CELEX: 31990R2676
Language: sv
Date: 1990-09-17 00:00:00
Title: Kommissionens förordning (EEG) nr 2676/90 av den 17 september 1990 om fastställande av gemensamma analysmetoder för vin

Avis juridique important

|

31990R2676

Kommissionens förordning (EEG) nr 2676/90 av den 17 september 1990 om fastställande av gemensamma analysmetoder för vin  

Europeiska gemenskapernas officiella tidning nr L 272 , 03/10/1990 s. 0001 - 0192 Finsk specialutgåva Område 3 Volym 34 s. 0005  Svensk specialutgåva Område 3 Volym 34 s. 0005 

KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EEG) nr 2676/90 av den 17 september 1990 om fastställande av gemensamma analysmetoder för vinEUROPEISKA GEMENSKAPERNAS RÅD HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNINGmed beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,med beaktande av kommissionens förslag,med beaktande av rådets förordning (EEG) nr 822/87 av den 16 mars 1987 om den gemensamma organisationen av marknaden för vin(1), ändrad genom förordning (EEG) nr 1325/90(2), särskilt artikel 74 i denna, ochmed beaktande av följande:Enligt artikel 74.1. i förordning (EEG) nr 822/87 skall analysmetoder fastställas för att bestämma sammansättningen av de produkter som anges i artikel 1 i samma förordning samt regler för kontroll av huruvida dessa produkter har utsatts för någon behandling som strider mot godkänt enologiskt förfarande.Eftersom gemenskapen ännu inte har fastställt gränsvärden för substanser, vars förekomst visar att vissa enologiska metoder har tillämpats eller tabeller som gör det möjligt att jämföra analysdata, bör medlemsstaterna bemyndigas att fastställa dessa gränsvärden.Artikel 13.1. i förordning (EEG) nr 822/87 innehåller bestämmelser om en analytisk undersökning som omfattar åtminstone en bedömning av de egenskaper hos det aktuella kvalitetsvinet fso som anges i bilagan till den förordningen.Det är nödvändigt att införa enhetliga analysmetoder för kontroll av de uppgifter som anges i dokumentationen för de aktuella produkterna, så att uppgifterna blir korrekta och jämförbara. Dessa metoder bör därför vara obligatoriska för alla handelstransaktioner och alla kontrollåtgärder. Med hänsyn till de begränsade möjligheterna i detta avseende inom handeln bör ett begränsat antal rutinmetoder tillåtas, som gör det möjligt att snabbt och med tillräcklig säkerhet fastställa de nödvändiga faktorerna.Allmänt erkända metoder, som de som utvecklats för 1954 års internationella konvention om standardisering av metoder för analys och bedömning av vin och som publicerats av Internationella vinkontoret i Recueil des méthodes internationales d'analyse des vins (samling av internationella metoder för vinanalys), bör i möjligaste mån bibehållas.De vinanalysmetoder som används inom gemenskapen fastställdes i kommissionens förordning (EEG) nr 1108/82(3). Den vetenskapliga utvecklingen gör det nödvändigt att ersätta vissa av dessa metoder med sådana som är mer ändamålsenliga, ändra vissa metoder och införa nya, särskilt sådana som sedermera har godkänts av Internationella vinkontoret. Med hänsyn till det stora antalet ändringar och deras komplexitet bör alla analysmetoder samlas i en ny förordning och förordning (EEG) nr 1108/82 bör upphävas.För att säkerställa jämförbarheten av de resultat som erhålls genom användning av de analysmetoder som avses i artikel 74 i förordning (EEG) nr 822/87 skall de av Internationella vinkontoret fastställda definitionerna av resultatens noggrannhet, repeterbarhet och reproducerbarhet användas.Med hänsyn till de vetenskapliga framstegen å ena sidan och de officiella laboratoriernas tekniska utrustning å den andra, samt i syfte att förbättra dessa laboratoriers effektivitet och lönsamhet, bör automatiserade analysmetoder tillåtas under vissa omständigheter. Det måste dock föreskrivas att dessa automatiserade metoder i händelse av tvist inte kan ersätta referensmetoderna eller de allmänt använda metoderna.Resultaten av densitetsbestämningar utförda med den automatiserade metoden, som bygger på principen för frekvensoscillatorn, är i fråga om noggrannhet, repeterbarhet och reproducerbarhet minst lika goda som de resultat som erhålls med de metoder som anges i punkt 1 i bilagan till denna förordning för bestämning av densitet eller specifik vikt. Enligt artikel 74.3. i förordning (EEG) nr 822/87 skall denna automatiserade metod sålunda anses vara likvärdig med de metoder som anges i bilagan till den här förordningen.Den metod som beskrivs i kapitel 25 punkt 2.2.3.3.2 i bilagan till denna förordning för analys av den totala svaveldioxidhalten i vin och vinmust med en förmodad halt under 50 mg/l ger en bättre extraktion av denna substans än de metoder som beskrivs i kapitel 13 punkt 13.4 i bilagan till förordning (EEG) nr 1108/82. Den förstnämnda metoden ger ett högre värde för den totala svaveldioxidhalten i de analyserade produkterna. Denna halt kan, särskilt i vissa druvsafter, vara högre än den högsta tillåtna halten. För att undvika problem med avsättning av druvsaft som redan har framställts vid tidpunkten för denna förordnings ikraftträdande och till dess att produktionsprocesserna ändrats såatt bättre avsvavling uppnås av druvsaft vars jäsning avstannats genom tillsats av alkohol, bör det förfarande som beskrivs i den ovannämnda förordningen tillåtas under en övergångsperiod.De åtgärder som avses i denna förordning är förenliga med yttrandet från Förvaltningskommittén för vin.HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.Artikel 1 1. Gemenskapsmetoderna för vinanalys, som i samband med handelstransaktioner och kontrollåtgärder skall göra det möjligt att- fastställa sammansättningen av de produkter som anges i artikel 1 i förordning (EEG) nr 822/87, och- kontrollera om dessa produkter har utsatts för någon behandling som strider mot godkänt enologiskt förfarande,skall vara de som anges i bilagan till denna förordning.2. För ämnen för vilka referensmetoder och rutinmetoder finns angivna skall de resultat som erhålls med referens-metoderna ha företräde.Artikel 2 I denna förordning avses meda) repeterbarhet: det värde under vilket den absoluta skillnaden mellan två individuella resultat som har uppnåtts i prov på identiskt provmaterial som har genomförts under samma förhållanden (samma person, samma apparatur, samma laboratorium och ett kort tidsintervall) kan förväntas ligga inom en angiven sannolikhet,b) reproducerbarhet: det värde under vilket den absoluta skillnaden mellan två individuella resultat som har erhållits under olika förhållanden (olika personer, olika apparatur, olika laboratorier eller olika tidsintervall) kan förväntas ligga inom en angiven sannolikhet.Begreppet "individuellt provresultat" avser det värde som erhålls när den standardiserade analysmetoden tillämpas fullständigt och en gång på ett enda prov.Om inte annat anges, skall sannolikheten vara 95 %.Artikel 3 1. Automatiserade analysmetoder får användas, på laboratoriechefens ansvar, under förutsättning att resultatens noggrannhet, repeterbarhet och reproducerbarhet åtminstone är likvärdiga med de resultat som erhålls med de analysmetoder som anges i bilagan.I händelse av tvist får de metoder som anges i bilagan inte ersättas av automatiserade metoder.2. Den automatiserade metod för densitetsbestämning som bygger på principen för frekvensoscillatorn skall anses vara likvärdig med de metoder som anges i avsnitt 1 i bilagan till denna förordning.Artikel 4 Det vatten som används för lösning, spädning eller tvätt skall vara destillerat vatten eller avjoniserat vatten av minst motsvarande renhetsgrad. Om inte annat anges, skall alla kemikalier vara av analysren kvalitet.Artikel 5 Förordning (EEG) nr 1108/82 skall upphöra att gälla.Artikel 1.4 i förordningen skall dock gälla till och med den 31 december 1990.Artikel 6 Denna förordning träder i kraft samma dag som den offentliggörs i Europeiska gemenskapernas officiella tidning.Den skall tillämpas från och med den 1 oktober 1990.Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.Utfärdad i Bryssel den 17 september 1990.På kommissionens vägnarRay MAC SHARRYLedamot av kommissionen(1) EGT nr L 84, 27.3.1987, s. 1.(2) EGT nr L 132, 23.5.1990, s. 19.(3) EGT nr L 133, 14.5.1982, s. 1.BILAGA 1. DENSITET OCH SPECIFIK VIKT VID 20 °C 1. DEFINITIONERMed densitet avses massan per volymenhet vin eller must vid 20 °C. Den uttrycks i gram per milliliter och betecknas med symbolen ñ20 °C.Med specifik vikt vid 20 °C (eller relativ densitet 20 °C/20 °C) avses förhållandet, uttryckt som decimalbråk, mellan densiteten hos en viss volym vin eller must vid 20 °C och densiteten hos samma volym vatten vid samma temperatur. Den betecknas med symbolen d20 °C20 °C.2. PRINCIP FÖR METODERNADensiteten och den specifika vikten vid 20 °C bestäms på ett analysprov- antingen med pyknometri: referensmetod,- eller med areometeranalys eller densimetri med en hydrostatisk våg: rutinmetoder.Anmärkning:För mycket noggrann bestämning skall densiteten korrigeras för effekten av svaveldioxid enligt formeln:ñ20 °C = ñ'20 °C   0,0006 × Sdär>Plats för tabell>3. FÖRBEHANDLING AV PROVETOm vinet eller musten innehåller nämnvärda mängder koldioxid avlägsnas merparten av denna genom att 250 ml av vinet skakas om i en enliters kolv eller genom filtrering under reducerat tryck genom 2 g bomull som placerats i ett förlängningsrör.4. REFERENSMETOD4.1 ApparaturVanlig laboratorieutrustning, särskilt:4.1.1. Pyknometer av pyrexglas(1) på ca. 100 ml, med en löstagbar termometer med slipad glaskoppling med en skala i tiondels grader från 10 till 30 °C (figur 1). Termometern skall vara kalibrerad.>Hänvisning till >Pyknometern har ett 25 mm långt sidorör med en innerdiameter på högst 1 mm som avslutas med en konisk koppling av slipat glas. Sidoröret kan tillslutas med en "uppsamlingspropp" bestående av en slipad glaskon som utmynnar i ett smalt rör. Proppen fungerar som en expansionskammare.Apparatens båda slipade kopplingar skall vara mycket noggrant utförda.4.1.2. En tareringsflaska, bestående av ett kärl med samma yttre volym som pyknometern (mindre än 1 ml avvikelse) och med samma massa som pyknometern när den är fylld med en vätska med en specifik vikt av 1,01 (2,0 % m/v koksaltlösning).En värmeisolerad behållare som är exakt avpassad för pyknometern.4.1.3. Våg med två vågskålar med minst 300 g kapacitet och 0,1 mg noggrannhetellervåg med en vågskål med minst 200 g kapacitet och 0,1 mg noggrannhet.4.2 Kalibrering av pyknometernKalibrering av pyknometern innebär bestämning av följande faktorer:- tara (tom pyknometer),- pyknometerns volym vid 20 °C,- den vattenfyllda pyknometerns massa vid 20 °C.4.2.1. Metod vid användning av en våg med två vågskålarPlacera tareringsflaskan i vågens vänstra vågskål och den torra och rena pyknometern med "uppsamlingsproppen" i den högra vågskålen. Placera vikter i vågskålen med pyknometern och notera den vikt där vågskålarna väger jämnt. Benämn denna p gram.Fyll försiktigt pyknometern med destillerat, rumstempererat vatten och sätt i termometern. Pyknometern avtorkas omsorgsfullt och placeras i den värmeisolerade behållaren. Blanda genom att vända behållaren flera gånger till dess att en konstant temperatur kan avläsas på termometern. Justera vätskenivån tills den når sidorörets övre kant. Torka sidoröret torrt och anbringa uppsamlingsproppen. Läs av temperaturen t°C noggrant och korrigera eventuellt för temperaturskalans bristande noggrannhet. Väg den vattenfyllda pyknometern mot taran och anteckna vikten p' i gram där jämvikt uppnås.Beräkning(2)Tarering av den tomma pyknometern:Taran för den tomma pyknometern = p + m,där>Plats för tabell>Volym vid 20 °C:V20 °C = (p + m   p') × Ftdär Ft = en faktor som hämtas från tabell 1 för temperaturen t °C.V20 °C skall vara känd med noggrannheten ± 0,001 ml.Vattnets massa vid 20 °C:M20 °C = V20 °C × 0,998203där 0,998203 = vattnets densitet vid 20 °C.4.2.2 Metod vid användning av en våg med en vågskålBestäm- den torra och rena pyknometerns massa, P,- den vattenfyllda pyknometerns massa när vattnet har temperaturen t °C, P1. Följ anvisningarna i 4.2.1 ovan.- tarans massa, T0.Beräkning(3)Tarering av den tomma pyknometern:Tara för den tomma pyknometern = P   m,där>Plats för tabell>Volym vid 20 °C:V20 °C = [P1   (P   m)] × Ft,där Ft = en faktor som hämtas från tabell 1 för temperaturen t °C.Volymen vid 20 °C skall vara känd med noggrannheten ± 0,001 ml.Vattnets massa vid 20 °C:M20 °C = V20 °C × 0,998203,där 0,998203 = vattnets densitet vid 20 °C.4.3. Mätmetod(4)4.3.1 Metod vid användning av en våg med två vågskålarFyll pyknometern med det färdiga analysprovet och följ anvisningarna i 4.2.1 ovan.Den massa i gram som krävs för att uppnå jämvikt vid t °C benämns p".Massan av vätskan i pyknometern = p + m   p".Skenbar densitet vid t °C:ñt °C = >NUM>p + m   p"/>DEN>V20 °CBeräkna densiteten vid 20 °C med hjälp av någon av följande tabeller, beroende på vilken vätska som skall analyseras: torrt vin (tabell 2), naturlig eller koncentrerad must (tabell 3), sött vin (tabell 4).Vinets relativa densitet 20 °C/20 °C beräknas genom att densiteten vid 20 °C divideras med 0,998203.4.3.2 Metod vid användning av en våg med en vågskål(5)Väg tareringsflaskan och benämn dess massa T.Beräkna dT = T1   T0.Den tomma pyknometerns massa vid tidpunkten för mätningen = P   m + dT.Väg pyknometern, fylld med det färdiga analysprovet, enligt anvisningarna i 4.2.1 ovan. Massan vid t °C benämns P2.Massan av vätskan i pyknometern vid t °C = P2   (P   m + dT)Skenbar densitet vid t °C:ñt °C = >NUM>P2   (P   m + dT)/>DEN>V20 °CBeräkna provvätskans densitet vid 20 °C (torrt vin, naturlig eller koncentrerad must eller sött vin) enligt 4.3.1 ovan.Den relativa densiteten 20 °C/20 °C beräknas genom att densiteten vid 20 °C divideras med 0,998203.4.3.3. Densitetsbestämningarnas repeterbarhetför torra och halvsöta viner: r = 0,00010för söta viner: r = 0,00018.4.3.4. Densitetsbestämningarnas reproducerbarhetför torra och halvsöta viner: R = 0,00037för söta viner: R = 0,00045.5. RUTINMETODER5.1 Areometeranalys5.1.1 Apparatur5.1.1.1. AreometerAreometrar skall överensstämma med ISO-standarderna vad gäller dimensioner och gradering.Areometrarna skall ha en cylindrisk kula och rördel med cylindrisk genomskärning med minst 3 mm diameter. För torra viner skall areometern vara graderad från 0,983 till 1,003 med markeringar för tusendelar och femtusendelar därav. Avståndet mellan tusendelsmarkeringarna skall vara minst 5 mm. För bestämning av densiteten hos avalkoholiserade och söta viner och must skall fem areometrar användas, med gradering från 1,000 till 1,030, 1,030 till 1,060, 1,060 till 1,090, 1,090 till 1,120 och 1,120 till 1,150. Areometrarna skall vara graderade i densiteter vid 20 °C med markering för minst varje tusendel och halv tusendel. Avståndet mellan varje tusendelsmarkering skall vara minst 3 mm.Areometrarna skall vara graderade så att de avläses vid "meniskens övre kant". Avläsning av skalan för densitet vid 20 °C eller den specifika vikten vid 20 °C görs antingen vid meniskens övre kant eller på en pappersremsa i areometerns rördel.Areometrar av detta slag skall vara kalibrerade av en offentlig myndighet.5.1.1.2. Kalibrerad termometer, med gradindelning i minst 0,5 °C.5.1.1.3. Mätcylinder med 36 mm innerdiameter och 320 mm höjd, som hålls i lodrätt läge med hjälp av ett stativ med stödskruvar.5.1.2 MetodMätmetodHäll 250 ml av analysprovet, berett enligt 5.1.1.3 ovan, i mätcylindern och placera termometern och areometern i cylindern. Läs av termometern en minut efter noggrann omrörning av provet så att en jämn temperatur erhålls. Avlägsna termometern och läs av den skenbara densiteten vid t °C på areometern efter ytterligare en minut.Den skenbara densiteten vid t °C korrigeras därefter till 20 °C med hjälp av tabellerna för torrt vin (tabell 5), must (tabell 6) eller vin innehållande socker (tabell 7).Den relativa densiteten 20 °C/20 °C erhålls genom att densiteten vid 20 °C divideras med 0,998203.5.2 Densimetri med en hydrostatisk våg5.2.1 ApparaturHydrostatisk vågHydrostatisk våg med maximal kapacitet på minst 100 g och 0,1 mg känslighet.Identiska flottörer av pyrexglas med minst 20 ml volym anbringas under vågskålarna genom upphängning i en tråd med högst 0,1 mm diameter.Den flottör som är upphängd under den högra vågskålen skall kunna nedsänkas i en mätcylinder försedd med nivåmarkering. Mätcylinderns innerdiameter skall vara minst 6 mm större än flottörens. Flottören skall kunna rymmas helt under mätcylinderns nivåmarkering, så att endast upphängningstråden tränger igenom ytan på den vätska som skall mätas. Temperaturen på vätskan i mätcylindern mäts med en termometer som är indelad i steg på 0,2 °C.En hydrostatisk våg med en vågskål kan också användas.5.2.2 Metod5.2.2.1. Kalibrering av en hydrostatisk vågJämvikt erhålls med de båda flottörerna i luften genom att vikter placeras i den högra vågskålen. Notera den totala massan p för vikterna.Fyll mätcylindern med rent vatten till markeringen och läs av temperaturen t °C efter det att kolven har skakats om och fått stå i två tre minuter.Återställ jämvikten genom att placera vikter i den högra vågskålen. Vikternas massa betecknas p'.Flottörens volym vid 20 °C erhålls med formeln:V20 °C = (p'   p)(F + 0,0012)där F är den faktor som anges i tabell 1 för temperaturen t °C,p och V20 °C är egenskaper hos flottören.5.2.2.2. MätmetodDen högra flottören sänks ned i mätcylindern som har fyllts med vin (eller must) upp till märket. Vinets (eller mustens) temperatur t °C avläses och den massa p" som krävs för att återställa jämvikten antecknas.Den skenbara densiteten ñt erhålls med formelnñt °C = >NUM>(p"  />DEN>p);V + 0,0012Om flottören är av pyrexglas, korrigeras densiteten till 20 °C med hjälp av tabell 2, 3 eller 4.6. EXEMPEL PÅ BERÄKNING AV DENSITETEN VID 20 °C OCH DEN RELATIVA DENSITETEN 20 °C/20 °C (REFERENSMETOD)6.1 Pyknometri med en våg med två vågskålar6.1.1 Kalibrering av pyknometern1. Vägning av den rena och torra pyknometern:>Plats för tabell>2. Vägning av pyknometern fylld med vatten vid temperatur t °C:>Plats för tabell>3. Beräkning av massan av luften i behållaren:>Plats för tabell>4. Konstanter som skall användas senare:Tara för den tomma pyknometern, p + m:p + m = 104,9454 + 0,1244p + m = 105,0698 gVolym vid 20 °C = (p + m   p') × Ft °C:F20,50 °C = 1,001900V20 °C = (105,0698   1,2396) × 1,001900V20 °C = 104,0275 mlVattnets massa vid 20 °C: = V20 °C × 0,998203M20 °C = 103,8405 g6.1.2 Bestämning av densiteten och den relativa densiteten 20 °C/20 °C hos ett torrt vinñ" = 1,2622 vid 17,80 °Cñ17,80 °C = >NUM>105,0698  />DEN>1,2622;104,0275ñ17,80 °C = 0,99788 g/mlTabell 2 gör det möjligt att beräkna ñ20°C utifrån ñt °C med hjälp av förhållandet:ñ20 °C = ñt °C ± >NUM>c/>DEN>1 000När t = 17,80 °C och alkoholhalten 11 % vol. är c = 0,54.ñ20 °C = 0,99788   >NUM>0,54/>DEN>1 000ñ20 °C = 0,99734 g/mld20 °C20 °C = >NUM>0,99734/>DEN>0,998203 = 0,999136.2 Pyknometri med en våg med en vågskål6.2.1 Kalibrering av pyknometern1. Vikten av den rena och torra pyknometern:P = 67,7913 g2. Vikten av pyknometern fylld med vatten vid temperaturen t °C:P1 = 169,2715 vid 21,65 °C3. Massan av luften i pyknometern:m = 0,0012 (P1   P)m = 0,0012 × 101,4802m = 0,1218 g4. Konstanter som skall användas senare:Tara för den tomma pyknometern, P   m:P   m = 67,7913   0,1218P   m = 67,6695 gVolym vid 20 °C = [P1   (P   m)]Ft °CF21,65 °C = 1,002140V20 °C = (169,2715   67,6695) × 1,002140V20 °C = 101,8194 mlVattnets massa vid 20 °C = V20 °C × 0,998203M20 °C = 101,6364 gTareringsflaskans massa, T0:T0 = 171,9160 g6.2.2 Bestämning av densiteten och den relativa densiteten 20 °C/20 °C hos ett torrt vinT1 = 171,9178 gdT = 171,9178   171,9160 = 0,0018 gP   m + dT = 67,6695 + 0,0018 = 67,6713 gP2 = 169,2799 vid 18 °Cñ18 °C = >NUM>169,2799  />DEN>67,6713;101,8194ñ18 °C = 0,99793 g/mlTabell 2 gör det möjligt att beräkna ñ20 °C utifrån ñt °C med hjälp av förhållandet:ñ20 °C = ñt °C ± >NUM>c/>DEN>1 000När t = 18 °C och alkoholhalten 11% vol. är c = 0,49.ñ20 °C = 0,99793   >NUM>0,49/>DEN>1 000ñ20 °C = 0,99744 g/mld20 °C20 °C = >NUM>0,99744/>DEN>0,998203 = 0,99923TABELL 1 (F-faktorer med vilka massan av vattnet i pyrexpyknometern vid t °C skall multipliceras för att beräkna pyknometerns volym vid 20 °C) >Hänvisning till >>Start Grafik>>Slut Grafik>TABELL 2 Temperaturkorrektionen c för densiteten hos torra och alkoholfria torra viner, bestämd med en pyknometer av pyrexglas vid t °C, för att erhålla resultated vid 20 °C >Hänvisning till >>Start Grafik>>Slut Grafik>TABELL 3 Temperaturkorrektionen c för densiteten hos naturlig must och koncentrerad must, bestämd med en pyrexpyknometer vid t °C, för att erhålla resultated vid 20 °C >Hänvisning till >>Start Grafik>>Slut Grafik>TABELL 4 Temperaturkorrektionen för densiteten hos vin med en alkoholhalt av lägst 13 % vol. som innehåller restsocker, bestämd med en pyrexpyknometer vid t °C, för att erhålla resultatet vid 20 °C >Hänvisning till >>Start Grafik>>Slut Grafik>TABELL 5 Temperaturkorrektionen c för densiteten hos torra viner och alkoholfria torra viner, bestämd med en areometer eller en pyknometer av vanligt glas vid t °C, för att erhålla resultated vid 20 °C >Hänvisning till >>Start Grafik>>Slut Grafik>TABELL 6 Temperaturkerroktionen c för densiteten hos naturlig must och koncentrerad must, bestämd med en areometer eller en pyknometer av vanligt glas vid t °C, för att erhålla resultated vid 20 °C >Hänvisning till >>Start Grafik>>Slut Grafik>TABELL 7 Temperaturkorrektionen c för densiteten hos vin med en alkoholhalt av lägst 13 % vol. som innehåller restsocker, bestämd med en areometer eller en pyknometer av vanligt glas vid t °C, för att erhålla resultated vid 20 °C >Hänvisning till >>Start Grafik>>Slut Grafik>2. BESTÄMNING AV SOCKERHALTEN I DRUVMUST, KONCENTRERAD DRUVMUST OCH RENAD KONCENTRERAD DRUVMUST MED REFRAKTOMETRI 1. PRINCIPER FÖR METODENBrytningsindex vid 20 °C, uttryckt antingen som absolut värde eller som viktprocent sackaros, söks i respektive tabeller för bestämning av sockerhalten i g/l och i g/kg för druvmust, koncentrerad druvmust och renad koncentrerad druvmust.2. APPARATUR2.1 Refraktometer enligt AbbéRefraktometern skall vara försedd med en skala som visar- viktprocent sackaros, med 0,1 % noggrannhet,- eller brytningsindex, med fyra decimaler.Refraktometern skall vara försedd med en termometer med en skala från minst + 15 °C till + 25 °C samt med en anordning för att cirkulera vatten så att bestämning kan göras vid en temperatur av 20 ± 5 °C.Bruksanvisningen för denna apparat skall följas noggrant, i synnerhet vad gäller kalibrering och ljuskälla.3. BEREDNING AV PROVET3.1 Must och koncentrerad mustPassera vid behov musten genom fyra lager med torr gasväv. Kassera de första filtrerade dropparna och utför bestämningen på den filtrerade produkten.3.2 Renad koncentrerad mustBeroende på koncentrationen används antingen själva den renade koncentrerade musten eller en lösning som erhålls genom att 200 g renad koncentrerad must späds med vatten till 500 g. All vägning skall utföras noggrant.4. METODVärm provet till en temperatur av omkring 20 °C. Placera ett mindre analysprov på refraktometerns nedre prisma och se till att analysprovet fördelas enhetligt över glasytan när prismorna pressas hårt mot varandra. Utför mätningen i enlighet med anvisningarna för det mätinstrument som används.Läs av viktprocenten sackaros med en noggrannhet av 0,1 % eller brytningsindex med fyra decimaler.Utför minst två bestämningar på samma prov. Notera temperaturen t °C.5. BERÄKNING5.1 Temperaturkorrektion5.1.1. Instrument med skala för viktprocent sackaros. Tabell 1 används för temperaturkorrektion.5.1.2. Instrument med skala för brytningsindex: index mätt vid t °C i tabell 2 används för att finna motsvarande värde för viktprocenten sackaros vid t °C (spalt 1). Använd tabell 1 för att korrigera värdet och räkna fram koncentrationen vid 20 °C.5.2 Sockerhalt i must och koncentrerad mustSök viktprocenten sackaros vid 20 °C i tabell 2 och läs på samma rad av sockerhalten i g/l och g/kg. Sockerhalten uttrycks som invertsocker med en decimal.5.3 Sockerhalt i renad koncentrerad mustSök viktprocenten sackaros vid 20 °C i tabell 3 och läs på samma rad av sockerhalten i g/l och g/kg. Sockerhalten uttrycks som invertsocker med en decimal.Om mätningen görs på utspädd renad koncentrerad must multipliceras resultatet med spädningsfaktorn.5.4 Brytningsindex för must, koncentrerad must och renad koncentrerad mustSök viktprocenten sackaros vid 20 °C i tabell 2 och läs på samma rad av brytningsindex vid 20 °C. Index uttrycks med fyra decimaler.TABELL 1>Plats för tabell>Temperaturen får inte avvika från 20 °C med mer än ± 5 °C.TABELL 2 Tabel som visar sockerhalten(6) i renad koncentrerad must i g/l och g/kg, bestämd med en refraktometer som visar antingen viktprocenten av sackaros vid 20 °C eller brytningsindexet vid 20 °C. Densititeten vid 20 °C visas också. >Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >TABELL 3 Tabell som visar sockerhalten(7) i renad koncentrerad must i g/l och g/kg, bestämd med en refraktometer som visar antingen viktprocenten av sackaros vid 20 °C eller brytningsindexet vid 20 °C. Densiteten vid 20 °C visas också. >Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >3. ALKOHOLHALT I VOLYMPROCENT 1. DEFINITIONAlkoholhalten i volymprocent motsvarar antalet liter etanol per 100 liter vin. Båda volymerna mäts vid 20 °C. Alkoholhalt i volymprocent uttrycks med beteckningen % vol.Anmärkning:Etanolhomologa föreningar, samt etanol och etanolhomologa föreningar i etylestrar, ingår i alkoholhalten eftersom dessa förekommer i destillatet.2. PRINCIP FÖR METODERNA2.1 Destillation av vin som gjorts alkaliskt med uppslammad kalciumhydroxid. Bestämning av destillatets alkoholhalt.2.2 Referensmetod: Bestämning av destillatets densitet med pyknometer.2.3 Rutinmetoder:2.3.1 Bestämning av alkoholhalten i destillatet med areometer.2.3.2 Densimetrisk bestämning av alkoholhalten i destillatet med hydrostatisk våg.2.3.3 Bestämning av alkoholhalten i destillatet med refraktometri.Anmärkning:Använd tabellerna 1, 2 och 3 i bilaga 2 till detta kapitel för att bestämma alkoholhalten utifrån destillatets densitet. Dessa har räknats fram med hjälp av Internationella tabeller över alkoholhalt, publicerade 1972 av Internationella organisationen för rättsmetrologi i dess rekommendation nr 22 och antagna av OIV (generalförsamlingen 1974).Tabell 1 ger den generella formeln för förhållandet mellan alkoholhalten i volymprocent och densiteten i blandningar av alkohol och vatten som en funktion av temperaturen.3. METOD FÖR FRAMSTÄLLNING AV DESTILLAT3.1 Apparatur3.1.1 Destillationsapparat, bestående av- rundbottnad enliters kolv med slipade glaskopplingar,- ca 20 cm lång destillationskolonn eller annan apparat som förhindrar stänk,- värmekälla: lämpliga åtgärder vidtas för att förhindra pyrolys av extraherat material,- kylare som avslutas med ett smalt rör som leder destillatet till botten av ett graderat förlag som innehåller några ml vatten.3.1.2 Ångdestillationsapparat bestående av1. en ånggenerator,2. ett ångrör,3. en destillationskolonn,4. en kylare.Andra modeller av destillationsapparater eller ångdestillationsapparater får användas om de uppfyller kraven för följande analys: En blandning av etanol och vatten med en alkoholhalt av 10 % vol. destilleras fem gånger i följd. Destillatet skall efter den femte destillationen ha en alkoholhalt av minst 9,9 % vol., dvs. alkoholförlusten vid varje destillation får inte överstiga 0,02 % vol.3.2 Reagenser3.2.1 2 M kalciumhydroxidsuspensionFramställs genom att en liter vatten med en temperatur av 60 70 °C försiktigt hälls över 120 g osläckt kalk (CaO).3.3 Beredning av provetAvlägsna större delen av koldioxioden i unga eller mousserande viner genom att skaka om 250 till 300 ml vin i en 500 ml kolv.3.4 MetodMät upp 200 ml vin i en mätkolv. Notera vinets temperatur.Häll över vinet i en destillationskolv och för ner ångdestillationsapparatens ångrör i kolven. Skölj mätkolven fyra gånger med 5 ml vatten som tillsätts kolven eller ångröret. Tillsätt 10 ml kalciumhydroxid (se 3.2.1) och några bitar av ett inert poröst material (t.ex. pimpsten).Samla upp destillatet i den 200 ml mätkolv som användes för att mäta upp vinet.Samla upp en volym motsvarande ca tre fjärdedelar av den ursprungliga volymen vid vanlig destillation och vid ångdestillation 198 199 ml av destillatet. Fyll på med destillerat vatten till 200 ml och håll destillatet vid ursprungstemperaturen ± 2 °C.Rör om försiktigt med en cirkelrörelse.Anmärkning:För viner som innehåller särskilt höga koncentrationer av ammoniumjoner kan destillatet omdestilleras enligt ovan, men kalciumhydroxidsuspensionen ersätts med 1 M svavelsyra i spädning 10:100 (v/v).4. REFERENSMETODBestämning av alkoholhalten i destillatet med pyknometer.4.1 Apparatur4.1.1 Kalibrerad pyknometer (se kapitel 1, "Densitet och specifik vikt").4.2 MetodBestäm destillatets skenbara densitet (3.4.) vid t °C enligt anvisningar i kapitlet "Densitet och specifik vikt" (kapitel 1, punkterna 4.3.1 och 4.3.2). Densiteten betecknas ñt.4.3 Redovisning av resultaten4.3.1 BeräkningsmetodBestäm alkoholhalten vid 20 °C med hjälp av tabell 1. På den vågräta raden i tabellen som motsvarar temperaturen T (uttryckt i hela tal) direkt under t °C söks den minsta densitet som är större än ñt. Beräkna densiteten ñ vid temperaturen T med hjälp av den differens som anges nedanför densiteten i tabellen.På raden för temperaturen T söks densiteten ñ, som är omedelbart över ñ'. Beräkna skillnaden mellan densiteterna ñ och ñ'. Dividera skillnaden med den differens som anges i tabellen direkt till höger om densiteten ñ'. Kvoten anger decimaldelen för alkoholhalten, medan heltalsdelen av alkoholhalten anges längst upp i den spalt som visar densiteten ñ'.Exempel på beräkning av alkoholhalten ges i bilagan till detta kapitel.Anmärkning:Temperaturkorrektionen har lagts in i ett datorprogram och kan eventuellt utföras automatiskt.4.3.2 Repeterbarhet (r):r = 0,10 % vol.4.3.3 Reproducerbarhet (R):R = 0,19 % vol.5. RUTINMETODER5.1 Areometeranalys5.1.1 Apparatur5.1.1.1 Alkoholometer.Alkoholometern skall uppfylla specifikationerna för apparatur av klass 1 eller klass 2 enligt definition i internationell rekommendation nr 44, Alkoholometrar och areometrar för alkohol från ILMO (Internationella organisationen för rättsmetrologi).5.1.1.2 Termometer indelad i tiondels grader från 0° till 40 °C certifierad för en noggrannhet av 1/20:s grad.5.1.1.3 Mätcylinder med diameter 36 mm och höjd 320 mm, som hålls i lodrätt läge med hjälp av ett stativ med stödskruvar.5.1.2 MetodHäll destillatet (3.4) i mätcylindern. Se till att cylindern hålls i lodrätt läge. Sänk ned termometern och alkoholometern. Läs av temperaturen på termometern en minut efter omrörning för att få samma temperatur på mätkolven, termometern, alkoholometern och destillatet. Avlägsna termometern och läs av den skenbara alkoholhalten efter en minut. Minst tre avläsningar görs med hjälp av ett förstoringsglas. Den skenbara halt som mätts vid t °C korrigeras för temperatureffekten med hjälp av tabell 2.Vätskans temperatur får avvika med högst 5 °C från rumstemperaturen.5.2 Densimetri med hydrostatisk våg5.2.1 ApparaturDen hydrostatiska vågen används enligt anvisningarna i kapitlet "Densitet och specifik vikt".5.2.2 MetodDestillatets skenbara densitet vid t°C bestäms enligt anvisningarna i kapitlet "Densitet och specifik vikt", punkt 5.2.2.5.2.3 Redovisning av resultatenAlkoholhalten vid 20 °C bestäms med hjälp av den metod som beskrivs i 4.3.1. Använd tabell 1 om flottören är av pyrexglas och tabell 3 om den är av vanligt glas.5.3 Refraktometri5.3.1 Apparatur5.3.1.1 Refraktometer som möjliggör bestämning av brytningsindex mellan 1,330 och 1,346.Beroende på typen av utrustning görs följande bestämningar:- antingen vid 20 °C med ett lämpligt instrument,- eller vid rumstemperatur med ett instrument försett med en termometer som tillåter temperaturmätning med en noggrannhet av minst 0,05 °C. En tabell med temperaturkorrektioner följer med instrumentet.5.3.2 MetodDestillatets brytningsindex bestäms enligt 3.4 ovan med den metod som anvisas för den använda apparaten.5.3.3 Redovisning av resultatenTabell 4 används för att bestämma den alkoholhalt som motsvarar brytningsindex vid 20 °C.Anmärkning:Tabell 4 anger alkoholhalter som motsvarar brytningsindex för såväl rena blandningar av alkohol och vatten som för vindestillat. För vindestillat tas hänsyn till förekomst av föroreningar i destillatet (främst högre alkoholer). Förekomst av metanol sänker brytningsindex och därmed alkoholhalten.6. EXEMPEL PÅ BERÄKNING AV ALKOHOLHALTEN I VIN6.1 Pyknometri på en våg med två vågskålar6.1.1 Pyknometerns konstanter har bestämts och beräknats enligt beskrivningen i kapitel 1, "Densitet och specifik vikt" (6.1.1).6.1.2 Vägning av pyknometer fylld med destillat>Plats för tabell>p + m   p" = destillatets massa vid t °C 105,0698   2,8074 = 102,2624 gSkenbar densitet vid t °C>Plats för tabell>6.1.3 Beräkning av alkoholhalten>Plats för tabell>6.2 Bestämning med pyknometer på en våg med en vågskål6.2.1. Pyknometerns konstanter har bestämts och beräknats enligt beskrivningen i kapitel 1, "Densitet och specifik vikt", punkt 6.2.1.6.2.2 Vägning av pyknometer fylld med destillat>Plats för tabell>6.2.3 Beräkning av alkoholhalten>Plats för tabell>FORMEL FRÅN VILKA TABELLERNA ÖVER ALKOHOLHALTEN I ETANOL/VATTENBLANDNINGAR HAR BERÄKNATSDensiteten ñ i kilogram per kubikmeter (kg/m3) hos en blandning av etanol och vatten vid temperaturen t i grader Celsius erhålls med formeln nedan som en funktion av:- alkoholhalten i viktprocent (p), angiven med en decimal(8)( - temperaturen t i °C (EIPT 68)- nedanstående talkoefficienterFormeln gäller för temperaturer mellan   20 och + 40 °C.ñ = A1 + Ók = 212 Ak pk - 1 + Ók = 16 Bk(t - 20 °C)k + Ói = 1n Ók = 1m Ci,k pk(t - 20 °C)in = 5m1 = 11m2 = 10m3 = 9m4 = 4m5 = 2>Plats för tabell>TABELL 1 >Start Grafik>INTERNATIONELL ALKOHOLHALT VID 20 °CTabell över skenbar densitet hos etanol/vattenblandningar - Pyknometer av pyrexglasDensitet vid t C, korrigerad för luftens upptryck>Slut Grafik>>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >TABELL 2 >Start Grafik>INTERNATIONELI ALKOHOLHALT VID 20 °CTabell för korrektion av den skenbara alkoholhalten med hänsyn till temperaturenDen skenbara alkoholhalten vid t °C korrigeras genom addition eller subtraktion enligt nedan (alkoholometer av vanligt glas)>Slut Grafik>>Hänvisning till >>Hänvisning till >TABELL 3 >Start Grafik>INTERNATIONELI ALKOHOLHALT VID 20 °CTabell över skenbar densitet hos etanol/vattenblandningar - vanlig glasapparaturDenstet vid t °C, korrigerad för luftens upptryck>Slut Grafik>>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >TABELL 4 >Start Grafik>Tabellen återger brytningsindex för rena blandningar av etanol/vatten och destillat vid 20 °C och motsvarande alkoholhalt i % vol. vid 20 °C.>Slut Grafik>>Hänvisning till > 4. TOTALT TORREXTRAKT Totala mängden torrsubstans 1. DEFINITIONDet totala torrextraktet är mängden av alla ämnen som inte förflyktigas under givna fysikaliska betingelser. De fysikaliska betingelserna skall vara sådana att det ämne som utgör torrsubstansen förändras så lite som möjligt under undersökningen.Det sockerfria extraktet är skillnaden mellan det totala torrextraktet och den totala mängden av socker.Det reducerade extraktet är skillnaden mellan det totala torrextraktet och den totala mängden av socker som överskrider 1 g/l, den totala mängden kaliumsulfat som överskrider 1 g/l samt eventuellt förekommande mannitol och andra kemiska ämnen som kan ha tillsatts vinet.Restextraktet är det sockerfria extraktet minus icke-flyktiga syror, uttryckta som vinsyra.Extraktet uttrycks i gram per liter och skall bestämmas med en noggrannhet av 0,5 g.2. PRINCIP FÖR METODENEnda metod: bestämning med densimeter.Det totala torrextraktet beräknas indirekt utifrån mustens specifika vikt och, för vin, utifrån det alkoholfria vinets specifika vikt.Torrextraktet uttrycks som den mängd sackaros, som när den löses i vatten och späds till en volym på en liter, ger en lösning med samma specifika vikt som musten eller det alkoholfria vinet. Denna mängd anges i tabell 1.3. BERÄKNINGSMETODDet "alkoholfria vinets" specifika vikt d2020 (dr) beräknas med hjälp av följande formel:>Plats för tabell>dr kan också beräknas med hjälp av nedanstående formel, utifrån densiteterna vid 20 °C, ñv för vinet och ña för blandningen av vatten och alkohol med samma alkoholstyrka:dr = 1,0018(ñv   ña) + 1,000där koefficienten 1,0018 avrundas till 1 när ñv är mindre än 1,05, vilket oftast är fallet.4. REDOVISNING AV RESULTATENTabell 1 används för att beräkna det totala torrextraktet i g/l utifrån det alkoholfria vinets relativa densitet dr2020 eller mustens relativa densitet d2020.Det totala torrextraktet uttrycks i g/l med en decimal.TABEL 4 >Start Grafik>För beräkning av det totala torrextraket (g/l)>Slut Grafik>>Hänvisning till >5. REDUCERANDE SOCKER 1. DEFINITIONReducerande socker omfattar alla sockerarter med keton- och aldehydgrupper och kännetecknas av sin reducerande verkan på en basisk kopparsaltlösning.2. PRINCIPER FÖR METODERNA2.1 Klarning2.1.1. Referensmetod: Efter neutralisering och avlägsnande av alkoholen förs vinet genom en jonbytarkolonn där anjonerna byts mot acetatjoner, och klaras därefter med neutralt blyacetat.2.1.2. Rutinmetod: Vinet behandlas med något av följande reagenser:2.1.2.1. Neutralt blyacetat2.1.2.2. Zinkhexacyanoferrat (II)2.2. Bestämning2.2.1. Enda metod: Det klarade vinet eller den klarade musten reageras med en given mängd basisk kopparsaltlösning och överskottet av kopparjoner bestäms därefter jodometriskt.3. KLARNINGSockermängden i den vätska vars sockerhalt skall bestämmas skall vara mellan 0,5 och 5 g/l.Torra viner bör inte spädas under klarningen. Söta viner bör spädas under klarningen så att sockerhalten ligger inom gränserna i tabellen nedan:>Plats för tabell>3.1. Referensmetod3.1.1. Reagenser3.1.1.1. 1 M saltsyra (HCI)3.1.1.2. 1 M natriumhydroxid (NaOH)3.1.1.3. 4 M ättiksyra (CH3COOH)3.1.1.4. 2 M natriumhydroxid (NaOH)3.1.1.5. Anjonbytare (Dowex 3, mesh 20-50) eller likvärdig jonbytare.Beredning av anjonbytarkolonnen. Placera en liten tuss glasull och 15 ml av anjonbytaren (3.1.1.5) på byrettens botten.Innan jonbytaren används skall den behandlas i två fullständiga regenereringscykler genom att 1 M lösningar av saltsyra (3.1.1.1) och natriumhydroxid (3.1.1.2) omväxlande passeras genom den. Skölj i 50 ml destillerat vatten och flytta över jonbytaren till en bägare. Tillsätt 50 ml av 4 M ättiksyran (3.1.1.3) och rör om i fem minuter. Fyll på nytt byretten med jonbytare och häll 100 ml 4 M ättiksyra (3.1.1.3) genom kolonnen. (Det är lämpligt att ha ett lager av jonbytare i en flaska med 4 M ättiksyra.) Tvätta kolonnen med destillerat vatten till dess att utflödet är neutralt.Regenerering av jonbytaren. Häll 150 ml av en 2 M natriumhydroxidlösning genom jonbytaren för att avlägsna syror och större delen av de färgämnen som är bundna i jonbytaren. Skölj med 100 ml vatten och häll sedan 100 ml 4 M ättiksyra genom jonbytaren. Tvätta kolonnen till dess att utflödet är neutralt.3.1.1.6. Neutral blyacetatlösning (nästan mättad):neutralt blyacetat Pb (CH3COO)2,3 H2O 250 gmycket hett vatten till 500 mlRör om tills blyacetat et är löst.3.1.1.7. Kalciumkarbonat (CaCO3)3.1.2 Metod3.1.2.1. Torra vinerHäll 50 ml av vinet i en bägare med en diameter av 10 12 cm, tillsammans med 1/2 (n 0,5) ml av 1 M natriumhydroxidlösning (3.1.1.2) (n är den volym 0,1 M natriumhydroxidlösning som åtgår för bestämning av totala syrahalten i 10 ml vin) och låt indunsta över vattenbad med kokande vatten i en varm luftström till dess att vätskan reducerats till cirka 20 ml.Häll denna vätska genom en anjonbytarkolonn i acetatform (3.1.1.5) med en hastighet av 3 ml per 2 minuter. Samla upp utflödet i en 100 ml mätkolv. Tvätta kärlet och kolonnen sex gånger med 10 ml destillerat vatten per gång. Rör om hela tiden, tillsätt 2,5 ml mättad blyacetatlösning (3.1.1.6) och 0,5 g kalciumkarbonat (3.1.1.7) till utflödet. Skaka om flera gånger och låt stå i minst 15 minuter. Fyll upp med vatten till märket. Filtrera.1 ml filtrat motsvarar 0,5 ml vin.3.1.2.2. Must, mistella, sött och halvsött vin:Nedanstående spädningar är endast avsedda som vägledning.1. Must och mistella:bered en 10 % lösning av den vätska som skall analyseras och ta 10 ml av det utspädda provet.2. Söta viner, med eller utan tillsats av alkohol, med en densitet mellan 1,005 och 1,038: bered en 20 % lösning av den vätska som skall analyseras och ta 20 ml av det utspädda provet.3. Halvsöta viner med en densitet vid 20 °C mellan 0,997 och 1,005: ta 20 ml av det outspädda vinet.Låt ovan angivna volym vin eller must passera genom en anjonbytarkolonn i acetatform med en hastighet av 3 ml per 2 minuter. Samla upp utflödet i en 100 ml mätkolv och skölj kolonnen med vatten tills cirka 90 ml utflöde har erhållits. Tillsätt 0,5 g kalciumkarbonat och 1 ml mättad blyacetatlösning till utflödet. Rör om och låt stå i 15 minuter. Rör om då och då. Fyll upp med vatten till märket. Filtrera.1. 1 ml filtrat motsvarar 0,01 ml must eller mistella.2. 1 ml filtrat motsvarar 0,04 ml sött vin.3. 1 ml filtrat motsvarar 0,20 ml halvsött vin.3.2 Rutinmetoder3.2.1 Klarning med neutralt blyacetat3.2.1.1. ReagenserLösning av neutralt blyacetat (nästan mättad) (se 3.1.1.6).Kalciumkarbonat.3.2.1.2. Metod3.2.1.2.1 Torra viner:Häll 50 ml av vinet i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 1/2 (n 0,5) ml 1 M natriumhydroxidlösning (3.1.1.2) (n är den volym av 0,1 M natriumhydroxidlösning som åtgår för bestämning av den totala syrahalten i 10 ml vin). Tillsätt under omrörning 2,5 ml mättad blyacetatlösning (3.1.1.6) och 0,5 g kalciumkarbonat (3.1.1.7). Skaka om flera gånger och låt stå i minst 15 minuter. Fyll upp med vatten till märket. Filtrera.1 ml filtrat motsvarar 0,5 ml vin.3.2.1.2.2 Must, mistella, söta och halvsöta viner:Häll följande mängder vin (eller must eller mistella) i en 100 ml mätkolv. Angivna spädningar är endast avsedda som vägledning.1. Must och mistella:Bered en 10 % lösning av den vätska som skall analyseras och ta 10 ml av det utspädda provet.2. Söta viner, med eller utan tillsats av alkohol, med en densitet mellan 1,005 och 1,038: bered en 20 % lösning av den vätska som skall analyseras och ta 20 ml av det utspädda provet.3. Halvsöta viner med en densitet vid 20 °C mellan 0,997 och 1,005: ta 20 ml av det outspädda vinet.Tillsätt 0,5 g kalciumkarbonat, cirka 60 ml vatten och 0,5 1 eller 2 ml mättad blyacetatlösning. Rör om och låt stå i minst 15 minuter. Rör om då och då. Fyll upp med vatten till märket. Filtrera.1. 1 ml filtrat motsvarar 0,01 ml must eller mistella.2. 1 ml filtrat motsvarar 0,04 ml sött vin.3. 1 ml filtrat motsvarar 0,20 ml halvsött vin.3.2.2 Klarning med zink-2-hexacyanoferratDenna klarningsprocess bör endast användas för vita viner, svagt färgade söta viner och must.3.2.2.1. Reagenser3.2.2.1.1. Lösning 1, kalium-2-hexacyanoferrat:>Plats för tabell>3.2.2.1.2. Lösning 2, zinksulfat:>Plats för tabell>3.2.2.2. MetodHäll följande mängder vin (eller must eller mistella) i en 100 ml mätkolv. Angivna spädningar är endast avsedda som vägledning.1. Must och mistella:Bered en 10 % lösning av den vätska som skall analyseras och ta 10 ml av det utspädda provet.2. Söta viner, med eller utan tillsats av alkohol, med en densitet mellan 1,005 och 1,038: bered en 20 % lösning av den vätska som skall analyseras och ta 20 ml av det utspädda provet.3. Halvsöta viner med en densitet mellan 0,997 och 1,005: ta 20 ml av det outspädda vinet.4. Torra viner: ta 50 ml av det outspädda vinet.Tillsätt 5 ml av lösning 1, kalium-2-hexacyanoferrat (3.2.2.1.1), och 5 ml av lösning 2, zinksulfat (3.2.2.1.2). Blanda. Fyll upp med vatten till märket. Vänta 10 minuter. Filtrera.1. 1 ml filtrat motsvarar 0,01 ml must eller mistella.2. 1 ml filtrat motsvarar 0,04 ml sött vin.3. 1 ml filtrat motsvarar 0,20 ml halvsött vin.4. 1 ml filtrat motsvarar 0,50 ml torrt vin.4. BESTÄMNING AV SOCKER4.1 Reagenser4.1.1 Basisk kopparlösning:>Plats för tabell>Lös kopparsulfatet i 100 ml vatten, citronsyran i 300 ml vatten och natriumkarbonatet i 300-400 ml hett vatten. Blanda citronsyra- och natriumkarbonatlösningarna. Tillsätt kopparsulfatlösningen och späd till en liter.4.1.2 30 % kaliumjodidlösning:>Plats för tabell>Förvara i en flaska av färgat glas.4.1.3 25 % svavelsyra:>Plats för tabell>Tillsätt långsamt syran till vattnet, låt svalna och späd med vatten till 100 ml.4.1.4 Stärklselösning 5 g/l:Blanda 5 g stärkelse med cirka 500 ml vatten. Låt koka upp under omrörning och koka i tio minuter. Tillsätt 200 g natriumklorid (NaCl). Låt svalna och späd med vatten till en liter.- 0,1 M natriumtiosulfaltlösning- Invertsockerlösning, 5 g/l, används för att kontrollera bestämningsmetoden.Häll följande i en 200 ml mätkolv:>Plats för tabell>Värm kolven i vattenbad vid 60 °C till dess att lösningens temperatur är 50 °C. Håll kolven och lösningen vid 50 °C i 15 minuter. Låt kolven svalna naturligt i 30 minuter och sänk därefter ned den i ett kallt vattenbad. Häll över lösningen i en 1 l mätkolv och späd till en liter. Denna lösning kan förvaras i en månad. När den skall användas neutraliseras den (lösningen har en surhet av cirka 0,06 M) med natriumhydroxidlösning.4.2 MetodBlanda 25 ml av den basiska kopparlösningen, 15 ml vatten och 10 ml av den klarade lösningen i en 300 ml konisk kolv. Denna volym sockerlösning får inte innehålla mer än 60 mg invertsocker.Tillsätt några bitar pimpsten. Anbringa en återloppskylare på kolven och låt blandningen koka upp inom två minuter. Låt blandningen koka i exakt tio minuter.Kyl av kolven omedelbart under kallt rinnande vatten. När den är helt avkyld, tillsätt 10 ml 30 % kaliumjodidlösning (4.1.2), 25 ml 25 % svavelsyra (4.1.3) och 2 ml stärkelselösning (4.1.4).Titrera med 0,1 M natriumtiosulfatlösning (4.1.5). Den använda mängden i ml betecknas n.Utför också ett nollprov där sockerlösningen på 10 ml ersätts med 10 ml destillerat vatten. Den använda mängden natriumtiosulfat i ml betecknas n'.4.3 Redovisning av resultaten4.3.1 BeräkningarSockermängden i provet, uttryckt som invertsocker, anges i tabellen nedan som en funktion av den använda mängden (n'   n) natriumtiosulfat i ml.Vinets sockerhalt uttrycks i gram invertsocker per liter med en decimal, med hänsyn tagen till den spädning som görs under klarningen samt till provets volym.4.3.2 Repeterbarhet>Plats för tabell>4.3.3 Reproducerbarhet>Plats för tabell>>Plats för tabell>6. SACKAROS 1. PRINCIPER FÖR METODERNA1. Kvalitativ undersökning med tunnskiktskromatografi. Sackaros separeras från andra sockerarter med tunnskiktskromatografi på en cellulosabelagd platta och påvisas med hjälp av urea-saltsyrareagens vid 105 °C.2. Undersökning och bestämning med HPLC (vätskekromatografi): sackaros separeras i en kolonn av alkylaminbunden silica och påvisas med refraktometri. Resultatet kvantifieras i förhållande till en extern standard som analyseras under samma betingelser.Anmärkning:Äktheten hos en must eller ett vin kan kontrolleras med den metod som använder deuterium-NMR och som har beskrivits för att påvisa sockertillsats i must, renad koncentrerad must och vin.För undersökning och bestämning av sackaros kan också gaskromatografi användas, såsom beskrivs i kapitel 42, punkt f.2. KVALITATIV UNDERSÖKNING MED TUNNSKIKTSKROMATOGRAFI2.1 Apparatur2.1.1. Kromatografiplattor täckta med cellulosapulver till önskad tjocklek (t.ex. MN 300) (20×20).2.1.2. Kromatografikärl.2.1.3. Mikrometerspruta eller mikropipett.2.1.4. Torkskåp som kan regleras till 105 ± 2 °C.2.2 Reagenser2.2.1. Aktivt kol för avfärgning.2.2.2 Mobil fas: diklormetan - isättika (ñ20 = 1,05 g/ml) - etanol - metanol - vatten (50:25:9:6:10).2.2.3 Framkallare>Plats för tabell>2.2.4 Referenslösningar>Plats för tabell>2.3 Metod2.3.1 Beredning av provetMust eller vin med kraftig färg avfärgas genom behandling med aktivt kol.För renad koncentrerad must används en lösning med en sockerhalt av 25 % (m/m) (25 °Brix) som bereds enligt anvisningarna i kapitlet "pH-värde", punkt 4.1.2, och späds till en fjärdedel av koncentrationen genom att 25 ml späds med vatten till 100 ml i en mätkolv.2.3.2 Framställning av kromatogramPlacera följande bredvid varandra, 2,5 cm från plattans nederkant:- 10 ìl av provet- 10 ìl standardlösning.Placera plattan i kärlet som tidigare mättats med ånga från den mobila fasen. Låt den mobila fasen vandra till inom 1 cm från plattans överkant. Avlägsna plattan och torka den i en varm luftström. Upprepa vandringen ytterligare två gånger och torka plattan varje gång. Spraya på 15 ml av framkallaren i ett jämnt lager och lägg plattan i 105 °C i ett torkskåp i ca fem minuter.2.4 ResultatSackaros och fruktos framträder som mörkblå fläckar mot vit bakgrund, medan glukos framträder som en svagare grönfärgad fläck.3. UNDERSÖKNING OCH BESTÄMNING MED HPLCAnvisningarna för kromatografi lämnas endast som vägledning.3.1 Utrustning3.1.1. HPLC-apparat utrustad med följande:1. 10 ìl injektor.2. Detektor: differentialrefraktometer eller refraktometer av interferometertyp.3. Alkylaminbunden silicakolonn (25 cm lång, 4 mm innerdiameter).4. Förkolonn fylld med samma fas.5. Anordning for isolering eller termostatkontroll (vid 30 °C) av förkolonnen och provkolonnerna.6. Skrivare samt eventuellt integrator.7. Flödeshastighet i mobil fas: 1 ml/min.3.1.2 Anordning för membranfiltrering (0,45 ìm).3.2 Reagenser3.2.1. Dubbeldestillerat vatten.3.2.2. Acetonitril av HPLC-kvalitet (CH3CN).3.2.3 Mobil fas: acetonitrilvatten som genomgått membranfiltrering (0,45 ìm), (80:20, v/v).Den mobila fasen skall avgasas före användning.3.2.4 Standardlösning: 1,2 g/l vattenhaltig sackaroslösning. Filtreringsanordning med 0,45 ìm membranfilter.3.3 Metod3.3.1. Beredning av provet- För vin och must:filtreringsanordning med 0,45 ìm membranfilter.- För renad koncentrerad must:använd en lösning som erhålls genom spädning av den renade koncentrerade musten till 40 % (m/v) enligt anvisningarna i kapitlet "Total syrahalt", punkt 5.1.2, och filtrera den genom ett 0,45 ìm membranfilter.3.3.2 Kromatografisk bestämningInjicera först 10 ìl av standardlösningen i kromatografen och därefter 10 ìl av provet som beretts enligt anvisningarna i 3.3.1. Upprepa injektionerna i samma ordning.Skriv ut kromatogrammet.Retentionstiden för sackaros är cirka 10 minuter.3.4 BeräkningarFör beräkningen används medelvärdet av två resultat för standardlösningen och provet.3.4.1 För vin och must:Beräkna koncentrationen i g/l.3.4.2 För renad koncentrerad must:Sackaroshalten i g/l i den 40-procentiga (m/v) lösningen av renad koncentrerad must betecknas C.Sackaroshalten i g/kg i den renade koncentrerade musten blir då 2,5 C.3.5 Redovisning av resultatenSackaroshalten i vin, must och renad koncentrerad must uttrycks i gram per liter för vin och must och i gram per kilogram för renad koncentrerad must, i båda fallen med en decimal.7. GLUKOS OCH FRUKTOS 1. DEFINITIONGlukos och fruktos kan bestämmas var för sig med en enzymatisk metod enbart i syfte att beräkna förhållandet glukos/fruktos.2. PRINCIPGlukos och fruktos fosforyleras med adenosintrifosfat (ATP) under en enzymreaktion som katalyseras av hexokinas (HK) och ger då glukos-6-fosfat (G6P) och fruktos-6-fosfat (F6P):glukos + ATP>Start Grafik>HK>Slut Grafik>G6P + ADPfruktos + ATP>Start Grafik>HK>Slut Grafik>F6P + ADPGlukos-6-fosfat oxideras först till glukonat-6-fosfat med nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADP) i närvaro av enzymet glukos-6-fosfatdehydrogenas (G6PDH). Den mängd reducerat nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADPH) som erhålls motsvarar mängden glukos-6-fosfat och därmed också mängden glukos.G6P + NADP+>Start Grafik>G6PDH>Slut Grafik>glukonat-6-fosfat + NADPH + H+Det reducerade nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfatet bestäms utifrån dess absorption vid 340 nm.I slutet av reaktionsförloppet omvandlas fruktos-6-fosfat till glukos-6-fosfat under påverkan av fosfoglukosisomeras (PGI):F6P>Start Grafik>PGI>Slut Grafik>G6PGlukos-6-fosfat reagerar i sin tur med nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfatet och producerar glukonat-6-fosfat och reducerat nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat, som därefter bestäms.3. APPARATUR- Spektrofotometer för mätning vid 340 nm, den våglängd där NADPH har maximal absorption. Eftersom absoluta mätningar görs (dvs. kalibreringskurvor används inte, utan standardisering görs med hjälp av extinktionskoefficienten för NADPH), måste apparatens våglängdsskalor och absorptionsvärden kontrolleras.Om ovanstående utrustning inte finns tillgänglig kan en spektrofotometer med diskontinuerligt spektrum användas, för mätning vid 334 nm eller 365 nm.- Glaskuvetter med en optisk väglängd på 1 cm eller engångskuvetter.- Pipetter för de enzymatiska provlösningarna, 0,02 - 0,05 - 0,1 - 0,2 ml.4. REAGENSER4.1 Lösning 1: buffertlösning (0,3 M trietanolamin, pH 7,6; 4 × 10-3 M Mg2+). Lös 11,2 g trietanolaminhydroklorid ((C2H5)3N × HCl) och 0,2 g MgSO4 × 7H2O i 150 ml dubbeldestillerat vatten. Tillsätt cirka 4 ml 5 M natriumhydroxidlösning (NaOH) för att uppnå pH 7,6. Späd till 200 ml.Denna buffertlösning kan förvaras i fyra veckor vid + 4 °C.4.2 Lösning 2: nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfatlösning (ca 11,5 × 10-3 M). Lös 50 mg dinatrium-nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat i 5 ml dubbeldestillerat vatten.Lösningen kan förvaras i fyra veckor vid + 4 °C.4.3 Lösning 3: adenosin-5'-trifosfatlösning (ca 81 × 10-3 M). Lös 250 mg dinatrium-adenosin-5'-trifosfat och 250 mg natriumhydrogenkarbonat (NaHCO3) i 5 ml dubbeldestillerat vatten.Lösningen kan förvaras i fyra veckor vid + 4 °C.4.4 Lösning 4: hexokinas/glukos-6-fosfatdehydrogenas: Blanda 0,5 ml hexokinas (2 mg protein/ml eller 280 E/ml) med 0,5 ml glukos-6-fosfatdehydrogenas (1 mg protein/ml).Blandningen kan förvaras i ett år vid + 4 °C.4.5 Lösning 5: fosfoglukosisomeras (2 mg protein/ml eller 700 E/ml). Suspensionen används outspädd.Kan förvaras i ett år vid + 4 °C.Anmärkning:Samtliga ovan angivna lösningar finns i handeln.5. METOD5.1 Beredning av provetBeroende på den uppskattade mängden glukos + fruktos per liter skall provet spädas enligt följande:>Plats för tabell>5.2 BestämningStäll in spektrofotometern på våglängden 340 nm och utför bestämningarna i förhållande till luften (ingen kuvett i strålgången) eller till vatten.Temperatur mellan 20 och 25 °C.Placera följande i två kuvetter med 1 cm väglängd:>Plats för tabell>Blanda och läs av lösningarnas absorbans (A1) efter cirka tre minuter. Sätt igång reaktionen genom att tillsätta>Plats för tabell>Blanda. Vänta 15 minuter och läs av absorbansen. Kontrollera efter ytterligare 2 minuter (A2) att reaktionen har avstannat.Tillsätt omedelbart:>Plats för tabell>Blanda, läs av absorbansen (A3) efter 10 minuter och kontrollera efter ytterligare 2 minuter att reaktionen har avstannat.Beräkna absorbansdifferenserna:A2 - A1 motsvarar glukosA3 - A2 motsvarar fruktosför såväl referens- som provvätskan.Beräkna absorbansdifferenserna för referensvätskan (ÄAT) och provvätskan (ÄDP) och gör följande beräkningar:>Plats för tabell>Anmärkning:Tidsåtgången för att enzymerna skall utöva sin fulla verkan varierar mellan olika prover. Ovanstående värde anges endast som vägledning och vârdet bör bestämmas individuellt för varje prov.5.3 Redovisning av resulttaten5.3.1. BeräkningFöljande allmänna formel används för att beräkna koncentrationerna:C = >NUM>V × PM/>DEN>å × d × v × 1 000 Ä A(g/l)där>Plats för tabell>och>Plats för tabell>Då erhålls:>Plats för tabell>Om provet har spätts i samband med beredningen multipliceras resultatet med spädningsfaktorn F.Anmärkning:Om bestämningarna görs vid 334 eller 365 nm erhålls följande resultat:- bestämning vid 334 nm: Ó = 6,2 (mnol-1 × 1 × cm-1)>Plats för tabell>- bestämning vid 365 nm: Ó = 3,4 (nmol-1 × 1 × cm-1)>Plats för tabell>5.3.2 Repeterbarhet (r)r = 0,056 xi5.3.3 Reproducerbarhet (R)>Plats för tabell>8. PÅVISANDE AV SOCKERTILLSATS I DRUVMUST, KONCENTRERAD DRUVMUST, RENAD KONCENTRERAD DRUVMUST OCH VIN GENOM TILLÄMPNING AV KÄRNMAGNETISK RESONANS AV DEUTERIUM (SNIF-NMR/RMN-FINS) 1. DEFINITIONDe deuteriumatomer som finns i socker och i vattnet i druvmust omfördelas efter jäsning i molekylerna I, II, III och IV i vinet:>Plats för tabell>Tillsats av främmande sockerarter (chaptalisering) före jäsning av musten påverkar deuteriumfördelningen.Vid en jämförelse med värdena för motsvarande parametrar i ett naturligt referensvin från samma område jakttas följande variationer efter tillsats av främmande sockerarter:>Plats för tabell>(D/H)I: Isotopförhållande i molekyl I(D/H)II: Isotopförhållande i molekyl II(D/H)QW: Isotopförhållande i vattnet i vinetR = 2(D/H)II/(D/H)I uttrycker den relativa distributionen av deuterium i molekylerna I och II. R mäts direkt från signalernas h-intensitet, så att R = 3hII/hI.(D/H)I karakteriserar främst den växtart i vilken sockret har syntetiserats och i mindre utsträckning de geografiska förhållandena på den plats där skörden ägt rum (typ av vatten vid fotosyntesen).(D/H)II representerar klimatförhållandena på den plats där druvorna vuxit (regnvatten och väderleksförhållanden) och i mindre utsträckning sockerhalten i den ursprungliga musten.(D/H)QW representerar klimatförhållandena på produkttionsplaten och sockerhalten i den ursprungliga musten.2. PRINCIPOvan angivna parametrar [R, (D/H)I, (D/H)II] bestäms med deuterium-NMR i etanol som extraherats från vinet eller från de jäsningsprodukter från den must, den koncentrerade must eller den renade koncentrerade must som bar producerats under de givna förhållandena. Bestämningarna kan kompletteras med en bestämning av isotopförhållandet i vatten som extraherats från vinet, (D/H)WQ, och en bestämning av förhållandet 13C/12C i etanolen.I avvaktan på at en databank upprättas på gemenskapsnivå gâller följande:- Vad gäller vin, skall kontrollprover som har tagits inom de olika områdena åtföljas av naturliga kontrollprover (minst tre) av samma ursprung (geografisk plats och årgång). Tre provserier skall tas.- Vad gäller must, koncentrerad must och renad koncentrerad must, skall tre serier av kontrollprover tas på naturlig must av samma ursprung (geografisk plats och årgång).I avvaktan på att en databank upprättas på gemenskapsnivå kan medlemsstaterna för kontroll av produkter som framställs inom det egna territoriet använda en egen nationell databank under en övergångsperiod.3. BEREDNING AV PROVET FÖR ANALYS3.1 Extraktion av etanol och vatten från vinAnmärkning: Valfri metod får användas för extraktion av etanol, så länge 98 98,5 % av vinets totala alkoholhalt utvinns i ett destillat som innehåller 92 93 % mas (95 % vol.).3.1.1 Apparatur och reagenser- Apparatur för extraktion av etanol (figur 1) bestående av:- elektriskt uppvärmd kolv med spänningsregulator,- 1 l rundbottnad kolv med halskoppling av slipat glas,- cadiotkolonn med roterande band (rörlig del av teflon),- 125 ml koniska kolvar med halskoppling av slipat glas,- 125 ml och 60 ml flaskor med plastproppar.- Reagenser för bestämning av vatten enligt Karl Fischer-metoden (t.ex. Merck 9241 och 9243).3.1.2 Metod3.1.2.1. Bestäm alkoholstyrkan i vinet (tv) med en noggrannhet av minst 0,05 % vol.3.1.2.2. Extraktion av etanolEtt homogent vinprov på 500 ml med en alkoholhalt tv hälls i destillationsapparatens kolv med ett konstant återflödesförhållande på ca 0,9. En 125 ml slipad förlagskolv som kalibrerats i förväg används för att fånga upp destillatet. Extrahera 40 60 ml av vätskan, som kokar mellan 78,0 och 78,2 °C. Om temperaturen överstiger 78,5 °C avbryts extraktionen i fem minuter.När temperaturen återgår till 78 °C fortsätts uppsamlingen av destillatet tills temperaturen återigen når 78,5 °C. Upprepa detta förfarande till dess att temperaturen, efter avbruten extraktion och funktion i ett slutet kretslopp, förblir konstant. Fullständig destillation tar ca fem timmar. Detta förfarande gör det möjligt att extrahera 98 98,5 % av vinets totala alkoholhalt, vilket ger ett destillat med en alkoholhalt av 92 93 % mas (95 % vol.), dvs. den halt som har valts för NMR-betingelserna i punkt 4.Väg den extraherade etanolen.Ett homogent 60 ml prov av destillationsresterna förvaras i en 60 ml kolv och representerar vattnet i vinet. Dess isotopförhållande kan bestämmas om så önskas.Anmärkning:Om en spektrometer med 10 mm sond finns tillgänglig (jfr punkt 4), är ett homogent prov på 300 ml vin tillräckligt.3.1.2.3. Bestämning av alkoholhalten i den extraherade alkoholenVattenhalten (p'g) bestäms enligt Karl Fischer-metoden i ett prov på ca 0,5 ml alkohol med exakt känd massa p.>Hänvisning till >Etanolhalten per enhet massa erhålls med formeln:tDm = >NUM>p - p'/>DEN>p × 1003.2 Jäsning av must, koncentrerad must och renad koncentrerad must3.2.1 Apparatur och reagenser- Vinsyra- DIFCO Bacto Yeast Nitrogen Base utan aminosyror- Aktiv torrjäst (Saccharomyces cerevisae)Om isotopförhållandet i musten är känt, kan jästen reaktiveras före användning i 15 minuter i minsta möjliga mängd ljummet icke-destillerat vatten (1 g/50 ml), så att isotopförhållandet blir detsamma som i musten.Om mustens isotopförhållande inte är känt är det bättre att använda torrjästen direkt.Mängden torrjäst som tillsätt skall vara 1 g (1010 celler) per liter must.Ett 1,5-liters jäskärl, med en anordning som gör det lufttätt och möjliggör kondensation av alkoholångor, eftersom det inte får ske något svinn av etanol under jäsningen. Graden av omvandling av jäsbara sockerarter till etanol bör överstiga 98 %.3.2.2 Metod3.2.2.1. Must- Färsk mustHäll 1 liter must, med i förväg bestämd sockerhalt, i jäskärlet. Tillsätt 1 g i förväg reaktiverad torrjäst. Tillslut kärlet så att det är lufttätt. Låt jäsning ske vid omkring 20 °C till dess att allt socker har förbrukats. Efter bestämning av alkoholhalten i jäsningsprodukten och beräkning av graden av omvandling av socker till etanol centrifugeras den jästa vätskan och destilleras för att extrahera etanolen.- Must som förhindrats att jäsa genom tillsats av svaveldioxidAvsvavla drygt 1 liter must (dvs. 1,2 l) genom att leda kväve genom musten under återflöde i ett vattenbad vid 70-80 °C, tills den total svaveldioxidhalten är mindre än 200 mg/l. Sörj för effektiv kylning av musten för att förhindra att den koncentreras genom indunstning av vattnet.Häll 1 liter av den avsvavlade musten i jäskärlet och fortsätt enligt anvisningarna för färsk must.Anmärkning:Om kaliummetabisulfit används för sulfitbehandlingen av musten måste 0,25 ml svavelsyra (ñ20 = 1,84 g/ml) per gram metabisulfit använd per liter must tillsättas musten före avsvavling.3.2.2.2. Koncentrerad mustHäll V ml koncentrerad must med känd sockerhalt (omkring 170 g) i ett jäskärl. Fyll upp till 1 liter med (1 000   V) ml vatten från den vattenkälla som normalt används, som skall ha samma isotopförhållande som vattnet i naturlig must. Tillsätt (3.2.1) torrjäst (1 g) och 3 g DIFCO Bacto Yeast Nitrogen Base utan aminosyror. Homogenisera och fortsätt enligt ovan.3.2.2.3. Renad koncentrerad mustFörfar enligt anvisningarna i 3.2.2.2 och fyll upp till 1 liter med (1 000   V) ml vatten med samma isotopförhållande som vatten i naturlig must, med en tillsats av 3 g löst vinsyra.AnmärkningBehåll 50 ml av mustprovet eller av den svaveldioxidbehandlade musten eller den renade koncentrerade musten, för att vid behov kunna extrahera vattnet och bestämma dess isotopförhållande (D/H)QW.Extraktion av vattnet i musten kan utföras mycket enkelt genom azeotropisk destillation med toluen.3.3 Beredning av provet för NMR-bestämning3.3.1 ReagenserN, N-tetrametylurea (TMU). Använd TMU-standardprov med givet, kontrollerat isotopförhållande D/H. Detta prov kan tillhandahållas av:Generaldirektoratet för vetenskap, forskning och utvecklingEG:s referensbyrå200. rue de la Loi, B-1409 BrysselBelgien3.3.2 Metod- NMR-sond, 15 mm i diameter:Häll 7 ml alkohol som framställts enligt anvisningarna i 3.1.2 i en på förhand vägd flaska och bestäm alkoholens vikt med 0,1 mg noggrannhet (mA). Ta ut ett 3 ml prov av intern standard (TMU) och bestäm dess vikt med 0,1 mg noggrannhet (mst). Homogenisera genom omskakning.- NMR-sond, 10 mm i diameter:3,2 ml alkohol och 1,3 ml TMU är tillräckligt.Beroende på vilken typ av spektrometer och sond som används (jfr punkt 4) tillsätts en tillräcklig mängd hexafluorbensen som fältfrekvensstabilisator (lås):>Plats för tabell>3.4 Beredning av vattenprov för NMR-bestämning för eventuell bestämning av vattnets isotopförhållande3.4.1 ReagenserN, N-tetrametylurea (TMU): se 3.3.1.3.4.2 MetodHäll 3 ml vatten som har erhållits enligt 3.1.2 eller 3.2 (anmärkning) ovan i en tarerad kolv och bestäm vikten ± 0,1 mg (m'E). Tillsätt 4 ml intern standard (TMU) och bestäm vikten med 0,1 mg noggrannhet (m'st). Homogenisera genom omskakning.AnmärkningOm laboratoriet har tillgång till masspektrometer för bestämning av isotopförhållandet kan mätningen utföras med denna apparat för att minska belastningen på NMR-spektrometern. TIV-förhållandet (5.2) måste kalibreras för varje vinserie som undersöks.4. REGISTRERING AV 2H-NMR-SPEKTRUM I ALKOHOL OCH VINBestämning av isotopparametrar.4.1 Apparatur- NMR-spektrometer med speciell "deuteriumsond" som är avstämd efter den karakteristiska frekvensen V° för fältet Bo (t.ex. för Bo  = 7,05T, V° = 46,05 MHz och för B° = 9,4 T, V° = 61,4 MHz), med en protonavkopplingskanal (B2) och kanal för stabilisering av fältfrekvensen (lås) vid frekvensen för fluor.Den på spektrumet bestämda upplösningen (transformerad utan exponentiell multiplikation, dvs. LB = 0), (figur 2b) som uttrycks genom linjebredden vid halv höjd av metyl- och metylensignalerna för etanol och metylsignalen för TMU, måste vara mindre än 0,5 Hz. Noggrannheten, som bestäms med en exponentiell multiplikationsfaktor LB = 2 (figur 2a), måste vara större än eller lika med 150 för metylsignalen för etanol med en alkoholhalt av 95 % vol. (93,5 %) (vikt).Under dessa betingelser blir konfidensintervallet för bestämning av signalhöjden, beräknad med 97,5 % sannolikhet (ensidigt test) och 10 repetitioner av spektrumet, 0,35 %.- Automatisk provväxlare (eventuellt)- Programvara för databehandling- 15 mm eller 10 mm provrör, beroende på spektrometerns prestanda.4.2 Kalibrering av spektrometer och kontroller4.2.1 KalibreringKalibrera för homogenitet och noggrannhet i enlighet med tillverkarens specifikationer.4.2.2 Kontroll av kalibreringens korrekthetAnvänd prover av standardetanol, markerad med bokstäverna C, V och B, med olika, men kända, isotopkoncentrationer. Bokstävernas innebörd är för C: alkohol från rörsocker eller majs; för V: alkohol från vin; för B: alkohol från betsocker. Proven tillhandahålls av gemenskapens referensbyrå.Bestäm alkoholprovernas isotopvärden med hjälp av den metod som beskrivs i 4.3, och beteckna dem Cbest, Vbest, Bbest (se 5.3).Jämför dessa med motsvarande angivna standardvärden, betecknade Cst,Bst, Vst(se 5.3).>Hänvisning till >Figur 2a2H-NMR-spektrum för vinetanol med intern standard(TMU: N, N-tetrametylurea)>Hänvisning till >Figur 2b2H-spektrum för etanol bestämt under samma förhållanden som i figur 2a, men utan exponentiell multiplikation (LB = 0).Standardavvikelsen för repeterbarheten beräknad som medelvärdet av 10 repetitioner av varje spektrum skall vara mindre än 0,01 för förhållandet R och mindre än 0,3 ppm för (D/H)I och (D/H)II.De medelvärden som erhålls för de olika isotopparametrarna (R, (D/H)I, (D/H)II) skall ligga inom den av gemenskapens referensbyrå angivna motsvarande standardavvikelsen för repeterbarheten för dessa parametrar vad gäller de tre referensalkoholerna. Om så inte är fallet utförs kontrollen igen.4.3 Betingelser för bestämning av NMR-spektraHäll ett alkoholprov, berett enligt 3.3 (eller ett vattenprov berett enligt 3.4) i ett 15 mm eller 10 mm rör och för in det i sonden.NMR-spektrumet bestäms under följande betingelser:- Konstant sondtemperatur (t.ex. 302 K).- En uppsamlingstid av minst 6,8 s vid en spektrumbredd om 1200 Hz (16K minne) (dvs. omkring 20 ppm vid 61,4 MHz eller 27 ppm vid 46,1 MHz).- Pulsvinkel: 90°.- Väntetiden för uppsamlingen ("acquisition delay") skall vara i samma storleksordning som uppsamlingstiden för en enskild mätpunkt ("dwell time").- Kvadratisk likriktning: "offset" 01 ställs in mellan OD- och CHD-referenssignalerna för etanol och mellan HOD- och TMU-referenssignalerna för vatten.- Bestäm värdet för frånkopplingsoffset 02 utifrån det protonspektrum som bestämts med avkopplingsspolen på samma rör. Bra frånkoppling erhålls när 02 ligger i mitten av frekvensintervallet mellan CH3- och CH2-grupperna. Använd bredbandsavkoppling.För varje spektrum utförs så många ackumulationer NS som behövs för att uppnå det signal/brus-förhållande som anges i 4.1. Upprepa NS-ackumulationerna NE = 10 gånger. NS-värdena beror på vilken typ av spektrometer och sond som används (jfr. punkt 4). Följande är exempel på möjliga kombinationer:>Plats för tabell>5. REDOVISNING AV RESULTATEN5.1 EtanolFör vart och ett av de 10 spektra (se NMR-spektrum för etanol, figur 2a) bestäms följande:- R = 3 >NUM>hII/>DEN>hI = 3 × >NUM>höjden på signal II (CH3CHD OH)/>DEN>höjden på signal I (CH2D CH2OH)- (D/H)I = 1,5866 × TI × >NUM>mst/>DEN>mA × >NUM>(D/H)st/>DEN>tmD- (D/H)II = 2,3799 × TII × >NUM>mst/>DEN>mA × >NUM>(D/H)st/>DEN>tmDmed- TI = >NUM>höjden på signal I (CH2D CH2OH)/>DEN>höjden på signalen för intern standard (TMU)- TII = >NUM>höjden på signal II (CH3T CHD OH)/>DEN>höjden på signalen för intern standard (TMU)- CH3CHDOH mst och mA, se 3.3.2.- tmD se 3.1.2.3.- (D/H)st = isotopförhållandet i intern standard (TMU) (anges på den flaska som tillhandahålls av gemenskapens referensbyrå).Användning av signalernas topphöjd, i stället för toppens yta som är ett mindre exakt mått, förutsätter att linjebredden vid halv höjd är den samma och utgör en rimlig uppskattning (figur 2b).5.2 VattenFör bestämning av vattens isotopförhållande med NMR utifrån en blandning av vatten och TMU används följande formel:- (D/H)WQ = 0,9306 × TIV × >NUM>m'st/>DEN>m'E × (D/H)stdär- TIV = >NUM>HOD-signalens område för vatten som extraherats från vinet/>DEN>signalområde från intern standard (TMU)- m'st och m'E, se 3.4.2.- (D/H)st  = isotopförhållandet i intern standard (TMU) (anges på den >Start Grafik>>Slut Grafik>flaska som tillhandahålls av EG:s>Start Grafik>>Slut Grafik>referensbyrå).5.3. För var och en av isotopparametrarna beräknas medelvärdet av 10 bestämningar och konfidensintervallet.Med valfri programvara (t. ex. SNIF-NMR), anpassad till spektrometerns dator, kan dessa beräkningar utföras on-line.Anmärkning:Om en systematisk differens, inom standardavvikelsen, föreligger efter inställning av spektrometern mellan de medelvärden som erhålls för referensalkoholernas karakteristiska isotoper (4.2.2) och de värden som anges av EG:s referensbyrå kan det korrekta värdet för ett prov X erhållas genom korrektion enligt följande.Interpolering utförs med hjälp av de värden för referensprovet som ligger på vardera sidan om värdet för provet X.Om (D/H)XIbest är det uppmätta värdet och (D/H)XIkorr är det korrigerade värdet erhålls följande:(D/H)Xikorr = (D/H)Bist + á [(D/H)Xibest   (D/H)Bibest]där á = >NUM>(D/H)VstI × (D/H)BstI/>DEN>(D/H)VmesI × (D/H)BmesIExempel:Referensprover som tillhandahålls och kalibreras av gemenskapens referensbyrå:(D/H)VIst = 102,0 ppm (D/H)BIst = 91,95 ppmReferensprover bestämda i laboratoriet:(D/H)VIbest = 102,8 ppm (D/H)BIbest = 93,0 ppmMisstänkt okorrigerat prov:(D/H)XIbest = 100,2 ppmá = 1,0255 och (D/H)XIkorr = 99,3 ppm är beräknade.6. TOLKNING AV RESULTATENJämför värdet Rx, som anger förhållandet R för det misstänkt uppblandade provet, med de förhållanden som erhålls för referensvinerna. Om Rx avviker med mer än två standardavvikelser från medelvärdet RT för referensvinet kan uppblandning misstänkas.6.1 Tillsats av betsocker, rörsocker eller majsglukos6.1.1 VinRX högre än RT: förmodad tillsats av betsocker.RX lägre än RT: förmodad tillsats av rörsocker eller majssocker.Observera att (D/H)XII och (D/H)QXW är förhöjda.Undersök (D/H)XI:- Förmodad tillsats av betsocker:(D/H)XI för det misstänkta provet är mer än en standardavvikelse lägre än medelvärdet för referensproven (D/H)TI.- Förmodad tillsats av rörsocker eller majssocker:(D/H)XI är mer än en standardavvikelse högre än (D/H)TI.- Beräkning av tillsatsen E, uttryckt i % vol. etanol:- Tillsats av betsocker:E % vol = tv >NUM>(D/H)TI - (D/H)XI/>DEN>(D/H)TI - (D/H)BIdär(D/H)BI - isotopförhållandet för position I i alkohol från betsocker.(D/H)BI = 92,5(9)tv  = alkoholhalten i det analyserade vinet (X).- Tillsats av rörsocker eller majssocker:E % vol = tv >NUM>(D/H)XI - (D/H)TI/>DEN>(D/H)CI - (D/H)TIdär(D/H)CI - isotopförhållandet för plats I i alkohol från rörsocker eller majssocker: (D/H)CI = 110,5(10)tv = alkoholhalten i det analyserade vinet (X).6.1.2 Must, koncentrerad must och renad koncentrerad mustVärdena för isotopparametrarna för den enligt i 3.1 extraherade alkoholen från de jäsprodukter som erhålls (3.2) från must, koncentrerad must och renad koncentrerad must undersöks enligt de anvisningar som ges i 6, "Tolkning av resultat" (6.1.1), och jämförs med den alkohol som extraheras från jäsprodukterna från must.E % vol. representerar den alkoholvolym som har tillsatts den jästa produkten. Om man känner till den eventuella spädning som gjorts före jäsning (koncentrerad must och renad koncentrerad must) och antar att 16,83 g socker ger 1 % vol. alkohol kan man beräkna mängden socker (vikt) som har tillsatts per liter must, koncentrerad must eller renad koncentrerad must.6.2 Tillsats av en blandning av betsocker och rörsocker eller majsglukosIsotopförhållandena (D/H)I och R är mindre förändrade än när endast en sockertyp har tillsatts.(D/H)II och (D/H)QW är förhöjda.Dessa tillsatser kan konstateras genom bestämning av etanolens 13C/12C-förhållande med masspektrometri. I detta fall blir förhållandet högre.9. ASKHALT 1. DEFINITIONAskhalten definieras som alla produkter som återstår efter glödgning av den rest som återstår efter indunstning av vinet. Glödgningen utförs så att alla katjoner (med undantag av ammonium) omvandlas till karbonater eller andra vattenfria oorganiska salter.2. PRINCIP FÖR METODENVinextraktet glödgas vid en temperatur mellan 500 och 550 °C, till dess att allt organiskt material helt har förbränts (oxiderats).3. APPARATUR3.1. Kokande vattenbad.3.2. Våg med 0,1 mg noggrannhet.3.3. Värmeplatta eller infraröd förångare.3.4. Elektrisk muffelugn med temperaturreglering.3.5. Exsickator.3.6. Flatbottnad platinaskål, 25 mm hög och 70 mm i diameter.4. METOD20 ml vin sugs upp med pipett i en i förväg tarerad platinaskål (tom vikt P0 g). Vinet indunstas över det kokande vattenbadet och resten värms upp på värmeplattan till 200 °C eller under IR-förångaren till förkolning. När ånga inte längre avges placeras skålen i en elektrisk muffelugn med en temperatur på 525 ± 25 °C. Efter 15 minuters förkolning tas skålen ut ur ugnen. Tillsätt 5 ml destillerat vatten, låt indunsta över vattenbadet eller under IR-förångaren och hetta upp resten igen till 525 °C i 10 minuter.Om förbränningen (oxidationen) av de förkolnade partiklarna inte är fullständig upprepas förfarandet med tvättning av de förkolnade partiklarna, indunstning av vatten och glödgning.För viner med hög sockerhalt bör några droppar ren vegetabilisk olja tillsättas extraktet före första glödgningen för att förhindra alltför kraftig skumbildning.Efter avkylning i exsickatorn vägs skålen (P1 g).Vikten av askan i provet (20 ml) är p = (P1   P0) g.5. REDOVISNING AV RESULTATENBeräkningsmetodAskans vikt P i gram per liter anges med två decimaler och uttrycks som P = 50 × p.10. ASKANS ALKALITET 1. DEFINITIONAskans alkalitet definieras som summan av samtliga katjoner, utom ammonium, som är bundna till vinets organiska syror.2. PRINCIP FÖR METODENAskan löses i en känd (överskotts-) mängd av en het kalibrerad syralösning. Överskottet bestäms genom titrering med metylorange som indikator.3. REAGENSER OCH APPARATUR3.1. 0,05 M svavelsyralösning (H2SO4).3.2. 0,1 M natriumlösning (NaOH).3.3. Metylorange, 0,1 % lösning i destillerat vatten.3.4. Kokande vattenbad.4. METODTillsätt 10 ml 0,05 M svavelsyralösning (3.1) till platinaskålen med askan från 20 ml vin. Placera skålen över det kokande vattenbadet i ca 15 minuter. Rör om resten med en glasstav för att påskynda upplösningen. Tillsätt två droppar metylorangelösning och titrera överskottet av svavelsyra med 0,1 M natriumhydroxid (3.2) till dess att indikatorn slår om till gult.5. REDOVISNING AV RESULTATENBeräkningsmetodAskans alkalitet, uttryckt i milliekvivalenter per liter med en decimal, erhålls med formeln:A = 5 (10   n)där n ml är den använda volymen 0,1 M natriumhydroxid.11. KLORIDER 1. PRINCIPKlorider bestäms direkt i vinet genom potentiometri med hjälp av en Ag/AgCl-elektrod.2. APPARATUR2.1. pH/mV-meter, graderad i intervall om minst 2mV.2.2. Magnetomrörare.2.3. Ag/AgCl-elektrod med mättad lösning av kaliumnitrat som elektrolyt.2.4. Mikrobyrett, indelad i 1/100 ml.2.5. Kronometer.3. REAGENSER3.1. Standardkloridlösning: 2,1027 g kaliumklorid, KCl (max. 0,005 % Br), som före användningen torkats i exsickator i flera dagar, späds ut i destillerat vatten till 1 liter. 1 ml av denna lösning innehåller 1 mg Cl-.3.2. Titreringslösning av silvernitrat: 4,7912 g silvernitrat, AgNO3 av analyskvalitet, späds i en 10 % (v/v) alkohollösning till 1 liter. 1 ml av denna lösning motsvarar 1 mg Cl-.3.3. Salpetersyra, minst 65 % renhetsgrad (ñ20 = 1,40 g/ml).4. METOD4.1. 5,0 ml av standardkloridlösningen mäts upp i ett 150 ml cylindriskt kärl som placeras över en magnetomrörare, späds med destillerat vatten till ca 100 ml och surgörs med 1,0 ml salpetersyra (minst 65 %). Sänk ned elektroden och titrera genom att tillsätta titreringslösningen av silvernitrat med mikrobyretten under måttlig omrörning. Börja med att tillsätta 1,00 ml för de första 4 ml och läs av motsvarande värden i millivolt. Tillsätt nästa 2 ml i fraktioner om 0,20 ml. Fortsätt därefter med att tillsätta lösningen i fraktioner om 1 ml till dess att totalt 10 ml har tillsatts. Vänta ca 30 sekunder efter varje tillsats av lösningen innan motsvarande millivoltvärde läses av. Överför de avlästa värdena till millimeterpapper som funktioner av motsvarande antal milliliter titreringslösning och bestäm ekvivalenspunktens potential utifrån vändpunkten på den kurva som erhålls.4.2. 5 ml av standardkloridlösningen mäts upp i ett 150 ml cylindriskt kärl med 95 ml destillerat vatten och 1 ml salpetersyra (minst 65 %). Sänk ned elektroden och titrera under omrörning tills ekvivalenspunktens potential uppnås. Denna bestämning upprepas till dess att det råder god överensstämmelse mellan resultaten. Denna kontroll måste utföras före varje serie kloridbestämningar i proven.4.3. 50 ml vin för analys mäts upp i ett 150 ml cylindriskt kärl. Tillsätt 50 ml destillerat vatten och 1 ml salpetersyra (minst 65 %) och titrera enligt förfarandet i 4.2.5. REDOVISNING AV RESULTATEN5.1 BeräkningarOm n anger antalet milliliter av titreringslösningen av silvernitrat blir kloridhalten i den analyserade vätskan>Plats för tabell>5.2 Repeterbarhet (r):>Plats för tabell>5.3 Reproducerbarhet (R):>Plats för tabell>6. Anmärkning: Mycket exakt bestämningDet hänvisas till den fullständiga titreringskurva som erhålls vid bestämning av analysvätskan med silvernitratlösningen.a) Mät upp 50 ml av det vin som skall analyseras i ett 150 ml cylindriskt kärl. Tillsätt 50 ml destillerat vatten och 1 ml salpetersyra (minst 65 %). Titrera med silvernitratlösningen och tillsätt 0,5 ml i taget. Notera den motsvarande potentialen i millivolt. Från den första titreringen avläses den ungefärliga mängd silvernitrat som behövs.b) Inled bestämningen igen under samma betingelser. Börja med att tillsätta 0,5 ml titreringslösning i taget, till dess att den tillsatta volymen är 1,5 2 ml mindre än den volym som bestäms enligt a. Fortsätt med att tillsätta lösningen, först med 0,2 ml och därefter 0,5 ml i taget, bortom den ungefärligt avlästa ekvivalenspunkten.Bestämningens slutpunkt och den exakta volym silvernitrat som används erhålls:- antingen genom att kurvan ritas och ekvivalenspunkten bestäms,- eller med följande formel:V = V' + Ä Vi >NUM>ÄÄ E1/>DEN>ÄÄ E1 + ÄÄ E2där>Plats för tabell>Exempel:>Plats för tabell>I detta exempel ligger titreringens slutpunkt mellan 1,6 och 1,8 ml. Den största potentialförändringen (ÄE = 44 mV) uppträder i detta intervall. Den mängd titreringslösning av silvernitrat som används för att bestämma kloriderna i provet blir:V = 1,6 + 0,2 >NUM>22/>DEN>22 + 10 = 1,74 ml.12. SULFATER 1. PRINCIP1.1 ReferensmetodUtfällning av bariumsulfat och vägning. Det bariumfosfat som fällts ut under samma betingelser avlägsnas genom tvättning av fällningen i saltsyra.För must och viner med höga halter av svaveldioxid rekommenderas föregående avsvavling genom kokning i ett lufttätt kärl.1.2 Snabb analysmetodKlassificering av viner i kategorier med den så kallade gränsmetoden som baseras på utfällning av bariumsulfat med en titreringslösning av bariumjoner.2. REFERENSMETOD2.1 Reagenser2.1.1. 2 M saltsyrelösning.2.1.2. Bariumkloridlösning av 200 g/l BaCl2, 2 H2O.2.2 Metod2.2.1 Allmän metod:Mät upp 40 ml av analysprovet i ett 50 ml centrifugrör. Tillsätt 2 ml 2 M saltsyra och 2 ml bariumkloridlösning, 200 g/l. Rör om med en glasstav. Skölj staven med lite destillerat vatten och låt lösningen stå i fem minuter. Centrifugera i fem minuter, varefter centrifugatet dekanteras försiktigt.Därefter tvättas bariumsulfatfällningen på följande sätt: tillsätt 10 ml 2 M saltsyra, slamma upp fällningen och centrifugera i fem minuter. Dekantera försiktigt centrifugatet. Upprepa tvättningen två gånger under samma betingelser med 15 ml destillerat vatten varje gång.Överför fällningen kvantitativt genom sköljning med destillerat vatten till en tarerad platinakapsel. Placera över ett vattenbad vid 100 °C till dess att fullständig indunstning skett. Den torkade fällningen kalcineras flera gånger kortvarigt över en låga tills en vit rest erhålls. Låt svalna i exsickator och väg.Den erhållna massan i mg av bariumsulfatet betecknas m.2.2.2 Specialmetod: svavlad must och svavlat vin med hög svaveldioxidhalt.Svaveldioxiden avlägsnas först.Mät upp 25 ml vatten och 1 ml ren saltsyra (ñ20 = 1,15 - 1,18 g/ml) i en 500 ml konisk kolv med dropptratt och utloppsrör. Koka lösningen för att avlägsna luften och tillsätt 100 ml vin genom dropptratten. Fortsätt att koka till dess att vätskevolymen i kolven har reducerats till ca 75 ml och överför den kvantitativt efter kylning till en 100 ml mätkolv. Fyll upp till märket med vatten. Bestäm sulfaterna i ett prov på 40 ml enligt 2.2.1 ovan2.3 Redovisning av resultaten2.3.1 BeräkningarSulfathalten, uttryckt i milligram per liter kaliumsulfat, K2SO4, är:18,67 × mSulfathalten i must eller vin uttrycks i milligram per liter kaliumsulfat, utan några decimaler.2.3.2 Repeterbarhet>Plats för tabell>2.3.3 Reproducerbarhet>Plats för tabell>3. SNABB ANALYSMETOD3.1 Reagenser3.1.1. Titreringslösning av bariumklorid2,804 g bariumklorid, BaCl2, 2 H2O och 10 ml saltsyra (ñ20 = 1,15 1,18 g/ml) löses i tillräckligt mycket vatten för att ge 1 liter lösning. 1 ml av denna lösning fäller en mängd sulfatjoner motsvarande 2 mg kaliumsulfat.3.1.2. Svavelsyra (ñ20 = 1,84 g/ml), 1/10 (w/v) lösning.3.2 MetodMät upp 10 ml must eller vin i tre provrör. Tillsätt 3,5; 5 respektive 10 ml av bariumkloridlösningen till rör 1, 2 och 3. Skaka om och låt koka upp. Låt stå i 1 2 timmar. Vätskan i rören dekanteras, filtreras och delas i två delar. Till den ena delen tillsätts ett flertal droppar av den spädda svavelsyralösningen, till den andra några droppar bariumkloridlösning. Notera om vätskan i de olika rören är klar eller grumlig. Observationerna tolkas enligt tabellen nedan.>Plats för tabell>13. TOTAL SYRAHALT 1. DEFINITIONVinets totala syrahalt är summan av dess titrerbara syror när en alkalisk standardlösning tillsätts så att vinets pH blir 7.Koldioxid ingår inte i den totala syrahalten.2. PRINCIP FÖR METODENPotentiometrisk titrering eller titrering med bromtymolblått som indikator och jämförelse med färgstandard.3. REAGENSER3.1. Buffertlösning pH 7,00:monokaliumfosfat (KH2PO4): 107,3 g1 M natriumhydroxidlösning (NaOH): 500 mlvatten till: 1 000 mlAlternativt kan färdiga buffertlösningar som finns i handeln användas.3.2. 0,1 M natriumhydroxidlösning (NaOH).3.3. 4 g/l indikatorlösning av bromtymolblått:>Plats för tabell>Lös upp och tillsätt>Plats för tabell>4. APPARATUR4.1. Vattensug.4.2. 500 ml vakuumsugkolv.4.3. Potentiometer med skalindelning i pH-enheter och med elektroder. Glaselektroden skall förvaras i destillerat vatten. Elektroden med kalomelmättad kaliumklorid skall förvaras i mättad kaliumkloridlösning. Oftast används en kombinerad elektrod, som skall förvaras i destillerat vatten.4.4. Mätglas på 50 ml (vin) resp. 100 ml (renad koncentrerad must).5. METOD5.1 Beredning av provet5.1.1 Vin:Avlägsna koldioxiden. Häll ca 50 ml av vinet i en vakuumsugkolv. Sug med vattensugen i 1 2 minuter under omskakning.5.1.2 Renad koncentrerad must:Häll i 200 g noggrant uppvägd renad koncentrerad must i en 500 ml mätkolv. Fyll upp till märket med vatten. Homogenisera blandningen.5.2 Potentiometrisk titrering5.2.1 Kalibrering av pH-mätareKalibrering av pH-mätaren görs vid 20 °C med buffertlösning med pH 7,00 vid 20 °C enligt tillverkarens anvisningar.5.2.2 MätmetodHäll ett prov, berett som i 5.1, på 10 ml för vin och 50 ml för renad koncentrerad must i en mätcylinder (4.4). Tillsätt ca 10 ml destillerat vatten och därefter 0,1 M natriumhydroxidlösning (3.2) från byretten, till dess att pH är 7 vid 20 °C. Natriumhydroxiden skall tillsättas långsamt under kontinuerlig omrörning av lösningen. Den tillsatta mängden milliliter 0,1 M NaOH betecknas n.5.3 Titrering med indikator (bromtymolblått)5.3.1 Förberedande analys: färgbestämningHäll 25 ml kokt destillerat vatten, 1 ml lösning av bromtymolblått (3.3) och ett prov, berett enligt 5.1, på 10 ml för vin och 50 ml för renad koncentrerad must i en mätcylinder (4.4). Tillsätt 0,1 M natriumhydroxidlösningen (3.2), till dess att färgen slår om till blågrönt. Tillsätt därefter 5 ml av buffertlösningen med pH 7 (3.1).5.3.2 BestämningHäll 30 ml kokt destillerat vatten, 1 ml lösning av bromtymolblått (3.3) och ett prov, berett enligt 5.1, på 10 ml för vin och 50 ml för renad koncentrerad must i en mätcylinder (4.4). Tillsätt 0,1 M natriumhydroxidlösning (3.2), till dess att samma färg som i det förberedande provet (5.3.1) uppträder. Den tillsatta mängden natriumhydroxid betecknas n.6. REDOVISNING AV RESULTATEN6.1 Beräkningsmetod6.1.1 VinDen totala syrahalten uttryckt i milliekvivalenter per liter blir:A = 10nHalten anges med en decimal.Den totala syrahalten uttryckt i gram vinsyra per liter blir:A' = 0,075 × AHalten anges med en decimal.6.1.2 Renad koncentrerad must- Den totala syrahalten uttryckt i milliekvivalenter per kg för renad koncentrerad must blir: a = 5 × n.- Den totala syrahalten uttryckt i milliekvivalenter per kg totalsocker blir:A = >NUM>500 ×/>DEN>n;PP = halten i % (w/w) av totalsocker.Halten anges med en decimal.6.2 Repeterbarhet (r) för titrering med indikatorn>Plats för tabell>för vita viner, roséviner och röda viner.6.3 Reproducerbarhet (R) för titrering med indikatorn (5.3)För vitviner och rosévin:>Plats för tabell>För rödvin:>Plats för tabell>14. FLYKTIGA SYROR 1. DEFINITIONDe flyktiga syrorna består av de syror i ättiksyraserien som förekommer i vin i fri form och som salt.2. PRINCIP FÖR METODENTitrering av flyktiga syror, som har separerats från vinet genom ångdestillation och titrering av destillatet.Koldioxid avlägsnas först från vinet.Syran i fri och bunden svaveldioxid som destilleras på så sätt skall dras ifrån destillatets syrahalt.Eventuell sorbinsyra som har tillsatts vinet skall också dras ifrån.Anmärkning:En del av den salicylsyra som används i vissa länder för att stabilisera viner före analys återfinns i destillatet. Denna måste bestämmas och dras ifrån syrahalten. Bestämningsmetoden anges i punkt 7 i detta kapitel.3. REAGENSER3.1. Kristalliserad vinsyra (C4H6O6).3.2. 0,1 M natriumhydroxidlösning (NaOH).3.3. 1 % fenolftalinlösning i 96 % vol. neutral alkohol.3.4. Saltsyra (ñ20 = 1,18 1,19 g/ml), spädd 1:4 (v/v).3.5. 0,005 M jodlösning (I2).3.6. Kristalliserad kaliumjodid (KI).3.7. Stärkelselösning 5 g/l.Blanda 5 g stärkelse med ca 500 ml vatten. Koka upp under omrörning och koka i tio minuter. Tillsätt 200 g natriumklorid, kyl och späd till 1 liter.3.8. Mättad lösning av natriumborat (Na2B4O7, 10H2O), dvs. ca 55 g/l vid 20 °C.4. APPARATUR4.1. Ångdestillationsapparat bestående av1. Ånggenerator. Ångan skall vara fri från koldioxid.2. Kolv med ångrör.3. Destillationskolonn.4. Kylare.Apparaturen skall uppfylla följande tre krav:a) Häll 20 ml kokt vatten i kolven. Samla upp 250 ml av destillatet och tillsätt 0,1 ml 0,1 M natriumhydroxidlösning (3.2) och två droppar av fenolftalinlösningen (3.3). Rosafärgningen skall vara stabil i minst tio sekunder (dvs. ångan skall vara fri från koldioxid).b) Häll 20 ml av en 0,1 M ättiksyralösning i kolven. Samla upp 250 ml av destillatet. Titrera med 0,1 M natriumhydroxidlösning (3.2). Den använda volymen skall vara minst 19,9 ml (dvs. minst 99,5 % av ättiksyran skall avlägsnas med ångan).c) Häll 20 ml av 1 M mjölksyralösning i kolven. Samla upp 250 ml av destillatet och titrera syran med 0,1 M natriumhydroxidlösning (3.2).Den volym natriumhydroxidlösning som tillsätts skall vara mindre än eller lika med 1,0 ml (dvs. inte mer än 0,5 % mjölksyra destilleras).Apparatur och metoder som klarar dessa prov med godkänt resultat uppfyller de officiella internationella apparat- och metodkraven.4.2. Vattenpump.4.3. Vakuumkolv.5. METOD5.1 Beredning av provet: avlägsna koldioxiden.Häll ca 50 ml vin i en vakuumkolv. Sug med vattenpumpen i 1 2 minuter under ständig omrörning.5.2 Ångdestillation20 ml vin från vilket koldioxiden avlägsnats enligt 5.1 hälls i kolven. Tillsätt ca 0,5 g vinsyra (3.1). Samla upp minst 250 ml av destillatet.5.3 TitreringTitrera med 0,1 M natriumhydroxidlösning (3.2) som innehåller två droppar fenolftalin (3.3) som indikator. Den använda mängden natriumhydroxid betecknas n ml.Tillsätt fyra droppar saltsyra, spädd 1:4 (3.4), 2 ml stärkelselösning (3.7) och några kristaller kaliumjodid (3.6). Titrera den fria svaveldioxiden med 0,005 M jodlösning (3.5). Den använda mängden betecknas n'.Tillsätt den mättade natriumboratlösningen (3.8) till dess att den rosa färgen kommer tillbaka. Titrera den bundna svaveldioxiden med 0,005 M jodlösning (3.5). Den använda volymen betecknas n".6. REDOVISNING AV RESULTATEN6.1 BeräkningsmetodHalten av flyktiga syror, uttryckt i milliekvivalenter/liter med en decimal, blir:A = 5 (n   0,1 n'   0,05 n").Halten av flyktiga syror, uttryckt i gram ättiksyra/liter med två decimaler, blir:0,300 (n   0,1 n'   0,05 n").6.2 Repeterbarhet (r)>Plats för tabell>6.3 Reproducerbarhet (R)>Plats för tabell>6.4 Vin tillsatt med sorbinsyraEftersom 96 % av sorbinsyran ångsdestilleras vid en destillatvolym på 250 ml måste denna syra dras ifrån de flyktiga syrorna. 100 mg sorbinsyra motsvarar en syrahalt av 0,89 milliekvivalenter eller 0,053 g ättiksyra; halten av sorbinsyra i mg/l bestäms med en annan metod.7. BESTÄMNING AV SALICYLSYRA SOM FÖLJER MED DESTILLATET FRÅN FLYKTIGA SYROR7.1 PrincipEfter bestämning av de flyktiga syrorna och korrektion för svaveldioxid påvisas förekomsten av salicylsyra efter surgöring av att provet lilafärgas när ett järn(III)salt tillsätts.Bestämning av salicylsyra som följer med destillatet från de flyktiga syrorna utförs på ett andra destillat med samma volym som den på vilken halten av flyktiga syror bestämdes. I detta destillat bestäms salicylsyran med en jämförande kolorimetrisk metod. Den dras ifrån syrahalten i destillatet av flyktiga syror.7.2 Reagenser7.2.1. Saltsyra (HCl) (ñ20 = 1,18 - 1,19 g/l).7.2.2. Natriumtiosulfat (Na2S2O3, 5H2O) i en 0,1 M lösning.7.2.3. 10 % (w/v) lösning av järn(III)ammoniumsulfat (Fe2(SO4)3. (NH4)2SO4 × 24H2O).7.2.4. 0,01 M lösning av natriumsalicylat. Lösningen skall innehålla 1,60 g natriumsalicylat (NaC7H5O3) per liter.7.3 Metod7.3.1 Identifiering av salicylsyra i destillatet av flyktiga syrorOmedelbart efter bestämning av de flyktiga syrorna och korrektion för fri och bunden svaveldioxid hälls 0,5 ml saltsyra (7.2.1), 3 ml 0,1 M natriumtiosulfatlösning (7.2.2) och 1 ml järn(III)ammoniumsulfatlösning (7.2.3) i en konisk kolv.Om destillatet innehåller salicylsyra träder en lila färg fram.7.3.2 Bestämning av salicylsyrahaltenDestillatets volym markeras på den koniska kolven. Töm och skölj flaskan.Ett nytt analysprov på 20 ml vin ångdestilleras och destillatet samlas upp i den koniska kolven till märket. Tillsätt 0,3 ml ren saltsyra (7.2.1) och 1 ml järn(III)ammoniumsulfatlösning (7.2.3). Innehållet i kolven lilafärgas.Häll i destillerat vatten i en konisk kolv som är identisk med den kolv på vilken volymen har markerats upp till samma nivå som destillatnivån. Tillsätt 0,3 ml ren saltsyra (7.2.1) och 1 ml järn(III)ammoniumsulfatlösning (7.2.3). Natriumsalicylatlösning, 0,01 M (7.2.4), tillsätts via byretten, till dess att lilafärgningen är av samma intensitet som i kolven med vindestillatet.Den mängd lösning som tillsätts från byretten betecknas n.7.4 Korrektion av flyktiga syrorDra ifrån volymen 0,1 × n ml från volymen n ml av 0,1 M natriumhydroxidlösning som använts för att titrera destillatets surhetsgrad under bestämningen av de flyktiga syrorna.15. HALTEN AV ICKE-FLYKTIGA SYROR 1. PRINCIPHalten av icke-flyktiga syror beräknas som skillnaden mellan den totala syrahalten och halten av flyktiga syror.2. REDOVISNING AV RESULTATENHalten av icke-flyktiga syror uttrycks i:- milliekvivalenter per liter,- gram vinsyra per liter.16. VINSYRA 1. PRINCIP FÖR METODERNA1.1 ReferensmetodVinsyra fälls ut i form av kalcium(±)tartrat och bestäms gravimetriskt. Bestämningen kan kompletteras med volymetrisk bestämning. Utfällningsbetingelserna (pH, total använd volym, koncentrationer av utfällande joner) innebär att kalcium(±)tartrat fälls ut fullständigt, medan kalcium-D( )-tartrat förblir i lösning.När metavinsyra har tillsatts vinet måste detta först hydrolyseras eftersom metavinsyra gör att utfällningen av kalcium(±)tartrat blir ofullständig.1.2 RutinmetodVinsyran separeras med en jonbytarkolonn och bestäms kolorimetriskt i eluatet genom mätning av den röda färg som framträder vid reaktion med vanadinsyra. Eluatet innehåller också mjölksyra och äppelsyra, som dock inte stör analysen.2. REFERENSMETOD2.1 Gravimetrisk metod2.1.1 Reagenser2.1.1.1. Kalciumacetatlösning innehållande 10 g kalcium per liter:>Plats för tabell>2.1.1.2. Kalcium(±)tartrat, kristalliserat: CaC4O6H4. 4H2O:Häll 20 ml av en lösning av L(+)vinsyra (5 g/l) i en 400 ml bägare. Tillsätt 20 ml av en ammonium D( )tartratlösning (6,126 g/l) och 6 ml kalciumacetatlösning innehållande 10 g kalcium per liter (2.1.1.1).Låt utfällning pågå i två timmar. Samla upp fällningen på en degel av sintrat glas med porositeten 4 och tvätta den tre gånger med omkring 30 ml destillerat vatten. Torka till konstant vikt i torkskåp vid 70 °C. Med de reagensmängder som anges ovan erhålls ca 340 mg kristalliserat kalcium(±)tartrat.Förvara i en flaska med propp.2.1.1.3. Fällningslösning (pH 4,75):>Plats för tabell>Lös D( )vinsyran, tillsätt ammoniumhydroxiden och fyll upp till ca 900 ml. Tillsätt 8,8 ml kalciumacetatlösning (2.1.1), fyll upp till 1 liter och justera pH-värdet till 4,75 med ättiksyra.Eftersom kalcium(±)tartrat är lätt lösligt i denna lösning tillsätts 5 mg kalcium(±)tartrat per liter. Rör om i 12 timmar och filtrera.2.1.2 Metod2.1.2.1. Vin utan tillsats av metavinsyraHäll 500 ml av fällningslösningen och 10 ml vin i en 600 ml bägare. Blanda och sätt igång utfällningen genom att gnida kärlets sidor med en glasstav. Låt utfällning pågå i 12 timmar (över natten).Filtrera vätskan och fällningen genom en vägd degel av sintrat glas med porositeten 4 som placerats på en ren vakuumkolv. Skölj det kärl där fällningen gjordes med filtratet så att alla utfällda partiklar följer med.Torka till konstant vikt i torkskåp vid 70 °C. Väg. Låt p ange vikten av den mängd kristalliserat kalcium(±)tartrat (CaC4O6H4) som erhålls.2.1.2.2. Vin med tillsats av metavinsyraVid analys av vin med konstaterad eller misstänkt tillsats av metavinsyra skall syran först hydrolyseras enligt följande:Häll 10 ml av vinet och 0,4 ml isättika (CH3COOH, ñ20 = 1,05 g/ml) i en 50 ml konisk kolv. Tillslut kolven med en återloppskylare och koka i 30 minuter. Låt svalna och överför sedan lösningen i den koniska kolven till en 600 ml bägare. Skölj kolven två gånger med 5 ml vatten och fortsätt därefter enligt anvisningarna ovan.Metavinsyran bestäms och inräknas som vinsyra i bestämningsresultatet.2.1.3 Redovisning av resultatenEn molekyl kalcium(±)tartrat motsvarar en halv molekyl L(+) vinsyra i vinet.Mängden vinsyra per liter vin, uttryckt i milliekvivalenter, motsvarar 384,5 p.Mängden anges med en decimal.Mängden vinsyra per liter vin, uttryckt i gram vinsyra, motsvarar 28,84 p.Mängden anges med en decimal.Mängden vinsyra per liter, uttryckt i gram kaliumvätetartrat, motsvarar 36,15 p.Mängden anges med en decimal.2.2. Jämförande volymetrisk analys2.2.1 Reagenser2.2.1.1. Saltsyra (HCl) (1:5 v/v) (ñ20 = 1,18 1,19 g/ml)2.2.1.2. EDTA-lösning, 0,05 M:EDTA (etylendiamin-tetraättiksyra-dinatriumsalt:>Plats för tabell>2.2.1.3. Natriumhydroxidlösning, 40 % (w/v):>Plats för tabell>2.2.1.4. Komplexometrisk indikator: 1 % (w/w)-hydroxi-1-(2-hydroxi-4-sulfo-1-naftylazo)-3-naftylsyra>Plats för tabell>2.2.2 MetodEfter vägning sätts degeln av sintrat glas med kalcium(±)tartratfällningen tillbaka på vakuumkolven och fällningen löses med 10 ml utspädd saltsyra (2.2.1.1). Tvätta degeln med 50 ml destillerat vatten.Tillsätt 5 ml 40 % natriumhydroxidlösning (2.2.1.3) och ca 30 mg indikator (2.2.1.4). Titrera med 0,05 M EDTA-lösning (2.2.1.2). Det antal ml som används betecknas n.2.2.3 Redovisning av resultatenMängden vinsyra per liter vin, uttryckt i milliekvivalenter, motsvarar 5 n.Mängden anges med en decimal.Mängden vinsyra per liter vin, uttryckt i gram vinsyra, motsvarar 0,375 n.Mängden anges med en decimal.Mängden vinsyra per liter vin, uttryckt i gram kaliumvätetartrat, motsvarar 0,470 n.Mängden anges med en decimal.3. RUTINMETOD3.1 Reagenser3.1.1 Vid den inledande behandlingen av vinet3.1.1.1. Ättiksyra (CH3COOH, ñ20  = 1,05 g/ml), utspädd till 30 % (v/v).3.1.1.2. Kraftigt basisk jonbytarharts (t. ex. anjonbytarharts Merck III, mesh 20 - 50) i acetatform. Bered en suspension av jonbytaren (ca 100 g) i 200 ml 30 % ättiksyra (3.1.1.1). Låt stå i minst 24 timmar före användning. Förvara jonbytarhartsen i 30 % ättiksyra för senare bestämningar.3.1.1.3. Ättiksyra (CH3COOH, ñ20 = 1,05 g/ml), utspädd till 0,5 % (v/v).3.1.1.4. Natriumsulfatlösning, 7,1 g per 100 ml (0,5 M).Lös 71 g vattenfritt natriumsulfat (Na2SO4) i destillerat vatten och fyll upp till 1 000 ml med destillerat vatten.3.1.2 Bestämning av vinsyra3.1.2.1. Natriumacetatlösning (NaCH3COO) 27 % (w/v):Lös 270 g vattenfritt natriumacetat (NaCH3COO) i destillerat vatten och fyll upp till 1 000 ml.3.1.2.2. VanadinreagensLös 10 g ammoniummetavanadat (NH4VO3) i 150 ml 1 M natriumhydroxidlösning (3.1.2.10). Överför lösningen till en 500 ml mätkolv och tillsätt 200 ml av den 27-procentiga natriumacetatlösningen (3.1.2.1). Fyll upp till 500 ml med destillerat vatten.3.1.2.3. 1 M H2SO4-lösning.3.1.2.4. 0,5 M H2SO4-lösning.3.1.2.5. 0,05 M H2SO4-lösning.3.1.2.6. 0,05 M perjodsyralösning:Häll 10,696 natriumperjodat, NaIO4, och 50 ml 0,5 M svavelsyra (3.1.2.4) i en 1 000 ml mätkolv och fyll upp till 1 000 ml med destillerat vatten.3.1.2.7. Glycerollösning, 10 % (w/v):Häll 10 g glycerol, C3H8O3; i en 100 ml mätkolv och fyll upp till 100 ml med destillerat vatten.3.1.2.8. Natriumsulfatlösning, 7,1 g per 100 ml (se 3.1.1.4).3.1.2.9. Vinsyralösning, 1 g/l:Häll 0,5 g vinsyra och 6,66 ml 1 M natriumhydroxidlösning (3.1.2.10) i en 500 ml mätkolv och fyll upp till 500 ml med 7,1 % natriumsulfatlösning (3.1.1.4).3.1.2.10. Natriumhydroxidlösning, NaOH, 1 M.3.2 Apparatur3.2.1. Glaskolonn, ca 300 mm lång, innerdiameter 10 11 mm, med en avtappningskran.3.2.2. Spektrofotometer för bestämning av absorbansen vid en väglängd om 490 nm och kuvetter med 10 mm optisk våglängd.3.3 Metod3.3.1 Beredning av jonbytarkolonnPlacera en propp av glasull i glaskolonnen ovanför avtappningskranen (3.2.1). Vät proppen med destillerat vatten. Häll 10 ml av suspensionen av jonbytarharts i acetatform (3.1.1.2) i kolonnen. Låt jonbytaren sedimentera. Placera en propp av glasull ovanpå jonbytaren (för att förhindra att denna slammas upp igen vid påföljande tvättningar).Jonbytaren får endast användas en gång.3.3.2 Separation av organiska syrorÖppna avtappningskranen och låt ättiksyralösningen rinna ner längs kolonnen till ca 2 3 mm från den övre glasullproppen.Tillsätt 10 ml av den 0,5-procentiga ättiksyralösningen (3.1.1.3) och låt vätskan rinna ut igen till samma nivå som i föregående steg. Upprepa tvättningen ytterligare fyra gånger.Efter den sista tvättningen stängs kranen och 10 ml av vinet eller musten hälls över jonbytarhartsen. Låt vätskan rinna i med en droppe i taget (1 droppe/sekund i genomsnitt) och avbryt när nivån ligger precis ovanför jonbytaren. Tillsätt ytterligare 10 ml av den 0,5-procentiga ättiksyralösningen (3.1.1.3) till kolonnen, låt rinna ut med samma hastighet som tidigare och tvätta därefter sju gånger på samma sätt med 10 ml vatten varje gång. Under den sista tvättningen stängs kranen så snart vätskenivån är precis ovanför den övre glasullproppen.Eluera de syror som absorberats på jonbytaren med en 7,1-procentig lösning av natriumsulfat (3.1.1.4). Samla upp eluatet i en 100 ml graderad mätkolv upp till det kalibrerade märket.3.3.3 Bestämning av vinsyra3.3.3.1. Vin utan tillsats av metavinsyraHäll 20 ml av eluatet i två koniska kolvar, a och b.Använd kolv a för bestämning och kolv b, i vilken vinsyran destruerats av perjodsyra, för bestämning av nollvärdet.Häll i kolv a:- 2 ml M H2SO4 (3.1.2.3),- 5 ml 0,05 M H2SO4 (3.1.2.5),- 1 ml 10 % glycerol (3.1.2.7).Häll i kolv b:- 2 ml M H2SO4 (3.1.2.3),- 5 ml 0,05 M perjodsyralösning (3.1.2.6),Tillsätt efter 15 minuter:1 ml 10 % glycerol (3.1.2.7) för att destruera överskottet av perjodsyra.Vänta två minuter.Tillsätt med pipett under omrörning 5 ml vanadinreagens (3.1.2.2), först till kolv b och omedelbart därefter till kolv a. Starta ett stoppur omedelbart och häll innehållet i kolvarna a och b i spektrofotometerkuvetterna. Läs efter 90 sekunder av absorbansen vid 490 nm hos vätskan i kolv a (bestämning) i förhållande till vätska b (nollvärde).Lösningar med hög halt av vinsyra med för hög absorbans bör spädas med 7,1-procentig natriumsulfat och därefter bestämmas enligt ovan.3.3.3.2. Vin utan tillsats av metavinsyraVid analys av vin med konstaterad eller misstänkt tillsats av metavinsyra skall syran först hydrolyseras enligt anvisningarna för referensmetoden.Efter kylning hälls innehållet i den koniska kolven i jonbytarkolonnen, varefter sköljvatten hälls i (5 ml × 2). Fortsätt enligt anvisningarna ovan.Metavinsyran räknas in i den totala syrahalten i slutresultatet av bestämningen.3.3.4 Utskrift av kalibreringskurvaPipettera 10, 20, 30, 40 resp. 50 ml av 1 g/l vinsyralösningen (3.1.2.9) i 100 ml graderade mätkolvar och fyll upp till 100 ml med den 7,1-procentiga natriumsulfatlösningen (3.1.1.4). Dessa lösningars koncentrationer motsvarar vineluat med en vinsyrahalt av 1, 2, 3, 4 resp. 5 g/l.Häll 20 ml av lösningarna i två koniska kolvar, a och b, och fortsätt enligt anvisningarna ovan för vineluatet.Kurvan över dessa lösningars absorbanser som en funktion av deras vinsyrahalt blir en rak linje som böjer av något i närheten av nollpunkten. Vid behov ritas denna del av kurvan med större noggrannhet på grundval av bestämningar utförda på lösningar med exakt kända koncentrationer under 1,0 g/l.3.3.5 Redovisning av resultatenDen för eluatet bestämda absorbansen framgår av kurvan och anger halten av vinsyra i vinet i gram per liter.Resultatet anges med en decimal.17. CITRONSYRA 1. PRINCIP FÖR METODENCitronsyra omvandlas till oxalacetat och acetat i en reaktion som katalyseras av citratlyas (CL):citrat>Start Grafik>CL>Slut Grafik>oxalacetat + acetatI närvaro av malatdehydrogenas (MDH) och laktatdehydrogenas (LDH) reduceras oxalacetatet och dess dekarbolyxeringsderivat, pyruvat, till L-malat och L-laktat med hjälp av reducerad nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH):oxalacetat + NADH + H+>Start Grafik>MDH>Slut Grafik>L-malat + NAD+pyruvat + NADH + H+>Start Grafik>MDH>Slut Grafik>L-laktat + NAD+Mängden NADH som oxideras till NAD+ i dessa reaktioner är proportionerlig mot den mängd citrat som finns närvarande. Oxidationen av NADH bestäms med hjälp av den resulterande absorbansminskningen vid 340 nm våglängd.2. REAGENSER2.1. Buffertlösning, pH 7,8(0,51 M glycylglycin, pH = 7,8, Zn2+: 0,6 × 10-3 M):Lös 7,13 g glycylglycin i ca 70 ml dubbeldestillerat vatten.Justera pH till 7,8 med ca 13 ml 5 M natriumhydroxidlösning, tillsätt 10 ml zinkkloridlösning (80 mg ZnCl2 i 100 ml H2O) och fyll upp till 100 ml med dubbeldestillerat vatten.Denna tosning är hällbar i minst fyra veckor vid 4 °C.2.2. Reducerad nikotinamid-adenin-dinukleotidlösning (NADH) (ca 6. 10-3M): lös 30 mg NADH och 60 mg NaHCO3 i 6 ml dubbeldestillerat vatten.2.3. Lösning av malathydrogenas/laktathydrogenas (MDH/LDH, 0,5 mg MDH/ml, 2,5 mg LDH/ml): blanda 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml ammoniumsulfatlösning (3,2 M) och 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Denna suspension är hållbar i minst ett år vid 4 °C.2.4. Citratlyas (CL, 5 mg protein/ml): lös 168 mg lyofilisat i 1 ml iskallt vatten. Denna lösning är hållbar i minst en vecka vid 4 °C och i minst fyra veckor i fruset tillstånd.Enzymaktiviteten bör kontrolleras före bestämningen.2.5. Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP)Anmärkning: Samtliga ovannämnda reagenser finns i handeln.3. APPARATUR3.1. Spektrofotometer för bestämning vid 340 nm, den våglängd där NADH har maximal absorption.Om denna utrustning saknas, kan en spektrofotometer med diskontinuerligt spektrum för bestämning vid 334 nm eller 365 nm användas. Eftersom absoluta absorbansbestämningar skall utföras (dvs. kalibreringskurvor används inte, utan bestämning görs med hjälp av extinktionskoefficienten för NADH), måste apparatens våglängdsskalor och absorption kontrolleras.3.2. Glaskuvetter med en optisk vågängd av 1 cm eller engångskuvetter.3.3. Mikropipetter för pipettering av volymer mellan 0,02 och 2 ml.4. BEREDNING AV PROVETCitratbestämning utförs normalt direkt i vinet utan föregående avfärgning och spädning, under förutsättning att citronsyrahalten är lägre än 400 mg/l. Om så inte är fallet späds vinet till dess att citrathalten är mellan 20 och 400 mg/l (dvs. mellan 5 och 80 ìg citrat i provet).För röda viner med höga halter av fenolföreningar rekommenderas förbehandling med PVPP:Slamma upp ca 0,2 g PVPP i vatten och låt stå i 15 minuter. Filtrera genom ett veckfilter.Häll 10 ml vin i en 50 ml konisk kolv, tillsätt fuktad PVPP som skrapats av från filtret med en spatel. Skaka om i två till tre minuter. Filtrera.5. METODSpektrofotometern ställs in på våglängden 340 nm. Bestämning sker med 1 cm kuvetter med luft som nollabsorbansstandard (referens, ingen kuvett i strålgången). Sätt följande till 1 cm kuvetterna:>Plats för tabell>Blanda och läs av absorbansen för lösningarna i referens- och provkuvetterna (A1) efter ca fem minuter.Tillsätt:>Plats för tabell>Blanda och vänta till dess att reaktionen är avslutad (ca fem minuter) och läs av absorbansen för lösningarna i referens- och provkuvetterna (A2).Beräkna absorbansdifferensen (A2   A1) för referens- och provkuvetterna, ÄAR och ÄAP.Beräkna slutligen skillnaden mellan dessa differenser:ÄA = ÄAD   ÄATAnmärkning: Den tid som krävs för enzymerna att verka kan variera mellan serierna och värdet ovan anges endast som vägledning. Värdet bör bestämmas för varje serie.6. REDOVISNING AV RESULTATENCitronsyrahalten anges i milligram per liter och avrundas till närmaste heltal.6.1 BeräkningsmetodNedanstående allmänna formel används för beräkning av koncentrationen i mg/l:C = >NUM>V × PM/>DEN>å × d × v × Ä A>Plats för tabell>så attC = 479 × ÄAOm lösningen har spätts i samband med beredningen multipliceras resultatet med spädningsfaktorn.Anmärkning:>Plats för tabell>6.2 Repeterbarhet (r)>Plats för tabell>6.3 Reproducerbarhet (R)>Plats för tabell>18. MJÖLKSYRA 1. PRINCIP FÖR METODEN1.1 All mjölksyra (L-laktat och D-laktat) oxideras till pyruvat i närvaro av nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) i en reaktion som katalyseras av L-laktatdehydrogenas (L-LDH) och D-laktatdehydrogenas (D-LDH).Reaktionsjämvikten ligger vanligtvis närmare laktat. Om pyruvatet avlägsnas från reaktionsblandningen förflyttas reaktionsjämvikten mot bildning av pyruvat.I närvaro av L-glutamat omvandlas pyruvat till L-alanin i en reaktion som katalyseras av glutamatpyruvattransaminas (GPT):1. L-laktat + NAD+>Start Grafik>L-LDH>Slut Grafik>pyruvat + NADH + H+2. D-laktat + NAD+>Start Grafik>D-LDH>Slut Grafik>pyruvat + NADH + H+3. Pyruvat + L-glutamat>Start Grafik>GPT>Slut Grafik>L-alanin + á-ketoglutaratDen mängd NADH som bildas, bestämd på grundval av absorbansökningen vid 340 nm våglängd, är proportionell mot den ursprungliga mängden laktat.Anmärkning:L-mjölksyra kan bestämmas separat med reaktionerna 1 och 3.D-mjölksyra kan bestämmas separat med reaktionerna 2 och 3.1.2 RutinmetodMjölksyra som separeras i en jonbytarkolonn oxideras till etanal och bestäms kolorimetriskt efter reaktion med natriumnitroprussid och piperidin.2. REFERENSMETOD2.1 Reagenser2.1.1. Buffertlösning, pH 10 (glycylglycin 0,6 mol/l, L-glutamat 0,1 mol/l).Lös 4,75 g glycylglycin och 0,88 g L-glutaminsyra i ca 50 ml dubbeldestillerat vatten. Justera pH till 10 med några ml 10 M natriumhydroxid och fyll upp till 60 ml med dubbeldestillerat vatten.Denna lösning är hållbar i minst 12 veckor vid 4 °C.2.1.2. Nikotinamid-adenin-dinukleotidlösning (NAD), ca 40 × 10-3 M. Lös 900 mg NAD i 30 ml dubbeldestillerat vatten. Lösningen är hållbar i minst fyra veckor vid 4 °C.2.1.3. Glutamat-pyruvat-transaminas-suspension (GPT), 20 mg/ml. Suspensionen är hållbar i minst ett år vid 4 °C.2.1.4. L-laktatdehydrogenas-suspension (L-LDH), 5 mg/ml. Suspensionen är hållbar i minst ett år vid 4 °C.2.1.5. D-laktatdehydrogenas-suspension (D-LDH), 5 mg/ml. Suspensionen är hållbar i minst ett år vid 4 °C.Enzymaktiviteten bör kontrolleras före bestämningen.Anmärkning: Samtliga reagenser finns i handeln.2.2 Apparatur2.2.1. Spektrofotometer för bestämning vid 340 nm, den våglängd där NADH har maximal absorption.I avsaknad av sådan apparatur kan en spektrofotometer med diskontinuerligt spektrum för bestämning vid 334 nm eller 365 nm användas.Eftersom absoluta absorbansbestämningar skall utföras (dvs. kalibreringskurvor används inte, utan bestämning görs med hjälp av extinktionskoefficienten för NADH), måste apparatens våglängdsskalor och absorptionsvärden kontrolleras.2.2.2. Glaskuvetter med en optisk väglängd av 1 cm eller engångskuvetter.2.2.3. Mikropipetter för pipettering av provvolymer mellan 0,02 och 2 ml.2.3 Beredning av provetIngen glasdel i apparaturen som kommer i kontakt med reaktionsblandningen får vidröras med fingrarna eftersom detta kan leda till en ökning av halten av L-mjölksyra, vilket leder till ett felaktigt provresultat.Laktatbestämning utförs normalt direkt i vinet utan föregående avfärgning och spädning, förutsatt att mjölksyrahalten är lägre än 100 mg/l. Om mjölksyrahalten ligger mellan:100 mg/l och 1 g/l, späd 1:10 med dubbeldestillerat vatten,1 g/l och 2,5 g/l, späd 1:25 med dubbeldestillerat vatten,2,5 g/l och 5 g/l, späd 1:50 med dubbeldestillerat vatten.2.4 Metod2.4.1 Bestämning av den totala halten av mjölksyraBuffertlösningen skall ha en temperatur mellan 20 och 25 °C innan bestämningen utförs.Med spektrofotometern inställd på 340 nm bestäms absorbansen med kuvetter med en optisk väglängd av 1 cm. Bestämningen görs i förhållande till luft (absorbans 0, ingen kuvett i strålgången) eller i förhållande till vatten.Häll följande i kuvetter med 1 cm optisk väglängd:>Plats för tabell>Blanda om med en glas- eller plaststav som är platt i ena änden och läs av absorbansen för lösningarna i referens- och provkuvetterna (A1) efter ca fem minuter.Tillsätt 0,02 ml av lösning 2.1.4 och 0,05 ml av lösning 2.1.5. Homogenisera och vänta tills reaktionen är avslutad (ca 30 minuter). Läs av absorbansen för lösningarna i referens- och provkuvetterna (A2).Beräkna absorbansdifferensen (A2   A1) för referens- och provkuvetterna.Beräkna slutligen skillnaden mellan dessa differenser:ÄA = ÄAP   ÄAR2.4.2 Bestämning av L-mjölksyra och D-mjölksyraBestämning av L-mjölksyra eller D-mjölksyra kan utföras separat genom tillämpning av samma förfarande som ovan för den totala halten av mjölksyra, fram till bestämning av A1. Fortsätt därefter enligt följande anvisningar.Tillsätt 0,02 ml av lösning 2.1.4. Homogenisera och vänta tills reaktionen är avslutad (ca 20 minuter). Läs av absorbansen för lösningarna i referens- och provkuvetterna (A2).Tillsätt 0,05 ml av lösning 2.1.5. Homogenisera och vänta tills reaktionen är avslutad (ca 30 minuter). Läs av absorbansen för lösningarna i referens- och provkuvetterna (A3).Beräkna absorbansdifferensen (A2   A1) för L-mjölksyra och (A3   A2) för D-mjölksyra mellan absorbansen för lösningarna i referens- och provkuvetterna.Beräkna slutligen skillnaden mellan dessa differenser:ÄA = ÄAP   ÄARAnmärkning:Den tid som åtgår för att enzymerna skall verka kan variera mellan serierna och värdet ovan anges endast som vägledning. Värdet bör bestämmas för varje serie. När bestämning görs av enbart L-mjölksyra kan inkubationstiden minskas till 10 minuter.2.5 Redovisning av resultatenMjölksyrahalten anges i gram per liter med en decimal.2.5.1 BeräkningsmetodNedanstående allmänna formel används för beräkning av koncentrationen i g/l:C = >NUM>V × PM/>DEN>å × d × v × 1 000 × Ä Adär>Plats för tabell>2.5.1.1. Den totala halten av mjölksyra och D-mjölksyraC = 0,164 × ÄAOm lösningen har spätts i samband med beredningen multipliceras resultatet med spädningsfaktorn.Anmärkning:>Plats för tabell>2.5.1.2. L-mjölksyraC = 0,160 × ÄAOm lösningen har spätts i samband med beredningen multipliceras resultatet med spädningsfaktorn.Anmärkning:>Plats för tabell>2.5.2 Repeterbarhet (r)r = 0,02 + 0,07x1 g/lxi är mjölksyrakoncentrationen i provet i g/l.2.5.3 Reproducerbarhet (R)R = 0,05 + 0,125xi g/l.xi är mjölksyrakoncentrationen i provet i g/l.3. RUTINMETOD3.1.1 För förbehandling av vinetSe kapitlet "Vinsyra", rutinmetod, punkt 3.1.1.3.1.2 För bestämning av mjölksyra3.1.2.1. 0,1 M lösning av cerium(IV)sulfat i 0,35 M svavelsyra:Håll lösningen kall, lös 40,431 g cerium(IV)sulfat, Ce(SO4)2, 4H2O i exakt 350 ml 1 M svavelsyralösning (3.1.2.4). Fyll upp till 1 000 ml med destillerat vatten.3.1.2.2. 2,5 M natriumhydroxidlösning (NaOH).3.1.2.3. Natriumacetatlösning, 270 g/l (beredd av torrt natriumacetat, NaCH3COO).3.1.2.4. 1 M svavelsyra (H2SO4).3.1.2.5. 2 % (w/v) natriumnitroprussidlösning [Na2(Fe(CN)5NO) × 2H2O]Förvaras mörkt i en väl tillsluten flaska.Hållbar i högst åtta timmar.3.1.2.6. 10 % (v/v) piperidinlösning (C5H11N).3.1.2.7. 1 M mjölksyralösning.100 ml mjölksyra (C3H6O3) löses i 400 ml vatten. Lösningen upphettas i en indunstningsskål över kokande vattenbad i fyra timmar. Fyll på emellanåt med destillerat vatten. Kyl och fyll upp till 1 liter. Titrera mjölksyran i 10 ml av lösningen med 1 M natriumhydroxidlösning (3.1.2.8). Justera lösningen till 1 M mjölksyra (90 g).3.1.2.8. 1 M natriumhydroxidlösning (NaOH).3.2 Apparatur3.2.1. Glaskolonn, ca 300 mm lång, med 10 11 mm innerdiameter och utloppsrör för reglering av flödet.3.2.2. Vattenbad med en konstant temperatur av 65 °C.3.2.3. Spektrofotometer för absorbansbestämning vid 570 nm med kuvetter med 1 cm optisk väglängd.3.3 Metod3.3.1 Beredning av jonbytarkolonnSe kapitlet "Vinsyra", rutinmetod, 3.3.1.3.3.2 Separering av organiska syrorSe kapitlet "Vinsyra", rutinmetod, 3.3.2.3.3.3 Bestämning av mjölksyraHäll 10 ml eluat i ett 50 ml provrör med en propp av slipat glas och tillsätt 10 ml ceriumsulfatlösning (3.1.2.1). Rör om och placera i vattenbad med en konstant temperatur av 65 °C i exakt 10 minuter. När röret sänks ner i vattenbadet avlägsnas glasproppen i några sekunder för att kompensera för tryckhöjningen till följd av uppvärmningen. Proppen sätts därefter tillbaka så att röret tillsluts och den etanal (acetaldehyd) som bildas inte förflyktigas. Avlägsna röret från vattenbadet och kyl under rinnande vatten till en temperatur av ca 20 °C. Tillsätt 5 ml 2,5 M natriumhydroxidlösning (3.1.2.2), blanda och filtrera.Tag 15 ml av filtratet och häll det i en 50 ml kolv med propp som redan innehåller en homogen blandning av 5 ml 27 % natriumacetatlösning (3.1.2.3) och 2 ml 1 M svavelsyra (3.1.2.4). Tillsätt 5 ml natriumnitroprussidlösning (3.1.2.5), blanda och tillsätt därefter 5 ml piperidinlösning (3.1.2.6). Blanda om snabbt och häll omedelbart i lösningen i kuvetten i spektrofotometern. Den färgning som uppträder varierar från grön till violett och bestäms vid 570 nm i förhållande till luft (ingen kuvett i strålgången). Den ökar och minskar därefter snabbt.Följ motsvarande absorbansvariation och välj det högsta värdet som slutvärde.Om eluatet innehåller för mycket mjölksyra och absorbansen är för hög, späds eluatet med 7,1 % natriumsulfatlösning (3.1.1). Utför bestämningen på den spädda lösningen.3.3.4 Utskrift av kalibreringskurvanPipettera 10 ml av 1 M mjölksyralösning (3.1.2.7) och 10 ml av den titrerade 1 M natriumhydroxidlösningen (3.1.2.8) i en 1 000 ml mätkolv och fyll upp till märket med 7,1 % natriumsulfatlösning. Ta 5, 10, 15, 20 resp. 25 ml av lösningen och häll i 100 ml mätkolvar. Fyll upp till referensmärket med 7,1 % natriumsulfatlösning (3.1.1). Tag 10 ml av var av en av de erhållna lösningarna och bestäm deras absorbans enligt den metod som beskrivs i 3.3.3 för eluatet.Dessa lösningars koncentrationer motsvarar vineluat som innehåller 0,45; 0,9; 1,35; 1,80 resp. 2,25 gram mjölksyra per liter.En grafisk framställning av dessa lösningars absorbansvärden som en funktion av halten av mjölksyra blir en rak linje.3.4 Redovisning av resultatenDen för eluatet bestämda absorbansen kan sökas på kalibreringskurvan och anger halten av mjölksyra i gram per liter vin.Resultatet anges med en decimal.Anmärkning: Vin som innehåller mer än 250 mg svaveldioxid per liter kan ha en halt av etanalsulfonsyra som inräknas i halten av mjölksyra. I detta fall måste resultatet korrigeras med en mängd som erhålls genom följande extra beräkning: 15 ml av eluatet blandas i ett provrör med propp med 5 ml 27 % natriumacetat (3.1.2.3) och 2 ml 0,775 M H2SO4 (77,5 ml 1 M H2SO4 späds till 100 ml med destillerat vatten). Därefter tillsätts, som vid bestämning av mjölksyra, 5 ml 2 % natriumnitroprussid (3.1.2.5) och 5 ml 10 % (3.1.1.6) piperidin. Efter blandning bestäms absorbansen under samma betingelser som de som har angivits för bestämning av mjölksyra. Finn absorbansen på kalibreringskurvan för att erhålla värde B för mjölksyran i gram per liter i förhållande till etanalsulfonsyra. Om L' är den skenbara koncentrationen av mjölksyra i vinet i gram per liter, erhålls den verkliga koncentrationen L' av mjölksyra med formeln:L = L'   B × 0,4 (g/l)19. L-ÄPPELSYRA 1. PRINCIP FÖR METODENL-äppelsyra (L-malat) oxiderar i närvaro av nikotinamid-adenindinukleotid (NAD) till oxalacetat i en reaktion som katalyseras av L-malatdehydrogenas (L-MDH).Reaktionsjämvikten ligger vanligtvis närmare malat. Om oxalacetat avlägsnas från reaktionsblandningen förflyttas reaktionsjämvikten mot bildning av oxalacetat. I närvaro av L-glutamat omvandlas oxalacetat till L-aspartat i en reaktion som katalyseras av glutamat-oxalacetat-transaminas (GOT):1. L-malat + NAD+>Start Grafik>L-MDH>Slut Grafik>oxalacetat + NADH + H+2. Oxalacetat + L-glutamat>Start Grafik>GOT>Slut Grafik>L-aspartat + á-ketoglutaratDen mängd NADH som bildas, bestämd på grundval av absorbansökningen vid 340 nm, är proportionell mot den ursprungliga mängden L-malat.2. REAGENSER2.1. Buffertlösning, pH 10(0,60 M glycylglycin, 0,1 M L-glutamat).Lös 4,75 g glycylglycin och 0,88 g L-glutaminsyra i ca 50 ml dubbeldestillerat vatten. Justera pH till 10 med ca 4,6 ml 10 M natriumhydroxid och späd till 60 ml med dubbeldestillerat vatten.Denna lösning är hållbar i minst 12 veckor vid 4 °C.2.2. Nikotinamid-adenin-dinukleotidlösning (NAD), ca 47 × 10-3 M: lös 420 mg NAD i 12 ml dubbeldestillerat vatten. Denna lösning är hållbar i minst 4 veckor vid 4 °C.2.3. Suspension av glutamat-oxalacetat-transaminas (GOT), 2 mg/ml. Suspensionen är hållbar i minst 1 år vid 4 °C.2.4. L-malatdehydrogenaslösning (L-MDH), 5 mg/ml. Denna lösning är hållbar i minst 1 år vid 4 °C.Anmärkning: Samtliga ovannämnda reagenser finns i handeln.3. APPARATUR3.1. Spektrofotometer för bestämning vid 340 nm, den våglängd där NADH har maximal absorption.Om sådan apparatur saknas, är det möjligt att använda en spektrofotometer med diskontinuerligt spektrum som tillåter bestämning vid 334 eller 365 nm.Eftersom absoluta absorbansbestämningar görs (dvs. kalibreringskurvor används inte, utan standardisering görs med hjälp av extinktionskoefficienten för NADH), måste apparatens våglängdsskalor och absorption kontrolleras.3.2. Glaskuvetter med en optisk väglängd av 1 cm eller engångskuvetter.3.3. Mikropipetter för pipettering av prov med en volym mellan 0,01 och 2 ml.4. BEREDNING AV PROVETBestämning av L-malat utförs normalt direkt i vinet utan föregående avfärgning och spädning, under förutsättning att halten av L-äppelsyra är mindre än 350 mg/l (bestämt vid 365 nm). Om så inte är fallet späds vinet med dubbeldestillerat vatten till dess att halten av L-malat ligger mellan 30 och 350 mg/l (dvs. mängden L-malat i analysprovet är mellan 3 och 35 ìg).Om halten av L-malat i vinet är mindre än 30 mg/l kan analysprovets volym ökas till 1 ml. I så fall minskas den vattenvolym som tillsätts på så sätt att den totala volymen i de båda kuvetterna blir densamma.5. METODSpektrofotometern ställs in på våglängden 340 nm och absorbansen bestäms i kuvetter med en optisk väglängd av 1 cm i förhållande till luft (ingen kuvett i strålgången) eller vatten.Häll i kuvetter med 1 cm optisk väglängd:>Plats för tabell>Blanda och läs av absorbansen för lösningarna i referens- och provkuvetterna (A1) efter ca tre minuter.Tillsätt:>Plats för tabell>Blanda och vänta till dess att reaktionen är avslutad (ca 5 10 minuter) och läs av absorbansen för lösningarna i referens- och provkuvetterna (A2).Beräkna absorbansdifferensen (A2   A1) för referens- och provkuvetterna, ÄAP och ÄAR.Absorbansdifferensen för referenslösningen dras ifrån absorbansdifferensen för provlösningen:ÄA = ÄAD   ÄATAnmärkning: Den tid som krävs för att enzymerna skall verka kan variera mellan serierna och värdet ovan anges endast som vägledning. Värdet bör bestämmas för varje serie.6. REDOVISNING AV RESULTATENHalten av L-äppelsyra i gram per liter med en decimal.6.1 BeräkningsmetodDen allmänna formeln nedan används för beräkning av halten i gram per liter:C = >NUM>V × PM/>DEN>å × d × v × 1 000 × Ä Adär>Plats för tabell>För L-malat erhålls:C = 0,473 × ÄA g/lOm lösningen har spätts i samband med beredningen multipliceras resultatet med spädningsfaktorn.Anmärkning:>Plats för tabell>6.2 Repeterbarhet (r)>Plats för tabell>6.3 Reproducerbarhet (R)>Plats för tabell>20. D-ÄPPELSYRA (Enzymmetod) ANALYSSET FR CA 30 BESTMNINGAR.1. PRINCIPI närvaro av D-malat-dekarboxyl-dehydrogenas (D-MDH) oxideras D-äppelsyra (D-malat) av nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) till oxalacetat. Den oxalacetat som bildas genom denna reaktion delas upp i pyruvat och kolsyra.D-malat + NAD>Start Grafik>D-MDH>Slut Grafik>pyruvat + CO2 + NADH + H+Den mängd NADH som bildas är proportionell mot halten av D-äppelsyra och bestäms vid 334, 340 eller 365 nm.2. ANALYSSETET INNEHÅLLER:a) Flaska 1 med ca 30 ml lösning bestående av Hepes-buffert 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetan-sulfonsyra), pH = 9,0 och stabilisatorer.b) Flaska 2 med ca 210 mg NAD-lyofilisat.c) Tre flaskor med D-MDH-lyofilisat, ca 8 E vardera.2.1 Beredning av lösningar2.1.1. Använd innehållet i flaska 1 outspätt. Före användning värms lösningen till mellan 20 och 25 °C.2.1.2. Lös innehållet i flaska 2 i 4 ml omdestillerat vatten. Före användning värms lösningen till 20 25 °C.2.1.3. Lös innehållet i en av flaskorna 3 i 0,6 ml omdestillerat vatten. Före användning värms lösningen till 20 25 °C.2.2 Lösningarnas stabilitetInnehållet i flaska 2.1.1 är hållbart i ett år om det lagras vid + 4 °C. Lösning 2.1.2 är hållbar i tre veckor om den lagras vid + 4 °C och i två månader om den lagras vid   20 °C.Lösning 2.1.3. är hållbar i fem dagar om den lagras vid + 4 °C.3. APPARATUR3.1. Spektrofotometer för bestämning vid 340 nm, den våglängd där NADH och NADPH har maximal absorption.Om sådan apparatur saknas, är det möjligt att använda spektrofotometer med diskontinuerligt spektrum för bestämning vid 334 eller 365 nm användas.3.2. Glaskuvetter, 1 cm (om så önskas kan engångskuvetter användas i stället).3.3. Mikropipetter, lämpliga för pipettering av volymer mellan 0,01 och 2 ml.4. BEREDNING AV PROVETMängden D-äppelsyra i kuvetten ska vara mellan 2 och 50 ìg. Provlösningen måste därför spädas så att halten av D-äppelsyra är mellan 0,02 och 0,5 g/l eller 0,02 och 0,3 g/l.Om absorbansdifferensen ÄA är Plats för tabell>Beräkna absorbansskillnaderna (A2   A1) för såväl referensprovet som analysprovet. Dra ifrån referensprovets absorbansskillnad (ÄAR) från provets absorbansdifferens (ÄAP).ÄA = ÄAP   ÄAR6. REDOVISNING AV RESULTATEN:Halten av D-äppelsyra anges i gram per liter med en decimal.6.1 BeräkningEnligt den allmänna formeln för beräkning av koncentrationer blir ekvationen följande:C = >NUM>V × PM/>DEN>å × d × v × 1 000 × Ä A (g/l)där>Plats för tabell>>Plats för tabell>Med D-äppelsyra:C = >NUM>2,95 × 134,9/>DEN>å × 1 × 0,1 × 1 000 × Ä A = >NUM>3,956/>DEN>å × Ä A (g D-äppelsyraperprov)Om lösningen har spätts i samband med beredningen multipliceras resultatet med spädningsfaktorn F.6.2 Repeterbarhet (r)r = 0,05xi.6.3 Reproducerbarhet (R)>Plats för tabell>21. TOTAL HALT AV ÄPPELSYRA RUTINMETOD1. PRINCIPÄppelsyra som separeras med en anjonbytarkolonn bestäms kolorimetriskt i eluatet genom bestämning av den gula färg som bildas med kromotropsyra i närvaro av koncentrerad svavelsyra. Korrektion för orenheter görs genom att dra ifrån den absorbans som erhålls med 86 % svavelsyra och kromotropsyra (äppelsyra reagerar inte vid dessa syrakoncentrationer) från den absorbans som erhålls vid användning av 96-procentiga syror.2. APPARATUR2.1. Glaskolonn, ca 250 mm lång, 35 mm innerdiameter, med avtappningskran.2.2. Glaskolonn, ca 300 mm lång, 10 11 mm innerdiameter, med avtappningskran.2.3. Termostatreglerat vattenbad, 100 °C.2.4. Spektrofotometer med 10 mm kuvetter för absorbansbestämning vid 420 nm.3. REAGENSER3.1. Starkt basisk jonbytarharts (t.ex. Merck III).3.2. Natriumhydroxid, 5 % (w/v).3.3. Ättiksyra, 30 % (w/v).3.4. Ättiksyra, 0,5 % (w/v).3.5. Natriumsulfatlösning (Na2SO2),1 0 % (w/v).3.6. Koncentrerad svavelsyra, 95-97 % (w/w).3.7. Svavelsyra, 86 % (w/w).3.8. Kromotropsyra, 5 % (w/v).Bered en färsk lösning före varje bestämning genom att lösa 500 mg natriumkromotropat (C10H6Na2O8S2, 2H2O) i 10 ml destillerat vatten.3.9. DL-äppelsyralösning, 0,5 g/l.Lös 250 mg äppelsyra (C4H6O5) i natriumsulfatlösning (10 %). Fyll upp till 500 ml med natriumsulfatlösning (10 %) (3.5).4. METOD4.1 Beredning av jonbytarhartsPlacera en bomullstuss som är indränkt med destillerat vatten på kolonnens botten (35 × 250 mm) ovanför avtappningskranen. Häll en suspension av jonbytarharts i glaskolonnen. Vätskan bör nå 50 mm över hartsens översta nivå. Skölj med 1 000 ml destillerat vatten. Tvätta kolonnen med natriumhydroxidlösning (5 %). Låt rinna av så att nivån är 263 mm ovanför hartsens översta nivå, tvätta ytterligare två gånger med 5 % natriumhydroxid och låt stå i en timme. Tvätta kolonnen med 1 000 ml destillerat vatten. Fyll kolonnen igen med ättiksyra (30 %), låt rinna av till 2 3 mm från kolonnens översta del och tvätta ytterligare två gånger med ättiksyra (30 %). Låt stå i minst 24 timmar före användning. Förvara jonbytarhartsen i ättiksyra (30 %) för senare analyser.4.2 Beredning av jonbytarkolonnPlacera en bomullstuss på kolonnens botten (11 × 300 mm) ovanför kranen. Häll i suspensionen av jonbytarharts (beredd enligt 4.1) till en nivå av 10 cm. Öppna kranen och låt ättiksyralösningen (30 %) rinna ut till en nivå 2 3 mm ovanför hartsens översta nivå. Tvätta med 50 ml ättiksyra (0,5 %).4.3 Separering av DL-äppelsyraHäll 10 ml vin eller must i kolonnen (beredd enligt 4.2). Låt en droppe i taget rinna ut (i genomsnitt en droppe per sekund) och hejda flödet när nivån är 2 3 mm från hartsens översta nivå. Tvätta kolonnen med 50 ml ättiksyra (0,5 %), därefter med 50 ml destillerat vatten och låt rinna av med samma hastiget som tidigare. Avsluta när nivån är 2 3 mm från hartsens översta nivå.Eluera de syror som absorberats på jonbytarhartsen med en 10 % natriumsulfatlösning (3.5). Samla upp eluatet i en 100 ml mätkolv.Kolonnen kan regenereras med hjälp av den metod som beskrivs i (4.1).4.4 Bestämning av äppelsyraMärk två 30 ml rör A och B med bred hals (med proppar av slipat glas). Häll 1,0 ml av eluatet (4.3) och 1 ml kromotropsyra (5 %) i vardera röret. Tillsätt 10 ml svavelsyra (86 %) (referens) i rör A och 10 ml (96 %) svavelsyra i rör B (analysprov). Tillslut och skaka om för att homogenisera. Se till att proppen inte blir våt. Sänk ner rören i kokande vattenbad i exakt 10 minuter. Kyl rören i mörker vid 20 °C i exakt 90 minuter. Bestäm omedelbart absorbansen i förhållande till referensen vid 420 nm i en 10 mm kuvett.4.5 Utskrift av kalibreringskurvaPipettera 5,0; 10,0; 15,0 och 20 ml i fyra 50 ml mätkolvar. Fyll upp till märket med natriumsulfatlösning (10 %).Dessa lösningar motsvarar eluat som erhållits från viner innehållande 0,5; 1,0; 1,5 respektive 2,0 g/l äppelsyra.Fortsätt som i 4.4.Kurvan över dessa lösningars absorbanser är en funktion av deras halt av äppelsyra och beskriver en rak linje som skär igenom nollpukten.Den färgintensitet som erhålls beror i stor utsträckning på koncentrationen av den använda svavelsyran. Det är nödvändigt att kontrollera kalibreringskurvan med åtminstone en punkt per serie bestämningar för att påvisa en eventuell förändring av svavelsyrans koncentration.5. REDOVISNING AV RESULTATENDen absorbans som mäts för eluatet söks på kalibreringskurvan genom extrapolering av de uppmätta värdena, och motsvarande äppelsyrakoncentration i g/l läses av. Resultatet anges med en decimal.Repeterbarhet:>Plats för tabell>Reproducerbarhet:R = 0,3 g/l.22. SORBINSYRA 1. PRINCIP FÖR METODERNA1.1 Bestämning med ultraviolett absorptionsspektrofotometriSorbinsyra (trans, trans, 2,4-hexadiensyra) som extraherats genom ångdestillation bestäms i vindestillatet med ultraviolett absorptionsspektrofotometri. Substanser som interfererar med absorptionsbestämningen i den ultravioletta delen av spektrum avlägsnas genom indunstning till torrhet med hjälp av lätt alkalisk kalciumhydroxid. Tunnskiktskromatografi används för identifiering av nivåer (känslighet: 1 mg/l) under 20 mg/l.1.2 Bestämning med gaskromatografiSorbinsyra som extraheras i etyleter bestäms med gaskromatografi med en intern standard.1.3 Identifiering av spårmängder med tunnskiktskromatografiSorbinsyra som extraheras i etyleter separeras med tunnskiktskromatografi och koncentrationen bestäms semikvantitativt.2. BESTÄMNING MED ULTRAVIOLETT ABSORPTIONSSPEKTROFOTOMETRI2.1 Reagenser2.1.1. Kristallinisk vinsyra, C4H6O6.2.1.2. Kalciumhydroxid, Ca(OH)2, lösning, ca 0,02 M.2.1.3. Referenslösning av sorbinsyra, 20 mg/l:Lös 20 mg sorbinsyra, C6H8O2, i ca 2 ml 0,1 M natriumhydroxidlösning. Häll i en 1 000 ml mätkolv och fyll upp till märket med vatten. Alternativt löses 26,8 mg kaliumsorbat, C6H7KO2, i vatten och lösningen späds till 1 000 ml med vatten.2.2 Apparatur2.2.1. Ångdestillationsapparat (se kapitlet "Halten av flyktiga syror").2.2.2. Vattenbad, 100 °C.2.2.3. Spektrofotometer för absorbansbestämning vid 256 nm med en kuvett av kvarts med 1 cm optisk väglängd.2.3 Metod2.3.1 DestillationHäll 10 ml vin i kolven i en ångdestillationsapparat och tillsätt 1 2 g vinsyra (2.1.1). Samla upp 250 ml av destillatet.2.3.2 Beredning av kalibreringskurvanGenom spädning av referenslösningen (2.1.3) bereds fyra spädda referenslösningar med 0,5; 1,0; 2,5 respektive 5 mg sorbinsyra/l. Bestäm deras absorbanser med spektrofotometern vid 256 nm, varvid lösningen med destillerat vatten använts som nollprov. Rita en kurva som visar absorbansvariationen som en funktion av halten. Variationen är linjär.2.3.3 BestämningHäll 5 ml av destillatet i en indunstningsskål med 55 mm diameter och tillsätt 1 ml kalciumhydroxidlösning (2.1.2). Indunsta över vattenbad tills destillatet är torrt.Lös resten i flera ml destillerat vatten och överför helt till en 20 ml mätkolv. Fyll upp till märket med sköljvatten. Bestäm absorbansen vid 256 nm med en spektrofotometer i förhållande till en referenslösning som erhålls genom spädning av 1 ml kalciumhydroxidlösning (2.1.2) till 20 ml med vatten.Rita in värdet för den bestämda absorbansen på kalibreringskurvan och sök koncentrationen C av sorbinsyra i lösningen med hjälp av denna.Anmärkning: Med denna metod kan förlusten till följd av indunstning bortses ifrån. Absorbansbestämningen utförs direkt på destillatet som spätts 1:4 med destillerat vatten.2.4 Redovisning av resultaten2.4.1 BeräkningHalten av sorbinsyra i vinet uttrycks i mg/l och erhålls med 100 × C.C = halten av sorbinsyra i den spektrofotometriskt analyserade lösningen uttryckt i mg/l.3. BESTÄMNING MED GASKROMATOGRAFI3.1 Reagenser3.1.1. Etyleter (C2H5)2O, destillerad omedelbart före användning.3.1.2. Intern referenslösning: lösning av undekansyra, C11H22O2, i 95 % etanol med en koncentration av 1 g/l.3.1.3. Vattenhaltig svavelsyralösning, H2SO4 (ñ20 = 1,84 g/ml),spädd 1:3 (v/v).3.2 Apparatur3.2.1. Gaskromatograf med flamjoniseringsdetektor och kolonn av rostfritt stål (4 m × 1/8 tum) som behandlats med dimetyldiklorsilan och packats med en stationär fas bestående av en blandning av dietylenglykolsuccinat (5 %) och fosforsyra (1 %) (DEGS - H3 PO4) eller med en blandning av dietylenglykoladipat (7 %) och fosforsyra (1 %) (DEGA - H3 PO4) bundet till Gaschrome Q 80 - 100 mesh.Behandling av kolonnen med DMDCS utförs så att en lösning innehållande 2 3 g DMDCS i toluen hälls genom kolonnen. Skölj omedelbart med metanol, följt av kvävgas. Tvätta därefter med hexan och sedan mer kvävgas. Kolonnen är nu färdig att packas.Analysbetingelser:Ugnstemperatur: 175 °C.Injektorns och detektorns temperatur: 230 °C.Bärargas: kvävgas (flödeshastighet = 200 ml/minut).3.2.2. Mikrospruta, 10 ìl, graderad i 0,1 ìl.Anmärkning: Andra typer av kolonner som ger god separation kan användas, särskilt kapillärkolonner (t.ex. FFAP).Den metod som beskrivs här anges som exempel.3.3 Metod3.3.1 Beredning av analysprovetHäll 20 ml vin i ett provrör av glas med ca 40 ml volym, med propp av slipat glas. Tillsätt 2 ml av den interna referenslösningen (3.1.2) och 1 ml svavelsyralösning (3.1.3).Efter att lösningen har blandats genom att röret vänds upp och ner flera gånger tillsätts 10 ml etyleter (3.1.1). Extrahera sorbinsyran i den organiska fasen genom att skaka röret i fem minuter. Låt sedimentera.3.3.2 Beredning av referenslösningenVälj ett vin för vilket kromatogrammet för eterextraktet inte visar någon topp som motsvarar eluering av sorbinsyra. Tillsätt sorbinsyra till vinet till en koncentration av 100 mg/l. Behandla 20 ml av det färdiga provet enligt den metod som beskrivs i 3.3.1.3.3.3 KromotografiAnvänd en mikrospruta för att spruta in följande i kromatografen: först 2 ìl av eterextraktfasen som framställts enligt 3.3.2 och därefter 2 ìl av eterextraktfasen som framställts enligt 3.3.1Skriv ut kromatogrammen. Kontrollera identiteten för respektive retentionstider för sorbinsyran och den interna standarden. Bestäm höjden (eller arean) för respektive registrerad topp.3.4 Redovisning av resultaten3.4.1 BeräkningHalten av sorbinsyra i det analyserade vinet uttryckt i mg/l blir:100 × >NUM>h/>DEN>H × >NUM>1/>DEN>idär>Plats för tabell>Anmärkning: Halten av sorbinsyra kan bestämmas på samma sätt på grundval av bestämningar av ytorna under respektive toppar.4. SPÅRNING AV SORBINSYRA MED TUNNSKIKTSKROMATOGRAFI4.1 Reagenser4.1.1. Etyleter (C2H5)2O.4.1.2. Vattenhaltig svavelsyralösning, H2SO4 (ñ20 = 1,84 g/ml),spädd 1:3 (v/v).4.1.3. Referenslösning av sorbinsyra i en blandning av etanol och vatten, ca 10 %, innehållande 20 mg/l.4.1.4. Mobil fas: hexan-pentan-ättiksyra (20:20:3)(C6H14 - C5H12 - CH3COOH, ñ20 = 1,05 g/ml).4.2 Apparatur4.2.1. Plattor för tunnskiktskromatografi, 20 × 20 cm, täckta med polyamidgel (tjocklek: 0,15 mm), med tillsats av fluorescensindikator.4.2.2. Kuvett för tunnskiktskromatografi.4.2.3. Mikropipett eller mikrospruta för insprutning av volymer på 5 ìl med ± 0,1 ìl noggrannhet.4.2.4. Ultraviolett lampa (254 nm).4.3. Metod4.3.1 Beredning av provetHäll 10 ml vin i ett provrör av glas, ca 25 ml, med en propp av slipat glas. Tillsätt 1 ml spädd svavelsyra (4.1.2) och 5 ml etyleter (4.1.1). Blanda genom att vända röret flera gånger. Låt sedimentera.4.3.2 Beredning av spädda referenslösningarBered fem spädda referenslösningar från lösningen i 4.1.3 med en sorbinsyrahalt av 2, 4, 6, 8 respektive 10 mg per liter.4.3.3. KromatografiAnvänd en mikrospruta eller mikropipett för att anbringa 5 ìl av eterfasen som framställts enligt 4.3.1 och 5 ìl av var och en av de spädda referenslösningarna (4.3.2) 2 cm från plattans nedre kant och med 2 cm avstånd från varandra.Häll den mobila fasen (4.1.4) i kromatografikärlet i en höjd av ca 0,5 cm och låt atmosfären i kärlet bli mättad med ångor från lösningen. Placera plattan i kärlet. Låt kromatogrammet framkallas över 12 15 cm (framkallningstid ca 30 min.). Torka plattan i en ström av kall luft. Undersök kromatogrammet under en ultraviolett lampa med 254 nm våglängd.Sorbinsyran framträder som mörkvioletta fläckar mot den gula fluorescerande bakgrunden på plattan.4.4 Redovisning av resultatenGenom att jämföra intensiteten hos fläckarna i analysprovet respektive referenslösningarna är det möjligt att göra en semikvantitativ bedömning av halten av sorbinsyra mellan 2 och 10 mg per liter. En halt av 1 mg/l kan bestämmas genom avsättning av 10 ìl av den provlösning som skall analyseras.Halter över 10 mg/l kan bestämmas genom avsättning av mindre än 5 ìl av provlösningen (uppmäts med hjälp av mikrospruta).23. L-ASKORBINSYRA 1. PRINCIP FÖR METODERNADe här föreslagna metoderna möjliggör bestämning av L-askorbinsyra och dehydroaskorbinsyra i vin eller must.1.1. Referensmetod (fluorimetri)L-askorbinsyran oxideras med aktivt kol till dehydroaskorbinsyra. Den senare bildar en fluorescerande förening genom reaktion med ortofenylendiamin (OPDA). Med hjälp av ett referensprov i närvaro av borsyra kan eventuell falsk fluorescens bestämmas (genom att borsyra/dehydroaskorbinsyrakomplex bildas). Den fluorimetriska bestämningen kan göras utifrån föregående bestämning.1.2 Rutinmetod (kolorimetri)L-askorbinsyra oxideras med jod till dehydroaskorbinsyra som därefter fälls ut med 2,4-dinitrofenylhydrazin som ger bis-(2,4-dinitrofenylhydrazon). Efter separering med tunnskiktskromatografi och lösning i ättiksyra medium bestäms det rödfärgade derivatet med spektrofotometri vid 500 nm.2. REFERENSMETOD (fluorimetrisk metod)2.1. Reagenser2.1.1. Ortofenylendiamin-dihydrokloridlösning (C6H10Cl2N2), 0,02 g per 100 ml, som bereds omedelbart före användning.2.1.2. Natriumacetat-tri-hydratlösning (CH3COONa. 3H2O), 500 g/l.2.1.3. Blandad lösning av borsyra och natriumacetat:Lös 3 g borsyra, H3BO3, i 100 ml natriumacetatlösning (2.1.2). Denna lösning ska beredas omedelbart före användning.2.1.4. Lösning av isättika, CH3COOH (ñ20 = 1,05 g/ml), spädd till 56 % (v/v) med pH nära 1,2.2.1.5. Referenslösning av L-askorbinsyra, 1 g/l:Omedelbart före användningen löses 50 mg L-askorbinsyra, C6H8O6, efter att ha torkats i en exsickator som är skyddad mot ljus, i 50 ml ättiksyralösning (2.1.4).2.1.6. Aktivt kol p. a.(11)Häll 100 g aktivt kol i en 2 l konisk kolv och tillsätt 500 ml 10 % (v/v) saltsyra (HCl) (ñ20 = 1,19 g/ml). Låt koka upp och filtrera genom ett filter av sintrat glas med porositet 3. Samla upp det behandlade kolet i en 2 l konisk kolv, tillsätt 1 liter vatten, skaka om och filtrera genom ett filter av sintrat glas med porositet 3. Upprepa detta förfarande ytterligare två gånger. Placera återstoden i ett torkskåp som ställts in på 115 ± 5 °C i 12 timmar (över natten).2.2 Apparatur2.2.1. Fluorimeter. Använd en spektrofluorimeter med en lampa som ger ett kontinuerligt spektrum genom att den används på lägsta effekt. Optimala excitations- och emissionsvåglängder för provet bestäms i förväg och beror på vilken utrustning som används. Som vägledning skall excitationsvåglängden vara ca 350 nm och emissionsvåglängden ca 430 nm.Kuvetter med 1 cm optisk väglängd.2.2.2. Filter av sintrat glas, porositet 3.2.2.3. Provrör (diameter ca 10 mm).2.2.4. Stavar för omrörning i provrören.2.3 Metod2.3.1 Beredning av vin- eller mustprovTa något vin eller must och späd till 100 ml i en mätkolv med 56 % ättiksyralösning (2.1.4) för att erhålla en lösning med en halt av L-askorbinsyra mellan 0 och 60 mg/l. Homogenisera innehållet i kolven genom att röra om. Tillsätt 2 g aktivt kol (2.1.6) och låt stå i 15 minuter. Rör om emellanåt. Filtrera genom vanligt filterpapper och kassera de första millilitrarna av filtratet.Häll 5 ml av filtratet i två 100 ml mätkolvar. I den första kolven hälls 5 ml av den blandade lösningen av borsyra och natriumacetatlösning (2.1.3) (nollprov) och i den andra kolven hälls 5 ml av natriumacetatlösningen (2.1.2) (analysprov). Låt stå i 15 minuter och rör om emellanåt. Fyll upp till 100 ml med destillerat vatten.Ta 2 ml från innehållet i vardera kolven och tillsätt 5 ml ortofenylendiaminlösning (2.1.1). Rör om och låt reaktionen fortsätta i 30 minuter till dess att lösningen mörknar och utför därefter den spektrofluorimetriska bestämningen.2.3.2 Beredning av kalibreringskurvanHäll 2, 4 respektive 6 ml av referenslösningen av L-askorbinsyra (2.1.5) i tre 100 ml mätkolvar. Fyll upp till 100 ml med ättiksyralösning (2.1.4) och homogenisera genom omrörning. De referenslösningar som bereds på detta sätt innehåller 2, 4 respektive 6 mg/100 ml.Tillsätt 2 g aktivt kol (2.1.6) till vardera av kolvarna och låt stå i 15 minuter. Rör om emellanåt. Filtrera genom vanligt filterpapper och kassera de första millilitrarna. Häll 5 ml av det filtrat som samlats upp i tre 100 ml mätkolvar (serie 1). Upprepa förfarandet med en andra serie om tre mätkolvar. Tillsätt 5 ml av den blandade lösningen av borsyra och natriumacetat (2.1.3) till kolvarna i serie 1 (motsvarande nollprovet) och 5 ml natriumacetatlösning (2.1.2) till kolvarna i serie 2.Låt stå i 15 minuter och rör om emellanåt. Fyll upp till 100 ml med destillerat vatten. Ta 2 ml av innehållet i vardera kolven och tillsätt 5 ml ortofenylendiaminlösning (2.1.1.). Rör om och låt reaktionen fortsätta i 30 minuter till dess att lösningen mörknar och utför därefter den spektrofluorimetriska bestämningen.2.3.3 Fluorimetrisk bestämningNollställ mätskalan för de olika lösningarna på kalibreringskurvan och för den lösning som skall bestämmas med hjälp av motsvarande nollprov. Bestäm därefter fluorescensens intensitet för respektive lösning från kalibreringskalan för den lösning som skall bestämmas.Rita kalibreringskurvan, som skall vara en rak linje som skär genom nollpunkten. Sök värdet som svarar mot bestämningen på denna linje och bestäm koncentrationen C av L-askorbinsyra + dehydroaskorbinsyra i analyslösningen med ledning av denna.2.3.4 Redovisning av resultatenHalten av L-askorbinsyra och dehydroaskorbinsyra i vinet i mg/l blir:C × F,där F är spädningsfaktorn.3. RUTINMETOD (kolorimetrisk metod)3.1 Reagenser3.1.1. Metafosforsyralösning, 30 % (w/v):Ta 30 g metafosforsyra (HPO3)n, som först krossats i en mortel. Skölj snabbt genom att hälla den i destillerat vatten och röra om. Lös den tvättade syran i destillerat vatten genom att skaka den i en 100 ml mätkolv och fyll upp till referensmärket. Den lösning som erhålls innehåller ca 30 % (w/v) metafosforsyra.3.1.2. 3 % (w/v) metafosforsyralösning som har beretts omedelbart före användning genom spädning 1:10 med destillerat vatten av den lösning som framställts enligt 3.1.1.3.1.3. 1 % (w/v) metafosforsyralösning som har beretts omedelbart före användning genom spädning 1:30 med destillerat vatten av den lösning som framställts enligt 3.1.1.3.1.4. Polyamidsuspension:Slamma upp 10 g polyamid för kromatografi i 60 ml destillerat vatten. Låt stå i två timmar. Den beredda kvantiteten räcker till fyra bestämningar.3.1.5. Tiourinämne (H2NCSNH2).3.1.6. Jodlösning, I2, 0,05 M.3.1.7. Lösning av 2,4-dinitrofenylhydrazin, 6 % (w/v). Slamma upp 6 g 2,4-dinitrofenylhydrazin, (C6H6N4O4) i 50 ml isättika (ñ20 = 1,05 g/ml) och tillsätt 50 ml svavelsyra (ñ20 = 1,84 g/ml). 2,4-dinitrofenylhydrazinet löses genom omrörning.3.1.8. Etylacetat (C4H802) med tillsats av 2 % (v/v) isättika (3.1.12).3.1.9. Kloroform (CHCl3).3.1.10. Vattenhaltig stärkelselösning, 0,5 % (w/v).3.1.11. Mobil fas:>Plats för tabell>Låt blandningen stå orörd i 12 timmar före användning.3.1.12. Isättika, CH3COOH (ñ20 = 1,05 g/ml).3.1.13. L-askorbinsyralösning, 0,1 g per 100 ml, av 1 % metafosforsyralösning (3.1.3).3.2 Apparatur3.2.1. Laboratoriecentrifug med 50 ml centrifugrör med proppar av slipat glas.3.2.2. Kallt vattenbad som regleras termostatiskt till 5 10 °C.3.2.3. Termostatiskt reglerat vattenbad med en temperatur av 20 °C.3.2.4. Plattor för tunnskiktskromatografi, 20 × 20 cm, täckta med silicagel G (tjocklek: 0,25 eller 0,3 mm).3.2.5. Kromatografikärl.3.2.6. Mikropipett för volymer på 0,2 ml.3.2.7. Spektrofotometer för absorbansbestämning vid 500 nm med kuvetter med 1 cm optisk väglängd.3.3 Metod3.3.1 Oxidering av L-askorbinsyra till dehydroaskorbinsyraHäll 50 ml av vinet i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 15 ml polyamidsuspension (3.1.4) och fyll upp till märket med 3 % metafosforsyralösning (3.1.2). Låt stå i en timme och skaka om ofta. Filtrera genom ett veckfilter. Samla upp 20 ml av filtratet i ett centrifugrör och tillsätt 1 ml 0,05 M jodlösning (3.1.6). Homogenisera genom att skaka om det tillproppade centrifugröret och reducera överskottet av jod efter en minut genom att tillsätta ca 25 mg tiourinämne.3.3.2 Bildning och extraktion av bis(2,4-dinitrofenylhydrazon)derivat av diketogulonsyraPlacera röret i ett vattenbad som hålls mellan 5 och 10 °C. Tillsätt 4 ml av 2,4-dinitrofenylhydrazinlösningen (3.1.7). Blanda innehållet försiktigt och undvik att väta glasproppen. Tillslut röret helt och placera i ett vattenbad vid 20 °C i ca 16 timmar (över natten).Häll 15 ml etylacetat (3.1.8) i centrifugröret. Tillslut röret med proppen av slipat glas och skaka om kraftigt i 30 sekunder. Centrifugera i 5 minuter vid en centrifugalkraft av 350 400 g. Pipettera 10 ml av etylacetatextraktet i en konisk kolv med en propp av slipat glas. Ta ur proppen och tillsätt ytterligare 5 ml etylacetat (3.1.8) till centrifugröret, skaka om igen i 30 sekunder och centrifugera i 5 minuter vid samma hastighet. Pipettera 5 ml av etylacetatextraktet i den koniska kolven som innehåller 10 ml från den första extraktionen. Blanda.3.3.3 Separation av bis(2,4-dinitrofenylhydrazon) med kromatografi. Utförs inom två timmar efter extraktion (3.3.2).Anbringa 0,2 ml av etylacetatextraktet längs hela den startlinje som är placerad 2 cm från plattans kant, vilket ger en 2 cm marginal längs plattans sidor. Häll den mobila fasen (3.1.11) i kromotografikärlet till ett djup av 1 cm och låt atmosfären bli mättad av ångor från lösningsmedlet. Sätt i plattan och låt lösningsmedlet vandra till plattans övre kant. Torka plattan i 1 timme under en ventilerad huv. Håll plattan vertikalt över ett ark glanspapper och skrapa av rödfärgningen (karakteristisk för 2,4-dinitrofenylhydrazon) med en spatel (vinkelrätt mot vandringsriktningen). Överför det pulver som erhålls utan att något går förlorat till en konisk kolv med en propp av slipat glas och tillsätt 4 ml ättiksyra (3.1.12). Låt stå i 30 minuter och rör om ofta. Filtrera genom ett veckfilter direkt i en spektrofotometerkuvett (3.2.7). Det erhållna filtratet måste vara helt klart. Bestäm absorbansen för denna lösning vid 500 nm med ättiksyra (3.1.12) i referenskuvetten för att erhålla ett nollvärde för bestämningarna.3.3.4 Beredning av kalibreringskurvaHäll 5, 10 respektive 15 ml av L-askorbinsyralösningen (3.1.13) i tre 100 ml mätkolvar och fyll upp till märket med den 1-procentiga metafosforsyralösningen (3.1.3). De lösningar som erhålls har askorbinsyrahalter av 50, 100 respektive 150 mg/l.Behandla lösningarna enligt den metod som beskrivs i 3.3.1, 3.3.2 och 3.3.3. Rita kalibreringskurvan, som bör vara en rak linje som skär genom nollpunkten.3.3.5 Redovisning av resultatenHalten av L-askorbinsyra + dehydroaskorbinsyra i vinet uttrycks i milligram per liter.3.3.5.1. BeräkningSök värdet för absorbansen som bestämts i 3.3.3 på den raka kalibreringskurvan och bestäm därigenom halten av L-askorbinsyra + dehydroaskorbinsyra i den lösning som skall analyseras.Anmärkning: Om halten av L-askorbinsyra + dehydroaskorbinsyra är större än 150 mg/l minskas analysprovets volym till 25, 20 respektive 10 ml vin och det erhållna resultatet multipliceras med spädningsfaktorn F.24. pH 1. PRINCIPPotentialskillnaden mellan två elektroder som är nedsänkta i provvätskan bestäms. En av dessa två elektroder har en potential som är en funktion av vätskans pH, medan den andra har en fast och känd potential och utgör referenselektroden.2. APPARATUR2.1. pH-mätare med en skala i pH-enheter som tillåter bestämning med en noggrannhet av minst ± 0,05 pH-enheter.2.2. Elektroder:2.2.1. Glaselektrod som förvaras i destillerat vatten.2.2.2. Kalomelmättad referenselektrod med kaliumklorid, som förvaras i en mättad lösning av kaliumklorid.2.2.3. Alternativt används en kombinerad elektrod som förvaras i destillerat vatten.3. REAGENSER3.1. Buffertlösningar:3.1.1. Mättad lösning av kaliumvätetartrat, innehållande minst 5,7 g kaliumvätetartrat/l (C4H5KO6) vid 20 °C. (Denna lösning kan förvaras i minst 2 månader genom tillsats av 0,1 g tymol/200 ml.)>Plats för tabell>3.1.2. Lösning av kaliumväteftalat, 0,05 M, innehållande 10,211 g kaliumväteftalat (C8H5KO4) per liter vid 20 °C. (Hållbar i högst 2 månader).>Plats för tabell>3.1.3. Lösning innehållande:>Plats för tabell>(Hållbar i högst 2 månader)>Plats för tabell>Anmärkning: Referensbuffertlösningar som finns i handeln kan också användas.4. METOD4.1 Beredning av analysprov4.1.1. För must och vinAnvänd musten eller vinet direkt.4.1.2. För renad koncentrerad mustSpäd den renade koncentrerade musten med vatten till en koncentration av 25 ± 0,5 % (w/w) av den totala sockerhalten (25 °Brix).Om P är halten i procent (w/w) av totala sockermängden i den renade koncentrerade musten, väg en massa av>NUM>2 500/>DEN>Poch fyll upp till 100 g med vatten. Vattnet skall ha en konduktivitet under 2 mikrosiemens/cm.4.2 Nollställning av apparaturenApparaturen nollställs innan några bestämningar görs enligt de anvisningar som medföljer.4.3 Kalibrering av pH-mätareKalibrera pH-mätaren vid 20 °C med hjälp av buffertlösningar med pH 6,88 och 3,57 vid 20 °C.Använd buffertlösningen med pH 4,00 vid 20 °C för att kontrollera kalibreringen av skalan.4.4 BestämningDoppa ner elektroden i det prov som skall analyseras, vilket skall ha en temperatur mellan 20 och 25 °C och ligga så nära 20 °C som möjligt. Läs av pH-värdet direkt på skalan.Utför minst två bestämningar på samma prov.Slutresultatet erhålls genom att man tar det aritmetiska medelvärdet av två bestämningar.5. REDOVISNING AV RESULTATENpH-värdet för musten, vinet eller den 25-procentiga (w/w) (25 °Brix) lösningen av renad koncentrerad must anges med två decimaler.25. SVAVELDIOXID 1. DEFINITIONERFri svaveldioxid definieras som den svaveldioxid som finns i must eller vin i följande former: H2SO3 och HSO3-. Jämvikten mellan dessa båda former är en funktion av pH och temperaturen:H2SO3>Start Grafik>>Slut Grafik>H+ + HSO3-H2SO3 betecknar svaveldioxid i molekylär form.Den totala svaveldioxiden definieras som totalhalten av samtliga former av svaveldioxid i vinet, antingen i fri form eller i förening med andra beståndsdelar.2. FRI SVAVELDIOXID OCH TOTAL SVAVELDIOXID2.1 Princip2.1.1 Referensmetod2.1.1.1. Vin och mustSvaveldioxiden överförs med en luft- eller kvävgasström. Den binds och oxideras genom att bubblas genom en spädd och neutral väteperoxidlösning. Den svavelsyra som bildas bestäms genom titrering med en standardlösning av natriumhydroxid. Fri svaveldioxid avlägsnas från vinet vid låg temperatur (10 °C).Den totala svaveldioxiden avlägsnas från vinet vid hög temperatur (ca 100 °C).2.1.1.2. Renad koncentrerad mustDen totala svaveldioxiden extraheras från den i förväg spädda renade koncentrerade musten vid hög temperatur (ca 100 °C).2.1.2 Snabb bestämningsmetod (för vin och must)Fri svaveldioxid bestäms genom direkt jodometrisk titrering.Bunden svaveldioxid bestäms därefter genom jodometrisk titrering efter alkalisk hydrolys. När den bundna svaveldioxiden tillsätts den fria svaveldioxiden erhålls den totala svaveldioxidhalten.2.2 Referensmetod2.2.1 Apparatur2.2.1.1. Den apparatur som används skall överensstämma med figuren nedan, i synnerhet vad gäller kylaren.>Hänvisning till >Figur 1Måtten anges i mm. De fyra glasrör som utgör kylaren har eninnerdiameter av 45, 34, 27 resp. 10 mm.Röret för gastillförsel till bubbelflaskan B avslutas med en liten kula med diametern 1 cm som på sin största horisontella omkrets har 20 hål med diametern 0,2 mm. Alternativt kan röret avslutas med en platta av sintrat glas som ger ett stort antal mycket små bubblor vilket ger god kontakt mellan vätske- och gasfaserna.Gasflödet genom apparaturen bör vara ca 40 l/h. Med flaskan till höger i figuren minskas det undertryck som vattenpumpen åstadkommer till 20 30 cm vatten. För att reglera detta undertryck så att ett korrekt värde erhålls installeras en flödesmätare med semikapillärt rör mellan bubbelflaskan och flaskan.2.2.1.2. Mikrobyrett.2.2.2 Reagenser2.2.2.1. Fosforsyra, 85 % (H3PO4)(ñ20 = 1,71 g/ml).2.2.2.2. Väteperoxidlösning, 9,1 g H2O2/l (3 volymer).2.2.2.3. Indikatorreagens:>Plats för tabell>2.2.2.4. Natriumhydroxidlösning, NaOH, 0,01 M.2.2.3 Metod2.2.3.1. Bestämning av fri svaveldioxidVinet skall förvaras i en fylld och tillsluten flaska vid 20 °C i 2 dagar före bestämning.- Häll 2 3 ml väteperoxidlösning (2.2.2.2) och 2 droppar indikatorreagens i bubbelflaskan B och neutralisera väteperoxidlösningen med 0,01 M natriumhydroxidlösning (2.2.2.4). Anslut bubbelflaskan till apparaturen.- Häll i 50 ml av provet och 15 ml fosforsyra (2.2.2.1) i kolven A (som rymmer 250 ml) i apparaten. Kolven sätts på plats i apparaten.Bubbla luft (eller kvävgas) genom bubbelflaskan i 15 minuter. Den fria svaveldioxid som överförs oxideras till svavelsyra. Avlägsna bubbelflaskan från apparaten och titrera den syra som har bildats med 0,01 M natriumhydroxidlösning (2.2.2.4). Den använda volymen betecknas n ml.2.2.3.2. Redovisning av resultatenDen fria svaveldioxiden uttrycks i mg/l till närmaste heltal.2.2.3.2.1. BeräkningDen fria svaveldioxiden i mg/l är 6,4 n.2.2.3.3. Bestämning av den totala svaveldioxidhalten2.2.3.3.1. För renad koncentrerad must används den lösning som erhålls genom spädning av analysprovet till 40 % (w/v), såsom anges i kapitlet "Total syrahalt", punkt 5.1.2. Häll 50 ml av denna lösning och 5 ml fosforsyra (2.2.2.1) i kolv A (250 ml) i apparaten. Montera kolven i apparaten.2.2.3.3.2. Vin och mustOm det beräknade innehållet i provet inte överstiger totalt 50 mg svaveldioxid per liter, hälls 50 ml av provet och 15 ml fosforsyra (2.2.2.1) i kolven A (250 ml) i apparaten. Sätt kolven på plats i apparaten.T. o. m. den 31 december 1992 skall dock 5 ml av en 25 % lösning (w/v) av fosforsyra (2.2.2.1) användas för analys av svaveldioxidhalten i druvsaft.2.2.3.3.3. Om det beräknade innehållet i provet överstiger totalt 50 mg SO2/l hälls 20 ml av provet och 5 ml fosforsyra (2.2.2.1) i kolven A (100 ml) i apparaten. Sätt kolven på plats i apparaten.Häll 2-3 ml väteperoxidlösning (2.2.2.2) i bubbelflaskan B, som neutraliserats på samma sätt som tidigare, och låt vinet i kolv A koka upp över en liten låga (ca 4 5 cm hög) som når upp till kolvens botten. Ställ inte kolven på en metallplatta, utan på en skiva med ett hål med ca 30 mm diameter för att undvika överhettning av substanser som extraheras från vinet och som avsätts på kolvens väggar.Låt koka medan en luft- eller kvävgasström förs igenom. Inom 15 minuter har den totala svaveldioxidhalten överförts och oxiderats. Bestäm den svavelsyra som har bildats genom titrering med 0,01 M natriumhydroxidlösning (2.2.2.4).Den använda volymen betecknas n ml.2.2.3.4. Redovisning av resultatenMust och vin: den totala svaveldioxidhalten anges i mg/l. Renad koncentrerad must: den totala svaveldioxidhalten anges i mg/kg av totala sockermängden.2.2.3.4.1. Beräkning- Vin och mustDen totala svaveldioxidhalten i mg/l.- prov med låg svaveldioxidhalt (50 ml analysprov):6,4 × n- andra prov (20 ml analysprov):16 × n- Renad koncentrerad mustDen totala svaveldioxidhalten i mg/kg av den totala sockermängden (50 ml berett analysprov) (2.2.3.3.1):>NUM>1600 ×/>DEN>n;PP = den totala sockerhalten (w/w) i procent2.2.3.4.2. Repeterbarhet (r)>Plats för tabell>2.2.3.4.3. Reproducerbarhet (r)>Plats för tabell>2.3 Snabbmetod för bestämning2.3.1 Reagenser2.3.1.1. EDTA (Complexone III:) dinatriumsalt av etendiamin-tetraättiksyra (C10H14N2O8NA2, 2H2O).2.3.1.2. Natriumhydroxidlösning, NaOH, 4 M (160 g/l).2.3.1.3. Svavelsyra, H2SO4 (ñ20 = 1,84 g/ml) (1:10 v/v).2.3.1.4. Stärkelselösning, 5 g/l:Blanda 5 g stärkelse med ca 500 ml vatten. Låt koka upp under omrörning och koka i 10 minuter. Tillsätt 200 g natriumklorid (NaCl). Fyll upp till 1 l efter kylning.2.3.1.5. 0,025 M jodlösning, I2.2.3.2 Apparatur2.3.2.1. 500 ml koniska kolvar.2.3.2.2. Byrett.2.3.2.3. 1, 2, 5 resp. 50 ml pipetter.2.3.3 Metod2.3.3.1. Fri svaveldioxidHäll i en 500 ml konisk kolv:- 50 ml vin,- 5 ml stärkelselösning (2.3.1.4),- 30 mg EDTA (2.3.1.1),- 3 ml H2SO4, 1:10 (v/v) (2.3.1.3).Titrera omedelbart med 0,025 M jod (2.3.1.5) till dess att en klar blåfärgning uppträder under 10 15 sekunder. Den använda volymen jod betecknas n ml.2.3.3.2. SvaveldioxidTillsätt 8 ml 4 M natriumhydroxidlösning (2.3.1.2), skaka blandningen en gång och låt stå i 5 minuter. Tillsätt under kraftig omrörning hela innehållet i en liten bägare med 10 ml svavelsyra, 1:10 v/v (2.3.1.3). Titrera omedelbart med 0,025 M jod (2.3.1.5). Den använda volymen betecknas n' ml.Tillsätt 20 ml 4 M natriumhydroxidlösning (2.3.1.2). Skaka om en gång och låt stå i 5 minuter. Späd med 200 ml iskallt vatten.Tillsätt under kraftig omrörning hela innehållet i ett provrör innehållande 30 ml svavelsyra, 1:10 (v/v) (2.3.1.3). Titrera den fria svaveldioxiden omedelbart med 0,025 M jod (2.3.1.5). Den använda volymen betecknas n" ml.2.3.4 Redovisning av resultaten2.3.4.1. Beräkning:Fri svaveldioxid i mg/l: 32 n.Den totala svaveldioxidhalten i mg/l: 32 (n + n' + n").Anmärkning:1. För rödvin med en låg halt av SO2 bör jod som är mer utspätt än 0,025 M (t. ex. 0,01 M) användas. Byt då ut koefficienten 32 mot 12,8 i formlerna ovan.2. Rödvin bör belysas underifrån med en stråle av gult ljus från en vanlig elektrisk glödlampa som får lysa genom en lösning av kaliumkromat, eller från en natriumlampa. Bestämningen skall utföras i ett mörkt rum och vinets transparens noteras. Vinet blir ogenomskinligt när slutpunkten nås.3. Om mängden svaveldioxid ligger nära eller överskrider det tillåtna gränsvärdet, skall den totala svaveldioxidhalten bestämmas med referensmetoden.4. Om en särskild bestämning av fri svaveldioxid krävs, utförs analysen på ett prov som före analys förvaras under anaeroba förhållanden i 2 dagar vid 20 °C. Utför bestämningen vid 20 °C.5. Eftersom vissa substanser oxideras av jod i ett surt medium skall den mängd jod som används på detta sätt fastställas för mer exakta bestämningar. Den fria svaveldioxiden kombineras då med överskottet av etanal eller propanal innan jodtitreringen utförs. Tillsätt 5 ml 7 g/l etanollösning (C2H4O) eller 5 ml av en 10 g/l propanallösning (C3H6O) till 50 ml vin i en 300 ml konisk kolv.Sätt en propp i kolven och låt stå i minst 30 minuter. Tillsätt 3 ml svavelsyra, 1:10 v/v (2.3.1.3), och tillräckligt med 0,025 M jod (2.3.1.5) för att stärkelsen skall ändra färg. Den använda volymen jod betecknas n'''. Denna skall dras ifrån n (fri svaveldioxid) och n + n' + n" (den totala svaveldioxidhalten).n är oftast ett lågt värde, mellan 0,2 och 0,3 ml 0,025 M jod. Om askorbinsyra har tillsatts vinet, blir n mycket högre och det är möjligt att åtminstone ungefärligt bestämma mängden av denna substans utifrån värdet för n, eftersom 1 ml 0,025 M jod oxiderar 4,4 mg askorbinsyra. Bestämning av n''' gör det ganska lätt att upptäcka förekomsten av restaskorbinsyra i större mängder än 20 mg/l i vin till vilka sådan syra har tillsatts.3. MOLEKYLÄR SVAVELDIOXID3.1 PrincipMängden molekylär svaveldioxid, H2SO3, i procent i fri svaveldioxid beräknas som en funktion av pH, alkoholhalten och temperaturen.För en given temperatur och alkoholhalt:H2SO3>Start Grafik>>Slut Grafik>H+ + HSO3-[H2SO3] = >NUM>L/>DEN>10(pH × pkM) + 1(1)med pKM = pKT - >NUM>AI/>DEN>1 + BIL = [H2SO3] + [HCO3-]därI = jonstyrkan,A och B = koefficienter som varierar med temperaturen och alkoholhalten,KT = den termodynamiska dissociationskonstanten. Värden för pKT anges i tabell 1 för olika alkoholhalter och temperaturer,KM = den blandade dissociationskonstanten.Vid ett medelvärde av 0,038 för jonstyrkan I ger tabell 2 värden för pKM vid olika temperaturer och alkoholhalter.Halten av molekylär svaveldioxid, beräknat med hjälp av formel (1), anges i tabell 3 vid olika värden för pH, temperatur och alkoholhalt.3.2 BeräkningNär vinets pH-värde och alkoholhalt är kända kan halten i procent av molekylär svaveldioxid sökas i tabell 3 för en temperatur t °C. Detta värde betecknas X%.Halten av molekylär svaveldioxid i mg/l är:X × Cdär C = halt av fri svaveldioxid i mg/l.TABELL 1 >Start Grafik>Värden för den termodynamiska dissociationskonstanten pKT>Slut Grafik>>Hänvisning till >TABELL 2 >Start Grafik>Värden för den blandade dissociatonskonstanten pKM (I = 0,038)>Slut Grafik>>Hänvisning till >TABELL 3 >Start Grafik>Molekylär svaveldioxid i procent av fri svaveldioxid>Slut Grafik>>Hänvisning till >TABELL 3 (forts.) >Start Grafik>Molekylär svaveldioxid i procent av fri svaveldioxid>Slut Grafik>>Hänvisning till >26. NATRIUM 1. PRINCIPER FÖR METODERNA1.1 Referensmetod: atomabsorptionsspektrofotometriNatrium bestäms direkt i vinet genom atomabsorptionsspektrofotometri efter tillsats av en joniseringsdämpande reagens (cesiumklorid) som förhindrar jonisering av natrium.1.2 Rutinmetod: flamfotometriNatrium bestäms direkt i utspätt vin (minst 1:10) med flamfotometri.2. REFERENSMETOD2.1 Reagenser2.1.1 Lösning innehållande 1 g natrium/lAnvänd en standardlösning som finns i handeln med en halt av 1 g natrium/l. Denna lösning kan beredas genom att 2,542 g vattenfri natriumklorid, NaCl, löses i destillerat vatten och späds till en volym av 1 l.Förvara denna lösning i en flaska av polyeten.2.1.2 Modellösning>Plats för tabell>2.1.3 Cesiumkloridlösning innehållande 5 % cesiumLös 6,330 g cesiumklorid, CsCl, i 100 ml destillerat vatten.2.2 Apparatur2.2.1. Atomabsorptionsspektrofotometer med luftacetylenbrännare.2.2.2. Natriumhålkatodlampa.2.3 Metod2.3.1 Beredning av provetSug upp 2,5 ml vin med pipett i en 50 ml mätkolv. Tillsätt 1 ml cesiumkloridlösning (2.1.3) och fyll upp till märket med destillerat vatten.2.3.2 KalibreringHäll 5,0 ml av modellösningen i var och en av en serie 100 ml mätkolvar och tillsätt 0; 2,5; 5,0; 7,5 resp. 10 ml av 1 g/l natriumlösning (2.1.1) som har spätts i förväg till 1:100. Tillsätt 2 ml cesiumkloridlösning (2.1.3) till respektive kolv och fyll upp till 100 ml med destillerat vatten.De standardlösningar som bereds på detta sätt innehåller 0; 0,25; 0,50; 0,75 resp. 1,0 mg natrium/l och var och en innehåller ett gram cesium per liter. Förvara lösningarna i flaskor av polyeten.2.3.3 BestämningStäll in våglängden på 589,0 nm. Nollställ absorbansskalan med den modellösning som innehåller 1 g cesium per liter (2.3.2). Sug upp det utspädda vinet direkt i spektrofotometerns brännare och därefter de olika standardlösningarna (2.3.2). Läs av absorbansvärdena. Upprepa varje bestämning.2.4 Redovisning av resultaten2.4.1 BeräkningsmetodRita en kurva som visar absorbansen som en funktion av natriumhalten i standardlösningarna.Notera den absorbans som erhålls med det utspädda vinet och bestäm dess natriumhalt C i mg/l.Natriumhalten i mg/l i vinet blir då 20 × C, utan decimaler.2.4.2 Repeterbarhet (r)>Plats för tabell>2.4.3 Reproducerbarhet (R)>Plats för tabell>3. Rutinmetod3.1 Reagenser3.1.1 Referenslösning innehållande 20 mg natrium per liter>Plats för tabell>3.1.2 Lösning för spädning>Plats för tabell>Lösningarna 3.1.1 och 3.1.2 bereds genom att kaliumvätetartrat löses i ca 500 ml mycket hett destillerat vatten och blandas med 400 ml destillerat vatten, i vilket övriga kemikalier redan har lösts. Fyll upp till 1 liter.Förvara lösningarna i flaskor av polyeten med en tillsats av 2 droppar allylisotiocyanat.3.2 Apparatur3.2.1. Flamfotometer som tillförs en blandning av luft och butan.3.3 Metod3.3.1 KalibreringHäll 5, 10, 15, 20 resp. 25 ml av referenslösningen (3.1.1) i 100 ml mätkolvar och fyll upp till 100 ml med lösningen för spädning (3.1.2). På detta sätt erhålls lösningar med 1, 2, 3, 4 resp. 5 mg natrium per liter.3.3.2 BestämningUtför bestämningen vid 589,0 nm. Justera till 100 % transmission med destillerat vatten. Sug upp standardlösningarna successivt (3.3.1) direkt i fotometerns brännare och därefter vin som är spätt 1:10 med destillerat vatten och läs av transmissionen i procent. Vid behov kan det redan spädda vinet 1:10 spädas ytterligare med lösningen för spädning (3.1.2).3.4 Redovisning av resultaten3.4.1 BeräkningsmetodRita en kurva som visar transmissionens variation i procent med halten av natrium i standardlösningarna. Anteckna den transmission som kurvan visar för provet med utspätt vin och läs av den motsvarande natriumkoncentration C.Natriumkoncentration i mg/l blir då F × C,där F är spädningsfaktorn.3.4.2 Repeterbarhet (r)>Plats för tabell>3.4.3 Reproducerbarhet (R)>Plats för tabell>27. KALIUM 1. PRINCIPER FÖR METODERNA1.1 ReferensmetodKalium bestäms direkt i det utspädda vinet med atomabsorptionsspektrofotometri efter tillsats av en joniseringsdämpande substans (cesiumklorid) för att förhindra jonisering av kalium.1.2 RutinmetodKalium bestäms direkt i det utspädda vinet med flamfotometri.2. REFERENSMETOD2.1 Reagenser2.1.1 Lösning innehållande 1 g kalium per literAnvänd en standardlösning som finns i handeln med 1 g kalium per liter. Denna lösning kan beredas genom att 4,813 g kaliumvätetartrat (C4H5KO6) löses i destillerat vatten och späds till en volym av 1 l.2.1.2 Modellösning>Plats för tabell>2.1.3 Cesiumkloridlösning innehållande 5 % cesiumLös 6,330 g cesiumklorid, CsCl, i 100 ml destillerat vatten.2.2 Apparatur2.2.1. Atomabsorptionsspektrofotometer med luftacetylenbrännare.2.2.2. Kaliumhålkatodlampa.2.3. Metod2.3.1 Beredning av provetPipettera 2,5 ml vin (i förväg spätt 1:10) i en 50 ml mätkolv. Tillsätt 1 ml cesiumkloridlösning (2.1.3) och fyll upp till märket med destillerat vatten.2.3.2 KalibreringHäll 5,0 ml av modellösningen (2.1.2) i var och en av en serie 100 ml mätkolvar och tillsätt 0; 2,0; 4,0; 6,0 resp. 8,0 ml av 1 g/l kaliumlösning (2.1.1) som har spätts i förväg till 1:10. Tillsätt 2 ml cesiumkloridlösning (2.1.3) till respektive kolv och fyll upp till 100 ml med destillerat vatten.De standardlösningar som bereds på detta sätt innehåller 0, 2, 4, 6 resp. 8 mg kalium per liter och var och en innehåller ett gram cesium per liter. Förvara lösningarna i flaskor av polyeten.2.3.3 BestämningStäll in våglängden på 769,9 nm. Nollställ absorbansskalan med den modellösning som innehåller 1 g cesium per liter (2.3.1). Sug upp det utspädda vinet direkt i spektrofotometerns brännare och därefter de olika standardlösningarna (2.3.2). Läs av absorbansvärdena. Upprepa varje bestämning.2.4 Redovisning av resultaten2.4.1 BeräkningsmetodRita en kurva över absorbansvariationen som en funktion av kaliumhalten i standardlösningarna.Notera medelvärdet för absorbansen som erhålls med det spädda vinprovet på denna kurva och bestäm kaliumhalten C i mg/l.Kaliumhalten uttryckt i mg/l i vinet utan decimaler blir då F × C,där F är spädningsfaktorn (här 200).2.4.2 Repeterbarhet (r)r = 35 mg/l.2.4.3 Reproducerbarhet (R)R = 66 mg/l.2.4.4 Andra sätt att redovisa resultatet- I mval/l: 0,0256 × F × C- I mg kaliumvätetartrat/l:4,813 × F × C3. RUTINMETOD: FLAMFOTOMETRI3.1 Reagenser3.1.1 Referenslösning innehållande 100 mg kalium/l>Plats för tabell>Lös kaliumvätetartrat i 500 ml mycket hett destillerat vatten, blanda lösningen med 400 ml destillerat vatten i vilket övriga kemikalier redan har lösts och späd till 1 liter.3.1.2 Lösning för spädning>Plats för tabell>Förvara lösningarna i flaskor av polyeten med tillsats av två droppar allylisotiocyanat.3.2 Apparatur3.2.1. Flamfotometer som tillförs en blandning av luft och butan.3.3 Metod3.3.1 KalibreringHäll 25, 50, 75 resp. 100 ml av referenslösningen (3.1.1) i en serie 100 ml mätkolvar och fyll upp till 100 ml med lösningen för spädning (3.1.2). På detta sätt erhålls lösningar med 25, 50, 75 resp. 100 mg natrium per liter.3.3.2 BestämningUtför bestämningen vid 766 nm. Justera till 100 % transmission med destillerat vatten. Sug upp standardlösningarna successivt (3.3.1) direkt i fotometerns brännare och därefter vin spätt 1:10 med destillerat vatten och läs av transmissionen i procent. Vid behov kan det redan spädda vinet 1:10 spädas ytterligare med lösningen för spädning (3.1.2).3.4 Redovisning av resultaten3.4.1 BeräkningsmetodRita en kurva som visar transmissionens variation i procent med halten av kalium i standardlösningarna. Anteckna den transmission som kurvan visar för provet med utspätt vin och läs av den motsvarande kaliumkoncentrationen C.Kaliumkoncentrationen i mg/l, beräknad till närmaste heltal, blir dåF × Cdär F är spädningsfaktorn.3.4.2 Repeterbarhet (r)r = 17 mg/l.3.4.3 Reproducerbarhet (R)R = 66 mg/l.3.4.4 Andra sätt att redovisa resultatet:- i mval/l: 0,0256 × F × C- i mg kaliumvätetartrat per liter: 4,813 × F × C.28. MAGNESIUM 1. PRINCIP FÖR METODENMagnesium bestäms direkt i vinet, som har spätts på lämpligt sätt, med atomabsorptionsspektrofotometri.2. REAGENSER2.1 Koncentrerad standardlösning innehållande 1 g/l magnesiumAnvänd en standardlösning av magnesium (1 g/l) som finns i handeln. Denna lösning kan beredas genom att 8,3646 g magnesiumklorid (MgCl2, 6H2O) löses i destillerat vatten och späds till 1 liter.2.2 Spädd standardlösning innehållande 5 mg/l magnesium.Anmärkning: Förvara standardmagnesiumlösningen i flaskor av polyeten.3. APPARATUR3.1. Atomabsorptionsspektrofotometer med luftacetylenbrännare.3.2. Magnesiumhålkatodlampa.4. METOD4.1 Beredning av provetSpäd vinet 1:100 med destillerat vatten.4.2 KalibreringHäll 5, 10, 15 resp. 20 ml av den spädda standardmagnesiumlösningen (2.2) i var och en av en serie 100 ml mätkolvar och fyll upp till 100 ml med destillerat vatten. Standardlösningar som bereds på detta sätt innehåller 0,25; 0,50; 0,75 resp. 1,0 mg magnesium per liter. Lösningarna skall förvaras i flaskor av polyeten.4.3 BestämningStäll in våglängden på 285 nm. Nollställ absorbansskalan med destillerat vatten. Sug upp det spädda vinet direkt i spektrofotometerns brännare och därefter de olika standardlösningarna (4.2).Läs av absorbansvärderna. Upprepa bestämningen en gång.5. REDOVISNING AV RESULTATEN5.1 BeräkningsmetodRita en kurva över absorbansvariationen som en funktion av magnesiumhalten i standardlösningarna.Anteckna medelvärdet för den absorbans som kurvan visar för det utspädda vinprovet och läs av den motsvarande magnesiumkoncentrationen C.Magnesiumhalten i mg/l i vinet utan decimaler blir100 × C.5.2 Repeterbarhet (r)r = 3 mg/l.5.3 Reproducerbarhet (R)R = 8 mg/l.29. KALCIUM 1. PRINCIP FÖR METODENKalcium bestäms direkt i vinet, som har spätts på lämpligt sätt, med atomabsorptionsspektrofotometri efter tillsats av en joniseringsdämpande substans.2. REAGENSER2.1 Standardlösning innehållande 1 g/l kalciumAnvänd en standardlösning av kalcium 1 g/l som finns i handeln. Denna lösning kan beredas genom att 2,5 g kalciumkarbonat, CaCO3, löses i en mängd HCl, spädd 1:10 (v/v), som är tillräcklig för att kalciumkarbonatet skall lösas fullständigt. Fyll upp till 1 liter med destillerat vatten.2.2 Spädd standardlösning innehållande 50 mg/l kalciumAnmärkning: Förvara standardlösningar av kalcium i flaskor av polyeten.2.3 Lantankloridlösning innehållande 50 g/l lantanLös 13,369 g lantanklorid, LaCl3, 7H2O, i destillerat vatten. Tillsätt 1 ml HCl, spädd 1:10 (v/v), och fyll upp till 100 ml.3. APPARATUR3.1. Atomabsorptionsspektrofotometer med luftacetylenbrännare.3.2. Kalciumhålkatodlampa.4. METOD4.1 Beredning av provetHäll 1 ml av vinet och 2 ml lantankloridlösning (2.3) i en 20 ml mätkolv och fyll upp till märket med destillerat vatten. Vinet, spätt 1:20, innehåller 5 g lantan/l.Anmärkning: För söta viner är en lantankoncentration på 5 g/l tillräcklig, under förutsättning att spädningen inte innebär att sockerhalten sjunker under 2,5 g/l. För viner med högre sockerhalt bör lantankoncentrationen ökas till 10 g/l.4.2 KalibreringHäll 0, 5, 10, 15 och 20 ml av den spädda standardlösningen av kalcium (2.2) i en serie 100 ml mätkolvar. Tillsätt till vardera kolven 10 ml av lantankloridlösningen (2.3) och fyll upp till 100 ml med destillerat vatten. Lösningar som bereds på detta sätt innehåller 0; 2,5; 5,0; 7,5 resp. 10 mg kalcium per liter och 5 gram lantan per liter. Lösningarna skall förvaras i flaskor av polyeten.4.3 BestämningStäll in våglängden på 422,7 nm. Nollställ absorbansskalan med den lösning som innehåller 5 gram lantan per liter (4.2). Sug upp det spädda vinet direkt i spektrofotometerbrännaren och därefter i följd de fem standardlösningarna (4.2). Läs av absorbansvärdena och upprepa varje bestämning en gång.5. REDOVISNING AV RESULTATEN5.1 BeräkningsmetodRita en kurva över absorbansvariationen som en funktion av kalciumkoncentrationen i standardlösningarna.Anteckna medelvärdet för den absorbans som kurvan visar för det utspädda vinprovet och bestäm motsvarande kalciumkoncentration C för vin. Kalciumkoncentrationen i mg/l vin utan decimaler blir20 × C.5.2 Repeterbarhet (r)>Plats för tabell>5.3 Reproducerbarhet (R)>Plats för tabell>30. JÄRN 1. PRINCIPER FÖR METODERNA1.1 ReferensmetodEfter det att vinet har spätts på lämpligt sätt och alkoholen avlägsnats bestäms järnet direkt med atomabsorptionsspektrofotometri.RutinmetodEfter uppslutning i 30 % väteperoxidlösning reduceras den totala halten av järn, som nu är i form av Fe(III), till Fe(II) och bestäms på grundval av den röda färg som erhålls med ortofenantrolin.2. REFERENSMETOD2.1 Reagenser2.1.1. Koncentrerad standardjärnlösning innehållande 1 gram Fe(III) per liter.Använd en standardlösning (1 g/l) som finns i handeln. Denna lösning kan beredas genom att 8,6341 g järn(III)ammoniumsulfat (FeNH4(SO4)2 . 12H2O löses i destillerat vatten som har gjorts svagt surt med 1 M saltsyra och späds till 1 liter.2.1.2. Spädd standardjärnlösning innehållande 100 mg järn/l.2.2 Apparatur2.2.1. Roterande indunstningapparat med ett termostatiskt reglerat vattenbad.2.2.2. Atomabsorptionsspektrofotometer med luftacetylenbrännare.2.2.3. Järnhålkatodlampa.2.3 Metod2.3.1 Beredning av provetAvlägsna alkoholen från vinet genom att reducera provvolymen till hälften i en roterande indunstningsapparat (50 - 60 °C). Späd till den ursprungliga volymen med destillerat vatten.Vid behov görs spädningen före bestämningen.2.3.2 KalibreringHäll 1, 2, 3, 4 resp. 5 ml av lösningen med 100 mg järn/l (2.1.2) i en serie 100 ml mätkolvar och fyll upp till 100 ml med destillerat vatten. Lösningar som bereds på detta sätt innehåller 1, 2, 3, 4 resp. 5 mg järn per liter.Lösningarna skall förvaras i flaskor av polyeten.2.3.3 BestämningStäll in våglängden på 248,3 nm. Nollställ absorbansskalan med destillerat vatten. Sug upp det spädda provet direkt i spektrofotometerns brännare och därefter de fem standardlösningarna (2.3.2). Läs av absorbansvärdena. Upprepa varje bestämning en gång.2.4 Redovisning av resultaten2.4.1 BeräkningsmetodRita en kurva över absorbansvariationen som en funktion av järnkoncentrationen i standardlösningarna. Anteckna medelvärdet för den absorbans som kurvan visar för det spädda vinprovet och bestäm dess järnkoncentration C.Järnkoncentrationen i mg/l i vinet med en decimal blir:F × Cdär F är spädningsfaktorn.3. RUTINMETOD3.1 Reagenser3.1.1. Väteperoxidlösning, H2O2, 30 % (w/v), järnfri.3.1.2. 1 M saltsyra, järnfri.3.1.3. Ammoniumhydroxid (ñ20 = 0,92 g/ml).3.1.4. Korn av pimpsten som behandlats med kokande saltsyra i spädning 1:2 och tvättats med destillerat vatten.3.1.5. 2,5 % hydrokinonlösning (C6H6O2) som surgjorts med 1 ml koncentrerad svavelsyra (ñ20 = 1,84 mg/l) per 100 ml lösning. Lösningen skall förvaras i en gul flaska i kylskåp och kasseras vid minsta tecken på att den mörknar.3.1.6. 20 % natriumsulfitlösning (Na2SO3) beredd av neutral vattenfri natriumsulfit.3.1.7. 0,5 % ortofenantrolinlösning (C12O8N2, H2O) i 96 % vol. alkohol.3.1.8. 20 % (w/v) ammoniumacetatlösning (CH3COONH4).3.1.9. Fe(III)-lösning med 1 g järn/l. Använd en lösning som finns i handeln. Eventuellt kan en Fe(III)-lösning, 1 000 mg/l, beredas genom att 8,6341 g järn(III)ammoniumsulfat (FeNH4(SO4)2, 12 H2O) löses i 100 ml 1 M saltsyra (3.1.2) och späds till en volym av 1 liter med 1 M saltsyra (3.1.2).3.1.10. Spädd standardjärnlösning innehållande 100 mg järn/l.3.2 Apparatur3.2.1. Kjeldahlkolv, 100 ml.3.2.2. Spektrofotometer för bestämning vid en våglängd av 508 nm.3.3 Metod3.3.1 Uppslutning3.3.1.1. Vin med en sockerhalt som ligger under 50 g/l:Häll 25 ml av vinet, 10 ml av väteperoxidlösningen (3.1.1) och några korn pimpsten (3.1.4) i en 100 ml Kjeldahlkolv. Koncentrera blandningen till en volym på 2 3 ml.Låt svalna. Se till att kolvens väggar inte blir våta och tillsätt tillräckligt med ammoniumhydroxid (3.1.3) till resten för att göra vätskan alkalisk så att eventuella hydroxider fälls ut.Efter kylning tillsätts 1 M saltsyra (3.1.2) till den alkaliska vätskan i en mängd som är tillräcklig för att lösa de utfällda hydroxiderna. Överför den lösning som erhålls till en 100 ml mätkolv. Skölj Kjeldahlkolven med 1 M saltsyra (3.1.2) och tillsätt sköljvätskan till mätkolven så att volymen blir 100 ml.3.3.1.2. Must och vin med en sockerhalt som ligger över 50 g/l3.3.1.2.1. Om sockerhalten är mellan 50 och 200 g/l behandlas vinprovet på 25 ml med 20 ml väteperoxidlösning (3.1.1).Fortsätt som i 3.3.1.1.3.3.1.2.2. Om sockerhalten ligger över 200 g/l bör vinprovet eller musten spädas 1:2 eller möjligen 1:4 före behandling enligt 3.3.1.2.1.3.3.2 NollprovUtför ett nollprov med destillerat vatten med samma volym väteperoxidlösning (3.1.1.) som den som använts för uppslutning och följ samma metod som i 3.3.1.1.3.3.3 BestämningHäll 20 ml av den saltsyralösning som erhålls genom uppslutning (3.3.1.1) och 20 ml av saltsyralösningen från "nollprovet" (3.3.2) i två separata 50 ml mätkolvar. Tillsätt 2 ml hydrokinonlösning (3.1.5), 2 ml sulfitlösning (3.1.6) och 1 ml ortofenantrolinlösning (3.1.7) till respektive kolv. Låt stå i 15 min. så att Fe(III) reduceras till Fe(II). Tillsätt 10 ml ammoniumacetatlösning (3.1.8) och fyll upp till 50 ml med destillerat vatten. Skaka om de båda mätkolvarna. Använd lösningen från "nollprovet" för att nollställa absorbansskalan vid 508 nm och mät analyslösningens absorbans vid samma våglängd.3.3.4 KalibreringHäll 0,5; 1; 1,5 resp. 2 ml av lösningen med 100 mg järn/l (3.1.10) i en serie 50 ml mätkolvar och tillsätt 20 ml destillerat vatten till vardera kolven. Följ det förfarande som beskrivs i 3.3.3 för att bestämma absorbansen för de olika standardlösningarna med en järnhalt av 50, 100, 150 resp. 200 ìg.3.4 Redovisning av resultaten3.4.1 BeräkningsmetodRita en kurva över absorbansvariationen som en funktion av järnkoncentrationen i standardlösningarna. Notera den absorbans som erhålls med provlösningen och beräkna järnkoncentrationen C i det saltsyraprov på 20 ml som erhålls genom uppslutning, dvs. i 5 ml av det vinprov som skall analyseras.Järnkoncentrationen i mg/l i vinet med en decimal blir200 × C.Om vinet (eller musten) har spätts blir järnkoncentrationen i mg/l med en decimal:200 × F × Cdär F är spädningsfaktorn.31. KOPPAR 1. PRINCIP FÖR METODENMetoden baseras på atomabsorptionsspektrofotometri.2. APPARATUR2.1. Skål av platina.2.2. Atomabsorptionsspektrofotometer.2.3. Kopparhålkatodlampa.2.4. Gasförsörjning: luft/acetylen eller dikväveoxid/acetylen.3. REAGENSER3.1. Metallisk koppar.3.2. Koncentrerad 65 % salpetersyra (HNO3, ñ20 = 1,38 g/ml).3.3. Spädd salpetersyra, 1:2 (v/v).3.4. Kopparlösning, 1g/l.Använd en standardkopparlösning som finns i handeln. Denna lösning kan beredas genom att 1,000 g metallisk koppar vägs och överförs utan att någon koppar går förlorad till en 1 000 ml mätkolv. Tillsätt spädd salpetersyra, 1:2 (v/v) (3.3), i en mängd som är tillräcklig för att lösa metallen. Tillsätt 10 ml koncentrerad salpetersyra (3.2) och fyll upp till märket med dubbeldestillerat vatten.3.5. Kopparlösning, 100 mg/l.Häll 10 ml av den lösning som beretts enligt 3.4 i en 100 ml mätkolv och fyll upp till märket med dubbeldestillerat vatten.4. METOD4.1 Beredning av provet och bestämning av kopparVid behov bereds en lämpligt spädd lösning med dubbeldestillerat vatten.4.2 KalibreringSug med pipett upp 0,5, 1 resp. 2 ml av lösning 3.5 (100 mg koppar/l) i 100 ml mätkolvar och fyll upp till 100 ml med dubbeldestillerat vatten. De lösningar som erhålls innehåller 0,5; 1 resp. 2 mg koppar per liter.Bestämning4.3. Mät absorbansen vid 324,8 nm. Nollställ med dubbeldestillerat vatten. Bestäm absorbansen direkt för standardlösningar som beretts enligt 4.2. Utför bestämningarna två gånger.5. REDOVISNING AV RESULTATEN5.1 BeräkningsmetodRita en kurva som visar absorbansvariationen som en funktion av kopparkoncentrationen i standardlösningarna.Läs av koncentrationen C i mg/l från kalibreringskurvan med hjälp av den absorbans som har bestämts för proverna.Om F är spädningsfaktorn anges kopparkoncentrationen i mg/l av F × C. Halten anges med två decimaler.Anmärkning:a) Lösningarna för kalibreringskurvan och spädningarna av proven skall väljas så att de motsvarar den använda apparaturens känslighet och kopparkoncentrationen i provet.b) Fortsätt enligt följande när mycket låga kopparkoncentrationer förväntas i analysprovet. Häll 100 ml av provet i en platinaskål och indunsta över vattenbad vid 100 °C tills vätskan blir sirapsliknande. Tillsätt 2,5 ml koncentrerad salpetersyra (3.2) droppvis, så att det blir en bottenskyla i skålen. Glödga försiktigt resten på en elektrisk värmeplatta eller över en låga. Placera därefter skålen i en muffelugn inställd på 500 ± 25 °C och låt stå i ca 1 timme. Efter kylning fuktas askan med 1 ml koncentrerad salpetersyra (3.2) samtidigt som den krossas med en glasstav. Låt blandningen indunsta och låt den inaskas igen på samma sätt som i föregående steg. Ställ in skålen i muffelugnen igen i 15 minuter. Upprepa behandlingen med salpetersyra minst tre gånger. Lös askan genom att tillsätta 1 ml koncentrerad salpetersyra (3.2) och 2 ml dubbeldestillerat vatten till skålen och överför till en 10 ml kolv. Tvätta skålen 3 gånger med 2 ml dubbeldestillerat vatten varje gång. Slutligen fylls kolven upp till märket med dubbeldestillerat vatten.32. KADMIUM 1. PRINCIPKadmium bestäms direkt i vinet med flamlös atomabsorptionsspektrofotometri.2. APPARATURAll glasapparatur skall tvättas före användning i koncentrerad salpetersyra som upphettas till 70 80 °C och därefter sköljas i dubbeldestillerat vatten.2.1. Atomabsorptionsspektrofotometer med grafitugn, bakgrundskorrektion och multipotentiometer.2.2. Kadmiumhålkatodlampa.2.3. 5 ìl mikropipetter med specialmunstycken för atomabsorptionsbestämning.3. REAGENSERDet vatten som används i apparatur av borosilikatglas skall vara dubbeldestillerat eller av likvärdig renhetsgrad. Alla reagenser skall vara av analytisk kvalitet och skall i synnerhet vara fria från kadmium.3.1. 85 % fosforsyra (ñ20 = 1,71 g/ml).3.2. Fosforsyralösning som erhålls genom att 8 ml fosforsyra späds med vatten till 100 ml.3.3. 0,02 M lösning av dinatriumsalt av etylendiamin-tetraättiksyra (EDTA).3.4. Buffertlösning, pH 9: lös 5,4 g ammoniumklorid i några ml vatten i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 35 ml ammoniumhydroxidlösning (ñ20 = 0,92 g/ml), spädd till 25 % (v/v), och fyll upp till 100 ml med vatten.3.5. Eriokromsvart T: 1 % (w/w), fast lösning i natriumklorid.3.6. Kadmiumsulfat (CdSO4, 8 H2O).Kadmiumsulfatet verifieras med följande metod:Väg upp exakt 102,6 mg av kadmiumsulfatprovet i ett cylindriskt kärl med lite vatten och skaka till dess att substansen är löst. Tillsätt 5 ml av buffertlösningen med pH 9 och ca 20 mg eriokromsvart T. Titrera med EDTA-lösningen till dess att indikatorn slår om till blått.Den EDTA-volym som tillsätts skall vara 20 ml. Om volymen avviker något skall den vägda mängden kadmiumsulfat som används vid beredning av referenslösningen korrigeras på motsvarande sätt.3.7. Kadmiumreferenslösning, 1 g/l.Använd en standardlösning som finns i handeln. Denna lösning kan beredas genom att 2,2820 g kadmiumsulfat löses i vatten och späds till 1 l. Förvara lösningen i en flaska av borsilikatglas med en propp av slipat glas.4. METOD4.1 Beredning av provetSpäd vinet 1:2 (v/v) med fosforsyralösningen.4.2 Beredning av kalibreringslösningarBered spädningar med en halt av 2,5; 5; 10 resp. 15 ìg kadmium/l från kadmiumreferenslösningen.4.3 Bestämning4.3.1 Programmering av ugn (endast som vägledning):Torkning vid 100 °C i 30 sekunder.Mineralisering vid 900 °C i 20 sekunder.Atomisering vid 2 250 °C i 2 3 sekunder.Kvävgasgenomströmning: 6 l/minut.Anmärkning: Öka temperaturen till 2 700 °C i slutet för att rengöra ugnen.4.3.2 AtomabsorptionsbestämningVälj våglängden 228,8 nm. Nollställ absorbansskalan med dubbeldestillerat vatten. Använd en mikropipett för att spruta in tre volymer på 5 ìl av kalibreringslösningarna och av provlösningen i ugnen. Notera de uppmätta absorbanserna. Beräkna medelvärdet för absorbansen utifrån resultatet för de tre insprutningarna.5. REDOVISNING AV RESULTATEN5.1 BeräkningsmetodRita kurvan över absorbansvariationen som en funktion av kadmiumkoncentrationen i kalibreringslösningarna. Variationen är linjär. Rita in medelabsorbansen för provlösningen på kalibreringskurvan och härled koncentrationen av kadmium C från denna. Kadmiumkoncentrationen i ìg/l vin är lika med:2 C33. SILVER 1. PRINCIP FÖR METODENMetoden baseras på atomabsorptionsspektrofotometri efter mineralisering av provet.2. APPARATUR2.1. Skål av platina.2.2. Vattenbad, termostatiskt reglerat till 100 °C.2.3. Ugn inställd på 500 - 525 °C.2.4. Atomabsorptionsspektrofotometer.2.5. Silverhålkatodlampa.2.6. Gastillförsel: luft, acetylen.3. REAGENSER3.1. Silvernitrat (AgNO3).3.2. Koncentrerad salpetersyra (HNO3) 65 % (ñ20  = 1,38 g/ml).3.3. Spädd salpetersyra, 1:10 (v/v).3.4. Silverlösning, 1 g/lAnvänd en standardsilverlösning som finns i handeln.Lösningen kan beredas genom att 1,575 g silvernitrat löses i spädd salpetersyra och späds till en volym på 1 000 ml med spädd salpetersyra (3.3).3.5. Silverlösning, 10 mg/l.10 ml av lösningen enligt 3.4 späds i 1 000 ml med spädd salpetersyra.4. METOD4.1 Beredning av provetHäll 20 ml av provet i en platinaskål och indunsta fullständigt över kokande vattenbad. Mineralisera i ugnen vid 500 525 °C. Fukta den vita askan med 1 ml koncentrerad salpetersyra (3.2.. Indunsta över kokande vattenbad och tillsätt än en gång 1 ml salpetersyra (3.2) och indunsta en andra gång. Tillsätt 5 ml spädd salpetersyra (3.3) och värm försiktigt till dess att allt är löst.4.2 KalibreringPipettera 2; 4; 6; 8; 10 resp. 20 ml av lösning 3.5 (10 mg silver/l) i en serie 100 ml mätkolvar och fyll upp till märket med spädd salpetersyra (3.3). Dessa lösningar innehåller 0,20; 0,40; 0,60; 0,80; 1,0 resp. 2,0 mg silver/l.4.3. BestämningStäll in våglängden 328,1 nm. Nollställ med spädd salpetersyra (3.3). Bestäm absorbansen genom att suga upp provet enligt 4.1 i spektrofotometerns brännare och därefter de beredda standard-lösningarna. Läs av absorbansvärdena. Utför bestämningen två gånger.5. REDOVISNING AV RESULTATEN5.1 BeräkningsmetodRita en kurva över absorbansvariationerna som en funktion av silverkoncentrationen i standardlösningarna.Använd den uppmätta absorbansen för provet och läs av koncentrationen C i mg/l från kalibreringskurvan.Halten av silver i vinet i mg/l är:0,25 C. Halten anges med två decimaler.Anmärkning: Innehållet i lösningarna för framställning av kalibreringskurvan, de uttagna provernas volym och vätskans slutgiltiga volym väljs så att de är lämpliga för känsligheten hos den apparatur som används.34. ZINK 1. PRINCIP FÖR METODENEfter det att alkoholen har avlägsnats bestäms zink direkt i vinet med atomabsorptionsspektrofotometri.2. REAGENSERVatten som används i apparatur av borosilikatglas skall vara dubbeldestillerat eller av likvärdig renhetsgrad.2.1. Zinkstandardlösning, 1 g/l:Använd en zinkstandardlösning som finns i handeln. Lösningen kan beredas genom att 4,3975 g zinksulfat (ZnSO4, 7 H2O) löses i vatten och späds till en volym av 1 liter.2.2. Spädd zinkstandardlösning, 100 mg/l.3. APPARATUR3.1. Rotationsindunstare med ett termostatiskt kontrollerat vattenbad.3.2. Atomabsorptionsspektrofotometer med luftacetylenbrännare.3.3. Zinkhålkatodlampa.4. METOD4.1 Beredning av provetVinets alkoholhalt avlägsnas genom att en 100 ml provvolym reduceras till hälften i en rotationsindunstare (50 60 °C). Späd till den ursprungliga volymen på 100 ml med dubbeldestillerat vatten.4.2 KalibreringHäll 0,5; 1; 1,5 resp. 2 ml av zinklösningen, 100 mg/l (2.2), i var och en av en serie 100 ml mätkolvar och fyll upp till märket med dubbeldestillerat vatten. Lösningar som har beretts på detta sätt innehåller 0,5; 1; 1,5 resp. 2 mg zink/l.4.3 BestämningStäll in våglängden på 213,9 nm. Nollställ absorbansskalan med dubbeldestillerat vatten. Sug upp vinet direkt i spektrofotometerns brännare och därefter de fyra standardlösningarna. Läs av absorbanserna. Upprepa bestämningarna.5. REDOVISNING AV RESULTATEN5.1 BeräkningsmetodRita en kurva över absorbansvariationen som en funktion av zinkkoncentrationen i standardlösningarna. Anteckna medelvärdet för den absorbans som kurvan visar för det spädda vinprovet och bestäm zinkkoncentrationen med en decimal.35. BLY 1. PRINCIPBly bestäms direkt i vinet med flamlös atomabsorptionsspektrofotometri.2. APPARATURAll glasapparatur skall tvättas före användning i koncentrerad salpetersyra, upphettad till 70 80 °C, och sköljas i dubbeldestillerat vatten.2.1. Atomabsorptionsspektrofotometer med grafitugn, icke-specifik absorptionskorrektion och multipotentiometer.2.2. Blyhålkatodlampa.2.3. 5 ìl mikropipetter med speciella munstycken för atomabsorptionsbestämningar.3. REAGENSERAlla reagenser skall vara av analytisk kvalitet och skall i synnerhet vara blyfria. Vatten som används i apparatur av borosilikatglas skall vara dubbeldestillerat eller av likvärdig renhetsgrad.3.1. 85 % fosforsyra (ñ20 = 1,71 g/ml).3.2. Fosforsyralösning, som erhålls genom att 8 ml fosforsyra späds med vatten till 100 ml.3.3. Salpetersyra (ñ20 = 1,38 g/ml).3.4. Blylösning, 1 g/l.Använd en standardlösning som finns i handeln. Lösningen kan erhållas genom att 1,600 g bly(II)nitrat, Pb(NO3)2, löses i 1 % salpetersyra (v/v) och späds till 1 liter. Förvara lösningen i en flaska av borosilikatglas med en propp av slipat glas.4. METOD4.1 Beredning av provetSpäd vinet till 1:2 eller 1:3 med fosforsyralösningen, beroende på den förmodade blykoncentrationen.4.2 Beredning av kalibreringslösningarBered lösningar från blyreferenslösningen med 2,5; 5; 10 resp. 15 ìg bly per liter genom att späda med dubbeldestillerat vatten.4.3 Bestämning4.3.1 Programmering av ugn (endast som vägledning):Torkning vid 100 °C i 30 sekunder.Mineralisering vid 900 °C i 20 sekunder.Atomisering vid 2 250 °C i 2 3 sekunder.Kvävgasgenomströmning: 6 l/minut.Anmärkning: Öka temperaturen till 2 700 °C i slutet för att rengöra ugnen.4.3.2 BestämningVälj våglängden 217 nm. Nollställ absorbansskalan med dubbeldestillerat vatten. Spruta in 3 volymer om 5 ìl av var och en av kalibreringslösningarna och av provlösningen med hjälp av en mikropipett i den programmerade ugnen. Läs av den uppmätta absorbansen. Beräkna medelvärdet för absorbansen från resultaten för de tre insprutningarna.5. REDOVISNING AV RESULTATEN5.1 BeräkningsmetodRita kurvan över absorbansvariationen som en funktion av blykoncentrationen i kalibreringslösningarna. Variationen är linjär. För över medelvärdet på absorbansen för provlösningen till kalibreringskurvan och härled blykoncentrationen C från denna. Blykoncentrationen i ìg/l vin är lika med:C × Fdär F = spädningsfaktorn.36. FLUORIDER 1. PRINCIP FÖR METODENFluoridhalten i vinet, som har tillsatts en buffertlösning, bestäms med hjälp av en selektiv elektrod med fast membran. Den uppmätta potentialen är proportionell mot logaritmen för aktiviteten av fluoridjoner i det medium som analyseras, i enlighet med följande ekvation:E = E0 ± S log aFdärE>Plats för tabell>2. APPARATUR2.1. Fluoridjonselektiv kristallmembranelektrod.2.2. Referenselektrod (kalomel eller Ag/AgCl).2.3. Millivoltmeter (pH-mätare med skala i millivolt) med 0,1 mV noggrannhet.2.4. Magnetomrörare med isoleringsplatta för att skydda provlösningen mot värme från motorn. Kärl för omrörning som är täckt med plast (polyeten eller likvärdigt material).2.5. Plastbägare, 30 eller 50 ml, och plastflaskor (polyeten eller liknande material).2.6. Precisionspipetter (pipetter med skalindelning i ìl eller andra likvärdiga pipetter).3. REAGENSER3.1. Stamfluoridlösning, 1 g/l.Använd en standardlösning på 1 g/l som finns i handeln. Denna lösning kan beredas genom att 2,210 g natriumfluorid (torkad i 3 4 timmar i 105 °C) löses i destillerat vatten. Fyll upp till 1 l med destillerat vatten. Lösningen förvaras i en plastflaska.3.2. En standardfluoridlösning med lämplig koncentration bereds genom att stamlösningen späds med destillerat vatten och förvaras i plastflaskor. Lösningar med en fluoridkoncentration i storleksordningen mg/l får inte beredas i förväg.3.3. Buffertlösning, pH 5,5.10 g cyklohexan-diaminsyra-1,2-tetraättiksyra (CDTA) tillsätts ca 50 ml vatten. Tillsätt en lösning innehållande 58 g natriumklorid och 29,4 g trinatriumcitrat i 700 ml destillerat vatten. CDTA löses genom att ca 6 ml 32 % (w/v) natriumhydroxidlösning tillsätts.Slutligen tillsätts 57 ml ättiksyra (ñ20  = 1,05 g/ml) och pH justeras till 5,5 med 32 % natriumhydroxidlösning(ca 45 ml). Låt svalna och späd till 1 liter med destillerat vatten.4. METODInledande anmärkning:Se till att alla lösningar hålls vid en temperatur av 25 °C (± 1 °C) under bestämningen. (Avvikelser på mer än 1 C° ger en ändring om ca 0,2 mV.)4.1 Direkt metodHäll en definierad volym vin i en plastbägare med en lika stor volym buffertlösning.Lösningen rörs om med en jämn och måttlig rörelse. Läs av potentialvärdet i mV när apparatens visare är stabil (stabilitet har uppnåtts när potentialen inte varierar mer än 0,2-0,3 mV/3 min.).4.2 Metod med kända tillsatserTillsätt under kontinuerlig omrörning en känd volym standardfluoridlösning till analysprovet med hjälp av en precisionspipett. Läs av potentialvärdet i mV när visaren är stabil.Koncentrationen i den standardlösning som skall tillsättas väljs enligt följande:a) Fluoridkoncentrationen i analysmediet fördubblas två eller tre gånger.b) Analysmediets volym skall hållas i stort sett konstant (volymökning om 1 % eller mindre).Alternativ b underlättar beräkningarna (se 5.)Analysmediets ungefärliga koncentration läses av på en kalibreringslinje som ritas på en semilogaritmisk skala med standardfluoridlösningar med en koncentration av 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 resp 2,0 mg/l.Anmärkning: Om analysmediets ungefärliga koncentration ligger utanför standardlösningarnas koncentration skall provet spädas.Exempel:Om analysmediets ungefärliga fluoridkoncentration (volym 20 ml) är 0,25 mg/l F- skall koncentrationen ökas med 0,25 mg/l. För att åstadkomma detta används en lämplig pipett för att tillsätta 0,20 ml = 1 %) av en standardlösning innehållande 25 mg/l F- eller 0,050 ml av en standardlösning med 100 mg/l F-.5. BERÄKNINGARFluoridhalten i analysmediet i mg/l erhålls med följande formel:CF = >NUM>Va × Ca/>DEN>V° × >NUM>1/>DEN>(antilog ÄE/S) - 1>Plats för tabell>Om Va ligger mycket nära V° (se 4.2) används följande förenklade formel:CF = Ca × >NUM>1/>DEN>(antilog ÄE/S) - 1Värdet skall multipliceras med den spädningsfaktor som erhålls genom tillsats av buffertlösningen.37. KOLDIOXID 1. PRINCIPER FÖR METODERNA1.1 Referensmetod1.1.1 Icke mousserande viner (övertryck av CO2 &le; 0,5 × 105 Pa)(12)Den mängd vin som tas från provet kyls till ca 0 °C och blandas med tillräcklig mängd natriumhydroxid för att pH skall bli 10 11. Titrering utförs med en sur lösning i närvaro av kolsyreanhydras. Halten av koldioxid beräknas utifrån den mängd sur lösning som krävs för att ändra pH från 8,6 (bikarbonatform) till 4,0 (kolsyra). Nolltitrering utförs under samma betingelser på dekarboniserat vin för att korrigera för den volym natriumhydroxidlösning som förbrukas av vinsyrorna.1.1.2 Mousserande och pärlande vinerAnalysprovet kyls till nära fryspunkten. Efter uttagning av en mängd som skall användas som nollprov efter dekarbonisering görs resten av innehållet i flaskan alkaliskt för att binda all koldioxid som Na2CO3. Titrering utförs med en sur lösning i närvaro av kolsyreanhydras. Koldioxidhalten beräknas från den mängd sur lösning som krävs för att ändra pH från 8,6 (bikarbonatform) till 4,0 (kolsyra). Nolltitrering utförs under samma betingelser på dekarboniserat vin för att korrigera för den mängd natriumhydroxid som förbrukas av vinsyrorna.1.2 Rutinmetod: mousserande och pärlande vinerManometrisk metod: mätning av övertryck av koldioxid utförs direkt i flaskan med afrometer.2. REFERENSMETOD2.1. Icke mousserande viner (övertryck av CO2 &le; 0,5 × 105 Pa)2.1.1 Apparatur2.1.1.1. Magnetomrörare.2.1.1.2. pH-mätare.2.1.2 Reagenser2.1.2.1. Natriumhydroxidlösning (NaOH), 0,1 M.2.1.2.2. Svavelsyralösning (H2SO4), 0,05 M.2.1.2.3. Kolsyreanhydraslösning, 1 g/l.2.1.3 MetodKyl vinprovet till ca 0 °C tillsammans med den 10 ml pipett som används för provtagning.Häll 25 ml av natriumhydroxidlösningen (2.1.2.1) i en 100 ml bägare. Tillsätt 2 droppar vattenhaltig kolsyreanhydraslösning (2.1.2.3). Häll i 10 ml av vinet med hjälp av pipetten som kylts till 0 °C.Placera bägaren på magnetomröraren, anbringa pH-elektroden och rör om försiktigt.När vätskan har rumstemperatur tillsätts långsamt svavelsyralösningen (2.1.2.2) till dess att pH är 8,6. Notera värdet på byretten.Tillsätt mer svavelsyra (2.1.2.2) till dess att pH är 4,0. Den använda mängden mellan pH 8,6 och 4,0 betecknas n ml.Avlägsna CO2 från ca 50 ml av vinprovet genom omrörning under vakuum i 3 minuter medan kolven värms i ett vattenbad till ca 25 °C.Utför förfarandet ovan på 10 ml dekarboniserat vin. Den använda mängden betecknas n' ml.2.1.4 Redovisning av resultaten1 ml av den titrerade 0,1 M natriumhydroxidlösningen motsvarar 4,4 mg CO2.Mängden CO2 i g/l vin erhålls med formeln:0,44 (n   n')Resultatet anges med två decimaler.Anmärkning: För viner med låg koldioxidhalt (CO2 NUM>V - v + 20/>DEN>V - vResultatet anges med 2 decimaler.2.3 Redovisning av resultatenÖvertrycket vid 20 °C (Paph20) i pascal erhålls med formeln:Paph20 = >NUM>Q/>DEN>1,951 × 10-5(0,86 - 0,01 A) (1 - 0,00144 S) - Patmdär>Plats för tabell>3. RUTINMETOD: MOUSSERANDE OCH PÄRLANDE VINER3.1 Apparatur3.1.1 AfrometerDen apparat som möjliggör mätning av övertrycket i flaskor med mousserande eller pärlande vin kallas en afrometer. Den kan ha olika utformning beroende på hur flaskan är försluten (metallkapsel, kapsyl, kork eller plastpropp, se fig. 1 och 2).Apparaten är skalindelad i pascal (Pa)(13). Det är dock mest praktiskt att använda 105 Pa eller kilopascal (kPa) som enhet.Apparaterna är indelade i olika klasser. Manometerns klass anger avläsningens precision i förhållande till hela skalan uttryckt i procent (t. ex. en 1 000 kPa manometer av klass 1 innebär att maximala trycket 1 000 kPa kan läsas av med en noggrannhet av ± 10 kPa). Apparater av klass 1 rekommenderas för exakta bestämningar.Afrometrar skall kontrolleras regelbundet (minst 1 gång om året).3.2 MetodBestämningar skall utföras på flaskor vars temperatur har stabiliserats under minst 24 timmar.När kapsylen, korken eller proppen har genomborrats skall flaskan skakas om kraftigt till dess att trycket är konstant för att avläsningen skall kunna utföras.>Hänvisning till >3.3 Redovisning av resultatenÖvertrycket vid 20 °C (Paph20) anges i pascal (Pa) eller kilopascal (kPa).Resultatet skall anges på ett sätt som överensstämmer med manometerns exakthet (t.ex. 6,3 × 105 Pa eller 630 kPa, men inte 6,33×105 Pa eller 633 kPa, med en 1 000 kPa fullskalemanometer av klass 1).Om bestämningstemperaturen avviker från 20 °C bör korrektion göras genom att det uppmätta trycket multipliceras med koefficienten.>NUM>Paph20/>DEN>Paphtsom anges i tabell 1. Koefficienten ger värdet vid 20 °C.4. FÖRHÅLLANDE MELLAN TRYCK OCH KOLDIOXIDHALT I ETT PÄRLANDE VIN(14)Det absoluta trycket vid 20 °C (Pabs20) beräknas utifrån övertrycket vid 20 °C (Paph20) med formeln:Pabs20 = Patm + Paph20där Patm är det atmosfäriska trycket i bar.Vinets koldioxidhalt erhålls med följande formler:- i liter CO2/l vin:0,987 × 10-5 Pabs20(0,86   0,01A)(1   0,00144S)- i gram CO2/l vin:1,951 × 10-5 Pabs20(0,86   0,01A)(1   0,00144S)därA är vinets alkoholhalt vid 20 °C,S är vinets sockerhalt i gram/l.>Plats för tabell>38. CYANIDDERIVAT 1. PRINCIPER FÖR METODERNA1.1 Snabb analysmetod: analys av vin som har behandlats med kaliumhexacyanoferrat (II).Analys för frånvaro av järn (III) hexacyanoferrat (II) i suspension i fällningen.Analys för utebliven bildning av järn (III) hexacyanoferrat (II) genom tillsats av ett järn (III) salt till det surgjorda vinet.Analys för förekomst av järn som fällts ut genom tillsats till det surgjorda vinet av en blandning av alkalihexacyanoferrat (II) och hexacyanoferrat (III).1.2 RutinmetodArgentometrisk bestämning av den totala mängden cyanvätesyra (blåsyra) som frigörs genom sur hydrolys och separeras med destillation.2. SNABB ANALYSMETODAnalys av vin som har behandlas med kaliumhexacyanoferrat (II).2.1 ApparaturNågon av följande apparater bör användas:2.1.1. Centrifug med en centrifugalkraft på 1200 1500 g.2.1.2. Filtreringsapparat med membranfilter (pordiameter 0,45 ìm).2.2 Reagenser2.2.1. Saltsyra, spädd 1:2 (v/v), som erhålls genom spädning av järnfri saltsyra, HCl (ñ20 = 1,18 till 1,19 g/ml).2.2.2. 15 % lösning (w/v) av järn (III) ammoniumsulfat, Fe2(SO4)3,(NH4)2SO4,24H2O.2.2.3. Kaliumhexacyanoferrat (II), (K4[Fe(CN)6],3H2O), 10 % (w/v).2.2.4. 10 % (w/v) lösning av kaliumhexacyanoferrat (III), K3[Fe(CN)6]. Bereds omedelbart före användning.2.3 Metod2.3.1 Analys för spår av järn (III) hexacyanoferrat (II) i suspensionEfter omskakning av provet hälls 20 ml av vinet i ett 30 ml koniskt centrifugrör. Tillsätt 1 ml spädd saltsyra (2.2.1). Centrifugera i 15 minuter eller filtrera genom membranfilter med 0,45 ìm pordiameter. Den fällning som erhålls efter centrifugering eller filtrering skall vara helt fri från blå partiklar.2.3.2 Analys för spår av hexacyanoferrat (II) joner i lösningTillsätt en droppe järn (III) ammoniumsulfatlösning (2.2.2) till den översta vätskan eller filtratet från analys 2.3.1. Rör om och låt stå i minst 24 timmar.Centrifugera i 15 minuter eller filtrera genom ett membranfilter med pordiameter 0,45 ìm. Fällningen efter centrifugering eller filtrering skall vara helt fri från blå partiklar av järn (III) hexacyanoferrat (II).2.3.3 Analys för förekomst av järnjoner i vinetHäll 20 ml vin, 1 ml saltsyra (2.2.1), en droppe kaliumhexacyanoferrat (II) lösning (2.2.3) och en droppe kaliumhexacyanoferrat (III) lösning (2.2.4) i ett provrör. Blåfärgning eller en blå fällning skall synas inom mindre än 30 minuter. Efter centrifugering eller filtrering genom ett membranfilter med 0,45 ìm pordiametern, följt av sköljning två gånger i 5 ml vatten, bör en blå fällning synas i centrifugröret eller på membranfiltret.3. RUTINMETOD3.1 Apparatur3.1.1. Destillationsapparat bestående av en 500 ml rundbottnad kolv som är förbunden med ett rör med kopplingar av slipat glas till övre delen av en vertikal kylare som skall vara minst 350 mm lång.Kylarens nedre del är fästad vid en adapter med en utdragen del som leder destillatet till botten av en 50 ml kolv som är helt nedsänkt i iskallt vatten.3.1.2. Kokande elektriskt uppvärmt vattenbad (termostatstyrt).3.2 Reagenser3.2.1. Svavelsyra, spädd 1:5 (v/v).Tillsätt 200 ml svavelsyra, H2SO4, (ñ20 = 1,84 g/ml) med stor försiktighet till så mycket vatten att 1 l lösning erhålls.3.2.2. Kristallinisk koppar (II) klorid, CuCl2, 2 H2O.3.2.3. Fenolröttlösning.Lös 0,05 g fenolrött i 1,4 ml av en 0,1 M natriumhydroxidlösning. Späd lösningen till 1 000 ml.3.2.4. Kaliumjodidlösning.Lös 250 g kaliumjodid, KI, i tillräckligt med vatten för att ge 1 liter lösning.3.2.5. Silvernitratlösning, 0,001 M.Tillsätt 0,5 ml koncentrerad salpetersyra (HNO3, ñ20 = 1,40 g/ml) till 10 ml 0,1 M silvernitratlösning, AgNO3, och späd till 1 l med vatten.3.2.6. Natriumhydroxidlösning, 1 M, järnfri.3.3 METODHäll i 100 ml filtrerat vin (eller ofiltrerat vin om bestämning av cyanvätesyra som finns i eventuell blå grumlighet också skall utföras). Tillsätt ca 5 mg koppar(II)klorid (3.2.2) och 10 ml spädd svavelsyra (3.2.1). Häll 5 ml natriumhydroxidlösning (3.2.6) i uppsamlingskolven. Destillera till dess att kolven med 50 ml volym är full.Överför destillatet till en 400 ml bägare och placera den över ett kokande vattenbad. Påskynda indunstningen genom att blåsa en ganska stark kall luftström från en fläkt över den alkaliska vätskans yta. Volymen skall reduceras till 5 7 ml, vilket tar ca 30 minuter (se till att volymen inte reduceras till mindre än 5 ml).Filtrera den kylda lösningen vid behov och samla upp filtratet i ett cylindriskt rör med 20 mm diameter och 180 mm längd, eller överför lösningen direkt till röret. Tvätta bägaren och eventuellt filtret med några få ml vatten och tillsätt dessa till röret.Placera glasröret på en svart yta och låt en stråle vitt ljus falla på det från sidan. Vätskan skall då vara helt klar(15).Tillsätt två droppar fenolröttlösning (3.2.3) för att underlätta observation av slutpunkten(16) och en droppe kaliumjodidlösning (3.2.4). Titrera med 0,001 M silvernitratlösning (3.2.5) till dess att en svag men stabil grumlighet kan observeras. Den mängd titreringsmedel som används för att erhålla detta resultat betecknas n ml.Bered dessutom ett rör för nollprov. Röret skall innehålla 5 ml natriumhydroxidlösning (3.2.6), två droppar fenolröttlösning (3.2.3)(17), en droppe kaliumjodidlösning (3.2.4) och tillräckligt med vatten för att volymen skall bli densamma som i provet ovan. Tillsätt tillräckligt med silvernitratlösning (3.2.5) för att erhålla samma grumlighet som ovan. Den använda volymen betecknas n'(18).3.4 Redovisning av resultaten1 ml av 0,001 M silvernitratlösning motsvarar 54 ìg cyanvätesyra, HCN.Den totala cyanvätesyrahalten i 1 l vin är därför 0,54 (n   n') mg. Resultatet anges med två decimaler.Endast resultat där (n   n') är större än 0,5 ml skall betraktas som signifikanta.Om n   n' är större än 10 ml upprepas förfarandet med en 0,01 M silvernitratlösning.39. ALLYLISOTIOCYANAT 1. PRINCIP FÖR METODENAllylisotiocyanat i vinet samlas upp genom destillation och identifieras med gaskromatografi.2. REAGENSER2.1. Absolut etanol.2.2. Standardlösning: lösning av allylisotiocyanat i absolut alkohol med 15 mg allylisotiocyanat per liter.2.3. Frysblanding bestående av etanol och torris ( 60 °C).3. APPARATUR3.1. Destillationsapparat enligt figuren på nästa sida. Apparaten genomströmmas kontinuerligt med kvävgas.3.2. Termostatiskt reglerad värmemantel.3.3. Flödesmätare.3.4. Gaskromatograf med flamspektrofotometerdetektor med selektivt filter för svavelföreningar (våglängd = 394 nm) eller annan lämplig detektor.3.5. Kromatografkolonn av rostfritt stål, innerdiameter 3 mm, längd 3 meter, fylld med 10 % Carbowax 20 M på Chromosorb WHP, mesh 80 100.3.6. Mikrospruta, 10 ìl.4. METODHäll 2 l vin i destillationskolven och tillsätt några ml etanol (2.1) i två uppsamlingsrör så att gasdispersionsstavarnas porösa delar är helt nedsänkta i vätskan. Kyl de båda rören utifrån med frysblandningen. Anslut kolven till uppsamlingsröret och låt kvävgas strömma igenom apparaten med en hastighet av 3 liter per timme. Värm vinet till 80 °C med värmemanteln, destillera och samla upp 45 50 ml av destillatet.Stabilisera kromatografen. Följande betingelser rekommenderas:- injektortemperatur: 200 °C- kolonntemperatur: 130 °C- flödeshastighet för bärargasen (helium): 20 ml/min.Med hjälp av mikrosprutan sprutas en sådan mängd standardlösning in i kromatografen att den topp som motsvarar allylisotiocyanat lätt kan identifieras på gaskromatogrammet.På samma sätt sprutas en delmängd av destillatet in i kromatografen. Kontrollera att retentionstiden för den topp som erhålls motsvarar allylisotiocyanatets topp.Under de betingelser som beskrivs ovan kommer föreningar som förekommer naturligt i vinet inte att ge upphov till några interfererande toppar på kromatogrammet för provlösningen.>Hänvisning till >40. FÄRGEGENSKAPER 1. VIN OCH MUST1.1 DefinitionerVinets färgegenskaper är dess luminositet och dess kromaticitet.Luminositeten svarar mot transmittansen och varierar omvänt proportionellt mot vinets färgintensitet.Kromaticiteten svarar mot den dominerande våglängden (som karakteriserar nyansen) och färgens renhet.Traditionellt och av bekvämlighetsskäl anges röda viners och roséviners färgegenskaper som färgintensiteten och nyansen enligt ett förfarande som har antagits som rutinmetod.1.2 Principer för metoderna1.2.1 ReferensmetodDetta är en spektrofotometrisk metod som möjliggör bestämning av de tristimulusvärden och de tre kromaticitetskoordinater som krävs för specifikation av färgen enligt internationella belysningskommissionen (CIE).1.2.2 Rutinmetod (för rödvin och rosévin)Spektrofotometrisk metod, enligt vilken färgegenskaperna traditionellt uttrycks på följande sätt:Färgintensiteten anges som summan av absorbanserna vid våglängderna 420, 520 och 620 nm för den strålning som genomkorsar 1 cm optisk våglängd i provet.Nyansen uttrycks som förhållandet mellan absorbansen vid 420 nm och vid 520 nm.1.3 Referensmetod1.3.1 Apparatur1.3.1.1. Spektrofotometer för bestämning mellan 300 och 700 nm.1.3.1.2. Parvisa glaskuvetter med optisk väglängd b = 0,1 - 0,2 - 0,5 - 1 - 2 och 4 cm.1.3.2 Metod1.3.2.1. Beredning av provetGrumligt vin skall klaras med centrifugering.Större delen av koldioxiden i unga och mousserande viner måste avlägsnas genom omskakning under vakuum.1.3.2.2. BestämningDen optiska väglängden b i glaskuvetten skall väljas så att den uppmätta absorbansen ligger mellan 0,3 och 0,7.Följande riktlinjer anges för att underlätta valet av lämplig optisk väglängd: använd kuvetter med 2 (eller 4) cm optisk väglängd för vitvin, 1 cm för rosévin och 0,1 cm (eller 0,2 cm) för rödvin.De spektrofotometriska bestämningarna skall utföras med destillerat vatten i en kuvett med samma optiska våglängd b som referensvätskan för att nollställa absorbansskalan vid våglängderna 445, 495, 550 och 625 nm.De fyra motsvarande absorbanserna för vinet bestäms därefter med tre decimaler för den optiska väglängden b. Beteckna dessa A445, A495, A550 och A625.1.3.3 BeräkningMed ledning av dessa värden avläses vid en optisk väglängd = b cm motsvarande transmittansvärden (T%) i tabell 1. Beteckna dessa T445, T495, T550 och T625.- Beräkna tristimulusvärdena X, Y och Z, uttryckta som decimalbråk, med hjälp av följande formler:>Plats för tabell>- Beräkna kromaticitetskoordinaterna x och y medx = >NUM>X/>DEN>X + Y + Z y = >NUM>Y/>DEN>X + Y + Z1.3.4 Redovisning av resultaten1.3.4.1. Den relativa luminositeten erhålls med värdet för Y uttryckt i procent. (För svart är Y = 0 %, för färglösa vätskor är Y = 100 %.)1.3.4.2. Kromaticiteten uttrycks av den dominerande våglängden och renheten.Bestämning av dessa båda storheter görs utifrån kromaticitetsdiagrammet, begränsat av "spectrum locus", se figur 1. Punkten O som är inritad i diagrammet representerar den vita ljuskälla som används och har tilldelats koordinaterna för en standardljuskälla, C, xo  = 0,3101 och y° = 0,3163, dvs. dagsljus med normal ljusstyrka.- Dominerande våglängdRita in punkten C med koordinaterna x och y på kromaticitetsdiagrammet.Om C ligger utanför triangeln AOB ritas en rak linje som förbinder O med C och dras ut så att den skär igenom "spectrum locus" vid punkten S, som motsvarar den dominerande våglängden.Om C ligger innanför triangeln AOB ritas en rak linje från C till O och dras ut så att den skär igenom "spectum locus" vid en punkt som motsvarar våglängden för vinets komplementfärg. Denna våglängd anges med sitt värde åtföljt av bokstaven C.- Renhet.Om punkten C ligger utanför triangeln AOB anges renheten i procent med förhållandet:100 × >NUM>avstå/>DEN>ndet från C till O;avståndet från O till SOm punkten C ligger innanför triangeln AOB anges renheten i procent med förhållandet:100 × >NUM>avståndet från C:till O:hon(19)/>DEN>avståndet från O:till Pdär P är den punkt där den raka linjen OC skär igenom linjen för purpur (linje AB).Renheten anges också direkt med hjälp av kromaticitetsdiagram utifrån de kända värdena för x och y (fig. 2, 3, 4, 5 och 6).1.3.4.3. ResultatVinets färg definieras helt av dess luminositet, dess kromaticitet (den dominerade våglängden) och dess renhet.Dessa skall anges i analysrapporten tillsammans med den optiska våglängd som användes för bestämningen.1.4. RUTINMETOD1.4.1 Apparatur1.4.1.1. Spektrofotometer för bestämning mellan 300 och 700 nm.1.4.1.2. Parvisa glaskuvetter med optiska väglängder b motsvarande 0,1; 0,2; 0,5 och 1 cm.1.4.2 Förbehandling av provetGrumligt vin skall klaras med centrifugering.Större delen av koldioxiden i unga och mousserande viner skall avlägsnas genom omskakning under vakuum.1.4.3 MetodDen optiska väglängden b i glaskuvetten skall väljas så att den uppmätta absorbansen A ligger mellan 0,3 och 0,7.De spektrofotometriska bestämningarna skall göras med destillerat vatten i en kuvett med samma optiska våglängd b som referensvätskan för att nollställa absorbansskalan vid våglängderna 420, 520 och 620 nm.1.4.4 Redovisning av resultaten1.4.4.1. BeräkningBeräkna absorbanserna vid de tre våglängderna för en optisk väglängd av 1 cm genom att dividera de uppmätta absorbanserna med b i centimeter. Beteckna dessa A420, A520 och A620.Färgintensiteten I anges traditionellt med följande formel:I = A420 + A520 + A620Intensiteten anges med 3 decimaler.Nyansen N anges traditionellt med följande formel:N = >NUM>A420/>DEN>A520Nyansen anges med 3 decimaler.TABELL 1 >Start Grafik>Omvandling av absorbans till transmittans (T%)AnvändningsmetodSök absorbansens första decimal i den första lodräta kolumnen och kalla denna rad R. Sök absorbansens andra decimal i den övre horisontella raden och kalla denna kolumn C.Läs av siffran i rutan där rad R och kolumn C möts. För beräkning av transmittansen divideras denna siffra med 10 om absorbansen är mindre än 1, med 100 om den ligger mellan 1 och 2 och med 1 000 om den ligger mellan 2 och 3.Anmärkning:Siffran i övre högra hörnet i varje ruta gör det möjligt att beakta absorbansens tredje decimal genom interpolering.>Slut Grafik>>Hänvisning till >Exempel:>Plats för tabell>Transmittansen T% skall anges med 0,1 % noggrannhet.>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >2. RENAD KONCENTRERAD MUST2.1 PrincipBestämning av absorbansen, vid 425 nm genom 1 cm tjocklek, för renad koncentrerad must efter spädning för att erhålla en sockerhalt av 25 % (W/W) (25 °Brix).2.2 Apparatur2.2.1. Spektrofotometer för bestämning mellan 300 och 700 nm.2.2.2. Glaskuvetter med en optisk väglängd av 1 cm.2.2.3. Membranfilter med pordiameter 0,45 ìm.2.3 Metod2.3.1 Beredning av provetAnvänd en lösning med 25 % sockerhalt (w/w) (25 °Brix) som har beretts enligt anvisningarna i kapitlet "pH", punkt 4.1.2. Filtrering görs genom ett membranfilter med pordiameter 0,45 ìm.2.3.2 AbsorbansbestämningNollställ absorbansskalan på våglängden 425 nm med en kuvett med 1 cm optisk väglängd innehållande destillerat vatten.Bestäm absorbansen A vid samma våglängd som lösningen med 25 % socker (25 °Brix) som har beretts enligt 2.3.1 och hällts i en kuvett med 1 cm optisk väglängd.2.4 Redovisning av resultatenDen renade koncentrerade mustens absorbans vid 425 nm i en lösning med 25 % socker (25 °Brix) anges med två decimaler.41. FOLIN-CIOCALTEU-INDEX 1. DEFINITIONFolin-Ciocalteu-index erhålls med den metod som beskrivs nedan.2. PRINCIPER FÖR METODENSamtliga fenolföreningar i vinet oxideras av Folin-Ciocalteu-reagensen, som består av en blandning av fosforvolframsyra (H3PW12O40) och fosformolybdensyra (H3PMo12O40), som efter oxidering av fenolerna reduceras till en blandning av blå volframoxider (W8O23) och molybdenoxider (Mo8O23).Den blåfärgning som erhålls har maximal absorption omkring 750 nm och är proportionell mot den totala halten av fenolföreningar som ursprungligen fanns i vinet.3. REAGENSERDessa skall vara av analytisk kvalitet och det vatten som används skall vara destillerat eller av likvärdig renhetsgrad.3.1 Folin-Ciocalteu-reagensDetta reagens finns i handeln i en form som är färdig att använda. Den kan beredas på följande sätt: Lös 100 g natriumvolframat (NA2WO4 × 2H2O) och 25 g natriummolybdat (Na2MoO4, 2H2O) i 700 ml destillerat vatten. Tillsätt 50 ml 85-procentig fosforsyra (ñ20 = 1,71 g/ml) och 100 ml koncentrerad saltsyra (ñ20 = 1,19 g/ml). Låt koka upp och koka i 10 timmar under återflöde. Tillsätt därefter 150 g litiumsulfat (Li2SO4 × H2O) och några droppar brom. Koka därefter igen i 15 minuter. Låt svalna och späd till 1 liter med destillerat vatten.3.2. Vattenfritt natriumkarbonat, NA2CO3, som späds till en 20 % lösning (w/v).4. APPARATURVanlig laboratorieutrustning, i första hand:4.1. 100 ml mätkolvar.4.2. Spektrofotometer som kan användas vid 750 nm.5. METOD5.1 RödvinHäll följande i en 100 ml mätkolv (4.1) i den ordningsföljd som anges här:1 ml av vinet som har spätts i förväg 1:5,50 ml destillerat vatten,5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (3.1),20 ml natriumkarbonatlösning (3.2).Späd till 100 ml med destillerat vatten.Rör om för att homogenisera. Vänta i 30 minuter så att reaktionen stabiliseras. Bestäm absorbansen vid 750 nm genom en väglängd av 1 cm i förhållande till ett nollprov som har beretts med destillerat vatten istället för vin.Om absorbansen inte ligger omkring 0,3 skall lösningen spädas på lämpligt sätt.5.2 VitvinAnvänd samma metod med 1 ml outspätt vin.5.3 Renad koncentrerad must5.3.1 Beredning av provetAnvänd lösningen med en sockerhalt på 25 % (w/w) (25 °Brix) som har beretts enligt anvisningarna i kapitlet "pH", avsnitt 4.1.2.5.3.2 BestämningFörfar enligt anvisningarna för rödvin (5.1) och använd ett 5 ml prov som har beretts enligt anvisningarna i 5.3.1. Bestäm absorbansen i förhållande till ett referensprov som har beretts med 5 ml av en 25 % (w/w) invertsockerlösning.6. REDOVISING AV RESULTATEN6.1 BeräkningsmetodResultatet redovisas i form av ett index som erhålls genom att absorbansen multipliceras med 100 för röda viner spädda 1:5 (eller med motsvarande faktor för andra spädningar) och med 20 för vita viner. För renad koncentrerad must multipliceras med 16.6.2. RepeterbarhetDifferensen mellan resultaten från två bestämningar som utförts samtidigt eller omedelbart efter varandra av samma person får inte vara större än 1.God repeterbarhet uppnås om väl rengjord apparatur används (mätkolvar och spektrofotometer-kuvetter).42. SPECIELLA ANALYSMETODER FÖR RENAD DRUVMUST a) TOTALHALT AV KATJONER1. PRINCIPER FÖR METODENAnalysprovet behandlas med en kraftigt sur katjonbytare. Katjonerna byts mot H+. Den totala katjonhalten uttrycks som skillnaden mellan eluatets totala syrahalt och analysprovets syrahalt.2. APPARATUR2.1 Glaskolonn med en innerdiameter av 10 11 mm, ca 300 mm lång, med en avtappningskran.2.2 pH-mätare indelad i minst 0,1 pH-enheter.2.3 Elektroder:- glaselektrod som förvaras i destillerat vatten,- referenselektrod med kalomelmättad kaliumklorid som förvaras i en mättad lösning av kaliumklorid,- eller en kombinerad elektrod som förvaras i destillerat vatten.3. REAGENSER3.1 Kraftigt sur katjonbytarharts i H+-form som har fått svälla i vatten över natten.3.2 Natriumhydroxidlösning, 0,1 M.3.3 pH-indikatorpapper.4. METOD4.1 Beredning av provetAnvänd en lösning som framställs genom att renad koncentrerad must späds till 40 % (w/v) enligt anvisningarna i kapitlet "Total syrahalt", avsnitt 5.1.2.4.2 Beredning av jonbytarkolonnPlacera ca 10 ml i förväg svälld jonbytare i H+-form i kolonnen. Skölj kolonnen med destillerat vatten till dess att all syra har avlägsnats och kontrollera detta med indikatorpapper.4.3 JonbyteHäll 100 ml av lösningen av renad koncentrerad must som har beretts enligt 4.1. genom kolonnen med en hastighet av 1 droppe/sekund. Samla upp eluatet i bägaren. Skölj kolonnen med 50 ml destillerat vatten. Titrera syran i eluatet (ta med sköljvattnet) med 0,1 M natriumhydroxidlösning till dess att pH-värdet är 7 vid 20 °C. Den alkaliska lösningen skall tillsättas långsamt under omskakning av lösningen. Den använda mängden 0,1 M natriumhydroxidlösning betecknas n ml.5. REDOVISNING AV RESULTATENDen totala katjonhalten anges i mval/kg av den totala sockerhalten med en decimal.5.1 Beräkning- Eluatets syrahalt i mval/kg renad koncentrerad must:E = 2,5 × n- Den totala syrahalten i den renade koncentrerade musten i mval/kg (se "Total syrahalt", avsnitt 6.1.2): a- Den totala katjonhalten i mval/kg av totala sockerhalten:>NUM>2,5 n - a/>DEN>P × 100där P = halten i procent (w/w) av den totala sockerhalten.b) KONDUKTIVITET1. PRINCIP FÖR METODENDen elektriska konduktiviteten i en vätskekolonn som avgränsas av två parallella platinaelektroder bestäms genom att kolonnen placeras i ena grenen av en Wheatstone-mätbrygga.Konduktiviteten varierar med temperaturen och anges därför vid 20 °C.2. APPARATUR2.1 Konduktivitetsmätare för bestämning av konduktiviteten mellan 1 och 1 000 mikrosiemens/cm (ìS cm).2.2 Vattenbad för att ställa in analysprovernas temperatur till ca 20 °C (20 ± 2 °C).3. REAGENSER3.1 Demineraliserat vatten med specifik konduktivitet under 2 ìS cm-1 vid 20 °C.3.2 Referenslösning av kaliumklorid.Lös 0,581 g kaliumklorid, KCl, som i förväg torkats till en konstant vikt vid en temperatur av 105 °C, i demineraliserat vatten (3.1). Späd till 1 l med demineraliserat vatten (3.1). Denna lösning har en konduktivitet på 1 000 ìS cm-1 vid 20 °C och bör inte sparas i mer än tre månader.4. METOD4.1 Beredning av analysprovAnvänd en lösning med en total sockerhalt av 25 % (w/w) (25 °Brix), enligt beskrivning i kapitlet "pH", avsnitt 4.2.1.4.2 Bestämning av konduktivitetVärm analysprovet till 20 °C genom att sänka ned det i ett vattenbad. Håll temperaturen vid 20° ± 0,1 °C.Skölj konduktivitetscellen två gånger med den lösning som skall analyseras.Bestäm konduktiviteten och ange resultatet i ìS cm-1.5. REDOVISNING AV RESULTATENResultatet anges i mikrosiemens/cm (Scm-1) vid 20 °C till närmaste heltal för en 25 % (w/w) (25 °Brix) lösning av renad koncentrerad must.5.1 BeräkningOm apparaten inte har någon anordning för temperaturreglering korrigeras den uppmätta konduktiviteten med hjälp av tabell 1. Om temperaturen är under 20 °C läggs korrektionen till, om temperaturen är över 20 °C dras korrektionen ifrån.TABELL 1 >Start Grafik>Korrektion av konduktiviteten vid temperaturer som avviker från 20 °C (ìS cm-1)>Slut Grafik>>Hänvisning till >c) HYDROXIMETYLFURFURAL1. PRINCIPER FÖR METODERNA1.1 Kolorimetrisk metodAldehydderivat av furan, av vilka den viktigaste är hydroximetylfurfural, reagerar med barbitursyra och paratoluidin och ger upphov till en röd förening som bestäms kolorimetriskt vid 550 nm.1.2 HPLC (vätskekromatografi)Separering på kolonn med omvänd fas och bestämning vid 280 nm.2. KOLORIMETRISK METOD2.1 Apparatur2.1.1 Spektrofotometer för bestämning mellan 300 och 700 nm.2.1.2 Glaskuvetter med 1 cm optisk våglängd.2.2 Reagenser2.2.1 Barbitursyra, 0,5 % lösning (w/v).Lös 500 mg barbitursyra, C4O3N2H4, i destillerat vatten och värm lätt över vattenbad vid 100 °C. Späd till 100 ml med destillerat vatten. Lösningen är hållbar i ca en vecka.2.2.2 Paratoluidinlösning, 10 % (w/v).Häll 10 g paratoluidin, C6H4(CH3)NH2, i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 50 ml isopropanol, CH3CH(OH)CH3, och 10 ml isättika, CH3COOH (ñ20 = 1,05 g/ml). Späd till 100 ml med isopropanol. Lösningen är hållbar endast en dag.2.2.3 Etanal (acetaldehyd), CH3CHO, 1 % (w/v) vattenhaltig lösning.Bered omedelbart före användning.2.2.4 Vattenhaltig lösning av hydroximetylfurfural, C6O3H6, 1 g/l.Bered lösningar innehållande 5, 10, 20, 30 resp. 40 mg/l. Lösningarna om 1 g/l och de spädda lösningarna skall beredas omedelbart före användning.2.3 Metod2.3.1 Beredning av provetAnvänd den lösning som erhålls genom spädning av renad koncentrerad must till 40 % (m/v), enligt anvisningarna i kapitlet "Total syrahalt", avsnitt 5.1.2. Utför bestämningen på 2 ml av denna lösning.2.3.2 Kolorimetrisk bestämningHäll 2 ml av provet, som beretts enligt 2.3.1, i två 25 ml kolvar, a resp b, med proppar av slipat glas. Häll 5 ml paratoluidinlösning (2.2.2) i vardera flaskan. Blanda och tillsätt 1 ml destillerat vatten till kolv b (referens) och 1 ml barbitursyra (2.2.1) till kolv a. Skaka om för att homogenisera. Överför innehållet i kolvarna till spektrofotometerkuvetter med 1 cm optisk väglängd. Nollställ absorbansskalan med hjälp av innehållet i kolv b för en våglängd om 550 nm. Följ absorbansvariationen för innehållet i kolv a. Notera maximala värdet A som uppnås efter 2 5 min.Prov som innehåller mer hydroximetylfurfural än 30 mg/l skall spädas före analys.2.3.3 Beredning av kalibreringskurvanHäll 2 ml av hydroximetylfurfurallösningarna med 5, 10, 20, 30 resp. 40 mg/l (2.2.4.) i två serier 25 ml kolvar, benämnda a och b, och behandla dem enligt anvisningarna i 2.3.2.Kurvan över variationen av absorbansen med halten av hydroximetylfurfural i mg/l är en rak linje som skär igenom nollpunkten.2.4 Redovisning av resultatenHalten av hydroximetylfurfural i renad koncentrerad must anges i mg/kg av den totala sockerhalten.2.4.1 BeräkningsmetodHalten C av hydroximetylfurfural i mg/l i analysprovet är lika med den koncentration på kalibreringskurvan som motsvarar den för provet bestämda absorbansen A.Halten av hydroximetylfurfural i mg/kg av den totala sockerhalten blir:250 × >NUM>C/>DEN>PP = den totala sockerhalten i procent (w/w) i den renade koncentrerade musten.3. HPLC (VÄTSKEKROMATOGRAFI)3.1 Apparatur3.1.1 HPLC-apparat med- injektor, 5 eller 10 ìl,- spektrofotometerdetektor för bestämning vid 280 nm,- kolonn av oktadecylbunden silica (tex Bondapak C18 - Corasil, Waters Ass.),- skrivare, eventuellt integrator.Den mobila fasens flödeshastighet skall vara 1,5 ml/min.3.1.2 Membranfiltreringsapparat med pordiameter 0,45 ìm.3.2 Reagenser3.2.1 Dubbeldestillerat vatten.3.2.2 Metanol, CH3OH, destillerat eller av HPLC-kvalitet.3.2.3 Ättiksyra, CO3COOH (ñ20 = 1,05 g/ml).3.2.4 Mobil fas: vattenmetanol (3.2.2), ättiksyra (3.2.3) som i förväg filtrerats genom ett membranfilter (0,45 ìm), (40 - 9 - 1 v/v).Den mobila fasen skall beredas dagligen och avgasas före användning.3.2.5 Referenslösning av hydroximetylfurfural, 25 mg/l (v/v).Häll 25 mg noggrant vägd hydroximetylfurfural, C6H3O6, i en 100 ml mätkolv och fyll upp till märket med metanol (3.2.2). Späd denna lösning 1:10 med metanol (3.2.2) och filtrera genom membranfilter (0,45 ìm).Om lösningen förvaras i en brun flaska i kylskåp är den hållbar i 2 3 månader.3.3 Metod3.3.1 Beredning av provetAnvänd den lösning som erhålls genom spädning av den renade koncentrerade musten till 40 % (w/v) enligt anvisningarna i kapitlet "Total syrahalt", punkt 5.1.2., och filtrera den genom ett membranfilter med 0,45 ìm pordiameter.3.3.2 Kromatografisk bestämningSpruta in 5 (eller 10) ìl av provet som beretts enligt 3.3.1 och 5 (eller 10) ìl av referenslösningen av hydroximetylfurfural (3.2.5) i kromatografen. Skriv ut kromatogrammet.Retentionstiden för hydroximetylfurfural är ca 6 7 min.3.4 Redovisning av resultatenHalten av hydroximetylfurfural i renad koncentrerad must anges i mg/kg av den totala sockerhalten.3.4.1 BeräkningsmetodHalten av hydroximetylfurfural i den 40 % (m/v) lösningen av renad koncentrerad must betecknas C mg/l.Halten av hydroximetylfurfural i mg/kg av den totala sockerhalten blir:>NUM>250 ×/>DEN>C;Pdär P är den totala sockerhalten i procent (w/w) i den renade koncentrerade musten.d) TUNGMETALLER1. PRINCIPER FÖR METODERNAI. Snabbmetod för bestämning av tungmetallerTungmetaller kan upptäckas i den på lämpligt sätt spädda renade koncentrerade musten genom den färgning som uppträder när sulfider bildas. De bestäms genom jämförelse med en standardblylösning som motsvarar den högsta tillåtna halten.II. Bestämning av blyhalten med hjälp av atomabsorptionsspektrofotometriDet kelat som bly bildar tillsammans med ammonium-pyrrolidin-ditiokarbamat extraheras med metylisobutylketon och absorbansen bestäms vid 283,3 nm. Blyhalten bestäms genom att kända tillsatta mängder bly används i en serie referenslösningar.2. SNABBMETOD FÖR BESTÄMNING AV TUNGMETALLER2.1 Reagenser2.1.1 Spädd saltsyra, 70 % (w/v).Ta 70 g saltsyra, HCl (ñ20 = 1,16   1,19 g/ml) och späd till 100 ml med vatten.2.1.2 Spädd saltsyra, 20 % (w/v).Ta 20 g saltsyra, HCl (ñ20 = 1,16   1,19 g/ml) och späd till 100 ml med vatten.2.1.3 Spädd ammoniak.Ta 14 g ammoniak, NH3 (ñ20  = 0,931   0,934 g/ml) och späd till 100 ml med vatten.2.1.4 Buffertlösning, ph 3,5.Lös 25 g ammoniumacetat, CH3COONH4, i 25 ml vatten och tillsätt 38 ml spädd saltsyra (2.1.1). Vid behov justeras pH-värdet med den spädda saltsyran (2.1.2) eller spädd ammoniak (2.1.3). Späd till 100 ml med vatten.2.1.5 Tioacetamidlösning, C2H5SN, 4 % (w/v)2.1.6 Glycerollösning, C3H8O3, 85 % (w/v)(n20 °CD = 1,449 - 1,455).2.1.7 TioacetamidreagensTillsätt 1 ml av en blandning av 5 ml vatten, 15 ml 1 M natriumhydroxidlösning och 20 ml glycerol (2.1.6) till 0,2 ml tioacetamidlösning (2.1.5). Värm över vattenbad vid 100 °C i 20 sekunder. Bered omedelbart före användning.2.1.8 Blylösning, 0,002 g/lBered en blylösning, 1 g/l, genom att lösa 0,400 g blynitrat, Pb(NO3)2, i vatten och fyll upp till 250 ml med vatten. När lösningen skall användas späds den till 2 promille (v/v) så att en 0,002 g/l lösning erhålls.2.2 MetodLös ett analysprov om 10 g av den renade koncentrerade musten i 10 ml vatten. Tillsätt 2 ml av buffertlösningen med pH 3,5 (2.1.4). Blanda. Tillsätt 1,2 ml av tioacetamidreagensen (2.1.7). Blanda omedelbart. Bered referenslösningen under samma betingelser genom att använda 10 ml av 0,002 g/l blylösningen (2.1.8).Efter 2 minuter skall eventuell brunfärgning i lösningen av renad koncentrerad must inte vara intensivare än brunfärgningen i referensprovet.2.3 BeräkningUnder de betingelser som beskrivs ovan motsvarar referensprovet en högsta tillåten halt av tungmetaller, uttryckt som bly, av 2 mg/kg renad koncentrerad must.3. BESTÄMNING AV BLYINNEHÅLL MED ATOMABSORPTIONSSPEKTROFOTOMETRI3.1 Apparatur3.1.1 Atomabsorptionsspektrofotometer med luftacetylenbrännare.3.1.2 Blyhålkatodlampa.3.2 Reagenser3.2.1 Spädd ättiksyra.Ta 12 g isättika (ñ20 = 1,05 g/ml) och fyll upp till 100 ml med vatten.3.2.2 Lösning av ammoniumpyrrolidin-ditiokarbamat, C5H12N2S2, 1 % (w/v).3.2.3 Metylisobetylketon (CH3)2CHCH2COCH3.3.2.4 Blylösning, 0,010 g/l.Späd blylösningen, 1 g/l, (2.1.8) till 1 % (v/v).3.3 Metod3.3.1 Beredning av provlösningLös 10 g renad koncentrerad must i en blandning av lika stora volymer spädd ättiksyra (3.2.1) och vatten och fyll upp till 100 ml med denna blandning.Tillsätt 2 ml ammoniumpyrrolidin-ditiokarbamatlösning (3.2.2) och 10 ml metylisobutylketon (3.2.3). Skaka om i 30 sekunder och skydda från direkt ljus. Låt de båda skikten separera. Använd metylisobutylketonskiktet.3.3.2 Beredning av referenslösningarBered tre referenslösningar som förutom 10 g renad koncentrerad must innehåller 1, 2 resp. 3 ml av en blylösning, 0,010 g/l (3.2.4). Behandla dessa på samma sätt som provlösningen.3.3.3 ReferensprovBered ett referensprov enligt samma metod som i 3.3.1, men utan tillsats av renad koncentrerad must.3.3.4 BestämningStäll in våglängden på 283,3 nm.Atomisera metylisobutylketonet från referensprovet i flamman och nollställ absorbansskalan.Bestäm absorbanserna för respektive extrakt som motsvarar provlösningen och referenslösningarna.3.4 Redovisning av resultatenAnge blyhalten i mg/kg renad koncentrerat must med en decimal.3.4.1 BeräkningRita kurvan över absorbansvariationen som en funktion av den blykoncentration som tillsats referenslösningarna. Nollkoncentrationen motsvarar provlösningen.Extrapolera den räta linjen som sammanbinder punkterna tills den når den negativa delen av koncentrationsaxeln. Avståndet från denna punkt till nollpunkten anger blyhalten i provlösningen.e) KEMISK BESTÄMNING AV ETANOLDenna metod används för bestämning av alkoholhalten i vätskor med låg alkoholhalt, som must, koncentrerad must och renad koncentrerad must.1. PRINCIP FÖR METODENEnkel destillation av vätskan. Oxidation av etanolen i destillatet med kaliumdikromat. Filtrering av överskottsdikromat med järn(II)lösning.2. APPARATUR2.1 Använd den destillationsapparat som beskrivs i kapitlet "Alkoholhalt i volymprocent", avsnitt 3.2.3. REAGENSER3.1 KaliumdikromatlösningLös 33,600 g kaliumdikromat, K2Cr2O7, i tillräckligt med vatten för att ge 1 liter lösning vid 20 °C.1 ml av denna lösning oxiderar 7,8924 mg alkohol.3.2 Järn (II) ammoniumsulfatlösningLös 135 g järn (II) ammoniumsulfat, FeSO4, (NH4)2SO4, 6H2O, i tillräckligt med vatten för att ge 1 liter lösning och tillsätt 20 ml koncentrerad svavelsyra (H2SO4) (ñ20 = 1,84 g/ml). Denna lösning motsvarar ungefär halva volymen diktromatlösning när den just beretts och oxideras därefter långsamt.3.3 Kaliumpermanganatlösning.Lös 1,088 g kaliumpermanganat, KMnO4, i tillräcklig mängd vatten för att ge 1 liter lösning.3.4 Spädd svavelsyra, 1:2 (v/v)Tillsätt gradvis under omrörning 500 ml svavelsyra, H2SO4 (ñ20  = 1,84 g/ml) till 500 ml vatten.3.5 Ferro-ortofenantrolinreagensLös 0,695 g järnsulfat, FeSO4, 7 H2O, i 100 ml vatten och tillsätt 1,485 g ortofenantrolinmonohydrat, C12H8N2, H2O. Värm för att påskynda lösningen. Denna klart röda lösning har god hållbarhet.4. METOD4.1 DestillationHäll 100 g renad koncentrerad must och 100 ml vatten i en destillationskolv. Samla upp destillatet i en 100 ml mätkolv och fyll upp till märket med vatten.4.2 OxidationAnvänd en kolv (300 ml) med en propp av slipat glas och bred hals, vilket gör att halsen kan sköljas utan att något av innehållet går förlorat. Häll 20 ml av titreringsmedlet kaliumdikromatlösning (3.1) och 20 ml av den spädda svavelsyran, 1:2 (v/v) (3.4) i kolven och skaka om. Tillsätt 20 ml av destillatet. Tillslut kolven, skaka om och vänta i minst 30 minuter. Skaka emellanåt. (Detta är "bestämningskolven".)Titrera järn (II) ammoniumsulfatlösningen (3.2) i förhållande till kaliumdikromatlösningen genom att i en identisk kolv hälla samma mängder reagens, men ersätt de 20 millilitrarna destillat med 20 ml destillerat vatten. (Detta är "referenskolven").4.3 TitreringTillsätt fyra droppar ortofenantrolinreagens (3.5) till innehållet i "bestämningskolven". Titrera överskottsdikromat genom att tillsätta järn(II)ammoniumsulfatlösningen (3.2). Avbryt tillsatsen av järn(II)lösningen när blandningen ändrar färg från grönblått till brunt.För att kunna bestämma slutpunkten mer exakt ändras blandningens färg tillbaka från brunt till grönblått med kaliumpermanganatlösningen (3.3). Dra ifrån 1/10 av den använda volymen av denna lösning från den tillsatta volymen järn(II)lösning. Skillnaden betecknas n ml.Gör på samma sätt med "referenskolven". Skillnaden betecknas n' ml.5. REDOVISNING AV RESULTATENEtanolen anges i g/kg socker med 1 decimal.5.1 Beräkningsmetodn' ml järn (II) lösning reducerar 20 ml dikromatlösning, som oxiderar 157,85 mg ren etanol.1 ml järn (II) lösning har samma reducerande förmåga som>NUM>157,85/>DEN>n' mg etanoln   n' ml järn (II) lösning har samma reducerande förmåga som157,85 × >NUM>n' - n/>DEN>n' mg etanolEtanolhalten i g/kg renad koncentrerad must blir:7,892 × >NUM>n' - n/>DEN>n'Etanolhalten i g/kg av den totala sockerhalten blir:789,2 × >NUM>n' - n/>DEN>n' × Pdär P är halten i procent (w/w) av den totala sockerhalten.f) MESO-INOSITOL, SCYLLO-INOSITOL OCH SACKAROS1. PRINCIPGaskromatografi av silylerade derivat.2. REAGENSER2.1 Intern standard: xylitol (vattenhaltig lösning om ca 10 g/l till vilken en knivsudd natriumasid har tillsatts).2.2 Bis(trimetylsilyl)trifluoracetamid - BSTFA - (C8H18F3NOSi2).2.3 Trimetylklorsilan (C3H9ClSi).2.4 Pyridin p. A. (C5H5N).2.5 Meso-inositol (C6H12O6).3. APPARATUR3.1 Gaskromatograf med:3.2 Kapillärkolonn (t. ex. av kvartsglas, belagt med OV 1 med 15 ìm tjocklek, längd 25 m och innerdiameter 0,3 mm).Driftsbetingelser:- bärargas: väte eller helium- bärargasens flödeshastighet: ca 2 ml/minut- injektor- och detektortemperatur: 300 °C- temperaturprogrammering: 1 minut vid 160 °C, 4 °C per minut till 260 °C, konstant temperatur på 260 °C i 15 minuter.- splitförhållande: ca 1:20.3.3 Integrator.3.4 Mikrospruta, 10 ìl.3.5 Mikropipetter, 50, 100 resp. 200 ìl.3.6 2 ml kolv med en teflonpropp.3.7 Ugn.4. ARBETSMETODEtt noggrant vägt prov på ca 5 g renad koncentrerad must hälls i en 50 ml kolv. En ìl av en standardlösning av xylitol (2.1) tillsätts och kolven fylls upp med vatten. Efter blandning tas 100 ìl av lösningen ut och hälls i en kolv (3.6), där den torkas under en svag luftström. 100 ìl absolut etylalkohol kan tillsättas vid behov för att underlätta indunstningen.Resten löses försiktigt i 100 ìl pyridin (2.4) och 100 ìl bis(trimetylsilyl)trifluoracetamid (2.2) s vid 60 °C i en timme.Ta ut 0,5 ìl klar vätska och spruta in med hjälp av en ihålig upphettad nål i enlighet med det angivna splitförhållandet.5. BERÄKNING AV RESULTATEN5.1 Bered en lösning som innehåller:60 g/l glukos, 60 g/l fruktos, 1 g/l meso-inositol och 1g/l sackaros.5 g av lösningen vägs och metoden i punkt 4 följs. Resultaten för meso-inositol och sackaros beräknas i förhållande till xylitol från kromatogrammet.För scyllo-inositol, som inte finns i handeln och som har en retentionstid som ligger mellan den sista toppen för den anomera formen av glukos och toppen för meso-inositol (se diagram på nästa sida), används samma resultat som det som beräknats för meso-inositol.6. REDOVISNING AV RESULTATEN6.1 Meso-inositol och scyllo-inositol anges i mg/kg socker. Sackaros anges i g/kg must.>Hänvisning till >(1) Varje pyknometer med likvärda egenskaper kan användas.(2) Räkneexempel ges i punkt 6 i detta kapitel.(3) Räkneexempel ges i punkt 6 i detta kapitel.(4) Sockerhaltenär uttryckt som invertsocker).(5) Sockerhalten är uttryckt som invertsocker.(6) Exempel: vid en alkoholhalt av 12 viktprocent är p = 0,12.(7) Dessa värden anges i avvaktan på att en databank upprättas på gemenskapsnivå för sådana värden.(8) Ett varumärke är "norite".(9) 105 pascal (Pa) = 1 bar.(10) 1 Pa = 1 N/m2 = 10-5 bar.(11) Härvid bortses från andra gaser som är närvarande O22 m.fl.) i mängder som är för små för att påverka övertrycket.(12) Vissa viner, t.ex. starkviner, ger ett grumligt destillat även efter filtrering. I dessa fall skall destillatet hällas i en 200 ml destillationskolv, spädas till 30 ml med destillerat vatten och destilleras medan det fortfarande är alkaliskt. De första 15 ml av destillatet kastas bort. Kyl innehållet i kolven och surgör med ca 5 ml spädd svavelsyra och fortsätt destillationen. Samla upp destillatet i 5 ml av en 1 M natriumhydroxidlösning. Destillera ca 5 ml av vätskan som då blir klar.(13) Denna tillsättning är valfri. Det anses ibland lättare att observera förekomsten av grumlighet i en rosa lösning än i en färglös lösning.(14) n' = 0,05 eller 0,1 ml on den använda vattenvolymen är mindre än 10 ml. För att en tydlig slutpunkt skall erhållas skall den använda volymen vara så liten som möjmigt och eventuell spâdning skall därför i möjligaste mån undvikas i själva analysen.(15) Detta avstånd måste anges i riktning från O till C.