CELEX: 32001R0213
Language: el
Date: 2001-01-09 00:00:00
Title: Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 213/2001 της Επιτροπής, της 9ης Ιανουαρίου 2001, για τη θέσπιση λεπτομερειών εφαρμογής του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1255/1999, όσον αφορά τις μεθόδους που πρέπει να χρησιμοποιούνται για την ανάλυση και την αξιολόγηση της ποιότητας του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων και για την τροποποίηση των κανονισμών (ΕΚ) αριθ. 2771/1999 και (ΕΚ) αριθ. 2799/1999

Avis juridique important

|

32001R0213

Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 213/2001 της Επιτροπής, της 9ης Ιανουαρίου 2001, για τη θέσπιση λεπτομερειών εφαρμογής του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1255/1999, όσον αφορά τις μεθόδους που πρέπει να χρησιμοποιούνται για την ανάλυση και την αξιολόγηση της ποιότητας του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων και για την τροποποίηση των κανονισμών (ΕΚ) αριθ. 2771/1999 και (ΕΚ) αριθ. 2799/1999  

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 037 της 07/02/2001 σ. 0001 - 0099

Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 213/2001 της Επιτροπήςτης 9ης Ιανουαρίου 2001για τη θέσπιση λεπτομερειών εφαρμογής του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1255/1999, όσον αφορά τις μεθόδους που πρέπει να χρησιμοποιούνται για την ανάλυση και την αξιολόγηση της ποιότητας του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων και για την τροποποίηση των κανονισμών (ΕΚ) αριθ. 2771/1999 και (ΕΚ) αριθ. 2799/1999Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,Έχοντας υπόψη:τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας,τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 1255/1999 του Συμβουλίου, της 17ης Μαΐου 1999, περί κοινής οργανώσεως αγοράς στον τομέα του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων(1), και ιδίως τα άρθρα 10 και 15, το άρθρο 26 παράγραφος 3, το άρθρο 29 παράγραφος 1 και το άρθρο 31 παράγραφος 14,Εκτιμώντας τα ακόλουθα:(1) Οι κανονισμοί της Επιτροπής (ΕΟΚ) αριθ. 1216/68, (ΕΟΚ) αριθ. 3942/92, (ΕΚ) αριθ. 86/94, (ΕΚ) αριθ. 2721/95, (ΕΚ) αριθ. 1080/96, (ΕΚ) αριθ. 1081/96, (ΕΚ) αριθ. 1082/96, (ΕΚ) αριθ. 1854/96, (ΕΚ) αριθ. 880/98 και (ΕΚ) αριθ. 1459/98, οι πλήρεις αναφορές στους οποίους εμφαίνονται στο παράρτημα XXVI του παρόντος κανονισμού καθορίζουν τις μεθόδους αναφοράς και τις συνήθεις μεθόδους για την ανάλυση και την αξιολόγηση της ποιότητας του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων, καθώς και το πεδίο και τους κανόνες εφαρμογής των εν λόγω μεθόδων. Για λόγους σαφήνειας, προκειμένου να παρασχεθεί στους συναλλασσόμενους του τομέα ένα ενιαίο σώμα των εν λόγω μεθόδων και κανόνων για την εφαρμογή τους, πρέπει να πραγματοποιηθεί ανασύνταξη των προαναφερθέντων κανονισμών, συγκεντρώνοντάς τους σε ένα μόνο κείμενο. Με τον ίδιο σκοπό, πρέπει να τροποποιηθούν οι κανονισμοί της Επιτροπής (ΕΚ) αριθ. 2771/1999, της 16ης Δεκεμβρίου 1999, περί λεπτομερειών εφαρμογής του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1255/1999 του Συμβουλίου όσον αφορά τα μέτρα παρέμβασης στην αγορά του βουτύρου και της κρέμας γάλακτος(2) και (ΕΚ) αριθ. 2799/1999, της 17ης Δεκεμβρίου 1999, για λεπτομέρειες εφαρμογής του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1255/1999 όσον αφορά τη χορήγηση ενίσχυσης στο αποκορυφωμένο γάλα και στο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη που προορίζονται για τη διατροφή ζώων και για την πώληση του εν λόγω αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη(3), με σκοπό την ενσωμάτωση στον παρόντα κανονισμό των παραρτημάτων τους που αφορούν τις μεθόδους ανάλυσης.(2) Τα χαρακτηριστικά σύνθεσης του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων που έχουν καθοριστεί στο πλαίσιο των καθεστώτων που προβλέπονται από τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 1255/1999 πρέπει να επαληθευθούν προκειμένου να εξασφαλιστεί ότι είναι απόλυτα σύμφωνα με τις καθορισθείσες απαιτήσεις.(3) Έχει συχνά ορισθεί ότι οι μέθοδοι αναφοράς που χρησιμοποιούνται για τέτοιου είδους επαληθεύσεις είναι μέθοδοι που δημοσιεύονται από διεθνείς οργανισμούς όπως CEN, IDF, ISO και ΑΟΑC International και που ενημερώνονται κατά τακτά χρονικά διαστήματα από τους οργανισμούς αυτούς. Σε ορισμένες περιπτώσεις, μία κοινοτική μέθοδος αναφοράς έχει καθορισθεί· σε άλλες περιπτώσεις, δεν υφίσταται καμία ειδική μέθοδος αναφοράς στην κοινοτική νομοθεσία. Με σκοπό να εξασφαλισθεί η ομοιομορφία στην εφαρμογή των μεθόδων αναφοράς, πρέπει να καταρτίζεται κάθε έτος ένας πίνακας μεθόδων αναφοράς και να διευκρινίζεται ότι η προς εφαρμογή μέθοδος πρέπει να εμφαίνεται στον πίνακα αυτό.(4) Η εφαρμογή των συνήθων μεθόδων δεν πρέπει να αποκλεισθεί· οι όροι χρησιμοποίησής τους πρέπει ως εκ τούτου να καθοριστούν επακριβώς.(5) Προκειμένου να καθιερωθεί μία ενιαία πρακτική για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των αναλύσεων, πρέπει επίσης να καθοριστούν κοινές μέθοδοι. Το ίδιο ισχύει για την οργανοληπτική αξιολόγηση των σχετικών προϊόντων και για την επανεξέταση των αποτελεσμάτων που έχουν αποτελέσει αντικείμενο αμφισβήτησης.(6) Για να πραγματοποιηθούν ορισμένες αναλύσεις δεν υφίστανται επί του παρόντος διεθνώς αναγνωρισμένες μέθοδοι αναφοράς, οι οποίες να έχουν επικυρωθεί. Ως εκ τούτου, δεν υπάρχει καμία διαθέσιμη πληροφορία όσον αφορά τις αποκλίσεις των αποτελεσμάτων ανάλυσης από το ένα εργαστήριο στο άλλο. Πρέπει επομένως να καθοριστούν μέθοδοι σε κοινοτικό επίπεδο, οι οποίες να έχουν επικυρωθεί σύμφωνα με τους κανόνες που έχουν διεθνώς θεσπιστεί και οι οποίες εφαρμόζονται ως μέθοδοι αναφοράς.(7) Ο κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 2571/97 της Επιτροπής της 15ης Δεκεμβρίου 1997 σχετικά με την πώληση σε μειωμένη τιμή βουτύρου και τη χορήγηση ενίσχυσης στην κρέμα γάλακτος, στο βούτυρο και στο συμπυκνωμένο βούτυρο που προορίζονται για την παρασκευή προϊόντων ζαχαροπλαστικής, παγωτών και άλλων προϊόντων διατροφης(4), όπως τροποιήθηκε τελευταία με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 635/2005(5), προβλέπει, σε ορισμένες περιστάσεις, την ιχνοθέτηση της κρέμας, του βουτύρου και του συμπυκνωμένου βουτύρου για να εξασφαλιστεί μία σωστή τελική χρήση των προϊόντων αυτών. Λαμβανομένης υπόψη της σημασίας της ιχνοθέτησης για την καλή λειτουργία του καθεστώτος και προκειμένου να εξασφαλιστεί ισότητα μεταχείρισης μεταξύ των συναλλασσομένων που συμμετέχουν, πρέπει να καθοριστούν, κατά το μέτρο του δυνατού, κοινές μέθοδοι προσδιορισμού ορισμένων από τους εν λόγω ιχνηθέτες.(8) Το συμπυκνωμένο βούτυρο πρέπει να αποτελέσει αντικείμενο ιχνηθέτησης που θα υπόκειται σε έλεγχο, σύμφωνα με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 3143/85 της Επιτροπής της 11ης Νοεμβρίου 1985 για τη διάθεση, σε μειωμένη τιμή, βουτύρου παρέμβασης που προορίζεται για την άμεση κατανάλωση υπό μορφή συμπυκνωμένου βουτύρου(6), όπως τροποποιήθηκε τελευταία με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 101/1999(7) και σύμφωνα με τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 429/90 της Επιτροπής της 20ής Φεβρουαρίου 1990 σχετικά με τη χορήγηση βάσει δημοπρασίας ενίσχυσης στο συμπυκνωμένο βούτυρο που προορίζεται για άμεση κατανάλωση στην Κοινότητα(8), όπως τροποποιήθηκε τελευταία με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 124/1999(9) και με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 2571/97. Η αυστηρή τήρηση των όρων σχετικά με τη σήμανση του συμπυκνωμένου βουτύρου είναι απαραίτητη για να προληφθεί ο κίνδυνος εκτροπής. Πρέπει ως εκ τούτου να οριστεί μια κοινοτική μέθοδος ανίχνευσης των εν λόγω ιχνηθετών.(9) Μία ενίσχυση στην ιδιωτική αποθεματοποίηση των τυριών με βάση το πρόβειο γάλα μπορεί να χορηγηθεί δυνάμει του άρθρου 9 του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1255/1999. Μπορεί να χορηγηθεί ειδική επιστροφή για τα ίδια προϊόντα δυνάμει του άρθρου 31 του ιδίου κανονισμού. Προβλέπεται η εισαγωγή στην Κοινότητα από ορισμένες τρίτες χώρες, υπό προτιμησιακούς όρους, των τυριών με βάση το πρόβειο γάλα, το αίγειο γάλα και το βουβαλίσιο γάλα ή μειγμάτων πρόβειου, αίγειου και βουβαλίσιου γάλακτος. Λόγω των προαναφερθεισών διατάξεων, είναι αναγκαίο να διαπιστωθεί με κατάλληλους ελέγχους ότι δεν έχει ενσωματωθεί αγελαδινό γάλα στα σχετικά προϊόντα. Κατά συνέπεια, πρέπει να θεσπισθεί μία κοινοτική μέθοδος αναφοράς για την ανίχνευση του αγελαδινού γάλακτος, με την επιφύλαξη της εφαρμογής συνήθων μεθόδων, εφόσον αυτές είναι σύμφωνες με ορισμένα κριτήρια.(10) Ο κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 2921/90 της Επιτροπής της 10ης Οκτωβρίου 1990, περί χορηγήσεως ενισχύσεων για το αποκορυφωμένο γάλα το οποίο μεταποιείται για παρασκευή καζεΐνης και καζεϊνικών αλάτων(10), όπως τροποποιήθηκε τελευταία με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 2654/1999(11), προβλέπει ότι πρέπει να διαπιστώνεται η απουσία κολοβακτηριδίων. Η μέθοδος αναφοράς που είναι αποδεκτή σε διεθνές επίπεδο για την αναζήτηση κολοβακτηριδίων στο γάλα και στα γαλακτοκομικά προϊόντα είναι το διεθνές πρότυπο IDF73A: 1985. Ωστόσο, εφαρμόζεται μόνο με τροποποιημένη μορφή για την ανίχνευση των κολοβακτηριδίων σε μία ορισμένη ποσότητα προϊόντος. Πρέπει λοιπόν να θεσπιστεί μία κοινοτική μέθοδος αναφοράς για την ανίχνευση κολοβακτηριδίων, η οποία να βασίζεται στο προαναφερθέν πρότυπο.(11) Ο κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 2658/87 του Συμβουλίου της 23ης Ιουλίου 1987 για τη δασμολογική και στατιστική ονοματολογία και το κοινό δασμολόγιο(12), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό 254/2000(13), διαφοροποιεί το ύψος των δασμών για τις σύνθετες ζωοτροφές που υπάγονται στη θέση 2309 του δασμολογίου, σε συνάρτηση με την περιεκτικότητά τους σε γαλακτοκομικά προϊόντα. Για να εξασφαλιστεί μία ενιαία εφαρμογή των σχετικών διατάξεων, πρέπει να προσδιορισθεί μία μέθοδος ανάλυσης της περιεκτικότητας σε λακτόζη που είναι υποχρεωτική για όλα τα κράτη μέλη και να ληφθεί υπόψη για το σκοπό αυτό μία εν γένει αναγνωρισμένη μέθοδος.(12) Ο κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1255/1999 προβλέπει ότι ορισμένες ποιοτικές προϋποθέσεις πρέπει να τηρούνται όσον αφορά το βούτυρο και το αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη που προορίζονται για την παρέμβαση ή, στην περίπτωση του αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη που προορίζεται για τη διατροφή των ζώων. Πρέπει κατά συνέπεια να καθοριστούν μέθοδοι αναφοράς για τον έλεγχο των εν λόγω προϋποθέσεων.(13) Η θέση σε εφαρμογή ορισμένων από τις μεθόδους που εισάγονται για πρώτη φορά από τον παρόντα κανονισμό καθιστά αναγκαία μία περίοδο προσαρμογής πρέπει ως εκ τούτου να μετατεθεί χρονικά η εφαρμογή.(14) Η επιτροπή διαχείρισης γάλακτος και γαλακτοκομικών προϊόντων δεν διατύπωσε γνώμη εντός της προθεσμίας που καθόρισε ο πρόεδρός της,ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ:ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΙΓΕΝΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣΆρθρο 1Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογήςΟ παρών κανονισμός θεσπίζει τους κανόνες σχετικά με την εφαρμογή μεθόδων χημικής, φυσικής, μικροβιολογικής ανάλυσης και για την οργανοληπτική αξιολόγηση του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων στο πλαίσιο των καθεστώτων που προβλέπονται από την κοινή οργάνωση αγοράς στον τομέα του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων, που καθορίζονται από τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 1255/1999, καθώς και ορισμένων από τις μεθόδους αυτές.Άρθρο 2Πίνακας των μεθόδων1. Ο πίνακας των μεθόδων αναφοράς που εφαρμόζονται στις αναλύσεις που αναφέρονται στο άρθρο 1 περιλαμβάνεται στο παράρτημα Ι.2. Τουλάχιστον μία φορά κατ' έτος, η Επιτροπή ενημερώνει τον εν λόγω πίνακα σύμφωνα με τη διαδικασία που προβλέπεται στο άρθρο 42 του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1255/1999.Άρθρο 3Συνήθεις μέθοδοιΣυνήθεις μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τις αναλύσεις που προβλέπονται από την κοινοτική ρύθμιση υπό τον όρο ότι είναι σωστά ταξινομημένες και ελέγχονται τακτικά σε σχέση με τη μέθοδο αναφοράς.Η διαδικασία που αναφέρεται στο παράρτημα 2 μπορεί να εφαρμοστεί για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται μέσω των συνήθων μεθόδων, και τα οποία προσεγγίζουν τα όρια που καθορίζονται στους σχετικούς κανονισμούς.Σε περίπτωση διαφοράς, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τη μέθοδο αναφοράς είναι καθοριστικά.Άρθρο 4Επικύρωση των μεθόδων αναφοράς1. Μία μέθοδος αναφοράς επικυρώνεται εφόσον είναι σύμφωνη με προκαθορισμένα κριτήρια ακρίβειας, που αφορούν το όριο επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας.2. Εφόσον μία μέθοδος αναφοράς που καθορίζεται από τους σχετικούς κανονισμούς δεν έχει επικυρωθεί, τα κράτη μέλη καθορίζουν ένα προσωρινό όριο αναπαραγωγιμότητας.Το όριο αυτό λαμβάνεται σύμφωνα με τη διαδικασία που ορίζεται στο παράρτημα ΙΙΙ στοιχείο β). Ωστόσο, κατά τη διάρκεια των δεκαοκτώ μηνών πού έπονται της έναρξης της ισχύος του παρόντος κανονισμού, τα κράτη μέλη μπορούν να χρησιμοποιήσουν μια ισοδύναμη διαδικασία.Η τήρηση του ορίου ελέγχεται τουλάχιστον μία φορά κατ' έτος.3. Εφόσον τα αποτελέσματα της εφαρμογής των επικυρωμένων μεθόδων αναφοράς ή των μεθόδων με προσωρινά αριθμητικά στοιχεία όσον αφορά την ακρίβεια αναφέρουν την υπέρβαση ενός ορίου, εφαρμόζεται η μέθοδος αξιολόγησης των αποτελεσμάτων ανάλυσης που περιγράφεται στο παράρτημα IV με σκοπό τον προσδιορισμό της κρίσιμης διαφοράς σε σχέση με το εν λόγω όριο.Άρθρο 5Αποδοχή των αποτελεσμάτων των αναλύσεων1. Οι αναλύσεις πραγματοποιούνται σε εργαστήρια που εφαρμόζουν μία εσωτερική μέθοδο ελέγχου της ποιότητας, σύμφωνη με αυτή που περιγράφεται στο παράρτημα V α) ή μία μέθοδο συγκρίσιμου επιπέδου.Λεπτομερής περιγραφή της εφαρμοζόμενης μεθόδου πρέπει να είναι διαθέσιμη στο εργαστήριο.2. Τα εργαστήρια καθορίζουν τα εσωτερικά τους πρότυπα ακριβείας σε μία σειρά για όλες τις μεθόδους σύμφωνα με:α) τη μέθοδο που ορίζεται στο παράρτημα V σημείο β) ήβ) μία επικυρωμένη μέθοδος, που έχει δημοσιευτεί και που παρέχει μία καθορισμένη επαναληψιμότητα.Η τήρηση του ορίου αναπαραγωγιμότητας πρέπει να ελέγχεται τουλάχιστον μία φορά κατ' έτος σύμφωνα με τη διαδικασία που ορίζεται στο παράρτημα ΙΙΙ στοιχείο α).Το δεύτερο εδάφιο δεν εφαρμόζεται, αν το εργαστήριο έχει συμμετάσχει σε ένα πρόγραμμα δοκιμής καταλληλότητας κατά τη διάρκεια του έτους.3. Η έκθεση του εργαστηρίου επί των αποτελεσμάτων ανάλυσης πρέπει να περιέχει επαρκή στοιχεία για να καθιστά δυνατή μία αξιολόγηση των αποτελεσμάτων σύμφωνα με το παράρτημα IV και το παράρτημα VIII.4. Τα αποτελέσματα μιας ανάλυσης θεωρούνται αποδεκτά εφόσον έχουν ληφθεί σύμφωνα με κριτήρια αποδοχής που προσδιορίζονται στην εσωτερική μέθοδο ελέγχου της ποιότητας, η οποία αναφέρεται στην παράγραφο 1 και στα εσωτερικά πρότυπα ακρίβείας που αναφέρονται στην παράγραφο 2.Άρθρο 6Οργανοληπτική αξιολόγηση1. Όσον αφορά το βούτυρο, εφαρμόζονται οι μέθοδοι του παρόντος παραρτήματος VI για τον έλεγχο της εργασίας των εκτιμητών και την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων. Η μέθοδος που περιγράφεται στο παράρτημα VΙΙ εφαρμόζεται ως μέθοδος αναφοράς για την οργανοληπτική αξιολόγηση.2. Όσον αφορά το γάλα και τα γαλακτοκομικά προϊόντα εκτός του βουτύρου, τα κράτη μέλη χρησιμοποιούν ως μέθοδο αναφοράς για την οργανοληπτική αξιολόγηση είτε το πρότυπο IDF 99C/1997 είτε άλλες συγκρίσιμες μεθόδους, τις οποίες ανακοινώνουν στην Επιτροπή.Οι μέθοδοι του παραρτήματος VI μπορούν να εφαρμοστούν για τον έλεγχο των εργασιών των εκτιμητών και της αξιοπιστίας των αποτελεσμάτων.Άρθρο 7Δειγματοληψία και αμφισβήτηση των αποτελεσμάτων των αναλύσεων1. Ενόψει των αναλύσεων που προβλέπονται από την κοινοτική ρύθμιση, πρέπει να λαμβάνονται εις διπλούν δείγματα.2. Η διαδικασία που ορίζεται στο παράρτημα VIII εφαρμόζεται στις περιπτώσεις, όπου τα αποτελέσματα μιας ανάλυσης δεν γίνονται δεκτά από έναν συναλλασσόμενο.ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΙΙΜΕΘΟΔΟΙ ΤΩΝ ΑΝΑΛΥΣΕΩΝΆρθρο 8Περιεκτικότητα σε ύδωρ/ξηρές ουσίες/λιπαρές ουσίες στο βούτυρο1. Εφαρμόζεται η μέθοδος ανάλυσης που περιγράφεται στο παράρτημα ΙΧ, ως μέθοδος αναφοράς, για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε ύδωρ του βουτύρου.2. Εφαρμόζεται η μέθοδος ανάλυσης που περιγράφεται στο παράρτημα Χ, ως μέθοδος αναφοράς, για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε ξηρές μη λιπαρές ουσίες του βουτύρου.3. Εφαρμόζεται η μέθοδος ανάλυσης που περιγράφεται στο παράρτημα ΧΙ, ως μέθοδος αναφοράς, για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε λιπαρές ουσίες του βουτύρου.Άρθρο 9Ιχνηθέτες1. Η μέθοδος ανάλυσης που περιγράφεται στο παράρτημα ΧΙΙ εφαρμόζεται ως μέθοδος αναφοράς για τον προσδιορισμό της βανιλίνης στο συμπυκνωμένο βούτυρο, στο βούτυρο ή στην κρέμα.2. Η μέθοδος ανάλυσης που περιγράφεται στο παράρτημα ΧΙΙΙ εφαρμόζεται ως μέθοδος αναφοράς για τον προσδιορισμό της ποσότητας αιθυλικού εσθέρος του β-apo-8'-καροτινικού οξέος στο συμπυκνωμένο βούτυρο ή το βούτυρο.3. Η μέθοδος ανάλυσης που περιγράφεται στο παράρτημα XIV εφαρμόζεται ως μέθοδος αναφοράς για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας του βουτύρου και του συμπυκνωμένου βουτύρου σε στιγμαστερόλη ή σε β-σιτοστερόλη.4. Το συμπυκνωμένο βούτυρο, το βούτυρο ή η κρέμα έχουν ιχνοθετηθεί σύμφωνα με τη σχετική κοινοτική νομοθεσία, αν τα αποτελέσματα που λαμβάνονταν αντνστοιχούν στις προδιαγραφές του σημείου 8 των παραρτημάτων που αναφέρονται στις παραγράφους 1, 2 και 3.Άρθρο 10Ανίχνευση της καζεΐνης του αγελαδινού γάλακτος1. Η αναλυτική μέθοδος αναφοράς που εμφαίνεται στο παράρτημα XV εφαρμόζεται για να εξασφαλισθεί ότι το τυρί που πρέπει να παραχθεί αποκλειστικά από πρόβειο, αίγειο ή βουβαλίσιο γάλα ή από μείγμα πρόβειου, αίγειου ή βουβαλίσιου γάλακτος δεν περιέχει καζεΐνη αγελαδινού γάλακτος.Η καζεΐνη αγελαδινού γάλακτος θεωρείται παρούσα εφόσον η εμφανής περιεκτικότητα σε καζεΐνη του αγελαδινού γάλακτος του προς ανάλυση δείγματος είναι ίση ή ανώτερη με την περιεκτικότητα του δείγματος αναφοράς που περιέχει 1 % αγελαδινό γάλα, το οποίο προβλέπεται στο παράρτημα XV.2. Οι συνήθεις μέθοδοι για την ανίχνευση της καζεΐνης του αγελαδινού γάλακτος στα τυριά που αναφέρονται στην παράγραφο 1 μπορούν να χρησιμοποιηθούν υπό τους ακόλουθους όρους:α) Το όριο ανίχνευσης πρέπει να είναι κατ' ανώτατο όριο 0,5 %,β) δεν είναι δυνατό να υπάρξουν θετικά ψευδή αποτελέσματα,γ) η καζεΐνη αγελαδινού γάλακτος πρέπει να είναι ανιχνεύσιμη με την απαιτούμενη ευαισθησία, ακόμη και μετά από μακρές περιόδους ωρίμανσης, όπως αυτό μπορεί να συμβεί υπό συνήθεις όρους εμπορικής εκμετάλλευσης.Αν ο όρος που προβλέπεται στο στοιχείο β) δεν πληρούται, κάθε δείγμα που παρέχει θετικό αποτέλεσμα πρέπει να αναλυθεί μέσω της μεθόδου αναφοράς.Αν δεν πληρούται η απαίτηση που προβλέπεται στο στοιχείο γ) για έναν από τους τύπους τυριών που αναφέρονται στην παράγραφο 1, το τυρί αυτό πρέπει να αναλυθεί μέσω της μεθόδου αναφοράς.Άρθρο 11Ανίχνευση κολοβακτηριδίων1. Η αναλυτική μέθοδος αναφοράς που περιγράφεται στο παράρτημα XVI εφαρμόζεται για την ανίχνευση της παρουσίας κολοβακτηριδίων στο γάλα, στο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη, την καζεΐνη και τα καζεινικά άλατα.2. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν συνήθεις μέθοδοι για την ανίχνευση των κολοβακτηριδίων, υπό τον όρο ότι τα λαμβανόμενα αποτελέσματα είναι συγκρίσιμα με αυτά που λαμβάνονται με τη μέθοδο αναφοράς που περιγράφεται στο εν λόγω παράρτημα. Οι συνήθεις μέθοδοι πρέπει, ειδικότερα, να έχουν ένα επαρκές όριο ανίχνευσης. Δεν είναι δυνατό να υπάρξουν ψευδή αρνητικά αποτελέσματα. Αν είναι αδύνατο να αποκλείσουμε την παρουσία ψευδών θετικών αποτελεσμάτων, κάθε θετικό αποτέλεσμα πρέπει να επιβεβαιώνεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο αναφοράς.Άρθρο 12Περιεκτικότητα σε λακτόζηΗ μέθοδος για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε λακτόζη των προϊόντων που υπάγονται στη θέση 2309 της συνδυασμένης ονοματολογίας ορίζεται στο παράρτημα XVII.Άρθρο 13Ανίχνευση του τυρογάλακτος πυτίας1. Η μέθοδος για την παρουσία του τυρογάλακτος πυτίας στο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη που προορίζεται για δημόσια αποθεματοποίηση ορίζεται στο παράρτημα XVIII.2. Η μέθοδος για την ανίχνευση της παρουσίας τυρογάλακτος πυτίας στο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη και στα μίγματα που προορίζονται για τη διατροφή των ζώων ορίζεται στο παράρτημα ΧΙΧ.Άρθρο 14Ανίχνευση του βουτυρογάλακτοςΗ μέθοδος για την ανίχνευση της παρουσίας του βουτυρογάλακτος στο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη ορίζεται στο παράρτημα ΧΧ.Άρθρο 15Αντιμικροβιοτικά κατάλοιπαΗ μέθοδος για τον προσδιορισμό της παρουσίας καταλοίπων αντιβιοτικών και σουλφοναμιδών/dapson στο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη ορίζεται στο παράρτημα ΧΧΙ.Άρθρο 16Περιεκτικότητα σε αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνηΗ μέθοδος για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη στις σύνθετες ζωοτροφές ορίζεται στο άρθρο ΧΧΙΙ.Άρθρο 17Ανίχνευση του αμύλουΗ μέθοδος για την ανίχνευση της παρουσίας αμύλου στο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη, το μετουσιωμένο γάλα σε σκόνη και τις σύνθετες ζωοτροφές ορίζεται στο παράρτημα ΧΧΙΙΙ.Άρθρο 18Ποσοστό υγρασίας τον όξινου βουτυρογάλακτος σε σκόνηΗ μέθοδος για τον προσδιορισμό του ποσοστού υγρασίας του όξινου βουτυρογάλακτος σε σκόνη που προορίζεται να χρησιμοποιηθεί στις ζωοτροφές, ορίζεται στο άρθρο XXIV.Άρθρο 19Ανίχνευση ξένων λιπαρών ουσιώνΗ μέθοδος για τον προσδιορισμό της παρουσίας ξένων λιπαρών ουσιών στις λιπαρές ουσίες του γάλακτος ορίζεται στο παράρτημα XXV.ΚΕΦΑΛΑΙΟ IIIΤΕΛΙΚΕΣ ΔΙΑΤΑΞΕΙΣΆρθρο 20Τροποποίηση του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 2771/1999Ο κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 2771/1999 τροποποιείται ως εξής:1. Στο άρθρο 4 παράγραφος 1, η πρώτη περίοδος αντικαθίσταται από το ακόλουθο κείμενο: "Οι αρμόδιες αρχές ελέγχουν την ποιότητα του βουτύρου σύμφωνα με τις μεθόδους που αναφέρονται στο παράρτημα Ι και βάσει των δειγμάτων που λαμβάνονται σύμφωνα με τις λεπτομέρειες που αναφέρονται στο παράρτημα IV".2. Στο παράρτημα Ι, το κείμενο της υποσημείωσης 2 αντικαθίσταται ως εξής: "βλέπε παράρτημα Ι του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 213/2001 (παρών κανονισμός)."3. Καταργούνται τα παραρτήματα ΙΙ και ΙΙΙ.4. Στο παράρτημα IV, σημείο 2, προτελευταία σειρά, οι όροι "με το παράρτημα ΙΙΙ" αντικαθίστανται από τους όρους "με το παράρτημα VII του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 213/2001".Άρθρο 21Τροποποίηση του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 2799/1999Ο κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 2799/1999 τροποποιείται ως εξής:1. Στο άρθρο 20, οι παράγραφοι 1, 2, 3 και 4 αντικαθίστανται από το ακόλουθο κείμενο: "1. Η περιεκτικότητα σε αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη των μειγμάτων και των συνθέτων ζωοτροφών επαληθεύεται με ανάλυση, που διενεργείται τουλάχιστον εις διπλούν, σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρεται στο παράρτημα ΧΧΙΙ του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 213/2001, που συμπληρώνεται με τα μέτρα ελέγχου που προβλέπονται στο άρθρο 17 παράγραφος 3 του παρόντος κανονισμού. Αν υπάρχει διαφορά στα αποτελέσματα των δύο αυτών επαληθεύσεων, θεωρείται οριστικό το αποτέλεσμα των επιτόπιων ελέγχων.2. Η απουσία τυρογάλακτος πυτίας προσδιορίζεται με τη μέθοδο που περιγράφεται στο παράρτημα ΧΙΧ του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 213/2001.3. Η περιεκτικότητα σε άμυλο των συνθέτων ζωοτροφών προσδιορίζεται με τα μέτρα ελέγχου που αναφέρονται στο άρθρο 17 παράγραφος 3 του παρόντος κανονισμού, που πρέπει να συμπληρωθούν με τη μέθοδο ανάλυσης που ορίζεται στο παράρτημα ΧΧΙΙΙ του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 213/2001.4. Η περιεκτικότητα σε υγρασία του όξινου βουτυρογάλακτος σε σκόνη προσδιορίζεται με τη μέθοδο που περιγράφεται στο παράρτημα XXIV του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 213/2001"2. Καταργούνται τα παραρτήματα ΙΙΙ, IV, V και VI.Άρθρο 22ΚαταργήσειςΚαταργούνται οι κανονισμοί (ΕΟΚ) αριθ. 1216/68, (ΕΟΚ) αριθ. 3942/92, (ΕΟΚ) αριθ. 86/94, (ΕΚ), αριθ. 2721/95, (ΕΚ) αριθ. 1854/96, (ΕΚ) αριθ. 1080/96, (ΕΚ) αριθ. 1081/96, (ΕΚ) αριθ. 1082/96, (ΕΚ) αριθ. 880/98 και (ΕΟΚ) αριθ. 1459/98.Οι αναφορές στους κανονισμούς που καταργούνται νοούνται ότι πραγματοποιούνται στον παρόντα κανονισμό.Άρθρο 23Έναρξη της ισχύοςΟ παρών κανονισμός αρχίζει να ισχύει την έβδομη ημέρα από τη δημοσίευσή του στην Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων.Ωστόσο, οι μέθοδοι που προβλέπονται στα παραρτήματα ΙΙΙ, IV σημείο 4, V, VI και VIII εφαρμόζονται δεκαοκτώ μήνες μετά την έναρξη της ισχύος του παρόντος κανονισμού.Ο παρών κανονισμός είναι δεσμευτικός ως προς όλα τα μέρη του και ισχύει άμεσα σε κάθε κράτος μέλος.Βρυξέλλες, 9 Ιανουαρίου 2001.Για την ΕπιτροπήFranz FischlerΜέλος της Επιτροπής(1) ΕΕ L 160 της 26.6.1999, σ. 48.(2) ΕΕ L 333 της 24.12.1999, σ. 11.(3) ΕΕ L 340 της 31.12.1999, σ. 3.(4) ΕΕ L 350 της 20.12.1997, σ. 3.(5) ΕΕ L 76 της 25.3.2000, σ. 9.(6) ΕΕ L 298 της 12.11.1985, σ. 9.(7) ΕΕ L 11 της 16.1.1999, σ. 14.(8) ΕΕ L 45 της 21.2.1990, σ. 8.(9) ΕΕ L 16 της 21.1.1999, σ. 19.(10) ΕΕ L 279 της 11.10.1990, σ. 22.(11) ΕΕ L 325 της 17.12.1999, σ. 10.(12) ΕΕ L 256 της 7.9.1987, σ. 1.(13) ΕΕ L 28 της 3.2.2000, σ. 16.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I(Άρθρο 2)ΠΙΝΑΚΑΣ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΝΑΦΟΡΑΣΣημειώσεις στον πίνακα μεθόδων αναφοράς της Ευρωπαϊκής Ένωσης:Σημείωση 1: Απομόνωση των λιπαρών ουσιών του γάλακτος όπως περιγράφεται στο πρότυπο IDF 6B:1989 (προστασία από το φώς).Σημείωση 2: Δεν έχει καθοριστεί μέθοδος αναφοράς.Σημείωση 3: Προετοιμασία δειγμάτων σύμφωνα με το πρότυπο IDF 122C:1996 ή με το πρότυπο IDF 73A:1985.Σημείωση 4: Επώαση επί 48 ώρες σε θερμοκρασία 55 °C. Πρέπει να λαμβάνονται προφυλάξεις κατά της ξήρανσης του περιβάλλοντος καλλιέργειας.Σημείωση 5: % ΣΥΑΛ = % ξηράς ουσίας - % λιπαράς ουσίας.Σημείωση 6: Το βούτυρο πρέπει να αντιστοιχεί στην εθνική κατηγορία ποιότητας του κράτους μέλους παραγωγής που αναφέρεται στο παράρτημα V του κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 2771/1999 της Επιτροπής.Σημείωση 7: Οδηγία (ΕΟΚ) αριθ. 4/84 της Επιτροπής.Σημείωση 8: Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1758/94 της Επιτροπής (ΕΕ L 183 της 19.7.1994, σ. 14).Σημείωση 9: Οδηγία 78/633/ΕΟΚ της Επιτροπής.>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ(Άρθρο 3)ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΠΡΟΚΥΠΤΟΥΝ ΑΠΟ ΤΙΣ ΣΥΝΗΘΕΙΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ, ΟΙ ΟΠΟΙΕΣ ΕΓΓΙΖΟΥΝ ΤΑ ΟΡΙΑ ΠΟΥ ΚΑΘΟΡΙΖΟΝΤΑΙ ΣΤΟΥΣ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΥΣΕάν mο είναι όριο που ορίζεται σε έναν κανονισμό, το όριο απόφασης (L) είναι>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>εάν RRout/RRef &lt;=1RRout: ¼ñéï áíáðáñáãùãéìüôçôáò ôçò óõíÞèïõò ìåèüäïõRRef: ¼ñéï áíáðáñáãùãéìüôçôáò ôçò ìåèüäïõ áíáöïñÜòÅÜí mï åßíáé áíþôáôï üñéï êáé RRout/RRef &gt; 1, το όριο αυτό απόφασης προκύπτει βάσει του τύπου>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>Εάν, υπό τις ίδιες συνθήκες, mο είναι ένα κατώτερο όριο, το όριο απόφασης προκύπτει βάσει>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>CrD95: Κρίσιμη διαφορά της μεθόδου αναφοράς (βλέπε παράρτημα IV)Στην περίπτωση που το mο είναι ανώτατο όριο, ένα τελικό αποτέλεσμα που προκύπτει βάσει της συνήθους μεθόδου και το οποίο είναι μεγαλύτερο του ορίου απόφασης, πρέπει να αντικαθίσταται από ένα τελικό αποτέλεσμα που προκύπτει βάσει της μεθόδου αναφοράς. Το τελικό αυτό αποτέλεσμα πρέπει να βασίζεται τουλάχιστον στον ίδιο αριθμό αναλύσεων δειγμάτων όπως το τελικό αποτέλεσμα της συνήθους μεθόδου.Στην περίπτωση που το mο είναι κατώτατο όριο, πρέπει να ακολουθείται η ίδια διαδικασία για την επίτευξη τελικού αποτελέσματος βάσει της συνήθους μεθόδου, το οποίο είναι μικρότερο του ορίου απόφασης.ΠαρατήρησηΗ προαναφερθείσα διαδικασία μπορεί να εφαρμοστεί εφόσον δεν υπάρχουν ανιχνεύσιμες επιδράσεις υποστρώματος.Οι επιδράσεις του υποστρώματος είναι δυνατόν να ανιχνευθούν με τον ακόλουθο τρόπο: για κάθε δείγμα που χρησιμοποιείται για βαθμονόμηση προσδιορίζεται η διαφορά (wi) μεταξύ των αποτελεσμάτων που προκύπτουν βάσει της μεθόδου αναφοράς και της συνήθους μεθόδου.Η τυπική απόκλιση που υπολογίζεται βάσει του τύπου>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>m: Αριθμός δειγμάτων που χρησιμοποιούνται για βαθμονόμησησυγκρίνεται με τον αριθμητικό μέσο όρο της επαναλαμβανομένης τυπικής απόκλισης της μεθόδου αναφοράς και της συνήθους μεθόδου>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>Η επίδραση του υποστρώματος δεν μπορεί να εξαιρεθεί εάν&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.001502.EPS"&gt;f= m (f: αριθμός των βαθμών ελευθερίας)Y= Πιθανότητα σφάλματος α = 0,05.Στην περίπτωση αυτή, είναι απαραίτητη η διεξαγωγή περαιτέρω διερευνήσεων πριν τον καθορισμό ορίου απόφασης.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙΙ(Άρθρα 4 και 5)α) Διαδικασία για τον προσδιορισμό τήρησης ενός θεσπισμένου ορίου αναπαραγωγιμότητας (χημική ανάλυση)Η τήρηση του ορίου αναπαραγωγιμότητας ελέγχεται με σύγκριση των εργαστηριακών αποτελεσμάτων με τα αποτελέσματα ενός έμπειρου εργαστηρίου(1), τα οποία προκύπτουν από ένα πανομοιότυπο δείγμα. Διεξάγεται προσδιορισμός εις διπλούν και στα δύο εργαστήρια και τα αποτελέσματα αξιολογούνται βάσει του τύπου:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>CrD95: Κρίσιμη διαφορά (Ρ = 0.95)>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>: αριθμητικός μέσος όρος των δύο αποτελεσμάτων που λαμβάνονται στο εργαστήριο 1>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>: αριθμητικός μέσος όρος των δύο αποτελεσμάτων που λαμβάνονται στο εργαστήριο 2R: όριο αναπαραγωγιμότητας: προσδιορίζεται με προέκταση,r: όριο επαναληψιμότητας: εάν η ακρίβεια ποικίλλει σε σχέση με το επίπεδοΕάν παρατηρείται υπέρβαση της κρίσιμης διαφοράς, πρέπει να γίνεται κάθε προσπάθεια για την εντόπιση της αιτίας, και πρέπει να πραγματοποιείται άλλο ένα πείραμα εντός των επόμενων δύο μηνών. Σε περίπτωση μη τήρησης του ορίου αναπαραγωγιμότητας στο δεύτερο αυτό πείραμα, οι αρμόδιες αρχές πρέπει να παίρνουν τα απαραίτητα μέτρα.β) Διαδικασία για την επίτευξη προσωρινού ορίου αναπαραγωγικότητας (χημική ανάλυση)Το προσωρινό όριο αναπαραγωγιμότητας (Rprov) προκύπτει χρησιμοποιώντας την ακόλουθη ισότητα:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>: Μέσος όρος των δύο αποτελεσμάτων που λαμβάνονται στο εργαστήριο 1>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>: Μέσος όρος των δύο αποτελεσμάτων που λαμβάνονται στο εργαστήριο 2 (βλέπε παράρτημα ΙΙΙ σημείο α).r: Όριο επαναληψιμότητας ή προσωρινό όριο επαναληψιμότητας.Παρατηρήσεις:1. Η Rprov μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον υπολογισμό κρίσιμων διαφορών (βλέπε παράρτημα VI)2. Η Rprov ορίζεται σε 2r, εάν η υπολογισθείσα τιμή για Rprov είναι μικρότερη των 2r.3. Εάν η υπολογισθείσα τιμή είναι μεγαλύτερη από 3r ή υπερβαίνει πάνω από δύο φορές από την τιμή R-value που αναμένεται από την εξίσωση Horwitz(2), τότε η τιμή Rprov είναι απαράδεκτα υψηλή και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον υπολογισμό της κρίσιμης διαφοράς.4. Η Rprov θα πρέπει να προσδιορίζεται τουλάχιστον μία φορά ανά έτος βάσει των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται στα δύο εργαστήρια (βλέπε παράρτημα IV).5. Η μέση τιμή της Rprov θα πρέπει να χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό των κρίσιμων διαφορών. Οι κανόνες που δίδονται στα σημεία 2 και 3 ισχύουν για τη μέση τιμή της Rprov.Το όριο αναπαραγωγιμότητας (R-value) προκύπτει από τον υπολογισμό της τιμής RSDR- ως>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>(>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>= αριθμητικός μέσος όρος των αποτελεσμάτων)Ορισμένες υπολογισμένες τιμές RSDR-(παραδείγματα)>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Για συγκέντρωση του αναλύτη 1 g/100g λαμβάνουμε:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>.(1) Κατά γενικό κανόνα, το πεπειραμένο εργαστήριο πρέπει να είναι εργαστήριο που συμμετέχει επιτυχώς είτε στην επικύρωση της μεθόδου δοκιμής είτε σε μια δοκιμή επάρκειας.(2) Εξίσωση Horwitz:&gt;ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ&gt;RSDR: Σχετική τυπική απόκλιση της αναπαραγωγιμότηταςC: Συγκέντρωση που εκφράζεται ως δεκαδική τιμή (παράδειγμα: 10 g/100 g. = 0,1).Αναφορά:Peeler, J. Τ., Horwitz, W. and Albert, R.J. Ass. Off. Anal. Chem.72 (5), 784-806 (1989).ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IV(Άρθρο 4)ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΑΝΑΛΥΤΙΚΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΠΡΟΚΥΠΤΟΥΝ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩΝΤΑΣ ΕΠΙΚΥΡΩΜΕΝΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣΕάν το αναλυτικό αποτέλεσμα δεικνύει υπέρβαση ενός ορίου, υπολογίζεται ο αριθμητικός μέσος όρος δύο ή περισσοτέρων αποτελεσμάτων. Πρέπει να εφαρμόζεται η ακόλουθη διαδικασία:1. Σε περιπτώσεις όπου το αναλυτικό αποτέλεσμα αντιπροσωπεύει ένα και μόνον αποτέλεσμα, πρέπει να διεξάγεται δεύτερη ανάλυση υπό όρους επαναληψιμότητας. Εάν δεν είναι δυνατό να διεξαχθούν οι δύο αναλύσεις βάσει των όρων επαναληψιμότητας, πραγματοποιήσατε μία πρόσθετη ανάλυση εις διπλούν βάσει των όρων επαναληψιμότητας και χρησιμοποιήσατε τα αποτελέσματα αυτά για να εκτιμηθεί το κατά πόσον τηρείται η κρίσιμη διαφορά.2. Προσδιορίζεται η απόλυτος τιμή της διαφοράς μεταξύ του αριθμητικού μέσου όρου των αποτελεσμάτων που επιτυγχάνονται κάτω από συνθήκες επαναληψιμότητας και του ορίου. Μία απόλυτος τιμή της διαφοράς μεγαλύτερη από την κρίσιμη διαφορά δηλώνει ότι το δείγμα το οποίο υποβλήθηκε σε ανάλυση δεν πληροί τις προϋποθέσεις.Η κρίσιμη διαφορά προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>: αριθμητικός μέσος όρος των αποτελεσμάτων που λαμβάνονταιmo: όριοn: αριθμός των αναλύσεων/δείγμα.Εάν η ακρίβεια ποικίλλει ανάλογα με το επίπεδο, ίσως να είναι απαραίτητος ο προσδιορισμός του r και του R δια προέκτασης.Κανονικά, ένα τελικό αποτέλεσμα που αναφέρεται για ένα δείγμα πρέπει να δεικνύει τήρηση του ορίου.Τελικά αποτελέσματα συμπεριλαμβανόμενα- στην περιοχή>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>και>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>, εάν το όριο είναι ένα ανώτατο όριο·- στην περιοχή>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>και>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>εάν το όριο είναι ένα κατώτατο όριο,θα πρέπει να προκύπτουν μόνο σε εξαιρετικές περιπτώσεις.Τα τελικά αποτελέσματα εντός των προαναφερθέντων περιοχών είναι αποδεκτά εφόσον προκύπτουν μία φορά ανά 5 δείγματα που έχουν υποβληθεί σε ανάλυση ανά αποστολή, το πολύ. Εάν έχουν υποβληθεί σε ανάλυση λιγότερο από 5 δείγματα ανά αποστολή, ένα αποτέλεσμα εντός της προαναφερθείσας περιοχής είναι αποδεκτό. Ωστόσο, πρέπει να τηρείται ο κανόνας που λέει ότι μόνο ένα αποτέλεσμα εντός των προαναφερθεισών περιοχών επιτυγχάνεται ανά 5 δείγματα που υποβάλλονται σε ανάλυση, εάν ο παραγωγός φέρει αποστολές κατ' επανάληψη.3. Εάν το τελικό αποτέλεσμα X υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον τύπο της μορφής x = y1 +- y2 (παράδειγμα: νερό + περιεκτικότητα σε ξηρά ουσία του βουτύρου χωρίς λίπος για τον υπολογισμό της περιεκτικότητας σε λίπος) όπου y1 και y2 είναι τα τελικά αποτελέσματα ενός και μόνου τύπου ανάλυσης, τότε τα συνολικά όρια επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας rx και Rx των τελικών αποτελεσμάτων X υπολογίζονται ως εξής:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου r1 και r2 είναι τα όρια επαναληψιμότητας και R1 και R2 τα όρια αναπαραγωγιμότητας των y1 και y2 αντιστοίχως.Το x συγκρίνεται με το όριο mo βάσει των κανόνων που καθορίζονται στα σημεία 1 και 2. Η κρίσιμη διαφορά προσδιορίζεται βάσει του τύπου>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου x είναι ο αριθμητικός μέσος όρος των αποτελεσμάτων xi.4. Εάν το τελικό αποτέλεσμα υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον τύπο της μορφής>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>(παράδειγμα: λίπος σε περιεκτικότητα επί ξηράς ουσίας τυριού)όπου y1 και y2 είναι τα τελικά αποτελέσματα ενός και μόνο είδους ανάλυσης, τότε τα συνολικά όρια επανάληψιμότητας και αναπαραγωγικότητας rx και Rx είναι δυνατόν να υπολογιστούν ως εξής:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>μ1: όριο ή τιμή στόχος για το y1 (παράδειγμα: λίπος)μ2: όριο ή τιμή στόχος για το y2 (παράδειγμα: ξηρά ουσία)>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>r1: όριο επαναληψιμότητας y1r2: όριο επαναληψιμότητας y2&gt;ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ&gt;>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>R1: όριο αναπαραγωγιμότητας y1R2: όριο αναπαραγωγιμότητας y2.Οι διαδικασίες για τον υπολογισμό του rx και του Rx εφαρμόζονται μόνον εφόσον τα σχετικά όρια επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας (r*1 r*2 R*1 R*2) είναι μικρότερα ή ίσα με 0,15.Ο x συγκρίνεται με το όριο μx με βάση τους κανόνες που ορίζονται στα σημεία 1 και 2. Η κρίσιμη διαφορά προσδιορίζεται βάσει του τύπου>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>Όπου>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>είναι ο αριθμητικός μέσος όρος των αποτελεσμάτων x που προκύπτουν κατά χρονολογική σειρά(1).(1) Σημείωση:Εάν προκύπτουν για παράδειγμα τα αποτελέσματα y11, y12, και y22, πρέπει να υπολογίζεται ο αριθμητικός μέσος όρος του y11/y21 και y12/y22.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VΕΣΩΤΕΡΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ(Άρθρο 5)α) Διαδικασία εσωτερικού ποιοτικού ελέγχου (IQC) (χημική ανάλυση)Προσδιορισμός του υλικού ελέγχουΧρησιμοποιείται κάποιο υλικό για την IQC και υπόκειται στην ίδια, ή σε μέρος της ιδίας διαδικασίας, όπως και τα δοκιμασμένα υλικά.Το υλικό ελέγχου μπορεί να είναι:- πιστοποιημένο υλικό αναφοράς,- υλικό αναφοράς του εργαστηρίου,- επικυρωμένο υλικό βάσει δοκιμή επάρκειας,- υλικό εμβολιασμένο.Διαδικασία για τη θέσπιση IQCΤο εργαστήριο θα πρέπει να θεσπίσει IQC σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στο έγγραφο IUPAC "Εναρμονισμένες κατευθυντήριες γραμμές για τον εσωτερικό ποιοτικό έλεγχο σε αναλυτικά εργαστήρια"(1).Η IQC πραγματοποιείται συμπεριλαμβάνοντας υλικά ελέγχου στην αναλυτική αλληλουχία ή με επαναλαμβανόμενη ανάλυση του δείγματος για δοκιμή. Τα υλικά ελέγχου πρέπει να είναι παρόμοια σε χημική σύνθεση με τα δείγματα για δοκιμή και να είναι επαρκώς σταθερά κατά τη διάρκεια της εξεταζόμενης περιόδου. Πρέπει να αποδεικνύεται ότι μπορούν να καταμεριστούν κατάλληλα σε πανομοιότυπες αναλογίες για τους σκοπούς της ανάλυσης και ότι η συγκέντρωση της ουσίας προς ανάλυση είναι εντός της περιοχής ενδιαφέροντος.Ένα υλικό ελέγχου θα πρέπει να εισάγεται τουλάχιστον μία φορά σε κάθε αναλυτική μέτρηση και η τιμή που λαμβάνεται θα πρέπει να απεικονίζεται σε γραφικό ελέγχου με στόχο να υπολογίζονται τα μακροπρόθεσμα σφάλματα. Επιπλέον, το εργαστήριο θα πρέπει σε περιοδική βάση να αποδεικνύει ότι τηρεί τους όρους επαναληψιμότητας στο πλαίσιο μιας μεθόδου. Αυτό είναι δυνατόν να επιτευχθεί με ανάλυση των υλικών ελέγχου ή/και δοκιμής. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων αυτών θα πρέπει να συγκρίνονται με οιαδήποτε δημοσιευμένα όρια επαναληψιμότητας και οιαδήποτε δεδομένα ακριβείας που υπάρχουν στο εργαστήριο.Σε περίπτωση που χρησιμοποιούνται υλικά ελέγχου, οι τιμές που προκύπτονν από την ανάλυση μεταξύ μεθόδων του υλικού ελέγχου θα πρέπει να αποτυπώνονται σε γραφικό Shewhart [ISO 8258 (1991)] με κατάλληλα όρια ελέγχου. Τα όρια δράσης θα πρέπει να τίθενται σε>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>,όπου st είναι η συνολική τυπική απόκλιση,ή, τα όρια ασφαλείας σε>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>Ολική τυπική απόκλιση:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου:sb= Τυπική απόκλιση μεταξύ μεθόδωνsw= Τυπική απόκλιση στο πλαίσιο μιας μεθόδουn= αριθμός προσδιορισμών.Στις περιπτώσεις όπου δεν χρησιμοποιούνται υλικά ελέγχου (π.χ. λόγω έλλειψης σταθερότητος) τουλάχιστον ένα από τα δοκιμαστικά υλικά πρέπει να αναλύεται εις διπλούν σε κάθε μέθοδο.Οι απόλυτες διαφορές που προκύπτουν από τις αναλύσεις εις διπλούν στο πλαίσιο μιας μεθόδου (βλέπε παράρτημα ΙΙΙ) πρέπει να απεικονίζονται. Η κεντρική γραμμή είναι 1,128 sW, το κατώτατο όριο είναι 0, το ανώτατο όριο (όριο δράσης) είναι 3,686 sW, όπου sW είναι η τυπική απόκλιση στο πλαίσιο μιας μεθόδου.Η διαδικασία ελέγχου πρέπει να περιλαμβάνει υλικά με χαμηλό και υψηλό επίπεδο όπον η περιοχή συγκεντρώσεων είναι μεγάλη.Σε περίπτωση που τα δοκιμαστικά υλικά καλύπτουν μια ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων της προς ανάλυση ουσίας, το εργαστήριο θα πρέπει να καθορίσει τη σχέση μεταξύ ακρίβειας και επιπέδου συγκεντρώσεως. Εάν η ακρίβεια είναι ανάλογη του επιπέδου μεταγενέστερος έλεγχος θα πρέπει να γίνει με βάση την σχετική ακρίβεια (δηλαδή απόλυτη διαφορά ως ποσοστό μέσης τιμής).Εφόσον συμβεί ένα από τα ακόλουθα, παύει να υφίσταται η αξιοπιστία του αναλυτικού συστήματος:Α. η τρέχουσα τιμή βρίσκεται εκτός των ορίων δράσης,Β. η τρέχουσα και η προηγούμενη τιμή είναι εκτός των ορίων ασφαλείας αλλά εντός των ορίων δράσης,Γ. στην περίπτωση όπου χρησιμοποιούνται υλικά ελέγχου, εννέα διαδοχικές τιμές είναι στην ίδια πλευρά σε σχέση με τη μέση γραμμή.Το εργαστήριο πρέπει να ανταποκρίνεται στην εκτός ελέγχου κατάσταση με:Α. παύση των αναλύσεων εν αναμονή των διαγνωστικών δοκιμών και μέτρων αποκατάστασης και,Β. απόρριψη της σειράς αποτελεσμάτων και επανάληψη των αναλύσεων των δοκιμαστικών υλικών.β) Διαδικασία για την επιλογή υλικού ελέγχου του εργαστηρίου και για τον καθορισμό ορίων ακριβείας "του εργαστηρίου" (χημική ανάλυση)Δεδομένα εντός των ορίων ακρίβειας του εργαστηρίου είναι δυνατόν να προκύψουν με επανάληψη των αναλύσεων των υλικών ελέγχου ή/και με επαναληπτική ανάλυση των δοκιμαστικών δειγμάτων.Η κάτωθι προσέγγιση χρησιμεύει ως κατευθυντήρια γραμμή για εργαστήρια που θεσπίζουν παραμέτρους ακριβείας όσον αφορά τη διαφοροποίηση στο πλαίσιο μιας μεθόδου και μεταξύ μεθόδων, για μεταγενέστερη χρήση κατά την κατάρτιση γραφικών ελέγχου. Τα εργαστήρια μπορούν να θεσπίσουν εναλλακτικές διαδικασίες εφόσον μπορούν να αποδείξουν επαρκώς ότι προέκυψαν αξιόπιστα δεδομένα ακρίβειας.1. Επιλογή των υλικών ελέγχουΌταν το εργαστήριο κρίνει κατάλληλη τη χρήση υλικού ελέγχου πρέπει πρώτα να συγκεντρώνονται δεδομένα με σκοπό τον καθορισμό των ορίων. Εφόσον είναι δυνατό θα πρέπει να χρησιμοποιούνται Πιστοποιημένα Υλικά Αναφοράς (CRM). Τα υποψήφια υλικά ελέγχου θα πρέπει να αναλύονται βάσει των όρων για επαναληψιμότητα στα πλαίσια μιας μεθόδου, συμπεριλαμβανομένων κατάλληλων CRM με επανάληψη και τυχαία επιλογή. Τα υποψήφια υλικά ελέγχου θα πρέπει να αναλυθούν υπό συνθήκες επαναληπτικότητας μαζί με κατάλληλα CRM με επανάληψη και τυχαία δείγματα. Σε περίπτωση που η προσέγγιση αυτή δεν είναι εφικτή, τα εργαστήρια θα πρέπει να επιδιώκουν τη συμμετοχή τους σε δοκιμές επάρκειας και να καθορίζουν συμβατικούς μέσους όρους (προσδιορισμένες τιμές) που μπορούν να θεωρούνται ως συμβατικοί πραγματικοί μέσοι όροι στους οποίους μπορεί να αποδοθεί λογικό ποσοστό αβεβαιότητας. Άλλες διαδικασίες συμπεριλαμβάνουν προσδιορισμό πραγματικής τιμής με τυποποίηση ή με τη χρήση υλικών ελέγχου εμβολιασμένου.Επιπλέον, σε περίπτωση που το εργαστήριο έχει πείρα σχετική με την ανάλυση και έχει ήδη καθορίσει στατιστικό έλεχγο, τα οιαδήποτε νέα υλικά ελέγχου (π.χ. τα οποία απαιτούνται λόγω εξάντλησης των αποθεμάτων) πρέπει να αποκτώνται βάσει αναλύσεων οι οποίες υπόκεινται σε έλεγχο, χρησιμοποιώντας υλικά που ήδη υπάρχουν.2. Καθορισμός των ορίωνΈχοντας επιλέξει ένα υλικό ελέγχου, το εργαστήριο πρέπει να καθορίσει στοιχεία ακρίβειας στο πλαίσιο μιας μεθόδου και μεταξύ μεθόδων χρησιμοποιώντας το υλικό αυτό.Ως ελάχιστη προϋπόθεση για τη θέσπιση ακρίβειας στο πλαίσιο μιας μεθόδου, το υλικό ελέγχου θα πρέπει να αναλύεται εις διπλούν σε δώδεκα περιπτώσεις. Η ανάλυση εις διπλούν θα πρέπει να διεξάγεται βάσει των όρων επαναληψιμότητας, δηλαδή ο ίδιος χρήστης, τα ίδια αντιδραστήρια κ.λπ.. Η ανάλυση εις διπλούν του υλικού ελέγχου θα πρέπει να υποβάλλεται σε τυχαία δειγματοληψία στο πλαίσιο μίας αναλυτικής μεθόδου. Κάθε ανάλυση εις διπλούν θα πρέπει να πραγματοποιείται σε χωριστή ημέρα κατά τη διάρκεια μιας χρονικής περιόδου έτσι ώστε να αντιπροσωπεύει μία λογική διαφοροποίηση από μέτρηση σε μέτρηση, λαμβάνοντας υπόψη τις κανονικές διαφοροποιήσεις π.χ. αντιδραστήρια, αναβαθμονομήσεως οργάνων και ενδεχομένως διαφορετικοί αναλυτές.Σημείωση:Πρέπει να λαμβάνεται υπόψη ότι η χρήση δεδομένων τα οποία δεν είναι πλήρως αντιπροσωπευτικά της διαφοροποίησης μεταξύ των μεθόδων είναι δυνατό να οδηγήσουν σε μη απαραίτητη επανάληψη της ανάλυσης μέσω του καθορισμού πολύ στενών ορίων. Αντιστρόφως, ένα εργαστήριο που υποβάλλει δεδομένα ακριβείας τα οποία είναι άκρως ανακριβή, είναι δυνατόν να μην είναι σε θέση να τηρήσει τα προδιαγραφόμενα όρια των μεθόδων αναφοράς, θα πρέπει να αναμένει χαμηλή απόδοση σε σύγκριση με ισάξια εργαστήρια, και είναι δυνατόν να παράγει δεδομένα τα οποία δεν είναι κατάλληλα για τον συγκεκριμένο σκοπό.2.1. Καθορισμός ακρίβειας στο πλαίσιο μιας μεθόδου2.1.1. Ακρίβεια στο πλαίσιο μιας μεθόδου σε περίπτωση που υπάρχει υλικό ελέγχουΔεδομένα εις διπλούν (τουλάχιστον 12 δείγματα εις διπλούν) πρέπει πρώτα να υποβάλλονται σε δοκιμή μέγιστης διακύμανσης Cochrans. Αυτό σημαίνει σύγκριση του τετραγώνου της μεγίστης διαφοράς των διπλών δειγμάτων με το άθροισμα των ευρών των επαναλήψεων στο τετράγωνο.>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπουdi= η διαφορά μεταξύ των διπλών δειγμάτων.Η τιμή του κριτηρίου Cochran, C, συγκρίνεται με πινακοποιημένες τιμές [ISO 5725 ( 1994)]. Σε περίπτωση τιμών παράξενων (straggler) ή ακραίων (outlier), το αποτέλεσμα πρέπει να ερευνάται για να δοθεί εξήγηση, π.χ. τεχνικό σφάλμα, υπολογιστικό λάθος, παρεκτροπή κατά την διεξαγωγή της δοκιμής, ανάλυση λανθασμένου δείγματος. Σε περίπτωση που η εξήγηση του τεχνικού σφάλματος είναι τέτοια ώστε να είναι αδύνατον να αντικατασταθεί το ύποπτο αποτέλεσμα, θα πρέπει να απορρίπτεται ως πραγματικά ακραία τιμή. Σε περίπτωση που παράξενες ή ακραίες τιμές παραμένουν χωρίς να είναι δυνατόν να αιτιολογηθούν, οι παράξενες τιμές κρατώνται ως σωστές και απορρίπτονται οι ακραίες. Το εργαστήριο πρέπει να επιδιώκει την επίτευξη τιμών αντικατάστασης.Εφόσον το εργαστήριο είναι ικανοποιημένο ότι τα δεδομένα δεν εμπεριέχουν ακραίες τιμές, η τυπική απόκλιση στο πλαίσιο μιας μεθόδου sw επιτυγχάνεται ως εξής:Για κάθε ζεύγος xi1, xi2 των p δεδομένων εις διπλούν, το άθροισμα των δειγμάτων εις διπλούν,>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>και η διαφορά των δειγμάτων εις διπλούν,>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>υπολογίζονται και αθροίζονται σε>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>Μία κάποια εκτίμηση της τυπικής απόκλισης στο πλαίσιο μιας μεθόδου είναι:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>Το όριο ακρίβειας στο εργαστήριο είναι 2,8 sw.Εάν χρησιμοποιείται μέθοδος αναφοράς, το όριο ακρίβειας του εργαστηρίου πρέπει να συγκρίνεται με το δημοσιευμένο όριο επαναληψιμότητας. Το εργαστήριο πρέπει να τηρεί την προϋπόθεση σχετικά με την μέθοδο αναφοράς· αδυναμία τήρησης της προϋπόθεσης αυτής πρέπει να διερευνάται.Τα όρια που ορίζονται θα πρέπει να θεωρούνται ως προσωρινά και να υποβάλονται σε επανεξέταση.2.1.2. Ακρίβεια στο πλαίσιο μιας μεθόδου όπου δεν υπάρχει υλικό ελέγχουΤο εργαστήριο μπορεί να επιλέξει τον καθορισμό ακρίβειας στο πλαίσιο μιας μεθόδου με ανάλυση εις διπλούν των αντιπροσωπευτικών δοκιμαστικών δειγμάτων (τουλάχιστων 12 διπλές αναλύσεις). Σε περιπτώσεις όπου δεν είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν υλικά ελέγχου, π.χ. εξαιτίας αστάθειας, τα δεδομένα των διπλών αναλύσεων πρέπει να υπολογίζονται με αυτή τη μέθοδο.Σημείωση:Συμπεραίνεται ότι οι αναλύσεις καλύπτουν μια σχετικά στενή περιοχή τιμών και, ως εκ τούτου, μία μεμονωμένη τιμή δεν μπορεί να εφαρμοστεί για όλα τα δείγματα. Σε περιπτώσεις όπου η περιοχή των αποτελεσμάτων είναι μεγαλύτερη, π.χ. κατά σειρά μεγέθους, και η ακρίβεια εξαρτάται από το επίπεδο, τα εργαστήρια θα πρέπει να ερευνούν τη χρήση σχετικών τυπικών αποκλίσεων.Τα στοιχεία θα πρέπει να υποβάλλονται σε δοκιμή Cochrans, όπως στο 2.1.1. Εφόσον το εργαστήριο είναι ικανοποιημένο ότι τα δεδομένα είναι απαλλαγμένα από ακραίες τιμές, η τυπική απόκλιση στο πλαίσιο μιας μεθόδου και το όριο ακρίβειας του εργαστηρίου είναι δυνατόν να επιτευχθούν όπως στον τομέα 2.1.1.Η τυπική απόκλιση στο πλαίσιο μιας μεθόδου sw είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί για την κατασκευή γραφικών ελέγχου (βλέπε παράρτημα ΙΙ). Τα θεσπισμένα όρια θα πρέπει να θεωρούνται ως προσωρινά και να υπόκεινται σε αναθεώρηση.2.2. Καθορισμός της ακρίβειας μεταξύ μεθόδωνΥπολογίσατε τη μέση τιμή (si/2) για κάθε ζεύγος και υποβάλλετε αυτές τις τιμές σε δοκιμή Grubbs [ISO 5725 (1994)]. Τα κριτήρια απόρριψης/αποδοχής για παράξενες ή ακραίες τιμές περιγράφονται στο 2.1.1. Το εργαστήριο θα πρέπει να προσπαθεί να επιτύχει τιμή αντικατάστασης για κάθε απορριπτέο αποτέλεσμα. Εφόσον το εργαστήριο είναι ικανοποιημένο ότι τα δεδομένα είναι απαλλαγμένα από ακραίες τιμές, η τυπική απόκλιση μεταξύ των μεθόδων sb υπολογίζεται:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>ή 0 σε περίπτωση που το αποτέλεσμα υπό την τετραγωνική ρίζα είναι αρνητικό.Η ολική τυπική απόκλιση st χρησιμοποιείται για την κατασκευή γραφικών ελέγχου για το μέσο όρο η προσδιορισμών (βλέπε παράρτημα ΙΙ). Τα θεσπισμένα όρια θα πρέπει να θεωρούνται ως προσωρινά και να υπόκεινται σε αναθεώρηση.3. Αναθεώρηση των αρχικών ορίωνΤα όρια ελέγχου που έχουν θεσπιστεί όπως περιγράφεται ανωτέρω πρέπει να θεωρούνται ως αρχικές εκτιμήσεις και θα πρέπει να χρησιμοποιούνται με προσοχή πριν να χρησιμοποιηθούν για την απόρριψη αποτελεσμάτων μίας παρτίδας.Με σκοπό την ενημέρωση των ορίων τα οποία έχουν τεθεί βάσει αποδεκτής ακρίβειας στο πλαίσιο μιας μεθόδου (τομέας 2.1.2), πρέπει να συλλέγονται περαιτέρω δεδομένα εις διπλούν σχετικά με τα δοκιμαστικά δείγματα. Το διάστημα πριν την αναθεώρηση θα εξαρτάται σε ένα βαθμό από τη συχνότητα της ανάλυσης. Κατ' αρχήν, τα δεδομένα θα πρέπει να αναθεωρούνται αφού έχουν επιτευχθεί περαιτέρω 10 διπλές αναλύσεις. Το σύνολο των δεδομένων αυτών θα πρέπει στη συνέχεια να υποβάλλεται σε δοκιμή Cochran και να επαναπροσδιορίζονται τα όρια βάσει του νέου αριθμού τυπικής απόκλισης. Μεταγενέστερες αποφάσεις για την αξιοπιστία των ορίων του ελέγχου πρέπει να πραγματοποιηθούν υπό το φως πρόσθετων δεδομένων.Η αναθεώρηση των αρχικών δεδομένων που έχουν επιτευχθεί για την ακρίβεια μεταξύ μεθόδων εξαρτάται επίσης από τη συχνότητα της ανάλυσης. Ως βασική αρχή, μετά από την λήψη επιπλέον 10 σημείων δεδομένων από την ανάλυση υλικού ελέγχου, σε συχνότητα 1 ανάλυσης ανά παρτίδα, πρέπει να αναθεωρούνται τα αρχικά συμπεράσματα σχετικά με την τυπική απόκλιση και τον μέσο όρο.Το σύνολο των δεδομένων θα πρέπει να υποβάλλεται σε δοκιμή Grubbs για ακραίες τιμές. Ο μέσος όρος και η τυπική απόκλιση θα πρέπει να υπολογίζονται εκ νέου βάσει των νέων δεδομένων.Επιπλέον, κατά το στάδιο αυτό το εργαστήριο θα πρέπει να εφαρμόζει ένα γραφικό Cusum [BS S700: (1984) και τροποποίηση 5480 (1987)] για τη διερεύνηση οιωνδήποτε προβλημάτων που μπορούν να έχουν σχέση με π.χ. γήρανση των αντιδραστηρίων. Οιοδήποτε μεμονωμένο αποτέλεσμα που βρίσκεται εκτός των ορίων "V-mask" του γραφικού Cusum πρέπει να διερευνάται.Τα νέα όρια (μέσος όρος και τυπική απόκλιση) πρέπει να υπόκεινται σε τακτή επιθεώρηση χρησιμοποιώντας την τεχνική Cusum. Οιαδήποτε ένδειξη ότι η εγκυρότητα του υλικού ελέγχου τίθεται υπό αμφισβήτηση, πρέπει να εξετάζεται εκτενώς.4. Αναφορά των στοιχείων ακρίβειαςΤο εργαστήριο θα πρέπει να θέτει στη διάθεση της αρμόδιας κρατικής αρχής και της Επιτροπής, τις κάτωθι πληροφορίες:- χρησιμοποιηθείσα μέθοδος- τυπική απόκλιση στο πλαίσιο μιας μεθόδου, sw, και όριο ακριβείας του εργαστηρίου- τυπική απόκλιση μεταξύ των μετρήσεων, sb- ολική τυπική απόκλιση, st- αριθμός αναλύσεων για την επίτευξη δεδομένων ακριβείας.(1) Μ. Thomson and R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995).ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VI(Άρθρο 6)ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΕΚΤΙΜΗΤΩΝ ΚΑΙ ΤΗΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΣΕ ΟΡΓΑΝΟΛΗΠΤΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣΟι κάτωθι διαδικασίες εφαρμόζονται εφόσον χρησιμοποιούνται μέθοδοι βαθμολόγησης (πρότυπο IDF 99 C/1997).α) Προσδιορισμός του "δείκτη επαναληψιμότητας"Πρέπει να αναλύονται τουλάχιστον δέκα δείγματα σαν διπλά τυφλά από έναν εκτιμητή σε περίοδο 12 μηνών. Αυτό συνήθως θα συμβαίνει σε αρκετές περιόδους εργασιών. Τα αποτελέσματα για μεμονωμένα χαρακτηριστικά του προϊόντος αξιολογούνται βάσει του ακόλουθου τύπου:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>WΙ: δείκτης επαναληψιμότηταςxi1: βαθμολόγηση για την πρώτη αξιολόγηση του δείγματος xixi2: βαθμολόγηση για τη δεύτερη αξιολόγηση του δείγματος xin: αριθμός δειγμάτωνΤα δείγματα που πρέπει να αξιολογηθούν θα πρέπει να αντιπροσωπεύουν ένα ευρύ ποιοτικό φάσμα. Ο WI δε θα πρέπει να υπερβαίνει το 1,5 (κλίμακες 5 βαθμίδων)·β) Προσδιορισμός του "δείκτη απόκλισης"Ο δείκτης αυτός θα πρέπει να χρησιμοποιείται για το έλεγχο του κατά πόσον ένας εκτιμητής χρησιμοποιεί την ίδια κλίμακα για ποιοτική αξιολόγηση όπως μία έμπειρη ομάδα εκτιμητών. Οι βαθμολογίες που προκύπτουν από τον εκτιμητή συγκρίνονται με τον μέσο όρο των βαθμολογιών που προκύπτουν από την ομάδα εκτιμητών. Ο ακόλουθος τύπος χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>xi1; xi2: βλέπε τομέα (α)>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>;>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>: Μέσος όρος βαθμολογιών της ομάδας εκτιμητών για την πρώτη και τη δεύτερη αξιολόγηση, αντιστοίχως, του δείγματος xin: αριθμός των δειγμάτων (τουλάχιστον 10 ανά 12 μήνες).Τα δείγματα που πρόκειται να αξιολογηθούν θα πρέπει να αντιπροσωπεύουν ευρύ ποιοτικό φάσμα. Ο DΙ δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 1,5 (κλίμακες 5 βαθμίδων).Τα κράτη μέλη θα πρέπει να αναφέρουν οιανδήποτε δυσκολία κατά την εφαρμογή της διαδικασίας αυτής.γ) Σύγκριση των αποτελεσμάτων που προκύπτουν σε διάφορες περιφέρειες ενός κράτους μέλους και σε διάφορα κράτη μέληΌπου είναι δυνατόν, μία φορά το χρόνο, τουλάχιστον, οργανώνεται μία δοκιμή, η οποία επιτρέπει τη σύγκριση των αποτελεσμάτων που προκύπτουν από εκτιμητές διαφόρων περιφερειών. Εάν παρατηρούνται σημαντικές διαφορές, τα κράτη μέλη πρέπει να παίρνουν τα απαραίτητα μέτρα για τον προσδιορισμό των αιτίων και να καταλήγουν σε συγκρίσιμα αποτελέσματα.Συστήνεται στα κράτη μέλη να οργανώνουν δοκιμές οι οποίες επιτρέπουν τη σύγκριση των αποτελεσμάτων που προκύπτουν από τους δικούς τους εκτιμητές και από εκτιμητές γειτονικών κρατών μελών. Σημαντικές διαφορές θα πρέπει να καταλήγουν σε εις βάθος διερεύνηση, με στόχο την επίτευξη συγκρίσιμων αποτελεσμάτων.Ζητείται από τα κράτη μέλη να κοινοποιούν στην Επιτροπή τα αποτελέσματα αυτών των συγκρίσεων.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VΙΙ(Άρθρο 6)Οργανοληπτική αξιολόγηση βουτύρου1. Είδος εφαρμογήςΣκοπός της διαδικασίας αυτής για την οργανοληπτική αξιολόγηση του βουτύρου είναι να παράσχει μία ομοιόμορφη μέθοδο που να μπορεί να εφαρμόζεται σε όλα τα κράτη μέλη.2. ΟρισμοίΟργανοληπτική αξιολόγηση (εκτίμηση) σημαίνει την εξέταση των χαρακτηριστικών ενός προϊόντος με τα όργανα αισθήσεως.Πάνελ σημαίνει ομάδα επιλεγμένων εκτιμητών εργαζομένων, κατά τη διάρκεια της εκτιμήσεως, χωρίς διεπικοινωνία, και χωρίς να επηρρεάζει ο ένας τον άλλο.Βαθμολόγηση σημαίνει οργανοληπτική αξιολόγηση από πάνελ, χρησιμοποιώντας μία αριθμητική κλίμακα. Πρέπει να χρησιμοποιείται ονοματολογία ελαττωμάτων.Κατάταξη σημαίνει ποιοτική ταξινόμηση που πραγματοποιείται με βάση τη βαθμολογία.Δελτία ελέγχου: έντυπα που χρησιμοποιούνται για την καταχώρηση των επιμέρους βαθμολογήσεων για κάθε χαρακτηριστικό και την τελική κατάταξη του προϊόντος (το έντυπο αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί επίσης και για την καταγραφή της χημικής σύστασης).3. Χώρος δοκιμής3.1. Πρέπει να λαμβάνεται πρόνοια ώστε οι εκτιμητές στο χώρο δοκιμής να μην επηρρεάζονται από εξωτερικούς παράγοντες.3.2. Ο χώρος δοκιμής πρέπει να είναι απηλλαγμένος από ξένες οσμές και να μπορεί να καθαρίζεται εύκολα. Οι τοίχοι πρέπει να είναι ανοικτού χρώματος.3.3. Ο χώρος δοκιμής και ο φωτισμός που πρέπει να είναι τέτοιος ώστε να μην επηρρεάζονται οι ιδιότητες των προς βαθμολόγηση προϊόντων. Ο χώρος πρέπει να είναι εφοδιασμένος με κατάλληλο σύστημα ελέγχου της θερμοκρασίας.4. Επιλογή των εκτιμητώνΟ εκτιμητής πρέπει να είναι εξοικειωμένος με τα προϊόντα βουτύρου και ικανός για την πραγματοποίηση αισθητικού χαρακτηρισμού. Η ικανότητά του θα πρέπει να εκτιμάται σε τακτά χρονικά διαστήματα (τουλάχιστον μία φορά το χρόνο) από την αρμόδια αρχή.5. Απαιτήσεις για το πάνελΟ αριθμός των εκτιμητών του πάνελ πρέπει να είναι μονός, ο ελάχιστος δε αριθμός των εκτιμητών θα πρέπει να είναι τρεις. Η πλειοψηφία πρέπει να είναι υπάλληλοι της αρμόδιας αρχής ή εξουσιοδοτημένα πρόσωπα τα οποία δεν απασχολούνται στη γαλακτοβιομηχανία.Πρέπει να ληφθούν υπόψη περισσότεροι παράγοντες πριν από την αξιολόγηση, προκειμένου να επιτευχθούν οι βέλτιστες δυνατές επιδόσεις εκ μέρους των αξιολογητών:- Οι αξιολογητές δεν πρέπει να πάσχουν από καμία ασθένεια που μπορεί να επηρεάσει τις επιδόσεις τους. Εν τοιαύτη περιπτώσει, πρέπει να ενταχθεί άλλο πρόσωπο στο πάνελ.- Οι αξιολογητές πρέπει να βρίσκονται εγκαίρως επιτόπου προκειμένου να συμμετάσχουν στην αξιολόγηση και να βεβαιωθούν ότι έχουν αφιερώσει επαρκή χρόνο για την πραγματοποίηση της αξιολόγησης.- Οι αξιολογητές πρέπει να αποφεύγουν να χρησιμοποιούν προϊόντα με έντονο άρωμα, όπως αρώματα, λοσιόν για μετά το ξύρισμα, αποσμητικά, και την κατανάλωση τροφίμων με έντονη οσμή (μπαχαρικά) κ.λπ.- Οι αξιολογητές δεν μπορούν ούτε να καπνίσουν, ούτε να φάνε, ούτε να πιουν παρά μόνο νερό κατά τη διάρκεια της μισής ώρας που προηγείται της αξιολόγησης.6. Εκτίμηση της αξίας κάθε χαρακτηριστικού6.1. Η οργανοληπτική αξιολόγηση πρέπει να πραγματοποιείται σε σχέση με τα ακόλουθα τρία χαρακτηριστικά: εμφάνιση, σύσταση και γευστικοοσφραντικό αίσθημα.Η εμφάνιση περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία: χρώμα, ορατή καθαρότητα, ανάπτυξη μυκήτων και διασπορά νερού. Ο σχηματισμός κολλοειδών υδατικών διαλυμάτων ελέγχεται σύμφωνα με το πρότυπο IDF 112Α/1989.Η σύσταση περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία: συνεκτικότητα και επαλειψιμότητα.Για την αξιολόγηση της σύστασης του βουτύρου μπορούν να εφαρμοστούν φυσικές μέθοδοι. Η Επιτροπή σχεδιάζει τη μελλοντική εναρμόνιση των μεθόδων αυτών.Το γευστικοοσφραντικό αίσθημα περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία: γεύση και οσμή.Τυχόν σημαντική απόκλιση από τη συνιστώμενη θερμοκρασία παρεμποδίζει την αξιόπιστη αξιολόγηση της σύστασης, της γεύσης και του αρώματος. Η θερμοκρασία είναι παράγοντας υψίστης σπουδαιότητας.6.2. Κάθε χαρακτηριστικό πρέπει να αξιολογείται οργανοληπτικώς ξεχωριστά. Η βαθμολόγηση πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τον πίνακα 1.6.3. Μπορεί να είναι πρόσφορο οι εκτιμητές να βαθμολογήσουν μαζί, πριν από την έναρξη της εκτίμησης, ένα ή περισσότερα δείγματα αναφοράς για την εμφάνιση, σύσταση, γεύση και όσφρηση για την επίτευξη ομοιομορφίας.6.4. Η βαθμολογία για την αποδοχή είναι η εξής:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Όπου δεν επιτυγχάνεται η απαιτούμενη βαθμολογία, πρέπει να περιγράφεται το ελάττωμα. Η βαθμολογία που δίδεται από κάθε εκτιμητή για κάθε χαρακτηριστικό πρέπει να καταχωρείται στο δελτίο ελέγχου. Το προϊόν γίνεται αποδεκτό ή απορρίπτεται βάσει αποφάσεως κατά πλειοψηφία. Περιπτώσεις όπου διαφορές μεταξύ της επιμέρους βαθμολόγησης για κάθε χαρακτηριστικό είναι μεγαλύτερες από εκείνη προσκειμένων βαθμών δεν θα πρέπει να παρατηρούνται συχνά (όχι περισσότερο από μία φορά ανά 20 δείγματα). Άλλως, ο επικεφαλής του πάνελ θα πρέπει να ελέγχει την ικανότητα του πάνελ.7. ΕποπτείαΟ επικεφαλής του πάνελ που πρέπει να είναι μόνιμος υπάλληλος της αρμόδιας αρχής και μπορεί να είναι και μέλος του πάνελ, πρέπει να είναι εν γένει υπεύθυνος για το σύνολο της διαδικασίας. Πρέπει να καταχωρεί τις ατομικές βαθμολογίες για κάθε χαρακτηριστικά στο δελτίο ελέγχου και να πιστοποιεί αν το προϊόν είναι αποδεκτό ή αν απορρίπτεται.8. Δειγματοληψία και ετοιμασία του δείγματος8.1. - Καλόν είναι, κατά τη διάρκεια της εκτιμήσεως, η ταυτότητα των δειγμάτων να αποκρύπτεται, ώστε να αποφεύγεται οποιαδήποτε πιθανή προκατάληψη ή συμπάθεια.- Αυτό θα πρέπει να οργανώνεται από τον επικεφαλής του πάνελ πριν από την αξιολόγηση χωρίς την παρουσία των άλλων μελών του πάνελ.8.2. Όταν η οργανοληπτική αξιολόγηση πραγματοποιείται στον ψυχρό χώρο αποθήκευσης, το δείγμα λαμβάνεται χρησιμοποιώντας δοκιμαστή βουτύρου. Εάν η οργανοληπτική αξιολόγηση πραγματοποιείται σε άλλο τόπο, τότε θα πρέπει να λαμβάνεται δείγμα τουλάχιστον 500 g.8.3. Κατά τη διάρκεια της αξιολόγησης, το βούτυρο θα πρέπει να έχει θερμοκρασία 10 - 12 °C. Μεγάλες αποκλίσεις θα πρέπει να αποφεύγονται πάση θυσία.9. ΟνοματολογίαΒλέπε συνημμένο πίνακα 2.Πίνακας 1: Γνωμάτευση βουτύρου>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Πίνακας 2: Ονοματολογία ελαττωμάτων βουτύρουI. Εμφάνιση1. ελεύθερη υγρασία, εμφανή σταγονίδια νερού2. μη ομοιόμορφο, δίχρωμο3. ραβδωτό4. με νερά, έγχρωμα στίγματα5. κηλιδωμένο (έγχωμα σημάδια, κηλίδες τηγμένου βουτύρου)6. διαχωρισμός ελαίου7. έντονα χρωματισμένο8. πορώδες (εμφανής εγκλεισμός αέρα)9. κοκκώδες10. ξένες ύλες11. μουχλιασμένο12. αδιάλυτο άλαςII. Σύσταση14. εύθρυπτο15. πολτώδες16. κολλώδες17. σκληρό18. μαλακόIII. Γευστικοοσφραντικό αίσθημα20. έλλειψη αρώματος21. ακάθαρτο(1)22. ξένη γεύση23. μπαγιάτικο24. τυρώδες, γεύση όξινου τυριού25. όξινο26. ζυμωμένο27. α) γεύση μαγειρεμένουβ) γεύση καμμένου28. γεύση μούχλας29. ταγγό30. ελαιώδες, γεύση ιχθυελαίου31. γεύση ξυγγιού32. α) οξειδωμένη γεύσηβ) μεταλλική γεύση33. γεύση σανού34. καυστικό, πικρό35. πολύ αλατισμένο36. γεύση σάπιου37. γεύση βύνης38. χημική γεύση(1) Ο χαρακτηρισμός αυτός θα πρέπει να χρησιμοποιείται όσο το δυνατόν σπάνια και μόνον όταν το ελάττωμα δεν μπορεί να περιγραφεί ακριβέστερα.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VIII(Άρθρο 7)ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΟΥ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΤΗΡΕΙΤΑΙ ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΑΜΦΙΣΒΗΤΟΥΜΕΝΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ (ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ)1. Είναι δυνατό να διεξαχθεί μία πρόσθετη ανάλυση μετά από αίτημα της επιχείρησης, εντός προθεσμίας 7 εργάσιμων ημερών που έπονται της ανακοίνωσης των αποτελεσμάτων της πρώτης ανάλυσης, εφόσον υπάρχουν σφραγισμένα διπλά δείγματα του προϊόντος και εφόσον έχουν αποθηκευθεί καταλλήλως στους αρμόδιους οργανισμούς.2. Ο αρμόδιος οργανισμός αποστέλλει, μετά από αίτημα της επιχείρησης και επ' εξόδων της, τα δείγματα αυτά σε ένα δεύτερο εργαστήριο. Το εργαστήριο αυτό πρέπει να είναι εγκεκριμένο για τη διεξαγωγή επίσημων αναλύσεων και πρέπει να έχει αποδεδειγμένη αρμοδιότητα για τις εν λόγω αναλύσεις. Η αρμοδιότητα αυτή θα πρέπει να τεκμηριώνεται με επιτυχή συμμετοχή σε συλλογικές μελέτες, δοκιμές ικανότητας ή διεργαστηριακές συγκρίσεις. Το δεύτερο εργαστήριο πρέπει να χρησιμοποιήσει τη μέθοδο αναφοράς. Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από τα δύο εργαστήρια αξιολογούνται ως εξής:α) Σε περίπτωση που αμφότερα τα εργαστήρια πληρούν τις προϋποθέσεις επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότηταςΟ αριθμητικός μέσος όρος των αποτελεσμάτων των δοκιμών που προκύπτουν από αμφότερα τα εργαστήρια αναφέρεται ως το τελικό αποτέλεσμα. Το τελικό αυτό αποτέλεσμα αξιολογείται λαμβάνοντας υπόψη την κρίσιμη διαφορά, χρησιμοποιώντας τον κάτωθι τύπο:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>: αριθμητικός μέσος όρος όλων των αποτελεσμάτων που προκύπτουν από αμφότερα τα εργαστήριαmo: όριοR: αναπαραγωγιμότηταr: επαναληψιιμότηταn1: αριθμός των αποτελεσμάτων που προκύπτουν στο εργαστήριο 1n2: αριθμός των αποτελεσμάτων που προκύπτουν στο εργαστήριο 2.Σημείωση 8Εάν το τελικό αποτέλεσμα υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον τύπο>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>ή>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>(βλέπε παράρτημα VI σημεία 3. και 4., αντιστοίχως), Στον τύπο πρέπει να τοποθετούνται οι τιμές R2x και r2x αντί των R2 και r2.β) Σε περίπτωση που και τα δύο εργαστήρια πληρούν την προϋπόθεση για επαναληψιμότητα και η προϋπόθεση αναπαραγωγιμότητας δεν τηρείταιΗ προς ανάλυση ποσότητα τελικά απορρίπτεται, εάν τα αποτελέσματα αμφότερων των εργαστηρίων καταλήγουν στο συμπέρασμα αυτό. Σε άλλη περίπτωση, η αποστολή γίνεται αποδεκτή.γ) Σε περίπτωση που μόνο ένα εργαστήριο πληροί την προϋπόθεση επαναληψιμότηταςΤο τελικό αποτέλεσμα του εργαστηρίου που πληροί την προϋπόθεση για επαναληψιμότητα χρησιμοποιείται για την απόφαση όσον αφορά την αποδοχή ή όχι της αποστολής.δ) Σε περίπτωση πον κανένα εργαστήριο δεν πληροί την προϋπόθεση για επαναληψιμότητα, αλλά τηρείται η προϋπόθεση αναπαραγωγιμότηταςΕφαρμόζεται το σημείο α).ε) Σε περίπτωση που κανένα εργαστήριο δεν πληροί την προϋπόθεση για επαναληψιμότητα και δεν τηρείται η προϋπόθεση αναπαραγωγιμότηταςΗ προς ανάλυση ποσότητα γίνεται αποδεκτή εφόσον τα αποτελέσματα που προκύπτον από το ένα εργαστήριο καταλήγουν στο συμπέρασμα αυτό.στ) Σε περίπτωση που τα αποτελέσματα προκύπτουν χρησιμοποιώντας μη επικυρωμένες μεθόδουςΗ προς ανάλυση ποσότητα γίνεται αποδεκτή εφόσον τα αποτελέσματα που προκύπτουν από το ένα εργαστήριο καταλήγουν στο συμπέρασμα αυτό.3. Τα αποτελέσματα της δεύτερης ανάλυσης ανακοινώνονται στην επιχείρηση από την αρμόδια αρχή το ταχύτερο δυνατό. Το κόστος της δεύτερης ανάλυσης βαρύνει την επιχείρηση στην περίπτωση όπου απορρίπτεται η ποσότητα που υπόκειται σε ανάλυση.4. Εντός των πέντε εργάσιμων ημερών που ακολουθούν τη δειγματοληψία, εφόσον η επιχείρηση παρέχει την απόδειξη ότι η διαδικασία δειγματοληψίας δεν είναι σωστή, αυτή θα πρέπει, εφόσον είναι δυνατό, να επαναλαμβάνεται. Στην περίπτωση που δεν είναι δυνατή μία νέα δειγματοληψία, η ποσότητα που υπόκειται σε ανάλυση γίνεται αποδεκτή.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IX(Άρθρο 8)ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΒΟΥΤΥΡΟΥ ΣΕ ΥΓΡΑΣΙΑ1. Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογήςΣτην παρούσα μέθοδο αναφοράς καθορίζεται ο τρόπος προσδιορισμού της περιεκτικότητας του βουτύρου σε υγρασία.2. Στοιχεία αναφοράςΠρότυπο IDF 50 C: 1995. Γάλα και γαλακτοκομικά προϊόντα - Μέθοδοι δειγματοληψίας.3. ΟρισμόςΠεριεκτικότητα του βουτύρου σε υγρασία: η απώλεια μάζας μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας θέρμανσης που καθορίζεται στο πρότυπο αυτό. Εκφράζεται σε γραμμάρια ανά 100 γραμμάρια.4. Αρχή της μεθόδουΕξάτμιση του νερού από μια δεδομένη ποσότητα ελέγχου, παρουσία ελαφρόπετρας, σε θερμοκρασία 102 °C σε πυριατήριο.5. Εργαστηριακά όργανα και υλικάΣυνήθης εργαστηριακός εξοπλισμός και ειδικότερα:5.1. Αναλυτικός ζυγός με ευαισθησία 1 mg.5.2. Ξηραντήρας εφοδιασμένος με αποδοτικό ξηραντικό μέσο (π.χ. silica gel, που έχει πρόσφατα ξηρανθεί, με υγροσκοπικό δείκτη).5.3. Πυριατήριο με αερισμό και θερμοστατικό έλεγχο της θερμοκρασίας, που λειτουργεί στους 102 ± 2 °C σε όλο το χώρο εργασίας.5.4. Κάψες από γυαλί, πορσελάνη ή μη διαβρωτικό μέταλλο, ύψους περίπου 20 mm και διαμέτρου 60 έως 80 mm.5.5. Ελαφρόπετρα, κοκκοποιημένη και πλυμένη, διαμέτρου 0,8-10 mm.6. ΔειγματοληψίαΒλέπε πρότυπο IDF 50 C: 1995.7. Εκτέλεση7.1. Παρασκευή του δείγματος ελέγχουΤο εργαστηριακό δείγμα θερμαίνεται στο κλειστό δοχείο από γυαλί ή κατάλληλη πλαστική ύλη, το οποίο θα πρέπει να είναι γεμάτο κατά το ήμισυ έως τα δύο τρίτα, σε θερμοκρασία που επιτρέπει στο δείγμα να είναι αρκετά μαλακό, ώστε να διευκολύνεται η πλήρης ανάμειξή του προς ομοιογενοποίηση (είτε με μηχανικό αναδευτήρα είτε με το χέρι). Η θερμοκρασία ανάμειξης δεν θα πρέπει κατά κανόνα να υπερβαίνει τους 35 °C. Το δείγμα ψύχεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Το συντομότερο δυνατόν μετά την ψύξη, ανοίγεται το δοχείο του δείγματος και το περιεχόμενο ανακινείται για λίγο (όχι περισσότερο από 10 δευτερόλεπτα) με κατάλληλο όγρανο, π.χ. κοχλιάριο ή σπαθίδα, πριν από τη ζύγιση.7.2. Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε υγρασία7.2.1. Στην κάψα (5.4) φέρονται περίπου 10 g ελαφρόπετρας.7.2.2. Η κάψα με την ελαφρόπετρα ξηραίνεται στο πυριατήριο (5.3) στους 102 ± 2 °C τουλάχιστον για μία ώρα.Σημείωση:οι χρόνοι ξήρανσης που αναφέρονται στα σημεία 7.2.2, 7.2.5 και 7.2.7 υπολογίζονται από τη στιγμή που η θερμοκρασία του πυριατηρίου φθάνει τους 102 ± 2 °C.7.2.3. Η κάψα αφήνεται να ψυχθεί στον ξηραντήρα (5.2) στη θερμοκρασία του θαλάμου ζύγισης και ζυγίζεται με ακρίβεια 1 mg.7.2.4. Ζυγίζεται μέσα στην κάψα, με ακρίβεια 1 mg, ποσότητα ελέγχου περίπου 5 g από το δείγμα ελέγχου.7.2.5. Η κάψα τοποθετείται στο πυριατήριο στους 102 ± 2 °C και αφήνεται για τρεις ώρες.7.2.6. Η κάψα αφήνεται να ψυχθεί στον ξηραντήρα στη θερμοκρασία του θαλάμου ζύγισης και ζυγίζεται με ακρίβεια 1 mg.7.2.7. Η διαδικασία ξήρανσης επαναλαμβάνεται για επιπλέον περιόδους 1 ώρας, κάθε φορά με τις φάσεις ψύξης και ζύγισης που καθορίζονται στο σημείο 7.2.6 μέχρι σταθερού βάρους (η μεταβολή της μάζας δεν υπερβαίνει το 1 mg).Σε περίπτωση αύξησης της μάζας, χρησιμοποιείται για τους υπολογισμούς η μικρότερη μάζα που έχει καταγραφεί.8. Έκφραση των αποτελεσμάτων8.1. Τρόπος υπολογισμού και μαθηματικός τύποςΗ περιεκτικότητα σε υγρασία, W, υπολογίζεται σε κατά μάζα εκατοστιαία αναλογία με τη βοήθεια του ακόλουθου τύπου:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Το αποτέλεσμα καταγράφεται με ένα δεκαδικό ψηφίο.8.2. Ενδοεργαστηριακή επαναληπτικότηταΗ διαφορά, σε απόλυτες τιμές, μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο μεμονωμένων προσδιορισμών, που έχουν εκτελεστεί ταυτόχρονα ή με μικρή χρονική διαφορά από τον ίδιο τεχνικό στις ίδιες συνθήκες και με πανομοιότυπο υλικό ελέγχου, δεν υπερβαίνει το 0,2 %.8.3. Διεργαστηριακή επαναληπτικότηταΗ διαφορά, σε απόλυτες τιμές, μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο μεμονωμένων και ανεξάρτητων προσδιορισμών, που έχουν εκτελεστεί από δύο τεχνικούς εργαζόμενους σε διαφορετικά εργαστήρια με πανομοιότυπο υλικό ελέγχου, δεν υπερβαίνει το 0,3 %.9. Έκθεση ελέγχουΣτην έκθεση ελέγχου περιγράφεται η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε και παρατίθενται τα αποτελέσματα που ελήφθησαν. Αναφέρονται επίσης κάθε λεπτομέρεια της εκτέλεσης που δεν καθορίζεται στο παρόν διεθνές πρότυπο ή θεωρείται προαιρετική καθώς και οι λεπτομέρειες τυχόν συμβάντων που ενδέχεται να έχουν επηρεάσει τα αποτελέσματα. Η έκθεση ελέγχου περιλαμβάνει όλα τα στοιχεία που είναι απαραίτητα για την αναγνώριση της ταυτότητας του δείγματος.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ X(Άρθρο 8)ΒΟΥΤΥΡΟ: ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΣΤΕΡΕΟΥ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΟΣ ΧΩΡΙΣ ΛΙΠΟΣ1. Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογήςΣτο παρόν πρότυπο καθορίζεται μέθοδος προσδιορισμού της περιεκτικότητας του βουτύρου σε στερεό υπόλειμμα χωρίς λίπος.2. Στοιχεία αναφοράςΠρότυπο IDF 50 C: 1995. Γάλα και γαλακτοκομικά προϊόντα - Μέθοδοι δειγματοληψίας.3. ΟρισμόςΠεριεκτικότητα του βουτύρου σε στερεό υπόλειμμα χωρίς λίπος: η κατά μάζα εκατοστιαία αναλογία των ουσιών που προσδιορίζονται με την καθοριζόμενη μέθοδο. Εκφράζεται σε γραμμάρια ανά 100 γραμμάρια.4. Αρχή της μεθόδουΕξάτμιση του νερού από γνωστή ποσότητα βουτύρου, εκχύλιση του λίπους με πετρελαϊκό αιθέρα και ζύγιση του υπολείμματος.5. ΑντιδραστήριοΠετρελαϊκός αιθέρας με πεδίο τιμών σημείου ζέσεως 30-60 °C. Το αντιδραστήριο δεν αφήνει υπολείμματα σε ποσότητα ανώτερη από 1 mg μετά την εξάτμιση 100 ml.6. Εργαστηριακά όργανα και υλικά6.1. Αναλυτικός ζυγός με ευαισθησία 1 mg.6.2. Ξηραντήρας εφοδιασμένος με αποδοτικό ξηραντικό μέσο (π.χ. silica gel, που έχει πρόσφατα ξηρανθεί, με υγροσκοπικό δείκτη).6.3. Πυριατήριο με αερισμό και θερμοστατικό έλεγχο της θερμοκρασίας, που λειτουργεί στους 102 +- 2 °C σε όλο το χώρο εργασίας.6.4. Κάψες από γυαλί, πορσελάνη ή μη διαβρωτικό μέταλλο, με ύψους στομίου περίπου 20 mm και διάμετρο 60 έως 80 mm, εφοδιασμένες με γυάλινη ράβδο ανάδευσης.6.5. Διηθητικό χωνευτήριο από συντηγμένο γυαλί, διαμέτρου πόρων 16 έως 40 μm, με φιάλη αναρρόφησης.7. ΔειγματοληψίαΒλέπε πρότυπο IDF 50 C: 1995.8. Εκτέλεση8.1. Παρασκευή του δείγματος ελέγχουΤο εργαστηριακό δείγμα θερμαίνεται στο κλειστό δοχείο από γυαλί ή κατάλληλη πλαστική ύλη, το οποίο θα πρέπει να είναι γεμάτο κατά το ήμισυ έως τα δύο τρίτα, σε θερμοκρασία που επιτρέπει στο δείγμα να είναι αρκετά μαλακό, ώστε να διευκολύνεται η πλήρης ανάμειξή του προς ομοιογενοποίηση (είτε με μηχανικό αναδευτήρα είτε με το χέρι). Η θερμοκρασία ανάμειξης δεν θα πρέπει κατά κανόνα να υπερβαίνει τους 35 °C. Το δείγμα ψύχεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Το συντομότερο δυνατόν μετά την ψύξη, ανοίγεται το δοχείο του δείγματος και το περιεχόμενο ανακινείται για λίγο (όχι περισσότερο από 10 δευτερόλεπτα) με κατάλληλο όργανο, π.χ. κοχλιάριο ή σπαθίδα, πριν από τη ζύγιση.8.2. Προσδιορισμός8.2.1. Η κάψα με τη ράβδο (6.4) και το χωνευτήριο (6.5) ξηραίνονται στο πυριατήριο (6.3) για μία ώρα. Αφήνονται να ψυχθούν στον ξηραντήρα και ζυγίζονται όλα μαζί (δηλαδή κάψα, ράβδος και χωνευτήριο) με ακρίβεια 1 mg (m0).Σημειώσεις:- κατά κανόνα, αρκεί χρόνος ψύξης 45 λεπτών,- εάν υποβάλλονται σε ανάλυση περισσότερες από μία ποσότητες ελέγχου από την παρτίδα, έχει σημασία να χρησιμοποιείται για την καθεμία ο ίδιος συνδυασμός κάψας, ράβδου και χωνευτηρίου.8.2.2. Απομακρύνεται το χωνευτήριο και σημειώνεται το βάρος της κάψας με τη ράβδο με ακρίβεια 1 mg (m1).8.2.3. Ζυγίζεται μέσα στην κάψα, με ακρίβεια 1 mg, ποσότητα ελέγχου περίπου 5 g από το δείγμα ελέγχου (8.1) (m2).8.2.4. Η κάψα (που περιέχει τη ράβδο και το βούτυρο) τοποθετείται στο πυριατήριο στους 102 +- 2 °C και αφήνεται όλη τη νύχτα.8.2.5. Η κάψα (8.2.3) αφήνεται να ψυχθεί σε θερμοκρασία δωματίου.8.2.6. Προστίθενται στην κάψα 15 ml θερμού (περίπου 25 °C) πετρελαϊκού αιθέρα και με τη βοήθεια της γυάλινης ράβδου αποσπάται όσο το δυνατόν περισσότερο από το ίζημα που προσκολλάται στην κάψα. Ο διαλύτης μεταγγίζεται στο χωνευτήριο και αφήνεται να διηθηθεί στη φιάλη αναρρόφησης.8.2.7. Η εργασία 8.2.6 επαναλαμβάνεται τέσσερις φορές. Εάν δεν φαίνονται ίχνη λίπους στην επιφάνεια της κάψας, κατά την τέταρτη έκπλυση μεταφέρεται ποσοτικά στο χωνευτήριο όσο το δυνατόν περισσότερο από το ίζημα. Σε αντίθετη περίπτωση, επαναλαμβάνεται η εργασία 8.2.6 μέχρι να απομακρυνθεί τελείως κάθε ίχνος λίπους.8.2.8. Εκπλύνεται το ίζημα στο χωνευτήριο με 25 ml θερμού πετρελαϊκού αιθέρα.8.2.9. Η κάψα με τη γυάλινη ράβδο και το χωνευτήριο ξηραίνονται μαζί στο πυριατήριο στους 102 +- 2 °C για 30 λεπτά.8.2.10. Αφήνονται να ψυχθούν σε θερμοκρασία δωματίου στον ξηραντήρα και ζυγίζονται με ακρίβεια 1 mg.8.2.11. Οι εργασίες 8.2.9 και 8.2.10 επαναλαμβάνονται μέχρι σταθερού βάρους (η μεταβολή της μάζας δεν υπερβαίνει το 1 mg) του συνόλου κάψα-ράβδος-χωνευτήριο (m3).9. Έκφραση των αποτελεσμάτων9.1. Υπολογισμός του στερεού υπολείμματος χωρίς λίποςΤο στερεό υπόλειμμα χωρίς λίπος, SNF, υπολογίζεται σε κατά μάζα εκατοστιαία αναλογία με τη βοήθεια του ακόλουθου τύπου:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου:m0 είναι η μάζα της κενής κάψας με τη γυάλινη ράβδο και του χωνευτηρίου (8.2.1), σε γραμμάριαm1 είναι η μάζα της κενής κάψας με τη γυάλινη ράβδο (8.2.2), σε γραμμάριαm2 είναι η μάζα της ποσότητας ελέγχου και της κάψας με τη γυάλινη ράβδο (8.2.3), σε γραμμάριαm3 είναι η τελική μάζα της κάψας με τη ράβδο και του χωνευτηρίου που περιέχει το ίζημα (8.2.11), σε γραμμάρια.Το αποτέλεσμα καταγράφεται με ένα δεκαδικό ψηφίο.9.2. Ενδοεργαστηριακή επαναληπτικότηταΗ διαφορά, σε απόλυτες τιμές, μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο μεμονωμένων προσδιορισμών, που εκτελούνται ταυτόχρονα ή με μικρή χρονική διαφορά από τον ίδιο τεχνικό στις ίδιες συνθήκες και με πανομοιότυπο υλικό ελέγχου, δεν υπερβαίνει το 0,1 %.9.3. Διεργαστηριακή επαναληπτικότηταΗ διαφορά, σε απόλυτες τιμές, μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο μεμονωμένων και ανεξάρτητων προσδιορισμών, που εκτελούνται από δύο τεχνικούς εργαζόμενους σε διαφορετικά εργαστήρια με πανομοιότυπο υλικό ελέγχου, δεν υπερβαίνει το 0,2 %.10. Έκθεση ελέγχουΣτην έκθεση ελέγχου περιγράφεται η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε και παρατίθενται τα αποτελέσματα που ελήφθησαν. Αναφέρονται επίσης κάθε λεπτομέρεια της εκτέλεσης που δεν καθορίζεται στο παρόν διεθνές πρότυπο ή θεωρείται προαιρετική, καθώς και οι λεπτομέρειες τυχόν συμβάντων που ενδέχεται να έχουν επηρεάσει τα αποτελέσματα. Η έκθεση ελέγχου περιλαμβάνει όλα τα στοιχεία που είναι απαραίτητα για την αναγνώριση της ταυτότητας του δείγματος.Σημείωση:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Από τα ανωτέρω μπορεί να συναχθεί ότι οι τιμές ακρίβειας που προκύπτουν για τον προσδιορισμό του στερεού υπολείμματος χωρίς λίπος ισχύουν και για τον προσδιορισμό του στερεού υπολείμματος χωρίς λίπος του γάλακτος.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΧΙ(Άρθρο 8)ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΒΟΥΤΥΡΟΥ ΣΕ ΛΙΠΟΣΗ περιεκτικότητα σε λίπος προκύπτει έμμεσα από τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε υγρασία και της περιεκτικότητας σε στερεό υπόλειμμα χωρίς λίπος σύμφωνα με το παράρτημα ΙΧ και το παράρτημα Χ, αντίστοιχα. Η κατά μάζα εκατοστιαία αναλογία λίπους προς>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΧΙΙ(Άρθρο 9)ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΣΥΜΠΥΚΝΩΜΕΝΟΥ ΒΟΥΤΥΡΟΥ, ΤΟΥ ΒΟΥΤΥΡΟΥ Ή ΤΗΣ ΚΡΕΜΑΣ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΣΕ ΒΑΝΙΛΙΝΗ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ1. Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογήςΣτη μέθοδο αυτή περιγράφεται διαδικασία ποσοτικού προσδιορισμού της βανιλίνης στο συμπυκνωμένο βούτυρο ή την κρέμα γάλακτος.2. ΑρχήΕκχύλιση γνωστής ποσότητας δείγματος με μείγμα ισοπροπανόλης/αιθανόλης/ακετονιτριλίου (1:1:2). Καταβύθιση του μεγαλυτέρου μέρους των λιπαρών υλών με ψύξη σε θερμοκρασία - 15 °C έως - 20 °C, και στη συνέχεια φυγοκέντρηση.Αραίωση με νερό και προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε βανιλίνη με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC).3. Εργαστηριακά σκεύη και όργαναΣυνήθης εργαστηριακός εξοπλισμός και ειδικότερα:3.1. Καταψύκτης με πεδίο τιμών θερμοκρασίας λειτουργίας - 15 και - 20 °C·3.2. Σύριγγες μίας χρήσεως χωρητικότητας 2 ml·3.3. Μικροδιηθητικές μεμβράνες μεγέθους πόρων 0,45 μm, ανθεκτικές σε διάλυμα περιεκτικότητας 5 % στο διάλυμα εκχύλισης (4.4)·3.4. Σύστημα υγρής χρωματογραφίας αποτελούμενο από αντλία (παροχή 0,1 ml/min), διάταξη έγχυσης εγχυόμενη ποσότητα 20 μl, αυτόματη ή χειροκίνητη, ανιχνευτή υπεριώδους ακτινοβολίας (λειτουργία σε μήκος κύματος 306 nm, 0,01 AU πλήρους κλίμακας) καταγραφέα ή ολοκληρωτή και θερμοστάτη στήλης που λειτουργεί στους 25 °C.3.5. Αναλυτική στήλη (μήκος 250 mm και εσωτερικής διαμέτρου 4,6 mm), η οποία έχει πληρωθεί με LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm) ή ισοδύναμο υλικό·3.6. Στήλη ασφαλείας (μήκους 20 mm και εσωτερικής διαμέτρου 3 mm περίπου), η οποία έχει πληρωθεί σε ξηρά κατάσταση με Perisorb RP 18 (30-40 μm) ή ισοδύναμο υλικό.4. ΑντιδραστήριαΌλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναγνωρισμένης αναλυτικής καθαρότητας.4.1. Ισοπροπανόλη4.2. Αιθανόλη 96 % (v/v)4.3. Ακετοντρίλιο4.4. Διάλυμα εκχύλισηςΜείγμα ισοπροπανόλης (4.1), αιθανόλης (4.2) και ακετονιτριλίου (4.3) σε αναλογία 1:1:2 (v/v).4.5. Βανιλίνη (4-υδροξυ-3-μεθοξυβενζαλδεΰδη)4.5.1. Μητρικό διάλυμα βανιλίνης (= 500 μg/ml)Σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml ζυγίζονται με ακρίβεια 0,1 mg περίπου 50 mg (CM mg) βανιλίνης (4.5). Προστίθενται 25 ml διαλύματος εκχύλισης (4.4) και ο όγκος συμπληρώνεται με νερό.4.5.2. Πρότυπο διάλυμα βανιλίνης (= 10 μg/ml)Αναρροφώνται με σιφώνιο 5,00 ml μητρικού διαλύματος βανιλίνης (4.5.1) και φέρονται σε ογκομετρική φιάλη των 250 ml. Ο όγκος συμπληρώνεται με νερό.4.6. Μεθανόλη, καθαρότητας για HPLC4.7. Παγόμορφο οξικό οξύ4.8. Νερό, καθαρότητας για HPLC4.9. Κινητή φάση HPLCΣε ογκομετρική φιάλη των 1000 ml αναμειγνύονται 300 ml μεθανόλης (4.6), περίπου 500 ml νερού (4.8) και 20,0 ml οξικού οξέος (4.7) και ο όγκος συμπληρώνεται με νερό (4.8) μέχρι τη χαραγή. Ακολουθεί διήθηση με ηθμό 0,45 μm.5. Εκτέλεση5.1. Προετοιμασία του δείγματος δοκιμής5.1.1. ΒούτυροΤο δείγμα θερμαίνεται έως ότου αρχίσει να τήκεται. Πρέπει να αποφεύγεται τοπική υπερθέρμανση άνω των 40 °C. Όταν το δείγμα μαλακώσει αρκετά ομογενοποιείται με ανακίνηση. Το βούτνρο αναδεύεται επί 15 s πριν από τη δειγματοληψία. Σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml ζυγίζονται, με ακρίβεια 1 mg, περίπου 5 g (SM g) βουτύρου.5.1.2. Συμπυκνωμένο βούτυροΟ περιέκτης με το συμπυκνωμένο βούτυρο τοποθετείται αμέσως πριν από τη δειγματοληψία σε πυραντήριο στους 40-50 °C μέχρις πλήρους τήξεως. Το δείγμα αναμιγνύεται με περιστροφικές κινήσεις ή ανάδευση και αποφεύγεται ο σχηματισμός φυσαλίδων αέρα λόγω υπερβολικής ζωηρής ανάδευσης. Σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml ζυγίζονται, με ακρίβεια 1 mg, περίπου 4 g (SM σε g) συμπυκνωμένου βουτύρου.5.1.3. Κρέμα γάλακτοςΤο δείγμα θερμαίνεται σε υδατόλουτρο ή επωαστήρα στους 35-40 °C. Η λιπαρή ύλη κατανέμεται ομοιογενώς με περιστροφικές κινήσεις και, εάν είναι αναγκαίο, με ανάδευση. Το δείγμα ψύχεται ταχέως στους 20 +- 2 °C. Πρέπει να εμφανίζει ομοιογένεια. Σε αντίθετη περίπτωση η διαδικασία επαναλαμβάνεται. Σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml ζυγίζονται, με ακρίβεια 1 mg περίπου 10 g (SM g) κρέμας γάλακτος.5.2. Παρασκευή του διαλύματος δοκιμήςΣτη ζυγισμένη ποσότητα δείγματος (5.1.1, 5.1.2 ή 5.1.3). προστίθενται περίπου 75 ml διαλύματος εκχύλισης (4.4). Η φιάλη αναδεύεται ή ανακινείται ζωηρά επί 15 min περίπου και ο όγκος συμπληρώνεται με διάλυμα εκχύλισης (4.4). Από το εκχύλισμα αυτό μεταγγίζονται 10 ml περίπου σε δοκιμαστικό σωλήνα εφοδιασμένο με πώμα. Ο δοκιμαστικός σωλήνας τοποθετείται στον καταψύκτη (3.1) και αφήνεται σε ηρεμία επί 30 λεπτά περίπου. Το ψυχρό εκχύλισμα φυγοκεντρείται επί 5 min στις 2000 rpm περίπου και ακολουθεί αμέσως απόχυση. Το διάλυμα που αποχύνεται αφήνεται να ψυχθεί σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Με σιφώνιο φέρονται 5,00 ml του διαλύματος που αποχύνεται σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml και ο όγκος συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με νερό. Διηθείται κατάλληλη ποσότητα με μικροδιηθητική μεμβράνη (3.3.). Το διήθημα είναι έτοιμο για τον προσδιορισμό με HPLC.5.3. ΒαθμονόμησηΑναρροφώνται με σιφώνιο 5,00 ml προτύπου διαλύματος βανιλίνης (4.5.2) και φέρονται σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml. Προστίθενται 5,0 ml διαλύματος εκχύλισης (4.4) και ο όγκος συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με νερό. Η περιεκτικότητα του διαλύματος αυτού σε βανιλίνη είναι 0,5 μg/ml.5.4. Προσδιορισμός με HPLCΤο χρωματογραφικό σύστημα αφήνεται να σταθεροποιηθεί επί 30 min περίπου. Εγχέεται το πρότυπο διάλυμα (5.3). Η εργασία επαναλαμβάνεται έως ότου η διαφορά ως προς το εμβαδόν ή το ύψος των κορυφών μεταξύ δύο διαδοχικών εγχύσεων είναι μικρότερη από 2 % Στις συγκεκριμένες συνθήκες ο χρόνος κατακράτησης της βανιλίνης είναι 9 min περίπου. Το πρότυπο διάλυμα (5.3) υποβάλλεται σε ανάλυση εις διπλούν με έγχυση 20 μl. Εγχέονται 20 μl των διαλυμάτων δοκιμής (5.2). Προσδιορίζεται το εμβαδόν ή το ύψος της λαμβανόμενης κορυφής της βανιλίνης. Η ανάλυση του προτύπου διαλύματος (5.3) επαναλαμβάνεται εις διπλούν μετά από 10 εγχύσεις δειγμάτων δοκιμής (5.2).6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτωνΥπολογίζεται ο μέσος όρος των εμβαδών (ή υψών) (AC) των κορυφών της βανιλίνης που αντιστοιχούν στις διπλές εγχύσεις προτύπον διαλύματος για κάθε παρτίδα διαλυμάτων δοκιμής (τέσσερις περιοχές συνολικά).Υπολογίζεται ο συντελεστής απόκρισης (R):&gt;ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ&gt;όπου CM είναι η μάζα της βανιλίνης σε mg (4.5.1 ).Η περιεκτικότητα (C) του δείγματος δοκιμής σε βανιλίνη (mg/kg) δίδεται από τον τύπο:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου:AS= το εμβαδόν της κορυφής της βανιλίνης του δείγματος δοκιμής,SM= η μάζα του δείγματος δοκιμής σε g (5.1.1, 5.1.2 ή 5.1.3).Όταν η κρέμα γάλακτος υφίσταται ανάλυση για τον προσδιορισμό της βανιλίνης, πρέπει να εκφράζεται η συμπύκνωση του ιχνηθέτη σε mg ιχνηθέτη/kg λιπαρής ουσίας του βουτύρου, πολλαπλασιάζοντας C επί 100/f, όπου f είναι η περιεκτικότητα σε λιπαρή ουσία της κρέμας σε ποσοστό (m/m).20= ο συντελεστής αραίωσης του προτύπου δείγματος και του δείγματος δοκιμής,0,96= ο διορθωτικός συντελεστής για την περιεκτικότητα της πρώην αραίωσης του δείγματος δοκιμής σε λιπαρές ύλες.Σημείωση:Αντί των εμβαδών, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν τα ύψη των κορυφών (βλέπε σημείο 8.3).7. Ακρίβεια της μεθόδου7.1. Επαναληψιμότητα (r)Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που εκτελούνται με τη μικρότερη εφικτή χρονική διαφορά σε πανομοιότυπο ελεγχόμενο υλικό, από τον ίδιο τεχνικό που χρησιμοποιεί τον ίδιο εξοπλισμό δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 16 mg/kg.7.2. Αναπαραγωγιμότητα (R)Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που εκτελούνται σε πανομοιότυπο ελεγχόμενο υλικό από τους τεχνικούς διαφορετικών εργαστηρίων που χρησιμοποιούν διαφορετικό εξοπλισμό, δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 27 mg/kg.8. Όρια ανοχής8.1. Από το ιχνηθετημένο προϊόν λαμβάνονται τρία δείγματα για τον έλεγχο της ομοιογένειας.8.2. Όταν ο ιχνηθέτης έχει ληφθεί είτε από φυσική είτε από συνθετική βανίλια.8.2.1. Ο βαθμός ενσωμάτωσης της 4-υδροξυ-3-μεθοξυβενζαλδεΰδης είναι 250 g ανά τόνο συμπυκνωμένου βουτύρου ή βουτύρου. Όταν πρόκειται για ιχνηθετημένη κρέμα, το ποσοστό ενσωμάτωσης είναι 250 g ανά τόνο λιπαρής ουσίας του βουτύρου.8.2.2. Οι τιμές των τριών δειγμάτων που προκύπτουν από την ανάλυση του προϊόντος χρησιμοποιούνται για έλεγχο του ποσοστού και της ομοιογένειας κατανομής, της ενσωμάτωσης του ιχνηθέτη και η χαμηλότερη από αυτές τις τιμές συγκρίνεται με τις ακόλουθες οριακές τιμές [λαμβανομένης υπόψη της κρίσιμης διαφοράς που αντιστοιχεί σε τιμή πιθανότητας 95 % (DCr95)]:- 221,0 mg/kg (95 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης),- 159,0 mg/kg (70 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης).Χρησιμοποιείται η συγκέντρωση του ιχνηθέτη στο δείγμα η οποία δίδει τα χαμηλότερα αποτελέσματα σε συνδυασμό με παρεμβολή μεταξύ 221,0 mg/kg και 159,0 mg/kg.8.3. Όταν ο ιχνηθέτης έχει ληφθεί αποκλειστικά από καρπούς βανίλιας ή από πλήρη εκχυλίσματα αυτών.8.3.1. Ο βαθμός ενσωμάτωσης της 4-υδροξυ-3-μεθοξυβενζαλδεΰδης είναι 100 g ανά τόνο συμπυκνωμένου βουτύρου ή βουτύρου. Όταν προσδιορίζεται η κρέμα γάλακτος, το ποσοστό ενσωμάτωσης είναι 100 g ανά τόνο λιπαρής ουσίας του γάλακτος.8.3.2. Οι τιμές των τριών δειγμάτων που προκύπτουν από την ανάλυση του προϊόντος χρησιμοποιούνται για έλεγχο του ποσοστού και της ομοιογένειας ενσωμάτωσης του ιχνηθέτη και η χαμηλότερη από αυτές τις τιμές συγκρίνεται με τις ακόλουθες οριακές τιμές [λαμβανομένης υπόψη της κρίσιμης διαφοράς που αντιστοιχεί σε επίπεδο πιθανότητας 95 % (CrD95)]:- 79,0 mg/kg (95 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης),- 54,0 mg/kg (70 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης).Η συγκέντρωση του ιχνηθέτη στο δείγμα από το οποίο προκύπτει η χαμηλότερη τιμή χρησιμοποιείται μαζί με παρεμβολή μεταξύ των τιμών 79,0 mg/kg και 54,0 mg/kg.9. Σημειώσεις9.1. Η επαναληψιμότητα r είναι η τιμή κάτω από την οποία η διαφορά, σε απόλυτες τιμές, μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο μεμονωμένων δοκιμών που έχουν εκτελεστεί με πανομοιότυπο ελεγχόμενο υλικό, με την ίδια μέθοδο και τις ίδιες συνθήκες (ίδιος εξοπλισμός, ίδιο εργαστήριο, μικρή χρονική διαφορά) αναμένεται να προκύψει με δεδομένη πιθανότητα. Εκτός αντίθετων υποδείξεων, η πιθανότητα είναι 95 %.9.2. Η αναπαραγωγιμότητα R είναι η τιμή κάτω από την οποία η διαφορά, σε απόλυτες τιμές, μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο μεμονωμένων δοκιμών που έχουν εκτελεστεί με πανομοιότυπο ελεγχόμενο υλικό, με την ίδια μέθοδο και τις ίδιες συνθήκες (ίδιος εξοπλισμός, ίδιο εργαστήριο, μικρή χρονική διαφορά) αναμένεται να προκύψει με δεδομένη πιθανότητα. Εκτός αντίθετων υποδείξεων, η πιθανότητα είναι 95 %.9.3. Η ανάκτηση της βανιλίνης που έχει προστεθεί στο επίπεδο των 250 mg/kg βουτυρελαίου κυμαίνεται από 97,0 έως 103,8. Διαπιστώθηκε ότι η μέση περιεκτικότητα ήταν 99,9 % με τυπική απόκλιση 2,7 %.9.4. Το πρότυπο διάλυμα περιέχει διάλυμα εκχύλισης σε αναλογία 5 % για την αντιστάθμιση της διεύρυνσης της κορυφής που οφείλεται στην παρουσία του διαλύματος εκχύλισης 5 % των δειγμάτων δοκιμής. Αυτό επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό με μέτρηση του ύψους της κορυφής.9.5. Η ανάλυση βασίζεται σε καμπύλη βαθμονόμησης που είναι ευθεία γραμμή διερχόμενη από το μηδέν.Πριν από την πρώτη ανάλυση θα πρέπει να ελέγχεται η γραμμικότητα της καμπύλης χρησιμοποιώντας κατάλληλες αραιώσεις του προτύπου διαλύματος (4.5.2). Ο έλεγχος αυτός θα πρέπει να επαναλαμβάνεται σε τακτά χρονικά διαστήματα καθώς και μετά από οποιαδήποτε μετατροπή ή επισκευή του εξοπλισμού HPLC.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΧΙΙΙ(Άρθρο 9)ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΑΙΘΥΛΕΣΤΕΡΑ β-ΑΠΟ-8'ΚΑΡΟΤΕΝΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ ΣΕ ΣΥΜΠΥΚΝΩΜΕΝΟ ΒΟΥΤΥΡΟ ΚΑΙ ΒΟΥΤΥΡΟ1. Πεδίο εφαρμογήςΗ μέθοδος περιγράφει διαδικασία για τον ποσοτικό προσδιορισμό του αιθυλεστέρα του β-απο-8'-καροτενικού οξέος (αποκαροτενικός εστέρας) σε συμπυκνωμένο βούτυρο και βούτυρο. Ο αποκαροτενικός εστέρας είναι το σύνολο όλων των ουσιών που ανευρίσκονται σε συμπύκνωμα δειγμάτων που λαμβάνεται υπό τις συνθήκες που περιγράφονται στη μέθοδο και εμφανίζουν απορρόφηση φωτός στα 440 nm.2. ΑρχήΗ λιπαρή ουσία του βουτύρου διαλύεται σε πετρελαϊκό αιθέρα και μετριέται η απορρόφηση στα 440 nm. Η περιεκτικότητα σε αποκαροτενικό εστέρα προσδιορίζεται με αναφορά σε ένα εξωτερικό πρότυπο.3. Εξοπλισμός3.1. Βαθμονομημένα σιφώνια των 0,25, 0,50, 0,75 και 1,0 ml.3.2. Φασματοφωτόμετρο, κατάλληλο για χρήση στα 440 nm (και 447 - 449 nm) και με κυψελίδες μήκους οπτικής διαδρομής 1 cm.3.3. Ογκομετρικές φιάλες των 20 ml και 100 ml.3.4. Αναλυτικός ζυγός, ευαισθησία 0,1 mg.4. ΑντιδραστήριαΌλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αποδεκτής αναλυτικής καθαρότητας.4.1. Αιώρημα αποκαροτενικού εστέρα (περίπου 20 %).4.1.1. Η περιεκτικότητα του αιωρήματος ρυθμίζεται ως εξής:Περίπου 400 mg ζυγίζονται επακριβώς σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml, διαλύονται σε 20 ml χλωροφορμίου (4.4) και συμπληρώνονται με κυκλοεξάνιο (4.5). 5,0 ml του διαλύματος αυτού αραιώνονται μέχρις όγκου 100 ml με κυκλοεξάνιο (διάλυμα Α). Κατόπιν, 5,0 ml του διαλύματος Α αραιώνονται μέχρις όγκου 100 ml με κυκλοεξάνιο και μετριέται η απορρόφηση του προκύπτοντος διαλύματος στα 447 - 449 nm (μετριέται η μέγιστη απορρόφηση χρησιμοποιώντας κυκλοεξάνιο ως λευκό και κυψελίδες του 1 cm).&gt;ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ&gt;Amax= μέγιστη απορρόφηση του διαλύματοςΑ= βάρος του δείγματος (g)2550= τιμή αναφοράς Α (1 %, 1 cm)Η καθαρότητα του αιωρήματος είναι P (%).Σημείωση:Το αιώρημα του αποκαροτενικού εστέρα παρουσιάζει ευαισθησία στον αέρα, στη θερμότητα και στο φως. Στον αρχικό του περιέκτη που δεν έχει ακόμη ανοιχθεί, (σφραγισμένο σε ατμόσφαιρα αζώτου) και όταν αυτός φυλάσσεται σε ψυχρό μέρος, μπορεί να διατηρηθεί για δώδεκα μήνες περίπου. Μετά το άνοιγμα, το περιεχόμενο θα πρέπει να χρησιμοποιείται μέσα σε μικρό χρονικό διάστημα.4.1.2. Πρότυπο διάλυμα αποκαροτενικού εστέρα, περίπου 0,2 mg/mlΖυγίζονται, με ακρίβεια 0,1 mg, περίπου 0,100 g αιωρήματος αποκαροτενικού εστέρα (4.1.1) (Wg), διαλύονται σε πετρελαϊκό αιθέρα (4.2), μεταφέρονται ποσοτικά σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή με πετρελαϊκό αιθέρα.Το διάλυμα αυτό περιέχει (W.P) 10 mg/ml αποκαροτενικού εστέρα.Σημείωση:Το διάλυμα πρέπει να φυλάσσεται στο σκοτάδι και σε ψυχρό μέρος. Διάλυμα που δεν έχει χρησιμοποιηθεί μέσα σε διάστημα ενός μήνα, πρέπει να απορρίπτεται.4.2. Πετρελαϊκός αιθέρας (40-60 °C).4.3. Θειικό νάτριο, άνυδρο, κοκκώδες, που έχει ξηρανθεί προηγουμένως στους 102 °C επί δύο ώρες.4.4. Χλωροφόρμιο.4.5. Κυκλοεξάνιο.5. Διαδικασία5.1. Παρασκευή του δείγματος δοκιμής.5.1.1. Συμπυκνωμένο βούτυρο.Το δείγμα τήκεται σε φούρνο στους 45 °C περίπου.5.1.2. Βούτυρο.Το δείγμα τήκεται μέσα σε φούρνο στους 45 °C περίπου. Αντιπροσωπευτική ποσότητα του δείγματος διηθείται διαμέσου φίλτρου που περιέχει περίπου 10 g άνυδρο θειικό νάτριο (4.3) σε περιβάλλον που είναι προστατευμένο από ισχυρό φυσικό ή τεχνητό φωτισμό και διατηρείται στους 45 °C. Συλλέγεται η κατάλληλη ποσότητα λιπαρής ουσίας του βουτύρου.5.2. ΠροσδιορισμόςΖυγίζεται, με ακρίβεια 1 mg, ποσότητα 1 g περίπου συμπυκνωμένου βουτύρου [ή εκχυλισμένης λιπαρής ουσίας του βουτύρου (5.1.2)], (mg) και μεταφέρεται ποσοτικά σε ογκομετρική φιάλη των 20 ml (Vml) με πετρελαϊκό αιθέρα (4.2). Στη συνέχεια συμπληρώνεται μέχρι τη χαραγή και αναμειγνύεται καλά.Κατάλληλη ποσότητα του ανωτέρω δείγματος μεταφέρεται σε κυψελίδα 1 cm και μετριέται η απορρόφηση στα 440 nm σε σχέση με πετρελαϊκό αιθέρα, ως τιμή αναφοράς. Η συγκέντρωση του αποκαροτενικού εστέρα στο διάλυμα υπολογίζεται με βάση την καμπύλη αναφοράς (C μg/ml).5.3. Καμπύλη αναφοράςΛαμβάνονται με σιφώνιο 0, 0,25, 0,5, 0,75 και 1,0 ml πρότυπου διαλύματος αποκαροτενικού εστέρα (4.1.2) και φέρονται σε πέντε ογκομετρικές φιάλες των 100 ml, αντιστοίχως. Τα διαλύματα αραιώνονται μέχρι τη χαραγή με πετρελαϊκό αιθέρα (4.2) και αναμειγνύονται.Οι συγκεντρώσεις των διαλυμάτων κυμαίνονται από 0 έως 2 μg/ml, υπολογίζονται δε επακριβώς με αναφορά στη συγκέντρωση του πρότυπου διαλύματος (4.1.2) (W.P)/100 mg/ml. Μετριώνται οι τιμές απορρόφησης στα 440 nm χρησιμοποιώντας ως τιμή αναφοράς πετρελαϊκό αιθέρα (4.2).Οι τιμές απορροφήσεως σημειώνονται στον άξονα των Ψ ενώ οι σνγκεντρώσεις του αποκαροτενικού εστέρα σημειώνονται στον άξονα των Χ.6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων6.1. Η συγκέντρωση του αποκαροτενικού εστέρα, εκφραζόμενη σε mg/kg προϊόντος, δίνεται από τον τύπο:Συμπυκνωμένο βούτυρο: (C.V)/MΒούτυρο: 0,82 (C.V)Mόπου:C= συγκέντρωση του αποκαροτενικού εστέρα σε μg/ml με βάση την καμπύλη αναφοράς (5.3),V= όγκος (ml) του διαλύματος δοκιμής (5.2)M= μάζα (g) της ποσότητας δοκιμής (5.2)0,82= συντελεστής διόρθωσης για να ληφθεί υπόψη η περιεκτικότητα του βουτύρου σε λιπαρή ύλη.7. Ορθότητα της μεθόδου7.1. Επαναληψιμότητα7.1.1. Ανάλυση βουτύρουΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που διεξάγονται μέσα στο μικρότερο δυνατό χρονικό διάστημα, από έναν αναλυτή, χρησιμοποιώντας τον ίδιο εξοπλισμό σε ταυτόσημο υλικό δοκιμής δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 1,4 mg/kg.7.1.2. Ανάλυση συμπυκνωμένου βουτύρουΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που διεξάγονται μέσα στο μικρότερο δυνατό χρονικό διάστημα, από έναν αναλυτή, χρησιμοποιώντας τον ίδιο εξοπλισμό σε ταυτόσημο υλικό δοκιμής δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 1,6 mg/kg.7.2. Αναπαραγωγιμότητα7.2.1. Ανάλυση βουτύρουΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που διεξάγονται από διαφορετικούς αναλυτές σε διαφορετικά εργαστήρια, χρησιμοποιώντας διαφορετικό εξοπλισμό σε ταυτόσημο υλικό δοκιμής δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 4,7 mg/kg.7.2.2. Ανάλυση συμπυκνωμένου βουτύρουΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που διεξάγονται από διαφορετικούς αναλυτές σε διαφορετικά εργαστήρια, χρησιμοποιώντας διαφορετικό εξοπλισμό σε ταυτόσημο υλικό δοκιμής δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 5,3 mg/kg.7.3. Προέλευση των δεδομένων ακριβείαςΤα δεδομένα ακριβείας προσδιορίστηκαν σε κύκλο δοκιμών που διεξήχθησαν το 1995 σε ένδεκα εργαστήρια και δώδεκα ιχνηθετημένα δείγματα (έξι τυφλά εις διπλούν) για το βούτυρο και δώδεκα ιχνηθετημένα δείγματα (έξι τυφλά εις διπλούν) για το συμπυκνωμένο βούτυρο.8. Όρια ανοχών8.1. Πρέπει να λαμβάνονται τρία δείγματα από το ιχνηθετημένο προϊόν, ώστε να ελέγχεται η ορθή ιχνηθέτηση του προϊόντος.8.2. Βούτυρο8.2.1. Το ποσοστό ενσωμάτωσης για το βούτυρο, λαμβανομένης υπόψη της βασικής απορρόφησης, είναι 22 mg/kg.8.2.2. Οι τιμές των τριών δειγμάτων που λαμβάνονται από την ανάλυση του προϊόντος χρησιμοποιούνται για να ελεγχθεί το ποσοστό και η ομοιογένεια της ενσωμάτωσης του ιχνηθέτη και η χαμηλότερη από αυτές τις τιμές συγκρίνεται με τις ακόλουθες οριακές τιμές [λαμβανομένης υπόψη της κρίσιμης διαφοράς που αντιστοιχεί σε τιμή πιθανότητας 95 % (CrD95)]:- 18,0 mg/kg (95 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης),- 13,0 mg/kg (70 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης).Η συγκέντρωση του ιχνηθέτη στο δείγμα από το οποίο προκύπτει η χαμηλότερη τιμή χρησιμοποιείται μαζί με παρεμβολή μεταξύ των τιμών 18,0 mg/kg και 13,0 mg/kg.8.3. Συμπυκνωμένο βούτυρο8.3.1. Το ποσοστό ενσωμάτωσης για το συμπυκνωμένο βούτυρο, λαμβανομένης υπόψη της βασικής απορρόφησης, είναι 24 mg/kg.8.3.2. Οι τιμές των τριών δειγμάτων που προκύπτουν από την ανάλυση του προϊόντος χρησιμοποιούνται για έλεγχο του ποσοστού και της ομοιογένειας ενσωμάτωσης του ιχνηθέτη και η χαμηλότερη από αυτές τις τιμές συγκρίνεται με τις ακόλουθες οριακές τιμές [λαμβανομένης υπόψη της κρίσιμης διαφοράς που αντιστοιχεί σε επίπεδο πιθανότητας 95 % (CrD95)]:- 20,0 mg/kg (95 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης),- 14,0 mg/kg (70 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης).Η συγκέντρωση του ιχνηθέτη στο δείγμα από το οποίο προκύπτει η χαμηλότερη τιμή χρησιμοποιείται μαζί με παρεμβολή μεταξύ των τιμών 20,0 mg/kg και 14,0 mg/kg.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XIV(Άρθρο 9)ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΙΤΟΣΤΕΡΟΛΗΣ Ή ΣΤΙΓΜΑΣΤΕΡΟΛΗΣ ΣΤΟ ΣΥΜΠΥΚΝΩΜΕΝΟ ΒΟΥΤΥΡΟ ΜΕ ΑΕΡΙΟ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΤΡΙΧΟΕΙΔΟΥΣ ΣΤΗΛΗΣ1. Αντικείμενο και πεδίο εφαρμογήςΗ μέθοδος περιγράφει μια διαδικασία ποσοτικού προσδιορισμού σιτοστερόλης ή στιγμαστερόλης στο συμπυκνωμένο βούτυρο ή στο βούτυρο. Ως σιτοστερόλη λαμβάνεται το άθροισμα της β-σιτοστερόλης και της 22-διυδρο-β-σιτοστερόλης· άλλες σιτοστερόλες θεωρούνται αμελητέες.2. ΑρχήΤο συμπυκνωμένο βούτυρο ή το βούτυρο σαπωνοποιείται με υδροξείδιο του καλίου και τα μη σαπωνοποιήσιμα εκχυλίζονται με αιθέρα.Οι στερόλες μετατρέπονται σε τιμεθυλο-σιλυλο-αιθέρες και αναλύονται με αέριο χρωματογραφία τριχοειδούς στήλης με βετουλίνη ως εσωτερικό πρότυπο.3. Εξοπλισμός3.1. Φιάλη των 150 ml για τη σαπωνοποίηση εφοδιασμένη με εσμυρισμένο κάθετο ψυκτήρα.3.2. Χοάνες διαχωρισμού των 500 ml.3.3. Φιάλες των 250 ml.3.4. Χοάνες εξισορρόπησης πίεσης των 250 ml ή παερεμφερείς, προς συλλογή του απορριπτόμενου διαιθυλαιθέρα.3.5. Υάλινη στήλη των 350 mm x 20 mm, εφοδισμένη με υάλινο πορώδες διάφραγμα.3.6. Υδρόλουτρο ή θερμοστατούμενο μανδύα.3.7. Φιαλίδια αντίδρασης των 2 ml.3.8. Αεριοχρωματογράφος, που να δέχεται τριχοειδή στήλη, εφοδιασμένος με σύστημα διαχωρισμού (splitting) αποτελούμενο από:3.8.1. θερμοστατικό θάλαμο για στήλες ικανό προς διατήρηση της επιθυμητής θερμοκρασίας με ακρίβεια +- 1 °C·3.8.2. είσοδο ρυθμιζόμενης θερμοκρασίας·3.8.3. ανιχνευτή ιονισμού φλόγας και ηλεκτρόμετρο-ενισχυτή·3.8.4. ολοκληρωτή-καταγραφέα κατάλληλο προς χρήση με το ηλεκτρόμετρο-ενισχυτή (3.8.3).3.9. Τριχοειδής στήλη από συντετηγμένο πυρίτιο (fused-silica) πλήρως επικαλυμμένη με BP 1 ή ισοδύναμο σε ομοιόμορφο πάχος 0,25 μm· η στήλη πρέπει να είναι ικανή να διαχωρίζει τριμεθυλο-σίλυλο παράγωγα λανοστερόλης και σιτοστερόλης κατάλληλη στήλη BP 1 μήκους 12 m και εσωτερικής διαμέτρου 0,2 mm.3.10. Μικροσύριγγα του 1 μl, για αέρια χρωμογραφία, με σκληρυνθείσα βελόνα.4. ΑντιδραστήριαΌλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναγνωρισμένης αναλυτικής καθαρότητας. Το χρησιμοποιούμενο νερό πρέπει να είναι απεσταγμένο ή ισοδύναμης, τουλάχιστον, καθαρότητας.4.1. Αιθανόλη, τουλάχιστον 95 %.4.2. Υδροξείδιο του καλίου, διάλυμα 60 %: διαλύονται 600 g υδροξειδίου του καλίου (τουλάχιστον 85 %) σε νερό και ο όγκος συμπληρώνεται μέχρις ενός λίτρου με νερό.4.3. Βετουλίνη καθαρότητας τουλάχιστον 99 %.4.3.1. Διαλύματα βετουλίνης σε διαιθυλαιθέρα (4.4).4.3.1.1. Η συγκέντρωση του χρησιμοποιούμενου διαλύματος βετουλίνης προς προσδιορισμό της σιτοστερόλης πρέπει να είναι 1,0 mg/ml.4.3.1.2. Η συγκέντρωση του χρησιμοποιούμενου διαλύματος βετουλίνης προς προσδιορισμό της στιγμαστερόλης πρέπει να είναι 0,4 mg/ml.4.4. Διαιθυλαιθέρας, αναλυτικής καθαρότητας (απηλλαγμένος υπεροξειδίων ή υπολειμμάτων).4.5. Θειικό νάτριο, άνυδρο, κοκκώδες, προξηρανθέν στους 102 °C επί δύο ώρες.4.6. Αντιδραστήριο σιλυλίωσης, για παράδειγμα TRI-SIL (διαθέσιμο από την Pierce Chemical Co., Cat Νο. 49001) ή ισοδύναμο (Προσοχή: το TRI-SIL είναι εύφλεκτο, τοξικό, διαβρωτικό και πιθανώς καρκινογόνο. Το εργαστηριακό προσωπικό πρέπει να είναι εξοικειωμένο με τα στοιχεία ασφαλείας του TRI-SIL και να λαμβάνει τις απαραίτητες προφυλάξεις).4.7. Λανοστερόλη.4.8. Σιτοστερόλη γνωστής καθαρότητας τουλάχιστον 90 % (P).Σημ. 1:Η καθαρότητα των χρησιμοποιούμενων προς βαθμονόμηση πρότυπων ουσιών πρέπει να πρσδιοριστεί με τη μέθοδο της κανονικοποίησης. Υποτίθεται ότι όλες οι στερόλες που υπάρχουν στο δείγμα εμφανίζονται στο χρωματογράφημα, ότι η συνολική επιφάνεια των κορυφών αντιπροσωπεύει το 100 % των συστατικών στερολών και ότι οι στερόλες έχουν την ίδια απόκριση στον ανιχνευτή. Η γραμμικότητα του συστήματος πρέπει να επαληθεύεται στις συγκεντρώσεις που ενδιαφέρουν.4.8.1. Πρότυπο διάλυμα σιτοστερόλης - παρασκευάζεται διάλυμα περιέχον, με ακρίβεια 0,001 mg/ml, περίπου 0,5 mg/ml (W1) σιτοστερόλης (4.8) σε διαιθυλαιθέρα (4.4).4.9. Στιγμαστερόλη γνωστής καθαρότητας, τουλάχιστον 90 % (P).4.9.1. Πρότυπο διάλυμα στιγμαστερόλης παρασκευάζεται διάλυμα περιέχον, με ακρίβεια 0,001 mg/ml, περίπου 0,2 mg/ml (W1) στιγμαστερόλης (4.9) σε διαιθυλαιθέρα (4.4).4.10. Μείγμα ελέγχου διαχωριστικής ικανότητας. Παρασκευάζεται διάλυμα περιέχον 0,05 mg/ml λανοστερόλης (4.7) και 0,5 mg/ml σιτοστερόλης (4.8) σε διαιθυλαιθέρα (4.4).5. Πορεία εργασίας5.1. Παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων χρωματογραφίας. Το διάλυμα εσωτερικού πρότυπου (4.3.1 ) πρέπει να προστεθεί στο ανάλογο πρότυπο διάλυμα στερόλης ταυτόχρονα με την προσθήκη του και στο σαπωνοποιηθέν δείγμα (5.2.2).5.1.1. Πρότυπο χρωματογραφικό διάλυμα σιτοστερόλης: μεταφέρεται 1 ml πρότυπου διαλύματος σιτοστερόλης (4.8.1) σε καθένα από δύο φιαλίδια αντίδρασης (3.7) και ο διαιθυλαιθέρας απομακρύνεται με ρεύμα αζώτου. Προστίθεται 1 ml διαλύματος εσωτερικού πρότυπου (4.3.1.1) και ο διαιθυλαιθέρας απομακρύνεται με ρεύμα αζώτου.5.1.2. Πρότυπο χρωματογραφικό διάλυμα στιγμαστερόλης: μεταφέρεται 1 ml πρότυπου διαλύματος στιγμαστερόλης (4.9.1) σε καθένα από δύο φιαλίδια αντίδρασης (3.7) και ο διαιθυλαιθέρας απομακρύνεται με ρεύμα αζώτου. Προστίθεται 1 ml διαλύματος εσωτερικού πρότυπου (4.3.1.2) και ο διαιθυλαιθέρας απομακρύνεται με ρεύμα αζώτου.5.2. Παρασκευή των μη σαπωνοποιήσιμων5.2.1. Τήκεται το δείγμα του βουτύρου HPLC ή του συμπυκνωμένου βουτύρου (W2) σε θερμοκρασία όχι μεγαλύτερη από 35 °C, αναμειγνύεται καλά με ανάδευση.Ζυγίζεται με προσέγγιση 1 mg, 1 g περίπου βουτύρου (W2) ή συμπυκνωμένου βουτύρου (W2) σε φιάλη των 150 ml (3.1). Προστίθενται 50 ml αιθανόλης (4.1) και 10 ml διαλύματος υδροξειδίου του καλίου (4.2). Προσαρμόζεται ο κάθετος ψυκτήρας και το όλο θερμαίνεται στους 75 °C επί 30 λεπτά. Ο ψυκτήρας αποσυνδέεται και η φιάλη ψύχεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος.5.2.2. Προστίθεται στη φιάλη 1,0 ml διαλύματος εσωτερικού πρότυπου (4.3.1.1 εάν πρόκειται να προσδιοριστεί σιτοστερόλη, ή 4.3.1.2), εάν πρόκειται να προσδιοριστεί στιγμαστερόλη. Γίνεται πλήρης ανάμειξη. Το περιεχόμενο της φιάλης μεταφέρεται ποσοτικά σε διαχωριστική χοάνη των 500 ml (3.2), και εκπλύεται στη συνέχεια η φιάλη με 50 ml νερού και 250 ml διαιθυλαιθέρα (4.4). Η διαχωριστική χοάνη ανακινείται ζωηρά επί δύο λεπτά και αφήνονται οι φάσεις να διαχωριστούν. Η κατώτερη υδατική στοιβάδα αποχύνεται και η στοιβάδα του αιθέρα εκπλύεται με ανάδευση με τέσσερις διαδοχικές δόσεις νερού των 100 ml.Σημ. 2:Είναι ουσιώδες, προς αποφυγή σχηματισμού γαλακτώματος, να εκτελεστούν ήπια οι δύο πρώτες εκπλήσεις με νερό (10 αναστροφές). Η τρίτη έκπλυση μπορεί να πραγματοποιηθεί με ζωηρή ανάδευση επί 30 δευτερόλεπτα. Εάν σχηματιστεί γαλάκτωμα μπορεί να διασπασθεί με την προσθήκη 5 έως 10 ml αιθανόλης. Εάν προστεθεί αιθανόλη, πρέπει να εκτελεστούν δύο ακόμα ζωηρές εκπλύσεις με νερό.5.2.3. Η καθαρή, απαλλαγμένη σάπωνος στοιβάδα αιθέρα διαβιβάζεται μέσα από υάλινη στήλη (3.5) περιέχουσα 30 g άνυδρου θειικού νατρίου (4.5). Ο αιθέρας συλλέγεται σε φιάλη των 250 ml (3.3). Προστίθεται 1 σφαιρίδιο βρασμού και ακολουθεί εξάτμιση σχεδόν μέχρι ξηρού σε υδρόλουτρο ή θερμοστατούμενο μανδύα, λαμβάνοντας μέριμνα για τη συλλογή των απορριπτόμενων διαλυτών.Σημ. 3:Εάν τα εκχυλίσματα του δείγματος ξηραθούν πλήρως σε πολύ υψηλή θερμοκρασία, πιθανόν να επέλθουν απώλειες στερόλης.5.3. Παρασκευή τριμεθυλο-σιλυλο-αιθέρων5.3.1. Το αιθερικό διάλυμα που παρέμεινε στη φιάλη μεταφέρεται σε φιαλίδιο αντίδρασης των 2 ml (3.7) με 2 ml διαιθυλαιθέρα και ο αιθέρας απομακρύνεται χρησιμοποιώντας ρεύμα αζώτου. Η φιάλη εκπλύεται σε δύο ακόμη δόσεις διαιθυλαιθέρα των 2 ml, που μεταφέρονται στο φιαλίδιο και απομακρύνεται ο αιθέρας με άζωτο κάθε φορά.5.3.2. Το δείγμα σιλυλιούται με προσθήκη 1 ml TRI-SIL (4.6). Το φιαλίδιο κλείνεται και αναδεύεται ζωηρά ώστε να επέλθει διάλυση. Εάν η διάλυση δεν είναι πλήρης, θερμαίνεται στους 65 έως 70 °C. Αφήνεται να ηρεμήσει επί τουλάχιστον 5 λεπτά πριν ενωθεί στον αεριοχρωματογράφο. Τα πρότυπα σιλυλιούνται κατά τον ίδιο τρόπο με τα δείγματα. Το μείγμα ελέγχου της διαχωριστικής ικανότητας (4.10) σιλυλιούται κατά τον ίδιο τρόπο με τα δείγματα.Σημ. 4:Η σιλυλίωση πρέπει να λάβει χώρα σε περιβάλλον απηλλαγμένο από νερό. Η μη πλήρης σιλυλίωση της βετουλίνης εντοπίζεται από μια δεύτερη κορυφή κοντά σε αυτή της βετουλίνης.Η παρουσία αιθανόλης στο στάδιο της σιλυλίωσης θα έχει επίδραση στη σιλυλίωση. Αυτό μπορεί να προκύψει από ανεπαρκή έκπλυση κατά το στάδιο εκχύλισης. Εάν το πρόβλημα αυτό επιμένει, μια πέμπτη έκπλυση, με ζωηρή ανάδευση επί 30 δευτερόλεπτα, μπορεί να εισαχθεί στο στάδιο εκχύλισης.5.4. Αεριοχρωματογραφική ανάλυση5.4.1. Επιλογή συνθηκών λειτουργίαςΟ αεριοχρωματογράφος ρυθμίζεται ανάλογα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.Οι συνιστώμενες συνθήκες λειτουργίας είναι οι εξής:- θερμοκρασία στήλης: 265 °C- θερμοκρασία εισόδου: 280 °C- θερμοκρασία ανιχνευτή: 300 °C- ταχύτητα ροής φέροντας αερίου: 0,6 ml/min- πίεση υδρογόνου: 84 kPa- πίεση αέρα: 155 kPa- διαχωρισμός δείγματος 10:1 έως 50:1, ο λόγος διαχωρισμού πρέπει να βελτιστοποιηθεί σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και κατόπιν να εξεταστεί η γραμμικότητα της απόκρισης του ανιχνευτή στην περιοχή συγκεντρώσεων που ενδιαφέρει.Σημ. 5:Είναι εξαιρετικά σημαντικό να καθαρίζεται τακτικά ο υποδοχέας έκγχυσης.- ποσότητα ενιόμενης ουσίας: 1 μl διαλύματος TMSE.Το σύστημα αφήνεται να εξισορροπήσει και να αποκτήσει μια ικανοποιητικά σταθερή απόκριση, πριν αρχίσει οποιαδήποτε ανάλυση.Οι συνθήκες αυτές μπορούν να μεταβάλλονται ανάλογα με τα χαρακτηριστικά της στήλης και του αεριοχρωματογράφου, έτσι ώστε να λαμβάνονται χρωματογραφήματα που να εκπληρούν τις ακόλουθες προϋποθέσεις:- η κορυφή της σιτοστερόλης πρέπει να διαχωρίζεται επαρκώς από αυτή της λανοστερόλης. Το σχήμα 1 δείχνει το τυπικό χρωματογράφημα που πρέπει να ληφθεί από το σιλυλιωμένο μείγμα ελέγχου της διαχωριστικής ικανότητας (4.10),- οι σχετικοί χρόνοι κατακράτησης για τις ακόλουθες στερόλες πρέπει να είναι κατά προσέγγιση:χοληστερόλη 1,0στιγμαστερόλη 1,3σιτοστερόλη 1,5βετουλίνη 2,5- ο χρόνος κατακράτησης της βετουλίνης πρέπει να είναι κατά προσέγγιση 24 λεπτά.5.4.2. Αναλυτική πορεία εργασίας:Ενίεται 1 μl σιλυλιωμένου πρότυπου διαλύματος (στιγμαστερόλης ή σιτοστερόλης) και ρυθμίζονται οι παράμετροι βαθμονόμησης του ολοκληρωτή.Ενίεται 1 μl σιλυλιωμένου πρότυπου διαλύματος προς προσδιορισμό των σχετικών συντελεστών απόκρισης ως προς βετουλίνη.Ενίεται 1 μl σιλυλιωμένου διαλύματος και μετρώνται τα εμβαδά των κορυφών. Κάθε σειρά χρωματογραφικών αναλύσεων πρέπει να παρεμβάλλεται μεταξύ αναλύσεων προτύπων.Κατά κανόνα έξι εκγχύσεις δειγμάτων παρεμβάλλονται μεταξύ δύο ενέσεων προτύπων.Σημ. 6:Η ολοκλήρωση της κορυφής της στιγμαστερόλης πρέπει να συμπεριλαμβάνει κάθε τυχόν τμήμα "ουράς" όπως ορίζεται από τα σημεία 1, 2 και 3 στο σχήμα 2β.Η ολοκλήρωση της κορυφής της σιτοστερόλης πρέπει να συμπεριλαμβάνει το εμβαδόν της κορυφής της 22-διυδρο-β-σιτοστερόλης (στιγμαστανόλης), η οποία εκλούεται αμέσως μετά τη σιτοστερόλη (βλέπε σχήμα 3β), όταν μετράται η συνολική σιτοστερόλη.6. Υπολογισμός των αποτελεσμάτων6.1. Προσδιορίζεται το εμβαδόν των κορυφών των στερολών και των κορυφών βετουλίνης που συνοδεύουν μια σειρά αναλύσεων, και υπολογίζεται το R1:&gt;ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ&gt;Προσδιορίζεται το εμβαδόν της κορυφής της στερόλης (στιγμαστερόλης ή σιτοστερόλης) και της κορυφής της βετουλίνης στο δείγμα και υπολογίζεται το R2:&gt;ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ&gt;W1= περιεκτικότητα προτύπου σε στερόλη (mg) περιεχόμενη σε 1 ml πρότυπου διαλύματος (4.8.1 ή 4.9.1)W2= βάρος δείγματος (g) (5.2.1)P= καθαρότητα πρότυπης στερόλης (4.8 ή 4.9)>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>7. Ακρίβεια της μεθόδου7.1. Βούτυρο7.1.1. Επαναληψιμότητα7.1.1.1. ΣτιγμαστερόληΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών εκτελεσθέντων εντός του συντομότερου δυνατού χρονικού διαστήματος, από ένα χειριστή που χρησιμοποιεί τα ίδια όργανα με πανομοιότυπο αναλυτικό υλικό δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 19,3 mg/kg.7.1.1.2. ΣιτοστερόληΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών εκτελεσθέντων εντός του συντομότερου δυνατού χρονικού διαστήματος, από ένα χειριστή που χρησιμοποιεί τα ίδια όργανα με πανομοιότυπο αναλυτικό υλικό δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 23,0 mg/kg.7.1.2. Αναπαραγωγιμότητα7.1.2.1. ΣτιγμαστερόληΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών εκτελεσθέντων από χειριστές σε διαφορετικά εργαστήρια, χρησιμοποιώντας διαφορετικά όργανα με πανομοιότυπο αναλυτικό υλικό δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 31,9 mg/kg.7.1.2.2. ΣιτοστερόληΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών εκτελεσθέντων από χειριστές σε διαφορετικά εργαστήρια, χρησιμοποιώντας διαφορετικά όργανα με πανομοιότυπο αναλυτικό υλικό δεν πρέπει να υπερβαίνει το 8,7 % του μέσου των προσδιορισμών.7.1.3. Πηγή δεδομένων ακριβείαςΤα δεδομένα ακριβείας προσδιορίστηκαν σε πείραμα εκτελεσθέν το 1992, που περιλάμβανε οκτώ εργαστήρια, έξι δείγματα (τρία από δύο τυφλές αναζητήσεις) στιγμαστερόλης και έξι δείγματα (τρία από δύο τυφλές αναζητήσεις) σιτοστερόλης.7.2. Συμπυκνωμένο βούτυρο7.2.1. Επαναληψιμότητα7.2.1.1. ΣτιγμαστερόληΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών εκτελεσθέντων εντός του συντομότερου δυνατού χρονικού διαστήματος, από ένα χειριστή που χρησιμοποιεί τα ίδια όργανα με πανομοιότυπο αναλυτικό υλικό δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 10,2 mg/kg.7.2.1.2. ΣιτοστερόληΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών εκτελεσθέντων εντός του συντομοτέρου δυνατού χρονικού διαστήματος, από ένα χειριστή που χρησιμοποιεί τα ίδια όργανα με πανομοιότυπο αναλυτικό υλικό δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 3,6 % του μέσου των προσδιορισμών.7.2.2. Αναπαραγωγιμότητα7.2.2.1. ΣτιγμαστερόληΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών εκτελεσθέντων από χειριστές σε διαφορετικά εργαστήρια, χρησιμοποιώντας διαφορετικά όργανα με πανομοιότυπο αναλυτικό υλικό δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 25,3 mg/kg.7.2.2.2. ΣιτοστερόληΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών εκτελεσθέντων από χειριστές σε διαφορετικά εργαστήρια, χρησιμοποιώντας διαφορετικά όργανα με πανομοιότυπο αναλυτικό υλικό δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 8,9 % του μέσου των προσδιορισμών.7.2.3. Πηγή δεδομένων ακριβείαςΤα δεδομένα ακριβείας προσδιορίστηκαν σε πείραμα εκτελεσθέν το 1992, που περιλάμβανε εννέα εργαστήρια και έξι δείγματα (3 από δύο τυφλές αναζητήσεις), στιγμαστερόλης και έξι δείγματα (3 από δύο τυφλές αναζητήσεις) σιτοστερόλης.8. Όρια ανοχής8.1. Πρέπει να λαμβάνονται τρία δείγματα από το ιχνηθετημένο προϊόν, ώστε να ελέγχεται η ορθή ιχνηθέτηση του προϊόντος.8.2. Βούτυρο8.2.1. Στιγμαστερόλη8.2.1.1. Το ποσοστό ενσωμάτωσης της στιγμαστερόλης είναι 150 γραμμάρια στιγμαστερόλης καθαρότητας τουλάχιστον 95 % ανά τόνο βουτύρου, δηλαδή 142,5 mg/kg, ή 170 γραμμάρια στιγμαστερόλης καθαρότητας τουλάχιστον 85 % ανά τόνο βουτύρου, δηλαδή 144,5 mg/kg.8.2.1.2. Οι τιμές των τριών δειγμάτων που προκύπτουν από την ανάλυση του προϊόντος χρησιμοποιούνται για έλεγχο του ποσοστού και της ομοιογένειας κατανομής της ενσωμάτωσης του ιχνηθέτη και η χαμηλότερη από τις τιμές αυτές συγκρίνεται με τις ακόλουθες οριακές τιμές [λαμβανομένης υπόψη της κρίσιμης διαφοράς που αντιστοιχεί σε τιμή πιθανότητας 95 % (DCr95)]:- 116,0 mg/kg (95 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης για στιγμαστερόλη καθαρότητας 95 %),- 118,0 mg/kg (95 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης για στιγμαστερόλη καθαρότητας 85 %),- 81,0 mg/kg (70 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης για στιγμαστερόλη καθαρότητας 95 %),- 82,0 mg/kg (70 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης για στιγμαστερόλη καθαρότητας 85 %).Η συγκέντρωση του ιχνηθέτη στο δείγμα από το οποίο προκύπτουν οι χαμηλότερες τιμές χρησιμοποιείται μαζί με παρεμβολή μεταξύ των τιμών 116,0 mg/kg και 81,0 mg/kg ή 118,0 mg/kg και 82,0 mg/kg.8.2.2. Σιτοστερόλη8.2.2.1. Το ποσοστό ενσωμάτωσης της σιτοστερόλης είναι 600 g σιτοστερόλης καθαρότητας τουλάχιστον 90 % ανά τόνο βουτύρου, δηλαδή 540 mg/kg.8.2.2.2. Οι τιμές των τριών δειγμάτων που προκύπτουν από την ανάλυση του προϊόντος χρησιμοποιούνται για έλεγχο του ποσοστού και της ομοιογένειας ενσωμάτωσης του ιχνηθέτη και η χαμηλότερη από τις τιμές αυτές συγκρίνεται με τις ακόλουθες οριακές τιμές [λαμβανομένης υπόψη της κρίσιμης διαφοράς που αντιστοιχεί σε τιμή πιθανότητας 95 % (DCr95)]:- 486,0 mg/kg (95 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης για σιτοστερόλη καθαρότητας 90 %),- 358,0 mg/kg (70 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης για σιτοστερόλη καθαρότητας 90 %).Η συγκέντρωση του ιχνηθέτη στο δείγμα από το οποίο προκύπτει η χαμηλότερη τιμή χρησιμοποιείται μαζί με παρεμβολή μεταξύ των τιμών 486,0 mg/kg και 358,0 mg/kg.8.3. Συμπυκνωμένο βούτυρο8.3.1. Στιγμαστερόλη8.3.1.1. Το ποσοστό ενσωμάτωσης της στιγμαστερόλης είναι 150 g στιγμαστερόλης καθαρότητας τουλάχιστον 95 %, ανά τόνο συμπυκνωμένου βουτύρου, δηλαδή 142,5 mg/kg ή 170 g στιγμαστερόλης καθαρότητας τουλάχιστον 85 % ανά τόνο συμπυκνωμένου βουτύρου, δηλαδή 144,5 mg/kg.8.3.1.2. Οι τιμές των τριών δειγμάτων που λαμβάνονται από την ανάλυση του προϊόντος το οποίο χρησιμοποιείται για να ελεγχθεί το ποσοστό και η ομοιογένεια της ενσωμάτωσης του ιχνηθέτη και η χαμηλότερη από τις τιμές αυτές συγκρίνεται με τις ακόλουθες οριακές τιμές [λαμbανομένης υπόψη της κρίσιμης διαφοράς που αντιστοιχεί σε τιμή πιθανότητας 95 % (DCr95)]:- 120,0 mg/kg (95 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης για στιγμαστερόλη καθαρότητας 95 %),- 122,0 mg/kg (95 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης για στιγμαστερόλη καθαρότητας 85 %),- 84,0 mg/kg (70 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης για στιγμαστερόλη καθαρότητας 95 %),- 86,0 mg/kg (70 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης για στιγμαστερόλη καθαρότητας 85 %).Η συγκέντρωση του ιχνηθέτη στο δείγμα από το οποίο προκύπτει το χαμηλότερο αποτέλεσμα χρησιμοποιείται μαζί με παρεμβολή μεταξύ των τιμών 120,0 mg/kg και 84,0 mg/kg, ή μεταξύ 122,0 mg/kg και 86,0 mg/kg.8.3.2. Σιτοστερόλη8.3.2.1. Το ποσοστό ενσωμάτωσης για τη σιτοστερόλη είναι 600 g σιτοστερόλης καθαρότητας τουλάχιστον 90 % ανά τόνο συμπυκνωμένου βουτύρου, ήτοι 540 mg/kg.8.3.2.2. Οι τιμές των τριών δειγμάτων που λαμβάνονται από την ανάλυση του προϊόντος χρησιμοποιούνται για έλεγχο του ποσοστού και της ομοιογένειας της ενσωμάτωσης του ιχνηθέτη και η χαμηλότερη από αυτές συγκρίνεται με τις ακόλουθες οριακές τιμές [λαμβανομένης υπόψη της κρίσιμης διαφοράς που αντιστοιχεί σε τιμή πιθανότητας 95 % (DCr95)]:- 486,0 mg/kg (95 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης για σιτοστερόλη καθαρότητας 90 %),- 358,0 mg/kg (70 % του ελάχιστου ποσοστού ενσωμάτωσης για σιτοστερόλη καθαρότητας 90 %).Η συγκέντρωση του ιχνηθέτη στο δείγμα από το οποίο προκύπτει η χαμηλότερη τιμή χρησιμοποιείται μαζί με παρεμβολή μεταξύ των τιμών 486,0 mg/kg και 358,0 mg/kg.>PIC FILE= "L_2001037EL.004801.EPS">>PIC FILE= "L_2001037EL.004901.EPS">>PIC FILE= "L_2001037EL.005001.EPS">ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XV(Άρθρο 10)ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΓΕΛΑΔΙΝΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΚΑΙ ΚΑΖΕΪΝΙΚΩΝ ΑΛΑΤΩΝ ΣΕ ΤΥΡΙΑ ΠΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΖΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΠΡΟΒΕΙΟ, ΚΑΤΣΙΚΙΣΙΟ Ή ΒΟΥΒΑΛΙΣΙΟ ΓΑΛΑ Ή ΑΠΟ ΜΕΙΓΜΑΤΑ ΠΡΟΒΕΙΟΥ, ΚΑΤΣΙΚΙΣΙΟΥ Ή ΒΟΥΒΑΛΙΣΙΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ1. ΑντικείμενοΑνίχνευση αγελαδινού γάλακτος και καζεϊνικών αλάτων σε τυριά από πρόβειο κατσικίσιο ή βουβαλίσιο γάλα ή από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου ή βουβαλίσιου γάλακτος με ισοηλεκτρική εστίαση γ-καζεϊνών μετά από πλασμινόλυση.2. Πεδίο εφαρμογήςΗ μέθοδος είναι κατάλληλη για ευαίσθητη και συγκεκριμένη ανίχνευση αυτούσιου και θερμικά επεξεργασμένου αγελαδινού γάλακτος και καζεϊνικών αλάτων σε νωπά και ώριμα τυριά από πρόβειο, κατσικίσιο, βουβαλίσιο γάλα ή από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου και βουβαλίσιου γάλακτος. Η μέθοδος αυτή δεν είναι κατάλληλη για την ανίχνευση της νόθευσης του γάλακτος και του τυριού, με συμπυκνώματα πρωτεϊνών ορού γάλακτος βοοειδών που έχουν υποστεί θερμική κατεργασία.3. Αρχή της μεθόδου3.1. Απομόνωση καζεϊνών από το τυρί και των πρότυπων αναφοράς3.2. Διάλυση των καζεϊνών που έχουν απομονωθεί και υποβολή σε πλασμινόλυση (EC.3.4.21.7)3.3. Ισοηλεκτρική εστίαση των καζεϊνών οι οποίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πλασμίνη παρουσία ουρίας και χρώση πρωτεϊνών.3.4. Αξιολόγηση μορφών απεικόνισης βαμένων γ3 και γ2-καζεϊνών (αποδεικτικά αγελαδινού γάλακτος) δια συγκρίσεως της μορφής που προέκυψε από το δείγμα με εκείνες που προέκυψαν στην ίδια πηκτή από πρότυπα περιεκτικότητας 0 % και 1 % σε αγελαδινό γάλα.4. ΑντιδραστήριαΠρέπει να χρησιμοποιούνται αντιδραστήρια αναλυτικής καθαρότητας, εκτός εάν υποδεικνύεται διαφορετικά. Το νερά θα πρέπει να είναι δισαπεσταγμένο ή ισοδύναμης καθαρότητας.Σημείωση:Οι αναλογίες που ακολουθούν αφορούν πηκτές πολυακρυλαμιδίων με ουρία, διαστάσεων 265 x 125 x 0,25 mm, που έχουν παρασκευαστεί εργαστηριακά. Όπου χρησιμοποιούνται πηκτές άλλων διαστάσεων και τύπων, χρειάζεται ίσως προσαρμογή των συνθηκών διαχωρισμού.Ισοηλεκτρική εστίαση4.1. Αντιδραστήρια παρασκευής πηκτών πολυακριλαμιδίου, που περιέχουν ουρία.4.1.1. Μητρικό διάλυμα πηκτήςΔιαλύονται σε νερό:4,85 g ακρυλαμιδίου0,15 g Ν, Ν'-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου (BIS)48,05 g ουρίας15,00 g γλυκερίνης (87 % w/w),συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι 100 ml και το διάλυμα διατηρείται στο ψυγείο μέσα σε σκοτεινόχρωμη φιάλη.Σημείωση:Αντί των νευροτοξικών ακρυλαμιδίων (στις ανωτέρω ποσότητες), προτιμότερο είναι να χρησιμοποιείται προαναμειχθέν διάλυμα ακρυλαμιδίου/BIS, το οποίο διατίθεται στο εμπόριο. Αντί των ως άνω ποσοτήτων, χρειάζονται 16,2 ml ενός τέτοιου προαναμειχθέντος διαλύματος, εφόσον η περιεκτικότητά του σε ακρυλαμίδιο είναι 30 % m/v και η περιεκτικότητά του σε BIS είναι 0,8 % m/v. Ο μέγιστος χρόνος διατηρησιμότητας του μητρικού διαλύματος είναι δέκα ημέρες. Εάν η αγωγιμότητά του είναι μεγαλύτερη των 5μS, απιονίζεται υπό ανάδευση για 30 λεπτά με 2 g Amberlite ΜΒ-3 και στη συνέχεια διηθείται από μεμβράνη 0,45 μm.4.1.2. Διάλυμα πηκτήςΠαρασκευάζεται το διάλυμα πηκτής με ανάμειξη προσθέτων και αμφολυτών με το μητρικό διάλυμα πηκτής (βλέπε 4.1.1.).9,0 ml μητρικού διαλύματος24 mg β-αλανίνης500 μl αμφολύτου με pH 3,5-9,5(1)250 μl αμφολύτου με pH 5-7(2)250 μl αμφολύτου με pH 6-8(3).Το διάλυμα πηκτής αναμειγνύεται και απαερώνεται επί 2 έως 3 λεπτά σε λουτρά υπερήχων ή σε κενό.Σημείωση:Το διάλυμα πηκτής παρασκευάζεται αμέσως πριν μεταφερθεί πάνω στην πλάκα (βλέπε 6.2).4.1.3. Διαλύματα καταλυτών4.1.3.1. Ν, Ν, Ν' Ν'- τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνη (TEMED) 55 ml.4.1.3.2. Διάλυμα υπερθειικού αμμωνίου (PER) 40 % w/v:Διαλύονται σε νερό 800 mg PER και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρις όγκου 2 ml.Σημείωση:Να χρησιμοποιείται πάντοτε πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα PER.4.2. Υγρό επαφήςΚηροζίνη ή υγρή παραφίνη4.3. Ανοδικό διάλυμαΠαρασκευάζεται διάλυμα 5,77 g φωσφορικού οξέως (85 % m/m) σε 100 ml νερού.4.4. Καθοδικό διάλυμαΔιαλύονται σε νερό 2,00 g υδροξειδίου του νατρίου και το διάλυμα αραιώνεται με νερό μέχρις όγκου 100 ml.Παρασκευή του δείγματος4.5. Αντιδραστήρια απομόνωσης πρωτεϊνών4.5.1. Αραιό οξικό οξύ (25,0 ml κρυσταλλικού οξικού οξέος αραιώνονται με νερό μέχρις όγκου 100 ml)4.5.2. Διχλωρομεθάνιο4.5.3. Ακετόνη4.6. Ρυθμιστικά διάλυμα για τη διάλυση πρωτεϊνώνΔιαλύονται σε νερό5,75 g γλυκερίνης (87 % m/m)24,03 g ουρίας250 mg διθειοθρεϊτόληςκαι το διάλυμα αραιώνεται μέχρις όγκου 50 ml.Σημείωση:Φυλάσσεται στο ψυγείο - μέγιστος χρόνος διατήρησης μία εβδομάδα.4.7. Αντιδραστήρια πλασμινόλυσης καζεΐνης4.7.1. Ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού αμμωνίουΤιτλοδοτείται διάλυμα όξινου ανθρακικού αμμωνίου 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml νερού) που περιέχει 0,05 ml με διάλυμα ανθρακικού αμμωνίου 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml νερού) που περιέχει 0,05 mol/l EDTA έως pH 8.4.7.2. Πλασμίνη βοοειδούς (E.C. 3.4.21.7), ενεργότητας τουλάχιστον 5 U/ml.4.7.3. Διάλυμα ε-αμινοκαπρονικού οξέος για αναστολή ενζύμου.Διαλύονται 2,624 g ε-αμινοκαπρονικού οξέος (6-αμινο-n-εξανικό οξύ) σε 100 ml αιθανόλης 40 % v/v.4.8. Πρότυπα4.8.1. Πιστοποιημένα πρότυπα αναφοράς από μείγμα αποκορυφωμένου πρόβειου και κατσικίσιου γάλακτος που περιέχουν 0 % και 1 % αγελαδινού γάλακτος, είναι διαθέσιμα στο Commission's Institute for Reference Materials and Measurements B 2440 Geel, Βέλγιο.4.8.2. Παρασκευή προσωρινών προτύπων πηγμένου αποκορυφωμένου βουβαλίσιου γάλακτος που περιέχουν 0 % και 1 % αγελαδινού γάλακτος.Αποκορυφωμένο γάλα λαμβάνεται με φυγοκέντρηση βουβαλίσιου ή αγελαδινού μη κατεργασμένου ασυσκεύαστου γάλακτος στους 37 °C για 20 λεπτά, 2500 g. Αφού ο σωλήνας και το περιεχόμενο ψυχθούν ταχέως μέχρι θερμοκρασίας 6-8 °C, αφαιρείται εντελώς το ανώτερο στρώμα λίπους. Για την παρασκευή του προτύπου 1 %, προστίθενται 5,00 ml αποκορυφωμένου αγελαδινού γάλακτος σε 495 ml αποκορυφωμένου βουβαλίσιου γάλακτος μέσα σε ποτήρια ζέσεως 1 λίτρου και, με την προσθήκη αραιού γαλακτικού οξέος (10 % v/v), ρυθμίζεται το pH σε 6,4. Ρυθμίζεται η θερμοκρασία στους 35 °C και προστίθενται 100 μl πιτιάς μόσχου (ενεργότης πυτιάς 1: 10000, περίπου 3000 U/ml), γίνεται ανάδευση για 1 λεπτό και εν συνεχεία το ποτήριο ζέσεως, σκεπασμένο με φύλλο αλουμινίου, αφήνεται στους 35 °C επί μία ώρα για να σχηματισθεί το τυρόπηγμα. Αφού σχηματισθεί το τυρόπηγμα, το πηγμένο γάλα υφίσταται λυοφιλίωση χωρίς προηγούμενη ομοιογενοποίηση ή αποστράγγιση του ορού. Μετά τη λυσφιλίωση, κονιοποιείται προς σχηματισμό ομοιογενούς σκόνης. Για την παρασκευή του προτύπου 0 % ακολουθείται η ίδια διαδικασία με 500 ml αμιγούς αποκορυφωμένου βουβαλίσιου γάλακτος. Τα πρότυπα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία - 20 °C.Σημείωση:Πριν από την παρασκευή των προτύπων, συνίσταται ο έλεγχος του βαθμού καθαρότητας του προβείου γάλακτος με ισοηλεκτρική εστίαση των καζεϊνών οι οποίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πλασμίνη.Αντιδραστήρια χρέωσης πρωτεϊνών4.9. ΣταθεροποιητήςΔιαλύονται σε νερό 150 g τριχλωροοξικού οξέος και το διάλυμα αραιώνεται μέχρις όγκου 1000 ml.4.10. Διάλυμα αποχρωματισμούΑραιώνονται με απεσταγμένο νερά 500 ml μεθανόλης και 200 ml κρυσταλλικού οξικού οξέος μέχρις όγκου 2000 ml.Σημείωση:Το διάλυμα αποχρωματισμού παρασκευάζεται σε ημερήσια βάση. Μπορεί να παρασκευαστεί με ανάμειξη ίσων όγκων μητρικών διαλυμάτων μεθανόλης (50 % v/v) και κρυσταλλικού οξικού οξέος (20 % v/v).4.11. Διαλύματα βαφής4.11.1. Διαλύματα βαφής (μητρικά διάλυμα 1)Διαλύονται 3,0 g Coomassie brilliant bleu G 250 (Color Index 42655) σε 1000 ml μεθανόλης, 90 % v/v με τη χρησιμοποίηση μαγνητικού αναδευτήρα (45 λεπτά περίπου) και ακολουθεί διήθηση από δύο πτυχωτούς ηθμούς μέσης ταχύτητας.4.11.2. Διάλυμα βαφής (μητρικό διάλυμα 2)Διαλύονται 5,0 g ένυδρου θειικού χαλκού (CuSO4 x 5H20) σε 1000 ml οξικού οξέος 20 % (v/v).4.11.3. Διάλυμα βαφής (διάλυμα εργασίας)Αναμειγνύονται 125 ml από κάθε μητρικά διάλυμα (4.11.1, 4.11.2) αμέσως πριν από τη βαφή.Σημείωση:Το διάλυμα βαφής πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο την ημέρα παρασκευής του.5. Εξοπλισμός5.1. Γυάλινες πλάκες διαστάσεων 265 x 125 x 4 mm - ελαστικός κύλινδρος (πλάτος 15 cm) - τραπέζι οριζοντίωσης5.2. Φύλλο συγκράτησης πηκτής διαστάσεων 265 x 125 mm5.3. Φύλλο κάλυψης διαστάσεων 280 x 125 mm. Επικολλάται λωρίδα αυτοκόλλητης ταινίας διαστάσεων 280 x 6 x 0,25 mm σε κάθε μεγάλη πλευρά (βλέπε σχήμα 1).5.4. Θάλαμος ηλεκτροεστίασης με πλάκα ψύξης (π.χ. 265 x 125 mm) με κατάλληλη πηγή τάσης μεγαλύτερη ή ίση από 2,5 kv ή αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης.5.5. Κρυοστάτης κυκλοφορίας ρυθμισμένος στους 12 +- 0,5 °C5.6. Συσκευή φυγοκέντρησης προσαρμοσμένη στα 3000 g5.7. Ταινίες ηλεκτροδίου (μήκους μεγαλύτερου ή ίσου προς 265 mm)5.8. Πλαστικές σταγονομετρικές φιάλες για το ανοδικό και το καθοδικό διάλυμα5.9. Φορείς δείγματος (10 x 5 mm, διηθητικός χάρτης από βισκόζη ή χαμηλής προσροφητικότητας σε πρωτεϊνες)5.10. Ψαλίδια, νυστέρια και λαβίδες από ανοξείδωτο χάλυβα5.11. Δοχεία βαφής και αποχρωματισμού από ανοξείδωτο χάλυβα ή από γυαλί (π.χ. δίσκοι οργάνων 280 x 150 mm)5.12. Ομοιογενοποιητής με ράβδο διαμέτρου 10 mm, 8000 έως 20000 στροφές ανά λεπτό (rpm)5.13. Μαγνητικός αναδευτήρας5.14. Λουτρό υπερήχων5.15. Συγκολλητής ταινίας5.16. Μικροσιφώνια των 5 - 25 μl5.17. Συμπυκνωτής κενού ή συσκευή λυοφιλίωσης5.18. Θερμοστατούμενο υδρόλουτρο στους 35 και 40 +- 1 °C με τάρακτρο5.19. Πυκνόμετρο για μήκος κύματος λ = 634 nm6. Πορεία εργασίας6.1. Παρασκευή δείγματος6.1.1. Απομόνωση καζεϊνώνΖυγίζεται ποσότητα ισοδύναμη με 5 g ξερής μάζας τυριού ή προτύπων σε σωλήνα φυγοκέντρησης των 100 ml, προστίθενται 60 ml απεσταγμένου νερού και γίνεται ομοιογενοποίηση με ομοιογενοποιητή με ράβδο (8000 έως 10000 rpm). Ρυθμίζεται το pH σε 4,6 με αραιά οξικό οξύ (4.5.1), γίνεται φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 3000 g), το λίπος και ο ορός απορρίπτονται, το υπόλειμμα ομοιογενοποιείται σε 20000 rpm με 40 ml απεσταγμένου νερού προσαρμοσμένου σε pH 4 - 5 με αραιό οξικό οξύ (βλέπε 4.5.1), προστίθενται 20 ml διχλωρομεθανίου (βλέπε 4.5.2) και γίνεται εκ νέου ομοιογενοποίηση και φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 3000 g). Το στρώμα της καζεΐνης που επιπλέει μεταξύ της υδατικής και της οργανικής φάσης (βλέπε σχήμα 2) αφαιρείται με μια σπάτουλα και απορρίπτονται και οι δύο φάσεις. Η καζεϊνη ομοιογενοποιείται εκ νέου με 40 ml απεσταγμένου νερού (βλέπε ανωτέρω) και 20 ml διχλωρομεθανίου και υποβάλλεται σε φυγοκέντρηση. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται έως ότου και οι δύο φάσεις εκχύλισης γίνουν άχρωμες (2 έως 3 φορές). Το πρωτεϊνικό υπόλειμμα ομοιογενοποιείται με 50 ml άνυδρης ακετόνης (βλέπε 4.5.3) και διηθείται από πτυχωτό διηθητικό ηθμό μέσης ταχύτητας. Το υπόλειμμα εκπλύνεται πάνω στο διηθητικό ηθμό δύο φορές με 25 ml ακετόνης κάθε φορά και αφήνεται να ξεραθεί στον αέρα ή σε ρεύμα αζώτου, και στη συνέχεια κονιοποιείται σε γουδί.Σημείωση:Οι απομονωμένες ξερές πρωτεΐνες πρέπει να διατηρηθούν σε θερμοκρασία - 20 °C.6.1.2. Πλασμινόλυση ß-καζεϊνών προς ενίσχυση γ-καζεϊνώνΕτοιμάζεται αιώρημα 25 mg απομονωθείσας καζεΐνης (βλέπε 6.1.1) σε 0,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ανθρακικού αμμωνίου (βλέπε 4.7.1) και ομοιογενοποιούνται επί 20 λετπά, με υπέρηχους για παράδειγμα. Θερμαίνονται στους 40 °C και προστίθενται 10 μl πλασμίνης (βλέπε 4.7.2), αναμειγνύονται και επωάζονται επί μία ώρα στους 40 °C με συνεχή ανάδευση. Για αναστολή του ενζύμου προστίθενται 20 μl διαλύματος ε-αμινοκαπρονικού οξέος (βλέπε 4.7.3), και εν συνεχεία, προστίθενται 200 mg στερεάς ουρίας και 2 mg διθειοθρεϊτόλης.Σημείωση:Για να προκύψει μεγαλύτερη συμμετρία στις εστιασθείσες ταινίες καζεΐνης, συνιστάται λυοφιλίωση του διαλύματος μετά την προσθήκη του ε-αμινοκαπρονικού οξέος και εν συνέχεία διάλυση των υπολειμμάτων σε 0,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ουρίας (βλέπε 4.6).6.2. Παρασκευή πηκτών ακρυλαμιδίου περιεχόντων ουρίαΤο φύλλο συγκράτησης πήγματος (βλέπε 5.2) κυλίεται με τη βοήθεια μερικών σταγόνων νερού πάνω σε γυάλινη πλάκα (βλέπε 5.1) και απομακρύνεται το επιπλέον νερά με χαρτοπετσέτα. Το φύλλο κάλυψης (βλέπε 5.3) κυλίεται με διαχωριστήρες (0,25 mm) πάνω σε άλλη γυάλινη πλάκα κατά τον ίδιο τρόπο. Η πλάκα τοποθετείται οριζοντίως σε τραπέζι οριζοντίωσης.Προστίθενται 10 μl καθενός από το διαλύμα TEMED (βλέπε 4.1.3.1) στο παρασκευασθέν και απαερωθέν διάλυμα πηκτής (βλέπε 4.1.2), αναμειγνύονται και προστίθενται 10 μl διαλύματος PER (4.1.3.2), αναμειγνύονται καλά και αμέσως και μεταφέρονται ομοιόμορφα πάνω στο κέντρο του φύλλου κάλυψης. Τοποθετείται μια πλευρά της πλάκας συγκράτησης πήγματος (η πλευρά με το φύλλο προς τα κάτω) πάνω στην πλάκα με το φύλλο κάλυψης και χαμηλώνεται αργά, έτσι ώστε να σχηματίζεται μεταξύ των φύλλων ένα λεπτό στρώμα πήγματος που να απλώνεται κανονικά και να μην περιέχει φυσαλλίδες (βλέπε σχήμα 3). Η πλάκα συγκράτησης πηκτής χαμηλώνεται προσεκτικά και τελείως με τη βοήθεια μιας λεπτής σπάτουλας και τοποθετούνται από πάνω τρεις ακόμη γυάλινες πλάκες σαν βάρος. Αφού ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός (60 λεπτά περίπου), απομακρύνεται το φύλλο υποστήριξης πηκτής μαζί με το φύλλο κάλυψης δι' ελαφρών κτυπημάτων των γυάλινων πλακών. Η ανάστροφη πλευρά του φύλλου συγκράτησης καθαρίζεται προσεκτικά για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα πηκτής και ουρίας. Το "sandwίch" της πηκτής φέρεται σε κατάλληλο σωλήνα και αποθηκεύεται σε ψυγείο (επί ξι εβδομάδες το πολύ).Σημείωση:Το φύλλο κάλυψης με τους διαχωριστήρες μπορεί να χρησιμοποιηθεί εκ νέου. Η πηκτή πολυακριλαμιδίου μπορεί να κοπεί σε μικρότερα μεγέθη, πράγμα το οποίο συνίστάται όταν υπάρχουν λίγα δείγματα ή όταν χρησιμοποιείται αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης (δύο πηκτές διαστάσεων 4,5 x 5 cm).6.3. Ισοηλεκτρική εστίασηΟ θερμοστάτης ψύξης ρυθμίζεται στους 12 °C. Η ανάστροφη πλευρά του φύλλου συγκράτησης επαλείφεται με κηροζίνη και εν συνεχεία σταλάζονται μερικές σταγόνες κηροζίνης (βλέπε 4.2) στο κέντρο του ψυγόμενου τμήματος. Κυλίεται κατόπιν επ' αυτού το "sandwich" της πηκτής με το φύλλο συγκράτησης προς τα κάτω, με προσοχή ώστε να αποφευχθεί η δημιουργία φυσαλλίων. Καθαρίζεται το τυχόν περίσσευμα κηροζίνης και αφαιρείται το φύλλο κάλυψης. Διαβρέχονται οι ταινίες των ηλεκτροδίων με τα διαλύματα ανόδου και καθόδου (βλέπε 4.3, και 4.4), κόβονται στο μήκος της πηκτής και τοποθετούνται στις προβλεπόμενες θέσεις (απόσταση ηλεκτροδίων 9,5 cm).Συνθήκες για την ισοηλεκτρική εστίαση:6.3.1. Διαστάσεις πήγματος 265 x 125 x 0,25 mm&gt;ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ&gt;Σημείωση:Εάν μεταβληθεί το πάχος ή το πλάτος των πηκτών, θα πρέπει να προσαρμοσθούν κατάλληλα οι τιμές της εντάσεως του ρεύματος και της ισχύος (π.χ. οι τιμές της εντάσεως του ρεύματος και της ισχύος διπλασιάζονται εάν χρησιμοποιηθεί πήγμα διαστάσεων 265 x 125 x 0,5 mm).6.3.2. Παράδειγμα προγράμματος τάσης για αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης (2 πηκτές διαστάσεων 5,0 x 4,5 cm), με ηλεκτρόδια που εφαρμόζονται απευθείας στην πηκτή, χωρίς ταινίες ηλεκτροδίων>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Κατά τη φάση 2, ο φορέας δείγματος τοποθετείται στις 0 Vh.Κατά τη φάση 2, ο φορέας δείγματος απομακρύνεται στις 30 Vh.6.4. Βαφή πρωτεϊνών6.4.1. Σταθεροποίηση πρωτεϊνώνΑπομακρύνονται οι ταινίες των ηλεκτροδίων αμέσως μετά τη διακοπή του ρεύματος και η πηκτή τοποθετείται αμέσως σε ένα δοχείο βαφής/αποχρωματισμού που είναι γεμάτος με 200 ml σταθεροποιητή (βλέπε 4.9) - αφήνεται επί 15 λεπτά αναδευόμενο συνεχώς.6.4.2. Έκπλυση και βαφή της πλάκας της πηκτήςΟ σταθεροποιητής αποστραγγίζεται εντελώς και η πλάκα της πηκτής εκπλύνεται δύο φορές για 30 δευτερόλεπτα, κάθε φορά με 100 ml διαλύματος αποχρωματισμού (βλέπε 4.10). Το διάλυμα αποχρωματισμού αποχύνεται και πληρούται στο δοχείο με 250 ml διαλύματος βαφής (βλέπε 4.11.3), το οποίο και αφήνεται να ενεργήσει για 45 λεπτά υπό ελαφρή ανάδευση.6.4.3. Αποχρωματισμός της πλάκας της πηκτήςΑποχύνεται το δυάλυμα βαφής, εκπλύνεται η πλάκα της πηκτής δύο φορές με 100 ml διαλύματος αποχρωματισμού κάθε (4.10) φορά και εν συνεχεία αναδεύεται δύο φορές τουλάχιστον με 200 ml διαλύματος αποχρωματισμού επί 15 τουλάχιστον λεπτά κάθε φορά μέχρις ότου το υπόβαθρο γίνει εντελώς καθαρό και άχρωμο. Εκπλύνεται εν συνεχεία η πλάκα της πηκτής με απεσταγμένο νερό (δύο φορές x 2 λεπτά κάθε φορά) και αφήνεται να στεγνώσει στον αέρα (2 έως 3 ώρες) ή στεγνώνεται με ηλεκτρικό στεγνωτήρα (10 έως 15 λεπτά).Σημείωση 1:Η σταθεροποίηση, η έκπλυση, η χρώση και ο αποχρωματισμός γίνονται στους 20 °C. Οι υψηλές θερμοκρασίες να αποφεύγονται.Σημείωση 2:Εάν επιλεγεί πιο ευαίσθητη μέθοδος χρώσης με άργυρο (π.χ. αντιδραστήριο Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, (κωδικός αριθ. 17-1150-01), οι καζεΐνες που έχουν υποστεί επεξεργασία με πλασμίνη πρέπει να αραιώνονται στα 5 mg/ml.7. ΑξιολόγησηΗ αξιολόγηση γίνεται με σύγκριση των πρωτεϊνικών ταινιών του δείγματος με εκείνες δειγμάτων αναφοράς πάνω στην ίδια πηκτή. Η ανίχνευση αγελαδινού γάλακτος σε τυριά από πρόβειο, κατσικίσιο, βουβαλίσιο γάλα ή από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου και βουβαλίσιου γάλακτος γίνεται μέσω των γ2 και γ3-καζεϊνών των οποίων τα ισοηλεκτρικά σημεία βρίσκονται στην περιοχή τιμών ότι μεταξύ 6,5 και 7,5 (σχήματα 4α, 4β και 5). Το όριο ανίχνευσης είναι χαμηλότερο από 0,5 %.7.1. Οπτική εξέτασηΓια οπτική εξέταση της ποσότητας αγελαδινού γάλακτος συνίσταται η προσαρμογή των συγκεκριμένων δειγμάτων και προτύπων ώστε να προκύψει το ίδιο επίπεδο έντασης των γ2- και γ3-καζεϊνών αιγοπροβάτων ή/και βουβαλιών (βλέπε "γ2 Ε,G,Β" και "γ3 Ε, G, Β" στα σχήματα 4α, 4β και 5). Κατόπιν αυτού, η ποσότητα αγελαδινού γάλακτος (μικρότερη, ίση ή μεγαλύτερη από 1 %) στο άγνωστο δείγμα μπορεί να εκτιμηθεί απευθείας με σύγκριση της εντάσεως των γ2- και γ3- καζεϊνών βοοειδών (βλέπε "γ3 C" και "γ2 C" στα σχήματα 4α, 4β και 5) με εκείνες των προτύπων αναφοράς 0 και 1 % (προβατίνα, αίγα) ή των προσωρινών εργαστηριακών προτύπων (βουβάλι).7.2. Πυκνομετρική εξέτασηΕφόσον υπάρχει δυνατότητα, χρησιμοποιείται πυκνομετρία (βλέπε 5.19) για τον προσδιορισμό του λόγου των εμβαδών των κορυφών γ2- και γ3- καζεϊνών βοοειδών, αιγοπροβάτων ή/και βουβαλιών (βλέπε σχήμα 5). Η τιμή αυτή συγκρίνεται με το λόγο των γ2- και γ3- καζεϊνών στο πρότυπο 1 % (αίγα, προβατίνα) ή στο εργαστηριακό προσωρινό πρότυπο (βουβάλι) που αναλύθηκε επάνω στην ίδια πηκτή.Σημείωση:Η μέθοδος δίνει ικανοποιητικά αποτελέσματα εφόσον υπάρξει σαφής θετική ένδειξη γ2- και γ3-καζεΐνης βοοειδών στο πρότυπο 1 %, όχι όμως και στο πρότυπο 0 %. Εάν όχι, η διαδικασία βελτιστοποιείται με επακριβή εφαρμογή των λεπτομερειών της μεθόδου.Ένα δείγμα θεωρείται θετικά, εάν οι γ2- και γ3- καζεΐνες βοοειδών ή οι αντίστοιχοι λόγοι των εμβαδών των κορυφών είναι ίσοι ή μεγαλύτεροι από το επίπεδο του δείγματος αναφοράς 1 %.8. Βιβλιογραφία1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause L, Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).3. Krause I., Berner L, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goal milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholytelimmobilised pH gradient - isoelectric focusing of γ2-caseins using plasmin as signal amplifier. Στο: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radota, ed.) σσ. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).4. Krause I., Belitz H.-D, Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -kaese durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaligen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).5. Radota B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).Σχήμα 1: Σχηματική αναπαράσταση του φύλλου κάλυψης&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.005701.EPS"&gt;Σχήμα 2: Στρώμα καζεΐνης που επιπλέει μεταξύ υδατικής και οργανικής φάσης μετά από φυγοκέντρηση&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.005702.EPS"&gt;Σχήμα 3: Τεχνική επικάλυψης για στρώση υπερλέπτων πηκτών πολυακρυλαμιδίου&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.005703.EPS"&gt;α = λωρίδα διαχωριστήρια (0,25 mm)· b = φύλλο κάλυψης (5.3)· c, e = γυάλινες πλάκες (5.1)· d = διάλυμα πηκτής (4.1.2)· f = φύλλο συγκράτησης πηκτής (5.2)Σχήμα 4α: Ισοηλεκτρική εστίαση (IEF) καζεϊνών επεξεργασμένων με πλασμίνη από τυρί που προέρχεται από πρόβειο και κατσικίσιο γάλα με διαφορετικές ποσότητες αγελαδινού γάλακτος.&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.005801.EPS"&gt;% CM = ποσοστό αγελαδινού γάλακτος C = αγελάδα· E = πρόβατο· G = κατσίκι.Απεικονίζεται το ... της πηκτής της IEF.Σχήμα 4β: Ισοηλεκτιρκή εστίαση καζεϊνών επεξεργασμένων με πλασμίνη, από τυρί που προέρχονται από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου και βουβαλίσιου γάλακτος, με διαφορετικές ποσότητες αγελαδινού γάλακτος.&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.005802.EPS"&gt;% CM = ποσοστό αγελαδινού γάλακτος 1 + = δείγμα που περιέχει 1 % αγελαδινού γάλακτος και το οποίο έχει εμπλουτισθεί με καθαρή καζεΐνη βοοειδών στη μέση της διαδρομής C = αγελάδα· Ε = πρόβατο· G = κατσίκι· Β = βουβάλι.Απεικονίζεται η συνολική απόσταση διαχωρισμού της πηκτής της IEF.Σχήμα 5: Τοποθέτηση των πυκνογραφημάτων των προτύπων (STD) και των δειγμάτων τυριού από μείγματα πρόβειου και κατσικίσιου γάλακτος μετά την ισοηλεκτρική εστίαση&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.005901.EPS"&gt;α, b = πρότυπα που περιέχουν 0 και 1 % αγελαδινού γάλακτος αγελάδας· c-g = δείγματα τυριού που περιέχουν 0, 1, 2, 3 και 7 % αγελαδινού γάλακτος· C = αγελάδα· E = πρόβατο· G = κατσίκι.Το ανώτερο ήμιση της πηκτής της IEF υποβλήθηκε σε σάρωση σε μήκος κύματος λ = 634 nm.(1) Προϊόντα Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) και Resolyte® pH 5-7 και pH 6-8 (BDH, Merck) είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικά για την επίτευξη του απαιτούμενου διαχωρισμού των γ-καζεϊνών.(2) Προϊόντα Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) και Resolyte® pH 5-7 και pH 6-8 (BDH, Merck) είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικά για την επίτευξη του απαιτούμενου διαχωρισμού των γ-καζεϊνών.(3) Προϊόντα Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) και Resolyte® pH 5-7 και pH 6-8 (BDH, Merck) είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικά για την επίτευξη του απαιτούμενου διαχωρισμού των γ-καζεϊνών.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XVI(Άρθρο 11)ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΚΟΛΟΒΑΚΤΗΡΙΔΙΩΝ ΣΤΟ ΒΟΥΤΥΡΟ, ΤΟ ΑΠΟΚΟΡΥΦΩΜΕΝΟ ΓΑΛΑ ΣΕ ΣΚΟΝΗ, ΤΗΝ ΚΑΖΕΪΝΗ ΚΑΙ ΤΑ ΚΑΖΕΪΝΙΚΑ ΑΛΑΤΑΠραγματοποιείται καλλιέργεια των δειγμάτων τα οποία αντιστοιχούν σε 1 γραμμάριο βουτύρου εφόσον το βούτυρο εξετάζεται για την παρουσία κολοβακτηριδίων.Όταν το αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη ή η καζεΐνη και τα καζεϊνικά άλατα εξετάζονται για την παρουσία κολοβακτηριδίων, πραγματοποιείται καλλιέργεια 0,1 γραμμαρίων δειγμάτων.Το πρότυπο IDF 73Α:1985, μέθοδος Β, εφαρμόζεται με τις ακόλουθες τροποποιήσεις:1) Η προετοιμασία των δειγμάτων γίνεται σύμφωνα με το πρότυπο IDF 122Β:1992. Για την όξινη καζεΐνη, η διαδικασία προετοιμασίας των δειγμάτων που περιγράφεται στο IDF 73Α:1985 χρησιμοποιείται εναλλακτικά.2) Κάθε σωλήνας ο οποίος περιέχει καλλιέργεια 1 γραμμάριο δειγμάτων (βούτυρο) ή 0,1 γραμμάρια δειγμάτων (αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη, καζεΐνης/καζεϊνικών αλάτων) αντιστοίχως, παραμένει ένα ορισμένο χρονικό διάστημα για επώαση και στη συνέχεια αξιολογείται. Δεν γίνονται καλλιέργειες διαλυμμάτων σε δεκαδικά ψηφία.Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>ΠαρατήρησηΠεριεκτικότητα σε κολοβακτηρίδια: 1/10 γραμμάρια βουτύρου, 1/γραμμάριο αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη ή καζεΐνης/καζεϊνικών αλάτων κατά μέσο όρο:Τα αποτελέσματα τα οποία δείχνουν ότι έχει εκπληρωθεί η απαίτηση επιτυγχάνονται με ποσοστό πιθανοτήτων 93 %.Περιεκτικότητα σε κολοβακτηρίδια: 1/γραμμάριο βουτύρου, 1/0,1 γραμμάρια αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη ή καζεΐνης/καζεϊνικών αλάτων κατά μέσο όρο:Τα αποτελέσματα τα οποία δείχνουν ότι δεν έχει εκπληρωθεί η απαίτηση επιτυγχάνονται με ποσοστό πιθανοτήτων 91 %.(Υπόθεση: Διανομή του Poisson)ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XVII(Άρθρο 12)ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΝΑΛΥΣΕΩΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΚΑΘΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΛΑΚΤΟΖΗ ΣΤΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΤΗΣ ΚΛΑΣΗΣ 2309 ΤΗΣ ΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗΣ ΟΝΟΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ(1)ΜΕΡΟΣ Ι1. Πεδίο εφαρμογήςΗ μέθοδος εφαρμόζεται στις περιπτώσεις περιεκτικότητος σε λακτόζη ανωτέρας του 0,5 %.2. ΑρχήΔιαλύομε τα σάκχαρα στο νερό. Ανακινούμε τη ζύμη (Saccharomyces cerevisiae) η οποία αφήνει τη λακτόζη ανέπαφη. Προσδιορίζομε την περιεκτικότητα του διαλύματος σε λακτόζη κατά τη μέθοδο Luff Schoorl, κατόπιν διυλίσεως και διηθήσεως.3. ΑντιδραστήριαΘειοθειικό νάτριο 0,1 ΝΔείκτης: διάλυμα αμύλου. Μείγμα 5 γραμμαρίων διαλυτού αμύλου (προσθέτομε ενδεχομένως 10 mg ιωδιούχου υδραργύρου ως παράγοντος συντηρήσεως) και 30 ml νερού προστίθενται σε 1 λίτρο ζέοντος νερού. Διατηρούμε το μείγμα αυτό σε βρασμό επί τρία λεπτά - το αφήνομε να ψυχθεί.Διάλυμα ιωδιούχου καλίου p.a. σε 30 % (p/v).Διάλυμα θειικού οξέος 6 ΝΑντιδραστήριο κατά Luff-Schoorl:α) Διαλύομε 25 g θειικού χαλκού p.a. απηλλαγμένου σιδήρου·β) Διαλύομε 50 ml κιτρικού οξέως p.a. (C6H8O7H20) σε 50 ml ύδατος·γ) Διαλύομε σε 300 ml περίπου θερμού νερού, 143,8 γραμ. ανύδρου ανθρακικού νατρίου (Na2C03).Αποχέομε το β) εντός του γ) (κατόπιν ψύξεως) ανακινώντας προσεκτικά και προσθέτοντας εν συνεχεία το α). Συμπληρώνομε μέχρι 1 λίτρο και το αφήνομε να ηρεμήσει επί μία νύχτα και κατόπιν το διηθούμε. Πρέπει να διαπιστωθούν οι κανονικότητες του ούτω επιτυγχανομένου αντιδραστηρίου (0,1 Ν σε Cu, 2 Ν σε Na2C03). Το pH πρέπει να πλησιάζει το 9,4.Διάλυμα Carrez Ι: Διαλύομε 23,8 γραμμάρια Zn (C2H302) 2.2Η2Ο και 3 γραμμάρια οξικού οξέος (glacial) και συμπληρώνουμε 100 ml.Διάλυμα Carrez ΙΙ: Διαλύομε 10,6 γραμμάρια K4F2 (CN)6.3Η2Ο σε νερό και συμπληρώνουμε 100 ml.Τμήματα ελαφρόπετρας, επεξεργασμένα δια βρασμού με υδροχλωρικό οξύ, πλυμένα με νερό και αποξηραμένα. Αιώρημα Saccharomyces cerevisiae: 25 γραμμάρια νωπής ζύμης σε 100 ml ύδατος. (Να μη διατηρηθεί στο ψυγείο πλέον της μιας εβδομάδος).4. Τρόπος χρήσεωςΖυγίζομε, με ακρίβεια 1 ml, 1 g του προς ανάλυση δείγματος και θέτομε την ποσότητα αυτή εντός ογκομετρικής φιάλης των 100 ml. Προσθέτομε 25 έως 30 ml νερού, τοποθετούμε τη φιάλη επί 30 λεπτά εντός ζέοντος υδρολούτρου. Την ψύχομε, εν συνεχεία σε 35 °C περίπου.Προσθέτομε 5 ml του αιωρήματος ζύμης(2) και ανακινούμε. Διατηρούμε τη φιάλη και το περιεχόμενό της επί 2 ώρες στο υδρόλουτρο στη θερμοκρασία των 38 έως 40 °C.Έπειτα από τη ζύμωση ψύχομε σε θερμοκρασία περίπον 20 °C. Προσθέτομε 2,5 ml του διαλύματος Carrez Ι και ανακοινούμε επί 30 δευτερόλεπτα- προσθέτομε εν συνεχεία 2,5 ml του διαλύματος Carrez ΙΙ και ανακοινούμε εκ νέου επί 30 δευτερόλεπτα. Συμπληρώνομε μέχρι 100 ml με νερό, ανακινούμε και διηθούμε. Λαμβάνομε με σιφώνιο ποσότητα διηθήματος μη υπερβαίνουσα τα 25 ml, και περιέχουσα κατά προτίμηση 40 έως 80 mg λακτόζη. Αν είναι αναγκαίο, συμπληρώνομε στα 25 ml με νερό και προσδιορίζομε την περιεκτικότητα σε άνυδρη λακτόζη κατά Luff-Schoorl.Προβαίνομε σε πλήρη λευκό προσδιορισμό μόνο με τη ζύμη.ΜΕΡΟΣ ΙΙ1. Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε λακτόζη κατά Luff-SchoorlΛαμβάνομε με σιφώνιο 25 ml αντιδραστηρίου Luff-Schoorl σε κωνική φιάλη των 300 ml. Προσθέτομε 25 ml επακριβώς μετρηθέντα του κατασταλαγμένου διαλύματος.Αφού προσθέσομε δύο τμήματα ελαφρόπετρας, θερμαίνομε, αναδεύοντας με το χέρι, επάνω από ελεύθερη φλόγα μέσου ύψους και φέρομε το υγρό σε βρασμό επί 2 λεπτά περίπου. Τοποθετούμε αμέσως την κωνική φιάλη επί μεταλλικου πλέγματος εφοδιασμένου με οθόνη από αμίαντο κάτω από το οποίο, έχομε προηγουμένως, ανάψει φλόγα. Αυτή είναι ρυθμισμένη κατά τέτοιο τρόπο ώστε η κωνική φιάλη να θερμαίνεται αποκλειστικά κάτω από τη βάση. Προσαρμόζομε, εν συνεχεία, ένα ψυκτήρα με οπισθοδρομική κίνηση. Από τη στιγμή αυτή, βράζομε επί 10 λεπτά ακριβώς. Ψύχομε αμέσως σε ψυχρό νερό και μετά 5 λεπτά περίπου τιτλοδοτούμε ως ακολούθως:Προσθέτομε στο υγρό 10 ml ιωδιούχου καλίου και ευθύς αμέσως, αλλά προσεκτικά (λόγω σχηματισμού άφθονου αφρού) 25 ml θειικού οξέως 6 Ν.Τιτλοδοτούμε, εν συνεχεία, με θειοθειικό νάτριο μέχρι της εμφανίσεως ενός κιτρίνου απαλού χρώματος και, προς το τέλος της τιτλοδοτήσεως, προσθέτομε το δείκτη αμύλου.Πραγματοποιούμε την ίδια τιτλοδότηση επί ενός μείγματος, επακριβώς μετρηθέντος 25 ml αντιδραστηρίου κατά Luff-Schoorl και 25 ml νερού, αφού πρώτα προσθέσουμε 10 ml ιωδιούχου καλίου και 25 ml θειικού οξέως 6 Ν, χωρίς να το φέρομε αυτή τη φορά σε βρασμό.Καταρτίζομε με τη βοήθεια του κατωτέρω πίνακος την ποσότητα σε χιλιόγραμμα λακτόζης που ανταποκρίνεται στη διαφορά των αποτελεσμάτων των δύο τιτλοδοτήσεων (εκφραζομένων σε ml θειοθειικού νατρίου 0,1 Ν).ΠΙΝΑΚΑΣΠίνακας για 25 ml αντιδραστηρίου Luff-Schorrl(βλέπε συνθήκες ως έχουν στο κείμενο)1. Θειοθειικό νάτριο 0,1 N2. Λακτόζη C12H22O11&gt;ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ&gt;(1) Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 222/88(2) Στην περίπτωση προϊόντων που περιέχουν περισσότερο του 40 % ζυμουμένων σακχάρων αυξάνομε την ποσότητα του αιωρήματος ζύμης.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XVΙΙΙ(Άρθρο 13)AΝΙΧΝΕΥΣΗ ΟΡΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΤΥΠΟΥ ΠΥΤΙΑΣ ΣΤΟ ΑΠΟΚΟΡΥΦΩΜΕΝΟ ΓΑΛΑ ΣΕ ΣΚΟΝΗ, ΠΟΥ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙ ΓΙΑ ΚΡΑΤΙΚΗ ΑΠΟΘΕΜΑΤΟΠΟΙΗΣΗ, ΜΕ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΩΝ ΓΛΥΚΟΜΑΚΡΟΠΕΠΤΙΔΙΩΝ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΕΩΣ (ΥΧΥΑ)1. Θέμα και τομέας εφαρμογήςΜε τη μέθοδο αυτή είναι δυνατόν να διαπιστωθεί η παρουσία ορού γάλακτος τύπου πυτίας στο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη που προορίζεται για κρατική αποθεματοποίηση διά του προσδιορισμού των γλυκoμακροπεπτιδίων.2. ΑναφορέςΔιεθνές πρότυπο ISO 707 - Γάλα και γαλακτοκομικά προϊόντα - Μέθοδοι δειγματοληψίας σύμφωνα με τις ενδείξεις που αναφέρονται στο τελευταίο εδάφιο σημείο 2 στοιχείο γ) του παραρτήματος Ι.3. ΟρισμόςΠεριεκτικότητα σε γλυκομακροπεπτίδια του αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη: περιεκτικότητα σε ουσίες προσδιοριζόμενη σύμφωνα με τη μέθοδο που ορίζεται παρακάτω και εκφραζόμενη σε επί τοις εκατό, ποσοστό κατά μάζα.4. Αρχή- Ανασύσταση του αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη: απομάκρυνση των λιπαρών ουσιών και των πρωτεϊνών, με τη βοήθεια τριχλωροξικού οξέος και φυγοκέντρηση.- Ποσοτικός προσδιρισμός των γλυκομακροπεπτιδίων (GMP) του επιπλέοντος μέρους, με τη βοήθεια υγρής χρωματογραφίας υψηλής αποδόσεως (YXYA).- Αξιολόγηση του αποτελέσματος σε συνάρτηση με δείγματα αναφοράς τα οποία συνίστανται από αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη απηλλαγμένο από γνωστό ποσοστό ορού γάλακτος σε σκόνη ή στο οποίο έχει προστεθεί γνωστό ποσοστό ορού γάλακτος σε σκόνη.5. ΑντιδραστήριαΌλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αποδεδειγμένου αναλυτικού βαθμού καθαρότητας. Το χρησιμοποιούμενο νερό είναι αποσταγμένο ή τουλάχιστον ισοδύναμης καθαρότητας.5.1. Διάλυμα τριχλωροξικού οξέοςΔιαλύονται 240 g τριχλωροξικού οξέος (CI3CCOOH) σε νερό και συμπληρώνονται μέχρι τελικού όγκου 1000 ml.5.2. Διάλυμα εκλούσεως, pH 6,0Διαλύονται 1,74 g όξινου φωσφορικού καλίου (K2HPO4), 12,37 g δισόξινου φωσφορικού καλίου (KH2 PO4) και 21,41 g θειικoύ νατρίου (Na2S04) σε 700 ml νερού περίπου. Εφόσον αυτό είναι αναγκαίο, προστίθεται διάλυμα φωσφορικού οξέος ή υδροξειδίου του νατρίου μέχρι pH 6,0.Προστίθεται νερό μέχρι τελικού όγκου 1000 ml και επακολουθεί ομογενοποίηση.Διηθείται το διάλυμα εκλούσεως, πριν από τη χρησιμοποίησή του, με τη βοήθεια ηθμού διαμέτρου πόρων 0,45 μm.5.3. Διάλυμα εκπλύσεως και διατηρήσεως των στηλώνΑναμειγνύεται ένας όγκος κυανιούχου μεθυλίου ακετονιτριλίου (CH3CN) με εννέα όγκους νερού. Διηθείται το μείγμα, προτού χρησιμοποιηθεί, σε ηθμό διαμέτρου πόρων 0,45 μm.Σημείωση:Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί οποιοδήποτε άλλο διάλυμα εκπλύσεως το οποίο έχει βακτηριοκτόνες ιδιότητες και δεν μεταβάλλει τη διαχωριστική ικανότητα των στηλών.5.4. Δείγματα αναφοράς5.4.1. Αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη το οποίο ανταποκρίνεται στις απαιτήσεις του παρόντος κανονισμού, δηλαδή [0].5.4.2. Το ίδιο γάλα, νοθευμένο σε ποσοστό 5 % (m/m) με ορό γάλακτος σε σκόνη τύπου πυτίας, μέσης σύνθεσης, δηλαδή [5].6. Όργανα6.1. Αναλυτικός ζυγός.6.2. Συσκευή φυγοκεντρήσεως η οποία μπορεί να επιτύχει δύναμη φυγοκεντρήσεως 2200 g, εφοδιασμένη με πωματισμένους σωλήνες φυγοκεντρήσεως, χωρητικότητας 25 ml περίπου.6.3. Μηχανικός αναδευτήρας.6.4. Μαγνητικός αναδευτήρας.6.5. Υάλινο χωνί, διαμέτρου περίπου 7 cm.6.6. Χάρτινοι ηθμοί μέσης διηθητικής ικανότητας, διαμέτρου 12,5 cm περίπου.6.7. Υάλινη διάταξη διηθήσεως εφοδιασμένη με ηθμό διαμέτρου πόρων 0,45 μm.6.8. Βαθμονομημένο σιφώνιο χωρητικότητας 10 ml, σύμφωνο με το ISO 648, κατηγορία Α, ή το ISO/R 835.6.9. Υδρόλουτρο, με θερμοστάτη ρυθμισμένο στους 25 +- 0,5 °C.6.10. Εξοπλισμός υγρής χρωματογραφίας υψηλής αποδόσεως, ο οποίος περιλαμβάνει:6.10.1. αντλία·6.10.2. εγχυτήρα, χειροκίνητο ή αυτόματο, χωρητικότητας 15 έως 30 μl·6.10.3. δύο στήλες εν σειρά TSK 2000 SW (μήκοc 30 cm, εσωτερική διάμετρος 0,75 cm) και μια στήλη αρχικής φάσεως άναντα (3 cm x 0,3 cm) εφοδιασμένη με Ι 125 ή με υλικό αντίστοιχης απόδοσης·6.10.4. κλίβανο με στήλη που φέρει θερμοστάτη ρυθμιζόμενο στους 35 +- 1 °C·6.10.5. ανιχνευτή υπεριωδών διαφόρου μήκος κύματος, με δυνατότητες διενέργειας μετρήσεων στα 205 nm, ευαισθησίας 0,008 Α·6.10.6. ολοκληρωτής με δυνατότητες υλοκλήρωσης από τη μία πτωτική περιοχή της καμπύλης στην άλλη.Σημείωση:Είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν στήλες που έχουν διατηρηθεί σε θερμοκρασία του περιβάλλοντος. Η διαχωριστική τους ικανότητα όμως είναι κατά τι μικρότερη. Στην περίπτωση που χρησιμοποιηθούν, οι διακυμάνσεις θερμοκρασίας κατά την ίδια σειρά αναλύσεων πρέπει να είναι μικρότερες των +- 5 °C.7. Δειγματοληψία7.1. Διεθνές πρότυπο ISO 707 - Γάλα και γαλακτοκομικά προϊόντα - Μέθοδοι δειγματοληψίας σύμφωνα με τις ενδείξεις που αναφέρονται στο τελευταίο εδάφιο σημείο 2 στοιχείο γ) του παραρτήματος I.7.2. Το δείγμα διατηρείται σε συνθήκες τέτοιες ώστε να μη σημειωθεί αλλοίωση ή μεταβολή της σύστασης.8. Τρόπος εργασίας8.1. Προετοιμασία του υπό δοκιμασία μείγματοςΜεταφέρεται το γάλα σε σκόνη σε περιέκτη διπλάσιας περίπου χωρητικότητας από τον όγκο της σκόνης, εφοδιασμένο με αεροστεγές κάλυμμα. Κλείνουμε τον περιέκτη αμέσως. Αναδεύεται καλά το γάλα σε σκόνη διά διαδοχικών αναστροφών του περιέκτη.8.2. ΔειγματοληψίαΖυγίζονται 2,000 +- 0,001 g υπό δοκιμασία δείγματος, σε σωλήνα φυγοκεντρώσεως (6.2).8.3. Απομάκρυνση των λιπαρών και πρωτεϊνικών ουσιών8.3.1. Στο δείγμα προστίθενται 20 g χλιαρού νερού (50 °C). Διαλύεται η σκόνη αναδεύοντας επί πέντε λεπτά με τη βοήθεια του αναδευτήρα (6.3). Η θερμοκρασία του σωλήνα ρυθμίζεται στους 25 °C.8.3.2. Προστίθενται, σε διάστημα δύο λεπτών, 10,0 ml διαλύματος τριχλωροξικού οξέος (5.1) υπό μαγνητική ανάδευση (6.4). Τοποθετείται ο σωλήνας στο υδρόλουτρο (6.9) και διατηρείται επί 60 λεπτά.8.3.3. Διενεργείται φυγοκέντρωση (6.2) στα 2200 g επί δέκα λεπτά. Η διήθηση επί χάρτου (6.6) και απομακρύνονται τα 5 πρώτα ml του διηθήματος.8.4. Χρωματογραφικός προσδιορισμός8.4.1. Ενίενται 15 έως 30 μl ακριβώς, υπερκείμενης στιβάδας ή διηθήματος (8.3.3) στη συσκευή υγρής χρωματογραφίας υψηλής αποδόσεως (6.10), υπό παροχή 1,0 ml διαλύματος εκλούσεως (5.2) ανά λεπτό.Σημείωση:1. Η θερμοκρασία του διαλύματος εκλούσεως (5.2) διατηρείται στους 85 °C καθ' όλη τη διάρκεια της χρωματογραφικής ανάλυσης προκειμένου να διατηρηθεί απαεριωμένο το διάλυμα εκλούσεως και να προβλεφθεί κάθε ανάπτυξη βακτηριδίων. Κάθε προληπτικό μέτρο με ανάλογο αποτέλεσμα είναι αποδεκτό.2. Σε κάθε διακοπή εκπλύνοντα οι στήλες με νερό. Δεν πρέπει να αφήνονται υπό το διάλυμα εκλούσεως (5.2).Πριν από κάθε διακοπή πέραν των 24 ωρών, εκπλύνονται οι στήλες με νερό και στη συνέχεια καθορίζονται με το διάλυμα (5.3) για τρεις ώρες τουλάχιστον, υπό παροχή 0,2 ml ανά λεπτό.8.4.2. Τα αποτελέσματα της χρωματογραφικής ανάλυσης του υπό δοκιμασία δείγματος [Ε] λαμβάνονται υπό μορφήν χρωματογράμματος, όπου κάθε κορυφή αναγνωρίζεται υπό το χρόνο κατακρατήσεώς της (RT), δηλαδή:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Η ποιότητα των στηλών μπορεί να επηρεάσει το χρόνο κατακρατήσεως των διαφόρων κορυφών.Ο ολοκληρωτής (6.10.6) υπολογίζει αυτόματα την επιφάνεια Α κάθε κορυφής δηλαδή:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Πρoκειμένου να εντοπισθούν οι τυχόν ανωμαλείες που οφείλονται είτε στην κακή λειτουργία των οργάνων ή των στηλών είτε στην προέλευσηη και τη φύση του υπό ανάλυση δείγματος, είναι αναγκαίο να μελετάται η μορφή κάθε χρωματογράμματος προτού επιχειρηθεί οποιαδήποτε ποσοτική ερμηνεία.Σε περίπτωση αμφιβολιών επαναλαμβάνεται η ανάλυση.8.5. Προτυποποίηση8.5.1. Εφαρμόζεται ακριβώς στα δείγματα αναφοράς (5.4) ο τρόπος εργασίας που περιγράφεται στα σημεία 8.2 και 8.4.2.Χρησιμοποιούνται προσφάτως παρασκευασθέντα διαλύματα, δεδομένου ότι τα γλυκομακροπεπτίδια (GMP) προσβάλλονται σε περιβάλλον τριχλωροξικού οξέως 8 %. Η περιεκτικότητά τους ελαττώνεται κατά 0,2 % περίπου ανά ώρα στους 30 °C.8.5.2. Προτού επιχειρηθεί οποιοσδήποτε χρωματογραφικός προσδιορισμός των δειγμάτων, ενίεται επανειλημμένως στις στήλες διάλυμα (8.5.1) του δείγματος αναφοράς (5.4.2) μέχρι σταθεροποιήσεως της επιφάνειας και του χρόνου κατακρατήσεως της κορυφής που αντιστοιχεί στα γλυκομακροπεπτίδια (GMP).8.5.3. Καθορίζονται οι συντελεστές ανταποκρίσεως R εγχέοντας τον ίδιο όγκο διηθημάτων (8.5.1) με αυτόν των δειγμάτων.9. Έκφραση των αποτελεσμάτων9.1. Τρόπος υπολογισμού και τύποι9.1.1. Υπολογισμός των συντελεστών ανταποκρίσεως R:&gt;ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ&gt;όπου:RII και RIV = είναι αντιστοίχως οι συντελεστές κορυφών ΙΙ και IV.ΑII [0] και ΑIV [0] = είναι αντιστοίχως οι επιφάνειες των κορυφών ΙΙ και IV του δείγματος αναφοράς [0] που λαμβάνονται υπό 8.5.3>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>όπου:RΙΙΙ = ο συντελεστής ανταποκρίσεως της κορυφής ΙΙΙ,ΑΙΙΙ [0] και ΑΙΙΙ [5] = είναι αντιστοίχως οι επιφάνειες της κορυφής ΙΙΙ στα δείγματα αναφοράς [0] και [5] που λαμβάνονται υπό 8.5.3.W = η ποσότητα ορού γάλακτος που περιέχεται στο δείγμα αναφοράς [5] δηλαδή 5.9.1.2. Υπολογισμός της σχετικής επιφάνειας των κορυφών του δείγματος [Ε]>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου:SΙΙ [E], SΙΙΙ [Ε], SIV [Ε]= είναι αντιστοίχως οι σχετικές επιφάνειες των κορυφών ΙΙ, ΙΙΙ και IV του δείγματος [Ε],ΑΙΙ [Ε], ΑΙΙΙ [Ε], ΑIV [Ε]= είναι αντιστοίχως οι επιφάνειες των κορυφών ΙΙ, ΙΙΙ και IV του δείγματος [Ε] οι οποίες λαμβάνονται υπό 8.4.2,RΙΙ, RΙΙΙ, RIV= είναι οι συντελεστές ανταποκρίσεως που υπολογίζονται στο σημείο 9.1.1.9.1.3. Υπολογισμός του σχετικού χρόνου κατακρατήσεως της κορυφής ΙΙΙ του δείγματος [Ε]:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου:RRTΙΙΙ [Ε]= είναι ο σχετικός χρόνος κατακρατήσεως της κορυφής ΙΙΙ του δείγματος [E],RTΙΙΙ [E]= είναι ο χρόνος κατακρατήσεως της κορυφής ΙΙΙ του δείγματος [Ε] που λαμβάνεται υπό 8.4.2,RTΙΙΙ [Ε]= είναι ο χρόνος κατακρατήσεως της κορυφής ΙΙΙ του δείγματος αναφοράς [5] που λαμβάνεται υπό 8.5.3.9.1.4. Έχει πειραματικά αποδειχθεί ότι υφίσταται γραμμική σχέση μεταξύ του σχετικού χρόνου κατακρατήσεως της κορυφής ΙΙΙ, δηλαδή RRTΙΙΙ, [Ε] και του ποσοστού του ορού γάλακτος σε σκόνη που προστίθεται μέχρι 10 %:- σε περιεκτικότητα  &gt; 5 % το RRTΙΙΙ [Ε] είναι &lt;  1,000,- σε περιεκτικότητα &lt;= 5 %, το RRTΙΙΙ [Ε] είναι &gt;= 1,000.Το επιτρεπόμενο περιθώριο αβεβαιότητας για τις τιμές του RRTΙΙΙ είναι +- 0,002.Κανονικά, η τιμή του RRTΙΙΙ [0] λίγο διαφέρει από 1,034. Ανάλογα με την κατάσταση των στηλών, η τιμή αυτή μπορεί να προσεγγίσει το 1,000, αλλά πρέπει πάντοτε να είναι μεγαλύτερη από αυτό.9.2. Υπολογισμός του επί τοις εκατό ποσοστού ορού γάλακτος σε σκόνη, τύπου πυτίας, που περιέχεται στο δείγμα:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>9.3. Ακρίβεια της μεθόδου9.3.1. ΕπαναληψιμότηταΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που διεξάγονται ταυτόχρονα ή με μικρή διαφορά μεταξύ τους, από τον ίδιο αναλυτή και με τα ίδια όργανα, επί του ίδιου δείγματος, δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 0,2 % m/m.9.3.2. ΑναπαραγωγικότηταΗ διαφορά μεταξύ δύο μεμονωμένων και ανεξαρτήτων αποτελεσμάτων από δύο διαφορετικά εργαστήρια επί του ίδιου δείγματος, δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 0,4 % m/m.9.4. Ερμηνεία9.4.1. Τεκμαίρεται η απουσία ορού γάλακτος εφόσον η σχετική επιφάνεια της κορυφής ΙΙΙ, SΙΙΙ [Ε], εκφρασμένη σε γραμμάρια ορού γάλακτος τύπου πυτιάς, ανά 100 γραμμάρια προϊόντος είναι &lt;=>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>9.4.2. Εάν η σχετική επιφάνεια της κορυφής ΙΙΙ,>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>είναι  &gt;>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>και η σχετική επιφάνεια της κορυφής ΙΙ, SΙΙ [Ε] &lt;= 160, υπολογίζεται η περιεκτικότητα σε ορό γάλακτος τύπου πυτιάς που υπάρχει όπως αναφέρεται στο σημείο 9.2.9.4.3. Εάν η σχετική επιφάνεια της κορυφής ΙΙΙ,>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>είναι  &gt;>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>και η σχετική επιφάνεια της κορυφής ΙΙ, SΙΙ [Ε]  &gt; 2,0 και η επιφάνεια της κορυφής ΙΙ, SΙΙ [Ε]  &gt; 160, προσδιορίζεται η περιεκτικότητα σε ολικές αζωτούχες ουσίες (P %)· στη συνέχεια εξετάζονται οι γραφικές παραστάσεις 1 και 2.9.4.3.1. Τα στοιχεία που λαμβάνονται μετά από ανάλυση των μη αλλοιωμένων δειγμάτων του αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη, με υψηλή η περιεκτικότητα σε ολικές αζωτούχες ουσίες συγκεντρώνονται στις γραφικές παραστάσεις 1 και 2.Η ευθεία που εμφαίνεται με συνεχή γραμμή αντιπροσωπεύει την ευθεία της γραμμικής παλινδρομήσεως της οποίας οι συντελεστές υπολογίζονται με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων.Η ευθεία που εμφαίνεται με διακεκομένη γραμμή καθορίζει το ανώτατο όριο της σχετικής επιφάνειας της κορυφής ΙΙΙ, με μια πιθανότητα να μην ξεπεραστεί στο 90 % των περιπτώσεων.Οι ισότητες των ευθειών με διακεκομένη γραμμή των γραφικών παραστάσεων 1 και 2 ισούνται αντίστοιχα με:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>όπου:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Οι εξισώσεις αυτές ισούνται με τον αριθμό 1,3 που μνημονεύονται στο σημείο 9.2.Η απόκλιση (Τ1 και Τ2) μεταξύ της σχετικής επιφάνειας SΙΙΙ [Ε] και της σχετικής επιφάνειας SΙΙΙ δίδεται από τις ακόλουθες σχέσεις:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>9.4.3.2.>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Η περιεκτικότητα σε υπάρχοντα ορό γάλακτος υπολογίζεται σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου:0,91 αντιπροσωπεύει την απόκλιση από τον κάθετο άξονα μεταξύ της ευθείας με συνεχή γραμμή και της ευθείας με διακεκομμένη γραμμή.&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.006801.EPS"&gt;ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XIX(Άρθρο 13)ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΞΗΡΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΟΡΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΠΟΥ ΠΡΟΚΥΠΤΕΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΠΗΞΗ, ΣΤΟ ΑΠΟΚΟΡΥΦΩΜΕΝΟ ΓΑΛΑ ΣΕ ΣΚΟΝΗ ΚΑΙ ΤΑ ΜΕΙΓΜΑΤΑ ΠΟΥ ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΣΤΟΝ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ (ΕΚ) ΑΡΙΘ. 2799/19991. Στόχος: ανίχνευση προσθήκης ξηρών εκχυλισμάτων ορού γάλακτος που προκύπτει μετά από πήξη στα ακόλουθα προϊόντα:α) αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη που ορίζεται στο άρθρο 2 του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 2799/1999,β) τα μείγματα που ορίζονται στο άρθρο 4 του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 2799/1999.2. Αναφορές: Διεθνής προδιαγραφή ISO 7073. ΟρισμόςΗ περιεκτικότητα σε ξηρά εκχυλίσματα του ορού γάλακτος που προκύπτει μετά από πήξη ορίζεται ως η ποσοστιαία αναλογία (κατά μάζα) που προσδιορίζεται με την παραπάνω τεχνική.4. ΑρχήΠροσδιορισμός της ποσότητας σε γλυκομακροπεπτίδια Α σύμφωνα με το παράρτημα XVIII. Τα δείγματα που δίδουν θετικά αποτελέσματα υποβάλλονται σε ανάλυση για την ανίχνευση των γλυκομακροπεπτιδίων Α με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ανεστραμμένης φάσεως (τεχνική HPLC). Τα αποτελέσματα που υπερβαίνουν το 1 % (m/m) αποδεικνύουν την παρουσία ξηρών εκχυλισμάτων ορού γάλακτος που προκύπτει μετά από πήξη.5. ΑντιδραστήριαΌλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναγνωρισμένης αναλυτικής καθαρότητας. Το νερό που χρησιμοποιείται πρέπει να είναι αποσταγμένο ή νερό ισοδύναμης καθαρότητας. Το ακετονιτρίλιο πρέπει να είναι φασματοσκοπικής καθαρότητας ή HPLC.Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την τεχνική περιγράφονται στο παράρτημα XVIII του παρόντος κανονισμού.Αντιδραστήρια για την τεχνική HPLC.5.1. Διάλυμα τριχλωρικού οξέοςΔιαλύονται 240 γραμμάρια τριχλωροξικού οξέος (CCl3CCOOH) σε νερό και ο όγκος συμπληρώνεται μέχρι 1000 ml.5.2. Εκλούσματα Α και ΒΈκλουσμα Α: σε διαβαθμισμένη φιάλη των 1000 ml προστίθενται 150 ml ακετονιτριλίου (CH3CN), 20 ml ισοπροπανώλης (CH3CHOHCH3) και 1,00 ml τριφθοροξικού οξέος (CF3COOH). Αραιώνομε μέχρι 1000 ml με νερό. Έκλουσμα Β: σε διαβαθμισμένη φιάλη των 1000 ml προστίθενται 550 ml ακετονιτριλίου, 20 ml ισοπροπανώλης και 1,00 ml του TFA. Αραιώνομε με νερό μέχρι 1000 ml. Το εκρέον διάλυμα διηθείται πριν από τη χρησιμοποίηση με μια διηθητική μεμβράνη που έχει διάμετρο πόρων 0,45 μικρομέτρων (μ,m).5.3. Διατήρηση της στήληςΜετά τις αναλύσεις η στήλη εκπλύνεται με το έκλουσμα Β (με τη βοήθεια κλίσης παροχών) κατόπιν εκπλύνεται με το ακετονιτρίλιο (με τη βοήθεια κλίσης παροχών κατά τη διάρκεια 30 λεπτών). Η στήλη διατηρείται σε ακετονιτρίλιο.5.4. Δείγματα μάρτυρες5.4.1. Αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη που ανταποκρίνεται στις απαιτήσεις για τη δημόσια αποθεματοποίηση, δηλαδή (0).5.4.2. Το ίδιο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη αναμεμειγμένο με 5 % (m/m) με τον ορό γάλακτος σε σκόνη που προκύπτει μετά από πήξη, πρότυπης σύνθεσης, δηλαδή (5).5.4.3. Το ίδιο αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη αναμεμειγμένο με 50 % (m/m) με τον ορό γάλακτος σε σκόνη που προκύπτει μετά από πήξη, πρότυπης σύνθεσης, δηλαδή (50)(1).6. Εργαστηριακά σκεύη και όργαναΟ εξοπλισμός που απαιτείται για τον τρόπο εργασίας περιγράφεται στο παράρτημα XVIII του παρόντος κανονισμού.6.1.1. Αναλυτικός ζυγός.6.2. Φυγοκεντρική μηχανή που μπορεί να επιτύχει μια κεντρόφυγο δύναμη 2200 γραμμαρίων και εξοπλισμένη με κεντρόφυγους σωλήνες με πώμα, χωρητικότητας περίπου 50 ml.6.3. Μηχανικός αναδευτήρας με δυνατότητα λειτουργίας στους 50 °C.6.4. Μαγνητικός αναδευτήρας.6.5. Γυάλινα χωνιά διαμέτρου περίπου 12,5 εκατοστών.6.6. Διηθητικά χαρτιά μέσης διηθητικής ικανότητας διαμέτρου περίπου 12,5 εκατοστών.6.7. Διάταξη γνάλινης διήθησης εξοπλισμένης με διηθητική μεμβράνη της οποίας η διάμετρος πόρων είναι 0,45 μικρόμετρα.6.8. Βαθμολογικά σιφώνια που επιτρέπουν την παροχή 10 ml (ISO 648, κατηγορίας Α ή ISO/R 835) ή σύστημα που μπορεί να παρέχει 10,0 ml σε δύο λεπτά.6.9. Θερμοστατούμενο υδρόλουτρο που ρυθμίζεται στους 25 +- 0,5 °C.6.10. Εξοπλισμός HPLC που περιλαμβάνει:6.10.1. Αντλία διπλής κλήσεως παροχών,6.10.2. Διάταξη έκχυσης χειροκίνητη ή αυτόματη, δυναμικότητας 100 μικρολίτρων (μl),6.10.3. Στήλη Dupont Protein Plus (μήκους 25 εκατοστών, εσωτερικής διαμέτρου 0,46 εκατοστών) ή ισοδύναμη στήλη ανεστραμμένης φάσεως με βάση διοξείδιο του πυριτίου με διευρυμένους πόρους,6.10.4. Κλίβανος με θερμοστατημένη στήλη που ρυθμίζεται σε 35 +- 1 °C,6.10.5. Ανιχνευτής UV με μεταβλητό μήκος κύματος, που επιτρέπει μετρήσεις έως 210 nm (σε περίπτωση ανάγκης μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα μήκος κύματος μεγαλύτερο το οποίο μπορεί να επιτύχει 220 nm) με ευαισθησία 0,02 Å,6.10.6. Ολοκληρωτής που μπορεί να σχηματίσει ολοκληρώματα από κοιλάδα σε κοιλάδα.ΣημείωσηΜπορεί κανείς να εργασθεί με στήλες που διατηρούνται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος υπό τον όρο ότι η θερμοκρασία αυτή δεν παρουσιάζει διακυμάνσεις μεγαλύτερες του 1 °C· αλλιώς, διαπιστώνονται μεγάλες μεταβολές στο χρόνο κατακράτησης των GMPÅ.7. Δειγματοληψία7.1. Η δειγματοληψία πραγματοποιείται σύμφωνα με το διεθνές πρότυπο ISO 707. Τα κράτη μέλη μπορούν ωστόσο να εφαρμόσουν άλλη μέθοδο δειγματοληψίας εφόσον αυτή είναι σύμφωνη με τις αρχές του προαναφερθέντος προτύπου.7.2. Το δείγμα διατηρείται σε συνθήκες κατάλληλες ώστε να μη προκληθεί αλλοίωση ή μεταβολή της σύνθεσης.8. Τρόπος εργασίας8.1. Παρασκευή του δείγματος για δοκιμήΤο γάλα σε σκόνη μεταγγίζεται σε δοχείο χωρητικότητας διπλής περίπου του όγκου της σκόνης, εξοπλισμένου με αεροστεγές πώμα. Το δοχείο κλείνεται αμέσως. Το γάλα σε σκόνη αναμειγνύεται καλά με διαδοχικές αναστροφές του δοχείου.8.2. Δείγμα δοκιμήςΣε φυγόκεντρους σωλήνες ζυγίζονται 2 +- 0,001 γραμμάρια δείγματος για δοκιμή (6.2) ή σε κατάλληλη σφαιρική φιάλη, με σμυρισμένο πώμα (50 ml).8.3. Απομάκρυνση των λιπαρών ουσιών και των πρωτεϊνών8.3.1. Στο δείγμα δοκιμής προστίθενται 20,0 γραμμάρια ζεστού νερού (50 °C). Η σκόνη διαλύεται με ανακίνηση πέντε λεπτών με τη βοήθεια ενός αναδευτήρα ή κατά τη διάρκεια 30 λεπτών, στην περίπτωση του όξινου βουτυρογάλακτος, με τη βοήθεια μηχανικού αναδευτήρα (6.3). Ο σωλήνας τοποθετείται σε υδρόλουτρο (6.9) και ρυθμίζεται η θερμοκρασία του σωλήνα σε 25 °C.8.3.2. Σε δύο λεπτά προστίθενται 10,0 ml διαλύματος τριχλωροξικού οξέος στους 25 °C (5.1) ανακοινώντας ζωηρά με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα (6.4). Ο σωλήνας τοποθετείται σε υδρόλουτρο (6.9) και διατηρείται σ' αυτό κατά τη διάρκεια 60 λεπτών.8.3.3. Φυγοκέντριση (6.2) 2200 γραμμάρια κατά τη διάρκεια 10 λεπτών ή διήθηση σε χαρτί (6.6), και απορρίπτονται τα πέντε πρώτα ml του διηθήματος.8.4. Χρωματογραφικός προσδιορισμός8.4.1. Η ανάλυση HPLC πραγματοποιείται όπως περιγράφεται στο παράρτημα XVIII. Εάν προκύψει αρνητικό αποτέλεσμα αυτό σημαίνει ότι το αναλυόμενο δείγμα δεν περιέχει ξηρά εκχυλίσματα ορού γάλακτος που προέκυψε από πήξη σε ανιχνεύσιμες ποσότητες. Σε περίπτωση θετικών αποτελεσμάτων πρέπει να εφαρμοστεί η τεχνική HPLC ανεστραμμένης φάσεως που περιγράφεται παρακάτω. Η παρουσία όξινου βουτυρογάλακτος σε σκόνη μπορεί να δώσει ψευδοθετικά αποτελέσματα. Η μέθοδος HPLC ανεστραμμένης φάσεως αποκλείει αυτήν τη δυνατότητα.8.4.2. Πριν να εφαρμοστεί η ανάλυση CLHP ανεστραμμένης φάσεως, πρέπει να βελτιστοποιηθούν οι συνθήκες της κλήσης παροχών. Ο ιδανικός χρόνος κατακράτησης για τα συστήματα της κλήσης παροχών νεκρού όγκου περίπου 6 ml (όγκος του σημείου όπου τα διαλύματα βρίσκονται στον όγκο του δακτυλίου της διάταξης έγχυσης) είναι 26 λεπτά +- 2 λεπτά για τα GMPΑ. Στην περίπτωση των συστημάτων κλήσης παροχών που έχουν νεκρό όγκο χαμηλότερο (για παράδειγμα 2 ml) πρέπει να εφαρμοσθεί ως ιδανικός χρόνος κατακράτησης ο χρόνος των 22 λεπτών.Τα διαλύματα των τύπων δειγμάτων λαμβάνονται (5.4) με ή χωρίς ορό γάλακτος που προκύπεει μετά τη πήξη κατά 50 %.Στη διάταξη CLHP εκχύονται 100 μl υπερκείμενου υγρού ή διηθήματος (8.3.3) με τη χρησιμοποίηση συνθηκών κλήσεως παροχών αναφοράς που αναφέρονται στον πίνακα 1.Πίνακας 1Συνθήκες κλήσεως παροχών αναφοράς για τη βελτιστοποίηση της χρωματογραφίας>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Μια σύγκριση των δύο χρωματογραφημάτων θα έπρεπε να φαίνεται εκεί όπου βρίσκεται η κορυφή των GMPΑ.Με τη βοήθεια του τύπου που αναφέρεται παρακάτω, η σύνθεση του αρχικού διαλύματος που θα χρησιμοποιηθεί για την κανονική κλήση παροχών (8.4.3) μπορεί να υπολογισθεί ως εξής:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>.όπου:RTgmpA: χρόνος κατακράτησης του GMPΑ στην κλήση παροχών αναφοράς10: το αρχικό ποσοστό Β της κλήσης παροχών αναφοράς2,5: το ποσοστό Β στο κεντρικό σημείο μείον το ποσοστό Β στην αρχή στην κανονική κλήση παροχών13,5: ο χρόνος στα μισά της διαδρομής της κλήσης παροχών αναφοράς26: αναγκαίος χρόνος κατακράτησης για τα GMPΑ6: λόγος των κλήσεων παροχών αναφοράς και της κανονικής κλήσης παροχών30: ποσοστό Β στην αρχή μείον το ποσοστό Β σε 27 λεπτά. Στην κλήση παροχών αναφοράς27: χρόνος διαδρομής της κλήσης παροχών αναφοράς.8.4.3. Λήψη διαλυμάτων των δοκιμώνΣτο σκεύος CLHP εκχύονται ακριβώς 100 ml υπερκείμενου υγρού ή διηθήματος (8.3.3) και παροχή 1,0 ml ρέοντος διαλύματος (5.2) ανά λεπτό.Η σύνθεση του εκλούσματος στην αρχή της ανάλυσης προκύπτει από το 8.4.2. Προσεγγίζει συνήθως το Α: Β = 76: 24 (5.2). Αμέσως μετά την έγχυση αρχίζει μια γραμμική κλήση παροχών που δίδει μετά από 25 λεπτά ποσοστό Β μεγαλύτερο του 5 %. Στη συνέχεια αρχίζει μια γραμμική κλήση παροχών που οδηγεί στη σύνθεση του εκλούσματος μέχρι 95 % του Β σε διάστημα 5 λεπτών. Η σύνθεση αυτή διατηρείται κατά τη διάρκεια 5 λεπτών, στη συνέχεια μεταβάλλεται η σύνθεση με γραμμική κλήση παροχής 5 λεπτών για να επιτευχθεί η αρχική σύνθεση. Σύμφωνα με τον εσωτερικό όγκο του συστήματος άντλησης, η επόμενη έγχυση μπορεί να γίνει σε 15 λεπτά αφού έχουν επιτευχθεί οι αρχικές συνθήκες.Παρατηρήσεις1. Ο χρόνος κατακράτησης των γλυκομακροπεπτιδίων θα έπρεπε να είναι 26 λεπτά +- 2 λεπτά, γεγονός που μπορεί να επιτευχθεί με τη μεταβολή των αρχικών συνθηκών και των τελικών συνθηκών της πρώτης κλήσης παροχών. Ωστόσο η διαφορά στο % Β για τις αρχικές συνθήκες και τις τελικές συνθήκες της πρώτης κλήσης παροχών πρέπει να παραμείνουν στο 5 % Β.2. Τα εκλούσματα πρέπει να απαερώνονιαι επαρκώς και επίσης να διατηρούνrαι απαερωμένα. Αυτό είναι απαραίτητο για την καλή λειτουργία του συστήματος άντλησης της κλήσης παροχών. Η τυπική απόκλιση που αφορά το χρόνο κατακράτησης στην κορυφή του GMP πρέπει να είναι κατώτερη από 0,1 λεπτό (n = 10).3. Για όλα, τα πέντε δείγματα πρέπει να εγχυθεί και να χρησιμοποιηθεί το δείγμα αναφοράς (5) για να υπολογισθεί ο νέος συντελεστής απόκρισης R (9.1.1).8.4.4. Τα αποτελέσματα της χρωματογραφικής ανάλυσης του δείγματος για δοκιμή (Ε) λαμβάνονται με τη μορφή χρωματογραφήματος όπου κάθε κορυφή GMP αναγνωρίζεται από το χρόνο κατακράτησης περίπου 26 λεπτών.Ο ολοκληρωτής (6.10.1) υπολογίζει αυτόματα το ύψος της κορυφής Η της κορυφής GPM. Η βασική γραμμή πρέπει να επαληθευθεί σε κάθε χρωματογράφημα. Η ανάλυση ή το ολοκλήρωμα θα έπρεπε να επαναληφθούν εάν η γραμμή δεν είναι σωστή.Για την ανίχνευση των ενδεχόμενων ανωμαλιών που οφείλονται είτε στην κακή λειτουργία του εξοπλισμού ή στη στήλη, είτε στη φύση του αναλυόμενου δείγματος, είναι αναγκαίο να εξεταστεί η μορφή κάθε χρωματογραφήματος πριν από κάθε ποσοτική ερμηνεία. Σε περίπτωση αμφιβολίας θα επαναληφθεί η ανάλυση.8.5. Καμπύλη αναφοράς8.5.1. Να εφαρμοσθεί επακριβώς στα δείγματα μάρτυρες (5.4.1-5.4.2) ο τρόπος εργασίας που περιγράφεται στο σημείο 8.2 στο σημείο 8.4.4. Να χρησιμοποιηθούν πρόσφατα παρασκευασμένα διαλύματα διότι τα GMP αποικοδομούνται σε τριχλωροξικό περιβάλλον μέχρι ποσοστού 8 %, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Σε 4 °C το διάλυμα παραμένει σταθερό κατά τη διάρκεια 24 ωρών. Στην περίπτωση μακρών σειρών ανάλυσης είναι σκόπιμο να χρησιμοποιηθεί ένας ψυχόμενος δίσκος δειγμάτων στην αυτόματη διάταξη έγχυσης.Σημείωση:Το σημείο 8.4.2 μπορεί να παραληφθεί εάν το % Β στις αρχικές συνθήκες είναι γνωστό από προηγούμενες αναλύσεις.Το χρωματογράφημα του δείγματος αναφοράς (5) πρέπει να είναι σύμφωνο με το σχέδιο 1. Σ' αυτήν τη γραφική αναπαράσταση, η κορυφή του GMPΑ ακολουθεί μετά από δύο μικρές κορυφές. Είναι αναγκαίο να γίνει ένας συγκρίσιμος διαχωρισμός.8.5.2. Πριν από κάθε χρωματογραφικό προσδιορισμό των δειγμάτων, να χυθούν 100 μικρολίτρα του προτύπου δείγματος χωρίς ορό γάλακτος (0) (5.4.1).Το χρωματογράφημα δεν θα έπρεπε να παρουσιάζει κορυφή στο χρόνο κατακράτησης της κορυφής του GMPΑ.8.5.3. Να προσδιοριστούν οι συντελεστές απόκρισης R με έγχυση του ιδίου όγκου διηθήματος (8.5.1) όπως και για τα δείγματα.9. Αποτέλεσμα9.1. Τρόπος υπολογισμσύ και τύποι9.1.1. Υπολογισμός του συντελεστή απόκρισης R:Κορυφή GMP: R = W/Hόπου:R= ο συντελεστής απόκρισης της κορυφής GMPΗ= στο ύψος της κορυφής GMPW= η ποσότητα του ορού γάλακτος που περιέχεται στο δείγμα μάρτυρα (5)9.2. Υπολογισμός του ποσού του ορού γάλακτος που προκύπτει μετά την πήξη και βρίσκεται μέσα στο δείγμα:W(Ε) = R x H(E)όπου:W(E)= το ποσοστό του ορού γάλακτος που προκύπτει μετά από πήξη και βρίσκεται στο δείγμα: (Ε)R= ο συντελεστής απόκρισης της κορυφής GMP (9.1.1)H(E)= το ύψος της κορυφής GMP του δείγματος (Ε).Εάν W(Ε) είναι ανώτερο από 1 % και η διαφορά μεταξύ του χρόνου κατακράτησης και του χρόνου του δείγματος μάρτυρα (5) είναι κατώτερος από 0,2 λεπτά, αποδεικνύεται η παρουσία ξηρών εκχυλισμάτων ορού γάλακτος.9.3. Ακρίβεια της μεθόδου9.3.1. ΕπαναληπτικότηταΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων των δύο προσδιορισμών που πραγματοποιήθηκαν ταυτόχρονα ή με μικρό χρονικό διάστημα από τον ίδιο τεχνικό εργαστηρίου που χρησιμοποίησε τον ίδιο εξοπλισμό, επί της ίδιας δειγματοληψίας δεν μπορεί να υπερβαίνει το 0,2 % m/m.9.3.2. ΑναπαραγωγιμότηταΔεν έχει προσδιοριστεί ακόμα.9.3.3. ΓραμμικότηταΈως ποσοστού 16 % ορού γάλακτος μετά από πήξη θα ληφθεί μια γραμμική σχέση με συντελεστή συσχέτισης μεγαλύτερου του 0,99.9.4. Ερμηνεία9.4.1. Αποδεικνύεται η παρουσία του ορού γάλακτος εάν το αποτέλεσμα που λαμβάνεται στο σημείο 9.2 είναι μεγαλύτερο από 1 % m/m και εάν ο χρόνος κατακράτησης της κορυφής GMP διαφέρει κατά 0,2 τουλάχιστον λεπτά από εκείνον του πρότυπου δείγματος (5). Το όριο του 1 % καθορίζεται σύμφωνα με πς διατάξεις του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 625/78 παράρτημα V σημεία 9.2 και 9.4.1.&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.007301.EPS"&gt;(1) Ο ορός γάλακτος σε σκόνη που προκύπτει μετά από πήξη πρότυπης σύνθεσης, καθώς και το αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη μπορούν να ληφθούν από τον NIZO, Kernhemseweg 2, PO Box 20, NL-6710 BA. Ωστόσο, μπορούν να χρησιμοποιηθούν επίσης σκόνες που παρέχουν ισοδύναμα αποτελέσματα με τις σκόνες NIZO.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΧΧ(Άρθρο 14)ΑΠΟΚΟΡΥΦΩΜΕΝΟ ΓΑΛΑ ΣΕ ΣΚΟΝΗ: ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΦΩΣΦΑΤΙΔΥΛΣΕΡΙΝΗ ΚΑΙ ΦΩΣΦΑΤΙΔΥΛΑΙΘΑΝΟΛΑΜΙΝΗΜέθοδος CLHT αναστροφής φάσης1. ΘΕΜΑ ΚΑΙ ΤΟΜΕΑΣ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣΗ μέθοδος περιγράφει μία διαδικασία για τον ποσοτικό προσδιορισμό της φωσφατιδυλσερίνης (PS) και φωσφατιδυλαιθανολαμίνης (PE) σε αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη (ΑΓΣ ) και είναι κατάλληλη για την ανίχνευση πηγμάτων βουτυρογάλακτος στο ΑΓΣ.2. ΟΡΙΣΜΟΣΠεριεκτικότητα σε PS + PE: η κατανομή μάζας ουσίας προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που ορίζεται στο παρόν παράρτημα. Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε mgr διπαλμτελαϊκής φωσφατιδυλαιθανολαμίνης (PEDP) ανά 100 g σκόνης.3. ΑΡΧΗΑπόσταξη αμινοφωσφολιπιδίων με μεθανόλη από ανασυσταθείσα σκόνη γάλακτος. Προσδιορισμός PS και PE ως παραγώγων της ο-φθαλδιαλδεΰδης (OPA) με CLHT ανάστροφης φάσης (RP) και ανίχνευση φθορισμού. Ποσοτικός προσδιορισμός της περιεκτικότητας PS και PE στο εξεταζόμενο δείγμα σε σχέση με πρότυπο δείγμα που περιέχει γνωστή ποσότητα PEDP.4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑΌλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αποδεδειγμένου αναλυτικού βαθμού. Το χρησιμοποιούμενο νερό είναι αποσταγμένο ή τουλάχιστον ισοδύναμης καθαρότητας.4.1. Πρότυπο υλικό: PEDP, τουλάχιστον 99 % καθαρό.Σημείωση:Το πρότυπο υλικό πρέπει να αποθηκεύεται σε - 18 °C.4.2. Αντιδραστήρια για την προετοιμασία πρότυπου δείγματος και εξεταζόμενου δείγματος4.2.1. Μεθανόλη CLHP βαθμού4.2.2. Χλωροφόρμιο CLHP βαθμού4.2.3. Τρυπταμίνη - μονοϋδροχλωρίδιο4.3. Αντιδραστήρια για σχηματισμό παραγώγων ο-φθαλδιαλδεΰδης4.3.1. Υδροξείδιο του νατρίου, υδάτινο διάλυμα 12 Μ4.3.2. Βορικό οξύ, υδάτινο διάλυμα 0,4 Μ προσαρμοσμένο σε pH 10,0 με υδροξείδιο του νατρίου (4.3.1)4.3.3. 2-μερκαπτοαιθανόλη4.3.4. Ο-φθαλδιαλδεΰδη (OPA)4.4. Διαλύτες έκπλυσης CLHPΟι διαλύτες έκπλυσης πρέπει να παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας τα αντιδραστήρια βαθμού CLHP.4.4.1. Νερό CLHP βαθμού4.4.2. Μεθανόλη φθορομετρικά ελεγχόμενης καθαρότητας4.4.3. Τετραϋδροφουράνιο4.4.4. Φωσφατικό διάλυμα διυδρογόνου του νατρίου4.4.5. Οξικό άλας του νατρίου4.4.6. Οξικό οξύ5. Όργανα5.1. Αναλυτικός ζυγός5.2. Μεζούρες, με χωρητικότητα 25 και 100 ml5.3. Σιφώνια έγχυσης 1 και 10 ml5.4. Μαγνητικός αναδευτήρας5.5. Βαθμονομημένα σιφώνια έγχυσης 0,2, 0,5 και 5 ml5.6. Ογκομετρικά χωνιά, με χωρητικότητα 10, 50 και 100 ml5.7. Σύριγγες, χωρητικότητας 20 και ml5.8. Λουτρό υπερήχων5.9. Φυγόκεντρος που λειτουργεί σε 27000 x g5.10. Γυάλινες φιάλες, χωρητικότητας περίπου 5 ml5.11. Βαθμονομημένος κύλινδρος, χωρητικότητας 25 ml5.12. pH-μέτρο5.13. Εξοπλισμός CLHP5.13.1. Βαθμονομημένο σύστημα άντλησης, ικανό να λειτουργεί σε 1,0 ml ανά λεπτό σε 200 bar5.13.2. Αυτόματος δειγματολήπτης με δυνατότητα σχηματισμού παραγώγων5.13.3. Θερμαντής στήλης σε 30 °C5.13.4. Ανιχνευτής φθορισμού σε 330 nm μήκος κύματος διέργεσης και 440 nm μήκος κύματος εκπομπής5.13.5. Ολοκληρωτής ή ηλεκτρονικός υπολογιστής επεξεργασίας δεδομένων ικανός για μετρήσεις στην περιοχή σχηματισμού κορυφής5.13.6. Λιχροσφαίρα - 100 στήλες (250 X 4,6 mm) ή ισοδύναμη στήλη γεμάτη με οκταδεκυλσιλάνη (C18), μέγεθος μορίου 5 μm6. ΔειγματοληψίαΗ δειγματοληψία πρέπει να διενεργείται σύμφωνα με το πρότυπο IDF 50Β 1985.7. Διαδικασία7.1. Προετοιμασία του πρότυπου διαλύματος του εργαστηρίουΖυγίζονται 30,0 +- 0,1 mg τρυπταμίνης-μονοϋδροχλωριδίου (4.2.3) σε ογκομετρικό χωνί 100 ml (5.6) και γεμίζεται έως τη χαραγή με μεθανόλη (4.2.1). Εγχύεται με πιπέτα 1 ml (5.3) του διαλύματος αυτού σε ογκομετρικό χωνί 10 ml (5.6) και γεμίζεται, ως τη χαραγή με μεθανόλη (4.2.1) έτσι ώστε να επιτευχθεί συγκέντρωση 0,15 mΜ τρυπταμίνης.7.2. Προετοιμασία του υπό δοκιμασία διαλύματοςΖυγίζονται 1,000 +- 0,001 g δείγματος ΑΓΣ σε μεζούρα 25 ml (5.2). Προστίθενται 10 ml αποσταγμένου νερού σε 40 °C με πιπέτα (5.3) και αναδεύονται με μαγνητικό αναδευτήρα (5.4) για 30 λεπτά με σκοπό τη διάλυση οιωνδήποτε συσσωρευμάτων. Εγχύεται με πιπέτα 0,2 ml (5.5) του ανασυσταθέντος γάλακτος σε ογκομετρικό χωνί 10 ml (5.6), προστίθενται 100 μl του διαλύματος 0,15 mM τριπταμίνης (7.1) χρησιμοποιώντας σύρριγγα (5.7) και συμπληρώνεται ο όγκος με μεθανόλη (4.2.1). Αναμειγνύονται προσεκτικά με αναστροφή και υποβάλλοντάς τα σε υπερήχους (5.8) για 15 λεπτά. Διενεργείται φυγοκέντρηση (5.9) σε 27000 x g για 10 λεπτά και συγκεντρώνεται το υπερπλέον διάλυμα σε γυάλινη φιάλη (5.10).Σημείωση:Το διάλυμα του υπό δοκιμή δείγματος πρέπει να αποθηκεύεται σε 4 °C έως τη διενέργεια της ανάλυσης CLHP.7.3. Προετοιμασία του εξωτερικού προτύπου διαλύματοςΖυγίζονται 55,4 mg PEDP (4.1) σε ογκομετρικό χωνί 50 ml (5.6) και προστίθενται περίπου 25 ml χλωροφορμίου (4.2.2) χρησιμοποιώντας βαθμονομημένο κύλινδρο (5.11). Θερμαίνεται το πωματισμένο χωνί σε 50 °C και αναμειγνύεται προσεκτικά έως τη διάλυση των PEDP. Ψύχεται το χωνί σε 20 °C, συμπληρώνεται ο όγκος με μεθανόλη (4.2.1) και αναμειγνύεται με αναστροφή. Εγχύεται με πιπέτα 1 ml (5.3) του διαλύματος αυτού σε ογκομετρικό χωνί 100 ml (5.6) και συμπληρώνεται ο όγκος με μεθανόλη (4.2.1). Εγχύεται με πιπέτα 1 ml (5.3) του διαλύματος αυτού σε ογκομετρικό χωνί 10 ml (5.6), προστίθενται 100 μl (5.7) του διαλύματος τρυπταμίνης 0,15 mM (7.1) και συμπληρώνεται ο όγκος με μεθανόλη (4.2.1). Αναμειγνύεται με αναστροφή.Σημείωση:Το πρότυπο διάλυμα δείγματος πρέπει να αποθηκεύεται σε 4 °C μέχρι τη διενέργεια της ανάλυσης CLHP.7.4. Προετοιμασία του αντιδραστηρίου σχηματισμού παραγώγωνΖυγίζονται 25,0 +- 0,1 mg OPA (4.3.4) σε ογκομετρικό χωνί 10 ml (5.6), προστίθενται 0,5 ml (5.5) μεθανόλης (4.2.1) και αναμειγνύονται προσεκτικά για τη διάλυση της OPA. Συμπληρώνεται ως τη χαραγή με διάλυμα βορικού οξέος (4.3.2) και προστίθενται 20 μl 2-μερκαπτοαιθανόλης (4.3.3) με σύριγγα (5.7).Ν.Β.:Το αντιδραστήριο σχηματισμού παραγώγων πρέπει να αποθηκεύεται σε 4 °C σε σκοτεινή φιάλη και είναι σταθερό για μία εβδομάδα7.5. Προσδιορισμός CLHP7.5.1. Διαλύτες έκπλυσης (4.4)Διαλύτης Α:0,3 mM ορθοφωσφορικό μονονάτριο και 3 mM οξικό άλας (προσαρμοσμένα σε pH 6,5 με οξικό οξύ): μεθανόλη: τετραϋδροφουράνιο = 558: 440: 2.Διαλύτης Β:μεθανόλη7.5.2. Προτεινόμενη βαθμονόμηση της έκπλυσης:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Σημείωση:Η βαθμονόμηση της έκπλυσης είναι δυνατόν να απαιτεί ελαφρά τροποποίηση με σκοπό να επιτευχθεί το αποτέλεσμα που δεικνύεται στο σχήμα 1.Θερμοκρασία στήλης: 30 °C7.5.3. Όγκος έγχυσης: 50 μl του αντιδραστηρίου σχηματισμού παραγώγων και 50 μl του διαλύματος δείγματος7.5.4. Εξισορρόπηση στήληςΑρχίζοντας το σύστημα σε ημερήσια βάση, εκπλύεται η στήλη με 100 % διαλύτη Β για 15 λεπτά, στη συνέχεια τίθεται σε Α:Β = 40:60 και ισορροπεί σε 1 ml ανά λεπτό για 15 λεπτά. Πραγματοποιείται μία σειρά τυφλού διαλύματος με έγχυση μεθανόλης (4.2.1).Σημείωση:Πριν από μακράς διάρκειας αποθήκευση υποβάλετε σε έκπλυση τη στήλη με μεθανόλη: χλωροφόρμιο = 80: 20 (%) για 30 λεπτά.7.5.5. Προσδιορισμός της περιεκτικότητας PS και PE στο υπό δοκιμασία δείγμα7.5.6. Πραγματοποιήσατε τη σειρά των χρωματογραφικών αναλύσεων κρατώντας σταθερό από σειρά σε σειρά το χρόνο με σκοπό να λάβετε σταθερούς χρόνους κατακράτησης. Εγχύσατε το εξωτερικό πρότυπο διάλυμα (7.3) κάθε 5 έως 10 διαλύματα του υπό δοκιμασία δείγματος με σκοπό να εκτιμήσετε τον παράγοντα αντίδρασης.Ν.Β.:Η στήλη πρέπει να καθαρίζεται με έκπλυση με 100 % διαλύτη Β (7.5.1) για τουλάχιστον 30 λεπτά κάθε 20 έως 25 σειρές.7.6. Μέθοδος ολοκλήρωσης7.6.1. Κορυφή PEDPΤο PEDP εγχύεται σε μία απλή κορυφή. Προσδιορίστε την περιοχή της κορυφής από καμπύλη σε καμπύλη ολοκλήρωση.7.6.2. Κορυφή τρυπταμίνηςΗ τρυπταμίνη εγχύεται ως μονή κορυφή (σχήμα 1). Προσδιορίστε το εμβαδόν της κορυφής με από καμπύλη σε καμπύλη ολοκλήρωση.7.6.3. Ομάδες κορυφών PS και PEΥπό τις περιγραφόμενες συνθήκες (σχήμα 1), η PS εγχύεται ως δύο βασικές μερικώς άλυτες κορυφές των οποίων προηγείται μία ελάσσων κορυφή. Η PE εγχύεται ως τρεις βασικές μερικώς άλυτες κορυφές. Προσδιορίστε το συνολικό εμβαδόν κάθε συγκέντρωσης κορυφών θέτοντας τη γραμμή βάσης όπως αναφέρεται στο σχήμα 1.8. Υπολογισμός και έκφραση των αποτελεσμάτωνΗ περιεκτικότητα PS και PE στο υπό διαδικασία δείγμα πρέπει να υπολογίζονται ως εξής:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου:C= περιεκτικότητα PS ή PE (mg/100 g σκόνης στο υπό δοκιμασία δείγμα)Α1= εμβαδόν κορυφής PEDP του πρότυπου διαλύματος δείγματος (7.3)Α2= εμβαδόν κορυφής PS ή ΡΕ του διαλύματος του υπό δοκιμασία δείγματος (7.2)Τ1= εμβαδόν κορυφής τρυπταμίνης του πρότυπου διαλύματος δείγματος (7.3)Τ2= εμβαδόν κορυφής τρυπταμίνης του διαλύματος του υπό δοκιμασία δείγματος (7.2).9. ΔΙΕΥΚΡΙΝΗΣΗΣημείωση:Οι τιμές για την επαναληψιμότητα υπολογίστηκαν σύμφωνα με το IDF Διεθνές Πρότυπο(1). Το προσωρινό όριο αναπαραγωγιμότητας υπολογίστηκε σύμφωνα με το παράρτημα ΙΙΙ, σημείο β.9.1. ΕπαναληψιμότηταΗ σχετική πρότυπη απόκλιση της επαναληψιμότητας, η οποία εκφράζει την ποικιλότητα των διαφόρων αναλυτικών αποτελεσμάτων που προέκυψαν από τον ίδιο χειριστή που χρησιμοποιεί τα ίδια όργανα υπό τις ίδιες συνθήκες επί του ιδίου υπό δοκιμασία δείγματος και εντός σύντομου παρεμβαλλόμενου διαστήματος χρόνου, δεν πρέπει να υπερβαίνει το 2 %. Σε περίπτωση που δύο προσδιορισμοί προκύπτουν υπό αυτούς τους όρους, η σχετική διαφορά μεταξύ δύο αποτελεσμάτων δεν θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 6 % του αριθμητικού μέσου των αποτελεσμάτων.9.2. ΑναπαραγωγιμότηταΣε περίπτωση που δύο προσδιορισμοί προκύπτουν από δύο χειριστές σε διαφορετικά εργαστήρια χρησιμοποιώντας διαφορετικά όργανα υπό διαφορετικές συνθήκες για την ανάλυση του ιδίου υπό δοκιμασία δείγματος, η σχετική διαφορά μεταξύ των δύο αποτελεσμάτων δεν πρέπει να υπερβαίνει το 11 % του αριθμητικού μέσου των αποτελεσμάτων.10. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ10.1. Resmini (Ρ.), Pellegrino (L.), Hogenboom (J.A.), Sadini (V.), Rampilli (Μ.), "Détection des solides du babeurre danw le lait écrémé en poudre par dosage des aminophospholipides á la CLHP", Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39, 395 (1988).Σχήμα 1: Σχεδιάγραμμα ΥΧΥΑ των παραγωγών ΟΡΑ φωσφατιδυλσερίνης (PS) και φωσφατιδυλαιθανολαμίνης (PE) σε εκχύλισμα ανασυσταθείσας σκόνης αποκορυφωμένου γάλακτος. Αναφέρεται ο τρόπος ολοκλήρωσης για τις κορυφές PS, PE και τρυπταμίνης (εργαστηριακό πρότυπο).&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.007801.EPS"&gt;(1) International IDF-Standard 135B/1991. Milk and milk products. Precision characteristics of analytical methods. Outline of collaborative study procedure (περιγραφή συλλογικής διαδικασίας μελέτης).ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XXI(Άρθρο 15)ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΚΑΤΑΛΟΙΠΩΝ ΣΟΥΛΦΟΝΑΜΙΔΗΣ/DAPSON ΣΕ ΑΠΟΚΟΡΥΦΩΜΕΝΟ ΓΑΛΑ ΣΕ ΣΚΟΝΗΧρησιμοποιείται μία μικροβιακή ανασταλτική δοκιμή διαχωρισμού χρησιμοποιώντας Bacillus stearothemophilus var. calidolactis C953 ως μικρo-οργανισμό δοκιμής και η οποία είναι αρκετά ευαίσθητη για την ανίχνευση 4 μg βενζυλπενικιλλίνης ανά λίτρο γάλακτος και 100 μg σουλφαδιμιδίνης ανά λίτρο γάλακτος. Υπάρχουν εμπορικά kit δοκιμών και μπορούν να χρησιμοποιηθούν εφόσον έχουν την απαραίτητη ευαισθησία για βενζυλπενικιλλίνη και σουλφαδιμιδίνη(1).Για τη δοκιμή, χρησιμοποιείται ανασυσταθέν αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη (1 g σκόνη + 9 ml απεσταγμένο ύδωρ). Η δοκιμή διενεργείται όπως περιγράφεται στο IDF (Δελτίο αριθ. 258/1991, τομέας 1, κεφάλαιο 2), ή σύμφωνα με τις οδηγίες του παρασκευαστή του δοκιμαστικού kit.Τα θετικά αποτελέσματα ερμηνεύονται ως εξής:1. Επαναλάβατε τη δοκιμή προσθέτοντας πενικιλλινάση στο σύστημα δοκιμής:Θετικό αποτέλεσμα: ανασταλτική ουσία δεν μπορεί να ταυτοποιηθεί με αυτή τη διαδικασία.Αρνητικό αποτέλεσμα: ανασταλτική ουσία είναι αντιβιοτικό β-λακτάμη.2. Επαναλάβατε τη δοκιμή προσθέτοντας π-αμινοβενζοϊκό οξύ στο σύστημα δοκιμής:Θετικό αποτέλεσμα: ανασταλτική ουσία δεν μπορεί να ταυτοποιηθεί με τη διαδικασία αυτή.Αρνητικό αποτέλεσμα: ανασταλτική ουσία είναι σουλφοναμίδη/dapson.3. Επαναλάβατε τη δοκιμή προσθέτοντας πενικιλλινάση + π-αμινοβενζοϊκό οξύ στο σύστημα δοκιμής:Θετικό αποτέλεσμα: ανασταλτική ουσία δεν μπορεί να ταυτοποιηθεί με τη διαδικασία αυτή.Αρνητικό αποτέλεσμα: ανασταλτικές ουσίες είναι αντιβιοτικό β-λακτάμη και σουλφοναμίδη/dapson.(1) Σημαντική σημείωση:είναι δυνατόν να προκύψουν λανθασμένα θετικά αποτελέσματα, όταν αναλύεται αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να εξακριβώνεται ότι το σύστημα δοκιμής που χρησιμοποιείται δεν παράγει λανθασμένα θετικά αποτελέσματα.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XXII(Άρθρο 16)ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΟΣΟΤΗΤΟΣ ΤΟΥ ΑΠΟΚΟΡΥΦΩΜΕΝΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΣΕ ΣΚΟΝΗ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΕΤΑΙ ΣΤΙΣ ΣΥΝΘΕΤΕΣ ΖΩΟΤΡΟΦΕΣ ΜΕ ΕΝΖΥΜΑΤΙΚΗ ΠΗΞΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΤΥΡΙΝΗΣ (ΠΑΡΑΚΑΖΕΪΝΗΣ)1. ΑντικείμενοΠροσδιορισμός της ποσότητας του αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη που περιέχεται στις σύνθετες ζωοτροφές με ενζυματική θρόμβωση της παρακαζεΐνης.2. Πεδίο εφαρμογήςΗ μέθοδος αυτή εφαρμόζεται στις σύνθετες ζωοτροφές που περιέχουν τουλάχιστον 10 % αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη. Η παρουσία σημαντικών ποσοτήτων αποβουτυρωμένου γάλακτος (babeurre) ή/και ορισμένων μη γαλακτικών πρωτεϊνών δύναται να προκαλέσει αλλοίωση των αποτελεσμάτων.3. Αρχή της μεθόδου3.1. Διάλυση της τυρίνης που περιέχεται στη σύνθετη ζωοτροφή δι' εκχυλίσεως με διάλυμα κιτρικού νατρίου.3.2. Επαναφορά της συγκεντρώσεως ιόντων ασβεστίου που είναι αναγκαία για την καταβύθιση της παρακαζεΐνης. Μετατροπή, διά πυτίας, της τυρίνης σε παρακαζεΐνη.3.3. Προσδιορισμός του αζώτου της παρακαζεΐνης κατόπιν εξαλατώσεως κατά τη μέθοδο Kjeldahl, που αναφέρεται "στην προδιαγραφή IDF 20Α 1986"· υπολογισμός της ποσότητας του αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη βάσει της ελαχίστης περιεκτικότητας σε τυρίνη 27,5 % (βλέπε σημείο 9.1).4. ΑντιδραστήριαΤα χρησιμοποιούμενα αντιδραστήρια πρέπει να παρουσιάζουν τον απαιτούμενο βαθμό καθαρότητας για τους σκοπούς της αναλύσεως. Το χρησιμοποιούμενο νερό πρέπει να είναι απεσταγμένο ή να παρουσιάζει ανάλογο βαθμό καθαρότητας. Εξαιρέσει της πυτίας (σημείο 4.5), όλα τα χρησιμοποιούμενα αντιδραστήρια και τα διαλύματα πρέπει να είναι απαλλαγμένα αζωτούχων ουσιών.4.1. Δίυδρο κιτρικό τρινάτριο (διάλυμα 1 % p/v).4.2. Αντικαταστείστε από χλωριούχο ασβέστιο (διάλυμα 2Μ). Βάρος 20,018 g ανθρακικού ασβεστίου (CaC03) (αναλυτικού βαθμού) σε κάψα πορσελάνης κατάλληλου μεγέθους (150-200 ml) ή σε ποτήρι ζέσεως. Συμπληρώστε με αποσταγμένο νερό και μεταφέρετε σε ζέον υδατόλουτρο. Προσθέστε 50-60 ml διαλύματος HCl (πυκνό HCl: νερό = 1:1) μέχρι να διαλυθεί πλήρως το ανθρακικό. Διατηρείστε σε ζέον υδατόλουτρο μέχρι ξηρού το CaCl2 και μέχρι τελείας αποβολής του υδροχλωρίου (HCl) που δεν έχει αντιδράσει. Μεταφέρετε με αποσταγμένο νερό σε ογκομετρική φιάλη 100 ml και αραιώνετε μέχρι τη χαραγή. Ελέγχετε την τιμή pΗ η οποία δεν πρέπει να είναι κατώτερη από 4,0. Διατηρείστε το διάλυμα σε ψυγείο.4.3. Υδροξείδιο του νατρίου 0,1 Ν.4.4. Χλωρικό οξύ 0,1 Ν.4.5. 1: 10000 πρότυπο διάλυμα πυτίας (εκχύλισμα τετάρτου στομάχου μόσχων), διατηρούμενο εντός ψυγείου στους 4-6 °C.4.6. Αντιδραστήρια για τον προσδιορισμό του αζώτου κατά τη μέθοδο Kjeldahl που αναφέρεται στην προδιαγραφή IDF 20Α 1986.5. ΌργαναΣυνήθη όργανα εργαστηρίου. Ειδικότερα τα εξής:5.1. Ιγδίο ή μύλος ομογενοποιήσεως.5.2. Ζυγός αναλύσεως.5.3. Επιτραπέζιος συσκευή φυγοκεντρήσεως (2000-3000 στροφές/λεπτό) εφοδιασμένες με σωλήνες φυγοκεντρήσεως των 50 ml.5.4. Μαγνητικός αναδευτήρας με ράβδους των 10-15 mm.5.5. Ποτήρια ζέσεως των 150-200 ml.5.6. Φιάλες αποστάξεως 250 ml και 500 ml.5.7. Γυάλινες χοάνες διαμέτρου 60 έως 80 mm.5.8. Ηθμοί ταχείας διηθήσεως κυκλικής διανομής απαλλαγμένοι τέφρας, διαμέτρου 150 mm (S.S.5892 S.S. 595 1/2).5.9. Σιφώνια διαφόρων μεγεθών.5.10. Υδρόλουτρο με θερμοστατική ρύθμιση στους 37 °C.5.11. Συσκευή μετρήσεως pΗ.5.12. Συσκευή εξαλατώσεως και αποστάξεως για τη μέθοδο Kjeldahl με τα αντίστοιχα εξαρτήματα.5.13. Βαθμολογημένη προχοΐδα των 25 ml για τιτλοδότηση.5.14. Πλαστική φιάλη για το απεσταγμένο νερό.5.15. Σπάτουλα αναδεύσεως από ανοξείδωτο χάλυβα.5.16. Θερμόμετρο.5.17. Πυριατήριο με θερμοστατική ρύθμιση της θερμοκρασίας.6. Τρόπος εργασίας6.1. Προετοιμασία του δείγματος.10-20 g του δείγματος συνθλίβονται σε ιγδίο ή σε συσκευή ομογενοποιήσεως, ώστε να ληφθεί ομογενές μείγμα.6.2. Η σκόνη γάλακτος διαλύεται και διαχωρίζεται το αδιάλυτο υπόλειμμα.6.2.1. Ζυγίζονται 1,000 +- 0,002 g της ομογενοποιημένης συνθέτου ζωοτροφής (σημείο 6.1) απευθείας σε φυγοκεντρικό σωλήνα των 50 ml. Προστίθενται 30 ml διαλύματος κιτρικού τρινατρίου (σημείο 4.1), κατόπιν προθερμάνσεως στους 45 °C. Η σκόνη διαλύεται δι' αναδεύσεως επί 5 λεπτά με τον μαγνητικό αναδευτήρα.6.2.2. Το διάλυμα φυγοκεντρείται επί 10 λεπτά στα 500 g (2000-3000 στροφές/λεπτό) και η υπερκείμενη υδατική στοιβάδα μεταγγίζεται σε ποτήριο ζέσεως των 150-200 ml. Λαμβάνεται μέριμνα ώστε να αποφευχθεί η απώλεια των αδιαλύτων μερών κατά τη μετάγγιση.6.2.3. Κατά τον αυτόν τρόπο λαμβάνονται δύο ακόμη εκχυλίσματα του υπολείμματος. Τα τρία ληφθέντα εκχυλίσματα αναμειγνύονται.6.2.4. Στην περίπτωση αποχωρισμού του λίπους το εκχύλισμα ψύχεται μέχρι στερεοποιήσεως της λιπαρής φάσεως, η οποία ακολούθως αφαιρείται με τη βοήθεια σπάτουλας.6.3. Προκαλείται πήξη της τυρίνης με τη βοήθεια των ενζύμων της πυτίας.6.3.1. Στο αναδευόμενο ολικό υδατικό εκχύλισμα (περίπου 100 ml) προστίθεται υπό μορφή σταγόνων 3,4 ml κορεσμένου διαλύματος χλωριούχου ασβεστίου (σημείο 4.2). Το pΗ ρυθμίζεται στην τιμή 6,4-6,5 με τη βοήθεια αραιού διαλύματος ΝaOH (σημείο 4.3) ή HCI (σημείο 4.4). Το εκχύλισμα εισάγεται σε υδρόλουτρο με θερμοστατική ρύθμιση της θερμοκρασίας στους 37 °C, επί 15 ως 20 λεπτά, μέχρι αποκαταστάσεως της ισορροπίας του άλατος. Αυτό διαπιστώνεται από τη γαλακτώδη όψη που αποκτά το εκχύλισμα.6.3.2. Μεταφέρετε το υγρό σε ένα (ή δύο) φυγοκεντρικούς σωλήνες και φυγοκεντρείτε σε 2000 g για 10 λεπτά για να απομακρυνθεί το ίζημα. Μεταφέρετε το υπερκείμενο υγρό δίχως να αποπλυθεί το ίζημα σε ένα (ή δύο) φυγοκεντρικούς σωλήνες.6.3.3. Επαναφέρατε τη θερμοκρασία του υπερκείμενου υγρού σε 37 °C. Αναδεύοντας το εκχύλισμα, προσθέστε, στάγδην, 0,5 ml του ενζυματικού υγρού (πυτιά) (σημείο 4.5). Η πήξη επιτυγχάνεται σε ένα ή δύο λεπτά.6.3.4. Επαναφέρατε το δείγμα στο υδατόλουτρο και το αφήνετε σε θερμοκρασία 37 °C για 15 λεπτά. Αφαιρείτε το δείγμα από το υδατόλουτρο και διασπάτε το πήγμα με ανάδευση. Φυγοκεντρείτε σε 2000 g για 10 λεπτά. Διηθείτε το υπερκείμενο υγρό με κατάλληλο διηθητικό χαρτί(1), whatman αριθ. 541 ή παρόμοιο και φυλάσσετε το διηθητικό χαρτί. Πλένετε το ίζημα σε φυγοκεντρικό σωλήνα με νερό 50 ml σε 35 °C περίπου, αναδεύοντας το ίζημα.Φυγοκεντρείτε πάλι σε 2000 g για 10 λεπτά. Διηθείτε το υπερκείμενο υγρό με το διηθητικό χαρτί που φυλάξατε προηγουμένως.6.4. Προσδιορισμοί των αζώτων της τυρίνης.6.4.1. Μετά από την πλήρη διήθηση, ο ηθμός εισάγεται στη φιάλη Kjeldahl και προσδιορίζεται το άζωτο κατά τη μέθοδο Kjeldahl, που αναφέρεται στην προδιαγραφή IDF 20Α 1986.7. Τυφλό πείραμα7.1. Διεξάγεται τυφλό πείραμα κατά τρόπο συστηματικό με τη βοήθεια ηθμού απαλλαγμένου τέφρας (σημείο 5.8), εμποτισμένου σε μείγμα 90 ml διαλύματος κιτρικού νατρίου (σημείο 4.1), 1 ml κορεσμένου διαλύματος χλωριούχου ασβεστίου (σημείο 4.2), 0,5 ml υγρής πυτίας (σημείο 4.5) και εκτελουμένου με 3 x 15 ml νερού πριν από την εξαλάτωση κατά τη μέθοδο Kjeldahl, που αναφέρεται στην προδιαγραφή IDF 20Α 1986.7.2. Ο όγκος του οξέος (σημείο 4.4) που απαιτείται για τη διεξαγωγή του τυφλού πειράματος αφαιρείται από τον όγκο του οξέος, που χρησιμοποιήθηκε για την τιτλοδότηση του προτύπου δείγματος.8. Δοκιμή ελέγχου8.1. Για τον έλεγχο της αναλυτικής μεθόδου και των αναφερθέντων αντιδραστηρίων, διενεργείται ο προσδιορισμός μιας προτύπου ζωοτροφής, της οποίας η γνωστή περιεκτικότητα σε αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη έχει προσδιορισθεί με τη βοήθεια κυκλικής αναλύσεως. Η μέση τιμή που προκύπτει από τον διπλό προσδιορισμό, δεν πρέπει να αποκλίνει περισσότερο από 1 % από την τιμή που προκύπτει από την κυκλική ανάλυση.9. Παρουσίαση των αποτελεσμάτων9.1. Η περιεκτικότητα επί τοις εκατό της σύνθεσης ζωοτροφής σε αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη υπολογίζεται με τον ακόλουθο τύπο:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου Ν είναι το ποσοστό του αζώτου της παρακαζεΐνης, 27,5 ο συντελεστής μετατροπής της καζεΐνης σε ποσοστό επί τοις εκατό του αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη, 2,81 και 0,908 είναι οι συντελεστές διόρθωσης που λαμβάνονται από την καμπύλη παλινδρόμησης.10. Ακρίβεια της μεθόδου10.1. ΕπαναληψιμότηταΣε 95 % τουλάχιστον των εξεταζομένων περιπτώσεων, η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων, που λαμβάνονται από την ανάλυση του ιδίου δείγματος, στο ίδιο εργαστήριο και από τον ίδιο ερευνητή, δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 2,3 g αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη ανά 100 g της εξεταζομένης συνθέτου ζωοτροφής.10.2. ΑναπαραγωγιμότηταΣε 95 % τουλάχιστον των εξεταζομένων περιπτώσεων, η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων, που λαμβάνονται από την ανάλυση ενός παρομοίου δείγματος σε δύο διαφορετικά εργαστήρια, δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 6,5 g αποκορυφωμένου γάλακτος σε σκόνη ανά 100 g εξεταζομένης συνθέτου ζωοτροφής.11. Όριο ανοχήςΗ τιμή CrD95 (κρίσιμη διαφορά· όριο αξιοπιστίας 95 %) υπολογίζεται με τη χρησιμοποίηση του τύπου (ISO 5725):&gt;ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ&gt;(R: αναπαραγωγιμότητα r: επαναληπτικότητα)Διπλός προσδιορισμός: CrD95 = 4,5 gΌταν το αποτέλεσμα της χημικής ανάλυσης διαφέρει από τη δηλωθείσα περιεκτικότητα σε αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη όχι περισσότερο από 4,5 g (διπλός προσδιορισμός), η αποστολή των σύνθετων ζωοτροφών θεωρείται ότι είναι σύμφωνη με αυτήν τη διάταξη του κανονισμού.12. Παρατηρήσεις12.1. Η πρόσθεση σημαντικών ποσοτήτων ορισμένων μη γαλακτικών πρωτεϊνών, ιδίως των προερχομένων από σόγια, όταν έχουν θερμανθεί μαζί με το αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη, οδηγεί σε πολύ μεγαλύτερες τιμές, λόγω της συγκαθιζήσεως των πρωτεϊνών αυτών με την παρακαζεϊνη του γάλακτος.12.2. Η πρόσθεση αποβουτυρωμένου γάλακτος δύναται ενδεχομένως να οδηγήσει σε πολύ χαμηλές τιμές, επειδή ο προσδιορισμός πραγματοποιείται επί του εκχυλίσματος που είναι απαλλαγμένο λίπους. Η πρόσθεση ορισμένων ειδών αποβουτυρωμένου γάλακτος λαμβανομένων από όξινη κρέμα δύναται να οδηγήσει σε αισθητά χαμηλότερες τιμές, επειδή δεν είναι πλήρως διαλυτά στο κιτρικό διάλυμα.12.3. Η πρόσθεση 0,5 % τουλάχιστον λικιθίνης δύναται επίσης να οδηγήσει σε μικρότερες τιμές.12.4. Η ενσωμάτωση σκόνης γάλακτος που έχει θερμανθεί σε υψηλή θερμοκρασία (high-heat) δύναται να οδηγήσει σε τιμές πολύ υψηλές, λόγω της συγκαθιζήσεως ορισμένων πρωτεϊνών του ορού του γάλακτος με την παρακαζεϊνη του γάλακτος.(1) Πρέπει να χρησιμοποιείται σταθμικό χαρτί ταχείας διήθησης.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XXIII(Άρθρο 17)ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΜΥΛΟΥ ΣΤΟ ΑΠΟΒΟΥΤΥΡΩΜΕΝΟ ΓΑΛΑ ΣΕ ΣΚΟΝΗ, ΜΕΤΟΥΣΙΩΜΕΝΟ ΓΑΛΑ ΣΕ ΣΚΟΝΗ ΚΑΙ ΣΥΝΘΕΤΕΣ ΖΩΟΤΡΟΦΕΣ1. Πεδίο εφαρμογήςΗ μέθοδος αυτή αποσκοπεί στην ανίχνευση του αμύλου που χρησιμοποιείται ως ιχνηθέτης σε μετουσιωμένο γάλα σε σκόνη.Το κατώτερο όριο ανίχνευσης της μεθόδου είναι περίπου 0,05 g αμύλου ανά 100 g δείγματος.2. ΣτοιχείαΗ αντίδραση βασίζεται στην αντίδραση που χρησιμοποιείται στην ιωδιομετρία:- δέσμευση από τα κολλοειδή σωματίδια ιωδίου σε υδατικό διάλυμα,- απορρόφηση από τα κολλοειδή συσσωματώματα αμύλου και με χρωματισμό.3. Αντιδραστήρια3.1. Διάλυμα ιωδίου- ιώδιο: 1 g,- ιωδιούχο νάτριο: 2 g,- απεσταγμένο ύδωρ: 100 ml.4. Όργανα4.1. Αναλυτικός ζυγός4.2. Λουτρό ύδατος4.3. Δοκιμαστικοί σωλήνες, 25 mm x 200 mm5. ΔιαδικασίαΖυγίζουμε 1 g του δείγματος και το μεταφέρουμε στο δοκιμαστικό σωλήνα (σημείο 4.3).Προσθέτουμε 20 ml απεσταγμένου ύδατος και ανακινούμε προκειμένου να διασπαρεί το δείγμα.Το τοποθετούμe στο λουτρό ύδατος που βράζει (σημείο 4.2) και το αφήνουμε 5 λεπτά της ώρας.Το βγάζουμε από το λουτρό και το ψύχουμε σε θερμοκρασία δωματίου.Προσθέτουμε 0,5 ml διαλύματος ιωδίου (σημείο 3.1), ανακινούμε και παρατηρούμε το χρώμα που εμφανίζεται.6. Διατύπωση των αποτελεσμάτωνΟ κυανούς χρωματισμός δείχνει την παρουσία φυσικού αμύλου στο δείγμα.Όταν το δείγμα περιέχει τροποποιημένο άμυλο τότε το χρώμα μπορεί να μην είναι κυανούν.7. ΠαρατηρήσειςΤο χρώμα, η ένταση του χρώματος και η μικροσκοπική εμφάνιση του αμύλου θα ποικίλλουν ανάλογα με την προέλευση του φυσικού αμύλου (π.χ. αραβόσιτος ή γεώμηλα) και το είδος του τροποποιημένου αμύλου που περιέχεται στο δείγμα.Παρουσία τροποποιημένων αμύλων το παραγόμενο χρώμα γίνεται ιώδες, ερυθρό ή φαιό, ανάλογα με το βαθμό τροποποίησης της κρυσταλλικής δομής του φυσικού αμύλου.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XXIV(Άρθρο 18)ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΥΓΡΑΣΙΑΣ ΣΤΟ ΟΞΙΝΟ ΒΟΥΤΥΡΟΓΑΛΑ ΣΕ ΣΚΟΝΗ1. ΘέμαΟ προσδιορισμός της υγρασίας του όξινου βουτυρογάλακτος σε σκόνη που προορίζεται για τη διατροφή των ζώων.2. Γενική αρχήΤο δείγμα υφίσταται ξήρανση εν κενώ. Η απώλεια βάρους προσδιορίζεται με ζύγιση.3. Συσκευές3.1. Αναλυτικός ζυγός.3.2. Στεγνά μεταλλικά δοχεία που αντέχουν στην οξείδωση ή δοχεία από γυαλί με πώματα που κλείνουν ερμητικά· χρήσιμη επιφάνεια που επιτρέπει την κατανομή του δείγματος σε 0,3 g/cm2.3.3. Ρυθμιζόμενος ηλεκτρικός κλίβανος κενού με ελαιοαντλία και με μηχανισμό εισαγωγής ξηρού και ζεστού αέρα ή αφυδατικού μέσου (για παράδειγμα: οξείδιο του ασβεστίου).3.4. Ξηραντήρας που περιέχει δραστικό αφυδατικό μέσο.3.5. Ξηραντήρας με αερισμό ελεγχόμενης θερμοκρασίας, με ρύθμιση θερμοκρασίας σε 102 +- 2 °C.4. ΔιαδικασίαΘερμαίνεται δοχείο (σημείο 3.2) με το πώμα του στον ξηραντήρα (σημείο 3.5) επί μία ώρα τουλάχιστον. Τοποθετείται το πώμα στο δοχείο, μεταφέρεται αμέσως το δοχείο σε ξηραντήρα (σημείο 3.4), αφήνεται να κρυώσει έως τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος και ζυγίζει με προσέγγιση 0,5 mg.Ζυγίζεται, με προσέγγιση 0,5 mg, δοχείο (σημείο 3.2) με το πώμα του. Ζυγίζεται, με προσέγγιση 1 mg, στο δοχείο που έχει ζυγιστεί, που έχει περίπου 5 g του δείγματος και κατανέμεται ενιαία. Τοποθετείται το δοχείο χωρίς το πώμα του στον κλίβανο κενού (σημείο 3.3) ο οποίος έχει θερμανθεί προηγουμένως σε 83 °C. Για να μην κατεβεί πολύ η θερμοκρασία του κλιβάνου πρέπει να εισαχθεί το δοχείο το συντομότερο δυνατό.Δημιουργείται πίεση 100 Torr (13,3 kPa) και αφήνεται να ξηρανθεί στην πίεση αυτή επί τέσσερις ώρες, είτε με ρεύμα ζεστού και ξηρού αέρος, είτε με την βοήθεια αφυδατικού μέσου (περίπου 300 g για 20 δείγματα). Στην τελευταία αυτή περίπτωση, σταματάει η σύνδεση με την αντλία κενού όταν επιτευχθεί η προαναφερόμενη πίεση. Υπολογίζεται η διάρκεια της ξήρανσης από τη στιγμή που η θερμοκρασία του κλιβάνου φθάσει τους 83 °C. Επαναφέρουμε στη συνέχεια με προσοχή τον κλίβανο στην ατμοσφαιρική πίεση. Ανοίγεται ο κλίβανος, τοποθετείται αμέσως το πώμα στο δοχείο, αποσύρεται το δοχείο από τον κλίβανο, αφήνεται να κρυώσει επί 30 έως 45 λεπτά στον ξηραντήρα (σημείο 3.4) και ζυγίζεται με προσέγγιση 1 mg. Υποβάλλεται σε συμπληρωματική ξήρανση 30 λεπτών στον κλίβανο κενού (σημείο 3.3), σε θερμοκρασία 83 °C και ζυγίζεται εκ νέου. Η διαφορά μεταξύ των δύο ζυγισμάτων δεν πρέπει να υπερβαίνει το 0,1 % υγρασίας.5. Τρόπος υπολογισμού>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>όπου:Ε= αρχική μάζα, σε γραμμάρια του δείγματος,m= μάζα, σε γραμμάρια, του ξηρού δείγματος.6. Ακρίβεια6.1. Όριο επαναληπτικότηταςΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων των δύο προσδιορισμών που πραγματοποιήθηκαν αμέσως μετά ο ένας από τον άλλο, από αναλυτή που χρησιμοποιεί τις ίδιες συσκεύες σε παρόμοιο υλικό δοκιμής, δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 0,4 g νερού ανά 100 g όξινου βουτυρογάλακτος σε σκόνη.6.2. Όριο αναπαραγωγιμότηταςΗ διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που πραγματοποιούνται από αναλυτές σε διαφορετικά εργαστήρια, οι οποίοι χρησιμοποιούν διαφορετικές συσκευές σε παρόμοιο υλικό δοκιμής, δεν πρέπει να υπερβαίνει 0,6 g νερού ανά 100 g όξινου βουτυρογάλακτος σε σκόνη.6.3. Πηγή των δεδομένων ακριβείαςΤα δεδομένα ακριβείας προσδιορίζονται από πείραμα που πραγματοποιήθηκε το 1995 σε οκτώ εργαστήρια και αφορούσε δώδεκα δείγματα (έξι σε διπλό τυφλό προσδιορισμό).ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XXV(Άρθρο 19)ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΞΕΝΩΝ ΛΙΠΩΝ ΣΕ ΛΙΠΟΣ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΜΕ ΑΕΡΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΡΙΓΛΥΚΕΡΙΔΙΩΝ1. Εύρος και πεδίο εφαρμογήςΤο πρότυπο αυτό θεσπίζει μέθοδο για την ανίχνευση ξένων λιπών, τόσο φυτικών όσο και ζωικών όπως το βόειο λίπος και το χοίρειο λίπος, σε λίπος γάλακτος και γαλακτοκομικά προϊόντα χρησιμοποιώντας αέρια χρωματογραφική ανάλυση τριγλυκεριδίων.Χρησιμοποιώντας καθορισμένους τύπους τριγλυκεριδίων, τα φυτικά και ζωικά λίπη ανιχνεύονται ποιοτικώς και ποσοτικώς σε καθαρό λίπος γάλακτος άσχετα με τις συνθήκες διατροφής ή γαλουχίας.Σημείωση 1:Αν και το βουτυρικό οξύ (C4) που συναντάται αποκλειστικά στο λίπος του γάλακτος παρέχει τη δυνατότητα πραγματοποίησης ποσοτικών εκτιμήσεων μικρών έως μέσων ποσοτήτων λίπους γάλακτος σε φυτικά λίπη, πολύ δύσκολα μπορούν να ληφθούν ποιοτικές και ποσοτικές πληροφορίες σε περιπτώσεις προσθήκης μέχρι τουλάχιστον 20 % (κ.β.) ξένου λίπους σε καθαρό λίπος γάλακτος λόγω της μεγάλης διακύμανσης στην περιεκτικότητα του λίπους γάλακτος σε C4 που κυμαίνεται περίπου από 3,5 έως 4,5 % (κ.β.).Σημείωση 2:Ποσοτικά αποτελέσματα μπορούν στην πράξη να ληφθούν μόνον σε αναλύσεις τριγλυκεριδίων, διότι η περιεκτικότητα των φυτικών λιπών σε στερόλες είναι διαφορετική εξαρτώμενη από τις συνθήκες παραγωγής και κατεργασίας.2. ΣημείωσηΞένα λίπη σε λίπος γάλακτος: τα ξένα λίπη όπως ορίζονται στο πρότυπο αυτό είναι όλα τα φυτικά και ζωικά λίπη εκτός από το λίπος του γάλακτος.3. Αρχή της μεθόδουΜετά από εκχύλιση του λίπους γάλακτος παρασκευάζεται ένα προς ανάλυση διάλυμα. Από το διάλυμα αυτό, τα τριγλυκερίδια (ολικού αριθμού ατόμων άνθρακα) προσδιορίζονται αεριοχρωματογραφικώς σε (συμβατικές) στήλες. Εισάγοντας το % βάρος των διαφόρων μεγεθών μορίων λίπους (C24 - C54 - μόνον ζυγοί αριθμοί) στον τριγλυκεριδικό τύπο, προσδιορίζονται ποσοτικώς ή ανιχνεύονται ποιοτικώς τα ξένα λίπη.Σημείωση:Τηρώντας την αξιολόγηση που περιγράφεται στο παρόν, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και τριχοειδής αέρια χρωματογραφία, εάν διασφαλίζεται ότι επιτυγχάνονται συγκρίσιμα αποτελέσματα(1).4. ΑντιδραστήριαΠρέπει να χρησιμοποιούνται αντιδραστήρια αναλυτικής καθαρότητας.4.1. Φέρον αέριο: άζωτο, βαθμός καθαρότητας [gE      ] 99,996 %.4.2. Πρότυπα τριγλυκερίδια(2), κορεσμένα, όπως επίσης και χοληστερόλη για την τυποποίηση προτύπου λίπους γάλακτος σύμφωνα με το 6.5.4.4.3. Μεθανόλη, απηλλαγμένη νερού.4.4. n-Εξάνιο.4.5. n-Επτάνιο.4.6. Τολουόλιο.4.7. Διάλυμα διμεθυλοχωροσιλανίου: 50 ml διμεθυλοχωροσιλανίου διαλύονται σε 283 ml τολουολίου.4.8. Αέριο καύσεως: υδρογόνο και συνθετικός αέρας.4.9. Στατική φάση, 3 % OV-Ι GasChromQ(3) 125/150 μm (100/120 mesh).4.10. Διάλυμα βουτύρου κακάο 10 %.5. ΌργαναΣυνήθεις εργαστηριακές συσκευές και ιδιαίτερα τα ακόλουθα:5.1. Αέριος χρωματογράφος υψηλών θερμοκρασιών κατάλληλος για θερμοκρασίες τουλάχιστον 400-450 °C, εφοδιασμένος με ανιχνευτή ιονισμού φλόγας (FID) και διάταξη ελέγχου ροής σταθερής μάζας για το φέρον αέριο. Αέριο καύσεως: 30 ml/min H2, 270 ml/min συνθετικός αέρας.Λόγω του υψηλού βαθμού ροής του φέροντος αερίου, το ακροφύσιο πρέπει να είναι ιδιαίτερα ευρύ.Σημείωση:Λόγω των υψηλών θερμοκρασιών που παρατηρούνται κατά την ανάλυση των τριγλυκεριδίων, τα γυάλινα μέρη στο FID ή στο σύστημα εγχύσεως πρέπει να καθαρίζονται συχνά.Ο αέριος χρωματογράφος πρέπει να είναι εφοδιασμένος με διαφράγματα (septa) ανθεκτικά στις υψηλές θερμοκρασίες, που μπορεί να χρησιμοποιούνται συχνά και που εμφανίζουν πολύ χαμηλό βαθμό "διαρροής".Σημείωση:Κατάλληλα είναι τα διαφράγματα Chromblue TM (Chrompack).Τα διαφράγματα πρέπει να αλλάζονται σε τακτικά διαστήματα, π.χ. μετά από 100 περίπου ενέσεις ή ευθύς ως αρχίσει να φθίνει η αναλυτική ικανότητα (βλέπε εικόνα 4).5.2. Χρωματογραφική στήληΥάλινη στήλη σχήματος U (εσωτερική διάμετρος 2 mm, μήκος 50 cm), η οποία καταρχήν υποβάλλεται σε κατεργασία με σιλάνιο (σιλάνωση) σύμφωνα με το 6.1 διμεθυλοχλωροσιλάνιο για την απενεργοποίηση της υάλινης επιφάνειας.Σημείωση:Κατάλληλες είναι επίσης και κάπως μεγαλύτερου μήκους (800-2000 mm) συμβατικές στήλες. Με αυτές, μπορεί να επιτευχθεί μία ελαφρώς καλύτερη αναπαραγωγιμότητα των αποτελεσμάτων. Από την άλλη μεριά, στατική φάση εμφανίζει περιοδικώς σπασίματα μετά τη λειτουργία, τα οποία μπορούν να οδηγήσουν, με τη σειρά τους, σε επιδείνωση των ποσοτικών αποτελεσμάτων. Περαιτέρω, η φλόγα του FID σβήνει εύκολα λόγω της απαιτούμενης εξαιρετικά υψηλής ροής φέροντος αερίου από 75-85 ml/min.5.3. Διάταξη για την πλήρωση της στήλης (βλέπε εικόνα 1).Εικόνα 1Πλήρωση της στήλης&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.008701.EPS"&gt;5.3.1. Πλαστική στήλη με βιδωτά στα άκρα πώματα, φέρουσα χαραγή μέχρι την οποία μπορεί να φθάσει η απαιτούμενη ποσότητα στατικής φάσης.5.3.2. Λεπτό πλέγμα (mesh περίπου 100 μm) με βιδωτό πώμα, κατάλληλο για την σφράγιση της υάλινης στήλης σύμφωνα με την εικόνα 1.5.3.3. Απενεργοποιημένος, επεξεργασμένος με σιλάνιο υαλοβάμβακας.5.3.4. Δονητής για την ομοιόμορφη κατανομή της στατικής φάσης κατά την πλήρωση.5.4. Στήλη Extrelut(4) 1-3 ml με silica gel. Η στήλη αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί εναλλακτικώς για την εκχύλιση λήψη λίπους γάλακτος.5.5. Σφράγιση από γραφίτη 6,4 mm (1/4") με οπή 6 mm.5.6. Διατάξεις για τη επεξεργασία με σιλάνιο της υάλινης επιφάνειας της στήλης σύμφωνα με το 6.1.5.6.1. Φιάλη Woulff.5.6.2. Αντλία αναρρόφησης νερού.5.7. Υδρόλουτρο, δυνάμενο να ρυθμίζεται στους 50 (+- 2) °C.5.8. Θάλαμος ξηράνσεως, δυνάμενος να ρυθμίζεται στους 50 (+- 2) °C και 100 (+- 2) °C.5.9. Μικρομετρικό σιφώνιο.5.10. Βαθμονομημένο σιφώνιο των 5 ml για την δοσομετρική παροχή 1,5 ml μεθανόλης.5.11. Φιάλη των 50 ml με στρογγυλό πυθμένα.5.12. Φιάλη Erlenmeyer, ονομαστικού όγκου 50 ml.5.13. Χοάνη.5.14. Λεπτόπορο φίλτρο.5.15. Περιστροφικός εξατμιστήρας.5.16. Φύσιγγες, ονομαστικού όγκου 1 ml, που σφραγίζονται με πώμα αλουμινίου, με διάφραγμα στο εσωτερικό τους.5.17. Σύριγγα εγχύσεως, το έμβολο της χρησιμοποιούμενης σύριγγας δεν πρέπει να φθάνει στο άκρο της βελόνας.Σημείωση:Με τις σύριγγες αυτές επιτυγχάνεται καλύτερη αναπαραγωγιμότητα των αποτελεσμάτων.Για την αποφυγή φθοράς του διαφράγματος, η άκρη της βελόνας θα πρέπει να ελέγχεται σε τακτά χρονικά διαστήματα (παραδείγματος χάρη, με ένα στερεομικροσκόπιο).6. Διαδικασία6.1. Προετοιμασία της στήλης (κατεργασία με σιλάνιο):Μετά τη σύνδεση της φιάλης Woulff, όπως φαίνεται στην εικόνα 2, με την αντλία αναρρόφησης νερού ο σωλήνας 2 βυθίζεται στο διάλυμα που αναφέρεται στο 4.7. Κλείνοντας την στρόφιγγα, η στήλη πληρούται. Ακολούθως οι δύο σωλήνες απομακρύνονται.Εικόνα 2Διάταξη για σιλάνωση&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.008801.EPS"&gt;Η στήλη στερεώνεται σε ένα υποστήριγμα και γεμίζεται τελείως με το διάλυμα διμεθυλοδιχλωροσιλανίου με τη βοήθεια σιφωνίου.Μετά 20-30 min η φιάλη Woulff αντικαθίσταται από μία κωνική φιάλη διηθήσεως και η στήλη αδειάζεται συνδέοντάς την με την αντλία αναρροφήσεως νερού (βλέπε εικόνα 3).6.2. Πλήρωση της στήλης:Στη συνέχεια γίνονται διαδοχικές χρησιμοποιώντας 75 ml τολουόλιο και 50 ml μαθανόλη. Κατόπιν η άδεια στήλη ξηραίνεται στο θάλαμο ξηράνσεως στους 100 °C για 30 min περίπου.Εικόνα 3Διάταξη για έκπλυση&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.008901.EPS"&gt;Για την πλήρωση της στήλης χρησιμοποιείται η διάταξη που εικονίζεται στην εικόνα 1. Η στατική φάση όπως περιγράφεται στο 4.9 εισάγεται στην πλαστική στήλη μέχρι τη χαραγή.Το κάτω άκρο της προς πλήρωση υάλινης στήλης σφραγίζεται με βύσμα από υαλοβάμβακα μήκους περίπου 1 cm, το οποίο έχει προηγουμένως υποβληθεί σε σιλάνωση και το οποίο ωθείται χρησιμοποιώντας μία χαλύβδινη ράβδο. Κατόπιν το άκρο της στήλης κλείεται με το πλέγμα που αναφέρεται στο 5.3.2.Η στήλη πληρούται υπό πίεση (3 bar, με N2) με στατική φάση. Για να επιτευχθεί ομοιόμορφο, συνεχές και στερεό γέμισμα, ένας δονητής κινείται πάνω-κάτω της υάλινης στήλης κατά την πλήρωση. Μετά την πλήρωση, στερεό βύσμα από υποστάντα κατεργασία με σιλάνιο υαλοβάμβακα ωθείται στο άλλο άκρο της γεμάτης στήλης, τα προεξέχοντα άκρα αποκόπτονται και το βύσμα ωθείται μέσα στη στήλη για λίγα χιλιοστόμετρα με μία σπάτουλα.6.3. Παρασκευή των δειγμάτων:Για την παρασκευή των δειγμάτων χρησιμοποιείται μία από τις ακόλουθες τρεις μεθόδους:6.3.1. Απομόνωση του λίπους γάλακτος από βούτυρο.5 έως 10 g βουτύρου τήκονται σε κατάλληλο δοχείο μέσα σε υδρόλουτρο σύμφωνο με το 5.7 στους 50 °C.Φιάλη Erlenmeyer 50 ml και χοάνη με εισηγμένο φίλτρο σύμφωνο με το 5.14 θερμαίνονται στο θάλαμο ξηράνσεως στους 50 °C. Η στιβάδα λίπους του τηγμένου δείγματος βουτύρου διηθείται χρησιμοποιώντας την προθερμασμένη διάταξη.Ένα τέτοιο λίπος γάλακτος είναι απηλλαγμένο φωσφολιπιδίων.6.3.2. Εκχύλιση του λιπαρού κλάσματος σύμφωνα με τη μέθοδο Rôse-Gottlieb.Η εκχύλιση πραγματοποιείται σύμφωνα με το πρότυπο IDF 1C: 1987, 16C: 1987, 116Α: 1987 ή 22Β: 1987.Τα φωσφολιπίδια σε ένα τέτοιο λίπος γάλακτος δίνουν μία κορυφή χοληστερόλης που είναι αυξημένη περίπου κατά 0,1 %.Το τριγλυκεριδικό φάσμα τυποποιημένο στα 100 με την χοληστερόλη επηρρεάζεται έτσι σε αμελητέο μόνο βαθμό.6.3.3. Εκχύλιση από γάλα χρησιμοποιώντας στήλες sillica gel.0,7 ml δείγματος γάλακτος θερμασμένο στους 20 °C φέρονται στη στήλη Extrelut 1-3 ml με μικρομετρικό σιφώνιο σύμφωνα με το 5.4 και αφήνεται να κατανεμηθεί ομοιόμορφα πάνω στο silica gel για 5 min περίπου.Για τη μετουσίωση των πρωτεϊνολιπιδικών συμπλόκων, προστίθενται με σιφώνιο 1,5 ml μεθανόλης. Ακολούθως το δείγμα εκχυλίζεται με 20 ml n-εξάνιο. Το n-εξάνιο προστίθεται αργά σε μικρές ποσότητες και ο διαλύτης στραγγίζει συλλεγόμενο σε μία φιάλη των 50 ml με στρογγυλό πυθμένα που έχει ξηρανθεί μέχρι σταθερού, γνωστού βάρους.Μετά την εκχύλιση, η στήλη αφήνεται να στραγγίσει μέχρι να αδιάσει.Από το έκλουσμα, οι διαλύτες απομακρύνονται δι' αποστάξεως με περιστροφικό εξατμιστήρα σε υδρόλουτρο με θερμοκρασία 40 έως 50 °C.Η φιάλη ξηραίνεται και η απόδοση σε λίπος προσδιορίζεται με ζύγισμα.Σημείωση:Οι εκχυλίσεις λίπους κατά Gerber, Weibull-Berntrop, Schmidt-Bondzynski-Ratzlaff ή η απομόνωση του λίπους γάλακτος χρησιμοποιώντας απορρυπαντικά (μέθοδος BDI) δεν είναι κατάλληλες για ανάλυση τριγλυκεριδίων, διότι με τις μεθόδους αυτές μπορούν να περάσουν στην λιπαρή φάση ποσότητες, περισσότερο ή λιγότερο μεγάλες μερικών τριγλυκεριδίων ή φωσφολιπιδίων.6.4. Ετοιμασία του διαλύματος δείγματοςΓια την αέρια χρωματογραφία, χρησιμοποιείται διάλυμα 5 % του λίπους σε n-επτάνιο λαμβανομένου σύμφωνα με το 6.3. Για την ετοιμασία του διαλύματος αυτού του δείγματος κατάλληλες ποσότητες του υλικού του δείγματος που λαμβάνονται κατά τα 6.3.1 και 6.3.2 ζυγίζονται και διαλύονται σε κατάλληλες ποσότητες n-επτανίου.Με την παρασκευή του δείγματος σύμφωνα με το 6.3.3 η προς προσθήκη στη φιάλη με το δείγμα ποσότητα n-επτανίου υπολογίζεται με ζύγισμα και το υπόλοιπο διαλύεται σε αυτό.1 ml περίπου του διαλύματος δείγματος φέρεται σε φύσιγγα όπως αυτή που αναφέρεται στο 5.16.6.5. Χρωματογραφικός προσδιορισμός τριγλυκεριδίωνΜε θερμοκρασίες μέχρι 350 °C για την έκλουση των τριγλυκεριδίων με μακρυά αλυσίδα C52-C56 επέρχεται αύξηση στη γραμμή βάσεως ιδιαίτερα εάν οι στήλες δεν έχουν σταθεροποιηθεί (κοντισιοναριστεί) καταλλήλως στην αρχή. Η ανύψωση της γραμμής βάσεως σε υψηλές θερμοκρασίες μπορεί να αποφευχθεί πλήρως είτε συνδέοντας δύο στήλες είτε με αφαίρεση της γραμμής βάσεως.Με τον αντισταθμιστικό τρόπο ή με μία μόνο στήλη, όπως επίσης και για τα γυάλινα ενθέματα στον εγχυτήρα και στον ανιχνευτή, πρέπει να χρησιμοποιούνται πώματα γραφίτη όπως το 5.5.6.5.1. Διόρθωση γραμμής βάσεωςΓια την αποφυγή ανύψωσης της γραμμής βάσεως χρησιμοποιείται μία από τις ακόλουθες τέσσερις μεθόδους:6.5.1.1. Συνδυασμός στηλώνΧρησιμοποιούνται δύο συμβατικές στήλες με αντισταθμιστικό τρόπο.6.5.1.2. Διόρθωση γραμμής βάσεως από τον αέριο χρωματογράφοΔι' εφαρμογής ενός κύκλου διαδικασίας αέριας χρωματογραφίας χωρίς έγχυση διαλύματος λίπους και εν συνεχεία αφαιρέσεως της αποθηκευμένης γραμμής βάσεως μπορεί να αποφευχθεί η ανύψωση της γραμμής βάσεως.6.5.1.3. Διόρθωση της γραμμής βάσεως με λογισμικό ολοκλήρωσηςΔι' εφαρμογής ενός κύκλου διαδικασίας αέριας χρωματογραφίας χωρίς έγχυση διαλύματος λίπους και εν συνεχεία αφαιρέσεως της αποθηκευμένης γραμμής βάσεως μπορεί να αποφευχθεί η ανύψωση της γραμμής βάσεως.6.5.1.4. Διόρθωση της γραμμής βάσεως με κατάλληλη σταθεροποίηση (κοντισιονάρισμα)Με κατάλληλη αρχική σταθεροποίηση της στήλης και 20 περίπου εκχύσεις με διαλύματα λίπους γάλακτος η ανύψωση της γραμμής βάσεως σε υψηλές θερμοκρασίες είναι συχνά τόσο χαμηλή ώστε να μην χρειάζονται διορθώσεις της γραμμής βάσεως.6.5.2. Τεχνική εγχύσεωςΓια την αποφυγή φαινομένων διακρίσεως εφαρμόζετια η τεχνική της "θερμής εγχύσεως" για την επίτευξη καλύτερων ποσοτικών αποτελεσμάτων με τα υψηλού σημείου ζέσεως τριγλυκεριδικά συστατικά. Εδώ, το διάλυμα λίπους αναρροφάται σε μία σύριγγα και η κρύα βελόνα της σύριγγας θερμαίνεται πριν από την έγχυση για 3 sec περίπου στην κεφαλή του εγχυτήρα. Κατόπιν, το περιεχόμενο της σύριγγας εγχύεται ταχέως.Σημείωση:Με την τεχνική αυτή εγχύσεως, μειώνεται ο κίνδυνος φαινομένων κλασματώσεων μέσα στη σύριγγα ή στο σύστημα εγχύσεως. Δεν εφαρμόζεται η επί της στήλης απ' ευθείας έγχυση στο πάνω, προεκταμένο θερμαινόμενο μέρος της στήλης, διότι τα θραύσματα του διαφράγματος που συσσωρεύονται εδώ, καθώς και τυχόν μολύνσεις μπορούν εύκολα να απομακρυνθούν με την χρησιμοποιούμενη τεχνική αλλάζοντας σε τακτικά χρονικά διαστήματα ένα ένθεμα του εγχυτήρα χωρίς αποσυναρμολόγηση της στήλης.Πρέπει να αποφεύγεται απολύτως τυχόν κάμψη του άκρου της βελόνας προκαλούμενη από τυχόν επαφή της με τον πυθμένα του δοχείου του δείγματος (ακόμη και αν με δυσκολία φαίνεται με το μάτι) για να αποφεύγεται καταστροφή του διαφράγματος.Εικόνα 4Χρωματογράφημα τριγλυκεριδίων δείγματος λίπους γάλακτος&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.009101.EPS"&gt;6.5.3. Ρύθμιση συμβατικής στήληςΚατά τη διάρκεια των σταδίων α) έως γ), η κορυφή της στήλης δεν συνδέεται με τον ανιχνευτή για την αποφυγή μολύνσεως.Οι γεμισμένες σύμφωνα με το 6.2 στήλες σταθεροποιούνται ως ακολούθως:α) 15 min 40 ml/min N2-ροή στους 50 °C·β) θέρμανση με 1 K/min μέχρι τους 355 °C με 10 ml N2/min·γ) διατήρηση για 12 έως 15 ώρες στους 355 °C·δ) δύο εγχύσεις με 1 μl διαλύματος βουτύρου κακάο σύμφωνα με το 4.10 και αντίστοιχο πρόγραμμα θερμοκρασίας·ε) 20 εκχύσεις με 0,5 μl διαλύματος λίπους γάλακτος για δύο έως τρεις ημέρες σύμφωνα με το 6.4.Σημείωση:Το βούτυρο του κακάο συνίσταται σχεδόν αποκλειστικά από υψηλού σημείου ζέσεως τριγλυκερίδια C50-C56. Η έκχυση του βουτύρου κακάο χρησιμεύει για ειδική σταθεροποίηση στην περιοχή αυτή που αντιστοιχεί σε μακρυές αλυσίδες. Με τα υψηλού σημείου ζέσεως τριγλυκερίδια C50 έως C54 μπορούν να απαντηθούν εν μέρη συντελεστές αποκρίσεως μέχρι περίπου 1,20. Κανονικά με επανειλημμένη έγχυση διαλύματος λίπους γάλακτος, αναμένεται μείωση των αρχικώς υψηλής αποκρίσεως συντελεστών για τα C50 έως C54. Με τριγλυκερίδια με μικρό αριθμό ακυλιωμένων ανθράκων οι συντελεστές είναι περίπου 1.Ετοιμάζονται τρία ζεύγη, αντιστοίχως, των πεπληρωμένων κατά το 6.2 στηλών. Τα σταθεροποιημένα ζεύγη ελέγχονται, αντιστοίχως με ανάλυση λίπους γάλακτος για δοκιμή ρουτίνας. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται το ζεύγος που εμφανίζει τα καλύτερα ποσοτικά αποτελέσματα (συντελεστές αποκρίσεως περίπου 1). Σε περίπτωση συντελεστών αποκρίσεως  &gt; 1,20, η στήλη δεν χρησιμοποιείται.6.5.4. ΒαθμονόμισηΓια τη βαθμονόμιση, οι συντελεστές αποκρίσεως των αντίστοιχων τριγλυκεριδίων, όπως επίσης και της χοληστερόλης λίπους γάλακτος (τυποποιημένο λίπος) θα πρέπει να προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας τα τυποποιημένα τριγλυκερίδια (τουλάχιστον τα κορεσμένα τριγλυκερίδια C24, C30, C36, C42, C48 και C54, όπως επίσης και χοληστερόλη· ακόμη καλύτερα και τα C50 και C52). Οι ενδιάμεσοι συντελεστές αποκρίσεως μπορούν να ευρεθούν με μαθηματική διέκταση.Χρησιμοποιώντας το τυποποιημένο λίπος, πρέπει να εκτελούνται κάθε ημέρα δύο έως τρεις βαθμονομήσεις. Εάν λαμβάνονται σχεδόν ταυτόσημα αποτελέσματα, στην ανάλυση τριγλυκεριδίων των δειγμάτων επιτυγχάνονται καλώς αναπαραγόμενα ποσοτικά αποτελέσματα.Το τυποποιημένο λίπος γάλακτος έχει διάρκεια ζωής αρκετούς μήνες σε θερμοκρασία αποθήκευσης το πολύ - 18 °C, και μπορεί έτσι να χρησιμοποιείται ως πρότυπο.Σημείωση:Ο συντελεστής απόκρισης κάθε συστατικού μπορεί επίσης να προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας μία λιπαρή ουσία αναφοράς, της οποίας η σύνθεση σε τριγλυκερίδια πιστοποιείται, ως CRM 519 (άνυδρη λιπαρή ουσία του γάλακτος) που διατίθεται προς πώληση από το "Ιστιτούτο Υλικών Αναφοράς και Μέτρων" στο Geel/Βέλγιο.6.5.5. Θερμοκρασιακό πρόγραμμα, φέρον αέριο και άλλες προϋποθέσεις για την ανάλυση τριγλυκεριδίων.Θερμοκρασιακό πρόγραμμα: αρχική θερμοκρασία στήλης 210 °C, διατήρηση επί 1 min, κατόπιν πρόγραμμα με 6 °C/min μέχρι τους 350 °C και διατήρηση στην τελική θερμοκρασία για 5 min.Θερμοκρασία ανιχνευτή και εγχυτήρα: 370 °C αντίστοιχα.Σημείωση:Οι θερμοκρασίες του ανιχνευτή, του εγχυτήρα και του φούρνου (αρχική θερμοκρασία) θα πρέπει να διατηρούνται σε σταθερό επίπεδο (επίσης και κατά τη διάρκεια της νύκτας, του σαββατοκύριακου και των αργιών).Φέρον αέριο: άζωτο, ταχύτητα ροής 40 ml/min.Σημείωση:Αν χρησιμοποιούνται στήλες των 80 cm, η ροή πρέπει να είναι τουλάχιστον 75 ml/min N2. Η ροή του φέροντος αερίου πρέπει να διατηρείται επίσης σταθερή (επίσης και κατά τη διάρκεια της νύκτας, όπως επίσης και κατά τα σαββατοκύριακα και τις αργίες). Η ακριβής ροή του φέροντος αερίου πρέπει να προσαρμόζεται έτσι ώστε ανεξάρτητα από το μήκος της στήλης το C54 να εκλούεται στους 341 °C.Διάρκεια της ανάλυσης: 29,3 min.Ποσότητα ενιομένης ουσίας: 0,5 μl.Σημείωση:Η σύριγγα, μετά από κάθε έγχυση, πρέπει να εκπλένεται μερικές φορές με καθαρό επτάνιο.Συνθήκες για τον FID: κατά το 5.1.Σημείωση:Ο ανιχνευτής ιονισμού ανάβεται, αντίστοιχα, στην αρχή κάθε εργάσιμης ημέρας.7. Ολοκλήρωση, αξιολόγηση και έλεγχος των συνθηκών μετρήσεωςΤα τριγλυκερίδια με μονό αριθμό ακυλιωμένων ανθράκων (2n + 1) συνδυάζονται με τα προηγούμενα ζυγού αριθμού τριγλυκερίδια (2n). Δεν λαμβάνονται υπόψη οι χαμηλού βαθμού αναπαραγωγιμότητας περιεκτικότητες σε C56. Τα παραμένοντα στο χρωματογράφημα τριλυκερίδια (εμβαδόν κορυφής), συμπεριλαμβανομένης της χοληστερόλης (κορυφή κοντά στο C24) πολλαπλασιάζονται επί τον αντίστοιχο συντελεστή αποκρίσεως του τυποποιημένου λίπους (τελευταία βαθμονόμηση) και όλα μαζί ανάγονται στο 100. Έτσι, εκτός από την ελεύθερη χοληστερόλη, αξιολογούνται και τα τριγλυκερίδια C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52 και C54. Τα αποτελέσματα δίδονται κ.β. % (g/100g).Η εκτίμηση των κορυφών του χρωματογραφήματος πρέπει να γίνεται με έναν ολοκληρωτή, με τον οποίο μπορεί να χαραχθεί η γραμμή βάσεως, θα πρέπει να είναι δυνατή και η επανολοκλήρωση με βελτιστοποιημένες παραμέτρους ολοκλήρωσης.Στις εικόνες 5 και 6 εμφαίνονται δύο παραδείγματα τριγλυκεριδικών χρωματογραφημάτων. Στην εικόνα 5 εμφαίνεται χρωματογράφημα που μπορεί να εκτιμηθεί καλώς, ενώ στην εικόνα 6 εμφαίνεται σποραδικό σφάλμα στην περιοχή C50 έως C54, αφού η γραμμή βάσεως εκτείνεται κατά μη ορθό τρόπο σε σχέση με την εικόνα 5. Τέτοια τυπικά σφάλματα μπορούν να ανιχνευθούν με υψηλό βαθμό βεβαιότητας και αποφεύγονται μόνο με τη χρήση ολοκληρωτή με τον οποίο χαράσσεται η γραμμή βάσεως.Εικόνα 5Εύκολο για εκτίμηση χρωματογράφημα τριγλυκεριδίων λίπους γάλακτος με χαραγμένη γραμμή βάσεως&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.009201.EPS"&gt;Εικόνα 6Κατά εσφαλμένο τρόπο ολοκληρωμένο χρωματογράφημα λίπους γάλακτος&gt;PIC FILE= "L_2001037EL.009301.EPS"&gt;Για να ελεγχθούν οι συνθήκες μέτρησης, μπορούν να χρησιμοποιηθούν οι σχετικές τυπικές αποκλίσεις (RSD: συντελεστής μεταβολής x 100) που παρατίθενται στον πίνακα 1 για τα διάφορα τριγλυκερίδια. Έχουν υπολογισθεί βάσει 19 διαδοχικών αναλύσεων της ίδιας λιπαρής ουσίας του γάλακτος.Πίνακας 1Σχετικές τυπικές αποκλίσεις (RSD) της περιεκτικότητας σε τριγλυκερίδια (n=19)&gt;ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ&gt;Όταν οι RSD είναι σαφώς ανώτερες από τις αξίες που εμφαίνονται στον πίνακα 1, οι συνθήκες χρωματογραφίας δεν είναι κατάλληλες και θα πρέπει να ελέγχονται τα διαφράγματα ή και ακόμη η παροχή του φέροντος αερίου. Επιπλέον, μικρά συστατικά του διαφράγματος μπορεί να έχουν δημιουργήσει αποθέσεις στον υαλοβάμβακα στην είσοδο της στήλης ή η στήλη να έχει καταστεί ακατάλληλη για χρήση λόγω γηράνσεως, θερμοκρασιακών επιδράσεων κ.λπ. (βλέπε εικόνα 3).Σημείωση:Οι τιμές που παρατίθενται στο πίνακα 1 δεν έχουν δεσμευτικό χαρακτήρα και παρέχουν απλώς μία κατεύθυνση για τον ποιοτικό έλεγχο. Εφόσον γίνονται αποδεκτές υψηλότερες RSD, θα πρέπει παρόλ' αυτά να τηρηθούν τα όρια επαναληψιμότητας και αναπαραγωγιμότητας που αναφέρονται στο σημείο 11.8. Ποιοτική ανίχνευση ξένου λίπουςΓια την ανίχνευση ξένων λιπών έχουν αναπτυχθεί τριγλυκεριδικοί τύποι (πίνακας 2) με όρια S (πίνακας 3), στους οποίους μπορούν να παίζουν οι τιμές S των καθαρών λιπών γάλακτος. Εάν τα όρια αυτά παραβιάζονται, αυτό θα πρέπει να αποδίδεται στην παρουσία ξένων λιπών.Ο πλέον ευαίσθητος τύπος για την ανίχνευση προσθήκης χοιρείου λίπους είναι, παραδείγματος χάρη:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>Σημείωση:Χρησιμοποιώντας 755 διαφορετικά δείγματα λίπους γάλακτος επιτεύχθηκε μία περιοχή αξιοπιστίας 99 % για S = 97,96-102,04 για δείγματα καθαρού λίπους γάλακτος με τυπική απόκλιση για όλες τις τιμές S SD = 0,39897.Ξεκινώντας από την τριγλυκεριδική σύσταση ενός άγνωστου δείγματος λίπους, ένας τέτοιος τύπος μας δίνει τη δυνατότητα, χωρίς τη χρήση υπολογιστή, να επαληθευθεί με απλό τρόπο αν το άθροισμα των περιεκτικοτήτων σε τριγλυκερίδια που αναφέρεται στο παρόν με τους αντίστοιχους συντελεστές πέφτει εκτός της περιοχής 97,96-102,04 περίπτωση στην οποία κατά πάσαν πιθανότητα έχουμε να κάνουμε με προσθήκη ξένου λίπους.Για την ανίχνευση διαφόρων ξένων λιπών, στον πίνακα 2 εμφαίνονται διάφοροι τριγλυκεριδικοί τύποι. Για την ανίχνευση των ξένων λιπών σογιελαίου, ηλιανθελαίου, ελαιολάδου, κραμβελαίου, λινελαίου, σιτελαίου, αραβοσιτελαίου, βαμβακελαίου και υδρογονωμένων ιχθυελαίων, για τα φυτικά λίπη κοκοφοινικελαίου και φοινικοπυρηνελαίου, όπως επίσης και για το φοινικέλαιο και βόειο λίπος μπορεί να χρησιμοποιηθεί, αντίστοιχα, ένας κοινός τύπος.Εφόσον η τριγλυκεριδική σύσταση των ξένων λιπών μπορεί επίσης να παίζει, χρησιμοποιήθηκαν 4 διαφορετικά, πειραματικώς υπολογισμένα στοιχεία τριγλυκεριδίων ξένων λιπών του ίδιου τύπου. [Με τους ίδιους τύπους ξένων λιπών, ελήφθησαν υπόψη τα λιγότερο ευνοϊκά όρια, αντιστοίχως (βλέπε πίνακα 4)].Μπορούν επίσης να ληφθούν το ίδιο καλά αποτελέσματα για όλα τα ξένα λίπη με τον ακόλουθο "ολικό τύπο":>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>Υπολογισμοί για την ανίχνευση οποιωνδήποτε συνδυασμών ξένων λιπών σε λίπος γάλακτος έδειξαν ότι, παραδείγματος χάρη, αν και με τον τύπο για το χοίρειο λίπος που δίδεται στον πίνακα 2 το όριο για το ξένο αυτό λίπος είναι χαμηλό, συγκεκριμένα 2,7 %, άλλα λίπη όπως το κοκοφοινικέλαιο, το φοινικέλαιο ή το φοινικοπυρηνέλαιο με όρια ανιχνεύσεως 26,8, 12,5 και 19,3 %, αντίστοιχα, μπορούν να ανιχνευθούν μόνον εάν έχουν προστεθεί στο λίπος γάλακτος σε εξαιρετικά μεγάλες ποσότητες. Αυτό ισχύει επίσης και για άλλους τύπους στον πίνακα 2.Πίνακας 2Τριγλυκεριδικοί τύποι για την ανίχνευση διαφόρων ξένων λιπών σε λίπος γάλακτος, με τις τυπικές αποκλίσεις SD για SΤύπος για σογιέλαιο, ηλιανθέλαιο, ελαιόλαδο, κραμβέλαιο, λινέλαιο, σιτέλαιο, αραβοσιτέλαιο, βαμβακέλαιο και ιχθυέλαιο>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>Τύπος για κοκοφοινικέλαιο και φοινικοπυρηνέλαιο>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>Τύπος για φοινικέλαιο και βόειο λίπος>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>Τύπος για χοίρειο λίπος>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>Συνεπώς, για τον έλεγχο ενός δείγματος άγνωστου λίπους πρέπει να χρησιμοποιηθούν όλοι οι τύποι του πίνακα 2 και ο ολικός τύπος (2), εάν το δείγμα είναι μείγμα λίπους γάλακτος και ενός από τα 14 διαφορετικά ξένα λίπη ή συνδυασμού των ξένων αυτών λιπών. Εάν, με την εισαγωγή των τριγλυκεριδίων ενός προς ανάλυση δείγματος λίπους ληφθεί μία τιμή S, η οποία πέφτει έξω από τις περιοχές του πίνακα 3 για ένα μόνο από τους πέντε τύπους, τότε το δείγμα είναι πιθανότατα ένα τροποποιημένο λίπος γάλακτος. Η ανίχνευση ξένου λίπους σε λίπος γάλακτος μέσω ενός των τεσσάρων τύπων στον πίνακα 2 δεν δίνει τη δυνατότητα εξαγωγής συμπερασμάτων για τύπο του προσμεμειγμένου ξένου λίπους.Πίνακας 3Όρια S για λίπη γάλακτος>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Στον πίνακα 4 δίδονται τα όρια ανιχνεύσεως για τα διάφορα ξένα λίπη με αξιοπιστία 99 %. Η πρώτη στήλη δείχνει τα ελάχιστα όρια ανιχνεύσεως για τους καλύτερους τύπους λίπους γάλακτος στον πίνακα 2. Στη δεύτερη στήλη δίδονται τα όρια ανιχνεύσεως για τον ολικό τύπο. Αν και τα όρια είναι κάπως υψηλότερα, μόνον ο τύπος αυτός χρειάζεται για την ανίχνευση λίγο μεγαλύτερων ποσοτήτων ξένων λιπών. Με όλους τους τύπους, μπορούν να ανιχνευθούν και συνδυασμοί των διαφόρων ξένων λιπών. Οι περιοχές δακύμανσης των τριγλυκεριδίων των διαφόρων ξένων λιπών ενός τύπου δεν έχουν σημαντική επίδραση στα όρια ανιχνεύσεως.Πίνακας 4Όρια ανιχνεύσεως 99 % διά προσθήκης ξένου λίπους σε λίπος γάλακτος σε %>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>Σημείωση:Οι περιοχές S υπολογίζονται με τον τρόπο αυτό, ότι αναμένεται η ύπαρξη ενός ξένου λίπους εάν επέλθει υπέρβαση των ορίων των επιμέρους τύπων (βλέπε πίνακα 4).9. Ποσοτικός προσδιορισμός ξένου λίπουςΓια να ληφθούν ποσοτικές πληροφορίες για τη συγκέντρωση του ξένου λίπους σε δείγμα λίπους γάλακτος, χρησιμοποιείται ο ακόλουθος τύπος:>ΑΝΑΦΟΡΑ ΣΕ ΓΡΑΦΙΚΟ>, όπου X είναι η ποσότητα ενός άγνωστου ξένου λίπους ή μείγματος ξένων λιπών σε ένα άγνωστο λίπος γάλακτος. Το S προκύπτει από την προσθήκη ενός άγνωστου ξένου λίπους δια εισαγωγής των τριγλυκεριδίων του μείγματος ξένου λίπους γάλακτος στον ανωτέρω ολικό τύπο τριγλυκεριδίων. Εάν στο λίπος του γάλακτος προστεθεί ένα άγνωστο ξένο λίπος, για το SF επιλέγεται η μέση τιμή S των διαφόρων ξένων λιπών για τον ολικό τύπο. Η μέση τιμή S λαμβάνεται δια εισαγωγής των στοιχείων για τα τριγλυκερίδια των καθαρών ξένων λιπών στον τύπο αυτό δια υπολογισμού μίας μέσης τιμής (SF = 7,46). Καλά ποσοτικά αποτελέσματα για οποιεσδήποτε προσθήκες ξένων λιπών λαμβάνονται επίσης και χρησιμοποιώντας τον τύπο φοινικελαίου/βοείου λίπους (πίνακα 2) και μία μέση τιμή SF 10,57.Με γνωστά είδη ξένων λιπών, στον ανωτέρω τύπο πρέπει να εισάγονται οι παρακάτω τιμές SF = και να επιλέγεται ο αντίστοιχος τύπος ξένου λίπους από τον πίνακα 2.Πίνακας 5Τιμές SF διαφόρων ξένων λιπών>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>10. Εύρος εφαρμογής της μεθόδου ανιχνεύσεωςΗ περιγραφείσα μέθοδος έχει εφαρμογή σε χύμα γάλατα και βασίζεται στην αντιπροσωπευτικότητα των δειγμάτων του λίπους γάλακτος.Θα ήταν δυνατή η με μεγάλη εξειδίκευση ανίχνευση εάν, για ένα αντιπροσωπευτικό αριθμό λιπών γάλακτος, υπήρχαν τύποι που περιγράφησαν ανωτέρω προερχόμενοι από διάφορες χώρες.Θα μπορούσαν να επιτευχθούν ιδιαίτερα επιτυχημένες δυνατότητες ανιχνεύσεως, εάν οι τύποι για τις διάφορες χώρες, όπως περιγράφονται εδώ, συγκροτούνταν από ένα αντιπροσωπευτικό αριθμό λιπών γάλακτος. Στην περίπτωση αυτή, δεν απαιτείται η χρήση πολύπλοκων προγραμμάτων υπολογισμού, εάν εφαρμόζονται οι συνδυασμοί τριγλυκεριδίων που χρησιμοποιούνται στον πίνακα 2 και επαναπροσδιορίζονται οι συντελεστές χρησιμοποιώντας τη μέθοδο των ελάχιστων τετραγώνων.Εφαρμόζοντας τις κλίμακες S όπως φαίνεται στον πίνακα 3, οι τύποι μπορούν να εφαρμοστούν κάτω από διάφορες συγκεκριμένες συνθήκες εκτροφής όπως, παραδείγματος χάρη, υποσιτισμός ή διατροφή αγελάδων με ζύμες ή σάπωνες Ca. Μόνο στην περίπτωση ακραίων συνθηκών διατροφής (παραδείγματος χάρη, υψηλή πρόσληψη καθαρών ελαίων διατροφής κ.λπ.) οι τύποι εν μέρει δείχνουν τροποποιημένο λίπος γάλακτος.Σημείωση:Τα κλασματοποιημένα λίπη γάλακτος αναγνωρίζονται εν γένει ως μη τροποποιημένο λίπος γάλακτος, εάν υποτίθεται ότι υπάρχει μόνο μία τροποποίηση, όταν εμφανίζεται υπέρβαση των ορίων. Μόνον με κλασματοποιημένα λίπη γάλακτος με ασυνήθη σύνθεση λίπους γάλακτος όπως παραδείγματος χάρη, η περίπτωση με σκληρό κλάσμα, που λαμβάνονται με κλασματοποίηση με φυσικές μεθόδους σε υψηλές θερμοκρασίες περίπου 30 °C με χαμηλές αποδόσεις λίγων εκατοστιαίων μονάδων ή με κλασμάτωση με άνω του κρισίμου σημείου CO2, οι τύποι δείχνουν μία τροποποίηση.Η κλασμάτωση λίπους γάλακτος μπορεί, εντούτοις, να ανιχνευθεί χρησιμοποιώντας άλλες διαδικασίες, παραδείγματος χάρη, θερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης.11. Ορθότητα της μεθόδουΠροσδιορίζεται χρησιμοποιώντας λίπος γάλακτος με βάση τους τύπους από τον πίνακα 2 και τις περιοχές S στον πίνακα 3.11.1. ΕπαναληψιμότηταΩς διαφορά των τιμών S δύο προσδιορισμών που πραγματοποιούνται μέσα στο συντομότερο εφικτό χρονικό διάστημα από ένα άτομο χρησιμοποιώντας την ίδια διαδικασία και ταυτόσημο υλικό δείγματος υπό τις ίδιες συνθήκες (ίδιο πρόσωπο, ίδια όργανα/ίδιες, συσκευές/ίδιο εργαστήριο):Πίνακας 6Όρια επαναληψιμότητας (r) για τους διάφορους τύπους>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>11.2. ΑναπαραγωγιμότηταΩς διαφορά των τιμών S δύο προσδιορισμών που πραγματοποιούνται από άτομα σε διαφορετικά εργαστήρια, σύμφωνα με την ίδια διαδικασία χρησιμοποιώντας ταυτόσημο υλικό δείγματος από διαφορετικές συνθήκες (διαφορετικό πρόσωπο, διαφορετικά όργανα) σε διαφορετικές χρονικές στιγμές.Πίνακας 7Όρια αναπαραγωγιμότητας (R) για τους διάφορους τύπους>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>11.3. Κρίσιμη διαφοράΜε τα όρια επαναληψιμότητας (r) και αναπαραγωγιμότητας (R) μπορούν να υπολογιστούν οι κρίσιμες διαφορές για όλες τις περιοχές S του πίνακα 3 (διπλές αναλύσεις). Οι αντίστοιχες τιμές δίδονται στον πίνακα 8.Πίνακας 8Κρίσιμες διαφορές για όλους τους τριγλυκεριδικούς τύπους>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>11.4. Αποδεξιμότητα των αποτελεσμάτωνΌλες οι βαθμονομούμενες με στρογγυλοποίηση στο δεύτερο δεκαδικό ψηφίο, υπολογιζόμενες περιεκτικότητες σε τριγλυκερίδια C24, C26, C28 έως C54 πρέπει να ανάγονται ακριβώς στο 100.Τα αποτελέσματα της διπλής ανάλυψης χρησιμοποιούνται ως έλεγχος για την επαναληψιμότητα. Εάν οι απόλυτες διαφορές μεταξύ των δύο αποτελεσμάτων για το S για όλους τους τριγλυκεριδικούς τύπους δεν παραβιάζουν τα όρια επαναληψιμότητας r του πίνακα 6, αυτό σημαίνει ότι τηρείται η απαίτηση της επαναληψιμότητας.Για τον έλεγχο των άριστων αεριοχρωματογραφικών συνθηκών και ειδικά της ποιότητας της στήλης, θα πρέπει να διασφαλίζεται ότι σε δέκα κύκλους επανάληψης οι διαφορές των μέγιστων και ελαχίστων τιμών S και των 5 τριγλυκεριδικών τύπων δεν παραβιάζουν την κλίμακα x· r με x = 1,58 (για δέκα κύκλους βλέπε βιβλιογραφία 16) και τα όρια επαναληψιμότητας r για τους διάφορους τύπους του πίνακα 6.12. Αναφερόμενα πρότυπα>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>13. Βιβλιογραφία1. Επιτροπή των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων: Ανίχνευση ξένων λιπών σε λίπος γάλακτος με αεριοχρωματογραφική ανάλυση τριγλυκεριδίων, Doc. No. VI/5202/90-EN, VI/2645/91.2. Επιτροπή των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων: Έλεγχος καθαρότητας λίπους βουτύρου 100 διαφορετικών δειγμάτων περιόδων διατροφής από 11 κοινοτικά κράτη, Doc. No. VI/4577/93.3. Επιτροπή των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων: Εξέταση αποτελεσμάτων από την πρώτη, δεύτερη, τρίτη, τέταρτη, πέμπτη και έκτη συνεργασιακή δοκιμή ΕΟΚ: Προσδιορισμός τριγλυκεριδίων σε λίπος γάλακτος, Doc. No. VI/2644/91, VI/8.11.91, VI/1919/92, VI/3842/92, VI/5317/92 και VI/4604/93.4. Timms, R. E.: Detection and quantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 4 72 95-303 (1980).5. Precht, D., Heine, K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen 4 14 06-410 (1986).6. Luf. W., Stock, A., Brandl, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett über die Triglyceridanalyse. Österr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 20-35 (1987).7. Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 4 21 43/157 (1989).8. Precht D.: Schnelle Extraktion von Milchfett, Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 4 21 19-128 (1990).9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 4 21 39-154 (1900).10. Precht, D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 43 (3) 219-242 (1991).11. Precht, D.: Detection of adulterated milk fat by fatty acid and triglyceride analysis. Fat Sci. Technol. 9 35 38-544 (1991).12. Precht, D.: Detection for foreign fat in milk fat. I. Qualitative dtection by triacylglycerol formulae. II. Quantitative evaluation of foreign fat mixtures. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 194 1-8, 107-114 (1992).13. Precht, D.: Gas chromatography of triacylglycerols and other lipids on packed columns in CRC Handbook of Chromatography: Analysis of Lipids, p. 123-138, Ed. K.D. Mukherjee, N. Weber, J. Sherma, CRC Press, Boca Raton (1993).14. Precht, D., Molkentin, J.: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4 16-17 (1993).15. Molkentin, J., Precht, D.: Comparison of packed and capillary columns for quantitative gas chromatography of triglycerides in milk fat. Chromatographia 39 (5/6) 265-270 (1994).16. Stange, K.: Angewandte Statistik, Erster Teil, Eindimensionale Probleme, Springer-Verlag, Berlin, p. 378 (1970).(1) Κατάλληλες μέθοδοι έχουν ήδη περιγραφεί, βλέπε D. Precht και J. Molkentin: Quantitative triglycerid analysis using short capillary colomns, Chrompack News 416-17 (1993).(2) Κατάλληλα προϊόντα υπάρχουν διαθέσιμα στο εμπόριο.(3) Κατάλληλα προϊόντα διαθέσιμα στο εμπόριο είναι π.χ. τα με τις εμπορικές ονομασίες Extrelut, Gas ChromQ, Chrompack. Οι πληροφορίες αυτές αποσκοπούν στο να δώσουν τη δυνατότητα εύκολου χειρισμού του προτύπου από τον χρήστη και δεν αποτελούν απαίτηση του προϊόντος. Η ένδειξη της κοκκομετρικής σύστασης εκφράστηκε στη μονάδα μm του SI σύμφωνα με το BS 410:1988 "British Standard Specification for test sieves".(4) Βλέπε υποσημείωση 3 στην σελίδα 86.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ XXVIΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΤΩΝ ΚΑΝΟΝΙΣΜΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΠΡΩΤΗ ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΚΗ ΣΚΕΨΗ- Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 1216/68 της Επιτροπής, της 9ης Αυγούστου 1968, περί καθορισμού της μεθόδου διαπιστώσεως της περιεκτικότητας σε λακτόζη των τροφών που παρασκευάζονται για τα εισαγόμενα ζώα προελεύσεως τρίτων χωρών(1), όπως τροποποιήθηκε από τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 222/88 της Επιτροπής της 22ας Δεκεμβρίου 1987 για την τροποποίηση ορισμένων πράξεων στον τομέα του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων στη συνέχεια της καθιέρωσης της συνδυασμένης ονοματολογίας(2)·- Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 3942/92 της Επιτροπής, της 22ας Δεκεμβρίου 1992, για τη θέσπιση μεθόδου αναφοράς για τον προσδιορισμό σιτοστερόλης και στιγμαστερόλης στο βουτυρέλαιο(3), όπως τροποποιήθηκε τελευταία με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 175/1999 της Επιτροπής για την τροποποίηση των κανονισμών (ΕΟΚ) αριθ. 3942/92, (ΕΚ) αριθ. 86/94, (ΕΚ) αριθ. 1082/96 και (ΕΚ) αριθ. 1459/98 σχετικά με τη θέσπιση μεθόδων αναφοράς για τον προσδιορισμό ορισμένων ιχνηθετών στο βούτυρο, το βουτυρέλαιο και στην κρέμα γάλακτος(4)·- Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 86/94 της Επιτροπής, της 19ης Ιανουαρίου 1994, σχετικά με τη θέσπιση μεθόδου αναφοράς για τον προσδιορισμό σιτοστερόλης και στιγμαστερόλης στο βούτυρο(5), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 175/1999·- Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 2721/95 της Επιτροπής, της 24ης Νοεμβρίου 1995, περί θέσπισης κανόνων για την εφαρμογή των συνήθων μεθόδων και των μεθόδων αναφοράς για την ανάλυση και την ποιοτική αξιολόγηση του γάλυκτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων στο πλαίσιο της οργάνωσης κοινής αγοράς(6)·- Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1080/96 της Επιτροπής, της 14ης Ιουνίου 1996, σχετικά με τον καθορισμό μίας μεθόδου αναφοράς για την ανίχνευση κολοβακτηριδίων στο βούτυρο, το αποκορυφωμένο γάλα σε σκόνη και την καζεΐνη-καζεϊνικά άλατα(7)·- Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1081/96 της Επιτροπής, της 14ης Ιουνίου 1996, που αφορά τη θέσπιση μεθόδου αναφοράς για την ανίχνευση αγελαδινού γάλακτος και, καζεϊνικών αλάτων σε τυριά από πρόβειο, κατσικίσιο ή βουβαλίσιο γάλα ή από μείγματα πρόβειου, κατσικίσιου και βουβαλίσιου γάλακτος και περί κατάργησης του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 690/92(8)·- Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1082/96 της Επιτροπής, της 14ης Ιουνίου 1996, για τη θέσπιση μεθόδου αναφοράς για τον προσδιορισμό του αιθυλεστέρα του β-από-8'-καροτενικού οξέος σε συμπυκνωμένο βούτυρο και βούτυρο(9), όπως τροποποιήθηκε από τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 175/1999·- Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1854/96 της Επιτροπής, της 26ης Σεπτεμβρίου 1996, για τον καθορισμό πίνακα μεθόδων αναφοράς που πρέπει να χρησιμοποιούνται για την ανάλυση και ποιοτική αξιολόγηση του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων στο πλαίσιο της κοινής οργάνωσης αγοράς(10), όπως τροποποιήθηκε από τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 881/1999(11)·- Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 880/98 της Επιτροπής, της 24ης Απριλίου 1998, σχετικά με τη θέσπιση μεθόδων αναφοράς για τον προσδιορισμό περιεκτικότητας του βουτύρου σε υγρασία, σε στερεό υπόλειμμα χωρίς λίπος και σε λίπος(12)·- Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1459/98 της Επιτροπής, της 8ης Ιουλίου 1998, σχετικά με τη θέσπιση μεθόδου αναφοράς για τον προσδιορισμό της βανιλίνης στο συμπυκνωμένο βούτυρο, στο βούτυρο ή στην κρέμα γάλακτος(13), όπως τροποποιήθηκε με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 175/1999.(1) ΕΕ L 198 της 10.8.1968, σ. 13.(2) ΕΕ L 28 της 1.2.1988, σ. 1.(3) ΕΕ L 399 της 31.12.1992, σ. 29.(4) ΕΕ L 20 της 27.1.1999, σ. 22.(5) ΕΕ L 17 της 20.1.1994, σ. 7.(6) ΕΕ L 283 της 25.11.1995, σ. 7.(7) ΕΕ L 142 της 15.6.1996, σ. 13.(8) ΕΕ L 142 της 15.6.1996, σ. 15.(9) ΕΕ L 142 της 15.6.1996, σ. 26.(10) ΕΕ L 246 της 27.9.1996, σ. 5.(11) ΕΕ L 111 της 29.4.1999, σ. 24.(12) ΕΕ L 124 της 25.4.1998, σ. 16.(13) ΕΕ L 193 της 9.7.1998, σ. 16.