CELEX: 31993L0070
Language: pl
Date: 1993-07-28 00:00:00
Title: Jedenasta Dyrektywa Komisji 93/70/EWG z dnia 28 lipca 1993 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analiz do celów urzędowej kontroli pasz

Ważna informacja prawna

|

31993L0070

Dziennik Urzędowy L 234 , 17/09/1993 P. 0017 - 0021 Specjalne wydanie fińskie: Rozdział 3 Tom 52 P. 0132  Specjalne wydanie szwedzkie: Rozdział 3 Tom 52 P. 0132 

		Jedenasta Dyrektywa Komisji 93/70/EWGz dnia 28 lipca 1993 r.ustanawiająca wspólnotowe metody analiz do celów urzędowej kontroli paszKOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą,uwzględniając dyrektywę Rady 70/373/EWG z dnia 20 lipca 1970 r. w sprawie wprowadzenia wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów urzędowej kontroli pasz [1], ostatnio zmienioną rozporządzeniem (EWG) nr 3768/85 [2], w szczególności jej art. 2,a także mając na uwadze, co następuje:dyrektywa 70/373/EWG wymaga, aby urzędowe kontrole pasz były przeprowadzane przy użyciu wspólnotowych metody pobierania próbek i analizy w celu sprawdzenia zgodności z wymaganiami wynikającymi z przepisów ustawowych, wykonawczych lub administracyjnych dotyczących jakości i składu pasz;należy ustalić wspólnotową metodę analizy dotyczącą dodatku halofuginonu w celu jej wykorzystywania przy sprawdzaniu zgodności z warunkami jego stosowania w żywieniu zwierząt;środki przyjęte w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Pasz,PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:Artykuł 1Państwa Członkowskie wymagają, aby do analizy zawartości halofuginonu, do celów urzędowej kontroli pasz, stosowana była metoda opisana w Załączniku do niniejszej dyrektywy.Artykuł 2Państwa Członkowskie wprowadzą w życie przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy najpóźniej do dnia 30 czerwca 1994 r. i niezwłocznie powiadomią o tym Komisję.Przepisy przyjęte przez Państwa Członkowskie zawierają odniesienie do niniejszej dyrektywy lub odniesienie takie towarzyszy ich urzędowej publikacji. Metody dokonywania takiego odniesienia określane są przez Państwa Członkowskie.Artykuł 3Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.Sporządzono w Brukseli, dnia 28 lipca 1993 r.W imieniu KomisjiRené SteichenCzłonek Komisji[1] Dz.U. L 170 z 3.8.1970, str. 2.[2] Dz.U. L 362 z 31.12.1985, str. 8.--------------------------------------------------ZAŁĄCZNIKOZNACZANIE HALOFUGINONUDL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3–3-hydroksy-2-piperydyl)acetonyl]-chinazolina-4-(3H)-jednohydrobromian.1. Cel i zakresMetoda ta służy oznaczaniu zawartości halofuginonu w paszach. Dolna granica oznaczenia wynosi 1 mg/kg.2. ZasadaPoddany działaniu gorącej wody halofuginon jest ekstrahowany jako wolna zasada w octanie etylowym, a następnie rozdzielona jako związek chlorowodorowy w wodnym roztworze kwasu. Ekstrakt jest oczyszczany metodą chromatografii jonowymiennej. Zawartość halofuginonu jest oznaczana za pomocą chromatografii cieczowej wysokiej wydajności z odwróconymi fazami (HPLC) z wykorzystaniem detektora UV.3. Odczynniki3.1. Acetonitryl, klasa HPLC3.2. Żywica amberlitowa XAD-23.3. Octan amonowy3.4. Octan etylowy3.5. Lodowy kwas octowy3.6. Wzorcowy halofuginon (DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3–3-hydroksy-2-piperydyl)acetonyl]-chinazolina-4-(3H)-jednohydrobromian, E 764)3.6.1. Wzorcowy roztwór halofuginonu o stężeniu 100 μg/mlOdważyć 50 mg halofuginonu (ppkt 3.6) z dokładnością do 0,1 mg w kolbie z podziałką o pojemności 500 ml, rozpuścić w buforowym roztworze octanu amonowego (ppkt 3.18), uzupełnić do oznaczenia roztworem buforowym i zamieszać. Roztwór ten przechowywany bez dopływu światła zachowuje stabilność przez trzy tygodnie w temperaturze 5 °C.3.6.2. Roztwory wzorcoweDo kilku kolb z podziałką o pojemności 100 ml przenieść 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 i 6,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (ppkt 3.6.1). Uzupełnić do oznaczenia fazą ruchomą (ppkt 3.21) i wymieszać. Roztwory te mają odpowiednio stężenia 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 i 6,0 μg/ml halofuginonu. Roztwory te należy przygotowywać tuż przed użyciem.3.7. Kwas chlorowodorowy (ρ20 około 1,16 g/ml).3.8. Metanol3.9. Azotan srebra3.10. Askorbinian sodu3.11. Węglan sodu3.12. Chlorek sodu3.13. EDTA (kwas etylenodwuaminoczterooctowy, sól disodowa)3.14. Woda, klasa HPLC3.15. Roztwór węglanu sodowego, β = 10 g/100 ml3.16. Roztwór węglanu sodowego nasycony chlorkiem sodowym, β = 5 g/100 mlRozpuścić 50 g węglanu sodowego (ppkt 3.11) w wodzie, rozcieńczyć w stosunku 1:1 i dodawać chlorek sodu (ppkt 3.12) aż do nasycenia roztworu.3.17. Kwas chlorowodorowy o stężeniu 0,1 mol/lSporządzić roztwór 10 ml HCl (ppkt 3.7) w wodzie w stosunku 1: 1.3.18. Roztwór buforowy octanu amonowego, w przybliżeniu 0,25.Rozpuścić 19,3 g octanu amonowego (ppkt 3.3) i 30 ml kwasu octowego (ppkt 3.5) w wodzie (ppkt 3.14) i rozcieńczyć w stosunku 1:1.3.19. Przygotowanie żywicy amberlitowej XAD-2Płukać odpowiednią ilość amberlitu (ppkt 3.2) w wodzie, dopóki nie zostaną usunięte wszystkie jony chlorkowe, zgodnie ze wskazaniami badania azotanem srebra (ppkt 3.20) przeprowadzanego na odrzuconej fazie ciekłej. Następnie wypłukać żywicę w 50 ml metanolu (ppkt 3.8), wylać metanol i przechowywać żywicę w świeżym metanolu.3.20. Roztwór azotanu srebra o stężeniu około 1 mol/lRozpuścić 0,17 g azotanu srebra (ppkt 3.9) w 10 ml wody.3.21. Faza ruchoma chromatografii cieczowej HPLCWymieszać 500 ml acetonitrylu (ppkt 3.1) z 300 ml buforowego roztworu octanu amonowego (ppkt 3.18) i 1200 ml wody (ppkt 3.14). Skorygować pH do poziomu 4,3, stosując w tym celu kwas octowy (ppkt 3.5). Przefiltrować przez filtr 0,22 μm (ppkt 4.8) i odgazować roztwór (np. stosując ultradźwięki przez 10 min). Roztwór ten przechowywany bez dopływu światła w zamkniętym naczyniu zachowuje stabilność przez jeden miesiąc.4. Aparatura4.1. Łaźnia ultradźwiękowa4.2. Obrotowy aparat wyparny4.3. Wirówka4.4. Sprzęt do chromatografii cieczowej HPLC z detektorem promieniowania UV o różnych długościach fal lub detektor z zespołem diod.4.4.1. Kolumna do chromatografii cieczowej, 300 mm × 4 mm, C 18, napełnienie 10 mm lub inna równoważna kolumna4.5. Szklana kolumna (300 mm × 10 mm) wyposażona w filtr ze szkła matowego i zawór.4.6. Filtry z włókien szklanych, średnica 150 mm4.7. Filtry membranowe, 0,45 μm4.8. Filtry membranowe, 0,22 μm5. ProceduraUwaga:Halofuginon w postaci wolnej zasady jest niestabilny w roztworach zasadowym i octanu etylowego. Nie powinien on pozostawać w octanie etylowym dłużej niż przez 30 min.5.1. Przepisy ogólne5.1.1. Należy przeprowadzić analizę metodą ślepej próby w celu sprawdzenia obecności halofuginonu lub substancji zakłócających.5.1.2. Test odzysku powinien być przeprowadzony poprzez analizę metodą ślepej próby, która została wzmocniona przez dodanie pewnej ilości halofuginonu, podobnego do występującego w próbce. W celu zwiększenia stężenia do poziomu 3 mg/kg dodać 300 ml wzorcowego roztworu podstawowego (ppkt 3.6.1) do 10 g ślepej próby, wymieszać i odczekać przez 10 min przed rozpoczęciem etapu ekstrakcji (ppkt 5.2).Uwaga:do celów niniejszej metody ślepa próba powinna być podobna pod względem rodzaju do tej z badanej próbki i w czasie analizy nie powinno dojść do wykrycia halofuginonu.5.2. EkstrakcjaOdważyć 10 g przygotowanej próbki z dokładnością do 0,1 g do probówki wirówki o pojemności 200 ml, dodać 0,5 g askorbinianu sodu (ppkt 3.10), 0,5 g EDTA (ppkt 3.13) i 20 ml wody, a następnie wymieszać. Umieścić probówkę na 5 min w łaźni wodnej (80 °C). Po schłodzeniu do temperatury pokojowej dodać 20 ml roztworu węglanu sodowego (ppkt 3.15) i wymieszać. Natychmiast dodać 100 ml octanu etylowego (ppkt 3.4) i mocno wstrząsać w ręku przez 15 sekund. Następnie umieścić probówkę na trzy minuty w łaźni ultradźwiękowej (ppkt 4.1) i poluzować korek. Odwirowywać przez dwie minuty i zdekantować fazę octanu etylowego przez filtr z włókna szklanego (ppkt 4.6) do lejka rozdzielczego o pojemności 500 ml. Powtórzyć proces ekstrakcji próbki z drugą porcją 100 ml octanu etylowego. Płukać połączone ekstrakty przez jedną minutę, używając 50 ml roztworu węglanu sodowego nasyconego chlorkiem sodowym (ppkt 3.16), i odrzucić warstwę wody.Ekstrahować warstwę organiczną przez 1 min za pomocą 50 ml kwasu chlorowodorowego (ppkt 3.17). Odprowadzić dolną warstwę kwasu do lejka rozdzielczego o pojemności 250 ml. Ponownie ekstrahować warstwę organiczną przez 1,5 min następną porcją 50 ml kwasu chlorowodorowego i połączyć z pierwszym ekstraktem. Wypłukać połączone ekstrakty kwasowe, mieszając przez około 10 sekund z 10 ml octanu etylowego (ppkt 3.4).Przenieść ilościowo warstwę wody do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml i odrzucić fazę organiczną. Odparować cały pozostały octan etylowy z roztworu kwasu za pomocą obrotowego aparatu wyparnego (ppkt 2.4). Temperatura łaźni wodnej nie powinna przekraczać 40 °C. W warunkach podciśnienia wynoszącego około 25 mbara i w temperaturze 38 °C cała pozostała część octanu etylowego zostanie usunięta w ciągu 5 min.5.3. Czyszczenie5.3.1. Przygotowanie kolumny amberlitowejKolumna XAD-2 jest przygotowywana do ekstrakcji każdej próbki. Przenieść 10 g przygotowanego amberlitu (ppkt 3.19) do szklanej kolumny (ppkt 4.5) z metanolem (ppkt 3.8). Wprowadzić mały korek z wełny szklanej w górną część złoża żywicy. Usunąć metanol z kolumny i przepłukać żywicę za pomocą 100 ml wody, zatrzymując odpływ z chwilą, gdy ciecz znajdzie się na poziomie górnej części złoża żywicy. Przed użyciem pozostawić kolumnę na 10 min w celu ustabilizowania. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia kolumny.5.3.2. Czyszczenie próbkiPrzenieść ekstrakt (ppkt 5.2) ilościowo do górnej części przygotowanej kolumny amberlitowej (ppkt 5.3.1) i poddać elucji, odrzucając eluat. Prędkość elucji nie powinna przekraczać 20 ml/min. Wypłukać kolbę okrągłodenną za pomocą 20 ml kwasu chlorowodorowego (ppkt 3.17) i wykorzystać go do przepłukania kolumny. Usunąć wszystkie pozostałości roztworu kwasu za pomocą strumienia powietrza. Zlać popłuczyny. Dodać 100 ml metanolu (ppkt 3.8) do kolumny i umożliwić elucję 5–10 ml, zbierając eluat do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml. Pozostawić resztę metanolu na 10 minut, aby uzyskać równowagę między nim i żywicą, i kontynuować elucję z prędkością nieprzekraczającą 20 ml/min, zbierając eluat do tej samej kolby okrągłodennej. Odparować metanol w obrotowym aparacie wyparnym (ppkt 4.2), przy czym temperatura łaźni wodnej nie powinna przekraczać 40 °C. Przenieść pozostałość ilościowo do kolby kalibracyjnej o pojemności 10 ml, używając fazy ruchomej (ppkt 3.21). Uzupełnić do oznaczenia fazą ruchomą i wymieszać. Podwielokrotność jest filtrowana przez filtr membranowy (ppkt 4.7). Zachować ten roztwór do oznaczenia HPLC (ppkt 5.4).5.4. Oznaczanie za pomocą HPLC5.4.1. ParametryW celach orientacyjnych proponuje się zachowanie następujących warunków; można też stosować inne warunki, o ile pozwalają one uzyskać równoważne wyniki.Kolumna do chromatografii cieczowej (ppkt 4.4.1)Faza ruchoma do HCLP (ppkt 3.21)Szybkość przepływu: 1,5–2 ml/min.Długość fali wykrywania: 243 nmObjętość iniekcji: 40–100 μl.Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, wtryskując kilkakrotnie roztwór wzorcowy (ppkt 3.6.2) zawierający 3,0 μg/l, dopóki nie uzyska się stałych wartości szczytowych (lub obszarów) i długości czasu retencji.5.4.2. Krzywa wzorcowaKażdy roztwór wzorcowy wstrzyknąć kilkakrotnie (ppkt 3.6.2) i dokonać pomiarów wartości szczytowych (obszarów) dla każdego stężenia. Sporządzić wzorcowy wykre, stosując średnie wartości szczytowe lub obszary roztworów wzorcowych jako rzędne oraz odpowiadające im stężenia w μg/ml jako wartości osi odciętych.5.4.3. Roztwór próbkiEkstrakt próbki wstrzyknąć kilkakrotnie (ppkt 5.3.2), używając takiej samej objętości jak w przypadku roztworów wzorcowych, i ustalić średnią wartość szczytową (obszar) halofuginonu.6. Obliczanie wynikówUstalić stężenie roztworu próbki w μg/ml na podstawie średniej wartości szczytowej (obszaru) halofuginonu w roztworze próbnym przez porównanie z wykresem wzorcowym (ppkt 5.4.2).Zawartość halofuginonu w (mg/kg) próbki oblicza się według następującego wzoru:w =gdzie:c : stężenie halofuginonu w roztworze próbnym w μg/l,m : masa badanej porcji w gramach.7. Ocena poprawności wyników7.1. IdentycznośćIdentyczność analitu może być potwierdzona za pomocą chromatografii równoległej lub zastosowanie detektora z układem diod, za pomocą którego porównywane są zakresy ekstraktu próbki i roztworu wzorcowego (ppkt 3.6.2) zawierającej 6,0 μg/ml.7.1.1. Chromatografia równoległaPróbny ekstrakt jest wzmacniany przez dodanie odpowiedniej ilości roztworu wzorcowego (ppkt 3.6.2). Ilość dodanego halofuginonu powinna być podobna do ilości szacunkowej halofuginonu odkrytej w próbnym ekstrakcie.Tylko wysokość szczytowej wartości halofuginonu powinna zostać podwyższona po uwzględnieniu zarówno dodanej ilości, jak i rozcieńczenia ekstraktu. Szerokość wartości szczytowej, przy połowie maksymalnej wysokości, musi mieścić się w około 10 % szerokości pierwotnej.7.1.2. Wykrywanie diodoweWyniki są oceniane w oparciu o następujące kryteria:a) długość fali maksymalnej absorpcji próbki i widm wzorcowych, odnotowana dla szczytowego punktu chromatogramu, musi być taka sama w ramach marginesu ustalonego poprzez zdolność rozdzielczą systemu detekcji. W przypadku detekcji diodowej wynosi ona na ogół ± 2 nm;b) między 225 a 300 nm próbka i wzorcowe widma odnotowane dla szczytowego wierzchołka chromatogramu nie mogą różnić się dla tych części widma w zakresie 10–100 % lub względnej absorbancji. To kryterium zostaje spełnione, gdy występują te same wartości maksymalne i w żadnym badanym punkcie odchylenia między dwoma widmami nie przekracza 15 % absorbancji wzorcowego analitu;c) między 225 a 300 nm widma wartości rosnących, szczytowych i malejących ekstraktu próbki nie mogą się różnić od siebie dla tych części widma w zakresie 10–100 % względnej absorbancji. Kryterium to zostaje spełnione, gdy występują takie same wartości maksymalne i we wszystkich badanych punktach odchyłka między dwoma widmami nie przekracza 15 % absorbancji widma wartości szczytowej;Jeżeli jedno z tych kryteriów nie zostanie spełnione, obecność analizowanej substancji nie została potwierdzona.7.2. PowtarzalnośćRóżnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce nie może przekroczyć 0,5 mg/kg przy zawartości halofuginonu powyżej 3 mg/kg.7.3. OdzyskW przypadku wzmocnionej ślepej próbki odzysk powinien wynosić co najmniej 80 %.8. Wyniki badań porównawczychZorganizowano badania porównawcze [1], podczas których przeanalizowano trzy próbki w ośmiu laboratoriach.Wyniki1 : jednostki w mg/kg.n.d. : nie wykryto.SR : odchylenie standardowe powtarzalności.CVR : współczynnik zmienności (%).rec. : odzysk (%).| Próbka A (Ślepa) przy odbiorze | Próbka B (Mączka) | Próbka C (Granulki) |przy odbiorze | po dwóch miesiącach | przy odbiorze | po dwóch miesiącach |Średnia 1 | n.d. | 2,80 | 2,42 | 2,89 | 2,45 |SR | - | 0,45 | 0,43 | 0,40 | 0,42 |CVR | - | 16 | 18 | 14 | 17 |rec. | | 86 | 74 | 88 | 75 |[1] The Analyst 108 z 1983 r., str. 1252–1256.--------------------------------------------------