CELEX: 32016D1840
Language: sk
Date: 2016-10-14 00:00:00
Title: Vykonávacie rozhodnutie Komisie (EÚ) 2016/1840 zo 14. októbra 2016, ktorým sa mení príloha IV k smernici Rady 2009/156/ES, pokiaľ ide o metódy diagnostiky afrického moru koní [oznámené pod číslom C(2016) 6509] (Text s významom pre EHP)

18.10.2016   
            
            
               SK
            
            
               Úradný vestník Európskej únie
            
            
               L 280/33
            
         VYKONÁVACIE ROZHODNUTIE KOMISIE (EÚ) 2016/1840
   zo 14. októbra 2016,
   ktorým sa mení príloha IV k smernici Rady 2009/156/ES, pokiaľ ide o metódy diagnostiky afrického moru koní
   
      
         [oznámené pod číslom C(2016) 6509]
      
   
   (Text s významom pre EHP)
   EURÓPSKA KOMISIA,
   so zreteľom na Zmluvu o fungovaní Európskej únie,
   so zreteľom na smernicu Rady 2009/156/ES z 30. novembra 2009 o zdravotnom stave zvierat v súvislosti s presunom a dovozom zvierat čeľade koňovité z tretích krajín (1), a najmä na jej článok 20,
   keďže:
   
               (1)
            
            
               V prílohe IV k smernici 2009/156/ES sa vymedzujú diagnostické metódy afrického moru koní, ktoré sa v prípade potreby majú použiť na testovanie zvierat čeľade koňovité pred ich pohybom v Únii alebo dovozom z nečlenských krajín EÚ.
            
         
               (2)
            
            
               Od prijatia smernice 2009/156/ES sa vyvinuli laboratórne kapacity na vykonávanie moderných, vysoko citlivých a účinných testov na diagnostiku afrického moru koní. S cieľom zohľadniť tento vývoj sa v Príručke diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá Svetovej organizácie pre zdravie zvierat (OIE) (2) súbežne zmenila kapitola týkajúca sa diagnostiky afrického moru koní.
            
         
               (3)
            
            
               Referenčné laboratórium Európskej únie pre africký mor koní (3) vypracovalo ako súčasť svojho pracovného programu na rok 2014 správu o technickom posúdení diagnostických metód opísaných v prílohe IV k smernici 2009/156/ES. V posúdení, ktoré bolo predstavené Komisii v máji 2015, sa dospelo k záveru, že kompetitívna ELISA už nie je k dispozícii, nepriama ELISA sa bežne nepoužíva, ale mohla by sa zabezpečiť do 4 až 6 mesiacov od žiadosti, a že blokujúca ELISA je komerčne dostupná a bežne používaná na analýzu vzoriek počas vykonávania testov spôsobilosti, ktoré organizuje referenčné laboratórium Európskej únie v prípade afrického moru koní.
            
         
               (4)
            
            
               V správe sa okrem toho zdôrazňuje, že stanovenie nukleových kyselín na základe metód polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou (RT-PCR) má výhody oproti metódam sérologickej diagnostiky choroby, pretože umožňuje odhalenie choroby v ranom štádiu infekcie. Väčšina národných referenčných laboratórií členských štátov Európskej únie navyše používa metódy polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase, a to aj na účely diagnostiky afrického moru koní, ktoré sa ukázali ako vhodné na ciele v ročnom testovaní spôsobilosti, ktoré sa vykonávalo v rokoch 2009 až 2014. V správe sa takisto uvádza, že mimo Únie existuje niekoľko referenčných laboratórií OIE a ďalších laboratórií so špecifickými odbornými znalosťami o africkom more koní, ktoré zaviedli aspoň jednu metódu polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase na zistenie genómu afrického moru koní.
            
         
               (5)
            
            
               Na spoločnom seminári o africkom more koní/katarálnej horúčke oviec, ktorý organizovali referenčné laboratóriá Európskej únie spolu s národnými referenčnými laboratóriami 24. – 25. novembra 2015 v meste Ascot v Spojenom kráľovstve, sa odporúčalo začleniť metódy polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase na detekciu vírusu afrického moru koní do prílohy IV k smernici 2009/156/ES.
            
         
               (6)
            
            
               Hoci sú všetky dostupné metódy polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase na zistenie genómu afrického moru koní dostatočne citlivé, laboratóriá najviac využívajú postup, ktorý opísal Agüero et al. (2008) (4). Metóda, ktorú opísal Guthrie et al. (2013) (5), bola osobitne navrhnutá s cieľom zaistiť, aby sa kone z oblastí s rizikom afrického moru koní mohli bezpečne prepraviť po minimálnom období karantény, ktoré sa vyžaduje v súlade s Kódexom zdravia suchozemských zvierat (6) OIE.
            
         
               (7)
            
            
               Z tohto dôvodu je správne začleniť do prílohy IV k smernici 2009/156/ES metódy na identifikáciu agensu a na zistenie protilátky ako doplnkových metód na účely rýchlej diagnostiky afrického moru koní.
            
         
               (8)
            
            
               Príloha IV k smernici 2009/156/ES by sa preto mala zmeniť, a to vypustením testu kompetitívna ELISA a aktualizáciou postupov pre testy priama a blokujúca ELISA v súlade s kapitolou 2.5.1 Príručky diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá Svetovej organizácie pre zdravie zvierat (OIE), vydanie 2016, na základe verzie, ktorú schválilo Svetové združenie zástupcov OIE v máji 2012 (7). Zároveň by sa postupy polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase, ktoré opísal Agüero et al. (2008), ako aj Guthrie et al. (2013), mali začleniť do tejto prílohy s cieľom sprístupniť tieto testy identifikácie agensa na účely testovania pred premiestnením.
            
         
               (9)
            
            
               Smernica 2009/156/ES by sa preto mala zodpovedajúcim spôsobom zmeniť.
            
         
               (10)
            
            
               Opatrenia stanovené v tomto rozhodnutí sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre rastliny, zvieratá, potraviny a krmivá,
            
         PRIJALA TOTO ROZHODNUTIE:
   Článok 1
   Príloha IV k smernici 2009/156/ES sa nahrádza textom uvedeným v prílohe k tomuto rozhodnutiu.
   Článok 2
   Toto rozhodnutie je určené členským štátom.
   
      V Bruseli 14. októbra 2016
      
         
            Za Komisiu
         
         Vytenis ANDRIUKAITIS
         
            člen Komisie
         
      
   
   
      (1)  Ú. v. EÚ L 192, 23.7.2010, s. 1.
   
      (2)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf.
   
      (3)  Smernica Rady 92/35/EHS z 29. apríla 1992, ktorou sa stanovujú pravidlá kontroly a opatrenia na boj s africkým morom koní (Ú. v. ES L 157, 10.6.1992, s. 19).
   
      (4)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. a Jimenez-Clavero A. (2008). Skúška fluórogenovej polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase na detekciu vírusu afrického moru koní. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325 – 328.
   
      (5)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostická presnosť dvojitej skúšky kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase na detekciu vírusu afrického moru koní. Žurnál virologických metód. 2013; 189(1):30 – 35.
   
      (6)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf
   
      (7)  Pozri poznámku pod čiarou č. 2.
   
      PRÍLOHA
      
         
            „PRÍLOHA IV
            
               AFRICKÝ MOR KONÍ
            
            
               DIAGNOSTIKA
            
            ČASŤ A
            Sérologické testy
            Sérologickou metódou opísanou ďalej je enzýmové imunosorbentové stanovenie (ELISA) na základe kapitoly 2.5.1. oddielu B bodu 2 Príručky diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá, vydanie 2016, ktorú schválilo Svetové združenie zástupcov Svetovej organizácie pre zdravie zvierat (OIE) v máji 2012.
            Vírusový proteín VP7 je imunodominantný hlavný antigén vírusu afrického moru koní (AHSV) a zachováva sa v rámci deviatich sérotypov AHSV. Ukázalo sa, že rekombinantné proteíny AHSV-VP7 sú stabilné a neškodné a sú vhodné na použitie ako antigény v postupoch ELISA na stanovenie protilátok AHSV s vysokým stupňom citlivosti a špecifickosti (Laviada et al., 1992b (1); Maree a Paweska, 2005). Nepriama ELISA a blokujúca ELISA predstavujú dva testy na určenie AHS-VP7 v rámci testov ELISA, ktoré sú vhodné na sérologickú diagnostiku afrického moru koní (AHS).
            1.   Nepriama ELISA na zistenie protilátok proti vírusu afrického moru koní (AHSV)
            
            Konjugát použitý pri tejto metóde je chrenová peroxidáza konjugovaná s anti-konským gama-globulínom reagujúcim so sérom koní, mulíc a somárov. V metóde, ktorú opísali Maree & Paweska (2005) (2), sa používa proteín G ako konjugát, ktorý takisto reaguje so sérom zebry.
            Antigén môže poskytnúť Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), Španielsko, a to do 4 až 6 mesiacov od žiadosti.
            1.1.   Postup skúšky
            
            1.1.1.   Fáza tuhosti
            
                     
                        1.1.1.1.
                     
                     
                        Pokryte platničky ELISA rekombinantom AHSV-4 VP7 rozpusteným v karbonátovom/bikarbonátovom tlmivom roztoku, pH 9,6. Platničky inkubujte cez noc pri teplote 4 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.1.2.
                     
                     
                        Platničky opláchnite päťkrát destilovanou vodou obsahujúcou 0,01 % (v/v) Tween 20 (čistiaci roztok). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.
                     
                  
                     
                        1.1.1.3.
                     
                     
                        Platničky blokujte fosfátovým slaným tlmivým roztokom (PBS) pH 7,2 + 5 % (w/v) odstredeného mlieka (sušené odstredené mlieko NestléTM), 200 μl/jamku 1 hodinu pri teplote 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.1.4.
                     
                     
                        Odstráňte blokujúci roztok a jemne pritlačte platničky na savý materiál.
                     
                  1.1.2.   Skúšobné vzorky
            
                     
                        1.1.2.1.
                     
                     
                        Testované vzorky séra, pozitívne a negatívne kontrolné séra sa rozpustia 1:25 v PBS + 5 % (w/v) odstredeného mlieka + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl/jamku. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.
                        Pri titrácii urobte dvojnásobné riedenie 1: 25 (100 μl/jamku), jedno sérum na jeden stĺpec platničky, a to isté vykonajte s pozitívnou a negatívnou kontrolou. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.2.2.
                     
                     
                        Platničky opláchnite päťkrát destilovanou vodou obsahujúcou 0,01 % (v/v) Tween 20 (čistiaci roztok). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.
                     
                  1.1.3.   Konjugácia
            
                     
                        1.1.3.1.
                     
                     
                        Dajte 100 μl/jamku chrenovej peroxidázy (HRP) konjugovanej s anti-konským gama-globulínom rozpusteným v PBS + 5 % mlieku + 0,05 % Tween 20, pH 7,2. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.3.2.
                     
                     
                        Platničky opláchnite päťkrát destilovanou vodou obsahujúcou 0,01 % (v/v) Tween 20 (čistiaci roztok). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.
                     
                  1.1.4.   Chromogén/substrát
            
                     
                        1.1.4.1.
                     
                     
                        Pridajte 200 μl/jamku chromogénového/substrátového roztoku (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetyl aminobenzaldehyd) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metyl-2-benzo-tiazolin hydrazon hydrochlorid) + 5 μl H2O2).
                        Vyvolávanie farby sa zastaví pridaním 50 μl 3N H2SO4 po približne 5 až 10 minútach (predtým, ako sa začne sfarbovať negatívna kontrola).
                        Tiež je možné použiť aj iné chromogény ako ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-etylbenzotiazolin-6- kyselina sulfónová], TMB (tetrametyl benzidín) alebo OPD (orto-fenyldiamín).
                     
                  
                     
                        1.1.4.2.
                     
                     
                        Odčítajte pri 600 nm (alebo 620 nm).
                     
                  1.2.   Interpretácia výsledkov
            
            
                     
                        1.2.1.
                     
                     
                        Vypočítajte medznú hodnotu pripočítaním 0,06 k hodnote negatívnej kontroly (0,06 je štandardná odchýlka odvodená zo skupiny 30 negatívnych sér).
                     
                  
                     
                        1.2.2.
                     
                     
                        Skúšobné vzorky, pri ktorých sa uvádzajú absorpčné hodnoty nižšie než je medzná hodnota, sa považujú za negatívne.
                     
                  
                     
                        1.2.3.
                     
                     
                        Skúšobné vzorky, pri ktorých sa uvádzajú absorpčné hodnoty vyššie než je medzná hodnota + 0,15, sa považujú za pozitívne.
                     
                  
                     
                        1.2.4.
                     
                     
                        Skúšobné vzorky, pri ktorých sa uvádzajú prostredné absorpčné hodnoty, sú nerozhodné a na potvrdenie výsledku je potrebné použiť inú metódu.
                     
                  2.   Blokujúca ELISA na zistenie protilátok proti vírusu afrického moru koní (AHSV)
            
            Kompetitívna blokujúca ELISA je určená na zisťovanie špecifických protilátok AHSV v sérach akýchkoľvek zvierat čeľade koňovité, t. j. koní, somárov, zebier a ich krížencov, ktorou sa zabraňuje problému špecifickosti, ku ktorej občasne dochádza pri použití testu nepriama ELISA.
            Princípom skúšky je blokovanie reakcie medzi rekombinantným proteínom VP7 absorbovaným do platničky ELISA a konjugovanou špecifickou monoklonálnou protilátkou AHS-VP7. Protilátka v skúšobnom sére zablokuje reakciu medzi antigénom a monoklonálnou protilátkou, čo vyústi do zníženia zafarbenia. Keďže monoklonálna protilátka je tiež namierená proti VP7, daná skúška poskytne vysokú hladinu citlivosti a osobitosti.
            Kompetitívna blokujúca ELISA je komerčne dostupná.
            2.1.   Postup skúšky
            
            2.1.1.   Fáza tuhosti
            
                     
                        2.1.1.1.
                     
                     
                        Pokryte platničky ELISA rekombinantým AHSV-4 VP7 (50 – 100 ng) rozpusteným v karbonátovom/bikarbonátovom tlmivom roztoku, pH 9,6. Inkubujte cez noc pri teplote 4 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.1.2.
                     
                     
                        Platničky trikrát premyte vo fosfátovom soľnom tlmivom roztoku (PBS) 0,1 × obsahujúcom 0,135 M NaCl a 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.
                     
                  2.1.2.   Skúšobné vzorky a kontroly
            
                     
                        2.1.2.1.
                     
                     
                        Testované vzorky séra a pozitívne a negatívne kontrolné séra sa rozpustia v pomere 1:5 v rozpúšťadle obsahujúcom 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 a 0,1 % Kathon, 100 μl/jamku. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.
                        Pri titrácii urobte dvojnásobné riedenie testovaného séra od 1:10 do 1:280 v 8 jamkách (100 μl/jamku), jedno sérum na jeden stĺpec platničky, a to isté vykonajte s pozitívnou a negatívnou kontrolou. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.2.2.
                     
                     
                        Platničky päťkrát premyte vo fosfátovom soľnom tlmivom roztoku (PBS) 0,1× obsahujúcom 0,135 M NaCl a 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.
                     
                  2.1.3.   Konjugácia
            
                     
                        2.1.3.1.
                     
                     
                        Dajte 100 μl/jamku monoklonálnej protilátky anti-VP7 konjugovanej chrenovou peroxidázou. Táto monoklonálna protilátka bola vopred rozpustená v pomere 1:5 000 až 1:15 000 v roztoku 1:1 StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics; odkaz: SZ03) v destilovanej vode. Inkubujte 30 minút pri teplote 37 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.3.2.
                     
                     
                        Platničky päťkrát premyte vo fosfátovom soľnom tlmivom roztoku (PBS) 0,1 × obsahujúcom 0,135 M NaCl a 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.
                     
                  2.1.4.   Chromogén/substrát
            Pridajte 100 μl/jamku roztoku chromogén/substrátu (1 ml ABTS (kyselina 2,2′-azino-bis-[3-etylbenzotiazolín-6-sulfónová]) 5 mg/ml + 9 ml substrátového tlmivého roztoku (0,1 M fosfátovo-citrátový tlmivý roztok s pH 4 obsahujúci 0,03 % H2O2) a inkubujte 10 minút pri izbovej teplote. Vývoj farby sa zastaví pridaním 100 μl/jamku 2 % (w/v) SDS (dodecylsulfát sodný).
            2.1.5.   Odčítanie
            Odčítajte pri 405 nm v snímači ELISA.
            2.2.   Interpretácia výsledkov
            
            
                     
                        2.2.1.
                     
                     
                        Stanovte blokujúce percento (BP) každej vzorky pomocou nasledujúceho vzorca, kde „Abs“ znamená protilátky:
                        
                           
                     
                  
                     
                        2.2.2.
                     
                     
                        Vzorky vykazujúce hodnotu BP vyššiu ako 50 % by sa mali považovať za pozitívne pre protilátky AHSV.
                     
                  
                     
                        2.2.3.
                     
                     
                        Vzorky vykazujúce hodnotu BP nižšiu ako 45 % by sa mali považovať za negatívne pre protilátky AHSV.
                     
                  
                     
                        2.2.4.
                     
                     
                        Vzorky vykazujúce hodnotu BP medzi 45 % a 50 % by sa mali považovať za nerozhodné a musia sa nanovo otestovať. Ak bude výsledok opäť nerozhodný, zvieratá by sa mali nanovo otestovať na vzorkách odobratých nie skôr ako dva týždne po odobratí vzorky, ktorá sa považovala za nerozhodnú.
                     
                  ČASŤ B
            Identifikácia agensa
            Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase
            Pri testoch na identifikáciu agensa na základe metód nukleových kyselín sa musia zistiť referenčné kmene z deviatich vírusových sérotypov AHSV.
            Metóda opísaná v bode 2.1. je založená na kapitole 2.5.1. oddiele B bode 1.2. Príručky diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá, vydanie 2016, ktorú schválilo Svetové združenie zástupcov Svetovej organizácie pre zdravie zvierat (OIE) v máji 2012.
            Akákoľvek metóda detekcie polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou použitá na testovanie vzoriek, buď krvi, alebo sleziny, musí byť v kontexte smernice 2009/156/ES rovnocenná alebo musí presiahnuť citlivosť metodík opísaných v bode 2.
            Inaktivovaný vírus sérotypov 1 až 9 referenčných kmeňov možno získať z referenčného laboratória Európskej únie alebo referenčného laboratória OIE pre africký mor koní, Algete, Španielsko.
            1.   Extrakcia vírusovej RNA
            
            Na zaistenie správnej reakcie je potrebné zo vzorky extrahovať RNA AHSV vysokej kvality. Extrakciu nukleových kyselín z klinických vzoriek možno vykonať rôznymi internými a komerčne dostupnými metódami.
            V rámci komerčných súprav sa na izoláciu RNA používajú rôzne prístupy. Väčšina z nich je založená na týchto postupoch:
            
                        —
                     
                     
                        fenol-chloroformová extrakcia nukleových kyselín,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        adsorpcia nukleových kyselín na filtračný systém,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        adsorpcia nukleových kyselín na systém magnetických lôžok.
                     
                  Príklad internej extrakcie RNA je uvedený nižšie:
            
                        1.1.
                     
                     
                        1 g vzorky tkaniva sa homogenizuje v 1 ml denaturovaného roztoku (4 M tiokyanatan guanidínu, 25 mM citranu sodného, 0,1 M 2-merkaptoetanolu, 0,5 % sarkosyl).
                     
                  
                        1.2.
                     
                     
                        Do supernatantu sa po centrifugácii pridá 1 μg RNA z kvasiniek, 0,1 ml 2 M citranu sodného s pH 4, 1 ml fenolu a 0,2 ml chloroformu/zmesi izoamylalkoholu (49:1).
                     
                  
                        1.3.
                     
                     
                        Suspenzia sa silno pretrasie a schladí na ľade na 15 minút.
                     
                  
                        1.4.
                     
                     
                        Po centrifugácii je RNA prítomná vo vodnej fáze extrahovaná fenolom, vyzrážaná etanolom a resuspendovaná v sterilnej vode.
                     
                  2.   Postup pri polymerázovej reťazovej reakcii spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase
            
            2.1.   Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase špecifická pre skupinu podľa Agüero et al., 2008
                (3)
            
            Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase špecifická pre skupinu je zameraná na VP7 AHSV a možno ňou zistiť všetky v súčasnosti známe cirkulujúce sérotypy a kmene AHSV. Túto metódu použili s veľmi dobrými výsledkami zúčastňujúce sa národné referenčné laboratóriá členských štátov Európskej únie v skúškach spôsobilosti, ktoré každoročne organizuje referenčné laboratórium Európskej únie na obdobie rokov 2009 – 2015. Tento protokol okrem toho získal spomedzi ďalších protokolov veľmi vysoké skóre v medzinárodnom kruhovom teste organizovanom v roku 2015 v rámci siete referenčných laboratórií OIE.
            Sekvencie primerov a sond na zistenie prítomnosti vírusov druhov AHSV:
            
                        —
                     
                     
                        priamy primer
                     
                     
                        5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        reverzný primer
                     
                     
                        5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        TaqMan MGB sonda
                     
                     
                        5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
                     
                  
                        2.1.1.
                     
                     
                        Koncentrácia vzorky primeru sa rozpustí na pracovnú koncentráciu 8 μM („pracovná vzorka primeru 8 μM“) a sonda sa rozpustí na pracovnú koncentráciu 50 μM („pracovná vzorka sondy 50 μM“). Je potrebné navrhnúť usporiadanie testovacej platničky, ktorá sa vloží do softvéru v stroji na polymerázovú reťazovú reakciu v reálnom čase. Použitím daného usporiadania ako vodidla sa 2,5 μl každej pracovnej vzorky primeru 8 μM pridá do každej jamky, ktorá bude obsahovať vzorky RNA, pozitívne a/alebo negatívne kontroly (konečná koncentrácia primeru bude 1 μM v 20 μl zmesi RT-PCR). Platnička je uložená na ľade.
                     
                  
                        2.1.2.
                     
                     
                        S priamym a reverzným primerom sa zmieša 2 μl izolovanej RNA (skúšobné vzorky a pozitívna kontrola) alebo 2 μl vody bez obsahu RNázy v negatívne reagujúcich kontrolách. Táto zmes sa denaturuje ohrevom na 95 °C počas 5 minút, po čom nasleduje rýchle ochladenie na ľade počas aspoň 5 minút.
                     
                  
                        2.1.3.
                     
                     
                        Podľa pokynov výrobcu sa pre niekoľko vzoriek, ktoré sa budú testovať, pripraví príslušný objem zmesi „master mix“ v jednom kroku na polymerázovú reťazovú reakciu spojenú s reverznou transkripciou v reálnom čase. 0,1μl pracovnej vzorky sondy 50 μM sa pridá do každej jamky s obsahom vzoriek RNA (konečná koncentrácia sondy bude 0,25 μM v každej jamke s obsahom vzoriek RNA),13 μl zmesi „master mix“ v jednom kroku na polymerázovú reťazovú reakciu spojenú s reverznou transkripciou v reálnom čase sa rozdelí do každej jamky na platničke polymerázovej reťazovej reakcie, ktorá obsahuje denaturované primery a RNA.
                     
                  
                        2.1.4.
                     
                     
                        Platnička sa umiestni do termocykléru v reálnom čase naprogramovaného na reverznú transkripciu a zistenie amplifikácie/fluorescencie cDNA. Podmienky amplifikácie pozostávajú z kroku prvej reverznej transkripcie pri teplote 48 °C počas 25 minút, po čom nasleduje 10 minút pri teplote 95 °C („hot start“) a 40 cyklov po 15 sekúnd pri teplote 95 °C, 35 sekúnd pri teplote 55 °C a 30 sekúnd pri teplote 72 °C (alebo 40 cyklov pri teplote 97 °C po 2 sekundy a pri teplote 55 °C po 30 sekúnd, ak sa použijú reagenty a termocyklér umožňujúci rýchle reakcie). Údaje o fluorescencii sa získajú pri konečnom kroku pri teplote 55 °C.
                     
                  
                        2.1.5.
                     
                     
                        Ak sa získajú atypické amplifikačné krivky, skúška sa nepovažuje za platnú a treba ju zopakovať.
                        Vzorky sa považujú za pozitívne v prípade, ak hodnota Ct (číslo cyklu, pri ktorom fluorescencia vytvorená pri reakcii prekročí prahovú hodnotu fluorescencie) bude nižšia než stanovená prahová hodnota Ct (35) v rámci 40 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie (Ct ≤ 35) alebo jej rovná.
                        Vzorky sa považujú za nerozhodné v prípade, ak hodnota Ct bude vyššia ako stanovená prahová hodnota Ct (35) v rámci 40 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie (Ct ≥ 35).
                        Vzorky sa považujú za negatívne v prípade, ak sa získa horizontálna amplifikačná krivka, ktorá neprekročí líniu prahovej hodnoty v rámci 40 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie.
                     
                  2.2.   Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase špecifická pre skupinu podľa Guthrie et al., 2013
                (4)
            
            Polymerázová reťazová reakcia spojená s reverznou transkripciou v reálnom čase pomocou sond FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) na zistenie nukleovej kyseliny AHSV.
            Opísaná skúška polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou AHSV bola navrhnutá pomocou sekvencií zo širokého množstva v súčasnosti cirkulujúcich voľne sa vyskytujúcich kmeňov AHSV (Quan et al., 2010 (5)). Zároveň zahŕňa originálnu syntetickú externú kontrolnú skúšku na overenie správneho fungovania komponentov skúšky.
            Súpravy na polymerázovú reťazovú reakciu v reálnom čase v jednom kroku sú komerčne dostupné. Ďalej sú uvedené niektoré základné kroky podľa opisu Guthrie et al. (2013), ktoré možno upraviť v závislosti od miestnych/prípadových požiadaviek, použitých súprav a dostupného vybavenia.
            Sekvencie primerov a sond na zistenie prítomnosti vírusov druhov AHSV:
            
                        —
                     
                     
                        priamy primer
                     
                     
                        5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        reverzný primer
                     
                     
                        5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        TaqMan MGB sonda
                     
                     
                        5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
                     
                  
                        2.2.1.
                     
                     
                        Pracovné roztoky zmesi primeru a sondy sú vytvorené v koncentrácii 25 × v 5 μΜ pre priame primery a 3 μΜ pre sondu. Je potrebné navrhnúť usporiadanie testovacej platničky, ktorá sa vloží do softvéru v stroji na polymerázovú reťazovú reakciu v reálnom čase. Použitím daného usporiadania sa do príslušných jamiek platničky pridá 5 μl vzoriek RNA vrátane testovacích vzoriek a pozitívnych a negatívnych kontrol.
                     
                  
                        2.2.2.
                     
                     
                        RNA sa denaturuje ohrevom na 95 °C počas 5 minút, po čom nasleduje rýchle ochladenie na ľade počas aspoň 3 minút.
                     
                  
                        2.2.3.
                     
                     
                        Podľa pokynov výrobcu sa pre niekoľko vzoriek, ktoré sa budú testovať, pripraví príslušný objem zmesi „master mix“ v jednom kroku na polymerázovú reťazovú reakciu spojenú s reverznou transkripciou v reálnom čase. 1 μl 25 × pracovného roztoku zmesi primeru-sondy (z bodu 2.2.1 vyššie) sa zahrnie do zmesi „master mix“ s cieľom dosiahnuť konečnú koncentráciu každej jamky 200 nM pre každý primer a 120 nM pre sondu. 20 μl zmesi „master mix“ sa rozdelí do každej jamky na platničke polymerázovej reťazovej reakcie, ktorá obsahuje denaturovanú RNA.
                     
                  
                        2.2.4.
                     
                     
                        Platnička sa umiestni do termocykléru v reálnom čase naprogramovaného na reverznú transkripciu a zistenie amplifikácie/fluorescencie cDNA podľa odporúčania výrobcov. Podmienky amplifikácie pozostávajú napríklad z kroku prvej reverznej transkripcie pri teplote 48 °C počas 10 minút, po čom nasleduje 10 minút pri teplote 95 °C a 40 cyklov po 15 sekúnd pri teplote 95 °C a 45 sekúnd pri teplote 60 °C.
                     
                  
                        2.2.5.
                     
                     
                        Vzorky sa považujú za pozitívne v prípade, ak normalizovaná fluorescencia pre skúšku AHSV polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou prekročí prahovú hodnotu 0,1 pri 36 cykloch polymerázovej reťazovej reakcie vo všetkých replikátoch vzorky.
                        Vzorky sa považujú za nerozhodné v prípade, ak normalizovaná fluorescencia pre skúšku AHSV polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou prekročí prahovú hodnotu 0,1 pri 36 až 40 cykloch polymerázovej reťazovej reakcie v ktoromkoľvek replikáte vzorky.
                        Vzorky sa považujú za negatívne v prípade, ak normalizovaná fluorescencia pre skúšku AHSV polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou neprekročila prahovú hodnotu 0,1 pri 40 cykloch polymerázovej reťazovej reakcie vo všetkých replikátoch vzorky a v prípade, ak normalizovaná fluorescencia v prípade chránenej syntetickej externej kontrolnej skúšky prekročila prahovú hodnotu 0,1 pri 33 cykloch polymerázovej reťazovej reakcie.“
                     
                  
      
      
         (1)  Laviada M.D., Roy P. a Sanchez-Vizcaino J.M (1992b). Adaptácia a hodnotenie testu nepriama ELISA a testu imunoblot na zistenie protilátok proti africkému moru koní. V: Katarálna horúčka oviec, africký mor koní a súvisiace orbivírusy: Zápis z druhého medzinárodného sympózia. Walton T.E. & Osburn B.l., Eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646 – 650.
      
         (2)  Maree S. a Paweska J.T. (2005). Príprava rekombinantného antigénu VP7 vírusu afrického moru koní jednoduchou metódou a validáciou testom nepriama ELISA na základe antigénu VP7 na zistenie prítomnosti protilátok IgG v sére koní špecifických pre skupinu. J. Virol. Metódy, 125 (1), 55 – 65.
      
         (3)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. a Jimenez-Clavero A. (2008). Skúška fluórogenovej polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase na detekciu vírusu afrického moru koní. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325 – 328.
      
         (4)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostická presnosť dvojitej skúšky kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou v reálnom čase na detekciu vírusu afrického moru koní. Žurnál virologických metód. 2013; 189(1):30-5.
      
         (5)  Quan, M., Lourens, C.W., MacLachlan, N.J., Gardner, I.A., Guthrie, A.J., 2010. Rozvoj a optimalizácia dvojitej skúšky kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie s reverznou transkripciou v reálnom čase zameranej na gény VP7 a NS2 vírusu afrického moru koní. J. Virol. Metódy 167, 45 – 52.