CELEX: 31977R1058
Language: es
Date: 1977-05-18 00:00:00
Title: Reglamento (CEE) n° 1058/77 de la Comisión, de 18 de mayo de 1977, relativo a las características de los aceites de oliva y de determinados productos que contienen aceite de oliva y por el que se modifica la nomenclatura del arancel aduanero común en lo que se refiere al aceite de oliva

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31977R1058

Reglamento (CEE) n° 1058/77 de la Comisión, de 18 de mayo de 1977, relativo a las características de los aceites de oliva y de determinados productos que contienen aceite de oliva y por el que se modifica la nomenclatura del arancel aduanero común en lo que se refiere al aceite de oliva  

Diario Oficial n° L 128 de 24/05/1977 p. 0006 - 0025 Edición especial griega: Capítulo 03 Tomo 18 p. 0046  Edición especial en español: Capítulo 03 Tomo 12 p. 0121  Edición especial en portugués: Capítulo 03 Tomo 12 p. 0121 

 REGLAMENTO ( CEE ) N º 1058/77 DE LA COMISIÓN    de 18 de mayo de 1977    relativo a las características de los aceites   de oliva y de determinados productos que contienen   aceite de oliva y por el que se modifica la   nomenclatura del arancel aduanero común en lo que   se refiere al aceite de oliva    LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,    Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad   Económica Europea ,    Visto el Reglamento n º 136/66/CEE del Consejo , de   22 de septiembre de 1966 , por el que se establece una   organización común de mercados en el sector de las   materias grasas (1) , modificado en último lugar por el   Reglamento ( CEE ) n º 1707/73 (2) , y , en particular ,   el apartado 4 de su artículo 13 y el apartado 3 de su   artículo 18 ,    Visto el Reglamento n º 162/66/CEE del Consejo , de   27 de octubre de 1966 , relativo a los intercambios de   materias grasas entre la Comunidad y Grecia (3) , y , en   particular el apartado 4 de su artículo 3 y su   artículo 9 ,    Visto el Reglamento ( CEE ) n º 443/72 del Consejo , de   29 de febrero de 1972 , relativo a las exacciones   reguladoras aplicables al aceite de oliva que haya sufrido   un proceso de refinado , así como a determinados productos   que contienen aceite de oliva (4) , y , en particular , su   artículo 8 ,    Considerando que , en la actualidad , todos los aceites de   oliva vírgenes se incluyan en la subpartida 15.07 A II a )   del arancel aduanero común , que en consecuencia , se fija   una única exacción reguladora para dichos productos ;   que , para que la exacción reguladora a la importación   pueda alcanzar su objetivo , precede fijarla según los   distintos tipos de aceite virgen y , con tal fin ,   distinguir los aceites de oliva según sus   características fisicoquímicas ; que es oportuno , en   consecuencia , adaptar la nomenclatura del arancel   aduanero común ;    Considerando que la nomenclatura arancelaria resultante   de la aplicación del Reglamento n º 136/66/CEE se   recoge en el arancel aduanero común incorporado como   anexo al Reglamento ( CEE ) n º 950/68 (5) , modificado   en último lugar por el Reglamento ( CEE )   n º 875/77 (6) ;    Considerando que , para garantizar el funcionamiento   correcto del sistema de exacciones reguladoras aplicables   a la importación de los orujos de oliva , procede prever   un método único para la determinación del contenido en   aceite de dichos productos ;    Considerando que el Reglamento ( CEE ) n º 618/72 de la   Comisión , de 29 de marzo de 1972 , relativo a las   características de los aceites de oliva , así como de   determinados productos que contienen aceite de oliva (7) ,   ha sido modificado en diversas ocasiones , en especial por   el Reglamento ( CEE ) n º 3366/75 (8) ; que , habida   cuenta de las nuevas modificaciones que deban introducirse   en él , se considera oportuno derogarlo y recoger en un   nuevo reglamento el conjunto de las disposiciones ;    Considerando que las medidas previstas en el presente   artículo se ajustan al dictamen del Comité de gestión   de materias grasas ,    HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO :    Artículo 1    1 . Unicamente será considerado aceite de oliva , con   arreglo a la subpartida 15.07 A del arancel aduanero   común , el aceite de oliva que proceda únicamente del   tratamiento de las aceitunas , excluido el aceite de oliva   reesterificado y cualquier mezcla de aceite de oliva con   aceites de otra naturaleza .    La detección de la presencia de aceite de oliva   reesterificado o de aceites de otra naturaleza se   efectuará mediante los métodos recogidos respectivamente   en los Anexos VII y VIII .    2 . Se incluirán en las subpartidas 15.07 A I a ) ,   15.07 A I b ) y 15.07 A I c ) del arancel aduanero común   los aceites que reúnan las características indicadas en   los puntos 1 , 2 y 3 del Anexo 1 . Por la determinación de   las características mencionadas anteriormente , se   utilizarán los métodos descritos en los Anexos IV ,   V y VI .    3 . Se incluirán en la subpartida 15.07 A II a ) del   arancel aduanero común los aceites que reúnan las   características citadas en el punto 4 del Anexo I .    No se incluirán en la subpartida 15.17 A del arancel   aduanero común los productos de la partida n º 15.17   que reúna las características indicadas en el Anexo II .    Artículo 2    1 . El contenido en aceite de oliva de los orujos y de   los demás residuos de la extracción del aceite de oliva   incluidos en la subpartida 23.04 A se determinará de   acuerdo con el método que figura en el Anexo IX .    2 . El contenido en aceite de oliva contemplado en el   apartado 1 se expresará en porcentaje de su peso con   relación a la materia seca .    Artículo 3    Se modifica el arancel aduanero común incorporado   como anexo al Reglamento ( CEE ) n º 950/68 del modo   siguiente :    1 . En la nota complementaria 1 del Capítulo 15 , se   sustituyen los términos « de la partida n º 15.07 »   por « de la subpartida 15.07 D » .    2 . Se sustituyen las notas complementarias 2 , 3 y 4 del   Capítulo 15 por las notas complementarias 2 , 3 y 4   que figuran en el Anexo III del presente Reglamento .    3 . Se sustituye la subpartida 15.07 A por el texto   siguiente :    Número del arancel * Designación de la mercancía *   Tipo de los derechos *     * * autónomos % o exacciones reguladoras ( E ) *   convencionales *    1 * 2 * 3 * 4 *    15.07 * A . Aceite de oliva : * * *     * I . sin tratar : * * *     * a ) Aceite de oliva virgen * 20 ( E ) * - *     * b ) Aceite de oliva virgen lampante * 20 ( E ) * - *     * c ) Los demás * 20 ( E ) * - *     * II . que se hayan * * *     * a ) obtenido de los aceites de las subpartidas   15.07 A I a ) o 15.07 A I b ) incluso con adición   de aceite de oliva virgen * 20 ( E ) * - *     * b ) Los demás * 20 ( E ) * - *    Artículo 4    En todos los actos comunitarios en que se haga   referencia a las subpartidas 15.07 A II o 15.07 a I a )   y b ) del arancel aduanero común , dichas referencias   se entenderán hechas respectivamente , según   las características del producto afectado , a   las subpartidas 15.07 A I a ) , b ) y c ) y   15.07 A II a ) y b ) del arancel aduanero común .    Artículo 5    Queda derogado el Reglamento ( CEE ) n º 618/72   de la Comisión .    Artículo 6    El presente Reglamento entrará en vigor el   cuadragésimo tercer día siguiente al de su   publicación en el Diario Oficial de las Comunidades   Europeas .    El presente Reglamento será obligatorio en todos   sus elementos y directamente aplicable en cada Estado   miembro .    Hecho en Bruselas , el 18 de mayo de 1977 .    Por la Comisión    Finn GUNDELACH    Vicepresidente    (1) DO n º 172 de 30 . 9 . 1966 , p. 3025/66 .    (2) DO n º L 175 de 29 . 6 . 1973 , p. 5 .    (3) DO n º 197 de 29 . 10 . 1966 , p. 3393/66 .    (4) DO n º L 54 de 3 . 3 . 1972 , p. 3 .    (5) DO n º L 172 de 22 . 7 . 1968 , p. 1 .    (6) DO n º L 106 de 29 . 4 . 1977 , p. 20 .    (7) DO n º L 78 de 31 . 3 . 1972 , p. 5 .    (8) DO n º L 333 de 30 . 12 . 1975 , p. 13 .    ANEXOS    Indice     * Páginas *    ANEXO I : Características de los aceites de   oliva * 124 *    ANEXO II : Productos de la subpartida 15.17 A * 125 *    ANEXO III : Notas complementarias 2 , 3 y 4 del   capítulo 15 del arancel aduanero común * 125 *    ANEXO IV :    I . Tratamiento de la muestra por la alúmina   activada * 127 *     * II . Neutralización y decoloración del   aceite de oliva en laboratorio * 127 *    ANEXO V :    Investigación de la presencia de aceite   de orujos de oliva en los aceites de oliva * 129 *    A . Método llamado « de Bellier » * 129 *    B . Método llamado « de Vizern modificado » * 129 *    ANEXO VI : Investigación de jabones para   evidenciar la alcalinidad * 131 *    ANEXO VII : Investigación de la presencia de   los aceites reesterificados * 131 *    ANEXO VIII : Investigación de la presencia de   otros aceites dentro del aceite de oliva : análisis   de la fracción estereolítica de las materias   grasas * 135 *    ANEXO IX : Contenido en aceite de los orujos de   oliva * 139 *    ANEXO I    CARACTERÍSTICAS DE LOS ACEITES DE OLIVA    1 . Sólo se considera « aceite de oliva   virgen » , para la aplicación de la subpartida   15.07 A I a ) , el aceite de oliva natural obtenido   únicamente por procedimientos mecánicos ,   incluida la presión y con exclusión de cualquier   mezcla con aceite de oliva obtenido de diferente modo , y   que presente las características siguientes :    a ) un contenido de ácidos grasos libres , expresado   en ácido oleico , de 3 % como máximo ;    b ) un coeficiente de extinción K270 [ absorbancia   en un espesor de un centímetro de una disolución   de un gramo de aceite en 100 mililitros en isooctano   ( 2,2,4 trimetilpentano ) para la longitud de onda   de 270 nanómetros ] no superior a 0,25 y , después   de tratar la muestra de aceite con alúmina   activa , no superior a 0,11 ;    c ) una variación del coeficiente de extinción   en la zona de 270 nanómetros no superior a 0,01 .    Esta variación se define como sigue :    D K = K m - 0,5 ( K m-4 + K m+4 )    K m designa el coeficiente de extinción a la   longitud de onda del máximo de la curva de   absorción en la zona de 270 nanómetros ,    K m-4 y K m+4 designan los coeficientes de extinción   a las longitudes de onda inferior y superior en   4 nanómetros a la de K m ;    d ) reacciones de Beller y de Vizern modificada   negativa , efectuadas con arreglo a los métodos   descritos en el Anexo V , A y B ;    e ) prueba de jabones negativa , efectuada con   arreglo al método descrito en el Anexo VI .    2 . Sólo se considera « aceite de oliva   lampante » para la aplicación de la subpartida   15.07 A I b ) , cualquiera que sea la acidez , el aceite de   oliva que presente las características siguientes :    a ) Un coeficiente de extinción K270 superior   a 0,25 y , después de tratar la muestra con alúmina   activada no superior a 0,11 .    Los aceites con un contenido de ácidos grasos   libres , expresado en ácido oleico , superior   a 3 % pueden tener , después de pasar sobre alúmina   activada , un coeficiente de extinción K270   superior a 0,11 . En tal caso , después de   neutralizarlos y decolorarlos en el laboratorio ,   deberán tener las características siguientes :     - un coeficiente de extinción K270 no superior   a 1,10 ,     - una variación del coeficiente de extinción   en la zona de 270 nanómetros superior a 0,01   y no superior a 0,16 ;    b ) reacciones de Beller y de Vinzern modificadas   negativas , efectuadas con arreglo a los métodos   descritos en el Anexo VI , A y B ;    c ) prueba de jabones negativa , efectuada con   arreglo al método descrito en el Anexo VI .    3 . Sólo se consideran « productos de la   subpartida 15.07 A I c ) » los aceites , principalmente   el aceite de « orujo de aceituna » , que   presenten las características siguientes :    a ) un contenido de ácidos grasos libres ,   expresado en ácido oleico superior a 3 % ;    b ) reacciones de Beller y/o Vozern modificada   positivas , efectuadas con arreglo a los métodos   descritos en el Anexo V , A y B ,    c ) prueba de jabones negativa , efectuada con   arreglo al método descrito en el Anexo VI .    4 . La subpartida 15.07 A II a ) incluye el   aceite de oliva obtenido por tratamiento de los   aceites de las subpartidas 15.07 A I a ) y/o A I b ) ,   incluso con adición de aceite de oliva virgen ,   que presente las siguientes características :    a ) un contenido máximo del 3 % de ácidos   grasos libres expresado en ácido oleico ;    b ) prueba de jabones positiva , efectuada con   arreglo al método descrito en el Anexo VI .    o :     - un coeficiente de extinción K270 superior   a 0,25 y no superior a 1,10 y , después de tratar   la muestra con alúmina activada , superior a 0,11 ,    y     - una variación del coeficiente de extinción   en la vecindad de 270 nanómetros superior a   0,01 y no superior a 0,16 .    Esta variación se define por :    D K = K m - 0,5 ( K m-4 + K m+4 )    K m designa el coeficiente de extinción a la   longitud de onda del máximo de la curva de   absorción en la zona de 270 nanómetros ,    K m-4 y K m+4 designan los coeficientes de extinción   a las longitudes de onda inferior y superior en   4 nanómetros a la de K m ;    c ) reacciones de Beller y de Vizern modificada   negativas , efectuadas con arreglo a los métodos   descritos en el Anexo V , A y B .    ANEXO II    PRODUCTOS DE LA SUBPARTIDA 15.17 A    Se excluyen de la subpartida 15.17 A :    a ) Los residuos procedentes del tratamiento de   grasas que contengan aceite cuyo índice de yodo ,   determinado por el método Wijs sin catalizador ,   sea inferior a 70 o superior a 100 ;    b ) Los residuos procedentes del tratamiento de   grasas que contengan aceite cuyo índice de   yodo esté comprendido entre 70 y 100 pero en los   que la superficie del pico con el volumen de   retención de beta-sitosterol , determinada de   acuerdo con las disposiciones del Anexo VIII ,   represente menos del 93 % de la superficie total   de los picos de los esteroles .    ANEXO III    NOTAS COMPLEMENTARIAS 2 , 3 y 4 DEL CAPÍTULO 15   DEL ARANCEL ADUANERO COMUN    2 . A . Sólo se considera « aceite de oliva » ,   para la aplicación de la subpartida 15.07 A ,   el aceite que proceda exclusivamente del tratamiento   de aceitunas , con exclusión del aceite de oliva   reesterificado y de cualquier mezcla de aceite   de oliva con aceites de otra naturaleza .    B . Se consideran « aceite de oliva sin tratar »   los aceites definidos en los apartados I , II y III   siguientes .    I . Sólo se considera « aceite de oliva virgen » ,   para la aplicación de la subpartida 15.07 A I a ) ,   el aceite de oliva natural obtenido únicamente por   procedimientos mecánicos , incluida la presión ,   y con exclusión de cualquier mezcla con aceite   de oliva de diferente modo , y que presente las   características siguientes :    a ) un contenido de ácidos grasos libres ,   expresado en ácido oleico , de 3 % como máximo ;    b ) un coeficiente de extinción K270 ( absorbancia   en un espesor de un centímetro de una disolución   de un gramo de aceite en 100 mililitros en isooctano   ( 2,2,4 trimetilpentano ) para la longitud de onda   de 270 nanómetros no superior a 0,25 y , después   de tratar la muestra de aceite con alúmina activada ,   no superior a 0,11 ;    c ) una variación del coeficiente de extinción   en la zona de 270 nanómetros no superior a 0,01 .    Esta variación se define como sigue :    D K = K m - 0,5 ( K m-4 + K m+4 )    K m designa el coeficiente de extinción a la   longitud de onda del máximo de la curva de absorción   en la zona de 270 nanómetros ,    K m-4 y K m+4 designan los coeficientes de extinción   a las longitudes de onda inferior y superior en   4 nanómetros a la de K m ;    d ) reacciones de Beller y de Vizern modificada negativas ;    e ) prueba de jabones negativa .    II . Se considera « aceite de oliva virgen lampante »   para la aplicación de la subpartida 15.07 A I b ) ,   cualquiera que sea la acidez , el aceite de oliva que   presente las características siguientes :    a ) un coeficiente de extinción K270 superior a   0,25 y , después de tratar la muestra con alúmina   activada no superior a 0,11 . Los aceites con un   contenido de ácidos grasos libres , expresado   en ácido oleico , superior a 3 % pueden tener ,   después de pasar sobre alúmina activada , un   coeficiente de extinción K270 superior a 0,11 . En   tal caso , después de neutralizarlos y decolorarlos   en el laboratorio , deberán tener las características   siguientes :     - un coeficiente de extinción K270 no superior a 1,10 ,     - una variación del coeficiente de extinción   en la zona de 270 nanómetros superior a 0,01 y no   superior a 0,16 ;    b ) reacciones de Beller y de Vizern modificadas   negativas ;    c ) prueba de jabones negativa .    III . Se consideran « productos de la subpartida   15.07 A I c ) » los aceites , principalmente el   aceite de « orujo de aceituna » , que presenten las   características siguientes :    a ) un contenido de ácido grasos libres ,   expresado en ácido oleico superior a 3 % ;    b ) reacciones de Beller y/o Vizern modificada positivas ;    c ) prueba de jabones negativa .    C . La subpartida 15.07 A II a ) incluye el aceite   de oliva obtenido por tratamiento de los aceites de las   subpartidas 15.07 A I a ) y/o A I b ) , incluso con   adición de aceite de oliva virgen , que presente las   siguientes características :    a ) un contenido máximo del 3 % de ácidos grasos   libres expresado en ácido oleico ;    b ) prueba de jabones positiva    o     - un coeficiente de extinción K270 superior a   0,25 y no superior a 1,10 y , después de tratar la   muestra con alúmina activada , superior a 0,11 ,    y     - una variación del coeficiente de extinción   en la vecindad de 270 nanómetros superior a 0,01 y   no superior a 0,16 .    Esta variación se define por :    D K = K m - 0,5 ( K m-4 + K m+4 )    K m designa el coeficiente de extinción a la   longitud de onda del máximo de la curva de absorción   en la zona de 270 nanómetros ,    K m-4 y K m+4 designan los coeficientes de extinción   a las longitudes de onda inferior y superior en   4 nanómetros a la K m ;    c ) reacciones de Beller y de Vizern modificada   negativas .    3 . Se excluyen de la subpartida 15.17 A :    a ) Los residuos procedentes del tratamiento de   grasas que contengan aceite cuyo índice de yodo ,   determinado por el método Wijs sin catalizador ,   sea inferior a 70 o superior a 100 ;    b ) Los residuos procedentes del tratamiento de grasas   que contengan aceite cuyo índice de yodo esté   comprendido entre 70 y 100 pero en los que la   superficie del pico con el volumen de retención de   beta-sitosterol , determinada de acuerdo con las   disposiciones del anexo VIII del Reglamento mencionado   en la nota complementaria 4 siguiente , represente   menos del 93 % de la superficie total de los picos   de los esteroles .    4 . Los métodos de análisis para la determinación   de las características de los productos contemplados   anteriormente son los previstos respectivamente en   los anexos del Reglamento ( CEE ) n º 1058/77 .    ANEXO IV    I . TRATAMIENTO DE LA MUESTRA POR LA ALÚMINA ACTIVADA    1 . Introducir 30 g de alúmina básica , obtenida   según el procedimiento descrito en el apartado 2 ,   dentro de una columna de cromatografía de 35 mm   de diámetro aproximadamente y de 450 mm de longitud ,   provista de un tubo de salida de 10 mm de diámetro   aproximadamente .    Aplastar mecánicamente la alúmina , dejando caer   suavemente la columna mantenida vertical petidamente ,   sobre una superficie de madera . Introducir , dentro   de la columna así preparada , 100 ml de una solución   al 10 % de aceite en el hexano .    Recoger el elegido y evaporar el disolvente a una   temperatura inferior a 25 ° C .    Sobre el aceite obtenido así deberá hacerse   inmediatamente la determinación del coeficiente de   extinción a 270 nm .    2 . Se obtendrá el aluminio básico de actividad   Brockmann ( 0 % de agua ) calentado durante tres horas   a 380-400 ° C de la alúmina básica ( para   cromatografía ) de granulometria entre 30 mm y 130 mm   ( 80 mm de media ) . A 100 g de dicho producto se   añadirán 5 ml de agua destilada para obtener de la   alúmina básica de una actividad Brockmann   comprendida entre II y III . Agitar frecuentemente y   dejar reposar una noche en un recipiente cerrado   herméticamente .    Verificación de la actividad de la alúmina    Introducir 30 g de alúmina básica ( obtenida de   la forma indicada anteriormente ) en una columna   para cromotografía de 35 mm de diámetro aproximadamente   y de 450 mm de longitud , hacer pasar a través de   dicha columna , en las condiciones especificadas por   el método , una mezcla del 95 % de aceite de oliva virgen   con un coeficiente de extinción K270 inferior   a 0,18 y del 5 % de un aceite de cacahuete tratado   durante su refinado por las tierras decolorantes   que tenga un coeficiente de extinción K270   no inferior a 4 . Si la mezcla presentara un coeficiente   de extinción superior a 0,11 , la alúmina será   aceptable . Si la elusión de los trienes conjugados   sobre dicha alúmina no se produjera , será   necesario utilizar una alúmina más hidratada ,   después de haber visto si satisface las exigencias   del test precedente .    II . NEUTRALIZACIÓN Y DECOLORACIÓN DEL ACEITE DE   OLIVA EN LABORATORIO    A . NEUTRALIZACIÓN DEL ACEITE    1 . Equipo     - vaso de 300 ml de forma alta ,     - centrifugadora de laboratorio con tubos de 100 ml ,     - vaso de 250 ml ,     - matraces de 100 ml ,     - ampolla de decantar de 1 litro .    2 . Reactivos     - solución acuosa de hidróxido de sodio al 12 % ,     - solución etanólica al 1 % de fenolftaleina ,     - hexano para análisis ,     - alcohol isopropílico puro para análisis .    3 . Modo de operar    a ) Aceites de acidez expresada en ácido oleico   inferior al 30 %    Introducir en un vaso de 300 ml de forma alta ,   50 g de aceite bruto y calentar a 65 ° C al baño   maria . Agitar lentamente , y añadir una cantidad de   solución de hidróxido de sodio al 12 % que   corresponda a la acidez libre del aceite con un   exceso del 5 % . Continuar agitando durante cinco   minutos , manteniendo la temperatura a 65 ° C .    Trasladar el total a unos tubos de centrifugar   de 100 ml , separar la masa jabonosa por centrifugación .   Verter el aceite decantado en un vaso de 250 ml y   lavar con 50-60 ml de agua destilada hirviendo   eliminando durante este proceso la capa acuosa con   la ayuda de un sifón . Repetir los lavados hasta   eliminar completamente los restos de jabon residual   ( desaparición de la coloración rosa en la   fenolftalesina ) .    Centrifugar el aceite para eliminar las pequeñas   cantidades de agua residual .    b ) Aceites de acidez expresada en ácido oleico   superior al 30 %    Introducir en una ampolla de decantar de un   litro , 50 g de aceite bruto , 200 ml de hexano ,   100 ml de alcohol isopropílico y una cantidad   de solución de hidróxido de sódio al 12 % que   corresponda a la acidez libre del aceite , con un   exceso del 0,3 % . Agitar energicamente durante   un minuto . Añadir 100 ml de agua destilada , agitar   de nuevo y dejar reposar .    Después de la separación de las capas , dejar   salir la capa inferior que contiene los jabones .   Entre ambas capas ( aceitosa por encima y acuosa   por debajo ) se forma frecuentemente una capa   intermedia constituida por mucílagos y subtancias   indisolubles que deberá eliminarse igualmente .    Proceder a continuación al lavado de la solución   hexánica de aceite neutro con porciones de 50-60 ml   de una solución de alcohol isopropílico/agua destilado   1/1 ( v/v ) hasta la desaparición de la coloración   rosa en la fenolftalina . Proceder a continuación a   la eliminación completa del hexano por destilación   en vacío ( por ejemplo , en el evaporador rotativo ) .    B . DECOLORACIÓN DEL ACEITE NEUTRALIZADO    1 . Equipo     - matraz de 250 ml con 3 cuellos que permitan la   inserción de :    a ) un termómetro graduado en grados que permita   hacer lecturas hasta 90 ° C ,    b ) un agitador mecánico que gire a 250-300 vueltas   por minuto equipado para el funcionamiento   en vacío ,    c ) un rácor hacia la bomba de vacío ,     - bomba de vacío , provista de un manómetro ,   capaz de lograr presiones residuales de 15-30 milibares .    2 . Modo de operar    Pesar en el matraz de 3 cuellos cerca de 100 g del   aceite neutralizado . Insertar el termométro y el   agitador , volver a unir a la bomba de vacío y   calentar hasta 90 ° C agitándolo ,    Mantener dicha temperatura , siempre bajo agitación ,   hasta que el aceite que deba analizarse este   completamente liberado de su humedad ( treinta minutos   aproximadamente ) .    Interrumpir entonces el vacío y añadirle 2 a 3 g   de tierra activada . Restablecer el vacío hasta   obtener una presión residual de 15-30 milibares y ,   siempre con una temperatura de 90 ° C , agitar   durante 30 minutos a 250 vueltas por minuto   aproximadamente .    Filtrar a continuación en caliente en un baño   termoestático ( 50-60 ° C )    ANEXO V    INVESTIGACIÓN DE LA PRESENCIA DE ACEITE DE   ORUJOS DE OLIVA EN LOS ACEITES DE OLIVA    A . MÉTODO LLAMADO DE BELLIER    1 . Material     - matraz de 100 ml , provisto de un refrigerante   de reflujo ,     - pipeta de 5 ml graduado en décimas     - sistema calentador que permita alcanzar la   temperatura de 80 ° C aproximadamente     - termómetro de 15 a 60 ° C .    2 . Reactivos     - solución hidro-alcohólica de potasa ( 42,5 g   de KOH disuelto en 72 ml de agua destilada , el   volumen se completará a 500 ml con alcohol etílico   a 95 ° ) ,     - solución de alcohol etílico graduado a 70 ° ,     - solución acuosa de acido acético 1 + 2   ( en volumen ) , ajustado de forma que 1,5 ml   neutralicen exactamente 5 ml de la solución   hidroalcohólica de hidróxido de potasio en presencia   de fenoltaleina .    3 . Preparación de la muestra    El aceite se privará de agua por decantación   y filtración sobre papel efectuados a una temperatura   ligeramente superior al punto de fusión de   determinados constituyentes concretos que se habrian   podido separar de la materia grasa fluida .    4 . Modo de operar    Introducir en el matraz alrededor de 1 ml de aceite   preparado como se indica en el apartado 3 . Añadir   5 ml de solución hidro-alcohólica de potasa .   Adaptar el refrigerante a reflujo y ponerlo a   hervir durante diez minutos agitando de vez   en cuando . Dejar que se refrigere hasta la   temperatura ambiente . Añadir 1,5 ml de solución   acuosa de ácido acético y 50 ml de solución de   alcohol etílico previamente llevado a la temperatura   de 50 ° C . Mezclar por agitación , introducir   el termometro y dejar que se refrigere , observando   el aspecto de la solución desde el momento   que alcance la temperatura de 45 ° C . Cuando   se forme un precipitado , coposo a una temperatura   superior a 40 ° C , la reacción será positiva .   En ausencia de un precipitado coposo caracterizado ,   mantener el líquido a una temperatura ambiente ,   que deberá estar comprendida entre 20 ° C y   22 ° C durante al menos veinticuatro horas , y si   fuere necesario durante cuarenta y ocho horas .   Observar de nuevo la solución , la formación   de un precipitado coposo en suspensión en medio   del líquido indicará igualmente que la reacción   es positiva .    Expresión de los resultados    Investigación del aceite de orujos ( método de   Bellier ) positiva o negativa .    B . MÉTODO LLAMADO DE VIZERN MODIFICADO    Lo insaponificable del aceite que deberá analizarse   se aislará y su comportamiento en solución en el   alcohol a 85 ° se estudiará bajo determinadas   condiciones .    1 . Material     - matraces de 300 ml de un cristal resistente   a los alcalinos y provisto de un refrigerante de reflujo ,     - ampollas de decantación de 500 ml o de 1 000 ml ,     - vaso de 300 ml y de 250 ml ,     - probeta de cristal .    2 . Reactivos     - solución alcohólica de hidroxido de potasio 2N ,     - éter de petróleo ,     - alcohol etílico al 50 % ,     - alcohol etílico a 96 ° medido por alcoholímetro ,     - agua oxigenada a 10 volúmenes ,     - alcohol etílico a 85 ° medido por alcoholímetro ,    3 . Modo de operar    Pesar alrededor de 5 g de la muestra que deba   analizarse dentro de un matraz de 300 ml . Añadir   50 ml de la solución alcohólica de hidróxido   de potasio 2 N . Montar el refrigerante de reflujo y   llevar a una ebullición lígera . Agitar después   de una hora de calentamiento , refrigerar a 30-50 ° C   y trasladar a una ampolla de decantación utilizando 50 ml   de agua destilada .    Lavar cuidadosamente el matraz con 50 ml de éter   de petróleo , repetir la operación varias veces .   Trasladar el éter de petróleo a una ampolla de   decantación . Agitar enérgicamente el contenido un   poco más de un minuto . Después de la decantación ,   eliminar la fase acuosa trasladándola a una segunda   ampolla de decantación . Añadir todavía 50 ml   de éter de petróleo , agitar enérgicamente el   contenido un poco más de un minuto y dejar decantar .   La fase acuosa se trasladará a una tercera ampolla   de decantación a la que se añadirá 50 ml   más de éter de petróleo . Agitar enérgicamente   a continuación y dejar decantar .    Recoger en una ampolla de decantación los extractos   etéreos procedentes de las distintas extracciones   de lo insaponificable y lavar al menos tres veces con   alcohol al 50 % ( 50 ml cada vez ) hasta que el   líquido de lavado no dé más reacción alcalina   a la fenolftaleina .    Filtrar la solución de lo insaponificable en un   vaso de 300 ml , lavar el filtro con éter de petróleo y   eliminar el disolvente por destilación . Añadir   10 ml de alcohol a 96 % y después de un calentamiento   moderado ( cerca de 40 ° C ) filtrar en un vaso   de 100 ml .    Lavar el vaso de 300 ml con 10 ml de alcohol a 96 °   y filtrar a continuación en un segundo vaso .    En un vaso de 100 ml que contenga los extractos   alcohólicos de lo insaponificable , añadir 5 ml de   agua oxigenada a 10 volúmenes , calentar al baño   maría hasta la completa evaporación . Añadir aún   50 ml de alcohol a 96 ° y 5 ml de agua oxigenada ,   dejar de nuevo evaporar completamente .    Retirar el vaso del baño maría y añadir   20 ml de alcohol a 85 ° . Calentar al baño   maría prestando mucha atención de no provocar   pérdidas de alcohol para no disminuir la   concentración . Se trata de un elemento muy importante   que no debe descuidarse .    Filtrar sobre papel , refrigerar y examinar el   comportamiento de la solución al cabo de una hora ,   después de cuatro horas . Si después de una hora ,   la solución es absolutamente transparente , el   análisis será negativo , o sea que no habrá   aceite de orujos .    Si después de una hora la solución está   turbia , repetir la operación cuatro horas mas tarde .    Si al cabo de cuatro horas , la solución   está todavía turbia , pero no presenta copos , el   análisis será también negativo . Por el contrario ,   si se observa la formación de copos , el análisis   será positivo y entonces se tratará de aceite de orujos .    Expresión de los resultados    Investigación del aceite de orujos ( método de   Vizern modificado ) : positivo o negativo .    Observaciones    Los aceites de oliva darán una solución transparente   o como máximo ligeramente opalino durante todo   el ensayo . Los aceites de orujos puros o mezclas   presentarán copos característicos que permanecerán   en suspensión como pequeñas nubes y que terminarán   por depositarse al cabo de varias horas de reposo .    ANEXO VI    INVESTIGACIÓN DE LOS JABONES POR LA DETECCIÓN   DE LA ALCALINIDAD    Principio del método    Detección de los jabones alcalinos por acción   sobre el azul de bromofanol .   Reactivos     - solución al 0,1 % de azul de bromofenol en el   etanol al 96 % ( v/v ) ,     - acetona destilada , con un 2 % de agua ( v/v )   añadido .    La acetona al 2 % de agua deberá presentar una   tintura amarilla verdosa en presencia de algunas   gotas de la solución de azul de bromofenol .    Material    Tubo de ensayo de 150 mm por 15 mm .    Modo de operar    Introducir en el tubo de ensayo 10 ml de acetona   y una gota de solución de bromofenol . La solución   deberá virar al amarillo . Si no , enjuagar el   tubo y el tapón con acetona hasta la desaparición   de la coloración azul . Introducir 10 g de aceite   en el tubo obturarlo con ayuda de un tapón que   corresponda , agitar y dejar reposar . Un viraje   al azul en la capa superior de acetona indicará   la presencia de jabón .    Expresión de los resultados    Los resultados se expresarán como positivos o   negativos .    ANEXO VII    INVESTIGACIÓN DE LA PRESENCIA DE ACEITES   REESTERIFICADOS    El método tiene por fin determinar , dentro de   los aceites y grasas , la composición de la fracción   de los ácidos grasos que se esterifican en la   posición 2 ( posición B o posición interna ) del   glicerol , los aceites de oliva reesterificados que   contengan más ácido palmítico en posición B   que los aceites de oliva no reesterificados .    Principio    Este método se basa en la hidrólisis parcial y   específica de los triglicéridos por la lipasa   pancreática con formación preferente de mono-2   glicéridos . Dicha hidrólisis conducirá a una   mezcla que contendrá , junto a triglicéridos no   hidrolizados , glicéridos , de los mono-2 glicéridos   y de los ácidos grasos libres . Dicha mezcla se   dividirá por cromotografía en capa fina y se   aislarán los monoglicéridos . Estos monoglicéridos   se meranolizarán y los ésteres metílicos obtenidos   se analizarán por cromotografía en fase gaseosa .    El producto analizado deberá considerarse como si   se le hubiera añadido aceite reesterificado cuando   el porcentaje de ácido palmítico observado en la   posición 2 de los triglicéridos sea superior al 2 % .    1 . Material     - ampolla de decantación de 500 ml ,     - columna de cristal para cromotografía de 13 mm   de diámetro inferior y de 400 mm de longitud ,   equipado con una placa de cristal calcinada y   de una espita ,     - matraz de 250 ml de cuello largo ,     - matraz de 100 ml ,     - tubo de centrifugadora de 10 ml , con tapón ,     - jeringa hipodérmica de 1 ml , equipada con   una aguja fina ,     - matraz de 25 ml , con refrigerante de aire   de cerca de 1 m de longitud con manguito ,     - vaso de 50 ml ,     - bureta de 5 ml , graduado a 1/20 ml ,     - dispositivo para cromatografía en capa fina   con placas de vidrio de 20 por 20 cm ,     - microjeringa de gotas de 3-4 ml ,     - tina de revelado para cromatografía en capa fija ,     - evaporizador rotativo ,     - baño regulable a 103 ± 2 ° C ,     - termostato regulable entre 30 ° C y 45 ° C   a ± 0,5 ° C ,     - agitador eléctrico que vibre y que posibilite una   agitación eléctrica de tuno de centrifugadora ,     - pulverizador para cromatografía en capa fina ,     - lámpara ultravioleta para el examen de las   placas cromatográficas ,     - agitador de laboratorio , de un tipo conveniente   para la dispersión y la mezcla de materiales   heterogéneos ,     - pH-metro , medidor de PH ,     - agitador de hélice ,     - cronómetro .    2 . Reactivos     - solución acuosa de hidróxido de sodio al   12 % ( m/v ) ,     - solución al 1 % ( m/v ) de fenolftalina en el   etanol a 95 % ( v/v ) ,     - oxido dietílico , exento de peróxidos ,     - alcohol isopropílico , o alcohol etílico al   95 % ( v/v ) para análisis ,     - alumina activada para cromatografía neutra   de grado de actividad Brockmann I , recientemente   activada durante diez horas a 260 ° C y   conservada en un desecado ,     - hexano , o en su defecto eter de petroleo   ( Eb = 30-50 ° C ) , para cromatografía ,     - ácido fórmico al 98 % ( m/m ) al máximo ,     - lipasa pancreática de actividad conveniente   ( nota 1 , nota 2 ) ,     - solución tampón : solución acuosa 1 M   de trihidrometil- aminometano llevado hasta pH 8   por el ácido clorhídrico 6 N ( controlado   potenciométrico )     - solución acuosa al 0,1 % ( m/v ) de colate   de sodio ( evalidad encimática ) ,     - solución de ácido clorhídrico 6 N ,     - disolvente de revelado : hexano ( o , en su   defecto éter de petróleo ) /oxido dietílico/ácido   fórmico 70/30/l ( v/v/v ) ,     - solución acuosa de goma arábica al   10 % ( m/v ) ,     - solución acuosa de cloruro de calcio ( CACI2 ) al   22 % ( m/v ) ,     - solución alcohólica al 0,2 % ( m/v ) de   dicloro-2'7' fluoresceína ligeramente alcalizado   por adición de una gota de hidróxido de   sodio 1 N por 100 ml ,     - silice en polvo , para cromatografía en   capa fina ,     - solución acuosa de colato de sodio al   20 % ( m/v ) ,     - solución acuosa de hidróxido de sodio   0,1 N ,     - aceite vegetal neutralizado .    3 . Preparación de la muestra    Muestra de acidez inferior al 3 % : neutralización   directa sobre aluminio 3.2 .    Muestra de actividad superior al 3 % : neutralización   por las álcalis en presencia de disolvente según   3.1 después paso sobre alúmina según 3.2 .    3.1 . Neutralización por los álcalis en   presencia de disolvente    Verter , en una ampolla de decantar de 500 ml ,   10 g aproximadamente de aceite bruto , 100 ml de   hexano , o en su falta , de eter de petróleo ,   50 ml de alcohol isopropílico o de alcohol etílico   a 95 ° algunas gotas de la solución de fenoltoleina   y una cantidad de sorio al 12 % que corresponda a la   acidez libre del aceite , mas un exceso del 0,3 % .   Agitar energicamente durante un minuto : añadir 50   ml de agua destilada , agitar de nuevo y dejar reposar .    Después de la decantación , eliminar la capa   inferior que contiene los jabones . Eliminar las   posibles capas intermedias ( nucílagos y sustancias   insolubles ) , lavar la solución hexanica del   aceite neutralizado con unas porciones sucesivas de   25 ó 30 ml de una solución de alcohol isopropílico ,   o etílico , y de agua destilada 1-1 ( v/v )   hasta desaparición de la coloración rosada de la   fenolftaleína .    Eliminar la mayor parte del hexano por destilación   en vacío , y secar el aceite a 30-40 ° C en vacio   con ayuda de una corriente de nitrógeno puro hasta   la eliminación total del disolvente .    3.2 . Paso sobre alúmina    Preparar una suspensión de 15 g de alúmina   activada en 50 ml de hexano o , en su defecto , de   éter de petróleo , y verter , agitándolo , en una   solumna de cristal para cromatografía . Regularizar   el reparto de la alúmina y dejar salir el disolvente   hasta 1-2 mm por encima del nivel superior del   absorbente . Verter cuidadosamente en una columna   una solución preparada unos quince minutos antes   por disolución de 5 g. de aceite en 25 ml de hexano   o , en su defecto , de éter de petróleo , y recoger   la totalidad del líquido que salga de la columna ,   en un matraz de 100 ml .    Eliminar la mayor parte del disolvente por destilación   en vacio , después secar el aceite a 30-40 ° C en   vacío con la ayuda de una corriente de nitrógeno   puro hasta la eliminación total del disolvente .    4 . Preparación    Poner , dentro de un matraz de 250 ml de cuello   largo , 30 g de sílice en polvo y 60 ml de agua   destilada , y agitar hasta la obtención de una   pasta bien homogénea . Extraer el gas manteniendolo   en el vacio de la trompa de agua durante un minuto .    Instalar en las condiciones habituales la pasta   sobre las placas por medio de un instalador regulando   el espesor de la capa a 0,25 mm .    La cantidad de pasta anterior será suficiente   para la preparación de 5 placas 20 por 20 cm .    Dejar secar las placas al aire durante 15 minutos   aproximadamente y , después , secarlas en una   estufa a 103 ° C ± 2 ° C durante dos horas .    Conservar las placas así preparadas en un desecador .    5 . Modo de operar    5.1 . Hidrólisis por la lipasa pancreática    Pesar en el tubo de centrífuga de 10 ml   aproximadamente 0,1 g de la muestra preparada .    Añadir 20 mg de lipasa y 2 ml de solución   tampón . Agitar cuidadosamente y con precaución ,   y después añadir 0,5 ml de la solución de   colato de sodio al 0,1 % y 0,2 ml de la solución   de cloruro de calcio . Cerrar el tubo con el   tapón esmerilado , sacudir con precaución   ( evitando mojar el tapón ) y poner inmediatamente   el tubo en el termostato , ajustado a 40 ° C   ± 0,5 ° C , agitando durante un minuto exactamente .    Retirar el tubo del termostato y agitar   enérgicamente durante diez minutos exactamente .    Refrigerar en seguida bajo una corriente de agua :   añadir 1 ml de ácido clorhídrico 6 N y 1 ml de   óxido dietílico . Tapar y agitar energicamente .   Dejar reposar y extraer la fase orgánica superior   con la ayuda de la jeringa .    5.2 . Separación de los manoglicéridos por   cromatografía en capa fina    Depositar el extracto sobre la placa cromatografica   a aproximadamente 1,5 cm del borde inferior en   línea continua y uniforme para obtener una línea   de salida lo más fina posible .    Introducir la placa en la cuba de revelado bien   saturada y revelar con el disolvente de revelado hasta   1 cm aproximadamente del borde superior . El revelado   de la placa deberá hacerse a la temperatura de   20 ° C aproximadamente .    Secar la placa al aire a la temperatura de la cuba y   pulverizar la solución de dicloro-2'7' fluoresceína .   Delimitar la banda de los monoglicéridos ( Rf = 0,035   aproximadamente ) bajo luz ultravioleta , recuperarlas   con la ayuda de una espátula metálica ( evitando   levantar los componentes que hayan permanecido sobre la   línea de salida ) y recoger al sílice en un   matraz de metilation de 25 ml .    Transformar los monoglicéridos en ésteres   metílicos tratando directamente en las condiciones del   método general de preparación de los metilésteres   de los ácidos grasos indicados en el punto 7.3 el   silice anteriormente recogido , después proceder   a la cromatografía en fase gaseosa de los ésteres   según el método indicado en el punto 7.4 .    Determinar sobre la misma muestra de la composición   de los ácidos grasos totales , cuya composición   con la de los ácidos grasos en posición 2 será   útil para la interpretación de los resultados   obtenidos .    6 . Expresión de los resultados    Calcular la composición de los ácidos grasos   en posición 2 en % con una cifra decimal ( nota 3 ) .    7 . Notas    7.1 . Control de la actividad lipósica    Preparar una emulsión de aceite agitando , en un   mezclador adecuado durante alrededor de 10 minutos ,   una mezcla constituida por 165 ml de la solución   de goma arábiga al 10 % , 15 gramos de hielo picado   y 20 ml de un aceite previamente neutralizado .    Dentro de un vaso de 50 ml , meter sucesivamente   10 ml de la emulsión anterior ; 0,3 ml de solución   de colato de sodio al 20 % y 20 ml de agua destilada .    Colocar el vaso en un termostato regulado a   37 ° C ± 0,5 ° C e introducir en el vaso los   electrodos de un ph-metro y un agitador a hélice .    Por medio de una bureta de 5 ml , añadir gota a   gota una solución de hidróxido de sodio 0,1 N   hasta la obtención de un pH de 8,5 .    Añadir un volumen adecuado de una suspensión   de polvo de lipasa en el agua ( ver más adelante ) .   Desde el momento en que el pH-metro indique un pH   de 8,3 poner en marcha el cronometro y añadir   la solución de hidroxido de sodio 0,1 N al ritmo   necesario para mantener el pH en el valor de 8,3 .   Anotar cada minuto el volumen de solución alcalina   consumida .    Llevar los datos obtenidos a un sistema de ejes   de coordenadas , poniendo en las abcises los tiempos y   en las ordenadas los ml de solución alcalina   consumida para mantener el pH constante . Deberá   obtenerse un gráfico lineal .    La suspensión de lipasa mencionada en el párrafo   precedente es una suspensión al 1 % en peso en el   agua . Tomar para cada ensayo la cantidad necesaria   de dicha suspensión para que en cuatro o cinco   minutos aproximadamente , se consuma 1 ml de solución   alcalina . Normalmente , dicho resultado se obtendrá   con 1 a 5 mg de polvo .    La unidad lipasa se definirá como la cantidad de   encima que liberan 10 micro-equivalentes de ácido   por minuto .    Actividad A del polvo utilizado , medido en   unidades lipasa por mg :    A = V por 10/m    V = número de ml de solución de hidróxido   de sodio 0,1 N por minuto , calculado a partir del   gráfico ,    m = masa de la toma de muestra de polvo , en mg .    La lipasa utilizada deberá tener una actividad   comprendida entre 0,8 y 2 unidades lipasa por mg .    7.2 . Preparación de la lipasa    Existe en el comercio de las lipasas con una actividad   lipasica satisfactoria . Puede prepararse en el   laboratorio de la siguiente manera :    Refrigerar a 0 ° C 5 kg de páncreas frescas   de cerdo , a las que se les haya despojado previamente   de la grasa sólida y del tejido conjuntivo que les   rodea , triturarles en un molino de cuchillas para   obtener una pasta fluida . Agitar dicha pasta fluida   durante cuatro a seis horas con 2,5 l de acetona   anhidro , después centrifugar . Extraer el residuo   tres veces más con el mismo volumen de acetona ,   dos veces con una mezcla de acetona-óxido   dietílico 1/1 ( v/v ) , y dos veces con el   óxido dietílico .    Secar el residuo durante cuarenta y ocho horas en   vacío para obtener un polvo estable que deberá   conservarse en el refrigerador .    7.3 . Preparación de los ésteres metílicos   de ácidos grasos    Según el método descrito en el punto II del   anexo VI del Reglamento ( CEE ) n º 72/77 de la   Comisión , de 13 de enero de 1977 , por el que se   modifica el Reglamento ( CEE ) n º 1470/68 relativo   a la toma y reducción de muestras así como a la   determinación del contenido en aceite en impurezas   y en humedad de las semillas oleaginosas (1) .    7.4 . Cromatografía en fase gaseosa de los   ésteres metílicos de ácidos grasos    Según el método descrito en el punto III   del anexo VI del Reglamento ( CEE ) n º 72/77 .    (1) DO n º L 12 de 15 . 1 . 1977 , p. 11 .    ANEXO VIII    INVESTIGACIÓN DE LA PRESENCIA DE OTROS ACEITES EN EL   ACEITE DE OLIVA : ANÁLISIS DE LA FRACCIÓN ESTEROLÍTICA   DE LAS MATERIAS GRASAS    Principio    Análisis por cromatografía en fase gaseosa de los   esteroles preparados por cromatografía en capa fina a   partir de lo insaponificable secado con precaución .    Equipo    1 . equipo para cromotografía en capa fina , comprendido   en particular cuatro placas de cristal de   20 por 20 por 0,4 cm , dos de 20 por 5 por 0,4 cm y una   microjeringa de 0,1 ml ,    2 . vasos de 50 ml ,    3 . filtros porosos , porosidad , 3 diámetro 1,5 mm ,    4 . matraz de 100 ml ,    5 . probeta de centrifugadora de fondo cónico   de 10 ml , provista de tapón esmerilado ,    6 . pipetas graduadas de 1 ml ,    7 . aparato de cromatografía en fase gaseosa equipado   con un detector de ionización de llama con un   inyector de plata o de cristal o sistema de inyección   directa sobre la columna y conectado a un aparato   registrador ,    8 . columna de cromatografía en fase gaseosa , de cristal   o de acero inoxidable en U o en espiral , de 1 a 2 m   de largo y de 3 a 4 metros de diámetro interior , fase   estacionaria de goma de silicona [ tipo metil (1) ]   estable hasta al menos 300 ° C , que impregne a un   indice del 2 al 4 % tierra de Diatonea calcinada , lavada   con ácidos y silanizada , de granulometría 80/100   o 100/120 mesh ,    Observación : Cuando determinados tipos de acero   inoxidable puedan provocar resultados erróneos por   deterioro de los esteroles se recomienda la utilización   de cristal ,    9 . microjeringa que pueda aportar dosis de hasta 5   a 10 ml ,    Reactivos    1 . cloroformo para cromatografía ,    2 . benceno para cromatografía ,    3 . heptano ,    4 . gel de sílice ( por ejemplo Kieselgel G ) ,    5 . solución de referencia para la cromatografía   sobre placa constituida por colesterol al 5 % en el   cloroformo .    6 . acetona para cromatografía ,    7 . solución al 0,1 % en el alcohol etílico absoluto   de sal sódica de 2'7' disclorofluoresceno ,    8 . piridina ,    9 . hexametildisilazano ,    10 . trimetil clorosilano ,    11 . solución para la prueba de sensibilidad : 1 mg   de colesterol por ml de n-pentano ,    12 . solución para el test de la resolución de los   picos : 0,9 mg de fitoesteroles de aceite de colza y   0,1 mg de colesterol por ml de n-pentano . Los esteroles   deberán prepararse según el procedimiento descrito   en B del modo operativo .    13 . solución para el test de referencia : 1 mg de   fitoesteroles de aceite de girasol por ml de n-pentano ,   preparados como ello se describe en B del modo operativo ,    Preparación de las placas para cromatografía    Colocar en orden sobre el dispositivo , una placa de   20 por 5 por 0,4 cm , cuatro placas de 20 por 20 por 0,4 cm   y una placa de 20 por 5 por 0,4 cm .    En un matraz de 500 ml de cuello largo , verter 40 g   de gel de sílice y aproximadamente 80 ml de agua .   Agitar con una varilla de vidrio , y en caso con un   agitador mecánico de vidrio hasta obtener una   suspensión homogénea . Eliminar los eventuales gases   practicando el vacío con ayuda de una trompa de vacío   por lo menos durante un minuto . Pasar enseguida la   suspensión al dispositivo , regulando el espesor   a 0,5 mm , y recubrir uniformemente las placas . Dejar   que las placas se sequen al aire durante 15 minutos   aproximadamente y secar después en estufa a 105 ° C   durante dos horas . Conservar las placas así preparadas   en un desecador al vacío .    MODO DE OPERAR    A . Preparación del insaponificable    Introducción    Se designan con el nombre de insaponificable las   sustancias solubles en la materia grasa que , después de   saponificación , son insolubles en agua y solubles en el   solvente utilizado para la determinación . Comprende   los componentes naturales de las materias grasas   ( esteroles , alcoholes , hidrocarburos ) , así como   las sustancias orgánicas no volátiles a 100 ° C   ( aceites minerales ) distintas de las materias grasas ,   que contenga en su caso . Como solvente , se utiliza   éter de petróleo o bien óxido de etilo . Hay que   tener en cuenta que , en la mayor parte de los casos , los   resultados con los dos solventes son diferentes y que con   el óxido de etilo se obtienen contenidos en % más   elevado . Para el aceite de oliva , teniendo en cuenta   las condiciones climáticas en que se encuentran la   mayoría de los laboratorios de análisis , el éter   de petróleo ha sido reconocido como el solvente que debe   emplearse .    Método del éter de petróleo    Material     - matraz de 150 ml , aproximadamente , que pueda   adaptarse a un refrigerante de reflujo ,     - ampollas de decantación de aproximadamente 500 ml ,     - estufa regulada a 103 ° C ± 2 ° C .    Reactivos     - solución etanólica de KOH de aproximadamente   2 N en etanol al 95 % ( v/v ) . El reactivo no debe   tener un color más oscuro que el amarillo pajizo ,     - éter de petróleo destilado entre 40 y 60 ° C ,   con un índice de bromo inferior a 1 , exento de   residuo .    Modo de operar    Pesar exactamente 5 g , con una precisión de 0,01 g ,   de materia grasa en el matraz . Añadir 50 ml de la   solución atanólica de KOH de aproximadamente 2 N .   Adaptar al refrigerante de reflujo . Calentar durante una   hora a ebullición ligera . Para el calentamiento . Añadir   por la parte superior del refrigerante aproximadamente   50 ml de agua destilada y agitar .    Trasvasar , después de enfriamiento , a una ampolla   de decantación y enjuagar el matraz varias veces , con   un total de 50 ml , aproximadamente , de éter de   petróleo .    Agitar enérgicamente durante un minuto .    Dejar reposar hasta que se produzca la separación   completa de las dos fases y recoger la solución   jabonosa en una segunda ampolla de decantación . Si se   forma , excepcionalmente , una emulsión , destruirla   añadiendo pequeñas cantidades de etanol o de   solución concentrada de hidróxido de potasio .    Retirar la extracción de la solución jabonosa otras   dos veces , cada una de ellas con 50 ml , aproximadamente ,   de éter de petróleo .    Reunir las tres fracciones en una misma ampolla , y   lavarlas tres veces con 50 ml , aproximadamente , de   etanol al 50 % ( v/v ) .    Por la parte superior de la ampolla , trasvasar , en   varias veces si fuere necesario , cuantitativamente la   solución de éter de petróleo a un matraz de 250 ml   tarado ( efectuando pequeños enjuagues de la ampolla   con el éter de petróleo ) .    El solvente se elimina calentándolo prudentemente al   vacío y los residuos se secan a temperatura inferior   a 50 ° C al vacío , para evitar oxidaciones   indeseables .    B . Separación de la fracción esterolítica por   cromotografía sobre capa fina    Introducir en la cubeta de revelado la mezcla heptano   n/acetona 85/15 o benzol/acetona 95/5 ( v/v ) hasta   la altura de 1 cm aproximadamente ; cerrar con la ayuda   de la tapadera y dejar reposar durante tres horas al   menos de forma que el equilibrio/vapor se establezca .   Se aconsejará igualmente fijar sobre las superficies   interiores de la cámara bandas de papel filtro . Esta   precaución ofrece la ventaja de reducir en un tercio   la duración de migración del frente del líquido .    Preparar entretanto una solución al 5 % de   insaponificable extraido al éter de petroleo en el   cloroformo . Tomar 0,3 ml aproximadamente de dicha solución   y depositarla con la ayuda de la microjeringa de 0,1 ml   sobre la placa cromotográfica a 1,5 cm aproximadamente   del borde inferior , en banda continua y uniforme de   forma que se pueda obtener una linea de partida lo   más delgada posible . Según la técnica habitual ,   depositar en una extremidad de la placa algunos   milimetros de la solución de referencia que contenga   colesterol para identificar el Rf de la fracción   esterolítica .    Situar la placa en la cubeta de revelado preparada   como se indica anteriormente . La temperatura ambiente   deberá ser de 20 ° C aproximadamente . Cerrar con   la tapadera y revelar hasta que el frente del disolvente   haya llegado a 1 cm aproximadamente del borde superior   de la placa . Retirar la placa de la cámara de   revelado y dejar evaporar el disolvente en una corriente   de nitrógeno caliente .    Revelar vaporizando uniformemente y con precaución   la solución alcoholica de sal sódica de la 2'7'   diclorofluoresceno sobre la placa . Examinando la   placa por ultravioleta , se determinará la posición   de los esteroles gracias al alineamiento con la mezcla   de colesterol procedente de la solución de referencia .   Recuperar arañando con la ayuda de una espátula   metálica la banda de los esteroles . Introducir el gel   de sílice separando en un vaso de 50 ml con 15 ml de   cloroformo caliente , agitar y transferir la   totalidad de gel de sílice sobre el filtro poroso   y filtrar .    Lavar 3 veces el filtro cada vez con una porción de   15 ml de cloroformo caliente , recogiendo el filtrado   en un matraz de 100 ml .    Evaporar la solución clorofórmica de 4 a 5 ml   y verterla en la probeta para centrifugadora provista de   un tapón esmerila do , lavado previamente . Secar   evaporando el disolvente por un ligero recalentamiento   en una corriente de nitrógeno y pesar la fracción   esterolítica obtenida de esta manera .    C . Análisis cromatográfico en fase gaseosa de los   esteroles    1 . Preparación de los trimetilsilésteres ( TMSE )    Por cada mg de esterol , añadir en la probeta 0,02 ml   de reactivo para la silonización , compuesta por una   mezcla de piridina-hexametilazano-trimetilclorisilano   9/3/1 ( v/v/v ) poniendo cuidado de evitar cualquier resto   de humedad . Colocar la probeta en un desecador durante   treinta minutos aproximadamente , cerrar después ,   centrifugar durante algunos minutos . Tomar , para el   análisis que deberá practicarse a continuación , la   solución restante .    2 . Condiciones del análisis por cromatografia en   fase gaseosa    Temperatura de la columna 220 a 250 ° C .    Temperatura del sistema de inyección cuando se caliente   por separado : 20 a 40 ° C por encima de la   temperatura de la columna . Caudal del nitrógeno :   30 a 60 ml por minuto . Desconectar el detector y equilibrar   las nuevas columnas en dichas condiciones durante dieciseis   a veinticuatro horas . Conectar el detector , encender la   llama y regular los caudales de hidrógeno , de oxígeno   o de aire de forma que se obtenga una altura de llama   y una sensibilidad convenientes . Poner en marcha el   aparato y dejar desenrollar el papel a una velocidad   apropiada ; añadir el cero y el atenuador . Cuando la   línea de baja sea estable , el aparato estará   preparado para ser utilizado .    3 . Tests de sensibilidad    Tomar 5 ml de la solución del test de sensibilidad ,   evaporar el disolvente , tratar como se indica en 1 ;   inyectar de 0,1 a 0,2 ml de la solución preparada así   ( TMSE ) . Sólo aparecerá un pico de colesterol en   el cromatograma .    Regular el atenuador de forma que se utilice   aproximadamente toda la escala del aparato grabador .    4 . Tests de resolución de los picos    Tomar 5 ml de la solución preparada para el test de   resolución .    Evaporar el disolvente , tratar como se indica en 1 .    Inyectar 0,1 a 0,2 ml de la solución preparada de   esta manera ( TMSE ) .    Los picos de colesterol , de brasicaesterol , de   compesterol y de ss-sitosterol deben aparecer sobre el   cromatograma . Medir las distancias de retención   ( distancia del punto de inyección al punto de   máxima altura del pico ) de los picos , d CH para el   colesterol , d B para el brasicaesterol , d C para el   campesterol y d S para el ss-sitosterol y las anchuras   en la base de los picos ( longitud de retención entre   las intersecciones con la línea de base de las tangentes   a los puntos de inflexión situados sobre los lados   anterior y posterior del pico o CH para el colesterol   y o B para el brasicaesterol . La resolución de los   picos , expresada por la fórmula .    PR = 2 ( d B - d CH ) /o B + o CH    Deberá ser igual al menos a 1 .    Calcular los tiempos de retención relativos   ( colesterol = 1,00 ) para el brasicaesterol , el   compesterol y ss-sitosterol .    5 . Prueba de referencia    Tomar 5 ml de la solución de la prueba de   referencia , evaporar el disolvente , tratar como se   indica en 1 , inyectar 0,1 a 0,2 ml de la solución   preparada de esta manera ( TMSE ) . Los picos de   compesterol , de estigmastenol , de ss-sitosterol y   D 7 estimastenol deberán aparecer sobre el cromatograma .    Medir las distancias de retención de los picos , d C   para el compesterol , d ST para el estigmastend , d S   para ss-sitosterol y d ST para D 7 estigmastenol .    Calcular los tiempos de retención , que serán   aproximadamente :    colesterol : 1,0    brasicasterol : 1,1    compesterol : 1,3    estigmasterol : 1,4    ss-sitosterol : 1,6 (2)    D 7 estigmasterol : 1,8 (2)    6 . Análisis    Inyectar de 0,1 a 0,2 ml de la solución TMSE de los   esteroles que deban analizarse y registrar el cromatograma .    D . Expresión de los resultados    Para la interpretación de la composición de la   fracción esterolítica analizada , no será necesario   seleccionar los picos que tengan tiempos de retención   diferentes de los determinados experimentalmente para los   6 esteroles mencionados anteriormente .    El contenido en % en ss-sitosterol vendrá dado por   la fórmula :    Área del pico del ss-sitosterol/Suma de las   áreas de los seis picos de esteroles por 100    El contenido en ss-sitosterol no debe ser inferior   al 93 % con relación a la composición en % de los   esteroles totales .    (1) Por ejemplo SE 30 .    (2) Cuando otros esteroles tengan , como el 5 avenasterol ,   en dichas condiciones , el mismo volumen de retención   que el ss-sitosterol , se contarán como ss-sitosterol .    (3) Cuando otros esteroles tengan , en dichas   condiciones , el mismo volumen de retención que el D 7   estigmastenol , se contarán como del D 7 estigmastenol .    ANEXO IX    CONTENIDO EN ACEITE DE LOS ORUJOS DE OLIVA    Material     - aparato de extracción apropiado provisto de   un matraz de 200 a 250 ml ,     - baño por calefacción electrica ( baño de   arena , baño de agua , etc. ) o placa calentadora .     - balanza analítica ,     - estufa regulada a 80 ° C como máximo ,     - estufa de calefacción electrica provista de   un dispositivo de termoregulación regulado a   103 ° C ± 2 ° C y que permita realizar una   insuflación de aire o una presión reducida ,   - triturador mecanico fácil de limpiar y que   permita el triturado sin calentamiento y sin disminución   sensible de su contenido en agua y en aceite ,     - cartucho de extracción y algodón hidrófilo   o papel filtro , exentos de productos extraibles por   el hexano ,     - desecador ,     - criba con agujeros de 1 mm de diametro ,     - piedra pómez en pequeños granos , previamente   secada .    Reactivo    n-hexano técnico cuyo residuo en evaporación   completa deberá ser inferior a 0,002 g para 100 ml .    MODO DE OPERAR    Preparación de la muestra para ensayo    Triturar la muestra para laboratorio , si fuera   necesario , en el triturador mecánico , previamente   bien limpiado , para reducirla a particulas que puedan   atravesar completamente la criba .    Utilizar aproximadamente una vigésima parte de la   muestra para completar la limpieza del triturador ,   tirar dicha mezcla , triturar el resto , recogerlo ,   mezclarlo con cuidado y analizarlo sin demora .    Toma de muestra    Pesar a 0,01 g aproximadamente , desde el momento del   final del triturado , alrededor de 10 g de la muestra   para ensayo .    Preparación del cartucho de extracción    Colocar la toma de muestra en el cartucho y taparlo   con el tampón de algodón hidrofilo . En caso de   haber utilizado un papel filtro , envolver la molienda   en dicho papel .    Presecado    Cuando el orujo este muy húmedo ( contenido en agua   y en materias volátiles superior al 10 % ) , efectuar   un presecado colocando durante un tiempo conveniente   el cartucho lleno ( o el papel filtro ) en la estufa   calentada a 8 ° C como máximo , para llevar el   contenido en agua y en materias volátiles por debajo   del 10 % .    Preparación del matraz    Pesar , a 1 g aproximadamente , el matraz que contenga   1 a 2 granos de piedra pómez , previamente secado   en la estufa a 103 ° C ± 2 ° C y después   refrigerado durante al menos una hora en el desecador .    Primera extracción    Colocar en el aparato de extracción el cartucho   ( o el papel filtro ) que contenga la toma de muestra .   Verter en el matraz la cantidad necesaria de hexano .   Adoptar el matraz al aparato de extracción y colocarlo   todo sobre la estufa de calefacción electrica .   Llevar la calefacción a tal estado que el caudal   de reflujo sea al menos de tres gotas por segundo   ( ebullición moderada , no tumultuosa ) .    Después de cuatro horas de extracción , dejar   enfriar . Quitar el cartucho del aparato de extracción   y colocarlo en una corriente de aire para eliminar la   mayor parte del disolvente que lo impregna .    Segunda extracción    Vaciar el cartucho en el microtriturador y triturar   tan finamente como sea posible . Colocar de nuevo   cuantitativamente la mezcla en el cartucho y ésta   en el aparato de extracción .    Empezar de nuevo la extracción durante dos horas   más , utilizando el mismo matraz conteniendo la   primera extracción .    La solución obtenida en el matraz de extracción   deberá ser límpido . Si no fuere así , filtrarla   sobre un papel de filtro lavando varias veces el   primer matraz y el papel de filtro con hexano . Recoger   el filtrado y el disolvente en un segundo matraz   previamente secado y tarado a 1 mg aproximadamente .    Eliminación del disolvente y pesada del extracto    Expulsar por destilación sobre estufa de calefacción   electrica la mayor parte del disolvente . Eliminar los   últimos restos de disolvente calentando el matraz   en la estufa a 103 ° C ± 2 ° C durante 20 minutos .   Facilitar dicha eliminación , ya sea insuflando aire   de vez en cuando o preferiblemente un gas inerte ,   o actuando bajo una presión reducida .    Dejar enfriar el matraz en un desecador durante al   menos una hora , y pesarlo con una precisión de 1 mg   aproximadamente .    Calentar de nuevo 10 minutos en las mismas condiciones ,   refrigerar al desecador y pesar .    La diferencia entre los resultados de estas dos pesadas   deberá ser inferior o igual a 10 mg , si no , calentar   de nuevo durante períodos de diez minutos seguidos   de la refrigeración y la pesada , hasta que la   diferencia de masa sea a lo sumo de 10 mg . Seleccionar   la última pesada del matraz .    Efectuar dos determinaciones sobre la misma muestra   para ensayo.    EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS   Modo de cálculo y fórmula    a ) El extracto expresado en masa del producto tal   cual será igual a :    S = m1 por 100/m0    donde : S es el porcentaje en masa del extracto   del producto tal cual ,    m0 es la masa , en gramos , de la toma de muestra ,    m1 es la masa , en gramos , del extracto después   de secado .    Tomar como resultado la media aritmética de las   dos determinaciones , si las condiciones de repetitividad   se cumplen .    Expresar el resultado con un solo decimal .    b ) El extracto se relacionará con la materia   seca utilizando la siguiente fórmula :    S por 100/ ( 100 - U ) = extracto en % grasa/seca    donde :    S es el porcentaje en masa de extracto del producto   tal cual ver a ) ,    U es su contenido en agua y en materias volátiles .    Repetitividad    La diferencia entre los resultados de las dos   determinaciones , efectuadas simultáneamente o   rapidamente la una a continuación de la otra mediante   el mismo análisis , no deberá ser superior a 0,2 g   de extracto de hexano por cada 100 g de muestra .    En caso contrario , repetir sobre otras dos tomas   de muestra . Si esta vez la diferencia es de nuevo   superior a 0,2 g tomar como resultado la media   aritmética de las cuatro determinaciones efectuadas .