferică, temperatură care în mod ideal corespunde temperaturii de congelare.
      Deoarece în cazul multor substanţe tranziţia de fază are loc într-un anumit interval de temperatură, aceasta este deseori descrisă ca interval de topire.
      Transformarea unităţilor de măsură (K în oC)
      t = T – 273,15
      
                  t =
               
               
                  temperatura Celsius, exprimată în grade Celsius ( oC)
               
            
                  T =
               
               
                  temperatura termodinamică, exprimată în grade Kelvin (K)
               
            1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă de fiecare dată când se studiază o substanţă nouă. Acestea trebuie să servească în special la verificarea periodică a acurateţei metodei şi să permită comparaţia cu rezultatele obţinute prin alte metode.
      Câteva substanţe-mamă sunt enumerate în referinţele bibliografice (4).
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Se determină temperatura (intervalul de temperatură) la care are loc tranziţia de fază din starea solidă în starea lichidă. În practică, se determină temperaturile fazei iniţiale de topire/congelare şi finale de topire/congelare în timpul încălzirii/răcirii unei mostre de substanţă la presiunea atmosferică Sunt descrise cinci tipuri de metode, şi anume: metoda capilară, metoda blocului fierbinte, determinarea punctului de congelare, metoda analizei termice şi determinarea punctului de curgere (pentru uleiurile din petrol).
      În anumite cazuri, poate fi mai uşor să se măsoare punctul de congelare în locul punctului de topire.
      1.4.1.   Metoda tubului capilar
      1.4.1.1.   Dispozitiv cu baie de lichid
      Se introduce o cantitate mică de substanţă pulverizată fin într-un tub capilar şi se tasează cu atenţie. Se încălzeşte tubul în acelaşi timp cu un termometru şi pe parcursul operaţiei se reglează creşterea temperaturii cu puţin sub 1 K pe minut. Se înregistrează temperaturile la început şi la sfârşit de topire.
      1.4.1.2.   Dispozitiv prevăzut cu bloc metalic fierbinte
      Metoda este aceeaşi cu cea descrisă la punctul 1.4.1.1, cu diferenţa că tubul capilar şi termometrul sunt plasate într-un bloc de metal încălzit şi observate prin orificii practicate în acest bloc.
      1.4.1.3.   Detecţie fotoelectrică
      Eşantionul conţinut în tubul capilar se încălzeşte automat într-un cilindru metalic. Printr-un orificiu practicat în acest cilindru se trimite un fascicul de lumină prin substanţa de testat către o celulă fotoelectrică etalonată cu precizie. În momentul topirii, proprietăţile optice ale majorităţii substanţelor se modifică, în sensul că din opace devin transparente. Astfel, intensitatea luminii care atinge celula fotoelectrică creşte şi trimite un semnal de oprire indicatorului digital care înregistrează temperatura termometrului cu rezistenţă de platină plasat în incinta de încălzire. Această metodă nu se poate aplica anumitor substanţe puternic colorate.
      1.4.2.   Metode cu suprafaţă încălzită
      1.4.2.1.   Metoda bancului de încălzire Kofler
      Bancul de încălzire Kofler este compus din două piese cu conductivitate termică diferită care se încălzesc electric. Bancul este construit astfel încât gradientul de temperatură să fie aproape linear pe toată lungimea. Temperatura acestui banc de încălzire poate fi determinată de la 283 la 573 K datorită unui dispozitiv de citire a temperaturii format dintr-un cursor cu ac indicator şi o riglă gradată concepute special pentru bancul în cauză. Pentru a determina un punct de topire, este suficientă depunerea unui strat fin de substanţă direct pe suprafaţa bancului. În câtva secunde se formează o linie fină de diviziune între faza fluidă şi faza solidă. Temperatura la linia de diviziune se citeşte plasând acul indicator în dreptul acesteia.
      1.4.2.2.   Microscop pentru determinarea punctului de topire
      Pentru determinarea punctelor de topire cu cantităţi foarte mici de substanţă se folosesc câteva tipuri de microscoape optice cu încălzire. Temperatura se măsoară în general cu ajutorul unui termocuplu sensibil, dar şi cu ajutorul unui termometru cu mercur. Dispozitivul tip pentru determinarea punctului de topire prin microscopie optică la cald este format dintr-o incintă cu încălzire, care conţine o placă de metal deasupra căreia se pune eşantionul, deja aşezat pe o lamă transparentă. În centrul plăcii metalice există un orificiu care permite trecerea luminii provenite din oglinda de iluminare a microscopului. În timpul utilizării, incinta se închide cu ajutorul unei plăci de sticlă pentru a împiedica circulaţia aerului în câmpul de lucru.
      Încălzirea eşantionului se reglează cu ajutorul unui reostat. Pentru măsurători foarte precise la substanţele anizotrope optic se poate folosi lumina polarizată.
      1.4.2.3.   Metoda meniscului
      Această metodă se aplică în special poliamidelor.
      Se determină temperatura la care se observă cu ochiul liber deplasarea unui menisc de ulei de silicon, prins între o suprafaţă caldă şi o lamelă plasată peste eşantionul de poliamidă de testat.
      1.4.3.   Metoda de determinare a punctului de congelare
      Se introduce eşantionul într-o eprubetă specială şi se aşează într-un aparat care permite determinarea punctului de congelare. Se agită uşor eprubeta pe parcursul răcirii, iar temperatura este măsurată la intervale adecvate. Din momentul în care temperatura rămâne constantă la câteva citiri, valoarea acesteia este considerată punct de congelare (după corecţia termometrică).
      Trebuie evitată răcirea forţată prin menţinerea echilibrului între faza solidă şi cea lichidă.
      1.4.4.   Analiza termică
      1.4.4.1.   Analiza termică diferenţială (DTA)
      Această tehnică înregistrează diferenţa de temperatură dintre eşantion şi un material de referinţă, în funcţie de temperatură, atunci când substanţa şi materialul de referinţă sunt supuse aceluiaşi regim termic controlat. Atunci când eşantionul suferă o transformare ce presupune o modificare de entalpie, acea modificare este indicată prin îndepărtarea endotermă (topire) sau exotermă (congelare) de linia de referinţă a temperaturii.
      1.4.4.2.   Calorimetrie diferenţială (DSC)
      Această tehnică înregistrează diferenţa dintre cantităţile de energie absorbite de eşantion şi un material de referinţă în funcţie de timp, atunci când eşantionul şi materialul de referinţă sunt supuse aceluiaşi regim de temperatură controlată. Această energie reprezintă energia necesară pentru ca diferenţa de temperatură dintre substanţă şi materialul de referinţă să devină nulă. Atunci când eşantionul suferă o transformare care implică o modificare de entalpie, acea modificare este indicată prin îndepărtarea endotermă (topire) sau exotermă (congelare) de la linia de referinţă a fluxului termic.
      1.4.5.   Punctul de curgere
      Această metodă a fost elaborată pentru a fi folosită în cazul uleiurilor din petrol şi se utilizează în cazul substanţelor uleioase cu temperaturi de topire scăzute.
      După o încălzire preliminară, eşantionul se răceşte cu o viteză specifică şi se examinează din punctul de vedere al caracteristicilor de curgere la intervale de 3 K. Cea mai scăzută temperatură la care se mai observă o deplasare a substanţei se înregistrează ca punct de curgere.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Aplicabilitatea şi acurateţea diferitelor metode folosite pentru determinarea punctului de topire/intervalului de topire sunt prezentate în următorul tabel:
      TABEL: APLICABILITATEA METODELOR
      A.   Metode capilare
      
      
                  Metodă de măsurare
               
               
                  Substanţe uşor pulverizabile
               
               
                  Substanţe greu pulverizabile
               
               
                  Interval de temperatură
               
               
                  Acurateţea estimării (1)
                  
               
               
                  Standarde existente
               
            
                  Dispozitiv prevăzut cu baie de lichid
               
               
                  Da
               
               
                  Numai câteva
               
               
                  273 la 573 K
               
               
                  ±0,3 K
               
               
                  JIS K 0064
               
            
                  Dispozitiv prevăzut cu bloc metalic
               
               
                  Da
               
               
                  Numai câteva
               
               
                  293 la > 573 K
               
               
                  ±0,5 K
               
               
                  ISO 1218 (E)
               
            
                  Detecţie fotoelectrică
               
               
                  Da
               
               
                  Mai multe cu dispozitive de aplicare
               
               
                  253 la 573 K
               
               
                  ±0,5 K
               
               
                   
               
            
         
      B.   Metoda cu suprafaţă încălzită şi metoda punctului de congelare
      
      
                  Metodă de măsurare
               
               
                  Substanţe uşor pulverizabile
               
               
                  Substanţe greu pulverizabile
               
               
                  Interval de temperatură
               
               
                  Acurateţea estimării (2)
                  
               
               
                  Standarde existente
               
            
                  Banc de încălzire Kofler
               
               
                  Da
               
               
                  N u
               
               
                  283 la > 573 K
               
               
                  ± 1 K
               
               
                  ANSI/ASTM D 3451-76
               
            
                  Microscop pentru determinarea punctului de topire
               
               
                  Da
               
               
                  Numai la câteva
               
               
                  273 la > 573 K
               
               
                  ±0,5 K
               
               
                  DIN 53736
               
            
                  Metoda meniscului
               
               
                  Nu
               
               
                  Special pentru poliamide
               
               
                  293 la > 573 K
               
               
                  ±0,5 K
               
               
                  ISO 1218 (E)
               
            
                  Metode de determinare a punctului de congelare
               
               
                  Da
               
               
                  Da
               
               
                  223 la 573 K
               
               
                  ±0,5 K
               
               
                  ex. BS 4695
               
            
         
      C.   Metode de analiză termică
      
      
                  Metodă de măsurare
               
               
                  Substanţe uşor pulverizabile
               
               
                  Substanţe greu pulverizabile
               
               
                  Interval de temperatură
               
               
                  Acurateţea estimării (3)
                  
               
               
                  Standarde existente
               
            
                  Analiza termică diferenţială
               
               
                  Da
               
               
                  Da
               
               
                  173 la 1 273 K
               
               
                  până la 600 K ±0,5 K până la 1 273 K ±2,0 K
               
               
                  ASTM E 537-76
               
            
                  Calorimetrie diferenţială
               
               
                  Da
               
               
                  Da
               
               
                  173 la 1 273 K
               
               
                  până la 600 K ±0,5 K până la 1 273 K ±2,0 K
               
               
                  ASTM E 537-76
               
            
         
      D.   Punct de curgere
      
      
                  Metodă de măsurare
               
               
                  Substanţe uşor pulverizabile
               
               
                  Substanţe greu pulverizabile
               
               
                  Interval de temperatură
               
               
                  Acurateţea estimării (4)
                  
               
               
                  Standarde existente
               
            
                  Punct de curgere
               
               
                  Pentru uleiuri petroliere şi substanţe uleioase
               
               
                  Pentru uleiuri petroliere şi substanţe uleioase
               
               
                  223 la 323 K
               
               
                  ±0,3 K
               
               
                  ASTM D 97-66
               
            1.6.   DESCRIEREA METODELOR
      Modurile de operare corespunzătoare aproape tuturor metodelor de testare au fost descrise în standardele internaţionale şi naţionale (a se vedea apendicele).
      1.6.1.   Metode cu tub capilar
      Atunci când sunt supuse unei creşteri de temperatură, substanţele fin pulverizate prezintă de regulă stadiile de topire prezentate în figura 1.
      Figura 1
      
         
      În timpul determinării punctului de topire se înregistrează temperaturile corespunzătoare primului şi ultimului stadiu al procesului.
      1.6.1.1.   Instalaţie pentru determinarea punctului de topire cu baie de lichid
      Figura 2 descrie un tip de aparat standardizat, confecţionat din sticlă (JIS K 0064). Toate specificaţiile sunt exprimate în milimetri.
      Figura 2
      
         
      Baia de lichid:
      Lichidul care se foloseşte se alege în funcţie de punctul de topire care urmează să fie determinat, de exemplu parafină lichidă pentru punctele de topire care nu depăşesc 473 K, ulei de silicon pentru punctele de topire care nu depăşesc 573 K.
      Se poate folosi un amestec din trei părţi de acid sulfuric şi două părţi de sulfat de potasiu (în proporţie masică) pentru punctele de topire care depăşesc 523 K. În cazul utilizării unui astfel de amestec, se vor lua măsurile de precauţie corespunzătoare.
      Termometrul:
      Pot fi folosite numai acele termometre care îndeplinesc cerinţele următoarelor standarde sau ale standardelor echivalente:
      ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.
      Mod de operare:
      Substanţa uscată se pulverizează fin într-un mojar şi se introduce într-un tub capilar, închis la un capăt, astfel încât înălţimea de umplere să fie de aproximativ 3 mm după ce substanţa a fost compactată. Pentru a obţine un eşantion uniform compactat, tubul capilar trebuie să fie lăsat să cadă de la o înălţime de aproximativ 700 mm, printr-un tub de sticlă vertical pe o sticlă de ceas.
      Tubul capilar plin este plasat în baie astfel încât partea centrală a rezervorului de mercur al termometrului să fie în contact cu partea tubului capilar care este amplasat eşantionul. De obicei, tubul capilar se introduce în baie la aproximativ 10 K sub punctul de topire.
      Lichidul băii se încălzeşte astfel încât creşterea temperaturii să fie de 3 K/min. Lichidul trebuie agitat. La aproximativ 10 K sub temperatura presupusă de topire, viteza de creştere a temperaturii se stabileşte la maximum 1 K pe minut.
      Calcul:
      Calculul punctului de topire este redat mai jos:
      T = TD + 0,00016 (TD – TE) × n
      unde:
      
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatura de topire corectată, exprimată în K
               
            
                  TD
                  
               
               
                  =
               
               
                  temperatura citită la termometrul D, exprimată în K
               
            
                  TE
                  
               
               
                  =
               
               
                  temperatura citită la termometrul E, exprimată în K
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  numărul de gradaţii ale coloanei de mercur citite pe tija termometrului D, aflate deasupra lichidului.
               
            1.6.1.2.   Dispozitive cu bloc metalic pentru măsurarea punctului de topire
      Aparatură:
      
         Aparatul cuprinde:
      
      
                  —
               
               
                  un bloc metalic cilindric, a cărui parte superioară este scobită şi formează o incintă de încălzire (a se vedea figura 3);
               
            
                  —
               
               
                  un dop metalic prevăzut cu două sau mai multe orificii care permit introducerea tuburilor în bloc;
               
            
                  —
               
               
                  un sistem de încălzire a blocului metalic care poate fi format dintr-o rezistenţă electrică în bloc;
               
            
                  —
               
               
                  un reostat pentru reglarea puterii, în cazul unei încălziri electrice;
               
            
                  —
               
               
                  patru ferestre din sticlă termorezistentă, pe pereţii laterali ai incintei, dispuse simetric în unghi drept. În faţa uneia din ferestre se montează un ocular pentru observarea tubului capilar. Celelalte trei ferestre permit iluminarea interiorului incintei cu ajutorul unor lămpi;
               
            
                  —
               
               
                  un tub capilar din sticlă termorezistentă închis la un capăt (a se vedea punctul 1.6.1.1).
               
            A se vedea standardele menţionate la punctul 1.6.1.1. Se pot folosi, de asemenea, elemente termoelectrice de precizie echivalentă.
      Figura 3
      
         
      1.6.1.3.   Detecţie fotoelectrică
      
         Aparatură şi mod de operare:
      
      Aparatul este format dintr-o incintă metalică prevăzută cu un sistem de încălzire automatizat. Se umplu trei tuburi capilare după cum s-a indicat la punctul 1.6.1.1 şi se pun în cuptor.
      Pentru calibrarea aparatului se folosesc mai multe creşteri liniare de temperatură, iar creşterea de temperatură convenabilă este reglată electric la o viteză constantă şi liniară, preselectată. Înregistratoarele indică temperatura reală a cuptorului şi temperatura substanţei în tuburile capilare.
      1.6.2.   Metodele suprafeţei încălzite
      1.6.2.1.   Bancul de încălzire Kofler
      A se vedea apendicele.
      1.6.2.2.   Microscopul pentru determinarea punctului de topire
      A se vedea apendicele.
      1.6.2.3.   Metoda meniscului (poliamide)
      A se vedea apendicele.
      În jurul punctului de topire, creşterea temperaturii trebuie să fie mai mică de 1 K pe minut.
      1.6.3.   Metode pentru determinarea punctului de congelare
      A se vedea apendicele.
      1.6.4.   Analiza termică
      1.6.4.1.   Analiza termică diferenţială
      A se vedea apendicele.
      1.6.4.2.   Calorimetria diferenţială
      A se vedea apendicele.
      1.6.5.   Determinarea punctului de curgere
      A se vedea apendicele.
      2.   DATE
      În unele cazuri se impune corecţia termometrică.
      3.   RAPORT
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, informaţiile următoare:
      
                  —
               
               
                  metoda folosită;
               
            
                  —
               
               
                  specificaţiile precise ale substanţei (identitate şi impurităţi) şi etapa de purificare preliminară, dacă există;
               
            
                  —
               
               
                  estimare acurateţei metodei.
               
            Punctul de topire indicat în raport este media a cel puţin două măsurători care se găsesc în intervalul de precizie estimat (a se vedea tabelele).
      Dacă diferenţa dintre temperatura din stadiul iniţial şi cea din stadiul final al topirii se află în limitele de precizie a metodei, temperatura de topire în stadiul final este considerată ca punct de topire; în caz contrar, se indică în raport cele două temperaturi.
      Dacă substanţa se descompune sau sublimează înainte de a atinge punctul de topire, se indică în raport temperatura la care s-a observat efectul.
      Trebuie prezentate toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special cele cu privire la impurităţile şi starea fizică a substanţei.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline. 102, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II, p. 803-834.
               
            
                  3.
               
               
                  R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed, Interscience Publ, New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
               
            
                  4.
               
               
                  IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 505-515.
               
            
         Apendice
         Pentru mai multe detalii tehnice, pot fi consultate următoarele standarde.
         1.   Metodele tubului capilar
         1.1.   Dispozitive pentru măsurarea punctului de topire cu baie de lichid
         
                     ASTM E 324-69
                  
                  
                     Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals
                  
               
                     BS 4634
                  
                  
                     Method for the determination of melting point and/or melting range
                  
               
                     DIN 53181
                  
                  
                     Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfarehn
                  
               
                     JIS K 00-64
                  
                  
                     Testing methods for melting point of chemical products
                  
               1.2.   Dispozitive pentru determinarea punctului de topire cu bloc metalic fierbinte
         
                     DIN 53736
                  
                  
                     Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
                  
               
                     ISO 1218 (E)
                  
                  
                     Plastics – polyamides – determination of „melting point”
                  
               2.   Metodele suprafeţei calde
         2.1.   Banc de încălzire Kofler
         
                     ANSI/ASTM D 3451-76
                  
                  
                     Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings
                  
               2.2.   Microscop pentru determinarea punctului de topire
         
                     DIN 53736
                  
                  
                     Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
                  
               2.3.   Metoda meniscului (poliamide)
         
                     ISO 1218 (E)
                  
                  
                     Plastics – polyamides – determination of „melting point”
                  
               
                     ANSI/ASTM D 2133-66
                  
                  
                     Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials
                  
               
                     NF T 51-050
                  
                  
                     Résines de polyamides. Détermination du „point de fusion” méthode du menisque
                  
               3.   Metode pentru determinarea punctului de congelare
         
                     BS 4633
                  
                  
                     Method for the determination of crystallising point
                  
               
                     BS 4695
                  
                  
                     Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve)
                  
               
                     DIN 51421
                  
                  
                     Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen
                  
               
                     ISO 2207
                  
                  
                     Cires de pétrole: détermination de la température de figeage
                  
               
                     DIN 53175
                  
                  
                     Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsäuren
                  
               
                     NF T 60-114
                  
                  
                     Point de fusion des paraffines
                  
               
                     NF T 20-051
                  
                  
                     Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congelation)
                  
               
                     ISO 1392
                  
                  
                     Method for the determination of the freezing point
                  
               4.   Analiza termică
         4.1.   Analiza termică diferenţială
         
                     ASTM E 537-76
                  
                  
                     Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 473-85
                  
                  
                     Standard definitions of terms relating to thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 472-86
                  
                  
                     Standard practice for reporting thermoanalytical data
                  
               
                     DIN 51005
                  
                  
                     Thermische Analyse, Begriffe
                  
               4.2.   Calorimetrie diferenţială
         
                     ASTM E 537-76
                  
                  
                     Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 473-85
                  
                  
                     Standard definitions of terms relating to thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 472-86
                  
                  
                     Standard practice for reporting thermoanalytical data
                  
               
                     DIN 51005
                  
                  
                     Thermische Analyse, Begriffe
                  
               5.   Determinarea punctului de curgere
         
                     NBN 52014
                  
                  
                     Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite – Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt
                  
               
                     ASTM D 97-66
                  
                  
                     Standard test method for pour point of petroleum oils
                  
               
                     ISO 3016
                  
                  
                     Petroleum oils – Determination of pour point
                  
               
      A.2.   PUNCTUL DE FIERBERE
      1.   METODĂ
      Majoritatea metodelor descrise se bazează pe orientările OCDE privind testele (1). Principiile fundamentale sunt prezentate în referinţele bibliografice 2 şi 3.
      1.1.   INTRODUCERE
      Metodele şi aparatele descrise în continuare pot fi aplicate substanţelor lichide şi celor cu punct de topire scăzut, care nu intră în reacţie chimică sub punctul de fierbere (de exemplu, auto-oxidare, izomerizări, degradare etc.). Metodele se aplică substanţelor lichide pure şi impure.
      Se acordă atenţie descrierii metodelor care folosesc detecţia fotoelectrică şi analiza termică deoarece acestea permit determinarea nu numai a punctului de fierbere, ci şi a punctului de topire. În plus, măsurările se pot efectua în mod automat.
      „Metoda dinamică” are avantajul că poate fi folosită şi pentru determinarea presiunii vaporilor, iar aducerea temperaturii de fierbere la condiţii normale de presiune (101,325 kPa) nu este necesară, deoarece se poate menţine presiunea normală pe parcursul măsurării, folosind un manometru de contact.
      
         Observaţii:
      
      Influenţa impurităţilor asupra determinării punctului de fierbere depinde în mare măsură de natura impurităţilor. Atunci când există în eşantion impurităţi volatile care ar putea afecta rezultatele, substanţa se purifică.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Punctul de fierbere normal se defineşte ca temperatura la care presiunea de vapori a lichidului este 101,325 kPa.
      Dacă punctul de fierbere nu se măsoară la presiune atmosferică normală, relaţia între temperatură şi presiunea de vapori este dată de ecuaţia Clausius-Clapeyron:
      
         
      unde:
      
                  P
               
               
                  =
               
               
                  presiunea de vapori a substanţei, exprimată în pascali
               
            
                  ΔHv
                  
               
               
                  =
               
               
                  căldura sa de vaporizare, exprimată în J mol–1
                  
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  constanta universală a gazelor = 8,314 J mol–1 K–1
                  
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatura termodinamică, exprimată în K
               
            Indicarea punctului de fierbere este însoţită de precizarea presiunii ambiante în timpul măsurătorii.
      
         Formule de conversie
      
      Presiunea (unităţi: kPa)
      
                  100 kPa
               
               
                  =
               
               
                  1 bar = 0,1 MPa
                  (folosirea „barului” este încă permisă, dar nu este recomandată)
               
            
                  133 Pa
               
               
                  =
               
               
                  1 mm Hg = 1 Torr
                  (unităţile „mm Hg” şi „Torr” nu sunt permise).
               
            
                  1 atm
               
               
                  =
               
               
                  atmosferă standard = 101 325 Pa
                  (unitatea „atm” nu este permisă).
               
            Temperatura (unităţi: K)
      t = T – 273,15
      
                  t
               
               
                  :
               
               
                  temperatura Celsius, exprimată în grade Celsius ( oC)
               
            
                  T
               
               
                  :
               
               
                  temperatura termodinamică, exprimată în grade Kelvin (K)
               
            1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă în toate cazurile în care se studiază o nouă substanţă. Acestea trebuie în special să servească la etalonarea periodică a metodei şi la comparaţia cu rezultatele obţinute prin alte metode.
      Anumite substanţe de etalonare sunt menţionate în metodele enumerate în apendice.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Cinci metode pentru determinarea punctului de fierbere (a intervalului de fierbere) se bazează pe măsurătoarea temperaturii de fierbere, alte două se bazează pe analiza termică.
      1.4.1.   Determinarea prin folosirea ebuliometrului
      Ebuliometrele au fost create iniţial pentru determinarea masei moleculare prin creşterea punctului de fierbere, dar sunt adecvate şi pentru măsurarea exactă a punctului de fierbere. Un aparat foarte simplu este descris în standardul ASTM D 1120-72 (a se vedea apendicele). Lichidul se încălzeşte în acest aparat în condiţii de echilibru la presiune atmosferică, până la fierbere.
      1.4.2.   Metoda dinamică
      Această metodă prevede măsurarea temperaturii de recondensare a vaporilor cu ajutorul unui termocuplu montat în reflux în timpul fierberii. În această metodă se poate modifica presiunea.
      1.4.3.   Metoda distilării pentru punctul de fierbere
      Această metodă prevede distilarea lichidului, măsurarea temperaturii de recondensare a vaporilor şi determinarea cantităţii de distilat.
      1.4.4.   Metoda Siwoloboff
      Se încălzeşte un eşantion într-o eprubetă care este imersată într-o baie cu lichid încălzit. Se scufundă în eprubetă un capilar închis, care conţine o bulă de aer în partea inferioară.
      1.4.5.   Detecţia fotoelectrică
      Conform principiului Siwoloboff, măsurarea fotoelectrică automată se face folosind ascensiunea bulelor.
      1.4.6.   Analiza termică diferenţială
      Această tehnică înregistrează diferenţa de temperatură dintre substanţă şi un material de referinţă în funcţie de temperatură în timp ce substanţa şi materialul de referinţă sunt supuse aceluiaşi regim termic controlat. Atunci când eşantionul trece printr-o stare de tranziţie ce presupune o variaţie de entalpie, această modificare este indicată prin endotermică (fierbere) de la linia de referinţă a temperaturii.
      1.4.7.   Calorimetria diferenţială
      Această tehnică înregistrează diferenţa dintre cantităţile de energie absorbite de o substanţă şi un material de referinţă în funcţie de timp, atunci când eşantionul şi materialul de referinţă sunt supuse aceluiaşi regim de temperatură controlată. Această energie reprezintă energia necesară pentru ca diferenţa de temperatură dintre substanţă şi materialul de referinţă să devină nulă. Atunci când eşantionul suferă o transformare care implică o modificare de entalpie, acea modificare este indicată prin îndepărtarea endotermă (fierbere) de la linia de referinţă a fluxului termic.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Aplicabilitatea şi precizia diferitelor metode folosite la determinarea temperaturii/intervalului de fierbere sunt prezentate în tabelul 1.
      Tabelul 1
      Compararea metodelor
      
                  Metodă de măsurare
               
               
                  Precizie estimată
               
               
                  Standard existent
               
            
                  Ebuliometru
               
               
                  ±1,4 K (până la 373 K) (5)
                      (6)
                  
                  ±2,5 K (până la 600 K) (5)
                      (6)
                  
               
               
                  ASTM D 1120-72 (5)
                  
               
            
                  Metoda dinamică
               
               
                  ±0,5 K (până la 600 K) (6)
                  
               
               
                   
               
            
                  Metoda distilării (domeniu de fierbere)
               
               
                  ±0,5 K (până la 600 K)
               
               
                  ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/71
               
            
                  Conform cu Siwoloboff
               
               
                  ± 2 K (până la 600 K) (6)
                  
               
               
                   
               
            
                  Detecţie fotoelectrică
               
               
                  ±0,3 K (până la 373 K) (6)
                  
               
               
                   
               
            
                  Calorimetrie termică diferenţială
               
               
                  ±0,5 K (până la 600 K)
                  ±2,0 K (până la 1 273 K)
               
               
                  ASTM E 537-76
               
            
                  Calorimetrie diferenţială
               
               
                  ±0,5 K (până la 600 K)
                  ±2,0 K (până la 1 273 K)
               
               
                  ASTM E 537-76
               
            1.6.   DESCRIEREA METODELOR
      Modurile de operare în unele metode de testare sunt descrise în standardele naţionale şi internaţionale (a se vedea apendicele).
      1.6.1.   Ebuliometru
      A se vedea apendicele.
      1.6.2.   Metoda dinamică
      A se vedea metoda de analiză A.4 pentru determinarea presiunii de vapori.
      Se înregistrează temperatura de fierbere observată la o presiune aplicată de 101,325 kPa.
      1.6.3.   Metoda distilării (intervalul de fierbere)
      A se vedea apendicele.
      1.6.4.   Metoda Siwoloboff
      Se introduce eşantionul într-o eprubetă cu un diametru de cca. 5 milimetri şi se încălzeşte într-un aparat care serveşte la determinarea punctului de topire (figura 1).
      Figura 1 prezintă schema unui aparat standardizat de măsurare a punctului de topire şi fierbere (JIS K 0064) (confecţionat din sticlă, toate specificaţiile sunt în milimetri).
      Figura 1
      
         
      Se scufundă un tub capilar (capilar de fierbere), închis la cca. 1 centimetru deasupra extremităţii inferioare, în eprubeta cu substanţa de testat. Nivelul până la care se adaugă substanţă de testat este astfel încât partea etanşată a capilarului să fie sub nivelul suprafeţei lichidului. Eprubeta se ataşează la termometru cu o bandă de cauciuc sau se fixează cu un suport de partea laterală (a se vedea figura 2).
      
                  
                     Figura 2
                  
                  
                     Metoda Siwoloboff
                  
               
               
                  
                     Figura 3
                  
                  
                     Metoda modificată
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  
                     
               
            Lichidul din baie se alege în funcţie de punctul de fierbere. La temperaturi de până la 573 K se foloseşte uleiul de silicon. Parafina lichidă se poate folosi numai până la 473 K. Încălzirea băii de lichid se reglează pentru început la o creştere de temperatură de 3 K/min. Lichidul din baie trebuie agitat. La aproximativ 10 K sub punctul de fierbere presupus, încălzirea se reduce astfel încât viteza de creştere a temperaturii să fie mai mică de 1 K/min. Atunci când se apropie de punctul de fierbere, bulele încep să se ridice rapid din capilar.
      Punctul de fierbere este acea temperatură la care, în cazul unei răciri momentane, şiragul de bule se întrerupe, iar fluidul începe brusc să se ridice în capilar. Temperatura citită în acel moment pe termometru indică punctul de fierbere a substanţei.
      În metoda modificată (a se vedea figura 3), punctul de fierbere se determină într-un tub capilar de măsurat la punctul de topire. Extremitatea inferioară a acestuia se prelungeşte cu un vârf cu o lungime de aproximativ 2 cm (a) în interiorul căruia se aspiră o cantitate mică de substanţă de testat. Se etanşează vârful prin încălzire, captându-se o bulă mică de aer în interior. În timpul încălzirii, în aparatul de măsurat punctul de topire (b), bula de aer se dilată. Punctul de fierbere corespunde temperaturii la care eşantionul de substanţă atinge nivelul suprafeţei lichidului din baie (c).
      1.6.5.   Detecţia fotoelectrică
      Se încălzeşte un eşantion din substanţa de testat într-un tub capilar aşezat în interiorul unui bloc metalic de încălzire.
      Prin orificiile practicate în bloc, un fascicol de lumină este trimis prin substanţă către o celulă fotoelectrică calibrată cu precizie.
      În timp ce creşte temperatura eşantionului, bule de aer individuale încep să se ridice din tubul capilar. Când punctul de fierbere este atins, numărul de bule creşte substanţial. Modificarea intensităţii luminoase care urmează este înregistrată de către celulă, care trimite un semnal de oprire indicatorului de temperatură, respectiv un termometru cu rezistenţă de platină plasat în interiorul blocului.
      Această metodă este deosebit de utilă deoarece permite efectuarea unor determinări sub nivelul temperaturii ambiante până la 253,15 K (– 20 oC), fără nicio modificare a aparatului. Este necesar doar ca aparatul să fie aşezat într-o baie de răcire.
      1.6.6.   Analize termice
      1.6.6.1.   Analiza termică diferenţială
      A se vedea apendicele.
      1.6.6.2.   Calorimetria diferenţială
      A se vedea apendicele.
      2.   DATE
      Pentru diferenţe mici faţă de presiunea normală (maximum ± 5 kPa) punctul de fierbere se poate corecta (Tn) cu ajutorul ecuaţiei Sidney-Young:
      Tn = T + (fT × Δp)
      unde:
      
                  Δp
               
               
                  =
               
               
                  (101,325 – p) (atenţie la semn)
               
            
                  p
               
               
                  =
               
               
                  presiunea măsurată, în kPa
               
            
                  fT
                  
               
               
                  =
               
               
                  viteza de variaţie a punctului de fierbere cu presiunea, în K/kPa
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatura de fierbere măsurată, în K
               
            
                  Tn
                  
               
               
                  =
               
               
                  temperatura de fierbere corectată la presiunea normală, în K
               
            Pentru numeroase substanţe, factorii de corecţie a temperaturii fT şi ecuaţiile pentru aproximarea acestora figurează în standardele naţionale şi internaţionale mai sus menţionate.
      De exemplu, metoda DIN 53171 menţionează următoarele corecţii aproximative pentru solvenţi conţinuţi în vopsele.
      Tabelul 2
      Temperatura – factori de corecţie fT
      
      
                  Temperatura T (K)
               
               
                  Factori de corecţie fT (K/kPa)
               
            
                  323,15
               
               
                  0,26
               
            
                  348,15
               
               
                  0,28
               
            
                  373,15
               
               
                  0,31
               
            
                  398,15
               
               
                  0,33
               
            
                  423,15
               
               
                  0,35
               
            
                  448,15
               
               
                  0,37
               
            
                  473,15
               
               
                  0,39
               
            
                  498,15
               
               
                  0,41
               
            
                  523,15
               
               
                  0,44
               
            
                  548,15
               
               
                  0,45
               
            
                  573,15
               
               
                  0,47
               
            3.   RAPORT
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, informaţiile următoare:
      
                  —
               
               
                  metoda folosită;
               
            
                  —
               
               
                  specificaţiile precise ale substanţei (identitate şi impurităţi) şi etapa de purificare preliminară, dacă există;
               
            
                  —
               
               
                  estimarea acurateţei metodei.
               
            Punctul de fierbere indicat în raport este media a cel puţin două măsurători care se găsesc în intervalul de precizie estimat (a se vedea tabelul 1).
      Se prezintă punctele de fierbere măsurate şi media lor, iar presiunea (presiunile) la care s-au făcut măsurătorile se exprimă în kPa. Este preferabil ca presiunea să fie apropiată de presiunea atmosferică normală.
      Trebuie prezentate toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special cele cu privire la impurităţi şi la starea fizică a substanţei.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II.
               
            
                  3.
               
               
                  R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.
               
            
         Apendice
         Pentru mai multe date tehnice, pot fi consultate standardele următoare, de exemplu.
         1.   Ebuliometru
         
                     1.1.
                  
                  
                     Dispozitive cu baie de lichid
                  
               
                     ASTM D 1120-72
                  
                  
                     Standard test method for boiling point of engine anti-freezes
                  
               2.   Metoda distilării (a intervalului de fierbere)
         
                     ISO/R 918
                  
                  
                     Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)
                  
               
                     BS 4349/68
                  
                  
                     Method for determination of distillation of petroleum products
                  
               
                     BS 4591/71
                  
                  
                     Method for the determination of distillation characteristics
                  
               
                     DIN 53171
                  
                  
                     Losungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes
                  
               
                     NF T 20-608
                  
                  
                     Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation
                  
               3.   Analiza termică diferenţială şi calorimetria diferenţială
         
                     ASTM E 537-76
                  
                  
                     Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 473-85
                  
                  
                     Standard definitions of terms relating to thermal analysis
                  
               
                     ASTM E 472-86
                  
                  
                     Standard practice for reporting thermoanalytical data
                  
               
                     DIN 51005
                  
                  
                     Thermische Analyse, Begriffe
                  
               
      A.3.   DENSITATEA RELATIVĂ
      1.   METODĂ
      Majoritatea metodelor descrise se bazează pe orientările OCDE privind testele (1). Principiile fundamentale sunt menţionate în referinţa bibliografică 2.
      1.1.   INTRODUCERE
      Metodele descrise pentru determinarea densităţii relative sunt aplicabile substanţelor solide şi lichide, fără nicio restricţie cu privire la gradul de puritate. Diferitele metode care pot fi folosite sunt prezentate în tabelul 1.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Densitatea relativă D20
         4 a solidelor sau lichidelor reprezintă raportul dintre masa unui volum de substanţă, determinată la 20 oC, şi masa aceluiaşi volum de apă, determinată la 4 oC. Densitatea relativă este un număr adimensional.
      Densitatea ρ a unei substanţe este raportul dintre masa acesteia m şi volumul său v.
      Densitatea ρ este exprimată în unităţi SI în kg/m3.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ (1) (3)
      Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă de fiecare dată când se studiază o substanţă nouă. Acestea trebuie să servească în special la verificarea periodică a acurateţei metodei şi să permită comparaţia cu rezultatele obţinute prin alte metode.
      1.4.   PRINCIPIUL METODELOR
      Se folosesc 4 clase de metode.
      1.4.1.   Metode prin flotabilitate
      1.4.1.1.   Hidrometrul (pentru substanţe lichide)
      
      Se pot obţine determinări ale densităţii suficient de precise şi de rapide cu ajutorul unor hidrometre plutitoare care permit deducerea densităţii unui lichid din adâncimea de imersiune indicată pe o scară gradată.
      1.4.1.2.   Balanţa hidrostatică (pentru substanţe lichide şi solide)
      
      Diferenţa dintre masa unui eşantion măsurate în aer şi într-un lichid corespunzător (de exemplu apa) poate fi folosită pentru a determina densitatea acestuia.
      În cazul solidelor, densitatea măsurată nu este reprezentativă decât în cazul acelui eşantion. Pentru a determina densitatea unui lichid se cântăreşte un corp cu volum V cunoscut, întâi în aer, apoi în lichid.
      1.4.1.3.   Metoda corpului scufundat (pentru substanţe lichide) (4)
      
      În această metodă, densitatea unui lichid este determinată ca diferenţa dintre rezultatele cântăririlor lichidului înainte şi după imersia unui corp de volum cunoscut în acest lichid.
      1.4.2.   Metode picnometrice
      În cazul solidelor sau al lichidelor se pot folosi picnometre cu forme diferite, ale căror volume sunt cunoscute. Densitatea se determină pornind de la diferenţa de greutate între picnometrul plin şi picnometrul gol, pe de o parte, şi volumul cunoscut al acestuia, pe de altă parte.
      1.4.3.   Picnometru de comparaţie cu aer (pentru solide)
      
      Densitatea unui solid cu orice formă poate fi măsurată, la temperatura camerei cu ajutorul unui picnometru de comparaţie cu gaz. Volumul unei substanţe în aer sau în gaz inert se măsoară într-un cilindru gradat, cu volum variabil calibrat. Pentru determinarea densităţii, după măsurarea volumului se măsoară şi masa solidului.
      1.4.4.   Densimetru oscilant (5) (6) (7)
      
      Densitatea unui lichid se poate măsura cu densimetrul oscilant. Un oscilator mecanic în formă de U vibrează cu o frecvenţă de rezonanţă care depinde de masa sa. Introducerea unui eşantion de substanţă modifică frecvenţa de rezonanţă a oscilatorului. Acesta trebuie etalonat cu ajutorul a două substanţe ale căror densităţi se cunosc. Substanţele se aleg astfel încât densităţile acestora să acopere intervalul de măsură.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Aplicabilitatea diferitelor metode folosite pentru determinarea densităţii relative este prezentată în tabel.
      1.6.   DESCRIEREA METODELOR
      Standardele menţionate ca exemple, care se pot consulta pentru mai multe detalii tehnice, sunt enumerate în apendice.
      Testele se efectuează la o temperatură de 20 oC şi trebuie să cuprindă cel puţin două măsurători.
      2.   DATE
      A se vedea standardele.
      3.   RAPORT
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, informaţiile următoare:
      
                  —
               
               
                  metoda folosită;
               
            
                  —
               
               
                  specificaţiile precise ale substanţei (identitate şi impurităţi) şi etapa de purificare preliminară, dacă există.
               
            Densitatea relativă  se indică în conformitate cu definiţia de la punctul 1.2, împreună cu starea fizică a substanţei.
      Trebuie prezentate toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special cele cu privire la impurităţile şi starea fizică a substanţei.
      Tabel
      Aplicabilitatea metodelor
      
                  Metoda de măsurare
               
               
                  Densitate
               
               
                  Vâscozitatea dinamică maximă posibilă
               
               
                  Standarde existente
               
            
                  Solid
               
               
                  Lichid
               
            
                  
                              1.4.1.1.
                           
                           
                              Hidrometru
                           
                        
               
                   
               
               
                  Da
               
               
                  5 Pa s
               
               
                  ISO 387
                  ISO 649-2
                  NF T 20-050
               
            
                  
                              1.4.1.2.
                           
                           
                              Balanţa hidrostatică
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              (a)
                           
                           
                              solide
                           
                        
               
                  Da
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  ISO 1183(A)
               
            
                  
                              (b)
                           
                           
                              lichide
                           
                        
               
                   
               
               
                  Da
               
               
                  5 Pa s
               
               
                  ISO 901 şi 758
               
            
                  
                              1.4.1.3.
                           
                           
                              Metoda plutitorului
                           
                        
               
                   
               
               
                  Da
               
               
                  20 Pa s
               
               
                  DIN 53217
               
            
                  
                              1.4.2.
                           
                           
                              Picnometru
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  ISO 3507
               
            
                  
                              (a)
                           
                           
                              solide
                           
                        
               
                  Da
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  ISO 1183(B)
                  NFT 20-053
               
            
                  
                              (b)
                           
                           
                              lichide
                           
                        
               
                   
               
               
                  Da
               
               
                  500 Pa s
               
               
                  ISO 758
               
            
                  
                              1.4.3.
                           
                           
                              Picnometru de comparaţie cu aer
                           
                        
               
                  Da
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  DIN 55990 Teil 3
                  DIN 53243
               
            
                  
                              1.4.4.
                           
                           
                              Densimetru oscilant
                           
                        
               
                   
               
               
                  Da
               
               
                  5 Pa s
               
               
                   
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.
               
            
                  3.
               
               
                  IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508.
               
            
                  4.
               
               
                  Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. II, p. 427-430.
               
            
                  5.
               
               
                  Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, p. 297-302.
               
            
                  6.
               
               
                  Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, p. 717-726.
               
            
                  7.
               
               
                  Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, p. 253-255.
               
            
         Apendice
         Pentru mai multe detalii tehnice pot fi consultate următoarele standarde suplimentare.
         1.   Metode prin flotabilitate
         1.1.   Hidrometrul
         
                     DIN 12790, ISO 387
                  
                  
                     Hydrometer; general instructions
                  
               
                     DIN 12791
                  
                  
                     Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use
                     Part II: Density hydrometers; standardised sizes, designation
                     Part III: Use and test
                  
               
                     ISO 649-2
                  
                  
                     Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose
                  
               
                     NF T 20-050
                  
                  
                     Chemical products for industrial use – Determination of density of liquids – Areometric method
                  
               
                     DIN 12793
                  
                  
                     Laboratory glassware: range find hydrometers
                  
               1.2.   Balanţa hidrostatică
         Pentru substanţe solide:
         
                     ISO 1183
                  
                  
                     Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics
                  
               
                     NF T 20-049
                  
                  
                     Chemical products for industrial use – Determination of the density of solids other than powders and cellular products – Hydrostatic balance method
                  
               
                     ASTM-D-792
                  
                  
                     Specific gravity and density of plastics by displacement
                  
               
                     DIN 53479
                  
                  
                     Testing of plastics and elastomers; determination of density
                  
               Pentru substanţe lichide:
         
                     ISO 901
                  
                  
                     ISO 758
                  
               
                     DIN 51757
                  
                  
                     Testing of mineral oils and related materials; determination of density
                  
               
                     ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 şi ASTM D 1481-62
                  
               
                     ASTM D 1298
                  
                  
                     Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
                  
               
                     BS 4714
                  
                  
                     Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
                  
               1.3.   Metoda corpului scufundat
         
                     DIN 53217
                  
                  
                     Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method
                  
               2.   Metode picnometrice
         2.1.   Pentru substanţe lichide
         
                     ISO 3507
                  
                  
                     Pycnometers
                  
               
                     ISO 758
                  
                  
                     Liquid chemical products; determination of density at 20 oC
                  
               
                     DIN 12797
                  
                  
                     Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous)
                  
               
                     DIN 12798
                  
                  
                     Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100.10–6 m2 s–1 at 15 oC)
                  
               
                     DIN 12800
                  
                  
                     Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798)
                  
               
                     DIN 12801
                  
                  
                     Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100.10–6 m2 s–1 at 20 oC, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90 oC)
                  
               
                     DIN 12806
                  
                  
                     Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have a too high vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen)
                  
               
                     DIN 12807
                  
                  
                     Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801)
                  
               
                     DIN 12808
                  
                  
                     Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol – water mixture)
                  
               
                     DIN 12809
                  
                  
                     Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous)
                  
               
                     DIN 53217
                  
                  
                     Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer
                  
               
                     DIN 51757
                  
                  
                     Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density
                  
               
                     ASTM D 297
                  
                  
                     Section 15: Rubber products – chemical analysis
                  
               
                     ASTM D 2111
                  
                  
                     Method C: Halogenated organic compounds
                  
               
                     BS 4699
                  
                  
                     Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)
                  
               
                     BS 5903
                  
                  
                     Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method
                  
               
                     NF T 20-053
                  
                  
                     Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method
                  
               2.2.   Pentru substanţe solide
         
                     ISO 1183
                  
                  
                     Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics
                  
               
                     NF T 20-053
                  
                  
                     Chemical products for industrial use – Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric method
                  
               
                     DIN 19683
                  
                  
                     Determination of the density of soils
                  
               3.   Picnometru de comparaţie cu aer
         
                     DIN 55990
                  
                  
                     Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte
                  
               
                     DIN 53243
                  
                  
                     Anstrichstoffe; chlorhaltige Polymere; Prüfung
                  
               
      A.4.   PRESIUNEA DE VAPORI
      1.   METODĂ
      Majoritatea metodelor descrise se bazează pe orientările OCDE privind testele (1). Principiile fundamentale sunt menţionate în referinţele bibliografice 2 şi 3.
      1.1.   INTRODUCERE
      Este util să existe informaţii preliminare privind structura, punctul de topire şi punctul de fierbere ale substanţei pentru care se efectuează determinarea.
      Nu există o metodă de măsurare aplicabilă întregului interval de presiuni de vapori. În consecinţă, se recomandă folosirea mai multor metode pentru măsurarea presiunii de vapori de la < 10–4 la 105 Pa.
      În general, impurităţile afectează presiunea de vapori, într-o măsură care depinde în mare parte de natura impurităţii.
      Dacă eşantionul prezintă impurităţi volatile care ar putea afecta rezultatul, substanţa se purifică. Menţionarea presiunii de vapori a materialul iniţial se poate dovedi adecvată.
      Unele din metodele descrise aici folosesc aparate cu părţi metalice; acest aspect trebuie avut în vedere la testarea substanţelor corosive.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Presiunea de vapori a unei substanţe este definită ca presiunea de saturaţie la suprafaţa de contact cu aerul a unei substanţe solide sau lichide. La echilibru termodinamic, presiunea de vapori a unei substanţe pure este o funcţie numai de temperatură.
      Unitatea SI de presiune care trebuie folosită este pascalul (Pa).
      Unităţile alternative folosite de-a lungul timpului, împreună cu factorii lor de conversie sunt:
      
                  1 Torr (≡ 1 mm Hg)
               
               
                  = 1,333 × 102 Pa
               
            
                  1 atmosferă
               
               
                  = 1,013 × 105 Pa
               
            
                  1 bar
               
               
                  = 105 Pa
               
            Unitatea de măsură folosită în Sistemul Internaţional (SI) pentru temperatură este kelvinul (K).
      Constanta molară universală a gazelor R este 8,314 J/mol–1K–1.
      Presiunea de vapori ca funcţie de temperatură este descrisă de ecuaţia lui Clausius-Clapeyron:
      
         
      unde:
      
                  p
               
               
                  =
               
               
                  presiunea de vapori a substanţei, în pascali
               
            
                  ΔHv
                  
               
               
                  =
               
               
                  căldura sa de vaporizare, în Jmol–l
                  
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  constanta universală a gazelor, în Jmol–l K–1
                  
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatura termodinamică, în K
               
            1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă în toate cazurile în care se studiază o nouă substanţă. Acestea trebuie în special să servească la etalonarea periodică a metodei şi la comparaţia cu rezultatele obţinute prin alte metode.
      1.4.   PRINCIPIUL METODELOR DE TESTARE
      Pentru determinarea presiunii de vapori, sunt propuse şapte metode diferite care trebuie aplicate pe diferite intervale de presiuni de vapori. Pentru fiecare metodă, presiunea de vapori este determinată la diferite temperaturi. Într-un interval limitat de temperaturi, logaritmul presiunii de vapori a unei substanţe pure este o funcţie lineară a inversului temperaturii.
      1.4.1.   Metodă dinamică
      Metoda dinamică se bazează pe măsurarea temperaturii de fierbere care corespunde unei presiuni specificate.
      Intervalul recomandat:
      103 Pa-105 Pa
      Metodă este recomandată şi pentru determinarea punctului normal de fierbere şi este utilă în acest sens pentru temperaturi sub 600 K.
      1.4.2.   Metoda statică
      Prin procedeul static, presiunea vaporilor care se stabileşte într-un sistem închis în echilibru termodinamic este determinată la o temperatură specificată. Metoda este adecvată solidelor şi lichidelor care conţin unul sau mai mulţi componenţi.
      Intervalul recomandat:
      10-105 Pa
      Această metodă poate să fie folosită şi în intervalul 1-10 Pa, cu condiţia să fie aplicată atent.
      1.4.3.   Izoteniscop
      Această metodă standardizată este tot o metodă statică, dar este în general nepotrivită pentru sistemele multicomponent. Informaţii suplimentare sunt disponibile în ASTM metoda D-2879-86.
      Intervalul recomandat:
      100-105 Pa.
      1.4.4.   Metoda prin efuziune: Balanţa pentru presiune de vapori
      Cantitatea de substanţă care iese dintr-o celulă în unitatea de timp printr-o deschidere de dimensiuni cunoscute se determină sub vid, astfel încât cantitatea de substanţă pe retur să fie neglijabilă (de exemplu, prin măsurarea impulsului imprimat unei balanţe sensibile printr-un jet de vapori sau prin măsurarea pierderilor de masă).
      Intervalul recomandat:
      10–3-1 Pa.
      1.4.5.   Metoda prin efuziune: prin pierderea de masă sau prin captarea vaporizatului
      Metoda se bazează pe estimarea cantităţii de substanţă analizate care se elimină în unitatea de timp dintr-o celulă Knudsen (4) sub formă de vapori, printr-un orificiu foarte mic, în condiţii de vid avansat. Cantitatea de vapori degajaţi se poate calcula fie prin determinarea pierderii de masă a celulei, fie prin condensarea vaporilor la temperatură joasă şi determinarea cantităţii de substanţă volatilizată prin analiză cromatografică. Presiunea de vapori se calculează prin aplicarea relaţiei Hertz-Knudsen.
      Intervalul recomandat:
      10–3-1 Pa.
      1.4.6.   Metoda gazului saturat
      Un curent de gaz purtător inert este trecut peste o substanţă astfel încât să fie saturat cu vapori. Cantitatea de material transportat de o cantitate cunoscută de gaz purtător este măsurabilă fie prin colectare cu barbotare în lichid, fie printr-o tehnică analitică în flux. Aceasta este apoi folosită la calcularea presiunii de vapori la o temperatură dată.
      Intervalul recomandat:
      10–4-1 Pa
      Această metodă mai poate fi folosită în intervalul 1-10 Pa, cu condiţia să fie aplicată atent.
      1.4.7.   Metoda rotorului
      Într-un rotor etalon, elementul concret de măsurare este un rulment mic din oţel, suspendat într-un câmp magnetic, care se roteşte cu viteză mare. Presiunea gazului este calculată din încetinirea mişcării bilei de oţel, care este dependentă de presiune.
      Intervalul recomandat:
      10–4-0,5 Pa.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Diferitele metode de determinare a presiunii de vapori sunt comparate în tabelul de mai jos cu privire la aplicabilitate, repetabilitate, reproductibilitate, interval de măsurare, standarde existente.
      Tabel
      Criterii de calitate
      
                  Metoda de măsurare
               
               
                  Substanţa
               
               
                  Repetabilitate estimată (7)
                  
               
               
                  Reproductibilitate estimată (7)
                  
               
               
                  Domeniu recomandat
               
               
                  Standarde existente
               
            
                  solid
               
               
                  lichid
               
            
                  
                              1.4.1.
                           
                           
                              Metoda dinamică
                           
                        
               
                  Topire joasă
               
               
                  Da
               
               
                  Până la 25 %
               
               
                  Până la 25 %
               
               
                  103 Pa-2 × 103 Pa
               
               
                  —
               
            
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  1-5 %
               
               
                  1-5 %
               
               
                  2 × 103 Pa-105 Pa
               
               
                  —
               
            
                  
                              1.4.2.
                           
                           
                              Metoda statică
                           
                        
               
                  Da
               
               
                  Da
               
               
                  5-10 %
               
               
                  5-10 %
               
               
                  10 Pa-105 Pa (8)
                  
               
               
                  NFT 20-048 (5)
               
            
                  
                              1.4.3
                           
                           
                              Izoteniscop
                           
                        
               
                  Da
               
               
                  Da
               
               
                  5-10 %
               
               
                  5-10 %
               
               
                  102 Pa-105 Pa
               
               
                  ASTM-D
                  2879-86
               
            
                  
                              1.4.4.
                           
                           
                              Metoda prin vaporizare (balanţă)
                           
                        
               
                  Da
               
               
                  Da
               
               
                  5-20 %
               
               
                  Până la 50 %
               
               
                  10–3 Pa-1 Pa
               
               
                  NFT
                  20-047 (6)
               
            
                  
                              1.4.5.
                           
                           
                              Metoda prin vaporizare (pierdere de masă)
                           
                        
               
                  Da
               
               
                  Da
               
               
                  10-30 %
               
               
                  —
               
               
                  10–3 Pa-1 Pa
               
               
                  —
               
            
                  
                              1.4.6.
                           
                           
                              Metoda gazului saturat
                           
                        
               
                  Da
               
               
                  Da
               
               
                  10-30 %
               
               
                  Până la 50 %
               
               
                  10–4 Pa-1 Pa (8)
                  
               
               
                  —
               
            
                  
                              1.4.7.
                           
                           
                              Metoda rotorului
                           
                        
               
                  Da
               
               
                  Da
               
               
                  10-20 %
               
               
                  —
               
               
                  10–4 Pa-0,5 Pa
               
               
                  —
               
            1.6.   DESCRIEREA METODELOR
      1.6.1.   Metoda măsurătorii dinamice
      1.6.1.1.   Aparatură
      Aparatul de măsură constă de obicei dintr-un vas de fierbere cu vas de răcire ataşat, din sticlă sau metal (figura 1), echipament de măsurare a temperaturii şi echipament de reglare şi măsurare a presiunii. Aparatul de măsură tipic prezentat în desen este confecţionat din sticlă termorezistentă şi este compus din 5 părţi:
      Tubul mare, cu pereţi parţial dubli, constă dintr-o garnitură rodată, un agent de răcire, un vas de răcire şi un racord de intrare.
      Cilindrul de sticlă, prevăzut cu „pompă” Cottrell, este montat în zona de fierbere a tubului şi are o suprafaţă rugoasă, de sticlă pisată, pentru a evita vaporizarea locală cu fierbere violentă.
      Temperatura se măsoară cu un senzor de temperatură corespunzător (de exemplu, termometru cu rezistenţă, termocuplu de manta) imersat în aparat la punctul de măsurare (nr. 5, figura 1) printr-un orificiu de admisie corespunzător (de exemplu, printr-un dop rodat).
      Se fac legăturile necesare la echipamentul de măsură şi reglare a presiunii.
      Rezervorul bulbiform, care acţionează ca un volum-tampon, se conectează la aparatul de măsură prin intermediul unui tub capilar.
      Vasul de fierbere se încălzeşte cu un element de încălzire (de exemplu un cartuş caloric) montat în aparatul de sticlă pe la partea interioară. Alimentarea cu curent electric pentru încălzire este fixată şi reglată cu ajutorul termocuplului.
      Vidul necesar cuprins între 102 Pa şi aproximativ 105 Pa este realizat cu ajutorul unei pompe de vid.
      Dozarea aerului sau a azotului pentru reglarea presiunii (interval de măsurare aproximativ 102-105 Pa) şi ventilaţie se face printr-o valvă adecvată.
      Presiunea se măsoară la manometru.
      1.6.1.2.   Metodă de măsurare
      Se măsoară presiunea de vapori determinându-se punctul de fierbere al eşantionului la diferite presiuni specificate între aproximativ 103 şi 105 Pa. O temperatură de fierbere stabilă la presiune constantă arată că punctul de fierbere a fost atins. Metoda nu poate fi folosită în cazul substanţelor care spumează.
      Substanţa se pune într-o coloană curată şi uscată. Pot să apară probleme în cazul solidelor care nu sunt sub formă de pulbere, dar în unele cazuri acestea se pot rezolva încălzind agentul de răcire din mantaua de răcire. După umplere, aparatul se închide la flanşă şi substanţa se degazează. Se stabileşte cea mai joasă dintre presiunile dorite şi se începe încălzirea. În acelaşi timp, senzorul de temperatură se conectează la contor.
      Echilibrul este atins atunci când se înregistrează o temperatură de fierbere constantă la presiune constantă. Trebuie evitat fenomenul de vaporizare locală cu fierbere violentă. În plus, în vasul de răcire condensarea trebuie să fie completă. Când se determină presiunea de vapori a solidelor cu punct de topire scăzut, trebuie evitată blocarea condensatorului.
      După înregistrarea acestui punct de echilibru se stabileşte o presiune mai ridicată. Procesul se continuă în acelaşi fel până când se atinge o presiune de 105 Pa (cca. 5-10 măsurători în total). Pentru verificare, aceleaşi puncte de echilibru trebuie să se regăsească la descreşterea presiunii.
      1.6.2.   Măsurători statice
      1.6.2.1.   Aparatură
      Aparatura cuprinde un vas de probe, un sistem de încălzire şi răcire pentru a regla şi măsura temperatura eşantionului. Aparatura include, de asemenea, instrumente de reglare şi măsurare a presiunii. Figurile 2a şi 2b ilustrează principiile de bază ale sistemului.
      Vasul cu eşantion (figura 2a) este conectat pe o parte la un ventil de vid avansat. Pe partea cealaltă se ataşează un tub în formă de U cu un lichid manometric adecvat, formând un manometru auxiliar. Un capăt al tubului în formă de U este racordat la tubul ce face legătura cu pompa de vid, cilindrul cu azot sau ventilul de aerisire, şi la manometru.
      În locul tubului în formă de U se poate folosi un regulator de presiune cu manometru (figura 2b).
      Pentru a regla temperatura eşantionului, vasul împreună cu ventilul şi tubul în formă de U (sau manometru) este plasat într-o baie păstrată la o temperatură constantă de ±0,2 K. Măsurarea temperaturii se face pe peretele exterior al vasului ce conţine eşantionul sau chiar în vas.
      Pentru golirea aparatului se foloseşte o pompă de vid cu separator de răcire în amonte.
      În metoda 2a presiunea de vapori a substanţei este măsurată indirect folosind un indicator de zero. Aceasta ţine seama de faptul că densitatea fluidului din manometrul auxiliar se modifică dacă temperatura variază mult.
      Următoarele fluide sunt potrivite ca indicatori de zero pentru manometrul auxiliar, în funcţie de intervalul de presiune şi de comportarea chimică a substanţelor: uleiurile de silicon, ftalaţii. Substanţa de testat nu trebuie să se dizolve perceptibil sau să reacţioneze cu fluidul din manometrul auxiliar.
      Pentru manometru, mercurul poate fi utilizat în intervalul de presiune de la normală până la 102 Pa, pe când uleiurile de silicon şi ftalaţii se folosesc sub 102 Pa până la 10 Pa. Manometrele cu membrană rezistente la temperatură pot fi folosite chiar sub 10–1 Pa. Există şi tipuri de aparate de măsurare a presiunii utilizabile sub 102 Pa.
      1.6.2.2.   Procedeul de măsurare
      Înainte de măsurare, toate componentele aparaturii prezentate în figura 2 trebuie să fie curăţate şi uscate perfect.
      Pentru metoda 2a se umple vasul în formă de U cu lichidul ales, care trebuie să fie degazat la o temperatură ridicată înainte de a se face citirile.
      Substanţa de testat se introduce în aparat, care este apoi închis, şi temperatura se reduce suficient pentru degazare. Temperatura trebuie să fie suficient de scăzută pentru a asigura aspirarea aerului, dar în cazul sistemelor multicomponent trebuie să nu altereze compoziţia materialului. Dacă este necesar, echilibrul poate fi stabilit mai rapid prin agitare.
      Eşantionul poate fi suprarăcit, de exemplu cu azot lichid (evitând condensarea aerului sau a fluidului pompei) sau cu un amestec de etanol şi gheaţă uscată. Pentru măsurători la temperaturi scăzute se foloseşte o baie termostatată conectată la un criostat.
      Cu ventilul de deasupra vasului deschis, se evacuează aerul prin aspiraţie, timp de câteva minute. Apoi ventilul se închide iar temperatura eşantionului este redusă la nivelul cel mai scăzut dorit. Dacă este necesar, operaţia de degazare se repetă de câteva ori.
      Când eşantionul se încălzeşte, presiunea de vapori creşte şi modifică echilibrul fluidului din manometrul auxiliar. Pentru compensare se introduce azot sau aer în aparat printr-un ventil până când fluidul indicator de presiune revine la zero. Presiunea cerută pentru echilibrare trebuie să fie citită la un manometru de precizie, la temperatura camerei. Această presiune corespunde presiunii de vapori a substanţei la temperatura dată a eşantionului.
      Metoda 2b este similară, dar presiunea de vapori este citită direct.
      Valorile presiunii de vapori în funcţie de temperatură se determină la intervale de timp mici (aproximativ 5-10 măsurători în total) până la temperatura maximă cerută. Citirile la temperaturi scăzute trebuie să fie repetate pentru verificare.
      Dacă valorile obţinute la citirile repetate nu coincid cu curba obţinută pentru creşterea temperaturii, aceasta se poate datora următoarelor cauze:
      
                  1.
               
               
                  Proba conţine încă aer (de exemplu materiale cu vâscozitate mare) sau impurităţi cu temperaturi de fierbere scăzute, care se evaporă în timpul încălzirii şi pot fi îndepărtate prin aspiraţie după o suprarăcire suplimentară.
               
            
                  2.
               
               
                  Temperatura de răcire nu este suficientă. În acest caz se foloseşte ca agent de răcire azotul lichid.
                  În ambele situaţii, măsurătoarea trebuie repetată.
               
            
                  3.
               
               
                  Substanţa suferă o reacţie chimică în intervalul de temperatură analizat (de exemplu descompunere, polimerizare).
               
            1.6.3.   Izoteniscopul
      O descriere completă a acestei metode poate fi găsită în referinţa bibliografică 7. Principiul aparatului de măsurare este prezentat în figura 3. La fel ca în cazul metodei statice descrisă la punctul 1.6.2, izoteniscopul este adecvat pentru analizarea solidelor sau a lichidelor.
      În cazul lichidelor, substanţa însăşi serveşte ca fluid în manometrul auxiliar. O cantitate de lichid, suficientă pentru a umple rezervorul şi braţul scurt al manometrului se introduce în izoteniscop. Izoteniscopul este ataşat la sistemul de vid şi golit, apoi se umple cu azot. Evacuarea şi purjarea sistemului se repetă de două ori pentru îndepărtarea oxigenului rezidual. Izoteniscopul plin este plasat în poziţie orizontală, astfel încât proba să se împrăştie într-un strat subţire în rezervorul bulbiform şi în manometru (partea în U). Presiunea sistemului se reduce la 133 Pa şi proba se încălzeşte uşor numai până la fierbere (îndepărtarea gazelor dizolvate). Apoi izoteniscopul este plasat astfel încât proba să se întoarcă în rezervor şi în manometru, astfel încât ambele să fie pline cu lichid. Presiunea se menţine la fel ca pentru degazare; vârful rezervorului bulbiform se încălzeşte la flacără mică până când vaporii degajaţi împing o parte din lichidul de la partea superioară şi din braţul manometrului în secţiunea manometrică a izoteniscopului, creând un spaţiu umplut cu vapori şi fără azot.
      Izoteniscopul este introdus într-o baie termostatată şi presiunea azotului este corectată până la presiunea eşantionului. Echilibrul de presiune este indicat de secţiunea manometrică a izoteniscopului. La echilibru, presiunea de vapori a azotului este egală cu presiunea de vapori a substanţei.
      În cazul substanţelor solide, în funcţie de intervalul de presiune şi temperatură, se utilizează lichidele manometrice enumerate la punctul 1.6.2.1. Lichidul manometric degazat este turnat în curbura braţului lung al izoteniscopului. Apoi, substanţele solide ce urmează să fie analizate sunt puse în rezervorul bulbiform şi sunt degazate la temperatură ridicată. În continuare, izoteniscopul este înclinat astfel încât lichidul manometric să curgă în tubul în formă de U. Măsurătoarea presiunii de vapori în funcţie de temperatură se efectuează în conformitate cu punctul 1.6.2.
      1.6.4.   Metoda prin efuziune: balanţa pentru presiunea de vapori
      1.6.4.1.   Aparatură
      În literatura de specialitate sunt descrise diferite modele de aparate (1). Aparatul descris aici ilustrează principiul general al metodei (figura 4). Figura 4 prezintă principalele componente ale aparatului, cuprinzând un vas de sticlă sau oţel inoxidabil pentru vid înaintat, echipament pentru producerea şi măsurarea vidului şi componente pentru măsurarea presiunii de vapori cu ajutorul unei balanţe. Aparatura are încorporate următoarele componente:
      
                  —
               
               
                  un cuptor evaporator cu flanşă şi canal de admisie rotativ. Cuptorul evaporator este un vas cilindric confecţionat, de exemplu, din cupru sau dintr-un aliaj rezistent chimic cu o conductibilitate termică bună. Se poate folosi şi un vas de sticlă cu perete de cupru. Cuptorul are un diametru de aproximativ 3-5 cm şi este înalt de 2-5 cm. Există între unul până la trei orificii de diferite dimensiuni pentru fluxul de vapori. Cuptorul este încălzit ori dedesubt cu o placă de încălzire, ori în exterior cu o serpentină de încălzire. Pentru a preveni pierderea de căldură în bază, sistemul de încălzire se montează la placa de bază folosind un metal cu conductivitate termică scăzută (oţel aliat cu nichel-argint sau cu crom-nichel) de exemplu o conductă de oţel cu nichel-argint montată la canalul de admisie rotativ, dacă se utilizează un cuptor cu mai multe orificii. Acest sistem are avantajul de a permite introducerea unei bare de cupru care permite răcirea din exterior folosind o baie de răcire;
               
            
                  —
               
               
                  în cazul în care capacul de cupru al cuptorului are 3 deschideri de diametre diferite orientate la 90o una faţă de cealaltă, se pot acoperi diferite intervale de presiuni de vapori din întregul interval de măsurare (diametrul orificiilor fiind între 0,3 şi 4,5 mm). Deschiderile mari sunt utilizate pentru presiuni de vapori scăzute şi invers. Prin rotirea cuptorului se poate fixa apertura dorită sau chiar o poziţie intermediară în fluxul de vapori (orificiul cuptorului – scut-pâlnie – taler de balanţă) iar fluxul molecular este degajat sau deviat printr-un orificiu al cuptorului spre talerul balanţei. Pentru a măsura temperatura substanţei se plasează într-un punct potrivit un termocuplu sau un termometru cu rezistenţă;
               
            
                  —
               
               
                  deasupra scutului-pâlnie se găseşte un taler de balanţă aparţinând unei microbalanţe de înaltă precizie. Talerul balanţei este de aproximativ 30 mm diametru. Materialul optim este aluminiul placat cu aur;
               
            
                  —
               
               
                  talerul de balanţă este acoperit cu o cutie cilindrică de răcire, din alamă sau cupru. În funcţie de tipul de balanţă, cutia de răcire are fante pentru braţul de balanţă şi pentru scutul-pâlnie, trebuind să asigure condensarea completă a vaporilor pe talerul de balanţă. Degajarea căldurii în exterior este asigurată, de exemplu, de o tijă de cupru conectată la cutia de răcire. Tija trece prin placa de bază şi este izolată termic de aceasta, de exemplu cu un tub de oţel cu crom-nichel. Tija se imersează într-un vas Dewar conţinând azot lichid amplasat sub placa de bază sau în interiorul său este circulat azot lichid. Cutia de răcire este astfel păstrată la aproximativ – 120 oC. Talerul de balanţă este răcit exclusiv prin radiere şi este suficient pentru intervalul de presiuni investigat (răcire aproximativ 1 oră înainte de începerea măsurătorii);
               
            
                  —
               
               
                  balanţa este poziţionată deasupra cutiei de răcire. Balanţe corespunzătoare sunt de exemplu: microbalanţa electronică de înaltă sensibilitate cu două braţe (8) sau un instrument cu serpentină mobilă de înaltă sensibilitate (a se vedea Orientarea 104 a OCDE, ediţia 12.05.81);
               
            
                  —
               
               
                  placa de bază încorporează de asemenea legături electrice pentru termocupluri (sau termometre cu rezistenţă) şi serpentine de încălzire;
               
            
                  —
               
               
                  vidul este produs în vas folosind o pompă de vid parţial sau înaintat (vidul necesar, aproximativ de la 1 la 2 × 10–3 Pa, obţinut după 2 ore de pompare). Presiunea este reglată cu un manometru cu ionizare adecvat.
               
            1.6.4.2.   Procedeul de măsurare
      Vasul se umple cu substanţa de testat şi se închide capacul. Pâlnia protectoare şi cutia de răcire sunt aşezate deasupra cuptorului. Se închide aparatul şi se porneşte pompa de vid. Presiunea finală înainte de a efectua măsurătoarea trebuie să fie de aproximativ 10–4 Pa. Răcirea cutiei de refrigerare porneşte de la 10–3 Pa.
      Odată ce vidul necesar a fost obţinut, începe seria etalonărilor la cea mai scăzută temperatură. Este fixat capacul la orificiul corespunzător, jetul de vapori traversează scutul-pâlnie direct deasupra deschiderii şi loveşte talerul răcit al balanţei. Talerul trebuie să fie suficient de mare pentru ca întreg jetul trecut prin scutul-pâlnie să îl atingă. Forţa jetului de vapori acţionează asupra talerului şi moleculele condensează pe suprafaţa sa rece.
      Forţa jetului şi condensarea simultană produc un semnal pe un înregistrator. Evaluarea semnalului ne oferă două informaţii:
      
                  1.
               
               
                  În aparatul descris aici presiunea de vapori este determinată direct de forţa exercitată asupra balanţei [nu este necesar să se cunoască masa moleculară în acest scop (2)]. Când se interpretează citirile trebuie să se ţină seama de factori geometrici cum ar fi deschiderea cuptorului şi unghiul jetului.
               
            
                  2.
               
               
                  Se poate măsura în acelaşi timp masa condensului, iar viteza de evaporare se poate calcula din această valoare. Presiunea de vapori se poate, de asemenea, calcula din viteza de evaporare şi masa moleculară, prin folosirea ecuaţiei Hertz (2):
               
            
         
      unde
      
                  G
               
               
                  =
               
               
                  viteza de evaporare (kg s–l m–2)
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  masa moleculară (g mol–l)
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatura (K)
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  constanta universală a gazelor (Jmol–l K–1)
               
            
                  p
               
               
                  =
               
               
                  presiunea de vapori (Pa)
               
            După realizarea vidului necesar, începe seria de măsurători de la temperatura minimă dorită.
      Pentru măsurători ulterioare se măreşte temperatura pe intervale mici, până la atingerea temperaturii maxime dorite. Proba este răcită din nou şi poate fi înregistrată a doua curbă a presiunii de vapori. Dacă un al doilea test nu confirmă rezultatul primului, atunci este posibil ca substanţa să se descompună în intervalul de temperaturi ales pentru măsurători.
      1.6.5.   Metoda prin efuziune: măsurarea pierderii de greutate
      1.6.5.1.   Aparatură
      Instalaţia de efuziune constă din următoarele părţi principale:
      
                  —
               
               
                  o cuvă care poate fi termostatată şi vidată şi în care sunt localizate celulele de efuziune;
               
            
                  —
               
               
                  o pompă de vid înaintat (exemplu pompă de difuziune sau pompă turbomoleculară) cu manometru de vid);
               
            
                  —
               
               
                  un separator folosind azot lichid sau gheaţă uscată.
               
            În figura 5 este prezentată o cuvă de vid din aluminiu, încălzită electric, cu 4 celule de efuziune din oţel inoxidabil. Foiţa de oţel inoxidabil de aproape 0,3 mm grosime are un orificiu de evaporare de 0,2-1,0 mm diametru şi este montată pe celula de efuziune cu un capac filetat.
      1.6.5.2.   Procedeul de măsurare
      Substanţa de referinţă şi substanţa de testat sunt introduse în celule de efuziune separate, diafragma de metal cu orificiu este închisă cu capacul filetat şi fiecare celulă este cântărită cu o precizie de 0,1 mg. Celula se introduce în aparatul termostatat, care este apoi vidat pentru a scădea presiunea până la 10-a parte din presiunea preconizată. La intervale definite de timp variind de la 5 la 30 ore se devidează aparatura şi se determină pierderea de masă în celulele de efuziune printr-o nouă cântărire.
      Pentru a garanta că rezultatele nu sunt influenţate de impurităţi volatile, celula este recântărită la intervale de timp bine definite, verificând dacă viteza de evaporare este constantă pe cel puţin două astfel de intervale de timp.
      Presiunea de vapori p în celula de efuziune este dată de:
      
         
      unde:
      
                  p
               
               
                  =
               
               
                  presiunea de vapori (Pa)
               
            
                  m
               
               
                  =
               
               
                  masa substanţei ce părăseşte celula în timpul t (kg)
               
            
                  t
               
               
                  =
               
               
                  timp (s)
               
            
                  A
               
               
                  =
               
               
                  suprafaţa orificiului (m2)
               
            
                  K
               
               
                  =
               
               
                  factor de corecţie
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  constantă universală molară a gazelor (Jmol–l K–1)
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatura (K)
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  masa moleculară (kg mol–1)
               
            Factorul de corecţie K depinde de raportul dintre lungime şi rază a orificiului de efuziune:
      
                  raport
               
               
                  0,1
               
               
                  0,2
               
               
                  0,6
               
               
                  1,0
               
               
                  2,0
               
            
                  factor K
               
               
                  0,952
               
               
                  0,909
               
               
                  0,771
               
               
                  0,672
               
               
                  0,514
               
            Ecuaţia de mai sus se poate scrie:
      
         
      unde  şi este constanta celulei de efuziune.
      Această constantă a celulei de vaporizare E poate fi determinată cu ajutorul substanţelor de referinţă (2) (9) şi se foloseşte următoarea ecuaţie:
      
         
      unde:
      
                  p(r)
               
               
                  =
               
               
                  presiunea de vapori a substanţei de referinţă (Pa)
               
            
                  M(r)
               
               
                  =
               
               
                  masa moleculară a substanţei de referinţă (kg × mol–l)
               
            1.6.6.   Metoda gazului saturat
      1.6.6.1.   Aparatură
      Aparatura tipic folosită la realizarea acestui test cuprinde mai multe componente prezentate în figura 6a şi este descrisă mai jos (1).
      Gaz inert:
      Gazul purtător nu trebuie să reacţioneze chimic cu substanţa de analizat. Azotul este un gaz suficient de inert pentru acest scop dar uneori pot fi utile şi alte gaze (10). Gazul utilizat trebuie să fie uscat (a se vedea figura 6a, explicaţia 4: senzor de umiditate relativă).
      Controlul debitului:
      Este necesar un sistem de control al debitului de gaz pentru a asigura în coloana de saturaţie un debit constant fixat.
      Separatoare de condens:
      Acestea depind de caracteristicile particulare ale probelor şi de metoda de analiză aleasă. Vaporii trebuie să fie captaţi cantitativ într-o formă care să permită analiza. Pentru unele substanţe sunt necesare separatoare care conţin lichide cum ar fi hexanul sau etilenoglicolul. Pentru altele se pot folosi absorbanţi solizi.
      Ca alternativă la captarea vaporilor şi analiza ulterioară, pot fi folosite tehnici analitice precum cromatografia pentru determinarea cantitativă a masei de substanţă transportată de o cantitate cunoscută de gaz purtător. În plus, se poate măsura şi pierderea de masă a eşantionului.
      Schimbător de căldură:
      Pentru măsurători la temperaturi diferite, poate fi necesară includerea în ansamblu a unui schimbător de căldură.
      Coloana de saturaţie:
      Substanţa de analizat, în soluţie, se depune pe un suport inert convenabil. Suportul astfel acoperit se tasează în coloana de saturaţie, care are o mărime şi o viteză de curgere astfel încât să asigure saturaţia completă a gazului purtător. Coloana de saturaţie trebuie termostatată. Pentru măsurători peste temperatura camerei, zona dintre coloana de saturaţie şi separator trebuie să fie încălzită pentru a preveni condensarea substanţei de testat.
      Pentru a reduce cantitatea de substanţă antrenată datorită difuziei se poate amplasa un tub capilar după coloana de saturaţie (figura 6b).
      1.6.6.2.   Procedura de măsurare
      Pregătirea coloanei de saturaţie:
      O soluţie din substanţa de testat într-un solvent foarte volatil se adaugă unei cantităţi adecvate de suport. Trebuie să se utilizeze suficientă substanţă pentru menţinerea saturaţiei pe toată durata analizei. Solventul este evaporat complet în aer într-un evaporator rotativ şi materialul, amestecat bine, este tasat în coloana de saturaţie. După termostatarea eşantionului se trece prin aparat azot uscat.
      Măsurătoare:
      Separatoarele sau detectorul în flux sunt conectate la linia de efluent a coloanei şi se înregistrează timpul. Viteza de curgere se verifică la început şi la intervale egale în timpul experimentului, folosind un debitmetru cu bule (sau în mod continuu, cu un debitmetru de masă).
      Se măsoară presiunea la ieşirea din coloana de saturaţie astfel:
      
                  (a)
               
               
                  fie prin montarea unui manometru între coloana de saturaţie şi separatoare (acest lucru s-ar putea să nu fie posibil deoarece creşte spaţiul mort şi suprafaţa de adsorbţie);
               
            
                  (b)
               
               
                  fie prin determinarea căderii de presiune prin separator în funcţie de viteză, într-un experiment separat (aceasta s-ar putea să nu fie posibil în cazul separatoarelor de lichid).
               
            Timpul de colectare a cantităţii de substanţă necesar în diferitele metode de analiză este determinat într-o testare preliminară sau prin estimare. Ca alternativă la colectarea substanţei pentru analize ulterioare se pot utiliza tehnici analitice cantitative în flux (de exemplu cromatografia). Înainte de calcularea presiunii de vapori la temperatura dată se realizează o testare preliminară pentru a determina viteza maximă la care gazul purtător se saturează complet. Saturaţia este garantată dacă gazul purtător este trecut prin coloană la o viteză atât de scăzută încât o viteză şi mai scăzută să nu conducă la o presiune de vapori calculată mai mare.
      Metoda analitică specifică este determinată de natura substanţei de testat (de exemplu gaz cromatografie sau gravimetrie).
      Se determină cantitatea de substanţă transportată de un volum cunoscut de gaz purtător.
      1.6.6.3.   Calcularea presiunii de vapori
      Presiunea de vapori se calculează din densitatea de vapori, W/V, cu ecuaţia:
      
         
      unde:
      
                  P
               
               
                  =
               
               
                  presiunea de vapori (Pa)
               
            
                  W
               
               
                  =
               
               
                  masa de substanţă de testat, evaporată (g)
               
            
                  V
               
               
                  =
               
               
                  volumul de gaz saturat (m3)
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  constanta gazelor molară universală (Jmol–l K–1)
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatura (K)
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  masa molară a substanţei de testat (g mol–l)
               
            Volumele măsurate trebuie să fie corectate cu privire la diferenţele de presiune şi temperatură între debitmetru şi coloana de saturaţie termostatată. Dacă debitmetrul este localizat în aval de separatorul de condens, ar putea fi necesare corecţii pentru produsele vaporizate din separator (1).
      1.6.7.   Metoda rotorului (8) (11) (13)
      1.6.7.1.   Aparatură
      În metoda rotorului în mişcare se foloseşte un indicator de viscozitate cu rotor, conform figurii 8. Figura 7 prezintă schema configuraţiei experimentale.
      Instalaţia de măsurare constă dintr-un cap de măsurare cu rotor în mişcare, introdus într-o incintă termostatată (reglată cu o abatere de 0,1 oC). Recipientul conţinând eşantionul este plasat într-o incintă termostatată (reglată cu o abatere de 0,01 oC) şi toate celelalte părţi ale configuraţiei sunt menţinute la o temperatură mai înaltă, pentru a preveni condensarea. Un dispozitiv cu pompă de vid înaintat se conectează printr-un ventil la sistemul de vid avansat.
      Capul de măsurare cu rotor constă dintr-o bilă de oţel (de diametru 4-5 mm) plasat într-un tub. Bila este suspendată şi stabilizată într-un câmp magnetic (în general se foloseşte o combinaţie de magneţi permanenţi şi bobine de control).
      Bila este făcută să se rotească prin rotirea câmpului produs de bobine. Bobinele de control măsoară magnetizarea laterală a bilei, care este slabă dar permanent prezentă, permiţând astfel măsurarea vitezei de rotire.
      1.6.7.2.   Procedeul de măsurare
      Când bila a atins o viteză de rotaţie dată v(0) (de regulă aproximativ 400 rotaţii pe secundă), se opreşte alimentarea bobinelor şi are loc o decelerare datorată frecării cu moleculele de gaz.
      Scăderea vitezei de rotaţie este măsurată în funcţie de timp. Deoarece frecarea cauzată de suspendarea magnetică este neglijabilă în comparaţie cu frecarea cu moleculele de gaz, presiunea gazului p este dată de:
      
         
      unde:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  viteza medie a moleculelor de gaz
               
            
                  r
               
               
                  =
               
               
                  raza bilei
               
            
                  ρ
               
               
                  =
               
               
                  densitatea bilei
               
            
                  σ
               
               
                  =
               
               
                  coeficientul de transfer tangenţial al momentului cinetic (ε = 1 pentru o suprafaţă sferică ideală a bilei)
               
            
                  t
               
               
                  =
               
               
                  timp
               
            
                  v(t)
               
               
                  =
               
               
                  viteza de rotaţie după timpul t
               
            
                  v(0)
               
               
                  =
               
               
                  viteza de rotaţie iniţială
               
            Această ecuaţie poate fi, de asemenea, scrisă:
      
         
      unde tn, tn–1 sunt timpii necesari pentru un număr de rotaţii date, N. Aceste intervale de timp tn şi tn–1 sunt succesive, astfel tn > tn–1.
      Viteza medie a moleculei gazului  este dată de relaţia:
      
         
      unde:
      
                  T
               
               
                  =
               
               
                  temperatura
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  constanta universală a gazelor
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  masa molară
               
            2.   DATE
      În oricare metodă, presiunea de vapori se determină la cel puţin două temperaturi diferite. Este de preferat să se folosească trei sau mai multe temperaturi, în intervalul 0-50 oC, pentru a verifica linearitatea curbei presiunii de vapori.
      3.   RAPORT
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  metoda folosită;
               
            
                  —
               
               
                  specificaţiile precise ale substanţei (identitate şi impurităţi) şi etapa preliminară de purificare, dacă există;
               
            
                  —
               
               
                  cel puţin 2 valori ale presiunii de vapori la temperaturi diferite, de preferinţă în intervalul 0-50 oC;
               
            
                  —
               
               
                  toate datele primare;
               
            
                  —
               
               
                  o curbă log p în funcţie de 1/T;
               
            
                  —
               
               
                  o estimare a presiunii de vapori la 20 oC sau 25 oC.
               
            Dacă se observă o transformare (schimbarea de stare, descompunere), se consemnează următoarele date:
      
                  —
               
               
                  natura modificării;
               
            
                  —
               
               
                  temperatura la care are loc transformarea corectată la presiune atmosferică;
               
            
                  —
               
               
                  presiunea de vapori la 10 oC şi 20 oC sub temperatura de tranziţie şi la 10 oC şi 20 oC peste această temperatură (numai dacă tranziţia este de la solid la gaz).
               
            Se consemnează toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special cele privitoare la impurităţi şi starea fizică a substanţei.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, vol. II.
               
            
                  3.
               
               
                  R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I.
               
            
                  4.
               
               
                  Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, p. 593.
               
            
                  5.
               
               
                  NF T 20-048 AFNOR (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–1 to 105 Pa – Static method.
               
            
                  6.
               
               
                  NF T 20-047 AFNOR (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method.
               
            
                  7.
               
               
                  ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.
               
            
                  8.
               
               
                  G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, voI. 5 (4), p. 2440.
               
            
                  9.
               
               
                  Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, p. 1173.
               
            
                  10.
               
               
                  B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, p. 435.
               
            
                  11.
               
               
                  G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), p. 642.
               
            
                  12.
               
               
                  G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), p. 1148.
               
            
                  13.
               
               
                  J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3), p. 1715.
               
            
         Apendicele 1
         Metoda estimării
         INTRODUCERE
         Valorile calculate ale presiunii de vapori pot fi folosite:
         
                     —
                  
                  
                     pentru a stabili care metodă experimentală este cea optimă;
                  
               
                     —
                  
                  
                     pentru a furniza o estimare sau o valoare-limită în cazul în care metoda experimentală nu poate să fie aplicată din cauza unor probleme tehnice (inclusiv situaţiile în care presiunea de vapori este foarte scăzută);
                  
               
                     —
                  
                  
                     pentru a ajuta la identificarea acelor cazuri în care omiterea măsurătorilor experimentale este justificată deoarece presiunea de vapori este cel mai probabil sub 10–5 Pa la temperatura camerei.
                  
               METODA ESTIMĂRII
         Presiunea de vapori a solidelor şi lichidelor poate fi estimată folosind corelaţia Watson modificată (a). Singura dată experimentală necesară este punctul de fierbere în condiţii normale. Metoda este aplicabilă pentru intervalul de presiune 105-10–5 Pa.
         Informaţii detailate asupra metodei se găsesc în „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (b) (Manual de metode de estimare a proprietăţilor substanţelor).
         METODA DE CALCUL
         În conformitate cu referinţa (b), presiunea de vapori este calculată după relaţia:
         
            
         unde:
         
                     T
                  
                  
                     = temperatura care interesează
                  
               
                     Tb
                     
                  
                  
                     = punct de fierbere în condiţii normale
                  
               
                     Pvp
                     
                  
                  
                     = presiunea de vapori la temperatura T
                  
               
                     ΔHvb
                     
                  
                  
                     = căldura de vaporizare
                  
               
                     ΔZb
                     
                  
                  
                     = factor de compresibilitate (este estimat la 0,97)
                  
               
                     m
                  
                  
                     = factor empiric depinzând de starea fizică la temperatura T
                  
               În continuare
         
            
         unde KF este un factor empiric dependent de polaritatea substanţei. Pentru unele tipuri de compuşi, factorul KF este listat în referinţa bibliografică (b).
         Adesea, există date disponibile pentru punctul de fierbere la presiune redusă. În asemenea situaţii, în conformitate cu referinţa (b), presiunea de vapori se calculează conform relaţiei:
         
            
         unde T1 = punct de fierbere la presiunea redusă P1.
         RAPORT
         În cazul în care se foloseşte metoda estimării, raportul de testare cuprinde o documentaţie cuprinzătoare a calculului utilizat.
         REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
         
                     (a)
                  
                  
                     K.M. Watson, Ind. Eng. Chem; 1943, vol. 35, p. 398.
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.
                  
               
      
         Apendicele 2
         Figura 1
         Aparatură pentru determinarea curbei presiunii de vapori după metoda dinamică
         
            
         Figura 2a
         Aparatură pentru determinarea curbei presiunii de vapori prin metoda statică (prin folosirea unui manometru în U)
         
            
         Figura 2b
         Aparat pentru determinarea curbei presiunii de vapori prin metoda statică (folosind un indicator de presiune)
         
            
         Figura 3
         Izoteniscop (a se vedea referinţa 7)
         
            
         Figura 4
         Aparat pentru determinarea curbei presiunii de vapori prin metoda balanţei
         
            
         Figura 5
         Exemplu de aparat pentru determinarea presiunilor de vapori scăzute prin metoda efuziunii cu celulă de efuziune de 8 cm3
         
         
            
         Figura 6a
         Un exemplu de sistem în flux pentru determinarea presiunii de vapori prin metoda saturaţiei gazului
         
            
         Figura 6b
         Un exemplu de sistem de determinare a presiunii de vapori prin metoda saturării gazului, cu tub capilar în aval de coloana de saturaţie
         
            
         Figura 7
         Exemplu de configuraţie pentru metoda rotorului
         
            
         Figura 8
         Exemplu de cap de măsurare
         
            
      
      A.5.   TENSIUNEA SUPERFICIALĂ
      1.   METODĂ
      Majoritatea metodelor descrise se bazează pe orientările OCDE privind testele (1). Principiile fundamentale sunt menţionate în referinţa bibliografică 2.
      1.1.   INTRODUCERE
      Metodele descrise se aplică măsurării tensiunii superficiale a soluţiilor apoase.
      Este util să se colecteze informaţii preliminare asupra solubilităţii în apă, structurii, proprietăţilor la hidroliză şi concentraţiei critice pentru formarea de micelii ale substanţei înainte de realizarea acestor teste.
      Următoarele metode sunt aplicabile celor mai multe substanţe chimice, fără nicio restricţie cu privire la gradul de puritate.
      Măsurarea tensiunii superficiale prin metoda tensiometrului cu inel se limitează la soluţiile apoase cu o vâscozitate dinamică mai mică decât aproximativ 200 mPa s.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Entalpia unui lichid la suprafaţa de contact cu aerul raportată la unitatea de suprafaţă se numeşte tensiune superficială.
      Unităţile de măsură sunt:
      N/m (SI) sau
      mN/m (subunitate SI)
      1 N/m = 103 dyn/cm
      1 mN/m = 1 dyn/cm în sistemul CGS vechi
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă în toate cazurile în care se studiază o nouă substanţă. Acestea trebuie în special să servească la etalonarea periodică a metodei şi la comparaţia cu rezultatele obţinute prin alte metode.
      Substanţele de referinţă care acoperă un interval larg de tensiuni superficiale sunt date în referinţele 1 şi 3.
      1.4.   PRINCIPIUL METODELOR
      Metodele se bazează pe măsurarea forţei maxime care este necesar să se exercite vertical pe o bridă circulară ori pe un inel aflat în contact cu suprafaţa lichidului dintr-un vas etalonat, pentru a-l separa de această suprafaţă, sau pe o placă având o margine în contact cu suprafaţa lichidului, pentru a ridica pelicula care s-a format.
      Substanţele care sunt solubile în apă cel puţin într-o concentraţie de 1 mg/l sunt analizate în soluţii apoase la o singură concentraţie.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Aceste metode oferă o precizie mai mare decât este probabil necesară în analizele de mediu.
      1.6.   DESCRIEREA METODELOR
      Se prepară o soluţie a substanţei de testat în apă distilată. Concentraţia acestei soluţii reprezintă 90 % din solubilitatea de saturaţie a substanţei în apă; când această concentraţie depăşeşte 1 g/l, pentru determinare se utilizează o concentraţie de 1 g/l. Testarea substanţelor cu solubilitate în apă mai scăzută de 1 mg/l nu este necesară.
      1.6.1.   Metoda cu placă
      A se vedea ISO 304 şi NFT 73-060 (Agenţi activi de suprafaţă – determinarea tensiunii superficiale prin ridicarea unei pelicule de lichid).
      1.6.2.   Metoda cu bridă
      A se vedea ISO 304 şi NFT 73-060 (agenţi activi de suprafaţă – determinarea tensiunii superficiale prin ridicarea unei pelicule de lichid)
      1.6.3.   Metoda cu inel
      A se vedea ISO 304 şi NFT 73-060 (Agenţi activi de suprafaţă – determinarea tensiunii superficiale prin ridicarea unei pelicule de lichid).
      1.6.4.   Metodă cu inel corelată cu principiile OCDE
      1.6.4.1.   Aparatură
      Pentru această măsurătoare sunt folosite tensiometre comerciale. Ele constau în următoarele elemente:
      
                  —
               
               
                  porteşantion mobil;
               
            
                  —
               
               
                  dinamometru;
               
            
                  —
               
               
                  corp de măsurare (inel);
               
            
                  —
               
               
                  vas de măsurare.
               
            1.6.4.1.1.   Porteşantionul mobil
      
      Porteşantionul mobil se foloseşte ca suport al recipientului de măsurare termostatat care conţine lichidul de testare. Se montează pe acelaşi soclu ca şi dinamometrul.
      1.6.4.1.2.   Dinamometrul
      
      Dinamometrul (a se vedea figura) se aşează deasupra porteşantionului. Eroarea în măsurarea forţei nu trebuie să depăşească ± 10–6 N, echivalentul unei limite de eroare de ±0,1 miligrame în măsurarea masei. În majoritatea cazurilor, scara de măsură a tensiometrelor comercializate este etalonată în mN/m, astfel încât se poate citi direct tensiunea superficială în mN/m, cu o precizie de 0,1 mN/m.
      1.6.4.1.3.   Corpul de măsurare (inel)
      
      Inelul este de obicei format dintr-un film de platină sau de platină-iridiu cu o grosime de 0,4 milimetri şi o circumferinţă de 60 milimetri. Acest inel este suspendat orizontal pe etrierul de montaj care este legat printr-o tijă metalică la dinamometru (a se vedea figura).
      Figură
      Corp de măsurare
      (Toate dimensiunile sunt exprimate în milimetri)
      
         
      1.6.4.1.4.   Vasul de măsurare
      
      Vasul de măsurare conţinând proba ce urmează să fie măsurată trebuie să fie un vas de sticlă cu termostat. Acesta trebuie să fie astfel realizat încât în timpul măsurătorilor temperatura soluţiei de lichid şi a fazei gazoase de deasupra acesteia să rămână constantă, astfel încât proba să nu se poată evapora. Sunt acceptabile vase cilindrice de sticlă cu diametrul interior mai mare de 45 mm.
      1.6.4.2.   Pregătirea aparaturii
      1.6.4.2.1.   Curăţarea
      
      Vasele de sticlă se spală cu atenţie. Dacă este necesar, sunt spălate cu amestec oxidant (bicromat/acid sulfuric) cald apoi cu acid fosforic concentrat (83-98 % procent de greutate H3PO4), clătite cu apă şi în final spălate cu apă dublu distilată până la reacţie neutră, apoi uscate sau clătite cu o parte din lichidul de analizat.
      Inelul este mai întâi clătit bine cu apă pentru a îndepărta orice substanţă solubilă, scufundat rapid în amestec oxidant, spălat cu apă dublu distilată până la reacţie neutră şi în final încălzit scurt deasupra unei flăcări de metanol.
      
         Notă:
      
      Substanţele contaminante care nu se dizolvă şi nu sunt distruse de amestecul oxidant sau de acidul fosforic, precum siliconii, vor fi îndepărtate cu ajutorul unui solvent organic potrivit.
      1.6.4.2.2.   Calibrarea aparatului
      
      Validarea aparatului constă din verificarea punctului zero şi corectarea acestuia astfel încât indicaţia instrumentului să permită realizarea unor determinări corecte în unităţi mN/m.
      Montare:
      Aparatul va fi aşezat plan, de exemplu cu ajutorul unei nivele cu bulă de aer aşezată la baza termometrului, prin ajustarea picioarelor mobile.
      Corectarea punctului zero:
      După montarea inelului pe aparat şi înaintea imersării în lichid, indicaţia tensiometrului va fi corectată la zero, iar inelul se va verifica pentru a fi perfect paralel cu suprafaţa lichidului. În acest scop, suprafaţa lichidului poate fi folosită ca oglindă.
      Calibrarea:
      Testul de calibrare poate fi realizat prin una din următoarele metode:
      
                  (a)
               
               
                  folosind o greutate: metoda foloseşte călăreţi de masă cunoscută între 0,1 şi 1,0 g amplasaţi pe inel. Factorul de calibrare Φa cu care se înmulţesc toate citirile de pe instrument se stabileşte în conformitate cu ecuaţia (1):
                  
                              
                                 
                           
                           
                               
                           
                        unde:
                  
                      (mN/m)
                  
                              m
                           
                           
                              =
                           
                           
                              masa călăreţului (g)
                           
                        
                              g
                           
                           
                              =
                           
                           
                              acceleraţia gravitaţională (981 cm s–2 la nivelul mării)
                           
                        
                              b
                           
                           
                              =
                           
                           
                              circumferinţa medie a inelului (cm)
                           
                        
                              σa
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              citirea tensiometrului după plasarea călăreţului pe inel (mN/M);
                           
                        
            
                  (b)
               
               
                  folosind apa: procedeul utilizează apa pură a cărei tensiune superficială la, de exemplu 23 oC, este egală cu 72,3 mN/m. Acest procedeu se realizează mai rapid decât calibrarea cu greutăţi, dar există întotdeauna pericolul ca tensiunea superficială a apei să fie falsificată prin contaminare cu agenţi tensioactivi.
                  Factorul de calibrare (Φb) cu care se înmulţesc toate citirile de pe instrument se stabileşte în conformitate cu ecuaţia (2):
                  
                              
                                 
                           
                           
                               
                           
                        unde:
                  
                              σo
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              valoarea citată în literatură pentru tensiunea superficială a apei (în mN/m)
                           
                        
                              σg
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              valoarea măsurată a tensiunii superficiale a apei (mN/m) ambele la aceeaşi temperatură.
                           
                        
            1.6.4.3.   Prepararea eşantioanelor
      Soluţiile apoase se prepară din substanţa de testat folosind concentraţia necesară în apă şi nu conţin nicio substanţă nedizolvată.
      Soluţia trebuie păstrată la o temperatură constantă (±0,5 oC). Deoarece tensiunea superficială a unei soluţii într-un vas variază în timp, se realizează măsurători la anumite intervale de timp şi se trasează graficul tensiunii superficiale ca funcţie de timp. Atunci când nu se mai produce nicio modificare se consideră că s-a atins starea de echilibru.
      Contaminarea cu praf sau gaze din mediul înconjurător poate modifica rezultatele, aşadar se va lucra sub clopot de protecţie.
      1.6.5.   Condiţii experimentale
      Măsurătorile se efectuează la temperatura de aproximativ 20 oC controlată la ±0,5 oC.
      1.6.6.   Desfăşurarea testului
      Soluţiile ce urmează să fie măsurate se transferă cu atenţie într-un vas de măsurare curat, evitându-se spumarea, după care vasul de măsurare se aşează pe porteşantion. Acesta se ridică până când inelul este imersat sub suprafaţa soluţiei de măsurat. Se coboară apoi treptat şi uniform (la o viteză de aproximativ 0,5 cm/min) pentru desprinderea inelului de pe suprafaţă până la atingerea forţei maxime necesare. Stratul de lichid ataşat de inel trebuie să nu fie separat de inel. După terminarea măsurării, inelul se imersează din nou în lichid, iar măsurătorile se repetă până când se ajunge la o valoare constantă a tensiunii superficiale. Timpul scurs de la transferul soluţiei în vasul de măsurare se înregistrează pentru fiecare determinare. Citirile se efectuează la forţa maximă necesară pentru desprinderea inelului de suprafaţa lichidului.
      2.   DATE
      Pentru a calcula tensiunea superficială, valoarea citită în mN/m pe aparat este în primul rând multiplicată cu un factor de calibrare Φa sau Φb (în funcţie de procedura de calibrare utilizată). Acest rezultat este aproximativ şi ca urmare trebuie să fie corectat ulterior.
      Harkins şi Jordan (4) au determinat un factor de corecţie empiric pentru valorile de tensiune superficială măsurate prin metoda cu inel, care depinde de dimensiunile inelului, densitatea lichidului şi tensiunea superficială.
      Deoarece determinarea factorului de corecţie pentru fiecare măsurătoare individuală din tabelele lui Harkins şi Jordan este laborioasă, pentru a determina tensiunea superficială la soluţii apoase poate fi folosită metoda simplificată de a citi valorile corectate de tensiune superficială direct din tabel. (În cazul citirilor situate între valorile tabelate se va folosi metoda interpolării.)
      Tabel
      Corecţia tensiunii superficiale măsurate
      
         numai pentru soluţii apoase, ρ = 1 g/cm3
         
      
      
                  r
               
               
                  = 9,55 mm (raza medie a inelului)
               
            
                  r
               
               
                  = 0,185 mm (raza sârmei inelului)
               
            
         
      
                  Valoare experimentală mN/m
               
               
                  Valoare corectată (mN/m)
               
            
                  Calibrarea greutăţii [a se vedea 1.6.4.2.2 (a)]
               
               
                  Calibrarea apei [a se vedea 1.6.4.2.2 (b)]
               
            
                  20
               
               
                  16,9
               
               
                  18,1
               
            
                  22
               
               
                  18,7
               
               
                  20,1
               
            
                  24
               
               
                  20,6
               
               
                  22,1
               
            
                  26
               
               
                  22,4
               
               
                  24,1
               
            
                  28
               
               
                  24,3
               
               
                  26,1
               
            
                  30
               
               
                  26,2
               
               
                  28,1
               
            
                  32
               
               
                  28,1
               
               
                  30,1
               
            
                  34
               
               
                  29,9
               
               
                  32,1
               
            
                  36
               
               
                  31,8
               
               
                  34,1
               
            
                  38
               
               
                  33,7
               
               
                  36,1
               
            
                  40
               
               
                  35,6
               
               
                  38,2
               
            
                  42
               
               
                  37,6
               
               
                  40,3
               
            
                  44
               
               
                  39,5
               
               
                  42,3
               
            
                  46
               
               
                  41,4
               
               
                  44,4
               
            
                  48
               
               
                  43,4
               
               
                  46,5
               
            
                  50
               
               
                  45,3
               
               
                  48,6
               
            
                  52
               
               
                  47,3
               
               
                  50,7
               
            
                  54
               
               
                  49,3
               
               
                  52,8
               
            
                  56
               
               
                  51,2
               
               
                  54,9
               
            
                  58
               
               
                  53,2
               
               
                  57,0
               
            
                  60
               
               
                  55,2
               
               
                  59,1
               
            
                  62
               
               
                  57,2
               
               
                  61,3
               
            
                  64
               
               
                  59,2
               
               
                  63,4
               
            
                  66
               
               
                  61,2
               
               
                  65,5
               
            
                  68
               
               
                  63,2
               
               
                  67,7
               
            
                  70
               
               
                  65,2
               
               
                  69,9
               
            
                  72
               
               
                  67,2
               
               
                  72,0
               
            
                  74
               
               
                  69,2
               
               
                  —
               
            
                  76
               
               
                  71,2
               
               
                  —
               
            
                  78
               
               
                  73,2
               
               
                  —
               
            Acest tabel a fost realizat pe baza corecţiei Harkins-Jordan. Tabelul este similar cu cel din standardul DIN (DIN 53914) pentru apă şi soluţii apoase (ρ = 1 g/cm3) şi se referă la un inel disponibil în comerţ cu diametru de R = 9,55 mm (însemnând raza medie a inelului) şi r = 0,185 mm (raza sârmei inelului). Tabelul conţine valori corectate pentru măsurătorile de tensiune superficială făcute după calibrarea cu greutăţi sau cu apă.
      Alternativ, în absenţa procedurii de calibrare, tensiunea superficială poate să fie calculată conform formulei:
      
         
      unde:
      
                  F
               
               
                  =
               
               
                  forţa măsurată la dinamometru la întreruperea filmului
               
            
                  R
               
               
                  =
               
               
                  raza inelului
               
            
                  f
               
               
                  =
               
               
                  factor de corecţie (1)
               
            3.   RAPORT
      3.1.   RAPORT DE TESTARE
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele date:
      
                  —
               
               
                  metoda folosită;
               
            
                  —
               
               
                  tipul de apă sau soluţie folosită;
               
            
                  —
               
               
                  specificaţiile precise ale substanţelor (identitate, impurităţi);
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele măsurătorii: tensiune superficială (citire) menţionând citiri individuale şi media lor aritmetică, precum şi media corectată (luând în considerare factorul de echipament şi tabelul cu factorii de corecţie);
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia soluţiei;
               
            
                  —
               
               
                  temperatura de testare;
               
            
                  —
               
               
                  vechimea soluţiei folosite; în particular timpul scurs între prepararea şi măsurarea soluţiei;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea tensiunii superficiale ca funcţie de timp după transferul soluţiei la vasul de măsurare;
               
            
                  —
               
               
                  toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor ce urmează a fi raportate, în special cu privire la impurităţi şi starea fizică a substanţei.
               
            3.2.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Având în vedere că apa distilată are tensiunea superficială de 72,75 mN/m la 20 oC, substanţele prezentând o tensiune superficială mai scăzută de 60 mN/m în condiţiile acestei metode sunt considerate ca fiind agenţi activi de suprafaţă.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter XIV.
               
            
                  3.
               
               
                  Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, p. 511.
               
            
                  4.
               
               
                  Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, p. 1751.
               
            A.6.   SOLUBILITATEA ÎN APĂ
      1.   METODĂ
      Majoritatea metodelor descrise se bazează pe orientările OCDE privind testele (1).
      1.1.   INTRODUCERE
      Pentru realizarea acestui test, sunt necesare anumite informaţii preliminare referitoare la formula structurală, presiunea de vapori, constanta de disociere şi de hidroliză a substanţei (în funcţie de pH).
      Pentru a acoperi întregul interval de solubilităţi în apă, sunt disponibile mai multe metode.
      Cele două metode de analiză descrise mai jos acoperă întregul interval de solubilităţi dar nu sunt aplicabile substanţelor volatile:
      
                  —
               
               
                  o metodă care se aplică substanţelor relativ pure, cu solubilitate scăzută (< 10–2 grame pe litru) şi care sunt stabile în apă, denumită „metoda eluţiei pe coloană”;
               
            
                  —
               
               
                  o altă metodă care se aplică substanţelor relativ pure, cu solubilitate mai mare (> 10–2 grame pe litru) şi care sunt stabile în apă denumită „metoda prin solubilitate în flacon”.
               
            Solubilitatea în apă a probei poate fi considerabil afectată de prezenţa impurităţilor.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Solubilitatea în apă a unei substanţei este definită prin concentraţia masică de saturaţie a substanţei în apă la o temperatură dată. Solubilitatea în apă se măsoară în unităţi de masă pe volum de soluţie. Unitatea SI este kg/m3 (ca unitate de măsură se poate folosi de asemenea gramul pe litru).
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă în toate cazurile în care se studiază o nouă substanţă. Acestea trebuie în special să servească la etalonarea periodică a metodei şi la comparaţia cu rezultatele obţinute prin alte metode.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Cantitatea aproximativă dintr-o probă şi timpul necesar pentru a realiza concentraţia de saturaţie vor fi determinate într-un test preliminar simplu.
      1.4.1.   Metoda eluţiei pe coloană
      Această metodă se bazează pe eluţia substanţei de testat cu apă dintr-o microcoloană încărcată cu un suport inert, cum ar fi mărgele de sticlă sau nisip, acoperite cu proba în exces. Solubilitatea în apă se determină atunci când concentraţia masică de eluat este constantă. Valoarea este reprezentată de zona aplatizată a curbei de concentraţie ca funcţie de timp.
      1.4.2.   Metoda prin solubilitate în flacon
      În această metodă, substanţa (solidele trebuie să fie pulverizate) se dizolvă în apă la o temperatură puţin mai mare decât temperatura de testare. Când se atinge saturaţia, amestecul se răceşte şi se păstrează la temperatura de testare, sub agitare, atâta timp cât este necesar pentru a ajunge la echilibru. Ca alternativă, determinarea poate fi efectuată direct la temperatura de testare, dacă se garantează, printr-o probă adecvată, că s-a atins starea de echilibru de saturaţie. Apoi se determină printr-o metodă analitică potrivită concentraţia substanţei în soluţie apoasă, care nu trebuie să conţină niciun fel de particule nedizolvate.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      1.5.1.   Repetabilitatea
      Pentru metoda eluţiei pe coloană, este acceptabilă < 30 %; pentru metoda prin solubilitate în flacon, este necesar ca aceasta să fie < 15 %.
      1.5.2.   Sensibilitatea metodei
      Aceasta depinde de metoda de analiză, dar pot fi realizate determinări ale concentraţiei până la 10–6 grame pe litru.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      1.6.1.   Condiţii experimentale
      Este preferabil ca testul să aibă loc la 20 ±0,5 oC. Dacă se presupune că solubilitatea este dependentă de temperatură (> 3 % pe oC), vor fi folosite două alte temperaturi cu cel puţin 10 oC peste sau sub temperatura aleasă iniţial. În acest caz controlul temperaturii va fi de ±0,1 oC. Temperatura aleasă se menţine constantă în toate părţile relevante ale echipamentului.
      1.6.2.   Testul preliminar
      La aproximativ 0,1 grame din proba (substanţele solide trebuie să fie pulverizate) aflată într-un cilindru gradat de 10 ml cu dop de sticlă se adaugă volume crescânde de apă distilată la temperatura camerei în concordanţă cu paşii arătaţi în tabelul de mai jos:
      
                  0,1 grame solubile în „x” ml apă
               
               
                  0,1
               
               
                  0,5
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  10
               
               
                  100
               
               
                  > 100
               
            
                  Solubilitate aproximativă (grame pe litru)
               
               
                  > 1 000
               
               
                  1 000-200
               
               
                  200-100
               
               
                  100-50
               
               
                  50-10
               
               
                  10-1
               
               
                  < 1
               
            După fiecare adăugare a cantităţii de apă indicate, amestecul este agitat puternic timp de 10 minute şi examinat vizual pentru a observa particule din probă nedizolvate. Dacă după adăugarea a 10 ml de apă, proba sau părţi din ea rămân nedizolvate, experimentul trebuie repetat într-un cilindru gradat de 100 de ml, cu volume mai mari de apă. La solubilităţi mai mici timpul necesar pentru dizolvarea substanţei poate fi considerabil mai mare (cel puţin 24 de ore). Solubilitatea aproximativă se înregistrează într-un tabel, odată cu volumul de apă adăugată la care apare o dizolvare completă a probei. Dacă substanţa este încă aparent insolubilă se lasă mai mult de 24 de ore (maximum 96 de ore) sau se diluează în continuare pentru a stabili dacă se foloseşte metoda eluţiei pe coloană sau metoda flaconului.
      1.6.3.   Metoda eluţiei pe coloană
      1.6.3.1.   Suport, solvent şi eluent
      Materialul suport pentru metoda eluţiei pe coloană trebuie să fie inert. Materiale care pot fi folosite sunt mărgelele de sticlă şi nisipul. Pentru a aplica proba pe suport se foloseşte un solvent volatil potrivit de calitate pro analisis. Ca eluent se foloseşte apa dublu distilată, în aparatură de sticlă sau cuarţ.
      Notă:
      Nu trebuie folosită apă proaspăt trecută printr-un schimbător de ioni organic.
      1.6.3.2.   Încărcarea suportului
      Aproximativ 600 mg din suport sunt cântărite şi transferate într-un balon cu fund rotund de 50 ml.
      O cantitate convenabilă de substanţă de testat, cântărită, se dizolvă în solventul ales. O cantitate adecvată din această soluţie se adaugă la suport. Solventul trebuie să fie complet evaporat, de exemplu într-un evaporator rotativ; în caz contrar, saturarea cu apă a suportului nu se realizează datorită efectelor de partiţie pe suprafaţa suportului.
      Încărcarea suportului poate conduce la rezultate eronate dacă proba este depusă ca fază uleioasă sau cristale. Problema se examinează experimental şi detaliile se consemnează.
      Suportul încărcat se lasă să se îmbibe timp de aproximativ două ore în aproximativ 5 ml de apă, apoi suspensia se adaugă în microcoloană. Ca alternativă, suportul uscat poate fi turnat în microcoloană, care a fost deja umplută cu apă, şi apoi lăsat timp de aproximativ 2 ore până la atingerea echilibrului.
      Procedură de testare:
      Eluţia substanţei din suport poate fi efectuată într-unul din următoare două moduri:
      
                  —
               
               
                  cu pompă de recirculare (a se vedea figura 1),
               
            
                  —
               
               
                  cu rezervor de apă (a se vedea figura 4).
               
            1.6.3.3.   Metoda eluţiei pe coloană cu pompă de recirculare
      Aparatură
      Schema unui sistem tipic este prezentată în figura 1. O microcoloană corespunzătoare este prezentată în figura 2, deşi sunt acceptabile orice dimensiuni, cu condiţia respectării criteriilor de reproductibilitate şi sensibilitate. Coloana este prevăzută cu un volum tampon la vârf egal cu cel puţin 5 volume de apă şi poate să cuprindă minimum 5 probe. Ca alternativă, dimensiunea poate fi redusă dacă este folosit un solvent pentru a înlocui 5 volume iniţiale pentru a îndepărta impurităţile.
      Coloana se conectează la o pompă de recirculare cu un debit de aproximativ 25 ml/h. Pompa se conectează cu racorduri din politetrafloretilenă (P.T.F.E) şi/sau sticlă. Coloana şi pompa, odată asamblate, trebuie să permită eşantionarea efluentului şi echilibrarea volumului liber din vârful coloanei la presiunea atmosferică. Materialul din coloană este sprijinit pe un mic dop (5 mm) din vată de sticlă, care serveşte de asemenea pentru a filtra particulele. Pompa de recirculare poate fi, de exemplu, o pompă peristaltică sau o pompă cu membrană (atenţie să nu se producă nicio contaminare şi/sau absorbţii cu materialul tubului).
      Procedeul de măsurare
      Se porneşte circuitul prin coloană. Se recomandă utilizarea unui debit de aproximativ 25 ml/h (aceasta corespunde la 10 volume/h pentru coloana descrisă). Primele cinci volume (minim) sunt folosite pentru a îndepărta impurităţile solubile din apă. Apoi, pompa de recirculare se lasă să funcţioneze până la stabilirea echilibrului, care este definit prin 5 probe succesive a căror concentraţie nu diferă cu mai mult de ± 30 %, în mod aleatoriu. Aceste probe sunt separate de intervale de timp corespunzătoare trecerii a cel puţin 10 volume de eluent.
      1.6.3.4.   Metoda eluţiei pe coloană cu vas de nivel
      Aparatură (a se vedea figurile 4 şi 3)
      
      Vasul de nivel: Conectarea la vasul de nivel este făcută prin folosirea unei olive de sticlă conectată prin tuburi din PTFE. Este recomandată folosirea unui debit de aproximativ 25 ml/h. Eluaţii succesivi se colectează şi se analizează prin metoda aleasă.
      Procedeul de măsurare
      Pentru a determina solubilitatea în apă sunt folosite acele fracţiuni din intervalul de eluţie unde concentraţiile sunt constante (± 30 %) pentru cel puţin 5 fracţiuni consecutive.
      În ambele cazuri (folosind o pompă de recirculare sau un vas de nivel), o a doua serie de probe se efectuează la jumătate din debitul primei. Dacă rezultatele celei de a doua serii sunt în concordanţă, testul este satisfăcător; dacă există o solubilitate aparentă mai mare la un debit mai mic, atunci înjumătăţirea debitului va trebui să continue până când două serii succesive vor da aceeaşi solubilitate.
      În ambele cazuri (folosind o pompă de recirculare sau un vas de nivel) fracţiunile se verifică pentru a decela prezenţa materiilor coloidale, prin examinarea efectului Tyndall (împrăştierea luminii). Prezenţa unor astfel de particule invalidează rezultatele şi testul se repetă cu îmbunătăţirea acţiunii de filtrare a coloanei.
      Se înregistrează pH-ul fiecărei probe. Cea de-a doua serie va fi efectuată la aceeaşi temperatură.
      1.6.4.   Metoda prin solubilitate în flacon
      1.6.4.1.   Aparatură
      Pentru metoda prin solubilitate în flacon sunt necesare următoarele materiale:
      
                  —
               
               
                  sticlărie şi instrumente obişnuite de laborator;
               
            
                  —
               
               
                  un dispozitiv potrivit pentru agitarea soluţiilor la temperatură constantă controlată;
               
            
                  —
               
               
                  o centrifugă (preferabil termostatată), în cazul emulsiilor; şi
               
            
                  —
               
               
                  echipament pentru determinări analitice.
               
            1.6.4.2.   Procedeul de măsurare
      Cantitatea de substanţă necesară pentru a satura volumul de apă dorit este estimată printr-un test preliminar. Volumul de apă necesar depinde de metoda analitică şi de intervalul de solubilitate. Aproximativ de cinci ori cantitatea de material determinată mai sus este cântărită în fiecare dintre cele trei vase de sticlă prevăzute cu dopuri de sticlă (de exemplu eprubete pentru centrifugă, flacoane). Volumul de apă este adăugat în fiecare vas şi vasele sunt închise ermetic. Vasele închise sunt apoi agitate la 30 oC. (Se foloseşte un dispozitiv de agitare sau de amestecare care poate funcţiona la temperatură constantă, de exemplu un agitator magnetic într-o baie de apă termostatată.) După o zi, unul dintre vase este scos şi reechilibrat timp de 24 de ore la temperatura de testare, agitând din când în când. Conţinutul vasului este apoi centrifugat la temperatura de testare şi concentraţia de probă în faza apoasă clară este determinată printr-o metodă analitică adecvată. Celelalte două flacoane sunt tratate similar după atingerea echilibrului iniţial la 30 oC timp de 2, respectiv 3 zile. Când concentraţia rezultată cel puţin din ultimele două vase este în concordanţă cu reproductibilitatea cerută, testul este satisfăcător. Întregul test se repetă, folosind timpi de echilibru mai lungi, dacă rezultatele de la vasele 1, 2 şi 3 arată o tendinţă de creştere a valorilor.
      Procedeul de măsurare poate fi aplicat şi fără preincubare la 30 oC. Pentru a estima durata necesară stabilirii echilibrului de saturaţie se iau probe până în momentul în care timpul de agitare nu mai influenţează concentraţia soluţiei de probă.
      Se înregistrează pH-ul fiecărei probe.
      1.6.5.   Analiză
      Pentru aceste determinări se preferă o metodă analitică specifică substanţei, deoarece cantităţi mici de impurităţi solubile pot antrena erori mari la măsurarea solubilităţii. Exemple de astfel de metode sunt: cromatografia de gaz sau lichid, metodele titrimetrice, metodele fotometrice, metodele voltametrice.
      2.   DATE
      2.1.   METODA ELUŢIEI PE COLOANĂ
      Valoarea medie obţinută de la cel puţin cinci probe consecutive în zona platoului de saturaţie al curbei de solubilitate în funcţie de timp se ia în considerare pentru calculul saturaţiei, precum şi pentru calcularea deviaţiei standard. Rezultatele se exprimă în unităţi de masă pe volum de soluţie.
      Mediile calculate pe două teste folosind debite diferite se compară şi trebuie să aibă o repetabilitate mai mică de 30 %.
      2.2.   METODA PRIN SOLUBILITATE ÎN FLACON
      Se prezintă rezultatele individuale pentru fiecare dintre cele trei flacoane, iar pentru acele rezultate considerate a fi constante (repetabilitate mai mică de 15 %) se calculează media, care se exprimă în unităţi de masă pe volum de soluţie. Poate fi necesară convertirea unităţilor de masă în unităţi de volum, folosind densitatea, dacă solubilitatea este foarte mare (> 100 grame pe litru).
      3.   RAPORT
      3.1.   METODA ELUŢIEI PE COLOANĂ
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  rezultatele testului preliminar;
               
            
                  —
               
               
                  specificaţiile exacte ale substanţei (identitate şi impurităţi);
               
            
                  —
               
               
                  concentraţiile individuale, debitele şi pH-ul pentru fiecare eşantion;
               
            
                  —
               
               
                  deviaţia medie şi deviaţia standard de la cel puţin 5 probe din zona platoului de saturaţie a fiecărei testări;
               
            
                  —
               
               
                  media a două testări succesive, acceptabile;
               
            
                  —
               
               
                  temperatura apei în timpul procesului de saturaţie;
               
            
                  —
               
               
                  metoda de analiză folosită;
               
            
                  —
               
               
                  natura suportului folosit;
               
            
                  —
               
               
                  cantitatea de substanţă depusă pe suport;
               
            
                  —
               
               
                  solventul folosit;
               
            
                  —
               
               
                  dovezi despre orice instabilitate chimică a substanţei în timpul testului şi metoda folosită;
               
            
                  —
               
               
                  toate informaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special referitoare la impurităţi şi la starea fizică a substanţei.
               
            3.2.   METODA FLACONULUI
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  rezultatele testului preliminar;
               
            
                  —
               
               
                  specificaţiile exacte ale substanţei (identitate şi impurităţi);
               
            
                  —
               
               
                  determinările analitice individuale şi media lor, acolo unde a fost determinată mai mult decât o valoare pentru fiecare flacon;
               
            
                  —
               
               
                  pH-ul fiecărui eşantion;
               
            
                  —
               
               
                  media valorilor pentru flacoanele diferite aflate în concordanţă;
               
            
                  —
               
               
                  temperatura de testare;
               
            
                  —
               
               
                  metoda analitică folosită;
               
            
                  —
               
               
                  dovezi despre orice instabilitate chimică a substanţei în timpul testului şi metoda folosită;
               
            
                  —
               
               
                  toate informaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special referitoare la impurităţi şi starea fizică a substanţelor.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  NF T 20-045 (AFNOR) (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.
               
            
                  3.
               
               
                  NF T 20-046 (AFNOR) (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.
               
            
         Apendice
         Figura 1
         Metoda eluţiei pe coloană cu pompă de recirculare
         
            
         Figura 2
         Microcoloană tip
         
            (Toate dimensiunile în milimetri)
         
         
            
         Figura 3
         Microcoloană tip
         
            (Toate dimensiunile în milimetri)
         
         
            
         Figura 4
         Metoda coloanei de eluţie cu vas de nivel
         
            
      
      A.8.   COEFICIENTUL DE PARTIŢIE
      1.   METODĂ
      Metoda „agitării flaconului” descrisă se bazează pe orientările OCDE privind testele (1).
      1.1.   INTRODUCERE
      Pentru efectuarea acestui test este util să se colecteze informaţii preliminare despre formula structurală, constanta de disociere, solubilitatea în apă, hidroliză, solubilitatea în n-octanol şi tensiunea superficială a substanţei.
      Măsurătorile se fac pe substanţe ionizabile, numai în forma lor neionizată (acizi liberi şi baze libere) produse prin folosirea unei soluţii tampon adecvate, cu un pH de cel puţin o unitate de mai mic (acizi liberi) sau mai mare (baze libere) decât pK.
      Această metodă de analiză include două metode separate: metoda „agitării flaconului” şi cromatografia lichidă de mare performanţă (HPLC). Prima este aplicabilă când valoarea log Pow (pentru definiţii a se vedea mai jos) este în intervalul de la – 2 la 4, iar cea de-a doua în intervalul de la 0 la 6. Înainte de a aplica oricare dintre metodele experimentale se obţine o estimare a coeficientului de partiţie.
      Metoda agitării flaconului se aplică numai substanţelor pure solubile în apă şi în n-octanol. Nu este aplicabilă agenţilor tensioactivi (pentru care se furnizează o valoare calculată sau estimată a solubilităţii individuale în apă şi n-octanol).
      Metoda HPLC nu este aplicabilă acizilor şi bazelor puternice, complecşilor metalici, agenţilor tensioactivi sau substanţelor care reacţionează cu eluentul. Pentru aceste materiale se furnizează valori calculate sau estimate ale solubilităţii individuale în apă şi n-octanol.
      Metoda HPLC este mai puţin sensibilă la prezenţa impurităţilor din probă decât metoda agitării flaconului. Cu toate acestea, în unele cazuri impurităţile pot face interpretarea rezultatelor dificilă pentru că identificarea picurilor devine incertă. Pentru amestecuri care dau o bandă imprecisă se menţionează limitele superioară şi inferioară ale log P.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Coeficientul de partiţie (P) este definit ca raportul dintre concentraţiile de echilibru (ci) ale substanţei dizolvate în sistemul bifazic constând din doi solvenţi aproape nemiscibili. În cazul n-octanol şi apă:
      
         
      Coeficientul de partiţie (P) este prin urmare raportul dintre două concentraţii şi de regulă este exprimat ca logaritm în baza 10 (log P).
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Metoda agitării flaconului
      Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă în toate cazurile în care se studiază o nouă substanţă. Acestea trebuie în special să servească la etalonarea periodică a metodei şi la comparaţia cu rezultatele obţinute prin alte metode.
      Metoda HPLC
      Pentru a corela datele despre un compus determinate prin HPLC cu valoarea sa P, trebuie stabilit un grafic de calibrare log P vs. date cromatografice, folosind cel puţin 6 puncte de referinţă. Utilizatorul trebuie să selecteze substanţele de referinţă adecvate. Dacă este posibil, cel puţin un compus de referinţă trebuie să aibă Pow mai ridicat decât substanţa de testat şi un altul – un Pow mai scăzut decât eşantionul. Pentru valorile log P mai mici de 4, calibrarea se poate baza pe datele obţinute prin metoda agitării flaconului. Pentru valori log P mai mari de 4, calibrarea se poate baza pe valori recunoscute din literatură, dacă acestea sunt în concordanţă cu valorile calculate. Pentru o mai mare acurateţe, este preferabil să se aleagă compuşi de referinţă care sunt înrudiţi structural cu substanţa de testat.
      Este disponibilă o listă exhaustivă de valori pentru log Pow pentru mai multe grupe de substanţe chimice (2) (3). Dacă nu sunt disponibile date despre coeficienţii de partiţie ai compuşilor înrudiţi structural, atunci poate fi folosită o calibrare mai generală, stabilită cu alţi compuşi de referinţă.
      În apendicele 2 figurează o listă a substanţelor de referinţă recomandate care cuprinde şi valori pentru Pow.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI
      1.4.1.   Metoda agitării flaconului
      Pentru a determina coeficientul de partiţie trebuie realizat echilibrul între toţi componenţii sistemului care interacţionează şi trebuie determinate concentraţiile substanţelor dizolvate în cele două faze. Un studiu asupra literaturii de specialitate dedicată acestui subiect indică mai multe tehnici diferite ce pot fi folosite pentru rezolvarea acestei probleme, de exemplu prin amestecarea completă a două faze urmată de separarea lor pentru a determina concentraţia de echilibru a substanţei.
      1.4.2.   Metoda HPLC
      HPLC este efectuat într-o coloană analitică umplută cu o fază solidă disponibilă în comerţ care conţine lanţuri lungi de hidrocarburi (de exemplu C8, C18) legate chimic pe silice. Substanţele injectate într-o astfel de coloană se mişcă de-a lungul ei cu diferite viteze din cauza gradelor diferite de partiţie între faza mobilă şi faza staţionară cu hidrocarburi. Eluţia amestecurilor de substanţe se face în funcţie de caracterul hidrofob, substanţele solubile în apă fiind eluate mai întâi şi cele solubile în solvenţi organici eluate ultimele, proporţional cu coeficientul lor de partiţie hidrocarbură/apă. Aceasta face posibilă să fie stabilită relaţia dintre timpul de retenţie pe o astfel de coloană (faza inversă) şi coeficientul de partiţie n-octanol/apă ce trebuie determinat. Coeficientul de partiţie este dedus din factorul de capacitate k, dat de:
      
         
      în care tr = timpul de retenţie al substanţei de testat şi to = timpul mediu necesar unei molecule de solvent pentru a trece prin coloană (timp mort).
      Nu sunt necesare metode analitice cantitative, ci doar determinarea timpilor de eluţie.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      1.5.1.   Repetabilitatea
      Metoda agitării flaconului
      Pentru a asigura acurateţea măsurătorii coeficientului de partiţie trebuie realizate determinări duble în trei condiţii de testare diferite, prin care cantitatea de substanţă utilizată, precum şi raportul volumelor de solvent poate fi variat. Valorile determinate ale coeficientului de partiţie exprimate logaritmic vor fi în intervalul ±0,3 unităţi logaritmice.
      Metoda HPLC
      Pentru a creşte coeficientul de încredere al măsurătorilor, trebuie să fie făcute determinări duble. Valorile pentru log P derivate din măsurătorile individuale vor fi în intervalul ±0,1 unităţi logaritmice.
      1.5.2.   Sensibilitate
      Metoda agitării flaconului
      Intervalul de aplicabilitate al metodei este determinat de limita de detectare a metodei analitice. Aceasta trebuie să permită evaluarea valorilor log Pow în intervalul de la – 2 la 4 (ocazional, când condiţiile impun acest lucru, acest interval poate fi extins pentru log Pow până la 5) când concentraţia solutului în oricare fază nu este mai mare de 0,01 mol pe litru.
      Metoda HPLC
      Metoda HPLC face posibilă estimarea coeficienţilor de partiţie în intervalul 0 până la 6 pentru log Pow.
      În mod normal, coeficientul de partiţie al unui compus poate fi estimat cu o eroare de ±1 unitate logaritmică faţă de valoarea determinată prin metoda agitării flaconului. Corelaţii tipice pot se găsesc în literatura de specialitate (4) (5) (6) (7) (8). O mai mare acurateţe poate fi obţinută în mod normal când graficele de corelare se bazează pe compuşi de referinţă înrudiţi structural (9).
      1.5.3.   Specificitate
      Metoda agitării flaconului
      Legea partiţiei a lui Nernst se aplică numai la temperatură, presiune şi pH constante pentru soluţii diluate. Ea se aplică strict unei substanţe pure dispersată între doi solvenţi puri. Dacă sunt prezenţi diferiţi soluţi în una sau în ambele faze în acelaşi timp, aceasta poate afecta rezultatele.
      Disocierea sau asocierea moleculelor dizolvate duce la deviaţii de la legea partiţiei a lui Nernst. Astfel de deviaţii sunt indicate de funcţia care descrie dependenţa coeficientului de partiţie de concentraţia soluţiei.
      Întrucât presupune echilibre multiple, această metodă nu se foloseşte în cazul compuşilor ionizabili fără a aplica o corecţie. Pentru astfel de compuşi se ia în considerare folosirea soluţiilor tampon în locul apei; pH-ul soluţiei tampon trebuie să difere cu cel puţin 1 unitate de pKa-ul substanţei ţinând seama şi de semnificaţia acestui pH pentru mediu.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      1.6.1.   Estimarea preliminară a coeficientului de partiţie
      Coeficientul de partiţie este estimat de preferinţă prin calcul (a se vedea apendicele 1) sau, acolo unde este posibil, prin raportul solubilităţilor substanţei testate în solvenţi puri (10).
      1.6.2.   Metoda agitării flaconului
      1.6.2.1.   Pregătire
      n-Octanol: Determinarea coeficientului de partiţie va fi efectuată cu reactivi de puritate analitică ridicată.
      Apă: se foloseşte apă distilată sau dublu distilată în aparate din sticlă sau cuarţ. Dacă este cazul, pentru compuşii ionizabili vor fi folosite în locul apei soluţii tampon.
      
         Notă:
      
      Nu se foloseşte apa luată direct dintr-un aparat cu schimbători de ioni.
      1.6.2.1.1.   Presaturarea solvenţilor
      
      Înaintea determinării coeficientului de partiţie, fazele sistemului de solvent sunt saturate reciproc prin agitare la temperatura de testare. În acest scop, de obicei se agită două sticle mari cu n-octanol de puritate analitică sau apă, fiecare cu o cantitate suficientă din celălalt solvent, timp de 24 de ore, cu un agitator mecanic, apoi se lasă suficient de mult timp pentru a permite fazelor să se separe şi pentru a realiza o stare de saturaţie.
      1.6.2.1.2.   Pregătirea testului
      
      Întregul volum al sistemului bifazic trebuie să umple aproape total vasul de testare. Aceasta va ajuta la prevenirea pierderilor de material datorită volatilizării. Raportul volumelor şi cantităţile de substanţă ce vor fi folosite sunt fixate prin următoarele condiţii:
      
                  —
               
               
                  evaluarea preliminară a coeficientului de partiţie (a se vedea mai sus);
               
            
                  —
               
               
                  cantitatea minimă din substanţa de testat necesară la determinările analitice; şi
               
            
                  —
               
               
                  limita concentraţiei maxime în fiecare fază este de 0,01 mol pe litru.
               
            Sunt efectuate 3 măsurători. În prima este folosit raportul de volume n-octanol/apă calculat; în a doua măsurătoare acest raport se împarte la 2; în a treia acest raport înmulţeşte cu 2 (de exemplu 1:1, 1:2, 2:1).
      1.6.2.1.3.   Substanţa de testat
      
      O soluţie mamă este preparată în n-octanol presaturat cu apă. Concentraţia acestei soluţii mamă va fi determinată cu precizie înaintea folosirii ei pentru stabili coeficientului de partiţie. Această soluţie va fi depozitată în condiţii care să-i asigure stabilitatea.
      1.6.2.2.   Condiţii experimentale
      Temperatura de testare se menţine constantă (± 1 oC) şi se află în intervalul 20-25 oC.
      1.6.2.3.   Procedeul de măsurare
      1.6.2.3.1.   Stabilirea echilibrului de partiţie
      
      Pentru fiecare dintre condiţiile de testare se pregătesc două vase de testare conţinând cantităţile necesare, precis măsurate din cei doi solvenţi, împreună cu cantitatea necesară din soluţia mamă.
      Fazele cu n-octanol vor fi măsurate volumetric. Vasele de testare sunt amplasate într-un agitator adecvat sau sunt agitate în mână. Când se foloseşte un tub de centrifugă, o metodă recomandată este aceea să se rotească acest tub repede într-o direcţie aflată la 180o faţă de axa sa transversală, astfel încât aerul captat să se ridice prin cele două faze. Experienţa a arătat că 50 de astfel de rotaţii sunt de regulă suficiente pentru stabilirea partiţiei de echilibru. Pentru siguranţă se recomandă 100 de rotaţii în 5 minute.
      1.6.2.3.2.   Separarea fazelor
      
      Dacă este necesar, se efectuează centrifugarea amestecului pentru a separa fazele. Acest lucru se desfăşoară într-o centrifugă de laborator menţinută la temperatura camerei sau, dacă este folosită o centrifugă netermostatată, tuburile centrifugei se păstrează pentru echilibrare la temperatura de testare cel puţin o oră înainte de analiză.
      1.6.2.4.   Analiza
      Pentru determinarea coeficientului de partiţie este necesară determinarea concentraţiilor de substanţă analizată în ambele faze. Aceasta poate fi făcută prin prelevarea unei probe alicote din fiecare din cele două faze din fiecare tub pentru fiecare condiţie de testare şi analizarea lor prin metoda aleasă. Cantitatea totală de substanţă prezentă în ambele faze se calculează şi se compară cu cantitatea de substanţă introdusă la început.
      Faza apoasă este eşantionată printr-o operaţiune care reduce la minim riscul includerii unor urme de n-octanol: o seringă de sticlă cu ac detaşabil poate fi folosită pentru a lua probe din faza apoasă. Iniţial, seringa se umple parţial cu aer. Aerul se elimină cu atenţie în timp ce se introduce acul prin stratul de n-octanol. Un volum corespunzător din faza apoasă este tras în seringă. Seringa se scoate repede din soluţie şi acul se detaşează. Conţinutul seringii poate fi apoi folosit ca probă apoasă. Concentraţia în cele două faze separate este determinată de preferinţă printr-o metodă specifică substanţei. Exemple de metode analitice adecvate sunt:
      
                  —
               
               
                  metode fotometrice;
               
            
                  —
               
               
                  cromatografia cu gaz;
               
            
                  —
               
               
                  cromatografia lichidă de înaltă performanţă.
               
            1.6.3.   Metoda HPLC
      1.6.3.1.   Pregătire
      Aparatură
      Este necesar un cromatograf de lichide la care s-a ataşat o pompă fără pulsaţii şi un instrument de detecţie adecvat. Este recomandată folosirea unei valve de injecţie cu bucle de injecţie. Prezenţa grupelor polare în faza staţionară poate diminua serios performanţele coloanei HPLC. Prin urmare, faza staţionară va avea un procent minim de grupe polare (11). Pot fi folosite umpluturi de microparticule pentru inversarea fazelor sau coloane gata umplute. O coloană de gardă poate fi poziţionată între sistemul de injecţie şi coloana analitică.
      Faza mobilă
      Pentru a prepara solventul de eluţie se foloseşte metanol grad HPLC şi apă de puritate HPLC; solventul este degazat înainte de folosire. Se foloseşte eluţia izocratică. Se utilizează un raport metanol/apă cu un conţinut minim de apă de 25 %. În general, un amestec metanol-apă 3:1 este satisfăcător pentru eluţia compuşilor cu log P 6 într-o oră, la un debit de 1 ml/minut. Pentru compuşii cu log P mare poate fi necesar să se scurteze timpul de eluţie (şi cel al compuşilor de referinţă) prin descreşterea polarităţii fazei mobile sau a lungimii coloanei.
      Substanţele cu solubilitate foarte scăzută în n-octanol tind să dea valori neobişnuit de mici pentru log Pow prin metoda HPLC; picurile unor astfel de compuşi însoţesc uneori frontul de solvent. Aceasta se datorează probabil faptului că procesul de partiţie este prea lent pentru a atinge echilibrul în timpul necesar în mod normal pentru o separare. Scăderea debitului şi/sau micşorarea raportului metanol/apă poate fi o măsură eficientă pentru a ajunge la o valoare fiabilă.
      Compuşii de testare şi compuşii de referinţă trebuie să fie solubili în faza mobilă într-o concentraţie suficientă pentru a permite detectarea lor. Numai în cazuri excepţionale pot fi folosiţi aditivi împreună cu amestecul metanol-apă, deoarece aditivii vor schimba proprietăţile coloanei. Pentru cromatograme cu aditivi este obligatoriu să se folosească o coloană separată de acelaşi tip. Dacă amestecul metanol-apă nu este corespunzător, pot fi folosite alte amestecuri solvent organic-apă, de exemplu etanol-apă sau acetonitril-apă.
      PH-ul eluentului este un factor critic pentru compuşii ionizabili. Trebuie să fie în intervalul de pH al coloanei, care este de obicei cuprins între 2 şi 8. Este recomandabilă tamponarea. Se evită atent precipitarea sărurilor şi deteriorarea coloanei în cazul unor amestecuri fază organică-soluţie tampon. Măsurătorile HPLC cu fază staţionară de silicagel nu sunt recomandabile în cazul unui pH mai mare de 8 deoarece folosirea unei faze mobile alcaline poate cauza scăderea rapidă a performanţelor coloanei.
      Soluţii
      Compuşii de referinţă sunt cei mai puri disponibili. Dacă este posibil, compuşii care sunt folosiţi în scopuri de testare sau calibrare se dizolvă în faza mobilă.
      Condiţii experimentale
      În timpul măsurătorilor, temperatura nu variază cu mai mult de ± 2 K.
      1.6.3.2.   Măsurători
      
      Calcularea timpului mort t0
      
      Timpul mort t0 poate fi determinat prin folosirea unei serii omoloage (de exemplu n-alchil metil cetone) sau compuşi organici care nu se absorb pe coloană (de exemplu tioureea sau formamida). Pentru calcularea timpului mort t0 prin folosirea unei serii omoloage, un set de cel puţin 7 membri ai seriei omoloage este injectat şi sunt determinaţi timpii respectivi de retenţie. Timpii retenţiei brute tr(nc+1) sunt reprezentaţi ca funcţie de tr(nc) şi sunt determinate constanta a şi panta b a ecuaţiei de regresie:
      tr (nc + 1) = a + b tr (nc)
      
      (nc = numărul de atomi de carbon).Timpul mort t0 este dat de:
      t0 = a/(l – b)
      Graficul de calibrare
      Următorul pas este trasarea graficului de corelaţie între valorile lui log k şi log P pentru compuşii de referinţă. În practică, un set de 5 până la 10 compuşi de referinţă standard al căror log P se găseşte în limitele intervalului preconizat se injectează simultan şi se determină timpii de retenţie, preferabil cu un înregistrator conectat la sistemul de detecţie. Se calculează logaritmii corespunzători ai factorilor de capacitate, log k, şi se trasează graficul funcţiei log P determinat prin metoda agitării flaconului. Calibrarea se execută la intervale egale, cel puţin o dată pe zi, aşa încât să se poată ţine seama de posibilele schimbări în performanţele coloanei.
      Determinarea factorului de capacitate al substanţei de testat
      Proba este injectată într-o cantitate cât mai mică posibil de fază mobilă. Se determină timpul de retenţie (în duplicat), permiţând calcularea factorului de capacitate k. Din graficul de corelare al compuşilor de referinţă poate fi interpolat coeficientul de partiţie al substanţei de testat. Pentru coeficienţii de partiţie foarte mici şi pentru cei foarte mari, este necesară extrapolarea. În aceste cazuri particulare trebuie să se acorde atenţie limitelor de încredere ale liniei de regresie.
      2.   DATE
      Metoda agitării flaconului
      Fiabilitatea valorilor determinate pentru P poate fi testată prin compararea valorilor medii rezultate la determinările duble cu media generală.
      3.   RAPORT
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specificaţiile exacte ale substanţei (identitate şi impurităţi);
               
            
                  —
               
               
                  când metodele nu sunt aplicabile (de exemplu, pentru agenţii tensioactivi) se prezintă o valoare calculată sau una estimată bazată pe solubilităţile individuale în n-octanol şi apă;
               
            
                  —
               
               
                  toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special cele referitoare la impurităţi şi la starea fizică a substanţei.
               
            Pentru metoda agitării flaconului:
      
                  —
               
               
                  rezultatul estimării preliminare, dacă există;
               
            
                  —
               
               
                  temperatura la care s-au făcut determinările;
               
            
                  —
               
               
                  date despre metodele analitice folosite pentru determinarea concentraţiilor;
               
            
                  —
               
               
                  timpul şi viteza de centrifugare, dacă a fost folosită;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţiile măsurate în ambele faze pentru fiecare determinare (aceasta înseamnă că se prezintă un total de 12 concentraţii);
               
            
                  —
               
               
                  masa substanţei de testat, volumul fiecărei faze folosite în fiecare vas de testare şi cantitatea totală calculată de substanţă, prezentă în fiecare fază după atingerea echilibrului;
               
            
                  —
               
               
                  valorile calculate ale coeficientului de partiţie (P) şi media lor se consemnează pentru fiecare set de condiţii experimentale, ca şi media pentru toate determinările. Dacă există vreun indiciu privind coeficientul de partiţie în funcţie de concentraţie, aceasta este notată în raport;
               
            
                  —
               
               
                  se consemnează deviaţia standard a valorilor individuale ale lui P de la media lor;
               
            
                  —
               
               
                  media P a tuturor determinărilor se exprimă şi ca logaritm (în baza 10);
               
            
                  —
               
               
                  valoarea calculată teoretic pentru Pow când această valoare a fost determinată sau când valoarea măsurată este > 104;
               
            
                  —
               
               
                  pH-ul apei folosite în timpul experimentului şi al fazei apoase;
               
            
                  —
               
               
                  dacă sunt folosite soluţii tampon, justificarea pentru folosirea soluţiilor tampon în locul apei, compoziţia, concentraţia şi pH-ul soluţiilor tampon, pH-ul fazei apoase, înainte şi după experiment.
               
            Pentru metoda HPLC:
      
                  —
               
               
                  rezultatul estimării preliminare, dacă există;
               
            
                  —
               
               
                  substanţele de referinţă şi de testat şi puritatea lor;
               
            
                  —
               
               
                  intervalul de temperatură al determinărilor;
               
            
                  —
               
               
                  pH-ul la care au fost făcute determinările;
               
            
                  —
               
               
                  detalii despre coloana analitică şi de gardă, faza mobilă şi mijlocul de detecţie;
               
            
                  —
               
               
                  datele privind retenţia şi valorile log P din literatură pentru compuşii de referinţă folosiţi la calibrare;
               
            
                  —
               
               
                  detalii despre dreapta de regresie calculată (log k în funcţie de log P);
               
            
                  —
               
               
                  datele de retenţie medii şi valoarea interpolată log P pentru compusul de testat;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea echipamentului şi a condiţiilor de operare;
               
            
                  —
               
               
                  profilurile de eluţie;
               
            
                  —
               
               
                  cantităţile de substanţă de testat şi de referinţă introduse în coloană;
               
            
                  —
               
               
                  timpul mort şi cum a fost măsurat.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.
               
            
                  3.
               
               
                  Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
               
            
                  4.
               
               
                  L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, p. 683.
               
            
                  5.
               
               
                  H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, p. 219 (1981).
               
            
                  6.
               
               
                  B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, p. 73.
               
            
                  7.
               
               
                  W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1.
               
            
                  8.
               
               
                  J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, p. 675.
               
            
                  9.
               
               
                  S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, p. 787.
               
            
                  10.
               
               
                  O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, p. 223-339.
               
            
                  11.
               
               
                  R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, p. 479.
               
            
                  12.
               
               
                  A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.
               
            
                  13.
               
               
                  R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.
               
            
                  14.
               
               
                  NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.
               
            
                  15.
               
               
                  C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459.
               
            
                  16.
               
               
                  A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.
               
            
                  17.
               
               
                  C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, p. 1207.
               
            
                  18.
               
               
                  W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, p. 1113.
               
            
                  19.
               
               
                  D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, p. 382.
               
            
                  20.
               
               
                  J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979.
               
            
                  21.
               
               
                  R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984.
               
            
                  22.
               
               
                  Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Base1,1978.
               
            
                  23.
               
               
                  N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, p. 615.
               
            
         Apendicele 1
         Metode de calcul/estimare
         INTRODUCERE
         O introducere generală în metodele de calcul, cu date şi exemple este furnizată de Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a).
         Valorile calculate pentru Pow pot fi folosite:
         
                     —
                  
                  
                     pentru a decide care dintre metodele experimentale este adecvată (intervalul pentru metoda agitării flaconului: log Pow: – 2 până la 4, intervalul HPLC: log Pow: 0 până la 6);
                  
               
                     —
                  
                  
                     pentru selectarea condiţiilor de testare adecvate (de exemplu, substanţe de referinţă pentru procedurile HPLC, raportul de volume n-octanol/apă pentru metoda agitării flaconului);
                  
               
                     —
                  
                  
                     ca verificare internă de laborator a posibilelor erori experimentale;
                  
               
                     —
                  
                  
                     pentru a furniza un Pow estimat în cazul când metodele experimentale nu pot fi aplicate din motive tehnice.
                  
               METODA ESTIMATIVĂ
         
            Estimarea preliminară a coeficientului de partiţie
         
         Valoarea coeficientului de partiţie poate fi estimată prin folosirea solubilităţilor substanţei de testat în solvenţi puri. Astfel,
         
            
         METODE DE CALCUL
         
            Principiul metodelor de calcul
         
         Toate metodele de calcul se bazează pe fragmentarea formală a moleculei în structuri adecvate pentru care se cunosc creşteri fiabile ale valorilor log Pow. Log Pow al întregii molecule este apoi calculat ca sumă a valorilor corespunzătoare fragmentelor plus suma termenilor de corecţie pentru interacţiunile intramoleculare.
         Listele constantelor fragmentelor şi ale termenilor de corecţie sunt disponibile în (b), (c), (d) şi (e). Unele sunt actualizate cu regularitate (b).
         Criterii de calitate
         În general, fiabilitatea metodei de calcul scade odată cu creşterea complexităţii compusului studiat. În cazul moleculelor simple, cu masa moleculară scăzută şi una sau două grupe funcţionale, se preconizează abateri de la 0,1 până la 0,3 unităţi log Pow între rezultatele diferitelor metode de fragmentare şi valoarea măsurată. În cazul moleculelor mai complexe, marja de eroare poate fi mai mare. Aceasta va depinde de fiabilitatea şi disponibilitatea constantelor de fragmente, precum şi de abilitatea analistului de a recunoaşte interacţiuni intramoleculare (de exemplu legături de hidrogen) şi de corecta folosire a factorilor de corecţie (o problemă care apare mai puţin dacă se foloseşte programul CLOGP-3) (b). În cazul compuşilor ionizabili este importantă atribuirea corectă a sarcinii sau a gradului de ionizare.
         Metode de calcul
         Metoda π a lui Hansch
         Constanta substituentului hidrofob original, π, introdusă de Fujita et al. (f) se defineşte ca:
         πx = log Pow (PhX) – log Pow (PhH)
         unde Pow (PhX) este coeficientul de partiţie al unui derivat aromatic şi Pow (PhH) este coeficientul de partiţie al compusului iniţial.
         [de exemplu πCl = log Pow (C6H5Cl) – log Pow (C6H6) = 2,84 – 2,13 = 0,71].
         În concordanţă cu definiţia, metoda π este aplicabilă în special pentru substituenţii aromatici, valorile π pentru un mare număr de substituenţi fiind tabelate (b) (c) (d). Acestea sunt folosite pentru calcularea log Pow pentru molecule sau substructuri aromatice.
         Metoda Rekker
         Conform lui Rekker (g), valoarea pentru log Pow se calculează după cum urmează:
         
            
         unde fi reprezintă constantele diferitelor fragmente moleculare şi ai frecvenţa apariţiei lor în molecula investigată. Termenii de corecţie pot fi exprimaţi ca un multiplu întreg al unei singure constante Cm (aşa numita „constantă magică”). Constantele de fragment fi şi Cm au fost determinate dintr-o listă de 1 054 valori experimentale pentru Pow (825 de compuşi), folosind analiza regresivă multiplă (c) (h). Determinarea termenilor de interacţiune este efectuată în concordanţă cu regulile stabilite descrise în literatură (e) (h) (i).
         Metoda Leo-Hansch
         Potrivit lui Leo şi Hansch (c), valoarea log Pow se calculează din:
         
            
         unde fi reprezintă constantele diferitelor fragmente moleculare, Fj termenii de corecţie, iar ai, bj frecvenţa fragmentului corespunzător. Din valorile experimentale Pow, a fost determinată prin încercare şi eroare o listă a valorilor pentru fragmentele atomice şi de grup şi o listă a termenilor de corecţie Fj (aşa numiţii „factori”).Termenii de corecţie au fost ordonaţi în diferite clase (a) (c). A lua în considerare toate regulile şi termenii de corecţie este relativ complicat şi consumă timp. Pentru această metodă există câteva pachete de programe computerizate (b).
         Metoda combinată
         Calculul log Pow al moleculelor complexe poate fi considerabil îmbunătăţit, dacă molecula este împărţită în substructuri mari, pentru care există valori log Pow fiabile fie din tabele (b) (c), fie din măsurătorile proprii. Astfel de fragmente (de exemplu heterocicluri, antrachinona, azobenzen) pot fi apoi combinate cu valorile π Hansch sau cu constantele fragmentelor Rekker sau Leo.
         Observaţii
         
                     (i)
                  
                  
                     Metodele de calcul pot fi aplicate compuşilor parţial sau total ionizaţi numai atunci când este posibil să se ia în considerare factorii de corecţie necesari.
                  
               
                     (ii)
                  
                  
                     Dacă se presupune că există legături de hidrogen intramoleculare, trebuie adăugaţi termenii de corecţie corespunzători (aproximativ +0,6 până la +1,0 unităţi log Pow) (a). Indicaţii privind prezenţa unor astfel de legături pot fi obţinute din modelele stereochimice sau din datele spectroscopice ale moleculei.
                  
               
                     (iii)
                  
                  
                     Dacă sunt posibile diferite forme tautomere, structura cea mai probabilă va fi folosită ca bază de calcul.
                  
               
                     (iv)
                  
                  
                     Ediţiile revizuite ale listelor cu constantele fragmentelor se vor urmări atent.
                  
               Raport de testare
         Când se folosesc metodele de calcul/estimare, raportul de testare cuprinde următoarele informaţii, dacă este posibil:
         
                     —
                  
                  
                     descrierea substanţei (amestec, impurităţi etc.);
                  
               
                     —
                  
                  
                     indicarea oricăror posibile legături de hidrogen intramoleculare, a disocierii, a sarcinii şi a oricăror altor efecte neobişnuite (de exemplu tautomerie);
                  
               
                     —
                  
                  
                     descrierea metodei de calcul;
                  
               
                     —
                  
                  
                     identificarea sau anexarea bazei de date folosită;
                  
               
                     —
                  
                  
                     particularităţi în alegerea fragmentelor;
                  
               
                     —
                  
                  
                     documentaţia cuprinzătoare a calculului.
                  
               REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
         
                     (a)
                  
                  
                     W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).
                  
               
                     (c)
                  
                  
                     C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
                  
               
                     (d)
                  
                  
                     A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.
                  
               
                     (e)
                  
                  
                     R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem.-Chill. Ther. 1979, vol. 14, p. 479.
                  
               
                     (f)
                  
                  
                     T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, p. 5175.
                  
               
                     (g)
                  
                  
                     R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.
                  
               
                     (h)
                  
                  
                     C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459.
                  
               
                     (i)
                  
                  
                     R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.
                  
               
      
         Apendicele 2
         Substanţele de referinţă recomandate pentru metoda HPLC
         
                     Nr. crt.
                  
                  
                     Substanţă de referinţă
                  
                  
                     log Pow
                     
                  
                  
                     pKa
                  
               
                     1
                  
                  
                     2-butanonă
                  
                  
                     0,3
                  
                  
                      
                  
               
                     2
                  
                  
                     4-acetilpiridină
                  
                  
                     0,5
                  
                  
                      
                  
               
                     3
                  
                  
                     anilină
                  
                  
                     0,9
                  
                  
                      
                  
               
                     4
                  
                  
                     acetanilidă
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                      
                  
               
                     5
                  
                  
                     alcool benzilic
                  
                  
                     1,1
                  
                  
                      
                  
               
                     6
                  
                  
                     p-metoxifenol
                  
                  
                     1,3
                  
                  
                     pKa = 10,26
                  
               
                     7
                  
                  
                     acid fenoxi acetic
                  
                  
                     1,4
                  
                  
                     pKa = 3,12
                  
               
                     8
                  
                  
                     fenol
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     pKa = 9,92
                  
               
                     9
                  
                  
                     2,4-dinitrofenol
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     pKa = 3,96
                  
               
                     10
                  
                  
                     benzonitril
                  
                  
                     1,6
                  
                  
                      
                  
               
                     11
                  
                  
                     fenilacetonitril
                  
                  
                     1,6
                  
                  
                      
                  
               
                     12
                  
                  
                     alcool 4-metilbenzilic
                  
                  
                     1,6
                  
                  
                      
                  
               
                     13
                  
                  
                     acetofenonă
                  
                  
                     1,7
                  
                  
                      
                  
               
                     14
                  
                  
                     2-nitrofenol
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     pKa = 7,17
                  
               
                     15
                  
                  
                     acid 3-nitrobenzoic
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     pKa = 3,47
                  
               
                     16
                  
                  
                     4-cloranilină
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     pKa = 4,15
                  
               
                     17
                  
                  
                     nitrobenzen
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                      
                  
               
                     18
                  
                  
                     alcool cinamic
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                      
                  
               
                     19
                  
                  
                     acid benzoic
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                     pKa = 4,19
                  
               
                     20
                  
                  
                     p-crezol
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                     pKa = 10,17
                  
               
                     21
                  
                  
                     acid cinamic
                  
                  
                     2,1
                  
                  
                     pKa = 3,89 cis 4,44 trans
                  
               
                     22
                  
                  
                     anisol
                  
                  
                     2,1
                  
                  
                      
                  
               
                     23
                  
                  
                     benzoat de metil
                  
                  
                     2,1
                  
                  
                      
                  
               
                     24
                  
                  
                     benzen
                  
                  
                     2,1
                  
                  
                      
                  
               
                     25
                  
                  
                     acid 3- metilbezoic
                  
                  
                     2,4
                  
                  
                     pKa = 4,27
                  
               
                     26
                  
                  
                     4-clorofenol
                  
                  
                     2,4
                  
                  
                     pKa = 9,1
                  
               
                     27
                  
                  
                     tricloretilenă
                  
                  
                     2,4
                  
                  
                      
                  
               
                     28
                  
                  
                     atrazină
                  
                  
                     2,6
                  
                  
                      
                  
               
                     29
                  
                  
                     benzoat de etil
                  
                  
                     2,6
                  
                  
                      
                  
               
                     30
                  
                  
                     2,6-diclorbenzonitril
                  
                  
                     2,6
                  
                  
                      
                  
               
                     31
                  
                  
                     acid 3-clorbenzoic
                  
                  
                     2,7
                  
                  
                     pKa = 3,82
                  
               
                     32
                  
                  
                     toluen
                  
                  
                     2,7
                  
                  
                      
                  
               
                     33
                  
                  
                     1- naftol
                  
                  
                     2,7
                  
                  
                     pKa = 9,34
                  
               
                     34
                  
                  
                     2,3-dicloranilină
                  
                  
                     2,8
                  
                  
                      
                  
               
                     35
                  
                  
                     clorbenzen
                  
                  
                     2,8
                  
                  
                      
                  
               
                     36
                  
                  
                     alil-fenileter
                  
                  
                     2,9
                  
                  
                      
                  
               
                     37
                  
                  
                     brombenzen
                  
                  
                     3,0
                  
                  
                      
                  
               
                     38
                  
                  
                     etilbenzen
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                      
                  
               
                     39
                  
                  
                     benzofenonă
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                      
                  
               
                     40
                  
                  
                     4-fenilfenol
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                     pKa = 9,54
                  
               
                     41
                  
                  
                     timol
                  
                  
                     3,3
                  
                  
                      
                  
               
                     42
                  
                  
                     1,4-diclorbenzen
                  
                  
                     3,4
                  
                  
                      
                  
               
                     43
                  
                  
                     difenilamină
                  
                  
                     3,4
                  
                  
                     pKa = 0,79
                  
               
                     44
                  
                  
                     naftalină
                  
                  
                     3,6
                  
                  
                      
                  
               
                     45
                  
                  
                     fenilbenzoat
                  
                  
                     3,6
                  
                  
                      
                  
               
                     46
                  
                  
                     izopropilbenzen
                  
                  
                     3,7
                  
                  
                      
                  
               
                     47
                  
                  
                     2,4,6-triclorfenol
                  
                  
                     3,7
                  
                  
                     pKa = 6
                  
               
                     48
                  
                  
                     bifenil
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                      
                  
               
                     49
                  
                  
                     benzilbenzoat
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                      
                  
               
                     50
                  
                  
                     2,4-dinitro-6 sec-butilfenol
                  
                  
                     4,1
                  
                  
                      
                  
               
                     51
                  
                  
                     1,2,4-triclorbenzen
                  
                  
                     4,2
                  
                  
                      
                  
               
                     52
                  
                  
                     acid dodecanoic
                  
                  
                     4,2
                  
                  
                      
                  
               
                     53
                  
                  
                     difenileter
                  
                  
                     4,2
                  
                  
                      
                  
               
                     54
                  
                  
                     n- butilbenzen
                  
                  
                     4,5
                  
                  
                      
                  
               
                     55
                  
                  
                     fenantren
                  
                  
                     4,5
                  
                  
                      
                  
               
                     56
                  
                  
                     fluoranten
                  
                  
                     4,7
                  
                  
                      
                  
               
                     57
                  
                  
                     dibenzil
                  
                  
                     4,8
                  
                  
                      
                  
               
                     58
                  
                  
                     2,6-difenil-piridină
                  
                  
                     4,9
                  
                  
                      
                  
               
                     59
                  
                  
                     trifenilamină
                  
                  
                     5,7
                  
                  
                      
                  
               
                     60
                  
                  
                     DDT
                  
                  
                     6,2
                  
                  
                      
                  
               
                     Alte substanţe de referinţă cu log Pow mic
                  
               
                     1
                  
                  
                     acid nicotinic
                  
                  
                     -0,07
                  
                  
                      
                  
               
      A.9.   PUNCTUL DE INFLAMABILITATE
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Pentru efectuarea acestui test, este util să se colecteze informaţii preliminare despre inflamabilitatea substanţei. Modul de operare este aplicabil substanţelor lichide ai căror vapori se pot aprinde în prezenţa unei surse de aprindere. Metodele de testare prezentate în acest text sunt fiabile numai pentru intervalele de puncte de inflamabilitate specificate pentru fiecare metodă în parte.
      La alegerea metodei ce urmează să fie folosită se va lua în considerare posibilitatea apariţiei unor reacţii chimice între substanţă şi suportul probei.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Punctul de inflamabilitate este cea mai joasă temperatură, corectată la presiunea de 101,325 kPa, la care lichidul degajă vapori, în condiţiile specifice ale metodei de analiză, într-o asemenea cantitate încât în vasul de testare se produce un amestec inflamabil vapori/aer.
      Unităţi: oC
      t = T – 273,15
      (t în oC şi T în K)
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă în toate cazurile în care se studiază o nouă substanţă. Acestea trebuie în special să servească la etalonarea periodică a metodei şi la comparaţia cu rezultatele obţinute prin alte metode
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI
      Substanţa se introduce în vasul de testare şi este încălzită sau răcită până la temperatura de testare conform procedurii specifice metodei de testare. Încercările de aprindere sunt efectuate pentru a dovedi dacă eşantionul se aprinde sau nu la temperatura de testare.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      1.5.1.   Repetabilitate
      Repetabilitatea variază în funcţie de intervalul punctului de inflamabilitate şi de metoda folosită; maximum 2 oC.
      1.5.2.   Sensibilitate
      Sensibilitatea depinde de metoda de testare folosită.
      1.5.3.   Specificitate
      Specificitatea unora dintre metode este limitată la anumite intervale de puncte de inflamabilitate şi depinde de caracteristicile substanţei (de exemplu, viscozitate mare).
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      1.6.1.   Pregătiri
      O probă de substanţă se introduce într-un aparat de testare în conformitate cu punctul 1.6.3.1 şi/sau 1.6.3.2.
      Pentru siguranţă se recomandă ca pentru substanţele reactive sau toxice să fie folosită o metodă care utilizează o cantitate mică de probă, circa 2 cm3.
      1.6.2.   Condiţii experimentale
      Aparatul se aşează într-o poziţie fără curenţi de aer, în conformitate cu normele de siguranţă.
      1.6.3.   Desfăşurarea testului
      1.6.3.1.   Metoda echilibrului
      A se vedea ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.
      1.6.3.2.   Metoda non-echilibrului
      Aparatul Abel:
      A se vedea BS 2000 partea 170, NF M07-011, NF T66-009.
      Aparatul Abel-Pensky:
      A se vedea EN 57, DIN 51755 partea 1 (pentru temperaturi de la 5o la 65 oC), DIN 51755 partea 2 (pentru temperaturi sub 5 oC), NF M07-036.
      Aparatul Tag:
      A se vedea ASTM D 56.
      Aparatul Pensky-Martens:
      A se vedea ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.
      Observaţii:
      Când punctul de inflamabilitate, determinat printr-o metodă de non-echilibru în conformitate cu punctul 1.6.3.2, are valori de 0 ± 2 oC, 21 ± 2 oC sau 55 ± 2 oC, acest lucru se confirmă printr-o metodă de echilibru, folosindu-se acelaşi aparat.
      Numai metodele prin care se poate determina temperatura de inflamabilitate pot fi folosite pentru notificări.
      Pentru a determina punctul de inflamabilitate al lichidelor vâscoase (vopsele, răşini şi altele similare) care conţin solvenţi, pot fi folosite numai aparate şi metode potrivite pentru determinarea punctului de inflamabilitate al lichidelor vâscoase.
      A se vedea ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 partea 1.
      
                  2.
               
               
                  DATE
               
            3.   RAPORT
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specificaţiile exacte ale substanţei (identificare şi impurităţi);
               
            
                  —
               
               
                  o descriere a metodei folosite, precum şi orice posibile abateri;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele şi orice observaţie suplimentară relevantă pentru interpretarea rezultatelor.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      Niciuna.
      A.10.   INFLAMABILITATE (SOLIDE)
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Înainte de efectuarea testului este util să se colecteze informaţii preliminare asupra posibilelor proprietăţi explozive ale substanţei.
      Acest test se aplică numai substanţelor sub formă de pulbere, granule sau pastă.
      Pentru a nu include toate substanţele care se pot aprinde, ci numai acelea care ard rapid sau acelea al căror comportament la ardere este periculos în orice mod, se consideră că sunt foarte inflamabile numai substanţele a căror viteză de ardere depăşeşte o anumită valoare-limită.
      Poate fi deosebit de periculos dacă incandescenţa se propagă printr-o pulbere metalică din cauza dificultăţilor în stingerea focului. Pulberile metalice vor fi considerate foarte inflamabile dacă întreţin propagarea incandescenţei în toată masa într-un interval de timp definit.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Timpul de ardere este exprimat în secunde.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Nu sunt menţionate.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI
      Substanţa este dispusă sub forma unei benzi continue sau a unui amestec de pulbere explozivă de aproximativ 250 mm lungime şi este efectuat un test preliminar pentru a stabili dacă are loc, prin aprindere cu o flacără de gaz, propagarea prin ardere cu flacără sau mocnit. Dacă propagarea de-a lungul a 200 mm de amestec are loc într-un interval de timp specificat, atunci se efectuează un program complet de testare pentru a determina viteza de ardere.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Nu sunt menţionate.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      1.6.1.   Testul preliminar
      Substanţa este dispusă sub forma unui cartuş compact sau a unui amestec de pulbere explozivă de aproximativ 250 mm lungime, 20 mm lăţime, 10 mm înălţime, pe o placă de bază necombustibilă, neporoasă şi care nu conduce bine căldura. O flacără de la un arzător cu gaz (minimum 5 mm diametru) este aplicată la unul din capetele amestecului de pulbere explozivă până când pulberea se aprinde sau timp de maximum 2 minute (5 minute pentru pulberi metalice sau de aliaje metalice). Se observă dacă de-a lungul celor 200 mm de amestec combustia se propagă în perioada de testare de 4 minute (sau 40 de minute pentru pulberile de metal). Dacă substanţa nu se aprinde şi combustia nu se propagă, nici prin ardere cu flacără, nici prin ardere mocnită, de-a lungul celor 200 mm de amestec de pulbere explozivă în perioada de testare de 4 minute (sau 40 minute), atunci substanţa nu este considerată foarte inflamabilă şi nu este necesară o altă testare. Dacă substanţa propagă arderea de-a lungul a 200 mm lungime de amestec de pulbere explozivă în mai puţin de 4 minute, sau mai puţin de 40 de minute pentru pulberile metalice, atunci se urmează metoda descrisă mai jos (punctul 1.6.2 şi următoarele).
      1.6.2.   Testarea vitezei de ardere
      1.6.2.1.   Pregătire
      Substanţele granulare sau pulberile sunt introduse lejer într-o matriţă de 250 mm lungime cu secţiune transversală triunghiulară cu înălţime interioară de 10 mm şi lăţime de 20 mm. Pe ambele feţe ale matriţei, pe direcţie longitudinală, se montează două plăci metalice ca opritoare laterale care depăşesc cu 2 mm extremitatea superioară a secţiunii transversale triunghiulare (figura). Apoi se lasă matriţa să cadă de trei ori de la o înălţime de 2 cm pe o suprafaţă solidă. Dacă este necesar, forma este apoi umplută din nou. Substanţa în exces care rămâne se curăţă cu o racletă oblică. Plăcile opritoare se scot şi substanţa rămasă este îndepărtată cu o racletă. Se pune deasupra matriţei o placă de bază necombustibilă, neporoasă şi slab conducătoare de căldură, ansamblul este răsturnat şi se scoate forma.
      Substanţele sub formă de pastă sunt întinse pe o placă necombustibilă, neporoasă şi slab conducătoare de căldură sub forma unei fâşii de 250 mm lungime cu o secţiune transversală de aproximativ 1 cm.
      1.6.2.2.   Condiţii experimentale
      În cazul substanţelor sensibile la umezeală, testul va fi efectuat cât mai repede posibil după scoaterea din recipient.
      1.6.2.3.   Desfăşurarea testului
      Se pune eşantionul perpendicular pe curentul de aer din nişa de tiraj.
      Viteza aerului trebuie să fie suficientă pentru a preveni degajarea vaporilor în laborator şi să nu varieze în timpul testului. Curentul de aer trebuie să formeze un ecran în jurul aparatului.
      O flacără fierbinte de la un arzător cu gaz (minimum 5 mm diametru) este folosită pentru a aprinde substanţa în formă de cartuş, la o margine. Când cartuşul a ars pe o distanţă de 80 mm se măsoară viteza de ardere de-a lungul următorilor 100 de mm.
      Testul se efectuează de 6 ori, folosind de fiecare dată o placă rece, curată, afară de cazul când este observat mai devreme un rezultat pozitiv.
      2.   DATE
      Timpul de ardere din testul preliminar (1.6.1) şi cel mai scurt timp de ardere din cele 6 teste (1.6.2.3) sunt relevante pentru evaluare.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORT DE TESTARE
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specificaţiile exacte ale substanţei (identificare şi impurităţi);
               
            
                  —
               
               
                  o descriere a substanţei de testat, starea sa fizică, inclusiv conţinutul de umezeală;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele testului preliminar de triere şi ale testului vitezei de ardere, dacă au fost efectuate;
               
            
                  —
               
               
                  toate observaţiile suplimentare relevante pentru interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Substanţele sub formă de pulbere, pastă sau granulare se consideră foarte inflamabile dacă timpul de ardere dintr-unul din testele efectuate conform metodei de testare descrise la 1.6.2. este mai mic de 45 de secunde. Pulberile metalice sau de aliaje metalice sunt considerate foarte inflamabile dacă pot fi aprinse şi flacăra sau zona de reacţie se întinde asupra întregului eşantion în 10 minute sau mai puţin.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.
      
         Apendice
         Figură
         Matriţa şi accesoriile pentru eşantionul în formă de cartuş
         (Toate dimensiunile în milimetri)
         
            
      
      A.11.   INFLAMABILITATE (GAZE)
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Prin această metodă se determină dacă amestecurile de gaze cu aer, la temperatura camerei (circa 20 oC) şi presiune atmosferică, sunt inflamabile şi, în acest caz, în ce interval de concentraţii. Amestecurile cu aer ale gazului testat, în concentraţii crescânde, sunt expuse unei scântei electrice şi se observă dacă are loc aprinderea.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Intervalul de inflamabilitate este intervalul de concentraţie dintre limita de explozie inferioară şi cea superioară. Limitele de explozie inferioară şi superioară sunt acele limite de concentraţie ale gazului inflamabil în aer la care propagarea flăcării nu are loc.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Nu sunt menţionate.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI
      Concentraţia gazului în aer se creşte treptat şi în fiecare etapă amestecul se expune la scânteie electrică.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Nu sunt menţionate.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      1.6.1.   Aparatură
      Vasul de testare este un cilindru de sticlă vertical cu un diametru interior de minimum 50 mm şi o înălţime de minimum 300 de mm. Electrozii de aprindere sunt separaţi de o distanţă de 3 până la 5 mm şi sunt plasaţi la 60 mm deasupra fundului cilindrului. Cilindrul este prevăzut cu o supapă de descărcare a presiunii. Aparatul trebuie să fie protejat pentru a limita posibilele efecte ale exploziei.
      Ca sursă de aprindere este folosită o scânteie cu o durată de 0,5 secunde, generată de un transformator de înaltă tensiune cu o tensiune de ieşire de 10-15 kV (maximum de putere consumată 300 W). Un exemplu de aparat adecvat este descris în referinţa bibliografică 2.
      1.6.2.   Condiţii experimentale
      Testul trebuie efectuat la temperatura camerei (circa 20 oC).
      1.6.3.   Desfăşurarea testului
      Folosind o pompă dozatoare, un amestec cu concentraţie cunoscută de gaz în aer este introdus în cilindrul de sticlă. Prin amestec se trece o scânteie şi se observă dacă flacăra se detaşează de sursa de aprindere şi se propagă independent. Concentraţia gazului este mărită în paşi de 1 % din volum până când are loc aprinderea conform descrierii de mai sus.
      Dacă structura chimică a gazului indică faptul că acesta nu este inflamabil şi poate fi calculată compoziţia amestecului stoechiometric cu aerul, atunci este necesar să se testeze numai amestecuri din intervalul de la 10 % sub concentraţia stoechiometrică până la 10 % peste această concentraţie, în paşi de 1 %.
      2.   DATE
      Propagarea flăcării este singura informaţie relevantă pentru determinarea acestei proprietăţi.
      3.   RAPORT
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specificaţiile exacte ale substanţei (identificare şi impurităţi);
               
            
                  —
               
               
                  o descriere, cu dimensiuni, a aparatului utilizat;
               
            
                  —
               
               
                  temperatura la care a fost efectuat testul;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţiile testate şi rezultatele obţinute;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatul testului: gaz neinflamabil sau gaz foarte inflamabil;
               
            
                  —
               
               
                  dacă se ajunge la concluzia că gazul nu este inflamabil, se va specifica intervalul de concentraţie în care a fost testat în paşi de 1 %;
               
            
                  —
               
               
                  toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor trebuie raportate.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  NF T 20-041 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.
               
            
                  2.
               
               
                  W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen'. Chem.-Ing.- Tech. 1984, vol, 156, 2, p. 126-127. Wortmann, T. Redeker und H. Schacke. 'Entwicklung
               
            A.12.   INFLAMABILITATE (CONTACTUL CU APA)
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Metoda poate fi folosită pentru a stabili dacă reacţia substanţei cu apa sau cu umezeala din aer conduce la degajarea unor cantităţi periculoase de gaz sau gaze foarte inflamabile.
      Metoda poate fi aplicată atât substanţelor solide, cât şi celor lichide. Această metodă nu este aplicabilă substanţelor care se aprind în mod spontan în contact cu aerul.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Foarte inflamabil: o substanţă care în contact cu apa sau aerul umed degajă gaze foarte inflamabile în cantităţi periculoase la un debit minim de 1 litru/kg pe oră.
      1.3.   PRINCIPUL METODEI
      Substanţa este testată în concordanţă cu succesiunea de paşi descrisă mai jos; dacă are loc aprinderea la unul din paşi, nu mai este necesară testarea în continuare. Dacă se ştie că substanţa nu reacţionează violent cu apa atunci se va trece direct la pasul 4 (punctul 1.3.4).
      1.3.1.   Pasul 1
      Proba se introduce într-un jgheab care conţine apă distilată la 20 oC şi se notează dacă gazul dezvoltat se aprinde.
      1.3.2.   Pasul 2
      Substanţa este plastă pe o hârtie de filtru care pluteşte la suprafaţa apei distilate dintr-o capsulă de laborator, la 20 oC, şi se observă dacă gazul dezvoltat se aprinde. Hârtia de filtru are rolul numai de a ţine substanţa într-un loc, pentru a creşte şansa de aprindere.
      1.3.3.   Pasul 3
      Eşantionul este prelucrat sub forma unui cartuş de aproximativ 2 cm înălţime şi 3 cm diametru. Se adaugă câteva picături de apă şi se notează dacă gazul dezvoltat se aprinde.
      1.3.4.   Pasul 4
      Eşantionul este amestecat cu apă distilată la 20 oC şi este măsurată viteza de degajare a gazului în timpul unei perioade de 7 ore, la intervale de 1 oră. Dacă viteza de degajare este inegală, sau este crescătoare, după 7 ore, timpul de măsurare poate fi extins la un timp maxim de 5 zile. Testul poate fi oprit dacă viteza la un moment dat depăşeşte 1 l/kg/h.
      1.4.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Nu sunt menţionate.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Nu sunt menţionate.
      1.6.   DESCRIEREA METODELOR
      1.6.1.   Pasul 1
      1.6.1.1.   Condiţii experimentale
      Testul este efectuat la temperatura camerei (circa 20 oC).
      1.6.1.2.   Desfăşurarea testului
      O cantitate mică (aproximativ 2 mm diametru) din eşantion se introduce într-un jgheab cu apă distilată. Se notează dacă (i) se dezvoltă vreun gaz şi (ii) dacă are loc aprinderea gazului. Dacă are loc aprinderea gazului, nu mai este necesară testarea în continuare a substanţei deoarece substanţa este considerată periculoasă.
      1.6.2.   Pasul 2
      1.6.2.1.   Aparatură
      O hârtie de filtru este făcută să plutească pe suprafaţa plană de apă distilată într-un vas potrivit, de exemplu o sticlă de ceas cu 100 mm diametru.
      1.6.2.2.   Condiţii experimentale
      Testul se efectuează la temperatura camerei (circa 20 oC).
      1.6.2.3.   Desfăşurarea testului
      O cantitate mică (aproximativ 2 mm diametru) din eşantion se introduce în centrul unei hârtii de filtru. Se va nota dacă (i) apar gaze şi (ii) dacă are loc aprinderea gazului. Dacă are loc aprinderea gazului, nu mai este necesară testarea în continuare a substanţei deoarece substanţa este considerată periculoasă.
      1.6.3.   Pasul 3
      1.6.3.1.   Condiţiile experimentale
      Testul se efectuează la temperatura camerei (circa 20 oC).
      1.6.3.2.   Desfăşurarea testului
      Eşantionul este prelucrat sub forma unui cartuş de aproximativ 2 cm înălţime şi 3 cm diametru şi cu o scobitură la vârf. Câteva picături de apă sunt adăugate în scobitură şi se notează dacă (i) apar gaze şi (ii) dacă are loc aprinderea gazului. Dacă are loc aprinderea gazului, nu mai este necesară testarea în continuare a substanţei deoarece substanţa este considerată periculoasă.
      1.6.4.   Pasul 4
      1.6.4.1.   Aparatură
      Instalaţia este descrisă în figură.
      1.6.4.2.   Condiţiile experimentale
      Se examinează containerul cu eşantion pentru a observa dacă există pulberi < 500 μm (dimensiunea particulei). Dacă pulberea reprezintă mai mult de 1 % g/g din total sau dacă eşantionul este friabil, atunci toată substanţa va fi mojarată până la pulbere înainte de testare pentru a permite reducerea dimensiunilor particulelor în timpul depozitării şi manipulării; în caz contrar, substanţa va fi testată aşa cum a fost primită. Testul va fi efectuat la temperatura camerei (circa 20 oC) şi la presiune atmosferică.
      1.6.4.3.   Desfăşurarea testului
      10-20 ml de apă se pun în pâlnia de picurare a aparatului şi 10 grame din substanţă se introduc în paharul conic. Volumul de gaz degajat poate fi măsurat prin orice mijloc corespunzător. Se deschide robinetul pâlniei de picurare pentru a lăsa apa să treacă în paharul conic şi se porneşte cronometrul. Degajarea gazului este măsurată la intervale de o oră de-a lungul unei perioade de 7 ore. Dacă în timpul acestei perioade degajarea gazului este inegală sau dacă la sfârşitul acestei perioade viteza de degajare a gazului este în creştere, atunci măsurătorile vor fi continuate timp de cel mult 5 zile. Dacă la un moment dat în timpul măsurărilor viteza de degajare a gazului depăşeşte 1 l/kg/oră, testul poate fi întrerupt. Testul se efectuează de 3 ori.
      Dacă identitatea chimică a gazului este necunoscută, gazul se analizează. Atunci când gazul conţine componenţi foarte inflamabili şi nu se cunoaşte dacă amestecul este foarte inflamabil, trebuie preparat un amestec cu aceeaşi compoziţie şi testat conform metodei A.11.
      2.   DATE
      Substanţa este considerată periculoasă dacă:
      
                  —
               
               
                  are loc o aprindere spontană în oricare din etapele metodei de testare;
                  sau
               
            
                  —
               
               
                  există o degajare de gaz inflamabil cu o viteză mai mare de 1 l/kg de substanţă pe oră.
               
            3.   RAPORT
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specificaţiile exacte ale substanţei (identificare şi impurităţi);
               
            
                  —
               
               
                  detalii despre prepararea iniţială a substanţei;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele testelor (paşii 1, 2, 3 şi 4);
               
            
                  —
               
               
                  identitatea chimică a gazului degajat;
               
            
                  —
               
               
                  viteza de degajare a gazului, dacă s-a efectuat pasul 4 (punctul 1.6.4);
               
            
                  —
               
               
                  orice observaţie suplimentară relevantă pentru interpretarea rezultatelor.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.
               
            
                  2.
               
               
                  NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
               
            
         Apendice
         Figura
         Aparat
         
            
      
      A.13.   PROPRIETĂŢI PIROFORICE ALE SOLIDELOR ŞI ALE LICHIDELOR
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Procedura este aplicabilă substanţelor solide sau lichide care, în cantităţi mici, se aprind spontan la scurt timp după ce intră în contact cu aerul la temperatura camerei (circa 20 oC).
      Această metodă de testare nu reglementează substanţele care necesită expunere la aer ore sau zile la temperatura camerei sau cele la care se produce aprinderea la temperaturi ridicate.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Substanţele sunt considerate ca având proprietăţi piroforice dacă se aprind sau se carbonizează în condiţiile descrise la punctul 1.6.
      Autoaprinderea lichidelor poate fi, de asemenea, testată folosind metoda A.15 Temperatura de autoaprindere (lichide şi gaze).
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Nu sunt menţionate.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI
      Substanţa, solidă sau lichidă, este depusă pe un suport inert şi adusă în contact cu aerul la temperatura ambiantă timp de 5 minute. Dacă substanţele lichide nu se aprind, sunt absorbite pe o hârtie de filtru şi expuse la aer la temperatura ambiantă (circa 20 oC) pentru 5 minute. Dacă o substanţă lichidă ori solidă se aprinde sau dacă o substanţă lichidă aprinde sau carbonizează hârtia de filtru, atunci acea substanţă este considerată a fi piroforică.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Repetabilitatea: din motive de siguranţă, un singur rezultat pozitiv este suficient pentru ca substanţa să fie considerată piroforică.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      1.6.1.   Aparatură
      O capsulă de porţelan de cca. 10 cm diametru se umple cu pământ de diatomee până la o înălţime de aproximativ 5 mm, la temperatura camerei (circa 20 oC).
      Notă:
      Pământul de diatomee sau o altă substanţă inertă comparabilă care este disponibilă în mod uzual este considerat ca reprezentativ pentru solul pe care proba poate fi răsturnată în caz de accident.
      Pentru testarea lichidelor care nu se aprind în contact cu aerul este necesară o hârtie de filtru uscată atunci când intră în contact cu un agent purtător inert.
      1.6.2.   Desfăşurarea testului
      (a)   Solide sub formă de pulbere
      Se toarnă 1-2 cm3 de pulbere de substanţă de la circa 1 m înălţime pe o suprafaţă necombustibilă şi se observă dacă substanţa se aprinde în timpul turnării sau în 5 minute de la depunere.
      Testul este efectuat de 6 ori dacă nu are loc aprinderea.
      (b)   Lichide
      Se toarnă aproximativ circa 5 cm3 de lichid într-o capsulă de porţelan şi se observă dacă substanţa se aprinde în interval de 5 minute.
      Dacă nu are loc nicio aprindere în 6 testări, se vor efectua următoarele teste:
      Un eşantion de 0,5 ml este împins dintr-o seringă pe o hârtie de filtru pliată şi se observă dacă are loc aprinderea sau carbonizarea hârtiei de filtru în 5 minute de la adăugarea lichidului. Testul este efectuat de 3 ori dacă nu are loc aprinderea sau carbonizarea.
      2.   DATE
      2.1.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Testarea poate fi întreruptă atunci când apare un rezultat pozitiv într-unul din teste.
      2.2.   EVALUARE
      Dacă substanţa se aprinde în 5 minute de la adăugarea ei la un purtător inert şi expunerea la aer sau o substanţă lichidă carbonizează sau aprinde o hârtie de filtru în 5 minute de când a fost adăugată şi expusă la aer, este considerată a fi piroforică.
      3.   RAPORT
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specificaţiile exacte ale substanţei (identificare şi impurităţi);
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele testelor;
               
            
                  —
               
               
                  orice observaţie suplimentară relevantă pentru interpretarea rezultatelor.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.
               
            
                  2.
               
               
                  Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.
               
            A.14.   PROPRIETĂŢI EXPLOZIVE
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Prezenta metodă permite determinarea probabilităţii ca o substanţă solidă sau sub formă de pastă să prezinte pericol de explozie atunci când este supusă la efectul unei flăcări (sensibilitate termică), la şoc mecanic sau la frecare (sensibilitate la stimuli mecanici) sau ca o substanţă lichidă să prezinte pericol de explozie atunci când este supusă la efectul unei flăcări sau la şoc.
      Metoda cuprinde trei părţi:
      
                  (a)
               
               
                  un test de sensibilitate termică (1);
               
            
                  (b)
               
               
                  un test de sensibilitate mecanică la şoc (1);
               
            
                  (c)
               
               
                  un test de sensibilitate mecanică la frecare (1).
               
            Metoda oferă date care permit evaluarea probabilităţii de a amorsa o explozie cu ajutorul unor stimuli obişnuiţi. Scopul ei nu este să determine dacă o substanţă sau un preparat este sau nu este susceptibil de a exploda în orice condiţii.
      Metoda este în măsură să determine dacă o substanţă sau un preparat va prezenta pericol de explozie (sensibilitate termică sau mecanică) în condiţiile speciale definite în directivă. Metoda se bazează pe mai multe tipuri de aparate, folosite pe scară largă pe plan internaţional (1) şi care au, în general, rezultate edificatoare. Se admite totuşi că metoda nu este definitivă. Se pot folosi aparate alternative, cu condiţia ca acestea să fie recunoscute pe plan internaţional şi ca rezultatele să poată fi corelate în mod adecvat cu cele obţinute pe aparatul specificat.
      Testele nu se justifică dacă datele termodinamice disponibile (căldura de formare, căldura de descompunere) şi absenţa anumitor grupe reactive (2) în formula structurală permit să se stabilească în mod cert că substanţa sau preparatul nu este susceptibil de a se descompune rapid cu degajare de gaze sau de căldură (altfel spus, materialul nu prezintă riscuri de explozie). Pentru lichide nu este necesar testul de sensibilitate mecanică la frecare.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Exploziv:
      Substanţe care sunt susceptibile de a exploda sub efectul flăcării sau sunt sensibile la şoc ori frecare în aparatul specificat (sau sunt mai sensibile din punct de vedere mecanic decât 1,3-dinitrobenzenul într-un aparat alternativ).
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      1,3-dinitrobenzen, în stare cristalină, de puritate tehnică, cernut să treacă prin sita cu ochiuri de 0,5 mm, pentru metodele de testare prin frecare şi prin şoc.
      Perhidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX, hexogen, ciclonit – CAS 121-82-4), recristalizată din soluţie apoasă de ciclohexanonă, cernută în stare umedă prin sită cu ochiuri de 250 μm şi reţinută pe sită cu ochiuri de 150 μm şi apoi uscată la 103 ± 2 oC (timp de 4 ore) pentru o a doua serie de teste de sensibilitate mecanică (la şoc şi frecare).
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI
      Sunt necesare teste preliminare pentru a determina condiţiile de siguranţă în care se desfăşoară cele trei teste de sensibilitate.
      1.4.1.   Teste pentru determinarea siguranţei în manipulare (3)
      Din motive de siguranţă, înainte de realizarea testelor principale, se supun eşantioane foarte mici (cca. 10 mg.) de substanţă la încălzire în aer liber cu flacără de arzător cu gaz, la şoc, în orice formă adecvată de aparat, şi la frecare, folosind un ciocan de lemn şi o nicovală, sau orice alt dispozitiv de frecare. Obiectivul constă în a determina dacă substanţa este suficient de sensibilă şi explozibilă încât realizarea testelor de sensibilitate prescrise, în special cel de sensibilitate termică, să necesite precauţii speciale pentru a evita vătămarea operatorului.
      1.4.2.   Sensibilitatea termică
      Metoda constă în încălzirea substanţei într-un tub din oţel, închis cu plăci cu orificii de diametre diferite, pentru a determina dacă substanţa este susceptibilă de a exploda în condiţii de încălzire intensă şi spaţiu limitat într-un mod definit.
      1.4.3.   Sensibilitatea mecanică (la şoc)
      Metoda constă în supunerea substanţei la şocul produs de un corp cu masă specificată care cade de la o înălţime specificată.
      1.4.4.   Sensibilitatea mecanică (la frecare)
      Metoda constă în supunerea unei substanţe, aflată în stare solidă sau sub formă de pastă, la frecare între suprafeţe standardizate, în condiţii specificate de forţă şi deplasare relativă.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Nu sunt menţionate.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      1.6.1.   Sensibilitatea termică (efectul flăcării)
      1.6.1.1.   Aparatură
      Aparatura este constituită dintr-un tub din oţel, de unică folosinţă, cu dispozitive de închidere refolosibile (figura 1), instalat într-un dispozitiv de încălzire şi protecţie. Fiecare tub este obţinut prin ambutisarea adâncă a tablei de oţel (a se vedea apendicele) şi are un diametru interior de 24 mm, o lungime de 75 mm şi o grosime a pereţilor de 0,5 mm. Tuburile sunt prevăzute cu flanşă la extremitatea deschisă, pentru a permite închiderea fiecăruia cu setul plăcii cu orificii. Acesta este constituit dintr-o placă cu rezistenţă la presiune, cu un orificiu central, montată strâns pe tub printr-o îmbinare cu şurub din două părţi (piuliţă şi o şaibă filetată). Piuliţa şi şaiba filetată sunt realizate din oţel crom-mangan (a se vedea apendicele) care nu produce scântei până la 800 oC. Plăcile perforate au o grosime de 6 mm, sunt realizate din oţel termorezistent (a se vedea apendicele) şi sunt disponibile într-o gamă de diametre şi orificii.
      1.6.1.2.   Condiţii experimentale
      În general, substanţa este supusă testului în forma în care este primită, deşi în anumite cazuri, de exemplu dacă este presată, turnată sau condensată într-un mod anume, s-ar putea să fie necesară mărunţirea acesteia înaintea testului.
      Pentru substanţele solide, masa materialului ce urmează să fie supus testelor se determină printr-o metodă, în două etape, a probei în gol. Un tub căruia i s-a determinat tara este umplut cu 9 cm3 de substanţă şi aceasta este tasată cu o forţă de 80 N aplicată pe toată secţiunea transversală a tubului. Din motive de siguranţă sau în cazurile în care este posibilă modificarea formei fizice a eşantionului prin compresie, se pot folosi alte procedee de umplere; de exemplu, dacă substanţa este foarte sensibilă la frecare, nu se recomandă tasarea. Dacă substanţa se poate comprima, atunci se mai adaugă şi se tasează până la umplerea tubului pe o lungime de 55 mm de la capăt. Se determină masa totală a substanţei folosite la umplerea tubului până la 55 mm şi se mai adaugă substanţă în două reprize, tasându-se de fiecare dată cu o forţă de 80 N. Apoi se mai adaugă şi se tasează sau se scoate material, astfel încât tubul să fie umplut pe o lungime de 15 mm de la partea superioară. Se execută a doua operaţie preliminară a probei în gol, plecând de la o cantitate tasată egală cu o treime din masa totală rezultată în prima etapă a probei gol. Se mai adaugă substanţă în două reprize şi se tasează cu o forţă de 80 N reglându-se nivelul substanţei din tub până la 15 mm de la partea superioară prin adăugare sau scoatere de substanţă, după caz. Cantitatea de substanţă solidă determinată în a doua operaţie preliminară se utilizează pentru fiecare test; umplerea fiind realizată în trei reprize, cu cantităţi egale, fiecare comprimată până la 9 cm3 cu forţa necesară, oricare ar fi valoarea acesteia. (Această operaţie poate fi facilitată prin folosirea unor inele de distanţare.)
      Lichidele şi gelurile se încarcă în tub până la o înălţime de 60 mm, având grijă în mod deosebit să se evite formarea bulelor în gel. Şaiba filetată este glisată pe tub dinspre bază, se inserează placa perforată corespunzătoare şi se strânge piuliţa după aplicare unui lubrifiant pe bază de disulfură de molibden. Este esenţial să se verifice dacă nu a rămas substanţă prinsă între flanşă şi placă sau în filet.
      Încălzirea se realizează cu propan dintr-o butelie industrială, prevăzută cu un regulator de presiune (60-70 mbar), care trece printr-un contor de gaze şi este distribuit uniform (în funcţie de flacăra arzătoarelor) dintr-un rezervor către patru arzătoare. Arzătoarele sunt distribuite în jurul incintei de testare, aşa cum se arată în figura 1. Cele patru arzătoare au un consum combinat de aproximativ 3,2 litri de propan pe minut. Se pot utiliza şi alte gaze, respectiv arzătoare, dar viteza de încălzire trebui să fie cea menţionată în figura 3. Pentru toate aparatele, viteza de încălzire trebuie să se verifice periodic cu ajutorul tuburilor umplute cu dibutilftalat, după cum se indică în figura 3.
      1.6.1.3.   Desfăşurarea testelor
      Fiecare test se realizează până la fragmentarea tubului sau după încălzirea tubului timp de cinci minute. Dacă la test se produce fragmentarea tubului în trei sau mai multe bucăţi, care uneori pot să fie legate între ele prin fâşii înguste de metal ca în figura 2, se estimează că s-a produs o explozie. Dacă la test rezultă mai puţine fragmente sau nu are loc fragmentarea, se consideră că nu s-a produs explozie.
      Se realizează mai întâi o serie de trei teste cu o placă perforată, cu orificiul cu diametrul de 6,0 mm şi, dacă nu rezultă nicio explozie, se realizează o a doua serie de trei teste cu o placă cu orificiul de 2,0 mm. Dacă în oricare din seria de teste se produce explozia, nu mai este necesară continuarea testelor.
      1.6.1.4.   Evaluare
      Rezultatul testului se consideră ca fiind pozitiv, dacă se produce explozie în oricare din seria de teste menţionate anterior.
      1.6.2.   Sensibilitatea mecanică (la şoc)
      1.6.2.1.   Aparatura (figura 4)
      Piesele esenţiale ale unei sonete clasice cu berbec sunt un bloc de oţel turnat cu soclu, nicovală, coloană, ghidaje, greutăţi de şoc, dispozitiv de decuplare şi suport pentru probă. Nicovala din oţel cu diametru de 100 mm şi înălţimea de 70 mm este prinsă în şuruburi la partea superioară a unui bloc din oţel de 230 mm (lungime) × 250 mm (lăţime) × 200 mm (înălţime) cu un soclu turnat de 450 mm (lungime) × 450 (lăţime) × 60 mm (înălţime). O coloană, realizată dintr-un tub de oţel trefilat fără sudură, este prinsă într-un suport fixat cu şuruburi pe spatele blocului din oţel. Aparatul este fixat cu patru şuruburi pe un bloc din beton de 60 × 60 × 60 cm, astfel încât şinele de ghidare să fie perfect verticale şi greutatea de şoc să cadă liber. Sunt disponibile greutăţi de 5-10 kg, realizate din oţel calmat. Berbecul este din oţel călit, HRC 60-63, cu un diametru de minimum 25 mm.
      Proba supusă testului este închisă într-un dispozitiv de şoc constituit din doi cilindri coaxiali din oţel calmat, unul deasupra celuilalt, situaţi într-un cilindru gol de oţel, care se foloseşte ca inel de ghidare. Cilindrii din oţel calmat au diametrul de 10 (-0,003, -0,005) mm şi înălţimea de 10 mm, cu feţele lustruite, muchiile rotunjite (raza de curbură de 0,5 mm) şi o duritate HRC de 58-65. Cilindrul gol trebuie să aibă un diametru exterior de 16 mm, un alezaj şlefuit de 10 (+0,005, +0,010) mm şi o înălţime de 13 mm. Dispozitivul de şoc este asamblat pe o nicovală intermediară (diametrul 26 mm şi înălţimea de 26 mm) realizată din oţel şi centrată cu ajutorul unui inel de centrare cu perforaţii pentru a permite evacuarea vaporilor.
      1.6.2.2.   Condiţii experimentale
      Volumul eşantionului este de 40 mm3 sau un volum corespunzător aparatului utilizat. Substanţele solide se supun testului în stare uscată şi se pregătesc după cum urmează:
      
                  (a)
               
               
                  substanţele sub formă de pulberi se cern (ochiul sitei de 0,5 mm); tot materialul care a trecut prin sită se supune testului;
               
            
                  (b)
               
               
                  substanţele presate, turnate sau condensate se fărâmiţează şi se cern; la teste se foloseşte fracţia dintre sita cu ochiuri de 0,5 mm şi sita cu ochiuri de 1 mm, care ar trebui să fie reprezentativă.
               
            Substanţele care se livrează în general sub formă de pastă ar trebui să fie supuse testului în stare uscată, dacă este posibil, sau, în orice caz, după eliminarea cantităţii maxime posibile de diluant. Pentru testarea substanţelor lichide, aparatul de testare se reglează, astfel încât între cilindrii de oţel superior şi inferior să existe un spaţiu de 1 mm.
      1.6.2.3.   Desfăşurarea testelor
      Se realizează o serie de şase teste cu o greutate de şoc de 10 kg în cădere de la 0,40 m (40 J). Dacă se obţine o explozie în primele şase teste la 40 J, trebuie să se mai realizeze un set de şase teste, cu greutatea de 5 kg în cădere de la 0,15 m (7,5 J). În alt aparat, proba se compară cu substanţa de referinţă aleasă printr-o metodă stabilită (de exemplu metoda „up-and-down” etc.).
      1.6.2.4.   Evaluare
      Rezultatul se consideră pozitiv dacă se produce o explozie (izbucnirea unei flăcări şi/sau un zgomot caracteristic unei explozii) cel puţin o dată în oricare din testele cu aparatul specificat sau dacă proba este mai sensibilă decât 1,3-dinitrobenzenul sau RDX într-un test alternativ de sensibilitate la şoc.
      1.6.3.   Sensibilitatea mecanică (la frecare)
      1.6.3.1.   Aparatură (figura 5)
      Aparatul pentru testul de sensibilitate la frecare este constituit dintr-o placă de bază din fontă pe care se montează aparatul de testare la frecare. Acesta conţine un bulon din porţelan şi un disc mobil din porţelan. Discul din porţelan este fixat într-un culisou care se deplasează pe două ghidaje. Culisoul este cuplat la un motor electric prin intermediul unei biele, a unui excentric şi unui angrenaj de transmisie corespunzător, astfel încât să se asigure o deplasare a discului de porţelan, doar o singură dată, înainte şi înapoi, pe o distanţă de 10 mm, sub bulonul din porţelan. Bulonul poate să fie supus unei sarcini, de exemplu, de 120 sau 360 newtoni.
      Discurile din porţelan sunt realizate din porţelan tehnic (rugozitatea de 9-32 μm) şi au dimensiuni de 25 mm (lungime) × 25 mm (lăţimea) × 5 mm (înălţimea). Bulonul cilindric din porţelan se realizează, de asemenea, din porţelan tehnic şi are o lungime de 15 mm, diametru de 10 mm şi extremităţile rotunjite, cu suprafaţa rugoasă şi cu o rază de curbură de 10 mm.
      1.6.3.2.   Condiţii experimentale
      Volumul probei este de 10 mm3 sau un volum corespunzător aparatului utilizat.
      Substanţele solide se supun testului în stare uscată şi se pregătesc după cum urmează:
      
                  (a)
               
               
                  substanţele sub formă de pulberi se cern (sită cu ochiuri de 0,5 mm); tot materialul care a trecut prin sită se supune testului;
               
            
                  (b)
               
               
                  substanţele presate, formate în matriţă sau condensate se fărâmiţează şi se cern; la teste se utilizează fracţiunea care a trecut prin site cu ochiuri < 0,5 mm.
               
            Substanţele care se livrează în general sub formă de paste se supun testului în stare uscată, dacă este posibil. Dacă substanţa nu se poate prepara în stare uscată, pasta (după eliminarea cantităţii maxime posibile de diluant) se supune testului sub forma unei pelicule cu următoarele dimensiuni: 0,5 mm grosime, 2 mm lăţime şi 10 mm lungime, realizată cu un şablon.
      1.6.3.3.   Desfăşurarea testelor
      Bulonul din porţelan se aşează deasupra eşantionului de testat şi se aplică sarcina. În timpul testului, urmele lăsate de burete pe placa de porţelan trebuie să fie dispuse transversal faţă de direcţia de deplasare. Bulonul trebuie să rămână pe eşantion, cantitatea de substanţă de testat trebuie să fie suficientă, iar discul să se deplaseze corect sub bulon. Substanţele în formă de pastă se depun, cu un şablon, sub forma unei pelicule cu grosimea de 0,5 mm şi 2 × 10 mm. Discul de porţelan trebuie să se deplaseze înainte şi înapoi pe o distanţă de 10 mm sub bulonul de porţelan timp de 0,44 secunde; cele două extremităţi ale fiecărui bulon se folosesc fiecare la două încercări şi cele două suprafeţe ale discului se utilizează fiecare la trei încercări.
      Se realizează o serie de şase teste la o sarcină de 360 N. Dacă în aceste şase aceste teste se obţine un rezultat pozitiv, trebuie să se mai realizeze o serie de şase teste cu o sarcină de 120 N. În alt aparat, proba se compară cu substanţa de referinţă aleasă printr-o metodă stabilită (de exemplu metoda „up-and-down” etc.).
      1.6.3.4.   Evaluarea
      Rezultatul se consideră pozitiv dacă se produce o explozie (pocnitură şi/sau zgomot sau izbucnirea unei flăcări sunt echivalente cu o explozie) cel puţin o dată în oricare din teste cu aparatul de testare la frecare specificat sau sunt satisfăcute criteriile echivalente pentru o altă test de sensibilitate mecanică (la frecare).
      2.   DATE
      În principiu, se consideră că o substanţă prezintă pericol de explozie în sensul prezentei directive, în cazul în care se obţine un rezultat pozitiv la testele de sensibilitate termică sau de sensibilitate mecanică (la şoc sau la frecare).
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORT DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, informaţiile următoare:
      
                  —
               
               
                  identitatea, compoziţia, puritatea, conţinutul de umiditate etc. al substanţei de testat;
               
            
                  —
               
               
                  starea fizică a probei şi, dacă a fost sau nu mărunţită şi/sau cernută;
               
            
                  —
               
               
                  observaţiile din timpul testelor de sensibilitate termică (de exemplu masa probei, numărul de fragmente etc.);
               
            
                  —
               
               
                  observaţiile din timpul testelor de sensibilitate mecanică (de exemplu formarea unor cantităţi importante de fum sau descompunerea totală fără zgomot, flăcări, scântei, pocnitură etc.);
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele fiecărui tip de test;
               
            
                  —
               
               
                  dacă se utilizează alte aparate, trebuie să se prezinte fundamentarea ştiinţifică, precum şi dovada corelaţiei dintre rezultatele obţinute cu aparatul specificat şi cele obţinute cu unul echivalent;
               
            
                  —
               
               
                  orice observaţie utilă, cum ar fi trimiterea la teste cu produse similare care ar putea să fie relevante pentru o interpretare corectă a rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  orice alte constatări relevante pentru interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   INTERPRETAREA ŞI EVALUAREA REZULTATELOR
      Raportul de testare menţionează toate rezultatele considerate false, anormale sau nereprezentative. Dacă unele rezultate se resping, se prezintă o explicaţie şi rezultatele unor teste suplimentare sau alternative. Cu excepţia cazului în care un rezultat anormal se pot explica, acesta trebuie să fie acceptat ca atare şi să fie folosit la clasificarea substanţei în consecinţă.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.
               
            
                  2.
               
               
                  Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.
               
            
                  3.
               
               
                  Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 and 30-42.
               
            
                  4.
               
               
                  NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.
               
            
         Apendice
         Exemple de specificaţii ale materialelor pentru testul de sensibilitate termică (a se vedea DIN 1623)
         
                     1.
                  
                  
                     Tubul: Specificaţiile materialelor nr. 1.0336.505 g
                  
               
                     2.
                  
                  
                     Placa cu orificiu: Specificaţiile materialelor nr. 1.4873
                  
               
                     3.
                  
                  
                     Flanşa filetată şi piuliţa: Specificaţiile materialelor nr. 1.3817
                  
               Figura 1
         Aparatul de testare a sensibilităţii termice
         (toate dimensiunile sunt date în milimetri)
         
            
         Figura 2
         Testul de sensibilitate termică
         (Exemple de fragmentare)
         
            
         Figura 3
         Etalonarea vitezei de încălzire pentru testarea sensibilităţii termice
         
            
         Curba temperatură/timp obţinută la încălzirea dibutilftalatului (27 cm3) într-un tub închis (placă cu orificiu de 1,5 mm) cu un debit de propan de 3,2 litri/minut. Temperatura se măsoară cu un termocuplu cromel/alumel placat cu oţel inoxidabil, cu diametrul de 1 mm, amplasat central la distanţa de 43 mm sub bordura tubului. Viteza de încălzire în intervalul cuprins între 135 oC şi 285 oC este între 185 şi 215 K/minut.
         Figura 4
         Aparatul de testare a sensibilităţii mecanice (la şoc)
         
            (toate dimensiunile în milimetri)
         
         
            
         Figura 4
         Continuare
         
            
         Figura 5
         Aparatul de testare a sensibilităţii mecanice (la frecare)
         
            
      
      A.15.   PUNCTUL DE AUTOAPRINDERE (LICHIDE ŞI GAZE)
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Substanţele explozive şi substanţele care se aprind spontan în contact cu aerul la temperatura ambiantă nu se supun prezentului test. Modul de operare este aplicabil la gaze, lichide şi vapori care, în prezenţa aerului, se aprind la contactul cu o suprafaţă încălzită.
      Punctul de autoaprindere scade considerabil prin influenţa impurităţilor catalitice existente, materialul suprafeţei în contact sau prin creşterea volumului recipientului de testare.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Gradul de autoinflamabilitate se exprimă ca punct de autoaprindere. Punctul de autoaprindere este cea mai mică temperatură la care substanţa se aprinde în contact cu aerul în condiţiile definite în metoda de testare.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Substanţele de referinţă sunt specificate în standarde (a se vedea 1.6.3). Acestea trebuie să servească în special la verificarea periodică a acurateţei metodei şi să permită compararea cu rezultatele obţinute prin alte metode.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI
      Metoda determină temperatura minimă a suprafeţei interioare a unei incinte, la care are loc aprinderea unui gaz, a vaporilor sau a unui lichid injectat în incinta respectivă.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Repetabilitatea variază în funcţie de intervalul de temperaturi de autoaprindere şi de metoda de testare folosită.
      Sensibilitatea şi specificitatea depind de metoda de testare folosită.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      1.6.1.   Aparatură
      Aparatura este descrisă în metoda menţionată la punctul 1.6.3.
      1.6.2.   Condiţii experimentale
      Un eşantion din substanţa de testat este supus testului conform metodei menţionate la punctul 1.6.3.
      1.6.3.   Desfăşurarea testului
      A se vedea IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.
      2.   DATE
      Se înregistrează temperatura, presiunea atmosferică, cantitatea de probă utilizată şi timpul scurs până la producerea aprinderii.
      3.   RAPORT
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specificaţiile precise ale substanţei (identificarea şi proprietăţile);
               
            
                  —
               
               
                  cantitatea de probă utilizată, presiunea atmosferică;
               
            
                  —
               
               
                  aparatura utilizată;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele măsurătorilor (temperaturile de testare, rezultatele referitoare la aprindere, timpul scurs);
               
            
                  —
               
               
                  toate observaţiile suplimentare relevante pentru interpretarea rezultatelor.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      Niciuna.
      A.16.   TEMPERATURA RELATIVĂ DE AUTOAPRINDERE PENTRU SUBSTANŢELE SOLIDE
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Substanţele explozive şi substanţele care se aprind spontan în contact cu aerul la temperatura ambiantă nu se supun prezentului test.
      Scopul prezentului test este de a furniza informaţii preliminare privind autoaprinderea substanţelor solide la temperaturi ridicate.
      Dacă temperatura degajată, fie prin reacţia substanţei cu oxigenul, fie prin descompunerea exotermă, nu se împrăştie destul de repede în mediul înconjurător, se produce autoîncălzirea care conduce la autoaprindere. Autoaprinderea se produce, prin urmare, atunci când viteza de producere a căldurii este mai mare decât viteza de pierdere a căldurii.
      Metoda de testare este utilă ca test preliminar de triere a substanţelor solide. Având în vedere natura complexă a fenomenelor de aprindere şi de combustie a solidelor, temperatura de autoaprindere determinată conform prezentei metode de testare se foloseşte numai pentru comparare.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Temperatura de autoaprindere determinată prin prezenta metodă este temperatura minimă a mediului ambiant, exprimată în oC, la care un volum determinat dintr-o substanţă se aprinde în condiţii definite.
      1.3.   SUBSTANŢĂ DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI
      Un anumit volum din substanţă se introduce într-o etuvă la temperatura camerei; în timp ce temperatura etuvei este crescută cu o viteză de 0,5 oC/min până la 400 oC sau până la punctul de topire, dacă este mai mic, se înregistrează curba temperatură/timp pentru condiţiile din centrul eşantionului. În sensul prezentului test, temperatura etuvei la care temperatura eşantionului ajunge la 400 oC prin autoîncălzire se numeşte temperatură de autoaprindere.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      1.6.1.   Aparatură
      1.6.1.1.   Etuva
      Etuvă de laborator termoreglabilă (volum de aproximativ 2 litri) prevăzură cu circulaţie naturală de aer şi o supapă pentru atenuarea exploziei. Pentru evitarea unui posibil risc de explozie, trebuie evitat contactul tuturor gazelor de descompunere cu elementele de încălzire electrică.
      1.6.1.2.   Cubul din plasă metalică
      Se taie o bucată dintr-o plasă fin oţel inoxidabil cu ochiuri de 0,045 mm conform modelului din figura 1. Plasa se pliază şi se fixează cu sârmă într-un cub deschis la partea superioară.
      1.6.1.3.   Termocuplurile
      Termocupluri corespunzătoare.
      1.6.1.4.   Înregistratorul
      Orice înregistrator cu două canale etalonat de la 0 la 600 oC sau la o tensiune corespunzătoare.
      1.6.2.   Condiţii experimentale
      Substanţele se supun testului în forma în care se primesc.
      1.6.3.   Desfăşurarea testului
      Cubul se umple cu substanţă, se tasează uşor, adăugând substanţă până la umplerea cubului. Cubul se suspendă apoi în centrul unei etuve la temperatura camerei. Un termocuplu se instalează în centrul cubului şi celălalt între cub şi peretele etuvei pentru înregistrarea temperaturii din etuvă.
      Temperatura etuvei şi cea a probei se înregistrează permanent în timpul creşterii temperaturii etuvei până la 400 oC sau până la punctul de topire, dacă este mai mic, cu o viteză de 0,5 oC/min.
      Când substanţa se aprinde, termocuplul probei va indica o creştere foarte bruscă a temperaturii, peste temperatura etuvei.
      2.   DATE
      Temperatura etuvei la care temperatura probei ajunge la 400 oC prin autoîncălzire este importantă pentru evaluare (a se vedea figura 2).
      3.   RAPORT
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  descrierea substanţei;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele măsurătorilor, inclusiv curba temperatură/timp;
               
            
                  —
               
               
                  toate observaţiile suplimentare relevante pentru interpretarea rezultatelor.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.
      Figura 1
      Modelul cubului de testare de 20 mm
      
         
      Figura 2
      Curbă de tipul temperatură/timp
      
         
      A.17.   PROPRIETĂŢI OXIDANTE (SOLIDE)
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Înainte de a realiza acest test, este util să se colecteze informaţii preliminare privind orice posibile proprietăţi explozive ale substanţei de testat.
      Prezentul test nu se aplică lichidelor, gazelor, substanţelor explozive sau inflamabile sau peroxizilor organici.
      Prezentul test nu este necesar dacă examinarea formulei structurale stabileşte dincolo de orice îndoială că substanţa nu are capacitate de reacţie exotermă cu un material combustibil.
      Pentru a stabili dacă sunt necesare precauţii speciale în timpul testului, se realizează un test preliminar.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Timpul de ardere: timpul de reacţie, exprimat în secunde, necesar pentru ca zona de reacţie să traverseze un cartuş, în conformitate cu procedura descrisă la punctul 1.6.
      Viteza de ardere: exprimată în milimetri pe secundă.
      Viteza maximă de ardere: cea mai mare valoare a vitezelor de ardere obţinută cu amestecuri ce conţin oxidant în proporţie de 10-90 % greutate.
      1.3.   SUBSTANŢA DE REFERINŢĂ
      Azotatul de bariu (de puritate analitică) se foloseşte ca substanţă de referinţă în test şi în testul preliminar.
      Amestecul de referinţă este amestecul constituit din azotat de bariu şi pudră de celuloză, preparat conform descrierii de la punctul 1.6, care are viteza maximă de ardere (amestecul conţine, de regulă, 60 % greutate azotat de bariu).
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI
      Pentru siguranţă se realizează un test preliminar. În cazul în care testul preliminar indică în mod clar că substanţa supusă testului are proprietăţi oxidante, nu mai este necesar alt test. Dacă nu se întâmplă astfel, substanţa se supune testului complet.
      Pentru testul complet, se prepară amestecuri cu proporţii diferite de substanţă de testat şi substanţă combustibilă. Se prepară apoi câte un cartuş din fiecare amestec, care se aprinde la o extremitate.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Dacă este necesar, orice metodă de mărunţire şi amestecare este valabilă, cu condiţia ca diferenţa dintre viteza maximă de ardere şi valoarea mediei aritmetice, în şase teste separate, să fie de maximum 10 %.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      1.6.1.   Pregătire
      1.6.1.1.   Substanţa de testat
      Proba de analizat se aduce la dimensiuni ale particulelor < 0,125 mm prin următoarea metodă: se cerne substanţa, se mărunţeşte fracţia rămasă, se repetă acţiunea până când întreaga cantitate de probă trece prin sită.
      Se poate utiliza orice metodă de mărunţire sau cernere care satisface criteriile de calitate.
      Înaintea preparării amestecului, substanţa se usucă la 105 oC, până la o greutate constantă. Dacă temperatura de descompunere a substanţei de testat este mai mică de 105 oC, substanţa trebuie să se usuce la o temperatură mai mică.
      1.6.1.2.   Substanţa combustibilă
      Pulberea de celuloză se utilizează ca substanţă combustibilă. Celuloza ar trebui să fie de tipul utilizat în cromatografia în strat subţire sau în cromatografia în coloană. S-a dovedit că tipul care conţine mai mult de 85 % fibre cu lungimea de 0,020-0,075 mm este corespunzătoare. Pulberea de celuloză se trece printr-o sită cu ochiuri de 0,125 mm. Se foloseşte acelaşi lot de celuloză pentru tot testul.
      Înainte de prepararea amestecului, pulberea de celuloză este uscată la 105 oC până se obţine o greutate constantă.
      Dacă în testul preliminar se utilizează rumeguş de lemn, se prepară un rumeguş prin colectarea porţiunii care trece prin sita cu ochiuri de 1,6 mm, se amestecă cu grijă, apoi se usucă la 105 oC timp de patru ore într-un strat cu o grosime de maximum 25 mm. Se răceşte şi se păstrează până când este necesar, de preferinţă într-un interval de 24 de ore de la uscare, într-un recipient etanş cât mai bine umplut.
      1.6.1.3.   Sursa de ardere
      Ar trebui să se folosească flacăra unui bec de gaz (diametrul minim de 5 mm) ca sursă de aprindere. Dacă de utilizează altă sursă de aprindere (de exemplu la testul în atmosferă inertă), trebuie să se prezinte în raportul de testare descrierea şi justificarea acesteia.
      1.6.2.   Desfăşurarea testului
      
         Notă:
      Amestecurile din oxidanţi şi celuloză sau rumeguş trebuie să fie tratate ca posibil explozive şi manipulate cu atenţia cuvenită.
      1.6.2.1.   Testul preliminar
      Substanţa uscată se amestecă cu grijă cu celuloza uscată sau rumeguşul uscat în proporţii din greutate de substanţă/celuloză sau rumeguş de 2:1 şi din amestecul obţinut se formează un cartuş conic cu dimensiunile 3,5 cm (diametrul la bază) × 2,5 cm (înălţimea) prin umplerea, fără îndesare, a unei forme conice (de exemplu o pâlnie din sticlă de laborator cu robinetul închis).
      Cartuşul este aşezat pe o placă rece, necombustibilă, neporoasă şi cu conductibilitate termică redusă. Testul ar trebui să se realizeze sub nişă de tiraj, conform descrierii de la punctul 1.6.2.2.
      Sursa de aprindere se aduce în contact cu conul. Se urmăresc amploarea şi durata reacţiei rezultate şi se înregistrează.
      Dacă reacţia este viguroasă, substanţa se consideră ca fiind oxidantă.
      Dacă rezultatele nu sunt certe, este necesar să se realizeze testul complet descris în continuare.
      1.6.2.2.   Test complet
      Se prepară amestecuri oxidant/celuloză ce conţin 10-90 % greutate oxidant, cu o raţie de creştere de 10 % a cantităţii de oxidant. Pentru cazurile-limită, ar trebui să se utilizeze amestecuri intermediare oxidant/celuloză pentru a obţine viteza maximă de ardere cu mai multă precizie.
      Cartuşul se obţine cu o matriţă. Matriţa este din metal, are o lungime de 250 mm şi o secţiune transversală triunghiulară cu o înălţime interioară de 10 mm şi o lăţime interioară de 20 mm. Pe ambele feţe ale matriţei, pe direcţie longitudinală, se montează două plăci metalice ca opritoare laterale care depăşesc cu 2 mm extremitatea superioară a secţiunii transversale triunghiulare (figura). Dispozitivul obţinut se umple fără tasare cu amestec, puţin în exces. După ce se lasă matriţa să cadă de la o înălţime de 2 cm pe o suprafaţă solidă, substanţa în exces se curăţă cu o racletă oblică. Plăcile opritoare se scot şi pulberea rămasă se netezeşte cu un rulou. Se aşează apoi o placă cu conductibilitate termică mică, neporoasă şi necombustibilă peste formă, ansamblul se răstoarnă şi se scoate forma.
      Se introduce cartuşul în nişă, perpendicular pe direcţia curentului de aer.
      Viteza aerului trebuie să fie suficientă pentru a preveni răspândirea vaporilor în laborator şi ar trebui să fie constantă în timpul testului. Curentul de aer trebuie să formeze un ecran în jurul aparatului.
      Datorită caracterului higroscopic al celulozei şi al unor substanţe de testat, testul se execută cât se poate de repede.
      Se aprinde un capăt al cartuşului prin contactul cu flacăra.
      Se măsoară timpul de reacţie pe o distanţă de 200 mm după ce zona de reacţie s-a propagat pe o distanţă iniţială de 30 mm.
      Testul se realizează cu substanţa de referinţă şi cel puţin o dată cu fiecare amestec din gama celor constituite din substanţa de testat şi celuloză în diferite proporţii.
      Dacă se constată o viteză maximă de ardere cu mult mai mare decât cea a amestecului de referinţă, testul se poate opri; în caz contrar, testul se repetă de cinci ori pentru fiecare din cele trei amestecuri care au cea mai mare viteză de ardere.
      Dacă se suspectează un rezultat fals pozitiv, atunci ar trebui să se repete testul cu o substanţă inertă cu particule de dimensiuni similare, de exemplu kiselgur, în loc de celuloză. O altă posibilitate constă în repetarea testului cu amestecul cu viteza de ardere cea mai mare, în atmosferă inertă (cu un conţinut de oxigen < 2 % v/v).
      2.   DATE
      Din motive de siguranţă, se consideră că viteza maximă de ardere – nu valoarea medie – reprezintă proprietatea oxidantă maximă a substanţei supuse testului.
      Valoarea cea mai mare a vitezei de ardere într-o serie de şase teste pe un amestec dat este relevantă pentru evaluare.
      Se reprezintă grafic valoarea cea mai mare a vitezei de ardere pentru fiecare amestec în funcţie de concentraţia oxidantului. Din grafic se citeşte viteza maximă de ardere.
      Cele şase valori ale vitezei de ardere măsurate într-un set realizat cu amestecul cu viteza maximă de ardere trebuie să difere cu maximum 10 % faţă de valoarea mediei aritmetice; în caz contrar, sunt necesare metode îmbunătăţite de mărunţire şi amestecare.
      Se compară viteza maximă de ardere cu viteza maximă de ardere a amestecului de referinţă (a se vedea punctul 1.3).
      Dacă încercările se realizează în atmosferă inertă, se compară viteza maximă de reacţie cu cea obţinută cu amestecul de referinţă în atmosferă inertă.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORT DE TESTARE
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  identitatea, compoziţia, puritatea, conţinutul de umiditate etc. ale substanţei de testat;
               
            
                  —
               
               
                  orice tratament aplicat eşantionului (de exemplu măcinare, uscare,...);
               
            
                  —
               
               
                  sursa de aprindere folosită;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele măsurătorilor;
               
            
                  —
               
               
                  tipul reacţiei (de exemplu ardere superficială cu flacără, ardere în întreaga masă, orice informaţii privind produsele de ardere, ...);
               
            
                  —
               
               
                  orice observaţie suplimentară relevantă pentru interpretarea rezultatelor, inclusiv descrierea vigorii (flacără, scântei, degajare de vapori, ardere înăbuşită înceată etc.) şi durata aproximativă obţinută în testul preliminar de siguranţă/triere atât pentru substanţa de testat, cât şi pentru substanţa de referinţă;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele testelor cu substanţă inertă, după caz;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele testelor în atmosferă inertă, după caz.
               
            3.2.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Se consideră că o substanţă este substanţă oxidantă, în cazul în care:
      
                  (a)
               
               
                  la testul preliminar există o reacţie viguroasă;
               
            
                  (b)
               
               
                  la testul complet viteza maximă de ardere a amestecurilor testate este mai mare decât sau egală cu viteza maximă de ardere a amestecului de referinţă constituit din celuloză şi azotat de bariu.
               
            Pentru a se evita rezultatele fals pozitive, la interpretarea rezultatelor se iau în considerare şi rezultatele obţinute la testarea substanţei cu un material inert şi/sau la testul în atmosferă inertă.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.
      
         Apendice
         Figură
         Matriţa şi accesoriile pentru prepararea cartuşului
         (Toate dimensiunile sunt în milimetri)
         
            
      
      A.18.   DETERMINAREA MASEI MOLECULARE NUMERICE MEDII ŞI A DISTRIBUŢIEI MASELOR MOLECULARE A POLIMERILOR
      1.   METODĂ
      Această metodă cromatografică pe gel permeabil urmează Orientarea 118 (1996) a OCDE. Principiile fundamentale şi toate celelalte informaţii tehnice sunt prezentate în bibliografie.
      1.1.   INTRODUCERE
      Proprietăţile polimerilor sunt atât de diversificate, încât este imposibil de descris o metodă unică, care să indice cu precizie condiţiile de separare şi evaluare, care să acopere toate eventualităţile şi particularităţile întâlnite la separarea polimerilor. Sistemele complexe de polimeri, în special, se pretează mai rar la cromatografia pe gel permeabil. În cazul în care cromatografia pe gel permeabil nu este aplicabilă, se poate determina conţinutul de polimeri cu masă moleculară medie, utilizând alte metode (a se vedea apendicele). Într-o astfel de situaţie, este necesară furnizarea tuturor detaliilor legate de metoda folosită, cu justificarea alegerii.
      Metoda descrisă în continuare se bazează pe norma DIN 55672 (1). Aceasta furnizează indicaţii detaliate asupra modului de realizare a experienţelor şi de evaluare a rezultatelor. Dacă este necesară modificarea condiţiilor experimentale, schimbările trebuie justificate. Pot fi utilizate alte normative, cu condiţia menţionării tuturor referinţelor. Metoda descrisă utilizează pentru etalonare eşantioane de polistiren a căror polidispersie este cunoscută şi ar putea fi, probabil, adaptată pentru cazul altor polimeri, de exemplu, polimerii solubili în apă şi polimerii ramificaţi cu catenă lungă.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Masa moleculară numerică medie Mn şi masa moleculară medie ponderală Mw, se determină prin ecuaţiile următoare:
      
                  
                     
               
               
                  
                     
               
            unde:
      Hi este amplitudinea semnalului detectat, corespunzător volumului de retenţie Vi, faţă de nivelul de referinţă;
      Mi este masa moleculară a fracţiunii de polimer, corespunzătoare volumului de retenţie Vi şi
      n este numărul de puncte experimentale.
      Lărgimea distribuţiei maselor moleculare, care reprezintă o măsură a polidispersiei sistemului, este exprimată de raportul Mw/Mn.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Metoda cromatografiei pe gel permeabil este o metodă relativă, fiind necesar să se procedeze la o etalonare. În general, aceasta se realizează cu ajutorul polistirenilor etalon cu lanţ liniar şi distribuţie îngustă, pentru care se cunosc atât masele moleculare medii Mn şi Mw, cât şi distribuţia maselor moleculare. Curba de etalonare nu poate fi utilizată pentru determinarea masei moleculare a unui eşantion necunoscut, decât dacă condiţiile de separare a eşantioanelor şi etaloanelor au fost selecţionate într-un mod identic.
      O relaţie determinată între masa moleculară şi volumul de eluare nu este valabilă decât în condiţiile particulare ale unei experienţe date. Printre aceste condiţii figurează, înainte de toate: temperatura, solventul (sau amestecul de solvenţi), condiţiile cromatografice, precum şi coloana de separare sau sistemul de coloane.
      Masele moleculare ale eşantioanelor determinate prin această metodă constituie valori relative; le vom numi „mase moleculare în echivalent-polistiren”. Aceasta semnifică faptul că, în funcţie de diferenţele chimice şi structurale dintre eşantioanele testate şi etaloane, masele moleculare pot devia faţă de valorile absolute, într-o manieră mai mult sau mai puţin importantă. Dacă sunt utilizate alte etaloane, de exemplu, polietilenglicol, poli(etilenoxid), poli(metacrilat de metil) sau acid poliacrilic, este important să se justifice motivul.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Cromatografia pe gel permeabil permite determinarea distribuţiei maselor moleculare, precum şi a maselor moleculare medii (Mn, Mw). Cromatografia pe gel permeabil reprezintă o metodă particulară de cromatografie lichidă, în cadrul căreia eşantionul pentru testat este separat în funcţie de volumul hidrodinamic al fiecărui constituent (2).
      Separarea se efectuează pe măsură ce eşantionul înaintează printr-o coloană umplută cu un material poros, în general un gel organic. Moleculele mici pot penetra în pori, în vreme ce moleculele mari sunt excluse. Din acest motiv, traseul moleculelor mari este mai scurt; acestea sunt separate primele. Moleculele de dimensiuni medii penetrează parţial în pori, fiind separate mai târziu. Moleculele cele mai mici, a căror rază hidrodinamică medie este mai mică decât cea a porilor de gel, pot penetra în toţi porii. Acestea vor fi eluate ultimele.
      În situaţia ideală, dimensiunea speciilor moleculare este cea care decide integral separarea, dar în practică, este greu de evitat interferenţa unor fenomene de absorbţie. O umplere neregulată a coloanei, ca şi existenţa unui volum mort important, pot agrava situaţia (2).
      Detecţia se efectuează, de exemplu, prin măsurarea indicelui de refracţie sau al absorbţiei în UV, pentru realizarea unei curbe de distribuţie simple. Totuşi, pentru a putea asocia acestei curbe valorile maselor moleculare reale, este necesară etalonarea coloanei prin trecerea unui polimer cu masa moleculară cunoscută şi, în cazul ideal, cu o structură cât mai apropiată, de exemplu diferiţi polistireni standard. În general, se va obţine o curbă Gauss; uneori, aceasta poate prezenta o asimetrie, pe partea maselor moleculare mici; axa verticală indică cantitatea (greutatea) speciilor de diferite mase moleculare eluate, iar pe axa orizontală, figurează logaritmul masei moleculare.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Reproductivitatea (deviaţia-standard relativă) a volumului de eluare trebuie să fie cel mult egală cu 0,3 %. Există modalităţi de ameliorare a reproductivităţii de analiză, graţie unei corecţii ce utilizează un standard intern, dacă un cromatograf este evaluat în funcţie de timp şi nu satisface criteriile menţionate mai sus [a se vedea informaţiile complementare la referinţa (1)]. Polidispersările depind de masele moleculare ale etaloanelor. În cazul polistirenilor etalon, valorile tipice sunt:
      
                  Mp < 2 000
               
               
                  Mw/Mn < 1,20
               
            
                  2 000 ≤ Mp ≤ 106
                  
               
               
                  Mw/Mn < 1,05
               
            
                  Mp > 106
                  
               
               
                  Mw/Mn < 1,20
               
            (Mp este masa moleculară a etalonului, corespunzătoare semnalului maxim)
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      1.6.1.   Prepararea soluţiilor etalon de polistiren
      Se vor dizolva polistirenii etalon, amestecând cu grijă până la diluţia aleasă. Soluţiile se vor prepara ţinând cont de recomandările fabricantului.
      Concentraţiile etaloanelor alese depind de diferiţi factori, cum ar fi: volumul de injecţie, viscozitatea soluţiei şi sensibilitatea detectorului. Volumul de injecţie maxim trebuie să fie adaptat lungimii coloanei, având grijă să nu o supraîncarce. Volumele de injecţie curente pentru separările analitice prin metoda cromatografică pe gel permeabil, pentru o coloană de 30 cm × 7,8 mm, variază de obicei între 40 şi 100 μl. Se va determina raportul optim între volumul de injecţie şi concentraţie, înainte de etalonarea coloanei.
      1.6.2.   Prepararea soluţiei de eşantion
      În principiu, prepararea soluţiilor de eşantion se realizează în condiţii identice. Eşantionul se dizolvă într-un solvent adecvat, de exemplu THF, agitând cu grijă. În niciun caz, nu se va dizolva într-o baie cu ultrasunete. Dacă este necesar, soluţia de probă se purifică cu ajutorul unui filtru cu membrană, cu dimensiunea porilor cuprinsă între 0,2-2 μm.
      Prezenţa particulelor nedizolvate trebuie menţionată în raportul final, în măsura în care acestea pot rezulta din specii cu mase moleculare mari. Trebuie să se recurgă la o metodă potrivită pentru determinarea procentajului în greutate a particulelor nedizolvate. Analiza soluţiilor se va face în termen de 24 ore.
      1.6.3.   Aparatură
      
                  —
               
               
                  un rezervor pentru solvent;
               
            
                  —
               
               
                  un sistem pentru degazare (dacă este necesar);
               
            
                  —
               
               
                  o pompă;
               
            
                  —
               
               
                  un amortizor de impulsuri (dacă este necesar);
               
            
                  —
               
               
                  un sistem de injecţie;
               
            
                  —
               
               
                  coloane cromatografice;
               
            
                  —
               
               
                  un detector;
               
            
                  —
               
               
                  un debitmetru (dacă este necesar);
               
            
                  —
               
               
                  un sistem de înregistrare şi tratare a datelor;
               
            
                  —
               
               
                  un recipient pentru recuperarea soluţiilor utilizate.
               
            Sistemul cromatografic pe gel permeabil trebuie să fie inert faţă de solventul utilizat (de exemplu, utilizarea capilarelor din oţel, atunci când solvent este THF).
      1.6.4.   Injecţia şi sistemul de pompare a solventului
      Un volum definit din soluţia de probă este injectat în coloană, într-o zonă bine definită, cu ajutorul unui aparat pentru eşantionare automată sau manuală. Dacă se operează manual, retragerea ori împingerea prea bruscă a pistonului seringii poate determina modificări în distribuţia maselor moleculare observate. Este indicat ca sistemul de pompare a solventului să fie lipsit de pulsaţii; este de preferat ca acesta să includă un amortizor de impulsuri. Debitul este de ordinul a 1 ml/min.
      1.6.5.   Coloana
      În funcţie de natura eşantionului testat, polimerul se caracterizează făcând recurs la o singură coloană sau la mai multe coloane, conectate în serie. În comerţ sunt disponibile mai multe materiale poroase pentru coloane, cu proprietăţi definite (de exemplu, dimensiunea porilor, limita de excludere). Alegerea unui gel de separare sau a lungimii de coloană depinde, pe de o parte, de proprietăţile eşantionului testat (volume hidrodinamice, distribuţia maselor moleculare) şi, pe de altă parte, de condiţiile particulare ale separării, cum ar fi: natura solventului, temperatura şi debitul (1) (2) (3).
      1.6.6.   Talere teoretice
      Coloana (sau combinaţia de coloane) utilizată pentru separare trebuie caracterizată prin numărul de talere teoretice. Pentru aceasta, în cazul în care solventul de eluare este THF, se trece o soluţie de etilbenzen sau o altă substanţă dizolvată nepolară potrivită, printr-o coloană de lungime cunoscută. Numărul de talere teoretice este dat de ecuaţia următoare:
      
                  
                     
               
               
                  sau
               
               
                  
                     
               
            unde:
      
                  N
               
               
                  =
               
               
                  numărul de talere teoretice
               
            
                  Ve
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul de eluare, corespunzător semnalului maxim
               
            
                  W
               
               
                  =
               
               
                  lărgimea semnalului maxim, la nivelul liniei de bază
               
            
                  W1/2
                  
               
               
                  =
               
               
                  este lărgimea semnalului maxim, la jumătatea înălţimii coloanei
               
            1.6.7.   Eficacitatea separării
      În afară de numărul de talere teoretice, parametru determinant al lărgimii de bandă, eficacitatea de separare este o altă importantă caracteristică, determinată de panta curbei de calibrare. Eficacitatea de separare a unei coloane se calculează cu ajutorul relaţiei următoare:
      
         
      unde:
      
                  Ve, Mx
                     
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară Mx
                     
                  
               
            
                  Ve,(10.Mx)
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară de 10 ori mai mare
               
            Rezoluţia sistemului este în general definită după cum urmează:
      
         
      unde:
      
                  Ve1, Ve2
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumele de eluare ale celor doi polistireni standard la semnalul maxim
               
            
                  W1, W2
                  
               
               
                  =
               
               
                  lărgimile vârfului la nivelul liniei bazei
               
            
                  M1, M2
                  
               
               
                  =
               
               
                  masele moleculare corespunzătoare semnalului maxim (aceste mase ar trebui să fie diferite printr-un factor 10)
               
            Valoarea lui R pentru sistemul de coloane trebuie să fie superioară valorii de 1,7 (4).
      1.6.8.   Solvenţi
      Toţi solvenţii trebuie să aibă o mare puritate (se va folosi THF de puritate 99,5 %). Rezervorul pentru solvent (la nevoie, pus în atmosferă de gaz inert), trebuie să fie suficient de mare pentru a permite etalonarea coloanei şi mai multe analize de eşantioane. Solventul va fi degazat înainte de a fi pompat în coloană.
      1.6.9.   Reglarea temperaturii
      Temperatura componentelor interne critice (bucla de injecţie, coloana sau coloanele, detectorul şi tuburile) trebuie să fie constantă şi compatibilă cu solventul ales.
      1.6.10.   Detectorul
      Detectorul înregistrează în mod cantitativ concentraţia eşantionului eluat din coloană. Pentru evitarea unei lărgimi nedorite a picului, volumul cuvei detectorului va fi ales cât mai mic posibil. Acesta nu trebuie să depăşească 10 μl, cu excepţia detectoarelor ce funcţionează prin difuzia luminii şi a viscozimetrelor. În general, detecţia se realizează prin refractometrie diferenţială. Totuşi, dacă proprietăţile specifice ale eşantionului sau ale solventului pentru eluare o cer, se pot folosi alte tipuri de detectoare, cum ar fi cele UV/VIS sau IR, viscozimetrele etc.
      2.   DATE ŞI RAPORT
      2.1.   DATE
      Se va face referinţă la normele DIN (1) în ceea ce priveşte criteriile de evaluare detaliate, la fel pentru specificaţiile relative la colectarea şi interpretarea datelor.
      Pentru fiecare eşantion analizat, se vor realiza două experienţe independente. Rezultatele acestora se vor analiza separat.
      Parametrii Mn, Mw, Mw/Mn, Mp se determină pentru fiecare măsurătoare. Trebuie indicat în mod explicit că valorile măsurate sunt valori relative corespunzând unor echivalenţi de masă moleculară ale standardului folosit.
      După determinarea volumelor şi a timpilor de retenţie (eventual corectate cu ajutorul unui standard intern) se vor reprezenta grafic valorile log MP (MP fiind semnalul maxim al polimerilor standard), în funcţie de una dintre acele cantităţi. Sunt necesare cel puţin 2 puncte de etalonare pentru fiecare factor 10 de masă moleculară. Pentru trasarea întregii curbe sunt necesare cel puţin 5 puncte de măsură; această curbă va acoperi masa moleculară estimată a eşantionului. Punctul extrem al curbei de etalonare, spre partea maselor moleculare mici, se poate defini folosind n-hexilbenzenul sau altă substanţă dizolvată nepolară adecvată. Masele moleculare medii, ca număr şi ca greutate, sunt în general determinate prin prelucrarea informatică a datelor, bazată pe formule menţionate la punctul 1.2. Dacă s-a optat pentru o prelucrare manuală, este indicat să se consulte ASTM D 3536-91 (3).
      Curba de distribuţie va fi prezentată sub forma unui tabel sau a unui grafic (frecvenţa diferenţială sau procentajele cumulative în funcţie de log M). În cazul reprezentării grafice, o putere de 10 pentru masa moleculară corespunde în mod normal, unei lărgimi de aproximativ 4 cm, în vreme ce pentru maximul de semnal, este adecvată o înălţime de aproximativ 8 cm. În cazul curbelor de distribuţie cumulative, diferenţa între 0 şi 100 % pe axa ordonatei trebuie să fie în jur de 10 cm.
      2.2.   RAPORT DE TESTARE
      Raportul de testare va cuprinde informaţiile următoare:
      2.2.1.   Substanţa testată:
      
                  —
               
               
                  informaţii disponibile legate de substanţa testată (natură, aditivi, impurităţi);
               
            
                  —
               
               
                  descrierea tratamentului aplicat eşantionului, observaţii, probleme.
               
            2.2.2.   Dispozitivul experimental:
      
                  —
               
               
                  un rezervor pentru solvent, gaz inert, sistem pentru degazarea solventului, compoziţia solventului, impurităţi;
               
            
                  —
               
               
                  pompă, amortizor de impulsuri, sistem de injecţie;
               
            
                  —
               
               
                  coloane de separare (fabricant, toate precizările legate de caracteristicile coloanei, cum ar fi dimensiunea porilor, natura materialului de separare etc., numărul, lungimea şi ordinul coloanelor utilizate);
               
            
                  —
               
               
                  numărul de talere teoretice ale coloanei (sau al combinaţiei de coloane), eficacitatea separării (resorbţia sistemului);
               
            
                  —
               
               
                  informaţii legate de simetria semnalelor maxime;
               
            
                  —
               
               
                  temperatura coloanei, modul de reglare a temperaturii;
               
            
                  —
               
               
                  detector (principiul de măsurare, tip, volumul cuvei);
               
            
                  —
               
               
                  debitmetru dacă există (fabricant, principiul de măsurare);
               
            
                  —
               
               
                  sistemul utilizat pentru culegere şi prelucrarea datelor (echipament şi programe informatice).
               
            2.2.3.   Etalonarea sistemului:
      
                  —
               
               
                  descrierea detaliată a metodei utilizate pentru determinarea curbei de etalonare;
               
            
                  —
               
               
                  precizări asupra criteriilor de calitate proprii acestei metode (de exemplu, coeficientul de corelare, eroarea pătratică medie etc.);
               
            
                  —
               
               
                  informaţii asupra tuturor extrapolărilor, ipotezelor şi aproximărilor efectuate în cursul proceselor experimentale, precum şi asupra evaluării şi prelucrării datelor;
               
            
                  —
               
               
                  toate măsurătorile efectuate pentru stabilirea curbei de etalonare trebuie prezentate sub forma unui tabel, care cuprinde, pentru fiecare punct de etalonare, următoarele informaţii:
                  
                              —
                           
                           
                              denumirea eşantionului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              fabricantul eşantionului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              valorile caracteristice Mp, Mn, Mw, Mw/Mn ale etaloanelor furnizate de fabricant, deduse din măsurătorile ulterioare, completate de indicaţiile legate de metoda de determinare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              volumul de injecţie şi concentraţia soluţiei injectate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              valoarea de Mp utilizată pentru etalonare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              volumul de eluare sau timpul de retenţie corectat, măsurat la semnalul maxim;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              Mp calculat la semnalul maxim;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              procentajul de eroare la Mp calculat şi la valoarea de etalonare.
                           
                        
            2.2.4.   Evaluare:
      
                  —
               
               
                  evaluare în funcţie de timp: toate metodele care vizează ameliorarea reproductivităţii cerute (metode de corecţie, standard intern etc.);
               
            
                  —
               
               
                  se precizează dacă evaluarea s-a efectuat plecând de la volumul de eluare sau de la timpul de retenţie;
               
            
                  —
               
               
                  se indică limitele de evaluare, dacă un pic nu a fost complet analizat;
               
            
                  —
               
               
                  se descriu metodele de netezire, dacă s-au folosit;
               
            
                  —
               
               
                  se indică procedeelor de preparare şi pretratare a eşantionului;
               
            
                  —
               
               
                  dacă există, se indică prezenţa particulelor nedizolvate;
               
            
                  —
               
               
                  se indică volumul de injecţie (μl) şi concentraţia de injecţie (mg/ml);
               
            
                  —
               
               
                  se menţionează observaţiile privind efectele generatoare de deviaţii, în raport cu profilul ideal de cromatografie pe gel permeabil;
               
            
                  —
               
               
                  se descriu în detaliu toate modificările aduse procedurilor de analiză;
               
            
                  —
               
               
                  se precizează intervalele de eroare;
               
            
                  —
               
               
                  se consemnează orice alte informaţii şi observaţii utile pentru interpretarea rezultatelor.
               
            3.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.
               
            
                  2.
               
               
                  Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979), Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.
               
            
                  3.
               
               
                  ASTM D 3536-91, (1991) Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
               
            
                  4.
               
               
                  ASTM D 5296-92, (1992) Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
               
            
         Apendice
         Exemple de alte metode de determinare a masei moleculare numerice medii (Mn) a polimerilor
         Cromatografia pe gel permeabil reprezintă metoda preferată pentru determinarea Mn, mai ales atunci când dispunem de un ansamblu de substanţe standard cu o structură comparabilă cu cea a polimerului. Totuşi, atunci când folosirea metodei cromatografiei pe gel permeabil prezintă dificultăţi practice sau când ne putem aştepta ca substanţa să nu satisfacă un criteriu reglementar pentru Mn (ceea ce cere o confirmare), există metode alternative, ca de exemplu:
         1.   Utilizarea proprietăţilor coligative
         
                     1.1.
                  
                  
                     Ebulioscopia şi crioscopia
                     înseamnă măsurarea creşterii punctului de fierbere (ebulioscopia) sau coborârea punctului de congelare (crioscopia) ale unui solvent atunci când este adăugat un polimer. Metoda se bazează pe faptul că dizolvarea unui polimer într-un lichid are un efect asupra punctelor de fierbere sau de congelare ale acestuia care depinde de masa moleculară a polimerului (1) (2).
                     Domeniul de aplicare corespunde unei Mn < 20 000.
                  
               
                     1.2.
                  
                  
                     Coborârea presiunii vaporilor
                     constă în măsurarea presiunii vaporilor unui lichid de referinţă înainte şi după adăugarea unor cantităţi stabilite de polimeri (1) (2).
                     Domeniul de aplicare corespunde unei Mn < 20 000 (în teorie; în practică, nu reprezintă decât o valoare limitată).
                  
               
                     1.3.
                  
                  
                     Osmometria cu membrană
                     se bazează pe principiul osmozei, adică tendinţa naturală a moleculelor de solvent de a traversa o membrană semipermeabilă plecând de la o soluţie diluată către o soluţie concentrată aşa încât să se realizeze echilibrul. În experiment, concentraţia soluţiei diluate este nulă, în timp ce soluţia concentrată conţine polimerul. Trecerea solventului de-a lungul membranei induce o diferenţă de presiune care depinde de concentraţie şi de masa moleculară a polimerului (1) (3) (4).
                     Domeniul de aplicare corespunde valorilor lui Mn între 20 000 şi 200 000.
                  
               
                     1.4.
                  
                  
                     Osmometria – faza de vapori
                     constă în comparaţia vitezei de evaporare a unui aerosol de solvent pur cu viteza a cel puţin trei aerosoli care conţin polimerul la diferite concentraţii (1) (5) (6).
                     Domeniul de aplicare corespunde unei Mn < 20 000.
                  
               2.   Analiza grupurilor terminale
         Pentru a se utiliza această metodă, trebuie cunoscute atât structura globală a polimerului, cât şi natura grupurilor terminale situate în capetele catenei (acestea trebuie să poată fi diferenţiate de catena principală, de exemplu, prin spectrul lor RMN sau prin titrarea şi formarea derivaţilor). Determinarea concentraţiei moleculare a grupurilor terminale prezente pe polimer poate, apoi, să furnizeze o valoare a masei moleculare (7) (8) (9).
         Domeniul de aplicare corespunde valorilor lui Mn ce pot atinge valoarea de 50 000 (cu o fiabilitate descrescătoare)
         3.   Referinţe bibliografice
         
                     1.
                  
                  
                     Billmeyer, F.W. Jr., (1984), Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York.
                  
               
                     2.
                  
                  
                     Glover, C.A., (1975), Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.
                  
               
                     3.
                  
                  
                     ASTM D 3750-79, (1979), Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
                  
               
                     4.
                  
                  
                     Coll, H. (1989), Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52.
                  
               
                     5.
                  
                  
                     ASTM 3592-77, (1977), Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
                  
               
                     6.
                  
                  
                     Morris, C.E.M., (1989), Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
                  
               
                     7.
                  
                  
                     Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989), Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.
                  
               
                     8.
                  
                  
                     Garmon, R.G., (1975), End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
                  
               
                     9.
                  
                  
                     Amiya, S., et al. (1990), Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.
                  
               
      A.19.   DETERMINAREA CONŢINUTULUI ÎN POLIMERI CU MASĂ MOLECULARĂ MICĂ
      1.   METODĂ
      Această metodă cromatografică pe gel permeabil urmează Orientarea 118 (1996) a OCDE. Principiile fundamentale şi toate celelalte informaţii tehnice sunt prezentate în bibliografie.
      1.1.   INTRODUCERE
      Proprietăţile polimerilor sunt atât de diversificate, încât este imposibil de descris o metodă unică, care să indice cu precizie condiţiile de separare şi evaluare, care să acopere toate eventualităţile şi particularităţile întâlnite la separarea polimerilor. Sistemele complexe de polimeri, în special, se pretează mai rar la cromatografia pe gel permeabil. În cazul în care cromatografia pe gel permeabil nu este aplicabilă, se poate determina conţinutul de polimeri cu masă moleculară medie, utilizând alte metode (a se vedea apendicele). Într-o astfel de situaţie, este necesară furnizarea tuturor detaliilor legate de metoda folosită, cu justificarea alegerii.
      Metoda descrisă în continuare se bazează pe norma DIN 55672 (1). Aceasta furnizează indicaţii detaliate asupra modului de realizare a experienţelor şi de evaluare a rezultatelor. Dacă este necesară modificarea condiţiilor experimentale, schimbările trebuie justificate. Pot fi utilizate alte normative, cu condiţia menţionării tuturor referinţelor. Metoda descrisă utilizează pentru etalonare eşantioane de polistiren a căror polidispersie este cunoscută şi ar putea fi, probabil, adaptată pentru cazul altor polimeri, de exemplu, polimerii solubili în apă şi polimerii ramificaţi cu catenă lungă.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Masa moleculară mică se defineşte în mod arbitrar ca fiind o masă moleculară inferioară celei de 1 000 daltoni.
      Masa moleculară medie (numerică) Mn şi masa moleculară medie (greutate) Mw, sunt determinate cu ajutorul ecuaţiilor următoare:
      
                  
                     
               
               
                  
                     
               
            unde:
      
                  Hi
                  
               
               
                  =
               
               
                  amplitudinea semnalului detectat, corespunzător volumului de retenţie Vi, în funcţie de nivelul de referinţă,
               
            
                  Mi
                  
               
               
                  =
               
               
                  este masa moleculară a fracţiunii de polimer, corespunzătoare volumului de retenţie Vi şi n este numărul de puncte experimentale
               
            Lărgimea de distribuţie a maselor moleculare, care reprezintă o măsură a polidispersiei sistemului, este exprimată de raportul Mw/Mn.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Metoda cromatografiei pe gel permeabil este o metodă relativă, fiind necesar să se procedeze la o etalonare. În general, aceasta se realizează cu ajutorul polistirenilor etalon cu lanţ liniar şi distribuţie îngustă, pentru care se cunosc atât masele moleculare medii Mn şi Mw, cât şi distribuţia maselor moleculare. Curba de etalonare nu poate fi utilizată pentru determinarea masei moleculare a unui eşantion necunoscut, decât dacă condiţiile de separare a eşantioanelor şi etaloanelor au fost selecţionate într-un mod identic.
      O relaţie determinată între masa moleculară şi volumul de eluare nu este valabilă decât în condiţiile particulare ale unei experienţe date. Printre aceste condiţii figurează, înainte de toate: temperatura, solventul (sau amestecul de solvenţi), condiţiile cromatografice, precum şi coloana de separare sau sistemul de coloane.
      Masele moleculare ale eşantioanelor determinate prin această metodă constituie valori relative; le vom numi „mase moleculare în echivalent-polistiren”. Aceasta semnifică faptul că, în funcţie de diferenţele chimice şi structurale dintre eşantioanele testate şi etaloane, masele moleculare pot devia faţă de valorile absolute, într-o manieră mai mult sau mai puţin importantă. Dacă sunt utilizate alte etaloane, de exemplu, polietilenglicol, poli(etilenoxid), poli(metacrilat de metil) sau acid poliacrilic, este important să se justifice motivul.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Cromatografia pe gel permeabil permite determinarea distribuţiei maselor moleculare, precum şi a maselor moleculare medii (Mn, Mw). Cromatografia pe gel permeabil reprezintă o metodă particulară de cromatografie lichidă, în cadrul căreia eşantionul pentru testat este separat în funcţie de volumul hidrodinamic al fiecărui constituent (2).
      Separarea se efectuează pe măsură ce eşantionul înaintează printr-o coloană umplută cu un material poros, în general un gel organic. Moleculele mici pot penetra în pori, în vreme ce moleculele mari sunt excluse. Din acest motiv, traseul moleculelor mari este mai scurt; acestea sunt separate primele. Moleculele de dimensiuni medii penetrează parţial în pori, fiind separate mai târziu. Moleculele cele mai mici, a căror rază hidrodinamică medie este mai mică decât cea a porilor de gel, pot penetra în toţi porii. Acestea vor fi eluate ultimele.
      În situaţia ideală, dimensiunea speciilor moleculare este cea care decide integral separarea, dar în practică, este greu de evitat interferenţa unor fenomene de absorbţie. O umplere neregulată a coloanei, ca şi existenţa unui volum mort important, pot agrava situaţia (2).
      Detecţia se efectuează, de exemplu, prin măsurarea indicelui de refracţie sau al absorbţiei în UV, pentru realizarea unei curbe de distribuţie simple. Totuşi, pentru a putea asocia acestei curbe valorile maselor moleculare reale, este necesară etalonarea coloanei prin trecerea unui polimer cu masa moleculară cunoscută şi, în cazul ideal, cu o structură cât mai apropiată, de exemplu diferiţi polistireni standard. În general, se va obţine o curbă Gauss; uneori, aceasta poate prezenta o asimetrie, pe partea maselor moleculare mici; axa verticală indică cantitatea (greutatea) speciilor de diferite mase moleculare eluate, iar pe axa orizontală, figurează logaritmul masei moleculare.
      Conţinutul în polimeri cu masă moleculară mică se deduce cu ajutorul acestei curbe. Calculul nu poate fi exact decât dacă speciile cu masă moleculară mică se comportă în acelaşi fel cu ansamblul polimerului, pe unitatea de masă.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Reproductivitatea (deviaţia-standard relativă) a volumului de eluare trebuie să fie cel mult egală cu 0,3 %. Există modalităţi de ameliorare a reproductivităţii de analiză, graţie unei corecţii ce utilizează un standard intern, dacă un cromatograf este evaluat în funcţie de timp şi nu satisface criteriile menţionate mai sus (a se vedea informaţiile complementare la referinţa 1). Polidispersările depind de masele moleculare ale etaloanelor. În cazul polistirenilor etalon, valorile tipice sunt:
      
                  Mp < 2 000
               
               
                  Mw/Mn < 1,20
               
            
                  2 000 ≤ Mp ≤ 106
                  
               
               
                  Mw/Mn < 1,05
               
            
                  Mp > 106
                  
               
               
                  Mw/Mn < 1,20
               
            (Mp este masa moleculară a etalonului, corespunzătoare semnalului maxim)
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      1.6.1.   Prepararea soluţiilor etalon de polistiren
      Se vor dizolva polistirenii etalon, amestecând cu grijă până la diluţia aleasă. Soluţiile se vor prepara ţinând cont de recomandările fabricantului.
      Concentraţiile etaloanelor alese depind de diferiţi factori, cum ar fi: volumul de injecţie, viscozitatea soluţiei şi sensibilitatea detectorului. Volumul de injecţie maxim trebuie să fie adaptat lungimii coloanei, având grijă să nu o supraîncarce. Volumele de injecţie curente pentru separările analitice prin metoda cromatografică pe gel permeabil, pentru o coloană de 30 cm × 7,8 mm, variază de obicei între 40 şi 100 μl. Se va determina raportul optim între volumul de injecţie şi concentraţie, înainte de etalonarea coloanei.
      1.6.2.   Prepararea soluţiilor de eşantion
      În principiu, prepararea soluţiilor de eşantion se realizează în condiţii identice. Eşantionul se dizolvă într-un solvent adecvat, de exemplu THF, agitând cu grijă. În niciun caz nu se va dizolva într-o baie cu ultrasunete. Dacă este necesar, soluţia de probă se purifică cu ajutorul unui filtru cu membrană, cu dimensiunea porilor cuprinsă între 0,2-2 μm.
      Prezenţa particulelor nedizolvate trebuie menţionată în raportul final, în măsura în care acestea pot rezulta din specii cu mase moleculare mari. Trebuie să se recurgă la o metodă potrivită pentru determinarea procentajului în greutate a particulelor nedizolvate. Analiza soluţiilor se va face în termen de 24 ore.
      1.6.3.   Corecţie legată de prezenţa impurităţilor şi a aditivilor
      Fiind vorba despre conţinutul în specii cu M < 1 000, pentru care este necesar, în general, să se aplice o corecţie care să ţină cont de prezenţa compuşilor particulari nepolimerici (cum ar fi impurităţile sau aditivii), cu excepţia cazului în care conţinutul măsurat nu depăşeşte valoarea de 1 %. Această corecţie se poate realiza prin analiza directă a soluţiei de polimer sau a eluatului pentru cromatografia pe gel permeabil.
      În cazul în care eluatul este prea diluat pentru a permite analizarea, după traversarea coloanei, este necesar să fie concentrat. Va fi, eventual, necesară evaporarea soluţiei până la sec, urmată de redizolvare. Concentrarea soluţiei se va efectua astfel încât să nu intervină nicio modificare a compoziţiei. Tratamentul soluţiei, după faza cromatografiei pe gel permeabil, este funcţie de metoda de analiză utilizată pentru determinarea cantitativă.
      1.6.4.   Aparatură
      Un aparat pentru cromatografie pe gel permeabil este compus din următoarele elemente:
      
                  —
               
               
                  un rezervor pentru solvent;
               
            
                  —
               
               
                  un sistem pentru degazare (dacă este necesar);
               
            
                  —
               
               
                  o pompă;
               
            
                  —
               
               
                  un amortizor de impulsuri (dacă este necesar);
               
            
                  —
               
               
                  un sistem de injecţie;
               
            
                  —
               
               
                  coloane cromatografice;
               
            
                  —
               
               
                  un detector;
               
            
                  —
               
               
                  un debitmetru (dacă este necesar);
               
            
                  —
               
               
                  un sistem de înregistrare şi tratare a datelor;
               
            
                  —
               
               
                  un recipient pentru recuperarea soluţiilor utilizate.
               
            Sistemul cromatografic pe gel permeabil trebuie să fie inert faţă de solventul utilizat (de exemplu, utilizarea capilarelor din oţel, atunci când solvent este THF).
      1.6.5.   Injecţia şi sistemul de pompare a solventului
      Un volum definit din soluţia de probă este injectat în coloană, într-o zonă bine definită, cu ajutorul unui aparat pentru eşantionare automată sau manuală. Dacă se operează manual, retragerea ori împingerea prea bruscă a pistonului seringii poate determina modificări în distribuţia maselor moleculare observate. Este indicat ca sistemul de pompare a solventului să fie lipsit de pulsaţii; este de preferat ca acesta să includă un amortizor de impulsuri. Debitul este de ordinul a 1 ml/min.
      1.6.6.   Coloana
      În funcţie de natura eşantionului testat, polimerul se caracterizează făcând recurs la o singură coloană sau la mai multe coloane, conectate în serie. În comerţ, sunt disponibile mai multe materiale poroase pentru coloane, cu proprietăţi definite (de exemplu, dimensiunea porilor, limita de excludere). Alegerea unui gel de separare sau a lungimii de coloană depinde, pe de o parte, de proprietăţile eşantionului testat (volume hidrodinamice, distribuţia maselor moleculare) şi, pe de altă parte, de condiţiile particulare ale separării, cum ar fi: natura solventului, temperatura şi debitul (1) (2) (3).
      1.6.7.   Talere teoretice
      Coloana (sau combinaţia de coloane) utilizată pentru separare trebuie caracterizată prin numărul de talere teoretice. Pentru aceasta, în cazul în care solventul de eluare este THF, se trece o soluţie de etilbenzen sau o altă substanţă dizolvată nepolară potrivită, printr-o coloană de lungime cunoscută. Numărul de talere teoretice este dat de ecuaţia următoare:
      
                  
                     
               
               
                  sau
               
               
                  
                     
               
            unde:
      
                  N
               
               
                  =
               
               
                  numărul de talere teoretice
               
            
                  Ve
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul de eluare, corespunzător semnalului maxim
               
            
                  W
               
               
                  =
               
               
                  lărgimea semnalului maxim, la nivelul liniei de bază
               
            
                  W1/2
                  
               
               
                  =
               
               
                  lărgimea semnalului maxim, la jumătatea înălţimii coloanei
               
            1.6.8.   Eficacitatea separării
      În afară de numărul de talere teoretice, parametru determinant al lărgimii de bandă, eficacitatea de separare este o altă caracteristică importantă, determinată de panta curbei de calibrare. Eficacitatea de separare a unei coloane se calculează cu ajutorul relaţiei următoare:
      
         
      unde:
      
                  Ve, Mx
                     
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară Mx;
               
            
                  Ve,(10.Mx)
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară de 10 ori mai mare
               
            Rezoluţia sistemului este în general definită după cum urmează:
      
         
      unde:
      
                  Ve1, Ve2
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumele de eluare ale celor doi polistireni standard la semnalul maxim
               
            
                  W1, W2
                  
               
               
                  =
               
               
                  lărgimile vârfului la nivelul liniei bazei
               
            
                  M1, M2
                  
               
               
                  =
               
               
                  masele moleculare corespunzătoare semnalului maxim (aceste mase ar trebui să fie diferite printr-un factor 10)
               
            Valoarea lui R pentru sistemul de coloane trebuie să fie superioară valorii de 1,7 (4).
      1.6.9.   Solvenţi
      Toţi solvenţii trebuie să aibă o mare puritate (se va folosi THF de puritate 99,5 %). Rezervorul pentru solvent (la nevoie, pus în atmosferă de gaz inert), trebuie să fie suficient de mare pentru a permite etalonarea coloanei şi mai multe analize de eşantioane. Solventul va fi degazat înainte de a fi pompat în coloană.
      1.6.10.   Reglarea temperaturii
      Temperatura componentelor interne critice (bucla de injecţie, coloana sau coloanele, detectorul şi tuburile) trebuie să fie constantă şi compatibilă cu solventul ales.
      1.6.11.   Detectorul
      Detectorul înregistrează în mod cantitativ concentraţia eşantionului eluat din coloană. Pentru evitarea unei lărgimi nedorite a picului, volumul cuvei detectorului va fi ales cât mai mic posibil. Acesta nu trebuie să depăşească 10 μl, cu excepţia detectoarelor ce funcţionează prin difuzia luminii şi a viscozimetrelor. În general, detecţia se realizează prin refractometrie diferenţială. Totuşi, dacă proprietăţile specifice ale eşantionului sau ale solventului pentru eluare o cer, se pot folosi alte tipuri de detectoare, cum ar fi cele UV/VIS sau IR, viscozimetrele etc.
      2.   DATE ŞI RAPORT
      2.1.   DATE
      Se va face referinţă la normele DIN (1) pentru ceea ce priveşte criteriile de evaluare detaliate, la fel pentru specificaţiile relative la colectarea şi interpretarea datelor.
      Pentru fiecare eşantion analizat, se vor realiza două experienţe independente. Rezultatele acestora se vor analiza separat.
      Trebuie indicat în mod explicit că valorile măsurate sunt valori relative corespunzând unor echivalenţi de masă moleculară ale standardului folosit.
      În toate cazurile, este esenţial să se determine şi datele relative la blancuri, acestea fiind tratate în acelaşi mod ca eşantioanele.
      După determinarea volumelor şi a timpilor de retenţie (eventual corectate cu ajutorul unui standard intern) se vor reprezenta grafic valorile log Mp (Mp fiind semnalul maxim al polimerilor standard), în funcţie de una dintre acele cantităţi. Sunt necesare cel puţin 2 puncte de etalonare pentru fiecare factor 10 de masă moleculară. Pentru trasarea întregii curbe sunt necesare cel puţin 5 puncte de măsură; această curbă va acoperi masa moleculară estimată a eşantionului. Punctul extrem al curbei de etalonare, spre partea maselor moleculare mici, se poate defini folosind n-hexilbenzenul sau altă substanţă dizolvată nepolară adecvată. Se determină porţiunea de curbă corespunzătoare maselor moleculare mai mici de 1 000 şi se va corecta, dacă va fi necesar, luând în considerare prezenţa impurităţilor şi a aditivilor. În general, curbele de eluare sunt evaluate prin intermediul unui sistem de prelucrare informatică a datelor. Dacă s-a optat pentru o prelucrare manuală, este indicat să se consulte ASTM D 3536-91 (3).
      Dacă un polimer insolubil este reţinut în coloană, masa sa moleculară este, foarte probabil, superioară celei corespunzătoare fracţiunii solubile şi trebuie ţinut cont de aceasta, pentru a evita subestimarea conţinutului în polimeri de masă moleculară mică. În apendice se află indicaţiile ce permit corecţia conţinutului în polimeri de masă moleculară mică, luând în considerare polimerii insolubili.
      Curba de distribuţie va fi prezentată sub forma unui tabel sau a unui grafic (frecvenţa diferenţială sau procentajele cumulative în funcţie de log M). În cazul reprezentării grafice, o putere de 10 pentru masa moleculară corespunde în mod normal unei lărgimi de aproximativ 4 cm, în vreme ce pentru maximul de semnal, este adecvată o înălţime de aproximativ 8 cm. În cazul curbelor de distribuţie cumulative, diferenţa între 0 şi 100 % pe axa ordonatei trebuie să fie în jur de 10 cm.
      2.2.   RAPORT DE TESTARE
      Raportul de testare va cuprinde informaţiile următoare:
      2.2.1.   Substanţa testată:
      
                  —
               
               
                  informaţii disponibile legate de substanţa testată (natură, aditivi, impurităţi);
               
            
                  —
               
               
                  descrierea tratamentului aplicat eşantionului, observaţii, probleme.
               
            2.2.2.   Dispozitivul experimental:
      
                  —
               
               
                  un rezervor pentru solvent, gaz inert, sistem pentru degazarea solventului, compoziţia solventului, impurităţi;
               
            
                  —
               
               
                  pompă, amortizor de impulsuri, sistem de injecţie;
               
            
                  —
               
               
                  coloane de separare (fabricant, toate precizările legate de caracteristicile coloanei, cum ar fi dimensiunea porilor, natura materialului de separare etc., numărul, lungimea şi ordinul coloanelor utilizate);
               
            
                  —
               
               
                  numărul de talere teoretice ale coloanei (sau al combinaţiei de coloane), eficacitatea separării (resorbţia sistemului);
               
            
                  —
               
               
                  informaţii legate de simetria semnalelor maxime;
               
            
                  —
               
               
                  temperatura coloanei, modul de reglare a temperaturii;
               
            
                  —
               
               
                  detector (principiul de măsurare, tip, volumul cuvei);
               
            
                  —
               
               
                  debitmetru, dacă există (fabricant, principiul de măsurare);
               
            
                  —
               
               
                  sistemul utilizat pentru culegere şi prelucrarea datelor (echipament şi programe informatice).
               
            2.2.3.   Etalonarea sistemului:
      
                  —
               
               
                  descrierea detaliată a metodei utilizate pentru determinarea curbei de etalonare;
               
            
                  —
               
               
                  precizări asupra criteriilor de calitate proprii acestei metode (de exemplu, coeficientul de corelare, eroarea pătratică medie etc.);
               
            
                  —
               
               
                  informaţii asupra tuturor extrapolărilor, ipotezelor şi aproximărilor efectuate în cursul proceselor experimentale, precum şi asupra evaluării şi prelucrării datelor;
               
            
                  —
               
               
                  toate măsurătorile efectuate pentru stabilirea curbei de etalonare trebuie prezentate sub forma unui tabel, care cuprinde, pentru fiecare punct de etalonare, următoarele informaţii:
                  
                              —
                           
                           
                              denumirea eşantionului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              fabricantul eşantionului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              valorile caracteristice Mp, Mn, Mw, Mw/Mn ale etaloanelor furnizate de fabricant, deduse din măsurătorile ulterioare, completate de indicaţiile legate de metoda de determinare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              volumul de injecţie şi concentraţia substanţei injectate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              valoarea de Mp utilizată pentru etalonare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              volumul de eluare sau timpul de retenţie corectat, măsurat la semnalul maxim;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              Mp calculat la semnalul maxim;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              procentajul de eroare la Mp calculat şi la valoarea de etalonare.
                           
                        
            2.2.4.   Informaţii asupra conţinutului în polimeri cu masă moleculară mică:
      
                  —
               
               
                  descrierea metodelor de analiză utilizate şi a modului în care au fost conduse experimentele;
               
            
                  —
               
               
                  informaţii privind procentajul conţinutului în specii de masă moleculară mică (greutate/greutate) în raport cu ansamblul eşantionului;
               
            
                  —
               
               
                  informaţii legate de impurităţi, aditivi şi alte substanţe nepolimerice, în procentaj ponderal, funcţie de ansamblul eşantionului;
               
            2.2.5.   Evaluare:
      
                  —
               
               
                  evaluare în funcţie de timp: toate metodele care vizează ameliorarea reproductivităţii cerute (metode de corecţie, standard intern etc.);
               
            
                  —
               
               
                  se precizează dacă evaluarea s-a efectuat plecând de la volumul de eluare sau de la timpul de retenţie;
               
            
                  —
               
               
                  se indică limitele de evaluare, dacă un pic nu a fost complet analizat;
               
            
                  —
               
               
                  se descriu metodelor de netezire, dacă s-au folosit;
               
            
                  —
               
               
                  se indică procedeele de preparare şi pretratare a eşantionului;
               
            
                  —
               
               
                  dacă există, se indică prezenţa particulelor nedizolvate;
               
            
                  —
               
               
                  se indică volumul de injecţie (μl) şi concentraţia de injecţie (mg/ml);
               
            
                  —
               
               
                  se menţionează observaţiile privind efectele generatoare de deviaţii, în raport cu profilul ideal de cromatografie pe gel permeabil;
               
            
                  —
               
               
                  se descriu în detaliu toate modificările aduse procedurilor de analiză;
               
            
                  —
               
               
                  se precizează intervalele de eroare;
               
            
                  —
               
               
                  se consemnează orice alte informaţii şi observaţii utile pentru interpretarea rezultatelor.
               
            3.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  DIN 55672 (1995), Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.
               
            
                  2.
               
               
                  Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979), Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.
               
            
                  3.
               
               
                  ASTM D 3536-91, (1991), Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
               
            
                  4.
               
               
                  ASTM D 5296-92, (1992), Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
               
            
         Apendice
         Indicaţii care permit corecţia conţinutului de polimeri cu masă moleculară mică, luând în considerare polimerii insolubili
         Prezenţa unui polimer insolubil într-un eşantion antrenează o pierdere de masă în cursul analizei cromatografice pe gel permeabil. Polimerul insolubil este ireversibil reţinut în coloană sau în filtrul eşantionului, atunci când partea solubilă a eşantionului traversează coloana. Dacă indicele de refracţie diferenţial (dn/dc) al polimerului poate fi estimat sau măsurat, este posibilă estimarea masei pe care eşantionul a pierdut-o în coloană. În acest caz, se efectuează o corecţie cu ajutorul unui etalonare extern al refractometrului, cu etaloane având concentraţia şi raportul dn/dc, cunoscute. În exemplul următor, s-a utilizat un etalon de poli(metacrilat de metil).
         Etalonarea externă, practicată în timpul analizei polimerilor acrilici, constă în analizarea cu ajutorul metodei cromatografice pe gel permeabil, a unei soluţii etalon de poli(metacrilat de metil) în tetrahidrofuran, cu concentraţia cunoscută; rezultatele servesc la calcularea constantei refractometrului, conform ecuaţiei următoare:
         K = R/(C × V × dn/dc)
         unde:
         
                     K
                  
                  
                     =
                  
                  
                     constanta refractometrului (μV sec/ml)
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     răspunsul etalonului de polimetacrilat de metil (μV/sec)
                  
               
                     C
                  
                  
                     =
                  
                  
                     concentraţia etalonului de polimetacrilat de metil (mg/ml)
                  
               
                     V
                  
                  
                     =
                  
                  
                     volumul de injecţie (ml) şi
                  
               
                     dn/dc
                  
                  
                     =
                  
                  
                     indicele de refracţie diferenţial al unei soluţii de polimetacrilat de metil în tetrahidrofuran (ml/mg)
                  
               Următoarele date caracterizează în general un etalon de polimetacrilat de metil:
         
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     2 937 891
                  
               
                     C
                  
                  
                     =
                  
                  
                     1,07 mg/ml
                  
               
                     V
                  
                  
                     =
                  
                  
                     0,1 ml
                  
               
                     dn/dc
                  
                  
                     =
                  
                  
                     9 × 10–5 ml/mg
                  
               Valoarea K rezultată, 3,05 × 1011, este apoi utilizată pentru a calcula răspunsul teoretic al detectorului, adică ceea ce s-ar obţine dacă 100 % din polimerul injectat s-ar alege la traversarea detectorului.
      
      A.20.   COMPORTAMENTUL DE DIZOLVARE/EXTRACŢIE AL POLIMERILOR ÎN APĂ
      1.   METODĂ
      Metoda descrisă urmează Orientarea 120 (1997) a OCDE. Mai multe informaţii tehnice se găsesc în referinţele bibliografice (1).
      1.1.   INTRODUCERE
      În cazul anumitor polimeri, cum ar fi polimerii în emulsie, poate fi necesar un tratament iniţial, înainte de utilizarea metodei expuse. Metoda nu este aplicabilă polimerilor lichizi, nici polimerilor care reacţionează cu apa în condiţiile experimentale.
      Dacă este dificil sau imposibil să se pună în practică metoda, comportamentul de dizolvare/extracţie al polimerilor poate fi studiat cu ajutorul altor metode. În acest caz, metoda utilizată va fi în întregime detaliată şi justificată.
      1.2.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI
      Comportamentul de dizolvare/extracţie al polimerilor în mediu apos se determină prin metoda flaconului (a se vedea A.6 Solubilitatea în apă, metoda flaconului), căreia i se vor aduce modificările descrise mai jos.
      1.4.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.5.   DESCRIEREA METODEI
      1.5.1.   Aparatură
      Aparatura necesară pentru aplicarea metodei este următoarea:
      
                  —
               
               
                  un dispozitiv care permite măcinarea eşantionului până la obţinerea unei pulberi, cum ar fi un concasor ce produce particule de dimensiuni determinate (1);
               
            
                  —
               
               
                  un sistem de agitare, cu posibilitatea de reglare a temperaturii;
               
            
                  —
               
               
                  un sistem de filtrare cu membrane;
               
            
                  —
               
               
                  un dispozitiv de analiză;
               
            
                  —
               
               
                  site standardizate.
               
            1.5.2.   Prepararea soluţiei de eşantion
      Iniţial trebuie măcinat un eşantion reprezentativ, până la dimensiuni ale particulelor cuprinse între 0,125 şi 0,25 mm, utilizând sitele potrivite. Poate fi necesară o răcire pentru a garanta stabilitatea eşantionului sau pentru a se proceda la concasare. Materialele de tipul cauciucului pot fi pulverizate la temperatura azotului lichid (1).
      Dacă nu este posibilă obţinerea de particule la dimensiunile cerute, se vor reduce dimensiunile acestora cât mai mult posibil şi se va consemna rezultatul. În cuprinsul raportului, este necesar să se indice modul în care eşantionul pulverizat a fost conservat înainte de analiză.
      1.5.3.   Mod de operare
      Se cântăresc trei eşantioane din substanţa testată, fiecare de 10 g, în trei recipiente prevăzute cu dop de sticlă şi se adaugă câte 1 000 ml apă în fiecare recipient. Dacă manipularea a 10 g de polimer se dovedeşte imposibilă, este indicat să se folosească cea mai mare cantitate care poate fi manipulată; volumul de apă va fi mărit în mod proporţional.
      Recipientele se vor închide bine, apoi se vor agita la temperatura de 20 oC. Se va folosi un dispozitiv de agitare care funcţionează la temperatură constantă. După 24 ore, conţinutul fiecărui recipient este centrifugat sau filtrat, iar concentraţia polimerului în faza apoasă limpede va fi determinată cu ajutorul unei metode potrivite de analiză. Dacă nu există o metodă adecvată, care să permită o analiză în faza apoasă, se poate obţine o estimare a solubilităţii/extractibilităţii totale, prin cântărirea, după uscare, a reziduului filtrat sau a precipitatului centrifugat.
      De asemenea, este necesară diferenţierea cantitativă a impurităţilor şi aditivilor, pe de o parte, şi a speciilor de masă moleculară mică, pe de altă parte. În cazul unei determinări gravimetrice, este important să se realizeze o analiză iniţială, fără substanţă de testare, în scopul de a lua în considerare reziduurile generate prin metoda experimentală.
      În mod similar, se poate determina comportamentul de dizolvare/extracţie al polimerilor în apă, la 37 oC, pentru pH 2 şi pH 9, aşa cum a fost descrisă experienţa realizată la 20 oC. Valorile pH-ului pot fi obţinute prin adăugare de soluţii tampon adecvate sau adăugare de acizi ori baze, potriviţi; dintre aceştia, se pot enumera: acid clorhidric, acid acetic, hidroxizi de sodiu şi de potasiu de calitate analitică sau amoniac.
      Trebuie realizate una sau două experienţe, conform metodei. În cazul în care sunt disponibile metode suficient de specifice, pentru analizarea directă a polimerului în faza apoasă, un experiment ca acela descris mai sus este destul. Însă, atunci când aceste metode nu există, iar determinarea comportamentului de dizolvare-extracţie al polimerului, nu se poate face decât indirect – respectiv prin determinarea conţinutului în carbon organic total (COT) al extractului apos – este necesară o experienţă suplimentară. De asemenea, şi aceasta se va face în triplicat, cu eşantioane de polimer de 10 ori mai mici şi cu aceleaşi cantităţi de apă, ca şi la primul experiment.
      1.5.4.   Analiza
      1.5.4.1.   Experimente realizate cu eşantioane de dimensiuni unice
      Este posibil să dispunem de metode care permit o analiză directă a polimerilor, în fază apoasă. În caz contrar, poate fi luată în considerare analiza indirectă a polimerilor dizolvaţi sau extraşi. Pentru aceasta, se va determina conţinutul total în părţi solubile, care se va corecta ţinând cont de substanţele nepolimerice.
      Pentru a determina conţinutul total în specii polimerice, analiza extrasului apos se poate realiza:
      fie printr-o metodă suficient de sensibilă, de exemplu:
      
                  —
               
               
                  determinarea COT cu persulfat sau dicromat, pentru a se obţine CO2, urmată de o estimare prin IR sau de o analiză chimică;
               
            
                  —
               
               
                  spectrometria de absorbţie atomică (SAA) sau echivalentul acesteia, emisie în plasmă cuplată prin inducţie (PCI);, în cazul polimerilor ce conţin siliciu sau un metal;
               
            
                  —
               
               
                  absorbţia UV sau spectrofluorimetria pentru polimerii arilici;
               
            
                  —
               
               
                  cromatografia în fază lichidă cuplată cu spectrometria de masă, pentru eşantioane cu mase moleculare mici,
               
            fie prin evaporare completă, în vid, a extrasului apos, urmată de o analiză a reziduului prin spectroscopie (IR, UV etc.) sau prin SAA-PCI.
      Dacă o astfel de analiză a fazei apoase este imposibilă, extrasul apos se va obţine cu ajutorul unui solvent organic nemiscibil în apă (o hidrocarbură clorurată, de exemplu). Apoi, solventul este evaporat şi reziduul se analizează (prin IR, UV sau SAA-PCI), pentru determinarea conţinutului său în polimer specificat. Toţi constituenţii acestui reziduu care se dovedesc a fi impurităţi sau aditivi trebuie separaţi, în scopul determinării gradului de dizolvare/extracţie al polimerului.
      Atunci când astfel de substanţe sunt prezente în cantităţi relativ importante, poate fi necesară supunerea reziduului unei analize cromatografice în fază lichidă, de înaltă performanţă, sau în fază gazoasă, de exemplu, în scopul diferenţierii acelor impurităţi prezente, de monomeri şi derivaţi monomerici, astfel încât conţinutul real în aceste ultime specii, să poată fi determinat.
      În anumite cazuri, o simplă evaporare completă a solventului organic, urmată de cântărirea reziduului uscat, poate fi suficientă.
      1.5.4.2.   Experimente realizate cu două eşantioane de mărimi diferite
      Conţinutul în carbon organic total trebuie determinat pentru toate extrasele apoase.
      Se realizează o determinare prin gravimetrie, asupra părţii nedizolvate sau neextrase a eşantionului. Dacă, după centrifugarea sau filtrarea conţinutului fiecărui recipient, reziduul de polimer aderă încă la peretele recipientului, trebuie clătit respectivul recipient cu filtratul, până când nu se mai observă urme de reziduu. După aceea, filtratul este refiltrat sau centrifugat. Reziduurile depuse pe filtru sau în tubul centrifugei sunt uscate la 40 oC, în vid, apoi se cântăresc. Se va continua uscarea, până la obţinerea unei mase constante.
      2.   DATE
      2.1.   EXPERIMENTE REALIZATE CU EŞANTIOANE DE DIMENSIUNI UNICE
      Rezultatele obţinute pentru fiecare dintre cele trei flacoane, precum şi valorile medii, trebuie consemnate şi exprimate în unităţi de masă per volum de soluţie (în general, în mg/l) sau în unităţi de masă per masă de eşantion de polimer (de obicei, în mg/g). În plus, pierderea de masă de eşantion (calculată prin raportarea masei soluţiei la masa iniţială de eşantion), va fi de asemenea menţionată. Trebuie calculate deviaţiile standard relative. Diversele valori vor fi menţionate o dată, pentru produsul total (polimer + principalii aditivi etc.) şi repetate, pentru polimerul singur (pentru a cunoaşte, după separare, mărimea relativă a respectivilor aditivi).
      2.2.   EXPERIMENTE REALIZATE CU EŞANTIOANE DE DIMENSIUNI DIFERITE
      Diferitele concentraţii ale carbonului organic total în extrasele apoase, provenite din cele două serii a câte trei experienţe, precum şi valorile medii pentru fiecare serie, trebuie consemnate şi exprimate în unităţi de masă per volum de soluţie (în general, în mgC/l), precum şi în unităţi de masă per masă de eşantion iniţial (de obicei, în mgC/g).
      Dacă nu există diferenţe între rezultatele corespunzătoare rapoartelor dimensiune de eşantion/volum de apă mare sau mic, aceasta poate semnifica faptul că toţi constituenţii susceptibili a fi extraşi, au fost efectiv extraşi. În acest caz, o analiză directă nu este, de regulă, necesară.
      Diferitele mase de reziduu trebuie consemnate şi exprimate în procente de masă iniţială de eşantion. Se vor calcula valori medii pentru fiecare experienţă. Diferenţa dintre 100 şi procentajul obţinut, reprezintă procentul de materii solubile şi extractibile din eşantioanele iniţiale.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORT DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să cuprindă următoarele informaţii:
      3.1.1.   Substanţa testată:
      
                  —
               
               
                  informaţii disponibile, legate de substanţa testată (natură, aditivi, impurităţi, proporţia speciilor cu masă moleculară mică).
               
            3.1.2.   Condiţii experimentale:
      
                  —
               
               
                  descrierea metodelor utilizate şi a condiţiilor experimentale;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea metodelor de analiză şi detecţie.
               
            3.1.3.   Rezultate:
      
                  —
               
               
                  rezultate de solubilitate/extractibilitate în mg/l: toate valorile şi valorile medii obţinute pentru experienţele de extracţie în diferite soluţii, repartizate în polimeri şi impurităţi, aditivi etc.;
               
            
                  —
               
               
                  rezultate de solubilitate/extractibilitate în mg/g de polimer;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţiile carbonului organic total în extractele apoase, masa soluţiei şi procentajele calculate, dacă s-a făcut măsurarea;
               
            
                  —
               
               
                  pH-ul fiecărui eşantion;
               
            
                  —
               
               
                  informaţii privind valorile obţinute în experienţele martor (fără solvent);
               
            
                  —
               
               
                  descrierea metodelor de analiză şi detecţie;
               
            
                  —
               
               
                  dacă este necesar, se va menţiona instabilitatea chimică a substanţei testate, în cursul procedurii experimentale şi în cursul analizei;
               
            
                  —
               
               
                  toate informaţiile importante pentru interpretarea rezultatelor.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.
      A.21.   PROPRIETĂŢI OXIDANTE (LICHIDE)
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Această metodă de testare este concepută pentru a măsura potenţialul unei substanţe lichide de a creşte rata sau intensitatea arderii unei substanţe combustibile sau de a forma cu o substanţă combustibilă un amestec care se aprinde spontan când cele două se amestecă omogen. Se bazează pe testul ONU pentru lichide oxidante (1) şi este echivalent cu acesta. Cu toate acestea, întrucât această metodă A.21 este concepută în special pentru a îndeplini cerinţele Regulamentului (CE) nr. 1907/2006, este necesară comparaţia cu o singură substanţă de referinţă. Testarea şi comparaţia cu alte substanţe de referinţă pot fi necesare în cazul în care se estimează utilizarea rezultatelor în alte scopuri (9).
      Nu este necesar să se efectueze acest test în cazul în care examinarea formulei structurale stabileşte indubitabil că substanţa este incapabilă să reacţioneze exotermic cu un material combustibil.
      Înainte de efectuarea testului este util să se cunoască informaţii privind orice potenţiale proprietăţi explozive ale substanţei.
      Acest test nu se aplică substanţelor solide, gazoase, explozive sau foarte inflamabile sau peroxizilor organici.
      Nu este necesar să se efectueze acest test în cazul în care sunt disponibile rezultatele pentru substanţa de testat în cadrul testului ONU pentru lichide oxidante (1).
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Timpul mediu de creştere a presiunii reprezintă media timpilor măsuraţi în care un amestec testat produce o creştere de presiune de la 690 kPa la 2 070 kPa peste presiunea atmosferică.
      1.3.   SUBSTANŢA DE REFERINŢĂ
      Ca substanţă de referinţă se utilizează o soluţie apoasă de acid azotic (calitate analitică) la 65 % (g/g) (10).
      Opţional, dacă experimentatorul prevede că rezultatele acestui test ar putea fi utilizate în alte scopuri, ar putea fi oportună testarea altor substanţe de referinţă (11).
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Lichidul care urmează a fi testat se amestecă, în proporţie masică de 1 la 1 cu celuloză fibroasă şi se introduce într-un vas de presiune. Dacă în timpul amestecării sau umplerii are loc combustia spontană, nu mai sunt necesare alte teste.
      Dacă nu intervine combustia spontană, se efectuează testul complet. Amestecul se încălzeşte într-un vas de presiune şi se măsoară timpul mediu de creştere a presiunii de la 690 kPa la 2 070 kPa peste presiunea atmosferică. Acesta este comparat cu timpul mediu de creştere a presiunii pentru amestecul de substanţă sau substanţe de referinţă şi celuloză în proporţie de 1:1.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Dintr-o serie de cinci teste asupra unei singure substanţe, rezultatele nu trebuie să prezinte diferenţe de peste 30 % faţă de media aritmetică. Rezultatele care se abat cu peste 30 % de la medie se ignoră, se îmbunătăţeşte procedura de amestecare şi umplere şi se repetă testele.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      1.6.1.   Pregătire
      1.6.1.1.   Substanţa combustibilă
      Ca material combustibil se utilizează celuloză fibroasă uscată, cu fibre de o lungime între 50 şi 250 μm şi un diametru mediu de 25 μm (12). Celuloza se usucă până la obţinerea unei greutăţi constante în straturi de maximum 25 mm grosime, la 105 oC timp de patru ore, după care se păstrează într-un exsicator, în prezenţa unui deshidratant, până la răcire şi utilizare. Conţinutul de apă al celulozei uscate trebuie să fie sub 0,5 % din masa uscată (13). Dacă este necesar, timpul de uscare se prelungeşte pentru îndeplinirea acestei condiţii (14). Pe întreg parcursul testului se utilizează acelaşi lot de celuloză.
      1.6.1.2.   Aparatură
      1.6.1.2.1.   Vas de presiune
      
      Este necesar un vas de presiune. Vasul este format dintr-un vas de presiune cilindric, din oţel, cu o lungime de 89 mm şi un diametru exterior de 60 mm (a se vedea figura 1). În două puncte diametral opuse se formează două suprafeţe plane (care reduc secţiunea transversală a vasului la 50 mm) care permit fixarea sa în momentul instalării dopului de aprindere şi a dopului de aerisire. Vasul, care are un alezaj cu un diametru de 20 mm, este fălţuit intern la ambele capete pe o adâncime de 19 mm şi filetat pentru fileturi de 1" conform British Standard Pipe (BSP) sau echivalent metric. O priză de presiune, sub forma unui braţ lateral, este înfiletată pe faţa curbată a vasului de presiune la 35 de mm de unul dintre capete şi la 90o faţă de suprafeţele plane. Orificiul pentru priză este alezat la o adâncime de 12 mm şi filetat pentru fileturi de 1/2" BSP (sau echivalent metric) la extremitatea braţului lateral. Dacă este necesar, pentru a asigura etanşeitatea la gaz, se foloseşte o garnitură inertă. Braţul lateral se extinde 55 mm de la corpul vasului de presiune şi are un alezaj de 6 mm. Extremitatea braţului lateral este fălţuită şi filetată pentru un traductor de presiune de tip diafragmă. Se poate utiliza orice dispozitiv de măsurare a presiunii care nu este afectat de gazele calde sau de produsele de descompunere şi care poate reacţiona la o creştere de presiune de la 690 la 2 070 kPa în cel mult 5 ms.
      Extremitatea vasului de presiune cea mai îndepărtată de braţul lateral este închisă cu un dop de aprindere prevăzut cu doi electrozi, unul izolat de corpul dopului, iar celălalt pus la masă. Cealaltă extremitate a vasului de presiune este închisă cu un disc de rupere (presiunea de rupere aproximativ 2 200 kPa), fixat cu un dop de fixare având un orificiu de 20 mm. Dacă este necesar, dopul de aprindere se montează cu o garnitură inertă pentru a asigura etanşeitatea la gaz. În timpul utilizării, ansamblul este menţinut în poziţia corectă de un stand de sprijin (figura 2). Acesta cuprinde, de obicei, o placă de bază din oţel moale de 235 mm × 184 mm × 6 mm şi un tub cu secţiune pătrată de 70 mm × 70 mm × 4 mm de 185 mm lungime.
      La una dintre extremităţile tubului cu secţiune pătrată, se taie câte o secţiune de fiecare parte, astfel încât să se obţină o structură cu secţiune pătrată de 86 mm lungime cu două picioare plate. Capetele acestor picioare pătrate se taie într-un unghi de 60o faţă de orizontală şi sudate pe placa de bază. Pe o parte a capătului superior al secţiunii de bază se decupează o fantă de 22 mm lăţime şi 46 mm adâncime, astfel încât, atunci când ansamblul vasului de presiune este pus pe suport, cu dopul de aprindere în jos, braţul lateral să intre în fantă. O piesă de oţel de 30 mm lăţime şi 6 mm grosime se sudează pe faţa interioară a părţii inferioare a tubului cu secţiune pătrată, pentru a acţiona ca distanţier. Două şuruburi cu cap fluture de 7 mm, fixate pe partea opusă, menţin vasul de presiune într-o poziţie fixă. Două benzi de 12 mm lăţime din tablă de oţel de 6 mm grosime, sudate pe părţile laterale de la baza tubului cu secţiune pătrată, sprijină vasul de presiune de dedesubt.
      1.6.1.2.2.   Sistemul de aprindere
      
      Sistemul de aprindere este format dintr-o sârmă de Ni/Cr cu o lungime de 25 cm, un diametru de 0,6 mm şi o rezistenţă de 3,85 ohm/m. Sârma se înfăşoară, pe o tijă cu un diametru de 5 mm, sub forma unei bobine, şi se leagă la electrozii dopului de aprindere. Bobina trebuie să aibă una dintre configuraţiile prezentate în figura 3. Distanţa dintre fundul vasului şi partea inferioară a bobinei de aprindere trebuie să fie de 20 mm. Dacă electrozii nu pot fi reglaţi, secţiunile sârmei de aprindere dintre bobină şi fundul vasului se izolează cu o manta ceramică. Sârma este încălzită de o sursă de alimentare constantă care poate asigura cel puţin 10 A.
      1.6.2.   Desfăşurarea testului
             (15)
         
      
      Aparatul, echipat complet cu traductor de presiune şi sistem de încălzire, dar fără discul de rupere, se sprijină vertical, cu dopul de aprindere în jos. Se amestecă 2,5 g din lichidul de testat cu 2,5 g de celuloză uscată într-un pahar de laborator cu un agitator de sticlă (16). Pentru siguranţă, în timpul amestecării între operator şi amestec se amplasează un ecran de protecţie. Dacă amestecul se aprinde în timpul amestecării sau umplerii, nu mai sunt necesare teste suplimentare. Amestecul se adaugă, în cantităţi mici, lovindu-l încet de container, în vasul de presiune, asigurându-se că nu există spaţii goale în jurul bobinei de aprindere şi că amestecul este în contact perfect cu aceasta. Este important ca bobina să nu fie deformată în procesul de umplere, întrucât acest lucru ar putea conduce la rezultate eronate (17). Discul de rupere se pune pe poziţie şi dopul de fixare se înşurubează strâns. Vasul umplut se pune, cu discul de rupere în sus, pe suportul de sprijin pentru încălzire care se amplasează într-o hotă sau o cameră de tiraj adecvată. Se conectează sursa de alimentare la bornele externe ale dopului de aprindere şi se aplică un curent de 10 A. De la începerea amestecării şi până la punerea sub tensiune nu trebuie să treacă mai mult de 10 minute.
      Semnalul produs de traductorul de presiune se înregistrează într-un sistem adecvat care permite atât evaluarea, cât şi generarea unei înregistrări permanente a graficului presiune/timp obţinut (de exemplu un înregistrator de semnale tranzitorii legat la un înregistrator cu bandă). Amestecul se încălzeşte până când se rupe discul de rupere sau cel puţin 60 s. Dacă discul de rupere nu se rupe, amestecul se lasă să se răcească, după care se dezmembrează cu atenţie aparatul, luând măsurile necesare pentru a ţine seama de eventuala presurizare. Se fac cinci teste cu substanţa de testat şi substanţa sau substanţele de referinţă. Se notează timpul necesar pentru creşterea presiunii de la 690 kPa la 2 070 kPa peste presiunea atmosferică. Se calculează timpul mediu de creştere a presiunii.
      În unele cazuri, substanţele pot genera o creştere de presiune (prea mare sau prea mică), cauzată de reacţii chimice care nu caracterizează proprietăţile oxidante ale substanţei. În aceste cazuri, este posibil să fie necesară repetarea testului cu o substanţă inertă, de exemplu diatomit (kieselgur), în loc de celuloză, pentru a se clarifica natura reacţiei.
      2.   DATE
      Timpii de creştere a presiunii atât pentru substanţa de testat, cât şi pentru substanţa (substanţele) de referinţă. Timpii de creştere a presiunii pentru testele cu o substanţă inertă, dacă se efectuează astfel de teste.
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Se calculează timpii medii de creştere a presiunii atât pentru substanţa de testat, cât şi pentru substanţa sau substanţele de referinţă.
      Se calculează timpul mediu de creştere a presiunii pentru testele cu o substanţă inertă (dacă se efectuează).
      Tabelul 1 prezintă câteva exemple de rezultate.
      Tabelul 1
      Exemple de rezultate
             (18)
         
      
      
                  Substanţa (19)
                  
               
               
                  Timpul mediu de creştere a presiunii pentru un amestec 1:1 cu celuloză
                  (ms)
               
            
                  Dicromat de amoniu, soluţie apoasă saturată
               
               
                  20 800
               
            
                  Nitrat de calciu, soluţie apoasă saturată
               
               
                  6 700
               
            
                  Nitrat feric, soluţie apoasă saturată
               
               
                  4 133
               
            
                  Perclorat de litiu, soluţie apoasă saturată
               
               
                  1 686
               
            
                  Perclorat de magneziu, soluţie apoasă saturată
               
               
                  777
               
            
                  Nitrat de nichel, soluţie apoasă saturată
               
               
                  6 250
               
            
                  Acid azotic, 65 %
               
               
                  4 767 (20)
                  
               
            
                  Acid percloric, 50 %
               
               
                  121 (20)
                  
               
            
                  Acid percloric, 55 %
               
               
                  59
               
            
                  Nitrat de potasiu, soluţie apoasă 30 %
               
               
                  26 690
               
            
                  Nitrat de argint, soluţie apoasă saturată
               
               
                  
                      (21)
                  
               
            
                  Clorat de sodiu, soluţie apoasă 40 %
               
               
                  2 555 (20)
                  
               
            
                  Nitrat de sodiu, soluţie apoasă 45 %
               
               
                  4 133
               
            
                  
                     Substanţă inertă
                  
               
               
                   
               
            
                  Apă:celuloză
               
               
                  
                      (21)
                  
               
            3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să cuprindă următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  identitatea, puritatea, compoziţia, puritatea etc. substanţei de testat;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia substanţei de testat;
               
            
                  —
               
               
                  procedura de uscare a celulozei utilizate;
               
            
                  —
               
               
                  conţinutul de apă al celulozei utilizate;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele măsurătorilor;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele testelor cu o substanţă inertă, dacă este cazul;
               
            
                  —
               
               
                  timpii medii de creştere a presiunii calculaţi;
               
            
                  —
               
               
                  orice abatere de la această metodă şi motivele acesteia;
               
            
                  —
               
               
                  orice informaţii şi observaţii suplimentare relevante pentru interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   INTERPRETAREA REZULTATELOR (22)
      
      Rezultatele testelor se evaluează în funcţie de:
      
                  (a)
               
               
                  eventuala combustie spontană a amestecului de substanţă de testat şi celuloză; şi
               
            
                  (b)
               
               
                  compararea timpului mediu necesar pentru creşterea presiunii de la 690 kPa la 2 070 kPa cu cel al substanţei (substanţelor) de referinţă.
               
            O substanţă lichidă este considerată oxidant dacă:
      
                  (a)
               
               
                  un amestec de substanţă de testat şi celuloză în proporţie masică de 1:1 se aprinde spontan; sau
               
            
                  (b)
               
               
                  un amestec de substanţă de testat şi celuloză în proporţie masică de 1:1 are un timp mediu de creştere a presiunii mai mic sau egal cu cel al unui amestec de acid azotic în soluţie apoasă de 65 % (g/g) şi celuloză în proporţie masică de 1:1.
               
            Dacă este necesar pentru a evita un rezultat pozitiv fals, la interpretarea rezultatelor se iau în considerare şi rezultatele obţinute la testarea substanţei cu un material inert.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, p. 342. Test O.2: Test for oxidising liquids.
      Figura 1
      Vas de presiune
      
         
      Figura 2
      Stand de sprijin
      
         
      Figura 3
      Sistemul de aprindere
      
         
      Notă: se poate folosi oricare dintre aceste configuraţii.
      
         (1)  În funcţie de tipul de instrument şi gradul de puritate a substanţei.
      
         (2)  În funcţie de tipul de instrument şi gradul de puritate al substanţei.
      
         (3)  În funcţie de tipul de instrument şi gradul de puritate al substanţei.
      
         (4)  În funcţie de tipul de instrument şi gradul de puritate al substanţei.
      
         (5)  Această precizie este valabilă numai pentru dispozitive simple cum ar fi cel descris în ASTM D 1120-72; aceasta poate fi îmbunătăţită cu ebuliometre mult mai sofisticate.
      
         (6)  Valabil numai pentru substanţe pure. Folosirea în alte circumstanţe trebuie să fie justificată.
      
         (7)  Depind de gradul de puritate.
      
         (8)  Aceste metode pot fi folosite în domeniul 1-10 Pa, cu condiţia să fie aplicate atent.
      
         (9)  Ca de exemplu în cadrul reglementărilor privind transportul.
      
         (10)  Înainte de testare, acidul trebuie titrat pentru a i se confirma concentraţia.
      
         (11)  De exemplu: acid percloric 50 % (g/g) şi clorat de sodiu 40 % (g/g) se utilizează în referinţa 1.
      
         (12)  De exemplu, pudră de celuloză Whatman pentru cromatografie pe coloană CF11, nr. de catalog 4021 050.
      
         (13)  Confirmat prin (de exemplu) titrare Karl-Fisher.
      
         (14)  Alternativ, acest conţinut de apă poate fi realizat prin (de exemplu) încălzire la 105 oC sub vid, timp de 24 h.
      
         (15)  Amestecurile de oxidanţi cu celuloză trebuie tratate ca fiind potenţial explozive şi manipulate cu atenţia cuvenită.
      
         (16)  În practică, aceste lucru se poate realiza prin prepararea unui amestec 1:1 din lichidul de testat şi celuloză, într-o cantitate mai mare decât cea necesară pentru test şi mutând 5 ±0,1 g în vasul de presiune. Amestecul trebuie să fie proaspăt preparat pentru fiecare testare.
      
         (17)  Trebuie să se evite, în special, contactul dintre spirele adiacente ale bobinei.
      
         (18)  A se vedea referinţa 1 pentru clasificarea conform regimului de transport ONU.
      
         (19)  Soluţiile saturate se prepară la 20 oC.
      
         (20)  Valoarea medie obţinută la teste comparative interlaboratoare.
      
         (21)  Presiunea maximă de 2 070 kPa nu a fost atinsă.
      
         (22)  A se vedea referinţa 1 pentru interpretarea rezultatelor conform reglementărilor ONU privind transportul utilizând mai multe substanţe de referinţă.
   
   
      PARTEA B: METODE DE DETERMINARE A TOXICITĂŢII ŞI A ALTOR EFECTE ASUPRA SĂNĂTĂŢII
      CUPRINS
      INTRODUCERE GENERALĂ
      
                  B.1 bis.
               
               TOXICITATE ORALĂ ACUTĂ – PROCEDURA CU DOZĂ FIXĂ
            
                  B.1 tris.
               
               TOXICITATE ORALĂ ACUTĂ – METODA CLASEI DE TOXICITATE ACUTĂ
            
                  B.2.
               
               TOXICITATEA ACUTĂ (ADMINISTRARE PRIN INHALARE)
            
                  B.3.
               
               TOXICITATEA ACUTĂ (ADMINISTRARE CUTANATĂ)
            
                  B.4.
               
               TOXICITATE ACUTĂ: IRITAŢIE/COROZIUNE DERMICĂ
            
                  B.5.
               
               TOXICITATE ACUTĂ: IRITAŢIE/COROZIUNE OCULARĂ
            
                  B.6.
               
               SENSIBILIZARE CUTANATĂ
            
                  B.7.
               
               TOXICITATE (ORALĂ) PRIN ADMINISTRARE ÎN MOD REPETAT (28 DE ZILE)
            
                  B.8.
               
               TOXICITATE LA DOZĂ REPETATĂ (28 DE ZILE) (ADMINISTRARE PRIN INHALARE)
            
                  B.9.
               
               TOXICITATE LA DOZĂ REPETATĂ (28 DE ZILE) (ADMINISTRARE CUTANATĂ)
            
                  B.10.
               
               MUTAGENITATEA –TESTUL IN VITRO DE ABERAŢIE CROMOZOMIALĂ PE CELULE DE MAMIFERE
            
                  B.11.
               
               MUTAGENITATEA – TESTUL IN VIVO DE ABERAŢIE CROMOZOMIALĂ PE MĂDUVĂ OSOASĂ DE MAMIFERE
            
                  B.12.
               
               MUTAGENITATEA – TESTUL IN VIVO DE MICRONUCLEU PE ERITROCITE DE MAMIFERE
            
                  B.13/14.
               
               MUTAGENITATEA – TESTUL DE MUTAŢIE INVERSĂ PE BACTERII
            
                  B.15
               
               TESTE DE MUTAGENEZĂ ŞI DE DEPISTARE A CANCEROGENEZEI. MUTAŢIA GENICĂ – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
               
            
                  B.16
               
               RECOMBINAREA MITOTICĂ – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
               
            
                  B.17.
               
               MUTAGENITATEA – TEST IN VITRO DE MUTAŢIE GENICĂ PE CELULE DE MAMIFERE
            
                  B.18.
               
               ALTERAREA ŞI REPARAREA ADN-ului – SINTEZA NEPROGRAMATĂ A ADN (UDS – UNSCHEDULED DNA SYNTHESIS) – TEST IN VITRO PE CELULE DE MAMIFERE
            
                  B.19.
               
               TEST IN VITRO DE SCHIMBARE A CROMATIDELOR SURORI (SCE)
            
                  B.20.
               
               TEST DE LETALITATE RECESIVĂ ÎN RAPORT CU SEXUL LA DROSOPHILA MELANOGASTER (SLRL)
            
                  B.21.
               
               TEST IN VITRO DE TRANSFORMARE A CELULELOR DE MAMIFERE
            
                  B.22.
               
               TESTUL DE LETALITATE DOMINANTĂ LA ROZĂTOARE
            
                  B.23.
               
               TEST DE ABERAŢIE CROMOZOMIALĂ PE SPERMATOGONII DE MAMIFERE
            
                  B.24.
               
               TESTUL PETEI (SPOT TEST) LA ŞOARECI
            
                  B.25.
               
               TRANSLOCAŢII EREDITARE LA ŞOARECI
            
                  B.26.
               
               TESTUL DE TOXICITATE ORALĂ SUBCRONICĂ. STUDIU DE 90 DE ZILE DE TOXICITATE ORALĂ CU DOZĂ REPETATĂ LA ROZĂTOARE
            
                  B.27.
               
               TESTUL DE TOXICITATE ORALĂ SUBCRONICĂ. STUDIU DE 90 DE ZILE DE TOXICITATE ORALĂ CU DOZĂ REPETATĂ LA NEROZĂTOARE
            
                  B. 28
               
               STUDIU DE TOXICITATE SUBCRONICĂ – ADMINISTRARE CUTANATĂ. EXPERIMENT EFECTUAT TIMP DE 90 DE ZILE ASUPRA UNOR ROZĂTOARE
            
                  B.29
               
               STUDIU DE TOXICITATE SUBCRONICĂ – ADMINISTRARE PRIN INHALARE. EXPERIMENT EFECTUAT TIMP DE 90 DE ZILE ASUPRA UNOR ROZĂTOARE
            
                  B.30
               
               STUDIU DE TOXICITATE CRONICĂ
            
                  B.31.
               
               STUDIU DE TOXICITATE ASUPRA DEZVOLTĂRII INTRAUTERINE
            
                  B.32
               
               STUDIU DE CANCEROGENEZĂ
            
                  B.33
               
               STUDIU COMBINAT DE TOXICITATE CRONICĂ ŞI DE CANCEROGENEZĂ
            
                  B.34.
               
               STUDIU DE TOXICITATE PRIVIND REPRODUCEREA LA O GENERAŢIE
            
                  B.35.
               
               STUDIU DE TOXICITATE ASUPRA REPRODUCERII PE DURATA A DOUĂ GENERAŢII
            
                  B.36.
               
               TOXICOCINETICA
            
                  B.37.
               
               NEUROTOXICITATE ÎNTÂRZIATĂ A SUBSTANŢELOR ORGANOFOSFORICE DUPĂ EXPUNERE ACUTĂ
            
                  B.38.
               
               NEUROTOXICITATE ÎNTÂRZIATĂ A SUBSTANŢELOR ORGANOFOSFORICE – STUDIU CU ADMINISTRARE ÎN MOD REPETAT PE O DURATĂ DE 28 DE ZILE
            
                  B.39.
               
               TEST IN VIVO DE SINTEZĂ NEPROGRAMATĂ A ADN (UDS) PE CELULE HEPATICE DE MAMIFERE
            
                  B.40.
               
               COROZIUNEA CUTANATĂ IN VITRO: TESTUL REZISTENŢEI ELECTRICE TRANSCUTANATE (RET)
            
                  B.40 BIS.
               
               COROZIUNEA CUTANATĂ IN VITRO: TESTARE PE UN MODEL DE PIELE UMANĂ
            
                  B.41.
               
               TESTUL DE FOTOTOXICITATE 3T3 NRU IN VITRO
               
            
                  B.42.
               
               SENSIBILIZAREA DERMICĂ: TESTUL LOCAL PE GANGLIONII LIMFATICI
            
                  B.43.
               
               STUDII DE NEUROTOXICITATE PE ROZĂTOARE
            
                  B.44.
               
               ABSORBŢIA CUTANATĂ: METODA IN VIVO
               
            
                  B.45.
               
               ABSORBŢIA CUTANATĂ: METODA DE TESTARE IN VITRO
               
            INTRODUCERE GENERALĂ
      A.   CARACTERIZAREA SUBSTANŢEI ANALIZATE
      Înainte de începerea oricărui studiu de toxicitate, trebuie să fie cunoscute compoziţia substanţei, inclusiv principalele sale impurităţi, proprietăţile sale fizice şi chimice, între care şi stabilitatea sa.
      Proprietăţile fizice şi chimice ale substanţei furnizează informaţii importante cu privire la alegerea căii de administrare, cu privire la conceperea unor studii, precum şi cu privire la manipularea şi stocarea substanţei.
      Dezvoltarea unei metode de analiză care să permită o evaluare calitativă şi cantitativă a substanţei testate (inclusiv a principalelor sale impurităţi, dacă este posibil), în vehiculul de administrare şi în materialul biologic, trebuie să preceadă efectuarea studiului.
      Toate informaţiile privind identificarea, proprietăţile fizice şi chimice, puritatea şi comportamentul substanţei testate trebuie înregistrate în raportul de testare.
      B.   ÎNGRIJIREA ANIMALELOR
      În cadrul testelor de toxicitate se va proceda în mod obligatoriu la controlarea condiţiilor de mediu şi se vor utiliza tehnici adecvate de îngrijire a animalelor.
      (i)   Condiţii de adăpostire
      Condiţiile de mediu în spaţiile sau incintele rezervate animalelor experimentale trebuie să fie adaptate speciei utilizate. La şobolani, la şoareci şi la cobai temperatura ambiantă trebuie să fie de 22 ± 3 oC, iar umiditatea relativă trebuie să fie de 30-70 %; la iepuri, temperatura ambiantă trebuie să fie de 20 ± 3 oC, iar umiditatea relativă trebuie să fie de 30-70 %.
      Unele tehnici de testare sunt deosebit de sensibile la efectele termice; în asemenea cazuri indicaţii exacte sunt menţionate în descrierea metodei de testare, cu privire la condiţiile adecvate. În toate testele de toxicitate, temperatura şi umiditatea trebuie controlate şi înregistrate şi trebuie să figureze în raportul final al studiului.
      Alternarea de 12 de ore de lumină şi de 12 de ore de întuneric va fi asigurată de iluminarea artificială. Detaliile cu privire la iluminare trebuie să fie înregistrate în raportul final al studiului.
      Dacă metoda adoptată nu prevede alte condiţii, animalele trebuie să fie adăpostite individual sau în grupuri mici de acelaşi sex în cuşti. În cazul cuştilor colective nu se poate depăşi numărul de cinci animale.
      Este important ca rapoartele testelor efectuate pe animale să precizeze tipul de cuşti utilizate şi numărul de animale pe cuşti, în momentul expunerii la substanţa chimică şi pe toată perioada de observaţie care urmează după test.
      (ii)   Condiţii de hrănire
      Regimul alimentar trebuie să aibă în vedere toate necesităţile nutriţionale ale speciei supuse testului. În cazul în care substanţele sunt administrate prin hrană, este posibil ca valoarea nutriţională a hranei să fie diminuată printr-o interacţiune dintre substanţă şi un ingredient al hranei. Această eventualitate trebuie luată în considerare în momentul interpretării rezultatelor testului. Regimurile alimentare clasice folosite în laboratoare sunt acceptabile, apa de băut trebuie furnizată în mod nelimitat. Alegerea regimului alimentar poate fi ghidată de necesitatea de a garanta o proporţie adecvată de substanţă în cazul alegerii acestei căi de administrare.
      Substanţele contaminante din alimentaţie care au un efect asupra toxicităţii nu trebuie să fie prezente în concentraţii susceptibile de a influenţa rezultatele.
      C.   METODE ALTERNATIVE
      Unul dintre obiectivele Uniunii Europene este promovarea dezvoltării şi validării unor metode alternative care să furnizeze aceeaşi cantitate de informaţii ca testele actuale efectuate pe animale, dar pentru care să se necesite un număr mai redus de animale, care să minimizeze suferinţele animalelor şi să permită evitarea sacrificării acestora.
      Din momentul în care asemenea metode sunt disponibile, ele trebuie avute în vedere ori de câte ori este posibil, în vederea caracterizării riscurilor, în vederea clasificării şi etichetării substanţelor în funcţie de riscurile intrinseci.
      D.   EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA
      Extrapolarea directă la om a rezultatelor testelor efectuate asupra animalelor şi a testelor in vitro nu este posibilă decât în anumite limite; acest lucru trebuie avut în vedere cu ocazia evaluării şi interpretării rezultatelor testelor; pe de altă parte, atunci când au fost observate efecte nedorite la om, aceste informaţii pot fi folosite în vederea confirmării rezultatelor testelor.
      E.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE
      Majoritatea metodelor prezentate mai sus sunt elaborate în cadrul programului OCDE cu privire la principiile de testare, şi trebuie puse în aplicare în conformitate cu principiile de bună practică de laborator, astfel încât să se garanteze recunoaşterea reciprocă a datelor.
      Informaţii suplimentare pot fi obţinute din referinţele citate în cadrul principiilor de bază ale OCDE, precum şi din bibliografia de specialitate.
      B.1 bis.   TOXICITATE ORALĂ ACUTĂ – PROCEDURA CU DOZĂ FIXĂ
      1.   METODĂ
      Acest test este echivalent cu Orientarea 420 (2001) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Metodele tradiţionale de evaluare a toxicităţii acute utilizează ca punct final decesul animalelor. În 1984, British Toxicology Society a sugerat o nouă abordare pentru testarea toxicităţii acute, pe baza administrării unei serii de doze fixe (1). Această abordare evita uciderea animalelor ca punct final, bazându-se pe observarea unor semne clare de toxicitate la una dintre seriile de doze fixe. În urma unor studii de validare in vivo, britanice (2) şi internaţionale (3), procedura a fost adoptată ca metodă de testare în 1992. Ulterior, proprietăţile statistice ale procedurii cu doză fixă au fost evaluate utilizând modele matematice într-o serie de studii (4) (5) (6). Împreună, studiile in vivo şi cele de modelare au demonstrat că procedura este reproductibilă, utilizează mai puţine animale şi cauzează mai puţină suferinţă decât metodele tradiţionale şi poate fi utilizată pentru clasificarea substanţelor într-un mod similar cu celelalte metode de testare a toxicităţii acute.
      Indicaţii pentru selectarea celei mai adecvate metode de testare pentru un anumit scop sunt prezentate în Liniile directoare privind testarea toxicităţii acute orale (7). Liniile directoare în cauză conţin, de asemenea, informaţii suplimentare privind aplicarea şi interpretarea metodei de testare B.1 bis.
      Ca un principiu al metodei, în studiul principal se utilizează exclusiv doze cu un nivel mediu de toxicitate şi se evită administrarea dozelor care se estimează că sunt letale. De asemenea, nu este necesar să se administreze dozele despre care se ştie că provoacă dureri şi suferinţe grave din cauza acţiunilor corozive şi puternic iritante. Animalele muribunde sau cele care manifestă dureri evidente sau prezintă semne de suferinţă gravă şi prelungită sunt eutanasiate şi sunt luate în considerare la interpretarea rezultatelor la fel ca animalele care au murit în timpul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde şi indicaţii pentru recunoaşterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul unor linii directoare separate (8).
      Metoda furnizează informaţii privind proprietăţile periculoase şi permite clasificarea substanţei în conformitate cu Sistemul global armonizat (SGA) de clasificare a substanţelor chimice care cauzează toxicitate acută (9).
      Laboratorul care efectuează testul ia în considerare toate informaţiile disponibile privind substanţa de testat înainte de efectuarea studiului. Printre aceste informaţii se numără identitatea şi structura chimică a substanţei; proprietăţile sale fizico-chimice; rezultatele oricăror alte teste de toxicitate in vitro sau in vivo asupra substanţei; date toxicologice privind substanţele înrudite structural şi utilizarea sau utilizările anticipate ale substanţei. Aceste informaţii sunt necesare pentru a dovedi tuturor celor interesaţi că testul este relevant pentru protecţia sănătăţii oamenilor şi vor contribui la selectarea unei doze iniţiale adecvate.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Toxicitate orală acută: efectele adverse care intervin după administrarea orală a unei singure doze dintr-o substanţă sau a mai multor doze în cursul a 24 de ore.
      
         Deces întârziat: un animal nu moare şi nu pare muribund în termen de 48 ore, dar moare în perioada de observaţie de 14 zile.
      
         Doză: cantitatea administrată din substanţa de testat. Doza se exprimă ca greutatea de substanţă de testat per unitate de greutate a animalului de experienţă (de exemplu mg/kg).
      
         Toxicitate evidentă: termen general care descrie semne clare de toxicitate apărute după administrarea substanţei de testat (a se vedea referinţa 3 pentru exemple), pe baza cărora se poate estima că următoarea doză fixă mai mare ar putea provoca dureri mari şi semne persistente de suferinţă profundă, o stare muribundă [criteriile sunt prezentate în Humane Endpoints Guidance Document (8)] sau, probabil, decesul celor mai multe dintre animale.
      
         SGA: Sistem global armonizat de clasificare a substanţelor şi amestecurilor chimice. O activitate comună a OCDE (sănătatea oamenilor şi mediul) a Comitetului de experţi ONU pentru transportul bunurilor periculoase (proprietăţi fizico-chimice) şi a OIM (comunicarea pericolelor) şi coordonată de Programul interorganizaţional pentru buna gestionare a substanţelor chimice (IOMC).
      
         Deces iminent: se aşteaptă o stare muribundă sau decesul înainte de următorul moment de observare planificat. Printre semnele care indică această stare la rozătoare s-ar putea număra convulsii, poziţie laterală, poziţia culcată şi tremurat [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (8) pentru mai multe detalii].
      
         LD
         
            50
         
         (doza letală mediană): o singură doză de substanţă, derivată statistic, care se poate estima că va cauza decesul a 50 % dintre animale dacă este administrată pe cale orală. Valoarea LD50 se exprimă în greutatea de substanţă de testat pe unitate de greutate a animalului de experienţă (mg/kg).
      
         Doză-limită: o doză la limita superioară a testării (2 000 sau 5 000 mg/kg).
      
         Stare muribundă: starea precedentă decesului sau incapacitatea de a supravieţui, chiar în cazul administrării unui tratament [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (8) pentru mai multe detalii].
      
         Deces previzibil: prezenţa semnelor clinice care indică decesul într-un moment cunoscut din viitor, înainte de sfârşitul planificat al experimentului, ca de exemplu: incapacitatea de a ajunge la apă şi mâncare [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (8) pentru mai multe detalii].
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Unor grupuri de animale de acelaşi sex li se administrează doze fixe de 5, 50, 300 şi 2 000 mg/kg într-o procedură secvenţială (în mod excepţional, poate fi luată în considerare o doză fixă suplimentară de 5 000 mg/kg, a se vedea punctul 1.6.2). Doza iniţială se selectează pe baza unui studiu de observare pentru identificarea dozei care se presupune că produce unele semne de toxicitate fără a cauza efecte toxice grave sau decesul. Manifestările clinice şi efectele asociate durerii, suferinţei şi decesului iminent sunt descrise detaliat într-un document de orientare OCDE (8). Altor grupuri de animale li se pot administra doze fixe mai mari sau mai mici, în funcţie de prezenţa sau absenţa semnelor de toxicitate sau mortalitate. Această procedură continuă până la doza care provoacă toxicitate evidentă sau decesul unui singur animal, dacă nu se observă efecte la cea mai mare doză sau dacă decesul survine la cea mai mică doză.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Selectarea speciei de animale
      Specia preferată de rozătoare este şobolanul, dar pot fi utilizate şi alte specii de rozătoare. În mod normal, se utilizează femele (7). Acest lucru este motivat de faptul că studiile din literatură asupra testelor convenţionale LD50 arată că, de obicei, diferenţele de sensibilitate între sexe sunt mici, dar în cazurile în care se observă diferenţe, femelele sunt, în general, puţin mai sensibile (10). Cu toate acestea, în cazul în care informaţiile privind proprietăţile toxicologice sau toxicocinetice ale unor substanţe chimice înrudite structural arată că este probabil ca masculii să fie mai sensibili, se utilizează acest sex. Dacă testul se efectuează pe masculi, se oferă justificări adecvate.
      Se utilizează animale adulte, tinere, sănătoase provenind din liniile utilizate în mod obişnuit în laboratoare. Femelele trebuie să fie nulipare şi să nu fie gestante. La începerea testului, fiecare animal trebuie să aibă între 8 şi 12 săptămâni, iar greutatea sa trebuie să se situeze într-un interval de ± 20 % faţă de greutatea medie a animalelor testate anterior.
      1.4.2.   Condiţii de adăpostire şi hrănire
      În spaţiul pentru adăpostirea animalelor de experienţă se asigură o temperatură de 22 oC (± 3 oC). Se asigură o umiditate relativă de 50-60 %, cu o valoare minimă de 30 % şi o valoare maximă de 70 %, cu excepţia momentelor în care se curăţă spaţiul. Spaţiul se iluminează artificial, cu o alternanţă de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă. Animalele pot fi grupate în cuşti în funcţie de doză, dar numărul animalelor dintr-o cuşcă nu trebuie să împiedice observarea corectă a fiecărui animal.
      1.4.3.   Pregătirea animalelor
      Animalele sunt selectate la întâmplare, marcate pentru a permite identificarea individuală şi ţinute în cuştile lor cu cel puţin 5 zile înainte de începerea administrării dozelor, pentru a permite aclimatizarea lor la condiţiile de laborator.
      1.4.4.   Pregătirea dozelor
      În general, substanţele de testat se administrează într-un volum constant indiferent de dozele testate, variindu-se concentraţia preparatului. În cazul testării unui produs sau amestec final lichid, utilizarea substanţei de testat nediluate, și anume la o concentraţie constantă, poate fi mai relevantă pentru evaluarea ulterioară a riscurilor substanţei şi este impusă de unele autorităţi de reglementare. În orice caz, nu trebuie depăşit volumul dozei maxime de administrat. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o singură dată depinde de dimensiunea animalului de experienţă. La rozătoare, volumul nu trebuie să depăşească, în mod normal, 1 ml/100 g greutate corporală; cu toate acestea, în cazul soluţiilor apoase, pot fi administraţi 2 ml/100 g greutate corporală. În ceea ce priveşte forma de preparare a dozei, se recomandă utilizarea, ori de câte ori este posibil, a unei soluţii/suspensii/emulsii apoase, urmată, în ordinea preferinţei, de o soluţie/suspensie/emulsie în ulei (de exemplu, în ulei de porumb) şi, eventual, soluţii în alte vehicule. Pentru vehicule altele decât apa, este necesar să se cunoască caracteristicile toxicologice ale vehiculului. Dozele se prepară cu puţin timp înaintea administrării, cu excepţia cazului în care stabilitatea preparatului în perioada în care urmează a fi utilizat este cunoscută şi s-a demonstrat că este acceptabilă.
      1.5.   MOD DE LUCRU
      1.5.1.   Administrarea dozelor
      Substanţa de testat se administrează într-o singură doză, prin gavaj, utilizând o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată. În cazurile deosebite în care nu este posibilă administrarea unei singure doze, doza poate fi administrată în fracţiuni mai mici pe parcursul unei perioade de maximum 24 de ore.
      Animalele nu se hrănesc înainte de administrarea dozei (de exemplu, şobolanii nu trebuie să fie hrăniţi peste noapte, dar pot primi apă; şoarecii nu trebuie să fie hrăniţi, dar pot primi apă, cu 3-4 ore înainte). După perioada de flămânzire, animalele se cântăresc şi se administrează substanţa de testat. După administrarea substanţei, animalele pot fi private din nou de hrană, 3-4 ore la şobolani şi 1-2 ore la şoareci. Dacă doza se administrează fracţionat într-o perioadă de timp, este posibil să fie necesar să li se ofere animalelor hrană şi apă, în funcţie de durata perioadei de administrare.
      1.5.2.   Studiu de observare
      Scopul studiului de observare este de a permite selectarea dozei iniţiale adecvate pentru studiul principal. Substanţa de testat se administrează, într-o procedură secvenţială, câte unui animal, conform diagramelor din apendicele 1. Studiul de observare este finalizat când se poate lua o decizie privind doza iniţială pentru studiul principal (sau dacă survine decesul unui animal la cea mai mică doză fixă).
      Doza iniţială pentru studiul de observare se selectează dintre dozele fixe de 5, 50, 300 şi 2 000 mg/kg ca doza care se aşteaptă că provoace toxicitate evidentă, dacă este posibil, pe baza datelor obţinute in vivo şi in vitro pentru aceeaşi substanţă chimică sau alte substanţe înrudite structural. În absenţa acestor informaţii, doza iniţială va fi de 300 mg/kg.
      Dozele se administrează la un interval de minimum 24 de ore pentru fiecare animal. Toate animalele trebuie observate cel puţin 14 zile.
      În mod excepţional şi doar dacă acest lucru este necesar pentru îndeplinirea unor cerinţe specifice, poate fi administrată o doză suplimentară mai mare, de 5 000 mg/kg (a se vedea apendicele 3). Din motive justificate de bunăstarea animală, testarea pe animale a substanţelor din categoria 5 SGA (2 000-5 000 mg/kg) este descurajată şi se ia în considerare doar în cazul în care este foarte probabil ca rezultatele acestor teste să fie direct relevante pentru protecţia sănătăţii oamenilor, a sănătăţii animale sau a mediului.
      În cazurile în care un animal căruia i s-a administrat doza fixă cea mai redusă (5 mg/kg) în cadrul studiului de observare moare, procedura normală este de a încheia studiul şi de a încadra substanţa în categoria 1 SGA (conform anexei 1). Cu toate acestea, dacă este necesară o confirmare suplimentară a clasificării, se poate aplica o procedură suplimentară opţională, descrisă în continuare. Se administrează o doză de 5 mg/kg unui alt animal. Dacă şi al doilea animal moare, se confirmă categoria 1 SGA, iar studiul se încheie imediat. Dacă al doilea animal supravieţuieşte, se administrează o doză de 5 mg/kg unui nou grup, de maximum 3 animale. Deoarece riscul de mortalitate este foarte ridicat, dozele vor fi administrate secvenţial, pentru protecţia bunăstării animale. Intervalul de timp între administrarea dozelor la fiecare animal trebuie să fie suficient pentru a stabili probabilitatea ca animalul anterior să supravieţuiască. Dacă survine decesul unui alt animal, secvenţa de administrare se încheie imediat, fără testarea pe alte animale. Deoarece decesul celui de-al doilea animal (indiferent de numărul de animale testate în momentul încheierii studiului) se încadrează în rezultatul A (2 sau mai multe decese), se aplică regula de clasificare din apendicele 2 la o doză fixă de 5 mg/kg (categoria 1, dacă survin două sau mai multe decese, sau categoria 2 dacă survine un singur deces). În plus, apendicele 4 ofertă indicaţii pentru clasificarea în sistemul UE, până la punerea în aplicare a noului SGA.
      1.5.3.   Studiul principal
      1.5.3.1.   Numărul de animale şi nivelul dozelor
      Acţiunile care se întreprind după administrarea dozei iniţiale sunt indicate în diagramele din apendicele 2. Se adoptă unul dintre cele trei cursuri de acţiune: fie se opreşte testarea şi se atribuie clasa adecvată de clasificare a periculozităţii, fie se continuă testarea cu o doză fixă mai mare sau cu o doză fixă mai mică. Cu toate acestea, pentru a proteja animalele, o doză care a cauzat decesul animalelor în studiul de observare nu va fi reutilizată în studiul principal (a se vedea apendicele 2). Experienţa a demonstrat că, cel mai probabil, după administrarea dozei iniţiale, substanţa va putea fi clasificată şi nu vor fi necesare teste suplimentare.
      În mod normal, se utilizează un număr total de cinci animale de acelaşi sex pentru fiecare nivel investigat al dozei. Grupul de cinci animale va fi format dintr-un animal căruia i s-a administrat doza selectată în studiul de orientare şi alte patru animale (cu excepţia cazului excepţional în care nivelul dozei utilizat în studiul principal nu a fost inclus în studiul de orientare).
      Intervalul de timp dintre administrarea dozelor de la fiecare nivel la fiecare animal se determină în funcţie de momentul declanşării, durata şi severitatea semnelor de toxicitate. Administrarea următoarei doze se amână până când există certitudinea că animalele testate anterior vor supravieţui. Se recomandă un interval de 3 sau 4 zile între administrarea fiecărui nivel, pentru a permite observarea toxicităţii întârziate. Intervalul de timp poate fi adaptat după caz, de exemplu în cazul unor rezultate neconcludente.
      Dacă se ia în considerare utilizarea dozei fixe maxime de 5 000 mg/kg, se aplică procedura prevăzută în apendicele 3 (a se vedea, de asemenea, punctul 1.6.2).
      1.5.3.2.   Testul-limită
      Testul-limită se utilizează în special în situaţiile în care experimentatorul are informaţii care arată că este posibil ca materialul testat să nu fie toxic, având o toxicitate puţin peste dozele-limită reglementate. Informaţiile privind toxicitatea materialului de testat pot fi deduse din cunoştinţele despre compuşi, amestecuri şi produse similare testate, ţinând seama de identitatea şi procentajul componentelor cunoscute ca fiind semnificative din punct de vedere toxicologic. În situaţiile în care nu există sau există puţine informaţii privind toxicitatea materialului sau în care se estimează că materialul de testat este toxic, se efectuează testul principal.
      Urmând procedura normală, un studiu de observare cu o doză iniţială de 2 000 mg/kg (sau, în cazuri excepţionale, 5 000 mg/kg), urmat de administrarea aceleaşi doze altor patru animale, constituie testul-limită conform acestei linii directoare.
      1.6.   OBSERVAŢII
      Animalele sunt observate individual după administrarea dozelor, cel puţin o dată în primele 30 de minute, periodic în primele 24 de ore, acordându-li-se o atenţie specială în primele 4 ore, şi, ulterior, zilnic, timp de 14 zile, cu excepţia cazului în care trebuie excluse din studiu şi eutanasiate din motive de bunăstare animală sau sunt găsite moarte. Cu toate acestea, perioada de observaţie nu se stabileşte rigid. Ea se determină în funcţie de reacţiile toxice şi momentul declanşării acestora şi de durata perioadei de recuperare şi, prin urmare, poate fi prelungită, dacă este necesar. Momentele în care semnele de toxicitate apar şi dispar sunt importante, în special în cazurile în care semnele de toxicitate au tendinţa de a apărea cu întârziere (11). Toate observaţiile se înregistrează sistematic, întocmindu-se fişe individuale pentru fiecare animal.
      Vor fi necesare observaţii suplimentare în cazul în care animalele manifestă în continuare semne de toxicitate. Observaţiile vizează modificările pielii şi blănii, ochilor şi membranelor mucoaselor, modificările activităţii sistemului respirator, sistemului circulator, sistemului nervos central şi vegetativ şi ale activităţii somato-motorii şi modificările de comportament. Se va acorda o atenţie specială observării tremuratului, convulsiilor, salivării, diareii, letargiei, somnului şi comei. Se iau în considerare principiile şi criteriile rezumate în Humane Endpoints Guidance Document (8). Animalele găsite în stare muribundă şi animalele care manifestă dureri mari şi semne prelungite de suferinţă profundă sunt eutanasiate. În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt găsite moarte, momentul morţii se înregistrează cât mai exact posibil.
      1.6.1.   Greutatea corporală
      Animalele se cântăresc puţin înainte de administrarea substanţei de testat şi, ulterior, cel puţin o dată pe săptămână. Se calculează şi se înregistrează variaţiile de greutate. La sfârşitul testului, animalele care au supravieţuit sunt cântărite şi apoi eutanasiate.
      1.6.2.   Patologie
      Toate animalele participante la test (inclusiv cele care mor în cursul testului sau sunt eliminate din studiu din motive de bunăstare animală) sunt supuse unei autopsii macroscopice. Se înregistrează toate modificările patologice majore intervenite la fiecare animal. Se poate efectua, de asemenea, o examinare microscopică a organelor care prezintă semne de modificări patologice majore la animalele care au supravieţuit cel puţin 24 de ore de la administrarea dozei iniţiale, întrucât ar putea furniza informaţii utile.
      2.   DATE
      Se furnizează date individuale despre animale. În plus, se face un rezumat tabelar al tuturor datelor, prezentând pentru fiecare grup testat, numărul de animale utilizate, numărul de animale care au prezentat semne de toxicitate, numărul de animale găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate, ora decesului pentru fiecare animal, o descriere, evoluţia în timp şi reversibilitatea efectelor toxice şi constatările autopsiei.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare include următoarele informaţii, după caz:
      
                   
               
               
                  Substanţa de testat:
                  
                              —
                           
                           
                              natura fizică, puritate şi, dacă este cazul, proprietăţi fizico-chimice (inclusiv izomerizare);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date de identificare, inclusiv numărul CAS.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Vehicul (dacă este cazul):
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului, dacă este altul decât apa.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animalele de experienţă:
                  
                              —
                           
                           
                              specie/suşă utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              starea microbiologică a animalelor, dacă se cunoaşte;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul, vârsta şi sexul animalelor (inclusiv, dacă este cazul, o justificare pentru utilizarea de masculi în locul femelelor);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursă, condiţii de adăpostire, hrănire etc.;
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea substanţei de testat, inclusiv detalii privind forma fizică a materialului administrat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind administrarea substanţei de testat, inclusiv volumul dozelor şi durata administrării;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei şi a apei (inclusiv tipul/sursa hranei, sursa apei);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              o justificare pentru selectarea dozei iniţiale.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              un tabel cu datele privind reacţia şi nivelul dozei la fiecare animal (animale care prezintă semne de toxicitate, inclusiv mortalitatea, natura, gravitatea şi durata efectelor);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              un tabel cu greutatea corporală şi variaţiile acesteia;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal în ziua administrării dozei, la intervale săptămânale ulterior şi în momentul morţii sau al eutanasierii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              data şi ora morţii, dacă a survenit înainte de momentul planificat pentru sacrificare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              graficul declanşării semnelor de toxicitate şi reversibilitatea acestora pentru fiecare animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              concluziile autopsiei şi concluziile examenului histopatologic pentru fiecare animal, dacă sunt disponibile.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea şi interpretarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, p. 85-92.
               
            
                  2.
               
               
                  Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279-291.
               
            
                  3.
               
               
                  Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469-482.
               
            
                  4.
               
               
                  Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, p. 313-324.
               
            
                  5.
               
               
                  Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.
               
            
                  6.
               
               
                  Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183-196.
               
            
                  7.
               
               
                  OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
               
            
                  8.
               
               
                  OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.
               
            
                  9.
               
               
                  OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].
               
            
                  10.
               
               
                  Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223-231.
               
            
                  11.
               
               
                  Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.
               
            
         APENDICELE 1
         DIAGRAMA PENTRU STUDIUL DE OBSERVARE
         
            
         
            
      
      
         APENDICELE 2
         DIAGRAMA PENTRU STUDIUL PRINCIPAL
         
            
         
            
      
      
         APENDICELE 3
         CRITERIILE PENTRU CLASIFICAREA SUBSTANŢELOR DE TESTAT CU VALORI ESTIMATE ALE LD50 DE PESTE 2 000 MG/KG FĂRĂ A FI NECESARĂ TESTAREA
         Criteriile pentru categoria de periculozitate 5 au ca scop să permită identificarea substanţelor de testat care prezintă un pericol relativ scăzut de toxicitate acută, dar care, în anumite circumstanţe, pot prezenta pericole pentru populaţiile vulnerabile. Se anticipează că aceste substanţe au o LD50 orală şi dermică între 2 000 şi 5 000 mg/kg sau doze echivalente pentru alte căi de administrare. Substanţa de testat se clasifică în categoria de periculozitate definită prin: 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (categoria 5 din SGA) în următoarele cazuri:
         
                     (a)
                  
                  
                     dacă este încadrată în această categorie de oricare dintre diagramele de testare din apendicele 2, pe baza incidenţei deceselor;
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     dacă sunt deja disponibile date fiabile care arată că LD50 se situează în limitele categoriei 5 sau alte studii pe animale sau privind efectele toxice asupra oamenilor indică o problemă acută pentru sănătatea oamenilor;
                  
               
                     (c)
                  
                  
                     prin extrapolare, estimare sau măsurarea de date, dacă nu se justifică clasificarea într-o clasă de periculozitate mai mare; şi
                     
                                 —
                              
                              
                                 sunt disponibile informaţii fiabile privind efecte toxice semnificative asupra oamenilor; sau
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 se observă decese la testarea până la valorile din categoria 4 pe cale orală; sau
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dacă concluziile unor experţi confirmă semne clinice semnificative de toxicitate, la testarea până la valorile din categoria 4, cu excepţia diareii, piloerecţiei sau a aspectului neîngrijit; sau
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dacă concluziile experţilor confirmă informaţii fiabile care indică potenţiale efecte acute semnificative conform altor studii asupra animalelor.
                              
                           
               TESTAREA CU DOZE PESTE 2 000 MG/KG
         În mod excepţional şi exclusiv în cazurile în care este justificată pentru îndeplinirea unor cerinţe specifice, poate fi luată în considerare utilizarea unei doze fixe mai mari, de 5 000 mg/kg. Recunoscând necesitatea de a proteja bunăstarea animală, testarea cu 5 000 mg/kg este descurajată şi se ia în considerare doar în cazul în care este foarte probabil ca rezultatele acestor teste să fie direct relevante pentru protecţia sănătăţii animale sau a sănătăţii oamenilor (9).
         Studiul de observare
         Regulile de luare a deciziilor pentru procedura secvenţială prezentată în apendicele 1 sunt extinse pentru a include doza de 5 000 mg/kg. Astfel, dacă într-un studiu de observare se utilizează o doză iniţială de 5 000 mg/kg, rezultatul A (deces) impune testarea unui alt animal la 2 000 mg/kg; rezultatele B şi C (toxicitate evidentă sau fără semne de toxicitate) permit selectarea dozei de 5 000 mg/kg ca doză iniţială pentru studiul principal. În mod similar, dacă se foloseşte o altă doză decât 5 000 mg/kg, testarea va avansa la 5 000 mg/kg în cazul în care se obţin rezultatele B sau C la 2 000 mg/kg: un rezultat ulterior A, la o doză de 5 000 mg/kg, va impune o doză iniţială pentru studiul principal de 2 000 mg/kg, iar rezultatele B şi C vor impune o doză iniţială pentru studiul principal de 5 000 mg/kg.
         Studiul principal
         Regulile de luare a deciziilor pentru procedura secvenţială prezentată în apendicele 2 sunt extinse pentru a include doza de 5 000 mg/kg. Astfel, dacă doza iniţială pentru studiul principal este de 5 000 mg/kg, rezultatul A (≥ 2 decese) va impune testarea unui al doilea grup la 2 000 mg/kg; rezultatul B (toxicitate evidentă şi/sau ≤ 1 deces) sau C (fără semne de toxicitate) va conduce la neclasificarea conform SGA. În mod similar, dacă se utilizează o doză iniţială alta decât cea de 5 000 mg/kg, testarea continuă cu 5 000 mg/kg în cazul obţinerii rezultatului C la 2 000 mg/kg; un rezultat ulterior A, la doza de 5 000 mg/kg, va conduce la clasificarea substanţei în categoria 5 SGA, iar rezultatele B sau C vor conduce la neclasificarea substanţei.
      
      
         APENDICELE 4
         METODA DE TESTARE B.1 bis
         Linii directoare pentru clasificarea conform schemei UE pentru perioada de tranziţie până la punerea completă în aplicare a Sistemului global armonizat de clasificare (SGA) (preluate din referinţa 8)
         
            
         
            
      
      B.1 tris.   TOXICITATE ORALĂ ACUTĂ – METODA CLASEI DE TOXICITATE ACUTĂ
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 423 (2001) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Metoda clasei de toxicitate acută (1) prezentată în acest test este o procedură secvenţială care utilizează 3 animale de acelaşi sex într-o etapă. În funcţie de mortalitatea şi/sau starea muribundă a animalelor, pot fi necesare, în medie, 2-4 etape pentru a permite determinarea toxicităţii acute a substanţei de testat. Această procedură este reproductibilă, utilizează foarte puţine animale şi permite clasificarea substanţelor într-un mod similar cu celelalte metode de testare a toxicităţii acute. Metoda clasei de toxicitate acută se bazează pe evaluări biometrice (2) (3) (4) (5) cu doze fixe, separate adecvat pentru a permite clasificarea unei substanţe pentru includerea în diverse categorii şi evaluarea riscurilor. Metoda, adoptată în 1996, a fost validată intens in vivo comparativ cu datele LD50 obţinute din literatură, atât la nivel naţional (6), cât şi la nivel internaţional (7).
      Pentru indicaţii privind selectarea celei mai adecvate metode de testare pentru un anumit scop, consultaţi Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8). Acest document conţine, de asemenea, informaţii suplimentare pentru aplicarea şi interpretarea metodei de testare B.1 tris.
      Nu este necesar să se administreze substanţele de testat la doze despre care se ştie că provoacă dureri mari şi suferinţe profunde din cauza acţiunilor corozive şi pronunţat iritante. Animalele muribunde sau cele care manifestă dureri evidente sau prezintă semne de suferinţă gravă şi prelungită sunt eutanasiate şi sunt luate în considerare la interpretarea rezultatelor la fel ca animalele care au murit în timpul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde şi indicaţii pentru recunoaşterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul unor linii directoare separate (9).
      Metoda utilizează doze predefinite, iar rezultatele permit clasarea şi clasificarea unei substanţei în conformitate cu Sistemul global armonizat de clasificare a substanţelor chimice care provoacă toxicitate acută (10).
      În principiu, această metodă nu are ca scop să permită calcularea unei valori exacte a LD50, dar permite determinarea nivelurilor definite de expunere letale, deoarece decesul unei proporţii dintre animale rămâne principalul punct final al acestui test. Metoda permite determinarea unei valori a LD50 doar dacă cel puţin două doze determină o mortalitate peste 0 %, dar mai mică decât 100 %. Utilizarea unor doze predefinite, indiferent de substanţa de testat, şi faptul că clasificarea se face explicit în funcţie de numărul de animale observate în diverse stări favorizează consecvenţa şi repetabilitatea datelor prezentate de diverse laboratoare.
      Laboratorul care efectuează testul ia în considerare toate informaţiile disponibile privind substanţa de testat înainte de efectuarea studiului. Printre aceste informaţii se numără identitatea şi structura chimică a substanţei; proprietăţile sale fizico-chimice; rezultatele oricăror alte teste de toxicitate in vitro sau in vivo asupra substanţei; date toxicologice privind substanţele înrudite structural şi utilizarea (utilizările) anticipată (anticipate) a(le) substanţei. Aceste informaţii sunt necesare pentru a dovedi tuturor celor interesaţi că testul este relevant pentru protecţia sănătăţii oamenilor şi va contribui la selectarea unei doze iniţiale adecvate.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Toxicitate orală acută: se referă la efectele adverse care intervin după administrarea orală a unei singure doze dintr-o substanţă sau a mai multor doze în cursul a 24 de ore.
      
         Deces întârziat: înseamnă că un animal nu moare şi nu pare muribund în termen de 48 ore, dar moare în perioada de observaţie de 14 zile.
      
         Doză: este cantitatea administrată din substanţa de testat. Doza se exprimă ca greutatea de substanţă de testat per unitate de greutate a animalului de experienţă (de exemplu: mg/kg).
      
         SGA: Sistemul global armonizat de clasificare a substanţelor şi amestecurilor chimice. O activitate comună a OCDE (sănătatea oamenilor şi mediul), a Comitetului de experţi ONU pentru transportul bunurilor periculoase (proprietăţi fizico-chimice) şi a OIM (comunicarea pericolelor) şi coordonată de Programul interorganizaţional pentru buna gestionare a substanţelor chimice (IOMC).
      
         Deces iminent: când se aşteaptă o stare muribundă sau decesul înainte de următorul moment de observare planificat. Printre semnele care indică această stare la rozătoare s-ar putea număra convulsii, poziţie laterală, poziţia culcată şi tremurat [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (9) pentru mai multe detalii].
      
         LD
         
            50
         
         (doza letală mediană): este o singură doză de substanţă, derivată statistic, care se poate estima că va cauza decesul a 50 % dintre animale dacă este administrată pe cale orală. Valoarea LD50 se exprimă în greutatea de substanţă de testat per unitate de greutate a animalului de experienţă (mg/kg).
      
         Doză-limită: se referă la o doză la limita superioară a testării (2 000 sau 5 000 mg/kg).
      
         Stare muribundă: starea precedentă decesului sau incapacitatea de a supravieţui, chiar în cazul administrării unui tratament [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (9) pentru mai multe detalii].
      
         Deces previzibil: prezenţa semnelor clinice care indică decesul într-un moment cunoscut din viitor, înainte de sfârşitul planificat al experimentului, ca de exemplu: incapacitatea de a ajunge la apă şi mâncare [a se vedea Humane Endpoint Guidance Document (9) pentru mai multe detalii].
      1.3.   PRINCIPIUL TESTULUI
      Principiul acestui test este că, prin aplicarea unei proceduri secvenţiale, cu utilizarea unui număr minim de animale în fiecare etapă, se obţin informaţii suficiente privind toxicitatea acută a substanţei de testat pentru a permite clasificarea acesteia. Substanţa se administrează oral unui grup de animale de experienţă, la una dintre dozele definite. Substanţa se testează conform unei proceduri secvenţiale, în fiecare etapă utilizându-se trei animale de acelaşi sex (de obicei, femele). Absenţa sau prezenţa mortalităţii cauzate de substanţa de testat la animalele testate într-o etapă determină etapa următoare, astfel;
      
                  —
               
               
                  nu sunt necesare alte teste;
               
            
                  —
               
               
                  administrarea aceleiaşi doze altor trei animale;
               
            
                  —
               
               
                  administrarea următoarei doze mai mari sau mai mici altor trei animale.
               
            Detaliile procedurii de testare sunt prezentate în apendicele 1. Metoda permite adoptarea unei concluzii privind clasificarea substanţei de testat într-una dintre clasele de toxicitate delimitate de valori prestabilite ale LD50.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI
      1.4.1.   Selectarea speciei de animale
      Specia preferată de rozătoare este şobolanul, dar pot fi utilizate şi alte specii de rozătoare. În mod normal, se utilizează femele (9). Acest lucru este motivat de faptul că studiile din literatură asupra testelor convenţionale LD50 arată că, deşi diferenţele de sensibilitate între sexe sunt mici, în cazurile în care se observă diferenţe, femelele sunt, în general, puţin mai sensibile (11). Cu toate acestea, în cazul în care informaţiile privind proprietăţile toxicologice sau toxicocinetice ale unor substanţe chimice înrudite structural arată că este probabil ca masculii să fie mai sensibili, se utilizează acest sex. Dacă testul se efectuează pe masculi, se oferă justificări adecvate.
      Se utilizează animale adulte, tinere, sănătoase provenind din liniile utilizate în mod obişnuit în laboratoare. Femelele trebuie să fie nulipare şi să nu fie gestante. La începerea testului, fiecare animal trebuie să aibă între 8 şi 12 săptămâni, iar greutatea sa trebuie să se situeze într-un interval de ± 20 % faţă de greutatea medie a animalelor testate anterior.
      1.4.2.   Condiţii de adăpostire şi hrănire
      În spaţiul pentru adăpostirea animalelor de experienţă se asigură o temperatură de 22 oC (± 3 oC). Se asigură o umiditate relativă de 50-60 %, cu o valoare minimă de 30 % şi o valoare maximă de 70 %, cu excepţia momentelor în care se curăţă spaţiul. Spaţiul se iluminează artificial, cu o alternanţă de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă. Animalele pot fi grupate în cuşti în funcţie de doză, dar numărul animalelor dintr-o cuşcă nu trebuie să împiedice observarea corectă a fiecărui animal.
      1.4.3.   Pregătirea animalelor
      Animalele sunt selectate la întâmplare, marcate pentru a permite identificarea individuală şi ţinute în cuştile lor cu cel puţin 5 zile înainte de începerea administrării dozelor, pentru a permite aclimatizarea lor la condiţiile de laborator.
      1.4.4.   Pregătirea dozelor
      În general, substanţele de testat se administrează într-un volum constant indiferent de dozele testate, variind concentraţia preparatului. În cazul testării unui produs sau amestec final lichid, utilizarea substanţei de testat nediluate, și anume la o concentraţie constantă, poate fi mai relevantă pentru evaluarea ulterioară a riscurilor substanţei şi este impusă de unele autorităţi de reglementare. În orice caz, nu trebuie depăşit volumul dozei maxime de administrat. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o singură dată depinde de dimensiunea animalului de experienţă. La rozătoare, volumul nu trebuie să depăşească, în mod normal, 1 ml/100 g greutate corporală; cu toate acestea, în cazul soluţiilor apoase, pot fi administraţi 2 ml/100 g greutate corporală. În ceea ce priveşte forma de preparare a dozei, se recomandă utilizarea, ori de câte ori este posibil, a unei soluţii/suspensii/emulsii apoase, urmată, în ordinea preferinţei, de o soluţie/suspensie/emulsie în ulei (de exemplu, în ulei de porumb) şi, eventual, soluţii în alte vehicule. Pentru vehicule altele decât apa, este necesar să se cunoască caracteristicile toxicologice ale vehiculului. Dozele se prepară cu puţin timp înaintea administrării, cu excepţia cazului în care stabilitatea preparatului în perioada în care urmează a fi utilizat este cunoscută şi s-a demonstrat că este acceptabilă.
      1.5.   MOD DE LUCRU
      1.5.1.   Administrarea dozelor
      Substanţa de testat se administrează într-o singură doză, prin gavaj, utilizând o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată. În cazurile deosebite în care nu este posibilă administrarea unei singure doze, doza poate fi administrată în fracţiuni mai mici pe parcursul unei perioade de maximum 24 de ore.
      Animalele nu se hrănesc înainte de administrarea dozei (de exemplu, şobolanii nu trebuie să fie hrăniţi peste noapte, dar pot primi apă; şoarecii nu trebuie să fie hrăniţi, dar pot primi apă, cu 3-4 ore înainte). După perioada de flămânzire, animalele se cântăresc şi li se administrează substanţa de testat. După administrarea substanţei, animalele pot fi private din nou de hrană, 3-4 ore la şobolani şi 1-2 ore la şoareci. Dacă doza se administrează fracţionat într-o perioadă de timp, este posibil să fie necesar să li se ofere animalelor hrană şi apă, în funcţie de durata perioadei de administrare.
      1.5.2.   Numărul de animale şi nivelul dozelor
      În fiecare etapă se utilizează trei animale. Nivelul dozei utilizate ca doză iniţială se selectează din cele patru doze fixe: 5, 50, 300 şi 2 000 mg/kg greutate corporală. Se alege nivelul dozei iniţiale cu cea mai mare probabilitate de a produce decesul unora dintre animalele cărora li se administrează. Diagramele din apendicele 1 descriu procedura de urmat pentru fiecare doză iniţială. În plus, apendicele 4 prezintă indicaţii pentru clasificarea în sistemul UE până la punerea în aplicare a noului SGA.
      Dacă informaţiile disponibile sugerează că este puţin probabil ca cel mai ridicat nivel al dozei iniţiale (2 000 mg/kg greutate corporală) să provoace decese, se efectuează testul-limită. Dacă nu există informaţii privind substanţa de testat, din motive de bunăstare animală, se recomandă utilizarea dozei iniţiale de 300 mg/kg greutate corporală.
      Intervalul de timp dintre administrarea dozelor diverselor grupuri se determină în funcţie de momentul declanşării, durata şi severitatea semnelor de toxicitate. Administrarea următoarei doze se amână până când există certitudinea că animalele testate anterior vor supravieţui.
      În mod excepţional şi doar dacă acest lucru este necesar pentru îndeplinirea unor cerinţe specifice, poate fi luată în considerare o doză suplimentară mai mare, de 5 000 mg/kg greutate corporală (a se vedea apendicele 2). Din motive de bunăstare animală, testarea pe animale a substanţelor din categoria 5 SGA (2 000-5 000 mg/kg) este descurajată şi se ia în considerare doar în cazul în care este foarte probabil că rezultatele acestor teste vor fi direct relevante pentru protecţia sănătăţii oamenilor, a sănătăţii animale sau a mediului.
      1.5.3.   Testul-limită
      Testul-limită se utilizează în special în situaţiile în care experimentatorul are informaţii care arată că este posibil ca materialul de testat să nu fie toxic, având o toxicitate puţin peste dozele-limită reglementate. Informaţiile privind toxicitatea materialului de testat pot fi deduse din cunoştinţele despre compuşi, amestecuri şi produse similare testate, ţinând seama de identitatea şi procentajul componentelor cunoscute ca fiind semnificative din punct de vedere toxicologic. În situaţiile în care nu există sau există puţine informaţii privind toxicitatea materialului sau în care se estimează că materialul de testat este toxic, se efectuează testul principal.
      Se poate efectua un test-limită cu o doză de 2 000 mg/kg greutate corporală pe şase animale (trei animale în fiecare etapă). În mod excepţional, se poate efectua un test-limită cu o doză de 5 000 mg/kg cu trei animale (a se vedea apendicele 2). Dacă intervin decese cauzate de substanţa de testat, se poate dovedi necesară efectuarea de teste la următorul nivel inferior.
      1.6.   OBSERVAŢII
      Animalele sunt observate individual după administrarea dozelor, cel puţin o dată în primele 30 de minute, periodic în primele 24 de ore, acordându-li-se o atenţie specială în primele 4 ore, şi, ulterior, zilnic, timp de 14 zile, cu excepţia cazului în care trebuie excluse din studiu şi eutanasiate din motive de bunăstare animală sau sunt găsite moarte. Cu toate acestea, perioada de observaţie nu se stabileşte rigid. Ea se determină în funcţie de reacţiile toxice şi momentul declanşării acestora şi de durata perioadei de recuperare şi, prin urmare, poate fi prelungită, dacă este necesar. Momentele în care semnele de toxicitate apar şi dispar sunt importante, în special în cazurile în care semnele de toxicitate au tendinţa de a apărea cu întârziere (12). Toate observaţiile se înregistrează sistematic, întocmindu-se fişe individuale pentru fiecare animal.
      Vor fi necesare observaţii suplimentare în cazul în care animalele manifestă în continuare semne de toxicitate. Observaţiile vizează modificările pielii şi blănii, ochilor şi membranelor mucoaselor, modificările activităţii sistemului respirator, sistemului circulator, sistemului nervos central şi vegetativ şi ale activităţii somato-motorii şi modificările de comportament. Se va acorda o atenţie specială observării tremuratului, convulsiilor, salivării, diareii, letargiei, somnului şi comei. Se iau în considerare principiile şi criteriile rezumate în Humane Endpoints Guidance Document (9). Animalele găsite în stare muribundă şi animalele care manifestă dureri mari şi semne prelungite de suferinţă profundă sunt eutanasiate. În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt găsite moarte, momentul morţii se înregistrează cât mai exact posibil.
      1.6.1.   Greutatea corporală
      Animalele se cântăresc individual puţin înainte de administrarea substanţei de testat şi, ulterior, cel puţin o dată pe săptămână. Se calculează şi se înregistrează variaţiile de greutate. La sfârşitul testului, animalele care au supravieţuit sunt cântărite şi apoi eutanasiate.
      1.6.2.   Patologie
      Toate animalele participante la test (inclusiv cele care mor în cursul testului sau sunt eliminate din studiu din motive de bunăstare animală) sunt supuse unei autopsii macroscopice. Se înregistrează toate modificările patologice majore intervenite la fiecare animal. Se poate efectua, de asemenea, o examinare microscopică a organelor care prezintă semne de modificări patologice majore la animalele care au supravieţuit cel puţin 24 de ore, întrucât ar putea furniza informaţii utile.
      2.   DATE
      Se furnizează date individuale despre animale. În plus, se face un rezumat tabelar al tuturor datelor, prezentând pentru fiecare grup testat numărul de animale utilizate, numărul de animale care au prezentat semne de toxicitate, numărul de animale găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate, ora decesului pentru fiecare animal, o descriere, evoluţia în timp şi reversibilitatea efectelor toxice şi constatările autopsiei.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare include următoarele informaţii, după caz:
      
                   
               
               
                  Substanţa de testat:
                  
                              —
                           
                           
                              natura fizică, puritate şi, dacă este cazul, proprietăţi fizico-chimice (inclusiv izomerizare);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date de identificare, inclusiv numărul CAS.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Vehicul (dacă este cazul):
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului, dacă este altul decât apa.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animalele de experienţă:
                  
                              —
                           
                           
                              specie/suşă utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              starea microbiologică a animalelor, dacă se cunoaşte;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul, vârsta şi sexul animalelor (inclusiv, dacă este cazul, o justificare pentru utilizarea de masculi în locul femelelor);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursă, condiţii de adăpostire, hrănire etc.;
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea substanţei de testat, inclusiv detalii privind forma fizică a materialului administrat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind administrarea substanţei de testat, inclusiv volumul dozelor şi durata administrării;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei şi a apei (inclusiv tipul/sursa hranei, sursa apei);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              o justificare pentru selectarea dozei iniţiale.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              un tabel cu datele privind reacţia şi nivelul dozei la fiecare animal (animale care prezintă semne de toxicitate, inclusiv mortalitate, natura, gravitatea şi durata efectelor);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              un tabel cu greutatea corporală şi variaţiile acesteia;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal în ziua administrării dozei, la intervale săptămânale ulterior şi în momentul morţii sau al sacrificării;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              data şi ora morţii, dacă a survenit înainte de momentul planificat pentru sacrificare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              graficul declanşării semnelor de toxicitate şi reversibilitatea acestora pentru fiecare animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              concluziile autopsiei şi concluziile examenului histopatologic pentru fiecare animal, dacă sunt disponibile.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea şi interpretarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86
               
            
                  2.
               
               
                  Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.
               
            
                  3.
               
               
                  Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610
               
            
                  4.
               
               
                  Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.
               
            
                  5.
               
               
                  Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134
               
            
                  6.
               
               
                  Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.
               
            
                  7.
               
               
                  Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.
               
            
                  8.
               
               
                  OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
               
            
                  9.
               
               
                  OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.
               
            
                  10.
               
               
                  OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].
               
            
                  11.
               
               
                  Lipnick R L, Cotruvo, J. A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel K. A., Walker A. P., Chu I; Goddard M., Segal L., Springer J. A. and Myers R. C. (1995), Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.
               
            
                  12.
               
               
                  Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
               
            
         ANEXA 1
         PROCEDURA DE URMAT PENTRU FIECARE DOZĂ INIŢIALĂ
         OBSERVAŢII GENERALE
         Pentru fiecare doză iniţială, trebuie urmate diferitele scheme de testare, în conformitate cu cele prezentate în prezentul apendice.
         
                     —
                  
                  
                     Apendicele 1a: doza iniţială este de 5 mg/kg de greutate corporală
                  
               
                     —
                  
                  
                     Apendicele 1b: doza iniţială este de 50 mg/kg de greutate corporală
                  
               
                     —
                  
                  
                     Apendicele 1c: doza iniţială este de 300 mg/kg de greutate corporală
                  
               
                     —
                  
                  
                     Apendicele 1d: doza iniţială este de 2 000 mg/kg de greutate corporală
                  
               În funcţie de numărul de animale moarte sau eutanasiate, procedura de testare de urmat este indicată prin săgeţi.
         
            APENDICELE 1A
            PROCEDURA DE TESTARE CU O DOZĂ INIŢIALĂ DE 5 MG/KG GREUTATE CORPORALĂ
            
               
         
         
            APENDICELE 1B
            PROCEDURA DE TESTARE CU O DOZĂ INIŢIALĂ DE 50 MG/KG GREUTATE CORPORALĂ
            
               
         
         
            APENDICELE 1C
            PROCEDURA DE TESTARE CU O DOZĂ INIŢIALĂ DE 300 MG/KG GREUTATE CORPORALĂ
            
               
         
         
            APENDICELE 1D
            PROCEDURA DE TESTARE CU O DOZĂ INIŢIALĂ DE 2 000 MG/KG GREUTATE CORPORALĂ
            
               
         
      
      
         APENDICELE 2
         CRITERIILE PENTRU CLASIFICAREA SUBSTANŢELOR DE TESTAT CU VALORI ESTIMATE ALE LD50 DE PESTE 2 000 MG/KG FĂRĂ A FI NECESARĂ TESTAREA
         Criteriile pentru categoria de periculozitate 5 au ca scop să permită identificarea substanţelor de testat care prezintă un pericol relativ scăzut de toxicitate acută dar care, în anumite circumstanţe, pot prezenta pericole pentru populaţiile vulnerabile. Se anticipează că aceste substanţe au o LD50 orală sau dermică între 2 000 şi 5 000 mg/kg sau doze echivalente pentru alte căi. Substanţa de testat se clasifică în categoria de periculozitate definită prin: 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (categoria 5 din SGA) în următoarele cazuri:
         
                     (a)
                  
                  
                     dacă este încadrată în această categorie de oricare dintre diagramele de testare din anexele 1a-1d, pe baza incidenţei deceselor;
                  
               
                     (b)
                  
                  
                     dacă sunt deja disponibile date fiabile care arată că LD50 se situează în limitele categoriei 5 sau alte studii pe animale sau privind efectele toxice asupra oamenilor indică o problemă acută pentru sănătatea oamenilor;
                  
               
                     (c)
                  
                  
                     prin extrapolare, estimare sau măsurarea de date, dacă nu se justifică clasificarea într-o clasă de periculozitate mai mare şi
                     
                                 —
                              
                              
                                 sunt disponibile informaţii fiabile privind efectele toxice semnificative asupra oamenilor; sau
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 se observă decese la testarea până la valorile din categoria 4 pe cale orală; sau
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dacă concluziile unor experţi confirmă semne clinice semnificative de toxicitate, la testarea până la valorile din categoria 4, cu excepţia diareii, piloerecţiei sau a aspectului neîngrijit; sau
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 dacă concluziile experţilor confirmă informaţii fiabile care indică potenţiale efecte acute semnificative conform altor studii asupra animalelor.
                              
                           
               TESTAREA CU DOZE PESTE 2 000 MG/KG
         Recunoscând necesitatea de a proteja bunăstarea animală, testarea pe animale în limitele categoriei 5 (5 000 mg/kg) este descurajată şi se ia în considerare doar în cazul în care este foarte probabil că rezultatele acestor teste vor fi direct relevante pentru protecţia sănătăţii oamenilor şi a sănătăţii animale (10). Nu se efectuează alte teste cu doze mai mari.
         Când se impune testarea cu o doză de 5 000 mg/kg, este necesară o singură etapă (trei animale). Dacă primul animal tratat moare, testul continuă cu administrarea dozei de 2 000 mg/kg, în conformitate cu diagramele din apendicele 1. Dacă primul animal supravieţuieşte, se administrează aceeaşi doză altor două animale. Dacă doar unul dintre cele trei animale moare, valoarea LD50 este estimată la peste 5 000 mg/kg. Dacă mor două animale, se continuă procedura de administrare cu 2 000 mg/kg.
      
      
         APENDICELE 3
         METODA DE TESTARE B.1 tris Indicaţii pentru clasificarea conform sistemului UE pentru perioada de tranziţie până la punerea completă în aplicare a Sistemului global armonizat de clasificare (SGA) (preluate din referinţa 8)
         
            
         
            
         
            
         
            
      
      B.2.   TOXICITATEA ACUTĂ (ADMINISTRARE PRIN INHALARE)
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Este util să se folosească informaţii preliminare asupra substanţei cu privire la mărimea şi distribuţia particulelor, presiunea vaporilor, punctul de topire, punctul de fierbere, punctul de aprindere şi proprietăţile explozive (după caz).
      A se vedea şi introducerea generală partea B (litera A).
      1.2.   DEFINIŢIE
      A se vedea introducerea generală: partea B (litera B).
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Mai multe loturi de animale de experienţă se tratează cu substanţa de testat pentru o perioadă de timp definită, în concentraţii crescătoare, folosindu-se o singură concentraţie pe lot. Ulterior, se observă efectele toxice şi mortalitatea. Animalele care mor pe parcursul testului şi cele care supravieţuiesc până la încheierea experimentului se supun autopsiei.
      Animalele care prezintă semne de suferinţă intensă şi de durată trebuie eutanasiate. Se evită administrarea substanţelor cu proprietăţi corosive sau iritante în moduri care pot produce suferinţă intensă.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Pregătiri
      Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează la întâmplare într-un număr necesar de loturi. Animalele nu sunt supuse unei expuneri simulate decât dacă acest lucru este indicat de tipul de aparat de expunere folosit.
      Substanţele solide testate trebuie să fie reduse la dimensiuni micronice, în scopul obţinerii unor particule de dimensiuni corespunzătoare.
      Atunci când este necesar, la substanţa de testat se poate adăuga un vehicul care să ajute la generarea unei concentraţii adecvate de substanţă de testat în atmosferă şi, în acest caz, se foloseşte un lot martor pentru vehicul. Dacă pentru facilitarea administrării se foloseşte un vehicul sau alt aditiv, trebuie să fie cunoscute eventualele efecte toxice ale acestuia.
      1.6.2.   Condiţii de testare
      1.6.2.1.   Animale de experienţă
      Dacă nu sunt contraindicaţii, specia preferată este şobolanul. Se folosesc animale aparţinând liniilor obişnuite în laborator. Pentru fiecare sex, la începutul experimentului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie.
      1.6.2.2.   Număr şi sex
      Pentru fiecare nivel de dozare se folosesc minimum 10 rozătoare (5 masculi şi 5 femele). Femelele trebuie să fie nulipare şi negestante.
      Notă: În testele de toxicitate acută cu animale aparţinând unui ordin mai înalt decât cel al rozătoarelor, se are în vedere introducerea în experiment a unui număr mai mic de animale. Dozele se aleg cu atenţie şi se depun toate eforturile pentru a nu se depăşi dozele moderat toxice. În asemenea teste se evită administrarea dozelor letale.
      1.6.2.3.   Concentraţii de expunere
      Acestea trebuie să fie în număr suficient, cel puţin 3, distanţate adecvat pentru a produce o gamă de efecte toxice şi mortalitate la loturile testate. Rezultatele trebuie să fie suficient de numeroase pentru a permite înregistrarea unei curbe concentraţie-mortalitate şi determinarea acceptabilă a CL50 acolo unde este posibil.
      1.6.2.4.   Testul-limită
      Dacă expunerea a cinci animale experimentale masculi şi cinci animale experimentale femele la 20 mg per litru dintr-o substanţă gazoasă sau 5 mg per litru dintr-o substanţă sub formă de aerosoli sau dispersii timp de patru ore (sau, dacă acest lucru nu este posibil datorită proprietăţilor fizice sau chimice, inclusiv cele explozive, ale substanţei de testare, concentraţia maximă accesibilă) nu produce moartea niciunui animal în termen de 14 zile, se apreciază că nu mai este necesară continuarea testului (a 18-a APT, Directiva 93/21/CEE, L 110/93).
      1.6.2.5.   Timpul de expunere
      Timpul de expunere este de 4 ore.
      1.6.2.6.   Echipamente
      Animalele se expun la substanţa de testat cu ajutorul unui dispozitiv de inhalare conceput pentru a asigura un flux continuu sau cel puţin 12 aerisiri pe oră, garantând un conţinut de oxigen adecvat şi o distribuţie uniformă a produsului de testat în aer. Dacă se foloseşte o incintă, aceasta trebuie concepută astfel încât să reducă la minim aglomerarea animalelor de experiment şi să le asigure o expunere maximă, prin inhalare, a substanţei de testat. De regulă, pentru a asigura stabilitatea atmosferei din incintă, volumul total al animalelor nu trebuie să depăşească 5 % din volumul incintei. Se mai pot folosi expuneri oro-nazale, numai ale capului sau ale întregului corp, în incinte individuale; primele două tipuri de expunere limitează absorbţia pe alte căi a substanţei de testat.
      1.6.2.7.   Perioada de observaţie
      Perioada de observaţie este de minimum 14 zile. Cu toate acestea, durata observaţiilor nu este fixată în mod rigid. Ea se stabileşte în funcţie de efectele toxice, de intensitatea lor la debut şi de perioada de recuperare; perioada de observaţie poate fi extinsă, dacă se consideră necesar. Momentul în care apar şi dispar semnele de toxicitate şi momentul morţii sunt factori importanţi, mai ales dacă mortalitatea tinde să fie una tardivă.
      1.6.3.   Mod de operare
      Animalele sunt cântărite cu puţin timp înaintea tratamentului, apoi se tratează cu concentraţia testată, în aparatul respectiv, timp de patru ore, după echilibrarea concentraţiei în incintă. Timpul de echilibrare trebuie să fie scurt. Temperatura la care se realizează testul este de 22 ± 3 oC. În mod ideal, umiditatea relativă este menţinută între 30 % şi 70 %, dar în anumite cazuri, cum ar fi testarea anumitor aerosoli, acest lucru nu este practicabil. Menţinerea unei uşoare presiuni negative în incintă (de exemplu 5 mm H2O) previne pierderea substanţei de testat în spaţiul înconjurător. Hrana şi apa sunt restricţionate în timpul expunerii. Se folosesc sisteme corespunzătoare de generare şi monitorizare a atmosferei testate. Sistemul este proiectat şi funcţionează astfel încât să menţină o distribuţie omogenă a atmosferei testate în interiorul incintei.
      Se măsoară şi se controlează:
      
                  (a)
               
               
                  debitul de aer (în permanenţă);
               
            
                  (b)
               
               
                  concentraţia reală a substanţei de testat măsurate în zona de respiraţie, cel puţin de trei ori în timpul expunerii (unele atmosfere, de exemplu cea cu aerosoli la concentraţii mari, necesită măsurări mai frecvente); pe parcursul perioadei de expunere, concentraţia nu trebuie să varieze cu mai mult de ± 15 % faţă de valoarea medie; cu toate acestea, în cazul prafului şi al aerosolilor, acest grad de control poate să nu fie atins, iar în acest caz se poate accepta o diferenţă mai mare; în cazul aerosolilor, analiza granulometrică se efectuează ori de câte ori este necesar (cel puţin o dată pe lot);
               
            
                  (c)
               
               
                  temperatura şi umiditatea, continuu, dacă este posibil.
               
            În timpul expunerii şi după aceasta au loc observaţii care sunt înregistrate sistematic; pentru fiecare animal se consemnează date individuale. Se fac observaţii frecvente în prima zi. Cel puţin o dată pe zi lucrătoare, se procedează la o examinare clinică atentă; se fac şi alte observaţii zilnice şi se iau măsurile necesare pentru a reduce la minim pierderea animalelor din studiu, precum autopsia sau congelarea exemplarelor găsite moarte şi izolarea sau sacrificarea celor slăbite sau muribunde.
      Observaţiile vizează modificări ale părului şi ale blănii, ale ochilor şi ale mucoaselor, ale aparatului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom şi ale sistemului nervos central, precum şi ale activităţii somato-motrice şi ale comportamentului. Trebuie acordată o atenţie deosebită următoarelor aspecte: tremor, convulsii, salivaţie, diaree, letargie, somn şi comă. Momentul morţii este înregistrat cât mai precis posibil. Fiecare animal este cântărit săptămânal, după tratament şi la deces.
      Animalele care mor pe parcursul testului şi cele care supravieţuiesc sunt supuse autopsiei la încheierea testului, acordându-se o atenţie specială modificărilor tractului respirator. Trebuie înregistrate toate modificările anatomopatologice macroscopice. Unde este cazul, ţesuturile se prelevează pentru examen histopatologic.
      2.   DATE
      Datele se sistematizează în tabele. Pentru fiecare lot testat se consemnează: numărul animalelor introduse în experiment; momentul morţii fiecărui animal; numărul de animale care prezintă alte semne de toxicitate; descrierea efectelor toxice; rezultatele autopsiei. Modificările în greutate se calculează şi se înregistrează, dacă supravieţuirea depăşeşte o zi. Animalele eutanasiate datorită suferinţei intense provocate de compusul folosit se înregistrează ca decese datorate efectelor substanţei de testat. LC50 se determină printr-o metodă standardizată. Rezultatele evaluării cuprind, dacă este posibil, o apreciere a relaţiei între expunerea animalului la substanţa de testat şi incidenţa şi severitatea tuturor modificărilor apărute, care includ: modificări comportamentale şi clinice, leziuni anatomopatologice macroscopice, variaţii ale greutăţii corporale, mortalitate, alte efecte toxice.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare conţine, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specia, linia, sursa, condiţiile ambiante, regimul alimentar etc.;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare: descrierea aparatului de expunere, inclusiv concepţia, tipul, dimensiunile, sursa de aer, sistemul generator de particule şi de aerosoli, metoda de condiţionare a aerului şi, după caz, modul de adăpostire a animalelor în incinta de testare. Se descrie echipamentul folosit pentru măsurarea temperaturii şi, dacă este necesar, stabilitatea concentraţiilor de aerosoli şi granulometria particulelor.
               
            Datele privind expunerea
      Se prezintă sub forma unui tabel care indică valorile medii, precum şi măsura variabilităţii (de exemplu, deviaţia standard); ele trebuie să includă:
      
                  (a)
               
               
                  debitul de aer în dispozitivul de inhalare;
               
            
                  (b)
               
               
                  temperatura şi umiditatea aerului;
               
            
                  (c)
               
               
                  concentraţiile nominale (cantitatea totală de substanţă de testat introdusă în dispozitivul de inhalare raportată la volumul de aer);
               
            
                  (d)
               
               
                  după caz, natura vehiculului;
               
            
                  (e)
               
               
                  concentraţiile reale din zona de respiraţie;
               
            
                  (f)
               
               
                  mediana dimensiunilor particulelor (după caz);
               
            
                  (g)
               
               
                  perioada de echilibrare;
               
            
                  (h)
               
               
                  perioada de expunere:
                  
                              —
                           
                           
                              înregistrarea rezultatelor pe sexe şi nivel de expunere (numărul de animale moarte pe parcursul testului, numărul de animale care prezintă semne de toxicitate, numărul de animale expuse);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              momentul morţii pe parcursul testului, criteriile de eutanasiere;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toate observaţiile;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              valoarea CL50 calculată pe fiecare sex, determinată la sfârşitul perioadei de observaţie, cu specificarea metodei de calcul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              intervalul de încredere 95 % pentru CL50 (în cazul în care poate fi furnizat);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              curba doză/mortalitate şi panta (dacă este permisă de metoda de determinare);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultatele autopsiei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultatele examenului histopatologic;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              discutarea rezultatelor (o atenţie specială se acordă efectelor pe care numărul animalelor sacrificate pe parcursul testului le-ar putea avea asupra valorii calculate a CL50);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              interpretarea rezultatelor.
                           
                        
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B (litera D).
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B (litera E).
      B.3.   TOXICITATEA ACUTĂ (ADMINISTRARE CUTANATĂ)
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B (litera A).
      1.2.   DEFINIŢIE
      A se vedea introducerea generală partea B (litera B).
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa de testat se aplică pe piele, în doze crescătoare, la mai multe loturi, câte o doză pentru fiecare lot. Ulterior se fac observaţii cu privire la efectele toxice şi mortalitate. Animalele care mor pe perioada testării sunt autopsiate, iar la sfârşitul testului animalele supravieţuitoare se supun şi ele autopsiei.
      Animalele care prezintă semne grave de suferinţă sunt eutanasiate. Se evită administrarea substanţelor cu proprietăţi corosive sau iritante în moduri care pot produce suferinţe grave.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Pregătiri
      Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de testare, animalele tinere sănătoase se repartizează la întâmplare în loturile tratate. Cu aproximativ 24 ore înaintea testului, blana din zona dorsală a trunchiului animalelor se tunde sau se rade cu atenţie pentru a nu produce escoriaţii care ar putea altera permeabilitatea pielii. Pentru aplicarea substanţei de testat este pregătită cel puţin 10 % din suprafaţa corpului. Dacă se testează substanţe solide, acestea se umezesc suficient cu apă sau, dacă este necesar, cu un vehicul corespunzător care să asigure un contact bun cu pielea. Dacă se foloseşte un vehicul, trebuie luată în considerare influenţa acestuia asupra penetrabilităţii cutanate. Substanţele lichide testate se folosesc, în general, nediluate.
      1.6.2.   Condiţii de testare
      1.6.2.1.   Animale de experienţă
      Se folosesc şobolani sau iepuri adulţi. Se pot folosi şi alte specii, dar folosirea acestora trebuie justificată. Se folosesc animale din liniile obişnuite de laborator. Pentru fiecare sex, la începutul experimentului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie.
      1.6.2.2.   Număr şi sex
      Pentru fiecare doză se folosesc cel puţin 5 animale, de acelaşi sex. Dacă se folosesc femele, acestea trebuie să fie nulipare şi negestante. Dacă există informaţii demonstrate că unul din sexe prezintă o sensibilitate mai mare, vor fi supuse testului animale de sexul respectiv.
      Notă: În testele de toxicitate acută efectuate pe animale aparţinând unui ordin mai înalt decât rozătoarele se folosesc mai puţine animale. Dozele se aleg astfel încât să nu se depăşească dozele moderat toxice. În astfel de teste se evită administrarea dozelor letale de substanţă de testat.
      1.6.2.3.   Doze
      Dozele trebuie alese în număr suficient (cel puţin trei) şi astfel încât să producă o gamă de efecte toxice şi mortalitate. La alegerea dozelor trebuie luate în considerare eventualele efecte iritante sau corosive. Informaţiile trebuie să permită înregistrarea unei curbe doză/răspuns şi, unde este posibil, determinarea DL50.
      1.6.2.4.   Testul-limită
      Pe un lot de 5 masculi şi 5 femele se poate efectua un test-limită cu doză unică de cel puţin 2 000 mg/kg masă corporală, folosind tehnica descrisă mai sus. Dacă apare mortalitate corelată cu doza, se efectuează un studiu complet.
      1.6.2.5.   Perioada de observaţie
      Perioada de observaţie este de minimum 14 zile. Cu toate acestea, durata observaţiilor nu este fixată în mod rigid, ci se stabileşte în funcţie de efectele toxice, intensitatea lor la debut şi perioada de recuperare. Perioada de observaţie poate fi extinsă, dacă se consideră necesar. Momentul în care apar şi dispar semnele de toxicitate şi momentul morţii sunt factori importanţi, mai ales dacă mortalitatea tinde să fie una tardivă.
      1.6.3.   Mod de operare
      Fiecare animal este ţinut într-o cuşcă individuală. Substanţa de testat se aplică uniform pe o porţiune de aproximativ 10 % din suprafaţa corporală totală. Zona de aplicare poate fi mai redusă în cazul substanţelor foarte toxice, dar se acoperă o suprafaţă cât mai mare, cu un strat cât se poate de subţire şi de uniform.
      Pe parcursul expunerii, substanţa de testat se menţine în contact cu pielea cu ajutorul unui bandaj de tifon şi al unui plasture neiritant. Suprafaţa tratată se acoperă astfel încât să menţină bandajul de tifon şi substanţa de testat şi să se evite ingerarea acesteia de către animale. Se poate folosi contenţionarea pentru a împiedica animalele să ingereze substanţa de testat, dar nu se recomandă imobilizarea completă.
      La sfârşitul perioadei de expunere, se elimină, dacă este posibil, orice reziduu de substanţă, cu apă sau cu ajutorul unui alt procedeu de curăţare a pielii.
      În timpul expunerii şi după aceasta au loc observaţii care sunt înregistrate sistematic; pentru fiecare animal se consemnează date individuale. Se fac observaţii frecvente în prima zi. Cel puţin o dată pe zi lucrătoare, se procedează la o examinare clinică atentă; se fac şi alte observaţii zilnice şi se iau măsurile necesare pentru a reduce la minim pierderea animalelor din studiu, cum ar fi autopsia sau congelarea exemplarelor găsite moarte şi izolarea sau sacrificarea celor slăbite sau muribunde.
      Observaţiile vizează modificări ale blănii, pielii tratate, ochilor, mucoaselor, sistemului respirator, circulator, sistemului nervos central şi sistemului nervos autonom, ale activităţii somato-motrice şi comportamentului. Trebuie acordată o atenţie deosebită următoarelor aspecte: tremor, convulsii, salivaţie, diaree, letargie, somn şi comă. Momentul morţii se înregistrează cât mai exact posibil. Animalele care mor pe parcursul testului şi cele care supravieţuiesc la terminarea lui se supun autopsiei. Toate modificările anatomopatologice macroscopice sunt înregistrate. Dacă este astfel indicat, se recoltează ţesuturi pentru examenul histopatologic.
      Evaluarea toxicităţii la sexul opus
      După terminarea studiului pentru unul din sexe, substanţa de testat se administrează la cel puţin un lot de 5 animale de sex opus, pentru a stabili dacă animalele care aparţin acestui sex prezintă o sensibilitate mai pronunţată la substanţa de testat. În circumstanţe individuale poate fi justificată folosirea unui număr mic de animale. Dacă sunt disponibile informaţii care demonstrează că animalele aparţinând sexului tratat prezintă o sensibilitate mai mare, nu mai este necesară testarea pe animale de sex opus.
      2.   DATE
      Datele se sistematizează în tabele. Pentru fiecare lot testat se consemnează: numărul animalelor la începutul testului; momentul morţii pentru fiecare animal; numărul de animale care manifestă alte semne de toxicitate; descrierea efectelor toxice; rezultatele autopsiei. Greutatea animalelor este determinată şi înregistrată cu puţin timp înaintea aplicării substanţei de testat, apoi săptămânal până în momentul decesului; modificările în greutate se calculează şi se înregistrează, dacă supravieţuirea depăşeşte o zi. Animalele sacrificate datorită suferinţei intense provocate de compusul folosit se înregistrează ca decese datorate efectelor substanţei de testat. DL50 se determină printr-o metodă recunoscută.
      Rezultatele evaluării cuprind, dacă este posibil, o apreciere a relaţiei între expunerea animalului la substanţa de testat şi incidenţa şi severitatea tuturor modificărilor apărute, inclusiv: modificări comportamentale şi clinice, leziuni macroscopice, variaţii ale greutăţii corporale, mortalitate, alte efecte toxice.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specia, linia, sursa, condiţiile ambiante, regimul alimentar etc.;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare (inclusiv metoda de curăţare a pielii şi tipul de bandaj: ocluziv sau neocluziv);
               
            
                  —
               
               
                  dozele (cu indicarea vehiculului, dacă se foloseşte, şi concentraţiile);
               
            
                  —
               
               
                  sexul animalelor tratate;
               
            
                  —
               
               
                  tabele cu rezultatele răspunsului, structurate după sex şi doză (numărul animalelor care au murit sau au fost sacrificate pe parcursul testului, numărul animalelor care prezintă semne de toxicitate, numărul animalelor expuse);
               
            
                  —
               
               
                  momentul morţii după tratament, argumente şi criterii folosite pentru eutanasierea animalelor;
               
            
                  —
               
               
                  toate observaţiile;
               
            
                  —
               
               
                  valoarea DL50 (cu specificarea metodei de determinare) pentru sexul care a reprezentat obiectul unui studiu complet pe o perioadă de 14 zile;
               
            
                  —
               
               
                  intervalul de încredere 95 % pentru DL50 (când poate fi prezentat);
               
            
                  —
               
               
                  curba doză/mortalitate şi panta dreptei de regresie, acolo unde permite metoda de determinare;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele autopsiei;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele histopatologice;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele testelor pe sexul opus;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor (o atenţie particulară se acordă efectului pe care numărul animalelor sacrificate pe parcursul testului l-ar putea avea asupra valorii calculate a DL50);
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B (litera D).
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B (litera E).
      B.4.   TOXICITATE ACUTĂ: IRITAŢIE/COROZIUNE DERMICĂ
      1.   METODĂ
      Această metodă este echivalentă cu Orientarea 404 (2002) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      La elaborarea acestei metode actualizate, s-a acordat o atenţie deosebită posibilelor îmbunătăţiri în ceea ce priveşte problemele de bunăstare animală şi evaluării tuturor informaţiilor existente privind substanţa de testat pentru a se evita testarea inutilă pe animale de laborator. Această metodă include recomandarea ca, anterior efectuării a testului in vivo de iritaţie/coroziune descris asupra substanţei, să se facă o analiză a valorii probante a datelor existente relevante. Dacă datele disponibile sunt insuficiente, ele pot fi dezvoltate prin aplicarea unor teste secvenţiale (1). Strategia de testare include efectuarea unor teste in vitro validate şi acceptate şi este prezentată în apendicele la această metodă. În plus, dacă este cazul, se recomandă optarea pentru aplicarea succesivă, şi nu simultană, a celor trei plasturi la animalul de experienţă în cadrul testului iniţial in vivo.
      
      În interesul acurateţei ştiinţifice şi al bunăstării animale, testele in vivo se efectuează doar după o analiză a valorii probante a tuturor datelor relevante disponibile privind caracterul coroziv/iritant al substanţei la nivel dermic. Printre aceste date se numără dovezi din studiile deja efectuate asupra oamenilor şi/sau animalelor de laborator, dovezi privind caracterul coroziv/iritant al uneia sau mai multor substanţe chimice înrudite structural sau al unor amestecuri de astfel de substanţe, date demonstrând o puternică aciditate sau alcalinitate a substanţei (2) (3) şi rezultatele unor teste in vitro sau ex vivo validate şi acceptate (4) (5) (5a). Această analiză ar trebui să reducă necesitatea efectuării unor teste in vivo de coroziune/iritaţie dermică asupra substanţelor pentru care există deja dovezi suficiente din alte teste privind aceste două puncte finale.
      Apendicele la prezenta metodă prezintă o strategie preferată de testare de tip secvenţial, care include efectuarea unor teste in vitro şi ex vivo de coroziune/iritaţie. Strategia prezentată a fost dezvoltată şi recomandată unanim de participanţii la un atelier de lucru OCDE (6) şi a fost adoptată ca strategie de testare recomandată în Sistemul global armonizat de clasificare a substanţelor chimice (SGA) (7). Se recomandă aplicarea acestei strategii de testare înainte de efectuarea testelor in vivo. Pentru substanţele noi, se recomandă o abordare a testelor pe etape pentru obţinerea unor date ştiinţifice exacte privind caracterul coroziv/iritant al substanţei. În cazul substanţelor existente pentru care datele privind coroziunea/iritaţia dermică sunt insuficiente, se aplică strategia pentru completarea datelor lipsă. Utilizarea unei strategii sau proceduri diferite de testare sau decizia de a nu utiliza o abordare a testării pe etape trebuie justificată.
      În cazul în care analiza valorii probante a datelor, în conformitate cu strategia de testare secvenţială, nu permite determinarea caracterului coroziv sau iritant, se ia în considerare un test in vivo (a se vedea apendicele).
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Iritaţie dermică: constă în producerea unor leziuni cutanate reversibile ca urmare a aplicării unei substanţe de testat timp de maximum patru ore.
      
         Coroziune dermică: constă în producerea unor leziuni cutanate ireversibile; mai exact, necroză vizibilă prin epidermă şi în dermă, ca urmare a aplicării unei substanţe de testat timp de maximum patru ore. Reacţiile cutanate se manifestă, în general, prin ulcere, sângerare, cruste sângerânde, şi, spre sfârşitul perioadei de observaţie de 14 zile, o decolorare datorată albirii pielii, zone de alopecie completă şi cicatrice. Leziunile suspecte se supun unui examen histopatologic.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa de testat se aplică într-o singură doză pe pielea unui animal de experienţă; zonele netratate ale pielii animalului de experienţă se utilizează ca martor. La intervale specificate se examinează şi se punctează gradul de iritare/coroziune, care este descris în detaliu pentru a permite o evaluare completă a efectelor. Durata studiului trebuie să fie suficientă pentru evaluarea reversibilităţii sau ireversibilităţii efectelor observate.
      Animalele care manifestă semne persistente de suferinţă profundă şi/sau durere în orice etapă a testului sunt eutanasiate, iar substanţa este evaluată în consecinţă. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde pot fi consultate în referinţa (8).
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Pregătirea testului in vivo
      
      1.4.1.1.   Selectarea speciei de animale
      Se utilizează, de preferat, exemplare adulte tinere, sănătoase, de iepure albinos. Utilizarea altor specii trebuie justificată.
      1.4.1.2.   Pregătirea animalelor
      Cu aproximativ 24 de ore înainte de test, se rade blana din regiunea dorsală de pe corpul animalelor. Se evită cu atenţie jupuirea pielii şi se utilizează exclusiv animalele cu pielea sănătoasă, intactă.
      La unele suşe de iepuri, blana este mai deasă în unele zone, în anumite perioade ale anului. Zonele în cauză nu se utilizează ca zone de testare.
      1.4.1.3.   Condiţii de adăpostire şi de hrănire
      Animalele se adăpostesc individual. În spaţiul pentru adăpostirea animalelor de experienţă, se asigură o temperatură de 20 oC (± 3 oC) pentru iepuri. Se asigură o umiditate relativă de 50-60 %, cu o valoare minimă de 30 % şi o valoare maximă 70 %, cu excepţia momentelor în care se curăţă spaţiul. Spaţiul se iluminează artificial, cu o alternanţă de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă.
      1.4.2.   Procedura de testare
      1.4.2.1.   Aplicarea substanţei de testat
      Substanţa de testat se alică pe o suprafaţă redusă (aproximativ 6 cm2 a pielii şi se acoperă cu o compresă de tifon, care se fixează cu plasture care nu irită. În cazurile în care nu este posibilă aplicarea directă (de exemplu, în cazul lichidelor şi al unor paste), substanţa de testat se aplică mai întâi pe compresa de tifon, care se aplică apoi pe piele. Se asigură un contact uşor între compresă şi piele cu ajutorul unui pansament semi-ocluziv pentru întreaga durată a perioadei de expunere. Dacă substanţa de testat se aplică pe compresă, aceasta se fixează pe piele astfel încât să se asigure un contact adecvat şi o distribuţie uniformă a substanţei pe piele. Este necesar să se prevină accesul animalului la compresă şi ingerarea sau inhalarea substanţei de testat.
      Substanţele de testat lichide se utilizează, în general, nediluate. La testarea solidelor (care pot fi pulverizate, dacă este necesar), substanţa solidă se înmoaie cu cea mai mică cantitate de apă (sau, dacă este necesar, cu un alt vehicul adecvat) suficientă pentru a asigura un contact adecvat cu pielea. Dacă se utilizează alte vehicule decât apa, potenţiala influenţă a vehiculului asupra iritaţiei provocate de substanţă la nivel dermic trebuie să fie minimă sau nulă.
      La sfârşitul perioadei de expunere, care este, în mod normal, de 4 ore, reziduurile de substanţă de testat se îndepărtează, dacă este posibil, cu apă sau un solvent adecvat fără a se modifica reacţia existentă sau integritatea epidermei.
      1.4.2.2.   Nivelul dozei
      Pe zona de testare se aplică o doză de 0,5 ml de lichid sau de 0,5 g de substanţă solidă sau pastă.
      1.4.2.3.   Testul iniţial (test in vivo de iritaţie/coroziune dermică utilizând un animal)
      Se recomandă ca testul in vivo să se efectueze iniţial pe un singur animal, în special dacă substanţa de testat riscă să fie corozivă. Această abordare este consecventă cu strategia de testare secvenţială (a se vedea apendicele 1).
      Dacă se stabileşte, pe baza analizei valorii probante a datelor, că o substanţă este corozivă, nu este necesară testarea pe animale. Pentru cele mai multe substanţe care sunt considerate corozive, nu sunt, în mod normal, necesare teste suplimentare in vivo. Cu toate acestea, în cazurile în care se justifică obţinerea de date suplimentare având în vedere dovezile insuficiente, se pot efectua teste restrânse, utilizând următoarea abordare: Se aplică animalului, secvenţial, maximum trei plasturi. Primul plasture se îndepărtează după trei minute. Dacă nu se observă o reacţie cutanată serioasă, se aplică al doilea plasture, care se îndepărtează după o oră. Dacă în această etapă, observaţiile arată că poate fi permisă prelungirea expunerii la patru ore, fără a cauza suferinţe, se aplică un al treilea plasture, care se îndepărtează după patru ore şi se punctează reacţia.
      Dacă se observă un efect coroziv după oricare dintre cele trei expuneri secvenţiale, testul se încheie. Dacă nu se observă un efect coroziv după îndepărtarea ultimului plasture, animalul se observă timp de 14 zile, cu excepţia cazului în care coroziunea se manifestă mai devreme.
      În cazurile în care se estimează că substanţa de testat nu este corozivă, dar ar putea fi iritantă, se aplică un singur plasture unui animal, timp de patru ore.
      1.4.2.4.   Teste de confirmare (test de iritare in vivo pe animale suplimentare)
      Dacă la testul iniţial nu se observă efecte corozive, reacţia de iritaţie sau negativă se confirmă prin testarea a maximum alte două animale, fiecare cu câte un plasture, cu o perioadă de expunere de patru ore. Dacă se observă un efect iritant la testul iniţial, testul de confirmare poate fi efectuat secvenţial sau prin expunerea simultană a celor două animale suplimentare. În cazul excepţional în care nu se efectuează testul iniţial, două sau trei animale pot fi tratate cu câte un singur plasture, care se îndepărtează după patru ore. Dacă se utilizează două animale şi ambele manifestă aceeaşi reacţie, nu mai sunt necesare teste suplimentare. În caz contrar, se testează şi al treilea animal. Este posibil să fie necesară evaluarea reacţiilor echivoce utilizând alte animale.
      1.4.2.5.   Perioada de observare
      Durata perioadei de observare trebuie să fie suficientă pentru evaluarea completă a reversibilităţii efectelor observate. Cu toate acestea, experimentul se încheie dacă animalul prezintă semne persistente de durere sau suferinţă profundă. Pentru a determina reversibilitatea efectelor, animalele se observă timp de până la 14 zile de la îndepărtarea plasturilor. Dacă reversibilitatea intervine înainte de 14 zile, experimentul se încheie în acel moment.
      1.4.2.6.   Observaţii clinice şi punctarea reacţiilor cutanate
      Se examinează semnele de eritem şi edem la toate animalele şi se punctează reacţiile la 60 de minute, iar apoi la 24, 48 şi 72 de ore de la îndepărtarea plasturilor. Pentru testul iniţial pe un singur animal, zona de testare se examinează, de asemenea, imediat după îndepărtarea plasturelui. Reacţiile dermice se punctează şi se înregistrează conform punctajelor din tabelul de mai jos. Dacă la 72 de ore se observă leziuni cutanate care nu pot fi identificate ca iritaţii sau coroziuni, este posibil să fie necesară observarea timp de 14 zile, pentru a determina reversibilitatea efectelor. În plus faţă de examinarea iritaţiei, se descriu şi se înregistrează toate efectele toxice locale, precum uscarea pielii, şi orice efecte sistemice adverse (de exemplu, efecte manifestate prin semne clinice de toxicitate sau efecte asupra greutăţii corporale). Pentru clarificarea reacţiilor echivoce se efectuează un examen histopatologic.
      Punctarea reacţiilor cutanate este evident subiectivă. Pentru a promova armonizarea punctării reacţiilor cutanate şi pentru a veni în sprijinul laboratoarelor de testare şi a persoanelor implicate în efectuarea şi interpretarea observaţiilor, personalul care efectuează observaţiile trebuie să fie instruit corespunzător cu privire la sistemul de punctaj utilizat (a se vedea tabelul de mai jos). Ar putea fi util un ghid ilustrat pentru punctarea iritaţiilor dermice şi a altor leziuni (9).
      2.   DATE
      2.1.   PREZENTAREA REZULTATELOR
      Rezultatele studiului se rezumă în formă tabelară în raportul final al testului şi includ toate punctele prevăzute la punctul 3.1.
      2.2.   EVALUAREA REZULTATELOR
      Punctajele de iritaţie dermică se evaluează în legătură cu natura şi severitatea leziunilor, precum şi cu reversibilitatea sau ireversibilitatea lor. Punctajele individuale nu reprezintă un standard absolut pentru proprietăţile iritante ale materialului, întrucât se evaluează şi alte efecte ale materialului de testat. În schimb, punctajele individuale trebuie privite ca valori de referinţă, care se evaluează în legătură cu toate celelalte observaţii ale studiului.
      Reversibilitatea leziunilor cutanate se ia în considerare la evaluarea reacţiilor iritante. Dacă reacţiile precum alopecia (zonă limitată), hiperkeratoza, hiperplazia şi exfolierea persistă la sfârşitul perioadei de observare de 14 zile, substanţa de testat se consideră a fi iritantă.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare include următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Motivaţia pentru testarea in vivo: analiza valorii probante a datelor prealabile testului, inclusiv a rezultatelor strategiei de testare secvenţiale:
                  
                              —
                           
                           
                              descrierea datelor relevante disponibile înaintea testului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date obţinute în fiecare etapă a strategiei de testare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea testelor in vitro efectuate, inclusiv detaliile procedurilor, rezultatele obţinute cu substanţele de testat/de referinţă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analiza valorii probante pentru efectuarea studiului in vivo.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Substanţa de testat:
                  
                              —
                           
                           
                              date de identificare (de exemplu, numărul CAS; sursă; puritate; impurităţi cunoscute; numărul lotului);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              natura fizică şi proprietăţile fizico-chimice (de exemplu, pH, volatilitate, solubilitate, stabilitate);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pentru amestecuri, compoziţia şi procentele relative ale componentelor.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Vehicul:
                  
                              —
                           
                           
                              identificare, concentraţie (dacă este cazul), volumul utilizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animale de experienţă:
                  
                              —
                           
                           
                              specie/suşă utilizată, motivaţie pentru utilizarea altor animale decât iepurele albinos;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de animale din fiecare sex;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul şi la finalul testului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vârsta la începutul studiului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursa animalelor, condiţii de adăpostire, hrănire etc.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              tehnica pregătirii zonei de aplicare a plasturelui;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind materialele utilizate pentru plasturi şi metodele de aplicare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea, aplicarea şi îndepărtarea substanţei de testat.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              tabel cu punctajul acordat reacţiei de iritaţie/coroziune pentru fiecare animal în fiecare moment de observare prestabilit;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea tuturor leziunilor observate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea narativă a naturii şi gradului de iritaţie/coroziune observat şi concluziile examenului histopatologic;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea altor efecte locale adverse (de exemplu, uscarea pielii) şi a altor efecte sistemice apărute în plus faţă de iritaţia sau coroziunea dermică.
                           
                        
                              —
                           
                           
                              Discutarea rezultatelor.
                           
                        
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Barratt, M. D., Castell, J. V., Chamberlain, M., Combes, R. D., Dearden, J. C., Fentem, J. H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.
               
            
                  2.
               
               
                  Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.
               
            
                  3.
               
               
                  Worth, A. P., Fentem, J. H., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720.
               
            
                  4.
               
               
                  ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation”, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.
               
            
                  5.
               
               
                  Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Edsail, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 12, pp.483-524.
               
            
                  5a.
               
               
                  Metoda de testare B.40 Coroziunea cutanată.
               
            
                  6.
               
               
                  OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm).
               
            
                  7.
               
               
                  OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm).
               
            
                  8.
               
               
                  OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.htm).
               
            
                  9.
               
               
                  EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Disponibil la cerere la Secretariatul OCDE].
                  [Disponibile, la cerere, la secretariatul OCDE.]
               
            Tabelul 1
      PUNCTAREA REACŢIILOR CUTANATE
      
         Formarea de eriteme şi escare
      
      
                  Fără eritem
               
               
                  0
               
            
                  Eritem foarte uşor (abia perceptibil)
               
               
                  1
               
            
                  Eritem bine definit
               
               
                  2
               
            
                  Eritem moderat spre grav
               
               
                  3
               
            
                  Eritem grav (roşu violaceu) cu formare de escare care împiedică punctarea eritemului
               
               
                  4
               
            Maximum posibil: 4
      
         Formarea de edeme
      
      
                  Fără edem
               
               
                  0
               
            
                  Edem foarte uşor (abia perceptibil)
               
               
                  1
               
            
                  Edem uşor (marginile zonei bine definite printr-o umflătură vizibilă)
               
               
                  2
               
            
                  Edem moderat (umflătură de aproximativ 1 mm)
               
               
                  3
               
            
                  Edem grav (umflătură de peste 1 mm extins în afara zonei de expunere)
               
               
                  4
               
            Maximum posibil: 4
      Pentru clarificarea reacţiilor echivoce se procedează la un examen histopatologic.
      
         APENDICE
         O strategie de testare secvenţială pentru iritaţie şi coroziune dermică
         CONSIDERENTE GENERALE
         În interesul acurateţei ştiinţifice şi al bunăstării animale, este important să se evite utilizarea inutilă a animalelor de experienţă şi să se reducă la minimum testările care pot produce reacţii grave la animale. Este necesar să se evalueze toate informaţiile privind o substanţă care sunt relevante pentru potenţialul său caracter coroziv/iritant la nivel dermic înainte de luarea în considerare a testării in vivo. Este posibil să existe deja date suficiente pentru clasificarea unei substanţe de testat din punctul de vedere al potenţialului său coroziv/iritant la nivel dermic, fără a mai fi necesar să se efectueze teste pe animale de laborator. Prin urmare, prin utilizarea unei analize a valorii probante a datelor şi a unei strategii de testare secvenţiale, se reduce la minimum necesitatea de a efectua teste in vivo, în special dacă substanţa are potenţialul de a produce reacţii grave.
         Se recomandă utilizarea unei analize a valorii probante a datelor pentru a evalua informaţiile existente privind potenţialul iritant şi coroziv al substanţelor la nivel dermic şi a stabili dacă este necesară efectuarea unor teste suplimentare, altele decât studii dermice in vivo, pentru caracterizarea acestui potenţial. Dacă sunt necesare studii suplimentare, se recomandă aplicarea strategiei de testare secvenţiale pentru obţinerea datelor experimentale relevante. Pentru substanţele care nu au fost testate anterior, se recomandă aplicarea strategiei de testare secvenţiale pentru obţinerea setului de date necesare pentru evaluarea potenţialului său coroziv/iritant la nivel dermic. Strategia de testare descrisă în prezentul apendice a fost dezvoltată în cadrul unui atelier de lucru OCDE (1) şi a fost ulterior susţinută şi extinsă în cadrul Sistemului armonizat integrat de clasificare a riscurilor substanţelor chimice pentru sănătatea oamenilor şi mediu (Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances), adoptată la a 28-a reuniune comună a Comitetului pentru substanţe chimice şi a Grupului de lucru pentru substanţe chimice, în noiembrie 1998 (2).
         Deşi această strategie de testare secvenţială nu face parte integrantă din metoda de testare B.4, ea reprezintă abordarea recomandată pentru determinarea caracteristicilor iritante/corozive la nivel dermic. Această abordare reprezintă atât cea mai bună practică, cât şi un reper etic pentru testarea in vivo pentru iritaţie/coroziune dermică. Metoda de testare oferă indicaţii pentru efectuarea testului in vivo şi rezumă factorii care trebuie evaluaţi înainte de un astfel de test. Strategia oferă o abordare pentru evaluarea datelor existente privind proprietăţile iritante/corozive la nivel dermic ale substanţelor de testat şi o abordare graduală pentru generarea datelor relevante pentru substanţele pentru care sunt necesare studii suplimentare sau care nu au făcut încă obiectul unor studii. Strategia recomandă, de asemenea, efectuarea unor teste in vitro sau ex vivo validate şi acceptate pentru coroziune/iritaţie dermică în condiţii specifice.
         DESCRIEREA STRATEGIEI DE EVALUARE ŞI TESTARE
         Înainte de efectuarea testelor incluse în strategia de testare secvenţială (figură), se evaluează toate informaţiile disponibile pentru a stabili dacă este necesară testarea cutanată in vivo. Deşi se pot obţine informaţii semnificative din evaluarea unor parametri specifici (de exemplu, o valoare extremă a pH-ului), se iau în considerare toate informaţiile existente. Se evaluează toate datele relevante privind efectele substanţei în cauză şi a analogilor săi pentru adoptarea unei decizii prin analiza valorii probante a datelor şi se prezintă motivele care stau la baza deciziei. Se acordă o atenţie specială datelor privind efectele substanţei asupra oamenilor şi animalelor, apoi rezultatelor testelor in vitro sau ex vivo. Se evită, ori de câte ori este posibil, efectuarea unor studii in vivo pentru substanţele corozive. Factorii luaţi în considerare în strategia de testare includ:
         
            Evaluarea datelor privind efectele asupra oamenilor şi animalelor (Etapa I). Se iau în primul rând în considerare datele existente privind efectele asupra oamenilor, de exemplu studii clinice şi ocupaţionale sau studii de caz, şi/sau date obţinute în cadrul unor teste asupra animalelor, de exemplu studii privind toxicitatea dermică la o singură expunere sau expuneri repetate, deoarece acestea furnizează informaţii direct legate de efectele cutanate. Nu este necesar să se efectueze studii in vivo asupra substanţelor cu caracter iritant sau coroziv cunoscut şi a celor pentru care există date clare că nu sunt corozive sau iritante.
         
            Analiza relaţiilor structură-activitate (RSA) (Etapa 2). Se iau în considerare rezultatele testelor asupra substanţelor înrudite din punct de vedere structural, dacă sunt disponibile. Dacă sunt disponibile suficiente date privind efectele asupra oamenilor şi/sau animalelor ale unor substanţe înrudite structural sau ale unor amestecuri de astfel de substanţe care indică un potenţial coroziv/iritant la nivel dermic, se poate presupune că substanţa în curs de evaluare va produce aceleaşi reacţii. În astfel de cazuri, este posibil să nu fie necesare teste asupra substanţei în cauză. Datele negative obţinute de studiile asupra substanţelor înrudite structural sau asupra amestecurilor de astfel de substanţe nu constituie dovezi suficiente pentru caracterul necoroziv/neiritant al substanţei supuse strategiei de testare secvenţiale. Se utilizează abordări RSA validate şi acceptate pentru a identifica atât potenţialul de coroziune dermică, cât şi cel de iritaţie dermică.
         
            Proprietăţile fizico-chimice şi reactivitatea chimică (Etapa 3). Substanţele care prezintă valori extreme ale pH-ului, precum ≤ 2,0 şi ≥ 11,5 pot produce efecte locale puternice. Dacă valorile extreme ale pH-ului constituie baza pentru identificarea unei substanţe ca fiind corozivă la nivel dermic, atunci se poate lua în considerare şi rezerva sa acidă/alcalină (sau capacitatea de tamponare) (3) (4). În cazul în care capacitatea de tamponare sugerează că este posibil ca substanţa să nu fie corozivă la nivel dermic, se efectuează teste suplimentare pentru confirmare, de preferat prin utilizarea unui test in vitro sau ex vivo validat şi acceptat (a se vedea etapele 5 şi 6).
         
            Toxicitatea dermică (Etapa 4). Dacă o substanţă chimică s-a dovedit foarte toxică pe cale dermică, există riscul ca efectuarea un studiu in vivo de iritaţie/coroziune dermică să nu fie posibilă, întrucât cantitatea de substanţă de testat aplicată în mod normal ar putea depăşi doza foarte toxică şi, prin urmare, ar putea provoca moartea sau suferinţă profundă animalelor. În plus, dacă au fost deja efectuate teste de toxicitate dermică pe iepuri albinoşi, până la un nivel-limită al dozei de 2 000 mg/kg greutate corporală sau mai mare, fără să se observe iritaţii sau coroziune dermice, nu sunt necesare teste suplimentare pentru iritaţie/coroziune dermică. La evaluarea toxicităţii dermice acute determinate în studiile anterioare se iau în considerare o serie de factori. De exemplu, informaţiile raportate privind leziunile dermice pot fi incomplete. Este posibil ca testarea şi observaţiile să se fi făcut pe alte specii decât pe iepurele albinos, iar speciile pot prezenta diferenţe semnificative din punctul de vedere al sensibilităţii reacţiilor lor. De asemenea, este posibil ca forma substanţei de testat aplicate pe animale să nu fi fost adecvată pentru evaluarea iritaţiei/coroziunii dermice [de exemplu, diluarea substanţelor pentru testarea toxicităţii dermice (5)]. Cu toate acestea, în cazurile în care au fost efectuate teste concepute şi desfăşurate corespunzător pe iepuri, concluziile negative pot fi considerate dovezi suficiente că substanţa nu este corozivă sau iritantă.
         
            Rezultatele testelor in vitro sau ex vivo (Etapele 5 şi 6). Substanţele care au prezentat proprietăţi corozive sau puternic iritante într-un test in vitro sau ex vivo validat şi acceptat (6) (7) conceput pentru evaluarea acestor efecte specifice, nu trebuie să fie testate pe animale. Se poate presupune că substanţele în cauză vor produce efecte la fel de puternice in vivo.
         
         
            Testul in vivo pe iepuri (Etapele 7 şi 8). În cazul în care, în urma analizei valorii probante a datelor, se ia decizia efectuării unui test in vivo, se începe printr-un test iniţial pe un singur animal. Dacă rezultatele acestui test arată că substanţa este corozivă la nivel dermic, nu se efectuează teste suplimentare. Dacă în cadrul testului iniţial nu se observă efecte corozive, efectul iritant sau negativ se confirmă utilizând maximum alte două animale, cu o perioadă de expunere de patru ore. Dacă în cadrul testului iniţial se observă un efect iritant, testul de confirmare poate fi efectuat secvenţial sau prin expunerea altor două animale simultan.
         4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
         
                     1.
                  
                  
                     OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                  
               
                     2.
                  
                  
                     OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                  
               
                     3.
                  
                  
                     Worth, A. P., Fentem J. H., Balls M., Botham P .A., Curren R. D., Earl L. K., Esdaile D. J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709-720.
                  
               
                     4.
                  
                  
                     Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth, W. M. H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In vitro, 2 (1) pp. 19-26.
                  
               
                     5.
                  
                  
                     Patil, S. M., Patrick, E., Maibach, H. I. (1996) Animal, Human, and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, pp. 411-436.
                  
               
                     6.
                  
                  
                     Metoda de testare B.40.
                  
               
                     7.
                  
                  
                     Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.
                  
               Figură
         STRATEGIE DE TESTARE ŞI EVALUARE A IRITAŢIEI/COROZIUNII DERMICE
         
            
      
      B.5.   TOXICITATE ACUTĂ: IRITAŢIE/COROZIUNE OCULARĂ
      1.   METODĂ
      Această metodă este echivalentă cu Orientarea 405 (2002) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      La elaborarea acestei metode actualizate s-a acordat o atenţie deosebită posibilelor îmbunătăţiri prin evaluarea tuturor informaţiilor existente privind substanţa de testat, astfel încât să se evite testarea inutilă pe animale de laborator şi, prin urmare, pentru soluţionarea problemelor de bunăstare animală. Această metodă include recomandarea ca, înainte de a se efectua testul in vivo descris pentru coroziune/iritaţie oculară acută, să se facă o analiză a valorii probante a datelor relevante (1). Dacă datele disponibile sunt insuficiente, se recomandă dezvoltarea acestora prin aplicarea unor teste secvenţiale (2) (3). Strategia de testare include efectuarea unor teste in vitro validate şi acceptate şi este prezentată ca apendice la această metodă de testare. În plus, se recomandă utilizarea unui test in vivo de iritaţie/coroziune dermică pentru a face o estimare a coroziunii oculare, înainte de a se lua în considerare efectuarea unui test ocular in vivo.
      În interesul acurateţei ştiinţifice şi al bunăstării animale, testele in vivo se efectuează doar după o analiză a valorii probante a tuturor datelor disponibile relevante pentru potenţialul de coroziune/iritaţie oculară al substanţei. Printre aceste date se numără dovezi din studiile deja efectuate asupra oamenilor şi/sau animalelor de laborator, dovezi privind caracterul coroziv/iritant al uneia sau mai multor substanţe chimice înrudite structural sau al unor amestecuri de astfel de substanţe, date demonstrând o puternică aciditate sau alcalinitate a substanţei (4) (5) şi rezultatele unor teste in vitro sau ex vitro de coroziune şi iritaţie dermică validate şi acceptate (6) (6a). Este posibil ca aceste studii să fi fost efectuate înainte de sau ca urmare a analizei valorii probante a datelor.
      Pentru anumite substanţe, o astfel de analiză poate indica necesitatea efectuării unor studii in vivo privind potenţialul de coroziune/iritaţie oculară al substanţei. În toate aceste cazuri, înainte de a lua în considerare efectuarea testului ocular in vivo, este de preferat să se efectueze un studiu asupra efectelor cutanate in vivo ale substanţei şi o evaluare în conformitate cu metoda de testare B.4 (7). Efectuarea unei analize a valorii probante a datelor şi aplicarea strategiei de testare secvenţiale ar trebui să reducă necesitatea efectuării unor teste in vivo de coroziune/iritaţie oculară asupra substanţelor pentru care există deja date suficiente obţinute în cadrul altor studii. Dacă potenţialul de coroziune şi iritaţie oculară nu se poate determina prin aplicarea strategiei de testare secvenţiale, chiar după efectuarea unui studiu in vivo de coroziune şi iritaţie dermică, se poate trece la efectuarea unui test in vivo de coroziune/iritaţie oculară.
      Apendicele la prezenta metodă prezintă o strategie de testare secvenţială preferată, care include efectuarea unor teste in vitro sau ex vivo de coroziune/iritaţie. Strategia a fost dezvoltată şi unanim recomandată de participanţii la un atelier de lucru OCDE (8), iar ulterior a fost adoptată ca strategia de testare recomandată în Sistemul global armonizat de clasificare a substanţelor chimice (SGA) (9). Se recomandă aplicarea acestei strategii de testare înainte de efectuarea testelor in vivo. Pentru substanţe noi, este abordarea recomandată pentru testarea secvenţială în vederea dezvoltării unor date ştiinţifice fiabile privind caracterul coroziv/iritant al substanţei. În cazul substanţelor existente pentru care există date insuficiente privind coroziunea/iritaţia dermică şi oculară, strategia se utilizează pentru obţinerea unor date complete. Utilizarea unei strategii sau proceduri diferite de testare sau decizia de a nu aplica o abordare de testare secvenţială trebuie motivată.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Iritaţie oculară: reprezintă producerea unor modificări oculare ca urmare a aplicării unei substanţe de testat pe suprafaţa anterioară ochiului, care sunt complet reversibile în termen de 21 de zile de la aplicare.
      
         Coroziune oculară: reprezintă producerea unor leziuni tisulare la nivelul ochiului sau a unei deteriorări grave a vederii, ca urmare a aplicării unei substanţe de testat pe suprafaţa anterioară a ochiului, care nu sunt complet reversibile în termen de 21 de zile de la aplicare.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa de testat se aplică, într-o singură doză, pe un ochi al animalului de experienţă, celălalt ochi fiind utilizat ca martor. Nivelul de iritaţie/coroziune oculară se evaluează prin acordarea unui punctaj leziunilor care afectează conjunctiva, corneea şi irisul, la intervale prestabilite. Se descriu, de asemenea, celelalte efecte asupra ochiului sau efecte sistemice adverse, pentru a asigura o evaluare completă a efectelor. Durata studiului trebuie să fie suficientă pentru a evalua reversibilitatea sau ireversibilitatea efectelor.
      Animalele care manifestă semne persistente de suferinţă şi/sau dureri profunde în orice etapă a testului sunt eutanasiate, iar substanţa se evaluează în consecinţă. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde sunt prezentate în referinţa 10.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Pregătirea pentru testul in vivo
      
      1.4.1.1.   Selectarea speciei
      Se utilizează, de preferat, exemplare adulte tinere, sănătoase, de iepure albinos. Utilizarea altor suşe sau specii trebuie justificată.
      1.4.1.2.   Pregătirea animalelor
      Cu 24 de ore înainte de începerea testului se examinează ambii ochi ai animalului de experienţă selectat provizoriu. Nu se utilizează animalele care prezintă iritaţii sau defecte oculare sau leziuni corneene preexistente.
      1.4.1.3.   Condiţii de adăpostire şi de hrănire
      Animalele se adăpostesc individual. În spaţiul pentru adăpostirea animalelor de experienţă se asigură o temperatură de 20 oC (± 3 oC) pentru iepuri. Se asigură o umiditate relativă de 50-60 %, cu o valoare minimă de 30 % şi o valoare maximă 70 %, cu excepţia momentelor în care se curăţă spaţiul. Spaţiul se iluminează artificial, cu o alternanţă de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă.
      1.4.2.   Procedura de testare
      1.4.2.1.   Aplicarea substanţei de testat
      Substanţa de testat se aplică în sacul conjunctival al unui ochi al fiecărui animal, după îndepărtarea delicată a pleoapei inferioare de pe globul ocular. Pleoapele se ţin apoi lipite pentru circa o secundă, pentru a preveni pierderea materialului. Celălalt ochi, care nu se tratează, se utilizează ca martor.
      1.4.2.2.   Irigaţia
      Ochii animalelor testate nu se spală timp de cel puţin 24 de ore de la instilaţia substanţei de testat, cu excepţia cazului în care substanţa este solidă (a se vedea punctul 1.4.2.3.2) şi a cazului în care apar efecte corozive sau iritante imediate. După 24 de ore, se procedează la o spălare, dacă se consideră necesar.
      Nu se recomandă utilizarea unui grup satelit de animale pentru a analiza influenţa spălării, cu excepţia cazului în care este justificată ştiinţific. Dacă este necesar un grup satelit, se folosesc doi iepuri. Se descriu detaliat condiţiile de spălare, precizând momentul spălării; compoziţia şi temperatura soluţiei utilizate; durata, volumul şi viteza de aplicare.
      1.4.2.3.   Nivelul dozei
      1.4.2.3.1.   Testarea lichidelor
      
      Pentru testarea lichidelor se utilizează o doză de 0,1 ml. Nu se utilizează pulverizatoare cu pompă pentru instilarea substanţei direct în ochi. Se recomandă extragerea lichidului şi colectarea sa într-un container înainte de instilarea a 0,1 ml în ochi.
      1.4.2.3.2.   Testarea solidelor
      
      La testarea solidelor, a pastelor şi a substanţelor sub formă de particule, cantitatea utilizată are un volum de 0,1 ml sau o greutate de cel mult 100 mg. Materialul de testat se macină într-un praf fin. Volumul materialului solid se măsoară după o compactare delicată, de exemplu bătând uşor cu palma recipientul de măsură. Dacă substanţa solidă de testat nu a fost îndepărtată din ochiul animalului de experienţă prin mecanisme fiziologice în primul moment prestabilit de observare, și anume la o oră după tratament, ochiul poate fi spălat cu o soluţie salină sau cu apă distilată.
      1.4.2.3.3.   Testarea aerosolilor
      
      Se recomandă colectarea conţinutului tuturor pulverizatoarelor cu pompă şi aerosolilor înainte de instilarea în ochi. Singura excepţie o constituie substanţele în containere sub presiune pentru aerosoli, care nu pot fi colectate din cauza vaporizării. În acest caz, ochiul se ţine deschis, iar substanţa de testat se administrează în ochi cu un singur jet de circa o secundă, de la o distanţă de 10 cm perpendicular pe ochi. Distanţa poate varia în funcţie de presiunea pulverizatorului şi a conţinutului său. Se evită lezarea ochiului din cauza presiunii pulverizatorului. În unele cazuri, se poate dovedi necesar să se evalueze posibilitatea provocării unor leziuni „mecanice” ochiului prin forţa pulverizatorului.
      Se poate face o estimare a dozei dintr-un aerosol simulând testul astfel: substanţa se pulverizează pe o bucată de hârtie de cântărit, printr-o deschidere de dimensiunea ochiului unui iepure amplasată direct în faţa hârtiei. Cantitatea pulverizată în ochi se estimează pe baza creşterii greutăţii hârtiei. Pentru substanţele volatile, doza poate fi estimată prin cântărirea unui recipient în care este pulverizată substanţa, înainte şi după îndepărtarea materialului de testat.
      1.4.2.4.   Testul iniţial (Test in vivo de iritaţie/coroziune oculară pe un animal)
      Aşa cum se precizează în strategia de testare secvenţială (a se vedea apendicele), se recomandă ca testul in vivo să se efectueze pentru început pe un singur animal.
      Dacă rezultatul acestui test, obţinut conform procedurii descrise, arată că substanţa este corozivă sau foarte iritantă la nivel ocular, nu se efectuează teste suplimentare de iritaţie oculară.
      1.4.2.5.   Anestezice locale
      Se pot utiliza anestezice locale de la caz la caz. Dacă analiza valorii probante a datelor arată că este posibil ca substanţa să provoace durere sau dacă testul iniţial arată că va avea loc o reacţie dureroasă, se poate aplica un anestezic local înainte de instilarea substanţei de testat. Se alege cu atenţie tipul, concentraţia şi doza de anestezic local pentru a se asigura că utilizarea anestezicului nu determină reacţii diferite la substanţa de testat. Se anesteziază în mod similar şi ochiul martor.
      1.4.2.6.   Testul de confirmare (Test in vivo de iritaţie oculară pe alte animale)
      Dacă la testul iniţial nu se observă un efect coroziv, reacţia iritantă sau negativă se confirmă utilizând maximum alte două animale. Dacă la testul iniţial se observă un efect puternic iritant care indică posibilitatea provocării unui efect puternic (ireversibil) în cadrul testului de confirmare, se recomandă ca testul de confirmare să se efectueze secvenţial, pe câte un animal, şi nu prin expunerea simultană a ambelor animale. Dacă la al doilea animal apar efecte corozive sau puternic iritante, testul se întrerupe. Este posibil să fie necesară testarea altor animale pentru confirmarea unor reacţii iritante slabe sau moderate.
      1.4.2.7.   Perioada de observaţie
      Durata perioadei de observaţie trebuie să fie suficientă pentru evaluarea completă a amplorii şi a reversibilităţii efectelor observate. Cu toate acestea, experimentul se încheie în momentul în care animalul manifestă semne persistente de suferinţă sau dureri profunde (9). Pentru a determina reversibilitatea efectelor, animalele sunt puse observaţie timp de 21 de zile după administrarea substanţei de testat. Dacă reversibilitatea intervine înainte de expirarea celor 21 de zile, experimentul se încheie în acel moment.
      1.4.2.7.1.   Observaţii clinice şi punctarea reacţiilor oculare
      
      Ochii se examinează la 1, 24, 48 şi 72 de ore de la aplicarea substanţei de testat. Animalele nu sunt menţinute în experiment mai mult decât este necesar pentru obţinerea unor informaţii concludente. Animalele care prezintă semne persistente de durere sau suferinţă profunde sunt eutanasiate imediat, iar substanţa se evaluează în consecinţă. Animalele care după instilare prezintă următoarele leziuni oculare sunt eutanasiate: perforare corneană sau ulcerare corneană semnificativă, inclusiv stafilom; sânge în camera anterioară a ochiului; opacitate corneană de gradul 4 care persistă timp de 48 de ore; absenţa reflexului fotomotor (reacţie a irisului de gradul 2) care persistă timp de 72 de ore; ulcerare a membranei conjunctivale; necroză a conjunctivelor şi a membranei nictitante; sau desprinderea ţesutului necrozat. Eutanasierea se justifică întrucât astfel de leziuni sunt, în general, ireversibile.
      Animalele care nu prezintă leziuni oculare pot fi eutanasiate după cel puţin 3 zile de la instilare. Animalele care prezintă leziuni uşoare şi moderate sunt supuse observaţiei până la dispariţia leziunilor sau timp de 21 de zile, moment în care studiul se încheie. Animalele sunt examinate la 7, 14 şi 21 de zile, pentru a determina starea, reversibilitatea sau ireversibilitatea leziunilor.
      Nivelul reacţiei oculare (conjunctive, cornee şi iris) se înregistrează la fiecare examinare (tabelul I). Se înregistrează, de asemenea, orice altă leziune oculară (de exemplu, panus, colorare) şi orice efecte sistemice adverse.
      Pentru a facilita examinarea reacţiilor, se pot utiliza o lupă binoculară, o lampă portabilă cu fantă, un biomicroscop sau un alt dispozitiv adecvat. După înregistrarea observaţiilor la 24 de ore, examinarea ochilor se poate face cu ajutorul fluoresceinei.
      Punctarea reacţiilor oculare este evident subiectivă. Pentru a promova armonizarea punctării reacţiilor oculare şi pentru a veni în sprijinul laboratoarelor de testare şi a persoanelor implicate în efectuarea şi interpretarea observaţiilor, personalul care efectuează observaţiile trebuie să fie instruit corespunzător cu privire la sistemul de punctaj utilizat.
      2.   DATE
      2.2.   EVALUAREA REZULTATELOR
      Punctajele iritaţiei oculare se evaluează în legătură cu natura şi gravitatea leziunilor, precum şi cu reversibilitatea sau ireversibilitatea acestora. Punctajele individuale nu reprezintă un standard absolut pentru proprietăţile iritante ale unui material de testat, întrucât se evaluează şi alte efecte ale materialului. În schimb, punctajele individuale trebuie privite ca valori de referinţă şi nu sunt semnificative decât dacă sunt însoţite de o descriere şi o evaluare completă a tuturor observaţiilor.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare include următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Motivaţia pentru testarea in vivo: analiza valorii probante a datelor existente din teste anterioare, inclusiv a rezultatelor strategiei de testare secvenţiale
                  
                              —
                           
                           
                              descrierea datelor relevante disponibile din testele anterioare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date derivate din fiecare etapă a strategiei de testare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea testelor in vitro efectuate, inclusiv detalii privind procedurile, rezultatele obţinute cu substanţele de testat/de referinţă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea studiului in vivo de iritaţie/coroziune dermică efectuat, inclusiv rezultatele obţinute;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analiza valorii probante a datelor pentru efectuarea studiului in vivo.
                              
                           
                        
            
                   
               
               
                  Substanţa de testat:
                  
                              —
                           
                           
                              date de identificare (de exemplu, numărul CAS, sursă, puritate, impurităţi cunoscute, numărul lotului);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              natura fizică şi proprietăţile fizico-chimice (de exemplu, pH, volatilitate, solubilitate, stabilitate, reactivitatea cu apă);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              în cazul unui amestec, compoziţia şi procentajele relative ale componentelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dacă se utilizează anestezic local, identificare, puritate, doză şi potenţial de interacţiune cu substanţa de testat.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Vehicul:
                  
                              —
                           
                           
                              identificare, concentraţie (dacă este cazul), volumul utilizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animale de experienţă:
                  
                              —
                           
                           
                              specie/suşă utilizată, motivaţie pentru utilizarea altor animale decât iepurele albinos;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vârsta fiecărui animal la începutul studiului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de animale de fiecare sex participante la test şi în grupurile de control (dacă este cazul);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul şi la sfârşitul testului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursă, condiţii de adăpostire, hrănire etc.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              descrierea metodei utilizate pentru punctarea iritaţiei în fiecare moment de observaţie (de exemplu, lampă portabilă cu fantă, biomicroscop, fluoresceină);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              un tabel cu datele privind reacţiile iritante/corozive la fiecare animal în fiecare moment de observare, până la excluderea din test a fiecărui animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              o descriere narativă a gravităţii şi a naturii iritaţiei sau a coroziunii observate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              o descriere a oricăror alte leziuni observate la nivel ocular (de exemplu, vascularizare, formarea unui panus, aderenţe, colorare);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea efectelor adverse locale non-oculare şi sistemice şi a concluziilor examenului histopatologic, dacă sunt disponibile.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            3.2.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Extrapolarea rezultatelor studiilor de iritaţie oculară asupra animalelor la oameni este valabilă doar într-o măsură restrânsă. În multe cazuri, iepurele albinos este mai sensibil decât oamenii la substanţe cu proprietăţi iritante sau corozive la nivel ocular.
      La interpretarea datelor se acordă o atenţie specială excluderii iritaţiei generate de infecţii secundare.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Barratt, M. D., Castell, J. V., Chamberlain, M., Combes, R. D., Dearden, J. C., Fentem, J. H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410-429.
               
            
                  2.
               
               
                  de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K. G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K. C., Hill, R. N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164.
               
            
                  3.
               
               
                  Worth A. P. and Fentem J. H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177
               
            
                  4.
               
               
                  Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.
               
            
                  5.
               
               
                  Neun, D. J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231.
               
            
                  6.
               
               
                  Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Edsaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.
               
            
                  6a.
               
               
                  Metoda de testare B.40. Coroziunea cutanată.
               
            
                  7.
               
               
                  Metoda de testare B.4. Toxicitate acută: iritaţie/coroziune dermică.
               
            
                  8.
               
               
                  OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
               
            
                  9.
               
               
                  OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
               
            
                  10.
               
               
                  OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
               
            Tabelul 1
      Punctarea leziunilor oculare
      Cornee
      Opacitate: nivel de densitate (examinarea se face în zona cea mai densă) (1)
      
      
                  Fără ulcerare sau opacitate …
               
               
                  0
               
            
                  Zone dispersate sau difuze de opacitate (altele decât o uşoară atenuare a strălucirii normale); detaliile irisului clar vizibile …
               
               
                  1
               
            
                  Zonă translucidă uşor perceptibilă; detaliile irisului uşor mascate …
               
               
                  2
               
            
                  Zonă sidefată: detaliile irisului invizibile; dimensiunea pupilei greu perceptibilă …
               
               
                  3
               
            
                  Cornee opacă; iris invizibil din cauza opacităţii …
               
               
                  4
               
            Maximum posibil: 4
      Iris
      
                  Normal …
               
               
                  0
               
            
                  Pliuri vizibil mai adânci, congestie, tumefiere, hiperhemie pericorneană moderată sau conjunctivă injectată; iris reactiv la lumină (o reacţie lentă este considerată a fi un efect) …
               
               
                  1
               
            
                  Hemoragie, distrugere marcată sau absenţa reacţiei la lumină …
               
               
                  2
               
            Maximum posibil: 2
      Conjunctive
      
                  Roşeaţă (se aplică conjunctivelor palpebrală şi oculară, exclusiv corneei şi irisului) Normal …
               
               
                  0
               
            
                  Hiperhemie evidentă a anumitor vase sanguine (ochi injectaţi) …
               
               
                  1
               
            
                  Coloraţie purpurie difuză; vasele individuale greu perceptibile …
               
               
                  2
               
            
                  Coloraţie roşie susţinută difuză …
               
               
                  3
               
            Maximum posibil: 3
      Chemosis
      Tumefiere (se referă la pleoape şi/sau la membranele nictitante)
      
                  Normal …
               
               
                  0
               
            
                  Tumefiere superioară stării normale …
               
               
                  1
               
            
                  Tumefiere evidentă, cu eversiunea parţială a pleoapelor …
               
               
                  2
               
            
                  Tumefiere cu pleoapele aproape pe jumătate închise …
               
               
                  3
               
            
                  Tumefiere cu pleoape mai mult decât jumătate închise …
               
               
                  4
               
            Maximum posibil: 4
      
         APENDICE
         O strategie de testare secvenţială pentru iritaţia şi coroziunea oculară
         CONSIDERENTE GENERALE
         În interesul acurateţei ştiinţifice şi al bunăstării animale, este important să se evite utilizarea inutilă a animalelor de experienţă şi să se reducă la minimum testările care pot produce reacţii grave la animale. Este necesar să se evalueze toate informaţiile privind o substanţă care sunt relevante pentru potenţialul său caracter coroziv/iritant la nivel ocular înainte de luarea în considerare a testării in vivo. Este posibil să existe deja date suficiente pentru clasificarea unei substanţe de testat din punctul de vedere al potenţialului său coroziv/iritant la nivel ocular, fără a mai fi necesar să se efectueze teste pe animale de laborator. Prin urmare, prin utilizarea unei analize a valorii probante a datelor şi a unei strategii de testare secvenţiale, se reduce la minimum necesitatea de a efectua teste in vivo, în special dacă substanţa are potenţialul de a produce reacţii grave.
         Se recomandă utilizarea unei analize a valorii probante a datelor pentru a evalua informaţiile existente privind potenţialul iritant şi coroziv al substanţelor la nivel ocular şi a stabili dacă este necesară efectuarea unor studii suplimentare, altele decât studii oculare in vivo, pentru caracterizarea acestui potenţial. Dacă sunt necesare studii suplimentare, se recomandă aplicarea strategiei de testare secvenţiale pentru obţinerea datelor experimentale relevante. Pentru substanţele care nu au fost testate anterior, se recomandă aplicarea strategiei de testare secvenţiale pentru obţinerea datelor necesare pentru evaluarea potenţialului său coroziv/iritant la nivel ocular. Strategia de testare descrisă în prezentul apendice a fost dezvoltată în cadrul unui atelier de lucru OCDE (1). Ulterior, ea a fost susţinută şi extinsă în cadrul Sistemului armonizat integrat de clasificare a riscurilor substanţelor chimice pentru sănătatea oamenilor şi mediu (Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances), adoptat la a 28-a reuniune comună a Comitetului pentru substanţe chimice şi a Grupului de lucru pentru substanţe chimice, în noiembrie 1998 (2).
         Deşi această strategie de testare nu face parte integrantă din metoda de testare B.5, ea reprezintă abordarea recomandată pentru determinarea caracteristicilor iritante/corozive la nivel ocular. Această abordare reprezintă atât cea mai bună practică, cât şi un reper etic pentru testarea in vivo pentru iritaţie/coroziune oculară. Metoda de testare oferă indicaţii pentru efectuarea testului in vivo şi rezumă factorii care trebuie evaluaţi înainte de un astfel de test. Strategia de testare secvenţială oferă o abordare bazată pe analiza valorii probante a datelor pentru evaluarea datelor existente privind proprietăţile iritante/corozive la nivel ocular ale substanţelor şi o abordare graduală pentru generarea datelor relevante pentru substanţele pentru care sunt necesare studii suplimentare sau care nu au făcut încă obiectul unor studii. Strategia include, într-o primă etapă, efectuarea unor teste in vitro sau ex vivo validate şi acceptate, iar apoi aplicarea metodei de testare B.4 pentru coroziune/iritaţie dermică în condiţii specifice (3) (4).
         DESCRIEREA STRATEGIEI DE TESTARE SECVENŢIALE
         Înainte de efectuarea testelor incluse în strategia de testare secvenţială (figură), se evaluează toate informaţiile disponibile pentru a stabili dacă este necesară testarea oculară in vivo. Deşi se pot obţine informaţii semnificative din evaluarea unor parametri specifici (de exemplu, o valoare extremă a pH-ului), se iau în considerare toate informaţiile existente. Se evaluează toate datele relevante privind efectele substanţei în cauză şi a analogilor săi pentru adoptarea unei decizii prin analiza valorii probante a datelor şi se prezintă motivele care stau la baza deciziei. Se acordă o atenţie specială datelor privind efectele substanţei asupra oamenilor şi animalelor, apoi rezultatelor testelor in vitro sau ex vivo. Se evită, ori de câte ori este posibil, efectuarea unor studii in vivo pentru substanţele corozive. Factorii luaţi în considerare în strategia de testare includ:
         
            Evaluarea datelor privind efectele asupra oamenilor şi animalelor (Etapa I). Se iau în primul rând în considerare datele existente privind efectele asupra oamenilor, de exemplu studii clinice şi ocupaţionale sau studii de caz, şi/sau date obţinute în cadrul unor studii oculare asupra animalelor, deoarece acestea furnizează informaţii direct legate de efectele asupra ochilor. Apoi, se evaluează datele disponibile din studii de coroziune/iritaţie dermică asupra oamenilor şi/sau animalelor. Nu se instilează în ochii animalelor substanţele având un caracter coroziv sau un potenţial iritant sever cunoscut la nivel ocular sau substanţele care prezintă efecte corozive sau iritante la nivel dermic; acestea din urmă sunt considerate a fi corozive şi/sau iritante şi la nivel ocular. Nu este necesar să se efectueze studii in vivo nici asupra substanţelor pentru care există date suficiente, obţinute din studii oculare anterioare, că nu sunt corozive sau iritante.
         
            Analiza relaţiilor structură-activitate (RSA) (Etapa 2). Se iau în considerare rezultatele testelor asupra substanţelor înrudite din punct de vedere structural, dacă sunt disponibile. Dacă sunt disponibile suficiente date privind efectele asupra oamenilor şi/sau animalelor ale unor substanţe înrudite structural sau ale unor amestecuri de astfel de substanţe care indică un potenţial coroziv/iritant la nivel ocular, se poate presupune că substanţa în curs de evaluare va produce aceleaşi reacţii. În astfel de cazuri, este posibil să nu fie necesare teste asupra substanţei în cauză. Datele negative obţinute de studiile asupra substanţelor înrudite structural sau asupra amestecurilor de astfel de substanţe nu constituie dovezi suficiente pentru caracterul necoroziv/neiritant al substanţei supuse strategiei de testare secvenţiale. Se utilizează abordări RSA validate şi acceptate pentru a identifica potenţialul coroziv şi iritant atât la nivel dermic, cât şi ocular.
         
            Proprietăţile fizico-chimice şi reactivitatea chimică (Etapa 3). Substanţele care prezintă valori extreme ale pH-ului, ≤ 2,0 sau ≥ 11,5 pot produce efecte locale puternice. Dacă valorile extreme ale pH-ului constituie baza pentru identificarea unei substanţe ca fiind corozivă sau iritantă la nivel ocular, atunci se poate lua în considerare şi rezerva sa acidă/alcalină (sau capacitatea de tamponare) (5) (6). În cazul în care capacitatea de tamponare sugerează că este posibil ca substanţa să nu fie corozivă la nivel ocular, se efectuează teste suplimentare pentru confirmare, de preferat prin utilizarea unui test in vitro sau ex vivo validat şi acceptat (a se vedea etapele 5 şi 6 din această secţiune).
         
            Analiza altor informaţii existente (Etapa 4). În această etapă se evaluează toate informaţiile disponibile privind toxicitatea sistemică prin absorbţie cutanată. Se ia, de asemenea, în considerare toxicitatea dermică acută a substanţei. Dacă substanţa de testat s-a dovedit foarte toxică prin absorbţie cutanată, este posibil să nu fie necesare teste oculare. Deşi nu există obligatoriu o relaţie între toxicitate dermică acută şi iritaţia/coroziunea oculară, se poate presupune că un agent foarte toxic prin absorbţie cutanată va prezenta o toxicitate ridicată la instilarea în ochi. Astfel de date pot fi analizate, de asemenea, între etapele 2 şi 3.
         
            Rezultatele testelor in vitro sau ex vivo (Etapele 5 şi 6). Substanţele care au prezentat proprietăţi corozive sau puternic iritante într-un test in vitro sau ex vivo (7) (8) validat şi acceptat pentru evaluarea specifică a coroziunii/iritaţiei la nivel dermic sau ocular, nu trebuie să fie testate pe animale. Se poate presupune că substanţele în cauză vor produce efecte similare grave in vivo. Dacă nu sunt disponibile teste in vitro/ex vivo validate şi acceptate, se trece peste etapele 5 şi 6 şi se continuă direct cu etapa 7.
         
            Evaluarea caracterului iritant sau coroziv la nivel dermic al substanţei in vivo (Etapa 7). În cazul în care nu există informaţii suficiente pentru analiza valorii probante a datelor privind potenţialul iritant/coroziv la nivel ocular al unei substanţe pe baza studiilor enumerate anterior, se evaluează mai întâi potenţialul iritant/coroziv la nivel dermic, utilizând metoda de testare B.4 (4) şi apendicele său (9). Dacă se observă că substanţa produce coroziune sau iritaţie puternică la nivel dermic, ea este considerată a fi, de asemenea, corozivă sau iritantă la nivel ocular, cu excepţia cazului în care informaţiile disponibile conduc la o concluzie diferită. Astfel, nu este necesar să se efectueze un test ocular in vivo. Dacă substanţa nu este corozivă sau puternic iritantă la nivel dermic, se efectuează un test ocular in vivo.
         
         
            Testul in vivo pe iepuri (Etapele 8 şi 9). Testul ocular in vivo începe cu un test iniţial efectuat pe un singur animal. Dacă rezultatele acestui test indică că substanţa este puternic iritantă sau corozivă la nivel ocular, nu se efectuează teste suplimentare. Dacă testul nu relevă efecte corozive sau puternic iritante, se efectuează un test de confirmare pe alte două animale.
         REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
         
                     1.
                  
                  
                     OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                  
               
                     2.
                  
                  
                     OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                  
               
                     3.
                  
                  
                     Worth, A. P. and Fentem J. H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.
                  
               
                     4.
                  
                  
                     Metoda de testare B.4. Toxicitate acută: iritaţie/coroziune dermică.
                  
               
                     5.
                  
                  
                     Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26.
                  
               
                     6.
                  
                  
                     Neun, D. J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-231.
                  
               
                     7.
                  
                  
                     Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Edsail, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.
                  
               
                     8.
                  
                  
                     Metoda de testare B.40 Coroziunea cutanată.
                  
               
                     9.
                  
                  
                     Apendicele la metoda de testare B.4: O strategie de testare secvenţială pentru iritaţie şi coroziune dermică.
                  
               Figură
         Strategie de testare şi evaluare a iritaţiei/coroziunii oculare
         
            
         
            
      
      B.6.   SENSIBILIZARE CUTANATĂ
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      
         Observaţii
      
      Sensibilitatea şi capacitatea testelor de a detecta substanţele capabile să provoace o sensibilizare cutanată la om reprezintă criterii importante în sistemul de clasificare a toxicităţii din motive de sănătate publică.
      Nu există o metodă de testare unică care să permită identificarea adecvată a tuturor substanţelor cu un potenţial de sensibilizare cutanată la om şi care să fie aplicabilă tuturor substanţelor.
      Diverşi factori, cum ar fi proprietăţile fizice ale unei substanţe, inclusiv capacitatea sa de a penetra pielea, trebuie luaţi în considerare atunci când se alege metoda de testare.
      Au fost dezvoltate două tipuri de teste la care se folosesc cobai: pe de o parte, testele cu adjuvant la care starea alergică este potenţializată prin dizolvarea sau suspendarea substanţei testate în adjuvantul complet Freund (ADF) şi fără adjuvant, pe de altă parte.
      Testele cu folosirea adjuvantului au o capacitate mai bună de evidenţiere a potenţialul de sensibilizare cutanată a substanţei testate şi o mai mare precizie decât testele care nu utilizează adjuvantul complet Freund.
      Testul de maximizare la cobai (GPMT: Guinea Pig Maximisation Test) este un test cu adjuvant foarte răspândit. Cu toate că există mai multe metode pentru detectarea potenţialului de sensibilizare cutanată, testul GPMT este testul cu adjuvant folosit cu predilecţie.
      Testele fără adjuvant (testul Buehler este de preferat) sunt considerate a fi mai puţin sensibile în ceea ce priveşte numeroase clase de produse chimice.
      În unele cazuri există motive întemeiate în vederea alegerii testului Buehler, care constă într-o aplicare topică, pe când testul de maximizare necesită o injecţie intradermică. Utilizarea testului Buehler trebuie justificată din punct de vedere ştiinţific.
      Testul de maximizare la cobai GMPT şi testul Buehler sunt descrise în cadrul acestei metode. Se pot folosi şi alte metode, cu condiţia ca ele să fi fost validate în mod corespunzător, iar utilizarea lor să fie argumentată din punct de vedere ştiinţific.
      Dacă se obţine un rezultat pozitiv în cadrul unui test de depistare recunoscut, substanţa poate fi considerată ca potenţial sensibilizantă şi se poate să nu mai fie necesară efectuarea unui test suplimentar pe cobai. Cu toate acestea, dacă s-a obţinut un test negativ într-un asemenea test, trebuie efectuat un test pe cobai, utilizându-se procedura descrisă la prezenta metodă de testare.
      A se vedea şi introducerea generală, partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      Sensibilizarea cutanată (dermatita alergică de contact) reprezintă o reacţie imunologică cutanată la o substanţă. La om, reacţia se poate caracteriza prin apariţia pruritului, a unui eritem, al unui edem, a unor vezicule sau papule sau prin asocierea acestor manifestări. La alte specii, reacţia poate fi diferită şi se poate manifesta doar sub forma unor eriteme sau edeme.
      
         Expunere de inducţie: expunere experimentală a unui subiect la o substanţă cu scopul de a provoca o hipersensibilitate.
      
         Perioadă de inducţie: o perioadă de cel puţin o săptămână după expunerea de inducţie, în cursul căreia poate apărea o stare de hipersensibilitate.
      
         Expunere de declanşare: expunere experimentală, după o perioadă de inducţie, a unui subiect expus în prealabil substanţei respective, cu scopul de a verifica dacă subiectul va avea o reacţie hipersenzitivă.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Sensibilitatea şi fiabilitatea tehnicii de testare utilizate trebuie să fie verificate din şase în şase luni, cu ajutorul unor substanţe care au proprietăţi cunoscute de sensibilizare cutanată de la slab la moderat.
      La testele efectuate în mod corect, substanţele cu proprietăţi sensibilizante slabe sau moderate provoacă în mod normal o reacţie la cel puţin 30 % dintre animale, la metodele cu adjuvant şi la 15 % dintre ele, la metodele fără adjuvant.
      Se vor utiliza, de preferinţă, următoarele substanţe.
      
                  Număr CAS
               
               
                  Număr EINECS
               
               
                  Denumire EINECS
               
               
                  Denumire uzuală
               
            
                  101-86-0
               
               
                  202-983-3
               
               
                  α-hexilcinamaldehidă
               
               
                  α-hexilcinamaldehidă
               
            
                  149-30-4
               
               
                  205-736-8
               
               
                  benzotiazol-2-tiol (mercaptobenzotiazol)
               
               
                  kaptax
               
            
                  94-09-7
               
               
                  202-303-5
               
               
                  benzocaină
               
               
                  nordcaină
               
            În unele cazuri justificate în mod suficient, se pot folosi şi alte substanţe martor, care să răspundă criteriilor de mai sus.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Iniţial animalele de experienţă sunt expuse substanţei testate printr-o injecţie intradermică şi/sau prin aplicare epidermică (expunere de inducţie). După o perioadă de odihnă de la 10 la 14 zile (perioada de inducţie) în cursul căreia se poate produce o reacţie imunitară, animalele sunt supuse unei doze de declanşare. Suprafaţa şi intensitatea reacţiei cutanate a animalelor se compară cu cele ale animalelor martor cărora li s-a administrat placebo cu ocazia inducerii şi care au fost supuse expunerii de declanşare.
      1.5.   DESCRIEREA METODELOR DE TESTARE
      Dacă se dovedeşte necesară eliminarea substanţei testate, acest lucru se va face utilizându-se apă sau un solvent adecvat, astfel încât să nu se modifice reacţia existentă sau integritatea epidermei.
      1.5.1.   Testul de maximizare la cobai (GMPT)
      
      1.5.1.1.   Pregătirea testului
      
      Exemplare tinere de cobai albinoşi, în stare bună de sănătate, se aclimatizează în condiţiile de laborator, cel puţin cu cinci zile înaintea începerii testului. Înainte de începerea testului, animalele sunt distribuite aleator în grupuri care urmează a fi tratate şi loturi martor. Blana va fi tunsă, rasă sau epilată chimic, în funcţie de metoda utilizată. Pielea animalelor nu trebuie să fie jupuită. Animalele sunt cântărite, atât înaintea începerii testului, precum şi după încheierea acestuia.
      1.5.1.2.   Condiţii de testare
      
      1.5.1.2.1.   Animalele de experienţă
      
      Linii pure de cobai albinos folosite în mod curent în laboratoare.
      1.5.1.2.2.   Număr şi sex
      
      Se vor folosi animale de acelaşi sex, indiferent care este acesta. Dacă se vor folosi femele, acestea trebuie să fie nulipare şi nu trebuie să fie însărcinate.
      Se vor folosi minimum 10 animale în grupul tratat şi cel puţin 5 în lotul martor. Dacă grupul tratat constă din mai puţin de 20 de animale, iar lotul martor din mai puţin de 10 şi dacă în urma testului nu s-a putut conclude că substanţa testată este o substanţă sensibilizantă, se recomandă utilizarea şi a altor animale pentru a se ajunge la un număr total de cel puţin 20 de animale de experienţă şi 10 martor.
      1.5.1.2.3.   Doze
      
      Concentraţia de substanţă administrată la expunerea de inducţie trebuie să fie bine tolerată de organismul animalelor şi trebuie să corespundă concentraţiei maxime care provoacă o iritaţie cutanată uşoară şi moderată. Concentraţia folosită pentru expunerea de declanşare trebuie să corespundă concentraţiei maxime care nu provoacă nicio iritaţie. Dacă este necesar, concentraţiile adecvate pot fi determinate pe baza unui test-pilot pe două sau pe trei animale. În acest scop, se vor utiliza animale tratate cu adjuvantul complet Freund.
      1.5.1.3.   Procedură
      
      1.5.1.3.1.   Inducerea
      
      Ziua 0 – grupul tratat
      Trei serii de injecţii intradermice de un volum de câte 0,1 ml fiecare se vor administra în regiunea scapulară de unde a fost îndepărtată blana, în prealabil, de o parte şi de cealaltă a liniei mediane.
      Injecţia 1: amestec 1:1 (v/v) adjuvant complet Freund/apă sau ser fiziologic
      Injecţia 2: substanţa testată într-un vehicul adecvat la concentraţia aleasă
      Injecţia 3: substanţa de testat la concentraţia dorită, amestec 1:1 (v/v) cu adjuvantul complet Freund sau cu ser fiziologic
      La injecţia 3, substanţele solubile în apă sunt dizolvate în faza apoasă înainte de a fi amestecate cu adjuvantul complet Freund sau cu serul fiziologic. Substanţele liposolubile sau insolubile sunt mai întâi suspendate în adjuvantul complet Freund şi mai apoi în faza apoasă. Concentraţia finală a substanţei testate trebuie să fie egală cu cea utilizată la injecţia 2.
      Injecţiile 1 şi 2 sunt administrate aproape una de cealaltă şi cât mai aproape de cap, iar injecţia 3 va fi administrată spre partea caudală a zonei de testare.
      Ziua 0 – lotul martor
      Trei serii de câte două injecţii intradermice cu un volum de câte 0,1 ml fiecare se vor administra în aceeaşi regiune ca la animalele tratate.
      Injecţia 1: amestec 1:1 (v/v) adjuvant complet Freund/apă sau ser fiziologic
      Injecţia 2: vehiculul nediluat
      Injecţia 3: formulă de 50 % a vehiculului într-un amestec 1:1 (v/v) adjuvantul complet Freund/apă sau cu ser fiziologic
      Ziua 5-7 – grupul tratat, lotul martor
      Aproximativ cu 24 de ore înainte de aplicarea topică de inducţie şi în cazul în care substanţa nu a provocat iritaţii cutanate, zona de testare rasă şi/sau tunsă va fi tratată cu 0,5 ml de sulfat de lauril de sodiu în concentraţie de 10 % în vaselină, astfel încât să se provoace o iritaţie locală.
      Ziua 6-8 – grupul tratat
      De pe zona de testare se îndepărtează din nou blana. O bucată de hârtie de filtru (2 × 4 cm) îmbibată cu substanţa testată şi cu vehiculul adecvat se aplică pe zona de testare şi se menţine în contact cu pielea cu ajutorul unui pansament oclusiv, timp de 48 de ore. Alegerea vehiculului trebuie justificată. Substanţele solide sunt pulverizate şi incorporate într-un vehicul adecvat; eventual, substanţele lichide pot fi aplicate direct.
      Ziua 6-8 – lotul martor
      De pe zona de testare se îndepărtează din nou blana. Se aplică doar vehiculul pe zona de testare, după indicaţiile de mai sus şi se menţine în contact cu pielea cu ajutorul unui pansament oclusiv, timp de 48 de ore.
      1.5.1.3.2.   Declanşare
      
      Ziua 20-22 – grupul tratat şi lotul martor
      Se îndepărtează blana de pe şoldurile animalelor tratate şi de pe şoldurile animalelor martor. Un plasture sau o capsulă îmbibate cu substanţa testată se aplică pe unul dintre şoldurile animalelor şi dacă este necesar, un plasture sau o capsulă îmbibate doar cu vehicul se aplică pe celălalt şold. Plasturele se vor menţine în contact cu pielea timp de 24 de ore cu ajutorul unui pansament oclusiv.
      Examinare şi cotare: grupul tratat şi lotul martor
      
                  —
               
               
                  la aproximativ 21 de ore după înlăturarea plasturelui, zona de testare se curăţă şi se rade şi/sau se tunde şi se epilează dacă este necesar;
               
            
                  —
               
               
                  aproximativ 3 ore mai târziu (aproximativ la 48 de ore după începutul aplicării dozei de declanşare), reacţia cutanată este examinată şi cotată pe baza scalei indicate în apendice;
               
            
                  —
               
               
                  aproximativ 24 de ore după această examinare, urmează o nouă perioadă de examinare (la 72 ore) şi o nouă cotare.
               
            Se recomandă o citire oarbă a animalelor din ambele grupuri.
      Dacă este necesară precizarea rezultatelor obţinute cu ocazia primei expuneri de declanşare, o a doua expunere în vederea declanşării unei reacţii (și anume o redeclanşare), eventual cu un alt lot martor, poate fi avută în vedere, aproximativ cu o săptămână după prima expunere. Noua expunere în vederea declanşării unei reacţii se poate efectua, de asemenea, pe lotul martor iniţial.
      Toate observaţiile şi toate reacţiile cutanate, inclusiv cele sistemice, ca urmare a unei expuneri de inducţie sau de declanşare trebuie examinate şi cotate pe baza scalei Magnusson/Kligman (a se vedea apendicele). Alte tehnici, cum ar fi examinarea histopatologică sau măsurarea pliului cutanat, pot fi folosite la descrierea unor reacţii îndoielnice.
      1.5.2.   Testul Buehler
      
      1.5.2.1.   Pregătirea testului
      
      Exemplare tinere de cobai albinoşi, în stare bună de sănătate, sunt lăsaţi să se aclimatizeze la condiţiile de laborator cel puţin cu cinci zile înaintea începerii testului. Înainte de începerea testului, animalele sunt distribuite aleator în grupuri care urmează a fi tratate şi grupuri martor. Blana va fi tunsă, rasă sau epilată chimic, în funcţie de metoda utilizată. Pielea animalelor nu trebuie să fie jupuită. Animalele sunt cântărite atât înainte de începerea testului, precum şi după încheierea acestuia.
      1.5.2.2.   Condiţii de testare
      
      1.5.2.2.1.   Animalele de experienţă
      
      Linii pure de cobai albinos folosite în mod curent în laboratoare.
      1.5.2.2.2.   Număr şi sex
      
      Se vor folosi animale de acelaşi sex, indiferent care este acesta. Dacă se vor folosi femele, acestea trebuie să fie nulipare şi nu trebuie să fie însărcinate.
      Se vor folosi minimum 20 animale în grupul tratat şi cel puţin 10 în lotul martor.
      1.5.2.2.3.   Doze
      
      Concentraţia de substanţă administrată la expunerea de inducţie trebuie să corespundă concentraţiei maxime care provoacă o iritaţie cutanată moderată, dar nu exagerată. Concentraţia folosită pentru expunerea de declanşare trebuie să corespundă concentraţiei maxime care nu provoacă nicio iritaţie. Dacă este necesar, concentraţiile potrivite pot fi determinate pe baza unui test-pilot pe două sau pe trei animale.
      La substanţele hidrosolubile se va folosi apa ca vehicul sau o soluţie diluată neiritantă de surfactant. La celelalte substanţe, se va utiliza de preferinţă un amestec de etanol de 80 % în apă, la inducere şi de acetonă la declanşare.
      1.5.2.3.   Procedură
      
      1.5.2.3.1.   Inducerea
      
      Ziua 0 – grupul tratat
      Se îndepărtează blana de pe unul din şoldurile animalelor. Compresa care va servi la efectuarea testului se îmbibă cu substanţa testată, incorporată într-un vehicul adecvat (alegerea vehiculului trebuie justificată; dacă este necesar, substanţele lichide pot fi aplicate în mod direct).
      Compresa se aplică pe zona de testare şi se menţine în contact cu pielea timp de 6 ore cu ajutorul unui plasture oclusiv sau al unei capsule şi al unui pansament potrivit.
      Sistemul trebuie să fie oclusiv. Un tampon de vată circular sau pătrat de 4-6 cm2 este potrivit. Se va utiliza de preferinţă un dispozitiv de asigurare a etanşeităţii plasturelui pentru a asigura caracterul oclusiv. Dacă au fost folosite pansamente, o expunere suplimentară poate fi necesară.
      Ziua 0 – lotul martor
      Se îndepărtează blana de pe unul din şoldurile animalelor. Se aplică doar vehiculul pe zona de testare, după indicaţiile de mai sus, la animalele tratate. Compresa care serveşte la realizarea testului se menţine în contact cu pielea cu ajutorul unui plasture oclusiv sau al unei capsule şi al unui pansament potrivit. Dacă se poate demonstra faptul că simularea tratamentului pe lotul martor nu este necesară, această etapă poate fi omisă, utilizându-se un lot martor căruia nu i se administrează nimic.
      Zilele 6-8 şi 13-15 – grupul tratat şi lotul martor
      Acelaşi tratament ca cel descris pentru ziua 0 se aplică pe aceeaşi zonă de testare (de unde se îndepărtează blana, dacă acest lucru este necesar), pe acelaşi şold, în ziua 6-8 şi din nou în ziua 13-15.
      1.5.2.3.2.   Declanşare
      
      Ziua 27-29 – grupul tratat şi lotul martor
      Se îndepărtează blana de pe şoldurile netratate ale animalelor tratate şi ale animalelor martor. Un plasture oclusiv sau o capsulă care conţine cantitatea adecvată din substanţa testată, la concentraţia maximă care nu provoacă nicio iritaţie, se aplică pe partea posterioară a şoldului netratat al animalelor din grupul tratat şi din cel martor.
      Dacă este necesar, se aplică şi un plasture oclusiv sau o capsulă care nu conţine decât vehiculul, pe partea anterioară a şoldului netratat al animalelor din ambele grupuri. Plasturele sau capsulele se vor menţine în contact cu pielea timp de 6 de ore, cu ajutorul unui pansament potrivit.
      1.5.2.3.3.   Examinare şi cotare
      
      
                  —
               
               
                  la aproximativ 21 de ore după înlăturarea plasturelui, de pe zona de testare se îndepărtează blana;
               
            
                  —
               
               
                  cu aproximativ 3 ore mai târziu (aproximativ 30 de ore după începutul aplicării dozei de declanşare), reacţia cutanată este examinată şi cotată pe baza scalei indicate în apendice;
               
            
                  —
               
               
                  la aproximativ 24 de ore după această examinare (aproximativ 54 de ore după aplicarea dozei de declanşare), reacţia cutanată este din nou examinată şi cotată.
               
            Se recomandă o citire oarbă a reacţiilor, atât în grupul tratat, precum şi în lotul martor.
      Dacă este necesară precizarea rezultatelor obţinute cu ocazia primei expuneri de declanşare, o a doua expunere în vederea declanşării unei reacţii, eventual cu un alt lot martor, poate fi avută în vedere, aproximativ cu o săptămână după prima expunere. Noua expunere în vederea declanşării unei reacţii se poate efectua, de asemenea, pe primul lot martor.
      Toate reacţiile cutanate şi toate reacţiile neobişnuite, inclusiv reacţiile sistemice, ca urmare a unei expuneri de inducţie sau de declanşare (de redeclanşare) trebuie înregistrate şi cotate pe baza scalei Magnusson/Kligman (a se vedea apendicele). Alte tehnici, cum ar fi examinarea histopatologică sau măsurarea pliului cutanat, pot fi folosite la descrierea unor reacţii îndoielnice.
      2.   DATE (GMPT şi testul Buehler)
      Rezultatele sunt sintetizate şi incluse într-un tabel care va indica reacţiile cutanate la fiecare animal, pentru fiecare examinare.
      3.   RAPORT (GMPT şi testul Buehler)
      Dacă înainte de testul efectuat pe cobai s-a efectuat şi un test de depistare [de exemplu, testul de umflare a urechilor la şoareci (MEST)], trebuie furnizate descrierile sau referinţele acestora, precum şi detaliile modului de operare şi rezultatele obţinute cu substanţa testată şi cu substanţa de referinţă.
      Raportul de testare (GMPT sau testul Buehler)
      Raportul de testare va conţine, în măsura posibilităţilor, următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Animale de experienţă:
                  
                              —
                           
                           
                              specia/linia pură;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul animalelor, vârsta, sexul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              originea, condiţii de adăpostire, regim alimentar etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea corporală a fiecărui animal la începutul testului.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              tehnici de preparare a zonei de testare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii asupra materialelor folosite pentru aplicarea substanţei şi tehnica aplicării plasturelui;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultatele testului-pilot şi concluziile privind concentraţiile de inducţie şi de declanşare care trebuie utilizate în cadrul testului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea, aplicarea şi eliminarea substanţei testate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              concentraţii ale vehiculului şi ale substanţei testate utilizate pentru expunerile de inducţie şi de declanşare, cantitatea totală a substanţei aplicate în vederea inducerii şi a declanşării.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              sintetizarea rezultatelor ultimului control de sensibilitate şi de fiabilitate (a se vedea 1.3), inclusiv informaţii cu privire la substanţă, la concentraţia acesteia şi la vehiculul utilizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toate examinările efectuate pe fiecare animal, inclusiv cotările;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea naturii şi a gravităţii efectelor observate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toate examinările histopatologice.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Evaluarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      Această metodă corespunde Orientării 406 a OCDE.
      
         Apendice
         TABEL
         Scala de cotare Magnusson/Kligman pentru evaluarea reacţiilor declanşate pe locul aplicării plasturilor
         0 = niciun semn vizibil
         1 = eritem discret sau neomogen
         2 = eritem moderat şi confluent
         3 = eritem cu inflamaţie masivă
      
      B.7.   TOXICITATE (ORALĂ) PRIN ADMINISTRARE ÎN MOD REPETAT (28 DE ZILE)
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea şi introducerea generală, partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      A se vedea şi introducerea generală, partea B.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa testată va fi administrată zilnic, pe cale orală, cu doze crescânde, la mai multe grupuri de animale de experienţă, cu un singur nivel de doză pe grup de animale timp de 28 de zile. Pe perioada administrării, animalele sunt examinate cu atenţie zilnic, în vederea detectării eventualelor manifestări toxice. Animalele care au murit sau care au fost sacrificate în cursul testului, precum şi cele care supravieţuiesc până la sfârşitul testului, se supun unei autopsii.
      Această metodă insistă mai ales pe efectele neurologice; examinările clinice trebuie efectuate în mod riguros, pentru a se obţine un maximum de informaţii posibil. Metoda are în vedere identificarea produselor chimice cu un potenţial neurotoxic, care ar trebui supus unor studii mai aprofundate. Pe lângă aceasta, metoda prezentată mai poate furniza indicaţii asupra efectelor imune şi asupra toxicităţii substanţei cu privire la organele reproducătoare.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Pregătirea testului
      Exemplare tinere de animale adulte, cu stare bună de sănătate, sunt distribuite aleator în grupuri care urmează a fi tratate şi în loturi martor. Cuştile sunt distribuite astfel încât să se minimizeze eventualele efecte datorate amplasării cuştilor. Animalele sunt identificate individual şi ţinute în cuşti timp de cel puţin cinci zile înainte de începerea testului, pentru a se putea adapta la condiţiile de laborator.
      Substanţa se va administra prin gavaj sau prin hrană/apa de băut. Metoda administrării orale depinde de scopul studiului şi de proprietăţile fizice şi chimice ale substanţei.
      Dacă este necesar, substanţa de test se va dizolva sau suspenda într-un vehicul adecvat. Dacă este posibil se va folosi de preferinţă o soluţie/suspensie apoasă, dacă nu este posibil, se va recurge la o soluţie/emulsie în ulei (de exemplu, ulei de porumb) sau eventual la alte vehicule. Dacă vehiculul utilizat nu este mediul apos, caracteristicile sale toxice trebuie să fie cunoscute sau să fie determinate înainte de începerea testului. Trebuie determinată şi stabilitatea substanţei testate în vehiculul respectiv.
      1.4.2.   Condiţii de testare
      1.4.2.1.   Animalele de experienţă
      Testele se efectuează de preferinţă pe şobolani, dar pot fi utilizate şi alte specii de rozătoare. Pentru testare sunt selecţionate animale adulte, tinere şi sănătoase din linii pure folosite în mod curent în laboratoare. Femelele trebuie să fie nulipare şi nu trebuie să fie însărcinate. Administrarea substanţei trebuie să înceapă cât se poate de repede după înţărcare şi în toate cazurile înainte ca animalele să fi împlinit vârsta de 9 săptămâni.
      La începutul studiului, diferenţele de greutate corporală între animale trebuie să fie minime şi să nu depăşească ± 20 % a greutăţii medii la fiecare sex.
      Atunci când se efectuează un studiu prin administrare orală repetată înaintea unui studiu mai lung, se recomandă folosirea animalelor de aceeaşi linie pură şi origine la ambele studii.
      1.4.2.2.   Număr şi sex
      Se vor folosi minimum 10 animale (5 femele şi 5 masculi) pentru fiecare doză. Dacă protocolul testului prevede sacrificii în cursul studiului, numărul de animale trebuit mărit cu numărul de animale care sunt sacrificate.
      Pe lângă aceasta, un grup satelit de 10 animale (cinci din fiecare sex) poate fi tratat cu doza cea mai ridicată timp de 28 de zile şi ţinut sub observaţie timp de 14 zile după încheierea tratamentului pentru a se studia reversibilitatea, persistenţa sau apariţia întârziată a efectelor toxice. Se va utiliza şi un grup satelit martor, de 10 animale.
      1.4.2.3.   Doze
      În general, se vor utiliza cel puţin trei grupuri tratate şi un lot martor. Cu excepţia substanţei de testat, animalele din lotul martor au parte de acelaşi tratament ca animalele din grupurile tratate. Dacă s-a folosit un vehicul la administrarea substanţei de testat, volumul maxim din acest vehicul va fi administrat grupului martor.
      Dacă în urma evaluării unor date se poate estima că administrarea unei doze de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi nu va avea niciun efect, se poate efectua un test-limită. Dacă nu există informaţii relevante, se poate proceda la un studiu de explorare în vederea determinării dozelor de administrat.
      Dozele trebuie selecţionate ţinându-se cont de toate informaţiile disponibile şi de aspectele toxico-cinetice ale substanţei testate sau ale substanţelor cu o structură analoagă. Doza cea mai ridicată va produce efecte toxice care să nu ducă însă la moarte sau la suferinţe intense. Se va alege mai apoi o serie de doze descrescânde, pentru a se evidenţia relaţia dintre reacţie şi doza administrată şi pentru a obiectiviza absenţa efectelor dăunătoare la doza cea mai redusă (doza fără efecte dăunătoare). Diferenţa optimă dintre două doze este un factor 2 sau 4; este preferabil să se prevadă şi o a patra doză, pentru ca distanţa dintre două doze să nu fie prea mare (mai mult decât un factor 10, de exemplu).
      La substanţele care sunt administrate prin hrană sau prin apă, este important să se verifice dacă cantităţile de substanţă nu interferează cu nutriţia normală şi cu echilibrul hidric. Dacă substanţa este administrată prin intermediul hranei, se poate utiliza o concentraţie alimentară constantă (ppm) sau o doză constantă în raport cu greutatea animalului; soluţia aleasă trebuie precizată. Dacă substanţa va fi administrată prin gavaj, doza trebuie administrată zilnic la ore fixe şi dacă este nevoie, se va şi ajusta doza, astfel încât aceasta să rămână constantă în raport cu greutatea animalului.
      Atunci când se efectuează un studiu prin administrare orală repetată înainte de un studiu pe lungă durată, regimul alimentar trebuie să fie indicat în ambele cazuri.
      1.4.2.4.   Testul-limită
      Atunci când un test efectuat pe baza metodelor descrise în prezentul studiu, la o doză de cel puţin 1 000 mg/kilocorp/zi sau în cazul administrării prin hrană sau prin apa de băut, la o concentraţie echivalentă (în funcţie de greutatea corporală), nu produce efecte toxice detectabile şi dacă informaţiile despre substanţe cu structuri asemănătoare nu indică toxicitatea acesteia, efectuarea testului cu trei doze se poate dovedi a fi inutilă. În acest caz, un test-limită este justificat, cu excepţia cazului în care condiţiile de expunere umană impun utilizarea unei doze mai ridicate.
      1.4.2.5.   Perioada de observaţie
      Perioada de observaţie durează 28 de zile. Animalele din grupurile satelit, prevăzute pentru examinări suplimentare sunt ţinute sub observaţie, fără tratament timp de alte 14 zile cel puţin, astfel încât să se poată detecta eventualele apariţii întârziate ale efectelor toxice, persistenţa, precum şi reversibilitatea acestora.
      1.4.3.   Procedură
      Substanţa testată va fi administrată animalelor de experienţă, timp de 7 zile din 7, pe o perioadă de 28 de zile. Dacă substanţa nu este administrată decât câte cinci zile pe săptămână, această alegere trebuie justificată. În cazul administrării prin gavaj, doza trebuie administrată într-o singură doză cu ajutorul unei sonde esofagiene sau al unei canule de intubare adecvate. Volumul maxim de lichid care se poate administrat într-o singură doză depinde de mărimea animalului. Acest volum nu trebuie să depăşească 1 ml/100 g greutate corporală, dar poate atinge 2 ml/100 g greutate corporală în cazul soluţiilor apoase. Cu excepţia substanţelor iritante sau cu efecte corozive, la care mărirea concentraţiei ar duce la rezultate exacerbate, variabilitatea volumelor experimentale trebuie minimizată printr-o ajustare a concentraţiilor, astfel încât volumul să rămână constant, indiferent de doză.
      1.4.3.1.   Observaţii generale
      Observaţia clinică generală trebuie efectuată cel puţin o dată zilnic, de preferinţă în acelaşi moment (sau aceleaşi momente) ale zilei, în funcţie de perioada de după încheierea administrării în care efectele sunt mai pronunţate. Starea de sănătate a animalelor trebuie consemnată. Animalele sunt examinate cel puţin de două ori pe zi, toate animalele sunt examinate pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea. Animalele muribunde sau cele care prezintă semne de suferinţă intensă sau dureri sunt eliminate imediat, sacrificate cu suferinţă minimă şi autopsiate.
      Toate animalele sunt supuse unei observaţii clinice detaliate înaintea primei expuneri (astfel încât mai târziu să se poată facă comparaţii între diferitele stări de sănătate la acelaşi individ) şi cel puţin o dată pe săptămână în perioada următoare. Aceste examinări trebuie efectuate în afara cuştii animalelor într-o incintă standard şi trebuie efectuate de preferinţă de fiecare dată în acelaşi moment al zilei. Observaţiile sunt înregistrate în mod riguros, de preferinţă cu ajutorul unor sisteme de notare formulate în mod explicit de către laboratorul în care se efectuează testul. Variabilitatea condiţiilor de laborator trebuie redusă la minim, iar examinările trebuie să se facă de preferinţă de către persoane care nu sunt informate asupra tratamentului. Examinările vor avea în vedere între altele modificări ale pielii, ale ochilor, ale mucoaselor, ale secreţiilor şi ale excreţiilor, precum şi activitatea autonomă (de exemplu, lăcrimare, piloerecţie, respiraţie neobişnuită). Se vor nota, de asemenea, toate modificările de comportament, modificări ale posturii sau ale reacţiilor la manipulare, precum şi apariţia unor mişcări clonice sau tonice, a unor comportamente stereotipe (de exemplu, curăţare excesivă, mişcări circulare repetate), precum şi orice alt comportament bizar (automutilare, mers înapoi).
      În cursul celei de-a patra săptămâni de expunere, se evaluează reacţia la diferiţi stimuli senzoriali (auditivi, vizuali şi proprioceptivi), precum şi prehensiunea şi activitatea locomotorie. Metodele de adoptat în acest scop sunt detaliate în publicaţiile de specialitate (a se vedea introducerea generală, partea B).
      Observaţiile funcţionale din a patra săptămână de expunere pot fi omise dacă studiul este efectuat înaintea unui studiu subcronic (de 90 de zile). În acest caz observaţiile funcţionale trebuie să facă parte din studiul complementar. În schimb, dacă există informaţii pe baza unor observaţii funcţionale efectuate în cadrul unor studii anterioare prin administrarea în mod repetat, acest lucru poate facilita alegerea dozelor la studiul subcronic suplimentar.
      În mod excepţional, observaţiile funcţionale pot fi, de asemenea, omise la grupurile de animale care prezintă manifestări toxice care ar putea compromite rezultatul observaţiilor funcţionale.
      1.4.3.2.   Greutatea corporală şi consumul de hrană şi apă
      Toate animalele sunt cântărite cel puţin o dată pe săptămână. Consumul de alimente şi de apă trebuie măsurat cel puţin o dată pe săptămână. Dacă substanţa este administrată prin apa de băut, consumul de apă trebuie măsurat cel puţin o dată pe săptămână.
      1.4.3.3.   Hematologie
      Următoarele examinări histopatologice trebuie efectuate la sfârşitul perioadei de testare: hematocritul, concentraţia de hemoglobină, numărul de hematii şi de leucocite şi formula leucocitară, numărul de trombocite şi timpul/potenţialul de coagulare.
      Probele de sânge trebuie prelevate într-un punct determinat, chiar înainte sau în timpul sacrificării animalului şi trebuie conservate în condiţii adecvate.
      1.4.3.4.   Biochimie clinică
      Trebuie efectuate măsurări biochimice clinice în vederea stabilirii principalelor efecte toxice asupra ţesuturilor, în special asupra ficatului şi asupra rinichilor, pe baza unor probe de sânge prelevate de la toate animalele chiar înainte sau în timpul sacrificării lor (cu excepţia animalelor muribunde sau sacrificate în cursul testului). Se recomandă flămânzirea animalelor peste noapte (2). Aceste determinări efectuate în ser se fac cu privire la sodiu, la potasiu, la glucoză, la colesterolul total, la uree, la creatinină, la proteine totale şi la albumină sau cel puţin cu privire la două enzime revelatoare ale efectelor hepatocelulare (cum ar fi alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, fosfataza alcalină, gamma glutamil transpeptidaza şi sorbitol dezhidrogenaza). În unele cazuri, atât determinarea celorlalte enzime (de origine hepatică sau alta), precum şi acizii biliari pot furniza informaţii utile.
      Eventual, se pot efectua analize de urină în cursul ultimei săptămâni a studiului, cu colectarea într-un interval de timp a unui volum de urină, analiză care să includă examinarea aspectului, volumului, a osmolarităţii sau densităţii, a pH-ului, a proteinelor, a glucozei, a sângelui sau a celulelor sangvine.
      De asemenea, trebuie avute în vedere studii asupra markerilor serici la leziunile tisulare. Celelalte măsurări necesare eventual, în cazurile în care proprietăţile substanţei testate sunt susceptibile de a modifica profilul metabolic, se vor axa asupra calciului, fosfatului, asupra trigliceridelor măsurate după post, asupra hormonilor specifici, asupra metahemoglobinei şi asupra colinesterazei. Aceste analize trebuie efectuate în mod sistematic în cazul substanţelor care aparţin anumitor clase şi, după caz, la celelalte substanţe.
      În ansamblu, demersul care va fi adoptat va fi suplu şi adaptabil în funcţie de specia utilizată şi de efectele observate şi/sau previzibile ale substanţei testate.
      Dacă informaţiile de bază colectate anterior nu sunt suficiente, parametri hematologici şi biochimici ar trebui să fie determinaţi înaintea începerii testului.
      1.4.3.5.   Autopsia
      Toate animalele care participă la studiu trebuie supuse unei autopsii detaliate, care să includă o examinare aprofundată a suprafeţei externe a corpului, a tuturor orificiilor, a cavităţii craniene, toracice şi abdominale şi a conţinutului acestora. De pe ficatul, rinichii, glandele suprarenale, testiculele, epidimidele, timusul, splina, creierul şi inima tuturor animalelor se vor înlătura toate ţesuturile superficiale, după care aceste organe sunt cântărite cât se poate de repede în vederea evitării deshidratării lor.
      După aceasta, ţesuturile sunt conservate în mediul de fixare cel mai adecvat în funcţie de tipul ţesutului şi de examinările histopatologice prevăzute: toate ţesuturile care prezintă leziuni macroscopice, encefalul (regiuni reprezentative: creierul mare, cerebelul şi protuberanţa anulară), măduva spinării, stomacul, intestinul gros, intestinul subţire (inclusiv plăcile Pleyer), ficatul, rinichii, glandele suprarenale, splina, inima, timusul, tiroida, traheea şi plămânii (conservaţi prin fixare şi imersie), gonadele, organele genitale anexe (de exemplu, uterul şi prostata), vezica, ganglionii limfatici (de preferinţă un ganglion de pe traseul căii de administrare a substanţei şi un altul mai îndepărtat, pentru a se evidenţia efectele sistemice), nervii periferici (sciaţi sau tibiali), de preferinţă foarte aproape de muşchi, şi o secţiune de măduvă osoasă (sau aspirat de măduvă osoasă proaspăt fixat pe lamă). În funcţie de observaţiile clinice şi de celelalte rezultate, se poate dovedi necesară examinarea celorlalte ţesuturi. Toate organele considerate a fi organe-ţintă potenţiale pe baza proprietăţilor substanţei trebuie conservate şi ele.
      1.4.3.6.   Examinarea histopatologică
      Se efectuează o examinare histopatologică completă a organelor şi ţesuturilor conservate, la toate animalele, atât cele din grupul testat, cărora li s-a administrat doza cea mai ridicată, precum şi la cele din lotul martor. Acest examen va fi efectuat la toate grupurile expuse la doze inferioare, dacă sunt observate modificări provocate de substanţa testată la animalele din grupul tratat la doza cea mai înaltă.
      Toate leziunile macroscopice trebuie să fie examinate.
      Atunci când se foloseşte un grup satelit, se efectuează o examinare histopatologică şi la animalele din acest grup, pe organele şi ţesuturile pe care au fost observate efecte toxice la grupul tratat.
      2.   DATE
      Datele sunt indicate pentru fiecare animal individual. Pe lângă aceasta, datele sunt incluse într-un tabel care va indica la fiecare grup experimental numărul de animale utilizate, numărul de animale care au murit în cursul testului sau care au fost sacrificate din motive umanitare, momentul morţii fiecărui animal, numărul de animale care prezintă manifestări toxice, descrierea acestor manifestări, momentul apariţiei, durata şi gravitatea lor, numărul de animale care prezintă leziuni, tipurile de leziuni şi procentajul de animale care prezintă un anumit tip de leziuni.
      Dacă este posibil, datele cifrice sunt evaluate cu ajutorul unei metode statistice adecvate şi recunoscute. Metoda statistică va fi aleasă cu ocazia elaborării studiului.
      3.   RAPORT
      Raportul de testare
      Raportul de testare va conţine, în măsura posibilităţilor, următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Animale de experienţă:
                  
                              —
                           
                           
                              specia/linia pură utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul animalelor, vârsta, sexul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              originea, condiţii de adăpostire, regim alimentar etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea corporală a fiecărui animal la începutul testului, la intervale de o săptămână în timpul testului şi la sfârşitul acestuia
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului, altul decât apa;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii nivelului dozei administrate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii cu privire la formula/prepararea substanţei, la concentraţia obţinută, la stabilitatea şi la omogenitatea preparatului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii cu privire la administrarea substanţei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              după caz, conversia concentraţiei substanţei administrate prin raţia alimentară/apa de băut (ppm) în doză efectivă (mg/kg greutate corporală/zi);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii asupra calităţii hranei şi a apei.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              greutate corporală/modificări ale acesteia;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              consumul de alimente şi, după caz, consumul de apă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              reacţie toxică pe sexe şi pe doză, inclusiv manifestări toxice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              natura, gravitatea şi durata efectelor clinice observate (eventual, reversibilitatea acestora);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              evaluarea activităţii senzoriale, a prehensiunii şi a activităţii locomotorii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              examene hematologice şi valori de referinţă aplicabile;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              examene de biochimie clinică şi valori de referinţă aplicabile;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutate corporală în momentul sacrificării animalului şi greutatea organelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultatele autopsiei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descriere detaliată a tuturor rezultatelor histopatologice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              informaţii referitoare la absorbţie, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              prelucrare statistică a rezultatelor, după caz.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      Această metodă corespunde Orientării 407 a OCDE.
      B.8.   TOXICITATE LA DOZĂ REPETATĂ (28 DE ZILE) (ADMINISTRARE PRIN INHALARE)
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Este util să se colecteze informaţii preliminare asupra substanţei cu privire la mărimea şi distribuţia particulelor, presiunea vaporilor, punctul de topire, punctul de fierbere, punctul de aprindere şi proprietăţile explozive (după caz).
      A se vedea introducerea generală partea B (litera A).
      1.2.   DEFINIŢIE
      A se vedea introducerea generală partea B (litera B).
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Se expun zilnic mai multe grupe de animale, pe parcursul unei perioade determinate, la o substanţă de testat în concentraţii crescătoare, fiind administrată o doză pe lot timp de 28 de zile. În cazul în care se foloseşte un vehicul în vederea obţinerii unei concentraţii adecvate a substanţei de testat în atmosferă, se prevede un lot martor pentru vehicul. Pe parcursul perioadei de administrare, se observă zilnic animalele pentru a pune în evidenţă simptomele de toxicitate. Animalele care mor în timpul testului, precum şi cele care supravieţuiesc la sfârşitul testului sunt supuse autopsiei.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Pregătiri
      Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează la întâmplare în numărul de loturi necesare. La nevoie, se poate adăuga la substanţa de testat un vehicul adecvat în vederea obţinerii unei concentraţii corespunzătoare în atmosferă. Dacă, pentru a uşura administrarea, se foloseşte un vehicul sau alt tip de aditiv, acesta trebuie să nu producă efecte toxice. Pot fi folosite date istorice, dacă este necesar.
      1.6.2.   Condiţii de testare
      1.6.2.1.   Animale de experienţă
      Cu excepţia contraindicaţiilor, se preferă şobolanul. Se folosesc animale tinere, sănătoase, aparţinând unei linii de laborator obişnuite.
      La începutul testului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie respectivă.
      1.6.2.2.   Număr şi sex
      Se folosesc cel puţin 10 animale (5 femele şi 5 masculi) pentru fiecare lot tratat. Femelele trebuie să fie nulipare şi negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul testului, acest număr se adaugă la total. În plus, se poate trata un lot satelit de 10 animale (5 din fiecare sex) la doza maximă timp de 28 de zile, care poate fi supus observaţiei vizând reversibilitatea, persistenţa sau apariţia tardivă a efectelor toxice pe parcursul celor 14 zile care urmează tratamentului. Se foloseşte, de asemenea, un lot satelit cu 10 animale martor (5 de fiecare sex).
      1.6.2.3.   Concentraţii de expunere
      Cel puţin trei concentraţii sunt necesare, precum şi un lot martor sau, dacă este cazul, un lot martor pentru vehicul (corespunzând concentraţiei vehiculului la nivelul de expunere cel mai ridicat). Cu excepţia inhalării substanţei de testat, se tratează animalele din lotul martor la fel cu cele din grupul de experiment. Concentraţia maximă produce efecte toxice, dar nu provoacă sau provoacă rar moartea. Concentraţia minimă nu trebuie să provoace niciun efect toxic. Dacă există informaţii privind expunerea umană, concentraţia cea mai mică trebuie să fie superioară acestei valori. În condiţii ideale, concentraţia medie trebuie să producă minime efecte toxice observabile. Dacă se folosesc mai multe concentraţii intermediare, acestea se administrează eşalonat, astfel încât să provoace o gradare a efectelor toxice. În loturile care corespund concentraţiilor slabe şi intermediare, precum şi în lotul martor incidenţa mortalităţii trebuie să fie mică, pentru a permite o evaluare semnificativă a rezultatelor.
      1.6.2.4.   Durata expunerii
      Durata expunerii zilnice este de 6 ore, dar în cazul unor cerinţe specifice pot fi necesare alte durate de expunere.
      1.6.2.5.   Aparatură
      Animalele se expun la substanţa de testat cu ajutorul unui dispozitiv de inhalare conceput pentru a asigura un flux continuu sau cel puţin 12 aerisiri pe oră, garantând un conţinut de oxigen adecvat şi o distribuţie uniformă a produsului de testat în aer. Dacă se foloseşte o incintă, aceasta trebuie concepută astfel încât să reducă la minim aglomerarea animalelor de experiment şi să le asigure o expunere maximă, prin inhalare, a substanţei de testat. De regulă, pentru a se asigura stabilitatea atmosferei din incintă, volumul total al animalelor nu trebuie să depăşească 5 % din volumul incintei. Se mai pot folosi expuneri oro-nazale, numai ale capului sau ale întregului corp, în incinte individuale; primele două tipuri de expunere limitează absorbţia pe alte căi a substanţei de testat.
      1.6.2.6.   Perioada de observaţie
      Se observă toate animalele zilnic în vederea notării simptomelor de toxicitate, pe tot parcursul perioadei de tratare şi de recuperare. Se consemnează momentul morţii şi momentul când apar şi dispar simptomele de toxicitate.
      1.6.3.   Mod de operare
      Se expun zilnic animalele la substanţa de testat timp de 5-7 zile pe săptămână, pe o perioadă de 28 de zile. Animale aparţinând loturilor satelit prevăzute pentru observaţii ulterioare se ţin sub observaţie încă 14 zile, fără tratament, pentru a se studia vindecarea sau persistenţa efectelor toxice. Temperatura la care are loc testul se menţine la 22 ± 3 oC.
      În condiţii optime, umiditatea relativă se menţine între 30 şi 70 % dar, în anumite cazuri, acest lucru poate fi imposibil (de exemplu, în cazul testelor asupra aerosolilor). Menţinerea unei presiuni uşor negative în incintă (≤ 5 mm coloană de apă) împiedică împrăştierea substanţei în zona învecinată. Pe parcursul perioadei de expunere, nu se administrează animalelor nici hrană, nici apă.
      Se recomandă folosirea unui sistem de inhalare dinamic, prevăzut cu un dispozitiv adecvat de control analitic al concentraţiei. Pentru determinarea concentraţiilor de expunere adecvate, se recomandă să se procedeze la un test preliminar. Se reglează debitul pentru a asigura concentraţii omogene în toată incinta. Sistemul trebuie să permită obţinerea unor condiţii de expunere stabile cât de rapid posibil.
      Se măsoară şi se controlează:
      
                  (a)
               
               
                  debitul de aer (în permanenţă);
               
            
                  (b)
               
               
                  concentraţia reală a substanţei măsurate în zona de respiraţie; pe parcursul perioadei de expunere zilnică, concentraţia nu trebuie să varieze cu mai mult de ± 15 % faţă de valoarea medie; cu toate acestea, în cazul prafului şi al aerosolilor, acest grad de control poate să nu fie atins, iar în acest caz se poate accepta o diferenţă mai mare; pe durata experimentului concentraţiile administrate zilnic trebuie menţinute la valori cât de constante posibil; pentru aerosoli, se efectuează săptămânal cel puţin o analiză granulometrică pe lot tratat;
               
            
                  (c)
               
               
                  temperatura şi umiditatea, continuu, dacă este posibil.
               
            În timpul expunerii şi după aceasta au loc observaţii care sunt înregistrate sistematic; pentru fiecare animal se consemnează date individuale. Se observă zilnic toate animalele şi se înregistrează simptomele de toxicitate, precum şi momentul apariţiei, intensitatea şi durata acestora. Observaţiile includ modificări ale părului şi ale blănii, ale ochilor şi ale mucoaselor, ale aparatului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom şi ale sistemului nervos central, precum şi ale activităţii somato-motrice şi ale comportamentului. Se determină săptămânal greutatea animalelor. Se recomandă, de asemenea, măsurarea săptămânală a consumului alimentar. Animalele sunt observate cu regularitate, pentru a evita pe cât posibil pierderea lor din motive exterioare experimentului, precum: canibalism, autoliză a ţesuturilor sau greşeală de plasare a exemplarelor. La sfârşitul perioadei de expunere, se supun autopsiei toate animalele supravieţuitoare din loturile nesatelit. Animalele muribunde şi animalele cu suferinţe sau dureri grave se scot, se eutanasiază şi se supun autopsiei.
      Examinările următoare se efectuează la sfârşitul perioadei de testare asupra tuturor animalelor, inclusiv asupra martorilor:
      
                  (i)
               
               
                  examen hematologic, inclusiv: hematocritul, concentraţia hemoglobinei, numărul de eritrocite, formula leucocitară şi măsurători ale potenţialului de coagulare;
               
            
                  (ii)
               
               
                  determinările biochimice clinice ale sângelui cuprinzând cel puţin un parametru al funcţiei hepatice şi unul al celei renale: alanin aminotransferaza (cunoscută anterior ca transaminaza serică glutamo-piruvică), aspartat aminotransferaza (cunoscută anterior ca transaminaza serică glutamo-oxaloacetică), azotul ureic, albumina, creatinina sanguină, bilirubina totală şi proteinele totale.
               
            Alte determinări care se pot dovedi necesare pentru o evaluare toxicologică adecvată cuprind: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, glucoza à jeun, analiza lipidelor şi a hormonilor, echilibrul acidobazic, methemoglobina şi activitatea colinesterazică.
      Se pot efectua, dacă este necesar, şi alte determinări biochimice clinice pentru a extinde investigaţiile asupra efectelor toxice observate.
      1.6.3.1.   Autopsia
      Toate animalele supuse testului fac obiectul unei autopsii generale. Se cântăresc în stare umedă cel puţin ficatul, rinichii, glandele suprarenale, plămânii şi testiculele cât mai rapid posibil după disecţie pentru a se evita deshidratarea. Se conservă într-un mediu adecvat organele şi ţesuturile (tractul respirator, ficatul, rinichii, splina, testiculele, glandele suprarenale, inima, precum şi orice organ care prezintă leziuni macroscopice sau modificări volumetrice) în vederea unor examene histopatologice ulterioare. Plămânii se prelevează intacţi, se cântăresc şi se tratează cu un fixator adecvat care asigură conservarea structurii pulmonare.
      1.6.3.2.   Examen histopatologic
      Pentru lotul expus la concentraţii maxime şi pentru lotul martor se întreprinde un examen histopatologic al organelor şi al ţesuturilor conservate. Organele şi ţesuturile care prezintă leziuni induse de substanţa de testat la doza maximă se examinează în toate loturile care au fost expuse unor doze mai mici. Animalele oricărui lot satelit fac obiectul unui examen histopatologic axat în special pe organele şi ţesuturile pentru care s-au constatat leziuni în celelalte loturi tratate.
      2.   DATE
      Datele se sistematizează sub formă de tabele, prezentând pentru fiecare lot experimental numărul animalelor la începutul experimentului şi numărul animalelor prezentând fiecare tip de leziune.
      Toate rezultatele observate se evaluează printr-o metodă statistică adecvată. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specia, linia, sursa, condiţiile ambiante, regimul alimentar etc.;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare:
                  Descrierea aparatului de expunere inclusiv concepţia, tipul, dimensiunile, sursa de aer, sistemul generator de particule şi de aerosoli, metoda de condiţionare a aerului, tratarea aerului expirat şi, după caz, modul de adăpostire a animalelor în incinta de testare, atunci când se utilizează. Se descrie echipamentul folosit pentru măsurarea temperaturii şi, dacă este necesar, stabilitatea concentraţiilor de aerosoli şi granulometria particulelor.
                  Datele privind expunerea:
                  Acestea se prezintă sub forma unui tabel care indică valorile medii, precum şi măsura variabilităţii (de exemplu, deviaţia standard) şi trebuie, dacă este posibil, să includă:
                  
                              (a)
                           
                           
                              debitul de aer în dispozitivul de inhalare;
                           
                        
                              (b)
                           
                           
                              temperatura şi umiditatea aerului;
                           
                        
                              (c)
                           
                           
                              concentraţiile nominale (cantitatea totală de substanţă de testat introdusă în dispozitivul de inhalare raportată la volumul de aer);
                           
                        
                              (d)
                           
                           
                              după caz, natura vehiculului;
                           
                        
                              (e)
                           
                           
                              concentraţiile reale din zona de respiraţie;
                           
                        
                              (f)
                           
                           
                              diametrul aerodinamic median masic al particulelor (DAMM) şi deviaţia geometrică standard (DSG);
                           
                        
            
                  —
               
               
                  răspunsul toxic pe sexe şi doză;
               
            
                  —
               
               
                  momentul morţii în timpul experimentului sau dacă animalele au supravieţuit experimentului;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea efectelor toxice sau de altă natură, nivelul care nu are niciun efect;
               
            
                  —
               
               
                  momentul observării oricărui simptom anormal şi evoluţia acestuia;
               
            
                  —
               
               
                  cantităţile de hrană şi greutatea corporală;
               
            
                  —
               
               
                  examenele hematologice întreprinse şi rezultatele complete;
               
            
                  —
               
               
                  testele biochimice clinice practicate şi rezultatele complete;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele autopsiei;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea detaliată a tuturor observaţiilor histopatologice;
               
            
                  —
               
               
                  tratarea statistică a rezultatelor, când este cazul;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B (litera D)
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B (litera E).
      B.9.   TOXICITATE LA DOZĂ REPETATĂ (28 DE ZILE) (ADMINISTRARE CUTANATĂ)
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B (litera A).
      1.2.   DEFINIŢII
      A se vedea introducerea generală partea B (litera B).
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Se aplică zilnic substanţa de testat pe cale cutanată, în doze crescătoare, mai multor loturi de testare, fiind administrată o doză pe lot timp de 28 de zile. Pe parcursul perioadei de aplicare, se observă zilnic animalele pentru a pune în evidenţă simptomele de toxicitate Animalele care mor în timpul testului, precum şi cele care supravieţuiesc la sfârşitul testului, sunt supuse autopsiei.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Pregătiri
      Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de testare, animalele tinere sănătoase se repartizează la întâmplare în loturi tratate şi loturi martor. Cu puţin timp înainte de testare, se tunde blana din regiunea dorsală a animalelor. Se poate recurge la radere, dar în acest caz operaţia se efectuează cu cca. 24 de ore înainte de test. Repetarea este, de obicei, necesară la intervale aproximativ săptămânale. În timpul tunderii sau al raderii, trebuie evitată orice lezare a pielii. Suprafaţa care se degajează în vederea aplicării substanţei de testat nu trebuie să fie mai mică de 10 % din suprafaţa corporală. Pentru a decide zona care trebuie degajată şi dimensiunile suprafeţei care trebuie tratată, se ia în calcul greutatea animalului. Dacă testul vizează substanţele solide care, dacă este cazul, se pot pulveriza, substanţa de testat trebuie umezită cu ajutorul apei sau, la nevoie, al unui vehicul adecvat, astfel încât să se poată obţine un bun contact cu pielea. Substanţele lichide se folosesc, în general, în stare nediluată. Se efectuează o aplicare zilnică timp de 5 până la 7 zile pe săptămână.
      1.6.2.   Condiţii de testare
      1.6.2.1.   Animale de experienţă
      Animalele de laborator utilizate sunt şobolanul, iepurele sau cobaiul adult. Pot fi folosite şi alte specii, dar folosirea lor trebuie justificată.
      La începutul experimentului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie.
      1.6.2.2.   Număr şi sex
      Se folosesc, pentru fiecare doză, cel puţin 10 animale (5 femele şi 5 masculi) a căror piele este sănătoasă. Femelele trebuie să fie nulipare şi negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul experimentului, acest număr se adaugă la total. În plus, se poate trata un lot satelit de 10 de animale (5 din fiecare sex) la doza maximă timp de 28 de zile, care poate fi supus observaţiei vizând reversibilitatea, persistenţa sau apariţia tardivă a efectelor toxice pe parcursul celor 14 zile care urmează tratamentului. Se foloseşte, de asemenea, un lot satelit cu 10 animale martor (5 de fiecare sex).
      1.6.2.3.   Doze
      Se folosesc cel puţin trei doze, precum şi un lot martor sau, dacă este cazul, un lot martor pentru vehicul. Perioada de expunere este de cel puţin şase ore pe zi. Se aplică substanţa de testat în fiecare zi în acelaşi moment, iar dozele trebuie să facă obiectul unei adaptări (săptămânale sau bisăptămânale) pentru a se menţine constant nivelul dozei în raport cu greutatea corporală a animalului. Cu excepţia substanţei de testat, se tratează animalele din lotul martor la fel cu cele din grupul de experiment. În cazul în care se foloseşte un vehicul pentru a facilita administrarea dozei, acesta este administrat lotului martor în aceleaşi condiţii ca şi pentru loturile tratate, iar doza administrată corespunde cu cea primită de grupul tratat cu doza maximă. Doza maximă produce efecte toxice, dar nu provoacă sau provoacă rar moartea. Doza minimă nu provoacă niciun efect toxic. Atunci când există informaţii privind expunerea umană, doza cea mai mică trebuie să fie superioară acestei valori. În condiţii ideale, doza intermediară trebuie să producă minime efecte toxice observabile. În cazul în care se folosesc mai multe doze intermediare, acestea se administrează eşalonat, astfel încât să provoace o gradare a efectelor toxice. În loturile care corespund dozelor slabe şi intermediare, precum şi în loturile martor incidenţa mortalităţii trebuie să fie mică, pentru a permite o evaluare semnificativă a rezultatelor.
      În cazul în care aplicarea substanţei de testat provoacă o iritaţie cutanată gravă, se reduc concentraţiile; aceasta poate avea ca efect diminuarea, chiar dispariţia, celorlalte efecte toxice la doza maximă. De asemenea, dacă leziunile cutanate sunt foarte grave, poate fi necesară oprirea experimentului şi iniţierea unui studiu nou, la concentraţii mai scăzute.
      1.6.2.4.   Testul-limită
      În cazul în care în urma unei experienţe preliminare realizate cu o doză de 1 000 mg/kg sau o doză mai ridicată în funcţie de expunerea umană posibilă, când se cunoaşte această valoare, nu apare niciun efect toxic, continuarea experienţei poate fi inutilă.
      1.6.2.5.   Perioada de observaţie
      Se observă toate animalele zilnic în vederea notării simptomelor de toxicitate. Se consemnează momentul morţii şi momentul când apar şi dispar simptomele de toxicitate.
      1.6.3.   Mod de operare
      Se pun animalele în cuşti individuale. În condiţii ideale, substanţa de testat se administrează animalelor 7 zile pe săptămână timp de 28 de zile. Animalele din orice grup satelit destinate observaţiei ulterioare sunt menţinute în viaţă timp de încă 14 zile, fără tratament, în vederea constatării vindecării sau a persistenţei efectelor toxice. Durata de expunere este de minimum şase ore pe zi.
      Substanţa de testat se aplică pe o suprafaţă aproximativ egală cu 10 % din suprafaţa totală a corpului. În cazul substanţelor puternic toxice, suprafaţa tratată poate fi mai mică, dar stratul trebuie să fie cât mai subţire şi mai uniform posibil.
      Pe parcursul expunerii, substanţa de testat se menţine în contact cu pielea cu ajutorul unui pansament de tifon şi al unui plasture neiritant. Suprafaţa tratată se acoperă astfel încât să menţină pansamentul de tifon şi substanţa de testat şi să se evite ingerarea acesteia de către animale. Se poate folosi contenţionarea pentru a împiedica animalele să ingereze substanţa de testat, dar nu se recomandă imobilizarea completă. Ca alternativă poate fi folosit un „dispozitiv de protecţie cu guler înalt”.
      La sfârşitul perioadei de expunere, se elimină, dacă este posibil, orice reziduu de substanţă, cu apă sau cu ajutorul unui alt procedeu de curăţare a pielii.
      Se observă zilnic toate animalele şi se înregistrează simptomele de toxicitate, precum şi momentul apariţiei, intensitatea şi durata acestora. Observaţiile includ, între altele, modificări ale părului şi ale blănii, ale ochilor şi ale mucoaselor, ale sistemului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom şi ale sistemului nervos central, precum şi ale activităţii somato-motrice şi ale comportamentului. Se determină săptămânal greutatea animalelor. Se recomandă, de asemenea, determinarea săptămânală a consumului alimentar. Animalele sunt observate cu regularitate pentru a evita pe cât posibil pierderea lor din motive exterioare experimentului, precum: canibalism, autoliză a ţesuturilor sau greşeală de plasare a exemplarelor. La sfârşitul experimentului, se supun autopsiei toate animalele supravieţuitoare care aparţin loturilor tratate nesatelite. Animalele muribunde şi animalele cu suferinţe sau dureri grave se scot, se eutanasiază şi se supun autopsiei.
      Examinările următoare se efectuează la sfârşitul perioadei de testare asupra tuturor animalelor, inclusiv asupra martorilor:
      
                  1.
               
               
                  examen hematologic, inclusiv: hematocritul, concentraţia hemoglobinei, numărul de eritrocite, formula leucocitară şi măsurători ale potenţialului de coagulare;
               
            
                  2.
               
               
                  determinările biochimice clinice ale sângelui cuprinzând cel puţin un parametru al funcţiei hepatice şi unul al celei renale: alanin aminotransferaza (cunoscută anterior ca transaminaza serică glutamo-piruvică), aspartat aminotransferaza (cunoscută anterior ca transaminaza serică glutamo-oxaloacetică), azotul ureic, albumina, creatinina sanguină, bilirubina totală şi proteinele totale.
               
            Alte determinări care se pot dovedi necesare pentru o evaluare toxicologică adecvată cuprind: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, glucoza à jeun, analiza lipidelor şi a hormonilor, echilibrul acidobazic, methemoglobina şi activitatea colinesterazică.
      Se pot efectua, dacă este necesar, şi alte determinări biochimice clinice pentru a extinde investigaţiile asupra efectelor observate.
      1.6.4.   Autopsie
      Toate animalele supuse testului fac obiectul unei autopsii generale. Se cântăresc în stare umedă ficatul, rinichii, glandele suprarenale şi testiculele cât mai rapid posibil după disecţie pentru a evita deshidratarea. Se conservă într-un mediu adecvat ficatul, rinichii, splina, testiculele, glandele suprarenale şi inima, precum şi orice organ care prezintă leziuni macroscopice sau modificări volumetrice în vederea unor posibile examene histopatologice ulterioare.
      1.6.5.   Examen histopatologic
      Pentru lotul expus la doza maximă şi pentru lotul martor se întreprinde un examen histopatologic al organelor şi al ţesuturilor conservate. Organele şi ţesuturile care prezintă leziuni induse pe suprafaţa de testare la nivelul dozei maxime se examinează în toate loturile care au fost expuse unor doze mai mici. Animalele din lotul satelit fac obiectul unui examen histopatologic axat în special pe organele şi ţesuturile pentru care s-au constatat leziuni în celelalte loturi tratate.
      2.   DATE
      Datele se sistematizează într-un tabel care indică, pentru fiecare lot de experienţă, numărul de animale la începutul testului şi numărul de animale care prezintă fiecare tip de leziune.
      Toate rezultatele observate se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  date privind animalele (specia, linia, originea, condiţiile ambiante, regimul alimentar etc.);
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare (inclusiv tipul de pansament: ocluziv sau neocluziv);
               
            
                  —
               
               
                  dozele (inclusiv vehiculul, dacă este cazul) şi concentraţiile;
               
            
                  —
               
               
                  dacă este posibil, nivelul care nu are niciun efect;
               
            
                  —
               
               
                  răspunsul toxic pe sexe şi doză;
               
            
                  —
               
               
                  momentul morţii în timpul experimentului sau indicarea faptului că animalele au supravieţuit experimentului;
               
            
                  —
               
               
                  efectele toxice sau de altă natură;
               
            
                  —
               
               
                  momentul observării oricărui simptom anormal şi evoluţia acestuia;
               
            
                  —
               
               
                  cantităţile de hrană şi greutatea corporală;
               
            
                  —
               
               
                  examenele hematologice întreprinse şi rezultatele;
               
            
                  —
               
               
                  testele biochimice clinice practicate şi rezultatele;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele autopsiei;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea detaliată a tuturor observaţiilor histopatologice;
               
            
                  —
               
               
                  tratarea statistică a rezultatelor, când este cazul;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B (litera D).
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B (litera E).
      B.10.   MUTAGENITATEA –TESTUL IN VITRO DE ABERAŢIE CROMOZOMIALĂ PE CELULE DE MAMIFERE
      1.   METODĂ
      Prezenta metodă este reprodusă după Orientarea 473 a OCDE, Testul in vitro de aberaţie cromozomială pe celule de mamifere (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Scopul testului in vitro de aberaţie cromozomială este destinat depistării agenţilor care provoacă aberaţii cromozomiale ale structurii în celulele de mamifere, în cultură (1) (2) (3). Aberaţiile structurale pot fi de două tipuri, cromozomiale sau cromatidice. La majoritatea mutagenilor chimici, aberaţiile induse sunt de tip cromatidic, dar se produc şi aberaţii de tip cromozomial. O poliploidie crescută poate să indice că un produs chimic are capacitatea de a provoca aberaţii ale numărului de cromozomi. Cu toate acestea, prezenta metodă nu este destinată determinării aberaţiilor numerice şi, în general, nu se utilizează în acest scop. Mutaţiile cromozomiale şi fenomenele conexe sunt cauza multor maladii genetice umane şi există dovezi suficiente ale implicării mutaţiilor cromozomiale şi a fenomenelor conexe, care provoacă modificări ale oncogenelor şi ale genelor supresoare de tumori din celulele somatice, în inducerea cancerului la oameni şi la animalele de laborator.
      Testul in vitro de aberaţie cromozomială poate să utilizeze culturi de linii celulare stabilite, suşe celulare sau culturi celulare primare. Celulele utilizate se selectează în funcţie de potenţialul de dezvoltare în cultură, stabilitatea cariotipului, numărul de cromozomi, diversitatea cromozomilor şi frecvenţa aberaţiilor cromozomiale spontane.
      Pentru realizarea in vitro a testului este necesar să se utilizeze o sursă exogenă pentru activarea metabolică. Sistemul de activare metabolică de acest tip nu poate să reproducă integral condiţiile celulelor de mamifere in vivo. Ar trebui să se acorde atenţie evitării condiţiilor care ar putea să conducă la obţinerea unor rezultate pozitive care nu reflectă o mutagenitate intrinsecă, condiţii care s-ar putea datora modificărilor de pH, de osmolalitate sau unor valori mari ale citotoxicităţii (4) (5).
      Prezentul test se utilizează pentru depistarea substanţelor cu posibile efecte mutagene şi cancerigene pentru mamifere. Mulţi compuşi care dau rezultate pozitive la acest test sunt cancerigeni pentru mamifere; cu toate acestea, nu există o corelaţie perfectă între prezentul test şi cancerigenitate. Corelaţia depinde de clasa de produse chimice şi sunt tot mai multe dovezi că există agenţi cancerigeni care nu se depistează prin prezentul test deoarece este posibil ca aceştia să acţioneze printr-un alt mecanism decât cel care provoacă leziuni directe ale ADN.
      A se vedea şi introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Aberaţie de tip cromatidic: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea cromatidelor singure sau prin divizarea şi reuniunea între cromatide.
      
         Aberaţie de tip cromozomial: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea sau divizarea şi reuniunea ambelor cromatide în acelaşi situs.
      
         Endoreduplicare: proces în care, după o perioadă S de replicare a ADN, nucleul nu intră în mitoză, ci începe o altă fază S. Rezultă cromozomi cu 4, 8, 16, … cromatide.
      
         Lacună: leziune acromatică mai mică decât lăţimea unei cromatide şi cu o eroare minimă de aliniere a cromatidelor.
      
         Index mitotic: numărul celulelor în metafază împărţit la numărul total de celule observate într-o populaţie de celule; indică gradul de proliferare a populaţiei respective.
      
         Aberaţie numerică: modificare a numărului de cromozomi faţă de numărul normal caracteristic pentru celulele utilizate.
      
         Poliploidie: multiplicare a numărului (n) de cromozomi haploizi, alta decât diploidia (și anume 3n, 4n etc.).
      
         Aberaţie structurală: modificare a structurii cromozomilor, detectabilă la examinarea microscopică a celulelor în stadiul de metafază al diviziunii acestora, care se prezintă sub formă de deleţii şi fragmente, modificări intracromozomiale şi intercromozomiale.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Culturile de celule sunt expuse la substanţa de testat, atât cu, cât şi fără activare metabolică. După expunerea celulelor la substanţa de testat, acestea se tratează la intervale de timp prestabilite cu o substanţă de inhibare a metafazei (de exemplu Colcemid® sau colchicină), se recoltează, se colorează şi celulele în metafază sunt analizate la microscop pentru detectarea aberaţiilor cromozomiale.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Preparatele
      1.4.1.1.   Celulele
      Se pot utiliza diferite linii celulare, suşe de celule sau culturi de celule primare, inclusiv celule umane (de exemplu celule de hamster chinezesc, limfocite din sângele periferic uman sau al altor mamifere).
      1.4.1.2.   Mediile şi condiţiile de cultură
      Se recomandă utilizarea mediilor de cultură şi a condiţiilor de incubare (vasele de cultură, concentraţia CO2, temperatura şi umiditatea) corespunzătoare pentru dezvoltarea culturilor. Se impune controlul regulat al liniilor şi suşelor celulare, pentru verificarea stabilităţii numărului modal de cromozomi şi a absenţei contaminării cu micoplasmă şi, dacă se constată contaminarea, celulele nu se mai folosesc. Ar trebui să se cunoască perioada ciclului celular normal pentru celulele şi condiţiile de cultură utilizate.
      1.4.1.3.   Prepararea culturilor
      Liniile şi suşele celulare stabilite: celulele se prepară plecând de la culturile de rezervă, se însămânţează în mediul de cultură într-o anumită densitate, astfel încât culturile să nu ajungă la confluenţă înainte de momentul recoltării, apoi se incubează la 37 oC.
      Limfocitele: sângele complet, tratat cu un anticoagulant (de exemplu heparina) sau limfocitele separate obţinute de la subiecţi sănătoşi se adaugă la mediul de cultură ce conţine un mitogen (de exemplu fitohemaglutinină) şi se incubează la 37 oC.
      1.4.1.4.   Activarea metabolică
      Se recomandă ca expunerea celulelor la substanţa de testat să se realizeze atât în prezenţa, cât şi în absenţa sistemului de activare metabolică corespunzător. Sistemul cel mai frecvent utilizat este o fracţie postmitocondrială la care s-au adăugat cofactori (S9), preparată din ficat de rozătoare tratat cu agenţi de inducţie enzimatică, de exemplu Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) sau un amestec de fenobarbitonă şi β-naftoflavonă (10) (11) (12).
      Fracţia postmitocondrială se utilizează, de obicei, la concentraţii cuprinse între limitele 1-10 % v/v în mediul experimental final. Compoziţia unui sistem de activare metabolic poate să depindă de clasa din care face parte substanţa chimică de testat. În unele cazuri, s-ar putea să fie convenabilă utilizarea mai multor concentraţii ale fracţiei postmitocondriale.
      O serie de realizări, inclusiv crearea prin inginerie genetică a unor linii celulare care exprimă enzime activatoare specifice, poate furniza potenţialul pentru o activare endogenă. Alegerea liniilor celulare ar trebui să fie justificată din punct de vedere ştiinţific (de exemplu prin importanţa izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul substanţei de testat).
      1.4.1.5.   Substanţa de testat/prepararea
      Substanţele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluţii sau suspensii în solvenţii sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului celulelor. Substanţele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele experimentale şi se diluează înainte de utilizare în tratamentul celulelor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanţă de testat, cu excepţia cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.
      1.4.2.   Condiţiile de testare
      1.4.2.1.   Solventul/vehiculul
      Solventul/vehiculul ar trebui să fie ales, astfel încât să nu existe suspiciunea reacţiei chimice a acestuia cu substanţa de testat şi să nu afecteze negativ supravieţuirea celulelor şi activitatea S9. Utilizarea altor solvenţi/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere un solvent/vehicul în soluţie/dispersie apoasă. La testarea substanţelor instabile în apă, solventul organic utilizat nu ar trebui să conţină apă. Apa se poate elimina prin adăugarea unei site moleculare.
      1.4.2.2.   Concentraţiile de expunere
      Printre criteriile ce trebuie să fie avute în vedere la determinarea dozei maxime sunt citotoxicitatea, solubilitatea în sistemul experimental şi modificările de pH sau osmolalitate.
      Citotoxicitatea ar trebui să se determine cu şi fără activare metabolică în experimentarea principală, utilizând un indicator corespunzător al integrităţii şi dezvoltării celulare, ca gradul de confluenţă, numărul de celule viabile sau indexul mitotic. Ar putea fi utilă determinarea citotoxicităţii şi solubilităţii într-un test preliminar.
      Ar trebui să se utilizeze cel puţin trei concentraţii analizabile. Dacă o substanţă este citototoxică, concentraţiile respective ar trebui să acopere un domeniu de toxicităţi de la maximă la mică sau lipsa toxicităţii; aceasta semnifică, de obicei, concentraţii care ar trebui să fie separate printr-un factor cuprins între 2 şi √10 maximum. În momentul recoltării, concentraţia maximă ar trebui să determine o reducere importantă a gradului de confluenţă, a numărului de celule sau a indexului mitotic (pentru toate mai mare de 50 %). Indexul mitotic variază în timp după tratament şi reprezintă doar o măsură indirectă a efectelor citotoxice/citostatice. Cu toate acestea, indexul mitotic este acceptabil pentru culturile în suspensie în care alte determinări de toxicitate pot să fie dificile şi nepractice. Datele de cinetică a ciclului celular, cum ar fi timpul de generare medie (TGM), ar putea să reprezinte informaţii suplimentare. TGM este totuşi o medie generală, care nu demonstrează întotdeauna existenţa unei subpopulaţii întârziate; chiar şi creşterile uşoare ale timpului de generare medie pot să genereze o întârziere foarte substanţială a momentului în care numărul de aberaţii este optim.
      Pentru substanţele relativ necitotoxice, concentraţia experimentală maximă trebuie să fie cea mai mică dintre următoarele: 5 μl/ml, 5 mg/ml sau 0,01 M.
      Pentru substanţele relativ insolubile care nu sunt toxice la concentraţii mai mici decât concentraţia la care sunt insolubile, doza maximă utilizată ar trebui să fie o concentraţie superioară limitei de solubilitate în mediul final de cultură la terminarea perioadei de tratament. În unele cazuri (de exemplu atunci când toxicitatea se manifestă doar la o concentraţie mai mare decât concentraţia minimă de insolubilitate), se recomandă să se încerce mai multe concentraţii până la apariţia precipitării. Ar putea fi utilă evaluarea solubilităţii la începutul şi la sfârşitul tratamentului, deoarece solubilitatea poate să varieze în timpul expunerii în sistemul experimental datorită prezenţei celulelor, S9, serului etc. Insolubilitatea se poate constata cu ochiul liber. Ar trebui ca precipitarea să nu interfereze cu determinarea rezultatelor.
      1.4.2.3.   Martorii negativi şi pozitivi
      La fiecare experiment, ar trebui să se includă simultan martorii pozitivi şi negativi (solvent şi vehicul), atât cu, cât şi fără activare metabolică. În prezenţa unui sistem de activare metabolică, substanţa utilizată ca martor pozitiv ar trebui să fie aceea care necesită activare pentru a da un răspuns mutagen.
      Ca martori pozitivi ar trebui să se utilizeze un elastogen cunoscut, la niveluri de expunere care se estimează că determină o creştere reproductibilă şi detectabilă în raport cu zgomotul de fond, ceea ce demonstrează sensibilitatea sistemului de testare.
      Concentraţiile martorilor pozitivi ar trebui să fie selectate astfel încât să se obţină efecte clare, dar care să nu permită identificare imediată a lamelelor codificate. În tabelul următor se prezintă exemple de substanţe care se pot utiliza ca martori pozitivi:
      
                  Starea activării metabolice
               
               
                  Substanţa
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. EINECS
               
            
                  Absenţa activării metabolice exogene
               
               
                  metansulfonat de metil
               
               
                  66-27-3
               
               
                  200-625-0
               
            
                  metansulfonat de etil
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  etil nitrozouree
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  mitomicină C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  4-nitrochinolină-N-oxid
               
               
                  56-57-5
               
               
                  200-281-1
               
            
                  Prezenţa activării metabolice exogene
               
               
                  benzo[a] piren
               
               
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
            
                  ciclofosfamidă
                  ciclofosfamidă monohidrat
               
               
                  50-18-0
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
            Se pot utiliza şi alte substanţe corespunzătoare ca martori pozitivi. Ar trebui să se aibă în vedere utilizarea ca martori pozitivi a unor substanţe din aceeaşi clasă de produse chimice, dacă sunt disponibile.
      Pentru fiecare moment de recoltare, ar trebui să se utilizeze ca martori negativi solvenţi sau vehicule singure în mediul de tratare, care se tratează în acelaşi condiţii ca şi culturile tratate. În plus, ar trebui să se utilizeze şi martori netrataţi, cu excepţia cazului în care există date din testele anterioare care să ateste că solventul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene.
      1.4.3.   Modul de lucru
      1.4.3.1.   Tratamentul cu substanţa de testat
      Celulele în stadiu de proliferare se tratează cu substanţa de testat în prezenţa sau absenţa unui sistem de activare metabolică. Tratamentul limfocitelor ar trebui să înceapă la aproximativ 48 de ore de la stimularea mitogenică.
      
                  1.4.3.2.
               
               
                  Pentru fiecare concentraţie ar trebui să se realizeze în mod normal teste pe culturi de celule în dublu exemplar, procedură recomandată cu fermitate pentru culturile cu martor negativ/solvent. Dacă datele testelor anterioare pot să dovedească existenţa unor diferenţe minime între culturile duble (13) (14), se poate preconiza utilizarea unor culturi unice pentru fiecare concentraţie testată.
                  Substanţele în stare gazoasă sau cele volatile ar trebui să fie testate prin metode corespunzătoare, de exemplu în vase de cultură închise ermetic (15) (16).
               
            1.4.3.3.   Momentul recoltării culturilor
      În primul experiment, expunerea celulelor la substanţa de încercat ar trebui să se realizeze atât în prezenţa, cât şi în absenţa activării metabolice, timp de 3-6 ore, şi să se procedeze la prelevarea probelor după un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal de la iniţierea tratamentului (12). Dacă rezultatele testului sunt negative, atât în prezenţa, cât şi în absenţa activării, ar trebui să se repete testul fără activare, cu tratament continuu până în momentul prelevării probelor care să fie egal cu aproximativ de 1,5 ori durata ciclului celular normal. S-ar putea ca unele produse chimice să fie detectate mai uşor, prin prelungirea timpului de tratament/prelevare a probelor la mai mult de 1,5 ori durata ciclului celular. Rezultatele negative obţinute în prezenţa activării metabolice necesită o confirmare pentru fiecare caz. Pentru cazurile în care se consideră că nu este necesară confirmarea rezultatelor negative, trebuie să se prezinte o justificare.
      1.4.3.4.   Prepararea cromozomilor
      Culturile celulare se tratează cu Colcemid® sau colchicină, de obicei timp de 1-3 ore înainte de recoltare. Fiecare cultură celulară se recoltează şi se prelucrează separat pentru prepararea cromozomilor. Prepararea cromozomilor include tratamentul hipotonic al celulelor, precum şi fixarea şi colorarea acestora.
      1.4.3.5.   Analiza
      Toate lamelele, inclusiv cele cu martorii pozitivi şi negativi, ar trebui să fie codificate independent înaintea analizei microscopice. Deoarece procedurile de fixare generează adesea scindarea unei proporţii de celulele în metafază cu pierdere de cromozomi, toate celulele înregistrate ar trebui, prin urmare, să conţină un număr de centromeri egal cu numărul modal ± 2 pentru toate tipurile de celule. Pentru fiecare concentraţie şi fiecare martor ar trebui să se înregistreze cel puţin 200 de celule în metafază bine etalate, repartizate în mod egal între culturile în dublu exemplar, dacă este cazul. Atunci când se constată un număr mare de aberaţii, numărul menţionat se poate reduce.
      Deşi scopul testului este detectarea aberaţiilor cromozomial-structurale ale cromozomilor, este important să se semnaleze cazurile de poliploidie şi endoreduplicare, dacă se constată apariţia acestora.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Unitatea experimentală este celula şi, prin urmare, ar trebui să se evalueze procentul de celule care prezintă o aberaţie cromozomială sau mai multe aberaţii cromozomiale. Se întocmeşte o listă cu diferitele tipuri de aberaţii cromozomiale şi se specifică numărul şi frecvenţa acestora pentru culturile experimentale şi cele martor. Lacunele se înregistrează şi se prezintă separat, dar în general nu se includ în frecvenţa totală a aberaţiilor.
      De asemenea, se înregistrează rezultatele determinărilor concomitente de citotoxicitate realizate pentru toate culturile tratate şi pentru cele martor negativ în principalele teste de aberaţii.
      Ar trebui să se prezintă date pentru fiecare cultură. În plus, toate datele ar trebui să fie prezentate centralizat sub formă de tabel.
      Nu este necesară verificarea unui răspuns pozitiv net. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin realizarea de teste suplimentare în care este preferabil să se modifice condiţiile de testare. Necesitatea confirmării rezultatelor negative s-a discutat la punctul 1.4.3.3. În cazul experimentelor suplimentare, ar trebui să se aibă în vedere modificările parametrilor cercetaţi pentru a extinde gama condiţiilor evaluate. Parametrii studiaţi, susceptibili de modificare, includ intervalele dintre concentraţii şi condiţiile de activare metabolică.
      2.2.   EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o creştere în funcţie de concentraţie sau o creştere reproductibilă a numărului de celule cu aberaţii cromozomiale. În primul rând, ar trebui să se aibă în vedere relevanţa biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se pot utiliza metode statistice (3) (13). Semnificaţia statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv.
      O creştere a numărului de celule poliploide poate să indice faptul că substanţa de testat este capabilă să inhibe procesele mitotice şi să producă aberaţii ale numărului de cromozomi. O creştere a numărului de celule cu cromozomi endoreduplicaţi poate să indice faptul că substanţa de testat poate inhiba avansarea ciclului celular (17) (18).
      Dacă rezultatele obţinute pentru o substanţă de testat nu îndeplinesc criteriile menţionate anterior, se consideră că substanţa respectivă nu este mutagenă în sistemul respectiv.
      Deşi majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în rare cazuri datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanţei de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de repetări ale testului.
      Rezultatele pozitive ale unui test in vitro de aberaţie cromozomială indică faptul că substanţa de testat provoacă aberaţii cromozomiale ale structurii în celulele somatice de mamifere, în cultură. Rezultatele negative indică faptul că, în condiţiile de testare, substanţa de testat nu provoacă aberaţii cromozomiale în celulele somatice de mamifere, în cultură.
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Solventul/Vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea şi stabilitatea substanţei de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaşte.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Celulele:
                  
                              —
                           
                           
                              tipul şi sursa celulelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              caracteristicile cariotipului şi motivul alegerii celulelor utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              absenţa micoplasmei, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date privind durata ciclului celular;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sexul donatorilor de sânge, sângele complet sau limfocite izolate, mitogenul utilizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de reînsămânţări, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de întreţinere a culturilor celulare, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul modal de cromozomi.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              identitatea substanţei de inhibare a metafazei, concentraţiile acesteia şi timpul de expunere a celulelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii concentraţiilor şi numărului de culturi, inclusiv datele de citotoxicitate şi limitele de solubilitate, dacă sunt disponibile;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              compoziţia mediului, concentraţia de CO2, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              concentraţia substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              volumul vehiculului şi al substanţei de testat adăugate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatura de incubare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              timpul de incubare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              durata tratamentului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              densitatea celulară la însămânţare, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tipul şi compoziţia sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              martorii pozitivi şi negativi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de preparare a lamelelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile pentru numărătoarea aberaţiilor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de metafaze analizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de măsurare a toxicităţii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate, de exemplu gradul de confluenţă, datele privind ciclul celular, numărătoarea celulelor, indexul mitotic;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              semnele de precipitare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind valoarea pH-ului şi osmolalitatea mediului de tratare, dacă s-au determinat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              definirea aberaţiilor, inclusiv a lacunelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule cu aberaţii cromozomiale şi tipul aberaţiilor cromozomiale, prezentate separat pentru fiecare cultură tratată şi cultură martor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              variaţiile ploidiei, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analizele statistice, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele anterioare privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi, cu domeniile, valorile medii şi deviaţiile standard.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Evans, H. J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29.
               
            
                  2.
               
               
                  Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T. (1985). The in Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432.
               
            
                  3.
               
               
                  Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, M.A, Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1-175.
               
            
                  4.
               
               
                  Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res, 257, pp. 147-204.
               
            
                  5.
               
               
                  Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, pp. 297-305.
               
            
                  6.
               
               
                  Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, pp. 347-364.
               
            
                  7.
               
               
                  Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, pp. 173-215.
               
            
                  8.
               
               
                  Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, pp. 83-90.
               
            
                  9.
               
               
                  Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66, pp. 277-290.
               
            
                  10.
               
               
                  Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagenesis, 7, pp. 175-177.
               
            
                  11.
               
               
                  Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds) In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
               
            
                  12.
               
               
                  Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312, pp. 241-261.
               
            
                  13.
               
               
                  Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D. J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
               
            
                  14.
               
               
                  Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994). replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells. Mutation Res., 312, pp. 139-149.
               
            
                  15.
               
               
                  Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103.
               
            
                  16.
               
               
                  Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.
               
            
                  17.
               
               
                  Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, pp. 403-413.
               
            
                  18.
               
               
                  Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983). Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.
               
            B.11.   MUTAGENITATEA – TESTUL IN VIVO DE ABERAŢIE CROMOZOMIALĂ PE MĂDUVĂ OSOASĂ DE MAMIFERE
      1.   METODĂ
      Prezenta metodă este reprodusă după Orientarea 475 a OCDE, Testul in vivo de aberaţie cromozomială pe măduvă osoasă de mamifere (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Testul in vivo de aberaţie cromozomială pe măduva osoasă de mamifere se utilizează la detectarea aberaţiilor cromozomiale provocate de substanţa de testat în structura celulelor din măduva osoasă a mamiferelor, de obicei, rozătoare (1) (2) (3) (4). Aberaţiile structurale pot să fie de două tipuri, cromozomiale sau cromatidice. O poliploidie crescută poate să indice că un produs chimic poate să provoace aberaţii ale numărului de cromozomi. La majoritatea mutagenilor chimici, aberaţiile induse sunt de tip cromatidic, dar se produc şi aberaţii de tip cromozomial. Mutaţiile cromozomiale şi fenomenele conexe sunt cauza multor maladii genetice umane şi există dovezi suficiente ale implicării mutaţiilor cromozomiale şi a fenomenelor conexe, care provoacă modificări ale oncogenelor şi ale genelor supresoare de tumori din celulele somatice, în inducerea cancerului la oameni şi în sistemele experimentale.
      În prezentul test se utilizează, de obicei, rozătoare. Ţesutul-ţintă în prezentul test este măduva osoasă, deoarece este un ţesut puternic vascularizat şi conţine o populaţie de celule cu ciclu rapid care se pot izola şi prelucra uşor. Alte specii şi ţesuturi-ţintă nu fac obiectul prezentei metode.
      Prezentul test de aberaţie cromozomială este relevant în special la evaluarea riscului mutagen, deoarece permite să se ţină seama de factorii de metabolism in vivo, de farmacocinetică şi de procesele de reparare a ADN-ului, deşi aceştia pot să varieze între specii şi între ţesuturi. Un test in vivo este, de asemenea, util pentru studierea suplimentară a unui efect mutagen detectat printr-un test in vitro.
      Dacă există dovezi că substanţa de testat sau un metabolit reactiv nu ating ţesutul-ţintă, utilizarea prezentului test nu potrivită.
      A se vedea şi introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Aberaţie de tip cromatidic: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea cromatidelor singure sau prin divizarea şi reuniunea între cromatide.
      
         Aberaţie de tip cromozomial: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea sau divizarea şi reuniunea ambelor cromatide în acelaşi loc.
      
         Endoreduplicare: proces în care, după o perioadă S de replicare a ADN, nucleul nu intră în mitoză, ci începe o altă perioadă S. Rezultă cromozomi cu 4, 8, 16, … cromatide.
      
         Lacună: leziune acromatică mai mică decât lăţimea unei cromatide şi cu o eroare minimă de aliniere a cromatidei(lor).
      
         Aberaţie numerică: modificare a numărului de cromozomi faţă de numărul normal caracteristic pentru celulele utilizate.
      
         Poliploidie: multiplicare a numărului (n) de cromozomi haploizi, alta decât diploidia (și anume 3n, 4n etc.).
      
         Aberaţie structurală: modificare a structurii cromozomilor, detectabilă la examinarea microscopică a celulelor în stadiul de metafază al diviziunii acestora, care se prezintă sub formă de deleţii şi fragmente, modificări intracromozomiale şi intercromozomiale.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Animalele se expun la substanţa de testat printr-o cale de expunere corespunzătoare şi se sacrifică în momente corespunzătoare după tratament. Înainte de sacrificare, animalele se supun tratamentului cu un agent de inhibare a metafazei (de exemplu colchicină sau Colcemid®). Apoi, din celulele de măduvă osoasă se realizează preparate cromozomiale care se colorează şi celulele în metafază se examinează pentru a se pune în evidenţă aberaţiile cromozomiale.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Preparatele
      1.4.1.1.   Selectarea speciilor de animale
      Se utilizează, de obicei, şobolani, şoareci şi hamsteri chinezeşti, deşi se poate utiliza orice specie de mamifere potrivită. Se recomandă utilizarea unor animale adulte tinere sănătoase din suşe folosite în mod curent în laborator. La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui să prezinte variaţii minime, care să nu depăşească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex.
      1.4.1.2.   Condiţiile de adăpostire şi de hrănire
      Se aplică condiţiile generale menţionate în introducerea generală partea B, dar umiditatea atinsă ar trebui să fie de 50-60 %.
      1.4.1.3.   Pregătirea animalelor
      Animalele adulte tinere sănătoase se distribuie în mod aleatoriu în grupe martor şi grupe de tratament. Cuştile ar trebui să se aranjeze astfel încât posibilele efecte datorate amplasării acestora să fie reduse la minim. Animalele sunt identificate individual. Se procedează la aclimatizarea animalelor la condiţiile de laborator timp de minimum cinci zile.
      1.4.1.4.   Prepararea dozelor
      Substanţele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluţii sau suspensii în solvenţii sau vehiculele corespunzătoare şi să se dilueze, dacă este cazul, înainte de a fi administrate animalelor. Substanţele de testat lichide se pot administra direct sau dilua înainte de administrare. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanţă de testat, cu excepţia cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.
      1.4.2.   Condiţii de testare
      1.4.2.1.   Solventul/vehiculul
      Solventul/vehiculul nu ar trebui să producă efecte toxice la dozele utilizate şi nu ar trebui să existe suspiciunea reacţiei chimice a acestuia cu substanţa de testat. Utilizarea altor solvenţi/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos.
      1.4.2.2.   Martorii
      Pentru fiecare sex şi pentru fiecare test ar trebui să se prevadă martori pozitivi şi negativi (solvenţi/vehicule), utilizaţi în paralel. Cu excepţia tratamentului cu substanţa de testat, manipularea animalelor din grupele martor ar trebui să fie identică cu cea a animalelor din grupele tratate.
      Martorii pozitivi ar trebui să producă aberaţii cromozomiale de structură in vivo la nivelurile de expunere preconizate a genera o creştere detectabilă în raport cu fondul. Dozele de martor pozitiv ar trebui să fie alese astfel încât să se obţină efecte clare, dar fără a revela imediat examinatorului identitatea lamelelor codificate. Pentru martorul pozitiv, se poate accepta administrarea pe o cale diferită faţă de cea utilizată în cazul substanţei de testat şi doar o singură prelevare a probelor. Se poate avea în vedere utilizarea unor martori pozitivi din aceeaşi clasă de substanţe chimice, dacă sunt disponibili. În tabelul următor se prezintă exemple de substanţe care se pot utiliza ca martori pozitivi:
      
                  Substanţa
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. EINECS
               
            
                  metansulfonat de etil
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  etil nitrozouree
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  mitomicină C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  ciclofosfamidă
                  ciclofosfamidă monohidrat
               
               
                  50-18-0
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
            
                  trietilenmelamină
               
               
                  51-18-3
               
               
                  200-083-5
               
            Martorii negativi, trataţi doar cu solvent sau cu vehicule şi manipulaţi în acelaşi fel ca şi grupele tratate, ar trebui să fie incluşi la fiecare prelevare de probe, cu excepţia cazului în care se dispune de date acceptabile privind variabilitatea inter-animale şi frecvenţele celulelor cu aberaţii cromozomiale, provenite de la martori anteriori. Dacă, pentru martorii negativi, se face o singură prelevare de probe, momentul cel mai potrivit pentru prelevarea probelor este momentul primei prelevări. În plus, ar trebui să se utilizeze şi martori netrataţi, cu excepţia cazului în care există date de la martori anteriori sau date publicate, care să ateste că solventul/vehiculul selectat nu induce efecte vătămătoare sau mutagene.
      1.5.   MOD DE LUCRU
      1.5.1.   Numărul şi sexul animalelor
      Fiecare grup tratat şi grup martor include minimum cinci animale analizabile din fiecare sex. Dacă în momentul studiului există date disponibile din studii pe aceleaşi specii, în care s-a folosit aceeaşi cale de expunere, care să demonstreze lipsa unor diferenţe substanţiale de toxicitate între sexe, atunci va fi suficientă testarea pe animale de un singur sex. Dacă expunerea umană la produse chimice este specifică sexului, ca în cazul unor produse farmaceutice, testul ar trebui să se realizeze pe animale de sexul corespunzător.
      1.5.2.   Modalitatea de tratare
      Substanţele de testat se administrează de preferinţă o singură dată. Substanţele de testat se mai pot administra în doze fracţionate, și anume două tratamente în aceeaşi zi la distanţă de doar câteva ore, pentru a facilita administrarea unui volum mare de material. Alte modalităţi de tratare ar trebui să fie justificate în mod ştiinţific.
      Prelevarea probelor după tratament ar trebui să se realizeze în două momente diferite din aceeaşi zi. Pentru rozătoare, primul interval de timp este egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal (acesta din urmă fiind în mod normal de 12-18 ore) după tratament. Deoarece timpul necesar pentru absorbţia şi metabolismul substanţei de testat, precum şi acţiunea acesteia asupra cineticii ciclului celular pot să aibă efecte asupra timpului optim pentru detectarea aberaţiei cromozomiale, se recomandă să se procedeze la o altă prelevare de probe la 24 de ore după prima prelevare. Dacă administrarea dozelor durează mai mult de o zi, ar trebui să se procedeze la o prelevare de probe la un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal după tratamentul final.
      Înainte de sacrificare, se procedează la injectarea intraperitoneală a animalelor cu o doză corespunzătoare de agent de inhibare a metafazei (de exemplu Colcemid® sau colchicină). Probele de la animale se prelevează apoi la un interval corespunzător. Pentru şoareci intervalul respectiv este de aproximativ 3-5 ore; pentru hamsterii chinezeşti intervalul este de 4-5 ore. Celule se recoltează din măduva osoasă şi se examinează pentru detectarea aberaţiilor cromozomiale.
      1.5.3.   Doze
      Dacă, în lipsa datelor corespunzătoare, se realizează un studiu pentru stabilirea dozelor, acesta ar trebui să se realizeze în acelaşi laborator şi să utilizeze aceeaşi specie, aceeaşi suşă de animale de acelaşi sex, iar regimul de tratare să fie acelaşi ca cel ce urmează să fie utilizat în studiul principal (5). În caz de toxicitate, se utilizează trei doze diferite pentru prima prelevare. Aceste trei doze ar trebui să acopere un domeniu de toxicităţi, de la toxicitatea maximă până la toxicitatea minimă sau lipsă. Pentru prelevările ulterioare se utilizează doar doza maximă. Doza maximă se defineşte ca doza ce produce astfel de semne de toxicitate, încât dozele mai mari, administrate în acelaşi mod, se estimează că sunt letale. Substanţele cu activitate biologică specifică la doze mici netoxice (cum ar fi hormonii şi mitogenii) pot face excepţie de la criteriile de stabilire a dozelor şi să fie stabilite pentru fiecare caz în parte. Doza maximă se mai poate defini ca doza care produce anumite semne de toxicitate în măduva osoasă (de exemplu o reducere cu mai mult de 50 % a indexului mitotic).
      1.5.4.   Test-limită
      Dacă un test realizat cu o doză de minimum 2 000 mg/kg greutate corporală, administrată într-o singură repriză sau în două reprize în aceeaşi zi, nu produce efecte toxice detectabile şi dacă o genotoxicitate este improbabilă pe baza datelor referitoare la substanţe cu o structură apropiată, se poate considera că un studiu complet cu utilizarea a trei doze de mărimi diferite nu este necesar. Pentru studiile pe termen lung, doza-limită este de 2 000 mg/kg greutate corporală/zi pentru un tratament de până la 14 zile şi de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi pentru un tratament mai lung de 14 zile. În funcţie de expunerea umană preconizată, ar putea fi necesară o doză mai mare în testul-limită.
      1.5.5.   Administrarea dozelor
      Substanţa de testat se administrează, de obicei, prin cavitatea nazală cu ajutorul unui tub stomacal sau al unei canule de intubaţie adaptate sau printr-o injecţie intraperitoneală. Se pot accepta şi alte căi de administrare, dacă se pot justifica. Volumul maxim de lichid care se poate administra prin sondă gastrică introdusă prin cavitatea nazală sau prin injecţie într-o singură repriză depinde de dimensiunea animalului de laborator. Volumul ar trebui să fie mai mic sau egal cu 2 ml/100 g greutate corporală. Utilizarea unor volume mai mari decât cel menţionat ar trebui să se justifice. Cu excepţia substanţelor iritante şi corozive, care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentraţii mai mari, variaţia volumului administrat ar trebui să fie redusă la minim prin ajustarea concentraţiei, astfel încât să se asigure un volum constant pentru toate dozele.
      1.5.6.   Prepararea cromozomilor
      Măduva osoasă se extrage imediat după sacrificare, se expune la o soluţie hipotonică şi se fixează. Apoi, celulele se întind pe lamele şi se colorează.
      1.5.7.   Analiza
      Se procedează la determinarea indexului mitotic, care este o măsură a citotoxicităţii, pe cel puţin 1 000 de celule pentru fiecare animal tratat (inclusiv martorii pozitivi) şi pentru fiecare animal martor negativ netratat.
      Pentru fiecare animal se analizează minimum 100 de celule. Dacă se observă un număr mai mare de aberaţii, numărul specificat se poate reduce. Toate lamelele, inclusiv cele cu celule de la martorii pozitivi şi negativi, ar trebui să fie codificate independent, înainte de examinarea la microscop. Deoarece metodele de preparare a lamelelor conduc adesea la scindarea unei fracţii de celule în metafază cu pierdere de cromozomi, toate celulele examinate ar trebui, prin urmare, să conţină un număr de centromeri egal cu 2n ± 2.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Se recomandă prezentarea sub formă de tabel a datelor pentru fiecare animal. Unitatea experimentală este animalul. Pentru fiecare animal, ar trebui să se evalueze numărul de aberaţii per celulă şi procentul de celule cu aberaţie sau aberaţii cromozomiale de structură. Diferitele tipuri de aberaţii cromozomiale de structură ar trebui să fie consemnate împreună cu numărul şi frecvenţa acestora pentru grupele tratate şi cele martor. Lacunele se consemnează şi se raportează separat, dar în general acestea nu se includ în frecvenţa totală a aberaţiilor. Dacă nu există dovezi privind diferenţa de răspunsuri între sexe, datele de la ambele sexe se pot combina pentru analiza statistică.
      2.2.   EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o creştere în funcţie de doză a numărului relativ de celule cu aberaţii cromozomiale sau o creştere clară a numărului de celule cu aberaţii dintr-o grupă cu o doză unică la un singur moment de prelevare. În primul rând, ar trebui să se aibă în vedere relevanţa biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge şi la ajutorul unor metode statistice (6). Semnificaţia statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferinţă printr-o modificare a condiţiilor de testare.
      O creştere a numărului de celule poliploide poate să indice faptul că substanţa de testat poate produce aberaţii ale numărului de cromozomi. O creştere a numărului de celule cu cromozomi enderoduplicaţi poate să indice faptul că substanţa de testat poate să inhibe avansarea ciclului celular (7) (8).
      Dacă rezultatele pentru o substanţă de testat nu îndeplinesc criteriile menţionate anterior, substanţa respectivă se consideră a fi nemutagenă în prezentul test.
      Deşi majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare, datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanţei de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de experimente efectuate.
      Rezultatele pozitive ale unui test de aberaţie cromozomială in vivo indică faptul că o substanţă provoacă aberaţii cromozomiale în măduva osoasă a speciei testate. Rezultatele negative indică faptul că, în condiţiile de testare, substanţa de testat nu provoacă aberaţii cromozomiale în măduva osoasă a speciei testate.
      Ar trebui discutată probabilitatea ca substanţa de testat sau metaboliţii acesteia să ajungă în circulaţia generală sau în mod specific în ţesutul-ţintă (de exemplu toxicitatea sistemică).
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  
                     Solventul/vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea şi stabilitatea substanţei de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaşte.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animalele de laborator:
                  
                              —
                           
                           
                              specia/suşa utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul, vârsta şi sexul animalelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursa, condiţiile de adăpost şi hrănire etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul de greutate, greutatea medie şi deviaţia standard pentru fiecare grupă.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              martorii pozitivi şi negativi (solvent/vehicul);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dacă s-a realizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii dozelor utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind administrarea substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea căii de administrare selectate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de verificare pentru a constata dacă substanţa de testat a ajuns în circulaţia generală sau în ţesutul-ţintă, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conversia concentraţiei substanţei de testat (ppm) în hrană/apa de băut în doza reală (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei şi a apei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea amănunţită a modalităţilor de tratare şi de prelevare a probelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de măsurare a toxicităţii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identitatea substanţei de inhibare a metafazei, concentraţia acesteia şi durata tratamentului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de preparare a lamelelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile pentru numărătoarea aberaţiilor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule analizate per animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              indexul mitotic;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tipul şi numărul aberaţiilor, consemnate separat pentru fiecare animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul total de aberaţii pentru fiecare grupă împreună cu numărul mediu şi deviaţiile standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule cu aberaţii pentru fiecare grupă împreună cu numărul mediu al acestora şi deviaţiile standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              variaţiile ploidiei, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analizele statistice, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi studiaţi în paralel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele anterioare privind martorii negativi, cu domeniile, valorile medii şi deviaţiile standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii pozitivi studiaţi în paralel.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds.). IRL Press, Oxford, Washington D. C., pp. 275-306.
               
            
                  2.
               
               
                  Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, 157-165.
               
            
                  3.
               
               
                  Richold, M., Chandly, A., Ashby, J., Gatehouse D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland, (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New Cork, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
               
            
                  4.
               
               
                  Tice, R. R. Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Paccierotti, F., Preston R. J., Romagna F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the In Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312.
               
            
                  5.
               
               
                  Fielder, R. J., Alleen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK, Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
               
            
                  6.
               
               
                  Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland, (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.
               
            
                  7.
               
               
                  Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res. 119, pp. 403-413.
               
            
                  8.
               
               
                  Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1363-1364.
               
            B.12.   MUTAGENITATEA – TESTUL IN VIVO DE MICRONUCLEU PE ERITROCITE DE MAMIFERE
      1.   METODĂ
      Prezenta metodă este reprodusă după Orientarea 474 a OCDE, Testul in vivo de micronucleu pe eritrocite de mamifere (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Testul in vivo de micronucleu pe celule de mamifere se utilizează pentru detectarea leziunilor cromozomilor sau ale aparatului mitotic al eritroblaştilor produse de substanţa de testat; detectarea se realizează prin analiza eritrocitelor prelevate din măduva osoasă şi din celulele sângelui periferic ale animalelor, de obicei, rozătoare.
      Scopul testului de micronucleu este identificarea substanţelor care produc leziuni citogenetice ce determină formarea de micronuclee conţinând fragmente de cromozomi sau cromozomi întregi întârziaţi.
      Când un eritroblast din măduva osoasă evoluează într-un eritrocit policromatic, nucleul principal este expulzat; orice micronucleu care se formează poate să rămână în citoplasma anucleată. Micronucleele se vizualizează mai uşor în aceste celule cărora le lipseşte nucleul principal. O creştere a frecvenţei eritrocitelor policromatice micronucleate la animalele tratate indică producerea unei leziuni cromozomiale.
      În prezentul test se utilizează în mod curent măduva osoasă a rozătoarelor deoarece eritrocitele policromatice se produc în acest ţesut. Numărătoarea eritrocitelor (policromatice) imature micronucleate în sângele periferic este la fel de acceptabilă la toate speciile la care s-a demonstrat incapacitatea splinei de a elimina eritrocitele micronucleate sau care prezintă o sensibilitate specifică pentru detectarea agenţilor care produc aberaţii cromozomiale de natură structurală sau numerică. Există numeroase criterii care permit identificarea micronucleelor. Unul dintre acestea este identificarea prezenţei sau absenţei unui kinetocor sau a ADN centromeric în micronucleu. Frecvenţa eritrocitelor (policromatice) imature micronucleate este principalul criteriu. De asemenea, numărul de eritrocite (normocromatice) mature în sângele periferic care conţine micronuclee printre un număr dat de eritrocite mature se poate utiliza ca un criteriu în cazul tratării animalelor timp de patru săptămâni sau mai mult.
      Prezentul test in vivo de micronucleu pe eritrocite de mamifere este relevant în special la evaluarea riscului mutagen, deoarece permite să se ţină seama de factorii de metabolism in vivo, de farmacocinetică şi de procesele de regenerare a ADN-ului, deşi aceştia pot să varieze între specii, între ţesuturi şi între efectele genetice. Un test in vivo este, de asemenea, util pentru studierea suplimentară a unui efect mutagen detectat într-un sistem in vitro.
      Dacă există dovezi că substanţa de testat sau un metabolit reactiv nu atinge ţesutul-ţintă utilizarea prezentului test nu este potrivită.
      A se vedea şi introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Centromer (kinetocor): porţiune sau porţiuni dintr-un cromozom care în timpul diviziunii celulare este legată cu fibrele fusului mitotic, ceea ce permite deplasarea ordonată a cromozomilor fiice către polii celulelor fiice.
      
         Micronuclee: nuclee mici, separate de nucleele principale ale celulelor şi prezente în plus faţă de acestea, produse în timpul telofazei mitozei (meioză) de către fragmentele de cromozomi sau de cromozomii întregi întârziaţi.
      
         Eritrocit normocromatic: eritrocit matur lipsit de ribozomi şi care se poate distinge de eritrocitele policromatice imature cu ajutorul unor substanţe care colorează selectiv ribozomii.
      
         Eritrocit policromatic: eritrocit imatur, aflat într-un stadiu intermediar de dezvoltare, care mai conţine ribozomi şi, prin urmare, se poate distinge de eritrocitele normocromatice mature cu ajutorul substanţelor care colorează selectiv ribozomii.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Animalele sunt expuse la substanţa de testat printr-o cale de expunere corespunzătoare. Dacă se utilizează măduva osoasă, animalele se sacrifică la momente potrivite după tratament, se extrage măduva osoasă, se prepară şi se colorează lamelele (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Dacă se utilizează sângele periferic, acesta se colectează la momente potrivite după tratament, se depune pe lamele şi se colorează (4) (8) (9) (10). Pentru studiile cu sânge periferic, celulele ar trebui să se recolteze cât se poate de repede după ultima expunere. Lamelele preparate se examinează pentru a depista prezenţa micronucleelor.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Pregătire
      1.4.1.1.   Selectarea speciilor de animale
      Dacă se utilizează măduvă osoasă, se recomandă şoareci şi şobolani, deşi se poate utiliza orice specie adecvată de mamifere. Când se utilizează sânge periferic, se recomandă şoareci. Cu toate acestea, se poate utiliza orice specie adecvată de mamifere, cu condiţia să fie o specie la care s-a demonstrat incapacitatea splinei de a elimina eritrocitele micronucleate sau care prezintă o sensibilitate specifică pentru detectarea agenţilor care produc aberaţii cromozomiale de natură structurală sau numerică. Se recomandă utilizarea unor animale adulte tinere din suşe utilizate în mod curent în laborator. La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui să prezinte o variaţie minimă, ce nu trebuie să depăşească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex.
      1.4.1.2.   Condiţiile de adăpostire şi de hrănire
      Se aplică condiţiile generale menţionate în introducerea generală partea B, dar umiditatea atinsă ar trebui să fie de 50-60 %.
      1.4.1.3.   Pregătirea animalelor
      Animalele adulte tinere sănătoase se distribuie în mod aleatoriu în grupe martor şi grupe de tratament. Animalele sunt identificate individual. Se procedează la aclimatizarea animalelor la condiţiile de laborator timp de minimum cinci zile. Cuştile ar trebui să se aranjeze astfel încât posibilele efecte datorate amplasării acestora să fie reduse la minim.
      1.4.1.4.   Pregătirea dozelor
      Substanţele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluţii sau suspensii în solvenţii sau vehiculele corespunzătoare şi să se dilueze, dacă este cazul, înainte de a fi administrate animalelor. Substanţele de testat lichide se pot administra direct sau dilua înainte de administrare. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanţă de testat, cu excepţia cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.
      1.4.2.   Condiţii de testare
      1.4.2.1.   Solventul/vehiculul
      Solventul/vehiculul nu ar trebui să producă efecte toxice la dozele utilizate şi nu ar trebui să existe suspiciunea reacţiei chimice a acestuia cu substanţa de testat. Utilizarea altor solvenţi/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos.
      1.4.2.2.   Martorii
      Pentru fiecare sex şi pentru fiecare test ar trebui să se prevadă martori pozitivi şi negativi (solvent/vehicul), utilizaţi în paralel. Cu excepţia tratamentului cu substanţa de testat, manipularea animalelor din grupele martor ar trebui să fie identică cu cea a animalelor din grupele tratate.
      Martorii pozitivi ar trebui să producă micronuclee in vivo la nivelurile de expunere preconizate a genera o creştere detectabilă în raport cu fondul. Dozele de martor pozitiv ar trebui să fie alese astfel încât să se obţină efecte clare, dar fără să releve imediat examinatorului identitatea lamelelor codificate. Pentru martorul pozitiv, se poate accepta administrarea pe o cale diferită de cea prin care se administrează substanţa de testat cu o singură prelevare a probelor. În plus, se poate avea în vedere utilizarea unor martori pozitivi din aceeaşi clasă de produse chimice, dacă sunt disponibili. În tabelul următor se prezintă exemple de substanţe care se pot utiliza ca martori pozitivi:
      
                  Substanţa
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. EINECS
               
            
                  metansulfonat de etil
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  N-etil-N-nitrozouree
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  mitomicină C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  ciclofosfamidă
                  ciclofosfamidă monohidrat
               
               
                  50-18-0
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
            
                  trietilenmelamină
               
               
                  51-18-3
               
               
                  200-083-5
               
            Martorii negativi, trataţi doar cu solvent sau cu vehicul şi manipulaţi în acelaşi fel ca grupele tratate, ar trebui să fie incluşi la fiecare prelevare de probe, cu excepţia cazului în care se dispune de date acceptabile privind variabilitatea inter-animale şi frecvenţa incidenţei celulelor cu micronuclee, provenite de la martori anteriori. Dacă, pentru martorii negativi, se face o singură prelevare de probe, momentul cel mai potrivit pentru prelevarea probelor este momentul primei prelevări. În plus, ar trebui să se utilizeze şi martori netrataţi, cu excepţia cazului în care există date de la martori anteriori sau publicate să ateste că solventul/vehiculul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene.
      Dacă se utilizează sânge periferic, se poate accepta o probă prelevată înainte de tratament în calitate de martor negativ, dar doar în studiile de scurtă durată pe sânge periferic (de exemplu 1-3 tratamente), când datele rezultate se situează între limitele estimate pe baza datelor anterioare privind martorul.
      1.5.   MOD DE LUCRU
      1.5.1.   Numărul şi sexul animalelor
      Fiecare grupă tratată şi martor include minimum cinci animale analizabile din fiecare sex (11). Dacă în momentul studiului există date disponibile din studii pe aceleaşi specii, în care s-a folosit aceeaşi cale de expunere, care să demonstreze lipsa unor diferenţe substanţiale de toxicitate între sexe, atunci va fi suficientă testarea pe animale de un singur sex. Dacă expunerea umană la produse chimice este specifică sexului, ca în cazul unor produse farmaceutice, testul ar trebui să se realizeze pe animale de sexul corespunzător.
      1.5.2.   Modalitatea de tratare
      Nu se poate recomanda un program de tratament standard (și anume unul, două sau mai multe tratamente la intervale de 24 de ore). Probele provenite de la un studiu cu administrare prelungită a dozelor sunt acceptabile, atâta timp cât pentru studiul respectiv s-a demonstrat un efect pozitiv sau, pentru un studiu negativ, atâta timp cât s-a demonstrat toxicitatea sau s-a utilizat doza-limită şi administrarea dozei a continuat până în momentul prelevării probelor. Pentru a facilita administrarea unui volum mare de material, substanţele de testat se pot administra şi în doză fracţionată, și anume două tratamente în aceeaşi zi, la un interval de câteva ore.
      Testul se poate realiza în două moduri:
      
                  (a)
               
               
                  Substanţa de testat se administrează animalelor într-o singură repriză. Probele de măduvă osoasă se prelevează de cel puţin două ori, prelevarea începând cel mai devreme la 24 de ore după tratament, fără să se prelungească mai mult de 48 de ore după tratament, cu intervale corespunzătoare între probe. Dacă prelevarea probelor se realizează mai devreme de 24 de ore după tratament, ar trebui să se justifice acest lucru. Probele de sânge periferic se prelevează cel puţin de două ori, dar nu mai devreme de 36 de ore după tratament, cu intervale corespunzătoare după prima probă şi nu trebuie să depăşească 72 de ore. Dacă la un moment de prelevare se înregistrează un rezultat pozitiv, prelevarea probelor încetează.
               
            
                  (b)
               
               
                  Dacă se practică două sau mai multe tratamente zilnice (de exemplu două sau mai multe tratamente la intervale de 24 de ore), ar trebui ca prelevarea probelor să se realizeze o dată la un interval de timp cuprins între 18 şi 24 de ore după tratamentul final pentru măduva osoasă şi o dată într-un interval de timp cuprins între 36 şi 48 de ore după tratamentul final pentru sângele periferic (12).
               
            Dacă este relevant, se pot utiliza şi alte momente de prelevare a probelor.
      1.5.3.   Doze
      Dacă, în lipsa datelor corespunzătoare, se realizează un studiu pentru stabilirea dozelor, acesta ar trebui să se realizeze în acelaşi laborator şi să utilizeze aceeaşi specie, aceeaşi suşă de animale de acelaşi sex şi regimul de tratare să fie acelaşi ca cel ce urmează să fie utilizat în studiul principal (13). În caz de toxicitate, se utilizează trei doze diferite pentru prima prelevare. Aceste trei doze ar trebui să acopere un domeniu de toxicităţi de la toxicitate maximă până la toxicitate minimă sau netoxicitate. Pentru prelevările ulterioare se utilizează doar doza maximă. Doza maximă se defineşte ca doza ce produce astfel de semne de toxicitate, încât dozele mai mari, administrate în acelaşi mod, se estimează că sunt letale. Substanţele cu activitate biologică specifică la doze mici netoxice (cum ar fi hormonii şi mitogenii) pot face excepţie de la criteriile de stabilire a dozelor şi să fie stabilite pentru fiecare caz în parte. Doza maximă se mai poate defini ca doza care produce anumite semne de toxicitate în măduva osoasă (de exemplu o reducere a proporţiei de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite din măduva osoasă sau din sângele periferic).
      1.5.4.   Test-limită
      Dacă un test realizat cu o doză de minimum 2 000 mg/kg greutate corporală, administrată într-o singură repriză sau în două reprize în aceeaşi zi, nu produce efecte toxice detectabile şi dacă o genotoxicitate este improbabilă pe baza datelor referitoare la substanţe cu o structură apropiată, se poate considera că un studiu complet cu utilizarea a trei doze de mărimi diferite nu este necesar. Pentru studiile pe termen lung, doza-limită este de 2 000 mg/kg greutate corporală/zi pentru un tratament de până la 14 zile şi de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi pentru un tratament mai lung de 14 zile. În funcţie de expunerea umană preconizată, s-ar putea să fie necesară o doză mai mare în testul-limită.
      1.5.5.   Administrarea dozelor
      Substanţa de testat se administrează, de obicei, prin cavitatea nazală cu ajutorul unui tub stomacal sau a unei canule de intubaţie adaptate sau printr-o injecţie intraperitoneală. Se pot accepta şi alte căi de administrare, dacă se pot justifica. Volumul maxim de lichid care se poate administra prin sondă gastrică introdusă prin cavitatea nazală sau prin injecţie într-o singură repriză depinde de dimensiunea animalului de laborator. Volumul ar trebui să fie mai mic sau egal cu 2 ml/100 g greutate corporală. Utilizarea unor volume mai mari decât cel menţionat ar trebui să se justifice. Cu excepţia substanţelor iritante şi corozive care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentraţii mai mari, variaţia volumului testat ar trebui să fie redusă la minim prin ajustarea concentraţiei, astfel încât să se asigure un volum constant pentru toate dozele.
      1.5.6.   Prepararea măduvei osoase/a sângelui
      Celule de măduvă osoasă se extrag în mod curent din femur sau tibie imediat după sacrificare. De obicei, celulele se extrag din femur sau tibie, se depun pe lamele şi se colorează prin metodele stabilite. Sângele periferic se obţine din vena caudală sau alte vase de sânge corespunzătoare. Celulele sanguine se colorează imediat supravital (8) (9) (10) sau se întinde mai întâi pe lamele şi apoi se colorează. Utilizarea unui colorant specific pentru ADN [de exemplu oranj de acridină (14), Hoechst 33258 plus pironină –Y (15)] poate să elimine unele din artefacte datorită utilizării unui colorant nespecific pentru ADN. Avantajul menţionat nu exclude utilizarea coloranţilor convenţionali (de exemplu Giemsa). Se pot utiliza şi alte sisteme [de exemplu coloane de celuloză pentru eliminarea celulelor nucleate (16)], cu condiţia ca sistemele respective să se fi dovedit eficiente pentru prepararea micronucleelor în laborator.
      1.5.7.   Analiza
      Pentru fiecare animal se determină proporţia de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite (imature + mature) prin examinarea a cel puţin 200 de eritrocite pentru măduva osoasă şi 1 000 de eritrocite pentru sângele periferic (17). Fiecare dintre lamele, inclusiv cele cu martori pozitivi şi negativi, ar trebui codificată independent, înainte de analiza microscopică. Se identifică minimum 2 000 de eritrocite imature per animal pentru a determina incidenţa eritrocitelor imature micronucleate. Prin identificarea eritrocitelor mature pentru depistarea micronucleelor se pot obţine informaţii suplimentare. La examinarea lamelelor, proporţia de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite ar trebui să fie mai mare de 20 % faţă de valoarea martorilor. Dacă animalele sunt tratate în mod continuu timp de patru săptămâni sau mai mult, se pot identifica, de asemenea, cel puţin 2 000 de eritrocite mature per animal pentru a constata incidenţa micronucleelor. Sistemele de analiză automată (analiza imaginii şi citometria de flux a suspensiilor de celule) se pot utiliza în locul evaluării manuale, dacă sunt validate şi justificate corespunzător.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Se recomandă prezentarea sub formă de tabel a datelor pentru fiecare animal. Unitatea experimentală este animalul. Pentru fiecare animal analizat se consemnează în tabel numărul de eritrocite imature examinate, numărul de eritrocite imature micronucleate şi numărul de eritrocite imature, în raport cu numărul total de eritrocite. Dacă animalele se tratează continuu timp de patru săptămâni sau mai mult, ar trebui să se prezinte şi datele privind eritrocitele mature, dacă s-a făcut colectarea acestora. Pentru fiecare animal se prezintă proporţia de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite şi, dacă se consideră că este cazul, procentul de eritrocite micronucleate. Dacă nu există dovezi privind diferenţa de răspunsuri între sexe, datele de la ambele sexe se pot combina pentru analiza statistică.
      2.2.   EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, cum ar fi o creştere în funcţie de doză a numărului de celule micronucleate sau o creştere clară a numărului de celule micronucleate dintr-o grupă cu o doză unică la un singur moment de prelevare. În primul rând, ar trebui să se aibă în vedere relevanţa biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge şi la ajutorul unor metode statistice (18) (19). Semnificaţia statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferinţă printr-o modificare a condiţiilor de testare.
      Dacă rezultatele pentru o substanţă de testat nu îndeplinesc criteriile menţionate anterior, substanţa respectivă se consideră a fi nemutagenă în prezentul test.
      Deşi majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în cazuri rare datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanţei de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile, independent de numărul de experimente.
      Rezultatele pozitive ale testului de micronucleu indică faptul că substanţa induce formarea de micronuclee ca urmare a leziunilor cromozomiale sau a leziunilor aparatului mitotic din eritroblaştii speciei testate. Rezultatele negative indică faptul că, în condiţiile de testare, substanţa de testat nu produce micronuclee în eritrocitele imature ale speciei testate.
      Ar trebui să fie discutată probabilitatea ca substanţa de testat sau metaboliţii acesteia să ajungă în circulaţia generală sau în mod specific în ţesutul-ţintă (de exemplu toxicitatea sistemică).
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare ar trebui să conţină următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  
                     Solventul/vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea şi stabilitatea substanţei de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaşte.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animalele de laborator:
                  
                              —
                           
                           
                              specia/suşa utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul, vârsta şi sexul animalelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursa, condiţiile de adăpost şi hrănire etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul de greutate, greutatea medie şi deviaţia standard pentru fiecare grupă.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              martorii pozitivi şi negativi (solvent/vehicul);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dacă s-a realizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii dozelor utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind administrarea substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea căii de administrare selectate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de verificare pentru a constata dacă substanţa de testat a ajuns în circulaţia generală sau în ţesutul-ţintă, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conversia concentraţiei substanţei de testat (ppm) în hrană/apa de băut în doza reală (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei şi a apei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea amănunţită a modalităţilor de tratare şi de prelevare a probelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de preparare a lamelelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de măsurare a toxicităţii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile pentru numărătoarea eritrocitelor imature micronucleate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule analizate per animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              proporţia de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de eritrocite imature micronucleate, prezentat separat pentru fiecare animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              media ± deviaţia standard pentru eritrocitele imature micronucleate pentru fiecare grupă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analizele statistice şi metodele aplicate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi studiaţi în paralel şi anterior testului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii pozitivi studiaţi în paralel.
                           
                        
            
                   
               
               
                  — Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  — Concluzii.
               
            4.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190.
               
            
                  2.
               
               
                  Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15.
               
            
                  3.
               
               
                  Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61-118.
               
            
                  4.
               
               
                  Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80.
               
            
                  5.
               
               
                  MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N., and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya, Elsevier, Amsterdam, pp., 555-558.
               
            
                  6.
               
               
                  MacGregor, J. T., Heddle, J. A., Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C., Salamone, M. F., Tice, R. R. and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112.
               
            
                  7.
               
               
                  MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522.
               
            
                  8.
               
               
                  Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245-249.
               
            
                  9.
               
               
                  The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98.
               
            
                  10.
               
               
                  The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995). Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 153-159.
               
            
                  11.
               
               
                  Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), In Vivo, Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293-304.
               
            
                  12.
               
               
                  Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313-319.
               
            
                  13.
               
               
                  Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
               
            
                  14.
               
               
                  Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247.
               
            
                  15.
               
               
                  MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, pp. 269-275.
               
            
                  16.
               
               
                  Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104.
               
            
                  17.
               
               
                  Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97-99.
               
            
                  18.
               
               
                  Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report, Part I, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
               
            
                  19.
               
               
                  Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
               
            B.13/14.   MUTAGENITATEA – TESTUL DE MUTAŢIE INVERSĂ PE BACTERII
      1.   METODĂ
      Prezenta metodă este reprodusă după Orientarea 471 a OCDE, Testul de mutaţie inversă pe bacterii (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Testul bacterian de mutaţie inversă se bazează pe suşe de Salmonella typhimurium şi Escherichia coli, care necesită aminoacizi, şi urmăreşte detectarea mutaţiilor punctiforme, care includ substituţia, adăugarea sau deleţia uneia sau a câtorva perechi de bază din ADN (1) (2) (3). Principiul prezentului test bacterian de mutaţie inversă constă în detectarea mutaţiilor care reîntorc mutaţiile, prezente în suşele experimentale, în starea iniţială şi refac funcţionalitatea bacteriilor de a sintetiza un aminoacid esenţial. Bacteriile de inversare se detectează datorită capacităţii lor de a se dezvolta în absenţa aminoacidului necesar pentru suşa parentală experimentală.
      Mutaţiile punctiforme sunt cauza multor maladii genetice umane şi există dovezi substanţiale că mutaţiile din oncogene şi genele supresoare de tumori din celulele somatice sunt implicate în formarea tumorilor la oameni şi animalele de laborator. Testul bacterian de mutaţie inversă este rapid, ieftin şi relativ uşor de realizat. Multe dintre suşele experimentale au câteva particularităţi care le fac mai sensibile pentru detectarea de mutaţii, inclusiv secvenţe de ADN sensibile la mutaţii în locurile de inversare, permeabilitate celulară crescută pentru moleculele mari şi eliminarea sistemelor de regenerare a ADN sau intensificarea proceselor care au tendinţa să inducă erori în timpul regenerării ADN. Specificitatea suşelor experimentale poate să furnizeze informaţii utile privind tipurile de mutaţii care sunt induse de către agenţii genotoxici. O bază de date cu un număr mare de rezultate, pentru structuri foarte variate, este disponibilă pentru testele bacteriene de mutaţii inverse şi au fost elaborate metodologii bine stabilite pentru testarea produselor chimice cu diferite proprietăţi fizico-chimice, inclusiv a compuşilor volatili.
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Un test de mutaţie inversă, fie la Salmonella typhimurium, fie la Escherichia coli, detectează mutaţia într-o suşă care necesită un aminoacid (histidină sau respectiv triptofan) pentru a produce o suşă independentă de aportul exterior de aminoacid.
      
         Mutageni care provoacă substituţia perechilor de bază sunt agenţi care provoacă substituirea unei baze din ADN. Într-un test de reversie, acest tip de modificare poate să se producă la locul mutaţiei iniţiale sau într-un al doilea loc în genomul bacterian.
      
         Mutageni de decalare a cadrului de citire sunt agenţi care produc adăugarea sau deleţia uneia sau a mai multor perechi de bază din ADN, modificând astfel cadrul de citire în ARN.
      1.3.   CONSIDERAŢII PRELIMINARE
      Testul bacterian de mutaţie inversă utilizează celule procariote, care diferă de celulele mamiferelor în privinţa absorbţiei, a metabolismului, a structurii cromozomilor şi a proceselor de regenerare a ADN. Pentru testele realizate in vitro este necesară în general o sursă exogenă de activare metabolică. Sistemele de activare metabolică in vitro nu pot să reproducă în totalitate condiţiile metabolismului celulelor de mamifere in vivo. Testul nu furnizează, prin urmare, informaţii directe privind capacitatea mutagenă şi cancerigenă a unei substanţe la mamifere.
      Testul bacterian de mutaţie inversă se utilizează, de obicei, pentru o primă triere a activităţii genotoxice, în special pentru detectarea mutaţiei punctiforme. O bogată bază de date demonstrează că multe produse chimice care dau rezultate pozitive în prezentul test prezintă activitate mutagenă şi în alte teste. Există exemple de agenţi mutageni care nu se detectează prin acest test; aceste deficienţe se pot explica prin natura specifică a efectului detectat, activării metabolice diferite sau biodisponibilităţii diferite. Pe de altă parte, factorii care cresc sensibilitatea testului bacterian de mutaţie inversă pot să conducă la o supraestimare a activităţii mutagene.
      S-ar putea ca testul bacterian de mutaţie inversă să nu fie potrivit pentru evaluarea anumitor clase de substanţe chimice, de exemplu compuşii cu acţiune bactericidă puternică (de exemplu anumite antibiotice) sau cei despre care se consideră (sau se ştie) că interferează în mod specific cu sistemele de replicare a celulelor de mamifere (de exemplu unii inhibitori de topoizomerază şi unii analogi de nucleozide). În aceste cazuri, s-ar putea ca testele de mutaţie pe celule de mamifere să fie mai potrivite.
      Deşi mulţi compuşi care dau rezultate pozitive în prezentul test sunt cancerigene pentru mamifere, corelaţia nu este absolută. Aceasta depinde de clasa de substanţe chimice şi există agenţi cancerigeni care nu se detectează cu prezentul test, deoarece acţionează prin alte mecanisme negenotoxice sau mecanisme care nu sunt prezente în celulele bacteriene.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Suspensiile de celule bacteriene sunt expuse la substanţa de testat în prezenţa şi în absenţa unui sistem exogen de activare metabolică. În procedeul de încorporare prin depunere pe o placă, suspensiile menţionate se amestecă cu o geloză de acoperire (agar) şi se depun imediat pe un mediu minimal. În procedeul cu preincubare, amestecul de tratare se incubează şi apoi se amestecă cu geloza de acoperire înaintea depunerii pe un mediu minim. Pentru ambele metode, după două sau trei zile de incubare, coloniile care produc inversarea se numără şi numărul obţinut se compară cu cel al coloniilor spontane de inversare aflate pe plăci cu martor tratate cu solvent.
      Sunt descrise câteva proceduri pentru realizarea testului bacterian de mutaţie inversă. Printre cele utilizate în mod curent sunt metoda de încorporare prin depunere (1) (2) (3) (4), metoda cu preincubare (2) (3) (5) (6) (7) (8), metoda fluctuaţiei (9) (10) şi metoda cu suspensie (11). Sunt descrise modificări pentru testarea substanţelor în stare gazoasă sau de vapori (12).
      În prezenta metodă se descrie modul de lucru pentru procedeul de încorporare prin depunere şi pentru cel cu preincubare. Oricare dintre acestea se poate accepta pentru realizarea experimentelor, atât cu activare metabolică, cât şi fără aceasta. Pentru unele substanţe, este mai eficientă detectarea prin procedeul cu preincubare. Substanţele respective aparţin unor clase chimice care includ nitrozamine alifatice cu lanţ scurt, metale bivalente, aldehide, coloranţi azoici şi diazoderivaţii, alcaloizi ai pirolizidinei, compuşi alchilici şi nitroderivaţi (3). De asemenea, se admite că unele clase de mutageni nu se detectează întotdeauna prin procedee standard, ca încorporarea prin depunere sau procedeul cu incubare. Ar trebui să se considere că acestea sunt „cazuri izolate” şi se recomandă cu tărie utilizarea unor procedee alternative pentru detectarea lor. Din categoria „cazuri izolate” este posibilă identificarea (împreună cu exemple de procedeele care se pot utiliza pentru detectarea acestora) a următoarelor cazuri: coloranţi azoici şi compuşi diazoici (3) (5) (6) (13), cei în stare gazoasă şi volatili (12) (14) (15) (16) şi glicozidele (17) (18). Orice deviaţie de la procedura standard necesită o justificare ştiinţifică.
      1.5.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.5.1.   Pregătire
      1.5.1.1.   Bacteriile
      Culturile proaspete de bacterii ar trebui lăsate să se dezvolte până la finalul fazei exponenţiale sau debutul fazei staţionare de creştere (aproximativ 109 celule pe ml). Culturile aflate în faza staţionară finală nu ar trebui să se utilizeze. Este esenţial ca în experiment să se utilizeze culturi cu titru mare de bacterii viabile. Titrul se poate determina, fie plecând de la datele anterioare privind curbele de creştere ale culturilor martor, fie pentru fiecare test, prin determinarea numărului de celule viabile prin etalare.
      Temperatura de incubare recomandată este de 37 oC.
      Se recomandă utilizarea a minimum cinci suşe de bacterii. Acestea ar trebui să includă patru suşe de S. typhimurium (TA 1535; TA 1537 sau TA97a sau TA97; TA98 şi TA100) pentru care comparaţiile între laboratoare au indicat că sunt fiabile şi dau răspunsuri reproductibile. Cele patru suşe de S. typhimurium menţionate posedă perechi de bază GC în primul situs de reversie şi se cunoaşte că acestea nu pot să detecteze anumiţi agenţi mutageni oxidanţi, agenţi de reticulare şi unele hidrazine. Detectarea acestor substanţe este posibilă cu ajutorul suşelor de E. coli WP2 sau de S. typhimurium TA102 (19) care posedă o pereche de bază AT în situsul primar de reversie. Combinaţia de suşe recomandată este, prin urmare, următoarea:
      
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA1535; şi
               
            
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA1537 sau TA97 sau TA97a; şi
               
            
                  —
               
               
                  S. typhimurium TA98; şi
               
            
                  —
               
               
                  S. typhimurium TA100; şi
               
            
                  —
               
               
                  
                     E. coli WP2 uvrA sau E. coli WP2 uvrA (pKM101) sau S. typhimurium TA102.
               
            Pentru detectarea agenţilor mutageni de reticulare s-ar putea prefera includerea suşei TA102 sau adăugarea unei suşe de E. coli capabile de regenerarea ADN [de exemplu E. coli WP2 sau E. coli WP2 (pKM101)].
      Ar trebui să se utilizeze procedurile stabilite pentru prepararea culturilor de rezervă, verificarea markerilor şi pentru păstrare. Pentru fiecare preparat de cultură de rezervă congelată, ar trebui să se demonstreze necesitatea prezenţei unui aminoacid pentru dezvoltarea culturii (histidină pentru suşele S. typhimurium şi triptofan pentru suşele E. coli). Ar trebui să se verifice şi alte caracteristici ale fenotipului, de exemplu: prezenţa sau absenţa plasmidelor factorului R (rezistenţă), dacă este cazul [și anume rezistenţa la ampicilină a suşelor TA98, TA100, TA97a sau TA97, WP2 uvrA şi WP2 uvrA (pKM101) şi rezistenţa la ampicilină + tetraciclină a suşei TA102]; prezenţa mutaţiilor caracteristice (și anume mutaţia rfa în S. typhimurium prin sensibilizare la cristal violet şi mutaţia uvrA în E. coli sau mutaţia uvrB în S. typhimurium prin sensibilizare la lumina ultravioletă) (2) (3). De asemenea, suşele ar trebui să producă un număr de colonii spontane de reversie pe fiecare placă, între limitele de frecvenţă estimate pe baza datelor de laborator anterioare şi, de preferinţă, între limitele semnalate în literatura de specialitate.
      1.5.1.2.   Mediul
      Se utilizează o geloză minimală corespunzătoare (de exemplu una care conţine mediu minimal E Vogel-Bonner şi glucoză) şi o geloză de acoperire care conţine histidină şi biotin sau triptofan pentru a permite divizarea doar a unui număr mic de celule (1) (2) (9).
      1.5.1.3.   Activarea metabolică
      Expunerea bacteriilor la substanţa de testat ar trebui să se realizeze atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem corespunzător de activare metabolică. Sistemul utilizat cel mai frecvent conţine o fracţie post mitocondrială îmbogăţită cu un cofactor (S9), preparată din ficat de rozătoare tratat cu agenţi de inducţie enzimatică, de exemplu Aroclor 1254 (1) (2) sau un amestec de fenobarbitonă şi β-naftoflavonă (18) (20) (21). Fracţia postmitocondrială se utilizează, de obicei, la concentraţii cuprinse între 5 şi 30 % v/v în amestecul S9. Alegerea şi compoziţia unui sistem de activare metabolică pot să depindă de clasa chimică a substanţei de testat. În unele cazuri, s-ar putea să fie convenabilă utilizarea mai multor concentraţii ale fracţiei postmitocondriale. Pentru coloranţii azoici şi diazoderivaţi, s-ar putea să fie mai potrivită utilizarea unui sistem de activare metabolică reducător (6) (13).
      1.5.1.4.   Substanţa de testat/Preparare
      Substanţele de testat în stare solidă ar trebui să se prepare sub formă de soluţii sau suspensii în solvenţii sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului bacteriilor. Substanţele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele de testare şi se diluează înainte de utilizare în tratamentul bacteriilor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanţă de testat, cu excepţia cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.
      Solventul/vehiculul nu ar trebui să reacţioneze chimic cu substanţa de testat şi nu ar trebui să afecteze supravieţuirea bacteriilor şi activitatea S9 (22). Utilizarea altor solvenţi/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos. Când se testează substanţe instabile în apă, solventul organic utilizat ar trebui să nu conţină apă.
      1.5.2.   Condiţii de testare
      1.5.2.1.   Suşele experimentale (a se vedea 1.5.1.1)
      1.5.2.2.   Concentraţia de expunere
      Printre criteriile care trebuie luate în consideraţie la determinarea cantităţii maxime de substanţă de testat ce urmează se utilizeze sunt citotoxicitatea şi solubilitatea în amestecul final de tratare.
      Ar putea fi util un test preliminar pentru determinarea toxicităţii şi caracteristicilor de solubilitate. Detectarea citotoxicităţii poate fi posibilă printr-o reducere a numărului de colonii care provoacă reversia, o clarificare şi diminuare a fondului de bacterii sau a gradului de supravieţuire a culturilor tratate. Prezenţa sistemelor de activare metabolică poate să influenţeze citotoxicitatea unei substanţe. Insolubilitatea ar trebui să fie evaluată prin formarea în amestecul final, în condiţii de testare reale, a unui precipitat vizibil cu ochiul liber.
      Concentraţia de testare maximă recomandată pentru substanţele necitotoxice solubile este de 5 mg/placă sau 5 μl/placă. Pentru substanţele necitotoxice insolubile la 5 mg/placă sau 5 μl/placă, una sau mai multe din concentraţiile de testare ar trebui să fie insolubile în amestecul final de tratament. Pentru substanţele de testat care sunt deja citotoxice la concentraţii mai mici de 5 mg/placă sau 5 μl/placă, testarea ar trebui să se realizeze până la o concentraţie citotoxică. Ar trebui ca precipitatul să nu interfereze cu evaluarea rezultatelor.
      Într-un test iniţial, se recomandă utilizarea unui număr minim de cinci concentraţii analizabile diferite, cu intervale între punctele de testare de aproximativ o semiunitate logaritmică (și anume √10). Pentru stabilirea unei relaţii concentraţie – răspuns, intervale menţionate mai reduse ar putea fi mai adecvate. Când se evaluează substanţe cu un conţinut substanţial de posibile impurităţi mutagene, s-ar putea avea în vedere testarea la concentraţii mai mari de 5 mg/placă sau 5 μl/placă.
      1.5.2.3.   Martorii negativi şi pozitivi
      Martorii pozitivi specifici suşei şi martorii negativi (solvent sau vehicul) utilizaţi în paralel, ar trebui să se includă în fiecare test, atât în prezenţa, cât şi în absenţa activării metabolice. Pentru martorii pozitivi, ar trebui să fie selectate acele concentraţii care permit să se demonstreze eficienţa testului realizat.
      Pentru testele care utilizează un sistem de activare metabolică, selectarea substanţei sau a substanţelor de referinţă pentru martorii pozitivi ar trebui să se realizeze în funcţie de tipul suşelor bacteriene utilizate.
      În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanţe care se pot utiliza ca martori pozitivi pentru testele cu activare metabolică:
      
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. EINECS
               
               
                  Substanţa
               
            
                  781-43-1
               
               
                  212-308-4
               
               
                  9,10-dimetilantracen
               
            
                  57-97-6
               
               
                  200-359-5
               
               
                  7,12-dimetilbenz[a]antracen
               
            
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
               
                  benzo[a]piren
               
            
                  613-13-8
               
               
                  210-330-9
               
               
                  2-aminoantracen
               
            
                  50-18-0
               
               
                   
               
               
                  ciclofosfamidă
               
            
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
               
                  ciclofosfamidă monohidrat
               
            Următoarea substanţă este un martor pozitiv adecvat pentru metoda de activare metabolică reductivă:
      
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  573-58-0
               
               
                  209-358-4
               
               
                  Roşu de Congo
               
            2-aminoantracenul nu ar trebui să se utilizeze ca indicator unic al eficienţei amestecului S9. Dacă se utilizează 2-aminoantracenul, fiecare lot de S9 ar trebui să fie, de asemenea, caracterizat cu un mutagen care necesită o activare metabolică de către enzimele microzomiale, de exemplu benzo[a]pirenul, dimetilbenzantracenul.
      În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanţe care se pot utiliza ca martori pozitivi specifici suşei pentru testele realizate fără un sistem de activare metabolică exogenă:
      
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. EINECS
               
               
                  Substanţa
               
               
                  Suşa
               
            
                  26628-22-8
               
               
                  247-852-1
               
               
                  azidă de sodiu
               
               
                  TA 1535 şi TA 100
               
            
                  607-57-8
               
               
                  210-138-5
               
               
                  2-nitrofluoren
               
               
                  TA 98
               
            
                  90-45-9
               
               
                  201-995-6
               
               
                  9-aminoacridină
               
               
                  TA 1537, TA 97 şi TA 97a
               
            
                  17070-45-0
               
               
                  241-129-4
               
               
                  ICR 191
               
               
                  TA 1537, TA 97 şi TA 97a
               
            
                  80-15-9
               
               
                  201-254-7
               
               
                  hidroperoxid de cumenă
               
               
                  TA 102
               
            
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
               
                  mitomicin C
               
               
                  WP2 uvrA şi TA 102
               
            
                  70-25-7
               
               
                  200-730-1
               
               
                  N-etil-N-nitro-N-nitrozoguanidină
               
               
                  WP2, WP2 uvrA şi WP2uvrA(pKM101)
               
            
                  56-57-5
               
               
                  200-281-1
               
               
                  4-nitrochinolină-1-oxid
               
               
                  WP2, WP2 uvrA şi WP2uvrA(pKM101)
               
            
                  3688-53-7
               
               
                   
               
               
                  furilfuramidă (AF2)
               
               
                  suşe cu conţinut de plasmid
               
            Se pot utiliza şi alte substanţe de referinţă ca martori pozitivi corespunzători. Ar trebui să se aibă în vedere utilizarea unor martori pozitivi din aceeaşi clasă chimică, dacă sunt disponibili.
      Ar trebui să se utilizeze martori negativi, constituiţi din solvent sau vehicul fără substanţa de testat, dar trataţi în acelaşi mod ca grupele cu tratament. În plus, ar trebui să se utilizeze şi martori netrataţi, cu excepţia cazului în care există date din testele anterioare care să ateste că solventul ales nu are efecte dăunătoare sau mutagene.
      1.5.3.   Mod de lucru
      Pentru metoda de încorporare prin depunere pe o placă (1) (2) (3) (4), fără activare metabolică, se prepară, de obicei, un amestec din 0,05 ml sau 0,1 ml de soluţie de testat, 0,1 ml de cultură bacteriană proaspătă (ce conţine aproximativ 108 celule viabile) şi 0,5 ml de tampon steril cu 2,0 ml geloză de acoperire (agar). Pentru testul cu activare metabolică, se prepară, de obicei, un amestec din 0,5 ml preparat de activare metabolică, ce conţine o cantitate specifică de fracţie postmitocondrială (în proporţie de 5 până la 30 % v/v în preparatul de activare metabolică), 2,0 ml de geloză de acoperire, bacterii şi substanţa de testat/soluţia de testat. Conţinutul din fiecare eprubetă se agită şi se toarnă pe suprafaţa unui mediu minimal de geloză depus pe placă. Geloza de acoperire se lasă să se solidifice înainte de incubare.
      Pentru metoda de preincubare (2) (3) (5) (6), substanţa de testat/soluţia de testat se supune la preincubare împreună cu suşa experimentală (ce conţine aproximativ 108 celule viabile) şi cu tamponul steril sau sistemul de activare metabolică (0,5 ml) de obicei timp de 20 de minute sau mai mult, la 30-37 oC, înainte de a fi amestecată cu geloza de acoperire şi turnată pe suprafaţa unui mediu minimal de geloză depus pe placă. De obicei, se prepară un amestec din 0,05 ml sau 0,1 ml de substanţă de testat/soluţie de testat, 0,1 ml bacterii şi 0,5 ml amestec S9 sau tampon steril cu 2,0 ml geloză de acoperire. Eprubetele ar trebui să fie aerate cu ajutorul unui agitator în timpul preincubării.
      Pentru o bună estimare a variaţiei, ar trebui să se utilizeze câte trei plăci cu depuneri pentru fiecare doză. Se acceptă utilizarea a doar două plăci cu depuneri, dacă se justifică ştiinţific acest lucru. Pierderea ocazională a unei plăci nu invalidează în mod necesar testul.
      Substanţele în stare gazoasă sau cele volatile ar trebui să fie testate în condiţii corespunzătoare, de exemplu în vase închise ermetic (12) (14) (15) (16).
      1.5.4.   Incubarea
      Toată plăcile dintr-un test dat ar trebui să fie incubate la 37 oC timp de 48-72 de ore. După incubare, se procedează la numărătoarea coloniilor care provoacă reversia de pe fiecare placă.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Datele ar trebui să se prezinte sub forma numărului de colonii care provoacă reversia de pe fiecare placă. De asemenea, ar trebui să se prezinte numărul de colonii care provoacă reversie, atât pe plăcile cu martor negativ (martor solvent şi martor netratat, dacă s-a utilizat), cât şi pentru plăcile cu martor pozitiv. Ar trebui să se prezinte numărătoarea pentru fiecare placă, numărul mediu de colonii care provoacă reversia pentru fiecare placă şi deviaţia standard pentru substanţa de testat şi pentru martorii pozitivi şi negativi (netrataţi şi solvent).
      Nu este necesară verificarea unui răspuns clar pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferinţă prin modificarea uneia dintre condiţiile de testare. Rezultatele negative necesită confirmare pentru fiecare caz. În cazurile în care se consideră că nu este necesară confirmarea rezultatelor negative, ar trebui să se ofere o justificare. Pentru testele de confirmare ar trebui să se aibă în vedere modificarea condiţiilor de testare pentru lărgirea gamei de condiţii evaluate. Condiţiile de testare care ar putea fi modificate includ diferenţa dintre concentraţii, metoda de tratament (încorporarea prin depunere pe placă sau preincubarea în mediu lichid) şi condiţiile de activare metabolică.
      2.2.   EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, precum creşterea în funcţie de concentraţie peste intervalul testat şi o creştere reproductibilă a uneia sau mai multor concentraţii ale numărului de colonii care provoacă reversia per placă, la cel puţin o suşă cu sau fără sistem de activare metabolică (23). În primul rând ar trebui să se aibă în vedere relevanţa biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge şi la ajutorul unor metode statistice (24). Semnificaţia statistică nu ar trebui să fie totuşi singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv.
      Dacă rezultatele pentru o substanţă de testat nu îndeplinesc criteriile menţionate anterior, substanţa respectivă se consideră a fi nemutagenă în prezentul test.
      Deşi majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanţei de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile, independent de numărul de experimente.
      Rezultatele pozitive ale unui test de mutaţie bacteriană inversă indică faptul că substanţa de testat induce mutaţii punctiforme prin substituirea bazelor sau decalarea cadrului de citire în genomul de Salmonella typhimurium şi/sau Escherichia coli. Rezultatele negative indică faptul că, în condiţii de testare, substanţa de testat nu este mutagenă pentru speciile testate.
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  
                     Solventul/vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea şi stabilitatea substanţei de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaşte.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Suşele:
                  
                              —
                           
                           
                              suşele utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule per cultură;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              caracteristicile suşei.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              cantitatea de substanţă de testat per placă (mg/placă sau μl/placă) cu justificarea alegerii dozei şi numărului de plăci per concentraţie;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mediile utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tipul şi compoziţia sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              procedurile de tratament.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              semnele de precipitare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărătoarea pentru fiecare placă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul mediu de colonii care provoacă reversia pentru fiecare placă şi deviaţia standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analizele statistice, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi studiaţi în paralel, cu domenii, valori medii şi deviaţii standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi studiaţi anterior, cu domenii, valori medii şi deviaţii standard.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364.
               
            
                  2.
               
               
                  Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215.
               
            
                  3.
               
               
                  Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233.
               
            
                  4.
               
               
                  Kier, L. D., Brusick, D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69-240.
               
            
                  5.
               
               
                  Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, pp. 91-96.
               
            
                  6.
               
               
                  Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273-285.
               
            
                  7.
               
               
                  Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61.
               
            
                  8.
               
               
                  Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, pp. 167-177.
               
            
                  9.
               
               
                  Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutations Res., 38, pp. 33-42.
               
            
                  10.
               
               
                  Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and J. W. Bridges (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161.
               
            
                  11.
               
               
                  Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453-465.
               
            
                  12.
               
               
                  Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335-344.
               
            
                  13.
               
               
                  Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33-47.
               
            
                  14.
               
               
                  Zeiger, E., Anderson B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2-141.
               
            
                  15.
               
               
                  Simmon, V., Kauhanen K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258.
               
            
                  16.
               
               
                  Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421-441.
               
            
                  17.
               
               
                  Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M. and Sugimura T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salomonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780-3782.
               
            
                  18.
               
               
                  Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965.
               
            
                  19.
               
               
                  Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285-291.
               
            
                  20.
               
               
                  Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88.
               
            
                  21.
               
               
                  Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Tatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.
               
            
                  22.
               
               
                  Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343-350.
               
            
                  23.
               
               
                  Claxton, L. D., Allen J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83-91.
               
            
                  24.
               
               
                  Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchell, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, pp. 28-65.
               
            B.15.   TESTE DE MUTAGENEZĂ ŞI DE DEPISTARE A CANCEROGENEZEI MUTAŢIA GENICĂ – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
      
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢIE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Pentru a măsura producerea mutaţiilor genice induse de agenţi chimici, cu sau fără activare metabolică, pot fi folosite diverse suşe haploide şi diploide ale drojdiei Saccharomyces cerevisiae.
      Au fost utilizate metode de producere a mutaţiilor directe în suşe haploide, cum ar fi măsurarea transformării din mutanţi roşii, care au nevoie de adenină (ade-1, ade-2), în mutanţi albi cu nevoi duble de adenină, şi metode selective cum ar fi inducerea rezistenţei la canavnaină şi cicloheximidă.
      Cel mai folosit sistem de mutaţie inversă validat presupune folosirea suşei haploide XV 185-14C, care conţine mutaţii nonsens de codon ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 şi trp 5-48, reversibile prin acţiunea agenţilor mutageni responsabili de substituţia de bază, care induc mutaţii într-un situs specific sau mutaţii supresive de codon. Suşa XV 185-14C conţine, de asemenea, markerul his 1-7 cu o mutaţie cu sens greşit inversată, în special prin mutaţii în al doilea situs, şi markerul hom 3-10 care este inversat de agenţi mutageni care conduc la decalarea cadrului de citire a codului genetic (frameshift mutagens).
      Dintre suşele diploide de Saccharomyces cerevisiae, singura suşă folosită pe scară largă este D7, care este homozigotă pentru ilv 1-92.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      Pregătire
      Soluţiile substanţelor de testare, precum şi soluţiile martor trebuie să fie preparate imediat înaintea testării, utilizându-se un vehicul corespunzător. În cazul compuşilor organici insolubili în apă, trebuie să se utilizeze soluţii de cel mult 2 % v/v solvenţi organici cum ar fi etanolul, acetona sau dimetilsulfoxidul (DMSO). Concentraţia finală a vehiculului nu trebuie să afecteze semnificativ viabilitatea celulară şi caracteristicile de creştere.
      
         Activare metabolică
      
      Celulele trebuie expuse la substanţele de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem exogen de activare metabolică.
      Cel mai utilizat sistem este o fracţiune postmitocondrială suplimentată cu un cofactor preparat din ficatul de rozătoare tratate cu inductori enzimatici. Pentru activarea metabolică, pot fi folosite şi alte specii, ţesuturi, fracţiuni postmitocondriale sau alte metode.
      Condiţii de testare
      
         Suşe testate
      
      Suşele cel mai des utilizate în studiile de mutageneză sunt suşa haploidă XV 185-14C şi suşa diploidă D7. Se pot utiliza şi alte suşe.
      
         Medii de cultură
      
      Pentru stabilirea numărului de colonii supravieţuitoare şi mutante sunt utilizate medii de cultură corespunzătoare.
      
         Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi
      
      Martorii pozitivi, cei netrataţi şi cei trataţi cu solvent trebuie preparaţi simultan. Pentru fiecare mecanism mutagen specific se folosesc substanţe martor pozitiv adecvate.
      
         Concentraţia de expunere
      
      Trebuie folosite cel puţin cinci concentraţii ale substanţei de testat, cu intervale corespunzătoare între acestea. În cazul substanţelor toxice, cea mai mare concentraţie testată nu trebuie să reducă supravieţuirea la mai puţin de 5-10 %. Substanţele relativ insolubile în apă se testează până la limita de solubilitate, folosindu-se metode adecvate. Pentru substanţele netoxice cu un grad ridicat de solubilitate în apă, limita superioară a concentraţiei se determină de la caz la caz.
      
         Condiţii de incubare
      
      Cutiile se incubează timp de 4-7 zile, la o temperatură de 28-30 oC, la întuneric.
      
         Frecvenţele mutaţiilor spontane
      
      Se folosesc subculturi celulare cu o frecvenţă a mutaţiilor spontane în limitele normale admise.
      
         Numărul replicilor
      
      Pentru analiza prototrofilor produşi prin mutageneză şi a viabilităţii celulare se utilizează cel puţin trei replici pentru fiecare concentraţie. În cazul experimentelor în care se utilizează markeri cum ar fi hom 3-10 cu o rată scăzută a mutaţiilor, numărul replicilor trebuie să crească, astfel încât să se poată obţină rezultate relevante din punct de vedere statistic.
      Mod de operare
      Tratamentul suşelor de Saccharomyces cerevisiae se realizează de obicei printr-o metodă de testare în lichid, care presupune utilizarea fie de celule staţionare, fie de celule în creştere. Experimentele iniţiale trebuie realizate pe celule în creştere: 1-5 × 107 celule/ml sunt expuse la substanţa chimică de testat pe o perioadă de 18 ore, la o temperatură de 28-37 oC, cu agitare; dacă este necesar; pe parcursul expunerii, se adaugă o cantitate corespunzătoare de sistem de activare metabolică. La sfârşitul tratamentului, celulele sunt centrifugate, spălate şi însămânţate pe un mediu de cultură potrivit. După incubare, plăcile sunt inventariate în vederea stabilirii ratei de supravieţuire şi a mutaţiilor genice produse. Dacă primul experiment este negativ, trebuie realizat un al doilea experiment, folosind celule în fază staţionară. Dacă primul experiment este pozitiv, acesta trebuie confirmat printr-un experiment independent adecvat.
      2.   DATE
      Datele se prezintă într-un tabel, indicându-se numărul coloniilor, numărul mutanţilor, nivelul de supravieţuire şi frecvenţa mutanţilor. Toate rezultatele trebuie confirmate printr-un experiment independent. Toate rezultatele observate se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  suşele folosite;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare: celule în faza staţionară sau celule în creştere, compoziţia mediilor de cultură, temperatura de incubare şi durata acesteia, sistemul de activare metabolică;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de tratament: niveluri de expunere, metoda şi durata tratamentului, temperatura la care se realizează tratamentul, martori pozitivi şi negativi;
               
            
                  —
               
               
                  numărul coloniilor, numărul mutanţilor, nivelul de supravieţuire şi frecvenţa mutanţilor, relaţia doză/răspuns (după caz), evaluarea statistică a datelor;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.16.   RECOMBINAREA MITOTICĂ – SACCHAROMYCES CEREVISIAE
      
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢIE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      La Saccharomyces cerevisiae se poate decela recombinarea mitotică intergenică (sau, mai general, între o genă şi centromerul său) şi intragenică. Prima situaţie este denumită crossing-over mitotic şi dă naştere unor schimburi reciproce de material genetic, în timp ce a doua situaţie, în care schimburile sunt, cel mai adesea, nereciproce, este denumită conversie genică. Crossing-over-ul se determină, în general, prin producerea de colonii homozigote recesive sau sectoare produse într-o suşă heterozigotă, în timp ce conversia genică se determină prin producerea de revertanţi prototrofici într-o suşă auxotrofică heteroalelică, purtătoare a două alele defective diferite ale aceleiaşi gene. Suşele cele mai folosite la decelarea conversiei genice mitotice sunt D4 (heteroalelică la ade 2 şi trp 5), D7 (heteroalelică la trp 5), BZ34 (heteroalelică la arg 4) şi JD1 (heteroalelică la his 4 şi trp 5). Crossing-over-ul mitotic care produce sectoare homozigote roşu şi roz poate fi analizat în D5 sau în D7 (care măsoară, de asemenea, conversia genică mitotică şi mutaţia inversă la ilv 1-92), ambele suşe fiind heteroalelice pentru alelele complementare ale ade 2.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      Pregătire
      Soluţiile substanţelor chimice de testat şi ale compuşilor martor sau de referinţă trebuie preparate chiar înaintea testării, folosind un vehicul corespunzător. În cazul compuşilor organici insolubili în apă, trebuie utilizate soluţii de cel mult 2 % v/v de solvenţi organici cum ar fi etanolul, acetona sau dimetilsulfoxidul (DMSO). Concentraţia finală a vehiculului nu trebuie să afecteze semnificativ viabilitatea celulară şi caracteristicile de creştere.
      
         Activare metabolică
      
      Celulele trebuie să fie expuse la substanţele chimice de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem exogen adecvat de activare metabolică. Sistemul folosit cel mai des este o fracţiune postmitocondrială suplimentată cu un cofactor preparat din ficatul de rozătoare tratate cu inductori enzimatici. Pentru activarea metabolică pot fi utilizate şi alte specii, ţesuturi, fracţiuni postmitocondriale sau alte metode.
      Condiţiile de testare
      
         Suşe testate
      
      Suşele cel mai frecvent utilizate sunt cele diploide D4, D5, D7 şi JD1. Pot fi utilizate şi alte suşe.
      
         Medii de cultură
      
      Pentru a determina nivelul de supravieţuire şi frecvenţa recombinărilor mitotice se utilizează medii de cultură adecvate.
      
         Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi
      
      Martorii pozitivi, cei netrataţi şi cei trataţi cu solvent, trebuie preparaţi simultan. Pentru fiecare tip specific de recombinare se folosesc substanţe martor pozitiv adecvate.
      
         Concentraţii de expunere
      
      Trebuie realizate cel puţin cinci concentraţii ale substanţei de testat, cu intervale corespunzătoare între acestea. Printre factorii care trebuie luaţi în considerare se numără citotoxicitatea şi solubilitatea. Concentraţia minimă nu trebuie să afecteze viabilitatea celulară. În cazul substanţelor toxice, cea mai mare concentraţie testată nu trebuie să reducă supravieţuirea la mai puţin de 5-10 %. Substanţele relativ insolubile în apă trebuie să fie testate până la limita solubilităţii, folosindu-se metode adecvate. În cazul substanţelor netoxice cu un grad ridicat de solubilitate în apă, limita superioară a concentraţiei se determină de la caz la caz.
      Celulele pot fi expuse la substanţele chimice de testat fie în faza staţionară, fie în faza creşterii, pentru perioade de până la 18 ore. În cazul perioadelor lungi de tratament, culturile trebuie studiate microscopic în vederea decelării formării sporilor, prezenţa acestora invalidând testul.
      
         Condiţii de incubare
      
      Plăcile se incubează între 4 şi 7 zile la o temperatură de 28-30 oC, la întuneric. Plăcile utilizate pentru determinarea sectoarelor homozigote roşu şi roz produse prin crossing-over mitotic se păstrează în frigider la aproximativ 4 oC timp de una-două zile înaintea numărării, pentru a permite dezvoltarea de colonii pigmentate corespunzătoare.
      
         Frecvenţele recombinării mitotice spontane
      
      Se utilizează subculturi cu o frecvenţă a mutaţiilor spontane care se situează în limitele normale admise.
      
         Numărul replicilor
      
      Se utilizează cel puţin trei plăci pe concentraţie pentru analiza prototrofilor produşi prin conversia genică mitotică şi pentru analiza viabilităţii. În cazul analizei homozigotismului recesiv produs prin crossing-over mitotic, numărul plăcilor trebuie să crească, astfel încât să furnizeze un număr corespunzător de colonii.
      Mod de operare
      Tratamentul suşelor de Saccharomyces cerevisiae se realizează de obicei printr-o metodă de testare în lichid, care presupune utilizarea fie de celule staţionare, fie de celule în creştere. Experimentele iniţiale trebuie realizate pe celule în creştere. 1-5 × 107 celule/ml sunt expuse la substanţa chimică de testat pe o perioadă de 18 ore, la o temperatură de 28-37 oC, cu agitare; după caz, pe parcursul tratamentului, se adaugă o cantitate corespunzătoare de sistem de activare metabolică.
      La sfârşitul tratamentului celulele sunt centrifugate, spălate şi însămânţate pe un mediu de cultură potrivit. După incubare, plăcile sunt examinate în vederea stabilirii nivelului de supravieţuire şi inducerea recombinării mitotice.
      Dacă primul experiment este negativ, trebuie realizat un al doilea experiment în care se utilizează celule în fază staţionară. Dacă primul experiment este pozitiv, acesta trebuie confirmat printr-un experiment independent corespunzător.
      2.   DATE
      Datele se prezintă sub formă de tabele în care se indică numărul coloniilor numărate, numărul recombinanţilor, nivelul de supravieţuire şi frecvenţa recombinanţilor.
      Toate rezultatele trebuie confirmate printr-un experiment independent.
      Datele se evaluează prin metode statistice corespunzătoare.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  suşele folosite;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare: celule în faza staţionară sau în faza de creştere, compoziţia mediilor de cultură, temperatura de incubare şi durata acesteia, sistemul de activare metabolică;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de tratament: concentraţiile de expunere, procedura şi durata tratamentului, temperatura la care se realizează tratamentul, martorii pozitivi şi negativi;
               
            
                  —
               
               
                  numărul coloniilor, numărul recombinanţilor, nivelul de supravieţuire şi frecvenţa recombinării, relaţia doză/răspuns (după caz), evaluarea statistică a datelor;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.17.   MUTAGENITATEA – TEST IN VITRO DE MUTAŢIE GENICĂ PE CELULE DE MAMIFERE
      1.   METODĂ
      Prezenta metodă este reprodusă după Orientarea 476 a OCDE, Testul in vitro de mutaţie genică pe celule de mamifere (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Testul in vitro de mutaţie genică pe celule de mamifere se poate utiliza pentru detectarea mutaţiilor genice produse de substanţele chimice. Liniile celulare corespunzătoare conţin celule de limfom de şoarece L5178Y, liniile CHO, CHO-AS52 şi V79 de celule de hamster chinezesc şi celule limfoblastoide umane TK6 (1). În liniile celulare menţionate, efectele genetice cel mai frecvent măsurate sunt o mutaţie în poziţiile timidin kinază (TK) şi hipoxantin-guanină fosforibozil transferază (HPRT), precum şi o transgenă de xantin-guanină fosforibozil transferază (XPRT). Testele de mutaţie TK, HPRT şi XPRT permit detectarea diferitelor spectre ale diferitelor fenomene genetice. Amplasarea autozomică a TK şi XPRT poate să permită detectarea fenomenelor genetice (de exemplu deleţii importante) care nu sunt detectate în locusul HPRT la cromozomii X (2) (3) (4) (5) (6).
      În testul in vitro de mutaţie genică pe celule de mamifere, se pot utiliza culturi de linii celulare stabilite sau suşe celulare. Celule utilizate se selectează în funcţie de capacitatea de creştere în cultură şi de stabilitatea frecvenţei de mutaţie spontană.
      Testele realizate in vitro necesită, în general, utilizarea unei surse exogene de activare metabolică. Sistemul de activare metabolică de acest tip nu poate să reproducă integral condiţiile celulelor de mamifere in vivo. Ar trebui să se acorde atenţie evitării condiţiilor care ar putea să conducă la obţinerea unor rezultate care nu reflectă o mutagenitate intrinsecă. Rezultatele pozitive care reflectă o mutagenitate intrinsecă ar putea să provină în urma modificărilor de pH, de osmolalitate sau din valori mari ale citotoxicităţii (7).
      Prezentul test se utilizează la depistarea substanţelor cu posibile efecte mutagene şi cancerigene pentru mamifere. Mulţi compuşi care dau rezultate pozitive la acest test sunt cancerigeni pentru mamifere; cu toate acestea, nu există o corelaţie perfectă între prezentul test şi cancerigenicitate. Corelaţia depinde de clasa chimică şi sunt tot mai multe dovezi cu privire la existenţa unor agenţi cancerigeni care nu se depistează prin prezentul test, deoarece este posibil ca aceştia să acţioneze prin alte mecanisme, negenotoxice sau mecanisme absente în celulele bacteriene (6).
      A se vedea şi introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Mutaţie directă: o mutaţie a genelor de la forma originală la forma mutantă care generează o reducere a activităţii enzimatice din funcţia proteinei codificate.
      
         Mutageni care provoacă substituţia perechilor de bază: substanţe care produc substituţia uneia sau mai multor perechi de bază din ADN.
      
         Mutageni de decalare a cadrului de citire: substanţe care produc adăugarea sau deleţia uneia sau a mai multor perechi de bază din molecula de ADN.
      
         Timpul de manifestare a fenotipului: timpul în care produsele nemodificate ale genelor sunt epuizate din celulele care au suferit o nouă mutaţie.
      
         Frecvenţa mutantului: numărul de celule mutante observate împărţit la numărul de celule viabile.
      
         Creştere totală relativă: creşterea numărului de celule în timp, în raport cu populaţia de celule martor; se calculează ca produsul dintre creşterea în suspensie în raport cu martorul negativ şi eficacitatea clonării în raport cu martorul negativ.
      
         Creştere relativă în suspensie: creşterea numărului de celule în timpul de manifestare în raport cu martorul negativ.
      
         Viabilitate: eficacitatea clonării celulelor tratate în momentul depunerii pe placă în condiţii selective după perioada de manifestare.
      
         Supravieţuire: eficacitatea clonării celulelor tratate atunci când sunt depuse pe placă la încheierea perioadei de tratament; supravieţuirea se exprimă în raport cu supravieţuirea populaţiei de celule martor.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Celulele cu deficit de timidin chinază (TK) datorită mutaţiei TK+/- → TK-/- sunt rezistente la efectele citotoxice ale trifluorotimidinei (TFT), un analog al pirimidinei. Celulele care posedă timidin chinază sunt sensibile la TFT, care produce inhibarea metabolismului celular şi întrerupe diviziunea celulară. Prin urmare, celulele mutante pot să prolifereze în prezenţa TFT, în timp ce celulele normale, care conţin timidin chinază, nu pot. În mod similar, celulele cu deficit de HPRT sau XPRT sunt selectate în funcţie de rezistenţa la 6-tioguanină (TG) sau 8-azaguanină (AG). Dacă analogul unei baze sau un compus înrudit cu agentul selectiv este supus la unul din testele de mutaţie genică pe celule de mamifere, proprietăţile substanţei de testat trebuie studiate cu grijă. De exemplu, ar trebui să se examineze substanţa de testat suspectată de toxicitate selectivă pentru celule mutante şi nemutante. În consecinţă, performanţa sistemului/agentului de selecţie trebuie să fie confirmată atunci când se testează substanţe chimice cu o structură apropiată de cea a agentului selectiv (8).
      Celulele în suspensie sau în cultură monostrat se expun o perioadă de timp corespunzătoare la substanţa de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa activării metabolice şi se reînsămânţează pentru determinarea citotoxicităţii şi pentru a permite manifestarea fenotipului înaintea selecţiei mutantului (9) (10) (11) (12) (13). Citotoxicitatea se determină, de obicei, prin măsurarea eficacităţii clonării relative (supravieţuirii) sau a creşterii totale relative a culturilor după perioada de tratament. Culturile tratate sunt menţinute în mediul de cultură un timp suficient, caracteristic pentru fiecare locus şi tip de celulă selectate, pentru a permite o manifestare fenotipică aproape optimă a mutaţiilor induse. Frecvenţa mutanţilor se determină prin însămânţarea unui număr cunoscut de celule într-un mediu ce conţine agentul selectiv pentru a detecta celulele mutante şi într-un mediu fără agent selectiv pentru a determina eficacitatea clonării (viabilitatea). După un timp corespunzător de incubare, se numără coloniile. Frecvenţa mutantului se determină prin compararea numărului de colonii de mutanţi în mediul selectiv cu numărul de colonii în mediul neselectiv.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Pregătire
      1.4.1.1.   Celulele
      Există diferite tipuri de celule care se pot utiliza în prezentul test, inclusiv subclonele de celule L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 sau TK6. Tipurile de celule utilizate în prezentul test ar trebui să aibă o sensibilitate dovedită la mutageni chimici, o eficacitate mare de clonare şi o frecvenţă de mutaţie spontană stabilă. Ar trebui să se verifice contaminarea cu micoplasmă a celulelor şi, dacă se constată că sunt contaminate, nu ar trebui să se utilizeze.
      Testul ar trebui conceput astfel încât să aibă o sensibilitate şi putere predeterminate. Numărul de celule, culturi şi concentraţiile substanţei de testat utilizate ar trebui să reflecte parametrii definiţi anterior (14). Numărul minim de celule viabile care supravieţuiesc tratamentului şi se utilizează în fiecare stadiu al testului ar trebui să fie în funcţie de frecvenţa mutaţiei spontane. O regulă generală constă în utilizarea unui număr de celule cel puţin egal cu de 10 ori inversul frecvenţei de mutaţie spontană. Cu toate acestea, se recomandă utilizarea a minimum 106 celule. Pentru a asigura o performanţă constantă a testului, ar trebui să se dispună de date anterioare specifice privind sistemul celular utilizat.
      1.4.1.2.   Mediile şi condiţiile de cultură
      Se recomandă utilizarea mediilor de cultură şi a condiţiilor de incubare (vasele de cultură, temperatura, concentraţia CO2 şi umiditatea) corespunzătoare. Alegerea mediilor ar trebui să se facă în funcţie de sistemele selective şi de tipul celulelor utilizate în test. O importanţă deosebită o prezintă alegerea condiţiilor de cultură, astfel încât să asigure creşterea optimă a celulelor în perioada de manifestare şi capacitatea celulelor, atât mutante, cât şi nemutante, de a forma colonii.
      1.4.1.3.   Prepararea culturilor
      Celulele se obţin plecând de la culturile de rezervă, se însămânţează în mediul de cultură şi se incubează la 37 oC. Înainte de a fi utilizate în prezentul test, este necesară curăţarea culturilor de celulele mutante preexistente.
      1.4.1.4.   Activarea metabolică
      Se recomandă ca expunerea celulelor la substanţa de testat să se realizeze atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem de activare metabolică corespunzător. Sistemul cel mai frecvent utilizat este o fracţie postmitocondrială la care s-au adăugat cofactori (S9), preparată din ficat de rozătoare tratat cu agenţi de inducţie enzimatică, de exemplu Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) sau un amestec de fenobarbitonă şi β-naftoflavonă (19) (20).
      Fracţia post-mitocondrială se utilizează, de obicei, la concentraţii cuprinse între limitele 1-10 % v/v în mediul de testare final. Selectarea şi tipul unui sistem de activare metabolică poate să depindă de clasa chimică a substanţei de testat. În unele cazuri, ar putea fi convenabilă utilizarea mai multor concentraţii ale fracţiei postmitocondriale.
      O serie de realizări, inclusiv crearea prin inginerie genetică a unor linii celulare care exprimă enzime activatoare specifice, pot să furnizeze potenţialul pentru o activare endogenă. Alegerea liniilor celulare ar trebui să fie justificată din punct de vedere ştiinţific (de exemplu prin importanţa izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul substanţei de testat).
      1.4.1.5.   Substanţa de testat/Preparare
      Substanţele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluţii sau suspensii în solvenţii sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului celulelor. Substanţele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele de testare şi se diluează înainte de utilizare în tratamentul celulelor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanţă de testat, cu excepţia cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora la păstrare.
      1.4.2.   Condiţii de testare
      1.4.2.1.   Solventul/vehiculul
      Solventul/vehiculul ar trebui să fie ales astfel încât să nu existe suspiciunea reacţiei chimice a acestuia cu substanţa de testat şi să nu afecteze negativ supravieţuirea celulelor şi activitatea S9. Utilizarea altor solvenţi/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să se justifice cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere un solvent/vehicul apos. La testarea substanţelor instabile în apă, solventul organic utilizat nu ar trebui să conţină urme de apă. Apa se poate elimina prin adăugarea unei site moleculare.
      1.4.2.2.   Concentraţiile de expunere
      Printre criteriile ce trebuie să fie avute în vedere la determinarea dozei maxime sunt citotoxicitatea, solubilitatea în sistemul de testare şi modificările de pH sau osmolalitate.
      Citotoxicitatea ar trebui să se determine cu şi fără activare metabolică în experimentul principal, utilizând un indicator corespunzător al integrităţii şi dezvoltării celulare, ca eficacitatea clonării relative (supravieţuirea) sau creşterea totală relativă. Ar putea fi utilă determinarea citotoxicităţii şi solubilităţii într-un experiment preliminar.
      Ar trebui să se utilizeze cel puţin patru concentraţii analizabile. Dacă o substanţă este citototoxică, concentraţiile respective ar trebui să acopere un domeniu de toxicităţi de la maximă la mică sau lipsa toxicităţii; aceasta semnifică, de obicei, concentraţii care ar trebui să fie separate printr-un factor cuprins între 2 şi √10 maximum. Dacă, datorită citotoxicităţii, concentraţia este maximă, ar trebui să determine un procent de supravieţuire relativă (eficacitatea relativă a clonării) sau o creştere totală relativă de aproximativ 10-20 % (dar nu mai puţin de 10 %). Pentru substanţele relativ necitotoxice, concentraţia de testare maximă ar trebui să fie cea mai mică dintre următoarele trei concentraţii: 5 mg/ml, 5 μl/ml sau 1,01 M.
      Substanţele relativ insolubile ar trebui să fie testate la concentraţii egale sau superioare limitei de solubilitate în condiţiile de cultură. Insolubilitatea ar trebui să fie pusă în evidenţă în mediul final de tratament în care se expun celulele. Ar putea fi utilă evaluarea solubilităţii la începutul şi la sfârşitul tratamentului, deoarece solubilitatea poate să varieze în timpul expunerii în sistemul de testare datorită prezenţei celulelor, S9, serului etc. Insolubilitatea se poate constata cu ochiul liber. Ar trebui ca precipitarea să nu interfereze cu determinarea rezultatelor.
      1.4.2.3.   Martorii
      În fiecare experiment, ar trebui să se includă simultan martorii pozitivi şi negativi (solvent şi vehicul), atât cu, cât şi fără activare metabolică. În prezenţa activării metabolice, substanţa utilizată ca martor pozitiv ar trebui să fie aceea care necesită activare pentru a da un răspuns mutagen.
      În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanţe utilizate ca martori pozitivi:
      
                  Tipul activării
               
               
                  Poziţia
               
               
                  Substanţa
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. EINECS
               
            
                  Absenţa activării metabolice exogene
               
               
                  HPRT
               
               
                  Metansulfonat de etil
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  Etil nitrozouree
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  TK (colonii mici şi mari)
               
               
                  Metansulfonat de metil
               
               
                  66-27-3
               
               
                  200-625-0
               
            
                  XPRT
               
               
                  Metansulfonat de etil
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  Etil nitrozouree
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  Prezenţa activării metabolice exogene
               
               
                  HPRT
               
               
                  3-metilcolantren
               
               
                  56-49-5
               
               
                  200-276-4
               
            
                  N-nitrozodimetilamină
               
               
                  62-75-9
               
               
                  200-549-8
               
            
                  7,12-dimetilbenzantracen
               
               
                  57-97-6
               
               
                  200-359-5
               
            
                  TK (colonii mici şi mari)
               
               
                  Ciclofosfamidă
               
               
                  50-18-0
               
               
                  200-015-4
               
            
                  Ciclofosfamidmonohidrat
               
               
                  6055-19-2
               
               
                   
               
            
                  Benzo[a]piren
               
               
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
            
                  3-metilcolantren
               
               
                  56-49-5
               
               
                  200-276-5
               
            
                  XPRT
               
               
                  N-nitrozodimetilamină (pentru valori mari ale S9)
               
               
                  62-75-9
               
               
                  200-549-8
               
            
                  Benzo[a]piren
               
               
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
            Se pot utiliza şi alte substanţe corespunzătoare ca martori pozitivi, de exemplu se poate utiliza 5-bromo 2'-dezoxiuridina (nr. CAS 59-14-3, nr. EINECS 200-415-9), dacă laboratorul dispune de o bază de date anterioare privind această substanţă. Ar trebui să se aibă în vedere utilizarea ca martori pozitivi a unor substanţe din aceeaşi clasă chimică, dacă sunt disponibile.
      Ca martori negativi ar trebui să se utilizeze solvenţi sau vehicule singure în mediul de tratare, care se tratează în acelaşi condiţii ca şi culturile. În plus, ar trebui să se utilizeze şi martori netrataţi, cu excepţia cazului în care există date din testele anterioare care să ateste că solventul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene.
      1.4.3.   Mod de lucru
      1.4.3.1.   Tratamentul cu substanţa de testat
      Celulele în stadiu de proliferare se tratează cu substanţa de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem de activare metabolică. Timpul de expunere ar trebui să fie corespunzător (de obicei, un timp 3-6 ore este eficient). Timpul de expunere se poate prelungi cu unul sau mai multe cicluri celulare.
      Fiecare concentraţie se poate testa pe una sau pe două culturi tratate. Dacă se utilizează culturi unice, numărul concentraţiilor ar trebui să fie mai mare pentru a asigura un număr suficient de culturi pentru analiză (de exemplu minimum opt concentraţii analizabile). Se recomandă utilizarea culturilor duble pentru martorul negativ (solvent).
      Testarea substanţelor în stare gazoasă şi a celor volatile ar trebui să se realizeze prin metode specifice, de exemplu în vase de cultură închise ermetic (21) (22).
      1.4.3.2.   Determinări de supravieţuire, viabilitate şi frecvenţa mutantului
      La sfârşitul perioadei de expunere, celulele se spală şi se cultivă în mediul de cultură pentru determinarea supravieţuirii şi pentru a permite manifestarea fenotipului mutant. Determinarea citotoxicităţii începe, de obicei, după perioada de tratament şi constă în măsurarea eficacităţii de clonare relativă (supravieţuirii) sau a creşterii totale relative a culturilor.
      Fiecărui locus îi corespunde un timp minim definit, necesar pentru a permite manifestarea aproape optimă a fenotipului mutanţilor nou induşi (HPRT şi XPRT necesită minimum 6-8 zile şi TK minimum două zile). Pentru determinarea numărului de mutanţi şi a eficacităţii clonării, celulele sunt crescute în mediu cu şi, respectiv, fără agent sau agenţi selectivi. Măsurarea viabilităţii (utilizată la calcularea frecvenţei mutantului) începe la terminarea perioadei de manifestare prin depunerea celulelor într-un mediu neselectiv.
      Dacă substanţa de testat dă un rezultat pozitiv la testul pe TK+/- L5178Y, dimensiunile coloniilor ar trebui să se determine pe minimum una dintre culturile experimentale (la concentraţia pozitivă maximă) şi pe martorii negativi şi pozitivi. Dacă substanţa de testat dă un rezultat negativ la testul pe TK+/- L5178Y, dimensiunile coloniilor ar trebui să se determine pe martorii negativi şi pozitivi. Dimensiunile coloniilor se pot determina şi în studiile în care se utilizează TK6TK+/-.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Datele ar trebui să conţină determinarea citotoxicităţii şi viabilităţii, numărul de colonii şi frecvenţele mutanţilor pentru culturile tratate şi cele martor. Dacă se obţine un răspuns pozitiv în testul pe TK+/- L5178Y, la numărătoarea coloniilor se face distincţia între coloniile mici şi mari pentru minimum o concentraţie a substanţei de testat (concentraţia pozitivă maximă) şi pentru martorul negativ şi pozitiv. Ar trebui să se facă o examinare detaliată a naturii moleculare şi citogenice a coloniilor mari şi mici de mutanţi (23) (24). În testul pe TK+/-, numărătoarea coloniilor se realizează conform criteriului de creştere normală (mare) şi creştere lentă (mică) a coloniilor (25). Celulele mutante care au suferit cele mai însemnate alterări genetice au timpi de duplicare prelungiţi şi formează, aşadar, colonii mici. Această alterare variază, de obicei, de la pierderea întregii gene până la aberaţii cromozomiale care se manifestă în cariotip. Inducerea coloniilor mici de mutanţi este pusă pe seama substanţelor chimice care induc aberaţii cromozomiale însemnate (26). Celulele mutante mai puţin afectate se dezvoltă cu viteze similare cu cele ale celulelor originale şi formează colonii mari.
      Ar trebui să se prezinte datele privind supravieţuirea (eficacitatea clonării relative) sau creşterea totală relativă. Frecvenţa mutanţilor ar trebui să se exprime prin numărul de celule mutante împărţit la numărul de celule supravieţuitoare.
      Ar trebui să se prezinte datele pentru fiecare cultură. În plus, toate datele ar trebui să se prezinte sub formă de tabel.
      Nu este necesară verificarea unui răspuns pozitiv net. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferinţă prin modificarea condiţiilor de testare. Rezultatele negative necesită confirmare pentru fiecare caz. În cazurile în care se consideră că nu este necesară confirmarea rezultatelor negative, ar trebui să se ofere o justificare. Pentru testele de confirmare, atât a rezultatelor nesigure, cât şi acelor negative, ar trebui să se aibă în vedere modificarea condiţiilor de testare pentru lărgirea gamei de condiţii evaluate. Parametrii care ar putea fi modificaţi includ diferenţa dintre concentraţii şi condiţiile de activare metabolică.
      2.2.   EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o creştere în funcţie de concentraţie sau o creştere reproductibilă a frecvenţei mutanţilor. În primul rând, ar trebui să se aibă în vedere relevanţa biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge şi la ajutorul unor metode statistice. Semnificaţia statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv.
      Dacă rezultatele obţinute pentru o substanţă de testat nu îndeplinesc criteriile menţionate anterior, se consideră că substanţa respectivă nu este mutagenă în prezentul sistem.
      Deşi majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare, datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanţei de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de repetări ale experimentului.
      Rezultatele pozitive ale unui test in vitro de mutaţie genică pe celule de mamifere indică faptul că substanţa de testat produce mutaţii genice în celulele de mamifere, în cultură. Un rezultat concentraţie-răspuns pozitiv reproductibil este foarte semnificativ. Rezultatele negative indică faptul că, în condiţii de testare, substanţa de testat nu produce mutaţii genice în celulele de mamifere utilizate, în cultură.
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  
                     Solventul/vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea şi stabilitatea substanţei de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaşte.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Celulele:
                  
                              —
                           
                           
                              tipul şi sursa celulelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de culturi celulare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de reînsămânţări, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de întreţinere a culturilor celulare, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              absenţa micoplasmei.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii concentraţiilor şi a numărului de culturi, inclusiv, de exemplu, datele de citotoxicitate şi limitele de solubilitate, dacă sunt disponibile;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              compoziţia mediului, concentraţia CO2;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              concentraţia substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              volumul vehiculului şi al substanţei de testat adăugate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatura de incubare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              timpul de incubare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              durata tratamentului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              densitatea celulară în timpul tratamentului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tipul şi compoziţia sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              martorii pozitivi şi negativi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              timpul de manifestare (inclusiv numărul de celule însămânţate şi reînsămânţate, programele de alimentare, dacă este cazul);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              agenţii selectivi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele utilizate pentru numărătoarea celulelor viabile şi mutante;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              definirea coloniilor pentru care se ţine seama de dimensiuni şi de tip (inclusiv criteriile pentru coloniile „mici” şi „mari”, dacă este cazul).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              semnele de precipitare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind valoarea pH-ului şi osmolalitatea în timpul expunerii la substanţa de testat, dacă s-au determinat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dimensiunile coloniilor, dacă s-au determinat, cel puţin pentru martorii negativi şi pozitivi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              capacitatea laboratorului de a detecta mutanţii în colonii mici cu sistemul TK+/– L5178Y, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analizele statistice, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi utilizaţi în paralel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele anterioare privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi, cu domeniile, valorile medii şi deviaţiile standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              frecvenţa mutanţilor.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindall, K. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
               
            
                  2.
               
               
                  Chu, E. H. Y. and Malling, H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306-1312.
               
            
                  3.
               
               
                  Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res., 94, pp. 467-485.
               
            
                  4.
               
               
                  Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394-403.
               
            
                  5.
               
               
                  Aaron, C. S. and Stankowski, Jr. L. F. (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res., 223, pp. 121-128.
               
            
                  6.
               
               
                  Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, pp. 235-239.
               
            
                  7.
               
               
                  Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204.
               
            
                  8.
               
               
                  Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225-251.
               
            
                  9.
               
               
                  Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U. S. Environment Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17-36.
               
            
                  10.
               
               
                  Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., O'Neill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Cuanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135-141.
               
            
                  11.
               
               
                  Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9-17.
               
            
                  12.
               
               
                  Stankowski, L. F. Jr., Tindall, K. R. and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, pp. 133-147.
               
            
                  13.
               
               
                  Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedures for the L5178Y/TK+/- – TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268.
               
            
                  14.
               
               
                  Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith, J. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland D. J., ed., Cambridge University Press, pp. 66-101.
               
            
                  15.
               
               
                  Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res., 46, pp. 365-373.
               
            
                  16.
               
               
                  Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364.
               
            
                  17.
               
               
                  Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson, A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat Res., 59, pp. 61-108.
               
            
                  18.
               
               
                  Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215.
               
            
                  19.
               
               
                  Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcome, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.
               
            
                  20.
               
               
                  Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot. R. M. (eds.) Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
               
            
                  21.
               
               
                  Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds.), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103.
               
            
                  22.
               
               
                  Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.
               
            
                  23.
               
               
                  Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51-55.
               
            
                  24.
               
               
                  Moore, M. M., Clive, D., Hozier, J. C. Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) and Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res, 151, pp. 161-174.
               
            
                  25.
               
               
                  Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res., 229, pp. 89-102.
               
            
                  26.
               
               
                  Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- – 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis 5, pp. 609-614.
               
            B.18.   ALTERAREA ŞI REPARAREA ADN-ULUI – SINTEZA NEPROGRAMATĂ A ADN (UDS – UNSCHEDULED DNA SYNTHESIS) – TEST IN VITRO PE CELULE DE MAMIFERE
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢIE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Testul de sinteză neprogramată a ADN (UDS) măsoară sinteza de reparare a ADN-ului după excizia şi eliminarea unui fragment de ADN care conţine regiunea alterată de agenţi chimici şi fizici. Testul se bazează pe încorporarea timidinei marcate cu tritiu (timidină tritiată) 3H-TdR) în ADN-ul celulelor de mamifere care nu sunt în faza S a ciclului celular. Încorporarea 3H-TdR se poate determina prin autoradiografiere sau prin LSC (liquid scintillation counting) a ADN-ului din celulele tratate. Cu excepţia cazului când se folosesc hepatocite primare de şobolan, culturile de celule de mamifere se tratează cu substanţa de testat cu şi fără un sistem exogen de activare metabolică. USD poate fi măsurată prin metode in vivo.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      Pregătire
      Substanţele chimice de testat şi substanţele martor sau substanţele de referinţă trebuie preparate în mediul de creştere ori dizolvate sau suspensionate într-un vehicul adecvat şi ulterior diluate în mediul de cultură folosit în acest test. Concentraţia finală a vehiculului nu trebuie să afecteze viabilitatea celulară.
      În acest test pot fi folosite culturi celulare primare de hepatocite de şobolan, limfocite umane sau linii celulare bine caracterizate (de exemplu, fibroblaşti diploizi umani).
      Celulele trebuie tratate cu substanţele chimice de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem adecvat de activare metabolică.
      Condiţiile de testare
      
         Numărul culturilor
      
      Pentru fiecare metodă de testare sunt necesare cel puţin două culturi celulare pentru autoradiografiere şi şase culturi (sau mai puţine, dacă există argumente ştiinţifice) pentru determinările prin LSC a UDS.
      
         Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi
      
      În fiecare experiment trebuie incluşi simultan martori pozitivi şi negativi (netrataţi şi/sau vehicul) suplimentari, cu şi fără activare metabolică.
      În testele care folosesc hepatocite de şobolan, exemple de martori pozitivi sunt 7,12-dimetilbenzantracenul (7,12-DMBA) sau 2-acetilaminofluorenul (2-AAF). În cazul liniilor celulare bine caracterizate, 4-nitroquinolin-N oxid (4-NQO) este un exemplu de martor pozitiv care poate fi utilizat atât pentru autoradiografie, cât şi pentru testele LSC efectuate fără activare metabolică; N-dimetilnitrozamina este un exemplu de compus care poate fi folosit ca martor pozitiv când se utilizează sisteme de activare metabolică.
      
         Concentraţii de expunere
      
      Trebuie folosite mai multe concentraţii ale substanţei de testat, alese într-un interval adecvat pentru definirea răspunsului. Concentraţia maximă trebuie să producă unele efecte citotoxice. Compuşii relativ insolubili în apă trebuie testaţi până la limita superioară a solubilităţii. Pentru substanţele netoxice, uşor solubile în apă, limita superioară a concentraţiei se stabileşte de la caz la caz.
      
         Celule
      
      Mediile de creştere, concentraţia de CO2, temperatura şi umiditatea adecvate sunt necesare pentru menţinerea culturilor. Liniile celulare bine caracterizate trebuie verificate periodic în vederea decelării contaminării cu Mycoplasma.
      
         Activare metabolică
      
      Pentru culturile primare de hepatocite nu se utilizează un sistem de activare metabolică. Liniile celulare bine caracterizate şi limfocitele se tratează cu substanţa de testat cu şi fără un sistem adecvat de activare metabolică.
      Mod de operare
      
         Pregătirea culturilor
      
      Liniile celulare bine caracterizate se obţin din culturi de suşe (prin tripsinizare sau descuamare) cultivate cu o densitate corespunzătoare în vase de cultură şi incubate la 37 oC.
      Culturile pe termen scurt de hepatocite de şobolan se obţin permiţând hepatocitelor proaspăt disociate într-un mediu adecvat să se fixeze pe suprafaţa de creştere.
      Culturile de limfocite umane sunt produse prin tehnici adecvate.
      
         Tratarea culturilor cu substanţa de testat
      
      Hepatocite primare de şobolan
      Hepatocitele de şobolan proaspăt izolate se tratează cu substanţa de testat într-un mediu ce conţine 3H-TdR o perioadă de timp corespunzătoare. La sfârşitul perioadei de tratare, celulele trebuie filtrate, spălate, fixate şi uscate. Lamele trebuie introduse în emulsia autoradiografică (alternativ, poate fi folosit un film fotografic), expuse, developate, colorate şi numărate.
      Liniile celulare bine caracterizate şi limfocitele
      Tehnica de autoradiografiere: Culturile celulare se tratează cu substanţa de testat o perioadă de timp corespunzătoare, apoi se tratează cu 3H-TdR. Perioadele se stabilesc în funcţie de natura substanţei, de activitatea sistemelor metabolizante şi de tipul celulelor. Pentru determinarea maximului de USD, 3H-TdR trebuie adăugată fie simultan cu substanţa de testat, fie la câteva minute după expunerea la substanţa de testat. Alegerea uneia dintre aceste metode se va face în funcţie de interacţiunile posibile între substanţa de testat şi 3H-TdR. Pentru a putea face distincţia între USD şi replicarea semiconservativă a ADN, aceasta din urmă poate fi inhibată, de exemplu, prin utilizarea unui mediu sărac în arginină, cu conţinut scăzut în ser sau prin adăugare de hidroxiuree în mediul de cultură.
      Măsurarea USD prin LSC: Înainte de începerea tratamentului cu substanţa de testat, se blochează intrarea celulelor în faza S în modul descris mai sus. Ulterior, celulele se tratează cu substanţa de testat în conformitate cu descrierea pentru autoradiografie. La sfârşitul perioadei de incubare, ADN este extras din celule şi se determină conţinutul total de ADN şi proporţia de 3H-TdR încorporată.
      Trebuie menţionat faptul că dacă în tehnicile descrise mai sus se utilizează limfocite umane, nu este necesară suprimarea replicării semiconservative a ADN pe culturile nestimulate.
      Analiză
      
         
            Determinările autoradiografice
         
      
      Pentru determinarea USD în celulele din cultură, nucleele de fază S nu se numără. Trebuie numărate minimum 50 celule per concentraţie. Lamele trebuie etichetate înainte de numărare. De pe fiecare lamă se numără mai multe câmpuri distribuite aleatoriu, alese la distanţă unul de celălalt. Cantitatea de 3H-TdR încorporată în citoplasmă se determină prin numărarea a trei arii de mărimea nucleului, din citoplasma fiecărei celule numărate.
      
         Determinările LSC
      
      Pentru determinarea prin LSC a USD se utilizează un număr adecvat de culturi pentru fiecare concentraţie a substanţei de testat şi pentru martori.
      Toate rezultatele trebuie confirmate într-un experiment independent.
      2.   DATE
      Datele sunt prezentate sub formă de tabele.
      2.1.   DETERMINĂRILE AUTORADIOGRAFICE
      Cantitatea de 3H-TdR încorporată în citoplasmă şi numărul de granulaţii găsite în nucleii celulari trebuie să fie înregistrate separat.
      Pentru descrierea distribuţiei cantităţii de 3H-TdR încorporată în citoplasmă şi numărul de granulaţii per nucleu se vor folosi media, mediana şi modul şirului.
      2.2.   TEHNICA LSC
      În tehnica LSC, 3H-TdR încorporată trebuie raportată folosind ca unitate de măsură dpm/μg ADN. Pentru descrierea distribuţiei încorporării se poate folosi media dpm/μg ADN cu deviaţia standard.
      Datele se evaluează prin metode statistice adecvate.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  celulele folosite, densitatea şi numărul de pasaje celulare în momentul tratamentului, numărul de culturi celulare;
               
            
                  —
               
               
                  metodele folosite pentru menţinerea culturilor, inclusiv compoziţia mediului, temperatura şi concentraţia de CO2;
               
            
                  —
               
               
                  substanţa de testat, vehiculul folosit, concentraţiile şi argumentarea alegerii concentraţiilor folosite în experiment;
               
            
                  —
               
               
                  informaţii despre sistemul de activare metabolică;
               
            
                  —
               
               
                  schema de tratament;
               
            
                  —
               
               
                  martorii pozitivi şi negativi;
               
            
                  —
               
               
                  tehnica de autoradiografie folosită;
               
            
                  —
               
               
                  metodele folosite pentru a bloca intrarea celulelor în faza S;
               
            
                  —
               
               
                  metodele folosite pentru extragerea ADN şi determinarea conţinutului total în ADN prin tehnica LSC;
               
            
                  —
               
               
                  dacă este posibil, relaţia doză-efect;
               
            
                  —
               
               
                  evaluarea statistică;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.19.   TEST IN VITRO DE SCHIMBARE A CROMATIDELOR SURORI (SCE)
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢIE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      SCE este un test de scurtă durată de detectare a schimburilor reciproce de ADN între 2 cromatide surori ale unui cromozom în timpul duplicării. SCE reprezintă schimburile reciproce dintre produsele de replicare a ADN la loci aparent omologi. Se presupune că procesul de schimb implică ruperea şi refacerea ADN-ului, însă datele existente despre bazele moleculare ale procesului sunt limitate. Detectarea SCE necesită câteva mijloace de marcare diferenţiată a cromatidelor surori, rezultat ce poate fi obţinut prin încorporarea bromodeoxiuridinei (BrdU) în ADN-ul cromozomial pentru două cicluri celulare.
      Celulele de mamifere sunt tratate in vitro cu substanţa de testat cu şi fără un sistem exogen de activare metabolică la mamifere, după caz, apoi sunt cultivate pe o perioadă de două cicluri de replicare într-un mediu ce conţine BrdU. După tratarea cu un inhibitor de fus mitotic (de exemplu colchicină) pentru oprirea celulelor în stadiul de metafază al mitozei (c-metafaza), celulele sunt prelevate şi se efectuează preparatele cromozomiale.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      
         1.6.1.   Pregătire
      
      
                  —
               
               
                  Pentru acest test se pot folosi culturi celulare primare (limfocite umane) sau linii celulare bine caracterizate (de exemplu, celule ovariene de hamster chinezesc). Liniile celulare trebuie verificate pentru a decela contaminarea cu Mycoplasma.
               
            
                  —
               
               
                  Trebuie folosite medii de cultură şi condiţii de incubare (de exemplu temperatură, vase de cultură, concentraţia de CO2 şi umiditate) corespunzătoare.
               
            
                  —
               
               
                  Substanţele de testat pot fi preparate în mediul de cultură sau dizolvate sau suspensionate într-un vehicul adecvat înainte de începerea tratamentului celulelor. Concentraţia finală de vehicul în mediul de cultură nu trebuie să afecteze în mod semnificativ viabilitatea celulară sau rata de creştere, iar efectele asupra frecvenţei SCE trebuie monitorizate printr-un solvent martor.
               
            
                  —
               
               
                  Celulele se tratează cu substanţa de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem exogen adecvat de activare metabolică la mamifere. Alternativ, dacă se folosesc celule cu activitate metabolică intrinsecă, trebuie să se cunoască intensitatea şi natura acestei activităţi, astfel încât să fie corespunzătoare clasei de substanţe chimice testate.
               
            
         1.6.2.   Condiţii de testare
      
      
         Numărul de culturi
      
      Pentru fiecare punct experimental se folosesc cel puţin două culturi.
      
         Utilizarea martorilor pozitivi şi negativi
      
      În toate testele se includ martori pozitivi, utilizându-se atât un compus cu acţiune directă, cât şi un compus ce necesită activare metabolică; de asemenea, se utilizează şi un martor negativ pentru vehicul.
      Exemple de substanţe ce pot fi folosite ca martori pozitivi:
      
                  —
               
               
                  compuşi cu acţiune directă:
                  
                              —
                           
                           
                              etilmetansulfonatul;
                           
                        
            
                  —
               
               
                  compuşi cu acţiune indirectă:
                  
                              —
                           
                           
                              ciclofosfamida.
                           
                        
            După caz, se poate introduce un martor pozitiv suplimentar din aceeaşi clasă chimică cu substanţa de testat.
      
         Concentraţii de expunere
      
      Se folosesc cel puţin trei concentraţii ale substanţei de testat, spaţiate în mod adecvat. Concentraţia maximă trebuie să producă un efect toxic semnificativ, permiţând totuşi producerea unei replicări celulare corespunzătoare. Substanţele relativ insolubile în apă trebuie testate până la limita superioară a solubilităţii prin metode adecvate. Pentru substanţele netoxice uşor solubile în apă, limita superioară a concentraţiei substanţei de testat se stabileşte de la caz la caz.
      
         1.6.2.   Mod de operare
      
      
         Pregătirea culturilor
      
      Liniile celulare bine caracterizate se obţin din culturile de tulpini (de exemplu, prin tripsinizare sau prin descuamare), cultivate în vase de cultură cu o densitate corespunzătoare şi incubate la 37 oC. Pentru culturile unistratificate, numărul de celule pe cultură trebuie ajustat astfel încât în momentul prelevării culturile să nu fie confluente în proporţie mai mare de 50 %. Ca alternativă, se pot folosi suspensiile de culturi celulare. Culturile de limfocite umane se pot obţine din sânge heparinizat, prin tehnici adecvate şi sunt incubate la 37 oC.
      
         Tratament
      
      Celulele aflate în stadiul de creştere exponenţială se tratează cu substanţa de testat pe o perioadă de timp corespunzătoare, în majoritatea cazurilor fiind suficiente una sau două ore. Durata tratamentului poate fi extinsă în anumite cazuri până la două cicluri celulare complete. Celulele fără o activitate metabolică intrinsecă corespunzătoare se tratează cu substanţa de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem de activare metabolică. La sfârşitul perioadei de expunere, celulele se spală abundent pentru îndepărtarea substanţei de testat şi se cultivă timp de două cicluri de replicare în prezenţa BrdU. Ca metodă alternativă, celulele pot fi tratate simultan cu substanţa de testat şi BrdU pentru întreaga perioadă de cultură de două cicluri celulare.
      Culturile de limfocite umane trebuie tratate când sunt într-o stare semisincronă.
      Celulele trebuie analizate în perioada celei de-a doua diviziuni după tratament, asigurând astfel expunerea la substanţa chimică în cele mai sensibile stadii ale ciclului celular. Cu toate culturile la care s-a adăugat BrdU se va lucra la întuneric sau iluminare slabă de la o sursă incandescentă până în momentul prelevării celulelor, pentru reducerea la minim a fotolizei ADN-ului care conţine BrdU.
      
         Recoltarea celulelor
      
      Culturile se tratează cu un inhibitor de fus mitotic (de exemplu colchicină) cu 1-4 ore înainte de recoltarea celulelor. Fiecare cultură este recoltată şi prelucrată separat în vederea obţinerii preparatelor cromozomiale.
      
         Prepararea şi colorarea cromozomilor
      
      Preparatele cromozomiale se obţin prin tehnici citogenetice standard. Colorarea lamelelor pentru evidenţierea SCE se poate face prin mai multe tehnici (de exemplu, prin fluorescenţă plus metoda Giemsa).
      
         Analiza
      
      Numărul de celule analizate depinde de frecvenţa spontană a SCE la martori. De obicei, cel puţin 25 de metafaze bine exprimate pe cultură sunt analizate în termeni de SCE. Lamele trebuie etichetate înainte de analiză. La limfocitele umane se analizează numai celulele care conţin 46 de centromeri. Pe liniile celulare bine caracterizate se analizează numai metafazele care conţin ± 2 centromeri din numărul modal. Trebuie precizat dacă marcarea joncţiunii centromerice este sau nu inventariată ca SCE. Rezultatele trebuie confirmate într-un experiment independent.
      2.   DATE
      Datele se sistematizează în tabele. Pentru fiecare cultură tratată sau martor se menţionează separat numărul de SCE pentru fiecare metafază şi numărul de SCE pe cromozom pentru fiecare metafază.
      Datele se evaluează prin metode statistice adecvate.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  celulele folosite, metodele de menţinere a culturilor celulare;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de desfăşurare a testului: compoziţia mediului, concentraţia de CO2, concentraţia substanţei de testat, vehiculul folosit, temperatura de incubare, durata tratamentului, inhibitorul fusului de diviziune celulară folosit, concentraţia acestuia şi timpul de tratament cu acesta, tipul de sistem folosit pentru activarea metabolică la mamifere, martorii pozitivi şi negativi;
               
            
                  —
               
               
                  numărul de culturi la fiecare punct experimental;
               
            
                  —
               
               
                  detalii despre tehnica folosită pentru prepararea lamelelor;
               
            
                  —
               
               
                  numărul de metafaze analizate (datele vor fi redate separat pentru fiecare cultură în parte);
               
            
                  —
               
               
                  numărul mediu de SCE per celulă şi per cromozom (datele trebuie indicate separat pentru fiecare cultură în parte);
               
            
                  —
               
               
                  criteriile pentru numărarea SCE;
               
            
                  —
               
               
                  argumentarea alegerii dozelor;
               
            
                  —
               
               
                  relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;
               
            
                  —
               
               
                  evaluarea statistică;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.20.   TEST DE LETALITATE RECESIVĂ ÎN RAPORT CU SEXUL LA DROSOPHILA MELANOGASTER (SLRL)
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢIE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Testul SLRL pe Drosophila melanogaster este un test care depistează incidenţa mutaţiilor, atât a mutaţiilor punctiforme, cât şi a deleţiilor mici, în liniile germinale ale insectelor. Acest test este un test de mutaţie directă prin care pot decela mutaţiile în aproximativ 800 loci de pe cromozomul X, ceea ce reprezintă aproximativ 80 % din totalul de loci ai acestuia. Cromozomul X reprezintă aproximativ o cincime din întregul genom haploid.
      Mutaţiile cromozomului X la Drosophila melanogaster se exprimă fenotipic la masculi purtători ai genei mutante. Dacă mutaţia este letală în condiţii de hemizigotism, prezenţa sa se deduce din absenţa unei generaţii de descendenţi de sex masculin, din cele două care sunt normal produse de o femelă heterozigotă. Aceste determinări se fac prin intermediul unor cromozomi special marcaţi şi dispuşi.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.   6. DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      Pregătire
      
         Tulpini
      
      Pot fi folosiţi masculi dintr-o tulpină de tip sălbatic bine caracterizată şi femele care conţin cromozomul Muller-5. De asemenea, se pot folosi femele din alte tulpini marcate corespunzător cu cromozomi X cu inversiuni multiple.
      
         Substanţa de testat
      
      Substanţele trebuie dizolvate în apă. Substanţele insolubile în apă pot fi dizolvate sau suspensionate într-un vehicul adecvat (de exemplu, un amestec de etanol şi Tween-60 sau 80), apoi diluate cu apă sau soluţie salină înainte de administrare. Se recomandă evitarea folosirii ca vehicul a dimetilsulfoxidului (DMSO).
      
         Numărul de animale
      
      Sensibilitatea şi puterea testului sunt predeterminate. Frecvenţa mutanţilor spontani observaţi la martorul corespunzător influenţează puternic numărul de cromozomi trataţi care trebuie analizaţi.
      
         Calea de administrare
      
      Expunerea se poate face pe cale orală, prin injectare sau expunere la gaze sau vapori. Administrarea substanţei de testat prin hrană se poate face în soluţii zaharoase. Dacă este necesar, substanţa poate fi dizolvată într-o soluţie de NaCl 0,7 % şi injectată în torace sau abdomen.
      
         Utilizarea martorilor pozitivi şi negativi
      
      În fiecare experiment trebuie folosiţi martori negativi (pentru vehicul) şi pozitivi. Cu toate acestea, dacă sunt disponibile date istorice pertinente despre martori, nu este necesară folosirea simultană a acestora.
      
         Niveluri de expunere
      
      Se folosesc trei niveluri de expunere. Pentru o evaluare preliminară se poate folosi un singur nivel de expunere, acesta fiind fie concentraţia maximă tolerată, fie nivelul de concentraţie care produce câteva semne de toxicitate. Pentru substanţele netoxice se face expunerea la concentraţia maximă care poate fi obţinută practic.
      
         Mod de operare
      
      Masculii din tulpinile sălbatice (în vârstă de trei-cinci zile) se tratează cu substanţa de testat, apoi sunt împerecheaţi individual cu un număr în exces de femele virgine din tulpina Muller-S sau dintr-o altă tulpină marcată corespunzător (cu multiple inversiuni ale cromozomilor X). La fiecare două-trei zile femelele trebuie înlocuite cu alte femele virgine pentru a acoperi întregul ciclu al celulelor germinale. Descendenţii acestor femele trebuie inventariaţi pentru depistarea efectelor letale corespunzătoare efectelor asupra spermatozoizilor maturi, spermatidelor în stadiu intermediar şi tardiv, spermatidelor în stadiu timpuriu, spermatocitelor şi spermatogoniilor din timpul tratamentului.
      Femelele F1 heterozigote din împerecherea de mai sus vor fi împerecheate individual (de exemplu, o femelă per fiolă) cu fraţii lor. În generaţia F2 fiecare cultură este inventariată pentru a depista absenţa masculilor din tulpinile sălbatice. Dacă o cultură provine dintr-o femelă F1 purtătoare de genă letală în cromozomul X parental (de exemplu, nu se observă masculi cu cromozomul tratat), fiicele acestei femele cu acelaşi genotip trebuie testate pentru a se constata dacă gena letală se repetă în generaţia următoare.
      2.   DATE
      Datele se sistematizează în tabele în care se specifică numărul de cromozomi X testaţi, numărul de masculi nefertili şi numărul de cromozomi letali la fiecare concentraţie de expunere şi pentru fiecare perioadă de împerechere, pentru fiecare mascul tratat. Trebuie raportat numărul de clustere de diferite dimensiuni per mascul. Aceste rezultate trebuie confirmate într-un experiment separat.
      Pentru evaluarea SLRL se vor folosi metode statistice adecvate. Trebuie luată în considerare aglomerarea de gene letale recesive provenite de la un singur mascul, care trebuie evaluată cu metode statistice corespunzătoare.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  tulpina: tulpinile sau liniile de Drosophila folosite, vârsta insectelor, numărul de masculi trataţi, numărul de masculi sterili, numărul de culturi F2 obţinute, numărul de culturi F2 fără descendenţi, numărul de cromozomi purtători de genă dominantă letală detectaţi în fiecare stadiu al celulei germinale;
               
            
                  —
               
               
                  criteriile de stabilire a dimensiunilor lotului tratat;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare: descrierea detaliată a tratamentului şi schema prelevării probelor, nivelul de expunere, date de toxicitate, martori negativi (solvent) şi pozitivi, după caz;
               
            
                  —
               
               
                  criteriile pentru numărarea mutaţiilor letale;
               
            
                  —
               
               
                  dacă este posibil, relaţia expunere/efect;
               
            
                  —
               
               
                  evaluarea statistică;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.21.   TEST IN VITRO DE TRANSFORMARE A CELULELOR DE MAMIFERE
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢIE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Pentru determinarea modificărilor fenotipice in vitro induse de substanţele chimice asociate cu transformări maligne in vivo, se folosesc sisteme de cultură de celule de mamifere. Cele mai des utilizate celule sunt C3H10T1/2, 3T3, SHE şi celule de la şobolani Fisher. Testele urmăresc modificările în morfologia celulară, formarea de focare sau modificări în dependenţa de ancorare pe agar-agar semisolid. Există sisteme folosite mai rar care depistează alte modificări celulare morfologice sau fiziologice în urma expunerii la substanţe chimice cancerigene. Niciunul din mecanismele testate in vitro nu are o legătură mecanică determinată cu cancerul. Anumite sisteme de testare pot detecta promotori tumorali. Citotoxicitatea poate fi determinată prin măsurarea efectelor materialului testat asupra capacităţilor de formare de colonii (eficienţa de clonare) sau asupra ratei de creştere a culturilor. Măsurarea citotoxicităţii are rolul de a stabili dacă expunerea la substanţa chimică testată are relevanţă toxicologică, dar nu poate fi folosită pentru a calcula frecvenţa transformărilor în toate testele, deoarece unele dintre acestea pot necesita incubare prelungită şi/sau reînsămânţare.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      Pregătire
      
         Celule
      
      În funcţie de testul de transformare folosit, sunt disponibile diferite linii celulare sau celule primare. Cercetătorul trebuie să se asigure că celulele folosite în cadrul testului manifestă modificări fenotipice corespunzătoare după expunerea la un agent cancerigen cunoscut şi că testul efectuat are o validitate şi o fiabilitate demonstrate şi documentate.
      
         Mediu
      
      Se utilizează medii şi condiţii de testare corespunzătoare testului de transformare efectuat.
      
         Substanţa de testat
      
      Substanţele testate pot fi preparate în mediile de cultură sau dizolvate ori suspensionate într-un vehicul adecvat, înainte de tratarea celulelor. Concentraţia finală a vehiculului în sistem nu trebuie să afecteze viabilitatea celulară, rata de creştere sau incidenţa transformărilor.
      
         Activarea metabolică
      
      Celulele sunt expuse la substanţa de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem adecvat de activare metabolică. Dacă se utilizează un tip de celule cu activitate metabolică intrinsecă, natura acestei activităţi va fi recunoscută ca fiind adecvată clasei de substanţe chimice testate.
      Condiţii de testare
      
         Utilizarea martorilor pozitivi şi negativi
      
      În fiecare experiment se includ martori pozitivi, utilizându-se atât un compus cu acţiune directă, cât şi un compus ce necesită activare metabolică; de asemenea, se utilizează şi un martor negativ (pentru vehicul).
      Printre exemplele de substanţe ce pot fi folosite ca martor pozitiv se numără:
      
                  —
               
               
                  compuşi cu acţiune directă:
                  
                              —
                           
                           
                              etilmetansulfonatul,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              β-propiolactona;
                           
                        
            
                  —
               
               
                  compuşi care necesită activare metabolică:
                  
                              —
                           
                           
                              2-acetilaminofluoren,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              4-dimetilaminoazobenzen,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              7,12-dimetilbenzantracen.
                           
                        
            Dacă este necesar, poate fi inclus un martor pozitiv suplimentar care să aparţină aceleiaşi clase de substanţe ca şi substanţa de testat.
      
         Concentraţii de expunere
      
      Se folosesc mai multe concentraţii ale substanţei de testat. Acestea trebuie să prezinte efect toxic în funcţie de concentraţie, concentraţia maximă determinând un nivel scăzut de supravieţuire, iar supravieţuirea la concentraţia minimă fiind aproximativ aceeaşi cu cea de la martorul negativ. Pentru substanţele relativ insolubile în apă trebuie testată limita superioară a solubilităţii, folosind procedee corespunzătoare. Pentru substanţele netoxice, foarte uşor solubile în apă, limita superioară a concentraţiei se stabileşte de la caz la caz.
      Mod de operare
      Celulele se tratează o perioadă corespunzătoare, în funcţie de sistemul de testare utilizat, acest lucru putând presupune reevaluarea dozei prin schimbarea mediului (şi, după caz, un amestec de activare metabolică proaspăt) dacă expunerea este prelungită. Celulele fără o activitate metabolică intrinsecă suficientă sunt expuse la substanţa de testat atât în prezenţa, cât şi în absenţa unui sistem adecvat de activare metabolică. La sfârşitul perioadei de expunere, celulele trebuie spălate, îndepărtând substanţa de testat, şi cultivate în condiţii adecvate pentru apariţia modificărilor fenotipice urmărite şi pentru stabilirea incidenţei de transformare. Toate rezultatele trebuie confirmate în cadrul unui experiment independent.
      2.   DATE
      Datele se sistematizează în tabele şi pot avea diferite forme în funcţie de metoda folosită, ca, de exemplu, numărarea plăcilor, plăci pozitive sau număr de celule transformate. După caz, supravieţuirea se exprimă ca procent din nivelul de supravieţuire la probele martor, iar frecvenţa de transformare ca raport între numărul de celule transformate şi numărul de celule supravieţuitoare. Datele se evaluează prin metode statistice corespunzătoare.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  tipul de celule folosite, numărul de culturi celulare, metoda de menţinere a culturilor;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare: concentraţia substanţei de testat, vehiculul folosit, timpul de incubare, durata şi frecvenţa tratamentului, densitatea celulară pe parcursul tratamentului, tipul de sistem exogen folosit pentru activarea metabolismului, martorii pozitivi şi negativi, caracteristicile fenotipului monitorizat, tipul de sistem selectiv folosit (după caz), argumentarea alegerii dozelor;
               
            
                  —
               
               
                  metoda folosită pentru exprimarea numărului de celule viabile şi transformate;
               
            
                  —
               
               
                  evaluarea statistică;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.22.   TESTUL DE LETALITATE DOMINANTĂ LA ROZĂTOARE
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢIE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Efectele letalităţii dominante determină moartea embrionului sau a fetusului. Inducerea genelor letalităţii dominante prin expunere la o substanţă chimică indică faptul că acea substanţă a acţionat la nivelul ţesutului germinal al speciei testate. Este cunoscut faptul că letalitatea dominantă se datorează unei anomalii cromozomiale (numerice şi structurale). Moartea embrionului, în cazul în care femelele sunt tratate, se poate datora şi efectelor toxice.
      În general, masculii se tratează cu substanţa de testat şi se împerechează cu femele virgine netratate. Pot fi studiate separat diferitele stadii ale celulelor germinale, la intervale de împerechere succesive. Creşterea numărului de ovule fecundate moarte per femelă în lotul tratat comparativ cu femelele din lotul martor reflectă posibilitatea pierderii sarcinii după implantare. Pierderile înaintea ovoimplantaţiei pot fi estimate luând în considerare numărul de corpora lutea sau comparând numărul total de implanturi per femelă în lotul tratat şi în lotul martor. Efectul total de letalitate dominantă reprezintă suma pierderilor înainte şi după implantare. Calcularea efectului total al letalităţii dominante se bazează pe comparaţia dintre implanturile viabile la femelele din lotul tratat şi la cele din lotul martor. Reducerea numărului de implanturi la anumite intervale de timp poate fi rezultatul distrugerii celulelor (a spermatocitului şi/sau a spermatogoniei).
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      Pregătire
      Dacă este posibil, substanţele folosite se dizolvă sau se suspensionează într-o soluţie izotonică salină. Substanţele chimice insolubile în apă pot fi dizolvate sau suspensionate în vehicule corespunzătoare. Vehiculul folosit nu trebuie să interfereze cu substanţa chimică de testat şi nici nu trebuie să producă efecte toxice. Pentru testarea chimică, se folosesc substanţe chimice de testat proaspete.
      Condiţii de testare
      
         Calea de administrare
      
      De regulă, compusul de testat trebuie administrat o singură dată. În funcţie de informaţiile toxicologice, se poate utiliza o schemă de tratament repetat. Căile normale de administrare sunt: intubarea orală sau injectarea intraperitoneală. Se pot folosi şi alte căi de administrare corespunzătoare.
      
         Animale de experienţă
      
      Se recomandă utilizarea şobolanilor sau a şoarecilor. Animalele sănătoase şi mature din punct de vedere sexual se repartizează aleatoriu în loturile tratate şi în loturile martor.
      
         Numărul şi sexul animalelor
      
      Se utilizează un număr corespunzător de masculi trataţi, luând în considerare variaţia spontană a caracterelor biologice evaluate. Numărul se stabileşte în funcţie de sensibilitatea detectării şi de gradul de încredere care au fost predeterminate. De exemplu, în cadrul unui test tipic, numărul masculilor din fiecare lot tratat trebuie să fie suficient pentru a asigura între 30 şi 50 de femele gestante în fiecare perioadă de împerechere.
      
         Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi
      
      În general, în fiecare experiment se utilizează simultan martori pozitivi şi negativi. Când experimente efectuate recent în acelaşi laborator oferă rezultate acceptabile cu privire la martorii pozitivi, aceste rezultate pot fi folosite ca martori pozitivi în experimentul curent. Substanţele martor pozitiv trebuie folosite la o doză scăzută corespunzătoare (de ex: MMS, intraperitoneal într-o doză de 10 mg/kg) pentru a demonstra sensibilitatea testului.
      
         Doze
      
      În mod normal, se utilizează trei doze de tratament. Doza mare trebuie să producă efecte toxice sau să reducă fertilitatea animalelor tratate. În anumite cazuri, este suficientă folosirea unei singure doze mari.
      
         Test-limită
      
      Substanţele care nu sunt toxice se testează la doza de 5 g/kg în cazul unei singure administrări sau 1 g/kg/zi în cazul administrărilor repetate.
      Mod de operare
      Sunt disponibile mai multe scheme de tratament. Cea mai frecventă este aceea a administrării unice a substanţei de testat. Pot fi folosite şi alte scheme de tratament.
      Fiecare mascul se împerechează pe rând cu una sau două femele virgine netratate, la intervale corespunzătoare după tratament. Femelele sunt lăsate împreună cu masculii pe durata ciclului estral sau până la confirmarea împerecherii (prezenţa spermei în vagin sau a dopului vaginal).
      Numărul împerecherilor după tratament se stabileşte în funcţie de schema de tratament şi trebuie să asigure prelevarea de celule germinale în toate stadiile de dezvoltare a acestora.
      Femelele sunt sacrificate în cea de-a doua jumătate a gestaţiei, iar conţinutul uterului se examinează în vederea decelării numărului de implanturi viabile şi a numărului de implanturi neviabile. Ovarele se examinează pentru stabilirea numărului de corpora lutea.
      2.   DATE
      Datele se sistematizează în tabele şi prezintă numărul masculilor, al femelelor gestante şi cel al femelelor negestante. Rezultatele fiecărei împerecheri, inclusiv identitatea fiecărui mascul şi a fiecărei femele se înregistrează individual. În cazul fiecărei femele se menţionează săptămâna de împerechere, doza administrată masculilor şi numărul implanturilor vii şi moarte.
      Calcularea efectului total de letalitate dominantă se bazează pe comparaţia dintre implanturile vii, pentru fiecare femelă din cadrul lotului tratat şi a implanturilor vii pentru fiecare femelă din cadrul lotului martor. Raportul dintre numărul implanturilor vii şi moarte în lotul tratat se compară cu raportul din lotul martor şi este analizat pentru a evidenţia moartea produsului de concepţie în faza post-implantare.
      Dacă datele sunt înregistrate ca mortalitate precoce şi mortalitate tardivă, din tabele trebuie să rezulte clar acest lucru. De asemenea, trebuie înregistrate pierderile în faza de preimplantare. Pierderile în faza de preimplantare se pot calcula în funcţie de diferenţa dintre numărul de corpora lutea şi numărul implanturilor sau urmărind reducerea numărului mediu de implanturi per uter la lotul tratat în comparaţie cu împerecherile martor.
      Datele se evaluează prin metode statistice adecvate.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specia, linia, vârsta şi greutatea animalelor, numărul animalelor pe sexe folosite atât în lotul tratat, cât şi în lotul martor;
               
            
                  —
               
               
                  substanţa de testat, vehiculul, dozele testate şi argumentarea selectării dozelor, substanţe folosite ca martor negativ şi pozitiv, datele cu privire la toxicitate;
               
            
                  —
               
               
                  calea de administrare şi schema de tratament;
               
            
                  —
               
               
                  schema de împerechere;
               
            
                  —
               
               
                  metoda folosită pentru confirmarea împerecherii;
               
            
                  —
               
               
                  momentul sacrificării;
               
            
                  —
               
               
                  criteriul de inventariere a efectelor de letalitate dominantă;
               
            
                  —
               
               
                  relaţia doză/răspuns;
               
            
                  —
               
               
                  evaluarea statistică a rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.23.   TEST DE ABERAŢIE CROMOZOMIALĂ PE SPERMATOGONII DE MAMIFERE
      1.   METODĂ
      Prezenta metodă este reprodusă după Orientarea 483 a OCDE, Testul de aberaţie cromozomială pe spermatogonii de mamifere (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Scopul testului in vivo de aberaţie cromozomială pe spermatogonii de mamifere constă în identificarea acelor substanţe care produc aberaţii cromozomiale ale structurii în celulele spermatogoniale ale mamiferelor (1) (2) (3) (4) (5). Aberaţiile de structură pot fi de două tipuri, cromozomiale sau cromatidice. La majoritatea mutagenilor chimici, aberaţiile induse sunt de tip cromatidic, dar se produc şi aberaţii de tip cromozomial. Prezenta metodă nu este destinată determinării aberaţiilor numerice şi, în general, nu se utilizează în acest scop. Mutaţiile cromozomiale şi fenomenele conexe sunt cauza multor maladii genetice umane.
      Prezentul test determină fenomenele cromozomiale din celulele germinale spermatogoniale şi, prin urmare, ar trebui să permită estimarea mutaţiilor transmisibile produse în celulele germinale.
      Pentru test se utilizează, în general, rozătoare. Prezentul test citogenetic in vivo permite detectarea aberaţiilor cromozomiale din mitozele spermatogoniale. Alte celule ţintă nu fac obiectul prezentului test.
      Pentru detectarea aberaţiilor de tip cromatidic din celulele spermatogoniale, ar trebui să se examineze prima diviziune celulară mitotică după tratament, înainte ca leziunile respective să se piardă în diviziunile celulare ulterioare. Prin analiza cromozomilor meiotici pentru detectarea aberaţiilor de tip cromozomial în diakineză-metafaza I când celulele tratate se transformă în spermatocite, se pot obţine informaţii suplimentare referitoare la celulele germinale spermatogoniale tratate.
      Prezentul test in vivo este destinat să verifice dacă mutagenii sunt la fel de activi în celulele germinale ca şi în celulele somatice. În plus, testul pe spermatogonii este relevant în evaluarea riscului de mutagenitate, deoarece permite să se ţină seama de factorii de metabolism in vivo, de farmacocinetică şi de procesele de regenerare a ADN.
      Testiculele conţin un număr de generaţii de spermatogonii care prezintă sensibilităţi diferite la tratamentul chimic. Astfel, aberaţiile detectate reprezintă un răspuns global al populaţiilor de celule spermatogoniale tratate, în care predomină celulele spermatogoniale diferenţiate, mai numeroase. În funcţie de poziţia în testicul, diferitele generaţii de spermatogonii pot să fie sau să nu fie expuse la substanţele prezente în circulaţia generală, datorită barierei fizice şi fiziologice de celule Sertoli şi a barierei sânge-testicul.
      Dacă există dovezi că substanţa de testat sau un metabolit reactiv nu vor ajunge la ţesutul ţintă, nu este indicată utilizarea prezentului test.
      A se vedea şi introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Aberaţie de tip cromatidic: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea cromatidelor singure sau prin divizarea şi reuniunea între cromatide.
      
         Aberaţie de tip cromozomial: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea sau divizarea şi reuniunea ambelor cromatide în acelaşi loc.
      
         Lacună: leziune acromatică mai mică decât lăţimea unei cromatide şi cu o eroare minimă de aliniere a cromatidelor.
      
         Aberaţie numerică: modificare a numărului de cromozomi faţă de numărul normal caracteristic pentru animalele utilizate.
      
         Poliploidie: multiplicare a numărului (n) de cromozomi haploizi, alta decât diploidia (și anume 3n, 4n etc.).
      
         Aberaţie structurală: modificare a structurii cromozomilor, detectabilă la examinarea microscopică a celulelor în stadiul de metafază al diviziunii acestora, care se prezintă sub formă de deleţii, modificări intracromozomiale şi intercromozomiale.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Animalele se expun la substanţa de testat printr-o cale de expunere corespunzătoare şi sunt sacrificate în momente corespunzătoare după tratament. Înainte de sacrificare, animalele se tratează cu o substanţă de inhibare a metafazei (de exemplu colchicină sau Colcemid®). Apoi, din celulele germinale, se realizează preparate cromozomiale care se colorează, iar celulele în metafază sunt analizate la microscop pentru detectarea aberaţiilor cromozomiale.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Pregătire
      1.4.1.1.   Selectarea speciilor de animale
      Se utilizează, de obicei, hamsteri chinezeşti şi şoareci de sex masculin. Cu toate acestea, se pot utiliza masculi din orice altă specie de mamifere adecvată. Se recomandă utilizarea unor animale adulte tinere sănătoase, din suşe utilizate în mod curent în laborator. La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui să prezinte o variaţie minimă, ce nu trebuie să depăşească ± 20 % din greutatea medie.
      1.4.1.2.   Condiţiile de adăpostire şi de hrănire
      Se aplică condiţiile generale menţionate în introducerea generală partea B, dar umiditatea atinsă ar trebui să fie de 50-60 %.
      1.4.1.3.   Pregătirea animalelor
      Animalele de sex masculin, adulte, tinere, sănătoase se distribuie în mod aleatoriu în grupe martor şi grupe de tratament. Cuştile ar trebui să se aranjeze astfel încât posibilele efecte datorate amplasării acestora să fie reduse la minim. Animalele sunt identificate individual. Se procedează la aclimatizarea animalelor la condiţiile de laborator timp de minimum cinci zile înainte de începerea studiului.
      1.4.1.4.   Prepararea dozelor
      Substanţele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluţii sau suspensii în solvenţii sau vehiculele corespunzătoare şi să se dilueze, dacă este cazul, înainte de a fi administrate animalelor. Substanţele de testat lichide se pot administra direct sau dilua înainte de administrare. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanţă de testat, cu excepţia cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.
      1.4.2.   Condiţii de testare
      1.4.2.1.   Solventul/vehiculul
      Solventul/vehiculul nu ar trebui să producă efecte toxice la dozele utilizate şi nu ar trebui să existe suspiciunea reacţiei chimice a acestuia cu substanţa de testat. Utilizarea altor solvenţi/vehiculi decât cei recunoscuţi ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos.
      1.4.2.2.   Martorii
      Pentru fiecare test ar trebui să se prevadă martori pozitivi şi negativi (solvent/vehicul), utilizaţi în paralel. Cu excepţia tratamentului cu substanţa de testat, manipularea animalelor din grupele martor ar trebui să fie identică cu cea a animalelor din grupele tratate.
      Martorii pozitivi ar trebui să producă aberaţii structurale ale cromozomului in vivo la celule spermatogoniale, la nivelurile de expunere preconizate a genera o creştere detectabilă în raport cu fondul.
      Dozele de martor pozitiv ar trebui să fie alese, astfel încât să se obţină efecte clare, dar fără să releve imediat examinatorului identitatea lamelelor codificate. Pentru martorul pozitiv, se poate accepta administrarea pe o cale diferită de cea prin care se administrează substanţa de testat şi doar o singură prelevare a probelor. În plus, se poate avea în vedere utilizarea unor martori pozitivi din aceeaşi clasă de produse chimice, dacă sunt disponibili. În tabelul următor se prezintă exemple de substanţe care se pot utiliza ca martori pozitivi:
      
                  Substanţa
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. EINECS
               
            
                  ciclofosfamidă
                  ciclofosfamidă monohidrat
               
               
                  50-18-0
                  6055-19-2
               
               
                  200-015-4
               
            
                  ciclohexilamină
               
               
                  108-91-8
               
               
                  203-629-0
               
            
                  mitomicină C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  acrilamidă monomerică
               
               
                  79-06-1
               
               
                  201-173-7
               
            
                  trietilenmelamină
               
               
                  51-18-3
               
               
                  200-083-5
               
            Martorii negativi, trataţi doar cu solvent sau cu vehicule şi manipulaţi în acelaşi fel ca şi grupele tratate, ar trebui să fie incluşi la fiecare prelevare de probe, cu excepţia cazului în care se dispune de date acceptabile privind variabilitatea inter-animale şi frecvenţa celulelor cu aberaţii cromozomiale, provenite de la martori anteriori. În plus, ar trebui să se utilizeze şi martori netrataţi, cu excepţia cazului în care există date de la martori anteriori sau publicate care să ateste că solventul/vehiculul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene.
      1.5.   MOD DE LUCRU
      1.5.1.   Numărul de animale
      Fiecare grupă tratată şi martor trebuie să includă minimum cinci animale de sex masculin, analizabile.
      1.5.2.   Modalitatea de tratare
      Substanţele de testat se administrează de preferinţă o dată sau de două ori (și anume un singur tratament sau două tratamente). Substanţele de testat se mai pot administra în doze fracţionate, și anume două tratamente în aceeaşi zi la distanţă de doar câteva ore, pentru a facilita administrarea unui volum mare de material. Alte modalităţi de administrare ar trebui să fie justificate în mod ştiinţific.
      La grupa cu doza maximă prelevarea probelor după tratament se realizează în două momente. Deoarece substanţa de testat poate să influenţeze kinetica ciclului celular, prima şi ultima prelevare de probe se realizează la intervale de 24 de ore şi respectiv de 48 de ore după tratament. Pentru alte doze decât doza maximă, prelevarea probelor ar trebui să se realizeze la un interval de 24 de ore sau la un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular după tratament, cu excepţia cazului în care se cunoaşte un alt moment corespunzător de prelevare pentru detectarea efectelor (6).
      În plus, se pot utiliza şi alte momente de prelevare. De exemplu, pentru produsele chimice care pot produce cromozomi întârziaţi sau pot să aibă efecte independente de faza S, o prelevare timpurie a probelor ar putea fi adecvată (1).
      Adecvarea unui tratament repetat ar trebui să se determine de la caz la caz. După un program de tratamente repetate, animalele ar trebui să fie sacrificate după 24 de ore (1,5 ori durata ciclului celular) de la ultimul tratament. Se pot utiliza momente suplimentare de prelevare a probelor, dacă este necesar.
      Înainte de sacrificare, se procedează la injectarea intraperitoneală a animalelor cu o doză corespunzătoare de substanţă de inhibare a metafazei (de exemplu Colcemid® sau colchicină). Probele de la animale se prelevează apoi la un interval corespunzător. Pentru şoareci intervalul respectiv este de aproximativ 3-5 ore; pentru hamsterii chinezeşti intervalul este de 4-5 ore.
      1.5.3.   Dozele
      Dacă, în lipsa datelor corespunzătoare, se realizează un studiu pentru stabilirea dozelor, acesta ar trebui să se realizeze în acelaşi laborator şi să utilizeze aceeaşi specie, aceeaşi suşă de animale şi acelaşi regim de tratare ca în studiul principal ce urmează (7). În caz de toxicitate, se utilizează trei doze diferite pentru prima prelevare. Aceste trei doze ar trebui să acopere un domeniu de toxicităţi de la toxicitatea maximă până la toxicitatea minimă sau lipsă. Pentru prelevările ulterioare se utilizează doar doza maximă. Doza maximă se defineşte ca doza ce produce astfel de semne de toxicitate, încât dozele mai mari, administrate în acelaşi mod, se estimează că sunt letale.
      Substanţele cu activitate biologică specifică la doze mici netoxice (ca hormonii şi mitogenii) pot face excepţie de la criteriile de stabilire a dozelor şi să fie stabilite pentru fiecare caz în parte. Doza maximă se mai poate defini ca doza care produce anumite semne de toxicitate în celulele spermatogoniale (de exemplu o diminuare a proporţiei de mitoze spermatogoniale în raport cu prima şi a doua metafază meiotică; reducerea respectivă nu ar trebui să fie mai mare de 50 %).
      1.5.4.   Test-limită
      Dacă un test realizat cu o doză de minimum 2 000 mg/kg greutate corporală/zi, administrată într-o singură repriză sau în două reprize în aceeaşi zi, nu produce efecte toxice detectabile şi dacă o genotoxicitate este improbabilă pe baza datelor referitoare la substanţe cu o structură apropiată, se poate considera că un studiu complet cu utilizarea a trei doze de mărimi diferite nu este necesar. În funcţie de expunerea umană preconizată, ar putea fi necesară o doză mai mare în testul-limită.
      1.5.5.   Administrarea dozelor
      Substanţa de testat se administrează, de obicei, prin cavitatea nazală cu ajutorul unui tub stomacal sau a unei canule de intubaţie adaptate sau printr-o injecţie intraperitoneală. Se pot accepta şi alte căi de administrare, dacă se pot justifica. Volumul maxim de lichid care se poate administra prin sondă gastrică introdusă prin cavitatea nazală sau prin injecţie într-o singură repriză depinde de dimensiunea animalului de laborator. Volumul ar trebui să fie mai mic sau egal cu 2 ml/100 g greutate corporală. Utilizarea unor volume mai mari decât cel menţionat ar trebui să se justifice. Cu excepţia substanţelor iritante şi corozive care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentraţii mai mari, variaţia volumului testat ar trebui să fie redusă la minim prin ajustarea concentraţiei, astfel încât să se asigure un volum constant pentru toate dozele.
      1.5.6.   Prepararea cromozomilor
      Imediat după sacrificare, suspensiile celulare obţinute de la unul sau două testicule se expun la o soluţie hipotonică şi se fixează. Celulele se întind apoi pe lamele şi se colorează.
      1.5.7.   Analiza
      Pentru fiecare animal ar trebui să se analizeze minimum 100 de celule în metafază, bine etalate (de exemplu minimum 500 de celule în metafază pentru fiecare grupă). Dacă se observă un număr mai mare de aberaţii, numărul specificat se poate reduce. Toate lamelele, inclusiv cele cu celule de la martorii pozitivi şi negativi, ar trebui să fie codificate independent înainte de examinarea la microscop. Deoarece metodele de preparare a lamelelor conduc adesea la scindarea unei fracţii de celule în metafază cu pierdere de cromozomi, toate celulele examinate ar trebui, prin urmare, să conţină un număr de centromeri egal cu 2n ± 2.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Se recomandă prezentarea sub formă de tabel a datelor pentru fiecare animal. Unitatea experimentală este animalul. Pentru fiecare animal, ar trebui să se evalueze numărul de celule cu aberaţii cromozomiale de structură şi numărul de aberaţii cromozomiale per celulă. Diferitele tipuri de aberaţii cromozomiale de structură ar trebui să fie consemnate împreună cu numărul şi frecvenţa acestora pentru grupele tratate şi pentru grupele martor. Lacunele se consemnează şi se raportează separat, dar în general acestea nu se includ în frecvenţa totală a aberaţiilor.
      Dacă se observă concomitent mitoză şi meioză, ar trebui să se determine raportul dintre mitozele spermatogoniale, în prima, respectiv în a doua metafază meiotică; această determinare ar trebui să se realizeze pentru toate animalele tratate şi cele martori negativi, pe un eşantion total de 100 celule în diviziune pentru fiecare animal pentru a stabili un posibil efect citotoxic. Dacă se constată doar mitoză, ar trebui să se determine indexul mitotic în mimimum 1 000 de celule pentru fiecare animal.
      2.2.   EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o creştere în funcţie de doză a numărului relativ de celule cu aberaţii cromozomiale sau o creştere netă a numărului de celule cu aberaţii la o singură doză şi la o singură prelevare a probelor. În primul rând ar trebui să se aibă în vedere relevanţa biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge şi la ajutorul unor metode statistice (8). Semnificaţia statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferinţă printr-o modificare a condiţiilor de testare.
      Dacă rezultatele obţinute pentru o substanţă de testat nu îndeplinesc criteriile menţionate anterior, se consideră că substanţa respectivă nu este mutagenă în prezentul test.
      Deşi majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare, datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanţei de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de repetări ale experimentului.
      Rezultatele pozitive ale unui test in vivo de aberaţie cromozomială pe celule spermatogoniale indică faptul că substanţa de testat produce aberaţii cromozomiale de structură în celulele sexuale ale speciei testate. Rezultatele negative indică faptul că, în condiţiile de testare, substanţa de testat nu produce aberaţii cromozomiale în celulele germinale ale speciei testate.
      Ar trebui să se discute probabilitatea ca substanţa de testat sau metaboliţii acesteia să ajungă la ţesutul ţintă.
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Solventul/vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea şi stabilitatea substanţei de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaşte.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animalele de laborator:
                  
                              —
                           
                           
                              specia/suşa utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul şi vârsta animalelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursa, condiţiile de adăpost şi hrănire etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul de greutate, greutatea medie şi deviaţia standard pentru fiecare grupă.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dacă s-a realizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii dozelor utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea căii de administrare selectate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind administrarea substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea momentelor de sacrificare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conversia concentraţiei substanţei de testat (ppm) în hrană/apa de băut în doza reală (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei şi a apei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea amănunţită a modalităţilor de tratare şi de prelevare a probelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de măsurare a toxicităţii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identitatea substanţei de inhibare a metafazei, concentraţia acesteia şi durata tratamentului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de preparare a lamelelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile pentru numărătoarea aberaţiilor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule analizate per animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              indexul mitotic;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              procentul de celule spermatogoniale în mitoză în raport cu cele din prima şi a doua metafază meiotică;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tipul şi numărul aberaţiilor, consemnate separat pentru fiecare animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul total de aberaţii pentru fiecare grupă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule cu aberaţii pentru fiecare grupă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analizele statistice, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi studiaţi în paralel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele anterioare privind martorii negativi, cu domeniile, valorile medii şi deviaţiile standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              modificările ploidiei, dacă există.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Adler, I. D. (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert B., and Magnusson, J. (eds.) Liss, New York, pp. 477-484.
               
            
                  2.
               
               
                  Adler, I. D. (1984), Cytogenic tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, ed. S. Venitt and J. M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.
               
            
                  3.
               
               
                  Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cytogenetics and Cell Genetics, 3, pp. 289-294.
               
            
                  4.
               
               
                  Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
               
            
                  5.
               
               
                  Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, Mutation Res., 52, pp. 207-209.
               
            
                  6.
               
               
                  Adler, I. D., Shelby, M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka, N. (1994), International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res., 312, pp. 313-318.
               
            
                  7.
               
               
                  Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
               
            
                  8.
               
               
                  Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
               
            B.24.   TESTUL PETEI (SPOT TEST) LA ŞOARECI
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢIE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Acesta este un test in vivo pe şoareci, în care embrionii aflaţi în dezvoltare sunt expuşi la substanţele chimice de testat. Celulele ţintă sunt melanoblastele, iar genele de interes sunt cele care controlează pigmentarea blănii. Embrionii aflaţi în dezvoltare sunt heterozigoţi pentru un număr dintre aceste gene care determină culoarea blănii. În cursul unor evenimente genetice, o mutaţie sau o pierdere a alelelor dominante ale acestor gene dintr-o melanoblastă determină exprimarea fenotipului recesiv la celulele descendenţilor, acest fapt manifestându-se prin apariţia unei pete de culoare pe suprafaţa blănii la puii de şoareci. Se evaluează numărul descendenţilor cu aceste pete (mutaţii), iar frecvenţa acestora se compară cu aceea observată la descendenţii proveniţi din embrionii trataţi doar cu solvent. Testul petei decelează apariţia presupuselor mutaţii somatice ce survin în celulele fetale.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      Pregătire
      Dacă este posibil, substanţele de testat se dizolvă sau se suspensionează în soluţie izotonică salină. Substanţele chimice insolubile în apă sunt dizolvate sau suspensionate în vehicule corespunzătoare. Vehiculul nu trebuie să interfereze cu substanţa de testat şi nu trebuie să producă efecte toxice. Se utilizează soluţii proaspăt preparate.
      
         Animalele de experienţă
      
      Se împerechează şoareci din linia T (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye, cchp/cchp; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting; s/s) fie cu linia HT (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, ln fz/ln fz; pearl pe/pe), fie cu linia C57BL (nonagouti, a/a). Se mai pot folosi alte împerecheri corespunzătoare, cum ar fi între NMRI (nonagouti, a/a; albino, c/c) şi DBA (nonagouti, a/a; brown, b/b; dilute, d/d) pentru a produce descendenţi nonagouti.
      
         Număr şi sex
      
      Se tratează un număr suficient de femele gestante pentru a produce un număr corespunzător de descendenţi pentru fiecare doză de tratament. Mărimea corespunzătoare a eşantionului este dată de numărul petelor observate la şoarecii trataţi în comparaţie cu datele obţinute la lotul martor. Rezultatele negative se acceptă numai după ce s-au inventariat cel puţin 300 de descendenţi de la femelele tratate cu doza maximă.
      
         Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi
      
      Este necesar să fie disponibile date martor simultane obţinute de la şoarecii trataţi numai cu vehicul (martor negativ). Pentru a mări sensibilitatea testului, pot fi puse laolaltă şi date martor istorice de la acelaşi laborator, cu condiţia să fie omogene. În cazul în care nu se detectează niciun efect mutagen al substanţei de testat, pot fi folosite ca martor pozitiv rezultatele recente obţinute în acelaşi laborator pe loturi tratate cu o substanţă cunoscută ca fiind mutagenă.
      
         Calea de administrare
      
      Calea obişnuită de administrare a substanţei la femelele gestante este intubarea orală sau injectarea intraperitoneală. Pot fi utilizate, după caz, şi alte căi de administrare.
      
         Doze
      
      Se folosesc cel puţin două doze, inclusiv o doză care să determine apariţia semnelor de toxicitate sau reducerea numărului de pui la o fătare. Pentru substanţele netoxice trebuie folosită doza maximă care poate fi administrată.
      Mod de operare
      În mod normal, se administrează un tratament unic, în ziua a opta, a noua sau a zecea de gestaţie, considerând ziua 1 ziua în care se observă pentru prima dată dopul vaginal. Aceste zile corespund zilelor 7,25, 8,25 şi 9,25 de la concepţie. Tratamente succesive se pot efectua în zilele menţionate.
      
         Analiză
      
      În intervalul cuprins între trei şi patru săptămâni de la fătare, descendenţii se codează şi se examinează pentru observarea eventualelor pete apărute. Se disting trei categorii de pete:
      
                  (a)
               
               
                  pete albe de până la 5 mm pe linia medio-ventrală, despre care se presupune că apar prin moarte celulară (WMVS);
               
            
                  (b)
               
               
                  pete galbene, de tip agouti, dispuse în regiunile mamare, genitale, axilare şi inghinale, pe gât, precum şi în mijlocul frunţii, despre care se presupune că apar ca urmare a procesului de nediferenţiere (MDS);
               
            
                  (c)
               
               
                  pete pigmentare şi pete albe distribuite aleatoriu pe piele, despre care se presupune că provin din mutaţiile somatice (RS).
               
            Toate cele trei clase sunt descrise şi înregistrate, dar numai ultima, RS, prezintă relevanţă din punct de vedere genetic. Problemele pe care le ridică distincţia între MDS şi RS pot fi rezolvate prin examinarea probelor de blană prin microscopie cu fluorescenţă.
      Se înregistrează anomaliile morfologice genetice macroscopice apărute la descendenţi.
      2.   DATE
      Datele sunt prezentate ca număr total al descendenţilor inventariaţi şi numărul celor care au una sau mai multe pete produse prin mutaţii somatice. Datele din loturile tratate şi loturile martor negativ se compară printr-o metodă corespunzătoare. De asemenea, datele sunt prezentate în raport cu seria de pui de la o fătare.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  liniile folosite la încrucişare;
               
            
                  —
               
               
                  numărul femelelor gestante din loturile tratate şi loturile martor;
               
            
                  —
               
               
                  mărimea medie a seriei de pui din loturile tratate şi loturile martor, la naştere şi la înţărcare;
               
            
                  —
               
               
                  dozele de substanţă de testat;
               
            
                  —
               
               
                  solventul utilizat;
               
            
                  —
               
               
                  ziua gestaţiei în care s-a efectuat tratamentul;
               
            
                  —
               
               
                  calea de administrare;
               
            
                  —
               
               
                  numărul total de descendenţi examinaţi şi numărul celor care prezintă WMVS, MDS şi RS din loturile tratate şi loturile martor;
               
            
                  —
               
               
                  anomalii morfologice macroscopice;
               
            
                  —
               
               
                  relaţia doză-răspuns la RS dacă este posibil;
               
            
                  —
               
               
                  evaluarea statistică;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.25.   TRANSLOCAŢII EREDITARE LA ŞOARECI
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢIE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Testul translocaţiei ereditare la şoareci decelează modificările cromozomiale structurale şi numerice ale celulelor germinale de mamifere, apărute la descendenţii din prima generaţie. Tipurile de modificări cromozomiale detectate sunt translocaţii reciproce şi, dacă în experiment sunt incluşi şi descendenţii femele din generaţia F1, pierderea cromozomului X. Purtătorii de translocaţii şi femelele XO prezintă fertilitate redusă care este folosită la selecţia descendenţilor F1 pentru efectuarea analizelor citogenetice. Sterilitatea completă este determinată de anumite tipuri de translocaţii (X-autozom şi tipul c-t). Translocaţiile se observă citogenetic în timpul celulele meiotice în diachineză-metafaza I la masculi, fie că sunt masculi F1, fie descendenţi masculi ai femelelor F1. Femelele XO sunt identificate citogenetic prin prezenţa a doar 39 de cromozomi în mitozele măduvei osoase.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA TESTULUI
      Pregătire
      Substanţele chimice de testat se dizolvă în soluţie izotonică salină. Dacă sunt insolubile în apă, se dizolvă sau se suspensionează într-un vehicul corespunzător. Se utilizează soluţii proaspăt preparate ale compusului de testat. Vehiculul nu trebuie să interfereze cu compusul de testat şi nu trebuie să producă efecte toxice.
      
         Calea de administrare
      
      Calea de administrare obişnuită este intubarea orală sau injectarea intraperitoneală. Se pot folosi şi alte căi de administrare.
      
         Animale de experienţă
      
      Pentru a facilita reproducerea şi verificarea citologică, aceste experimente se fac pe şoareci. Nu este necesară utilizarea anumitor linii de şoareci. Cu toate acestea, mărimea medie a seriei de pui din linia respectivă trebuie să fie în medie mai mare de opt şi să fie relativ constant.
      Se folosesc animale mature din punct de vedere sexual.
      
         Numărul animalelor
      
      Numărul de animale necesare depinde de frecvenţa apariţiei translocaţiilor spontane şi de rata minimă de inducţie necesară pentru un rezultat pozitiv.
      De obicei, testul se efectuează pe descendenţii masculi F1. Trebuie testaţi cel puţin 500 de descendenţi masculi F1 pe lot. Dacă experimentul include şi descendenţi femele F1, sunt necesari 300 de masculi şi 300 de femele.
      
         Utilizarea martorilor negativi şi pozitivi
      
      Este necesar să fie disponibile date martor adecvate obţinute din martori simultani şi din martori istorici. Atunci când sunt disponibile rezultate acceptabile de la martorul pozitiv din alte experimente desfăşurate recent în acelaşi laborator, acestea pot fi folosite în locul unui martor pozitiv simultan.
      
         Doze
      
      Se testează o singură doză, de obicei doza maximă asociată cu producerea de efecte toxice minime, dar care nu produce efecte asupra comportamentului de reproducere sau asupra supravieţuirii. Pentru stabilirea unei relaţii doză/răspuns sunt necesare încă două doze mai mici. În cazul expunerii la substanţe chimice netoxice, este necesar să se administreze doza maximă posibilă.
      Mod de operare
      
         Tratament şi împerechere
      
      Există două scheme de tratament. Administrarea în doză unică este cel mai des utilizată; se poate recurge şi la administrarea substanţei de testat şapte zile pe săptămână timp de 35 de zile. Numărul de împerecheri după efectuarea tratamentului depinde de schema de tratament şi trebuie să asigure prelevarea de celule germinale tratate în toate stadiile. La sfârşitul perioadei de împerechere, femelele sunt plasate în cuşti individuale. Când gestantele fată, se înregistrează data, mărimea seriei de pui şi sexul descendenţilor. Toţi puii masculi sunt înţărcaţi, iar femelele pui sunt eliminate, cu excepţia cazului în care sunt incluse şi ele în experiment.
      
         Testarea heterozigoţilor de translocaţie
      
      Se utilizează una din cele două metode posibile:
      
                  —
               
               
                  testarea, prin analize citogenetice, a fertilităţii descendenţei F1 şi verificarea ulterioară a eventualilor purtători de translocaţii prin analiză citogenetică;
               
            
                  —
               
               
                  analiza citogenetică a tuturor descendenţilor masculi F1 fără o selecţie prealabilă prin testarea fertilităţii.
               
            
                  (a)
               
               
                  Testarea fertilităţii
                  Fertilitatea redusă a unui descendent F1 poate fi stabilită prin observaţii asupra mărimii seriei de pui şi/sau prin analizarea conţinutului uterin la femelele gestante.
                  Este necesar să se stabilească criteriile de determinare a fertilităţii normale sau reduse la linia de şoareci folosită.
                  Observaţii asupra mărimii seriei de pui: Masculii F1 care urmează să fie testaţi sunt plasaţi în cuşti individuale cu femele din acelaşi experiment sau din colonie. Cuştile se verifică zilnic începând cu a optsprezecea zi de la împerechere. La fătare se înregistrează mărimea seriei de pui şi sexul descendenţei F2, după care puii sunt eliminaţi. Dacă se testează descendenţa feminină F1, descendenţii F2 proveniţi din serii mici de pui sunt păstraţi pentru testări suplimentare. Toate femelele purtătoare de translocaţii sunt verificate prin analiza citogenetică a unei translocaţii la oricare din descendenţii lor masculi. Femelele XO se recunosc prin schimbarea raportului între sexe masculi/femele la descendenţii lor, de la 1:1 la 1:2. Într-o metodă secvenţială, animalele F1 normale nu fac obiectul unei alte verificări dacă prima serie de pui F2 atinge sau depăşeşte o valoare normală predeterminată, în caz contrar observându-se o a doua sau o a treia serie de pui F2.
                  Animalele F1 care nu pot fi clasificate ca normale după observaţiile efectuate pe cel mult trei serii de pui F2, sunt testate prin analiza conţinutului uterin al femelelor gestante sau sunt supuse direct analizei citogenetice.
                  Analiza conţinutului uterin: Reducerea mărimii seriei de pui în cazul purtătorilor de translocaţii se datorează morţii embrionilor, astfel încât un număr mare de implanturi moarte reprezintă un indiciu al prezenţei unei translocaţii la animalul testat. Fiecare mascul F1 care urmează să fie testat este împerecheat cu două-trei femele. Momentul concepţiei se stabileşte prin examinarea zilnică, dimineaţa, în vederea decelării prezenţei dopului vaginal. Femelele se sacrifică în a 14-16-a zi de gestaţie, înregistrându-se apoi implanturile vii sau moarte din uterul fiecăreia.
               
            
                  (b)
               
               
                  Analiză citogenetică
                  Preparatele testiculare se obţin prin tehnica uscării la aer. Purtătorii de translocaţii se identifică prin prezenţa configuraţiilor multivalente la diachineză-metafaza I la nivelul spermatociţilor primari. Prezenţa a cel puţin două celule cu asociaţii multivalente constituie dovada necesară că animalul testat este purtătorul unei translocaţii.
                  Dacă nu s-a produs nicio selecţie prin analiza reproducerii, toţi masculii F1 se examinează citogenetic. Se analizează microscopic cel puţin 25 de celule în faza de diachineză-metafaza I pentru fiecare mascul. Examinarea metafazei mitotice în spermatogonii sau în măduva osoasă este necesară la masculii F1 cu testicule mici şi rupere meiotică înainte de diachineză sau la femele F1 suspecte de a fi XO. Prezenţa unui cromozom neobişnuit de lung şi/sau scurt în fiecare a zecea celulă indică o translocaţie specială care induce sterilitatea masculului (tip c-t). Anumite translocaţii X-autozome care determină sterilitatea masculină pot fi identificate numai printr-o serie de analize ale benzilor de cromozomi mitotici. Prezenţa a 39 de cromozomi în toate cele 10 mitoze indică starea XO la o femelă.
               
            2.   DATE
      Datele sunt prezentate sub formă de tabele.
      Mărimea medie a seriei de pui şi raportul numeric între sexe se înregistrează de la naştere până la înţărcare pentru fiecare perioadă de împerechere.
      Pentru evaluarea fertilităţii animalelor F1, se prezintă mărimea medie a seriei de pui pentru toate împerecherile normale şi mărimea fiecărei serii de pui proveniţi din animale F1 purtătoare de translocaţii. Pentru examinarea conţinutului uterin se specifică numărul mediu al implanturilor vii şi moarte în împerecherile normale şi numărul implanturilor vii şi moarte pentru fiecare împerechere a purtătorilor de translocaţii F1.
      Pentru analiza citogenetică a diachineză-metafazei I, se înregistrează numărul tipurilor de configuraţii multivalente şi numărul total de celule pentru fiecare purtător de translocaţii.
      Pentru fiecare exemplar F1 steril se raportează numărul total de împerecheri şi durata perioadei de împerechere. Se fac analize citogenetice detaliate şi se cântăresc testiculele.
      Pentru femelele XO se specifică mărimea medie a seriei de pui, raportul numeric dintre sexe la descendenţa F2 şi rezultatele analizei citogenetice.
      În cazul în care posibilii purtători de translocaţii F1 sunt preselecţionaţi în teste de fertilitate, tabelele trebuie să cuprindă informaţii despre numărul celor care sunt confirmaţi cu heterozigoţi de translocaţie.
      Se raportează, de asemenea, date referitoare la experimentele pe martorii pozitivi şi negativi.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  linia de şoareci, vârsta animalelor, greutatea animalelor tratate;
               
            
                  —
               
               
                  numărul animalelor parentale de fiecare sex din lotul tratat şi din lotul martor;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare, descrierea amănunţită a tratamentului, dozele, solvenţii, schema de împerechere;
               
            
                  —
               
               
                  numărul şi sexul descendenţilor pentru fiecare femelă, numărul şi sexul descendenţilor aleşi pentru analiza de translocaţie;
               
            
                  —
               
               
                  momentul şi criteriile analizei de translocaţie;
               
            
                  —
               
               
                  numărul şi descrierea amănunţită a purtătorilor de translocaţii, inclusiv date privind reproducerea şi conţinutul uterin, după caz;
               
            
                  —
               
               
                  metode citogenetice şi detalii asupra analizei microscopice, preferabil cu imagini;
               
            
                  —
               
               
                  evaluarea statistică;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.26.   TESTUL DE TOXICITATE ORALĂ SUBCRONICĂ STUDIU DE 90 DE ZILE DE TOXICITATE ORALĂ CU DOZĂ REPETATĂ LA ROZĂTOARE
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare a toxicităţii orale subcronice reproduce Orientarea 408 (1998) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      La aprecierea şi evaluarea caracteristicilor toxice ale unui produs chimic, determinarea toxicităţii orale subcronice folosind doze repetate se poate realiza după ce au fost obţinute informaţiile iniţiale asupra toxicităţii din teste de toxicitate acută sau teste de toxicitate de 28 de zile cu doză repetată. Studiul de 90 de zile furnizează informaţii despre posibilele pericole pentru sănătate ce pot fi antrenate de expunerea repetată pe o perioadă îndelungată, care se extinde de la înţărcare până la vârsta adultă. Studiul furnizează informaţii asupra efectelor toxice majore, indicând organele-ţintă şi posibilitatea de acumulare, şi poate furniza şi o estimare a nivelului de expunere la risc la care nu se observă efecte adverse, care poate fi folosită în alegerea dozelor pentru studiile de toxicitate cronică şi la stabilirea criteriilor de securitate în cazul expunerii la risc a oamenilor.
      Această metodă de testare pune un accent suplimentar pe efectele neurologice şi furnizează indicii despre efectele imunologice şi de reproducere. Se subliniază, de asemenea, necesitatea observării clinice atente a animalelor, astfel încât să se obţină numărul maxim posibil de informaţii. Studiul ar trebui să aibă în vedere identificarea substanţelor care au potenţialul de a produce efecte neurotoxice sau imunologice ori efecte asupra organelor de reproducere, ceea ce ar justifica efectuarea în continuare a unor studii mai aprofundate.
      A se vedea şi introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Doza: este cantitatea de substanţă testată administrată. Doza este exprimată ca greutate (g, mg) sau ca greutatea substanţei testate raportată la unitatea de greutate a animalului de laborator (de exemplu mg/kg) ori ca o concentraţie constantă în alimentaţie (ppm).
      
         Dozajul: este un termen general care cuprinde doza, frecvenţa acesteia şi durata administrării.
      
         DFEAO: este abrevierea pentru „doza fără efecte adverse observabile” (NOAEL: No Observable Adverse Effect Level) şi reprezintă doza maximă la care nu s-au constatat stări adverse legate de tratament.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Diferite doze din substanţa testată se administrează zilnic, pe cale orală, câtorva grupuri de animale de laborator, nivelul dozei fiind acelaşi pentru un grup, timp de 90 de zile. În perioada administrării, animalele se ţin sub observaţie atentă în scopul de a constata semnele de toxicitate. Animalele care mor sau care sunt sacrificate în timpul testului sunt autopsiate şi la sfârşitul testului animalele supravieţuitoare sunt, de asemenea, sacrificate şi autopsiate.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Pregătirea animalelor
      Trebuie folosite animale sănătoase, care au fost acomodate la condiţiile de laborator timp de minimum 5 zile şi nu au mai fost folosite în alte experienţe. Trebuie precizate specia, suşa, provenienţa, sexul, greutatea şi vârsta. Animalele se repartizează aleator în grupurile tratate şi grupurile martor. Cuştile se amplasează astfel încât să se reducă la minimum posibilele efecte datorate modului lor de dispunere. Fiecărui animal i se atribuie un număr de identificare unic.
      1.4.2.   Pregătirea dozelor
      Substanţa testată se administrează prin introducerea în stomac cu ajutorul unei sonde sau prin alimente ori apa de băut. Metoda de administrare pe cale orală depinde de scopul studiului şi de proprietăţile fizico-chimice ale substanţei testate.
      Acolo unde este necesar, substanţa testată se dizolvă sau se trece în suspensie într-un purtător adecvat. Se recomandă ca, acolo unde este posibil, să se ia mai întâi în considerare folosirea unei soluţii/suspensii apoase, urmată de o soluţie/emulsie în ulei (de exemplu ulei de porumb) şi în cele din urmă de o soluţie în alţi purtători. Trebuie cunoscute caracteristicile de toxicitate ale purtătorilor alţii decât apa. Se determină stabilitatea substanţei testate în condiţiile de administrare.
      1.4.3.   Condiţiile de testare
      1.4.3.1.   Animalele de laborator
      Specia preferată este şobolanul, deşi pot fi folosite şi alte specii de rozătoare, de exemplu şoarecele. Este recomandabil să se folosească animale adulte tinere, sănătoase, provenind din suşe de laborator obişnuite. Femelele trebuie să fie nulipare şi să nu fie însărcinate. Administrarea începe cât mai curând posibil după înţărcare şi în niciun caz mai târziu de vârsta de nouă săptămâni. La începutul studiului, diferenţele de greutate între animalele folosite trebuie să fie minime şi să nu depăşească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex. Atunci când studiul este efectuat în preliminariile unui studiu pe termen lung de toxicitate cronică, în ambele studii trebuie folosite animale din aceeaşi suşă şi din aceeaşi sursă.
      1.4.3.2.   Numărul şi sexul animalelor
      La fiecare nivel al dozei se folosesc cel puţin 20 de animale (10 femele şi 10 masculi). Dacă sunt planificate sacrificări pe parcurs, numărul trebuie suplimentat cu numărul de animale planificate pentru sacrificare înainte de sfârşitul studiului. Pe baza cunoştinţelor existente despre produsul chimic sau un produs foarte asemănător, ar trebui să se ia în considerare includerea unui grup satelit suplimentar de 10 animale (5 de fiecare sex) în grupul martor şi în grupul tratat cu doza cea mai puternică, pentru a observa, după tratament, reversibilitatea sau persistenţa oricărui efect toxic. Durata perioadei post-tratament se fixează în funcţie de efectele observate.
      1.4.3.3.   Doze
      Dozele folosite sunt la minimum trei niveluri şi există un grup martor, în afara cazului în care se face un test la valori-limită (a se vedea punctul 1.4.3.4). Nivelul dozelor este stabilit în funcţie de rezultatele studiilor cu doză repetată sau ale studiilor preliminare şi iau în considerare orice date toxicologice şi toxico-cinetice disponibile pentru substanţa testată sau substanţe înrudite. Dacă nu există limitări datorate proprietăţilor fizico-chimice sau efectelor biologice ale substanţei, este recomandabil să se aleagă doza maximă care induce efectul toxic, dar nu şi moartea sau suferinţa severă. Se alege o serie descrescătoare de doze, în scopul de a demonstra legătura între răspuns şi nivelul dozei, precum şi nivelul dozei fără efecte adverse observabile (DFEAO), în cazul celei mai mici doze. În mod frecvent, se dovedeşte că la formarea seriei descrescătoare a dozelor este optimă progresia geometrică cu raţia 2-4 şi deseori adăugarea unui al patrulea grup de probă este preferabil folosirii unor raţii foarte mari (de exemplu, mai mari de 6-10) între doze.
      Grupul martor este un grup netratat sau tratat cu purtător, dacă se foloseşte un purtător la administrarea substanţei testate. Cu excepţia substanţei testate, animalele din grupul martor trebuie tratate în mod identic cu acelea din grupurile de probă. Dacă se foloseşte un purtător, grupul martor primeşte purtătorul în cantitatea maximă folosită. Dacă substanţa testată se administrează în alimente şi provoacă reducerea apetitului, un grup martor hrănit în paralel se poate dovedi folositor pentru a determina dacă reducerea se datorează modificării caracteristicilor organoleptice ale alimentelor sau alterărilor toxicologice din organismul animalelor de laborator.
      Trebuie luate în considerare următoarele caracteristici ale purtătorului şi ale altor aditivi, după caz: efectele asupra absorbţiei, circulaţiei, metabolizării sau retenţiei substanţei testate; efectele asupra proprietăţilor chimice ale substanţei testate care pot să altereze caracteristicile sale toxice şi efectele asupra consumului de hrană sau apă ori asupra stării de nutriţie a animalelor.
      1.4.3.4.   Testul-limită
      Dacă testul efectuat la o doză unică, echivalentă cu cel puţin 1 000 mg/kg greutate corporală/zi, folosind metodologia descrisă pentru acest studiu, nu produce efecte adverse observabile şi toxicitatea nu este de aşteptat în baza datelor existente pentru substanţele înrudite structural, se consideră că nu este necesar un studiu integral cu trei doze de niveluri diferite. Testul la valori-limită este aplicabil cu excepţia cazului în care expunerea oamenilor arată că este necesară folosirea unei doze mai mari.
      1.5.   MOD DE LUCRU
      1.5.1.   Administrarea dozelor
      Animalelor li se administrează substanţa testată zilnic, şapte zile în fiecare săptămână, pentru o perioadă de 90 de zile. Orice alt regim de dozare, de exemplu cinci zile pe săptămână, trebuie justificat. Când substanţa testată se administrează cu ajutorul sondei introduse în stomac, se administrează toată doza o dată fiecărui animal, folosind o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o dată depinde de mărimea animalului de laborator. Volumul nu trebuie să depăşească 1 ml/100 g greutate corporală, cu excepţia soluţiilor apoase, când se pot folosi 2 ml/100 g greutate corporală. Cu excepţia substanţelor iritante sau corozive, care provoacă în mod obişnuit efecte exacerbate la concentraţii mai mari, este recomandabil ca variaţiile în volumul probei să fie reduse la minimum, ajustându-se concentraţia astfel încât să se asigure un volum constant, indiferent de nivelul dozei.
      Pentru substanţele administrate în alimente sau în apa de băut, este important să se ia măsuri astfel încât cantităţile de substanţă testată implicate să nu interfereze cu nutriţia normală sau cu echilibrul hidric. Când substanţa testată este administrată în alimente, se foloseşte fie o concentraţie constantă în alimente (ppm), fie o doză de nivel constant în raport cu greutatea animalului; alternativa folosită trebuie specificată. În cazul folosirii sondei, doza trebuie administrată aproximativ în acelaşi moment al zilei şi ajustată după necesităţi, pentru a rămâne constantă în raport cu greutatea corporală a animalului. Atunci când un studiu de 90 de zile este folosit în preliminariile unui studiu pe termen lung de toxicitate cronică, se recomandă folosirea unei alimentaţii asemănătoare în ambele studii.
      1.5.2.   Observaţiile
      Perioada de observaţie se recomandă să fie de minimum 90 de zile. Animalele din grupul satelit programat pentru observaţie ulterioară trebuie să nu primească tratament o perioadă adecvată, pentru a detecta persistenţa sau reversibilitatea efectelor toxice.
      Se recomandă ca observaţiile clinice generale să fie făcute cel puţin o dată pe zi, de preferat la aceeaşi oră (aceleaşi ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrare. Se recomandă înregistrarea stării clinice a animalelor. Cel puţin de două ori pe zi, de regulă la începutul şi la sfârşitul fiecărei zile, toate animalele sunt examinate pentru constatarea simptomelor de morbiditate şi mortalitate.
      Se recomandă efectuarea de observaţii clinice detaliate asupra tuturor animalelor cel puţin o dată înainte de prima expunere (pentru a putea face comparaţii în cazul aceluiaşi individ) şi apoi o dată pe săptămână. Aceste examene se recomandă să fie făcute în afara cuştii, de preferinţă într-o incintă standardizată şi la aceeaşi oră de fiecare dată. Ele se consemnează cu atenţie, de preferat folosind un sistem de notare definit explicit de laboratorul de testare. Trebuie acţionat astfel încât variaţia condiţiilor de observare să fie minimă. Simptomele urmărite cuprind, fără a se limita la ele, schimbări ale pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, frecvenţa secreţiilor şi a excreţiilor, ca şi activitatea reflexă (de exemplu: lăcrimarea, erecţia piloasă, modificarea pupilelor, respiraţia anormală). Este recomandabil să fie observate, de asemenea, schimbările în mers, ţinută şi reacţie la manipulare, precum şi prezenţa mişcărilor clonice şi tonice, a stereotipiilor (de exemplu îngrijirea corporală excesivă, mersul circular repetat) sau a comportamentelor bizare (de exemplu automutilarea, mersul înapoi) (1).
      Examinarea oftalmologică, cu un oftalmoscop sau un aparat echivalent adecvat, de preferat a tuturor animalelor dar cel puţin a animalelor din grupul cu doza cea mai mare şi din grupul martor, trebuie efectuată înainte de administrarea substanţei testate şi la încheierea studiului. Dacă se constată modificări ale ochilor, toate animalele trebuie examinate.
      Spre sfârşitul perioadei de expunere şi în orice caz nu înainte de săptămâna 11, se evaluează reactivitatea senzorială la diferite tipuri de stimuli (1) (de exemplu stimuli auditivi, vizuali, proprioceptivi) (2) (3) (4), se evaluează forţa de apucare (5) şi activitatea motorie (6). Detalii suplimentare referitoare la metodele utilizabile figurează în referinţele bibliografice respective. Se pot folosi şi metode diferite de cele menţionate.
      Observaţiile funcţionale pot fi omise spre sfârşitul studiului atunci când sunt disponibile date despre observaţiile funcţionale din alte studii şi observaţiile clinice zilnice nu au evidenţiat deficite funcţionale.
      În mod excepţional, observaţiile funcţionale pot fi, de asemenea, omise pentru grupurile care, pe de altă parte, prezintă simptome de toxicitate în asemenea măsură încât ar interfera semnificativ cu desfăşurarea testului funcţional.
      1.5.2.1.   Greutatea corporală şi consumul de hrană/apă
      Toate animalele trebuie cântărite cel puţin o dată pe săptămână. Măsurarea consumului de hrană se face cel puţin săptămânal. Dacă substanţa testată se administrează în apa de băut, se măsoară şi apa de băut cel puţin săptămânal. Este recomandabil să se măsoare consumul de apă şi în studiile cu substanţă testată administrată în alimente sau prin sondă, atunci când băutul apei poate suferi modificări.
      1.5.2.2.   Hematologia şi biochimia clinică
      Se prelevează probe de sânge din puncte determinate şi se conservă, dacă este cazul, în condiţii adecvate. La sfârşitul perioadei de testare, probele se colectează imediat înainte de sacrificarea animalelor sau ca parte a acestei proceduri.
      La sfârşitul perioadei de testare şi atunci când se colectează probe de sânge pe parcurs, se procedează la următoarele examene hematologice: hematocrit, concentraţie de hemoglobină, numărătoarea eritrocitelor şi a leucocitelor, formula leucocitară, numărătoarea plachetelor sangvine, măsurarea timpului de coagulare.
      Determinările de biochimie clinică în scopul determinării efectelor toxice majore în ţesuturi şi, în special, efectele asupra rinichiului şi a ficatului sunt practicate pe probe de sânge obţinute de la fiecare animal imediat înainte de sacrificare sau ca parte a acestei proceduri (dar nu de la cele găsite muribunde sau care au fost sacrificate pe parcurs). Ca şi la investigaţiile hematologice, se pot recolta pe parcurs probe pentru analize de biochimie chimică. Se recomandă ca animalele să nu primească hrană în timpul nopţii dinainte de recoltare (3). Analizele de plasmă sau ser cuprind sodiu, potasiu, glucoză, colesterol total, uree, acid uric în sânge, creatinină, proteine şi albumine totale şi mai mult de două enzime indicând efectele hepatocelulare (ca alaninaminotransferaza, aspartat aminotransferaza, fosfataza alcalină, gamaglutamiltranspeptidaza şi sorbitol dehidrogenaza). Pot fi incluse şi măsurători ale altor enzime (hepatice sau de altă origine) şi ale acizilor biliari, care pot furniza informaţii utile în anumite situaţii.
      Opţional, pot fi efectuate următoarele analize de urină în ultima săptămână a studiului, folosind probe de urină prelevate după un anumit orar: aspect, volum, osmolaritate sau densitate, pH, proteinurie, glucozurie, hematurie.
      În plus, trebuie avute în vedere investigaţii asupra constantelor plasmatice ale leziunilor generale ale ţesuturilor. Dacă proprietăţile cunoscute ale substanţei testate pot sau se apreciază că pot să afecteze curbele metabolice conexe, trebuie efectuate şi alte analize, cum sunt: calciu, fosfor, trigliceride à jeun, hormoni specifici, methemoglobină şi colinesterază. Acestea trebuie identificate pentru substanţele chimice din anumite clase sau de la caz la caz.
      În general, este nevoie de o abordare flexibilă, în funcţie de specii şi de efectele constatate şi scontate ale substanţei în cauză.
      Dacă datele istorice de referinţă sunt insuficiente, este cazul să se ia în considerare necesitatea de a determina variabilele hematologice şi de biochimie clinică înainte de începerea administrării; în general, nu se recomandă ca aceste date să se obţină înaintea tratamentului (7).
      1.5.2.3.   Autopsia
      Toate animalele cuprinse în studiu sunt supuse unei autopsii complete şi detaliate, care cuprinde examinarea atentă a suprafeţei externe a corpului, a tuturor orificiilor, a cavităţilor craniană, toracică şi abdominală, precum şi a conţinutului acestora. Ficatul, rinichii, glandele suprarenale, testiculele, epididimul, uterul, ovarele, timusul, splina, creierul şi inima fiecărui animal (cu excepţia celor găsite muribunde şi a celor sacrificate pe parcurs) sunt curăţate de ţesuturile aderente, după caz, şi cântărite proaspete cât mai repede după disecţie, pentru a evita deshidratarea.
      Ţesuturile următoare se conservă în mediul de fixare cel mai adecvat atât pentru tipul de ţesut, cât şi pentru examenul histopatologic prevăzut: toate organele prezentând leziuni macroscopice, creierul (regiunile reprezentative, cuprinzând encefalul, cerebelul şi trunchiul cerebral), măduva spinării (din trei segmente: cervical, medio-toracic şi lombar), hipofiza, glanda tiroidă, glandele paratiroide, timusul, esofagul, glandele salivare, stomacul, intestinul subţire şi intestinul gros (inclusiv plăcile lui Peyer), ficatul, pancreasul, rinichii, glandele suprarenale, splina, inima, traheea şi plămânii (conservaţi prin exces de fixativ şi apoi imersie) aorta, gonadele, uterul, organele genitale anexe, glanda mamară feminină, prostata, vezica urinară, vezica biliară (şoarece), ganglionii limfatici (de preferinţă un ganglion limfatic din zona afectată de calea de administrare şi un alt ganglion limfatic din altă zonă, aflată la distanţă, pentru a detecta eventualele efecte sistemice), nervii periferici (sciatic sau tibial), de preferat din apropierea muşchiului, o probă de măduvă osoasă (şi o puncţie aspirativă de măduvă osoasă examinată pe loc), piele şi ochi (dacă s-au constat modificări la examenele oftalmologice). Observaţiile clinice şi cele macroscopice pot să conducă la necesitatea de a examina ţesuturi suplimentare. Se conservă şi alte organe considerate probabile organe-ţintă pentru substanţa testată, având în vedere proprietăţile sale cunoscute.
      1.5.2.4.   Histopatologia
      Se efectuează un examen histopatologic complet al ţesuturilor şi organelor tuturor animalelor aparţinând grupului martor şi grupului tratat cu doza cea mai mare. Aceste examene trebuie extinse la animalele tratate cu alte doze, dacă se constată modificări care au legătură cu tratamentul la grupul tratat cu doza cea mai mare.
      1.5.2.5. Se examinează toate leziunile macroscopice
      Atunci când se foloseşte un grup satelit, se efectuează un examen histopatologic al ţesuturilor şi organelor la care au fost identificate efecte în grupurile tratate.
      2.   DATE ŞI RAPORT
      2.1.   DATE
      Datele se prezintă individual. În plus, toate datele trebuie rezumate în formă tabelară, arătându-se pentru fiecare grup de experienţă, numărul de animale la începutul testului, numărul de animale găsite moarte în timpul testului sau sacrificate din motive umanitare şi momentul morţii sau al sacrificării, numărul de animale prezentând simptome de toxicitate, o descriere a simptomelor de toxicitate, inclusiv momentul apariţiei acestora, durata şi severitatea tuturor efectelor toxice, numărul animalelor prezentând leziuni, tipul leziunilor şi procentul animalelor prezentând fiecare tip de leziune.
      Dacă este cazul, datele numerice se evaluează printr-o metodă statistică adecvată şi general acceptată. Metodele statistice şi datele care urmează să fie analizate trebuie să fie selecţionate în etapa de redactare a protocolului de testare.
      2.2.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare cuprinde următoarele informaţii:
      2.2.1.   Substanţa testată:
      
                  —
               
               
                  natura fizică, puritatea și proprietăţile fizico-chimice;
               
            
                  —
               
               
                  datele de identificare chimică;
               
            
                  —
               
               
                  purtătorul (dacă este cazul); justificarea alegerii purtătorului dacă este altul decât apa.
               
            2.2.2.   Animalele de laborator:
      
                  —
               
               
                  specia şi suşa folosite;
               
            
                  —
               
               
                  numărul, vârsta şi sexul animalelor;
               
            
                  —
               
               
                  sursa, condiţiile de adăpost, regimul alimentar etc.;
               
            
                  —
               
               
                  greutatea individuală a animalelor la începutul testului.
               
            2.2.3.   Condiţiile de testare:
      
                  —
               
               
                  motivaţia alegerii dozelor;
               
            
                  —
               
               
                  detalii privind preparatul hrană/reţeta substanţei testate, concentraţia realizată, stabilitatea şi omogenitatea preparatului;
               
            
                  —
               
               
                  detalii privind administrarea substanţei testate;
               
            
                  —
               
               
                  dozele reale (mg/kg greutate corporală/zi) şi factorul de conversie a substanţei testate din concentraţia în hrană sau apa de băut (ppm) în doza reală, dacă este cazul;
               
            
                  —
               
               
                  detalii privind calitatea hranei şi a apei.
               
            2.2.4.   Rezultatele:
      
                  —
               
               
                  greutatea corporală şi modificările în greutatea corporală;
               
            
                  —
               
               
                  consumul de hrană și apă, dacă este cazul;
               
            
                  —
               
               
                  rezultate privind răspunsul toxic, pe sexe şi nivelul dozelor, inclusiv simptomele de toxicitate;
               
            
                  —
               
               
                  natura, severitatea şi durata efectelor observate clinic (reversibile sau nu);
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele examenului oftalmologic;
               
            
                  —
               
               
                  activitatea senzorială, forţa de apucare, aprecierea activităţii motorii (dacă sunt disponibile);
               
            
                  —
               
               
                  valorile hematologice şi valorile de referinţă corespunzătoare;
               
            
                  —
               
               
                  valorile de biochimie clinică şi valorile de referinţă corespunzătoare;
               
            
                  —
               
               
                  greutatea corporală la moartea animalului, greutăţile organelor interne, raporturile dintre greutatea organului intern şi greutatea corporală;
               
            
                  —
               
               
                  constatările de la autopsie;
               
            
                  —
               
               
                  o descriere detaliată a tuturor observaţiilor histopatologice;
               
            
                  —
               
               
                  date privind absorbţia, dacă sunt disponibile;
               
            
                  —
               
               
                  prelucrarea statistică a rezultatelor, dacă este cazul.
               
            Discutarea rezultatelor.
      Concluzii.
      3.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No 60.
               
            
                  2.
               
               
                  Tupper, D. E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, pp. 999-1003.
               
            
                  3.
               
               
                  Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, pp. 691-704.
               
            
                  4.
               
               
                  Moser, V. C., Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, pp. 267-283.
               
            
                  5.
               
               
                  Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C., Riley M. T. (1979). A Method for the Routine Assesment of Fore- and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 233-236.
               
            
                  6.
               
               
                  Crofton K. M., Howard J. L., Moser V. C., Gill M. W., Reiter L. W., Tilson H. A., MacPhail R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, pp. 599-609.
               
            
                  7.
               
               
                  Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). „Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies”, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198-201.
               
            B.27.   TESTUL DE TOXICITATE ORALĂ SUBCRONICĂ STUDIU DE 90 DE ZILE DE TOXICITATE ORALĂ CU DOZĂ REPETATĂ LA NEROZĂTOARE
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare a toxicităţii orale subcronice reproduce Orientarea 409 (1998) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      La aprecierea şi evaluarea caracteristicilor toxice ale unui produs chimic, determinarea toxicităţii orale subcronice folosind doze repetate se poate realiza după ce au fost obţinute informaţiile iniţiale asupra toxicităţii din teste de toxicitate acută sau teste de toxicitate de 28 de zile cu doză repetată. Studiul de 90 de zile furnizează informaţii despre posibilele pericole pentru sănătate care pot fi antrenate de expunerea repetată la risc pe o perioadă îndelungată, care se extinde de la înţărcare până la vârsta adultă. Studiul furnizează informaţii asupra efectelor toxice majore, indicând organele-ţintă şi posibilitatea de acumulare şi poate furniza şi o estimare a nivelului de expunere la care nu se observă efecte adverse, care poate fi folosită în alegerea dozelor pentru studiile de toxicitate cronică şi la stabilirea criteriilor de securitate în cazul expunerii la risc a oamenilor.
      Metoda are în vedere identificarea la speciile nerozătoare a efectelor adverse ale expunerii chimice şi se foloseşte doar:
      
                  —
               
               
                  în cazul în care efectele observate în alte studii indică necesitatea unei clarificări/caracterizări cu ajutorul unei a doua specii, nerozătoare; sau
               
            
                  —
               
               
                  în cazul în care studiile toxico-cinetice indică faptul că folosirea unei anumite specii nerozătoare reprezintă cea mai relevantă alegere a animalului de laborator; sau
               
            
                  —
               
               
                  în cazul în care alte anumite motive justifică folosirea unei specii nerozătoare.
               
            A se vedea şi introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Doză: este cantitatea de substanţă testată administrată. Doza este exprimată ca greutate (g, mg) sau ca greutatea substanţei testate pe unitatea de greutate a animalului de laborator (de exemplu mg/kg) sau în concentraţii constante în alimentaţie (ppm).
      
         Dozaj: este un termen general care cuprinde doza, frecvenţa acesteia şi durata administrării.
      
         DFEAO: este abrevierea pentru „doza fără efecte adverse observabile” (NOAEL: No Observable Adverse Effect Level) şi reprezintă doza maximă la care nu s-au constatat stări adverse legate de tratament.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Diferite doze din substanţa testată se administrează zilnic, pe cale orală, câtorva grupuri de animale de laborator, nivelul dozei fiind acelaşi pentru un grup, timp de 90 de zile. În perioada administrării, animalele se ţin sub observaţie atentă în scopul de a constata semnele de toxicitate. Animalele care mor sau care sunt sacrificate în timpul testului sunt autopsiate şi la sfârşitul testului animalele supravieţuitoare sunt, de asemenea, sacrificate şi autopsiate.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Alegerea speciei de animale
      Specia nerozătoare folosită în mod obişnuit este câinele, care trebuie să fie de rasă definită; frecvent este folosit basetul. Pot fi folosite şi alte specii, de exemplu porcul sau porcul pitic. Nu se recomandă primatele, iar folosirea lor trebuie justificată. Trebuie folosite animale tinere şi sănătoase, iar în cazul câinelui administrarea trebuie să înceapă de preferinţă la vârsta de 4-6 luni şi nu mai târziu de vârsta de nouă luni. Atunci când studiul este efectuat în preliminariile unui studiu pe termen lung de toxicitate cronică, în ambele studii trebuie folosite animale din aceeaşi specie/rasă.
      1.4.2.   Pregătirea animalelor
      Trebuie folosite animale tinere şi sănătoase, care au fost acomodate la condiţiile de laborator şi care nu au mai fost folosite în alte experienţe. Durata aclimatizării depinde de specia aleasă şi de provenienţa sa. Se recomandă cel puţin cinci zile pentru câini sau pentru porci hrăniţi anume în acest scop în colonia laboratorului şi cel puţin două săptămâni pentru aceleaşi animale din surse externe. Trebuie precizate specia, suşa, provenienţa, sexul, greutatea şi vârsta. Animalele se repartizează aleator în grupurile tratate şi grupurile martor. Cuştile se amplasează astfel încât să se reducă la minimum posibilele efecte datorate modului lor de dispunere. Fiecărui animal i se atribuie un număr de identificare unic.
      1.4.3.   Pregătirea dozelor
      Substanţa testată se administrează în alimente sau în apa de băut ori prin introducerea în stomac cu ajutorul unei sonde sau în capsule. Metoda de administrare pe cale orală depinde de scopul studiului şi de proprietăţile fizico-chimice ale substanţei testate.
      Acolo unde este necesar, substanţa testată se dizolvă sau se trece în suspensie într-un purtător adecvat. Se recomandă ca, acolo unde este posibil, să se ia mai întâi în considerare folosirea unei soluţii/suspensii apoase, urmată de o soluţie/emulsie în ulei (de exemplu ulei de porumb) şi în cele din urmă de o soluţie în alţi purtători. Trebuie cunoscute caracteristicile de toxicitate ale purtătorilor, alţii decât apa. Trebuie determinată stabilitatea substanţei testate în condiţiile de administrare.
      1.5.   MOD DE LUCRU
      1.5.1.   Numărul şi sexul animalelor
      La fiecare nivel al dozei se folosesc cel puţin opt animale (patru femele şi patru masculi). Dacă sunt planificate sacrificări pe parcurs, numărul trebuie suplimentat cu numărul de animale planificate să fie sacrificate înainte de sfârşitul testului. Numărul animalelor la încheierea studiului trebuie să fie adecvat pentru ca evaluarea efectelor toxice să aibă semnificaţie. Pe baza cunoştinţelor existente despre produsul chimic sau un produs foarte asemănător, ar trebui să se ia în considerare includerea unui grup satelit suplimentar de opt animale (patru de fiecare sex) în grupul martor şi în grupul tratat cu doza cea mai puternică, pentru a observa, după tratament, reversibilitatea sau persistenţa oricărui efect toxic. Durata perioadei post-tratament se fixează în funcţie de efectele observate.
      1.5.2.   Dozajul
      Dozele folosite sunt la minimum trei niveluri şi există un grup martor, în afara cazului în care se face un test la valori-limită (a se vedea 1.5.3). Nivelul dozelor se stabileşte în funcţie de rezultatele studiilor cu doză repetată sau ale studiilor preliminare şi ia în considerare orice date toxicologice şi toxico-cinetice disponibile pentru substanţa testată sau substanţe înrudite. Dacă nu există limitări datorate proprietăţilor fizico-chimice sau efectelor biologice ale substanţei, este recomandabil să se aleagă doza maximă care induce efectul toxic, dar nu şi moartea sau suferinţa severă. Se alege o serie descrescătoare de doze, în scopul de a demonstra legătura între răspuns şi nivelul dozei precum şi nivelul dozei fără efecte adverse observabile (DFEAO), în cazul celei mai mici doze. În mod frecvent, se dovedeşte că, la formarea seriei descrescătoare a dozelor, este optimă progresia geometrică cu raţia 2-4 şi deseori adăugarea unui al patrulea grup de testare este preferabil folosirii unor raţii foarte mari (de exemplu, mai mari de 6-10) între doze.
      Grupul martor este un grup netratat sau tratat cu purtătorul, dacă se foloseşte un purtător la administrarea substanţei testate. Cu excepţia substanţei testate, animalele din grupul martor trebuie tratate în mod identic cu acelea din grupurile testate. Dacă se foloseşte un purtător, grupul martor primeşte purtătorul în cantitatea maximă folosită. Dacă substanţa testată se administrează în alimente şi provoacă reducerea apetitului, un grup martor hrănit în paralel se poate dovedi folositor pentru a determina dacă reducerea de datorează modificării caracteristicilor organoleptice ale alimentelor sau alterărilor toxicologice din organismul animalelor de laborator.
      Trebuie luate în considerare următoarele caracteristici ale purtătorului şi ale altor aditivi, după caz: efectele asupra absorbţiei, circulaţiei, metabolizării sau retenţiei substanţei testate; efectele asupra proprietăţilor chimice ale substanţei testate care pot să altereze caracteristicile sale toxice; şi efectele asupra consumului de hrană sau apă sau asupra stării de nutriţie a animalelor.
      1.5.3.   Testul la valori-limită
      Dacă testul efectuat la o doză unică, echivalentă cu cel puţin 1 000 mg/kg greutate corporală/zi, folosind metodele de testare descrise pentru acest studiu, nu produce efecte adverse observabile şi dacă toxicitatea nu este de aşteptat în baza datelor existente pentru substanţele înrudite structural, se consideră că nu este necesar un studiu integral cu trei doze de niveluri diferite. Testul la valori-limită este aplicabil cu excepţia cazului în care expunerea oamenilor arată că este necesară folosirea unei doze mai mari.
      1.5.4.   Administrarea dozelor
      Animalelor li se administrează substanţa testată zilnic, şapte zile în fiecare săptămână, pentru o perioadă de 90 de zile. Orice alt regim de dozare, de exemplu cinci zile pe săptămână, trebuie justificat. Când substanţa testată se administrează cu ajutorul sondei introduse în stomac, se administrează toată doza o dată fiecărui animal, folosind o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o dată depinde de mărimea animalului de laborator. În mod normal, volumul trebuie menţinut cât mai scăzut posibil. Cu excepţia substanţelor iritante sau corozive, care provoacă în mod obişnuit efecte exacerbate la concentraţii mai mari, este recomandabil ca variaţiile în volumul probei să fie reduse la minimum, ajustându-se concentraţia astfel încât să asigure un volum constant, indiferent de nivelul dozei.
      Pentru substanţele administrate în alimente sau în apa de băut, este important să se ia măsuri astfel încât cantităţile de substanţă testată implicate să nu interfereze cu nutriţia normală sau cu echilibrul hidric. Când substanţa testată este administrată în alimente se poate folosi fie o concentraţie constantă în alimente (ppm), fie o doză de nivel constant în raport cu greutatea animalului; alternativa folosită trebuie specificată. În cazul administrării prin sondă sau în capsulă, doza trebuie administrată aproximativ în acelaşi moment al zilei şi ajustată după necesităţi, pentru a rămâne constantă în raport cu greutatea corporală a animalului. Atunci când un studiu de 90 de zile este folosit în preliminariile unui studiu pe termen lung de toxicitate cronică, se recomandă folosirea unei alimentaţii asemănătoare în ambele studii.
      1.5.5.   Observaţiile
      Perioada de observaţie se recomandă să fie de minimum 90 de zile. Animalele din grupul satelit programat pentru observaţii ulterioare trebuie să nu primească tratament o perioadă adecvată, pentru a detecta persistenţa sau reversibilitatea efectelor toxice.
      Se recomandă ca observaţiile clinice generale să fie făcute cel puţin o dată pe zi, de preferat la aceeaşi oră (aceleaşi ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrare. Se recomandă înregistrarea stării clinice a animalelor. Cel puţin de două ori pe zi, de regulă la începutul şi la sfârşitul fiecărei zile, toate animalele sunt examinate pentru constatarea simptomelor de morbiditate şi mortalitate.
      Se recomandă efectuarea de observaţii clinice detaliate asupra tuturor animalelor cel puţin o dată înainte de prima expunere (pentru a putea face comparaţii în cazul aceluiaşi individ) şi apoi o dată pe săptămână. Aceste examene se recomandă să fie făcute, dacă e posibil, în afara cuştii, de preferinţă într-o incintă standardizată şi la aceeaşi oră de fiecare dată. Trebuie acţionat astfel încât variaţia condiţiilor de observare să fie minimă. Simptomele de toxicitate trebuie să fie consemnate cu atenţie, incluzând ora apariţiei, gradul şi durata acestora. Observaţiile cuprind, fără a se limita la ele, schimbări ale pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, frecvenţa secreţiilor şi a excreţiilor, ca şi activitatea reflexă (de exemplu: lăcrimarea, erecţia piloasă, modificarea pupilelor, respiraţia anormală). Este recomandabil să fie observate, de asemenea, schimbările în mers, ţinută şi reacţia la manipulare, precum şi prezenţa mişcărilor clonice şi tonice, a stereotipiilor (de exemplu, îngrijirea corporală excesivă, mersul circular repetat) sau a comportamentelor bizare.
      Examinarea oftalmologică, cu un oftalmoscop sau un aparat echivalent adecvat, de preferat a tuturor animalelor şi cel puţin a animalelor din grupul cu doza cea mai mare şi din grupul martor, trebuie efectuată înainte de administrarea substanţei testate şi la încheierea studiului. Dacă se constată modificări ale ochilor legate de tratament, toate animalele trebuie examinate.
      1.5.5.1.   Greutatea corporală şi consumul de hrană/apă
      Toate animalele trebuie cântărite cel puţin o dată pe săptămână. Măsurarea consumului de hrană se face cel puţin săptămânal. Dacă substanţa testată se administrează în apa de băut, se măsoară şi apa de băut cel puţin săptămânal. Este recomandabil să se măsoare consumul de apă şi în studiile cu substanţa testată administrată în alimente sau prin sondă, atunci când băutul apei poate suferi modificări.
      1.5.5.2.   Hematologia şi biochimia clinică
      Se prelevează probe de sânge din puncte determinate şi se conservă, dacă este cazul, în condiţii adecvate. La încheierea testului, probele se colectează imediat înainte de sacrificarea animalelor sau ca parte a acestei proceduri.
      Se procedează la următoarele examene hematologice: hematocrit, concentraţie de hemoglobină, numărătoarea eritrocitelor şi a leucocitelor, formula leucocitară, numărătoarea plachetelor sangvine şi o măsurare a potenţialului de coagulare, cum sunt timpul de coagulare, timpul de protrombină sau de tromboplastină, la începutul studiului şi apoi la intervale lunare sau la jumătatea perioadei de testare şi, în cele din urmă, la încheierea testului.
      Determinările de biochimie clinică în scopul determinării efectelor toxice majore în ţesuturi şi, în special, efectele asupra rinichiului şi a ficatului sunt practicate pe probe de sânge obţinute de la toate animalele la începutul studiului, la intervale lunare sau la jumătatea perioadei de testare şi la încheierea testului. Domeniile de analiză care trebuie luate în considerare sunt balanţa electrolitică, metabolismul carbohidraţilor şi funcţiile hepatică şi renală. Alegerea analizelor specifice este influenţată de observaţiile asupra modului de acţiune a substanţei testate. Se recomandă ca animalele să nu primească hrană pentru o perioadă adecvată speciei înainte de prelevarea probei de sânge. Analizele recomandabile cuprind măsurarea următoarelor: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, glucoză à jeun, alaninaminotransferază, aspartat aminotransferază, ornitin decarboxilază, gamaglutamiltranspeptidază, acid uric, albumină, creatinină sangvină, bilirubină totală şi proteine serice totale.
      Analizele de urină trebuie efectuate cel puţin la început, apoi la jumătatea perioadei şi la încheierea testului, folosind probe de urină prelevate după un anumit orar. Analizele cuprind: aspect, volum, osmolaritate sau densitate, pH, proteinurie, glucozurie, hematurie. Se pot folosi şi alţi parametri dacă este necesar să se extindă investigarea efectului (efectelor) observat(e).
      În plus, trebuie avute în vedere investigaţii asupra constantelor plasmatice ale leziunilor generale ale ţesuturilor. Alte analize care se pot dovedi necesare pentru o evaluare toxicologică adecvată includ: analiza lipidelor, a hormonilor, echilibrul acido-bazic, methemoglobina şi inhibarea colinesterazei. Pot fi folosite analize de biochimie clinică suplimentare, dacă este necesar să se extindă investigarea efectelor observate. Acestea trebuie identificate pentru substanţele din anumite clase sau de la caz la caz.
      În general, este nevoie de o abordare flexibilă, în funcţie de specii şi de efectele constatate şi scontate ale substanţei în cauză.
      1.5.5.3.   Autopsia
      Toate animalele cuprinse în studiu sunt supuse unei autopsii complete şi detaliate, care cuprinde examinarea atentă a suprafeţei externe a corpului, a tuturor orificiilor, a cavităţilor craniană, toracică şi abdominală, precum şi a conţinutului acestora. Ficatul, rinichii, glandele suprarenale, testiculele, epididimul, ovarele, uterul, glanda tiroidă (cu glandele paratiroide) timusul, splina, creierul şi inima fiecărui animal (cu excepţia celor găsite muribunde şi a celor sacrificate pe parcurs) sunt curăţate de ţesuturile aderente, după caz, şi cântărite proaspete cât mai repede după disecţie, pentru a evita deshidratarea.
      Ţesuturile următoare trebuie conservate în mediul de fixare cel mai adecvat atât pentru tipul de ţesut, cât şi pentru examenul histopatologic prevăzut: toate organele prezentând leziuni macroscopice, creierul (regiunile reprezentative, cuprinzând encefalul, cerebelul şi trunchiul cerebral), măduva spinării (din trei segmente: cervical, medio-toracic şi lombar), hipofiza, ochii, glanda tiroidă, glandele paratiroide, timusul, esofagul, glandele salivare, stomacul, intestinul subţire şi intestinul gros (inclusiv plăcile lui Peyer), ficatul, vezica biliară, pancreasul, rinichii, glandele suprarenale, splina, inima, traheea şi plămânii, aorta, gonadele, uterul, organele genitale anexe, glanda mamară feminină, prostata, vezica urinară, ganglionii limfatici (de preferinţă un ganglion limfatic din zona afectată de calea de administrare şi un alt ganglion limfatic din altă zonă, aflată la distanţă, pentru a detecta eventualele efecte sistemice), nervii periferici (sciatic sau tibial), de preferat din apropierea muşchiului, o probă de măduvă osoasă (şi o puncţie aspirativă de măduvă osoasă examinată pe loc), piele. Observaţiile clinice şi cele macroscopice pot să conducă la necesitatea de a examina ţesuturi suplimentare. Se conservă şi alte organe considerate probabile organe-ţintă pentru substanţa testată, având în vedere proprietăţile sale cunoscute.
      1.5.5.4.   Histopatologia
      Se efectuează un examen histopatologic complet al ţesuturilor şi organelor conservate ale tuturor animalelor aparţinând grupului martor şi grupului tratat cu doza cea mai mare. Aceste examene trebuie extinse la animalele tratate cu alte doze, dacă se constată modificări care au legătură cu tratamentul la grupul tratat cu doza cea mai mare.
      Se examinează toate leziunile macroscopice.
      Atunci când se foloseşte un grup satelit, se efectuează un examen histopatologic al ţesuturilor şi organelor la care au fost identificate efecte în grupurile tratate.
      2.   DATE ȘI RAPORT
      2.1.   DATE
      Datele se prezintă individual. În plus, toate datele trebuie rezumate în formă tabelară, arătându-se pentru fiecare grup de experienţă, numărul de animale la începutul testului, numărul de animale găsite moarte în timpul testului sau sacrificate din motive umanitare şi momentul morţii sau al sacrificării, numărul de animale prezentând simptome de toxicitate, o descriere a simptomelor de toxicitate, în special momentul apariţiei acestora, durata şi severitatea tuturor efectelor toxice, numărul animalelor prezentând leziuni, tipul leziunilor şi procentul animalelor prezentând fiecare tip de leziune.
      Dacă este cazul, datele numerice se evaluează printr-o metodă statistică adecvată şi general acceptată. Metodele statistice şi datele care urmează să fie analizate trebuie să fie selecţionate în etapa de redactare a protocolului de testare.
      2.2.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare cuprinde următoarele informaţii:
      2.2.1.   Substanţa testată:
      
                  —
               
               
                  natura fizică, puritatea și proprietăţile fizico-chimice;
               
            
                  —
               
               
                  datele de identificare chimică;
               
            
                  —
               
               
                  purtătorul (dacă este cazul); justificarea alegerii purtătorului dacă este altul decât apa.
               
            2.2.2.   Animalele de laborator:
      
                  —
               
               
                  specia şi suşa folosite;
               
            
                  —
               
               
                  numărul, vârsta şi sexul animalelor;
               
            
                  —
               
               
                  sursa, condiţiile de adăpost, regimul alimentar etc.;
               
            
                  —
               
               
                  greutatea individuală a animalelor la începutul testului.
               
            2.2.3.   Condiţiile de testare:
      
                  —
               
               
                  motivaţia alegerii dozelor;
               
            
                  —
               
               
                  detalii privind preparatul hrană/reţeta substanţei testate, concentraţia realizată, stabilitatea şi omogenitatea preparatului;
               
            
                  —
               
               
                  detalii privind administrarea substanţei testate;
               
            
                  —
               
               
                  dozele reale (mg/kg greutate corporală/zi) şi factorul de conversie a substanţei testate din concentraţie în hrană sau apa de băut (ppm) în doza reală, dacă este cazul;
               
            
                  —
               
               
                  detalii privind calitatea hranei şi a apei.
               
            2.2.4.   Rezultatele:
      
                  —
               
               
                  greutatea corporală şi modificările în greutatea corporală;
               
            
                  —
               
               
                  consumul de hrană și apă, dacă este cazul;
               
            
                  —
               
               
                  rezultate privind reacţia toxică, pe sexe şi nivelul dozelor, inclusiv simptomele de toxicitate;
               
            
                  —
               
               
                  natura, severitatea şi durata efectelor observate clinic (reversibile sau nu);
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele examenului oftalmologic;
               
            
                  —
               
               
                  valorile hematologice şi valorile de referinţă corespunzătoare;
               
            
                  —
               
               
                  valorile de biochimie clinică şi valorile de referinţă corespunzătoare;
               
            
                  —
               
               
                  greutatea corporală la moartea animalului, greutăţile organelor interne, raporturile greutatea organului intern/greutate corporală;
               
            
                  —
               
               
                  constatările de la autopsie;
               
            
                  —
               
               
                  o descriere detaliată a tuturor observaţiilor histopatologice;
               
            
                  —
               
               
                  date referitoare la absorbţie, dacă e cazul;
               
            
                  —
               
               
                  prelucrarea statistică a rezultatelor, unde este cazul.
               
            Discutarea rezultatelor.
      Concluzii.
      B.28.   STUDIU DE TOXICITATE SUBCRONICĂ – ADMINISTRARE CUTANATĂ EXPERIMENT EFECTUAT TIMP DE 90 DE ZILE ASUPRA UNOR ROZĂTOARE
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Nu sunt specificate.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Se aplică zilnic substanţa de testat pe cale cutanată, în concentraţii crescătoare, mai multor loturi de testare, fiind administrată o doză pe lot timp de 90 de zile. Pe parcursul perioadei de aplicare, se observă zilnic animalele pentru a pune în evidenţă simptomele de toxicitate. Animalele care mor în timpul testului, precum şi cele care supravieţuiesc la sfârşitul testului sunt supuse autopsiei.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Pregătiri
      Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului în cel puţin cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează aleatoriu în loturi tratate şi loturi martor. Cu puţin timp înainte de test, se tunde blana din regiunea dorsală a animalelor. Se poate recurge la radere, dar în acest caz operaţia se efectuează cu aproximativ 24 de ore înainte de test. În timpul tunderii sau al raderii, trebuie evitată orice lezare a pielii. Suprafaţa care se degajează în vederea aplicării substanţei nu trebuie să fie mai mică de 10 % din suprafaţa corporală. Pentru a decide zona care trebuie degajată şi dimensiunile suprafeţei care trebuie tratată, se ia în calcul greutatea animalului. Dacă testul vizează substanţele solide care, după caz, se pot pulveriza, substanţa de testat trebuie umezită cu ajutorul apei sau, la nevoie, al unui vehicul adecvat, astfel încât să se poată obţine un bun contact cu pielea. Substanţele de testat lichide se folosesc în general în stare nediluată. Se efectuează o aplicare zilnică timp de cinci până la şapte zile pe săptămână.
      1.6.2.   Condiţii de testare
      1.6.2.1.   Animale de experienţă
      
      Animalele de laborator utilizate sunt şobolanul, iepurele sau cobaiul adult. Pot fi folosite şi alte specii, dar folosirea lor trebuie justificată. La începutul experimentului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie. Când studiul de toxicitate subcronică prin administrare cutanată este efectuat ca fază preliminară a unui studiu pe termen lung, trebuie să se folosească aceeaşi specie şi linie pentru ambele studii.
      1.6.2.2.   Număr şi sex
      
      Se folosesc, pentru fiecare doză, cel puţin 20 de animale (10 femele şi 10 masculi) a căror piele este sănătoasă. Femelele trebuie să fie nulipare şi negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul experimentului, acest număr se adaugă la total. În plus, se poate trata un lot satelit de 20 de animale (10 din fiecare sex) la doza cea mai mare timp de 90 de zile, care poate fi supus observaţiei cu privire la reversibilitatea, persistenţa sau apariţia tardivă a efectelor toxice pe parcursul celor 28 zile care urmează tratamentului.
      1.6.2.3.   Doze
      
      Se folosesc cel puţin trei doze, precum şi un lot martor sau, după caz, un lot martor pentru vehicul. Perioada de expunere este de cel puţin 6 ore pe zi. Se aplică substanţa de testat în fiecare zi în acelaşi moment, iar dozele trebuie să facă obiectul unei adaptări (săptămânale sau bisăptămânale) pentru a menţine constant nivelul dozei în raport cu greutatea corporală a animalului. Cu excepţia tratamentului cu substanţa de testat, animalele din lotul martor se tratează în acelaşi mod ca şi subiecţii din loturile tratate. Dacă se foloseşte un vehicul pentru a facilita administrarea dozei, acesta este administrat lotului martor în aceleaşi condiţii ca şi pentru loturile tratate, iar doza administrată corespunde cu cea primită de lotul tratat cu doza maximă. Doza maximă trebuie să producă efecte toxice, dar nu trebuie să provoace sau trebuie să provoace rar moartea. Doza minimă nu trebuie să provoace niciun efect toxic. Dacă există informaţii privind expunerea umană, doza minimă trebuie să fie superioară acestei valori. În condiţii ideale, doza intermediară trebuie să producă efecte toxice minime observabile. Dacă se folosesc mai multe doze intermediare, acestea se administrează eşalonat, astfel încât să provoace o gradare a efectelor toxice. În loturile care corespund dozelor mici şi intermediare, precum şi în loturile martor, incidenţa mortalităţii trebuie să fie mică, pentru a permite o evaluare semnificativă a rezultatelor.
      Dacă aplicarea substanţei de testat provoacă o iritaţie cutanată gravă, se reduc concentraţiile; aceasta poate avea ca efect diminuarea, chiar dispariţia, celorlalte efecte toxice la doza mare. În plus, dacă leziunile cutanate sunt foarte grave, poate fi necesară oprirea experimentului şi iniţierea unui studiu nou, la concentraţii mai mici.
      1.6.3.   Test-limită
      
      Dacă în urma unei experienţe preliminare realizate cu o doză de 1 000 miligrame pe kilogram sau o doză mai mare în funcţie de expunerea umană posibilă, când se cunoaşte această valoare, nu apare niciun efect toxic, continuarea experienţei poate fi inutilă.
      1.6.4.   Perioada de observaţie
      
      Se observă toate animalele zilnic în vederea notării simptomelor de toxicitate. Se consemnează momentul morţii şi momentul când apar şi dispar simptomele de toxicitate.
      1.6.5.   Mod de operare
      
      Se pun animalele în cuşti individuale. În condiţii ideale, substanţa de testat se administrează animalelor şapte zile pe săptămână timp de 90 de zile.
      Animalele din toate loturile satelit destinate observaţiei ulterioare sunt menţinute în viaţă timp de încă 28 zile, fără tratament, în vederea constatării vindecării sau a persistenţei efectelor toxice. Durata de expunere este de minimum şase ore pe zi.
      Substanţa de testat se aplică pe o suprafaţă aproximativ egală cu 10 % din suprafaţa totală a corpului. În cazul substanţelor foarte toxice, suprafaţa tratată poate fi mai mică, dar stratul trebuie să fie cât mai subţire şi mai uniform posibil.
      Pe parcursul expunerii, substanţa de testat se menţine în contact cu pielea cu ajutorul unui pansament de tifon şi al unui plasture neiritant. Suprafaţa tratată se acoperă astfel încât să menţină pansamentul de tifon şi substanţa de testat şi să se evite ingerarea acesteia de către animale. Se poate folosi contenţionarea pentru a împiedica animalele să ingereze substanţa de testat, dar nu se recomandă imobilizarea completă.
      La sfârşitul perioadei de expunere, se elimină, dacă este posibil, orice reziduu de substanţă, cu apă sau cu ajutorul unui alt procedeu de curăţare a pielii.
      Se observă zilnic toate animalele şi se înregistrează simptomele de toxicitate, precum şi momentul apariţiei, intensitatea şi durata acestora. Observaţia zilnică vizează, între altele, modificări ale părului şi ale blănii, ale ochilor şi ale mucoaselor, ale aparatului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom şi central, precum şi ale activităţii somato-motrice şi ale comportamentului. Se determină săptămânal greutatea animalelor. Se recomandă, de asemenea, măsurarea săptămânală a consumului de hrană. Animalele sunt observate cu regularitate pentru a evita, pe cât posibil, pierderea lor din motive exterioare experimentului, cum ar fi: canibalism, autoliză a ţesuturilor sau greşeală de plasare a exemplarelor. La sfârşitul experimentului, se supun autopsiei toate animalele supravieţuitoare care aparţin loturilor nesatelit tratate. Animalele muribunde se scot imediat şi se supun autopsiei.
      Examinările următoare se efectuează de regulă asupra tuturor animalelor, inclusiv asupra martorilor:
      
                  (a)
               
               
                  examenul oftalmologic, folosind un oftalmoscop sau un instrument echivalent corespunzător, trebuie făcut înainte de administrarea substanţei de testat şi la terminarea studiului, de preferinţă tuturor animalelor, dar cel puţin celor din lotul tratat cu doza mare şi celor din lotul martor; dacă se constată modificări oculare, se vor examina toate animalele;
               
            
                  (b)
               
               
                  examen hematologic, inclusiv hematocritul, concentraţia hemoglobinei, numărul de hematii, numărul de leucocite şi măsurători ale potenţialului de coagulare, cum ar fi timpul de coagulare, timpul de protrombină, timpul de tromboplastină sau numărul de trombocite se măsoară la sfârşitul perioadei de testare;
               
            
                  (c)
               
               
                  determinările biochimice clinice ale sângelui se realizează la sfârşitul perioadei de testare; testele considerate caracteristice pentru toate studiile sunt: balanţa electrolitică, metabolismul carbohidraţilor, funcţia hepatică şi renală; alegerea unor determinări specifice depinde de observaţiile asupra modului de acţiune a substanţei de testat. Se pot sugera următoarele determinări: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, glucoza à jeun (cu privare de hrană pentru o perioadă caracteristică speciei), transaminaza serică glutamo-piruvică (4), transaminaza serică glutamo-oxaloacetică (5), ornitin decarboxilază, gama-glutamil transpetidaza, ureea, albumina, creatinina sanguină, bilirubina totală şi proteinele totale. Pentru o evaluare toxicologică adecvată pot fi necesare şi alte determinări, care includ analizarea lipidelor, hormonilor, echilibrul acidobazic, methemoglobina şi activitatea colinesterazică. Se pot efectua, dacă este necesar, şi alte determinări biochimice clinice pentru a extinde investigaţiile asupra efectelor observate;
               
            
                  (d)
               
               
                  nu este necesară efectuarea cu regularitate a analizei de urină, ci numai atunci când există o indicaţie bazată pe o toxicitate presupusă sau observată.
               
            Dacă datele istorice de bază sunt insuficiente, înainte de începerea tratamentului trebuie să se determine parametrii hematologici şi biochimici clinici.
      
         Autopsia
      
      Toate animalele supuse testului fac obiectul autopsiei generale, aceasta incluzând aspectul exterior al corpului, toate orificiile, cavitatea craniană, toracică şi cea abdominală şi conţinutul acestora. Ficatul, rinichii, glandele suprarenale şi testiculele trebuie cântărite în stare umedă, cât mai repede posibil după disecţie, pentru a se evita deshidratarea. În vederea unor posibile examene histopatologice ulterioare, următoarele organe şi ţesuturi vor fi păstrate într-un mediu corespunzător: toate leziunile macroscopice, creier, inclusiv secţiuni prin bulb/punte, cortex cerebelos şi cortex cerebral, glanda pituitară, tiroida/paratiroidele, ţesut timic, traheea şi plămânii, inimă, aortă, (glandele salivare), ficat, splină, rinichi, glande suprarenale, pancreas, gonade, uter (glande genitale anexe), (piele), esofag, stomac, duoden, jejun, ileon, cec, colon, rect, vezică urinară, ganglioni limfatici reprezentativi, (glanda mamară la femele), (musculatura coapsei), nervi periferici, stern cu măduvă osoasă, (ochi), (femur – incluzând articulaţia), (măduva spinării la trei niveluri – cervical, torace mediu şi lombar) şi (glande lacrimale extraorbitale). Ţesuturile menţionate între paranteze trebuie examinate doar atunci când acest lucru este indicat prin apariţia semnelor de toxicitate sau implicarea organelor ţintă.
      
         Examenul histopatologic
      
      
                  (a)
               
               
                  Se efectuează examen histopatologic complet pentru toate organele şi ţesuturile recoltate de la animalele din lotul martor şi loturile expuse la doza maximă.
               
            
                  (b)
               
               
                  Se examinează toate leziunile macroscopice.
               
            
                  (c)
               
               
                  Se examinează organele-ţintă ale animalelor din loturile expuse la celelalte doze.
               
            
                  (d)
               
               
                  Se examinează histopatologic plămânii animalelor din lotul expus la doza minimă şi la cea intermediară pentru a detecta infecţiile, deoarece acestea oferă o evaluare acceptabilă a stării de sănătate a animalelor. Trebuie să fie luată în considerare, de asemenea, examinarea histopatologică a ficatului şi rinichiului în cazul acestor loturi. La animalele din aceste loturi nu se fac în mod curent examene histopatologice suplimentare, dar acestea trebuie făcute întotdeauna în cazul acelor organe pentru care s-au constatat leziuni la lotul expus la doza maximă.
               
            
                  (e)
               
               
                  Atunci când este folosit un lot satelit, trebuie să se efectueze examene histopatologice pe ţesuturile şi organele pentru care s-au constatat leziuni la celelalte loturi tratate.
               
            2.   DATE
      Datele se sistematizează într-un tabel care indică, pentru fiecare lot de experienţă, numărul de animale la începutul testului şi numărul de animale care prezintă fiecare tip de leziune. Toate rezultatele observate se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specia, linia, originea, condiţiile ambiante, regimul alimentar etc.;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare;
               
            
                  —
               
               
                  dozele (inclusiv vehiculul, dacă este cazul) şi concentraţiile;
               
            
                  —
               
               
                  răspunsul toxic pe sexe şi doză;
               
            
                  —
               
               
                  dacă este posibil, nivelul care nu are niciun efect;
               
            
                  —
               
               
                  momentul morţii în timpul experimentului sau indicarea faptului că animalele au supravieţuit experimentului;
               
            
                  —
               
               
                  efectele toxice sau de alt tip;
               
            
                  —
               
               
                  momentul observării oricărui simptom anormal şi evoluţia acestuia;
               
            
                  —
               
               
                  consumul de hrană şi greutatea corporală;
               
            
                  —
               
               
                  observaţiile oftalmologice;
               
            
                  —
               
               
                  examenele hematologice întreprinse şi rezultatele complete;
               
            
                  —
               
               
                  testele biochimice clinice practicate şi rezultatele complete (inclusiv cele urinare);
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele autopsiei;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea detaliată a tuturor observaţiilor histopatologice;
               
            
                  —
               
               
                  tratarea statistică a rezultatelor, după caz;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.29.   STUDIU DE TOXICITATE SUBCRONICĂ – ADMINISTRARE PRIN INHALARE EXPERIMENT EFECTUAT TIMP DE 90 DE ZILE ASUPRA UNOR ROZĂTOARE
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Se expun zilnic mai multe loturi de animale, pe parcursul unei perioade determinate, la o substanţă de testat în concentraţii crescătoare, fiind administrată o doză pe lot timp de 90 de zile. Când se foloseşte un vehicul în vederea obţinerii unei concentraţii adecvate a substanţei de testat în atmosferă, se prevede un lot martor pentru vehicul. Pe parcursul perioadei de administrare, se observă zilnic animalele pentru a pune în evidenţă simptomele de toxicitate. Animalele care mor în timpul testului, precum şi cele care supravieţuiesc la sfârşitul testului, sunt supuse autopsiei.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      
         1.6.1.   Pregătiri
      
      Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează aleatoriu în loturi tratate şi loturi martor. La nevoie, se poate adăuga la substanţa de testat un vehicul adecvat în vederea obţinerii unei concentraţii corespunzătoare în atmosferă. Dacă, pentru a uşura administrarea, se foloseşte un vehicul sau alt tip de aditiv, acesta trebuie să fie netoxic. Pot fi folosite date istorice, dacă este necesar.
      
         1.6.2.   Condiţii de testare
      
      
         Animale de experienţă
      
      Cu excepţia contraindicaţiilor, specia preferată este şobolanul. Se folosesc animale tinere, sănătoase, aparţinând unei linii de laborator obişnuite. La începutul experimentului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie. Când studiul de toxicitate subcronică prin inhalare este efectuat ca fază preliminară a unui studiu pe termen lung, trebuie să se folosească aceeaşi specie şi linie pentru ambele studii.
      
         Număr şi sex
      
      Se folosesc cel puţin 20 de animale (10 femele şi 10 masculi) pentru fiecare concentraţie de expunere. Femelele trebuie să fie nulipare şi negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul experimentului, acest număr se adaugă la total. De asemenea, se poate trata un lot satelit de 20 de animale (10 din fiecare sex) la doza maximă timp de 90 de zile, care poate fi supus observaţiei cu privire la reversibilitatea, persistenţa sau apariţia tardivă a efectelor toxice pe parcursul celor 28 de zile care urmează tratamentului.
      
         Concentraţii de expunere
      
      Cel puţin trei concentraţii sunt necesare, precum şi un lot martor sau, după caz, un lot martor pentru vehicul (corespunzând concentraţiei vehiculului la nivelul de expunere cel mai ridicat). Cu excepţia tratamentului cu substanţa de testat, animalele din lotul martor se tratează în acelaşi mod ca şi subiecţii din loturile tratate. Concentraţia maximă provoacă efecte toxice, dar nu trebuie să provoace sau provoacă rar moartea. Dacă există informaţii privind expunerea umană, concentraţia minimă trebuie să fie superioară acestei valori. În condiţii ideale, concentraţia intermediară trebuie să producă efecte toxice minime observabile. Dacă se folosesc mai multe concentraţii intermediare, acestea se administrează eşalonat, astfel încât să provoace o gradare a efectelor toxice. În loturile care corespund concentraţiilor mici şi intermediare, precum şi în lotul martor, incidenţa mortalităţii trebuie să fie mică, pentru a permite o evaluare semnificativă a rezultatelor.
      
         Timpul de expunere
      
      Expunerea zilnică trebuie să fie de 6 ore după echilibrarea concentraţiei în incinta de testare. Se pot utiliza alte perioade de expunere pentru a răspunde unor cerinţe specifice.
      
         Echipament
      
      Animalele se expun la substanţa de testat cu ajutorul unui dispozitiv de inhalare conceput pentru a asigura un flux continuu sau cel puţin 12 aerisiri pe oră, garantând un conţinut de oxigen adecvat şi o distribuţie uniformă a substanţei de testat în aer. Dacă se foloseşte o incintă, aceasta trebuie concepută astfel încât să reducă la minim aglomerarea animalelor de experienţă şi să le asigure o expunere maximă, prin inhalare, a substanţei de testat. De regulă, pentru a asigura stabilitatea atmosferei din incintă, volumul total al animalelor nu trebuie să depăşească 5 % din volumul incintei. Se mai pot folosi expuneri oro-nazale, numai ale capului sau ale întregului corp, în incinte individuale; primele două tipuri de expunere limitează absorbţia pe alte căi a substanţei de testat.
      
         Perioada de observaţie
      
      Se observă toate animalele zilnic în vederea notării simptomelor de toxicitate, pe tot parcursul perioadei de tratare şi de refacere. Se consemnează momentul morţii şi momentul când apar şi dispar simptomele de toxicitate.
      
         1.6.3.   Mod de operare
      
      Se expun zilnic animalele la substanţa de testat timp de cinci până la şapte zile pe săptămână, pe o perioadă de 90 de zile. Animale aparţinând loturilor satelit prevăzute pentru observaţii ulterioare se ţin sub observaţie încă 28 de zile, fără tratament, pentru a studia vindecarea sau persistenţa efectelor toxice. Temperatura la care are loc testul se menţine la 22 ± 3 oC. În condiţii optime, umiditatea relativă se menţine între 30 şi 70 % dar, în anumite cazuri, acest lucru poate fi imposibil (de exemplu, în cazul testelor cu aerosoli). Pe parcursul perioadei de expunere, nu se administrează animalelor nici hrană, nici apă.
      Se foloseşte un sistem de inhalare dinamic, prevăzut cu un dispozitiv adecvat de control analitic al concentraţiei. Pentru determinarea concentraţiilor de expunere adecvate, se recomandă să se procedeze la un test preliminar. Se ajustează debitul pentru a asigura concentraţii omogene în toată incinta. Sistemul trebuie să permită obţinerea unor condiţii de expunere stabile cât de rapid posibil.
      Se măsoară şi se controlează:
      
                  (a)
               
               
                  debitul de aer (în permanenţă);
               
            
                  (b)
               
               
                  concentraţia reală a substanţei măsurate în zona de respiraţie; pe parcursul perioadei de expunere zilnică, concentraţia nu trebuie să varieze cu mai mult de ± 15 % faţă de valoarea medie; cu toate acestea, în cazul prafului şi al aerosolilor, acest grad de control poate să nu fie atins, iar în acest caz se poate accepta o diferenţă mai mare; pe durata experimentului concentraţiile administrate zilnic trebuie menţinute la valori cât de constante posibil; pe durata generării aerosolilor trebuie efectuată analiza granulometrică pentru a determina stabilitatea concentraţiei acestora; în timpul expunerii, analiza trebuie efectuată suficient de des pentru a determina măsura în care distribuţia particulelor este constantă;
               
            
                  (c)
               
               
                  temperatura şi umiditatea;
               
            
                  (d)
               
               
                  în timpul expunerii şi după aceasta au loc observaţii care sunt înregistrate sistematic; pentru fiecare animal se consemnează date individuale; se observă zilnic toate animalele şi se înregistrează simptomele de toxicitate, precum şi momentul apariţiei, intensitatea şi durata acestora. Observaţia zilnică în cuşcă vizează, între altele, modificări ale pielii şi ale blănii, ale ochilor şi ale mucoaselor, ale aparatului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos autonom şi central, precum şi ale activităţii somato-motrice şi ale comportamentului; se determină săptămânal consumul de hrană şi greutatea animalelor. animalele sunt observate cu regularitate, pentru a evita pe cât posibil pierderea lor din motive exterioare experimentului, cum ar fi: canibalism, autoliză a ţesuturilor sau greşeală de plasare a exemplarelor; la sfârşitul perioadei de expunere, se supun autopsiei toate animalele supravieţuitoare. Animalele muribunde sunt retrase imediat şi supuse autopsiei.
               
            Examinările următoare se efectuează de regulă asupra tuturor animalelor, inclusiv asupra martorilor:
      
                  (a)
               
               
                  examenul oftalmologic, folosind un oftalmoscop sau un instrument echivalent corespunzător, trebuie făcut înainte de administrarea substanţei de testat şi la terminarea studiului, de preferinţă tuturor animalelor, dar cel puţin celor din lotul tratat cu doza cea mai mare şi din lotul martor; dacă se constată modificări oculare, se vor examina toate animalele;
               
            
                  (b)
               
               
                  examen hematologic, inclusiv hematocritul, concentraţia hemoglobinei, numărul de hematii, numărul de leucocite şi măsurători ale potenţialului de coagulare, cum ar fi timpul de coagulare, timpul de protrombină, timpul de tromboplastină sau numărul de trombocite se măsoară la sfârşitul perioadei de testare;
               
            
                  (c)
               
               
                  determinările biochimice clinice ale sângelui se realizează la sfârşitul perioadei de testare; testele considerate caracteristice pentru toate studiile sunt: balanţa electrolitică, metabolismul carbohidraţilor, funcţia hepatică şi renală; alegerea unor determinări specifice depinde de observaţiile asupra modului de acţiune a substanţei de testat; se pot sugera următoarele determinări: calciu, fosfor, clor, sodiu, potasiu, glucoza à jeun (cu privare de hrană pentru o perioadă caracteristică speciei), transaminaza serică glutamo-piruvică (4), transaminaza serică glutamo-oxaloacetică (5), ornitin decarboxilază, gama-glutamil transpetidaza, ureea, albumina, creatinina sanguină, bilirubina totală şi proteinele totale; pentru o evaluare toxicologică adecvată pot fi necesare şi alte determinări, care includ analizarea lipidelor, a hormonilor, echilibrul acidobazic, methemoglobina şi activitatea colinesterazică; se pot efectua, dacă este necesar, şi alte determinări biochimice clinice pentru a extinde investigaţiile asupra efectelor observate;
               
            
                  (d)
               
               
                  nu este necesară efectuarea cu regularitate a analizei de urină, ci numai atunci când există o indicaţie bazată pe o toxicitate presupusă sau observată.
               
            Dacă datele istorice de bază sunt insuficiente, înainte de începerea tratamentului trebuie să se determine parametrii hematologici şi biochimici clinici.
      
         Autopsia
      
      Toate animalele supuse testului fac obiectul autopsiei generale, aceasta incluzând aspectul exterior al corpului, toate orificiile, cavitatea craniană, toracică şi cea abdominală şi conţinutul acestora. Ficatul, rinichii, glandele suprarenale şi testiculele trebuie cântărite în stare umedă, cât mai repede posibil după disecţie, pentru a se evita deshidratarea. În vederea unor posibile examene histopatologice ulterioare, următoarele organe şi ţesuturi vor fi păstrate într-un mediu corespunzător: toate leziunile macroscopice, plămânii – care trebuie scoşi intacţi, cântăriţi şi trataţi cu un fixator potrivit care permite conservarea structurii pulmonare (se consideră că perfuzia cu acest fixator este o metodă eficientă), ţesuturile nazo-faringiene, creierul – inclusiv secţiuni prin bulb/punte, cortex cerebelos şi cortex cerebral, glanda pituitară, tiroida/paratiroidele, ţesutul timic, traheea şi plămânii, inima, aorta, (glandele salivare), ficatul, splina, rinichii, glandele suprarenale, pancreasul, gonadele, uterul (glandele genitale anexe), (pielea), esofagul, stomacul, duodenul, jejunul, ileonul, cecul, colonul, rectul, vezica urinară, ganglionii limfatici reprezentativi, (glanda mamară la femele), (musculatura coapsei), nervii periferici, (ochii), sternul cu măduvă osoasă, (femurul, inclusiv articulaţia), (măduva spinării la trei niveluri – cervical, torace mediu şi lombar) şi (glande lacrimale extraorbitale). Ţesuturile menţionate între paranteze trebuie examinate doar atunci când acest lucru este indicat prin apariţia semnelor de toxicitate sau implicarea organelor ţintă.
      
         Examenul histopatologic
      
      
                  (a)
               
               
                  Se efectuează examen histopatologic complet pentru tractul respirator şi alte organe şi ţesuturi recoltate de la animalele din lotul martor şi loturile expuse la doza cea mai mare.
               
            
                  (b)
               
               
                  Se examinează toate leziunile macroscopice.
               
            
                  (c)
               
               
                  Se examinează organele-ţintă ale animalelor din loturile expuse la celelalte doze.
               
            
                  (d)
               
               
                  Se examinează histopatologic plămânii animalelor din lotul expus la doza mică şi la cea intermediară, urmărind detectarea infecţiilor, deoarece acestea oferă o evaluare acceptabilă a stării de sănătate a animalelor. La animalele din aceste loturi nu se fac în mod curent examene histopatologice suplimentare, dar acestea trebuie făcute întotdeauna în cazul acelor organe pentru care s-au constat leziuni la lotul expus la doza cea mai mare.
               
            
                  (e)
               
               
                  Atunci când este folosit un lot satelit, trebuie să se efectueze examene histopatologice pe ţesuturile şi organele pentru care s-au constatat leziuni la celelalte loturi tratate.
               
            2.   DATE
      Datele se sistematizează într-un tabel care indică, pentru fiecare lot de experienţă, numărul de animale la începutul testului şi numărul de animale care prezintă fiecare tip de leziune. Toate rezultatele observate se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specia, linia, originea, condiţiile ambiante, regimul alimentar etc.;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare:
                  Descrierea aparatului de expunere: inclusiv concepţia, tipul, dimensiunile, sursa de aer, sistemul generator de particule şi de aerosoli, metoda de condiţionare a aerului, tratarea aerului expirat şi, după caz, modul de adăpostire a animalelor în incinta de testare. Se descrie echipamentul folosit pentru măsurarea temperaturii şi, dacă este necesar, stabilitatea concentraţiilor de aerosoli şi granulometria particulelor.
                  Datele privind expunerea: se prezintă sub forma unui tabel care indică valorile medii, precum şi măsura variabilităţii
                  (de exemplu, deviaţia standard); ele trebuie să includă:
                  
                              (a)
                           
                           
                              debitul de aer în dispozitivul de inhalare;
                           
                        
                              (b)
                           
                           
                              temperatura şi umiditatea aerului;
                           
                        
                              (c)
                           
                           
                              concentraţiile nominale (cantitatea totală de substanţă de testat introdusă în dispozitivul de inhalare raportată la volumul de aer);
                           
                        
                              (d)
                           
                           
                              după caz, natura vehiculului;
                           
                        
                              (e)
                           
                           
                              concentraţiile reale din zona de respiraţie;
                           
                        
                              (f)
                           
                           
                              dimensiunile mediane ale particulelor (după caz),
                           
                        
            
                  —
               
               
                  răspunsul toxic pe sexe şi concentraţie;
               
            
                  —
               
               
                  dacă este posibil, nivelul care nu are niciun efect;
               
            
                  —
               
               
                  momentul morţii în timpul experimentului sau indicarea faptului că animalele au supravieţuit experimentului;
               
            
                  —
               
               
                  efectele toxice sau de alt tip;
               
            
                  —
               
               
                  momentul observării oricărui simptom anormal şi evoluţia acestuia;
               
            
                  —
               
               
                  consumul de hrană şi greutatea corporală;
               
            
                  —
               
               
                  observaţii oftalmologice;
               
            
                  —
               
               
                  examenele hematologice întreprinse şi rezultatele complete;
               
            
                  —
               
               
                  testele biochimice clinice practicate şi rezultatele complete (inclusiv cele urinare);
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele autopsiei;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea detaliată a tuturor observaţiilor histopatologice;
               
            
                  —
               
               
                  tratarea statistică a rezultatelor, după caz;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.30.   STUDIU DE TOXICITATE CRONICĂ
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa de testat se administrează în mod normal pe mai multe loturi de animale de experienţă, câte o doză pe lot, pe o cale de administrare convenabilă, şapte zile pe săptămână, pe o perioadă îndelungată din viaţa lor. Pe parcursul expunerii şi după expunere la substanţa de testat, animalele de experienţă sunt ţinute sub observaţie zilnic pentru a depista semnele de toxicitate.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI
      
         1.6.1.   Pregătirea testului
      
      Animalele se ţin în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului în cel puţin cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează aleatoriu în loturile tratate şi loturile martor.
      
         1.6.2.   Condiţii de testare
      
      
         Animale de experienţă
      
      Specia preferată este şobolanul.
      În funcţie de rezultatele obţinute din studiile anterioare, pot fi folosite şi alte specii (rozătoare sau nerozătoare). Se folosesc animale tinere şi sănătoase aparţinând unei linii de laborator obişnuite, iar tratamentul trebuie să înceapă cât mai repede după înţărcare.
      La începutul studiului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie. Când se efectuează un studiu de toxicitate subcronică prin administrare orală în faza pregătitoare a unui studiu pe termen lung, trebuie să se folosească aceeaşi specie şi linie pentru ambele studii.
      
         Număr şi sex
      
      În cazul rozătoarelor, se utilizează cel puţin 40 de animale (20 femele şi 20 masculi) pentru fiecare doză şi pentru fiecare lot martor. Femelele trebuie să fie nulipare şi negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul experimentului, acest număr se adaugă la total.
      În cazul nerozătoarelor, se acceptă un număr mai mic de animale, însă nu mai puţin de patru din fiecare sex pentru fiecare lot.
      
         Doze şi frecvenţa expunerii
      
      Pe lângă lotul martor pregătit în simultan, se folosesc cel puţin trei doze. Doza maximă trebuie să producă efecte evidente de toxicitate fără a produce mortalitate excesivă.
      Doza minimă nu trebuie să producă o toxicitate evidentă.
      Doza sau dozele intermediare trebuie să aibă o valoare apropiată de media dozelor maximă şi minimă.
      Alegerea dozelor trebuie să ia în considerare datele obţinute în studiile de toxicitate precedente.
      În mod normal, expunerea este zilnică. Dacă substanţa se administrează în apa de băut sau în hrană, animalele trebuie să aibă acces permanent la acestea.
      
         Martori
      
      Se recomandă folosirea unui lot martor identic din toate punctele de vedere cu loturile tratate, cu excepţia expunerii la substanţa de testat.
      În circumstanţe speciale, cum ar fi studiile de toxicitate prin inhalare care presupun folosirea aerosolilor sau folosirea unui emulsifiant cu activitate biologică necunoscută în studii orale, se impune folosirea unui lot martor negativ. Lotul martor negativ este tratat în aceleaşi condiţii ca loturile testate, exceptând faptul că animalele nu sunt expuse la substanţa de testat sau la vreun vehicul.
      
         Calea de administrare
      
      Cele două căi principale de administrare sunt cea orală şi prin inhalare. Alegerea căii de administrare depinde de caracteristicile fizice şi chimice ale substanţei de testat şi de calea probabilă de expunere a oamenilor.
      Folosirea căii cutanate de administrare ridică probleme practice considerabile. Toxicitatea cronică sistemică rezultată în urma absorbţiei percutanate se poate deduce, în mod normal, din rezultatele unui alt test cu administrare orală; informaţii asupra cantităţii de substanţă absorbită pe cale percutanată pot fi obţinute pe baza testelor precedente de toxicitate cu administrare percutanată.
      
         Studii prin administrare orală
      
      Dacă substanţa de testat se absoarbe prin tractul gastro-intestinal şi dacă ingestia este una din posibilele căi de expunere la om, atunci este preferată calea de administrare orală, exceptând cazurile în care aceasta este contraindicată. Animalele pot primi substanţa în hrană, dizolvată în apa de băut sau sub formă de capsule. În mod ideal, doza trebuie administrată zilnic, şapte zile pe săptămână, deoarece dozarea de cinci zile pe săptămână face posibilă remiterea sau diminuarea toxicităţii în perioada de pauză, astfel încât ar putea fi afectate rezultatele şi evaluările ulterioare. Cu toate acestea, din considerente practice, poate fi acceptată dozarea de cinci zile pe săptămână.
      
         Studii de toxicitate prin inhalare
      
      Deoarece studiile de toxicitate prin inhalare ridică probleme tehnice de o mai mare complexitate în comparaţie cu celelalte căi de administrare, în cele ce urmează se prezintă îndrumări detaliate privind acest mod de administrare. Trebuie remarcat că în anumite situaţii o alternativă viabilă o constituie instilaţiile intratraheale.
      Expunerile pe termen lung se modelează de obicei după posibila expunere a omului: substanţa se administrează fie zilnic, timp de 6 ore, după echilibrarea concentraţiei în incintă, câte cinci zile pe săptămână (expunere intermitentă), fie, dacă se urmăresc efectele unei posibile expuneri în mediul înconjurător, timp de 22-24 ore/zi, câte şapte zile pe săptămână (expunere continuă), în acest ultim caz cu pauză de o oră/zi pentru hrănirea animalelor, în acelaşi moment al zilei şi menţinând condiţiile specifice din incintă.
      În ambele cazuri, animalele sunt expuse de obicei la concentraţii constante de substanţă. Diferenţa esenţială dintre expunerea intermitentă şi cea continuă este aceea că în primul caz există o perioadă de 17-18 ore în care animalele se pot reface după efectele fiecărei expuneri zilnice, refacere chiar mai îndelungată la sfârşit de săptămână.
      Alegerea modalităţii de expunere – intermitentă sau continuă – depinde de obiectivele studiului şi de tipul de expunere umană simulat. Cu toate acestea, trebuie avute în vedere anumite dificultăţi tehnice. De exemplu, avantajul expunerii continue prin simularea condiţiilor de mediu este contrabalansat de cerinţa hrănirii şi adăpării animalelor în timpul expunerii şi de necesitatea de a dispune de tehnici mai complicate (şi mai fiabile) atât de generare a aerosolilor şi a vaporilor, cât şi de monitorizare.
      
         Incinte de testare
      
      Animalele se expun la substanţa de testat în incinte de inhalare concepute pentru a asigura un flux continuu sau cel puţin 12 aerisiri pe oră, garantând un conţinut de oxigen adecvat şi o distribuţie uniformă a produsului de testat în aer. Incinta martor şi cea de testare trebuie să fie identice ca proiectare şi construcţie, astfel încât să asigure condiţii comparabile sub toate aspectele, cu excepţia expunerii la substanţele testate. În incintă se menţine o presiune uşor negativă pentru a împiedica pierderea substanţei de testat în zona înconjurătoare. În incinte trebuie redusă la minim aglomerarea animalelor testate De regulă, pentru a asigura stabilitatea atmosferei din incintă, volumul total al animalelor nu trebuie să depăşească 5 % din volumul incintei.
      Se măsoară şi se controlează:
      
                  (i)
               
               
                  fluxul de aer: debitul de aer în incintă este, de preferinţă, monitorizat continuu;
               
            
                  (ii)
               
               
                  concentraţia: pe parcursul expunerii zilnice, concentraţia substanţei de testat nu trebuie să varieze cu mai mult de ± 15 % din valoarea medie;
               
            
                  (iii)
               
               
                  temperatura şi umiditatea: în cazul rozătoarelor, temperatura trebuie menţinută la 22 ± 2 oC, iar umiditatea din incintă la 30-70 %, exceptând cazurile în care se foloseşte apă ca mediu de suspensie pentru substanţa de testat în atmosfera incintei (aerosoli); de preferinţă, ambii parametri trebuie să fie monitorizaţi continuu;
               
            
                  (iv)
               
               
                  analiza granulometrică a particulelor: în atmosfera incintei unde există aerosoli lichizi sau solizi, trebuie să fie determinată distribuţia granulometrică a particulelor; particulele din componenţa aerosolilor trebuie să aibă o dimensiune respirabilă pentru animalele testate; probele din atmosfera incintei se prelevează de la nivelul zonei de respiraţie; probele de aer trebuie să fie reprezentative din punct de vedere al distribuţiei particulelor la care sunt expuse animalele şi trebuie să reflecte, în termeni gravimetrici, toate suspensiile de tip aerosol, chiar dacă o mare parte din acestea nu sunt respirabile; pe durata generării aerosolilor trebuie efectuată analiza granulometrică pentru a determina stabilitatea concentraţiei acestora şi, ulterior, ori de câte ori este necesar în timpul expunerii a determina măsura în care este constantă distribuţia particulelor la care au fost expuse animalele.
               
            
         Durata studiului
      
      Durata administrării trebuie să fie de cel puţin 12 luni.
      
         1.6.3.   Mod de operare
      
      
         Observaţii
      
      Se efectuează zilnic o examinare clinică amănunţită. După caz, se fac zilnic observaţii suplimentare şi se iau măsuri în consecinţă pentru a reduce la minim pierderea animalelor din motive exterioare testului, cum ar fi autopsierea sau congelarea animalelor găsite moarte sau izolarea sau sacrificarea celor bolnave sau muribunde. Este necesară observarea detaliată a animalelor pentru a detecta declanşarea şi evoluţia tuturor efectelor toxice, precum şi pentru a reduce la minim pierderile datorate bolilor, autolizei sau canibalismului.
      Pentru toate animalele se înregistrează semnele clinice, inclusiv modificările neurologice şi oculare, şi mortalitatea. Se înregistrează momentul apariţiei efectelor toxice şi evoluţia acestora, inclusiv tumorile suspecte.
      Greutatea fiecărui animal se înregistrează săptămânal în primele 13 săptămâni de studiu şi, ulterior, cel puţin o dată la fiecare 4 săptămâni. Consumul de hrană se determină săptămânal în primele 13 săptămâni de studiu, apoi la intervale de aproximativ trei luni, exceptând cazurile în care starea de sănătate şi greutatea corporală a animalelor impun alte intervale.
      
         Examene hematologice
      
      Examenele hematologice (de exemplu hemoglobina, hematocritul, numărul hematiilor, numărul leucocitelor, trombocitele sau alte măsurători ale potenţialului de coagulare) trebuie efectuate la trei luni, şase luni, apoi la intervale de şase luni, iar la sfârşitul studiului se recoltează probe de sânge de la toate nerozătoarele şi de la câte 10 şobolani/sex din toate loturile. Dacă este posibil, probele se prelevează de fiecare dată de la aceiaşi şobolani. În plus, la nerozătoare se recoltează probe de sânge şi înainte de începerea experimentului.
      Dacă observaţiile clinice sugerează o deteriorare a stării de sănătate a animalelor pe parcursul studiului, se stabileşte formula leucocitară a fiecărui animal afectat.
      Se determină formula leucocitară pe probe prelevate de la animalele aparţinând lotului expus la doza maximă şi lotului martor. Această formulă nu se determină pentru loturile expuse la doze imediat mai mici decât dacă se constată o discrepanţă între loturile expuse la doza maximă şi loturile martor sau dacă examenul patologic indică acest lucru.
      
         Analiza urinei
      
      Trebuie colectate probe de urină de la toate nerozătoarele şi de la câte 10 şobolani/sex din toate loturile, dacă este posibil de la aceiaşi şobolani şi la aceleaşi intervale de timp ca probele de sânge necesare efectuării examenelor hematologice. Pentru fiecare animal sau pe o probă colectată de la mai multe animale rozătoare, de acelaşi sex, din acelaşi lot, se fac următoarele determinări:
      
                  —
               
               
                  aspect: volum şi densitate pentru fiecare animal;
               
            
                  —
               
               
                  proteine, glucoză, corpi cetonici, hemoragii oculte (semicantitativ);
               
            
                  —
               
               
                  microscopia sedimentului (semicantitativ).
               
            
         Biochimie clinică
      
      La intervale de aproximativ 6 luni, precum şi la sfârşitul experimentului, se recoltează probe de sânge pentru determinări biochimice de la toate animalele nerozătoare şi de la câte 10 şobolani/sex din toate loturile, dacă este posibil de fiecare dată de la aceiaşi şobolani. În plus, de la nerozătoare trebuie să se recolteze probe înaintea testului. Pe plasma obţinută din aceste probe se vor efectua următoarele determinări:
      
                  —
               
               
                  concentraţia proteinelor totale;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia albuminelor;
               
            
                  —
               
               
                  teste ale funcţiei hepatice: activitatea fosfatazei alcaline, transaminază glutampiruvică (4), transaminază oxalacetică (5), gamma glutamil transpeptidază, ornitin decarboxilază;
               
            
                  —
               
               
                  metabolismul carbohidraţilor, cum ar fi glucoza à jeun;
               
            
                  —
               
               
                  explorarea funcţiei renale, cum ar fi azotul ureic din sânge.
               
            
         Autopsia
      
      Se efectuează autopsia generală a tuturor animalelor, inclusiv a celor care mor pe parcursul experimentului sau care au fost sacrificate, fiind muribunde. Înainte de sacrificare, se prelevează probe de sânge de la toate animalele, pentru formula leucocitară. Se conservă toate leziunile macroscopice, tumorile sau leziunile suspecte de a deveni tumori. Se procedează la corelarea observaţiilor macroscopice cu rezultatele microscopice.
      Toate organele şi ţesuturile trebuie conservate într-un mediu corespunzător în vederea examenului histopatologic. De obicei, sunt vizate următoarele organe şi ţesuturi: creier (6) (bulb rahidian, punte, cortex cerebelos şi cortex cerebral), glanda pituitară, tiroida (inclusiv paratiroida), timus, plămâni (inclusiv trahee), inimă, aortă, glandele salivare, ficat (6), splină, rinichi (6), glandele suprarenale (6), esofag, stomac, duoden, jejun, ileon, cec, colon, rect, uter, vezica urinară, ganglionii limfatici, pancreas, gonade (6), organe genitale anexe, glandele mamare feminine, piele, muşchi, nervi periferici, măduva spinării (cervicală, toracică, lombară) stern cu măduvă şi femur (inclusiv articulaţia) şi ochi. Umplerea plămânilor şi a vezicii urinare cu fixator prezintă modalitatea optimă de conservarea a acestora; în studiile de toxicitate prin inhalare, umplerea plămânilor este o cerinţă esenţială pentru examinarea histopatologică adecvată. În cazul acestor studii, întregul tract respirator trebuie conservat, inclusiv cavitatea nazală, faringele şi laringele.
      Dacă se realizează şi alte examinări clinice, informaţiile obţinute din aceste studii trebuie să fie disponibile înainte de examinarea microscopică, deoarece pot să dea indicii medicului patolog.
      
         Examen histopatologic
      
      Se examinează microscopic toate modificările vizibile, în special tumorile şi alte tipuri de leziuni ce apar la nivelul oricărui organ. De asemenea, se recomandă efectuarea următoarelor examinări:
      
                  (a)
               
               
                  examinarea microscopică a tuturor organelor şi ţesuturilor conservate, cu descrierea completă a leziunilor evidenţiate la:
                  
                              1.
                           
                           
                              toate animalele care au murit sau au fost sacrificate pe parcursul studiului;
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              toate animalele din loturile martor şi din loturile tratate cu doza maximă;
                           
                        
            
                  (b)
               
               
                  de asemenea, sunt examinate organele şi ţesuturile care prezintă modificări induse sau posibil induse de substanţa de testat la loturile tratate cu doze mai mici;
               
            
                  (c)
               
               
                  dacă rezultatul testului indică reducerea substanţială a vieţii animalelor sau inducerea unor efecte ce pot afecta răspunsul toxic, atunci se examinează microscopic şi lotul tratat cu doza imediat mai mică;
               
            
                  (d)
               
               
                  informaţiile privind incidenţa leziunilor care apar în mod normal la linia de animal folosită, în aceleaşi condiţii de laborator, și anume date istorice pentru martori, sunt indispensabile pentru evaluarea corectă a importanţei modificărilor observate la animalele tratate.
               
            2.   DATE
      Datele se sistematizează în tabele care să indice pentru fiecare lot numărul iniţial de animale, numărul de animale care prezintă leziuni şi procentul de animale pentru fiecare tip de leziune. Rezultatele se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specia, linia, originea, condiţiile ambiante, regimul alimentar etc.;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare.
                  3.1.1. Descrierea aparatului de expunere:
                  Inclusiv concepţia, tipul, dimensiunile, sursa de aer, sistemul generator de particule şi de aerosoli, metoda de condiţionare a aerului, tratarea aerului expirat şi, după caz, modul de adăpostire a animalelor în incinta de testare. Se descrie echipamentul folosit pentru măsurarea temperaturii şi, dacă este necesar, stabilitatea concentraţiilor de aerosoli şi granulometria particulelor.
                  3.1.2. Datele privind expunerea:
                  Se prezintă sub forma unui tabel care indică valorile medii, precum şi măsura variabilităţii (de exemplu, deviaţia standard); ele trebuie să includă:
                  
                              (a)
                           
                           
                              debitul de aer în dispozitivul de inhalare;
                           
                        
                              (b)
                           
                           
                              temperatura şi umiditatea aerului;
                           
                        
                              (c)
                           
                           
                              concentraţiile nominale (cantitatea totală de substanţă de testat introdusă în dispozitivul de inhalare raportată la volumul de aer);
                           
                        
                              (d)
                           
                           
                              după caz, natura vehiculului;
                           
                        
                              (e)
                           
                           
                              concentraţiile reale din zona de respiraţie;
                           
                        
                              (f)
                           
                           
                              dimensiunile mediane ale particulelor (după caz);
                           
                        
            
                  —
               
               
                  dozele (inclusiv vehiculul, dacă este cazul) şi concentraţiile;
               
            
                  —
               
               
                  răspunsul toxic pe sexe şi doză;
               
            
                  —
               
               
                  doza la care nu apar efecte;
               
            
                  —
               
               
                  momentul morţii în timpul experimentului sau indicarea faptului că animalele au supravieţuit experimentului;
               
            
                  —
               
               
                  efectele toxice sau de alt tip;
               
            
                  —
               
               
                  momentul observării fiecărui simptom anormal şi evoluţia acestuia;
               
            
                  —
               
               
                  consumul de hrană şi greutatea corporală;
               
            
                  —
               
               
                  observaţiile oftalmologice;
               
            
                  —
               
               
                  examenele hematologice întreprinse şi rezultatele complete;
               
            
                  —
               
               
                  testele biochimice clinice practicate şi rezultatele complete (inclusiv cele urinare);
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele autopsiei;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea detaliată a tuturor observaţiilor histopatologice;
               
            
                  —
               
               
                  tratarea statistică a rezultatelor, după caz;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.31.   STUDIU DE TOXICITATE ASUPRA DEZVOLTĂRII INTRAUTERINE
      1.   METODĂ
      Această metodă corespunde Orientării 414 (2001) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Această metodă de testare a toxicităţii asupra dezvoltării intrauterine este concepută pentru a furniza informaţii generale privind efectele expunerii prenatale asupra animalelor de experienţă gestante şi asupra dezvoltării intrauterine a organismului; printre acestea se pot număra evaluarea efectelor asupra mamei, precum şi moartea, anomalii structurale sau modificările de creştere la fetus. Deficienţele funcţionale, deşi constituie o parte importantă a dezvoltării, nu sunt incluse în această metodă de testare. Ele pot face obiectul unui studiu separat sau al unei completări a acestui studiu, utilizând metoda privind neurotoxicitatea asupra dezvoltării. Pentru informaţii privind testarea deficienţelor funcţionale şi alte efecte postnatale se consultă Metoda de testare a toxicităţii asupra funcţiei de reproducere la două generaţii şi studiul privind neurotoxicitatea asupra dezvoltării, după caz.
      Este posibil să fie necesară o adaptare a acestei metode de testare la cazurile individuale, pe baza cunoştinţelor specifice privind, de exemplu, proprietăţile fizico-chimice sau toxicologice ale substanţei de testat. Astfel de adaptări sunt acceptabile, în cazurile în care date ştiinţifice concludente sugerează că adaptarea va conduce la obţinerea mai multor informaţii din test. În acest caz, datele ştiinţifice se documentează în detaliu în raportul studiului.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Toxicologia dezvoltării: studiul efectelor adverse asupra organismului în curs de dezvoltare care ar putea fi provocate de expunerea înainte de concepţie, în cursul dezvoltării intrauterine sau postnatal, până în momentul maturizării sexuale. Principalele manifestări ale toxicităţii dezvoltării sunt (1) moartea organismului, (2) o anomalie structurală, (3) o modificare a creşterii şi (4) o deficienţă funcţională. Până acum, toxicitatea dezvoltării a fost denumită deseori teratologie.
      
         Efect advers: orice deviere de la situaţia de referinţă care are legătură cu tratamentul şi care scade abilitatea unui organism de a supravieţui, de a se reproduce sau de a se adapta la mediu. În ceea ce priveşte toxicologia dezvoltării, în sensul său cel mai larg, aceasta include orice efect care interferează cu dezvoltarea normală a produsului de concepţie atât înainte, cât şi după naştere.
      
         Modificare a creşterii: o modificare care afectează un organ, greutatea sau dimensiunea corporale ale descendentului.
      
         Modificări (anomalii): modificări structurale în dezvoltare, care includ malformaţii şi variaţii (28).
      
         Malformaţie/Anomalie majoră: modificare structurală considerată dăunătoare animalului (poate fi chiar letală) şi, de obicei, rară.
      
         Variaţie/Anomalie minoră: modificare structurală considerată puţin sau deloc dăunătoare animalului; poate fi temporară şi poate interveni relativ frecvent la populaţia martor.
      
         Produs de concepţie: ansamblul produselor unui ovul fecundat în orice stadiu de dezvoltare, de la fertilizare până la naştere, inclusiv membranele extra-embrionare, precum şi embrionul sau fetusul.
      
         Implantare (nidaţie): ataşarea blastocistului în membrana epitelială a uterului, inclusiv penetrarea sa prin epiteliul uterin, şi fixarea sa în endometru.
      
         Embrion: stadiul precoce sau de dezvoltare al oricărui organism, în special produsul în curs de dezvoltare al fertilizării unui ovul după apariţia axei longitudinale şi până la apariţia tuturor structurilor majore.
      
         Embriotoxicitate: nocivitate pentru structura, dezvoltarea, creşterea şi/sau viabilitatea normale ale unui embrion.
      
         Fetus: descendentul nenăscut în perioada post-embrionară.
      
         Fetotoxicitate: nocivitate pentru structura, dezvoltarea, creşterea şi/sau viabilitatea normale ale unui fetus.
      
         Avort: expulzarea prematură din uter a unui produs de concepţie: a embrionului sau a unui fetus neviabil.
      
         Resorbţie: fenomenul prin care un produs de concepţie care a decedat după implantarea în uter este sau a fost resorbit.
      
         Resorbţie precoce: dovada implantării fără un embrion/fetus detectat.
      
         Resorbţie tardivă: embrion sau fetus decedat cu modificări externe degenerative.
      
         NOAEL: abreviere pentru nivelul dozei fără efect advers (no-observed-adverse-effect level); cel mai ridicat nivel al dozei sau al expunerii la care nu se observă efecte adverse provocate de tratament.
      1.3.   SUBSTANŢA DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      În mod normal, substanţa de testat se administrează animalelor gestante cel puţin de la implantare până în ziua anterioară celei planificate pentru sacrificare, care se stabileşte cât mai aproape posibil de ziua normală a fătării fără să existe riscul de pierdere a datelor din cauza unei fătări premature. Metoda de testare nu are ca scop doar studierea perioadei de organogeneză (de exemplu, zilele 5-15 la rozătoare şi zilele 6-18 la iepure), ci şi examinarea efectelor din perioada de preimplantare, dacă este cazul, pe întreaga durată a perioadei de gestaţie, până în ziua anterioară cezarienei. Cu scurt timp înainte de cezariană, se sacrifică femelele, se examinează conţinutul uterin şi se examinează fetuşii pentru detectarea anomaliilor externe vizibile şi a modificărilor ţesuturilor moi şi ale scheletului.
      1.5.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.5.1.   Selectarea speciei de animale
      Se recomandă ca testele să se efectueze pe specia cea mai relevantă şi să se utilizeze specii şi suşe de laborator care sunt cel mai des utilizate în teste privind toxicitatea asupra dezvoltării intrauterine. Specia preferată de rozătoare este şobolanul, iar specia preferată de nerozătoare este iepurele. Dacă se utilizează altă specie, decizia se motivează.
      1.5.2.   Condiţii de adăpostire şi de hrănire
      În spaţiul pentru adăpostirea animalelor de experienţă, se asigură o temperatură de 22 oC (± 3 oC) pentru rozătoare şi de 18 oC (± 3 oC) pentru iepuri. Se asigură o umiditate relativă de 50-60 %, cu o valoare minimă de 30 % şi o valoare maximă de 70 %, cu excepţia momentelor în care se curăţă spaţiul. Spaţiul se iluminează artificial, cu o alternanţă de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă.
      Procedurile de împerechere se desfăşoară în cuşti adecvate acestui scop. Deşi este de preferat adăpostirea individuală a animalelor împerecheate, adăpostirea în grupuri puţin numeroase este, de asemenea, acceptabilă.
      1.5.3.   Pregătirea animalelor
      Se utilizează animale sănătoase, care au fost aclimatizate la condiţiile de laborator timp de cel puţin 5 zile înainte şi nu au fost supuse anterior altor proceduri de testare. Pentru animalele de experienţă se precizează specia, suşa, sursa, sexul, greutatea şi/sau vârsta. Se recomandă ca animalele din toate grupurile testate să aibă, în cea mai mare măsură posibilă, greutăţi şi vârste apropiate. La fiecare nivel al dozei se utilizează femele adulte tinere, nulipare. Femelele se împerechează cu masculi din aceeaşi specie şi suşă, evitându-se împerecherile între animale cosangvine. La rozătoare, ziua 0 de gestaţie este ziua în care se observă un dop vaginal şi/sau spermă; la iepuri, ziua 0 de gestaţie este, de obicei, ziua copulaţiei sau a însămânţării artificiale, dacă se utilizează această tehnică. Femelele împerecheate se distribuie la întâmplare în grupurile martor şi de tratament. Cuştile se aranjează astfel încât posibilele efecte cauzate de amplasarea lor să fie reduse la minimum. Fiecărui animal i se atribuie un număr unic de identificare. Femelele împerecheate se distribuie la întâmplare în grupurile martor şi de tratament, iar dacă împerecherea se face în loturi, animalele din acelaşi lot se distribuie uniform în toate grupurile. În mod similar, femelele inseminate de acelaşi mascul se distribuie uniform în toate grupurile.
      1.6.   MOD DE LUCRU
      1.6.1.   Numărul şi sexul animalelor
      Fiecare grup tratat şi grup martor trebuie să conţină un număr suficient de femele pentru a obţine aproximativ 20 de femele cu puncte de implantare la autopsie. Grupurile cu sub 16 animale cu puncte de implantare riscă să fie inadecvate. Mortalitatea maternă nu invalidează obligatoriu studiul, cu condiţia să nu depăşească aproximativ 10 %.
      1.6.2.   Pregătirea dozelor
      Dacă se foloseşte un vehicul sau un alt aditiv pentru facilitarea dozării, se iau în considerare următoarele caracteristici: efectele asupra absorbţiei, distribuţiei, metabolismului şi retenţiei sau excreţiei substanţei de testat; efectele asupra proprietăţilor chimice ale substanţei de testat care i-ar putea modifica caracteristicile toxice; şi efectele asupra consumului de hrană sau apă sau asupra stării nutriţionale a animalelor. Vehiculul trebuie să nu fie toxic asupra dezvoltării şi să nu aibă efecte asupra reproducerii.
      1.6.3.   Dozare
      În mod normal, substanţa de testat se administrează zilnic de la implantare (de exemplu, ziua 5 după împerechere) până în ziua anterioară celei planificate pentru cezariană. În cazul în care studiile preliminare, dacă sunt disponibile, nu indică un risc ridicat de pierdere preimplantare, tratamentul poate fi extins astfel încât să includă întreaga perioadă de gestaţie, de la împerechere până în ziua anterioară sacrificării planificate. Este binecunoscut faptul că manipularea inadecvată şi stresul în perioada gestaţiei pot genera pierderi prenatale. Ca măsură de prevenire a pierderilor prenatale cauzate de factori fără legătură cu tratamentul, se evită manipularea inutilă a animalelor gestante, precum şi stresul cauzat de factori externi, precum zgomotul.
      Se utilizează cel puţin trei doze diferite şi un grup martor paralel. În grupurile martor şi de tratament se distribuie uniform animale sănătoase. Dozele se administrează eşalonat astfel încât efectele toxice să fie graduale. Cu excepţia cazului în care există limite impuse de natura fizică/chimică sau proprietăţile biologice ale substanţei, doza cea mai mare se alege astfel încât să inducă toxicitate asupra dezvoltării şi/sau toxicitate asupra mamei (semne clinice sau o scădere a greutăţii corporale), dar nu decesul sau o suferinţă profundă. Cel puţin una dintre dozele intermediare trebuie să producă efecte toxice minime, observabile. Doza cea mai mică nu trebuie să producă niciun efect toxic asupra mamei sau asupra dezvoltării. Se selectează o serie descrescătoare a nivelurilor dozelor pentru a demonstra o eventuală relaţie doză-efect şi nivelul dozei fără efect advers vizibil (NOAEL). Intervalul optim pentru determinarea nivelurilor descrescătoare ale dozelor este frecvent un factor de doi sau patru şi este deseori de preferat să se adauge un al patrulea grup de tratament în loc să se utilizeze intervale foarte mari (de exemplu, un factor mai mare decât 10) între doze. Deşi obiectivul este stabilirea unui NOAEL matern, sunt, de asemenea, acceptabile studiile care nu stabilesc un astfel de nivel (1).
      Pentru selectarea nivelurilor dozelor se ţine seama de datele existente privind toxicitatea, precum şi de informaţiile suplimentare privind metabolismul şi toxicocinetica substanţei de testat sau a materialelor înrudite. Informaţiile în cauză se utilizează, de asemenea, pentru a demonstra că regimul de dozare este adecvat.
      Se utilizează un grup martor paralel. Acest grup este supus unui tratament simulat sau unui tratament exclusiv cu vehicul, în cazul în care pentru administrarea substanţei se utilizează un vehicul. Tuturor grupurilor li se administrează acelaşi volum de substanţă de testat sau vehicul. Animalele din grupul martor se manipulează în acelaşi fel ca animalele din grupul de tratament. Animalelor din grupurile martor tratate doar cu vehiculul li se administrează cea mai mare cantitate de vehicul utilizată (la fel ca în grupul de tratament căruia i se administrează doza cea mai mică).
      1.6.4.   Testul-limită
      Dacă un test cu o singură doză de cel puţin 1 000 mg/kg greutate corporală/zi administrată oral, utilizând procedurile descrise pentru prezentul studiu, nu produce efecte toxice observabile la animalele gestante sau descendenţii acestora şi dacă, pe baza datelor existente (de exemplu, date privind compuşi înrudiţi structural şi/sau metabolic) nu se prevede niciun efect, este posibil să nu fie necesar un studiu complet cu trei niveluri ale dozei. Expunerea umană prevăzută poate indica necesitatea utilizării unui nivel mai ridicat al dozei administrate oral în testul-limită. Pentru alte căi de administrare, precum inhalarea sau aplicarea cutanată, proprietăţile fizico-chimice ale substanţei de testat pot indica şi limita, deseori, nivelul maxim de expunere care poate fi atins (de exemplu, aplicarea cutanată nu trebuie să cauzeze o toxicitate locală ridicată).
      1.6.5.   Administrarea dozelor
      Substanţa de testat sau vehiculul se administrează, de obicei, oral, prin intubare. În cazul în care se utilizează o altă cale de administrare, examinatorul trebuie să îşi justifice şi să îşi motiveze alegerea şi pot fi necesare modificări adecvate (2) (3) (4). Substanţa de testat se administrează aproximativ la aceeaşi oră în fiecare zi.
      Doza pentru animalele individuale se calculează, în mod normal, în funcţie de greutatea corporală a animalului la cea mai recentă cântărire. Cu toate acestea, în ultimul trimestru al gestaţiei, doza se calculează cu prudenţă. Se utilizează datele existente privind selectarea dozei, pentru a preveni o toxicitate excesivă asupra mamei. Cu toate acestea, dacă se observă o toxicitate excesivă la femelele gestante, animalele în cauză sunt eutanasiate. Dacă mai multe animale gestante prezintă semne de toxicitate excesivă, se ia în considerare sacrificarea grupului tratat cu doza respectivă. Dacă se recurge la gavaj, substanţa se administrează, de preferinţă, într-o singură doză animalelor, printr-o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o singură dată depinde de greutatea animalului. Volumul nu trebuie să depăşească 1 ml/100 g greutate corporală, exceptând cazul soluţiilor apoase, din care se pot administra 2 ml/100 g greutate corporală. Dacă vehiculul utilizat este uleiul de porumb, volumul nu trebuie să depăşească 0,4 ml/100 g greutate corporală. Se recomandă ca variaţiile volumului administrat să fie reduse la minimum prin modificarea concentraţiilor, astfel încât să se asigure un volum constant la toate nivelurile dozelor.
      1.6.6.   Observarea femelelor gestante
      Observaţiile clinice se efectuează şi se înregistrează cel puţin o dată pe zi, de preferinţă în acelaşi moment (aceleaşi momente) ale zilei, ţinând seama de perioada de vârf a efectelor anticipate după administrarea dozei. Se înregistrează starea animalelor, inclusiv decesul, agonia, modificările comportamentale relevante şi toate semnele de toxicitate evidentă.
      1.6.7.   Greutatea corporală şi consumul de hrană
      Animalele se cântăresc în ziua 0 de gestaţie sau nu mai târziu de ziua 3 de gestaţie, dacă animalele împerecheate anterior sunt furnizate de către un crescător exterior, în prima zi a tratamentului, cel puţin o dată la trei zile în perioada tratamentului şi în ziua planificată pentru sacrificare.
      Consumul de hrană se înregistrează o dată la trei zile, în zilele în care se cântăresc animalele.
      1.6.8.   Examinarea post-mortem
      
      Femelele se sacrifică cu o zi înainte de ziua prevăzută pentru fătare. Femelele care manifestă semne de avort sau fătare prematură înainte de ziua planificată pentru sacrificare sunt sacrificate şi supuse unui examen macroscopic complet.
      În momentul sacrificării sau al decesului în cursul studiului, femela este examinată macroscopic pentru determinarea oricăror anomalii structurale sau modificări patologice. Evaluarea femelelor în cursul cezarienei şi analizele ulterioare asupra fetusului se efectuează, de preferinţă, fără să se cunoască grupul de tratament, pentru a se asigura un nivel maxim de imparţialitate.
      1.6.9.   Examinarea conţinutului uterin
      Imediat după sacrificare sau imediat ce este posibil după deces, se îndepărtează uterul şi se confirmă statutul de gestaţie al animalelor. Uterele care nu par gestante sunt supuse unui examen suplimentar (de exemplu, prin colorare cu sulfură de amoniu la rozătoare şi prin colorare Salewski sau o metodă alternativă adecvată la iepuri) pentru confirmarea absenţei gestaţiei (5).
      Uterele gestante, inclusiv cervixul, se cântăresc. Nu se cântăresc uterele gestante ale animalelor care au fost găsite moarte în cursul studiului.
      La animalele gestante se determină numărul de corpuri galbene.
      Conţinutul uterin se examinează pentru a determina numărul de embrioni sau fetuşi decedaţi şi numărul de fetuşi viabili. Se descrie gradul de resorbţie pentru a estima momentul relativ al decesului produsului de concepţie (a se vedea punctul 1.2).
      1.6.10.   Examinarea fetuşilor
      Se determină sexul şi greutatea fiecărui fetus.
      Se examinează fiecare fetus pentru determinarea modificărilor externe (6).
      Se examinează fetuşii pentru determinarea modificărilor scheletului şi ale ţesuturilor moi (de exemplu, variaţii şi malformaţii sau anomalii) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). Este de preferat, dar nu obligatoriu, ca modificările fetale să fie înregistrate pe categorii. Dacă se stabilesc categorii, se precizează clar criteriile pentru definirea fiecărei categorii. Se examinează cu o atenţie specială tractul genital pentru a se stabili dacă prezintă modificări în dezvoltare.
      La rozătoare, circa jumătate din fiecare cuib se pregăteşte şi se examinează pentru modificări ale scheletului. Restul se pregăteşte şi se examinează pentru modificări ale ţesuturilor moi, utilizând metode de secţionare serială acceptate sau adecvate sau procedând cu atenţie la disecţia macroscopică.
      La nerozătoare, de exemplu la iepuri, se examinează toţi fetuşii atât pentru modificări ale ţesuturilor moi, cât şi pentru modificări ale scheletului. Corpul fetuşilor se evaluează prin disecţie atentă pentru modificări ale ţesuturilor moi, putând fi utilizate inclusiv proceduri pentru evaluarea structurii cardiace interne (25). Capetele a jumătate din fetuşii examinaţi astfel sunt prelevate şi prelucrate pentru evaluarea modificărilor ţesuturilor moi (inclusiv ochi, creier, pasaje nazale şi limbă), utilizând metode de secţionare serială (26) sau o altă metodă la fel de sensibilă. Corpurile acestor fetuşi şi ceilalţi fetuşi intacţi se prelucrează şi se examinează pentru modificări ale scheletului, utilizând metodele descrise pentru rozătoare.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Datele se prezintă individual atât pentru femelele gestante, precum şi pentru descendenţii acestora şi sub forma unui rezumat tabelar care include, pentru fiecare grup de tratament şi fiecare generaţie, numărul de animale la începutul testului, numărul de animale găsite moarte sau eutanasiate, momentul decesului sau al eutanasierii, numărul de animale care au prezentat semne de toxicitate, o descriere a semnelor de toxicitate observate, inclusiv momentul declanşării, durata şi severitatea efectelor toxice, tipurile de observaţii asupra embrionilor/fetuşilor şi toate datele relevante privind cuiburile.
      Rezultatele numerice se evaluează printr-o metodă statistică adecvată, utilizând cuibul ca unitate pentru analiza datelor. Se utilizează o metodă statistică general acceptată; metodele statistice se selectează în etapa de concepere a studiului şi se justifică. Se includ şi datele privind animalele care nu supravieţuiesc până în ziua planificată pentru sacrificare. Datele în cauză pot fi incluse în mediile grupurilor, dacă sunt relevante. Relevanţa datelor obţinute de la aceste animale şi, prin urmare, includerea sau excluderea lor din media (mediile) grupurilor se justifică şi se analizează de la caz la caz.
      2.2.   EVALUAREA REZULTATELOR
      Rezultatele studiului de toxicitate asupra dezvoltării intrauterine se evaluează din punctul de vedere al efectelor observate. Evaluarea include următoarele observaţii:
      
                  —
               
               
                  rezultatele testelor asupra mamelor şi embrionilor/fetuşilor, inclusiv evaluarea relaţiei sau a absenţei unei relaţii între expunerea animalelor la substanţa de testat şi incidenţa şi gravitatea tuturor efectelor observate;
               
            
                  —
               
               
                  criteriile utilizate pentru stabilirea unor categorii de modificări externe, ale ţesuturilor moi şi ale scheletului la fetuşi, dacă s-au stabilit astfel de categorii;
               
            
                  —
               
               
                  dacă este cazul, date istorice de control, pentru o mai bună interpretare a rezultatelor studiului;
               
            
                  —
               
               
                  numerele utilizate pentru calcularea tuturor procentajelor şi indicilor;
               
            
                  —
               
               
                  o analiză statistică adecvată a rezultatelor studiului, dacă este cazul, inclusiv informaţii suficiente privind metoda de analiză pentru ca un revizor/statistician independent să poate reevalua şi reface analiza.
               
            În cazul unui studiu care demonstrează absenţa oricăror efecte toxice, se are în vedere efectuarea unor investigaţii suplimentare pentru a stabili absorbţia şi biodisponibilitatea substanţei de testat.
      2.3.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Un studiu de toxicitate asupra dezvoltării intrauterine furnizează informaţii privind efectele expunerii repetate la o substanţă în timpul gestaţiei asupra femelelor gestante şi asupra dezvoltării intrauterine a descendenţilor lor. Rezultatele studiului se interpretează în strânsă legătură cu rezultatele altor studii de toxicitate subcronică, de toxicitate asupra reproducerii, toxicocinetice şi altele. Întrucât accentul se pune pe toxicitatea generală, prin toxicitatea asupra mamei, şi pe toxicitatea asupra dezvoltării intrauterine, rezultatele studiului permit, într-o anumită măsură, să se facă diferenţa între efectele asupra dezvoltării în absenţa toxicităţii generale şi cele care sunt induse doar la nivelul care este, de asemenea, toxic pentru animalul gestant (27).
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare include următoarele informaţii specifice.
      
                   
               
               
                  Substanţa de testat:
                  
                              —
                           
                           
                              natura fizică şi, dacă sunt relevante, proprietăţile fizico-chimice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identificare, inclusiv numărul CAS, dacă este cunoscut/stabilit;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              puritate.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Vehicul (dacă este cazul):
                  
                              —
                           
                           
                              justificare pentru alegerea vehiculului, dacă acesta este diferit de apă.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animalele de experienţă:
                  
                              —
                           
                           
                              specie şi suşă utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul şi vârsta animalelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursă, condiţii de adăpostire, hrănire etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul testului.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              motivaţia pentru nivelurile dozelor alese;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind formula/includerea în hrană a substanţei de testat, concentraţia obţinută, stabilitatea şi omogenitatea preparatului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind administrarea substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              transformarea concentraţiei de substanţă de testat în hrană/apa potabilă (ppm) în doza reală (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              condiţii ambientale;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei şi a apei.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
               
            
                   
               
               
                  Date privind reacţie toxică a femelelor gestante, în funcţie de doză, inclusiv, fără a se limita la:
                  
                              —
                           
                           
                              numărul de animale la începutul testului, numărul de animale supravieţuitoare, numărul de animale gestante şi care au avortat, numărul de animale care au fătat prematur;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ziua decesului în cursul studiului sau dacă animalele au supravieţuit până la sacrificare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind animalele care nu supravieţuiesc până în ziua planificată pentru sacrificare se precizează, dar nu se includ în comparaţiile statistice între grupuri;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ziua observării oricărui semn clinic anormal şi evoluţia sa ulterioară;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea corporală, variaţiile acesteia şi greutatea uterului gestant, inclusiv, opţional, variaţiile de greutate corporală corectate în funcţie de greutatea uterului gestant;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              consumul de hrană şi, dacă se măsoară, consumul de apă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              concluziile autopsiei, inclusiv greutatea uterului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              se raportează valorile NOAEL pentru efecte asupra femelei gestante şi asupra dezvoltării.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Puncte finale pentru dezvoltare în funcţie de doză pentru cuiburi cu implantări, inclusiv:
                  
                              —
                           
                           
                              numărul de corpuri galbene;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de implantări, numărul şi procentajul de fetuşi vii şi decedaţi şi de resorbţii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul şi procentajul de pierderi înainte şi după implantare.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Puncte finale pentru dezvoltare în funcţie de doză, pentru cuiburile cu fetuşi vii, inclusiv:
                  
                              —
                           
                           
                              numărul şi procentajul de descendenţi vii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              raportul între cele două sexe;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea corporală a fetuşilor, de preferinţă defalcat pe sexe şi pentru ambele sexe;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              malformaţii externe, ale ţesuturilor moi şi ale scheletului şi alte modificări relevante;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criterii pentru includerea în diverse categorii, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul total şi procentajul de fetuşi şi cuiburi cu modificări externe, ale ţesuturilor moi şi ale scheletului, precum şi tipurile şi incidenţele diverselor anomalii, precum şi alte modificări relevante.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Kavlock R. J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; 399-410.
               
            
                  2.
               
               
                  Kimmel, C. A. and Francis, E. Z. (1990) Proceedings of the Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied Toxicology 14; 386-398.
               
            
                  3.
               
               
                  Wong, B. A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation Exposure Systems to Address Toxicological Problems. CUT Activities 17; 1-8.
               
            
                  4.
               
               
                  US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350; Inhalation Developmental Toxicity Study.
               
            
                  5.
               
               
                  Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte. Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experimentelle Pathologie 247:367.
               
            
                  6.
               
               
                  Edwards, J. A. (1968) The external Development of the Rabbit and Rat Embryo. In Advances in Teratology. D.H.M. Woolam (ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.
               
            
                  7.
               
               
                  Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S. Congenital Anomalies 16; 171-173.
               
            
                  8.
               
               
                  Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial Skeletal Variations Detected by the Double Staining Technique for Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses. Congenital Anomalies 32; 381-391.
               
            
                  9.
               
               
                  Kimmel, C. A. et al. (1993) Skeletal Development Following Heat Exposure in the Rat. Teratology 47; 229-242.
               
            
                  10.
               
               
                  Marr, M. C. et al. (1988) Comparison of Single and Double Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476.
               
            
                  11.
               
               
                  Barrow, M. V. and Taylor, W. J. (1969) A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morphology 127; 291-306.
               
            
                  12.
               
               
                  Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of Foetal Maturity. Teratology 11; 313-320.
               
            
                  13.
               
               
                  Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity Studies. Toxicology and Applied Pharmacology 9;:398-408.
               
            
                  14.
               
               
                  Kimmel, C. A. and Wilson, J. G. (1973) Skeletal Deviation in Rats: Malformations or Variations? Teratology 8; 309-316.
               
            
                  15.
               
               
                  Marr, M. C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD (Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to Ethylene Glycol. Teratology 46; 169-181.
               
            
                  16.
               
               
                  Monie, I. W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histological Study of Viscera. Supplement to Teratology Workshop Manual, pp. 163-173.
               
            
                  17.
               
               
                  Spark, C. and Dawson, A. B. (1928) The Order and Time of appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible Influence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy 41; 411-445.
               
            
                  18.
               
               
                  Staples, R. E. and Schnell, V. L. (1964) Refinements in Rapid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone. Stain Technology 39; 61-63.
               
            
                  19.
               
               
                  Strong, R. M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton. American Journal of Anatomy 36; 313-355.
               
            
                  20.
               
               
                  Stuckhardt, J. L. and Poppe, S. M. (1984) Fresh Visceral Examination of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing. Teralogenesis, Carcinogenesis, and Mulagenesis 4; 181-188.
               
            
                  21.
               
               
                  Walker, D. G. and Wirtschafter, Z. T. (1957) The Genesis of the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL.
               
            
                  22.
               
               
                  Wilson, J. G. (1965) Embryological Considerations in Teratology. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J. G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp. 251-277.
               
            
                  23.
               
               
                  Wilson, J. G. and Fraser, F. C. (eds). (1977) Handbook of Teratology, Vol. 4. Plenum, NY.
               
            
                  24.
               
               
                  Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Techniques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity. Acta Vet. Acad. Sci. Hung. 28; 233-239.
               
            
                  25.
               
               
                  Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mammalian Foetuses. Teratology 9; 37-38.
               
            
                  26.
               
               
                  Van Julsingha, E. B. and C. G. Bennett (1977) A Dissecting Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, Chicago, IL, pp. 126-144.
               
            
                  27.
               
               
                  US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for Developmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register 56; 63798-63826.
               
            
                  28.
               
               
                  Wise, D. L. et al. (1997) Terminology of Developmental Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Teratology 55; 249-292.
               
            B.32.   STUDIU DE CANCEROGENEZĂ
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa de testat se administrează în mod normal şapte zile pe săptămână, pe o cale adecvată, o doză pe lot, la mai multe loturi de animale de experienţă, pe o perioadă semnificativă din viaţa acestora. Pe parcursul expunerii şi după expunere la substanţa de testat, animalele de experienţă sunt ţinute sub observaţie zilnic pentru a detecta semnele de toxicitate, în special formarea tumorilor.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      Animalele se ţin în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează aleatoriu în loturi tratate şi loturi martor.
      
         1.6.1.   Animale de experienţă
      
      În funcţie de rezultatele studiilor anterioare, pot fi folosite alte specii (rozătoare sau nerozătoare). Se folosesc animale tinere, sănătoase, aparţinând unei linii de laborator obişnuite şi administrarea dozei începe cât mai curând după înţărcare.
      La începutul studiului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie. Atunci când studiul de toxicitate subcronică prin administrare orală este efectuat ca fază preliminară a unui studiu pe termen lung, trebuie să se folosească aceeaşi specie şi linie pentru ambele studii.
      
         1.6.2.   Număr şi sex
      
      În cazul rozătoarelor se folosesc cel puţin 100 de animale (50 femele şi 50 masculi) pentru fiecare doză şi pentru lotul martor. Femelele trebuie să fie nulipare şi negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul studiului, efectivul trebuie mărit cu numărul de animale preconizate a fi sacrificate până la sfârşitul studiului.
      
         1.6.3.   Doze şi frecvenţa expunerii
      
      În afara loturilor martor corespunzătoare, se mai folosesc cel puţin trei doze şi un lot martor. Doza maximă ar trebui să fie suficient de mare încât să provoace semne de toxicitate minimă, de exemplu o uşoară diminuare a ritmului de creştere în greutate (mai puţin de 10 %), fără a schimba semnificativ speranţa de viaţă normală datorită altor efecte decât tumorile.
      Doza minimă nu trebuie să interfereze cu creşterea normală, dezvoltarea şi longevitatea animalului sau să prezinte vreun indiciu de toxicitate. În general, această doză nu trebuie să fie mai mică de 10 % din doza maximă.
      Doza sau dozele intermediare se stabilesc în intervalul mediu dintre doza maximă şi cea minimă.
      Alegerea nivelurilor dozei ia în considerare datele din testele şi studiile de toxicitate precedente.
      Frecvenţa expunerii este, în mod normal, zilnică.
      Dacă substanţa se administrează în apa de băut sau se amestecă în hrană, acestea trebuie să fie permanent disponibile.
      
         1.6.4.   Loturi martor
      
      Se foloseşte un lot martor care este în toate privinţele identic cu loturile tratate, cu excepţia expunerii la substanţa de testat.
      În situaţii speciale, cum ar fi studiile de toxicitate prin inhalare de aerosoli sau studiile de toxicitate prin administrare orală care folosesc un emulsifiant cu activitate biologică neanalizată, se poate folosi un lot martor suplimentar, care nu este expus nici la vehicul.
      
         1.6.5.   Calea de administrare
      
      Cele trei căi de administrare principale sunt orală, cutanată şi prin inhalare. Alegerea căii de administrare depinde de caracteristicile fizice şi chimice ale substanţei de testat şi de calea de expunere probabilă în cazul omului.
      1.6.5.1.   Studii de toxicitate prin administrare orală
      Atunci când substanţa de testat este absorbită din tractul gastro-intestinal, iar ingestia poate fi una din căile la care poate fi expus şi omul, se preferă calea orală de administrare, dacă nu există contraindicaţii. Animalele pot primi substanţa de testat în hrană, dizolvată în apa de băut sau sub formă de capsule.
      În mod ideal, se folosesc doze zilnice timp de şapte zile pe săptămână, pentru că dozarea pentru cinci zile poate permite remiterea sau diminuarea toxicităţii în perioadele fără tratament, afectând astfel rezultatele şi evaluarea lor. Cu toate acestea, în primul rând din considerente practice, administrarea timp de cinci zile pe săptămână este acceptată.
      1.6.5.2.   Studii de toxicitate prin administrare cutanată
      Expunerea cutanată prin badijonarea pielii poate fi folosită pentru a simula o cale principală de expunere umană şi ca modalitate de inducere a leziunilor cutanate.
      1.6.5.3.   Studii de toxicitate prin inhalare
      Deoarece studiile de toxicitate prin inhalare ridică probleme tehnice de o mai mare complexitate în comparaţie cu celelalte căi de administrare, în cele ce urmează se prezintă îndrumări detaliate privind acest mod de administrare. Trebuie remarcat că în anumite situaţii o alternativă viabilă o constituie instilaţiile intratraheale.
      Expunerile pe termen lung se modelează de obicei după posibila expunere a omului: substanţa se administrează fie zilnic, timp de 6 ore, după echilibrarea concentraţiei în incintă, câte cinci zile pe săptămână (expunere intermitentă), fie, dacă se urmăresc efectele unei posibile expuneri în mediul înconjurător, timp de 22-24 ore/zi, câte şapte zile pe săptămână (expunere continuă), în acest ultim caz cu pauză de o oră/zi pentru hrănirea animalelor, în acelaşi moment al zilei şi menţinând condiţiile specifice din incintă. În ambele cazuri, animalele sunt expuse de obicei la concentraţii constante de substanţă de testat. Diferenţa esenţială dintre expunerea intermitentă şi cea continuă este aceea că în primul caz există o perioadă de 17-18 ore în care animalele se pot reface după efectele fiecărei expuneri zilnice, refacere chiar mai îndelungată la sfârşit de săptămână.
      Alegerea modalităţii de expunere – intermitentă sau continuă – depinde de obiectivele studiului şi de tipul de expunere umană simulat. Cu toate acestea, trebuie avute în vedere anumite dificultăţi tehnice. De exemplu, avantajul expunerii continue prin simularea condiţiilor de mediu este contrabalansat de cerinţa hrănirii şi adăpării animalelor în timpul expunerii şi de necesitatea de a dispune de tehnici mai complicate (şi mai fiabile) atât de generare a aerosolilor şi a vaporilor, cât şi de monitorizare.
      
         1.6.6.   Incinte de testare
      
      Animalele se expun la substanţa de testat în incinte de inhalare concepute pentru a asigura un flux continuu sau cel puţin 12 aerisiri pe oră, garantând un conţinut de oxigen adecvat şi o distribuţie uniformă a produsului de testat în aer. Incinta martor şi cea de testare trebuie să fie identice ca proiectare şi construcţie, astfel încât să asigure condiţii comparabile sub toate aspectele, cu excepţia expunerii la substanţele de testat. În incintă se menţine o presiune uşor negativă pentru a împiedica pierderea substanţei de testat în zona înconjurătoare. În incinte trebuie redusă la minim aglomerarea animalelor testate. De regulă, pentru a asigura stabilitatea atmosferei din incintă, volumul total al animalelor nu trebuie să depăşească 5 % din volumul incintei.
      Se măsoară şi se controlează:
      
                  (i)
               
               
                  fluxul de aer: debitul de aer în incintă este recomandabil să fie monitorizat continuu;
               
            
                  (ii)
               
               
                  concentraţia: pe parcursul expunerii zilnice, concentraţia substanţei de testat nu trebuie să varieze cu mai mult de ± 15 % din valoarea medie; pe întreaga durată a studiului, concentraţiile zilnice trebuie să fie menţinute, pe cât posibil, la niveluri constant;
               
            
                  (iii)
               
               
                  temperatura şi umiditatea: în cazul rozătoarelor, temperatura trebuie menţinută la 22 ± 2 oC, iar umiditatea din incintă la 30-70 %, exceptând cazurile în care se foloseşte apă ca mediu de suspensie pentru substanţă de testat în atmosfera incintei (aerosoli). De preferinţă, ambii parametri trebuie să fie monitorizaţi continuu;
               
            
                  (iv)
               
               
                  analiza granulometrică a particulelor: în atmosfera incintei unde există aerosoli lichizi sau solizi, trebuie să fie determinată distribuţia granulometrică a particulelor; particulele din componenţa aerosolilor trebuie să aibă o dimensiune compatibilă cu respirarea lor de către animalele testate; probele din atmosfera incintei se prelevează de la nivelul zonei de respiraţie; probele de aer trebuie să fie reprezentative din punct de vedere al distribuţiei particulelor la care sunt expuse animalele şi trebuie să reflecte, în termeni gravimetrici, toate suspensiile de tip aerosol, chiar dacă o mare parte din acestea nu sunt respirabile; în perioada întregului studiu este necesară menţinerea concentraţiilor administrate zilnic la valori constante, pe cât este posibil; pe durata generării aerosolilor trebuie efectuată analiza granulometrică pentru a determina stabilitatea concentraţiei acestora şi după aceea, cât de des este necesar în timpul expunerii pentru a determina în mod corespunzător măsura în care este constantă distribuţia particulelor la care au fost expuse animalele.
               
            
         1.6.7.   Durata studiului
      
      Durata studiului de cancerogeneză acoperă o perioadă mare de timp în raport cu viaţa animalelor de experienţă. În cazul şoarecilor şi hamsterilor, testul se încheie la 18 luni de la momentul iniţial, iar în cazul şobolanilor, la 24 de luni; cu toate acestea, în cazul unor linii cu longevitate mai mare şi/sau cu o rată mai scăzută de apariţie a tumorilor, testul se va încheia după 24 de luni în cazul şoarecilor şi hamsterilor, respectiv după 30 de luni în cazul şobolanilor. Alternativ, încheierea unui asemenea test prelungit este acceptabilă atunci când numărul supravieţuitorilor în lotul martor tratat cu doza minimă atinge 25 %. Dacă după încheierea testului se înregistrează răspunsuri diferite în funcţie de sex, animalele de acelaşi sex trebuie tratate separat. În cazul în care numai animalele din lotul tratat cu doza maximă mor prematur din motive evident legate de toxicitate, acest lucru nu impune încheierea testului decât dacă manifestările toxice cauzează apariţia problemelor la alte loturi. Pentru ca rezultatul negativ al unui test să fie acceptabil, se impune ca maximum 10 % din animalele din fiecare lot să fie eliminate în timpul experimentului prin autoliză, canibalism sau probleme organizatorice, iar rata supravieţuitorilor din toate loturile să fie mai mare de 50 % la 18 luni de la începerea studiului pentru şoareci şi hamsteri şi la 24 de luni în cazul şobolanilor.
      
         1.6.8.   Mod de operare
      
      
         1.6.8.1.   Observaţii
      
      Trebuie efectuate observaţii zilnice care să cuprindă eventuale modificări ale pielii, blănii, ochilor şi mucoaselor, precum şi ale sistemelor respirator şi circulator, sistemului nervos central şi autonom, ale activităţii somato-motrice şi ale comportamentului.
      Animalele sunt observate cu regularitate, pentru a evita pe cât posibil pierderea lor din motive exterioare experimentului, cum ar fi: canibalism, autoliză a ţesuturilor sau greşeală de plasare a exemplarelor. Animalele muribunde sunt retrase imediat şi supuse autopsiei.
      Pentru toate animalele se înregistrează semnele clinice şi mortalitatea. O atenţie specială trebuie acordată dezvoltării tumorilor: se înregistrează momentul apariţiei, localizarea, dimensiunile, aspectul şi dezvoltarea atât a tumorilor vizibile macroscopic, cât şi a celor palpabile.
      Consumul de hrană şi de apă (în cazul în care substanţa de testat se administrează în apa de băut) se măsoară săptămânal în primele 13 săptămâni de studiu, apoi la intervale de aproximativ trei luni, exceptând cazurile în care starea de sănătate şi greutatea corporală a animalelor impun alte intervale.
      Greutatea corporală trebuie înregistrată o dată pe săptămână pentru fiecare animal în timpul primelor 13 săptămâni de testare, apoi cel puţin o dată la patru săptămâni.
      
         1.6.8.2.   Examene clinice
      
      
         Examen hematologic
      
      Dacă observaţiile zilnice sugerează o deteriorare a stării de sănătate a animalelor pe parcursul studiului, se stabileşte formula leucocitară a fiecărui animal afectat.
      La 12 luni, la 18 luni şi înainte de sacrificare se recoltează probe de sânge. Se determină formula leucocitară pe probe prelevate de la animalele aparţinând lotului expus la doza maximă şi lotului martor. Dacă datele, în special cele obţinute înainte de sacrificare, sau rezultatele examinării patologice sugerează că este necesar, se determină formula leucocitară şi pentru lotul sau loturile cu doza imediat inferioară.
      
         Autopsia
      
      Se efectuează autopsia generală a tuturor animalelor, inclusiv a celor care mor pe parcursul experimentului sau care au fost sacrificate, fiind muribunde. Se conservă toate leziunile macroscopice, tumorile sau leziunile suspecte de a deveni tumori.
      Toate organele şi ţesuturile trebuie conservate într-un mediu corespunzător în vederea unui viitor examen histopatologic: creierul (inclusiv porţiuni din bulbul rahidian, punte, cortexul cerebelos şi cortexul cerebral), glanda pituitară, tiroida/paratiroida, timusul, plămânii şi traheea, inima, aorta, glandele salivare, ficatul, splina, rinichii, glandele suprarenale, esofagul, stomacul, duodenul, jejunul, ileonul, cecul, colonul, rectul, uterul, vezica urinară, ganglionii limfatici, pancreasul, gonadele, organele genitale anexe, glandele mamare feminine, pielea, muşchii, nervii periferici, sternul cu măduvă, femurul (inclusiv articulaţia), măduva spinării la trei niveluri (cervical, toracic şi lombar) şi ochii.
      Umplerea plămânilor şi a vezicii urinare cu fixator prezintă modalitatea optimă de conservarea a acestora; în studiile de toxicitate prin inhalare, umplerea plămânilor este o cerinţă esenţială pentru examinarea histopatologică adecvată. În cazul acestor studii, întregul tract respirator trebuie conservat, inclusiv cavitatea nazală, faringele şi laringele.
      
         Examen histopatologic
      
      
                  (a)
               
               
                  Se efectuează examenul histopatologic complet al organelor şi ţesuturilor pentru toate animalele care mor sau sunt sacrificate în perioada testului, precum şi pentru toate animalele din loturile martor şi loturile tratate expuse la doza maximă.
               
            
                  (b)
               
               
                  Se examinează microscopic toate tumorile vizibile sau leziunile suspecte a deveni tumori, pentru fiecare lot, indiferent de organul afectat.
               
            
                  (c)
               
               
                  Dacă există o diferenţă semnificativă între incidenţa apariţiei leziunilor neoplazice între loturile martor şi lotul expus la doza maximă, atunci se impune examinarea histopatologică a organului sau a ţesutului respectiv în cazul celorlalte loturi.
               
            
                  (d)
               
               
                  Dacă supravieţuirea în lotul expus la doza maximă este substanţial mai mică decât în lotul martor, atunci se impune examinarea completă a loturilor expuse la doza imediat inferioară.
               
            
                  (e)
               
               
                  Dacă în lotul expus la doza maximă este dovedită prezenţa unor efecte toxice sau de alt tip care ar putea afecta răspunsul neoplazic, atunci se impune examinarea completă la loturile expuse la doza imediat inferioară.
               
            2.   DATE
      Datele se sistematizează într-un tabel care indică, pentru fiecare lot de experienţă, numărul de animale la începutul testului, numărul de animale care prezintă tumori sau efecte toxice detectate în perioada testului, momentul apariţiei acestora, precum şi numărul animalelor la care s-au constatat tumori după sacrificare. Toate rezultatele observate se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specia, linia, originea, condiţiile ambiante, regimul alimentar;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare:
                  3.1.1. Descrierea aparatului de expunere:
                  inclusiv concepţia, tipul, dimensiunile, sursa de aer, sistemul generator de particule şi de aerosoli, metoda de condiţionare a aerului, tratarea aerului expirat şi, după caz, modul de adăpostire a animalelor în incinta de testare, atunci când se foloseşte o astfel de incintă. Se descrie echipamentul folosit pentru măsurarea temperaturii şi, dacă este necesar, stabilitatea concentraţiei de aerosoli sau granulometria particulelor.
                  3.1.2. Datele privind expunerea:
                  se prezintă sub forma unui tabel care indică valorile medii, precum şi măsura variabilităţii (de exemplu, deviaţia standard) şi trebuie să includă:
                  
                              (a)
                           
                           
                              debitul de aer în dispozitivul de inhalare;
                           
                        
                              (b)
                           
                           
                              temperatura şi umiditatea aerului;
                           
                        
                              (c)
                           
                           
                              concentraţiile nominale (cantitatea totală de substanţă de testat introdusă în dispozitivul de inhalare raportată la volumul de aer);
                           
                        
                              (d)
                           
                           
                              după caz, natura vehiculului;
                           
                        
                              (e)
                           
                           
                              concentraţiile reale din zona de respiraţie;
                           
                        
                              (f)
                           
                           
                              dimensiunile mediane ale particulelor (după caz);
                           
                        
            
                  —
               
               
                  dozele (inclusiv vehiculul, dacă este cazul) şi concentraţiile;
               
            
                  —
               
               
                  incidenţa tumorilor pe sexe, doză şi tip de tumoare;
               
            
                  —
               
               
                  momentul morţii în timpul experimentului sau indicarea faptului că animalele au supravieţuit experimentului;
               
            
                  —
               
               
                  răspunsul toxic pe sexe şi doză;
               
            
                  —
               
               
                  efectele toxice sau de alt tip;
               
            
                  —
               
               
                  momentul observării oricărui simptom anormal şi evoluţia acestuia;
               
            
                  —
               
               
                  consumul de hrană şi greutatea corporală;
               
            
                  —
               
               
                  examenele hematologice întreprinse şi rezultatele complete;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele autopsiei;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea detaliată a tuturor observaţiilor histopatologice;
               
            
                  —
               
               
                  tratarea statistică a rezultatelor cu o descriere a metodelor utilizate, după caz;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.33.   STUDIU COMBINAT DE TOXICITATE CRONICĂ ŞI DE CANCEROGENEZĂ
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Obiectivul studiului combinat de toxicitate cronică/cancerogeneză este acela de a determina efectele cronice şi cancerigene ale unei substanţe după administrare prelungită la o specie de mamifere.
      În acest scop, studiul de cancerogeneză se suplimentează cu cel puţin un lot satelit tratat şi un lot satelit martor. Doza folosită pentru lotul satelit expus la doza maximă poate fi mai mare decât cea utilizată pe loturile expuse la doza maximă în studiile de cancerogeneză. Animalele folosite la acest test sunt examinate atât cu privire la toxicitatea generală, cât şi la răspunsul cancerigen. Animalele din lotul satelit tratat sunt examinate din punct de vedere al toxicităţii generale.
      Substanţa de testat se administrează în mod normal şapte zile pe săptămână, pe o cale de administrare convenabilă, la mai multe loturi de animale, o doză pentru fiecare lot, pe o perioadă îndelungată în raport cu viaţa lor. În timpul şi după expunerea la substanţa de testat, animalele sunt observate zilnic în vederea detectării semnelor de toxicitate şi a dezvoltării tumorilor.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Înainte de începerea testului, animalele tinere sănătoase se repartizează aleatoriu în loturi tratate şi loturi martor.
      
         1.6.1.   Animale de experienţă
      
      Specia preferată este şobolanul. Pe baza rezultatelor din teste anterioare pot fi folosite şi alte specii de animale (rozătoare sau nerozătoare). Se folosesc animale tinere, sănătoase, aparţinând unei linii de laborator obişnuite şi administrarea dozei începe cât mai curând după înţărcare.
      La începutul experimentului, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie. Atunci când studiul de toxicitate subcronică prin administrare orală este efectuat ca fază preliminară a unui studiu pe termen lung, trebuie să se folosească aceeaşi specie şi linie pentru ambele studii.
      
         1.6.2.   Număr şi sex
      
      În cazul rozătoarelor se folosesc cel puţin 100 de animale (50 femele şi 50 masculi) pentru fiecare doză şi pentru lotul martor. Femelele trebuie să fie nulipare şi negestante. Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul studiului, acest număr se adaugă la total.
      Lotul sau loturile satelit tratate în scopul evaluării altor efecte patologice decât tumorile trebuie să cuprindă câte 20 de animale de fiecare sex, în timp ce lotul satelit martor trebuie să cuprindă 10 animale/sex.
      
         1.6.3.   Doze şi frecvenţa expunerii
      
      Pentru studiile de cancerogeneză, se folosesc cel puţin trei doze şi un lot martor. Doza maximă ar trebui să provoace semne de toxicitate minimă, de exemplu o uşoară diminuare a ritmului de creştere în greutate (mai puţin de 10 %), fără să schimbe semnificativ speranţa de viaţă normală datorită altor efecte decât tumorile.
      Doza minimă nu trebuie să interfereze cu creşterea normală, dezvoltarea şi longevitatea animalului sau să prezinte vreun indiciu de toxicitate. În general, această doză nu trebuie să fie mai mică de 10 % din doza maximă.
      Doza sau dozele intermediare se fixează pe segmentul mediu al intervalului dintre doza maximă şi cea minimă.
      Alegerea nivelurilor dozei ia în considerare datele din precedentele teste şi studii de toxicitate.
      Pentru studierea toxicităţii cronice, se includ în studiu alte loturi tratate, precum şi un lot satelit martor corespunzător. Pentru animalele din lotul satelit tratat doza puternică este aleasă astfel încât să producă un efect toxic sigur.
      Frecvenţa expunerii este, în mod normal, zilnică.
      Dacă substanţa chimică se administrează în apa de băut sau se amestecă în hrană, acestea trebuie să fie permanent disponibile.
      
         1.6.4.   Loturi martor
      
      Se foloseşte simultan un lot martor care este în toate privinţele identic cu loturile tratate, cu excepţia expunerii la substanţa tratată.
      În situaţii speciale, cum ar fi studiile de toxicitate prin inhalare de aerosoli sau studiile de toxicitate prin administrare orală care folosesc un emulsifiant cu activitate biologică neanalizată, se poate folosi un lot martor suplimentar care nu este expus nici la vehicul.
      
         1.6.5.   Cale de administrare
      
      Cele trei căi de administrare principale sunt orală, cutanată şi prin inhalare. Alegerea căii de administrare depinde de caracteristicile fizice şi chimice ale substanţei de testat şi de calea de expunere probabilă în cazul omului.
      
         1.6.5.1.   Studii de toxicitate prin administrare orală
      
      Atunci când substanţa de testat este absorbită din tractul gastro-intestinal, iar ingestia poate fi una din căile la care poate fi expus şi omul, se preferă calea orală de administrare, dacă nu există contraindicaţii. Animalele pot primi substanţa de testat în hrană, dizolvată în apa de băut sau sub formă de capsule.
      În mod ideal, se folosesc doze zilnice timp de şapte zile pe săptămână, pentru că dozarea pentru cinci zile poate permite refacerea animalului sau diminuarea toxicităţii în perioadele fără tratament, afectând astfel rezultatele şi evaluarea lor. Cu toate acestea, în primul rând din considerente practice, administrarea timp de cinci zile pe săptămână este acceptată.
      
         1.6.5.2.   Studii de toxicitate prin administrare cutanată
      
      Expunerea cutanată prin badijonarea pielii poate fi folosită pentru a simula o cale principală de expunere umană şi ca modalitate de inducere a leziunilor cutanate.
      
         1.6.5.3.   Studii de toxicitate prin inhalare
      
      Deoarece studiile de toxicitate prin inhalare ridică probleme tehnice de o mai mare complexitate în comparaţie cu celelalte căi de administrare, în cele ce urmează se prezintă recomandări detaliate privind acest mod de administrare. Trebuie remarcat că în anumite situaţii o alternativă viabilă o constituie instilaţiile intratraheale.
      Expunerile pe termen lung se modelează, de obicei, după posibila expunere a omului: substanţa se administrează fie zilnic, timp de 6 ore, după echilibrarea concentraţiei în incintă, câte cinci zile pe săptămână (expunere intermitentă), fie, dacă se urmăresc efectele unei posibile expuneri în mediul înconjurător, timp de 22-24 ore/zi, câte şapte zile pe săptămână (expunere continuă), în acest ultim caz cu pauză de o oră/zi pentru hrănirea animalelor în acelaşi moment al zilei şi menţinând condiţiile specifice din incintă. În ambele cazuri, animalele sunt expuse de obicei la concentraţii constante de substanţă. Diferenţa esenţială dintre expunerea intermitentă şi cea continuă este aceea că în primul caz există o perioadă de 17-18 ore în care animalele se pot reface după efectele fiecărei expuneri zilnice, refacere chiar mai îndelungată la sfârşit de săptămână.
      Alegerea modalităţii de expunere – intermitentă sau continuă – depinde de obiectivele studiului şi de tipul de expunere umană simulat. Cu toate acestea, trebuie avute în vedere anumite dificultăţi tehnice. De exemplu, avantajele expunerii continue prin simularea condiţiilor de mediu sunt contrabalansate de necesitatea hrănirii şi adăpării animalelor în timpul expunerii şi de necesitatea de a dispune de tehnici mai complicate (şi mai fiabile) atât de generare a aerosolilor şi a vaporilor, cât şi de monitorizare.
      
         1.6.6.   Incinte de testare
      
      Animalele se expun la substanţa de testat în incinte de inhalare concepute pentru a asigura un flux continuu de cel puţin 12 aerisiri pe oră, garantând un conţinut de oxigen adecvat şi o distribuţie uniformă a substanţei de testat în aer. Incinta martor şi cea de testare trebuie să fie identice ca proiectare şi construcţie, astfel încât să asigure condiţii comparabile sub toate aspectele, cu excepţia expunerii la substanţele de testat. În incintă se menţine o presiune uşor negativă pentru a împiedica pierderea substanţei de testat în zona înconjurătoare. În incinte trebuie redusă la minim aglomerarea animalelor testate. De regulă, pentru a asigura stabilitatea atmosferei din incintă, volumul total al animalelor nu trebuie să depăşească 5 % din volumul incintei.
      Se măsoară şi se controlează:
      
                  (i)
               
               
                  fluxul de aer: debitul de aer în incintă este recomandabil să fie monitorizat continuu;
               
            
                  (ii)
               
               
                  concentraţia: pe parcursul expunerii zilnice, concentraţia substanţei de testat nu trebuie să varieze cu mai mult de ± 15 % din valoarea medie; pe întreaga durată a studiului, concentraţiile zilnice trebuie să fie menţinute, pe cât posibil, la niveluri constante;
               
            
                  (iii)
               
               
                  temperatura şi umiditatea: în cazul rozătoarelor, temperatura trebuie menţinută la 22 ± 2 oC iar umiditatea din incintă la 30-70 %, exceptând cazurile în care se foloseşte apă ca mediu de suspensie pentru substanţă de testat în atmosfera incintei. De preferinţă, ambii parametri trebuie să fie monitorizaţi continuu;
               
            
                  (iv)
               
               
                  analiza granulometrică a particulelor: în atmosfera incintei unde există aerosoli lichizi sau solizi: trebuie să fie determinată distribuţia granulometrică a particulelor în atmosfere ale incintei în care se folosesc aerosoli lichizi sau solizi; particulele din componenţa aerosolilor trebuie să aibă o dimensiune compatibilă cu respirarea lor de către animalele testate; probele din atmosfera incintei se prelevează de la nivelul zonei de respiraţie; probele de aer trebuie să fie reprezentative din punct de vedere al distribuţiei particulelor la care sunt expuse animalele şi trebuie să reflecte, în termeni gravimetrici, toate suspensiile de tip aerosol, chiar dacă o mare parte din acestea nu sunt respirabile; pe durata întregului studiu este necesară menţinerea concentraţiilor administrate zilnic la valori constante, pe cât este posibil; pe durata generării aerosolilor trebuie efectuată frecvent analiza granulometrică pentru a determina stabilitatea concentraţiei acestora şi ulterior cât de des este necesar în timpul expunerii, pentru a determina în mod corespunzător măsura în care este constantă distribuţia particulelor la care au fost expuse animalele.
               
            
         1.6.7.   Durata testului
      
      Durata segmentului de test cu privire la cancerogeneză acoperă o perioadă mare de timp în raport cu viaţa animalelor de experienţă. În cazul şoarecilor şi hamsterilor, testul se încheie la 18 luni de la momentul iniţial, iar în cazul şobolanilor – la 24 de luni; cu toate acestea, în cazul unor linii cu longevitate mai mare şi/sau cu o rată mai scăzută de apariţie a tumorilor, testul se va încheia după 24 de luni în cazul şoarecilor şi hamsterilor, respectiv după 30 de luni în cazul şobolanilor. Alternativ, încheierea unui asemenea test prelungit este acceptabilă atunci când numărul supravieţuitorilor în lotul martor tratat cu doza minimă atinge 25 %. Dacă după încheierea testului se înregistrează răspunsuri diferite în funcţie de sex, animalele de acelaşi sex trebuie tratate separat. În cazul în care numai animalele din lotul tratat cu doza maximă mor prematur din motive evident legate de toxicitate, acest lucru nu impune încheierea testului decât dacă manifestările toxice cauzează apariţia problemelor la alte loturi. Pentru ca rezultatul negativ al unui test să fie acceptabil, se impune ca procentul animalelor din fiecare lot care se elimină în timpul experimentului prin autoliză, canibalism sau probleme organizatorice să nu depăşească 10 %, iar rata supravieţuitorilor din toate loturile să nu fie sub 50 % la 18 luni de la începerea studiului pe şoareci şi hamsteri şi la 24 de luni în cazul şobolanilor.
      Loturile satelit alcătuite din 20 animale/sex şi loturile martor satelit corespunzătoare, alcătuite din 10 animale/sex şi folosite la testarea toxicităţii cronice, trebuie menţinute în experiment timp de cel puţin 12 luni. Aceste animale urmează să fie sacrificate pentru a examina patologia indusă de substanţa de testat, dar necomplicată cu modificări gerontologice.
      
         1.6.8.   Mod de operare
      
      
         1.6.8.1.   Observaţiile
      
      Trebuie efectuate observaţii în cuşcă zilnice care să cuprindă eventuale modificări ale pielii, blănii, ochilor şi mucoaselor, precum şi ale sistemului respirator, ale sistemului circulator, ale sistemului nervos central şi autonom, ale activităţii somato-motrice şi ale comportamentului.
      La intervale adecvate se procedează la examinarea clinică a animalelor din lotul sau loturile satelit tratate.
      Animalele sunt observate cu regularitate, pentru a evita pe cât posibil pierderea lor din motive cum ar fi canibalismul, autoliza ţesuturilor sau plasarea greşită a exemplarelor. Animalele muribunde sunt retrase imediat şi sunt supuse autopsiei.
      Pentru toate animalele se înregistrează semnele clinice, în special modificările neurologice şi oculare, şi mortalitatea. O atenţie specială trebuie acordată dezvoltării tumorilor: se înregistrează momentul apariţiei, localizarea, dimensiunile, aspectul şi dezvoltarea atât a tumorilor vizibile macroscopic, cât şi a celor palpabile; se înregistrează momentul apariţiei şi evoluţia stărilor toxice.
      Consumul de hrană şi de apă (în cazul în care substanţa de testat se administrează în apa de băut) se măsoară săptămânal în primele 13 săptămâni de studiu, apoi la intervale de aproximativ trei luni, exceptând cazurile în care starea de sănătate şi greutatea corporală a animalelor impun alte intervale.
      Greutatea corporală trebuie înregistrată o dată pe săptămână pentru fiecare animal în timpul primelor 13 săptămâni de testare, apoi cel puţin o dată la patru săptămâni.
      
         1.6.8.2.   Examene clinice
      
      
         Examen hematologic
      
      Examenul hematologic (de exemplu: hemoglobina, hematocritul, concentraţia hemoglobinei, număr de hematii, număr de leucocite sau alte măsurători ale potenţialului de coagulare) trebuie realizat la trei şi la şase luni şi apoi la un interval de şase luni; la sfârşitul studiului se recoltează probe de sânge de la 10 şobolani/sex din toate loturile. Dacă este posibil, probele se prelevează de fiecare dată de la aceiaşi şobolani.
      Dacă observaţiile zilnice efectuate în perioada în care sunt ţinute în cuşcă sugerează o deteriorare a stării de sănătate a animalelor pe parcursul studiului, se stabileşte formula leucocitară a fiecărui animal afectat. Se examinează formula leucocitară pe probe prelevate de la animalele din lotul expus la doza maximă şi din loturile martor. La lotul sau loturile de animale expuse la dozele imediat inferioare, aceste determinări se vor efectua numai dacă se constată diferenţe majore între lotul martor şi lotul expus la doza maximă sau dacă există alte indicii patologice.
      
         Analiza urinei
      
      Trebuie colectate probe de urină de la 10 şobolani/sex din toate loturile, dacă este posibil de la aceiaşi şobolani, la acelaşi interval de timp, ca şi în cazul examenului hematologic. Pentru fiecare animal sau pe o probă comună/sex/lot de rozătoare, se fac următoarele determinări:
      
                  —
               
               
                  aspect: volum şi densitate pentru fiecare animal;
               
            
                  —
               
               
                  proteine, glucoză, corpi cetonici, hemoragii oculte (semicantitativ);
               
            
                  —
               
               
                  microscopia sedimentului urinar (semicantitativ).
               
            
         Biochimie clinică
      
      La intervale de aproximativ 6 luni, precum şi la sfârşitul experimentului se recoltează probe de sânge pentru determinări biochimice de la toate animalele nerozătoare şi de la câte 10 şobolani/sex din toate loturile, dacă este posibil de fiecare dată de la aceiaşi şobolani. În plus, de la nerozătoare trebuie să se recolteze probe înaintea testului. Pe plasma obţinută din aceste probe se vor efectua următoarele determinări:
      
                  —
               
               
                  concentraţia proteinelor totale;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia albuminelor;
               
            
                  —
               
               
                  teste ale funcţiei hepatice: activitatea fosfatazei alcaline, transaminază glutampiruvică (4) şi transaminază oxalacetică (5), gamma glutamil transpeptidază, ornitin decarboxilază;
               
            
                  —
               
               
                  metabolismul carbohidraţilor, cum ar fi glucoza à jeun;
               
            
                  —
               
               
                  teste ale funcţiei renale, cum ar fi azotul ureic din sânge.
               
            
         Autopsia
      
      Se efectuează autopsia generală a tuturor animalelor, inclusiv a celor care mor pe parcursul experimentului sau care au fost sacrificate, fiind muribunde. Înainte de sacrificare, se prelevează probe de sânge de la toate animalele, pentru stabilirea formulei leucocitare. Se conservă toate leziunile macroscopice, tumorile sau leziunile suspecte de a deveni tumori. Se procedează la corelarea observaţiilor macroscopice cu rezultatele microscopice.
      Toate organele şi ţesuturile trebuie conservate într-un mediu corespunzător în vederea examenului histopatologic: creier (7) (bulb rahidian, punte, cortex cerebelos şi cortex cerebral), glanda pituitară, tiroida (inclusiv paratiroida), timus, plămâni (inclusiv trahee), inimă, aortă, glandele salivare, ficat (7), splină, rinichi (7), glande suprarenale (7), esofag, stomac, duoden, jejun, ileon, cec, colon, rect, uter, vezica urinară, ganglioni limfatici, pancreas, gonade (7), organele genitale anexe, glandele mamare feminine, piele, musculatură, nervi periferici, măduva spinării (cervicală, toracică, lombară) stern cu măduvă şi femur (inclusiv articulaţia) şi ochi.
      Deşi umplerea plămânilor şi a vezicii urinare cu fixator reprezintă modalitatea optimă de conservarea a acestora, în studiile de toxicitate prin inhalare, umplerea plămânilor este o cerinţă esenţială pentru examinarea histopatologică adecvată. În cazul acestor studii, întregul tract respirator trebuie conservat, inclusiv cavitatea nazală, faringele şi laringele.
      Dacă se realizează şi alte examinări clinice, informaţiile obţinute din aceste studii trebuie să fie disponibile înainte de examinarea microscopică, deoarece pot să dea indicii medicului patolog.
      
         Examen histopatologic
      
      Pentru segmentul studiului care urmăreşte toxicitatea cronică:
      Se examinează în detaliu toate organele conservate ce provin de la toate animalele din lotul satelit tratat cu doza maximă şi din lotul sau loturile martor. Dacă la lotul satelit tratat cu doza maximă se stabileşte o patologie în legătură cu substanţa de testat, organele ţintă ale tuturor animalelor din orice alt lot satelit tratat vor fi examinate complet şi detaliat din punct de vedere histologic, precum şi animalele din loturile tratate din segmentul studiului privind cancerogeneza, la sfârşitul acestuia.
      Pentru segmentul studiului care urmăreşte cancerogeneza:
      
                  (a)
               
               
                  se efectuează examenul histopatologic complet al organelor şi ţesuturilor pentru toate animalele care mor sau sunt sacrificate în perioada testului, precum şi pentru toate animalele din lotul martor şi loturile expuse la doza maximă;
               
            
                  (b)
               
               
                  se examinează microscopic toate tumorile vizibile sau leziunile suspecte a deveni tumori, pentru fiecare lot, indiferent de organul afectat;
               
            
                  (c)
               
               
                  dacă există o diferenţă semnificativă între incidenţa apariţiei leziunilor neoplazice între loturile martor şi lotul expus la doza maximă, atunci se impune examinarea histopatologică a organului sau a ţesutului respectiv în cazul celorlalte loturi;
               
            
                  (d)
               
               
                  dacă supravieţuirea în lotul expus la doza maximă este substanţial mai mică decât în lotul martor, atunci se impune examinarea completă a loturilor expuse la doza imediat inferioară;
               
            
                  (e)
               
               
                  dacă în lotul expus la doza maximă este dovedită prezenţa unor efecte toxice sau de alt tip care ar putea afecta răspunsul neoplazic, atunci se impune examinarea completă la loturile expuse la doza imediat inferioară.
               
            2.   DATE
      Datele se sistematizează într-un tabel care indică, pentru fiecare lot de experienţă, numărul de animale la începutul testului, numărul de animale care prezintă tumori sau efecte toxice detectate în perioada testului, momentul apariţiei acestora, precum şi numărul animalelor care au prezentat tumori la autopsie. Toate rezultatele observate se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate. Se poate folosi orice metodă statistică recunoscută.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specia, linia, originea, condiţiile ambiante, regimul alimentar etc.;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare:
                  3.1.1. Descrierea aparatului de expunere:
                  inclusiv concepţia, tipul, dimensiunile, sursa de aer, sistemul generator de particule şi de aerosoli, metoda de condiţionare a aerului, tratarea aerului expirat şi, după caz, modul de adăpostire a animalelor în incinta de testare. Se descrie echipamentul folosit pentru măsurarea temperaturii, a umidităţii şi, dacă este necesar, stabilitatea concentraţiei de aerosoli şi granulometria particulelor.
                  3.1.2. Datele privind expunerea:
                  se prezintă sub forma unui tabel care indică valorile medii, precum şi măsura variabilităţii (de exemplu, deviaţia standard); ele trebuie să includă:
                  
                              (a)
                           
                           
                              debitul de aer în dispozitivul de inhalare;
                           
                        
                              (b)
                           
                           
                              temperatura şi umiditatea aerului;
                           
                        
                              (c)
                           
                           
                              concentraţiile nominale (cantitatea totală de substanţă de testat introdusă în dispozitivul de inhalare divizată la volumul de aer);
                           
                        
                              (d)
                           
                           
                              după caz, natura vehiculului;
                           
                        
                              (e)
                           
                           
                              concentraţiile reale din zona de respiraţie;
                           
                        
                              (f)
                           
                           
                              dimensiunile mediane ale particulelor (după caz);
                           
                        
            
                  —
               
               
                  dozele (inclusiv vehiculul, dacă este cazul) şi concentraţiile;
               
            
                  —
               
               
                  incidenţa tumorilor pe sexe, doză şi tip de tumoare;
               
            
                  —
               
               
                  momentul morţii în timpul studiului sau indicarea faptului că animalele au supravieţuit studiului;
               
            
                  —
               
               
                  răspunsul toxic pe sexe şi doză;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea efectelor toxice sau de alt tip;
               
            
                  —
               
               
                  momentul observării fiecărui simptom anormal şi evoluţia acestuia;
               
            
                  —
               
               
                  observaţii oftalmologice;
               
            
                  —
               
               
                  consumul de hrană şi greutatea corporală;
               
            
                  —
               
               
                  examenele hematologice întreprinse şi rezultatele complete;
               
            
                  —
               
               
                  testul biochimic clinic practicat şi rezultatele complete (inclusiv cele urinare);
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele autopsiei;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea detaliată a tuturor observaţiilor histopatologice;
               
            
                  —
               
               
                  tratarea statistică a rezultatelor, cu o descriere a metodelor utilizate;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.34.   STUDIU DE TOXICITATE PRIVIND REPRODUCEREA LA O GENERAŢIE
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa de testat se administrează în doze crescătoare mai multor loturi de masculi şi femele. Masculii trebuie trataţi în timpul perioadei de creştere şi pe durata a cel puţin unui ciclu spermatogen complet (aproximativ 56 de zile la şoarece şi 70 de zile la şobolan), astfel încât substanţa de testat să îşi producă efectele adverse asupra spermatogenezei.
      Femelele din generaţia parentală (P) trebuie să fie tratate pe perioada a cel puţin două cicluri estrale complete astfel încât substanţa de testat să producă efectele adverse asupra ciclului estral. Apoi animalele sunt împerecheate. Substanţa de testat se administrează ambelor sexe în perioada împerecherii, iar apoi numai femelelor în perioada gestaţiei şi a alăptării. În cazul administrării prin inhalare, metoda va fi adaptată.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      
         1.6.1.   Pregătire
      
      Înainte de testare, animalele tinere sănătoase se repartizează aleatoriu în loturi tratate şi loturi martor. Se ţin animalele în condiţiile de adăpostire şi de hrănire specifice experimentului cel puţin în cele 5 zile care îl preced. Se recomandă ca substanţa de testat să se administreze în hrană sau în apa de băut. Şi alte căi de administrare sunt acceptabile. Aceeaşi metodă de administrare va fi utilizată pentru toate animalele pe tot parcursul experimentului. Dacă se foloseşte un vehicul sau alţi aditivi pentru a facilita administrarea, aceştia trebuie să nu aibă producă toxice. Tratamentul se face zilnic, şapte zile pe săptămână.
      
         1.6.2.   Animale de experienţă
      
      Alegerea speciei
      Specia preferată este şoarecele sau şobolanul. Se folosesc animale sănătoase, care nu au mai fost supuse anterior altor experimente. Nu se recomandă folosirea liniilor cu fertilitate scăzută. Animalele de experienţă trebuie caracterizate în termeni de specie, linie de descendenţă, sex, greutate şi/sau vârstă.
      Pentru o evaluare corespunzătoare a fertilităţii se studiază atât femelele, cât şi masculii. Toate animalele tratate şi cele martor trebuie înţărcate înainte de a începe tratamentul.
      Număr şi sex
      Fiecare lot martor şi fiecare lot tratat trebuie să conţină suficiente animale pentru a se asigura un număr de 20 de femele gestante în momentul sau aproape de momentul fătării.
      Obiectivul este acela de a avea un număr suficient de femele gestante şi descendenţi pentru a asigura o evaluare reprezentativă a potenţialului substanţei de testat de a afecta fertilitatea, gestaţia şi comportamentul matern la animalele din generaţia P, precum şi suptul, creşterea şi dezvoltarea la descendenţii F1, de la concepţie până la înţărcare.
      
         1.6.3.   Condiţii de testare
      
      Hrana şi apa trebuie furnizate ad libitum. În apropierea parturiţiei, femelele gestante se izolează în cuşti speciale de fătare sau maternitate şi pot primi materiale pentru construirea culcuşului.
      
         1.6.3.1.   Doze
      
      Se utilizează cel puţin trei doze şi un lot martor. Dacă pentru administrarea substanţei de testat se foloseşte un vehicul, acesta i se administrează lotului martor în volumul maxim folosit în experiment. Dacă substanţa de testat conduce la scăderea consumului zilnic de hrană, ar putea fi necesar un lot martor hrănit identic. În mod ideal, dacă nu există limite impuse de natura fizică/chimică ori de efectele biologice ale substanţei de testat, doza maximă trebuie să inducă efecte toxice, dar nu şi mortalitate la animalele parentale (P). Doza sau dozele intermediare trebuie să inducă efecte toxice minime atribuibile substanţei de testat, iar doza minimă nu trebuie să determine efecte adverse observabile la părinţi sau descendenţi. Dacă substanţa de testat se administrează prin gavaj sau sub formă de capsule, doza trebuie stabilită în funcţie de greutatea corporală a fiecărui animal în parte şi ajustată săptămânal, în funcţie de modificările în greutatea corporală. În cazul femelelor gestante, administrarea dozelor se poate face, dacă se doreşte, în funcţie de greutatea corporală în ziua 0 sau 6 de graviditate.
      
         1.6.3.2.   Test-limită
      
      În cazul substanţelor cu toxicitate scăzută, dacă o doză de cel puţin 1 000 mg/kg nu prezintă nicio interferenţă asupra capacităţii de reproducere, continuarea experienţei poate fi inutilă. Dacă un studiu preliminar cu doza maximă relevă o toxicitate maternă evidentă, dar nu prezintă efecte adverse asupra fertilităţii, atunci nu mai sunt necesare studii cu alte doze.
      
         1.6.3.3.   Desfăşurarea testului
      
      
         Schema de tratament
      
      Administrarea tratamentului zilnic la masculii parentali (P) poate începe când aceştia au între cinci şi nouă săptămâni, după ce au fost înţărcaţi şi aclimatizaţi timp de cel puţin cinci zile. La şobolani, administrarea substanţei continuă timp de 10 săptămâni înainte de perioada de împerechere (la şoareci, timp de opt săptămâni). Masculii trebuie sacrificaţi şi examinaţi fie la sfârşitul perioadei de împerechere, fie, alternativ, pot fi păstraţi primind regimul alimentar prevăzut în test, în vederea unei împerecheri ulterioare, fiind sacrificaţi şi examinaţi înainte de terminarea studiului. În cazul femelelor parentale (P), administrarea zilnică trebuie să înceapă după cel puţin cinci zile de aclimatizare şi să continue timp de cel puţin două săptămâni înainte de împerechere. Administrarea zilnică a dozei de tratament femelelor P continuă în perioada de trei săptămâni de împerechere, pe parcursul gestaţiei şi până la înţărcarea descendenţilor F1. Se poate avea în vedere modificarea schemei de tratament pe baza altor informaţii disponibile cu privire la substanţa de testat cum ar fi inducerea metabolismului sau bioacumularea.
      
         Procedura de împerechere
      
      Pentru studiile de toxicitate privind reproducerea, schemele de împerechere folosite pot fi: un mascul la o femelă (1:1) sau un mascul la două femele (1:2).
      În varianta împerecherii 1:1, o femelă este plasată împreună cu acelaşi mascul până când se produce fecundarea sau trec trei săptămâni. În fiecare dimineaţă femelele trebuie examinate pentru a identifica prezenţa spermei sau a dopului vaginal. Ziua „0” a sarcinii este definită ca fiind ziua în care se identifică prezenţa dopului vaginal sau a spermei în vagin.
      Animalele care nu s-au împerecheat trebuie evaluate pentru a stabili cauza aparentei infertilităţi.
      Evaluarea poate presupune posibilităţi suplimentare de împerechere cu alte exemplare dovedite ca fiind apte, examinarea microscopică a organelor de reproducere, precum şi examinarea ciclului estral şi a spermatogenezei.
      
         Mărimea seriei de pui
      
      Animalele tratate în timpul studiului de fertilitate fată normal şi îşi cresc puii până la înţărcare, fără a se face o standardizare numerică a seriei de pui.
      Dacă are loc standardizarea numerică, se recomandă următoarea metodă. Între zilele 1 şi 4 după fătare se ajustează numărul feţilor, eliminând surplusul de pui prin selecţie astfel încât să se obţină un număr de patru pui masculi şi patru pui femele pentru fiecare serie de pui.
      Dacă numărul de masculi sau femele fătate nu permite obţinerea unui număr de patru pui de fiecare sex, se acceptă ajustarea parţială (de exemplu, cinci masculi şi trei femele). Ajustările nu se aplică în cazul seriilor cu mai puţin de opt pui.
      
         1.6.4.   Observaţiile
      
      Pe toată durata testului, fiecare animal trebuie observat cel puţin o dată pe zi. Se înregistrează modificările comportamentale semnificative, semnele unor fătări dificile sau prelungite şi toate semnele de toxicitate, inclusiv mortalitatea. În timpul perioadelor de pre-împerechere şi de împerechere se măsoară zilnic consumul de hrană. După fătare şi în perioada lactaţiei, consumul de hrană (şi de apă, în cazul în care substanţa de testat se administrează în apa de băut) se măsoară în ziua în care se cântăresc puii. Masculii şi femelele din generaţia P se cântăresc în prima zi a tratamentului, apoi săptămânal. Aceste observaţii se înregistrează pentru fiecare animal adult în parte.
      Perioada gestaţiei trebuie calculată din ziua 0 de graviditate. Fiecare serie de pui proveniţi de la o gestantă trebuie examinat imediat după naştere, pentru a se stabili numărul şi sexul puilor, numărul de pui vii şi morţi, precum şi prezenţa anomaliilor macroscopice.
      Puii morţi şi puii sacrificaţi în ziua a patra trebuie conservaţi şi studiaţi în vederea identificării posibilelor anomalii. Puii vii se numără şi se cântăresc în dimineaţa de după naştere, în ziua a patra şi a şaptea, ulterior săptămânal până la încheierea studiului, când animalele se cântăresc individual.
      Anomaliile fizice sau comportamentale observate la femele sau la descendenţi trebuie înregistrate.
      
         1.6.5.   Patologie
      
      
         1.6.5.1.   Autopsia
      
      În momentul sacrificării sau al decesului în timpul studiului, toate animalele din generaţia P sunt supuse unui examen macroscopic în vederea evidenţierii anomaliilor structurale sau a modificărilor patologice, o atenţie deosebită acordându-se organelor sistemului de reproducere. Puii muribunzi sau morţi se examinează în vederea decelării eventualelor anomalii.
      
         1.6.5.2.   Examen histopatologic
      
      În vederea examinării microscopice, de la toate animalele P se conservă următoarele organe: ovare, uter, cervix, vagin, testicule, epididim, vezicule seminale, prostată, glanda coagulantă, glanda pituitară şi organul sau organele ţintă. În cazul în care aceste organe nu au fost examinate în cadrul altor studii cu doză multiplă, se efectuează un examen microscopic al tuturor animalelor din lotul martor şi din lotul tratat cu doza maximă şi, dacă este posibil, al animalelor care mor pe perioada studiului.
      Dacă la aceste animale se evidenţiază anomalii, organele respective se examinează la toate celelalte animale P. În aceste cazuri, se examinează microscopic toate ţesuturile care prezintă modificări patologice macroscopice. După cum s-a arătat în paragraful referitor la procedura de împerechere, organele de reproducere ale animalelor suspectate de infertilitate trebuie examinate microscopic.
      2.   DATE
      Datele se sistematizează într-un tabel care indică, pentru fiecare lot de experienţă, numărul de animale la începutul testului, numărul de masculi fertili, numărul de femele gestante, tipurile de modificări şi procentul de animale care prezintă fiecare tip de modificare.
      Dacă este posibil, rezultatele se evaluează printr-o metodă statistică adecvată. Poate fi folosită orice metodă statistică recunoscută.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specia/linia folosită;
               
            
                  —
               
               
                  răspunsul toxic pe sexe şi doză, inclusiv fertilitatea, gestaţia şi viabilitatea;
               
            
                  —
               
               
                  momentul morţii în timpul studiului sau indicarea faptului că animalele au supravieţuit studiului;
               
            
                  —
               
               
                  tabel cu greutatea corporală pentru fiecare serie de pui, greutatea corporală medie a puilor şi greutăţile corporale individuale la încheierea studiului;
               
            
                  —
               
               
                  efectele toxice sau de alt tip asupra reproducerii, descendenţilor şi evoluţiei postnatale;
               
            
                  —
               
               
                  ziua observării oricărui simptom anormal şi evoluţia acestuia;
               
            
                  —
               
               
                  greutatea corporală a animalelor P;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele autopsiei;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea detaliată a tuturor observaţiilor microscopice;
               
            
                  —
               
               
                  tratarea statistică a rezultatelor, după caz;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.35.   STUDIU DE TOXICITATE ASUPRA REPRODUCERII PE DURATA A DOUĂ GENERAŢII
      1.   METODĂ
      Această metodă corespunde Orientării 416 (2001) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Această metodă de testare a reproducerii pe durata a două generaţii este concepută pentru a furniza informaţii generale privind efectele unei substanţe de testat asupra integrităţii şi funcţionării sistemelor de reproducere masculin şi feminin, inclusiv asupra funcţiei gonadice, ciclului estral, comportamentului de împerechere, concepţiei, gestaţiei, fătării, alăptării şi înţărcării şi asupra creşterii şi dezvoltării descendenţilor. Studiul poate furniza, de asemenea, informaţii privind efectele substanţei de testat asupra morbidităţii şi mortalităţii neonatale şi date preliminare privind toxicitatea asupra dezvoltării prenatale şi postnatale şi poate constitui un ghid pentru testele ulterioare. Această metodă de testare nu studiază doar creşterea şi dezvoltarea generaţiei F1, ci evaluează, de asemenea, integritatea şi funcţionarea sistemelor de reproducere masculin şi feminin, precum şi creşterea şi dezvoltarea generaţiei F2. Pentru informaţii suplimentare privind toxicitatea asupra dezvoltării şi deficienţele funcţionale, fie pot fi incluse în acest protocol secvenţe suplimentare de studiu, consultând metodele pentru toxicitatea asupra dezvoltării şi/sau neurotoxicitatea asupra dezvoltării, după caz, fie aceste puncte finale pot fi studiate în cadrul unor studii separate, utilizând metodele de testare adecvate.
      1.2.   PRINCIPIILE METODEI DE TESTARE
      Substanţa de testat se administrează în doze graduale mai multor grupuri de masculi şi femele. Substanţa se administrează masculilor din generaţia P în timpul creşterii şi cel puţin pe durata unui ciclu spermatogenetic complet (aproximativ 56 de zile la şoarece şi 70 de zile la şobolan) pentru a pune în evidenţă efectele adverse asupra spermatogenezei. Efectele asupra spermei se determină în funcţie de mai mulţi parametri ai spermei (de exemplu, morfologia şi motilitatea spermatozoizilor) şi prin preparate de ţesut şi examene histopatologice detaliate. Dacă sunt disponibile date privind spermatogeneza dintr-un studiu anterior cu doze repetate cu o durată suficientă, de exemplu un studiu de 90 de zile, masculii din generaţia P nu este necesar să fie incluşi în evaluare. Se recomandă totuşi ca eşantioanele şi înregistrările digitale ale spermei din generaţia P să fie păstrate, pentru a permite o evaluare ulterioară. Substanţa se administrează femelelor din generaţia P în timpul creşterii şi pe durata mai multor cicluri estrale complete pentru a detecta orice efecte adverse produse asupra normalităţii ciclului estral de către substanţa de testat. Substanţa de testat se administrează animalelor din generaţia parentală (P) în perioada împerecherii, pe durata gestaţiilor ulterioare şi până la înţărcarea descendenţilor lor din generaţia F1. După înţărcare, substanţa se administrează în continuare descendenţilor F1 în perioada de creştere şi la vârsta adultă şi în perioada de împerechere şi producere a generaţiei F2, până la înţărcarea generaţiei F2.
      Observaţiile clinice şi examenele patologice se efectuează asupra tuturor animalelor pentru detectarea semnelor de toxicitate, acordându-se o atenţie specială efectelor asupra integrităţii şi funcţionării sistemelor de reproducere masculin şi feminin şi asupra creşterii şi dezvoltării descendenţilor.
      1.3.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.3.1.   Selectarea speciei de animale
      Specia preferată pentru testare este şobolanul. Dacă se utilizează o altă specie, această opţiune se justifică şi este necesar să se facă modificările adecvate. Nu se utilizează liniile cu o fecunditate scăzută sau o incidenţă ridicată bine-cunoscută a defectelor de dezvoltare. La începutul studiului, variaţiile în greutate între animalele utilizate trebuie să fie minime şi să nu depăşească 20 % din greutatea medie pentru fiecare sex.
      1.3.2.   Condiţii de adăpostire şi de hrănire
      În spaţiul pentru adăpostirea animalelor de experienţă, se asigură o temperatură de 22 oC (± 3 oC). Se asigură o umiditate relativă de 50-60 %, cu o valoare minimă de 30 % şi o valoare maximă de 70 %, cu excepţia momentelor în care se curăţă spaţiul. Spaţiul se iluminează artificial, cu o alternanţă de 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă. Animalele pot fi grupate în cuşti în funcţie de doză, dar numărul animalelor dintr-o cuşcă nu trebuie să împiedice observarea corectă a fiecărui animal. Alegerea hranei poate fi influenţată de necesitatea de a încorpora în hrană substanţa de testat, dacă se administrează prin această metodă.
      Animalele se adăpostesc individual sau în grupuri mici de acelaşi sex. Procedurile de împerechere se desfăşoară în cuşti adecvate acestui scop. După constatarea copulaţiei, femelele împerecheate se adăpostesc individual în cuşti amenajate pentru fătare şi maternitate. Şobolanii împerecheaţi pot fi adăpostiţi în grupuri mici, dar se separă cu una sau două zile înainte de fătare. Când se apropie momentul fătării, animalelor împerecheate li se asigură materialele adecvate şi determinate pentru construirea cuibului.
      1.3.3.   Pregătirea animalelor
      Se utilizează animale sănătoase, care au fost aclimatizate la condiţiile de laborator timp de cel puţin 5 zile înainte şi nu au fost supuse anterior altor proceduri de testare. Pentru animalele de experienţă se precizează specia, suşa, sursa, sexul, greutatea şi/sau vârsta. Este necesar să se cunoască legăturile colaterale dintre animale, pentru a se evita împerecherea între cosangvini. Animalele se distribuie aleatoriu în grupurile martor şi de testare (se recomandă gruparea în funcţie de greutate). Cuştile se aranjează astfel încât posibilele efecte cauzate de amplasarea lor să fie reduse la minimum. Fiecărui animal i se atribuie un număr unic de identificare. La animalele din generaţia P, identificarea se face înainte de începerea tratamentului. La animalele din generaţia F1, identificarea se face la înţărcare, pentru animalele selectate pentru împerechere. Pentru toate animalele selectate din generaţia F1 se înregistrează cuibul de origine. În plus, dacă se au în vedere cântărirea individuală a puilor sau orice alte teste funcţionale, se recomandă ca identificarea individuală a puilor să se efectueze cât mai curând posibil după fătare.
      Animalele din generaţia P trebuie să aibă circa 5 până la 9 săptămâni la începutul tratamentului. Se recomandă ca animalele din toate grupurile de tratament să aibă, în cea mai mare măsură posibilă, greutăţi şi vârste apropiate.
      1.4.   MOD DE LUCRU
      1.4.1.   Numărul şi sexul animalelor
      Fiecare grup de tratament şi grup martor trebuie să conţină un număr suficient de animale pentru a obţine, de preferat, cel puţin 20 de femele gestante în momentul sau în apropierea momentului fătării. În cazul substanţelor care cauzează efecte nedorite corelate tratamentului (de exemplu, sterilitate, toxicitate excesivă, la cea mai mare doză), există riscul ca acest lucru să nu fie posibil. Obiectivul este obţinerea unui număr suficient de femele gestante pentru a asigura o evaluare relevantă a potenţialului substanţei de a afecta fertilitatea, gestaţia şi comportamentul mamei şi alăptarea, creşterea şi dezvoltarea descendenţilor F1 de la concepţie până la maturitate, precum şi dezvoltarea descendenţilor acestora (F2), până la înţărcare. Prin urmare, faptul că nu se obţine numărul dorit de animale gestante (20) nu invalidează obligatoriu studiul şi se evaluează de la caz la caz.
      1.4.2.   Pregătirea dozelor
      Se recomandă ca substanţa de testat să se administreze oral (în hrană, în apa potabilă sau prin gavaj), cu excepţia cazului în care o altă cale de administrare (de exemplu, prin absorbţie dermică sau inhalare) este considerată a fi mai adecvată.
      Dacă este necesar, substanţa de testat se dizolvă într-un vehicul adecvat. Se recomandă, ori de câte ori este posibil, să se ia în considerare în primul rând utilizarea unei soluţii/suspensii apoase, apoi o soluţie/emulsie în ulei (de exemplu, ulei de porumb) şi ulterior o altă soluţie posibilă într-un alt vehicul. Pentru alte vehicule decât apa, este necesar să se cunoască proprietăţile toxice ale vehiculului. Se determină stabilitatea substanţei de testat în vehicul.
      1.4.3.   Dozare
      Se utilizează cel puţin trei niveluri ale dozei şi un martor paralel. Cu excepţia cazului în care există limite impuse de natura fizico-chimică sau de efectele biologice ale substanţei de testat, doza cea mai mare se alege astfel încât să inducă toxicitate, dar nu decesul sau o suferinţă profundă. În cazul unei mortalităţi neaşteptate, studiile cu o rată a mortalităţii mai mică decât circa 10 procente la animalele din generaţia parentală (P) este totuşi acceptabil, în mod normal. Se alege o serie de administrare în ordine descrescătoare a dozelor, pentru a pune în evidenţă o eventuală relaţie doză-efect şi nivelul dozei fără efect advers vizibil (NOAEL). Intervalul optim pentru determinarea nivelurilor descrescătoare ale dozelor este frecvent un factor de doi sau patru şi este deseori de preferat să se adauge un al patrulea grup de tratament în loc să se utilizeze intervale foarte mari (de exemplu, un factor mai mare decât 10) între doze. Pentru studiile cu administrare în hrană, intervalul între doze nu trebuie să depăşească un factor de trei. Nivelurile dozelor se selectează ţinând seama de datele existente privind toxicitatea, în special de rezultatele studiilor cu doze repetate. Se iau, de asemenea, în considerare orice informaţii disponibile cu privire la metabolismul şi cinetica compusului de testat sau ale materialelor înrudite. În plus, informaţiile în cauză se utilizează, de asemenea, pentru a demonstra că regimul de dozare este adecvat.
      Grupul martor nu este supus tratamentului sau i se administrează exclusiv vehiculul, în cazul în care pentru administrarea substanţei de testat se utilizează un vehicul. Cu excepţia tratamentului cu substanţa de testat, animalele din grupul martor sunt manipulate în acelaşi fel ca animalele din grupul de tratament. Dacă se utilizează un vehicul, grupului martor i se administrează cel mai mare volum utilizat de vehicul. Dacă substanţa de testat se administrează în amestec cu hrana şi provoacă o reducere a aportului şi consumului de hrană, poate fi considerată necesară utilizarea unui grup martor hrănit în paralel. Alternativ, se pot utiliza date obţinute din studii controlate, concepute pentru evaluarea efectelor unui consum redus de hrană asupra parametrilor reproducerii în locul unui grup martor simultan, hrănit în paralel.
      Se iau în considerare următoarele caracteristici ale vehiculului şi ale altor aditivi: efectele asupra absorbţiei, distribuţiei, metabolismului sau retenţiei de substanţă de testat; efectele asupra proprietăţilor chimice ale substanţei de testat care ar putea modifica caracteristicile sale toxice; şi efectele asupra consumului de hrană sau apă sau asupra stării nutriţionale a animalelor.
      1.4.4.   Testul-limită
      Dacă un studiu oral cu o singură doză de cel puţin 1 000 mg/kg greutate corporală/zi sau, în cazul administrării în amestec cu hrana sau apa potabilă, un procentaj echivalent în hrana sau apa potabilă, efectuat conform procedurilor descrise pentru prezentul studiu, nu produce efecte toxice evidente nici la animalele din generaţia parentală, nici la descendenţii acestora şi, dacă, pe baza datelor privind compuşii înrudiţi structural şi/sau metabolic, nu se prevede niciun efect toxic, este posibil să nu fie necesar un studiu complet cu mai multe niveluri ale dozei. Se efectuează testul-limită, cu excepţia cazului în care expunerea umană indică necesitatea de a utiliza un nivel al dozei administrate oral mai ridicat. În cazul altor căi de administrare, precum inhalarea sau aplicarea cutanată, proprietăţile fizico-chimice ale substanţei de testat, precum solubilitatea, pot indica şi limita, deseori, nivelul maxim de expunere posibil de realizat.
      1.4.5.   Administrarea dozelor
      Animalelor li se administrează substanţa de testat zilnic, 7 zile din 7. Se preferă administrarea pe cale orală (în amestec cu hrana, apa potabilă sau prin gavaj). Alegerea unei alte căi de administrare trebuie justificată şi poate impune modificări adecvate. Substanţa de testat se administrează prin aceeaşi metodă tuturor animalelor, pe durata adecvată a experimentului. Dacă substanţa de testat se administrează prin gavaj, se utilizează o sondă gastrică. Volumul de lichid administrat o singură dată nu trebuie să depăşească 1 ml/100 g greutate corporală (0,4 ml/100 g greutate corporală este volumul maxim pentru uleiul de porumb), cu excepţia cazului soluţiilor apoase, din care se pot administra 2 ml/100 g greutate corporală. Cu excepţia cazului substanţelor iritante sau corozive, care provoacă, în mod normal, efecte exacerbate la concentraţii mai ridicate, se recomandă ca variaţiile volumului administrat să fie reduse la minimum prin ajustarea concentraţiei, pentru a asigura un volum constant la toate nivelurile dozelor. În studiile efectuate prin gavaj, în mod normal puilor li se administrează substanţa de testat doar în amestec cu lapte, până la începerea dozării indirecte după înţărcarea lor. În studiile în care se utilizează amestecul în hrană sau apa potabilă, puilor li se administrează substanţa de testat direct din momentul în care încep să se hrănească singuri, în ultima săptămână a perioadei de alăptare.
      Pentru substanţele administrate în amestec cu hrana sau apa potabilă, este important ca echilibrul nutriţional şi hidric normal să nu fie afectat de cantitatea de substanţă de testat administrată. Dacă substanţa de testat se administrează în amestec cu hrana se poate utiliza fie o concentraţie constantă în hrană (ppm), fie o doză constantă raportată la greutatea corporală a animalului; se specifică opţiunea utilizată. În cazul unei substanţe administrate prin gavaj, doza se administrează aproximativ la aceeaşi oră în fiecare zi şi se ajustează cel puţin săptămânal pentru a menţine un nivel constant în funcţie de greutatea corporală a animalului. La ajustarea în funcţie de greutate a dozei administrate prin gavaj, se ţine seama de informaţiile privind distribuţia placentară.
      1.4.6.   Programe experimentale
      Administrarea zilnică a substanţei de testat la femelele şi masculii din generaţia parentală (P) începe la vârsta de 5-9 săptămâni. Administrarea zilnică a substanţei de testat la femelele şi masculii din generaţia F1 începe la înţărcare; se ţine seama de faptul că, în cazul substanţelor de testat administrate în amestec cu hrana sau apa potabilă, expunerea directă a puilor din generaţia F1 la substanţa de testat poate începe încă din perioada de alăptare. La ambele sexe (P şi F1), tratamentul continuă timp de cel puţin 10 săptămâni înainte de perioada de împerechere. Tratamentul continuă la ambele sexe în cele 2 săptămâni ale perioadei de împerechere. Masculii sunt eutanasiaţi şi examinaţi în momentul în care nu mai sunt necesari pentru evaluarea efectelor asupra reproducerii. La femelele din generaţia parentală (P), tratamentul continuă pe întreaga perioadă a gestaţiei şi până la înţărcarea descendenţilor F1. Se ia în considerare modificarea programului de administrare în funcţie de informaţiile disponibile privind substanţa de testat, inclusiv date existente privind toxicitatea, inducţia metabolică şi bioacumulare. Doza administrată fiecărui animal se calculează, în mod normal, pe greutatea corporală individuală la ultima cântărire. Cu toate acestea, ajustarea dozelor se face cu atenţie în ultimul trimestru de gestaţie.
      Tratamentul masculilor şi femelelor din generaţiile P şi F1 continuă până la sacrificare. Toate animalele adulte din generaţiile P şi F1, masculi şi femele, sunt eutanasiate când nu mai sunt necesare pentru evaluarea efectelor asupra reproducerii. Descendenţii F1 care nu sunt selectaţi pentru împerechere şi toţi descendenţii F2 sunt eutanasiaţi după înţărcare.
      1.4.7.   Procedura de împerechere
      1.4.7.1.   Împerecherea generaţiei parentale (P)
      Pentru fiecare împerechere, se adăposteşte fiecare femelă cu un singur mascul de la acelaşi nivel al dozei (împerechere 1:1), până când are loc copulaţia sau expiră un termen de 2 săptămâni. În fiecare zi, femele sunt examinate pentru a detecta prezenţa spermei sau a dopului vaginal. Ziua 0 de gestaţie se defineşte ca ziua în care se observă spermă sau un dop vaginal. În cazurile în care împerecherea eşuează, se poate lua în calcul reîmperecherea femelelor în cauză cu masculi care şi-au dovedit capacitatea reproductivă. Cuplurile împerecheate se identifică clar în cadrul datelor. Se evită împerecherea cosangvinilor.
      1.4.7.2.   Împerecherea generaţiei F1
      
      Pentru împerecherea descendenţilor F1 se selectează cel puţin un mascul şi o femelă din fiecare cuib, la înţărcare, pentru împerecherea cu alţi pui de la acelaşi nivel al dozei, dar din cuiburi diferite, pentru producerea generaţiei F2. Selecţia puilor din fiecare cuib se face aleatoriu dacă nu există diferenţe majore între puii din acelaşi cuib din punctul de vedere al greutăţii corporale şi a aspectului fizic. Dacă se observă astfel de diferenţe, se selectează cei mai buni reprezentanţi din fiecare cuib. Pragmatic, selecţia se face cel mai uşor în funcţie de greutatea corporală, dar este posibil ca selecţia în funcţie de aspect să fie mai relevantă. Descendenţii F1 nu se împerechează înainte de a fi atins maturitatea sexuală deplină.
      Cuplurile fără descendenţi sunt evaluate pentru determinarea cauzei aparente a infertilităţii. Evaluarea include proceduri precum oportunităţi suplimentare de împerechere cu alţi masculi sau femele care şi-au dovedit capacitatea reproductivă, examinarea microscopică a organelor de reproducere şi analiza ciclurilor estrale şi a spermatogenezei.
      1.4.7.3.   A doua împerechere
      În anumite situaţii, precum modificări ale dimensiunii cuibului corelate cu tratamentul sau observarea unor efecte echivoce la prima împerechere, se recomandă a doua împerechere a adulţilor P sau F1, pentru a produce un al doilea cuib. Se recomandă reîmperecherea femelelor sau masculilor care nu au produs un cuib cu animale de sex opus care şi-au dovedit capacităţile reproductive. Dacă se consideră necesară producerea celui de-al doilea cuib la oricare dintre generaţii, animalele se împerechează din nou la aproximativ o săptămână după înţărcarea cuibului anterior.
      1.4.7.4.   Dimensiunea cuibului
      Animalele se lasă să fete normal şi să îşi crească descendenţii până la înţărcare. Standardizarea dimensiunii cuibului este opţională. Dacă se recurge la standardizare, se descrie detaliat metoda utilizată.
      1.5.   OBSERVAŢIILE
      1.5.1.   Observaţiile clinice
      Se efectuează zilnic un examen clinic general, iar în cazul administrării prin gavaj, planificarea examenului clinic ţine seama de perioada de vârf a efectelor după administrare. Se înregistrează modificările de comportament, semnele de fătare dificilă sau prelungită şi orice semne de toxicitate. Cel puţin o dată pe săptămână fiecare animal este supus unui examen mai detaliat, care se poate efectua, pentru convenienţă, simultan cu cântărirea animalului. De două ori pe zi sau o singură dată pe zi la sfârşitul săptămânii, dacă este cazul, fiecare animal este supus unui examen pentru stabilirea morbidităţii sau decesului.
      1.5.2.   Greutatea corporală şi consumul de hrană/apă ale animalelor părinţi
      Animalele părinţi (P şi F1) sunt cântărite în prima zi de tratament şi, ulterior, cel puţin o dată pe săptămână. Femelele părinţi (P şi F1) sunt cântărite cel puţin în zilele de gestaţie 0, 7, 14 şi 20 sau 21, iar în perioada de alăptare în zilele în care sunt cântăriţi puii şi în ziua în care sunt sacrificate. Aceste observaţii se înregistrează individual pentru fiecare animal adult. În perioada de dinainte de împerechere şi în perioada de gestaţie, consumul de hrană se măsoară cel puţin o dată pe săptămână. Consumul de apă se măsoară cel puţin o dată pe săptămână, dacă substanţa de testat se administrează în apă.
      1.5.3.   Ciclul estral
      Lungimea şi normalitatea ciclului estral se evaluează la femelele P şi F1 prin frotiuri vaginale înainte de împerechere şi în perioada de împerechere, opţional, până la obţinerea de probe ale împerecherii. La prelevarea de celule vaginale/cervicale se evită cu atenţie deteriorarea mucoaselor şi, prin urmare, inducerea pseudogestaţiei (1).
      1.5.4.   Parametrii de evaluare a spermei
      La sacrificarea tuturor masculilor din generaţiile P şi F1, se înregistrează greutatea testiculelor şi a epididimului, păstrându-se câte un exemplar din fiecare organ pentru examenul histopatologic (a se vedea secţiunile 1.5.7, 1.5.8.1). Restul testiculelor şi epididimelor de la un subgrup de cel puţin zece masculi din fiecare grup de masculi din generaţiile P şi F1 se utilizează pentru numărarea spermatidelor rezistente la omogenizare şi, respectiv, a rezervelor de spermatozoizi din coada epididimului. De la acelaşi subgrup de masculi se colectează spermă din coada epididimului sau din canalul deferent pentru evaluarea motilităţii şi a morfologiei spermatozoizilor. Dacă se observă efecte corelate cu tratamentul sau dacă există dovezi din alte studii privind posibilele efecte asupra spermatogenezei, se efectuează o evaluare a spermei tuturor masculilor din grupurile tratate cu diverse niveluri ale dozei; în caz contrar, evaluarea spermei se poate restrânge la masculii din generaţiile P şi F1 din grupul martor şi grupul tratat cu cea mai mare doză.
      Se determină numărul total de spermatide testiculare rezistente la omogenizare şi numărul de spermatozoizi din coada epididimului (2) (3). Rezervele de spermatozoizi din coada epididimului se pot calcula din concentraţia şi volumul spermei din suspensia utilizată pentru realizarea evaluărilor calitative şi numărul de spermatozoizi recuperaţi din mărunţirea şi/sau omogenizarea ulterioară a ţesutului caudal rămas. Evaluarea numerică se efectuează pe subgrupul de masculi selectaţi din grupurile tratate la toate nivelurile dozei imediat după sacrificarea animalelor, cu excepţia cazului în care se fac înregistrări video sau digitale sau a cazului în care eşantioanele sunt îngheţate şi analizate ulterior. În aceste cazuri, se poate proceda mai întâi la analizarea grupurilor martor şi a grupului tratat cu doza cea mai mare. Dacă nu se observă efecte corelate cu tratamentul (de exemplu, efecte asupra numărului de spermatozoizi, motilităţii şi morfologiei spermatozoizilor), nu este necesar să se analizeze grupurile tratate cu alte doze. Dacă la grupul tratat cu doza cea mai mare se observă efecte corelate cu tratamentul, se evaluează şi grupurile tratate cu doze mai mici.
      Motilitatea spermei din epididim (sau canalele deferente) se evaluează sau se înregistrează pe suport video imediat după sacrificare. Sperma se colectează astfel încât să se evite deteriorarea organelor şi se diluează pentru analiza motilităţii utilizând metode acceptabile (4). Procentajul de spermatozoizi cu motilitate progresivă se determină subiectiv sau obiectiv. Dacă se face o analiză a mobilităţii asistată de computer (5) (6) (7) (8) (9) (10), calculul motilităţii progresive se bazează pe limite definite de utilizator pentru viteza medie pe traiectorie, rectiliniaritate şi indicele liniar. Dacă eşantioanele sunt înregistrate pe suport video (11) sau se înregistrează imagini în alt mod în momentul autopsiei, analiza ulterioară poate fi restrânsă doar la masculii P şi F1 din grupul martor şi grupul tratat la cea mai mare doză, cu excepţia cazului în care se observă efecte corelate cu tratamentul; în acest caz, se evaluează şi grupurile tratate cu doze mai mici. În absenţa unei imagini video sau digitale, toate eşantioanele prelevate de la toate grupurile de tratament se analizează în momentul autopsiei.
      Se efectuează o evaluare morfologică a unui eşantion de spermă colectat din epididim (sau canalul deferent). Spermatozoizii (cel puţin 200 per eşantion) se examinează ca preparate fixe, lichide (12) şi clasificaţi ca normali sau anormali. Printre anomaliile morfologice ale spermatozoizilor se numără fuziunea, capete izolate şi capete şi/sau cozi malformate. Evaluarea vizează subgrupul selectat de masculi din toate grupurile tratate cu diverse doze şi se efectuează fie imediat după sacrificare, fie ulterior, pe baza înregistrărilor video sau digitale. Odată fixate, frotiurile pot fi citite ulterior. În aceste cazuri, se poate proceda mai întâi la analizarea grupurilor martor şi a grupului tratat cu doza cea mai mare. Dacă nu se observă efecte corelate cu tratamentul (de exemplu, efecte asupra morfologiei spermatozoizilor), nu este necesar să se analizeze grupurile tratate cu alte doze. Dacă la grupul tratat cu doza cea mai mare se observă efecte corelate cu tratamentul, se evaluează şi grupurile tratate cu doze mai mici.
      Dacă oricare dintre parametrii de evaluare a spermei menţionaţi anterior a fost analizat în cadrul unui studiu de toxicitate sistemică de cel puţin 90 de zile, nu este obligatoriu ca acesta să fie reevaluat în cadrul studiului pe două generaţii. Cu toate acestea, se recomandă păstrarea de eşantioane sau înregistrări digitale ale spermei din generaţia P, pentru a permite efectuarea unor evaluări ulterioare, dacă este cazul.
      1.5.5.   Descendenţi
      Se examinează fiecare cuib, cât mai curând posibil după fătare (ziua de alăptare 0) pentru stabilirea numărului de pui şi a sexului acestora, a numărului de pui fătaţi morţi, a numărului de pui vii şi a prezenţei unor anomalii macroscopice. Este de preferat ca puii găsiţi morţi în ziua 0, dacă nu sunt maceraţi, să fie examinaţi pentru detectarea posibilelor anomalii şi determinarea cauzei morţii şi conservaţi. Puii vii se numără şi se cântăresc individual, la naştere (ziua de alăptare 0) sau în ziua 1 şi, ulterior, în zilele normale de cântărire, de exemplu, în zilele 4, 7, 14 şi 21 de alăptare. Se înregistrează orice anormalităţi fizice sau comportamentale observate la femele sau descendenţi.
      Se urmăreşte dezvoltarea fizică a descendenţilor, în special prin creşterea greutăţii corporale. Alţi parametri fizici (de exemplu, deschiderea urechilor şi a ochilor, erupţia dinţilor, creşterea blănii) pot oferi informaţii suplimentare, dar aceste date se evaluează, de preferinţă, în contextul datelor privind maturitatea sexuală (de exemplu, vârsta şi greutatea corporală la deschiderea vaginului sau separarea balano-prepuţială) (13). Se recomandă efectuarea unor investigaţii funcţionale (de exemplu, activitatea motorie, funcţiile senzoriale, ontogeneza reflexelor) asupra descendenţilor F1 înainte şi/sau după înţărcare, în special a celor legate de maturizarea sexuală, dacă astfel de investigaţii nu sunt incluse în studii separate. La puii înţărcaţi din generaţia F1 selectaţi pentru împerechere se determină vârsta la care survine deschiderea vaginului sau separarea prepuţială. În ziua 0 după fătare se măsoară distanţa ano-genitală la puii din generaţia F2, dacă se constantă modificări ale proporţiei de masculi şi femele sau ale momentului maturizării sexuale la generaţia F1.
      Se pot omite observaţiile funcţionale la grupurile care prezintă semne clare ale unor efecte adverse (de exemplu, o scădere semnificativă a greutăţii corporale etc.). Dacă se efectuează investigaţii funcţionale, acestea nu se efectuează asupra puilor selectaţi pentru împerechere.
      1.5.6.   Autopsia
      În momentul sacrificării sau al decesului în cursul studiului, toate animalele din generaţiile parentale (P şi F1), toţi puii care prezintă anormalităţi externe sau semne clinice, precum şi câte un pui/sex/cuib selectat aleatoriu din generaţiile F1 şi F2 sunt supuşi unei autopsii pentru determinarea anomaliilor structurale sau a modificărilor patologice. Se acordă o atenţie specială organelor sistemului de reproducere. Puii care sunt eutanasiaţi în stare muribundă sau puii decedaţi, dacă nu sunt maceraţi, sunt examinaţi pentru determinarea posibilelor defecte şi/sau a cauzei decesului şi conservaţi.
      Se examinează uterele tuturor femelelor primipare, astfel încât să nu se compromită examenul histopatologic, pentru determinarea prezenţei şi a numărului de locuri de implantare.
      1.5.7.   Greutatea organelor
      În momentul sacrificării, se stabileşte greutatea corporală şi greutatea următoarelor organe ale tuturor animalelor din generaţiile parentale P şi F1 (organele pereche se cântăresc individual):
      
                  —
               
               
                  uter, ovare;
               
            
                  —
               
               
                  testicule, epididime (greutate totală şi greutatea cozii);
               
            
                  —
               
               
                  prostată;
               
            
                  —
               
               
                  vezicule seminale cu glande coagulante şi fluidele lor şi prostată (împreună);
               
            
                  —
               
               
                  creier, ficat, rinichi, splină, glandele pituitare, tiroidă şi suprarenale, precum şi organele ţintă cunoscute.
               
            Se stabileşte greutatea corporală la sacrificare a puilor din generaţiile F1 şi F2 selectaţi pentru autopsie. Se cântăresc următoarele organe ale puiului/sexului/cuibului selectat aleatoriu (a se vedea punctul 1.5.6): creier, splină şi timus.
      Dacă este posibil, rezultatele autopsiei macroscopice şi greutatea organelor se analizează în corelaţie cu observaţiile altor studii cu doze repetate.
      1.5.8.   Histopatologie
      1.5.8.1.   Animale din generaţiile parentale
      Se fixează şi se conversă într-un mediu adecvat pentru examenul histopatologic următoarele organe şi ţesuturi ale animalelor din generaţiile parentale (P şi F1) sau eşantioane reprezentative ale acestora.
      
                  —
               
               
                  vagin, uter cu cervix şi ovare (conservate într-un fixativ adecvat);
               
            
                  —
               
               
                  un testicul (conservat în fixator Bouin sau fixator analog), un epididim, vezicule seminale, prostată şi glanda coagulantă;
               
            
                  —
               
               
                  organul sau organele ţintă identificate anterior de la toate animalele P şi F1 selectate pentru împerechere.
               
            Se efectuează un examen histopatologic complet asupra organelor şi ţesuturilor conservate enumerate anterior de la toate animalele P şi F1 selectate pentru împerechere din grupul martor şi grupul tratat cu cea mai mare doză. Examinarea ovarelor animalelor P este opţională. Se examinează, de asemenea, organele care prezintă modificări corelate cu tratamentul de la grupurile tratate cu doza cea mai mică şi cu o doză intermediară, pentru a facilita determinarea NOAEL. În plus, se efectuează un examen histopatologic asupra organelor de reproducere ale animalelor tratate cu doza cea mai mică şi o doză intermediară care sunt suspectate de fertilitate scăzută, de exemplu, cele care nu s-au împerecheat, nu au conceput, nu au generat sau nu au fătat descendenţi sănătoşi sau la care au fost afectate ciclul estral sau numărul, motilitatea sau morfologia spermatozoizilor. Se examinează toate leziunile macroscopice, precum atrofia sau tumorile.
      Se efectuează un examen histopatologic detaliat al testiculelor (utilizând, de exemplu, fixator Bouin, încapsulare în parafină şi secţiuni transversale de 4-5 μm grosime), pentru a identifica efectele corelate cu tratamentul, precum retenţia de spermatide, straturi sau tipuri de celule germinale absente, celule multinucleate gigant sau inserţia celulelor spermatogene în lumen (14). Examinarea epididimului intact vizează capul, corpul şi coada şi se poate realiza prin examinarea unei secţiuni longitudinale. Se examinează epididimul pentru detectarea infiltraţiei de leucocite, modificarea tipurilor de celule preponderente, tipuri de celule aberante şi fagocitoza spermatozoizilor. Pentru examinarea organelor masculine de reproducere se poate utiliza colorarea cu periodic acid Schiff (PAS) şi hematoxilină.
      În perioada de după alăptare, ovarul trebuie să conţină foliculi primordiali şi foliculi în creştere, precum şi marile corpuri galbene ale lactaţiei. Examenul histopatologic relevă o scădere calitativă a populaţiei de foliculi primordiali. Se efectuează o analiză cantitativă a foliculilor primordiali la femelele F1; numărul de animale, selectarea secţiunii ovariene şi dimensiunea eşantionului de secţiuni trebuie să corespundă din punct de vedere statistic procedurii de evaluare utilizate. Examenul include numărarea foliculilor primordiali, care pot fi amestecaţi cu foliculi mici în creştere, pentru compararea uterelor tratate cu uterele martor (15) (16) (17) (18) (19).
      1.5.8.2.   Pui înţărcaţi
      Se fixează şi se conservă într-un mediu adecvat pentru examenul histopatologic ţesuturile care prezintă anormalităţi macroscopice şi organele ţintă de la toţi puii care prezintă anomalii externe sau semne clinice, precum şi de la puiul/sexul/cuibul selectat aleatoriu din generaţiile F1 şi F2 care nu au fost selectaţi pentru împerechere. Se face o descriere histopatologică a ţesuturilor conservate, acordându-se o atenţie specială organelor sistemului de reproducere.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Datele se prezintă individual şi sub forma unui rezumat tabelar, prezentându-se, pentru fiecare grup de tratament şi fiecare generaţie, numărul de animale la începutul testului, numărul de animale găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate, data decesului sau a eutanasierii, numărul de animale fertile, numărul de femele gestante, numărul de animale care prezintă semne de toxicitate, o descriere a semnelor de toxicitate observate, inclusiv momentul declanşării, durata şi gravitatea efectelor toxice, tipul de observaţii asupra animalelor parentale şi descendenţilor, tipul de modificări histopatologice şi toate datele relevante privind cuiburile.
      Datele numerice se evaluează printr-o metodă statistică adecvată, general acceptată; metodele statistice se selectează în etapa de concepere a studiului şi se justifică. Modelele statistice doză-reacţii pot fi utile pentru analiza datelor. Raportul trebuie să includă informaţii suficiente privind metoda de analiză şi programul computerizat utilizate pentru ca un revizor/statistician independent să poată reevalua şi reface analiza.
      2.2.   EVALUAREA REZULTATELOR
      Rezultatele acestui studiu de toxicitate asupra reproducerii pe două generaţii se evaluează în funcţie de efectele observate, inclusiv rezultatele autopsiei şi ale examenului microscopic. Evaluarea include relaţia sau absenţa unei relaţii între doza de substanţă de testat şi prezenţa sau absenţa, incidenţa şi gravitatea unor anomalii, inclusiv leziuni macroscopice, organe ţintă identificate, efecte asupra fertilităţii, anomalii clinice, efecte asupra producerii şi asupra performanţelor descendenţilor, modificări ale greutăţii corporale, efecte asupra mortalităţii şi orice alte efecte toxice. La evaluarea rezultatelor se iau în considerare proprietăţile fizico-chimice ale substanţei de testat şi, dacă sunt disponibile, date privind toxicocinetica.
      Un test de toxicitate efectuat corespunzător generează o estimare satisfăcătoare a nivelului la care nu se observă efecte şi permite înţelegerea efectelor adverse asupra reproducerii, fătării, alăptării şi dezvoltării postnatale, inclusiv asupra creşterii şi dezvoltării sexuale.
      2.3.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Un studiu de toxicitate asupra reproducerii pe două generaţii furnizează informaţii privind efectele expunerii repetate la o substanţă în toate etapele ciclului de reproducere. Studiul furnizează în special informaţii privind parametrii reproducerii şi asupra dezvoltării, creşterii, maturizării şi supravieţuirii descendenţilor. Rezultatele studiului se interpretează în strânsă legătură cu rezultatele studiilor de toxicitate subcronică, de toxicitate asupra dezvoltării intrauterine, de toxicocinetică şi ale altor studii disponibile. Rezultatele acestui studiu pot fi utilizate pentru a se determina necesitatea efectuării altor teste asupra unei substanţe. Extrapolarea rezultatelor studiului la om este valabilă într-o măsură restrânsă. Rezultatele studiului sunt mai utile pentru a furniza informaţii privind nivelurile fără efecte adverse şi nivelul admisibil de expunere umană (20) (21) (22) (23).
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare include următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Substanţa de testat:
                  
                              —
                           
                           
                              natura fizică şi, dacă sunt relevante, proprietăţile fizico-chimice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date de identificare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              puritate.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Vehicul (dacă este cazul):
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea vehiculului ales, în cazul unui vehicul altul decât apa.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animalele de experienţă:
                  
                              —
                           
                           
                              specie/suşă utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul, vârsta şi sexul animalelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursă, condiţii de adăpostire, hrană, materiale pentru construirea cuibului etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutului testului.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              motivaţie pentru nivelul selectat al dozei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind formula/includerea în hrană a substanţei de testat, concentraţia obţinută;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              stabilitatea şi omogenitatea preparatului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind administrarea substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              transformarea concentraţiei de substanţă de testat în hrană/apa potabilă (ppm) în doza reală (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei şi a apei.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              consumul de hrană şi consumul de apă, dacă este disponibil, eficienţa hranei (creştere a greutăţii corporale per gram de hrană consumată) şi consumul de material testat la animalele P şi F1, exceptând perioada de coabitare şi cel puţin ultima treime a perioadei de alăptare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date privind absorbţia (dacă sunt disponibile);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date privind greutatea corporală a animalelor P şi F1 selectate pentru împerechere;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date privind greutatea cuibului şi a puilor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea corporală la sacrificare şi date privind greutatea absolută şi relativă a organelor la animalele parentale;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              natura, gravitatea şi durata semnelor clinice (dacă sunt reversibile sau nu);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              data decesului în cursul studiului sau date privind animalele care au supravieţuit până la sacrificare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date privind reacţia toxică în funcţie de sex şi doză, inclusiv indici de împerechere, fertilitate, gestaţie, fătare, viabilitate şi alăptare; raportul prezintă cifrele utilizate pentru calcularea indicilor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              efecte toxice sau de altă natură asupra reproducerii, descendenţilor, creşterii postnatale etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              concluziile autopsiei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              o descriere detaliată a tuturor observaţiilor histopatologice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de femele P şi F1 cu ciclul normal şi durata ciclului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul total de spermatozoizi în coada epididimului, procentul de spermatozoizi cu motilitate progresivă, procentajul de spermatozoizi normali din punct de vedere morfologic şi procentajul de spermatozoizi pentru fiecare anomalie identificată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              perioada până la împerechere, inclusiv numărul de zile până la împerechere;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              durata gestaţiei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de implantări, corpuri galbene, dimensiunea cuiburilor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de pui născuţi vii şi pierderi după implantare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de pui cu anomalii macroscopice, numărul de pui mai mici decât normal, dacă se determină;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date privind reperele fizice la pui şi alte date privind dezvoltarea postnatală; reperele fizice evaluate se justifică;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date privind investigaţiile funcţionale la pui şi adulţi, după caz;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              prelucrarea statistică a rezultatelor, dacă este cazul.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii, inclusiv valorile NOAEL pentru efectele asupra femelelor gestante şi descendenţi.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Sadleir, R. M. F. S. (1979). Cycles and Seasons, In: Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.
               
            
                  2.
               
               
                  Gray, L. E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology 12; 92-108.
               
            
                  3.
               
               
                  Robb, G. W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal of Reproduction and Fertility 54; 103-107.
               
            
                  4.
               
               
                  Klinefelter, G. R. et al., (1991). The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology 5; 39-44
               
            
                  5.
               
               
                  Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report. Reproductive Toxicology 10(3); 237- 244.
               
            
                  6.
               
               
                  Chapin, R. E. et al., (1992). Methods for Assessing Rat Sperm Motility. Reproductive Toxicology 6; 267-273
               
            
                  7.
               
               
                  Klinefelter, G. R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration. Journal of Andrology 13:409-421.
               
            
                  8.
               
               
                  Slott, V. L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology 5:449-458.
               
            
                  9.
               
               
                  Slott, V. L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, Part A., Academic, Orlando, Florida, pp. 319-333.
               
            
                  10.
               
               
                  Toth, G. P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10:401-415.
               
            
                  11.
               
               
                  Working, P. K. and M. Hurtt, (1987). Computerised Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andrology 8:330-337.
               
            
                  12.
               
               
                  Linder, R. E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491-505.
               
            
                  13.
               
               
                  Korenbrot, C. C. et al., (1977). Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biological Reproduction 17; 298-303.
               
            
                  14.
               
               
                  Russell, L. D. et al., (1990). Histological and Histopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.
               
            
                  15.
               
               
                  Heindel, J. J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.
               
            
                  16.
               
               
                  Heindel, J. J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, pp. 421-426.
               
            
                  17.
               
               
                  Manson, J. M. and Y. J. Kang, (1989). Test Methods for Assessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven, New York.
               
            
                  18.
               
               
                  Smith, B. J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive Toxicology 5; 379-383.
               
            
                  19.
               
               
                  Heindel, J. J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histology. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. and C. A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.
               
            
                  20.
               
               
                  Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and C. D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.
               
            
                  21.
               
               
                  Zenick, H. and E. D. Clegg, (1989). Assessment of Male Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A. W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.
               
            
                  22.
               
               
                  Palmer, A. K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, C. A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.
               
            
                  23.
               
               
                  Palmer, A. K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J. G. Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.
               
            B.36.   TOXICOCINETICA
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      A se vedea introducerea generală partea B.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa de testat se administrează pe calea corespunzătoare. În funcţie de scopul studiului, substanţa poate fi administrată în doză unică sau în doze repetate, pe anumite perioade de timp determinate, pe unul sau mai multe loturi de animale. Ulterior, în funcţie de tipul studiului, se vor determina substanţa şi/sau metaboliţii acesteia în fluidele corpului, în ţesuturi şi/sau în produsele de excreţie.
      Studiile pot fi făcute cu forme ale substanţei de testat „nemarcate” sau „marcate”. În cazul în care se utilizează un marcaj, acesta trebuie poziţionat în substanţă în aşa fel încât să furnizeze maximul de informaţii cu privire la evoluţia compusului.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Niciunul.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      
         Pregătirea testului
      
      Animalele tinere adulte, sănătoase, sunt aclimatizate la condiţiile de laborator cu cel puţin cinci zile înainte de începerea experimentului. Înainte de testare, animalele sunt repartizate aleatoriu în loturile de tratament. În situaţii speciale, se pot utiliza animale foarte tinere, femele gestante sau animale pretratate.
      
         Condiţii de testare
      
      Animale de experienţă
      Studiile de toxicocinetică se efectuează pe una sau mai multe specii adecvate şi trebuie să ia în considerare speciile folosite sau care urmează să fie folosite în alte studii toxicologice pentru aceeaşi substanţă. Dacă pentru un test se folosesc rozătoare, diferenţa de greutate între animale nu trebuie să depăşească cu mai mult de ± 20 % valoarea medie.
      Număr şi sex
      Pentru studiile de absorbţie sau excreţie, fiecare lot tratat trebuie să cuprindă iniţial patru animale. Alegerea în funcţie de sexe nu este obligatorie, dar în anumite circumstanţe ar putea fi necesară studierea animalelor de ambele sexe. Dacă răspunsul la substanţa de testat diferă în funcţie de sex, trebuie testate câte patru animale din fiecare sex. În cazul studiilor pe nerozătoare, se pot utiliza mai puţine animale. În studiile privind distribuţia tisulară, pentru stabilirea mărimii iniţiale a lotului se va ţine seama de numărul de animale care trebuie sacrificate la fiecare dată fixată pentru examinare, precum şi de numărul preconizat de examinări.
      Dacă se studiază metabolismul, mărimea lotului depinde de cerinţele studiului. În cazul studiilor cu doze multiple şi cu examene intermediare multiple, mărimea lotului se stabileşte în funcţie de numărul de examinări şi sacrificări planificate, însă nu trebuie să fie mai mică de două animale. Mărimea lotului trebuie să fie suficientă pentru a permite o evaluare acceptabilă a absorbţiei, a platoului şi a depleţiei (după caz) substanţei de testat şi/sau ale metaboliţilor.
      Doze
      În cazul administrării unei doze unice, se utilizează cel puţin două niveluri. Se utilizează o doză mică, la care să nu se observe efecte toxice şi o doză mare, la care pot să apară modificări ale parametrilor toxicocinetici sau la care apar efecte toxice.
      În cazul administrării dozelor repetate, doza mică este, de obicei, suficientă, însă în anumite circumstanţe poate fi necesară şi o doză mare.
      Calea de administrare
      În studiile de toxicocinetică se foloseşte aceeaşi cale şi, după caz, acelaşi vehicul ca în celelalte studii de toxicitate. Substanţa de testat se administrează loturilor de animale de experienţă oral, prin gavaj sau în hrană, prin inhalaţii sau aplicaţii cutanate, pe perioade prestabilite. Administrarea intravenoasă a substanţei de testat poate fi utilă în determinarea absorbţiei pe alte căi, pentru comparaţie. În plus, se pot afla informaţii importante asupra modului de distribuţie imediat după administrarea intravenoasă a substanţei.
      Se ia în considerare posibilitatea interferenţei dintre substanţa de testat şi vehicul. O atenţie deosebită trebuie acordată diferenţelor de absorbţie dintre administrarea prin gavaj şi cea prin hrană, precum şi necesităţii de a stabili doza cu acurateţe, în special atunci când substanţa de testat se administrează în hrană.
      Perioada de observaţie
      Toate animalele trebuie observate zilnic, înregistrându-se semnele de toxicitate şi alte particularităţi clinice, momentul apariţiei, amploarea şi durata acestora.
      
         Mod de operare
      
      După cântărirea animalelor de experienţă, substanţa se administrează pe o cale adecvată. Dacă se consideră relevant, animalele pot fi private de hrană înainte de administrarea substanţei.
      
         Absorbţia
      
      Nivelul şi gradul de absorbţie a substanţei administrate pot fi evaluate folosind metode variate, cu sau fără lot de referinţă (8), de exemplu, prin:
      
                  —
               
               
                  stabilirea cantităţii de substanţă de testat şi/sau a metaboliţilor în produse de excreţie cum ar fi: urina, bilă, fecale, aerul expirat şi rezidual;
               
            
                  —
               
               
                  compararea răspunsului biologic (de exemplu studii de toxicitate acută) între loturile tratate, martor şi/sau de referinţă;
               
            
                  —
               
               
                  compararea cantităţii de substanţă excretată pe cale renală şi/sau a metaboliţilor la loturile tratate şi de referinţă;
               
            
                  —
               
               
                  determinarea ariei de sub curba formată concentraţia plasmă/timp a substanţei şi/sau a metaboliţilor, comparativ cu datele obţinute de la lotul de referinţă.
               
            
         Distribuţia
      
      În prezent, sunt disponibile două metodologii pentru analizarea modelelor de distribuţie:
      
                  —
               
               
                  obţinerea de informaţii calitative utile folosind tehnici autoradiografice ale întregului corp;
               
            
                  —
               
               
                  obţinerea de informaţii cantitative prin sacrificarea animalelor la momente diferite după expunere şi determinarea concentraţiei şi cantităţii totale de substanţă şi/sau metaboliţi în ţesuturi şi organe.
               
            
         Excreţia
      
      În studiile de excreţie se colectează: urină, fecale, aer expirat şi, în anumite circumstanţe, bilă. Cantitatea de substanţă de testat şi/sau metaboliţii în aceste produse de excreţie se măsoară de mai multe ori după administrare, până când aproximativ 95 % din doza administrată a fost excretată sau timp de şapte zile, dacă procentul menţionat nu a fost atins înainte de acest termen.
      În cazuri speciale, se poate determina excreţia substanţei în secreţia lactată a animalelor de experienţă care alăptează.
      
         Metabolismul
      
      Pentru a se stabili calea metabolică şi intensitatea metabolismului, probele biologice se analizează prin utilizarea unor tehnici corespunzătoare. Atunci când se caută răspuns la unele întrebări ridicate în studii toxicologice anterioare, trebuie elucidate structurile metaboliţilor şi sugerate căile metabolice adecvate. Ar putea fi utilă efectuarea de studii in vitro în vederea obţinerii de informaţii cu privire la căile metabolice.
      Informaţii suplimentare despre relaţia dintre metabolism şi toxicitate pot fi obţinute prin studii biochimice, cum ar fi cele referitoare la determinarea efectelor asupra sistemelor enzimatice metabolizante, depleţia din compuşii endogeni a grupărilor sulfhidril non-proteice şi stabilirea legăturii chimice dintre substanţă şi macromolecule.
      2.   DATE
      În funcţie de tipul studiului realizat, rezultatele sunt sistematizate sub formă de tabele însoţite, după caz, de grafice. Pentru fiecare lot tratat se vor specifica media şi variaţia statistică a măsurătorilor în raport cu timpul, doza, ţesuturile şi organele, după caz. Gradul de absorbţie şi cantitatea şi ritmul excreţiei se stabilesc prin metode corespunzătoare. Dacă se realizează studii de metabolism, se indică structura metaboliţilor identificaţi şi căile metabolice posibile.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      În funcţie de tipul de studiu realizat, raportul de testare trebuie să cuprindă următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  specia, linia, sursa, condiţiile ambiante, regimul alimentar;
               
            
                  —
               
               
                  caracterizarea materialelor folosite pentru marcare, după caz;
               
            
                  —
               
               
                  dozele şi intervalele de administrare folosite;
               
            
                  —
               
               
                  calea sau căile de administrare şi vehiculul folosit;
               
            
                  —
               
               
                  efectele toxice sau de alt tip;
               
            
                  —
               
               
                  metodele pentru determinarea substanţei de testat şi/sau metaboliţi din probele biologice, inclusiv din aerul expirat;
               
            
                  —
               
               
                  prezentarea sub formă de tabele a măsurătorilor în funcţie de sex, doză, regim, moment, ţesuturi şi organe;
               
            
                  —
               
               
                  prezentarea gradului de absorbţie şi excreţie în funcţie de timp;
               
            
                  —
               
               
                  metodele pentru caracterizarea şi identificarea metaboliţilor din probele biologice;
               
            
                  —
               
               
                  metodele biochimice referitoare la metabolism;
               
            
                  —
               
               
                  căile de metabolizare propuse;
               
            
                  —
               
               
                  discutarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  interpretarea rezultatelor.
               
            3.2.   EVALUARE ŞI INTERPRETARE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      A se vedea introducerea generală partea B.
      B.37.   NEUROTOXICITATE ÎNTÂRZIATĂ A SUBSTANŢELOR ORGANOFOSFORICE DUPĂ EXPUNERE ACUTĂ
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Atunci când se face evaluarea efectelor toxice ale unor substanţe, este important să se studieze capacitatea pe care o prezintă unele substanţe de a provoca anumite tipuri de neurotoxicitate pe care alte tipuri de studii nu ar putea să le evidenţieze. Unii compuşi organofosforici prezintă o neurotoxicitate întârziată şi trebuie să fie analizate în cadrul unor asemenea studii.
      Teste de depistare in vitro pot fi utilizate în vederea identificării substanţelor care pot provoca o polineuropatie întârziată; cu toate acestea, rezultatele negative în urma unor teste in vitro nu sunt suficiente pentru a demonstra că substanţa testată nu este neurotoxică.
      A se vedea şi introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Substanţele organofosforice includ esteri, tioesteri organofosforici neîncărcaţi sau anhidride ale acizilor organofosforici, organofosfonici sau organofosforamidici sau ale acizilor fosforotioci, fosfonotioci sau fosforotioamidici din aceeaşi clasă sau ale unor substanţe care pot provoca neurotoxicitatea întârziată detectabilă câteodată la substanţele din această clasă.
      
         Neurotoxicitatea întârziată este un sindrom asociat cu instalarea prelungită a unei ataxii întârziate, asociate cu axonopatii distale la nivelul măduvei spinării şi a nervilor periferici şi cu o inhibare şi o îmbătrânire a esterazei caracteristică neuropatiilor (neuropathy target esterase – NTE) în ţesuturile nervoase.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      O substanţă de referinţă poate fi testată pe un lot martor pozitiv, astfel încât să se demonstreze că, în condiţiile de testare, reacţia preconizată a speciei nu s-a schimbat în mod semnificativ.
      Un exemplu de substanţă neurotoxică cu spectru larg de utilizare este fosfat tri-o-tolil-ul (nr. CAS 78-30-8, nr. EINECS 201-103-5, nomenclatura CAS: acid fosforic, tris(2-metilfenil)ester, cunoscut şi sub numele de tris-o-cresilfosfat).
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa testată va fi administrată pe cale orală, într-o singură doză, unor găini de casă protejate, după caz, contra efectelor colinergice acute. Animalele sunt ţinute sub observaţie timp de 21 de zile în vederea detectării anomaliilor de comportament, unei ataxii sau a unei paralizii. Sunt efectuate măsurători biochimice, în special pentru evidenţierea inhibării esterazei NTE, pe găinile selecţionate aleator din fiecare grup, în general la 24 şi la 48 de ore după administrare. La 21 de zile după expunere, găinile care au mai rămas sunt sacrificate şi se va efectua o examinare histopatologică a ţesuturilor nervoase selecţionate.
      1.5.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.5.1.   Pregătirea testului
      Găini adulte tinere, fără afecţiuni virale sub tratamente care pot intra în interferenţă cu substanţa testată şi care nu prezintă tulburări ale aparatului locomotor, sunt distribuite aleator în grupuri experimentale şi în loturi martor şi lăsate să se aclimatizeze la condiţiile de laborator cel puţin cu cinci zile înaintea începerii testului.
      Cuştile sau incintele sunt destul de voluminoase pentru a permite o mişcare liberă găinilor, astfel încât mersul lor să poată fi observat uşor.
      Substanţa testată va fi administrată în general pe cale orală, prin gavaj sau în capsule de gelatină sau printr-o metodă asemănătoare. Substanţele lichide pot fi administrate în mod direct sau dizolvate într-un vehicul adecvat, cum ar fi uleiul de porumb; substanţele solide trebuie dizolvate, dacă este posibil, altfel se poate întâmpla ca importante cantităţi de substanţe solide administrate în capsule de gelatină să nu fie absorbite în mod corespunzător. Dacă vehiculul este altul decât apa, caracteristicile sale toxice trebuie să fie cunoscute sau, în caz contrar, determinate înaintea începerii testului.
      1.5.2.   Condiţii de testare
      1.5.2.1.   Animalele de experienţă
      Specia recomandată este găina domestică ouătoare adultă şi tânără, de o vârstă cuprinsă între 8-12 luni (Gallus gallus domesticus). Se vor folosi rase şi linii pure de mărime standard; în mod normal, găinile folosite au fost crescute în condiţii care le-au permis mişcarea liberă.
      1.5.2.2.   Număr şi sex
      În afară de grupul experimental, va fi selecţionat şi un lot martor căruia i se administrează doar vectorul, precum şi un lot martor pozitiv. Grupul căreia i se administrează doar vectorul va fi tratat la fel ca şi grupul experimental, singura excepţie constând în administrarea substanţei testate.
      Trebuie selecţionat un număr suficient de ridicat de animale în fiecare grup, astfel încât să se poată sacrifica cel puţin şase în vederea efectuării măsurărilor biochimice (trei la ambele prelevări) şi astfel încât să supravieţuiască cel puţin şase după perioada de observaţie de 21 de zile.
      Lotul martor pozitiv poate fi studiat în paralel sau se pot folosi datele unui studiu realizat recent. Trebuie să fie constituit din cel puţin şase găini adulte tratate cu un produs neurotoxic cunoscut, cu efect întârziat; trei găini sunt rezervate măsurărilor biochimice şi trei evidenţierii semnelor patologice. Se recomandă actualizarea periodică a datelor istorice colectate anterior. Sunt selecţionate alte grupuri martor pozitiv, în cazul în care una dintre condiţiile esenţiale ale testului (cum ar fi linia pură, alimentaţia, adăpostirea) va fi modificată de către laboratorul care efectuează testul.
      1.5.2.3.   Doze
      Se recomandă efectuarea unui studiu preliminar pe un număr adecvat de găini, distribuite aleator în grupuri experimentale tratate cu doze diferite, în vederea determinării dozei care va fi utilizată în cadrul studiului principal. O anumită rată a mortalităţii este inevitabilă în acest studiu preliminar. Cu toate acestea, pentru a se evita moartea din cauza efectelor colinergice acute, se poate folosi atropina sau un alt agent protector care să nu perturbe reacţia neurologică întârziată. Se pot folosi metode de testare diverse pentru a se evalua doza maximă care nu este letală la o substanţă dată (a se vedea metoda B.1 bis). Datele colectate anterior pe găini sau alte informaţii de ordin toxicologic sunt luate, de asemenea, în considerare la determinarea dozei.
      Doza utilizată în studiul principal trebuie să fie cât se poate de ridicată, avându-se în vedere rezultatele studiului anterior şi limita superioară de 2 000 mg/kg greutate corporală. Oricare ar fi rata mortalităţii, trebuie să supravieţuiască un număr suficient de animale pentru a se putea efectua măsurările biochimice (şase) şi examenele histologice (şase), în cea de-a 21-a zi. Se va utiliza atropina sau un alt agent care nu perturbă reacţiile neurotoxice întârziate, astfel încât să se evite mortalitatea datorită efectelor colinergice acute.
      1.5.2.4.   Testul-limită
      Atunci când un test efectuat pe baza metodelor descrise în prezentul studiu, la o doză de cel puţin 2 000 mg/kg greutate corporală/zi nu produce efecte toxice detectabile şi dacă informaţiile cu privire la substanţe cu structuri asemănătoare nu indică toxicitatea acestora, nu este necesar să se efectueze un studiu cu o doză mai ridicată. Testul-limită este justificat, cu excepţia cazului în care condiţiile de expunere umană impun utilizarea unei doze mai ridicate.
      1.5.3.   Perioada de observaţie
      Perioada de observaţie este de 21 de zile.
      1.5.4.   Procedură
      După administrarea unui agent protector în vederea evitării provocării morţii din cauza efectelor colinergice acute, se administrează substanţa testată într-o singură doză.
      
         Observaţii generale
      
      Observaţiile încep imediat după expunere. Toate găinile sunt observate cu grijă de mai multe ori în cursul primelor două zile, după care cel puţin o dată pe zi, timp de 21 de zile sau până în data sacrificării. Se înregistrează toate manifestările de toxicitate, data apariţiei anomaliilor de comportament, tipul, gravitatea şi durata lor. Ataxia se măsoară cu ajutorul unei scale de evaluare obişnuite cu cel puţin patru niveluri; paralizia trebuie consemnată. Cel puţin de două ori pe săptămână găinile destinate evidenţierii semnelor patologice, sunt scoase din cuşti şi supuse unei activităţi locomotorii forţate, cum ar fi de exemplu urcarea pe scară, astfel încât să se faciliteze examinarea manifestării efectelor toxice uşoare. Animalele muribunde sau cele care prezintă semne de suferinţă sau dureri intense trebuie excluse imediat din studiu, eutanasiate şi autopsiate.
      
         Greutate corporală
      
      Toate găinile sunt cântărite cu puţin înaintea administrării substanţei, după care cel puţin o dată pe săptămână.
      
         Biochimie
      
      Şase găini selecţionate aleator din fiecare grup experimental şi din grupurile martor negative, precum şi trei găini din lotul martor pozitiv (dacă testul este realizat în paralel şi pe acesta) sunt sacrificate câteva zile după administrare, creierul şi măduva spinării din zona lombară sunt preparate şi analizate în vederea detectării inhibării esterazei caracteristică neuropatiilor. Pe lângă aceasta, poate să fie necesară şi analiza inhibării acestei esteraze pe nervul sciatic. În general, sunt sacrificate trei găini din lotul martor şi din fiecare grup experimental, după 24 de ore şi alte trei, după 48 de ore, iar cele trei găini din lotul martor pozitiv sunt sacrificate după 24 de ore. Dacă observarea semnelor clinice de intoxicare (estimate deseori pe baza momentului apariţiei efectelor colinergice) indică faptul că substanţa toxică se elimină în mod foarte lent, se poate să fie preferabilă prelevarea ţesuturilor de la trei găini la alte intervale de timp, între 24 sau cel mult 72 de ore după administrare.
      Dacă este necesar, se pot efectua, de asemenea, determinări de acetilcolinesterază (AChE) pe eşantioane. Cu toate acestea, poate avea loc in vivo o reactivare spontană a acetilcolinesterazei, fapt care ar duce la subestimarea activităţii de inhibitor de AChE a substanţei.
      
         Autopsia
      
      Autopsia tuturor animalelor (sacrificii prevăzute sau impuse de starea animalului) trebuie să includă o examinare a aspectului creierului şi a măduvei spinării.
      
         Examinarea histopatologică
      
      Ţesuturile nervoase ale tuturor animalelor care au supravieţuit după perioada de observaţie şi care nu au fost utilizate pentru măsurări biochimice, trebuie să fie supuse unui examen microscopic. Ţesuturile trebuie fixate in situ prin tehnica perfuziei. Secţiunile sunt practicate la nivelul cerebelului (pe plan longitudinal mediu), al bulbului rahidian, al măduvei spinării şi al nervilor periferici. Secţiunile din măduva spinării sunt practicate pe segmentul cervical superior, în regiunea toracică medie şi în regiunea lombo-sacrală. Se vor efectua secţionări şi în partea distală al nervului tibial, la nivelul ramurilor acestuia spre muşchii gastrocnemieni, precum şi la nivelul nervului sciatic. Secţiunile sunt colorate cu ajutorul unor coloranţi adecvaţi, specifici mielinei şi axonilor.
      2.   DATE
      De regulă, rezultatele obţinute pentru diferitele criterii de evaluare reţinute (biochimice, histopatologice şi cele referitoare la examinarea comportamentului) sunt negative, în mod normal, nu mai este nevoie să se recurgă la teste de neurotoxicitate întârziată. Rezultatele ambigue sau neconcludente pot impune continuarea studiului.
      Datele sunt indicate pentru fiecare animal separat. Pe lângă aceasta, datele sunt incluse într-un tabel care va indica la fiecare grup experimental, numărul de animale prezente la începutul testului, numărul de animale care prezintă leziuni, anomalii de comportament sau modificări biochimice, tipul şi gravitatea leziunilor sau tulburărilor, precum şi procentajul de animale care prezintă fiecare tip de leziuni sau tulburări, la diferite niveluri de gravitate.
      Rezultatele acestui studiu trebuie evaluate din punct de vedere al incidenţei lor asupra efectelor comportamentale, biochimice şi histopatologice sau asupra oricărui alt efect observat la grupurile experimentale şi cele martor sau din punct de vedere al gravităţii acestora şi al corelării dintre ele.
      Rezultatele cifrice sunt evaluate cu ajutorul unei metode statistice adecvate şi recunoscute. Metoda statistică trebuie să fie aleasă cu ocazia elaborării studiului.
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare va conţine, pe cât posibil, următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  3.1. Animale de experienţă:
                  
                              —
                           
                           
                              linia pură utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul animalelor, vârsta, sexul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              originea, condiţii de adăpostire etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea corporală a fiecărui animal la începutul testului.
                           
                        
            
                   
               
               
                  3.2. Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              detalii cu privire la prepararea substanţei testate şi la stabilitatea şi omogenitatea preparatului, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii cu privire la administrarea substanţei testate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii asupra calităţii hranei şi a apei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii dozei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              specificarea dozelor administrate, cu indicaţii detaliate cu privire la vehicul, la volumul şi starea de agregare a substanţei administrate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              eventual, identitatea agentului protector utilizat şi detalii cu privire la administrarea acestuia.
                           
                        
            
                   
               
               
                  3.3. Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              informaţii cu privire la greutatea corporală;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              informaţii cu privire la reacţia toxică pe grupuri, inclusiv mortalitatea;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              natura, gravitatea şi durata efectelor clinice observate (eventual, reversibilitatea acestora);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea detaliată a metodelor şi rezultatelor biochimice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultatele autopsiei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea detaliată a tuturor rezultatelor histopatologice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              prelucrare statistică a rezultatelor, după caz.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Evaluarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      Această metodă corespunde Orientării 418 a OCDE.
      B.38.   NEUROTOXICITATE ÎNTÂRZIATĂ A SUBSTANŢELOR ORGANOFOSFORICE – STUDIU CU ADMINISTRARE ÎN MOD REPETAT PE O DURATĂ DE 28 DE ZILE
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Atunci când se face evaluarea efectelor toxice ale unor substanţe, este important să se studieze capacitatea pe care o prezintă unele substanţe de a provoca anumite tipuri de neurotoxicitate pe care alte tipuri de studii nu ar putea să le evidenţieze. Unii compuşi organofosforici prezintă o neurotoxicitate întârziată şi trebuie să fie supuşi unor asemenea studii.
      Teste de depistare in vitro pot fi utilizate în vederea identificării substanţelor care ar putea provoca o polineuropatie întârziată; cu toate acestea, rezultatele negative în urma unor teste in vitro nu sunt suficiente pentru a demonstra că substanţa testată nu este neurotoxică.
      Acest test de neurotoxicitate întârziată pe o durată de 28 de zile furnizează informaţii despre eventualele riscuri pentru sănătate, ca urmare a unor expuneri repetate în cursul unei perioade determinate. Acest test furnizează informaţii asupra relaţiei doză-efect, precum şi o estimare a nivelului dozei care nu are efecte nefaste detectabile şi care poate fi utilă la stabilirea criteriilor de securitate în cazul unei expuneri.
      A se vedea, de asemenea, introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      Substanţele organofosforice includ esteri, tioesteri organofosforici neîncărcaţi sau anihidraţi ale acizilor organofosforici, organofosfonici sau organofosforamidici sau ale acizilor fosforotioci, fosfonotioci sau fosforotioamidici din aceeaşi clasă sau ale altor substanţe care pot provoca neurotoxicitatea întârziată detectabilă câteodată la substanţele din această clasă.
      Neurotoxicitatea întârziată este un sindrom asociat cu instalarea prelungită a unei ataxii întârziate, asociate cu axonopatii distale la nivelul măduvei spinării şi a nervilor periferici şi cu o inhibare şi o îmbătrânire a esterazei caracteristică neuropatiilor (neuropathy target esterase – NTE) în ţesuturile nervoase.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa testată se administrează pe cale orală, timp de 28 de zile, unor găini de casă. Animalele sunt observate cel puţin o dată zilnic, până în a 14-a zi după administrarea ultimei doze, în vederea detectării tulburărilor de comportament, a unei ataxii sau a unei paralizii. Sunt efectuate măsurări biochimice, în special pentru evidenţierea inhibării esterazei NTE, pe găinile selecţionate aleator din fiecare lot, în general la 24 şi la 48 de ore după ultima administrare. La două săptămâni după ultima administrare, găinile care au mai rămas sunt sacrificate şi se efectuează examinarea histopatologică a ţesuturilor nervoase selecţionate.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Pregătirea testului
      Găini adulte tinere, fără afecţiuni virale supuse unor tratamente care pot intra în interferenţă cu substanţa testată şi care nu prezintă tulburări ale aparatului locomotor, sunt distribuite aleator în grupuri experimentale şi în loturi martor şi sunt lăsate să se aclimatizeze la condiţiile de laborator, cel puţin cu cinci zile înaintea începerii testului.
      Cuştile sau incintele sunt destul de voluminoase pentru a permite o mişcare liberă găinilor, astfel încât mersul lor să poată fi observat uşor.
      Substanţa testată va fi administrată zilnic, şapte zile din şapte, pe cale orală, prin gavaj sau prin capsule de gelatină. Substanţele lichide pot fi administrate în mod direct sau dizolvate într-un vehicul adecvat, cum ar fi uleiul de porumb; substanţele solide trebuie dizolvate, dacă este posibil, altfel se poate întâmpla ca importante cantităţi de substanţe solide administrate în capsule de gelatină să nu fie absorbite în mod corespunzător. Dacă vehiculul este altul decât apa, caracteristicile sale toxice trebuie să fie cunoscute sau, în caz contrar, trebuie determinate înaintea începerii testului.
      1.4.2.   Condiţii de testare
      Animalele de experienţă
      Specia recomandată este găina domestică ouătoare adultă şi tânără, de o vârstă cuprinsă între 8-12 luni (Gallus gallus domesticus). Se folosesc rase şi linii pure de mărime standard; în mod normal, găinile folosite au fost crescute în condiţii care le-au permis mişcarea liberă.
      Număr şi sex
      Ca regulă generală, se lucrează cu cel puţin trei grupuri experimentale şi un lot martor căreia i se administrează doar vectorul. Grupul căreia i se administrează doar vectorul, va fi tratat la fel ca şi grupul experimental, singura excepţie constând în administrarea substanţei testate.
      Trebuie selecţionat un număr suficient de ridicat de animale în fiecare grup, astfel încât să se poată sacrifica cel puţin şase găini în vederea efectuării măsurărilor biochimice (trei la ambele prelevări) şi astfel încât să supravieţuiască cel puţin şase după perioada de observaţie de după tratament de 14 zile.
      Doze
      Dozele trebuie selecţionate ţinându-se de cont de rezultatele unui test de neurotoxicitate întârziată după expunere acută şi de orice alte informaţii disponibile cu privire la toxicitatea sau la cinetica substanţei testate. Se selecţionează doza cea mai ridicată, astfel încât aceasta să producă efecte toxice şi de preferinţă o neurotoxicitate întârziată, fără să ducă însă la moarte sau la suferinţe intense. După aceasta se definesc o serie de doze descrescătoare, astfel încât să se evidenţieze o eventuală relaţie doză-efect, precum şi o doză minimă fără niciun efect detectabil.
      Testul-limită
      Atunci când un test efectuat pe baza metodelor descrise în prezentul studiu, la o doză de cel puţin 1 000 mg/kg greutate corporală/zi, nu produce efecte toxice detectabile şi dacă informaţiile relevante despre substanţe cu structuri asemănătoare nu indică toxicitatea acestora, nu este necesară efectuarea unui studiu la o doză mai ridicată. Testul-limită este justificat, cu excepţia cazului în care condiţiile de expunere umană impun utilizarea unei doze mai ridicate.
      Perioada de observaţie
      Toate animalele sunt observate cel puţin o dată zilnic, în timpul expunerii şi în următoarele 14 zile, dacă nu este programată sacrificarea lor în vederea efectuării autopsiei.
      1.4.3.   Mod de lucru
      Substanţa testată se administrează zilnic, şapte zile din şapte, timp de 28 de zile.
      Observaţii generale
      Observaţiile încep imediat după expunere. Toate găinile sunt observate cu atenţie cel puţin o dată pe zi, în timpul celor 28 de zile de tratament şi în cursul celor 14 zile după ultima administrare sau până în data sacrificării. Sunt notate toate manifestările de toxicitate, data apariţiei, tipul, gravitatea şi durata lor. Observaţia are în vedere tulburările de comportament, dar nu trebuie să se limiteze la acestea. Ataxia va fi măsurată cu ajutorul unei scale de evaluare obişnuite cu cel puţin patru niveluri; paralizia trebuie consemnată. Cel puţin de două ori pe săptămână găinile sunt scoase din cuşti şi supuse unei activităţi locomotorii forţate, cum ar fi de exemplu urcarea pe scară, astfel încât să se faciliteze examinarea manifestării efectelor toxice uşoare. Animalele muribunde sau cele care prezintă semne de suferinţă sau dureri intense trebuie excluse imediat din studiu, eutanasiate şi supuse autopsiei.
      Greutate corporală
      Toate găinile sunt cântărite cu puţin înaintea primei administrări a substanţei, după care cel puţin o dată pe săptămână.
      Biochimie
      Şase găini selecţionate aleator din fiecare grup experimental şi din grupurile martor cărora li se administrează doar vectorul, sunt sacrificate câteva zile după ultima administrare; creierul şi măduva spinării din zona lombară se prepară şi se analizează în vederea detectării inhibării esterazei caracteristice neuropatiilor (NTE). Pe lângă aceasta, poate să fie necesară şi analiza inhibării acestei esteraze pe nervul sciatic. În general, sunt sacrificate trei găini din lotul martor şi din fiecare grup experimental, 24 de ore după ultima administrare şi alte trei, după alte 24 de ore, și anume 48 de ore după ultima administrare; dacă pe baza rezultatelor studiului prin expunere acută sau ale altor studii (studiul toxicocinetic, de exemplu) se consideră că ar fi indicată alegerea unor altor intervale de timp pentru sacrificii, acestea pot fi modificate în consecinţă cu condiţia furnizării documentelor justificative.
      Dacă este necesar, se pot efectua, de asemenea, măsurări de acetilcolinesterază (AChE) pe eşantioane. Cu toate acestea, poate avea loc in vivo o reactivare spontană a acetilcolinesterazei, fapt care ar duce la subestimarea activităţii de inhibitor de AChE a substanţei.
      Autopsia
      Autopsia tuturor animalelor (sacrificii prevăzute sau impuse de starea animalului) trebuie să includă o examinare a aspectului creierului şi a măduvei spinării.
      Examinarea histopatologică
      Ţesuturile nervoase ale tuturor animalelor care au supravieţuit după perioada de observaţie şi care nu au fost utilizate pentru măsurări biochimice, trebuie să fie supuse unui examen microscopic. Ţesuturile trebuie fixate in situ prin tehnica perfuziei. Secţiunile sunt practicate la nivelul cerebelului (pe plan longitudinal mediu), al bulbului rahidian, al măduvei spinării şi al nervilor periferici. Secţiunile la măduva spinării sunt practicate în segmentul cervical superior, în regiunea toracică medie şi în regiunea lombo-sacrală. Se vor efectua secţionări şi în partea distală a nervului tibial şi la nivelul ramurilor acestuia spre muşchii gemeni ai tricepsului, precum şi la nivelul nervului sciatic. Secţiunile sunt colorate cu ajutorul unor coloranţi adecvaţi, specifici mielinei şi axonilor. Mai întâi, examinarea histopatologică va fi efectuată asupra ţesuturilor conservate prelevate de la toate animalele din grupul experimental cărora li s-a administrat doza cea mai ridicată şi din lotul martor. Dacă există efecte detectabile la grupul căruia i s-a administrat doza cea mai ridicată, se va efectua un examen microscopic şi asupra ţesuturilor animalelor cărora li s-a administrat doza intermediară, respectiv doza cea mai scăzută.
      2.   DATE
      De regulă, dacă rezultatele obţinute pentru diferitele criterii de evaluare reţinute la această metodă (biochimice, histopatologice şi cele referitoare la comportament) sunt negative, nu mai este nevoie să se recurgă la teste de neurotoxicitate întârziată. Rezultatele ambigue sau neconcludente pot impune continuarea studiului.
      Datele sunt indicate pentru fiecare animal individual. Pe lângă aceasta, datele sunt incluse într-un tabel care va indica la fiecare grup experimental, numărul de animale prezente la începutul testului, numărul de animale care prezintă leziuni, anomalii de comportament sau modificări biochimice, tipul şi gravitatea acestor leziuni sau simptome, precum şi procentajul de animale care prezintă fiecare tip de leziuni sau simptome la diferite niveluri de gravitate.
      Rezultatele acestui studiu trebuie evaluate din punct de vedere al incidenţei lor asupra efectelor comportamentale, biochimice şi histopatologice sau asupra oricărui alt efect observat la grupurile experimentale şi cele martor sau din punct de vedere al gravităţii acestora şi al corelării dintre ele.
      Rezultatele cifrice sunt evaluate cu ajutorul unei metode statistice adecvate şi recunoscute. Metoda statistică va fi aleasă cu ocazia elaborării studiului.
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare va conţine, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  3.1. Animale de experienţă:
                  
                              —
                           
                           
                              linia pură utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul animalelor, vârsta;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              originea, condiţii de adăpostire etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea corporală a fiecărui animal la începutul testului.
                           
                        
            
                   
               
               
                  3.2. Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              detalii cu privire la prepararea substanţei testate şi la stabilitatea şi omogenitatea preparatului, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii cu privire la administrarea substanţei testate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii asupra calităţii hranei şi a apei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii dozei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              specificarea dozelor administrate, cu indicaţii detaliate cu privire la vehicul, la volumul şi la starea de agregare a substanţei administrate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dacă măsurările biochimice nu sunt efectuate la 24 şi 48 de ore după ultima administrare, justificarea alegerii intervalelor de timp practicate.
                           
                        
            
                   
               
               
                  3.3. Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              informaţii cu privire la greutatea corporală;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              informaţii cu privire la reacţia toxică pe grupuri, inclusiv mortalitatea;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nivelul dozei fără efect nefast detectat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              natura, gravitatea şi durata efectelor clinice detectate (eventual, reversibilitatea acestora);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea detaliată a metodelor şi rezultatelor biochimice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultatele autopsiei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea detaliată a tuturor rezultatelor histopatologice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              prelucrare statistică a rezultatelor, după caz.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      Această metodă corespunde Orientării 419 a OCDE.
      B.39.   TEST IN VIVO DE SINTEZĂ NEPROGRAMATĂ A ADN (UDS) PE CELULE HEPATICE DE MAMIFERE
      1.   METODĂ
      Prezenta metodă este reprodusă după Orientarea 486 a OCDE, Testul in vivo de sinteză neprogramată a ADN (UDS) pe celule hepatice de mamifere (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Scopul testului in vivo de sinteză neprogramată a ADN (UDS) pe celule hepatice de mamifere este identificarea substanţelor de testat care induc regenerarea ADN în celulele hepatice ale animalelor (1) (2) (3) (4).
      Prezentul test in vivo oferă o metodă pentru studiul efectelor genotoxice ale produselor chimice în ficat. Efectul măsurat este o indicaţie a deteriorării ADN şi a regenerării ulterioare a acestuia în celulele hepatice. Ficatul este, de obicei, principalul loc de metabolism al compuşilor absorbiţi. De aceea, este un loc corespunzător pentru determinarea in vivo a degradării ADN.
      Dacă există dovezi că substanţa de testat nu ajunge la ţesutul ţintă, nu este indicată utilizarea prezentului test.
      Sinteza neprogramată a ADN (UDS) se determină prin încorporarea nucleozidelor marcate în celulele care nu suferă o sinteză programată (faza S) a ADN. Metoda utilizată cel mai frecvent constă în determinarea prin autoradiografie a timidinei marcate cu tritiu 3H-TdR) care a fost încorporată. Pentru testele in vivo, USD se preferă utilizarea ficatului de şobolan. Se pot utiliza şi alte ţesuturi, dar acestea nu constituie obiectul prezentei metode.
      Detectarea unui răspuns UDS depinde de numărul de baze din ADN excizate şi înlocuite la locul modificării. Prin urmare testul UDS este valoros în special pentru detectarea regenerării secvenţelor lungi (20-30 de baze) induse de substanţă. Spre deosebire de acestea, pentru detectarea regenerării secvenţelor scurte (1-3 baze) este necesară o sensibilitate mult mai mică. În plus, datorită nereparării, unei reparări eronate sau a unei replicări eronate a leziunilor din ADN, pot apărea fenomene mutagene. Amploarea răspunsului UDS nu oferă nicio indicaţie despre fidelitatea procesului de regenerare. În plus, este posibilă reacţia unui mutagen cu ADN, fără ca modificarea ADN rezultată să poată fi remediată printr-un proces de reparare prin excizie. În testul UDS, lipsa informaţiilor specifice privind activitatea mutagenă este compensată de sensibilitatea potenţială a acestui efect, care se poate măsura în totalitatea genomului.
      A se vedea şi introducerea generală partea B.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Celule în curs de reparare: număr net de grăunţi nucleari (NNG) mai mare decât o valoare prestabilită, ce trebuie justificată de laboratorul care realizează testul.
      
         Număr net de grăunţi nucleari (NNG): măsură cantitativă a activităţii UDS a celulelor în testele autoradiografice UDS, calculată prin scăderea numărului mediu de grăunţi citoplasmici din zonele citoplasmice echivalente nucleului (CG) din numărul de grăunţi nucleari (NG): NNG = NG – CG. NNG se calculează pentru celulele individuale, iar apoi se extrapolează pentru celulele dintr-o cultură, din culturi paralele etc.
      
         Sinteza neprogramată a ADN (UDS): sinteza reparării ADN după excizia şi eliminarea unui fragment din ADN, ce conţine o regiune deteriorată indusă de acţiunea unor substanţe chimice sau a unor agenţi fizici.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Testul in vivo UDS pe celule hepatice de mamifere indică o sinteză de reparare a ADN după excizia şi eliminarea unui fragment din ADN, ce conţine o regiune deteriorată indusă de acţiunea unor substanţe chimice sau a unor agenţi fizici. Testul se întemeiază, de obicei, pe încorporarea 3H-TdR în ADN-ul celulelor hepatice care prezintă o frecvenţă redusă de celule în faza S a ciclului celular. Încorporarea 3H-TdR se determină, de obicei, prin autoradiografie, deoarece această tehnică nu este sensibilă la interferenţa cu celulele în fază S, aşa cum este, de exemplu, numărătoarea în scintilaţie lichidă.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Pregătirea testului
      1.4.1.1.   Selectarea speciei de animale
      Se utilizează, de obicei, şobolani, deşi se poate utiliza orice specie de mamifere. Se recomandă utilizarea unor animale adulte tinere sănătoase din suşe folosite în mod curent în laborator. La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui să prezinte variaţii minime, ce nu trebuie să depăşească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex.
      1.4.1.2.   Condiţiile de adăpostire şi de hrănire
      Se aplică condiţiile generale menţionate în introducerea generală partea B, dar umiditatea atinsă ar trebui să fie de 50-60 %.
      1.4.1.3.   Pregătirea animalelor
      Animalele adulte tinere sănătoase se distribuie în mod aleatoriu în grupe martor şi grupe de tratament. Cuştile ar trebui să se aranjeze astfel încât posibilele efecte datorate amplasării acestora să fie reduse la minim. Animalele sunt identificate individual şi se ţin în cuştile lor timp de minimum cinci zile înainte de începerea studiului, pentru a permite aclimatizarea acestora la condiţiile de laborator.
      1.4.1.4.   Substanţa de testat/Preparare
      Substanţele de testat în stare solidă ar trebui să se preparare sub formă de soluţii sau suspensii în solvenţii sau vehiculele corespunzătoare şi să se dilueze, dacă este cazul, înainte de a fi administrate animalelor. Substanţele de testat lichide se pot administra direct sau dilua înainte de administrare. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanţă de testat, cu excepţia cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.
      1.4.2.   Condiţiile de testare
      1.4.2.1.   Solventul/vehiculul
      Solventul/vehiculul nu ar trebui să producă efecte toxice la dozele utilizate şi nu ar trebui să existe suspiciunea reacţiei chimice a acestuia cu substanţa de testat. Utilizarea altor solvenţi/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos.
      1.4.2.2.   Martorii
      Martorii pozitivi şi negativi (solvent/vehicul) utilizaţi în paralel ar trebui să se includă în fiecare parte a experimentului, realizată independent. Cu excepţia tratamentului cu substanţa de testat, manipularea animalelor din grupele martor ar trebui să fie identică cu cea a animalelor din grupele tratate.
      Martorii pozitivi ar trebui să fie substanţe despre care se ştie că produc UDS atunci când se administrează în doze de expunere estimate a genera o creştere detectabilă în raport cu fondul. Martorii pozitivi care necesită o activare metabolică ar trebui să se utilizeze în doze care provoacă un răspuns moderat (4). Dozele se pot alege astfel încât să se obţină efecte clare, dar fără să releve imediat examinatorului identitatea lamelelor codificate. În tabelul următor se prezintă exemple de substanţe care se pot utiliza ca martori pozitivi:
      
                  Momentele de prelevare a probelor
               
               
                  Substanţa
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. EINECS
               
            
                  Primele prelevări (2-4 ore)
               
               
                  N-nitrozodimetilamină
               
               
                  62-75-9
               
               
                  200-249-8
               
            
                  Ultimele prelevări (12-16 ore)
               
               
                  N-2-fluorenilacetamidă (2-AAF)
               
               
                  53-96-3
               
               
                  200-188-6
               
            Se pot utiliza şi alte substanţe corespunzătoare ca martori pozitivi. Martorul pozitiv ar trebui să se administreze pe o cale diferită de cea pentru substanţa de testat.
      1.5.   MOD DE LUCRU
      1.5.1.   Numărul şi sexul animalelor
      Ar trebui să se utilizeze un număr suficient de animale pentru a ţine seama de variaţia răspunsului testului în funcţie de natura biologică. Ar trebui să se utilizeze un număr de minimum trei animale analizabile din fiecare grupă. Dacă în momentul studiului există date acumulate din experimentele anterioare, sunt necesare doar unul sau două animale pentru grupele de martorii pozitivi şi negativi analizate în paralel.
      Dacă în momentul studiului există date disponibile din studii pe aceleaşi specii, în care s-a folosit aceeaşi cale de expunere, care să demonstreze lipsa unor diferenţe substanţiale de toxicitate între sexe, atunci va fi suficientă testarea pe animale de un singur sex, de preferinţă de sex masculin. Dacă expunerea umană la produse chimice este specifică sexului, ca în cazul unor produse farmaceutice, testul ar trebui să se realizeze pe animale de sexul corespunzător.
      1.5.2.   Modalitatea de tratare
      Substanţele se administrează în general într-o singură repriză.
      1.5.3.   Dozele
      În mod normal, se utilizează minimum două doze diferite. Doza maximă se defineşte ca doza ce produce astfel de semne de toxicitate, încât dozele mai mari, administrate în acelaşi mod, se estimează că sunt letale. În general, doza mai mică trebuie să fie egală cu 50 % până la 25 % din doza mare.
      Substanţele cu activitate biologică specifică la doze mici netoxice (ca hormonii şi mitogenii) pot să facă excepţie de la criteriile de stabilire a dozelor şi ar trebui evaluate pentru fiecare caz în parte. Dacă, în lipsa datelor corespunzătoare, se realizează un studiu pentru stabilirea dozelor, acesta ar trebui să se realizeze în acelaşi laborator şi să utilizeze aceeaşi specie, aceeaşi suşă de animale de acelaşi sex şi regimul de tratare să fie acelaşi ca cel ce urmează să fie utilizat în studiul principal.
      Doza maximă se mai poate defini ca doza care produce anumite semne de toxicitate în ficat (de exemplu nuclee picnotice).
      1.5.4.   Testul-limită
      Dacă un test realizat cu o doză de minimum 2 000 mg/kg greutate corporală, administrată într-o singură repriză sau în două reprize în aceeaşi zi, nu produce efecte toxice detectabile şi dacă o genotoxicitate este improbabilă pe baza datelor referitoare la substanţe cu o structură apropiată, se poate considera că un studiu complet nu este necesar. În funcţie de expunerea umană preconizată, ar putea fi necesară o doză mai mare în testul limită.
      1.5.5.   Administrarea dozelor
      Substanţa de testat se administrează, de obicei, prin cavitatea nazală cu ajutorul unui tub stomacal sau a unei canule de intubaţie adaptate. Se pot accepta şi alte căi de administrare, dacă se pot justifica. Cu toate acestea, calea intraperitoneală nu se recomandă, deoarece probabilitatea de expunere a ficatului este mai mare decât la administrarea prin intermediul sistemului circulator. Volumul maxim de lichid care se poate administra prin sondă gastrică introdusă prin cavitatea nazală sau prin injecţie într-o singură repriză depinde de dimensiunea animalului de laborator. Volumul ar trebui să fie mai mic sau egal cu 2 ml/100 g greutate corporală. Utilizarea unor volume mai mari decât cel menţionat ar trebui să se justifice. Cu excepţia substanţelor iritante şi corozive, care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentraţii mai mari, variaţia volumului testat ar trebui să fie redusă la minim prin ajustarea concentraţiei, astfel încât să se asigure un volum constant pentru toate dozele.
      1.5.6.   Prepararea celulelor hepatice
      Prelevarea celulelor hepatice de la animalele tratate se realizează, de obicei, după 12-16 ore de la administrarea dozei. În general, mai este necesară o prelevare (de obicei, după 2-4 ore de la tratament), cu excepţia cazului în care există un răspuns pozitiv net după 12-16 ore. Cu toate acestea, se pot utiliza şi alte momente de prelevare, dacă datele toxicokinetice justifică acest lucru.
      Culturile pe termen scurt de celule hepatice de mamifere se realizează, de obicei, perfuzând ficatul in situ cu colagenază şi lăsând celulele hepatice proaspăt disociate să se fixeze pe o suprafaţă corespunzătoare. Celulele hepatice de la animale martori negativi ar trebui să aibă o viabilitate (5) de minimum 50 %.
      1.5.7.   Determinarea UDS
      Celulele hepatice proaspăt izolate se supun în general incubării într-un mediu, ce conţine 3H-TdR, pentru o perioadă de timp corespunzătoare, de exemplu 3-8 ore. La încheierea perioadei de incubare, ar trebui ca mediul să fie îndepărtat de pe celule, care pot să fie incubate apoi într-un mediu ce conţine timidină nemarcată în exces, pentru diminuarea radioactivităţii neîncorporate („cold chase”). Celulele sunt apoi spălate, fixate şi uscate. Pentru perioade de incubare mai lungi, s-ar putea ca procedeul „cold chase” să nu fie necesar. Lamelele sunt imersate în soluţie autoradiografică, păstrate la întuneric (de exemplu refrigerate timp de 7-14 zile), developate, colorate şi apoi se procedează la numărarea grăunţilor de argint expuşi. Pentru fiecare animal se pregătesc două până la trei lamele.
      1.5.8.   Analiza
      Preparatele depuse pe lamele ar trebui să conţină un număr suficient de celule cu o morfologie normală, pentru a permite o evaluare semnificativă a UDS. Preparatele se examinează la microscop pentru identificarea semnelor de citotoxicitate evidentă (de exemplu picnoză, diminuarea nivelului de marcaj radioactiv).
      Se recomandă codificarea lamelelor înainte de numărătoarea grăunţilor. În general, pentru fiecare animal se identifică 100 de celule pe minimum două lamele; numărătoarea unui număr de celule mai mic de 100 pentru fiecare animal ar trebui justificată. Numărul de grăunţi nu se determină pentru nucleele în fază S, dar se poate înregistra proporţia de celule în faza S.
      Cantitatea de 3H-TdR încorporată în nuclee şi citoplasma celulelor normale din punct de vedere morfologic, puse în evidenţă prin depunerea de grăunţi de argint, ar trebui să se determine prin metode corespunzătoare.
      Numărul grăunţilor se determină pe baza nucleelor (grăunţi nucleari, NG), iar zonele echivalente nucleului se determină pe baza citoplasmei (grăunţi citoplasmici, CG). Numărul CG se obţine măsurând fie zona cea mai marcată a citoplasmei, fie media a două sau trei numărători de grăunţi citoplasmici adiacenţi nucleului. Se pot folosi şi alte metode de numărare (de exemplu numărarea celulelor complete), în măsura în care acestea pot fi justificate (6).
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Ar trebui să se prezinte date pentru fiecare lamelă şi pentru fiecare animal. În plus, toate datele ar trebui să se prezinte sub formă de tabel. Numărul net de grăunţi nucleari (NNG) ar trebui să se calculeze pentru fiecare celulă, pentru fiecare animal şi pentru fiecare doză şi moment de prelevare prin scăderea numărului CG din numărul NG. Dacă se face numărătoarea „celulelor în curs de reparare”, ar trebui să se justifice criteriile folosite la definirea „celulelor în curs de reparare”, care ar trebui să se întemeieze pe datele obţinute din experimentele anterioare sau pe datele obţinute pe martori negativi testaţi în paralel. Pentru evaluarea rezultatelor numerice se pot utiliza metode statistice. În acest caz, ar trebui, înaintea realizării studiului, să se selecteze şi să se justifice testele statistice.
      2.2.   EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Exemplele de criterii de răspunsuri pozitive/negative includ:
      
                  pozitiv
               
               
                  (i)
               
               
                  valori ale NNG mai mari de o valoare-prag stabilită, care se justifică prin datele obţinute în laborator în experimente anterioare; sau
               
            
                   
               
               
                  (ii)
               
               
                  valori ale NNG cu mult mai mari decât cele pentru martorul analizat în paralel;
               
            
                  negativ
               
               
                  (i)
               
               
                  valori ale NNG egale cu/mai mici decât valoarea-prag pentru martor, rezultată din experimente anterioare; sau
               
            
                   
               
               
                  (ii)
               
               
                  valori ale NNG care nu sunt cu mult mai mari decât cele pentru martorul analizat în paralel.
               
            Ar trebui să se aibă în vedere relevanţa biologică a rezultatelor, și anume ar trebui să se ţină seama de parametri ca variaţia între animale, relaţia doză-răspuns şi citotoxicitatea. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge şi la ajutorul unor metode statistice. Semnificaţia statistică nu ar trebui să fie totuşi singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv.
      Deşi majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în anumite cazuri rare, datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanţei de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de repetări ale experimentului.
      Un rezultat pozitiv al unui test UDS in vivo pe celule hepatice de mamifere indică faptul că substanţa de testat produce leziuni in vivo ale ADN din celulele hepatice ale mamiferelor, care se pot remedia prin sinteza neprogramată a ADN in vitro. Un rezultat negativ indică faptul că, în condiţiile de testare, substanţa de testat nu produce o deteriorare a ADN care să se poată detecta prin prezentul test.
      Ar trebui să se discute probabilitatea ca substanţa de testat să ajungă în circulaţia generală sau la ţesutul ţintă (de exemplu toxicitatea sistemică).
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Solventul/vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea şi stabilitatea substanţei de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaşte.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animalele de laborator:
                  
                              —
                           
                           
                              specia/suşa utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul, vârsta şi sexul animalelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursa, condiţiile de adăpost, regimul alimentar etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul de greutate, greutatea medie şi deviaţia standard pentru fiecare grupă.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              martorii pozitivi şi negativi vehicul/solvent;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dacă s-a realizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii dozelor utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind modalitatea de administrare selectată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea căii de administrare alese;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metode de verificare pentru a constata dacă substanţa de testat a ajuns în circulaţia generală sau în ţesutul ţintă, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conversia concentraţiei substanţei de testat (ppm) în hrană/apa de băut în doza reală (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei şi a apei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea amănunţită a modalităţilor de tratare şi de prelevare a probelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de măsurare a toxicităţii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metoda de preparare şi de cultură a celulelor hepatice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metoda autoradiografică utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de lamele preparate şi numărul de celule numărate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile de evaluare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              valorile medii ale numărului de grăunţi nucleari, grăunţi citoplasmatici şi ale numărului net de grăunţi nucleari pentru fiecare lamelă, fiecare animal şi fiecare grupă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relaţia doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              evaluarea statistică, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi studiaţi în paralel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele anterioare privind martorii negativi (solvent/vehicul) şi pozitivi, cu domeniile, valorile medii şi deviaţiile standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule „în curs de reparare”, dacă s-a determinat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule în faza S, dacă s-a determinat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              viabilitatea celulelor.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. (1985), An Assessment of the In Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1-18.
               
            
                  2.
               
               
                  Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst G. and Williams, G. (1987), A Protocol and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay, Mutation Res., 189, pp. 123-133.
               
            
                  3.
               
               
                  Kennelly, J. C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell I. de G. (1993), In Vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M., (eds.), Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing Report. Part II revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 52-77.
               
            
                  4.
               
               
                  Madle, S., Dean, S. W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, B., Doolittle, D. J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C. A. and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests In Vitro and In Vivo, Mutations Res., 312, pp. 263-285.
               
            
                  5.
               
               
                  Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initital Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS), Mutation Res., 291, pp. 21-27.
               
            
                  6.
               
               
                  Mirsalis, J. C., Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), Detection of Genotoxic Carcinogens in the In Vivo/In Vitro Hepatocyte DNA Repair Assay, Environ Mutagen, 4, pp. 553-562.
               
            B.40.   COROZIUNEA CUTANATĂ IN VITRO: TESTUL REZISTENŢEI ELECTRICE TRANSCUTANATE (RET)
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 430 (2004) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Coroziunea cutanată se referă la producerea unei vătămări ireversibile a ţesuturilor pielii ca urmare a aplicării unei substanţe de testare [definită de Sistemul global armonizat de clasificare şi etichetare a substanţelor şi amestecurilor chimice (GHS)] (1). Această metodă prevede o procedură de evaluare a corozivităţii care nu se efectuează pe animale vii.
      Evaluarea corozivităţii cutanate a implicat în mod obişnuit utilizarea animalelor de laborator (2). Preocuparea pentru durerea şi suferinţa pe care această metodă le implică s-a concretizat în revizuirea metodei de testare B.4 care permite determinarea nivelului de coroziune cutanată utilizând metode alternative, in vitro, prin care se evită provocarea durerii şi suferinţei animalelor.
      O primă etapă către definirea unor teste alternative care ar putea fi folosite pentru testarea corozivităţii cutanate în vederea reglementării acestora a constat în efectuarea de studii de pre-validare (3). Ca urmare, s-a realizat (6) (7) (8) un studiu precis de validare a metodelor in vitro pentru determinarea coroziunii cutanate (4) (5). Rezultatele acestor studii şi al literaturii de specialitate publicate au arătat că următoarele teste ar putea fi folosite pentru evaluarea in vivo a corozivităţii cutanate (9) (10) (11): testarea pe un model de piele umană (a se vedea metoda de testare B.40 bis) şi testul rezistenţei electrice transcutanate (prezenta metodă).
      Într-un studiu de validare şi în alte studii publicate s-a menţionat că testul rezistenţei electrice transcutanate (RET) efectuat pe o piele de şobolan (12) (13) poate face distincţia, într-o manieră fiabilă, între substanţele corozive şi necorozive pentru piele cunoscute (5) (9).
      Testul descris în această metodă permite identificarea amestecurilor şi a substanţelor chimice corozive. În egală măsură, acesta permite identificarea amestecurilor şi a substanţelor necorozive pe baza altor elemente de determinare, folosind alte informaţii existente (de exemplu pH-ul, relaţii structură-activitate, date despre om sau/şi animal) (1) (2) (11) (14). Nu furnizează informaţii cu privire la iritarea cutanată şi nici nu face sub-clasificarea substanţelor corozive, aşa cum se procedează în Sistemul global armonizat de clasificare şi etichetare a substanţelor şi amestecurilor chimice (GHS) (1).
      Pentru o evaluare completă a efectelor cutanate locale după o singură expunere, se recomandă să se urmeze strategia de testare secvenţială anexată la metoda de testare B.4 (2) şi prevăzută în Sistemul global armonizat (1). Această strategie de testare include efectuarea de teste in vitro pentru coroziunea cutanată (aşa cum sunt descrise în prezenta metodă) şi pentru iritarea cutanată înainte de a se lua în considerare testarea pe animale vii.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Coroziune cutanată in vivo
         : producerea unei vătămări ireversibile a pielii, şi anume necroza vizibilă prin epidermă şi în dermă ca urmare a aplicării unei substanţe de testare pentru o durată de până la patru ore. Reacţiile corozive sunt caracterizate de ulceraţii, sângerări, cruste însângerate şi, la sfârşitul perioadei de observare de 14 zile, decolorare datorată albirii pielii, zone caracterizate de alopecie şi cicatrice. Pentru a evalua leziunile incerte ar trebui să se aibă în vedere efectuarea unui examen histopatologic.
      
         Rezistenţa electrică transcutanată (RET): măsură a impedanţei electrice a pielii, exprimată ca valoare a rezistenţei în kiloohmi. Este o metodă simplă şi fiabilă de evaluare a funcţiei de barieră a pielii prin înregistrarea trecerii ionilor prin piele folosind o punte Wheatstone.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Tabel 1
      Substanţe chimice de referinţă
      
                  Denumire
               
               
                  Nr. EINECS
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                   
               
            
                  1,2-Diaminopropan
               
               
                  201-155-9
               
               
                  78-90-0
               
               
                  Puternic coroziv
               
            
                  Acid acrilic
               
               
                  201-177-9
               
               
                  79-10-7
               
               
                  Puternic coroziv
               
            
                  2-terţ-butilfenol
               
               
                  201-807-2
               
               
                  88-18-6
               
               
                  Coroziv
               
            
                  Hidroxid de potasiu (10 %)
               
               
                  215-181-3
               
               
                  1310-58-3
               
               
                  Coroziv
               
            
                  Acid sulfuric (10 %)
               
               
                  231-639-5
               
               
                  7664-93-9
               
               
                  Coroziv
               
            
                  Acid octanoic (acid caprilic)
               
               
                  204-677-5
               
               
                  124-07-02
               
               
                  Coroziv
               
            
                  4-amino-1,2,4-triazol
               
               
                  209-533-5
               
               
                  584-13-4
               
               
                  Necoroziv
               
            
                  Eugenol
               
               
                  202-589-1
               
               
                  97-53-0
               
               
                  Necoroziv
               
            
                  Fenetil bromură
               
               
                  203-130-8
               
               
                  103-63-9
               
               
                  Necoroziv
               
            
                  Tetracloretilenă
               
               
                  204-825-9
               
               
                  27-18-4
               
               
                  Necoroziv
               
            
                  Acid isostearic
               
               
                  250-178-0
               
               
                  30399-84-9
               
               
                  Necoroziv
               
            
                  4-(metiltio)-benzaldehidă
               
               
                  222-365-7
               
               
                  3446-89-7
               
               
                  Necoroziv
               
            Majoritatea substanţelor chimice menţionate sunt preluate din lista substanţelor chimice selectate pentru studiul internaţional de validare ECVAM (4). Selectarea lor are la bază următoarele criterii:
      
                  (i)
               
               
                  număr egal de substanţe corozive şi necorozive;
               
            
                  (ii)
               
               
                  substanţe disponibile pe piaţă, acoperind majoritatea claselor de substanţe chimice relevante;
               
            
                  (iii)
               
               
                  includerea substanţelor puternic corozive, precum şi a celor mai puţin corozive pentru a permite diferenţierea bazată pe puterea de corodare;
               
            
                  (iv)
               
               
                  selectarea substanţelor chimice care pot fi manipulate în laborator fără expunere la alte pericole grave în afară de coroziune.
               
            1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa testului este aplicată o perioadă de până la 24 de ore pe suprafeţele epidermice ale discurilor de piele într-un sistem de testare cu două compartimente, în care discurile de piele funcţionează ca separaţie între compartimente. Discurile de piele sunt prelevate de la şobolani cu vârsta de 28-30 de zile, eutanasiaţi fără durere. Materialele corozive sunt identificate după capacitatea lor de a produce o pierdere a integrităţii normale a stratului cornos şi a funcţiei de barieră, care este măsurată ca o micşorare a RET sub nivelul de prag (12). Pentru testarea RET a pielii de şobolan a fost aleasă o valoare-limită de 5 kΏ, pe baza numeroaselor date referitoare la o gamă largă de substanţe chimice, în care marea majoritate a valorilor au fost în mod clar cu mult peste (deseori > 10 kΩ) sau cu mult sub (deseori < 3 kΩ) această valoare (12). În general, materialele care sunt necorozive pentru animale, dar sunt iritante sau neiritante, nu reduc RET sub această valoare-limită. Mai mult decât atât, utilizarea altor preparate de piele sau a altor echipamente poate modifica valoarea-limită, necesitând o validare ulterioară.
      În procedura de testare este introdusă o etapă de fixare a unui colorant pentru testarea de confirmare a rezultatelor pozitive ale RET care prezintă valori apropiate de 5 kΩ. Această etapă de fixare a unui colorant determină dacă creşterea permeabilităţii ionice are loc datorită distrugerii fizice a stratului cornos. Metoda RET, în care s-a utilizat piele de şobolan, s-a demonstrat a fi anticipativă pentru coroziunea in vivo la iepure, evaluată prin metoda de testare B.4 (2). Trebuie subliniat că testarea in vivo pe iepuri este mult mai conservatoare în ceea ce priveşte corozivitatea şi iritaţia cutanată în comparaţie cu testarea pe un eşantion de piele umană (15).
      1.5.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.5.1.   Animale
      Şobolanii sunt speciile alese deoarece sensibilitatea pielii lor la substanţele chimice utilizate pentru acest test a fost demonstrată anterior (10). Vârsta (la care pielea este prelevată) şi specia şobolanului sunt extrem de importante pentru a se asigura că foliculii piloşi sunt în stare latentă, înainte să înceapă creşterea părului adult.
      Părul dorsal şi de pe coaste al şobolanilor tineri de aproximativ 22 de zile, femele sau masculi (specia Wistar – comparabilă sau derivată), este îndepărtat cu grijă cu un cleşte mic. Apoi animalele sunt spălate prin ştergere atentă, în timp ce zona fără păr este cufundată într-o soluţie cu antibiotic (care conţine de exemplu streptomicină, penicilină, cloramfenicol şi amfotericin cu concentraţii eficiente pentru inhibarea creşterii bacteriilor). Animalele sunt spălate încă o dată cu antibiotic în a treia sau a patra zi după prima spălare şi sunt folosite în termen de trei zile după a doua spălare, atunci când stratul cornos s-a refăcut după îndepărtarea părului.
      1.5.2.   Pregătirea discurilor de piele
      Animalele sunt eutanasiate fără durere la vârsta de 28-30 de zile, această vârstă fiind deosebit de importantă. Se îndepărtează pielea dorso-laterală a fiecărui animal şi se desprinde grăsimea subcutanată în exces prin jupuirea cu grijă a acesteia de pe piele. Se prelevează discuri de piele cu un diametru de aproximativ 20 mm fiecare. Pielea poate fi păstrată înainte ca discurile să fie folosite, în cazurile în care se demonstrează că datele de control negative şi pozitive sunt echivalente cu cele obţinute cu pielea proaspătă.
      Fiecare disc de piele este aşezat peste un capăt al unui tub PTFE (politetrafluoretilenă), asigurându-se că suprafaţa epidermei se află în contact cu tubul. Peste capătul tubului se aşează prin apăsare un inel de cauciuc „O” pentru a fixa pielea, iar excesul de ţesut este tăiat. Dimensiunile tubului şi ale inelului „O” sunt prezentate în figura 2. Apoi inelul de cauciuc „O” este etanşat cu grijă la capătul tubului PTFE cu vaselină. Tubul este susţinut de o clemă elastică în interiorul unei camere recipient care conţine soluţie de MgSO4 (154 mM) (figura 1). Discul de piele trebuie scufundat în întregime în soluţia de MgSO4. Dintr-o singură piele de şobolan se pot obţine 10-15 discuri de piele.
      Înainte de începerea testării se măsoară rezistenţa electrică a două discuri de piele din fiecare piele de animal ca o procedură de control al calităţii. Ambele discuri ar trebui să aibă valorile rezistenţei mai mari de 10 kΩ pentru ca restul discurilor să poată fi folosite pentru test. Dacă valoarea rezistenţei este mai mică de 10 kΩ, discurile rămase din pielea respectivă trebuie eliminate.
      1.5.3.   Aplicarea substanţelor de testare şi de control
      Pentru fiecare studiu ar trebui efectuate controale pozitive şi negative simultane pentru a se asigura realizarea corespunzătoare a modelului experimental. Ar trebui folosite discuri de piele de la un singur animal. Substanţele de control pozitiv şi negativ propuse sunt acid clorhidric 10 M şi, respectiv, apă distilată.
      Substanţele lichide de testare (150 μl) sunt aplicate uniform pe suprafaţa epidermei din interiorul tubului. Atunci când se testează substanţe solide, pe disc se aplică o cantitate suficientă din substanţa solidă, astfel încât întreaga suprafaţă a epidermei să fie acoperită. Peste substanţa solidă se adaugă apă deionizată (150 μl), iar tubul este agitat uşor. Pentru a se obţine un contact maxim cu pielea, substanţele solide ar trebui încălzite la 30 oC pentru ca substanţele de testare să se topească sau să se înmoaie sau ar trebui să fie măcinate pentru a se obţine granule sau pulbere.
      Pentru fiecare test şi fiecare substanţă de testare se utilizează trei discuri de piele. Substanţele de testare sunt aplicate timp de 24 de ore la o temperatură 20-23 oC, apoi se îndepărtează complet prin spălare cu jet de apă de la robinet, la maximum 30 oC.
      1.5.4.   Măsurători ale RET
      Impedanţa pielii, respectiv RET, se măsoară utilizând o punte Wheatstone (13) în curent alternativ de tensiune joasă care prezintă următoarele caracteristici: tensiunea de lucru 1-3 V, curent alternativ sinusoidal sau dreptunghiular de 50-1 000 Hz şi un interval de măsurare de cel puţin 0,1-30 kΩ. Puntea folosită în studiul de validare măsoară inductanţa, capacitatea electrică şi rezistenţa până la valori de 2 000 H, 2 000 μF şi 2 MΩ la frecvenţe de 100 Hz sau 1 KHz, utilizând valori în serie sau în paralel. Măsurările testului de corozivitate RET constau în înregistrarea rezistenţei la o frecvenţă de 100 Hz utilizând valori în serie. Înainte de măsurarea rezistenţei electrice, se micşorează tensiunea suprafeţei pielii prin adăugarea unui volum suficient de etanol 70 % pentru a acoperi epiderma. După câteva secunde etanolul este îndepărtat din tub şi apoi ţesutul este hidratat prin adăugarea de 3 ml soluţie MgSO4 (154 mM). Electrozii punţii sunt aşezaţi pe ambele părţi ale discului de piele pentru a măsura rezistenţa în kΩ/disc de piele (figura 1). Dimensiunile electrozilor şi lungimea electrodului expus sub clemele-crocodil sunt prezentate în figura 2. În timpul măsurării rezistenţei, clema ataşată electrodului interior este aşezată pe partea superioară a tubului PTFE pentru a se asigura că lungimea electrodului scufundat în soluţia de MgSO4 rămâne constantă. Electrodul exterior este introdus în interiorul compartimentului receptor astfel încât să se sprijine pe fundul compartimentului. Distanţa dintre clema elastică şi fundul tubului PTFE este menţinută constantă (figura 2) deoarece această distanţă influenţează valoarea rezistenţei obţinute. Prin urmare, distanţa dintre electrodul interior şi discul de piele trebuie să fie constantă şi minimă (1-2 mm).
      Dacă valoarea rezistenţei măsurate este mai mare de 20 kΩ, acest lucru se poate datora resturilor de substanţă de testare care acoperă suprafaţa epidermică a discului de piele. Se poate încerca o îndepărtare suplimentară a acesteia, de exemplu prin etanşarea tubului PTFE cu degetul mare protejat şi agitarea acestuia timp de aproximativ 10 secunde; soluţia de MgSO4 este înlăturată şi se repetă măsurarea rezistenţei cu MgSO4 proaspăt.
      Proprietăţile şi dimensiunile aparatului de testare şi ale procedurii de testare utilizate pot influenţa valorile RET obţinute. Pe baza datelor obţinute utilizând aparatul specific şi procedura descrisă în această metodă, s-a stabilit un prag de corozivitate de 5 kΩ. Dacă se modifică condiţiile de testare sau dacă se foloseşte un alt aparat, valorile de control şi de prag pot fi diferite. Prin urmare, este necesar să se etaloneze metodologia şi valorile de prag ale rezistenţei prin testarea unei serii de substanţe de referinţă alese dintre substanţele chimice utilizate pentru studiul de validare (4) (5) sau dintre clase de substanţe chimice similare cu substanţele chimice studiate. Tabelul 1 prezintă un set de substanţe chimice de referinţă adecvate.
      1.5.5.   Metode de fixare a unui colorant
      Expunerea anumitor materiale necorozive poate duce la micşorarea rezistenţei sub limita de 5 kΩ, permiţându-se trecerea ionilor prin stratul cornos, ceea ce reduce rezistenţa electrică (5). De exemplu, substanţele chimice şi substanţele organice neutre care au proprietăţi de tensioactive (inclusiv detergenţi, emulgatori şi alţi agenţi tensioactivi) pot îndepărta lipidele pielii, făcând bariera cutanată mai permeabilă pentru ioni. Astfel, dacă în absenţa unei leziuni vizibile, valorile RET ale substanţelor de testare sunt de aproximativ 5 kΩ sau mai mici, ar trebui efectuată o evaluare a penetrării colorantului pentru ţesuturile tratate şi de control pentru a se determina dacă valorile RET obţinute rezultă dintr-o permeabilitate cutanată mărită sau dintr-o coroziune cutanată (3) (5). Dacă este vorba de o coroziune, acolo unde stratul cornos este rupt, colorantul sulforhodamină B aplicat pe suprafaţa pielii penetrează rapid şi colorează ţesutul de dedesubt Acest colorant special rămâne stabil la contactul cu o gamă largă de substanţe chimice şi nu este influenţat de procedura de extracţie descrisă mai jos.
      1.5.5.1.   Aplicarea şi îndepărtarea colorantului sulforhodamină B
      După efectuarea măsurătorilor RET, sulfatul de magneziu este îndepărtat din tub, iar pielea este examinată cu atenţie pentru a se depista deteriorări evidente. Dacă nu există nicio deteriorare majoră clară, 150 μl de substanţă diluată de 10 % (greutate/volum) în apă distilată de sulforhodamină B (Acid roşu 52; C.I. 45100; număr EINECS 222-529-8; număr CAS 3520-42-1), este aplicată pe suprafaţa epidermică a fiecărui disc de piele timp de 2 ore. Ulterior, aceste discuri de piele sunt spălate cu apă de la robinet la temperatura camerei, timp de aproximativ 10 secunde, pentru a îndepărta colorantul în exces/nefixat. Fiecare disc de piele este scos cu atenţie din tubul PTFE şi aşezat într-o fiolă (de exemplu o fiolă de sticlă cu scintilaţie de 20 ml) care conţine apă deionizată (8 ml). Fiolele sunt agitate uşor timp de 5 minute pentru a se îndepărta orice cantitate de colorant nefixat. Se repetă procedura de spălare, după care discurile de piele sunt scoase şi aşezate în fiole care conţin 5 ml de dodecilsulfat de sodiu (SDS) 30 % (greutate/volum) în apă distilată şi incubate la 60 oC în timpul nopţii.
      După incubare, fiecare disc de piele este scos şi eliminat, iar soluţia rămasă este centrifugată timp de 8 minute la 21 oC (forţa centrifugală relativă ~ 175 × g). Un eşantion de supernatant de 1 ml este diluat într-o proporţie de 1 la 5 (volum/volum) [și anume 1 ml + 4 ml] cu SDS 30 % (greutate/volum) în apă distilată. Densitatea optică (DO) a soluţiei este măsurată la 565 nm.
      1.5.5.2.   Calcularea conţinutului de colorant
      Conţinutul de colorant sulforhodamină B al fiecărui disc este calculat plecând de la valorile DO (5) (coeficient molar de extincţie al colorantului sulforhodamină B la 565 nm = 8,7 × l04; greutate moleculară = 580). Conţinutul de colorant este determinat pentru fiecare disc de piele folosind o curbă caracteristică de etalonare, iar ulterior se calculează conţinutul mediu de colorant pentru testele repetate.
      2.   DATE
      Acolo unde este necesar, valorile rezistenţei (kΩ) şi valorile conţinutului mediu de colorant (μg/disc), pentru materialul de testare, precum şi pentru controalele pozitive şi negative, ar trebui prezentate sub formă de tabel (date individuale de testare şi mediile ± DT), inclusiv date pentru mostre/teste repetate, valori medii şi individuale.
      2.1.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Valorile medii ale RET sunt acceptate cu condiţia ca valorile controalelor pozitive şi negative efectuate în paralel să se încadreze în intervalele acceptabile pentru metoda în laboratorul de testare. Pentru metodologia şi aparatele descrise mai sus, intervalele acceptabile ale rezistenţei sunt prezentate în următorul tabel:
      
                  Control
               
               
                  Substanţă
               
               
                  Interval de rezistenţă (kΩ)
               
            
                  Pozitiv
               
               
                  Acid clorhidric 10 moli
               
               
                  0,5-1,0
               
            
                  Negativ
               
               
                  Apă distilată
               
               
                  10-25
               
            Valorile medii de fixare ale colorantului sunt acceptate cu condiţia ca valorile controalelor efectuate în paralel să se încadreze în intervalele acceptabile pentru metodă. Pentru metodologia şi aparatele descrise mai sus, intervalele propuse pentru conţinutul acceptabil de colorant pentru substanţele de control sunt prezentate mai jos:
      
                  Control
               
               
                  Substanţă
               
               
                  Interval pentru conţinutul de colorant (μg/disc)
               
            
                  Pozitiv
               
               
                  Acid clorhidric 10 moli
               
               
                  40-100
               
            
                  Negativ
               
               
                  Apă distilată
               
               
                  15-35
               
            Se consideră că substanţa de testare nu este corozivă pentru piele:
      
                  (i)
               
               
                  dacă valoarea medie a RET obţinută pentru substanţa de testare este mai mare de 5 kΩ; sau
               
            
                  (ii)
               
               
                  dacă valoarea medie a RET este mai mică sau egală cu 5 kΩ; şi
                  
                              —
                           
                           
                              discul de piele nu prezintă vreo leziune evidentă; şi
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conţinutul mediu de colorant al discului este mult inferior conţinutului mediu de colorant al discului de control pozitiv (HCl 10 moli) obţinut în paralel.
                           
                        
            Se consideră că substanţa de testare este corozivă pentru piele:
      
                  (i)
               
               
                  dacă valoarea medie a RET este mai mică sau egală cu 5 kΩ şi discul de piele este evident deteriorat; sau
               
            
                  (ii)
               
               
                  dacă valoarea medie a RET este mai mică sau egală cu 5 kΩ; şi
                  
                              —
                           
                           
                              discul de piele nu prezintă vreo leziune evidentă; dar
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conţinutul mediu de colorant al discului este mai mare sau egal cu conţinutul mediu de colorant al discului de control pozitiv (HCl 10 moli) obţinut în paralel.
                           
                        
            3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să includă următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Substanţe de testare şi control:
                  
                              —
                           
                           
                              numele substanţelor chimice, precum numele IUPAC sau CAS şi număr CAS, dacă este cunoscut;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              puritatea şi compoziţia substanţei sau a preparatului [în procent(e) pe greutate] şi starea fizică;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              proprietăţi fizico-chimice relevante pentru efectuarea studiului, precum starea fizică, pH-ul, stabilitatea, solubilitatea în apă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tratamentul aplicat substanţelor de testare/control înainte de testare, după caz (de exemplu încălzire, măcinare);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              stabilitate, dacă este cunoscută.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animale testate:
                  
                              —
                           
                           
                              specia şi sexul animalului utilizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vârsta animalelor în momentul prelevării pielii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursa, condiţiile de viaţă, dieta etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind pregătirea pielii.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              curbe de etalonare pentru aparatele de testare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              curbe de etalonare pentru desfăşurarea testului cu fixarea colorantului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii ale procedurii de testare utilizate pentru măsurările RET;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii ale procedurii de testare utilizate pentru evaluarea fixării colorantului, după caz;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea oricărei modificări a procedurilor de testare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea criteriilor de evaluare utilizate.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              prezentarea sub formă de tabel a datelor obţinute în urma testării RET şi testului de fixare a colorantului (după caz) pentru fiecare animal şi fiecare mostră de piele;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea tuturor efectelor observate.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OCDE (2001) Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OCDE Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.OCDE.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
               
            
                  2.
               
               
                  Metoda de testare B.4. Toxicitate acută: iritaţie/coroziune dermică.
               
            
                  3.
               
               
                  Botham, P. A., Chamberlain, M., Barratt, M. D., Curren, R. D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219-255.
               
            
                  4.
               
               
                  Barratt, M. D., Brantom, P. G., Fentem, J. H., Gerner, I., Walker, A. P., and Worth, A. P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12, 471-482.
               
            
                  5.
               
               
                  Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxic. in Vitro 12, 483-524.
               
            
                  6.
               
               
                  OCDE (1996). Final Report of the OCDE Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, 62pp.
               
            
                  7.
               
               
                  Balls, M., Blaauboer, B. J., Fentem. J. H., Bruner. L., Combes, R. D., Ekwall, B., Fielder. R. J., Guillouzo, A., Lewis, R. W., Lovell, D. P., Reinhardt, C. A., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. The report and recommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
               
            
                  8.
               
               
                  ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
               
            
                  9.
               
               
                  ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.
               
            
                  10.
               
               
                  ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
               
            
                  11.
               
               
                  OCDE (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st–2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March 2002, OCDE ENV/EHS, available upon request from the Secretariat
               
            
                  12.
               
               
                  Oliver, G. J. A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An in vitro skin corrosivity test -modification sand validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.
               
            
                  13.
               
               
                  Botham, P. A., Hall, T. J., Dennett, R., McCall, J. C., Basketter, D. A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D. J., and Gardner, J. (1992). The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial. Toxic. in Vitro 6, 191-194.
               
            
                  14.
               
               
                  Worth A. P., Fentem J. H., Balls M., Botham P. A., Curren R. D., Earl L. K., Esdaile D. J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OCDE Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709-720.
               
            
                  15.
               
               
                  Basketter, D. A., Chamberlain, M., Griffiths, H. A., Rowson, M., Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845-852.
               
            
                  16.
               
               
                  Oliver G. J. A., Pemberton M. A. and Rhodes C. (1988). An In Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial Validation. Toxic. in Vitro. 2, 7-17.
               
            Figura 1
      Aparatura pentru testarea RET pe pielea de şobolan
      
         
      Figura 2
      Dimensiunile tubului de politetrafluoretilenă (PFTE) şi a tuburilor receptoare şi a electrozilor utilizaţi
      
         
      
         Factori importanţi ai aparatului prezentat mai sus:
      
      
                  —
               
               
                  diametrul interior al tubului PFTE;
               
            
                  —
               
               
                  lungimea electrozilor în raport cu tubul PFTE şi tubul receptor, astfel încât discul de piele să nu fie atins de electrozi, iar lungimea standard a electrodului să fie în contact cu soluţia de MgSO4;
               
            
                  —
               
               
                  cantitatea de soluţie de MgSO4 din tubul receptor trebuie să fie suficientă pentru ca adâncimea lichidului, în raport cu nivelul din tubul PFTE, să fie astfel cum se indică în figura 1;
               
            
                  —
               
               
                  discul de piele ar trebui fixat de tubul PFTE suficient de bine, astfel încât rezistenţa electrică să fie o măsură reală a proprietăţilor pielii.
               
            B.40 BIS.   COROZIUNEA CUTANATĂ IN VITRO: TESTARE PE UN MODEL DE PIELE UMANĂ
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 431 (2004) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Coroziunea cutanată se referă la producerea unei vătămări ireversibile a ţesuturilor pielii în urma aplicării unei substanţe de testare [definită de Sistemul global armonizat de clasificare şi etichetare a substanţelor şi amestecurilor chimice (GHS)] (1). Această metodă de testare prevede o procedură de evaluare a corozivităţii cutanate care nu se efectuează pe animale vii sau piele animală.
      Evaluarea corozivităţii cutanate implică în mod obişnuit utilizarea animalelor de laborator (2). Preocuparea pentru durerea şi suferinţa pe care această metodă le implică s-a concretizat în revizuirea metodei de testare B.4 care permite determinarea nivelului de coroziune cutanată utilizând metode alternative, in vitro, prin care se evită provocarea durerii şi suferinţei animalelor.
      O primă etapă către definirea unor teste alternative, care ar putea fi utilizate pentru testarea corozivităţii cutanate în vederea reglementării acestora, a constat în efectuarea de studii de prevalidare (3). În urma acestora, s-a efectuat un studiu formal de validare (6) (7) (8) a metodelor in vitro pentru evaluarea coroziunii pielii (4) (5). Rezultatele acestor studii şi al literaturii de specialitate publicate (9) au arătat că testele următoare ar putea fi utilizate pentru evaluarea in vivo a corozivităţii cutanate (10) (11) (12) (13): testarea pe un model de piele umană (prezenta metodă) şi testul rezistenţei electrice transcutanate (metoda de testare B.40).
      Studiile de validare au arătat că testele care implică folosirea modelelor de piele umană (3) (4) (5) (9) pot face distincţia, într-o manieră fiabilă, între substanţele corozive şi necorozive pentru piele cunoscute. Protocolul de testare poate furniza, de asemenea, un indicator pentru distincţia între substanţele puternic corozive şi substanţele mai puţin corozive.
      Testul descris în prezenta metodă permite identificarea substanţelor şi amestecurilor chimice corozive. În egală măsură, acesta permite identificarea substanţelor şi amestecurilor necorozive pe baza unor alte elemente de determinare, folosind alte informaţii existente (de exemplu pH-ul, relaţii structură-activitate, date despre om şi/sau animal) (1) (2) (13) (14). În mod normal nu furnizează informaţii cu privire la iritaţiile cutanate şi nici nu permite subclasificarea substanţelor corozive conform Sistemului global armonizat de clasificare (GHS) (1).
      Pentru o evaluare completă a efectelor cutanate locale după o singură expunere, se recomandă strategia de testare secvenţială anexată la metoda de testare B.4 (2) şi prevăzută în Sistemul global armonizat de clasificare (GHS) (1). Această strategie de testare include efectuarea de teste in vitro pentru coroziunea cutanată (aşa cum sunt descrise în prezenta metodă) şi pentru iritarea cutanată, înainte de a se lua în considerare testarea pe animale vii.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Coroziune cutanată
         
            in vivo
         : producerea unei vătămări ireversibile a pielii, şi anume necroza vizibilă prin epidermă şi în dermă, ca urmare a aplicării unei substanţe de testare pentru o durată de până la patru ore. Reacţiile corozive sunt caracterizate de ulceraţii, sângerări, cruste însângerate şi, la sfârşitul perioadei de observare de 14 zile, decolorare datorată albirii pielii, zone caracterizate de alopecie şi cicatrice. Pentru evaluarea leziunilor incerte ar trebui să se aibă în vedere efectuarea unui examen histopatologic.
      
         Viabilitate celulară: parametru care măsoară activitatea unei populaţii celulare (de exemplu capacitatea dehidrogenazei mitocondrale celulare de a reduce colorantul vital MTT), care, în funcţie de efectul măsurat şi de tipul testului utilizat, se corelează cu numărul total şi/sau vitalitatea celulelor.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Tabel 1
      Substanţe chimice de referinţă
      
                  Denumire
               
               
                  Nr. EINECS
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                   
               
            
                  1,2-Diaminopropan
               
               
                  201-155-9
               
               
                  78-90-0
               
               
                  Puternic coroziv
               
            
                  Acid acrilic
               
               
                  201-177-9
               
               
                  79-10-7
               
               
                  Puternic coroziv
               
            
                  2-terţ-butilfenol
               
               
                  201-807-2
               
               
                  88-18-6
               
               
                  Coroziv
               
            
                  Hidroxid de potasiu (10 %)
               
               
                  215-181-3
               
               
                  1310-58-3
               
               
                  Coroziv
               
            
                  Acid sulfuric (10 %)
               
               
                  231-639-5
               
               
                  7664-93-9
               
               
                  Coroziv
               
            
                  Acid octanoic (acid caprilic)
               
               
                  204-677-5
               
               
                  124-07-02
               
               
                  Coroziv
               
            
                  4-Amino-1,2,4-triazol
               
               
                  209-533-5
               
               
                  584-13-4
               
               
                  Necoroziv
               
            
                  Eugenol
               
               
                  202-589-1
               
               
                  97-53-0
               
               
                  Necoroziv
               
            
                  Fenetil bromură
               
               
                  203-130-8
               
               
                  103-63-9
               
               
                  Necoroziv
               
            
                  Tetracloretilenă
               
               
                  204-825-9
               
               
                  27-18-4
               
               
                  Necoroziv
               
            
                  Acid isostearic
               
               
                  250-178-0
               
               
                  30399-84-9
               
               
                  Necoroziv
               
            
                  4-(metiltio)-benzaldehidă
               
               
                  222-365-7
               
               
                  3446-89-7
               
               
                  Necoroziv
               
            Majoritatea substanţelor chimice menţionate sunt preluate din lista substanţelor chimice selectate pentru studiul internaţional de validare ECVAM (4). Selectarea lor se bazează pe următoarele criterii:
      
                  (i)
               
               
                  număr egal de substanţe corozive şi necorozive;
               
            
                  (ii)
               
               
                  substanţe disponibile pe piaţă, acoperind majoritatea claselor de substanţe chimice relevante;
               
            
                  (iii)
               
               
                  includerea substanţelor puternic corozive, precum şi a celor mai puţin corozive pentru a permite diferenţierea bazată pe potenţialul coroziv;
               
            
                  (iv)
               
               
                  selectarea substanţelor care pot fi manipulate în laborator fără expunere la alte pericole grave în afară de coroziune.
               
            1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Materialul de testare se aplică local pe un model tridimensional de piele umană, conţinând cel puţin epidermă reconstruită cu un strat cornos funcţional. Materialele corozive sunt identificate în funcţie de capacitatea de a produce scăderea viabilităţii celulare [determinată, de exemplu, prin metoda de reducere MTT (15)] sub nivelele definite pentru perioadele de expunere specificate. Principiul testului pe piele umană se bazează pe ipoteza că substanţele chimice corozive sunt capabile să penetreze stratul cornos prin difuziune sau eroziune şi sunt citotoxice până la nivelul epidermei inferioare.
      1.4.1.   Procedura
      1.4.1.1.   Modele de piele umană
      Modelele din piele umană pot fi construite sau obţinute pe cale comercială (de exemplu modelele EpiDermTM şi EPISKINTM) (16) (17) (18) (19) sau pot fi dezvoltate sau construite în laboratorul de testare (20) (21). Se admite că utilizarea pielii umane este subiectul consideraţiilor şi condiţiilor etice la nivel naţional şi internaţional. Orice nou model ar trebui validat (cel puţin în înţelesul descris la punctul 1.4.1.1.2). Modelele de piele umană utilizate pentru acest test trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
      1.4.1.1.1.   Condiţii generale ale modelului
      
      Pentru construcţia epiteliului trebuie utilizate cheratinocite umane. Sub stratul cornos funcţional trebuie incluse mai multe straturi de celule epiteliale viabile. Modelul de piele poate avea, de asemenea, un strat component stromal. Startul cornos ar trebui să fie multistratificat, cu profilul lipidic necesar pentru a produce o barieră funcţională suficient de robustă care să reziste penetrării rapide a marcatorilor citotoxici. Proprietăţile de conţinut ale modelului trebuie să prevină trecerea substanţei de stratul cornos către ţesutul viabil. Trecerea substanţelor chimice de stratul cornos va determina o slabă prezentare a expunerii pielii. Modelul de piele nu trebuie să fie contaminat cu bacterii (inclusiv micoplasmă) sau ciuperci.
      1.4.1.1.2.   Condiţii funcţionale ale modelului
      
      Amplitudinea viabilităţii este cuantificată, de obicei, utilizând MTT sau alţi coloranţi vitali convertiţi metabolic. În aceste cazuri, densitatea optică (DO) a colorantului (solubilizat) extras din ţesutul negativ de control trebuie să fie de cel puţin 20 de ori mai mare decât densitatea optică a solventului extras [pentru rezumat, a se vedea (22)]. Ţesutul negativ de control trebuie să fie stabil în cultură (să furnizeze măsurători ale viabilităţii similare) pentru durata perioadei de expunere la testare. Startul cornos trebuie să fie suficient de robust pentru a rezista la penetrarea rapidă a anumitor marcatori citotoxici chimici (ex. 1 % Triton X-100). Această proprietate poate fi estimată prin timpul de expunere necesar pentru a reduce viabilitatea celulei cu 50 % (ET50) (de exemplu pentru modelele EpiDermTM şi EPISKINTM acesta este > 2 ore) Ţesutul trebuie să poată fi reprodus în timp şi de preferat între laboratoare diferite. Mai mult decât atât, acesta ar trebui să fie capabil să estimeze potenţialul coroziv al substanţelor chimice de referinţă (a se vedea tabelul 1) atunci când se utilizează în cadrul protocolului de testare selectat.
      1.4.1.2.   Aplicarea testului şi a substanţelor de control
      Se folosesc două mostre de ţesut pentru fiecare tratament (perioada de expunere), incluzând controalele. În cazul substanţelor lichide, trebuie aplicată o cantitate suficientă de substanţă de testare pentru a acoperi toată suprafaţa de piele în mod uniform: trebuie utilizat un minimum de 25 μL/cm2. În cazul substanţelor solide, trebuie aplicată o cantitate suficientă de substanţă de testare, în mod egal pe toată suprafaţa şi trebuie hidratată cu apă distilată sau deionizată pentru a asigura un contact bun cu pielea. Atunci când este necesar, substanţele solide trebuie transformate în pudră înainte de aplicare. Metoda de aplicare trebuie selectată în funcţie de substanţa chimică de testare (a se vedea, de exemplu, substanţa de referinţă 5). La sfârşitul perioadei de expunere, substanţa de testare trebuie spălată cu atenţie de pe suprafaţa de piele, utilizând o soluţie-tampon adecvată sau 0,9 % NaCl.
      Pentru fiecare studiu trebuie utilizate controale pozitive sau negative concomitente pentru a asigura calitatea rezultatelor modelului experimental. Substanţele recomandate pentru controlul pozitiv sunt acidul acetic glacial sau 8N KOH. Substanţele recomandate pentru controlul negativ sunt 0,9 % NaCl sau apă.
      1.4.1.3.   Măsurători ale viabilităţii celulare
      Pentru măsurarea viabilităţii celulare trebuie folosite numai metode cantitative validate. În plus, măsurarea viabilităţii trebuie să fie compatibilă cu utilizarea pe un ţesut tridimensional. Fixarea nespecifică a colorantului nu trebuie să interfereze cu măsurarea viabilităţii. De asemenea, nu sunt adecvaţi coloranţii care se fixează prin utilizarea unei proteine şi aceia care nu sunt supuşi unei conversii metabolice (de exemplu roşul neutru). Produsul cel mai frecvent utilizat este MTT [bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazoliu, tiazolil albastru: nr. EINECS 206-069-5, nr. CAS 298-93-1)], care a demonstrat rezultate clare şi reproductibile (5), dar se pot utiliza şi alte produse. Mostra de piele este introdusă într-o soluţie MTT de concentraţie potrivită (de exemplu 0,3-1 mg/ml) la o temperatură de incubaţie adecvată, timp de 3 ore. Precipitatul de formazan albastru este apoi extras utilizând un solvent (izopropanol) şi concentraţia acestuia se măsoară determinând densitatea optică la o lungime de undă cuprinsă între 540 şi 595 nm.
      Acţiunea chimică a substanţei de testare asupra colorantului vital poate imita acţiunea metabolismului celular, determinând o falsă estimare a viabilităţii. S-a demonstrat că acest fenomen apare atunci când substanţa de testare nu este complet eliminată prin spălare de pe suprafaţa pielii (9). Dacă substanţa de testare acţionează direct asupra colorantului, trebuie efectuate controale suplimentare pentru a detecta şi corecta interferenţele substanţei de testare cu măsurarea viabilităţii (9) (23).
      2.   DATE
      Pentru fiecare ţesut, trebuie raportate sub formă de tabel valorile densităţii optice şi procentele calculate ale viabilităţii celulare pentru substanţa de testare, precum și controalele negative şi pozitive, inclusiv datele obţinute din testele repetate, valorile medii şi individuale.
      2.1.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Valorile densităţii optice obţinute pentru fiecare mostră pot fi utilizate pentru a calcula un procent de viabilitate relativ la controlul negativ, care este stabilit, în mod arbitrar, la 100 %. Este necesar să se definească în mod clar şi documentat, precum şi să se demonstreze, caracterul compatibil al valorii prag a procentului de viabilitate celulară care diferenţiază substanţele corozive de cele necorozive (sau diferenţiază diferitele clase de substanţe corozive) sau al procedurii (procedurilor) statistice utilizate pentru evaluarea rezultatelor şi identificarea materialelor corozive. În general, aceste valori sunt stabilite în timpul etapei de optimizare a testării, controlate în faza de prevalidare şi confirmate într-un studiu de validare. De exemplu, evaluarea coroziunii asociate cu modelul EpiDermTM este (9):
      Substanţa testată este considerată corozivă în contact cu pielea:
      
                  (i)
               
               
                  dacă viabilitatea este mai mică de 50 % după 3 minute de expunere; sau
               
            
                  (ii)
               
               
                  dacă viabilitatea este mai mare sau egală cu 50 % după 3 minute de expunere, respectiv mai mică de 15 % după 1 oră de expunere.
               
            Substanţa testată este considerată necorozivă în contact cu pielea:
      
                  (i)
               
               
                  dacă viabilitatea este mai mare sau egală cu 50 % după 3 minute de expunere, respectiv mai mare sau egală de 15 % după 1 oră de expunere.
               
            3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să includă următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Substanţe testate şi de control:
                  
                              —
                           
                           
                              denumire chimică, precum denumirea IUPAC sau CAS şi numărul CAS, dacă se cunosc;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              puritatea şi compoziţia substanţei sau a preparatului [în procent(e) per greutate];
                           
                        
                              —
                           
                           
                              proprietăţi fizico-chimice, precum starea fizică, pH-ul, stabilitatea, hidrosolubilitatea, utile pentru efectuarea studiului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tratamentul substanţelor testate/de control înainte de efectuarea testului, după caz (de exemplu încălzire, măcinare);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              stabilitate, dacă este cunoscută.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Justificarea modelului de piele şi a protocolului utilizat.
               
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare
                  
                              —
                           
                           
                              sistem celular utilizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              informaţii de calibrare pentru instrumentul de măsurare a viabilităţii celulare (de exemplu spectrofotometru);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              informaţii complete privind modelul de piele utilizat, inclusiv validitatea acestuia;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii cu privire la procedura de testare utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dozaje utilizate în testare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea oricărei modificări a procedurii de testare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              referinţe la istoricul modelului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea criteriilor de evaluare folosite.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              prezentarea sub formă de tabel a rezultatelor obţinute cu fiecare mostră de testare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea altor efecte observate.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzie.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OCDE (2001) Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OCDE Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.OCDE.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
               
            
                  2.
               
               
                  Metoda de testare B.4. Toxicitate acută: iritaţie/coroziune dermică.
               
            
                  3.
               
               
                  Botham, P. A., Chamberlain, M., Barratt, M. D., Curren, R. D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219-255.
               
            
                  4.
               
               
                  Barratt, M. D., Brantom, P. G., Fentem, J. H., Gerner, I., Walker, A. P., and Worth, A. P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro 12, 471-482.
               
            
                  5.
               
               
                  Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxic. In Vitro 12, 483-524.
               
            
                  6.
               
               
                  OCDE (1996). Final Report of the OCDE Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, 62pp.
               
            
                  7.
               
               
                  Balls, M., Blaauboer, B. J., Fentem, J. H., Bruner, L., Combes, R. D., Ekwall, B., Fielder, R. J., Guillouzo, A., Lewis, R. W., Lovell, D. P., Reinhardt, C. A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. Test report and recommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
               
            
                  8.
               
               
                  ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
               
            
                  9.
               
               
                  Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, P., Wilkins, S., McPherson, J. P., Wiemann, C., Kaufmann, T., Remmele, M. and Holzhutter, H. G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp.371-401.
               
            
                  10.
               
               
                  ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.
               
            
                  11.
               
               
                  ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365-67.
               
            
                  12.
               
               
                  ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
               
            
                  13.
               
               
                  OCDE (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st–2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March 2002, OCDE ENV/EHS, available upon request from the Secretariat
               
            
                  14.
               
               
                  Worth A. P., Fentem J. H., Balls M., Botham P. A., Curren R. D., Earl L. K., Esdaile D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OCDE Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709-720.
               
            
                  15.
               
               
                  Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity asssays. J. Immunol. Meth. 65, 55-63.
               
            
                  16.
               
               
                  Cannon, C. L., Neal, P. J., Southee, J. A., Kubilus, J., and Klausner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxic. In Vitro 8, 889-891.
               
            
                  17.
               
               
                  Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural characterization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, 211-225.
               
            
                  18.
               
               
                  Tinois E., Gaetani Q., Gayraud B., Dupont D., Rougier A., Pouradier D.X. (1994). The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxicology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 133-140
               
            
                  19.
               
               
                  Tinois E., Tiollier J., Gaucherand M., Dumas H., Tardy M., Thivolet J. (1991). In vitro and post–transplantation differentiation of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental Cell Research 193: 310-319
               
            
                  20.
               
               
                  Parentau, N. L., Bilbo, P., Molte, C. J., Mason, V. S., and Rosenberg, H. (1992). The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology 9, 163-171.
               
            
                  21.
               
               
                  Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parentau, N. L. (1994). Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengineering 43/8, 747-756.
               
            
                  22.
               
               
                  Marshall, N. J., Goodwin, C. J., Holt, S. J. (1995). A critical assessment of the use of microculture tetrazolium assays to measure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69-84.
               
            
                  23.
               
               
                  Fentem, J. H., Briggs, D., Chesne’, C., Elliot, G. R., Harbell, J. W., Heylings, J. R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J. J. M., and Botham, P. A. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation: results and evaluation by the Management Team. Toxic. InVitro 15, 57-93.
               
            B.41.   TESTUL DE FOTOTOXICITATE 3T3 NRU IN VITRO
      
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 432 (2004) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Fototoxicitatea se defineşte ca o reacţie toxică datorată aplicării unei substanţe pe corp, declanşată sau accentuată (şi vizibilă în cazul unor doze mici) după o expunere ulterioară la lumină sau indusă prin iradierea pielii după administrarea sistemică a unei substanţe.
      Testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro se foloseşte pentru identificarea potenţialului fototoxic al unei substanţe testate, indus de substanţa chimică după expunerea la lumină. Testul evaluează fotocitotoxicitatea prin reducerea relativă a viabilităţii celulelor expuse la substanţa respectivă în prezenţa sau în absenţa luminii. Substanţele identificate prin acest test pot fi fototoxice in vivo după aplicare sistemică şi distribuţie în piele sau după aplicare locală.
      S-au semnalat efecte fototoxice pentru multe tipuri de substanţe chimice (1) (2) (3) (4). Trăsătura comună a acestor substanţe este capacitatea de a absorbi energia luminoasă din gama luminii solare. Conform primei legi din fotochimie (legea lui Grotthaus-Draper), reacţia fotochimică necesită absorbţia unui număr suficient de cuante de lumină. Astfel, înainte de a se avea în vedere realizarea unui test biologic, se recomandă determinarea unui spectru de absorbţie UV/vizibil a produsului chimic analizat, conform liniei directoare 101 a OCDE pentru teste. În cazul în care un coeficient de extincţie/absorbţie molară este mai mic de 10 litri × mol–1 × cm–1, acel produs chimic nu deţine potenţial fotoreactiv. Nu este necesar ca un astfel de produs chimic să fie supus testului de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro sau oricărui alt test biologic destinat detectării efectelor fotochimice adverse (1) (5). A se vedea, de asemenea, apendicele 1.
      Importanţa și fiabilitatea testului de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro au fost evaluate recent (6) (7) (8) (9). S-a dovedit că testul de fototoxicitate 3T3 NRU oferă posibilitatea de a anticipa efectele fototoxicităţii acute in vivo la oameni şi animale. Testul nu este destinat să anticipeze alte efecte adverse care ar putea apărea în urma acţiunii combinate a unui produs chimic şi a luminii, precum fotogenotoxicitatea, fotoalergia şi fotocancerigenitatea şi nici nu evaluează puterea fototoxică. În plus, testul nu este conceput pentru a determina mecanismele indirecte ale fototoxicităţii, efectele metaboliţilor substanţei de testare sau efectele amestecurilor.
      În timp ce utilizarea sistemelor de metabolizare este o cerinţă generală pentru toate testele in vitro utilizate pentru estimarea potenţialului genotoxic şi cancerigen, până în prezent, în cazul fototoxicologiei, se cunosc puţine exemple în care este necesară o transformare metabolică, astfel încât substanţa chimică să acţioneze ca o fototoxină in vivo sau in vitro. Astfel, efectuarea prezentului test cu un sistem de activare metabolică nu se consideră nici necesară şi nici nu se justifică din punct de vedere ştiinţific.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Iradianţă: intensitatea luminii ultraviolete (UV) sau vizibile, incidente pe o suprafaţă, măsurată în W/m2 sau mW/cm2.
      
         Doză de lumină: cantitatea (= intensitate × timp) de lumină ultravioletă (UV) sau vizibilă, incidentă pe o suprafaţă, exprimată în jouli (= W × s) pe unitate de suprafaţă, de exemplu J/m2 sau J/cm2.
      
         Benzi de lungimi de undă a luminii UV: specificaţiile recomandate de CIE (Commission Internationale de l'Eclairage) sunt: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) şi UVC (100-280 nm). Se utilizează, de asemenea, şi alte specificaţii: limita dintre UVB şi UVA este plasată adesea la 320 nm, iar UVA se poate diviza în UV-A1 şi UV-A2, cu o limită situată la aproximativ 340 nm.
      
         Viabilitate celulară: parametru care măsoară întreaga activitate a unei populaţii celulare (de exemplu absorbţia colorantului vital roşu neutru în lizozomii celulari), care, în funcţie de efectul măsurat şi de tipul testului utilizat, se corelează cu numărul total şi/sau vitalitatea celulelor.
      
         Viabilitate celulară relativă: viabilitatea celulară exprimată în funcţie de probele solvente (negative) prelevate pe toată durata realizării testului (fie + Irr, fie – Irr), dar care nu au fost tratate cu un produs chimic.
      
         PIF (Photo-Irritation Factor) (factor de fotoiritare): factor obţinut prin compararea a două concentraţii citotoxice la fel de eficiente (IC50) ale produsului chimic testat obţinute în absenţa (– Irr) şi în prezenţa (+ Irr) unei iradieri necitotoxice cu lumină UV/vizibilă.
      
         IC
         
            50
         : concentraţia produsului chimic testat prin care viabilitatea celulară se reduce cu 50 %.
      
         MPE (Mean-Photo-Effect) (fotoefect mediu): măsură rezultată din analiza matematică a două curbe concentraţie-răspuns obţinute în absenţa (– Irr) şi în prezenţa (+ Irr) unei iradieri necitotoxice cu lumină UVA/vizibilă.
      
         Fototoxicitate: reacţie toxică acută care apare după o primă expunere a pielii la anumite produse chimice şi expunere ulterioară la lumină sau care este indusă în mod similar prin iradierea pielii după administrarea sistemică a unui produs chimic.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro se bazează pe o comparaţie a citotoxicităţii unui produs chimic atunci când este testat cu expunere sau fără expunere la o doză necitotoxică de lumină solară simulată. În prezentul test, citotoxicitatea se exprimă printr-o diminuare, în funcţie de concentraţie, a colorantului vital roşu neutru (NR) fixat (9) după 24 de ore de la tratarea cu produsul chimic testat şi iradierea acestuia (10). Colorantul roşu neutru este un cation slab care penetrează imediat membranele celulare prin nedifuziune acumulându-se intracelular în lizozomi. Modificarea suprafeţei sensibile a membranei lizozomilor duce la o fragilitate a acestora şi la alte modificări care, gradual, devin ireversibile. Aceste schimbări produse de acţiunea xenobioticelor duc la o diminuare a fixării colorantului roşu neutru. Astfel, se poate face distincţia între celulele viabile, deteriorate sau moarte, fapt ce reprezintă însăşi fundamentul acestui test.
      Celulele Balb/c 3T3 sunt păstrate în cultură timp de 24 ore pentru formarea monostraturilor. Pentru fiecare produs chimic testat, sunt preincubate două plăci cu 96 de godeuri, cu opt concentraţii diferite ale substanţei de testare, timp de 1 oră. Ulterior, una dintre cele două plăci este expusă la cea mai înaltă doză de iradiere necitotoxică, iar cealaltă placă se păstrează la întuneric. În ambele plăci, mediul de tratare este înlocuit, ulterior, cu mediul de cultură şi după alte 24 de ore de incubare, se determină viabilitatea celulară prin fixarea colorantului roşu neutru. Viabilitatea celulară este exprimată în procent de probe martor solvente netratate şi se calculează pentru fiecare concentraţie de testare. Pentru estimarea potenţialului fotoxic, se compară răspunsurile la concentraţii, obţinute în prezenţa şi absenţa iradierii, de obicei la nivelul IC50, respectiv la concentraţia care reduce viabilitatea celulară cu 50 % faţă de probele martor netratate.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Etape pregătitoare
      1.4.1.1.   Celule
      În studiul de validare s-a utilizat o linie permanentă de celule fibroblaste de şoarece – Balb/c 3T3, clona 31 – provenind fie de la ATCC (American Type Culture Collection) Manassas, VA, SUA, fie de la ECACC (European Collection of Cell Cultures) Salisbury, Wiltshire, UK şi, prin urmare se recomandă ca celulele să provină de la un depozit de celule calificat corespunzător. Dacă se adaptează condiţiile de cultură la nevoile specifice ale celulelor, se pot utiliza cu succes alte celule sau linii celulare pentru aceeaşi procedură de testare, cu condiţia demonstrării echivalenţei.
      Celulele trebuie controlate cu regularitate pentru a verifica absenţa contaminării acestora cu micoplasmă şi trebuie utilizate numai dacă rezultatele acestui control sunt satisfăcătoare (11).
      Este important ca sensibilitatea celulelor la UVA să fie controlată în mod regulat, conform procedurii pentru controlul calităţii descrisă în prezenta metodă. Datorită faptului că sensibilitatea celulelor la UVA poate să crească o dată cu numărul de reînsămânţări, ar trebui să se utilizeze celulele Balb/c 3T3 cu cel mai mic număr de reînsămânţări posibile, de preferinţă mai mic de 100 (a se vedea punctul 1.4.2.2.2 şi apendicele 2).
      1.4.1.2.   Medii și condiţii de cultură
      Se recomandă utilizarea unor medii de cultură şi a unor condiţii de incubare corespunzătoare pentru reînsămânţarea sistematică a celulelor şi în timpul procedurii de testare. De exemplu, pentru celulele Balb/c 3T3, mediul de cultură este DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) la care s-a adăugat 10 % ser de viţel nou-născut, 4 mM de glutamină, penicilină (100 IU), şi streptomicină (100 μg/ml), incubarea în atmosferă umidificată la 37 oC, 5-7,5 % CO2,, în funcţie de tampon (a se vedea punctul 1.4.1.4, al doilea paragraf). Este foarte important ca aceste condiţii de cultură celulară să asigure o durată a ciclului celular într-un interval normal pentru celulele sau linia celulară utilizată.
      1.4.1.3.   Pregătirea culturilor
      Celulele din stocul de culturi congelate se însămânţează într-un mediu de cultură la o densitate corespunzătoare şi se reînsămânţează cel puţin o dată înainte de a fi folosite pentru testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro.
      
      Celulele folosite pentru testul de fototoxicitate sunt însămânţate în mediul de cultură la densitatea corespunzătoare, astfel încât culturile să nu ajungă la confluenţă înainte de terminarea testului, respectiv atunci când se determină viabilitatea celulară după 48 de ore de la însămânţarea celulelor. Pentru celulele Balb/c 3T3 cultivate pe plăci cu 96 de godeuri, densitatea celulară recomandată este de 1 × 104 celule pe godeu.
      Pentru fiecare substanţă chimică testată, celule sunt însămânţate în mod identic pe două plăci separate, cu câte 96 de godeuri, utilizate ulterior, în mod concomitent pe toată durata procedurii de testare, în condiţii de cultură identice, cu excepţia intervalului de timp în care o placă este iradiată (+ Irr) şi cealaltă este păstrată la întuneric (– Irr).
      1.4.1.4.   Pregătirea substanţelor de testare
      Substanţele de testare trebuie să fie proaspăt preparate, chiar înaintea utilizării, cu excepţia cazului în care există date care dovedesc stabilitatea acestora în timpul depozitării. Se recomandă ca manipularea tuturor substanţelor chimice, precum şi tratarea iniţială a celulelor să se efectueze în condiţii de luminozitate care să evite fotoactivarea sau degradarea substanţei de testare înaintea iradierii.
      Substanţele chimice testate trebuie dizolvate în soluţii saline tamponate, de exemplu soluţie salină echilibrată Earl (Earle's Balanced Salt Solution – EBSS) sau alte soluţii tampon echilibrate fiziologic, care nu trebuie să conţină componente proteice şi care absorb lumina (de exemplu indicatori de pH coloraţi şi vitamine), în vederea evitării interferenţei în timpul iradierii. Din moment ce, în timpul iradierii, celulele sunt ţinute timp de aproximativ 50 de minute în afara incubatorului CO2, trebuie luate măsuri pentru a evita alcalinizarea. Aceasta se poate realiza prin incubarea celulelor la 7,5 % CO2, în cazul în care se folosesc tampoane slabe ca EBSS. Dacă celulele sunt incubate la doar 5 % CO2, se va selecta un tampon mai puternic.
      Substanţele chimice de testare cu solubilitate limitată în apă trebuie dizolvate într-un solvent corespunzător. În cazul în care se utilizează un anumit solvent, acesta trebuie să fie prezent în volum constant în toate culturile, respectiv în probele negative (solvent), precum şi în toate concentraţiile substanţei chimice testate şi să fie necitotoxic în concentraţia utilizată. Concentraţiile soluţiilor de testat ar trebui selectate astfel încât să se evite precipitarea sau soluţiile în suspensie.
      Solvenţii recomandaţi sunt dimetilsulfoxidul (DMSO) şi etanolul (EtOH). Pot fi adecvaţi şi alţi solvenţi cu citotoxicitate redusă (de exemplu acetona). Se recomandă ca, înainte de utilizare, să se efectueze o evaluare atentă a proprietăţilor specifice ale tuturor solvenţilor, de exemplu reacţia cu substanţa chimică testată, atenuarea efectului fototoxic, proprietăţile de fixare a radicalilor şi/sau stabilitatea chimică în solvent.
      Pentru facilitarea solubilizării, se pot utiliza agitatorul Vortex, dezintegrarea cu ultrasunete şi/sau încălzirea la temperaturi adecvate, cu condiţia ca stabilitatea substanţei testate să nu fie afectată.
      1.4.1.5.   Condiţii de iradiere
      1.4.1.5.1.   Sursa de lumină
      
      Alegerea unei surse de lumină şi a unei filtrări corespunzătoare reprezintă factorul principal pentru testarea fototoxicităţii. Gama UVA şi de lumină vizibilă sunt asociate, de obicei, reacţiilor fototoxice in vivo (3) (12), în timp ce, în general, gama UVB este mai puţin importantă, dar este foarte citotoxică; citotoxicitatea creşte de o mie de ori pe măsură ce lungimea de undă trece de la 313 nm la 280 nm (13). Criteriile pentru alegerea unei surse corespunzătoare de lumină trebuie să includă cerinţa ca sursa de lumină să emită lungimi de undă absorbite de substanţa chimică testată (spectru de absorbţie) şi ca doza de lumină (care se poate obţine într-un timp de expunere rezonabil) să fie suficientă pentru detectarea substanţelor fotocitotoxice cunoscute. În plus, lungimile de undă şi dozele utilizate nu ar trebui să dăuneze în mod nejustificat sistemului, de exemplu emisia de căldură (regiunea infraroşu).
      Simularea luminii solare cu simulatori solari este considerată sursa optimă de lumină artificială. Distribuţia puterii de iradiere a simulatorului solar cu filtru trebuie să fie apropiată de cea a luminii exterioare naturale menţionate la punctul (14). Se utilizează ca simulatoarele solare atât arcurile cu xenon, cât şi arcurile (dopate) cu halogenuri din mercur/metalice. Acestea din urmă prezintă avantajul că emit mai puţină căldură şi sunt mai ieftine, dar reproducerea luminii solare este inferioară în comparaţie cu arcurile cu xenon. Deoarece toate simulatoarele solare emit cantităţi importante de UVB, ar trebui să fie dotate cu filtre corespunzătoare pentru atenuarea lungimilor de undă UVB puternic citotoxice. Deoarece materialele plastice pentru culturile de celule conţin stabilizatori UV, spectrul al trebui măsurat cu ajutorul aceluiaşi tip de placă cu 96 de godeuri, utilizat la testare. Indiferent de măsurile luate pentru atenuarea unor părţi din spectru prin filtrare sau prin efecte inevitabile de filtrare a echipamentului, spectrul înregistrat sub aceste filtre nu trebuie să devieze de la lumina naturală, exterioară, standardizată (14). Un exemplu de distribuţie a iradianţei spectrale a simulatorului solar cu filtru, utilizat în studiul de validare a testului de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro, a fost publicat în (8) (16). A se vedea, de asemenea, apendicele 2 figura 1.
      1.4.1.5.2.   Dozimetrie
      
      Intensitatea luminii (iradianţa) ar trebui controlată în mod regulat înaintea fiecărui test de fototoxicitate, folosind un radiometru UV corespunzător, cu bandă largă. Intensitatea trebuie măsurată cu ajutorul aceluiaşi tip de placă cu 96 de godeuri, care va fi utilizat la testare. Radiometrul UV trebuie să fie calibrat în funcţie de sursă. Performanţa radiometrului UV ar trebui verificată, recomandându-se utilizarea unui al doilea radiometru de referinţă pentru măsurarea UV, de acelaşi tip, calibrat în mod identic. În mod ideal, la intervale mai mari, ar trebui utilizat un spectroradiometru pentru măsurarea iradianţei spectrale a sursei de lumină filtrate şi controlul calibrării radiometrului UV cu bandă largă.
      S-a stabilit că o doză de 5 J/cm2 (măsurată în gama UVA) nu este citotoxică pentru celulele Balb/c 3T3, fiind suficient de puternică pentru a excita chiar şi substanţele chimice pentru a obţine reacţii fototoxice (6) (17). De exemplu, pentru a obţine 5 J/cm2 în 50 de minute, iradianţa a fost reglată la 1,7 mW/cm2. A se vedea apendicele 2, figura 2. Dacă se utilizează o altă linie de celule sau o sursă diferită de lumină, calibrarea dozei de iradianţă poate fi necesară astfel încât doza respectivă să nu fie nocivă pentru celule, dar să fie suficientă pentru a excita fototoxinele standard. Timpul de expunere la lumină se calculează astfel:
      
                  
                     
               
               
                  (1 J = 1 Ws)
               
            1.4.2.   Condiţii de testare
      1.4.2.1.   Concentraţii ale substanţelor de testare:
      Gama concentraţiilor unei substanţe chimice testate în prezenţa (+ Irr) şi în absenţa (–Irr) luminii ar trebui determinate corespunzător prin experimente pentru aflarea dozelor. S-ar putea dovedi folositoare evaluarea solubilităţii, la început şi după 60 de minute (sau după intervalul de timp utilizat pentru tratare), deoarece solubilitatea se poate modifica în timp sau pe durata expunerii. Pentru a evita toxicitatea provocată de condiţiile necorespunzătoare de cultură sau de substanţele chimice puternic acide ori alcaline, pH-ul culturilor de celule la care s-a adăugat substanţa chimică testată ar trebui să se încadreze în limitele 6,5-7,8.
      Cea mai mare concentraţie a substanţei testate trebuie să se încadreze în condiţiile fiziologice de testare, de exemplu trebuie evitat pH-ul osmotic și de stres. În funcţie de substanţa chimică testată, ar putea fi necesar să se aibă în vedere şi alte proprietăţi fizico-chimice ca factori importanţi în limitarea celei mai mari valori a concentraţiei de test. În ceea ce priveşte substanţele relativ insolubile netoxice la concentraţii care merg până la punctul de saturaţie, ar trebui testată cea mai mare concentraţie care poate fi atinsă. În general, trebuie evitată precipitarea substanţei chimice de testare la oricare dintre concentraţiile de testare. Concentraţia maximă a unei substanţe de test nu trebuie să depăşească 1 000 μg/ml; osmolaritatea nu ar trebui să depăşească 10 mmolar. Ar trebui utilizată o serie de diluţii geometrice incluzând 8 concentraţii ale substanţei testate cu un factor constant de diluţie (a se vedea punctul 2.1 al doilea paragraf).
      Dacă s-a obţinut informaţia (pe baza unui experiment de identificare a limitelor) că substanţa testată nu este citotoxică până la limita de concentraţie a experimentului la întuneric (– Irr), dar că este puternic citotoxică la lumină (+ Irr), limitele concentraţiei care trebuie selectate pentru experimentul la lumină (+ Irr) pot fi diferite de limitele selectate pentru experimentul la întuneric (– Irr), în vederea îndeplinirii cerinţelor privind calitatea corespunzătoare a datelor.
      1.4.2.2.   Controale
      1.4.2.2.1.   Sensibilitatea celulelor la radiaţii, stabilirea datelor anterioare
      
      Celulele ar trebui verificate în mod regulat (aproximativ la fiecare a cincea reînsămânţare), în ceea ce priveşte sensibilitatea la sursa de lumină, evaluând viabilitatea acestora în urma expunerii la doze din ce în ce mai mari de iradiere. Pentru această evaluare, trebuie folosite mai multe doze de iradiere, inclusiv niveluri semnificativ mai ridicate decât cele utilizate pentru testul de fototoxicitate 3T3 NRU. Metoda cea mai simplă de cuantificare a acestor doze constă în măsurarea spectrului UV din sursa de lumină. Celulele sunt însămânţate la densitatea utilizată pentru testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro şi iradiate în ziua următoare. Ulterior, viabilitatea celulară se determină o zi mai târziu, utilizând fixarea colorantului roşu neutru. Trebuie să se demonstreze că cea mai mare doză necitotoxică rezultată (de exemplu în studiul de validare: 5 J/cm2 [UVA]) este suficientă pentru a clasifica, în mod corect, substanţele chimice de referinţă (tabelul 1).
      1.4.2.2.2.   Sensibilitatea la radiaţii, verificarea testului în curs
      
      Testul îndeplineşte criteriile de calitate dacă probele negative/solvente iradiate indică o viabilitate mai mare de 80 % în comparaţie cu probele negative/solvente neiradiate.
      1.4.2.2.3.   Viabilitatea probelor de solvent
      
      Densitatea optică absolută (DO540 NRU) din colorantul roşu neutru extras din probele de solvent indică dacă cele 1 × 104 celule însămânţate per godeu s-au dezvoltat cu un timp de dublare normal în cele două zile de testare. Testul îndeplineşte criteriile de acceptare dacă media DO540 NRU pentru probele netratate este ≥ 0,4 (aproximativ de douăzeci de ori absorbanţa de bază a solventului).
      1.4.2.2.4.   Controlul pozitiv
      
      O substanţă chimică fototoxică cunoscută este testată în acelaşi timp cu fiecare test de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro. Se recomandă clorpromazinul (CPZ). Pentru CPZ testat conform procedurii standard în testul de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro, s-au stabilit următoarele criterii de acceptare a testului: CPZ iradiată (+ Irr): IC50 = 0,1-2,0 μg/ml, CPZ neiradiată (– Irr): IC50 = 7,0-90,0 μg/ml. Factorul de fotoiritare (PIF) ar trebui să fie > 6. Datele controlului pozitiv trebuie monitorizate.
      În locul clorpromazinului se pot utiliza ca probe pozitive simultane şi alte substanţe chimice fototoxice, care corespund clasei de substanţe chimice sau caracteristicilor de solubilitate ale substanţei chimie evaluate.
      1.4.3.   Procedura de testare (6) (7) (8) (16) (17):
      1.4.3.1.   Prima zi
      Se varsă 100 μl mediu de cultură în godeurile periferice ale unei plăci de microtitru de cultură tisulară cu 96 de godeuri (= goale). În celelalte godeuri se varsă 100 μl dintr-o suspensie celulară de 1 × 105 celule/ml în mediul de cultură (= 1 × 104 celule/godeu). Se pregătesc două plăci pentru fiecare serie de concentraţii ale substanţei de testare, precum şi pentru probele pozitive şi de solvent.
      Se incubează celulele timp de 24 de ore (a se vedea punctul 1.4.1.2) până când formează un monostrat semiconfluent. Această perioadă de incubare permite recuperarea, aderenţa şi creşterea exponenţială a celulei.
      1.4.3.2.   A doua zi
      După incubaţie, se decantează mediul de cultură din celule şi se spală cu atenţie cu 150 μl din soluţia tampon folosită pentru incubaţie. Se adaugă 100 μl de soluţie tampon cu o concentraţie adecvată a substanţei chimice de testare sau a solventului (solvent de control). Se aplică 8 concentraţii diferite din substanţa chimică de testare. Se incubează celulele cu substanţa de testare la întuneric timp de 60 de minute (a se vedea punctul 1.4.1.2 şi punctul 1.4.1.4 paragraful al doilea).
      Dintre cele două plăci pregătite pentru fiecare serie de concentraţii ale substanţei de testare şi ale probelor de control, se selectează una, în general în mod aleatoriu, pentru a se determina citotoxicitatea (– Irr) (de exemplu, placa de control), iar cealaltă (placa de tratare) pentru determinarea fotocitotoxicităţii (+ Irr).
      Pentru realizarea expunerii la + Irr, se iradiază celulele la temperatura camerei timp de 50 de minute, prin capacul plăcii, cu cea mai mare doză de radiaţie necitotoxică (a se vedea, de asemenea, apendicele 2). Plăcile neiradiate (– Irr) se păstrează la temperatura camerei, într-o cutie închisă, timp de 50 de minute (= timpul de expunere la lumină).
      Se decantează soluţia de testare şi se spală cu atenţie, de două ori, cu 150 μl din soluţia tampon folosită pentru incubaţie, dar care nu conţine substanţa de testare. Se înlocuieşte soluţia tampon cu mediul de cultură şi se incubează (a se vedea punctul 1.4.1.2) peste noapte (18-22 ore).
      1.4.3.3.   A treia zi
      1.4.3.3.1.   Evaluarea microscopică
      
      Pentru examinarea celulelor din punct de vedere al dezvoltării, morfologiei şi integrităţii monostratului trebuie utilizat un microscop cu contrast de fază. Se înregistrează modificările apărute în morfologia celulei şi efectele asupra dezvoltării celulei.
      1.4.3.3.2.   Testul de fixare a colorantului roşului neutru
      
      Se spală celulele cu 150 μl de soluţie tampon încălzită în prealabil. Soluţia de spălare se îndepărtează prin tamponare uşoară. Se adaugă 100 μl de soluţie de roşu neutru 50 μg/ml (RN) (clorhidrat de 3-amino-7-dimetilamino-2-metilfenazin, număr EINECS 209-035-8; număr CAS 553-24-2; C.I. 50040) în mediu fără ser (16) şi se incubează conform descrierii de la punctul 1.4.1.2, timp de 3 ore. După incubaţie, se îndepărtează mediul de RN şi se spală celulele cu 150 μl de soluţie tampon. Se decantează, iar surplusul de soluţie tampon se îndepărtează cu un material absorbant sau prin centrifugare.
      Se adaugă exact 150 μl de soluţie RN de desorbţie (preparată proaspăt din 49 părţi apă + 50 părţi etanol + 1 parte acid acetic).
      Se agită uşor placa de microtitru pe un aparat de agitare pentru plăcile de microtitru timp de 10 minute, până când roşul neutru este extras din celule şi formează o soluţie omogenă.
      Se măsoară densitatea optică a extrasului de roşu neutru la 540 nm într-un spectrofotometru, utilizându-se godeurile goale ca puncte de referinţă. Pentru analize ulterioare, datele se salvează într-un fişier electronic corespunzător.
      2.   DATE
      2.1.   CALITATEA ŞI CANTITATEA DATELOR
      Datele testului trebuie să permită o analiză semnificativă relaţiilor concentraţie-răspuns obţinute în prezenţa şi în absenţa iradierii şi, dacă este posibil, o identificare a concentraţiei substanţei chimice de testare la care viabilitatea celulară este redusă la 50 % (IC50). Dacă se constată o citotoxicitate, atât gama de concentraţii cât şi intervalul între fiecare concentraţie trebuie stabilite astfel încât să permită adaptarea unei curbe la datele experimentale.
      Atât pentru rezultatele clar pozitive, cât şi pentru cele clar negative (a se vedea punctul 2.3, primul paragraf), experimentul principal poate fi suficient, însoţit de unul sau mai multe experimente preliminare de identificare a gamei de doze.
      Rezultatele echivoce, la limită sau neclare trebuie clarificate prin testări suplimentare (a se vedea, de asemenea, punctul 2.4 al doilea paragraf). În astfel de cazuri, trebuie luată în considerare modificarea condiţiilor de testare. Condiţiile de testare care ar putea fi modificate includ: gama de concentraţii sau distanţa dintre ele, timpul de preincubare, precum şi timpul de expunere la iradiere. Pentru substanţele chimice instabile în apă, poate fi mai adecvat un timp de expunere mai scurt.
      2.2.   EVALUAREA REZULTATELOR
      Pentru a facilita evaluarea datelor, se poate calcula factorul de fotoiritare (PIF) sau fotoefectul mediu (MPE).
      Pentru calcularea măsurilor de fotocitotoxicitate (a se vedea mai jos), setul valorilor concentraţie-răspuns distincte trebuie aproximat printr-o curbă concentraţie-răspuns continuă corespunzătoare (model). Adaptarea curbei la date se realizează în mod obişnuit printr-o metodă de regresie nelineară (18). Pentru a estima influenţa variabilităţii datelor asupra curbei adaptate, se recomandă o procedură de „bootstrap”.
      Factorul de fotoiritare (PIF) se calculează folosind următoarea formulă:
      
         
      Dacă IC50 în prezenţa sau în absenţa luminii nu se poate calcula, nici PIF pentru substanţa de testare nu poate fi determinat. Fotoefectul mediu (MPE) se bazează pe comparaţia curbelor concentraţie-răspuns complete (19). Acesta este definit ca media ponderală a unui set reprezentativ de valori ale fotoefectului.
      
         
      Fotoefectul PEc, la o concentraţie oarecare C este definit ca produsul dintre efectul de răspuns REc şi efectul de doză DEc, respectiv PEc = REc × DEc. Efectul de răspuns REc reprezintă diferenţa dintre răspunsurile obţinute în absenţa şi în prezenţa luminii, respectiv REc = Rc (– Irr) – Rc (+ Irr). Efectul de doză este dat de formula:
      
         
      unde C* reprezintă concentraţia de echivalenţă, respectiv concentraţia la care răspunsul + Irr este egal cu răspunsul la – Irr la concentraţia C. Dacă C* nu poate fi determinat din cauză că valorile de răspuns ale curbei + Irr sunt, în mod constant, mai mari sau mai mici decât de RC(– Irr), efectul de doză este stabilit la valoarea 1. Factorii de ponderare wi rezultă din valoarea de răspuns cea mai mare, respectiv, wi = MAX {Ri (+ Irr), Ri (– Irr)}. Grila de concentraţii Ci este selectată astfel încât acelaşi număr de puncte să figureze în fiecare dintre intervalele de concentraţii definite de valorile de concentraţii utilizate în experiment. Calculul MPE se limitează la valoarea maximă a concentraţiei pentru care cel puţin una dintre cele două curbe indică o valoare de răspuns de minim 10 %. Dacă această concentraţie maximă este mai mare decât cea mai mare concentraţie utilizată în experimentul + Irr, partea rămasă din curba + Irr se fixează la valoarea de răspuns „0”. Substanţa chimică este clasificată drept fototoxică în funcţie de valoarea MPE, mai mare sau nu decât o valoare limită selectată corespunzător (MPEc = 0,15).
      Pentru calcularea PIF şi MPE, referinţa (20) pune la dispoziţie un pachet de programe.
      2.3.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Pe baza studiului de validare (8), substanţa de testare cu un PIF < 2 sau un MPE < 0,1 indică: „absenţa fototoxicităţii”. Un PIF > 2 şi < 5 sau un MPE > 0,1 şi < 0,15 indică: „fototoxicitate probabilă”, iar un PIF > 5 sau un MPE > 0,15 indică: „fototoxicitate”.
      În cazul laboratoarelor care efectuează acest test pentru prima dată, substanţele de referinţă menţionate în tabelul 1 trebuie testate înainte de evaluarea fototoxicităţii substanţelor de testare. Valorile PIF sau MPE trebuie să fie apropiate de valorile menţionate în tabelul 1.
      
         Tabelul 1
      
      
                  Denumirea chimică
               
               
                  Nr. EINECS
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  PIF
               
               
                  MPE
               
               
                  Punctul maxim de absorbţie
               
               
                  Solvent (9)
                  
               
            
                  Amiodaronă HCL
               
               
                  243-293-2
               
               
                  [19774-82-4]
               
               
                  > 3,25
               
               
                  0,27-0,54
               
               
                  242 nm
                  300 nm
                  (prag)
               
               
                  etanol
               
            
                  Clorpromazin HCL
               
               
                  200-701-3
               
               
                  [69-09-0]
               
               
                  > 14,4
               
               
                  0,33-0,63
               
               
                  309 nm
               
               
                  etanol
               
            
                  Norfloxacin
               
               
                  274-614-4
               
               
                  [70458-96-7]
               
               
                  > 71,6
               
               
                  0,34-0,90
               
               
                  316 nm
               
               
                  acetonitril
               
            
                  Antracen
               
               
                  204-371-1
               
               
                  [120-12-7]
               
               
                  > 18,5
               
               
                  0,19-0,81
               
               
                  356 nm
               
               
                  acetonitril
               
            
                  Protoporfirină IX de disodiu
               
               
                  256-815-9
               
               
                  [50865-01-5]
               
               
                  > 45,3
               
               
                  0,54-0,74
               
               
                  402 nm
               
               
                  etanol
               
            
                  L-Histidină
               
               
                   
               
               
                  [7006-35-1]
               
               
                  fără PIF
               
               
                  0,05-0,10
               
               
                  211 nm
               
               
                  apă
               
            
                  Hexaclorofen
               
               
                  200-733-8
               
               
                  [70-30-4]
               
               
                  1,1-1,7
               
               
                  0,00-0,05
               
               
                  299 nm
                  317 nm
                  (prag)
               
               
                  etanol
               
            
                  Lauril sulfat de sodiu
               
               
                  205-788-1
               
               
                  [151-21-3]
               
               
                  1,0-1,9
               
               
                  0,00-0,05
               
               
                  fără absorbţie
               
               
                  apă
               
            2.4.   INTERPRETAREA DATELOR
      Dacă efectele fototoxice sunt observate doar la cea mai mare concentraţie de testare, (în special pentru substanţele chimice solubile în apă), poate fi necesar să se ia în considerare alte elemente pentru evaluarea riscurilor, precum date privind absorbţia cutanată, acumularea substanţelor chimice în piele şi/sau date obţinute de la alte teste, cum ar fi testarea substanţei chimice in vitro, pe piele umană sau animală sau pe alte modele de piele.
      Dacă nu se demonstrează existenţa toxicităţii (+ Irr şi – Irr) şi dacă solubilitatea scăzută a limitat concentraţiile care puteau fi testate, atunci se poate pune sub semnul întrebării compatibilitatea substanţei de testate cu testul, fiind util să se ia în considerare efectuarea unui test de confirmare utilizând, de exemplu, un alt model.
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să includă cel puţin următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Substanţa testată:
                  
                              —
                           
                           
                              datele de identificare, denumirile generice comune şi numerele IUPAC şi CAS, dacă se cunosc;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              starea fizică şi puritatea;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              proprietăţile fizico-chimice relevante pentru efectuarea studiului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              spectrul de absorbţie UV/vizibilă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              stabilitatea şi fotostabilitatea, dacă se cunosc.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Solventul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii solventului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea substanţei chimice testate în solvent;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              procentul de solvent prezent în mediul de tratare.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Celulele:
                  
                              —
                           
                           
                              tipul şi sursa celulelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              absenţa micoplasmei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de reînsămânţare al celulelor, dacă se cunoaşte;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sensibilitatea celulelor la radiaţii, stabilită cu aparatul de iradiere utilizat în cadrul testului de fototoxicitate 3T3 NRU in vitro.
                              
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţiile de testare (1); incubaţia înainte şi după tratare:
                  
                  
                              —
                           
                           
                              tipul şi compoziţia mediului de cultură;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              condiţiile de incubare (concentraţia de CO2; temperatura; umiditatea);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              durata incubaţiei (înainte şi după tratare).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţiile de testare (2); tratare cu substanţa chimică:
                  
                  
                              —
                           
                           
                              motivele selectării concentraţiilor substanţei chimice de testare utilizate în prezenţa şi în absenţa iradierii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              în cazul unei solubilităţi limitate a substanţei de testare şi a absenţei cititoxicităţii: motivul testării celei mai ridicate concentraţii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tipul şi compoziţia mediului de tratare (soluţie salină tampon);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              durata tratării chimice.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare (3); iradierea:
                  
                              —
                           
                           
                              motivul pentru alegerea sursei de lumină utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              producătorul şi tipul sursei de lumină şi a radiometrului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              caracteristicile de iradiere spectrală ale sursei de lumină;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              caracteristicile de transmisie şi absorbţie ale filtrului (filtrelor) utilizat(e);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              caracteristicile radiometrului şi detaliile privind calibrarea acestuia;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              distanţa dintre sursa de lumină şi sistemul de testare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              iradierea UVA la această distanţă, exprimată în mW/cm2;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              durata expunerii la lumină UV/vizibilă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              doza de UVA (iradiere × timp), exprimată în J/cm2;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatura culturilor de celule în timpul iradierii şi a culturilor de celule ţinute concomitent la întuneric.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare (4); testul de viabilitate cu roşu neutru:
                  
                  
                              —
                           
                           
                              compoziţia mediului de tratare cu roşu neutru;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              durata de incubaţie a roşului neutru;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              condiţiile de incubaţie (concentraţia de CO2, temperatura, umiditatea);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              condiţiile de extragere a roşului neutru (soluţia de extragere, durata);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lungimea de undă utilizată pentru citirea spectrofotometrică a densităţii optice a roşului neutru;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              a doua lungime de undă (referinţă), dacă este utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conţinutul spaţiului liber al spectrofotometrului, dacă este utilizat.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              viabilitatea celulară obţinută la fiecare concentraţie a substanţei chimice de testare, exprimată în viabilitatea procentuală medie a probelor de solvent simultane;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              curbele concentraţie-răspuns (concentraţia substanţei chimice de testare comparată cu viabilitatea celulară relativă) obţinute în experimente simultane + Irr şi – Irr;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analiza curbelor concentraţie-răspuns: dacă este posibil, estimarea/calcularea IC50 (+ Irr) şi IC50 (– Irr);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              compararea celor două curbe concentraţie-răspuns obţinute în prezenţa şi în absenţa iradierii, fie prin calcularea factorului de fotoiritare (PIF), fie prin calcularea fotoefectului mediu (MPE);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile de acceptare a testului, solvent de control simultan:
                           
                        
                              —
                           
                           
                              viabilitatea absolută (densitatea optică a extrasului de roşu neutru) a celulelor iradiate şi neiradiate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele istorice privind controalele negativ şi de solvent simultane, deviaţii medii şi standard.
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile de acceptare ale testului, control pozitiv simultan:
                           
                        
                              —
                           
                           
                              IC50(+ Irr) şi IC50(– Irr) şi PIF/MPE ale substanţei chimice de control pozitiv;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele chimice istorice ale controlului pozitiv: IC50(+ Irr) şi IC50(– Irr) şi PIF/MPE, deviaţii medii şi standard.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Lovell W. W. (1993). A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7: 95-102.
               
            
                  2.
               
               
                  Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic substances. In „Research Progress in Organic, Biological and Medicinal Chemistry” Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam. p XI-XXXV.
               
            
                  3.
               
               
                  Spielmann, H., Lovell, W. W., Hölzle, E., Johnson, B. E., Maurer, T., Miranda, M. A., Pape, W. J. W., Sapora, O., and Sladowski, D. (1994). In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 314-348.
               
            
                  4.
               
               
                  Spikes, J. D. (1989). Photosensitization. In „The science of Photobiology” Edited by K. C. Smith. Plenum Press, New York. 2nd edition, pp. 79-110.
               
            
                  5.
               
               
                  OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 7 „Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water” Environment Directorate, OECD, Paris.
               
            
                  6.
               
               
                  Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H. G., Kalweit, S., Klecak, G., L’Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8, 793-796.
               
            
                  7.
               
               
                  Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA, 26, 7-8.
               
            
                  8.
               
               
                  Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., Pechovitch, G. De Silva, O., Holzhütter, H. G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EU/COLIPA In vitro phototoxicity validation study: results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In Vitro 12, 305-327.
               
            
                  9.
               
               
                  OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 30th-31th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 15th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat.
               
            
                  10.
               
               
                  Borenfreund, E., and Puerner, J. A. (1985). Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Lett., 24, 119-124.
               
            
                  11.
               
               
                  Hay, R. J. (1988) The seed stock concept and quality control for cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225-237.
               
            
                  12.
               
               
                  Lambert L. A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicology”, edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, pp. 515-530.
               
            
                  13.
               
               
                  Tyrrell R. M., Pidoux M. (1987) Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825-1829.
               
            
                  14.
               
               
                  ISO 10977. (1993). Photography – Processed photographic colour films and paper prints – Methods for measuring image stability.
               
            
                  15.
               
               
                  Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, International Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275
               
            
                  16.
               
               
                  ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure: In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 1998. 18 pgs.
               
            
                  17.
               
               
                  Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals from Annex VII of the European Union Directive 76/768/EEC, in the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 679-708.
               
            
                  18.
               
               
                  Holzhütter, H. G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical modeling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, 127-138.
               
            
                  19.
               
               
                  Holzhütter, H. G. (1997). A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 445-462.
               
            
                  20.
               
               
                  http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_2349687_1_1_1_1,00.html
               
            
         APENDICELE 1
         Rolul testului de fototoxicitate 3T3 NRU într-o abordare secvenţială a testării fototoxicităţii substanţelor chimice
         
            
      
      
         APENDICELE 2
         Figura 1
         Distribuţia spectrală a iradierii unui simulator solar cu filtru
         
            
         (a se vedea punctul 1.4.1.5 al doilea paragraf)
         Figura 1 oferă un exemplu al unei distribuţii acceptabile de iradiere spectrală pentru un simulator solar cu filtru. Aceasta corespunde sursei de halgenură metalică dopată utilizată în studiul de validare a testului 3T3 NRU (6) (8) (17). Se prezintă efectul a două filtre diferite şi efectul de filtrare suplimentară a capacului plăcii de cultură cu 96 de godeuri. Filtrul H2 a fost utilizat doar cu sistemele de testare care pot tolera o cantitate mai mare de UVB (testul pe modelul de piele şi testul de fotohemoliză a globulelor roşii). În cadrul testului 3T3 NRU s-a utilizat filtrul H1. Figura arată că efectul de filtrare suplimentară a capacului plăcii se observă în principal în gama UVB, lăsând suficiente raze UVB în spectrul de iradiere pentru a stimula substanţele chimice care absorb în mod obişnuit gama UVB, precum amiodarona (a se vedea tabelul 1).
         Figura 2
         Sensibilitatea celulelor Balb/c 3T3 la iradiere (conform măsurătorilor în gama UVA)
         Viabilitatea celulară ( % de fixare a roşului neutru a probelor de control la întuneric)
         
            
         (a se vedea punctele 1.4.1.5.2 al doilea paragraf; 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2)
         Sensibilitatea celulelor Balb/c 3T3 la iradierea cu simulatorul solar utilizat în studiul de validare a testului de fototoxicitate 3T3 NRU, conform măsurătorilor efectuate în gama UVA. Figura prezintă rezultatele obţinute în 7 laboratoare diferite în cadrul studiului de prevalidare (1). Cele două curbe cu simboluri deschise la culoare au fost obţinute cu celule îmbătrânite (număr mai mare de reînsămânţări) care au trebuit înlocuite cu serii de celule noi, iar curbele cu simboluri îngroşate indică celule cu o toleranţă acceptabilă la iradiere.
         Pe baza acestor date a fost derivată doza cea mai mare de iradiere necitotoxică de 5 J/cm2 (linia verticală punctată). Linia orizontală punctată arată, în plus, efectul de iradiere maxim acceptabil menţionat la punctul 1.4.2.2.
      
      B.42.   SENSIBILIZAREA DERMICĂ: TESTUL LOCAL PE GANGLIONII LIMFATICI
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 429 (2002) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Validarea şi acceptarea testului local pe ganglionii limfatici (LLNA) sunt suficiente pentru a justifica adoptarea acestuia ca nouă metodă (1) (2) (3). Acesta reprezintă a doua metodă de evaluare a potenţialului de sensibilizare dermică al substanţelor chimice la animale. Cealaltă metodă (B.6) implică teste pe cobai, în special testul de maximizare la cobai şi testul Buehler (4).
      LLNA reprezintă o metodă alternativă de identificare a substanţelor chimice care produc o sensibilizare dermică şi de confirmare a faptului că substanţele chimice nu au un potenţial semnificativ de sensibilizare dermică. Acest lucru nu înseamnă în mod necesar că LLNA trebuie utilizat întotdeauna în locul testului pe cobai, ci că acest test este de aceeaşi calitate şi că poate fi utilizat ca o alternativă pentru care rezultatele pozitive sau negative nu necesită în general confirmări suplimentare.
      LLNA oferă anumite avantaje atât legate de progresul ştiinţific, cât şi în ceea ce priveşte bunăstarea animală. În cadrul testului se studiază etapa de inducere a sensibilizării dermice şi sunt furnizate date cantitative adecvate pentru evaluarea relaţiei doză-efect. Detaliile privind validarea LLNA şi o prezentare a lucrărilor asociate sunt publicate (5) (6) (7) (8). În plus, trebuie avut în vedere faptul că agenţii de sensibilizare slabi/moderaţi, recomandaţi ca substanţe martor pozitiv adecvate pentru metodele de testare pe cobai, sunt adecvaţi şi pentru utilizarea în cadrul LLNA (6) (8) (9).
      LLNA este o metodă in vivo şi, în consecinţă, nu elimină utilizarea animalelor pentru evaluarea activităţii de sensibilizare prin contact. Cu toate acestea, metoda oferă posibilitatea de a reduce numărul de animale necesare în acest scop. În plus, LLNA permite îmbunătăţirea considerabilă a modului în care sunt utilizate animalele pentru testele de sensibilizare prin contact. LLNA se bazează pe evaluarea evenimentelor imunologice stimulate de substanţele chimice pe parcursul etapei de inducere a sensibilizării. Spre deosebire de testele pe cobai, LLNA nu impune inducerea unor reacţii de hipersensibilitate dermică provocate de o probă declanşatoare. În plus, spre deosebire de testul de maximizare la cobai, pentru LLNA nu este necesară utilizarea unui adjuvant. Astfel, LLNA reduce suferinţa animalelor. În ciuda avantajelor oferite de LLNA în comparaţie cu testele tradiţionale pe cobai, trebuie avute în vedere şi anumite limitări care pot face necesară utilizarea testelor tradiţionale pe cobai (de exemplu rezultatele fals negative la LLNA pentru anumite metale, rezultatele fals pozitive pentru anumiţi agenţi iritanţi dermici) (10).
      A se vedea şi introducerea generală partea B.
      1.2.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      LLNA se bazează pe principiul conform căruia agenţii de sensibilizare induc o proliferare primară a limfocitelor din ganglionul limfatic care drenează zona în care a fost aplicată substanţa chimică. Această proliferare este proporţională cu doza aplicată (şi cu puterea alergenului) şi constituie o metodă simplă pe baza căreia se pot efectua măsurători cantitative obiective ale sensibilizării. Prin LLNA această proliferare este evaluată ca relaţie doză-efect, comparându-se proliferarea la grupul tratat cu cea de la grupul martor tratat cu vehicul. Se determină raportul dintre proliferarea produsă la grupul tratat şi cea produsă la grupul martor tratat cu vehicul, numit indice de stimulare, care trebuie să aibă cel puţin valoarea trei pentru ca o substanţă de testat să poată fi evaluată în continuare ca potenţial agent de sensibilizare dermică. Metodele descrise în prezentul document se bazează pe utilizarea marcării radioactive pentru măsurarea proliferării celulare. Cu toate acestea, pentru evaluarea proliferării se pot utiliza şi alte criterii, cu condiţia să existe justificări şi dovezi ştiinţifice adecvate, inclusiv citări şi descrieri complete ale metodologiei.
      1.3.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.3.1.   Pregătire
      1.3.1.1.   Condiţii de adăpostire şi de hrănire
      Animalele se adăpostesc în incinte individuale. Temperatura sălii în care se află animalele de experienţă trebuie să fie de 22 oC (± 3 oC). Deşi umiditatea relativă trebuie să fie de cel puţin 30 % şi preferabil să nu depăşească 70 % decât în timpul operaţiunilor de curăţare a sălii, obiectivul pentru umiditate este ca aceasta să fie de 50-60 %. Iluminatul trebuie să fie artificial şi se alternează 12 ore de lumină cu 12 ore de întuneric. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă.
      1.3.1.2.   Pregătirea animalelor
      Animalele se selectează aleatoriu, se marchează pentru a putea fi identificate individual (dar nu se foloseşte niciun tip de crotalie) şi se ţin în cuştile lor timp de cel puţin 5 zile înainte de a se începe administrarea dozei astfel încât să se aclimatizeze la condiţiile de laborator. Toate animalele sunt examinate înainte de începerea tratamentului, pentru a se stabili că nu prezintă leziuni observabile la nivel dermic.
      1.3.2.   Condiţii de testare
      1.3.2.1.   Animalele de experienţă
      Specia preferată pentru acest test este şoarecele. Se folosesc femele adulte din rasa CBA/Ca sau CBA/J, nulipare şi care nu sunt însărcinate. La începutul studiului, animalele trebuie să aibă între 8-12 săptămâni, iar diferenţele de greutate dintre ele trebuie să fie minime şi să nu depăşească 20 % din greutatea medie. Se pot utiliza şi alte soiuri şi masculi dacă se generează suficiente date pentru a demonstra că nu există diferenţe semnificative în răspunsul la LLNA specifice rasei şi/sau sexului.
      1.3.2.2.   Verificarea fiabilităţii
      Grupul martor pozitiv se foloseşte pentru a demonstra că testul a fost realizat corect şi că laboratorul îl poate realiza cu succes. Grupul martor pozitiv trebuie să prezinte un răspuns pozitiv la LLNA la un nivel de expunere care se consideră că determină o creştere a indicelui de stimulare (IS) > 3 faţă de grupul martor negativ. Doza administrată grupului martor pozitiv trebuie aleasă astfel încât inducerea răspunsului să fie evidentă, dar nu excesivă. Substanţele preferate sunt aldehida hexil-cinamică (nr. CAS 101-86-0, nr. EINECS 202-983-3) şi mercaptobenzotiazolul (nr. CAS 149-30-4, nr. EINECS 205-736-8). În unele situaţii şi pe bază de justificări adecvate se pot utiliza alte substanţe martor care îndeplinesc criteriile menţionate anterior. Deşi de obicei pentru fiecare test este necesar un grup martor pozitiv, este posibil ca în anumite situaţii laboratoarele de testare să aibă la dispoziţie date istorice privind grupurile martor pozitiv care să ateste obţinerea constantă a unui răspuns satisfăcător pe parcursul unei perioade de şase luni sau mai mare. În astfel de situaţii se pot efectua teste cu o frecvenţă mai redusă pe grupul martor pozitiv, dar la intervale de cel mult 6 luni. Deşi substanţa martor pozitiv trebuie testată împreună cu un vehicul despre care se ştie că va provoca un răspuns constant (de exemplu acetonă: ulei de măsline), este posibil să existe şi situaţii prevăzute de lege în care este necesară şi testarea cu un vehicul non-standard (preparat cu relevanţă clinică/chimică). În astfel de situaţii trebuie testată posibila interacţiune dintre substanţa martor pozitiv şi acest vehicul neconvenţional.
      1.3.2.3.   Numărul de animale, doze şi selectarea vehiculului
      Fiecare grup tratat trebuie să fie format din minimum patru animale şi se folosesc cel puţin trei concentraţii ale substanţei de testat plus un grup martor negativ tratat numai cu vehiculul utilizat împreună cu substanţa de testat şi, dacă este cazul, un martor pozitiv. Dacă se colectează date individuale privind animalele se folosesc cel puţin cinci animale în fiecare grup tratat. Animalele din grupul martor trebuie manipulate şi tratate în mod identic cu animalele din grupurile tratate, cu excepţia faptului că nu li se administrează tratamentul cu substanţa de testat.
      Doza şi vehiculul se aleg pe baza recomandărilor din cadrul referinţelor (1). Dozele se aleg din gama de concentraţii de 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 0,5 % etc. Dacă există, datele privind toxicitatea acută şi iritaţia dermică trebuie avute în vedere la alegerea celor trei concentraţii consecutive astfel încât cea mai mare să maximizeze expunerea evitând în acelaşi timp toxicitatea sistemică şi iritaţia dermică locală excesivă (2) (11).
      Vehiculul trebuie selectat astfel încât să maximizeze concentraţiile de testare şi solubilitatea, producând în acelaşi timp şi o soluţie/suspensie adecvată pentru aplicarea substanţei de testat. În ordinea preferinţelor, vehiculele recomandate sunt: acetonă/ulei de măsline (4:1 v/v), dimetilformamidă, metil etil cetonă, propilen glicol şi dimetil sulfoxid (2) (10), dar se pot utiliza şi altele dacă sunt furnizate justificări ştiinţifice suficiente. În anumite situaţii este posibil să fie necesară utilizarea unui solvent cu relevanţă clinică sau a unui preparat comercial sub forma căruia este comercializată substanţa de testat ca martor suplimentar. Trebuie acordată o atenţie specială pentru ca materialele hidrofile să fie încorporate într-un sistem vehicul care să umezească pielea şi să nu curgă imediat. Astfel, vehiculele formate numai din apă trebuie evitate.
      1.3.3.   Procedura de testare
      1.3.3.1.   Schema de tratament
      Pentru acest test, schema de tratament este următoarea:
      
                   
               
               
                  
                     Ziua 1:
                  
                  Se determină şi se identifică greutatea fiecărui animal în parte. Se aplică 25 μl de substanţă de test diluată în mod adecvat, numai sistemul vehicul sau martorul pozitiv (după caz) în regiunea dorsală a fiecărei urechi.
               
            
                   
               
               
                  
                     Zilele 2 şi 3:
                  
                  Se repetă procedura de aplicare efectuată în ziua 1.
               
            
                   
               
               
                  
                     Zilele 4 şi 5:
                  
                  Nu se aplică tratament.
               
            
                   
               
               
                  
                     Ziua 6:
                  
                  Se înregistrează greutatea fiecărui animal. Li se injectează 25 μl de ser fiziologic tamponat cu fosfat (PBS) conţinând 20 μCi (7,4e + 8 Bq) de 3H-metil timidină tuturor şoarecilor de experienţă şi celor din grupul martor prin vena codală. Alternativ, tuturor şoarecilor li se injectează 250 μl PBS conţinând 2 μCi (7,4e + 8 Bq) de 125I–iododeoxiuridină şi 10–5 M fluorodeoxiuridină prin vena codală.
                  După cinci ore, animalele sunt sacrificate. Se excizează ganglionii limfatici auriculari de drenare de la fiecare ureche de la toate animalele dintr-un grup experimental şi se păstrează împreună în PBS (metodă colectivă la nivel de grup tratat); alternativ, se pot exciza perechi de ganglioni limfatici de la fiecare animal care se păstrează separat în PBS (metodă individuală la nivel de animal). Anexa I din referinţa 10 conţine detalii şi diagrame privind identificarea şi disecţia ganglionilor.
               
            1.3.3.2.   Prepararea suspensiilor celulare
      Se prepară o singură suspensie celulară conţinând celule din ganglionii limfatici fie de la un întreg grup tratat, fie de la un singur animal, printr-o separare mecanică uşoară realizată cu ajutorul unei site din oţel inoxidabil cu ochiuri de 200 μm. Celulele din ganglionii limfatici se spală de două ori cu PBS în exces şi se precipită cu o soluţie de acid tricloracetic (TCA) 5 % la 4 oC timp de 18 h (2). Granulele se suspendă din nou în 1 ml de soluţie de acid tricloracetic şi se transferă în flacoane de scintilaţie conţinând 10 ml de fluid de scintilaţie pentru determinarea tritiului 3H sau se transferă direct în tuburile cu raze gama pentru determinarea iodului 125I.
      1.3.3.3.   Determinarea proliferării celulare (radioactivitate încorporată)
      Încorporarea de 3H-metil timidină se măsoară prin determinarea β-scintilaţiei, în dezintegrări pe minut (DPM). Încorporarea de 125I-iododeoxiuridină se măsoară prin determinarea 125I-iododeoxiuridinei şi se exprimă, de asemenea, în DPM. În funcţie de metoda utilizată, încorporarea se exprimă ca DPM/grup tratat (metoda colectivă la nivel de grup) sau în DPM/animal (metoda individuală la nivel de animal).
      1.3.3.4.   Observaţiile
      1.3.3.4.1.   Observaţii clinice
      
      Animalele se examinează atent o dată pe zi pentru identificarea oricăror semne clinice, fie iritaţii la locul aplicării, fie toxicitate sistemică. Toate observaţiile se consemnează sistematic în înregistrările individuale pentru fiecare animal.
      1.3.3.4.2.   Greutatea corporală
      
      După cum se arată în punctul 1.3.3.1, greutatea corporală a fiecărui animal se măsoară la începutul testului şi în momentul prevăzut pentru sacrificare.
      1.3.4.   Calcularea rezultatelor
      Rezultatele se exprimă ca indice de stimulare (IS). Dacă se foloseşte metoda colectivă, IS se obţine prin împărţirea încorporării radioactive colective înregistrate de fiecare grup tratat la încorporarea înregistrată de grupul martor tratat cu vehicul; astfel se calculează un IS mediu. Dacă se foloseşte metoda individuală, IS se determină prin împărţirea valorii medii a DPM/animal din fiecare grup tratat cu substanţa de testat şi a valorii medii pentru grupul martor pozitiv la valoarea medie a DPM/animal din grupul martor tratat cu vehicul. Indicele de stimulare mediu pentru grupul martor tratat cu vehicul are valoarea 1.
      Utilizarea metodei individuale de calculare a IS permite efectuarea unei analize statistice a datelor. Pentru alegerea metodei adecvate de analiză statistică, experimentatorul trebuie să aibă în vedere posibilele inegalităţi la nivelul varianţelor şi alte probleme conexe care ar putea impune transformarea datelor sau o analiză statistică non-parametrică. O bună modalitate de interpretare a datelor constă din evaluarea tuturor datelor individuale obţinute pentru grupurile tratate şi pentru grupurile martor tratate cu vehicul urmată de determinarea celei mai adecvate curbe care descrie relaţia doză-efect, având în vedere pragurile de încredere (8) (12) (13). Cu toate acestea, experimentatorul trebuie să acorde atenţie posibilelor reacţii „excepţionale” prezentate de unele animale dintr-un grup, care ar putea impune utilizarea unui mod alternativ de măsurare a reacţiilor (de exemplu mediana în locul mediei) sau eliminarea reacţiei excepţionale.
      O reacţie este considerată pozitivă dacă indicele de stimulare este ≥ 3, luându-se în considerare relaţia doză-efect şi, dacă este cazul, semnificaţia statistică (3) (6) (8) (12) (14).
      Dacă rezultatele obţinute nu sunt suficient de concludente, trebuie examinate diversele proprietăţi ale substanţei de testat, inclusiv dacă prezintă similitudini structurale cu agenţi cunoscuţi de sensibilizare dermică şi dacă provoacă iritaţii cutanate excesive, precum şi relaţia doză-efect observată. Aceste consideraţii, precum şi altele, sunt discutate în detaliu în alt document (7).
      2.   DATE
      Datele trebuie recapitulate sub formă de tabel, precizându-se valorile DPM medii şi individuale şi indicii de stimulare pentru fiecare grup tratat (inclusiv grupul martor tratat cu vehicul).
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Substanţa de testat:
                  
                              —
                           
                           
                              date de identificare (de exemplu numărul CAS, dacă se cunoaşte; sursa; puritatea; impurităţile cunoscute; numărul grupului);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              starea fizică şi proprietăţile fizice şi chimice (de exemplu volatilitatea, stabilitatea, solubilitatea);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              în cazul amestecurilor, compoziţia şi procentul fiecărui constituent.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              date de identificare [puritate; concentraţie (dacă este cazul); volum utilizat];
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animale de experienţă:
                  
                              —
                           
                           
                              linia de şoareci utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              statutul microbiologic al animalelor, dacă se cunoaşte;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul, vârsta şi sexul animalelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursa animalelor, condiţiile de adăpostire, regimul alimentar etc.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea şi aplicarea substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea dozei alese, inclusiv rezultatele studiului prin care a fost stabilit intervalul de dozare, dacă este cazul; concentraţiile vehiculului şi ale substanţei de testat utilizate şi cantitatea totală de substanţă aplicată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei şi a apei (inclusiv tipul/sursa regimului alimentar, sursele de apă).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Verificarea fiabilităţii
                  
                              —
                           
                           
                              un rezumat al rezultatelor obţinute la ultima verificare a fiabilităţii, inclusiv informaţii privind substanţa, concentraţia şi vehiculul utilizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date concomitente şi/sau istorice privind martorii pozitivi şi negativi utilizate de laboratorul de testare.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul testului şi în momentul prevăzut pentru sacrificare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tabloul valorilor DPM medii (pentru metoda colectivă) şi individuale (metoda individuală) precum şi intervalul de valori pentru ambele metode şi indicii de stimulare pentru fiecare grup tratat (inclusiv grupul martor tratat cu vehicul);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analiza statistică, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              momentul declanşării şi semnele de toxicitate, inclusiv iritaţia dermică la locul administrării, dacă este cazul, pentru fiecare animal.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor:
                  
                              —
                           
                           
                              un scurt comentariu privind rezultatele, analiza relaţiei doză-efect şi analize statistice, dacă este cazul, şi o concluzie care să indice dacă substanţa de testat trebuie considerată agent de sensibilizare dermică.
                           
                        
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Kimber, I. and Basketter, D. A. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology 30, 165-169.
               
            
                  2.
               
               
                  Kimber, I, Derman, R. J., Scholes E. W, and Basketter, D. A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, 13-31.
               
            
                  3.
               
               
                  Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., Basketter, D. A., Lea, L., House, R. V., Ladies, G. S., Loveless, S. E., Hastings, K. L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An inter laboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, 563-79.
               
            
                  4.
               
               
                  Metoda de testare B.6.
               
            
                  5.
               
               
                  Chamberlain, M. and Basketter, D. A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food and Chemical Toxicology 34, 999-1002.
               
            
                  6.
               
               
                  Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, T. and Loveless, S. E. (1996). The local lymph node assay- A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, 985-997.
               
            
                  7.
               
               
                  Basketter, D. A., Gerberick, G. F. and Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, 327-33.
               
            
                  8.
               
               
                  Van Och, F. M. M, Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J., Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49-59.
               
            
                  9.
               
               
                  Dearman, R. J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D. A. and Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281-4.
               
            
                  10.
               
               
                  National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).
               
            
                  11.
               
               
                  Metoda de testare B.4.
               
            
                  12.
               
               
                  Basketter, D. A., Selbie, E., Scholes, E. W. Lees, D. Kimber, I. and Botham, P.A. (1993) Results with OCDE recommended positive control sensitisers in the maximisation, Buehler and local lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63-67.
               
            
                  13.
               
               
                  Basketter D. A., Lea L. J., Dickens A., Briggs D., Pate I., Dearman R. J., Kimber I. (1999). A comparison of statistical approaches to the derivation of EC3 values from local lymph node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, 261-266.
               
            
                  14.
               
               
                  Basketter D. A., Blaikie L., Derman R. J., Kimber T., Ryan C. A., Gerberick G. F., Harvey P., Evans P., White T. R. and Rycroft R. T. G. (2000). Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis 42, 344-48.
               
            B.43.   STUDII DE NEUROTOXICITATE PE ROZĂTOARE
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 424 (1997) a OCDE.
      Această metodă de testare a fost elaborată în vederea obţinerii informaţiilor necesare pentru a confirma sau pentru a caracteriza mai eficient potenţiala neurotoxicitate a unei substanţe la animale adulte. Poate fi utilizată împreună cu alte metode de testare în cadrul studiilor de toxicitate cu doză repetată sau în cadrul unui studiu separat. Se recomandă consultarea Liniilor directoare OCDE privind strategiile şi metodele de testare a neurotoxicităţii (1) pentru elaborarea studiilor bazate pe această metodă de testare. Acest lucru este deosebit de important dacă se anticipează modificarea observaţiilor şi a procedurilor de testare recomandate în mod obişnuit pentru această metodă. Liniile directoare au fost elaborate pentru facilita alegerea altor proceduri de testare care urmează să fie utilizate în împrejurări speciale.
      Această metodă nu este destinată evaluării neurotoxicităţii asupra dezvoltării.
      1.1.   INTRODUCERE
      Pentru evaluarea caracteristicilor toxice ale produselor chimice trebuie avute în vedere posibilele efecte neurotoxice. Metoda de testare a toxicităţii sistemice cu doză repetată permite o primă triere a substanţelor care ar putea fi neurotoxice. Această metodă de testare poate fi utilizată pentru elaborarea unui studiu destinat obţinerii de informaţii suplimentare privind efectele neurotoxice observate în cadrul studiilor de toxicitate sistemică cu doză repetată sau confirmării acestora. Cu toate acestea, în unele cazuri, potenţiala neurotoxicitate a anumitor categorii de substanţe chimice poate fi evaluată în mod mai adecvat direct prin aplicarea acestei metode, fără colectarea în prealabil a indicaţiilor care pot fi oferite de studiile de toxicitate sistemică cu doză repetată. Aici sunt incluse, de exemplu, cazurile în care:
      
                  —
               
               
                  sunt observate semne de neurotoxicitate sau leziuni neuropatologice în cadrul studiilor de toxicitate, altele decât studiile de toxicitate sistemică cu doză repetată; sau
               
            
                  —
               
               
                  substanţele prezintă asemănări de structură sau există alte informaţii privind existenţa unor caracteristici comune cu substanţe neurotoxice cunoscute.
               
            În plus, utilizarea acestei metode poate fi adecvată şi în alte cazuri; pentru mai multe informaţii a se vedea referinţa 1.
      Această metodă a fost elaborată astfel încât să poată fi adaptată în funcţie de diverse nevoi specifice privind confirmarea neurotoxicităţii histopatologice şi comportamentale a unei substanţe chimice, precum şi pentru a oferi o caracterizare şi o cuantificare a reacţiei neurotoxice.
      În trecut, neurotoxicitatea era asimilată unei neuropatii implicând leziuni neuropatologice sau disfuncţii neurologice, cum ar fi convulsiile, paralizia sau tremorul. Deşi neuropatia reprezintă o manifestare importantă a neurotoxicităţii, în prezent este evident că mai există multe alte semne de toxicitate la nivelul sistemului nervos (de exemplu pierderea coordonării motorii, deficienţe senzoriale, diminuarea capacităţii de învăţare şi a memoriei) care nu sunt întotdeauna evidenţiate de studiile asupra neuropatiei sau de alte tipuri de studii.
      Această metodă de testare a neurotoxicităţii a fost elaborată în vederea detectării efectelor neurocomportamentale şi neuropatologice importante la rozătoare adulte. Deşi efectele la nivelul comportamentului pot indica un impact negativ asupra organismului chiar şi în absenţa unor modificări morfologice, nu toate modificările la nivelul comportamentului sunt specifice sistemului nervos. În consecinţă, toate modificările observate trebuie evaluate având în vedere şi datele histopatologice, hematologice sau biochimice corespondente, precum şi datele privind alte tipuri de toxicitate sistemică. Testele care trebuie realizate în cadrul acestei metode pentru caracterizarea şi cuantificarea reacţiilor neurotoxice cuprind proceduri histopatologice şi comportamentale specifice care pot fi completate prin investigaţii electrofiziologice şi/sau biochimice (1) (2) (3) (4).
      Substanţele neurotoxice pot acţiona asupra mai multor ţinte din cadrul sistemului nervos prin mai multe mecanisme. Deoarece nu se poate elabora o singură serie de teste care să permită o evaluare aprofundată a potenţialului neurotoxic al tuturor substanţelor, poate fi necesară şi efectuarea altor teste in vivo sau in vitro specifice tipurilor de neurotoxicitate studiate sau preconizate.
      Această metodă de testare poate fi utilizată, de asemenea, împreună cu indicaţiile prevăzute în Liniile directoare OCDE privind strategiile şi metodele de testare a neurotoxicităţii (1) în vederea elaborării de studii destinate unei mai bune caracterizări şi cuantificări a relaţiei doză-efect pentru o mai bună estimare a nivelului concentraţiei la care nu se observă niciun efect advers sau pentru a pune în evidenţă pericolele cunoscute sau potenţiale prezentate de substanţa respectivă. De exemplu, pot fi elaborate studii destinate identificării şi evaluării mecanismului sau mecanismelor neurotoxice sau completării datelor deja obţinute prin protocoalele de observaţie neurocomportamentale şi neuropatologice de bază. Prin aceste studii nu trebuie să se încerce obţinerea aceloraşi date care ar fi obţinute oricum prin utilizarea protocoalelor standard recomandate pentru această metodă dacă datele respective sunt deja disponibile şi nu sunt considerate necesare pentru interpretarea rezultatelor studiului.
      Informaţiile oferite de acest test de neurotoxicitate, efectuat independent sau în combinaţie cu alte teste, permit:
      
                  —
               
               
                  determinarea caracterului permanent sau reversibil al efectelor substanţei chimice asupra sistemului nervos;
               
            
                  —
               
               
                  o mai bună caracterizare a alterărilor de la nivelul sistemului nervos asociate expunerii la substanţa chimică şi o mai bună înţelegere a mecanismelor care stau la baza acestora;
               
            
                  —
               
               
                  determinarea relaţiei doză-efect şi timp-efect în vederea estimării nivelului concentraţiei la care nu se observă niciun efect advers (care se poate utiliza pentru stabilirea criteriilor de siguranţă pentru substanţa chimică respectivă).
               
            În cadrul acestei metode de testare, substanţa de testat se administrează pe cale orală. Dacă sunt mai adecvate alte căi de administrare (de exemplu dermică sau prin inhalare), este posibil să se impună şi modificarea procedurilor recomandate. Alegerea căii de administrare depinde de tipul expunerii la om şi de informaţiile toxicologice şi cinetice disponibile.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Efect advers: orice alterare faţă de nivelul de referinţă provocată de tratament şi care reduce capacitatea de supravieţuire, de reproducere sau de adaptare la mediu a organismului.
      
         Doză: cantitatea de substanţă de testat administrată. Doza se exprimă ca greutate (g, mg) a substanţei de testat sau ca greutate a substanţei de testat pe unitatea de greutate corporală a animalului de experienţă (de exemplu mg/kg) sau sub formă de concentraţie alimentară constantă (ppm).
      
         Dozare: termen general care desemnează doza administrată, frecvenţa şi durata administrării.
      
         Neurotoxicitate: modificare adversă a structurii sau a funcţiei sistemului nervos provocată de expunerea la un agent chimic, biologic sau fizic.
      
         Substanţă neurotoxică: orice agent chimic, biologic sau fizic care poate provoca neurotoxicitate.
      
         NOAEL: abrevierea pentru nivelul dozei fără efect advers vizibil; reprezintă nivelul cel mai mare al dozei la care nu se observă niciun efect advers provocat de tratament.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa de testat se administrează pe cale orală sub forma mai multor doze mai multor grupuri de rozătoare de experienţă. În general, se administrează doze repetate, în cadrul unui regim de dozare de 28 de zile, subcronic (90 de zile) sau cronic (1 an sau mai mult). Procedura descrisă în cadrul acestei metode poate fi utilizată şi pentru studiile de neurotoxicitate acută. Animalele sunt testate în vederea detectării sau a caracterizării anomaliilor comportamentale şi/sau neurologice. Pe parcursul fiecărei perioade de observaţie se evaluează diferite aspecte ale comportamentului care pot fi afectate de substanţe neurotoxice. La sfârşitul testului se perfuzează in situ animale de fiecare sex din fiecare grup şi li se recoltează în vederea preparării şi a examinării secţiuni din creier, din măduva spinării şi din nervii periferici.
      Dacă studiul se realizează independent în vederea depistării neurotoxicităţii sau a caracterizării efectelor neurotoxice, animalele din fiecare grup care nu sunt utilizate pentru perfuzare şi pentru examenul histopatologic ulterior (a se vedea tabelul 1) pot fi utilizate pentru diferite proceduri neurocomportamentale, neurochimice sau electrofiziologice pe baza cărora se pot completa datele colectate în cadrul examinărilor standard impuse de această metodă (1). Aceste examinări suplimentare pot fi deosebit de utile în cazurile în care observaţiile empirice sau efectele anticipate sugerează un tip specific de neurotoxicitate sau o ţintă a neurotoxicităţii substanţei. Restul animalelor pot fi, de asemenea, utilizate pentru evaluări de tipul celor din cadrul metodelor de testare din studiile de toxicitate cu doză repetată pe rozătoare.
      Dacă procedurile din cadrul acestei metode sunt combinate cu cele din cadrul altor metode, trebuie să se prevadă un număr de animale suficient pentru realizarea observaţiilor impuse de ambele studii.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Alegerea speciei de animale
      Specia preferată de rozătoare este şobolanul, deşi se pot utiliza şi alte specii, dacă se justifică alegerea. Se folosesc rase de experienţă, alegându-se animale adulte tinere şi sănătoase. Femelele trebuie să fie nulipare şi să nu fie însărcinate. Administrarea dozelor trebuie să înceapă cât mai curând posibil după înţărcare, preferabil înainte ca animalele să împlinească vârsta de şase săptămâni şi în orice caz înainte de atingerea vârstei de nouă săptămâni. Cu toate acestea, dacă acest studiu se realizează în combinaţie cu altele, este posibil să fie necesară ajustarea acestei limite de vârstă. La începutul studiului diferenţele de greutate dintre animalele utilizate nu trebuie să depăşească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex. Dacă se realizează un studiu de scurtă durată cu doză repetată ca test preliminar pentru un studiu pe termen lung, în ambele studii se folosesc animale din aceeaşi suşă şi din aceeaşi sursă.
      1.4.2.   Condiţii de adăpostire şi de hrănire
      Temperatura sălii în care se află animalele de experienţă trebuie să fie de 22 oC (± 3 oC). Deşi umiditatea relativă trebuie să fie de cel puţin 30 % şi preferabil să nu depăşească 70 % decât în timpul operaţiunilor de curăţare a sălii, obiectivul pentru umiditate este ca aceasta să fie de 50-60 %. Iluminatul trebuie să fie artificial, şi se alternează 12 ore de lumină şi 12 ore de întuneric. Sunetele puternice intermitente trebuie reduse la minimum. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă.. Alegerea regimului alimentar poate fi influenţată de faptul că în acesta trebuie adăugată şi substanţa de testat, dacă se administrează prin această metodă. Animalele pot fi găzduite în cuşti fie individual, fie în grupuri mici de acelaşi sex.
      1.4.3.   Pregătirea animalelor
      Se aleg aleatoriu animal tinere şi sănătoase care se împart în grupul tratat şi în grupul martor. Cuştile trebuie aranjate astfel încât să se reducă la minimum posibilele efecte provocate de această aranjare. Animalele se marchează individual astfel încât să poată fi identificate şi se păstrează în cuşti timp de cel puţin 5 (cinci) zile înainte de începerea studiului pentru a permite aclimatizarea la condiţiile de laborator.
      1.4.4.   Calea de administrare şi pregătirea dozelor
      În cadrul acestei metode substanţa de testat se administrează pe cale orală. Substanţa de testat se poate administra prin gavaj, prin alimentaţie, prin apa potabilă sau prin capsule. Se pot utiliza şi alte căi de administrare (de exemplu dermică sau prin inhalare), dar este posibil să fie necesară modificarea procedurilor recomandate. Alegerea căii de administrare depinde de tipul expunerii la om şi de informaţii toxicologice şi cinetice disponibile. Alegerea căii de administrare precum şi eventualele modificări aduse procedurilor din cadrul acestei metode de testare trebuie justificate.
      Dacă este necesar, substanţa de testat se poate dizolva sau suspenda într-un vehicul adecvat. Se recomandă utilizarea de soluţii sau suspensii apoase, şi numai dacă acest lucru nu este posibil, utilizarea de soluţii/suspensii în ulei (de exemplu, ulei de porumb) sau, ca soluţie de ultimă instanţă, utilizarea de soluţii/suspensii în care se folosesc alte vehicule. Proprietăţile toxice ale vehiculului trebuie să fie cunoscute. În plus, trebuie avute în vedere şi următoarele caracteristici ale vehiculului: efectele acestuia asupra absorbţiei, distribuţiei, metabolismului sau retenţiei substanţei de testat care i-ar putea afecta caracteristicile toxice şi efectele asupra consumului de hrană sau de apă sau asupra stării de nutriţie a animalului.
      1.5.   PROCEDURA DE TESTARE
      1.5.1.   Numărul şi sexul animalelor
      Dacă studiul se realizează independent, se folosesc cel puţin 20 de animale (10 femele şi 10 masculi) pentru fiecare grup tratat sau grup martor pe care se vor realiza observaţii clinice şi funcţionale. La sfârşitul studiului, dintre cei zece masculi şi cele zece femele se selectează cel puţin cinci masculi şi cinci femele care sunt perfuzaţi in situ şi supuşi unui examen neuro-histopatologic detaliat. Dacă se observă doar un număr limitat de animale dintr-un grup tratat în vederea detectării efectelor neurotoxice, animalele în cauză trebuie să fie printre cele perfuzate. Dacă studiul se realizează împreună cu un studiu de toxicitate cu doză repetată, se foloseşte un număr adecvat de animale care permite îndeplinirea obiectivelor ambelor studii. În tabelul 1 este indicat numărul minim de animale din fiecare grup necesar pentru diferite combinaţii de studii. Dacă este prevăzută sacrificarea unor animale înainte de finalizarea studiului sau constituirea unor grupuri pe care să se observe reversibilitatea efectelor, persistenţa sau survenirea efectelor toxice cu întârziere după tratare, sau dacă se preconizează realizarea unor observaţii suplimentare, numărul de animale trebuie majorat astfel încât să fie suficient pentru efectuarea observaţiilor şi a examenelor histopatologice.
      1.5.2.   Grupul tratat şi grupul martor
      Ca regulă generală, trebuie să existe cel puţin trei grupuri tratate, dar dacă din evaluarea altor date disponibile rezultă că administrarea repetată a unei doze de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi nu are niciun efect, se poate realiza un test-limită. Dacă nu sunt disponibile date adecvate, se poate realiza un studiu preliminar destinat stabilirii nivelurilor dozelor care trebuie utilizate. Exceptând tratamentul cu substanţa de testat, animalele din grupul martor se tratează în mod identic cu animalele din grupul tratat. Dacă substanţa de testat se administrează cu ajutorul unui vehicul, grupul martor trebuie să primească, de asemenea, un volum de vehicul egal cu cel mai mare volum utilizat pentru grupul tratat.
      1.5.3.   Verificarea fiabilităţii
      Laboratorul care realizează studiul trebuie să prezinte date care demonstrează capacitatea sa de a realiza studiul şi sensibilitatea metodelor utilizate. Aceste date trebuie să dovedească posibilitatea de detectare şi cuantificare, după caz, a diferitelor criterii recomandate, de exemplu reacţii neurovegetative, reactivitate senzorială, forţă de prehensiune şi activitate motorie. Referinţele 2-9 conţin informaţii privind substanţele care provoacă diferite tipuri de reacţii neurotoxice şi care pot fi utilizate ca substanţe martor pozitiv. Se pot utiliza şi date istorice, cu condiţia ca elementele principale ale procedurilor de testare să rămână aceleaşi. Se recomandă actualizarea periodică a datelor istorice. De fiecare dată când laboratorul modifică un element esenţial al testelor sau al metodelor trebuie să se obţină date noi care să demonstreze că sensibilitatea procedurii se menţine.
      1.5.4.   Alegerea dozei
      Nivelurile dozelor trebuie alese având în vedere toate datele disponibile privind toxicitatea şi cinetica substanţei de testat sau ale substanţele înrudite. Se alege cea mai mare doză pentru a provoca efecte neurotoxice sau efecte de toxicitate sistemică evidente. În continuare se alege o serie de doze descrescătoare pentru a se pune în evidenţă o eventuală relaţie doză-efect şi absenţa nivelului dozei fără efect advers vizibil (NOAEL) la cel mai mic nivel al dozei. În principiu nivelurile dozelor trebuie alese astfel încât efectele neurotoxice primare de la nivelul sistemului nervos să poată fi deosebite de efectele legate de toxicitatea sistemică. Cea mai bună soluţie constă de multe ori din alegerea a două sau trei intervale, iar adăugarea unui al patrulea interval este adesea preferabilă utilizării unor intervale foarte mari (de exemplu care depăşesc factorul 10) între dozaje. Dacă există estimări realiste privind expunerea umană, acestea trebuie, de asemenea, luate în considerare.
      1.5.5.   Testul-limită
      Dacă un studiu cu o doză de cel puţin 1 000 mg/kg greutate corporală/zi realizat în conformitate cu metoda descrisă anterior nu provoacă niciun efect neurotoxic observabil şi dacă datele privind compuşii cu structură asemănătoare sugerează că este puţin probabil ca substanţa să fie toxică, se poate considera că nu este necesară realizarea unui studiu cu trei niveluri de dozare. În funcţie de expunerea umană anticipată, este posibil să fie necesară mărirea dozei orale administrate în cadrul testului-limită. Pentru celelalte căi de administrare, cum sunt inhalarea şi aplicarea dermică, nivelul maxim posibil de expunere este adesea determinat de proprietăţile fizice şi chimice ale substanţei de testat. Pentru studiile orale acute, doza din cadrul testului-limită trebuie să fie de cel puţin 2 000 mg/kg.
      1.5.6.   Administrarea dozelor
      Animalelor li se administrează substanţa de testat în fiecare zi, şapte zile pe săptămână, timp de cel puţin 28 de zile; administrarea timp de cinci zile pe săptămână sau alegerea unei perioade mai scurte de expunere trebuie justificate. Dacă substanţa de testat se administrează prin gavaj, animalele trebuie să primească o doză unică, introdusă cu ajutorul unei sonde gastrice sau al unei canule de intubaţie adecvate. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o dată depinde de dimensiunea animalelor de experienţă. Acest volum nu trebuie să depăşească 1 ml/100 g greutate corporală. Cu toate acestea, în cazul soluţiilor apoase se pot utiliza până la 2 ml/100 g greutate corporală. Cu excepţia cazului substanţelor iritante sau corozive care produc efecte exacerbate în concentraţii mai mari, variaţiile volumului administrat trebuie reduse la minimum prin ajustarea concentraţiei astfel încât să se menţină un volum constant la toate nivelurile dozei.
      În cazul substanţelor administrate prin intermediul hranei sau al apei potabile este important ca bilanţul nutriţional sau hidric normal să nu fie afectat de cantitatea de substanţă utilizată. Dacă substanţa de testat se administrează prin hrană, există două posibilităţi: fie sub forma unei concentraţii constante în alimentaţie (ppm), fie sub forma unei doze constante în raport cu greutatea corporală a animalului; trebuie să se precizeze alternativa utilizată. Dacă substanţa se administrează prin gavaj, doza se administrează în fiecare zi aproximativ la aceeaşi oră, şi se ajustează după cum este necesar pentru a menţine un nivel constant al dozei în raport cu greutatea corporală a animalului. Dacă se realizează un studiu cu doză repetată ca studiu preliminar în vederea realizării unui studiu pe termen lung, în cadrul ambelor studii trebuie să se folosească regimuri alimentare similare. În cadrul studiilor de toxicitate acută, dacă nu se poate administra o doză unică, aceasta poate fi administrată în părţi mai mici pe parcursul unei perioade de cel mult 24 de ore.
      1.6.   OBSERVAŢII
      1.6.1.   Frecvenţa observaţiilor şi a testelor
      În cadrul studiilor cu doză repetată, perioada de observaţie trebuie să acopere întreaga perioadă de tratament. În cadrul studiilor de toxicitate acută, observaţiile se realizează pe parcursul unei perioade de 14 zile post-tratament. Şi animalele din grupurile satelit care nu sunt expuse pe parcursul unei perioade post-tratament trebuie observate pe parcursul aceleiaşi perioade.
      Observaţiile trebuie să fie suficient de frecvente pentru a maximiza probabilitatea de detectare a oricăror anomalii comportamentale şi/sau neurologice. Observaţiile se realizează de preferinţă în fiecare zi la aceeaşi oră, având în vedere şi perioada pe parcursul căreia se estimează că efectele anticipate ale tratamentului sunt mai pronunţate. Tabelul 2 conţine informaţii privind frecvenţa observaţiilor clinice şi a testelor funcţionale. Dacă există date cinetice sau de altă natură obţinute în cadrul unor studii anterioare care sugerează că sunt mai adecvate alte momente ale zilei pentru observaţii, teste sau pentru observaţiile post-tratament, se adoptă un alt program care să permită colectarea cât mai multor informaţii posibil. Modificările programului trebuie justificate.
      1.6.1.1.   Supravegherea stării generale de sănătate şi a mortalităţii/morbidităţii
      Se examinează minuţios toate animalele cel puţin o dată pe zi, verificându-se starea lor de sănătate, iar mortalitatea şi morbiditatea se verifică de două ori pe zi.
      1.6.1.2.   Observaţii clinice detaliate
      Toate animalele selectate pentru a fi supuse unor examinări clinice detaliate (a se vedea tabelul 1) sunt supuse acestei examinări o dată înainte de prima expunere (pentru a permite realizarea de comparaţii pe acelaşi individ) şi în continuare la diferite intervale, în funcţie de durata studiului (a se vedea tabelul 2). Grupurile satelit pe care se studiază reversibilitatea efectelor sunt supuse unei examinări detaliate la sfârşitul perioadei de recuperare. Aceste examinări se efectuează într-o zonă standard, situată în afara cuştii în care se află animalele de obicei. Rezultatele se consemnează cu atenţie, prin utilizarea unor sisteme de cotare incluzând criterii sau scale de cotare pentru fiecare dintre măsurătorile efectuate. Criteriile şi scalele utilizate trebuie definite în mod explicit de către laboratorul care efectuează testul. Sunt necesare eforturi pentru a reduce la minimum variaţiile condiţiilor de testare (cu excepţia celor legate de tratament) şi pentru ca examinările să fie realizate de observatori experimentaţi care nu au fost informaţi cu privire la tratamentul administrat.
      Se recomandă o abordare structurată, în cadrul căreia fiecărui animal studiat să i se aplice sistematic criterii clar definite (inclusiv definiţia „intervalului” normal) la fiecare examinare. „Intervalul normal” se documentează în mod adecvat. Se înregistrează toate semnele observate. Dacă este posibil, se înregistrează şi magnitudinea semnelor observate. Observaţiile clinice vizează, dar nu în mod limitativ, modificările la nivelul pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, apariţia unor secreţii şi excreţii şi reacţiile neurovegetative (de exemplu secreţii lacrimale, piloerecţie, dimensiunea pupilei, respiraţie neobişnuită şi/sau respiraţie pe gură, urinare şi/sau defecaţie neobişnuită, de exemplu decolorarea urinei).
      Se consemnează şi toate reacţiile neobişnuite legate de poziţia corpului, de nivelul de activitate (de exemplu explorarea mai intensă sau mai redusă a zonei standard) şi de coordonarea mişcărilor. Se consemnează, de asemenea, modificările mersului (de exemplu, mers legănat, ataxie), modificările posturii (de exemplu, cocoaşe) şi reacţiile la manipulare, la locul în care se află şi la alţi stimuli din mediu, precum şi prezenţa unor mişcări clonice sau tonice, a convulsiilor sau a tremorului, comportamentul stereotip (de exemplu, curăţarea excesivă, mişcări neobişnuite ale capului, mişcări circulare repetate) precum şi comportamentele bizare (de exemplu, muşcături, lins excesiv, automutilare, mers înapoi, emiterea de sunete) sau agresivitatea.
      1.6.1.3.   Teste funcţionale
      Ca şi observaţiile clinice detaliate, testele funcţionale se realizează pe toate animalele selecţionate în acest scop (a se vedea tabelul 1) o dată înainte de expunere, iar apoi periodic. Frecvenţa testelor funcţionale depinde şi de durata studiului (a se vedea tabelul 2). Pe lângă perioadele de observare prevăzute în tabelul 2, se realizează şi observaţii funcţionale pe grupurile satelit, cât mai aproape de momentul sacrificării. Testele funcţionale studiază reactivitatea senzorială la diferiţi stimuli [de exemplu auditivi, vizuali şi proprioceptivi (5) (6) (7)], forţa de prehensiune (8) şi activitatea motorie (9). Activitatea motorie se măsoară cu ajutorul unui dispozitiv automat care poate detecta atât intensificarea, cât şi reducerea activităţii. Dacă se foloseşte un alt sistem anume, acesta trebuie să fie cantitativ, şi să aibă o sensibilitate şi o fiabilitate demonstrate. Fiecare dispozitiv se testează pentru a asigura fiabilitatea sa în timp şi coerenţa rezultatelor obţinute cu ajutorul diferitelor dispozitive. Referinţele relevante conţin informaţii suplimentare privind procedurile care pot fi utilizate. Dacă nu există date (de exemplu, informaţii privind legătura dintre structură şi activitate, date epidemiologice, alte studii toxicologice) privind potenţialele efecte neurotoxice, trebuie avute în vedere teste mai specializate pentru explorarea funcţiilor senzorială şi motorie sau a memoriei şi a capacităţii de învăţare. Referinţa (1) conţine informaţii suplimentare privind teste mai specializate şi utilizarea acestora.
      În mod excepţional, animalele care prezintă semne marcate de toxicitate care ar putea afecta considerabil testul funcţional pot fi eliminate din cadrul acestui test. Eliminarea animalelor din cadrul unui test funcţional trebuie justificată.
      1.6.2.   Greutatea corporală şi consumul de hrană/apă
      În cadrul studiilor cu o durată de până la 90 de zile, toate animalele se cântăresc cel puţin o dată pe săptămână şi se măsoară, de asemenea, şi consumul de hrană (sau consumul de apă, dacă substanţa de testat se administrează pe această cale) cel puţin săptămânal. În cadrul studiilor pe termen lung, toate animalele sunt cântărite cel puţin o dată pe săptămână pe parcursul primelor 13 săptămâni, iar apoi cel puţin o dată la 4 săptămâni. Se măsoară şi consumul de hrană (sau consumul de apă, dacă substanţa de testat se administrează pe această cale) cel puţin săptămânal pe parcursul primelor 13 săptămâni, iar apoi la intervale de aproximativ trei luni, cu excepţia cazurilor în care trebuie procedat altfel din cauza stării de sănătate sau a greutăţii corporale.
      1.6.3.   Examenul oftalmologic
      În cadrul studiilor cu o durată de peste 28 de zile, înainte de administrarea substanţei de testat şi la sfârşitul studiului, se realizează un examen oftalmologic cu ajutorul unui oftalmoscop sau al unui instrument echivalent adecvat, de preferinţă la toate animalele sau cel puţin la animalele din grupul căruia i-a fost administrată doza cea mai mare şi la animalele din grupurile martor. Dacă se detectează modificări la nivelul ochilor sau dacă semnele clinice sugerează că este necesar, se examinează toate animalele. În cadrul studiilor pe termen lung se realizează şi un examen oftalmologic la 13 săptămâni. Examenele oftalmologice nu sunt necesare dacă există deja date disponibile obţinute în cadrul altor studii cu durată şi doze similare.
      1.6.4.   Hematologie şi biochimie clinică
      În cazul studiilor de neurotoxicitate realizate în combinaţie cu un studiu de toxicitate sistemică cu doză repetată, examinările hematologice şi determinările biochimice clinice se realizează în conformitate cu metoda utilizată în cadrul studiului de toxicitate sistemică. Probele se prelevează astfel încât să se reducă la minimum orice potenţiale efecte asupra comportamentului neurologic.
      1.6.5.   Histopatologie
      Examenul neuropatologic trebuie elaborat astfel încât să vină în completarea observaţiilor realizate în etapa in vivo a studiului şi să le aprofundeze. Se fixează in situ ţesuturi de la cel puţin 5 animale/sex/grup (a se vedea tabelul 1 şi paragraful următor) utilizându-se tehnicile obişnuite de perfuzare şi de fixare (a se vedea referinţa 3, capitolul 5 şi referinţa 4, capitolul 50). Se înregistrează toate modificările observabile importante. Dacă studiul se realizează independent în vederea depistării neurotoxicităţii sau pentru caracterizarea efectelor neurotoxice, restul animalelor pot fi utilizate fie pentru examinarea comportamentului neurologic (10) (11), pentru examinări neuropatologice (10) (11) (12) (13), neurochimice (10) (11) (14) (15) sau electrofiziologice (10) (11) (16) (17) în completarea procedurilor şi a examinărilor descrise sau pot fi incluse între animalele supuse examenului histopatologic, mărind numărul acestora. Aceste proceduri suplimentare sunt deosebit de utile în cazurile în care observaţiile empirice sau efectele anticipate sugerează un tip specific de neurotoxicitate sau o ţintă a neurotoxicităţii (2) (3). Restul animalelor pot fi, de asemenea, utilizate pentru evaluările patologice de rutină din cadrul metodei utilizate în studiile cu doză repetată.
      Toate probele de ţesut acoperite cu parafină sunt supuse unei proceduri obişnuite de coloraţie, de exemplu coloraţie hematoxilin-eozină, şi examinate la microscop. Dacă se observă semne de neuropatii periferice sau dacă există suspiciuni în acest sens, se examinează probe de ţesut nervos periferic acoperite cu plastic. Semnele clinice pot recomanda, de asemenea, examinarea altor zone sau utilizarea unor proceduri speciale de coloraţie. Referinţele 3 şi 4 conţin informaţii privind alte zone care pot fi examinate suplimentar. Coloranţii speciali pot fi utili şi pentru evidenţierea unor tipuri specifice de modificări patologice (18).
      Se realizează şi un examen histologic pe secţiuni reprezentative din sistemul nervos central şi periferic (a se vedea referinţa 3, capitolul 5 şi referinţa 4, capitolul 50). În mod normal zonele examinate includ: creierul anterior, centrul emisferelor cerebrale, inclusiv o secţiune din hipocamp, creierul central, cerebelul, puntea lui Varolio, bulbul rahidian, ochiul împreună cu nervul optic şi retina, măduva spinării şi protuberanţele cervicale şi lombare, ganglionii din rădăcina posterioară, fibrele din rădăcinile posterioară şi anterioară, nervul sciatic proximal, nervul tibial proximal (la nivelul genunchiului) şi ramificaţiile nervului tibial în muşchii gambei. Secţiunile din măduva spinării şi din nervii periferici trebuie să fie atât transversale cât şi longitudinale. Se acordă o atenţie specială vascularizării sistemului nervos. Trebuie examinată şi o probă de muşchi scheletici, în special de la nivelul gambei. Se acordă o atenţie specială regiunilor din sistemul nervos central şi din sistemul nervos periferic care au o structură celulară şi fibroasă despre care se ştie că sunt afectate în mod special de substanţele neurotoxice.
      Referinţele (3) şi (4) conţin informaţii privind alterările neuropatologice tipice provocate de expunerea la substanţe neurotoxice. Se recomandă o examinare în etape a probelor de ţesut, în cadrul căreia probele prelevate de la grupul căruia i s-a administrat doza cea mai mare sunt comparate cu probele prelevate de la grupul martor. Dacă nu este identificată nicio alterare neuropatologică pe baza probelor de la aceste grupuri, nu mai sunt necesare alte analize. Dacă se observă alterări neurologice la grupul căruia i s-a administrat doza cea mai mare, trebuie codate şi examinate succesiv probe din toate ţesuturile care pot fi afectate, prelevate de la grupurile cărora li s-au administrat doza intermediară şi doza cea mai redusă.
      Dacă prin examinarea calitativă se evidenţiază alterări neuropatologice, se realizează o a doua examinare a tuturor regiunilor sistemului nervos care prezintă astfel de alterări. Se realizează secţiuni din toate regiunile care pot fi afectate de la toate grupurile tratate, şi se examinează aleatoriu fără a se cunoaşte codul. Se înregistrează frecvenţa şi gravitatea tuturor leziunilor. După evaluarea tuturor regiunilor pentru toate grupurile tratate, se poate realiza decodarea şi se efectuează o analiză statistică în vederea determinării relaţiei doză-răspuns. Trebuie descrise diversele niveluri de gravitate pentru fiecare leziune.
      Rezultatele examenului neuropatologic se evaluează având în vedere observaţiile şi măsurătorile privind comportamentul, precum şi alte date obţinute prin studii de toxicitate sistemică anterioare sau concomitente asupra substanţei de testat.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Rezultatele sunt indicate pentru fiecare animal în parte. Pe lângă aceasta, toate rezultatele sunt recapitulate într-un tabel care indică, pentru fiecare test sau grup martor, numărul de animale de la începutul testului, numărul de animale care au murit în timpul testului sau care au fost sacrificate în conformitate cu principiul minimei suferinţe, momentul morţii sau al sacrificării cu minimă suferinţă, numărul animalelor care prezentau semne de toxicitate, descrierea semnelor de toxicitate observate, inclusiv momentul apariţiei, durata, tipul şi gravitatea efectelor toxice, numărul de animale care au prezentat leziuni, inclusiv tipul şi gravitatea acestora.
      2.2.   EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Rezultatele studiului se evaluează în vederea stabilirii frecvenţei, a gravităţii şi pentru corelarea efectelor neuropatologice şi de comportament (şi a efectelor neurochimice şi electrofiziologice dacă se realizează examinări suplimentare) şi a altor efecte adverse observate. Dacă este posibil, rezultatele numerice se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate şi general acceptate. Metodele statistice se aleg în etapa în care este conceput studiul.
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Substanţa de testat:
                  
                              —
                           
                           
                              natura fizică (inclusiv izomerizare, puritate, proprietăţi fizice şi chimice);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date de identificare.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Vehiculul (dacă este cazul):
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animale de experienţă:
                  
                              —
                           
                           
                              specia/rasa utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul, vârsta şi sexul animalelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursa animalelor, condiţiile de adăpostire, aclimatizare, regimul alimentar etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul testului.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea substanţei de testat/prepararea hranei, concentraţia obţinută, stabilitatea şi omogenitatea preparatului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              precizări privind dozele administrate, inclusiv privind vehiculul, volumul şi forma fizică a materialului administrat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind administrarea substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea dozei alese;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea căii şi a duratei de expunere alese;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              transformarea concentraţiei substanţei de testat administrate prin hrană/apa potabilă (ppm) în doză efectivă (mg/kilogram greutate corporală/zi), dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei şi a apei.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Proceduri de observaţie şi de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              detalii privind repartizarea de animale din fiecare grup în sub-grupul perfuzat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind sistemele de evaluare, inclusiv criterii şi scale de evaluare utilizate pentru fiecare măsurătoare din cadrul observaţiilor clinice detaliate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind testele funcţionale de explorare a reactivităţii senzoriale la diverşi stimuli (de exemplu auditivi, vizuali şi proprioceptivi); detalii privind evaluarea forţei de prehensiune; detalii privind evaluarea activităţii motorii (inclusiv privind dispozitivele automate pentru detectarea activităţii) şi detalii privind celelalte proceduri utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date privind examenul oftalmologic şi, dacă este cazul, examenele hematologice şi testele de biochimie clinică, cu indicarea nivelurilor de referinţă relevante;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind procedurile specifice de cercetare a modificărilor neurocomportamentale, neuropatologice, neurochimice sau electrofiziologice.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              greutatea corporală/modificările acesteia, inclusiv greutatea la sacrificare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              consumul de alimente şi, după caz, de apă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              reacţia toxică pe sexe şi pe doză, inclusiv semnele de toxicitate sau mortalitatea;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              natura, gravitatea şi durata (momentul apariţiei şi durata ulterioară) efectelor clinice observate (indiferent dacă sunt sau nu reversibile);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea detaliată a rezultatelor tuturor testelor funcţionale;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultatele autopsiei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea detaliată a tuturor modificărilor neurocomportamentale, neuropatologice, neurochimice sau electrofiziologice, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date privind absorbţia şi metabolismul, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tratamentul statistic aplicat rezultatelor, dacă este cazul.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor:
                  
                              —
                           
                           
                              informaţii privind relaţia doză-răspuns;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              legătura dintre orice alte efecte toxice şi concluzia privind potenţialul neurotoxic al substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              nivelul concentraţiei la care nu se observă niciun efect advers.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Concluzii:
                  
                              —
                           
                           
                              se încurajează furnizarea unei aprecieri privind neurotoxicitatea globală a substanţei de testat.
                           
                        
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris. In preparation.
               
            
                  2.
               
               
                  Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.
               
            
                  3.
               
               
                  World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria Document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals.
               
            
                  4.
               
               
                  Spencer. P. S. and Schauraburg, H. H. (1980). Spencer, P. S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co., Baltimore/London, 726-742.
               
            
                  5.
               
               
                  Tupper D. E. and Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003.
               
            
                  6.
               
               
                  Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.
               
            
                  7.
               
               
                  Moser V. C., McDaniel, K. M. and Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl, Pharmacol., 108, 267-283.
               
            
                  8.
               
               
                  Meyer O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C. and Riley, M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236.
               
            
                  9.
               
               
                  Crofton, K. M., Haward, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reirer, L. W., Tilson, H. A. and MacPhail, R. C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. teratol., 13, 599-609.
               
            
                  10.
               
               
                  Tilson, H. A,, and Mitchell, C. L. eds. (1992), Neumtoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.
               
            
                  11.
               
               
                  Chang, L. W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker. New York.
               
            
                  12.
               
               
                  Broxup, B. (1991). Neuropathology as a screen for Neurotoxicity Assessement. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695.
               
            
                  13.
               
               
                  Moser, V. C., Anthony, D. C., Sette, W. F. and MacPhail, R. C. (1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343-352.
               
            
                  14.
               
               
                  O’Callaghan J. P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452.
               
            
                  15.
               
               
                  O’Callaghan J. P. and Miller, D. B. (1988). Acute Exposure of the Neonatal Rut to Triethyltin Rcsults in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378.
               
            
                  16.
               
               
                  Fox. D. A., Lowndes, H. E. and Birkamper, G. G. (1982). Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, pp. 299-335.
               
            
                  17.
               
               
                  Johnson, B. L. (1980). Electrophysiological Methods in Neurotoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co.,. Baltimore/London, pp. 726-742.
               
            
                  18.
               
               
                  Bancroft, J. D. and Steven A. (1990). Theory and Practice of Histological Techniques, Chapter 17, Neuropathological Techniques, Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.
               
            Tabelul 1
      Numărul minim de animale necesare pe grup pentru studiile de neurotoxicitate realizate separat sau în combinaţie cu alte studii
      
                   
               
               
                  STUDIU DE NEUROTOXICITATE REALIZAT:
               
            
                  Separat
               
               
                  În combinaţie cu un studiu de 28 de zile
               
               
                  În combinaţie cu un studiu de 90 de zile
               
               
                  În combinaţie cu un studiu de toxicitate cronică
               
            
                  Număr total de animale pe grup
               
               
                  10 masculi şi 10 femele
               
               
                  10 masculi şi 10 femele
               
               
                  15 masculi şi 15 femele
               
               
                  25 masculi şi 25 femele
               
            
                  Număr de animale selectate pentru testele funcţionale, inclusiv pentru observaţii clinice detaliate
               
               
                  10 masculi şi 10 femele
               
               
                  10 masculi şi 10 femele
               
               
                  10 masculi şi 10 femele
               
               
                  10 masculi şi 10 femele
               
            
                  Număr de animale selectate pentru perfuzarea in situ şi examinare neurohistopatologică
               
               
                  5 masculi şi 5 femele
               
               
                  5 masculi şi 5 femele
               
               
                  5 masculi şi 5 femele
               
               
                  5 masculi şi 5 femele
               
            
                  Număr de animale selectate pentru studii cu doză repetată/subcronice/de toxicitate cronică, examinări hematologice, de biochimie clinică, histopatologie etc. conform dispoziţiilor din Linia directoare relevantă
               
               
                   
               
               
                  5 masculi şi 5 femele
               
               
                  10 masculi (10) şi 10 femele (10)
                  
               
               
                  20 masculi (10) şi 20 femele (10)
                  
               
            
                  Observaţii suplimentare, după caz
               
               
                  5 masculi şi 5 femele
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
         
      Tabelul 2
      Frecvenţa observaţiilor clinice şi a testelor funcţionale
      
                  Tipul observaţiilor
               
               
                  Durata studiului
               
            
                  Acut
               
               
                  28 de zile
               
               
                  90 de zile
               
               
                  Cronic
               
            
                  La toate animalele
               
               
                  Stare generală de sănătate
               
               
                  zilnic
               
               
                  zilnic
               
               
                  zilnic
               
               
                  zilnic
               
            
                  Mortalitate/morbiditate
               
               
                  de două ori pe zi
               
               
                  de două ori pe zi
               
               
                  de două ori pe zi
               
               
                  de două ori pe zi
               
            
                  La animalele selectate pentru observaţii funcţionale
               
               
                  Observaţii clinice detaliate
               
               
                  
                              —
                           
                           
                              înainte de prima expunere
                           
                        
                              —
                           
                           
                              în termen de 8 ore de la administrarea dozei, în momentul estimat al efectului maxim
                           
                        
                              —
                           
                           
                              în zilele 7 şi 14 după administrarea dozei
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              înainte de prima expunere
                           
                        
                              —
                           
                           
                              săptămânal în continuare
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              înainte de prima expunere
                           
                        
                              —
                           
                           
                              o dată în prima sau a doua săptămână de după expunere
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lunar în continuare
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              înainte de prima expunere
                           
                        
                              —
                           
                           
                              o dată la sfârşitul primei luni de expunere
                           
                        
                              —
                           
                           
                              la fiecare trei luni în continuare
                           
                        
            
                  Teste funcţionale
               
               
                  
                              —
                           
                           
                              înainte de prima expunere
                           
                        
                              —
                           
                           
                              în termen de 8 ore de la administrarea dozei, în momentul estimat al efectului maxim
                           
                        
                              —
                           
                           
                              în zilele 7 şi 14 după administrarea dozei
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              înainte de prima expunere
                           
                        
                              —
                           
                           
                              în a patra săptămână de tratament, cât mai aproape posibil de sfârşitul perioadei de expunere
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              înainte de prima expunere
                           
                        
                              —
                           
                           
                              o dată în prima sau a doua săptămână de după expunere
                           
                        
                              —
                           
                           
                              lunar în continuare
                           
                        
               
                  
                              —
                           
                           
                              înainte de prima expunere
                           
                        
                              —
                           
                           
                              o dată la sfârşitul primei luni de expunere
                           
                        
                              —
                           
                           
                              la fiecare trei luni în continuare
                           
                        
            B.44.   ABSORBŢIA CUTANATĂ: METODA IN VIVO
      
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 427 (2004) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Expunerea la multe produse chimice are loc în principal prin piele în timp ce majoritatea studiilor toxicologice efectuate pe animale în laboratoare folosesc administrarea pe cale orală. Studiul asupra absorbţiei percutanate in vivo descris în metoda de faţă asigură conexiunea necesară pentru a extrapola rezultatele studiilor realizate prin administrare orală atunci când se realizează evaluări în materie de siguranţă după expunerea cutanată.
      O substanţă trebuie să traverseze un număr mare de straturi celulare ale pielii înainte să pătrundă în sânge. Pentru cele mai multe substanţe, stratul care determină proporţia de absorbţie este stratul cornos compus din celule moarte. Permeabilitatea cutanată depinde atât de lipofilicitatea unor produşi chimici şi de grosimea stratului extern al epidermei, cât şi de factori precum greutatea moleculară şi concentraţia substanţei. În general, pielea şobolanilor şi a iepurilor are o permeabilitate mai mare decât cea a oamenilor, în timp ce porcuşorii de guineea şi maimuţele au pielea asemănătoare cu cea a oamenilor.
      Metodele pentru măsurarea absorbţiei percutanate pot fi împărţite în două categorii: in vivo şi in vitro. Metoda in vivo este capabilă să furnizeze informaţii corespunzătoare asupra absorbţiei cutanate la diferite animale de laborator. Mult mai recent dezvoltate, metodele in vitro utilizează transportul parţial sau total prin stratul de piele umană sau animală până la un rezervor de fluid. Metoda in vitro este descrisă separat, în cadrul unei alte metode de testare (1). Pentru a alege metoda cea mai adecvată într-o situaţie dată, se recomandă să se consulte documentul de orientare al OCDE pentru realizarea de studii privind absorbţia cutanată (2) care furnizează mai multe detalii privind pertinenţa metodelor in vivo şi in vitro.
      Metoda in vivo, descrisă în prezenta metodă, permite determinarea adâncimii de pătrundere prin piele a substanţei de testare, în compartimentul sistemic. Tehnica a fost folosită la scară largă timp de mulţi ani (3) (4) (5) (6) (7). Deşi studiile cu privire la absorbţia percutanată in vitro pot fi adecvate în multe cazuri, există situaţii în care doar un studiu in vivo poate să asigure informaţiile necesare.
      Avantajele metodei in vivo sunt următoarele: utilizarea unui sistem intact din punct de vedere fiziologic şi metabolic, utilizarea unei specii comune multor studii de toxicitate şi posibilitatea de modificare în vederea utilizării cu alte specii. Dezavantajele sunt: utilizarea animalelor vii, utilizarea materialului marcat radioactiv pentru a facilita fiabilitatea rezultatelor, dificultăţi în determinarea fazei de absorbţie precoce şi diferenţele de permeabilitate între pielea umană şi cea a speciilor preferate (şobolani). Pielea animalelor este în general mai permeabilă, ceea ce poate duce la o supraestimare a absorbţiei percutanate la om (6) (8) (9). Substanţele caustice/corosive nu trebuie testate pe animale vii.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Doza neabsorbită reprezintă cantitatea de substanţă eliminată prin curăţare de pe suprafaţa pielii după expunere şi oricare altă cantitate prezentă pe pansamentul nonocluziv, inclusiv orice cantitate volatilizată de pe suprafaţa pielii în timpul expunerii.
      
         Doza absorbită (in vivo
         ) reprezintă cantitatea de substanţă prezentă în urină, în reziduurile colectate la curăţarea cuştii, în fecale, în aerul expirat (dacă este măsurat), în sânge, ţesuturi (dacă sunt colectate) şi pe carcasa rămasă, după îndepărtarea pielii corespunzătoare zonei de aplicare.
      
         Doza absorbabilă reprezintă cantitatea de substanţă prezentă pe piele sau în piele după curăţare.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa testată, de preferinţă marcată radioactiv, este aplicată pe pielea rasă a animalelor în regim de dozaj normal sau adecvat, sub forma unui preparat caracteristic folosit în mod curent. Preparatul de testare rămâne în contact cu pielea o perioadă de timp stabilită sub pansament corespunzător (nonocluziv, semiocluziv sau ocluziv) pentru a preveni ingerarea acestuia. La finalul perioadei de expunere, pansamentul este îndepărtat şi pielea este curăţată cu agent de curăţare adecvat, pansamentul şi materialul folosit pentru aplicarea agentului de curăţare sunt păstrate pentru analiză şi se aplică un pansament nou. Înainte, în timpul şi după perioada de expunere, animalele sunt adăpostite în cuşti individuale metabolice, iar excreţiile şi aerul expirat, pe parcursul acestor perioade, sunt colectate pentru analiză. Colectarea aerului expirat poate fi omisă dacă există suficiente informaţii care să confirme absenţa sau formarea în cantităţi limitate a unui metabolit volatil radioactiv. Fiecare studiu necesită în mod normal mai multe grupuri de animale care vor fi expuse la preparatul de testare. La finalul perioadei de expunere, animalele dintr-un lot sunt eutanasiate. Ulterior şi alte loturi de animale sunt eutanasiate la intervale de timp planificate (2). La finalul perioadei de prelevare, animalele rămase sunt eutanasiate, sângele este colectat pentru analiză, zona folosită pentru aplicare este prelevată pentru analiză şi carcasa este analizată pentru a găsi substanţele neexcretate. Se examinează probele prin mijloace adecvate şi se estimează gradul de absorbţie percutanată (6) (8) (9).
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Selectarea speciei de animale
      Specia cea mai des utilizată este şobolanul, dar pot fi folosite, de asemenea, speciile fără păr sau cele care au rata de absorbţie cutanată mai apropiată de rata de absorbţie la om (3) (6) (7) (8) (9). Se utilizează animale adulte tinere, sănătoase, de acelaşi sex (de regulă masculi), dintre speciile folosite de obicei în laborator. La începutul studiului, variaţia greutăţii animalelor utilizate nu trebuie să depăşească ± 20 % din greutatea medie. De exemplu, se utilizează şobolani masculi cu greutatea cuprinsă între 200 şi 250 g, în special şobolanii cu greutatea situată spre limita superioară a acestui interval.
      1.4.2.   Numărul şi sexul animalelor
      Pentru fiecare preparat de testare şi fiecare programată se utilizează un lot de cel puţin patru animale de acelaşi sex. Fiecare lot de animale este eutanasiat la intervale de timp diferite, de exemplu la sfârşitul perioadei de expunere (de obicei 6 sau 24 de ore) şi la sfârşitul altor perioadelor (de exemplu, 48 şi 72 de ore). Dacă există date disponibile care să ateste diferenţe semnificative între masculi şi femele în ceea ce priveşte nivelul de toxicitate dermică, se alege sexul cel mai sensibil. Dacă nu există asemenea date, atunci se pot folosi animale de orice sex.
      1.4.3.   Condiţii de adăpostire şi de hrănire
      Temperatura din camera experimentală trebuie să fie de 22 oC (± 3 oC). Deşi se recomandă ca umiditatea relativă să fie de cel puţin 30 % şi să nu depăşească, de preferinţă, 70 %, cu excepţia momentului în care se curăţă camera, se tinde spre un nivel de 50-60 %. Iluminatul trebuie să fie artificial, succesiunea fiind de 12 ore de lumină, 12 ore de întuneric. Pentru alimentaţie, se poate utiliza hrană convenţională de laborator, cu furnizarea unei cantităţi nelimitate de apă potabilă. În timpul studiului şi de preferinţă în perioada de aclimatizare, animalele sunt adăpostite în cuşti metabolice separate. Din moment ce hrana şi apa vărsate ar compromite rezultatele, riscurile unor astfel de evenimente trebuie reduse.
      1.4.4.   Pregătirea animalelor
      Animalele sunt marcate pentru a permite identificarea individuală şi sunt ţinute în cuşti timp de cel puţin cinci zile înainte de începerea studiului pentru a permite aclimatizarea la condiţiile de laborator.
      După perioada de aclimatizare şi cu aproximativ 24 de ore înainte de dozare, pielea fiecărui animal va fi rasă pe o porţiune din zona omoplaţilor şi spatelui. Proprietăţile de permeabilitate ale pielii vătămate sunt diferite de proprietăţile de permeabilitate ale pielii intacte; prin urmare, este necesară o atenţie sporită pentru a nu zgâria pielea. După operaţiunea de radere şi cu aproximativ 24 de ore înainte ca substanţa de testare să fie aplicată pe piele (a se vedea punctul 1.4.7) suprafaţa pielii trebuie ştearsă cu acetonă pentru a îndepărta sebumul. Nu se recomandă spălarea suplimentară cu apă şi săpun deoarece orice depunere de săpun poate facilita absorbţia substanţei de testare. Suprafaţa trebuie să fie suficient de mare, de preferinţă de cel puţin 10 cm2, pentru a permite calcularea cantităţii de substanţă chimică absorbită pe cm2 de piele. Această suprafaţă este practicabilă în cazul şobolanilor cu greutatea de 200-250 g. După pregătire, animalele sunt repuse în cuştile metabolice.
      1.4.5.   Substanţa de testare
      Substanţa de testare reprezintă produsul ale cărui caracteristici de penetrare urmează să fie studiate. În mod ideal, substanţa de testare trebuie să fie marcată radioactiv.
      1.4.6.   Preparatul de testare
      Preparatul de testare (de exemplu material pur, diluat sau amestec care conţine substanţa chimică de testare aplicată pe piele) trebuie să fie acelaşi (sau un înlocuitor realist) cu preparatul la care pot fi expuşi oamenii sau alte posibile specii ţintă. Orice variaţie de la preparatul utilizat trebuie justificată. Atunci când este necesar, substanţa de testare este dizolvată sau pusă într-o suspensie într-un mediu corespunzător Caracteristicile de absorbţie şi interacţiunea potenţială cu substanţa de testare trebuie cunoscute, pentru medii altele decât apa.
      1.4.7.   Aplicarea pe piele
      Pe suprafaţa pielii se delimitează o zonă de aplicare de dimensiuni specifice. Ulterior, o cantitate cunoscută din preparatul de testare este uniform aplicată pe zona respectivă. În mod normal, această cantitate trebuie să simuleze expunerea umană potenţială, de obicei 1-5 mg/cm2 pentru solide şi până la 10 μl/cm2 pentru lichide. Orice alte cantităţi trebuie justificate prin condiţiile de utilizare preconizate, obiectivele experimentului sau caracteristicile fizice ale preparatului de testare. După aplicare, zona tratată trebuie protejată astfel încât animalul să nu poată să se cureţe. Figura 1 prezintă un exemplu de dispozitiv utilizat în acest scop. În mod normal, zona de aplicare este protejată printr-un pansament nonocluziv (de exemplu un pansament permeabil de tifon din nailon). Totuşi, pentru aplicaţii nelimitate, zona de aplicare trebuie protejată cu un pansament ocluziv. În cazul în care de evaporarea substanţelor de testare semivolatile reduce gradul de recuperare al substanţei de testare până la un nivel inacceptabil (a se vedea punctul 1.4.10, primul paragraf), este necesar să se capteze substanţă evaporată într-un filtru de cărbune care acoperă dispozitivul de aplicare (a se vedea figura 1). Este important ca niciun dispozitiv să nu producă vătămări ale pielii, să nu absoarbă sau să nu reacţioneze cu preparatul de testare. Animalele sunt aduse înapoi în cuştile individuale metabolice pentru colectarea excrementelor.
      1.4.8.   Durata expunerii şi recoltarea probelor
      Durata expunerii reprezintă intervalul de timp cuprins între aplicarea şi îndepărtarea preparatului de testare prin spălarea pielii. Se utilizează o perioadă de expunere relevantă (de obicei de 6 sau 24 de ore), în funcţie de durata de expunere umană presupusă. După perioada de expunere, animalele sunt ţinute în cuştile metabolice până la termenul prevăzut. În timpul perioadei de studiu, animalele trebuie ţinute sub observaţie la intervale regulate, pentru depistarea simptomelor de toxicitate/reacţii anormale. La sfârşitul perioadei de expunere, pielea tratată trebuie cercetată pentru depistarea semnelor vizibile de iritaţie.
      Cuştile metabolice trebuie să faciliteze colectarea separată a urinei şi fecalelor pe tot parcursul studiului. Ele trebuie să permită, de asemenea, colectarea de dioxid de carbon 14C şi compuşi de carbon 14C volatili, care trebuie analizaţi atunci când sunt produşi într-o cantitate (> 5 %). Urina, fecalele şi fluidele recuperate (de exemplu dioxid de carbon 14C şi compuşi de carbon 14C volatili) trebuie colectate individual de la fiecare lot la fiecare interval de recoltare a probelor. Dacă există suficiente informaţii că nu se formează niciun metabolit volatil radioactiv sau că este prezent în cantităţi mici, se pot utiliza cuşti deschise.
      Excrementele sunt colectate pe parcursul perioadei de expunere, până la 24 de ore de la contactul iniţial cu pielea şi ulterior în fiecare zi până la finalul experimentului. În mod normal, trei intervale de colectare a excrementelor sunt suficiente, dar, în funcţie de scopul preconizat pentru preparatul de testare sau de datele cinetice existente, poate fi necesar să se prevadă intervale de timp suplimentare sau adaptate pentru studiu.
      La sfârşitul perioadei de expunere, dispozitivul de protecţie este îndepărtat de la fiecare animal şi păstrat separat pentru analiză. Pielea tratată a tuturor animalelor trebuie spălată de cel puţin trei ori cu agent de curăţare folosind tampoane adecvate. Trebuie evitată contaminarea celorlalte părţi ale corpului. Agentul de curăţare trebuie să fie reprezentativ pentru practicile de igienă normale (de exemplu, soluţie apoasă de săpun). La final, pielea trebuie uscată. Toate tampoanele şi materialele de curăţare trebuie păstrate pentru analiză. Animalelor din loturile stabilite pentru observaţii ulterioare li se aplică, înainte de repunerea în cuştile individuale, un pansament nou pentru a proteja zona tratată.
      1.4.9.   Proceduri finale
      Pentru fiecare lot, fiecare animal trebuie eutanasiat la momentul de timp prevăzut, iar sângele trebuie colectat pentru analiză. Dispozitivul protector sau pansamentul trebuie îndepărtate pentru analiză. Pielea din zona de aplicare şi o suprafaţă similară de piele rasă pe care nu s-a aplicat nicio substanţă trebuie prelevate de la fiecare animal pentru o analiză separată. Zona de aplicare poate fi fracţionată pentru separarea stratului cornos de epiderma de bază pentru a furniza mai multe informaţii asupra dispunerii substanţei chimice. Determinarea acestei dispuneri pe parcursul unui interval de timp, după perioada de expunere, trebuie să furnizeze indicii asupra comportamentului oricărei substanţe chimice în stratul cornos. Pentru a facilita fracţionarea pielii (după spălarea finală a pielii şi eutanasierea animalului), se îndepărtează orice pansamentul protector. Pielea din zona de aplicare, împreună cu o suprafaţă de piele circulară din jurul zonei de aplicare este prelevată şi fixată în ace pe o planşetă. Pe suprafaţa de piele se aplică o fâşie de bandă adezivă exercitând o presiune moderată şi se îndepărtează banda o dată cu stratul cornos. Se aplică fâşii succesive de bandă până când banda respectivă nu mai aderă la suprafaţa de piele, atunci când toată porţiunea de strat cornos a fost îndepărtată. Toate fâşiile de bandă adezivă, care provin de la acelaşi animal, pot fi amestecate într-un singur recipient în care se adaugă un digestiv de ţesut pentru a solubiliza stratul cornos. Se pot îndepărta orice ţesuturi-ţintă potenţiale pentru măsurători separate înainte ca carcasa rămasă să fie analizată pentru determinarea dozei absorbite. Carcasele animalelor sunt reţinute pentru analiză. O analiză a conţinutului total este de obicei suficientă. Organele ţintă pot fi îndepărtate pentru analiză separată (dacă acest lucru este indicat de către alte studii). Urina prezentă în vezică în momentul planificat pentru eutanasiere se adaugă la urina colectată anterior. După colectarea excrementelor din cuştile metabolice în momentul planificat pentru eutanasiere, cuştile şi trapele lor trebuie spălate cu un solvent corespunzător. Se analizează, în egală măsură, orice alt echipament potenţial contaminat.
      1.4.10.   Analiza
      În toate studiile trebuie să se obţină un nivel adecvat de recuperare (respectiv o medie de 100 ± 10 % de radioactivitate). Recuperările în afara acestui interval trebuie justificate. Cantitatea dozei administrate în fiecare mostră trebuie analizată prin proceduri validate în mod corespunzător.
      Consideraţiile de natură statistică trebuie să includă o măsurare a variaţiei testelor repetate pentru fiecare aplicaţie.
      2.   DATE
      Pentru fiecare animal, la fiecare interval de prelevare trebuie efectuate următoarele măsurători pentru depistarea substanţei chimice de testare şi/sau a metaboliţilor. În afară de datele individuale, datele grupate în funcţie de intervalele de prelevare se raportează sub formă de medii:
      
                  —
               
               
                  cantitatea asociată cu dispozitivele de protecţie;
               
            
                  —
               
               
                  cantitatea care poate fi îndepărtată de pe piele;
               
            
                  —
               
               
                  cantitatea din/de pe piele care nu poate fi spălată;
               
            
                  —
               
               
                  cantitatea prezentă în probele de sânge;
               
            
                  —
               
               
                  cantitatea din excremente şi aerul expirat (dacă este cazul);
               
            
                  —
               
               
                  cantitatea care rămâne în carcasă şi orice organe îndepărtate pentru analiză separată.
               
            Cantitatea de substanţă de testare şi/sau metaboliţii din excremente, din aerul expirat, din sânge şi din carcasă permit determinarea cantităţii totale absorbite la fiecare interval de timp. De asemenea, se poate calcula cantitatea de substanţă chimică de testare absorbită pe cm2 de piele expusă la substanţa de testare pe parcursul perioadei de expunere.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să includă cerinţele stipulate în protocolul de testare, inclusiv o justificare pentru sistemul de testare utilizat şi trebuie să cuprindă următoarele:
      
                   
               
               
                  Substanţa de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              date de identificare [număr CAS, dacă este disponibil, sursă, puritate (puritatea radiochimică), impurităţi cunoscute, număr lot];
                           
                        
                              —
                           
                           
                              stare fizică, proprietăţi fizico-chimice (de exemplu pH, volatilitate, solubilitate, stabilitate, greutate moleculară şi coeficientul de partiţie octanol/apă – log Pow)
                           
                        
            
                   
               
               
                  Pregătirea testului:
                  
                              —
                           
                           
                              formularea şi justificarea utilizării;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii referitoare la pregătirea testului, cantitatea aplicată, concentraţiile obţinute, mijloacele, stabilitatea şi omogenitatea.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animalele testate:
                  
                              —
                           
                           
                              speciile/rasele utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul, vârsta şi sexul animalelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              provenienţa animalelor, condiţii de adăpostire, diete, etc;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul testului.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              detalii cu privire la administrarea preparatului de testare (zonă de aplicare, metode de tastare, ocluzie/non-ocluzie, volum, extracţie, detectare);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii cu privire la calitatea hranei şi apei.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              orice semne de toxicitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date privind absorbţia, prezentate sub formă de tabel (exprimate ca rată, cantitate sau procent);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              recuperări totale ale experimentului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              interpretarea rezultatelor, comparaţie cu alte date disponibile privind absorbţia percutanată a substanţei de testare.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOFRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Testing Method B.45. Skin Absorption: In vitro Method.
               
            
                  2.
               
               
                  OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.
               
            
                  3.
               
               
                  ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20.
               
            
                  4.
               
               
                  Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for Environmental Protection Agency Requirements. J. Am. Coll. Toxicol. 8(5), 829-835.
               
            
                  5.
               
               
                  Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.
               
            
                  6.
               
               
                  EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Applications. Exposure Assessment Group, Office of Health and Environmental Assessment.
               
            
                  7.
               
               
                  EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic Substances.
               
            
                  8.
               
               
                  Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R (1990) In vivo percutaneous absorption of fragrance ingredients in reshus monkeys and humans. Fd. Chem. Toxic. 28, 369-373.
               
            
                  9.
               
               
                  Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic compounds through the skin in man. J. Invest Dermatol. 54, 399-404.
               
            Figura 1
      Exemplu de dispozitiv clasic utilizat pentru delimitarea şi protejarea zonei de aplicare în timpul studiilor de absorbţie percutanată in vivo
      
      
         
      B.   45. ABSORBŢIA CUTANATĂ: METODA DE TESTARE IN VITRO
      
      1.   METODĂ
      Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 428 (2004) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Prezenta metodă a fost concepută pentru a furniza informaţii cu privire la absorbţia unei substanţe de testare aplicată pe un eşantion de piele excizată. Metoda poate fi folosită fie în combinaţie cu metoda de absorbţie cutanată: metoda in vivo (1), fie separat. În vederea elaborării studiilor bazate pe prezenta metodă se recomandă consultarea documentului de orientare al OCDE pentru realizarea de studii privind absorbţia cutanată (2). Documentul de orientare a fost elaborat pentru a facilita alegerea procedurilor in vitro adecvate utilizării în situaţii specifice, care să asigure fiabilitatea rezultatelor obţinute cu ajutorul acestei metode.
      Metodele de măsurare a absorbţiei cutanate şi a expunerii dermice pot fi împărţite în două categorii: in vivo și in vitro. Metodele in vivo de măsurare a absorbţiei cutanate sunt bine cunoscute şi furnizează date farmacokinetice în cazul mai multor specii de animale. Metoda in vivo este descrisă separat în cadrul unei alte metode de testare (1). Metodele in vitro au fost utilizate timp de mai mulţi ani pentru măsurarea absorbţiei cutanate. Cu toate că nu s-au efectuat studii de validare a metodelor in vitro incluse în prezenta metodă de testare, experţii OCDE au stabilit în 1999 că există suficiente date evaluate pentru susţinerea metodei in vitro (3). Documentul de orientare (2) furnizează detalii suplimentare care fundamentează această decizie, printre care şi un număr important de comparaţii directe între metodele in vitro şi in vivo. Există o serie de monografii care tratează acest subiect şi prezintă un context amănunţit al utilizării metodei in vitro (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12). Metodele in vitro măsoară difuzia substanţelor chimice în piele şi prin piele până la un rezervor de fluid; acestea utilizează eşantioane de piele neviabilă, pentru a măsura doar difuzia sau eşantioane de piele proaspătă, activă din punct de vedere metabolic, pentru a măsura simultan difuzia şi metabolismul cutanat. Astfel de metode sunt folosite pentru a compara absorbţia, în piele şi prin piele, a diferite formule de substanţe chimice, furnizând în acelaşi timp modele utile pentru evaluarea absorbţiei percutanate la om.
      Metoda in vitro nu se poate aplica în toate cazurile sau clasele de substanţe chimice, dar poate fi folosită pentru o evaluare preliminară calitativă a penetraţiei cutanate. În anumite cazuri poate fi nevoie şi de completarea acesteia cu datele in vivo. Se recomandă consultarea documentului de orientare (2) pentru a stabili situaţiile în care utilizarea metodei in vitro este adecvată. Referinţa (3) furnizează informaţii detaliate suplimentare pentru a facilita luarea unei decizii.
      Prezenta metodă prezintă principiile generale pentru măsurarea absorbţiei cutanate şi a difuziei unei substanţe de testare folosind un eşantion de piele excizată. Se poate folosi piele de la multe specii mamifere, inclusiv de la om. Proprietăţile de permeabilitate ale pielii se păstrează după excizie pentru că obstacolul principal în calea difuziei este stratul cornos neviabil; nu s-a identificat nicio formă de transport activ al substanţelor chimice prin piele. S-a observat că pielea posedă capacitatea de metabolizare a unor substanţe chimice în timpul absorbţiei percutanate (6), însă acest proces nu limitează proporţia dozei reale absorbite, deşi poate afecta natura substanţei care intră în fluxul sanguin.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Doză neabsorbită: reprezintă cantitatea de substanţă eliminată prin curăţare de la suprafaţa pielii după expunere, precum şi oricare altă cantitate prezentă pe pansamentul neocluziv, inclusiv orice cantitate volatilizată de pe suprafaţa pielii în timpul expunerii.
      
         Doză absorbită (in vitro
         ): masă de substanţă de testare care ajunge la fluidul receptor sau în circulaţia sistemică într-o perioadă de timp stabilită.
      
         Doză absorbabilă (in vitro
         ): reprezintă cantitatea de substanţă prezentă pe piele sau în piele după curăţare.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Substanţa de testare, marcată radioactiv după caz, este aplicată pe suprafaţa unui eşantion de piele care separă cele două camere ale unei celule de difuzie. Înainte de a fi îndepărtată printr-o procedură corespunzătoare de curăţare, substanţa chimică rămâne pe piele în condiţii specifice şi pentru o perioadă determinată de timp. Fluidul receptor este prelevat la intervale stabilite în cursul perioadei de testare şi analizat pentru a căuta substanţa de testare şi/sau metaboliţi.
      Atunci când sunt utilizate sisteme metabolic active, metaboliţii substanţei chimice de testare pot fi analizaţi utilizând metode corespunzătoare. La sfârşitul experimentului se cuantifică distribuţia substanţei chimice de testare şi a metaboliţilor.
      Absorbţia substanţei de testare pe o perioadă de timp determinată este măsurată cu ajutorul analizei fluidului receptor şi a pielii tratate, în condiţiile corespunzătoare descrise în cadrul prezentei metode şi în documentul de orientare (2). Dacă nu se poate demonstra că absorbţia poate fi determinată numai cu ajutorul valorilor fluidului receptor, substanţa de testare rămasă în piele trebuie considerată ca şi absorbită. Analiza altor componente (materialul curăţat de pe piele şi cel rămas în straturile pielii) permite continuarea evaluării datelor, inclusiv evacuarea totală a substanţei de testare şi procentajul de recuperare.
      Pentru a demonstra funcţionarea şi fiabilitatea sistemului de testare în laboratorul în care se efectuează studiul, trebuie să fie disponibile rezultatele obţinute pentru substanţele chimice de referinţă, în concordanţă cu literatura de specialitate referitoare la metoda folosită. Această cerinţă poate fi îndeplinită prin testarea unei substanţe de referinţă corespunzătoare (care prezintă, de preferinţă, o lipofilicitate apropiată de substanţa de testare) în paralel cu substanţa de testare sau prin furnizarea unui istoric adecvat al datelor referitoare la un anumit număr de substanţe de referinţă cu lipofilicitate diferită (de exemplu cofeină, acid benzoic şi testosteron).
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Celula de difuzie
      Celula de difuzie este formată dintr-o cameră donatoare şi o cameră receptoare, grefa de piele fiind aşezată între acestea (un exemplu de model tipic este prezentat în figura 1). Celula trebuie să asigure o etanşare perfectă în jurul pielii, să permită o prelevare uşoară şi amestecare bună a soluţiei receptoare în contact cu partea inferioară a pielii, precum şi o bună supraveghere a temperaturii din celulă şi a conţinutului acesteia. Sunt acceptate celule de difuzie atât statice, cât şi dinamice. În mod normal, camerele donatoare sunt lăsate deschise în timpul expunerii la o doză limitată dintr-un preparat de testare. Totuşi, camerele donatoare pot fi închise pentru aplicaţii nelimitate şi în anumite cazuri cu doze limitate.
      1.4.2.   Fluidul receptor
      Se preferă folosirea unui fluid receptor care favorizează fenomenele fiziologice, deşi se pot folosi şi alte fluide, cu condiţia ca acestea să fie justificate. Se furnizează compoziţia exactă a fluidului receptor. Se demonstrează solubilitatea corespunzătoare a substanţei chimice de testare în fluidul receptor, astfel încât aceasta să nu acţioneze ca o barieră pentru absorbţie. În plus, fluidul receptor nu trebuie să afecteze integritatea de preparare a pielii. Într-un sistem dinamic, viteza de scurgere nu trebuie să împiedice difuzia substanţei de testare în fluidul receptor. Într-un sistem celular static, fluidul trebuie amestecat continuu şi recoltat în mod regulat. Dacă se studiază metabolismul, fluidul receptor trebuie să întreţină viabilitatea pielii pe parcursul experimentului.
      1.4.3.   Preparatul de piele
      Se poate folosi piele de origine umană sau animală. Se cunoaşte faptul că folosirea pielii umane este supusă considerentelor şi condiţiilor etice naţionale şi internaţionale. Deşi se preferă pielea viabilă, se poate folosi şi piele neviabilă, cu condiţia ca integritatea pielii să poată fi demonstrată. Se acceptă atât membrane epidermice (separate enzimatic, termic sau chimic), cât şi eşantioane de piele cu grosime limitată (în mod tipic, cu grosimea cuprinsă între 200-400 μm) prelucrată cu un dermatom. Se poate folosi piele cu grosime integrală, însă trebuie evitată folosirea grosimii excesive (aproximativ > 1 mm), cu excepţia cazului în care este necesar pentru determinarea substanţei chimice din straturile de piele. Trebuie explicată selecţia speciilor, zona anatomică şi tehnica de preparare. Trebuie furnizate date acceptabile de la minimum patru mostre pentru fiecare preparat de testare.
      1.4.4.   Integritatea preparatului de piele
      Este esenţial ca pielea să fie preparată în mod adecvat. Manevrarea incorectă poate duce la deteriorarea stratului cornos, aşadar trebuie verificată integritatea pielii preparate. Atunci când se studiază metabolismul pielii, pielea excizată proaspăt trebuie folosită cât mai repede posibil şi în condiţii despre care se ştie că favorizează activitatea metabolică. În general, pielea proaspăt excizată trebuie folosită în termen de 24 de ore, însă perioada acceptabilă de stocare poate varia în funcţie de sistemul enzimatic implicat în metabolism şi de temperaturile de stocare (13). Atunci când preparatele de piele au fost stocate înainte de utilizare, trebuie dovedit că şi-au păstrat funcţia de barieră.
      1.4.5.   Substanţa de testare
      Substanţa de testare reprezintă produsul ale cărui caracteristici de penetrare urmează să fie studiate. În mod ideal, substanţa de testare este marcată radioactiv.
      1.4.6.   Preparatul de testare
      Preparatul de testare (de exemplu materialul pur, diluat sau amestec care conţine substanţa de testare aplicată pe piele) trebuie să fie acelaşi (sau un înlocuitor realist) cu preparatul la care pot fi expuşi oamenii sau alte specii ţintă posibile. Orice variaţie de la preparatul utilizat trebuie justificată.
      1.4.7.   Concentraţiile şi formulele substanţelor de testare
      În mod normal se folosesc mai multe concentraţii ale substanţei de testare, astfel încât să se acopere valorile superioare din gama de expuneri potenţiale în cazul oamenilor. În egală măsură, se poate lua în considerare testarea unei serii de formule tipice.
      1.4.8.   Aplicarea pe piele
      În condiţii normale, omul este supus expunerilor la substanţe chimice în doze limitate. Prin urmare, se foloseşte o aplicare care simulează expunerea umană, în mod normal de 1-5 mg/cm2 de piele pentru solide şi până la 10 μl/cm2 pentru lichide. Cantitatea este explicată de condiţiile presupuse de folosire, de obiectivele studiului sau de caracteristicile fizice ale preparatului de testare. De exemplu, aplicările pe suprafaţa pielii pot fi nelimitate atunci când se aplică volume mari pe unitate de suprafaţă.
      1.4.9.   Temperatura
      Difuzia pasivă a substanţelor chimice (prin urmare şi absorbţia acestora în piele) este afectată de temperatură. Camera de difuzie şi pielea trebuie menţinute la o temperatură constantă apropiată de temperatura normală a pielii de 32 ± 1 oC. În funcţie de modele de celule, temperatura băii sau blocului încălzit poate varia, pentru a asigura respectarea normei fiziologice a receptorului/pielii. Se preferă ca umiditatea să fie între 30 şi 70 %.
      1.4.10.   Durata expunerii şi prelevarea
      Expunerea pielii la preparatul de testare poate avea loc pe durata întregului experiment sau pe o perioadă mai scurtă (pentru a imita un anumit tip de expunere a omului). Pielea se curăţă de surplusul de preparat de testare cu ajutorul unui agent de curăţare corespunzător, iar materialul rezultat în urma curăţării este colectat pentru analiză. Procedura de eliminare a preparatului de testare depinde de condiţiile de utilizare prevăzute şi trebuie să fie justificată. O caracterizare adecvată a profilului de absorbţie necesită, în mod normal, o perioadă de 24 de ore de prelevare a probelor. Perioadele de prelevare nu trebuie să depăşească în mod normal 24 de ore, deoarece integritatea pielii poate începe să se deterioreze. În cazul substanţelor de testare care penetrează pielea rapid nu este nevoie de această perioadă de 24 de ore, însă în cazul substanţelor care penetrează încet, poate fi nevoie de perioade mai lungi de timp. Frecvenţa de prelevare a fluidului receptor ar trebui să permită prezentarea grafică a profilului de absorbţie a substanţei de testare.
      1.4.11.   Proceduri finale
      Trebuie analizate toate componentele sistemului de testare (camera donatoare, materialul rezultat în urma curăţării suprafeţei de piele, preparatul de piele şi camera receptoare/fluidul receptor), iar rata de recuperare trebuie determinată. În unele cazuri, pielea poate fi fracţionată în zona de piele expusă şi zona de piele sub marginea celulei şi în fracţiuni de strat cornos, epidermă şi dermă destinate unei analize separate.
      1.4.12.   Analiza
      În toate studiile trebuie să se obţină un nivel adecvat de recuperare (respectiv o medie de 100 ± 10 % de radioactivitate) Recuperările în afara acestui interval trebuie justificate. Cantitatea de substanţă de testare din fluidul receptor, din preparatul de piele, din materialul rezultat în urma curăţării suprafeţei pielii şi din resturile din dispozitiv sunt analizate printr-o procedură corespunzătoare.
      2.   DATE
      Se prezintă analiza fluidului receptor, distribuţia substanţei chimice testate în sistemul de testare şi profilul absorbţiei în timp. Atunci când are loc expunerea la doze limitate, se calculează cantitatea curăţată prin spălare de pe piele, cantitatea prezentă în piele (inclusiv în diferite straturi de piele, în cazul în care există o analiză) şi cantitatea prezentă în fluidul receptor (rata şi cantitatea sau procentul din doza aplicată). Absorbţia cutanată poate fi uneori exprimată doar cu ajutorul datelor fluidului receptor. Totuşi, atunci când substanţa de testare rămâne în piele la sfârşitul studiului, poate fi necesară includerea acesteia în cantitatea totală absorbită (a se vedea alineatul 66 din referinţa 3). Atunci când are loc expunerea la doze nelimitate, datele pot permite calcularea unei constante de permeabilitate (Kp). În aceste condiţii, procentul absorbit este irelevant.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să includă cerinţele stipulate în protocol, inclusiv justificarea sistemului de testare utilizat, şi trebuie să cuprindă următoarele:
      
                   
               
               
                  Substanţa de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              stare fizică, proprietăţi fizico-chimice (cel puţin greutatea moleculară şi coeficientul de partiţie octanol/apă – log Pow), puritate (puritatea radiochimică);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date de identificare (de exemplu numărul de lot);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea în fluidul receptor.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Preparatul de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              formula şi justificarea utilizării;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              omogenitatea.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              sursele şi locul pielii, metoda de preparare, condiţiile de stocare înainte de folosire, orice tratări preliminare (curăţare, tratare cu antibiotice etc.), măsurători de integritate a pielii, statutul metabolic, justificarea utilizării;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              modelul celulei, compoziţia fluidului receptor, viteza de scurgere a fluidului receptor sau intervalele şi procedeele de prelevare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind aplicarea preparatului de testare şi cuantificare a a dozei aplicate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              durata de expunere;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind înlăturarea preparatului de testare de pe piele, de exemplu curăţarea prin spălare a pielii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind analiza pielii şi tehnicile de fracţionare utilizate pentru a demonstra distribuţia în piele;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              procedurile de spălare a celulei şi a aparaturii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de analiză, tehnicile de extracţie, limitele de detectare şi validarea metodei analitice.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              recuperările totale ale experimentului (doza aplicată ≡ spălări ale pielii + piele + fluid receptor + spălări ale celulei);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              întocmirea unui tabel cu recuperările fiecărei celule în fiecare compartiment;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              profilul absorbţiei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              întocmirea unui tabel cu datele absorbţiei (exprimate ca rată, cantitate sau procent).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluzii.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Testing Method B.44. Skin Absorption: In vivo Method.
               
            
                  2.
               
               
                  OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.
               
            
                  3.
               
               
                  OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, Anexa 1 la ENV/JM/TG(2 000)5. OECD, Paris.
               
            
                  4.
               
               
                  Kemppainen B. W. and Reifenrath W. G. (1990). Methods for skin absorption. CRC Press, Boca Raton.
               
            
                  5.
               
               
                  Bronaugh R.L. and Collier, SW. (1991). Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Studies, in In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications, RL Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pag. 237-241.
               
            
                  6.
               
               
                  Bronaugh R. L. and Maibach H. I. (1991). In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications. CRC Press, Boca Raton.
               
            
                  7.
               
               
                  European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals (1993). Monografia No. 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussels.
               
            
                  8.
               
               
                  Diembeck W., Beck H., Benech-Kieffer F. Courtellemont P., Dupuis J., Lovell W., Paye M., Spengler J., Steiling W. (1999). Test Guidelines for In Vitro Assessment of Dermal Absorption and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191-205.
               
            
                  9.
               
               
                  Recommended Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, Nr. 65.
               
            
                  10.
               
               
                  Howes D., Guy R, Hadgraft J., Heylings JR et al. (1996). Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM Workshop Report ATLA 24, 81 R10.
               
            
                  11.
               
               
                  Schaefer H. and Redelmeier T. E. (1996). Skin barrier: principles of percutaneous absorption. Karger, Basel.
               
            
                  12.
               
               
                  Roberts M. S. and Walters K. A. (1998). Dermal absorption and toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.
               
            
                  13.
               
               
                  Jewell, C., Heylings, J. R., Clowes, H. M. And Williams, F. M. (2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356-365.
               
            Figura 1
      Exemplu de model tipic al celulei de difuzie statică pentru studiile in vitro a absorbţiei percutanate
      
         
      
         (1)  Se notează suprafaţa cu opacitate corneană.
      
         (2)  La anumite măsurări în ser sau în plasmă, şi în special pentru cele de glucoză, se recomandă ca animalele să fi fost flămânzite peste noapte. Dacă nu au fost flămânzite în prealabil, variabilitatea rezultatelor va fi mai mare şi riscă să mascheze efectele mai subtile, precum şi să îngreuneze interpretarea. În schimb, flămânzirea poate modifica metabolismul general al animalelor şi, în special în cazul studiilor bazate pe alimentaţie, poate să perturbe expunerea cotidiană la substanţa testată. Dacă probele sunt prelevate după o perioadă de flămânzire, măsurările trebuie efectuate după examinările funcţionale din săptămâna a patra.
      
         (3)  Pentru mai multe analize de ser şi plasmă, în special pentru glucoză, este de preferat absenţa hranei în timpul nopţii. Cel mai important motiv este că variaţia crescută care ar rezulta inevitabil în urma consumului de hrană ar putea să mascheze efectele mai subtile şi ar face dificilă interpretarea. Pe de altă parte însă, lipsa hranei pe durata nopţii poate să interfereze cu metabolismul general al animalelor şi riscă, în special în studiile în care substanţa testată este administrată în alimente, să perturbe expunerea zilnică la această substanţă. Dacă se optează pentru lipsa hranei pe timpul nopţii, trebuie efectuate analize de biochimie clinică după observaţiile funcţionale ale studiului.
      
         (4)  În prezent cunoscută sub denumirea de alaninaminotransferază.
      
         (5)  În prezent cunoscută sub denumirea de aspartataminotransferază.
      
         (6)  Aceste organe se recoltează de la 10 animale/sex/lot în cazul rozătoarelor şi de la toate nerozătoarele şi se cântăresc.
      
         (7)  Aceste organe se recoltează de la 10 animale/sex/lot în cazul rozătoarelor şi de la toate nerozătoarele şi se cântăresc.
      
         (8)  În această metodă, prin lot de referinţă se înţelege un lot căreia substanţa de testat i se administrează pe o altă cale garantându-se o disponibilitate completă a dozei.
      
         (9)  Solventul utilizat pentru măsurarea absorbţiei.
      
         (10)  
      
                  †
               
               
                  Aici sunt incluse cinci animale selectate pentru teste funcţionale şi observaţii clinice detaliate din cadrul studiului de neurotoxicitate.
               
            
   
      PARTEA C: METODE PENTRU DETERMINAREA ECOTOXICITĂŢII
      CUPRINS
      
                  C.1.
               
               TOXICITATEA ACUTĂ LA PEŞTI
            
                  C.2.
               
               
                  DAPHNIA SP. TESTUL IMOBILIZĂRII ACUTE
            
                  C.3.
               
               TESTUL DE INHIBIŢIE A CREŞTERII ALGELOR
            
                  C.4.
               
               DETERMINAREA BIODEGRADABILITĂŢII „RAPIDE”
            
                  PARTEA I.
               
               CONSIDERAŢII GENERALE
            
                  PARTEA II.
               
               TESTUL DE EPUIZARE COD (Metoda C.4-A)
            
                  PARTEA III.
               
               TESTUL DE SCREENING MODIFICAT OCDE (Metoda C.4-B)
            
                  PARTEA IV.
               
               TESTUL DE DEGAJARE A CO2 (Metoda C.4-C)
            
                  PARTEA V.
               
               TESTUL DE RESPIROMETRIE MANOMETRICĂ (Metoda C.4-D)
            
                  PARTEA VI.
               
               TESTUL CU VAS ÎNCHIS (Metoda C.4-E)
            
                  PARTEA VII.
               
               TESTUL MITI (METODA C.4-F)
            
                  C.5.
               
               DEGRADAREA – CONSUMUL BIOCHIMIC DE OXIGEN
            
                  C.6.
               
               DEGRADAREA – CONSUMUL CHIMIC DE OXIGEN
            
                  C.7.
               
               DEGRADAREA – DEGRADAREA ABIOTICĂ: HIDROLIZA CA O FUNCŢIE A PH-ULUI
            
                  C.8.
               
               TOXICITATEA LA RÂME
            
                  C.9.
               
               BIODEGRADARE – METODA ZAHN-WELLENS
            
                  C.10.
               
               BIODEGRADARE – TESTE DE SIMULARE CU NĂMOL ACTIV
            
                  C.11.
               
               BIODEGRADARE – NĂMOLUL ACTIV: TEST DE INHIBIŢIE A RESPIRAŢIEI
            
                  C.12.
               
               BIODEGRADARE – TESTUL SCAS MODIFICAT
            
                  C.13.
               
               BIOCONCENTRAREA: EXPERIENŢA CU REÎNNOIRE CONTINUĂ ASUPRA PEŞTILOR
            
                  C.14.
               
               TESTUL DE CREŞTERE A PUIETULUI DE PEŞTE
            
                  C.15.
               
               PEŞTII, TESTUL DE TOXICITATE PE TERMEN SCURT ÎN STADIILE DE EMBRION ŞI DE ALEVIN
            
                  C.16.
               
               ALBINELE – TESTUL DE TOXICITATE ORALĂ ACUTĂ
            
                  C.17.
               
               ALBINELE – TESTUL DE TOXICITATE ACUTĂ PRIN CONTACT
            
                  C.18.
               
               ADSORBŢIA/DESORBŢIA PRINTR-O METODĂ DE STABILIRE A ECHILIBRULUI PROBELOR
            
                  C.19.
               
               ESTIMAREA COEFICIENTULUI DE ADSORBŢIE (KCO) PE SOL ŞI NĂMOL DE EPURARE CU AJUTORUL CROMATOGRAFIEI LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ (HPLC)
            
                  C.20.
               
               TEST DE REPRODUCERE PENTRU DAPHNIA MAGNA
               
            
                  C.21.
               
               MICROORGANISMELE DIN SOL: TESTUL DE TRANSFORMARE A AZOTULUI
            
                  C.22.
               
               MICROORGANISMELE DIN SOL: TESTUL DE TRANSFORMARE A CARBONULUI
            
                  C.23.
               
               TRANSFORMĂRI AEROBE ŞI ANAEROBE ÎN SOL
            
                  C.24.
               
               TRANSFORMĂRI AEROBE ŞI ANAEROBE ÎN SISTEMELE DE SEDIMENTE ACVATICE
            C.1.   TOXICITATEA ACUTĂ LA PEŞTI
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Scopul testului de faţă este de a determina toxicitatea letală acută a unei substanţe la peştii de apă dulce. Este de dorit să se colecteze informaţii legate de solubilitatea în apă, presiunea vaporilor, stabilitatea chimică, constantele de disociere şi biodegradabilitatea substanţei, pentru a alege metoda optimă de testare (statică, semistatică sau dinamică) şi pentru a asigura concentraţii constante satisfăcătoare ale substanţei pe durata testării.
      Atât la planificarea testului, cât şi la interpretarea rezultatelor se iau în considerare informaţiile suplimentare (de exemplu formula structurală, gradul de puritate, natura şi procentul de impurităţi semnificative, prezenţa şi cantitatea de aditivi şi coeficientul de partiţie n-octanol/apă).
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Toxicitatea acută reprezintă efectul advers vizibil indus într-un organism într-o perioadă scurtă (zile) de expunere la o substanţă. În testul de faţă, toxicitatea acută se exprimă drept concentraţia letală mediană (CL50), care este acea concentraţie a substanţei de testat în apă care provoacă moartea a 50 % din lotul de peşti de experienţă într-o perioadă de expunere continuă şi definită.
      Toate concentraţiile substanţei de testat se exprimă ca greutate pe volum (miligrame pe litru). Ele pot fi, de asemenea, exprimate ca greutate din greutate (mg/kg–1).
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Se poate testa o substanţă de referinţă pentru a demonstra că în condiţiile de testare din laborator răspunsul speciilor testate nu s-a schimbat semnificativ.
      Pentru acest test nu sunt specificate substanţe de referinţă.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Se efectuează un test-limită la 100 mg/l pentru a demonstra că CL50 este mai mare decât această concentraţie.
      Peştii se tratează cu substanţa de testat solubilizată în apă, într-o serie de concentraţii, pe o perioadă de 96 de ore. Se înregistrează mortalitatea la intervale de cel puţin 24 de ore şi se calculează concentraţiile care provoacă moartea a 50 % dintre peşti (CL50) în fiecare perioadă de observare, dacă este posibil.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Criteriile de calitate se aplică testului-limită, precum şi testului complet.
      Mortalitatea la martori nu trebuie să depăşească 10 % (sau un peşte dacă se folosesc mai puţin de zece peşti) până la sfârşitul testului.
      Concentraţia de oxigen dizolvat trebuie să fie mai mare de 60 % din valoarea de saturaţie în aer, până la sfârşitul testului.
      Concentraţiile substanţei de testat se menţin în limita a 80 % din concentraţiile iniţiale pe toată durata testului.
      Pentru substanţele care se dizolvă uşor în mediul de testare, rezultând soluţii stabile, respectiv soluţii care nu se volatilizează, degradează, hidrolizează sau adsorb într-o măsură considerabilă, concentraţia iniţială poate fi considerată echivalentă cu concentraţia nominală. Trebuie demonstrat că pe toată durata testului au fost menţinute aceleaşi concentraţii, iar criteriile de calitate au fost satisfăcute.
      Pentru substanţele care sunt:
      
                  (i)
               
               
                  puţin solubile în mediul de testare; sau
               
            
                  (ii)
               
               
                  capabile să formeze emulsii stabile ori dispersii; sau
               
            
                  (iii)
               
               
                  instabile în soluţii apoase,
               
            concentraţia iniţială este considerată drept concentraţia determinată analitic în soluţie (sau, în cazul în care nu este posibil tehnic, măsurată în coloana de apă) la începutul testului. Concentraţia se determină după o perioadă de echilibrare, dar înainte de introducerea peştilor de experienţă.
      În oricare din aceste cazuri, se efectuează determinări suplimentare pe parcursul testului pentru a confirma concentraţiile reale de expunere sau respectarea criteriilor de calitate.
      Valoarea pH-ului trebuie să nu varieze cu mai mult de o unitate.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      Se pot folosi trei tipuri de metode:
      
         Test în regim static:
      
      Test de toxicitate în care soluţia testată nu se înlocuieşte (soluţiile rămân nemodificate pe toată durata testului).
      
         Test în regim semistatic:
      
      Test fără înlocuirea continuă a soluţiei testate, dar cu înlocuirea cu regularitate a întregii soluţii (de exemplu la 24 de ore).
      
         Test în regim dinamic:
      
      Test de toxicitate în care soluţia testată este reînnoită constant în vasele de testare, substanţa de testat fiind transportată cu apa folosită pentru a reînnoi soluţia.
      1.6.1.   Reactivi
      1.6.1.1.   Soluţiile substanţelor de testat
      Soluţiile mamă în concentraţia necesară se prepară prin dizolvarea substanţei în apă deionizată sau în apă conform punctului 1.6.1.2.
      Concentraţiile de testare alese sunt preparate prin diluarea soluţiei mamă. Dacă se testează concentraţii ridicate, cantităţile corespunzătoare din substanţa de testat pot fi solubilizate direct în apa de diluţie.
      Substanţele se testează în mod normal numai până la limita solubilităţii. Pentru unele substanţe (de exemplu: substanţele puţin solubile în apă sau cele cu Pow ridicat sau care formează dispersii stabile în loc de soluţii apoase propriu-zise), se acceptă folosirea unei concentraţii deasupra limitei de solubilitate a substanţei, pentru a garanta concentraţia maximă solubilă/stabilă. Cu toate acestea, este important ca această concentraţie să nu perturbe sistemul de testare (de exemplu, o peliculă de substanţă pe suprafaţa apei care să împiedice oxigenarea apei etc.).
      Pentru a prepara soluţiile mamă ale substanţelor cu solubilitate scăzută în apă sau pentru a facilita dispersia acestor substanţe în mediul de testare se pot folosi dispersia cu ultrasunete, solvenţi organici, agenţi de emulsionare sau agenţi de dispersie. În cazul în care se folosesc astfel de substanţe auxiliare, toate concentraţiile trebuie să conţină aceeaşi cantitate de substanţă auxiliară, iar peştii martor sunt trataţi cu aceeaşi concentraţie a substanţei auxiliare ca şi cea folosită în loturile tratate. Concentraţia unor astfel de substanţe auxiliare trebuie redusă la minimum şi în niciun caz nu trebuie să depăşească 100 mg/l.
      Testul se efectuează fără reglarea pH-ului. Dacă există dovada unei schimbări pronunţate a pH-ului, se recomandă ca testul să se repete după reglarea pH-ului, iar rezultatele să se consemneze. În acest caz, valoarea pH-ului soluţiei mamă se reglează la valoarea pH-ului apei de diluţie, dacă nu există contraargumente specifice. Pentru reglarea pH-ului sunt preferate HCl şi NaOH. Această reglare a pH-ului se face astfel încât concentraţia substanţei de testat din soluţia mamă să nu se modifice în mod semnificativ. Dacă în urma acestei corecţii de pH are loc o reacţie chimică sau precipitarea fizică a substanţei de testat, acest lucru trebuie consemnat.
      1.6.1.2.   Apa de întreţinere şi de diluţie
      Se poate folosi apa potabilă (necontaminată de concentraţii potenţial dăunătoare de clor, metale grele sau alte substanţe), apa naturală de calitate bună sau apa reconstituită (a se vedea apendicele 1). Se preferă apa cu o duritate totală între 10 şi 250 mg/l (CaCO3) şi cu un pH cuprins în intervalul 6,0-8,5.
      1.6.2.   Aparatură
      Toată aparatura este confecţionată din material inert din punct de vedere chimic.
      
                  —
               
               
                  sistem automat de diluare (pentru testare în condiţii dinamice);
               
            
                  —
               
               
                  oxigenometru;
               
            
                  —
               
               
                  echipament pentru determinarea durităţii apei;
               
            
                  —
               
               
                  aparatură adecvată pentru controlul temperaturii;
               
            
                  —
               
               
                  pH-metru.
               
            1.6.3.   Peşti de experienţă
      Peştii trebuie să fie sănătoşi şi fără malformaţii vizibile.
      Speciile folosite sunt selectate pe baza unor criterii practice cum sunt: disponibilitatea lor tot timpul anului, întreţinere uşoară, testare convenabilă, sensibilitatea relativă la substanţe chimice şi orice factor economic şi biologic sau ecologic important. La selectarea speciilor de peşti se va ţine seama de necesitatea comparabilităţii datelor obţinute şi de armonizarea internaţională existentă (referinţa bibliografică 1).
      Lista speciilor de peşti recomandate pentru efectuarea acestui test este prezentată în apendicele 2; peştele zebră şi păstrăvul curcubeu sunt speciile preferate.
      1.6.3.1.   Întreţinere
      Peştii supuşi testului trebuie, de preferinţă, să provină dintr-un singur lot ai cărui indivizi au lungimea şi vârsta asemănătoare. Sunt ţinuţi timp de cel puţin 12 zile în condiţiile următoare:
      
         încărcătură:
      
      adecvată sistemului folosit (recirculare sau în regim dinamic) şi de specia de peşti;
      
         apă:
      
      a se vedea punctul 1.6.1.2;
      
         lumină:
      
      iluminare 12-16 ore pe zi;
      
         concentraţia de oxigen dizolvat:
      
      cel puţin 80 % din valoarea de saturaţie în aer;
      
         alimentaţie:
      
      zilnic sau de 3 ori pe săptămână, cu o pauză de 24 de ore înaintea începerii testului.
      1.6.3.2.   Mortalitate
      După o perioadă de 48 de ore de adaptare, se înregistrează mortalitatea şi se aplică următoarele criterii:
      
                  —
               
               
                  mai mare de 10 % din populaţie în 7 zile:
                  respingerea întregului lot;
               
            
                  —
               
               
                  între 5 şi 10 % din populaţie:
                  perioada de întreţinere continuă încă 7 zile.
                  Dacă nu mai apare mortalitate, lotul este acceptat, în caz contrar este respins;
               
            
                  —
               
               
                  sub 5 % din populaţie:
                  acceptarea lotului.
               
            1.6.4.   Adaptare
      Toţi peştii trebuie să fie ţinuţi în apă de calitatea şi temperatura care urmează să fie folosite la test, timp de cel puţin 7 zile înainte de a fi folosiţi.
      1.6.5.   Procedura de testare
      Testul principal poate fi precedat de un test de stabilire a intervalului, pentru a obţine informaţii legate de intervalul de concentraţii ce urmează să fie folosite.
      Pe lângă testarea propriu-zisă, se efectuează un test martor fără substanţă de testat şi, dacă are semnificaţie, încă un test martor pentru substanţa auxiliară.
      În funcţie de proprietăţile fizice şi chimice ale substanţei de testat, se alege metoda adecvată statică, semistatică sau dinamică, pentru a îndeplini criteriile de calitate.
      Peştii sunt expuşi substanţei conform celor descrise mai jos:
      
                  —
               
               
                  durata: 96 ore;
               
            
                  —
               
               
                  numărul de organisme testate: cel puţin 7 pe concentraţie;
               
            
                  —
               
               
                  vase: de capacitate adecvată în funcţie de greutatea recomandată a lotului;
               
            
                  —
               
               
                  greutatea lotului testat: se recomandă greutatea maximă de 1 g/l pentru testele în regim static şi semistatic; pentru testele în regim dinamic se acceptă o greutate mai mare;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia testată: cel puţin 5 concentraţii spaţiate printr-un factor constant care nu depăşeşte 2,2 şi, dacă este posibil, într-un interval de 0-100 % mortalitate;
               
            
                  —
               
               
                  apă: a se vedea punctul 1.6.1.2;
               
            
                  —
               
               
                  lumină: 12-16 ore lumină zilnic;
               
            
                  —
               
               
                  temperatură: conform speciei (apendicele 2) dar în limita ± 1 oC în cadrul fiecărei testări;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia de oxigen dizolvat: nu mai puţin de 60 % din valoarea de saturaţie în aer la temperatura selectată;
               
            
                  —
               
               
                  hrănire: nu se administrează hrană.
               
            Peştii sunt observaţi după primele 2-4 ore şi la intervale de cel puţin 24 de ore. Peştii se consideră morţi dacă atingerea pedunculului caudal nu produce nicio reacţie şi nu sunt vizibile mişcări de respiraţie. Peştii morţi se îndepărtează în momentul în care sunt observaţi şi se înregistrează mortalitatea. Se ţine evidenţa comportamentului anormal vizibil (de exemplu, pierderea echilibrului, perturbări de înot, funcţia respiratorie, pigmentare etc.).
      Trebuie să se efectueze zilnic măsurători ale pH-ului, oxigenului dizolvat şi temperaturii.
      Test-limită
      Folosind modul de operare descris în prezenta metodă de testare, se poate efectua un test-limită la 100 mg/l pentru a demonstra că CL50 este mai mare decât această concentraţie.
      Dacă natura substanţei nu permite atingerea concentraţiei de 100 mg/l în soluţia de testare, testul-limită se efectuează la o concentraţie egală cu solubilitatea substanţei (sau concentraţia maximă pentru formarea unei dispersii stabile) în mediul folosit (a se vedea şi punctul 1.6.1.1).
      Testul-limită se efectuează folosind între 7 şi 10 peşti, cu acelaşi număr de teste martor. (Conform teoriei binomului, dacă se folosesc 10 peşti şi mortalitatea este 0, există 99,99 % încredere că CL50 este mai mare decât concentraţia folosită în testul-limită. Cu 7, 8 sau 9 peşti, absenţa mortalităţii asigură cel puţin 99 % încredere că CL50 este mai mare decât concentraţia folosită).
      Dacă apare mortalitate, trebuie să se efectueze un studiu complet. Dacă se observă efecte subletale, acestea se înregistrează.
      2.   DATE ŞI EVALUARE
      Pentru fiecare perioadă în care s-au înregistrat observaţii (24, 48, 72 şi 96 de ore) se reprezintă grafic mortalitatea exprimată în procente, în funcţie de concentraţie, pe o hârtie probit logaritmică.
      Dacă este posibil, pentru fiecare perioadă de observare se estimează CL50 şi limitele de încredere (p = 0,05) prin metode standard; aceste valori se rotunjesc la una sau cel mult două cifre semnificative (exemple de rotunjire la două cifre: 170 pentru 173,5; 0,13 pentru 0,127; 1,2 pentru 1,21).
      În cazul în care panta curbei de răspuns concentraţie/procentaj este prea abruptă pentru a permite calcularea valorii CL50, este suficientă estimarea grafică a acestei valori.
      În cazul în care două concentraţii consecutive aflate în raport de 2,2 dau numai 0 şi 100 % mortalitate, aceste două valori sunt suficiente pentru a indica intervalul în care se situează CL50.
      Dacă se observă că stabilitatea sau omogenitatea substanţei de testat nu poate fi menţinută, acest lucru se consemnează, iar rezultatele trebuie interpretate cu atenţie.
      3.   RAPORT
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  informaţii despre peştii de experienţă (denumirea ştiinţifică, linia, furnizorul, orice tratament preliminar, dimensiunea şi numărul folosit pentru fiecare concentraţie testată);
               
            
                  —
               
               
                  sursa apei de diluţie şi caracteristicile chimice principale (pH, duritate, temperatură);
               
            
                  —
               
               
                  în cazul unei substanţe puţin solubile în apă, metoda de preparare a soluţiei mamă şi a soluţiilor de testare;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia eventualelor substanţe auxiliare;
               
            
                  —
               
               
                  lista concentraţiilor folosite şi orice informaţii disponibile legate de stabilitatea substanţelor chimice la concentraţiile din soluţia de testare;
               
            
                  —
               
               
                  dacă se efectuează analize chimice, metodele folosite şi rezultatele obţinute;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele testului-limită, după caz;
               
            
                  —
               
               
                  motivele alegerii metodei de testare folosite şi detalii cu privire la aceasta (de exemplu: statică, semistatică, raportul dozelor, viteza curgerii, condiţiile de aerare, greutatea lotului de peşti testat etc.);
               
            
                  —
               
               
                  descrierea echipamentului de testare;
               
            
                  —
               
               
                  regimul de iluminare;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţiile de oxigen dizolvat, valorile pH-ului şi temperaturile soluţiilor testate la fiecare 24 de ore;
               
            
                  —
               
               
                  dovada îndeplinirii criteriilor de calitate;
               
            
                  —
               
               
                  tabelul care prezintă mortalitatea cumulată pentru fiecare concentraţie testată şi înregistrările aferente controlului (inclusiv pentru testul martor cu substanţă auxiliară, după caz) la fiecare perioadă de observaţie recomandată;
               
            
                  —
               
               
                  graficul curbei de răspuns concentraţie/procentaj la sfârşitul testării;
               
            
                  —
               
               
                  dacă e posibil, valorile CL50 la fiecare perioadă de observaţie recomandată (cu limite de încredere de 95 %);
               
            
                  —
               
               
                  metodele statistice folosite pentru determinarea valorilor CL50;
               
            
                  —
               
               
                  dacă s-a folosit o substanţă de referinţă, rezultatele obţinute;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia testată maximă care nu provoacă mortalitate pe durata testării;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia testată minimă care provoacă mortalitate 100 % pe durata testării.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.
               
            
                  2.
               
               
                  AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio – Static and Flow Through methods – NFT 90-303 June 1985.
               
            
                  3.
               
               
                  AFNOR- Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri – Static and Flow – Through methods – NFT 90-305 June 1985.
               
            
                  4.
               
               
                  ISO 7346/1,/2 and/3 – Water Quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan – Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.
               
            
                  5.
               
               
                  Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden – Part II 1974.
               
            
                  6.
               
               
                  DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (11) und 1 (15).
               
            
                  7.
               
               
                  JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.
               
            
                  8.
               
               
                  NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.
               
            
                  9.
               
               
                  Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.
               
            
                  10.
               
               
                  Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.
               
            
                  11.
               
               
                  Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.
               
            
                  12.
               
               
                  Standard methods for the examination of water and wastewater, fourteen edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.
               
            
                  13.
               
               
                  Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.
               
            
                  14.
               
               
                  Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grundlagen für die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.
               
            
                  15.
               
               
                  Litchfield, J. T and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm, Exp. Therap., 1949, vol. 96, p. 99.
               
            
                  16.
               
               
                  Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.
               
            
                  17.
               
               
                  Sprague, J .B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, p. 793-821.
               
            
                  18.
               
               
                  Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, p. 3-32.
               
            
                  19.
               
               
                  Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, p. 65-84.
               
            
                  20.
               
               
                  Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.
               
            
         Apendicele 1
         Apă reconstituită
         Exemplu de apă de diluţie adecvată
         Toate substanţele chimice sunt de puritate analitică.
         Apa este apă distilată şi de calitate bună sau apă deionizată cu o conductibilitate mai mică de 5 μScm–1.
         Aparatura pentru distilarea apei trebuie să nu conţină nicio piesă din cupru.
         Soluţiile mamă
         
                     CaCl2. 2H2O (clorură de calciu dihidrat):
                     Dizolvată şi completată până la 1 litru cu apă.
                  
                  
                     11,76 g
                  
               
                     MgSO4. 7H2O (sulfat de magneziu heptahidrat):
                     Dizolvat şi completat până la 1 litru cu apă.
                  
                  
                     4,93 g
                  
               
                     NaHCO3 (carbonat acid de sodiu):
                     Dizolvat şi completat până la 1 litru cu apă.
                  
                  
                     2,59 g
                  
               
                     KCl (clorură de potasiu):
                     Dizolvată şi completată până la 1 litru cu apă.
                  
                  
                     0,23 g
                  
               Apă de diluţie reconstituită
         Se adaugă câte 25 ml din cele patru soluţii mamă şi se completează până la 1 litru cu apă.
         Se aerează până când concentraţia oxigenului dizolvat este egală cu valoarea de saturaţie în aer.
         PH-ul este 7,8 ± 0,2.
         Dacă este necesar, pH-ul se reglează cu NaOH (hidroxid de sodiu) sau HCl (acid clorhidric).
         Apa de diluţie astfel preparată este lăsată în repaos aproximativ 12 ore şi nu mai este aerată.
         Suma ionilor de Ca şi Mg în această soluţie este 2,5 mmol/l. Raportul ionilor Ca:Mg este 4:1, iar cel al ionilor Na:K este 10:1. Alcalinitatea totală a acestei soluţii este 0,8 mmol/l.
         Orice abatere în prepararea apei de diluţie nu trebuie să schimbe compoziţia sau proprietăţile apei.
      
      
         Apendicele 2
         Speciile de peşti recomandate pentru testare
         
                     Speciile recomandate
                  
                  
                     Intervalul de temperatură recomandat pentru testare ( oC)
                  
                  
                     Lungimea totală recomandată a animalului de experienţă (cm)
                  
               
                     
                        Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) Peştele zebră
                  
                  
                     20-24
                  
                  
                     3,0 ± 0,5
                  
               
                     
                        Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Boiştean
                  
                  
                     20-24
                  
                  
                     5,0 ± 2,5
                  
               
                     
                        Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758) Crap comun
                  
                  
                     20-24
                  
                  
                     6,0 ± 2,0
                  
               
                     
                        Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) Cyprinodontidae (Tomminck and Schlege 1850)
                  
                  
                     20-24
                  
                  
                     3,0 ± 1,0
                  
               
                     
                        Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters 1859) Guppy
                  
                  
                     20-24
                  
                  
                     3,0 ± 1,0
                  
               
                     
                        Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque Linneaus 1758)
                  
                  
                     20-24
                  
                  
                     5,0 ± 2,0
                  
               
                     
                        Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum 1988) Păstrăv curcubeu
                  
                  
                     12-17
                  
                  
                     6,0 ± 2,0
                  
               
                     
                        Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758) Văduviţă
                  
                  
                     20-24
                  
                  
                     6,0 ± 2,0
                  
               Aprovizionare
         Peştii din lista de mai sus sunt uşor de crescut şi/sau se găsesc din abundenţă în tot timpul anului. Pot fi crescuţi şi înmulţiţi în crescătoriile de peşti sau în laborator, în condiţii controlate de boală şi paraziţi astfel încât animalele testate să fie sănătoase şi cu ascendenţă cunoscută. Aceşti peşti sunt disponibili în multe locuri ale lumii.
      
      
         Apendicele 3
         Exemplu de înregistrare grafică: concentraţie/procentul de mortalitate
         Exemplu de determinare a CL50 cu hârtie probit logaritmică
         
            
      
      C.2.   DAPHNIA SP. TESTUL IMOBILIZĂRII ACUTE
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare a imobilizării acute este echivalentă cu Orientarea 202 (2004) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Această metodă descrie un test de toxicitate acută care are rolul de a evalua efectele substanţelor chimice asupra dafniilor. Utilizarea măsurilor de testare existente s-a făcut în limita posibilului (1) (2) (3).
      1.2.   DEFINIŢII
      În contextul utilizării acestei metode s-au folosit următoarele definiţii:
      
                   
               
               
                  
                     CE
                     
                        50
                     : concentraţia estimată capabilă să imobilizeze 50 % din dafnii în cadrul unei perioade de expunere determinate. În cazul în care se utilizează o altă definiţie, aceasta trebuie raportată împreună cu referinţa.
               
            
                   
               
               
                  
                     Imobilizare: animalele incapabile să înoate în intervalul de 15 secunde după agitarea uşoară a recipientului de testare sunt considerate ca fiind imobilizate (chiar dacă îşi pot mişca încă antenele).
               
            1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Dafniile tinere, cu vârsta mai mică de 24 ore în momentul începerii testului, sunt expuse timp de 48 de ore la diferite concentraţii ale substanţei de testare. Imobilizarea este înregistrată la 24 şi la 48 de ore şi comparată cu valorile de control. Se analizează rezultatele în scopul calculării CE50 la 48 de ore (a se vedea punctul 1.2 pentru definiţii). Determinarea CE50 la 24 de ore este opţională.
      1.4.   INFORMAŢII REFERITOARE LA SUBSTANŢA DE TESTARE
      Se recomandă cunoaşterea solubilităţii în apă şi a presiunii vaporilor substanţei de testare şi existenţa unei metode analitice fiabile pentru dozarea substanţei în soluţiile de testare, ale cărei eficienţă de recuperare şi limită de determinare sunt cunoscute. Informaţiile utile includ formula structurală, gradul de puritate al substanţei, stabilitatea în apă sau la lumină, coeficientul de partiţie octanol/apă – log Pow şi rezultatele unui test privind biodegrabilitatea imediată (a se vedea metoda C.4).
      Notă: Referinţa 4 furnizează recomandări în ceea ce priveşte substanţele de testare cu proprietăţile fizice şi chimice care fac dificilă testarea acestora.
      1.5.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      O substanţă de referinţă poate fi testată pentru determinarea CE50 ca o metodă de siguranţă în sensul fiabilităţii condiţiilor de testare. Se recomandă în acest scop substanţe toxice utilizate în testele circulare internaţionale (1) (5) (1). Se recomandă ca testele cu o substanţă de referinţă să se realizeze de preferinţă în fiecare lună şi cel puţin de două ori pe an.
      1.6.   CRITERII DE CALITATE
      Pentru ca testul să fie valid, se aplică următoarele criterii de performanţă:
      
                  —
               
               
                  în cadrul grupurilor de control, inclusiv grupul de control care conţine agent de solubilizare, se recomandă a fi imobilizate cel mult 10 % dintre dafnii;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia de oxigen dizolvată la sfârşitul testului ar trebui să fie ≥ 3 mg/l în recipientele de control şi testare.
               
            Notă: Pentru primul criteriu, cel mult 10 % dintre dafniile din grupul de control trebuie să fie imobilizate sau să prezinte alte semne de maladie sau de stress, precum decolorare sau comportament neobişnuit (de exemplu, rămân prinse la suprafaţa apei).
      1.7.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.7.1.   Aparatură
      Se recomandă ca recipientele de testare şi alte aparate care vor intra în contact cu soluţiile de testare să fie complet din sticlă sau dintr-un alt material inert din punct de vedere chimic. În mod normal recipientele de testare sunt eprubete sau pahare de laborator. Se recomandă curăţarea acestora înainte de fiecare utilizare prin metodele standard de laborator. Se recomandă ca recipientele de testare să fie acoperite pentru a reduce pierderea de apă prin evaporare, precum şi pentru a se evita pătrunderea de praf în soluţii. Se recomandă ca substanţele volatile să fie testate în recipiente umplute complet şi închise, suficient de mari astfel încât concentraţia de oxigen să nu fie prea slabă sau limitată (a se vedea punctul 1.6 şi primul alineat al punctului 1.8.3).
      În plus, se vor folosi unul sau toate echipamentele următoare: un aparat pentru măsurarea concentraţiei de oxigen (cu microelectrod sau un alt dispozitiv corespunzător pentru măsurarea oxigenului dizolvat în mostre de volum mic); un aparat pentru măsurarea pH-ului; aparatură adecvată pentru controlul temperaturii; echipament pentru determinarea concentraţiei totale de carbon organic (COT); echipament pentru determinarea necesarului de oxigen chimic (NOC); echipament pentru determinarea durităţii etc.
      1.7.2.   Organism de testare
      Specia preferată pentru testare este Daphnia magna Straus, deşi se pot folosi pentru acest test şi alte specii de Daphnia adecvate (de exemplu, Daphnia pulex). La începutul testului, animalele trebuie să aibă vârsta mai mică de 24 de ore, iar pentru reducerea variabilităţii, se recomandă ca acestea să nu provină din prima generaţie de descendenţi. Se recomandă să provină dintr-un lot sănătos (să nu prezinte semne de stres cum ar fi mortalitatea ridicată, prezenţa masculilor şi ephippia, întârzieri în producerea primei progenituri, animale decolorate etc.). Se recomandă ca toate organismele utilizate pentru un anumit test să provină din culturi înfiinţate din acelaşi lot de dafnii. Lotul respectiv trebuie să fie menţinut în condiţii de cultură (lumină, temperatură, mediu) similare cu cele utilizate în timpul testului. Dacă mediul de cultură al dafniilor care vor fi utilizate în timpul testului diferă de cel utilizat în mod normal pentru o cultură de dafnii, este bine să se includă o perioadă de aclimatizare înainte de test. De aceea, se recomandă ca dafniile provenite din aceeaşi cultură să fie menţinute în apă de diluare la temperatura de testare timp de aproximativ 48 ore înainte de începerea testului.
      1.7.3.   Apa de păstrare şi diluare
      Sunt acceptate ca lichid de păstrare şi de diluare apele naturale (de suprafaţă şi subterane), lichid reconstituit sau apă de la robinet declorurată dacă dafniile vor supravieţui în acesta pe durata culturii, aclimatizării şi testării fără a prezenta semne de stres. Orice tip de apă care corespunde caracteristicilor chimice ale unei ape de diluare de nivel acceptabil aşa cum este prezentat în apendicele 1 este potrivit ca apă pentru testare. Este bine ca aceasta să aibă o calitate constantă de-a lungul perioadei de testare. Apa reconstituită poate fi obţinută prin adăugarea, la apa deionizată sau distilată, a unei cantităţi specifice de reactivi având o gradare analitică recunoscută. Referinţele 1, 6 şi apendicele 2 oferă exemple de apă reconstituită. A se observa că mediile care conţin agenţi de chelare cunoscuţi, cum ar fi mediile M4 şi M7 din apendicele 2, trebuie evitate la testarea substanţelor care conţin metale. Se recomandă un pH într-o gamă de la 6 la 9. Pentru Daphnia Magna se recomandă o duritate cuprinsă între 140 şi 250 mg/l (cum ar fi CaCO3), în timp ce un grad mai scăzut de duritate poate fi adecvat pentru alte specii de Daphnia. Apa pentru diluare poate fi aerată înainte de a fi utilizată pentru test astfel încât concentraţia de oxigen dizolvat să fi atins gradul de saturaţie.
      Dacă se utilizează apă naturală, se recomandă ca parametrii de calitate să fie măsuraţi cel puţin de două ori pe an sau ori de câte ori se presupune că aceste caracteristici este posibil să se fi schimbat semnificativ (a se vedea alineatul anterior şi apendicele 1). De asemenea, se recomandă realizarea măsurătorilor concentraţiei de metale grele (de exemplu, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni). Dacă se utilizează apă de robinet declorurată, este de dorit să se realizeze o analiză zilnică a conţinutului de cloruri. Dacă apa de diluare provine de la o apă de suprafaţă sau subterană, se recomandă măsurarea necesarului de conductivitate şi carbon organic total (COT) sau de oxigen chimic.
      1.7.4.   Soluţii de testare
      Soluţiile de testare cu concentraţiile alese se prepară de obicei prin diluarea unei soluţii din stoc. Este preferabil ca soluţiile din stoc să se prepare prin dizolvarea substanţei de testare în apa de diluare. Pe cât posibil, se recomandă evitarea solvenţilor, a emulsifianţilor sau a dispersanţilor. Totuşi, astfel de componente pot fi necesare în anumite situaţii pentru a se produce o soluţie de stoc cu o concentraţie corespunzătoare. Recomandări privind solvenţii, emulsifianţii şi dispersanţii adecvaţi se regăsesc la referinţa 4. În orice caz, se recomandă ca substanţele de testare din soluţiile de testare să nu depăşească limita solubilităţii în apa de diluare.
      Se recomandă ca testul să se desfăşoare fără a se regla pH-ul. Dacă pH-ul nu rămâne în interiorul gamei 6-9, atunci se poate realiza un al doilea test, reglând pH-ul soluţiei de stoc la acela al apei de diluare înainte de adăugarea substanţei de testare. Se recomandă ca reglarea pH-ului să se facă astfel încât concentraţia soluţiei de stoc să nu fie schimbată semnificativ şi astfel încât să nu se producă nicio reacţie chimică sau precipitare a substanţei de testare. Se preferă HCl şi NaOH.
      1.8.   PROCEDURĂ
      1.8.1.   Condiţii de expunere
      1.8.1.1.   Grupuri de testare şi control
      Vasele pentru testare se umplu cu volume corespunzătoare de apă diluată şi soluţii de substanţe de testare. Se recomandă ca proporţia aer/volum de apă din vas să fie identică pentru grupurile de testare şi control. Se plasează apoi dafniile în vasele de testare. Se recomandă a se utiliza cel puţin 20 de animale, împărţite în patru grupuri de câte cinci animale fiecare, la fiecare concentraţie a testului şi pentru controale. Se vor furniza cel puţin 20 ml de soluţie pentru fiecare animal (respectiv o cantitate de 10 ml pentru cinci dafnii pe fiecare vas de testare). Atunci când concentraţia substanţei de testare nu este stabilă, testul se poate desfăşura utilizând un sistem de reînnoire semi-statică sau continuă.
      În plus faţă de seria pentru tratament, trebuie desfăşurate o serie de control a apei de diluare şi, de asemenea, dacă este relevant, o serie de control conţinând agent de solubilizare.
      1.8.1.2.   Concentraţiile pentru testare
      Se poate desfăşura un test pentru definirea gamei de concentraţii de utilizat la testarea definitivă cu condiţia să existe informaţii privind toxicitatea substanţei de test. În acest scop, dafniile sunt expuse unei serii de concentraţii a substanţei de testare întinsă pe un interval larg. Se vor expune un număr de cinci dafnii la fiecare concentraţie de testare timp de 48 ore sau mai puţin, şi nu este necesară repetarea. Perioada de expunere poate fi scurtată (de exemplu, 24 ore sau mai puţin) dacă datele necesare desfăşurării testului de definire a gamei pot fi obţinute în mai puţin timp.
      Se recomandă a se utiliza cel puţin cinci concentraţii de testare. Se recomandă aranjarea acestora într-o serie geometrică având un factor de separare care este preferabil să nu depăşească 2.2. În cazul în care se utilizează mai puţin de cinci concentraţii, se vor aduce argumente pentru aceasta. Este de preferat ca cea mai înaltă concentraţie testată să conducă la o imobilizare de 100 %, iar cea mai joasă concentraţie testată este preferabil să nu producă efecte observabile.
      1.8.1.3.   Condiţii de incubare
      Este recomandat ca temperatura să se situeze în intervalul 18-22 oC, iar în cazul unei singure testări, este bine ca aceasta să rămână constantă în limita ± 1 oC. Se recomandă un ciclu de 16 ore de lumină şi 8 ore de întuneric. Se acceptă şi întuneric deplin, în special pentru substanţele de testare care prezintă instabilitate la lumină.
      Este interzis ca vasele să fie aerate pe perioada testării. Testul se desfăşoară fără reglarea pH-ului. Se recomandă ca dafniile să nu fie hrănite pe perioada testului.
      1.8.1.4.   Durată
      Durata testului este de 48 ore.
      1.8.2.   Observaţii
      La fiecare 24 ore şi 48 ore după începerea testării, fiecare vas de testare va fi verificat pentru depistarea dafniilor imobilizate (a se vedea punctul 1.2 pentru definiţii). În plus faţă de imobilitate, se va raporta orice reacţie sau imagine anormală.
      1.8.3.   Măsurători analitice
      Se măsoară oxigenul dizolvat şi pH-ul la începutul şi la sfârşitul testării şi concentraţia cea mai înaltă a substanţei de testare şi de control. Se recomandă o concentraţie a oxigenului dizolvat care să fie în concordanţă cu criteriile de validitate (a se vedea punctul 1.6). În mod normal concentraţia pH-ului nu trebuie să varieze cu mai mult de 1,5 unităţi în cadrul oricărui test. De obicei se măsoară temperatura în vasele de control sau în aerul ambiental şi se recomandă ca aceasta să fie înregistrată, de preferinţă, în mod continuu pe perioada testului sau, ca cerinţă minimă, la începutul şi la sfârşitul testării.
      Se recomandă măsurarea concentraţiei substanţei de testare cel puţin la valoarea maximă şi la valoarea minimă, la începutul şi la sfârşitul testării (4). Se recomandă ca rezultatele să fie bazate pe concentraţii măsurate. Totuşi, dacă există probe care să demonstreze că s-a menţinut concentraţia substanţei de testare în mod corespunzător în intervalul ± 20 % faţă de concentraţia nominală sau măsurată iniţial, pe tot parcursul perioadei de testare, atunci rezultatele pot fi calculate pe baza valorilor nominale sau măsurate iniţial.
      1.9.   TEST-LIMITĂ
      Utilizând procedurile descrise în prezenta metodă, se poate efectua un test-limită la 100 mg/l de substanţă de testare sau până la limita sa de solubilitate în mediul de testare (oricare dintre acestea este mai scăzută) pentru a demonstra că CE50 este mai mare decât această concentraţie. Se recomandă efectuarea testului-limită prin utilizarea a 20 de dafnii (împărţite preferabil în patru grupuri de câte cinci), cu acelaşi număr de animale grupurile de control. Dacă imobilizarea se manifestă, se va realiza un studiu complet. Se va înregistra orice reacţie anormală detectată.
      2.   DATE
      Datele sunt sintetizate sub formă de tabel, indicând, pentru fiecare grup de tratament şi control, numărul de dafnii utilizat, imobilizarea la fiecare observare. Procentele imobilizate la 24 şi 48 de ore se vor pondera faţă de concentraţiile de testare. Datele se analizează cu mijloace statistice adecvate (de exemplu analiză de probitate etc.) pentru a se calcula pantele curbelor şi CE50 în limite de fiabilitate de 95 % (p = 0,05) (7) (8).
      În situaţiile în care metodele standard de calculare a CE50 nu sunt aplicabile pentru datele obţinute, se recomandă utilizarea celei mai mari concentraţii care nu produce imobilitate şi a celei mai scăzute concentraţii care produce imobilitate 100 % ca metodă de aproximare a CE50 (aceasta devenind media geometrică a acestor două concentraţii).
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare va include următoarele:
      Substanţa de testare:
      
                  —
               
               
                  stare fizică şi proprietăţile fizico-chimice relevante;
               
            
                  —
               
               
                  date de identificare de natură chimică, inclusiv puritatea.
               
            Specia folosită pentru testare:
      
                  —
               
               
                  sursa şi speciile de Daphnia, originea sursei (dacă este cunoscută) şi condiţiile de cultură utilizate (inclusiv origine, tip şi cantitate de hrană, frecvenţa hrănirii).
               
            Condiţii de testare:
      
                  —
               
               
                  descrierea vaselor de testare: tipul de vase, volumul soluţiei, numărul de dafnii pe vas de testare, numărul de vase de testare (replicate) pe concentraţie;
               
            
                  —
               
               
                  metode de preparare a stocului şi a soluţiilor de testare, inclusiv utilizarea oricărui solvent sau dispersant, concentraţiile utilizate;
               
            
                  —
               
               
                  detalii privind apa utilizată pentru diluare: caracteristicile sursei şi calităţii apei (pH, duritate; proporţia Ca/Mg; proporţia Na/K; alcalinitate, conductivitate etc.); compoziţia apei reconstituite dacă aceasta a fost utilizată;
               
            
                  —
               
               
                  condiţii de incubare: temperatură, intensitatea şi frecvenţa luminii; cantitatea de oxigen dizolvat, pH etc.
               
            Rezultate:
      
                  —
               
               
                  numărul şi procentajul de dafnii care au fost imobilizate sau care au prezentat efecte negative (inclusiv reacţii anormale) în grupurile de control şi în fiecare grup de tratare, la fiecare interval de observare şi o descriere a naturii efectelor observate;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele şi datele testului efectuat cu substanţe de referinţă, dacă sunt disponibile;
               
            
                  —
               
               
                  valorile nominale ale concentraţiilor de testare şi rezultatul tuturor analizelor pentru a determina concentraţia substanţei de testare în vasele de testare; de asemenea, se vor raporta eficienţa de recuperare a metodei şi limita de determinare;
               
            
                  —
               
               
                  toate măsurătorile fizico-chimice ale temperaturii, pH-ului şi oxigenului dizolvat de-a lungul perioadei de testare;
               
            
                  —
               
               
                  CE50 la 48 de ore referitor la imobilizare cu limite de fiabilitate şi grafice ale modelului adecvat utilizat pentru calcul, pantele curbelor de răspuns la dozaj şi eroarea standard; procedurile statistice utilizate pentru determinarea CE50; (aceste informaţii referitoare la imobilizare la 24 de ore se vor raporta la momentul la care au fost măsurate);
               
            
                  —
               
               
                  explicaţii privind orice abatere de la metoda de testare şi dacă abaterea a afectat rezultatele testului.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) – Acute toxicity test. Third edition, 1996.
               
            
                  2.
               
               
                  EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guidelines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater Daphnids.
               
            
                  3.
               
               
                  Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute Lethality Test Using Daphnia sp. EPS 1/RM/11. Environment Canada, Ottawa, Ontario, Canada.
               
            
                  4.
               
               
                  Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris 2000.
               
            
                  5.
               
               
                  Commission of the European Communities. Study D8369. (1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to Daphnia.
                  
               
            
                  6.
               
               
                  OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211: Daphnia magna Reproduction Test, adopted September 1998.
               
            
                  7.
               
               
                  Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 – American Society for Testing and Materials, p. 65-84.
               
            
                  8.
               
               
                  Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3rd ed. London. Griffin, Weycombe, UK.
               
            
         APENDICELE 1
         ANUMITE CARACTERISTICI CHIMICE ALE UNEI APE DE DILUARE DE NIVEL ACCEPTABIL
         
                     Substanţă
                  
                  
                     Concentraţie
                  
               
                     Particule
                  
                  
                     < 20 mg/l
                  
               
                     Carbon organic total
                  
                  
                     < 2 mg/l
                  
               
                     Amoniac neionizat
                  
                  
                     < 1 μg/l
                  
               
                     Clorură reziduală
                  
                  
                     < 10 μg/l
                  
               
                     Cantitate totală de pesticide organofosforoase
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     Cantitate totală de pesticide organoclorurate plus bifenili policloruraţi
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     Cantitate totală de clorură organică
                  
                  
                     < 25 ng/l
                  
               
      
         APENDICELE 2
         EXEMPLE DE APĂ DE TESTARE RECONSTITUITĂ ACCEPTABILĂ
         ISO Apă de testare (1)
         
                     Soluţie de stoc (o singură substanţă)
                  
                  
                     Pentru prepararea apei reconstituite, se adaugă următoarele volume de soluţii din stoc la 1 l de apă (2)
                     
                  
               
                     Substanţă
                  
                  
                     Cantitate adăugată la 1 l de apă (2)
                     
                  
               
                     Clorură de calciu
                     CaCl2, 2H2O
                  
                  
                     11,76 g
                  
                  
                     25 ml
                  
               
                     Sulfat de magneziu
                     MgSO4, 7H2O
                  
                  
                     4,93 g
                  
                  
                     25 ml
                  
               
                     Bicarbonat de sodiu
                     NaHCO3
                     
                  
                  
                     2,59 g
                  
                  
                     25 ml
                  
               
                     Clorură de potasiu
                     KCl
                  
                  
                     0,23 g
                  
                  
                     25 ml
                  
               Medii Elendt M4 şi M7
         Aclimatizare la mediile Elendt M4 şi M7
         Anumite laboratoare au întâmpinat dificultăţi în a transfera direct Daphnia în mediile M4 şi M7. Totuşi, au fost obţinute anumite succese printr-o aclimatizate graduală, respectiv prin mutarea din propriul mediu la 30 % Elendt, apoi la 60 % Elendt şi apoi la 100 % Elendt. Este posibil ca perioada de aclimatizare să ajungă până la o lună.
         Pregătire
         Element de urmărire
         Soluţiile de stoc separate (I), conţinând elemente individuale de urmărire se prepară mai întâi în apă cu o puritate adecvată, de exemplu, deionizată, distilată sau obţinută prin osmoză inversă. Din aceste soluţii de stoc diferite (I) se prepară o singură soluţie de stoc (II), care conţine toate elementele de urmărire (soluţie combinată), de exemplu:
         
                     Soluţie (soluţii) de stoc I (o singură substanţă)
                  
                  
                     Cantitate adăugată la apă (mg/l)
                  
                  
                     Concentraţie (în raport cu mediul M4)
                  
                  
                     Pentru prepararea soluţiei combinate de stoc II, se adaugă următoarele volume de soluţii de stoc I la cantitatea de apă (ml/l)
                  
               
                     M4
                  
                  
                     M7
                  
               
                     H3 BO3
                     
                  
                  
                     57 190
                  
                  
                     20 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     MnCl2.4H2O
                  
                  
                     7 210
                  
                  
                     20 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     LiCl
                  
                  
                     6 120
                  
                  
                     20 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     RbCl
                  
                  
                     1 420
                  
                  
                     20 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     SrCl2.6H2O
                  
                  
                     3 040
                  
                  
                     20 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     NaBr
                  
                  
                     320
                  
                  
                     20 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     Na2 MoO4.2H2O
                  
                  
                     1 230
                  
                  
                     20 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     CuCl2.2H2O
                  
                  
                     335
                  
                  
                     20 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     ZnCl2
                     
                  
                  
                     260
                  
                  
                     20 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     CoCl2.6H2O
                  
                  
                     200
                  
                  
                     20 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     KI
                  
                  
                     65
                  
                  
                     20 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2 SeO3
                     
                  
                  
                     43,8
                  
                  
                     20 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     NH4 VO3
                     
                  
                  
                     11,5
                  
                  
                     20 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2 EDTA.2H2O
                  
                  
                     5 000
                  
                  
                     2 000 de ori
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     FeSO4.7H2O
                  
                  
                     1 991
                  
                  
                     2 000 de ori
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Ambele soluţii, Na 2 EDTA şi FeSO4, se prepară independent, se toarnă împreună şi se autoclavează imediat.
                  
               
                     Aceasta conduce la:
                  
               
                     Soluţie 2 l Fe-EDTA
                  
                  
                      
                  
                  
                     1 000 de ori
                  
                  
                     20,0
                  
                  
                     5,0
                  
               Mediile M4 şi M7
         Mediile M4 şi M7 se prepară utilizând soluţia de stoc II, macro-nutrienţi şi vitamine după cum urmează:
         
                      
                  
                  
                     Cantitate adăugată la apă (mg/l)
                  
                  
                     Concentraţie (în raport cu mediul M4)
                  
                  
                     Cantitate de soluţie de stoc II adăugată pentru a prepara mediul (ml/l)
                  
               
                     M4
                  
                  
                     M7
                  
               
                     Soluţie de stoc II (elemente de urmărire combinate)
                  
                  
                      
                  
                  
                     20 de ori
                  
                  
                     50
                  
                  
                     50
                  
               
                     Soluţii complexe pe bază de macro nutrienţi (substanţă singulară)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     CaCl2 · 2H2O
                  
                  
                     293 800
                  
                  
                     1 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     MgSO4 · 7H2O
                  
                  
                     246 600
                  
                  
                     2 000 de ori
                  
                  
                     0,5
                  
                  
                     0,5
                  
               
                     KCl
                  
                  
                     58 000
                  
                  
                     10 000 de ori
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     NaHCO3
                     
                  
                  
                     64 800
                  
                  
                     1 000 de ori
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2 SiO3 · 9H2O
                  
                  
                     50 000
                  
                  
                     5 000 de ori
                  
                  
                     0,2
                  
                  
                     0,2
                  
               
                     NaNO3
                     
                  
                  
                     2 740
                  
                  
                     10 000 de ori
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     KH2 PO4
                     
                  
                  
                     1 430
                  
                  
                     10 000 de ori
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     K2HPO4
                     
                  
                  
                     1 840
                  
                  
                     10 000 de ori
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     Soluţie de stoc de vitamine combinate
                  
                  
                     —
                  
                  
                     10 000 de ori
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     Soluţia de stoc pe bază de vitamine combinate se prepară prin adăugarea a 3 vitamine la 1 l de apă, după cum se indică mai jos:
                  
               
                     Clorhidrat de tiamină
                  
                  
                     750
                  
                  
                     10 000 de ori
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Cianocobalamin (B12)
                  
                  
                     10
                  
                  
                     10 000 de ori
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Biotină
                  
                  
                     7,5
                  
                  
                     10 000 de ori
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Soluţia pe bază de vitamine combinate se păstrează congelată în alicoturi. Vitaminele se adaugă în medii imediat înainte de utilizare.
         
                     NB
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Pentru a evita precipitarea sărurilor atunci când se pregătesc mediile finale, se adaugă conţinutul din alicoturi de substanţă de stoc la o cantitate de aproximativ 500-800 ml de apă deionizată şi apoi se umple până la 1 l.
                  
               
                     NB
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Prima publicaţie referitoare la mediul M4 se găseşte în Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, p. 25-33.
                  
               
      C.3.   TESTUL DE INHIBIŢIE A CREŞTERII ALGELOR
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Scopul acestui test este acela de a determina efectele unei substanţe asupra creşterii speciilor de alge verzi unicelulare. Testele de durată relativ scurtă (72 de ore) pot estima efectele asupra câtorva generaţii. Această metodă poate fi adaptată pentru a fi folosită în cazul câtorva specii de alge unicelulare, caz în care este furnizată o descriere a metodei împreună cu raportul de testare.
      Această metodă este cel mai uşor de aplicat în cazul substanţelor solubile în apă, pentru care în condiţiile de testare există probabilitatea de a rămâne în apă.
      Metoda poate fi folosită pentru substanţele care nu interferează direct cu măsurătorile de creştere a algelor.
      Este de dorit să se colecteze, pe cât posibil, informaţii legate de solubilitatea în apă, presiunea vaporilor, stabilitatea chimică, constanta de disociere şi biodegradabilitatea substanţei înainte de începerea testului.
      Atât la planificarea testului, cât şi la interpretarea rezultatelor trebuie luate în considerare informaţiile suplimentare (de exemplu, formula structurală, gradul de puritate, natura şi procentul de impurităţi semnificative, prezenţa şi cantitatea aditivilor şi coeficientul de partiţie n-octanol/apă).
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      
         Densitatea celulară: numărul de celule/mililitru;
      
         Creştere: creşterea densităţii celulare în perioada de testare;
      
         Viteza de creştere: creşterea densităţii celulare în unitatea de timp;
      
         CE50
         : în această metodă, acea concentraţie a substanţei de testat care determină o reducere cu 50 % fie a creşterii (CEb50), fie a vitezei de creştere (CEr50) în comparaţie cu testul martor;
      
         NOEC (concentraţia pentru care nu se observă niciun efect advers): în această metodă, cea mai mare concentraţie testată pentru care nu se observă niciun efect semnificativ de inhibiţie a creşterii în comparaţie cu testul martor.
      Toate concentraţiile substanţei de testat se exprimă în greutate pe volum (mg/l). Ele pot fi exprimate, de asemenea, ca greutate din greutate (mg/kg–1).
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Se poate testa o substanţă de referinţă pentru a demonstra că în condiţiile de testare din laborator răspunsul speciilor testate nu s-a schimbat semnificativ.
      Dacă se utilizează o substanţă de referinţă, rezultatele sunt prezentate în raportul de testare. Dicromatul de potasiu poate fi folosit ca substanţă de referinţă, însă culoarea acestuia poate afecta calitatea şi intensitatea luminii accesibile celulelor, precum şi determinările spectrofotometrice, dacă se fac. Dicromatul de potasiu s-a folosit într-un test internaţional inter-laboratoare (a se vedea referinţa bibliografică 3 şi apendicele 2).
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Se poate efectua un test-limită la 100 mg/l, pentru a demonstra că CE50 este mai mare decât această concentraţie.
      Culturile cu creştere exponenţială de alge verzi selecţionate sunt expuse acţiunii diverselor concentraţii de substanţă de testat, pe câteva generaţii, în condiţii definite.
      Soluţiile de testare se incubează timp de 72 de ore, pe durata cărora densitatea celulară din fiecare soluţie se măsoară cel puţin din 24 în 24 de ore. Inhibiţia creşterii se determină prin comparaţie cu o cultură martor.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Criteriile de calitate se aplică atât testului-limită, cât şi testului complet.
      Densitatea celulară din culturile martor trebuie să crească cu un factor de cel puţin 16 în decurs de 3 zile.
      Concentraţiile substanţei de testat se menţin în limita a 80 % din concentraţiile iniţiale pe toată perioada testului.
      Pentru substanţele care se dizolvă uşor în mediul de testare, rezultând soluţii stabile, adică acelea care nu se volatilizează, degradează, hidrolizează sau adsorb într-o măsură considerabilă, concentraţia iniţială poate fi considerată echivalentă cu concentraţia nominală. Trebuie demonstrat că pe toată durata testului au fost menţinute aceleaşi concentraţii, iar criteriile de calitate au fost satisfăcute.
      Pentru substanţele care sunt:
      
                  (i)
               
               
                  puţin solubile în mediul de testare; sau
               
            
                  (ii)
               
               
                  capabile să formeze emulsii stabile ori dispersii; sau
               
            
                  (iii)
               
               
                  instabile în soluţii apoase,
               
            concentraţia iniţială se consideră a fi concentraţia determinată analitic la începutul testului. Concentraţia se determină după o perioadă de echilibrare.
      În oricare din aceste cazuri, trebuie să se efectueze determinări suplimentare pe parcursul testului pentru a confirma concentraţiile reale de expunere sau respectarea criteriilor de calitate.
      Cantităţi semnificative de substanţă de testat pot fi incorporate în biomasa de alge pe durata testului. De aceea, pentru a demonstra respectarea criteriilor de calitate de mai sus, trebuie luate în consideraţie atât cantitatea de substanţă încorporată în biomasa de alge, cât şi substanţa din soluţie (sau, dacă nu este posibil din punct de vedere tehnic, măsurată în coloana de apă). Cu toate acestea, întrucât determinarea concentraţiei substanţei în biomasa de alge poate pune probleme tehnice serioase, respectarea criteriilor de calitate poate fi demonstrată folosind un vas de testare cu cea mai mare concentraţie a substanţei, dar fără alge şi măsurând concentraţiile în soluţie (sau, dacă nu este posibil din punct de vedere tehnic, în coloana de apă) la începutul şi la sfârşitul perioadei de testare.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Reactivi
      1.6.1.1.   Soluţiile substanţelor de testat
      Soluţiile mamă de concentraţia necesară sunt preparate prin dizolvarea substanţei în apă deionizată sau în apă conform punctului 1.6.1.2.
      Concentraţiile alese sunt preparate prin adăugarea unor cantităţi alicote la preculturile de alge (a se vedea apendicele 1).
      Substanţele se testează în mod normal numai până la limita solubilităţii. Pentru unele substanţe (de exemplu: substanţele puţin solubile în apă, sau cele cu Pow ridicat, sau care formează dispersii stabile în loc de soluţii apoase propriu-zise), se acceptă folosirea unei concentraţii deasupra limitei de solubilitate a substanţei, pentru a garanta concentraţia maximă solubilă/stabilă. Cu toate acestea, este important ca această concentraţie să nu perturbe sistemul de testare (de exemplu, o peliculă de substanţă pe suprafaţa apei care să împiedice oxigenarea apei etc.).
      Pentru a prepara soluţiile mamă ale substanţelor cu solubilitate scăzută în apă sau pentru a facilita dispersia acestor substanţe în mediul de testare se pot folosi: dispersia cu ultrasunete, solvenţi organici, agenţi de emulsionare sau agenţi de dispersie. În cazul în care se folosesc astfel de substanţe auxiliare, toate concentraţiile trebuie să conţină aceeaşi cantitate de substanţă auxiliară, iar un lot martor suplimentar de organisme Daphnia este tratat cu aceeaşi concentraţie a substanţei auxiliare ca şi cea folosită în loturile tratate. Concentraţia unor astfel de substanţe auxiliare este redusă la minimum şi în niciun caz nu trebuie să depăşească 100 mg/l în mediul de testare.
      Testul se efectuează fără reglarea pH-ului. Dacă există dovada unei schimbări pronunţate a pH-ului, se recomandă ca testul să se repete după reglarea pH-ului, iar rezultatele să se consemneze. În acest caz, valoarea pH-ului soluţiei mamă se reglează la valoarea pH-ului apei de diluţie, dacă nu există contraargumente specifice. Pentru reglarea pH-ului sunt preferate HCl şi NaOH. Această reglare a pH-ului se face astfel încât concentraţia substanţei de testat din soluţia mamă să nu se modifice în mod semnificativ. Dacă în urma acestei corecţii de pH are loc o reacţie chimică sau precipitarea fizică a substanţei de testat, acest lucru trebuie consemnat.
      1.6.1.2.   Mediul de testare
      Se poate utiliza apă distilată de bună calitate sau apă deionizată cu o conductibilitate mai mică de 5μS.cm–1. Aparatul pentru distilarea apei trebuie să nu conţină nicio componentă din cupru.
      Se recomandă următorul mediu:
      Se prepară patru soluţii mamă conform următorului tabel. Soluţiile mamă se sterilizează prin filtrare prin membrană sau termic şi se depozitează la întuneric la 4 oC. Soluţia mamă numărul patru se sterilizează numai prin filtrare prin membrană. Aceste soluţii mamă se diluează pentru a se obţine concentraţiile finale de elemente nutritive în soluţiile de testare.
      
                  Elemente nutritive
               
               
                  Concentraţia soluţiei mamă
               
               
                  Concentraţia finală în soluţia de testare
               
            
                  
                     Soluţia mamă 1: macroelemente nutritive
                  
               
            
                  NH4Cl
               
               
                  1,5 g/l
               
               
                  15 mg/l
               
            
                  MgCl2·6H2O
               
               
                  1,2 g/l
               
               
                  12 mg/l
               
            
                  CaCl2·2H2O
               
               
                  1,8 g/l
               
               
                  18 mg/l
               
            
                  MgSO4·7H2O
               
               
                  1,5 g/l
               
               
                  15 mg/l
               
            
                  KH2·PO4
                  
               
               
                  0,16 g/l
               
               
                  1,6 mg/l
               
            
                  
                     Soluţia mamă 2: Fe-EDTA
                  
               
            
                  FeCl3·6H2O
               
               
                  80 mg/l
               
               
                  0,08 mg/l
               
            
                  Na2EDTA·2H2O
               
               
                  100 mg/l
               
               
                  0,1 mg/l
               
            
                  
                     Soluţia mamă 3: microelemente
                  
               
            
                  H3BO3
                  
               
               
                  185 mg/l
               
               
                  0,185 mg/l
               
            
                  MnCl2·4H2O
               
               
                  415 mg/l
               
               
                  0,415 mg/l
               
            
                  ZnCl2
                  
               
               
                  3 mg/l
               
               
                  3 × 10–3 mg/l
               
            
                  CoCl2·6H2O
               
               
                  1,5 mg/l
               
               
                  1,5 × 10–3 mg/l
               
            
                  CuCl2·2H2O
               
               
                  0,01 mg/l
               
               
                  10–5 mg/l
               
            
                  Na2MoO4·2H2O
               
               
                  7 mg/l
               
               
                  7 × 10–3 mg/l
               
            
                  
                     Soluţia mamă 4: NaHCO3
                     
                  
               
            
                  NaHCO3
                  
               
               
                  50 g/l
               
               
                  50 mg/l
               
            pH-ul mediului după aerare este aproximativ 8.
      1.6.2.   Aparatură
      
                  —
               
               
                  Echipament obişnuit de laborator,
               
            
                  —
               
               
                  Vase de laborator cu un volum adecvat (de exemplu, vasele conice de 250 ml sunt adecvate când volumul soluţiei de testare este de 100 ml). Toate vasele de testare sunt identice în ceea ce priveşte materialul şi dimensiunile.
               
            
                  —
               
               
                  Aparatură pentru cultură: laboratorul sau camera în care se poate menţine o temperatură în limita de 21-25 oC ± 2 oC şi o iluminare continuă uniformă în gama spectrală 400-700 nm. Dacă algele din culturile martor au atins ratele recomandate de creştere se poate presupune că condiţiile de creştere, inclusiv intensitatea luminii, au fost adecvate.
                  Se recomandă să se folosească o intensitate a luminii care variază în domeniul 60-120 μE· m–2·s–1 (35-70 × 1018 fotoni· m–2·s–1) când este măsurată în domeniul 400-700 nm folosind un receptor adecvat. Pentru instrumentele de măsurare a luminii calibrate în lucşi, se acceptă un domeniu echivalent de 6 000-10 000 lx.
                  Intensitatea luminii se poate obţine folosind 4-7 lămpi fluorescente de 30 W de tip universal alb (temperatura culorii de aproximativ 4 300 K), la o distanţă de 0,35 m de cultura de alge.
               
            
                  —
               
               
                  Măsurătorile densităţii celulare se fac folosind metoda directă de numărare a celulelor vii, de exemplu, un microscop cu camere de numărare. Cu toate acestea, se pot folosi şi alte procedee (fotometrie, turbidimetrie, …) dacă sunt suficient de sensibile şi dacă se demonstrează că sunt suficient de bine corelate cu densitatea celulară.
               
            1.6.3.   Organisme de testare
      Se recomandă utilizarea de specii de alge verzi cu creştere rapidă, care prezintă avantaje pentru cultură şi testare. Se preferă următoarele specii:
      
                  —
               
               
                  
                     Selenastrum capricornutum, de exemplu, ATCC 22662 sau CCAP 278/4,
               
            
                  —
               
               
                  
                     Scenedesmus subspicatus, de exemplu, 86.81 SAG.
               
            
         Notă:
      
      
                  ATCC
               
               
                  =
               
               
                  Colecţie de culturi tip american (SUA)
               
            
                  CCAP
               
               
                  =
               
               
                  Centrul de cultură al algelor şi protozoarelor (UK)
               
            
                  SAG
               
               
                  =
               
               
                  Colecţie de culturi de alge (Göttingen, RFG)
               
            Dacă se folosesc alte specii, trebuie consemnată suşa în raportul de testare.
      1.6.4.   Mod de operare
      Intervalul concentraţiilor în care pot apărea efectele se determină pe baza rezultatelor testelor de stabilire a intervalului.
      Cele două moduri de a măsura creşterea (biomasa şi viteza de creştere) pot conduce la rezultate considerabil diferite în măsurarea inhibiţiei creşterii; ambele trebuie folosite în testul de stabilire a intervalului, pentru a asigura o progresie geometrică a concentraţiilor care să permită estimarea atât a valorii CEb50, cât şi a valorii CEr50.
      Densitatea celulară iniţială
      Se recomandă ca densitatea celulară iniţială din culturile testate să fie de aproximativ 104 celule/ml pentru Selenastrum capricornutum şi Scenedesmus subspicatus. Dacă se folosesc alte specii, biomasa trebuie să fie comparabilă.
      Concentraţiile substanţei de testat
      Pentru testare se aleg cel puţin cinci concentraţii într-o serie geometrică cu o raţie care nu depăşeşte 2,2. La cele mai mici concentraţii testate trebuie să nu se observe niciun efect asupra creşterii algelor. Cele mai ridicate concentraţii testate trebuie să inhibeze creşterea cu cel puţin 50 % faţă de martor şi de preferinţă să oprească complet creşterea.
      Replici şi martori
      Proiectul de testare include trei replici la fiecare concentraţie testată. Se efectuează trei teste martor fără substanţă şi, dacă este relevant, se realizează şi trei teste martor cu substanţa auxiliară. Dacă se justifică, planul testului poate fi modificat astfel încât să se mărească numărul de concentraţii şi să se reducă numărul de replici pe concentraţie.
      Desfăşurarea testului
      Culturile care conţin concentraţiile dorite ale substanţei de testat şi cantitatea dorită de inocul sunt preparate adăugând cantităţi alicote din soluţiile mamă ale substanţei la cantităţi adecvate de preculturi de alge (a se vedea apendicele 1).
      Se agită flacoanele de cultură şi se introduc în aparatul de cultură. Algele monocelulare sunt menţinute în suspensie prin agitare, amestecare sau barbotare cu aer, pentru a îmbunătăţi schimbul de gaz şi a reduce variaţia pH-ului în soluţiile de testare. Culturile sunt menţinute la o temperatură în intervalul 21-25 oC ± 2 oC.
      Densitatea celulară în fiecare flacon de testare se determină la cel puţin 24, 48 şi 72 de ore după începerea testului. Mediul de alge filtrat conţinând concentraţia adecvată de substanţă de testat se foloseşte pentru a determina fondul. Pentru măsurători de densitate celulară, altele decât metodele de numărare directă, se utilizează un mediu de alge filtrat cu concentraţia adecvată de substanţă.
      PH-ul se măsoară la începutul testului şi la 72 de ore.
      PH-ul martorilor nu variază în mod normal cu mai mult de 1,5 unităţi pe parcursul testului.
      Testarea substanţelor volatile
      Nu există o modalitate general acceptată de testare a substanţelor volatile. Dacă se cunoaşte că o substanţă are tendinţa de evaporare, se pot folosi flacoane de testare închise, cu spaţiul liber între capac şi nivelul lichidului. Trebuie luată în considerare posibilitatea lipsei CO2 când se calculează spaţiul liber din flacoanele închise. S-au propus variante ale acestei metode (a se vedea referinţa bibliografică 4).
      Trebuie făcute încercări pentru a determina cantitatea de substanţă care rămâne în soluţie şi se recomandă o atenţie deosebită la interpretarea rezultatelor testelor cu substanţe chimice volatile folosind sisteme închise.
      Test-limită
      Folosind modul de operare descris în această metodă, se poate efectua un test-limită la 100 mg/l pentru a demonstra că CE50 este mai mare decât această concentraţie.
      Dacă natura substanţei nu permite atingerea concentraţiei de 100 mg/l în soluţia testată, testul-limită se efectuează la o concentraţie egală cu solubilitatea substanţei (sau concentraţia maximă pentru formarea unei dispersii stabile) în mediul folosit (a se vedea şi punctul 1.6.1.1).
      Testul-limită se efectuează cel puţin în trei replici, cu acelaşi număr de martori. Cele două măsurători ale creşterii (biomasa şi viteza de creştere) trebuie folosite pentru testul-limită.
      Dacă într-un test-limită se întâlneşte o descreştere minimă de 25 % sau mai mult, atât a biomasei, cât şi a vitezei de creştere faţă de testul martor, trebuie să se efectueze o testare completă.
      2.   DATE ŞI EVALUARE
      Densitatea celulară măsurată în culturile tratate şi culturile martor se înregistrează în tabel împreună cu concentraţiile substanţei de testat şi timpii de măsurare. Valoarea medie a densităţii celulare pentru fiecare concentraţie a substanţei de testat şi pentru martori se tratează în funcţie de timp (0-72 h) pentru a se obţine curbele de creştere.
      Pentru a se determina relaţia concentraţie/efect se folosesc următoarele două abordări. Unele substanţe pot stimula creşterea la concentraţii scăzute. Se iau în considerare numai punctele care indică inhibiţia între 0 şi 100 %.
      2.1.   COMPARAREA ARIILOR DINTRE CURBELE DE CREŞTERE
      Aria dintre curbele de creştere şi linia orizontală N = N0 se poate calcula conform formulei:
      
         
      unde:
      
                  A
               
               
                  =
               
               
                  aria
               
            
                  N0
                  
               
               
                  =
               
               
                  număr de celule/ml la timpul t0 (începutul testului),
               
            
                  N1
                  
               
               
                  =
               
               
                  număr de celule/ml măsurat la t1
                  
               
            
                  Nn
                  
               
               
                  =
               
               
                  număr de celule/ml măsurat la tn
                  
               
            
                  tl
                  
               
               
                  =
               
               
                  timpul primei măsurători după începerea testului
               
            
                  tn
                  
               
               
                  =
               
               
                  timpul celei de-a n măsurători după începerea testului
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  numărul de măsurători efectuate după începerea testului
               
            Procentul de inhibiţie a creşterii celulare la fiecare concentraţie a substanţei de testat (IA) se calculează conform formulei:
      
         
      unde:
      
                  Ac
                  
               
               
                  =
               
               
                  aria dintre curba de creştere a testului martor şi linia orizontală N = N0
                  
               
            
                  At
                  
               
               
                  =
               
               
                  aria dintre curba de creştere la concentraţia t şi linia orizontală N = N0
                  
               
            
                  IA
                  
               
               
                  =
               
               
                  valorile IA sunt trasate pe hârtie semilogaritmică sau pe hârtie probit semilogaritmică faţă de concentraţiile corespunzătoare. Dacă se trasează pe hârtie probit, punctele se unesc printr-o linie dreaptă, fie cu ochiul liber, fie calculată prin regresie
               
            Valoarea CE50 se estimează din linia de regresie prin citirea concentraţiei echivalentă cu inhibiţia de 50 % (IA = 50 %). Pentru a nota această valoare fără ambiguitate se propune folosirea simbolului CEb50. Este esenţial ca CEb50 să se citeze împreună cu perioada corespunzătoare de expunere, de exemplu, CEb50 (0-72 h).
      2.2.   COMPARAREA VITEZELOR DE CREŞTERE
      Viteza medie specifică de creştere (μ) pentru culturile cu o creştere exponenţială se poate calcula după formula:
      
         
      unde t0 = timpul de la începutul testului.
      Ca metodă alternativă, viteza medie specifică de creştere se calculează din panta dreptei de regresie a diagramei lnN versus timp.
      Procentul de inhibiţie a vitezei specifice de creştere la fiecare concentraţie a substanţei de testat (Iμt) se calculează cu formula:
      
         
      unde:
      
                  μc
                  
               
               
                  =
               
               
                  viteza medie specifică de creştere pentru proba martor
               
            
                  μt
                  
               
               
                  =
               
               
                  viteza medie specifică de creştere pentru concentraţia testată t
               
            Scăderea procentuală a vitezei medii specifice de creştere la fiecare concentraţie a substanţei faţă de testul martor este trasată ca funcţie de logaritmul concentraţiei. Valoarea CE50 se poate citi din acest grafic. Se propune să se folosească simbolul CEb50 pentru a nu denumi ambiguu valoarea CE50 derivată prin această metodă. Timpii de măsurare trebuie indicaţi, de exemplu, dacă valoarea se referă la timpii 0 şi 72 de ore, simbolul devine CEr50 (0-72 h).
      
         Notă: viteza specifică de creştere are expresie logaritmică, iar modificările mici ale vitezei de creştere pot duce la modificări mari ale biomasei. Prin urmare, valorile CEb şi CEt nu sunt comparabile numeric.
      2.3.   CALCULUL VALORII NOEC
      NOEC se determină printr-o metodă statistică adecvată pentru compararea probelor multiple (de exemplu, analiza varianţei şi testul Dunnett), folosind valoarea individuală a ariei dintre curba de creştere A (a se vedea punctul 2.1) sau a vitezei specifică de creştere μ (a se vedea punctul 2.2) pentru fiecare replică.
      3.   RAPORT
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  substanţa de testat: date de identificare chimică a substanţei;
               
            
                  —
               
               
                  organismele de experienţă: origine, cultura de laborator, numărul suşei, metodă de cultivare;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              data de începere şi de încheiere a testului, durata;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatură;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              compoziţia mediului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aparatul de cultură;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pH-ul soluţiei la începutul şi sfârşitul testării (cu o explicaţie, dacă se observă modificări ale pH-ului cu mai mult de 1,5 unităţi);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              vehiculul şi metoda folosită pentru solubilizarea substanţei de testat şi concentraţia vehiculului în soluţiile de testare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              intensitatea şi calitatea luminii;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              concentraţiile testate (determinate sau nominale);
                           
                        
            
                  —
               
               
                  rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              densitatea celulară pentru fiecare flacon la fiecare timp de măsurare şi metoda de măsurare a densităţii celulare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              valorile medii ale densităţii celulare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              curbele de creştere;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              prezentarea grafică a relaţiei concentraţie/efect;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              valorile CE şi metoda de calcul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              NOEC;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              alte efecte observate.
                           
                        
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.
               
            
                  2.
               
               
                  Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag ’Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus’, in: Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
               
            
                  3.
               
               
                  ISO 8692 – Water quality – Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.
                  
               
            
                  4.
               
               
                  S. Galassi and M. Vighi – Chemosphere, 1981, vol. 10, p. 1123-1126.
               
            
         Apendicele 1
         Exemplu de mod de operare pentru cultura algelor
         Observaţii generale
         Scopul cultivării pe baza metodei de mai jos este acela de a obţine culturi de alge pentru testele de toxicitate.
         Se folosesc metode adecvate pentru a garanta lipsa infectării cu bacterii a culturilor de alge (ISO 4833). Se recomandă culturile necontaminate, dar esenţiale sunt culturile cu un singur tip de alge.
         Toate operaţiile se efectuează în condiţii sterile pentru a evita contaminarea cu bacterii sau alte alge. Culturile contaminate trebuie îndepărtate.
         Mod de operare pentru obţinerea culturilor de alge
         Prepararea soluţiilor de elemente nutritive (medii):
         Mediul se poate prepara prin diluarea soluţiilor mamă de elemente nutritive. Pentru mediul solid se adaugă 0,8 % agar-agar. Mediul trebuie să fie steril. Sterilizarea termică poate duce la o pierdere de NH3.
         Cultura mamă:
         Culturile mamă sunt culturi mici de alge care se transferă cu regularitate într-un mediu proaspăt pentru a acţiona ca material iniţial de testare. Dacă nu sunt folosite cu regularitate, se scurg pe tuburile înclinate acoperite cu agar-agar. Culturile se transferă într-un mediu proaspăt cel puţin o dată la 2 luni.
         Culturile mamă se cresc în vase conice care conţin mediul corespunzător (volum cca. 100 ml). Când algele sunt incubate la 20 oC cu iluminare continuă, este necesar un transfer săptămânal.
         În timpul transferului o cantitate din cultura „veche” se transferă cu pipete sterile într-un vas cu mediu proaspăt, astfel încât în cazul speciilor cu creştere rapidă concentraţia iniţială să fie de cca. 100 ori mai mică decât în culturile vechi.
         Viteza de creştere a speciei se poate determina din curba de creştere. Dacă aceasta se cunoaşte, este posibil să se estimeze densitatea la care cultura trebuie transferată într-un mediu nou. Acest lucru trebuie să se facă înainte ca algele din cultură să atingă faza morţii.
         Precultura:
         Precultura are ca scop obţinerea unei cantităţi de alge adecvată pentru inocularea culturilor de testare. Precultura se incubează în condiţiile testării şi se foloseşte în timpul creşterii exponenţiale, în mod normal după o perioadă de incubare de aproximativ trei zile. Când culturile de alge conţin celule deformate sau anormale, ele sunt înlăturate.
      
      
         Apendicele 2
         ISO 8692 – Calitatea apei – testul de inhibiţie a creşterii algelor în apa proaspătă cu Selenastrum capricornutum şi Scenedesmus subspicatus consemnează următoarele rezultate pentru testele circulare între 16 laboratoare privind bicromatul de potasiu:
         
                      
                  
                  
                     Mediu (mg/l)
                  
                  
                     Interval (mg/l)
                  
               
                     CEr50 (0-72 h)
                  
                  
                     0,84
                  
                  
                     0,60-1,03
                  
               
                     CEb50 (0-72 h)
                  
                  
                     0,53
                  
                  
                     0,20-0,75
                  
               
      C.4.   DETERMINAREA BIODEGRADABILITĂŢII „RAPIDE”
      PARTEA I.   CONSIDERAŢII GENERALE
      I.1.   INTRODUCERE
      Sunt descrise şase metode de testare care permit trierea substanţelor chimice pentru biodegradabilitate rapidă în mediul apos aerob:
      
                  (a)
               
               
                  Epuizarea Carbonului Organic Dizolvat (COD) (Metoda C.4-A)
               
            
                  (b)
               
               
                  Test de screening OCDE – Epuizarea COD (Metoda C.4-B)
               
            
                  (c)
               
               
                  Degajarea bioxidului de carbon (CO2) (Testul modificat Sturm) (Metoda C.4-C)
               
            
                  (d)
               
               
                  Respirometrie manometrică (Metoda C.4-D)
               
            
                  (e)
               
               
                  Vas închis (Metoda C.4-E)
               
            
                  (f)
               
               
                  MITI (Ministerul Comerţului şi Industriei Internaţionale – Japonia) (Metoda C.4-F)
               
            Consideraţiile generale şi comune privind cele şase teste sunt prezentate în partea I a metodei. Aspectele specifice metodelor individuale sunt prezentate în părţile II-VII. Apendicele conţin definiţii, formule şi material orientativ.
      Un test interlaboratoare OCDE, efectuat în 1988 ca exerciţiu de comparabilitate, a arătat că metodele dau rezultate compatibile. Cu toate acestea, în funcţie de caracteristicile fizice ale substanţei ce urmează a fi testată, poate fi preferată o metodă sau alta.
      I.2.   ALEGEREA METODEI ADECVATE
      Pentru a alege cea mai adecvată metodă, sunt necesare informaţii legate de solubilitatea substanţei chimice, presiunea de vapori şi caracteristicile de adsorbţie. Structura sau formula chimică trebuie cunoscute pentru a calcula valorile teoretice şi/sau a verifica valorile determinate ale parametrilor, de exemplu, CTO, CO2T, COD, COT, CCO (a se vedea apendicele 1 şi 2).
      Substanţele de testat care sunt solubile în apă până la cel puţin 100 mg/l pot fi evaluate prin toate metodele, cu condiţia ca ele să fie nevolatile şi neadsorbante. Pentru substanţele chimice care sunt greu solubile în apă, volatile sau adsorbante, metodele adecvate sunt indicate în tabelul 1 şi descrise în apendicele 3. Substanţele chimice cu volatilitate moderată pot fi testate prin metoda epuizării COD, dacă există destul spaţiu pentru gaz în vasele de testare (care trebuie să aibă dopuri adecvate). În acest caz, se pregăteşte şi un martor abiotic care să permită urmărirea pierderilor de masă.
      Tabelul 1
      Aplicabilitatea metodelor de testare
      
                  Test
               
               
                  Metoda analitică
               
               
                  Adecvare la substanţele care sunt:
               
            
                  greu solubile
               
               
                  volatile
               
               
                  adsorbante
               
            
                  Epuizare COD
               
               
                  Carbon organic dizolvat
               
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                  +/–
               
            
                  Epuizare OCDE modificată
               
               
                  Carbon organic dizolvat
               
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                  +/–
               
            
                  Degajarea CO2
                  
               
               
                  Respirometrie: degajarea CO2
                  
               
               
                  +
               
               
                  —
               
               
                  +
               
            
                  Respirometrie manometrică
               
               
                  Respirometrie manometrică: consum de oxigen
               
               
                  +
               
               
                  +/–
               
               
                  +
               
            
                  Vas închis
               
               
                  Respirometrie: oxigen dizolvat
               
               
                  +/–
               
               
                  +
               
               
                  +
               
            
                  MITI
               
               
                  Respirometrie: consum de oxigen
               
               
                  +
               
               
                  +/–
               
               
                  +
               
            Sunt necesare informaţii legate de puritatea sau proporţiile relative ale componentelor majore ale compusului de testat pentru a interpreta rezultatele obţinute, în special când rezultatele au valori mici sau marginale.
      Informaţiile legate de toxicitatea substanţei faţă de bacterii (apendicele 4) sunt foarte folositoare pentru alegerea concentraţiilor şi se pot dovedi esenţiale pentru interpretarea corectă a valorilor scăzute de biodegradare.
      I.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Pentru a verifica metoda, se testează substanţe de referinţă care îndeplinesc criteriile de biodegradabilitate rapidă într-un flacon adecvat în paralel cu testele propriu-zise.
      Substanţele chimice adecvate sunt anilina (proaspăt distilată), acetatul de sodiu şi benzoatul de sodiu. Toate aceste substanţe chimice de referinţă se degradează în condiţiile de lucru din prezentele metode, chiar şi când nu se adaugă deliberat inocul.
      S-a sugerat faptul că trebuie găsită o substanţă chimică de referinţă uşor degradabilă, dar care să necesite adăugarea unui inocul. S-a propus ftalatul acid de potasiu, însă este nevoie de obţinerea mai multor dovezi în cazul acestei substanţe înainte ca ea să fie acceptată ca substanţă de referinţă.
      La testele de respirometrie, compuşii care conţin azot pot afecta consumul de oxigen din cauza nitrificării (a se vedea apendicele 2 şi 5).
      I.4.   PRINCIPIUL METODELOR DE TESTARE
      O soluţie sau suspensie a substanţei de testat în mediu mineral este inoculată şi incubată în condiţii aerobe la întuneric sau lumină difuză. Cantitatea de COD datorată inoculului în soluţie trebuie să fie menţinută la valori cât mai mici posibile în comparaţie cu cantitatea de COD datorată substanţei de testat. Activitatea endogenă a inoculului este cuantificată făcând teste martor paralele, cu inocul şi fără substanţă de testat, deşi activitatea endogenă a celulelor în prezenţa substanţei nu se suprapune exact peste activitatea endogenă a martorului. În paralel se testează o substanţă de referinţă pentru a controla funcţionarea modului de operare.
      În general, degradarea este urmată de determinarea parametrilor, cum ar fi COD, generarea de CO2 şi consumul de oxigen, iar măsurătorile se fac la intervale destul de scurte, pentru a permite identificarea momentului de începere şi terminare a biodegradării. Cu respirometre automate măsurarea se efectuează continuu. COD se măsoară uneori alături de un alt parametru, dar acest lucru se face în mod obişnuit numai la începutul şi sfârşitul testării. De asemenea, se poate folosi o analiză chimică specifică pentru a estima degradarea primară a substanţei de testat şi pentru a se determina concentraţia substanţelor intermediare formate (obligatoriu în testul MITI).
      În mod normal, testul durează 28 zile. Cu toate acestea, testele se pot încheia înainte de 28 zile, adică de îndată ce curba biodegradării se aplatizează pentru cel puţin 3 determinări. Testele se pot, de asemenea, prelungi peste 28 zile, când curba arată că biodegradarea a început, dar că nu s-a ajuns la aplatizare în a 28-a zi.
      I.5.   CRITERII DE CALITATE
      I.5.1.   Reproductibilitate
      Dată fiind natura biodegradării şi a culturilor bacteriene mixte folosite ca inoculi, determinările se fac cel puţin în duplicat.
      S-a observat experimental că la o concentraţie mai mare de microorganisme adăugate iniţial în mediul de testare variaţiile între replici sunt mai mici. Testele interlaboratoare au arătat, de asemenea, că pot exista mari variaţii între rezultatele obţinute de diferite laboratoare, dar că se poate ajunge la o armonizare acceptabilă în cazul compuşilor uşor biodegradabili.
      I.5.2.   Validitatea testului
      Testul se consideră validat dacă diferenţa dintre valorile extreme reprezentând gradul de îndepărtare al substanţei la momentul aplatizării curbelor de biodegradare ale replicilor este mai mică de 20 % fie la sfârşitul testului, fie la începutul ferestrei de 10 zile, după caz, şi dacă procentul de degradare a substanţei de referinţă a atins nivelul de biodegradabilitate rapidă în 14 zile. Dacă nu este întrunită niciuna din aceste condiţii, testul se repetă. Dată fiind rigoarea metodelor, valorile scăzute nu înseamnă în mod necesar că substanţa de testat nu este biodegradabilă în condiţii de mediu, ci că sunt necesare alte studii pentru a determina biodegradabilitatea.
      Dacă într-un test de toxicitate care conţine atât substanţa de testat, cât şi o substanţă chimică de referinţă are loc mai puţin de 35 % degradare (bazat pe COD) sau mai puţin de 25 % (bazat pe CTO sau CO2T) în 14 zile, se poate presupune că substanţa de testat este inhibitoare (a se vedea şi apendicele 4). Seria de teste se repetă, dacă este posibil folosind o concentraţie mai scăzută a substanţei de testat şi/sau o concentraţie mai ridicată a inoculului, dar nu mai mult de 30 mg solide/litru.
      I.6.   MOD DE OPERARE GENERAL ŞI PREGĂTIRI
      Condiţiile generale aplicabile testelor sunt rezumate în tabelul 2. Aparatura şi alte condiţii de testare legate în mod specific de un anume test sunt descrise în subcapitolul destinat testului respectiv.
      Tabelul 2
      Condiţii de testare
      
                  Test
               
               
                  Epuizare COD
               
               
                  Eliminare CO2
                  
               
               
                  Respirometrie manometrică
               
               
                  Test de screening OCDE
               
               
                  Vas închis
               
               
                  MITI (I)
               
            
                  Concentraţia substanţei de testat
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  în mg/l
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  100
               
               
                   
               
               
                  2-10
               
               
                  100
               
            
                  mg COD/l
               
               
                  10-40
               
               
                  10-20
               
               
                   
               
               
                  10-40
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  mg CTO/l
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  50-100
               
               
                   
               
               
                  5-10
               
               
                   
               
            
                  Concentraţia inoculului (în celule/l, aprox.)
               
               
                  ≤ 30 mg/l SS sau ≤ 100 ml efluent/l (107-108)
               
               
                  0,5ml efluent secundar/l
                  (105)
               
               
                  ≤ 5 ml efluent/l
                  (104-106)
               
               
                  30 mg/l SS
                  (107-108)
               
            
                  Concentraţia elementelor în mediu mineral (în mg/l)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  P
               
               
                  116
               
               
                  11,6
               
               
                  29
               
            
                  N
               
               
                  1,3
               
               
                  0,13
               
               
                  1,3
               
            
                  Na
               
               
                  86
               
               
                  8,6
               
               
                  17,2
               
            
                  K
               
               
                  122
               
               
                  12,2
               
               
                  36,5
               
            
                  Mg
               
               
                  2,2
               
               
                  2,2
               
               
                  6,6
               
            
                  Ca
               
               
                  9,9
               
               
                  9,9
               
               
                  29,7
               
            
                  Fe
               
               
                  0,05-0,1
               
               
                  0,05-0,1
               
               
                  0,15
               
            
                  pH
               
               
                  7,4±0,2
               
               
                  De preferinţă 7,0
               
            
                  temperatură
               
               
                  22 ± 2 oC
               
               
                  25 ± 1 oC
               
            
                  
                              COD
                           
                           
                              =
                           
                           
                              carbon organic dizolvat
                           
                        
               
                  
                              CTO
                           
                           
                              =
                           
                           
                              cerere teoretică de oxigen
                           
                        
               
                  
                              SS
                           
                           
                              =
                           
                           
                              materii solide în suspensie
                           
                        
            I.6.1.   Apa de diluţie
      Se foloseşte apa deionizată sau distilată fără concentraţii inhibitoare de substanţe toxice (de exemplu, ioni de Cu++). Compusul de testat trebuie să nu contribuie cu mai mult de 10 % la conţinutul de carbon organic al apei. Pentru a elimina valorile ridicate ale probei martor este necesar ca apa de testare să aibă o puritate ridicată. Contaminarea poate rezulta din impurităţile inerente şi din răşinile schimbătoare de ioni şi material provenit din liza de bacterii şi alge. Pentru fiecare serie tratată se foloseşte numai o şarjă de apă, verificată înainte prin analiza COD. O astfel de verificare nu este necesară pentru testul în vas flacon închis, dar consumul de oxigen al apei trebuie să fie scăzut.
      I.6.2.   Soluţiile mamă ale componentelor minerale
      Pentru a prepara soluţiile de testare se prepară soluţiile mamă ale componentelor minerale, cu concentraţiile adecvate. Se pot folosi următoarele soluţii mamă (cu factori de diluţie diferiţi) pentru metodele: epuizare COD, test de screening modificat OCDE, eliminare CO2, respirometrie manometrică, testul în vas închis.
      Factorii de diluţie şi, pentru testul MITI, pregătirea specifică a mediului mineral, sunt prezentate în capitolele referitoare la testele respective.
      Soluţiile mamă:
      Se prepară următoarele soluţii mamă folosind reactivi de puritate analitică:
      
                  (a)
               
               
                  ortofosfat diacid de potasiu, KH2PO4
                  
               
               
                  8,50 g
               
            
                  ortofosfat acid de potasiu, K2HPO4
                  
               
               
                  21,75 g
               
            
                  ortofosfat acid de sodiu dihidrat, Na2HPO4·2 H2O
               
               
                  33,40 g
               
            
                  clorură de amoniu, NH4Cl
               
               
                  0,50 g
               
            
                  Se dizolvă în apă şi se completează până la 1 litru. pH-ul soluţiei este 7,4.
               
               
                   
               
            
                  (b)
               
               
                  clorură de calciu, anhidră, CaCl2
                  
               
               
                  27,50 g
               
            
                  sau clorură de calciu dihidrat, CaCl2·2 H2O
               
               
                  36,40 g
               
            
                  Se dizolvă în apă şi se completează până la 1 litru
               
               
                   
               
            
                  (c)
               
               
                  sulfat de magneziu heptahidrat, MgSO4·7H2O
               
               
                  22,50 g
               
            
                  Se dizolvă în apă şi se completează până la 1 litru.
               
               
                   
               
            
                  (d)
               
               
                  clorură ferică (III) hexahidrat, FeCl3·6H2O
               
               
                  0,25 g
               
            
                  Se dizolvă în apă şi se completează până la 1 litru.
               
               
                   
               
            Notă: Pentru a evita prepararea acestei soluţii imediat înainte de folosire, se adaugă o picătură de HCl concentrat sau 0,4 g sare disodică a acidului etilendiamin-tetraacetic (EDTA) pe litru.
      I.6.3.   Soluţii mamă ale substanţelor chimice
      De exemplu, 1-10 g de substanţă de testat sau de referinţă se dizolvă în apă deionizată şi se completează până la 1 litru, când solubilitatea depăşeşte 1 g/l. În caz contrar, soluţiile mamă se prepară în mediu mineral sau se adaugă substanţa de testat direct în mediul mineral. Pentru manevrarea substanţelor chimice mai puţin solubile, a se vedea apendicele 3, dar în testul MITI (Metoda C.4-F), nu se folosesc nici solvenţi şi nici agenţi de emulsionare.
      I.6.4.   Inocul
      Inoculul poate proveni dintr-o varietate de surse: nămol activ, efluenţi uzaţi (neclorinaţi), ape de suprafaţă şi soluri sau dintr-un amestec al acestora. Pentru testele de epuizare COD, eliminarea CO2 şi respirometrie manometrică, dacă se foloseşte nămol activ, acesta se ia dintr-o instalaţie de tratare sau o instalaţie de laborator care primeşte predominant ape reziduale menajere. S-a constatat că inoculi din alte surse dau rezultate foarte difuze. Pentru testul de screening modificat OCDE şi testul în vas închis, este nevoie de un inocul mai diluat, fără agregate floculate de nămol, iar sursa preferată este un efluent secundar dintr-o instalaţie industrială sau de laborator pentru tratarea apei reziduale menajere. În testele MITI inoculul provine dintr-un amestec de surse şi este descris în capitolul testului respectiv.
      I.6.4.1.   Inocul din nămoluri active
      Se prelevează o probă de nămol activ proaspăt din bazinul de aerare al unei instalaţii de tratare ape reziduale sau dintr-o instalaţie de laborator care tratează în special apele reziduale menajere. Se îndepărtează particulele grosiere dacă este necesar, prin filtrate printr-o sită fină, apoi nămolul se menţine în condiţii aerobe.
      Ca alternativă, se lasă la decantat sau se centrifughează proba (de exemplu, la 1 100 rot./min timp de 10 minute) după îndepărtarea tuturor particulelor grosiere. Se îndepărtează stratul de supernatant. Nămolul se spală în mediu mineral. Se prepară o suspensie de nămol concentrat în mediu mineral pentru a obţine o concentraţie de 3-5 g solide în suspensie/l şi se aerează până în momentul folosirii.
      Nămolul este prelevat dintr-o instalaţie clasică, care funcţionează corect. Dacă nămolul provine dintr-o instalaţie de tratare cu debit mare sau se presupune că ar conţine inhibitori, trebuie spălat. După o amestecare puternică, se lasă la decantat sau se centrifughează nămolul din noua suspensie, apoi se îndepărtează supernatantul; nămolul spălat se trece din nou în suspensie într-un alt volum de mediu mineral. Se repetă această procedură până când se consideră că nămolul nu mai conţine substrat sau inhibitori în exces.
      Imediat înainte de folosire, se prelevează o probă după ce nămolul este suspensionat complet sau, după caz, din nămol netratat, pentru a determina greutatea uscată a solidelor în suspensie.
      O altă alternativă de obţinere a inoculului este de a omogeniza nămolul activ (3-5 g solide în suspensie/l) într-un amestecător mecanic două minute la viteză medie; se lasă apoi timp de 30 minute, sau mai mult dacă este nevoie, la decantat şi se prelevează supernatantul pentru a fi folosit ca inocul într-un raport de 10 ml/l de mediu mineral.
      I.6.4.2.   Alte surse de inocul
      Inoculul se poate obţine din efluentul secundar al unei instalaţii de tratare sau al unei instalaţii de laborator care se alimentează mai ales cu apă uzată menajeră. Se prelevează o probă proaspătă de apă uzată; se transportă în condiţii aerobe. Se lasă să se decanteze timp de o oră sau se filtrează prin hârtie de filtru cu porozitate mare. Se menţine efluentul decantat sau filtrat în condiţii aerobe până în momentul folosirii. Până la 100 ml din acest tip de inocul se poate folosi pe litru de mediu mineral.
      O altă sursă de inocul este apa de suprafaţă. În acest caz, se prelevează o probă de apă de suprafaţă adecvată (de exemplu, râu, lac) şi se menţine în condiţii aerobe până în momentul folosirii. Dacă este nevoie, inoculul se concentrează prin filtrare sau centrifugare.
      I.6.5.   Precondiţionarea inoculului
      Inoculul poate fi precondiţionare şi adus în condiţiile de testare, dar nu şi preadaptat la substanţa de testat. Precondiţionarea constă în aerarea nămolului activ în mediu mineral sau efluent secundar timp de 5-7 zile, la temperatura de testare. Această precondiţionare îmbunătăţeşte uneori precizia metodelor prin reducerea valorilor din probele martor. Nu se consideră necesară precondiţionarea inoculului în cazul testului MITI.
      I.6.6.   Martori abiotici
      Dacă este necesar, posibila degradare abiotică a substanţei de testat se verifică prin determinarea îndepărtării COD, a consumului de oxigen sau a eliminării bioxidului de carbon în probe martor sterile, care nu conţin inocul. Se sterilizează prin filtrare cu membrană filtrantă (0,2-0,45 μm) sau prin adăugarea unei substanţe toxice adecvate într-o concentraţie corespunzătoare. Dacă se foloseşte filtrarea prin membrană, se prelevează probe în mod aseptic, pentru a menţine sterilitatea. Dacă nu s-a realizat înainte adsorbţia substanţei de testat, testele care măsoară biodegradarea ca îndepărtare a COD, în special cele care folosesc ca inocul nămolul activ, trebuie să includă un martor abiotic care este inoculat şi otrăvit.
      I.6.7.   Număr de vase
      Numărul de vase într-un experiment tipic este prezentat în capitolul aferent fiecărui test.
      Se pot folosi următoarele tipuri de vase:
      
                  —
               
               
                  Suspensie de testare: conţine substanţă de testat şi inocul
               
            
                  —
               
               
                  Proba martor cu inocul: conţine numai inocul
               
            
                  —
               
               
                  Martor de metodă: conţine substanţă de referinţă şi inocul
               
            
                  —
               
               
                  Martor steril abiotic: conţine substanţă de testat, steril (a se vedea punctul I.6.6)
               
            
                  —
               
               
                  Martor de adsorbţie: conţine substanţă de testat, inocul şi agentul de sterilizare
               
            
                  —
               
               
                  Martor de toxicitate: conţine substanţă de testat, substanţă de referinţă şi inocul
               
            Este obligatoriu ca testul propriu-zis şi testul martor cu inocul să se facă în paralel. Este de dorit să se facă determinări şi în alte vase, în paralel.
      Acest lucru s-ar putea totuşi să nu fie posibil întotdeauna. Se asigură suficiente probe sau citiri pentru a permite evaluarea procentului de degradare a substanţei într-o perioadă de 10 zile.
      I.7.   DATE ŞI EVALUARE
      Pentru calcularea lui Dt, degradarea procentuală, se folosesc valorile medii ale măsurătorilor duplicate ale parametrilor determinaţi atât în testul propriu-zis, cât şi în proba martor cu inocul. Formulele matematice pentru calcularea Dt sunt prezentate în capitolele de mai jos pentru fiecare test. Evoluţia degradării este ilustrată grafic şi se indică fereastra de 10 zile. Se calculează şi se consemnează procentul de eliminare a substanţei obţinut la sfârşitul perioadei de 10 zile şi valoarea corespunzătoare aplatizării curbei de biodegradare sau sfârşitului testului, după caz.
      La testele respirometrice, compuşii care conţin azot pot afecta consumul de oxigen din cauza nitrificării (a se vedea apendicele 2 şi 5).
      I.7.1.   Măsurarea degradării prin intermediul determinării COD
      Pentru a se putea evalua validitatea testului (a se vedea punctul I.5.2), se calculează Dt, degradarea procentuală, de fiecare dată când se prelevează o probă, şi anume se calculează separat pentru vasele conţinând substanţa de testat folosind media valorilor din măsurătorile COD duplicate. Se calculează folosind următoarea ecuaţie:
      
         
      unde:
      
                  Dt
                  
               
               
                  =
               
               
                  % degradare la timpul t
               
            
                  Co
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia medie iniţială a COD în mediul de cultură inoculat ce conţine substanţa de testat (mg COD/l)
               
            
                  Ct
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia medie a COD la timpul t în mediul de cultură inoculat ce conţine substanţa de testat (mg COD/l)
               
            
                  Cbo
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia medie iniţială a COD în proba martor cu mediu mineral inoculat (mg COD/l)
               
            
                  Cbt
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia medie a COD la timpul t în proba martor cu mediu mineral inoculat (mg COD/l)
               
            Toate concentraţiile se măsoară experimental.
      I.7.2.   Măsurarea degradării prin intermediul analizei specifice
      Dacă sunt disponibile date analitice specifice, biodegradarea primară se calculează din:
      
         
      unde:
      
                  Dt
                  
               
               
                  =
               
               
                  % degradare la un timp t, în mod normal 28 zile
               
            
                  Sa
                  
               
               
                  =
               
               
                  cantitatea reziduală de substanţă de testat în mediu inoculat, la sfârşitul testării (mg)
               
            
                  Sb
                  
               
               
                  =
               
               
                  cantitatea reziduală de substanţă de testat în proba martor, cu apă/mediu mineral, la care s-a adăugat numai substanţa de testat (mg)
               
            I.7.3.   Degradarea abiotică
      Dacă se foloseşte un martor steril, abiotic, degradarea abiotică se calculează în procente folosind formula:
      
         
      unde:
      
                  Cs(o)
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia COD în martorul steril la ziua 0
               
            
                  C s(t)
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia COD în martorul steril în ziua t
               
            I.8.   RAPORT
      Raportul de testare cuprinde, dacă este posibil, următoarele date:
      
                  —
               
               
                  substanţele chimice de testat şi de referinţă, precum şi puritatea lor;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de testare;
               
            
                  —
               
               
                  inocul: natura, locul de prelevare, concentraţia şi eventuala precondiţionare;
               
            
                  —
               
               
                  proporţia şi natura deşeurilor industriale prezente în nămol, dacă se cunosc;
               
            
                  —
               
               
                  durata şi temperatura testului;
               
            
                  —
               
               
                  în cazul substanţelor greu solubile, tratamentul aplicat;
               
            
                  —
               
               
                  metoda de testare aplicată; pentru orice modificare a modului de operare trebuie prezentate argumentele ştiinţifice şi explicaţia;
               
            
                  —
               
               
                  fişa de date;
               
            
                  —
               
               
                  orice fenomene de inhibiţie observate;
               
            
                  —
               
               
                  orice degradare abiotică observată;
               
            
                  —
               
               
                  date analitice specifice, dacă sunt disponibile;
               
            
                  —
               
               
                  date analitice referitoare la produsele intermediare, dacă există;
               
            
                  —
               
               
                  graficul degradării, exprimat în procente în funcţie de timp pentru substanţele de testat şi de referinţă; faza de latenţă, faza de degradare, fereastra de 10 zile şi panta sunt indicate clar (apendicele 1). Dacă testul satisface criteriile de validare, la trasarea graficului se poate folosi media procentelor de eliminare ale vaselor ce conţin substanţa de testat;
               
            
                  —
               
               
                  eliminarea procentuală după fereastra de 10 zile şi cea corespunzătoare aplatizării curbei de biodegradare sau sfârşitului testului.
               
            PARTEA II.   TESTUL DE EPUIZARE COD (Metoda C.4-A)
      
      II.1.   PRINCIPIUL METODEI
      Un volum măsurat de mediu mineral inoculat care conţine o concentraţie cunoscută de substanţă de testat (10-40 mg COD/l) ca singura sursă nominală de carbon organic, se aerează la întuneric sau lumină difuză la 22 ± 2 oC.
      Degradarea este urmată de analiza COD la intervale frecvente pe o perioadă de 28 de zile. Gradul de biodegradare se calculează exprimând concentraţia COD îndepărtată (corectată în funcţie de cea din proba martor cu inocul) ca procent din concentraţia prezentă iniţial. Gradul de biodegradare primară poate fi, de asemenea, calculat din analiza chimică suplimentară făcută la începutul şi la sfârşitul incubării.
      II.2.   DESCRIEREA METODEI
      II.2.1.   Aparatură
      
                  (a)
               
               
                  vase conice, de exemplu, 250 ml-2 litri în funcţie de volumul necesar pentru analiza COD;
               
            
                  (b)
               
               
                  agitatoare pentru vase conice, fie cu control automat al temperaturii, fie fără acest control, dar folosite într-o încăpere cu temperatură constantă şi având putere suficientă pentru a menţine condiţiile aerobe în toate vasele;
               
            
                  (c)
               
               
                  aparatură de filtrare cu membrane adecvate;
               
            
                  (d)
               
               
                  analizor COD;
               
            
                  (e)
               
               
                  oxigenometru;
               
            
                  (f)
               
               
                  centrifugă.
               
            II.2.2.   Prepararea mediului mineral
      Pentru prepararea soluţiilor mamă, a se vedea I.6.2.
      Se amestecă 10 ml de soluţie (a) cu 800 ml apă de diluţie, se adaugă câte 1 ml din soluţiile (b)-(d) şi se completează până la 1 litru cu apă de diluţie.
      II.2.3.   Prepararea şi adaptarea inoculului
      Inoculul poate proveni dintr-o varietate de surse: efluenţi uzaţi, ape de suprafaţă, soluri sau dintr-un amestec al acestora.
      A se vedea punctele I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 şi I.6.5.
      II.2.4.   Pregătirea vaselor
      De exemplu, se introduc 800 ml de mediu mineral în vase conice de 2 litri şi se adaugă volume suficiente de soluţii mamă ale substanţelor de testat şi de referinţă în fiecare vas pentru a obţine o concentraţie a substanţei chimice echivalentă cu 10-40 mg COD/l. Se verifică valorile pH şi se reglează, după caz, la 7,4. Se inoculează vasele cu nămol activ sau cu o altă sursă de inocul (a se vedea punctul I.6.4), pentru a obţine o concentraţie finală nu mai mare de 30 mg solide în suspensie/l. De asemenea, se prepară probe martor de inocul în mediu mineral, dar fără substanţă de testat sau de referinţă.
      După caz, se foloseşte un vas pentru a verifica efectul inhibitor posibil al substanţei de testat, inoculând o soluţie în mediu mineral având concentraţii comparabile ale substanţei de testat şi ale celei de referinţă.
      De asemenea, dacă este necesar, se pregăteşte încă un vas, steril, pentru a verifica dacă substanţa de testat este degradată abiotic, folosind o soluţie neinoculată a substanţei de testat (a se vedea punctul I.6.6).
      Suplimentar, dacă se presupune că substanţa de testat este adsorbită în mod semnificativ pe sticlă, nămol etc., se face o estimare preliminară pentru a determina gradul probabil de adsorbţie şi, astfel, adecvarea testului la substanţa respectivă (a se vedea tabelul 1). Se foloseşte un vas ce conţine substanţă de testat, inocul şi agent de sterilizare.
      Se completează volumele în toate vasele până la 1 litru cu mediu mineral şi, după amestecare, se ia o probă din fiecare vas pentru a determina concentraţia iniţială a COD (a se vedea apendicele 2 punctul 4). Se acoperă gura vaselor, de exemplu, cu folie de aluminiu, astfel încât să se permită schimbul liber de aer între vas şi atmosfera înconjurătoare. Apoi acestea se montează la agitatoare pentru începerea testului.
      II.2.5.   Numărul de vase într-o testare tipică
      Vasele 1 şi 2: suspensia de testare
      Vasele 3 şi 4: proba martor cu inocul
      Vasul 5: martor de metodă
      De preferinţă şi când este necesar, se folosesc:
      Vasul 6: martor steril abiotic
      Vasul 7: martor de adsorbţie
      Vasul 8: martor de toxicitate
      A se vedea şi punctul I.6.7.
      II.2.6.   Efectuarea testului
      Pe parcursul testului se determină concentraţiile COD în fiecare vas, în duplicat şi la intervalele de timp cunoscute, suficient de frecvent pentru a putea determina începutul ferestrei de 10 zile şi eliminarea procentuală la sfârşitul ferestrei de 10 zile. Se prelevează numai volumul minim de suspensie necesar pentru fiecare determinare.
      Înainte de prelevarea probelor se completează pierderile cauzate de evaporare, adăugând apă de diluţie (punctul 1.6.1) în cantitatea necesară, după caz. Se amestecă mediul de cultură foarte bine, verificând dacă materialul ce aderă pe pereţii vaselor s-a dizolvat sau a trecut în suspensie. Se filtrează prin membrană sau se centrifughează proba (a se vedea apendicele 2 punctul 4), imediat după ce a fost prelevată. Probele filtrate sau centrifugate se analizează în aceeaşi zi sau se depozitează la 2-4 oC timp de maxim 48 de ore ori se menţin la temperaturi mai mici de – 18 oC pentru un timp mai îndelungat.
      II.3.   DATE ŞI RAPORT
      II.3.1.   Interpretarea rezultatelor
      Se calculează degradarea în procente la timpul t conform punctului I.7.1 (determinare COD) şi, opţional, punctului I.7.2. (analize specifice).
      Se înregistrează toate rezultatele pe fişele de date prevăzute.
      II.3.2.   Validarea rezultatelor
      A se vedea punctul I.5.2.
      II.3.3.   Raportul de testare
      A se vedea punctul I.8.
      II.4.   FIŞA DE DATE
      Un exemplu de fişă de date este prezentat mai jos.
      TEST DE EPUIZARE COD
      
                  1.
               
               
                  LABORATOR
               
            
                  2.
               
               
                  DATA ÎNCEPERII TESTULUI
               
            3.   SUBSTANŢA DE TESTAT
      Denumire:
      Concentraţia soluţiei mamă: mg/l substanţă
      Concentraţia iniţială în mediul de testare, t0: mg/l substanţă
      4.   INOCUL
      Sursa:
      Tratament aplicat:
      Precondiţionare, dacă există:
      Concentraţia solidelor în suspensie în amestecul de reacţie: mg/l
      5.   DETERMINĂRI DE CARBON
      Analizor de carbon:
      
                   
               
               
                  Vas nr.
               
               
                   
               
               
                  COD după n zile (mg/l)
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                  n4
                  
               
            
                  Substanţă de testat + inocul
               
               
                  1
               
               
                  a1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a, medie
                  Ca(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  b1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b, medie
                  Cb(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Probă martor cu inocul fără substanţă de testat
               
               
                  3
               
               
                  c1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  c2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  c, medie Cc(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  4
               
               
                  d1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  d2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  d, medie
                  Cd(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            6.   EVALUAREA DATELOR BRUTE
      
                  Vas nr.
               
               
                   
               
               
                  % degradare după n zile
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                  n4
                  
               
            
                  1
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Medie (3)
                  
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
         Notă: formate similare se pot folosi pentru substanţele de referinţă şi pentru martorii de toxicitate.
      7.   MARTOR ABIOTIC (Opţional)
      
      
                   
               
               
                  Timp (zile)
               
            
                  0
               
               
                  t
               
            
                  Conc. COD mg/l în martor steril
               
               
                  Cs(0)
                  
               
               
                  Cs(t)
                  
               
            
         
      8.   ANALIZE CHIMICE SPECIFICE (Opţional)
      
      
                   
               
               
                  Cantitatea reziduală a substanţei de testat la sfârşitul testului (mg/l)
               
               
                  % degradare primară
               
            
                  Martor steril
               
               
                  Sb
                  
               
               
                   
               
            
                  Mediu de testare inoculat
               
               
                  Sa
                  
               
               
                  
                     
               
            PARTEA III.   TESTUL DE SCREENING MODIFICAT OCDE (Metoda C.4-B)
      
      III.1.   PRINCIPIUL METODEI
      Un volum măsurat de mediu mineral, cu o concentraţie cunoscută de substanţă de testat (10-40 mg COD/l) ca singura sursă nominală de carbon organic, se inoculează cu 0,5 ml efluent/litru de mediu. Amestecul se aerează la întuneric sau lumină difuză la 22 oC ± 2 oC.
      Degradarea este urmată de analiza COD la intervale frecvente într-o perioadă de 28 de zile. Gradul de biodegradare este calculat exprimând concentraţia COD eliminată (corectată în funcţie de cea din proba martor cu inocul) ca procent din concentraţia iniţială. Gradul de biodegradare primară poate fi de asemenea calculat din analiza chimică suplimentară făcută la începutul şi sfârşitul incubării.
      III.2.   DESCRIEREA METODEI
      III.2.1.   Aparatură
      
      
                  (a)
               
               
                  vase conice, de exemplu, de la 250 ml la 2 litri, în funcţie de volumul necesar pentru analiza COD;
               
            
                  (b)
               
               
                  agitatoare pentru vase conice, fie cu control automat al temperaturii, fie fără acest control, dar folosite într-o încăpere cu temperatură constantă şi având putere suficientă pentru a menţine condiţiile aerobe în toate vasele;
               
            
                  (c)
               
               
                  aparatură de filtrare cu membrane adecvate;
               
            
                  (d)
               
               
                  analizor COD;
               
            
                  (e)
               
               
                  oxigenometru;
               
            
                  (f)
               
               
                  centrifugă.
               
            III.2.2.   Prepararea mediului mineral
      Pentru prepararea soluţiilor mamă a se vedea punctul I.6.2.
      Se amestecă 10 ml de soluţie (a) cu 800 ml apă de diluţie, se adaugă câte 1 ml din soluţiile (b)-(d) şi se completează până la 1 litru cu apă de diluţie.
      Această metodă foloseşte numai 0,5 ml efluent/litru ca inocul şi prin urmare mediul poate necesita adăugarea de microelemente şi factori de creştere. Acest lucru se face prin adăugarea câte unui mililitru din fiecare din următoarele soluţii/litru de mediu final:
      Soluţie cu microelemente:
      
                  Sulfat de mangan tetrahidrat, MnSO4·4H2O
               
               
                  39,9 mg
               
            
                  Acid boric, H3BO3
                  
               
               
                  57,2 mg
               
            
                  Sulfat de zinc heptahidrat, ZnSO4·7H2O
               
               
                  42,8 mg
               
            
                  Heptamolibdat de amoniu, (NH4)6 Mo7O24
                  
               
               
                  34,7 mg
               
            
                  Chelaţi de fier (FeCl3 cu acid etilendiamin-tetraacetic)
               
               
                  100,0 mg
               
            
                  Se dizolvă şi se aduce până la 1 000 ml cu apă de diluţie
               
               
                   
               
            
                  Soluţie de vitamine:
               
               
                   
               
            
                  Extract de drojdie
               
               
                  15,0 mg
               
            Se dizolvă extractul de drojdie în 100 ml apă. Se sterilizează prin trecere printr-o membrană de 0,2 microni sau se pregăteşte proaspătă.
      III.2.3.   Prepararea şi precondiţionarea inoculului
      Inoculul este obţinut din efluentul secundar al unei instalaţii de tratare sau al unei instalaţii de laborator care foloseşte în special ape menajere (a se vedea punctele I.6.4.2 şi I.6.5).
      Se folosesc 0,5 ml/l de mediu mineral.
      III.2.4.   Pregătirea vaselor
      De exemplu, se introduc câte 800 ml de mediu mineral în vase conice de 2 litri şi se adaugă volume suficiente de soluţii mamă ale substanţelor de testat şi de referinţă, în vase separate, pentru a obţine o concentraţie a substanţei echivalentă cu 10-40 mg COD/l. Se verifică valoarea pH-ului şi se reglează, dacă este necesar, la 7,4. Se inoculează vasele cu 0,5 ml/l efluent de apă reziduală (a se vedea punctul I.6.4.2). De asemenea, se prepară probe de inocul pentru martor, în mediu mineral, fără substanţă de testat sau de referinţă.
      Dacă este necesar, se foloseşte un vas pentru a verifica posibilul efect inhibitor al substanţei, inoculând o soluţie în mediu mineral având concentraţii comparabile ale substanţei de testat şi de referinţă.
      De asemenea, dacă este necesar, se pregăteşte încă un vas, steril, pentru a se verifica dacă substanţa de testat este degradată abiotic, folosind o soluţie neinoculată a substanţei de testat (a se vedea punctul I.6.6).
      Suplimentar, dacă se presupune că substanţa de testat este adsorbită în mod semnificativ pe sticlă, nămol etc., se face o estimare preliminară pentru a determina gradul probabil de adsorbţie şi, astfel, adecvarea testului la substanţa respectivă (a se vedea tabelul 1). Se foloseşte un vas ce conţine substanţă de testat, inocul şi agent de sterilizare.
      Se completează volumele în toate vasele până la 1 litru cu mediu mineral şi, după amestecare, se ia o probă din fiecare vas pentru a determina concentraţia iniţială a COD (a se vedea apendicele 2 punctul 4). Se acoperă gura vaselor, de exemplu, cu folie de aluminiu, astfel încât să se permită schimbul liber de aer între vas şi atmosfera înconjurătoare. Apoi acestea se montează la agitatoare pentru începerea testului.
      III.2.5.   Numărul de vase într-un test tipic
      Vasele 1 şi 2: suspensia de testare
      Vasele 3 şi 4: probă martor cu inocul
      Vasul 5: martor de metodă
      De preferinţă şi când este necesar, se folosesc:
      Vasul 6: martor steril abiotic
      Vasul 7: martor de adsorbţie
      Vasul 8: martor de toxicitate
      A se vedea şi punctul I.6.7.
      III.2.6.   Desfăşurarea testului
      Pe parcursul testului se determină concentraţiile COD în fiecare vas, în duplicat şi la intervalele de timp cunoscute, suficient de frecvent pentru a putea determina începutul ferestrei de 10 zile şi eliminarea procentuală la sfârşitul ferestrei de 10 zile. Se prelevează numai volumul minim de suspensie necesar pentru fiecare determinare.
      Înainte de prelevarea probelor se completează pierderile cauzate de evaporare, adăugând apă de diluţie (punctul I.6.1) în cantitatea necesară, după caz. Se amestecă mediul de cultură foarte bine, verificând dacă materialul ce aderă pe pereţii vaselor s-a dizolvat sau a trecut în suspensie. Se filtrează prin membrană sau se centrifughează proba (a se vedea apendicele 2 punctul 4), imediat după ce a fost prelevată. Probele filtrate sau centrifugate se analizează în aceeaşi zi sau se depozitează la 2-4 oC timp de maxim 48 de ore ori se menţin la temperaturi mai mici de – 18 oC pentru un timp mai îndelungat.
      III.3.   DATE ŞI RAPORT
      III.3.1.   Interpretarea rezultatelor
      Se calculează degradarea în procente la timpul t conform punctului I.7.1 (determinare COD) şi, opţional, punctului I.7.2 (analize specifice).
      Se înregistrează toate rezultatele pe fişele de date prevăzute.
      III.3.2.   Validarea rezultatelor
      
      A se vedea punctul I.5.2.
      III.3.3.   Raportul de testare
      
      A se vedea punctul I.8.
      III.4.   FIŞA DE DATE
      Un exemplu de fişă de date este prezentat mai jos.
      TEST DE SCREENING MODIFICAT OCDE
      
                  1.
               
               
                  LABORATOR
               
            
                  2.
               
               
                  DATA ÎNCEPERII TESTULUI
               
            3.   SUBSTANŢA DE TESTAT
      Denumire:
      Concentraţia soluţiei mamă: mg/l substanţă
      Concentraţia iniţială în mediul de testare, t0: mg/l substanţă
      4.   INOCUL
      Sursa:
      Tratament aplicat:
      Precondiţionare, dacă există:
      Concentraţia materiilor în suspensie în amestecul de reacţie: mg/l
      5.   DETERMINĂRI DE CARBON
      
      Analizor de carbon:
      
                   
               
               
                  Vas nr.
               
               
                   
               
               
                  COD după n zile (mg/l)
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                  n4
                  
               
            
                  Substanţă de testat + inocul
               
               
                  1
               
               
                  a1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a, medie
                  Ca(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  b1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b, medie
                  Cb(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Probă martor cu inocul fără substanţă de testat
               
               
                  3
               
               
                  c1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  c2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  c, medie Cc(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  4
               
               
                  d1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  d2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  d, medie
                  Cd(t)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            6.   EVALUAREA DATELOR BRUTE
      
                  Vas nr.
               
               
                   
               
               
                  % degradare după n zile
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                  n4
                  
               
            
                  1
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Medie (4)
                  
               
               
                  
                     
               
               
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
         Notă: formate similare se pot folosi pentru substanţele de referinţă şi pentru martorii de toxicitate.
      7.   MARTOR ABIOTIC (Opţional)
      
      
                   
               
               
                  Timp (zile)
               
            
                  0
               
               
                  t
               
            
                  Conc. COD (mg/l) în martor steril
               
               
                  Cs(0)
                  
               
               
                  Cs(t)
                  
               
            
         
      8.   ANALIZE CHIMICE SPECIFICE (Opţional)
      
      
                   
               
               
                  Cantitatea reziduală a substanţei de testat la sfârşitul testului (mg/l)
               
               
                  % degradare primară
               
            
                  Martor steril
               
               
                  Sb
                  
               
               
                   
               
            
                  Mediu de testare inoculat
               
               
                  Sa
                  
               
               
                  
                     
               
            PARTEA IV.   TESTUL DE DEGAJARE A CO2 (Metoda C.4-C)
      
      IV.1.   PRINCIPIUL METODEI
      Un volum măsurat de mediu mineral inoculat, cu o concentraţie cunoscută de substanţă de testat (10-20 mg COD sau TOC/l) ca unică sursă nominală de carbon organic, se aerează prin trecerea aerului fără dioxid de carbon, cu debit controlat, la întuneric sau la lumină difuză. Degradarea este urmărită timp de 28 zile prin determinarea dioxidului de carbon produs, care este absorbit pe hidroxid de bariu sau de sodiu şi este măsurat prin titrarea hidroxidului rămas sau drept carbon anorganic. Cantitatea de dioxid de carbon produs de substanţa de testat (corectată cu cea rezultată din proba martor cu inocul) este exprimată ca procent din CO2T. Gradul de biodegradare se poate de asemenea calcula din analizele COD suplimentare, făcute la începutul şi la sfârşitul incubării.
      IV.2.   DESCRIEREA METODEI
      IV.2.1.   Aparatură
      
                  (a)
               
               
                  vase de 2-5 litri, fiecare prevăzut cu un tub de aerare cu un capăt ajungând aproape de baza vasului şi cu celălalt ieşind din vas;
               
            
                  (b)
               
               
                  agitatoare magnetice, când se testează substanţe puţin solubile;
               
            
                  (c)
               
               
                  vase pentru absorbţia gazului;
               
            
                  (d)
               
               
                  dispozitiv pentru controlul şi măsurarea debitului de aer;
               
            
                  (e)
               
               
                  aparatură pentru absorbţia dioxidului de carbon, pentru prepararea aerului care nu conţine dioxid de carbon; ca alternativă, se poate folosi un amestec de oxigen fără CO2 şi azot fără CO2, din butelie, în proporţia corectă (20 % O2: 80 % N2);
               
            
                  (f)
               
               
                  dispozitiv pentru determinarea dioxidului de carbon, fie prin titrimetrie, fie printr-una din analizele cantitative ale carbonului anorganic;
               
            
                  (g)
               
               
                  dispozitiv de filtrare cu membrană (opţional);
               
            
                  (h)
               
               
                  analizor de COD (opţional).
               
            IV.2.2.   Prepararea mediului mineral
      Pentru prepararea soluţiilor mamă, a se vedea punctul I.6.2.
      Se amestecă 10 ml de soluţie (a) cu 800 ml apă de diluţie, se adaugă câte 1 ml din soluţiile (b)-(d) şi se completează până la un 1 litru cu apă de diluţie.
      IV.2.3.   Prepararea şi precondiţionarea inoculului
      Inoculul poate proveni dintr-o varietate de surse: nămol activ, efluenţi menajeri, ape de suprafaţă, soluri sau un amestec al acestora.
      A se vedea punctele I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 şi I.6.5.
      IV.2.4.   Pregătirea vaselor
      Ca exemplu, următoarele volume şi cantităţi sunt indicate pentru vase de 5 litri ce conţin 3 l de suspensie. Dacă se folosesc volume mai mici, valorile se modifică în consecinţă, dar se asigură precizia măsurării dioxidului de carbon format.
      În fiecare vas de 5 litri se introduc 2 400 ml mediu mineral. Se adaugă un volum adecvat de nămol activ preparat (a se vedea punctele I.6.4.1 şi I.6.5) pentru a rezulta o concentraţie de solide în suspensie de cel mult 30 mg/l în 3 l de amestec inoculat. Ca alternativă, mai întâi se diluează nămolul preparat pentru a rezulta o suspensie de 500-1 000 mg/l în mediu mineral, înainte de adăugarea unei cantităţi alicote la conţinutul vasului de 5 litri astfel încât să se obţină o concentraţie de 30 mg/l; astfel se asigură o precizie mai mare. Pot fi folosite alte surse de inocul (a se vedea punctul I.6.4.2).
      Acest amestec inoculat se aerează peste noapte, cu aer fără CO2, pentru a elimina dioxidul de carbon din sistem.
      Se adaugă volume cunoscute din soluţiile mamă ale materialului de testat şi ale substanţei de referinţă, separat, în vase de testare replicate, astfel încât concentraţiile de COD sau de COT provenite din substanţele adăugate să fie cuprinse între 10 şi 20 mg/l; se lasă câteva vase fără adăugare de substanţă de testat, fiind folosite drept martori pentru inocul. Substanţele de testat puţin solubile se adaugă direct în vas în funcţie de greutate sau volum sau sunt tratate conform descrierii din apendicele 3.
      Dacă este necesar, un vas se foloseşte pentru a verifica posibilul efect inhibitor al substanţei de testat, prin adăugarea atât a substanţei respective, cât şi a substanţei de referinţă, în aceleaşi concentraţii ca şi cele prezente în alte vase.
      De asemenea, dacă este necesar, se foloseşte un vas steril pentru a verifica dacă substanţa de testat este degradată abiotic, prin folosirea unei soluţii neinoculate de substanţă (a se vedea punctul I.6.6). Se sterilizează prin adăugarea unei substanţe toxice în concentraţie adecvată.
      Se aduc volumele de suspensii din toate vasele la 3 litri, prin adăugarea de mediu mineral înainte de aerare cu aer fără CO2. Opţional, pot fi luate probe pentru analiza COD (a se vedea apendicele 2 punctul 4) şi/sau pentru analize specifice. Se conectează vasele de absorbţie la aerisirile vaselor.
      Dacă se foloseşte hidroxid de bariu, se conectează trei vase de absorbţie, fiecare conţinând 100 ml de soluţie de hidroxid de bariu 0,0125 M, în serie cu fiecare dintre vasele de 5 litri. Soluţia trebuie să nu conţină sulfat şi carbonat precipitat, iar concentraţia sa se determină imediat înainte de utilizare. Dacă se foloseşte hidroxid de sodiu, se conectează două vase în paralel, cel de-al doilea acţionând ca martor pentru a demonstra că tot dioxidul de carbon a fost absorbit în primul. Sunt adecvate vase de absorbţie cu sistemul de închidere al flacoanelor pentru ser. Se adaugă 200 ml de hidroxid de sodiu 0,05 M la fiecare vas, ceea ce este suficient pentru a absorbi cantitatea totală de dioxid de carbon degajată, când substanţa de testat este complet degradată. Soluţia de hidroxid de sodiu, chiar când este proaspăt preparată, conţine urme de carbonaţi; aceasta este corectată prin deducerea carbonatului din proba martor.
      IV.2.5.   Numărul de vase pentru o testare tipică
      Vasele 1 şi 2: suspensie de testare
      Vasele 3 şi 4: probă martor cu inocul
      Vasul 5: martor de metodă
      De preferinţă şi când este necesar, se folosesc:
      Vasul 6: martor steril abiotic
      Vasul 7: martor de toxicitate
      A se vedea, de asemenea, punctul I.6.7.
      IV.2.6.   Desfăşurarea testului
      Testul începe cu barbotarea aerului fără CO2 prin suspensie la o viteză de 30-100 ml/min. Se prelevează periodic probe din absorbantul dioxidului de carbon, pentru analizarea conţinutului de CO2. În timpul primelor zece zile este recomandat ca analizele să fie făcute în fiecare a doua sau a treia zi şi apoi în fiecare a 5-a zi până la a 28-a zi, astfel încât perioada ferestrei de 10 zile să poată fi identificată.
      În a 28-zi se prelevează probe (opţional) pentru determinarea COD şi/sau analize specifice, se măsoară pH-ul suspensiei şi se adaugă 1 ml acid clorhidric concentrat la fiecare vas; se aerează vasele peste noapte pentru a elimina dioxidul de carbon prezent în suspensii. În ziua a 29-a se face ultima analiză a dioxidului de carbon degajat.
      În zilele în care se determină CO2, se deconectează vasul de absorbţie cu hidroxid de bariu cel mai apropiat de vas şi se titrează soluţia de hidroxid cu HCl 0,05 M, folosind fenolftaleină ca indicator. Se mută vasele de absorbţie rămase cu un loc mai aproape de vas şi se adaugă un nou vas ce conţine 100 ml hidroxid de bariu proaspăt 0,0125 M, ultimul în serie. Se fac titrări când e necesar, de exemplu când se observă un precipitat substanţial în primul vas de absorbţie şi înainte ca în cel de-al doilea să se observe ceva, sau cel puţin săptămânal. Ca alternativă, când se foloseşte NaOH ca absorbant, se ia cu o seringă o probă (depinzând de caracteristicile analizorului de carbon folosit) de soluţie de hidroxid de sodiu din vasul de absorbţie mai apropiat de vasul de testare. Se injectează proba în partea anorganică (CA) a analizorului de carbon pentru analiza directă a dioxidului de carbon degajat.
      Se analizează conţinutul celui de-al doilea vas de absorbţie numai la sfârşitul testului, pentru a face corecţia datelor în cazul în care dioxidul de carbon a pătruns şi în acest vas.
      IV.3.   DATE ŞI RAPORT
      IV.3.1.   Interpretarea rezultatelor
      Cantitatea de CO2 captată de absorbant şi titrată este dată de formula:
      mgCO2 = (100 × CB – 0,5 × V × CA) × 44
      unde:
      
                  V
               
               
                  =
               
               
                  volumul de HCl folosit pentru titrarea a 100 ml de absorbant (ml)
               
            
                  CB
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia soluţiei de hidroxid de bariu (M)
               
            
                  CA
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia soluţiei de acid clorhidric (M)
               
            dacă CB este 0,0125 M, iar CA este 0,05 M, 100 ml hidroxid de bariu se titrează cu 50 ml, iar cantitatea de CO2 este dată de formula:
      
         
      Astfel, în acest caz, pentru a converti volumul de HCl titrat în mg CO2 produs, factorul este 1,1.
      Se calculează cantităţile de CO2 produs de inocul în sine şi de inocul plus substanţa de testat, folosind respectivele valori de titrare, diferenţa fiind cantitatea de CO2 produsă numai de substanţa de testat.
      De exemplu, dacă martorul cu inocul se titrează cu 48 ml şi proba conţinând inocul plus substanţa de testat cu 45 ml,
      CO2 de la inocul = 1,1 × (50 – 48) = 2,2 mg
      CO2 de la inocul plus substanţa de testat = 1,1 × (50 – 45) = 5,5 mg
      Astfel, cantitatea de CO2 produsă de substanţa de testat este de 3,3 mg.
      Procentul de biodegradabilitate se calculează din formula:
      
         
      sau
      
         
      3,67 fiind factorul de conversie (44/12) de la carbon la dioxid de carbon.
      Se calculează degradarea procentuală în orice moment ca sumă a procentelor teoretice de eliminare a CO2 (CO2T) calculate pentru fiecare din zilele în care eliminarea CO2 a fost măsurată.
      Pentru vasele de absorbţie cu hidroxid de sodiu se calculează cantitatea de dioxid de carbon produs, exprimat ca CI (mg), prin înmulţirea concentraţiei de CI în absorbant cu volumul de absorbant.
      Se calculează procentul de degradare din:
      
         
      Se calculează COD eliminat (opţional) conform descrierii de la punctul I.7. Se înregistrează aceste rezultate şi toate celelalte rezultate pe fişele de date prevăzute.
      IV.3.2.   Validarea rezultatelor
      Conţinutul de CI al suspensiei de substanţă în mediul mineral la începutul testului trebuie să fie mai mic decât 5 % din CT, iar CO2 total din martorul cu inocul, la sfârşitul testului, nu va depăşi în mod normal media de 40 mg/l. Dacă se obţin valori mai mari de 70 mg CO2/litru, datele şi tehnica experimentală vor fi supuse unui examen critic.
      A se vedea, de asemenea, I.5.2.
      IV.3.3.   Raportul de testare
      A se vedea I.8.
      IV.4.   FIŞA DE DATE
      Un exemplu de fişă de date este prezentat în continuare.
      TEST DE DEGAJARE A DIOXIDULUI DE CARBON
      
                  1.
               
               
                  LABORATOR
               
            
                  2.
               
               
                  DATE LA ÎNCEPUTUL TESTULUI
               
            3.   SUBSTANŢA DE TESTAT
      Denumire:
      Concentraţia soluţiei mamă: mg/litru substanţă
      Concentraţia iniţială în mediu: mg/litru substanţă
      C total adăugat în vas: mg C
      CO2T: mg CO2
      
      4.   INOCUL
      Sursa:
      Tratament aplicat:
      Precondiţionare, dacă există:
      Concentraţia de solide în suspensie în amestecul de reacţie: mg/litru
      
                  5.
               
               
                  PRODUCEREA DIOXIDULUI DE CARBON ŞI DEGRADABILITATEA
               
            Metodă: Ba(OH)2/NaOH/altele
      
                  Timpul
               
               
                  CO2 format
                  Test (mg)
               
               
                  CO2 format
                  Probă martor (mg)
               
               
                  CO2 cumulat (mg)
                  (media test minus proba martor)
               
               
                  CO2T
                  
                     
               
            
                  1
                  2
               
               
                  media
               
               
                  3
                  4
               
               
                  media
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  1
               
               
                  2
               
               
                  media
               
            
                  0
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  n1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  n2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  n3
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  28
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            Notă: Pentru substanţele de referinţă şi pentru martorii de toxicitate pot fi folosite formate similare.
      6.   ANALIZA CARBONULUI (opţional)
      
      Analizor de carbon:
      
                  Timpul (ziua)
               
               
                  Proba martor mg/l
               
               
                  Substanţa de testat mg/l
               
            
                  0
               
               
                  Cb(0)
                  
               
               
                  Co
                  
               
            
                  28 (5)
                  
               
               
                  Cb(t)
                  
               
               
                  Ct
                  
               
            
         
      7.   DEGRADAREA ABIOTICĂ (opţional)
      
      
         
      PARTEA V.   TESTUL DE RESPIROMETRIE MANOMETRICĂ (Metoda C.4-D)
      
      V.1.   PRINCIPIUL METODEI
      Un volum măsurat de mediu mineral inoculat, cu o concentraţie cunoscută din substanţa de testat (100 mg/litru de substanţă testată, pentru a rezulta cel puţin 50-100 mg CTO/litru), ca unică sursă nominală de carbon organic, este agitat într-un vas închis, la o temperatură constantă (± 1 oC sau mai apropiat) timp de mai mult de 28 zile. Consumul de oxigen se determină fie prin măsurarea cantităţii de oxigen (produs electrolitic) necesare pentru menţinerea constantă a volumului de gaz din vasul respirometrului, fie din schimbări ale volumului sau presiunii (sau o combinaţie a celor două) în aparatură. Dioxidul de carbon degajat este absorbit într-o soluţie de hidroxid de potasiu sau într-un alt absorbant potrivit. Cantitatea de oxigen consumată de substanţa de testat (corectată cu cea consumată de proba martor cu inocul testat în paralel) este exprimată ca procent de CTO sau CCO. Opţional, biodegradabilitatea primară poate fi de asemenea calculată prin analize specifice suplimentare, făcute la începutul şi la sfârşitul incubării, iar biodegradabilitatea finală prin analiza COD.
      V.2.   DESCRIEREA METODEI
      V.2.1.   Aparatură
      
                  (a)
               
               
                  respirometru adecvat;
               
            
                  (b)
               
               
                  dispozitiv martor a temperaturii, menţinută la ± 1 oC sau mai precis;
               
            
                  (c)
               
               
                  dispozitiv de filtrare prin membrană (opţional);
               
            
                  (d)
               
               
                  analizor de carbon (opţional).
               
            V.2.2.   Prepararea mediului mineral
      Pentru prepararea soluţiilor mamă, a se vedea punctul I.6.2.
      Se amestecă 10 ml soluţie (a) cu 800 ml apă de diluţie, se adaugă câte 1 ml din soluţiile (b)-(d) şi se completează până la 1 litru cu apă de diluţie.
      V.2.3.   Prepararea şi precondiţionarea inoculului
      Inoculul poate proveni de la o varietate de surse: nămol activ, efluenţi menajeri, ape de suprafaţă, soluri sau dintr-un amestec al acestora.
      A se vedea punctele I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 şi I.6.5.
      V.2.4.   Pregătirea vaselor
      Folosind soluţii mamă, se prepară în şarje separate soluţii ale substanţelor de testat şi de referinţă în mediu mineral, astfel încât să rezulte, de regulă, o concentraţie de 100 mg substanţă/litru (rezultând cel puţin 50-100 mg CTO/litru).
      Se calculează CTO pe baza formării sărurilor de amoniu, dacă nu se anticipează nitrificarea, caz în care calculul va fi bazat pe formarea nitraţilor (a se vedea apendicele 2 punctul 2).
      Se determină valorile pH-ului şi, dacă este necesar, se reglează la 7,4±0,2.
      Substanţele greu solubile vor fi adăugate în ultima etapă (a se vedea mai jos).
      Dacă se determină toxicitatea substanţei de testat, se prepară o altă soluţie în mediu mineral ce conţine atât substanţă de testat, cât şi substanţă de referinţă, în concentraţii similare cu cele ale soluţiilor individuale.
      Dacă sunt necesare măsurători ale consumului fizico-chimic de oxigen se prepară o soluţie a substanţei de testat având de regulă 100 mg CTO/litru, care se sterilizează prin adăugarea unei substanţe toxice potrivite (a se vedea punctul I.6.6).
      Se introduc volumele necesare de soluţii ale substanţei de testat şi de referinţă, în cel puţin două vase. În alte vase se adaugă numai mediu mineral (pentru proba martor cu inocul) şi, dacă este necesar, soluţia comună de substanţă de testat/substanţă de referinţă şi soluţia sterilă.
      Dacă substanţa de testat este puţin solubilă, se adaugă direct în această etapă în funcţie de cantitate sau volum sau este tratată conform descrierii din apendicele 3. Se adaugă hidroxid de potasiu, pelete de hidroxid de calciu sau alt absorbant în compartimentele vasului de absorbţie a CO2.
      V.2.5.   Numărul de vase într-un test tipic
      Vasele 1 şi 2: suspensie de testare
      Vasele 3 şi 4: proba martor cu inocul
      Vasul 5: martor de metodă
      De preferinţă şi când este necesar, se folosesc:
      Vasul 6: martor steril
      Vasul 7: martor de toxicitate
      A se vedea, de asemenea, punctul I.6.7.
      V.2.6.   Desfăşurarea testului
      Se lasă vasele să atingă temperatura dorită, iar apoi se inoculează cu nămol activ preparat sau cu altă sursă de inocul, pentru a obţine o concentraţie de solide în suspensie nu mai mare de 30 mg/litru. Se asamblează echipamentul, se porneşte agitatorul, se verifică etanşarea şi se porneşte măsurarea consumului de oxigen. De obicei, nu este necesară altă supraveghere în afara citirilor şi verificărilor zilnice pentru a urmări menţinerea unei temperaturi corecte şi unei agitări adecvate.
      Se calculează consumul de oxigen din citirile efectuate la intervale regulate şi frecvente, folosind metodele date de producătorul echipamentului. La sfârşitul incubării, în mod normal după 28 zile, se măsoară pH-ul soluţiilor din vase, în special în cazul în care consumurile de oxigen sunt scăzute sau mai mici decât CTONH4 (pentru compuşii care conţin azot).
      Dacă este necesar, se prelevează probe iniţiale şi finale din vasele respirometrului, pentru analiza COD sau dozarea substanţei (a se vedea apendicele 2 punctul 4). După prelevarea iniţială, se înregistrează volumul suspensiei rămasă în vas. Când oxigenul este consumat de substanţa de testat ce conţine azot, se determină creşterea concentraţiei de nitrit şi nitrat după 28 zile şi se calculează corecţia pentru oxigenul consumat prin nitrificare (apendicele 5).
      V.3.   DATE ŞI RAPORT
      V.3.1.   Interpretarea rezultatelor
      Se împarte consumul de oxigen (mg) al substanţei de testat după un timp dat (corectat cu acela al probei martor cu inocul după acelaşi timp) la cantitatea de substanţă folosită. Rezultă CBO exprimat ca mg oxigen/mg substanţă testată, după cum urmează:
      
         
      Procentul de biodegradare se calculează din:
      
         
      sau din:
      
         
      Trebuie remarcat că aceste două metode nu dau în mod necesar aceeaşi valoare; este preferabil să fie folosită prima metodă.
      Pentru substanţele de testat ce conţin azot, se foloseşte CTO adecvat (NH4 sau NO3), în conformitate cu datele cunoscute sau anticipate cu privire la incidenţa nitrificării (apendicele 2 punctul 2). Dacă nitrificarea are loc, dar nu este completă, se calculează corecţia pentru oxigenul consumat prin nitrificare din schimbarea concentraţiilor de nitrit şi nitrat (apendicele 5).
      În cazul în care se fac determinări opţionale ale carbonului organic şi/sau ale unei substanţe specifice, se calculează degradarea procentuală, conform descrierii de la punctul I.7.
      Se înregistrează toate rezultatele pe fişele de date anexate.
      V.3.2.   Validarea rezultatelor
      Consumul de oxigen al martorului cu inocul este în mod normal de 20-30 mg O2/litru şi nu este mai mare de 60 mg/litru în 28 zile. Valorile mai mari de 60 mg/litru necesită un examen critic al datelor şi tehnicilor experimentale. Dacă valoarea pH-ului este în afara intervalului 6-8,5 iar consumul de oxigen de către substanţa chimică de testat este mai mic de 60 %, testul se repetă cu o concentraţie mai mică a substanţei de testat.
      A se vedea, de asemenea, punctul I.5.2.
      V.3.3.   Raport
      A se vedea punctul I.8.
      V.4.   FIŞA DE DATE
      
      Un exemplu de fişă de date este prezentat mai jos.
      TEST DE RESPIROMETRIE MANOMETRICĂ
      
                  1.
               
               
                  LABORATORUL
               
            
                  2.
               
               
                  DATE LA ÎNCEPUTUL TESTULUI
               
            3.   SUBSTANŢA DE TESTAT
      Denumire:
      Concentraţia soluţiei mamă: mg/litru
      Concentraţia iniţială în mediu, C0: mg/litru
      Volumul vasului de testare (V): ml
      CTO sau CCO: mg O2/mg substanţă testată (NH4, NO3)
      4.   INOCUL
      Sursa:
      Tratament aplicat:
      Precondiţionare, dacă există:
      Concentraţia de solide în suspensie în amestecul de reacţie: mg/l
      5.   CONSUM DE OXIGEN: BIODEGRADABILITATE
      
                   
               
               
                  Ziua
               
            
                  0
               
               
                   
               
               
                  7
               
               
                   
               
               
                  14
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  21
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  28
               
               
                   
               
            
                  Consumul de O2 (mg) al substanţei de testat
               
               
                  1
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a, medie
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Consumul de O2 (mg) al probei martor
               
               
                  3
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  4
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  b, medie
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  CBO corectat (mg)
               
               
                  (a1 – bm)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  (a2 – bm)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  CBO (mg) substanţă de testat
               
               
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  % degradare
                  
                     
               
               
                  D1 (a1)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  D2 (a2)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Media (6)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  V = volumul mediului mineral din vasul de testare
               
            N.B.: Formate similare pot fi folosite pentru substanţa de referinţă şi pentru martorii de toxicitate.
      6.   CORECŢIA PENTRU NITRIFICARE (a se vedea apendicele 5)
      
      
                  Ziua
               
               
                  0
               
               
                  28
               
               
                  Diferenţa
               
            
                  
                              (i)
                           
                           
                              Concentraţia de nitrat (mg N/litru)
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                  (N)
               
            
                  
                              (ii)
                           
                           
                              Echivalentul de oxigen (4,57 × N × V) (mg)
                           
                        
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                   
               
            
                  
                              (iii)
                           
                           
                              Concentraţia de nitrat (mg N/litru)
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                  (N)
               
            
                  
                              (iv)
                           
                           
                              Echivalentul de oxigen (3,43 × N × V) (mg)
                           
                        
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                   
               
            
                  
                              (ii) + (iv)
                           
                           
                              Echivalentul oxigenului total
                           
                        
               
                  —
               
               
                  —
               
               
                   
               
            7.   ANALIZA CARBONULUI (opţional)
      
      Analizorul de carbon:
      
                  Timpul (zile)
               
               
                  Proba martor mg/litru
               
               
                  Substanţa de testat mg/litru
               
            
                  0
               
               
                  (Cblo)
               
               
                  (Co)
               
            
                  28 (7)
                  
               
               
                  (Cblt)
               
               
                  (Ct)
               
            
         
      8.   SUBSTANŢA SPECIFICĂ (opţional)
      
      
                  Sb
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia în controlul fizico-chimic (steril) după 28 zile
               
            
                  Sa
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia în vasul inoculat după 28 zile
               
            
         
      9.   DEGRADARE ABIOTICĂ (opţional)
      
      
                  a
               
               
                  =
               
               
                  consumul de oxigen din vasul steril după 28 zile, (mg)
               
            
         
      (a se vedea punctele 1 şi 3)
      
         
      PARTEA VI   – TESTUL CU VAS ÎNCHIS (Metoda C.4-E)
      
      VI.1.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Soluţia de substanţă de testat în mediu mineral, de obicei 2-5 mg/litru, se inoculează cu un număr relativ mic de microorganisme dintr-o populaţie bacteriană mixtă, în vase de testare complet pline, închise, ţinute la întuneric, la temperatură constantă. Degradarea este urmată de analiza oxigenului dizolvat după o perioadă de 28 zile. Cantitatea de oxigen consumată de către substanţa de testat, corectată cu consumul din proba martor cu inocul, testat în paralel, se exprimă ca procent de CTO sau CCO.
      VI.2.   DESCRIEREA METODEI
      VI.2.1.   Aparatură
      
                  (a)
               
               
                  vase CBO, cu dopuri de sticlă, de exemplu de 250-300 ml;
               
            
                  (b)
               
               
                  baie de apă sau incubator, pentru păstrarea vaselor la temperatură constantă (± 1 oC sau mai precis) şi la întuneric;
               
            
                  (c)
               
               
                  vase mari (2-5 litri) pentru prepararea mediului şi pentru umplerea vaselor CBO;
               
            
                  (d)
               
               
                  oxigenometru sau echipament şi reactivi pentru titrarea Winkler.
               
            VI.2.2.   Prepararea mediului mineral
      Pentru prepararea soluţiilor mamă, a se vedea punctul I.6.2.
      Se amestecă câte 1 ml din soluţiile (a)-(d) şi se aduce la 1 litru cu apă de diluţie.
      VI.2.3.   Prepararea inoculului
      Inoculul provine în mod normal din efluentul secundar al instalaţiei de epurare sau din sedimentul provenit predominant de la apa uzată menajeră. O sursă alternativă de inocul este apa de suprafaţă. În mod normal, se foloseşte de la o picătură (0,05 ml) până la 5 ml de filtrat pe litru de mediu; pot fi necesare experimentări pentru a determina volumul optim pentru un efluent dat (a se vedea punctele I.6.4.2 şi I.6.5).
      VI.2.4.   Pregătirea vaselor
      Se aerează puternic mediul mineral timp de cel puţin 20 min. Fiecare serie de teste se efectuează cu mediu mineral provenit din acelaşi lot. În general, mediul este gata pentru folosire după păstrarea sa la temperatura de testare timp de 20 ore. Se determină concentraţia oxigenului dizolvat pentru control; valoarea va fi de aproximativ 9 mg/litru la 20 oC. Toate operaţiile de transfer şi umplere se efectuează într-un mediu saturat cu oxigen, fără barbotare, prin folosirea sifoanelor.
      Se pregătesc grupuri paralele de vase CBO cu substanţă de testat şi de referinţă pentru determinări în serii experimentale simultane. Se montează un număr suficient de vase CBO, inclusiv proba martor cu inocul, pentru a permite ca măsurătorile duplicate ale consumului de oxigen să fie făcute la intervalele de timp dorite, de exemplu, după 0, 7, 14, 21 şi 28 de zile. Pentru a fi posibilă identificarea ferestrei de 10 zile, se folosesc mai multe vase.
      Vasele mari se umplu o treime cu mediu mineral aerat. Apoi se adaugă soluţii mamă de substanţă testată şi de referinţă în vase mari separate, în cantităţi suficiente pentru a obţine o concentraţie finală a substanţelor mai mică de 10 mg/litru. Nu se adaugă nicio substanţă la mediul probei martor cu inocul, conţinut într-un alt vas mare.
      Pentru a nu limita activitatea inoculului, concentraţia oxigenului dizolvat nu trebuie să scadă sub 0,5 mg/litru în vasele CBO. Aceasta limitează concentraţia substanţei de testat la aproximativ 2 mg/litru. Cu toate acestea, pentru compuşii puţin degradabili şi pentru aceia cu un CTO mic, se pot folosi 5-10 mg/litru. În unele cazuri, se recomandă să se efectueze serii paralele cu substanţă de testat la două concentraţii diferite, de exemplu, 2 şi 5 mg/litru. În mod normal, se calculează CTO pe baza formării sărurilor de amoniu dar, dacă se presupune sau se ştie că are loc nitrificarea, se calculează pe baza formării nitratului (CTONO3: a se vedea apendicele 2 punctul 2). Cu toate acestea, dacă nitrificarea nu este completă, dar are loc, se corectează cu modificările în concentraţiile de nitrit şi de nitrat, determinate prin analiză (a se vedea apendicele 5).
      Dacă trebuie determinată toxicitatea substanţei de testat (de exemplu, în cazul în care au fost găsite anterior valori de biodegradabilitate scăzute), este necesară o altă serie de vase.
      Se pregăteşte un alt vas mare ce conţine mediu mineral aerat (aproximativ o treime din volumul său) plus substanţă de testat şi substanţă de referinţă la aceleaşi concentraţii finale ca şi acelea din celelalte vase mari.
      Se inoculează soluţiile din vasele mari cu efluent secundar (de la o picătură sau aproximativ 0,05 ml până la 5 ml/litru) sau cu o altă sursă cum ar fi apă de râu (a se vedea punctul I.6.4.2). În final, se aduc soluţiile la volum cu mediu mineral aerat folosind un furtun care ajunge la fundul vasului pentru a realiza o amestecare adecvată.
      VI.2.5.   Numărul de vase într-un test tipic
      Într-un test tipic sunt folosite următoarele vase:
      
                  —
               
               
                  cel puţin 10 conţinând substanţă de testat şi inocul (suspensia de testare);
               
            
                  —
               
               
                  cel puţin 10 conţinând numai inocul (proba martor cu inocul);
               
            
                  —
               
               
                  cel puţin 10 conţinând substanţa de referinţă şi inocul (martor de metodă);
               
            
                  —
               
               
                  şi, dacă este necesar, 6 vase conţinând substanţă de testat, substanţă de referinţă şi inocul (martor de toxicitate). În plus, pentru a fi posibilă identificarea ferestrei de 10 zile, sunt necesare aproape de două ori mai multe vase.
               
            VI.2.6.   Desfăşurarea testului
      
      Fiecare soluţie preparată se distribuie imediat în vasele CBO din grupul respectiv, prin furtun, din sfertul inferior (nu la bază) al vasului mare corespunzător, astfel încât toate vasele CBO să fie complet umplute. Se lovesc uşor pentru a îndepărta bulele de aer. Se analizează imediat, la momentul zero, oxigenul dizolvat din vase, prin metoda Winkler sau prin metoda electrodului. Conţinutul vaselor poate fi păstrat pentru a fi analizat mai târziu, prin metoda Winkler, prin adăugarea de sulfat de magneziu (II) şi de hidroxid de sodiu (primul reactiv Winkler). Se depozitează vasele închise cu grijă, ce conţin oxigen fixat ca oxid brun de magneziu (III) hidratat, la întuneric, la 10-20 oC, timp de cel mult 24 de ore, înainte de efectuarea etapelor rămase ale metodei Winkler. Se astupă cu dop vasele replicate rămase, urmărind să nu fie incluse bule de aer, şi se incubează la 20 oC, la întuneric. Fiecare serie experimentală este însoţită de o serie paralelă completă, pentru determinarea probei martor inoculate. Se prelevează probe din vasele duplicate, din toate seriile, pentru analiza oxigenului dizolvat la intervale egale de timp (cel puţin săptămânal), de-a lungul celor 28 zile de incubare.
      Probele prelevate săptămânal permit evaluarea procentului de eliminare în fereastra de 14 zile, în timp ce prelevarea de probe la 3-4 zile permite identificarea ferestrei de 10 zile, care necesită dublarea numărului celor mai multe vase.
      Pentru substanţele de testat care conţin azot, se fac corecţii ale consumului de oxigen necesar oricărei nitrificări care ar avea loc. În acest scop, se foloseşte metoda electrodului de O2 pentru determinarea concentraţiei oxigenului dizolvat şi apoi se prelevează o probă din vasul CBO pentru analiza nitritului şi nitratului. Din creşterea concentraţiei de nitrit şi nitrat se calculează oxigenul folosit (a se vedea apendicele 5).
      VI.3.   DATE ŞI RAPORT
      VI.3.1.   Interpretarea rezultatelor
      Mai întâi se calculează CBO la fiecare interval, scăzând cantitatea de oxigen consumat (mg O2/litru) de proba martor cu inocul din cantitatea consumată de substanţa de testat. Se împarte acest consum corectat la concentraţia substanţei de testat (mg/litru), pentru a obţine CBO specific ca mg oxigen pe mg substanţă testată. Se calculează procentul de biodegradabilitate prin împărţirea CBO specific la CTO specific (calculat în conformitate cu apendicele 2 punctul 2) sau CCO (determinat prin analiză, a se vedea apendicele 2 punctul 3), după cum urmează:
      
         
      = mg O2 pe mg substanţă de testat
      
         
      sau
      
         
      Trebuie remarcat că aceste două metode nu conduc în mod necesar la aceeaşi valoare; este preferabil să se utilizeze prima metodă.
      Pentru substanţele de testat ce conţin azot, se foloseşte CTO (NH4 sau NO3) în funcţie de datele cunoscute sau anticipate privind incidenţa nitrificării (apendicele 2 punctul 2). Dacă nitrificarea are loc, dar nu este completă, se calculează corecţia pentru oxigenul consumat la nitrificare din modificarea concentraţiilor de nitrit şi nitrat (apendicele 5).
      VI.3.2.   Validarea rezultatelor
      Scăderea conţinutului de oxigen în martorul cu inocul nu trebuie să depăşească 1,5 mg oxigen dizolvat/litru, după 28 zile. Valorile mai mari decât aceasta impun investigarea tehnicilor experimentale. Concentraţiile reziduale de oxigen din vasele de testare nu trebuie în niciun moment să scadă sub 0,5 mg/litru. Astfel, nivele de oxigen mai scăzute sunt valide numai dacă metoda de determinare a oxigenului dizolvat folosită este capabilă de măsurarea cu precizie a unor astfel de niveluri de concentraţie.
      A se vedea, de asemenea, punctul I.5.2.
      VI.3.3.   Raport
      A se vedea punctul I.8.
      VI.4.   FIŞA DE DATE
      Un exemplu de fişă de date este prezentat mai jos.
      TEST ÎN VAS ÎNCHIS
      
                  1.
               
               
                  LABORATOR
               
            
                  2.
               
               
                  DATE LA ÎNCEPUTUL TESTULUI
               
            3.   SUBSTANŢA DE TESTAT
      Denumire:
      Concentraţia soluţiei mamă: mg/litru
      Concentraţia iniţială în vas: mg/litru
      CTO sau CCO: mg O2/mg substanţă testată
      4.   INOCUL
      Sursă:
      Tratamentul aplicat:
      Precondiţionare, dacă există:
      Concentraţia în amestecul de reacţie: mg/litru
      5.   DETERMINAREA OD
      Metoda: Winkler/electrod
      
         Analizele vaselor
      
      
                  Timpul de incubare (zile)
               
               
                  OD (mg/l)
               
            
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                   
               
            
                  Proba martor (fără substanţă)
               
               
                  1
               
               
                  C1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                  C2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Media
               
               
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Substanţa de testat
               
               
                  1
               
               
                  a1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                   
               
               
                  2
               
               
                  a2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Media
               
               
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            Notă: Un format similar poate fi folosit pentru substanţa de referinţă şi martorul de toxicitate.
      6.   CORECŢIA PENTRU NITRIFICARE (a se vedea apendicele 5)
      
      
                  Timpul de incubare (zile)
               
               
                  0
               
               
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
            
                  
                              (i)
                           
                           
                              Concentraţia de nitrat (mg N/litru)
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              (ii)
                           
                           
                              Modificarea concentraţiei de nitrat (mg N/litru)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              (iii)
                           
                           
                              Echivalentul de oxigen (mg/litru)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              (iv)
                           
                           
                              Concentraţia de nitrit (mg N/litru)
                           
                        
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              (v)
                           
                           
                              Modificarea concentraţiei de nitrat (mg N/litru)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              (vi)
                           
                           
                              Echivalentul de oxigen (mg/litru)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  
                              (iii) + (vi)
                           
                           
                              Echivalentul de oxigen total (mg/litru)
                           
                        
               
                  —
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            7.   CONSUM DE OD: % DEGRADARE
      
                   
               
               
                  Îndepărtarea după n zile (mg/litru)
               
            
                  n1
                  
               
               
                  n2
                  
               
               
                  n3
                  
               
               
                   
               
            
                  VAS 1: (mto – mtx) – (mbo – mbx)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  VAS 2: (mto – mtx) – (mbo – mbx)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  VAS 1
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  VAS 2
                  
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            % medie (8)= 
                     
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  mt0
                  
               
               
                  =
               
               
                  valoarea în vasul de testare la momentul 0
               
            
                  mtx
                  
               
               
                  =
               
               
                  valoarea în vasul de testare la momentul x
               
            
                  mb0
                  
               
               
                  =
               
               
                  valoarea medie a probei martor la momentul 0
               
            
                  mbx
                  
               
               
                  =
               
               
                  valoarea medie a probei martor la momentul x
               
            Se aplică, de asemenea, corecţii pentru nitrificare la punctul (iii) + (vi) în punctul 6.
      8.   CONSUM DE OD ÎN PROBA MARTOR
      Consumul de oxigen al probei martor: (mb0 – mb28) mg/litru. Consumul este important pentru validarea testului. El trebuie să fie mai mic de 1,5 mg/litru.
      PARTEA VII   – TESTUL MITI (METODA C.4-F)
      VII.1.   PRINCIPIUL METODEI
      Consumul de oxigen al soluţiei sau al suspensiei sub agitare de substanţă de testat în mediu mineral, inoculată cu microorganisme mature, neadaptate, se măsoară automat după o perioadă de 28 zile într-un respirometru cu circuit închis, la întuneric, la 25 ± 1 oC. Dioxidul de carbon degajat este absorbit în calce sodică. Biodegradabilitatea este exprimată ca procent de oxigen absorbit (corectat cu absorbţia în proba martor) faţă de absorbţia teoretică (CTO). Procentul biodegradabilităţii primare se calculează de asemenea din analiza chimică specifică suplimentară realizată la începutul şi la sfârşitul incubării şi, opţional, prin analiza COD.
      VII.2.   DESCRIEREA METODEI
      VII.2.1.   Aparatură
      
                  (a)
               
               
                  aparat automat de măsurare electrolitică a CBO sau respirometru normal echipat cu 6 vase de 300 ml fiecare şi cu capsule ce conţin absorbant de CO2;
               
            
                  (b)
               
               
                  cameră cu temperatură constantă şi/sau baie de apă la 25 ± 1 oC sau mai mult;
               
            
                  (c)
               
               
                  dispozitiv de filtrare cu membrană (opţional);
               
            
                  (d)
               
               
                  analizor de carbon (opţional).
               
            VII.2.2.   Prepararea mediului mineral
      Se prepară următoarele soluţii mamă, folosind reactivi puri pentru analiză şi apă (I.6.1):
      
                  (a)
               
               
                  Ortofosfat diacid de potasiu, KH2PO4
                  
               
               
                  8,50 g
               
            
                  Ortofosfat monoacid de potasiu, K2HPO4
                  
               
               
                  21,75 g
               
            
                  Ortofosfat monoacid de sodiu dodecahidrat, Na2HPO4·12 H2O
               
               
                  44,60 g
               
            
                  Clorură de amoniu, NH4Cl
               
               
                  1,70 g
               
            
                  Se dizolvă în apă şi se aduce la 1 litru.
               
               
                   
               
            
                  Valoarea pH-ului soluţiei va fi de 7,2.
               
               
                   
               
            
                  (b)
               
               
                  Sulfat de magneziu heptahidrat, MgSO4·7 H2O
               
               
                  22,50 g
               
            
                  Se dizolvă în apă şi se aduce la 1 litru.
               
               
                   
               
            
                  (c)
               
               
                  Clorură de calciu anhidră, CaCl2
                  
               
               
                  27,50 g
               
            
                  Se dizolvă în apă şi se aduce la 1 litru.
               
               
                   
               
            
                  (d)
               
               
                  Clorură de fier (III) hexahidrat, FeCl3·6 H2O
               
               
                  0,25 g
               
            
                  Se dizolvă în apă şi se aduce la 1 litru.
               
               
                   
               
            Se iau 3 ml din fiecare soluţie (a), (b), (c) şi (d) şi se aduce soluţia la 1 litru.
      VII.2.3.   Prepararea inoculului
      Se prelevează probe proaspete din cel puţin zece locuri, în principal din ariile unde sunt folosite şi descărcate diferite substanţe chimice. Din locuri cum ar fi instalaţii de tratare a nămolurilor, staţii de epurare ale apelor uzate industriale, râuri, lacuri, mări, se prelevează probe de 1 l de nămol, sol de suprafaţă, apă etc. şi se amestecă bine. După îndepărtarea materiilor plutitoare şi după decantare, se reglează pH-ul supernatantului la 7 ± 1 cu hidroxid de sodiu sau acid fosforic.
      Se foloseşte un volum adecvat de supernatant filtrat pentru a umple cu nămol activ un vas de încărcare-descărcare şi se aerează lichidul aproximativ 23 1/2 h. După treizeci de minute de la oprirea aerării se îndepărtează aproximativ o treime din întregul volum al supernatantului şi se adaugă la materialul sedimentat un volum egal de soluţie (pH 7) ce conţine 0,1 % glucoză, 0,1 % peptonă şi 0,1 % ortofosfat diacid de potasiu şi se reîncepe aerarea. Se repetă această procedură o dată pe zi. Operarea instalaţiei cu nămol se face conform bunelor practici de laborator: efluenţii sunt limpezi, temperatura este menţinută la 25 ± 2 oC, pH-ul este 7 ± 1, nămolul sedimentează bine, există suficientă aerare pentru a păstra amestecul în condiţii aerobe tot timpul, protozoarele sunt prezente şi activitatea nămolului este testată faţă de o substanţă de referinţă cel puţin la fiecare trei luni. Nu se foloseşte nămolul ca inocul decât după cel puţin o lună de întreţinere, dar nu după mai mult de patru luni. Prin urmare, se vor preleva probe din cel puţin 10 locuri la intervale egale, o dată la trei luni.
      Pentru a menţine nămolul proaspăt şi pe cel vechi la aceeaşi activitate, se amestecă supernatantul filtrat de la nămolul activ în uz cu un volum egal de supernatant filtrat de la un amestec proaspăt prelevat din zece surse şi se cultivă lichidul combinat ca mai sus. Se prelevează nămol pentru folosire ca inocul după 18-24 de ore de la alimentarea instalaţiei.
      VII.2.4.   Pregătirea vaselor
      Se pregătesc următoarele şase vase, astfel încât să conţină:
      Nr. 1: substanţa de testat în apă de diluţie la 100 mg/l
      Nr. 2, 3 şi 4: substanţa de testat în mediu mineral la 100 mg/l
      Nr. 5: substanţa de referinţă (de exemplu anilină) în mediu mineral la 100 mg/l
      Nr. 6: numai mediu mineral
      Substanţele de testat greu solubile se adaugă direct, în funcţie de cantitate sau de volum, sau se tratează conform descrierii din apendicele 3, excepţie făcând faptul că nu se folosesc solvenţi şi nici agenţi de emulsionare. Se adaugă la toate vasele absorbanţi de CO2 în capsulele speciale prevăzute în acest scop. Se reglează pH-ul din vasele 2, 3 şi 4 la valoarea de 7,0.
      VII.2.5.   Efectuarea testului
      Se inoculează vasele nr. 2, 3 şi 4 (cu suspensie de testare), nr. 5 (martor de activitate) şi nr. 6 (probă martor cu inocul) cu un mic volum de inocul pentru a rezulta o concentraţie de 30 mg/l de solide în suspensie. Nu se adaugă inocul vasului nr. 1 care serveşte drept martor abiotic. Se montează echipamentul, se verifică etanşeitatea, se porneşte agitarea şi se încep măsurătorile de consum de oxigen la întuneric. Zilnic se verifică temperatura, agitatorul şi înregistratorul oxigenului consumat şi se notează orice schimbare a culorii conţinutului vaselor. Se citeşte direct consumul de oxigen la şase vase, printr-o metodă adecvată, de exemplu, prin intermediul unui înregistrator cu diagramă cu şase puncte, care furnizează curba CBO. La sfârşitul incubării, în mod normal după 28 zile, se măsoară pH-ul conţinutului vaselor şi se determină concentraţia substanţei de testat rămasă şi a oricărui intermediar şi, în cazul substanţelor solubile în apă, concentraţia de COD (apendicele 2 punctul 4). Este necesară o atenţie deosebită în cazul substanţelor volatile. Dacă se anticipează nitrificarea, se determină concentraţia de nitrat şi de nitrit, dacă este posibil.
      VII.3.   DATE ŞI RAPORT
      VII.3.1.   Interpretarea rezultatelor
      Se împarte consumul de oxigen (mg) al substanţei de testat, corectat cu acela citit la proba martor cu inocul după acelaşi timp, la cantitatea substanţei de testat folosită. Rezultă CBO, exprimat ca mg oxigen/mg substanţă testată, după cum urmează:
      
         
      = mg O2 pe mg substanţă de testat
      Procentul de biodegradare se obţine apoi din:
      
         
      Pentru amestecuri se calculează CTO din analiza elementară, ca şi pentru compuşii simpli. Se foloseşte CTO adecvat (CTONH4 sau CTONO3) dacă nitrificarea este absentă sau este completă (apendicele 2 punctul 2). Dacă totuşi nitrificarea are loc, dar este incompletă, se face o corecţie pentru consumul de oxigen la nitrificare, calculat din modificarea concentraţiilor de nitrit şi nitrat (apendicele 5).
      Se calculează procentul de biodegradare primară cu ajutorul pierderii de substanţă chimică iniţială (a se vedea punctul I.7.2).
      
         
      Dacă s-a înregistrat o pierdere de substanţă în vasul nr. 1, care măsoară eliminarea fizico-chimică, această constatare se consemnează şi se foloseşte concentraţia de substanţă (Sb) după 28 zile din acest vas pentru a se calcula biodegradarea procentuală.
      Când se fac determinări de COD (opţional), se calculează biodegradarea procentuală finală din:
      
         
      conform descrierii de la punctul I.7.1. Dacă s-a înregistrat o pierdere de COD în vasul nr. 1, care măsoară eliminarea fizico-chimică, concentraţia de COD din acest vas se foloseşte pentru a calcula biodegradarea procentuală.
      Se înregistrează toate rezultatele pe fişele de date ataşate.
      VII.3.2.   Validarea rezultatelor
      Consumul de oxigen în proba martor cu inocul este în mod normal 20-30 mg O2/l şi nu trebuie să fie mai mare de 60 mg/l în timpul celor 28 de zile. Valorile mai mari de 60 mg/l necesită un examen critic al datelor şi al tehnicilor experimentale. Dacă valoarea pH-ului este în afara intervalului 6-8,5 şi consumul de oxigen al substanţei de testat este mai mic de 60 %, testul se repetă cu o concentraţie mai mică a substanţei.
      A se vedea, de asemenea, punctul I.5.2.
      Dacă procentul de degradare al anilinei, calculat din consumul de oxigen, nu depăşeşte 40 % după 7 zile şi 65 % după 14 zile, testul este invalidat.
      VII.3.3.   Raport
      A se vedea punctul I.8.
      VII.4.   FIŞA DE DATE
      Un exemplu de fişă de date este prezentat mai jos.
      TESTUL MITI (I)
      
                  1.
               
               
                  LABORATORUL
               
            
                  2.
               
               
                  DATE LA ÎNCEPUTUL TESTULUI
               
            3.   SUBSTANŢA DE TESTAT
      Denumire:
      Concentraţia soluţiei mamă: mg/l substanţă de testat
      Concentraţia iniţială în mediul mineral, C0: mg/l substanţă de testat
      Volumul amestecului de reacţie, V: ml
      CTO: mg O2/l
      4.   INOCUL
      Locurile de prelevare a probelor de nămol:
      
                  
                              1)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              6)
                           
                           
                              …
                           
                        
            
                  
                              2)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              7)
                           
                           
                              …
                           
                        
            
                  
                              3)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              8)
                           
                           
                              …
                           
                        
            
                  
                              4)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              9)
                           
                           
                              …
                           
                        
            
                  
                              5)
                           
                           
                              …
                           
                        
               
                  
                              10)
                           
                           
                              …
                           
                        
            Concentraţia materiilor solide în suspensie în nămolul activ după aclimatizare cu apă uzată sintetică = ... mg/l
      Volumul de nămol activ pe litru de mediu mineral final = ...ml
      Concentraţia de nămol în mediul mineral final = ...mg/l
      5.   CONSUMUL DE OXIGEN: BIODEGRADABILITATEA
      Tipul de respirometru folosit:
      
                   
               
               
                  Ziua
               
            
                  0
               
               
                  7
               
               
                  14
               
               
                  21
               
               
                  28
               
            
                  Consumul de O2 la substanţa de testat
               
               
                  a1
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a2
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  a3
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Consumul de O2 (mg) la proba martor
               
               
                  b
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Consumul de O2 (mg) corectat
               
               
                  (a1 – b)
                  (a2 – b)
                  (a3 – b)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  CBO/mg substanţă de testat
               
               
                  
                     
               
               
                  Vas 1
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Vas 2
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Vas 3
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  % degradare
                  
                     
               
               
                   
               
               
                  1
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  2
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  3
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  media (9)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            Notă: Formate similare pot fi folosite pentru substanţa de referinţă.
      6.   ANALIZA DE CARBON (opţional)
      
      Analizorul de carbon:
      
                  Vas
               
               
                  COD
               
               
                  Îndepărtat % COD
               
               
                  Media
               
            
                  Măsurat
               
               
                  Corectat
               
            
                  Apă + substanţă de testat
               
               
                  a
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  —
               
               
                  —
               
            
                  Nămol + substanţă de testat
               
               
                  b1
                  
               
               
                   
               
               
                  b1 – c
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Nămol + substanţă de testat
               
               
                  b2
                  
               
               
                   
               
               
                  b2 – c
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Nămol + substanţă de testat
               
               
                  b3
                  
               
               
                   
               
               
                  b3 – c
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Probă martor cu inocul
               
               
                  c
               
               
                   
               
               
                  —
               
               
                   
               
               
                  —
               
               
                  —
               
            
         
      7.   DATE ANALITICE SPECIFICE SUBSTANŢEI
      
                   
               
               
                  Cantitatea rămasă de substanţă de testat la sfârşitul testului
               
               
                  % de degradare
               
            
                  probă martor cu apă
               
               
                  Sb
                  
               
               
                   
               
            
                  mediu inoculat
               
               
                  Sa1
                  
               
               
                   
               
            
                  Sa2
                  
               
               
                   
               
            
                  Sa3
                  
               
               
                   
               
            
         
      Se calculează % degradare pentru vasele a1, a2 şi a3.
      8.   OBSERVAŢII
      Se ataşează curba CBO în funcţie de timp, dacă este disponibilă.
      
         Apendicele 1
         ABREVIERI ŞI DEFINIŢII
         
                     OD
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Oxigenul dizolvat (mg/l) este concentraţia de oxigen dizolvat într-o probă de apă.
                  
               
                     CBO
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Consumul biochimic de oxigen (g) este cantitatea de oxigen consumată de microorganisme când se metabolizează un compus de testat; de asemenea, se exprimă în g de oxigen consumat pe g substanţă testată (a se vedea metoda C.5).
                  
               
                     CCO
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Consumul chimic de oxigen (g) este cantitatea de oxigen consumată în timpul oxidării unui compus de testat cu dicromat acid fierbinte; el furnizează o măsură a cantităţii prezente de materie oxidabilă; se exprimă şi ca g oxigen consumat pe g compus de testat (a se vedea metoda C.6).
                  
               
                     COD
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Carbonul organic dizolvat este carbonul organic prezent în soluţie sau acela care trece printr-un filtru de 0,45 microni sau rămâne în supernatant după centrifugare la 40 000 m· s–2 (±4 000 g) timp de 15 min.
                  
               
                     CTO
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Consumul teoretic de oxigen (mg) este cantitatea totală de oxigen necesară pentru a oxida complet substanţa; este calculat din formula moleculară (a se vedea apendicele 2 punctul 2) şi este de asemenea exprimat ca mg oxigen necesar pe mg compus de testat.
                  
               
                     CO2T
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Cantitatea teoretică de dioxid de carbon (mg) este cantitatea de dioxid de carbon calculată din conţinutul de carbon cunoscut sau măsurat al compusului de testat când acesta este complet mineralizat; se exprimă şi ca mg dioxid de carbon degajat pe mg substanţă.
                  
               
                     COT
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Carbonul organic total al probei este suma carbonului organic în soluţie şi în suspensie.
                  
               
                     CA
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Carbonul anorganic
                  
               
                     CT
                  
                  
                     :
                  
                  
                     Carbonul total este suma carbonului organic şi anorganic prezent în eşantion.
                  
               Biodegradarea primară:
         este modificarea structurii chimice a substanţei, produsă prin acţiune biologică, care are ca rezultat pierderea proprietăţilor specifice ale substanţei.
         Biodegradarea finală (aerobică):
         este nivelul de degradare realizat când substanţa de testat este complet folosită de microorganisme având ca rezultat producerea de dioxid de carbon, apă, săruri minerale şi noi constituenţi celulari microbieni (biomasă).
         Uşor biodegradabil:
         o clasificare arbitrară a substanţelor care au trecut anumite teste de screening specificate pentru biodegradabilitatea finală; aceste teste sunt atât de riguroase încât se admite că asemenea compuşi se vor degrada biologic rapid şi complet în medii acvatice în condiţii aerobe.
         Intrinsec biodegradabil:
         o clasificare a substanţelor pentru care există probe neechivoce de biodegradare (primară sau finală) în orice test de biodegradabilitate recunoscut.
         Tratabilitate:
         este capacitatea substanţelor de a fi eliminate în timpul tratamentului biologic al apelor reziduale fără a afecta negativ funcţionarea normală a procesului de tratare. În general, compuşii uşor biodegradabili sunt tratabili, dar nu este cazul tuturor sunt compuşi intrinsec biodegradabili. Se pot produce, de asemenea, şi procese abiotice.
         Timpul de latenţă
         este timpul de la inoculare, în testul de epuizare, până când procentul de degradare creşte cel puţin până la 10 %. Timpul de latenţă este adesea foarte variabil şi slab reproductibil.
         Timpul de degradare
         este timpul de la sfârşitul perioadei de latenţă până în momentul în care se atinge 90 % din nivelul maxim de degradare.
         Fereastra de 10 zile
         este intervalul de 10 zile care urmează imediat după atingerea nivelului de 10 % degradare.
      
      
         Apendicele 2
         CALCULAREA ŞI DETERMINAREA UNOR PARAMETRI SINTETICI ADECVAŢI
         În funcţie de metoda aleasă, sunt necesari anumiţi parametri sintetici. Următoarea secţiune descrie modul de obţinere a acestor valori. Folosirea acestor parametri este descrisă la fiecare metodă.
         1.   Conţinutul de carbon
         Conţinutul de carbon se calculează din compoziţia elementară cunoscută sau determinată din analiza elementară a substanţei de testat.
         2.   Consumul teoretic de oxigen (CTO)
         Consumul teoretic de oxigen (CTO) poate fi calculat dacă este cunoscută compoziţia elementară sau este determinată prin analiză elementară. Acesta este, pentru compusul
         CcHhClclNnNanaOoPpSs
         
         fără nitrificare,
         
             mg/mg
         sau cu nitrificare,
         
             mg/mg
         3.   Consumul chimic de oxigen (CCO)
         Consumul chimic de oxigen (CCO) se determină în conformitate cu metoda C.6.
         4.   Carbonul organic dizolvat (COD)
         Carbonul organic dizolvat (COD) este prin definiţie carbonul organic al unei substanţe sau al unui amestec în apă care trece prin filtrul de 0,45 microni.
         Se iau probe din vasele de testare şi se filtrează imediat în aparatul de filtrare, folosind un filtru cu membrana adecvată. Primii 20 ml (cantitatea poate fi redusă când se folosesc filtre mici) de filtrat sunt eliminaţi. Volume de 10-20 ml sau mai mici, dacă sunt injectate (volumul depinde de cantitatea necesară la analizorul de carbon) sunt reţinute pentru analiza carbonului. Concentraţia COD se determină cu ajutorul unui analizor de carbon organic care poate măsura exact o concentraţie de carbon echivalentă sau mai mică de 10 % din concentraţia iniţială de COD folosită la test.
         Probele filtrate care nu pot fi analizate în aceeaşi zi de lucru pot fi păstrate la frigider, la 2-4
               o
            C, timp de 48 de ore sau sub – 18 oC pentru perioade mai lungi.
         Observaţii:
         Filtrele cu membrană sunt adesea impregnate cu agenţi tensioactivi pentru hidrofilizare. Astfel, filtrul poate conţine mai mult de câteva mg de carbon organic solubil care interferează cu determinările de biodegradabilitate. Agenţii tensioactivi şi alţi compuşi organici solubili sunt îndepărtaţi din filtre prin fierbere în apă deionizată timp de trei perioade a câte o oră fiecare. Filtrele pot fi apoi depozitate în apă timp de o săptămână. Dacă se folosesc cartuşe de filtrare, fiecare lot trebuie verificat pentru a confirma că nu eliberează carbon organic solubil.
         În funcţie de tipul membranei de filtrare, substanţa de testat poate fi reţinută prin adsorbţie. Prin urmare, este recomandabil să se ia măsuri pentru ca substanţa să nu fie reţinută pe filtru.
         
            Centrifugarea la 40 000 m· sec-2 (4 000 g) timp de 15 minute se poate folosi în locul filtrării pentru a face diferenţa între COT şi COD. Metoda nu este viabilă la concentraţia iniţială de < 10 mg COD/l deoarece fie că nu sunt îndepărtate toate bacteriile, fie că este redizolvat carbonul, ca parte a plasmei bacteriene.
         REFERINŢE BILBIOGRAFICE
         
                     —
                  
                  
                     Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th ed., Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, p. 65.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, p. 139.
                  
               
                     —
                  
                  
                     DIN – Entwurf 38 409, Teil 41 – Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuß Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.V.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol 13 (1), p. 169.
                  
               
      
         Apendicele 3
         EVALUAREA BIODEGRADABILITĂŢII SUBSTANŢELOR PUŢIN SOLUBILE
         În testele de biodegradabilitate aplicate la substanţe puţin solubile, se acordă o deosebită atenţie următoarelor aspecte.
         Lichidele omogene prezintă rareori probleme de eşantionare, dar în cazul materialelor solide se recomandă omogenizarea cu mijloace adecvate, pentru a evita erorile datorate neomogenităţii. Se impun precauţii speciale în cazul în care sunt necesare eşantioane reprezentative de câteva miligrame din amestecuri sau substanţe cu cantităţi mari de impurităţi.
         Pot fi folosite diferite forme de agitare în timpul testelor. Se foloseşte cu atenţie numai agitarea suficientă pentru a ţine substanţa dispersată, evitându-se supraîncălzirea, spumarea excesivă şi forţele mari de forfecare.
         Poate fi folosit un agent de emulsionare care dă o dispersie stabilă a substanţei. Acesta nu trebuie să fie toxic pentru bacterii, biodegradat sau să spumeze în condiţiile de testare.
         Solvenţilor li se aplică aceleaşi criterii ca şi agenţilor de emulsionare.
         Nu se recomandă să se folosească purtători solizi pentru substanţele de testat solide, dar pot fi potriviţi pentru substanţele uleioase.
         Dacă se folosesc substanţe auxiliare cum ar fi agenţi de emulsionare, solvenţi şi purtători, se testează o probă martor ce conţine substanţa auxiliară.
         Unul dintre testele de respirometrie CO2, CBO, MITI poate fi folosit pentru a studia biodegradabilitatea substanţelor greu solubile.
         REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
         
                     —
                  
                  
                     de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. Chemosphere, 1987, vol. 16, p. 833.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, p. 169.
                  
               
      
         Apendicele 4
         EVALUAREA BIODEGRADABILITATII SUBSTANTELOR SUSCEPTIBILE DE A FI TOXICE PENTRU INOCUL
         Când o substanţă este supusă testării pentru biodegradabilitate uşoară şi pare a fi ne-biodegradabilă, se recomandă următoarea procedură dacă se urmăreşte distincţia între inhibiţie şi inerţie (Reynolds et al, 1987).
         Se folosesc inoculi similari sau identici pentru testele de toxicitate şi biodegradare.
         Pentru a evalua toxicitatea substanţelor studiate în testele de biodegradabilitate uşoară, se aplică una dintre metodele următoare: metoda de inhibiţie a vitezei de respiraţie a nămolului (testul de inhibiţie a respiraţiei nămolului activ – Directiva 87/302/CEE), CBO şi/sau metodele de inhibiţie a creşterii sau a unei combinaţii între acestea.
         Dacă trebuie evitată inhibiţia datorată toxicităţii, se propune ca valoarea concentraţiei substanţei de testat folosită în testul de biodegradabilitate uşoară să fie mai mică decât 1/10 din valoarea CE50 (sau mai mică decât valoarea CE20) obţinută în testul de toxicitate. Compuşii cu un CE50 mai mare de 300 mg/l nu au, probabil, efecte toxice în testul de biodegradabilitate uşoară.
         Valorile CE50 mai mici de 20 mg/l probabil pun serioase probleme pentru testările următoare. Se vor folosi concentraţii de testare mici, ce necesită folosirea testului în vasului închis, riguros şi sensibil, sau folosirea materialului marcat cu C. Ca alternativă, un inocul aclimatizat permite să fie folosite concentraţii mai mari ale substanţei de testat. În ultimul caz totuşi criteriul specific al testului de biodegradabilitate uşoară este pierdut.
         REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
         Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.
      
      
         Apendicele 5
         CORECŢIA CONSUMULUI DE OXIGEN ÎN CAZUL INTERFERENŢEI CU NITRIFICAREA
         Erorile datorate omiterii nitrificării la evaluarea consumului de oxigen necesar pentru biodegradarea substanţei de testat care nu conţine azot sunt minime (nu mai mari de 5 %), chiar dacă oxidarea azotului amoniacal în mediul de testare se produce ocazional atât în vasele cu substanţă de testat, cât şi în cele cu probă martor. Cu toate acestea, în cazul substanţelor care conţin azot, pot apărea erori grave.
         Dacă nitrificarea are loc, dar nu este completă, consumul de oxigen observat al amestecului de reacţie poate fi corectat prin cantitatea de oxigen folosită la oxidarea amoniului la nitrit sau la nitrat, dacă modificările concentraţiei în timpul incubării nitritului şi nitratului sunt determinate luând în considerare următoarele ecuaţii:
         
                     2 NH4Cl + 3O2 = 2 HN O2 + 2 HCI + 2 H2O
                  
                  
                     (1)
                  
               
                     2 HNO2 + O2 = 2 HNO3
                     
                  
                  
                     (2)
                  
               
                     Reacţia globală este:
                  
                  
                      
                  
               
                     2 NH4Cl + 4 O2 = 2 HNO3 + 2 HCl + 2 H2O
                  
                  
                     (3)
                  
               Din ecuaţia (1), consumul de oxigen pentru ca 28 g azot conţinut în clorura de amoniu (NH4Cl) să fie oxidat la nitrit este de 96 g, adică un factor de 3,43 (96/28). În acelaşi mod, din ecuaţia (3) rezultă un consum de oxigen de 128 g pentru ca 28 g de azot să fie oxidat la nitrat, adică un factor de 4,57 (128/28).
         Deoarece reacţiile sunt succesive, fiind realizate în prezenţa unor specii distincte şi diferite de bacterii, concentraţia de nitrit creşte sau descreşte; în ultimul caz se formează o concentraţie echivalentă de nitrat. Astfel, cantitatea de oxigen consumată pentru formarea nitratului este de 4,57 înmulţit cu creşterea concentraţiei de nitrat, în timp ce cantitatea de oxigen asociată cu formarea nitritului este de 3,43 înmulţit cu creşterea concentraţiei de nitrit sau pierderea de oxigen este de -3,43 înmulţit cu descreşterea concentraţiei.
         Aceasta este:
         
                     O2 consumat la formarea nitratului = 4,57 × creşterea concentraţiei de nitrat
                  
                  
                     (4)
                  
               
                     şi
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 consumat la formarea nitritului = 3,43 × creşterea concentraţiei de nitrit
                  
                  
                     (5)
                  
               
                     şi
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 consumat la dispariţia nitritului = -3,43 × descreşterea concentraţiei de nitrat
                  
                  
                     (6)
                  
               
                     astfel încât:
                  
                  
                      
                  
               
                     Consumul de O2 datorat nitrificării = ±3,43 × modificarea concentraţiei de nitrit +4,57 × creşterea concentraţiei de nitrat
                  
                  
                     (7)
                  
               
                     şi astfel
                  
                  
                      
                  
               
                     Consumul de O2 datorat oxidării carbonului = consumul total observat – consumul datorită nitrificării
                  
                  
                     (8)
                  
               Ca alternativă, dacă se determină numai azotul total oxidat, consumul de oxigen datorat nitrificării poate fi considerat, ca primă aproximaţie, ca fiind de 4,57 × creşterea azotului oxidat.
         Valoarea corectată a consumului de oxigen datorat oxidării carbonului este apoi comparată cu CTONH3, conform calculelor din apendicele 2.
      
      C.5.   DEGRADAREA – CONSUMUL BIOCHIMIC DE OXIGEN
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Scopul acestei metode este determinarea consumului biochimic de oxigen (CBO) al substanţelor organice solide sau lichide.
      Prin această metodă se pot testa compuşi solubili în apă; se pot testa totuşi, cel puţin în principiu, şi compuşii volatili şi cei puţin solubili în apă.
      Metoda este aplicabilă numai acelor compuşi organici care nu sunt inhibitori pentru bacterii la concentraţia folosită în test. În cazul în care compusul testat nu este solubil la concentraţia testată, se pot folosi măsuri speciale, precum utilizarea dispersiei ultrasonice, pentru a obţine o dispersie bună a compusului de testat.
      Informaţiile despre toxicitatea substanţei chimice pot fi utile pentru interpretarea rezultatelor cu valori scăzute şi pentru selectarea unor concentraţii adecvate la test.
      1.2.   DEFINIŢIE ŞI UNITĂŢI
      CBO este cantitatea de oxigen dizolvat necesară pentru un volum specificat de soluţie a substanţei supusă procesului de oxidare biochimică în condiţii definite.
      Rezultatele se exprimă în grame de CBO pe gram de substanţă.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Se recomandă folosirea unei substanţe de referinţă adecvate pentru a verifica activitatea inoculului.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      O cantitate predeterminată de substanţă, dizolvată sau dispersată într-un mediu adecvat bine aerat, este inoculată cu microorganisme şi incubată la o temperatură constantă, definită, la întuneric.
      CBO se determină prin diferenţa dintre concentraţiile de oxigen dizolvat la începutul şi la sfârşitul testului. Durata testului este de minimum 5 zile şi maximum 28 de zile.
      Într-o testare paralelă se determină CBO pe o probă martor, care nu conţine substanţă de testat.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Determinarea CBO nu poate fi considerată ca o determinare valabilă a biodegradabilităţii unei substanţe. Acest test este considerat doar test de triere.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      Se prepară o soluţie sau dispersie preliminară de substanţă pentru a obţine concentraţia CBO compatibilă cu metoda folosită. Apoi, se determină CBO conform oricărei metode naţionale sau internaţionale standardizate.
      2.   DATE ŞI EVALUARE
      CBO conţinut în soluţia preliminară se calculează conform metodei standardizate alese şi se transformă în grame de CBO pe gram de substanţă testată.
      3.   RAPORT
      Trebuie consemnată metoda folosită.
      Consumul biochimic de oxigen trebuie să fie o medie a cel puţin trei măsurători valabile.
      Toate informaţiile şi observaţiile importante pentru interpretarea rezultatelor trebuie consemnate, în special cu privire la impurităţi, starea fizică, efectele toxice şi compoziţia intrinsecă a substanţei care ar afecta rezultatele.
      Folosirea unui aditiv pentru inhibiţia nitrificării biologice trebuie consemnată.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
      Listă de metode standardizate, de exemplu:
      
                   
               
               
                  NF T 90 -103: Determination of the biochemical oxygen demand.
               
            
                   
               
               
                  NBN 407: Biochemical oxygen demand.
               
            
                   
               
               
                  NEN 32355.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV).
               
            
                   
               
               
                  The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the examination of water and associated materials, HMSO, London.
               
            
                   
               
               
                  ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.
               
            C.6.   DEGRADAREA – CONSUMUL CHIMIC DE OXIGEN
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Scopul acestei metode este determinarea consumului chimic de oxigen (CCO) al substanţelor organice solide sau lichide prin aplicarea oricărei metode standardizate, în condiţii de laborator stabilite.
      Informaţiile privind formula substanţei sunt utile în realizarea acestui test şi pentru interpretarea rezultatului obţinut (de exemplu, halogenuri, săruri feroase ale compuşilor organici, compuşi organici cloruraţi).
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Consumul chimic de oxigen este o măsură a oxidabilităţii unei substanţe, exprimat prin cantitatea echivalentă de oxigen a unui reactiv oxidant consumat de substanţă în condiţii de laborator stabilite.
      Rezultatul se exprimă în grame de CCO pe gram de substanţă.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Nu este necesar să se folosească substanţe de referinţă în toate cazurile în care se studiază o substanţă nouă. Aceste substanţe se folosesc în primul rând pentru a calibra periodic metoda şi pentru compararea rezultatelor atunci când se aplică altă metodă.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      O cantitate predeterminată de substanţă, dizolvată sau dispersată în apă, se oxidează cu dicromat de potasiu, în prezenţa unui catalizator de argint (sulfat de argint) în mediu de acid sulfuric concentrat, cu reflux, timp de două ore. Dicromatul rezidual se determină prin titrare cu sulfat de amoniu şi fier.
      În cazul substanţelor care conţin clor se adaugă sulfat de mercur (10) pentru a reduce interferenţa acestuia.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Datorită modului arbitrar de determinare, CCO este un „indicator de oxidabilitate” şi se foloseşte ca atare ca metodă practică pentru determinarea conţinutul de substanţă organică.
      Clorurile pot interfera în acest test; agenţii anorganici reducători sau oxidanţi pot de asemenea să interfereze la determinarea CCO.
      Unii compuşi ciclici şi multe substanţe volatile (de exemplu, acizi graşi inferiori) nu sunt oxidaţi complet în acest test.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      Se prepară o soluţie sau dispersie preliminară de substanţă pentru a obţine CCO între 250 şi 600 mg/l.
      
         Observaţii:
      
      În cazul substanţelor puţin solubile şi nedispersabile se poate cântări o cantitate de substanţă fin pulverizată sau lichidă, corespunzând la aproximativ 5 mg CCO, care se introduce în aparatul experimental cu apă.
      CCO se determină mai uşor, deseori şi în special în cazul substanţelor puţin solubile, printr-o variantă a metodei, în sistem închis cu egalizator de presiune (H. Kelkenberg, 1975). Prin această variantă a metodei, compuşii care sunt determinaţi cu dificultate prin metoda convenţională – de exemplu acid acetic – pot fi adesea determinaţi cu succes. Metoda nu dă rezultate bune, însă, în cazul piridinei. Dacă, în conformitate cu referinţa bibliografică 1, concentraţia de dicromat de potasiu creşte la 0,25 N (0,0416 M), devine mai uşoară cântărirea directă a 5-10 mg de substanţă, ceea ce este esenţial pentru determinarea CCO la substanţele puţin solubile în apă (referinţa 2).
      În alte cazuri, CCO se determină apoi după orice metodă adecvată naţională sau internaţională standardizată.
      2.   DATE ŞI EVALUARE
      CCO conţinut în vasul experimental se calculează după metoda standardizată aleasă şi se converteşte în grame de CCO pe gram de substanţă.
      3.   RAPORT
      Se consemnează metoda de referinţă folosită.
      Consumul chimic de oxigen trebuie să fie media a cel puţin 3 măsurători. Trebuie prezentate toate informaţiile şi observaţiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special cu privire la impurităţi, starea fizică, proprietăţile intrinseci ale substanţei (dacă se cunosc) care ar putea afecta rezultatele.
      Trebuie consemnată utilizarea sulfatului de mercur pentru a reduce la minim interferenţa clorurilor.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Kelkenberg, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, vol. 8, p. 146.
               
            
                  2.
               
               
                  Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, p. 169.
                  Lista metodelor standardizate, de exemplu:
                  
                               
                           
                           
                              NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen demand.
                           
                        
                               
                           
                           
                              ISBN O 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate value) of polluted and waste waters.
                           
                        
                               
                           
                           
                              NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.
                           
                        
                               
                           
                           
                              DS 217 = water analysis Determination of the chemical oxygen demand.
                           
                        
                               
                           
                           
                              DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg per litre.
                           
                        
                               
                           
                           
                              NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.
                           
                        
                               
                           
                           
                              ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichromate methods.
                           
                        
            C.7.   DEGRADAREA – DEGRADAREA ABIOTICĂ: HIDROLIZA CA O FUNCŢIE A PH-ULUI
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 111 (2004) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Substanţele chimice pot pătrunde în apele de suprafaţă prin următoarele căi: direct, prin pulverizare, prin spălare, prin sistemul de canalizare, prin depozitarea deşeurilor, prin deversări industriale, casnice sau agricole şi prin depuneri din atmosferă. În apă, substanţele suferă procese chimice (de exemplu hidrolizare sau oxidare), procese fotochimice şi/sau procese microbiologice de transformare. Această Orientare, bazată pe Orientările menţionate la referinţele 1, 2, 3, 4, 5, 6 şi 7 existente, descrie o metodă de laborator prin care se evaluează transformarea prin hidroliză abiotică a substanţelor chimice în sistemele apoase, la o valoare a pH-ului găsită în mod normal în mediul înconjurător (pH = 4-9).
      Experimentele sunt realizate pentru a determina (i) rata hidrolizării substanţei test ca funcţie a pH-ului şi (ii) felul sau natura şi ratele de formare şi epurare a produşilor de hidroliză la care poate fi expus organismul. Asemenea studii pot fi necesare pentru substanţele chimice care pătrund în apă direct, sau care ajung în mediul înconjurător prin metodele descrise mai sus.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      A se vedea apendicele 2.
      1.3.   APLICABILITATEA METODEI
      Această metodă este aplicabilă în general substanţelor chimice (marcate sau nu) pentru care este disponibilă o metodă analitică suficient de sensibilă şi sigură. Este aplicabilă pentru compuşii slab volatili sau nevolatili şi care sunt suficient de solubili în apă. Testul nu trebuie aplicat substanţelor chimice puternic volatile din apă (de exemplu fumiganţi, solvenţi organici) care, din această cauză, nu pot fi menţinuţi în soluţie, în condiţiile experimentale ale acestui test. Pentru substanţele cu solubilitate mică în apă, testul este dificil de realizat (8).
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Soluţiile apoase tampon sterile, cu valori diferite ale pH-ului (pH de 4, 7 şi 9), sunt tratate cu substanţa testată şi incubate la întuneric, în condiţii controlate de laborator (la temperatură constantă). După un interval adecvat de timp, soluţiile tampon sunt analizate atât pentru substanţa testată, cât şi pentru produşii de hidroliză. În cazul substanţelor de testare marcate (de exemplu cu 14C), bilanţul maselor poate să fie calculat mai uşor.
      Această metodă de testare este realizată secvenţial, aşa cum este arătat şi explicat în apendicele 1. Fiecare secvenţă este declanşată de rezultatul celei anterioare.
      1.5.   INFORMAŢII REFERITOARE LA SUBSTANŢA DE TESTARE
      Rata de hidroliză poate fi măsurată cu ajutorul substanţelor marcate sau nemarcate. Deşi pentru studierea procesului de hidroliză şi pentru stabilirea bilanţului maselor, este preferat în general materialul marcat, totuşi, în unele cazuri, acesta nu este absolut necesar. Este recomandată marcarea cu 14C, însă este la fel de utilă şi folosirea altor izotopi, cum ar fi 13C, 15N, 3H. Pe cât posibil, marcarea ar trebui făcută în porţiunea (porţiunile) cea mai stabilă a moleculei. De exemplu, dacă substanţa testată are în structură un inel, este necesar ca marcarea să se facă la acest nivel. Dacă substanţa testată conţine două sau mai multe inele, sunt necesare studii separate pentru a evalua rezultatul marcării fiecărui inel în parte şi pentru a obţine informaţii adecvate despre formarea produşilor de hidroliză. Puritatea substanţei testate trebuie să fie de cel puţin 95 %.
      Înaintea desfăşurării unui test de hidroliză, trebuie să fie disponibile următoarele informaţii despre substanţa testată:
      
                  (a)
               
               
                  solubilitatea în apă [Metoda de testare A.6];
               
            
                  (b)
               
               
                  solubilitatea în solvenţi organici;
               
            
                  (c)
               
               
                  presiunea vaporilor [Metoda de Testare A.4] şi/sau constanta lui Henry;
               
            
                  (d)
               
               
                  coeficientul de partiţie n-octanol/apă [Metoda de testare A.8];
               
            
                  (e)
               
               
                  constanta de disociere (pKa) (Orientarea 112 a OCDE) (9);
               
            
                  (f)
               
               
                  rata de fototransformare directă sau indirectă în apă, acolo unde este cazul.
               
            Trebuie să fie disponibile metode analitice de cuantificare ale substanţei testate şi, dacă este relevant, metode de identificare şi cuantificare ale produşilor de hidroliză în soluţii apoase (a se vedea, de asemenea, punctul 1.7.2).
      1.6.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Atunci când este posibil, substanţele de referinţă ar trebui utilizate pentru identificarea şi cuantificarea produşilor de hidroliză prin metode spectroscopice, cromatografice sau prin alte metode sensibile adecvate.
      1.7.   CRITERII DE CALITATE
      1.7.1.   Randamentul de recuperare
      Analizarea cel puţin a substanţelor tampon duplicate sau a produşilor lor de reacţie rezultaţi imediat după adăugarea substanţei testate oferă o primă concluzie asupra repetabilităţii metodei analitice şi asupra uniformităţii procedurii pentru substanţa experimentală. Randamentul de recuperare pentru stadiile mai avansate ale experimentelor este indicat de bilanţul maselor respectiv (când sunt folosite substanţe marcate). Pentru substanţele chimice marcate şi nemarcate, randamentele de recuperare trebuie să aibă valori cuprinse între 90 % şi 110 %. În cazul existenţei dificultăţilor tehnice pentru atingerea acestor valori, un randament de 70 % este acceptat pentru substanţele chimice nemarcate, dar ar trebui oferite explicaţii suplimentare.
      1.7.2.   Repetabilitatea şi sensibilitatea metodei analitice
      Repetabilitatea metodei/metodelor analitice folosite pentru măsurarea în stadii avansate a substanţei de testat şi a produşilor de hidroliză poate fi verificată prin repetarea analizei aceleiaşi substanţe tampon (sau a produşilor ei de reacţie), după ce s-a format o cantitate suficientă de produşi de hidroliză pentru a putea fi măsurată.
      Metoda analitică trebuie să fie suficient de sensibilă pentru cuantificarea substanţei test la o concentraţie de 10 % sau mai puţin din concentraţia iniţială. În anumite cazuri, metodele analitice ar trebui să fie suficient de sensibile pentru a măsura produşii de hidroliză reprezentând 10 % sau mai mult din substanţa iniţială (în orice moment al studiului) şi până la 25 % sau mai puţin din concentraţia maximă.
      1.7.3.   Intervalele de încredere pentru cinetica hidrolizei
      Pentru toţi coeficienţii de regresie, constantele vitezei de reacţie, timpii de înjumătăţire şi oricare alţi parametri de cinetică (de exemplu DT50) trebuie calculate şi prezentate intervalele de încredere.
      1.8.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.8.1.   Aparatură şi echipament
      Experimentul trebuie desfăşurat în recipiente de sticlă (de exemplu tuburi de test, retorte mici) în condiţii sterile, la întuneric dacă este necesar, cu excepţia cazurilor în care informaţiile preliminare (de exemplu coeficientul de partiţie n-octanol/apă) au indicat că substanţa testată este aderentă de sticlă. În asemenea cazuri, trebuie luate în considerare materialele alternative (cum ar fi teflonul). Problema aderenţei la sticlă poate fi evitată şi prin folosirea uneia sau mai multora dintre următoarele metode:
      
                  —
               
               
                  determinarea masei substanţei de testat şi produşii de hidroliză absorbiţi de recipientul testat;
               
            
                  —
               
               
                  folosirea unei băi ultrasonice;
               
            
                  —
               
               
                  asigurarea unei spălări pe bază de solvent a recipientelor de sticlă la fiecare interval de colectare a datelor;
               
            
                  —
               
               
                  utilizarea produselor preparate;
               
            
                  —
               
               
                  folosirea unei cantităţi crescute de cosolvent pentru adăugarea substanţei de testat; dacă se foloseşte un cosolvent, acesta nu trebuie să hidrolizeze substanţa de testat.
               
            În mod normal, sunt necesare băi de apă termostatate cu sistem de vibraţie sau incubatoare termostatate pentru incubarea diferitelor substanţe de testat.
      Este necesară folosirea unui echipament de laborator standard, care să cuprindă în special următoarele:
      
                  —
               
               
                  pH-metru;
               
            
                  —
               
               
                  instrumente analitice cum ar fi echipament GC, HPLC, TLC, inclusiv sisteme adecvate de detectare pentru analiza substanţelor marcate radioactiv şi a celor nemarcate sau a metodei de diluare izotopică inversă;
               
            
                  —
               
               
                  instrumente folosite în scopul identificării (de exemplu MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR etc.);
               
            
                  —
               
               
                  contor de scintilaţie lichidă;
               
            
                  —
               
               
                  pâlnii separatoare pentru extracţia lichid-lichid;
               
            
                  —
               
               
                  instrumente pentru concentrarea soluţiilor şi a produşilor de reacţie (de exemplu evaporator rotativ);
               
            
                  —
               
               
                  dispozitiv de control al temperaturii (de exemplu baie de apă).
               
            Reactanţii chimici cuprind, de exemplu:
      
                  —
               
               
                  solvenţi organici, puri din punct de vedere chimic, cum ar fi hexanul, diclormetanul etc.;
               
            
                  —
               
               
                  lichid de scintilaţie;
               
            
                  —
               
               
                  soluţie tampon (pentru detalii a se vedea punctul 1.8.3).
               
            Toate recipientele din sticlă, apa pură şi soluţiile tampon folosite în testele de hidroliză trebuie să fie sterilizate.
      1.8.2.   Utilizarea substanţei de testare
      Substanţele de testare trebuie folosite ca soluţii apoase în diferite soluţii tampon (a se vedea apendicele 3). Dacă este necesar pentru dizolvarea adecvată, este permisă folosirea unor cantităţi mici de solvenţi care pot fi amestecaţi cu apa (cum sunt acetonitrilul, acetona, etanolul) în vederea aplicării şi distribuţiei substanţei testate, dar în mod normal nu ar trebui să se depăşească 1 % v/v. Folosirea unei concentraţii mai mari de solvent (de exemplu în cazul substanţelor de testare cu solubilitate mică în apă) nu este permisă decât atunci când se demonstrează că solventul nu are efect asupra hidrolizei substanţei de testare.
      Utilizarea unui produs preparat nu este recomandată în mod curent, deoarece nu se poate exclude că ingredientele de preparare pot influenţa procesul de hidroliză. Totuşi, pentru substanţele de testare cu solubilitate mică în apă sau pentru substanţele aderente de sticlă (a se vedea punctul 1.8.1), folosirea substanţelor preparate constituie o alternativă adecvată.
      Trebuie folosită o singură concentraţie a substanţei de testare; aceasta nu trebuie să depăşească 0,01 M sau jumătate din concentraţia de saturare (a se vedea apendicele 1).
      1.8.3   Soluţii tampon
      Testul de hidroliză trebuie realizat la valori ale pH-ului de 4, 7 şi 9. În acest scop, soluţiile tampon trebuie preparate folosind apă şi substanţe chimice purificate. În apendicele 3 sunt prezentate câteva sisteme tampon folositoare. Trebuie avut în vedere că sistemele tampon pot influenţa rata de hidroliză; când acest lucru este observat trebuie folosit un alt sistem tampon (11).
      PH-ul fiecărei soluţii tampon trebuie să corespundă, cu o precizie de cel puţin 0,1, cu valoarea pH-ului măsurată de un pH-metru calibrat la temperatura cerută.
      1.8.4.   Condiţii de testare
      1.8.4.1.   Temperatura de testare
      Reacţiile de hidroliză din experiment trebuie efectuate la o temperatură constantă. În vederea extrapolării, este important ca temperatura să fie menţinută la cel puţin ±0,5 oC.
      Dacă nu se cunoaşte comportamentul hidrolitic al substanţei test, trebuie efectuat un test preliminar (faza 1) la o temperatură de 50 oC. Testele cinetice de fază mai avansată ar trebui realizate la un minimum de trei temperaturi (incluzând testul la 50 oC), cu excepţia cazului în care substanţa este stabilă la hidroliză, aşa cum s-a demonstrat în faza 1 a testului. Intervalul de temperatură sugerat este cuprins între 10 şi 70 oC (preferabil cu utilizarea a cel puţin unei temperaturi sub 25 oC), care va include şi temperatura raportată de 25 oC şi cele mai multe dintre temperaturile întâlnite.
      1.8.4.2.   Lumina şi oxigenul
      Toate testele de hidroliză se vor desfăşura prin folosirea unor metode adecvate care evită efectul fotolitic. Vor fi luate toate măsurile pentru evitarea oxigenului (de exemplu prin barbotarea heliului, a nitrogenului sau a argonului timp de 5 minute înaintea pregătirii soluţiei).
      1.8.4.3.   Durata testului
      Testul preliminar trebuie să dureze 5 zile, în timp ce fazele mai avansate trebuie să se desfăşoare fie până când hidroliza substanţei test s-a produs în proporţie de 90 %, fie timp de 30 de zile, în funcţie de care din evenimente se produce primul.
      1.8.5.   Realizarea testului
      1.8.5.1.   Testul preliminar (faza 1)
      Testul preliminar trebuie realizat la o temperatură de 50 ±0,5 oC şi la un pH de 4, 7 şi 9. Dacă după 5 zile hidroliza s-a produs într-un procent mai mic de 10 % (t0,5 la 25 oC > 1 an), substanţa testată este considerată stabilă la hidroliză şi nu mai este necesar niciun test suplimentar. Dacă se cunoaşte că substanţa este instabilă la temperatura mediului înconjurător (12), testul preliminar nu mai este necesar. Metoda analitică trebuie să fie suficient de precisă şi sensibilă pentru a detecta reducerea cu 10 procente din concentraţia iniţială.
      1.8.5.2.   Hidroliza substanţelor instabile (faza 2)
      Fazele avansate ale testului trebuie să fie realizate la valori ale pH-ului la care substanţele test au fost găsite instabile, după cum s-a arătat în testul preliminar de mai sus. Soluţiile tampon ale substanţei de testat trebuie să fie incubate la temperaturile selectate. Pentru a testa comportamentul primar, fiecare soluţie din reacţie trebuie să fie analizată în intervalele de timp care asigură un minimum de şase puncte de reper normale separate ale hidrolizării între 10 % şi 90 % ale substanţei de testat. Replicarea fiecărei probe a testului (minim dublarea probelor conţinute în vase separate de reacţie) trebuie înlăturată, iar conţinutul trebuie analizat la fiecare din cel puţin şase momente de eşantionare (pentru un minimum de douăsprezece puncte de reper replicate). Utilizarea unui singur eşantion de mărime de la care s-au îndepărtat părţile alicote ale soluţiilor experimentale la fiecare moment de eşantionare, este considerată neadecvată deoarece, în acest fel nu este permisă analizarea variabilităţii datelor şi se poate ajunge la probleme de contaminare a soluţiilor testate. La finalul fazei avansate a testului (adică la hidrolizarea în procent de 90 % sau după 30 de zile) trebuie efectuate teste de confirmare a sterilităţii. Totuşi, testele de sterilitate nu sunt necesare dacă nu s-a observat nicio degradare (adică transformare).
      1.8.5.3.   Identificarea produşilor de hidroliză (faza 3)
      Orice produşi majori de hidroliză, cel puţin cei care reprezintă > 10 % din doza iniţială, trebuie identificaţi prin metode analitice adecvate.
      1.8.5.4.   Teste opţionale
      Pentru substanţele test instabile la hidroliză pot fi necesare teste suplimentare la alte valori ale pH-ului decât 4, 7 şi 9. De exemplu, în scopuri fiziologice, un test în condiţii mai acide (de exemplu pH de 1,2) poate fi necesar prin înlocuirea unei singure temperaturi relevante fiziologic (37 oC).
      2.   DATE
      Cantităţile de substanţă test şi de produşi de hidroliză trebuie date ca procente din substanţa folosită iniţial, iar acolo unde este cazul, ca mg/L pentru fiecare interval de eşantionare şi pentru fiecare pH şi temperatură din test. În plus, bilanţul maselor trebuie calculat ca procent din concentraţia iniţială, atunci când s-au folosit substanţe test marcate.
      Trebuie realizată reprezentarea grafică a transformării logaritmice a concentraţiei substanţei test în funcţie de timp. Trebuie identificaţi orice produşi majori de hidroliză, cel puţin cei care reprezintă > 10 % din doza iniţială, iar transformarea logaritmică a concentraţiei lor trebuie reprezentată în aceeaşi manieră ca pentru substanţa iniţială, pentru a arăta ratele de formare şi de declin.
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Se pot obţine determinări mai precise ale timpilor de înjumătăţire sau ale DT50 prin folosirea unor modele cinetice adecvate. Timpii de înjumătăţire şi/sau valoarea DT50 (inclusiv marjele de eroare) trebuie raportate pentru fiecare valoare a pH-ului sau a temperaturii, împreună cu descrierea modelului folosit, ordinul cinetic şi coeficientul de determinare (r2). Acolo unde este cazul, aceste calcule trebuie să fie aplicate şi asupra produşilor de hidroliză.
      În cazul studierii vitezei de reacţie desfăşurate la temperaturi diferite, constantele vitezei de reacţie (Kobs) ale hidrolizei cu cinetică de pseudo ordin I trebuie descrise în funcţie de temperatură. Calculele trebuie să se bazeze atât pe separarea Kobs în constante ale vitezelor de reacţie pentru hidroliza catalizată în mediu acid, neutru sau bazic (kH, kneutru şi, respectiv kOH), cât şi pe ecuaţia Arrhenius:
      
         
      unde Ai şi Bi sunt constantele de regresie pentru segment şi respectiv pantă, ale liniilor de optimă ajustare, generate din regresia lineară ln ki reprezentată în funcţie de inversul temperaturii absolute în grade Kelvin (T) Prin folosirea ecuaţiei Arrhenius pentru hidroliza catalizată în mediu acid, neutru sau bazic, se pot calcula constantele vitezei de reacţie cu cinetică de pseudo ordin I, şi astfel timpii de înjumătăţire pentru alte temperaturi, pentru care determinarea directă a constantei vitezei de reacţie nu este posibilă (10).
      2.2.   EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Majoritatea reacţiilor de hidroliză sunt aparent reacţii de ordinul I şi, de aceea, timpii de înjumătăţire sunt independenţi de concentraţie (a se vedea ecuaţia 4 din apendicele 2) Acest lucru permite de obicei aplicarea rezultatelor de laborator, determinate de la 10–2 la 10–3 M, în condiţiile mediului înconjurător (≤ 10–6 M) (10). Mabey şi Mill au raportat câteva exemple de corespondenţă între vitezele de hidroliză atât în apă pură, cât şi în apă naturală, pentru o varietate de substanţe chimice, cu condiţia ca pH-ul şi temperatura să fi fost măsurate.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORT DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să includă cel puţin următoarele informaţii:
      Substanţa de testare:
      
                  —
               
               
                  numele obişnuit, numele chimic, numărul CAS, structura chimică (indicându-se poziţia în care a fost marcată, atunci când se folosesc substanţe marcate radioactiv) şi proprietăţile fizico-chimice relevante (a se vedea punctul 1.5);
               
            
                  —
               
               
                  puritatea (impurităţile) substanţei experimentale;
               
            
                  —
               
               
                  puritatea substanţei de marcare pentru substanţele chimice marcate şi activitatea molară (acolo unde este cazul).
               
            
                  —
               
               
                  Soluţiile tampon:
               
            
                  —
               
               
                  date şi detalii despre preparare;
               
            
                  —
               
               
                  soluţiile tampon şi soluţiile apoase folosite;
               
            
                  —
               
               
                  molaritatea şi pH-ul soluţiilor tampon.
               
            Condiţiile de testare:
      
                  —
               
               
                  date despre desfăşurarea experimentelor;
               
            
                  —
               
               
                  cantitatea de substanţă de testare folosită;
               
            
                  —
               
               
                  metodă şi solvenţi (tip şi cantitate) folosiţi pentru aplicarea substanţei de testare;
               
            
                  —
               
               
                  volumul soluţiilor tampon ale substanţei de testare incubate;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea sistemelor de incubare folosite;
               
            
                  —
               
               
                  pH-ul şi temperatura în timpul experimentului;
               
            
                  —
               
               
                  intervalele de eşantionare;
               
            
                  —
               
               
                  metoda (metodele) de extracţie;
               
            
                  —
               
               
                  metode de cuantificare şi identificare ale substanţei de testare şi ale produşilor de hidroliză în soluţiile tampon;
               
            
                  —
               
               
                  număr de repetări.
               
            Rezultate:
      
                  —
               
               
                  repetabilitatea şi sensibilitatea metodei analitice folosite;
               
            
                  —
               
               
                  randamentele de recuperare (valorile procentuale pentru un experiment valabil sunt date în punctul 1.7.1);
               
            
                  —
               
               
                  replicarea datelor şi mijloacelor sub formă de tabel;
               
            
                  —
               
               
                  bilanţul maselor în timpul şi la sfârşitul experimentelor (când se folosesc substanţe test marcate);
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele testului preliminar;
               
            
                  —
               
               
                  discuţii şi interpretarea rezultatelor;
               
            
                  —
               
               
                  toate datele şi cifrele originale.
               
            Următoarele date sunt necesare doar în cazul în care viteza reacţiei de hidroliză este determinată:
      
                  —
               
               
                  graficele concentraţiilor în funcţie de timp pentru substanţa de testare şi, acolo unde este cazul, pentru produşii de hidroliză la fiecare valoare a pH-ului şi a temperaturii;
               
            
                  —
               
               
                  tabele cu rezultatele ecuaţiei Arrhenius pentru temperaturi de 20 oC/25 oC, cu pH, constanta vitezei de reacţie [ora–1 sau ziua–1], timpii de înjumătăţire sau DT50, temperaturi [ oC], inclusiv intervalele de încredere şi coeficienţii de corelaţie (r2) sau informaţii similare;
               
            
                  —
               
               
                  calea de hidroliză propusă.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD (1981), Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guideline for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981.
               
            
                  2.
               
               
                  US-Environmental Protection Agency (1982), 40 CFR 796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25 oC. Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
               
            
                  3.
               
               
                  Agriculture Canada (1987), Environmental Chemistry and Fate Guidelines for registration of pesticides in Canada.
               
            
                  4.
               
               
                  Uniunea Europeană (UE) (1995), Directiva 95/36/CE a Comisiei din 14 iulie 1995 de modificare a Directivei 91/414/CEE a Consiliului privind introducerea pe piaţă a produselor fitosanitare. Apendicele V: Comportamentul în mediu.
               
            
                  5.
               
               
                  Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991), Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
               
            
                  6.
               
               
                  BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (October 1980).
               
            
                  7.
               
               
                  SETAC (1995), Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.
               
            
                  8.
               
               
                  OECD (2000), Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No 23.
               
            
                  9.
               
               
                  OECD (1993), Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994 – 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
               
            
                  10.
               
               
                  Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997), Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14th Annual Meeting of the Society of Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, November 1993).
               
            
                  11.
               
               
                  Mabey, W. and Mill, T. (1978), Critical review of hydrolysis of organic compounds in water under environmental conditions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.
               
            
         Apendicele 1
         Schema secvenţelor testului de hidroliză
         
            
      
      
         Apendicele 2
         Definiţii şi unităţi
         
            Unităţile internaţionale standard (SI) trebuie folosite în toate cazurile.
         
            Substanţa experimentală: orice substanţă, fie compusul iniţial, fie produşii de transformare relevanţi.
         
            Produşi de transformare: toate substanţele care rezultă din reacţiile de transformare biotică sau abiotică a substanţei experimentale.
         
            Produşi de hidroliză: toate substanţele care rezultă din reacţiile de hidroliză ale substanţei experimentale.
         
            Hidroliza se referă la reacţia unei substanţe experimentale RX cu apa, cu schimbarea grupului X cu OH în timpul reacţiei:
         
                     RX + HOH → ROH + HX
                  
                  
                     [1]
                  
               Viteza cu care scade concentraţia substanţei RX în acest proces simplificat este dată de
         
                     viteza = k [H2O] [RX]
                  
                  
                     reacţie de ordin doi
                  
               
                     sau
                  
               
                     viteza = k [RX]
                  
                  
                     reacţie de ordinul întâi
                  
               depinzând de viteza pasului determinant. Deoarece apa este prezentă în exces comparativ cu substanţa test, acest tip de reacţie este descrisă de obicei ca reacţie de pseudo ordin întâi, în care constanta observată a vitezei de reacţie este dată de relaţia
         
                     kobs = k [H2O]
                  
                  
                     [2]
                  
               şi poate fi determinată din formula (13)
         
         
                     
                         ln 
                        
                  
                  
                     [3]
                  
               unde:
         t= timp
         şi C0, Ct= concentraţiile RX la momentul 0 şi t.
         Unităţile de măsură ale acestei constante au dimensiunea (timp)–1, iar timpul de înjumătăţire al reacţiei (timpul necesar pentru ca 50 % din substanţa RX să reacţioneze) este dat de
         
                     
                        
                  
                  
                     [4]
                  
               
            Timpul de înjumătăţire: (t0,5) este timpul necesar pentru hidroliza a 50 % din substanţa test când reacţia poate fi descrisă ca reacţie cu cinetică de ordin întâi; este dependent de concentraţie.
         
            DT
            
               50
            
            (timp de dispariţie 50) este timpul în care concentraţia substanţei experimentale este redusă cu 50 %; este diferit de timpul de înjumătăţire t0,5 atunci când reacţia nu se supune unei cinetici de ordinul întâi.
         
            Determinarea constantei k la diferite temperaturi
         
         Atunci când se cunosc constantele vitezei de reacţie pentru două temperaturi, constantele pentru alte temperaturi se pot calcula folosind ecuaţia Arrhenius:
         
             sau 
         Graficul ln k în funcţie de 1/T este o dreaptă având panta de – E/R
         unde:
         
                     k
                  
                  
                     =
                  
                  
                     constanta vitezei de reacţie măsurată la diferite temperaturi
                  
               
                     E
                  
                  
                     =
                  
                  
                     energia de activare [kJ/mol]
                  
               
                     T
                  
                  
                     =
                  
                  
                     temperatura absolută [K]
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     constanta gazului [8,314 J/mol.K]
                  
               Energia de activare este calculată prin analiza regresiei sau prin următoarea ecuaţie:
         
            
         unde: T2 > T1.
      
      
         Apendicele 3
         Sisteme tampon
         A.   CLARK ŞI LUBS:
         Amestecuri tampon tip CLARK şi LUBS
                (14)
            
         
         
                     Compoziţie
                  
                  
                     pH
                  
               
                     
                        HCl 0,2 N şi KCl 0,2 N la 20 oC
                     
                  
               
                     47,5 ml HCl + 25 ml KCl dil. până la 100 ml
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     32,25 ml HCL + 25 ml KCl dil. până la 100 ml
                  
                  
                     1,2
                  
               
                     20,75 ml HCl + 25 ml KCl dil. până la 100 ml
                  
                  
                     1,4
                  
               
                     13,15 ml HCl + 25 ml KCl dil. până la 100 ml
                  
                  
                     1,6
                  
               
                     8,3 ml HCl + 25 ml KCl dil. până la 100 ml
                  
                  
                     1,8
                  
               
                     5,3 ml HCl + 25 ml KCl dil. până la 100 ml
                  
                  
                     2,0
                  
               
                     3,35 ml HCl + 25 ml KCl dil. până la 100 ml
                  
                  
                     2,2
                  
               
                     
                        Biftalat monopotasic 0,1 M + HCl 0,1 N la 20 oC
                     
                  
               
                     46,70 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     2,2
                  
               
                     39,60 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     2,4
                  
               
                     32,95 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     2,6
                  
               
                     26,42 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     2,8
                  
               
                     20,32 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     3,0
                  
               
                     14,70 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     3,2
                  
               
                     9,90 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     3,4
                  
               
                     5,97 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     3,6
                  
               
                     2,63 ml HCl 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     3,8
                  
               
                     
                        Biftalat potasic 0,1 M + NaOH 0,1 N la 20 oC
                     
                  
               
                     0,40 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     4,0
                  
               
                     3,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     4,2
                  
               
                     7,50 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     4,4
                  
               
                     12,15 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     4,6
                  
               
                     17,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     4,8
                  
               
                     23,85 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     5,0
                  
               
                     29,95 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     5,2
                  
               
                     35,45 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     5,4
                  
               
                     39,85 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     5,6
                  
               
                     43,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     5,8
                  
               
                     45,45 ml NaOH 0,1 N + 50 ml biftalat până la 100 ml
                  
                  
                     6,0
                  
               Amestecuri tampon tip CLARK şi LUBS (Continuare)
         
                     
                        Fosfat monopotasic 0,1 M + NaOH 0,1 N la 20 oC
                     
                  
               
                     5,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat până la 100 ml
                  
                  
                     6,0
                  
               
                     8,60 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat până la 100 ml
                  
                  
                     6,2
                  
               
                     12,60 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat până la 100 ml
                  
                  
                     6,4
                  
               
                     17,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat până la 100 ml
                  
                  
                     6,6
                  
               
                     23,45 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat până la 100 ml
                  
                  
                     6,8
                  
               
                     29,63 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat până la 100 ml
                  
                  
                     7,0
                  
               
                     35,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat până la 100 ml
                  
                  
                     7,2
                  
               
                     39,50 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat până la 100 ml
                  
                  
                     7,4
                  
               
                     42,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat până la 100 ml
                  
                  
                     7,6
                  
               
                     45,20 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat până la 100 ml
                  
                  
                     7,8
                  
               
                     46,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml fosfat până la 100 ml
                  
                  
                     8,0
                  
               
                     
                        H3BO30,1 M în KCl 0,1 M + NaOH 0,1 N la 20 oC
                     
                  
               
                     2,61 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric până la 100 ml
                  
                  
                     7,8
                  
               
                     3,97 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric până la 100 ml
                  
                  
                     8,0
                  
               
                     5,90 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric până la 100 ml
                  
                  
                     8,2
                  
               
                     8,50 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric până la 100 ml
                  
                  
                     8,4
                  
               
                     12,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric până la 100 ml
                  
                  
                     8,6
                  
               
                     16,30 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric până la 100 ml
                  
                  
                     8,8
                  
               
                     21,30 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric până la 100 ml
                  
                  
                     9,0
                  
               
                     26,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric până la 100 ml
                  
                  
                     9,2
                  
               
                     32,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric până la 100 ml
                  
                  
                     9,4
                  
               
                     36,85 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric până la 100 ml
                  
                  
                     9,6
                  
               
                     40,80 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric până la 100 ml
                  
                  
                     9,8
                  
               
                     43,90 ml NaOH 0,1 N + 50 ml acid boric până la 100 ml
                  
                  
                     10,0
                  
               B.   KOLTHOFF ŞI VLEESCHHOUWER:
         Sisteme tampon citrat tip KOLTHOFF şi VLEESCHHOUWER
         
                     Compoziţie
                  
                  
                     pH
                  
               
                     
                        Citrat monopotasic 0,1 M şi HCl 0,1 N la 18 oC
                         (15)
                     
                  
               
                     49,7 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     2,2
                  
               
                     43,4 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     2,4
                  
               
                     36,8 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     2,6
                  
               
                     30,2 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     2,8
                  
               
                     23,6 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     3,0
                  
               
                     17,2 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     3,2
                  
               
                     10,7 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     3,4
                  
               
                     4,2 ml HCl 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     3,6
                  
               
                     
                        Citrat monopotasic 0,1 M şi NaOH 0,1 N la 18 oC
                         (15)
                     
                  
               
                     2,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     3,8
                  
               
                     9,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     4,0
                  
               
                     16,3 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     4,2
                  
               
                     23,7 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     4,4
                  
               
                     31,5 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     4,6
                  
               
                     39,2 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     4,8
                  
               
                     46,7 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     5,0
                  
               
                     54,2 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     5,2
                  
               
                     61,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     5,4
                  
               
                     68,0 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     5,6
                  
               
                     74,4 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     5,8
                  
               
                     81,2 ml NaOH 0,1 N + 50 ml citrat până la 100 ml
                  
                  
                     6,0
                  
               C.   SÖRENSEN:
         Amestecuri borate tip SÖRENSEN
         
                     Compoziţie
                  
                  
                     Sörensen
                     18 oC
                  
                  
                     Walbum, pH la
                  
               
                     ml Borax
                  
                  
                     ml HCl/NaOH
                  
                  
                     10 oC
                  
                  
                     40 oC
                  
                  
                     70 oC
                  
               
                     
                        borax 0,05 M + HCl 0,1 N
                     
                  
               
                     5,25
                  
                  
                     4,75
                  
                  
                     7,62
                  
                  
                     7,64
                  
                  
                     7,55
                  
                  
                     7,47
                  
               
                     5,50
                  
                  
                     4,50
                  
                  
                     7,94
                  
                  
                     7,98
                  
                  
                     7,86
                  
                  
                     7,76
                  
               
                     5,75
                  
                  
                     4,25
                  
                  
                     8,14
                  
                  
                     8,17
                  
                  
                     8,06
                  
                  
                     7,95
                  
               
                     6,00
                  
                  
                     4,00
                  
                  
                     8,29
                  
                  
                     8,32
                  
                  
                     8,19
                  
                  
                     8,08
                  
               
                     6,50
                  
                  
                     3,50
                  
                  
                     8,51
                  
                  
                     8,54
                  
                  
                     8,40
                  
                  
                     8,28
                  
               
                     7,00
                  
                  
                     3,00
                  
                  
                     8,08
                  
                  
                     8,72
                  
                  
                     8,56
                  
                  
                     8,40
                  
               
                     7,50
                  
                  
                     2,50
                  
                  
                     8,80
                  
                  
                     8,84
                  
                  
                     8,67
                  
                  
                     8,50
                  
               
                     8,00
                  
                  
                     2,00
                  
                  
                     8,91
                  
                  
                     8,96
                  
                  
                     8,77
                  
                  
                     8,59
                  
               
                     8,50
                  
                  
                     1,50
                  
                  
                     9,01
                  
                  
                     9,06
                  
                  
                     8,86
                  
                  
                     8,67
                  
               
                     9,00
                  
                  
                     1,00
                  
                  
                     9,09
                  
                  
                     9,14
                  
                  
                     8,94
                  
                  
                     8,74
                  
               
                     9,50
                  
                  
                     0,50
                  
                  
                     9,17
                  
                  
                     9,22
                  
                  
                     9,01
                  
                  
                     8,80
                  
               
                     10,00
                  
                  
                     0,00
                  
                  
                     9,24
                  
                  
                     9,30
                  
                  
                     9,08
                  
                  
                     8,86
                  
               
                     
                        borax 0,05 M + NaOH 0,1 N
                     
                  
               
                     10,0
                  
                  
                     0,0
                  
                  
                     9,24
                  
                  
                     9,30
                  
                  
                     9,08
                  
                  
                     8,86
                  
               
                     9,0
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     9,36
                  
                  
                     9,42
                  
                  
                     9,18
                  
                  
                     8,94
                  
               
                     8,0
                  
                  
                     2,0
                  
                  
                     9,50
                  
                  
                     9,57
                  
                  
                     9,30
                  
                  
                     9,02
                  
               
                     7,0
                  
                  
                     3,0
                  
                  
                     9,68
                  
                  
                     9,76
                  
                  
                     9,44
                  
                  
                     9,12
                  
               
                     6,0
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                     9,97
                  
                  
                     10,06
                  
                  
                     9,67
                  
                  
                     9,28
                  
               Amestecuri fosfate tip SÖRENSEN
         
                     Compoziţie
                  
                  
                     pH
                  
               
                     
                        Fosfat monopotasic 0,0667 M + Fosfat disodic 0,0667 M la 20 oC
                     
                  
               
                     99,2 ml KH2PO4+0,8 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,0
                  
               
                     98,4 ml KH2PO4+1,6 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,2
                  
               
                     97,3 ml KH2PO4+2,7 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,4
                  
               
                     95,5 ml KH2PO4+4,5 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,6
                  
               
                     92,8 ml KH2PO4+7,2 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     5,8
                  
               
                     88,9 ml KH2PO4+11,1 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,0
                  
               
                     83,0 ml KH2PO4+17,0 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,2
                  
               
                     75,4 ml KH2PO4+24,6 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,4
                  
               
                     65,3 ml KH2PO4+34,7 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,6
                  
               
                     53,4 ml KH2PO4+46,6 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     6,8
                  
               
                     41,3 ml KH2PO4+58,7 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,0
                  
               
                     29,6 ml KH2PO4+70,4 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,2
                  
               
                     19,7 ml KH2PO4+80,3 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,4
                  
               
                     12,8 ml KH2PO4+87,2 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,6
                  
               
                     7,4 ml KH2PO4+92,6 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     7,8
                  
               
                     3,7 ml KH2PO4+96,3 ml Na2HPO4
                     
                  
                  
                     8,0
                  
               
      C.8.   TOXICITATEA LA RÂME
      TEST PE SOL ARTIFICIAL
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      În acest test de laborator substanţa de testat se adaugă la un sol artificial în care se plasează râme timp de 14 zile. După această perioadă (şi opţional după 7 zile) se examinează efectul letal al substanţei pe râme. Testul reprezintă o metodă pentru determinarea pe termen relativ scurt a efectului substanţelor chimice pe râme prin absorbţie cutanată şi prin ingestie.
      1.2.   DEFINIŢIE ŞI UNITATE DE MĂSURĂ
      CL50: concentraţia unei substanţe care este statistic responsabilă pe parcursul unei expuneri de moartea a 50 % din animalele expuse pe durata testului.
      1.3.   SUBSTANŢA DE REFERINŢĂ
      Se foloseşte periodic o substanţă de referinţă ca modalitate de a demonstra că sensibilitatea sistemului de testare nu s-a schimbat semnificativ.
      Se recomandă ca substanţă de referinţă cloracetamida de puritate analitică.
      1.4.   PRINCIPIUL TESTULUI
      Solul fiind un mediu variabil, pentru acest test se foloseşte un sol artificial de argilă cu caracteristici definite cu atenţie. Râmele adulte din specia Eisenia foetida (a se vedea nota din apendice) sunt ţinute într-un sol artificial, definit, tratat cu diferite concentraţii ale substanţei de testat. Conţinutul recipientelor este aşezat pe o tavă după 14 zile (opţional 7 zile) de la începerea testului şi se numără râmele care au supravieţuit fiecărei concentraţii.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Testul este conceput astfel încât să fie cât se poate de reproductibil cu privire la substratul de testare şi organism. Dacă mortalitatea în loturile martor depăşeşte 10 % la sfârşitul testului, acesta este invalidat.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Materiale
      
      1.6.1.1.   Substrat de testare
      
      Ca substrat de bază se foloseşte un sol artificial definit.
      
                  (a)
               
               
                  Substratul de bază (procente exprimate în greutate uscată):
                  
                              —
                           
                           
                              10 % muşchi de turbă (cât se poate de aproape de pH 5,5-6,0 şi pe cât posibil fără resturi vizibile de plante şi pământ);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              20 % argilă caolinică, de preferat cu mai mult de 50 % caolinit;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aproximativ 69 % nisip industrial de cuarţ (mai mult de 50 % nisip fin cu dimensiunea particulelor de 0,05-0,2 mm). Dacă substanţa nu se dispersează suficient în apă, trebuie păstrată o cantitate de 10 g nisip/recipient de testare pentru amestecare ulterioară cu substanţa de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aproximativ 1 % carbonat de calciu (CaCO3) pulbere, chimic pur, adăugat pentru a ajusta pH-ul la 6,0±0,5.
                           
                        
            
                  (b)
               
               
                  Substratul de testare
                  Substratul de testare conţine substratul de bază, substanţa de testat şi apă deionizată.
                  Conţinutul de apă este de aproximativ 25-42 % din greutatea uscată a substratului de bază. Conţinutul de apă al substratului este determinat aducând la greutate constantă un eşantion, prin uscare la 105 oC. Criteriul cheie este acela că solul artificial trebuie udat aşa încât apa să nu ajungă să băltească. Amestecarea se face cu grijă pentru a se obţine o distribuţie uniformă a substanţei de testat şi a substratului. Modul de introducere a substanţei de testat în substrat trebuie trecut în raportul de testare.
               
            
                  (c)
               
               
                  Substratul martor
                  Substratul martor conţine substratul de bază şi apă. Dacă se foloseşte un aditiv, se adaugă un substrat martor suplimentar care trebuie să conţină aceeaşi cantitate de aditiv.
               
            1.6.1.2.   Recipiente de testare
      
      Recipiente de sticlă cu o capacitate de aproximativ 1 l (acoperite adecvat cu capace de plastic, discuri sau foi de plastic cu perforaţii de aerisire) umplute cu o cantitate de substrat de testare umed sau substrat martor umed, echivalent cu 500 g de substrat uscat.
      1.6.2.   Condiţii de testare
      
      Recipientele trebuie păstrate în incinte climatizate la o temperatură de 20 ± 2 oC cu lumină continuă. Intensitatea luminii trebuie să fie de 400-800 de lucşi.
      Perioada de testare este de 14 zile, dar mortalitatea poate fi evaluată opţional la 7 zile de la începerea testului.
      1.6.3.   Mod de operare
      
      
         Concentraţiile substanţei de testat
      
      Concentraţiile substanţei de testat sunt exprimate ca raport între masa substanţei şi masa substratului de bază uscat (mg/kg).
      
         Testul preliminar
      
      Intervalul de concentraţii care provoacă mortalităţi de 0-100 % se poate determina printr-un test preliminar, care să ofere informaţii despre intervalul de concentraţii ce trebuie folosite în testul definitiv.
      Substanţa trebuie testată la următoarele concentraţii: 1 000; 100; 10; 1 şi 0,1 mg substanţă/kg substrat de testare (greutate uscată).
      Dacă urmează să se efectueze un test final, complet, un lot per concentraţie şi un lot pentru martorul netratat, fiecare cu câte 10 râme, pot fi suficiente pentru testul preliminar.
      
         Testul definitiv
      
      Rezultatele testului preliminar se folosesc pentru a selecta cel puţin 5 concentraţii într-o serie geometrică din domeniul 0-100 % mortalitate, care diferă cu un raport constant de maximum 1,8.
      Testele în care se folosesc aceste serii de concentraţii trebuie să permită, cu cea mai mare precizie posibilă, estimarea valorii CL50 şi a limitelor de încredere.
      În testul definitiv se folosesc 4 loturi de testare per concentraţie şi 4 loturi martor netratate, fiecare cu 10 râme. Rezultatele acestor loturi replicate se prezintă ca medie, precizându-se deviaţia standard.
      Dacă două concentraţii consecutive aflate în raport de 1,8 dau numai 0 % şi 100 % mortalitate, aceste două valori sunt suficiente pentru a indica intervalul în care se află CL50.
      
         Amestecul de substrat de bază şi substanţă testată
      
      Dacă este posibil, substratul de testare trebuie preparat fără agenţi suplimentari alţii decât apa. Imediat înainte de începerea testului, o emulsie sau dispersie de substanţă de testat în apă deionizată sau alt solvent se amestecă cu substratul de bază sau este pulverizată uniform peste el, cu un pulverizator de cromatografie fină sau similar.
      Dacă este insolubilă în apă, substanţa de testat se poate dizolva într-un volum cât se poate de mic de solvent organic adecvat (de exemplu, hexan, acetonă sau cloroform).
      Se pot folosi numai agenţi care se volatilizează rapid pentru a solubiliza, dispersa sau emulsiona substanţa de testat. Substratul trebuie aerisit înainte de utilizare. Cantitatea de apă evaporată trebuie înlocuită. Martorul trebuie să conţină aceeaşi cantitate din orice aditiv.
      Dacă substanţa de testat nu este solubilă, dispersabilă sau emulsionabilă în solvenţi organici, se amestecă 10 g de nisip de cuarţ fin măcinat cu o cantitate de substanţă de testat necesară pentru a trata 500 g de sol artificial uscat cu 490 g de substrat de testare uscat.
      Pentru fiecare lot, o cantitate de substrat de testare umed echivalent cu 500 g greutate uscată se plasează în fiecare recipient din sticlă şi 10 râme, care au fost ţinute 24 de ore într-un substrat de bază umed similar, apoi clătite rapid, surplusul de apă fiind absorbit pe hârtie de filtru, sunt aşezate pe substratul de testare.
      Recipientele se acoperă cu capace de plastic, discuri sau foi de plastic perforate pentru a împiedica uscarea substratului şi sunt ţinute în condiţii de testare 14 zile.
      Evaluările trebuie făcute după 14 zile (opţional 7 zile) de la începerea testului. Substratul se întinde pe o placă de sticlă sau oţel inoxidabil. Râmele se examinează şi se determină numărul de râme supravieţuitoare. Râmele se consideră moarte dacă nu răspund la un stimul mecanic uşor, aplicat în extremitatea anterioară.
      Dacă examinarea are loc la 7 zile, recipientul se reumple cu substrat, iar râmele supravieţuitoare se aşează pe acelaşi substrat de testare.
      1.6.4.   Organisme de testare
      
      Organismele de testare trebuie să fie Eisenia foetida adulte (a se vedea nota din apendice) (în vârstă de cel puţin 2 luni, cu clitellum) cu o greutate umedă de 300-600 mg (pentru metoda de reproducere, a se vedea apendicele).
      2.   DATE
      2.1.   INTERPRETAREA ŞI EVALUAREA REZULTATELOR
      Concentraţiile substanţei de testat se raportează la procentele corespunzătoare de mortalitate a râmelor.
      Dacă datele sunt adecvate, valoarea CL50 şi limitele de încredere (p = 0,05) se determină prin metode standard (Litchfield şi Wilcoxon, 1949, pentru metoda echivalentă). CL50 se exprimă în mg de substanţă de testat pe kg de substrat de testare (greutate uscată).
      În cazurile în care panta curbei de concentraţie este prea mare pentru a permite calculul CL50, este suficientă o estimare grafică a acestei valori.
      Dacă două concentraţii consecutive aflate în raport de 1,8 dau numai 0 % şi 100 % mortalitate, cele două valori sunt suficiente pentru a indica intervalul în care se află CL50.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  declaraţia de conformitate a testului cu criteriile de calitate menţionate mai sus;
               
            
                  —
               
               
                  testul realizat (testul preliminar şi/sau testul definitiv);
               
            
                  —
               
               
                  descrierea exactă a condiţiilor de testare sau a declaraţiei de conformitate a testului cu metoda; trebuie raportată orice abatere;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea exactă a modului în care s-a amestecat substanţa de testat în substratul de bază;
               
            
                  —
               
               
                  informaţii despre organismele testate (specia, vârsta, media şi gama de greutate, condiţii de păstrare şi reproducere, furnizor);
               
            
                  —
               
               
                  metoda folosită pentru determinarea CL50;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele testului, inclusiv toate datele folosite;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea simptomelor observate sau a modificărilor de comportament ale organismelor testate;
               
            
                  —
               
               
                  mortalitatea la loturile martor;
               
            
                  —
               
               
                  CL50 sau cea mai mare concentraţie testată fără mortalitate şi concentraţia minimă testată cu mortalitate de 100 % la 14 zile (şi opţional 7 zile) de la începerea testului;
               
            
                  —
               
               
                  trasarea curbei concentraţie/răspuns;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele obţinute cu substanţa de referinţă, fie în cadrul testului de faţă, fie în cel al unor teste anterioare de control al calităţii.
               
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decision of the Council C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  Edwards, C. A. and Lofty, J. R., 1977, Biology of Earthworms, Chapman and Hall, London, p. 331
               
            
                  3.
               
               
                  Bouche, M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Systématique, Institut National de la Recherche Agronomique, p. 671
               
            
                  4.
               
               
                  Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of evaluation dose effect experiments./. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 1949, p. 99.
               
            
                  5.
               
               
                  Commission of the European Communities, Development of a standardized laboratory method for assessing the toxicity of chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.
               
            
                  6.
               
               
                  Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur Land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, „Verfahrensvorschlag Toxizitätstest am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden”, in: Rudolph/Boje, Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
               
            
         Apendice
         Reproducerea şi păstrarea râmelor înainte de testare
         Pentru reproducerea organismelor, 30-50 de râme adulte sunt puse într-o cutie de reproducere, cu substrat proaspăt, şi scoase după 14 zile. Aceste organisme se pot folosi ulterior pentru alte loturi de reproducere. Râmele scoase din coconi se folosesc pentru testare când ajung la maturitate (în condiţiile cerute, după 2-3 luni).
         Condiţii de păstrare şi reproducere
         
                     Incinta climatizată
                  
                  
                     :
                  
                  
                     temperatura 20 ± 2 oC de preferinţă cu lumină continuă (intensitatea 400-800 de lucşi).
                  
               
                     Cutii de reproducere
                  
                  
                     :
                  
                  
                     recipiente puţin adânci, cu o capacitate de 10-20 l.
                  
               
                     Substrat
                  
                  
                     :
                  
                  
                     
                        Eisenia foetida se poate reproduce în diferite excremente de animale. Se recomandă să se folosească ca mediu de reproducere un amestec de 50 % volum turbă şi 50 % bălegar de vacă sau cal. Mediul trebuie să aibă o valoare a pH-ului de 6-7 (ajustată cu carbonat de calciu) şi o conductivitate ionică scăzută (mai puţin de 6 mmhos sau 0,5 % concentraţie de sare).
                     Substratul trebuie să fie umed, dar nu foarte ud.
                     Se pot folosi alte metode de succes pe lângă metoda prezentată mai sus.
                  
               
            Notă: Unii taxonomişti au împărţit Eisenia foetida în două specii (Bouche, 1972). Acestea sunt morfologic similare, dar una, Eisenia foetida foetida prezintă dungi transversale tipice pe segmente, în timp ce a doua, Eisenia foetida andrei nu are aceste dungi şi are o culoare roşiatică, cu pete. Dacă este posibil, se recomandă folosirea speciei Eisenia foetida andrei. Dacă este disponibilă metodologia necesară, se pot folosi alte specii.
      
      C.9.   BIODEGRADARE
      METODA ZAHN-WELLENS
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Scopul acestei metode este evaluarea potenţialului de biodegradabilitate totală al substanţelor organice nevolatile solubile în apă, atunci când sunt expuse la concentraţii relativ mari de microorganisme într-un test static.
      Pe materiile solide în suspensie poate avea loc adsorbţia fizico-chimică, iar acest aspect trebuie luat în considerare la interpretarea rezultatelor (a se vedea punctul 3.2).
      Substanţele de studiat se folosesc în concentraţii corespunzătoare valorilor COD în intervalul 50-400 mg/l, sau valorilor CCO în intervalul 100-1 000 mg/l (COD = carbon organic dizolvat; CCO = consum chimic de oxigen). Aceste concentraţii relativ mari garantează o bună fiabilitate analitică. Compuşii cu proprietăţi toxice pot întârzia sau inhiba procesul de degradare.
      În această metodă se foloseşte măsurarea concentraţiei de carbon organic dizolvat sau a consumului chimic de oxigen pentru a evalua biodegradabilitatea totală a substanţei de testat.
      Folosirea simultană a unei metode analitice specifice permite evaluarea biodegradabilităţii primare a substanţei (dispariţia structurii chimice iniţiale).
      Metoda este aplicabilă numai acelor substanţe organice testate care la concentraţia folosită în test:
      
                  —
               
               
                  sunt solubile în apă în condiţiile de testare;
               
            
                  —
               
               
                  au o presiune a vaporilor neglijabilă în condiţiile de testare;
               
            
                  —
               
               
                  nu sunt inhibitoare pentru bacterii;
               
            
                  —
               
               
                  sunt adsorbite în sistemul de testare numai în cantităţi limitate;
               
            
                  —
               
               
                  nu se pierd prin spumare din soluţia testată.
               
            Informaţiile despre proporţiile relative ale principalelor componente ale compusului testat se utilizează la interpretarea rezultatelor obţinute, în special în cazurile în care rezultatele indică valori scăzute sau marginale.
      Informaţiile despre acţiunea toxică a substanţei de testat asupra microorganismelor se folosesc pentru interpretarea rezultatelor cu valori scăzute şi pentru selecţia concentraţiilor testate corespunzătoare.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Gradul de degradare atins la sfârşitul testului se raportează ca „Biodegradabilitate în testul Zahn-Wellens”:
      
         
      unde:
      
                  DT
                  
               
               
                  =
               
               
                  gradul de biodegradare exprimat în % la momentul T,
               
            
                  CA
                  
               
               
                  =
               
               
                  valori COD sau (CCO) în amestecul testat, măsurate la trei ore după începerea testului (mg/l) (COD = carbon organic dizolvat, CCO = consum chimic de oxigen),
               
            
                  CT
                  
               
               
                  =
               
               
                  valori COD sau CCO în amestecul testat la momentul prelevării probelor (mg/l),
               
            
                  CB
                  
               
               
                  =
               
               
                  valori COD sau CCO ale probei martor la momentul prelevării probelor (mg/l),
               
            
                  CBA
                  
               
               
                  =
               
               
                  valorile COD sau CCO ale probei martor, măsurate la trei ore de la începerea testului (mg/l).
               
            Gradul de degradare se rotunjeşte la cel mai apropiat procent întreg.
      Procentul de degradare se exprimă ca procent de îndepărtare a COD (sau CCO) din substanţa de testat.
      Diferenţa dintre valoarea măsurată după trei ore şi valoarea iniţială calculată sau, de preferinţă, măsurată poate furniza informaţii utile cu privire la eliminarea substanţei (a se vedea punctul 3.2 – Interpretarea rezultatelor).
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      În anumite cazuri, când se studiază substanţe noi, substanţele de referinţă pot fi utile; cu toate acestea, nu se pot recomanda încă substanţe de referinţă specifice.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Nămolul activ, substanţe nutritive minerale şi substanţa de testat – ca singură sursă de carbon în soluţia apoasă – se introduc împreună într-un recipient din sticlă cu o capacitate de 1-4 l, prevăzut cu un dispozitiv de agitare şi un aerator. Amestecul se agită şi se aerează la 20-25 oC, în condiţii de iluminare difuză sau într-o incintă întunecată, timp de până la 28 de zile. Procesul de degradare se monitorizează prin determinarea valorilor COD (sau CCO) în soluţie filtrată, zilnic sau la alte intervale egale de timp adecvate. Raportul dintre COD (sau CCO) eliminat după fiecare interval şi valoarea constatată la trei ore după începerea testului se exprimă ca procent de biodegradare şi serveşte ca măsură a gradului de degradare în acel moment. Procentele se reprezintă grafic în funcţie de timp, formând curba de biodegradare.
      Atunci când se foloseşte o metodă analitică specifică, se pot măsura schimbările în concentraţia moleculei primare datorate biodegradării (biodegradabilitate primară).
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Reproductibilitatea acestui test s-a dovedit a fi satisfăcătoare în cadrul unui test de comparaţie interlaboratoare.
      Sensibilitatea metodei este determinată în mare măsură de variabilitatea probei martor şi într-o mai mică măsură de precizia determinării carbonului organic dizolvat şi nivelul compusului de testat în soluţie.
      1.6.   DESCRIEREA MODULUI DE OPERARE
      1.6.1.   Pregătire
      
      1.6.1.1.   Reactivi
      
      Apa de testare: apă potabilă cu conţinut de carbon organic < 5 mg/l. Concentraţia de ioni de magneziu şi calciu, luate împreună, nu trebuie să depăşească 2,7 mmol/l, altfel este necesară o diluare adecvată cu apă deionizată sau distilată.
      
                  Acid sulfuric, puritate analitică (p.a.)
               
               
                  50 g/l
               
            
                  Soluţie de hidroxid de sodiu p.a.
               
               
                  40 g/l
               
            
                  Soluţie nutritivă minerală: dizolvare într-un litru de apă deionizată:
               
               
                   
               
            
                  Clorură de amoniu, NH4Cl, p.a.
               
               
                  38,5 g
               
            
                  Dihidrogenofosfat de sodiu, NaH2PO4.2H2O p.a.:
               
               
                  33,4 g
               
            
                  Dihidrogenofosfat de potasiu, KH2PO4 p.a.:
               
               
                  8,5 g
               
            
                  Dipotasiu mono-hidrogen fosfat K2HPO4, p.a.:
               
               
                  21,75 g
               
            Amestecul serveşte atât ca substanţă nutritivă, cât şi ca soluţie tampon.
      1.6.1.2.   Aparatură
      
      Recipiente din sticlă cu o capacitate de 1-4 l (de exemplu, recipiente cilindrice).
      Dispozitiv de agitare cu agitator din sticlă sau metal, pe un ax adecvat (agitatorul trebuie să se rotească la aproximativ 5-10 cm deasupra bazei recipientului). Se poate folosi, alternativ, un agitator magnetic cu tijă lungă de 7-10 cm.
      Tub de sticlă cu diametrul interior de 2-4 mm, folosit pentru a introduce aer. Deschiderea tubului trebuie să fie de aproximativ 1 cm înălţime de la baza recipientului.
      Centrifugă (aproximativ 3 550 g).
      Ph-metru.
      Aparat pentru măsurarea oxigenului dizolvat.
      Filtre de hârtie.
      Aparat de filtrare cu membrană.
      Membrane de filtrare, cu dimensiunea porilor de 0,45 μm. Membranele de filtrare sunt adecvate dacă nu elimină carbon şi nu adsorb substanţa în faza de filtrare.
      Echipament analitic pentru determinarea conţinutului de carbon organic şi a consumului chimic de oxigen.
      1.6.1.3.   Pregătirea inoculului
      
      Nămolul activ, provenit dintr-o staţie de epurare biologică, se spală prin centrifugare (repetată) sau decantare în apa de testare (a se vedea mai sus).
      Nămolul activ trebuie să fie în stare corespunzătoare. Acest nămol se poate preleva de la o staţie de epurare a apei uzate aflată în bună stare de funcţionare. Pentru a obţine cât mai multe specii sau suşe bacteriene diferite, este preferabilă amestecarea de inocul provenit din diferite surse (de exemplu, diferite staţii de epurare, extracte de sol, apă de râu etc.). Amestecul trebuie tratat conform descrierii de mai sus.
      Pentru verificarea activităţii nămolului activ, a se vedea „Controlul funcţional” de mai jos.
      1.6.1.4.   Pregătirea soluţiilor de testare
      
      În recipientul de testare se adaugă: 500 ml apă de testare, 2,5 ml/l soluţie nutritivă minerală, nămol activ într-o cantitate care să corespundă cu 0,2-1,0 g/l substanţă uscată în amestecul final. Se adaugă suficientă soluţie mamă de substanţă de testat, astfel încât să se obţină în amestecul final o concentraţie COD de 50-400 mg/l. Valorile CCO corespunzătoare sunt de 100-1 000 mg/l. Se adaugă apă până la un volum total de 1-4 l. Alegerea volumului total depinde de numărul de probe ce trebuie prelevate pentru determinările COD sau CCO şi de volumele necesare pentru metoda analitică.
      În mod normal, un volum de 2 litri poate fi considerat satisfăcător. Pentru fiecare serie de teste se prepară în paralel cel puţin un recipient cu probă martor; acesta conţine numai nămol activ şi soluţie nutritivă minerală completată cu apă la acelaşi volum total ca în recipientele de testare.
      1.6.2.   Mod de operare
      
      Recipientele de testare se agită cu agitatoare magnetice sau cu elice, în condiţii de iluminare difuză, sau într-o incintă întunecată, la 20-25 oC. Aerarea se face cu aer comprimat, filtrat printr-un tampon de vată şi, dacă este necesar, printr-un balon de spălare. Nămolul nu trebuie să se decanteze, iar concentraţia de oxigen nu trebuie să scadă sub 2 mg/l.
      Valoarea pH-ului se verifică periodic (de exemplu, zilnic) şi, dacă este necesar, se ajustează la pH 7-8.
      Pierderile prin evaporare se completează chiar înaintea fiecărei prelevări de probe, cu apă deionizată sau distilată în cantităţile necesare. O bună metodă este marcarea nivelului lichidului din recipientul de testare înainte de începerea testului. Noi marcaje se fac după fiecare prelevare de probe (fără aerare şi amestecare). Primele probe se prelevează întotdeauna după trei ore de la începerea testului, pentru a se decela adsorbţia substanţei de testat pe nămolul activ.
      Eliminarea substanţei de testat este urmată de determinări COD sau CCO făcute zilnic sau la alte intervale egale. Probele din recipientul de testare şi proba martor sunt filtrate printr-o hârtie de filtru spălată atent. Primii 5 ml de soluţie filtrată se îndepărtează. Nămolurile greu de filtrat se pot înlătura anterior prin centrifugare timp de 10 minute. Determinările COD şi CCO se fac cel puţin în duplicat. Testul durează 28 de zile.
      
         Notă: Probele care rămân tulburi se filtrează prin filtrele cu membrană. Acestea nu trebuie să elimine sau să adsoarbă nicio substanţă organică.
      
         Controlul funcţional al nămolului activ
      
      Pentru fiecare serie de teste, trebuie studiat în paralel un recipient ce conţine o substanţă cunoscută, astfel încât să se poată verifica capacitatea funcţională a nămolului activ. S-a observat că dietilenglicolul este util în acest scop.
      
         Adaptare
      
      Dacă analizele se efectuează la intervale relativ scurte (de exemplu, zilnic) adaptarea poate fi recunoscută în mod evident din curba de degradare (a se vedea figura 2). Din această cauză, testul nu trebuie să înceapă imediat înainte de sfârşitul săptămânii.
      Dacă adaptarea are loc la sfârşitul perioadei, testul poate fi prelungit până când degradarea s-a încheiat.
      
         Notă: Dacă sunt necesare cunoştinţe mai ample despre comportamentul nămolului activ, acelaşi nămol activ se tratează din nou cu aceeaşi substanţă de testat în conformitate cu metoda de mai jos:
      Se opreşte dispozitivul de agitare şi aeratorul şi se lasă nămolul activ să decanteze. Se elimină supernatantul, se umple cu până la 2 litri cu apă, se agită 15 minute şi se lasă să decanteze din nou. După ce se elimină din nou supenatantul, cu nămolul rămas se repetă testul cu acelaşi compus în conformitate cu punctele 1.6.1.4 şi 1.6.2 de mai sus. Nămolul activ poate fi izolat şi prin centrifugare în loc de decantare.
      Nămolul adaptat poate fi amestecat cu nămol proaspăt într-o concentraţie de 0,2-1 g substanţă uscată pe litru.
      
         Mijloace analitice
      
      În mod normal, probele se filtrează printr-o hârtie de filtru spălată atent (pentru spălare se foloseşte apă deionizată).
      Probele care rămân tulburi se filtrează prin filtre cu membrană (0,45 μm).
      Concentraţia COD se determină pe probe duplicate din eşantioanele filtrate (primii 5 ml sunt înlăturaţi) cu ajutorul analizorului TOC (total organic carbon). Dacă filtratul nu poate fi analizat în aceeaşi zi, acesta trebuie păstrat în frigider până în ziua următoare. Nu se recomandă o depozitare mai îndelungată.
      Concentraţia CCO se determină în proba filtrată prin metoda analitică CCO iniţiată de procedura descrisă în referinţa bibliografică 2 de mai jos.
      2.   DATE ŞI EVALUARE
      Concentraţiile COD şi/sau CCO se determină cel puţin de două ori pe probe conform punctului 1.6.2 de mai sus. Degradarea la momentul T se calculează conform formulei (cu definiţii) date la punctul 1.2 de mai sus.
      Gradul de degradare se rotunjeşte la procentul întreg cel mai apropiat. Gradul de degradare atins la sfârşitul testului constituie „biodegradabilitatea Zahn Wellens”.
      
         Notă: Dacă are loc o degradare completă înainte de expirarea duratei testului, iar acest rezultat este confirmat de o a doua analiză efectuată în ziua următoare, testul poate fi încheiat.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  concentraţia iniţială a substanţei;
               
            
                  —
               
               
                  toate celelalte informaţii şi rezultatele experimentale privind substanţa de testat, substanţa de referinţă, după caz, şi proba martor;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia după trei ore;
               
            
                  —
               
               
                  curba de biodegradare cu descriere;
               
            
                  —
               
               
                  data şi locul de unde s-a prelevat nămolul activ, stadiul de adaptare, concentraţia folosită etc.;
               
            
                  —
               
               
                  argumentele ştiinţifice pentru orice modificare a metodei de testare.
               
            3.2.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Eliminarea COD (CCO) care are loc treptat după zile sau săptămâni indică faptul că substanţa de testat se biodegradează.
      Cu toate acestea, adsorbţia fizico-chimică poate să joace un rol în unele cazuri şi acest lucru este indicat de existenţa unei eliminări complete sau parţiale de la început, în primele trei ore, iar diferenţa dintre martor şi supernatantul de testare rămâne la un nivel neaşteptat de scăzut.
      Dacă trebuie să se facă o distincţie între biodegradare (sau biodegradare parţială) şi adsorbţie, sunt necesare teste suplimentare.
      În acest scop există mai multe metode, însă cea mai convingătoare este utilizarea supernatantului sau a nămolului ca agent de inoculare într-un test din setul de bază (de preferinţă un test respirometric).
      Substanţele de testat care duc la o eliminare avansată neadsorbtivă a COD (CCO) în acest test trebuie considerate ca potenţial biodegradabile. Eliminarea parţială, neadsorbtivă, arată că substanţa chimică este cel puţin biodegradabilă într-o anumită măsură. Eliminările reduse sau nule ale COD (CCO) se pot datora inhibării microorganismelor de către substanţa de testat, acest lucru fiind indicat de liză şi pierderea de nămol din care rezultă supernatanţi tulburi. Testul se repetă cu o concentraţie mai scăzută de substanţă de testat.
      Folosirea unei metode analitice specifice pentru compusul de testat sau a unei substanţe de testat marcate cu 14C permite o sensibilitate mai mare. În cazul compusului marcat cu 14C, recuperarea 14CO2 confirmă că biodegradarea a avut loc.
      Dacă rezultatele sunt exprimate în termeni de biodegradare primară, trebuie să se furnizeze, în măsura în care este posibil, o explicaţie cu privire la modificarea structurii chimice care duce la diminuarea răspunsului substanţei iniţiale.
      Validarea metodei analitice trebuie însoţită de rezultatul obţinut de la proba martor.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Decision of the Council (81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  Anexa V C.6. Degradarea – Consumul chimic de oxigen. Directiva 92/69/CEE a Comisiei, Jurnalul Oficial al Comunităţilor Europene L 383, 29.12.1992, p. 1.
               
            
         Apendice
         EXEMPLU DE EVALUARE
         
                     Compus organic:
                  
                  
                     4-acid etoxibenzoic
                  
               
                     Concentraţia teoretică:
                  
                  
                     600 mg/l
                  
               
                     COD teoretic:
                  
                  
                     390 mg/l
                  
               
                     Inocul
                  
                  
                     instalaţia de epurare a apei uzate …
                  
               
                     Concentraţie:
                  
                  
                     1 g material uscată/l
                  
               
                     Adaptare:
                  
                  
                     neadaptat
                  
               
                     Analiza:
                  
                  
                     determinarea DOC
                  
               
                     Cantitatea de probă:
                  
                  
                     3 ml
                  
               
                     Substanţa martor:
                  
                  
                     dietilenglicol
                  
               
                     Toxicitatea compusului:
                  
                  
                     niciun efect toxic sub 1 000 mg/l
                     Metoda utilizată: test cu tuburi de fermentaţie
                  
               
            
         
                     Durata testului
                  
                  
                     Substanţa martor
                  
                  
                     Substanţa de testat
                  
               
                     Proba martor
                     DOC (16)
                     
                     mg/l
                  
                  
                     DOC (16)
                     
                     mg/l
                  
                  
                     DOC net
                     mg/l
                  
                  
                     Degradare
                     %
                  
                  
                     DOC (16)
                     
                     mg/l
                  
                  
                     DOC net
                     mg/l
                  
                  
                     Degradare
                     %
                  
               
                     0
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     300,0
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     390,0
                  
                  
                     —
                  
               
                     3 ore
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                     298,0
                  
                  
                     294,0
                  
                  
                     2,0
                  
                  
                     371,6
                  
                  
                     367,6
                  
                  
                     6
                  
               
                     1 zi
                  
                  
                     6,1
                  
                  
                     288,3
                  
                  
                     282,2
                  
                  
                     6
                  
                  
                     373,3
                  
                  
                     367,2
                  
                  
                     6
                  
               
                     2 zile
                  
                  
                     5,0
                  
                  
                     281,2
                  
                  
                     276,2
                  
                  
                     8
                  
                  
                     360,0
                  
                  
                     355,0
                  
                  
                     9
                  
               
                     5 zile
                  
                  
                     6,3
                  
                  
                     270,5
                  
                  
                     264,2
                  
                  
                     12
                  
                  
                     193,8
                  
                  
                     187,5
                  
                  
                     52
                  
               
                     6 zile
                  
                  
                     7,4
                  
                  
                     253,3
                  
                  
                     245,9
                  
                  
                     18
                  
                  
                     143,9
                  
                  
                     136,5
                  
                  
                     65
                  
               
                     7 zile
                  
                  
                     11,3
                  
                  
                     212,5
                  
                  
                     201,2
                  
                  
                     33
                  
                  
                     104,5
                  
                  
                     93,2
                  
                  
                     76
                  
               
                     8 zile
                  
                  
                     7,8
                  
                  
                     142,5
                  
                  
                     134,7
                  
                  
                     55
                  
                  
                     58,9
                  
                  
                     51,1
                  
                  
                     87
                  
               
                     9 zile
                  
                  
                     7,0
                  
                  
                     35,0
                  
                  
                     28,0
                  
                  
                     91
                  
                  
                     18,1
                  
                  
                     11,1
                  
                  
                     97
                  
               
                     10 zile
                  
                  
                     18,0
                  
                  
                     37,0
                  
                  
                     19,0
                  
                  
                     94
                  
                  
                     20,0
                  
                  
                     2,0
                  
                  
                     99
                  
               Figura 1
         Exemple de curbe de biodegradabilitate
         
            
         Figura 2
         Exemple de adaptare a nămolului
         
            
      
      C.10.   BIODEGRADARE
      TESTE DE SIMULARE CU NĂMOL ACTIV
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      1.1.1.   Observaţii generale
      
      Această metodă se aplică numai pentru acele substanţe organice care, la concentraţia folosită la testare:
      
                  —
               
               
                  sunt solubile în apă la nivelul necesar pentru pregătirea soluţiilor testate;
               
            
                  —
               
               
                  au presiunea vaporilor neglijabilă în condiţiile de testare;
               
            
                  —
               
               
                  nu sunt inhibitoare pentru bacterii.
               
            Informaţiile cu privire la proporţiile relative ale principalelor componente ale compusului de testat se utilizează la interpretarea rezultatelor obţinute, în special în cazurile în care rezultatele indică valori scăzute sau marginale.
      Informaţiile cu privire la toxicitatea substanţei asupra microorganismelor se folosesc pentru interpretarea rezultatelor cu valori scăzute şi pentru alegerea unor concentraţii adecvate de testare.
      1.1.2.   Determinarea biodegradabilităţii totale (analiza COD/CCO)
      
      Scopul metodei este de a determina biodegradabilitatea totală prin măsurarea eliminării substanţei şi a tuturor metaboliţilor dintr-un model de instalaţie de tratare a nămolului activ pornind de la o concentraţie iniţială corespunzătoare a > 12 mg COD/l (sau aproximativ 40 mg CCO/l); 20 mg COD/l se pare că este concentraţia optimă. (COD = carbon organic dizolvat; CCO = consum chimic de oxigen).
      Trebuie stabilit conţinutul de carbon organic (sau consumul chimic de oxigen) al substanţei de testat.
      1.1.3.   Determinarea biodegradabilităţii primare (analize specifice)
      
      Scopul metodei este determinarea biodegradabilităţii primare a unei substanţe într-un model de instalaţie de tratare a nămolului activ în concentraţie de aproximativ 20 mg/l, printr-o metodă analitică specifică (se pot folosi concentraţii mai mari sau mai mici dacă metoda analitică şi limitele de toxicitate permit acest lucru). Acest lucru permite evaluarea biodegradabilităţii primare a substanţei (dispariţia structurii chimice iniţiale).
      Scopul acestei metode nu este determinarea mineralizării substanţei de testat.
      Trebuie să fie disponibilă o metodă analitică corespunzătoare pentru determinarea substanţei de testat.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      1.2.1.   Analiza COD/CCO
      
      Gradul de eliminare al substanţei este dat de:
      
                  
                     
               
               
                  [1(a)]
               
            unde:
      
                  DR
               
               
                  =
               
               
                  gradul de eliminare în procente de COD (sau CCO) în cadrul timpului mediu de retenţie dat, faţă de substanţa de testat.
               
            
                  T
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia substanţei de testat în influentul instalaţiei, în mg COD/l sau (mg CCO/l)
               
            
                  E
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia COD (sau CCO) în efluentul instalaţiei de testare, în mg COD/l sau (mg CCO/l)
               
            
                  E0
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia COD (sau CCO) în efluentul instalaţiei martor, în mg COD/l sau (mg CCO/l)
               
            Degradarea se exprimă ca procent de eliminare COD (sau CCO) în timpul de retenţie dat, faţă de substanţa de testat.
      1.2.2.   Analiza specifică
      
      Procentul de eliminare a substanţei de testat din faza apoasă (RW) în timpul mediu de retenţie dat se calculează cu ajutorul formulei:
      
                  
                     
               
               
                  [1(b)]
               
            unde:
      
                  C1
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia substanţei în influentul instalaţiei de testare (mg de substanţă/l determinată prin analize specifice)
               
            
                  C0
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia substanţei în efluentul instalaţiei de testare (mg de substanţă/l determinată prin analize specifice)
               
            1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      În anumite cazuri, când se studiază o substanţă nouă, substanţele de referinţă pot fi utile; cu toate acestea, nu se pot recomanda încă substanţe de referinţă specifice.
      1.4.   PRINCIPIUL METODELOR DE TESTARE
      Pentru determinarea biodegradabilităţii totale se folosesc în paralel două instalaţii pilot de tratare a nămolului activ (testul de confirmare OCDE sau instalaţii de tip vas poros). Substanţa de testat se adaugă în influentul (apă uzată sintetică sau menajeră) uneia dintre instalaţii, în timp ce cealaltă este alimentată numai cu apă uzată. Pentru determinarea biodegradabilităţii primare prin analize specifice ale influentului şi efluentului, se foloseşte numai o instalaţie de testare.
      Se măsoară concentraţiile COD (sau CCO) în efluenţi sau se determină concentraţiile substanţei prin analize specifice.
      COD datorat substanţei de testat nu se măsoară, ci doar se menţionează.
      În cazul în care se fac măsurători COD (sau CCO), se presupune că diferenţa dintre concentraţiile medii ale efluenţilor testaţi şi ale efluenţilor martor se datorează substanţei de testat nedegradate.
      În cazul în care se fac analize specifice, se poate măsura modificarea concentraţiei moleculei de bază (biodegradare primară).
      Aceste instalaţii pot funcţiona în „regim cu instalaţii cuplate”, printr-o metodă de transinoculare.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Concentraţia iniţială a substanţei depinde de tipul şi de limitele analizelor efectuate.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Pregătire
      
      1.6.1.1.   Aparatură
      
      Sunt necesare două instalaţii de acelaşi tip, excepţie făcând cazurile în care se efectuează analize specifice. Se pot folosi două tipuri de dispozitive:
      Testul de confirmare OCDE
      Echipamentul (apendicele 1) constă dintr-un vas de alimentare (A) pentru apa uzată sintetică, pompă dozatoare (B), vas de aerare (C), vas de decantare (D), pompă cu aer comprimat (E) pentru recircularea nămolului activ şi vas colector (F) pentru efluentul tratat.
      Vasele (A) şi (F) trebuie să fie din sticlă sau din material plastic adecvat, cu un volum util de cel puţin 24 litri. Pompa (B) trebuie să asigure un debit constant de ape uzate sintetice în vasul de aerare; se poate folosi orice sistem corespunzător, cu condiţia ca debitul de intrare şi concentraţia să fie asigurate. În timpul funcţionării normale, nivelul vasului de decantare (D) este fixat astfel încât volumul din vasul de aerare să fie de 3 litri de soluţie amestecată. Un sistem de aerare din material sinterizat (G) este suspendat în vasul (C) la vârful conului. Cantitatea de aer suflată prin aerator poate fi monitorizată cu ajutorul unui debitmetru.
      Pompa cu aer comprimat (E) se reglează astfel încât nămolul activ din vasul de decantare să fie recirculat continuu şi cu regularitate în vasul de aerare (C).
      „Vas poros”
      Vasul poros este construit din folii de polietilenă poroase (2 mm grosime, dimensiunea maximă a porilor 95 μm) sub formă de cilindri cu diametru de 14 cm cu bază conică la 45o (figurile 1 şi 2 din apendicele 2). Vasul poros se aşează într-un recipient impermeabil din material plastic, cu diametrul de 15 cm cu un orificiu la înălţimea de 17,2 cm pe partea cilindrică, care determină capacitatea vasului (3 litri). În partea de sus a vasului poros se găseşte un inel de sprijin rigid, realizat din material plastic, care lasă un spaţiu pentru efluent de 0,5 cm între vasul interior şi cel exterior.
      Vasele poroase pot fi montate la baza unei băi de apă cu control termostatic. La baza vasului poros există un flux de aer pe care se plasează difuzorii corespunzători.
      Recipientele (A) şi (E) trebuie să fie din sticlă sau material plastic adecvat şi să aibă un volum util de cel puţin 24 litri. Pompa (B) trebuie să asigure un debit constant al apei uzate sintetice în vasul de aerare; se poate folosi orice sistem convenabil, cu condiţia asigurării debitului de alimentare şi a concentraţiei.
      Sunt necesare vase poroase de rezervă, pentru a le înlocui pe cele care se blochează în timpul funcţionării; vasele blocate se curăţă prin imersare timp de 24 ore în soluţie de hipoclorit, apoi se spală cu apă de la robinet.
      1.6.1.2.   Filtrarea
      
      Aparatul de filtrare cu membrană şi membrane de filtrare cu dimensiunea porilor de 0,45 μm. Membranele de filtrare se pot folosi dacă este sigur că ele nu evacuează carbon şi nici nu adsorb substanţa în faza de filtrare.
      1.6.1.3.   Apa uzată
      
      Se poate folosi fie un efluent sintetic, fie apă uzată menajeră.
      Exemplu de efluent sintetic
      Dizolvaţi pentru fiecare litru de apă de la robinet:
      
                  Peptonă:
               
               
                  160 mg,
               
            
                  Extract de carne:
               
               
                  110 mg,
               
            
                  Uree:
               
               
                  30 mg,
               
            
                  NaCl:
               
               
                  7 mg,
               
            
                  CaCl2·2H2O:
               
               
                  4 mg,
               
            
                  MgSO4·7H2O:
               
               
                  2 mg,
               
            
                  K2HPO4:
               
               
                  28 mg.
               
            Apă uzată menajeră
      Aceasta se colectează proaspătă în fiecare zi, de la preaplinul vasului de decantare primară al instalaţiei de tratare a apei uzate menajere.
      1.6.1.4.   Soluţia mamă a substanţei de testat
      
      Se prepară o soluţie a substanţei de testat, de exemplu 1 %, care se adaugă în instalaţia de testare. Se determină concentraţia substanţei, astfel încât să se calculeze volumul corect care urmează să se adauge în apa uzată sau direct în instalaţie printr-o a doua pompă, astfel încât să se obţină concentraţia de testare necesară.
      1.6.1.5.   Inoculul
      
      
         Observaţie: Dacă se foloseşte apă uzată menajeră, nu are niciun sens să se folosească un inocul cu concentraţie bacteriană scăzută, dar se poate folosi nămol activ.
      Se pot folosi mai multe tipuri de inocul.
      Se dau trei exemple de inocul adecvat:
      
                  (a)
               
               
                  Inocul pe bază de efluent secundar
                  Inoculul trebuie obţinut dintr-un efluent secundar de bună calitate prelevat de la o instalaţie de tratare alimentată preponderent cu apă uzată menajeră. Efluentul trebuie menţinut în condiţii aerobe în perioada dintre prelevarea probei şi folosirea ei. Pentru prepararea inoculului, proba se filtrează printr-un filtru cu porozitate mare, primii 200 ml eliminându-se. Filtratul se păstrează în condiţii aerobe până la utilizare. Inoculul trebuie folosit în ziua prelevării. Pentru inoculare se folosesc cel puţin 3 ml.
               
            
                  (b)
               
               
                  Inocul compus
                  Inocul provenit de la efluentul secundar:
                  A se vedea descrierea de mai sus.
                  Inocul pe bază de pământ:
                  Se pun în suspensie 100 g de sol de grădină (fertil, nu steril) în 1 000 ml apă potabilă fără clor. (Solurile cu o cantitate extrem de mare de argilă, nisip sau humus nu sunt adecvate). După agitare, suspensia se lasă să se decanteze timp de 30 minute. Supernatantul se filtrează printr-o hârtie de filtru cu porozitate mare, primii 200 ml eliminându-se. Filtratul se păstrează în condiţii aerobe până la utilizare. Inoculul trebuie folosit în ziua prelevării.
                  Inocul pe bază de apă de suprafaţă:
                  Se prelevează un inocul dintr-o apă de suprafaţă mezosaprobă. Proba se filtrează printr-o hârtie de filtru cu porozitate mare, primii 200 ml eliminându-se. Filtratul se păstrează în condiţii aerobe până la utilizare. Inoculul trebuie folosit în ziua prelevării.
                  Se amestecă cu grijă volume egale din cele tipuri de eşantioane de inoculi definiţi anterior, astfel încât din acest amestec să se obţină inoculul final. Pentru inoculare, se folosesc cel puţin 3 ml.
               
            
                  (c)
               
               
                  Inocul pe bază de nămol activ
                  Ca inocul se poate folosi un volum (nu mai mare de 3 l) de nămol activ (conţinutul de materii solide în suspensie este de până la 2,5 g/l) prelevat din vasul de aerare al unei instalaţii în care se tratează cu preponderenţă apă uzată menajeră.
               
            1.6.2.   Mod de operare
      
      Testul se realizează la temperatura incintei; aceasta trebuie menţinută între 18 şi 25 oC.
      Dacă este necesar, testul se poate realiza la o temperatură mai joasă (până la 10 oC); dacă substanţa este degradată, nu mai este necesară nicio altă acţiune. Cu toate acestea, dacă substanţa nu este degradată, testul trebuie efectuat la o temperatură constantă de 18-25 oC.
      1.6.2.1.   Perioada de pornire: formarea nămolului/stabilizarea instalaţiilor
      
      Perioada de formare a nămolului/stabilizare este perioada în care concentraţia de materii solide în suspensie din nămolul activ şi performanţele instalaţiilor cresc până se atinge un regim constant în condiţiile de funcţionare dorite.
      Perioada de pornire este perioada care durează din momentul în care se adaugă prima dată substanţa de testat până în momentul în care curba valorilor de îndepărtare a acesteia se stabilizează (se ajunge la o valoare relativ constantă). Această perioadă nu trebuie să depăşească şase săptămâni.
      Perioada de evaluare este o perioadă de trei săptămâni, care începe în momentul în care îndepărtarea substanţei de testat ajunge la o valoare relativ constantă şi, de regulă, mare. Pentru substanţele care prezintă o degradare redusă sau nicio degradare în primele şase săptămâni, perioada de evaluare este considerată ca fiind următoarele trei săptămâni.
      La început, instalaţiile se alimentează cu cantitatea de inocul amestecat cu influent necesar pentru un singur test.
      Dispozitivul de aerare [şi pompa cu aer comprimat (E), în cazul instalaţiilor pentru testul de confirmare OCDE] şi pompa dozatoare (B) sunt puse apoi în funcţiune.
      Influentul fără substanţa de testat trebuie să treacă prin vasul de aerare (C) fie cu viteza de 1 l/h, fie cu viteza de ½ l/h; acest lucru dă un timp de retenţie mediu de trei sau şase ore.
      Viteza de aerare trebuie reglată astfel încât conţinutul vasului de aerare (C) să fie menţinut constant în suspensie, în timp ce conţinutul de oxigen dizolvat să fie de cel puţin 2 mg/l.
      Trebuie evitată spumarea cu mijloace adecvate. Nu trebuie folosiţi agenţi antispumare care inhibă nămolul activ.
      Nămolul care s-a acumulat în partea de sus a vasului de aerare (C) [iar în cazul instalaţiilor pentru testul de confirmare OCDE, la baza vasului de decantare (D) şi în circuit] trebuie să fie recirculat în soluţia amestecată cel puţin o dată pe zi, prin periere sau alte mijloace convenabile.
      Dacă nămolul nu se decantează, densitatea acestuia se poate creşte în mod repetat, de câte ori este nevoie, prin adăugarea a 2 ml de soluţie de 5 % clorură ferică.
      Efluentul se colectează în vasul (E) sau (F) timp de 20-24 ore şi se prelevează o probă după amestecare. Vasul (E) sau (F) trebuie să fie curăţat cu grijă.
      Pentru a se monitoriza şi controla eficienţa procesului, consumul chimic de oxigen (CCO) sau carbonul organic dizolvat (COD) din filtratul de efluent acumulat, precum şi cel din filtratul de influent se măsoară cel puţin de 2 ori pe săptămână [folosind o membrană cu dimensiunea porilor de 0,45 μm, primii (aproximativ) 20 ml eliminându-se].
      Scăderea CCO sau COD se stabilizează atunci când se obţine o degradare zilnică aproape uniformă.
      Conţinutul de substanţă uscată al nămolului activ din vasul de aerare trebuie determinat de două ori pe săptămână (în g/l). Instalaţiile pot funcţiona în unul dintre următoarele două moduri: fie conţinutul de substanţă uscată din nămolul activ trebuie determinat de două ori pe săptămână, iar dacă este mai mare de 2,5 g/l, nămolul activ în exces trebuie eliminat; fie 500 ml de soluţie amestecată se elimină zilnic din fiecare vas pentru a da un timp mediu de retenţie a nămolului de 6 zile.
      Când parametrii măsuraţi şi estimaţi [eficienţa procesului (în înlăturarea CCO sau COD), concentraţia de nămol, capacitatea de sedimentare a nămolului, turbiditatea efluenţilor etc.] ai celor două instalaţii sunt suficient de stabili, substanţa de testat se poate introduce în influentul uneia dintre instalaţii în conformitate cu punctul 1.6.2.2.
      Alternativ, substanţa de testat se poate adăuga la începutul perioadei de formare a nămolului (1.6.2.1), în special atunci când nămolul se adaugă ca inocul.
      1.6.2.2.   Mod de operare
      
      Se menţin condiţiile de funcţionare din perioada de pornire şi se adaugă suficientă soluţie mamă (aproximativ 1 %) de substanţă de testat în influentul instalaţiei de testare, astfel încât să se obţină concentraţia dorită de substanţă de testat (aproximativ 10-20 mg COD/l sau 40 mg CCO/l) în apa uzată. Aceasta se poate obţine prin amestecarea soluţiei mamă cu apă uzată zilnic sau cu ajutorul unui sistem de pompare separat. Această concentraţie poate fi atinsă progresiv. Dacă nu există efecte toxice ale substanţei de testat asupra nămolului activ, se pot testa concentraţii mai mari.
      Instalaţia martor se alimentează cu influent fără adaos de substanţe. Se iau pentru analiză volume adecvate de efluenţi şi se filtrează prin filtrele cu membrană (0,45 μm), iar primii 20 ml (aproximativ) de filtrat se elimină.
      Probele filtrate trebuie analizate în aceeaşi zi, altfel acestea trebuie conservate prin orice metodă convenabilă, folosindu-se, de exemplu, 0,05 ml soluţie de clorură de mercur 1 % (HgCl2) la fiecare 10 ml de filtrat sau prin depozitarea lor la 2-4 oC timp de 24 ore sau sub –18 oC pe perioade mai îndelungate.
      Perioada de pornire, cu adăugarea substanţei de testat, nu trebuie să depăşească şase săptămâni, iar perioada de evaluare nu trebuie să fie mai scurtă de trei săptămâni, pentru calcularea rezultatului final fiind recomandabil să fie disponibile aproximativ 14-20 de determinări.
      Regimul cu instalaţii cuplate
      Cuplarea instalaţiilor se realizează prin schimbul reciproc de 1,5 l de soluţie amestecată (inclusiv nămol) din vasele de aerare a nămolului activ între cele două instalaţii, o dată pe zi. În cazul substanţelor de testat puternic absorbante, se scot 1,5 l numai de supernatant din vasele de decantare şi se toarnă în vasul cu nămol activ al celeilalte instalaţii.
      1.6.2.3.   Analiza
      
      Se efectuează 2 tipuri de analize pentru a urmări comportamentul substanţei:
      COD şi CCO
      Se determină concentraţiile CCO de două ori cu analizorul de carbon şi/sau valorile CCO, conform referinţei 2.
      Analiza specifică
      Concentraţiile substanţei de testat se determină printr-o metodă analitică corespunzătoare. Dacă este posibil, se determină substanţa absorbită de nămol.
      2.   DATE ŞI EVALUARE
      2.1.   CUPLAREA INSTALAŢIILOR
      Când se foloseşte „regimul cu instalaţii cuplate”, gradele zilnice de eliminare (DR) se calculează în conformitate cu punctul 1.2.1.
      Aceste grade zilnice de eliminare DR se corectează la DRc pentru transferul de soluţie datorită metodei de transinoculare cu ecuaţia [2] pentru un timp de retenţie mediu de trei ore şi cu ecuaţia [3] pentru un timp de retenţie mediu de şase ore.
      
                  
                     
               
               
                  [2]
               
            
                  
                     
               
               
                  [3]
               
            Se calculează media seriilor valorilor DRc şi, de asemenea, deviaţia standard conform ecuaţiei [4]
      
                  
                     
               
               
                  [4]
               
            unde:
      
                  SDRc
                  
               
               
                  =
               
               
                  deviaţia standard a seriilor valorilor DRc
                  
               
            
                  
                     c
               
                  =
               
               
                  media valorilor DRc
                  
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  numărul de determinări
               
            Valorile excepţionale ale seriilor DRc se elimină prin metode statistice adecvate, de exemplu Nalimov (6), la nivelul de probabilitate de 95 %, şi se recalculează media şi deviaţia standard a setului de date DRc fără valorile excepţionale.
      Rezultatul final se calculează apoi cu ecuaţia [5] ca:
      
                  
                     
               
               
                  [5]
               
            unde:
      
                  tn – 1;α
               
               
                  =
               
               
                  valoarea din tabel a lui t pentru n perechi de valori E şi Eo şi încrederea statistică P (P = 1 – α), unde P reprezintă 95 % (1).
               
            Rezultatul este exprimat ca medie cu limite de toleranţă la nivelul de probabilitate de 95 %, cu deviaţia standard respectivă şi numărul de date din setul DRC fără valori excepţionale, precum şi numărul de valori excepţionale, de exemplu:
      
                  DRc
                  
               
               
                  =
               
               
                  98,6±2,3 % eliminare COD
               
            
                  s
               
               
                  =
               
               
                  4,65 % eliminare COD
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  18
               
            
                  x
               
               
                  =
               
               
                  numărul de valori excepţionale.
               
            2.2.   REGIMUL CU INSTALAŢII NECUPLATE
      Performanţa instalaţiilor se poate verifica după cum urmează:
      
         
      Aceste eliminări zilnice se pot reprezenta grafic pentru a reliefa orice tendinţă, de exemplu la aclimatizare.
      2.2.1.   Folosirea determinărilor CCO/COD
      
      Gradul zilnic de eliminare a DR se calculează conform punctului 1.2.1.
      Se calculează media seriei de valori DR; în plus, se calculează deviaţia standard conform:
      
                  
                     
               
               
                  [6]
               
            unde:
      
                  SDR
                  
               
               
                  =
               
               
                  deviaţia standard a seriilor de valori DRi
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  media valorilor DRi
                  
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  număr de determinări
               
            Valorile excepţionale din seriile DR se elimină conform metodei statistice corespunzătoare, de exemplu Nalimov (6), la nivelul de probabilitate de 95 %, şi se recalculează media şi deviaţia standard a setului de date DRc fără valorile excepţionale.
      Rezultatul final este calculat apoi cu ecuaţia [7] ca:
      
                  
                     
               
               
                  [7]
               
            unde:
      
                  tn – 1;α
               
               
                  =
               
               
                  valoarea din tabel a lui t pentru n perechi de valori ale lui E şi Eo şi încrederea statistică P (P = 1 – α), unde P reprezintă 95 % (1).
               
            Rezultatul este exprimat ca medie cu limite de toleranţă la nivel de probabilitate de 95 %, deviaţia standard respectivă şi numărul de date din setul DRc fără valori excepţionale, precum şi numărul de valori excepţionale, de exemplu:
      
                  DR
               
               
                  =
               
               
                  98,6±2,3 % eliminare COD
               
            
                  s
               
               
                  =
               
               
                  4,65 % eliminare COD
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  18
               
            
                  x
               
               
                  =
               
               
                  numărul de valori excepţionale.
               
            2.2.2.   Folosirea analizei specifice
      
      Procentul de eliminare a substanţei de testat din faza apoasă (RW) se calculează în conformitate cu punctul 1.2.2.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  formularul din apendicele 3, indicând condiţiile de funcţionare ale testului;
               
            
                  —
               
               
                  aparatul ales (testul de confirmare OCDE sau vasul poros);
               
            
                  —
               
               
                  modul de funcţionare ales: instalaţii cuplate sau nu;
               
            
                  —
               
               
                  tipul apei uzate: sintetică sau menajeră – în cazul apei uzate menajere data şi locul prelevării;
               
            
                  —
               
               
                  inoculul cu data şi locul prelevării;
               
            
                  —
               
               
                  menţionarea şi descrierea metodei analitice, dacă se fac analize specifice;
               
            
                  —
               
               
                  reprezentarea grafică a eliminării CCO sau COD în funcţie de timp, inclusiv perioada de pornire şi de evaluare;
               
            
                  —
               
               
                  determinarea analitică a substanţei de testat ca CCO sau COD din soluţia mamă;
               
            
                  —
               
               
                  dacă s-au făcut analize specifice, reprezentarea grafică a procentului de eliminare a substanţei de testat din faza apoasă în funcţie de timp (perioada de pornire şi de evaluare);
               
            
                  —
               
               
                  media eliminării COD sau CCO din substanţa de testat şi deviaţia standard se calculează din rezultatele perioadei de evaluare, dacă există o eliminare constantă a substanţei de testat sau o perioadă de funcţionare în regim constant;
               
            
                  —
               
               
                  reprezentarea grafică a concentraţiei de nămol activ în funcţie de timp;
               
            
                  —
               
               
                  eventualele observaţii privind nămolul activ (eliminarea nămolului în exces, prezenţa unor aglomerate, FeCl3 etc.);
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia substanţei de testat;
               
            
                  —
               
               
                  toate rezultatele privind analizele efectuate asupra nămolului;
               
            
                  —
               
               
                  toate informaţiile şi rezultatele experimentale privind substanţa de testat şi substanţa de referinţă, dacă s-a utilizat;
               
            
                  —
               
               
                  argumente ştiinţifice pentru toate schimbările modului de operare.
               
            3.2.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Un grad scăzut de îndepărtare a substanţei de testat din faza apoasă se poate datora faptului că substanţa inhibă microorganismele. Acest lucru se poate observa prin liză şi pierdere de nămol, rezultând un supernatant tulbure, şi prin scăderea eficienţei eliminării CCO (sau COD) din instalaţia pilot.
      Adsorbţia fizico-chimică poate să joace uneori un rol. Diferenţele între acţiunea biologică asupra moleculei şi adsorbţia fizico-chimică se pot observa prin analizele efectuate pe nămol după o desorbţie adecvată.
      Dacă trebuie să se facă o distincţie între biodegradare (sau biodegradare parţială) şi adsorbţie, sunt necesare teste suplimentare.
      Aceasta se poate face în mai multe moduri, cel mai convingător fiind utilizarea supernatantului ca inocul într-un test din setul de bază (de preferinţă testul respirometric).
      Dacă se observă eliminări mari ale COD sau CCO, aceasta se datorează biodegradării, în timp ce la eliminările reduse biodegradarea nu se distinge de eliminare. De exemplu, dacă un compus solubil prezintă o constantă de adsorbţie ridicată, de 98 %, iar rata de pierdere a surplusului de nămol este de 10 % pe zi, este posibilă o eliminare de până la 40 %; la o rată de pierdere a surplusului de nămol de 30 %, eliminarea datorată adsorbţiei pe nămol şi eliminării surplusului poate ajunge la 65 % (4).
      În cazul în care se folosesc analize specifice, trebuie să se acorde atenţie relaţiei dintre structura substanţei şi analizele specifice folosite. În acest caz, fenomenul observat nu poate fi interpretat ca o mineralizare a substanţei.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OCDE, Paris, 1981, Linii directoare privind testele 303 A, Decizia Consiliului C(81) 30 final.
               
            
                  2.
               
               
                  Anexa V C.6. Degradarea – Consumul chimic de oxigen. Directiva 92/69/CEE a Comisiei, 
                        Jurnalul Oficial al Comunităţilor Europene L 383, 29.12.1992, p. 1.
               
            
                  3.
               
               
                  Painter, H.A., King, ESTE.F., WRC Porous Pot method for assessing biodegradability, Technical Report TR70, June 1978, Water Research Centre, United Kingdom.
               
            
                  4.
               
               
                  Wierich, P., Gerike, P., The fate of soluble, recalcitrant, and adsorbing compounds in activated sludge plants, Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 5, No 2, June 1981, p. 161-171.
               
            
                  5.
               
               
                  Directivele 82/242/CEE şi 82/243/CEE ale Consiliului, 
                        Jurnalul Oficial al Comunităţilor Europene L 109, 22.4.1982, p. 1, de rectificare a Directivelor 73/404/CEE şi 73/405/CEE ale Consiliului privind diodegradabilitatea detergenţilor, 
                        Jurnalul Oficial al Comunităţilor Europene L 347, 17.12.1973, p. 53.
               
            
                  6.
               
               
                  Streuli, H., Fehlerhafte Interpretation und Anwendung von Ausreißertests, insbesondere bei Ringsversuchen zur Űberprüfung analytisch-chemischer Untersuchungsmethoden, Fresenius-Zeitschrift für Analytische Chemie, 303 (1980), p. 406-408.
               
            
         Apendicele 1
         Figura 1
         
            
         Figura 2
         
            
      
      
         Apendicele 2
         Figura 1
         Echipament utilizat pentru evaluarea biodegradabilităţii
         
            
         Figura 2
         Detalii ale vasului poros de aerare de 3 l
         
            
      
      
         Apendicele 3
         Condiţii de operare pentru testele de simulare cu nămol activ
         A se verifica fiecare grup
         Aparatură
         
                     Test de confirmare OCDE
                  
                  
                      
                  
               
                     Vas poros
                  
                  
                      
                  
               Mod de funcţionare
         
                     O singură instalaţie
                  
                  
                      
                  
               
                     Instalaţii cuplate
                  
                  
                      
                  
               
                     Instalaţii necuplate
                  
                  
                      
                  
               Transinoculare
         
                     Niciuna
                  
                  
                      
                  
               
                     Nămol activ
                  
                  
                      
                  
               
                     Supernatant
                  
                  
                      
                  
               Timp de retenţie mediu
         
                     Trei ore
                  
                  
                      
                  
               
                     Şase ore
                  
                  
                      
                  
               Component de bază
         
                     Apă menajeră
                  
                  
                      
                  
               
                     Apă sintetică
                  
                  
                      
                  
               Inocul
         
                     Efluent secundar
                  
                  
                      
                  
               
                     Compozit
                  
                  
                      
                  
               
                     Nămol activ
                  
                  
                      
                  
               Adăugare de material testat
         
                     La început
                  
                  
                      
                  
               
                     Creştere în etape
                  
                  
                      
                  
               
                     După formarea nămolului
                  
                  
                      
                  
               Analiză
         
                     Specială
                  
                  
                      
                  
               
                     CCO
                  
                  
                      
                  
               
                     COD
                  
                  
                      
                  
               
      C.11.   BIODEGRADARE
      NĂMOLUL ACTIV: TEST DE INHIBIŢIE A RESPIRAŢIEI
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Metoda descrisă evaluează efectul substanţei de testat asupra microorganismelor măsurând rata respiraţiei în condiţii definite, în prezenţa unor concentraţii diferite ale substanţei de testat.
      Scopul acestei metode este de a asigura o metodă de selecţie rapidă prin care să se poată identifica substanţele care afectează negativ instalaţiile de tratare microbiană aerobă şi să se facă estimări asupra unor concentraţii convenabile, neinhibitoare, ale substanţelor folosite în testele de biodegradabilitate.
      Testul definitiv poate fi precedat de un test preliminar. Acesta poate oferi informaţii cu privire la intervalul de concentraţii folosite în testul principal.
      Testul este conceput astfel încât să cuprindă doi martori fără substanţă testată, unul la începutul iar celălalt la sfârşitul seriei de teste. Fiecare lot de nămol activ trebuie apoi verificat cu o substanţă de referinţă.
      Această metodă se aplică substanţelor care, datorită solubilităţii în apă şi volatilităţii reduse, pot să rămână în apă.
      Pentru substanţele cu solubilitate limitată în mediul de testare nu se poate determina CE50.
      Rezultatele bazate pe absorbţia de oxigen pot conduce la concluzii eronate atunci când substanţa de testat are tendinţa de a întrerupe lanţul metabolic de fosforilare oxidativă.
      Pentru efectuarea testului sunt utile următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  solubilitatea în apă;
               
            
                  —
               
               
                  presiunea vaporilor;
               
            
                  —
               
               
                  formula structurală;
               
            
                  —
               
               
                  puritatea substanţei de testat.
               
            
         Recomandare
      
      Nămolul activ poate conţine organisme potenţial patogene şi trebuie manipulat cu atenţie.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      Rata respiraţiei reprezintă consumul de oxigen al microorganismelor din apa uzată aflate în nămol aerob, exprimată, în general, ca mg O2 pe mg de nămol pe oră.
      Pentru a calcula efectul inhibitor al substanţei de testat la o anumită concentraţie, rata respiraţiei se exprimă ca procent din media celor două rate-martor
      
         
      unde:
      
                  Rs
                  
               
               
                  =
               
               
                  debitul consumului de oxigen la concentraţia testată a substanţei de testat;
               
            
                  Rc1
                  
               
               
                  =
               
               
                  debitul consumului de oxigen, martorul 1;
               
            
                  Rc2
                  
               
               
                  =
               
               
                  debitul consumului de oxigen, martorul 2,
               
            CE50 reprezintă în prezenta metodă concentraţia substanţei de testat la care rata respiraţiei este de 50 % din cea rezultată în proba martor, în condiţiile descrise în prezenta metodă.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Se recomandă ca 3,5-diclorfenolul, cunoscut ca inhibitor al respiraţiei, să fie folosit ca substanţă de referinţă şi să fie testat pentru CE50 pe fiecare lot de nămol activ, ca mijloc de verificare a faptului că sensibilitatea nămolului nu este anormală.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Se măsoară rata respiraţiei nămolului activ alimentat cu o cantitate standard de apă uzată sintetică, după un timp de contact de 30 minute sau trei ore sau ambele. Se măsoară şi rata respiraţiei aceluiaşi nămol activ în prezenţa diferitelor concentraţii ale substanţei de testat, toate celelalte condiţii fiind identice. Efectul inhibitor al substanţei de testat la o anumită concentraţie se exprimă ca procent faţă de media celor două rate ale respiraţiei din cei doi martori. Valoarea CE50 se calculează din determinări la diferite concentraţii.
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Rezultatele testului sunt validate dacă:
      
                  —
               
               
                  ratele de respiraţie în cei doi martori diferă în limita a 15 % una faţă de alta;
               
            
                  —
               
               
                  CE50 (30 minute şi/sau trei ore) a 3,5-diclorfenolului se găseşte în intervalul acceptat de 5-30 mg/l.
               
            1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Reactivi
      
      1.6.1.1.   Soluţiile substanţei de testat
      
      Se prepară soluţii proaspete ale substanţelor de testat la începutul studiului, folosindu-se o soluţie mamă. Dacă se urmează metoda recomandată mai jos, concentraţia adecvată a soluţiei mamă este de 0,5 g/l.
      1.6.1.2.   Soluţia substanţei martor
      
      De exemplu, se poate pregăti o soluţie de 3,5-diclorofenol astfel: se dizolvă 0,5 g de 3,5-diclorofenol în 10 ml NaOH 1M, se adaugă aproximativ 30 ml apă distilată, se adaugă sub agitare H2SO40,5M până în punctul precipitării incipiente (vor fi necesari aproximativ 8 ml de H2SO40,5 M) şi, în final, se aduce amestecul la 1 l, folosind apă distilată. PH-ul trebuie să fie între 7 şi 8.
      1.6.1.3.   Apă reziduală sintetică
      
      Se prepară un efluent sintetic prin dizolvarea următoarelor cantităţi de substanţe într-un litru de apă:
      
                  —
               
               
                  16 g peptonă
               
            
                  —
               
               
                  11 g extract de carne
               
            
                  —
               
               
                  3 g uree
               
            
                  —
               
               
                  0,7 g NaCl
               
            
                  —
               
               
                  0,4 g CaCl2·2H2O
               
            
                  —
               
               
                  0,2 g MgSO4·7H2O
               
            
                  —
               
               
                  2,8 g K2HPO4.
               
            
         Nota 1: Această apă uzată sintetică este de 100 de ori mai concentrată decât cea descrisă în raportul tehnic al OCDE „Metodă propusă pentru determinarea biodegradabilităţii agenţilor tensioactivi folosiţi la detergenţii sintetici” (11 iunie 1976) cu adăugarea fosfatului acid de potasiu.
      
         Nota 2: Dacă mediul preparat nu se foloseşte imediat, trebuie păstrat la întuneric la 0-4 oC, nu mai mult de o săptămână, în condiţii care nu produc nicio schimbare în compoziţia sa. Mediul poate fi şi sterilizat înainte de depozitare sau peptona şi extractul de carne se pot adăuga imediat înainte de începerea testului. Înainte de utilizare, mediul se agită bine şi se ajustează pH-ul.
      1.6.2.   Aparatură
      
      Aparate de măsurare: nu este important ca aparatul să aibă o formă precisă. Cu toate acestea, nu trebuie să rămână spaţiu liber în recipientul de măsurare plin, iar electrodul trebuie să adere perfect la gâtul acestuia.
      Sunt necesare echipamente de laborator normale şi în special următoarele:
      
                  —
               
               
                  aparatură de măsurare;
               
            
                  —
               
               
                  dispozitiv de aerare;
               
            
                  —
               
               
                  electrod de pH şi aparatură adecvată pentru măsurarea pH-ului;
               
            
                  —
               
               
                  electrod de oxigen.
               
            1.6.3.   Pregătirea inoculului
      
      Se foloseşte nămol activ dintr-o instalaţie de tratare a apelor uzate preponderent menajere, ca inocul microbian pentru testare.
      Dacă este necesar, la revenirea în laborator, particulele mari se pot înlătura prin sedimentare după o scurtă perioadă de timp, de exemplu 15 minute, iar stratul superior de materii solide fine poate fi decantat pentru utilizare. Alternativ, nămolul poate fi agitat folosind un amestecător timp de câteva secunde.
      În plus, dacă se consideră că sunt prezente substanţe inhibitoare, nămolul trebuie spălat cu apă de la robinet sau cu o soluţie izotonică. După centrifugare, se decantează supernatantul (acest procedeu se repetă de 3 ori).
      O cantitate mică de nămol este cântărită şi uscată. Pornind de la acest rezultat, se poate calcula cantitatea de nămol umed cu care se realizează suspensia apoasă aşa încât să se obţină o soluţie de nămol activ cu un conţinut de materii solide în suspensie între 2 şi 4 g/l. Acest nivel dă o concentraţie între 0,8 şi 1,6 g/l în mediul de testare dacă se urmează metoda recomandată mai jos.
      Dacă nămolul nu poate fi folosit în ziua prelevării, se adaugă 50 ml apă uzată sintetică la fiecare litru de nămol activ pregătit conform descrierii de mai sus; acesta este apoi aerat peste noapte la 20 ± 2 oC. În continuare este păstrat în condiţii de aerare în vederea utilizării în timpul zilei. Înainte de utilizare, se verifică şi se ajustează pH-ul, dacă este necesar, la pH 6-8. Materiile solide în suspensie din soluţia amestecată se determină după metoda descrisă în paragraful anterior.
      Dacă este necesar ca acelaşi lot de nămol să fie folosit în zilele următoare (maximum patru zile), se adaugă 50 ml de apă uzată sintetică la 1 litru de nămol, la sfârşitul fiecărei zile de lucru.
      1.6.4.   Desfăşurarea testului
      
      
                  Durată/timp de contact:
               
               
                  30 de minute şi/sau trei ore, cu aerare
               
            
                  Apă:
               
               
                  Apă potabilă (declorinată, dacă este necesar)
               
            
                  Alimentare cu aer:
               
               
                  Aer curat, fără uleiuri. Debit de aer de la 0,5 la 1 litru/minut
               
            
                  Aparat de măsurare:
               
               
                  Pahar de laborator cu fund plat, cum ar fi pahar de tip CBO (consum biochimic de oxigen)
               
            
                  Oxigenometru:
               
               
                  Electrod de oxigen adecvat, cu înregistrare
               
            
                  Soluţie nutritivă:
               
               
                  Apă uzată sintetică (a se vedea mai sus)
               
            
                  Substanţă de testat:
               
               
                  Soluţia de testare se prepară imediat înainte de începerea testului
               
            
                  Substanţă de referinţă:
               
               
                  de exemplu 3,5-diclorfenol (la cel puţin trei concentraţii)
               
            
                  Martori:
               
               
                  Mostră inoculată fără substanţă de testat
               
            
                  Temperatură:
               
               
                  20 ± 2 oC
               
            O metodă experimentală, care poate fi urmată atât pentru test cât şi pentru substanţa de referinţă, pe o perioadă de contact de trei ore, este prezentată mai jos:
      Se folosesc câteva vase (de exemplu, pahare de laborator de 1 l).
      Trebuie folosite cel puţin 5 concentraţii într-o serie geometrică, cu un raport care este de preferat să nu depăşească 3,2.
      La momentul „0”, se aduc 16 ml apă de efluent sintetic care se completează până la 300 ml cu apă. Se adaugă 200 ml de inocul microbian, iar amestecul total (500 ml) se toarnă într-un prim vas (prima probă martor C1).
      Vasele de testare trebuie aerate în permanenţă pentru ca O2 dizolvat să nu scadă sub 2,5 mg/litru şi pentru ca, imediat înainte de măsurarea ratei respiraţiei, concentraţia de O2 să fie de aproximativ 6,5 mg/litru.
      La momentul „15 minute” (15 minute este un interval arbitrar, dar convenabil) procedeul de mai sus se repetă, exceptând faptul că se adaugă 100 ml din soluţia mamă de substanţă de testat la 16 ml apă uzată sintetică înainte de a se adăuga apă până la 300 ml şi inocul microbian, pentru a obţine un volum de 500 ml. Acest amestec se toarnă apoi în al doilea vas şi se aerează conform metodei de mai sus. Acest procedeu se repetă la intervale de 15 minute, cu adăugare de volume diferite de soluţie mamă pentru a obţine o serie de recipiente ce conţin concentraţii diferite ale substanţei de testat. În final, se pregăteşte un al doilea martor (C2).
      După trei ore, se înregistrează pH-ul, iar la o probă bine amestecată din conţinutul primului vas se măsoară rata respiraţiei pe o perioadă de până la 10 minute.
      Această determinare se repetă pentru conţinutul fiecărui recipient la intervale de 15 minute, astfel încât timpul de contact în fiecare vas să fie de trei ore.
      Substanţa de referinţă se testează pe fiecare lot de inocul microbian în acelaşi mod.
      Va fi necesar un regim diferit (de exemplu, mai mult de un oxigenometru) dacă măsurătorile trebuie să se facă după 30 minute de contact.
      Dacă este necesară măsurarea consumului chimic de oxigen, se pregătesc alte recipiente ce conţin substanţă de testat, efluent sintetic şi apă, dar nu şi nămol activ. Se măsoară consumul de oxigen şi se înregistrează după un timp de aerare de 30 minute şi/sau trei ore (timp de contact).
      2.   DATE ŞI EVALUARE
      Rata respiraţiei se calculează după înregistrările cuprinse între aproximativ 6,5 mg O2/l şi 2,5 mg O2/l sau pe o perioadă de 10 minute, dacă viteza respiraţiei este redusă. Porţiunea curbei de respiraţie pe care se măsoară ratei respiraţiei trebuie să fie liniară.
      Dacă ratele respiraţiei la cele două probe martor diferă cu mai mult de 15 % sau CE50 a substanţei de referinţă (la 30 minute şi/sau trei ore) nu se găseşte în intervalul acceptat (5-30 mg/l pentru 3,5-diclorfenol), testul este invalidat şi trebuie repetat.
      Procentul de inhibiţie se calculează la fiecare concentraţie de testare (a se vedea punctul 1.2). Procentul de inhibiţie se reprezintă grafic în raport cu concentraţia, pe hârtie lognormală (sau de logaritmică probit) şi se obţine valoarea CE50.
      Limita de încredere de 95 % pentru valorile CE50 se poate determina folosindu-se metode standard.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  substanţa de testat: datele de identificare chimică;
               
            
                  —
               
               
                  sistemul de testare: sursa, concentraţia şi orice pretratare a nămolului activ;
               
            
                  —
               
               
                  condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              pH-ul amestecului de reacţie înainte de măsurarea respiraţiei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatura de testare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              durata testului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              substanţa de referinţă şi CE50 măsurat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              absorbţia abiotică de oxigen (după caz);
                           
                        
            
                  —
               
               
                  rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              toate datele măsurate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              curba de inhibiţie şi metoda de calcul al CE50;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              CE50 şi, dacă este posibil, la limita de încredere 95 %, CE20 şi CE80;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toate observaţiile şi abaterile de la această metodă care ar putea influenţa rezultatul.
                           
                        
            3.2.   INTERPRETAREA DATELOR
      Valoarea CE50 trebuie considerată doar ca un indiciu al toxicităţii probabile a substanţei de testat asupra nămolului activ utilizat la tratarea apei uzate sau asupra microorganismelor din apa uzată, deoarece interacţiunile complexe care au loc în mediu nu pot fi simulate precis în testul de laborator. De asemenea, substanţele de testat care pot avea un efect inhibitor asupra oxidării amoniacului pot produce şi curbe de inhibiţie atipice. De aceea, aceste curbe trebuie interpretate cu atenţie.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  International Standard ISO 8192-1986.
               
            
                  2.
               
               
                  Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, p. 165.
               
            
                  3.
               
               
                  Brown, D., Hitz, H.R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, p. 245.
               
            
                  4.
               
               
                  ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs Manufacturing Industries), Recommended Method No 103, descrisă şi de:
               
            
                  5.
               
               
                  Robra, B., Wasser/Abwasser 117, 1976, p. 80.
               
            
                  6.
               
               
                  Schefer, w., Textilveredlung 6, 1977, p. 247.
               
            
                  7.
               
               
                  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council C (84) 30 final.
               
            C.12.   BIODEGRADARE
      TESTUL SCAS MODIFICAT
      1.   METODĂ
      1.1.   INTRODUCERE
      Scopul metodei este evaluarea biodegradabilităţii totale potenţiale a substanţelor organice nevolatile şi solubile în apă, când sunt expuse la concentraţii relativ mari de microorganisme pe o perioadă lungă de timp. Viabilitatea microorganismelor se menţine pe această perioadă prin aport zilnic de apă uzată decantată (pentru condiţiile de sfârşit de săptămână, apa poate fi păstrată la 4 oC. Alternativ, se poate folosi apa uzată sintetică din testul de confirmare OCDE).
      Poate avea loc adsorbţia fizico-chimică pe materiile solide în suspensie, acest lucru trebuind luat în considerare la interpretarea rezultatelor (a se vedea punctul 3.2.).
      Datorită perioadei de păstrare îndelungată a fazei apoase (36 de ore) şi adăugării intermitente a substanţelor nutritive, testul nu simulează condiţiile din mediul natural în staţia de epurare a apei uzate. Rezultatele obţinute cu diferite substanţe de testat arată că testul are un potenţial mare de evaluare a biodegradabilităţii.
      Condiţiile prevăzute de test sunt extrem de favorabile selecţiei şi/sau adaptării microorganismelor capabile să degradeze compusul de testare. (Procedura poate fi folosită şi pentru a produce inoculi aclimatizaţi pentru utilizare în alte teste.)
      În această metodă, măsurarea concentraţiei carbonului organic dizolvat se foloseşte pentru a evalua biodegradabilitatea totală a substanţelor de testat. Este preferabil să se determine COD după acidificare şi purjare, nu ca diferenţă între Ctotal – Canorganic
      
      Utilizarea simultană a metodei analitice specifice poate permite evaluarea biodegradării primare a substanţei (dispariţia structurii chimice iniţiale).
      Metoda se aplică numai pentru substanţele organice care, la concentraţia folosită în test:
      
                  —
               
               
                  sunt solubile în apă (cel puţin 20 mg carbon organic dizolvat/litru);
               
            
                  —
               
               
                  au presiunea vaporilor neglijabilă;
               
            
                  —
               
               
                  nu sunt inhibitoare pentru bacterii;
               
            
                  —
               
               
                  nu se adsorb semnificativ în sistemul de testare;
               
            
                  —
               
               
                  nu se pierd prin spumare din soluţia testată.
               
            Trebuie stabilit conţinutul de carbon organic al compusului testat.
      Informaţiile despre proporţiile relative ale principalelor componente ale substanţei de testat se utilizează la interpretarea rezultatelor obţinute, în special în cazurile în care rezultatele indică valori scăzute sau marginale.
      Informaţiile despre toxicitatea substanţei de testat asupra microorganismelor se folosesc pentru interpretarea rezultatelor cu valori scăzute şi pentru alegerea unor concentraţii adecvate de testare.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      
                  CT
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia substanţei de testat, exprimată în carbon organic prezent sau adăugat în apa uzată decantată la începutul perioadei de aerare (mg/l);
               
            
                  Ct
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia de carbon organic dizolvat determinată în supernatantul soluţiei testate la sfârşitul perioadei de aerare (mg/l);
               
            
                  Cc
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia de carbon organic dizolvat determinată în supernatantul soluţiei de control la sfârşitul perioadei de aerare (mg/l).
               
            Biodegradarea se defineşte în această metodă ca fiind dispariţia carbonului organic. Biodegradarea poate fi exprimată ca:
      
                  1.
               
               
                  Procentul de eliminare Dda al cantităţii de substanţă adăugată zilnic:
                  
                              
                                 
                           
                           
                              [1]
                           
                        unde:
                  
                              Dda
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              degradare/adaos zilnic.
                           
                        
            
                  2.
               
               
                  Procentul de eliminare Dssd a cantităţii de substanţă prezente la începutul fiecărei zile:
                  
                              
                                 
                           
                           
                              [2(a)]
                           
                        
                              
                                 
                           
                           
                              [2(b)]
                           
                        unde
                  
                              Dssd
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              degradare/substanţă la începutul zilei;
                           
                        indicii i şi (i + 1) se referă la ziua măsurării.
                  Se recomandă ecuaţia 2(a) dacă COD al efluentului variază de la zi la zi, în timp ce ecuaţia 2(b) se poate folosi când COD al efluentului rămâne relativ constant de la zi la zi.
               
            1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      În unele cazuri, când se studiază o substanţă nouă, pot fi utile substanţele de referinţă; cu toate acestea, nu se recomandă aici nicio substanţă de referinţă specifică.
      Datele despre mai mulţi compuşi evaluaţi în testele de comparaţie interlaboratoare (a se vedea apendicele 1) se prezintă în principal pentru a permite calibrarea periodică acestei metode şi compararea rezultatelor dacă se foloseşte altă metodă.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Nămolul activ din instalaţia de tratare a apei uzate se introduce într-o instalaţie de tratare cu nămol activ cu alimentare semicontinuă (SCAS). Se adaugă substanţa de testat şi apa uzată menajeră decantată, iar amestecul se aerează 23 de ore. Aerarea este apoi oprită, nămolul se lasă să se decanteze şi se elimină supernatantul.
      Nămolul care rămâne în vasul de aerare se amestecă apoi cu o parte din substanţa de testat şi de apă uzată, iar ciclul se repetă.
      Biodegradarea se evaluează prin determinarea conţinutului de carbon organic dizolvat în soluţia de supernatant. Valoarea obţinută se compară cu cea găsită pentru soluţia dintr-un tub martor alimentat numai cu apă uzată decantată.
      Dacă se foloseşte o metodă analitică specifică, se pot măsura schimbările din concentraţia moleculei iniţiale care se datorează biodegradării (biodegradabilitate primară).
      1.5.   CRITERII DE CALITATE
      Nu s-a stabilit încă reproductibilitatea prezentei metode bazate pe eliminarea carbonului organic dizolvat. (Dacă se ia în considerare biodegradarea primară, se obţin date foarte exacte pentru substanţele care sunt foarte degradate).
      Sensibilitatea acestei metode este determinată în mare parte de variabilitatea probei martor şi într-o mai mică măsură de precizia determinării carbonului organic dizolvat şi de nivelul substanţei de testat în soluţie la începutul fiecărui ciclu.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Pregătire
      
      Se foloseşte un număr suficient de unităţi de aerare curate, alternativ cu unitatea originală de testare SCAS de 1,5 l şi se montează tuburile de intrare a aerului (figura 1) pentru fiecare substanţă testată şi proba martor. Aerul comprimat care pătrunde în unităţile de testare, purificat printr-un filtru de vată hidrofilă, nu trebuie să conţină carbon organic şi să fie deja saturat cu apă pentru a se reduce pierderile prin evaporare.
      Se prelevează o probă de soluţie mixtă ce conţine 1-4 g materii solide în suspensie pe litru din staţia de epurare a apei uzate cu nămol activ. Sunt necesari aproximativ 150 ml de soluţie omogenă pentru fiecare instalaţie de aerare.
      Soluţiile mamă se prepară cu apă distilată; în mod normal, concentraţia necesară este de 400 mg/l exprimată în carbon organic, ceea ce dă o concentraţie a substanţei de testat de 20 mg/l carbon la începutul fiecărui ciclu de aerare, dacă nu se produce nicio biodegradare.
      Sunt acceptabile concentraţii mai mari dacă toxicitatea faţă de microorganisme permite acest lucru.
      Se măsoară conţinutul în carbon organic al soluţiilor mamă.
      1.6.2.   Condiţii de testare
      
      Testul trebuie realizat la 20-25 oC.
      Se foloseşte o concentraţie mare de microorganisme aerobe (1-4 g/l materii solide în suspensie), iar perioada de păstrare efectivă este de 36 ore. Carbonul organic din efluentul uzat este, în mod normal, oxidat puternic după 8 ore după începerea fiecărui ciclu de aerare. Apoi, nămolul respiră endogen în perioada rămasă de aerare, timp în care singurul substrat disponibil este substanţa de testat, dacă aceasta nu se metabolizează uşor. Aceste caracteristici, combinate cu reinocularea zilnică a soluţiei de testat, dacă se foloseşte apă de uzată menajeră ca mediu, oferă condiţii favorabile atât pentru aclimatizare, cât şi pentru o biodegradare rapidă.
      1.6.3.   Desfăşurarea testului
      
      Se prelevează o probă de soluţie omogenă din instalaţia de epurare a apei predominant menajere cu nămol activ sau dintr-o unitate de laborator şi se păstrează în condiţii aerobe până la folosirea în laborator. Fiecare unitate de aerare, precum şi unitatea martor, se umple cu 150 ml de soluţie omogenă (dacă se foloseşte unitatea de testare originală SCAS, volumele date se înmulţesc cu 10) şi începe aerarea. După 23 de ore aerarea se opreşte, iar nămolul se lasă să se decanteze timp de 45 de minute. Se deschide pe rând robinetul fiecărui recipient şi se extrag 100 ml din supernatant. Se prelevează o probă de apă uzată menajeră decantată, imediat înainte de utilizare, şi se adaugă 100 ml la nămolul rămas în fiecare unitate de aerare. Aerarea se porneşte din nou. În această fază nu se adaugă nicio substanţă de testat, iar unităţile se alimentează zilnic cu apă uzată menajeră până când la decantare se obţine un supernatant limpede. De obicei, aceasta poate să dureze 2 săptămâni, timp în care carbonul organic dizolvat în supernatant, la sfârşitul fiecărui ciclu de aerare, se apropie de o valoare constantă.
      La sfârşitul acestei perioade, nămolurile decantate individual se amestecă şi se adaugă în fiecare unitate câte 50 ml din nămolul compozit rezultat.
      În unităţile martor se adaugă 95 ml apă uzată decantată şi 5 ml de apă, iar în unităţile de testare se adaugă 95 ml de apă uzată decantată şi 5 ml de soluţie mamă a substanţei de testat corespunzătoare (400 mg/l). Aerarea începe din nou şi continuă 23 de ore. Nămolul se lasă să se decanteze 45 minute, se scoate supernatantul şi se analizează conţinutul de carbon organic dizolvat.
      Procedeul de mai sus, de umplere şi scoatere, se repetă zilnic, pe toată perioada testului.
      Înainte de decantare, poate fi necesară curăţarea pereţilor unităţilor pentru a preveni acumularea de materii solide peste nivelul lichidului. Se foloseşte o racletă sau o perie pentru fiecare unitate, pentru a preveni contaminarea.
      Ideal este să se determine zilnic conţinutul de carbon organic dizolvat în supernatant. Înainte de analiză, soluţiile se filtrează prin filtre cu membrană de 0,45 μm, se spală sau se centrifughează. Filtrele cu membrană sunt acceptabile dacă se asigură că nu are loc nici eliminare de carbon, nici absorbţie de substanţă în faza de filtrare. Temperatura probei nu trebuie să depăşească 40 oC când aceasta este în centrifugă.
      Durata testului pentru substanţele care prezintă biodegradare scăzută sau nulă este nedeterminată, dar experienţa arată că aceasta trebuie să fie de cel puţin 12 săptămâni, în general, dar nu mai mult de 26 săptămâni.
      2.   DATE ŞI EVALUARE
      Valorile masei de carbon organic dizolvat în soluţiile de supernatant din unităţile de testare şi din unităţile martor sunt reprezentate grafic în funcţie de timp.
      Pe măsură ce se realizează biodegradarea, nivelul constatat la testare se apropie de cel din proba martor. Când se constată că diferenţa dintre cele două niveluri este constantă la trei măsurări consecutive, se efectuează un număr suficient de măsurări suplimentare, pentru a permite interpretarea statistică a datelor şi calcularea procentului de biodegradare al substanţei de testat (Dda sau Dssd, a se vedea punctul 1.2).
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină, dacă este posibil, următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  toate informaţiile despre tipul de apă uzată, tipul de unităţi folosite şi rezultatele experimentale privind substanţa de testat, substanţa de referinţă (dacă s-a folosit) şi proba martor;
               
            
                  —
               
               
                  temperatura;
               
            
                  —
               
               
                  curba de eliminare cu descriere şi mod de calcul (a se vedea punctul 1.2);
               
            
                  —
               
               
                  data şi locul unde au fost prelevate probele de nămol activ şi apă uzată, starea adaptării, concentraţia etc.;
               
            
                  —
               
               
                  argumentele ştiinţifice pentru eventualele modificări ale metodei de testare;
               
            
                  —
               
               
                  semnătura şi data.
               
            3.2.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Deoarece substanţa care urmează să fie testată prin această metodă nu este uşor biodegradabilă, orice eliminare a COD datorată numai biodegradării este în mod normal treptată, în zile sau săptămâni, cu excepţia cazurilor în care aclimatizarea este bruscă, aşa cum indică dispariţia bruscă care se petrece după câteva săptămâni.
      Cu toate acestea, adsorbţia fizico-chimică poate juca uneori un rol important; acesta se manifestă prin eliminarea completă sau parţială a COD-ului adăugat de la început. Ceea ce se întâmplă ulterior depinde de factori cum ar fi gradul de absorbţie şi concentraţia materiilor solide în suspensie în efluentul eliminat. De obicei, diferenţa dintre concentraţia COD în soluţia martor şi în supernatantul de testare creşte treptat de la valoarea iniţială redusă, această diferenţă rămânând apoi la noua valoare în restul experimentului, dacă nu are loc aclimatizarea.
      Dacă trebuie să se facă o distincţie între biodegradare (sau biodegradare parţială) şi adsorbţie, sunt necesare teste ulterioare. În acest scop există mai multe metode, cea mai convingătoare fiind utilizarea supernatantului sau a nămolului ca inocul într-un test din setul de bază (de preferinţă un test respirometric).
      Substanţele de testat care dau valori mari de eliminare de COD neadsorbit în acest test trebuie considerate ca posibil biodegradabile. Eliminarea parţială neadsorbtivă arată că substanţa chimică este supusă cel puţin unei degradări parţiale.
      Eliminările reduse sau nule ale COD se pot datora inhibării microorganismelor de către substanţa de testat şi acest lucru poate fi dovedit prin liză şi pierderea nămolului, rezultând supernatanţi tulburi. Testul trebuie repetat folosindu-se o concentraţie mai scăzută de substanţă testată.
      Utilizarea unei metode analitice specifice sau a unei substanţe de testat marcate cu 14C permite o sensibilitate mai mare. În cazul substanţei de testat cu 14C, recuperarea 14CO2 va confirma că biodegradarea s-a produs.
      În cazul în care rezultatele sunt exprimate în termeni de biodegradare primară, este necesar să se dea, în măsura în care este posibil, explicaţii cu privire la modificarea structurii chimice care duce la pierderea răspunsului substanţei de testat iniţiale.
      Validarea metodei analitice trebuie însoţită de rezultatul obţinut în mediului testului martor.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OCDE, Paris, 1981, Linii directoare privind testele 302 A, Decizia Consiliului C(81) 30 final.
               
            
         Apendicele 1
         Test SCAS: Exemple de rezultate
         
                     Substanţă
                  
                  
                     CT
                     
                     (mg/l)
                  
                  
                     Ct – Cc
                     
                     (mg/l)
                  
                  
                     Procent de biodegradare
                     Dda
                     
                  
                  
                     Durata testului
                     (zile)
                  
               
                     4-acetil aminobenzen sulfonat
                  
                  
                     17,2
                  
                  
                     2,0
                  
                  
                     85
                  
                  
                     40
                  
               
                     Tetra-propilen benzen sulfonat
                  
                  
                     17,3
                  
                  
                     8,4
                  
                  
                     51,4
                  
                  
                     40
                  
               
                     4-nitrofenol
                  
                  
                     16,9
                  
                  
                     0,8
                  
                  
                     95,3
                  
                  
                     40
                  
               
                     Dietilen glicol
                  
                  
                     16,5
                  
                  
                     0,2
                  
                  
                     98,8
                  
                  
                     40
                  
               
                     Anilină
                  
                  
                     16,9
                  
                  
                     1,7
                  
                  
                     95,9
                  
                  
                     40
                  
               
                     Ciclopentan tetra carboxilat
                  
                  
                     16,9
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                     81,1
                  
                  
                     120
                  
               
      
         Apendicele 2
         Exemplu de aparatură de testare
         
            
      
      C.13.   BIOCONCENTRAREA: EXPERIENŢA CU REÎNNOIRE CONTINUĂ ASUPRA PEŞTILOR
      1.   METODĂ
      Prezenta metodă de bioconcentrare reproduce Orientarea 305 (1996) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Prezenta metodă descrie o procedură de caracterizare a potenţialului de bioconcentrare, în cazul peştilor supuşi la o reînnoire continuă a anumitor substanţe. Regimurile experimentale cu reînnoire continuă sunt de departe preferate, dar şi cele semistatice sunt acceptate, în măsura în care sunt îndeplinite criteriile de validitate.
      Metoda oferă toate informaţiile necesare executării experimentului, însă lasă libertatea indispensabilă de adaptare a conceptului experimental, la condiţiile specifice fiecărui laborator şi nu impune în mod strict, caracteristicile substanţelor testate. În special, sunt indicate produsele organice stabile, pentru care valorile log Pow sunt cuprinse între 1,5 şi 6,0 (1), însă metoda este aplicabilă şi substanţelor superlipofile (log Pow > 6,0). Pentru acestea din urmă, estimarea prealabilă a factorului de bioconcentrare (BCF), denumit uneori KB, va fi probabil superioară valorii factorului de bioconcentrare în starea staţionară (BCFSS), la care ne putem aştepta în cazul unei experienţe de laborator. Evaluările preliminare ale factorului de bioconcentrare, pentru produsele organice ale căror valori log Pow ajung până la aproximativ 9,0 pot fi calculate cu ajutorul ecuaţiei Bintein et al (2). Potenţialul de bioconcentrare se caracterizează pentru anumiţi parametri, cum ar fi: constanta de viteză de absorbţie (k1), constanta de viteză de eliminare (k2) şi BCFSS.
      Substanţele experimentale marcate radioactiv pot facilita analiza eşantioanelor de apă şi de peşti; de asemenea, pot servi la definirea degradării, dacă este necesar să o identificăm şi să o cuantificăm. Dacă se măsoară totalul de reziduu radioactiv (de exemplu, prin combustia ori solubilizarea ţesuturilor), BCF se bazează pe compusul de origine, toţi metaboliţii reţinuţi şi carbonul asimilat. Factorii BCF care se bazează pe reziduurile radioactive totale nu pot fi, aşadar, comparaţi direct cu un factor BCF derivat dintr-o analiză chimică particulară exclusiv a compusului de origine.
      Pot fi utilizate proceduri de epurare, în cadrul studiilor cu markeri radioactivi, pentru determinarea BCF pe baza compusului original, iar principalii metaboliţi vor fi determinaţi dacă se consideră necesar. De asemenea, există posibilitatea combinării unui studiu de metabolism al peştilor, cu un studiu de bioconcentrare, prin analiza şi identificarea reziduurilor tisulare.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      
         Bioconcentrare/Bioacumulare: creşterea concentraţiei substanţei testate la un sau într-un organism (ţesuturile specifice ale acestuia) în raport cu concentraţia acestei substanţe în mediul ambiant.
      
         Factor de bioconcentrare (BCF sau KB): în orice moment din faza de absorbţie a experienţei de acumulare, concentraţia substanţei testate la/în peşti, sau pe ţesuturi determinate ale acestora, [Cf în μg/g (ppm)] raportată la concentraţia substanţei chimice din mediul ambiant [CW în μg/ml (ppm)].
      
         Factor de bioconcentrare în stare staţionară (BCFss sau KB): nu se modifică prea mult într-o perioadă mare de timp, concentraţia substanţei experimentale din mediul ambiant fiind constantă pentru aceeaşi perioadă de timp.
      
         Platoul sau starea staţionară: în reprezentarea grafică a substanţei experimentale la peşti (Cf), în funcţie de timp, este de aşteptat pentru curbă să devieze paralel faţă de axa timpului, iar pentru trei analize succesive ale Cf – realizate asupra unor eşantioane prelevate la intervale de cel puţin două zile – să rămână într-o plajă de 20 % una faţă de alta; nu există diferenţe semnificative între cele trei perioade de eşantionare. Când se analizează eşantioane reunite, se efectuează minimum patru analize succesive. Dacă substanţele experimentale au caracteristici de absorbţie lente, este preferabil să se opteze pentru intervale săptămânale.
      
         Factori de bioconcentrare: se calculează direct, plecând de la constantele cinetice (k1/k2); se numesc factori de concentrare cinetică BCFk.
      
         Coeficient de partiţie octanol-apă (Pow): raportul de solubilitate a unui produs chimic în n-octanol şi în apă, la echilibru (Metoda A.8), de asemenea desemnat prin Kow. Logaritmul lui Pow indică potenţialul de bioconcentrare al unui produs chimic în organismele acvatice.
      
         Faza de expunere sau de absorbţie: timpul în care peştii sunt expuşi la produsul chimic testat.
      
         Constanta de viteză de absorbţie (k1): valoare numerică ce defineşte viteza de creştere a concentraţiei substanţei testate la/în peşti (sau în ţesuturile specifice ale acestora), atunci când sunt expuşi la acea substanţă chimică (k1 este exprimată în zile–1).
      
         Faza de post-expunere sau de eliminare (pierdere): ca urmare a transferării peştilor dintr-un mediu care conţine substanţa testată, într-un mediu care nu conţine acea substanţă, timp în care eliminarea (sau pierderea netă) de substanţă de către peşti (sau de către ţesuturile specifice) este studiată.
      
         Constanta de viteză de eliminare (pierdere) (k2): valoare numerică ce defineşte viteza de scădere a concentraţiei substanţei testate la/în peşti (sau în ţesuturile specifice ale acestora), ca urmare a transferării lor dintr-un mediu care conţine substanţa testată, într-un mediu care nu conţine acea substanţă (k2 este exprimată în zile–1).
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Experimentul se împarte în două faze: faza de expunere (absorbţie) şi de post-expunere (eliminare). În cursul fazei de absorbţie, grupele separate de peşti dintr-o specie sunt supuse la cel puţin două concentraţii ale substanţei totale. Apoi, aceştia sunt transferaţi într-un mediu care nu conţine respectiva substanţă, pentru faza de eliminare. Aceasta din urmă este întotdeauna necesară, în afară de cazul în care absorbţia substanţei în timpul fazei de absorbţie a fost nesemnificativă (de exemplu, dacă BCF este mai mic de 10). Concentraţia substanţei testate la/în peşti (sau în ţesuturile specificate ale acestora) este urmărită de-a lungul celor două faze ale experimentului. În afară de cele două concentraţii experimentale, un grup martor de peşti este menţinut în condiţii identice, cu excepţia substanţei testate, care este absentă. Acest lucru este necesar pentru stabilirea eventualelor relaţii între efectele nefaste observate la testul de bioconcentrare şi acest grup martor, precum şi pentru deducerea concentraţiei de bază a substanţei testate.
      Faza de absorbţie durează 28 de zile, în cazul în care nu se demonstrează mai devreme că a fost atins echilibrul. Se poate estima durata fazei de absorbţie şi timpul necesar pentru obţinerea stării staţionare, cu ajutorul ecuaţiilor din apendicele 3. Perioada de epurare începe aşadar, cu transferarea peştilor în alt recipient curat, conţinând acelaşi mediu, cu excepţia substanţei testate. Atunci când devine posibil, se calculează factorul de bioconcentrare, de preferinţă sub formă de raport (BCFss) de concentraţie de peşti (Cf) şi în apă (Cw), în starea de echilibru aparent şi în calitate de factor de bioconcentrare cinetică; şi BCFk ca raport al constantelor de viteză de absorbţie (k1) şi de epurare (k2), considerând o cinetică de ordinul întâi. Dacă se constată că nu a urmat o cinetică de ordinul întâi, trebuie utilizate modele mai complexe (apendicele 5).
      Dacă nu se obţine o stare staţionară în 28 de zile, faza de absorbţie se va prelungi până la obţinerea acesteia sau timp de 60 de zile, preferându-se alternativa cea mai scurtă; apoi începe faza de eliminare.
      Constanta de viteză de absorbţie, constanta de viteză de epurare (pierdere) (sau constantele, atunci când este vorba de modele complexe), factorul de bioconcentrare şi, dacă este posibil, limitele de încredere pentru fiecare dintre aceşti parametri, sunt calculate pornind de la modelul care descrie cel mai fidel măsurătorile de concentraţie a substanţei testate, în peşti şi în apă.
      Factorul BCF se exprimă în funcţie de greutatea totală umedă de peşte. Totuşi, pentru anumite studii, pot fi utilizate ţesuturi sau organe specifice (de exemplu, muşchi, ficat), dacă peştii sunt suficient de mari sau dacă pot fi separaţi în părţi comestibile (fileuri) şi necomestibile (viscere). Existând o relaţie clară care leagă potenţialul de bioconcentrare şi lipofilia pentru numeroase substanţe organice, va exista şi o relaţie corespunzătoare între conţinutul lipidic la peştii pentru experienţă şi bioconcentraţiile observate pentru aceste substanţe. Aşadar, pentru a elimina această variabilă din rezultatele experienţelor cu substanţe foarte lipofile (adică având log Pow > 3), bioconcentrarea trebuie exprimată în funcţie de masa corporală totală şi de conţinutul lipidic.
      Dacă este posibil, conţinutul lipidic se va stabili folosind acelaşi material biologic care a servit la determinarea concentraţiei substanţei testate.
      1.4.   INFORMAŢII REFERITOARE LA SUBSTANŢA DE TESTARE
      Înainte de a executa experienţa de bioconcentrare, următoarele informaţii trebuie cunoscute despre substanţa testată:
      
                  —
               
               
                  solubilitatea în apă;
               
            
                  —
               
               
                  coeficientul de partiţie octanol-apă Pow (de asemenea, Kow, determinat printr-o metodă HPLC în A.8);
               
            
                  —
               
               
                  hidroliza;
               
            
                  —
               
               
                  fototransformarea în apă, la radiaţia solară sau solară artificială simulată şi în condiţiile de radiaţii ale experienţei de bioconcentrare (3);
               
            
                  —
               
               
                  tensiunea superficială (adică pentru substanţele la care log Pow nu a putut fi măsurat);
               
            
                  —
               
               
                  presiunea de vapori;
               
            
                  —
               
               
                  biodegradabilitatea numită „facilă” (dacă este cazul).
               
            De asemenea, trebuie cunoscută toxicitatea relativă pentru specia de peşti utilizată pentru experienţă, de preferinţă CL50 asimptotică (adică, independentă de timp). Este indispensabil să se utilizeze o metodă analitică potrivită, cu exactitatea, precizia şi sensibilitatea, cunoscute, pentru a cuantifica substanţa testată în soluţia experimentală şi în materialul biologic, precum şi informaţii precise legate de prepararea şi păstrarea eşantioanelor. De asemenea, trebuie să fie cunoscută limita de detecţie analitică a substanţei testate, atât în apă cât şi în ţesuturile peştilor. Dacă se utilizează o substanţă pentru testat marcată cu 14C, trebuie cunoscut procentajul de radioactivitate asociat impurităţilor.
      1.5.   VALIDITATEA TESTULUI
      Pentru ca un test să fie valabil, trebuie îndeplinite următoarele condiţii:
      
                  —
               
               
                  variaţia de temperatură să fie mai mică de ± 2 oC;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia oxigenului dizolvat să nu coboare sub 60 % din nivelul de saturaţie;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia substanţei testate în vase să fie menţinută la ± 20 % din media valorilor măsurate în timpul fazei de absorbţie;
               
            
                  —
               
               
                  mortalitatea şi alte efecte sau maladii indezirabile, înregistrate la peştii martor sau la cei supuşi experimentului, să fie mai mici de 10 %, la sfârşitul experimentului; atunci când experimentul se prelungeşte pe mai multe săptămâni sau luni, mortalitatea sau alte efecte indezirabile, apărute la cele două grupe de peşti, trebuie să fie mai mici de 5 % pe lună şi să nu depăşească 30 % în total.
               
            1.6.   COMPUŞI DE REFERINŢĂ
      Utilizarea compuşilor de referinţă, având un potenţial de bioconcentrare cunoscut, ar putea sprijini controlul asupra procedurii experimentale, dacă este necesar. Totuşi, nu se pot încă recomanda substanţe specifice.
      1.7.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.7.1.   Aparatură
      
      Se vor evita materialele care pot prezenta un efect indezirabil de absorbţie, de dizolvare sau de lesivaj asupra peştilor, şi aceasta pentru toate echipamentele folosite. Se vor utiliza bazine standard rectangulare sau cilindrice, din materiale inerte chimic, de capacitate adaptată regimului de umplere. Se va reduce la minimum folosirea de ţevi din plastic flexibil. Este preferabilă tubulatura din teflon (®), oţel inoxidabil şi/sau sticlă. Experienţele au dovedit că, pentru substanţele cu coeficienţi mari de absorbţie, cum ar fi piretrinele de sinteză, poate fi necesară sticla silanizată. În acest caz, echipamentul se va arunca după utilizare.
      1.7.2.   Apa
      
      În general, se utilizează apă naturală, provenită dintr-o sursă nepoluată şi de calitate uniformă. Calitatea apei utilizate pentru diluţie trebuie să permită supravieţuirea speciei de peşti aleasă, în perioada de aclimatare şi în cursul experimentului, fără apariţia vreunui comportament anormal. În cazul ideal, ar trebui demonstrat că speciile supuse experimentului, pot supravieţui, creşte şi reproduce în apa de diluţie (de exemplu, prin creştere în laborator sau printr-un studiu de toxicitate asupra unui ciclu biologic). Apa va fi caracterizată cel puţin prin pH, duritate, materii solide totale, carbon organic total şi, de preferinţă, prin conţinutul de substanţe amoniacale, nitraţi şi alcalinitate; pentru speciile marine, apa va fi caracterizată şi prin salinitate. Se cunosc perfect principalii parametri optimi pentru peşti, iar apendicele 1 indică concentraţiile maxime recomandate unui anumit număr de parametri, privind apa folosită la experiment, dulce şi marină.
      Pe toată perioada testării, apa trebuie să fie de calitate constantă. pH-ul se aduce la valori cuprinse între 6,0 şi 8,5, însă pentru un experiment dat, pH-ul trebuie să rămână în interiorul unei plaje de ±0,5 unităţi de pH. Pentru a avea siguranţa că apa de diluţie nu influenţează rezultatele studiului (de exemplu, prin complexarea substanţei testate) sau că nu afectează negativ performanţele stocului de peşti, se vor preleva în mod regulat, eşantioane pentru analiză. De exemplu, este convenabil de făcut aceasta o dată la trei luni, interval în care o apă de diluţie îşi păstrează calităţile, relativ constante; se determină metalele grele (de exemplu: Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), anionii şi cationii principali (de exemplu: Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidele (de exemplu: cele organofosforice totale şi cele organoclorurate totale), carbonul organic total şi solidele aflate în suspensie. Dacă se demonstrează constanţa calităţilor apei, pe parcursul a cel puţin un an, aceste analize se pot rări, iar intervalele dintre ele pot fi distanţate (de exemplu, la şase luni).
      Conţinutul în particule naturale, precum şi în carbon organic total (TOC) din apa de diluţie, vor fi cât mai mici posibil, pentru a evita absorbţia substanţei testate în materiile organice, ceea ce i-ar putea reduce biodisponibilitatea (4). Valoarea maximă admisă este de 5 mg/l, pentru particulele de materie (materia uscată nu trece printr-un filtru de 0,45 μm) şi de 2 mg/l, pentru carbonul organic total (a se vedea apendicele 1). Dacă este necesar, apa se va filtra înainte de utilizare. De asemenea, contribuţiile peştilor testaţi (excreţii), a reziduurilor alimentare, ca şi conţinutul apei în carbon organic total – trebuie să fie cât mai mici posibil. De-a lungul întregului experiment, concentraţia în carbon organic din recipient, nu trebuie să depăşească cu mai mult de 10 mg/l (± 20 %), concentraţia de carbon organic provenit din substanţa testată şi, eventual, pe cea a agentului de dizolvare.
      1.7.3.   Soluţii de testat
      
      Se prepară o soluţie stoc de substanţă de testat, la concentraţia dorită. De preferinţă, soluţia stoc va fi preparată prin simpla amestecare ori agitare a substanţei testate, în apa de diluţie. Nu este recomandată utilizarea solvenţilor sau a dispersanţilor (agenţi de dizolvare); se poate totuşi recurge la aceştia, în anumite situaţii, pentru producerea soluţiei stoc, la concentraţia necesară. Solvenţii susceptibili a fi utilizaţi sunt: etanol, metanol, eterul monometilic de etilen glicol, eterul dimetilic de etilen glicol, dimetilformamida şi trietilen glicolul. Dispersanţii utilizabili sunt: Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloză 0,01 % şi HCO-40. Se vor lua măsuri de precauţie în cazul utilizării agenţilor uşor biodegradabili, aceştia putând provoca probleme de creştere bacteriană în testele cu reînnoire continuă. Substanţa testată poate fi marcată radioactiv şi trebuie să aibă cea mai mare puritate posibilă (de exemplu, de preferinţă, > 98 %).
      Pentru experimentele cu reînnoire continuă, se va utiliza aparatură care să aducă şi să dilueze în permanenţă, soluţia stoc de substanţă testată (cum ar fi: pompe dozatoare, diluator proporţional, sistem saturator), pentru a aduce concentraţiilor experimentale până la recipiente. Trebuie prevăzute minimum cinci volume de înlocuitor pe zi, pentru fiecare incintă experimentală. Se optează pentru metoda cu reînnoire continuă, însă dacă aplicarea acesteia devine imposibilă (de exemplu, organismele din cadrul experimentului suferă efecte nefaste), se poate recurge la o tehnică semistatică, în cazul în care criteriile de validare rămân satisfăcătoare. Debitul soluţiilor stoc şi al apei de diluţie va fi controlat cu 48 de ore înainte de experiment, iar în cursul derulării acestuia, cel puţin zilnic. Controlul comportă determinarea debitului în fiecare incintă experimentală, având grijă ca acesta să nu difere cu mai mult de 20 %, pentru fiecare dintre ele.
      1.7.4.   Alegerea speciilor
      
      Printre criteriile importante de alegere a speciilor, figurează cel al facilităţii de procurare, dimensiunea şi posibilitatea întreţinerii uşoare în laborator. De asemenea, speciile de peşti se aleg în funcţie de importanţa lor în materie de distracţii, comerţ sau ecologie. Speciile de peşti trebuie să fie de sensibilitate comparabilă, care au produs rezultate bune anterior etc.
      În apendicele 2 se află o listă de specii recomandate pentru experienţe. Pot fi utilizate şi alte specii, însă atunci procedura experimentală ar putea avea nevoie de adaptări, pentru a se determina condiţii de testare adecvate. Într-un asemenea caz, se expun motivaţiile alegerii speciilor şi a metodei de testare folosite.
      1.7.5.   Păstrarea peştilor
      
      Populaţia de peşti trebuie aclimatizată timp de cel puţin două săptămâni, în apă aflată la temperatura experimentală, oferindu-li-se hrană suficientă şi de acelaşi tip cu cea folosită în cursul experimentului.
      După o perioadă de instalare de 48 de ore, se înregistrează rata mortalităţii, aplicându-se următoarele criterii:
      
                  —
               
               
                  mortalitate mai mare de 10 % din populaţie, în şapte zile: se renunţă la întregul lot;
               
            
                  —
               
               
                  mortalitate cuprinsă între 5 şi 10 % din populaţie, în şapte zile: se prelungeşte perioada de aclimatare cu şapte zile;
               
            
                  —
               
               
                  mortalitate mai mică de 5 % din populaţie, în şapte zile: se acceptă lotul – dacă mortalitatea depăşeşte 5 % în următoarele şapte zile, se renunţă la întregul lot.
               
            Peştii utilizaţi pentru experimente nu trebuie să prezinte maladii şi nici anomalii observabile. Se elimină toţi peştii bolnavi. Peştii nu vor fi trataţi contra niciunei maladii, două săptămâni înaintea experimentului şi nici în cursul acestuia.
      1.8.   DESFĂŞURAREA TESTULUI
      1.8.1.   Testul preliminar
      
      Se poate dovedi utilă o experimentare preliminară, pentru optimizarea condiţiilor de execuţie ale experimentului real, în ceea ce priveşte, de exemplu, selecţia concentraţiilor substanţei testate, duratele fazelor de absorbţie şi de eliminare.
      1.8.2.   Condiţii de expunere
      
      1.8.2.1.   Durata fazei de absorbţie
      
      Se poate estima durata fazei de absorbţie, cu ajutorul unei experienţe preliminare (de exemplu, plecând de la un studiu anterior sau de la un produs chimic cu proprietăţi de acumulare) sau pornind de la anumite relaţii empirice, bazate pe ceea ce se cunoaşte despre solubilitatea în apă ori folosind coeficientul de partiţie octanol/apă, al substanţei testate (a se vedea apendicele 3).
      Faza de absorbţie va dura 28 de zile, exceptând cazul în care se poate demonstra că a fost atins un echilibru mai devreme. Dacă nu se ajunge la o stare staţionară în decurs de 28 de zile, faza de echilibru se va prelungi şi se vor face alte măsurători, până la obţinerea stării staţionare sau timp de 60 de zile (are întâietate alternativa cea mai scurtă).
      1.8.2.2.   Durata fazei de eliminare
      
      În general, jumătate din durata fazei de absorbţie este suficient pentru a se produce o reducere convenabilă (de exemplu, 95 %) a conţinutului corporal în substanţă testată (a se vedea explicaţiile privind estimarea, în apendicele 3). Dacă timpul necesar pentru realizarea unei pierderi de 95 % este prea lung, depăşind, de exemplu, de două ori durata fazei de absorbţie (adică mai mare de 56 de zile), se poate opta pentru o perioadă mai scurtă (respectiv, până ce concentraţia substanţei testate devine mai mică cu 10 % din concentraţia stării staţionare). Totuşi, pentru substanţele având scheme de absorbţie şi eliminare mai complexe decât modelul peştilor în compartiment unic, după o cinetică de ordinul întâi, se utilizează faze de epurare mai lungi, pentru determinarea constantelor de viteză de eliminare. Această perioadă de timp poate fi totuşi controlată prin intermediul perioadei în care concentraţia substanţei testate din peşti se situează deasupra limitei de detecţie analitice.
      1.8.2.3.   Numărul de peşti pentru experiment
      
      Alegerea numărului de peşti pentru concentraţia experimentală, se face astfel încât să fie disponibili cel puţin patru peşti per eşantion, la fiecare eşantionare. Dacă se doreşte o statistică mai performantă, numărul peştilor per eşantion va fi mărit.
      Dacă se folosesc peşti adulţi, se va indica dacă sunt masculi sau femele ori dacă ambele sexe servesc experimentului. În această ultimă situaţie, înainte de a începe expunerea, trebuie verificat ca diferenţele de conţinut lipidic să nu fie semnificative; s-ar putea dovedi necesară utilizarea de loturi distincte de masculi şi femele.
      Toate experienţele se fac utilizând peşti de greutate asemănătoare, în sensul că cei mai mici nu vor avea o greutate mai mică decât 2/3 din cea a peştilor celor mai mari. Toţi vor aparţine aceleiaşi clase de vârstă şi vor proveni din aceeaşi sursă. Greutatea şi vârsta unui peşte, având aparent efecte notabile asupra valorilor BCF (1), aceste informaţii vor fi înregistrate cu precizie. Este indicat ca un sub-eşantion din populaţia de peşti să fie cântărit înainte de experiment, pentru estimarea greutăţii medii.
      1.8.2.4.   Încărcarea
      
      Raporturile apă/peşti se măresc, în scopul de a minimiza scăderea CW datorită adăugării peştilor, la începutul experimentului, dar şi pentru a evita diminuarea concentraţiei în oxigen dizolvat. Este important ca regimul de încărcare să fie adaptat speciei utilizate pentru experiment. Un regim de încărcare de 0,1-1,0 g de peşte (produs viu) la litru de apă şi pe zi, este cel recomandat pentru toate cazurile experimentale. Se pot realiza încărcări mai rapide, dacă se demonstrează că se poate ajusta concentraţia necesară de substanţă testată, în limitele de ± 20 % şi că, de asemenea, concentraţia oxigenului dizolvat, nu coboară sub 60 % din nivelul de saturare.
      La alegerea regimului de încărcare, se va ţine cont de habitatul normal al speciei. De exemplu, peştii bentonici pot necesita un acvariu cu suprafaţa fundului mai mare, spre deosebire de speciile pelagice, la acelaşi volum de apă.
      1.8.2.5.   Alimentaţia
      
      Pe parcursul perioadelor de alimentare şi experimentale, peştii vor fi hrăniţi după un regim adecvat, cu un conţinut cunoscut în lipide şi proteine totale, în cantitate suficientă menţinerii peştilor în stare bună de sănătate, astfel încât greutatea lor corporală să se conserve. Peştii vor fi alimentaţi zilnic, în perioadele de aclimatare şi în cele experimentale, cu raţii de aproximativ 1-2 % din greutatea lor corporală. Astfel, pentru cea mai mare parte dintre specii, se menţine concentraţia lipidică la un nivel relativ constant, de-a lungul experimentului. Cantitatea de hrană trebuie recalculată o dată pe săptămână, de exemplu, pentru menţinerea greutăţii corporale şi a conţinutului lipidic la un nivel consistent. Pentru acest calcul, greutatea peştilor din fiecare incintă experimentală se va estima pornind de la greutatea peştilor eşantionaţi cel mai recent, din respectiva incintă. Nu se cântăresc peştii rămaşi în incintă.
      Hrana neconsumată şi excrementele vor fi evacuate zilnic, prin sifonarea incintelor experimentale, la puţin timp după alimentare (30 minute-1 oră). Incintele vor fi menţinute cât mai curate posibil, în cursul întregului experiment, astfel încât concentraţia de materie organică să fie cât mai mică, deoarece prezenţa carbonului organic poate limita biodisponibilitatea substanţei testate (1).
      Numeroase alimente fiind derivate din făină de peşte, acestea vor fi analizate pentru determinarea conţinutului în substanţă testată. De asemenea, trebuie analizat conţinutul hranei în pesticide şi metale grele.
      1.8.2.6.   Iluminare şi temperatură
      
      În general, fotoperioada este de 12-16 ore, la temperatura (± 2 oC) corespunzătoare speciei utilizate (a se vedea apendicele 2). Tipul şi caracteristicile iluminării vor fi clar definite. Se va ţine seama de eventualele fototransformări ale substanţei testate, în condiţiile de iradiere ale studiului. Iluminarea nu trebuie să expună peştii la fotoproduse nenaturale. În anumite cazuri, poate fi esenţială utilizarea de filtre, pentru blocarea radiaţiei UV mai mică de 290 nm.
      1.8.2.7.   Concentraţii experimentale
      
      Peştii sunt expuşi la o reînnoire continuă de cel puţin două concentraţii apoase ale substanţei testate. În mod normal, concentraţia mare (sau cea mai mare) a substanţei testate, este stabilită la aproximativ 1 % din CL50 acută asimptotică şi de cel puţin 10 ori mai mare decât limita sa de detecţie în apă, prin metoda de analiză aleasă.
      Cea mai mare concentraţie testată poate fi stabilită şi împărţind CL50 la 96 ore, printr-un raport procentual adecvat acut/cronic (rapoartele procentuale adecvate ale anumitor produşi chimici pot varia de la 3 la 100). Dacă este posibil, se alege altă concentraţie (alte concentraţii), astfel încât diferenţa faţă de cea căreia îi este superioară, să atingă un factor zece. Dacă este imposibil, din cauza criteriului de 1 % al CL50 şi a limitei analitice, poate fi utilizat un factor inferior celui de zece sau se poate accepta intervenţia unei substanţe marcate radioactiv cu 14C. Niciuna dintre concentraţiile utilizate nu va depăşi solubilitatea substanţei testate.
      Atunci când se utilizează un agent de dizolvare, concentraţia acestuia nu va depăşi 0,1 ml/l şi trebuie să fie aceeaşi, în toate recipientele pentru experiment. Contribuţia sa, adăugată celei a substanţei testate, la conţinutul global de carbon organic din apa pentru experiment, trebuie să fie cunoscute. Totuşi, se va face tot posibilul să nu se recurgă la astfel de materiale.
      1.8.2.8.   Martori
      
      Apă de diluţie martor sau, dacă este necesar, un martor conţinând agentul de dizolvare va fi disponibil pentru seria de teste, în măsura în care a fost stabilit că agentul nu are niciun efect asupra peştilor. În caz contrar, se vor folosi doi martori.
      1.8.3.   Frecvenţa de măsurare a calităţii apei
      
      În cursul experimentului, oxigenul dizolvat, COT, pH-ul şi temperatura vor fi măsurate în toate recipientele. Duritatea totală şi eventual, salinitatea, vor fi măsurate pe martori şi la un recipient cu conţinutul având concentraţia mare (cea mai mare). Oxigenul dizolvat şi eventual, salinitatea vor fi măsurate de cel puţin trei ori – la începutul, mijlocul şi sfârşitul perioadei de absorbţie – şi cel puţin o dată pe săptămână, în perioada de eliminare. TOC se va măsura la începutul experimentului (24 şi 48 ore înainte de demararea fazei de absorbţie), înainte de adăugarea peştilor şi cel puţin o dată pe săptămână, în perioadele de absorbţie şi de eliminare. Temperatura se va măsura zilnic, pH-ul – la începutul şi la sfârşitul fiecărei perioade – iar duritatea, o dată pentru fiecare experiment. De preferinţă, temperatura va fi supravegheată continuu, cel puţin într-unul dintre recipiente.
      1.8.4.   Eşantionarea şi analiza peştilor şi a apei
      
      1.8.4.1.   Programarea eşantionării peştilor şi a apei
      
      Se va preleva apă din incintele experimentale, pentru determinarea concentraţiei substanţei testate, înainte de adăugarea peştilor şi în cursul fazelor de absorbţie şi de epurare. Ca un minim, apa va fi prelevată în acelaşi timp cu prelevarea peştilor şi înainte de hrănirea lor. În timpul fazei de absorbţie, concentraţiile de substanţă testată se determină pentru a verifica dacă ele satisfac criteriile de validitate.
      În cursul fazei de absorbţie, peştii sunt eşantionaţi de cel puţin cinci ori, iar în timpul fazei de epurare, de cel puţin patru ori. Uneori este dificil de calculat o valoare estimativă rezonabil de precisă pentru BCF, pe baza acestui număr de eşantioane, în special atunci când nu urmează o cinetică simplă de epurare, de ordinul întâi. În acest caz, se pot realiza eşantionările mai frecvent, pentru cele două perioade (a se vedea apendicele 4). Eşantioanele suplimentare sunt stocate şi analizate numai dacă rezultatele primei serii de analize se dovedesc insuficiente pentru calculul BCF cu precizia dorită.
      În apendicele 4 se găseşte un exemplu de calendar acceptabil de eşantionare. Altele pot fi determinate cu uşurinţă, pe baza valorilor presupuse ale Pow, pentru a calcula timpul de expunere, corespunzător unei absorbţii de 95 %.
      Se continuă eşantionarea în cursul fazei de absorbţie, până la obţinerea unei stări staţionare sau timp de 28 de zile, optându-se pentru varianta cea mai scurtă. Dacă nu se obţine o stare staţionară după 28 de zile, eşantionare continuă până la obţinerea unei astfel de stări sau timp de 60 de zile, optându-se pentru alternativa cea mai scurtă. Înainte de începerea fazei de eliminare, peştii se transferă în rezervoare curate.
      1.8.4.2.   Eşantionajul şi prepararea eşantioanelor
      
      Se prelevează eşantioane de apă pentru analize, de exemplu prin sifonare cu ajutorul unui tub inert, într-un punct central al incintei experimentale. Întrucât se pare că fracţiile non biodisponibile de substanţă testată, nu pot fi separate de cele biodisponibile – nici prin filtrare şi nici prin centrifugare – (în particular, în cazul produselor chimice super-lipofile, adică cele care au log Pow > 5) (1) (5), se poate renunţa la supunerea eşantioanelor la astfel de tratamente.
      În schimb, trebuie avut grijă ca rezervoarele să fie cât mai curate posibil, iar conţinutul în carbon organic va fi supravegheat pe întreaga durată a fazelor de absorbţie şi de eliminare.
      Un număr convenabil de peşti (în mod normal, cel puţin patru), se prelevează din fiecare incintă experimentală, pentru fiecare eşantionare. Peştii prelevaţi vor fi clătiţi rapid cu apă, uscaţi cu ajutorul hârtiei absorbante şi sacrificaţi în mod instantaneu, într-o manieră cât mai umană posibil, după care se cântăresc.
      Este preferabil să se analizeze peştii şi apa, imediat după eşantionare, pentru a se evita orice degradare sau alte pierderi şi pentru a calcula în mod aproximativ regimurile de absorbţie şi de purificare, în vreme ce experimentul continuă să se desfăşoare. De asemenea, analiza imediată evită întârzierea constatării atingerii unui platou.
      În lipsa unei analize imediate, eşantioanele se vor conserva după o metodă convenabilă. Înainte de începerea studiului, se vor aduna toate datele cu privire la metodele de stocare adecvate substanţei testate; de exemplu: congelare, menţinere la 4 oC, durata stocării, extracţia etc.
      1.8.4.3.   Calitatea metodei analitice
      
      Integralitatea procedurii fiind determinată, în principal, de exactitatea, precizia şi sensibilitatea metodei analitice utilizate pentru substanţa testată, trebuie controlat în mod experimental, ca precizia şi reproductivitatea analizei chimice, precum şi recuperarea substanţei testate – atât din apă cât şi din peşti – să fie pe deplin satisfăcătoare, în cazul particular al respectivei metode. De asemenea, se are în vedere ca substanţa testată să nu fie detectabilă în apa de diluţie folosită.
      Dacă este necesar, valorile pentru Cw şi Cf, derivate din experiment, vor fi corectate după compararea cu valorile furnizate de martori şi cu concentraţia naturală a substanţei testate. Pe tot parcursul testării, eşantioanele de peşti şi de apă sunt astfel manipulate încât să se minimizeze contaminările şi pierderile (rezultate, de exemplu, de absorbţia prin materialul de eşantionare).
      1.8.4.4.   Analiza eşantioanelor de peşti
      
      Dacă se utilizează materiale marcate radioactiv, se poate analiza marcajul radioactiv total (respectiv, compuşii de origine şi metaboliţii) sau purifica eşantioanele, astfel încât compusul de origine să poată fi analizat separat. În plus, principalii metaboliţi pot fi caracterizaţi fie la starea staţionară, fie la sfârşitul fazei de absorbţie, optându-se pentru varianta cea mai scurtă. Dacă BCF, în funcţie de reziduurile marcate radioactiv totale, este ≥ 1 000 %, ar fi indicat (şi, pentru anumite categorii de produse chimice, cum ar fi pesticidele, chiar recomandat cu tărie), să se identifice şi cuantifice produsele de degradare reprezentând ≥ 10 % reziduuri totale în ţesuturile peştilor, în starea staţionară. Dacă aceste produse reprezintă ≥ 10 % reziduuri totale marcate radioactiv, în ţesuturile peştilor, ele vor fi identificate şi cuantificate; apoi, este recomandat ca acestea să fie identificate şi cuantificate, de asemenea, în apa pentru experiment.
      În general, concentraţia substanţei testate trebuie să fie determinată pentru fiecare peşte cântărit. Dacă nu este posibil, se pot pune în comun eşantioanele la fiecare testare, însă această metodă restrânge veridicitatea procedurilor statistice a rezultatelor. Dacă o anumită procedură şi o fineţe statistică specifică sunt urmărite, va fi convenabil să se folosească în experiment, un număr adecvat de peşti, pentru satisfacerea procedurii de regrupare şi precizia statistică dorită (6) (7).
      BCF-ul va fi exprimat atât în funcţie de greutatea totală de produs viu, cât şi pentru substanţele puternic lipofile, în funcţie de conţinutul lipidic. Conţinutul lipidic al peştilor se determină, dacă este posibil, la fiecare eşantionare. Pentru stabilirea conţinutului lipidic, se vor utiliza metode bine adaptate (referinţele 8 şi 2 ale apendicelui 3). Se recomandă tehnici de extracţie prin cloroform/metanol, ca metode standard (9). Metodele nu oferă rezultate identice (10), motiv pentru care este important să se precizeze care metodă s-a utilizat. Analiza lipidelor se va face, pe cât posibil, pe aceleaşi extracte consacrate şi pentru analiza substanţei testate, întrucât, adesea, lipidele trebuie scoase din extras înainte de a-l putea analiza prin cromatografie. Conţinutul lipidic al peştilor (în mg/kg de produs proaspăt), la sfârşitul experienţei, nu trebuie să difere faţă de cel iniţial, cu mai mult de ± 25 %. De asemenea, se va indica procentajul de solide din ţesuturi, pentru a permite conversia concentraţiei lipidice a bazei umede, la cea a bazei uscate.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Curba de absorbţie a substanţei testate va rezulta din traseul concentraţiei sale în funcţie de timp, la/în peşti (sau în ţesuturile specifice), în perioada fazei de absorbţie, folosind o scară aritmetică. Dacă curba atinge un platou, adică adoptă aproximativ un traseu asimptotic la axa timpului, starea staţionară BCFSS se va calcula, după cum urmează:
      
         
      Atunci când nu se obţine nicio stare staţionară, rămâne posibilitatea calculării unui BCFss de o precizie suficientă pentru evaluarea riscurilor, pornind de la o „stare staţionară” la 80 % (1,6/k2) sau 95 % (3,0/k2) de echilibru.
      În plus, factorul de concentrare (BCFk) va fi definit ca raport k1/k2 de două constante cinetice de ordinul întâi. Constanta de viteză de eliminare (k2) se determină, în general, plecând de la curba de eliminare (adică de la un traseu al descreşterii concentraţiei substanţei testate din peşti, în funcţie de timp). Apoi, constanta de viteză de absorbţie (k1) va fi calculată în funcţie de k2 şi de o valoare a Cf derivată din curba de absorbţie (a se vedea şi apendicele 5). Metoda cea mai bună pentru obţinerea BCFk şi a constantelor de viteză k1 şi k2 este aceea care recurge la metode informatice neliniare de estimare a parametrilor (11). Alternativ, se pot utiliza metode grafice pentru calculul k1 şi k2. Dacă curba de purificare se dovedeşte a nu fi de ordinul întâi, trebuie utilizate modele mai complexe (a se vedea referinţele din apendicele 3) şi să se ceară opinia unui biostatistician.
      2.2.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Rezultatele se vor interpreta cu precauţie, atunci când concentraţiile măsurate de soluţie experimentală se află la valori apropiate de limita de detecţie a metodei de analiză.
      Claritatea cu care sunt definite curbele de absorbţie şi de eliminare, dovedeşte buna calitate a datelor de bioconcentrare. Variaţia constantelor de absorbţie/eliminare, între cele două concentraţii experimentale, trebuie să fie mai mică de 20 %. Diferenţele considerabile observate la ratele de absorbţie/eliminare, între cele două experimente de concentrare, vor fi înregistrate şi explicate, dacă este posibil. În general, limita de încredere pentru BCF se apropie de ± 20 %, în studiile bine concepute.
      3.   RAPORT
      Procesul verbal al testării va cuprinde informaţiile următoare:
      3.1.   SUBSTANŢA TESTATĂ:
      
                  —
               
               
                  natura fizică şi, eventual, proprietăţile fizico-chimice;
               
            
                  —
               
               
                  date de identificare chimică (inclusiv conţinutul în carbon organic, dacă este necesar);
               
            
                  —
               
               
                  în cazul marcării radioactive, poziţia precisă a atomului (atomilor) marcat (marcaţi) şi procentajul de radioactivitate asociată impurităţilor.
               
            3.2.   SPECIILE UTILIZATE:
      
                  —
               
               
                  denumire ştiinţifică, suşă, sursă, orice tratament prealabil eventual, aclimatare, vârstă, gama de dimensiuni etc.
               
            3.3.   CONDIŢII DE TESTARE:
      
                  —
               
               
                  procedura utilizată (de exemplu, reînnoirea continuă sau semistatică);
               
            
                  —
               
               
                  tipul şi caracteristicile iluminării utilizate şi fotoperioada (fotoperioadele);
               
            
                  —
               
               
                  conceptul experimental (de exemplu, numărul şi dimensiunea incintelor experimentale, regimul de înlocuire al volumelor de apă, numărul de subeşantioane şi de peşti per subeşantion, număr de concentraţii testate, durata fazelor de absorbţie şi de epurare, frecvenţa eşantionării pentru peşti şi pentru apă);
               
            
                  —
               
               
                  metoda de preparare a soluţiilor mamă şi frecvenţa de reînnoire (agentul de dizolvare, concentraţia sa şi contribuţia sa la conţinutul în carbon organic al apei pentru experienţă – vor fi menţionate, dacă este cazul);
               
            
                  —
               
               
                  concentraţiile experimentale nominale, mediile valorilor măsurate şi deviaţia standard a acestora în recipientele experimentale, precum şi metoda de obţinere;
               
            
                  —
               
               
                  sursa de apă de diluţie, descrierea tuturor tratamentelor prealabile, rezultatele tuturor demonstraţiilor de aptitudine a peştilor de supravieţuire în această apă şi caracteristicile apei: pH, duritate, temperatură, concentraţia în oxigen dizolvat, nivelul clorului rezidual (dacă este măsurat), carbonul organic total, solide în suspensie, salinitatea mediului experimental (dacă este cazul) şi orice alte măsurători făcute;
               
            
                  —
               
               
                  calitatea apei în recipientele experimentale, pH, duritate, temperatura şi concentraţia în oxigen dizolvat;
               
            
                  —
               
               
                  informaţii precise legate de alimentaţie (de exemplu, tipul de hrană, sursă, compoziţie – cel puţin conţinutul în lipide şi proteine dacă este posibil, cantitatea dată şi frecvenţa);
               
            
                  —
               
               
                  informaţii legate de tratamentul peştilor şi al apei eşantionate, inclusiv detalii de preparare, stocare, extracţie, proceduri (şi precizia) de analiză a substanţei testate şi conţinutul în lipide (dacă s-a măsurat).
               
            3.4.   REZULTATE:
      
                  —
               
               
                  rezultatele studiilor preliminare efectuate;
               
            
                  —
               
               
                  mortalitatea peştilor martor şi a peştilor din fiecare incintă experimentală, precum şi orice comportament anormal observat;
               
            
                  —
               
               
                  conţinutul lipidic al peştilor (dacă a fost determinat cu ocazia experimentului);
               
            
                  —
               
               
                  curbele (din toate măsurătorile efectuate) exprimând absorbţia şi eliminarea produselor chimice experimentale la peşti, timpul de acces la starea staţionară;
               
            
                  —
               
               
                  Cf şi Cw (cu deviaţia standard şi, eventual, intervalul) la momentul fiecărei eşantionări [Cf se exprimă în μg/g de produs viu (ppm), din întreg peştele sau din anumite ţesuturi; de exemplu, lipidele şi Cw se exprimă în μg/ml (ppm)]. Valorile Cw pentru seria martor (de asemenea, se indică concentraţia de bază);
               
            
                  —
               
               
                  factorul de bioconcentrare în starea staţionară (BCFss) şi/sau factorul de concentrare cinetică (BCFk) şi, dacă este cazul, limitele de încredere la 95 % ale constantelor de viteză de absorbţie şi de eliminare (pierdere), toate exprimate în raport cu întregul corp şi cu conţinutul total de lipide, dacă acesta este măsurat, ale peştelui (ori ale anumitor ţesuturi), limitele de încredere şi deviaţia standard (dacă este disponibilă), metode de calcul/analiză ale rezultatelor, pentru fiecare concentraţie a substanţei test utilizate;
               
            
                  —
               
               
                  atunci când se folosesc substanţe marcate radioactiv, poate fi semnalată acumularea tuturor metaboliţilor, dacă este necesar;
               
            
                  —
               
               
                  toate situaţiile neobişnuite legate de experiment, toate devierile de la aceste proceduri şi orice alte informaţii pertinente.
               
            Se minimizează rezultatele de tipul „nedetectabil la limita de detecţie”, prin folosirea unei metode experimentale preliminare şi elaborarea unui concept experimental, deoarece astfel de rezultate sunt inutile pentru calculul constantelor de viteză.
      4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Connell D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, p. 117-156.
               
            
                  2.
               
               
                  Bintein S., Devillers, J. and Karcher W. (1993). Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, 29-390.
               
            
                  3.
               
               
                  OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals No 3.
               
            
                  4.
               
               
                  Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: Comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
               
            
                  5.
               
               
                  US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Doc. for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.
               
            
                  6.
               
               
                  US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher’s Lane, Rockville, MD 20852, July 1975
               
            
                  7.
               
               
                  US EPA (1974). Section 5, A(1) Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.
               
            
                  8.
               
               
                  Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulatio” Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, Haga, Olanda.
               
            
                  9.
               
               
                  Gardner et al., (1995) Limn. & Oceanogr. 30, 1099-1105.
               
            
                  10.
               
               
                  Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, p. 1431-1436.
               
            
                  11.
               
               
                  CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method – Ring Test Programme, 1984-1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm.
               
            
                  12.
               
               
                  ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988) Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
               
            
         Apendicele 1
         Caracteristici chimice acceptabile ale apei de diluţie
         
                      
                  
                  
                     Substanţa
                  
                  
                     Concentraţia-limită
                  
               
                     1
                  
                  
                     Particule insolubile
                  
                  
                     5 mg/l
                  
               
                     2
                  
                  
                     Carbon organic total
                  
                  
                     2 mg/l
                  
               
                     3
                  
                  
                     Amoniac neionizat
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     4
                  
                  
                     Clor rezidual
                  
                  
                     10 μg/l
                  
               
                     5
                  
                  
                     Pesticide organofosforice totale
                  
                  
                     50 ng/l
                  
               
                     6
                  
                  
                     Pesticide organofluorurate totale + policlorobifenili
                  
                  
                     50 ng/l
                  
               
                     7
                  
                  
                     Clor organic total
                  
                  
                     25 ng/l
                  
               
                     8
                  
                  
                     Aluminiu
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     9
                  
                  
                     Arsen
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     10
                  
                  
                     Crom
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     11
                  
                  
                     Cobalt
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     12
                  
                  
                     Cupru
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     13
                  
                  
                     Fier
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     14
                  
                  
                     Plumb
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     15
                  
                  
                     Nichel
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     16
                  
                  
                     Zinc
                  
                  
                     1 μg/l
                  
               
                     17
                  
                  
                     Cadmiu
                  
                  
                     100 ng/l
                  
               
                     18
                  
                  
                     Mercur
                  
                  
                     100 ng/l
                  
               
                     19
                  
                  
                     Argint
                  
                  
                     100 ng/l
                  
               
      
         Apendicele 2
         Specii de peşti recomandate pentru experimente
         
                      
                  
                  
                     Specii recomandate
                  
                  
                     Intervalul de temperatură recomandat pentru testare (oC)
                  
                  
                     Lungimea totală recomandată a animalului de experiență (cm)
                  
               
                     1
                  
                  
                     Danio rerio (17) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) Zebra
                  
                  
                     20-25
                  
                  
                     3,0±0,5
                  
               
                     2
                  
                  
                     Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque)
                  
                  
                     20-25
                  
                  
                     5,0±2,0
                  
               
                     3
                  
                  
                     Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) Crap
                  
                  
                     20-25
                  
                  
                     5,0±3,0
                  
               
                     4
                  
                  
                     Oryzias lapites (Teleostei, Poeciliidae) (Temmink and Schlegel) Medaka
                  
                  
                     20-25
                  
                  
                     4,0±1,0
                  
               
                     5
                  
                  
                     Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Guppy
                  
                  
                     20-25
                  
                  
                     3,0±1,0
                  
               
                     6
                  
                  
                     Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque) Biban-soare
                  
                  
                     20-25
                  
                  
                     5,0±2,0
                  
               
                     7
                  
                  
                     Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) Păstrăv curcubeu
                  
                  
                     13-17
                  
                  
                     8,0±4,0
                  
               
                     8
                  
                  
                     Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus) Ghidrin ţepos
                  
                  
                     18-20
                  
                  
                     3,0±1,0
                  
               În anumite ţări, au fost utilizate diverse specii marine şi de estuar, de exemplu:
         
                     
                        Leiostomus xanthurus
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        Cyprinodon variegatus
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        Menidia beryllina
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        Cymatogaster aggregata
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        Parophrys vetulus
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        Leptocottus armatus
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        Gasterosteus aculeatus
                     
                  
                  
                     Ghidrin ţepos
                  
               
                     
                        Dicentracus labrax
                     
                  
                  
                     Biban comun
                  
               
                     
                        Alburnus alburnus
                     
                  
                  
                     Obleţ
                  
               Recoltare
         Peştii de apă dulce, menţionaţi în tabelul de mai sus, sunt uşor de crescut şi/sau foarte disponibili, tot timpul anului, faţă de speciile marine sau de estuar, a căror disponibilitate este, în anumite ţări, limitată. Ei se reproduc şi trăiesc atât în fermele piscicole cât şi în laboratoare, în condiţiile în care maladiile şi paraziţii se află sub control; aşadar, animalele utilizate vor fi în stare bună de sănătate, cu ascendenţă genetică cunoscută. Pot fi găsiţi aproape în întreaga lume.
      
      
         Apendicele 3
         Estimarea duratei fazelor de absorbţie şi de eliminare
         1.   Prognoza pentru durata fazei de absorbţie
         Înainte de executarea testării, se poate estima k2 şi deci, un procentaj de timp necesar pentru a ajunge la starea staţionară, pornind de la relaţiile empirice între k2 şi coeficientul de separare n-octanol/apă (Pow) sau între k2 şi solubilitatea în apă (s).
         Se estimează k2 (zile–1) pornind, de exemplu, de la relaţia empirică următoare (1):
         
                     log10k2 = 0,414 log10(Pow) + 1,47 (r2 = 0,95)
                  
                  
                     (ecuaţia 1)
                  
               Pentru alte relaţii, a se vedea referinţa bibliografică 2.
         Dacă coeficientul de partiţie (Pow) nu este cunoscut, se va proceda la o estimare (3), plecând de la solubilitatea în apă (s) a substanţei, după cum urmează:
         
                     log10(Pow) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2 = 0,994)
                  
                  
                     (ecuaţia 2)
                  
               unde:
         s = solubilitatea (mol/l): (n = 36)
         Aceste relaţii se aplică numai produselor chimice, ale căror valori log Pow se situează între 2 şi 6,5 (4).
         Timpul necesar pentru atingerea unui anumit procentaj din starea staţionară va rezulta din ecuaţia cinetică generală, indicându-se absorbţia şi eliminarea (cinetica de ordinul I), prin aplicarea estimării k2:
         
            
         unde, dacă Cw este constant:
         
                     
                        
                  
                  
                     (ecuaţia 3)
                  
               Atunci când ne apropiem de starea staţionară (t → ∞), ecuaţia 3 se reduce (5) (6) la:
         
             sau Cf/Cw = k1/k2
             = BCF
         Raportul k1/k2 · Cw se apropie astfel de concentraţia substanţei din peşti, în „starea staţionară” (Cf, s).
         Aşadar, ecuaţia 3 poate fi transcrisă:
         
                     
                         sau 
                        
                  
                  
                     (ecuaţia 4)
                  
               Timpul necesar pentru atingerea unui anumit procentaj din starea staţionară poate fi prevăzut graţie ecuaţiei 4, atunci când k2 a fost în prealabil estimat cu ajutorul ecuaţiilor 1 sau 2.
         Cu titlu informativ, durata optimă statistică a fazei de absorbţie, care permite obţinerea de rezultate statistice acceptabile (BCFk), este perioada necesară pentru ca curba logaritmului concentraţiei de substanţă testată din peşti, trasată în funcţie de timp în scară lineară, să ajungă la punctul median, adică la 1,6/k2 sau la 80 % din starea staţionară, fără a depăşi 3,0/k2 sau 95 % din starea staţionară (7).
         Timpul până la atingerea a 80 % din starea staţionară este (ecuaţia 4):
         
                     
                         sau 
                        
                  
                  
                     (ecuaţia 5)
                  
               Similar, pentru 95 % din starea staţionară:
         
                     
                        
                  
                  
                     (ecuaţia 6)
                  
               De exemplu, durata fazei de absorbţie (abs.) a unei substanţe testate, având un log Pow = 4, va fi (folosind ecuaţiile 1, 5 şi 6):
         
                     log10k2 = -0,414.(4) + 1,47
                  
                  
                     k2 = 0,652 zile-1
                     
                  
               abs. (80 %) = 1,6/0,652 adică 2,45 zile (59 ore)
         sau abs. (95 %) = 3,0/0,652 adică 4,60 zile (110 ore)
         În acelaşi mod, pentru o substanţă testată cu s = 10–5 mol/l [log (s) = -5,0], durata de absorbţie va fi (folosind ecuaţiile 1, 2, 5 şi 6):
         log10 (Pow) = 0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02
         log10 K2 = 0,414 (5,02) + 1,47
         k2 = 0,246 zile -1
         
         abs. (80 %) = 1,6/0,246 adică 6,5 zile (156 ore)
         sau abs. (95 %) = 3,0/0,246 adică 12,2 zile (293 ore)
         De asemenea, se poate utiliza expresia alternativă:
         teq = 6,54 × 103 Pow + 55,31 (ore)
         pentru calculul timpului de atingere a stării staţionare (4).
         2.   Estimarea duratei fazei de eliminare
         Se poate estima, de asemenea, timpul necesar pentru ca substanţa testată ajunsă în corpul peştilor să se reducă la un anumit procentaj din concentraţia iniţială, graţie ecuaţiei generale, ilustrând absorbţia şi eliminarea (cinetica de ordinul I) (1) (8).
         Pentru faza de eliminare Cw este considerată nulă. Ecuaţia poate fi redusă la:
         
             sau 
         unde Cf, 0 este concentraţia la începutul perioadei de eliminare. Se va obţine apoi o eliminare de 50 %, la momentul (t50):
         
             sau 
         În acelaşi mod, 95 % din faza de eliminare va fi atinsă la:
         
            
         Dacă ne plasăm la 80 % din faza de absorbţie pentru prima perioadă (1,6/k2) şi la 95 % din pierderi pentru faza de eliminare (3,0/k2), atunci faza de eliminare este aproximativ dublul duratei fazei de absorbţie.
         Totuşi, este important de menţionat că aceste estimări se bazează pe ipoteza că schemele de absorbţie şi eliminare urmează o cinetică de ordinul întâi. Dacă nu este cazul, se vor folosi modele mai complexe (de exemplu, referinţa bibliografică 1).
         Bibliografie (pentru apendicele 3)
         
                     1.
                  
                  
                     Spacie A. and Hamelink J. L. (1982) Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, p. 309-320.
                  
               
                     2.
                  
                  
                     Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.
                  
               
                     3.
                  
                  
                     Chiou C. T. and Schmedding D. W. (1982) Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), p. 4-10.
                  
               
                     4.
                  
                  
                     Hawker D. W. and Connell D. W. (1988) Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), p. 701-707.
                  
               
                     5.
                  
                  
                     Branson D. R., Blau G.E., Alexander H. C. and Neely W. B. (1975) Transactions of the Aamerican Fisheries Society, 104 (4), p. 785-792.
                  
               
                     6.
                  
                  
                     Ernst W. (1985) Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehmann P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4.4 p. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N.Y.
                  
               
                     7.
                  
                  
                     Reilly P. M., Bajramovic R., Blau G. E., Branson D.R. and Sauerhoff M. W. (1977) Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, p. 614-622.
                  
               
                     8.
                  
                  
                     Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980) Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, p. 3-19.
                  
               
      
         Apendicele 4
         Exemple teoretice de grafice de eşantionare pentru testele de bioconcentrare ale substanţelor cu log Pow = 4
         
                     Prelevări de peşti
                  
                  
                     Calendar de eşantionare
                  
                  
                     Număr eşantioane de apă
                  
                  
                     Număr de peşti per eşantion
                  
               
                     Frecvenţa minimă cerută (zile)
                  
                  
                     Eşantionare suplimentară
                  
               
                     Faza de absorbţie
                  
                  
                     – 1
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                     2 (18)
                     
                     2
                  
                  
                     se adaugă 45-80 de peşti
                  
               
                     I
                  
                  
                     0,3
                  
                  
                     0,4
                  
                  
                     2
                     (2)
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     II
                  
                  
                     0,6
                  
                  
                     0,9
                  
                  
                     2
                     (2)
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     III
                  
                  
                     1,2
                  
                  
                     1,7
                  
                  
                     2
                     (2)
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     IV
                  
                  
                     2,4
                  
                  
                     3,3
                  
                  
                     2
                     (2)
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     V
                  
                  
                     4,7
                  
                  
                      
                  
                  
                     2
                  
                  
                     6
                  
               
                     Faza de epurare
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Peştii se transferă într-o apă care nu conţine produsul testat
                  
               
                     VI
                  
                  
                     5,0
                  
                  
                     5,3
                  
                  
                      
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     VII
                  
                  
                     5,9
                  
                  
                     7,0
                  
                  
                      
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     VIII
                  
                  
                     9,3
                  
                  
                     11,2
                  
                  
                      
                  
                  
                     4
                     (4)
                  
               
                     IX
                  
                  
                     14,0
                  
                  
                     17,5
                  
                  
                      
                  
                  
                     4
                     (6)
                  
               
                     Valorile dintre paranteze sunt numere de eşantioane (apă, peşti) care trebuie prelevate, dacă se procedează la o eşantionare suplimentară.
                     
                                 
                                    Notă
                                 
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 Estimarea înaintea experimentului a lui k2, pentru un log Pow = 4,0 este de 0,652 zile–1. Durata totală a experimentului este fixată la: 3 × abs. = 3 × 4,6 zile, adică 14 zile. Pentru estimarea „abs.” se utilizează apendicele 3.
                              
                           
               
      
         Apendicele 5
         Deosebirile dintre modele
         S-a presupus că majoritatea rezultatelor de bioconcentrare sunt „rezonabil” de bine descrise, printr-un model simplu cu două compartimente/doi parametri, respectiv printr-o curbă rectilinie ce reprezintă aproximativ punctele de măsură ale concentraţiilor de substanţă testată din peşti, în cursul fazei de eliminare, pe hârtie semilogaritmică. (Atunci când aceste puncte nu se pot reduce la o dreaptă, este indicat să se recurgă la modele mai complexe, a se vedea, de exemplu, Spacie and Hamelink, referinţa 1 din bibliografia apendicelui 3.)
         Metoda grafică pentru determinarea constantei de viteză de eliminare (pierdere) k2
         
         Se reprezintă, pe hârtie semilogaritmică, concentraţia substanţei testate, determinată la fiecare eşantion de peşti, conform graficului de eşantionare. Panta acestei drepte este k2.
         
            
         
            
         Atenţie: abaterile faţă de această linie dreaptă pot indica o schemă de eliminare mai complexă decât cinetica de ordinul întâi. O metodă grafică poate rezolva acest tip de eliminare care se abate de la cinetica de ordinul întâi.
         Metoda grafică pentru determinarea constantei de viteză de absorbţie k1
         
         k2 fiind determinat, se calculează k1 după cum urmează:
         
                     
                        
                  
                  
                     (ecuaţia 1)
                  
               Se citeşte valoarea Cf în punctul median al curbei de absorbţie netezite, aproximată cu o dreaptă, atunci când concentraţia logaritmică este trasată în funcţie de timp (pe o scară aritmetică).
         Metoda de calcul informatic a constantelor de viteză de absorbţie şi de eliminare (pierdere)
         Pentru obţinerea factorului de bioconcentrare şi a constantelor de viteză k1 şi k2, se vor utiliza de preferinţă metode informatice neliniare de estimare parametrică. Aceste programe determină valorile pentru k1 şi k2, utilizând un ansamblu de rezultate secvenţiale ale concentraţiei în timp, în funcţie de model:
         
                     
                         0 < t < tc
                  
                  
                     (ecuaţia 2)
                  
               
                     
                         t > tc
                  
                  
                     (ecuaţia 3)
                  
               unde tc = timpul la sfârşitul fazei de absorbţie.
         Această metodă furnizează estimarea deviaţiilor standard a k1 şi k2.
         Întrucât, în majoritatea cazurilor, se poate estima k2 pornind de la curba de eliminare, şi aceasta cu o precizie destul de mare, şi întrucât există o strânsă corelare între cei doi parametri k1 şi k2, este de dorit să se calculeze mai întâi k2, pornind numai de la datele de eliminare şi după aceea să se calculeze k1, de la datele de absorbţie, cu ajutorul unei regresii neliniare.
      
      C.14.   TESTUL DE CREŞTERE A PUIETULUI DE PEŞTE
      1.   METODĂ
      Metoda de testare a influenţei toxicităţii asupra creşterii reproduce Orientarea 215 (2000) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Acest test urmăreşte să evalueze efectele expunerii prelungite la produse chimice asupra creşterii puietului de peşte. Are la bază o metodă, elaborată şi intercalibrată (1) (2) în Uniunea Europeană, de evaluare a efectelor produselor chimice asupra puietului de păstrăv-curcubeu (Oncorynchus mykiss) în regim dinamic. Pot fi folosite şi alte specii, dacă au fost bine studiate. De exemplu, s-a câştigat experienţă din testele de creştere cu peştele-zebră (Danio rerio) (19) (3) (4) şi medaka (Oryzias latipes) (5) (6) (7).
      A se vedea şi Introducerea generală partea C.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Concentraţia minimă cu efect observabil (CMEO): este cea mai scăzută concentraţie testată a substanţei testate la care se constată un efect semnificativ (la p < 0,05) în comparaţie cu lotul martor. Toate concentraţiile mai mari decât CMEO trebuie să aibă efect nociv egal sau mai mare decât cel observat la CMEO.
      
         Concentraţia fără efecte observabile (CFEO): este concentraţia testată imediat sub valoarea CMEO.
      
         CE
         
            x
         : în această metodă de testare este concentraţia substanţei testate care provoacă o variaţie de x % în rata de creştere a peştelui în comparaţie cu lotul martor.
      
         Rata de încărcare: este greutatea peştelui pe unitatea de volum de apă.
      
         Densitatea populaţiei: este numărul de peşti pe unitatea de volum de apă.
      
         Rata de creştere specifică individuală: exprimă rata de creştere a unui individ, prin raportare la greutatea sa iniţială.
      
         Rata de creştere specifică medie a bazinului: exprimă rata de creştere medie a populaţiei din bazin la o concentraţie dată.
      
         Rata de creştere pseudospecifică: exprimă rata de creştere individuală raportată la greutatea iniţială medie a populaţiei din bazin.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Puietul piscicol aflat în faza de creştere exponenţială este pus, după ce este cântărit, în incintele experimentale şi expus la o gamă de concentraţii subletale din substanţa testată, dizolvată în apă, de preferinţă în regim dinamic sau, dacă nu este posibil, în condiţii semistatice adecvate (regim de curgere discontinuă) Durata testului este de 28 de zile. Peştii sunt hrăniţi zilnic. Raţia alimentară este în funcţie de greutăţile corporale iniţiale şi poate fi recalculată după 14 zile. La sfârşitul testului, peştii sunt cântăriţi din nou. Efectele asupra ratelor de creştere sunt analizate folosind un model de regresie, pentru a estima acea concentraţie care ar avea ca efect o variaţie a ratei de creştere de x %, adică a CEx (de exemplu CE10, CE20 sau CE30). O altă variantă este ca datele să fie comparate cu valorile lotului martor, în scopul de a determina concentraţia minimă cu efecte observabile (CMEO) şi, de aici, concentraţia fără efecte observabile (CFEO).
      1.4.   INFORMAŢII REFERITOARE LA SUBSTANŢA DE TESTARE
      Trebuie să fie disponibile rezultatele unui test de toxicitate acută (a se vedea metoda de testare C.1), de preferinţă efectuat cu speciile alese pentru acest test. Aceasta înseamnă că se cunosc solubilitatea în apă şi presiunea de vapori ale substanţei testate, precum şi că există o metodă analitică fiabilă şi disponibilă pentru cuantificarea substanţei în soluţii, a cărei precizie şi ale cărei limite de detecţie sunt cunoscute şi specificate în raport.
      Informaţiile utile cuprind: formula structurală, puritatea substanţei, stabilitatea în apă şi la lumină, pKa, Pow şi rezultatele testului de biodegradabilitate rapidă (a se vedea metoda de testare C.4).
      1.5.   VALIDITATEA TESTULUI
      Pentru ca testul să fie valid, trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
      
                  —
               
               
                  mortalitatea în lotul (loturile) martor nu trebuie să depăşească 10 % la sfârşitul testului;
               
            
                  —
               
               
                  greutatea medie a peştilor în lotul (loturile) martor trebuie să fi crescut suficient pentru a permite detectarea variaţiei minime a ratei de creştere considerată ca semnificativă. Un test de intercalibrare (2) a arătat că în cazul păstrăvului-curcubeu greutatea medie a peştelui în lotul martor trebuie să fi crescut în 28 de zile cu cel puţin jumătate (adică 50 %) din greutatea iniţială; de exemplu, greutatea iniţială: 1 g/peşte (= 100 %), greutatea finală, după 28 de zile: ≥ 1,5 g/peşte (≥ 150 %);
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia de oxigen dizolvat trebuie să fi fost pe toată durata testului de cel puţin 60 % din valoarea de saturaţie din aer (VSA);
               
            
                  —
               
               
                  temperatura apei trebuie să nu difere cu mai mult de ± 1 oC între bazine în niciun moment pe durata testului şi să fie menţinută într-un interval de 2 oC în intervalele de temperatură specificate pentru speciile de peşti (apendicele 1).
               
            1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Aparatură
      Echipamentul obişnuit de laborator şi în special următoarele:
      
                  —
               
               
                  pH-metru şi aparat de măsurare a oxigenului;
               
            
                  —
               
               
                  echipament pentru determinarea durităţii şi alcalinităţii apei;
               
            
                  —
               
               
                  aparatură adecvată pentru controlul temperaturii, de preferat cu supraveghere continuă;
               
            
                  —
               
               
                  bazine din material chimic inert şi de capacitate adaptată la încărcarea şi densitatea populaţiei recomandate (a se vedea punctul 1.8.5 şi apendicele 1);
               
            
                  —
               
               
                  balanţă de precizie adecvată (adică până la ±0,5 %).
               
            1.6.2.   Apa
      În test poate fi folosită orice apă în care specia testată prezintă o rată de supravieţuire şi de creştere pe termen lung corespunzătoare. Trebuie să fie de calitate constantă pe durata testului. Apa trebuie să aibă un pH în intervalul 6,5-8,5, dar pe durata unui test dat trebuie să se încadreze într-un interval de ±0,5 unităţi de pH. Se recomandă o duritate (în CaCO3) de peste 140 mg/l. Pentru ca apa de diluare să nu influenţeze în mod nepermis rezultatele testelor (de exemplu prin complexare cu substanţa testată), trebuie luate probe la intervale egale pentru analiză. Acolo unde se cunoaşte calitatea relativ constantă a apei de diluare, se măsoară la interval de trei luni conţinutul în metale grele (de exemplu: Cu, Pb, Zn, Hg, Cd şi Ni), anioni şi cationi principali (de exemplu: Ca, Mg, Na, K, Cl şi SO4), pesticide (de exemplu pesticide organofosforice totale şi pesticide organoclorice totale), carbon organic total, solide în suspensie. Dacă s-a demonstrat că apa are calitate constantă pe o perioadă de cel puţin un an, analizele se pot face la intervale mai mari (de exemplu la fiecare şase luni). Câteva caracteristici chimice ale unei ape de diluare acceptabile sunt enumerate în apendicele 2.
      1.6.3.   Soluţiile de lucru
      Soluţiile de lucru de concentraţii date se prepară prin diluarea unei soluţii de bază.
      Soluţia de bază se prepară de preferinţă prin simpla amestecare sau agitare a substanţei testate în apa de diluare, folosind mijloace mecanice (de exemplu cu agitator sau ultrasunete). Pentru obţinerea unei soluţii de bază cu o concentraţie corespunzătoare se pot folosi coloane de saturare (coloane de solubilitate).
      În unele cazuri, folosirea solvenţilor sau a agenţilor de dispersie poate fi necesară pentru a realiza soluţia de bază de concentraţie corespunzătoare. Exemple de solvenţi adecvaţi sunt acetona, etanolul, metanolul, dimetilsulfoxidul, dimetilformamida şi trietilenglicolul. Exemple de agenţi de dispersie adecvaţi sunt Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloză 0,01 % şi HCO-40. Folosirea compuşilor uşor biodegradabili (de exemplu acetona) şi a compuşilor foarte volatili trebuie să se facă atent, deoarece aceştia pot antrena proliferarea bacteriană în testele cu regim dinamic. Când se foloseşte agent de dispersie, acesta trebuie, în demonstraţia pe un lot martor tratat numai cu solventul, să nu provoace efecte semnificative asupra creşterii peştilor şi nici efecte adverse vizibile asupra puietului.
      La testele în regim dinamic este necesar un sistem care să distribuie şi să dilueze continuu soluţia de bază a substanţei testate (de exemplu pompă dozatoare, diluator proporţional, sistem de saturaţie) pentru a asigura seria concentraţiilor din incintele experimentale. Debitele soluţiilor de bază şi ale apei de diluare se verifică la intervale definite, de preferinţă zilnic, pe durata testului şi trebuie să nu varieze cu mai mult de 10 % pe parcursul întregului test. Un test de intercalibrare (2) a demonstrat că, în cazul păstrăvului-curcubeu, o frecvenţă a schimbării apei de 6 litri/g de peşte/zi este acceptabilă (a se vedea punctul 1.8.2.2).
      La testele în regim semistatic (regim dinamic discontinuu), frecvenţa schimbării apei depinde de stabilitatea substanţei testate, dar se recomandă schimbarea zilnică. Dacă testele de stabilitate preliminare (a se vedea punctul 1.4) arată o instabilitate a concentraţiei substanţei testate (adică în afara intervalului de 80-120 % din concentraţia nominală sau sub 80 % din concentraţia măsurată iniţial) pe parcursul schimbării apei, trebuie luată în considerare folosirea unui test în regim dinamic.
      1.6.4.   Alegerea speciilor
      Păstrăvul-curcubeu (Oncorynchus mykiss) este specia recomandată pentru acest test deoarece de această specie se leagă cea mai mare parte a experienţei câştigate în testele de intercalibrare (1) (2). Cu toate acestea, pot fi folosite şi alte specii, bine studiate, dar metoda experimentală s-ar putea să necesite adaptări, pentru a asigura condiţii de testare adecvate. De exemplu, există experienţă disponibilă şi cu peştele-zebră (Danio rerio) (3) (4) şi cu medaka (Oryzias latipes) (5) (6) (7). În acest caz, justificarea alegerii speciei şi a metodei de testare trebuie specificată în raport.
      1.6.5.   Îngrijirea peştilor
      Peştii de laborator trebuie aleşi din aceeaşi populaţie, de preferinţă din aceleaşi icre, care a fost îngrijită pentru cel puţin două săptămâni înainte de test în condiţii de calitate a apei şi de expunere la lumină similare cu acelea folosite la test. Peştii trebuie hrăniţi cu o raţie minimă zilnică reprezentând 2 % din greutatea corporală, de preferinţă 4 %, pe întreaga durată de îngrijire şi testare.
      După o perioadă de acomodare de 48 de ore, se înregistrează mortalitatea şi se aplică următoarele criterii:
      
                  —
               
               
                  mortalitate mai ridicată de 10 % din populaţie în şapte zile: se respinge întregul lot;
               
            
                  —
               
               
                  mortalitate între 5 % şi 10 % din populaţie: acomodare pentru încă şapte zile; dacă mortalitatea este peste 5 % în a doua perioadă de şapte zile, se respinge întregul lot;
               
            
                  —
               
               
                  mortalitate mai scăzută de 5 % din populaţie în şapte zile: se acceptă lotul.
               
            Peştii nu trebuie să primească tratament pentru boală în cele două săptămâni anterioare testului sau în timpul testului.
      1.7.   STRUCTURAREA TESTULUI
      „Structurarea testului” se referă la alegerea numărului şi a intervalelor de concentraţii testate, la numărul de bazine pentru fiecare nivel al concentraţiei şi la numărul de peşti pe bazin. În mod ideal, structurarea testului ia în considerare:
      
                  —
               
               
                  obiectivul studiului;
               
            
                  —
               
               
                  metoda de analiză statistică urmând a fi folosită;
               
            
                  —
               
               
                  disponibilitatea şi costul resurselor alocate.
               
            Enunţul obiectivului ar trebui, dacă este posibil, să specifice puterea statistică la care se cere să fie detectată mărimea unei diferenţe date (de exemplu în rata creşterii) sau, alternativ, precizia cu care se cere estimarea CEx (de exemplu cu x = 10, 20 sau 30 şi de preferinţă nu mai mic decât 10). În absenţa acestor informaţii, nu se poate indica în mod precis scara de desfăşurare a studiului.
      Este important să se accepte ideea că structurarea optimă (care foloseşte cel mai bine resursele) în raport cu o metodă de analiză statistică nu este în mod necesar optimă în raport cu altă metodă. Structurarea recomandată pentru estimarea CMEO/CFEO nu va fi aceeaşi cu cea recomandată pentru analiza prin regresie.
      În cele mai multe cazuri, analiza de regresie este preferabilă analizei de varianţă, din motivele discutate de Stephan şi Rogers (8). Cu toate acestea, atunci când nu se găseşte un model de regresie corespunzător (r2 < 0,9), ar trebui să se recurgă la CFEO/CMEO.
      1.7.1.   Structurarea pentru analiza de regresie
      La structurarea unui test care urmează să fie interpretat cu ajutorul analizei de regresie, considerentele importante sunt:
      
                  (a)
               
               
                  concentraţiile cu efect (de exemplu CE10,20,30) şi intervalul de concentraţii în care efectul substanţei testate prezintă interes trebuie cu necesitate să fie cuprinse în test. Precizia cu care pot fi făcute estimările concentraţiilor cu efect va fi mai bună atunci când concentraţia cu efect este la jumătatea intervalului de concentraţii testate. În alegerea concentraţiilor adecvate pentru test este util un test preliminar de stabilire a intervalului;
               
            
                  (b)
               
               
                  pentru a permite o modelare statistică satisfăcătoare, testul trebuie să includă cel puţin un bazin martor şi alte cinci bazine la concentraţii diferite. Unde este cazul, atunci când se foloseşte un agent de dispersie, se studiază, în afară de lotul testat, un lot martor dintr-un bazin conţinând agentul de dispersie la concentraţia maximă testată (a se vedea punctele 1.8.3 şi 1.8.4);
               
            
                  (c)
               
               
                  se poate folosi o serie geometrică sau una logaritmică adecvată (9) (a se vedea apendicele 3). Este de preferat seria logaritmică în definirea intervalelor între nivelurile concentraţiilor testate;
               
            
                  (d)
               
               
                  dacă sunt disponibile mai mult de şase bazine, bazinele suplimentare ar trebui folosite fie la dublarea probelor, fie la distribuirea lor în intervalele de concentraţii, în scopul îngustării acestora. Ambele măsuri sunt oportune în egală măsură.
               
            1.7.2.   Structurarea pentru CFEO/CMEO folosind analiza de varianţă
      Ar fi de preferat să existe bazine-dublură la fiecare concentraţie, iar analiza statistică să se facă la nivelul fiecărui bazin (10). Fără bazine-dublură nu poate fi luată în considerare variabilitatea între bazine separat de variabilitatea de la un peşte la altul. Cu toate acestea, experienţa a arătat (11) că, în cazul examinat, variabilitatea între bazine a fost foarte scăzută comparativ cu cea din interiorul aceluiaşi bazin (adică între peşti). Prin urmare, o alternativă relativ acceptabilă este efectuarea analizei statistice la nivelul fiecărui exemplar.
      În mod convenţional, se folosesc cel puţin cinci concentraţii dispuse în serie geometrică, cu o raţie care de preferinţă nu depăşeşte 3,2.
      În general, atunci când testele se fac cu bazine-dublură, numărul bazinelor martor, şi prin urmare cel al peştilor, reprezintă dublul numărului de bazine testate la fiecare concentraţie, iar acesta din urmă este acelaşi la toate concentraţiile (12) (13) (14). Dimpotrivă, în absenţa bazinelor-dublură, numărul peştilor din lotul martor este egal cu numărul peştilor folosiţi la fiecare concentraţie.
      Dacă analiza de varianţă urmează să pornească de la bazin şi nu de la fiecare peşte [ceea ce ar presupune fie marcarea individuală a peştilor, fie folosirea ratelor de creştere pseudospecifice (a se vedea punctul 2.1.2)], apare necesitatea folosirii unui număr suficient de dubluri pentru a se putea determina deviaţia standard a „bazinelor cu aceeaşi concentraţie”. Aceasta înseamnă că gradele de libertate pentru erorile din analiza de varianţă trebuie să fie de minimum 5 (10). Dacă sunt dublate numai bazinele martor, există pericolul ca variabilitatea erorilor să fie falsificată, deoarece ea poate creşte odată cu valoarea medie a ratei de creştere în cauză. Deoarece este probabil ca rata de creştere să scadă odată cu creşterea concentraţiei, se poate ajunge la o variabilitate supraestimată.
      1.8.   MODUL DE LUCRU
      1.8.1.   Selectarea şi cântărirea peştilor
      Este important ca variaţia în cântărirea peştilor să fie redusă la minimum la începutul testului. În apendicele 1 se dau intervalele corespunzătoare pentru mărimea diferitelor specii recomandate în acest test. Pentru întregul lot de peşti folosit, limitele greutăţilor corporale individuale la începutul testului sunt, în mod ideal, cuprinse în intervalul de ± 10 % din media aritmetică a greutăţilor şi, în orice caz, trebuie să nu depăşească 25 %. Se recomandă cântărirea unui sub-eşantion de peşti înainte de testare, pentru a estima greutatea medie.
      Peştii nu trebuie hrăniţi timp de 24 de ore înainte de începerea testului. Apoi sunt aleşi la întâmplare. Folosind un anestezic general [de exemplu o soluţie apoasă de 100 mg/l de metansulfonat de tricaină (MS 222) neutralizată prin adăugarea a două părţi bicarbonat de sodiu la o parte de MS 222], peştii sunt cântăriţi individual ca greutate in vivo zvântaţi, la precizia indicată în apendicele 1. Se reţin peştii a căror greutate se află în intervalul dorit şi apoi sunt distribuiţi aleator în bazine. Trebuie înregistrată greutatea totală a peştilor din fiecare bazin. Folosirea anestezicului, precum şi manipularea peştilor (inclusiv zvântarea şi cântărirea) pot să streseze şi să rănească puietul, în special pe cel din speciile de talie mică. Prin urmare, manipularea puietului trebuie făcută cu cea mai mare grijă pentru a evita stresarea şi rănirea animalelor de experienţă.
      Peştii sunt cântăriţi din nou în a 28-a zi a testului (a se vedea punctul 1.8.6). Cu toate acestea, dacă se consideră necesar să fie recalculată raţia alimentară, peştii pot fi cântăriţi din nou în ziua a 14-a a testului (a se vedea punctul 1.8.2.3). Altă metodă, cum ar fi metoda fotografică, poate fi folosită pentru a determina schimbările în dimensiunile peştilor pe baza cărora se pot ajusta raţiile alimentare.
      1.8.2.   Condiţiile de expunere
      1.8.2.1.   Durata
      Durata testului este de 28 de zile.
      1.8.2.2.   Rata de încărcare şi densitatea populaţiei
      Este important ca rata de încărcare şi densitatea populaţiei să fie adecvate pentru specia folosită (a se vedea apendicele 1). Dacă densitatea populaţiei este prea mare, apare stresul de supraaglomeraţie, conducând la reducerea ratei de creştere şi, posibil, la boli. Dacă densitatea este prea mică, poate apărea un comportament teritorial care de asemenea să afecteze creşterea. În orice caz, rata de încărcare trebuie să fie suficient de redusă pentru ca o concentraţie de oxigen dizolvat de cel puţin 60 % VSA să poată fi menţinută fără aerare. Un test de intercalibrare (2) a arătat că, pentru păstrăvul-curcubeu, o rată de încărcare de 16 păstrăvi de 3-5 g într-un volum de 40 l este acceptabilă. Frecvenţa recomandată de schimbare a apei pe durata testului este de 6 l/g de peşte/zi.
      1.8.2.3.   Hrănirea
      Peştelui i se administrează o alimentaţie corespunzătoare (apendicele 1) într-o cantitate suficientă pentru a induce o rată de creştere acceptabilă. Se veghează la evitarea proliferării microbilor şi a turbidităţii apei. Pentru păstrăvul-curcubeu, o raţie zilnică reprezentând 4 % din greutatea corporală satisface aceste condiţii (2) (15) (16) (17). Raţia zilnică poate fi împărţită în două porţii egale şi dată în două etape, la interval de cel puţin 5 ore. Raţia se calculează pornind de la greutatea totală a peştilor din fiecare bazin. Dacă peştii sunt cântăriţi din nou în ziua a 14-a, raţia se recalculează în acea zi. Peştii nu sunt hrăniţi timp de 24 de ore înainte de cântărire.
      Alimentele neconsumate şi materiile fecale trebuie îndepărtate zilnic din bazine, prin curăţarea atentă a fundului fiecărui bazin folosind o ţeavă aspiratoare.
      1.8.2.4.   Lumina şi temperatura
      Perioada în care bazinul este expus la lumină şi temperatura apei trebuie să fie adecvate speciei testate (apendicele 1).
      1.8.3.   Concentraţiile de lucru
      În mod normal, sunt necesare cinci concentraţii ale substanţei testate, indiferent de structurarea testului (a se vedea punctul 1.7.2). Cunoaşterea prealabilă a toxicităţii substanţei testate (de exemplu dintr-un test de toxicitate acută şi din studii de determinare a intervalelor) ajută la alegerea concentraţiilor adecvate. Trebuie justificată folosirea a mai puţin de cinci concentraţii. Concentraţia maximă testată nu trebuie să depăşească limita de solubilitate a substanţei în apă.
      Când se foloseşte un agent de dispersie la prepararea soluţiei de bază, concentraţia finală a acestuia nu trebuie să depăşească 0,1 ml/l şi este de preferat să fie aceeaşi în toate bazinele (a se vedea punctul 1.6.3). Recurgerea la astfel de produse trebuie totuşi evitată pe cât posibil.
      1.8.4.   Bazinele martor
      Numărul bazinelor martor cu apă de diluare depinde de structurarea testului (a se vedea punctele 1.7-1.7.2). Dacă se foloseşte agent de dispersie, trebuie cuprins în test şi un număr de bazine martor cu agent de dispersie egal cu numărul bazinelor martor cu apă de diluare.
      1.8.5.   Frecvenţa măsurătorilor şi determinărilor analitice
      Pe durata testului concentraţiile substanţei testate se determină cu regularitate (a se vedea în continuare).
      La testele în regim dinamic, debitele diluantului şi al soluţiei de bază conţinând substanţa toxică trebuie verificate cu regularitate, de preferinţă zilnic, şi nu trebuie să varieze cu mai mult de 10 % pe întreaga durată a testului. Atunci când concentraţiile substanţei testate se aşteaptă să rămână în intervalul ± 20 % faţă de valoarea nominală (adică în intervalul 80-120 %; a se vedea punctele 1.6.2 şi 1.6.3), se recomandă minimal analiza celei mai ridicate şi a celei mai scăzute concentraţii la începutul testului, iar apoi la intervale de o săptămână. În cazul testului la care concentraţia substanţei testate nu se aşteaptă a rămâne în intervalul ± 20 % faţă de valoarea nominală (pe baza datelor de stabilitate privind substanţa testată), este necesară analizarea tuturor concentraţiilor, dar urmând acelaşi procedeu.
      La testele în regim semistatic (cu schimbarea apei) unde concentraţia substanţei testate este de aşteptat să rămână în intervalul ± 20 % faţă de valoarea nominală, se recomandă ca, minimal, concentraţia cea mai ridicată şi cea mai scăzută să fie analizate imediat după preparare şi imediat înainte de schimbarea apei la începutul studiului şi săptămânal după aceea. La testele unde concentraţia substanţei testate nu este de aşteptat să rămână în intervalul ± 20 % faţă de valoarea nominală, trebuie analizate toate concentraţiile urmând aceeaşi metodă ca şi pentru substanţele mai stabile.
      Se recomandă ca rezultatele să fie fundamentate pe concentraţii măsurate. Cu toate acestea, atunci când, în mod demonstrabil, concentraţia substanţei testate în soluţie a fost menţinută pe parcursul întregului test în intervalul ± 20 % faţă de concentraţia nominală sau concentraţia măsurată iniţial, rezultatele pot fi fundamentate pe valorile nominale sau măsurate.
      Poate fi necesară filtrarea probelor (de exemplu cu ajutorul unui filtru cu pori de 0,45 μm) sau centrifugarea lor. Centrifugarea este metoda recomandată. Cu toate acestea, dacă mediul de lucru nu se adsoarbe pe filtru, filtrarea este în egală măsură acceptabilă.
      În timpul testului, oxigenul dizolvat, pH-ul şi temperatura se măsoară în toate bazinele. Duritatea totală, alcalinitatea şi salinitatea se măsoară (dacă are relevanţă) în bazinele martor şi în bazinul cu cea mai ridicată concentraţie. Minimal, oxigenul dizolvat şi salinitatea (dacă are relevanţă) se măsoară de trei ori (la început, la jumătatea şi la sfârşitul testului). În testele în regim semistatic, se recomandă ca oxigenul dizolvat să se măsoare mai frecvent, de preferinţă înainte şi după schimbarea apei sau cel puţin o dată pe săptămână. pH-ul se măsoară la începutul şi la sfârşitul fiecărei schimbări a apei la testele în regim semistatic şi cel puţin săptămânal la testele în regim dinamic. Duritatea şi alcalinitatea se măsoară o dată la fiecare test. Este de preferat ca temperatura să fie monitorizată continuu cel puţin într-unul din bazine.
      1.8.6.   Observaţii
      Greutatea: la sfârşitul testului toţi peştii supravieţuitori trebuie cântăriţi in vivo zvântaţi (blotted dry), fie în grupuri pe fiecare bazin, fie individual. Cântărirea în grup este preferată cântăririlor individuale, care necesită marcarea individuală a peştilor. În cazul măsurării greutăţii individuale în scopul determinării ratei de creştere specifice individuale, tehnica de marcare aleasă trebuie să evite stresarea animalelor (se poate folosi o metodă diferită de metoda crio-marcajului, de exemplu un fir de undiţă subţire, colorat).
      Peştii sunt examinaţi zilnic pe durata testului şi se observă orice anomalii exterioare (cum ar fi hemoragia, decolorarea) şi comportamente anormale. Se înregistrează cazurile de deces şi se îndepărtează peştii morţi cât mai repede posibil. Peştii morţi nu sunt înlocuiţi, rata de încărcare şi densitatea populaţiei fiind suficiente pentru a evita efectele asupra creşterii provocate de schimbarea numărului de peşti din bazin. Este necesar totuşi să se ajusteze raţia alimentară.
      2.   DATE ŞI RAPORT
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Se recomandă implicarea unui statistician atât în structurarea, cât şi în analiza testului, deoarece această metodă de testare permite variaţii considerabile în modul de lucru, cum ar fi, de exemplu, variaţii în numărul de bazine, de concentraţii folosite, de peşti etc. Luând în considerare opţiunile disponibile în structurarea testului, nu sunt prezentate aici îndrumările specifice referitoare la metoda statistică.
      Ratele de creştere nu se calculează pentru bazinele în care mortalitatea depăşeşte 10 %. Cu toate acestea, rata mortalităţii trebuie indicată la toate concentraţiile folosite.
      Oricare din metode este folosită la analizarea rezultatelor, conceptul central este rata r de creştere specifică între momentul t1 şi momentul t2. Aceasta poate fi definită în câteva moduri, în funcţie de prezenţa sau absenţa marcajului individual al peştilor sau în funcţie de necesitatea aflării unei medii pe bazin.
      
         
      
         
      
         
      unde:
      
                  r1
                  
               
               
                  = rata de creştere specifică individuală
               
            
                  r2
                  
               
               
                  = rata de creştere specifică medie a bazinului
               
            
                  r3
                  
               
               
                  = rata de creştere pseudospecifică
               
            
                  w1, w2
                  
               
               
                  greutăţile corporale ale unui anumit peşte la momentele t1 şi respectiv t2
                  
               
            
                  logew1
                  
               
               
                  = logaritmul greutăţii corporale a unui anumit peşte la începutul perioadei de studiu
               
            
                  logew2
                  
               
               
                  = logaritmul greutăţii corporale a unui anumit peşte la sfârşitul perioadei de studiu
               
            
                  logeW1
                  
               
               
                  = media logaritmilor valorilor w1 pentru peştii din bazin la începutul perioadei de studiu
               
            
                  logeW2
                  
               
               
                  = media logaritmilor valorilor w2 pentru peştii din bazin la sfârşitul perioadei de studiu
               
            r1, r2, r3 pot fi calculate pentru perioada cuprinsă între ziua 0 şi ziua 28 şi acolo unde este cazul (adică atunci când s-a făcut o măsurătoare în ziua 14) pentru perioadele dintre ziua 0 şi ziua 14 şi ziua 14 şi ziua 28.
      2.1.1.   Analiza rezultatelor prin regresie (modelarea concentraţie-răspuns)
      Această metodă de analiză stabileşte o relaţie matematică adecvată între ratele de creştere specifice şi concentraţie, ceea ce permite estimarea mărimii „CEx”, adică orice valoare CE necesară. Folosind această metodă nu mai este necesar calculul mărimii r pentru fiecare peşte (r1) şi în schimb analiza porneşte de la valoarea medie pe bazin a lui r (r2). Această ultimă metodă este preferabilă. În plus, este şi mai adecvată în cazul speciilor de talie mică.
      Pentru a studia relaţia concentraţie-răspuns, ratele de creştere specifice medii ale bazinelor (r2) se aşează pe un grafic ca funcţie de valorile concentraţiilor.
      Pentru exprimarea relaţiei dintre r2 şi concentraţie trebuie ales modelul adecvat, iar alegerea trebuie susţinută de o justificare pertinentă.
      Dacă peştii supravieţuitori sunt în număr diferit de la un bazin la altul, atunci procesul de ajustare a modelului, fie acesta simplu sau nelinear, se ponderează pentru a lua în considerare mărimile diferite ale grupurilor.
      Metoda de ajustare a modelului trebuie să facă posibilă estimarea, de exemplu, a valorii CE20 şi a dispersiei sale (fie eroare standard, fie interval de încredere). Graficul modelului ajustat este prezentat în relaţie cu rezultatele, aşa încât să poată fi apreciat gradul de adecvare a modelului (8) (18) (19) (20).
      2.1.2.   Analiza rezultatelor pentru estimarea DMEO
      Dacă testul a cuprins bazine-dublură la toate nivelurile de concentraţie, estimarea CMEO poate fi făcută pe baza analizei de varianţă a ratei de creştere specifice medii a bazinului (a se vedea punctul 2.1), urmată de o metodă pertinentă [de exemplu testul Dunnett sau testul William (12) (13) (14) (21)] de comparare a r medii corespunzătoare fiecărei concentraţii cu r medie din bazinele martor, pentru a identifica valoarea cea mai scăzută a concentraţiei pentru care diferenţa este semnificativă la nivelul de probabilitate de 0,05. Dacă nu sunt îndeplinite condiţiile impuse pentru metodele parametrice – distribuţie nenormală (de exemplu testul Shapiro-Wilk) sau varianţă heterogenă (testul Barlett) – trebuie luată în considerare transformarea datelor, în scopul omogenizării varianţelor înainte de efectuarea analizei de varianţă, sau efectuarea unei analize de varianţă ponderate.
      Dacă testul nu a cuprins bazine-dublură la fiecare concentraţie, o analiză de varianţă pe baza rezultatelor pe bazin va fi insensibilă sau imposibilă. În această situaţie, un compromis acceptabil este să se efectueze analiza pornind de la rata de creştere pseudospecifică r3 pentru fiecare peşte.
      r3 medie de la fiecare nivel de concentraţie se compară cu r3 medie din cazul bazinelor martor. CMEO poate fi identificată ca mai sus. Trebuie admis că această metodă nu ia în considerare variabilitatea între bazine în afară de ce se poate explica prin variabilitatea între peşti, trataţi individual, şi nici nu oferă protecţie în acest sens. Cu toate acestea, experienţa a arătat (8) că variabilitatea între bazine a fost foarte mică în comparaţie cu variabilitatea în interiorul aceluiaşi bazin (adică între peşti). Dacă analiza nu cuprinde fiecare peşte, trebuie să se prezinte metoda de identificare a valorilor aberante şi justificarea folosirii ei.
      2.2.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Rezultatele se interpretează cu precauţie atunci când concentraţiile măsurate ale substanţelor toxice ajung la niveluri apropiate de limitele de detecţie ale metodei analitice sau, la testele în regim semistatic, atunci când concentraţia substanţei testate scade între momentul preparării soluţiei şi momentul schimbării apei.
      2.3.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să cuprindă următoarele informaţii:
      2.3.1.   Substanţa testată:
      
                  —
               
               
                  natura fizică şi proprietăţile fizico-chimice relevante;
               
            
                  —
               
               
                  datele de identificare chimică, inclusiv puritatea şi metoda analitică de cuantificare a substanţei testate, după caz.
               
            2.3.2.   Specia testată:
      
                  —
               
               
                  numele ştiinţific, dacă este posibil;
               
            
                  —
               
               
                  suşa, mărimea, furnizorul, eventuale tratamente prealabile etc.
               
            2.3.3.   Condiţiile de testare:
      
                  —
               
               
                  metoda folosită (de exemplu: regim semistatic/schimbarea apei, regim dinamic, încărcare, densitatea populaţiei etc.);
               
            
                  —
               
               
                  structurarea testului (de exemplu: număr de bazine, concentraţii folosite şi dubluri, număr de peşti pe bazin);
               
            
                  —
               
               
                  metoda de preparare a soluţiilor de bază şi frecvenţa schimbării apei (se specifică agentul de solubilizare şi concentraţia sa, atunci când este folosit);
               
            
                  —
               
               
                  concentraţiile nominale, mediile valorilor măsurate şi deviaţiile lor standard în bazine şi metoda prin care au fost obţinute, precum şi date care să demonstreze că măsurătorile se referă la concentraţia substanţei testate în soluţia reală;
               
            
                  —
               
               
                  caracteristicile apei de diluare: pH, duritate, alcalinitate, temperatură, concentraţia oxigenului dizolvat, nivelul clorului rezidual (dacă se măsoară), carbon organic total, solide în suspensie, salinitatea mediului de lucru (dacă se măsoară) şi orice alte măsurători efectuate;
               
            
                  —
               
               
                  calitatea apei din bazine: pH, duritate, temperatură şi concentraţia oxigenului dizolvat;
               
            
                  —
               
               
                  informaţii detaliate despre alimentaţie [de exemplu tipul alimentului (alimentelor), sursa, cantitatea administrată şi frecvenţa].
               
            2.3.4.   Rezultatele:
      
                  —
               
               
                  date demonstrând că loturile din bazinele martor au îndeplinit criteriile de validitate referitoare la supravieţuire şi date privind mortalitatea de la fiecare nivel de concentraţie;
               
            
                  —
               
               
                  tehnicile de analiză statistică folosite, statistici întemeiate pe bazine-dublură sau pe fiecare peşte, prelucrarea datelor şi justificarea tehnicilor folosite;
               
            
                  —
               
               
                  date tabelare privind greutăţile corporale individuale şi medii din zilele 0, 14 (dacă se măsoară) şi 28, valorile ratelor de creştere specifice medii ale bazinelor sau pseudospecifice (după caz) pentru perioadele dintre ziua 0 şi ziua 28 sau, posibil, dintre ziua 0 şi ziua 14 şi dintre ziua 14 şi ziua 28;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele analizei statistice (adică analiza prin regresie sau de varianţă), de preferat în formă tabelară şi grafică şi CMEO (p = 0,05) şi CFEO sau CEx cu erori standard când este posibil, după caz;
               
            
                  —
               
               
                  incidenţa oricăror reacţii neobişnuite a peştilor şi orice efecte vizibile provocate de substanţa testată.
               
            3.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
      
                  1.
               
               
                  Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. WRc Report No. PRD 1388-M/2.
               
            
                  2.
               
               
                  Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
               
            
                  3.
               
               
                  Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, p. 1855-1870.
               
            
                  4.
               
               
                  Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N. and Höfte B.B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, p. 157-164.
               
            
                  5.
               
               
                  Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.
               
            
                  6.
               
               
                  Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes).Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, p. 287-297.
               
            
                  7.
               
               
                  Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. U. S. Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.
               
            
                  8.
               
               
                  Stephan C.E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R C Bahner and D J Hansen, Eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, p. 328-338.
               
            
                  9.
               
               
                  Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, p. 81.
               
            
                  10.
               
               
                  Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.
               
            
                  11.
               
               
                  Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10-12 December 1991.
               
            
                  12.
               
               
                  Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, p. 1096-1121.
               
            
                  13.
               
               
                  Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, p. 482-491.
               
            
                  14.
               
               
                  Williams D. A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, p. 103-117.
               
            
                  15.
               
               
                  Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994), A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, p. 123-133.
               
            
                  16.
               
               
                  Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990), The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, p. 33-41.
               
            
                  17.
               
               
                  Post, G. (1987), Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 P.
               
            
                  18.
               
               
                  Bruce, R. D. and Versteeg D.J. (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data . Environ. Toxicol. Chem. 11, p. 1485-1494.
               
            
                  19.
               
               
                  DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989), Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, n. 4468). Electric Power Research Institute, Palo alto, CA.
               
            
                  20.
               
               
                  Norbert-King T. J. (1988), An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. p. 12.
               
            
                  21.
               
               
                  Williams D. A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, p. 510-531.
               
            
         Apendice 1
         SPECIILE DE PEŞTI RECOMANDATE PENTRU TESTARE ŞI CONDIŢIILE DE LUCRU ADECVATE
         
                     Specia
                  
                  
                     Intervalul de temperatură recomandat
                     ( oC)
                  
                  
                     Perioada de expunere la lumină
                     (ore)
                  
                  
                     Intervalul recomandat pentru greutatea iniţială a peştilor
                     (g)
                  
                  
                     Precizia obligatorie a măsurătorilor
                  
                  
                     Rata de încărcare
                     (g/l)
                  
                  
                     Densitatea populaţiei
                     (pe litru)
                  
                  
                     Alimentaţia
                  
                  
                     Durata testului
                     (zile)
                  
               
                     
                        Specii recomandate:
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        Oncorhynchus mykiss
                     
                     păstrăv-curcubeu
                  
                  
                     12,5-16,0
                  
                  
                     12-16
                  
                  
                     1-5
                  
                  
                     până la 100 mg
                  
                  
                     1,2-2,0
                  
                  
                     4
                  
                  
                     Hrană uscată din larve salmonide (produsă sub licenţă)
                  
                  
                     ≥ 28
                  
               
                     
                        Alte specii bine studiate:
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     
                        Danio rerio
                     
                     Peştele-zebră
                  
                  
                     21-25
                  
                  
                     12-16
                  
                  
                     0,050-0,100
                  
                  
                     până la 1 mg
                  
                  
                     0,2-1,0
                  
                  
                     5-10
                  
                  
                     Hrană vie (Brachionus Artemia)
                  
                  
                     ≥ 28
                  
               
                     
                        Oryzias latipes
                     
                     Medaka
                  
                  
                     21-25
                  
                  
                     12-16
                  
                  
                     0,050-0,100
                  
                  
                     până la 1 mg
                  
                  
                     0,2-1,0
                  
                  
                     5-20
                  
                  
                     Hrană vie (Brachionus Artemia)
                  
                  
                     ≥ 28
                  
               
      
         Apendice 2
         UNELE CARACTERISTICI CHIMICE ALE UNEI APE DE DILUARE ACCEPTABILE
         
                     SUBSTANŢA
                  
                  
                     CONCENTRAŢIILE
                  
               
                     materie în particule
                  
                  
                     < 20 mg/l
                  
               
                     carbon organic total
                  
                  
                     < 2 mg/l
                  
               
                     amoniac neionizat
                  
                  
                     < 1 μg/l
                  
               
                     clor rezidual
                  
                  
                     < 10 μg/l
                  
               
                     pesticide organofosforice totale
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     pesticide organoclorice totale plus bifenili policlorinaţi
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     clor organic total
                  
                  
                     < 25 ng/l
                  
               
      
         Apendice 3
         Seriile logaritmice ale concentraţiilor adecvate pentru testul de toxicitate (9)
         
                     Coloană (număr de concentraţii între 100 şi 10 sau între 10 şi 1) (20)
                     
                  
               
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     3
                  
                  
                     4
                  
                  
                     5
                  
                  
                     6
                  
                  
                     7
                  
               
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
                  
                     100
                  
               
                     32
                  
                  
                     46
                  
                  
                     56
                  
                  
                     63
                  
                  
                     68
                  
                  
                     72
                  
                  
                     75
                  
               
                     10
                  
                  
                     22
                  
                  
                     32
                  
                  
                     40
                  
                  
                     46
                  
                  
                     52
                  
                  
                     56
                  
               
                     3,2
                  
                  
                     10
                  
                  
                     18
                  
                  
                     25
                  
                  
                     32
                  
                  
                     37
                  
                  
                     42
                  
               
                     1,0
                  
                  
                     4,6
                  
                  
                     10
                  
                  
                     16
                  
                  
                     22
                  
                  
                     27
                  
                  
                     32
                  
               
                      
                  
                  
                     2,2
                  
                  
                     5,6
                  
                  
                     10
                  
                  
                     15
                  
                  
                     19
                  
                  
                     24
                  
               
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                     6,3
                  
                  
                     10
                  
                  
                     14
                  
                  
                     18
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     4,0
                  
                  
                     6,8
                  
                  
                     10
                  
                  
                     13
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     2,5
                  
                  
                     4,6
                  
                  
                     7,2
                  
                  
                     10
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,6
                  
                  
                     3,2
                  
                  
                     5,2
                  
                  
                     7,5
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     2,2
                  
                  
                     3,7
                  
                  
                     5,6
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     2,7
                  
                  
                     4,2
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,9
                  
                  
                     3,2
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,4
                  
                  
                     2,4
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,8
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,3
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     1,0
                  
               
      C.15.   PEŞTII, TESTUL DE TOXICITATE PE TERMEN SCURT ÎN STADIILE DE EMBRION ŞI DE ALEVIN
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare a toxicităţii pe termen scurt reproduce Orientarea 212 (1998) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Prezentul test de toxicitate pe termen scurt în stadiile de embrion şi de alevin ale peştilor este un test în care sunt expuse toxicităţii stadiile de dezvoltare între începutul stadiului de ou fertilizat şi sfârşitul stadiului de alevin. În acest test nu se administrează hrană şi testul trebuie să se încheie când alevinii sunt încă hrăniţi din sacul vitelin.
      Testul urmăreşte să definească efectele letale şi, în măsură limitată, efectele subletale ale produselor chimice asupra stadiilor de dezvoltare ale speciilor testate. Acest test furnizează informaţii utile, putând (a) să formeze o punte între testele letale şi subletale, (b) să fie folosit ca test preliminar fie pentru un test de toxicitate complet în stadiile de viaţă timpurii, fie pentru testele de toxicitate cronică şi (c) să fie folosit la testarea speciilor acolo unde tehnicile de creştere a animalelor de experienţă nu sunt suficient de avansate pentru a acoperi perioada de trecere de la alimentaţia endogenă la cea exogenă.
      Trebuie ştiut că numai testele care acoperă toate stadiile din ciclul de viaţă a peştelui sunt în general în măsură să prezinte o estimare corectă a toxicităţii cronice la peşte a produselor chimice şi orice expunere care omite vreunul din stadii poate reduce sensibilitatea şi astfel poate subestima toxicitatea cronică. Prin urmare, este de aşteptat ca testul pe embrioni şi alevini să fie mai puţin sensibil decât un test complet în stadiile de viaţă timpurii, în special în privinţa produselor chimice puternic lipofile (log Pow > 4) şi a celor având un mod specific de acţiune toxică. Cu toate acestea, este de aşteptat ca diferenţele de sensibilitate între cele două teste să fie mai mici în cazul produselor cu mod de acţiune nespecific, narcotic (1).
      Înainte de publicarea acestui test, cea mai mare parte a experienţei legate de testul pe embrioni şi alevini s-a obţinut cu peştii de râu Danio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – nume popular peştele-zebră). Mai multe îndrumări detaliate asupra modului de lucru în cazul acestei specii sunt prezentate în apendicele 1. Aceasta nu exclude folosirea altor specii în cazul cărora există experienţă acumulată (tabelele 1A şi 1B)
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Concentraţia minimă cu efect observabil (CMEO): este cea mai scăzută concentraţie testată a substanţei testate la care se constată un efect semnificativ (la p < 0,05) în comparaţie cu lotul martor. Cu toate acestea, toate concentraţiile mai mari decât CMEO trebuie să aibă efect nociv egal sau mai mare decât cel observat la CMEO.
      
         Concentraţia fără efecte observabile (CFEO): este concentraţia testată imediat sub valoarea CMEO.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Embrionii şi alevinii sunt expuşi la o serie de concentraţii ale substanţei testate dizolvate în apă. Protocolul de testare permite alegerea între regimul semistatic şi cel dinamic. Alegerea depinde de natura substanţei testate. Testul începe prin aşezarea ouălor fertilizate în incintele experimentale şi se încheie imediat înainte ca sacul vitelin al fiecărei larve din fiecare incintă să fi fost complet absorbit sau înainte de a apărea moartea prin inaniţie la loturile martor. Efectele letale şi subletale sunt evaluate şi comparate cu valorile din loturile martor, pentru a determina concentraţia minimă cu efect observabil şi, de aici, concentraţia fără efect observabil. O altă metodă este analiza folosind un model de regresie în scopul de a estima concentraţia care ar provoca o variaţie procentuală dată (adică CL/CEx, unde x este definit ca % variaţie).
      1.4.   INFORMAŢII REFERITOARE LA SUBSTANŢA TESTATĂ
      Ar trebui să fie disponibile rezultatele testului de toxicitate acută (a se vedea metoda C.1), de preferinţă efectuat pe specii alese pentru prezentul test. Rezultatele pot fi utile în alegerea intervalului adecvat de concentraţii de lucru la testul în stadiile de viaţă timpurii. Ar trebui cunoscute solubilitatea în apă (inclusiv solubilitatea în apa folosită la test) şi presiunea vaporilor substanţei testate. Este oportun să fie disponibilă o metodă analitică fiabilă de cuantificare a substanţei în soluţii testate, a cărei precizie şi ale cărei limite de detecţie sunt cunoscute şi menţionate în raport.
      Informaţiile asupra substanţei testate care sunt utile în fixarea condiţiilor de lucru cuprind: formula structurală, puritatea substanţei, stabilitatea la lumină, stabilitatea în condiţiile testului, pKa, Pow şi rezultatele unui test de biodegradabilitate rapidă (a se vedea metoda de testare C.4).
      1.5.   VALIDITATEA TESTULUI
      Pentru ca testul să fie valid, trebuie îndeplinite următoarele condiţii:
      
                  —
               
               
                  supravieţuirea globală a ouălor fertilizate în loturile martor si, unde este cazul, în incintele conţinând solvent, dar fără substanţă testată, trebuie să fie mai mare sau egală cu limitele definite în apendicele 2 şi 3;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia oxigenului dizolvat trebuie să fie între 60 % şi 100 % din valoarea de saturaţie în aer (VSA), pe toată durata testului;
               
            
                  —
               
               
                  temperatura apei nu trebuie să difere cu mai mult de ±1,5 oC între incintele experimentale sau între zile succesive în orice moment al testului şi trebuie să fie în intervalele de temperatură specificate pentru specia testată (apendicele 2 şi 3).
               
            1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Incintele experimentale
      Pot fi folosite orice recipiente de sticlă sau din alt material chimic inert. Dimensiunile recipientelor trebuie să fie suficient de mari pentru a permite respectarea ratei de încărcare (a se vedea punctul 1.7.1.2). Se recomandă poziţionarea aleatoare a incintelor în laborator. La dispunerea incintelor, o schemă de randomizare a blocurilor de incinte, fiecare tratament fiind reprezentat în fiecare bloc, este preferabilă unei scheme de randomizare integrală a incintelor, dacă în laborator există efecte sistematice care pot fi controlate folosind gruparea incintelor. Gruparea în blocuri, dacă se foloseşte, trebuie să fie luată în considerare în analiza ulterioară a rezultatelor. Incintele experimentale trebuie protejate de orice perturbare nedorită.
      1.6.2.   Alegerea speciilor de peşti
      Speciile de peşti recomandate sunt prezentate în tabelul 1A. Aceasta nu exclude folosirea altor specii (exemple sunt prezentate în tabelul 1B), dar modul de lucru trebuie adaptat pentru a asigura condiţii corespunzătoare. În acest caz, justificarea alegerii speciei şi a metodei de testare trebuie specificată în raport.
      1.6.3.   Îngrijirea peştilor reproducători
      Detalii despre îngrijirea populaţiei de peşti reproducători în condiţii satisfăcătoare se găsesc în Orientarea 210 a OCDE (21) şi în referinţele bibliografice 2, 3, 4, 5 şi 6.
      1.6.4.   Manipularea embrionilor şi a larvelor
      Embrionii şi larvele pot fi puse, în interiorul cuvei principale, în recipiente mai mici, cu laturile sau extremităţile din plasă, pentru a permite curgerea soluţiei prin recipient. Curgerea neturbulentă prin aceste recipiente mici poate fi indusă prin ataşarea lor la un braţ mobil, care deplasează vertical recipientele, dar aşa încât să menţină organismele imersate; se poate folosi de asemenea un sistem sifon. Ouăle fertilizate de salmonide pot fi puse pe suporturi sau site cu ochiul suficient de mare pentru a permite larvelor să traverseze după eclozare. Folosirea pipetelor Pasteur este oportună pentru îndepărtarea embrionilor şi a larvelor în testele semistatice cu schimbarea zilnică şi completă a apei (a se vedea punctul 1.6.6).
      Când au fost folosite recipiente, site sau plase pentru a păstra ouăle în cuva principală, acestea trebuie îndepărtate după eclozarea larvelor (1), cu excepţia plaselor care sunt păstrate pentru a împiedica peştii să scape. Dacă este necesar să se transfere larvele, acestea nu trebuie expuse la aer şi nu trebuie folosite minciocuri pentru a scoate peştii din recipientele conţinând ouăle (aceste precauţii nu sunt necesare în cazul speciilor mai puţin fragile, cum este crapul). Momentul transferului variază în funcţie de specie şi transferul nu este întotdeauna necesar. În regim semistatic se pot folosi pahare de laborator sau vase cu înălţimea redusă şi, dacă este necesar, echipate cu o sită la mică distanţă de fundul paharului. Dacă volumul acestor recipiente este suficient pentru a respecta cerinţele de încărcare (a se vedea 1.7.1.2) nu este necesar transferul embrionilor şi larvelor.
      1.6.5.   Apa
      Este corespunzătoare pentru test orice apă care respectă caracteristicile chimice ale unei ape de diluare enumerate în apendicele 4 şi în care supravieţuirea loturilor martor din specia testată este cel puţin la fel de bună ca aceea prezentată în apendicele 2 şi 3. Apa trebuie să îşi menţină calitatea constantă pe durata testului. pH-ul trebuie să rămână în intervalul de ±0,5 unităţi. Pentru ca apa de diluare să nu influenţeze în mod nepermis rezultatele testelor (de exemplu prin complexare cu substanţa testată) sau să afecteze negativ comportamentul peştilor reproducători, trebuie luate probe la intervale egale pentru analiză. Acolo unde se cunoaşte calitatea relativ constantă a apei de diluare, se măsoară, de exemplu, la interval de trei luni conţinutul în metale grele (de exemplu: Cu, Pb, Zn, Hg, Cd şi Ni), anioni şi cationi principali (de exemplu: Ca, Mg, Na, K, Cl şi SO4), pesticide (de exemplu pesticide organofosforice totale şi pesticide organoclorice totale), carbon organic total, solide în suspensie. Dacă s-a demonstrat că apa are calitate constantă pe o perioadă de cel puţin un an, analizele se pot efectua la intervale mai mari (de exemplu la fiecare şase luni).
      1.6.6.   Soluţiile de lucru
      Soluţiile de lucru de concentraţii date se prepară prin diluarea unei soluţii de bază.
      Soluţia de bază se prepară de preferinţă prin simpla amestecare sau agitare a substanţei testate în apa de diluare, folosind mijloace mecanice (de exemplu cu agitator sau ultrasunete). Pentru obţinerea unei soluţii de bază cu o concentraţie corespunzătoare se pot folosi coloane de saturare (coloane de solubilitate). Folosirea solvenţilor sau a agenţilor de dispersie trebuie evitată pe cât posibil; totuşi, în unele cazuri, astfel de compuşi pot fi necesari pentru a produce o soluţie de bază cu o concentraţie corespunzătoare. Exemple de solvenţi adecvaţi sunt acetona, etanolul, metanolul, dimetilsulfoxidul, dimetilformamida şi trietilenglicolul. Exemple de agenţi de dispersie adecvaţi sunt Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloză 0,01 % şi HCO-40. Folosirea compuşilor uşor biodegradabili (de exemplu acetona) şi a compuşilor foarte volatili trebuie să se facă atent, deoarece aceştia pot antrena proliferarea bacteriană în testele cu regim dinamic. Când se foloseşte un agent de dispersie, acesta trebuie, în demonstraţia pe un lot martor tratat numai cu solventul, să nu provoace efecte semnificative asupra supravieţuirii şi nici efecte adverse vizibile asupra stadiilor de viaţă timpurii.
      La testele în regim semistatic, pot fi adoptate două moduri de lucru diferite: fie (i) se prepară soluţii de lucru noi în recipiente curate, iar ouăle şi larvele sunt transferate cu grijă în noile recipiente, într-un volum mic din vechea soluţie evitând expunerea la aer fie (ii) organismele sunt păstrate în recipientele iniţiale în timp ce o fracţiune (cel puţin trei sferturi) din apa de testare este schimbată. Frecvenţa schimbării apei depinde de stabilitatea substanţei testate, dar se recomandă schimbarea zilnică. Dacă testele de stabilitate preliminare (a se vedea punctul 1.4) arată o instabilitate a concentraţiei substanţei testate (adică în afara intervalului de 80-120 % din concentraţia nominală sau sub 80 % din concentraţia măsurată iniţial) pe parcursul schimbării apei, trebuie luată în considerare folosirea unui test în regim dinamic. În oricare dintre cazuri, trebuie evitată stresarea larvelor în timpul operaţiunii de schimbare a apei.
      La testele în regim dinamic este necesar un sistem care să dozeze şi să dilueze continuu soluţia de bază a substanţei testate (de exemplu pompă dozatoare, diluator proporţional, sistem de saturaţie) pentru a asigura seria concentraţiilor din incintele experimentale. Debitele soluţiilor de bază şi ale apei de diluare trebuie verificate la intervale definite, de preferinţă zilnic, pe durata testului şi trebuie să nu varieze cu mai mult de 10 % pe parcursul întregului test. Un debit echivalent cu cel puţin cinci volume de incintă în 24 de ore s-a dovedit adecvat (2)
      1.7.   DESFĂŞURAREA TESTULUI
      Informaţii utile despre desfăşurarea testelor pe embrioni de peşte şi alevini sunt disponibile în literatură, unele exemple fiind incluse în referinţele bibliografice din prezentul text (7) (8) (9).
      1.7.1.   Condiţiile de expunere
      1.7.1.1.   Durata
      Testul este recomandabil să înceapă în următoarele 30 de minute după fertilizarea ouălor. Embrionii sunt imersaţi în soluţia testată înainte sau cât de curând după începerea fazei de segmentare a blastodiscului şi în orice caz înainte de debutul fazei de gastrulă. În cazul ouălor obţinute de la furnizori comerciali, s-ar putea să nu fie posibilă începerea testului imediat după fertilizare. Deoarece amânarea începerii testului poate influenţa puternic sensibilitatea acestuia, testul trebuie iniţiat în următoarele opt ore după fertilizare. Deoarece larvele nu sunt hrănite pe durata expunerii, testul trebuie să se încheie imediat înainte ca sacul vitelin al fiecărei larve din fiecare incintă să fi fost complet absorbit sau înainte de a apărea moartea prin inaniţie la loturile martor. Durata depinde de specia folosită. Câteva durate recomandate sunt prezentate în apendicele 2 şi 3.
      1.7.1.2.   Încărcarea
      Numărul de ouă fertilizate la începutul testului trebuie să fie suficient pentru a îndeplini condiţiile statistice. Ele trebuie distribuite aleator între tratamente şi trebuie folosite la fiecare concentraţie cel puţin 30 de ouă, împărţite în loturi egale (sau cât mai uniforme numeric, deoarece poate fi dificil să se obţină loturi egale când se folosesc unele specii) în cel puţin trei incinte identice. Rata de încărcare (biomasă pe volum de soluţie de lucru) trebuie să fie suficient de scăzută pentru ca o concentraţie a oxigenului dizolvat de minimum 60 % VSA să se poată menţine fără aerare. La testele în regim dinamic a fost recomandată (2) o rată de încărcare nedepăşind 0,5 g/l în 24 de ore şi nedepăşind 5 g/l de soluţie în orice moment.
      1.7.1.3.   Lumina şi temperatura
      Perioada de expunere la lumină şi temperatura apei trebuie să fie adecvate pentru specia testată (apendicele 2 şi 3). În scopul monitorizării temperaturii, poate fi adecvată folosirea unui recipient martor suplimentar.
      1.7.2.   Concentraţiile de lucru
      În mod normal, sunt necesare cinci valori de concentraţii ale substanţei testate, aflate în progresie geometrică cu o raţie care să nu depăşească 3,2. La alegerea intervalului de concentraţii trebuie luată în considerare curba reprezentând CL50 în funcţie de expunere, rezultată din studiul de toxicitate acută. Folosirea a mai puţin de cinci concentraţii, de exemplu în testele la valori-limită, şi un interval mai îngust se pot dovedi adecvate în unele cazuri. Trebuie justificată folosirea a mai puţin de cinci concentraţii. Nu este necesară testarea concentraţiilor mai ridicate fie de CL50 la 96 de ore, fie mai ridicate de 100 mg/l (care valoare este mai scăzută dintre acestea) Concentraţia maximă testată nu trebuie să depăşească limita de solubilitate a substanţei în apă.
      Când se foloseşte un agent de dispersie la prepararea soluţiilor (a se vedea punctul 1.6.6), concentraţia finală a acestuia în recipiente trebuie să nu depăşească 0,1 ml/l şi este de preferat să fie aceeaşi în toate recipientele.
      1.7.3.   Loturile martor
      În paralel cu loturile tratate trebuie să fie studiate şi loturile dintr-o incintă cu apă de diluare (cu dublură, dacă este cazul) şi, dacă prezintă relevanţă, dintr-o incintă cu agent de dispersie (cu dublură, dacă este cazul).
      1.7.4.   Frecvenţa măsurătorilor şi a determinărilor analitice
      Pe durata testului concentraţiile substanţei testate se determină cu regularitate.
      La testele în regim semistatic în care concentraţia substanţei testate este de aşteptat să rămână în intervalul ± 20 % faţă de valoarea nominală (adică în intervalul 80-120 %; a se vedea punctele 1.4 şi 1.6.6), se recomandă ca, minimal, concentraţia cea mai ridicată şi cea mai scăzută să fie analizate imediat după preparare şi la schimbarea apei de cel puţin trei ori, la intervale egale pe durata testului (adică analizele trebuie efectuate pe o probă din aceeaşi soluţie, o dată când este proaspăt preparată şi o dată înainte de schimbarea apei).
      La testele în care concentraţiile nu este de aşteptat să rămână în intervalul ± 20 % faţă de valoarea nominală (pe baza datelor referitoare la stabilitatea substanţei), trebuie analizate toate concentraţiile imediat după preparare şi imediat înainte de schimbarea apei, dar urmând aceeaşi metodă (adică de cel puţin trei ori la intervale egale pe durata testului. Determinarea concentraţiilor substanţei testate înainte de schimbarea apei este suficient să fie făcută numai la un singur recipient la fiecare concentraţie. Determinările trebuie să nu fie făcute la intervale mai lungi de şapte zile. Se recomandă ca rezultatele să fie fundamentate pe concentraţii măsurate. Cu toate acestea, atunci când, în mod demonstrabil, concentraţia substanţei testate în soluţie a fost menţinută pe parcursul întregului test în intervalul ± 20 % faţă de concentraţia nominală sau concentraţia măsurată iniţial, rezultatele pot fi fundamentate pe valorile nominale sau măsurate iniţial.
      La testele în regim dinamic este adecvat un sistem de prelevare a probelor similar cu acela prescris pentru regimul semistatic (dar măsurarea soluţiilor „vechi” nu se aplică în acest caz). Cu toate acestea, dacă durata testului este mai mare de şapte zile, este recomandabilă creşterea numărului de prelevări în prima săptămână (de exemplu trei seturi de măsurători) pentru a se asigura stabilitatea concentraţiilor.
      Se poate dovedi necesară centrifugarea probelor sau filtrarea lor (de exemplu cu ajutorul unui filtru cu pori de 0,45 μm). Cu toate acestea, deoarece se pare că nici centrifugarea nici filtrarea nu separă întotdeauna fracţia non-biodisponibilă a substanţei testate de fracţiunea biodisponibilă, se poate dovedi inutilă supunerea probelor la aceste tratamente.
      În timpul testului, oxigenul dizolvat, pH-ul şi temperatura se măsoară în toate bazinele. Duritatea totală şi salinitatea (dacă are relevanţă) se măsoară în incintele martor şi în incinta cu cea mai ridicată concentraţie. Minimal, oxigenul dizolvat şi salinitatea (dacă are relevanţă) se măsoară de trei ori (la începutul, la jumătatea şi la sfârşitul testului). În testele în regim semistatic, se recomandă ca oxigenul dizolvat să se măsoare mai frecvent, de preferinţă înainte şi după schimbarea apei sau cel puţin o dată pe săptămână. pH-ul trebuie măsurat la începutul şi la sfârşitul fiecărei schimbări a apei la testele în regim semistatic şi cel puţin săptămânal la testele în regim dinamic. Duritatea trebuie măsurată o dată la fiecare test. Temperatura se măsoară zilnic şi este de preferat să fie monitorizată continuu cel puţin într-una din incinte.
      1.7.5.   Observaţii
      1.7.5.1.   Stadiul dezvoltării embrionare
      Stadiul embrionar (adică stadiul de gastrulă) la începutul expunerii la substanţa testată trebuie verificat cât mai exact posibil. Aceasta se poate face folosind un eşantion reprezentativ de ouă păstrate corespunzător şi curăţate până devin translucide. Pentru descrierea şi ilustrarea stadiilor embrionare se poate consulta şi literatura (2) (5) (10) (11).
      1.7.5.2.   Eclozarea şi supravieţuirea
      Observaţiile referitoare la eclozare şi supravieţuire trebuie să fie făcute cel puţin o dată pe zi şi numărul ouălor eclozate şi al supravieţuitorilor trebuie înregistrat. La începutul testului este de dorit ca observaţiile să fie mai frecvente (de exemplu la fiecare 30 de minute în primele trei ore), deoarece în unele cazuri timpul de supravieţuire este mai relevant decât numărul deceselor (de exemplu când există efecte toxice acute). Embrionii şi larvele moarte trebuie îndepărtate imediat ce sunt observate, fiindcă se pot descompune rapid. La îndepărtarea exemplarelor moarte trebuie să se manifeste o grijă extremă pentru a nu răni sau leza ouăle/larvele din vecinătate, acestea fiind extrem de delicate şi de sensibile. Simptomele care indică moartea organismului variază în funcţie de stadiul de viaţă:
      
                  —
               
               
                  
                     pentru ouă: în special în stadiile timpurii, o pierdere accentuată a translucidităţii şi schimbarea coloraţiei, provocată de coagularea şi precipitarea proteinelor, conducând la un aspect alb-opac;
               
            
                  —
               
               
                  
                     pentru embrioni: absenţa mişcărilor corpului şi absenţa bătăilor inimii şi decolorarea opacă la speciile ai căror embrioni sunt în mod normal translucizi;
               
            
                  —
               
               
                  
                     pentru larve: imobilitatea şi absenţa mişcărilor respiratorii şi absenţa bătăilor inimii şi coloraţia alb-opacă a sistemului nervos central şi absenţa reacţiei la stimuli mecanici.
               
            1.7.5.3.   Aspectul anormal
      Numărul larvelor prezentând anomalii ale formei corpului şi pigmentare, precum şi stadiul absorbţiei sacului vitelin trebuie înregistrate la intervale adecvate, în funcţie de durata testului şi de natura anomaliei în cauză. Trebuie spus că embrioni şi larve anormale apar în mod natural şi numărul lor poate reprezenta câteva procente în loturile martor ale unor specii. Animalele anormale nu trebuie îndepărtate din recipiente decât atunci când mor.
      1.7.5.4.   Comportamentul anormal
      Anomaliile, de exemplu hiperventilarea, înotul necoordonat şi imobilitatea neobişnuită, trebuie înregistrate la intervale adecvate, în funcţie de durata testului. Aceste efecte, deşi dificil de cuantificat, pot, atunci când sunt ţinute sub observaţie, să ajute la interpretarea datelor privind mortalitatea, adică pot furniza informaţii despre modul de acţiune toxică a substanţei.
      1.7.5.5.   Lungimea
      La sfârşitul testului se recomandă măsurarea lungimilor individuale; poate fi folosită oricare din lungimile standard, până la scobitura caudală sau totală. Cu toate acestea, dacă se constată o putrefacţie sau o rosătură la înotătoarea caudală, se folosesc lungimile standard. În general, într-un test efectuat corect, coeficientul de variaţie a lungimii în lotul martor este ≤ 20 %.
      1.7.5.6.   Greutatea
      La încheierea testului poate fi măsurată greutatea corporală individuală; greutatea organismului uscat (24 de ore la 60 oC) este preferată greutăţii in vivo (peşte zvântat). În general, într-un test efectuat corect, coeficientul de variaţie a lungimii în lotul martor este ≤ 20 %.
      Aceste observaţii pun la dispoziţia analizei statistice totalitatea datelor următoare sau unele dintre acestea:
      
                  —
               
               
                  mortalitatea cumulată;
               
            
                  —
               
               
                  numărul larvelor sănătoase la încheierea testului;
               
            
                  —
               
               
                  momentele de început şi sfârşit al eclozării (adică 90 % ouă eclozate în fiecare incintă de la acelaşi nivel al concentraţiei);
               
            
                  —
               
               
                  numărul larvelor eclozate în fiecare zi;
               
            
                  —
               
               
                  lungimea (şi greutatea) animalelor supravieţuitoare la încheierea testului;
               
            
                  —
               
               
                  numărul larvelor cu diformităţi sau cu aspect anormal;
               
            
                  —
               
               
                  numărul larvelor prezentând comportament anormal.
               
            2.   DATE ŞI RAPORT
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Se recomandă implicarea unui statistician atât în structurarea cât şi în analiza testului, deoarece această metodă de testare permite variaţii considerabile în modul de lucru, cum ar fi, de exemplu, variaţii în numărul de incinte experimentale şi de concentraţii folosite, în numărul iniţial de ouă fertilizate şi în parametrii măsuraţi. Luând în considerare opţiunile disponibile în structurarea testului, nu sunt prezentate aici îndrumările specifice referitoare la metoda statistică.
      Dacă urmează să fie estimate CMEO/CFEO, este necesar ca variaţiile să fie estimate în cadrul fiecărui set de incinte de la aceeaşi concentraţie, folosind analiza de variaţie sau metodele tabelelor de contingenţă. Metoda Dunnett se poate dovedi folositoare (12) (13) pentru a realiza o comparaţie multiplă între rezultatele obţinute la concentraţii individuale şi rezultatele obţinute în legătură cu loturile martor. De asemenea sunt disponibile şi alte exemple utile (14) (15). Mărimea efectului detectabil folosind analiza de varianţă sau alte metode (adică puterea testului) trebuie calculată şi menţionată în raport. Trebuie spus că nu toate observaţiile enumerate la punctul 1.7.5.6 sunt adecvate pentru analiza statistică de varianţă. De exemplu, mortalitatea cumulată şi numărul larvelor sănătoase la încheierea testului pot fi analizate folosind metode probit.
      Dacă urmează să fie estimate CL/CEx, una sau mai multe curbe, cum ar fi curba logistică, trebuie ajustate la datele studiate folosind o metodă precum metoda celor mai mici pătrate sau metoda celor mai mici pătrate neliniare. Curba (curbele) trebuie parametrizate astfel încât CL/CEx studiate şi eroarea standard respectivă să poată fi estimate direct. Aceasta va uşura mult calculul intervalului de încredere din jurul CL/CEx. Dacă nu sunt motive întemeiate să fie preferate alte niveluri de încredere, ar trebui alese nivelurile de 95 % la ambele capete ale intervalului. Este de preferat ca metoda de ajustare să asigure un mijloc de a evalua semnificaţia neajustării. Pot fi folosite metode grafice de ajustare a curbelor. Analiza prin regresie este adecvată pentru toate observaţiile enumerate la punctul 1.7.5.6.
      2.2.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Rezultatele se interpretează cu precauţie atunci când concentraţiile măsurate ale substanţelor toxice ajung la niveluri apropiate de limitele de detecţie ale metodei analitice. Rezultatele se interpretează de asemenea cu precauţie în cazul concentraţiilor mai mari decât solubilitatea în apă a substanţei.
      2.3.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să cuprindă următoarele informaţii:
      2.3.1.   Substanţa testată:
      
                  —
               
               
                  natura fizică şi proprietăţile fizico-chimice relevante,
               
            
                  —
               
               
                  datele de identificare chimică, inclusiv puritatea şi metoda analitică de cuantificare a substanţei, după caz.
               
            2.3.2.   Specia testată:
      
                  —
               
               
                  numele ştiinţific, suşa, numărul peştilor parentali (câte femele au fost folosite pentru a asigura numărul necesar de ouă), sursa şi metoda de colectare a ouălor fertilizate şi manipularea ulterioară.
               
            2.3.3.   Condiţiile de testare:
      
                  —
               
               
                  metoda folosită (de exemplu: regim semistatic, regim dinamic, timpul scurs de la fertilizare până la începerea testului, încărcare etc.);
               
            
                  —
               
               
                  perioada (perioadele) de expunere la lumină;
               
            
                  —
               
               
                  structurarea testului (de exemplu: număr de incinte şi de dubluri, număr de embrioni pe incintă);
               
            
                  —
               
               
                  metoda de preparare a soluţiilor de bază şi frecvenţa schimbării apei (trebuie specificat agentul de solubilizare şi concentraţia acestuia, dacă se foloseşte);
               
            
                  —
               
               
                  concentraţiile de lucru nominale, valorile măsurate, mediile lor şi deviaţiile lor standard în recipiente şi metoda prin care au fost obţinute, precum şi, dacă substanţa testată este solubilă în apă la concentraţii mai reduse decât cele testate, date care să demonstreze că măsurătorile se referă la concentraţiile substanţei testate în soluţie reală;
               
            
                  —
               
               
                  caracteristicile apei de diluare: pH, duritate, temperatură, concentraţia oxigenului dizolvat, nivelul clorului rezidual (dacă se măsoară), carbon organic total, solide în suspensie, salinitatea mediului de lucru (dacă se măsoară) şi orice alte măsurători efectuate;
               
            
                  —
               
               
                  calitatea apei din recipiente: pH, duritate, temperatură şi concentraţia oxigenului dizolvat.
               
            2.3.4.   Rezultatele:
      
                  —
               
               
                  rezultatele oricăror studii preliminare referitoare la stabilitatea substanţei testate;
               
            
                  —
               
               
                  date demonstrând că loturile din incintele martor au îndeplinit standardul de supravieţuire globală acceptabilă al speciei testate (apendicele 2 şi 3);
               
            
                  —
               
               
                  rezultate despre mortalitate/supravieţuire în stadiile de embrion şi larvă şi mortalitatea/supravieţuirea globală;
               
            
                  —
               
               
                  zilele de eclozare şi numărul eclozărilor;
               
            
                  —
               
               
                  lungimea (şi greutatea) corporală;
               
            
                  —
               
               
                  incidenţa şi descrierea anomaliilor morfologice, dacă există;
               
            
                  —
               
               
                  incidenţa şi descrierea efectelor comportamentale, dacă există;
               
            
                  —
               
               
                  analiza statistică şi prelucrarea datelor;
               
            
                  —
               
               
                  la testele analizate folosind analiza de varianţă, concentraţia minimă cu efecte observabile (CMEO) la p = 0,05 şi concentraţia fără efecte observabile (CFEO) pentru fiecare răspuns evaluat, inclusiv descrierea metodelor statistice folosite şi indicarea mărimii efectului care poate fi detectat;
               
            
                  —
               
               
                  la testele analizate folosind analiza prin regresie, CL/CEx şi intervalele de încredere, precum şi un grafic al modelului ajustat folosit în calcule;
               
            
                  —
               
               
                  explicaţii pentru orice abatere de la această metodă de testare.
               
            3.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Kristensen P. (1990) Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, p. 60, June 1990.
               
            
                  2.
               
               
                  ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. p. 26.
               
            
                  3.
               
               
                  Brauhn J. L. and Schoettger R.A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
               
            
                  4.
               
               
                  Brungs W. A. and Jones B. R. (1977) Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
               
            
                  5.
               
               
                  Laale H. W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, p. 121-173.
               
            
                  6.
               
               
                  Legault R. (1958) A Technique for Controlling the Time of Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, p. 328-330.
               
            
                  7.
               
               
                  Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemistry, 6, p. 61-71.
               
            
                  8.
               
               
                  Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, p. 807-821.
               
            
                  9.
               
               
                  Van Leeuwen C.J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986) Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, p. 129-145.
               
            
                  10.
               
               
                  Kirchen R.V. and W. R. West (1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company.
               
            
                  11.
               
               
                  Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina, p. 36.
               
            
                  12.
               
               
                  Dunnett C. W. (1955) A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, p. 1096-1121.
               
            
                  13.
               
               
                  Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, p. 482-491.
               
            
                  14.
               
               
                  Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J. G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.
               
            
                  15.
               
               
                  Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, p. 321-334.
               
            
                  16.
               
               
                  Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, p. 81.
               
            
                  17.
               
               
                  Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 21, p. 126-134.
               
            
                  18.
               
               
                  Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: p. 231-236.
               
            
                  19.
               
               
                  Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F. and Roubaud P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Environmental Safety 32, p. 19-28.
               
            
                  20.
               
               
                  US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.
               
            
                  21.
               
               
                  US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.
               
            
                  22.
               
               
                  De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, p. 1189-1203.
               
            
                  23.
               
               
                  Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.
               
            
                  24.
               
               
                  Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, p. 280.
               
            
                  25.
               
               
                  Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, In: W. S. Hoar and D. J. Randall Eds., Fish Physiology, vol. XIA, Academic press, p. 1-58.
               
            Tabelul 1a
      Specii de peşti recomandate pentru testare
      
                  APĂ DULCE
               
            
                  
                     Oncorhynchus mykiss
                  
                  Păstrăv-curcubeu (9) (16)
               
            
                  
                     Danio rerio
                  
                  Peştele-zebră (7) (17) (18)
               
            
                  
                     Cyprinus caprio
                  
                  Crap (8) (19)
               
            
                  
                     Oryzias latipes
                  
                  Medaka (20) (21)
               
            
                  
                     Pimephales promelas (8) (22)
               
            
         
      Tabelul 1b
      Exemple de alte specii de peşti bine studiate care au fost folosite
      
                  APĂ DULCE
               
               
                  APĂ SĂRATĂ
               
            
                  
                     Carassius auratus
                  
                  Caras auriu (8)
               
               
                  
                     Menidia peninsulae
                  
                  (23) (24) (25)
               
            
                  
                     Lepomis macrochirus (8)
               
               
                  
                     Clupea harengus
                  
                  Herring (24) (25)
               
            
                  
                     Gadus morhua
                  
                  Cod (24) (25)
               
            
                  
                     Cyprinodon variegatus (23) (24) (25)
               
            
         Apendicele 1
         GHID PENTRU EFECTUAREA UNUI TEST DE TOXICITATE LA EMBRIONI ŞI ALEVINI DE PEŞTE-ZEBRĂ (BRACHYDANIO RERIO)
         
         INTRODUCERE
         Peştele zebră provine de pe coasta Coromandel din India unde trăieşte în apele repezi. Este un peşte obişnuit de acvariu din familia crapului şi datele referitoare la creşterea şi îngrijirea acestuia se pot găsi în cărţile de specialitate privind peştii tropicali. Laale descrie biologia şi utilizarea acestuia în studiul privind peştii (1).
         Acest peşte are rareori o lungime mai mare de 45 cm. Corpul este cilindric cu 7-9 dungi argintii orizontale de culoare albastru închis. Aceste dungi ajung până la înotătoarele caudale şi anale. Spatele este de culoare verde-măsliniu. Masculii sunt mai subţiri decât femelele. Femelele sunt mai argintii şi abdomenul este umflat, în special înainte de depunerea icrelor.
         Peştii adulţi pot să suporte fluctuaţii mari de temperatură, pH şi duritate a apei. Cu toate acestea, pentru a obţine peşti sănătoşi care să producă icre de bună calitate, trebuie asigurate condiţii optime.
         În timpul depunerii icrelor, masculii urmăresc şi lovesc cu capul femelele şi astfel se produce fecundarea icrelor atunci când sunt expulzate. Icrele, care sunt transparente şi nelipicioase, cad la fund unde pot fi mâncate de părinţi. Depunerea icrelor este influenţată de lumină. Dacă lumina dimineţii este corespunzătoare, peştele depune icrele de obicei în primele ore din zori.
         O femelă poate să producă loturi de câteva sute de icre săptămânal.
         CONDIŢII PENTRU PEŞTII PĂRINŢI, REPRODUCERE ŞI PRIMELE STADII DE VIAŢĂ
         Se selectează un număr potrivit de peşti sănătoşi care se păstrează în apă corespunzătoare (de exemplu apendicele 4) cu cel puţin două săptămâni înainte de data preconizată pentru depunerea icrelor. Este necesar ca grupul de peşti să fie lăsat să se reproducă cel puţin o dată înaintea producerii lotului de icre utilizate în test. Densitatea peştelui în perioada respectivă nu trebuie să depăşească 1 gram de peşte per litru. Schimbările regulate de apă sau utilizarea sistemelor de purificare permit o densitate mai mare. Temperatura din acvarii se menţine la 25 ± 2 oC. Peştelui trebuie să i se asigure o alimentaţie variată, care poate să conţină, de exemplu hrana uscată specifică comercializată, Arthemia, chironomide, dafnia vii proaspăt ieşiţi din ou, viermi albi (Enchytraeide).
         În continuare, sunt prezentate două procedee, prin care s-a obţinut în practică un lot suficient de icre fecundate, sănătoase pentru efectuarea unui test:
         
                     (i)
                  
                  
                     8 femele şi 16 masculi se introduc într-un acvariu cu 50 litri apă de diluţie, ecranat de lumina directă şi se lasă cât se poate de liniştiţi timp de 48 ore. La fundul vasului se aşează o tavă pentru depunerea icrelor în după-amiaza zilei de dinaintea iniţierii testului. Tava pentru depunerea icrelor este alcătuită dintr-un cadru (plexiglas sau alt material potrivit) înalt de 5-7 cm, prevăzut cu o plasă cu ochiuri mari, de 2-5 mm, fixată la partea superioară şi o plasă fină, cu ochiuri de 10-30 μm, la partea inferioară. La plasele cu ochiuri mari ale cadrului, se ataşează un număr de „pomi pentru depunerea icrelor” dintr-o frânghie de nylon nerăsucită. După ce peştii au fost lăsaţi în întuneric timp de 12 ore, se aprinde o lumină slabă care va iniţia depunerea icrelor. La 2-4 ore după depunerea icrelor, se scoate tava pentru depunerea icrelor şi se colectează icrele. Cu tava pentru depunerea icrelor se evită mâncarea icrelor de către peşti şi se facilitează colectarea icrelor. Este necesar ca grupul de peşti să fi depus icre cel puţin o dată înaintea depunerii din care se iau icre pentru efectuarea testului.
                  
               
                     (ii)
                  
                  
                     Un număr de 5-10 masculi şi femele se adăpostesc individual cu cel puţin două săptămâni înaintea depunerii icrelor. După 5-10 zile, abdomenele femelelor se umflă şi papila genitală a acestora devine vizibilă. Masculii nu au papilă. Depunerea icrelor se realizează în acvarii de depunere a icrelor prevăzute cu un fund fals din plasă (cum s-a descris anterior). Acvariul este umplut cu apă de diluţie, astfel încât, deasupra plasei apa să fie de 5-10 cm. O femelă şi doi masculi se introduc în acvariu cu o zi înaintea datei preconizate pentru depunerea icrelor. Temperatura apei se creşte treptat la o valoare cu un grad mai mare decât temperatura de aclimatizare. Se stinge lumina şi acvariul se lasă cât se poate de liniştit. Dimineaţă, se aprinde o lumină slabă care va iniţia depunerea icrelor. După 2-4 ore, peştele se scoate şi se colectează icrele. Dacă sunt necesare loturi mai mari de icre decât se pot obţine de la o femelă, se pot instala, în paralel, mai multe acvarii de depunere a icrelor. Prin înregistrarea rezultatului fiecărei femele înaintea testului (dimensiunea lotului şi calitatea), se selectează pentru reproducere femelele cu cele mai bune rezultate la reproducere.
                  
               Este necesar ca icrele să fie transferate în vasele pentru efectuarea testului cu ajutorul unor tuburi de sticlă (diametrul interior de minimum 4 mm) prevăzute cu un bulb de aspiraţie flexibil. Cantitatea de apă care se transferă odată cu icrele trebuie să fie cât mai mică posibilă. Icrele sunt mai grele decât apa şi ies pe la fundul tubului. Trebuie avut grijă pentru a preveni ca icrele (şi larvele) să vină în contact cu aerul. Proba (probele) din lot(uri) se examinează la microscop pentru a se asigura că nu există anomalii în primele etape de dezvoltare a embrionului. Nu este permisă dezinfecţia icrelor.
         Rata mortalităţii icrelor atinge apogeul în primele 24 de ore după fecundare. În această perioadă, se întâlneşte adesea o mortalitate de 5-40 %. Icrele degenerează ca urmare a unei fecundări nereuşite sau a dezvoltării insuficiente a embrionului. Calitatea lotului de icre se pare că depinde de peştele femelă, deoarece unele femele produc în mod constant icre de bună calitate, iar altele niciodată. De asemenea, rata de dezvoltare a embrionului şi rata de ieşire din ou variază de la un lot la altul. Icrele fecundate cu succes şi larvele din sacul vitelin supravieţuiesc bine, în mod normal peste 90 %. La 25 oC, ieşirea din ou se produce la 3-5 zile de la fertilizare şi sacul vitelin se absoarbe în aproximativ 13 zile după fecundare.
         Hisaoka şi Battle au descris bine dezvoltarea embrionului (2). Datorită transparenţei icrelor şi larvelor după ieşirea din ou, se poate urmări dezvoltarea peştelui şi este posibilă observarea malformaţiilor. La aproximativ patru ore după depunerea icrelor, icrele nefecundate se pot distinge de cele fecundate (3). Pentru a efectua această examinare, icrele şi larvele se aşează pe vase de laborator de volum mic şi se studiază la microscop.
         Condiţiile de desfăşurare a testului, care se aplică în primele etape de viaţă, sunt prezentate în lista din apendicele 2. Valorile optime ale pH-ului şi durităţii apei de diluţie sunt 7,8 şi, respectiv, 250 mg CaCO3/l.
         CALCULE ŞI STATISTICĂ
         Se propune un procedeu în două etape. Mai întâi, se analizează statistic datele privind mortalitatea, dezvoltarea anormală şi momentul ieşirii din ou. Apoi, pentru acele concentraţii la care nu s-au observat efecte negative asupra oricăruia din parametrii menţionaţi, se evaluează statistic lungimea corpului. Această abordare este recomandabilă deoarece toxicul poate să ucidă selectiv peştii mai mici, să întârzie momentul ieşirii din ou şi să inducă malformaţii majore, obţinându-se astfel măsurători viciate ale lungimii. În plus, pentru fiecare tratament, va exista acelaşi număr de peşti ce urmează să se măsoare, asigurându-se validitatea statisticii testului.
         DETERMINAREA CL50 ŞI CE50
         
         Se calculează procentul de icre şi larve supravieţuitoare şi se corectează cu mortalitatea din probele martor conform formulei lui Abbott (4):
         
            
         unde:
         
                     P
                  
                  
                     =
                  
                  
                     supravieţuirea corectată, %
                  
               
                     P'
                  
                  
                     =
                  
                  
                     supravieţuirea observată la concentraţiile experimentate, %
                  
               
                     C
                  
                  
                     =
                  
                  
                     supravieţuirea în cazul martorului, %
                  
               Dacă este posibil, CL50 se determină printr-o metodă corespunzătoare la sfârşitul testului.
         Dacă se doreşte introducerea anomaliilor morfologice în statistica CE50, se poate folosi lucrarea lui Stephan (5) pentru orientare.
         ESTIMAREA CMEO ŞI CFEO
         Un obiectiv al testului efectuat pe icre şi alevini este compararea concentraţiilor non-zero cu proba martor, adică determinarea CMEO. Pentru aceasta se utilizează multiple procedee de comparare (6) (7) (8) (9) (10).
         REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
         
                     1.
                  
                  
                     Laale H. W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, p. 121-173.
                  
               
                     2.
                  
                  
                     Hisaoka K. K. and Battle H.I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, p. 311.
                  
               
                     3.
                  
                  
                     Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 2, p. 173-181.
                  
               
                     4.
                  
                  
                     Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, p. 1-333.
                  
               
                     5.
                  
                  
                     Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, p. 69-81.
                  
               
                     6.
                  
                  
                     Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, p. 1096-1121.
                  
               
                     7.
                  
                  
                     Dunnett C. W. (1964) New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, p. 482-491.
                  
               
                     8.
                  
                  
                     Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, p. 103-117.
                  
               
                     9.
                  
                  
                     Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. Biometrics 28, p. 519-531.
                  
               
                     10.
                  
                  
                     Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W.H. Freeman and Co., San Francisco.
                  
               
      
         Apendicele 2
         CONDIŢIILE, DURATA TESTULUI ŞI CRITERIILE DE SUPRAVIEŢUIRE PENTRU SPECIILE RECOMANDATE
         
                     Specia
                  
                  
                     Temperatura
                     (oC)
                  
                  
                     Salinitatea
                     (0/00)
                  
                  
                     Perioada de expunere la lumină
                     (ore)
                  
                  
                     Durata etapelor
                     (zile)
                  
                  
                     Durata normală a testului
                  
                  
                     Supravieţuirea martorului
                     (minimum %)
                  
               
                     Embrion
                  
                  
                     Alevin
                  
                  
                     Reuşita ieşirii din ou
                  
                  
                     După ieşirea din ou
                  
               
                      
                  
               
                     
                        Brachydanio rerio
                     
                     Peştele-zebră
                  
                  
                     25 ± 1
                  
                  
                     —
                  
                  
                     12-16
                  
                  
                     3-5
                  
                  
                     8-10
                  
                  
                     De îndată ce este posibil după fecundare (prima fază de gastrulă) până la 5 zile după ieşirea din ou (8-10 zile)
                  
                  
                     80
                  
                  
                     90
                  
               
                     
                        Oncorhynchus mykiss
                     
                     Păstrăv-curcubeu
                  
                  
                     10 ± 1 (22)
                     
                     12 ± 1 (23)
                     
                  
                  
                     —
                  
                  
                     0 (24)
                     
                  
                  
                     30-35
                  
                  
                     25-30
                  
                  
                     De îndată ce este posibil după fecundare (prima fază de gastrulă) până la 20 de zile după ieşirea din ou (50-55 zile)
                  
                  
                     66
                  
                  
                     70
                  
               
                     
                        Cyprinus carpio
                     
                     Crap
                  
                  
                     21-25
                  
                  
                     —
                  
                  
                     12-16
                  
                  
                     5
                  
                  
                     > 4
                  
                  
                     De îndată ce este posibil după fecundare (prima fază de gastrulă) până la 4 zile după ieşirea din ou (8-9 zile)
                  
                  
                     80
                  
                  
                     75
                  
               
                     
                        Oryzias latipes
                     
                     Medaka
                  
                  
                     24 ± 1 (22)
                     
                     23 ± 1 (23)
                     
                  
                  
                     —
                  
                  
                     12-16
                  
                  
                     8-11
                  
                  
                     4-8
                  
                  
                     De îndată ce este posibil după fecundare (prima fază de gastrulă) până la 5 zile după ieşirea din ou (13-16 zile)
                  
                  
                     80
                  
                  
                     80
                  
               
                     
                        Pimephales promelas
                     
                  
                  
                     25 ± 2
                  
                  
                     —
                  
                  
                     16
                  
                  
                     4-5
                  
                  
                     5
                  
                  
                     De îndată ce este posibil după fecundare (prima fază de gastrulă) până la 4 zile după ieşirea din ou (8-9 zile)
                  
                  
                     60
                  
                  
                     70
                  
               
      
         Apendicele 3
         Condiţiile, durata testului şi criteriile de supravieţuire pentru alte specii bine studiate
         
                     Specii
                  
                  
                     Temperatura (oC)
                  
                  
                     Salinitatea (0/00)
                  
                  
                     Perioada de expunere la lumină (ore)
                  
                  
                     Durata etapelor (zile)
                  
                  
                     Durata normală a testului
                  
                  
                     Supravieţuirea martorului (minimum %)
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Embrion
                  
                  
                     Alevin
                  
                  
                     Reuşita ieşirii din ou
                  
                  
                     După ieşirea din ou
                  
               
                     APĂ DULCE
                  
               
                     
                        Carassius auratus
                     
                     Caras auriu
                  
                  
                     24 ± 1
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     3-4
                  
                  
                     > 4
                  
                  
                     De îndată ce este posibil după fecundare (prima fază de gastrulă) până la 4 zile după ieşirea din ou (7 zile)
                  
                  
                     —
                  
                  
                     80
                  
               
                     
                        Leopomis macrochirus
                     
                  
                  
                     21 ± 1
                  
                  
                     —
                  
                  
                     16
                  
                  
                     3
                  
                  
                     > 4
                  
                  
                     De îndată ce este posibil după fecundare (prima fază de gastrulă) până la 4 de zile după ieşirea din ou (7 zile)
                  
                  
                     —
                  
                  
                     75
                  
               
                     APĂ SĂRATĂ
                  
               
                     
                        Menidia peninsulae
                     
                  
                  
                     22-25
                  
                  
                     15-22
                  
                  
                     12
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     10
                  
                  
                     De îndată ce este posibil după fecundare (prima fază de gastrulă) până la 5 zile după ieşirea din ou (6-7 zile)
                  
                  
                     80
                  
                  
                     60
                  
               
                     
                        Clupea harengus
                     
                     Hering
                  
                  
                     10 ± 1
                  
                  
                     8-15
                  
                  
                     12
                  
                  
                     20-25
                  
                  
                     3-5
                  
                  
                     De îndată ce este posibil după fecundare (prima fază de gastrulă) până la 3 zile după ieşirea din ou (23-27 de zile)
                  
                  
                     60
                  
                  
                     80
                  
               
                     
                        Gadus morhua
                     
                     Cod
                  
                  
                     5 ± 1
                  
                  
                     5-30
                  
                  
                     12
                  
                  
                     14-16
                  
                  
                     3-5
                  
                  
                     De îndată ce este posibil după fecundare (prima fază de gastrulă) până la 3 zile după ieşirea din ou (18 zile)
                  
                  
                     60
                  
                  
                     80
                  
               
                     
                        Cyprinodon variegatus
                     
                  
                  
                     25 ± 1
                  
                  
                     15-30
                  
                  
                     12
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
                  
                     De îndată ce este posibil după fecundare (prima fază de gastrulă) până la 4/7 zile după ieşirea din ou (28 de zile)
                  
                  
                     > 75
                  
                  
                     80
                  
               
      
         Apendicele 4
         CÂTEVA CARACTERISTICI CHIMICE ALE UNEI APE DE DILUŢIE ADMISE
         
                     SUBSTANŢA
                  
                  
                     CONCENTRAŢIILE
                  
               
                     Substanţă impurificatoare
                  
                  
                     < 20 mg/l
                  
               
                     Carbon organic total
                  
                  
                     < 2 mg/l
                  
               
                     Amoniac neionizat
                  
                  
                     < 1 μg/l
                  
               
                     Clor rezidual
                  
                  
                     < 10 μg/l
                  
               
                     Totalul pesticidelor organofosforoase
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     Totalul pesticidelor organoclorice şi a bifenililor policloruraţi
                  
                  
                     < 50 ng/l
                  
               
                     Clorul organic total
                  
                  
                     < 25 ng/l
                  
               
      C.16.   ALBINELE – TESTUL DE TOXICITATE ORALĂ ACUTĂ
      1.   METODĂ
      Metoda de determinare a toxicităţii acute reproduce Orientarea 213 (1998) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Prezentul test de toxicitate este o metodă de laborator, destinată determinării toxicităţii orale acute a produselor pentru protecţia plantelor şi a altor produse chimice la albinele lucrătoare adulte.
      În aprecierea şi evaluarea caracteristicilor toxice ale substanţelor, ar putea fi necesară determinarea toxicităţii orale acute la albine, de exemplu când este posibilă expunerea albinelor la un anumit produs chimic. Testul de toxicitate orală acută se efectuează pentru determinarea toxicităţii inerente a pesticidelor şi altor produse chimice la albine. Rezultatele testului respectiv trebuie utilizate pentru a stabili necesitatea unei evaluări suplimentare. Prezenta metodă se poate utiliza în special în programele în mai multe etape pentru evaluarea pericolelor pesticidelor pentru albine, prin înaintare secvenţială de la testele de toxicitate de laborator la experimentările de semi-teren şi teren (1). Pesticidele se pot testa sub formă de substanţe active (s.a.) sau de preparate.
      Pentru verificarea sensibilităţii albinelor şi a preciziei metodei de testare este necesară utilizarea unui etalon de toxicitate.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Toxicitatea orală acută: reprezintă efectele negative care apar în termen de maximum 96 ore (h) de la administrarea orală unei doze unice de substanţă testată.
      
         Doza: reprezintă cantitatea de substanţă testată consumată. Doza se exprimă ca masa (μg) de substanţă testată per animal experimental (μg/albină). Nu se poate calcula doza reală pentru fiecare albină, deoarece albinele sunt hrănite în colectiv, dar se poate estima o doză medie (substanţa testată consumată în total/numărul de albine experimentale dintr-o cuşcă).
      
         DL
         
            50
         
         (doza letală medie) orală: este o doză unică, obţinută statistic, dintr-o substanţă care poate provoca moartea a 50 % din animale atunci când se administrează pe cale orală. Valoarea DL50 se exprimă în (μg) de substanţă testată per albină. Pentru pesticide, substanţa testată poate să fie sub formă de substanţă activă (s.a.) sau de preparat ce conţine una sau mai multe substanţe active.
      
         Mortalitatea: un animal se înregistrează ca mort atunci când este complet imobil.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Se procedează la expunerea albinelor lucrătoare adulte (Apis mellifera) la o serie de doze de substanţă testată dispersată în soluţie de zaharoză. Albinele primesc apoi aceeaşi hrană, fără substanţa testată. Mortalitatea se înregistrează zilnic timp de cel puţin 48 h şi se compară cu valorile pentru proba martor. Dacă rata mortalităţii creşte în intervalul dintre 24 ore şi 48 ore, în timp ce mortalitatea martorului rămâne la un nivel acceptabil, adică ≤ 10 %, este potrivit să se prelungească durata testului până la maximum 96 h. Se analizează rezultatele pentru a calcula valoarea DL50 la 24 h şi 48 h şi, dacă studiul se prelungeşte, la 72 h şi 96 h.
      1.4.   VALIDITATEA TESTULUI
      Pentru ca un test să fie valabil, trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
      
                  —
               
               
                  media mortalităţii pentru numărul total de martori trebuie să fie mai mică sau egală cu 10 % la sfârşitul testului;
               
            
                  —
               
               
                  DL50 a etalonului de toxicitate să se încadreze în intervalul specificat.
               
            1.5.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.5.1.   Colectarea albinelor
      Este necesar să se utilizeze albinele lucrătoare adulte tinere din acelaşi roi, adică albinele de aceeaşi vârstă, modalitate de hrană etc. Albinele se obţin din colonii hrănite în mod corespunzător, sănătoase, pe cât posibil fără boli şi care provin din aceeaşi regină, cu antecedente şi stare fiziologică cunoscute. Acestea se pot colecta în dimineaţa în care se utilizează sau în seara de dinaintea testului şi ţinute în condiţiile de testare până în ziua următoare. Sunt potrivite albinele colectate din rame fără progenituri. Se evită colectarea primăvara devreme sau toamna târziu, deoarece albinele au o fiziologie modificată în perioadele menţionate. Dacă este necesară efectuarea testelor la începutul primăverii sau sfârşitul toamnei, albinele se pot introduce într-un incubator şi se hrănesc timp de o săptămână cu „pâinea albinelor” (polen recoltat din fagure) şi soluţie de zaharoză. Albinele tratate cu substanţe chimice, ca antibiotice, produse antivirale etc. nu se utilizează în testele de toxicitate timp de patru săptămâni din momentul terminării ultimului tratament.
      1.5.2.   Condiţii de adăpost şi hrană
      Se utilizează cuşti uşor de curăţat şi cu ventilaţie bună. Se poate utiliza orice material corespunzător, de exemplu oţel inoxidabil, plasă de sârmă, cuşti din material plastic sau din lemn disponibile etc. Se preferă grupuri de 10 albine în fiecare cuşcă. Dimensiunile cuştilor experimentale trebuie să corespundă numărului de albine, adică să asigure spaţiul corespunzător.
      Albinele se ţin la întuneric într-o cameră experimentală la o temperatură de 25 ± 2 oC. Pe toată durata testului, se înregistrează umiditatea relativă, care este în mod normal de aproximativ 50-70 %. Manipularea, care include tratamentul şi observaţiile se efectuează la lumină (lumina zilei). Ca hrană se utilizează soluţie apoasă de zaharoză cu o concentraţie finală de 500 g/l (50 % g/v). După administrarea dozelor de testare, hrana se furnizează ad libitum. Este necesar ca sistemul de alimentare să permită înregistrarea hranei consumate în fiecare cuşcă (1.6.3.1). Se poate utiliza o eprubetă (cu lungimea de aproximativ 50 mm şi diametrul de aproximativ 10 mm cu capătul deschis îngustat până la un diametru de aproximativ 2 mm).
      1.5.3.   Pregătirea albinelor
      Albinele colectate se repartizează în mod aleatoriu în cuştile experimentale, care se aranjează în mod aleatoriu în camera experimentală.
      Albinele se pot înfometa timp de până la 2 ore înaintea începerii testului. Se recomandă ca albinele să fie lipsite de hrană înaintea tratamentului, astfel încât, la începutul testului, intestinele tuturor albinelor să aibă acelaşi conţinut. Albinele muribunde se resping şi se înlocuiesc cu albine sănătoase înaintea începerii testului.
      1.5.4.   Pregătirea dozelor
      Dacă substanţa testată este un compus miscibil cu apa, se poate dispersa direct în soluţia de zaharoză 50 %. Pentru produsele şi substanţele tehnice cu solubilitate mică în apă, se pot utiliza purtători care pot să fie solvenţi organici, emulgatori sau agenţi de dispersie cu toxicitate mică pentru albine (de exemplu acetone, dimetilformamidă, dimetilsulfoxid). Concentraţia purtătorului depinde de solubilitatea substanţei testate şi ar trebui să fie aceeaşi pentru toate concentraţiile experimentate ale substanţei. Cu toate acestea, în general, este potrivită o concentraţie a purtătorului de 1 % care nu trebuie să fie depăşită.
      Se prepară soluţiile etalon corespunzătoare, adică, dacă se utilizează un solvent sau un agent de dispersie pentru solubilizarea substanţei testate, trebuie să se utilizeze două grupe etalon separate: o soluţie în apă şi o soluţie de zaharoză cu solventul/purtătorul la concentraţia utilizată în soluţiile de dozare.
      1.6.   DESFĂŞURAREA TESTULUI
      1.6.1.   Grupele experimentale şi cele martor
      Numărul de doze şi probe identice trebuie să satisfacă condiţiile statistice pentru determinarea DL50 cu limite de încredere de 95 %. În mod normal, sunt necesare pentru test cinci doze în serie geometrică, cu un factor mai mic sau egal cu 2,2 şi care să cuprindă valorile pentru DL50. Cu toate acestea, factorul de diluţie şi numărul de concentraţii pentru dozare trebuie să se determine în funcţie de panta curbei de toxicitate (doza în funcţie de mortalitate) şi ţinând cont de metoda statistică aleasă pentru analiza rezultatelor. O probă pentru determinarea domeniului permite alegerea concentraţiilor potrivite pentru dozare.
      La minimum trei grupe experimentale identice, fiecare de 10 albine, se administrează doze cu fiecare concentraţie experimentată. În afară de seriile tratate cu concentraţiile experimentate, se urmăresc minimum trei serii martor, fiecare de 10 albine. Sunt prevăzute serii martor şi pentru solvenţii/purtătorii utilizaţi (1.5.4).
      1.6.2.   Etalonul de toxicitate
      În seria de teste se include un etalon de toxicitate. Se selectează cel puţin trei doze pentru a cuprinde valorile preconizate ale DL50. Pentru fiecare doză testată se utilizează minimum trei cuşti identice, fiecare conţinând 10 albine. Etalonul de toxicitate preferat este dimetoatul, pentru care DL50 – 24 h semnalată se situează între valorile 0,10-0,35 μg s.a./albină (2). Cu toate acestea, dacă se pot furniza suficiente date pentru verificarea răspunsului preconizat la doză, se pot accepta alte etaloane de toxicitate (de exemplu, parationul).
      1.6.3.   Expunerea
      1.6.3.1.   Administrarea dozelor
      Fiecărei grupe de albine i se administrează 100-200 μl soluţie apoasă 50 % de zaharoză, ce conţine substanţa testată la concentraţia corespunzătoare. Pentru produsele cu solubilitate mică, toxicitate mică sau concentraţie mică în preparat este necesar un volum mare, deoarece trebuie să se utilizeze proporţii mai mari din soluţia de zaharoză. Se monitorizează cantitatea de hrană tratată consumată per grupă. După consumarea hranei (de obicei în 3-4 h), vasul de alimentare se scoate din cuşcă şi se înlocuieşte cu unul care conţine numai soluţie de zaharoză. Soluţiile de zaharoză se furnizează apoi ad libitum. Pentru unii compuşi, la concentraţii mai mari, respingerea dozei testate poate să genereze un consum mic sau inexistent de hrană. După maximum 6 h, hrana tratată neconsumată se înlocuieşte numai cu soluţia de zaharoză. Se evaluează cantitatea de hrană tratată consumată (de exemplu prin măsurarea raportului volum/greutate pentru hrana tratată neconsumată).
      1.6.3.2.   Durata
      Durata testului este de preferinţă de 48 ore după ce soluţia de substanţă testată este înlocuită cu soluţia de zaharoză singură. Dacă mortalitatea continuă să crească cu mai mult de 10 % după primele 24 h, durata testului se prelungeşte la maximum 96 ore, cu condiţia ca mortalitatea martorului să fie mai mică sau egală cu 10 %.
      1.6.4.   Observaţiile
      Mortalitatea se înregistrează la 4 h după începerea testului şi apoi la 24 h şi 48 h (adică după administrarea dozei). Dacă este necesară o perioadă prelungită de observare, se fac alte evaluări la intervale de 24 h, până la maximum 96 h, cu condiţia ca mortalitatea martorului să fie mai mică sau egală cu 10 %.
      Se estimează cantitatea de hrană consumată per grupă. Compararea cantităţilor consumate din hrana tratată şi netratată în 6 ore de administrare poate furniza date referitoare la gustul plăcut al hranei tratate.
      Se consemnează toate manifestările anormale observate în timpul desfăşurării testului.
      1.6.5.   Testul la valori-limită
      În unele cazuri (de exemplu când se preconizează că o substanţă testată are o toxicitate mică) se poate efectua un test la valori-limită, utilizând 100 μg s.a./albină pentru a demonstra că DL50 este mai mare decât valoarea respectivă. Se utilizează acelaşi mod de lucru, care include trei grupe experimentale identice pentru dozele experimentate, martorii relevanţi, evaluarea cantităţii de hrană consumată şi utilizarea etalonului de toxicitate. Dacă apar mortalităţi, se efectuează un studiu complet. Dacă se observă efecte subletale (1.6.4), se consemnează.
      2.   DATE ŞI RAPORT
      2.1.   DATE
      Rezultatele se sistematizează în tabele, care prezintă pentru fiecare grupă supusă tratamentului, precum şi pentru grupele martor şi cele tratate cu etalon de toxicitate, numărul de albine utilizate, mortalitatea în fiecare moment de observare şi numărul de albine cu un comportament negativ. Datele privind mortalitatea se analizează prin metode statistice corespunzătoare (de exemplu analiza probit, media mobilă, probabilitatea binominală) (3) (4). Se trasează curbele doză-răspuns pentru fiecare observare recomandată şi se calculează pantele curbelor şi dozele letale medii (DL50) cu limite de încredere de 95 %. Sunt posibile corecţii pentru mortalitatea martorului cu ajutorul corecţiei lui Abbott (4) (5). Dacă hrana tratată nu se consumă în întregime, se determină doza de substanţă testată per grupă. DL50 se exprimă în μg de substanţă testată per albină.
      2.2.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele date:
      2.2.1.   Substanţa testată:
      
                  —
               
               
                  natura fizică şi proprietăţile fizico-chimice relevante (de exemplu stabilitatea în apă, presiunea vaporilor);
               
            
                  —
               
               
                  datele de identificare chimică, care includ formula structurală, puritatea [adică pentru pesticide, identitatea şi concentraţia substanţei (substanţelor) activ(e)].
               
            2.2.2.   Speciile experimentale:
      
                  —
               
               
                  denumirea ştiinţifică, roiul, vârsta aproximativă (în săptămâni), metoda de colectare, data colectării;
               
            
                  —
               
               
                  datele privind coloniile din care s-au colectat albinele experimentale, care includ starea de sănătate, eventuale boli ale adulţilor, tratamente prealabile etc.
               
            2.2.3.   Condiţii de testare:
      
                  —
               
               
                  temperatura şi umiditatea relativă în camera experimentală;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de adăpost care includ tipul, dimensiunea şi materialul cuştilor;
               
            
                  —
               
               
                  metodele de preparare a soluţiilor mamă şi experimentate (se specifică solventul şi concentraţiile acestuia, dacă se utilizează);
               
            
                  —
               
               
                  metoda de preparare a soluţiilor mamă şi frecvenţa reînnoirii (trebuie să se specifice agentul de solubilizare şi concentraţiile acestuia, dacă se utilizează);
               
            
                  —
               
               
                  protocolul testului, de exemplu numărul de încercări şi concentraţiile experimentate, numărul de martori; pentru fiecare concentraţie experimentată şi martor, numărul de cuşti identice şi numărul de albine per cuşcă;
               
            
                  —
               
               
                  data efectuării testului.
               
            2.2.4.   Rezultatele
      
                  —
               
               
                  rezultatele studiului preliminar de determinare a domeniului, dacă s-a efectuat;
               
            
                  —
               
               
                  datele brute: mortalitatea la fiecare doză experimentată şi fiecare moment de observare;
               
            
                  —
               
               
                  trasarea curbelor doză-răspuns la sfârşitul testului;
               
            
                  —
               
               
                  valorile DL50 cu limite de încredere de 95 %, la fiecare din momentele de observare recomandate, pentru substanţa testată şi etalonul de toxicitate;
               
            
                  —
               
               
                  metodele statistice utilizate pentru determinarea DL50;
               
            
                  —
               
               
                  mortalitatea la martori;
               
            
                  —
               
               
                  alte efecte biologice observate sau măsurate, de exemplu comportamentul anormal al albinelor (inclusiv respingerea dozei cu substanţa testată), rata consumului de hrană la grupele tratate şi netratate;
               
            
                  —
               
               
                  orice abatere de la modul de lucru descris şi orice alte date relevante.
               
            3.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO Bulletin, vol. 23, N.1, p. 151-165. March 1993.
               
            
                  2.
               
               
                  Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal of Apicultural Research, 22, p. 119-125.
               
            
                  3.
               
               
                  Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, p. 99-113.
               
            
                  4.
               
               
                  Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
               
            
                  5.
               
               
                  Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol.,18, p. 265-267.
               
            C.17.   ALBINELE – TESTUL DE TOXICITATE ACUTĂ PRIN CONTACT
      1.   METODĂ
      Metoda de determinare a toxicităţii acute reproduce Orientarea 214 (1998) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Prezentul test de toxicitate este o metodă de laborator, destinată determinării toxicităţii acute prin contact a produselor pentru protecţia plantelor şi a altor produse chimice la albinele lucrătoare adulte.
      În evaluarea caracteristicilor toxice ale substanţelor, s-ar putea să fie necesară determinarea toxicităţii acute de contact la albine, de exemplu când este posibilă expunerea albinelor la un anumit produs chimic. Testul de toxicitate acută prin contact se efectuează pentru determinarea toxicităţii inerente a pesticidelor şi altor produse chimice la albine. Rezultatele testului respectiv se utilizează pentru a stabili necesitatea unei evaluări suplimentare. Prezenta metodă se poate utiliza în special în programele în mai multe etape pentru evaluarea pericolelor pesticidelor pentru albine, prin înaintare secvenţială de la testele de toxicitate de laborator la experimentările de semi-teren şi teren (1). Pesticidele se pot testa sub formă de substanţe active (s.a.) sau de preparate.
      Pentru verificarea sensibilităţii albinelor şi a preciziei metodei de testare este necesară utilizarea unui etalon de toxicitate.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Toxicitatea orală acută: reprezintă efectele negative care apar în termen de maximum 96 ore de la aplicarea locală a unei doze unice dintr-o substanţă.
      
         Doza: reprezintă cantitatea de substanţă testată aplicată. Doza se exprimă ca masa (μg) de substanţă testată per animal experimental (μg/albină).
      
         DL
         
            50
         
         (doza letală medie) de contact: este o doză unică, obţinută statistic, dintr-o substanţă care poate provoca moartea a 50 % din animale atunci când se administrează prin contact. Valoarea DL50 se exprimă în (μg) de substanţă testată per albină. Pentru pesticide, substanţa testată poate să fie sub formă de substanţă activă (s.a.) sau de preparat ce conţine una sau mai multe substanţe active.
      
         Mortalitatea: un animal se înregistrează ca mort atunci când este complet imobil.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Se procedează la expunerea albinelor lucrătoare adulte (Apis mellifera) la o serie de doze de substanţă testată dizolvată într-un purtător corespunzător, prin aplicare directă pe torace (picături). Durata testului este de 48 h. Dacă rata mortalităţii creşte în intervalul dintre 24 ore şi 48 ore în timp ce mortalitatea martorului rămâne la un nivel acceptabil, adică ≤ 10 %, este potrivit să se prelungească durata testului până la maximum 96 h. Mortalitatea se înregistrează zilnic şi se compară cu valorile martorului. Se analizează rezultatele pentru a calcula valoarea DL50 la 24 h şi 48 h şi, dacă studiul se prelungeşte, la 72 h şi 96 h.
      1.4.   VALIDITATEA TESTULUI
      Pentru ca un test să fie valabil, trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
      
                  —
               
               
                  media mortalităţii pentru numărul total de martori trebuie să fie mai mică sau egală cu 10 % la sfârşitul testului;
               
            
                  —
               
               
                  DL50 a etalonului de toxicitate să se încadreze în intervalul specificat.
               
            1.5.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.5.1.   Colectarea albinelor
      Este necesar să se utilizeze albinele lucrătoare adulte tinere, adică albinele de aceeaşi vârstă, modalitate de hrană, din acelaşi roi etc. Albinele se obţin din colonii hrănite în mod corespunzător, sănătoase, pe cât posibil fără boli şi care provin din aceeaşi regină, cu antecedente şi stare fiziologică cunoscute. Acestea se pot colecta în dimineaţa în care se utilizează sau în seara de dinaintea testului şi ţinute în condiţiile de testare până în ziua următoare. Sunt potrivite albinele colectate din rame fără progenituri. Se evită colectarea primăvara devreme sau toamna târziu, deoarece albinele au o fiziologie modificată în perioadele menţionate. Dacă este necesară efectuarea testelor la începutul primăverii sau sfârşitul toamnei, albinele se pot introduce într-un incubator şi se hrănesc timp de o săptămână cu „pâinea albinelor” (polen recoltat din fagure) şi soluţie de zaharoză. Albinele tratate cu substanţe chimice, ca antibiotice, produse antivirale etc. nu se utilizează în testele de toxicitate timp de patru săptămâni din momentul terminării ultimului tratament.
      1.5.2.   Condiţii de adăpost şi hrană
      Se utilizează cuşti uşor de curăţat şi cu ventilaţie bună. Se poate utiliza un material corespunzător, de exemplu oţel inoxidabil, plasă de sârmă, cuşti din material plastic sau din lemn disponibile etc. Dimensiunile cuştilor experimentale trebuie să corespundă numărului de albine, adică să asigure spaţiul corespunzător. Se preferă grupuri de 10 albine în fiecare cuşcă.
      Albinele se ţin la întuneric într-o cameră experimentală la o temperatură de 25 ± 2 oC. Pe toată durata testului, se înregistrează umiditatea relativă, care este în mod normal de aproximativ 50-70 %. Manipularea, care include tratamentul şi observaţiile, se efectuează la lumină (lumina zilei). Ca hrană se utilizează soluţie apoasă de zaharoză cu o concentraţie finală de 500 g/l (50 % g/v) şi se furnizează ad libitum pe durata testului, într-un vas de alimentare. Acesta poate să fie o eprubetă (cu lungimea de aproximativ 50 mm şi diametrul de aproximativ 10 mm cu capătul deschis îngustat până la un diametru de aproximativ 2 mm).
      1.5.3.   Pregătirea albinelor
      Albinele colectate se anesteziază cu bioxid de carbon sau azot pentru aplicarea substanţei testate. Cantitatea de anestezic utilizat şi durata expunerii trebuie să fie minime. Albinele muribunde se resping şi se înlocuiesc cu albine sănătoase înaintea începerii testului.
      1.5.4.   Pregătirea dozelor
      Substanţa testată urmează să se aplice sub formă de soluţie într-un purtător, adică un solvent organic sau o soluţie apoasă cu un agent de umectare. Ca solvent organic, se preferă acetona, dar se pot utiliza şi alţi solvenţi organici cu toxicitate mică pentru albine (de exemplu dimetilformamidă, dimetilsulfoxid). Pentru preparatele dispersate în apă şi substanţele organice cu polaritate mare, care nu sunt solubile în solvenţii organici purtători, soluţiile se pot aplica mai uşor, dacă se prepară într-o soluţie slabă de agent de umectare comercializat (de exemplu Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).
      Se prepară soluţiile etalon corespunzătoare, adică, dacă se utilizează un solvent sau un agent de dispersie pentru solubilizarea substanţei testate, trebuie să se utilizeze două grupe etalon separate: una tratată cu apă şi una tratată cu solvent/agent de dispersie.
      1.6.   PROCEDURĂ
      1.6.1.   Grupele experimentale şi cele martor
      Numărul de doze şi probe identice experimentate trebuie să satisfacă condiţiile statistice pentru determinarea DL50 cu limite de încredere de 95 %. În mod normal, sunt necesare pentru test cinci doze în serie geometrică, cu un factor mai mic sau egal cu 2,2 şi care să cuprindă valorile pentru DL50. Cu toate acestea, factorul de diluţie şi numărul de concentraţii pentru dozare trebuie să se determine în funcţie de panta curbei de toxicitate (doza în funcţie de mortalitate) şi ţinând cont de metoda statistică aleasă pentru analiza rezultatelor. O probă pentru determinarea domeniului permite alegerea concentraţiilor potrivite pentru dozare.
      La minimum trei grupe experimentale identice, fiecare de 10 albine, se administrează doze cu fiecare concentraţie experimentată.
      În afară de seriile tratate cu concentraţiile experimentate, se urmăresc minimum trei serii martor, fiecare de 10 albine. Dacă se utilizează un solvent organic sau un agent de umectare, trebuie să se includă trei serii martor suplimentare, de câte 10 albine fiecare.
      1.6.2.   Etalonul de toxicitate
      În seria de teste se include un etalon de toxicitate. Se selectează cel puţin trei doze pentru a cuprinde valorile preconizate ale DL50. Pentru fiecare doză experimentată se utilizează minimum trei cuşti identice, fiecare conţinând 10 albine. Etalonul de toxicitate preferat este dimetoatul, pentru care DL50 – 24 h prin contact semnalată se situează între valorile 0,10-0,35 μg s.a./albină (2). Cu toate acestea, dacă se pot furniza suficiente date pentru verificarea răspunsului preconizat la doză, se pot accepta alte etaloane de toxicitate (de exemplu parationul).
      1.6.3.   Expunerea
      1.6.3.1.   Administrarea dozelor
      Albinele anesteziate se tratează individual prin aplicare locală. Albinele se distribuie în mod aleatoriu pentru diferite doze experimentate şi diferiţi martori. Se aplică un volum de 1 μl soluţie de substanţă testată în concentraţii potrivite cu o micropipetă pe partea dorsală a toracelui fiecărei albine. Dacă este necesar, se pot utiliza alte volume. După aplicare, albinele sunt repartizate în cuşti şi li se administrează soluţii de zaharoză.
      1.6.3.2.   Durata
      Durata testului este de preferinţă de 48 ore. Dacă mortalitatea creşte cu mai mult de 10 % între 24 h şi 48 h, durata testului se prelungeşte la maximum 96 ore, cu condiţia ca mortalitatea martorului să fie mai mică sau egală cu 10 %.
      1.6.4.   Observaţiile
      Mortalitatea se înregistrează la 4 h după administrarea dozelor şi apoi la 24 h şi 48 h. Dacă este necesară o perioadă prelungită de observare, se fac alte evaluări la intervale de 24 h, până la maximum 96 h, cu condiţia ca mortalitatea martorului să fie mai mică sau egală cu 10 %.
      Se consemnează toate manifestările anormale observate în timpul desfăşurării testului.
      1.6.5.   Testul la valori-limită
      În unele cazuri (de exemplu când se preconizează că o substanţă testată are o toxicitate mică) se poate efectua un test la valori-limită, utilizând 100 μg s.a./albină pentru a demonstra că DL50 este mai mare decât valoarea respectivă. Se utilizează acelaşi mod de lucru, care include trei grupe experimentale identice pentru dozele experimentate, martorii relevanţi şi utilizarea etalonului de toxicitate. Dacă se observă efecte subletale (a se vedea 1.6.4), se consemnează.
      2.   DATE ŞI RAPORT
      2.1.   DATE
      Rezultatele se sistematizează în tabele, care prezintă pentru fiecare grupă supusă tratamentului, precum şi pentru grupele martor şi cele tratate cu etalon de toxicitate, numărul de albine utilizate, mortalitatea în fiecare moment de observare şi numărul de albine cu un comportament negativ. Datele privind mortalitatea se analizează prin metode statistice corespunzătoare (de exemplu analiza probit, media mobilă, probabilitatea binominală) (3) (4). Se trasează curbele doză-răspuns pentru fiecare observare recomandată (adică la 24 h, 48 h şi, dacă este relevant, 72 h, 96 h) şi se calculează pantele curbelor şi dozele letale medii (DL50) cu limite de încredere de 95 %. Sunt posibile corecţii pentru mortalitatea martorului cu ajutorul corecţiei lui Abbott (4) (5). DL50 se exprimă în μg de substanţă testată per albină.
      2.2.   RAPORT DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele date:
      2.2.1.   Substanţa testată:
      
                  —
               
               
                  natura fizică şi proprietăţile fizico-chimice relevante (de exemplu stabilitatea în apă, presiunea de vapori);
               
            
                  —
               
               
                  datele de identificare chimică, care includ formula structurală, puritatea [adică pentru pesticide, identitatea şi concentraţia substanţei (substanţelor) active].
               
            2.2.2.   Speciile experimentale:
      
                  —
               
               
                  denumirea ştiinţifică, roiul, vârsta aproximativă (în săptămâni), metoda de colectare, data colectării;
               
            
                  —
               
               
                  datele privind coloniile din care s-au colectat albinele experimentale, care includ starea de sănătate, eventuale boli ale adulţilor, tratamente prealabile etc.
               
            2.2.3.   Condiţii de testare:
      
                  —
               
               
                  temperatura şi umiditatea relativă în camera experimentală;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de adăpost care includ tipul, dimensiunea şi materialul cuştilor;
               
            
                  —
               
               
                  metodele de administrare a substanţei testate, de exemplu solventul purtător utilizat, volumul soluţiei de substanţă testată aplicat, anestezicele utilizate;
               
            
                  —
               
               
                  protocolul testului, de exemplu numărul de încercări şi concentraţiile testate, numărul de martori; pentru fiecare concentraţie experimentată şi martor, numărul de cuşti identice, şi numărul de albine per cuşcă;
               
            
                  —
               
               
                  data efectuării testului.
               
            2.2.4.   Rezultatele:
      
                  —
               
               
                  rezultatele studiului preliminar de determinare a domeniului, dacă s-a efectuat;
               
            
                  —
               
               
                  datele brute: mortalitatea la fiecare concentraţie experimentată şi fiecare moment de observare;
               
            
                  —
               
               
                  trasarea curbelor doză-răspuns la sfârşitul testului;
               
            
                  —
               
               
                  valorile DL50 cu limite de încredere de 95 %, la fiecare din momentele de observare recomandate, pentru substanţa testată şi etalonul de toxicitate;
               
            
                  —
               
               
                  metodele statistice utilizate pentru determinarea DL50;
               
            
                  —
               
               
                  mortalitatea la martori;
               
            
                  —
               
               
                  alte efecte biologice observate sau măsurate şi orice răspunsuri anormale ale albinelor;
               
            
                  —
               
               
                  orice abatere de la modul de lucru descris şi orice alte date relevante.
               
            3.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, p. 151-165. March, 1993.
               
            
                  2.
               
               
                  Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G.B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981-1992. Journal of Apicultural Research 22, p. 119-125.
               
            
                  3.
               
               
                  Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, p. 99-113.
               
            
                  4.
               
               
                  Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
               
            
                  5.
               
               
                  Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, p. 265-267.
               
            C.18.   ADSORBŢIA/DESORBŢIA PRINTR-O METODĂ DE STABILIRE A ECHILIBRULUI PROBELOR
      1.   METODĂ
      Prezenta metodă reproduce Orientarea 106 a OCDE pentru determinarea adsorbţiei/desorbţiei printr-o metodă de stabilire a echilibrului probelor (2000).
      1.1.   INTRODUCERE
      Metoda ia în considerare un test de intercalibrare şi un schimb de experienţă în vederea selecţiei solului pentru realizarea unei încercări de adsorbţie (1) (2) (3) (4) şi, de asemenea, liniile directoare existente la nivel naţional (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).
      Studiile de adsorbţie/desorbţie sunt utile pentru obţinerea de date esenţiale privind mobilitatea substanţelor chimice şi distribuţia acestora în compartimentele solului, apei şi aerului din biosferă (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Datele se pot utiliza pentru a prognoza sau estima, de exemplu, predispoziţia unei substanţe chimice pentru degradare (22) (23), transformare sau asimilare de organisme (24); extracţie prin spălare în profilul solului (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28); volatilitate din sol (21) (29) (30); scurgere de pe suprafaţa terenurilor în apele naturale (18) (31) (32). Rezultatele adsorbţiei se pot utiliza pentru comparare şi modelare (19) (33) (34) (35).
      Distribuţia unei substanţe chimice între fazele solului şi cea apoasă este un proces complex care depinde de o serie de factori diferiţi: natura chimică a substanţei (12) (36) (37) (38) (39) (40), caracteristicile solului (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49), factorii climatici cum sunt precipitaţiile atmosferice, temperatura, lumina soarelui şi vântul. Astfel, numeroasele fenomene şi mecanisme implicate în procesul de adsorbţie a unei substanţe chimice în sol nu se pot explica în întregime printr-un model simplificat de laborator, cum este prezenta metodă. Cu toate acestea, chiar dacă o experienţă de acest fel nu poate să cuprindă toate cazurile posibile din mediu, poate furniza date valoroase privind relaţia dintre mediul înconjurător şi adsorbţia unei substanţe chimice.
      A se vedea şi introducerea generală.
      1.2.   DOMENIUL DE APLICARE
      Metoda are ca obiect determinarea comportamentului de adsorbţie/desorbţie al unei substanţe pe diferite soluri. Scopul este obţinerea unei valori a sorbţiei care să se poată utiliza la prognoza repartiţiei în condiţii de mediu diferite; în acest scop, se determină coeficienţii de adsorbţie la echilibru pentru o substanţă chimică pe diferite soluri în funcţie de caracteristicile solului (de exemplu, conţinutul de carbon organic, conţinutul de argilă şi structura şi pH-ul solului). Trebuie să se utilizeze tipuri diferite de soluri pentru a cuprinde cât mai multe interacţiuni posibile ale unei anumite substanţe cu solurile existente în natură.
      În prezenta metodă, adsorbţia reprezintă procesul de legare a unei substanţe chimice la suprafeţele solurilor; nu se poate face deosebire între diferitele procese de adsorbţie (adsorbţia fizică şi chimică) şi procese ca degradarea catalizată a suprafeţei, adsorbţia în grosime sau reacţia chimică. Adsorbţia care apare pe particulele coloidale (diametrul < 0,2 μm) generate de soluri nu se ia în considerare.
      Parametrii solurilor consideraţi cei mai importanţi pentru adsorbţie sunt: conţinutul de carbon organic (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) (45) (46) (47) (48); conţinutul de argilă şi structura solului (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) şi valoarea pH-ului pentru compuşii ionizabili (3) (4) (42). Alţi parametri ai solurilor care pot să aibă un impact asupra adsorbţiei/desorbţiei unei anumite substanţe sunt: capacitatea efectivă de schimb de cationi (CESC), conţinutul de oxizi de fier şi aluminiu amorfi, în special pentru solurile vulcanice şi tropicale (4), precum şi suprafaţa specifică (49).
      Testarea este destinată evaluării adsorbţiei unei substanţe chimice pe diferite tipuri de soluri cu valori diferite ale conţinutului de carbon organic, ale conţinutului de argilă şi ale structurii solului şi ale pH-ului. Aceasta conţine trei etape:
      
                  
                     Etapa 1:
               
               
                  Studiu preliminar pentru determinarea:
                  
                              —
                           
                           
                              raportului sol/soluţie;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              timpului de stabilire a echilibrului de adsorbţie şi a cantităţii de substanţă testată adsorbită la echilibru;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              adsorbţiei substanţei testate pe suprafaţa vaselor experimentale şi stabilităţii substanţei testate în timpul încercării.
                           
                        
            
                  
                     Etapa 2:
               
               
                  Proba de identificare: se studiază adsorbţia pe cinci tipuri diferite de soluri cu ajutorul cineticii adsorbţiei la o singură concentraţie şi se determină coeficienţii de distribuţie Kd şi Kco.
               
            
                  
                     Etapa 3:
               
               
                  Determinarea izotermelor de adsorbţie Freundlich pentru stabilirea influenţei concentraţiei asupra gradului de adsorbţie pe soluri.
                  Studiul desorbţiei cu ajutorul cineticii de desorbţie/izotermele de desorbţie Freundlich (apendicele 1).
               
            1.3.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      
                  Simbol
               
               
                  Definiţie
               
               
                  Unităţi
               
            
                  
                     
               
               
                  adsorbţia la momentul ti
                  
               
               
                  %
               
            
                  Aec
                  
               
               
                  adsorbţia la stabilirea echilibrului de adsorbţie
               
               
                  %
               
            
                  
                     
               
               
                  masa substanţei testate adsorbite pe sol la momentul ti
                  
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  masa substanţei testate adsorbite pe sol în intervalul de timp Δti
                  
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  masa substanţei testate adsorbite pe sol la echilibrul de adsorbţie
               
               
                  μg
               
            
                  m0
                  
               
               
                  masa substanţei testate din eprubetă, la începutul analizei de adsorbţie
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               masa substanţei testate măsurate într-un alicot (
                     ) la momentul ti
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  masa substanţei testate în soluţie la echilibrul de adsorbţie
               
               
                  μg
               
            
                  msol
                  
               
               
                  cantitatea fazei de sol, exprimată în substanţă uscată a solului
               
               
                  g
               
            
                  Csm
                  
               
               
                  concentraţia masică a soluţiei mamă de substanţă
               
               
                  μg cm–3
                  
               
            
                  C0
                  
               
               
                  concentraţia masică iniţială a soluţiei testate în contact cu solul
               
               
                  μg cm–3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  concentraţia masică a substanţei în fază apoasă la momentul ti de efectuare a încercării
               
               
                  μg cm–3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  conţinutul de substanţă adsorbită pe sol la echilibrul de adsorbţie
               
               
                  μg g–1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  concentraţia masică a substanţei în faza apoasă la echilibrul de adsorbţie
               
               
                  μg cm–3
                  
               
            
                  V0
                  
               
               
                  volumul iniţial al fazei apoase în contact cu solul în timpul încercării de adsorbţie
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  volumul alicotului în care se măsoară substanţa testată
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  Kd
                  
               
               
                  coeficientul de distribuţie pentru adsorbţie
               
               
                  cm3 g–1
                  
               
            
                  Kco
                  
               
               
                  coeficientul de adsorbţie normalizată a carbonului organic
               
               
                  cm3 g–1
                  
               
            
                  Kso
                  
               
               
                  coeficientul de distribuţie normalizată a substanţei organice
               
               
                  cm3 g–1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  coeficientul de adsorbţie Freundlich
               
               
                  μg 1–1/n (cm3) 1/n g–1
                  
               
            
                  1/n
               
               
                  exponentul Freundlich
               
               
                   
               
            
                  
                     
               
               
                  desorbţia la momentul ti
                  
               
               
                  %
               
            
                  
                     
               
               
                  desorbţia corespunzătoare unui interval de timp Δti
                  
               
               
                  %
               
            
                  Kdes
                  
               
               
                  coeficientul de desorbţie aparentă
               
               
                  cm3 g–1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  coeficientul de desorbţie Freundlich
               
               
                  μg 1–1/n (cm3) 1/n g–1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  masa substanţei testate desorbite din sol la momentul ti
                  
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  masa substanţei testate desorbite din sol în intervalul de timp Δti
                  
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  masa substanţei, determinată analitic în fază apoasă la stabilirea echilibrului de desorbţie
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  masa totală a substanţei testate desorbite la stabilirea echilibrului de desorbţie
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  masa substanţei adsorbită în continuare pe sol după intervalul de timp Δti
                  
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  masa substanţei rămase de la stabilirea echilibrului de adsorbţie datorită înlocuirii incomplete a volumului
               
               
                  μg
               
            
                  
                     
               
               
                  conţinutul de substanţă testată adsorbită în continuare pe sol la stabilirea echilibrului de desorbţie
               
               
                  μg g–1
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  concentraţia masică a substanţei testate în fază apoasă la stabilirea echilibrului de desorbţie
               
               
                  μg cm–3
                  
               
            
                  VT
                  
               
               
                  volumul total al fazei apoase în contact cu solul în timpul experimentării cineticii de desorbţie prin metoda în serie
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  VR
                  
               
               
                  volumul supernatantului scos din eprubetă după stabilirea echilibrului de adsorbţie şi înlocuit cu acelaşi volum dintr-o soluţie 0,01 M de CaCl2
                  
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  volumul unui alicot din care s-au luat probe pentru analiză la momentul (i), în timpul experimentării cineticii de desorbţie prin metoda în serie
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  volumul soluţiei luate din eprubeta (i) pentru determinarea substanţei testate, în experimentarea cineticii de desorbţie prin metoda paralelă
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  
                     
               
               
                  volumul soluţiei luate din eprubetă pentru determinarea substanţei testate, la stabilirea echilibrului de desorbţie
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  BM
               
               
                  bilanţul masic
               
               
                  %
               
            
                  mE
                  
               
               
                  masa totală a substanţei testate extrase din sol şi pereţii vasului experimental în două etape
               
               
                  μg
               
            
                  Vrec
                  
               
               
                  volumul supernatantului recuperat după stabilirea echilibrului de adsorpţie
               
               
                  cm3
                  
               
            
                  Pow
                  
               
               
                  coeficientul de partiţie octanol/apă
               
               
                   
               
            
                  pKa
               
               
                  constanta de disociere
               
               
                   
               
            
                  Sa
                  
               
               
                  solubilitatea apei
               
               
                  g l–1
                  
               
            1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Se adaugă volume cunoscute de soluţii ale substanţei testate, nemarcate sau marcate radioactiv, în concentraţii cunoscute în CaCl20,01 M, la probele de sol cu un conţinut de substanţă uscată cunoscut, care au fost aduse în prealabil la echilibru în CaCl20,01 M. Se agită amestecul un timp corespunzător. Suspensiile de sol se separă apoi prin centrifugare şi, dacă se doreşte, prin filtrare şi se analizează faza apoasă. Se calculează cantitatea de substanţă testată adsorbită pe proba de sol prin diferenţa dintre cantitatea de substanţă testată prezentă iniţial în soluţie şi cantitatea rămasă la sfârşitul experimentării (metoda indirectă).
      Ca alternativă, cantitatea de substanţă testată adsorbită se mai poate determina direct prin analiza solului (metoda directă). Această metodă, care include extracţia treptată a solului cu un solvent potrivit, se recomandă în cazurile în care concentraţia diferită în soluţie a substanţei nu se poate determina cu precizie. Exemple de asemenea cazuri sunt: adsorbţia substanţei testate pe suprafaţa vaselor experimentale, instabilitatea substanţei testate pe durata experimentării, adsorbţia slabă care generează doar modificări mici ale concentraţiei în soluţie şi adsorbţia puternică care generează concentraţii mici care nu se pot determina cu precizie. Dacă se utilizează o substanţă marcată radioactiv, se poate evita extracţia solului prin analiza fazei de sol prin calcinare şi numărătoarea în scintilaţie lichidă. Cu toate acestea, numărătoarea în scintilaţie lichidă este un procedeu nespecific care nu poate să facă diferenţa dintre produsele de bază şi cele de transformare; prin urmare, se utilizează numai în situaţia în care substanţa chimică testată este stabilă pe durata studiului.
      1.5.   INFORMAŢII REFERITOARE LA SUBSTANŢA TESTATĂ
      Reactivii chimici trebuie să fie de tip analitic. Se recomandă utilizarea substanţelor de testare nemarcate cu o compoziţie cunoscută şi, de preferat, cu o puritate de minimum 95 % sau a substanţelor de testare marcate radioactiv cu o compoziţie şi puritate cunoscute. La indicatorii cu perioada de înjumătăţire scurtă se aplică corecţii de dezintegrare.
      Înaintea realizării unei încercări de adsorbţie/desorbţie, trebuie să fie cunoscute datele referitoare de substanţa testată, prezentate în continuare:
      
                  (a)
               
               
                  solubilitatea în apă (A.6);
               
            
                  (b)
               
               
                  presiunea de vapori (A.4) şi constanta legii lui Henry;
               
            
                  (c)
               
               
                  degradarea abiotică: hidroliza în funcţie de pH (C.7);
               
            
                  (d)
               
               
                  coeficientul de partiţie (A.8);
               
            
                  (e)
               
               
                  biodegradabilitatea imediată (C.4) sau transformarea aerobică şi anaerobică în sol;
               
            
                  (f)
               
               
                  pKa pentru substanţele ionizabile;
               
            
                  (g)
               
               
                  fotoliza directă în apă (adică spectrul de absorbţie UV-vizibil în apă, randamentul cuantic) şi fotodegradarea pe sol.
               
            1.6.   APLICABILITATEA TESTULUI
      Testarea se poate aplica substanţelor chimice pentru care este disponibilă o metodă analitică suficient de precisă. Un parametru important care influenţează credibilitatea rezultatelor, în special atunci când se utilizează metoda indirectă, este stabilitatea substanţei testate în scara de timp a probei. Prin urmare, este necesară verificarea stabilităţii într-un studiu preliminar; dacă, în scara de timp a încercării, se observă o modificare, se recomandă ca studiul principal să se realizeze prin analizarea atât a solului, cât şi a fazelor apoase.
      În realizarea prezentei încercări, pot să apară dificultăţi pentru substanţele cu solubilitate mică în apă (Sw < 10–4 g l–1), precum şi pentru substanţele cu sarcini mari, deoarece concentraţia în faza apoasă nu se poate măsura analitic cu suficientă precizie. În situaţiile de acest fel, trebuie să se ia măsuri suplimentare. Modalitatea de rezolvare a acestor probleme se indică, orientativ, la punctele respective ale prezentei metode.
      La testarea substanţelor volatile, trebuie să se aibă grijă să se evite pierderile în timpul studiului.
      1.7.   DESCRIEREA METODEI
      1.7.1.   Aparatura şi reactivii chimici
      Aparatură standard de laborator, în special cea prezentată în continuare:
      
                  (a)
               
               
                  Eprubete sau vase pentru realizarea experimentelor. Este important ca eprubetele şi vasele respective:
                  
                              —
                           
                           
                              să fie instalate direct în centrifugă pentru a minimiza erorile de manipulare şi transfer;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              să fie obţinute dintr-un material inert, care minimizează adsorbţia substanţei testate pe suprafaţa acestora.
                           
                        
            
                  (b)
               
               
                  Agitator: agitator acţionat de sus sau un dispozitiv echivalent; agitatorul menţine solul în suspensie în timpul agitării.
               
            
                  (c)
               
               
                  Centrifugă: de preferinţă una de viteză mare, de exemplu forţele de centrifugare > 3 000 g, termoreglabilă, care să poată să separe particulele cu diametrul mai mare de 0,2 μm din soluţia apoasă. Recipientele trebuie să fie închise în timpul agitării şi centrifugării pentru a evita volatilizarea şi pierderile de apă; pentru a minimiza adsorbţia pe acestea, se recomandă utilizarea capacelor dezactivate, cum ar fi capacele cu filet căptuşite cu teflon.
               
            
                  (d)
               
               
                  Opţional: dispozitiv de filtrare; filtre cu o porozitate de 0,2 μm, sterile, de unică folosinţă. Trebuie să se acorde o atenţie deosebită la alegerea materialului pentru filtru, pentru a evita pierderile de substanţă testată pe acesta; pentru substanţele testate cu solubilitate mică, nu se recomandă un material de filtrare organic.
               
            
                  (e)
               
               
                  Instrumente analitice, potrivite pentru măsurarea concentraţiei substanţei testate.
               
            
                  (f)
               
               
                  Etuvă de laborator care permite menţinerea unei temperaturi de 103-110 oC.
               
            1.7.2.   Caracterizarea şi selectarea solurilor
      Solurile se caracterizează prin trei parametri de care se consideră că depinde în mare măsură capacitatea adsorbantă: carbonul organic, conţinutul de argilă şi structura solului şi pH-ul. După cum s-a menţionat deja (a se vedea Domeniul de aplicare), şi alte proprietăţi fizico-chimice ale solului pot să aibă impact asupra adsorbţiei/desorbţiei unei anumite substanţe şi aceste cazuri trebuie avute în vedere.
      Metodele utilizate pentru caracterizarea solului sunt foarte importante şi pot avea o influenţă semnificativă asupra rezultatelor. Prin urmare, se recomandă ca pH-ul solului să se măsoare într-o soluţie de CaCl20,01 M (adică soluţia utilizată în testarea de adsorbţie/desorbţie) conform metodei ISO corespunzătoare (ISO-10390-1). Se mai recomandă determinarea altor proprietăţi relevante ale solului conform metodelor standard (de exemplu „Îndreptarul pentru analiza solului” ISO); acest lucru permite ca analiza datelor privind sorbţia să se facă pe baza parametrilor solului standardizaţi la nivel mondial. O orientare pentru metodele standard existente pentru analiza şi caracterizarea solului este oferită în bibliografie (50-52). Pentru etalonarea metodelor de analiză a solului, se recomandă utilizarea solurilor de referinţă.
      O orientare privind selecţia solurilor pentru încercările de adsorbţie/desorbţie se prezintă în tabelul 1. Cele şapte soluri selectate cuprind tipurile de soluri întâlnite în zonele geografice temperate. Pentru substanţele testate ionizabile, solurile selectate trebuie să cuprindă un domeniu larg de pH, pentru a fi posibilă evaluarea adsorbţiei substanţei în formele ionizată şi neionizată ale acesteia. O orientare privind modul de utilizare a mai multor soluri diferite în diferite etape ale încercării se prezintă la punctul 1.9 Realizarea încercării.
      Dacă se preferă alte tipuri de soluri, este necesar ca parametrii şi variaţia proprietăţilor acestora să fie similare cu cele descrise în tabelul 1, chiar dacă nu satisfac criteriile cu exactitate.
      Tabelul 1
      Orientare pentru selectarea probelor de soluri pentru adsorbţie-desorbţie
      
                  Tipul solului
               
               
                  Valorile pH-ului (în CaCl20,01 M)
               
               
                  Conţinutul de carbon organic ( %)
               
               
                  Conţinutul de argilă ( %)
               
               
                  Structura solului (25)
                  
               
            
                  1
               
               
                  4,5-5,5
               
               
                  1,0-2,0
               
               
                  65-80
               
               
                  argilă
               
            
                  2
               
               
                  > 7,5
               
               
                  3,5-5,0
               
               
                  20-40
               
               
                  pământ argilos-nisipos
               
            
                  3
               
               
                  5,5-7,0
               
               
                  1,5-3,0
               
               
                  15-25
               
               
                  argilă nisipoasă din aluviuni
               
            
                  4
               
               
                  4,0-5,5
               
               
                  3,0-4,0
               
               
                  15-30
               
               
                  argilă nisipoasă
               
            
                  5
               
               
                  < 4,0-6,0 (26)
                  
               
               
                  < 0,5-1,5 (26)
                      (27)
                  
               
               
                  < 10-15 (26)
                  
               
               
                  nisip argilos
               
            
                  6
               
               
                  > 7,0
               
               
                  < 0,5-1,0 (26)
                      (27)
                  
               
               
                  40-65
               
               
                  pământ argilos-nisipos/argilă
               
            
                  7
               
               
                  < 4,5
               
               
                  > 10
               
               
                  < 10
               
               
                  nisip/nisip argilos
               
            1.7.3.   Colectarea şi depozitarea probelor de sol
      1.7.3.1.   Colectarea
      Nu se recomandă tehnici de prelevare a probelor sau instrumente specifice; tehnica de prelevare a probelor depinde de scopul studiului (53) (54) (55) (56) (57) (58).
      Se au în vedere cele menţionate în continuare:
      
                  (a)
               
               
                  este necesară o descriere detaliată a situaţiei terenului; aceasta include poziţia, acoperirea cu vegetaţie, tratamentul cu pesticide şi îngrăşăminte, adaosuri biologice sau contaminarea accidentală. Este necesar să se respecte recomandările standardelor ISO privind prelevarea probelor de sol (ISO 10381-6), referitoare la descrierea locului de prelevare a probelor;
               
            
                  (b)
               
               
                  locul de prelevare a probelor trebuie să fie stabilit cu ajutorul UTM (proiecţia Mercator transversală universală/cota convenţională europeană) sau a coordonatelor geografice; astfel ar fi posibilă repetarea colectării unui anumit sol în viitor sau ar ajuta la încadrarea solului în diferite sisteme de clasificare utilizate în diferite ţări. De asemenea, se recomandă să se colecteze sol numai din planul de referinţă A de până la 20 cm adâncime. În special pentru tipul de sol nr. 7, dacă există un plan de referinţă Oh ca parte a solului, acesta se include în prelevarea probelor.
               
            Probele de sol se transportă în recipiente şi în condiţii de temperatură care să garanteze păstrarea proprietăţilor iniţiale ale solului, nealterate în mare parte.
      1.7.3.2.   Depozitarea
      Se preferă utilizarea solurilor proaspăt colectate de pe teren. Numai dacă acest lucru nu este posibil, solul se poate păstra la temperatura ambiantă şi în aer uscat. Nu se recomandă termene-limită, dar solurile depozitate mai mult de trei ani se analizează din nou înaintea utilizării pentru determinarea conţinutului de carbon organic, pH-ului şi CSC (capacitatea de schimb de cationi).
      1.7.3.3.   Manipularea şi pregătirea probelor de sol pentru testare
      Solurile se usucă în aer la temperatura ambiantă (de preferinţă la 20-25 oC). Dezagregarea se realizează cu o forţă minimă, astfel încât structura originală a solului să se modifice cât se poate de puţin. Solurile se cern până la dimensiuni ale particulelor ≤ 2 mm; se respectă recomandările standardului ISO privind prelevarea probelor de sol (ISO 10381-6), referitoare la cernere. Se recomandă omogenizarea atentă, deoarece aceasta creşte reproductibilitatea rezultatelor. Conţinutul de umiditate din fiecare sol se determină pe trei alicoţi şi încălzire la 105 oC până la greutate constantă (aproximativ 12 ore). În toate calculele, pentru masa de sol se consideră masa uscată în etuvă, adică greutatea solului la care se aplică corecţia pentru conţinutul de umiditate.
      1.7.4.   Pregătirea substanţei testate pentru aplicarea pe sol
      Substanţa testată se dizolvă într-o soluţie de CaCl20,01 M în apă distilată sau apă deionizată; soluţia de CaCl2 se utilizează sub formă de fază apoasă de solvent pentru îmbunătăţirea centrifugării şi minimizarea schimbului de cationi. Concentraţia soluţiei mamă este, de preferinţă, mai mare cu trei ordine de mărime decât limita de detecţie a metodei analitice utilizate. Pragul menţionat asigură măsurători precise pentru metodologia urmată în prezenta metodă; în afară de aceasta, concentraţia soluţiei mamă trebuie să fie mai mică decât solubilitatea în apă a substanţei testate.
      Este de preferat ca soluţia mamă să se prepare chiar înaintea aplicării pe probele de sol şi să se păstreze închisă, la întuneric, la 4 oC. Durata depozitării depinde de stabilitatea substanţei testate şi de concentraţia acesteia în soluţie.
      Numai pentru substanţele cu solubilitate mică (Sa < 10–4 g l–1), ar putea să fie necesar un agent de solubilizare corespunzător, dacă dizolvarea substanţei testate este dificilă. Agentul de solubilizare respectiv: (a) trebuie să fie miscibil cu apa, de exemplu metanol sau acetonitril; (b) concentraţia acestuia nu trebuie să fie mai mare de 1 % din volumul total al soluţiei mamă şi să reprezinte mai puţin decât cea din soluţia substanţei testate care va veni în contact cu solul (de preferinţă mai mică de 0,1 %); şi (c) nu trebuie să fie un agent tensioactiv sau să intre în reacţii solvolitice cu substanţa chimică testată. Utilizarea unui agent de solubilizare se stipulează şi se justifică în raportarea rezultatelor.
      O altă posibilitate pentru substanţele cu solubilitate mică constă în adăugarea substanţei testate în sistemul experimental prin îmbogăţire: substanţa de testat se dizolvă într-un solvent organic, din care se ia un alicot care se adaugă în sistemul format din sol şi soluţie de CaCl20,01 M în apă distilată sau deionizată. Conţinutul de solvent organic în faza apoasă se menţine cât se poate de mic, de obicei mai mic sau egal cu 0,1 %. Se poate ca îmbogăţirea dintr-o soluţie organică să nu fie reproductibilă din punct de vedere al volumului. Astfel, se poate introduce încă o eroare, deoarece concentraţia substanţei testate şi a cosolventului s-ar putea să nu fie aceleaşi în toate încercările.
      1.8.   CONDIŢII NECESARE PENTRU REALIZAREA TESTULUI DE ADSORBŢIE/DESORBŢIE
      1.8.1.   Metoda analitică
      Parametrii importanţi care pot să influenţeze precizia măsurătorilor de sorbţie includ acurateţea metodei analitice pentru analiza atât a fazei soluţiei, cât şi a celei adsorbite, stabilitatea şi puritatea substanţei testate, realizarea echilibrului de sorpţie, amploarea variaţiei concentraţiei soluţiei, raportul sol/soluţie şi modificările din structura solului în timpul procesului de stabilire a echilibrului (35) (59)-(62). Câteva exemple privind problemele de acurateţe sunt prezentate în apendicele 2.
      Trebuie să se verifice fiabilitatea metodei analitice pentru un domeniu de concentraţii care se pot întâlni în timpul încercării. Cercetătorul trebuie să aibă libertatea de a elabora o metodă potrivită care să prezinte acurateţe, precizie, reproductibilitate, limite de detecţie şi recuperare optime. În continuare, se oferă o orientare privind modul de efectuare a acestei încercări.
      Un volum potrivit de CaCl20,01 M, de exemplu 100 cm3, se supune agitării timp de 4 ore împreună cu o cantitate de sol, de exemplu 20 g, cu o capacitate mare de adsorbţie, adică cu un conţinut mare de carbon organic şi argilă; greutăţile şi volumele menţionate pot să varieze în funcţie de necesităţile analitice, dar ca punct de plecare se preferă un raport sol/soluţie de 1:5. Amestecul se supune centrifugării şi faza apoasă se poate filtra. Se adaugă un volum determinat de soluţie mamă a substanţei testate la aceasta din urmă pentru a obţine o concentraţie nominală care să se încadreze în domeniul de concentraţii care se pot întâlni în timpul încercării. Volumul respectiv trebuie să fie mai mic sau egal cu 10 % din volumul final al fazei apoase, pentru a modifica cât se poate de puţin natura soluţiei la preechilibru. Se analizează soluţia.
      Pentru verificarea artefactelor din metoda analitică şi a efectelor de matrice provocate de sol, trebuie să se includă o probă oarbă care să conţină sistemul sol + soluţie de CaCl20,01 M (fără substanţa testată).
      Metodele analitice care se pot utiliza pentru măsurători de sorbţie includ cromatografia gaz-lichid (CGL), cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC), spectrometria (de exemplu GC/spectrometrie de masă, HPLC/spectrometrie de masă) şi numărătoare în scintilaţie lichidă (pentru substanţele marcate radioactiv). Indiferent de metoda analitică utilizată, se consideră că este bine, dacă recuperările se situează între 90 % şi 110 % din valoarea nominală. Pentru a permite detectarea şi evaluarea după ce a avut loc partiţia, este necesar ca limitele de detecţie ale metodei analitice să fie cu cel puţin două ordine de mărime mai mici decât concentraţia nominală.
      Caracteristicile şi limitele de detecţie ale metodei analitice disponibile pentru efectuarea studiilor de adsorbţie joacă un rol important în stabilirea condiţiilor de testare şi în întreaga desfăşurare a încercării. Metoda urmează o cale experimentală generală şi oferă recomandări şi orientare pentru alte soluţii, dacă există posibilitatea impunerii unor restricţii datorită metodei analitice şi dotării laboratorului.
      1.8.2.   Selectarea raporturilor optime sol/soluţie
      Selectarea raporturilor optime sol/soluţie pentru studiile se sorbţie depinde de coeficientul de distribuţie Kd şi de gradul relativ al adsorbţiei dorite. Modificarea concentraţiei substanţei în soluţie determină acurateţea statistică a măsurătorii, datorită formei ecuaţiei pentru adsorbţie şi limitei de detecţie a metodologiei analitice, în determinarea concentraţiei substanţei chimice în soluţie. Prin urmare, în practica generală, este util să se stabilească câteva raporturi fixe, pentru care procentul adsorbit să fie mai mare de 20 % şi de preferinţă > 50 % (62), având grijă în acelaşi timp să se menţină o concentraţie suficient de mare a substanţei testate în fază apoasă, pentru a fi măsurată cu acurateţe. Acest lucru este deosebit de important pentru cantităţile mari, în procente, adsorbite.
      Un procedeu comod de selectare a raporturilor optime sol/apă constă în estimarea valorii Kd fie prin studii preliminare, fie prin tehnici de estimare stabilite (apendicele 3). Apoi, selectarea unui raport optim se poate realiza cu ajutorul reprezentării grafice a raportului sol/soluţie în funcţie de Kd pentru procente stabilite ale adsorbţiei (figura 1). În reprezentarea grafică menţionată, se consideră că ecuaţia de adsorbţie este lineară (28). Relaţia aplicabilă se obţine printr-o ecuaţie de rearanjare (4) a Kd sub forma ecuaţiei (1):
      
                  
                     
               
               
                  (1)
               
            sau sub forma sa logaritmică, considerând că R = msol/V0 şi 
      
                  
                     
               
               
                  (2)
               
            
         
      Figura 1 prezintă raporturile sol/soluţie în funcţie de Kd pentru diferite valori ale adsorbţiei. De exemplu, pentru un raport sol/soluţie de 1:5 şi o valoare a Kd de 20, ar avea loc o adsorbţie de 80 %. Pentru a obţine o adsorbţie de 50 % pentru aceeaşi valoare a Kd, trebuie să se utilizeze un raport de 1:25. Acest procedeu pentru selectarea raporturilor optime sol/soluţie oferă persoanei care efectuează studiul flexibilitatea de a satisface necesităţile experimentale.
      Zonele care sunt mai greu de rezolvat sunt cele în care substanţa chimică este puternic sau foarte puţin adsorbită. Dacă se produce o adsorbţie slabă, se recomandă un raport sol/soluţie de 1:1, deşi s-ar putea ca pentru unele tipuri de soluri foarte organice să fie necesare raporturi mai mici pentru a obţine un mâl. La metodologia analitică, trebuie să se acorde o atenţie deosebită la măsurarea modificărilor mici ale concentraţiei soluţiei; în caz contrar, măsurarea adsorbţiei nu va fi exactă. Pe de altă parte, la valori foarte mari ale coeficienţilor de distribuţie Kd, se poate merge până la un raport sol/soluţie de 1:100 pentru a lăsa o cantitate importantă de substanţă chimică în soluţie. Cu toate acestea, trebuie mare grijă pentru asigurarea unei amestecări bune şi sistemul trebuie lăsat un timp suficient pentru stabilirea echilibrului. Un alt procedeu utilizat pentru rezolvarea cazurilor extreme de acest tip, atunci când nu există o metodologie analitică specifică, constă în estimarea valorii Kd cu ajutorul unor procedee de estimare, de exemplu, cu ajutorul valorilor Pow (apendicele 3). Acesta ar putea să fie util, în special pentru substanţele chimice puţin adsorbite/polare, cu Pow < 20 şi pentru substanţele chimice lipofile/care se adsorb puternic, cu Pow > 104.
      1.9.   DESFĂŞURAREA TESTULUI
      1.9.1.   Condiţii de testare
      Toate testele se realizează la temperatura ambiantă şi, dacă este posibil, la o temperatură constantă între 20 oC şi 25 oC.
      Condiţiile de centrifugare trebuie să permită eliminarea particulelor mai mari de 0,2 μm din soluţie. Valoarea menţionată activează particulele de cele mai mici dimensiuni care sunt considerate particule solide şi reprezintă limita dintre particulele solide şi coloidale. O orientare asupra modului de determinare a condiţiilor de centrifugare se prezintă în apendicele 4.
      Dacă dispozitivele de centrifugare nu pot să garanteze eliminarea particulelor mai mari de 0,2 μm, se poate utiliza o combinaţie de centrifugare cu filtrare, cu filtre de 0,2 μm. Filtrele de acest tip ar trebui realizate dintr-un material inert potrivit pentru a evita pierderile de substanţă testată pe acestea. În orice caz, trebuie dovedit că nu se produc pierderi de substanţă testată în timpul filtrării.
      1.9.2.   Etapa 1 – Studiu preliminar
      Scopul realizării unui studiu preliminar a fost deja prezentat la punctul „Domeniu de aplicare”. O orientare privind iniţierea unei încercări de acest tip se prezintă în experimentul propus în continuare.
      1.9.2.1.   Selectarea raporturilor optime sol/soluţie
      Se utilizează două tipuri de soluri şi trei raporturi sol/soluţie (şase probe). Un tip de sol are conţinut mare de carbon organic şi conţinut mic de argilă şi celălalt are conţinut mic de carbon organic şi conţinut mare de argilă. Se propun următoarele raporturi sol/soluţie:
      
                  —
               
               
                  50 g sol şi 50 cm3 soluţie apoasă de substanţă testată (raport 1/1);
               
            
                  —
               
               
                  10 g sol şi 50 cm3 soluţie apoasă de substanţă testată (raport 1/5);
               
            
                  —
               
               
                  2 g sol şi 50 cm3 soluţie apoasă de substanţă testată (raport 1/25).
               
            Cantitatea minimă de sol pe care se poate efectua testarea depinde de dotările din laborator şi de performanţa metodelor analitice utilizate. Cu toate acestea, se recomandă să se utilizeze cel puţin 1 g şi, de preferinţă, 2 g, pentru a obţine rezultate credibile în urma încercărilor.
      O probă martor care conţine numai substanţa testată în soluţie de CaCl20,01 M (fără sol) se supune unor etape precis identice cu cele ale sistemelor studiate, pentru a verifica stabilitatea substanţei testate în soluţie de CaCl2 şi posibilitatea adsorbţiei acesteia pe suprafeţele vaselor experimentale.
      O probă oarbă pentru fiecare sol, care conţine aceeaşi cantitate de sol şi un volum total de 50 cm3 de soluţie de CaCl20,01 M (fără substanţa testată) se supune aceluiaşi procedeu de testare. Acesta reprezintă principalul control în timpul analizei pentru detectarea substanţelor care interferează sau a solurilor contaminate.
      Toate încercările, inclusiv cele cu probă martor şi probă oarbă, se realizează cel puţin de două ori. Numărul total de probe care trebuie pregătite pentru studiu se poate calcula ţinând seama de metodologia care va fi urmată.
      Metodele pentru studiul preliminar şi studiul principal sunt, în general, aceleaşi, excepţiile fiind menţionate, dacă este cazul.
      Probele de sol uscate în aer se aduc la echilibru prin agitare cu un volum minim de 45 cm3 de soluţie de CaCl20,01 M peste noapte (12 h) înaintea zilei în care se efectuează testarea. Apoi, se adaugă un volum determinat din soluţia mamă a substanţei testate pentru a aduce volumul final la 50 cm3. Volumul respectiv de soluţie mamă adăugat: (a) nu trebuie să fie mai mare de 10 % din volumul final de 50 cm3 de fază apoasă pentru a modifica cât se poate de puţin natura soluţiei de prestabilire a echilibrului; (b) trebuie să dea, de preferinţă, o concentraţie iniţială a substanţei testate în contact cu solul (C0) cu cel puţin două ordine de mărime mai mare decât limita de detecţie a metodei analitice; pragul menţionat asigură posibilitatea de a efectua măsurători exacte chiar şi atunci când se produc adsorbţii puternice (> 90 %) şi de determinare a izotermelor de adsorbţie. Se recomandă, dacă este posibil, ca şi concentraţia iniţială a substanţei (C0) să nu fie mai mare decât jumătate din limita de solubilitate a acesteia.
      În continuare se prezintă un exemplu de mod de calcul al concentraţiei soluţiei mamă (Csm). Se consideră o limită de detecţie de 0,01 μg cm–3 şi o adsorbţie de 90 %; astfel, concentraţia iniţială a substanţei testate în contact cu solul este, de preferinţă, de 1 μg cm–3 (cu două ordine de mărime mai mare decât limita de detecţie). Considerând că se adaugă volum maxim recomandat de soluţie mamă, adică 5-45 cm3 soluţie de echilibrare de CaCl20,01 M (= 10 % din soluţia mamă până la 50 cm3 volumul total al fazei apoase), concentraţia soluţiei mamă este de 10 μg cm–3; aceasta este cu trei ordine de mărime mai mare decât limita de detecţie a metodei analitice.
      Se măsoară valoarea pH-ului fazei apoase înainte şi după contactul cu solul, deoarece joacă un rol important în întregul proces de adsorbţie, în special pentru substanţele ionizabile.
      Amestecul se agită până la stabilirea echilibrului de adsorbţie. Momentul stabilirii echilibrului în sol variază în mare măsură, în funcţie de substanţa chimică şi de sol; în general, este suficient un timp de 24 h (77). În studiul preliminar, probele se pot colecta la anumite intervale de timp din cele 48 de ore de amestecare (de exemplu la 4, 8, 24, 48 h). Cu toate acestea, momentele în care se fac determinările se stabilesc şi în funcţie de programul de lucru al laboratorului.
      Există două opţiuni pentru analiza substanţei testate în soluţie apoasă: (a) metoda paralelă şi (b) metoda în serie. Trebuie să se sublinieze că, deşi metoda paralelă este mai incomodă din punct de vedere experimental, tratarea matematică a rezultatelor este mai simplă (apendicele 5). Cu toate acestea, alegerea metodologiei de urmat rămâne la latitudinea cercetătorului care trebuie să ia în considerare dotarea şi resursele de care dispune laboratorul.
      
                  (a)
               
               
                  Metoda paralelă: se pregătesc probe cu acelaşi raport sol/soluţie, în număr egal cu intervalele de timp la care se doreşte să se studieze cinetica adsorbţiei. După centrifugare şi dacă se doreşte filtrarea, se recuperează faza apoasă din prima eprubetă cât se poate de complet şi se măsoară după, de exemplu, 4 h, cea din a doua eprubetă după 8 h, cea din a treia după 24 h etc.
               
            
                  (b)
               
               
                  Metoda în serie: se prepară doar o probă dublă pentru fiecare raport sol/soluţie. La intervale determinate de timp, amestecul se supune centrifugării pentru separarea fazelor. Se analizează imediat un mic alicot din faza apoasă pentru determinarea substanţei testate; apoi testarea continuă cu amestecul iniţial. Dacă se aplică filtrarea după centrifugare, laboratorul trebuie să dispună de dispozitivele pentru realizarea filtrării unor mici alicoţi din soluţia apoasă. Se recomandă ca volumul total al alicoţilor luaţi să nu fie mai mare de 1 % din volumul total al soluţiei, pentru nu a modifica semnificativ raportul sol/soluţie şi pentru a reduce masa substanţei dizolvate care poate să fie adsorbită în timpul încercării.
               
            Se calculează adsorbţia , în procente, la fiecare moment (ti) în funcţie de concentraţia iniţială nominală şi concentraţia măsurată în momentul prelevării probei (ti), se corectează cu valoarea probei oarbe. Se reprezintă grafic  în funcţie de timp (apendicele 5 figura 1) pentru a estima stabilirea palierului de echilibru (29). Se mai calculează valoarea Kd la echilibru. În funcţie de această valoare Kd, se selectează raporturile optime sol/soluţie din figura 1, astfel încât adsorbţia în procente să ajungă la mai mult de 20 % şi, de preferinţă, la > 50 % (61). Toate ecuaţiile şi principiile aplicabile se prezintă la punctul „Rezultatele şi raportarea acestora” şi în apendicele 5.
      1.9.2.2.   Determinarea momentului de stabilire a echilibrului de adsorbţie şi a cantităţii de substanţă testată adsorbită la echilibru
      După cum s-a menţionat deja, reprezentările grafice ale  sau  în funcţie de timp permit estimarea stabilirii echilibrului de adsorbţie şi a cantităţii de substanţă testată adsorbită la echilibru. Figurile 1 şi 2 din apendicele 5 prezintă exemple de asemenea reprezentări grafice. Momentul de stabilire a echilibrului reprezintă nevoia sistemului de a ajunge la un palier.
      Dacă, pentru un anumit sol, nu se găseşte un palier, ci o creştere constantă, acest lucru se poate datora unor factori care complică situaţia, cum ar fi biodegradarea sau difuzia lentă. Biodegradarea se poate pune în evidenţă prin repetarea încercării cu o probă sterilizată de sol. Dacă nici în acest caz nu se obţine un palier, cercetătorul trebuie să caute alte fenomene care ar putea să fie implicate în studiile sale specifice; acest lucru se poate realiza prin modificări corespunzătoare ale condiţiilor experimentale (temperatură, timpi de agitare, raporturi sol/soluţie). Rămâne la latitudinea cercetătorului să decidă dacă să continue procedeul de testare, în ciuda unui posibil eşec în stabilirea echilibrului.
      1.9.2.3.   Adsorbţia pe suprafaţa vasului experimental şi stabilitatea substanţei testate
      Se pot obţine date privind adsorbţia substanţei testate pe suprafaţa vaselor experimentale, precum şi stabilitatea acesteia, prin analizarea probelor martor. Dacă se observă o epuizare mai mare decât eroarea standard a metodei analitice, se poate să fie implicată degradarea abiotică şi adsorbţia pe suprafaţa vasului experimental. Se poate face distincţia dintre aceste două fenomene prin spălarea cu grijă a pereţilor vasului experimental cu un volum cunoscut dintr-un solvent potrivit şi analizarea soluţiei de spălare pentru determinarea substanţei testate. Dacă nu se observă adsorbţie pe suprafaţa vaselor experimentale, epuizarea indică instabilitatea abiotică a substanţei testate. Dacă se găseşte adsorbţie, este necesar ca vasul experimental să fie din alt material. Cu toate acestea, rezultatele încercării descrise anterior privind adsorbţia pe suprafaţa vaselor experimentale nu pot fi extrapolate direct la testarea sol/soluţie. Prezenţa solului va afecta adsorbţia respectivă.
      Se pot obţine date suplimentare privind stabilitatea substanţei testate prin determinarea bilanţului de masă original în timp. Aceasta înseamnă că se analizează faza apoasă, extractele de sol şi pereţii vaselor experimentale pentru determinarea substanţei testate. Diferenţa dintre masa substanţei chimice testate adăugate şi suma maselor substanţei chimice testate în faza apoasă, extractele de sol şi de pe pereţii vaselor experimentale este egală cu masa degradată şi volatilizată şi neextrasă. Pentru a determina bilanţul de masă, este necesar ca echilibrul de adsorbţie să fi fost stabilit în timpul experimentării.
      Bilanţul de masă se face pe ambele soluri şi pentru un raport sol/soluţie per sol care dă o epuizare de peste 20 % şi, de preferinţă, > 50 % la echilibru. La terminarea încercării pentru găsirea raportului prin analiza ultimei probe de fază apoasă după 48 ore, fazele se separă prin centrifugare şi, dacă se doreşte, prin filtrare. Faza apoasă se recuperează atât cât este posibil şi se adaugă solului un solvent de extracţie potrivit (coeficientul de extracţie de cel puţin 95 %) pentru extragerea substanţei testate. Se recomandă cel puţin două extracţii succesive. Se determină cantitatea de substanţă din extractele din sol şi de pe pereţii vaselor experimentale şi se calculează bilanţul de masă (Date și raport, ecuaţia 10). Dacă acesta este mai mic de 90 %, se consideră că substanţa testată este instabilă pe scara timpului de testare. Cu toate acestea, studiile se mai pot continua, ţinând seama de instabilitatea substanţei testate; în cazul respectiv, se recomandă analizarea ambelor faze în studiul principal.
      1.9.2.4.   Etapa 2 – Cinetica de adsorbţie la o concentraţie a substanţei testate
      Se utilizează cinci soluri, selectate din tabelul 1. Este avantajoasă includerea unora sau a tuturor solurilor utilizate în studiul preliminar, dacă este cazul, printre cele cinci soluri. În cazul respectiv, pentru solurile utilizate în studiul preliminar, etapa 2 nu trebuie să se repete.
      Momentul stabilirii echilibrului, raportul sol/soluţie, greutatea probei de sol, volumul fazei apoase în contact cu solul şi concentraţia substanţei testate în soluţie se aleg în funcţie de rezultatele studiului preliminar. Determinarea se face de preferinţă după aproximativ 2, 4, 6, 8 (posibil şi 10) şi 24 h timp de contact; timpul de agitare se poate prelungi la maximum 48 h, dacă o substanţă chimică necesită un timp mai îndelungat pentru stabilirea echilibrului în privinţa rezultatelor încercării pentru găsirea raportului. Cu toate acestea, momentele de efectuare a determinărilor se pot stabili cu îngăduinţă.
      Fiecare testare (un sol şi o soluţie) se realizează cel puţin dublu pentru a permite estimarea variaţiei rezultatelor. Pentru fiecare testare se pregăteşte o probă oarbă. Aceasta conţine solul şi soluţia de CaCl20,01 M, fără substanţa testată şi având greutatea şi respectiv volumul identice cu cele din testare. O probă martor care conţine numai substanţa testată în soluţia de CaCl20,01 M (fără sol) se supune aceluiaşi procedeu de testare, servind drept garanţie pentru situaţii neprevăzute.
      Se calculează adsorbţia în procente la fiecare moment  şi interval de timp  (după necesităţi) şi se reprezintă grafic în funcţie de timp. Se mai calculează coeficientul de distribuţie Kd la echilibru, precum şi coeficientul de adsorbţie normalizat cu carbon organic Kco (pentru substanţele chimice organice nepolare).
      Rezultatele determinării cineticii de adsorbţie
      Valoarea Kd linear este în general exactă pentru descrierea comportamentului de sorbţie în sol (35) (78) şi reprezintă o expresie a mobilităţii inerente a substanţelor chimice în sol. De exemplu, se consideră, în general, că substanţele chimice cu Kd ≤ 1 cm3 g–1 sunt mobile calitativ. În mod similar, MacCall et al. (16) au elaborat un sistem de clasificare a mobilităţii în funcţie de valorile Kco. În afară de acesta, există sisteme de clasificare a extracţiei prin spălare în funcţie de relaţia dintre Kco şi TD-50 (30) (32) (79).
      De asemenea, conform studiilor de analiză a erorii (61), valorile Kd mai mici de 0,3 cm3 g–1 nu se pot determina cu exactitate dintr-o scădere a concentraţiei în fază apoasă, chiar şi atunci când se utilizează raportul sol/soluţie cel mai favorabil (din punct de vedere al exactităţii), adică 1:1. Într-un asemenea caz, se recomandă analiza ambelor faze, sol şi soluţie.
      Referitor la observaţiile anterioare, se recomandă ca studiul privind comportamentul de adsorbţie a unei substanţe chimice în sol şi posibila mobilitate a acesteia să fie continuat prin determinarea izotermelor de adsorbţie Freundlich pentru sistemele respective, pentru care este posibilă o determinare exactă a Kd după protocolul de testare din prezenta metodă de testare. Este posibilă o determinare exactă, dacă valoarea care rezultă prin amplificarea Kd cu raportul sol/soluţie este > 0,3, când măsurătorile au la bază scăderea concentraţiei în faza apoasă (metoda indirectă) sau > 0,1, când se analizează ambele faze (metoda directă) (61).
      1.9.2.5.   Etapa 3 – Izotermele de adsorbţie şi cinetica de desorbţie/izotermele de desorbţie
      1.9.2.5.1.   Izotermele de adsorbţie
      
      Se utilizează cinci concentraţii ale substanţei testate, care cuprind de preferinţă două ordine de mărime; în alegerea concentraţiilor respective, se ţine seama de solubilitatea în apă şi de concentraţiile în soluţie apoasă rezultate la echilibru. Pe toată durata studiului se menţine acelaşi raport sol/soluţie. Testarea de adsorbţie se realizează aşa cum s-a descris anterior, cu singura diferenţă că faza apoasă se analizează doar o singură dată la timpul necesar pentru stabilirea echilibrului, cum s-a determinat mai înainte în etapa 2. Se determină concentraţiile la echilibru în soluţie şi se calculează cantitatea adsorbită din epuizarea substanţei testate în soluţie sau prin metoda directă. Se reprezintă grafic masa adsorbită per unitatea de masă de sol în funcţie de concentraţia la echilibru a substanţei testate (a se vedea Date și raport).
      Rezultatele determinării izotermelor de adsorbţie
      Printre modelele matematice pentru adsorbţie propuse până în prezent, izoterma lui Freundlich este una utilizată frecvent pentru descrierea procesului de adsorbţie. Date mai detaliate privind interpretarea şi importanţa modelelor de adsorbţie se prezintă în bibliografie (41) (45) (80) (81) (82).
      
         Notă: Trebuie să se menţioneze că este posibilă o comparare a valorilor KF (coeficientul de adsorbţie Freundlich) pentru diferite substanţe, dacă valorile KF respective se exprimă în aceleaşi unităţi (83).
      1.9.2.5.2.   Cinetica de desorbţie
      
      Scopul prezentei încercări este de a cerceta dacă o substanţă chimică este adsorbită reversibil sau ireversibil pe un sol. Aceste date sunt importante, deoarece procesul de desorbţie joacă un rol important şi în comportamentul unei substanţe chimice în solul din teren. În plus, datele de desorbţie sunt date de intrare importante în modelarea pe calculator a simulărilor pentru extracţia prin spălarea şi scurgerea substanţelor dizolvate. Dacă se doreşte un studiu de desorbţie, se recomandă să se efectueze studiul descris în continuare pentru fiecare sistem pentru care a fost posibilă o determinare exactă a Kd în testarea precedentă pentru determinarea cineticii de adsorbţie.
      Ca şi în cazul studiului cineticii de adsorbţie, există două opţiuni pentru continuarea încercării pentru determinarea cineticii de desorbţie: (a) metoda paralelă şi (b) metoda în serie. Alegerea metodologiei de urmat rămâne la latitudinea cercetătorului care trebuie să ţină seama de dotarea şi resursele laboratorului.
      
                  (a)
               
               
                  Metoda paralelă: pentru fiecare sol care se alege pentru continuarea studiului de desorbţie, se pregătesc probe cu acelaşi raport sol/soluţie, în număr egal cu numărul intervalelor de timp la care se doreşte să se studieze cinetica de desorbţie. Este preferabil să se utilizeze aceleaşi intervale de timp ca în testarea pentru determinarea cineticii de adsorbţie; totuşi, timpul total se poate prelungi, dacă este cazul, pentru ca în sistem să se stabilească echilibrul de desorbţie. Pentru orice testare (un sol, o soluţie) se pregăteşte o probă oarbă. Aceasta conţine solul şi soluţia de CaCl20,01 M, fără substanţa testată şi având greutatea şi respectiv volumul identice cu cele din testare. Ca probă martor, substanţa testată în soluţie de CaCl20,01 M (fără sol) se supune aceleaşi proceduri de testare. Toate amestecurile de sol cu soluţie se agită până se stabileşte echilibrul de adsorbţie (după cum s-a stabilit anterior în etapa 2). Apoi, fazele se separă prin centrifugare şi se îndepărtează fazele apoase cât se poate de mult. Volumul soluţiei îndepărtate se înlocuieşte cu un volum egal de soluţie de CaCl20,01 M, fără substanţa testată şi noile amestecuri se agită din nou. Faza apoasă din prima eprubetă se recuperează cât se poate de mult şi se măsoară după, de exemplu, 2 h, cea din a doua eprubetă după 4 h, cea din a treia după 6 h etc., până când se realizează echilibrul de desorbţie.
               
            
                  (b)
               
               
                  Metoda în serie: după testarea pentru determinarea cineticii de adsorbţie, amestecul este supus centrifugării şi se elimină faza apoasă cât se poate de mult. Volumul de soluţie îndepărtat se înlocuieşte cu un volum egal de soluţie de CaCl20,01 M, fără substanţa testată. Noul amestec se agită până când se stabileşte echilibrul de desorbţie. În acest timp, la intervale egale, amestecul se supune centrifugării pentru separarea fazelor. Se analizează imediat un mic alicot de fază apoasă pentru determinarea substanţei testate; apoi, testarea continuă cu amestecul original. Volumul fiecărui alicot trebuie să fie mai mic de 1 % din volumul total. Se adaugă aceeaşi cantitate de soluţie proaspătă de CaCl20,01 M la amestec pentru a menţine raportul sol/soluţie şi se continuă agitarea până la următorul interval de timp.
               
            Se calculează desorbţia, în procente, la fiecare moment  şi interval de timp  (în funcţie de necesităţile studiului) şi se reprezintă grafic în funcţie de timp. Se mai calculează coeficientul de desorbţie Kdes la echilibru. Toate ecuaţiile aplicabile sunt date la punctul „Date și raport” şi în apendicele 5.
      Rezultatele încercării pentru determinarea cineticii de desorbţie
      Reprezentările grafice obişnuite ale desorbţiei şi adsorbţiei , în procente, în funcţie de timp, permit determinarea reversibilităţii procesului de adsorbţie. Dacă echilibrul de desorbţie se atinge chiar într-un timp dublu faţă de timpul necesar pentru atingerea echilibrului de adsorbţie şi desorbţia totală este mai mare decât 75 % din cantitatea adsorbită, se consideră că adsorbţia este reversibilă.
      1.9.2.5.3.   Izotermele de desorbţie
      
      Se determină izotermele de desorbţie Freundlich pe solurile utilizate în testarea pentru izotermele de adsorbţie. Testarea de desorbţie se efectuează conform descrierii de la punctul „Cinetica de desorbţie”, cu singura diferenţă că faza apoasă se analizează doar o singură dată, la echilibrul de desorbţie. Se calculează cantitatea de substanţă testată desorbită. Se reprezintă grafic conţinutul de substanţă testată, care rămâne adsorbită pe sol la atingerea echilibrul de desorbţie, în funcţie de concentraţia la echilibru a substanţei testate în soluţie (a se vedea Date şi raport şi apendicele 5).
      2.   DATE ŞI RAPORT
      Rezultatele analitice se prezintă sub formă de tabel (a se vedea apendicele 6). Se prezintă măsurătorile individuale şi mediile calculate. Se prezintă reprezentările grafice ale izotermelor de adsorbţie. Calculele se fac conform metodologiei descrise în continuare.
      În sensul prezentei încercări, se consideră că greutatea pentru 1 cm3 de soluţie apoasă este 1 g. Raportul sol/soluţie se poate exprima în unităţi de greutate/greutate sau greutate/volum cu aceeaşi cifră.
      2.1.   ADSORPŢIA
      Adsorbţia () se defineşte ca fiind cantitatea de substanţă, în procente, adsorbită pe sol raportată la cantitatea prezentă la începutul încercării, în condiţiile de testare. Dacă substanţa testată este stabilă şi nu se adsoarbe într-o măsură importantă pe pereţii vasului experimental, se calculează  pentru fiecare moment ti, conform ecuaţiei:
      
                  
                     
               
               
                  (3)
               
            unde:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  adsorbţia la momentul ti ( %)
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  masa substanţei testate adsorbite pe sol la momentul ti (μg)
               
            
                  m0
                  
               
               
                  =
               
               
                  masa substanţei testate din eprubetă, la începutul încercării (μg).
               
            Date detaliate privind modul de calcul al adsorbţiei , în procente, pentru metodele paralelă şi în serie se prezintă în apendicele 5.
      Coeficientul de distribuţie Kd este raportul dintre conţinutul de substanţă din faza de sol şi concentraţia masică de substanţă în soluţia apoasă, în condiţiile de testare, când se stabileşte echilibrul de adsorbţie.
      
                  
                     (4)
               
                  (4)
               
            unde
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  conţinutul de substanţă adsorbită pe sol la echilibrul de adsorbţie (μg g–1);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia masică a substanţei în faza apoasă la echilibrul de adsorbţie (μg cm–3). Concentraţia respectivă se determină analitic ţinând seama de valorile date de probele oarbe
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  masa substanţei testate adsorbite pe sol la echilibrul de adsorbţie (μg)
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  masa substanţei testate în soluţie la echilibrul de adsorbţie (μg)
               
            
                  msol
                  
               
               
                  =
               
               
                  cantitatea de fază de sol, exprimată în masă uscată de sol (g)
               
            
                  V0
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul iniţial al fazei apoase în contact cu solul (cm3.
               
            Relaţia dintre Aec şi Kd este dată de:
      
                  
                     
               
               
                  (5)
               
            unde:
      
                  Aec
                  
               
               
                  =
               
               
                  adsorbţia la echilibru, %
               
            Coeficientul de adsorbţie normalizată a carbonului organic Kco reprezintă relaţia dintre coeficientul de distribuţie Kd şi conţinutul de carbon organic din proba de sol:
      
                  
                     (cm3 g-1)
               
                  (6)
               
            unde:
      
                  % co
               
               
                  =
               
               
                  procentajul de carbon organic în proba de sol (g g–1)
               
            Coeficientul Kco reprezintă o valoare unică ce caracterizează partiţia în principal a substanţelor chimice organice nepolare între carbonul organic din sol sau sediment şi apă. Adsorbţia substanţelor chimice respective este corelată cu conţinutul organic al solidului adsorbant (7); astfel, valorile Kco depind de caracteristicile specifice ale fracţiilor humice care au o capacitate de sorbţie foarte diferită, datorită diferenţelor de origine, geneză etc.
      2.1.1.   Izoterme de adsorbţie
      Ecuaţia izotermelor de adsorbţie Freundlich reprezintă relaţia dintre cantitatea de substanţă testată adsorbită şi concentraţia substanţei testate în soluţie la echilibru (ecuaţia 8).
      Rezultatele sunt tratate ca la „Adsorbţie” şi, pentru fiecare eprubetă, se calculează conţinutul de substanţă testată adsorbită pe sol după testarea de adsorbţie [, indicată în altă parte ca x/m]. Se consideră că echilibrul a fost stabilit şi că  reprezintă valoarea la echilibru:
      
                  
                      (μgg-1)
               
                  (7)
               
            Ecuaţia de adsorbţie Freundlich este prezentată la (8):
      
                  
                     (μg g-1)
               
                  (8)
               
            sau sub formă lineară:
      
                  
                     
               
               
                  (9)
               
            unde:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  coeficientul de adsorbţie Freundlich; se exprimă în cm3 g–1, numai dacă 1/n = 1; în toate celelalte cazuri, panta 1/n se introduce în dimensiunea  [μg1–1/n(cm3)1/n g–1]
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  constanta de regresie, 1/n variază în general între 0,7-1,0, ceea ce indică faptul că rezultatele privind sorbţia sunt în mod frecvent uşor nelineare.
               
            Ecuaţiile (8) şi (9) sunt reprezentate grafic şi se calculează valorile pentru  şi 1/n prin analiza de regresie cu ajutorul ecuaţiei 9. Se mai calculează coeficientul de corelare r2 al ecuaţiei logaritmice. În figura 2 se prezintă un exemplu al acestor reprezentări grafice.
      
         
      2.1.2.   Bilanţul de masă
      Bilanţul de masă (BM) se defineşte ca procentul de substanţă care se poate recupera analitic după o testare de adsorbţie în funcţie de cantitatea de substanţă la începutul încercării.
      Prelucrarea rezultatelor va fi diferită, dacă solventul este complet miscibil cu apa. În cazul solventului miscibil cu apa, se poate aplica prelucrarea datelor descrise la „Desorbţie” pentru determinarea cantităţii de substanţă recuperată prin extracţia solventului. Dacă solventul este mai puţin miscibil cu apa, trebuie să se determine cantitatea recuperată.
      Bilanţul de masă BM pentru adsorbţie se calculează după cum urmează: se consideră că termenul (mE) corespunde sumei maselor substanţei chimice testate extrase din sol şi de pe suprafaţa vasului experimental cu un solvent organic:
      
                  
                     
               
               
                  (10)
               
            unde:
      
                  BM
               
               
                  =
               
               
                  bilanţul de masă ( %);
               
            
                  mE
                  
               
               
                  =
               
               
                  masa totală a substanţei testate extrase din sol şi de pe pereţii vasului experimental în două etape (μg);
               
            
                  C0
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia iniţială în unităţi de masă a soluţiei experimentale în contact cu solul (μg cm–3);
               
            
                  Vrec
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul supernatantului recuperat după echilibrul de adsorbţie (cm–3).
               
            2.2.   DESORBŢIA
      Desorbţia (D) se defineşte ca fiind cantitatea de substanţă testată desorbită, exprimată în procente, corelată cu cantitatea de substanţă adsorbită anterior, în condiţiile de testare:
      
                  
                     
               
               
                  (11)
               
            unde:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  desorbţia la momentul ti ( %);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  masa substanţei testate desorbite din sol la momentul ti(μg);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  masa substanţei testate adsorbite pe sol la echilibrul de adsorbţie (μg).
               
            Informaţii detaliate privind modul de calcul a desorbţiei , în procente, pentru metodele paralelă şi în serie, se prezintă în apendicele 5.
      Coeficientul de desorbţie aparentă (Kdes) este, în condiţiile de testare, raportul dintre conţinutul de substanţă ce rămâne în faza de sol şi concentraţia masică a substanţei desorbite în soluţie apoasă, când se realizează echilibrul de desorbţie.
      
                  
                      (cm3 g-1)
               
                  (12)
               
            unde:
      
                  Kdes
                  
               
               
                  =
               
               
                  coeficientul de desorbţie (cm3 g–1)
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  masa totală a substanţei testate desorbite din sol la echilibrul de desorbţie (μg)
               
            
                  VT
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul total al fazei apoase în contact cu solul în timpul determinării cineticii de desorbţie (cm3
                  
               
            Modul de calculare a este prezentat în apendicele 5 la punctul „Desorbţie”.
      Observaţie:
      Dacă testarea anterioară de adsorbţie s-a realizat prin metoda paralelă, volumul VT din ecuaţia 12 se consideră egal cu V0.
      
      2.2.1.   Izotermele de desorbţie
      Ecuaţia pentru izotermele de desorbţie Freundlich reprezintă corelaţia dintre conţinutul de substanţă testată care rămâne adsorbită pe sol şi concentraţia de substanţă testată în soluţie la echilibrul de desorbţie (ecuaţia 16).
      Pentru fiecare eprubetă, se calculează conţinutul de substanţă ce rămâne adsorbită pe sol la echilibrul de desorbţie cu formula următoare:
      
                  
                      (μgg-1)
               
                  (13)
               
            
         se defineşte prin relaţia:
      
                  
                     (μg)
               
                  (14)
               
            unde:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  conţinutul de substanţă testată ce rămâne adsorbită pe sol la echilibrul de desorbţie (μg g–1);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  masa substanţei determinate analitic în fază apoasă la echilibrul de desorbţie (μg);
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  masa substanţei testate rămase de la echilibrul de adsorbţie datorită înlocuirii incomplete a volumului (μg)
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  masa substanţei din soluţie la echilibrul de adsorbţie (μg);
               
            
                  
                     
               
               
                  (15)
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  volumul de soluţie luat din eprubetă pentru determinarea substanţei testate, la echilibrul de desorbţie (cm3);
               
            
                  VR
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul supernatantului scos din eprubetă după atingerea echilibrului de adsorbţie şi înlocuit cu acelaşi volum de soluţie de CaCl20,01 M (cm3).
               
            Ecuaţia de desorbţie Freundlich este prezentată în ecuaţia 16:
      
                  
                      (μgg-1)
               
                  (16)
               
            sau în forma lineară:
      
                  
                     
               
               
                  (17)
               
            unde:
      
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  coeficientul de desorbţie Freundlich;
               
            
                  n
               
               
                  =
               
               
                  constanta de regresie;
               
            
                  
                     
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia masică de substanţă în fază apoasă la echilibrul de desorbţie (μg cm–3).
               
            Ecuaţiile 16 şi 17 se pot reprezenta grafic şi se calculează valorile pentru şi 1/n prin analiza de regresie cu ajutorul ecuaţiei 17.
      Observaţie:
      Dacă exponentul 1/n al adsorbţiei sau desorbţiei Freundlich este egal cu 1, constantele de legătură (şi ) vor fi egale cu constantele de adsorbţie sau desorbţie la echilibru (Kd şi respectiv Kdes) şi reprezentările grafice ale Cs în funcţie de Cap vor fi lineare. Dacă exponenţii nu sunt egali cu 1, reprezentările grafice ale Cs în funcţie de Cap vor fi nelineare şi constantele de adsorbţie şi desorbţie vor varia în lungul izotermelor.
      2.2.2.   Raportul de testare
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele date:
      
                  —
               
               
                  Identificarea completă a probelor de sol utilizate, care include:
               
            
                  —
               
               
                  definirea geografică a locului (latitudine, longitudine);
               
            
                  —
               
               
                  data prelevării probelor;
               
            
                  —
               
               
                  destinaţia terenului (de exemplu sol agricol, forestier etc.);
               
            
                  —
               
               
                  adâncimea prelevării probelor;
               
            
                  —
               
               
                  conţinutul de nisip/mâl/argilă;
               
            
                  —
               
               
                  valorile pH-ului (în soluţie de CaCl20,01 M);
               
            
                  —
               
               
                  conţinutul de carbon organic;
               
            
                  —
               
               
                  conţinutul de substanţe organice;
               
            
                  —
               
               
                  conţinutul de azot;
               
            
                  —
               
               
                  raportul C/N;
               
            
                  —
               
               
                  capacitatea de schimb de cationi (mmol/kg);
               
            
                  —
               
               
                  toate datele referitoare la colectarea şi depozitarea probelor de sol;
               
            
                  —
               
               
                  dacă este cazul, toate datele relevante pentru interpretarea adsorbţiei/desorbţiei substanţei testate;
               
            
                  —
               
               
                  specificarea metodelor utilizate pentru determinarea fiecărui parametru;
               
            
                  —
               
               
                  date privind substanţa testată, dacă este cazul;
               
            
                  —
               
               
                  temperatura la care s-a efectuat testarea;
               
            
                  —
               
               
                  condiţiile de centrifugare;
               
            
                  —
               
               
                  metoda analitică utilizată pentru determinarea substanţei testate;
               
            
                  —
               
               
                  justificarea oricărei utilizări a agentului de solubilizare pentru pregătirea soluţiei mamă a substanţei testate;
               
            
                  —
               
               
                  explicarea corecţiilor făcute în calcule, dacă este relevant;
               
            
                  —
               
               
                  rezultatele conform formularului (apendicele 6) şi prezentările grafice;
               
            
                  —
               
               
                  toate datele şi observaţiile utile pentru interpretarea rezultatelor încercării.
               
            3.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02045, Part II.
               
            
                  2.
               
               
                  Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02045, Part I.
               
            
                  3.
               
               
                  Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication no. 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.
               
            
                  4.
               
               
                  OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995 (June 1995).
               
            
                  5.
               
               
                  US-Environment Protection Agency: Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.
               
            
                  6.
               
               
                  US-Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, 0PPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.
               
            
                  7.
               
               
                  ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Determining a Sorption Constant (Koc) for an Organic Chemical in Soil and Sediments.
               
            
                  8.
               
               
                  Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.
               
            
                  9.
               
               
                  Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Application for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
               
            
                  10.
               
               
                  Danish National Agency of Environmental Protection (October 1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment.
               
            
                  11.
               
               
                  BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany.
               
            
                  12.
               
               
                  Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and the prediction of the mobilities of pesticides in soils”, in Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
               
            
                  13.
               
               
                  Calvet R., (1980) „Adsorption-Desorption Phenomena” in Interactions between herbicides and the soil. (R.J. Hance ed.), Academic Press, London, p. 83-122.
               
            
                  14.
               
               
                  Hasset J.J., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of nonpolar organics by soils and sediments” in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, p. 31-44.
               
            
                  15.
               
               
                  van Genuchten M. Th., Davidson J.M., and Wierenga P.J., (1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media”. Soil Sci. Soc. Am. Proc., Vol. 38(1), p. 29-35.
               
            
                  16.
               
               
                  McCall P.J., Laskowski D.A., Swann R.L., and Dishburger H.J., (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis”, in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.
               
            
                  17.
               
               
                  Lambert S.M., Porter P.E., and Schieferrstein R.H., (1965), „Movement and sorption of chemicals applied to the soil”. Weeds, 13, p. 185-190.
               
            
                  18.
               
               
                  Rhodes R.C., Belasco I.J., and Pease H.L., (1970) „Determination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils”. J. Agric. Food Chem., 18, p. 524-528.
               
            
                  19.
               
               
                  Russell M.H., (1995), „Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil” in Environmental Behavior of Agrochemicals (ed. T.R. Roberts and P.C. Kearney). John Wiley & Sons Ltd.
               
            
                  20.
               
               
                  Esser H.O., Hemingway R.J., Klein W., Sharp D.B., Vonk J.W. and Holland P.T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides”, IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, p. 901-932.
               
            
                  21.
               
               
                  Guth J.A., Burkhard N., and D.O. Eberle, (1976), „Experimental models for studying the persistence of pesticides in soils”. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, p. 137-157, BCPC, Surrey, UK.
               
            
                  22.
               
               
                  Furminge C.G.L., and Osgerby J.M., (1967), „Persistence of herbicides in soil”. J. Sci. Fd Agric., 18, p. 269-273.
               
            
                  23.
               
               
                  Burkhard N., and Guth J.A., (1981), „Chemical hydrolysis of 2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption”. Pestic. Sci. 12, p. 45-52.
               
            
                  24.
               
               
                  Guth J.A., Gerber H.R., and Schlaepfer T., (1977). „Effect of adsorption, movement and persistence on the biological availability of soil-applied pesticides”. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, p. 961-971.
               
            
                  25.
               
               
                  Osgerby J.M., (1973), „Process affecting herbicide action in soil”. Pestic. Sci., 4, p. 247-258.
               
            
                  26.
               
               
                  Guth J.A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von Pflanzenschutzmitteln in Böden”. Schr. Reihe Ver. Wass. -Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, p. 143-154.
               
            
                  27.
               
               
                  Hamaker J.W., (1975), „The interpretation of soil leaching experiments”, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), p. 135-172, Plenum Press, NY.
               
            
                  28.
               
               
                  Helling C.S., (1971), „Pesticide mobility in soils”. Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 35, p. 732-210.
               
            
                  29.
               
               
                  Hamaker J.W., (1972), „Diffusion and volatilization” in Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J.W. Hamaker eds), Vol. I, p. 49-143.
               
            
                  30.
               
               
                  Burkhard N. and Guth J.A., (1981), „Rate of volatilisation of pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results with those determined in a laboratory model system”. Pestic. Sci. 12, p. 37-44.
               
            
                  31.
               
               
                  Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G., (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, p. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
               
            
                  32.
               
               
                  Gustafson D.I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple method for assessing pesticide leachability”. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), p. 339-357.
               
            
                  33.
               
               
                  Leistra M., and Dekkers W.A., (1976). „Computed effects of adsorption kinetics on pesticide movement in soils”. J. of Soil Sci., 28, p. 340-350.
               
            
                  34.
               
               
                  Bromilov R.H., and Leistra M., (1980), „Measured and simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils”. Pest. Sci., 11, p. 389-395.
               
            
                  35.
               
               
                  Green R.E., and Karickoff S.W., (1990), „Sorption estimates for modeling”, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., Book Series no. 2, p. 80-101,
               
            
                  36.
               
               
                  Lambert S.M., (1967), „Functional relationship between sorption in soil and chemical structure”. J. Agri. Food Chem., 15, p. 572-576.
               
            
                  37.
               
               
                  Hance R.J., (1969), „An empirical relationship between chemical structure and the sorption of some herbicides by soils”. J. Agri. Food Chem., 17, p. 667-668.
               
            
                  38.
               
               
                  Briggs G.G. (1969), „Molecular structure of herbicides and their sorption by soils”. Nature, 223, p. 1288.
               
            
                  39.
               
               
                  Briggs G.G. (1981). „Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor”. J. Agric. Food Chem., 29, p. 1050-1059.
               
            
                  40.
               
               
                  Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of soil sorption of organic polutance by molecular topology”. J. Agric. Food Chem., 32, p. 243-246.
               
            
                  41.
               
               
                  Bailey G.W., and White J.L., (1970), „Factors influencing the adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil”. Residue Rev., 32, p. 29-92.
               
            
                  42.
               
               
                  Bailey G.W., J.L. White and Y. Rothberg., (1968), „Adsorption of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate”. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 32:222-234.
               
            
                  43.
               
               
                  Karickhoff S.W., (1981) „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere 10, p. 833-846.
               
            
                  44.
               
               
                  Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners”. Environ. Toxicol. Safety 21, p. 1-17.
               
            
                  45.
               
               
                  Hamaker J.W., and Thompson J.M., (1972). „Adsorption in organic chemicals” in Organic Chemicals in the Soil Environment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, p. 49-143.
               
            
                  46.
               
               
                  Deli J., and Warren G.F., 1971, „Adsorption, desorption and leaching of diphenamid in soils”. Weed Sci. 19:67-69.
               
            
                  47.
               
               
                  Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J.M. and Santelmann, (1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils”. Weed Science, Vol. 23, p. 454-457.
               
            
                  48.
               
               
                  Haues M.H.B., Stacey M., and Thompson J.M., (1968) „Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations” in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
               
            
                  49.
               
               
                  Pionke H.B., and Deangelis R.J., (1980), „Methods for distributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase”, CREAMS, in A Field Scale Model for Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.
               
            
                  50.
               
               
                  ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition (1994).
               
            
                  51.
               
               
                  Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.
               
            
                  52.
               
               
                  Black, Evans D.D., White J.L., Ensminger L.E., and Clark F.E., eds. „Methods of Soil Analysis”, Vol 1 and 2, American Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.
               
            
                  53.
               
               
                  ISO/DIS 10381-1 Soil Quality – Sampling – Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.
               
            
                  54.
               
               
                  ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance on sampling techniques.
               
            
                  55.
               
               
                  ISO/DIS 10381-3 Soil Quality – Sampling – Part 3: Guidance on safety of sampling.
               
            
                  56.
               
               
                  ISO/DIS 10381-4 Soil Quality – Sampling – Part 4: Guidance on the investigation of natural and cultivated soils.
               
            
                  57.
               
               
                  ISO/DIS 10381-5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.
               
            
                  58.
               
               
                  ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
               
            
                  59.
               
               
                  Green R.E., and Yamane V.K., (1970) „Precision in pesticide adsorption measurements”. Soil Sci. Am. Proc., 34, p. 353-354.
               
            
                  60.
               
               
                  Grover R., and Hance R.J. (1970), „Effect of ratio of soil to water on adsorption of linuron and atrazine”. Soil Sci., p. 109-138.
               
            
                  61.
               
               
                  Boesten, J.J.T.I, „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system”. Pest. Sci. 1990, 30, 31-41.
               
            
                  62.
               
               
                  Boesten, J.J.T.I. „Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106” Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.
               
            
                  63.
               
               
                  Bastide J., Cantier J.M., et Coste C., (1980), „Comportement de substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique”. Weed Res. 21, p. 227-231.
               
            
                  64.
               
               
                  Brown D.S., and Flagg E.W., (1981), „Empirical prediction of organic pollutants sorption in natural sediments”. J. Environ.Qual., 10(3), p. 382-386.
               
            
                  65.
               
               
                  Chiou C.T., Porter P.E., and Schmedding D.W., (1983), „Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water”. Environ. Sci. Technol., 17(4), p. 227-231.
               
            
                  66.
               
               
                  Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic substances by soils and sediments”. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), p. 297-312.
               
            
                  67.
               
               
                  Vowles P.D., and Mantoura R.F.C., (1987), „Sediment-water partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons”. Chemosphere, 16(1), p. 109-116.
               
            
                  68.
               
               
                  Lyman W.J., Reehl W.F.and Rosenblatt D.H. (1990). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
               
            
                  69.
               
               
                  Keniga E.E., and Goring, C.A.I. (1980). „Relationship between water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota” in Aquatic Toxicology (eds J.G. Eaton, et al.), p. 78-115, ASTM STP 707, Philadelphia.
               
            
                  70.
               
               
                  Chiou C.T., Peters L.J., and Freed V.H., (1979), „A physical concept of soil-water equilibria for non-ionic organic compounds”. Science, Vol. 206, p. 831-832.
               
            
                  71.
               
               
                  Hassett J.J., Banwart W.I., Wood S.G., and Means J.C., (1981), „Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption”. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, p. 38-42.
               
            
                  72.
               
               
                  Karickhoff S.W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere, Vol. 10(8), 833-846.
               
            
                  73.
               
               
                  Moreale A., van Bladel R., (1981), “Adsorption de 13 herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilité – reactivité. Revue de l’Agric., 34 (4), p. 319-322.
               
            
                  74.
               
               
                  Müller M., Kördel W. (1996), „Comparison of screening methods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil”. Chemosphere, 32(12), p. 2493-2504.
               
            
                  75.
               
               
                  Kördel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), „HPLC – screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil – results of a ring test”. Chemosphere 30 (7), p. 1373-1384.
               
            
                  76.
               
               
                  Kördel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), “HPLC – screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil – comparison of different stationary phases. Chemosphere 27 (12), p. 2341-2352.
               
            
                  77.
               
               
                  Hance, R.J., (1967), „The speed of Attainment of Sorption Equilibria in Some Systems Involving Herbicides”. Weed Research, Vol. 7, p. 29-36.
               
            
                  78.
               
               
                  Koskinen W.C., and Harper S.S., (1990), „The retention processes: mechanisms” in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
               
            
                  79.
               
               
                  Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G. (1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, p.297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
               
            
                  80.
               
               
                  Giles C.H., (1970), „Interpretation and use of sorption isotherms” in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, p. 14-32.
               
            
                  81.
               
               
                  Giles, C.H.; McEwan J.H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, (1960), „Studies in adsorption: XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils”. J. Chem. Soc., 3973-93.
               
            
                  82.
               
               
                  Calvet R., Tercé M., and Arvien J.C., (1980), „Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques générales de l’adsorption”. Ann. Agron. 31: 239-251.
               
            
                  83.
               
               
                  Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equation”, Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, U.K.
               
            
                  84.
               
               
                  Guth, J.A., (1985), „Adsorption/desorption”, in Joint International Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.
               
            
                  85.
               
               
                  Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
               
            
         Apendicele 1
         Protocolul testului
         
            
      
      
         Apendicele 2
         INFLUENŢA PRECIZIEI METODEI ANALITICE ŞI A VARIAŢIEI CONCENTRAŢIEI ASUPRA PRECIZIEI REZULTATELOR PRIVIND ADSORBŢIA
         Din tabelul prezentat în continuare (84), este evident că atunci când diferenţa dintre masa iniţială (m0 = 110 μg) şi masa la echilibru [ = 100 μg] a substanţei testate în soluţie este foarte mică, o eroare de 5 % la măsurarea concentraţiei la echilibru conduce la o eroare de 50 % în calculul masei de substanţă adsorbită în sol [] şi de 52,4 % în calculul Kd.
         
                     Cantitatea de sol
                  
                  
                     msol
                     
                  
                  
                     = 10 g
                  
               
                     Volumul soluţiei
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     = 100 cm3
                     
                  
               
            
         
                      
                  
                  FOR-L_2008142RO.01044401.notes.0187.xml.jpg(μg)
                  
                  FOR-L_2008142RO.01044401.notes.0188.xml.jpg(μg cm-3)
                  
                  
                     R
                  
                  FOR-L_2008142RO.01044401.notes.0189.xml.jpg(μg)
                  
                  FOR-L_2008142RO.01044401.notes.0190.xml.jpg(μg g-1)
                  
                  
                     R‡
                  
                  
                     Kd*
                  
                  
                     R‡
                  
               
                     
                        PENTRU A = 9 %
                     
                  
               
                     m0 = 110 μg sau C0 = 1,100 μg/cm3
                     
                  
                  
                     100
                  
                  
                     1,000
                  
                  
                     valoarea reală
                  
                  
                     10
                  
                  
                     1,00
                  
                  
                     valoarea reală
                  
                  
                     1
                  
                  
                      
                  
               
                     101
                  
                  
                     1,010
                  
                  
                     1 %
                  
                  
                     9
                  
                  
                     0,90
                  
                  
                     10 %
                  
                  
                     0,891
                  
                  
                     10,9 %
                  
               
                     105
                  
                  
                     1,050
                  
                  
                     5 %
                  
                  
                     5
                  
                  
                     0,50
                  
                  
                     50 %
                  
                  
                     0,476
                  
                  
                     52,4 %
                  
               
                     109
                  
                  
                     1,090
                  
                  
                     9 %
                  
                  
                     1
                  
                  
                     0,10
                  
                  
                     90 %
                  
                  
                     0,092
                  
                  
                     90,8 %
                  
               
                     
                        PENTRU A = 55 %
                     
                  
               
                     m0 = 110 μg sau C0 = 1,100 μg/cm3
                     
                  
                  
                     50,0
                  
                  
                     0,500
                  
                  
                     valoarea reală
                  
                  
                     60,0
                  
                  
                     6,00
                  
                  
                     valoarea reală
                  
                  
                     12,00
                  
                  
                      
                  
               
                     50,5
                  
                  
                     0,505
                  
                  
                     1 %
                  
                  
                     59,5
                  
                  
                     5,95
                  
                  
                     0,8 %
                  
                  
                     11,78
                  
                  
                     1,8 %
                  
               
                     52,5
                  
                  
                     0,525
                  
                  
                     5 %
                  
                  
                     57,5
                  
                  
                     5,75
                  
                  
                     4,0 %
                  
                  
                     10,95
                  
                  
                     8,8 %
                  
               
                     55,0
                  
                  
                     0,550
                  
                  
                     10 %
                  
                  
                     55,0
                  
                  
                     5,50
                  
                  
                     8,3 %
                  
                  
                     10,00
                  
                  
                     16,7 %
                  
               
                     
                        PENTRU A = 99 %
                     
                  
               
                     m0 = 110 μg sau C0 = 1,100 μg/cm3
                     
                  
                  
                     1,100
                  
                  
                     0,011
                  
                  
                     valoarea reală
                  
                  
                     108,9
                  
                  
                     10,89
                  
                  
                     valoarea reală
                  
                  
                     990
                  
                  
                      
                  
               
                     1,111
                  
                  
                     0,01111
                  
                  
                     1 %
                  
                  
                     108,889
                  
                  
                     10,8889
                  
                  
                     0,01 %
                  
                  
                     980
                  
                  
                     1,0 %
                  
               
                     1,155
                  
                  
                     0,01155
                  
                  
                     5 %
                  
                  
                     108,845
                  
                  
                     10,8845
                  
                  
                     0,05 %
                  
                  
                     942
                  
                  
                     4,8 %
                  
               
                     1,21
                  
                  
                     0,0121
                  
                  
                     10 %
                  
                  
                     108,790
                  
                  
                     10,8790
                  
                  
                     0,10 %
                  
                  
                     899
                  
                  
                     9,2 %
                  
               unde:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     
                        
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei testate în faza de sol la echilibru, μg
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei testate în faza apoasă la echilibru, μg
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     conţinutul de substanţă testată în faza de sol la echilibru, μg g–1
                     
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     concentraţia masică a substanţei încercate în faza apoasă la echilibru, μg cm–3
                     
                  
               
                     R
                  
                  
                     =
                  
                  
                     eroarea analitică în determinarea ;
                  
               
                     R‡
                  
                  
                     =
                  
                  
                     eroarea calculată datorită erorii analitice R.
                  
               
      
         Apendicele 3
         METODE DE ESTIMARE PENTRU Kd
         
         
                     1.
                  
                  
                     Metodele de estimare permit estimarea Kd din corelaţiile cu, de exemplu, valorile Pow (12) (39) (63)-(68), datele privind solubilitatea apei (12) (19) (21) (39) (68-73) sau datele privind polaritatea, rezultate din aplicarea HPLC (cromatografia lichidă de înaltă performanţă) la faza inversată (74-76). Conform celor prezentate în tabelele 1 şi 2, Kco sau Kso se calculează din ecuaţiile menţionate şi, apoi, Kd se calculează indirect din ecuaţiile următoare:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 
                                    
                              
                           
               
                     2.
                  
                  
                     Concepţia corelaţiilor prezentate are în vedere două ipoteze: (1) adsorbţia şi desorbţia sunt influenţate în principal de substanţa organică din sol şi (2) interacţiunile implicate sunt în principal nepolare. Ca urmare, corelaţiile de acest tip: (1) nu se pot aplica sau se pot aplica într-o anumită măsură la substanţele polare şi (2) nu se pot aplica pentru un conţinut foarte mic de substanţă organică în sol (12). În afară de aceasta, deşi s-au găsit corelaţii satisfăcătoare între Pow şi adsorbţie (19), nu se poate spune acelaşi lucru pentru relaţia dintre solubilitatea apei şi gradul de adsorbţie (19) (21); până în prezent, studiile sunt foarte contradictorii.
                  
               
                     3.
                  
                  
                     În tabelele 1 şi 2 se prezintă câteva exemple de corelaţii între coeficientul de adsorbţie şi coeficientul de partiţie octanol-apă şi respectiv solubilitatea în apă.
                     Tabelul 1
                     Exemple de corelaţie între coeficientul de distribuţie a adsorbţiei şi coeficientul de partiţie octanol-apă; pentru alte exemple, a se vedea referinţele 12 şi 68
                     
                                 Substanţe
                              
                              
                                 Corelaţii
                              
                              
                                 Autori
                              
                           
                                 Urei substituite
                              
                              
                                 log Kso = 0,69 + 0,52 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Briggs (1981) (39)
                              
                           
                                 Clorurate aromate
                              
                              
                                 log Kco = -0,779 + 0,904 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Chiou et al. (1983) (65)
                              
                           
                                 Diferite pesticide
                              
                              
                                 log Kso = 4,4 + 0,72 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Gerstl şi Mingelgrin (1984) (66)
                              
                           
                                 Hidrocarburi aromate
                              
                              
                                 log Kco = -2,53 + 1,15 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Vowles şi Mantoura (1987) (67)
                              
                           
                        
                     Tabelul 2
                     Exemple de corelaţie între coeficientul de distribuţie a adsorbţiei şi solubilitatea în apă; pentru alte exemple, a se vedea referinţele 68 şi 69
                     
                                 Substanţe
                              
                              
                                 Corelaţii
                              
                              
                                 Autori
                              
                           
                                 Diferite pesticide
                              
                              
                                 log Kso = 3,8 - 0,561 log Sa
                                 
                              
                              
                                 Gerstl şi Mingelgrin (1984) (66)
                              
                           
                                 Substanţe clorurate aromate, alifatice
                              
                              
                                 log Kso = (4,040 +/– 0,038) - (0,557+/-0,012) log Sa
                                 
                              
                              
                                 Chiou et al. (1979) (70)
                              
                           
                                 α-naftol
                              
                              
                                 logKco = 4,273 - 0,686 log Sa
                                 
                              
                              
                                 Hasset et al. (1981) (71)
                              
                           
                                 Substanţe aromate, alifatice ciclice
                              
                              
                                 logKco = -1,405 - 0,921 log Sa - 0,00953 (mp-25)
                              
                              
                                 Karickhoff (1981) (72)
                              
                           
                                 Compuşi diverşi
                              
                              
                                 log Kso = 2,75 - 0,45 log Sa
                                 
                              
                              
                                 Moreale van Blade (1982) (73)
                              
                           
               
      
         Apendicele 4
         CALCULE PENTRU STABILIREA CONDIŢIILOR DE CENTRIFUGARE
         
                     1.
                  
                  
                     Timpul de centrifugare se obţine cu formula următoare, considerând că particulele sunt sferice:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (1)
                              
                           Pentru simplificare, toţi parametrii se exprimă în unităţi non-SI (g, cm).
                     unde:
                     
                                 ω
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 viteza rotaţională (= 2 π rpm/60), rad s-1
                                 
                              
                           
                                 rpm
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 rotaţii pe minut
                              
                           
                                 η
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 vâscozitatea soluţiei, g s-1 cm–1
                                 
                              
                           
                                 rp
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 raza particulei, cm
                              
                           
                                 ρs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 densitatea solului, g cm-3
                                 
                              
                           
                                 ρap
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 densitatea soluţiei, g cm-3
                                 
                              
                           
                                 Rt
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 distanţa de la centrul rotorului centrifugei până la suprafaţa soluţiei din eprubeta din centrifugă, cm
                              
                           
                                 Rb
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 distanţa de la centrul rotorului centrifugei până la fundul eprubetei din centrifugă, cm
                              
                           
                                 Rb – Rt
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 lungimea amestecului sol/soluţie în eprubeta din centrifugă, cm
                              
                           În practică, se utilizează dublul timpilor calculaţi pentru a asigura separarea completă.
                  
               
                     2.
                  
                  
                     Ecuaţia (1) se mai poate simplifica, dacă se consideră că vâscozitatea (η) şi densitatea (ρap) soluţiei sunt egale cu vâscozitatea şi densitatea apei la 25 oC; astfel, η = 8,95 × 10-3 g s-1 cm-1 şi ρap = 1,0 g cm-3.
                     Atunci, timpul de centrifugare se obţine cu ecuaţia (2):
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (2)
                              
                           
               
                     3.
                  
                  
                     Din ecuaţia 2 se vede că doi parametri sunt importanţi pentru stabilirea condiţiilor de centrifugare, adică timpul (t) şi viteza (rpm), pentru a realiza separarea particulelor cu o anumită dimensiune (în cazul nostru cu raza de 0,1 μm): (1) densitatea solului şi (2) lungimea amestecului în eprubeta din centrifugă (Rb – Rt), adică distanţa parcursă de particula de sol de la suprafaţa soluţiei până la fundul eprubetei; evident, pentru un volum stabilit, lungimea amestecului din eprubetă va depinde de pătratul razei eprubetei din centrifugă.
                  
               
                     4.
                  
                  
                     Figura 1 prezintă variaţiile timpului de centrifugare (t) în funcţie de viteza de centrifugare (rpm) la diferite densităţi ale solului (ρs) (figura 1a) şi diferite lungimi ale amestecului din eprubetele din centrifugă (figura 1b). Din figura 1a, este evidentă influenţa densităţii solului; de exemplu, pentru o centrifugare clasică de 3 000 rpm, timpul de centrifugare este de aproximativ 240 minute pentru o densitate a solului de 1,2 g cm3, şi de numai 50 minute pentru o densitate a solului de 2,0 g cm3. În mod similar, din figura 1b, pentru o centrifugare clasică de 3 000 rpm timpul este de 50 minute pentru o lungime a amestecului de 10 cm şi de numai 7 minute pentru o lungime de 1 cm. Cu toate acestea, este important să se găsească o relaţie optimă între centrifugare, care necesită o lungime cât se poate mai mică şi uşurinţa manipulării de către executant la separarea fazelor după centrifugare.
                  
               
                     5.
                  
                  
                     În plus, la stabilirea condiţiilor experimentale pentru separarea fazelor sol/soluţie, este important să se ia în consideraţie posibilitatea existenţei unei a treia „pseudo-faze”, coloizii. Particulele de acest tip, cu o dimensiune mai mică de 0,2 μm, pot să aibă un impact important asupra întregului mecanism de adsorbţie a unei substanţe într-o suspensie de sol. Atunci când centrifugarea se realizează ca în descrierea anterioară, coloizii rămân în faza apoasă şi se analizează împreună cu faza apoasă. Astfel, datele privind impactul acestora se pierd.
                     Dacă laboratorul executant posedă dispozitive de ultracentrifugare sau ultrafiltrare, ar putea fi posibil un studiu mai aprofundat al fenomenului de adsorbţie/desorbţie al unei substanţe în sol, care să includă date privind adsorbţia substanţei pe coloizi. În cazul respectiv, se aplică o ultracentrifugare la 60 000 rpm sau o ultrafiltrare cu un filtru cu porozitatea de 100 000 daltoni pentru separarea celor trei faze: sol, coloizi, soluţie. Este necesar ca şi protocolul testului să se modifice corespunzător, pentru ca la toate cele trei faze să se analizeze substanţa.
                  
               Figura 1a.
         
            
         Figura 1b.
         
            
      
      
         Apendicele 5
         CALCULUL ADSORBŢIEI A (%) ŞI DESORBŢIEI D (%)
         Diagrama timpului procedeului este:
         
            
         În toate calculele se consideră să substanţa testată este stabilă şi nu se adsoarbe semnificativ pe pereţii recipientului.
         ADSORBŢIA A (A %)
         (a)   Metoda paralelă
         Adsorbţia, în procente, se calculează pentru fiecare eprubetă (i) şi pentru fiecare moment (ti), conform ecuaţiei:
         
                     
                         (%)
                  
                     (1)
                  
               Termenii ecuaţiei anterioare se pot calcula după cum urmează:
         
                     m0 = C0 · V0 (μg)
                  
                  
                     (2)
                  
               
                     
                         (μg)
                  
                     (3)
                  
               unde:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     adsorbţia în procente ( %) la momentul ti;
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei testate pe sol la timpul ti la care se efectuează analiza (μg);
                  
               
                     m0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei testate din eprubetă, la începutul încercării (μg);
                  
               
                     C0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     concentraţia masică iniţială a substanţei din soluţia de testare în contact cu solul (μg cm–3);
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     concentraţia masică a substanţei în faza apoasă la timpul ti la care se realizează analiza (μg cm–3); concentraţia respectivă se determină analitic, ţinând seama de valorile oferite de probele oarbe;
                  
               
                     V0
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     volumul iniţial al soluţiei testate în contact cu solul (cm3).
                  
               Valorile adsorbţiei, în procente,  sau  se reprezintă grafic în funcţie de timp şi se determină timpul după care se atinge echilibrul de sorbţie. Exemple cu aceste reprezentări grafice se prezintă în figurile 1 şi, respectiv, 2.
         
            
         
            
         (b)   Metoda în serie
         Ecuaţiile prezentate în continuare ţin seama de faptul că determinarea adsorbţiei se realizează prin măsurători ale substanţei testate în mici alicoţi de fază apoasă la anumite intervale de timp.
         
                     —
                  
                  
                     În fiecare interval de timp, se calculează cantitatea de substanţă adsorbită pe sol, după cum urmează:
                     
                                 —
                              
                              
                                 pentru primul interval de timp Δt1 = t1 – t0
                                 
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (4)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 pentru al doilea interval de timp Δt2 = t2 – t1
                                 
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (5)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 pentru al treilea interval de timp Δt3 = t3 – t2
                                 
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (6)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 pentru al n-lea interval de timp Δtn = tn – tn-1
                                 
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (7)
                                          
                                       
                           
               
                     —
                  
                  
                     Adsorbţia, în procente, la fiecare interval de timp, , se calculează cu ecuaţia următoare:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (8)
                              
                           în timp ce adsorbţia, în procente, () la momentul ti se obţine cu ecuaţia:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (9)
                              
                           Valorile adsorbţiei sau  (în funcţie de necesităţile studiului) se reprezintă grafic în funcţie de timp şi se determină timpul după care se atinge echilibrul sorbţiei.
                  
               
                     —
                  
                  
                     La momentul echilibrului tec:
                     
                                 —
                              
                              
                                 masa substanţei testate adsorbite pe sol este:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (10)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 masa substanţei testate în soluţie este:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (11)
                                          
                                       
                           
                                 —
                              
                              
                                 şi adsorbţia, în procente, la echilibru este:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             (12)
                                          
                                       
                           
               Parametrii din ecuaţiile anterioare se definesc după cum urmează:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei adsorbite pe sol în intervalele de timp Δt1, Δt2,… şi respectiv Δtn (μg)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei, măsurată într-un alicot  în momentele t1, t2,…, respectiv tn (μg)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei adsorbite pe sol la echilibrul de adsorbţie (μg)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei în soluţie la echilibrul de adsorbţie (μg)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     volumul alicotului în care se măsoară substanţa testată (cm3)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     adsorbţia, în procente, ce corespunde la un interval de timp Δti (%)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     adsorbţia, în procente, la echilibrul de adsorbţie (%)
                  
               DESORBŢIA D (%)
         Timpul t0, la care începe proba pentru cinetica de desorbţie, se consideră ca momentul în care volumul maxim recuperat de soluţie a substanţei testate (după atingerea echilibrului de adsorbţie) este înlocuit de un volum egal de soluţie de CaCl20,01 M.
         (a)   Metoda paralelă
         La momentul ti, se măsoară masa substanţei testate în faza apoasă luată din eprubeta i  şi masa desorbită se calculează conform ecuaţiei:
         
                     
                        
                  
                  
                     (13)
                  
               La echilibrul de desorbţie ti = tec şi, prin urmare,  = .
         Masa substanţei testate desorbite într-un interval (Δti) este dată de ecuaţia:
         
                     
                        
                  
                  
                     (14)
                  
               Desorbţia, în procente, se calculează:
         la momentul ti din ecuaţia:
         
                     
                        
                  
                  
                     (15)
                  
               şi în intervalul de timp (Δti) din ecuaţia:
         
                     
                        
                  
                  
                     (16)
                  
               unde:
         
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     desorbţia, în procente, la momentul ti (%)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     desorbţia, în procente, care corespunde unui interval Δti (%)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei testate desorbite la momentul ti, (μg)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei testate desorbite în intervalul de timp Δti (μg)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei testate măsurate analitic la timpul ti într-un volum de soluţie , care se ia pentru analiză (μg)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei testate rămase de la echilibrul de adsorbţie datorită înlocuirii incomplete a volumului (μg)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     (17)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei testate în soluţie la echilibrul de adsorbţie (μg)
                  
               
                     VR
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     volumul supernatantului scos din eprubetă după atingerea echilibrului de adsorbţie şi înlocuit de acelaşi volum de soluţie de CaCl20,01 M (cm3)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     volumul soluţiei luate din eprubeta (i) pentru măsurarea substanţei testate, în proba pentru cinetica desorbţiei (cm3)
                  
               Valorile desorbţiei  sau (în funcţie de necesităţile studiului) sunt reprezentate grafic în funcţie de timp şi se determină timpul după care se atinge echilibrul de desorbţie.
         (b)   Metoda în serie
         Ecuaţiile prezentate în continuare ţin seama de faptul că determinarea adsorbţiei, care a avut loc anterior, s-a realizat prin măsurarea substanţei testate în alicoţi mici  de fază apoasă (metoda în serie de la punctul 1.9 Realizarea încercării). Se consideră că: (a) volumul de supernatant scos din eprubetă după proba pentru determinarea cineticii de adsorbţie a fost înlocuit cu acelaşi volum de soluţie de CaCl20,01 M (VR) şi (b) volumul total al fazei apoase în contact cu solul (VT) în timpul probei pentru determinarea cineticii de desorbţie rămâne constant şi este dat de ecuaţia:
         
                     
                        
                  
                  
                     (18)
                  
               La momentul ti:
         
                     —
                  
                  
                     masa substanţei testate se măsoară într-un alicot mic  şi se calculează masa desorbită, conform ecuaţiei:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (19)
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     la echilibrul de desorbţie ti = tec şi prin urmare  = .
                  
               
                     —
                  
                  
                     desorbţia , în procente, se calculează din ecuaţia următoare:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (20)
                              
                           
               La un interval de timp (Δti):
         În fiecare interval de timp, se calculează cantitatea de substanţă desorbită după cum urmează:
         
                     —
                  
                  
                     pentru primul interval de timp Δt1 = t1 – t0
                     
                     
                                 
                                     şi 
                                    
                              
                              
                                 (21)
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     pentru al doilea interval de timp Δt2 = t2 – t1
                     
                     
                                 
                                     şi
                                 
                                    
                              
                              
                                 (22)
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     pentru al n-lea interval de timp Δtn = tn – tn-1
                     
                     
                                 
                                    
                                 
                                    
                              
                              
                                 (23)
                              
                           
               În sfârşit, desorbţia, în procente, la fiecare interval de timp, , se calculează cu următoarea ecuaţie:
         
                     
                        
                  
                  
                     (24)
                  
               în timp ce desorbţia, în procente,  la momentul ti este dată de ecuaţia:
         
                     
                        
                  
                  
                     (25)
                  
               unde parametrii utilizaţi anterior se definesc după cum urmează:
         
                     
                        , 
                        ,... , 
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei adsorbite în continuare pe sol după intervalele de timp Δt1, Δt2, …, respectiv Δtn (μg)
                  
               
                     
                        , 
                        ,... , 
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei desorbite în intervalele de timp Δt1, Δt2, …, respectiv Δtn (μg)
                  
               
                     
                        , 
                        ,... , 
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei măsurată într-un alicot  la momentele t1, t2, …, respectiv tn (μg)
                  
               
                     VT
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     volumul total al fazei apoase în contact cu solul în timpul probei de cinetică a desorbţiei efectuate prin metoda în serie (cm3)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     masa substanţei testate rămase de la echilibrul de desorbţie datorită înlocuirii incomplete a volumului (μg)
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (26)
                              
                           
               
                     VR
                     
                  
                  
                     =
                  
                  
                     volumul supernatantului scos din eprubetă după atingerea echilibrului de adsorbţie şi înlocuit cu acelaşi volum de soluţie de CaCl20,01 M (cm3)
                  
               
                     
                        
                  
                  
                     =
                  
                  
                     volumul alicotului luat pentru analiză din eprubeta (i) în timpul probei pentru cinetica desorbţiei realizate prin metoda în serie (cm3)
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 (27)
                              
                           
               
      
         Apendicele 6
         ADSORBŢIA – DESORBŢIA ÎN SOL: FORMULARE PENTRU RAPORTAREA DATELOR
         Substanţa testată:
         Solul testat:
         Conţinutul de substanţă uscată din sol (105 oC, 12 h): … %
         Temperatura: … oC
         Parametrii determinaţi prin metoda de analiză
         
                     Solul cântărit
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
               
                     Sol: substanţa uscată
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul soluţie de CaCl2
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Concentraţia nominală a soluţiei finale
                  
                  
                     μg cm–3
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Concentraţia analitică a soluţiei finale
                  
                  
                     μg cm–3
                     
                  
                  
                      
                  
               Principiul metodei analitice utilizate:
         Etalonarea metodei analitice:
         Substanţa testată:
         Solul testat:
         Conţinutul de substanţă uscată din sol (105 oC, 12 h): … %
         Temperatura: … oC
         
                     Metodologia analitică urmată:
                  
                  
                     Indirectă
                  
                  
                     
                  
                  
                     Paralelă
                  
                  
                     
                  
                  
                     În serie
                  
                  
                     
                  
               
                      
                  
                  
                     Directă
                  
                  
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Testarea de adsorbţie: eşantioanele
         
                      
                  
                  
                     Simbol
                  
                  
                     Unităţi
                  
                  
                     Timpul de stabilire a echilibrului
                  
                  
                     Timpul de stabilire a echilibrului
                  
                  
                     Timpul de stabilire a echilibrului
                  
                  
                     Timpul de stabilire a echilibrului
                  
               
                     Nr. de eprubete
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Solul cântărit
                  
                  
                     —
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Solul: substanţa uscată
                  
                  
                     msol
                     
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul apei din solul cântărit (calculat)
                  
                  
                     VAS
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul soluţiei de CaCl20,01 M pentru a aduce solul la echilibru
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul soluţiei mamă
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul total al fazei apoase în contact cu solul
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Concentraţia iniţială a soluţiei experimentale
                  
                  
                     C0
                     
                  
                  
                     μg cm–3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Masa substanţei testate la începutul încercării
                  
                  
                     m
                           0
                        
                     
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     După agitare şi centrifugare
                  
               
                     METODA INDIRECTĂ
                  
               
                     Metoda paralelă
                  
               
                     Concentraţia substanţei testate în fază apoasă, inclusiv corecţia probei martor
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg cm–3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Metoda în serie
                  
               Masa măsurată a substanţei testate în alicot 
                        
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     METODA DIRECTĂ
                  
               
                     Masa substanţei testate adsorbite pe sol
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Calculul adsorbţiei
                  
               
                     Adsorbţia
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mijloacele
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Coeficientul de adsorbţie
                  
                  
                     Kd
                     
                  
                  
                     μg cm–1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mijloacele
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Coeficientul de adsorbţie
                  
                  
                     Kco
                     
                  
                  
                     μg cm–1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Mijloacele
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Substanţa testată:
         Solul testat:
         Conţinutul de substanţă uscată din sol (105 oC, 12 h): … %
         Temperatura: … oC
         Testarea de adsorbţie: probe oarbe şi martor
         
                      
                  
                  
                     Simbol
                  
                  
                     Unităţi
                  
                  
                     Proba oarbă
                  
                  
                     Proba oarbă
                  
                  
                     Proba martor
                  
               
                     Nr. de eprubete
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Solurile cântărite
                  
                  
                      
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     0
                  
                  
                     0
                  
               
                     Volumul apei din solul cântărit (calculat)
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Volumul soluţiei de CaCl20,01 M adăugate
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul soluţiei mamă de substanţă testată adăugată
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                     0
                  
                  
                     0
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul total al fazei apoase (calculat)
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Concentraţia iniţială a substanţei testate în fază apoasă
                  
                  
                      
                  
                  
                     μg cm–3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     După agitare şi centrifugare
                  
               
                     Concentraţia în fază apoasă
                  
                  
                      
                  
                  
                     μg cm–3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Observaţie: Dacă este necesar, se adaugă coloane.
         Substanţa testată:
         Solul testat:
         Conţinutul de substanţă uscată din sol (105 oC, 12 h): …………………………………… %
         Temperatura: … oC
         Bilanţul de masă
         
                      
                  
                  
                     Simbol
                  
                  
                     Unităţi
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Nr. de eprubete
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Solul cântărit
                  
                  
                     —
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Solul: substanţa uscată
                  
                  
                     msol
                     
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul apei în solul cântărit (calculat)
                  
                  
                     VAS
                     
                  
                  
                     ml
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul soluţiei de CaCl20,01 M pentru a aduce solul la echilibru
                  
                  
                      
                  
                  
                     ml
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul soluţiei mamă
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul total al fazei apoase în contact cu solul
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Concentraţia iniţială a soluţiei experimentale
                  
                  
                     C0
                     
                  
                  
                     μg cm–3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Timpul de realizare a echilibrului
                  
                  
                     —
                  
                  
                     h
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     După agitare şi centrifugare
                  
               
                     Concentraţia substanţei testate în faza apoasă la adsorbţie, inclusiv corecţia probei oarbe la echilibru
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg cm–3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Timpul de realizare a echilibrului
                  
                  
                     tec
                     
                  
                  
                     h
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Prima diluţie cu solvent
                  
               
                     Volumul fazei apoase îndepărtate
                  
                  
                     Vrec
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul de solvent adăugat
                  
                  
                     ΔV
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Prima extracţie cu solvent
                  
               
                     Semnalul analizat în solvent
                  
                  
                     SEI
                     
                  
                  
                     var.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Concentraţia substanţei testate în solvent
                  
                  
                     CEI
                     
                  
                  
                     μg cm–3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Masa substanţei extrase din sol şi de pe pereţii vaselor
                  
                  
                     mEI
                     
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     A doua diluţie cu solvent
                  
               
                     Volumul de solvent îndepărtat
                  
                  
                     ΔVs
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul de solvent adăugat
                  
                  
                     ΔV'
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     A doua extracţie cu solvent
                  
               
                     Semnalul analizat în solvent
                  
                  
                     SE2
                     
                  
                  
                     var.
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Concentraţia substanţei testate în solvent
                  
                  
                     CE2
                     
                  
                  
                     μg cm–3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Masa substanţei extrase din sol şi de pe pereţii vaselor
                  
                  
                     mE2
                     
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Masa totală a substanţei testate extrase în două etape
                  
                  
                     mE
                     
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Bilanţul de masă
                  
                  
                     BM
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Substanţa testată:
         Solul testat:
         Conţinutul de substanţă uscată din sol (105 oC, 12 h): …………………………………… %
         Temperatura: … oC
         Izotermele de adsorbţie
         
                      
                  
                  
                     Simbol
                  
                  
                     Unităţi
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Nr. de eprubete
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Solul cântărit
                  
                  
                     —
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Solul; substanţă uscată
                  
                  
                     E
                  
                  
                     g
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul de apă din solul cântărit (calculat)
                  
                  
                     VAS
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul soluţiei de CaCl20,01 M pentru a aduce solul la echilibru
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul soluţiei mamă adăugat
                  
                  
                      
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul total al fazei apoase în contact cu solul (calculat)
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Concentraţia soluţiei
                  
                  
                     C0
                     
                  
                  
                     μg cm–3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Timpul de realizare a echilibrului
                  
                  
                     —
                  
                  
                     h
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     După agitare şi centrifugare
                  
               
                     Concentraţia substanţei în faza apoasă, inclusiv corecţia probei oarbe
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg cm–3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Temperatura
                  
                  
                      
                  
                  
                     
                        oC
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Masa adsorbită per unitatea de sol
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg g–1
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               Analiza de regresie:
         valoarea Kf
            ads:
         valoarea l/n:
         coeficientul de regresie r2:
         Substanţa testată:
         Solul testat:
         Conţinutul de substanţă uscată din sol (105 oC, 12 h): …. %
         Temperatura: … oC
         
                     Metodologia analitică urmată:
                  
                  
                     Indirectă
                  
                  
                     
                  
                  
                     Paralelă
                  
                  
                     
                  
                  
                     În serie
                  
                  
                     
                  
               Testarea de desorbţie
         
                      
                  
                  
                     Simbol
                  
                  
                     Unităţi
                  
                  
                     Interval de timp
                  
                  
                     Interval de timp
                  
                  
                     Interval de timp
                  
                  
                     Interval de timp
                  
               
                     Nr. de eprubete ce vin de la etapa de adsorbţie
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Masa substanţei adsorbite pe sol la echilibrul de adsorbţie
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul fazei apoase îndepărtate, înlocuit cu soluţie de CaCl20,01 M
                  
                  
                     VR
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul total al fazei apoase în contact cu solul
                  
                  
                     MP
                  
                  
                     V0
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     MS
                  
                  
                     VT
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Masa substanţei testate rămase după echilibrul de adsorbţie datorită înlocuirii incomplete a volumului
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Cinetica desorbţiei
                  
               
                     Masa măsurată a substanţei desorbite din sol la momentul ti
                     
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Volumul soluţiei luate din eprubeta (i) pentru măsurarea substanţei testate
                  
                  
                     MP
                  
                  
                     Vr
                        i
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     MS
                  
                  
                     Va
                        D
                     
                  
                  
                     cm3
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Masa substanţei desorbite din sol la momentul ti (calculată)
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Masa substanţei desorbite din sol în intervalul de timp Δti (calculată)
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     μg
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Desorbţia în procente
                  
               
                     Desorbţia la momentul ti
                     
                  
                  
                     Dti
                        
                     
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Desorbţia în intervalul de timp Δti
                     
                  
                  
                     
                        
                  
                  
                     %
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Coeficientul de desorbţie aparent
                  
                  
                     Kdes
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               MP: Metoda paralelă
         MS: Metoda în serie
      
      C.19.   ESTIMAREA COEFICIENTULUI DE ADSORBŢIE (KCO) PE SOL ŞI NĂMOL DE EPURARE CU AJUTORUL CROMATOGRAFIEI LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ (HPLC)
      1.   METODĂ
      Prezenta metodă este identică cu cea prevăzută în Orientarea 21 (2000) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Comportarea la sorbţie a substanţelor din soluri şi nămolurile de epurare se poate descrie cu ajutorul parametrilor determinaţi experimental prin metoda de testare C.18. Un parametru important este coeficientul de adsorbţie care reprezintă raportul dintre concentraţia substanţei din sol/nămol şi concentraţia substanţei în fază apoasă la echilibrul de adsorbţie. Coeficientul de adsorbţie normalizat la conţinutul de carbon organic al solului Kco este un indicator util al capacităţii de fixare a unei substanţe chimice pe o substanţă organică din sol şi din nămolul de epurare şi permite compararea diferitelor substanţe chimice. Parametrul menţionat se poate estima prin corelări cu solubilitatea apei şi coeficientul de partiţie n-octanol/apă (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
      Metoda experimentală descrisă în prezenta testare utilizează HPLC pentru estimarea coeficientului de adsorbţie Kco în sol şi în nămolul de epurare (8). Estimările prezintă o credibilitate mai mare decât cele din calculele de relaţie cantitativă structură-activitate [RCSA (QSAR)] (9). Ca metodă de estimare, aceasta nu poate înlocui în întregime încercările de realizare a echilibrului probelor utilizate în metoda de testare C.18. Cu toate acestea, Kco estimat poate fi util în alegerea parametrilor optimi de testare pentru studiile de adsorbţie/desorbţie conform metodei de testare C.18, prin calcularea Kd (coeficientul de distribuţie) sau Kf (coeficientul de adsorbţie Freundlich) conform ecuaţiei 3 (punctul 1.2).
      1.2.   DEFINIŢII
      
         K
         
            d
         : Coeficientul de distribuţie este raportul dintre concentraţiile la echilibru, C, ale unei substanţe testate dizolvate într-un sistem bifazic ce conţine un adsorbant (sol sau nămol de epurare) şi o fază apoasă; este o valoare adimensională atunci când concentraţiile în ambele faze se exprimă în greutate/greutate. Pentru concentraţia în faza apoasă exprimată în greutate/volum, unităţile sunt ml · g–1. Kd poate să varieze în funcţie de proprietăţile adsorbantului şi poate să fie dependent de concentraţie.
      
                  
                     
               
               
                  (1)
               
            unde:
      
                  Csol
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia substanţei testate în sol la echilibru (μg · g–1)
               
            
                  Cnămol
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia substanţei testate în nămol la echilibru (μg · g–1)
               
            
                  Cap
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia substanţei testate în faza apoasă la echilibru (μg · g–1, μg · ml–1).
               
            
         K
         
            f
         : Coeficientul de adsorbţie Freundlich este concentraţia substanţei testate în sol sau nămolul de epurare (x/m) atunci când concentraţia la echilibru, Cap, în faza apoasă este egală cu unu; unităţile sunt μg g–1 adsorbant. Valoarea poate să varieze în funcţie de proprietăţile adsorbantului.
      
                  
                     
               
               
                  (2)
               
            unde:
      
                  x/m
               
               
                  =
               
               
                  cantitatea de substanţă testată x (μg) adsorbită pe cantitatea de adsorbant m (g) la echilibru
               
            
                  1/n
               
               
                  =
               
               
                  panta izotermei de adsorbţie Freundlich
               
            
                  Cap
                  
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia substanţei testate în fază apoasă la echilibru (μg · ml–1).
               
            Pentru
      
         K
         
            co
         : Coeficientul de distribuţie (Kd) sau coeficientul de adsorbţie Freundlich (Kf) normalizat la conţinutul de carbon organic (fco) al adsorbantului; în special pentru substanţele chimice neionizate, este un indicator aproximativ al gradului de adsorbţie între o substanţă şi adsorbant şi permite compararea diferitelor substanţe chimice. În funcţie de dimensiunile Kd şi Kf, Kco poate să fie adimensional sau să aibă unităţile ml g–1 sau μg g–1 substanţă organică.
      
                  
                     
               
               
                  (3)
               
            Relaţia dintre Kco şi Kd nu este lineară întotdeauna şi, prin urmare, valorile Kco pot să varieze de la un sol la altul, dar gradul de variaţie a acestora este redus în mare măsură în comparaţie cu valorile Kd sau Kf.
      Coeficientul de adsorbţie (Kco) se obţine din factorul de capacitate (k'), utilizând o curbă de etalonare obţinută prin reprezentarea grafică a log k' în funcţie de log Kco pentru compuşii de referinţă selectaţi.
      
                  
                     
               
               
                  (4)
               
            unde:
      
                  tg
                  
               
               
                  =
               
               
                  timpul de retenţie HPLC pentru testare şi substanţa de referinţă (minute)
               
            
                  t0
                  
               
               
                  =
               
               
                  timpul mort HPLC (minute) (a se vedea punctul 1.8.2).
               
            
         P
         
            ow
         : Coeficientul de partiţie octanol-apă reprezintă raportul dintre concentraţiile substanţei dizolvate în n-octanol şi apă; este o mărime adimensională.
      
                  
                     
               
               
                  (5)
               
            1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Înaintea utilizării metodei, este necesar să se cunoască formula structurală, puritatea şi constanta de disociere (dacă este cazul). Sunt utile datele privind solubilitatea în apă şi solvenţi organici, coeficientul de partiţie octanol-apă şi caracteristicile hidrolizei.
      Pentru a corela datele de retenţie HPLC măsurate pentru o substanţă testată cu coeficientul de adsorbţie al acesteia Kco, trebuie să se reprezinte grafic curba de etalonare pentru log Kco în funcţie de log k'. Trebuie să se utilizeze cel puţin şase puncte, cel puţi unul peste şi unul sub valoarea preconizată pentru substanţa testată. Acurateţea metodei este mult îmbunătăţită, dacă se utilizează substanţe de referinţă cu structura asemănătoare cu a substanţei testate. Dacă astfel de date nu sunt disponibile, este la latitudinea utilizatorului să aleagă substanţele de etalonare potrivite. În acest caz, este necesar să se aleagă un set mai general de substanţe eterogene din punct de vedere structural. Substanţele şi valorile Kco care se pot utiliza sunt prezentate în apendice, în tabelul 1 pentru nămolul de epurare şi în tabelul 3 pentru sol. Alegerea altor substanţe de etalonare se justifică.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      HPLC se realizează pe o coloană analitică umplută cu o fază solidă de cianopropil care se comercializează şi care conţine grupe liofile şi polare. Se utilizează o fază staţionară polară din matrice de silice.
      
                  - O - Si
               
               
                  - CH2 - CH2 - CH2
                  
               
               
                  - CN
               
            
                  silice
               
               
                  distanţier nepolar
               
               
                  grupă polară
               
            Principiul metodei de testare este similar cu cel al metodei de testare A.8 (coeficientul de partiţie, metoda HPLC). Când trece prin coloană în lungul fazei mobile, substanţa testată interacţionează cu faza staţionară. Ca urmare a partiţiei dintre faza mobilă şi cea staţionară, substanţa testată este întârziată. Compoziţia dublă a fazei staţionare, care are porţiuni polare şi nepolare, permite interacţiunea grupelor polare şi nepolare dintr-o moleculă într-un mod similar cu cel pentru substanţa organică din matricele de sol sau nămol de epurare. Aceasta permite stabilirea relaţiei dintre timpul de retenţie pe coloană şi coeficientul de adsorbţie pe substanţa organică.
      pH-ul are o influenţă importantă în mod deosebit asupra comportamentului de sorbţie al substanţelor polare. Pentru solurile agricole sau rezervoarele staţiilor de tratare a apelor reziduale, pH-ul variază de obicei între 5,5 şi 7,5. Pentru substanţele ionizabile, trebuie să se efectueze două testări, atât cu forma ionizată, cât şi cu cea neionizată în soluţii tampon corespunzătoare, dar numai pentru situaţiile în care cel puţin 10 % din compusul testat se disociază între valorile pH-ului 5,5-7,5.
      Deoarece pentru evaluare se utilizează doar relaţia dintre retenţia pe coloana HPLC şi coeficientul de adsorbţie, nu este necesară o metodă analitică cantitativă, ci doar determinarea timpului de retenţie. Dacă este disponibil un set corespunzător de substanţe de referinţă şi se pot utiliza condiţiile de testare standard, metoda oferă un mod rapid şi eficient pentru estimarea coeficientului de adsorbţie Kco.
      1.5.   APLICABILITATEA TESTULUI
      Metoda HPLC se poate aplica substanţelor chimice (nemarcate şi marcate) pentru care există un sistem corespunzător de detecţie (de exemplu spectrofotometru, detector de radioactivitate) şi care sunt suficient de stabile în timpul testării. Această metodă poate să fie deosebit de utilă pentru substanţele chimice dificil de studiat în alte sisteme experimentale (adică substanţele volatile; substanţe care nu sunt solubile în apă la o concentraţie care să poată fi măsurată analitic; substanţe cu afinitate mare pentru suprafaţa sistemelor de incubare). Metoda se poate utiliza la amestecurile care dau benzi de eluţie neseparate. În acest caz, este necesar să se stabilească limitele superioară şi inferioară ale valorilor log Kco pentru compuşii amestecului testat.
      Impurităţile pot să creeze uneori probleme în interpretarea rezultatelor HPLC, dar sunt de importanţă minoră atâta timp cât substanţa testată se poate identifica şi separa analitic în mod clar de impurităţi.
      Metoda este validată pentru substanţele prezentate în tabelul 1 din apendice şi a fost de asemenea aplicată pentru o serie de alte substanţe din următoarele clase de substanţe chimice:
      
                  —
               
               
                  amine aromate (de exemplu trifluralin, 4-cloroanilină, 3,5-dinitroanilină, 4-metlanilină, N-metilanilină, 1-naftilamină), esterul etilic al acidului 3,5-dinitrobenzoic;
               
            
                  —
               
               
                  esteri ai acizilor carboxilici aromaţi (de exemplu esterul metilic al acidului benzoic, esterul etilic al acidului 3,5-dinitrobenzoic);
               
            
                  —
               
               
                  hidrocarburi aromate (de exemplu toluen, xilen, etilbenzen, nitrobenzen);
               
            
                  —
               
               
                  esteri ai acizilor ariloxifenoxipropionici (de exemplu metil-diclofop, etil-fenoxaprop, p-etil-fenoxaprop);
               
            
                  —
               
               
                  fungicide pe bază de benzimidazol sau imidazol (de exemplu carbendazim, fuberidazol, triazoxid);
               
            
                  —
               
               
                  amide ale acizilor carboxilici (de exemplu 2-clorobenzamida, N,N-dimetilbenzamida, 3,5-dinitrobenzamida, N-metilbenzamida, 2-nitrobenzamida, 3-nitrobenzamida);
               
            
                  —
               
               
                  hidrocarburi clorurate (de exemplu endosulfan, DDT, hexaclorobenzen, quintozen, 1,2,3-triclorobenzen);
               
            
                  —
               
               
                  insecticide organofosforoase (de exemplu metil-azinfor, disulfoton, fenamifos, izofenfos, pirazofos, sulprofos, triazofos);
               
            
                  —
               
               
                  fenoli (de exemplu fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentaclorofenol, 2,4,6-triclorofenol, 1-naftol);
               
            
                  —
               
               
                  derivaţi de feniluree (de exemplu izoproturon, monolinuron, pencycuron);
               
            
                  —
               
               
                  pigmenţi coloranţi (de exemplu Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 81);
               
            
                  —
               
               
                  hidrocarburi poliaromate (de exemplu acenaften, naftalen);
               
            
                  —
               
               
                  ierbicide pe bază de 1,3,5-triazine (de exemplu prometrin, propazină, simazină, terbutrin);
               
            
                  —
               
               
                  derivaţi de triazol (de exemplu tebuconazol, triadimefon, tradimenol, triapentenol).
               
            Prezenta metodă nu se poate aplica la substanţele care reacţionează fie cu eluentul, fie cu faza staţionară. De asemenea, nu se aplică la substanţele care interacţionează în mod specific cu componentele anorganice (de exemplu formarea de complecşi ramificaţi cu mineralele din argilă). Este posibil ca metoda să nu funcţioneze la substanţele tensioactive, compuşii anorganici şi acizii şi bazele organici(e) moderaţi(e) sau puternici(e). Se pot determina valorile log Kco cuprinse între 1,5 şi 5,0. Determinarea substanţelor ionizabile trebuie să se realizeze cu o fază mobilă tamponată, dar trebuie să se aibă grijă pentru a evita precipitarea componentelor tamponului sau a substanţei testate.
      1.6.   CRITERII DE CALITATE
      1.6.1.   Acurateţea
      De obicei, coeficientul de adsorbţie al unei substanţe testate se poate estima cu o aproximaţie de ±0,5 dintr-o unitate logaritmică din valoarea determinată prin metoda de stabilire a echilibrului probelor (tabelul 1 din apendice). Dacă substanţele de referinţă utilizate au structuri asemănătoare cu cea a substanţei testate, se poate obţine o acurateţe mai mare.
      1.6.2.   Repetabilitatea
      Determinările trebuie să se facă cel puţin în dublu exemplar. Valorile log Kco obţinute din măsurătorile individuale trebuie să se situeze într-un interval de 0,25 dintr-o unitate logaritmică.
      1.6.3.   Reproductibilitatea
      Experienţa acumulată până în prezent în aplicarea metodei susţine valabilitatea acesteia. Un studiu prin metoda HPLC, în care s-au utilizat 48 substanţe (majoritatea pesticide) pentru care existau date credibile privind Kco pentru soluri, a dat un coeficient de corelare R = 0,95 (10) (11).
      S-a realizat un studiu comparativ între laboratoare, cu participarea a 11 laboratoare, pentru îmbunătăţirea şi validarea metodei (12). Rezultatele sunt prezentate în tabelul 2 din apendice.
      1.7.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.7.1.   Estimarea preliminară a coeficientului de adsorbţie
      Coeficientul de partiţie octanol-apă Pow (= Kow) şi, într-o anumită măsură, solubilitatea în apă se pot utiliza ca indicatori pentru gradul de adsorbţie, în special pentru substanţele neionizate şi, prin urmare, se pot utiliza pentru aflarea preliminară a domeniului. Au fost publicate o serie de corelaţii utile pentru câteva grupe de substanţe chimice (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
      1.7.2.   Aparatura
      Este necesar un cromatograf lichid prevăzut cu o pompă fără impulsuri şi cu un dispozitiv potrivit de detecţie. Se recomandă utilizarea unui injector cu buclă de injecţie. Se utilizează răşini pe bază de cianopropil fixat chimic pe suport de silice (de exemplu Hypersil şi Zorax CN). O coloană de protecţie din acelaşi material se poate instala între sistemul de injecţie şi coloana analitică. Coloanele provenite de la diverşi furnizori pot să aibă randamente de separare foarte diferite. Pentru orientare, este necesar să se obţină următorii factori de capacitate k': log k' > 0,0 pentru log Kco = 3,0 şi log k' > -0,4 pentru log Kco = 2,0 atunci când se utilizează amestec metanol/apă 55/45 % ca fază mobilă.
      1.7.3.   Fazele mobile
      Au fost testate câteva faze mobile şi se recomandă următoarele două:
      
                  —
               
               
                  metanol/apă (55/45 % v/v);
               
            
                  —
               
               
                  metanol/tampon citrat 0,01 M, pH 6,0 (55/45 % v/v)
               
            Se utilizează metanolul de tip HPLC şi apă distilată sau tampon citrat pentru prepararea solventului de eluţie. Amestecul se dezaerează înainte de utilizare. Se utilizează eluţia izocratică. Dacă amestecurile metanol/apă nu sunt corespunzătoare, se pot încerca alte amestecuri solvent organic/apă, de exemplu amestecurile etanol/apă sau acrilonitril/apă. Pentru compuşii ionizabili se recomandă utilizarea soluţiei tampon pentru stabilizarea pH-ului. Trebuie să se aibă grijă pentru a evita precipitarea sărurilor şi deteriorarea coloanei, care pot să apară la unele amestecuri fază organică/tampon.
      Nu se pot utiliza aditivi cum ar fi reactivi cu perechi de ioni, deoarece pot să afecteze proprietăţile de sorbţie ale fazei staţionare. Astfel de modificări ale fazei staţionare pot să fie ireversibile. Din acest motiv, este obligatoriu ca testele cu aditivi să se efectueze pe coloane separate.
      1.7.4.   Substanţa dizolvată
      Substanţele testate şi de referinţă se dizolvă în faza mobilă.
      1.8.   DESFĂŞURAREA TESTULUI
      1.8.1.   Condiţii de testare
      Este necesară înregistrarea temperaturii în timpul măsurătorilor. Pentru asigurarea condiţiilor constante în timpul etalonării şi estimării şi măsurării substanţei testate, se recomandă cu stringenţă utilizarea unui compartiment termoreglabil pentru coloană.
      1.8.2.   Determinarea timpului mort t0
      
      Pentru determinarea timpului mort t0, se pot utiliza două metode diferite (a se vedea şi punctul 1.2).
      1.8.2.1.   Determinarea timpului mort t0 cu ajutorul seriilor omoloage
      S-a dovedit că procedeul de acest tip dă valori t0 credibile şi standardizate. Pentru detalii, a se vedea metoda de testare A.8 Coeficientul de partiţie (n-octanol/apă), metoda HPLC.
      1.8.2.2.   Determinarea timpului mort t0 cu substanţe inerte care nu sunt reţinute pe coloană
      Procedeul menţionat se bazează pe injecţia soluţiilor de formamidă, uree sau nitrat de sodiu. Măsurătorile se realizează cel puţin de două ori.
      1.8.3.   Determinarea timpilor de retenţie tR
      
      Se procedează la selectarea substanţelor de referinţă conform punctului 1.3. Acestea se pot injecta ca amestec etalon pentru determinarea timpilor lor de retenţie, cu condiţia confirmării că timpul de retenţie pentru fiecare etalon nu este afectat de prezenţa altor etaloane de referinţă. Etalonarea se face la intervale regulate, cel puţin de două ori pe zi, datorită modificărilor neaşteptate în funcţionarea coloanei. Pentru cea mai bună practică, injecţiile de etalonare se realizează înainte şi după injecţiile de substanţă testată pentru a confirma că timpii de retenţie nu au fost deplasaţi. Substanţele testate se injectează separat în cantităţi cât se poate de mici (pentru a evita supraîncărcarea coloanei) şi se determină timpii de retenţie pentru acestea.
      Pentru a creşte încrederea în măsurători, trebuie să se realizeze cel puţin două determinări. Valorile log Kco obţinute din măsurători individuale trebuie să se încadreze într-o valoare de 0,25 dintr-o unitate logaritmică.
      1.8.4.   Evaluarea
      Se calculează factorii de capacitate k' din timpul mort t0 şi timpii de retenţie tR pentru substanţele de referinţă selectate conform ecuaţiei 4 (punctul 1.2). Apoi, se reprezintă grafic valorile log k' ale substanţelor de referinţă în funcţie de valorile log Kco ale acestora, obţinute din testele cu realizarea echilibrului probelor, prezentate în tabelele 1 şi 3 din apendice. Din reprezentarea grafică menţionată, valoarea log k' a unei substanţe testate se utilizează apoi pentru determinarea valorii log Kco a acesteia. Dacă rezultatele reale indică o valoare a log Kco pentru substanţa testată în afara domeniului de etalonat, testarea se repetă, utilizând alte substanţe de referinţă mai potrivite.
      2.   DATE ȘI RAPORT
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:
      
                  —
               
               
                  identitatea testului şi a substanţelor de referinţă şi puritatea acestora şi valorile pKa, dacă sunt importante;
               
            
                  —
               
               
                  descrierea aparaturii şi a condiţiilor de operare, de exemplu tipul şi dimensiunea coloanei analitice (şi a celei de protecţie), mijloacele de detecţie, faza mobilă (raportul componentelor şi valoarea pH), valorile temperaturii în timpul măsurătorilor;
               
            
                  —
               
               
                  timpul mort şi metoda utilizată pentru determinarea acestuia;
               
            
                  —
               
               
                  cantităţile de substanţe testate şi de referinţă introduse în coloană;
               
            
                  —
               
               
                  timpii de retenţie pentru compuşii de referinţă utilizaţi la etalonare;
               
            
                  —
               
               
                  detalii privind linia de regresie ajustată (log k' în funcţie de log Kco) şi un grafic al liniei de regresie;
               
            
                  —
               
               
                  datele medii de retenţie şi valoarea estimată a log Kco pentru compusul testat;
               
            
                  —
               
               
                  cromatogramele.
               
            3.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt (ed). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, chapt. 4, McGraw-Hill, New York.
               
            
                  2.
               
               
                  J. Hodson, N.A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Koc) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, p. 1-67.
               
            
                  3.
               
               
                  G.G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, p. 1050-1059.
               
            
                  4.
               
               
                  C.T. Chiou, P.E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, p. 227-231.
               
            
                  5.
               
               
                  Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, p. 297-312.
               
            
                  6.
               
               
                  C.T. Chiou, L.J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, p. 831-832.
               
            
                  7.
               
               
                  S.W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, p. 833-846.
               
            
                  8.
               
               
                  W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), p. 121-128.
               
            
                  9.
               
               
                  M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), p. 2493-2504.
               
            
                  10.
               
               
                  W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), p. 2341-2352.
               
            
                  11.
               
               
                  B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, p. 285-304.
               
            
                  12.
               
               
                  W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), p. 1373-1384.
               
            
         Apendice
         Tabelul 1
         Compararea valorilor Kco pentru soluri şi nămoluri de epurare şi valorile calculate cu ajutorul metodei selective HPLC (31)
             (32)
         
         
                     Substanţa
                  
                  
                     Nr. CAS
                  
                  
                     Log Kco nămoluri de epurare
                  
                  
                     Log Kco HPLC
                  
                  
                     Δ
                  
                  
                     Log Kco soluri
                  
                  
                     Log Kco HPLC
                  
                  
                     Δ
                  
               
                     Atrazină
                  
                  
                     1912-24-9
                  
                  
                     1,66
                  
                  
                     2,14
                  
                  
                     0,48
                  
                  
                     1,81
                  
                  
                     2,20
                  
                  
                     0,39
                  
               
                     Linuron
                  
                  
                     330-55-2
                  
                  
                     2,43
                  
                  
                     2,96
                  
                  
                     0,53
                  
                  
                     2,59
                  
                  
                     2,89
                  
                  
                     0,30
                  
               
                     Fention
                  
                  
                     55-38-9
                  
                  
                     3,75
                  
                  
                     3,58
                  
                  
                     0,17
                  
                  
                     3,31
                  
                  
                     3,40
                  
                  
                     0,09
                  
               
                     Monuron
                  
                  
                     150-68-5
                  
                  
                     1,46
                  
                  
                     2,21
                  
                  
                     0,75
                  
                  
                     1,99
                  
                  
                     2,26
                  
                  
                     0,27
                  
               
                     Fenantren
                  
                  
                     85-01-8
                  
                  
                     4,35
                  
                  
                     3,72
                  
                  
                     0,63
                  
                  
                     4,09
                  
                  
                     3,52
                  
                  
                     0,57
                  
               
                     Esterul fenilic al acidului benzoic
                  
                  
                     93-99-2
                  
                  
                     3,26
                  
                  
                     3,03
                  
                  
                     0,23
                  
                  
                     2,87
                  
                  
                     2,94
                  
                  
                     0,07
                  
               
                     Benzamidă
                  
                  
                     55-21-0
                  
                  
                     1,60
                  
                  
                     1,00
                  
                  
                     0,60
                  
                  
                     1,26
                  
                  
                     1,25
                  
                  
                     0,01
                  
               
                     4-Nitrobenzamidă
                  
                  
                     619-80-7
                  
                  
                     1,52
                  
                  
                     1,49
                  
                  
                     0,03
                  
                  
                     1,93
                  
                  
                     1,66
                  
                  
                     0,27
                  
               
                     Acetanilidă
                  
                  
                     103-84-4
                  
                  
                     1,52
                  
                  
                     1,53
                  
                  
                     0,01
                  
                  
                     1,26
                  
                  
                     1,69
                  
                  
                     0,08
                  
               
                     Anilină
                  
                  
                     62-53-3
                  
                  
                     1,74
                  
                  
                     1,47
                  
                  
                     0,27
                  
                  
                     2,07
                  
                  
                     1,64
                  
                  
                     0,43
                  
               
                     2,5-Dicloroanilină
                  
                  
                     95-82-9
                  
                  
                     2,45
                  
                  
                     2,59
                  
                  
                     0,14
                  
                  
                     2,55
                  
                  
                     2,58
                  
                  
                     0,03
                  
               
            
         Tabelul 2
         Rezultatele studiului comparativ între laboratoare (11 laboratoare participante) efectuat pentru îmbunătăţirea şi validarea metodei HPLC (33)
         
         
                     Substanţa
                  
                  
                     Nr. CAS
                  
                  
                     Log Kco
                     
                  
                  
                     Kco
                     
                  
                  
                     log Kco
                     
                  
               
                     (OCDE 106)
                  
                  
                     metoda HPLC
                  
               
                     Atrazină
                  
                  
                     1912-24-9
                  
                  
                     1,81
                  
                  
                     78 ± 16
                  
                  
                     1,89
                  
               
                     Monuron
                  
                  
                     150-68-5
                  
                  
                     1,99
                  
                  
                     100 ± 8
                  
                  
                     2,00
                  
               
                     Triapentenol
                  
                  
                     77608-88-3
                  
                  
                     2,37
                  
                  
                     292 ± 58
                  
                  
                     2,47
                  
               
                     Linuron
                  
                  
                     330-55-2
                  
                  
                     2,59
                  
                  
                     465 ± 62
                  
                  
                     2,67
                  
               
                     Fention
                  
                  
                     55-38-9
                  
                  
                     3,31
                  
                  
                     2062 ± 648
                  
                  
                     3,31
                  
               
            
         Tabelul 3
         Substanţele de referinţă recomandate pentru metoda selectivă HPLC pe baza datelor de adsorbţie pe sol
         
                     Substanţa de referinţă
                  
                  
                     Nr. CAS
                  
                  
                     Valorile medii ale log Kco din echilibrul probelor
                  
                  
                     Nr. de date Kco
                     
                  
                  
                     Log D. S.
                  
                  
                     Sursa
                  
               
                     Acetanilidă
                  
                  
                     103-84-4
                  
                  
                     1,25
                  
                  
                     4
                  
                  
                     0,48
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Fenol
                  
                  
                     108-95-2
                  
                  
                     1,32
                  
                  
                     4
                  
                  
                     0,70
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     2-Nitrobenzamidă
                  
                  
                     610-15-1
                  
                  
                     1,45
                  
                  
                     3
                  
                  
                     0,90
                  
                  
                     
                         (35)
                     
                  
               
                     N, N-dimetilbenzamidă
                  
                  
                     611-74-5
                  
                  
                     1,52
                  
                  
                     2
                  
                  
                     0,45
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     4-Metilmenzamidă
                  
                  
                     619-55-6
                  
                  
                     1,78
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,76
                  
                  
                     
                         (35)
                     
                  
               
                     Metilbenzoat
                  
                  
                     93-58-3
                  
                  
                     1,80
                  
                  
                     4
                  
                  
                     1,08
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Atrazină
                  
                  
                     1912-24-9
                  
                  
                     1,81
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,08
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Izoproturon
                  
                  
                     34123-59-6
                  
                  
                     1,86
                  
                  
                     5
                  
                  
                     1,53
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     3-Nitrobenzamidă
                  
                  
                     645-09-0
                  
                  
                     1,95
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,31
                  
                  
                     
                         (35)
                     
                  
               
                     Anilină
                  
                  
                     62-53-3
                  
                  
                     2,07
                  
                  
                     4
                  
                  
                     1,73
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     3,5-Dinitrobenzamidă
                  
                  
                     121-81-3
                  
                  
                     2,31
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,27
                  
                  
                     
                         (35)
                     
                  
               
                     Carbendazim
                  
                  
                     10605-21-7
                  
                  
                     2,35
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,37
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Triadimenol
                  
                  
                     55219-65-3
                  
                  
                     2,40
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,85
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Triazoxid
                  
                  
                     72459-58-6
                  
                  
                     2,44
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,66
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Triazofos
                  
                  
                     24017-47-8
                  
                  
                     2,55
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,78
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Linuron
                  
                  
                     330-55-2
                  
                  
                     2,59
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1,97
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Naftalen
                  
                  
                     91-20-3
                  
                  
                     2,75
                  
                  
                     4
                  
                  
                     2,20
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Endosulfan-diol
                  
                  
                     2157-19-9
                  
                  
                     3,07
                  
                  
                     5
                  
                  
                     2,29
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Metiocarb
                  
                  
                     2032-65-7
                  
                  
                     3,10
                  
                  
                     4
                  
                  
                     2,39
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Acid Yellow 219
                  
                  
                     63405-85-6
                  
                  
                     3,16
                  
                  
                     4
                  
                  
                     2,83
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     1,2,3-Triclorobenzen
                  
                  
                     87-61-6
                  
                  
                     3,16
                  
                  
                     4
                  
                  
                     1,40
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     γ-HCH
                  
                  
                     58-89-9
                  
                  
                     3,23
                  
                  
                     5
                  
                  
                     2,94
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Fention
                  
                  
                     55-38-9
                  
                  
                     3,31
                  
                  
                     3
                  
                  
                     2,49
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Direct Red 81
                  
                  
                     2610-11-9
                  
                  
                     3,43
                  
                  
                     4
                  
                  
                     2,68
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Pirazofos
                  
                  
                     13457-18-6
                  
                  
                     3,65
                  
                  
                     3
                  
                  
                     2,70
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     α-Endosulfan
                  
                  
                     959-98-8
                  
                  
                     4,09
                  
                  
                     5
                  
                  
                     3,74
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Metil-diclofop
                  
                  
                     51338-27-3
                  
                  
                     4,20
                  
                  
                     3
                  
                  
                     3,77
                  
                  
                     
                         (36)
                     
                  
               
                     Fenantren
                  
                  
                     85-01-8
                  
                  
                     4,09
                  
                  
                     4
                  
                  
                     3,83
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     Basic Blue 41 (amestec)
                  
                  
                     26850-47-5
                     12270-13-2
                  
                  
                     4,89
                  
                  
                     4
                  
                  
                     4,46
                  
                  
                     
                         (34)
                     
                  
               
                     DDT
                  
                  
                     50-29-3
                  
                  
                     5,63
                  
                  
                     1
                  
                  
                     —
                  
                  
                     
                         (35)
                     
                  
               
      C.20.   TEST DE REPRODUCERE PENTRU DAPHNIA MAGNA
      
      1.   METODĂ
      Prezenta metodă de testare a toxicităţii pentru reproducere reproduce Orientarea 211 (1998) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Obiectivul principal al testului este evaluarea efectului produselor chimice asupra randamentului de reproducere al Daphnia magna.
      1.2.   DEFINIŢII ŞI UNITĂŢI
      
         Animale părinţi: sunt acele femele de dafnia prezente la începutul testului şi al căror randament de reproducere constituie obiectul studiului.
      
         Progenitură: exemplarele tinere de dafnia produse de animalele părinţi în cursul testului.
      
         Concentraţia la care se observă cele mai mici efecte (CMEO): este concentraţia cea mai mică experimentată la care se observă un efect important al substanţei din punct de vedere statistic asupra reproducerii şi mortalităţii părinţilor (la p < 0,05) în comparaţie cu martorul, într-un timp de expunere stabilit. Cu toate acestea, toate concentraţiile experimentate mai mari decât CMEO trebuie să aibă un efect nociv egal cu sau mai mare decât cele observate la CMEO. Când cele două condiţii menţionate nu pot fi satisfăcute, trebuie să se prezinte o explicaţie completă a modului de alegere a CMEO (şi, prin urmare, CFEO).
      
         Concentraţia la care nu se observă niciun efect (CFEO): este concentraţia experimentată imediat sub CMEO, care, în comparaţie cu martorul, nu are un efect important din punct de vedere statistic (p < 0,05), într-un timp de expunere stabilit.
      
         CE
         
            x
         : este concentraţia substanţei testate dizolvate în apă care generează o reducere de x % a reproducerii la Daphnia magna într-un timp de expunere stabilit.
      
         Rata intrinsecă de înmulţire: este o măsură a creşterii populaţiei care cuprinde capacitatea de reproducere şi mortalitatea specifică vârstei (20) (21) (22). La populaţiile în stare stabilă, aceasta va fi egală cu zero. La populaţiile în creştere, aceasta va fi pozitivă şi la populaţiile în scădere, va fi negativă. Este clar că aceasta din urmă nu este de susţinut şi în final va duce la dispariţie.
      
         Limita de detecţie: este cea mai mică concentraţie care se poate detecta dar nu se poate măsura.
      
         Limita de determinare: este cea mai mică concentraţie care se poate determina cantitativ.
      
         Mortalitatea: un animal se înregistrează ca mort atunci când este imobil, adică atunci când nu poate să înoate sau dacă nu se observă o mişcare a organelor externe sau a post-abdomenului, în 15 secunde de la o uşoară agitare a recipientului experimental (dacă se utilizează o altă definiţie, aceasta se specifică împreună cu sursa bibliografică).
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Femelele tinere de dafnia (animale părinţi), în vârstă de mai puţin de 24 ore la începutul testului, sunt expuse la substanţa testată, adăugată într-o o serie de concentraţii diferite. Durata testului este de 21 de zile. La sfârşitul testului, se evaluează numărul total de progenituri în viaţă produse per animal părinte viu la sfârşitul testului. Aceasta înseamnă că tineretul produs de adulţii care mor în timpul testului este exclus din calcule. Capacitatea de reproducere a animalelor părinţi se poate exprima în alte moduri (de exemplu numărul de progenituri în viaţă produse per animal per zi, din prima zi în care s-au observat progeniturile), dar acestea se semnalează în afară de numărul total de tineret produs per părinte viu la sfârşitul testului. Capacitatea de reproducere a animalelor expuse la substanţa testată se compară cu aceea a martorului (martorilor) pentru a determina concentraţia la care se observă cele mai mici efecte (CMEO) şi, din aceasta, concentraţia la care nu se observă niciun efect (CFEO). În afară de aceasta şi în măsura în care este posibil, rezultatele sunt analizate cu ajutorul unui model de regresie pentru estimarea concentraţiei care ar putea să provoace o reducere cu x % a capacităţii de reproducere (adică CE50, CE20 sau CE10).
      De asemenea, se semnalează supravieţuirea animalelor părinţi şi timpul producerii primilor pui. Se mai pot studia alte efecte aferente substanţei asupra unor parametri cum ar fi creşterea (de exemplu lungimea) şi posibil rata intrinsecă de înmulţire.
      1.4.   INFORMAŢII REFERITOARE LA SUBSTANŢA DE TESTARE
      Datele unui test de toxicitate acută (metoda C.2, partea I) efectuat cu Daphnia magna trebuie să fie disponibile. Rezultatul poate să fie util la selectarea unui domeniu potrivit de concentraţii experimentale în testele de reproducere. Este necesar să se cunoască solubilitatea în apă şi presiunea de vapori a substanţei testate şi să existe o metodă analitică fiabilă pentru determinarea cantitativă a substanţei în soluţiile experimentale, cu eficienţa recuperării şi limita de detecţie specificate.
      Datele privind substanţa testată, care pot să fie utile în stabilirea condiţiilor de testare, includ formula structurală, puritatea substanţei, stabilitatea la lumină, stabilitatea în condiţiile testului, pKa, Pow şi rezultatele testului pentru biodegradabilitate imediată (a se vedea metoda C.4).
      1.5.   VALIDITATEA TESTULUI
      Pentru ca un test să fie valid, martorul (martorii) trebuie să îndeplinească următoarele criterii de performanţă:
      
                  —
               
               
                  mortalitatea animalelor părinţi (femele de dafnia) să nu depăşească 20 % la sfârşitul testului;
               
            
                  —
               
               
                  numărul mediu de progenituri vii produse per animal părinte supravieţuitor la sfârşitul testului să fie ≥ 60.
               
            1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Aparatură
      Vasele experimentale şi altă aparatură care vine în contact cu soluţiile experimentale trebuie să fie realizate în întregime din sticlă sau alt material inert din punct de vedere chimic. De obicei, vasele experimentale sunt pahare de laborator.
      În afară de acestea, mai sunt necesare următoarele aparate:
      
                  —
               
               
                  contor de oxigen (cu microelectrod sau alt dispozitiv corespunzător pentru măsurarea oxigenului dizolvat în probe de volum mic);
               
            
                  —
               
               
                  aparat specific pentru controlul temperaturii;
               
            
                  —
               
               
                  pH-metru;
               
            
                  —
               
               
                  aparat pentru determinarea durităţii apei;
               
            
                  —
               
               
                  aparat pentru determinarea concentraţiei totale de carbon organic (COT) în apă sau aparat pentru determinarea consumului chimic de oxigen (CCO);
               
            
                  —
               
               
                  aparat specific pentru controlul regimului de iluminare şi măsurarea intensităţii luminii.
               
            1.6.2.   Organismul de testare
      Specia utilizată în test este Daphnia magna Straus. Se pot utiliza şi alte specii de dafnia, cu condiţia ca acestea să îndeplinească criteriile de validitate după caz (criteriul de validitate referitor la capacitatea de reproducere la martori trebuie să fie relevant pentru speciile dafnia). Dacă se utilizează alte specii de dafnia, acestea trebuie să se identifice în mod clar şi să se justifice utilizarea lor.
      De preferinţă, clonul trebuie să fi fost identificat după genotip. Studiul (1) a arătat că performanţa de reproducere a clonului A (care provine din IRCHA din Franţa) (3) satisface complet criteriile de validitate pentru o medie de ≥ 60 progenituri per animal părinte supravieţuitor atunci când se cultivă în condiţiile descrise în prezenta metodă. Cu toate acestea, se acceptă şi alţi cloni, cu condiţia să se indice îndeplinirea criteriilor de validitate pentru test de către cultura de dafnia.
      La începutul testului, animalele trebuie să fie mai tinere de 24 ore şi nu trebuie să fie prima generaţie. Acestea trebuie să provină dintr-o colonie sănătoasă (adică fără semne de stres, cum ar fi mortalitatea mare, prezenţa masculilor şi ephippia, întârziere în producerea primilor descendenţi, animale decolorate etc.). Animalele din colonie trebuie ţinute în condiţii de cultură (lumină, temperatură, mediu, hrană şi număr de animale per unitatea de volum) similare cu cele utilizate în test. Dacă mediul de cultură ce urmează să fie utilizat în test este diferit de cel pentru cultura obişnuită de dafnia, este o bună practică să se includă o perioadă de aclimatizare înaintea testului, de obicei de aproximativ trei săptămâni (adică o generaţie), pentru a evita stresarea animalelor părinţi.
      1.6.3.   Mediul de testare
      În prezentul test, se recomandă utilizarea unui mediu bine definit. Acesta poate să evite utilizarea aditivilor (de exemplu plante de mare, extract de sol etc.) a căror caracterizare este dificilă şi, prin urmare, se îmbunătăţesc posibilităţile de standardizare între laboratoare. S-a găsit că mediile Elendt M4 (4) şi M7 (a se vedea apendicele 1) sunt potrivite în acest sens. Cu toate acestea, se pot accepta şi alte medii [de exemplu (5) (6)], cu condiţia să asigure realizarea unei culturi de dafnia care să întrunească criteriile de validitate pentru test.
      Dacă se utilizează medii ce conţin aditivi care nu sunt caracterizaţi, este necesar ca aditivii respectivi să se specifice clar şi, în raportul de testare, să se prezinte date privind compoziţia, în special conţinutul de carbon, deoarece acesta poate contribui la hrana furnizată. Se recomandă determinarea concentraţiei totale de carbonului organic (COT) şi a consumului chimic de oxigen (CCO) la prepararea amestecului de aditivi organici şi să se facă o estimare a contribuţiei rezultate la COT/CCO în mediul de testare. Se recomandă ca valorile COT în mediu (adică înainte de adăugarea algelor) să fie mai mici de 2 mg/l (7).
      Când se testează substanţe cu conţinut de metale, este important să se admită că proprietăţile mediului de testare (de exemplu duritatea, capacitatea de chelatizare) ar putea să aibă legătură cu toxicitatea substanţei studiate. De aceea, este de preferat un mediu bine caracterizat. Cu toate acestea, în prezent, singurele medii bine caracterizate care se cunosc ca fiind optime pentru cultura pe termen lung a Daphnia magna sunt Elendt M4 şi M7. Ambele medii conţin agentul de chelatizare EDTA. Cercetările (2) arată că „toxicitatea aparentă” a cadmiului este în general mai mică atunci când testul de reproducere se realizează în mediile M4 şi M7 decât în mediile cu conţinut de EDTA. Prin urmare, M4 şi M7 nu se recomandă pentru substanţele de probă ce conţin metale şi, de asemenea, trebuie să se evite alte medii ce conţin agenţi de chelatizare cunoscuţi. Pentru substanţele cu conţinut de metale, se poate recomanda utilizarea unui mediu alternativ, de exemplu apa dură proaspătă reconstituită conform ASTM (7), care nu conţine EDTA, cu adaos de extract de plante de mare (8). Combinaţia menţionată, de apă dură proaspătă reconstituită conform ASTM şi extract de plante de mare, este potrivită şi pentru cultura pe termen lung şi testarea Daphnia magna (2), deşi aceasta mai exercită o acţiune slabă de chelatizare datorită componentei organice din extractul de plante de mare adăugat.
      La începutul şi în timpul testului, concentraţia oxigenului dizolvat trebuie să fie mai mare de 3 mg/l. pH-ul trebuie să aibă valori în domeniul 6-9 şi, în mod normal, nu trebuie să varieze cu mai mult de 1,5 unităţi în oricare din încercări. Se recomandă o duritate mai mare de 140 mg/l (exprimată în CaCO3). Testele efectuate la această valoare şi la valori mai mari au demonstrat o performanţă a reproducerii conformă cu criteriile de validitate (9) (10).
      1.6.4.   Soluţiile de testare
      Soluţiile de testare de concentraţiile alese se prepară de obicei prin diluarea unei soluţii mamă. Soluţiile mamă se prepară de preferinţă prin dizolvarea substanţei în mediul experimental.
      În unele cazuri, s-ar putea să fie necesară utilizarea solvenţilor organici sau a agenţilor de dispersie pentru a obţine o soluţie mamă de concentraţia indicată, dar trebuie făcut tot posibilul pentru a se evita utilizarea acestor materiale. Ca solvenţi potriviţi se pot utiliza acetona, etanolul, metanolul, dimetilformamida şi trietilen glicolul. Exemple de agenţi de dispersie potriviţi sunt Cremophor RH40, metilceluloza 0,01 % şi HCO-40. În orice caz, substanţa testată în soluţiile experimentale nu trebuie să depăşească limita de solubilitate în mediul de testare.
      Se utilizează solvenţi pentru a obţine o soluţie mamă care să se poată doza cu exactitate în apă. La concentraţia recomandată a solventului în mediul de testare final (adică ≤ 0,1 ml/l), solvenţii enumeraţi anterior nu sunt toxici şi nu cresc solubilitatea în apă a unei substanţe.
      Agenţii de dispersie pot să faciliteze dozarea exactă şi dispersia. La concentraţia recomandată în mediul de testare final (≤ 0,1 ml/l), agenţii de dispersie enumeraţi anterior nu sunt toxici şi nu cresc solubilitatea în apă a unei substanţe.
      1.7.   PROTOCOLUL TESTULUI
      Tratamentele se repartizează tuturor vaselor experimentale şi toată manipularea ulterioară a vaselor experimentale se face în mod aleatoriu. Nerespectarea acestui principiu poate să aducă prejudicii care pot fi interpretate ca fiind un efect al concentraţiei. În special, dacă unităţile experimentale sunt manipulate în ordinea tratamentului sau a concentraţiei, atunci unele efecte care depind de timp, cum ar fi oboseala operatorului sau altă eroare, ar putea să genereze efecte mai mari la concentraţii mai mari. În plus, dacă există posibilitatea ca rezultatele testului să fie influenţate de o condiţie iniţială sau de mediu a testului, cum ar fi poziţia în laborator, atunci trebuie să se aibă în vedere oprirea testului.
      1.8.   PROCEDURA DE TESTARE
      1.8.1.   Condiţii de expunere
      1.8.1.1.   Durata
      Durata testului este de 21 de zile.
      1.8.1.2.   Încărcarea
      Animalele părinţi se ţin individual, câte unul în fiecare vas experimental, care conţine 50-100 ml mediu.
      Uneori, s-ar putea să fie necesare volume mai mari pentru a satisface condiţiile procedeului analitic utilizat pentru determinarea concentraţiei substanţei testate, deşi este permisă şi unirea probelor duble pentru analiza chimică. Dacă se utilizează volume mai mari de 100 ml, s-ar putea ca raţia furnizată pentru dafnia să fie crescută pentru a asigura o alimentaţie adecvată şi respectarea criteriilor de validitate. Pentru testele în flux continuu, se pot avea în vedere, din motive tehnice, alte protocoale (de exemplu patru grupe de 10 animale într-un volum de mediu experimental mai mare), dar se specifică orice modificări ale protocolului testului.
      1.8.1.3.   Numărul animalelor
      Pentru testele semistatice, cel puţin 10 animale ţinute fiecare la fiecare concentraţie experimentată şi cel puţin 10 animale ţinute fiecare în seria martor.
      Pentru testele în flux continuu, s-a dovedit că sunt necesare 40 de animale împărţite în patru grupe de câte 10 animale pentru fiecare concentraţie experimentată (1). Se pot utiliza mai puţine organisme experimentale şi se recomandă un minimum de 20 de animale per concentraţie, împărţite în două sau mai multe probe identice cu un număr egal de animale (de exemplu patru probe identice, fiecare cu cinci daphnide). De reţinut că pentru testele în care animalele sunt ţinute în grupe, nu va fi posibilă exprimarea capacităţii de reproducere sub forma numărului total de progenituri vii produse per animal părinte în viaţă la sfârşitul testului, dacă animalele părinţi mor. În aceste cazuri, capacitatea de reproducere se exprimă prin „numărul total de progenituri vii produse per părinte prezent la începutul testului”.
      1.8.1.4.   Administrarea hranei
      Pentru testele semistatice, hrana se administrează de preferinţă zilnic, dar cel puţin de trei ori pe săptămână (adică să corespundă modificărilor mediilor). Se consemnează orice abatere de la această regulă (de exemplu pentru testele în flux continuu).
      Pe durata testului, hrana animalelor părinţi este alcătuită de preferinţă din celule de alge vii din una sau mai multe din următoarele specii: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum [acum Pseudokirchneriella subcapitata (11)] şi Scenedesmus subspicatus. Regimul alimentar ia în consideraţie conţinutul de carbon organic (C) administrat fiecărui animal părinte. Cercetările (12) au arătat că, pentru Daphnia magna, raţiile cuprinse între 0,1 şi 0,2 mg C/dafnia/zi sunt suficiente pentru obţinerea numărului necesar de progenituri care să satisfacă criteriile de validitate a testului. Raţia se poate administra fie sub forma unei porţii constante pe toată perioada testului sau, dacă se doreşte, se administrează o porţie mai mică la început şi apoi se creşte în timpul testului, ţinând cont de creşterea animalelor părinţi. În cazul menţionat, raţia tot trebuie să rămână între valorile recomandate de 0,1-0,2 mg C/dafnia/zi tot timpul.
      Dacă urmează să se utilizeze măsuri înlocuitoare, de exemplu numărul de celule de alge sau absorbanţa luminii, la administrarea raţiei (adică pentru uşurinţă, deoarece măsurarea conţinutului de carbon durează mult), fiecare laborator trebuie să-şi realizeze propria nomogramă referitoare la măsura înlocuitoare pentru conţinutul de carbon al culturii de alge (a se vedea apendicele 2 pentru recomandarea privind realizarea nomogramei). Nomogramele se verifică cel puţin anual şi mai frecvent, dacă au fost schimbate condiţiile de cultură a algelor. S-a găsit că absorbanţa luminii este un înlocuitor mai bun pentru conţinutul de carbon decât numărul de celule (13).
      Pentru a minimiza volumul mediului de cultură de alge transferat în vasele experimentale se administrează o suspensie de alge concentrată pentru dafnia. Concentraţia de alge se poate obţine prin centrifugare urmată de resuspensie în apă distilată, apă deionizată sau mediu de cultură pentru dafnia.
      1.8.1.5.   Lumina
      16 ore de lumină la o intensitate de maximum 15-20 μE· m–2 · s–1.
      1.8.1.6.   Temperatura
      Temperatura mediilor experimentale trebuie să fie cuprinsă între valorile 18 oC şi 22 oC. Cu toate acestea, pentru niciun test, temperatura nu trebuie să varieze, dacă se poate, cu mai mult de 2 oC în limitele specificate (de exemplu 18-20, 19-21 sau 20-22 oC). S-ar putea să fie necesară utilizarea unui vas experimental suplimentar pentru urmărirea temperaturii.
      1.8.1.7.   Aerarea
      Vasele experimentale nu se aerează în timpul testului.
      1.8.2.   Concentraţia experimentată
      În mod normal, trebuie să existe cel puţin cinci concentraţii experimentate aranjate în serie geometrică cu un factor de separare de maximum 3,2 şi trebuie să se utilizeze numărul optim de probe identice pentru fiecare concentraţie experimentată (a se vedea punctul 1.8.1.3). Dacă se utilizează mai puţin de cinci concentraţii, acest lucru se justifică. Substanţele nu se testează la concentraţii mai mari decât limita de solubilitate a acestora în mediul experimental.
      La stabilirea domeniului de concentraţii, trebuie să se reţină următoarele:
      
                  (i)
               
               
                  Dacă se urmăreşte obţinerea CMEO/CFEO, cea mai mică concentraţie experimentată trebuie să fie suficient de mică, astfel încât fecunditatea la această concentraţie să nu fie cu mult mai mică decât aceea din martor. Dacă nu este aşa, testul va trebui să fie repetat cu concentraţia cea mai mică redusă.
               
            
                  (ii)
               
               
                  Dacă se urmăreşte obţinerea CMEO/CFEO, cea mai mare concentraţie experimentată trebuie să fie suficient de mare, astfel încât fecunditatea la această concentraţie să fie cu mult mai mică decât aceea din martor. Dacă nu este aşa, testul va trebui să fie repetat cu concentraţia cea mai mare sporită.
               
            
                  (iii)
               
               
                  Dacă se determină CEx pentru efectele asupra reproducerii, se recomandă utilizarea unor concentraţii suficiente pentru stabilirea CEx cu un nivel corespunzător de siguranţă. Dacă se determină CE50 pentru efectele asupra reproducerii, se recomandă ca cea mai mare concentraţie experimentată să fie mai mare decât CE50 menţionat. În caz contrar, deşi va fi posibilă încă determinarea CE50, intervalul de siguranţă pentru CE50 va fi foarte larg şi s-ar putea să nu fie posibil să se aprecieze dacă modelul este cel indicat.
               
            
                  (iv)
               
               
                  Este de preferat ca valorile concentraţiei experimentate să nu includă concentraţii care au efect important din punct de vedere statistic asupra supravieţuirii adulţilor, deoarece acest lucru ar modifica natura testului de la un test pur şi simplu de reproducere la un test combinat de reproducere şi mortalitate care necesită o analiză statistică mult mai complexă.
               
            Cunoaşterea în prealabil a toxicităţii substanţei testate (de exemplu dintr-un test de toxicitate acută şi din studii de găsire a domeniului) ar fi utilă în selectarea concentraţiilor optime pentru test.
      Dacă se utilizează un solvent sau un agent de dispersie pentru a facilita prepararea soluţiilor experimentale (a se vedea punctul 1.6.4), concentraţia acestuia în vasele experimentale nu trebuie să fie mai mare de 0,1 ml/l şi trebuie să fie aceeaşi în toate vasele.
      1.8.3.   Probele martor
      În afară de seria pentru test, se mai realizează o serie de probe martor pentru mediul experimental şi, de asemenea, dacă este relevant, o serie de probe martor care conţin solventul sau agentul de dispersie. Dacă se utilizează, concentraţia solventului sau agentului de dispersie trebuie să fie egală cu cea utilizată în vasele ce conţin substanţa testată. Se utilizează numărul optim de probe identice (a se vedea punctul 1.8.1.3).
      În general, într-un test bine realizat, coeficientul de variaţie în jurul numărului mediu de progenituri vii obţinute per animal părinte în proba (probele) martor este ≤ 25 % şi acest lucru se consemnează în protocoalele testului care utilizează animale ţinute separat.
      1.8.4.   Reînnoirea mediului de testare
      Frecvenţa reînnoirii mediului de testare depinde de stabilitatea substanţei testate, dar trebuie să fie de cel puţin trei ori pe săptămână. Dacă, din testele preliminare de stabilitate (a se vedea punctul 1.4), concentraţia substanţei testate nu este stabilă (adică nu se încadrează în intervalul 80-120 %) din valoarea nominală sau este mai mică de 80 % din concentraţia iniţială măsurată) în perioada maximă de reînnoire (adică trei zile), trebuie să se aibă în vedere o reînnoire mai frecventă a mediului sau să se utilizeze un test în flux continuu.
      Când un mediu este reînnoit în teste semistatice, se pregăteşte o a doua serie de vase experimentale şi animalele părinţi se transferă în acestea cu ajutorul, de exemplu, unei pipete de sticlă cu un diametru potrivit. Volumul mediului transferat cu dafnia trebuie să fie minim.
      1.8.5.   Observaţii
      Rezultatele observaţiilor făcute în timpul testului se consemnează în fişe tehnice (a se vedea exemple în apendicele 3 şi 4). Dacă sunt necesare alte măsurători (a se vedea punctele 1.3 şi 1.8.8), s-ar putea să fie necesare observaţii suplimentare.
      1.8.6.   Progenituri
      Progeniturile produse de fiecare animal părinte se scot, de preferinţă, şi se numără zilnic de la apariţia primilor pui, pentru a preveni consumarea de către aceştia a hranei destinate adulţilor. În sensul prezentei metode, se numără doar numărul de progenituri vii, dar se consemnează şi prezenţa ouălor avortate sau a progeniturilor decedate.
      1.8.7.   Mortalitate
      Mortalitatea în rândul animalelor părinţi se înregistrează de preferinţă zilnic, cel puţin de câte ori se numără progeniturile.
      1.8.8.   Alţi parametri
      Deşi prezenta metodă este destinată în principal evaluării efectelor asupra reproducerii, este posibil să se poată măsura şi alte efecte suficient pentru a permite o analiză statistică. Măsurătorile de creştere sunt de dorit în mare măsură, deoarece oferă date privind posibilele efecte subletale, care s-ar putea să fie mai utile decât determinarea doar a reproducerii; se recomandă măsurarea lungimii animalelor părinţi (adică lungimea corpului, fără înotătoarea caudală, la sfârşitul testului. Alţi parametri care se pot măsura sau calcula includ timpul de producere a primului pui (şi a puilor ulteriori), numărul şi dimensiunea puilor per animal, numărul de pui avortaţi, prezenţa masculilor sau ephippia şi rata intrinsecă a creşterii populaţiei.
      1.8.9.   Frecvenţa determinărilor şi măsurătorilor analitice
      Este necesar să se măsoare concentraţia oxigenului, temperatura, duritatea şi valorile pH-ului cel puţin o dată pe săptămână, în mediile proaspete şi cele vechi, în proba (probele) martor şi în concentraţiile cele mai mari de substanţă testată.
      În timpul testului, se determină concentraţia substanţei testate la intervale regulate.
      În testele semistatice, unde se estimează o menţinere a concentraţiei substanţei testate în limitele de ± 20 % din cea nominală (adică în intervalul de 80-120 % – a se vedea punctele 1.4 şi 1.8.4), se recomandă analizarea cel puţin a celei mai mari şi a celei mai mici concentraţii experimentate, atunci când soluţiile sunt proaspăt preparate şi când sunt reînnoite în timpul primei săptămâni de testare (adică analizele se realizează pe o probă din aceeaşi soluţie – atunci când este proaspăt preparată şi la reînnoire). Ulterior, determinările respective se repetă la intervale de cel puţin o săptămână.
      Pentru testele în care nu se estimează menţinerea concentraţiei substanţei testate în limitele de ± 20 % din cea nominală, este necesară analizarea tuturor concentraţiilor experimentate, atunci când soluţiile sunt proaspăt preparate şi la reînnoire. Cu toate acestea, pentru acele teste în care concentraţia iniţială măsurată a substanţei testate nu se situează în limitele de ± 20 % din cea nominală, dar se pot aduce dovezi care să indice repetabilitatea şi stabilitatea concentraţiilor iniţiale (adică în intervalul de 80-120 % din concentraţiile iniţiale), determinarea chimică se poate reduce în săptămânile 2 şi 3 de testare la cea mai mare şi cea mai mică concentraţie experimentată. În toate cazurile, este necesar să se determine concentraţiile substanţei testate înaintea reînnoirii doar la un vas din cele identice pentru fiecare concentraţie experimentată.
      Dacă se utilizează un test cu flux continuu, se recomandă un regim de prelevare a probelor similar cu cel descris pentru testele semistatice (dar măsurarea soluţiilor „vechi” nu se aplică în acest caz). Cu toate acestea, ar putea fi recomandabil să se crească numărul prelevărilor de probe în prima săptămână (de exemplu trei seturi de măsurători) pentru a asigura menţinerea stabilităţii concentraţiilor experimentale. La aceste tipuri de testări, trebuie verificat zilnic fluxul diluantului şi al substanţei testate.
      Dacă se poate dovedi menţinerea satisfăcătoare, pe toată durata testului, a concentraţiei substanţei testate în limitele de ± 20 % din cea nominală sau măsurată iniţial, atunci rezultatele se pot obţine din valoarea nominală sau din cea măsurată iniţial. Dacă abaterea de la concentraţia nominală sau cea măsurată iniţial este mai mare de ± 20 %, este necesar ca rezultatele să se exprime în funcţie de media ponderată în timp (a se vedea apendicele 5).
      2.   DATE ȘI RAPORT
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Scopul prezentului test îl constituie determinarea efectului substanţei testate asupra numărului total de progenituri vii produse per animal părinte în viaţă la sfârşitul testului. Numărul total de progenituri per animal părinte se calculează pentru fiecare vas experimental (adică proba repetată). Dacă, în fiecare probă repetată, animalul părinte moare în timpul testului sau se dovedeşte a fi mascul, atunci proba repetată se exclude din analiză. Analiza se va face atunci pentru un număr redus de probe identice.
      Pentru estimarea CMEO şi, prin urmare, a CFEO, pentru efectele substanţei chimice asupra capacităţii de reproducere, este necesar să se calculeze capacitatea medie de reproducere pentru toate probele identice pentru fiecare concentraţie şi deviaţie standard remanentă comună şi acest lucru se poate realiza prin analiza de varianţă (ANOVA). Apoi, media pentru fiecare concentraţie se compară cu media probelor martor, utilizând o metodă potrivită de comparare multiplă. Ar putea să fie utile testele Dunnett sau Williams (14) (15) (16) (17). Este necesar să se verifice dacă estimarea ANOVA de varianţă uniformă este valabilă. Se recomandă ca acest lucru să se facă mai degrabă grafic decât printr-un test de importanţă oficială (18); o variantă potrivită este efectuarea unui test Barlett. Dacă această estimare (ANOVA) nu este valabilă, atunci ar trebui să se aibă în vedere transformarea datelor pentru a omogeniza varianţele înaintea efectuării ANOVA sau efectuarea unei ANOVA ponderate. Se calculează şi se prezintă dimensiunea efectului detectabil prin utilizarea ANOVA (adică diferenţa cea mai puţin importantă).
      Pentru estimarea concentraţiei care ar putea să genereze o reducere de 50 % a capacităţii de reproducere (adică CE50), trebuie să se realizeze o reprezentare grafică corespunzătoare a datelor, de exemplu printr-o curbă logaritmică, utilizând o metodă statistică cum ar fi metoda celor mai mici pătrate. Curba ar putea să fie bine caracterizată în funcţie de parametri, astfel încât să se poată determina direct CE50 şi eroarea sa standard. Aceasta ar uşura mult calcularea limitelor de încredere pentru CE50. Cu excepţia cazului în care există motive întemeiate să se prefere limite de încredere diferite, se fixează limite de încredere de 95 % de ambele părţi. Este preferabil ca procedeul de trasare a curbei să ofere un mijloc pentru evaluarea semnificaţiei ajustării incomplete. Acest lucru se poate realiza grafic sau prin împărţirea sumei remanente de pătrate în „ajustare incompletă” şi „componente de eroare pură” şi prin efectuarea unui test de importanţă pentru ajustarea incompletă. Deoarece există posibilitatea ca tratamentele care dau o fecunditate mare să aibă o varianţă mai mare a numărului de animale tinere produse decât tratamentele care dau o fecunditate mică, trebuie să se aibă în vedere ponderarea valorilor observate pentru a reflecta varianţele diferite din grupele tratate diferit [a se vedea referinţa bibliografică (18) pentru date de bază].
      Din analiza datelor din testul final de intercalibrare (2), s-a trasat o curbă logaritmică cu ajutorul modelului prezentat în continuare, deşi se pot utiliza şi alte modele:
      
         
      unde:
      
                  Y
               
               
                  =
               
               
                  numărul total de animale tinere per animal părinte în viaţă la sfârşitul testului (calculat pentru fiecare vas)
               
            
                  x
               
               
                  =
               
               
                  concentraţia substanţei
               
            
                  c
               
               
                  =
               
               
                  numărul preconizat de animale tinere atunci când x = 0
               
            
                  x0
                  
               
               
                  =
               
               
                  CE50 în populaţie
               
            
                  b
               
               
                  =
               
               
                  panta curbei
               
            Se pare că acest model este adecvat unui număr mare de situaţii, dar există teste pentru care nu este potrivit. Este necesară verificarea validităţii modelului recomandat anterior. În unele cazuri, se poate să fie potrivit modelul hormetic, în care concentraţiile mici generează efecte sporite (19).
      Se mai pot estima şi alte concentraţii de efect, de exemplu CE10 sau CE20, deşi ar fi preferabil să se utilizeze o caracterizare în funcţie de parametri a modelului diferită de cea utilizată la determinarea CE50.
      2.2.   RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să includă următoarele:
      2.2.1.   Substanţa testată:
      
                  —
               
               
                  natura fizică şi proprietăţile fizico-chimice relevante;
               
            
                  —
               
               
                  date de identificare chimică, inclusiv puritatea.
               
            2.2.2.   Speciile experimentale:
      
                  —
               
               
                  clonul (dacă a fost caracterizat genetic, astfel încât să corespundă speciei), furnizorul sau sursa (dacă se cunoaşte) şi condiţiile de cultură utilizate. Dacă se utilizează o specie diferită de Daphnia magna, acest lucru se consemnează şi se justifică.
               
            2.2.3.   Condiţiile de testare:
      
                  —
               
               
                  modul de lucru utilizat (de exemplu semistatic sau în flux continuu, volumul, încărcarea în număr de dafnia pe litru);
               
            
                  —
               
               
                  timpul de expunere la lumină şi intensitatea luminii;
               
            
                  —
               
               
                  protocolul testului (de exemplu numărul de probe identice, numărul de părinţi pentru fiecare probă repetată);
               
            
                  —
               
               
                  detalii privind mediul de cultură utilizat;
               
            
                  —
               
               
                  adaosurile de material organic, dacă se practică, inclusiv compoziţia, sursa, metoda de preparare, raportul COT/CCO al amestecurilor preparate, determinarea raportului COT/CCO rezultat în mediul experimental;
               
            
                  —
               
               
                  date detaliate privind hrana, inclusiv cantitatea (în mg C/dafnia/zi) şi programul (de exemplu tipul hranei, care include pentru alge denumirea specifică (specia) şi, dacă se cunoaşte, familia, condiţiile de cultură);
               
            
                  —
               
               
                  metoda de preparare a soluţiilor mamă şi frecvenţa reînnoirii (dacă se utilizează un solvent sau agent de dispersie, concentraţia acestora).
               
            2.2.4.   Rezultatele:
      
                  —
               
               
                  rezultatele oricăror studii preliminare privind stabilitatea substanţei testate;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţiile nominale experimentate şi rezultatele tuturor analizelor pentru determinarea concentraţiei substanţei testate în vasele experimentale (a se vedea fişele tehnice din apendicele 4); de asemenea, se prezintă eficienţa de regenerare a metodei şi limita determinării;
               
            
                  —
               
               
                  calitatea apei din vasele experimentale (adică pH, temperatura şi concentraţia oxigenului dizolvat, COT şi CCO şi duritatea, dacă este cazul (a se vedea exemplul de fişă tehnică din apendicele 3);
               
            
                  —
               
               
                  fişa completă cu progeniturile vii pentru fiecare animal părinte (a se vedea exemplul de fişă tehnică din apendicele 3);
               
            
                  —
               
               
                  numărul de decese printre animalele părinţi şi ziua în care au avut loc (a se vedea exemplul de fişă tehnică din apendicele 3);
               
            
                  —
               
               
                  coeficientul de variaţie pentru fecunditatea martorului (pe baza numărului total de progenituri vii per animal părinte în viaţă la sfârşitul testului);
               
            
                  —
               
               
                  reprezentarea grafică a numărului total de progenituri vii per animal părinte (pentru fiecare probă identică) în viaţă la sfârşitul testului în funcţie de concentraţia substanţei testate;
               
            
                  —
               
               
                  concentraţia la care se observă cele mai mici efecte (CMEO) pentru reproducere, care include o descriere a metodelor statistice utilizate şi indicarea dimensiunii efectului care ar putea să fie detectat şi concentraţia la care nu se observă niciun efect (CFEO) pentru reproducere; dacă este cazul, se consemnează şi raportul CMEO/CFEO pentru mortalitatea animalelor părinţi;
               
            
                  —
               
               
                  dacă este cazul, CEx pentru reproducere cu intervalele de încredere şi reprezentarea grafică a modelului utilizat pentru calculul acesteia, panta curbei doză-răspuns şi erorile standard ale acesteia;
               
            
                  —
               
               
                  alte efecte biologice observate sau măsurători: se consemnează orice alte efecte biologice care au fost observate sau măsurate (de exemplu, creşterea animalelor părinţi), inclusiv o justificare corespunzătoare;
               
            
                  —
               
               
                  explicarea oricărei abateri de la modul de lucru.
               
            3.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20-21 March 1993.
               
            
                  2.
               
               
                  OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No.6. Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.
               
            
                  3.
               
               
                  Baird D. J., Barber J., Bradley M. C., Soares A. M. V. M. and Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, p. 257-265.
               
            
                  4.
               
               
                  Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, p. 25-33.
               
            
                  5.
               
               
                  EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
               
            
                  6.
               
               
                  Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, p. 775-782.
               
            
                  7.
               
               
                  ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. p. 20.
               
            
                  8.
               
               
                  Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Løkke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.) p. 144-148.
               
            
                  9.
               
               
                  Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, p. 1-8.
               
            
                  10.
               
               
                  Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), p. 185-196.
               
            
                  11.
               
               
                  Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, p. 209.
               
            
                  12.
               
               
                  Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, p. 2053-2058.
               
            
                  13.
               
               
                  Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, p. 459-466.
               
            
                  14.
               
               
                  Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, p. 1096-1121.
               
            
                  15.
               
               
                  Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, p. 482-491.
               
            
                  16.
               
               
                  Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, p. 103-117.
               
            
                  17.
               
               
                  Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, p. 510-531.
               
            
                  18.
               
               
                  Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.
               
            
                  19.
               
               
                  Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, p. 93-96.
               
            
                  20.
               
               
                  Wilson E. O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
               
            
                  21.
               
               
                  Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, p. 532.
               
            
                  22.
               
               
                  Meyer J. S., Ingersoll C.G., McDonald L. L. and Boyce M. S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, p. 1156-1166.
               
            
         Apendicele 1
         PREPARAREA MEDIILOR ELENDT M7 ŞI M4 COMPLET DETERMINATE
         Adaptarea la mediile Elendt M7 şi M4
         Unele laboratoare au întâmpinat dificultăţi la transferul direct al dafniei în mediile M4 (1) şi M7. Cu toate acestea, s-au obţinut unele succese în adaptarea treptată, adică transferul din mediul propriu în 30 % Elendt, apoi 60 % Elendt şi apoi în 100 % Elendt. Perioadele de adaptare pot să fie de o lună.
         PREPARAREA
         Microelementele
         Se prepară mai întâi soluţii mamă separate (I) ale fiecărui microelement în apă de puritate corespunzătoare, de exemplu deionizată, distilată sau purificată prin osmoză inversă. Din soluţiile mamă menţionate (I), se prepară o soluţie mamă unică (II), care conţine toate microelementele (soluţie combinată), adică:
         
                     Soluţiile mamă I
                     (o singură substanţă)
                  
                  
                     Cantitatea adăugată în apă
                     (mg/l)
                  
                  
                     Concentraţia (în funcţie de mediul M4)
                     (multiplu)
                  
                  
                     Pentru prepararea soluţiei mamă combinate II, se adaugă următoarea cantitate de soluţie mamă I în apă
                     (ml/l)
                  
               
                     M4
                  
                  
                     M7
                  
               
                     H3BO3
                     
                  
                  
                     57 190
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     MnCl2 · 4 H2O
                  
                  
                     7 210
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     LiCl
                  
                  
                     6 120
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     RbCl
                  
                  
                     1 420
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     SrCl2 · 6 H2O
                  
                  
                     3 040
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     NaBr
                  
                  
                     320
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     Na2MoO4 · 2 H2O
                  
                  
                     1 260
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     CuCl2 · 2 H2O
                  
                  
                     335
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     0,25
                  
               
                     ZnCl2
                     
                  
                  
                     260
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     CoCl2 · 6 H2O
                  
                  
                     200
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     KI
                  
                  
                     65
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2SeO3
                     
                  
                  
                     43,8
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     NH4VO3
                     
                  
                  
                     11,5
                  
                  
                     20 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2 EDTA· 2 H2O
                  
                  
                     5 000
                  
                  
                     2 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Fe SO4 · 7 H2O
                  
                  
                     1 991
                  
                  
                     2 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Atât soluţiile de Na2EDTA cât şi de FeSO4 se prepară separat, se toarnă împreună şi se autoclavizează imediat. Rezultă:
                  
               
                     soluţia 21 Fe-EDTA
                  
                  
                      
                  
                  
                     1 000
                  
                  
                     20,0
                  
                  
                     5,0
                  
               Mediile M4 şi M7
         Mediile M4 şi M7 se prepară din soluţia mamă II, macroelemente nutritive şi vitamine, după cum urmează:
         
                      
                  
                  
                     Cantitatea adăugată în apă
                     (mg/l)
                  
                  
                     Concentraţia (în funcţie de mediul M4)
                     (multiplu)
                  
                  
                     Cantitatea de soluţie mamă adăugată pentru prepararea mediului
                     (ml/l)
                  
               
                     M4
                  
                  
                     M7
                  
               
                     Microelementele combinate în soluţia mamă II
                  
                  
                      
                  
                  
                     20
                  
                  
                     50
                  
                  
                     50
                  
               
                     Soluţiile mamă cu macroelemente nutritive (o singură substanţă)
                  
               
                     CaCl2 · 2 H2O
                  
                  
                     293 800
                  
                  
                     1 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     MgSO4 · 7 H2O
                  
                  
                     246 600
                  
                  
                     2 000
                  
                  
                     0,5
                  
                  
                     0,5
                  
               
                     KCl
                  
                  
                     58 000
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     NaHCO3
                     
                  
                  
                     64 800
                  
                  
                     1 000
                  
                  
                     1,0
                  
                  
                     1,0
                  
               
                     Na2SiO3 · 9 H2O
                  
                  
                     50 000
                  
                  
                     5 000
                  
                  
                     0,2
                  
                  
                     0,2
                  
               
                     NaNO3
                     
                  
                  
                     2 740
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     KH2PO4
                     
                  
                  
                     1 430
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     K2HPO4
                     
                  
                  
                     1 840
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     Soluţie combinată de vitamine
                  
                  
                     —
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     0,1
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     Soluţia mamă combinată de vitamine se prepară prin adăugarea celor 3 vitamine la 1 litru de apă conform indicaţiilor prezentate în continuare.
                  
               
                     Clorhidrat de tiamină
                  
                  
                     750
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Cianocobalamină (B12)
                  
                  
                     10
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Biotină
                  
                  
                     7,5
                  
                  
                     10 000
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     Soluţia combinată de vitamine se păstrează îngheţată în mici alicoţi. Vitaminele se adaugă în medii cu puţin timp înaintea utilizării.
                     
                                 Note:
                              
                              
                                 Pentru a evita precipitarea sărurilor în timpul preparării mediilor complete, se adaugă alicoţi de soluţii mamă în aproximativ 500-800 ml apă deionizată şi apoi se aduce la un litru.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Prima semnalare a mediului M4 se poate găsi în Elendt, B.P. (1990), Selenium deficiency in crustacea; an ultraastructural appropach to antennal demage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, p. 25-33.
                              
                           
               
      
         Apendicele 2
         ANALIZA CONŢINUTULUI DE CARBON ORGANIC TOTAL (COT) ŞI REALIZAREA UNEI NOMOGRAME PENTRU CONŢINUTUL COT DIN HRANA PE BAZĂ DE ALGE
         Se acceptă ca măsurarea conţinutului de carbon din hrana pe bază de alge să nu se măsoare în mod normal direct, ci din corelările (adică nomogramele) cu măsurile înlocuitoare, de exemplu numărul celulelor de alge sau absorbanţa luminii).
         Este necesar ca măsurarea COT să se efectueze mai degrabă prin oxidare la temperatură mare decât prin metodele UV sau cu persulfat. (A se vedea The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
         Pentru obţinerea nomogramelor, algele se separă din mediul de cultură prin centrifugare urmată de resuspensie în apă distilată. Se determină parametrul înlocuitor şi concentraţia COT în fiecare probă de trei ori. Se analizează probele oarbe în apă distilată şi concentraţia COT se scade din concentraţia COT din proba de alge.
         Nomogramele trebuie să fie liniare în domeniul necesar de concentraţii ale carbonului. Exemplele sunt prezentate în continuare.
         
            NB: Nomogramele nu se utilizează pentru conversiune; este esenţial ca laboratoarele să-şi elaboreze propriile nomograme.
         
            
         
            
         
            
      
      
         Apendicele 3
         EXEMPLU DE FIŞĂ TEHNICĂ PENTRU ÎNREGISTRAREA REÎNNOIRII MEDIULUI, DATELE CONTROLULUI FIZIC/CHIMIC, ADMINISTRAREA HRANEI, REPRODUCEREA DAFNIEI ŞI MORTALITATEA ADULŢILOR
         
                     Nr. experiment:
                  
                  
                     Început la data:
                  
                  
                     Conul:
                  
                  
                     Mediul:
                  
                  
                     Tipul hranei:
                  
                  
                     Substanţa testată:
                  
                  
                     Conc. nominală:
                  
               
                     Ziua
                  
                  
                     0
                  
                  
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     3
                  
                  
                     4
                  
                  
                     5
                  
                  
                     6
                  
                  
                     7
                  
                  
                     8
                  
                  
                     9
                  
                  
                     10
                  
                  
                     11
                  
                  
                     12
                  
                  
                     13
                  
                  
                     14
                  
                  
                     15
                  
                  
                     16
                  
                  
                     17
                  
                  
                     18
                  
                  
                     19
                  
                  
                     20
                  
                  
                     21
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Reînnoirea mediului (se bifează)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     PH (37)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     nou
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     vechi
                  
                  
                      
                  
               
                     O2 (mg/l)
                         (37)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     nou
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     vechi
                  
                  
                      
                  
               
                     Temperatura (oC) (37)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     nou
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     vechi
                  
                  
                      
                  
               
                     Hrana administrată (se bifează)
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Nr. progenituri vii (se bifează) (38)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Total
                  
               
                     Vasul 1
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     2
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     3
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     4
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     5
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     6
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     7
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     8
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     9
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     10
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Total
                  
                  
                      
                  
               
                     Mortalitatea cumulativă a adulţilor (39)
                     
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
      
         Apendicele 4
         EXEMPLU DE FIŞĂ TEHNICĂ PENTRU ÎNREGISTRAREA REZULTATELOR ANALIZEI CHIMICE
         (a)   Concentraţiile măsurate
         
                     Conc. nominală
                  
                  
                     Proba din săptămâna 1
                  
                  
                     Proba din săptămâna 2
                  
                  
                     Proba din săptămâna 3
                  
               
                     Proaspătă
                  
                  
                     Veche
                  
                  
                     Proaspătă
                  
                  
                     Veche
                  
                  
                     Proaspătă
                  
                  
                     Veche
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               (b)   Concentraţiile măsurate sub formă de procente din cea nominală
         
                     Conc. nominală
                  
                  
                     Proba din săptămâna 1
                  
                  
                     Proba din săptămâna 2
                  
                  
                     Proba din săptămâna 3
                  
               
                     Proaspătă
                  
                  
                     Veche
                  
                  
                     Proaspătă
                  
                  
                     Veche
                  
                  
                     Proaspătă
                  
                  
                     Veche
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
      
         Apendicele 5
         CALCULAREA MEDIEI PONDERATE DE TIMP
         Media ponderată de timp
         Deoarece concentraţia substanţei testate poate să scadă în intervalul de timp dintre reînnoiri, este necesar să se aibă în vedere necesitatea alegerii unei concentraţii reprezentative pentru domeniul de concentraţii experimentate cu dafnia părinţi. Alegerea se face pe principii atât biologice, cât şi statistice. De exemplu, dacă se consideră că reproducerea este afectată cel mai mult de concentraţia de vârf experimentată, atunci trebuie să se utilizeze concentraţia maximă. Cu toate acestea, dacă se consideră că efectul acumulat sau pe termen lung al substanţei toxice este mai important, atunci o concentraţie medie este mai relevantă. În cazul respectiv, o medie potrivită pentru utilizare este concentraţia medie ponderată de timp, deoarece ţine seama de variaţia concentraţiei instantanee în timp.
         Figura 1
         Exemplu de medie ponderată de timp
         
            
         Figura 1 prezintă un exemplu de test (simplificat) cu durata de şapte zile cu reînnoirea mediului în zilele 0, 2 şi 4.
         
                     —
                  
                  
                     Linia subţire în zig-zag reprezintă concentraţia în orice punct în timp. Se consideră că scăderea concentraţiei este urmarea unui proces de descompunere exponenţială.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Cele şase puncte reprezentate grafic arată concentraţiile observate, măsurate la începutul şi la sfârşitul fiecărei perioade de reînnoire.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Linia continuă groasă indică poziţia mediei ponderate de timp.
                  
               Media ponderată de timp se calculează, astfel încât aria de sub media ponderată de timp să fie egală cu aria de sub curba concentraţiilor. Calculul pentru exemplul anterior se prezintă în tabelul 1.
         Tabelul 1
         Calculul mediei ponderate de timp
         
                     Reînnoirea nr.
                  
                  
                     Zile
                  
                  
                     Conc0
                  
                  
                     Conc1
                  
                  
                     Ln(Conc0)
                  
                  
                     Ln(Conc1)
                  
                  
                     Aria
                  
               
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     10,000
                  
                  
                     4,493
                  
                  
                     2,303
                  
                  
                     1,503
                  
                  
                     13,767
                  
               
                     2
                  
                  
                     2
                  
                  
                     11,000
                  
                  
                     6,037
                  
                  
                     2,398
                  
                  
                     1,798
                  
                  
                     16,544
                  
               
                     3
                  
                  
                     3
                  
                  
                     10,000
                  
                  
                     4,066
                  
                  
                     2,303
                  
                  
                     1,403
                  
                  
                     19,781
                  
               
                     Total zile: 7
                  
                  
                     Aria totală
                  
                  
                     50,091
                  
               
                     Media PT
                  
                  
                     7,156
                  
               
                     „Zile” este numărul de zile din perioada de reînnoire.
                     „Conc0” este concentraţia măsurată la începutul fiecărei perioade de reînnoire.
                     „Conc1” este concentraţia măsurată la sfârşitul fiecărei perioade de reînnoire.
                     „Ln(Conc0)” este logaritmul natural al Conc0.
                     „Ln(Conc1)” este logaritmul natural al Conc1.
                     „Aria” este aria de sub curba exponenţială pentru fiecare perioadă de reînnoire. Se calculează cu:.
                     
                        
                  
               Media ponderată de timp („media PT”) este „Aria totală” împărţită la „Total zile”.
         Desigur, pentru testul de reproducere a dafniei, tabelul trebuie mărit până la 21 de zile.
         Este clar că atunci când observaţiile se fac numai la începutul şi sfârşitul fiecărei perioade de reînnoire, nu se poate confirma că procesul de descompunere este, de fapt, exponenţial. O curbă diferită ar genera un calcul diferit pentru „Arie”. Cu toate acestea, un proces de descompunere exponenţială nu este neverosimil şi este probabil cea mai bună curbă de utilizat în absenţa altor date.
         Cu toate acestea, este necesar să se procedeze cu prudenţă, dacă la analiza chimică nu se reuşeşte să se găsească nicio substanţă la sfârşitul perioadei I de reînnoire. Cu excepţia cazului în care este posibil să se estimeze rapiditatea dispariţiei substanţei din soluţie, este imposibil să se obţină o arie realistă sub curbă şi, prin urmare, este imposibil să se obţină o medie ponderată de timp rezonabilă.
      
      C.21.   MICROORGANISMELE DIN SOL: TESTUL DE TRANSFORMARE A AZOTULUI
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare reia Orientarea 216 (2000) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Această metodă de testare constă dintr-o metodă de laborator elaborată pentru studierea efectelor pe termen lung ale substanţelor chimice, după o singură expunere, asupra activităţii de transformare a azotului de către microorganismele din sol. Testul se bazează în principal pe recomandările emise de Organizaţia Europeană şi Mediteraneană pentru Protecţia Plantelor (1). Cu toate acestea, au fost avute în vedere şi alte linii directoare, inclusiv cele emise de Biologische Bundesanstalt din Germania (2), de Agenţia pentru protecţia mediului a Statelor Unite (3) din cadrul SETAC (4) şi de Organizaţia Internaţională de Standardizare (ISO) (5). Numărul şi tipul solurilor utilizate în cadrul acestui test au fost definite cu ocazia unui atelier de lucru al OCDE privind selectarea solului/sedimentelor care a avut loc la Belgirate, Italia, în 1995 (6). Recomandările privind prelevarea, manipularea şi depozitarea probelor de sol au la bază liniile directoare ISO (7) şi recomandările atelierului de la Belgirate. Pentru determinarea şi evaluarea caracteristicilor toxice ale substanţelor de testat este posibil să fie necesară determinarea efectelor acestora asupra activităţii microbiene din sol, de exemplu dacă sunt necesare date privind potenţialele efecte secundare ale produselor fitosanitare asupra microflorei din sol sau în cazul riscurilor de expunere a microorganismelor din sol la alte substanţe chimice decât cele din produsele fitosanitare. Testul de transformare a azotului se efectuează pentru a determina efectele acestor substanţe chimice asupra microflorei din sol. Dacă se testează produse agrochimice (de exemplu produse fitosanitare, îngrăşăminte, produse chimice de uz silvic) se efectuează atât testul de transformare a azotului cât şi testul de transformare a carbonului. Dacă se testează alte produse decât cele agrochimice este suficient testul de transformare a azotului. Cu toate acestea, dacă valorile CE50 obţinute în cadrul testului de transformare a azotului pentru substanţele în cauză se încadrează în intervalul de valori caracteristice inhibitorilor de nitrificare disponibili comercial (de exemplu nitrapirin), se poate efectua şi un test de transformare a carbonului în vederea obţinerii de informaţii suplimentare.
      Solurile sunt formate din componente şi vii şi din componente non-vii care formează amestecuri complexe şi eterogene. Microorganismele joacă un rol important în descompunerea şi transformarea materiei organice în sol fertil, multe specii aducându-şi contribuţia la diferitele aspecte ale fertilizării solurilor. Orice interferenţă pe termen lung în aceste procese biochimice riscă să perturbe ciclul elementelor nutritive şi, în consecinţă, să altereze fertilitatea solului. Deşi coloniile microbiene care determină aceste procese diferă de la un sol la altul, căile de transformare sunt în mare aceleaşi.
      Prezenta metodă de testare descrisă a fost elaborată în vederea detectării efectelor adverse pe termen lung ale unei substanţe asupra procesului de transformare a azotului asupra solurilor aerobe de suprafaţă. Metoda de test permite şi estimarea efectelor substanţelor asupra transformării carbonului de către microflora din sol. Nitratul se formează ca urmare a degradării legăturilor carbon-azot. De aceea, dacă ratele de producere a azotatului pentru solurile tratate şi pentru solurile martor sunt identice, este foarte probabil ca principalele căi de degradare a carbonului să fie intacte şi funcţionale. Raportul carbon-azot din substratul ales pentru test (praf de făină de lucernă) este adecvat (în general între 12/1 şi 16/1). Astfel, carenţele de carbon sunt reduse pe parcursul testului, iar în cazul în care comunităţile microbiene sunt afectate de o substanţă chimică, ele se pot reface în termen de 100 de zile.
      Testele pe baza cărora a fost elaborată această metodă de testare au fost concepute în primul rând pentru cazurile în care cantitatea de substanţă care pătrunde în sol poate fi estimată. Este, de exemplu, cazul produselor fitosanitare a căror doză de aplicare pe sol este cunoscută. Pentru produsele agrochimice este suficient un test cu două doze reprezentative pentru aplicarea pe sol anticipată sau estimată. Produsele agrochimice pot fi testate ca principii active (p.a.) sau ca produse preparate. Cu toate acestea, testul nu se limitează la produse agrochimice. Modificând atât cantitatea de substanţă de testat aplicată pe sol, cât şi modul de evaluare a datelor, testul poate fi utilizat şi pentru cazurile în care nu se cunoaşte cantitatea de substanţă care pătrunde în sol. Astfel, în cazul altor substanţe chimice decât cele din produsele agrochimice, se determină efectele unei serii de concentraţii asupra transformării azotului. Datele obţinute în cadrul acestor teste se folosesc pentru trasarea curbei doză-efect şi pentru calcularea valorilor CEx unde x se defineşte ca fiind efectul procentual.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Transformare a azotului: degradarea finală a materiei organice care conţine azot de către microorganisme prin procesele de amonificare şi de nitrificare până la produsul final, nitratul anorganic.
      
         CE
         
            x
         
         (Concentraţia efectivă): este concentraţia substanţei de testat în sol care inhibă cu x la sută transformarea azotului în nitrat.
      
         CE
         
            50
         
         (Concentraţia mediană efectivă): este concentraţia substanţei de testat în sol care inhibă cu 50 la sută (50 %) transformarea azotului în nitrat.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Se adaugă praf de făină vegetală în solul cernut, iar apoi fie se tratează cu substanţa de testat, fie se lasă netratat (martor). Dacă testul vizează produse agrochimice, se recomandă utilizarea a cel puţin două concentraţii, care trebuie alese în funcţie de concentraţia maximă previzibilă de pe teren. După 0, 7, 14 zile şi după 28 de zile de incubare, probele de sol tratate şi probele martor sunt supuse extracţiei cu un solvent adecvat şi se determină cantităţile de nitrat din extrase. Rata de formare a nitratului pentru probele tratate se compară cu cea a probelor martor şi se calculează deviaţia procentuală dintre probele tratate şi probele martor. Toate testele durează cel puţin 28 de zile. Dacă în a 28-a zi diferenţele dintre solurile tratate şi cele netratate sunt mai mari sau egale cu 25 %, se continuă măsurătorile timp de cel mult 100 de zile. Dacă se testează alte produse decât cele agrochimice, în probele de sol se adaugă o serie de concentraţii ale substanţei de testat şi se măsoară cantităţile de nitrat formate după 28 de zile de incubare. Rezultatele testelor cu mai multe concentraţii se analizează cu ajutorul unui model bazat pe regresie şi se calculează valorile CEx (de exemplu CE50, CE25 şi/sau CE10). A se vedea definiţiile.
      1.5.   VALABILITATEA TESTULUI
      Evaluarea rezultatelor testelor efectuate asupra produselor agrochimice se bazează pe diferenţe relativ mici (adică valori medii de ± 25 %) dintre concentraţiile de nitrat din probele martor şi din probele de sol tratate, fapt care poate determina obţinerea unor rezultate false dacă există variaţii mari între probele martor. De aceea variaţiile dintre probele martor trebuie să fie mai mici de ± 15 %.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Aparatură
      Se folosesc recipiente de testare confecţionate din materiale inerte din punct de vedere chimic. Aceste recipiente trebuie să aibă o capacitate adecvată procedurii de incubare a solului utilizate, de exemplu incubare în vrac sau sub forma unei serii de probe individuale (a se vedea punctul 1.7.1.2). Pierderile de apă trebuie reduse la minimum şi trebuie să se poată realiza schimbul de gaze (de exemplu, recipientele de testare se pot acoperi cu folie perforată de polietilenă). Dacă se testează substanţe volatile, se folosesc recipiente ermetice şi etanşe la gaz. Dimensiunea recipientelor se alege astfel încât numai un sfert din volumul acestora să fie ocupat de proba de sol.
      Se foloseşte echipament standard de laborator, inclusiv următoarele articole:
      
                  —
               
               
                  agitator: dispozitiv mecanic de amestecare sau echipament echivalent;
               
            
                  —
               
               
                  centrifugă (3 000 g) sau dispozitiv de filtrare (cu hârtie de filtru fără nitraţi);
               
            
                  —
               
               
                  instrument pentru analiza nitraţilor cu sensibilitate şi reproductibilitate adecvată.
               
            1.6.2.   Selectarea solurilor şi numărul acestora
      Se foloseşte un singur sol. Caracteristicile recomandate ale acestuia sunt următoarele:
      
                  —
               
               
                  conţinut de nisip: cel puţin 50 % dar nu mai mult de 75 %;
               
            
                  —
               
               
                  pH: 5,5-7,5;
               
            
                  —
               
               
                  conţinut de carbon organic: 0,5-1,5 %;
               
            
                  —
               
               
                  se măsoară biomasa microbiană (8) (9), al cărei conţinut de carbon trebuie să reprezinte cel puţin 1 % din carbonul organic total din sol.
               
            În majoritatea cazurilor, un sol cu caracteristicile descrise anterior reprezintă cele mai nefavorabile condiţii posibil, deoarece adsorbţia substanţei de testat este minimă, iar expunerea acesteia la microfloră este maximă. De aceea în general nu este necesar să se efectueze teste pe alte soluri. Cu toate acestea, în anumite situaţii, dacă principala utilizare preconizată a substanţei de testat vizează în special soluri forestiere acide, sau în cazul substanţelor chimice cu sarcină electrostatică, poate fi necesară utilizarea unui sol suplimentar.
      1.6.3.   Prelevarea şi depozitarea probelor de sol
      1.6.3.1.   Prelevare
      Se furnizează informaţii detaliate privind istoricul locului din care se prelevează solul testat. Aceste informaţii includ localizarea exactă, acoperirea vegetală, date privind tratamentele cu produse fitosanitare, cu îngrăşăminte organice şi anorganice, adaosurile de material biologic sau contaminările accidentale. Locul ales pentru prelevarea solului trebuie să poată fi utilizat pe termen lung. Păşunile permanente, câmpurile plantate cu cereale anuale (cu excepţia porumbului) sau semănături dese cu îngrăşăminte vegetale sunt adecvate în acest sens. Locul de prelevare selectat trebuie să nu fi fost tratat cu produse fitosanitare timp de cel puţin un an înainte de prelevarea probelor. De asemenea, trebuie să nu fi fost aplicat niciun îngrăşământ organic cel puţin pe parcursul ultimelor şase luni. Utilizarea îngrăşămintelor minerale este acceptabilă numai dacă respectă cerinţele de cultivare şi dacă nu se prelevează probe de sol mai repede de trei luni de la aplicarea îngrăşământului. Trebuie evitată utilizarea unor soluri tratate cu îngrăşăminte cu efecte biocide cunoscute (de exemplu, cianamidă de calciu).
      Se va evita prelevarea de probe în timpul sau imediat după perioadele lungi (de peste 30 de zile) de secetă sau de saturare cu apă. În cazul solurilor arate, probele se recoltează de la o adâncime situată între 0 şi 20 cm. În cazul păşunilor sau al altor soluri care nu sunt arate pe parcursul unor perioade lungi (cel puţin pe parcursul unei perioade de creştere), adâncimea maximă de prelevare poate fi puţin mai mare de 20 cm (de exemplu, 25 cm).
      Probele de sol se transportă în recipiente şi în condiţii de temperatură de natură să garanteze că proprietăţile iniţiale ale solului nu se modifică în mod semnificativ.
      1.6.3.2.   Depozitare
      Este preferabil ca solurile utilizate să fie proaspăt prelevate de pe teren. Dacă nu se poate evita depozitarea în laborator, solurile se depozitează la întuneric, la temperaturi de 4 ± 2 oC timp de maximum trei luni. Pe parcursul depozitării solurilor trebuie asigurate condiţii aerobe. Dacă solurile sunt prelevate dintr-o zonă în care sunt afectate de îngheţ timp de cel puţin trei luni pe an, se poate avea în vedere depozitarea acestora timp de şase luni la temperaturi între minus 18 oC şi minus 22 oC. Biomasa microbiană a solurilor depozitate se măsoară înaintea fiecărui experiment, iar conţinutul de carbon din biomasă trebuie să fie de cel puţin 1 % din conţinutul total de carbon organic al solului (a se vedea punctul 1.6.2).
      1.6.4.   Manipularea şi pregătirea solului pentru test
      1.6.4.1.   Preincubarea
      Dacă solul a fost depozitat (a se vedea punctul 1.6.3.2), se recomandă preincubarea timp de 2 până la 28 de zile. Temperatura şi conţinutul de umiditate al solului din perioada de pre-incubare trebuie să fie similare cu cele din cadrul testului (a se vedea punctele 1.6.4.2 şi 1.7.1.3).
      1.6.4.2.   Proprietăţi fizice şi chimice
      Se curăţă manual solul de obiectele mari (de exemplu pietre, resturi vegetale etc.) apoi se cerne umed fără uscare excesivă pentru a se obţine particule cu o dimensiune mai mică sau egală cu 2 mm. Conţinutul de apă al probei de sol se ajustează cu apă distilată sau deionizată până la o valoare cuprinsă între 40 % şi 60 % din capacitatea maximă de reţinere a apei.
      1.6.4.3.   Adiţionarea cu substrat organic
      Solul se adiţionează cu un substrat organic adecvat, de exemplu praf de făină de lucernă verde (component principal: Medicago sativa) cu un raport C/N între 12/1 şi 16/1. Raportul lucernă-sol recomandat este de 5 g lucernă pe kilogram de sol (greutate uscată).
      1.6.5.   Pregătirea substanţei de testat pentru aplicarea pe sol
      Substanţa de testat se aplică de obicei cu ajutorul unui excipient. Excipientul poate fi reprezentat de apă (în cazul substanţelor solubile în apă) sau de o substanţă solidă inertă cum este nisipul cuarţos fin (dimensiunea particulelor: 0,1-0,5 mm). Se vor evita excipienţii lichizi alţii decât apa (de exemplu solvenţii organici cum sunt acetona şi cloroformul) deoarece pot afecta microflora. Dacă se foloseşte nisip ca excipient, acesta poate fi tratat cu substanţa de testat dizolvată sau în suspensie într-un solvent adecvat. În acest caz, solventul se elimină prin evaporare înainte de amestecarea excipientului în sol. Pentru distribuirea optimă a substanţei de testat în sol, se recomandă un raport de 10 g de nisip pe kilogram de sol (greutate uscată). Probele martor se tratează numai cu o cantitate echivalentă de apă şi/sau de nisip cuarţos.
      Pentru testarea substanţelor chimice volatile, se evită în cea mai mare măsură posibilă pierderile din perioada tratamentului şi se încearcă repartizarea omogenă în sol (de exemplu, substanţa de testat se injectează în sol în mai multe locuri).
      1.6.6.   Concentraţiile de testare
      Dacă se testează produse agrochimice se folosesc cel puţin două concentraţii. Concentraţia mai mică trebuie să fie cel puţin egală cu cantitatea maximă susceptibilă să ajungă în sol în condiţii reale, iar concentraţia maximă trebuie să fie un multiplu al concentraţiei mai mici. Concentraţiile substanţei de testat adăugate în sol se calculează presupunând că încorporarea se realizează uniform, la o adâncime de 5 cm, şi că densitatea aparentă a solului este de 1,5. Pentru produsele agrochimice aplicate direct pe sol, sau în cazurile în care cantitatea de substanţă chimică ce pătrunde în sol este previzibilă, concentraţiile de testare recomandate sunt concentraţia maximă anticipată în mediu (PEC) şi o concentraţie de cinci ori mai mare. Pentru substanţele care se aplică pe sol de mai multe ori în acelaşi sezon, se testează concentraţii calculate prin înmulţirea PEC cu numărul maxim de aplicări anticipate. Cu toate acestea, cea mai mare concentraţie testată nu trebuie să depăşească de mai mult de zece ori doza maximă aplicată o dată. Dacă se testează alte produse decât cele agrochimice, se foloseşte o serie geometrică de cel puţin cinci concentraţii. Concentraţiile testate trebuie să acopere intervalul necesar pentru determinarea valorilor CEx.
      1.7.   DESFĂŞURAREA TESTULUI
      1.7.1.   Condiţii de expunere
      1.7.1.1   Lotul tratat şi lotul martor
      Dacă se testează produse agrochimice, solul se împarte în trei părţi cu greutate egală. Două părţi se amestecă cu excipient conţinând produsul, iar cealaltă se amestecă cu excipient fără produs (martor). Se recomandă pregătirea a cel puţin trei duplicate, atât pentru solul tratat, cât şi pentru cel netratat. Dacă se testează alte produse decât cele agrochimice, solul se împarte în şase părţi cu greutate egală. Cinci probe se amestecă cu excipient conţinând produsul, iar a şasea se amestecă cu excipient fără substanţă. Se recomandă pregătirea a trei duplicate atât pentru probele tratate, cât şi pentru probele martor. Se va acorda atenţie repartizării omogene a substanţei de testat în probele de sol tratate. În timpul amestecării se va evita comprimarea sau compactarea solului.
      1.7.1.2.   Incubarea probelor de sol
      Incubarea probelor de sol se poate realiza în două moduri: în vrac pentru probele de sol tratat şi netratat sau sub forma unor serii de subprobe individuale de dimensiuni identice de sol tratat şi netratat. Cu toate acestea, dacă se testează substanţe volatile, testul se efectuează numai pe o serie de subprobe individuale. Dacă solul se incubează în vrac, se prepară cantităţi mari de sol tratat şi netratat şi se prelevează subprobe după cum este necesar pe parcursul testului. Cantitatea pregătită iniţial atât pentru probele tratate, cât şi pentru probele martor depinde de dimensiunea subprobelor, de numărul de duplicate utilizate pentru analiză şi de numărul maxim de prelevări preconizat. Solurile incubate în vrac se amestecă bine înainte de prelevarea subprobelor. Dacă solurile se incubează sub forma unor serii de probe individuale, atât solul tratat cât şi solul martor se împart în numărul de subprobe necesare, care se folosesc după cum este necesar. Pentru experimentele pentru care se preconizează mai mult de două prelevări se pregăteşte o cantitate de subprobe suficientă pentru toate duplicatele şi pentru toate prelevările. Se incubează în mediu aerob cel puţin trei probe duplicat din solul testat (a se vedea punctul 1.7.1.1). În cadrul tuturor testelor se utilizează recipiente adecvate care asigură suficient spaţiu liber pentru a evita apariţia unor condiţii anaerobe. Dacă se testează substanţe volatile, testul se realizează pe o singură serie de subprobe individuale.
      1.7.1.3.   Condiţiile de testare şi durata testului
      Testul se realizează la întuneric şi la o temperatură a camerei de 20 ± 2 oC. Pe parcursul testului conţinutul de apă al probei de sol se menţine la o valoare cuprinsă între 40 % şi 60 % din capacitatea maximă de reţinere a apei a solului respectiv (a se vedea punctul 1.6.4.2), cu o marjă de ± 5 %. Se poate adăuga apă distilată, deionizată, după cum este necesar.
      Toate testele durează cel puţin 28 de zile. Dacă se testează produse agrochimice, se compară ratele de formare de nitraţi în probele tratate şi în probele martor. Dacă în a 28-a zi aceste diferenţe sunt mai mari de 25 %, testul se continuă până la obţinerea unei diferenţe de 25 % sau mai mică, sau timp de cel mult 100 de zile. Pentru alte produse decât cele agrochimice, testul este oprit după 28 de zile. În ziua 28 se măsoară cantităţile de nitrat formate în probele de sol tratate şi în probele de sol martor şi se calculează valorile CEx.
      1.7.2.   Prelevarea şi analiza solurilor
      1.7.2.1.   Programul de prelevare a probelor de sol
      Dacă se testează produse agrochimice, se analizează nitratul din probele de sol în zilele 0, 7, 14 şi 28. Dacă este necesară prelungirea testului, după ziua 28 se efectuează măsurători suplimentare la intervale de 14 zile.
      Dacă se testează alte produse decât cele agrochimice, se folosesc cel puţin cinci concentraţii şi se analizează probele de sol în vederea măsurării nitratului la începutul (ziua 0) şi la sfârşitul perioadei de expunere (28 de zile). Dacă se consideră necesar, se poate realiza o măsurătoare suplimentară, de exemplu în ziua 7. Datele obţinute în ziua 28 se folosesc pentru determinarea valorii CEx a substanţei chimice. Datele din ziua 0 privind probele martor pot fi utilizate pentru raportarea cantităţii iniţiale de nitrat din sol.
      1.7.2.2.   Analiza probelor de sol
      Cantitatea de nitrat formată în fiecare probă tratată şi martor duplicat se determină la fiecare prelevare. Nitratul se extrage din sol prin agitarea probelor în prezenţa unui solvent de extracţie, de exemplu o soluţie 0,1 M de clorură de potasiu. Se recomandă utilizarea a 5 ml de soluţie de KCl pe gram echivalent de greutate uscată de sol. Pentru optimizarea extracţiei, recipientele care conţin sol şi soluţie de extracţie nu trebuie umplute mai mult de jumătate. Amestecul se agită la 150 rpm timp de 60 de minute. Amestecurile se centrifughează sau se filtrează şi se analizează prezenţa nitratului în faza lichidă. Extractele lichide din care au fost eliminate particulele se pot depozita înainte de a fi supuse analizei la minus 20 ± 5 oC timp de până la şase luni.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Dacă se testează produse agrochimice, se înregistrează cantitatea de nitrat formată în fiecare probă de sol duplicat şi se furnizează valorile medii pentru toate duplicatele într-un tabel. Ratele de transformare a azotului se evaluează prin metode statistice adecvate şi general acceptate (de exemplu testul F, nivelul semnificativ de 5 %). Cantităţile de nitrat formate se exprimă în mg nitrat/kg greutate uscată/zi. Se compară rata formării de nitrat din fiecare probă tratată cu rata pentru proba martor şi se calculează deviaţia procentuală faţă de această valoare.
      Dacă se testează alte produse decât cele agrochimice, se determină cantitatea de nitrat formată în fiecare duplicat şi se trasează curba doză-răspuns în vederea determinării valorilor CEx. Cantităţile de nitrat (adică mg nitrat/kg greutate uscată de sol) determinate în probele tratate după 28 de zile se compară cu cele determinate pentru proba martor. Pe baza acestor date se calculează valorile de inhibare exprimate procentual pentru fiecare concentraţie de testare. Aceste procente sunt reprezentate în funcţie de concentraţie şi se folosesc proceduri statistice pentru calcularea valorilor CEx. Se determină şi pragurile de încredere (p = 0,95) pentru CEx calculate cu ajutorul procedurilor standard (10) (11) (12).
      Substanţele de testat care conţin cantităţi mari de azot pot contribui la formarea de nitrat în timpul testului. Dacă aceste substanţe se testează în concentraţii mari (de exemplu, în cazul substanţelor chimice care se anticipează că vor fi utilizate pentru aplicaţii repetate) trebuie incluşi în cadrul testului martori adecvaţi (de exemplu sol plus substanţă de testat, dar nu şi făină vegetală). Datele obţinute pentru aceste probe martor trebuie luate în considerare la calcularea CEx.
      2.2.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Dacă la evaluarea rezultatelor testelor pe substanţe agrochimice se constată că diferenţa dintre ratele de formare a nitratului pentru proba tratată cu concentraţia cea mai mică (concentraţia maximă previzibilă) şi pentru proba martor este, după 28 de zile, mai mică sau egală cu 25 % indiferent de momentul recoltării, se consideră că produsul în cauză nu influenţează pe termen lung transformarea azotului în sol. Pentru evaluarea rezultatelor testelor pe substanţe chimice altele decât produsele agrochimice se folosesc valorile CE50, CE25 şi/sau CE10.
      3.   RAPORT
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Date complete de identificare a solului utilizat, inclusiv:
                  
                              —
                           
                           
                              coordonatele geografice ale locului (latitudine, longitudine);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              informaţii privind istoricul locului (de exemplu, acoperirea vegetală, date privind tratamentele cu produse fitosanitare, cu îngrăşăminte organice şi anorganice, contaminările accidentale etc.);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tipul de utilizare (de exemplu sol agricol, forestier etc.);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              adâncimea de prelevare a probelor (cm);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conţinutul de nisip/aluviuni/argilă ( % greutate uscată);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pH (în apă);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conţinut de carbon organic ( % greutate uscată);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conţinut de azot ( % greutate uscată);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              concentraţie iniţială de nitrat (mg nitrat/kg greutate uscată);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              capacitate de schimb de cationi (mmol/kg);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              biomasă microbiană ca procent de carbon organic total;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metode de referinţă utilizate pentru determinarea fiecărui parametru;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toate informaţiile privind prelevarea şi depozitarea probelor de sol;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind preincubarea solului, dacă este cazul.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Substanţa de testat:
                  
                              —
                           
                           
                              natura fizică şi, dacă este cazul, proprietăţile fizice şi chimice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date de identificare a substanţelor chimice, dacă este cazul, inclusiv formula structurală, puritatea (pentru produsele fitosanitare procentul reprezentat de ingredientul activ), conţinutul de azot.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Substrat:
                  
                              —
                           
                           
                              sursa substratului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              compoziţie (făină de lucernă, făină de lucernă verde);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conţinut de carbon, de azot ( % greutate uscată);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dimensiunea sitei (mm).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              detalii privind adiţionarea solului cu substrat organic;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de concentraţii ale substanţei de testat utilizate şi, dacă este cazul, justificarea concentraţiilor selectate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind aplicarea substanţei de testat pe sol;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatura de incubare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conţinutul de apă al solului la începutul testului şi pe parcursul derulării acestuia;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metoda de incubare a solului utilizată (de exemplu, în vrac sau sub forma unei serii de subprobe individuale);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de duplicate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de prelevări;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metoda utilizată pentru extragerea nitratului din sol.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              procedura analitică şi echipamentul utilizate pentru analizarea nitratului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date sub formă de tabel privind valorile individuale şi medii ale măsurătorilor privind nitratul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              variaţiile la nivelul duplicatelor probelor tratate şi al duplicatelor probelor martor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              explicaţii privind ajustările calculelor, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              variaţia procentuală a ratelor de formare a nitratului la fiecare prelevare sau, dacă este cazul, valoarea CE50 cu un prag de încredere de 95 la sută, celelalte valori CEx (CE25 sau CE10) cu pragurile de încredere, şi un grafic al curbei doză-răspuns;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tratamentul statistic aplicat rezultatului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toate informaţiile şi observaţiile utile pentru interpretarea rezultatelor.
                           
                        
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
               
            
                  2.
               
               
                  BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
               
            
                  3.
               
               
                  EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
               
            
                  4.
               
               
                  SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M. R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.
               
            
                  5.
               
               
                  ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality – Biological Methods.
               
            
                  6.
               
               
                  OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
               
            
                  7.
               
               
                  ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
               
            
                  8.
               
               
                  ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.
               
            
                  9.
               
               
                  ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
               
            
                  10.
               
               
                  Litchfield, J. T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, p. 99-113.
               
            
                  11.
               
               
                  Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
               
            
                  12.
               
               
                  Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.
               
            C.22.   MICROORGANISMELE DIN SOL: TESTUL DE TRANSFORMARE A CARBONULUI
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare reia Orientarea 217 (2000) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Această metodă de testare constă dintr-o metodă de laborator elaborată pentru studierea efectelor pe termen lung ale produselor fitosanitare şi ale substanţelor chimice, după o singură expunere, asupra activităţii de transformare a carbonului de către microorganismele din sol. Testul se bazează în principal pe recomandările emise de Organizaţia europeană şi mediteraneană pentru protecţia plantelor (1). Cu toate acestea, au fost avute în vedere şi alte linii directoare, inclusiv cele emise de Biologische Bundesanstalt din Germania (2) şi de Agenţia pentru protecţia mediului a Statelor Unite (3) din cadrul SETAC (4). Numărul şi tipul solurilor utilizate în cadrul acestui test au fost definite cu ocazia unui atelier de lucru al OCDE privind selectarea solului/sedimentelor care a avut loc la Belgirate, Italia, în 1995 (5). Recomandările privind prelevarea, manipularea şi depozitarea probelor de sol au la bază liniile directoare ISO (6) şi recomandările atelierului de la Belgirate.
      Pentru determinarea şi evaluarea caracteristicilor toxice ale substanţelor de testat, este posibil să fie necesară determinarea efectelor acestora asupra activităţii microbiene din sol, de exemplu dacă sunt necesare date privind potenţialele efecte secundare ale produselor fitosanitare asupra microflorei din sol sau în cazul riscurilor de expunere a microorganismelor din sol la alte substanţe chimice decât cele din produsele fitosanitare. Testul de transformare a carbonului se efectuează pentru a determina efectele acestor substanţe chimice asupra microflorei din sol. Dacă se testează produse agrochimice (de exemplu produse fitosanitare, îngrăşăminte, produse chimice de uz silvic) se efectuează atât testul de transformare a carbonului, cât şi testul de transformare a azotului. Dacă se testează alte produse decât cele agrochimice este suficient testul de transformare a azotului. Cu toate acestea, dacă valorile CE50 obţinute în cadrul testului de transformare a azotului pentru substanţele în cauză se încadrează în intervalul de valori caracteristice inhibitorilor de nitrificare disponibili comercial (de exemplu nitrapirin), se poate efectua şi un test de transformare a carbonului în vederea obţinerii de informaţii suplimentare.
      Solurile sunt formate din componente vii şi din componente non-vii care formează amestecuri complexe şi eterogene. Microorganismele joacă un rol important în descompunerea şi transformarea materiei organice în sol fertil, multe specii aducându-şi contribuţia la diferitele aspecte ale fertilizării solurilor. Orice interferenţă pe termen lung în aceste procese biochimice riscă să perturbe ciclul elementelor nutritive şi, în consecinţă, să altereze fertilitatea solului. Transformarea azotului şi transformarea carbonului se produc în toate solurile fertile. Deşi coloniile microbiene care determină aceste procese diferă de la un sol la altul, căile de transformare sunt în mare aceleaşi.
      Prezenta metodă de testare a fost elaborată în vederea detectării efectelor adverse pe termen lung ale unei substanţe asupra procesului de transformare a carbonului în solurilor aerobe de suprafaţă. Testul este sensibil la modificările dimensiunilor şi activităţii coloniilor microbiene care determină transformarea carbonului deoarece supune aceste colonii atât unui stres chimic, cât şi unor carenţe de carbon. Se foloseşte un sol nisipos sărac în substanţe organice. Acesta se tratează cu substanţa de testat şi se incubează în condiţii care permit un metabolism microbian rapid. În aceste condiţii, sursele de carbon prezente în sol se epuizează rapid. Astfel sunt provocate carenţe de carbon care produc moartea celulelor microbiene şi induc o stare latentă/sporogeneză. Dacă durata testului depăşeşte 28 de zile, se poate măsura suma acestor reacţii la nivelul probelor martor (sol netratat) prin măsurarea dispariţiei progresive a biomasei microbiene cu activitate metabolică (7). Dacă biomasa dintr-un sol cu carenţe de carbon este afectată în cadrul testului de prezenţa unei substanţe chimice, este posibil ca aceasta să nu ajungă la acelaşi nivel ca şi proba martor. De aceea este adesea posibil ca perturbările provocate de substanţa de testat în orice moment de pe parcursul testului să se menţină până la finalul testului.
      Testele pe baza cărora a fost elaborată această metodă de testare au fost concepute în primul rând pentru cazurile în care cantitatea de substanţă care pătrunde în sol poate fi estimată. Este, de exemplu, cazul produselor fitosanitare a căror doză de aplicare pe sol este cunoscută. Pentru produsele agrochimice este suficient un test cu două doze reprezentative pentru aplicarea pe sol anticipată sau estimată. Produsele agrochimice pot fi testate ca principii active (p.a.) sau ca produse preparate. Cu toate acestea, testul nu se limitează la produse cu concentraţii anticipate în mediu previzibile. Modificând atât cantitatea de substanţă de testat aplicată pe sol, cât şi modul de evaluare a datelor, testul poate fi utilizat şi pentru cazurile în care nu se cunoaşte cantitatea de substanţă care pătrunde în sol. Astfel, în cazul altor substanţe chimice decât produsele agrochimice, se determină efectele unei serii de concentraţii asupra transformării carbonului. Datele obţinute în cadrul acestor teste se folosesc pentru trasarea curbei doză-efect şi pentru calcularea valorilor CEx, unde x se defineşte ca fiind efectul procentual.
      1.2   DEFINIŢII
      
         Transformare a carbonului: degradarea materiei organice de către microorganisme până la formarea produsului final, dioxidul de carbon.
      
         CE
         
            x
         
         (Concentraţia efectivă): este concentraţia substanţei de testat în sol care inhibă cu x la sută transformarea carbonului în dioxid de carbon.
      
         CE
         
            50
         
         (Concentraţia mediană efectivă): este concentraţia substanţei de testat în sol care inhibă cu 50 la sută (50 %) transformarea carbonului în dioxid de carbon.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Niciuna.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Solul cernut se tratează cu substanţa de testat sau se lasă netratat (martor). Dacă testul vizează produse agrochimice, se recomandă utilizarea a cel puţin două concentraţii, care trebuie alese în funcţie de concentraţia maximă previzibilă de pe teren. După 0, 7, 14 zile şi 28 de zile de incubaţie, probele de sol tratate şi probele martor se amestecă cu glucoză şi se măsoară rata respiraţiei induse de glucoză timp de 12 ore consecutiv. Rata respiraţiei se exprimă ca dioxid de carbon degajat (mg dioxid de carbon/kg sol uscat/h) sau ca oxigen consumat (mg oxigen/kg sol/h). Rata medie de respiraţie a probelor de sol tratate se compară cu cea a probelor martor şi se calculează deviaţia procentuală dintre probele tratate şi probele martor. Toate testele durează cel puţin 28 de zile. Dacă în a 28-a zi diferenţele dintre solurile tratate şi cele netratate sunt mai mari sau egale cu 25 %, se continuă efectuarea de măsurători la intervale de 14 zile timp de cel mult 100 de zile. Dacă se testează alte produse decât cele agrochimice, în probele de sol se adaugă o serie de concentraţii ale substanţei de testat şi se măsoară ratele de respiraţie induse de glucoză (de exemplu cantităţile medii de dioxid de carbon format sau de oxigen consumat) după 28 de zile. Rezultatele testelor cu mai multe concentraţii se analizează cu ajutorul unui model bazat pe regresie şi se calculează valorile CEx (de exemplu CE50, CE25 şi/sau CE10). A se vedea definiţiile.
      1.5.   VALABILITATEA TESTULUI
      Evaluarea rezultatelor testelor efectuate asupra produselor agrochimice se bazează pe diferenţe relativ mici (adică valori medii de ± 25 %) dintre dioxidul de carbon eliberat sau oxigenul consumat în (sau de către) probele martor şi probele tratate de sol, fapt care poate determina obţinerea unor rezultate false dacă există variaţii mari între probele martor. De aceea variaţiile dintre probele martor trebuie să fie mai mici de ± 15 %.
      1.6.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.6.1.   Aparatură
      Se folosesc recipiente de testare confecţionate din materiale inerte din punct de vedere chimic. Aceste recipiente trebuie să aibă o capacitate adecvată procedurii de incubare a solului utilizate, de exemplu incubare în vrac sau sub forma unei serii de probe individuale (a se vedea punctul 1.7.1.2). Pierderile de apă trebuie reduse la minimum şi trebuie să se poată realiza schimbul de gaze (de exemplu, recipientele de testare se pot acoperi cu folie perforată de polietilenă). Dacă se testează substanţe volatile, se folosesc recipiente ermetice şi etanşe la gaz. Dimensiunea recipientelor se alege astfel încât numai un sfert din volumul acestora să fie ocupat de proba de sol.
      Pentru determinarea respiraţiei induse de glucoză sunt necesare sisteme de incubare şi instrumente de măsurare a producţiei de dioxid de carbon şi a consumului de oxigen. În literatură există exemple de astfel de sisteme şi instrumente (8) (9) (10) (11).
      1.6.2.   Selectarea solurilor şi numărul acestora
      Se foloseşte un singur sol. Caracteristicile recomandate ale acestuia sunt următoarele:
      
                  —
               
               
                  conţinut de nisip: cel puţin 50 % dar nu mai mult de 75 %;
               
            
                  —
               
               
                  pH: 5,5-7,5;
               
            
                  —
               
               
                  conţinut de carbon organic: 0,5-1,5 %;
               
            
                  —
               
               
                  se măsoară biomasa microbiană (12) (13), al cărei conţinut de carbon trebuie să reprezinte cel puţin 1 % din carbonul organic total din sol.
               
            În majoritatea cazurilor, un sol cu caracteristicile descrise anterior reprezintă cele mai nefavorabile condiţii posibil, deoarece adsorbţia substanţei de testat este minimă, iar expunerea acesteia la microfloră este maximă. De aceea în general nu este necesar să se efectueze teste pe alte soluri. Cu toate acestea, în anumite situaţii, dacă principala utilizare preconizată a substanţei de testat vizează în special soluri de tipul solurilor forestiere acide, sau în cazul substanţelor chimice cu sarcină electrostatică, poate fi necesară utilizarea unui sol suplimentar.
      1.6.3.   Prelevarea şi depozitarea probelor de sol
      1.6.3.1.   Prelevare
      Se furnizează informaţii detaliate privind istoricul locului din care se prelevează solul testat. Aceste informaţii includ localizarea exactă, acoperirea vegetală, date privind tratamentele cu produse fitosanitare, cu îngrăşăminte organice şi anorganice, adaosurile de material biologic sau contaminările accidentale. Locul ales pentru prelevarea solului trebuie să poată fi utilizat pe termen lung. Păşunile permanente, câmpurile plantate cu cereale anuale (cu excepţia porumbului) sau semănături dese cu îngrăşăminte vegetale sunt adecvate în acest sens. Locul de prelevare selectat trebuie să nu fi fost tratat cu produse fitosanitare timp de cel puţin un an înainte de prelevarea probelor. De asemenea, trebuie să nu fi fost aplicat niciun îngrăşământ organic cel puţin pe parcursul ultimelor şase luni. Utilizarea îngrăşămintelor minerale este acceptabilă numai dacă respectă cerinţele de cultivare şi dacă nu se prelevează probe de sol mai repede de trei luni de la aplicarea îngrăşământului. Trebuie evitată utilizarea unor soluri tratate cu îngrăşăminte cu efecte biocide cunoscute (de exemplu cianamidă de calciu).
      Se va evita prelevarea de probe în timpul sau imediat după perioadele lungi (de peste 30 de zile) de secetă sau de saturare cu apă. În cazul solurilor arate, probele se recoltează de la o adâncime situată între 0 şi 20 cm. În cazul păşunilor sau al altor soluri care nu sunt arate pe parcursul unor perioade lungi (cel puţin pe parcursul unei perioade de creştere), adâncimea maximă de prelevare poate fi puţin mai mare de 20 cm (de exemplu 25 cm). Probele de sol se transportă în recipiente şi în condiţii de temperatură de natură să garanteze că proprietăţile sale iniţiale nu se modifică în mod semnificativ.
      1.6.3.2.   Depozitare
      Este preferabil ca solurile utilizate să fie proaspăt prelevate de pe teren. Dacă nu se poate evita depozitarea în laborator, solurile se depozitează la întuneric, la temperaturi de 4 ± 2 oC timp de maximum trei luni. Pe parcursul depozitării solurilor trebuie asigurate condiţii aerobe. Dacă solurile sunt prelevate dintr-o zonă în care sunt afectate de îngheţ timp de cel puţin trei luni pe an, se poate avea în vedere depozitarea acestora timp de şase luni la minus 18 oC. Biomasa microbiană a solurilor depozitate se măsoară înaintea fiecărui experiment, iar conţinutul de carbon din biomasă trebuie să fie de cel puţin 1 % din conţinutul total de carbon organic al solului (a se vedea punctul 1.6.2).
      1.6.4.   Manipularea şi pregătirea solului pentru test
      1.6.4.1.   Preincubarea
      Dacă solul a fost depozitat (a se vedea punctele 1.6.4.2 şi 1.7.1.3), se recomandă pre-incubarea timp de 2 până la 28 de zile. Temperatura şi conţinutul de umiditate al solului în perioada de pre-incubare trebuie să fie similare cu cele din cadrul testului (a se vedea punctele 1.6.4.2 şi 1.7.1.3).
      1.6.4.2.   Proprietăţi fizice şi chimice
      Se curăţă manual solul de obiectele mari (de exemplu pietre, resturi vegetale etc.) apoi se cerne umed fără uscare excesivă pentru a se obţine particule cu o dimensiune mai mică sau egală cu 2 mm. Conţinutul de apă al probei de sol se ajustează cu apă distilată sau deionizată până la o valoare cuprinsă între 40 % şi 60 % din capacitatea maximă de reţinere a apei.
      1.6.5.   Pregătirea substanţei de testat pentru aplicarea pe sol
      Substanţa de testat se aplică de obicei cu ajutorul unui excipient. Excipientul poate fi reprezentat de apă (în cazul substanţelor solubile în apă) sau de o substanţă solidă inertă cum este nisipul cuarţos fin (dimensiunea particulelor: 0,1-0,5 mm). Se vor evita excipienţii lichizi alţii decât apa (de exemplu solvenţii organici cum sunt acetona şi cloroformul) deoarece pot afecta microflora. Dacă se foloseşte nisip ca excipient, acesta poate fi tratat cu substanţa de testat dizolvată sau în suspensie într-un solvent adecvat. În acest caz, solventul se elimină prin evaporare înainte de amestecarea excipientului în sol. Pentru distribuirea optimă a substanţei de testat în sol, se recomandă un raport de 10 g de nisip pe kilogram de sol (greutate uscată). Probele martor se tratează numai cu o cantitate echivalentă de apă şi/sau de nisip cuarţos.
      Pentru testarea substanţelor chimice volatile, se evită în cea mai mare măsură posibilă pierderile din perioada tratamentului şi se încearcă repartizarea omogenă în sol (de exemplu, substanţa de testat se injectează în sol în mai multe locuri).
      1.6.6.   Concentraţiile de testare
      Dacă se testează produse fitosanitare sau alte produse chimice cu concentraţii anticipate în mediu previzibile, se folosesc cel puţin două concentraţii. Concentraţia mai mică trebuie să fie cel puţin egală cu cantitatea maximă susceptibilă să ajungă în sol în condiţii reale, iar concentraţia maximă trebuie să fie un multiplu al concentraţiei mai mici. Concentraţiile substanţei de testat adăugate în sol se calculează presupunând că încorporarea se realizează uniform, la o adâncime de 5 cm, şi că densitatea aparentă a solului este de 1,5. Pentru produsele agrochimice aplicate direct pe sol, sau în cazurile în care cantitatea de substanţă chimică ce pătrunde în sol este previzibilă, concentraţiile de testare recomandate sunt concentraţia anticipată în mediu (PEC) şi o concentraţie de cinci ori mai mare. Pentru substanţele care se aplică pe sol de mai multe ori în acelaşi sezon, se testează concentraţii calculate prin înmulţirea PEC cu numărul maxim de aplicări anticipate. Cu toate acestea, cea mai mare concentraţie testată nu trebuie să depăşească de mai mult de zece ori doza maximă aplicată o dată.
      Dacă se testează alte produse decât cele agrochimice, se foloseşte o serie geometrică de cel puţin cinci concentraţii. Concentraţiile testate trebuie să acopere intervalul necesar pentru determinarea valorilor CEx.
      1.7.   DESFĂŞURAREA TESTULUI
      1.7.1.   Condiţii de expunere
      1.7.1.1.   Lotul tratat şi lotul martor
      Dacă se testează produse agrochimice, solul se împarte în trei părţi cu greutate egală. Două părţi se amestecă cu excipient conţinând produsul, iar cealaltă se amestecă cu excipient fără produs (martor). Se recomandă pregătirea a cel puţin trei duplicate, atât pentru solul tratat, cât şi pentru cel netratat. Dacă se testează alte produse decât cele agrochimice, solul se împarte în şase părţi cu greutate egală. Cinci probe se amestecă cu excipient conţinând substanţa de testat, iar a şasea se amestecă cu excipient fără substanţă. Se recomandă pregătirea a trei duplicate atât pentru probele tratate, cât şi pentru probele martor. Se va acorda atenţie repartizării omogene a substanţei de testat în probele de sol tratate. În timpul amestecării se va evita comprimarea sau compactarea solului.
      1.7.1.2.   Incubarea probelor de sol
      Incubarea probelor de sol se poate realiza în două moduri: în vrac pentru probele de sol tratat şi netratat sau sub forma unor serii de subprobe individuale de dimensiuni identice de sol tratat şi netratat. Cu toate acestea, dacă se testează substanţe volatile, testul se efectuează numai pe o serie de subprobe individuale. Dacă solul se incubează în vrac, se prepară cantităţi mari de sol tratat şi netratat şi se prelevează subprobe după cum este necesar pe parcursul testului. Cantitatea pregătită iniţial atât pentru probele tratate cât şi pentru probele martor depinde de dimensiunea subprobelor, de numărul de duplicate utilizate pentru analiză şi de numărul maxim de prelevări preconizat. Solurile incubate în vrac se amestecă bine înainte de prelevarea subprobelor. Dacă solurile se incubează sub forma unor serii de probe individuale, atât solul tratat cât şi solul martor se împart în numărul de subprobe adecvat, care se folosesc după cum este necesar. Pentru experimentele pentru care se preconizează mai mult de două prelevări se pregăteşte o cantitate de subprobe suficientă pentru toate duplicatele şi pentru toate prelevările. Se incubează în mediu aerob cel puţin trei probe duplicat din solul testat (a se vedea punctul 1.7.1.1). În cadrul tuturor testelor se utilizează recipiente adecvate care asigură suficient spaţiu liber pentru a evita apariţia unor condiţii anaerobe. Dacă se testează substanţe volatile, testul se realizează pe o singură serie de subprobe individuale.
      1.7.1.3.   Condiţiile de testare şi durata testului
      Testul se realizează la întuneric şi la o temperatură a camerei de 20 ± 2 oC. Pe parcursul testului conţinutul de apă al probei de sol se menţine la o valoare cuprinsă între 40 % şi 60 % din capacitatea maximă de reţinere a apei a solului respectiv (a se vedea punctul 1.6.4.2), cu o marjă de ± 5 %. Se poate adăuga apă distilată, deionizată, după cum este necesar.
      Toate testele durează cel puţin 28 de zile. Dacă se testează produse agrochimice, se compară cantităţile de dioxid de carbon eliberat de probele tratate şi de probele martor. Dacă în a 28-a zi aceste diferenţe sunt mai mari de 25 %, testul se continuă până la obţinerea unei diferenţe de 25 % sau mai mică, sau timp de cel mult 100 de zile. Pentru alte produse decât cele agrochimice, testul este oprit după 28 de zile. În ziua 28 se măsoară cantităţile de dioxid de carbon eliberate sau de oxigen consumat de probele de sol tratate şi de probele de sol martor şi se calculează valorile CEx.
      1.7.2.   Prelevarea şi analiza solurilor
      1.7.2.1.   Programul de prelevare a probelor de sol
      Dacă se testează produse agrochimice, se analizează ratele respiraţiei induse de glucoză în probele din sol în zilele 0, 7, 14 şi 28. Dacă este necesară prelungirea testului, după ziua 28 se efectuează măsurători suplimentare la intervale de 14 zile.
      Dacă se testează alte produse decât cele agrochimice, se folosesc cel puţin cinci concentraţii şi se analizează probele de sol în vederea măsurării nitratului la începutul (ziua 0) şi la sfârşitul perioadei de expunere (28 de zile). Dacă se consideră necesar, se poate realiza o măsurătoare suplimentară, de exemplu în ziua 7. Datele obţinute în ziua 28 se folosesc pentru determinarea valorii CEx a substanţei chimice. Datele din ziua 0 privind probele martor pot fi utilizate pentru estimarea cantităţii iniţiale de biomasă microbiană cu activitate metabolică din sol (12).
      1.7.2.2.   Măsurarea ratelor de respiraţie induse de glucoză
      Rata respiraţiei induse de glucoză se determină pentru fiecare probă de sol tratat şi pentru fiecare probă martor la fiecare prelevare. Probele de sol se amestecă cu o cantitate de glucoză suficientă pentru a antrena o reacţie respiratorie maximă imediată. Cantitatea de glucoză necesară pentru provocarea unei reacţii respiratorii maxime într-un anumit sol se poate determina cu ajutorul unui test preliminar cu mai multe concentraţii de glucoză (14). Cu toate acestea, în cazul solurilor nisipoase cu un conţinut de carbon organic de 0,5-1,5 % sunt de obicei suficiente 2 000-4 000 mg de glucoză pe kg greutate uscată de sol. Glucoza se poate măcina în pulbere cu nisip cuarţos fin (10 g nisip/kg greutate uscată) şi se amestecă omogen în sol.
      Probele de sol adiţionate cu glucoză se incubează într-un aparat adaptat pentru măsurarea continuă a ratei de respiraţie la fiecare oră sau la fiecare două ore (a se vedea punctul 1.6.1) la 20 ± 2 oC. Se măsoară dioxidul de carbon degajat sau oxigenul consumat timp de 12 ore consecutive, iar măsurătorile se iniţiază cât mai repede posibil, adică după 1-2 ore de la adăugarea glucozei. Se măsoară cantitatea totală de dioxid de carbon degajat sau de oxigen consumat pe parcursul a 12 ore şi se determină ratele medii de respiraţie.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Dacă se testează produse agrochimice, se înregistrează cantitatea de dioxid de carbon eliberat sau de oxigen consumat de fiecare probă de sol duplicat şi se furnizează valorile medii pentru toate duplicatele într-un tabel. Rezultatele se evaluează prin metode statistice adecvate şi general acceptate (de exemplu testul F, nivelul semnificativ de 5 %). Rata de respiraţie indusă de glucoză se exprimă în mg dioxid de carbon/kg greutate uscată de sol/h sau în mg oxigen/greutate uscată de sol/h. Se compară rata medie a formării dioxidului de carbon sau rata medie a consumului de oxigen pentru fiecare probă tratată cu rata pentru proba martor şi se calculează deviaţia procentuală faţă de această valoare.
      Dacă se testează alte produse decât cele agrochimice, se determină cantitatea de dioxid de carbon eliberat sau de oxigen consumat de fiecare duplicat şi se trasează curba doză-răspuns în vederea determinării valorilor CEx. Ratele de respiraţie induse de glucoză (în mg dioxid de carbon/kg greutate uscată de sol/h sau în mg oxigen/greutate uscată de sol/h) determinate în probele tratate după 28 de zile se compară cu cele determinate pentru proba martor. Pe baza acestor date se calculează valorile de inhibare exprimate procentual pentru fiecare concentraţie de testare. Aceste procente sunt reprezentate în funcţie de concentraţie, iar pentru calcularea valorilor CEx se folosesc proceduri statistice. Se determină şi pragurile de încredere (p = 0,95) pentru CEx calculate cu ajutorul procedurilor standard (15) (16) (17).
      2.2.   INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Dacă la evaluarea rezultatelor testelor pe substanţe agrochimice se constată că diferenţa dintre ratele de respiraţie induse de glucoză pentru proba tratată cu concentraţia cea mai mică (concentraţia maximă previzibilă) şi pentru proba martor este, după 28 de zile, mai mică sau egală cu 25 % indiferent de momentul recoltării, se consideră că produsul în cauză nu influenţează pe termen lung transformarea carbonului în sol. Pentru evaluarea rezultatelor testelor pe substanţe chimice altele decât produsele agrochimice se folosesc valorile CE50, CE25 şi/sau CE10.
      3.   RAPORT
      RAPORTUL DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Date complete de identificare a solului utilizat, inclusiv:
                  
                              —
                           
                           
                              coordonatele geografice ale locului (latitudine, longitudine);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              informaţii privind istoricul locului (de exemplu, acoperirea vegetală, date privind tratamentele cu produse fitosanitare, tratamentele cu îngrăşăminte, contaminările accidentale etc.);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tipul de utilizare (de exemplu sol agricol, forestier etc.);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              adâncimea de prelevare a probelor (cm);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conţinutul de nisip/aluviuni/argilă ( % greutate uscată);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pH (în apă);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conţinut de carbon organic ( % greutate uscată);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conţinut de azot ( % greutate uscată);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              capacitate de schimb de cationi (mmol/kg);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              biomasă microbiană iniţială ca procent de carbon organic total;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metode de referinţă utilizate pentru determinarea fiecărui parametru;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toate informaţiile privind prelevarea şi depozitarea probelor de sol;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind pre-incubarea solului, dacă este cazul.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Substanţa de testat:
                  
                              —
                           
                           
                              natura fizică şi, dacă este cazul, proprietăţile fizice şi chimice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date de identificare a substanţelor chimice, dacă este cazul, inclusiv formula structurală, puritatea (pentru produsele fitosanitare procentul de ingredient activ), conţinutul de azot.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              detalii privind adiţionarea solului cu substrat organic;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de concentraţii ale substanţei de testat utilizate şi, dacă este cazul, justificarea concentraţiilor selectate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind aplicarea substanţei de testat pe sol;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatura de incubaţie;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conţinutul de apă al solului la începutul testului şi pe parcursul derulării acestuia;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metoda de incubare a solului utilizată (de exemplu în vrac sau sub forma unei serii de subprobe individuale);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de duplicate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de prelevări.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              metoda şi echipamentul utilizate pentru măsurarea ratelor de respiraţie;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date sub formă de tabel privind cantităţile individuale şi medii de dioxid de carbon sau de oxigen;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              variaţiile la nivelul duplicatelor probelor tratate şi al duplicatelor probelor martor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              explicaţii privind ajustările calculelor, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              variaţia procentuală a ratelor de respiraţie induse de glucoză la fiecare prelevare sau, dacă este cazul, valoarea CE50 cu un prag de încredere de 95 la sută, celelalte valori CEx (CE25 sau CE10) cu praguri de încredere şi un grafic al curbei doză-răspuns;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tratamentul statistic aplicat rezultatelor, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              toate informaţiile şi observaţiile utile pentru interpretarea rezultatelor.
                           
                        
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals, Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
               
            
                  2.
               
               
                  BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
               
            
                  3.
               
               
                  EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
               
            
                  4.
               
               
                  SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M. R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.
               
            
                  5.
               
               
                  OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
               
            
                  6.
               
               
                  ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
               
            
                  7.
               
               
                  Anderson, J. P. E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflora”. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.
               
            
                  8.
               
               
                  Anderson, J. P. E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties”. Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831-871.
               
            
                  9.
               
               
                  ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.
               
            
                  10.
               
               
                  ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
               
            
                  11.
               
               
                  Heinemeyer O., Insam, H., Kaiser, E. A, and Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
               
            
                  12.
               
               
                  ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.
               
            
                  13.
               
               
                  ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
               
            
                  14.
               
               
                  Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120.
               
            
                  15.
               
               
                  Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, p. 99-113.
               
            
                  16.
               
               
                  Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
               
            
                  17.
               
               
                  Finney D. J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.
               
            C.23.   TRANSFORMĂRI AEROBE ŞI ANAEROBE ÎN SOL
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare reia Orientarea 307 (2002) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Această metodă de testare se bazează pe liniile directoare existente (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Metoda descrisă în continuare a fost elaborată pentru măsurarea transformărilor aerobe şi anaerobe ale substanţelor chimice în sol. Scopul experimentelor este acela de a determina (i) rata de transformare a substanţei de testat şi (ii) natura şi ratele de formare şi de epuizare ale produşilor de transformare la care pot fi expuse plantele şi organismele din sol. Aceste studii sunt necesare pentru substanţele chimice aplicate direct pe sol sau susceptibile să ajungă în mediul din sol. Rezultatele acestor studii de laborator pot fi, de asemenea, utilizate pentru elaborarea de protocoale de prelevare de probe şi de analiză pentru studii din domenii înrudite.
      În general, pentru evaluarea căilor de transformare este suficientă realizarea de studii aerobe şi anaerobe pe un singur tip de sol (8) (10) (11). Ratele de transformare se determină pentru încă cel puţin trei alte soluri (8) (10).
      Numărul şi tipul solurilor utilizate în cadrul acestui test au fost definite cu ocazia unui atelier de lucru al OCDE privind selectarea solului şi a sedimentelor care a avut loc la Belgirate, Italia, în 1995 (10). Tipurile de sol testate trebuie să fie reprezentative pentru condiţiile de mediu în care va fi utilizată sau eliberată substanţa. De exemplu, substanţele chimice eliberate într-un climat subtropical sau tropical se testează cu Ferrasols sau Nitosols (sistemul FAO). În cadrul atelierului de lucru au fost de asemenea formulate recomandări privind prelevarea, manipularea şi depozitarea probelor de sol bazate pe liniile directoare ISO (15). În cadrul acestei metode se studiază şi utilizarea solurilor de orezărie.
      1.2.   DEFINIŢII
      
         Substanţă de testat: orice substanţă, indiferent dacă este vorba despre substanţa mamă sau despre produşii de transformare relevanţi.
      
         Produşi de transformare: toate substanţele rezultate din reacţiile biotice sau abiotice de transformare a substanţei de testat, în special CO2 şi produşii din reziduurile legate.
      
         Reziduuri legate:„reziduurile legate” sunt compuşi vegetali sau animali din sol, care persistă în matrice după extracţie sub forma substanţei mamă sau a metabolitului (metaboliţilor)/produşilor de transformare ai acesteia. Metoda de extracţie nu trebuie să modifice considerabil compuşii înşişi sau structura matricei. Natura legăturii poate fi determinată parţial prin metode de extracţie care modifică matricea şi prin tehnici analitice complexe. Până în prezent a fost identificată în acest mod natura legăturilor covalente, ionice, de sorbţie şi de captare. În general, formarea reziduurilor legate reduce bioaccesibilitatea şi biodisponibilitatea în mod considerabil (12) [modificare IUPAC 1984 (13)].
      
         Transformare aerobă: reacţie care se produce în prezenţa oxigenului molecular (14).
      
         Transformare anaerobă: reacţie care se produce în absenţa oxigenului molecular (14).
      
         Sol: este un amestec de constituenţi chimici minerali şi organici, aceştia din urmă conţinând compuşi cu un conţinut ridicat de carbon şi azot şi cu masă moleculară mare, care conţin mici organisme (în special microorganisme). Solul poate fi manipulat în două forme:
      
                  (a)
               
               
                  nederanjat, aşa cum s-a format în timp, în straturile caracteristice unui număr mare de tipuri de sol;
               
            
                  (b)
               
               
                  deranjat, aşa cum se găseşte de obicei pe terenurile arabile când probele se prelevează prin săpare şi se folosesc în cadrul prezentei metode de testare (14).
               
            
         Mineralizare: degradarea completă a unui compus organic în CO2 şi H2O în condiţii aerobe şi în CH4, CO2 şi H2O în condiţii anaerobe. În cadrul prezentei metode de testare, dacă se foloseşte un compus marcat cu 14C, mineralizare înseamnă o degradare considerabilă pe parcursul căreia un atom de carbon marcat este oxidat, degajându-se o cantitate adecvată de 14CO2 (14).
      
         Timp de înjumătăţire: t0,5 este timpul necesar pentru transformarea a 50 % dintr-o substanţă de testat în cazul transformărilor care pot fi descrise printr-o cinetică de prim ordin; nu depinde de concentraţie.
      
         DT
         
            50
         
         (timp de degradare 50): este timpul în care concentraţia substanţei de testat se reduce cu 50 %; diferă de timpul de înjumătăţire t0,5 dacă transformarea nu respectă o cinetică de prim ordin.
      
         DT
         
            75
         
         (timp de degradare 75): este timpul în care concentraţia substanţei de testat se reduce cu 75 %.
      
         DT
         
            90
         
         (timp de degradare 90): este timpul în care concentraţia substanţei de testat se reduce cu 90 %.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Substanţele de referinţă se folosesc pentru caracterizarea şi/sau identificarea produşilor de transformare prin metode spectroscopice şi cromatografice.
      1.4.   APLICABILITATEA TESTULUI
      Metoda se aplică tuturor substanţelor chimice (nemarcate sau marcate radioactiv) pentru care se poate utiliza o metodă analitică cu o precizie şi o sensibilitate suficientă. Se aplică pentru compuşii uşor volatili, nevolatili, solubili sau insolubili în apă. Testul nu se aplică substanţelor chimice puternic volatile în sol (de exemplu fumiganţi, solvenţi organici) care de aceea nu pot fi menţinute în sol în condiţiile experimentale din cadrul acestui test.
      1.5.   INFORMAŢII REFERITOARE LA SUBSTANŢA DE TESTAT
      Pentru măsurarea ratei de transformare se poate utiliza o substanţă de testat marcată sau nemarcată. Materialul marcat este necesar pentru studierea căilor de transformare şi pentru stabilirea bilanţului masic. Se recomandă marcarea cu 14C dar poate fi utilă şi utilizarea altor izotopi cum sunt 13C, 15N, 3H, 32P. În măsura în care este posibil, marcajul se amplasează în partea (părţile) cea (cele) mai stabilă (stabile) ale moleculei (40). Puritatea substanţei de testat trebuie să fie de cel puţin 95 %.
      Înainte de efectuarea unui test de transformare aerobă sau anaerobă în sol, sunt necesare următoarele informaţii privind substanţa de testat:
      
                  (a)
               
               
                  solubilitatea în apă (metoda A.6);
               
            
                  (b)
               
               
                  solubilitatea în solvenţi organici;
               
            
                  (c)
               
               
                  presiunea vaporilor (metoda A.4) şi constanta lui Henry;
               
            
                  (d)
               
               
                  coeficientul de împărţire n-octanol/apă (metoda A.8);
               
            
                  (e)
               
               
                  stabilitatea chimică la întuneric (hidroliză) (metoda C.7);
               
            
                  (f)
               
               
                  coeficientul pKa dacă este posibil ca o moleculă să fie supusă unei protonări sau deprotonări (Orientarea 112 a OCDE) (16).
               
            Este posibil să fie utile şi informaţii privind toxicitatea substanţei de testat asupra microorganismelor din sol (metodele de testare C.21 şi C.22) (16).
      Trebuie să fie disponibile metode analitice (inclusiv metode de extracţie şi de purificare) necesare pentru cuantificarea şi identificarea substanţei de testat şi a produşilor de transformare ai acesteia.
      1.6.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Probele de sol se tratează cu substanţa de testat şi se incubează la întuneric în baloane de tip biometric sau în sisteme cu circulaţie continuă în condiţii de laborator controlate (la temperatură şi umiditate constantă). După un interval de timp adecvat, se extrag şi se analizează probele de sol în vederea măsurării substanţei mamă şi a produşilor de transformare. Şi produşii volatili se colectează în vederea efectuării unei analize cu ajutorul unor dispozitive de absorbţie adecvate. Cu ajutorul materialului marcat cu 14C se pot măsura diferitele rate de mineralizare a substanţei de testat prin captarea 14CO2 degajat şi se poate stabili bilanţul masic, inclusiv formarea reziduurilor legate de sol.
      1.7.   CRITERII DE CALITATE
      1.7.1.   Recuperare
      Extracţia şi analizarea probelor de sol, cel puţin în duplicat, imediat după adăugarea substanţei de testat, oferă o primă indicaţie privind repetabilitatea metodei analitice şi uniformitatea procedurii de aplicare a substanţei de testat. Ratele de recuperare din etapele ulterioare ale experimentelor sunt furnizate de bilanţurile masice respective. Aceste rate de recuperare variază între 90 % şi 110 % pentru substanţele chimice marcate (8) şi între 70 % şi 110 % pentru substanţele chimice nemarcate (3).
      1.7.2.   Repetabilitatea şi sensibilitatea metodei analitice
      Repetabilitatea metodei analitice (cu excepţia randamentului extracţiei iniţiale) în ceea ce priveşte cuantificarea substanţei de testat şi a produşilor de transformare se poate controla prin efectuarea unei analize duplicat pe acelaşi extract de sol, incubat suficient timp pentru a se forma produşii de transformare.
      Pragul de detecţie (LOD) a substanţei de testat şi a produşilor de transformare din cadrul metodei analitice trebuie să fie de cel puţin 0,01 mg· kg–1 (substanţă de testat) în sol sau de 1 % din doza aplicată, respectiv valoarea mai mică dintre acestea. Se precizează şi pragul de cuantificare (LOQ).
      1.7.3.   Precizia datelor privind transformarea
      Analiza de regresie a concentraţiilor substanţei de testat în funcţie de timp oferă informaţii adecvate privind fiabilitatea curbei de transformare şi calcularea pragurilor de încredere pentru timpii de înjumătăţire (în cazurile de cinetică de pseudo prim ordin) sau a valorilor DT50 şi, dacă este cazul, a valorilor DT75 şi DT90.
      1.8.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.8.1.   Echipament şi reactivi chimici
      Incubatoarele sunt formate din circuite statice închise sau din sisteme cu circulaţie continuă (7) (17). În figurile 1 şi 2 sunt prezentate exemple de incubatoare cu circulaţie continuă şi de baloane de tip biometric. Ambele tipuri de incubatoare prezintă avantaje şi inconveniente (7) (17).
      Este necesar echipament standard de laborator, în special următoarele:
      
                  —
               
               
                  instrumente de analiză cum sunt: cromatografie în fază gazoasă sau lichidă (GLC), cromatografie în fază lichidă de înaltă performanţă (HPLC), echipament TLC, inclusiv sisteme adecvate pentru analiza substanţelor marcate radioactiv şi a substanţelor nemarcate sau metoda diluţiei izotopice inverse;
               
            
                  —
               
               
                  instrumente de identificare (de exemplu MS, GC-MS, HPLC-MS, RMN etc.);
               
            
                  —
               
               
                  contor de scintilaţie lichid;
               
            
                  —
               
               
                  aparat de oxidare pentru combustia materialului radioactiv;
               
            
                  —
               
               
                  centrifugă;
               
            
                  —
               
               
                  aparat de extracţie (de exemplu tuburi de centrifugare pentru extracţia la rece şi aparat Soxhlet pentru extracţia continuă sub reflux);
               
            
                  —
               
               
                  instrumente pentru concentrarea soluţiilor şi a extractelor (evaporator rotativ);
               
            
                  —
               
               
                  baie de aburi;
               
            
                  —
               
               
                  dispozitiv mecanic de amestecare (de exemplu malaxor, amestecător rotativ).
               
            Printre reactivii chimici utilizaţi se numără, de exemplu:
      
                  —
               
               
                  NaOH, puritate analitică, 2 moli· dm–3, sau altă bază adecvată (de exemplu KOH, etanolamină);
               
            
                  —
               
               
                  H2SO4, puritate analitică, 0,05 moli· dm–3,
               
            
                  —
               
               
                  etilen glicol, puritate analitică;
               
            
                  —
               
               
                  materiale de absorbţie solide, de exemplu var sodat sau tampoane poliuretanice;
               
            
                  —
               
               
                  solvenţi organici, puritate analitică, cum sunt acetona, metanolul etc.;
               
            
                  —
               
               
                  lichid de scintilaţie.
               
            1.8.2.   Aplicarea substanţei de testat
      Substanţa de testat se poate dizolva în apă (deionizată sau distilată) în vederea încorporării sau a distribuirii în sol, sau, dacă este necesar, se poate dizolva într-o cantitate minimă de acetonă sau de alţi solvenţi organici (6) dacă este suficient de solubilă şi de stabilă. Cu toate acestea, cantitatea de solvent selectată nu trebuie să aibă o influenţă semnificativă asupra activităţii microbiene din sol (a se vedea punctele 1.5 şi 1.9.2-1.9.3). Trebuie evitată utilizarea unor solvenţi care inhibă activitatea microbiană cum sunt cloroformul, diclormetanul şi alţi solvenţi halogenaţi.
      Substanţa de testat se poate adăuga şi sub formă solidă, amestecată cu nisip cuarţos (6) sau într-o subprobă de sol uscat cu aer şi sterilizată de mici dimensiuni. Dacă substanţa de testat se adaugă cu ajutorul unui solvent, acesta se lasă să se evaporeze înainte ca subproba tratată să fie adăugată în proba iniţială de sol nesterilă.
      În cazul substanţelor chimice obişnuite, pentru care principala cale de pătrundere în sol este prin nămolul de epurare sau prin tratamente agricole, se începe prin adăugarea substanţei de testat în nămol, care se introduce apoi în proba de sol (a se vedea punctele 1.9.2 şi 1.9.3)
      Nu se recomandă utilizarea de materiale preparate în mod sistematic. Cu toate acestea, de exemplu în cazul substanţelor puţin solubile, utilizarea de materiale preparate poate fi o soluţie bună.
      1.8.3.   Soluri
      1.8.3.1.   Selectarea solurilor
      Pentru determinarea căii de transformare se poate utiliza un sol reprezentativ; se recomandă argila nisipoasă sau lutul nisipos fin sau argila sau nisipul lutos [conform clasificării FAO şi USDA (18)] cu un pH de 5,5-8,0, cu conţinut de carbon organic de 0,5-2,5 % şi cu o biomasă microbiană de cel puţin 1 % din carbonul organic total (10).
      Pentru studiile privind ratele de transformare se folosesc cel puţin trei soluri suplimentare reprezentative pentru gama de soluri în cauză. Solurile trebuie să aibă pH-uri, conţinuturi de argilă şi biomase microbiene diferite (10).
      Toate solurile se clasifică, cel puţin din punctul de vedere al texturii (% nisip, % aluviuni, % argilă) [conform clasificării FAO şi USDA (18)], al pH-ului, al capacităţii de schimb de cationi, al densităţii aparente, al caracteristicilor de reţinere a apei (41) şi al biomasei microbiene (numai pentru studiile aerobe). Pentru interpretarea rezultatelor pot fi utile informaţii suplimentare privind proprietăţile solului. Pentru determinarea caracteristicilor solului se pot utiliza metodele recomandate la referinţe (19) (20) (21) (22) (23). Masa microbiană se determină prin metoda respiraţiei induse de substrat (SIR) (25) (26) sau prin metode alternative (20).
      1.8.3.2.   Prelevarea, manipularea şi depozitarea solurilor
      Se furnizează informaţii detaliate privind istoricul locului din care se prelevează solul testat. Aceste informaţii includ localizarea exactă, acoperirea vegetală, date privind tratamentele cu substanţe chimice, cu îngrăşăminte organice şi anorganice, adaosurile de material biologic sau alte contaminări. Solurile tratate cu substanţa de testat sau cu substanţe cu structură analogă pe parcursul ultimilor patru ani nu se folosesc în studiile de transformare (10) (15).
      Solurile utilizate trebuie să fie proaspăt prelevate de pe teren (din orizontul A sau din stratul de 20 cm de la suprafaţă), şi trebuie să aibă un conţinut de apă care facilitează cernerea. Pentru alte soluri decât cele de orezărie, se va evita prelevarea de probe în timpul sau imediat după perioadele lungi (> 30 zile) de secetă, de îngheţ sau de inundaţii (14). Probele se transportă astfel încât să se reducă la minimum modificările conţinutului de apă din sol şi se păstrează la întuneric, asigurându-se circulaţia liberă a aerului în cea mai mare măsură posibil. În acest sens este în general adecvată o pungă de polietilenă care nu se închide ermetic.
      Solul se prelucrează cât mai repede posibil după prelevare. Se scot resturile vegetale, animale şi pietrele mari înainte de cernerea solului printr-o sită cu ochiuri de 2 mm care reţine pietrele şi resturile vegetale şi animale de mici dimensiuni. Se va evita uscarea şi măcinarea solului înainte de cernere (15).
      În timpul iernii, când prelevarea de pe teren este dificilă (sol îngheţat sau acoperit cu straturi de zăpadă) probele se pot preleva dintr-un lot de sol depozitat într-o seră cu acoperire vegetală (de exemplu un amestec de iarbă şi trifoi). Sunt preferate în mod evident studiile efectuate pe sol proaspăt prelevat, dar dacă solul prelevat şi prelucrat trebuie depozitat înainte de iniţierea studiului, condiţiile de depozitare trebuie să fie adecvate iar depozitarea să se realizeze pe parcursul unei perioade limitate (4 ± 2 oC timp de maximum trei luni) pentru menţinerea activităţii microbiene (42). Referinţele 8, 10, 15, 26 şi 27) conţin instrucţiuni detaliate privind prelevarea, manipularea şi depozitarea solurilor utilizate în cadrul experimentelor de biotransformare.
      Înainte de a fi utilizat în cadrul acestui test, solul tratat se preincubează pentru a permite germinarea şi eliminarea seminţelor şi restabilirea echilibrului metabolismului microbian după trecerea de la condiţiile de prelevare sau de depozitare la condiţiile de incubare. În general este adecvat să se prevadă o perioadă de preincubare de 2 până la 28 de zile, aproximativ în condiţiile de temperatură şi de umiditate din cadrul testului real (15). În general durata de depozitare şi de preincubare însumate nu trebuie să depăşească trei luni.
      1.9.   DESFĂŞURAREA TESTULUI
      1.9.1.   Condiţii de testare
      1.9.1.1   Temperatura de testare
      Pe parcursul întregii perioade de testare, solurile se incubează la întuneric, la o temperatură constantă reprezentativă pentru condiţiile climatice în care va fi utilizată sau eliberată substanţa. Pentru toate substanţele testate care ajung în sol în climat temperat se recomandă o temperatură de 20 ± 2 oC. Temperatura se monitorizează.
      În cazul substanţelor aplicate sau eliberate într-un climat mai rece (de exemplu în ţările nordice, în perioade de toamnă/iarnă), se incubează probe suplimentare de sol la o temperatură mai mică (de exemplu 10 ± 2 oC).
      1.9.1.2   Conţinutul de umiditate
      Pentru testele de transformare în mediu aerob, conţinutul de umiditate al solului (43) se ajustează şi se menţine la un pF cuprins între 2,0 şi 2,5 (3). Conţinutul de umiditate al solului se exprimă ca masă de apă pe masă de sol uscat şi se controlează în mod regulat (de exemplu la intervale de 2 săptămâni) prin cântărirea balonului de incubare, iar pierderile de apă se compensează prin adăugarea de apă (de preferinţă apă de la robinet sterilizată prin filtrare). Pierderile de substanţă de testat şi/sau de produşi de transformare prin volatilizare şi/sau fotodegradare (dacă este cazul) produse când se adaugă apă se vor evita sau se vor reduce la minimum.
      Pentru testele de transformare în condiţii aerobe şi de orezărie solul se saturează cu apă prin inundare.
      1.9.1.3   Condiţii aerobe de incubare
      În sistemele cu circulaţie continuă condiţiile aerobe se menţin prin spălare intermitentă sau ventilare cu aer umezit. În baloanele de tip biometric, schimbul de aer se realizează prin difuziune.
      1.9.1.4   Condiţii aerobe sterile
      Pentru obţinerea de informaţii privind importanţa transformării abiotice a unei substanţe de testat probele de sol pot fi sterilizate (pentru metode de sterilizare a se vedea referinţele 16 şi 29), tratate cu o substanţă de testat sterilă (de exemplu prin adăugarea de soluţie printr-un filtru steril) şi aerate cu aer steril umed după cum se arată la punctul 1.9.1.3. În cazul solurilor de orezărie, solul şi apa se sterilizează, iar incubarea se efectuează după cum se arată în punctul 1.9.1.6.
      1.9.1.5.   Condiţii anaerobe de incubare
      Pentru crearea şi menţinerea condiţiilor anaerobe, solul tratat cu substanţa de testat şi incubat în condiţii aerobe timp de 30 de zile sau pe parcursul unei perioade egale cu timpul de înjumătăţire sau cu DT50 (aceea dintre ele care este mai scurtă) se acoperă apoi cu apă (strat de apă de 1-3 cm), iar sistemul de incubare se clăteşte cu un gaz inert (de exemplu azot sau argon) (44). Sistemul de testare trebuie să permită măsurarea pH-ului, a concentraţiei de oxigen şi a potenţialului redox şi să conţină dispozitive de captare a produşilor volatili. Sistemul de tip biometric trebuie să fie închis pentru a evita orice intrare a aerului prin difuziune.
      1.9.1.6.   Condiţii de incubare în solurile de orezărie
      Pentru studierea transformării în solurile de orezărie, solul se inundă cu un strat de apă de 1-5 cm iar substanţa de testat se introduce în faza apoasă (9). Se recomandă ca adâncimea stratului de sol să fie de cel puţin 5 cm. Sistemul se ventilează cu aer ca şi în condiţii aerobe. Se supraveghează şi se înregistrează pH-ul, concentraţia de oxigen şi potenţialul redox al stratului de apă. Înainte de începerea studiilor de transformare este necesară o perioadă de preincubare de cel puţin două săptămâni (a se vedea punctul 1.8.3.2).
      1.9.1.7.   Durata testului
      În general, studiile privind rata şi căile de transformare nu trebuie să depăşească 120 de zile (45) (3) (6) (8), deoarece după acest termen sistemele artificiale de laborator în care nu se produce o reconstituire naturală sunt afectate în timp de o scădere a activităţii microbiene din sol. Dacă este necesară o caracterizare a epuizării substanţei de testat şi a formării şi epuizării principalilor produşi de transformare, studiile pot fi continuate pe parcursul unor perioade mai lungi (de exemplu între 6 şi 12 luni) (8). Dacă se folosesc perioade de incubaţie mai lungi, acestea trebuie justificate în raportul de testare şi trebuie menţionate măsurătorile biomasei efectuate în timpul şi la sfârşitul acestor perioade.
      1.9.2.   Efectuarea testului
      Se introduc 50-200 g de sol (greutate uscată) în fiecare balon de incubare (a se vedea figurile 1 şi 2 din apendicele 3) şi se tratează cu substanţa de testat cu ajutorul uneia dintre metodele descrise în punctul 1.8.2. Dacă pentru aplicarea substanţei de testat se folosesc solvenţi organici, aceştia se elimină din sol prin evaporare. În continuare, solul se mestecă bine cu o spatulă şi/sau prin agitarea balonului. Dacă studiul se desfăşoară în condiţii de orezărie, solul şi apa se amestecă bine după aplicarea substanţei de testat. Se analizează substanţa de testat prezentă în părţi alicote mici (de exemplu 1 g) din solurile tratate pentru a verifica dacă repartizarea este uniformă. În continuare este prezentată o metodă alternativă.
      Tratamentul aplicat trebuie să corespundă celei mai mari rate de aplicare a produsului fitosanitar recomandate în instrucţiunile de utilizare şi să poată fi încorporat uniform şi la o adâncime adecvată în sol de exemplu în stratul (46) format de primii 10 cm de la suprafaţa solului. De exemplu, pentru substanţele chimice aplicate pe frunze sau pe sol care nu sunt încorporate în sol, adâncimea adecvată pentru calcularea cantităţii de substanţă chimică de adăugat în fiecare balon este de 2,5 cm. Pentru substanţele chimice încorporate în sol, adâncimea adecvată este adâncimea de încorporare menţionată în instrucţiunile de utilizare. Pentru substanţele chimice obişnuite, doza aplicată se estimează având în vedere cea mai relevantă cale de intrare; de exemplu, dacă cea mai relevantă cale de intrare în sol este prin nămoluri de epurare, substanţa chimică se dozează în nămol într-o concentraţie egală cu concentraţia anticipată din nămol, iar cantitatea de nămol adăugată în sol trebuie să fi egală cu cantitatea de nămol adăugată în mod obişnuit în solurile agricole. Dacă această concentraţie nu este suficient de ridicată pentru identificarea principalilor produşi de transformare, este utilă incubarea unor probe de sol separate care conţin rate mai mari de substanţă, dar trebuie evitate ratele excesive care influenţează funcţiile microbiene ale solului (a se vedea punctele 1.5 şi 1.8.2).
      Ca alternativă, se poate trata un lot mai mare de sol (1-2 kg) cu substanţa de testat, amestecându-se bine într-un malaxor adecvat, şi se transferă părţi mici de 50-200 g în baloane de incubare (de exemplu cu ajutorul unor repartitoare de probe). Se analizează părţi alicote mici (de exemplu de 1 g) din lotul de sol tratat pentru a verifica dacă repartizarea substanţei de testat este uniformă. Această procedură este preferabilă, deoarece permite o repartizare mai uniformă a substanţei de testat în sol.
      Se incubează şi probe de sol netratate în aceleaşi condiţii (aerobe) ca şi probele tratate cu substanţa de testat. Aceste probe se utilizează pentru măsurarea biomasei pe parcursul studiilor şi la finalul acestora.
      Dacă substanţa de testat se aplică pe sol dizolvată în unul sau mai mulţi solvenţi organici, se incubează probe de sol tratate cu aceeaşi cantitate de solvent sau solvenţi în aceleaşi condiţii (aerobe) ca şi probele tratate cu substanţa de testat. Aceste probe se folosesc pentru măsurarea biomasei la începutul, în timpul şi la finalul studiilor pentru a se verifica efectele solventului sau solvenţilor asupra biomasei microbiene.
      Baloanele care conţin sol tratat se conectează la un sistem cu circulaţie continuă de tipul celui descris în figura 1 sau se închid cu o coloană de absorbţie de tipul celei prezentate în figura 2 (a se vedea apendicele 3).
      1.9.3.   Prelevare de probe şi măsurători
      Se scot baloane de incubare duplicat la intervale adecvate şi se extrag probele de sol cu ajutorul unor solvenţi adecvaţi cu polaritate diferită şi se analizează în vederea măsurării substanţei de testat şi/sau a produşilor de transformare. Un studiu bine proiectat include suficiente baloane pentru ca două dintre acestea să poată fi sacrificate la fiecare prelevare. De asemenea, se scot soluţii de absorbţie sau materiale solide de absorbţie la diferite intervale de timp (la intervale de 7 zile în prima lună, iar apoi la intervale de 17 zile) pe parcursul şi la sfârşitul perioadei de incubare a fiecărei probe de sol şi se analizează produşii volatili. De altfel, pe lângă proba de sol prelevată direct după aplicare (proba din ziua 0) trebuie să mai existe cel puţin 5 puncte suplimentare de prelevare. Intervalele de timp se aleg astfel încât să se poată determina modelul de epuizare pentru substanţa de testat şi modelele de formare şi de epuizare a produşilor de transformare (de exemplu zilele 0, 1, 3, 7; 2, 3 săptămâni; 1, 2, 3 luni etc.).
      Dacă substanţa de testat este marcată cu 14C, radioactivitatea neextractibilă se cuantifică prin combustie şi se calculează un bilanţ masic pentru fiecare interval de prelevare.
      În cazul incubării anaerobe sau în mediu de orezărie, faza de sol şi faza apoasă se analizează împreună în vederea măsurării substanţei de testat, iar produşii de transformare se separă prin filtrare sau centrifugare înainte de extracţie şi de analizare.
      1.9.4.   Teste facultative
      Studiile aerobe nesterile la alte temperaturi şi umidităţi ale solului pot fi utile pentru estimarea influenţei temperaturii şi umidităţii solului asupra ratelor de transformare a unei substanţe de testat şi/sau a produşilor de transformare ai acesteia din sol.
      Se poate încerca realizarea unei caracterizări suplimentare a radioactivităţii neextractibilă utilizându-se, de exemplu, extracţia cu un lichid supercritic.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Cantităţile de substanţă de testat, de produşi de transformare, de substanţe volatile (exprimate numai în %) şi de produşi neextractibili se exprimă ca % din concentraţia iniţială aplicată şi, dacă este cazul, ca mg· kg–1 de sol (ca greutate uscată a solului) pentru fiecare interval de prelevare. Se furnizează şi un bilanţ masic exprimat ca procent din concentraţia aplicată iniţial pentru fiecare interval de prelevare. Reprezentarea grafică a concentraţiilor substanţei de testat în funcţie de timp permite estimarea timpului de înjumătăţire al transformării sau DT50. Se identifică principalii produşi de transformare, iar concentraţiile acestora se reprezintă în funcţie de timp astfel încât să fie ilustrate ratele de formare şi de epuizare ale acestora. Este produs principal de transformare orice produs care reprezintă > 10 % din doza aplicată în orice moment de pe parcursul studiului.
      Produsele volatile captate oferă indicaţii privind potenţialul volatil al substanţei de testat şi produşii de transformare ai acesteia din sol.
      Timpul de înjumătăţire sau valorile DT50 şi, dacă este cazul, valorile DT75 şi DT90 se pot determina cu mai multă precizie utilizându-se metode de calcul bazate pe modele cinetice adecvate. Durata timpului de înjumătăţire şi valorile DT50 sunt incluse în raport, împreună cu o descriere a modelului cinetic utilizat, cu ordinul cineticii şi cu coeficientul de determinare (r2. Este preferabilă cinetica de prim ordin, cu excepţia cazurilor în care r2 < 0,7. Dacă este cazul, calculele se aplică şi principalilor produşi de transformare. Referinţele 31-35 conţin exemple de modele adecvate.
      În cazul studiilor privind ratele de transformare realizate la diferite temperaturi, acestea sunt descrise în funcţie de temperatură în cadrul intervalului experimental de temperatură cu ajutorul relaţiei lui Arrhenius:
      
         sau
      unde ln A şi B sunt constantele de regresie, respectiv segmentul şi panta dreptei de interpolare determinate de regresia liniară a ln k faţă de 1/T, unde k este constanta de viteză la temperatura T, iar T este temperatura în grade Kelvin. Dacă transformarea depinde de activitatea microbiană, trebuie acordată o atenţie specială intervalului limitat de temperaturi în care se aplică relaţia Arrhenius.
      2.2.   EVALUAREA ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Deşi studiile se realizează într-un sistem artificial de laborator, rezultatele permit estimarea ratei de transformare a substanţei de testat, precum şi rata de formare şi de epuizare a produşilor de transformare în condiţii de teren (36) (37).
      Studiile asupra căilor de transformare a unei substanţe de testat oferă informaţii privind modul în care structura substanţei aplicate se modifică în sol prin reacţii chimice şi microbiene.
      3.   RAPORT
      RAPORT DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Substanţa de testat:
                  
                              —
                           
                           
                              denumirea comună, denumirea chimică, numărul CAS, formula structurală [indicându-se poziţia marcajului (marcajelor) radioactiv(e) dacă se foloseşte material marcat radioactiv] şi proprietăţile fizice şi chimice relevante (a se vedea punctul 1.5);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              puritatea (impurităţile) substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              puritatea radiochimică a substanţei chimice marcate şi activitatea specifică (dacă este cazul).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Substanţe de referinţă:
                  
                              —
                           
                           
                              denumirea chimică şi structura substanţelor de referinţă utilizate pentru caracterizarea şi/sau identificarea produşilor de transformare.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Solurile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              detalii privind locul de colectare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              data şi procedura de prelevare a solului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              proprietăţile solului cum sunt pH-ul, conţinutul de carbon organic, textura ( % nisip, % aluviuni, % argilă), capacitatea de schimb de cationi, densitatea aparentă, caracteristicile de reţinere a apei şi biomasa microbiană;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              durata depozitării solului şi condiţiile de depozitare (dacă este depozitat).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              datele la care au fost realizate studiile;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              cantitatea de substanţă de testat aplicată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solvenţii utilizaţi şi metoda de aplicare a substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea solului tratat iniţial şi prelevat la fiecare interval în vederea analizei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea sistemului de incubare utilizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              debitul de aer (numai pentru sistemele cu circulaţie continuă);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatura la începutul experimentului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conţinutul de umiditate din sol pe parcursul incubării;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              biomasa microbiană iniţială, de pe parcursul derulării şi de la sfârşitul studiilor aerobe şi în condiţii de orezărie;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              pH-ul, concentraţia de oxigen şi potenţialul redox iniţiale, de pe parcursul derulării şi de la sfârşitul studiilor aerobe şi în condiţii de orezărie;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metoda (metodele) de extracţie;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de identificare şi de cuantificare a substanţei de testat şi principalii produşi de transformare din sol şi materialele de absorbţie;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de duplicate şi de probe martor.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              rezultatul determinării activităţii microbiene;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              repetabilitatea şi sensibilitatea metodelor analitice utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ratele de recuperare (procentele acceptabile pentru ca un studiu să fie considerat valabil sunt prezentate la punctul 1.7.1);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tabelul rezultatelor exprimate ca % din doza iniţială aplicată şi, dacă este cazul, în mg· kg–1 de sol (greutate uscată);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bilanţul masic de pe parcursul şi de la începutul studiilor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              cuantificarea CO2 degajat şi a altor compuşi volatili;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              grafice ale concentraţiilor substanţei de testat din sol în funcţie de timp şi, dacă este cazul, grafice pentru produşii importanţi de transformare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              timpul de înjumătăţire sau DT50, DT75 şi DT90 pentru substanţa de testat şi, dacă este cazul, pentru produşii principali de transformare, inclusiv pragurile de încredere;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              estimarea ratei de degradare abiotică în condiţii sterile;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              o evaluare a cineticii de transformare a substanţei de testat şi, dacă este cazul, a principalilor produşi de transformare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              căile de transformare propuse, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              discutarea şi interpretarea rezultatelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date brute (de exemplu cromatogramele probelor, calculele privind viteza de transformare a probelor şi mijloacele utilizate pentru identificarea produşilor de transformare).
                           
                        
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
               
            
                  2.
               
               
                  Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.
               
            
                  3.
               
               
                  Uniunea Europeană (UE) (1995). Directiva 95/36/CE din 14 iulie 1995 de modificare a Directivei 91/414/CEE a Consiliului privind introducerea pe piaţă a produselor fitosanitare, anexa II partea A şi anexa III partea A: Transformarea şi comportamentul în mediu.
               
            
                  4.
               
               
                  Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
               
            
                  5.
               
               
                  BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.
               
            
                  6.
               
               
                  ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: Aerobic conditions.
               
            
                  7.
               
               
                  ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
               
            
                  8.
               
               
                  SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.
               
            
                  9.
               
               
                  MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).
               
            
                  10.
               
               
                  OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
               
            
                  11.
               
               
                  Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.
               
            
                  12.
               
               
                  DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).
               
            
                  13.
               
               
                  T. R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).
               
            
                  14.
               
               
                  OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981)
               
            
                  15.
               
               
                  ISO 10381-6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
               
            
                  16.
               
               
                  Anexa V la Directiva 67/548/CEE.
               
            
                  17.
               
               
                  Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, p. 85-114.
               
            
                  18.
               
               
                  Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
               
            
                  19.
               
               
                  Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
               
            
                  20.
               
               
                  Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
               
            
                  21.
               
               
                  ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
               
            
                  22.
               
               
                  Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
               
            
                  23.
               
               
                  Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.
               
            
                  24.
               
               
                  Anderson, J. P. E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, p. 215-221.
               
            
                  25.
               
               
                  ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.
               
            
                  26.
               
               
                  Anderson, J. P. E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, p. 45-60.
               
            
                  27.
               
               
                  Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16th Symposium on Environmental Science of Pesticides, p. 105-120.
               
            
                  28.
               
               
                  Keuken O., Anderson J. P. E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, p. 59-63 (SETAC-Europe).
               
            
                  29.
               
               
                  Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjödahl-Svensson K., Stenström J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, p. 68-69 (SETAC-Europe).
               
            
                  30.
               
               
                  Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, p. 197-200.
               
            
                  31.
               
               
                  Anderson, J. P. E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, p. 141-146.
               
            
                  32.
               
               
                  Hamaker, J. W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, p. 181-199.
               
            
                  33.
               
               
                  Goring, C. A. I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R. W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In „Environmental Dynamics of Pesticides”. R. Haque and V. H. Freed, Eds., p. 135-172.
               
            
                  34.
               
               
                  Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 39, p. 188-204.
               
            
                  35.
               
               
                  Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, p. 47-60.
               
            
                  36.
               
               
                  Gustafson D. I., Holden L. R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, p. 1032-1041.
               
            
                  37.
               
               
                  Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, p. 83-122.
               
            
         Apendicele 1
         SUCŢIUNEA, CAPACITATEA CÂMPULUI (FC) ŞI CAPACITATEA DE REŢINERE A APEI (WRC) (47)
         
         
                     Înălţimea coloanei de apă
                     [cm]
                  
                  
                     pF (48)
                     
                  
                  
                     Bari (49)
                     
                  
                  
                     Observaţii
                  
               
                     107
                     
                  
                  
                     7
                  
                  
                     104
                     
                  
                  
                     Sol uscat
                  
               
                     1,6 · 104
                     
                  
                  
                     4,2
                  
                  
                     16
                  
                  
                     Punct de ofilire
                  
               
                     104
                     
                  
                  
                     4
                  
                  
                     10
                  
                  
                      
                  
               
                     103
                     
                  
                  
                     3
                  
                  
                     1
                  
                  
                      
                  
               
                     6· 102
                     
                  
                  
                     2,8
                  
                  
                     0,6
                  
                  
                      
                  
               
                     3,3 · 102
                     
                  
                  
                     2,5
                  
                  
                     0,33 (50)
                     
                  
                  
                     Interval de capacităţi ale câmpului (51)
                     
                  
               
                     102
                     
                  
                  
                     2
                  
                  
                     0,1
                  
               
                     60
                  
                  
                     1,8
                  
                  
                     0,06
                  
               
                     33
                  
                  
                     1,5
                  
                  
                     0,033
                  
               
                     10
                  
                  
                     1
                  
                  
                     0,01
                  
                  
                     Capacitate de reţinere a apei (aproximativă)
                  
               
                     1
                  
                  
                     0
                  
                  
                     0,001
                  
                  
                     Sol saturat de apă
                  
               
            Sucţiunea se măsoară în cm coloană de apă sau în bari. Deoarece intervalul valorilor sucţiunii este foarte mare, se exprimă simplu ca valoare pF, adică echivalentul logaritmului din valoarea coloanei de apă exprimată în cm.
         
            Capacitatea câmpului se defineşte ca fiind cantitatea de apă care poate fi stocată, având în vedere gravitaţia, de un sol natural după 2 zile de la încheierea unei perioade lungi de ploaie sau după ce a fost irigat suficient. Se determină în sol nederanjat, in situ, pe câmp. Această măsurătoare nu se poate realiza pe probe de sol de laborator deranjat. Valorile FC determinate pentru soluri deranjate pot prezenta variaţii sistematice considerabile.
         
            Capacitatea de reţinere a apei (WHC) se determină în laborator pe soluri deranjate şi nederanjate prin saturarea unei coloane de sol cu apă prin transport capilar. Este extrem de utilă pentru solurile deranjate şi poate fi cu până la 30 % mai mare decât capacitatea câmpului (1). Se determină experimental mai uşor decât se determină valori FC fiabile.
         vide
      
      
         Apendicele 2
         Conţinutul de umiditate (g de apă în 100 g sol uscat) al diferitelor tipuri de sol din diferite ţări
         
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     Conţinut de umiditate la
                  
               
                     Tip de sol
                  
                  
                     Ţara
                  
               
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     WHC (52)
                     
                  
                  
                     pF = 1,8
                  
                  
                     pF = 2,5
                  
               
                     Nisip
                  
                  
                     Germania
                  
                  
                     28,7
                  
                  
                     8,8
                  
                  
                     3,9
                  
               
                     Nisip lutos
                  
                  
                     Germania
                  
                  
                     50,4
                  
                  
                     17,9
                  
                  
                     12,1
                  
               
                     Nisip lutos
                  
                  
                     Elveţia
                  
                  
                     44,0
                  
                  
                     35,3
                  
                  
                     9,2
                  
               
                     Lut nisipos fin
                  
                  
                     Elveţia
                  
                  
                     72,8
                  
                  
                     56,6
                  
                  
                     28,4
                  
               
                     Argilă lutoasă
                  
                  
                     Brazilia
                  
                  
                     69,7
                  
                  
                     38,4
                  
                  
                     27,3
                  
               
                     Argilă lutoasă
                  
                  
                     Japonia
                  
                  
                     74,4
                  
                  
                     57,8
                  
                  
                     31,4
                  
               
                     Argilă nisipoasă
                  
                  
                     Japonia
                  
                  
                     82,4
                  
                  
                     59,2
                  
                  
                     36,0
                  
               
                     Lut nisipos fin
                  
                  
                     Statele Unite
                  
                  
                     47,2
                  
                  
                     33,2
                  
                  
                     18,8
                  
               
                     Argilă nisipoasă
                  
                  
                     Statele Unite
                  
                  
                     40,4
                  
                  
                     25,2
                  
                  
                     13,3
                  
               
      
         Apendicele 3
         Figura 1
         Exemplu de aparat cu circulaţie continuă pentru studiul transformării substanţelor chimice în sol
                (53)
                (54)
            
         
         
            
         Figura 2
         Exemplu de balon de tip biometric pentru studiul transformării substanţelor chimice în sol
                (55)
            
         
         
            
      
      C.24.   TRANSFORMĂRI AEROBE ŞI ANAEROBE ÎN SISTEMELE DE SEDIMENTE ACVATICE
      1.   METODĂ
      Această metodă de testare reia Orientarea 308 (2002) a OCDE.
      1.1.   INTRODUCERE
      Substanţele chimice pot intra în apele de suprafaţă puţin adânci sau foarte adânci pe căi cum sunt aplicarea directă, pierderile la vaporizare, scurgerile, drenarea, eliminarea deşeurilor, efluenţii industriali, menajeri sau agricoli şi depunerile atmosferice. Această metodă de testare reia o metodă de laborator elaborată pentru măsurarea transformărilor aerobe şi anaerobe ale substanţelor chimice din sedimentele acvatice. Se bazează pe liniile directoare existente (1) (2) (3) (4) (5) (6). Numărul şi tipul sedimentelor utilizate în cadrul acestui test au fost definite cu ocazia unui atelier de lucru al OCDE privind selectarea solului/sedimentelor care a avut loc la Belgirate, Italia, în 1995 (7). În cadrul atelierului de lucru au fost de asemenea formulate recomandări privind prelevarea, manipularea şi depozitarea probelor de sedimente bazate pe liniile directoare ISO (8). Aceste studii sunt necesare pentru substanţele chimice introduse direct în apă sau care ar putea ajunge în mediul acvatic pe căile descrise anterior.
      Faza apoasă superioară a sistemelor naturale de sedimente acvatice asigură de obicei condiţii aerobe. Stratul de sediment de la suprafaţă poate fi atât aerob, cât şi anaerob, dar în adâncime sedimentele sunt în general anaerobe. Pentru a reflecta toate aceste posibilităţi, prezentul document descrie atât teste aerobe, cât şi teste anaerobe. Testul aerob constă din simularea unei coloane aerobe de apă peste un strat aerob de sediment şi un substrat cu gradient anaerob. Testul anaerob simulează un sistem apă-sediment complet anaerob. Dacă situaţia impune devieri semnificative de la aceste recomandări, de exemplu prin utilizarea de carote de sediment intact sau de sedimente care este posibil să fi fost expuse la substanţa de testat, pot fi utilizate alte metode (9).
      1.2.   DEFINIŢII
      Se folosesc întotdeauna unităţile standard internaţionale (SI).
      
         Substanţă de testat: orice substanţă, indiferent dacă este vorba despre substanţa mamă sau despre produşii de transformare relevanţi.
      
         Produşi de transformare: toate substanţele rezultate din reacţiile biotice sau abiotice de transformare a substanţei de testat, în special CO2 şi reziduurile legate.
      
         Reziduuri legate:„reziduurile legate” sunt compuşi vegetali sau animali din sol, care persistă în matrice după extracţie sub forma substanţei mamă sau a metabolitului (metaboliţilor) acesteia. Metoda de extracţie nu trebuie să modifice considerabil compuşii înşişi sau structura matricei. Natura legăturii poate fi determinată parţial prin metode de extracţie care modifică matricea şi prin tehnici analitice complexe. Până în prezent a fost identificată în acest mod natura legăturilor covalente, ionice, de sorbţie şi de captare. În general, formarea reziduurilor legate reduce bioaccesibilitatea şi biodisponibilitatea în mod considerabil (10) [modificare IUPAC 1984 (11)].
      
         Transformare aerobă: (oxidare): reacţie care se produce în prezenţa oxigenului molecular (12).
      
         Transformare anaerobă: (reducere): reacţie care se produce în absenţa oxigenului molecular (12).
      
         Ape naturale: sunt apele de suprafaţă obţinute din lacuri, râuri, fluvii etc.
      
         Sediment: este un amestec de constituenţi chimici minerali şi organici, aceştia din urmă conţinând compuşi cu un conţinut ridicat de carbon şi azot şi cu masă moleculară mare. Este depus de apele naturale şi formează interfaţa cu acestea.
      
         Mineralizare: este degradarea completă a unui compus organic în CO2 şi H2O în condiţii aerobe şi în CH4, CO2 şi H2O în condiţii anaerobe. În cadrul prezentei metode de test, dacă se foloseşte un compus marcat radioactiv, mineralizare înseamnă o degradare considerabilă pe parcursul căreia un atom de carbon marcat este oxidat sau redus cantitativ, degajându-se o cantitate adecvată de 14CO2 sau respectiv de 14CH4.
      
         Timp de înjumătăţire: t0,5 este timpul necesar pentru transformarea a 50 % dintr-o substanţă de testat în cazul transformărilor care pot fi descrise printr-o cinetică de prim ordin; nu depinde de concentraţia iniţială.
      
         DT
         
            50
         
         (timp de degradare 50): este timpul în care concentraţia iniţială a substanţei de testat se reduce cu 50 %.
      
         DT
         
            75
         
         (timp de degradare 75): este timpul în care concentraţia iniţială a substanţei de testat se reduce cu 75 %.
      
         DT
         
            90
         
         (timp de degradare 90): este timpul în care concentraţia iniţială a substanţei de testat se reduce cu 90 %.
      1.3.   SUBSTANŢE DE REFERINŢĂ
      Pentru identificarea şi cuantificarea produşilor prin metode spectroscopice şi cromatografice se folosesc substanţe de referinţă.
      1.4.   INFORMAŢII REFERITOARE LA SUBSTANŢA DE TESTAT
      Pentru măsurarea ratei de transformare se poate utiliza o substanţă de testat marcată sau nemarcată, deşi este preferabil materialul marcat. Materialul marcat este necesar pentru studierea căilor de transformare şi pentru stabilirea bilanţului masic. Se recomandă marcarea cu 14C dar poate fi utilă şi utilizarea altor izotopi cum sunt 13C, 15N, 3H, 32P. În măsura în care este posibil, marcajul se amplasează în partea sau părţile cele mai stabile ale moleculei (56). Puritatea chimică şi/sau radiochimică a substanţei de testat trebuie să fie de cel puţin 95 %.
      Înainte de efectuarea unui test sunt necesare următoarele informaţii privind substanţa de testat:
      
                  (a)
               
               
                  solubilitatea în apă (metoda A.6);
               
            
                  (b)
               
               
                  solubilitatea în solvenţi organici;
               
            
                  (c)
               
               
                  presiunea vaporilor (metoda A.4) şi constanta lui Henry;
               
            
                  (d)
               
               
                  coeficientul de împărţire n-octanol/apă (metoda A.8);
               
            
                  (e)
               
               
                  coeficientul de adsorbţie (Kd, Kr sau Koc, dacă este cazul) (metoda C.18);
               
            
                  (f)
               
               
                  hidroliza (metoda C.7);
               
            
                  (g)
               
               
                  constanta de disociere (pKa) [Orientarea 112 a OCDE] (13).
               
            
         Notă: Se precizează şi temperatura la care au fost efectuate aceste măsurători.
      Este posibil să fie utile şi informaţii privind toxicitatea substanţei de testat asupra microorganismelor din sol, privind biodegradabilitatea imediată şi/sau intrinsecă şi date privind transformările aerobe şi anaerobe din sol.
      Trebuie să fie disponibile metode analitice (inclusiv metode de extracţie şi de purificare) necesare pentru cuantificarea şi identificarea substanţei de testat şi a produşilor de transformare ai acesteia din apă şi din sedimente (a se vedea punctul 1.7.2).
      1.5.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      În cadrul metodei descrise se foloseşte un sistem de sedimente acvatice aerobe şi anaerobe (a se vedea apendicele 1) care permite:
      
                  (i)
               
               
                  măsurarea ratei de transformare a substanţei de testat într-un sistem apă-sediment;
               
            
                  (ii)
               
               
                  măsurarea ratei de transformare a substanţei de testat într-un sediment;
               
            
                  (iii)
               
               
                  măsurarea ratei de mineralizare a substanţei de testat şi/sau a produşilor săi de transformare (dacă se foloseşte o substanţă de testat marcată cu 14C);
               
            
                  (iv)
               
               
                  identificarea şi cuantificarea produşilor de transformare din faza apoasă şi din faza sedimentară şi în special realizarea bilanţului masic (dacă se testează o substanţă marcată);
               
            
                  (v)
               
               
                  măsurarea modului de repartizare a substanţei de testat şi a produşilor de transformare ai acesteia între cele două faze pe parcursul unei perioade de incubare la întuneric (pentru a evita, de exemplu, proliferarea algelor) la o temperatură constantă. Timpul de înjumătăţire, valorile DT50, DT75 şi DT90 se determină dacă datele permit acest lucru, dar nu trebuie extrapolate dincolo de perioada experimentală (a se vedea punctul 1.2).
               
            Pentru studiul aerob şi respectiv pentru studiul anaerob sunt necesare cel puţin două sedimente şi fazele apoase asociate acestora (7). Cu toate acestea, este posibil ca în unele cazuri să fie necesară utilizarea a mai mult de două sedimente acvatice, de exemplu în cazul substanţelor care pot fi prezente în apă dulce şi/sau în mediul marin.
      1.6.   APLICABILITATEA TESTULUI
      Metoda se aplică tuturor substanţelor chimice (nemarcate sau marcate) pentru care se poate utiliza o metodă analitică cu o precizie şi o sensibilitate suficientă. Se aplică pentru compuşii uşor volatili, nevolatili, solubili sau insolubili în apă. Testul nu se aplică substanţelor chimice puternic volatile în apă (de exemplu fumiganţi, solvenţi organici) care de aceea nu pot fi menţinute în apă şi/sau în sedimente în condiţiile experimentale din cadrul acestui test.
      Metoda a fost utilizată până în prezent pentru studierea transformării substanţelor chimice în ape dulci şi în sedimente, dar în principiu poate fi aplicată şi sistemelor de estuar/marine. Metoda nu este adecvată pentru simularea condiţiilor din ape curgătoare (de exemplu din râuri) sau din largul mării.
      1.7.   CRITERII DE CALITATE
      1.7.1.   Recuperare
      Extracţia şi analizarea probelor de apă şi de sediment, cel puţin în duplicat, imediat după adăugarea substanţei de testat, oferă o primă indicaţie privind repetabilitatea metodei analitice şi uniformitatea procedurii de aplicare a substanţei de testat. Ratele de recuperare din etapele ulterioare ale experimentelor sunt furnizate de bilanţurile masice respective (dacă se foloseşte material marcat). Ratele de recuperare variază între 90 % şi 110 % pentru substanţele chimice marcate (6) şi între 70 % şi 110 % pentru substanţele chimice nemarcate.
      1.7.2.   Repetabilitatea şi sensibilitatea metodei analitice
      Repetabilitatea metodei analitice (cu excepţia randamentului extracţiei iniţiale) în ceea ce priveşte cuantificarea substanţei de testat şi a produşilor de transformare se poate controla prin efectuarea unei analize duplicat pe acelaşi extract de apă sau de sediment, incubat suficient timp pentru a se forma produşii de transformare.
      Pragul de detecţie (LOD) a substanţei de testat şi a produşilor de transformare din cadrul metodei de analiză trebuie să fie de cel puţin 0,01 mg· kg–1 (substanţă de testat) în apă sau în sediment sau de 1 % din doza iniţială aplicată, respectiv valoarea mai mică dintre acestea. Se precizează şi pragul de cuantificare (LOQ).
      1.7.3.   Precizia datelor privind transformarea
      Analiza de regresie a concentraţiilor substanţei de testat în funcţie de timp oferă informaţii adecvate privind fiabilitatea curbei de transformare şi permite calcularea pragurilor de încredere pentru timpii de înjumătăţire (în cazurile de cinetică de pseudo prim ordin) sau a valorilor DT50 şi, dacă este cazul, a valorilor DT75 şi DT90.
      1.8.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.8.1.   Sistemul şi aparatura de testare
      Studiul se realizează în recipiente de sticlă (de exemplu sticle, tuburi de centrifugare), cu excepţia cazurilor în care informaţiile preliminare (coeficientul de împărţire n-octanol/apă, datele privind sorbţia etc.) arată că este posibil ca substanţa de testat să adere la sticlă, caz în care se poate lua în considerare utilizarea unui alt material (de exemplu Teflon). Dacă se ştie că substanţa de testat aderă la sticlă, problema poate fi evitată cu ajutorul uneia sau al mai multora dintre următoarele metode:
      
                  —
               
               
                  determinarea masei de substanţă de testat şi/sau de produşi de transformare ai acesteia absorbiţi pe sticlă;
               
            
                  —
               
               
                  spălarea tuturor vaselor de sticlă cu solvent la sfârşitul testului;
               
            
                  —
               
               
                  utilizarea unor produse preparate (a se vedea şi punctul 1.9.2);
               
            
                  —
               
               
                  utilizarea unei cantităţi mai mari de co-solvent pentru adăugarea substanţei de testat în sistem; dacă se foloseşte un co-solvent, acesta trebuie să nu producă o reacţie de solvoliză a substanţei de testat.
               
            În apendicele 2 şi 3 şi în referinţa 14 sunt prezentate exemple de aparatură de testare tipică (sisteme cu flux continuu şi de tip biometru). Alte sisteme utile de incubare sunt descrise la referinţa 15. Aparatura de experiment trebuie să permită schimbul de aer sau de azot şi captarea produşilor volatili. Dimensiunile aparaturii trebuie să permită îndeplinirea cerinţelor de testare (a se vedea punctul 1.9.1). Ventilarea se poate realiza fie prin barbotare uşoară, fie prin trecerea de aer sau de azot pe suprafaţa apei. În al doilea caz se recomandă amestecarea uşoară la suprafaţa apei pentru obţinerea unei mai bune repartizări a oxigenului sau a azotului în apă. Nu se va utiliza aer fără CO2, deoarece acesta poate provoca o creştere a pH-ului apei. În ambele cazuri, deranjarea sedimentului trebuie evitată în cea mai mare măsură posibil. Substanţele chimice puţin volatile se testează într-un sistem de tip biometru prin amestecarea uşoară a apei de la suprafaţă. Pentru captarea produşilor volatili se pot utiliza, de asemenea, recipiente închise, cu un spaţiu liber umplut fie cu aer atmosferic fie cu azot, şi fiole interne (16). În cadrul testelor anaerobe este necesar un schimb regulat de gaz la suprafaţă pentru compensarea consumului de oxigen de către biomasă.
      Pentru captarea produşilor volatili de transformare se pot utiliza, dar nu în mod limitativ, următoarele dispozitive: soluţii de 1 mol· dm–3 de hidroxid de potasiu sau de hidroxid de sodiu pentru dioxidul de carbon (57) şi etilen glicol, etanolamină sau parafină 2 % în xilen pentru compuşi organici. Produşii volatili formaţi în condiţii anaerobe, cum este metanul, se pot recupera, de exemplu cu ajutorul sitelor moleculare. Aceşti produşi volatili se pot arde, de exemplu până la CO2, prin trecerea gazului printr-un tub cu cuarţ umplut cu CuO la o temperatură de 900 oC şi captarea CO2 format într-o coloană de absorbţie conţinând produşi alcalini (17).
      Sunt necesare instrumente de laborator pentru analiza chimică a substanţei de testat şi a produşilor de transformare [cromatografie în fază gazoasă sau lichidă (GLC), cromatografie în fază lichidă de înaltă performanţă (HPLC), cromatografie în strat subţire (TLC), spectroscopie de masă (MS), cromatografie în fază gazoasă cuplată cu spectrometrie de masă (GC-MS), cromatografie în fază lichidă cuplată cu spectrometrie de masă (LC-MS), rezonanţă magnetică nucleară (RMN) etc.] precum şi, dacă este cazul, dispozitive de detectare a substanţelor chimice marcate radiologic sau nemarcate. Dacă se folosesc substanţe marcate radioactiv, sunt de asemenea necesare un contor de scintilaţie lichid şi un aparat de oxidare pentru combustie (pentru combustia probelor de sediment înainte de analizarea radioactivităţii).
      Pot fi necesare şi alte echipamente standard de laborator pentru realizarea analizelor fizico-chimice şi biologice (a se vedea tabelul 1 punctul 1.8.2.2), precum şi sticlărie, substanţe chimice şi reactivi.
      1.8.2.   Selectarea şi numărul de sedimente acvatice
      Locurile de prelevare se selectează în funcţie de finalitatea testului în fiecare caz în parte. Pentru alegerea locurilor de prelevare trebuie avut în vedere istoricul eventualelor aporturi de natură agricolă, industrială sau menajeră în bazinul de captare şi în apele din amonte. Nu se folosesc sedimente contaminate cu substanţa de testat sau cu produşi cu structură analogă pe parcursul ultimilor 4 ani.
      1.8.2.1.   Selectarea sedimentelor
      Pentru studiile aerobe se folosesc de obicei două sedimente (7). Cele două sedimente selectate trebuie să fie diferite în ceea ce priveşte textura şi conţinutul de carbon organic. Un sediment trebuie să aibă un conţinut ridicat de carbon organic (2,5-7,5 %) şi textură fină, iar celălalt trebuie să aibă un conţinut scăzut de carbon organic (0,5-2,5 %) şi o textură grosieră. Diferenţa dintre conţinuturile de carbon organic trebuie să fie de cel puţin 2 %. Prin „textură fină” se înţelege un conţinut de [argilă + aluviuni] (58) > 50 %, iar prin „textură grosieră” se înţelege un conţinut de [argilă + aluviuni] < 50 %. Diferenţa dintre conţinuturile de [argilă + aluviuni] ale sedimentelor trebuie să fie în mod normal mai mare sau egală cu 20 %. Dacă este posibil ca o substanţă chimică să ajungă şi în ape marine, cel puţin unul dintre cele două sisteme apă-sediment trebuie să fie de origine marină.
      Pentru studiile strict anaerobe se prelevează două probe de sediment (precum şi faza apoasă asociată) din zonele anaerobe ale sistemelor de ape de suprafaţă (7). Sedimentele şi fazele apoase se manipulează şi se transportă cu atenţie, evitându-se orice contact cu oxigenul.
      Şi alţi parametri pot fi importanţi pentru selectarea sedimentelor şi trebuie avuţi în vedere în fiecare caz în parte. De exemplu, pH-ul sedimentelor este important pentru testarea substanţelor chimice a căror transformare şi/sau sorbţie pot să depindă de pH. Dependenţa sorbţiei de pH poate fi provocată de pKa a substanţei de testat.
      1.8.2.2.   Caracteristicile probelor de apă-sediment
      Parametrii de importanţă cheie care se măsoară şi se notează în raport (precizându-se metoda utilizată) pentru apă şi sediment, precum şi etapa testului în care trebuie determinaţi sunt prezentate în rezumat în tabelul următor. Referinţele (18) (19) (20) (21) conţin informaţii privind metodele de determinare a acestor parametri.
      În plus, trebuie măsuraţi şi înregistraţi şi alţi parametri, după caz [pentru apă dulce: particule, alcalinitate, duritate, conductivitate, NO3/PO4 (raporturi şi valori individuale); pentru sedimente: capacitatea de schimb de cationi, capacitatea de reţinere a apei, carbonat, azot şi fosfor total; pentru sisteme marine: salinitatea]. Şi analiza sedimentelor şi a apei în vederea identificării nitratului, sulfatului şi a fierului biodisponibil precum şi a altor primitori de electroni poate fi utilă pentru evaluarea condiţiilor redox, în special în ceea ce priveşte transformările anaerobe.
      
         Măsurarea parametrilor caracteristici probelor apă-sediment (7) (22) (23)
      
      
                  Parametru
               
               
                  Etapele procedurii de testare
               
            
                  prelevare pe teren
               
               
                  post-manipulare
               
               
                  iniţierea aclimatizării
               
               
                  iniţierea testului
               
               
                  pe parcursul testului
               
               
                  la finalul testului
               
            
                  
                     Apă
                  
               
            
                  Origine/sursă
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Temperatură
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  pH
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
            
                  COT
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                  x
               
            
                  Concentraţie de O2
                      (59)
                  
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
            
                  Potenţial redox (59)
                  
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
            
                  
                     Sediment
                  
               
            
                  Origine/sursă
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  Adâncimea stratului
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  pH
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
            
                  Repartizarea dimensiunii particulelor
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                   
               
            
                  COT
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
            
                  Biomasă microbiană (60)
                  
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                   
               
               
                  x
               
            
                  Potenţial redox (59)
                  
               
               
                  Observaţie (culoare/miros)
               
               
                   
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
               
                  x
               
            1.8.3.   Colectarea, manipularea şi depozitarea
      1.8.3.1   Colectarea
      Pentru prelevarea de probe de sediment se foloseşte proiectul de linie directoare ISO privind prelevarea sedimentelor de fund (8). Probele de sediment se prelevează din întregul strat superior de 5-10 cm de sediment. Apa asociată se colectează din acelaşi loc şi în acelaşi timp ca şi sedimentele. Pentru studiile anaerobe, sedimentele şi apa asociată se prelevează şi se transportă evitându-se orice contact cu oxigenul (28) (a se vedea punctul 1.8.2.1). Câteva dintre dispozitivele de prelevare sunt descrise în literatură (8) (23).
      1.8.3.2   Manipulare
      Sedimentul se separă de apă prin filtrare şi se trece printr-o sită de 2 mm utilizându-se apa în exces prelevată din acelaşi loc, care apoi se elimină. Se amestecă în proporţia dorită cantităţi cunoscute de sedimente şi de apă (a se vedea punctul 1.9.1) în flacoane de incubare şi se prepară pentru perioada de aclimatizare (a se vedea punctul 1.8.4). În cazul studiului anaerobic, toate etapele de manipulare se efectuează în absenţa oxigenului (29) (30) (31) (32) (33).
      1.8.3.3   Depozitare
      Este preferabil ca probele de sediment şi apă utilizate să fie proaspăt prelevate de pe teren, dar dacă este necesară depozitarea, sedimentul şi apa se cern după cum s-a arătat anterior şi se depozitează împreună, sub apă (sub un strat de apă de 6-10 cm), la întuneric, la temperaturi de 4 ± 2 oC timp de maximum 4 săptămâni (7) (8) (23). Probele destinate studiilor aerobe se depozitează astfel încât să beneficieze de un acces nestingherit al aerului (de exemplu în recipiente deschise), iar probele destinate studiilor anaerobe se depozitează în absenţa oxigenului. Sedimentele şi apa nu trebuie să îngheţe sau să se usuce în timpul transportului şi al depozitării.
      1.8.4.   Pregătirea probelor de sediment/apă pentru test
      Înainte de a se adăuga substanţa de testat este necesară o perioadă de aclimatizare, pe parcursul căreia fiecare probă de sediment/apă se introduce în recipientul de incubare utilizat pentru testul principal, iar aclimatizarea se realizează exact în aceleaşi condiţii ca şi incubarea din cadrul testului (a se vedea punctul 1.9.1). Perioada de aclimatizare reprezintă timpul necesar pentru atingerea unei stabilităţi suficiente a sistemului în ceea ce priveşte pH-ul, concentraţia de oxigen în apă, potenţialul redox al sedimentului şi al apei şi separarea macroscopică a fazelor. Perioada de aclimatizare durează de obicei între una şi două săptămâni şi nu mai mult de patru săptămâni. Rezultatul determinărilor realizate pe parcursul acestei perioade se înregistrează.
      1.9.   DESFĂȘURAREA TESTULUI
      1.9.1.   Condiţii de testare
      Testul se efectuează într-un dispozitiv de incubare (a se vedea punctul 1.8.1) utilizându-se un raport al volumelor de apă şi de sediment între 3:1 şi 4:1 şi un strat de sediment de 2,5 cm (±0,5 cm) (61). Se recomandă utilizarea unei cantităţi de minimum 50 g sediment (greutate uscată) pentru fiecare recipient de incubare.
      Testul se realizează la întuneric, la o temperatură constantă din intervalul 10-30 oC. Temperatura recomandată este de (20 ± 2) oC. Dacă este cazul, se pot utiliza temperaturi mai scăzute (de exemplu 10 oC), în funcţie de informaţiile care trebuie obţinute prin test. Temperatura de incubare se controlează şi se înregistrează.
      1.9.2.   Tratarea şi aplicarea substanţei de testat
      Se foloseşte o singură concentraţie a substanţei de testat (62). Pentru produsele fitosanitare aplicate direct în mediul acvatic, se foloseşte doza maximă indicată în instrucţiunile de utilizare ca rată maximă de aplicare, iar calculele se efectuează având în vedere suprafaţa de apă din recipientul de test. În toate celelalte cazuri, concentraţia care trebuie utilizată se bazează pe estimările privind emisiile din mediu. Concentraţia de substanţă de testat aplicată trebuie să fie adecvată pentru caracterizarea căii de transformare şi a formării şi epuizării produşilor de transformare. Este posibil să fie necesară aplicarea unor doze mai mari (de exemplu de 10 ori) în cazurile în care concentraţiile substanţei de testat sunt apropiate de limita de detecţie la începutul studiului şi/sau dacă principalii produşi de transformare nu au putut fi detectaţi cu uşurinţă la o rată egală cu 10 % din rata de aplicare a substanţei de testat. Cu toate acestea, dacă se folosesc concentraţii mai mari ale substanţei de testat, acestea nu trebuie să aibă un efect advers important asupra activităţii microbiene din sistemul apă-sediment. Pentru obţinerea unei concentraţii constante a substanţei de testat în recipiente de diferite dimensiuni, poate fi indicată ajustarea cantităţii de produs aplicat în funcţie de adâncimea coloanei de apă din recipient faţă de adâncimea apei de pe teren (care se presupune a fi de 100 cm, dar se pot utiliza şi alte valori). Pentru un exemplu de calcul, a se vedea apendicele 4.
      Teoretic, substanţa de testat se aplică sub forma unei soluţii apoase în faza apoasă a sistemului testat. Dacă nu se poate proceda altfel, se pot utiliza cantităţi mici de solvenţi miscibili în apă (cum sunt acetona sau etanolul) pentru repartizarea şi aplicarea substanţei de testat, dar aceştia nu trebuie să depăşească 1 % v/v şi nu trebuie să aibă efecte adverse asupra activităţii microbiene a sistemului de testare. Soluţia apoasă de substanţă de testat se prepară cu atenţie – pentru a asigura o omogenizare totală se poate efectua o amestecare prealabilă cu ajutorul coloanelor de generator. După adăugarea soluţiei apoase în sistemul de testare se recomandă amestecarea uşoară a fazei apoase dar deranjând sedimentele cât mai puţin posibil.
      În mod obişnuit nu se recomandă utilizarea de produse preparate, deoarece ingredientele preparate pot afecta repartizarea substanţei de testat şi/sau a produşilor de transformare între faza apoasă şi faza sedimentară. Cu toate acestea, în cazul substanţelor puţin solubile în apă, utilizarea de materiale preparate poate constitui o alternativă adecvată.
      Numărul de recipiente de incubare depinde de numărul de prelevări (a se vedea punctul 1.9.3). Trebuie prevăzut un număr suficient de sisteme de testare, astfel încât două astfel de sisteme să poată fi sacrificate la fiecare prelevare. Dacă se folosesc unităţi martor pentru fiecare sistem de sedimente acvatice, acestea nu se tratează cu substanţa de testat. Unităţile martor pot fi utilizate pentru determinarea biomasei microbiene din sediment şi a carbonului organic total din apă şi din sediment la finalul studiului. Două dintre unităţile martor (de exemplu o unitate de martor din fiecare sediment acvatic) pot fi utilizate pentru monitorizarea parametrilor necesari privind sedimentul şi apa pe parcursul perioadei de aclimatizare (a se vedea tabelul din punctul 1.8.2.2). Dacă substanţa de testat se aplică cu ajutorul unui solvent se adaugă doi martori suplimentari pentru măsurarea efectelor negative asupra activităţii microbiene din sistemul de testare.
      1.9.3.   Durata testului şi recoltarea probelor
      Durata experimentului nu trebuie să depăşească în mod normal 100 de zile (6) şi trebuie să se desfăşoare până la stabilirea căilor de degradare şi a profilului de repartizare apă/sediment sau până la disiparea a 90 % din substanţa de testat prin transformare şi/sau volatilizare. Trebuie efectuate cel puţin şase recoltări (inclusiv timpul zero) şi se realizează un studiu facultativ preliminar (a se vedea punctul 1.9.4) pentru stabilirea regimului de recoltare şi a duratei testului, cu excepţia cazurilor în care sunt disponibile din studii anterioare suficiente date privind substanţa de testat. Pentru substanţele hidrofobe poate fi necesară instituirea unor puncte suplimentare de prelevare pe parcursul perioadei iniţiale pentru determinarea ratei de repartizare între faza apoasă şi faza sedimentară.
      La fiecare prelevare, se iau pentru analiză recipiente de incubare (duplicat). Sedimentul şi apa care îl acoperă se analizează separat (63). Se scoate cu atenţie apa de la suprafaţă, evitându-se atingerea sedimentului. Extracţia şi caracterizarea substanţei de testat şi a produşilor de transformare se realizează în conformitate cu procedurile analitice adecvate. Se elimină materialele adsorbite pe pereţii recipientului de incubare şi în tuburile utilizate pentru captarea produşilor volatili.
      1.9.4.   Testul preliminar opţional
      Dacă durata şi regimul de prelevare a probelor nu pot fi estimate pe baza altor studii relevante asupra substanţei de testat, poate fi adecvată efectuarea unui test preliminar în aceleaşi condiţii ca şi cele propuse pentru studiul definitiv. Dacă se efectuează acest test preliminar, se descriu pe scurt condiţiile experimentale şi rezultatele testului.
      1.9.5.   Măsurători şi analiză
      La fiecare prelevare se măsoară şi se înregistrează concentraţia substanţei de testat şi produşii de transformare din apă şi din sediment (ca procent şi concentraţie de substanţă aplicată). Ca regulă generală, se identifică toţi produşii de transformare pentru care se detectează ≥ 10 % din radioactivitatea totală aplicată sistemului apă/sediment, indiferent de prelevare, cu excepţia cazurilor în care există justificări rezonabile. Se identifică de asemenea produşii de transformare a căror concentraţie creşte constant pe durata studiului, chiar şi în cazurile în care concentraţiile acestora nu depăşesc limitele menţionate anterior, deoarece este posibil ca acesta să fie un indiciu asupra persistenţei. Procesul verbal trebuie să conţină justificări în acest sens.
      Rezultatele privind sistemele de captare a gazelor/produşilor volatili (CO2 şi alţii, de exemplu compuşi organici volatili) se înregistrează la fiecare prelevare. Se înregistrează şi ratele de mineralizare. La fiecare prelevare se menţionează şi reziduurile (legate) care nu pot fi extrase.
      2.   DATE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Se calculează bilanţul masic total şi recuperarea (a se vedea punctul 1.7.1) radioactivităţii adăugate pentru fiecare prelevare. Rezultatele se înregistrează ca procent de radioactivitate adăugată. Repartizarea radioactivităţii între apă şi sediment se înregistrează ca procent şi concentraţie pentru fiecare prelevare.
      Se calculează timpii de înjumătăţire, valorile DT50 şi, dacă este cazul, valorile DT75 şi DT90, precum şi pragurile de încredere (a se vedea punctul 1.7.3). Se pot obţine informaţii privind rata de disipare a substanţei de testat în apă şi în sediment cu ajutorul unor instrumente adecvate de evaluare. Acestea merg de la cinetica de pseudo-prim ordin, tehnici empirice de interpolare care folosesc soluţii grafice sau numerice până la alte metode de evaluare care folosesc de exemplu modele cu unul sau mai multe compartimente. Literatura de specialitate conţine detalii suplimentare în acest sens (35) (36) (37).
      Toate abordările prezintă avantaje şi inconveniente, iar complexitatea lor variază considerabil. Ipoteza unei cinetici de prim ordin constituie o simplificare excesivă a procesului de degradare şi de repartizare dar, dacă se poate utiliza, oferă un termen (constanta vitezei sau timpul de înjumătăţire) uşor de înţeles şi foarte util pentru modelele de simulare şi pentru calcularea concentraţiilor previzibile din mediu. Este posibil ca metodele empirice sau transformările liniare să producă o mai bună interpolare a curbelor şi a datelor şi să permită astfel o mai bună estimare a timpilor de înjumătăţire, a valorilor DT50 şi, dacă este cazul, a valorilor DT75 şi DT90. Cu toate acestea, utilizarea constantelor derivate este limitată. Modelele cu compartimente pot genera constante utile pentru evaluarea riscurilor care descriu viteza de degradare din diferitele compartimente şi repartizarea substanţei chimice. Acestea se folosesc în general pentru estimarea constantelor de viteză pentru formarea şi transformarea principalilor produşi de transformare. Metoda aleasă trebuie justificată în toate cazurile, iar experimentatorul trebuie să demonstreze grafic şi/sau statistic calitatea de ajustare.
      3.   RAPORT
      3.1.   RAPORT DE TESTARE
      Raportul de testare trebuie să conţină următoarele informaţii:
      
                   
               
               
                  Substanţa de testat:
                  
                              —
                           
                           
                              denumirea comună, denumirea chimică, numărul CAS, formula structurală (indicându-se poziţia marcajului dacă se foloseşte material marcat radioactiv) şi proprietăţile fizice şi chimice relevante;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              puritatea (impurităţile) substanţei de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              puritatea radiochimică a substanţei chimice marcate şi activitatea molară (dacă este cazul).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Substanţe de referinţă:
                  
                              —
                           
                           
                              denumirea chimică şi structura substanţelor de referinţă utilizate pentru caracterizarea şi/sau identificarea produşilor de transformare.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Sedimente şi apă de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              localizarea şi descrierea locului/locurilor din care au fost prelevate sedimentele acvatice şi, dacă este posibil, istoricul contaminării;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              orice informaţii privind recoltarea, depozitarea (dacă este cazul) şi aclimatizarea sistemelor apă-sediment;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              caracterizarea probelor apă-sediment în conformitate cu tabelul din punctul 1.8.2.2.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condiţii de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              sistemul de testare utilizat (cu circulaţie continuă, biometru, mod de ventilare, metodă de amestecare, volum de apă, masă sedimentară, grosime a stratului de apă şi a stratului de sediment, dimensiunea recipientelor de testare etc.);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              aplicarea substanţei de testat în sistemul de testare: concentraţia de testare, numărul de duplicate şi martori, modul de aplicare a substanţei de testat (de exemplu utilizarea unui solvent, dacă este cazul) etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatura de incubare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              număr de prelevări;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metode de extracţie, randamente şi praguri de detecţie şi metode analitice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metode de caracterizare/identificare a produşilor de transformare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              devierile de la protocolul de test sau de la condiţiile de testare pe parcursul studiului.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultate:
                  
                              —
                           
                           
                              date brute privind analizele reprezentative (toate datele brute se păstrează în arhivele BPL);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              repetabilitatea şi sensibilitatea metodelor analitice utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ratele de recuperare (valorile procentuale acceptabile pentru ca un studiu să fie considerat valabil sunt prezentate la punctul 1.7.1);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tabelul rezultatelor exprimate ca % din doza aplicată şi în mg· kg–1 în apă, sedimente şi în întregul sistem (numai %) din substanţa de testat şi, dacă este cazul, din produşii de transformare şi din radioactivitatea neextractibilă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              bilanţul masic de pe parcursul şi de la începutul studiilor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              reprezentări grafice ale transformării fracţiunilor apă/sediment şi ale celor din întregul sistem (inclusiv mineralizarea);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              ratele de mineralizare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              timpul de înjumătăţire sau valorile DT50, DT75 şi DT90 pentru substanţa de testat şi, dacă este cazul, pentru produşii principali de transformare, inclusiv pragurile de încredere în apă, sediment şi în întregul sistem;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              o evaluare a cineticii de transformare a substanţei de testat şi, dacă este cazul, a principalilor produşi de transformare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              o cale de transformare propusă, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              discutarea rezultatelor.
                           
                        
            4.   REFERINŢE BIBLIOGRAFICE
      
                  1.
               
               
                  BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.
               
            
                  2.
               
               
                  Commission for registration of pesticides: Application for registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.
               
            
                  3.
               
               
                  MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United-Kingdom.
               
            
                  4.
               
               
                  Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada. p. 35-37.
               
            
                  5.
               
               
                  US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism.
               
            
                  6.
               
               
                  SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.
               
            
                  7.
               
               
                  OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
               
            
                  8.
               
               
                  ISO/DIS 5667-12, (1994). Water quality – Sampling – Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments.
               
            
                  9.
               
               
                  US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080.
               
            
                  10.
               
               
                  DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).
               
            
                  11.
               
               
                  T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).
               
            
                  12.
               
               
                  OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).
               
            
                  13.
               
               
                  OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
               
            
                  14.
               
               
                  Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, p. 149-158.
               
            
                  15.
               
               
                  Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D. H. Hutson, T. R. Roberts, Eds.), Vol. 1, p. 85-114. J. Wiley & Sons.
               
            
                  16.
               
               
                  Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, p. 631-637.
               
            
                  17.
               
               
                  Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C-labelled model surfactants. Water Research 21, p. 661-667.
               
            
                  18.
               
               
                  Black, C. A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.
               
            
                  19.
               
               
                  APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (17th edition). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
               
            
                  20.
               
               
                  Rowell, D. L. (1994). Soil Science Methods and Applications, Longman.
               
            
                  21.
               
               
                  Light, T. S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chemistry 44, p. 1038-1039.
               
            
                  22.
               
               
                  SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests”, 3-4 July 1991.
               
            
                  23.
               
               
                  SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I. R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
               
            
                  24.
               
               
                  Vink, J. P. M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, p. 2858-2868.
               
            
                  25.
               
               
                  Vink, J. P. M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, p. 329-338.
               
            
                  26.
               
               
                  Anderson, T. H., Domsch, K. H. (1985). Maintenance carbon requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, p. 97-203.
               
            
                  27.
               
               
                  ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.
               
            
                  28.
               
               
                  Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), p. 13-21.
               
            
                  29.
               
               
                  Shelton, D. R. and Tiedje, J. M. (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. Ap. Environ. Microbiol. 47, p. 850-857.
               
            
                  30.
               
               
                  Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W. E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W. J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, p. 1527-1550.
               
            
                  31.
               
               
                  Pagga, U. and Beimborn, D. B. (1993). Anaerobic biodegradation tests for organic compounds. Chemoshpere 27, p. 1499-1509.
               
            
                  32.
               
               
                  Nuck, B. A. and Federle, T. W. (1986). A batch test for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, p. 3597-3603.
               
            
                  33.
               
               
                  US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090.
               
            
                  34.
               
               
                  Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, p. 961-968.
               
            
                  35.
               
               
                  Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, p.187 – 203.
               
            
                  36.
               
               
                  Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, p. 47-60.
               
            
                  37.
               
               
                  Carlton, R. R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Diseases, p. 1349-1354.
               
            
         Apendicele 1
         INFORMAŢII PRIVIND SISTEMELE DE TESTARE AEROBE ŞI ANAEROBE
         Sistemul aerob de testare
         Sistemul aerob de testare descris în prezenta metodă de testare este format dintr-un strat aerob de apă (concentraţiile tipice ale oxigenului variază între 7 şi 10 mg· l–1) şi dintr-un strat de sediment aerob la suprafaţă şi anaerob sub suprafaţă [potenţialul redox mediu tipic (Eh) din zona anaerobă a sedimentului variază între – 80 şi – 90 mV]. În fiecare unitate de incubare se trece aer umed pe suprafaţa apei pentru a asigura o cantitate suficientă de oxigen în spaţiul liber.
         Sistemul anaerob de testare
         Metoda de test din cadrul sistemului anaerob de testare este practic aceeaşi cu cea din cadrul sistemului aerob, cu excepţia faptului că se trece azot umed pe suprafaţa apei din fiecare unitate de incubare pentru a crea un spaţiu liber cu azot. Sedimentele şi apa se consideră anaerobe dacă potenţialul redox (Eh) este sub – 100 mV.
         În cadrul testului anaerob, evaluarea mineralizării cuprinde măsurarea dioxidului de carbon şi a metanului degajat.
      
      
         Apendicele 2
         EXEMPLU DE APARAT CU CIRCULAŢIE CONTINUĂ
         
            
      
      
         Apendicele 3
         EXEMPLU DE BIOMETRU
         
            
      
      
         Apendicele 4
         EXEMPLU DE CALCULARE A DOZEI APLICATE RECIPIENTULUI DE TESTARE
         
                     Diametrul intern al cilindrului:
                  
                  
                     = 8 cm
                  
               
                     Adâncimea coloanei de apă, fără sediment:
                  
                  
                     = 12 cm
                  
               
                     Suprafaţă: 3,142 × 42
                     
                  
                  
                     = 50,3 cm2
                     
                  
               
                     Rata de aplicare: 500 g substanţă de testat/ha înseamnă 5 μg/cm2
                     
                  
                  
                      
                  
               
                     Total în μg: 5 × 50,3
                  
                  
                     = 251,5 μg
                  
               
                     Ajustarea cantităţii pentru o adâncime de 100 cm:
                     12 × 251,5 ÷ 100
                  
                  
                     = 30,18 μg
                  
               
                     Volumul coloanei de apă: 50,3 × 12
                  
                  
                     = 603 ml
                  
               
                     Concentraţia în apă: 30,18 ÷ 603
                  
                  
                     = 0,050 μg/ml sau μg/l
                  
               
      
         (1)  Rezultatele acestor teste între laboratoare, precum şi un corringedum tehnic la ISO 6341 oferă un CE50 la 24 h al dicromatului de potasiu (K2Cr2O7) cuprins în intervalul 0,6-1,7 mg/l.
      
         (2)  Apă cu un grad de puritate adecvat, de exemplu deionizată, distilată sau obţinută prin osmoză inversă, cu o conductivitate de preferinţă inferioară valorii de 10 μS.cm–1.
      
         (3)  D1 şi D2 nu se exprimă ca medie, dacă există o diferenţă considerabilă.
      
         (4)  D1 şi D2 nu se exprimă ca medie, dacă există o diferenţă considerabilă.
      
         (5)  sau la sfârşitul incubării.
      
         (6)  D1 şi D2 nu se exprimă ca medie dacă există o diferenţă considerabilă.
      
         (7)  sau la sfârşitul incubării
      
         (8)  Nu se va lua în considerare media dacă este o diferenţă considerabilă între replici.
      
         (9)  Nu se face o medie dacă sunt diferenţe considerabile între replici.
      
         (10)  După folosire, soluţiile conţinând săruri de mercur trebuie tratate pentru a evita pătrunderea mercurului în mediul înconjurător.
      
         (11)  Mabey şi Mill recomandă folosirea boratului şi acetatului în locul fosfatului (11).
      
         (12)  Astfel de informaţii pot veni din alte surse, precum informaţiile despre hidroliza unor compuşi cu structură similară, din literatură sau din alte teste de hidroliză semicantitativă cu substanţele experimentale într-un stadiu incipient de dezvoltare.
      
         (13)  Dacă graficul transformării logaritmice în funcţie de timp nu arată o funcţie liniară (egalată de o viteză de reacţie de ordin întâi), atunci folosirea ecuaţiei [3] nu este adecvată pentru determinarea constantelor vitezelor de reacţie ale compuşilor experimentali.
      
         (14)  Valorile pH-ului din aceste tabele au fost calculate pornind de la măsurătorile potenţiale folosind ecuaţia Sörensen standard (1909). Valorile care corespund pH-ului sunt cu 0,04 unităţi mai mari decât valorile din tabel.
      
         (15)  Se adaugă cristale mici de timol sau substanţe asemănătoare pentru a preveni creşterea mucegaiurilor.
      
         (16)  Valori medii ale determinărilor efectuate de trei ori.
      
         (17)  Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231.
      
         (18)  Se prelevează apa după adăugarea a cel puţin 3 volume ale incintei experimentale.
      Valorile dintre paranteze sunt numere de eşantioane (apă, peşti) care trebuie prelevate, dacă se procedează la o eşantionare suplimentară.
      
                  
                     Notă
                  
               
               
                  :
               
               
                  Estimarea înaintea experimentului a lui k2, pentru un log Pow = 4,0 este de 0,652 zile–1. Durata totală a experimentului este fixată la: 3 × abs. = 3 × 4,6 zile, adică 14 zile. Pentru estimarea „abs.” se utilizează apendicele 3.
               
            
         (19)  Meyer, A., Bierman, C. H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, p. 231-236.
      
         (20)  Dintr-o coloană poate fi aleasă o serie de cinci (sau mai multe) concentraţii. Punctele de mijloc dintre concentraţiile din coloana (x) se găsesc în coloana (2x + 1). Valorile enumerate pot să reprezinte concentraţii exprimate ca procente greutate pe unitatea de volum (mg/l sau μg/l). Valorile pot fi înmulţite sau împărţite cu orice putere a lui 10, după caz. Coloana 1 poate fi folosită dacă există o incertitudine semnificativă asupra nivelului de toxicitate.
      
         (21)  OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, „Fish, Early-life Stage Toxicity Test”.
      
         (22)  Pentru embrioni.
      
         (23)  Pentru larve.
      
         (24)  Întuneric pentru embrioni şi larve până la o săptămână după ieşirea din ou, cu excepţia cazului în care se inspectează. Apoi se dă o lumină atenuată pe durata testului.
      
         (25)  Conform FAO şi sistemului SUA (85).
      
         (26)  Este de preferat ca parametrii respectivi să prezinte valori în domeniul dat. Dacă, totuşi, apar dificultăţi în găsirea unui sol corespunzător, se acceptă valorile mai mici decât minimum indicat.
      
         (27)  Solurile cu un conţinut de carbon organic mai mic de 3 % pot schimba corelaţia dintre conţinutul de substanţe organice şi adsorbţie. Astfel, se recomandă utilizarea solurilor cu un conţinut minimum de carbon organic de 0,3 %.
      
         (28)  
      
         (29)  Reprezentările grafice ale concentraţiei substanţei de testat în fază apoasă () în funcţie de timp s-ar mai putea utiliza la estimarea atingerii palierului de echilibru (apendicele 5 figura 2).
      
         (30)  TD-50: timpul de degradare pentru 50 % din substanţa testată.
      
         (31)  W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), p. 121-128.
      
         (32)  W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), p. 107-119.
      
         (33)  W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), p. 1373-1384.
      
         (34)  W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D Report No 106 01044 (1994).
      
         (35)  B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, p. 285-304.
      
         (36)  Date din industrie.
      
         (37)  Se indică vasul care s-a utilizat pentru experimentare.
      
         (38)  Mortalitatea animalelor adulte se consemnează cu „M” în căsuţa respectivă.
      
         (39)  Puii avortaţi se consemnează cu „AV” în căsuţa respectivă.
      
         (40)  De exemplu, dacă substanţa de testat conţine un ciclu, acesta trebuie marcat; dacă substanţa de testat conţine două sau mai multe cicluri, este posibil să fie necesare studii separate pentru evaluarea evoluţiei fiecărui ciclu şi pentru a obţine informaţii fiabile privind formarea produşilor de transformare.
      
         (41)  Caracteristica de reţinere a apei a unui sol se poate măsura ca fiind capacitatea câmpului, ca fiind capacitatea de reţinere a apei sau ca potenţial de sucţiune (pF). Pentru explicaţii a se vedea apendicele 1. În raportul de testare se precizează dacă densitatea aparentă şi caracteristica de reţinere a apei au fost determinate pe probe de sol nederanjat sau deranjat (prelucrat).
      
         (42)  Cercetări recente au arătat că solurile din zonele cu climat temperat se pot depozita la – 20 oC timp de peste trei luni (18) (29) fără pierderi semnificative la nivelul activităţii microbiene.
      
         (43)  Solul nu trebuie să fie nici prea umed, nici prea uscat, astfel încât să se asigure condiţii adecvate de aerare şi de nutriţie pentru microflora din sol. Conţinuturile de umiditate recomandat pentru o creştere microbiană optimă variază între 40-60 % din capacitatea de reţinere de apă (WHC) şi între 0,1-0,33 bari (6). Acest ultim interval corespunde unui interval de pF de 2,0-2,5. În apendicele 2 sunt prezentate conţinuturile tipice de umiditate ale diferitelor tipuri de soluri.
      
         (44)  Condiţiile aerobe sunt predominante în solurile de suprafaţă şi chiar în solurile subterane, după cum au arătat rezultatele unui proiect de cercetare finanţat de UE [K. Takagi et al. (1992), Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., p. 270-277, 17-21 August, Sigtuna, Suedia]. Producerea condiţiilor anaerobe este posibilă ocazional în timpul inundării solurilor după ploi abundente sau în cazul condiţiilor de orezărie.
      
         (45)  Studiile aerobe pot fi încheiate în mai puţin de 120 de zile sub rezerva utilizării căii de transformare şi a producerii mineralizării efective până la data respectivă. Testul poate fi încheiat după 120 de zile sau când cel puţin 90 % din substanţa de testat este transformată, dar numai dacă s-a format cel puţin 5 % CO2.
      
         (46)  Calculul concentraţiei iniţiale în funcţie de suprafaţă se realizează pe baza următoarei ecuaţii:
      
         
      
                  Csol
                  
               
               
                  =
               
               
                  Concentraţi iniţială din sol [mg· kg–1]
               
            
                  A
               
               
                  =
               
               
                  Rata de aplicare [mg· ha–1]; 1 = grosimea stratului de sol [m]; d = densitatea aparentă a solului uscat [kg· m–3].
               
            Ca regulă generală, o rată de aplicare de 1 kg· ha–1 determină o concentraţie de aproximativ 1 mg· kg–1 într-un strat de 10 cm (presupunând că densitatea aparentă este de g· cm–3).
      
         (47)  Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
      
         (48)  pF = log din valoarea coloanei de apă exprimate în cm.
      
         (49)  1 bar = 105 Pa.
      
         (50)  Corespunde unui conţinut aproximativ de apă de 10 % în nisip, de 35 % în aluviuni şi de 45 % în argilă.
      
         (51)  Capacitatea câmpului nu este constantă, ci variază în funcţie de tipul de sol de la pF 1,5 la 2,5.
      
         (52)  Capacitate de reţinere a apei.
      
         (53)  Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R. J. Hance, Ed.), Academic Press, p. 123-157.
      
         (54)  Guth, J. A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D. H. Hutson, T. R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, p. 85-114.
      
         (55)  Anderson, J. P. E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, p. 141-146.
      
         (56)  De exemplu, dacă substanţa de testat conţine un ciclu, acesta trebuie marcat; dacă substanţa de testat conţine două sau mai multe cicluri, este posibil să fie necesare studii separate pentru evaluarea evoluţiei fiecărui ciclu şi pentru a obţine informaţii fiabile privind formarea produşilor de transformare.
      
         (57)  Întrucât aceste soluţii alcaline de absorbţie absorb atât dioxidul de carbon din aerul utilizat pentru ventilaţie, cât şi pe cel produs prin respiraţie în cadrul experienţelor aerobe, acestea trebuie înlocuite la intervale regulate pentru a evita saturarea lor şi în consecinţă pierderea capacităţii de absorbţie.
      
         (58)  [Argilă + aluviuni] este fracţiunea minerală a sedimentului cu dimensiuni ale particulelor < 50 μm.
      
         (59)  Conform rezultatelor cercetărilor recente, măsurarea concentraţiilor de oxigen din apă şi a potenţialului redox nu au nici valoare mecanică, nici valoare predictivă în ceea ce priveşte creşterea şi dezvoltarea coloniilor microbiene în apele de suprafaţă (24) (25). Determinarea consumului biochimic de oxigen (la prelevare, la începutul şi la sfârşitul testului) şi a concentraţiilor micro/macro elementelor nutritive Ca, Mg şi Mn (la începutul şi la sfârşitul testului) în apă şi măsurarea N total şi P total în sedimente (la prelevare şi la sfârşitul testului) pot constitui instrumente mai bune de interpretare şi de evaluare a ratelor şi a căilor de biotransformare aerobă.
      
         (60)  Metoda ratei de respiraţie microbiene (26), metoda fumigării (27) sau măsurători numerice (bacterii, actinomicete, ciuperci şi total colonii) pentru studiile aerobe; rata metanogenezei pentru studiile anaerobe.
      
         (61)  Studii recente au arătat că depozitarea la 4 oC poate determina o scădere a conţinutului de carbon organic din sediment care poate duce la reducerea activităţii microbiene (34).
      
         (62)  Efectuarea unui test pentru o a doua concentraţie poate fi utilă pentru substanţele chimice care ajung în apele superficiale pe alte căi care determină concentraţii considerabil diferite, în măsura în care concentraţia cea mai mică poate fi analizată cu suficientă precizie.
      
         (63)  În cazurile în care este posibil ca produşii rezultaţi din transformările anaerobe să se reoxideze foarte repede, se asigură condiţii anaerobe şi în timpul recoltării şi al analizei.