CELEX: 32000L0032
Language: ro
Date: 2000-05-19 00:00:00
Title: Directiva 2000/32/CE a Comisiei din 19 mai 2000 de efectuare a celei de-a douăzeci și șasea adaptări la progresul tehnic a Directivei 67/548/CEE a Consiliului privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative cu privire la clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoaseText cu relevanță pentru SEE.

13/Volumul 29
            
            
               RO
            
            
               Jurnalul Ofícial al Uniunii Europene
            
            
               38
            
         32000L0032
   
               L 136/1
            
            
               JURNALUL OFÍCIAL AL UNIUNII EUROPENE
            
            
               
            
         
      DIRECTIVA 2000/32/CE A COMISIEI
   
   din 19 mai 2000
   de efectuare a celei de-a douăzeci și șasea adaptări la progresul tehnic a Directivei 67/548/CEE a Consiliului privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative cu privire la clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoase (1)
   
   (Text cu relevanță pentru SEE)
   COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,
   având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene,
   având în vedere Directiva 67/548/CEE a Consiliului din 27 iunie 1967 privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative referitoare la clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoase (2), astfel cum a fost modificată ultima dată prin Directiva 1999/33/CE a Parlamentului European și a Consiliului (3) și, în special, articolul 28 al acesteia,
   întrucât:
   
               (1)
            
            
               Anexa I la Directiva 67/548/CEE conține o listă de substanțe periculoase, precum și detalii privind clasificarea și etichetarea fiecărei substanțe. Cunoștințele tehnice și științifice actuale au demonstrat că lista de substanțe periculoase prevăzută în anexa menționată ar trebui adaptată. Anumite secțiuni din cuvântul introductiv și din tabelul A al anexei I la directivă necesită rectificări în anumite versiuni lingvistice.
            
         
               (2)
            
            
               Anexa III la Directiva 67/548/CEE conține o listă de fraze care indică natura riscurilor speciale atribuite substanțelor și preparatelor periculoase. Anexa IV la Directiva 67/548/CEE conține o listă de fraze care indică recomandări de prudență referitoare la substanțele și preparatele periculoase. Anexa VI la Directiva 67/548/CEE conține un ghid pentru clasificarea și etichetarea substanțelor și preparatelor periculoase. Anumite secțiuni din anexele III, IV și VI la directivă necesită rectificări în anumite versiuni lingvistice.
            
         
               (3)
            
            
               Anexa V la Directiva 67/548/CEE stabilește metodele de determinare a proprietăților fizico-chimice, toxicității și ecotoxicității substanțelor și preparatelor. Această anexă trebuie adaptată la progresul tehnic.
            
         
               (4)
            
            
               Anexa IX la Directiva 67/548/CEE conține dispoziții referitoare la sistemele de închidere de siguranță pentru copii. Aceste dispoziții ar trebui adaptate și actualizate. Este necesar să se extindă domeniul de aplicare al utilizării sistemelor de închidere de siguranță pentru copii.
            
         
               (5)
            
            
               Măsurile prevăzute în prezenta directivă sunt conforme cu avizul Comitetului pentru adaptarea la progresul tehnic a directivelor privind eliminarea barierelor tehnice din calea comerțului cu substanțe și preparate periculoase,
            
         ADOPTĂ PREZENTA DIRECTIVĂ:
   Articolul 1
   Directiva 67/548/CEE se modifică după cum urmează:
   
               1.
            
            
               Anexa I se modifică după cum urmează:
               
                           (a)
                        
                        
                           Nota Q din anexa 1A la prezenta directivă înlocuiește nota corespunzătoare din cuvântul introductiv.
                        
                     
                           (b)
                        
                        
                           Rândurile din anexa 1B la prezenta directivă înlocuiesc rândurile corespunzătoare din tabelul A.
                        
                     
                           (c)
                        
                        
                           Intrările din anexa 1C la prezenta directivă înlocuiesc intrările corespunzătoare.
                        
                     
                           (d)
                        
                        
                           Se adaugă intrările din anexa 1D la prezenta directivă.
                        
                     
         
               2.
            
            
               Fraza de risc din anexa 2 la prezenta directivă înlocuiește fraza corespunzătoare din anexa III.
            
         
               3.
            
            
               Anexa IV se modifică după cum urmează:
               
                           (a)
                        
                        
                           Frazele de prudență din anexa 3A la prezenta directivă înlocuiesc frazele corespunzătoare din anexa IV.
                        
                     
                           (b)
                        
                        
                           Frazele de prudență combinate din anexa 3B la prezenta directivă înlocuiesc frazele corespunzătoare din anexa IV.
                        
                     
         
               4.
            
            
               Partea B din anexa V se modifică după cum urmează:
               
                           (a)
                        
                        
                           Textul din anexa 4A la prezenta directivă înlocuiește capitolul B.10.
                        
                     
                           (b)
                        
                        
                           Textul din anexa 4B la prezenta directivă înlocuiește capitolul B.11.
                        
                     
                           (c)
                        
                        
                           Textul din anexa 4C la prezenta directivă înlocuiește capitolul B.12.
                        
                     
                           (d)
                        
                        
                           Textul din anexa 4D la prezenta directivă înlocuiește capitolele B.13 și B.14.
                        
                     
                           (e)
                        
                        
                           Textul din anexa 4E la prezenta directivă înlocuiește capitolul B.17.
                        
                     
                           (f)
                        
                        
                           Textul din anexa 4F la prezenta directivă înlocuiește capitolul B.23. Titlul capitolului B.23 din nota explicativă se modifică în consecință.
                        
                     
                           (g)
                        
                        
                           Se adaugă textul din anexa 4G la prezenta directivă.
                        
                     
         
               5.
            
            
               A patra liniuță din introducerea generală la partea C a anexei V se elimină.
            
         
               6.
            
            
               Textele din anexa 5 la prezenta directivă înlocuiesc textele corespunzătoare din anexa VI.
            
         
               7.
            
            
               Anexa IX se modifică în conformitate cu anexa 6 la prezenta directivă.
            
         Articolul 2
   (1)   Statele membre adoptă și pun în aplicare actele cu putere de lege și actele administrative necesare pentru a se conforma prezentei directive până la 1 iunie 2001. Statele membre informează de îndată Comisia cu privire la aceasta.
   Atunci când statele membre adoptă aceste acte, ele cuprind o trimitere la prezenta directivă sau sunt însoțite de o asemenea trimitere la data publicării lor oficiale. Statele membre stabilesc modalitatea de efectuare a acestei trimiteri.
   (2)   Comisiei îi sunt comunicate de către statele membre principalele dispoziții de drept intern pe care le adoptă în domeniul reglementat de prezenta directivă, precum și un tabel de corespondență între prezenta directivă și dispozițiile interne adoptate.
   Articolul 3
   Prezenta directivă intră în vigoare în a treia zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Comunităților Europene.
   Articolul 4
   Prezenta directivă se adresează statelor membre.
   
      Adoptată la Bruxelles, 19 mai 2000.
      
         
            Pentru Comisie
         
         Margot WALLSTRÖM
         
         
            Membru al Comisiei
         
      
   
   
      (1)  Adoptată după cea de-a douăzeci și șaptea adaptare.
   
      (2)  JO 196, 16.8.1967, p. 1.
   
      (3)  JO L 199, 30.7.1999, p. 57.
   ANEXA 1A
   CUVÂNT INTRODUCTIV LA ANEXA I
   
      A se vedea Directiva 2001/59/CE a Comisiei (JO L 225, 21.8.2001, p. 1).
   
   ANEXA 1B
   
      „TABEL A
      
                  Z
               
               
                  Simbol
               
               
                  ES
               
               
                  DA
               
               
                  DE
               
               
                  EL
               
               
                  EN
               
               
                  FI
               
               
                  FR
               
               
                  IT
               
               
                  NL
               
               
                  PT
               
               
                  SV
               
            
                  18
               
               
                  Ar
               
               
                  Argón
               
               
                  Argon
               
               
                  Argon
               
               
                  Αργό
               
               
                  Argon
               
               
                  Argon
               
               
                  Argon
               
               
                  Argon
               
               
                  Argon
               
               
                  Árgon
               
               
                  Argon
               
            
                  64
               
               
                  Gd
               
               
                  Gadolinio
               
               
                  Gadolinium
               
               
                  Gadolinium
               
               
                  Γαδολίνιο
               
               
                  Gadolinium
               
               
                  Gadolinium
               
               
                  Gadolinium
               
               
                  Gadolinio
               
               
                  Gadolinium
               
               
                  Gadolínio
               
               
                  Gadolinium”
               
            
   ANEXA 1C
   
               Nr. index
            
            
               Denumire chimică
            
            
               Note referitoare la substanțe
            
            
               Nr. CE
            
            
               Nr. CAS
            
            
               Clasificare
            
            
               Etichetare
            
            
               Limite de concentrație
            
            
               Note referitoare la preparate
            
         
               006-011-00-7
            
            
               carbaryl (ISO)
               1-naftilmetilcarbamat
            
            
                
            
            
               200-555-0
            
            
               63-25-2
            
            
               Carc. Cat. 3; R40
               Xn; R22
               N; R50
            
            
               Xn; N
               R: 22-40-50
               S: (2-)22-24-36/37-46-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-013-00-8
            
            
               metam-sodium (ISO)
               metilditiocarbamat de sodiu
            
            
                
            
            
               205-293-0
            
            
               137-42-8
            
            
               Xn; R22
               R31
               C; R34
               R43
               N; R50-53
            
            
               C; N
               R: 22-31-34-43-50/53
               S: (1/2-)26-36/37/39-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-015-00-9
            
            
               diuron (ISO)
               3 -(3,4-diclorfenil) -1,1-dimetiluree
            
            
                
            
            
               206-354-4
            
            
               330-54-1
            
            
               Carc. Cat. 3; R40
               Muta. Cat. 3; R40
               Xn; R22-48/22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-40-48/22-50/53
               S: (2-)13-22-23-37-46-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-016-00-4
            
            
               propoxur (ISO)
               
                  N-metilcarbamat de 2-isopropiloxifenimetilcarbamat de 2-isopropoxifenil
            
            
                
            
            
               204-043-8
            
            
               114-26-1
            
            
               T; R25
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 25-50/53
               S: (1/2-)37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-017-00-X
            
            
               aldicarb (ISO)
               2-metil-2-(metiltio)propanal-O-(N-metilcarbamoil)oximă
            
            
                
            
            
               204-123-2
            
            
               116-06-3
            
            
               T+; R26/28
               T; R24
               N; R50-53
            
            
               T+; N
               R: 24-26/28-50/53
               S: (1/2-)22-36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-018-00-5
            
            
               aminocarb (ISO)
               4-dimetilamino-3-tolil metilcarbamat
            
            
                
            
            
               217-990-7
            
            
               2032-59-9
            
            
               T; R24/25
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 24/25-50/53
               S: (1/2-)28-36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-019-00-0
            
            
               di-allate (ISO)
               S-(2,3-dicloralil)-N,N-diisopropiltiocarbamat
            
            
                
            
            
               218-961-1
            
            
               2303-16-4
            
            
               Carc. Cat. 3; R40
               Xn; R22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-40-50/53
               S: (2-)25-36/37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-020-00-6
            
            
               barban (ISO)
               4 - clorbut-2-inil N-(3 -clorfenil)carbamat
            
            
                
            
            
               202-930-4
            
            
               101-27-9
            
            
               Xn; R22
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-43-50/53
               S: (2-)24-36/37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-023-00-2
            
            
               mercaptodimethur (ISO)
               metiocarb;
               3,5-dimetil-4-metiltiofenil N-metilcarbamat
            
            
                
            
            
               217-991-2
            
            
               2032-65-7
            
            
               T; R25
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 25-50/53
               S: (1/2-)22-37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-024-00-8
            
            
               proxan-sodium (ISO)
               
                  O-izopropilditiocarbamat de sodiu
            
            
                
            
            
               205-443-5
            
            
               140-93-2
            
            
               Xn; R22
               Xi; R38
               N; R51-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-38-51/53
               S: (2-)13-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-026-00-9
            
            
               carbofuran (ISO)
               2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzofuranil-7-N-metilcarbamat
            
            
                
            
            
               216-353-0
            
            
               1563-66-2
            
            
               T+; R26/28
               N; R50-53
            
            
               T+; N
               R: 26/28-50/53
               S: (1/2-)36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-028-00-X
            
            
               dinobuton (ISO)
               2-(1-metilpropil)-4,6-dinitrofenil izopropil carbonat
            
            
                
            
            
               213-546-1
            
            
               973-21-7
            
            
               T; R25
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 25-50/53
               S: (1/2-)37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-029-00-5
            
            
               dioxacarb (ISO)
               2-(1,3-dioxolanil-2)fenil N-metilcarbamat
            
            
                
            
            
               230-253-4
            
            
               6988-21-2
            
            
               T; R25
               N; R51-53
            
            
               T; N
               R: 25-51/53
               S: (1/2-)37-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-033-00-7
            
            
               metoxuron (ISO)
               3-(3-clor-4-metoxifenil)-1,1-dimetiluree
            
            
                
            
            
               243-433-2
            
            
               19937-59-8
            
            
               N; R50-53
            
            
               N
               R: 50/53
               S: 60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-034-00-2
            
            
               pebulate (ISO)
               
                  N-butil-N-etil-S-propiltiocarbamat
            
            
                
            
            
               214-215-4
            
            
               1114-71-2
            
            
               Xn; R22
               N; R51-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-51/53
               S: (2-)23-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-035-00-8
            
            
               pirimicarb (ISO)
               5,6-dimetil-2-dimetilamino-pirimidin-4-il N,N-dimetilcarbamat
            
            
                
            
            
               245-430-1
            
            
               23103-98-2
            
            
               T; R25
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 25-50/53
               S: (1/2)22-37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-037-00-9
            
            
               promecarb (ISO)
               3-isopropil-5-metilfenil N-metilcarbamat
            
            
                
            
            
               220-113-0
            
            
               2631-37-0
            
            
               T; R25
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 25-50/53
               S: (1/2-)24-37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-038-00-4
            
            
               sulfallate (ISO)
               2-cloralil N,N-dimetilditiocarbamat
            
            
               E
            
            
               202-388-9
            
            
               95-06-7
            
            
               Carc. Cat. 2; R45
               Xn; R22
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 45-22-50/53
               S: 53-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-039-00-X
            
            
               tri-allate (ISO)
               
                  S-2,3,3-tricloralil diizopropiltiocarbamat
            
            
                
            
            
               218-962-7
            
            
               2303-17-5
            
            
               Xn; R22-48/22
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-43-48/22-50/53
               S: (2-)24-37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-042-00-6
            
            
               monuron (ISO)
               3-(4-clorfenil)-1,1-dimetiluree
            
            
                
            
            
               205-766-1
            
            
               150-68-5
            
            
               Carc. Cat. 3; R40
               Xn; R22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-40-50/53
               S: (2-)36/37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-043-00-1
            
            
               monuron-TCA
               3-(4-clorfenil)-1,1-dimetiluroniu tricloracetat
            
            
                
            
            
               —
            
            
               140-41-0
            
            
               Xi; R36/38
               Carc. Cat. 3; R40
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 36/38-40-50/53
               S: (2-)36/37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-045-00-2
            
            
               methomyl (ISO)
               1-(metiltio)etilidenamino N-metilcarbamat
            
            
                
            
            
               240-815-0
            
            
               16752-77-5
            
            
               T+; R28
               N; R50-53
            
            
               T+; N
               R: 28-50/53
               S: (1/2-)22-36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-046-00-8
            
            
               bendiocarb (ISO)
               N-metilcarbamat de 2,2-dimetil-1,3-benzodioxolil-4
            
            
                
            
            
               245-216-8
            
            
               22781-23-3
            
            
               T; R23/25
               Xn; R21
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 21-23/25-50/53
               S: (1/2-)22-36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-047-00-3
            
            
               bufencarb (ISO)
               amestec de 3-(1-metilbutil)fenil N-metilcarbamat și 3-(1-etilpropil)fenil N-metilcarbamat
            
            
                
            
            
               —
            
            
               8065-36-9
            
            
               T; R24/25
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 24/25-50/53
               S: (1/2-)28-36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-048-00-9
            
            
               ethiofencarb (ISO)
               N-metilcarbamat de 2-(etiltiometil)fenil
            
            
                
            
            
               249-981-9
            
            
               29973-13-5
            
            
               Xn; R22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-50/53
               S: (2-)60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-050-00-X
            
            
               fenuron-TCA
               tricloracetat de 1,1-dimetil-3-feniluroniu
            
            
                
            
            
               —
            
            
               4482-55-7
            
            
               Xi; R38
               N; R50-53
            
            
               Xi; N
               R: 38-50/53
               S: (2-)60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-053-00-6
            
            
               isoprocarb (ISO)
               2-izopropilfenil N-metilcarbamat
            
            
                
            
            
               220-114-6
            
            
               2631-40-5
            
            
               Xn; R22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-50/53
               S: (2-)60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-054-00-1
            
            
               mexacarbate (ISO)
               3,5-dimetil-4-dimetilaminofenil N-metilcarbamat
            
            
                
            
            
               206-249-3
            
            
               315-18-4
            
            
               T+; R28
               Xn; R21
               N; R50-53
            
            
               T+; N
               R: 21-28-50/53
               S: (1/2-)36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-057-00-8
            
            
               nitrapyrin (ISO)
               2-clor-6-triclormetilpiridină
            
            
                
            
            
               217-682-2
            
            
               1929-82-4
            
            
               Xn; R22
               N; R51-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-51/53
               S: (2-)24-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-060-00-4
            
            
               oxycarboxin (ISO)
               2,3-dihidro-6-metil-5-(N-fenilcarbamoil)-1,4-oxitiin 4,4-dioxid
            
            
                
            
            
               226-066-2
            
            
               5259-88-1
            
            
               Xn; R22
               R52-53
            
            
               Xn
               R: 22-52/53
               S: (2-)61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-069-00-3
            
            
               thiophanate-methyl (ISO)
               1,2-di-(3-metoxicarbonil-2-tioureido)benzen
            
            
                
            
            
               245-740-7
            
            
               23564-05-8
            
            
               Muta. Cat. 3; R40
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 40-50/53
               S: (2-)36/37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-070-00-9
            
            
               furmecyclox
               
                  N-ciclohexil-N-metoxi-2,5-dimetil-3-furamidă
            
            
                
            
            
               262-302-0
            
            
               60568-05-0
            
            
               Carc. Cat. 3; R40
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 40-50/53
               S: (2-)36/37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               006-088-00-7
            
            
               benfuracarb (ISO)
               etil N-[2,3-dihidro-2,2-dimetilbenzofuran-7-iloxicarbonil(metil)aminotio]-N-izopropil-b-alaninat
            
            
                
            
            
               —
            
            
               82560-54-1
            
            
               T; R23/25
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 23/25-50/53
               S: (1/2-)36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               007-012-00-5
            
            
               
                  N,N-dimetilhidrazină
               1,1-dimetilhidrazină
            
            
               E
            
            
               200-316-0
            
            
               57-14-7
            
            
               F; R11
               Carc. Cat. 2; R45
               T; R23/25
               C; R34
               N; R51-53
            
            
               F; T; N
               R: 45-11-23/25-34-51/53
               S: 53-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               007-013-00-0
            
            
               
                  N,N′-dimetilhidrazină
               1,1-dimetilhidrazină
            
            
               E
            
            
               —
            
            
               540-73-8
            
            
               Carc. Cat. 2; R45
               T; R23/24/25
               N; R51-53
            
            
               T; N
               R: 45-23/24/25-51/53
               S: 53-45-61
            
            
               C ≥ 25 %: T; R45-23/24/25
               3 % ≤ C < 25 %: T; R45-20/21/22
               0,01 % ≤ C < 3 %: T; R45
            
            
                
            
         
               009-003-00-1
            
            
               acid fluorhidric… %
            
            
               B
            
            
               231-634-8
            
            
               7664-39-3
            
            
               T+; R26/27/28
               C; R35
            
            
               T+; C
               R: 26/27/28-35
               S: (1/2-)7/9-26-36/37-45
            
            
               C ≥ 7 %: T+; C; R26/27/28-35
               1 % ≤ C < 7 %: T; R23/24/25-34
               0,1 % ≤ C < 1 %: Xn; R20/21/22-36/37/38
            
            
                
            
         
               015-039-00-9
            
            
               azinphos-methyl (ISO)
               
                  O,O-dimetil 4-oxobenzotriazin-3-il-metil fosforoditioat
            
            
                
            
            
               201-676-1
            
            
               86-50-0
            
            
               T+; R26/28
               T; R24
               R43
               N; R50-53
            
            
               T+; N
               R: 24-26/28-43-50/53
               S: (1/2-)28-36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               015-048-00-8
            
            
               fenthion (ISO)
               
                  O,O-dimetil-O-(4-metiltion-m-tolil) fosforotioat
            
            
                
            
            
               200-231-9
            
            
               55-38-9
            
            
               Muta. Cat. 3; R40
               T; R23-48/25
               Xn; R21/22
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 21/22-23-40-48/25-50/53
               S: (1/2-)36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               015-056-00-1
            
            
               azinphos-ethyl (ISO)
               
                  O,O-dietil 4-oxobenzotriazin-3-il-metil fosforoditioat
            
            
                
            
            
               220-147-6
            
            
               2642-71-9
            
            
               T+; R28
               T; R24
               N; R50-53
            
            
               T+; N
               R: 24-28-50/53
               S: (1/2-)28-36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               015-140-00-8
            
            
               triazophos (ISO)
               
                  O,O-dietil-O-1-fenil-1H,2,4-triazolil-3 fosforotioat
            
            
                
            
            
               245-986-5
            
            
               24017-47-8
            
            
               T; R23/25
               Xn; R21
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 21-23/25-50/53
               S: (1/2-)36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               016-013-00-X
            
            
               diclorură de sulf
            
            
                
            
            
               234-129-0
            
            
               10545-99-0
            
            
               R14
               C; R34
               N; R50
            
            
               C; N
               R: 14-34-50
               S: (1/2-)26-36/37/39-45-61
            
            
               C ≥ 10 %: C; R34
               5 % ≤ C < 10 %: Xi; R36/37/38
            
            
                
            
         
               016-014-00-5
            
            
               tetraclorură de sulf
            
            
                
            
            
               —
            
            
               13451-08-6
            
            
               R14
               C; R34
               N; R50
            
            
               C; N
               R: 14-34-50
               S: (1/2-)26-36/37/39-45-61
            
            
               C ≥ 10 %: C; R34
               5 % ≤ C < 10 %: Xi; R36/37/38
            
            
                
            
         
               016-023-00-4
            
            
               dimetil sulfat
            
            
               E
            
            
               201-058-1
            
            
               77-78-1
            
            
               Carc. Cat. 2; R45
               Muta. Cat. 3; R40
               T+; R26
               T; R25
               C; R34
               R43
            
            
               T+
               R: 45-25-26-34-43
               S: 53-45
            
            
               C ≥ 25 %: T+; R45-25-26-34-43
               10 % ≤ C < 25 %: T+; R45-22-26-34-43
               7 % ≤ C < 10 %: T+; R45-22-26-36/37/38-43
               5 % ≤ C < 7 %: T; R45-22-23-36/37/38-43
               3 % ≤ C < 5 %: T; R45-22-23-43
               1 % ≤ C < 3 %: T; R45-23-43
               0,1 % ≤ C < 1 %: T; R45-20
               0,01 % ≤ C < 0,1 %: T; R45
            
            
                
            
         
               016-024-00-X
            
            
               dimexano (ISO)
               
                  bi(metoxitiocarbonil) disulfură
            
            
                
            
            
               215-993-8
            
            
               1468-37-7
            
            
               Xn; R22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-50/53
               S: (2-)60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               016-071-00-6
            
            
               3-amino-6,13-diclor-10-[(3-[(4-clor-6-(2-sulfofenilamino)-1,3,5-triazinil-2-)amino)propil)amino)-4,11-trifenoxidioxazindisulfonat trisodic
            
            
                
            
            
               410-130-3
            
            
               136248-03-8
            
            
               R43
            
            
               Xi
               R: 43
               S: (2-)22-24-37
            
            
                
            
            
                
            
         
               022-001-00-5
            
            
               tetraclorură de titan
            
            
                
            
            
               231-441-9
            
            
               7550-45-0
            
            
               R14
               C; R34
            
            
               C
               R: 14-34
               S: (1/2-)7/8-26-36/37/39-45
            
            
               C ≥ 10 %: C; R34
               5 % ≤ C < 10 %: Xi; R36/37/38
            
            
                
            
         
               030-004-00-8
            
            
               dimetilzinc [1]
               dietilzinc [2]
            
            
                
            
            
               208-884-1 [1]
               209-161-3 [2]
            
            
               544-97-8 [1]
               557-20-0 [2]
            
            
               R14
               F; R17
               C; R34
               N; R50-53
            
            
               F; C; N
               R: 14-17-34-50/53
               S: (1/2-)16-43-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               050-002-00-0
            
            
               cyhexatin (ISO)
               hidroxitriciclohexilstanan;
               hidroxid de tri(ciclohexil)staniu
            
            
                
            
            
               236-049-1
            
            
               13121-70-5
            
            
               Xn; R20/21/22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 20/21/22-50/53
               S: (2-)13-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               050-012-00-5
            
            
               tetraciclohexilstanan [1]
               chlortriciclohexilstanan [2]
               butiltriciclohexilstanan [3]
            
            
                
            
            
               215-910-5 [1]
               221-437-5 [2]
               230-358-5 [3]
            
            
               1449-55-4 [1]
               3091-32-5 [2]
               7067-44-9 [3]
            
            
               Xn; R20/21/22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 20/21/22-50/53
               S: (2-)26-28-60-61
               C ≥ 1 %: Xn; R20/21/22
            
            
               1
            
            
                
            
         
               050-017-00-2
            
            
               fenbutatin oxide (ISO)
               bi(tri(2-metil-2-fenilpropil)staniu)oxid
            
            
                
            
            
               236-407-7
            
            
               13356-08-6
            
            
               T+; R26
               Xi; R36/38
               N; R50/53
            
            
               T+; N
               R: 26-36/38-50/53
               S: (1/2-)28-36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               082-009-00-X
            
            
               sulfocromat galben de plumb;
               pigment galben 34 C.I. [Această substanță este identificată în indexul de culori prin numărul de constituire din indexul de culori, C.I. 77603.]
            
            
                
            
            
               215-693-7
            
            
               1344-37-2
            
            
               Carc. Cat. 3; R40
               Repr. Cat. 1; R61
               Repr. Cat. 3; R62
               R33
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 61-33-40-50/53-62
               S: 53-45-60-61
            
            
                
            
            
               1
            
         
               082-010-00-5
            
            
               cromat, molibdat sulfat roșu de plumb;
               pigment roșu 104 C.I [Această substanță este identificată în Indexul de culori prin Numărul de constituire din Indexul de culori C.I. 77605.]
            
            
                
            
            
               235-759-9
            
            
               12656-85-8
            
            
               Carc. Cat. 3; R40
               Repr. Cat. 1; R61
               Repr. Cat. 3; R62
               R33
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 61-33-40-50/53-62
               S: 53-45-60-61
            
            
                
            
            
               1
            
         
               601-024-00-X
            
            
               cumen [1]
               propilbenzen [2]
            
            
                
            
            
               202-704-5 [1]
               203-132-9 [2]
            
            
               98-82-8 [1]
               103-65-1 [2]
            
            
               R10
               Xn; R65
               Xi; R37
               N; R51-53
            
            
               Xn; N
               R: 10-37-51/53-65
               S: (2-)24-37-61-62
            
            
                
            
            
               4
            
         
               601-032-00-3
            
            
               benzo[a]piren
               benzo[def]crisenă
            
            
                
            
            
               200-028-5
            
            
               50-32-8
            
            
               Carc. Cat.2; R45
               Muta. Cat. 2; R46
               Repr. Cat. 2; R60-61
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 45-46-60-61-50/53
               S: 53-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               601-034-00-4
            
            
               benz[e]acefenantrilen
            
            
                
            
            
               205-911-9
            
            
               205-99-2
            
            
               Carc. Cat.2; R45
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 45-50/53
               S: 53-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               602-035-00-2
            
            
               1,4-diclorbenzen
               
                  p-diclorbenzen
            
            
                
            
            
               203-400-5
            
            
               106-46-7
            
            
               Xi; R36
               N; R50-53
            
            
               Xi; N
               R: 36-50/53
               S: (2-)24/25-46-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               602-054-00-6
            
            
               3-iodpropenă
               iodură de alil
            
            
                
            
            
               209-130-4
            
            
               556-56-9
            
            
               R10
               C; R34
            
            
               C
               R: 10-34
               S: (1/2-)7-26-45
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-076-00-9
            
            
               2-butenă-1,4-diol
               2-butin-1,4-diol
            
            
                
            
            
               203-788-6
            
            
               110-65-6
            
            
               T; R23/25
               Xn; R21-48/22
               C; R34
            
            
               T
               R: 21-23/25-34-48/22
               S: (1/2-)26-36/37/39-45
            
            
               C ≥ 50 %: T; R21-23/25-34-48/22
               25 % ≤ C < 50 %: T; R21-23/25-36/38-48/22
               10 % ≤ C < 25 %: Xn; R20/22-48/22
               3 % ≤ C < 10 %: Xn; R20/22
            
            
                
            
         
               603-091-00-0
            
            
               exo-1-metil-4-(1-metiletil)-7-oxabiciclo[2.2.1]heptanol-2
            
            
                
            
            
               402-470-6
            
            
               87172-89-2
            
            
               O; R8
               Xn; R22
               Xi; R36
            
            
               O; Xn
               R: 8-22-36
               S: (2-)26
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-093-00-1
            
            
               exo-(+/-)-1-metil-4-(1-metiletil)-2-[(2-metilfenil)metoxi]-7-oxabiciclo[2.2.1]heptan
            
            
                
            
            
               402-410-9
            
            
               87818-31-3
            
            
               Xn; R20
               N; R51-53
            
            
               Xn; N
               R: 20-51/53
               S: (2-)23-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-097-00-3
            
            
               1,1′,1″-nitrilotripropanol-2;
               triizopropanolamină
            
            
                
            
            
               204-528-4
            
            
               122-20-3
            
            
               Xi; R36
               R52-53
            
            
               Xi
               R: 36-52/53
               S: (2-)26-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-117-00-0
            
            
               2-propanol
               alcool izopropilic
               izopropanol
            
            
                
            
            
               200-661-7
            
            
               67-63-0
            
            
               F; R11
               Xi; R36
               R67
            
            
               F; Xi
               R: 11-36-67
               S: (2-)7-16-24/25-26
            
            
                
            
            
               6
            
         
               604-020-00-6
            
            
               2-bifenilol
               2-hidroxibifenil
               2-phenylphenol (ISO)
            
            
                
            
            
               201-993-5
            
            
               90-43-7
            
            
               Xi; R36/37/38
               N; R50
            
            
               Xi; N
               R: 36/37/38-50
               S: (2-)22-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               604-021-00-1
            
            
               sare de sodiu 2-fenilfenol
               2-bifenilat de sodiu
            
            
                
            
            
               205-055-6
            
            
               132-27-4
            
            
               Xn; R22
               Xi; R37/38-41
               N; R50
            
            
               Xn; N
               R: 37/38-41-50
               S: (2-)22-26-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               604-024-00-8
            
            
               4,4′-izobutiletilidendifenol
               (alt.): 2,2-bi(4′-hidroxifenil)-4-metilpentan
            
            
                
            
            
               401-720-1
            
            
               6807-17-6
            
            
               Repr. Cat. 2; R60
               Xi; R36
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 60-36-50/53
               S: 53-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               604-041-00-0
            
            
               acifluorfen [1]
               acifluorfen-sodiu [2]
               acid 5-[2-clor-4-(trifluormetil)fenoxi]-2-nitrobenzoic [1]
               5-[2-clor-4-(trifluormetil)fenoxi]-2-nitrobenzoat de sodiu [2]
            
            
                
            
            
               256-634-5 [1]
               263-560-7 [2]
            
            
               50594-66-6 [1]
               62476-59-9 [2]
            
            
               Xn; R22
               Xi; R38-41
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-38-41-50/53
               S: (2-)24-39-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               604-043-00-1
            
            
               monobenzonă
               4-hidroxifenil benzil eter
               eterul monobenzilic al hidrochinonei
            
            
                
            
            
               203-083-3
            
            
               103-16-2
            
            
               Xi; R36
               R43
            
            
               Xi
               R: 36-43
               S: (2-)24/25-26-37
            
            
                
            
            
                
            
         
               604-044-00-7
            
            
               mechinol
               4-metoxifenol
               eterul monometilic al hidrochinonei
            
            
                
            
            
               205-769-8
            
            
               150-76-5
            
            
               Xn; R22
               Xi; R36
               R43
            
            
               Xn
               R: 22-36-43
               S: (2-)24/25-26-37/39-46
            
            
                
            
            
                
            
         
               605-016-00-7
            
            
               glioxal… %
               etandial… %
            
            
               B
            
            
               203-474-9
            
            
               107-22-2
            
            
               Muta. Cat. 3; R40
               Xn; R20
               Xi; R36/38
               R43
            
            
               Xn
               R: 20-36/38-40-43
               S: (2-)36/37
            
            
               C ≥ 10 %: Xn; R20-36/38-40-43
               1 % ≤ C < 10 %: Xn; R40-43
            
            
                
            
         
               606-016-00-X
            
            
               pindone (ISO)
               2-pivaloilindan dionă 1,3
            
            
                
            
            
               201-462-8
            
            
               83-26-1
            
            
               T; R25-48/25
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 25-48/25-50/53
               S: (1/2-)37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               606-018-00-0
            
            
               dichlone (ISO)
               2,3-diclor-1,4-naftochinonă
            
            
                
            
            
               204-210-5
            
            
               117-80-6
            
            
               Xn; R22
               Xi; R36/38
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-36/38-50/53
               S: (2-)26-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               606-019-00-6
            
            
               chlordecone (ISO)
               perclorpentaciclo[5,3,0,02,6,03,9,04,8]decanonă-5
               decacloropentaciclo[5,2,1,02,6,03,9,05,8]decanonă-4
            
            
                
            
            
               205-601-3
            
            
               143-50-0
            
            
               Carc. Cat. 3; R40
               T; R24/25
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 24/25-40-50/53
               S: (1/2-)22-36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               606-034-00-8
            
            
               metribuzin (ISO)
               4-amino-6-terț-butil-3-metiltio-1,2,4-triazinonă-5(4H)-;
               4-amino-4,5-dihidro-6-(1,1-dimetiletil)-3-metiltio-1,2,4-triazinonă-5
            
            
                
            
            
               244-209-7
            
            
               21087-64-9
            
            
               Xn; R22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-50/53
               S: (2-)60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               606-035-00-3
            
            
               chloridazon (ISO)
               5-amino-4-clor-2-fenilpiridazinonă-3-(2H)
               pirazon
            
            
                
            
            
               216-920-2
            
            
               1698-60-8
            
            
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xi; N
               R: 43-50/53
               S: (2-)24-37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               606-036-00-9
            
            
               quinomethionate
               chinomethionat (ISO);
               6-metil-1,3-ditiolo(4,5-b)chinoxalinonă-2
            
            
                
            
            
               219-455-3
            
            
               2439-01-2
            
            
               Repr. Cat. 3; R62
               Xn; R20/21/22-48/22
               Xi; R36
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 20/21/22-36-43-48/22-50/53-62
               S: (2-)24-37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               606-037-00-4
            
            
               triadimefon (ISO)
               1-(4-clorfenoxi)-3,3-dimetil-1-(1,2,4-triazolil-1)butanonă
            
            
                
            
            
               256-103-8
            
            
               43121-43-3
            
            
               Xn; R22
               N; R51-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-51/53
               S: (2-)61
            
            
                
            
            
                
            
         
               606-044-00-2
            
            
               2,4,6-trimetilbenzofenonă
            
            
                
            
            
               403-150-9
            
            
               954-16-5
            
            
               Xn; R22
               Xi; R36
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-36-50/53
               S: (2-)26-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-043-00-X
            
            
               dicamba (ISO)
               acid 2,5-diclor-6-metoxibenzoic
               acid 3,6-diclor-2-metoxibenzoic
            
            
                
            
            
               217-635-6
            
            
               1918-00-9
            
            
               Xn; R22
               Xi; R41
               R52-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-41-52/53
               S: (2-)26-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-057-00-6
            
            
               coumachlor (ISO)
               3-[1-(4-clorfenil)-3-oxobutil]-4-hidroxicumarină
            
            
                
            
            
               201-378-1
            
            
               81-82-3
            
            
               Xn; R48/22
               R52-53
            
            
               Xn
               R: 48/22-52/53
               S: (2-)37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-058-00-1
            
            
               cumafuryl (ISO)
               fumarin
               (RS)-3-(1-(2-furil)-3-oxobutil)-4-hidroxicumarină
               4-hidroxi-3-[3-oxo-1-(2-furil)butil]cumarină
            
            
                
            
            
               204-195-5
            
            
               117-52-2
            
            
               T; R25-48/25
               R52-53
            
            
               T
               R: 25-48/25-52/53
               S: (1/2-)37-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-079-00-6
            
            
               kelevan (ISO)
               etil 5-(perclor-5-hidroxipentaciclo[5,3,0,02,6,03,9,04,8] decanil-5)-4-oxopentanoat
               etil 5-(1,2,3,5,6,7,8,9,10,10-decaclor-4-hidroxipentaciclo(5,2,1,02,6,03,9,05,8)decil-4)-4-oxovalerianat
            
            
                
            
            
               —
            
            
               4234-79-1
            
            
               T; R24
               Xn; R22
               N; R51-53
            
            
               T; N
               R: 22-24-51/53
               S: (1/2-)36/37-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-097-00-4
            
            
               1,2-anhidrida acidului benzen-1,2,4-tricarboxilic
               anhidridă trimelitică
            
            
                
            
            
               209-008-0
            
            
               552-30-7
            
            
               Xi; R37-41
               R42/43
            
            
               Xn
               R: 37-41-42/43
               S: (2-)22-26-36/37/39
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-143-00-3
            
            
               acid valeric
            
            
                
            
            
               203-677-2
            
            
               109-52-4
            
            
               C; R34
               R52-53
            
            
               C
               R: 34-52/53
               S: (1/2-)26-36-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-152-00-2
            
            
               2,3,6-TBA (ISO)
               acid 2,3,6-triclorbenzoic
            
            
                
            
            
               200-026-4
            
            
               50-31-7
            
            
               Xn; R22
               N; R51-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-51/53
               S: (2-)61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-153-00-8
            
            
               benazolin (ISO)
               acid 4-clor-2,3-dihidro-2-oxo-1,3-benzotiazol-3-il acetic
            
            
                
            
            
               223-297-0
            
            
               3813-05-6
            
            
               Xi; R36/38
               R52-53
            
            
               Xi
               R: 36/38-52/53
               S: (2-)22-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-156-00-4
            
            
               chlorfenson (ISO)
               4-chlorfenil 4-clorbenzensulfonat
            
            
                
            
            
               201-270-4
            
            
               80-33-1
            
            
               Xn; R22
               Xi; R38
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-38-50/53
               S: (2-)37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-158-00-5
            
            
               sare de sodiu a acidului cloracetic
               cloracetat de sodiu
            
            
                
            
            
               223-498-3
            
            
               3926-62-3
            
            
               T; R25
               Xi; R38
               N; R50
            
            
               T; N
               R: 25-38-50
               S: (1/2-)22-37-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-159-00-0
            
            
               chlorobenzilate (ISO)
               etil 2,2-di(4-chlorfenil)-2-hidroxiacetat
               etil 4,4′-diclorbenzilat
            
            
                
            
            
               208-110-2
            
            
               510-15-6
            
            
               Xn; R22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-50/53
               S: (2-)60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-176-00-3
            
            
               Amestec de: a-3-(3-(2H-benzotriazolil-2)-5-terț-butil-4-hidroxifenil)propionil-w-hidroxipoli(oxietilen);a-3-(3-(2H-benzotriazoil-2)-5-terț-butil-4-hidroxifenil)propionil-w-3-(3-(2H-benzotriazolil-2)-5-terț-butil-4-hidroxifenil)propioniloxipoli(oxietilenă)
            
            
                
            
            
               400-830-7
            
            
               —
            
            
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 43-51/53
               S: (2-)36/37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-188-00-9
            
            
               N-carboxilatoetil-N-octadec-9-enilmaleamat acid de sodiu
            
            
                
            
            
               402-970-4
            
            
               —
            
            
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 43-51/53
               S: (2-)24/37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-209-00-1
            
            
               Amestec de: O,O-di(1-metiletil)tritio-bi-tioformiat;O,O-di(1-metiletil)tetratio-bi-tioformiat;O,O-di(1-metiletil)pentatio-bi-tioformiat
            
            
                
            
            
               403-030-6
            
            
               —
            
            
               Xn; R22
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-43-50/53
               S: (2-)36/37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-213-00-3
            
            
               3,3-bi [(1,1-dimetilpropil)peroxi] butirat de etil
            
            
                
            
            
               403-320-2
            
            
               67567-23-1
            
            
               E; R2
               O; R7
               R10
               N; R51-53
            
            
               E; N
               R: 2-7- 10-51/53
               S: (2-)3/7-14-33-36/37/39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-217-00-5
            
            
               2-etoxietil 2-(4-(2,6-dihidro-2,6-dioxo-7-fenil-1,5-dioxaindacenil-3) fenoxi)acetat
            
            
                
            
            
               403-960-2
            
            
               —
            
            
               R43
               R53
            
            
               Xi
               R: 43-53
               S: (2-)24-37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-243-00-7
            
            
               3,6-diclor-o-anisat de sodiu [1];
               acid 3,6-diclor-o-anisic, compus cu 2,2′-iminodietanol (1:1) [2];
               acid 3,6-diclor-o-anisic, compus cu 2-aminoetanol (1:1) [3]
            
            
                
            
            
               217-846-3 [1]
               246-590-5 [2]
               258-527-9 [3]
            
            
               1982-69-0 [1]
               25059-78-3 [2]
               53404-28-7 [3]
            
            
               R52-53
            
            
               R: 52/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-248-00-4
            
            
               naptalam-sodium
               N-napft-1-ilfhalamat de sodiu
            
            
                
            
            
               205-073-4
            
            
               132-67-2
            
            
               Xn; R22
            
            
               Xn
               R: 22
               S: (2)
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-249-00-X
            
            
               (1-metil-1,2-etandiil)bi [oxi(metil-2,1-etandiil)] diacrilat
               tripropilen glicol diacrilat
               TPGDA
            
            
                
            
            
               256-032-2
            
            
               42978-66-5
            
            
               Xi; R36/37/38
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 36/37/38-43-51/53
               S: (2-)24-37-61
            
            
               C ≥ 10 %: Xi; R36/37/38-43
               1 % ≤ C < 10 %: Xi; R43
            
            
                
            
         
               607-252-00-6
            
            
               lambda-cyhalothrin (ISO)
               amestec 1:1 de (S)-a-ciano-3-fenoxibenzil (Z)-(1R)-cis-3-(2-clor-3,3,3-trifluorpropenil)-2,2-dimetilciclopropancarboxilat și (R)-a-ciano-3-fenoxibenzil (Z)-(1S)-cis-3-(2-clor-3,3,3-trifluorpropenil)-2,2-dimetilciclopropancarboxilat
            
            
                
            
            
               415-130-7
            
            
               91465-08-6
            
            
               T+; R26
               T; R25
               Xn; R21
               N; R50-53
            
            
               T+; N
               R: 21-25-26-50/53
               S: (1/2-)28-36/37/39-38-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-255-00-2
            
            
               fluroxypyr (ISO)
               acid 4-amino-3,5-diclor-6-fluor-2-piridiloxiacetic
            
            
                
            
            
               —
            
            
               69377-81-7
            
            
               R52-53
            
            
               R: 52/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               608-003-00-4
            
            
               acrilonitril
            
            
               D
               E
            
            
               203-466-5
            
            
               107-13-1
            
            
               F; R11
               Carc. Cat. 2; R45
               T; R23/24/25
               Xi; R37/38-41
               R43
               N; R51-53
            
            
               F; T; N
               R: 45-11-23-/24/25-37/38-41-43-51/53
               S: 9-16-53-45-61
            
            
               C ≥ 20 %: T; R45-23/24/25-37/38-41-43
               10 % ≤ C < 20 %: T; R45-23/24/25-41-43
               5 % ≤ C < 10 %: T; R45-23/24/25-36-43
               1 % ≤ C < 5 %: T; R45-23/24/25-43
               0,2 % ≤ C < 1 %: T; R45-20/21/22
               0,1 % ≤ C < 0,2 %: T; R45
            
            
                
            
         
               608-016-00-5
            
            
               1,4-Diciano-2,3,5,6-tetra-clor-benzen
            
            
                
            
            
               401-550-8
            
            
               1897-41-2
            
            
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xi; N
               R: 43-50/53
               S: (2-)24-37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               609-030-00-4
            
            
               dinoterb (ISO)
               2-terț-butil-4,6-dinitrofenol
            
            
               E
            
            
               215-813-8
            
            
               1420-07-1
            
            
               Repr. Cat. 2; R61
               T+; R28
               T; R24
               R44
               N; R50-53
            
            
               T+; N
               R: 61-24-28-44-50/53
               S: 53-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               609-040-00-9
            
            
               nitrofen (ISO)
               2,4-diclorfenil 4-nitrofenil eter
            
            
               E
            
            
               217-406-0
            
            
               1836-75-5
            
            
               Carc. Cat. 2; R45
               Repr. Cat. 2; R61
               Xn; R22
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 45-61-22-50/53
               S: 53-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               609-044-00-0
            
            
               tecnazene (ISO);
               1,2,4,5-tetraclor-3-nitrobenzen
            
            
                
            
            
               204-178-2
            
            
               117-18-0
            
            
               Xn; R22
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-43-50/53
               S: (2-)24-37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               611-008-00-4
            
            
               4-aminoazobenzen
               4-fenilazoanilină
            
            
                
            
            
               200-453-6
            
            
               60-09-3
            
            
               Carc. Cat. 2; R45
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 45-50/53
               S: 53-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               611-013-00-1
            
            
               1-hidroxi-7-(3-sulfonatoanilino)-2-(3-metil-4-(2-metoxi-4-(3-sulfonatofenilazo)fenilazo)fenilazo)naftalen-3-sulfonat de trilitiu
            
            
                
            
            
               403-650-7
            
            
               117409-78-6
            
            
               E; R2
               N; R51-53
            
            
               E; N
               R: 2-51/53
               S: (2-)35-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               611-031-00-X
            
            
               clorhidrat de 4,4′-(4-iminociclohexa-2,5-dienilidenmetilen)dianilină
               C.I. Roșu 9
            
            
                
            
            
               209-321-2
            
            
               569-61-9
            
            
               Carc. Cat. 2; R45
            
            
               T
               R: 45
               S: 53-45
            
            
                
            
            
                
            
         
               612-035-00-4
            
            
               2-metoxianilină
               o-anisidină
            
            
               E
            
            
               201-963-1
            
            
               90-04-0
            
            
               Carc. Cat. 2; R45
               Muta. Cat. 3; R40
               T; R23/24/25
            
            
               T
               R: 45-23/24/25
               S: 53-45
            
            
                
            
            
                
            
         
               612-042-00-2
            
            
               benzidină
               1,1′-bifenil-4,4′-diamină
               4,4′-diaminobifenil
               bifenil-4,4′-ilendiamină
            
            
               E
            
            
               202-199-1
            
            
               92-87-5
            
            
               Carc. Cat. 1; R45
               Xn; R22
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 45-22-50/53
               S: 53-45-60-61
            
            
               C ≥ 25 %: T; R45-22
               0,01 % ≤ C < 25 %: T; R45
            
            
                
            
         
               612-051-00-1
            
            
               4,4′-diaminodifenilmetan
               4,4′-metilendianilină
            
            
               E
            
            
               202-974-4
            
            
               101-77-9
            
            
               Carc. Cat. 2; R45
               Muta. Cat. 3; R40
               T; R39/23/24/25
               Xn; R48/20/21/22
               R43
               N; R51-53
            
            
               T; N
               R: 45-39/23/24/25-43-48/20/21/22-51/53
               S: 53-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               612-081-00-5
            
            
               săruri de 4,4′-bi-o-toluidin
               săruri de 3,3′-dimetilbenzidină
               săruri de o-tolidin
            
            
               A
               E
            
            
               210-322-5
               265-294-7
               277-985-0
            
            
               612-82-8
               64969-36-4
               74753-18-7
            
            
               Carc. Cat. 2; R45
               Xn; R22
               N; R51-53
            
            
               T; N
               R: 45-22-51/53
               S: 53-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               612-099-00-3
            
            
               4-metil-m-fenilendiamină
               2,4-toluendiamină
            
            
               E
            
            
               202-453-1
            
            
               95-80-7
            
            
               Carc. Cat. 2; R45
               T; R25
               Xn; R21
               Xi; R36
               R43
               N; R51-53
            
            
               T; N
               R: 45-21-25-36-43-51/53
               S: 53-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               612-105-00-4
            
            
               2-piperazin-1-ylethylamine
            
            
                
            
            
               205-411-0
            
            
               140-31-8
            
            
               Xn, R21/22
               C; R34
               R43
               R52-53
            
            
               C
               R: 21/22-34-43-52/53
               S: (1/2-)26-36/37/39-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               612-111-00-7
            
            
               2-metil-m-fenilendiamină
               2,6-toluenediamină
            
            
                
            
            
               212-513-9
            
            
               823-40-5
            
            
               Muta. Cat. 3; R40
               Xn; R21/22
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xn; N
               R: 21/22-40-43-51/53
               S: (2-)24-36/37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               612-125-00-3
            
            
               2-metil-p-fenilendiamină
               2,5-toluendiamină
            
            
                
            
            
               202-442-1
            
            
               95-70-5
            
            
               T; R25
               Xn; R20/21
               R43
               N; R51-53
            
            
               T; N
               R: 20/21-25-43-51/53
               S: (1/2-)24-37-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               612-144-00-7
            
            
               flumetralin (ISO)
               N-(2-clor-6-fluorbenzil)-N-etil-a,a,a-trifluor-2,6-dinitro-p-toluidină
            
            
                
            
            
               —
            
            
               62924-70-3
            
            
               Xi; R36/38
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xi; N
               R: 36/38-43-50/53
               S: (2-)36/37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               612-151-00-5
            
            
               diaminotoluen
            
            
               E
            
            
               246-910-3
            
            
               25376-45-8
            
            
               Carc. Cat. 2; R45
               T; R25
               Xn; R20/21
               Xi; R36
               R43
               N; R51-53
            
            
               T; N
               R: 45-20/21-25-36-43-51/53
               S: 53-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-018-00-4
            
            
               morfamquat (ISO)
               1,1′-bi(3,5-dimetilmorfolinocarbonilmetil)-4,4′-bipiridiliu ion
            
            
                
            
            
               —
            
            
               7411-47-4
            
            
               Xn; R22
               Xi; R36/37/38
               R52-53
            
            
               Xn
               R: 22-36/37/38-52/53
               S: (2-)22-36-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-031-00-5
            
            
               simclosen
               acid triclorizocianuric
               triclor-1,3,5-triazintrion
            
            
                
            
            
               201-782-8
            
            
               87-90-1
            
            
               O; R8
               Xn; R22
               R31
               Xi; R36/37
               N; R50-53
            
            
               O; Xn; N
               R: 8-22-31-36/37-50/53
               S: (2-)8-26-41-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-038-00-3
            
            
               6-fenil-1,3,5-triazin-2,4-diildiamină
               6-fenil-1,3,5-triazin-2,4-diamină
               benzoguanamină
            
            
                
            
            
               202-095-6
            
            
               91-76-9
            
            
               Xn; R22
               R52-53
            
            
               Xn
               R: 22-52/53
               S: (2-)61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-042-00-5
            
            
               imazalil (ISO)
               1-[2-(aliloxi)-2-(2,4-diclorfenil)etil]-1H-imidazol
            
            
                
            
            
               252-615-0
            
            
               35554-44-0
            
            
               Xn; R20/22
               N; R41
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 20/22-41-50/53
               S: (2-)26-39-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-043-00-0
            
            
               imazalil sulfat (ISO)
               sulfat acid de 1-[2-(aliloxi)etil-2-(2,4-diclorfenil)]-1H-imidazol [1];
               sulfat acid de (+)-1-[2-(aliloxi)etil-2-(2,4-diclorfenil)]-1H-imidazol [2]
            
            
                
            
            
               261-351-5 [1]
               281-291-3 [2]
            
            
               58594-72-2 [1]
               83918-57-4 [2]
            
            
               Xn; R20/22
               Xi; R41
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 20/22-41-50/53
               S: (2-)26-39-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-066-00-6
            
            
               terbumeton (ISO)
               2-terț-butilamino-4-etilamino-6-metoxi-1,3,5-triazin
            
            
                
            
            
               251-637-8
            
            
               33693-04-8
            
            
               Xn; R22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-50/53
               S: (2-)60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-091-00-2
            
            
               diclorură morfamquat [1]
               sulfat morfamquat[2]
            
            
                
            
            
               225-062-8 [1]
            
            
               4636-83-3 [1]
               29873-36-7 [2]
            
            
               Xn; R22
               Xi; R36/37/38
               R52-53
            
            
               Xn;
               R: 22-36/37/38-52/53
               S: (2-)22-36-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-098-00-0
            
            
               N-(n-octil)-2-pirolidinonă
            
            
                
            
            
               403-700-8
            
            
               2687-94-7
            
            
               C; R34
               N; R51-53
            
            
               C; N
               R: 34-51/53
               S: (1/2-)23-26-36/37/39-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-130-00-3
            
            
               hexaconazole (ISO)
               (RS)-2-(2,4-diclorfenil)-1-(1H-1,2,4-triazolil-1)hexanol-2
            
            
                
            
            
               —
            
            
               79983-71-4
            
            
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 43-51/53
               S: (2-)24-37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-131-00-9
            
            
               piroquilon (ISO)
               1,2,5,6-tetrahidropirol[3,2,1-ij]chinolinonă-4
            
            
                
            
            
               —
            
            
               57369-32-1
            
            
               Xn; R22
               R52-53
            
            
               Xn
               R: 22-52/53
               S: (2-)61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-134-00-5
            
            
               myclobutanil (ISO)
               2-(4-clorfenil)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-ilmetil)hexannitril
            
            
                
            
            
               —
            
            
               88671-89-0
            
            
               Repr. Cat. 3; R63
               Xn; R22
               Xi; R36
               N; R51-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-36-51/53-63
               S: (2-)36/37-46-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-137-00-1
            
            
               methabenzthiazuron (ISO)
               1-(1,3-benzotiazolil-2)1,3-dimetiluree
            
            
                
            
            
               242-505-0
            
            
               18691-97-9
            
            
               N; R50-53
            
            
               N
               R: 50/53
               S: 60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-139-00-2
            
            
               metsulfuron-metil
               metil-2-(4-metoxi-6-metil-1,3,5-triazin-2-ilcarbamoilsulfamoil) benzoate
            
            
                
            
            
               —
            
            
               74223-64-6
            
            
               N; R50-53
            
            
               N
               R: 50/53
               S: 60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               614-001-00-4
            
            
               nicotine (ISO)
               3-(N-metil-2-pirolidinil)piridină
            
            
                
            
            
               200-193-3
            
            
               54-11-5
            
            
               T+; R27
               T; R25
               N; R51-53
            
            
               T+; N
               R: 25-27-51/53
               S: (1/2-)36/37-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               614-006-00-1
            
            
               brucină
               2,3-dimetoxistricnină
            
            
                
            
            
               206-614-7
            
            
               357-57-3
            
            
               T+; R26/28
               R52-53
            
            
               T+
               R: 26/28-52/53
               S: (1/2-)13-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               614-007-00-7
            
            
               sulfat de brucină [1]
               azotat de brucină [2]
               2,3-dimetoxi-stricnidin-10-onă, mono[(R)-1-metilheptil 1,2-benzendicarboxilat] [3]
               2,3-dimetoxi-stricnidin-10-onă, compus cu S-mono(1-metilheptil)-1,2-benzendicarboxilat (1:1) [4]
            
            
                
            
            
               225-432-9 [1]
               227-317-9 [2]
               269-439-5 [3]
               269-710-8 [4]
            
            
               4845-99-2 [1]
               5786-97-0 [2]
               68239-26-9 [3]
               68310-42-9 [4]
            
            
               T+; R26/28
               R52-53
            
            
               T+
               R: 26/28-52/53
               S: (1/2-)13-45-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               615-006-00-4
            
            
               2-metil-m-fenilen diizocianat [1]
               4-metil-m-fenilen diizocianat [2]
               
                  m-toliliden diizocianat [3]
               toluen-2,6-di-izocianat [1]
               toluen-2,4-di-izocianat [2]
               toluen-diizocianat [3]
            
            
               C
            
            
               202-039-0 [1]
               209-544-5 [2]
               247-722-4 [3]
            
            
               91-08-7 [1]
               584-84-9 [2]
               26471-62-5 [3]
            
            
               Carc. Cat. 3; R40
               T+; R26
               Xi; R36/37/38
               R42/43
               R52-53
            
            
               T+
               R: 26-36/37/38-40-42/43-52/53
               S: (1/2-)23-36/37-45-61
            
            
               C ≥ 20 %: T+; R26-36/37/38-40-42/43
               7 % ≤ C < 20 %: T+; R26-40-42/43
               1 % ≤ C < 7 %: T; R23-40-42/43
               0,1 % ≤ C < 1 %: Xn; R20-42
            
            
               2
            
         
               616-010-00-9
            
            
               tosilcloramidă de sodiu
            
            
                
            
            
               204-854-7
            
            
               127-65-1
            
            
               Xn; R22
               R31
               C; R34
               R42
            
            
               C
               R: 22-31-34-42
               S: (1/2-)7-22-26-36/37/39-45
            
            
                
            
            
                
            
         
               616-034-00-X
            
            
               pyracarbolid (ISO)
               3,4-dihidro-6-metil-2H-piran-5-carboxanilidă
            
            
                
            
            
               246-419-4
            
            
               24691-76-7
            
            
               R52-53
            
            
               R: 52/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               616-035-00-5
            
            
               cimoxanil
               2-ciano-N-[(etilamino)carbonil]-2-(methoxiimino)acetamidă
            
            
                
            
            
               261-043-0
            
            
               57966-95-7
            
            
               Xn; R22
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-43-50/53
               S: (2-)36/37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               617-004-00-9
            
            
               1,2,3,4-tetrahidro-1-naftil hidroperoxid
            
            
                
            
            
               212-230-0
            
            
               771-29-9
            
            
               O; R7
               Xn; R22
               C; R34
               N; R50-53
            
            
               O; C; N
               R: 7-22-34-50/53
               S: (1/2-)3/7-14-26-36/37/39-45-60-61
            
            
               C ≥ 25 %: C; R22-34
               10 %≤ C < 25 %: C; R34
               5 %≤ C < 10 %: Xi; R36/37/38
            
            
                
            
         
               617-006-00-X
            
            
               bi(a,a-dimetilbenzil) peroxid
            
            
                
            
            
               201-279-3
            
            
               80-43-3
            
            
               O; R7
               Xi; R36/38
               N; R51-53
            
            
               O; Xi; N
               R: 7-36/38-51/53
               S: (2-)3/7-14-36/37/39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               617-008-00-0
            
            
               peroxid de dibenzoil
               peroxid de benzoil
            
            
                
            
            
               202-327-6
            
            
               94-36-0
            
            
               E; R2
               Xi; R36
               R43
            
            
               E; Xi;
               R: 2-36-43
               S: (2-)3/7-14-36/37/39
            
            
                
            
            
                
            
         
               650-007-00-3
            
            
               chlordimeform (ISO)
               
                  N2
                  -(4-clor-o-tolyl)-N1
                  ,N1
                  -dimetilformamidină
            
            
                
            
            
               228-200-5
            
            
               6164-98-3
            
            
               Carc. Cat. 3; R40
               Xn; R21/22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 21/22-40-50/53
               S: (2-)22-36/37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               650-008-00-9
            
            
               drazoxolon (ISO)
               4-(2-clorfenilhidrazon)-3-metil-5-izoxazolonă
            
            
                
            
            
               227-197-8
            
            
               5707-69-7
            
            
               T; R25
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 25-50/53
               S: (1/2-)22-24-36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               650-009-00-4
            
            
               clorhidrat de chlordimeform
               monoclorhidrat de N1
                  -(4-clor-o-tolil)-N,N-dimetilformamidină
               clorhidrat de N2
                  -(4-clor-o-tolil)-N1
                  ,N1
                  -dimetilformamidină
            
            
                
            
            
               243-269-1
            
            
               19750-95-9
            
            
               Carc. Cat. 3; R40
               Xn; R22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-40-50/53
               S: (2-)22-36/37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               650-033-00-5
            
            
               esfenvalerate (ISO)
               (S)-a-ciano-3-fenoxi- benzil-(S)-2-(4-clorfenil)-3-metilbutirat
            
            
                
            
            
               —
            
            
               66230-04-4
            
            
               T; R23/25
               R43
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 23/25-43-50/53
               S: (1/2-)24-36/37/39-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               650-041-00-9
            
            
               triasulfuron (ISO)
               1-[2-(2-cloretoxi)fenilsulfonil]-3-(4-metoxi-6-metil-1,3,5-triazinil-2)uree
            
            
                
            
            
               —
            
            
               82097-50-5
            
            
               N; R50-53
            
            
               N
               R: 50/53
               S: 60-61
            
            
                
            
            
                
            
         ANEXA 1D
   
               Nr. index
            
            
               Denumire chimică
            
            
               Note referitoare la substanțe
            
            
               Nr. CE
            
            
               Nr. CAS
            
            
               Clasificare
            
            
               Etichetare
            
            
               Limite de concentrație
            
            
               Note referitoare la preparate
            
         
               006-090-00-8
            
            
               fenilcarbamat de 2-(3-iodoprop-2-in-1-iloxi)etil
            
            
                
            
            
               408-010-0
            
            
               88558-41-2
            
            
               Xn; R20
               Xi; R41
               R52-53
            
            
               Xn
               R: 20-41-52/53
               S: (2-)22-26-39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               014-016-00-0
            
            
               Amestec de: 1,3-dihex-5-en-1-il-1,1,3,3-tetrametildisiloxan; 1,3-dihex-n-en-1-il-1,1,3,3-tetrametildisiloxan
            
            
                
            
            
               406-490-6
            
            
               —
            
            
               N; R51-53
            
            
               N
               R51-53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               015-164-00-9
            
            
               P,P′-(1-hidroxietilen)bi(fosfonat acid)dihidrat de calciu
            
            
                
            
            
               400-480-5
            
            
               36669-85-9
            
            
               R52-53
            
            
               R: 52/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               015-165-00-4
            
            
               Amestec de: tiobi(4,1-fenilen)-S,S,S′,S′-tetrafenildisulfoniu bihexafluorofosfat; hexafluorofosfat de difenil(4-feniltiofenil)sulfoniu
            
            
                
            
            
               404-986-7
            
            
               —
            
            
               Xi; R41
               N; R50-53
            
            
               Xi; N
               R: 41-50/53
               S: (2-)15-26-39-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               015-166-00-X
            
            
               3,9-bi(2,6-di-terț-butil- 4-metilfenoxil-2,4,8,10-tetraoxa-3,9-difosfaspiro[5,5]undecan
            
            
                
            
            
               410-290-4
            
            
               80693-00-1
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               015-167-00-5
            
            
               acid 3-(hidroxifenilfosfonil) propanoic
            
            
                
            
            
               411-200-6
            
            
               14657-64-8
            
            
               Xi; R41
            
            
               Xi
               R: 41
               S: (2-)26-39
            
            
                
            
            
                
            
         
               601-050-00-1
            
            
               benzen, C10-C13-alchil derivații
            
            
                
            
            
               267-051-0
            
            
               67774-74-7
            
            
               N; R50
            
            
               N
               R: 50
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               601-051-00-7
            
            
               4-fenilbutenă-1
            
            
                
            
            
               405-980-7
            
            
               768-56-9
            
            
               Xi; R38
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 38-51/53
               S: (2-)37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               602-083-00-4
            
            
               pentabrom derivat de difenil eter pentabromdifenil eter
            
            
                
            
            
               251-084-2
            
            
               32534-81-9
            
            
               Xn; R48/21/22
               R64
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 48/21/22-50/53-64
               S: (1/2-)36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               602-084-00-X
            
            
               1,1-diclor-1-fluoretan
            
            
                
            
            
               404-080-1
            
            
               1717-00-6
            
            
               N; R52-53-59
            
            
               N
               R: 52/53-59
               S: 59-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-128-00-0
            
            
               2-(fenilmetoxi)naftalină
            
            
                
            
            
               405-490-3
            
            
               613-62-7
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-129-00-6
            
            
               1-terț-butoxipropanol-2
            
            
                
            
            
               406-180-0
            
            
               57018-52-7
            
            
               R10
               Xi; R41
            
            
               Xi
               R: 10-41
               S: (2-)26-39
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-130-00-1
            
            
               Amestec de izomeri ai: a-[(dimetil)bifenil)-w-hidroxipoli(oxietilenă)
            
            
                
            
            
               406-325-8
            
            
               —
            
            
               Xn; R22
               R52-53
            
            
               Xn
               R: 22-52/53
               S: (2-)39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-131-00-7
            
            
               Amestec 3:1 de: 1-deoxi-1-[metil-(1-oxododecil)amino]-D-glucitol; 1-deoxi-1-[metil-(1-oxotetradecil)amino]-D-glucitol
            
            
                
            
            
               407-290-1
            
            
               —
            
            
               Xi; R41
            
            
               Xi
               R: 41
               S: (2-)26-39
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-132-00-2
            
            
               2-hidroximetil-9-metil-6-(1-metiletil)-1,4-dioxaspiro[4.5]decan
            
            
                
            
            
               408-200-3
            
            
               63187-91-7
            
            
               Xi; R38-41
               R52-53
            
            
               Xi
               R: 38-41-52/53
               S: (2-)26-37/39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-133-00-8
            
            
               Amestec de: 3-[(4-amino-2-clor-5-nitrofenil)amino]-propandiol-1,2; 3,3′-(2-clor-5-nitro-1,4-fenilendiimino)bi(propandiol-1,2)
            
            
                
            
            
               408-240-1
            
            
               —
            
            
               Xn; R22
               R52-53
            
            
               Xn
               R: 22-52/53
               S: (2-)22-36-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-134-00-3
            
            
               Amestec de dodecil și tetradecil difenil eteri substituiți. Substanța este obținută prin reacția Friedel Crafts. Catalizatorul este separat din produșii de reacție. Difenil eterul este substituit de către grupele alchil C1-C10. Grupele alchil sunt legate aleatoriu între C1 și C6. Se utilizează 50/50 C12 și C14 linear.
            
            
                
            
            
               410-450-3
            
            
               —
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-135-00-9
            
            
               bi[[2,2′,2″-nitrilotri-[etanolato]]-1-N,O]-bi[2-(2-metoxietoxi)etoxi]-titan
            
            
                
            
            
               410-500-4
            
            
               —
            
            
               Xi; R41
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 41-51/53
               S: (2-)26-39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-136-00-4
            
            
               3-[(4-(bi(2-hidroxietil)amino)-2-nitrofenil)amino)-1-propanol
            
            
                
            
            
               410-910-3
            
            
               104226-19-9
            
            
               R43
               R52-53
            
            
               Xi
               R: 43-52/53
               S: (2-)24-37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-137-00-X
            
            
               1 amestec de: 1-deoxi-1-[metil-(1-oxohexadecil)amino]-D-glucitol; 1-deoxi-1-[metil-(1-oxooctadecil)amino]-D-glucitol
            
            
                
            
            
               411-130-6
            
            
               —
            
            
               Xi; R41
            
            
               Xi
               R: 41
               S: (2-)26-39
            
            
                
            
            
                
            
         
               603-138-00-5
            
            
               3-(2,2-dimetil-3-hidroxipropil)toluen; (alt.):
               2,2-dimetil-3-(3-metilfenil)propanol
            
            
                
            
            
               403-140-4
            
            
               103694-68-4
            
            
               R52-53
            
            
               R: 52/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               604-050-00-X
            
            
               4-clor-o-cresol
               4-clor-2-metil fenol
            
            
                
            
            
               216-381-3
            
            
               1570-64-5
            
            
               T; R23
               C; R35
               N; R50
            
            
               T; C; N
               R: 23-35-50
               S: (1/2-)26-36/37/39-45-61
            
            
               C ≥ 25 %: T; C; R23-35
               10 % ≤ C < 25 %: C; R20-35
               5 % ≤ C < 10 %: C; R20-34
               3 % ≤ C < 5 %: Xn; R20-36/37/38
               1 % ≤ C < 3 %: Xi; R36/37/38
            
            
                
            
         
               604-051-00-5
            
            
               3,5-bi[(3,5-di-terț-butil-4-hidroxi)benzil)-2,4,6-trimetilfenol
            
            
                
            
            
               401-110-5
            
            
               87113-78-8
            
            
               R52-53
            
            
               R: 52/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               604-052-00-0
            
            
               2,2′-metilenbi(6-(2H-benzotriazolil-2)-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenol)
            
            
                
            
            
               403-800-1
            
            
               103597-45-1
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               604-053-00-6
            
            
               2-metil-4-(1,1-dimetiletil)-6-(1-metil-pentadecil)-fenol
            
            
                
            
            
               410-760-9
            
            
               157661-93-3
            
            
               Xi; R38
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xi; N
               R: 38-43-50/53
               S: (2-)24-37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               604-054-00-1
            
            
               Amestec de: 2-metoxi-4-(tetrahidro-4-metilen-2H-piranil-2)-fenol; 4-(3,6-dihidro-4-metil-2H-piranil-2)-2-metoxifenol
            
            
                
            
            
               412-020-0
            
            
               —
            
            
               R43
               R52-53
            
            
               Xi
               R: 43-52/53
               S: (2-)24-37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               604-055-00-7
            
            
               2,2′-[(3,3′,5,5′-tetrametil-(1,1′-bifenil)-4,4′-diil)-bi(oximetilen)]-bi-oxiran
            
            
                
            
            
               413-900-7
            
            
               85954-11-6
            
            
               Muta. Cat.3; R40
            
            
               Xn
               R: 40
               S: (2-)22-36-37
            
            
                
            
            
                
            
         
               605-027-00-7
            
            
               Un amestec de: 3a,4,5,6,7,7a-hexahidro-4,7-metano-1H-indenă-6-carboxaldehidă; 3a,4,5,6,7,7a-hexahidro-4,7-metano-1H-inden-5-carboxaldehidă
            
            
                
            
            
               410-480-7
            
            
               —
            
            
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 43-51/53
               S: (2-)24-37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               606-051-00-0
            
            
               4-pentilciclohexanonă
            
            
                
            
            
               406-670-4
            
            
               61203-83-6
            
            
               N; R51-53
            
            
               N
               R: 51/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               606-052-00-6
            
            
               4-(N,N-dibutilamino)-2-hidroxi-2′-carboxibenzofenonă
            
            
                
            
            
               410-410-5
            
            
               54574-82-2
            
            
               R52-53
            
            
               R: 52/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-272-00-5
            
            
               fluroxypyr-meptyl (ISO) [1]
               fluroxypyr-butometyl (ISO) [2]
               acetat de metilheptil, O-(4-amino-3,5-diclor-6-fluor-2-piridiloxi) [1]
               acetat de 2-butoxi-1-metiletil, O-(4-amino-3,5-diclor-6-fluor-2-piridiloxi) [2]
            
            
                
            
            
               279-752-9 [1]
               —
            
            
               81406-37-3 [1]
               154486-27-8 [2]
            
            
               N; R50-53
            
            
               N
               R: 50/53
               S: 60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-273-00-0
            
            
               7-(2,6-dimetil-8-(2,2-dimetilbutiriloxi)-1,2,6,7,8,8a-hexahidro-1-naftil)-3,5-dihidroxiheptanoat de amoniu
            
            
                
            
            
               404-520-2
            
            
               —
            
            
               R52-53
            
            
               R: 52/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-274-00-6
            
            
               2-(N-benzil-N-metilamino)etil 3-amino-2-butenoat
            
            
                
            
            
               405-350-1
            
            
               54527-73-0
            
            
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 43-51/53
               S: (2-)24-37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-275-00-1
            
            
               benzoiloxibenzen-4-sulfonat de sodiu
            
            
                
            
            
               405-450-5
            
            
               66531-87-1
            
            
               R43
            
            
               Xi
               R: 43
               S: (2-)24-37
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-276-00-7
            
            
               bi [(1-metilimidazol)-(2-etil-hexanoat)], complex al zincului
            
            
                
            
            
               405-635-0
            
            
               —
            
            
               Xi; R38-41
               N; R50-53
            
            
               Xi; N
               R: 38-41-50/53
               S: (2-)26-37/39-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-277-00-2
            
            
               Un amestec de: clorhidrat de 2-(hexiltio)etilamină; propionat de sodiu
            
            
                
            
            
               405-720-2
            
            
               —
            
            
               Xn; R22
               Xi; R41
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-41-43-51/53
               S: (2-)24-26-37/39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-278-00-8
            
            
               Amestec de izomeri ai: fenetilnaftalensulfonat de sodiu; naftiletilbenzensulfonat de sodiu
            
            
                
            
            
               405-760-0
            
            
               —
            
            
               Xi; R41
               R43
               R52-53
            
            
               Xi
               R: 41-43-52/53
               S: (2-)24-26-37/39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-279-00-3
            
            
               Un amestec de: bi(maleat acid) n-octadecilaminodietil; naftalat acid maleat acid de n-octadecilaminodietil
            
            
                
            
            
               405-960-8
            
            
               —
            
            
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 43-51/53
               S: (2-)24-37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-280-00-9
            
            
               4-clor-1-hidroxibutan-1-sulfonat de sodiu
            
            
                
            
            
               406-190-5
            
            
               54322-20-2
            
            
               Xn; R22
               Xi; R36
               R43
            
            
               Xn
               R: 22-36-43
               S: (2-)22-26-36/37
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-281-00-4
            
            
               Amestec de C7-C9 alchil 3-[3-(2H-benzotriazolil-2)-5-(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil] propionați ramificați și lineari
            
            
                
            
            
               407-000-3
            
            
               127519-17-9
            
            
               N; R51-53
            
            
               N
               R: 51/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-282-00-X
            
            
               acetat de 2-acetoximetil-4-benziloxibutil-1
            
            
                
            
            
               407-140-5
            
            
               131266-10-9
            
            
               R52-53
            
            
               R: 52/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-283-00-5
            
            
               E-etil-4-oxo-4-fenilcrotonat
            
            
                
            
            
               408-040-4
            
            
               15121-89-8
            
            
               Xn; R21/22
               Xi; R38-41
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 21/22-38-41-43-50/53
               S: (2-)26-36/37/39-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-284-00-0
            
            
               Amestec 9:1 de: 3,3′-(1,4-fenilenbi (carbonilimino-3,1-propanediilimino)]bi (10-amino-6,13-diclor-4,11-trifenodioxazindisulfonat) de sodiu; 3,3′-(1,4-fenilenbi-(carbonilimino-3,1-propanediil-imino)]bi (10-amino-6,13-diclor)-4,11-trifenonodioxazindisulfonat de litiu
            
            
                
            
            
               410-040-4
            
            
               136213-76-8
            
            
               N; R51-53
            
            
               N
               R: 51/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-285-00-6
            
            
               Amestec de: acid 7-{[(3-aminofenil)sulfonil)amino)-naftalen-1,3-disulfonic; 7-{[(3-aminofenil)sulfonil)amino)-naftalen-1,3-disulfonat de sodiu; 7-{[(3-aminofenil)sulfonil)amino)-naftalen-1,3-disulfonat de potasiu
            
            
                
            
            
               410-065-0
            
            
               —
            
            
               R43
            
            
               Xi
               R: 43
               S: (2-)22-24-37
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-286-00-1
            
            
               Amestec de: 7-[[[3-[[4-[(2-hidroxi-naftil)azo)fenil]azo]fenil]sulfonil]amino]-naftalen-1,3-disulfonat de sodiu/potasiu
            
            
                
            
            
               410-070-8
            
            
               141880-36-6
            
            
               R43
               R52-53
            
            
               Xi
               R: 43-52/53
               S: (2-)22-24-37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-287-00-7
            
            
               O-(1-metil-2-metacriloiloxi-etil)-1,2,3,6-tetrahidroftalat de O′-metil
            
            
                
            
            
               410-140-8
            
            
               —
            
            
               R52-53
            
            
               R: 52/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-288-00-2
            
            
               (c-(3-(1-(3-(e-6-diclor-5-cianopirimidin-f-il(metil)amino)propil)-1,6-dihidro-2-hidroxi-4-metil-6-oxo-3-piridilazo)-4-sulfonatofenilsulfamoil)ftalocianin-a,b,d-trisulfonat(6-)]nickelato II tetrasodic, unde a este 1 sau 2 sau 3 sau 4, b este 8 sau 9 sau 10 sau 11, c este 15 sau 16 sau 17 sau 18, d este 22 sau 23 sau 24 sau 25 și unde e și f împreună sunt respectiv 2 și 4 sau 4 și 2
            
            
                
            
            
               410-160-7
            
            
               148732-74-5
            
            
               Xi; R36
               R43
               R52-53
            
            
               Xi
               R: 36-43-52/53
               S: (2-)22-26-36/37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-288-00-8
            
            
               acid 3-(3-(4-(2,4-bi(1,1-dimetilpropil)fenoxi)butilaminocarbonil-4-hidroxi-1-napftalenil)tio)propanoic
            
            
                
            
            
               410-370-9
            
            
               105488-33-3
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-290-00-3
            
            
               Amestec (raport necunoscut) de: 1-C14-C18-alchiloxicarbonil-2-(3-aliloxi-2-hidroxipropoxicarbonil)etan-1-sulfonat de amoniu; 2-C14-C18-alchiloxicarbonil-1-(3-aliloxi-2-hidroxipropoxicarbonil)etan-1-sulfonat de amoniu
            
            
                
            
            
               410-540-2
            
            
               —
            
            
               Xi; R38
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xi; N
               R: 38-43-50/53
               S: (2-)24-37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-291-00-9
            
            
               dodecil-w-(C5/C6-cicloalchil)alchil carboxilat
            
            
                
            
            
               410-630-1
            
            
               104051-92-5
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-292-00-4
            
            
               Amestec de: acid [1-(metoximetil)-2-(C12-alcoxi)-etoxi]acetic; acid [1-(metoximetil)-2-(C14-alcoxi)-etoxi] acetic
            
            
                
            
            
               410-640-6
            
            
               —
            
            
               Xi; R38-41
               N; R50-53
            
            
               Xi; N
               R: 38-41-50/53
               S: (2-)26-37/39-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-293-00-X
            
            
               Amestec de: N-aminoetilpiperazoniu mono-2,4,6-trimetilnonildifenil eter di-sulfonat; N-aminoetilpiperazoniu di-2,4,6-trimetilnonildifenil eter di-sulfonat
            
            
                
            
            
               410-650-0
            
            
               —
            
            
               Xi; R41
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 41-43-51/53
               S: (2-)26-36/37/39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-294-00-5
            
            
               2-benzoiloxi-1-hidroxietan-sulfonat de sodiu
            
            
                
            
            
               410-680-4
            
            
               —
            
            
               R43
            
            
               Xi
               R: 43
               S: (2-)24-37
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-295-00-0
            
            
               Amestec de: fosfonoetan-1,2-dicarboxilat tetrasodic; fosfonobutan-1,2,3,4-tetracarboxilat hexasodic
            
            
                
            
            
               410-800-5
            
            
               —
            
            
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 43-51/53
               S: (2-)24-37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-296-00-6
            
            
               Amestec de: pentaeritriol tetraesterii acidului heptanoic și acidului 2-etilhexanoic
            
            
                
            
            
               410-830-9
            
            
               —
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-297-00-1
            
            
               acid (E-E)-3,3′-(1,4-fenilenedimetiliden)bi(2-oxobornan-10-sulfonic)
            
            
                
            
            
               410-960-6
            
            
               92761-26-7
            
            
               Xi; R41
            
            
               Xi
               R: 41
               S: (2-)26-39
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-298-00-7
            
            
               2-(trimetilamoniu)etoxycarboxibenzen-4-sulfonat
            
            
                
            
            
               411-010-3
            
            
               —
            
            
               R43
            
            
               Xi
               R: 43
               S: (2-)22-36/37
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-299-00-2
            
            
               3-(acetiltio)-2-metil-propanoat de metil
            
            
                
            
            
               411-040-7
            
            
               97101-46-7
            
            
               Xn; R22
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-43-50/53
               S: (2-)24-37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-300-00-6
            
            
               [2-(5-clor-2,6-difluorpirimidin-4-ilamino)-5-(b-sulfamoil-c,d-sulfonatoftalocianin-a-il-K4,N29,N30,N31,N32-sulfonilamino)benzoato(5-)]cuprat (II) trisodic, unde a = 1,2,3,4; b = 8,9,10,11; c = 15,16,17,18; d = 22,23,24,25
            
            
                
            
            
               411-430-7
            
            
               —
            
            
               R43
            
            
               Xi
               R: 43
               S: (2-)22-24-37
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-301-00-1
            
            
               Amestec de: acid dodecanoic; poliesteri (1-7)lactați ai acidului dodecanoic
            
            
                
            
            
               411-860-5
            
            
               —
            
            
               Xi; R38-41
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 38-41-43-51/53
               S: (2-)24-26-37/39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-302-00-7
            
            
               Amestec de: acid tetradecanoic; poliesteri (1-7)lactați ai acidului tetradecano
            
            
                
            
            
               411-910-6
            
            
               —
            
            
               Xi; R38-41
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 38-41-43-51/53
               S: (2-)24-26-37/39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               607-303-00-2
            
            
               acid 1-ciclopropil-6,7-difluor-1,4-dihydro-4-oxochinolin-3-carboxilic
            
            
                
            
            
               413-760-7
            
            
               93107-30-3
            
            
               Repr. Cat.3; R62
               R52-53
            
            
               Xn
               R: 62-52/53
               S: (2-)22-36/37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               608-023-00-3
            
            
               4-(4-clorfenil)-2-fenil-2-[(1H-1,2,4-triazolil-1)metil] butannitril
            
            
                
            
            
               406-140-2
            
            
               114369-43-6
            
            
               N; R50-53
            
            
               N
               R: 50/53
               S: 60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               608-024-00-9
            
            
               2-(4-(N-butil-N-fenetilamino)fenil)etilen-1,1,2-tricarbonitril
            
            
                
            
            
               407-650-8
            
            
               97460-76-9
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               608-025-00-4
            
            
               2-nitro-4,5-bi(benziloxi)fenilacetonitril
            
            
                
            
            
               410-970-0
            
            
               117568-27-1
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               609-053-00-X
            
            
               hidrazin-tri-nitrometan
            
            
                
            
            
               414-850-9
            
            
               —
            
            
               E; R3
               O; R8
               Carc. Cat. 2; R45
               T; R23/25
               R43
            
            
               E; T
               R: 45-3-8-23/25-43
               S: 53-45
            
            
                
            
            
                
            
         
               610-010-00-2
            
            
               2-brom-1-(2-furil)-2-nitroetilen
            
            
                
            
            
               406-110-9
            
            
               35950-52-8
            
            
               Xn; R22-48/22
               C; R34
               R43
               N; R50-53
            
            
               C; N
               R: 22-34-43-48/22-50/53
               S: (1/2-)22-26-36/37/39-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               611-043-00-5
            
            
               Amestec 2:1:1 de: N(1′)-N(2):N(1‴)-N(2″)-h-6-[2-amino-4-(sau 6)-hidroxi-(sau 4-amino-2-hidroxi)fenilazo]-6″-(1-carbaniloil-2-hidroxiprop-1-enilazo)-5′,5‴-disulfamoil-3,3″-disulfonatobi (naftalen-2,1′-azobenzen-1,2′-diolato-O(1),O(2′) -cromat trisodic; N(1′)-N(2):N(1‴)-N(2″)-h-6,6″-bi(1-carbaniloil-2-hidroxiprop-1-enilazo)-5′,5‴-disulfamoil-3,3″-disulfonatobi (naftalen-2,1′-azobenzen-1,2′-diolato-O(1),O(2′) -cromat trisodic; N(1′)-N(2): N(1‴)-N(2″)-h-6,6″-bi(2-amino-4-(sau 6) - hidroxi-(sau 4-amino-2-hidrox)-fenilaz]-5′,5‴-disulfamoil-3,3″-disulfonatobi (naftalen-2,1′-azobenzen-1,2′-diolato-O(1),O(2′) -cromat trisodic;
            
            
                
            
            
               402-850-1
            
            
                
            
            
               Xi; R41
               52-53
            
            
               Xi
               R: 41-52/53
               S: (2-)26-39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               611-044-00-0
            
            
               Amestec de: bi [1-[(2-hidroxi-5-nitrofenil)azo]-2-naftalenolato(2-)]-cromat (1-) de terț-alchil(C12-C14)amoniu; bi [1-[(2-hidroxi-4-nitrofenil)azo]-2-naftalenolato(2-)]-cromat (1-) de terț-alchil(C12-C14)amoniu bi[1-[[5-(1,1-dimetilpropil)-2-hidroxi-3-nitrofenil]azo]-2-naftalenato(2-)]-cromat(1-) de terț-alchil(C12-C14)amoniu; [1-[(2-hidroxi-5-nitrofenil)azo]-2-naftalenolato(2-)]- [1-[(2-hidroxi-5-nitrofenil)azo]-2-naftalenolato(2-)]- cromat (1-) de terț-alchil(C12-C14)amoniu; [[1-[[(5-(1,1-dimetilpropil)-2-hidroxi-3-nitrofenil]azo]-2-naftalenolato(2-)]-[1-)[(2-hidroxi-5-nitrofenil)azo]-2-naftalenolato (2-)]]-cromat (1-) de terț-alchil(C12-C14)amoniu; [(1-(4(sau 5)-nitro-2-oxidofenilazo)-2-naftolato)(1-(3-nitro-2-oxido-5-pentilfenilazo)-2-naftolato)]- cromat (1-) de terț-alchil(C12-C14)amoniu + C1268;
            
            
                
            
            
               403-720-7
            
            
               117527-94-3
            
            
               N; R51-53
            
            
               N
               R: 51/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               611-045-00-6
            
            
               2-[4-[N-(4-acetoxibutil)-N-etil]amino-2-metilfenilazo]-3-acetil-5-nitrotiofen
            
            
                
            
            
               404-830-8
            
            
               —
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               611-046-00-1
            
            
               4,4′-diamino-2-metilazobenzen
            
            
                
            
            
               407-590-2
            
            
               43151-99-1
            
            
               T; R25
               Xn; R48/22
               R43
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 25-43-48/22-50/53
               S: (1/2-)22-28-36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               611-047-00-7
            
            
               Amestec 1:1 de: 2-[[4-[N-etil-N-(2-acetoxietil)amino]fenil]azo]-5,6-diclorbenzotiazol; 2-[[4-[N-etil-N-(2-acetoxietil)amino]fenil]azo]-6,7-diclorbenzotiazol
            
            
                
            
            
               407-890-3
            
            
               111381-11-4
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               611-048-00-2
            
            
               Amestec (1:1) de: 2-[[4-[bi(2-acetoxietil)amino]fenil]azo]-5,6-diclorbenzotiazol; 2-[[4-[bi (2-acetoxietil)amino]fenil]azo]-6,7-diclorbenzotiazol
            
            
                
            
            
               407-900-6
            
            
               111381-12-5
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               611-049-00-8
            
            
               7-[4-(3-dietilaminopropilamino)-6-(3-dietilamoniopropilamino)-1,3,5-triazin-2-ilamino]-4-hidroxi-3-(4-fenilazofenilazo)-naftalen-2-sulfonat, acid acetic, acid lactic (2:1:1)
            
            
                
            
            
               408-000-6
            
            
               118658-98-3
            
            
               Xn; R48/22
               R43
               R52-53
            
            
               Xn
               R: 43-48/22-52/53
               S: (2-(22-36/37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               611-051-00-9
            
            
               clorură de 2-(4-(N-etil-N-(2-hidroxi)etil)amino-2-metilfenil)azo-6-metoxi-3-metil-benzotiazol
            
            
                
            
            
               411-110-7
            
            
               136213-74-6
            
            
               N; R50-53
            
            
               N
               R: 50/53
               S: 60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               611-052-00-4
            
            
               apă -[5-[[2,4-dihidroxi-5-[(2-hidroxi-3,5-dinitrofenil)azo]fenil]azo]-2-naftalensulfonat de sodiu], complex cu fier
            
            
                
            
            
               400-720-9
            
            
               —
            
            
               R52-53
            
            
               R: 52/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               612-156-00-2
            
            
               Amestec de: clorură de trihexadecilmetilamoniu; clorură de dihexadecildimetilamoniu
            
            
                
            
            
               405-620-9
            
            
               —
            
            
               Xi; R41
               N; R50-53
            
            
               Xi; N
               R: 41-50/53
               S: (2-)26-39-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               612-157-00-8
            
            
               clorhidrat de (Z)-1-benzo[b]tien-2-iletanon oxima
            
            
                
            
            
               410-780-8
            
            
               —
            
            
               Xn; R22-48/22
               Xi; R41
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-41-43-48/22-51/53
               S: (2-)22-26-36/37/39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               612-158-00-3
            
            
               Amestec de: bi(5-dodecil-2-hidroxibenzald-oximat) cupru (II), grupul C12-alchil este ramificat; 4-dodecilsalicilaldoxima
            
            
                
            
            
               410-820-4
            
            
               —
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               612-159-00-9
            
            
               Produși de reacție ai: trimetilhexametilen diaminei (un amestec de 2,2,4-trimetil-1,6-hexandiamină și 2,4,4-trimetil-1,6-hexandiamină, conform listelor IESCE), Epoxid 8 (derivați ai mono[(C10-C16-alchiloxi)metil]oxiran) și ai acidului p-toluen-sulfonic
            
            
                
            
            
               410-880-1
            
            
               —
            
            
               Xn; R22
               C; R34
               N; R50-53
            
            
               C; N
               R: 22-34-50/53
               S: (1/2-)23-26-36/37/39-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-149-00-7
            
            
               2-terț-butil-5-(4-terț-butilbenziltio)-4-clorpiridazinonă-3(2H)
            
            
                
            
            
               405-700-3
            
            
               96489-71-3
            
            
               T; R23/25
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 23/25-50/53
               S: (1/2-)36/37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-150-00-2
            
            
               2,2′-[3,3′-(piperazindiil-1,4)dipropil]bi(1H-benzimidazo[2,1-b]benzo[1,m,n][3,8]fenantrolin-1,3,6-trionă
            
            
                
            
            
               406-295-6
            
            
               —
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-151-00-8
            
            
               1-(3-mesiloxi-5-tritiloximetil-2-D-treofuril)timină
            
            
                
            
            
               406-360-9
            
            
               104218-44-2
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-152-00-3
            
            
               N-(4,6-dimetoxipirimidinil-2)carbamat de fenil
            
            
                
            
            
               406-600-2
            
            
               89392-03-0
            
            
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 43-51/53
               S: (2-)24-37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-153-00-9
            
            
               2,3,5-triclorpiridină
            
            
                
            
            
               407-270-2
            
            
               16063-70-0
            
            
               R52-53
            
            
               R: 52/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-154-00-4
            
            
               2-amino-4-clor-6-metoxipirimidină
            
            
                
            
            
               410-050-9
            
            
               5734-64-5
            
            
               Xn; R22
            
            
               Xn
               R: 22
               S: (2-)22
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-155-00-X
            
            
               5-clor-2,3-difluorpiridină
            
            
                
            
            
               410-090-7
            
            
               89402-43-7
            
            
               R10
               Xn; R22
               R52-53
            
            
               Xn
               R: 10-22-52/53
               S: (2-)23-36-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-156-00-5
            
            
               2-butil-4-clor-5-formilimidazol
            
            
                
            
            
               410-260-0
            
            
               83857-96-9
            
            
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xi; N
               R: 43-51/53
               S: (2-)24-37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-157-00-0
            
            
               2,4-diamino-5-metoximetilpirimidină
            
            
                
            
            
               410-330-0
            
            
               54236-98-5
            
            
               Xn; R22-48/22
               Xi; R36
            
            
               Xn
               R: 22-36-48/22
               S: (2-)22-26-36
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-158-00-6
            
            
               2,3-diclor-5-trifluormetil-piridină
            
            
                
            
            
               410-340-5
            
            
               69045-84-7
            
            
               Xn; R20/22
               Xi; R41
               R43
               N; R51-53
            
            
               Xn; N
               R: 20/22-41-43-51/53
               S: (2-)24-26-37/39-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-159-00-1
            
            
               4-[2-[4-(1,1-dimetiletil)fenil]-etoxi]chinazolin
            
            
                
            
            
               410-580-0
            
            
               120928-09-8
            
            
               T; R25
               Xn; R20
               N; R50-53
            
            
               T; N
               R: 20-25-50/53
               S: (1/2-)37-45-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               613-160-00-7
            
            
               (1S)-2-metil-2,5-diazobiciclo[2.2.1]heptan dibromhidrat
            
            
                
            
            
               411-000-9
            
            
               125224-62-6
            
            
               R43
            
            
               Xi
               R: 43
               S: (2-)24-37
            
            
                
            
            
                
            
         
               615-022-00-1
            
            
               3-izocianatosulfonil-2-tiofen-carboxilat de met
            
            
                
            
            
               410-550-7
            
            
               79277-18-2
            
            
               E; R2
               R14
               Xn; R48/22
               R42/43
            
            
               E; Xn
               R: 2-14-42/43-48/22
               S: (2-)22-30-35-36/37
            
            
                
            
            
                
            
         
               615-023-00-7
            
            
               esterul metilic al acidului 2-(izocianatosulfonilmetil)benzoic; (alt.): 2-(izocianatosulfonilmetil)benzoat de metil
            
            
                
            
            
               410-900-9
            
            
               83056-32-0
            
            
               R10
               R14
               Muta. Cat.3; R40
               Xn; R20-48/22
               Xi; R41
               R42
            
            
               Xn
               R: 10-14-20-40-41-42-48/22
               S: (2-)23-26-36/37/39
            
            
                
            
            
                
            
         
               616-044-00-4
            
            
               N-(3,5-diclor-4-etil-2-hidroxifenil)-2-(3-pentadecilfenoxi)-butanamid
            
            
                
            
            
               402-510-2
            
            
               —
            
            
               N; R51-53
            
            
               N
               R: 51/53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               616-045-00-X
            
            
               2′-(4-clor-3-ciano-5-formil-2-tienilazo)-5′-dietilamino-2-metoxiacetanilid
            
            
                
            
            
               405-190-2
            
            
               122371-93-1
            
            
               R43
               R53
            
            
               Xi
               R: 43-53
               S: (2-)22-24-37-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               616-046-00-5
            
            
               N-(2-(6-clor-7-metilpirazolo(1,5-b)-1,2,4-triazolil-4)propil)-2-(2,4-di-terț-pentilfenoxi)octanamidă
            
            
                
            
            
               406-390-2
            
            
               —
            
            
               N; R50-53
            
            
               N
               R: 50/53
               S: 60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               616-047-00-0
            
            
               2,2′,2″,2‴-(etilendinitrilotetrakis-N,N-di(C16)alchilacetamidă; 2,2′,2″,2‴-(etilendinitrilotetrakis-N,N-di(C18)alchilacetamidă
            
            
                
            
            
               406-640-0
            
            
               —
            
            
               R43
            
            
               Xi
               R: 43
               S: (2-)24-37
            
            
                
            
            
                
            
         
               616-048-00-6
            
            
               3′-trifluormetilizobutiranilidă
            
            
                
            
            
               406-740-4
            
            
               1939-27-1
            
            
               Xn; R48/22
               N; R51-53
            
            
               Xn; N
               R: 48/22-51/53
               S: (2-)22-36-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               616-049-00-1
            
            
               2-(2,4-bi(1,1-dimetiletil)fenoxi)-N-(3,5-diclor-4-etil-2-hidroxifenil)-hexanamidă
            
            
                
            
            
               408-150-2
            
            
               99141-89-6
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               616-050-00-7
            
            
               N-[2,5-diclor-4-(1,1,2,3,3,3-hexafluorpropoxi)-fenil-aminocarbonil]-2,6-difluorbenzamidă
            
            
                
            
            
               410-690-9
            
            
               103055-07-8
            
            
               R43
               N; R50-53
            
            
               Xi; N
               R: 43-50/53
               S: (2-)24-37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               616-051-00-2
            
            
               Amestec de: 2,4 -bi(N′-(4-metilfenil)-ureido)-toluen; 2,6 -bi(N′-(4-metilfenil)-ureido)-toluen
            
            
                
            
            
               411-070-0
            
            
               —
            
            
               R53
            
            
               R: 53
               S: 61
            
            
                
            
            
                
            
         
               617-015-00-9
            
            
               bi(4-metilbenzoil)peroxid
            
            
                
            
            
               407-950-9
            
            
               895-85-2
            
            
               E; R2
               O; R7
               N; R50-53
            
            
               E; N
               R: 2-7- 50/53
               S: (2-)7-14-36/37/39-47-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         
               650-032-00-X
            
            
               ciproconazol (ISO)
               (2RS,3RS;2RS,3SR)-2-(4-clorfenil)-3-ciclopropil-1-(1H-1,2,4-triazolil-1)butanol-2
            
            
                
            
            
               —
            
            
               94361-06-5
            
            
               Repr. Cat. 3; R63
               Xn; R22
               N; R50-53
            
            
               Xn; N
               R: 22-50/53-63
               S: (2-)36/37-60-61
            
            
                
            
            
                
            
         ANEXA 2
   
      A se vedea Actul de aderare din 2003 (JO L 236, 23.9.2003, p. 96).
   
   ANEXA 3A
   
      A se vedea Actul de aderare din 2003 (JO L 236, 23.9.2003, p. 96).
   
   ANEXA 3B
   
      A se vedea Actul de aderare din 2003 (JO L 236, 23.9.2003, p. 96).
   
   ANEXA 4A
   
      „B.10.   MUTAGENITATEA –TESTUL IN VITRO DE ABERAȚIE CROMOZOMIALĂ PE CELULE DE MAMIFERE
      1.   METODA
      Prezenta metodă este reprodusă după orientarea OCDE TG 473, Testul in vitro de aberație cromozomială pe celule de mamifere (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Scopul testului in vitro de aberație cromozomială este destinat depistării agenților care provoacă aberații cromozomiale ale structurii în celulele de mamifere, în cultură (1) (2) (3). Aberațiile structurale pot fi de două tipuri, cromozomiale sau cromatidice. La majoritatea mutagenilor chimici, aberațiile induse sunt de tip cromatidic, dar se produc și aberații de tip cromozomial. O poliploidie crescută poate să indice că un produs chimic are capacitatea de a provoca aberații ale numărului de cromozomi. Cu toate acestea, prezenta metodă nu este destinată determinării aberațiilor numerice și, în general, nu se utilizează în acest scop. Mutațiile cromozomiale și fenomenele conexe sunt cauza multor maladii genetice umane și există dovezi suficiente ale implicării mutațiilor cromozomiale și a fenomenelor conexe, care provoacă modificări ale oncogenelor și ale genelor supresoare de tumori din celulele somatice, în inducerea cancerului la oameni și la animalele de laborator.
      Testul in vitro de aberație cromozomială poate să utilizeze culturi de linii celulare stabilite, sușe celulare sau culturi celulare primare. Celulele utilizate se selectează în funcție de potențialul de dezvoltare în cultură, stabilitatea cariotipului, numărul de cromozomi, diversitatea cromozomilor și frecvența aberațiilor cromozomiale spontane.
      Pentru realizarea in vitro a testului este necesar să se utilizeze o sursă exogenă pentru activarea metabolică. Sistemul de activare metabolică de acest tip nu poate să reproducă integral condițiile celulelor de mamifere in vivo. Ar trebui să se acorde atenție evitării condițiilor care ar putea să conducă la obținerea unor rezultate pozitive care nu reflectă o mutagenitate intrinsecă, condiții care s-ar putea datora modificărilor de pH, de osmolalitate sau unor valori mari ale citotoxicității (4) (5).
      Prezentul test se utilizează pentru depistarea substanțelor cu posibile efecte mutagene și cancerigene pentru mamifere. Mulți compuși care dau rezultate pozitive la acest test sunt cancerigeni pentru mamifere; cu toate acestea, nu există o corelație perfectă între prezentul test și cancerigenitate. Corelația depinde de clasa de produse chimice și sunt tot mai multe dovezi că există agenți cancerigeni care nu se depistează prin prezentul test deoarece este posibil ca aceștia să acționeze printr-un alt mecanism decât cel care provoacă leziuni directe ale ADN.
      A se vedea și introducerea generală din partea B.
      1.2.   DEFINIȚII
      Aberație de tip cromatidic: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea cromatidelor singure sau prin divizarea și reuniunea între cromatide.
      Aberație de tip cromozomial: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea sau divizarea și reuniunea ambelor cromatide în același situs.
      Endoreduplicare: proces în care, după o perioadă S de replicare a ADN, nucleul nu intră în mitoză, ci începe o altă fază S. Rezultă cromozomi cu 4, 8, 16, … cromatide.
      Lacună: leziune acromatică mai mică decât lățimea unei cromatide și cu o eroare minimă de aliniere a cromatidelor.
      Index mitotic: numărul celulelor în metafază împărțit la numărul total de celule observate într-o populație de celule; indică gradul de proliferare a populației respective.
      Aberație numerică: modificare a numărului de cromozomi față de numărul normal caracteristic pentru celulele utilizate.
      Poliploidie: multiplicare a numărului (n) de cromozomi haploizi, alta decât diploidia (adică 3n, 4n etc.).
      Aberație structurală: modificare a structurii cromozomilor, detectabilă la examinarea microscopică a celulelor în stadiul de metafază al diviziunii acestora, care se prezintă sub formă de deleții și fragmente, modificări intracromozomiale și intercromozomiale.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Culturile de celule sunt expuse la substanța de testat, atât cu, cât și fără activare metabolică. După expunerea celulelor la substanța de testat, acestea se tratează la intervale de timp prestabilite cu o substanță de inhibare a metafazei (de ex. Colcemid® sau colchicină), se recoltează, se colorează și celulele în metafază sunt analizate la microscop pentru detectarea aberațiilor cromozomiale.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Preparatele
      1.4.1.1.   Celulele
      Se pot utiliza diferite linii celulare, sușe de celule sau culturi de celule primare, inclusiv celule umane (de ex. celule de hamster chinezesc, limfocite din sângele periferic uman sau al altor mamifere).
      1.4.1.2.   Mediile și condițiile de cultură
      Se recomandă utilizarea mediilor de cultură și a condițiilor de incubare (vasele de cultură, concentrația CO2, temperatura și umiditatea) corespunzătoare pentru dezvoltarea culturilor. Se impune controlul regulat al liniilor și sușelor celulare, pentru verificarea stabilității numărului modal de cromozomi și a absenței contaminării cu micoplasmă și, dacă se constată contaminarea, celulele nu se mai folosesc. Ar trebui să se cunoască perioada ciclului celular normal pentru celulele și condițiile de cultură utilizate.
      1.4.1.3.   Prepararea culturilor
      Liniile și sușele celulare stabilite: celulele se prepară plecând de la culturile de rezervă, se însămânțează în mediul de cultură într-o anumită densitate, astfel încât culturile să nu ajungă la confluență înainte de momentul recoltării, apoi se incubează la 37 °C.
      Limfocitele: sângele complet, tratat cu un anticoagulant (de ex. heparina), sau limfocitele separate obținute de la subiecți sănătoși se adaugă la mediul de cultură ce conține un mitogen (de ex. fitohemaglutinină) și se incubează la 37 °C.
      1.4.1.4.   Activarea metabolică
      Se recomandă ca expunerea celulelor la substanța de testat să se realizeze atât în prezența, cât și în absența sistemului de activare metabolică corespunzător. Sistemul cel mai frecvent utilizat este o fracție postmitocondrială la care s-au adăugat cofactori (S9), preparată din ficat de rozătoare tratat cu agenți de inducție enzimatică, de ex. Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) sau un amestec de fenobarbitonă și β-naftoflavonă (10) (11) (12).
      Fracția postmitocondrială se utilizează, de obicei, la concentrații cuprinse între limitele 1-10 % vol./vol. în mediul experimental final. Compoziția unui sistem de activare metabolic poate să depindă de clasa din care face parte substanța chimică de testat. În unele cazuri, s-ar putea să fie convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale.
      O serie de realizări, inclusiv crearea prin inginerie genetică a unor linii celulare care exprimă enzime activatoare specifice, poate furniza potențialul pentru o activare endogenă. Alegerea liniilor celulare ar trebui să fie justificată din punct de vedere științific (de ex. prin importanța izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul substanței de testat).
      1.4.1.5.   Substanța de testat/prepararea
      Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se prepare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului celulelor. Substanțele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele experimentale și se diluează înainte de utilizare în tratamentul celulelor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanță de testat, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.
      1.4.2.   Condițiile de testare
      1.4.2.1.   Solventul/vehiculul
      Solventul/vehiculul ar trebui să fie ales astfel încât să nu existe suspiciunea reacției chimice a acestuia cu substanța de testat și să nu afecteze negativ supraviețuirea celulelor și activitatea S9. Utilizarea altor solvenți/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere un solvent/vehicul în soluție/dispersie apoasă. La testarea substanțelor instabile în apă, solventul organic utilizat nu ar trebui să conțină apă. Apa se poate elimina prin adăugarea unei site moleculare.
      1.4.2.2.   Concentrațiile de expunere
      Printre criteriile ce trebuie să fie avute în vedere la determinarea dozei maxime sunt citotoxicitatea, solubilitatea în sistemul experimental și modificările de pH sau osmolalitate.
      Citotoxicitatea ar trebui să se determine cu și fără activare metabolică în experimentarea principală, utilizând un indicator corespunzător al integrității și dezvoltării celulare, ca gradul de confluență, numărul de celule viabile sau indexul mitotic. Ar putea fi utilă determinarea citotoxicității și solubilității într-un test preliminar.
      Ar trebui să se utilizeze cel puțin trei concentrații analizabile. Dacă o substanță este citototoxică, concentrațiile respective ar trebui să acopere un domeniu de toxicități de la maximă la mică sau lipsa toxicității; aceasta semnifică, de obicei, concentrații care ar trebui să fie separate printr-un factor cuprins între 2 și √10 maximum. În momentul recoltării, concentrația maximă ar trebui să determine o reducere importantă a gradului de confluență, a numărului de celule sau a indexului mitotic (pentru toate mai mare de 50 %). Indexul mitotic variază în timp după tratament și reprezintă doar o măsură indirectă a efectelor citotoxice/citostatice. Cu toate acestea, indexul mitotic este acceptabil pentru culturile în suspensie în care alte determinări de toxicitate pot să fie dificile și nepractice. Datele de cinetică a ciclului celular, cum ar fi timpul de generare medie (TGM), ar putea să reprezinte informații suplimentare. TGM este totuși o medie generală, care nu demonstrează întotdeauna existența unei subpopulații întârziate; chiar și creșterile ușoare ale timpului de generare medie pot să genereze o întârziere foarte substanțială a momentului în care numărul de aberații este optim.
      Pentru substanțele relativ necitotoxice, concentrația experimentală maximă trebuie să fie cea mai mică dintre următoarele: 5μl/ml, 5 mg/ml sau 0,01 M.
      Pentru substanțele relativ insolubile care nu sunt toxice la concentrații mai mici decât concentrația la care sunt insolubile, doza maximă utilizată ar trebui să fie o concentrație superioară limitei de solubilitate în mediul final de cultură la terminarea perioadei de tratament. În unele cazuri (de ex. atunci când toxicitatea se manifestă doar la o concentrație mai mare decât concentrația minimă de insolubilitate), se recomandă să se încerce mai multe concentrații până la apariția precipitării. Ar putea fi utilă evaluarea solubilității la începutul și la sfârșitul tratamentului, deoarece solubilitatea poate să varieze în timpul expunerii în sistemul experimental datorită prezenței celulelor, S9, serului etc. Insolubilitatea se poate constata cu ochiul liber. Ar trebui ca precipitarea să nu interfereze cu determinarea rezultatelor.
      1.4.2.3.   Martorii negativi și pozitivi
      La fiecare experiment, ar trebui să se includă simultan martorii pozitivi și negativi (solvent și vehicul), atât cu, cât și fără activare metabolică. În prezența unui sistem de activare metabolică, substanța utilizată ca martor pozitiv ar trebui să fie aceea care necesită activare pentru a da un răspuns mutagen.
      Ca martori pozitivi ar trebui să se utilizeze un elastogen cunoscut, la niveluri de expunere care se estimează că determină o creștere reproductibilă și detectabilă în raport cu zgomotul de fond, ceea ce demonstrează sensibilitatea sistemului de testare.
      Concentrațiile martorilor pozitivi ar trebui să fie selectate astfel încât să se obțină efecte clare, dar care să nu permită identificarea imediată a lamelelor codificate. În tabelul următor se prezintă exemple de substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi:
      
                  Starea activării metabolice
               
               
                  Substanța
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. IESCE
               
            
                  Absența activării metabolice exogene
               
               
                  metansulfonat de metil
               
               
                  66-27-3
               
               
                  200-625-0
               
            
                  metansulfonat de etil
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  etil nitrozouree
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  mitomicină C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  4-nitrochinolină-N-oxid
               
               
                  56-57-5
               
               
                  200-281-1
               
            
                  Prezența activării metabolice exogene
               
               
                  benzo[a] piren
               
               
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
            
                  ciclofosfamidă
               
               
                  50-18-0
               
               
                  200-015-4
               
            
                  ciclofosfamidă monohidrat
               
               
                  6055-19-2
               
               
                   
               
            Se pot utiliza și alte substanțe corespunzătoare ca martori pozitivi. Ar trebui să se aibă în vedere utilizarea ca martori pozitivi a unor substanțe din aceeași clasă de produse chimice, dacă sunt disponibile.
      Pentru fiecare moment de recoltare, ar trebui să se utilizeze ca martori negativi solvenți sau vehicule singure în mediul de tratare, care se tratează în aceleași condiții ca și culturile tratate. În plus, ar trebui să se utilizeze și martori netratați, cu excepția cazului în care există date din testele anterioare care să ateste că solventul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene.
      1.4.3.   Modul de lucru
      1.4.3.1.   Tratamentul cu substanța de testat
      Celulele în stadiu de proliferare se tratează cu substanța de testat în prezența sau absența unui sistem de activare metabolică. Tratamentul limfocitelor ar trebui să înceapă la aproximativ 48 de ore de la stimularea mitogenică.
      1.4.3.2.   Pentru fiecare concentrație ar trebui să se realizeze în mod normal teste pe culturi de celule în dublu exemplar, procedură recomandată cu fermitate pentru culturile cu martor negativ/solvent. Dacă datele testelor anterioare pot să dovedească existența unor diferențe minime între culturile duble (13) (14), se poate preconiza utilizarea unor culturi unice pentru fiecare concentrație testată.
      Substanțele în stare gazoasă sau cele volatile ar trebui să fie testate prin metode corespunzătoare, de exemplu în vase de cultură închise ermetic (15) (16).
      1.4.3.3.   Momentul recoltării culturilor
      În primul experiment, expunerea celulelor la substanța de încercat ar trebui să se realizeze atât în prezența, cât și în absența activării metabolice, timp de 3-6 ore, și să se procedeze la prelevarea probelor după un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal de la inițierea tratamentului (12). Dacă rezultatele testului sunt negative, atât în prezența, cât și în absența activării, ar trebui să se repete testul fără activare, cu tratament continuu până în momentul prelevării probelor care să fie egal cu aproximativ de 1,5 ori durata ciclului celular normal. S-ar putea ca unele produse chimice să fie detectate mai ușor, prin prelungirea timpului de tratament/prelevare a probelor la mai mult de 1,5 ori durata ciclului celular. Rezultatele negative obținute în prezența activării metabolice necesită o confirmare pentru fiecare caz. Pentru cazurile în care se consideră că nu este necesară confirmarea rezultatelor negative, trebuie să se prezinte o justificare.
      1.4.3.4.   Prepararea cromozomilor
      Culturile celulare se tratează cu Colcemid® sau colchicină, de obicei timp de 1-3 ore înainte de recoltare. Fiecare cultură celulară se recoltează și se prelucrează separat pentru prepararea cromozomilor. Prepararea cromozomilor include tratamentul hipotonic al celulelor, precum și fixarea și colorarea acestora.
      1.4.3.5.   Analiza
      Toate lamelele, inclusiv cele cu martorii pozitivi și negativi, ar trebui să fie codificate independent înaintea analizei microscopice. Deoarece procedurile de fixare generează adesea scindarea unei proporții de celule în metafază cu pierdere de cromozomi, toate celulele înregistrate ar trebui, prin urmare, să conțină un număr de centromeri egal cu numărul modal ± 2 pentru toate tipurile de celule. Pentru fiecare concentrație și fiecare martor ar trebui să se înregistreze cel puțin 200 de celule în metafază bine etalate, repartizate în mod egal între culturile în dublu exemplar, dacă este cazul. Atunci când se constată un număr mare de aberații, numărul menționat se poate reduce.
      Deși scopul testului este detectarea aberațiilor cromozomial-structurale ale cromozomilor, este important să se semnaleze cazurile de poliploidie și endoreduplicare, dacă se constată apariția acestora.
      2.   DATELE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Unitatea experimentală este celula și, prin urmare, ar trebui să se evalueze procentul de celule care prezintă o aberație cromozomială sau mai multe aberații cromozomiale. Se întocmește o listă cu diferitele tipuri de aberații cromozomiale și se specifică numărul și frecvența acestora pentru culturile experimentale și cele martor. Lacunele se înregistrează și se prezintă separat, dar în general nu se includ în frecvența totală a aberațiilor.
      De asemenea, se înregistrează rezultatele determinărilor concomitente de citotoxicitate realizate pentru toate culturile tratate și pentru cele martor negativ în principalele teste de aberații.
      Ar trebui să se prezinte date pentru fiecare cultură. În plus, toate datele ar trebui să fie prezentate centralizat sub formă de tabel.
      Nu este necesară verificarea unui răspuns pozitiv net. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin realizarea de teste suplimentare în care este preferabil să se modifice condițiile experimentale. Necesitatea confirmării rezultatelor negative s-a discutat la punctul 1.4.3.3. În cazul experimentelor suplimentare, ar trebui să se aibă în vedere modificările parametrilor cercetați pentru a extinde gama condițiilor evaluate. Parametrii studiați, susceptibili de modificare, includ intervalele dintre concentrații și condițiile de activare metabolică.
      2.2.   EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o creștere în funcție de concentrație sau o creștere reproductibilă a numărului de celule cu aberații cromozomiale. În primul rând, ar trebui să se aibă în vedere relevanța biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se pot utiliza metode statistice (3) (13). Semnificația statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv.
      O creștere a numărului de celule poliploide poate să indice faptul că substanța de testat este capabilă să inhibe procesele mitotice și să producă aberații ale numărului de cromozomi. O creștere a numărului de celule cu cromozomi endoreduplicați poate să indice faptul că substanța de testat poate inhiba avansarea ciclului celular (17) (18).
      Dacă rezultatele obținute pentru o substanță de testat nu îndeplinesc criteriile menționate anterior, se consideră că substanța respectivă nu este mutagenă în sistemul respectiv.
      Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în rare cazuri datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de repetări ale testului.
      Rezultatele pozitive ale unui test in vitro de aberație cromozomială indică faptul că substanța de testat provoacă aberații cromozomiale ale structurii în celulele somatice de mamifere, în cultură. Rezultatele negative indică faptul că, în condițiile experimentale, substanța de testat nu provoacă aberații cromozomiale în celulele somatice de mamifere, în cultură.
      3.   RAPORTAREA
      RAPORTUL TESTULUI
      Raportul testului trebuie să conțină următoarele informații:
      
                   
               
               
                  Solventul/vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaște.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Celulele:
                  
                              —
                           
                           
                              tipul și sursa celulelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              caracteristicile cariotipului și motivul alegerii celulelor utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              absența micoplasmei, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              date privind durata ciclului celular;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sexul donatorilor de sânge, sângele complet sau limfocite izolate, mitogenul utilizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de reînsămânțări, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de întreținere a culturilor celulare, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul modal de cromozomi.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condițiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              identitatea substanței de inhibare a metafazei, concentrațiile acesteia și timpul de expunere a celulelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii concentrațiilor și numărului de culturi, inclusiv datele de citotoxicitate și limitele de solubilitate, dacă sunt disponibile;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              compoziția mediului, concentrația de CO2, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              concentrația substanței de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              volumul vehiculului și al substanței de testat adăugate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatura de incubare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              timpul de incubare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              durata tratamentului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              densitatea celulară la însămânțare, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tipul și compoziția sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              martorii pozitivi și negativi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de preparare a lamelelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile pentru numărătoarea aberațiilor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de metafaze analizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de măsurare a toxicității;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate, de exemplu, gradul de confluență, datele privind ciclul celular, numărătoarea celulelor, indexul mitotic;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              semnele de precipitare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind valoarea pH-ului și osmolalitatea mediului de tratare, dacă s-au determinat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              definirea aberațiilor, inclusiv a lacunelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule cu aberații cromozomiale și tipul aberațiilor cromozomiale, prezentate separat pentru fiecare cultură tratată și cultură martor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              variațiile ploidiei, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relația doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analizele statistice, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) și pozitivi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele anterioare privind martorii negativi (solvent/vehicul) și pozitivi, cu domeniile, valorile medii și deviațiile standard.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluziile.
               
            4.   BIBLIOGRAFIE
      
                  (1)
               
               
                  Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29.
               
            
                  (2)
               
               
                  Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (1985), The In Vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432.
               
            
                  (3)
               
               
                  Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1-175.
               
            
                  (4)
               
               
                  Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204.
               
            
                  (5)
               
               
                  Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, pp. 297-305.
               
            
                  (6)
               
               
                  Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364.
               
            
                  (7)
               
               
                  Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215.
               
            
                  (8)
               
               
                  Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83-90.
               
            
                  (9)
               
               
                  Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro, Mutation Res., 66, pp. 277-290.
               
            
                  (10)
               
               
                  Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.
               
            
                  (11)
               
               
                  Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
               
            
                  (12)
               
               
                  Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994), Report from Working Group on in In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241-261.
               
            
                  (13)
               
               
                  Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (cd) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
               
            
                  (14)
               
               
                  Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139-149.
               
            
                  (15)
               
               
                  Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103.
               
            
                  (16)
               
               
                  Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.
               
            
                  (17)
               
               
                  Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413.
               
            
                  (18)
               
               
                  Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.”
               
            
   ANEXA 4B
   
      „B.11.   MUTAGENITATEA – TESTUL IN VIVO DE ABERAȚIE CROMOZOMIALĂ PE MĂDUVĂ OSOASĂ DE MAMIFERE
      1.   METODA
      Prezenta metodă este reprodusă după orientarea OCDE TG 475, Testul in vivo de aberație cromozomială pe măduvă osoasă de mamifere (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Testul in vivo de aberație cromozomială pe măduva osoasă de mamifere se utilizează la detectarea aberațiilor cromozomiale provocate de substanța de testat în structura celulelor din măduva osoasă a mamiferelor, de obicei, rozătoare (1) (2) (3) (4). Aberațiile structurale pot să fie de două tipuri, cromozomiale sau cromatidice. O poliploidie crescută poate să indice că un produs chimic poate să provoace aberații ale numărului de cromozomi. La majoritatea mutagenilor chimici, aberațiile induse sunt de tip cromatidic, dar se produc și aberații de tip cromozomial. Mutațiile cromozomiale și fenomenele conexe sunt cauza multor maladii genetice umane și există dovezi suficiente ale implicării mutațiilor cromozomiale și a fenomenelor conexe, care provoacă modificări ale oncogenelor și ale genelor supresoare de tumori din celulele somatice, în inducerea cancerului la oameni și în sistemele experimentale.
      În prezentul test se utilizează, de obicei, rozătoare. Țesutul-țintă în prezentul test este măduva osoasă, deoarece este un țesut puternic vascularizat și conține o populație de celule cu ciclu rapid care se pot izola și prelucra ușor. Alte specii și țesuturi-țintă nu fac obiectul prezentei metode.
      Prezentul test de aberație cromozomială este relevant în special la evaluarea riscului mutagen, deoarece permite să se țină seama de factorii de metabolism in vivo, de farmacocinetică și de procesele de reparare a ADN-ului, deși aceștia pot să varieze între specii și între țesuturi. Un test in vivo este, de asemenea, util pentru studierea suplimentară a unui efect mutagen detectat printr-un test in vitro.
      Dacă există dovezi că substanța de testat sau un metabolit reactiv nu atinge țesutul-țintă, utilizarea prezentului test nu este potrivită.
      A se vedea și introducerea generală din partea B.
      1.2.   DEFINIȚII
      Aberație de tip cromatidic: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea cromatidelor singure sau prin divizarea și reuniunea între cromatide.
      Aberație de tip cromozomial: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea sau divizarea și reuniunea ambelor cromatide în același loc.
      Endoreduplicare: proces în care, după o perioadă S de replicare a ADN, nucleul nu intră în mitoză, ci începe o altă perioadă S. Rezultă cromozomi cu 4, 8, 16, … cromatide.
      Lacună: leziune acromatică mai mică decât lățimea unei cromatide și cu o eroare minimă de aliniere a cromatidei(cromatidelor).
      Aberație numerică: modificare a numărului de cromozomi față de numărul normal caracteristic pentru celulele utilizate.
      Poliploidie: multiplicare a numărului (n) de cromozomi haploizi, alta decât diploidia (adică 3n, 4n etc.).
      Aberație structurală: modificare a structurii cromozomilor, detectabilă la examinarea microscopică a celulelor în stadiul de metafază al diviziunii acestora, care se prezintă sub formă de deleții și fragmente, modificări intracromozomiale și intercromozomiale.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Animalele se expun la substanța de testat printr-o cale de expunere corespunzătoare și se sacrifică în momente corespunzătoare după tratament. Înainte de sacrificare, animalele se supun tratamentului cu un agent de inhibare a metafazei (de exemplu, colchicină sau Colcemid®). Apoi, din celulele de măduvă osoasă se realizează preparate cromozomiale care se colorează și celulele în metafază se examinează pentru a se pune în evidență aberațiile cromozomiale.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Preparatele
      1.4.1.1.   Selectarea speciilor de animale
      Se utilizează, de obicei, șobolani, șoareci și hamsteri chinezești, deși se poate utiliza orice specie de mamifere potrivită. Se recomandă utilizarea unor animale adulte tinere sănătoase din sușe folosite în mod curent în laborator. La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui să prezinte variații minime, care să nu depășească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex.
      1.4.1.2.   Condițiile de adăpost și de hrană
      Se aplică condițiile generale menționate în introducerea generală din partea B, dar umiditatea atinsă ar trebui să fie de 50-60 %.
      1.4.1.3.   Pregătirea animalelor
      Animalele adulte tinere sănătoase se distribuie în mod aleatoriu în grupe martor și grupe de tratament. Cuștile ar trebui să se aranjeze astfel încât posibilele efecte datorate amplasării acestora să fie reduse la minimum. Animalele sunt identificate individual. Se procedează la aclimatizarea animalelor la condițiile de laborator timp de minimum cinci zile.
      1.4.1.4.   Prepararea dozelor
      Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se prepare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare și să se dilueze, dacă este cazul, înainte de a fi administrate animalelor. Substanțele de testat lichide se pot administra direct sau dilua înainte de administrare. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanță de testat, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.
      1.4.2.   Condițiile de testare
      1.4.2.1.   Solventul/vehiculul
      Solventul/vehiculul nu ar trebui să producă efecte toxice la dozele utilizate și nu ar trebui să existe suspiciunea reacției chimice a acestuia cu substanța de testat. Utilizarea altor solvenți/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos.
      1.4.2.2.   Martorii
      Pentru fiecare sex și pentru fiecare test ar trebui să se prevadă martori pozitivi și negativi (solvenți/vehicule), utilizați în paralel. Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, manipularea animalelor din grupele martor ar trebui să fie identică cu cea a animalelor din grupele tratate.
      Martorii pozitivi ar trebui să producă aberații cromozomiale de structură in vivo la nivelurile de expunere preconizate a genera o creștere detectabilă în raport cu fondul. Dozele de martor pozitiv ar trebui să fie alese astfel încât să se obțină efecte clare, dar fără a revela imediat examinatorului identitatea lamelelor codificate. Pentru martorul pozitiv, se poate accepta administrarea pe o cale diferită față de cea utilizată în cazul substanței de testat și doar o singură prelevare a probelor. Se poate avea în vedere utilizarea unor martori pozitivi din aceeași clasă de substanțe chimice, dacă sunt disponibili. În tabelul următor se prezintă exemple de substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi:
      
                  Substanța
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. IESCE
               
            
                  metansulfonat de etil
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  etil nitrozouree
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  mitomicină C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  ciclofosfamidă
               
               
                  50-18-0
               
               
                  200-015-4
               
            
                  ciclofosfamidă monohidrat
               
               
                  6055-19-2
               
               
                   
               
            
                  trietilenmelamină
               
               
                  51-18-3
               
               
                  200-083-5
               
            Martorii negativi, tratați doar cu solvent sau cu vehicule și manipulați în același fel ca și grupele tratate, ar trebui să fie incluși la fiecare prelevare de probe, cu excepția cazului în care se dispune de date acceptabile privind variabilitatea interanimale și frecvențele celulelor cu aberații cromozomiale, provenite de la martori anteriori. Dacă, pentru martorii negativi, se face o singură prelevare de probe, momentul cel mai potrivit pentru prelevarea probelor este momentul primei prelevări. În plus, ar trebui să se utilizeze și martori netratați, cu excepția cazului în care există date de la martori anteriori sau date publicate, care să ateste că solventul/vehiculul selectat nu induce efecte vătămătoare sau mutagene.
      1.5.   MODUL DE LUCRU
      1.5.1.   Numărul și sexul animalelor
      Fiecare grupă tratată și martor include minimum cinci animale analizabile din fiecare sex. Dacă în momentul studiului există date disponibile din studii pe aceleași specii, în care s-a folosit aceeași cale de expunere, care să demonstreze lipsa unor diferențe substanțiale de toxicitate între sexe, atunci va fi suficientă testarea pe animale de un singur sex. Dacă expunerea umană la produse chimice este specifică sexului, ca în cazul unor produse farmaceutice, testul ar trebui să se realizeze pe animale de sexul corespunzător.
      1.5.2.   Modalitatea de tratare
      Substanțele de testat se administrează de preferință o singură dată. Substanțele de testat se mai pot administra în doze fracționate, adică două tratamente în aceeași zi la distanță de doar câteva ore, pentru a facilita administrarea unui volum mare de material. Alte modalități de tratare ar trebui să fie justificate în mod științific.
      Prelevarea probelor după tratament ar trebui să se realizeze în două momente diferite din aceeași zi. Pentru rozătoare, primul interval de timp este egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal (acesta din urmă fiind în mod normal de 12-18 ore) după tratament. Deoarece timpul necesar pentru absorbția și metabolismul substanței de testat, precum și acțiunea acesteia asupra cineticii ciclului celular pot să aibă efecte asupra timpului optim pentru detectarea aberației cromozomiale, se recomandă să se procedeze la o altă prelevare de probe la 24 de ore după prima prelevare. Dacă administrarea dozelor durează mai mult de o zi, ar trebui să se procedeze la o prelevare de probe la un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular normal după tratamentul final.
      Înainte de sacrificare, se procedează la injectarea intraperitoneală a animalelor cu o doză corespunzătoare de agent de inhibare a metafazei (de ex. Colcemid® sau colchicină). Probele de la animale se prelevează apoi la un interval corespunzător. Pentru șoareci intervalul respectiv este de aproximativ 3-5 ore; pentru hamsterii chinezești intervalul este de 4-5 ore. Celulele se recoltează din măduva osoasă și se examinează pentru detectarea aberațiilor cromozomiale.
      1.5.3.   Dozele
      Dacă, în lipsa datelor corespunzătoare, se realizează un studiu pentru stabilirea dozelor, acesta ar trebui să se realizeze în același laborator și să utilizeze aceeași specie, aceeași sușă de animale de același sex, iar regimul de tratare să fie același ca cel ce urmează să fie utilizat în studiul principal (5). În caz de toxicitate, se utilizează trei doze diferite pentru prima prelevare. Aceste trei doze ar trebui să acopere un domeniu de toxicități, de la toxicitatea maximă până la toxicitatea minimă sau lipsă. Pentru prelevările ulterioare se utilizează doar doza maximă. Doza maximă se definește ca doza ce produce astfel de semne de toxicitate, încât dozele mai mari, administrate în același mod, se estimează că sunt letale. Substanțele cu activitate biologică specifică la doze mici netoxice (cum ar fi hormonii și mitogenii) pot face excepție de la criteriile de stabilire a dozelor și să fie stabilite pentru fiecare caz în parte. Doza maximă se mai poate defini ca doza care produce anumite semne de toxicitate în măduva osoasă (de ex. o reducere cu mai mult de 50 % a indexului mitotic).
      1.5.4.   Test limită
      Dacă un test realizat cu o doză de minimum 2 000 mg/kg greutate corp, administrată într-o singură repriză sau în două reprize în aceeași zi, nu produce efecte toxice detectabile și dacă o genotoxicitate este improbabilă pe baza datelor referitoare la substanțe cu o structură apropiată, se poate considera că un studiu complet cu utilizarea a trei doze de mărimi diferite nu este necesar. Pentru studiile pe termen lung, doza limită este de 2 000 mg/kg greutate corp/zi pentru un tratament de până la 14 zile și de 1 000 mg/kg greutate corp/zi pentru un tratament mai lung de 14 zile. În funcție de expunerea umană preconizată, ar putea fi necesară o doză mai mare în testul limită.
      1.5.5.   Administrarea dozelor
      Substanța de testat se administrează, de obicei, prin cavitatea nazală cu ajutorul unui tub stomacal sau al unei canule de intubație adaptate sau printr-o injecție intraperitoneală. Se pot accepta și alte căi de administrare, dacă se pot justifica. Volumul maxim de lichid care se poate administra prin sondă gastrică introdusă prin cavitatea nazală sau prin injecție într-o singură repriză depinde de dimensiunea animalului de laborator. Volumul ar trebui să fie mai mic sau egal cu 2 ml/100g greutate corp. Utilizarea unor volume mai mari decât cel menționat ar trebui să se justifice. Cu excepția substanțelor iritante și corozive, care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentrații mai mari, variația volumului administrat ar trebui să fie redusă la minimum prin ajustarea concentrației, astfel încât să se asigure un volum constant pentru toate dozele.
      1.5.6.   Prepararea cromozomilor
      Măduva osoasă se extrage imediat după sacrificare, se expune la o soluție hipotonică și se fixează. Apoi, celulele se întind pe lamele și se colorează.
      1.5.7.   Analiza
      Se procedează la determinarea indexului mitotic, care este o măsură a citotoxicității, pe cel puțin 1 000 de celule pentru fiecare animal tratat (inclusiv martorii pozitivi) și pentru fiecare animal martor negativ netratat.
      Pentru fiecare animal se analizează minimum 100 de celule. Dacă se observă un număr mai mare de aberații, numărul specificat se poate reduce. Toate lamelele, inclusiv cele cu celule de la martorii pozitivi și negativi, ar trebui să fie codificate independent, înainte de examinarea la microscop. Deoarece metodele de preparare a lamelelor conduc adesea la scindarea unei fracții de celule în metafază cu pierdere de cromozomi, toate celulele examinate ar trebui, prin urmare, să conțină un număr de centromeri egal cu 2n ± 2.
      2.   DATELE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Se recomandă prezentarea sub formă de tabel a datelor pentru fiecare animal. Unitatea experimentală este animalul. Pentru fiecare animal, ar trebui să se evalueze numărul de aberații per celulă și procentul de celule cu aberație sau aberații cromozomiale de structură. Diferitele tipuri de aberații cromozomiale de structură ar trebui să fie consemnate împreună cu numărul și frecvența acestora pentru grupele tratate și cele martor. Lacunele se consemnează și se raportează separat, dar în general acestea nu se includ în frecvența totală a aberațiilor. Dacă nu există dovezi privind diferența de răspunsuri între sexe, datele de la ambele sexe se pot combina pentru analiza statistică.
      2.2.   EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o creștere în funcție de doză a numărului relativ de celule cu aberații cromozomiale sau o creștere clară a numărului de celule cu aberații dintr-o grupă cu o doză unică la un singur moment de prelevare. În primul rând, ar trebui să se aibă în vedere relevanța biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge și la ajutorul unor metode statistice (6). Semnificația statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferință printr-o modificare a condițiilor experimentale.
      O creștere a numărului de celule poliploide poate să indice faptul că substanța de testat poate produce aberații ale numărului de cromozomi. O creștere a numărului de celule cu cromozomi endoreduplicați poate să indice faptul că substanța de testat poate să inhibe avansarea ciclului celular (7) (8).
      Dacă rezultatele pentru o substanță de testat nu îndeplinesc criteriile menționate anterior, substanța respectivă se consideră a fi nemutagenă în prezentul test.
      Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare, datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de experimente efectuate.
      Rezultatele pozitive ale unui test de aberație cromozomială in vivo indică faptul că o substanță provoacă aberații cromozomiale în măduva osoasă a speciei testate. Rezultatele negative indică faptul că, în condițiile experimentale, substanța de testat nu provoacă aberații cromozomiale în măduva osoasă a speciei testate.
      Ar trebui discutată probabilitatea ca substanța de testat sau metaboliții acesteia să ajungă în circulația generală sau în mod specific în țesutul-țintă (de ex. toxicitatea sistemică).
      3.   RAPORTAREA
      RAPORTUL TESTULUI
      Raportul testului trebuie să conțină următoarele informații:
      
                   
               
               
                  Solventul/vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaște.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animalele de laborator:
                  
                              —
                           
                           
                              specia/sușa utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul, vârsta și sexul animalelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursa, condițiile de adăpost și hrană etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul de greutate, greutatea medie și deviația standard pentru fiecare grupă.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condițiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              martorii pozitivi și negativi (solvent/vehicul);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dacă s-a realizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii dozelor utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea substanței de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind administrarea substanței de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea căii de administrare selectate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de verificare pentru a constata dacă substanța de testat a ajuns în circulația generală sau în țesutul-țintă, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conversia concentrației substanței de testat (ppm) în hrană/apa de băut în doza reală (mg/kg greutate corp/zi), dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei și a apei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea amănunțită a modalităților de tratare și de prelevare a probelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de măsurare a toxicității;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identitatea substanței de inhibare a metafazei, concentrația acesteia și durata tratamentului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de preparare a lamelelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile pentru numărătoarea aberațiilor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule analizate per animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              indexul mitotic;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tipul și numărul aberațiilor, consemnate separat pentru fiecare animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul total de aberații pentru fiecare grupă împreună cu numărul mediu și deviațiile standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule cu aberații pentru fiecare grupă împreună cu numărul mediu al acestora și deviațiile standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              variațiile ploidiei, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relația doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analizele statistice, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi studiați în paralel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele anterioare privind martorii negativi, cu domeniile, valorile medii și deviațiile standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii pozitivi studiați în paralel.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluziile.
               
            4.   BIBLIOGRAFIA
      
                  (1)
               
               
                  Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D. C., pp. 275-306.
               
            
                  (2)
               
               
                  Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In Vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157-165.
               
            
                  (3)
               
               
                  Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
               
            
                  (4)
               
               
                  Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in Vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312.
               
            
                  (5)
               
               
                  Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
               
            
                  (6)
               
               
                  Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.
               
            
                  (7)
               
               
                  Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413.
               
            
                  (8)
               
               
                  Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.”
               
            
   ANEXA 4C
   
      „B.12.   MUTAGENITATEA - TESTUL IN VIVO DE MICRONUCLEU PE ERITROCITE DE MAMIFERE
      1.   METODA
      Prezenta metodă este reprodusă după orientarea OCDE TG 474, Testul in vivo de micronucleu pe eritrocite de mamifere (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Testul in vivo de micronucleu pe celule de mamifere se utilizează pentru detectarea leziunilor cromozomilor sau ale aparatului mitotic al eritroblaștilor produse de substanța de testat; detectarea se realizează prin analiza eritrocitelor prelevate din măduva osoasă și din celulele sângelui periferic ale animalelor, de obicei rozătoare.
      Scopul testului de micronucleu este identificarea substanțelor care produc leziuni citogenetice ce determină formarea de micronuclee conținând fragmente de cromozomi sau cromozomi întregi întârziați.
      Când un eritroblast din măduva osoasă evoluează într-un eritrocit policromatic, nucleul principal este expulzat; orice micronucleu care se formează poate să rămână în citoplasma anucleată. Micronucleele se vizualizează mai ușor în aceste celule cărora le lipsește nucleul principal. O creștere a frecvenței eritrocitelor policromatice micronucleate la animalele tratate indică producerea unei leziuni cromozomiale.
      În prezentul test se utilizează în mod curent măduva osoasă a rozătoarelor deoarece eritrocitele policromatice se produc în acest țesut. Numărătoarea eritrocitelor (policromatice) imature micronucleate în sângele periferic este la fel de acceptabilă la toate speciile la care s-a demonstrat incapacitatea splinei de a elimina eritrocitele micronucleate sau care prezintă o sensibilitate specifică pentru detectarea agenților care produc aberații cromozomiale de natură structurală sau numerică. Există numeroase criterii care permit identificarea micronucleelor. Unul dintre acestea este identificarea prezenței sau absenței unui kinetocor sau a ADN centromeric în micronucleu. Frecvența eritrocitelor (policromatice) imature micronucleate este principalul criteriu. De asemenea, numărul de eritrocite (normocromatice) mature în sângele periferic care conține micronuclee printre un număr dat de eritrocite mature se poate utiliza ca un criteriu în cazul tratării animalelor timp de patru săptămâni sau mai mult.
      Prezentul test in vivo de micronucleu pe eritrocite de mamifere este relevant în special la evaluarea riscului mutagen, deoarece permite să se țină seama de factorii de metabolism in vivo, de farmacocinetică și de procesele de regenerare a ADN-ului, deși aceștia pot să varieze între specii, între țesuturi și între efectele genetice. Un test in vivo este, de asemenea, util pentru studierea suplimentară a unui efect mutagen detectat într-un sistem in vitro.
      Dacă există dovezi că substanța de testat sau un metabolit reactiv nu atinge țesutul-țintă, utilizarea prezentului test nu este potrivită.
      A se vedea și introducerea generală din partea B.
      1.2.   DEFINIȚII
      Centromer (kinetocor): porțiune sau porțiuni dintr-un cromozom care în timpul diviziunii celulare sunt legate cu fibrele fusului mitotic, ceea ce permite deplasarea ordonată a cromozomilor fiice către polii celulelor fiice.
      Micronuclee: nuclee mici, separate de nucleele principale ale celulelor și prezente în plus față de acestea, produse în timpul telofazei mitozei (meioză) de către fragmentele de cromozomi sau de cromozomii întregi întârziați.
      Eritrocit normocromatic: eritrocit matur lipsit de ribozomi și care se poate distinge de eritrocitele policromatice imature cu ajutorul unor substanțe care colorează selectiv ribozomii.
      Eritrocit policromatic: eritrocit imatur, aflat într-un stadiu intermediar de dezvoltare, care mai conține ribozomi și, prin urmare, se poate distinge de eritrocitele normocromatice mature cu ajutorul substanțelor care colorează selectiv ribozomii.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Animalele sunt expuse la substanța de testat printr-o cale de expunere corespunzătoare. Dacă se utilizează măduva osoasă, animalele se sacrifică la momente potrivite după tratament, se extrage măduva osoasă, se prepară și se colorează lamelele (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Dacă se utilizează sângele periferic, acesta se colectează la momente potrivite după tratament, se depune pe lamele și se colorează (4) (8) (9) (10). Pentru studiile cu sânge periferic, celulele ar trebui să se recolteze cât se poate de repede după ultima expunere. Lamelele preparate se examinează pentru a depista prezența micronucleelor.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Preparatele
      1.4.1.1.   Selectarea speciilor de animale
      Dacă se utilizează măduvă osoasă, se recomandă șoareci și șobolani, deși se poate utiliza orice specie adecvată de mamifere. Când se utilizează sânge periferic, se recomandă șoareci. Cu toate acestea, se poate utiliza orice specie adecvată de mamifere, cu condiția să fie o specie la care s-a demonstrat incapacitatea splinei de a elimina eritrocitele micronucleate sau care prezintă o sensibilitate specifică pentru detectarea agenților care produc aberații cromozomiale de natură structurală sau numerică. Se recomandă utilizarea unor animale adulte tinere din sușe utilizate în mod curent în laborator. La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui să prezinte o variație minimă, ce nu trebuie să depășească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex.
      1.4.1.2.   Condițiile de adăpost și de hrană
      Se aplică condițiile generale menționate în introducerea generală din partea B, dar umiditatea atinsă ar trebui să fie de 50-60 %.
      1.4.1.3.   Pregătirea animalelor
      Animalele adulte tinere sănătoase se distribuie în mod aleatoriu în grupe martor și grupe de tratament. Animalele sunt identificate individual. Se procedează la aclimatizarea animalelor la condițiile de laborator timp de minimum cinci zile. Cuștile ar trebui să se aranjeze astfel încât posibilele efecte datorate amplasării acestora să fie reduse la minimum.
      1.4.1.4.   Prepararea dozelor
      Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se prepare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare și să se dilueze, dacă este cazul, înainte de a fi administrate animalelor. Substanțele de testat lichide se pot administra direct sau dilua înainte de administrare. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanță de testat, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.
      1.4.2.   Condițiile de testare
      1.4.2.1.   Solventul/vehiculul
      Solventul/vehiculul nu ar trebui să producă efecte toxice la dozele utilizate și nu ar trebui să existe suspiciunea reacției chimice a acestuia cu substanța de testat. Utilizarea altor solvenți/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos.
      1.4.2.2.   Martorii
      Pentru fiecare sex și pentru fiecare test ar trebui să se prevadă martori pozitivi și negativi (solvent/vehicul), utilizați în paralel. Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, manipularea animalelor din grupele martor ar trebui să fie identică cu cea a animalelor din grupele tratate.
      Martorii pozitivi ar trebui să producă micronuclee in vivo la nivelurile de expunere preconizate a genera o creștere detectabilă în raport cu fondul. Dozele de martor pozitiv ar trebui să fie alese astfel încât să se obțină efecte clare, dar fără să releve imediat examinatorului identitatea lamelelor codificate. Pentru martorul pozitiv, se poate accepta administrarea pe o cale diferită de cea prin care se administrează substanța de testat cu o singură prelevare a probelor. În plus, se poate avea în vedere utilizarea unor martori pozitivi din aceeași clasă de produse chimice, dacă sunt disponibili. În tabelul următor se prezintă exemple de substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi:
      
                  Substanța
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. IESCE
               
            
                  metansulfonat de etil
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  N-etil-N-nitrozouree
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  mitomicină C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  ciclofosfamidă
               
               
                  50-18-0
               
               
                  200-015-4
               
            
                  ciclofosfamidă monohidrat
               
               
                  6055-19-2
               
               
                   
               
            
                  trietilenmelamină
               
               
                  51-18-3
               
               
                  200-083-5
               
            Martorii negativi, tratați doar cu solvent sau cu vehicul și manipulați în același fel ca grupele tratate, ar trebui să fie incluși la fiecare prelevare de probe, cu excepția cazului în care se dispune de date acceptabile privind variabilitatea interanimale și frecvența incidenței celulelor cu micronuclee, provenite de la martori anteriori. Dacă, pentru martorii negativi, se face o singură prelevare de probe, momentul cel mai potrivit pentru prelevarea probelor este momentul primei prelevări. În plus, ar trebui să se utilizeze și martori netratați, cu excepția cazului în care există date de la martori anteriori sau publicate, care să ateste că solventul/vehiculul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene.
      Dacă se utilizează sânge periferic, se poate accepta o probă prelevată înainte de tratament în calitate de martor negativ, dar doar în studiile de scurtă durată pe sânge periferic (de ex. 1-3 tratamente), când datele rezultate se situează între limitele estimate pe baza datelor anterioare privind martorul.
      1.5.   MODUL DE LUCRU
      1.5.1.   Numărul și sexul animalelor
      Fiecare grupă tratată și martor include minimum cinci animale analizabile din fiecare sex (11). Dacă în momentul studiului există date disponibile din studii pe aceleași specii, în care s-a folosit aceeași cale de expunere, care să demonstreze lipsa unor diferențe substanțiale de toxicitate între sexe, atunci va fi suficientă testarea pe animale de un singur sex. Dacă expunerea umană la produse chimice este specifică sexului, ca în cazul unor produse farmaceutice, testul ar trebui să se realizeze pe animale de sexul corespunzător.
      1.5.2.   Modalitatea de tratare
      Nu se poate recomanda un program de tratament standard (adică unul, două sau mai multe tratamente la intervale de 24 de ore). Probele provenite de la un studiu cu administrare prelungită a dozelor sunt acceptabile, atâta timp cât pentru studiul respectiv s-a demonstrat un efect pozitiv sau, pentru un studiu negativ, atâta timp cât s-a demonstrat toxicitatea sau s-a utilizat doza limită și administrarea dozei a continuat până în momentul prelevării probelor. Pentru a facilita administrarea unui volum mare de material, substanțele de testat se pot administra și în doză fracționată, adică două tratamente în aceeași zi, la un interval de câteva ore.
      Testul se poate realiza în două moduri:
      
                  (a)
               
               
                  Substanța de testat se administrează animalelor într-o singură repriză. Probele de măduvă osoasă se prelevează de cel puțin două ori, prelevarea începând cel mai devreme la 24 de ore după tratament, fără să se prelungească mai mult de 48 de ore după tratament, cu intervale corespunzătoare între probe. Dacă prelevarea probelor se realizează mai devreme de 24 de ore după tratament, ar trebui să se justifice acest lucru. Probele de sânge periferic se prelevează cel puțin de două ori, dar nu mai devreme de 36 de ore după tratament, cu intervale corespunzătoare după prima probă și nu trebuie să depășească 72 de ore. Dacă la un moment de prelevare se înregistrează un rezultat pozitiv, prelevarea probelor încetează;
               
            
                  (b)
               
               
                  Dacă se practică două sau mai multe tratamente zilnice (de ex. două sau mai multe tratamente la intervale de 24 de ore), ar trebui ca prelevarea probelor să se realizeze o dată la un interval de timp cuprins între 18 și 24 de ore după tratamentul final pentru măduva osoasă și o dată într-un interval de timp cuprins între 36 și 48 de ore după tratamentul final pentru sângele periferic (12).
               
            Dacă este relevant, se pot utiliza și alte momente de prelevare a probelor.
      1.5.3.   Dozele
      Dacă, în lipsa datelor corespunzătoare, se realizează un studiu pentru stabilirea dozelor, acesta ar trebui să se realizeze în același laborator și să utilizeze aceeași specie, aceeași sușă de animale de același sex și regimul de tratare să fie același ca cel ce urmează să fie utilizat în studiul principal (13). În caz de toxicitate, se utilizează trei doze diferite pentru prima prelevare. Aceste trei doze ar trebui să acopere un domeniu de toxicități de la toxicitate maximă până la toxicitate minimă sau netoxicitate. Pentru prelevările ulterioare se utilizează doar doza maximă. Doza maximă se definește ca doza ce produce astfel de semne de toxicitate, încât dozele mai mari, administrate în același mod, se estimează că sunt letale. Substanțele cu activitate biologică specifică la doze mici netoxice (cum ar fi hormonii și mitogenii) pot face excepție de la criteriile de stabilire a dozelor și să fie stabilite pentru fiecare caz în parte. Doza maximă se mai poate defini ca doza care produce anumite semne de toxicitate în măduva osoasă (de ex. o reducere a proporției de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite din măduva osoasă sau din sângele periferic).
      1.5.4.   Test limită
      Dacă un test realizat cu o doză de minimum 2 000 mg/kg greutate corp, administrată într-o singură repriză sau în două reprize în aceeași zi, nu produce efecte toxice detectabile și dacă o genotoxicitate este improbabilă pe baza datelor referitoare la substanțe cu o structură apropiată, se poate considera că un studiu complet cu utilizarea a trei doze de mărimi diferite nu este necesar. Pentru studiile pe termen lung, doza limită este de 2 000 mg/kg greutate corp/zi pentru un tratament de până la 14 zile și de 1 000 mg/kg greutate corp/zi pentru un tratament mai lung de 14 zile. În funcție de expunerea umană preconizată, s-ar putea să fie necesară o doză mai mare în testul limită.
      1.5.5.   Administrarea dozelor
      Substanța de testat se administrează, de obicei, prin cavitatea nazală cu ajutorul unui tub stomacal sau al unei canule de intubație adaptate sau printr-o injecție intraperitoneală. Se pot accepta și alte căi de administrare, dacă se pot justifica. Volumul maxim de lichid care se poate administra prin sondă gastrică introdusă prin cavitatea nazală sau prin injecție într-o singură repriză depinde de dimensiunea animalului de laborator. Volumul ar trebui să fie mai mic sau egal cu 2 ml/100 g greutate corp. Utilizarea unor volume mai mari decât cel menționat ar trebui să se justifice. Cu excepția substanțelor iritante și corozive care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentrații mai mari, variația volumului testat ar trebui să fie redusă la minimum prin ajustarea concentrației, astfel încât să se asigure un volum constant pentru toate dozele.
      1.5.6.   Prepararea măduvei osoase/a sângelui
      Celulele de măduvă osoasă se extrag în mod curent din femur sau tibie imediat după sacrificare. De obicei, celulele se extrag din femur sau tibie, se depun pe lamele și se colorează prin metodele stabilite. Sângele periferic se obține din vena caudală sau alte vase de sânge corespunzătoare. Celulele sanguine se colorează imediat supravital (8) (9) (10) sau se întind mai întâi pe lamele și apoi se colorează. Utilizarea unui colorant specific pentru ADN [de ex. oranj de acridină (14), Hoechst 33258 plus pironină –Y (15)] poate să elimine unele din artefacte datorită utilizării unui colorant nespecific pentru ADN. Avantajul menționat nu exclude utilizarea coloranților convenționali (de ex. Giemsa). Se pot utiliza și alte sisteme [de ex. coloane de celuloză pentru eliminarea celulelor nucleate (16)], cu condiția ca sistemele respective să se fi dovedit eficiente pentru prepararea micronucleelor în laborator.
      1.5.7.   Analiza
      Pentru fiecare animal se determină proporția de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite (imature + mature) prin examinarea a cel puțin 200 de eritrocite pentru măduva osoasă și 1 000 de eritrocite pentru sângele periferic (17). Fiecare dintre lamele, inclusiv cele cu martori pozitivi și negativi, ar trebui codificată independent, înainte de analiza microscopică. Se identifică minimum 2 000 de eritrocite imature per animal pentru a determina incidența eritrocitelor imature micronucleate. Prin identificarea eritrocitelor mature pentru depistarea micronucleelor se pot obține informații suplimentare. La examinarea lamelelor, proporția de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite ar trebui să fie mai mare de 20 % față de valoarea martorilor. Dacă animalele sunt tratate în mod continuu timp de patru săptămâni sau mai mult, se pot identifica, de asemenea, cel puțin 2 000 de eritrocite mature per animal pentru a constata incidența micronucleelor. Sistemele de analiză automată (analiza imaginii și citometria de flux a suspensiilor de celule) se pot utiliza în locul evaluării manuale, dacă sunt validate și justificate corespunzător.
      2.   DATELE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Se recomandă prezentarea sub formă de tabel a datelor pentru fiecare animal. Unitatea experimentală este animalul. Pentru fiecare animal analizat se consemnează în tabel numărul de eritrocite imature examinate, numărul de eritrocite imature micronucleate și numărul de eritrocite imature, în raport cu numărul total de eritrocite. Dacă animalele se tratează continuu timp de patru săptămâni sau mai mult, ar trebui să se prezinte și datele privind eritrocitele mature, dacă s-a făcut colectarea acestora. Pentru fiecare animal se prezintă proporția de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite și, dacă se consideră că este cazul, procentul de eritrocite micronucleate. Dacă nu există dovezi privind diferența de răspunsuri între sexe, datele de la ambele sexe se pot combina pentru analiza statistică.
      2.2.   EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, cum ar fi o creștere în funcție de doză a numărului de celule micronucleate sau o creștere clară a numărului de celule micronucleate dintr-o grupă cu o doză unică la un singur moment de prelevare. În primul rând, ar trebui să se aibă în vedere relevanța biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge și la ajutorul unor metode statistice (18) (19). Semnificația statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferință printr-o modificare a condițiilor experimentale.
      Dacă rezultatele pentru o substanță de testat nu îndeplinesc criteriile menționate anterior, substanța respectivă se consideră a fi nemutagenă în prezentul test.
      Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în cazuri rare datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile, independent de numărul de experimente.
      Rezultatele pozitive ale testului de micronucleu indică faptul că substanța induce formarea de micronuclee ca urmare a leziunilor cromozomiale sau leziunilor aparatului mitotic din eritroblaștii speciei testate. Rezultatele negative indică faptul că, în condițiile experimentale, substanța de testat nu produce micronuclee în eritrocitele imature ale speciei testate.
      Ar trebui să fie discutată probabilitatea ca substanța de testat sau metaboliții acesteia să ajungă în circulația generală sau în mod specific în țesutul-țintă (de ex. toxicitatea sistemică).
      3.   RAPORTAREA
      RAPORTUL TESTULUI
      Raportul testului ar trebui să conțină următoarele informații:
      
                   
               
               
                  Solventul/vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaște.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animalele de laborator:
                  
                              —
                           
                           
                              specia/sușa utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul, vârsta și sexul animalelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursa, condițiile de adăpost și hrană etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul de greutate, greutatea medie și deviația standard pentru fiecare grupă.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condițiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              martorii pozitivi și negativi (solvent/vehicul);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dacă s-a realizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii dozelor utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea substanței de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind administrarea substanței de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea căii de administrare selectate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de verificare pentru a constata dacă substanța de testat a ajuns în circulația generală sau în țesutul-țintă, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conversia concentrației substanței de testat (ppm) în hrană/apa de băut în doza reală (mg/kg greutate corp/zi), dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei și a apei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea amănunțită a modalităților de tratare și de prelevare a probelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de preparare a lamelelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de măsurare a toxicității;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile pentru numărătoarea eritrocitelor imature micronucleate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule analizate per animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              proporția de eritrocite imature în raport cu numărul total de eritrocite;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de eritrocite imature micronucleate, prezentat separat pentru fiecare animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              media ± deviația standard pentru eritrocitele imature micronucleate pentru fiecare grupă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relația doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analizele statistice și metodele aplicate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi studiați în paralel și anterior testului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii pozitivi studiați în paralel.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluziile.
               
            4.   BIBLIOGRAFIA
      
                  (1)
               
               
                  Heddle, J. A. (1973), A Rapid In Vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190.
               
            
                  (2)
               
               
                  Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15.
               
            
                  (3)
               
               
                  Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61-118.
               
            
                  (4)
               
               
                  Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80.
               
            
                  (5)
               
               
                  MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.
               
            
                  (6)
               
               
                  MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C., Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112.
               
            
                  (7)
               
               
                  MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522.
               
            
                  (8)
               
               
                  Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245-249.
               
            
                  (9)
               
               
                  The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98.
               
            
                  (10)
               
               
                  The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 53-159.
               
            
                  (11)
               
               
                  Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. (1994), in Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293-304.
               
            
                  (12)
               
               
                  Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313-319.
               
            
                  (13)
               
               
                  Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
               
            
                  (14)
               
               
                  Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247.
               
            
                  (15)
               
               
                  MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, pp. 269-275.
               
            
                  (16)
               
               
                  Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104.
               
            
                  (17)
               
               
                  Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97-99.
               
            
                  (18)
               
               
                  Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part 1, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
               
            
                  (19)
               
               
                  Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Staticical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.”
               
            
   ANEXA 4D
   
      „B.13/14.   MUTAGENITATEA – TESTUL DE MUTAȚIE INVERSĂ PE BACTERII
      1.   METODA
      Prezenta metodă este reprodusă după orientarea OCDE TG 471, Testul de mutație inversă pe bacterii (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Testul bacterian de mutație inversă se bazează pe sușe de Salmonella typhimuriumși Escherichia coli, care necesită aminoacizi, și urmărește detectarea mutațiilor punctiforme, care includ substituția, adăugarea sau deleția uneia sau a câtorva perechi de bază din ADN (1) (2) (3). Principiul prezentului test bacterian de mutație inversă constă în detectarea mutațiilor care reîntorc mutațiile, prezente în sușele experimentale, în starea inițială și refac funcționalitatea bacteriilor de a sintetiza un aminoacid esențial. Bacteriile de inversare se detectează datorită capacității lor de a se dezvolta în absența aminoacidului necesar pentru sușa parentală experimentală.
      Mutațiile punctiforme sunt cauza multor maladii genetice umane și există dovezi substanțiale că mutațiile din oncogene și genele supresoare de tumori din celulele somatice sunt implicate în formarea tumorilor la oameni și animalele de laborator. Testul bacterian de mutație inversă este rapid, ieftin și relativ ușor de realizat. Multe dintre sușele experimentale au câteva particularități care le fac mai sensibile pentru detectarea de mutații, inclusiv secvențe de ADN sensibile la mutații în locurile de inversare, permeabilitate celulară crescută pentru moleculele mari și eliminarea sistemelor de regenerare a ADN sau intensificarea proceselor care au tendința să inducă erori în timpul regenerării ADN. Specificitatea sușelor experimentale poate să furnizeze informații utile privind tipurile de mutații care sunt induse de către agenții genotoxici. O bază de date cu un număr mare de rezultate, pentru structuri foarte variate, este disponibilă pentru testele bacteriene de mutații inverse și au fost elaborate metodologii bine stabilite pentru testarea produselor chimice cu diferite proprietăți fizico-chimice, inclusiv a compușilor volatili.
      A se vedea introducerea generală din partea B.
      1.2.   DEFINIȚII
      
         Un test de mutație inversă, fie la Salmonella typhimurium, fie la Escherichia coli, detectează mutația într-o sușă care necesită un aminoacid (histidină sau respectiv triptofan) pentru a produce o sușă independentă de aportul exterior de aminoacid.
      
         Mutageni care provoacă substituția perechilor de bază sunt agenți care provoacă substituirea unei baze din ADN. Într-un test de reversie, acest tip de modificare poate să se producă la locul mutației inițiale sau într-un al doilea loc în genomul bacterian.
      
         Mutageni de decalare a cadrului de citire sunt agenți care produc adăugarea sau deleția uneia sau a mai multor perechi de bază din ADN, modificând astfel cadrul de citire în ARN.
      1.3.   CONSIDERAȚII PRELIMINARE
      Testul bacterian de mutație inversă utilizează celule procariote, care diferă de celulele mamiferelor în privința absorbției, metabolismului, structurii cromozomilor și proceselor de regenerare a ADN. Pentru testele realizate in vitro este necesară în general o sursă exogenă de activare metabolică. Sistemele de activare metabolică in vitro nu pot să reproducă în totalitate condițiile metabolismului celulelor de mamifere in vivo. Testul nu furnizează, prin urmare, informații directe privind capacitatea mutagenă și cancerigenă a unei substanțe la mamifere.
      Testul bacterian de mutație inversă se utilizează, de obicei, pentru o primă triere a activității genotoxice, în special pentru detectarea mutației punctiforme. O bogată bază de date demonstrează că multe produse chimice care dau rezultate pozitive în prezentul test prezintă activitate mutagenă și în alte teste. Există exemple de agenți mutageni care nu se detectează prin acest test; aceste deficiențe se pot explica prin natura specifică a efectului detectat, activarea metabolică diferită sau biodisponibilitatea diferită. Pe de altă parte, factorii care cresc sensibilitatea testului bacterian de mutație inversă pot să conducă la o supraestimare a activității mutagene.
      S-ar putea ca testul bacterian de mutație inversă să nu fie potrivit pentru evaluarea anumitor clase de substanțe chimice, de exemplu, compușii cu acțiune bactericidă puternică (de ex. anumite antibiotice) sau cei despre care se consideră (sau se știe) că interferează în mod specific cu sistemele de replicare a celulelor de mamifere (de ex. unii inhibitori de topoizomerază și unii analogi de nucleozide). În aceste cazuri, s-ar putea ca testele de mutație pe celule de mamifere să fie mai potrivite.
      Deși mulți compuși care dau rezultate pozitive în prezentul test sunt cancerigeni pentru mamifere, corelația nu este absolută. Aceasta depinde de clasa de substanțe chimice și există agenți cancerigeni care nu se detectează cu prezentul test, deoarece acționează prin alte mecanisme negenotoxice sau mecanisme care nu sunt prezente în celulele bacteriene.
      1.4.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Suspensiile de celule bacteriene sunt expuse la substanța de testat în prezența și în absența unui sistem exogen de activare metabolică. În procedeul de încorporare prin depunere pe o placă, suspensiile menționate se amestecă cu o geloză de acoperire (agar) și se depun imediat pe un mediu minimal. În procedeul cu preincubare, amestecul de tratare se incubează și apoi se amestecă cu geloza de acoperire înaintea depunerii pe un mediu minim. Pentru ambele metode, după două sau trei zile de incubare, coloniile care produc inversarea se numără și numărul obținut se compară cu cel al coloniilor spontane de inversare aflate pe plăci cu martor tratate cu solvent.
      Sunt descrise câteva proceduri pentru realizarea testului bacterian de mutație inversă. Printre cele utilizate în mod curent sunt metoda de încorporare prin depunere (1) (2) (3) (4), metoda cu preincubare (2) (3) (5) (6) (7) (8), metoda fluctuației (9) (10) și metoda cu suspensie (11). Sunt descrise modificări pentru testarea substanțelor în stare gazoasă sau de vapori (12).
      În prezenta metodă se descrie modul de lucru pentru procedeul de încorporare prin depunere și pentru cel cu preincubare. Oricare dintre acestea se poate accepta pentru realizarea experimentelor, atât cu activare metabolică, cât și fără aceasta. Pentru unele substanțe, este mai eficientă detectarea prin procedeul cu preincubare. Substanțele respective aparțin unor clase chimice care includ nitrozamine alifatice cu lanț scurt, metale bivalente, aldehide, coloranți azoici și diazoderivații, alcaloizi ai pirolizidinei, compuși alchilici și nitroderivați (3). De asemenea, se admite că unele clase de mutageni nu se detectează întotdeauna prin procedee standard, ca încorporarea prin depunere sau procedeul cu incubare. Ar trebui să se considere că acestea sunt «cazuri izolate» și se recomandă cu tărie utilizarea unor procedee alternative pentru detectarea lor. Din categoria «cazuri izolate» este posibilă identificarea (împreună cu exemple de procedeele care se pot utiliza pentru detectarea acestora) a următoarelor cazuri: coloranți azoici și compuși diazoici (3) (5) (6) (13), cei în stare gazoasă și volatili (12) (14) (15) (16) și glicozidele (17) (18). Orice deviație de la procedura standard necesită o justificare științifică.
      1.5.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.5.1.   Preparatele
      1.5.1.1.   Bacteriile
      Culturile proaspete de bacterii ar trebui lăsate să se dezvolte până la finalul fazei exponențiale sau debutul fazei staționare de creștere (aproximativ 109 celule pe ml). Culturile aflate în faza staționară finală nu ar trebui să se utilizeze. Este esențial ca în experiment să se utilizeze culturi cu titru mare de bacterii viabile. Titrul se poate determina fie plecând de la datele anterioare privind curbele de creștere a culturilor martor, fie pentru fiecare test, prin determinarea numărului de celule viabile prin etalare.
      Temperatura de incubare recomandată este de 37 °C.
      Se recomandă utilizarea a minimum cinci sușe de bacterii. Acestea ar trebui să includă patru sușe de S. typhimurium (TA 1535; TA 1537 sau TA97a sau TA97; TA98 și TA100) pentru care comparațiile între laboratoare au indicat că sunt fiabile și dau răspunsuri reproductibile. Cele patru sușe de S. typhimurium menționate posedă perechi de bază GC în primul situs de reversie și se cunoaște că acestea nu pot să detecteze anumiți agenți mutageni oxidanți, agenți de reticulare și unele hidrazine. Detectarea acestor substanțe este posibilă cu ajutorul sușelor de E. coli WP2 sau de S. typhimurium TA102 (19) care posedă o pereche de bază AT în situsul primar de reversie. Combinația de sușe recomandată este, prin urmare, următoarea:
      
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA1535;
               
            
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA1537 sau TA97 sau TA97a;
               
            
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA98;
               
            
                  —
               
               
                  
                     S. typhimurium TA100;
               
            
                  —
               
               
                  
                     E. coli WP2 uvrA sau E. coli WP2 uvrA (pKM101) sau S. typhimurium TA102.
               
            Pentru detectarea agenților mutageni de reticulare s-ar putea prefera includerea sușei TA102 sau adăugarea unei sușe de E. coli capabile de regenerarea ADN [de ex. E. coli WP2 sau E. coli WP2 (pKM101)].
      Ar trebui să se utilizeze procedurile stabilite pentru prepararea culturilor de rezervă, verificarea markerilor și pentru păstrare. Pentru fiecare preparat de cultură de rezervă congelată, ar trebui să se demonstreze necesitatea prezenței unui aminoacid pentru dezvoltarea culturii (histidină pentru sușele S. typhimuriumși triptofan pentru sușele E. coli). Ar trebui să se verifice și alte caracteristici ale fenotipului, de ex. prezența sau absența plasmidelor factorului R (rezistență), dacă este cazul [adică rezistența la ampicilină a sușelor TA98, TA100, TA97a sau TA97, WP2 uvrA și WP2 uvrA (pKM101) și rezistența la ampicilină + tetraciclină a sușei TA102]; prezența mutațiilor caracteristice (adică mutația rfa în S. typhimurium prin sensibilizare la cristal violet și mutația uvrA în E. coli sau mutația uvrB în S.typhimurium prin sensibilizare la lumina ultravioletă) (2) (3). De asemenea, sușele ar trebui să producă un număr de colonii spontane de reversie pe fiecare placă, între limitele de frecvență estimate pe baza datelor de laborator anterioare și, de preferință, între limitele semnalate în literatura de specialitate.
      1.5.1.2.   Mediul
      Se utilizează o geloză minimală corespunzătoare (de ex. una care conține mediu minimal E Vogel-Bonner și glucoză) și o geloză de acoperire care conține histidină și biotin sau triptofan pentru a permite divizarea doar a unui număr mic de celule (1) (2) (9).
      1.5.1.3.   Activarea metabolică
      Expunerea bacteriilor la substanța de testat ar trebui să se realizeze atât în prezența, cât și în absența unui sistem corespunzător de activare metabolică. Sistemul utilizat cel mai frecvent conține o fracție postmitocondrială îmbogățită cu un cofactor (S9), preparată din ficat de rozătoare tratat cu agenți de inducție enzimatică, de ex. Aroclor 1254 (1) (2) sau un amestec de fenobarbitonă și β-naftoflavonă (18) (20) (21). Fracția postmitocondrială se utilizează, de obicei, la concentrații cuprinse între 5 și 30 % vol./vol. în amestecul S9. Alegerea și compoziția unui sistem de activare metabolică pot să depindă de clasa chimică a substanței de testat. În unele cazuri, s-ar putea să fie convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale. Pentru coloranții azoici și diazoderivați, s-ar putea să fie mai potrivită utilizarea unui sistem de activare metabolică reducător (6) (13).
      1.5.1.4.   Substanța de testat/prepararea
      Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se prepare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului bacteriilor. Substanțele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele de testare și se diluează înainte de utilizare în tratamentul bacteriilor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanță de testat, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.
      Solventul/vehiculul nu ar trebui să reacționeze chimic cu substanța de testat și nu ar trebui să afecteze supraviețuirea bacteriilor și activitatea S9 (22). Utilizarea altor solvenți/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos. Când se testează substanțe instabile în apă, solventul organic utilizat ar trebui să nu conțină apă.
      1.5.2.   Condițiile de testare
      1.5.2.1.   Sușele experimentale (a se vedea 1.5.1.1)
      
      1.5.2.2.   Concentrația de expunere
      Printre criteriile care trebuie luate în considerație la determinarea cantității maxime de substanță de testat ce urmează să se utilizeze sunt citotoxicitatea și solubilitatea în amestecul final de tratare.
      Ar putea fi util un test preliminar pentru determinarea toxicității și caracteristicilor de solubilitate. Detectarea citotoxicității poate fi posibilă printr-o reducere a numărului de colonii care provoacă reversia, o clarificare și diminuare a fondului de bacterii sau a gradului de supraviețuire a culturilor tratate. Prezența sistemelor de activare metabolică poate să influențeze citotoxicitatea unei substanțe. Insolubilitatea ar trebui să fie evaluată prin formarea în amestecul final, în condiții de testare reale, a unui precipitat vizibil cu ochiul liber.
      Concentrația de testare maximă recomandată pentru substanțele necitotoxice solubile este de 5 mg/placă sau 5μl/placă. Pentru substanțele necitotoxice insolubile la 5 mg/placă sau 5μl/placă, una sau mai multe din concentrațiile de testare ar trebui să fie insolubile în amestecul final de tratament. Pentru substanțele de testat care sunt deja citotoxice la concentrații mai mici de 5 mg/placă sau 5 μl/placă, testarea ar trebui să se realizeze până la o concentrație citotoxică. Ar trebui ca precipitatul să nu interfereze cu evaluarea rezultatelor.
      Într-un test inițial, se recomandă utilizarea unui număr minim de cinci concentrații analizabile diferite, cu intervale între punctele de testare de aproximativ o semiunitate logaritmică (adică √10). Pentru stabilirea unei relații concentrație-răspuns, intervale menționate mai reduse ar putea fi mai adecvate. Când se evaluează substanțe cu un conținut substanțial de posibile impurități mutagene, s-ar putea avea în vedere testarea la concentrații mai mari de 5 mg/placă sau 5 μl/placă.
      1.5.2.3.   Martorii negativi și pozitivi
      
      Martorii pozitivi specifici sușei și martorii negativi (solvent sau vehicul) utilizați în paralel ar trebui să se includă în fiecare test, atât în prezența, cât și în absența activării metabolice. Pentru martorii pozitivi, ar trebui să fie selectate acele concentrații care permit să se demonstreze eficiența testului realizat.
      Pentru testele care utilizează un sistem de activare metabolică, selectarea substanței sau substanțelor de referință pentru martorii pozitivi ar trebui să se realizeze în funcție de tipul sușelor bacteriene utilizate.
      În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi pentru testele cu activare metabolică:
      
                  Substanța
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. IESCE
               
            
                  9,10-dimetilantracen
               
               
                  781-43-1
               
               
                  212-308-4
               
            
                  7,12-dimetilbenz[a]antracen
               
               
                  57-97-6
               
               
                  200-359-5
               
            
                  benzo[a]piren
               
               
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
            
                  2-aminoantracen
               
               
                  613-13-8
               
               
                  210-330-9
               
            
                  ciclofosfamidă
               
               
                  50-18-0
               
               
                  200-015-4
               
            
                  ciclofosfamidă monohidrat
               
               
                  6055-19-2
               
               
                   
               
            Următoarea substanță este un martor pozitiv adecvat pentru metoda de activare metabolică reductivă:
      
                  Substanța
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. IESCE
               
            
                  Roșu de Congo
               
               
                  573-58-0
               
               
                  209-358-4
               
            2-aminoantracenul nu ar trebui să se utilizeze ca indicator unic al eficienței amestecului S9. Dacă se utilizează 2-aminoantracenul, fiecare lot de S9 ar trebui să fie, de asemenea, caracterizat cu un mutagen care necesită o activare metabolică de către enzimele microzomiale, de ex. benzo[a]pirenul, dimetilbenzantracenul.
      În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi specifici sușei pentru testele realizate fără un sistem de activare metabolică exogenă:
      
                  Substanța
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. IESCE
               
               
                  Sușa
               
            
                  azidă de sodiu
               
               
                  26628-22-8
               
               
                  247-852-1
               
               
                  TA 1535 și TA 100
               
            
                  2-nitrofluoren
               
               
                  607-57-8
               
               
                  210-138-5
               
               
                  TA 98
               
            
                  9-aminoacridină
               
               
                  90-45-9
               
               
                  201-995-6
               
               
                  TA 1537, TA 97 și TA 97a
               
            
                  ICR 191
               
               
                  17070-45-0
               
               
                  241-129-4
               
               
                  TA 1537, TA 97 și TA 97a
               
            
                  hidroperoxid de cumenă
               
               
                  80-15-9
               
               
                  201-254-7
               
               
                  TA 102
               
            
                  mitomicin C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
               
                  WP2 uvrA și TA 102
               
            
                  N-etil-N-nitro-N-nitrozoguanidină
               
               
                  70-25-7
               
               
                  200-730-1
               
               
                  WP2, WP2 uvrA și WP2uvrA(pKM101)
               
            
                  4-nitrochinolină-1-oxid
               
               
                  56-57-5
               
               
                  200-281-1
               
               
                  WP2, WP2 uvrA și WP2uvrA(pKM101)
               
            
                  furilfuramidă
                  (AF2)
               
               
                  3688-53-7
               
               
                   
               
               
                  Sușe cu conținut de plasmid
               
            Se pot utiliza și alte substanțe de referință ca martori pozitivi corespunzători. Ar trebui să se aibă în vedere utilizarea unor martori pozitivi din aceeași clasă chimică, dacă sunt disponibili.
      Ar trebui să se utilizeze martori negativi, constituiți din solvent sau vehicul fără substanța de testat, dar tratați în același mod ca grupele cu tratament. În plus, ar trebui să se utilizeze și martori netratați, cu excepția cazului în care există date din testele anterioare care să ateste că solventul ales nu are efecte dăunătoare sau mutagene.
      1.5.3.   Modul de lucru
      Pentru metoda de încorporare prin depunere pe o placă (1) (2) (3) (4), fără activare metabolică, se prepară, de obicei, un amestec din 0,05 ml sau 0,1 ml de soluție de testat, 0,1 ml de cultură bacteriană proaspătă (ce conține aproximativ 108 celule viabile) și 0,5 ml de tampon steril cu 2,0 ml geloză de acoperire (agar). Pentru testul cu activare metabolică, se prepară, de obicei, un amestec din 0,5 ml preparat de activare metabolică, ce conține o cantitate specifică de fracție postmitocondrială (în proporție de 5 până la 30 % vol./vol. în preparatul de activare metabolică), 2,0 ml de geloză de acoperire, bacterii și substanța de testat/soluția de testat. Conținutul din fiecare eprubetă se agită și se toarnă pe suprafața unui mediu minimal de geloză depus pe placă. Geloza de acoperire se lasă să se solidifice înainte de incubare.
      Pentru metoda de preincubare (2) (3) (5) (6), substanța de testat/soluția de testat se supune la preincubare împreună cu sușa experimentală (ce conține aproximativ 108 celule viabile) și cu tamponul steril sau sistemul de activare metabolică (0,5 ml) de obicei timp de 20 de minute sau mai mult, la 30-37 °C, înainte de a fi amestecată cu geloza de acoperire și turnată pe suprafața unui mediu minimal de geloză depus pe placă. De obicei, se prepară un amestec din 0,05 ml sau 0,1 ml de substanță de testat/soluție de testat, 0,1 ml bacterii și 0,5 ml amestec S9 sau tampon steril cu 2,0 ml geloză de acoperire. Eprubetele ar trebui să fie aerate cu ajutorul unui agitator în timpul preincubării.
      Pentru o bună estimare a variației, ar trebui să se utilizeze câte trei plăci cu depuneri pentru fiecare doză. Se acceptă utilizarea a doar două plăci cu depuneri, dacă se justifică științific acest lucru. Pierderea ocazională a unei plăci nu invalidează în mod necesar testul.
      Substanțele în stare gazoasă sau cele volatile ar trebui să fie testate în condiții corespunzătoare, de ex. în vase închise ermetic (12) (14) (15) (16).
      1.5.4.   Incubarea
      Toată plăcile dintr-un test dat ar trebui să fie incubate la 37 °C timp de 48-72 de ore. După incubare, se procedează la numărătoarea coloniilor care provoacă reversia de pe fiecare placă.
      2.   DATELE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Datele ar trebui să se prezinte sub forma numărului de colonii care provoacă reversia de pe fiecare placă. De asemenea, ar trebui să se prezinte numărul de colonii care provoacă reversie, atât pe plăcile cu martor negativ (martor solvent și martor netratat, dacă s-a utilizat), cât și pentru plăcile cu martor pozitiv. Ar trebui să se prezinte numărătoarea pentru fiecare placă, numărul mediu de colonii care provoacă reversia pentru fiecare placă și deviația standard pentru substanța de testat și pentru martorii pozitivi și negativi (netratați și solvent).
      Nu este necesară verificarea unui răspuns clar pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferință prin modificarea uneia dintre condițiile experimentale. Rezultatele negative necesită confirmare pentru fiecare caz. În cazurile în care se consideră că nu este necesară confirmarea rezultatelor negative, ar trebui să se ofere o justificare. Pentru testele de confirmare ar trebui să se aibă în vedere modificarea condițiilor experimentale pentru lărgirea gamei de condiții evaluate. Condițiile experimentale care ar putea fi modificate includ diferența dintre concentrații, metoda de tratament (încorporarea prin depunere pe placă sau preincubarea în mediu lichid) și condițiile de activare metabolică.
      2.2.   EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, precum creșterea în funcție de concentrație peste intervalul testat și o creștere reproductibilă a uneia sau mai multor concentrații ale numărului de colonii care provoacă reversia per placă, la cel puțin o sușă cu sau fără sistem de activare metabolică (23). În primul rând ar trebui să se aibă în vedere relevanța biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge și la ajutorul unor metode statistice (24). Semnificația statistică nu ar trebui să fie totuși singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv.
      Dacă rezultatele pentru o substanță de testat nu îndeplinesc criteriile menționate anterior, substanța respectivă se consideră a fi nemutagenă în prezentul test.
      Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile, independent de numărul de experimente.
      Rezultatele pozitive ale unui test de mutație bacteriană inversă indică faptul că substanța de testat induce mutații punctiforme prin substituirea bazelor sau decalarea cadrului de citire în genomul de Salmonella typhimuriumși Escherichia coli. Rezultatele negative indică faptul că, în condiții experimentale, substanța de testat nu este mutagenă pentru speciile testate.
      3.   RAPORTAREA
      RAPORTUL TESTULUI
      Raportul testului trebuie să conțină următoarele informații:
      
                   
               
               
                  Solventul/vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaște.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Sușele:
                  
                              —
                           
                           
                              sușele utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule per cultură;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              caracteristicile sușei.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condițiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              cantitatea de substanță de testat per placă (mg/placă sau μl/placă) cu justificarea alegerii dozei și numărului de plăci per concentrație;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              mediile utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tipul și compoziția sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              procedurile de tratament.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              semnele de precipitare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărătoarea pentru fiecare placă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul mediu de colonii care provoacă reversia pentru fiecare placă și deviația standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relația doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analizele statistice, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) și pozitivi studiați în paralel, cu domenii, valori medii și deviații standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) și pozitivi studiați anterior, cu domenii, valori medii și deviații standard.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluziile.
               
            4.   BIBLIOGRAFIA
      
                  (1)
               
               
                  Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364.
               
            
                  (2)
               
               
                  Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215.
               
            
                  (3)
               
               
                  Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutation Res., 312, pp. 217-233.
               
            
                  (4)
               
               
                  Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 168, pp. 69-240.
               
            
                  (5)
               
               
                  Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters 1, pp. 91-96.
               
            
                  (6)
               
               
                  Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273-285.
               
            
                  (7)
               
               
                  Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, pp. 13-61.
               
            
                  (8)
               
               
                  Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety, 8, pp. 167-177.
               
            
                  (9)
               
               
                  Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutation Res., 38, pp. 33-42.
               
            
                  (10)
               
               
                  Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2nd Edition, ed. Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161.
               
            
                  (11)
               
               
                  Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, pp. 453-465.
               
            
                  (12)
               
               
                  Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutation Res., 307, pp. 335-344.
               
            
                  (13)
               
               
                  Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutation Res., 136, pp. 33-47.
               
            
                  (14)
               
               
                  Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, pp. 2-141.
               
            
                  (15)
               
               
                  Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F., Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249-258.
               
            
                  (16)
               
               
                  Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames /Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, pp. 421-441.
               
            
                  (17)
               
               
                  Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, pp. 3780-3782.
               
            
                  (18)
               
               
                  Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 4961-4965.
               
            
                  (19)
               
               
                  Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, pp. 285-291.
               
            
                  (20)
               
               
                  Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, pp. 85-88.
               
            
                  (21)
               
               
                  Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.
               
            
                  (22)
               
               
                  Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutation Res., 88, pp. 343-350.
               
            
                  (23)
               
               
                  Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutation Res., 189, pp. 83-91.
               
            
                  (24)
               
               
                  Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, pp. 28-65.”
               
            
   ANEXA 4E
   
      „B.17.   MUTAGENITATEA – TEST IN VITRO DE MUTAȚIE GENICĂ PE CELULE DE MAMIFERE
      1.   METODA
      Prezenta metodă este reprodusă după orientarea OCDE TG 476, Testul in vitro de mutație genică pe celule de mamifere (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Testul in vitro de mutație genică pe celule de mamifere se poate utiliza pentru detectarea mutațiilor genice produse de substanțele chimice. Liniile celulare corespunzătoare conțin celule de limfom de șoarece L5178Y, liniile CHO, CHO-AS52 și V79 de celule de hamster chinezesc și celule limfoblastoide umane TK6 (1). În liniile celulare menționate, efectele genetice cel mai frecvent măsurate sunt o mutație în pozițiile timidin kinază (TK) și hipoxantin-guanină fosforibozil transferază (HPRT), precum și o transgenă de xantin-guanină fosforibozil transferază (XPRT). Testele de mutație TK, HPRT și XPRT permit detectarea diferitelor spectre ale diferitelor fenomene genetice. Amplasarea autozomică a TK și XPRT poate să permită detectarea fenomenelor genetice (de ex. deleții importante) care nu sunt detectate în locusul HPRT la cromozomii X (2) (3) (4) (5) (6).
      În testul in vitro de mutație genică pe celule de mamifere, se pot utiliza culturi de linii celulare stabilite sau sușe celulare. Celulele utilizate se selectează în funcție de capacitatea de creștere în cultură și de stabilitatea frecvenței de mutație spontană.
      Testele realizate in vitro necesită, în general, utilizarea unei surse exogene de activare metabolică. Sistemul de activare metabolică de acest tip nu poate să reproducă integral condițiile celulelor de mamifere in vivo. Ar trebui să se acorde atenție evitării condițiilor care ar putea să conducă la obținerea unor rezultate care nu reflectă o mutagenitate intrinsecă. Rezultatele pozitive care reflectă o mutagenitate intrinsecă ar putea să provină în urma modificărilor de pH, de osmolalitate sau din valori mari ale citotoxicității (7).
      Prezentul test se utilizează la depistarea substanțelor cu posibile efecte mutagene și cancerigene pentru mamifere. Mulți compuși care dau rezultate pozitive la acest test sunt cancerigeni pentru mamifere; cu toate acestea, nu există o corelație perfectă între prezentul test și cancerigenicitate. Corelația depinde de clasa chimică și sunt tot mai multe dovezi cu privire la existența unor agenți cancerigeni care nu se depistează prin prezentul test, deoarece este posibil ca aceștia să acționeze prin alte mecanisme, negenotoxice sau mecanisme absente în celulele bacteriene (6).
      A se vedea și introducerea generală din partea B.
      1.2.   DEFINIȚII
      Mutație directă: o mutație a genelor de la forma originală la forma mutantă care generează o reducere a activității enzimatice din funcția proteinei codificate.
      Mutageni care provoacă substituția perechilor de bază: substanțe care produc substituția uneia sau mai multor perechi de bază din ADN.
      Mutageni de decalare a cadrului de citire: substanțe care produc adăugarea sau deleția uneia sau a mai multor perechi de bază din molecula de ADN.
      Timpul de manifestare a fenotipului: timpul în care produsele nemodificate ale genelor sunt epuizate din celulele care au suferit o nouă mutație.
      Frecvența mutantului: numărul de celule mutante observate împărțit la numărul de celule viabile.
      Creștere totală relativă: creșterea numărului de celule în timp, în raport cu populația de celule martor; se calculează ca produsul dintre creșterea în suspensie în raport cu martorul negativ și eficacitatea clonării în raport cu martorul negativ.
      Creștere relativă în suspensie: creșterea numărului de celule în timpul de manifestare în raport cu martorul negativ.
      Viabilitate: eficacitatea clonării celulelor tratate în momentul depunerii pe placă în condiții selective după perioada de manifestare.
      Supraviețuire: eficacitatea clonării celulelor tratate atunci când sunt depuse pe placă la încheierea perioadei de tratament; supraviețuirea se exprimă în raport cu supraviețuirea populației de celule martor.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Celulele cu deficit de timidin chinază (TK) datorită mutației TK+/-→ TK-/- sunt rezistente la efectele citotoxice ale trifluorotimidinei (TFT), un analog al pirimidinei. Celulele care posedă timidin chinază sunt sensibile la TFT, care produce inhibarea metabolismului celular și întrerupe diviziunea celulară. Prin urmare, celulele mutante pot să prolifereze în prezența TFT, în timp ce celulele normale, care conțin timidin chinază, nu pot. În mod similar, celulele cu deficit de HPRT sau XPRT sunt selectate în funcție de rezistența la 6-tioguanină (TG) sau 8-azaguanină (AG). Dacă analogul unei baze sau un compus înrudit cu agentul selectiv este supus la unul dintre testele de mutație genică pe celule de mamifere, proprietățile substanței de testat trebuie studiate cu grijă. De exemplu, ar trebui să se examineze substanța de testat suspectată de toxicitate selectivă pentru celule mutante și nemutante. În consecință, performanța sistemului/agentului de selecție trebuie să fie confirmată atunci când se testează substanțe chimice cu o structură apropiată de cea a agentului selectiv (8).
      Celulele în suspensie sau în cultură monostrat se expun o perioadă de timp corespunzătoare la substanța de testat atât în prezența, cât și în absența activării metabolice și se reînsămânțează pentru determinarea citotoxicității și pentru a permite manifestarea fenotipului înaintea selecției mutantului (9) (10) (11) (12) (13). Citotoxicitatea se determină, de obicei, prin măsurarea eficacității clonării relative (supraviețuirii) sau a creșterii totale relative a culturilor după perioada de tratament. Culturile tratate sunt menținute în mediul de cultură un timp suficient, caracteristic pentru fiecare locus și tip de celulă selectate, pentru a permite o manifestare fenotipică aproape optimă a mutațiilor induse. Frecvența mutanților se determină prin însămânțarea unui număr cunoscut de celule într-un mediu ce conține agentul selectiv pentru a detecta celulele mutante și într-un mediu fără agent selectiv pentru a determina eficacitatea clonării (viabilitatea). După un timp corespunzător de incubare, se numără coloniile. Frecvența mutantului se determină prin compararea numărului de colonii de mutanți în mediul selectiv cu numărul de colonii în mediul neselectiv.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Preparatele
      1.4.1.1.   Celulele
      Există diferite tipuri de celule care se pot utiliza în prezentul test, inclusiv subclonele de celule L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 sau TK6. Tipurile de celule utilizate în prezentul test ar trebui să aibă o sensibilitate dovedită la mutageni chimici, o eficacitate mare de clonare și o frecvență de mutație spontană stabilă. Ar trebui să se verifice contaminarea cu micoplasmă a celulelor și, dacă se constată că sunt contaminate, nu ar trebui să se utilizeze.
      Testul ar trebui conceput astfel încât să aibă o sensibilitate și putere predeterminate. Numărul de celule, culturi și concentrațiile substanței de testat utilizate ar trebui să reflecte parametrii definiți anterior (14). Numărul minim de celule viabile care supraviețuiesc tratamentului și se utilizează în fiecare stadiu al testului ar trebui să fie în funcție de frecvența mutației spontane. O regulă generală constă în utilizarea unui număr de celule cel puțin egal cu de 10 ori inversul frecvenței de mutație spontană. Cu toate acestea, se recomandă utilizarea a minimum 106 celule. Pentru a asigura o performanță constantă a testului, ar trebui să se dispună de date anterioare specifice privind sistemul celular utilizat.
      1.4.1.2.   Mediile și condițiile de cultură
      Se recomandă utilizarea mediilor de cultură și a condițiilor de incubare (vasele de cultură, temperatura, concentrația CO2 și umiditatea) corespunzătoare. Alegerea mediilor ar trebui să se facă în funcție de sistemele selective și de tipul celulelor utilizate în test. O importanță deosebită o prezintă alegerea condițiilor de cultură, astfel încât să asigure creșterea optimă a celulelor în perioada de manifestare și capacitatea celulelor, atât mutante, cât și nemutante, de a forma colonii.
      1.4.1.3.   Prepararea culturilor
      Celulele se obțin plecând de la culturile de rezervă, se însămânțează în mediul de cultură și se incubează la 37 °C. Înainte de a fi utilizate în prezentul test, este necesară curățarea culturilor de celulele mutante preexistente.
      1.4.1.4.   Activarea metabolică
      Se recomandă ca expunerea celulelor la substanța de testat să se realizeze atât în prezența, cât și în absența unui sistem de activare metabolică corespunzător. Sistemul cel mai frecvent utilizat este o fracție postmitocondrială la care s-au adăugat cofactori (S9), preparată din ficat de rozătoare tratat cu agenți de inducție enzimatică, de ex. Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) sau un amestec de fenobarbitonă și β-naftoflavonă (19) (20).
      Fracția postmitocondrială se utilizează, de obicei, la concentrații cuprinse între limitele 1-10 % vol./vol. în mediul de testare final. Selectarea și tipul unui sistem de activare metabolică pot să depindă de clasa chimică a substanței de testat. În unele cazuri, ar putea fi convenabilă utilizarea mai multor concentrații ale fracției postmitocondriale.
      O serie de realizări, inclusiv crearea prin inginerie genetică a unor linii celulare care exprimă enzime activatoare specifice, pot să furnizeze potențialul pentru o activare endogenă. Alegerea liniilor celulare ar trebui să fie justificată din punct de vedere științific (de ex. prin importanța izoenzimei citocromului P450 pentru metabolismul substanței de testat).
      1.4.1.5.   Prepararea substanței de testat
      Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se prepare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare, care, dacă este cazul, se diluează înaintea tratamentului celulelor. Substanțele de testat lichide se pot adăuga direct în sistemele de testare și se diluează înainte de utilizare în tratamentul celulelor. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanță de testat, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora la păstrare.
      1.4.2.   Condițiile de testare
      1.4.2.1.   Solventul/vehiculul
      Solventul/vehiculul ar trebui să fie ales astfel încât să nu existe suspiciunea reacției chimice a acestuia cu substanța de testat și să nu afecteze negativ supraviețuirea celulelor și activitatea S9. Utilizarea altor solvenți/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să se justifice cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere un solvent/vehicul apos. La testarea substanțelor instabile în apă, solventul organic utilizat nu ar trebui să conțină urme de apă. Apa se poate elimina prin adăugarea unei site moleculare.
      1.4.2.2.   Concentrațiile de expunere
      Printre criteriile ce trebuie să fie avute în vedere la determinarea dozei maxime sunt citotoxicitatea, solubilitatea în sistemul de testare și modificările de pH sau osmolalitate.
      Citotoxicitatea ar trebui să se determine cu și fără activare metabolică în experimentul principal, utilizând un indicator corespunzător al integrității și dezvoltării celulare, ca eficacitatea clonării relative (supraviețuirea) sau creșterea totală relativă. Ar putea fi utilă determinarea citotoxicității și solubilității într-un experiment preliminar.
      Ar trebui să se utilizeze cel puțin patru concentrații analizabile. Dacă o substanță este citotoxică, concentrațiile respective ar trebui să acopere un domeniu de toxicități de la maximă la mică sau lipsa toxicității; aceasta semnifică, de obicei, concentrații care ar trebui să fie separate printr-un factor cuprins între 2 și √10 maximum. Dacă, datorită citotoxicității, concentrația este maximă, ar trebui să determine un procent de supraviețuire relativă (eficacitatea relativă a clonării) sau o creștere totală relativă de aproximativ 10-20 % (dar nu mai puțin de 10 %). Pentru substanțele relativ necitotoxice, concentrația de testare maximă ar trebui să fie cea mai mică dintre următoarele trei concentrații: 5 mg/ml, 5μl/ml sau 1,01 M.
      Substanțele relativ insolubile ar trebui să fie testate la concentrații egale sau superioare limitei de solubilitate în condițiile de cultură. Insolubilitatea ar trebui să fie pusă în evidență în mediul final de tratament în care se expun celulele. Ar putea fi utilă evaluarea solubilității la începutul și la sfârșitul tratamentului, deoarece solubilitatea poate să varieze în timpul expunerii în sistemul de testare datorită prezenței celulelor, S9, serului etc. Insolubilitatea se poate constata cu ochiul liber. Ar trebui ca precipitarea să nu interfereze cu determinarea rezultatelor.
      1.4.2.3.   Martorii
      În fiecare experiment, ar trebui să se includă simultan martorii pozitivi și negativi (solvent și vehicul), atât cu, cât și fără activare metabolică. În prezența activării metabolice, substanța utilizată ca martor pozitiv ar trebui să fie aceea care necesită activare pentru a da un răspuns mutagen.
      În tabelul următor sunt prezentate exemple de substanțe utilizate ca martori pozitivi:
      
                  Tipul activării
               
               
                  Poziția
               
               
                  Substanța
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. IESCE
               
            
                  Absența activării metabolice exogene
               
               
                  HPRT
               
               
                  Metansulfonat de etil
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  Etil nitrozouree
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  TK (colonii mici și mari)
               
               
                  Metansulfonat de metil
               
               
                  66-27-3
               
               
                  200-625-0
               
            
                  XPRT
               
               
                  Metansulfonat de etil
               
               
                  62-50-0
               
               
                  200-536-7
               
            
                  Etil nitrozouree
               
               
                  759-73-9
               
               
                  212-072-2
               
            
                  Prezența activării metabolice exogene
               
               
                  HPRT
               
               
                  3-metilcolantren
               
               
                  56-49-5
               
               
                  200-276-4
               
            
                  N-nitrozodimetilamină
               
               
                  62-75-9
               
               
                  200-549-8
               
            
                  7,12-dimetilbenzantracen
               
               
                  57-97-6
               
               
                  200-359-5
               
            
                  TK (colonii mici și mari)
               
               
                  Ciclofosfamidă
               
               
                  50-18-0
               
               
                  200-015-4
               
            
                  Ciclofosfamidmonohidrat
               
               
                  6055-19-2
               
               
                   
               
            
                  Benzo[a]piren
               
               
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
            
                  3-metilcolantren
               
               
                  56-49-5
               
               
                  200-276-5
               
            
                  XPRT
               
               
                  N-nitrozodimetilamină (pentru valori mari ale S9)
               
               
                  62-75-9
               
               
                  200-549-8
               
            
                  Benzo[a]piren
               
               
                  50-32-8
               
               
                  200-028-5
               
            Se pot utiliza și alte substanțe corespunzătoare ca martori pozitivi, de ex. se poate utiliza 5-bromo 2′-dezoxiuridina (nr. CAS 59-14-3, nr. IESCE 200-415-9), dacă laboratorul dispune de o bază de date anterioare privind această substanță. Ar trebui să se aibă în vedere utilizarea ca martori pozitivi a unor substanțe din aceeași clasă chimică, dacă sunt disponibile.
      Ca martori negativi ar trebui să se utilizeze solvenți sau vehicule singure în mediul de tratare, care se tratează în aceleași condiții ca și culturile. În plus, ar trebui să se utilizeze și martori netratați, cu excepția cazului în care există date din testele anterioare care să ateste că solventul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene.
      1.4.3.   Modul de lucru
      1.4.3.1.   Tratamentul cu substanța de testat
      Celulele în stadiu de proliferare se tratează cu substanța de testat atât în prezența, cât și în absența unui sistem de activare metabolică. Timpul de expunere ar trebui să fie corespunzător (de obicei, un timp de 3-6 ore este eficient). Timpul de expunere se poate prelungi cu unul sau mai multe cicluri celulare.
      Fiecare concentrație se poate testa pe una sau pe două culturi tratate. Dacă se utilizează culturi unice, numărul concentrațiilor ar trebui să fie mai mare pentru a asigura un număr suficient de culturi pentru analiză (de ex. minimum opt concentrații analizabile). Se recomandă utilizarea culturilor duble pentru martorul negativ (solvent).
      Testarea substanțelor în stare gazoasă și a celor volatile ar trebui să se realizeze prin metode specifice, de ex. în vase de cultură închise ermetic (21) (22).
      1.4.3.2.   Determinări de supraviețuire, viabilitate și frecvența mutantului
      La sfârșitul perioadei de expunere, celulele se spală și se cultivă în mediul de cultură pentru determinarea supraviețuirii și pentru a permite manifestarea fenotipului mutant. Determinarea citotoxicității începe, de obicei, după perioada de tratament și constă în măsurarea eficacității de clonare relativă (supraviețuirii) sau a creșterii totale relative a culturilor.
      Fiecărui locus îi corespunde un timp minim definit, necesar pentru a permite manifestarea aproape optimă a fenotipului mutanților nou induși (HPRT și XPRT necesită minimum 6-8 zile și TK minimum două zile). Pentru determinarea numărului de mutanți și a eficacității clonării, celulele sunt crescute în mediu cu și, respectiv, fără agent sau agenți selectivi. Măsurarea viabilității (utilizată la calcularea frecvenței mutantului) începe la terminarea perioadei de manifestare prin depunerea celulelor într-un mediu neselectiv.
      Dacă substanța de testat dă un rezultat pozitiv la testul pe TK+/- L5178Y, dimensiunile coloniilor ar trebui să se determine pe minimum una dintre culturile experimentale (la concentrația pozitivă maximă) și pe martorii negativi și pozitivi. Dacă substanța de testat dă un rezultat negativ la testul pe TK+/- L5178Y, dimensiunile coloniilor ar trebui să se determine pe martorii negativi și pozitivi. Dimensiunile coloniilor se pot determina și în studiile în care se utilizează TK6TK+/-.
      2.   DATELE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Datele ar trebui să conțină determinarea citotoxicității și viabilității, numărul de colonii și frecvențele mutanților pentru culturile tratate și cele martor. Dacă se obține un răspuns pozitiv în testul pe TK+/- L5178Y, la numărătoarea coloniilor se face distincția între coloniile mici și mari pentru minimum o concentrație a substanței de testat (concentrația pozitivă maximă) și pentru martorul negativ și pozitiv. Ar trebui să se facă o examinare detaliată a naturii moleculare și citogenice a coloniilor mari și mici de mutanți (23) (24). În testul pe TK+/-, numărătoarea coloniilor se realizează conform criteriului de creștere normală (mare) și creștere lentă (mică) a coloniilor (25). Celulele mutante care au suferit cele mai însemnate alterări genetice au timpi de duplicare prelungiți și formează, așadar, colonii mici. Această alterare variază, de obicei, de la pierderea întregii gene până la aberații cromozomiale care se manifestă în cariotip. Inducerea coloniilor mici de mutanți este pusă pe seama substanțelor chimice care induc aberații cromozomiale însemnate (26). Celulele mutante mai puțin afectate se dezvoltă cu viteze similare cu cele ale celulelor originale și formează colonii mari.
      Ar trebui să se prezinte datele privind supraviețuirea (eficacitatea clonării relative) sau creșterea totală relativă. Frecvența mutanților ar trebui să se exprime prin numărul de celule mutante împărțit la numărul de celule supraviețuitoare.
      Ar trebui să se prezinte datele pentru fiecare cultură. În plus, toate datele ar trebui să se prezinte sub formă de tabel.
      Nu este necesară verificarea unui răspuns pozitiv net. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferință prin modificarea condițiilor experimentale. Rezultatele negative necesită confirmare pentru fiecare caz. În cazurile în care se consideră că nu este necesară confirmarea rezultatelor negative, ar trebui să se ofere o justificare. Pentru testele de confirmare, atât a rezultatelor nesigure, cât și a celor negative, ar trebui să se aibă în vedere modificarea condițiilor experimentale pentru lărgirea gamei de condiții evaluate. Parametrii care ar putea fi modificați includ diferența dintre concentrații și condițiile de activare metabolică.
      2.2.   EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o creștere în funcție de concentrație sau o creștere reproductibilă a frecvenței mutanților. În primul rând, ar trebui să se aibă în vedere relevanța biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge și la ajutorul unor metode statistice. Semnificația statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv.
      Dacă rezultatele obținute pentru o substanță de testat nu îndeplinesc criteriile menționate anterior, se consideră că substanța respectivă nu este mutagenă în prezentul sistem.
      Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare, datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de repetări ale experimentului.
      Rezultatele pozitive ale unui test in vitro de mutație genică pe celule de mamifere indică faptul că substanța de testat produce mutații genice în celulele de mamifere, în cultură. Un rezultat concentrație-răspuns pozitiv reproductibil este foarte semnificativ. Rezultatele negative indică faptul că, în condiții experimentale, substanța de testat nu produce mutații genice în celulele de mamifere utilizate, în cultură.
      3.   RAPORTAREA
      RAPORTUL TESTULUI
      Raportul testului trebuie să conțină următoarele informații:
      
                   
               
               
                  Solventul/vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaște.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Celulele:
                  
                              —
                           
                           
                              tipul și sursa celulelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de culturi celulare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de reînsămânțări, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de întreținere a culturilor celulare, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              absența micoplasmei.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condițiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii concentrațiilor și numărului de culturi, inclusiv, de ex. datele de citotoxicitate și limitele de solubilitate, dacă sunt disponibile;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              compoziția mediului, concentrația CO2;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              concentrația substanței de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              volumul vehiculului și al substanței de testat adăugate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatura de incubare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              timpul de incubare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              durata tratamentului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              densitatea celulară în timpul tratamentului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tipul și compoziția sistemului de activare metabolică, inclusiv criteriile de acceptabilitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              martorii pozitivi și negativi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              timpul de manifestare (inclusiv numărul de celule însămânțate și reînsămânțate, programele de alimentare, dacă este cazul);
                           
                        
                              —
                           
                           
                              agenții selectivi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele utilizate pentru numărătoarea celulelor viabile și mutante;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              definirea coloniilor pentru care se ține seama de dimensiuni și de tip (inclusiv criteriile pentru coloniile «mici» și «mari», dacă este cazul).
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              semnele de precipitare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind valoarea pH-ului și osmolalitatea în timpul expunerii la substanța de testat, dacă s-au determinat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              dimensiunile coloniilor, dacă s-au determinat, cel puțin pentru martorii negativi și pozitivi;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              capacitatea laboratorului de a detecta mutanții în colonii mici cu sistemul TK+/- L5178Y, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relația doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analizele statistice, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) și pozitivi utilizați în paralel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele anterioare privind martorii negativi (solvent/vehicul) și pozitivi, cu domeniile, valorile medii și deviațiile standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              frecvența mutanților.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluziile.
               
            4.   BIBLIOGRAFIA
      
                  (1)
               
               
                  Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindal, K. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
               
            
                  (2)
               
               
                  Chu, E. H. Y. and Malling H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, pp. 1306-1312.
               
            
                  (3)
               
               
                  Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res. 94, pp. 467-485.
               
            
                  (4)
               
               
                  Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, pp. 394-403.
               
            
                  (5)
               
               
                  Aaron, C. S., and Stankowski, Jr. L. F., (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res. 223, pp. 121-128.
               
            
                  (6)
               
               
                  Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312, pp. 235-239.
               
            
                  (7)
               
               
                  Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, pp. 147-204.
               
            
                  (8)
               
               
                  Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 115, pp. 225-251.
               
            
                  (9)
               
               
                  Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U. S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 196, pp. 17-36.
               
            
                  (10)
               
               
                  Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutation Res., 189, pp. 135-141.
               
            
                  (11)
               
               
                  Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutation Res., 216, pp. 9-17.
               
            
                  (12)
               
               
                  Stankowski, L. F. Jr., Tindal,, K. R., and Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate — and ICR 191 Induced Mutation in AS52 Cells, Mutation Res., 160, pp. 133-147.
               
            
                  (13)
               
               
                  Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure for the L5178Y/TK+/- — TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, pp. 239-268.
               
            
                  (14)
               
               
                  Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, pp. 66-101.
               
            
                  (15)
               
               
                  Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome- Activated Dimethylnitrosamine, Mutation Res. 46, pp. 365-373.
               
            
                  (16)
               
               
                  Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res. 31, pp. 347-364.
               
            
                  (17)
               
               
                  Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/- — Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res. 59, pp. 61-108.
               
            
                  (18)
               
               
                  Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res. 113, pp. 173-215.
               
            
                  (19)
               
               
                  Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In Vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis 7, pp. 175-177.
               
            
                  (20)
               
               
                  Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
               
            
                  (21)
               
               
                  Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103.
               
            
                  (22)
               
               
                  Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.
               
            
                  (23)
               
               
                  Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 51-55.
               
            
                  (24)
               
               
                  Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C., Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluoronthymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK+/- — Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res. 151, pp. 161-174.
               
            
                  (25)
               
               
                  Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutation Res. 229, pp. 89-102.
               
            
                  (26)
               
               
                  Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- — 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, pp. 609-614.”
               
            
   ANEXA 4F
   
      „B.23.   TEST DE ABERAȚIE CROMOZOMIALĂ PE SPERMATOGONII DE MAMIFERE
      1.   METODA
      Prezenta metodă este reprodusă după orientarea OCDE TG 483, Testul de aberație cromozomială pe spermatogonii de mamifere (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Scopul testului in vivo de aberație cromozomială pe spermatogonii de mamifere constă în identificarea acelor substanțe care produc aberații cromozomiale ale structurii în celulele spermatogoniale ale mamiferelor (1) (2) (3) (4) (5). Aberațiile de structură pot fi de două tipuri, cromozomiale sau cromatidice. La majoritatea mutagenilor chimici, aberațiile induse sunt de tip cromatidic, dar se produc și aberații de tip cromozomial. Prezenta metodă nu este destinată determinării aberațiilor numerice și, în general, nu se utilizează în acest scop. Mutațiile cromozomiale și fenomenele conexe sunt cauza multor maladii genetice umane.
      Prezentul test determină fenomenele cromozomiale din celulele germinale spermatogoniale și, prin urmare, ar trebui să permită estimarea mutațiilor transmisibile produse în celulele germinale.
      Pentru test se utilizează, în general, rozătoare. Prezentul test citogenetic in vivo permite detectarea aberațiilor cromozomiale din mitozele spermatogoniale. Alte celule țintă nu fac obiectul prezentului test.
      Pentru detectarea aberațiilor de tip cromatidic din celulele spermatogoniale, ar trebui să se examineze prima diviziune celulară mitotică după tratament, înainte ca leziunile respective să se piardă în diviziunile celulare ulterioare. Prin analiza cromozomilor meiotici pentru detectarea aberațiilor de tip cromozomial în diakineză-metafaza I când celulele tratate se transformă în spermatocite, se pot obține informații suplimentare referitoare la celulele germinale spermatogoniale tratate.
      Prezentul test in vivo este destinat să verifice dacă mutagenii sunt la fel de activi în celulele germinale ca și în celulele somatice. În plus, testul pe spermatogonii este relevant în evaluarea riscului de mutagenitate, deoarece permite să se țină seama de factorii de metabolism in vivo, de farmacocinetică și de procesele de regenerare a ADN.
      Testiculele conțin un număr de generații de spermatogonii care prezintă sensibilități diferite la tratamentul chimic. Astfel, aberațiile detectate reprezintă un răspuns global al populațiilor de celule spermatogoniale tratate, în care predomină celulele spermatogoniale diferențiate, mai numeroase. În funcție de poziția în testicul, diferitele generații de spermatogonii pot să fie sau să nu fie expuse la substanțele prezente în circulația generală, datorită barierei fizice și fiziologice de celule Sertoli și barierei sânge-testicul.
      Dacă există dovezi că substanța de testat sau un metabolit reactiv nu va ajunge la țesutul țintă, nu este indicată utilizarea prezentului test.
      A se vedea și introducerea generală din partea B.
      1.2.   DEFINIȚII
      Aberație de tip cromatidic: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea cromatidelor singure sau prin divizarea și reuniunea între cromatide.
      Aberație de tip cromozomial: o leziune structurală a cromozomului, care se traduce prin divizarea sau divizarea și reuniunea ambelor cromatide în același loc.
      Lacună: leziune acromatică mai mică decât lățimea unei cromatide și cu o eroare minimă de aliniere a cromatidelor.
      Aberație numerică: modificare a numărului de cromozomi față de numărul normal caracteristic pentru animalele utilizate.
      Poliploidie: multiplicare a numărului (n) de cromozomi haploizi, alta decât diploidia (adică 3n, 4n etc.).
      Aberație structurală: modificare a structurii cromozomilor, detectabilă la examinarea microscopică a celulelor în stadiul de metafază al diviziunii acestora, care se prezintă sub formă de deleții, modificări intracromozomiale și intercromozomiale.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Animalele se expun la substanța de testat printr-o cale de expunere corespunzătoare și sunt sacrificate în momente corespunzătoare după tratament. Înainte de sacrificare, animalele se tratează cu o substanță de inhibare a metafazei (de ex. colchicină sau Colcemid®). Apoi, din celulele germinale, se realizează preparate cromozomiale care se colorează, iar celulele în metafază sunt analizate la microscop pentru detectarea aberațiilor cromozomiale.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
      1.4.1.   Preparatele
      1.4.1.1.   Selectarea speciilor de animale
      Se utilizează, de obicei, hamsteri chinezești și șoareci de sex masculin. Cu toate acestea, se pot utiliza masculi din orice altă specie de mamifere adecvată. Se recomandă utilizarea unor animale adulte tinere sănătoase, din sușe utilizate în mod curent în laborator. La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui să prezinte o variație minimă, ce nu trebuie să depășească ± 20 % din greutatea medie.
      1.4.1.2.   Condițiile de adăpost și hrană
      Se aplică condițiile generale menționate în introducerea generală din partea B, dar umiditatea atinsă ar trebui să fie de 50-60 %.
      1.4.1.3.   Pregătirea animalelor
      Animalele de sex masculin, adulte, tinere, sănătoase se distribuie în mod aleatoriu în grupe martor și grupe de tratament. Cuștile ar trebui să se aranjeze astfel încât posibilele efecte datorate amplasării acestora să fie reduse la minimum. Animalele sunt identificate individual. Se procedează la aclimatizarea animalelor la condițiile de laborator timp de minimum cinci zile înainte de începerea studiului.
      1.4.1.4.   Prepararea dozelor
      Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se prepare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare și să se dilueze, dacă este cazul, înainte de a fi administrate animalelor. Substanțele de testat lichide se pot administra direct sau dilua înainte de administrare. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanță de testat, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.
      1.4.2.   Condițiile de testare
      1.4.2.1.   Solventul/vehiculul
      Solventul/vehiculul nu ar trebui să producă efecte toxice la dozele utilizate și nu ar trebui să existe suspiciunea reacției chimice a acestuia cu substanța de testat. Utilizarea altor solvenți/vehiculi decât cei recunoscuți ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos.
      1.4.2.2.   Martorii
      Pentru fiecare test ar trebui să se prevadă martori pozitivi și negativi (solvent/vehicul), utilizați în paralel. Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, manipularea animalelor din grupele martor ar trebui să fie identică cu cea a animalelor din grupele tratate.
      Martorii pozitivi ar trebui să producă aberații structurale ale cromozomului in vivo la celule spermatogoniale, la nivelurile de expunere preconizate a genera o creștere detectabilă în raport cu fondul.
      Dozele de martor pozitiv ar trebui să fie alese astfel încât să se obțină efecte clare, dar fără să releve imediat examinatorului identitatea lamelelor codificate. Pentru martorul pozitiv, se poate accepta administrarea pe o cale diferită de cea prin care se administrează substanța de testat și doar o singură prelevare a probelor. În plus, se poate avea în vedere utilizarea unor martori pozitivi din aceeași clasă de produse chimice, dacă sunt disponibili. În tabelul următor se prezintă exemple de substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi:
      
                  Substanța
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. IESCE
               
            
                  ciclofosfamidă
               
               
                  50-18-0
               
               
                  200-015-4
               
            
                  ciclofosfamidă monohidrat
               
               
                  6055-19-2
               
               
                   
               
            
                  ciclohexilamină
               
               
                  108-91-8
               
               
                  203-629-0
               
            
                  mitomicină C
               
               
                  50-07-7
               
               
                  200-008-6
               
            
                  acrilamidă monomerică
               
               
                  79-06-1
               
               
                  201-173-7
               
            
                  trietilenmelamină
               
               
                  51-18-3
               
               
                  200-083-5
               
            Martorii negativi, tratați doar cu solvent sau cu vehicule și manipulați în același fel ca și grupele tratate, ar trebui să fie incluși la fiecare prelevare de probe, cu excepția cazului în care se dispune de date acceptabile privind variabilitatea interanimale și frecvența celulelor cu aberații cromozomiale, provenite de la martori anteriori. În plus, ar trebui să se utilizeze și martori netratați, cu excepția cazului în care există date de la martori anteriori sau publicate care să ateste că solventul/vehiculul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene.
      1.5.   MODUL DE LUCRU
      1.5.1.   Numărul de animale
      Fiecare grupă tratată și martor trebuie să includă minimum cinci animale de sex masculin, analizabile.
      1.5.2.   Modalitatea de tratare
      Substanțele de testat se administrează de preferință o dată sau de două ori (adică un singur tratament sau două tratamente). Substanțele de testat se mai pot administra în doze fracționate, adică două tratamente în aceeași zi la distanță de doar câteva ore, pentru a facilita administrarea unui volum mare de material. Alte modalități de administrare ar trebui să fie justificate în mod științific.
      La grupa cu doza maximă prelevarea probelor după tratament se realizează în două momente. Deoarece substanța de testat poate să influențeze kinetica ciclului celular, prima și ultima prelevare de probe se realizează la intervale de 24 de ore și respectiv de 48 de ore după tratament. Pentru alte doze decât doza maximă, prelevarea probelor ar trebui să se realizeze la un interval de 24 de ore sau la un interval de timp egal cu de 1,5 ori durata ciclului celular după tratament, cu excepția cazului în care se cunoaște un alt moment corespunzător de prelevare pentru detectarea efectelor (6).
      În plus, se pot utiliza și alte momente de prelevare. De exemplu, pentru produsele chimice care pot produce cromozomi întârziați sau pot să aibă efecte independente de faza S, o prelevare timpurie a probelor ar putea fi adecvată (1).
      Adecvarea unui tratament repetat ar trebui să se determine de la caz la caz. După un program de tratamente repetate, animalele ar trebui să fie sacrificate după 24 de ore (1,5 ori durata ciclului celular) de la ultimul tratament. Se pot utiliza momente suplimentare de prelevare a probelor, dacă este necesar.
      Înainte de sacrificare, se procedează la injectarea intraperitoneală a animalelor cu o doză corespunzătoare de substanță de inhibare a metafazei (de ex. Colcemid® sau colchicină). Probele de la animale se prelevează apoi la un interval corespunzător. Pentru șoareci intervalul respectiv este de aproximativ 3-5 ore; pentru hamsterii chinezești intervalul este de 4-5 ore.
      1.5.3.   Dozele
      Dacă, în lipsa datelor corespunzătoare, se realizează un studiu pentru stabilirea dozelor, acesta ar trebui să se realizeze în același laborator și să utilizeze aceeași specie, aceeași sușă de animale și același regim de tratare ca în studiul principal ce urmează (7). În caz de toxicitate, se utilizează trei doze diferite pentru prima prelevare. Aceste trei doze ar trebui să acopere un domeniu de toxicități de la toxicitatea maximă până la toxicitatea minimă sau lipsă. Pentru prelevările ulterioare se utilizează doar doza maximă. Doza maximă se definește ca doza ce produce astfel de semne de toxicitate încât dozele mai mari, administrate în același mod, se estimează că sunt letale.
      Substanțele cu activitate biologică specifică la doze mici netoxice (ca hormonii și mitogenii) pot face excepție de la criteriile de stabilire a dozelor și să fie stabilite pentru fiecare caz în parte. Doza maximă se mai poate defini ca doza care produce anumite semne de toxicitate în celulele spermatogoniale (de ex. o diminuare a proporției de mitoze spermatogoniale în raport cu prima și a doua metafază meiotică; reducerea respectivă nu ar trebui să fie mai mare de 50 %).
      1.5.4.   Test limită
      Dacă un test realizat cu o doză de minimum 2 000 mg/kg greutate corp, administrată într-o singură repriză sau în două reprize în aceeași zi, nu produce efecte toxice detectabile și dacă o genotoxicitate este improbabilă pe baza datelor referitoare la substanțe cu o structură apropiată, se poate considera că un studiu complet cu utilizarea a trei doze de mărimi diferite nu este necesar. În funcție de expunerea umană preconizată, ar putea fi necesară o doză mai mare în testul limită.
      1.5.5.   Administrarea dozelor
      Substanța de testat se administrează, de obicei, prin cavitatea nazală cu ajutorul unui tub stomacal sau al unei canule de intubație adaptate sau printr-o injecție intraperitoneală. Se pot accepta și alte căi de administrare, dacă se pot justifica. Volumul maxim de lichid care se poate administra prin sondă gastrică introdusă prin cavitatea nazală sau prin injecție într-o singură repriză depinde de dimensiunea animalului de laborator. Volumul ar trebui să fie mai mic sau egal cu 2 ml/100 g greutate corp. Utilizarea unor volume mai mari decât cel menționat ar trebui să se justifice. Cu excepția substanțelor iritante și corozive care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentrații mai mari, variația volumului testat ar trebui să fie redusă la minimum prin ajustarea concentrației, astfel încât să se asigure un volum constant pentru toate dozele.
      1.5.6.   Prepararea cromozomilor
      Imediat după sacrificare, suspensiile celulare obținute de la unul sau două testicule se expun la o soluție hipotonică și se fixează. Celulele se întind apoi pe lamele și se colorează.
      1.5.7.   Analiza
      Pentru fiecare animal ar trebui să se analizeze minimum 100 de celule în metafază, bine etalate (de ex. minimum 500 de celule în metafază pentru fiecare grupă). Dacă se observă un număr mai mare de aberații, numărul specificat se poate reduce. Toate lamelele, inclusiv cele cu celule de la martorii pozitivi și negativi, ar trebui să fie codificate independent înainte de examinarea la microscop. Deoarece metodele de preparare a lamelelor conduc adesea la scindarea unei fracții de celule în metafază cu pierdere de cromozomi, toate celulele examinate ar trebui, prin urmare, să conțină un număr de centromeri egal cu 2n ± 2.
      2.   DATELE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Se recomandă prezentarea sub formă de tabel a datelor pentru fiecare animal. Unitatea experimentală este animalul. Pentru fiecare animal, ar trebui să se evalueze numărul de celule cu aberații cromozomiale de structură și numărul de aberații cromozomiale per celulă. Diferitele tipuri de aberații cromozomiale de structură ar trebui să fie consemnate împreună cu numărul și frecvența acestora pentru grupele tratate și pentru grupele martor. Lacunele se consemnează și se raportează separat, dar în general acestea nu se includ în frecvența totală a aberațiilor.
      Dacă se observă concomitent mitoză și meioză, ar trebui să se determine raportul dintre mitozele spermatogoniale în prima, respectiv în a doua metafază meiotică; această determinare ar trebui să se realizeze pentru toate animalele tratate și cele martori negativi, pe un eșantion total de 100 de celule în diviziune pentru fiecare animal pentru a stabili un posibil efect citotoxic. Dacă se constată doar mitoză, ar trebui să se determine indexul mitotic în mimimum 1 000 de celule pentru fiecare animal.
      2.2.   EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Există câteva criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, ca o creștere în funcție de doză a numărului relativ de celule cu aberații cromozomiale sau o creștere netă a numărului de celule cu aberații la o singură doză și la o singură prelevare a probelor. În primul rând ar trebui să se aibă în vedere relevanța biologică a rezultatelor. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge și la ajutorul unor metode statistice (8). Semnificația statistică nu ar trebui să fie singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv. Rezultatele nesigure ar trebui să fie clarificate prin teste suplimentare, realizate de preferință printr-o modificare a condițiilor experimentale.
      Dacă rezultatele obținute pentru o substanță de testat nu îndeplinesc criteriile menționate anterior, se consideră că substanța respectivă nu este mutagenă în prezentul test.
      Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în unele cazuri rare, datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de repetări ale experimentului.
      Rezultatele pozitive ale unui test in vivo de aberație cromozomială pe celule spermatogoniale indică faptul că substanța de testat produce aberații cromozomiale de structură în celulele sexuale ale speciei testate. Rezultatele negative indică faptul că, în condițiile de testare, substanța de testat nu produce aberații cromozomiale în celulele germinale ale speciei testate.
      Ar trebui să se discute probabilitatea ca substanța de testat sau metaboliții acesteia să ajungă la țesutul țintă.
      3.   RAPORTAREA
      RAPORTUL TESTULUI
      Raportul testului trebuie să conțină următoarele informații:
      
                   
               
               
                  Solventul/vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaște.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animalele de laborator:
                  
                              —
                           
                           
                              specia/sușa utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul și vârsta animalelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursa, condițiile de adăpost și hrană etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul de greutate, greutatea medie și deviația standard pentru fiecare grupă.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condițiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dacă s-a realizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii dozelor utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea căii de administrare selectate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea substanței de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind administrarea substanței de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea momentelor de sacrificare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conversia concentrației substanței de testat (ppm) în hrană/apa de băut în doza reală (mg/kg greutate corp/zi), dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei și a apei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea amănunțită a modalităților de tratare și de prelevare a probelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de măsurare a toxicității;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              identitatea substanței de inhibare a metafazei, concentrația acesteia și durata tratamentului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de preparare a lamelelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile pentru numărătoarea aberațiilor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule analizate per animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              indexul mitotic;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              procentul de celule spermatogoniale în mitoză în raport cu cele din prima și a doua metafază meiotică;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              tipul și numărul aberațiilor, consemnate separat pentru fiecare animal;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul total de aberații pentru fiecare grupă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule cu aberații pentru fiecare grupă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relația doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              analizele statistice, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi studiați în paralel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele anterioare privind martorii negativi, cu domeniile, valorile medii și deviațiile standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii pozitivi studiați în paralel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              modificările ploidiei, dacă există.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluziile.
               
            4.   BIBLIOGRAFIA
      
                  (1)
               
               
                  Adler, I. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, pp. 477-484.
               
            
                  (2)
               
               
                  Adler, I. D., (1984), Cytogenetic tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, (ed.) S. Venitt and J. M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.
               
            
                  (3)
               
               
                  Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air-drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cytogenetics and Cell Genetics, 3, pp. 289-294.
               
            
                  (4)
               
               
                  Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
               
            
                  (5)
               
               
                  Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, Mutation Res., 52, pp. 207-209.
               
            
                  (6)
               
               
                  Adler, I. D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994), International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res., 312, pp. 313-318.
               
            
                  (7)
               
               
                  Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
               
            
                  (8)
               
               
                  Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clarc, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.”
               
            
   ANEXA 4G
   
      „B.39.   TEST IN VIVO DE SINTEZĂ NEPROGRAMATĂ A ADN (UDS) PE CELULE HEPATICE DE MAMIFERE
      1.   METODA
      Prezenta metodă este reprodusă după orientarea OCDE TG 486, Testul in vivo de sinteză neprogramată a ADN (UDS) pe celule hepatice de mamifere (1997).
      1.1.   INTRODUCERE
      Scopul testului in vivo de sinteză neprogramată a ADN (UDS) pe celule hepatice de mamifere este identificarea substanțelor de testat care induc regenerarea ADN în celulele hepatice ale animalelor (1) (2) (3) (4).
      Prezentul test in vivo oferă o metodă pentru studiul efectelor genotoxice ale produselor chimice în ficat. Efectul măsurat este o indicație a deteriorării ADN și a regenerării ulterioare a acestuia în celulele hepatice. Ficatul este, de obicei, principalul loc de metabolism al compușilor absorbiți. De aceea, este un loc corespunzător pentru determinarea in vivo a degradării ADN.
      Dacă există dovezi că substanța de testat nu ajunge la țesutul țintă, nu este indicată utilizarea prezentului test.
      Sinteza neprogramată a ADN (UDS) se determină prin încorporarea nucleozidelor marcate în celulele care nu suferă o sinteză programată (faza S) a ADN. Metoda utilizată cel mai frecvent constă în determinarea prin autoradiografie a timidinei marcate cu tritiu (3H-TdR) care a fost încorporată. Pentru testele in vivo, UDS se preferă utilizarea ficatului de șobolan. Se pot utiliza și alte țesuturi, dar acestea nu constituie obiectul prezentei metode.
      Detectarea unui răspuns UDS depinde de numărul de baze din ADN excizate și înlocuite la locul modificării. Prin urmare testul UDS este valoros în special pentru detectarea regenerării secvențelor lungi (20-30 de baze) induse de substanță. Spre deosebire de acestea, pentru detectarea regenerării secvențelor scurte (1-3 baze) este necesară o sensibilitate mult mai mică. În plus, datorită nereparării, unei reparări eronate sau a unei replicări eronate a leziunilor din ADN, pot apărea fenomene mutagene. Amploarea răspunsului UDS nu oferă nici o indicație despre fidelitatea procesului de regenerare. În plus, este posibilă reacția unui mutagen cu ADN, fără ca modificarea ADN rezultată să poată fi remediată printr-un proces de reparare prin excizie. În testul UDS, lipsa informațiilor specifice privind activitatea mutagenă este compensată de sensibilitatea potențială a acestui efect, care se poate măsura în totalitatea genomului.
      A se vedea și introducerea generală din partea B.
      1.2.   DEFINIȚII
      Celule în curs de reparare: număr net de grăunți nucleari (NNG) mai mare decât o valoare prestabilită, ce trebuie justificată de laboratorul care realizează testul.
      Număr net de grăunți nucleari (NNG): măsură cantitativă a activității UDS a celulelor în testele autoradiografice UDS, calculată prin scăderea numărului mediu de grăunți citoplasmici din zonele citoplasmice echivalente nucleului (CG) din numărul de grăunți nucleari (NG): NNG = NG-CG. NNG se calculează pentru celulele individuale, iar apoi se extrapolează pentru celulele dintr-o cultură, din culturi paralele etc.
      Sinteza neprogramată a ADN (UDS): sinteza reparării ADN după excizia și eliminarea unui fragment din ADN, ce conține o regiune deteriorată indusă de acțiunea unor substanțe chimice sau a unor agenți fizici.
      1.3.   PRINCIPIUL METODEI DE TESTARE
      Testul in vivo UDS pe celule hepatice de mamifere indică o sinteză de reparare a ADN după excizia și eliminarea unui fragment din ADN, ce conține o regiune deteriorată indusă de acțiunea unor substanțe chimice sau a unor agenți fizici. Testul se întemeiază, de obicei, pe încorporarea 3H-TdR în ADN-ul celulelor hepatice care prezintă o frecvență redusă de celule în faza S a ciclului celular. Încorporarea 3H-TdR se determină, de obicei, prin autoradiografie, deoarece această tehnică nu este sensibilă la interferența cu celulele în fază S, așa cum este, de exemplu, numărătoarea în scintilație lichidă.
      1.4.   DESCRIEREA METODEI
      1.4.1.   Preparatele
      1.4.1.1.   Selectarea speciei de animale
      Se utilizează, de obicei, șobolani, deși se poate utiliza orice specie de mamifere. Se recomandă utilizarea unor animale adulte tinere sănătoase din sușe folosite în mod curent în laborator. La începutul studiului, greutatea animalelor ar trebui să prezinte variații minime, ce nu trebuie să depășească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex.
      1.4.1.2.   Condițiile de adăpost și hrană
      Se aplică condițiile generale menționate în introducerea generală din partea B, dar umiditatea atinsă ar trebui să fie de 50-60 %.
      1.4.1.3.   Pregătirea animalelor
      Animalele adulte tinere sănătoase se distribuie în mod aleatoriu în grupe martor și grupe de tratament. Cuștile ar trebui să se aranjeze astfel încât posibilele efecte datorate amplasării acestora să fie reduse la minimum. Animalele sunt identificate individual și se țin în cuștile lor timp de minimum cinci zile înainte de începerea studiului, pentru a permite aclimatizarea acestora la condițiile de laborator.
      1.4.1.4.   Substanța de testat/prepararea
      Substanțele de testat în stare solidă ar trebui să se prepare sub formă de soluții sau suspensii în solvenții sau vehiculele corespunzătoare și să se dilueze, dacă este cazul, înainte de a fi administrate animalelor. Substanțele de testat lichide se pot administra direct sau dilua înainte de administrare. Se recomandă utilizarea preparatelor proaspete de substanță de testat, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în caz de păstrare.
      1.4.2.   Condițiile de testare
      1.4.2.1.   Solventul/vehiculul
      Solventul/vehiculul nu ar trebui să producă efecte toxice la dozele utilizate și nu ar trebui să existe suspiciunea reacției chimice a acestuia cu substanța de testat. Utilizarea altor solvenți/vehicule decât cele recunoscute ar trebui să fie justificată cu date care să demonstreze compatibilitatea acestora. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se prefere utilizarea unui solvent/vehicul apos.
      1.4.2.2.   Martorii
      Martorii pozitivi și negativi (solvent/vehicul) utilizați în paralel ar trebui să se includă în fiecare parte a experimentului, realizată independent. Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, manipularea animalelor din grupele martor ar trebui să fie identică cu cea a animalelor din grupele tratate.
      Martorii pozitivi ar trebui să fie substanțe despre care se știe că produc UDS atunci când se administrează în doze de expunere estimate a genera o creștere detectabilă în raport cu fondul. Martorii pozitivi care necesită o activare metabolică ar trebui să se utilizeze în doze care provoacă un răspuns moderat (4). Dozele se pot alege astfel încât să se obțină efecte clare, dar fără să releve imediat examinatorului identitatea lamelelor codificate. În tabelul următor se prezintă exemple de substanțe care se pot utiliza ca martori pozitivi:
      
                  Momentele de prelevare a probelor
               
               
                  Substanța
               
               
                  Nr. CAS
               
               
                  Nr. IESCE
               
            
                  Primele prelevări (2-4 ore)
               
               
                  N-nitrozodimetilamină
               
               
                  62-75-9
               
               
                  200-249-8
               
            
                  Ultimele prelevări (12-16 ore)
               
               
                  N-2-fluorenilacetamidă (2-AAF)
               
               
                  53-96-3
               
               
                  200-188-6
               
            Se pot utiliza și alte substanțe corespunzătoare ca martori pozitivi. Martorul pozitiv ar trebui să se administreze pe o cale diferită de cea pentru substanța de testat.
      1.5.   MODUL DE LUCRU
      1.5.1.   Numărul și sexul animalelor
      Ar trebui să se utilizeze un număr suficient de animale pentru a ține seama de variația răspunsului testului în funcție de natura biologică. Ar trebui să se utilizeze un număr de minimum trei animale analizabile din fiecare grupă. Dacă în momentul studiului există date acumulate din experimentele anterioare, sunt necesare doar unul sau două animale pentru grupele de martorii pozitivi și negativi analizate în paralel.
      Dacă în momentul studiului există date disponibile din studii pe aceleași specii, în care s-a folosit aceeași cale de expunere, care să demonstreze lipsa unor diferențe substanțiale de toxicitate între sexe, atunci va fi suficientă testarea pe animale de un singur sex, de preferință de sex masculin. Dacă expunerea umană la produse chimice este specifică sexului, ca în cazul unor produse farmaceutice, testul ar trebui să se realizeze pe animale de sexul corespunzător.
      1.5.2.   Modalitatea de tratare
      Substanțele se administrează în general într-o singură repriză.
      1.5.3.   Dozele
      În mod normal, se utilizează minimum două doze diferite. Doza maximă se definește ca doza ce produce astfel de semne de toxicitate, încât dozele mai mari, administrate în același mod, se estimează că sunt letale. În general, doza mai mică trebuie să fie egală cu 50 % până la 25 % din doza mare.
      Substanțele cu activitate biologică specifică la doze mici netoxice (ca hormonii și mitogenii) pot să facă excepție de la criteriile de stabilire a dozelor și ar trebui evaluate pentru fiecare caz în parte. Dacă, în lipsa datelor corespunzătoare, se realizează un studiu pentru stabilirea dozelor, acesta ar trebui să se realizeze în același laborator și să utilizeze aceeași specie, aceeași sușă de animale de același sex și regimul de tratare să fie același ca cel ce urmează să fie utilizat în studiul principal. Doza maximă se mai poate defini ca doza care produce anumite semne de toxicitate în ficat (de ex. nuclee picnotice).
      1.5.4.   Test limită
      Dacă un test realizat cu o doză de minimum 2 000 mg/kg greutate corp, administrată într-o singură repriză sau în două reprize în aceeași zi, nu produce efecte toxice detectabile și dacă o genotoxicitate este improbabilă pe baza datelor referitoare la substanțe cu o structură apropiată, se poate considera că un studiu complet nu este necesar. În funcție de expunerea umană preconizată, ar putea fi necesară o doză mai mare în testul limită.
      1.5.5.   Administrarea dozelor
      Substanța de testat se administrează, de obicei, prin cavitatea nazală cu ajutorul unui tub stomacal sau al unei canule de intubație adaptate. Se pot accepta și alte căi de administrare, dacă se pot justifica. Cu toate acestea, calea intraperitoneală nu se recomandă, deoarece probabilitatea de expunere a ficatului este mai mare decât la administrarea prin intermediul sistemului circulator. Volumul maxim de lichid care se poate administra prin sondă gastrică introdusă prin cavitatea nazală sau prin injecție într-o singură repriză depinde de dimensiunea animalului de laborator. Volumul ar trebui să fie mai mic sau egal cu 2 ml/100 g greutate corp. Utilizarea unor volume mai mari decât cel menționat ar trebui să se justifice. Cu excepția substanțelor iritante și corozive, care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentrații mai mari, variația volumului testat ar trebui să fie redusă la minimum prin ajustarea concentrației, astfel încât să se asigure un volum constant pentru toate dozele.
      1.5.6.   Prepararea celulelor hepatice
      Prelevarea celulelor hepatice de la animalele tratate se realizează, de obicei, după 12-16 ore de la administrarea dozei. În general, mai este necesară o prelevare (de obicei, după două până la patru ore de la tratament), cu excepția cazului în care există un răspuns pozitiv net după 12-16 ore, Cu toate acestea, se pot utiliza și alte momente de prelevare, dacă datele toxicokinetice justifică acest lucru.
      Culturile pe termen scurt de celule hepatice de mamifere se realizează, de obicei, perfuzând ficatul in situ cu colagenază și lăsând celulele hepatice proaspăt disociate să se fixeze pe o suprafață corespunzătoare. Celulele hepatice de la animale martori negativi ar trebui să aibă o viabilitate (5) de minimum 50 %.
      1.5.7.   Determinarea UDS
      Celulele hepatice proaspăt izolate se supun în general incubării într-un mediu, ce conține 3H-TdR, pentru o perioadă de timp corespunzătoare, de ex. trei până la opt ore. La încheierea perioadei de incubare, ar trebui ca mediul să fie îndepărtat de pe celule, care pot să fie incubate apoi într-un mediu, ce conține timidină nemarcată în exces, pentru diminuarea radioactivității neîncorporate («cold chase»). Celulele sunt apoi spălate, fixate și uscate. Pentru perioade de incubare mai lungi, s-ar putea ca procedeul «cold chase» să nu fie necesar. Lamelele sunt imersate în soluție autoradiografică, păstrate la întuneric (de ex. refrigerate timp de 7-14 zile), developate, colorate și apoi se procedează la numărarea grăunților de argint expuși. Pentru fiecare animal se pregătesc două până la trei lamele.
      1.5.8.   Analiza
      Preparatele depuse pe lamele ar trebui să conțină un număr suficient de celule cu o morfologie normală, pentru a permite o evaluare semnificativă a UDS. Preparatele se examinează la microscop pentru identificarea semnelor de citotoxicitate evidentă (de ex. picnoză, diminuarea nivelului de marcaj radioactiv).
      Se recomandă codificarea lamelelor înainte de numărătoarea grăunților. În general, pentru fiecare animal se identifică 100 de celule pe minimum două lamele; numărătoarea unui număr de celule mai mic de 100 pentru fiecare animal ar trebui justificată. Numărul de grăunți nu se determină pentru nucleele în fază S, dar se poate înregistra proporția de celule în faza S.
      Cantitatea de 3H-TdR încorporată în nucleele și citoplasma celulelor normale din punct de vedere morfologic, puse în evidență prin depunerea de grăunți de argint, ar trebui să se determine prin metode corespunzătoare.
      2.   DATELE
      2.1.   PRELUCRAREA REZULTATELOR
      Ar trebui să se prezinte date pentru fiecare lamelă și pentru fiecare animal. În plus, toate datele ar trebui să se prezinte sub formă de tabel. Numărul net de grăunți nucleari (NNG) ar trebui să se calculeze pentru fiecare celulă, pentru fiecare animal și pentru fiecare doză și moment de prelevare prin scăderea numărului CG din numărul NG. Dacă se face numărătoarea «celulelor în curs de reparare», ar trebui să se justifice criteriile folosite la definirea «celulelor în curs de reparare», care ar trebui să se întemeieze pe datele obținute din experimentele anterioare sau pe datele obținute pe martori negativi testați în paralel. Pentru evaluarea rezultatelor numerice se pot utiliza metode statistice. În acest caz, ar trebui, înaintea realizării studiului, să se selecteze și să se justifice testele statistice.
      2.2.   EVALUAREA ȘI INTERPRETAREA REZULTATELOR
      Exemplele de criterii de răspunsuri pozitive/negative includ:
      
         
      
                  pozitiv
               
               
                  (i)
               
               
                  valori ale NNG mai mari de o valoare-prag stabilită, care se justifică prin datele obținute în laborator în experimente anterioare;
               
            
                  sau
               
               
                  (ii)
               
               
                  valori ale NNG cu mult mai mari decât cele pentru martorul analizat în paralel;
               
            
                  negativ
               
               
                  (i)
               
               
                  valori ale NNG egale cu/mai mici decât valoarea-prag pentru martor, rezultată din experimente anterioare
               
            
                  sau
               
               
                  (ii)
               
               
                  valori ale NNG care nu sunt cu mult mai mari decât cele pentru martorul analizat în paralel.
               
            Ar trebui să se aibă în vedere relevanța biologică a rezultatelor: adică ar trebui să se țină seama de parametri ca variația între animale, relația doză-răspuns și citotoxicitatea. Pentru evaluarea rezultatelor testelor se poate recurge și la ajutorul unor metode statistice. Semnificația statistică nu ar trebui să fie totuși singurul factor determinant pentru a decide cu privire la un răspuns pozitiv.
      Deși majoritatea experimentelor vor da în mod clar rezultate pozitive sau negative, în anumite cazuri rare, datele stabilite vor exclude posibilitatea unei concluzii definitive cu privire la activitatea substanței de testat. Rezultatele pot să rămână nesigure sau discutabile independent de numărul de repetări ale experimentului.
      Un rezultat pozitiv al unui test UDS in vivo pe celule hepatice de mamifere indică faptul că substanța de testat produce leziuni in vivo ale ADN din celulele hepatice ale mamiferelor, care se pot remedia prin sinteza neprogramată a ADN in vitro. Un rezultat negativ indică faptul că, în condițiile experimentale, substanța de testat nu produce o deteriorare a ADN care să se poată detecta prin prezentul test.
      Ar trebui să se discute probabilitatea ca substanța de testat să ajungă în circulația generală sau la țesutul țintă (de ex. toxicitatea sistemică).
      3.   RAPORTAREA
      RAPORTUL TESTULUI
      Raportul testului trebuie să conțină următoarele informații:
      
                   
               
               
                  Solventul/vehiculul:
                  
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii vehiculului;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunoaște.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Animalele de laborator:
                  
                              —
                           
                           
                              specia/sușa utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul, vârsta și sexul animalelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sursa, condițiile de adăpost, regimul alimentar etc.;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              greutatea fiecărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul de greutate, greutatea medie și deviația standard pentru fiecare grupă.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Condițiile de testare:
                  
                              —
                           
                           
                              martorii pozitivi și negativi vehicul/solvent;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele din studiul pentru stabilirea dozelor, dacă s-a realizat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea alegerii dozelor utilizate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind prepararea substanței de testat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind modalitatea de administrare selectată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              justificarea căii de administrare alese;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metode de verificare pentru a constata dacă substanța de testat a ajuns în circulația generală sau în țesutul țintă, dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              conversia concentrației substanței de testat (ppm) în hrană/apa de băut în doza reală (mg/kg greutate corp/zi), dacă este cazul;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              detalii privind calitatea hranei și a apei;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              descrierea amănunțită a modalităților de tratare și de prelevare a probelor;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metodele de măsurare a toxicității;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metoda de preparare și de cultură a celulelor hepatice;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              metoda autoradiografică utilizată;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de lamele preparate și numărul de celule numărate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile de evaluare;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              criteriile utilizate la caracterizarea studiilor ca fiind pozitive, negative sau nesigure.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Rezultatele:
                  
                              —
                           
                           
                              valorile medii ale numărului de grăunți nucleari, grăunți citoplasmatici și numărului net de grăunți nucleari pentru fiecare lamelă, fiecare animal și fiecare grupă;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              relația doză-răspuns, dacă este posibil;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              evaluarea statistică, dacă există;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              semnele de toxicitate;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele privind martorii negativi (solvent/vehicul) și pozitivi studiați în paralel;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              datele anterioare privind martorii negativi (solvent/vehicul) și pozitivi, cu domeniile, valorile medii și deviațiile standard;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule «în curs de reparare», dacă s-a determinat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              numărul de celule în faza S, dacă s-a determinat;
                           
                        
                              —
                           
                           
                              viabilitatea celulelor.
                           
                        
            
                   
               
               
                  Discutarea rezultatelor.
               
            
                   
               
               
                  Concluziile.
               
            4.   BIBLIOGRAFIA
      
                  (1)
               
               
                  Ashby, J. Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. (1985), An Assessment of the In Vivo Rat. Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1-18.
               
            
                  (2)
               
               
                  Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987), A Protocol and Guide for the In Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutation Res., 189, pp. 123-133.
               
            
                  (3)
               
               
                  Kennelly, J. C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell, I. de G. (1993), In Vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M., (eds), Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 52-77.
               
            
                  (4)
               
               
                  Madle, S., Dean, S. W., Andrac, U., Brambilla. G., Burlinson, B., Doolittle, D. J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C. A. and Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests In Vitro and In Vivo, Mutation Res., 312, pp. 263-285.
               
            
                  (5)
               
               
                  Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl. C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the In Vivo/In Vitro DNA Repair Assay (UDS), Mutation Res., 291, pp. 21-27.
               
            
                  (6)
               
               
                  Mirsalis, J. C., Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), Detection of Genotoxic Carcinogens in the In Vivo/In Vitro Hepalocyte DNA Repair Assay, Environ. Mutagen, 4, pp. 553-562.”
               
            
   ANEXA 5
   
      A se vedea Directiva 2001/59/CE a Comisiei (JO L 225, 21.8.2001, p. 1).
   
   ANEXA 6
   
      
         „ANEXA IX
         PARTEA A
         Dispoziții privind sistemele de închidere de siguranță pentru copii
         În afară de dispozițiile prevăzute la articolul 22 alineatul (1) litera (e) din prezenta directivă, recipientele de orice capacitate, ce conțin substanțe periculoase în caz de aspirare (Xn; R65), și care sunt clasificate și etichetate în conformitate cu punctul 3.2.3 din anexa VI la prezenta directivă, cu excepția substanțelor introduse pe piață sub formă de aerosoli sau în recipiente prevăzute cu dispozitive de pulverizare fixate ermetic, sunt prevăzute cu sisteme de închidere de siguranță pentru copii.
         1.   Ambalaje care se reînchid
         Sistemele de închidere de siguranță pentru copii, cu care sunt prevăzute ambalajele care se reînchid, respectă standardul ISO 8317 (ediția din 1 iulie 1989) intitulat «Ambalaje de siguranță pentru copii - Cerințe și metode de încercare pentru ambalajele care se reînchid» adoptat de Organizația Internațională de Standardizare (ISO).
         2.   Ambalaje care nu se reînchid
         Sistemele de închidere de siguranță pentru copii, cu care sunt prevăzute ambalajele care nu se reînchid, respectă standardul CEN EN 862 (ediția din martie 1997) intitulat «Ambalarea – Ambalare de siguranță pentru copii – Cerințe și metode de încercare pentru ambalajele care nu se reînchid, destinate produselor farmaceutice» adoptat de Comitetul European pentru Standardizare (CEN).
         3.   Note
         
                     1.
                  
                  
                     Doar laboratoarele care îndeplinesc seria de standarde europene EN 45 000 sunt autorizate să certifice conformitatea cu standardele menționate anterior.
                  
               
                     2.
                  
                  
                     
                        Cazuri particulare
                     
                     Dacă pare evident că ambalarea prezintă siguranță suficientă pentru copii, deoarece aceștia din urmă nu pot accede la conținut fără ajutorul unui instrument, nu mai este necesară realizarea testului.
                     Pentru toate celelalte cazuri, în care există motive suficiente de îndoială cu privire la eficiența sistemului de închidere de siguranță pentru copii, autoritatea națională poate solicita persoanei responsabile cu introducerea pe piață a produsului să-i prezinte un certificat de la un laborator, definit la punctul 3.1, care să precizeze următoarele:
                     
                                 —
                              
                              
                                 că tipul sistemului de închidere utilizat este de așa natură încât nu necesită teste conform standardelor ISO și CEN menționate anterior
                                 sau
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 că sistemul de închidere a fost supus la teste și s-a constatat că se conformează standardelor menționate anterior.
                              
                           
               PARTEA B
         Dispoziții referitoare la dispozitivele de avertizare tactilă
         Specificațiile tehnice pentru dispozitivele de avertizare tactilă se conformează standardului EN ISO 11683 (ediția din 1997) intitulat «Ambalarea - Avertizarea tactilă privind pericolul - Cerințe».”