CELEX: 31991D0180
Language: it
Date: 1991-02-14 00:00:00
Title: 91/180/CEE: Decisione della Commissione, del 14 febbraio 1991, che stabilisce metodi di analisi e di prova relativi al latte crudo e al latte trattato termicamente

Avis juridique important

|

31991D0180

91/180/CEE: Decisione della Commissione, del 14 febbraio 1991, che stabilisce metodi di analisi e di prova relativi al latte crudo e al latte trattato termicamente  

Gazzetta ufficiale n. L 093 del 13/04/1991 pag. 0001 - 0048 edizione speciale finlandese: capitolo 3 tomo 37 pag. 0012  edizione speciale svedese/ capitolo 3 tomo 37 pag. 0012 

DECISIONE DELLA COMMISSIONE del 14 febbraio 1991 che stabilisce metodi di analisi e di prova relativi al latte crudo e al latte trattato termicamente (91/180/CEE) LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,  visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,  vista la direttiva 85/397/CEE del Consiglio, del 5 agosto 1985, concernente i problemi sanitari e di polizia sanitaria negli scambi intracomunitari di latte trattato termicamente (1), modificata da ultimo dalla direttiva 89/662/CEE (2), in particolare  l'articolo 10, paragrafo 2,  considerando che, a norma dell'articolo 10, paragrafo 2 della direttiva 85/397/CEE, la Commissione adotta i metodi d'analisi e di prova da applicare per la verifica dell'osservanza delle disposizioni relative al latte crudo e al latte trattato  termicamente;  considerando che, per il latte crudo, è necessario stabilire metodi che consentano di accertare il tenore di germi, il tenore di cellule, il punto di congelamento e la presenza di antibiotici;  considerando che, per il latte pastorizzato, è necessario stabilire metodi che consentano di accertare il tenore di germi, il tenore di cellule, il punto di congelamento e la presenza di antibiotici;  considerando che, per il latte pastorizzato, è necessario stabilire metodi che consentano di accertare l'assenza di germi patogeni, il numero di coliformi, il tenore di germi, l'assenza di fosfatasi, la presenza di perossidasi, l'assenza di antibiotici  e il punto di congelamento;  considerando che, per il latte sterilizzato e il latte UHT, è necessario stabilire metodi che consentano di accertare il tenore di germi e l'assenza di antibiotici;  considerando che, per motivi d'ordine tecnico, è opportuno che in una prima fase vengano definiti, per garantire l'osservanza di determinate disposizioni, metodi d'analisi e di prova di riferimento; che è necessario proseguire l'esame delle condizioni  d'impiego dei metodi d'analisi e di prova di uso corrente; che, in attesa dei risultati di questo esame, le autorità competenti devono verificare che siano applicati i metodi d'uso corrente idonei a garantire l'osservanza delle norme della direttiva  85/397/CEE;   considerando che, nello stabilire i metodi d'analisi e di prova di riferimento, occorre determinare i procedimenti d'analisi e fissare criteri di attendibilità, ai fini dell'interpretazione uniforme dei risultati;  considerando che le misure previste dalla presente decisione sono conformi al parere del comitato veterinario permanente,  HA ADOTTATO LA PRESENTE DECISIONE:  Articolo 1 I procedimenti di analisi e prova da applicare come procedimenti di riferimento per il latte crudo sono i seguenti:  - determinazione del punto di congelamento,  - conteggio dei microrganismi - tenore di germi a 30 gC,  - conteggio delle cellule somatiche,  - accertamento degli antibiotici e dei sulfamidici.  Articolo 2 I procedimenti di analisi e prova da applicare come procedimenti di riferimento per il latte pastorizzato sono i seguenti:  - determinazione del punto di congelamento,  - determinazione dell'attività fosfatasica,  - determinazione dell'attività perossidasica,  - conteggio dei microrganismi - tenore di germi a 30 gC,  - conteggio dei microrganismi - tenore di germi a 21 gC,  - conteggio dei coliformi - conteggio delle colonie a 30 gC,  - accertamento degli antibiotici e dei sulfamidici,  - accertamento di microrganismi patogeni.  Articolo 3 I procedimenti di analisi e prova da applicare come procedimento di riferimento per il latte UHT e per il latte sterilizzato sono i seguenti:  - determinazione del punto di congelamento,  - conteggio dei microrganismi - tenore di germi a 30 gC,  - accertamento degli antibiotici e dei sulfamidici.  Articolo 4 L'attuazione dei procedimenti d'analisi e di prova di riferimento, l'applicazione dei criteri di attendibilità e la raccolta dei campioni devono aver luogo secondo le norme stabilite nell'allegato I.  Articolo 5 I procedimenti d'analisi e di prova di riferimento, menzionati agli articoli 1, 2 e 3, sono descritti nell'allegato II.  Articolo 6 La presente decisione verrà riesaminata entro il 31 dicembre 1992, per adeguarla al progresso delle conoscenze tecniche e scientifiche.  Articolo 7 Gli Stati membri sono destinatari della presente decisione.  Fatto a Bruxelles, il 14 febbraio 1991. Per la Commissione Ray MAC SHARRY Membro della Commissione (1) GU n. L 226 del 24. 8. 1985, pag. 13.(2)  GU n. L 395 del 30. 12. 1989, pag. 13.   ALLEGATO I     INDICE  Pagina II.  Disposizioni generali .  4 II.  Campionamento del latte crudo e del latte trattato termicamente .  6 1. DISPOSIZIONI GENERALI  1.  Introduzione Sono descritte le disposizioni generali concernenti i reattivi, le apparecchiature, l'espressione dei risultati, la precisione e le reazioni delle prove. Le autorità competenti degli Stati membri e i laboratori preposti ai prelievi e alle analisi del  latte devono rispettare le disposizioni generali.  2.  Reattivi 2.1.  Acqua 2.1.1.  Tutte le volte che venga fatto riferimento all'acqua ai fini della dissoluzione, della diluizione o del lavaggio con acqua, salvo diverse indicazioni, deve essere impiegata acqua distillata, acqua deionizzata o acqua demineralizzata di purezza almeno  equivalente. Per l'analisi microbiologica l'acqua deve essere esente da sostanze che potrebbero interessare o influenzare la crescita di microrganismi nelle condizioni sperimentali.  2.1.2.  Ove si parli, senza ulteriori precisazioni, di «soluzione» o di «diluizione», si intende «soluzione in acqua» o «diluizione con acqua».  2.2.  Sostanze chimiche Salvo altra indicazione, tutte le sostanze chimiche impiegate devono avere purezza analitica riconosciuta.  3.  Apparecchiatura 3.1.  Elenco delle apparecchiature L'elenco delle apparecchiature dei vari metodi di riferimento comprende soltanto le apparecchiature destinate a particolari impieghi o che richiedono determinate specifiche.  3.2.  Bilancia analitica Per bilancia analitica si intende una bilancia con sensibilità di 0,1 mg.  4.  Espressione dei risultati 4.1.  Risultati A meno che non sia specificato diversamente il risultato dichiarato nella relazione dell'analisi deve essere la media aritmetica dei valori ottenuti da due prove che soddisfino ai criteri di ripetibilità (5.1.) fissati per quel dato metodo. Qualora tali  criteri non vengano rispettati occorre ripetere il saggio oppure dichiarare non valido il risultato.  4.2.  Calcolo delle percentuali Salvo altre indicazioni, i risultati devono essere calcolati come percentuale in massa del campione.  5.  Criteri di precisione: ripetibilità e riproducibilità 5.1.  I criteri di precisione adottati per i vari procedimenti sono così definiti:  5.1.1.  Ripetibilità (r) è il valore al di sotto del quale dovrebbe cadere la differenza assoluta tra due singoli risultati di prova ottenuti con lo stesso procedimento su campioni di materiali identici, nelle stesse condizioni (stesso operatore, stessa  apparecchiatura, stesso laboratorio e a breve distanza di tempo).  5.1.2.  Riproducibilità (R) è il valore al di sotto del quale dovrebbe cadere la differenza assoluta tra due singoli risultati di prova ottenuti con lo stesso procedimento su campioni di materiali identici, in condizioni differenti (differenti operatori,  differenti apparecchiature, differenti laboratori e/o tempi).  5.1.3.  A meno che non sia specificato diversamente i valori relativi ai criteri di ripetibilità e riproducibilità dati nelle condizioni relative a ciascun procedimento rappresentano intervalli al grado di affidabilità del 95 % secondo la definizione della  norma ISO 5725:2 ed. 1986. Questi sono calcolati dai risultati di prove interlaboratorio riconosciute che sono state eseguite per valutare il procedimento. Per alcuni di questi procedimenti però non sono state effettuate prove interlaboratorio. In tali  casi si è provveduto a fare una stima dei valori della ripetibilità e della riproducibilità.  5.1.4.  Le prove interlaboratorio e gli studi di cui al punto 5.1.3 dovrebbero essere programmati e svolti conformemente agli orientamenti internazionali.  6.  Relazione La relazione della prova deve specificare il metodo di analisi adottato ed i risultati ottenuti. Riporta inoltre nei particolari procedimenti seguiti che non sono specificati nel metodo di analisi o che sono facoltativi, come pure tutti i fattori che  possono aver condizionato i risultati ottenuti. La relazione della prova riporta anche tutte le informazioni necessarie per la completa identificazione del campione.  II. CAMPIONAMENTO DEL LATTE CRUDO E DEL LATTE TRATTATO TERMICAMENTE  1.  Oggetto e campo di applicazione Questo procedimento descrive il metodo di riferimento per il campionamento del latte crudo e del latte trattato termicamente. Tale metodo, così come quelli per il trasporto e la conservazione dei campioni, si applica al latte crudo fornito direttamente  dal produttore ed a quello crudo o trattato termicamente contenuto in cisterne adibite al deposito ed al trasporto.  I metodi di cui ai punti 2, 4.4, 5 e 6 si applicano al campionamento del latte trattato termicamente destinato al consumo diretto.  2.  Generalità La campionatura del latte trattato termicamente contenuto in bidoni, cisterne, ecc. viene effettuata da personale specializzato appositamente addestrato.  Se del caso, le autorità competenti o il laboratorio di analisi provvedono a dare al personale una specifica formazione sulle tecniche di campionamento atte a garantire che il campione sia rappresentativo di tutta la partita e ad essa conforme.  Le autorità competenti o il laboratorio provvedono eventualmente ad addestrare il personale su come etichettare il campione per poterlo identificare senza errori.  3.  Apparecchi per la campionatura 3.1.  Generalità L'attrezzatura per il campionamento deve essere fabbricata in acciaio inossidabile o in altro materiale equivalente sufficientemente robusto e realizzata in modo da servire adeguatamente allo scopo (miscelazione, campionamento, ecc.). Gli stantuffi e  gli agitatori per mescolare i liquidi nei recipienti devono avere dimensioni tali da garantire un adeguato rimescolamento del prodotto senza però provocare lo sviluppo di rancidità. I mestoli devono essere provvisti di un solido manico sufficientemente  lungo in modo da consentire il prelievo in qualsiasi punto del recipiente. La sua capacità non deve essere inferiore a 50 ml.  I recipienti destinati a contenere i campioni e i relativi coperchi devono essere di vetro oppure di un metallo o di una materia plastica adeguati.  I materiali con cui è realizzata l'attrezzatura per la campionatura (recipienti e coperchi compresi) non devono dare luogo ad alcuna interazione con il campione che possa alterare i risultati dell'esame. Tutte le superfici dell'attrezzatura per il  campionamento e dei recipienti devono essere pulite ed asciutte, levigate e prive di fessure; gli spigoli devono essere arrotondati.  3.2.  Attrezzatura di campionamento per l'analisi microbiologica L'attrezzatura per il campionamento, recipienti inclusi, oltre a soddisfare ai requisiti del punto 3.1 deve essere sterile.  Se la stessa attrezzatura viene usata per più campionamenti successivi, essa deve essere pulita e sterilizzata dopo ciascun campionamento, conformemente alle istruzioni o ai requisiti del laboratorio di prova o delle autorità competenti, in modo da non  condizionare i risultati degli esami successivi.  4.  Tecnica di campionatura 4.1.  Generalità A prescindere dal tipo di saggio da effettuare, prima del campionamento il latte deve essere mescolato bene manualmente o meccanicamente.  Il campione deve essere prelevato subito dopo il mescolamento, quando il latte è ancora in movimento.  Se nella stessa operazione si preleva dalle cisterne più di un campione per prove diverse, quello destinato all'esame microbiologico va prelevato per primo.  Il volume del campione deve essere in rapporto con le esigenze dell'analisi. I recipienti usati per il campione devono avere una capacità tale da risultare quasi completamente riempiti dal campione stesso, in modo che prima della prova sia possibile  mescolarne il contenuto, evitandone però la zangolatura durante il trasporto.  4.2.  Campionamento manuale 4.2.1.  Campionamento dal secchio o dal bidone Per agitare, muovere rapidamente uno stantuffo su e giù nel secchio o nel bidone accertando che il latte sia ben rimescolato e che sul collo del bidone non aderisca della panna. Prelevare un campione rappresentativo dell'intera partita seguendo il  procedimento descritto al punto 4.2.4.  4.2.2.  Campionamento da cisterne o vasche di refrigerazione del latte presso la stalla Omogeneizzare sufficientemente il latte agitandolo meccanicamente o manualmente.  Se il volume del latte è tale da non consentire l'impiego di un agitatore meccanico, agitare manualmente.  4.2.3.  Campionamento da un recipiente di misura È di fondamentale importanza che il latte versato in un recipiente di misura venga opportunamente mescolato. Per essere sicuri che il grasso si distribuisca uniformemente può essere necessaria un'ulteriore agitazione manuale o meccanica. Se il volume  della partita da campionare è maggiore della capacità del recipiente, prelevare un campione rappresentativo dell'intera partita seguendo il procedimento descritto al punto 4.2.4.  4.2.4.  Campionamento di una partita contenuta in più serbatoi Quando la partita di latte da campionare è contenuta in più di un serbatoio, si preleva da ciascuno di essi un campione rappresentativo annotando la quantità di latte corrispondente. Se i campioni di ciascun serbatoio non debbono essere esaminati  separatamente, mescolarli in quantità proporzionali al contenuto dei recipienti da cui erano stati effettuati i rispettivi prelievi. Dopo aver mescolato, prelevare uno o più campioni da queste quantità proporzionali.  4.2.5.  Campionamento da grandi recipienti - serbatoi di stoccaggio da autocisterne e vagoni cisterna 4.2.5.1.  Prima del campionamento mescolare il latte con un metodo adeguato.  Per mescolare il contenuto di grandi recipienti, dei serbatoi di stoccaggio, delle autocisterne o dei vagoni cisterna, si consiglia di ricorrere all'agitazione meccanica (4.2.5.2).  La durata della mescolazione deve essere commisurata al periodo durante il quale il latte è rimasto a riposo. Occorre dimostrare che il metodo di mescolamento adottato in ciascun caso particolare è adeguato agli scopi dell'analisi da effettuare; il  criterio di efficienza del mescolamento influisce sensibilmente sulla similarità dei risultati delle analisi effettuate su campioni prelevati da punti diversi della partita o dallo scarico della cisterna ad intervalli regolari durante le operazioni di  svuotamento. Un metodo per mescolare il latte è considerato efficace se la differenza del tenore di grassi fra due campioni, prelevati in tali condizioni, risulta inferiore allo 0,1 %.  Nei grandi serbatoi provvisti sul fondo di uno scarico si può avere in tale punto una piccola quantità di latte non rappresentativa di tutto il contenuto anche dopo aver proceduto al mescolamento. È preferibile pertanto prelevare i campioni attraverso  un passo d'uomo. Per i campioni prelevati dallo scarico fare scorrere prima un quantitativo sufficiente di latte in modo da garantire che i campioni siano rappresentativi di tutta la partita.  4.2.5.2.  Il contenuto dei grandi recipienti, dei serbatoi di stoccaggio, delle autocisterne o dei vagoni cisterna può essere mescolato:  - con un agitatore meccanico montato nel recipiente ed azionato da un motore elettrico;  - con un'elica o con un agitatore sospeso nel latte, azionati da un motore elettrico e montati nel passo d'uomo;  - nel caso di vagoni cisterna o di autocisterne facendo circolare il latte attraverso il tubo di trasferimento collegato alle pompe di scarico della cisterna e introdotto nel passo d'uomo.  - con aria compressa filtrata e pulita. In questo caso occorre ridurre al minimo la pressione e il volume dell'aria onde evitare lo sviluppo di rancidità.  4.3.  Campionamento automatico o semiautomatico Per campionare il latte crudo consegnato dai produttori possono essere usate apparecchiature automatiche o semiautomatiche, conformemente alle istruzioni date da un laboratorio di analisi o da un'altra autorità competente.  Prima dell'uso, e successivamente ad intervalli regolari, tali apparecchiature devono essere sottoposte alle prove previste dalle autorità responsabili. Occorre verificare l'adeguatezza dei procedimenti di campionamento per determinare:  - il volume minimo di latte raccolto che può essere correttamente campionato;  - la percentuale di un qualsiasi trascinamento (che è correlato al volume minimo del campione);  - la capacità di fornire dopo corretta agitazione un campione rappresentativo dell'intero insieme.  Per l'uso delle apparecchiature di campionamento automatiche e semiautomatiche le competenti autorità nazionali possono fissare:  - il volume minimo di latte da cui debbono essere prelevati i campioni;  - il volume minimo del campione;  - il valore massimo del trascinamento;  - quali analisi possono essere effettuate o le precauzioni da adottare.  4.4.  Campionamento di latte trattato termicamente destinato al consumo diretto in confezioni al dettaglio I campioni di latte trattato termicamente per il consumo diretto in confezioni al dettaglio devono essere costituiti da confezioni chiuse ermeticamente. I campioni devono essere prelevati il più presto possibile subito dopo il trattamento, se possibile  dalla macchina confezionatrice o dalla cella frigorifera dell'impianto di trattamento. Per il latte pastorizzato si dovrà procedere al prelievo dei campioni il giorno stesso del trattamento.  I campioni devono essere prelevati per ciascun tipo di trattamento termico (pastorizzazione, UHT e sterilizzazione) in numero corrispondente alle analisi previste e conformemente alle istruzioni del laboratorio preposto alle analisi o di altre autorità  competenti.  5.  Identificazione del campione Il campione deve essere contrassegnato secondo le istruzioni del laboratorio di analisi o dell'autorità competente, con un codice che ne renda agevole l'identificazione (2).  6.  Trasporto e deposito dei campioni Le istruzioni relative alle condizioni di trasporto e di deposito e al tempo che deve intercorrere tra il campionamento e l'analisi del latte devono essere fornite dal laboratorio di analisi a seconda del tipo di latte e del metodo di analisi applicato.  Dette istruzioni debbono essere impartite di concerto con l'autorità nazionale competente.  Nelle istruzioni debbono figurare i seguenti punti:  - durante il trasporto e il deposito debbono essere prese opportune misure per evitare l'esposizione ad odori sgradevoli o alla luce solare diretta. I contenitori dei campioni, se trasparenti, devono essere conservati al buio.  - i campioni di latte crudo destinati all'analisi microbiologica devono essere trasportati e conservati ad una temperatura compresa fra 0 gC e 4 gC. Il periodo che intercorre tra il campionamento e l'analisi deve essere il più breve possibile e in ogni  caso non superiore alle 36 ore. L'autorità competente può accettare una temperatura di deposito compresa fra 0 e 6 gC se il periodo che intercorre tra il campionamento e l'analisi non è superiore alle 24 ore.  - i campioni di latte pastorizzato destinati all'analisi microbiologica debbono essere trasportati e conservati ad una temperatura compresa fra 0 e 4 gC. Il tempo che intercorre fra il campionamento e l'analisi deve essere il più breve possibile ed in  ogni caso non superiore alle 24 ore.  - i campioni di latte diversi dal latte crudo e dal latte pastorizzato destinati all'analisi microbiologica debbono essere conservati in laboratorio in condizioni di refrigerazione e il tempo che intercorre fra il campionamento e l'analisi deve essere  il più breve possibile.  Le precauzioni speciali da prendere per alcune analisi vengono indicate nella descrizione dei diversi metodi utilizzabili.   ALLEGATO II     INDICE  Pagina I.  Determinazione del punto di congelamento .  10 II.  Determinazione dell'attività fosfatasica .  16 III.  Determinazione dell'attività perossidasica .  19 IV.  Enumerazione dei microrganismi - Conteggio in piastra prova a 30 oC .  20 V.  Enumerazione dei microrganismi - Conteggio in piastra prova a 21 oC .  25 VI.  Enumerazione dei coliformi - Conta delle colonie a 30 oC  .  29 VII.  Enumerazione delle cellule somatiche .  33 VIII.  Ricerca di antibiotici e sulfamidici .  39 IX.  Ricerca di microrganismi patogeni .  48 I. DETERMINAZIONE DEL PUNTO DI CONGELAMENTO  1.  Oggetto e campo di applicazione Il presente procedimento fissa il metodo ufficiale per la determinazione del punto di congelamento del latte intero crudo, pastorizzato, uperizzato e sterilizzato, del latte parzialmente scremato e del latte scremato mediante una apparecchiatura (il  crioscopio a termistori) in cui il bagno controllato termostaticamente è raffreddato per refrigerazione elettrica e il termometro a mercurio viene sostituito da una sonda a termistore.  Esistono due tipi di strumenti: uno consente di ottenere il punto di congelamento massimo in corrispondenza del «plateau» della curva di congelamento, mentre l'altro, per motivi commerciali è regolato, in modo da effettuare la lettura ad un dato istante  dopo l'inizio del congelamento. Poiché le curve di congelamento possono differire da un latte a un altro e tra il latte e le soluzioni standard usate per la taratura, questo metodo ufficiale richiede l'uso di strumenti di ricerca del plateau. Nel caso  di misure di routine per lo screening del latte possono essere usati strumenti per la lettura a un tempo prefissato. Il punto di congelamento può servire a valutare la percentuale di acqua addizionata nel latte, purché l'acidità del campione non sia  superiore a 0,18 g di acido lattico per 100 ml (vedi punto 7.4).  2.  Definizione Si definisce punto di congelamento del latte il valore espresso in gradi Celsius (gC) ottenuto effettuando la misurazione secondo il procedimento descritto.  3.  Principio Si raffredda un'aliquota di analisi del latte ad una determinata temperatura, dipendente dallo strumento, e si innesca la cristallizzazione per vibrazione meccanica provocando così un rapido aumento di temperatura fino al plateau che corrisponde al  punto di congelamento del campione.  Lo strumento viene tarato regolandolo in modo da ottenere delle letture esatte per due soluzioni standard, usando lo stesso procedimento seguito per i campioni di latte. In tali condizioni il plateau dà il punto di congelamento del latte in gradi  Celsius.  4.  Apparecchiatura e vetreria Attrezzatura di uso corrente in laboratorio e segnatamente:  4.1.  Crioscopio Il crioscopio è costituito da un bagno frigorifero termostato, da una sonda a termistore (un termometro a resistenza a semiconduttore) con relativo circuito e un galvanometro o «lettore», da un agitatore del campione, da un dispositivo per innescare il  congelamento e dalle provette contenenti il campione.  4.1.1.  Bagno frigorifero Possono essere usati due tipi di bagno frigorifero.  4.1.1.1.  Tipo a immersione È costituito da un bagno ben isolato contenente un liquido di raffreddamento appropriato che viene agitato in modo che la differenza di temperatura tra due punti qualsiasi del liquido non superi 0,2 gC. La temperatura del liquido non deve variare di p  0,5 gC, rispetto al valore nominale dichiarato dal fabbricante. È importante che il liquido del bagno sia mantenuto ad un livello costante. Tutta la superficie della provetta al di sotto della tacca di taratura del volume deve essere coperta dal liquido  di raffreddamento.  4.1.1.2.  Tipo a circolazione Un flusso continuo di un opportuno liquido refrigerante circola intorno alla provetta. Le fluttuazioni della temperatura del liquido intorno al valore nominale fissato dal fabbricante non devono superare gli p 0,5 gC.  Un liquido refrigerante adatto può essere costituito da una soluzione acquosa al 33 % (v/v) di 1,2 - etandiolo (glial etilenico).  4.1.2.  Termistore e circuito relativo Il termistore deve essere del tipo a sonda di vetro, con diametro massimo di 1,80 p 0,2 mm e con un diametro della biglia non superiore a 0,31 mm. La costante di tempo del termistore deve essere inferiore a 2 secondi e il valore di v (vedi nota) deve  essere elevato. La tensione di lavoro, la corrente e la costante di dissipazione devono essere tali che quando la temperatura della zona circostante è - 0,512 gC la temperatura del termistore non deve superarla di oltre 0,0005 gC. La tolleranza massima  per la resistenza deve essere di p 5 %.  Quando la sonda è in posizione di lavoro nel crioscopio, l'estremità della parte in vetro deve trovarsi sull'asse della provetta e a 44,6 p 0,1 mm sotto l'estremità superiore del tubo (vedi fig. a pag. 15). Occorre quindi disporre di una sagoma che  consenta all'utilizzatore di posizionare la sonda correttamente.  Note v definisce le caratteristiche resistenza/temperatura del termistore in base alla formula:  -  d R  ×  R  =  T 2  ,  - d Rd T × 1 R= v T 2  dove T = è la temperatura in oK R = è la resistenza in ohm alla temperatura T -  d R  ×  R  è il coefficiente di temperatura.  - d R d T × 1 R  è il coefficiente di temperatura.  v = è una costante che dipende dal materiale di costruzione del termistore. Di solito si raccomanda un valore di v superiore a 3 000.  4.1.3.  Misurazione e apparecchio di lettura 4.1.3.1.  Principio di misurazione L'apparecchio usato deve operare secondo il principio della ricerca del primo «plateau» della curva del punto di congelamento. Per plateau si intende la parte della curva in cui la temperatura rimane costante a p 0,0002 gC per almeno 20 secondi.  4.1.3.2.  Funzionamento manuale La resistenza del termistore deve essere equilibrata per mezzo di un ponte di Wheatstone o di un dispositivo analogo, utilizzando dei resistori stabili di qualità superiore con tolleranza massima di p 10 % ed il cui coefficiente di temperatura non  superi 2 × 10-5 gC.  La variabilità della resistenza in tutto il campo di lavoro non deve discostarsi dalla linearità più dello 0,3 % del suo valore massimo.  Deve essere possibile regolare i resistori per la taratura.  L'intervallo di graduazione della scala di lettura non deve essere superiore a 0,001 gC.  4.1.3.3.  Funzionamento automatico Il dispositivo di lettura deve essere tale da poter apprezzare almeno 0,001 gC nell'intervallo da 0 a - 1 gC.  Il dispositivo di lettura ed il relativo circuito devono avere una stabilità tale che indicazioni successive della stessa temperatura non varino di oltre 0,001 gC.  La linearità del circuito deve essere tale che, se lo strumento è correttamente usato, non si producano errori superiori a p 0,001 gC in nessun punto dell'intervallo compreso tra 0,400 e -0,600 gC.  4.1.4.  Agitatore Per agitare l'aliquota di analisi si usa un filo metallico inerte rispetto al latte del diametro di 1-1,5 mm.  L'agitatore deve essere regolato in ampiezza e deve essere posizionato verticalmente con la sua estremità inferiore allo stesso livello della punta della sonda a termistore. È consentita una tolleranza di circa 1,5 mm rispetto a tale posizione.  L'agitatore deve vibrare lateralmente con un'ampiezza sufficiente fissata dal fabbricante (non inferiore a p 1,5 mm) per assicurare che la temperatura nell'aliquota di analisi si mantenga uniforme per tutta la determinazione. Durante il funzionamento  l'agitatore non deve mai venire a contatto con la sonda a termistore o con le pareti della provetta.  4.1.5.  Apparecchiatura per innescare il congelamento Si può ricorrere a qualsiasi apparecchiatura che funzionando inneschi istantaneamente il congelamento dell'aliquota di analisi in modo da portarne la temperatura in prossimità del punto di congelamento. A tale scopo può essere usato l'agitatore; un  metodo consiste nell'aumentare l'ampiezza delle vibrazioni per 1-2 secondi in modo che l'agitatore tocchi la parete della provetta.  4.1.6.  Provette contenenti il campione Le provette per il campione (vedi fig. 1) devono essere di vetro di 50,8 p 0,1 mm con un diametro esterno di 16,0 p 0,1 mm e un diametro interno di 13,5 p 0,1 mm. Nella provetta lo spessore della parete non deve variare di oltre 0,1 mm.  Le provette devono recare una tacca di taratura a 29,8 mm sotto il bordo (21 mm sopra la base) in corrispondenza di un volume del campione di 2,5 p 0,1 ml.  4.1.7.  Alimentazione elettrica La tensione di alimentazione deve essere stabilizzata sia all'interno dell'apparecchio, sia esternamente in modo che le fluttuazioni non superino il p 1 % del valore nominale quando l'alimentazione principale varia del p 6 %.  4.2.  Bilancia analitica 4.3.  Palloni con tacca di taratura, da 1 000 ml, classe A.  4.4.  Stufe ad essicazione, ben ventilate, termostatabili ad una temperatura di 130 p 1 gC oppure forno elettrico, ventilato, termostatabile a una temperatura di 300 p 25 gC.  4.5.  Essiccatore 5.  Reattivi 5.1.  Acqua distillata in un apparecchio di vetro al borosilicato, bollita e raffreddata a 20 p 2 gC in un pallone provvisto di un tubo per l'assorbimento del biossido di carbonio.  5.2.  Cloruro di sodio, di qualità analitica, finemente polverizzato, essiccato per 5 ore in un forno a 300 p 25 gC oppure in alternativa in una stufa a 130 p 1 gC per almeno 24 ore e raffreddato a temperatura ambiente in un essiccatore efficace.  5.3.  Preparazione delle soluzioni standard Pesare la quantità opportuna (cfr. tabella 1) di cloruro di sodio essiccato (5.2) in un pesafiltri. Sciogliere in acqua distillata (5.1), trasferire quantitativamente in un pallone tarato da 1 000 ml e portare a volume con acqua a 20 p 2 gC.  Conservare per non più di 2 mesi a circa 5 gC in bottiglie di polietilene ben tappate di capacità non superiore a 250 ml.  Punto di congelamento delle soluzioni di cloruro di sodio a 20 oC     g NaCl/l oC  6,859  7,818  8,149  8,314  8,480  8,646  8,811  8,977  9,143 10,155 - 0,408 - 0,464 - 0,483 - 0,492 - 0,502 - 0,512 - 0,521 - 0,531 - 0,541 - 0,600 Prima di usare una soluzione standard, capovolgere dolcemente e ruotare più volte la bottiglia per mescolarne completamente il contenuto. Non agitare energicamente la soluzione standard per evitare che venga inglobata dell'aria.  I campioni di una soluzione standard devono essere prelevati dalla bottiglia versando la soluzione in un bicchiere pulito e asciutto. Non utilizzare pipette.  Non usare soluzioni contenute in flaconi vuoti per più di tre quarti né soluzioni aventi più di due mesi, se non sono conservate con un fungicida (ad esempio una soluzione di tiomersale a 10 g/l).  6.  Taratura del crioscopio a termistore Il crioscopio deve essere posizionato in modo tale che la temperatura dell'aria circostante non si discosti di oltre 1 gC dalla temperatura di taratura. Il crioscopio non deve essere esposto alla luce solare o a correnti d'aria e la temperatura ambiente  non deve superare i 26-27 gC.  Verificare che il crioscopio sia in buono stato di funzionamento, conformemente alle indicazioni del fabbricante e che sia stato azionato da almeno 12 ore prima di procedere alla taratura. Verificare la posizione della sonda, l'ampiezza di vibrazione  dell'agitatore e la temperatura dei liquidi refrigeranti.  Scegliere due soluzioni standard (vedi tabella sopra) che delimitino da vicino il valore presunto del punto di congelamento dei campioni di latte da analizzare. È preferibile che la differenza dei punti di congelamento delle due soluzioni non sia  inferiore a - 0,100 gC.  (In alcuni tipi diffusi di crioscopio il circuito del termistore è tale da raggiungere l'equilibrio per un determinato valore del punto di congelamento all'interno del campo di misurazione dello strumento. In tali casi l'impiego fra le altre soluzioni  di taratura di una soluzione standard avente tale punto di congelamento rende più facili le operazioni di taratura; il fabbricante deve fornire tale valore).  Pipettare 2,5 p 0,1 ml di una soluzione standard in una provetta per campioni pulita e asciutta e fare funzionare il crioscopio.  Nota Le provette per i campioni usate durante la taratura devono essere dello stesso tipo di vetro di quelle usate durante l'analisi dei campioni di latte e devono essere lavate e sciacquate contemporaneamente ad esse con acqua demineralizzata. Le  temperature delle soluzioni standard devono essere uguali a quelle dei campioni di latte.  Procedere ai controlli di taratura, seguendo le istruzioni del fabbricante, fino a quando la lettura del crioscopio coincide con il punto di congelamento della soluzione standard. Ripetere il procedimento con l'altra soluzione standard, e continuare ad  alternarle in questo modo fino a quando due letture successive danno per ciascuna soluzione il corretto valore del rispettivo punto di congelamento senza ulteriori aggiustamenti. Il crioscopio è così pronto per l'impiego ed indicherà direttamente, senza  alcuna correzione, il punto di congelamento del campione di latte.  7.  Preparazione del campione per l'analisi 7.1.  Se occorre conservare i campioni ad una temperatura compresa tra 0 e 5 gC.  7.2.  Eliminare dal campione i corpi estranei visibili ad occhio nudo o le particelle di materia grassa solida, filtrando eventualmente in un recipiente asciutto e pulito, e mescolare dolcemente il campione. L'eventuale filtro deve essere inerte rispetto al  latte e risultare efficiente alla temperatura di laboratorio.  7.3.  Il latte può essere analizzato alla temperatura di conservazione (tra 0 e 5 gC) oppure può essere portato alla temperatura di laboratorio prima di iniziare l'analisi. In ogni caso la soluzione standard ed i campioni di latte al momento della loro  utilizzazione devono essere alla stessa temperatura.   7.4.  Determinare l'acidità titolabile del latte per quanto possibile contemporaneamente alla determinazione del punto di congelamento. Non si possono analizzare campioni con acidità superiore a 0,18 g di acido lattico per 100 ml di latte.  7.5.  Prima dell'analisi il latte UHT e quello sterilizzato devono riposare in recipiente aperto per almeno 20 minuti.  8.  Procedimento 8.1.  Verifiche preliminari Verificare che il livello e la temperatura del liquido refrigerante sia quello previsto dalle istruzioni del fabbricante e che, se occorre, la sonda a termistore sia collocata in una provetta vuota nell'alloggiamento destinato al campione. Mettere in  funzione il crioscopio ed accertare che il liquido refrigerante secondo il caso sia adeguatamente agitato o circoli correttamente. Dopo almeno 12 ore di funzionamento, verificare la temperatura del liquido refrigerante nonché la posizione e l'ampiezza  di vibrazione dell'agitatore.  8.2.  Verifica di routine della taratura Prima di ciascuna serie di determinazioni, misurare il punto di congelamento di una soluzione standard di cloruro di sodio (ad es.: una soluzione con punto di congelamento - 0,512 gC) fino a quando la differenza fra due determinazioni consecutive non  sia maggiore di 0,001 gC. Se la media di questi due valori differisce dal punto di congelamento della soluzione standard di più di 0,002 gC, effettuare nuovamente la taratura del crioscopio come descritto al paragrafo 6.  Se il crioscopio viene utilizzato in continuo, effettuare la verifica di routine della taratura almeno ogni ora, tenendo conto anche delle istruzioni del fabbricante.  8.3.  Determinazione del punto di congelamento del latte Capovolgere dolcemente e far ruotare più volte il recipiente con il campione di latte in modo da mescolarne il contenuto. Evitare comunque di agitare violentemente il campione per non fare inglobare aria.  Pipettare 2,5 e p 0,1 ml di latte in una provetta pulita e asciutta prelevando l'eventuale quantità in eccesso con una pipetta. Verificare che la sonda e l'agitatore siano puliti ed asciutti strofinandoli, se occorre, attentamente dal basso verso l'alto  con una salviettina morbida, pulita e che non lasci peli.  Inserire la provetta nel crioscopio tarato seguendo le istruzioni del fabbricante. Il latte deve essere raffreddato e il congelamento deve innestarsi alla temperatura specificata dal fabbricante con una tolleranza di p 0,1 gC.  (Su alcuni strumenti automatici questa temperatura può essere rilevata con un lettore digitale; negli strumenti manuali la precisione richiesta si ottiene verificando che il congelamento inizi quando l'ago o il filo del galvanometro coincide con la  tacca specifica).  Se per qualche motivo il congelamento è iniziato prima o dopo il livello di temperatura indicata, interrompere l'analisi e ricominciarla con un'altra aliquota di analisi del latte. Se anche questa seconda aliquota congela prima della temperatura  indicata, riscaldare a 45 gC un'ulteriore aliquota di analisi e mantenerla per cinque minuti a questa temperatura per far fondere la materia grassa cristallina.  Raffreddare quindi alla temperatura della prova e procedere immediatamente al nuovo saggio. La temperatura del latte dopo l'innesco del congelamento aumenta rapidamente sino ad un valore che si mantiene praticamente costante per un certo periodo prima  di abbassarsi nuovamente. Il punto di congelamento corrisponde alla temperatura più elevata raggiunta durante tale periodo ed è questo il valore da registrare.  Nota Il periodo in cui la temperatura si mantiene costante e l'intervallo di tempo che intercorre tra l'innesco del congelamento e l'istante in cui si raggiunge la temperatura più elevata variano da un campione all'altro e per l'acqua e le soluzioni standard  di cloruro di sodio sono notevolmente più brevi che per il latte. È essenziale annotare la temperatura più elevata.  Una volta effettuata la misura in modo soddisfacente, estrarre la provetta e lavare con acqua la sonda a termistore e l'agitatore asciugandoli dal basso verso l'alto con una salviettina morbida pulita e che non lasci peli; effettuare quindi una seconda  determinazione su un'altra aliquota di analisi del latte.  Se la differenza fra i punti di congelamento ottenuti è maggiore del valore di ripetibilità (0,004 gC) eseguire una seconda determinazione su un'altra aliquota. Purché le due determinazioni non differiscano di più di 0,004 gC registrare i valori  ottenuti e utilizzarli per calcolare il risultato definitivo.  8.4.  Raffreddamento della sonda Dopo aver utilizzato l'apparecchio, collocare una provetta vuota nell'alloggiamento destinato al campione ed abbassare il mandrino in modo da mantenere la sonda fredda.  (Nei tipi di crioscopio in cui ciò non sia possibile prima di procedere alle misurazioni è indispensabile accertare che la sonda sia adeguatamente raffreddata effettuando, ad esempio, alcune determinazioni fittizie fino ad ottenere delle letture  costanti).  9.  Espressione dei risultati 9.1.  Calcolo Se la verifica di routine della taratura conferma la validità di quest'ultima, calcolare la media dei valori accettabili del punto di congelamento ottenuti con determinazioni effettuate in doppio, approssimata a meno della terza cifra decimale.  Se la somma dei due valori accettabili ottenuti con determinazioni effettuate in doppio è un numero dispari, la media dev'essere arrotondata al numero pari più vicino come mostra l'esempio seguente:  Punto di congelamento (oC)    Valori delle determinazioni in doppio Media - 0,544   - 0,545 - 0,545   - 0,546 - 0,544 - 0,546  9.2.  Precisione 9.2.1.  Ripetibilità (r): 0,004 oC.  9.2.2.  Riproducibilità (R): 0,006 oC. II. DETERMINAZIONE DELL'ATTIVITÀ FOSFATASICA  1.  Oggetto e campo di applicazione Il presente procedimento descrive il metodo di riferimento per la determinazione dell'attività fosfatasica nel latte pastorizzato.  2.  Definizione 2.1.  L'attività fosfatasica è una misura della quantità di fosfatasi alcalina attiva presente nel prodotto ed espressa come quantità di fenolo, in microgrammi, liberata da 1 ml di latte pastorizzato nelle condizioni specificate nel metodo.  2.2.  L'attività fosfatasica di un latte si considera negativa se risulta inferiore a 4 mg/ml.  3.  Principio L'attività fosfatasica è determinata dalla quantità di fenolo liberata dal fenilfosato disodico addizionato al campione. Il fenolo liberato reagisce con dibromochinoeclorimide dando dibromoindofenolo (di colore azzurrognolo) che viene determinato per  colorimetria a 610 nm. Si effettua quindi un confronto con un campione in cui l'enzima fosfatasi è stato precedentemente distrutto.  4.  Reattivi 4.1.  Tampone di borato e di idrossido di bario 4.1.1.  Sciogliere in acqua 50,0 g di idrossido di bario (Ba(OH)2.8H2O) e portare a 1 000 ml.  4.1.2.  Sciogliere in acqua 22,0 g di acido borico (H3BO3) e portare a 1 000 ml.  4.1.3.  Scaldare 500 ml di ciascuna soluzione a 50 gC, mescolare le soluzioni, agitare, raffreddare rapidamente a circa 20 gC e regolare eventualmente il pH a 10,6 p 0,1 con la soluzione 4.1.1 o con la 4.1.2. Filtrare. Conservare la soluzione in un recipiente  ermeticamente chiuso.  4.1.4.  Prima dell'uso, diluire la soluzione con uguale volume di acqua.  4.2.  Tampone per lo sviluppo del colore Sciogliere in acqua 6,0 g di metaborato sodico (NaBO2) oppure 12,6 g di NaBO2.4H2O e 20,0 g di cloruro di sodio (NaCl) e portare a 1 000 ml.  4.3.  Tampone del colore diluito Sciogliere con acqua 10 ml del tampone per lo sviluppo del colore (4.2) portando il volume a 100 ml.  4.4.  Substrato tamponato Sciogliere 0,1 g di fenilfosfato disodico disidratato esente da fenolo in 100 ml di tampone (4.1.3) oppure sciogliere 0,5 g di fenilfosfato disodico in 4,5 ml di soluzione tampone per lo sviluppo del colore (4.2). Aggiungere due gocce di soluzione BQC  (4.6) e lasciare in riposo a temperatura ambiente per trenta minuti. Estrarre il colore così formatosi con 2,5 ml di butan-1-olo. Lasciar riposare fino alla separazione del botan-1-olo. Togliere il butan-1-olo e eliminarlo. Dopo la separazione scartare  il butan-1-olo. Ripetere, se necessario, l'estrazione.  La soluzione può essere conservata in frigorifero per qualche giorno; prima dell'uso sviluppare il colore ed estrarre di nuovo. Preparare il substrato tamponato subito prima dell'uso diluendo 1 ml di questa soluzione a 100 ml con la soluzione tampone di  borato e di idrossido di bario (4.1.3).  4.5.  Precipitante al rame-zinco Sciogliere in acqua 3,0 g di solfato di zinco (ZnSO4, 7H2O) e 0,6 g di solfato rameico (CuSO4, 5H2O) e portare a 100 ml.  4.6.  Soluzione 2,6-dibromochinoneclorimide (soluzione BQC) Sciogliere 40 p 1 mg di 2,6-dibromochinoneclorimide (BQC) (C6H2Br2CNO6) in 10 ml di etanolo al 96 % (v/v).  Conservare in frigorifero in bottiglia di colore scuro. Il reattivo va buttato via se cambia colore o se è stato preparato da più di un mese.  4.7.  Soluzione di solfato rameico (II) Sciogliere in acqua 0,05 g di solfato rameico (II) (CuSO4.5H2O) e portare a 100 ml.  4.8.  Soluzioni standard di fenolo 4.8.1.  Pesare 200 p 2 mg di fenolo puro anidro, e portare con acqua a 100 ml in un pallone tarato mescolando. Questa soluzione madre può essere conservata per diversi mesi in frigorifero.  4.8.2.  Diluire 10 ml della soluzione madre a 100 ml con acqua e mescolare. 1 ml contiene 200 mg di fenolo.  5.  Apparecchiatura e vetreria Note a)  Tutta la vetreria, i tappi e gli attrezzi per il campionamento devono essere accuratamente puliti. È consigliabile risciacquarli con acqua distillata bollita di recente o passarli a vapore.  b)  Alcuni tipi di tappi di plastica possono cedere fenolo e non devono quindi essere usati.  Attrezzatura di uso corrente in laboratorio ed in particolare:  5.1.  Bilancia analitica 5.2.  Bagnomaria, termostatabile a 37 p 1 gC.  5.3.  Spettrofotometro, per letture ad una lunghezza d'onda di 610 nm.  5.4.  Provette per la prova, da 16 o 18 mm × 150 mm, preferibilmente graduate sui 5 e 10 ml.  5.5.  Pipette 5.6.  Imbuti di vetro di dimensioni appropriate, ad esempio con diametro di 5 cm.  5.7.  Filtri pieghettati con diametro di almeno 9 cm per velocità di filtrazione media.  5.8.  Palloni tarati per la preparazione delle soluzioni standard.  6.  Procedimento Note a)  Evitare, nel corso della determinazione, l'esposizione diretta alla luce solare.  b)  Devono essere evitate tracce di saliva o di sudore che possono dare risultati falsamente positivi. Prendere di conseguenza le necessarie precauzioni nel pipettare il campione.  6.1.  Preparazione del campione da analizzare 6.1.1.  Effettuare l'analisi subito dopo il campionamento. In caso contrario conservare il campione in frigorifero, ma per non più di 2 giorni.  6.2. Aliquota di analisi Pipettare in ciascuna delle due provette per la prova (5.4) 1 ml del campione da analizzare, usando una provetta come controllo o per la prova in bianco.  6.3.  Determinazione 6.3.1.  Scaldare il bianco per 2 minuti in acqua bollente; coprire la provetta e il becher contenente l'acqua bollente con un foglio di alluminio, per essere certi che tutta la provetta venga scaldata. Raffreddare rapidamente fino a temperatura ambiente.  6.3.2.  A partire da questo momento trattare il bianco ed il campione in esame nello stesso modo. Aggiungere 10 ml di substrato tamponato (4.4) e mescolare.  6.3.3.  Porre subito in incubazione i campioni nel bagnomaria (5.2) per 60 minuti, mescolando di tanto in tanto (almeno 4 volte) il contenuto della provetta.  6.3.4.  Scaldare in acqua bollente per 2 minuti come descritto al precedente punto 6.3.1. Raffreddare quindi rapidamente fino alla temperatura ambiente.  6.3.5.  Aggiungere 1 ml del principitante rame-zinco (4.5) a ciascuna provetta e mescolare accuratamente.  6.3.6.  Filtrare su carta da filtro asciutta, scartare i primi 2 ml e, se necessario filtrare di nuovo sino ad ottenere un filtrato limpido; raccogliere 5 ml di filtrato in una provetta;  6.3.7.  Aggiungere 5 ml del tampone per lo sviluppo del colore (4.2).  6.3.8.  Addizionare 0,1 ml della soluzione BQC (4.6), mescolare e lasciare sviluppare la colorazione per 30 minuti a temperatura ambiente.  6.3.9.  Misurare l'assorbanza rispetto al controllo o al bianco nello spettrofotometro (5.3) alla lunghezza d'onda di 610 nm.  6.3.10.  Se l'assorbanza misurata in 6.3.9 è superiore a quella della soluzione standard, contenente 20 mg di fenolo per provetta, misurata al punto 6.4.4, ripetere la determinazione diluendo opportunamente il campione.  Preparare tale diluizione mescolando 1 volume del campione in esame con un appropriato volume di una aliquota dello stesso campione portata con precauzione all'ebollizione per inattivare la fosfatasi.  6.4.  Preparazione della curva di taratura 6.4.1.  A partire dalla soluzione standard di fenolo 4.8.2, preparare una serie appropriata di soluzioni standard diluite contenenti 0 (controllo o bianco), 2, 5, 10 e 20 mg di fenolo per millilitro e pipettare rispettivamente 1 ml di acqua e 1 ml delle quattro  soluzioni standard di fenolo in ciascuna delle cinque provette.  6.4.2.  Aggiungere a ciascuna provetta 1 ml della soluzione di solfato rameico (II) (4.7), 5 ml del tampone del colore diluito (4.3), 3 ml di acqua e 0,1 ml della soluzione BQC (4.6); mescolare.  6.4.3.  Lasciare sviluppare il colore per 30 minuti a temperatura ambiente.  6.4.4.  Misurare l'assorbanza rispetto al controllo o al bianco nello spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 610 nm.  6.4.5.  A partire dai valori di assorbanza (6.4.4) ottenuti per ciascuna quantità di fenolo addizionata (6.4.1), calcolare la retta di regressione con il metodo dei minimi quadrati.  7.  Espressione dei risultati 7.1.  Calcolo e formula 7.1.1.  Partendo dalla lettura dell'assorbanza (6.3.9) determinare la quantità di fenolo utilizzando la retta di regressione ottenuta (6.4.5).  7.1.2.  Calcolare l'attività fosfatasica, espressa in microgrammi di fenolo per millilitro di latte pastorizzato con la seguente formula:  Attività fosfatasica = 2,4 × A × D dove A  è la quantità di fenolo in microgrammi ottenuta come indicato in 7.1.1;  D è il fattore di diluizione effettuata come indicato in 6.3.10 (in assenza di diluizione,  D = 1).  Il fattore 2,4 è il fattore di diluizione (5/12 di 1 ml del campione in esame) - vedi 6.2 ed ancora 6.3.2, 6.3.5 e 6.3.6.  7.2.  Precisione 7.2.1.  Ripetibilità (r): 2 mg fenolo/ml.  7.2.2.  Riproducibilità (R): 3 (iniziale) mg fenolo/ml.  7.2.3.  Se si è proceduto ad una diluizione come indicato in 6.3.10, le tolleranze di cui ai punti 7.2.1 e 7.2.2 si applicano ai risultati ottenuti sul campione diluito.  III. DETERMINAZIONE DELL'ATTIVITÀ PEROSSIDASICA  1.  Oggetto e campo di applicazione Il presente procedimento descrive il metodo ufficiale per la determinazione della presenza o assenza dell'enzima perossidasico nel latte come controllo della pastorizzazione.  2.  Definizione Reazione perossidasica positiva:  Se il latte è stato pastorizzato in modo corretto dopo aver mescolato comparirà entro 30 secondi una colorazione azzurra.  Reazione perossidasica negativa:  Nei 30 secondi che seguono la miscelazione, non appare alcuna colorazione.  3.  Principio L'enzima perossidasico decompone il perossido di idrogeno. L'ossigeno atomico liberato ossida l'1.4-fenilenediammina che è incolore trasformandolo in indofenolo di colore rosso porpora (test di Storchs). L'intensità del colore è proporzionale alla  concentrazione dell'enzima.  4.  Reattivi 4.1.  Soluzione di 1,4-fenilenediammina Sciogliere in acqua calda (50 gC) 2 g di 1,4-fenilenediammina (C6H8N2) e portare a 100 ml. Versare la soluzione in una bottiglia scura chiusa con un tappo di vetro e conservarla al fresco e al riparo dalla luce. Uno o due giorni dopo la preparazione una  soluzione di 1,4-fenilenediammina forma un deposito e non è più utilizzabile.  4.2.  Soluzione di perossido di idrogeno Diluire con acqua 9 ml di perossido di idrogeno al 30 % e portare a 100 ml. Per stabilizzare aggiungere 1 ml di acido solforico concentrato per litro di soluzione.  La soluzione di perossido di idrogeno è stabile per un mese se viene tenuta al fresco e al riparo dalla luce in una bottiglia con tappo di vetro evitando qualsiasi contatto con composti organici.  5.  Procedimento 5.1.  Introdurre 5 ml del campione di latte in una provetta pulita munita di chiusura adeguata.  5.2.  Aggiungere 5 ml della soluzione di 1,4-fenilenediammina (4.1).  5.3.  Aggiungere 2 gocce di soluzione di perossido di idrogeno (4.2).  5.4.  Controllare la colorazione nei 30 secondi che seguono la miscelazione. Se la colorazione azzurra si ottiene più di 30 secondi dopo l'addizione dei reagenti la reazione non è specifica.  IV. ENUMERAZIONE DEI MICRORGANISMI - CONTEGGIO IN PIASTRA PROVA A 30 gC  1.  Oggetto e campo d'applicazione Il presente procedimento descrive il metodo ufficiale per la numerazione dei microrganismi con la tecnica del conteggio delle colonie a 30 gC. Il metodo si applica al latte crudo, al latte pastorizzato, nonché al latte uperizzato e sterilizzato dopo  preincubazione a 30 gC per 15 giorni.  2.  Definizione Con il termine «microrganismi» si intendono gli organismi che formano colonie numerabili se posti in incubazione aerobica nelle condizioni di seguito specificate.  3.  Principio In alcune piastre di Petri si mescola un volume definito del campione di latte con il terreno colturale incubando a 30 gC per 72 ore. Si contano quindi le colonie e si calcola il numero di microrganismi per 1 ml nel caso del latte crudo o pastorizzato e  per 0,1 ml nel caso del latte uperizzato o sterilizzato preincubato.  4.  Apparecchiatura e vetreria Attrezzatura di uso corrente in laboratorio e in particolare:  4.1.  Apparecchiatura 4.1.1.  Stufa ad aria calda, in grado di operare a 170-175 gC.  4.1.2.  Autoclave, termostatabile a 121 p 1 gC.  4.1.3.  Termostato, regolabile ad una temperatura uniforme di 30 p 1 gC.  4.1.4.  pHmetro, con compensazione della temperatura e con una precisione di p 0,1 unità pH.  4.1.5.  a. Bagnomaria, regolabile a 45 p 1 gC.  4.1.6.  Lente, ingrandimento 2-4 ×.  4.1.7.  Lente, ingrandimento 8-10 ×.  4.1.8.  Apparecchio contacolonie 4.1.9.  Mescolatore in grado di mescolare 1 ml del campione di latte o della diluizione decimale con 9 ml del diluente e il cui funzionamento sia basato sul principio della rotazione eccentrica del contenuto della provetta.  4.2.  Vetreria 4.2.1.  Provette con chiusura opportuna e di capacità sufficiente a contenere 10 ml della prima diluizione o delle diluizioni decimali successive lasciando lo spazio necessario per la miscelazione.  4.2.2.  Palloni da 150-250 ml o provette, da circa 20 ml, per contenere il terreno colturale.  4.2.3.  Pipette sterili (chiuse ad una estremità con un batuffolo di cotone) in vetro o materiale sintetico con punta a foro normale, della capacità nominale di 1 ml, aventi un foro di scorrimento del diametro di 1,75-3 mm.  4.2.4.  Piastre di Petri sterili, in vetro trasparente e in colore o materiale sintetico sterile, con diametro interno del fondo della scatola di circa 90-100 mm. L'altezza interna deve essere di almeno 10 mm. Il fondo non deve presentare alcuna irregolarità  che possa interferire con il conteggio delle colonie.  4.2.5.  Sterilizzazione della vetreria La vetreria deve essere sterilizzata con uno dei seguenti metodi:  a)  mantenendola a 170-175 gC in una stufa ad aria calda (4.1.1) per almeno un'ora.  b) mantenendola a 121 p 1 gC in autoclave (4.1.2) per almeno 20 minuti.  Fare particolare attenzione a che nell'autoclave si abbia un'adeguata penetrazione del vapore - ad esempio se l'attrezzatura è sterilizzata in contenitori questi non devono essere chiusi ermeticamente e i tappi dei palloni non devono essere serrati.  La vetreria sterilizzata nell'autoclave deve essere asciugata facendo scaricare il vapore.  Le pipette devono essere sterilizzate in una stufa ad aria calda (4.1.1).  5.  Terreno colturale - Latte agarizzato per il conteggio in piastra 5.1.  Composizione Estratto di lievito 2,5 g Triptone 5,0 g Glucosio D(+) o destrosio 1,0 g Latte scremato in polvere 1,0 g Agar da 10 a 15 g a seconda delle proprietà gelatinizzanti dell'agar impiegato Acqua 1 000 ml Il latte scremato in polvere deve essere esente da sostanze inibenti. Ciò deve essere verificato con delle prove comparative utilizzando un latte scremato in polvere che sia riconosciuto esente da sostanze inibenti.  Preparazione Disperdere e sciogliere gli ingredienti in acqua nel seguente ordine: estratto di lievito, triptone, glucosio ed infine latte scremato in polvere. Questa operazione risulterà più facile riscaldando la sospensione. Aggiungere l'agar e portare ad  ebollizione, agitando in continuazione sino a quando l'agar è completamente disciolto oppure riscaldare a vapore per circa 30 minuti.  Filtrare eventualmente su carta da filtro.  Verificare il pH con un pHmetro (4.1.4) ed aggiustarlo eventualmente con una soluzione (almeno 0,1 mol/l) di idrossido di sodio o di acido cloridrico in modo che, dopo sterilizzazione, il pH a 25 gC sia 6,9 p 0,1.  5.2.  Distribuzione, sterilizzazione e conservazione del terreno di coltura.  Suddividere il terreno (5.1) in quantità di 100-150 ml per pallone o di 12-15 ml per provetta (4.2.2). Tappare i palloni e le provette.  Sterilizzare in autoclave (4.1.2) a 121 p 1 gC per 15 minuti.  Controllare il pH del terreno.  Se il terreno non deve essere usato immediatamente, conservarlo al riparo dalla luce a una temperatura compresa tra 1 e 5 gC per non più di un mese dopo la preparazione.  5.3.  Terreno colturale disidratato disponibile in commercio Il terreno di coltura (5.1) può essere preparato a partire da un terreno disidratato disponibile in commercio. Seguire in tal caso le istruzioni del fabbricante aggiungendo, prima della dissoluzione, il latte scremato in polvere, nel caso che questo non  sia indicato fra gli ingredienti.  Aggiustare il pH 6,9 p 0,1 a 25 gC come descritto al punto 5.1 e ripartire nei contenitori, sterilizzare e conservare il terreno come descritto al punto 5.2.  6.  Diluenti 6.1.  Soluzione salina/peptone Composizione Peptone 1,0 g Cloruro di sodio (NaCl) 8,5 g Acqua 1 000 ml Preparazione Sciogliere gli ingredienti in acqua, riscaldando, se necessario.  Verificare il pH con un pHmetro (4.1.4) e aggiustare eventualmente il pH con una soluzione (almeno 0,1 mol/l) di idrossido di sodio o di acido cloridrico in modo che, dopo sterilizzazione, il pH a 25 gC risulti 7,0 p 0,1.  6.2.  Distribuzione, sterilizzazione e conservazione del diluente Distribuire il diluente (6.1) nelle provette (4.2.1) in quantità tali che a sterilizzazione avvenuta ciascuna provetta ne contenga 9,0 ml p 0,2. Tappare le provette.  Sterilizzare in autoclave (4.1.2) a 121 p 1 gC per 15 minuti.  Verificare il pH del diluente.  Se non deve essere usato immediatamente, conservare il diluente, al riparo della luce, a una temperatura compresa tra 1 e 5 gC, per non più di un mese dopo la preparazione.  6.3.  Diluenti disidratati disponibili in commercio Il diluente (6.1) può essere preparato a partire da compresse o polveri disidratate disponibili in commercio. Seguire in tal caso le istruzioni del fabbricante. Aggiustare il pH come descritto al punto 6.1 e distribuire, sterilizzare e conservare i  diluenti come descritto in 6.2.  7.  Procedimento 7.1.  Fusione del terreno nutritivo Prima di procedere all'esame microbiologico, far fondere rapidamente la quantità di terreno necessaria e raffreddare il terreno a 45 p 1 gC in bagnomaria (4.1.5).  7.2.  Preparazione del campione di latte Mescolare a fondo il campione di latte, in modo che i microrganismi siano distribuiti il più uniformemente possibile, capovolgendo rapidamente per 25 volte il contenitore del campione. Evitare la formazione di schiuma oppure lasciarla disperdere. Tra la  miscelazione ed il prelievo dell'aliquota di analisi non devono trascorrere più di tre minuti.  7.3.  Preparazione della prima diluizione (10-;) (latte crudo e pastorizzato) Aggiungere con una pipetta sterile (4.2.3) 1 ml del campione del latte (7.2) crudo o pastorizzato a 9 ml di diluente (6.1) evitando di toccare il diluente con la pipetta. La temperatura del diluente deve essere approssimativamente uguale a quella del  campione di latte. Mescolare accuratamente questa prima diluizione nel mescolatore (4.1.9) per 5-10 secondi.  Si ottiene così una prima diluizione 10-;.  7.4.  Preparazione delle diluizioni decimali successive (latte crudo e pastorizzato) Trasferire con una pipetta sterile (4.2.3), 1 ml della prima diluizione (7.3) in 9 ml di diluente (6.1), secondo le istruzioni del punto 7.3.  Si ottiene così la diluizione 10-$.  Ripetere queste operazioni per ottenere diluizioni decimali successive fino ad ottenere un numero adeguato di microrganismi (8.1).  7.5.  Semina delle piastre di Petri 7.5.1.  Latte crudo: trasferire con una pipetta sterile (4.2.3), 1 ml del campione e/o della diluizione decimale appropriata in una piastra (4.2.4). L'esame deve essere effettuato almeno su due diluizioni. Preparare una capsula per ciascuna delle diluizioni  ritenute appropriate (8.1.1).  7.5.2.  Latte pastorizzato: trasferire con una pipetta sterile (4.2.3), 1 ml del campione e/o della diluizione decimale appropriata in una piastra (4.2.4). L'esame deve essere effettuato almeno su due diluizioni. Per ciascuna diluizione ritenuta appropriata  (8.1.1) preparare due piastre.  7.5.3.  Latte uperizzato e sterilizzato (analizzato dopo 15 giorni di preincubazione a 30 gC - allegato A della direttiva 85/397/CEE, capitolo VII, punto 5):  Trasferire con una pipetta sterile (4.2.3), 0,1 ml del campione di latte (7.2) in una piastra (4.2.4). Preparare due piastre.  7.6.  Distribuzione del terreno Versare circa 15-18 ml del terreno (7.1) in ciascuna delle piastre seminate. Mescolare immediatamente il terreno facendo ruotare la piastra di Petri in modo tale che dopo l'incubazione si ottenga una distribuzione uniforme delle colonie. Il tempo che intercorre tra la fine della preparazione del campione e la miscelazione dell'aliquota di analisi o, a seconda del tipo di latte, della sua diluizione con il terreno non deve superare i 15 minuti.  Lasciare solidificare su una superficie orizzontale fredda e pulita.  7.7.  Incubazione delle piastre di Petri Mettere le piastre, capovolte, in un termostato (4.1.3). Non impilarne più di sei alla volta. Le pile di piastre non devono toccarsi l'una con l'altra e non devono venire a contatto con le pareti o con la parte superiore del termostato.  Incubare a 30 p 1 gC per 72 p 2 ore.  7.8.  Conteggio delle colonie Contare le colonie nelle piastre di Petri che contengono al massimo 300 colonie.  Esaminare le piastre con una luce attenuata. Per agevolare il conteggio si può ricorrere a un'opportuna lente (4.1.6) e/o a un apparecchio contacolonie (4.1.8). Evitare di confondere le particelle di precipitato nelle piastre con le colonie puntiformi.  In caso di dubbio esaminarle con attenzione usando eventualmente una lente d'ingrandimento più forte (4.1.7), in modo da poter distinguere le colonie dalle sostanze estranee.  Le colonie invasive vanno considerate come singole colonie. Se queste ricoprono meno di un quarto della piastra, contare le colonie sulla restante parte e calcolare il numero corrispondente per l'intera piastra. Scartare invece la piastra se le colonie  invasive ne ricoprono più di un quarto.  8.  Calcolo ed espressione dei risultati 8.1.  Latte crudo e pastorizzato 8.1.1.  Utilizzare i risultati relativi alle piastre contenenti da 10 a 300 colonie. (vedi 8.1.3 e 8.1.4).  8.1.2.  Il numero di microrganismi in 1 ml di latte crudo o pastorizzato è dato dalla formula:   (n1 + 0,1 n2) d   S C (n1 + 0,1 n2) d doveS C è la somma del numero di colonie contate secondo 8.1.1,  (n1 + 0,1 n2) d è uguale al volume di campione inoculato dove:  n1 è il numero di piastre utilizzate per la prima diluizione,  n2 è il numero di piastre utilizzate per la seconda diluizione,  d è il fattore di diluizione relativo ai primi conteggi effettuati.  Il risultato ottenuto viene approssimato a due cifre significative. Se la cifra da arrotondare è un 5, effettuare l'approssimazione in modo che il numero immediatamente a sinistra sia un numero pari.  Esempio (latte pastorizzato) diluizione 10-2: 278 e 290 colonie diluizione 10-3:  33 e  28 colonie numero/ml =  278 + 290 + 33 + 28   numero/ml = 278 + 290 +33 + 28 (2 + 0,1 × 2) 10-2 numero/ml =  0,022   = 629% 0,022 = 28 590 = 29 000 = 2,9 × 10%.  8.1.3.  Se tutti i calcoli danno meno di 10, indicare che il numero di microrganismi per millilitro è «inferiore a 10 × d», dove «d» è il reciproco del fattore di diluizione più basso.  8.1.4.  Se tutti i calcoli danno più di 300 colonie ma il conteggio è possibile, procedere ad una stima e moltiplicare tale valore per il reciproco del fattore di diluizione. Riportare il risultato come «numero stimato di microrganismi per ml».  8.2.  Latte uperizzato e sterilizzato Conteggi in piastra di più di 10 colonie per 0,1 ml non soddisfano ai requisiti della direttiva 85/397/CEE.  9.  Precisione Non si dispone ancora di risultati di prove interlaboratorio riconosciute a livello internazionale.  V. ENUMERAZIONE DEI MICRORGANISMI - CONTEGGIO IN PIASTRA PROVA A 21 gC  1.  Scopo e campo di applicazione Il presente procedimento descrive il metodo ufficiale per l' enumerazione dei microrganismi con la tecnica del conteggio delle colonie a 21 gC, nel latte pastorizzato dopo incubazione dello stesso a 6 gC per 5 giorni al fine di determinare il grado di  contaminazione del latte pastorizzato con microrganismi psicrotrofi in grado di moltiplicarsi nel latte a 6 gC.  2.  Definizione Con il termine «microrganismi» si intendono gli organismi che se posti in incubazione aerobica nelle condizioni di seguito specificate formano colonie numerabili.  3.  Principio Viene preincubato il latte pastorizzato a 6 gC per 5 giorni. Si mescola quindi una aliquota definita del campione di latte con il terreno di coltura in alcune piastre di Petri che vengono incubate a 21 gC per 25 giorni. Si contano quindi le colonie e si  calcola il numero di microrganismi per 1 ml di latte pastorizzato.  4.  Apparecchiatura e vetreria Materiale di uso comune in laboratorio e in particolare:  4.1.  Apparecchiatura 4.1.1.  Stufa ad aria calda, in grado di funzionare a 170-175 gC.  4.1.2.  Autoclave termostatabile a 121 p 1 gC.  4.1.3.  Termostato, regolabili ad una temperatura uniforme di:  a) 6 p 0,2 gC;  b) 21 p 1 gC.  4.1.4.  pHmetro, con compensazione della temperatura e con una precisione di p 0,1 unità pH.  4.1.5.  Bagnomaria, regolabile a 45 p 1 gC.  4.1.6.  Lente, ingrandimento 2-4 ×.  4.1.7.  Lente, ingrandimento 8-10 ×.  4.1.8.  Apparecchio contacolonie.  4.1.9.  Mescolatore, in grado di mescolare 1 ml del campione di latte o della diluizione decimale con 9 ml del diluente ed il cui funzionamento sia basato sul principio della rotazione eccentrica del contenuto della provetta.  4.2.  Vetreria 4.2.1.  Provette, con opportuna chiusura, di capacità sufficiente a contenere 10 ml della prima diluizione, oppure delle diluizioni decimali successive, lasciando lo spazio necessario per la miscelazione.  4.2.2.  Palloni, da 150 e 250 ml oppure provette, da circa 20 ml, per contenere il mezzo di coltura.  4.2.3.  Pipette, chiuse ad una estremità con un batuffolo di cotone in vetro o in materiale sintetico sterile, con punta, della capacità nominale di 1 ml aventi un foro di scorrimento del diametro di 1,75-3 mm.  4.2.4.  Piastre di Petri, in vetro trasparente incolore o in materiale sintetico sterile, con un fondo avente un diametro interno di circa 90-100 mm. L'altezza interna deve essere di almeno 10 mm. Il fondo non deve presentare alcuna irregolarità che possa  interferire con le colonie da contare.  4.2.5.  Sterilizzazione della vetreria La vetreria deve essere sterilizzata con uno dei seguenti metodi:  a)  mantenendola a 170-175 gC in una stufa a aria calda (4.1.1) per almeno 1 ora;  b) mantenendola a 121 p gC in autoclave (4.1.2) per almeno 20 minuti.  Fare particolare attenzione a che nell'autoclave si abbia una adeguata penetrazione del vapore - ad esempio se l'attrezzatura è sterilizzata in recipienti, questi non devono essere chiusi ermeticamente e i tappi dei palloni non devono essere serrati.  La vetreria sterilizzata in autoclave deve essere asciugata facendo scaricare il vapore.  Le pipette devono essere sterilizzate in una stufa ad aria calda (4.1.1).  5.  Terreno colturale - Latte agarizzato per il conteggio in piastra 5.1.  Composizione Estratto di lievito 2,5 g Triptone 5,0 g Glucosio D(+)o destrosio 1,0 g Latte scremato in polvere 1,0 g Agar da 10 a 15 g, a seconda delle proprietà gelatinizzanti dell'agar impiegato Acqua 1 000 ml Il latte scremato in polvere deve essere esente da sostanze inibenti. Ciò deve essere verificato con prove comparative usando un latte scremato in polvere che sia stato accertato esente da sostanze inibenti.  Preparazione Disperdere e sciogliere gli ingredienti in acqua nel seguente ordine: estratto di lievito, triptone, glucosio ed infine latte scremato in polvere. Tale operazione risulterà più facile riscaldando la sospensione. Aggiungere l'agar e portare ad  ebollizione agitando in continuazione fino a sciogliere completamente l'agar oppure riscaldare a vapore per circa 30 minuti.  Filtrare eventualmente su carta da filtro.  Verificare il pH con pHmetro (4.1.4) ed aggiustarlo eventualmente con una soluzione (almeno 0,1 mol/l) di idrossido di sodio o di acido cloridrico in modo che, dopo sterilizzazione, si abbia a 25 gC un pH a 6,9 p 0,1.  5.2.  Distribuzione, sterilizzazione e conservazione del terreno di coltura Distribuire il terreno (5.1) con aliquote di 100-150 ml per pallone o di 12-15 ml per provetta (4.2.2). Tappare i palloni e le provette.  Sterilizzare in autoclave (4.1.2) a 121 p 1 gC per 15 minuti.  Verificare il pH del terreno.  Se il terreno di coltura non deve essere immediatamente utilizzato, conservarlo al riparo dalla luce ad una temperatura compresa fra 0 e 5 gC per non più di un mese dopo la preparazione.  5.3.  Terreno di coltura disidratato disponibile in commercio Il terreno di coltura (5.1) può essere preparato a partire da un terreno disidratato reperibile in commercio. Seguire in questo caso le istruzioni del fabbricante aggiungendo, prima della dissoluzione, se non fosse presente fra gli ingredienti il latte  scremato in polvere.  Aggiustare il pH a 6,9 p 0,1 a 25 gC come descritto al punto 5.1 e distribuire, sterilizzare e conservare il terreno secondo il procedimento di cui al punto 5.2.  6.  Diluenti 6.1.  Soluzione salina/peptone Composizione Peptone 1,0 g Cloruro di sodio (NaCl) 8,5 g Acqua 1 000 ml Preparazione Sciogliere gli ingredienti in acqua, riscaldando se occorre.  Verificare con un pHmetro (4.1.4) il pH ed aggiustarlo eventualmente con una soluzione (almeno 0,1 mol/l) di idrossido di sodio o acido cloridrico in modo che, dopo sterilizzazione, il pH a 25 gC sia 7,0 p 0,1.  6.2.  Distribuzione, sterilizzazione e conservazione del diluente Distribuire il diluente (6.1) nelle provette (4.2.1) in quantità tali che a sterilizzazione avvenuta ciascuna provetta contenga, 9,0 ml p 0,2 di diluente. Tappare le provette.  Sterilizzare in autoclave (4.1.2) a 121 p 1 gC per 15 minuti.  Verificare il pH del diluente.  Se non deve essere usato immediatamente, conservare il diluente al riparo dalla luce e ad una temperatura compresa tra 1 e 5 gC per non più di un mese dopo la preparazione.  6.3.  Diluenti disidratati disponibili in commercio I diluenti (6.1) possono essere preparati a partire da compresse o polveri disidratate disponibili in commercio. Seguire le istruzioni del fabbricante. Aggiustare il pH come descritto al punto 6.1 e distribuire, sterilizzare e conservare i diluenti come  descritto in 6.2.  7.  Procedimento 7.1.  Fusione del terreno di coltura Prima di procedere all'esame microbiologico, far fondere rapidamente la quantità di terreno necessaria e portare quindi il terreno a 45 p 1 gC in bagnomaria (4.1.5).  7.2.  Preparazione del campione di latte 7.2.1.  Mettere a preincubare una confezione non aperta di latte pastorizzato o, se non è possibile un campione rappresentativo di non meno di 100 ml in un termostato [4.1.3.a)] a 6 gC per 120 p 2 ore.  7.2.2.  Al termine della preincubazione mescolare a fondo, capovolgendo rapidamente per 25 volte il contenitore del campione di latte, in modo che i microrganismi siano distribuiti il più uniformemente possibile. Evitare la formazione di schiuma oppure lasciare  che si disperda. Tra la miscelazione ed il prelievo dell'aliquota di analisi non devono trascorrere più di 3 minuti.  7.3.  Preparazione della prima diluizione (10-;) Aggiungere con una pipetta sterile (4.2.3), 1 ml del campione di latte (7.2.2) a 9 ml di diluente (6.1), evitando di toccare il diluente con la pipetta. La temperatura del diluente deve essere approssimativamente uguale a quella del campione di latte.  Mescolare accuratamente la prima diluizione con il mescolatore (4.1.9) per 5-10 secondi.  Si ottiene così la prima diluizione 10-;.  7.4.  Preparazione delle diluizioni decimali successive Trasferire con una pipetta sterile (4.2.3), 1 ml della prima diluizione (7.3) in 9 ml di diluente (6.1), seguendo le istruzioni date in 7.3.  Si ottiene così la diluizione 10-$.  Ripetere queste operazioni per ottenere ulteriori diluizioni decimali sino a quando si ritiene di avere ottenuto un numero adeguato di microrganismi (8.1).  7.5.  Semina delle piastre di Petri Trasferire con una pipetta sterile (4.2.3), 1 ml del campione e/o della diluizione decimale appropriata in una piastra (4.2.4). L'esame deve essere effettuato su almeno due diluizioni. Per ciascuna diluizione scelta come appropriata (8.1) preparare due  piastre.  7.6.  Distribuzione del terreno di coltura Versare circa 15-18 ml del terreno (7.1) in ciascuna delle piastre inoculate.  Appena versato il terreno di coltura mescolare facendo ruotare la piastra di Petri in modo da ottenere dopo l'incubazione una distribuzione uniforme delle colonie.  Tra la fine della preparazione del campione di latte e la miscelazione della diluizione con il terreno non devono trascorrere più di 15 minuti.  Lasciare quindi solidificare su una superficie orizzontale pulita e fredda.  7.7.  Incubazione delle piastre di Petri Mettere in termostato [4.1.3.b)] le piastre capovolgendole. Non impilare più di sei piastre alla volta. Le pile di piastre non devono venire a contatto tra di loro né con le pareti o con la parte superiore del termostato.  Mettere a incubare a 21 p 1 gC per 25 ore.  7.8.  Conteggio delle colonie Contare le colonie delle piastre di Petri che non contengono più di 300 colonie.  Esaminare le scatole a luce attenuata. Per contare più facilmente si possono usare opportune lenti (4.1.6) e/o un apparecchio contacolonie (4.1.8). Evitare di confondere particelle di precipitato nelle piastre con le colonie puntiformi. In caso di  dubbio, esaminarle con attenzione ricorrendo eventualmente ad una lente d'ingrandimento più forte (4.1.7) per distinguere le colonie dalle sostanze estranee.  Le colonie invasive devono essere contate come singole colonie. Se queste ricoprono meno di un quarto della piastra contare le colonie sulla parte restante della stessa calcolando quindi il numero corrispondente per l'intera piastra. Scartare invece la  piastra se le colonie invasive ne ricoprono più di un quarto.  8.  Calcolo ed espressione dei risultati 8.1.  Utilizzare i risultati relativi a quelle piastre che contengono da 10 a 300 colonie (vedi 8.3 e 8.4).  8.2.  Il numero di microrganismi in 1 ml di latte pastorizzato è dato dalla formula:   (n1 + 0,1 n2) d   S C (n1 + 0,1 n2) d dove S C è la somma del numero di colonie contate secondo il procedimento di cui al punto 8.1,  (n1 + 0,1 n2) d è uguale al volume di campione inoculato in cui:  n1 è il numero di piastre utilizzate per la prima diluizione,  n2 è il numero di piastre utilizzate per la seconda diluizione,  d è il fattore di diluizione relativo ai primi conteggi effettuati.  Il risultato è approssimato a due cifre significative. Quando la cifra che deve essere arrotondata è 5, effettuare l'approssimazione in modo che la cifra immediatamente a sinistra sia un numero pari.  Esempio diluizione 10-2: 278 e 290 colonie diluizione 10-3:  33 e  28 colonie numero/ml =  278 + 290 + 33 + 28   numero/ml = 278 + 290 +33 + 28 (2 + 0,1 × 2) 10-2 numero/ml =  0,022   = 629 0,022 = 28 590 = 29 000 = 2,9 × 10%.   8.3.  Se tutti i calcoli danno meno di 10 colonie, indicare che il numero di microrganismi per millilitro è «inferiore a 10 × d per ml», dove «d» è il reciproco del fattore di diluizione più basso.  8.4.  Se tutti i calcoli danno più di 300 colonie ma il conteggio è possible, procedere ad una stima e moltiplicare tale valore per il reciproco del fattore di diluizione. Riportare il risultato come «numero probabile di microrganismi per ml».  9.  Precisione Non sono disponibili risultati di prove interlaboratorio accettate a livello internazionale.  VI. ENUMERAZIONE DEI COLIFORMI - CONTEGGIO DELLE COLONIE A 30 gC  1.  Oggetto e campo di applicazione Il presente procedimento descrive il metodo di riferimento per la enumerazione dei coliformi nel latte pastorizzato con la tecnica del conteggio delle colonie a 30 gC.  2.  Definizione Con il termine «coliformi» si intendono i batteri che a 30 gC formano colonie caratteristiche o non caratteristiche che, fermentano il lattosio con formazione di gas nelle condizioni descritte.  3.  Principio Si mescola un volume definito del campione di latte con il terreno di coltura nelle piastre di Petri che vengono messe a incubare a 30 gC per 24 ore. Si contano le colonie caratteristiche e se necessario si conferma l'identità di quelle non  caratteristiche dopo verifica della loro capacità di fermentare il lattosio. Si calcola quindi il numero di coliformi per 1 ml di latte pastorizzato.  4.  Apparecchiatura e vetreria Materiale di uso comune in laboratorio e in particolare:  4.1.  Apparecchiatura 4.1.1.  Stufa ad aria calda, in grado di operare a 170-175 gC.  4.1.2.  Autoclave, termostatabile a 121 p 1 gC. PER LA CONTINUAZIONE DEL TESTO VEDI SOTTO NUMERO : 391D0180.14.1.3.  Termostato, regolabile ad una temperatura uniforme di 30 p 1 gC.  4.1.4.  pHmetro, con compensazione automatica della temperatura e precisione di p 0,1 unità pH.  4.1.5.  Bagnomaria, in grado di funzionare a 45 p 1 gC.  4.1.6.  Ansa metallica in platino-iridio o nickel-cromo.  4.2.  Vetreria 4.2.1.  Provette con chiusure appropriate da 20 ml per contenere il terreno di coltura per la conferma (5.2) e tubi di fermentazione di Durham di dimensioni adatte all'impiego con le provette.  4.2.2.  Palloni da 150 a 250 ml per contenere il terreno di coltura solido selettivo (5.1).  4.2.3.  Pipette, con una estremità chiusa con batuffolo di cotone in vetro o in materiale sintetico sterile, con punta a foro normale, della capacità nominale di 1 10 ml, con diametro del foro di scorrimento compreso tra 1,76 e 3 mm.  4.2.4.  Scatole di Petri, in vetro trasparente incolore o in materiale sintetico sterile, con diametro interno del fondo della scatola di circa 90-100 mm. L'altezza interna deve essere di almeno 10 mm. Il fondo non deve presentare irregolarità che possano  interferire con le colonie da contare.  4.2.5.  Sterilizzazione della vetreria La vetreria deve essere sterilizzata con uno dei metodi seguenti:  a)  mantenendola alla temperatura di 170-175 gC per almeno 1 ora in una stufa ad aria calda (4.1.1);  b) mantenendola in autoclave (4.1.2) a 121 p 1 gC per almeno 20 minuti.  Fare attenzione a che nell'autoclave si abbia un'adeguata penetrazione del vapore; ad esempio gli eventuali recipienti nei quali si pone il materiale da sterilizzare non devono essere chiusi ermeticamente e i tappi dei palloni non devono essere serrati.   La vetreria sterilizzata in autoclave deve essere asciugata facendo fuoriuscire il vapore.  Le pipette devono essere sterilizzate in una stufa ad aria calda (4.1.1).  5.  Terreni colturali 5.1.  «Violet Red Bile Lactose Agar» (Agar VRBL). Terreno colturale solido selettivo.  Composizione Peptone 7 g Estratto di lievito 3 g Lattosio (C12H22O11.H2O) 10 g Cloruro di sodio (NaCl) 5 g Sali biliari 1,5 g Rosso neutro 0,03 g Cristalvioletto 0,002 g Agar 10-15 g (a seconda delle proprietà gelatinizzanti dell'agar usato) Acqua 1 000 ml Preparazione Disperdere e sciogliere gli ingredienti in acqua e lasciare riposare per alcuni minuti. Mescolare quindi energicamente.  Verificare il pH con un pHmetro (4.1.4) ed aggiustarlo eventualmente con una soluzione (almeno 0,1 mol/l) di idrossido di sodio o acido cloridrico, in modo che ad ebollizione avvenuta si abbia a 25 gC un pH a 7,4.  Portare rapidamente ad ebollizione, agitando di tanto in tanto e distribuire immediatamente il terreno in ragione di 100-150 ml in palloni sterili (4.2.2). Raffreddare quindi in bagnomaria (4.1.5) a 45 p 1 gC.  Controllare la sterilità del terreno al momento dell'uso (vedi 6.4).  Impiegare il terreno entro 3 ore dalla preparazione.  5.2.  «Brilliant Green Lactose Bile Broth». Terreno colturale di conferma.  Composizione Peptone 10 g Lattosio (C12H22O11.H2O) 10 g Bile di bue disidratata 20 g Verde brillante 0,0133 g Acqua 1 000 ml Preparazione Sciogliere gli ingredienti in acqua portando ad ebollizione.  Verificare il pH con un pHmetro (4.1.4) ed eventualmente aggiustarlo con una soluzione (almeno 0,1 mol/l) di idrossido di sodio o di acido cloridrico in modo che, a sterilizzazione avvenuta, si abbia a 25 gC un pH 7,2 p 0,1.  Distribuire il terreno in ragione di 10 ml nelle provette contenenti i tubi di Durham. Chiudere le provette.  Sterilizzare per 15 minuti in autoclave (4.1.2) a 121 p gC.  Dopo la sterilizzazione i tubi di Durham non devono contenere bolle d'aria.  Verificare il pH del terreno colturale.  Se non è utilizzato subito, conservare il terreno al riparo dalla luce per non più di un mese dopo la preparazione, ad una temperatura compresa tra 0 e 5 gC.  5.3.  Terreni di coltura disidratati disponibili in commercio I terreni di coltura (5.1, 5.2) possono essere preparati a partire da terreni disidratati reperibili in commercio. Seguire in tal caso le istruzioni del fabbricante. Aggiustare il pH e distribuire, bollire o sterilizzare e conservare i terreni secondo i  procedimenti descritti in 5.1 e 5.2.  6.  Procedimento 6.1.  Terreno colturale Usare il terreno (agar VRBL) come descritto al punto 5.1.  6.2.  Preparazione del campione di latte Rimescolare completamente il campione di latte capovolgendo rapidamente per 25 volte il recipiente contenente il campione in modo che i microrganismi siano distribuiti il più uniformemente possibile. Evitare la formazione di schiuma o lasciare che si  disperda. Tra la miscelazione ed il prelievo dell'aliquota di analisi non devono trascorrere più di 3 minuti.  6.3.  Semina delle piastre di Petri Seminare 3 ml del campione di latte (6.2) trasferendo con una pipetta sterile (4.2.3) 1 ml del campione di latte in ciascuna delle tre piastre (4.2.4).  6.4.  Distribuzione del terreno colturale Versare 12 ml circa di agar VRBL (6.1) in ciascuna delle inseminate.  Appena versato il terreno colturale mescolare facendo ruotare la piastra di Petri in modo da ottenere dopo l'incubazione una distribuzione uniforme delle colonie.  Tra la fine della preparazione del campione di latte e la miscelazione dell'aliquota di analisi con il terreno non devono trascorrere più di 15 minuti.  Preparare come controllo per la sterilità una piastra non seminata versandovi 12 ml dell'agar VRBL usato per le piastre seminate.  Lasciare riposare su una superficie orizzontale pulita e fredda sino a quando il terreno non si sia solidificato.  A solidificazione completamente avvenuta versare almeno 4 ml di agar VRBL (6.1) sulla superficie del terreno inoculato.  Lasciare solidificare.  6.5.  Incubazione delle piastre di Petri Trasferire le piastre nel termostato (4.1.3), capovolgendole. Non impilare più di sei piastre alla volta. Le pile di piastre non devono venire a contatto tra di loro né con le pareti o con la parte superiore del termostato.  Incubare a 30 p 1 gC per 24 p 2 ore.  6.6.  Conta delle colonie 6.6.1.  Contare le colonie nelle piastre di Petri contenenti non più di 150 colonie. Contare le colonie di colore rosso scuro aventi un diametro di almeno 0,5 mm, con o senza precipitato intorno, caratteristiche per i coliformi.  6.6.2.  Se tutte le colonie o parte di esse hanno un aspetto non caratteristico (ed esempio differiscono nel colore, nelle dimensioni o nella formazione di precipitato dalle colonie tipiche effettuare un saggio di conferma (6.7).  6.7.  Saggio di conferma Sulla base delle indicazioni date in 6.6.2, effettuare un saggio di conferma su un adeguato numero (per esempio 3 a 5) di colonie non caratteristiche inoculandole, con un'ansa metallica (4.1.6), in provette di brodo «Brilliant Green Lactose Bile» (5.2).  Mettere ad incubare le provette a 30 ± 1 oC per 24 ± 2 ore.  Considerare coliformi quelle colonie che nel tubo di Durham producono gas.  7.  Calcolo ed espressione dei risultati 7.1.  Utilizzare i risultati delle conte (vedi 7.4) relative alle piastre che contengono non più di 150 colonie.  7.2.  Nel caso del saggio di conferma, calcolare il numero di colonie di coliformi in base alla percentuale di colonie di coliformi confermate.  7.3.  Il numero di coliformi in 1 ml di latte pastorizzato è dato dalla formula:   S C  ,  S C n   dove:  S C = è il numero totale di colonie di coliformi (7.1 in relazione con 7.3) risultato dall'esame del campione di latte (3 ml).  n = è il numero di millilitri del campione esaminato (6.3.1) (3 ml).  Quando si hanno più di 100 colonie il risultato è approssimato a due cifre significative. Quando la cifra da arrotondare è 5, arrotondare in modo che la cifra immediatamente a sinistra sia un numero pari.  Se si ottengono soltanto conteggi con numero di colonie superiore a 150 indicare il risultato come «numero probabile di coliformi in 1 ml di prodotto».  8.  Precisione Non sono disponibili risultati di prove interlaboratorio accettate a livello internazionale.  VII. ENUMERAZIONE DELLE CELLULE SOMATICHE  Il presente procedimento descrive due metodi come metodi di riferimento per la enumerazione delle cellule somatiche:  A.  Il metodo microscopico B.  Il metodo fluoro-opto-elettronico.   A. Metodo Microscopico 1.  Oggetto e campo di applicazione Il presente procedimento descrive il metodo di riferimento per la enumerazione delle cellule somatiche nel latte crudo.  Il presente procedimento descrive il metodo per la determinazione del numero di cellule nel campione di latte per tarare e verificare l'accuratezza del metodo fluoro-opto-elettronico (vedi B.1).  2.  Definizione Ai fini del presente metodo per cellule somatiche si intendono quelle cellule, quali leucociti e cellule epiteliali, i cui nuclei possono essere distintamente colorati con il blu di metilene.  3.  Principio 0,01 ml di latte vengono distribuiti su un'area di 1 cm$ di vetrino. Il film viene quindi essiccato e colorato. Per il conteggio si usa un microscopio. Il numero di cellule contenute in 1 ml si ottiene moltiplicando il numero di cellule somatiche  contate in un'area determinata per il fattore di lavoro.  4.  Reattivi Le sostanze usate devono essere di purezza analitica.  Soluzione colorante Composizione Blu di metilene  0,6 g Etanolo - 99 % 54,6 ml 1,1,1-tricloroetano oppure tetracloroetano 40,6 ml Acido acetico glaciale  6,6 ml Avvertenza Il tetracloroetano è velenoso. Nel caso venga usato, la preparazione del colorante e l'applicazione sul vetrino devono essere effettuate sotto cappa.  Preparazione Mescolare l'etanolo con l'1,1,1,-tricloroetano o il tetracloroetano in una bottiglia e riscaldare a bagnomaria a 60-70 gC. Addizionare il blu di metilene, mescolare accuratamente, raffreddare in frigorifero a 4 gC per 12-24 ore ed aggiungere acido  acetico glaciale. Filtrare su filtro con diametro dei pori non superiore ai 10-12 micron e conservare la soluzione colorante in una bottiglia a tenuta d'aria. Se si sono formati granelli o sedimenti, prima dell'uso filtrare nuovamente.  5.  Apparecchiatura e vetreria 5.1.  Microscopio con ingrandimento di 500-1 000.  5.2.  Microsiringa 0,01 ml con precisione non inferiore a p 2 %.  5.3.  Vetrino con campo delimitato di 20 mm × 5 mm per il film, oppure un vetrino standard ed una sagoma di 20 mm × 5 mm delimitante il campo per il film.  5.4.  Piastra riscaldante livellata (30-50 gC) per essiccare i vetrini.  5.5.  Phon (asciugacapelli) per asciugare il film.  5.6.  Bagnomaria, termostatabile a 30-40 gC per riscaldare il campione di latte.  5.7.  Vetrino micrometrico di riferimento, con intervalli di 0,01 mm.  6.  Procedimento 6.1.  Campione di latte Il campione di latte deve essere analizzato entro 6 ore dal campionamento. La temperatura di conservazione non deve superare i 6 gC. Occorre evitare il congelamento.  6.2.  Preparazione del campione nel laboratorio Riscaldare il campione in bagnomaria (5.6) a 30-40 gC. Mescolare quindi con cura. Raffreddare alla temperatura alla quale è stata tarata la microsiringa (5.2), ad esempio 20 gC.  6.3.  Pre-trattamento dei vetrini Pulire i vetrini (5.3), ad esempio con etanolo, asciugare con carta che non lasci particelle, esporre alla fiamma e raffreddare. Conservare in una scatola per evitare la polvere.  6.4.  Preparazione del film Prelevare con una microsiringa (5.2) 0,01 ml di latte dal campione preparato come descritto. Pulire accuratamente la parte esterna della siringa che viene a contatto con il latte. Portare la siringa sul vetrino (5.3) seguendo dapprima il contorno del  rettangolo (20 mm × 5 mm) e ricoprendo quindi tutta la superficie il più uniformemente possibile. Porre il vetrino su una piastra riscaldante livellata (5.4) fino a essiccazione completa.  Per ciascun campione di latte devono essere preparati ed analizzati almeno due film.  6.5.  Colorazione dei film Immergere nella soluzione colorante (4) per 10 minuti. Essiccare, completando eventualmente con il phon (5.5). Immergere i film in acqua di rubinetto fino ad asportare tutto il colore in eccesso. Essiccare quindi nuovamente e conservare al riparo dalla  polvere.  6.6.  Taratura del campo microscopico Sulla base dell'ingrandimento scelto (× 500 - × 1 000) determinare il diametro del campo microscopico con il vetrino micrometrico di riferimento (5.7).  7.  Conteggio e calcolo 7.1.  Conta delle cellule Con il microscopio (5.1). Contare anziché le cellule soltanto i loro nuclei. Questi sono chiaramente riconoscibili e per la conta almeno la metà del nucleo deve essere visibile nel campo microscopico. Contare le strisce o i campi nel terzo centrale del  film, evitando di prendere in considerazione quelli che ricadono esclusivamente nelle zone periferiche del film. L'accuratezza con cui sono stati preparati i film e quindi l'attendibilità dei risultati, deve essere controllata almeno una volta al mese  eseguendo la conta in varie parti del film. Il conteggio può essere anche effettuato contando i campi microscopici ripartiti in modo tale che tutte le parti del film siano ugualmente rappresentate.  7.2.  Numero minimo di cellule da contare Poiché la conta delle cellule somatiche al microscopio può essere anche usata per la standardizzazione dei procedimenti di conteggio automatico e meccanizzato, il coefficiente di variazione delle conte su campioni identici non deve risultare più elevato  di quello ottenuto con strumenti elettronici. Il coefficiente di variazione per un campione di latte contenente 400 000-600 000 cellule/ml non deve superare il 5 %.  Per ottenere questo valore di ripetibilità il numero di cellule somatiche da contare per ciascun campione deve essere, in base alle caratteristiche della distribuzione di Poisson, di almeno 400.  La distribuzione di Poisson presuppone M = V = s$,  dove M è il valore medio,  V è la varianza e s è la deviazione standard.  Il coefficiente di variazione è:  CV =  s × 100 %  oppure CV =  100 %  oppure CV =  100 %   CV = s × 100 % M oppure CV = 100 % s oppure CV = 100 % wM- dove M (media) indica il numero di particelle (cellule) che sono state contate (cioè 400 per CV = 5 %).  7.3.  Calcolo del fattore di lavoro Nel caso di 0,01 ml di latte il fattore di lavoro è calcolato secondo 7.3.1 o 7.3.2.  7.3.1 Conteggio delle strisce tracciate trasversalmente al film La lunghezza di ciascuna striscia su cui effettuare la conta è di 5 mm mentre la larghezza corrisponde al diametro del campo microscopico delimitato dal vetrino micrometrico di riferimento (5.7).  Fattore di lavoro =  20× 100   Fattore di lavoro = 20 × 100 d × b dove d = è il diametro del campo microscopico in mm, delimitato dal vetrino micrometrico di riferimento (5.7),  b = è il numero di strisce su cui la conta è stata effettuata per intero.  7.3.2. Effettuando la conta dei campi microscopici nel terzo centrale del film oppure mediante la griglia Fattore di lavoro:  20 × 5 × 100  =  12 732   Fattore di lavoro:  20 × 5 × 100 P × d² × s 4 = 12 732 d² × s dove d = è il diametro del campo microscopico in mm delimitato dal vetrino micrometrico di riferimento (5.7),  s = è il numero di campi in cui è stata effettuata la conta.  7.4.  Calcolo del tenore in cellule Si moltiplica il numero di cellule somatiche contate (7.1 e 7.2) per il fattore di lavoro (7.3), ottenendo il numero di cellule per ml di latte.  7.5.  Precisione Il coefficiente di variazione (vedi 7.2) non deve essere superiore al 5 %.  Per la precisione non sono disponibili risultati di prove interlaboratorio accettate a livello internazionale.   B. Metodo fluoro-opto-elettronico 1.  Oggetto e campo d'applicazione Il presente procedimento descrive il metodo di riferimento che, dopo opportuna taratura (vedi A.1), può essere usato per la conta di cellule somatiche nel latte crudo - con o senza conservanti chimici.  2.  Definizione Ai fini del presente metodo con il termine cellule somatiche si intendono le particelle aventi un' intensità di fluorescenza minima dovuta alla colorazione del DNA del nucleo.  3.  Principio Si mescola a fondo una parte del campione (ad esempio 0,2 ml) con una soluzione tampone ed una soluzione fluorescente. Parte di tale miscela viene trasferita sotto forma di un film sottile su un disco rotante che funge da piano portaoggetti per il  microscopio.  Ogni cellula produce un impulso elettrico che viene amplificato e registrato. Il numero di cellule somatiche viene espresso in migliaia per ml.  4.  Reattivi Salvo altre indicazioni i reattivi devono essere di purezza analitica. L'acqua deve essere distillata, deionizzata o di purezza equivalente.  4.1.  Soluzione tampone Composizione Ftalato acido di potassio 51,0 g Idrossido di potassio 13,75 g Polietileneglicol-mono-p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil-etere (ad esempio Triton X-100), all'1 % in volume 10,0 ml pH 5,7-5,9. Portare con acqua distillata a 10 000 ml.  Preparazione Miscelare i vari ingredienti. Può essere conservata in recipienti a tenuta d'aria per non oltre 7 giorni.  4.2.  Soluzione fluorescente (soluzione madre) Composizione Bromuro di etidio 1,0 g Portare con acqua a 1 000 ml.  Preparazione Si scioglie in acqua il bromuro di etidio. La soluzione può essere conservata al massimo per 2 mesi in una bottiglia a tenuta di luce e d'aria.  4.3.  Soluzione fluorescente (soluzione di lavoro) Portare a 1 000 ml con la soluzione tampone (4.1) 20 ml della soluzione madre (4.2) e mescolare. La soluzione di lavoro deve essere utilizzata entro 7 giorni.  4.4.  Soluzione detergente Composizione Soluzione tampone (4.1) 10 ml Polietileneglicol-mono-p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil-etere (ad esempio Triton X-100), all'1 % in volume 10 ml Ammoniaca, 25 % in volume 25 ml Portare con acqua a 10 000 ml.  Preparazione Miscelare i vari ingredienti. Conservare al massimo per 30 giorni.  5.  Apparecchiatura e vetreria 5.1.  Contatore funzionante in base al principio ottico della fluorescenza.  Nota Lo strumento deve essere tarato prima dell'uso. Si determina quindi la relazione tra il volume delle particelle da contare e la soglia oltre la quale viene effettuato il conteggio. La taratura dell'apparecchiatura è effettuata secondo le istruzioni del  fabbricante usando campioni il cui numero di cellule è stato precedentemente determinato con il metodo microscopico (A).  5.2.  Bagnomaria con circolazione d'acqua, regolabile a 40 p 1 gC.  5.3.  Provetta con opportuna chiusura, da circa 15 ml.  6.  Il campione di latte 6.1.  Il campione deve essere conservato a bassa temperatura in una provetta (5.3). Se il campione è privo di conservanti chimici, la conta non può essere effettuata nelle 24 ore successive alla mungitura in quanto si otterrebbero valori troppo bassi. La  temperatura di conservazione non deve superare i 6 gC.  6.2.  Conservazione La conservazione chimica deve essere effettuata entro 24 ore.  6.2.1.  La conservazione chimica dei campioni può essere effettuata addizionando uno dei seguenti conservanti:  - Acido ortoborico La concentrazione finale dell'acido ortoborico nel campione non deve superare 0,6 g/100 ml. I campioni così addizionati possono essere conservati al massimo per altre 24 ore a 6-12 gC.  - Dicromato di potassio La concentrazione finale del dicromato di potassio non deve superare 0,2 g/100 ml. I campioni così addizionati possono essere conservati al massimo per altre 72 ore alla temperatura di 6-12 gC.  - Azoturo di sodio Il campione può essere conservato con azoturo di sodio ad una concentrazione finale di 0,024 g/100 ml, a condizione che venga raffreddato a 6-12 gC subito dopo il campionamento e che la conta venga effettuata entro 48 ore dal campionamento stesso.  - Bronopol Il campione può essere conservato con bronopol ad una concentrazione finale di 0,05 g/100 ml, purché venga raffreddato alla temperatura di 6-12 gC subito dopo il campionamento e la conta venga effettuata entro 72 ore dallo stesso.  6.2.2.  Il campione già trattato con acido ortoborico può essere conservato per altre 48 ore usando dicromato di potassio.  Nota Per i campioni trattati con dicromato di potassio devono essere rispettate le norme locali relative allo scarico degli effluenti.  7.  Procedimento 7.1.  Pretrattamento del campione Dopo la mungitura il latte da esaminare deve essere conservato per almeno 24 ore a circa 2-6 gC. Se i campioni non sono stati pretrattati, si sconsiglia di effettuarne il conteggio il giorno stesso della mungitura perché si potrebbero ottenere risultati  troppo bassi. Qualora si debba assolutamente procedere al conteggio, il campione deve essere pretrattato per almeno tre ore con dicromato di potassio (vedi 6.2.1).  7.2.  Preparazione Si riscalda in bagnomaria (5.2) termostatato a circa 40 gC il campione pretrattato (vedi 7.1) o il campione non trattato munto da almeno un giorno. Lo si mantiene quindi a temperatura ambiente sino a conta ultimata.  7.3.  Conta delle cellule La conta va effettuata con il contatore (5.1) entro 15 minuti dalla fine del trattamento termico (vedi 7.2). Il campione deve essere mescolato a fondo subito prima della conta al fine di ottenere una distribuzione delle cellule somatiche che sia la più  omogenea possibile.  L'ulteriore diluzione e la preparazione del campione si effettuano automaticamente nello strumento.  8.  Precisione Non si dispone di valori della ripetibilità (r) e della riproducibilità (R) ottenuti con prove interlaboratorio accettate a livello internazionale.  In futuro verranno fissati dei valori per quanto riguarda la precisione.  Sulla base dei dati disponibili a livello nazionale si possono effettuare le seguenti stime:  numero delle cellule compreso fra 400 000 e 500 000/ml - deviazione standard per la ripetibilità sr = 20 000 cellule/ml (pari ad un coefficiente di variazione del 5 %-4 %),  - deviazione standard per la riproducibilità:  sR = 40 000 cellule/ml (pari ad un coefficiente di variazione del 10 %-8 %).  9.  Controllo dell'accuratezza Il controllo dell'accuratezza è effettuato usando campioni il cui tenore di cellule (P) è noto essendo stato determinato per conteggio delle cellule al microscopio in un laboratorio nazionale di riferimento.  VIII. RICERCA DI ANTIBIOTICI E SULFAMIDICI  OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE Il presente procedimento descrive il metodo di riferimento per la ricerca di antibiotici e sulfamidici nel latte crudo e nel latte trattato termicamente.  Il metodo di riferimento si suddivide in:  A. Metodo qualitativo È il metodo che consente una prima selezione dei campioni di latte contenenti antibiotici e sulfamidici. Il metodo descritto è uno di quei metodi, simili fra loro, che si basano sull'uso del Bacillus stearothermophilus, varietà calidolactis, ATCC 10149  come microrganismo-test. Il metodo è stato scelto come rappresentativo di questo tipo di prove.  B. Metodo di conferma ed identificazione della penicillina Il presente metodo deve essere usato per confermare i risultati del procedimento qualitativo, per identificare la penicillina e determinarne la concentrazione.   A. Metodo qualitativo 1.  Oggetto e campo di applicazione Il procedimento descrive la tecnica di ricerca qualitativa, nel latte crudo ed in quello trattato termicamente, degli antibiotici e dei sulfamidici presenti in concentrazione superiore ai limiti fissati nella tabella:   Limiti di rivelazione di vari antibiotici e sulfamidici (¹)    Sensibilità della prova Completamente negativo Completamente positivo Benzilpenicillina 0,002  0,006 Ampicillina 0,002  0,005 Cloxacillina 0,015  0,035 Nafcillina 0,006  0,011 Tetraciclina 0,10   0,40  Ossitetraciclina 0,20   0,45  Clortetraciclina 0,15   0,50  Cloramfenicolo 7,  15,  Diidrostreptomicina 4,  13,  Neomicina 1,  22,  Kanamicina 9,  28,  Bacitracina 0,06   0,14  Eritromicina 1,   2,25  Rifamicina 0,01   0,14  Diafenilsolfone 0,01   0,1   Sulfametazina (sulfadimidina) 0,5    1,  (¹) La benzilpenicillina e la bacitracina sono espressi in UI/ml, tutti gli altri antibiotici in mg/ml.  2.  Definizione Se il colore del terreno colturale non cambia (vedi 7.1) il latte contiene antibiotici o sulfamidici.  3.  Principio Un campione di latte viene aggiunto con i nutrienti ad un gel di agar contenente un indicatore di pH e spore di Bacillus stearothermophilus, varietà calidolactis ATCC 10149 (vedi 5.4.1), che nel complesso ha una buona sensibilità ed è particolarmente  sensibile all'effetto inibente della penicillina. L'incubazione che provoca la normale crescita dell'organismo e sua produzione di acido fa cambiare il colore dell'indicatore di pH da rosso porpora a giallo. La presenza nel latte di sostanze che  inibiscono la crescita dell'organismo fanno sì che l'indicatore di pH mantenga il colore rosso porpora.  4.  Apparecchiatura e vetreria Materiale di uso comune in laboratorio e in particolare:  4.1.  Apparecchiatura 4.1.1.  Termostato regolabile a 64 p 1 gC.  4.1.2.  Bagnomaria termostatato a 64 p 1 gC.  4.1.3.  Rastrelliera per le provette o le fiale.  4.1.4.  Pipetta con punto monouso per campionamento e dosaggio di 0,1 ml.  4.1.5.  Pinze o pinzette.  4.1.6.  Stufa ad aria calda funzionante a 170-175 gC.  4.1.7.  Autoclave regolata a 121 p 1 gC.  4.1.8.  pHmetro.  4.2.  Vetreria 4.2.1.  Bottiglie per campioni con adeguate chiusure.  Nota:  Certi tappi di gomma possono rilasciare sostanze inibenti sulle pareti del collo della bottiglia.  4.2.2.  Piastre di Petri in vetro incolore trasparente o in materiale sintetico sterile con fondo piatto di spessore uniforme, e diametro interno minimo di circa 140 mm.  4.2.3.  Bottiglie da 250 ml.  4.2.4.  Pipette, (con una estremità chiusa da un batuffolo di cotone) sterile in vetro o di materiale sintetico sterile della capacità nominale di 1 ml e di 10 ml.  4.2.5.  Spatole di vetro 4.2.6.  Provette o ampolle, con diametro interno di circa 8 mm, con cappuccio o tappo 4.2.7.  Sterilizzazione della vetreria La vetreria deve essere sterilizzata con uno dei seguenti metodi:  a)  mantenendola in una stufa ad aria calda (4.1.6) alla temperatura di 170-175 gC per almeno un'ora;  b)  mantenendola in autoclave (4.1.7) a 121 gC p 1 gC per almeno 20 minuti. Fare particolare attenzione a che nell'autoclave si abbia una adeguata penetrazione di vapore (ad esempio gli eventuali recipienti nei quali si pone il materiale da sterilizzare non devono essere chiusi ermeticamente e i tappi dei palloni e delle  bottiglie non debbono essere serrati).  La vetreria sterilizzata in autoclave deve essere asciugata facendo fuoriuscire il vapore.  Le pipette devono essere sterilizzate in una stufa a secco.  5.  Terreni colturali, soluzioni, organismo-test, ecc.  Gli ingredienti dei terreni colturali devono essere del tipo per batteriologia. L'acqua usata deve essere distillata su vetro oppure demineralizzata di purezza almeno equivalente. Non deve inoltre contenere sostanze che inibiscano i microrganismi-test.   5.1.  Terreni colturali 5.1.1.  Agar nutritivo Composizione Estratto di lievito 2 g Peptone 5 g Estratto di carne 1 g Cloruro di sodio 5 g Agar 10-15 g Acqua 1 000 ml Preparazione Sciogliere in acqua i componenti. Portare ad ebollizione agitando di tanto in tanto. Aggiustare il pH in modo che a sterilizzazione avvenuta sia di 7,4 p 0,1 a 25 gC.  Distribuire con aliquote da 10 ml in provette per ottenere un terreno solidificato a becco di clarino oppure con aliquote da 100 ml in bottiglie.  Sterilizzare a 121 p 1 gC per 15 minuti:  5.1.2.  Terreno agarizzato Composizione Cloruro di sodio 2 g Agar 15 g Acqua 1 000 ml Soluzione di trimetoprim o tetroxoprim (vedi 5.1.3) (1) 10 ml Preparazione Sciogliere in acqua tutti i componenti eccetto il trimetoprim o il tetroxoprim. Portare ad ebollizione agitando di tanto in tanto. Aggiungere trimetoprim o tetroxoprim e sterilizzare a 121 p 1 gC per 15 minuti; aggiustare il pH in modo che, a  sterilizzazione avvenuta risulti a 25 gC di 7,0 p 0,1.  5.1.3.  Soluzione di trimetoprim o tetroxoprim Trimetoprim o tetroxoprim 5 mg/30 mg Etanolo al 96 % 5 ml/30 ml Acqua fino a 1 000 ml Sciogliere il trimetoprim o tetroxoprim in etanolo (5 ml/30 ml) e diluire con acqua.  5.1.4.  Terreno nutritivo Estratto di lievito 0,75 mg Glucosio 5,0 mg Amido solubile 8,0 mg Porpora di bromocresolo 0,025 g Acqua fino a 50 ml Sciogliere in acqua, eventualmente riscaldando, i nutrienti e l'indicatore e sterilizzare per filtrazione. Il terreno nutritivo agarizzato è disponibile in commercio in compresse.  5.2.  Soluzioni standard di penicillina 5.2.1.  Preparare, in una bottiglia sterile opportunamente tappata, una soluzione di penicillina da 60 mg/ml = (100 UI/ml) sciogliendo con benzilpenicillato di potassio o di sodio cristallino in acqua distillata sterile.  5.2.2.  Preparare una soluzione di lavoro di penicillina portando a 1 000 ml con acqua distillata sterile 1,25 ml della soluzione di penicillina (5.2.1). Tale soluzione di lavoro contiene 0,075 mg/ml (= 0,125 UI/ml).  5.2.3.  Preparare 75 ml di una soluzione standard di penicillina contenente 0,004 mg/ml (= 0,0067 UI/ml) di penicillina aggiungendo 71 ml di latte esente da sostanze inibenti (5.3) a 4 ml di soluzione di lavoro di penicillina (5.2.2) e mescolando.   5.2.4.  Le soluzioni di penicillina descritte ai punti da 5.2.1 a 5.2.3 devono essere preparate lo stesso giorno in cui viene effettuato il saggio.  5.3.  Latte esente da sostanze inibenti Preparare come controllo un latte esente da sostanze inibenti sciogliendo in acqua distillata sterile latte scremato (10 % m/V), in cui sia stata previamente constatata l'assenza di sostanze inibenti. In alternativa si possono preparare alcune bottiglie  di latte fresco in massa, in cui sia stata verificata l'assenza di sostanze inibenti, riscaldandolo per 1 ora a 100 gC e conservandolo quindi in frigorifero a 0-6 gC per non più di una settimana.  5.4.  Organismo-test 5.4.1.  Come organismo-test di prova si usa il Bacillus stearothermophilus, varietà calidolactis, ceppo ATCC 10149. Il ceppo ATCC 10149 è identico al C 953.  5.4.2.  Preparare una coltura madre per conservare la coltura di analisi. Questa è mantenuta su agar nutritivo solidificato a becco di clarino (5.1.1). Inoculare il terreno con uno striscio sulla superficie dell'agar usando un'ansa di coltura di analisi e  incubare in condizioni aerobiche per 48 ore a 63 p 1 gC. Dopo incubazione, chiudere ermeticamente la provetta con un tappo di gomma sterile. La soluzione madre così ottenuta può essere conservata in frigorifero per diversi mesi a 0-5 gC.  5.5.  Preparazione della coltura di analisi (sospensione di spore) 5.5.1.  Versare, in asepsi, 20 ml di agar nutritivo (5.1.1) in una piastra di Petri sterile (4.2.2) e raffreddare a temperatura ambiente.  5.5.2.  Versare con una pipetta sterile (4.2.4) 5 ml di acqua distillata sterile in una delle provette contenenti la coltura madre (5.4.2) e lavare con un'ansa sterile l'agar a becco di clarino per prelevare le spore. Tale sospensione di spore deve essere  mantenuta a 0-5 gC ed usata entro 36 ore.  5.5.3.  Trasferire con una pipetta sterile (4.2.4) 0,5 ml della sospensione di spore (5.5.2) su una piastra preparata (5.5.1) e spandere bene l'inoculo su tutta la superficie con una bacchetta di vetro piegata ad una estremità. Incubare al 63 p 1 gC (4.1.1) per  16-18 ore.  Quando si usano una coltura madre (5.4.2) o una coltura preparata da più di 36 ore, occorre ripetere almeno due volte il procedimento di inoculo con un intervallo di non più di 36 ore fra due subcolture successive.  5.5.4.  Con una pipetta sterile (4.2.4), versare 10 ml di acqua distillata sulla piastra (5.5.3) e trasferire le spore della superficie nella sospensione servendosi di una bacchetta di vetro.  Versare la sospensione di spore in una bottiglia (4.2.3) contenente 250 ml di acqua distillata sterile. Chiudere la bottiglia ed agitarla accuratamente. Le colture che non è possibile replicare subito devono essere conservate in frigorifero a 0-6 gC.  5.5.5.  La sospensione di spore deve dare una conta di colonie vive comprese tra 5 e 10 milioni per millilitro dopo incubazione a 63 p 1 gC per 16-18 ore su terreno agarizzato per il conteggio in piastra. La sospensione di spore deve essere uniformemente  torbida e se contiene flocculazioni o un sedimento deve essere scartata e sostituita con una nuova sospensione preparata con la coltura madre (5.4.2).  5.6.  Preparazione delle provette/ampolle 5.6.1.  Fondere il terreno agarizzato (5.1.2) e lasciarlo raffreddare a 55 gC.  5.6.2.  Aggiungere una parte della sospensione di spore preparata da poco (5.5.4) a 5 parti del terreno agarizzato (5.6.1) in una provetta o una bottiglia e mescolare accuratamente.  5.6.3.  Trasferire in una provetta o una ampolla sterili (4.2.6) 0,3 ml del terreno colturale inoculato (5.6.2) calcolato in modo da formare uno strato dello spessore di 5 mm e chiudere con un tappo o un cappuccio oppure saldando l'estremità alla fiamma.  Lasciare raffreddare le provette/ampolle in posizione verticale facendo solidificare il terreno e lasciare poi a riposo per almeno 12 ore.  5.6.4.  Le provette/ampolle possono essere usate lo stesso giorno, ma possono essere conservate per diversi mesi se vengono raffreddate subito dopo la preparazione e conservate a 0-6 gC.  6.  Procedimento 6.1.  I campioni devono essere analizzati al più presto possibile, preferibilmente entro 24 ore dal campionamento, mantenendoli nel frattempo alla temperatura di 0-5 gC. Nel caso non sia possibile analizzarli entro 24 ore, i campioni devono essere conservati  in un surgelatore (da -30 gC a -15 gC) per ridurre al massimo l'inattivazione della penicillina.  6.2.  Contrassegnare ciascuna provetta/ampolla (5.6) in modo leggibile e indelebile. Togliere il cappuccio o il tappo. Porre in un'opportuna rastrelliera (4.1.3) il numero necessario di provette/ampolle per i campioni per la prova e quelli di controllo (5.2 e  5.3) da esaminare.  6.3.  Aggiungere ad ogni provetta/ampolla 50 mcl della sostanza nutritiva di cui al punto 5.1.4.  6.4.  Mescolare a fondo il campione di latte e trasferirne con la siringa (4.1.4) 0,1 ml nella provetta/ampolla con l'etichetta corrispondente. Usare una punta monouso pulita per ciascun campione da trasferire.  6.5.  Ripetere in doppio l'operazione di cui al punto 6.4 usando invece del campione di latte (5.2.3) la soluzione standard di penicillina contenente 0,004 mg/ml (= 0,0067 UI/ml) di penicillina.  6.6.  Ripetere in doppio l'operazione del punto 6.4 usando invece del campione di latte il latte di controllo esente da inibitori (5.3).  6.7.  Chiudere le provette/ampolle e sistemare la rastrelliera che le contiene in bagnomaria a 63 p 1 gC (4.1.2) per almeno 2;/2-2 =/4 ore.  6.8.  Estrarre dal bagnomaria la rastrelliera contenente le provette/fiale.  6.9.  Osservare il colore del substrato del saggio (vedi 7).  7.  Interpretazione dei risultati 7.1.  Una colorazione purpurea del terreno di coltura di prova in una provetta/ampolla contenente il campione di latte o il latte di controllo indica la presenza nel campione di antibiotici o di sulfamidici esattamente o vicino al livello «totalmente  positivo» indicato nella tabella a pag. 39. Il permanere della colorazione purpurea nelle provette/ampolle contenenti la soluzione standard di penicillina (6.5) dimostra che il terreno di coltura adottato per il saggio è sufficientemente sensibile.  7.2.  La colorazione purpurea solo di una parte del terreno di coltura o la colorazione irregolare di una delle provette/fiale contenenti il campione di latte indicano la presenza nel campione di sostanze inibenti comprese fra i livelli indicati nella tabella  a pag. 39.  7.3.  Una colorazione giallastra del terreno di coltura in una delle provette/ampolle del campione di latte o del latte di controllo indica l'assenza di sostanze che inibiscono la crescita dell'organismo-test.  7.4.  Se tutte le provette/ampolle, compresa quella con il latte di controllo, acquistano una colorazione purpurea, queste non contengono spore vive ed occorre ripetere il saggio sui campioni usando sostanze preparate di recente.  8.  Conferma dei risultati 8.1.  Effettuare su tutti i campioni che danno le reazioni descritte in 7.1 e 7.2 la prova di conferma secondo il «metodo B». Se prima della prova di conferma è necessario procedere al deposito dei campioni di latte questi ultimi debbono essere surgelati per  impedire la degradazione degli antibiotici.   B. Metodo per la conferma delle penicilline e la determinazione della concentrazione 1.  Oggetto e campo di applicazione Il procedimento descrive il saggio di conferma per penicilline o per antibiotici diversi dalle penicilline ed il metodo per determinare la concentrazione della penicillina nei campioni di latte con reazione positiva (A.7.1) o incerta (A.7.2).  Sensibilità del metodo ai vari antibiotici Vedi A.1.  2.  Definizione 2.1.  Il campione di latte contiene antibiotici, sulfamidici compresi, quando con il metodo descritto il campione presenta attorno al disco un alone di inibizione largo almeno 2 mm.  2.2.  Se un campione contenente antibiotici, sulfamidici compresi (2.1), cui è stata aggiunta penicillinasi (betalattamasi) non dà alone oppure dà un alone di diametro inferiore a quello del campione senza penicillinasi, la sostanza inibente è la penicillina  con o senza un altro antibiotico, sulfamidici compresi.  2.3.  Se la zona non viene inattivata dalla penicillinasi (2.2), la sostanza inibente nel campione di latte non è penicillina, ma può essere un altro residuo [vedi direttiva 85/397/CEE, allegato A, capitolo VI, A.1.f e 2b)].  Alcune penicilline semisintetiche, ad esempio la sodio cloxacillina socica, non sono, o sono soltanto in parte, inattivate dalla penicillinasi oppure sono completamente resistenti e non sono quindi identificate come penicillina (vedi 7.3).  3.  Principio Un disco di carta bibula impregnato del latte in esame è posto sulla superficie di un terreno agarizzato inoculato con Bacillus stearothermophilus, varietà calidolactis. Quando con l'incubazione si ha una normale crescita dell'organismo l'agar diventa  opaco. La presenza nel latte di sostanze che inibiscono lo sviluppo degli organismi è indicata da un alone attorno al disco. La dimensione dell'alone dipende, tra l'altro, dalla concentrazione e dal tipo di sostanze inibenti presenti nel latte.  4.  Apparecchiatura, vetreria e attrezzatura 4.1.  Apparecchiatura 4.1.1.  Vedi A.4.1.  4.1.2.  Bagnomaria, regolabile a 80 gC p 1 gC.  4.2.  Vetreria (Vedi A.4.2).  4.3.  Dischi di carta, esenti da sostanze inibenti, di 9-13 mm di diametro, in grado di assorbire circa 130 mg di latte (di preferenza conservati in un essiccatore).  5.  Terreni colturali, soluzioni standard, soluzione di penicillinasi, reagenti, organismo-test, ecc.  Gli ingredienti dei terreni colturali devono essere del tipo per batteriologia. L'acqua usata deve essere distillata su vetro o demineralizzata di purezza almeno equivalente e non deve contenere sostanze che possano inibire la crescita del  microrganismo-test.  5.1.  Terreni colturali 5.1.1.  Agar nutritivo (A.5.1.1) 5.1.2.  Terreno di coltura per la ricerca di sostanze inibenti Composizione Estratto di lievito 2,5 g Triptone 5 g Glucosio 1 g Soluzione di trimetoprim o tetroxoprim (A.5.1.3) 10 ml Agar 10-15 g (a seconda del potere gelatinizzante) Acqua 1 000 ml Preparazione Sciogliere completamente gli ingredienti solidi in acqua riscaldando ed agitando prima di aggiungere la soluzione dei trimetoprim o di tetroxoprim. Aggiustare quindi il pH in modo che dopo la sterilizzazione il suo valore a 25 gC sia 8,0 + 0,1.  Sterilizzare il terreno per 15 minuti a 121 + 1 gC.  5.2.  Soluzioni standard di penicillina nel latte (Vedi A.5.2.) Per quantificare le sostanze inibenti (8) preparare delle soluzioni standard di penicillina con latte esente da sostanze inibenti (A.5.3) alle seguenti concentrazioni:  a)  0,004 mg/ml (0,0067 UI/ml);  b) 0,006 mg/ml (0,01 UI/ml);  c) 0,03 mg/ml (0,05 UI/ml);  d) 0,06 mg/ml (0,1 UI/ml).  5.3.  Soluzione di penicillinasi 5.3.1.  Sciogliere in acqua distillata sterile una quantità di penicillinasi (betalattamasi) sufficiente a dare una concentrazione di 1 000 U/ml. Tal soluzione, di preferenza ripartita in piccole aliquote, può essere conservata a 0-5 gC al massimo per 4  settimane.  Nota Non esiste uno standard internazionale per la penicillinasi. Per il presente metodo si assume che 10 unità di penicillinasi siano sufficienti ad inattivare 0,6 mg (= 1 UI) di penicillina. Per le preparazioni di penicillinasi di cui non si conosce la  concentrazione occorrerà verificare se tale supposizione è valida. In caso contrario, occorrerà correggere opportunamente la concentrazione della soluzione di penicillinasi.  5.3.2.  Invece della soluzione di penicillinasi, possono essere usati dischi reperibili in commercio preparati con penicillinasi a condizione che venga effettuato un controllo per verificare che contengano un'adeguata quantità di penicillinasi.  5.4.  Organismo-test Vedi A.5.4.  5.5.  Coltura per il saggio (sospensione di spore) Vedi A.5.5.  5.6.  Preparazione delle piastre per il saggio 5.6.1.  Far fondere il terreno di coltura per la ricerca delle sostanze inibenti (5.1.2) e lasciare raffreddare a 55 gC.  5.6.2.  In una bottiglia aggiungere una parte della sospensione di spore preparata da poco (5.5) a tante parti del terreno colturale per la ricerca delle sostanze inibenti (5.1.2) quanto sono necessarie per ottenere un'opportuna densità delle colonie nel  substrato inoculato e mescolare a fondo.  5.6.3.  Trasferire in una piastra di Petri sterile (A.4.2.2), previamente riscaldata a 55 gC, il terreno di coltura inoculato (5.6.2), in modo da formare uno strato dello spessore da 0,6 a 0,8 mm. In una piastra di Petri del diametro interno di 140 ml occorrono  circa 15 ml del terreno di coltura per ottenere uno spessore di 0,8 mm.  5.6.4.  Trasferire le piastre di Petri su una superficie orizzontale fredda controllata precedentemente con una livella a bolla d'aria, togliere i coperchi e lasciare solidificare il terreno agarizzato. Appena il substrato è solidificato, ricoprire le piastre  con i coperchi e capovolgerle per ridurre al massimo la condensazione sulla superficie del terreno agarizzato.  5.6.5.  Le piastre così preparate devono essere usate di preferenza il giorno stesso, ma possono essere utilizzate entro due settimane purché appena preparate vengano immediatamente conservate a 5 gC in un sacchetto di polietilene sigillato.  5.6.6.  Contrassegnare il fondo delle piastre per poter identificare i campioni.  6.  Procedimento 6.1.  Preparazione dei campioni 6.1.1.  I campioni che danno risultati positivi o incerti con il «metodo A» (A.7.1 e A.7.2) devono essere nuovamente esaminati, per identificare e quantificare la penicillina.  6.1.2.  Riscaldare inizialmente questi campioni di latte a 80 p 1 gC per 10 minuti, in modo da evitare l'influenza di sostanze inibenti termolabili non specifiche.  6.1.3.  Dopo aver mescolato energicamente, trasferire circa 10 ml del latte in esame riscaldato in un'appropriata bottiglia sterile a collo largo. Addizionare circa 0,4 ml della soluzione di penicillinasi (5.3) e mescolare a fondo.  6.2.  Ricerca delle sostanze inibenti 6.2.1.  Immergere un disco di carta (4.3) nel campione di latte (6.1.2) usando un paio di pinzette pulite e asciutte. Eliminare il latte in eccesso premendo il disco contro le pareti della bottiglia contenente il campione. Deporre il disco in piano sulla  superficie della piastra (5.6) e premere leggermente con le pinzette. 6.2.2.  I dischi preparati con i vari campioni di latte devono essere posti ad una distanza di almeno 20 mm l'uno dall'altro e di almeno 10 mm dal bordo.  6.2.3. Per il controllo della sensibilità, occorre porre a caso tra i dischi del campione di latte alcuni dischi (4.3) precedentemente immersi nella soluzione standard di penicillina [5.2.a)]; questi devono essere almeno il 2 % di quelli del campione di latte  e per ciascun saggio ne devono essere impiegati almeno 5.  6.2.4.  Dopo aver disposto a caso tutti i dischi sul terreno agarizzato ed averli contrassegnati, capovolgere le piastre ed incubarle a 63 p 1 gC per 2,5-5 ore.  6.2.5.  Dopo l'incubazione le piastre vengono esaminate contro un'opportuna sorgente luminosa per individuare gli aloni di inibizione attorno ai dischi di carta. Si misurano quindi tali aloni.  6.2.6.  Gli aloni attorno ai dischi contenenti la soluzione standard di penicillina (6.2.3) devono essere larghi almeno 2 mm.  6.2.7.  L'esistenza di aloni chiari attorno ai dischi contenenti il campione di latte di grandezza pari o maggiore a quella di cui in 6.2.6 indica la presenza di sostanze inibenti l'organismo test.  6.3.  Identificazione e determinazione quantitativa della sostanza inibente 6.3.1.  Effettuare in doppio il procedimento 6.2.1 su un campione di latte riscaldato (6.1.2) e su un campione trattato con penicillinasi (6.1.3). Invece di aggiungere penicillinasi a 10 ml del campione di latte si può immergere in questo campione un disco  preparato con penicillinasi (5.3.2) per poi disporlo nella piastra per il saggio.  6.3.2.  Effettuare in doppio il procedimento 6.2.1 per ciascuna delle soluzioni standard di penicillina elencate in 5.2.a)-d).  6.3.3.  Determinare i diametri medi degli aloni di inibizione per il campione di latte, per il controllo di penicillinasi e per le soluzioni standard di penicillina.  7.  Interpretazione dei risultati (Vedi 2) 7.1.  Se l'alone non si forma attorno al disco contenente il controllo di penicillinasi ma si forma attorno a quello che contiene il campione di latte ed ha dimensioni uguali o maggiori a quelle dell'alone che circonda il disco imbibito di soluzione standard  di penicillina [5.2.a)], la sostanza inibente presente nel campione di latte corrisponde ad una concentrazione di almeno 0,004 mg/ml di benzilpenicillina sodica o potassica.  7.2.  Se il diametro medio dell'alone attorno al disco contenente la penicillinasi è uguale al diametro medio dell'alone attorno al disco contenente il campione di latte, il latte contiene sostanze inibenti che non possono essere inattivate con le  concentrazioni di penicillinasi usate nel presente procedimento.  7.3.  Se il diametro medio dell'alone attorno al disco contenente la penicillinasi è inferiore al diametro medio dell'alone attorno al disco contenente soltanto il campione di latte, riscaldato come descritto in 6.1.2, il campione di latte contiene  penicillina associata ad altri antibiotici, sulfamidici compresi, oltre a penicillina o penicillina semi-sintetica, che non può essere identificata con la concentrazione di penicillinasi usata nel presente procedimento. Le penicilline sintetiche, quali  la cloxacillina sodica, non possono essere inattivate dalla penicillinasi nelle condizioni del saggio e possono pertanto essere classificate come sostanze inibenti diverse dalla penicillina.  Nota Le sostanze inibenti diverse dalla penicillina possono eventualmente essere identificate ricorrendo ad opportuni metodi.  8.  Determinazione del tenore di penicillina 8.1.  Il tenore di penicillina può essere determinato tracciando una curva standard oppure può essere calcolato dalle dimensioni dell'alone ottenuto con le soluzioni standard di penicillina nel latte [5.2.a)-d)].  8.2.  Determinazione della curva standard Poiché si ha una correlazione lineare tra il log 10 della concentrazione della penicillina ed il diametro degli aloni di inibizione, la curva standard può essere tracciata su carta semilogaritmica con le concentrazioni di penicillina in ordinata e gli  aloni di inibizione in ascissa. Questi vengono calcolati come media delle prove in doppio. I diametri degli aloni di inibizione vengono riportati in funzione delle concentrazioni standard di penicillina e si ottiene la curva standard.  8.3.  Calcolo Le concentrazioni di penicillina nel campione di latte possono essere calcolate dai diametri degli aloni usando l'equazione o la curva standard. Per prove precise il raggio degli aloni di inibizione deve essere non inferiore a due volte e non superiore  a cinque volte il raggio dei dischi.  9.  Espressione dei risultati 9.1.  I risultati si esprimono come tenore di penicillina uguale o superiore a 0,004 mg/ml (oppure indicando la concentrazione determinata) oppure come tenore di sostanze inibenti diverse dalla penicillina.  9.2.  Ripetibilità (r) e riproducibilità (R) I valori relativi non sono disponibili né sarebbero significativi dato che si effettua il confronto utilizzando uno standard.  IX. DETERMINAZIONE DEL TENORE LIPOPOLISACCARIDE BATTERICO - SAGGIO LPS  1.  Oggetto e campo di applicazione Il presente procedimento descrive il metodo ufficiale per la determinazione del tenore di lipopolisaccaridi (LPS) del latte. Il metodo si applica al latte UHT ed al latte sterilizzato.  2.  Definizione L'esame deve essere effettuato per le specie batteriche che sono più frequentemente causa di malattie trasmesse con gli alimenti.  La pastorizzazione è un trattamento che protegge dalla presenza di agenti patogeni non termoresistenti nel latte. Se le norme fissate dalla direttiva 85/397/CEE, allegato A, capitolo VII, paragrafo 2, per la conta delle colonie a 30 gC e a 21 gC, per la  fosfatasi e per i coliformi sono rispettate, un saggio specifico per gli agenti patogeni è necessario soltanto nel caso si sospetti che il latte sia all'origine dell'insorgenza di casi di intossicazione alimentare.  3.  Procedimento I metodi e la frequenza degli esami devono essere fissati dalle autorità nazionali, in modo da permettere il rilascio di certificati sanitari concernenti il latte trattato termicamente per il commercio intracomunitario. Per la ricerca dei microrganismi  patogeni si applicano, se esistono, i criteri ed i metodi riconosciuti a livello internazionale.  4.  Relazione dei risultati Per ogni microrganismo patogeno per il quale è stato effettuato l'esame il risultato deve essere espresso nel modo seguente:  numero per ml di latte oppure «presenza» o «assenza» nel volume di latte pastorizzato richiesto per il metodo adottato. La relazione deve descrivere chiaramente il metodo adottato.  (1) L'utilizzazione dei terreni di cultura contenenti sostanze antifolati deve essere effettuate nel rispetto delle regole relative ai brevetti che le proteggono.