CELEX: 31975L0084
Language: pt
Date: 1974-12-20 00:00:00
Title: Sexta Directiva 75/84/CEE da Comissão, de 20 de Dezembro de 1974, que fixa métodos comunitários de análise para o controlo oficial dos alimentos para animais

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31975L0084

Sexta Directiva 75/84/CEE da Comissão, de 20 de Dezembro de 1974, que fixa métodos comunitários de análise para o controlo oficial dos alimentos para animais  

Jornal Oficial nº L 032 de 05/02/1975 p. 0026 - 0033 Edição especial finlandesa: Capítulo 3 Fascículo 6 p. 0045  Edição especial grega: Capítulo 03 Fascículo 11 p. 0198  Edição especial sueca: Capítulo 3 Fascículo 6 p. 0045  Edição especial espanhola: Capítulo 03 Fascículo 8 p. 0079  Edição especial portuguesa: Capítulo 03 Fascículo 8 p. 0079 

SEXTA DIRECTIVA DA COMISSÃO de 20 de Dezembro de 1974 que fixa métodos comunitários de análise para o controlo oficial dos alimentos para animais(75/84/CEE)  A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,  Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,  Tendo em conta a Directiva do Conselho, de 20 de Julho de 1970, relativa à introdução de formas de colheita de amostras e de métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais (1), com a última redacção que lhe foi dada  pelo Acto (2), anexo ao Tratado relativo à adesão de novos Estados-membros à Comunidade Económica Europeia e à Comunidade Europeia de Energia Atómica (3) assinado em Bruxelas em 22 de Janeiro de 1972 e, nomeadamente, o artigo 2o,  Considerando que a referida directiva prevê que os controlos oficiais dos alimentos para animais para verificar se são respeitadas as condições exigidas em execução das disposições legislativas, regulamentares ou administrativas relativas à qualidade e  composição dos alimentos para animais sejam efectuadas em conformidade com formas de colheita de amostras e métodos de análise comunitários;  Considerando que as Directivas no 71/250/CEE, no 71/393/CEE, no 72/199/CEE, no 73/46/CEE e no 74/203/CEE da Comissão, de 15 de Junho de 1971 (4), de 18 de Novembro de 1971 (5), de 27 de Abril de 1972 (6), de 5 de Dezembro de 1972 (7) e de 25 de Março de  1974 (8) fixaram já um certo número de métodos comunitários de análise; que é conveniente, tendo em conta o estado de avanço dos trabalhos efectuados desde então, adoptar uma sexta série de métodos;  Considerando que as medidas previstas na presente directiva estão em conformidade ao parecer do Comité Permanente dos Alimentos para Animais,  ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:   Artigo 1o  Os Estados-membros determinarão que as análises para os controlos oficiais dos alimentos para animais, no que diz respeito aos seus teores em buquinolato, sulfaquinoxalina e furazolidona são efectuadas em conformidade com os métodos descritos  no anexo da presente directiva.  As disposições gerais que figuram na parte I (introdução) do anexo da primeira Directiva no 71/250/CEE da Comissão, de 15 de Junho de 1971, com exclusão da parte relativa à preparação da amostra a analisar são aplicáveis aos métodos descritos no anexo  da presente directiva.   Artigo 2o  Os Estados-membros porão em vigor, o mais tardar até 1 de Novembro de 1975, às disposições legislativas, regulamentares ou administrativas necessárias para dar cumprimento às disposições da presente directiva. Desse facto informarão  imediatamente a Comissão.   Artigo 3o  Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.  Feito em Bruxelas em 20 de Dezembro de 1974.  Pela Comissão O Presidente François-Xavier ORTOLI   (1) JO no L 170 de 3. 8. 1970, p. 2.(2) JO no L 73 de 27. 3. 1972, p. 14.(3) JO no L 73 de 27. 3. 1972, p. 5.(4) JO no L 155 de 12. 7. 1971, p. 31.(5) JO no L 279 de 20. 12. 1971, p. 7.(6) JO no L 123 de 29. 5. 1972, p. 6.(7) JO no L 83 de 30.  3. 1973, p. 21.(8) JO no L 108 de 22. 4. 1974, p. 7.     ANEXO   1. DOSAGEM DO BUQUINOLATO (étil-4-hidroxi-6,7-diisobutoxi-3-quinoleína carboxilato) 1. Objecto e domínio de aplicação O método permite dosear o buquinolato nos alimentos, nos concentrados e nas pré-misturas. O limite inferior de dosagem é de 10 ppm. O decoquinato influi na dosagem.  2. Princípio A amostra é submetida a extracção por clorofórmio. O extracto é evaporado a seco, o resíduo é resuspendido em clorofórmio e seguidamente a solução é submetida a uma cromatografia em camada fina. O buquinolato é eluído pelo etanol e determinado por  espectrofotofluorimetria por comparação com soluções padrão.  3. Reagentes 3.1. Clorofórmio p.a.  3.2. Etanol a 96 p. cento (v/v) p.a.  3.3. Mistura de clorofórmio e de etanol: misturar 10 volumes de clorofórmio (3.1) e 1 volume de etanol (3.2).  3.4. Etanol a 80 p. cento (v/v) p.a.  3.5. Gel de sílica G para cromatografia em camada fina.  3.6. Sustância padrão: buquinolato puro.  3.7. Soluções padrão:  3.7.1. Solução padrão a 0,2 mg de buquinolato por ml: Pesar com uma aproximação de 0,1 mg, 50 mg de substância padrão (3.6). Dissolver em clorofórmio (3.1) num balão aferido de 250 ml aquecendo um banho-maria a 50 ° C. Deixar arrefecer até à temperatura  ambiente, completar o volume com clorofórmio (3.1) e homogeneizar.  3.7.2. Soluções padrão de trabalho: colher volumes respectivamente de 5,0-10,0-15,0-20,0 e 25,0 ml de la solução (3.7.1) e introduzi-los em balões aferidos de 25 ml. Completar o volume com clorofórmio (3.1) e homogeneizar. Preparar no momento de  emprego. Estas soluções contêm respectivamente, 0,04-0,08-0,12-0,16 e 0,20 mg de buquinolato por ml.  4. Instrumentos 4.1. Balões cónicos de 50 e 250 ml, com tampa esmerilada.  4.2. Agitador 4.3. Centrifugadora, com tubos de 15 ml, com tampa esmerilada.  4.4. Banho-maria a 50 ° C.  4.5. Instrumentos para cromatografia em camada fina.  4.6. Placas de vidro para cromatografia em camada fina, 200 × 200 mm, preparadas do seguinte modo: estender uniformemente nas placas uma camada de 0,5 mm de espessura de gel de sílica G (3.5) e deixar secar ao ar durante 15 minutos. Em seguida, manter  as placas na estufa durante 2 horas (4.11), transferi-las depois para um dessecador munido de gel de sílica desidratante. As placas a empregar são adequadas na medida em que dêem resultados semelhantes às placas preparadas como acima se indica.  4.7. Micropipetas de 0,50 ml.  4.8. Colector de zonas para cromatografia em camada fina.  4.9. Lâmpada UV de ondas curtas.  4.10. Espectrofotofluorímetro equipado com uma lâmpada Xénon e dois monocromatógrafos.  4.11. Estufa munida de um ventilador e regulada para 100 ° C.  4.12. Aparelho rotativo para evapração no vácuo, com balão de 250 ml.  5. Modo operatório 5.1. Preparação da amostra Triturar a amostra de modo a fazê-la passar integralmente através de uma peneira com malhas de 1 mm (em conformidade com a recomendação ISO R 565).  5.2. Extracção Pesar com a aproximação de 1 mg. uma quantidade de amostra dividida e homogeneizada que contenha aproximadamente 1,25 mg de buquinolato. Introduzir a amostra num balão cónico de 250 ml (4.1) e acrescentar 100,0 ml de clorofórmio (3.1). Musturar, tapar o  balão e agitar durante uma hora com ajuda do agitador (4.2). Deixar decantar, filtrar e eliminar os primeiros ml do filtrado.  Introduzir 80,0 ml do filtrado límpido num copo de 150 ml ou no balão do aparelho rotativo (4.12). Evaporar quase a seco sobre banho-maria (4.4), resuspender de novo várias vezes o resíduo oleaginoso em alguns ml de clorofórmio (3.1) e transvasar  quantitativamente os líquidos num balão aferido de 10 ml com a ajuda de um funil de pé estreito. Completar o volume com clorofórmio (3.1) e homogeneizar. Se a solução não se apresentar límpida, centrifugar durante 3 minutos a 3 000 r/m em tubo fechado.   5.3. Cromatografia em camada fina Depositar pontualmente numa placa de cromatografia em camada fina (4.6), com a ajuda de uma micropipeta (4.7) e a distâncias respectivas de 2 cm, volumes de 0,25 ml do extracto obtido em 5.2 e das cinco soluções padrão de trabalho (3.7.2).  Revelar o cromatograma em clorofórmio (3.1) até que a linha de frente do solvente atinja praticamente o bordo superior da placa, secar em seguida com a ajuda de uma corrente de ar. Revelar seguidamente em mistura clorofórmio/etanol (3.3) até que aparte  superior do solvente tenha diminuído aproximadamente de 12 cm. Deixar evaporar os solventes. Irradiar o cromatograma pela luz UV (4.9) de delimitar as manchas de buquinolato (valor Rf: 0,4 a 0,6) com ajuda de uma agulha.  5.4. Eluição Recolher a sílica de cada zona delimitada, com um colector de zonas (4.8), num tubo de centrifugação (4.3). Juntar em cada tubo 10,0 ml de etanol (3.4), agitar durante 20 minutos, centrifugar em seguida durante 5 minutos a 3 000 r/m. Decantar as  soluções límpidas em balões cónicos de 50 ml (4.1.) 5.5. Medidas de fluorescência Regular a 100 a escala do espectrofotofluorímetro (4.10) com o líquido eluído (5.4) proveniente da solução padrão mais concentrada, utilizando para a excitação o comprimento de onda compreendido entre 200 e 280 nm que proporcione a fluorescência mais  intensa e para a emissão o comprimento de onda de 375 nm.  Medir nestas condições a intensidade de fluorescência das outras substâncias resultantes da separação (5.4). Determinar a partir dos valores encontrados a quantidade (A) de buquinolato em mg contida nos 10 ml de líquido eluído proveniente da amostra.  6. Cálculo dos resultados O conteúdo em mg de buquinolato por Kg de amostra é dado pela fórmula  · 50 000 sendo:  A - quantidade em mg de buqinolato determinada pela medida espectrofluorimétrica.  P - peso em g da tomada para ensaio.  7. Repetibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas na mesma amostra não deve ultrapassar:  50 % do resultado mais elevado para os teores em buqinolato compreendidos entre 10 e 20 ppm;  10 ppm, em valor absoluto, para os teores compreendidos entre 20 e 100 ppm;  10 % do resultado mais elevado para os teores compreendidos entre 100 e 5 000 ppm;  500 ppm, em valor absoluto, para os teores compreendidos entre 5 000 e 10 000 ppm;  5 % do resultado mais elevado para os conteúdos superiores a 10 000 ppm.  2. DOSAGEM DA SULFAQUINOXALINA (2-sulfanilamidoquinoxalina) 1. Objecto e domínio de aplicação O método permite dosear a sulfaquinoxalina nos alimentos, concentrados e pré-misturas. O limite inferior da dosagem é de 20 ppm. Outras sulfonamidas, bem como o ácido arsanílico, influem na dosagem.  2. Princípio A amostra é submetida a extracção pela dimetilformamida e pelo clorofórmio. A sulfaquinoxalina é hidrolizada em meio alcalino. Após neutralização, o derivado aminado obtido é diazotado e acoplado à N-(1-naftil) etilenediamina. A densidade óptica da  solução é medida a 545 nm.  3. Reagentes 3.1. N,N-dimetilformamida p.a.  3.2. Clorofórmio p.a.  3.3. Etanol absoluto.  3.4. Lixívia alcalina: dissolver em água 10 g de hidróxido de sódio p.a. e 25 g de cloreto de sódio p.a. Completar a 500 ml com água e homogeneizar.  3.5. Acido clorídrico concentrado p.a. (d = 1,18).  3.6. Solução a 0,1 % (p/v) de nitrito de sódio: dissolver em água 100 mg de nitrito de sódio p.a., completar a 100 ml com água e homogeneizar. Preparar imediatamente antes da utilização.  3.7. Solução a 0,5 % (p/v) sulfanato de amónio: dissolver em água 500 mg de sulfanato de amónio p.a., completar a 100 ml com água e homogeneizar. Preparar imediatamente antes da utilização.  3.8. Solução a 0,1 % (p/v) de dicloridrato de N-(1-naftil) etilenediamina: Dissolver em ácido clorídrico p.a. a 0,1 % (v/v) 100 mg de dicloridrato de N-(1-naftil) etilenediamina p.a., completar a 100 ml com o mesmo ácido e homogeneizar. Preparar  imediatamente antes da utilização.  3.9. Substância padrão: Sulfaquinoxalina pura.  3.10. Solução padrão: Pesar com a aproximação de 0,1 mg, 250 mg de substância padrão (3.9). Dissolver em 50 ml de uma solução de hidróxido de sódio (25 ml de solução de hidróxido de sódio p.a. 0,1 N + 25 ml de água), completar a 500 ml com água e  homogeneizar. Colher 5.0 ml dessa solução e diluir a 100 ml com água. 1 ml dessa situação contém 25 microgramas de sulfaquinoxalina.  4. Instrumentos 4.1. Balões cónicos de 250 ml, com gargalo esmerilado normalizado.  4.2. Agitador.  4.3. Cadinho filtrante, porosidade 3, diâmetro: 80 mm, com balão em vácuo.  4.4. Frasco de decantação de 250 ml.  4.5. Balões aferidos de 50, 100, 250 e 500 ml.  4.6. Tubos de ensaio, 150 mm × 25 mm.  4.7. Banho-maria em ebulição.  4.8. Espectrofotómetro, com cuvettes de 20 mm de espessura.  5. Modo operatório 5.1. Preparação da amostra Triturar a amostra de modo a fazê-la passar integralmente através de uma peneira com malhas de 1 mm (em conformidade com a recomendação ISO R 565).  5.2. Extracção Pesar com a aproximação de 1 mg, uma quantidade de amostra dividida e homogeneizada que contenha entre 0,25 e 1,25 mg de sulfaquinoxalina. Introduzir a amostra num balão cónico de 250 ml (4.1) e juntar 20 ml de N,N-dimetilformamida (3.1). Misturar e  aquecer durante 20 minutos em banho-maria (4.7). Deixar arrefecer numa corrente de água fria. Juntar 60 ml de clorofórmio (3.2), tapar o balão e agitar durante 30 minutos com a ajuda do agitador (4.2).  Filtrar o líquido num cadinho filtrante (4.3), aspirando ligeiramente. Lavar o balão com quatro porções de 5 ml de clorofórmio (3.2) e transvazar os líquidos para o cadinho filtrante. Transvazar de seguida o filtrado para um frasco de decantar (4.4),  lavar o balão com aproximadamente 15 ml de clorofórmio e transvazar o líquido para o frasco.  5.3. Hidrólise Juntar no frasco 50 ml de lixívia alcalina (3.4) e 5 ml de etanol (3.3). Misturar completamente, evitando a formação de emulsão quer invertendo o frasco uma vintena de vezes, quer fazendo-o girar à volta do eixo horizontal que vai do pé à rolha. Deixar  em seguida repousar até à separação das fases (a separação está geralmente terminada após aproximadamente 15 minutos.  Transvazar a fase superior (fase aquosa) para um balão aferido de 250 ml (4.5). Extrair de novo a fase clorofórmica por três porções de 50 ml de lixívia alcalina (3.4) e transvazar após cada extracção o extracto aquoso para o balão aferido. Completar o  volume com água e homogeneizar.  Introduzir 25,0 ml da solução num balão aferido de 50 ml (4.5), juntar 5,0 ml de ácido clorídrico (3.5), completar o volume com água e homogeneizar. Filtrar, se necessário, e eliminar os 15 primeiros ml do filtrado. Introduzir 10,0 ml da solução  respectivamente em dois tubos de ensaio (4.6) A e B.  5.4. Desenvolvimento da coloração e medida da densidade óptica Juntar em cade tubo 2,0 ml de solução de nitrito de sódio (3.6), agitar e deixar repousar 3 minutos. Juntar 2,0 ml de solução de sulfamató de amónio (3.7), agitar e deixar repousar 2 minutos. Juntar em seguida 1,0 ml de solução de dicoloridrato de  N-(1-naftil) etilenediamina (3,8) no tubo A e 1,0 ml. de água no tubo B. Misturar muito bem o conteúdo de cada tubo. Ligar os tubos a uma trompa de água com juntas de borracha e aplicar um ligeiro vácuo para eliminar do azoto dissolvido.  Medir 10 minutos depois as densidas ópticas EA e EB das soluções no espectrofotómetro (4.8) a 545 nm em comparação com a água. Determinar a partir do valor EA - EB a quantidade (A) de sulfaquinoxalina presente en la solução da amostra, referindo-se à  curva-padrão (5.5) previamente estabelecida.  5.5. Curva-padrão Introducir nos balões aferidos de 100 ml (4.5) volumes respectivos de 2,0 - 4,0 - 8,0 - 10,0 ml da solução padrão (3.10) correspondentes a 50, 100, 150, 200 e 250 microgramas de sulfaquinoxalina. Juntar 8 ml de ácido clorídrico (3.5) em cada balão,  completar o volume com água e homogeneizar.  Colher 10,0 ml de cada solução (o que corresponde respectivamente a 5, 10, 15, 20 e 25 microgramas de sulfaquinoxalina) e introduzi-los nos tubos de ensaio (4.6). Desenvolver a coloração como se indica no primeiro parágrafo de 5.4. Medir em seguida as  densidades ópticas a 545 nm por comparação com a água. Traçar a curva-padrão, colocando nas ordenadas os valores da densidade óptica e nas abcissas as quantidades correspondentes de sulfaquinoxalina em microgramas.  6. Cálculo de resultados O conteúdo em mg de sulfaquinoxalina por Kg de amostra é dado pela fórmula  · 50 sendo:  A = quantidade de sulfaquinoxalina em microgramas, determinada pela medida fotométrica;  P = peso em gramas de amostra para ensaio.  7. Repetibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas na mesma amostra, não deve ultrapassar:  10 ppm, em valor absoluto, para os teores em sulfaquinoxalina compreendidos entre 20 e 100 ppm;  10 p. cento do resultado mais elevado para os teores compreendidos entre 100 e 5 000 ppm;  500 ppm, em valor absoluto, para os teores compreendidos entre 5 000 e 10 000 ppm;  5 p. cento do resultado mais elevado para os teores superiores a 10 000 ppm.  3. DOSAGEM DA FURAZOLIDONA [N-(5-nitro-2-furfurilidene)-3-amino-2-oxazolidona] 1. Objecto e domínio de aplicação O método permite dosear a furazolidona nos alimentos, concentrados e pré-misturas. O limite inferior da dosagem é de 10 ppm.  2. Princípio A furazolidona é extraída por acetona, após uma extracção preliminar da gordura da amostra por meio de éter de petróleo. O extracto é purificado por cromatografia em coluna de óxido de alumínio e a furazolidona é eluída em acetona. O eluído é evaporado  a seco e o resíduo é ressuspendido em álcool amílico. A furazolidona é extraída por uma solução de ureia e a densidade óptica do extracto é medida a 375 nm.  3. Reagentes 3.1. Acetona p.a.  3.2. Oxido de alumínio para cromatografia, neutro,  granulometria: 100 a 240 mesh, preparado do seguinte modo: misturar 500 g de óxido de alumínio com 1 l de água destilada quente e decantar em seguida o líquido que ficar à superfície. Repetir duas vezes esta operação e filtrar seguidamente por um funil  Buchner. Secar o óxido de alumínio a 105 ° C até atingir peso constante.  3.3. Acetato de amilo p.a.  3.4. Alcool amílico p.a. (as misturas de isómeros são adequadas).  3.5. Éter de petróleo, éb. 40 - 60 ° C.  3.6. Solução de ureia: misturar 90 g de ureia p.a. com 100 ml de água, aquecer ligeiramente para dissolver completamente.  3.7. Substância padrão: furazolidona pura.  3.8. Solução padrão: pesar, com a aproximação de 0,1 mg, 25 mg de substância padrão (3.7). Dissolver em acetona (3.1) num balão aferido de 250 ml (4.1), completar o volume com acetona (3.1) e homogeneizar. 1 ml desta solução contém 100 microgrames de  furazolidona.  4. Instrumentos 4.1. Balões aferidos em vidro castanho, 100 e 250 ml.  4.2. Frascos para decantação em vidro castanho, 100 ml.  4.3. Aparelhos de extracção, por ex.: Soxhlet ou Twisselmann.  4.4. Cartuchos para extracção, 25 × 80 mm ou 28 × 100 mm.  4.5. Tubos para cromatografia, em vidro, diâmetro interior: 10 mm, comprimento: 300 mm.  4.6. Banho-maria em ebulição.  4.7. Espectrofotómetro com cuvettes de 10 mm de espessura.  5. Modo operatório NB Todas as manipulações devem ser efectuadas ao abrigo da incidência directa da luz.  5.1. Preparação de amostra Triturar a amostra de modo a fazê-la passar integralmente através de uma peneira com malhas de 1 mm (em conformidade com a recomendação ISO R 565).  5.2. Extracção Pesar, com a aproximação de 1 mg, 5 a 20 g de amostra dividida e homogeneizada (que contenha no máximo 1 mg de furazolidona) num cartucho de extracção (4.4), colocar este último num aparelho de extracção (4.3) e extrair com éter de petróleo (3.5). Para  o aparelho de Soxhlet, são necessários 13 a 17 ciclos de solvente; para outros aparelhos, a duração da extracção não deve ser inferior a 30 minutos. Seguidamente, retirar o cartucho do aparelho, eliminar o solvente residual e secar o cartucho e o seu  conteúdo com a ajuda de uma corrente de ar quente.  Colocar em seguida o cartucho e o seu conteúdo num instrumento de extracção limpo e extrair com acetona (3.1). Para o aparelho de Soxhlet, são necessários pelo menos 25 ciclos de solvente; para outros aparelhos as condições necessárias à obtenção de uma  extracção completa devem ser previamente determinados. Evaporar o extracto acetónico no banho-maria (4.6) até um volume de 5 a 10 ml e deixar arrefecer em seguida até à temperatura ambiente.  5.3. Cromatografia Introduzir um tampão de la de vidro na extremidade inferior de um tubo para cromatografia (4.5) e comprimir o tampão com a ajuda de uma vareta apropriada para obter uma espessura de 2 a 3 mm. Seguidamente, preparar uma suspensão de óxido de alumínio  (3.2) em acetona (3.1), introduzir a suspensão no tubo e deixar depositar. A coluna assim obtida deve ter uma altura de aproximadamente 200 mm. Deixar baixar a acetona até à superfície superior da coluna.  Transvazar o extracto acetónico obtido em 5.2 para a coluna, lavar o frasco várias vezes com acetona (3.1) e transvazar os líquidos para a coluna. Colocar um frasco apropriado por baixo da coluna e eluir a furazolidona em acetona (3.1). O volume total  de acetona a utilizar, incluindo o volume que tenha servido para a lavagem, deve ser de aproximadamente 150 ml.  5.4. Extracção e medida da densidade óptica Evaporar o líquido eluído obtido em 5.3 até à secagem em banho-maria (4.6). (Ocasionalmente, obtém-se uma pequena quantidade de diacetona-álcool, produzida por codensação da acetona sobre o óxido de alumínio, que não prejudica as extracções  posteriores). Dissolver o resíduo em 10 ml de álcool amílico (3.4) e transvazar a solução num frasco de decantação (4.2). Lavar o frasco sucessivamente em 10 ml de acetato de amido (3.3) e 10 ml de solução de ureia (3.6), transvazar estas soluções para  um frasco de decantação e agitar vigorosamente durante 2 minutos.  Deixar repousar durante 3 a 4 minutos e recolher em seguida a fase aquosa num balão aferido do 100 ml (4.1). Repetir a lavagem e a extracção com a ajuda de quatro porcões de 10 ml de solução de ureia (3.6) e recolher de cada vez a fase aquosa no balão  aferido. Completar o conteúdo do balão a 100 ml com a solução de ureia (3.6) e homogeneizar. Medir a densidade óptica da solução no espectrofotómetro (4.7) a 375 nm por comparação com a solução de ureia (3.6). Determinar a quantidade de furazolidona por  referência com a curva de padronização (5.5).  5.5. Curva-padrão Preparar quatro colunas cromatográficas em conformidade com o modo operatório indicado no primeiro parágrafo de 5.3. Introduzir com a pipeta nas colunas volumes respectivos de 2,5 - 5,0 - 7,5 - e 10,0 ml da solução padrão (3.8). Eluir cada coluna com  150 ml de acetona (3.1) e prosseguir o modo operatório como se indica em 5.4. Traçar a curva-padrão colocando nas ordenadas os valores da densidade óptica e nas abcissas as quantidades correspondentes de furazolidona em microgramas.  6. Cálculo dos resultados O conteúdo em mg de furazolidona por kg de amostra é fornecido pela fórmula  sendo:  A = quantidade em microgramas de furazolidona determinada pela medida fotométrica,  P = peso em gramas de amostra.  7. Repetibilidade A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas na mesma amostra não deve ultrapassar:  50 p. cento do resultado mais elevado para os teores em furazolidona compreendidos entre 10 e 20 ppm;  10 ppm, em valor absoluto, para os teores compreendidos entre 20 e 100 ppm;  10 p. cento do resultado mais elevado para os teores compreendidos entre 100 e 5 000 ppm;  500 ppm, em valor absoluto, para os teores compreendidos entre 5 000 e 10 000 ppm;  5 p. cento do resultado mais elevado para os teores superiores a 10 000 ppm.