CELEX: 32007R0702
Language: hr
Date: 2007-06-21 00:00:00
Title: Uredba Komisije (EZ) br. 702/2007 od 21. lipnja 2007. o izmjeni Uredbe Komisije (EEZ) br. 2568/91 o karakteristikama maslinovog ulja i ulja komine maslina te o odgovarajućim metodama analize

03/Sv. 022
            
            
               HR
            
            
               Službeni list Europske unije
            
            
               149
            
         32007R0702
   
               L 161/11
            
            
               SLUŽBENI LIST EUROPSKE UNIJE
            
            
               21.06.2007.
            
         
      UREDBA KOMISIJE (EZ) br. 702/2007
   od 21. lipnja 2007.
   o izmjeni Uredbe Komisije (EEZ) br. 2568/91 o karakteristikama maslinovog ulja i ulja komine maslina te o odgovarajućim metodama analize
   KOMISIJA EUROPSKIH ZAJEDNICA,
   uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske zajednice,
   uzimajući u obzir Uredbu Vijeća (EZ) br. 865/2004 od 29. travnja 2004. o zajedničkoj organizaciji tržišta maslinovog ulja i stolnih maslina i o izmjeni Uredbe (EEZ) br. 827/68 (1), a posebno njezin članak 5. stavak 3.,
   budući da:
   
               (1)
            
            
               Uredbom Komisije (EEZ) br. 2568/91 (2) određena su fizikalna i kemijska svojstva maslinovih ulja i ulja komine maslina te metode analize tih svojstava. Ove metode, i granične vrijednosti za karakteristike ulja, treba ažurirati na temelju mišljenja kemijskih stručnjaka i u skladu s aktivnostima koje se odvijaju unutar Međunarodnog vijeća za maslinovo ulje.
            
         
               (2)
            
            
               Posebno su kemijski stručnjaci zaključili da je određivanje količinskog postotka 2-gliceril monopalmitata preciznije za otkrivanje esterificiranih ulja. Smanjivanje granične vrijednosti za stigmastadien u djevičanskim maslinovim uljima također omogućava postizanje boljeg odvajanja djevičanskih maslinovih ulja i rafiniranih maslinovih ulja.
            
         
               (3)
            
            
               Kako bi se omogućilo razdoblje prilagodbe novim normama, te dalo vremena za uvođenje sredstava potrebnih za njihovu primjenu te kako bi se izbjegle smetnje u trgovinskim transakcijama, izmjene ovoj Uredbi se neće primjenjivati do 1. siječnja 2008. Iz istih razloga je potrebno donijeti odredbu za stavljanje na tržište do iscrpljenja svih zaliha maslinovog ulja i ulja komine maslina koje je zakonito proizvedeno i označeno u Zajednici ili je zakonito uvezeno u Zajednicu i pušteno u slobodan promet prije tog datuma.
            
         
               (4)
            
            
               Mjere predviđene ovom Uredbom u skladu su s mišljenjem Upravljačkog odbora za maslinovo ulje i stolne masline,
            
         DONIJELA JE OVU UREDBU:
   Članak 1.
   Uredba (EEZ) br. 2568/91 mijenja se kako slijedi:
   
               1.
            
            
               Šesta alineja članka 2. stavka 1. zamjenjuje se sljedećim:
               
                           „—
                        
                        
                           za određivanje postotka 2-gliceril monopalmitata, metoda postavljena u Prilogu VII.,”.
                        
                     
         
               2.
            
            
               Prilozi su izmijenjeni u skladu s Prilogom ovoj Uredbi.
            
         Članak 2.
   Ova Uredba stupa na snagu trećeg dana od dana objave u Službenom listu Europske unije.
   Ova Uredba se primjenjuje od 1. siječnja 2008.
   Međutim, proizvodi koji su zakonito proizvedeni i označeni u Zajednici ili zakonito uvezeni u Zajednicu i pušteni u slobodan promet do 1. siječnja 2008. mogu se stavljati na tržište do iscrpljenja svih zaliha.
   
      Ova je Uredba u cijelosti obvezujuća i izravno se primjenjuje u svim državama članicama.
      Sastavljeno u Bruxellesu 21. lipnja 2007.
      
         
            Za Komisiju
         
         Mariann FISCHER BOEL
         
         
            Članica Komisije
         
      
   
   
      (1)  SL L 161, 30.4.2004., str. 97., ispravljena u SL L 206, 9.6.2004., str. 37.
   
      (2)  SL L 248, 5.9.1991., str. 1. Uredba kako je zadnje izmijenjena Uredbom (EZ) br. 1989/2003 (SL L 295, 13.11.2003., str. 57.).
   PRILOG
   Prilozi Uredbe (EEZ) br. 2568/91 mijenjaju se kako slijedi:
   
               1.
            
            
               sažetak se mijenja kako slijedi:
               
                           (a)
                        
                        
                           naslov Priloga II. zamjenjuje se sljedećim:
                           „Određivanje masnih kiselina, hladna metoda”;
                        
                     
                           (b)
                        
                        
                           naslov Priloga VII. zamjenjuje se sljedećim:
                           „Određivanje postotka 2-gliceril monopalmitata”;
                        
                     
         
               2.
            
            
               Prilog I. zamjenjuje se sljedećim:
               
                  „PRILOG I.
                  OBILJEŽJA MASLINOVOG ULJA
                  
                     Bilješke:
                  
                  
                              (a)
                           
                           
                              Rezultati testova moraju biti izraženi istim brojem decimalnih mjesta kojim je izražena svaka karakteristika.
                              Zadnja znamenka mora se uvećati za jednu jedinicu ako je znamenka koja slijedi veća od 4.
                           
                        
                              (b)
                           
                           
                              Ako samo jedno obilježje ne odgovara navedenim vrijednostima, ulje se mora svrstati u drugu kategoriju ili deklarirati kao da nije usklađeno u smislu čistoće za potrebe ove Uredbe.
                           
                        
                              (c)
                           
                           
                              Ako je karakteristika označena zvjezdicom (*), u odnosu na kakvoću ulja, to znači sljedeće:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          za maslinovo ulje lampante, obje relevantne granice mogu biti različite od navedenih vrijednosti istodobno;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          za djevičanska maslinova ulja, ako je najmanje jedna od navedenih granica različita od navedenih vrijednosti, kategorija ulja se mijenja, iako će ista još uvijek biti klasificirana u jednoj od kategorija djevičanskog maslinovog ulja.
                                       
                                    
                        
                              (d)
                           
                           
                              Ako je karakteristika označena s dvije zvjezdice (**), u odnosu na kakvoću ulja, to znači da za sve vrste ulja komine maslina obje odnosne granice mogu biti različite od navedenih vrijednosti istodobno.’
                           
                        
                              Kategorija
                           
                           
                              Kiselost
                              (%)(*)
                           
                           
                              Peroksidni broj
                              meq 02/kg(*)
                           
                           
                              Voskovi
                              mg/kg(**)
                           
                           
                              2-gliceril monopalmitat
                              (%)
                           
                           
                              Stigmastadien
                              mg/kg (1)
                              
                           
                           
                              Razlika: između ECN42 (HPLC) i teoretskog izračuna ECN42
                           
                           
                              K232(*)
                           
                           
                              K270(*)
                           
                           
                              Delta-K(*)
                           
                           
                              Organoleptička ocjena medijan mana
                              (Md) (*)
                           
                           
                              Organoleptička ocjena medijan voćnosti
                              (Mf) (*)
                           
                        
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          Ekstra djevičansko maslinovo ulje
                                       
                                    
                           
                              ≤ 0,8
                           
                           
                              ≤ 20
                           
                           
                              ≤ 250
                           
                           
                              ≤ 0,9 ako je % ukupne palmitinske kiseline ≤ 14
                              ≤ 1,0 if total palmitic acid % > 14
                           
                           
                              ≤ 0,10
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 2,50
                           
                           
                              ≤ 0,22
                           
                           
                              ≤ 0,01
                           
                           
                              Md = 0
                           
                           
                              Mf > 0
                           
                        
                              
                                          2.
                                       
                                       
                                          Djevičansko maslinovo ulje
                                       
                                    
                           
                              ≤ 2,0
                           
                           
                              ≤ 20
                           
                           
                              ≤ 250
                           
                           
                              ≤ 0,9 ako je % ukupne palmitinske kiseline ≤ 14
                              ≤ 1,0 if total palmitic acid % > 14
                           
                           
                              ≤ 0,10
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 2,60
                           
                           
                              ≤ 0,25
                           
                           
                              ≤ 0,01
                           
                           
                              Md ≤ 2,5
                           
                           
                              Mf > 0
                           
                        
                              
                                          3.
                                       
                                       
                                          Maslinovo ulje lampante
                                       
                                    
                           
                              > 2,0
                           
                           
                              —
                           
                           
                              ≤ 300 (3)
                              
                           
                           
                              ≤ 0,9 ako je % ukupne palmitinske kiseline ≤ 14
                              ≤ 1,1 if total palmitic acid % > 14
                           
                           
                              ≤ 0,50
                           
                           
                              ≤ 0,3
                           
                           
                              —
                           
                           
                              —
                           
                           
                              —
                           
                           
                              Md > 2,5 (2)
                              
                           
                           
                              —
                           
                        
                              
                                          4.
                                       
                                       
                                          Rafinirano maslinovo ulje
                                       
                                    
                           
                              ≤ 0,3
                           
                           
                              ≤ 5
                           
                           
                              ≤ 350
                           
                           
                              ≤ 0,9 ako je % ukupne palmitinske kiseline ≤ 14
                              ≤ 1,1 if total palmitic acid % > 14
                           
                           
                              —
                           
                           
                              ≤ 0,3
                           
                           
                              —
                           
                           
                              ≤ 1,10
                           
                           
                              ≤ 0,16
                           
                           
                              —
                           
                           
                              —
                           
                        
                              
                                          5.
                                       
                                       
                                          Maslinovo ulje – mješavina rafiniranog i djevičanskog maslinovog ulja
                                       
                                    
                           
                              ≤ 1,0
                           
                           
                              ≤ 15
                           
                           
                              ≤ 350
                           
                           
                              ≤ 0,9 ako je % ukupne palmitinske kiseline ≤ 14
                              ≤ 1,0 if total palmitic acid % > 14
                           
                           
                              —
                           
                           
                              ≤ 0,3
                           
                           
                              —
                           
                           
                              ≤ 0,90
                           
                           
                              ≤ 0,15
                           
                           
                              —
                           
                           
                              —
                           
                        
                              
                                          6.
                                       
                                       
                                          Sirovo ulje komine maslina
                                       
                                    
                           
                              —
                           
                           
                              —
                           
                           
                              > 350 (4)
                              
                           
                           
                              ≤ 1,4
                           
                           
                              —
                           
                           
                              ≤ 0,6
                           
                           
                              —
                           
                           
                              —
                           
                           
                              —
                           
                           
                              —
                           
                           
                              —
                           
                        
                              
                                          7.
                                       
                                       
                                          Rafinirano ulje komine maslina
                                       
                                    
                           
                              ≤ 0,3
                           
                           
                              ≤ 5
                           
                           
                              > 350
                           
                           
                              ≤ 1,4
                           
                           
                              —
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              —
                           
                           
                              ≤ 2,00
                           
                           
                              ≤ 0,20
                           
                           
                              —
                           
                           
                              —
                           
                        
                              
                                          8.
                                       
                                       
                                          Ulje komine maslina
                                       
                                    
                           
                              ≤ 1,0
                           
                           
                              ≤ 15
                           
                           
                              > 350
                           
                           
                              ≤ 1,2
                           
                           
                              —
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              —
                           
                           
                              ≤ 1,70
                           
                           
                              ≤ 0,18
                           
                           
                              —
                           
                           
                              —
                           
                        
                     
                  
                              Kategorija
                           
                           
                              Sastav kiselina (5)
                              
                           
                           
                              Zbroj transoleinskih izomera
                              (%)
                           
                           
                              Zbroj translinolnih i translinolenskih izomera
                              (%)
                           
                           
                              Sastav sterola
                           
                           
                              UkupAN steroli
                              (mg/kg)
                           
                           
                              Eritrodiol i uvaol
                              (%)(**)
                           
                        
                              Miristinska
                              (%)
                           
                           
                              Linolenska
                              (%)
                           
                           
                              Arašidna
                              (%)
                           
                           
                              Eikosenoinska
                              (%)
                           
                           
                              Behenska
                              (%)
                           
                           
                              Lignocerinska
                              (%)
                           
                           
                              Kolesterol
                              (%)
                           
                           
                              Brasikasterol
                              (%)
                           
                           
                              Kampesterol
                              (%)
                           
                           
                              Stigmasterol
                              (%)
                           
                           
                              Betasitosterol
                              (%) (6)
                              
                           
                           
                              Delta-7-stigmasterol
                              (%)
                           
                        
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          Ekstra djevičansko maslinovo ulje
                                       
                                    
                           
                              ≤ 0,05
                           
                           
                              ≤ 1,0
                           
                           
                              ≤ 0,6
                           
                           
                              ≤ 0,4
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 0,05
                           
                           
                              ≤ 0,05
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≤ 0,1
                           
                           
                              ≤ 4,0
                           
                           
                              < Kamp.
                           
                           
                              ≥ 93,0
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≥ 1 000
                           
                           
                              ≤ 4,5
                           
                        
                              
                                          2.
                                       
                                       
                                          Djevičansko maslinovo ulje
                                       
                                    
                           
                              ≤ 0,05
                           
                           
                              ≤ 1,0
                           
                           
                              ≤ 0,6
                           
                           
                              ≤ 0,4
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 0,05
                           
                           
                              ≤ 0,05
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≤ 0,1
                           
                           
                              ≤ 4,0
                           
                           
                              < Kamp.
                           
                           
                              ≥ 93,0
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≥ 1 000
                           
                           
                              ≤ 4,5
                           
                        
                              
                                          3.
                                       
                                       
                                          Maslinovo ulje lampante
                                       
                                    
                           
                              ≤ 0,05
                           
                           
                              ≤ 1,0
                           
                           
                              ≤ 0,6
                           
                           
                              ≤ 0,4
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 0,10
                           
                           
                              ≤ 0,10
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≤ 0,1
                           
                           
                              ≤ 4,0
                           
                           
                              —
                           
                           
                              ≥ 93,0
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≥ 1 000
                           
                           
                              ≤ 4,5 (7)
                              
                           
                        
                              
                                          4.
                                       
                                       
                                          Rafinirano maslinovo ulje
                                       
                                    
                           
                              ≤ 0,05
                           
                           
                              ≤ 1,0
                           
                           
                              ≤ 0,6
                           
                           
                              ≤ 0,4
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 0,20
                           
                           
                              ≤ 0,30
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≤ 0,1
                           
                           
                              ≤ 4,0
                           
                           
                              < Kamp.
                           
                           
                              ≥ 93,0
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≥ 1 000
                           
                           
                              ≤ 4,5
                           
                        
                              
                                          5.
                                       
                                       
                                          Maslinovo ulje – mješavina rafiniranog i djevičanskog maslinovog ulja
                                       
                                    
                           
                              ≤ 0,05
                           
                           
                              ≤ 1,0
                           
                           
                              ≤ 0,6
                           
                           
                              ≤ 0,4
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 0,20
                           
                           
                              ≤ 0,30
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≤ 0,1
                           
                           
                              ≤ 4,0
                           
                           
                              < Kamp.
                           
                           
                              ≥ 93,0
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≥ 1 000
                           
                           
                              ≤ 4,5
                           
                        
                              
                                          6.
                                       
                                       
                                          Sirovo ulje komine maslina
                                       
                                    
                           
                              ≤ 0,05
                           
                           
                              ≤ 1,0
                           
                           
                              ≤ 0,6
                           
                           
                              ≤ 0,4
                           
                           
                              ≤ 0,3
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 0,20
                           
                           
                              ≤ 0,10
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 4,0
                           
                           
                              —
                           
                           
                              ≥ 93,0
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≥ 2 500
                           
                           
                              > 4,5 (8)
                              
                           
                        
                              
                                          7.
                                       
                                       
                                          Rafinirano ulje komine maslina
                                       
                                    
                           
                              ≤ 0,05
                           
                           
                              ≤ 1,0
                           
                           
                              ≤ 0,6
                           
                           
                              ≤ 0,4
                           
                           
                              ≤ 0,3
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 0,40
                           
                           
                              ≤ 0,35
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 4,0
                           
                           
                              < Kamp.
                           
                           
                              ≥ 93,0
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≥ 1 800
                           
                           
                              > 4,5
                           
                        
                              
                                          8.
                                       
                                       
                                          Ulje komine maslina
                                       
                                    
                           
                              ≤ 0,05
                           
                           
                              ≤ 1,0
                           
                           
                              ≤ 0,6
                           
                           
                              ≤ 0,4
                           
                           
                              ≤ 0,3
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 0,40
                           
                           
                              ≤ 0,35
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≤ 0,2
                           
                           
                              ≤ 4,0
                           
                           
                              < Kamp.
                           
                           
                              ≥ 93,0
                           
                           
                              ≤ 0,5
                           
                           
                              ≥ 1 600
                           
                           
                              > 4,5
                           
                        
            
         
               3.
            
            
               Dodatak I. mijenja se kako slijedi:
               
                           (a)
                        
                        
                           prva alineja zamjenjuje se sljedećim:
                           
                                       
                                                   „—
                                                
                                                
                                                   Kiselost
                                                
                                             
                                    
                                       Prilog II.
                                    
                                    
                                       Određivanje slobodnih masnih kiselina, hladna metoda”;
                                    
                                 
                     
                           (b)
                        
                        
                           trinaesta alineja zamjenjuje se sljedećim:
                           
                                       
                                                   „—
                                                
                                                
                                                   Zasićene masne kiseline u položaju 2.
                                                
                                             
                                    
                                       Prilog VII.
                                    
                                    
                                       Određivanje postotka 2-gliceril monopalmitata”;
                                    
                                 
                     
         
               4.
            
            
               naslov Priloga II. zamjenjuje se sljedećim:
            
         
               5.
            
            
               Prilog IV. zamjenjuje se sljedećim:„
                  PRILOG IV.
                  
                     ODREĐIVANJE SADRŽAJA VOSKA KAPILARNOM PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM
                  
                  1.   PREDMET
                  Ova metoda opisuje postupak za određivanje sadržaja voska u maslinovim uljima. Voskovi se odvajaju prema broju njihovih atoma ugljika. Metoda se posebno može koristiti za razlikovanje maslinovog ulja dobivenog prešanjem i onog dobivenog ekstrakcijom (ulje komine maslina).
                  2.   PRINCIP
                  Dodaje se odgovarajući interni standard masti ili ulju, potom frakcioniramo pomoću kromatografije na hidratiziranoj koloni od silikagela. Frakcija koja je u početku eluirana u uvjetima testiranja, (čija je polarnost slabija od polarnosti triglicerida), vraća se i neposredno analizira kapilarnom plinskom kromatografijom.
                  3.   OPREMA
                  3.1   Erlenmeyerova tikvica volumena 25 ml.
                  3.2.   Staklena kolona za plinsku kromatografiju, unutarnjeg promjer 15,0 mm, dužine 30 do 40 cm, s pipcem.
                  3.3.   Odgovarajući plinski kromatograf s kapilarnom kolonom, opremljen sustavom za neposredno uvođenje u kolonu koji se sastoji od sljedećeg:
                  3.3.1.   Termostatska komora za kolone, opremljena regulatorom temperature.
                  3.3.2.   Hladni injektor za izravno unošenje u kolonu.
                  3.3.3.   Plameno-ionizacijski detektor i pretvarač s pojačalom.
                  3.3.4.   Snimač-integrator kompatibilan s pretvaračem s pojačalom (3.3.3.), s vremenom reakcije koje nije dulje od jedne sekunde i s varijabilnom brzinom papira. (Također je moguće koristiti kompjutorizirane sustave koji omogućavaju dobivanje podataka o plinskoj kromatografiji putem osobnog računala.)
                  3.3.5.   Staklena ili kvarcna kapilarna kolona dužine 8 do 12 m, unutarnjeg promjera od 0,25 do 0,32 mm, s tekućom fazom, s ujednačenom debljinom filma između 0,10 i 0,30 μm. (Na tržištu su dostupne tekuće faze pogodne za tu svrhu tipa SE-52 ili SE-54.)
                  3.4.   Mikroštrcaljka za izravno unošenje u kolonu volumena 10 μl s čvrsto fiksiranom iglom.
                  3.5.   Električna tresilica.
                  3.6.   Rotirajući isparivač.
                  3.7.   Visokotemperaturna peć.
                  3.8.   Analitička vaga sa zajamčenom preciznošću od ± 0,1 mg.
                  3.9.   Uobičajeno laboratorijsko stakleno suđe.
                  4.   REAGENSI
                  4.1.   Silikagel veličine zrna između 60 i 200 μm.
                  Silikagel staviti na četiri sata u peć na 500 °C. Nakon hlađenja, dodati 2 % vode u odnosu na količinu uzorkovanog silikagela. Dobro protresti da se suspenzija homogenizira. Čuvati na tamnom mjestu najmanje 12 sati prije uporabe.
                  4.2.   n-heksan, za kromatografiju.
                  4.3.   dietilni eter, za kromatografiju.
                  4.4.   n-heptan, za kromatografiju.
                  4.5.   Standardna otopina lauril arahidata koncentracije 0,1 % (m/v) u heksanu (interni standard). (Moguće je koristiti palmitil palmitat ili miristil stearat.)
                  4.5.1.   Sudan 1 (1-fenil-azo-2-naftol).
                  
                  4.6.   Plin nosač: vodik ili helij, plinsko-kromatografska čistoća.
                  4.7.   Pomoćni plinovi:
                  
                              —
                           
                           
                              vodik, čistoće za plinsku kromatografiju,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              zrak, čistoće za plinsku kromatografiju.
                           
                        5.   POSTUPAK
                  5.1.   Priprema kromatografske kolone.
                  
                  Otopiti 15 g silikagela (4.1.) u n-heksanu (4.2.) i unijeti u kolonu (3.2.). Ostaviti da se samo slegne. Dovršiti taloženje pomoću električne tresilice (3.5.) kako bi se postigao što ujednačeniji kromatografski sloj. Propustiti 30 ml n-heksana kako bi se odstranile sve eventualne nečistoće. Korištenjem vage (3.8.) odvagati točno 500 mg uzorka u Erlenmeyerovu tikvicu volumena 25 ml (3.1.), dodati odgovarajuću količinu internog standarda (4.5.), ovisno o pretpostavljenom sadržaju voska. Na primjer, dodati 0,1 mg lauril arahidata za maslinovo ulje i 0,25 do 0,5 mg za ulje komine maslina. Prenijeti pripravljen uzorak na kromatografsku kolonu pomoću dva puta po 2 ml n-heksana (4.2.).
                  Otapalo ispuštati dok ne dostigne 1 mm iznad gornje razine absorbenta, potom filtrirati daljnjih 70 ml n-heksana kako bi se uklonili prirodno prisutni n-alkani. Potom započeti kromatografsko eluiranje sakupljanjem 180 ml mješavine n-heksana/dietilnog etera (omjer 99:1), pri brzini protoka od oko 15 kapi svakih 10 sekundi. Eluiranje uzorka se izvodi na sobnoj temperaturi pri 22 ± 4 °C.
                  
                     BILJEŠKA:
                  
                  
                              —
                           
                           
                              Mješavina n-heksana/dietilnog etera, (99:1), priprema se svakodnevno.
                           
                        
                              —
                           
                           
                              Za vizualnu provjeru ispravnog eluiranja voskova, može se dodati 100 μm 1 % sudana iz elucijske mješavine u uzorak u otopini. S obzirom da bojilo ima retenciju između voskova i triglicerida, kad obojenje dostigne dno kolone, elucijsku otopinu treba otopiti jer će tada svi voskovi biti eluirani.
                           
                        Osušiti tako dobivenu frakciju u rotirajućem isparivaču (3.6.) dok se ne ukloni gotovo svo otapalo. Ukloniti preostala 2 ml otpala pomoću slabe struje dušika; potom dodati 2-4 ml n-heptana.
                  5.2.   Analiza plinskom kromatografijom
                  
                  5.2.1.   Pripremne radnje
                  
                  Postaviti kolonu na plinski kromatograf (3.3) spajajući ulazni otvor na sustav neposredno na koloni i izlazni otvor na detektor. Obaviti opću provjeru plinskog kromatografa (funkcioniranje protoka plina, učinkovitost detektora i snimača itd.).
                  Ako se kolona koristi po prvu put, potrebno ju je najprije kondicionirati. Pustiti da kroz kolonu proteče malo plina, potom uključiti plinski kromatograf. Postupno zagrijavati do dostizanja temperature od 350 °C nakon približno četiri sata. Održavati temperaturu najmanje dva sata te potom regulirati aparat na radne uvjete, (reguliranje protoka plina, paljenje plamena, spoj na elektronički snimač (3.3.4), prilagođavanje temperature peći za kolonu, prilagođavanje detektora itd.), i zapisati signal pri osjetljivosti koja je najmanje dvostruka od one koju zahtijeva analiza. Bazna linija mora biti linearna, bez pikova i bez bilo kakvih znakova otklona.
                  Negativan pravocrtni otklon ukazuje da spojevi kolone nisu dobro postavljeni; pozitivan otklon da kolona nije pravilno kondicionirana.
                  5.2.2.   Odabir radnih uvjeta
                  
                  Radni uvjeti su uglavnom sljedeći:
                  
                              —
                           
                           
                              temperatura kolone:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          20 °C/minuti
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                          5 °C/minuti
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                          20 °C/minuti
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    
                                          Inicijalno 80 °C
                                          (1’)
                                       
                                       
                                          →
                                       
                                       
                                          240 °C
                                       
                                       
                                          →
                                       
                                       
                                          325 °C
                                          (6’)
                                       
                                       
                                          →
                                       
                                       
                                          340 °C
                                          (10’)
                                       
                                    
                        
                              —
                           
                           
                              temperatura detektora: 350 °C,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              količina ubrizgane tvari: 1 μl otopine n-heptana (2-4ml),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              plin nosač: helij ili vodik pri ispravnoj linearnoj brzini za odabrani plin (vidjeti Dodatak),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              osjetljivost instrumenta: pogodno za sljedeće uvjete:
                           
                        Uvjete se može modificirati u skladu s karakteristikama kolone i plinskog kromatografa kako bi se dobilo odvajanje svih voskova i zadovoljavajuća rezolucija pika, (vidjeti sliku); retencijsko vrijeme internog standarda C32 mora biti 18 ± 3 minute. Najreprezentativniji pik voska mora biti najmanje 60 % pune skale.
                  Parametre za integraciju pikova potrebno je odrediti na takav način da se postigne ispravna procjena površine pikova koje se analizira.
                  
                     BILJEŠKA: Zbog visoke konačne temperature, dopušten je pozitivan otklon od najviše 10 % pune skale.
                  5.3.   Provođenje analize
                  
                  Pomoću mikroštrcaljke volumena 10 μl unosi se 1 μl otopine; klip štrcaljke izvući dok se igla ne isprazni. Iglu uvesti u sustav za injektiranje i nakon 1-2 sekunde brzo injektirati; nakon otprilike pet sekundi, lagano izvući iglu.
                  Bilježiti sve dok voskovi nisu u potpunosti eluirani.
                  Bazna linija u svakom trenutku mora zadovoljavati tražene uvjete.
                  5.4.   Identificiranje pikova
                  
                  Pikovi se identificiraju pomoću retencijskih vremena uspoređivanjem s mješavinama voskova čije je retencijsko vrijeme poznato, a koji su analizirani u istim uvjetima.
                  Na slici je prikazan kromatogram voskova djevičanskog maslinovog ulja.
                  5.5.   Ocjena količina
                  
                  Pomoću integratora odrediti površine pikova koje odgovaraju internom standardu i alifatskim esterima od C40 do C46.
                  Izračunati sadržaj voska svakog pojedinog estera u mg/kg masti određujemo prema sljedećoj formuli: ester, mg/kg =
                  
                     
                  pri čemu je:
                  
                              Ax
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              površina pika svakog estera, u kvadratnim milimetrima;
                           
                        
                              As
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              površina pika internog standarda, u kvadratnim milimetrima;
                           
                        
                              ms
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              masa dodanog internog standarda, u miligramima;
                           
                        
                              m
                           
                           
                              =
                           
                           
                              masa uzorka za analizu, u gramima.
                           
                        6.   ISKAZIVANJE REZULTATA
                  Iskazati ukupan sadržaj različitih voskova C40 do C46 u mg/kg masti (ppm).
                  
                     BILJEŠKA: Sastojci koje treba kvantificirati se odnose na pikove s brojevima parova ugljika između C40 do C46 estera, korištenjem primjera kromatograma voska maslinovog ulja prikazanog na donjoj slici. U slučaju da se C46 ester pojavi dva puta, preporuča se da se za njegovu identifikaciju analizira frakcija voskova ulja komine maslina gdje je pik C46 jednostavno identificirati jer je u očiglednoj većini.
                  Rezultati trebaju biti izraženi na jednu decimalu.
                  
                     Slika
                  
                  Kromatogram voskova maslinovog ulja (9)
                  
                  
                     
               
               
                  Dodatak
                  
                     Određivanje linearne brzine plina
                  
                  U plinski kromatograf, postavljen na normalne radne uvjete, injektira se 1-3 μl metana (ili propana). Mjeri se vrijeme potrebno za protok plina kroz kolonu od trenutka injektiranja do pojave pika (tM).
                  Linearna brzina u cm/s zadana je formulom L/tM, pri čemu je L duljina kolone u cm, a tM je vrijeme mjereno u sekundama.;
               ”
         
               6.
            
            
               Prilog VII. zamjenjuje se sljedećim:
               
                  „PRILOG VII.
                  
                     ODREĐIVANJE POSTOTKA 2-GLICERIL MONOPALMITATA
                  
                  1.   SVRHA I PODRUČJE PRIMJENE
                  Ova metoda opisuje postupak za određivanje postotka palmitinske kiseline u položaju 2. na trigliceridima određivanjem 2-gliceril monopalmitata.
                  Ova metoda se može primijeniti na biljna ulja koja su tekuća na sobnoj temperaturi (20 °C).
                  2.   PRINCIP
                  Nakon pripreme, uzorak ulja se podvrgava djelovanju pankreasne lipaze: parcijalna i specifična hidroliza u položajima 1. i 3. na molekuli triglicerida uzrokuje pojavu monoglicerida u položaju 2. Postotak 2-gliceril monopalmitata u frakciji monoglicerida se određuje nakon sizlaniziranja kapilarnom plinskom kromatografijom.
                  3.   OPREMA I MATERIJALI
                  3.1.   Erlenmeyerova tikvica volumena 25 ml
                  3.2.   Laboratorijske čaše volumena 100, 250 i 300 ml,
                  3.3.   Staklena kromatografska kolona unutarnjeg promjera 21-33 mm, dužina 400 mm, s pločom od sinter-stakla i pipcem
                  3.4.   Menzure volumena 10, 50, 100 i 200 ml
                  3.5.   Tikvice volumena 100 i 250 ml
                  3.6.   Rotirajući isparivač
                  3.7.   Epruvete za centrifugiranje s konusnim dnom volumena 10 ml s čepom od brušenog stakla
                  3.8.   Centrifuga za epruvete volumena 10 i 100 ml
                  3.9.   Termostat koji omogućava stabilnu temperaturu od 40 ± 0,5 °C
                  3.10.   Graduirane pipete volumena 1 i 2 ml
                  3.11.   Štrcaljka volumena 1 ml
                  3.12.   Mikroštrcaljka volumena 100 μm
                  3.13.   Lijevak volumena 1 000 ml
                  3.14.   Kapilarni plinski kromatograf opremljen hladnim injektorom za neposredno ubrizgavanje uzorka u kolonu i peći koja može održavati odabranu temperaturu u granicama od oko 1 °C
                  3.15.   Hladni injektor na koloni za neposredno ubrizgavanje uzorka u kolonu
                  3.16.   Plameno-ionizacijski detektor i elektrometar
                  3.17.   Snimač-integrator prilagođen elektrometru s vremenom reakcije koje nije dulje od jedne sekunde i s varijabilnom brzinom papira
                  3.18.   Staklena ili kvarcna kapilarna kolona duljine 8-12 metara, unutarnjeg promjera 0,25-0,32 mm, prekrivena metilpolisiloksanom ili fenil metilpolisiloksanom 5 %, debljine 0,10-0,30 μm, koja se može koristiti na 370 °C
                  3.19.   Mikroštrcaljka volumena 10 μl s tvrdom iglom (od kaljenog stakla), dužine najmanje 7,5 cm za neposredno ubrizgavanje na koloni.
                  4.   REAGENSI
                  4.1.   Silikagel veličine zrna između 0,063 i 0,200 mm, (70/280 mesh), pripremljen kako slijedi: staviti silikagel u porculansku posudu, osušiti u inkubatoru pri 160 °C četiri sata, potom ga ostaviti da se ohladi u eksikatoru pri sobnoj temperaturi. Dodati 5 % vode na masu silikagela kako slijedi: izvagati 152 g silikagela u Erlenmeyerovu tikvicu, potom dodati 8 g destilirane vode, začepiti i lagano protresti da se voda jednakomjerno rasporedi. Ostaviti da odstoji najmanje 12 sati prije uporabe.
                  4.2.   n-heksan (za kromatografiju)
                  4.3.   Izopropanol
                  4.4.   Izopropanol, 1/1 (v/v) vodena otopina
                  4.5.   Pankreasna lipaza. Mora imati aktivnost između 2,0 i 10 jedinica lipaze po mg. (Pankreasne lipaze s aktivnošću između 2 i 10 jedinica po mg enzima su dostupne na tržištu.)
                  4.6.   Pufer otopina tris-hidroksimetilaminometana: 1 M otopine prilagođene na pH 8, (potenciomentrijska kontrola), koncentracijom HCl (1/1 v/v)
                  4.7.   Natrijev holat, enzimatske kvalitete, vodena otopina 0,1 % (ova otopina se mora iskoristiti u roku od dva tjedna od njezine pripreme)
                  4.8.   Kalcijev klorid, 22 % -tna vodena otopina
                  4.9.   Dietilni eter za kromatografiju
                  4.10.   Otopina za razvijanje: mješavina n-heksana/dietilnog etera (87:13 v:v)
                  4.11.   Natrijev hidroksid, otopina 12 % po težini
                  4.12.   Fenolftalein, 1 %-tna otopina u etanolu
                  4.13.   Plin nosač: vodik ili helij, za plinsku kromatografiju
                  4.14.   Pomoćni plinovi: vodik, čistoće najmanje 99 %, bez vlage i organskih tvari i zraka, za plinsku kromatografiju, iste čistoće
                  4.15.   Reagens za silaniziranje: mješavina piridina/heksametildisilazana, trimetilklorosilana 9/3/1 (v/v/v). (Otopine spremne za uporabu su dostupne na tržištu. Mogu se koristiti drugi reagensi za silaniziranje, posebno bistrimetilsilil trifloracetamid + 1 % trimetilklorosilan, razrijeđen jednakim volumenom bezvodnog piridina.)
                  4.16.   Referentni uzorci: čisti monogliceridi ili mješavine monoglicerida s poznatim postotnom udjelom sličnim uzorku.
                  5.   METODA
                  5.1.   Priprema uzorka
                  
                  5.1.1.   Ulja sa slobodnom kiselošću manjom od 3 % ne treba neutralizirati prije kromatografije na koloni silikagela. Ulja sa slobodnom kiselošću većom od 3 % se moraju neutralizirati kao u točki 5.1.1.1.
                  5.1.1.1.   Uliti 50 g ulja i 200 ml n-heksana u lijevak volumena 1 000 ml (3.13.). Dodati 100 ml izopropanola i količinu otopine 12 % natrijevog nitroksida (4.11.) istovrijednu slobodnoj kiselosti ulja uvećanu za 5 %. Snažno tresti jednu minutu. Dodati 100 ml destilirane vode, ponovo protresti i ostaviti da odstoji.
                  Nakon dekantiranja ukloniti donji sloj koji sadrži sapune. Skinuti međuslojeve (sluz i netopive tvari). Isprati heksansku otopinu neutraliziranog ulja uzastopnim dodavanjem otopine 1/1 (v/v) izopropanol/voda (4.4.) u obrocima od 50-60 ml dok ne nestane ružičasta boja fenolftaleina.
                  Ukloniti najveći dio heksana vakuumskom destilacijom, (pomoću rotacijskog isparivača, na primjer), i prenijeti ulje u tikvicu volumena 100 ml (3.5.). Osušiti ulje u vakuumu dok se otapalo potpuno ne ukloni.
                  Nakon okončanja postupka, kiselost ulja treba biti manja od 0,5 %.
                  5.1.2.   Staviti 1,0 g ulja pripravljenog kao što je gore navedeno u Erlenmeyerovu tikvicu volumena 25 ml (3.1.) i otopiti u 10 ml mješavine za razvijanje (4.10.). Ostaviti otopinu da odstoji najmanje 15 minuta prije kolonske kromatografije sa silikagelom.
                  Ako je otopina mutna, centrifugirati istu kako bi se osigurali optimalni uvjeti za kromatografiju. (Mogu se koristiti kapsule gotovog silikagela SPE od 500 mg pripremljene za uporabu.)
                  5.1.3.   Priprema kromatografske kolone
                  
                  Uliti oko 30 ml otopine za razvijanje (4.10.) u kolonu (3.3.), staviti komad vate u donji dio kolone pomoću staklenog štapića; utisnuti da se ukloni zrak.
                  U laboratorijskoj čaši pripremiti otopinu od 25 g silikagela (4.1.) u približno 80 ml otopine za razvijanje i prenijeti istu u kolonu pomoću lijevka.
                  Provjeriti nalazi li se sav silikagel u koloni; isprati otopinom za razvijanje (4.10.), otvoriti pipac i pustiti da tekućina dostigne razinu od oko 2 mm iznad razine silikagela.
                  5.1.4.   Kolonska kromatografija
                  
                  Točno odvagati 1,0 g uzorka pripremljenog kao u točki 5.1 u Erelnmeyerovu tikvicu volumena 25 ml (3.1.).
                  Rastopiti uzorak u 10 ml otopine za razvijanje (4.10.). Unijeti otopinu u kromatografsku kolonu pripremljenu kao u točki 5.1.3. Izbjeći remećenje površine kolone.
                  Otvoriti pipac i uliti otopinu uzorka dok ne dostigne razinu silikagela. Razviti sa 150 ml otopine za razvijanje. Prilagoditi brzinu protoka na 2 ml/min (tako da 150 ml uđe u kolonu za oko 60-70 minuta).
                  Sakupiti eluat u prethodno izvaganu tikvicu volumena 250 ml. Upariti otopinu pod vakuumom i skinuti konačne tragove otapala pod strujom dušika.
                  Izvagati tikvicu i izračunati dobiven ekstrakt
                  (Ako se koriste kapsule gotovog silikagela SPE spremnog za uporabu, primijeniti sljedeću metodu: staviti 1 ml otopine (5.1.2.) u pripremljene kapsule s 3 ml n-heksana.
                  Nakon filtriranja otopine, razviti s 4 ml n-heksana/dietilnog etera 9/1 (v/v).
                  Sakupiti eluat u epruvetu volumena 10 ml i osušiti pod strujom dušika.
                  Izložiti suhi ostatak pankreasnoj lipazi (5.2.). (Bitno je provjeriti sastav masne kiseline prije i nakon prelaska kapsule SPE.)
                  5.2.   Hidroliza pankreasnom lipazom
                  
                  5.2.1.   Odvagati u epruvetu za centrifugiranje 0,1 g ulja pripremljenog kao u točki 5.1. Dodati 2 ml pufer otopine, (4.6.), 0,5 ml otopine natrijevog holata, (4.7.), i 0,2 ml otopine kalcijevog klorida, dobro promiješati nakon svakog dodavanja. Zatvoriti epruvetu čepom od brušenog stakla i staviti u termostat na 40 + 0,5 °C.
                  5.2.2.   Dodati 20 mg lipaze, pažljivo protresti, (izbjeći močenje čepa), i staviti epruvetu u termostat na točno dvije minute. Potom ga skinuti, snažno tresti točno 1 minutu i ostaviti da se hladi.
                  5.2.3.   Dodati 1 ml dietilnog etera, začepiti i snažno protresti, potom centrifugirati i prenijeti otopinu etera u čistu, suhu epruvetu pomoću mikroštrcaljke.
                  5.3.   Priprema silaniziranih derivata i plinska kromatografija
                  
                  5.3.1.   Mikroštrcaljkom prenijeti 100 μm otopine, (5.2.3.), u epruvetu s konusnim dnom volumena 10 ml.
                  5.3.2.   Ukloniti otapalo pod blagom strujom dušika, dodati 200 μm reagensa za silaniziranje (4.15.), začepiti epruvetu i ostaviti da stoji 20 minuta.
                  5.3.3.   Nakon 20 minuta, dodati 1 do 5 ml n-heksana (ovisno o kromatografskim uvjetima): dobivena otopina je spremna za plinsku kromatografiju.
                  5.4.   Plinska kromatografija
                  
                  Radni uvjeti:
                  
                              —
                           
                           
                              temperatura injektora, (injektor neposredno na koloni), niža od vrelišta otapala (68 °C),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatura detektora: 350 °C,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              temperatura kolone; programiranje temperature peći: 60 °C u trajanju od 1 minute, povećavanje za 15 °C u minuti do 180 °C, potom po 5 °C u minuti do 340 °C, potom 340 °C u trajanju od 13 minuta,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              plin nosač: vodik ili helij, postavljen na linearnu brzinu dostatnu da se dobije rezolucija naznačena na slici 1. Retencijsko vrijeme triglicerida C54 mora biti 40 ± 5 minuta (vidjeti sliku 2.). (Gore naznačeni radni uvjeti su indikativni. Operateri će ih morati optimizirati kako bi dobili željenu rezoluciju. Pik koji odgovara 2-gliceril monopalmitatu mora imati minimalnu visinu jednaku 10 % skale snimača.),
                           
                        
                              —
                           
                           
                              količina injektirane tvari: 0,5-1 μm otopine n-heksana (5 ml) (5.3.3.).
                           
                        5.4.1.   Identificiranje pikova
                  
                  Pojedini monogliceridi mogu se identificirati na temelju svojih retencijskih vremena i usporedbom s onim dobivenim za standardne monogliceridne smjese pod istim uvjetima.
                  5.4.2.   Kvantitativna procjena
                  
                  Površina svakog pika izračunava se pomoću elektroničkog integratora.
                  6.   ISKAZIVANJE REZULTATA
                  Postotak gliceril monopalmitata se izračunava iz omjera površine relevantnog pika prema ukupnoj površini pikova monoglicerida, (vidjeti sliku 2.), korištenjem formule:
                  gliceril monopalmitat (%): 
                  gdje je:
                  
                              Ax
                              
                           
                           
                              =
                           
                           
                              površina pika koja odgovara gliceril monopalmitatu
                           
                        
                              ΣΑ
                           
                           
                              =
                           
                           
                              ukupna površina pikova za monogliceride
                           
                        Rezultat mora biti izražen na jednu decimalu.
                  7.   IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU
                  Izvješće o ispitivanju mora navoditi:
                  
                              —
                           
                           
                              upućivanje na ovu metodu,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              sve informacije potrebne za punu identifikaciju uzorka,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              rezultat analize,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              svako odstupanje od metode, bilo da je posljedica odluke predmetnih stranaka ili drugog razloga,
                           
                        
                              —
                           
                           
                              podaci za identifikaciju laboratorija, datum analize i potpis onih koji su odgovorni za analizu.
                           
                        
                     Slika 1.
                  
                  
                     Kromatogram proizvoda reakcije silaniziranja dobivenih djelovanjem lipaze na rafinirano maslinovo ulje s dodatkom 20 % esterificiranog ulja (100 %)
                  
                  
                     
                  
                     Slika 2.
                  
                  
                     Kromatogram:
                  
                  (A)   neesterificirano maslinovo ulje, nakon djelovanja lipaze; nakon silaniziranja; pod ovim uvjetima, (kapilarna kolona 8-12 m), frakcija voska se eluira istodobno kao i frakcija diglicerida ili malo nakon nje.
                  
                  
                     Nakon lipaze, sadržaj triglicerida ne smije prijeći 15 %
                  
                  
                     
                  
                     Kromatogram:
                  
                  (B)   neesterificirano ulje nakon djelovanja lipaze; nakon silaniziranja; pod ovim uvjetima, (kapilarna kolona 8-12 m), frakcija voska se eluira istodobno kad i frakcija diglicerida ili malo nakon nje.
                  
                  
                     Nakon lipaze, sadržaj triglicerida ne smije prelaziti 15 %.
                  
                  
                     
                  8.   BILJEŠKE
                  
                     Bilješka 1.   PRIPREMANJE LIPAZE
                  Lipaze sa zadovoljavajućom aktivnošću su dostupne na tržištu. One se također mogu pripraviti u laboratoriju na sljedeći način:
                  Ohladite 5 kg svježe svinjske gušterače na 0 °C. Odstranite okolnu krutu mast i vezivno tkivo i sameljite u gustu tekućinu u mikseru. Miješajte pastu s 2,5 litara bezvodnog acetona 4-6 sati, potom centrifugirati. Ekstrahirajte ostatak još tri puta s jednakim volumenom bezvodnog acetona, a zatim dva puta s mješavinom acetona/dietilnog etera (1/1 v/v) i dva puta s dietilnim eterom.
                  Osušiti ostatak u vakuumu 48 sati da biste dobili stabilan prah koji se može dugotrajno spremiti u hladnjaku, zaštićen od vlage.
                  
                     Bilješka 2.   PRAĆENJE AKTIVNOSTI LIPAZE
                  Pripraviti emulziju maslinovog ulja kako slijedi:
                  U mikseru miješajte 10 minuta mješavinu 165 ml otopine gumi arabike 100 g/l, 15 g zdrobljenog leda i 20 ml prethodno neutraliziranog maslinovog ulja.
                  Ulijte 10 ml emulzije u laboratorijsku čašu volumena 50 ml, zatim dodajte 0,3 ml otopine natrijevog holata 0,2 g/ml i potom 20 ml destilirane vode.
                  Stavite laboratorijsku čašu u termostat namješten na 37 °C; umetnite elektrode pH-metra i spiralnu miješalicu.
                  Biretom dodajte otopinu 0,1 N natrijevog hidroksida, kap po kap, dok se ne dobije pH od 8,3.
                  Dodajte alikvot vodene suspenzije praha lipaze (0,1 g/ml lipaze). Čim pH-metar pokaže 8,3, uključite zapornu uru i ukapajte otopinu natrijevog hidroksida brzinom kojom se održava pH na 8,3. Očitajte svake minute volumen potrošene otopine.
                  Zabilježite podatke na x/y grafu s vremenom na osi x i milimetrima potrošene alkalne otopine 0,1 N da se zadrži konstantan pH na y osi. Trebali biste dobiti linearni graf.
                  Aktivnost lipaze, izražena u jedinicama lipaze po mg, dana je u sljedećoj formuli:
                  
                     
                  pri čemu je:
                  
                              A
                           
                           
                              aktivnost lipaze u jedinicama/mg
                           
                        
                              V
                           
                           
                              broj mililitara otopine 0,1 N natrijevog hidroksida u minuti (izračun iz grafa)
                           
                        
                              N
                           
                           
                              titar otopine natrijevog hidoksida
                           
                        
                              m
                           
                           
                              masa u mg ispitne lipaze.
                           
                        Jedinica lipaze definirana je kao količina enzima koja oslobađa 10 mikroekvivalenata kiseline u minuti.”;
               
            
         
               7.
            
            
               U Prilogu X.A, točka 6.2. zamjenjuje se sljedećim:
               
                           „6.2.
                        
                        
                           Metilni esteri se pripremaju primjenom postupka B određenog u Prilogu X.B. Masne tvari koje imaju slobodnu kiselost iznad 3 % moraju se prvo neutralizirati u skladu s točkom 5.1.1. Priloga VII.”
                        
                     
         
      (1)  Zbroj izomera koji se (ne) može odvojiti kapilarnom kolonom.
   
      (2)  Ili tamo gdje je medijan mana manji ili jednak 2,5 i medijan voćnosti jednak 0.
   
      (3)  Ulja sa sadržajem voskova između 300 mg/kg i 350 mg/kg se smatraju maslinovim uljem lampante ako je ukupan sadržaj alifatskih alkohola manji od ili jednak 350 mg/kg ili ako je sadržaj eritrodiola i uvaola manji od ili jednak 3,5 %.
   
      (4)  Ulja sa sadržajem voskova između 300 mg/kg i 350 mg/kg se smatraju sirovim uljem komine masline ako je ukupan sadržaj alifatskih alkohola veći od 350 mg/kg i ako je sadržaj eritrodiola i uvaola veći od 3,5 %.
   
      (5)  Udio ostalih masnih kiselina (%): palmitinska 7,5-20,0; palmitoleinska: 0,3-3,5; heptadekanoinska: ≤ 0,3; heptadecenoinska: ≤ 0,3; stearinska: 0,5-5,0; oleinska: 55,0-83,0; linoleinska: 3,5-21,0.
   
      (6)  Ukupno: Delta-5,23-stigmastadienol + klerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-stigmastadienol.
   
      (7)  Ulja sa sadržajem voskova između 300 mg/kg i 350 mg/kg se smatraju maslinovim uljem lampante ako je sadržaj ukupnog alifatskih alkohola manji od ili jednak 350 mg/kg ili ako je sadržaj eritrodiola i uvaola manji od ili jednak 3,5 %.
   
      (8)  Ulja sa sadržajem voskova između 300 mg/kg i 350 mg/kg se smatraju sirovim uljem komine maslina ako je sadržaj ukupnog alifatskog alkohola veći od 350 mg/kg i ako je sadržaj eritrodiola i uvaola veći od 3,5 %.
   
      (9)  Nakon eluiranja sterolnih estera, linija kromatograma ne smije pokazivati nikakve znatne pikove (trigliceridi).