CELEX: 32001R0213
Language: lt
Date: 2001-01-09 00:00:00
Title: 2001 m. sausio 9 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 213/2001, nustatantis išsamias Tarybos reglamento (EB) Nr. 1255/1999 taikymo taisykles, susijusias su pieno ir pieno produktų analizės bei kokybės vertinimo metodais ir iš dalies pakeičiantis Reglamentus (EB) Nr. 2771/1999 ir (EB) Nr. 2799/1999

Svarbus teisinis pranešimas

|

32001R0213

2001 m. sausio 9 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 213/2001, nustatantis išsamias Tarybos reglamento (EB) Nr. 1255/1999 taikymo taisykles, susijusias su pieno ir pieno produktų analizės bei kokybės vertinimo metodais ir iš dalies pakeičiantis Reglamentus (EB) Nr. 2771/1999 ir (EB) Nr. 2799/1999  

Oficialusis leidinys L 037 , 07/02/2001 p. 0001 - 0099 CS.ES skyrius 3 tomas 31 p. 240  - 338 ET.ES skyrius 3 tomas 31 p. 240  - 338 HU.ES skyrius 3 tomas 31 p. 240  - 338 LT.ES skyrius 3 tomas 31 p. 240  - 338 LV.ES skyrius 3 tomas 31 p. 240  - 338 MT.ES skyrius 3 tomas 31 p. 240  - 338 PL.ES skyrius 3 tomas 31 p. 240  - 338 SK.ES skyrius 3 tomas 31 p. 240  - 338 SL.ES skyrius 3 tomas 31 p. 240  - 338

		Komisijos reglamentas (EB) Nr. 213/20012001 m. sausio 9 d.nustatantis išsamias Tarybos reglamento (EB) Nr. 1255/1999 taikymo taisykles, susijusias su pieno ir pieno produktų analizės bei kokybės vertinimo metodais ir iš dalies pakeičiantis Reglamentus (EB) Nr. 2771/1999 ir (EB) Nr. 2799/1999EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA,atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį,atsižvelgdama į 1999 m. gegužės 17 d. Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1255/1999 dėl bendro pieno ir pieno produktų rinkos organizavimo [1], ypač į jo 10 ir 15 straipsnius, 26 straipsnio 3 dalį, 29 straipsnio 1 dalį ir 31 straipsnio 14 dalį,kadangi:(1) Komisijos reglamentuose (EEB) Nr. 1216/68, (EEB) Nr. 3942/92, (EB) Nr. 86/94, (EB) Nr. 2721/95, (EB) Nr. 1080/96, (EB) Nr. 1081/96, (EB) Nr. 1082/96, (EB) Nr. 1854/96, (EB) Nr. 880/98 ir (EB) Nr. 1459/98, kurių visos nuorodos yra pateiktos šio reglamento XXVI priede, yra nustatyti pamatiniai ir įprastiniai pieno bei pieno produktų analizės bei kokybės vertinimo metodai ir šių metodų taikymo sritis bei taisyklės. Dėl aiškumo ir tam, kad dirbantys minimame sektoriuje turėtų vienodą metodų ir jų taikymo taisyklių rinkinį, pirmiau minėti reglamentai turėtų būti iš naujo suformuluoti ir sujungti į vieną tekstą. Dėl tos pačios priežasties 1999 m. gruodžio 16 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 2771/1999, nustatantis išsamias Tarybos reglamento (EB) Nr. 1255/1999 taikymo taisykles dėl intervencijos sviesto ir grietinėlės rinkoje [2], ir 1999 m. gruodžio 17 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 2799/1999, nustatantis išsamias Reglamento (EB) Nr. 1255/1999 taikymo taisykles, susijusias su pagalbos už pašarams skirtą nugriebtą pieną ir nugriebtus pieno miltelius suteikimu ir šių nugriebto pieno miltelių pardavimu [3], turėtų būti iš dalies pakeistas taip, kad minėtų reglamentų priedus, susijusius su analizės metodais būtų galima įtraukti į šį reglamentą.(2) Siekiant garantuoti, kad būtų griežtai laikomasi pieno ir pieno produktų sudėties bei kokybės reikalavimų, nustatytų remiantis Reglamente (EB) Nr. 1255/1999 numatyta tvarka, juos būtina tikrinti.(3) Pamatiniai tokių tikrinimų metodai – tai dažniausiai tarptautinių organizacijų, būtent CEN, IDF, ISO ir AOAC International, skelbiami metodai, kuriuos šios organizacijos nuolat atnaujina. Kartais Bendrijos taisyklėse Bendrijos pamatinis metodas nurodomas, kartais nenurodomas. Norint užtikrinti, kad pamatiniai metodai būtų taikomi vienodai, kasmet turi būti sudaromas pamatinių metodų sąrašas ir tik šie metodai gali būti taikomi.(4) Įprastiniai metodai taip pat neturėtų būti atmetami. Todėl reikėtų nurodyti jų taikymo sąlygas.(5) Be to, turėtų būti nustatyti bendri metodai, užtikrinantys vienodą analizės rezultatų vertinimą, aptariamų produktų juslinį vertinimą ir ginčytinų rezultatų pakartotinį nagrinėjimą.(6) Kai kuriems tyrimams šiuo metu nėra tarptautiniu mastu priimtų ir įteisintų pamatinių metodų, todėl nėra informacijos apie skirtingų laboratorijų analizės rezultatų variantus. Dėl šios priežasties reikėtų nustatyti Bendrijos metodus, kurie būtų patvirtinti pagal tarptautines taisykles ir būtų taikomi kaip pamatiniai.(7) 1997 m. gruodžio 15 d. Komisijos reglamente (EB) Nr. 2571/97 dėl sviesto pardavimo sumažintomis kainomis ir pagalbos suteikimo už grietinėlę, sviestą ir koncentruotą sviestą konditerijos, vartojamą produktams iš tešlos, ledams ir kitiems maisto produktams gaminti [4] su paskutiniais pakeitimais, padarytais Reglamentu (EB) Nr. 635/2000 [5], yra numatyta tam tikromis aplinkybėmis atsekti grietinėlės, sviesto ir koncentruoto sviesto tapatumą, kad būtų galima užtikrinti teisingą galutinį šių produktų panaudojimą. Kadangi atsekamumas yra svarbus norint užtikrinti, kad gerai veiktų schema, o kad joje dalyvaujantiems operatoriams būtų taikomos vienodos sąlygos, reikėtų nustatyti bendrus atsekamųjų medžiagų nustatymo metodus.(8) Vadovaujantis 1985 m. lapkričio 11 d. Komisijos reglamentu (EEB) Nr. 3143/85 dėl intervencinio sviesto, skirto vartoti tiesiogiai koncentruoto sviesto pavidalu, pardavimo sumažintomis kainomis [6] su paskutiniais pakeitimais, padarytais Reglamentu (EB) Nr. 101/1999 [7], 1990 m. vasario 20 d. Komisijos reglamentu (EEB) Nr. 429/90 dėl pagalbos už Bendrijoje tiesiogiai vartoti skirtą koncentruotą sviestą suteikimo konkurso tvarka [8] su paskutiniais pakeitimais, padarytais Reglamentu (EB) Nr. 124/1999 [9], ir Reglamentu (EB) Nr. 2571/97, į koncentruotą sviestą turi būti pridėta atsekamųjų medžiagų šį procesą prižiūrint. Kad produktai nenukryptų nuo normos, turi būti griežtai vykdoma koncentruoto sviesto tapatumo atsekimo reikalavimų laikymosi priežiūra. Todėl reikėtų nustatyti bendrąjį minėtų atsekamųjų medžiagų nustatymo metodą.(9) Remiantis Reglamento (EB) Nr. 1255/1999 9 straipsnio nuostatomis, gali būti suteikta pagalba iš avių pieno pagamintų sūrių privačiam saugojimui. Remiantis to reglamento 31 straipsnio nuostatomis, šiems produktams gali būti suteikiama speciali grąžinamoji išmoka. Sūriai, pagaminti iš avių, ožkų, buivolių pieno ir avių, ožkų bei buivolių pieno mišinio, taikant lengvatines priemones, gali būti įvežami į Bendriją iš tam tikrų trečiųjų šalių. Atsižvelgiant į pirmiau nurodytas nuostatas, siekiant užtikrinti, kad į minėtus produktus nebūtų įmaišyta karvių pieno, būtina atlikti atitinkamus patikrinimus. Todėl reikėtų nustatyti Bendrijos pamatinį metodą karvių pienui aptikti, neatmetant ir įprastinių metodų, jei šie atitinka tam tikrus kriterijus.(10) Remiantis 1990 m. spalio 10 d. Komisijos reglamentu (EEB) Nr. 2921/90 dėl pagalbos suteikimo už kazeino ir kazeinatų gamybai naudojamą nugriebtą pieną [10] su paskutiniais pakeitimais, padarytais Reglamentu (EB) Nr. 2654/1999 [11], turi būti nustatyta, ar juose nėra koliforminių bakterijų. Tarptautiniu mastu patvirtintas pamatinis koliforminių bakterijų nustatymo piene ir pieno produktuose metodas yra nurodytas Tarptautiniame standarte IDF 73A: 1985. Tačiau tas standartas yra taikytinas tik modifikuota forma nustatant koliformines bakterijas tam tikrame produkto kiekyje. Todėl remiantis anksčiau minėtu standartu yra nustatytas Bendrijos pamatinis šios bakterijos nustatymo metodas.(11) 1987 m. liepos 23 d. Tarybos reglamente (EEB) Nr. 2658/87 dėl tarifų ir statistinės nomenklatūros bei dėl Bendrojo muitų tarifo [12] su paskutiniais pakeitimais, padarytais Reglamentu (EB) Nr. 254/2000 [13], yra numatytos skirtingos 2309 pozicijoje klasifikuojamų kombinuotųjų pašarų muitų normos atsižvelgiant į juose esančio pieno produkto kiekį. Siekiant užtikrinti, kad minimos taisyklės būtų taikomos vienodai, visoms valstybėms narėms turėtų būti nustatytas visuotinai pripažintas ir privalomas laktozės kiekio analizes metodas.(12) Remiantis Reglamento (EB) Nr. 1255/19999 nuostatomis, intervencijai skirtas sviestas ir nugriebto pieno milteliai arba nugriebto pieno milteliai skirti pašarams turi atitikti tam tikrus kokybės reikalavimus. Turi būti nustatyti pamatiniai metodai, leidžiantys įsitikinti, ar šių reikalavimų laikomasi.(13) Įgyvendinant kai kuriuos pirmą kartą šiame reglamente nustatytus metodus reikės tam tikro prisitaikymo laikotarpio. Todėl šių metodų taikymą reikėtų atidėti.(14) Pieno ir pieno produktų vadybos komitetas per pirmininko nustatytą laiką nepateikė savo nuomonės,PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENTĄ:I SKYRIUSBENDROSIOS NUOSTATOS1 straipsnisTaikymo sritis ir apimtisŠis reglamentas nustato pieno ir pieno produktų cheminės, fizikinės bei mikrobiologinės analizės ir juslinio vertinimo metodų taikymo taisykles, įgyvendinant Reglamente (EB) Nr. 1255/1999 nustatytas bendro pieno ir pieno produktų rinkos organizavimo priemones. Be to, jame yra nustatyti ir kai kurie iš minėtų metodų.2 straipsnisMetodų sąrašas1. Šio reglamento I priede yra pateiktas pamatinių metodų, taikytinų atliekant 1 straipsnyje minėtas analizes, sąrašas.2. Reglamento (EB) Nr. 1255/1999 42 straipsnyje nustatyta tvarka Komisija ne rečiau kaip kartą per metus šį sąrašą atnaujina.3 straipsnisĮprastiniai metodaiAtliekant Bendrijos taisyklėse reglamentuojamą analizę, įprastiniai metodai gali būti taikomi tuo atveju, jei jie yra tinkamai kalibruojami ir nuolat tikrinami pagal pamatinį metodą.Tikrinant įprastiniais metodais gautus rezultatus, kurie yra artimi atitinkamuose reglamentuose nurodytoms riboms, gali būti taikoma II priede aprašyta procedūra.Ginčytinais atvejais lemia pamatiniu metodu gauti rezultatai.4 straipsnisPamatinių metodų įteisinimas1. Pamatiniai metodai įteisinami tada, kai jie atitinka iš anksto nustatytus preciziškumo kriterijus, susijusius su pakartojamumo ir atkuriamumo riba.2. Jei minėtuose reglamentuose nustatytas pamatinis metodas dar neįteisintas, valstybės narės nustato laikiną atkuriamumo ribą.Ta riba nustatoma remiantis III priedo b punkte aprašyta procedūra. Tačiau pirmuosius 18 mėnesių nuo šio reglamento įsigaliojimo valstybės narės gali taikyti lygiavertę procedūrą.Atitikimas nustatytoms riboms turi būti tikrinamas ne rečiau kaip kartą per metus.3. Kai įteisintais pamatiniais metodais arba metodais, kurių preciziškumo ribos apibrėžtos laikinai, gauti rezultatai viršija nustatytas ribas, analizės rezultatai gali būti vertinami taikant IV priede aprašytą metodą, kad būtų nustatytas kritinis nuokrypis nuo minėtų ribų.5 straipsnisAnalizės rezultatų priimtinumas1. Analizė atliekama laboratorijose, taikančiose vidaus kokybės kontrolės procedūrą pagal V priedo a dalyje aprašytą arba lygiavertį standartą atitinkančią procedūrą.Laboratorijos pasitikrinimui privalo turėti išsamų taikomos procedūros aprašymą.2. Laboratorijos nusistato jų vidaus preciziškumą visiems metodams remdamosi:a) V priedo b punkte aprašyta procedūra arbab) paskelbta ir galiojančia procedūra, kurioje yra nustatytas pakartojamumas.Atkuriamumo ribos turi būti tikrinamos ne rečiau kaip kartą per metus taikant III priedo a punkte aprašytą procedūrą.Antroji pastraipa netaikoma laboratorijoms, kurios tais metais dalyvavo kvalifikacijos tikrinimo programoje.3. Laboratorijų ataskaitose apie analizės rezultatus turi būti pakankamai informacijos, kad rezultatus būtų galima įvertinti taip, kaip nurodyta IV ir VIII prieduose.4. Analizės rezultatai laikomi priimtinais, jei jie buvo gauti laikantis priimtinumo kriterijų, aprašytų 1 dalyje nurodytoje vidaus kokybės kontrolės procedūroje, ir 2 dalyje minėto laboratorijos vidaus preciziškumo.6 straipsnisJuslinis vertinimas1. Sviesto vertintojų darbas ir rezultatų patikimumas tikrinami taikant VI priede aprašytas procedūras. VII priede aprašyta procedūra taikoma kaip pamatinis juslinio vertinimo metodas.2. Valstybės narės, atlikdamos juslinį pieno ir pieno produktų, išskyrus sviestą, vertinimą, privalo taikyti IDF standarte 99C/1997 nurodytą pamatinį metodą arba kitus palyginamus metodus, apie kuriuos jos praneša Komisijai.VI priede apibūdintos procedūros gali būti taikomos tikrinant vertintojų darbą ir rezultatų patikimumą.7 straipsnisMėginių ėmimas ir ginčai dėl analizės rezultatų1. Bendrijos taisyklėse numatytai analizei atlikti turi būti imami dubliuojami mėginiai.2. Kai veiklos vykdytojas analizės rezultatų nepripažįsta, taikoma VIII priede aprašyta procedūra.II SKYRIUSANALIZĖS METODAI8 straipsnisSviesto drėgmės, sausųjų neriebalinių medžiagų ir riebalų kiekio nustatymas1. IX priede aprašytas analizės metodas yra taikomas kaip pamatinis sviesto drėgmės kiekiui nustatyti.2. X priede aprašytas metodas yra taikomas kaip pamatinis sviesto sausųjų neriebalinių medžiagų kiekiui nustatyti.3. XI priede aprašytas metodas yra taikomas kaip pamatinis sviesto riebalų kiekiui nustatyti.9 straipsnisAtsekamosios medžiagos1. XII priede aprašytas metodas yra taikomas kaip pamatinis vanilinui koncentruotame svieste, svieste ir grietinėlėje nustatyti.2. XIII priede aprašytas metodas yra taikomas kaip pamatinis beta-apo-8' karotino rūgšties etilo esterių kiekiui koncentruotame svieste ir svieste nustatyti.3. XIV priede aprašytas metodas yra taikomas kaip pamatinis ß-sitosterolio arba stigmasterolio kiekiui svieste ir koncentruotame svieste nustatyti.4. Koncentruoto sviesto, sviesto ir grietinėlės tapatumas yra atsektas pagal atitinkamas Bendrijos taisykles, jei gauti rezultatai atitinka 1, 2 ir 3 dalyse nurodytų priedų 8 dalyje pateiktas specifikacijas.10 straipsnisKarvių pieno kazeino nustatymas1. XV priede aprašytas pamatinis analizes metodas yra taikomas siekiant užtikrinti, kad sūryje, kuris turi būti gaminamas tik iš avių, ožkų ar buivolių pieno arba šių gyvulių pieno mišinio, faktiškai nebūtų karvių pieno kazeino.Laikoma, kad produkte yra karvių pieno kazeino, kai matomas jo kiekis tiriamajame mėginyje yra lygus arba didesnis nei XV priede aprašytame etaloniniame mėginyje, kuriame yra 1 % karvių pieno, esantį kazeino kiekį.2. Įprastiniai 1 dalyje minimo karvių pieno kazeino aptikimo sūriuose metodai gali būti taikomi tada, kai:a) aptikimo riba yra 0, 5 % arba žemesnė,b) nepasitaiko tariamai teigiamų rezultatų,c) karvių pieno kazeinas yra nustatomas reikalaujamu jautrumu netgi po ilgų brandinimo laikotarpių, būdingų įprastinei prekybai.Jei nesilaikoma b punkte nurodyto reikalavimo, kiekvienas mėginys, kurio rezultatas yra teigiamas, turi būti tiriamas taikant pamatinį metodą.Jei nesilaikoma c punkte nurodyto reikalavimo vienos iš 1 dalyje nurodytų rūšių sūriui, šis sūris turi būti tiriamas taikant pamatinį metodą.11 straipsnisKoliforminių bakterijų nustatymas1. Koliforminėms bakterijoms svieste, nugriebto pieno milteliuose, kazeine ir kazeinėtuose nustatyti taikomas XVI priede aprašytas pamatinis metodas.2. Įprastiniai koliforminių bakterijų nustatymo metodai gali būti taikomi tuo atveju, jei gautus rezultatus galima palyginti su rezultatais, gautais taikant minėtame priede aprašytą pamatinį metodą. Svarbiausia, kad įprastiniai metodai turėtų adekvačią aptikimo ribą. Neturi būti gaunami tariamai neigiami rezultatai. Jei negalima išvengti tariamai teigiamų rezultatų, visi teigiami rezultatai turi būti patvirtinti taikant pamatinį metodą.12 straipsnisLaktozės kiekisLaktozės kiekio produktuose, klasikuojamuose pagal KN 2309 kodą, nustatymo metodas yra aprašytas XVII priede.13 straipsnisFermentinių išrūgų nustatymas1. Fermentinių išrūgųviešajam saugojimui skirtuose nugriebto pieno milteliuose nustatymo metodas yra aprašytas XVIII priede.2. Fermentinių išrūgų pašarams skirtuose nugriebto pieno milteliuose ir mišiniuose nustatymo metodas yra aprašytas XIX priede.14 straipsnisPasukų nustatymasPasukų nugriebto pieno milteliuose nustatymo metodas yra aprašytas XX priede.15 straipsnisAntimikrobinių medžiagų likučiaiAntibiotinių medžiagų ir sulfamido (dapsono) likučių nugriebto pieno milteliuose nustatymo metodas yra aprašytas XXI priede.16 straipsnisNugriebto pieno miltelių kiekisNugriebto pieno miltelių kiekio kombinuotuosiuose pašaruose nustatymo metodas yra aprašytas XXII priede.17 straipsnisKrakmolo nustatymasKrakmolo nugriebto pieno milteliuose, denatūruoto pieno milteliuose ir kombinuotuosiuose pašaruose nustatymo metodas yra aprašytas XXIII priede.18 straipsnisRūgščiųjų pasukų miltelių drėgnumasPašarams skirtų rūgščiųjų pasukų miltelių drėgmės kiekio nustatymo metodas yra aprašytas XXIV priede.19 straipsnisPašalinių riebalų nustatymasPašalinių riebalų pieno riebaluose nustatymo metodas yra aprašytas XXV priede.III SKYRIUSBAIGIAMOSIOS NUOSTATOS20 straipsnisReglamento (EB) Nr. 2771/1999 daliniai pakeitimaiReglamentas (EB) Nr. 2771/1999 iš dalies pakeičiamas taip:1. 4 straipsnio 1 dalies pirmas sakinys keičiamas taip: "Kompetentingos institucijos, taikydamos I priede aprašytus metodus ir remdamosi mėginiais, paimtais laikantis IV priede nustatytų taisyklių, patikrina sviesto kokybę".2. I priedo antra išnaša pakeičiama taip: "Žr. Reglamento (EB) Nr. 213/2001 I priedą".3. II ir III priedai išbraukiami.4. IV priedo 2 dalies priešpaskutiniame sakinyje žodžiai "pagal III priedą" keičiami žodžiais "pagal Reglamento (EB) Nr. 213/2001 VII priedą".21 straipsnisReglamento (EB) Nr. 2799/1999 daliniai pakeitimaiReglamentas (EB) Nr. 2799/1999 iš dalies pakeičiamas taip:1. 20 straipsnio 1, 2, 3 ir 4 dalys yra keičiamos šiomis dalimis:"1. Nugriebto pieno miltelių kiekis mišiniuose ir kombinuotuosiuose pašaruose nustatomas bent du kartus tiriant kiekvieną mėginį ir taikant Reglamento (EB) Nr. 213/2001 XXII priede aprašytą analizės metodą bei papildomai atliekant šio reglamento 17 straipsnio 3 dalyje numatytus patikrinimus. Jei šių patikrinimų rezultatai nesutaptų, lemia patikrinimo vietoje rezultatas.2. Fermentinių išrūgų nebuvimas įrodomas taikant Reglamento (EB) Nr. 213/2001 XIX priede aprašytą metodą.3. Krakmolo kiekis kombinuotuosiuose pašaruose nustatomas atliekant šio reglamento 17 straipsnio 3 dalyje numatytus patikrinimus ir papildomai taikant Reglamento (EB) Nr. 213/2001 XXIII priede aprašytą analizės metodą.4. Rūgščiųjų pasukų miltelių drėgmės kiekis nustatomas taikant Reglamento (EB) Nr. 213/2001 XXIV priede aprašytą analizės metodą."2. III, IV, V ir VI priedai išbraukiami.22 straipsnisPanaikinimaiReglamentai (EEB) Nr. 1216/68, (EEB) Nr. 3942/92, (EB) Nr. 86/94, (EB) Nr. 2721/95, (EB) Nr. 1854/96, (EB) Nr. 1080/96, (EB) Nr. 1081/96, (EB) Nr. 1082/96, (EB) Nr. 880/98 ir (EB) Nr. 1459/98 yra panaikinami.Nuorodos į panaikintus reglamentus laikomos nuorodomis į šį reglamentą.23 straipsnisĮsigaliojimasŠis reglamentas įsigalioja septintą dieną po jo paskelbimo Europos Bendrijų oficialiajame leidinyje.Tačiau III priede, IV priedo 4 dalyje, V, VI ir VIII prieduose aprašyti metodai yra taikomi praėjus 18 mėnesių po šio reglamento įsigaliojimo.Šis reglamentas yra privalomas visas ir tiesiogiai taikomas visose valstybėse narėse.Priimta Briuselyje, 2001 m. sausio 9 d.Komisijos varduFranz FischlerKomisijos narys[1] OL L 160, 1999 6 26, p. 48.[2] OL L 333, 1999 12 24, p. 11.[3] OL L 340, 1999 12 31, p. 3.[4] OL L 350, 1997 12 20, p. 3.[5] OL L 76, 2000 3 25, p. 9.[6] OL L 298, 1985 11 12, p. 9.[7] OL L 11, 1999 1 16, p. 14.[8] OL L 45, 1990 2 21, p. 8.[9] OL L 16, 1999 1 21, p. 19.[10] OL L 279, 1990 10 11, p. 22.[11] OL L 325, 1999 12 17, p. 10.[12] OL L 256, 1987 9 7, p. 1.[13] OL L 28, 2000 2 3, p. 16.--------------------------------------------------I PRIEDAS(2 straipsnis)PAMATINIŲ METODŲ SĄRAŠASVartojamos santrumpos:Min. = mažiausiai,maks. = daugiausiai,priedas = cituojamo reglamento priedas,SNM = sausosios neriebalinės medžiagos,LRR = laisvosios riebalų rūgštys,PS = peroksidų skaičius,I – = išvaizda,sk = skonis,Ks = konsistencija,BBS = bendras bakterijų skaičius,Therm. = termofilinių bkterijų skaičius,VN = valstybė narė,IDF = Tarptautinė pienininkystės federacija,ISO = Tarptautinė standartizacijos organizacija,IUPAC = Tarptautinė teorinės ir taikomosios chemijos sąjunga,ADPI = Amerikos pienininkystės institutas,SSP = saldintas sutirštintas pienas,SPG = sutirštintas pienas ir grietinėlė,SNPM = sausosios neriebalinės pieno medžiagos.1 pastaba : Riebalai atskiriami pagal IDF Standard 6B:1989 (apsauga nuo šviesos).2 pastaba : Pamatiniai metodai nenustatyti.3 pastaba : Mėginys ruošiamas pagal IDF Standard 122C:1996 arba IDF Standard 73A:1985.4 pastaba : Inkubuojama 48 val. 55° C temperatūroje saugant, kad neišdžiūtų terpė.5 pastaba : SNM %= SM %– R %.6 pastaba : Sviestas turi atitikti valstybėje narėje gamintojoje nustatytą nacionalinę kokzbės klasę, nurodytą Komisijos reglamento (EB) Nr. 2771/1999 V priede.7 pastaba : Komisijos direktyva 84/8/EEB.8 pastaba : Komisijos reglamentas (EB) Nr. 1758/94 (OL L 183, 1994 7 19, p. 14.).9 pastaba : Komisijos direktyva 78/633/EEB.A DALISKomisijos reglamentas | Produktas | Rodikliai | Ribos | Pamatinis metodas | Pastabos |Reglamentas (EB) Nr. 2771/1999 Viešasis saugojimas (OL L 333, 1999 12 24, p. 11.) | Nesūdytas sviestas | Pieno riebalai | Ne mažiau kaip 82 % | XI priedas | |Drėgmė | Ne daugiau kaip 16 % | IX priedas | |SNM | Ne daugiau kaip 2 % | X priedas | |LLR (maks.) | Ne daugiau kaip 1,2 mmol/100 g riebalų | IDF Standard 6B:1989 | |PS | Ne daugiau kaip 0,3 mekv. deguonies/1000 g riebalų | IDF Standard 74A:1991 (angliškas tekstas), | 1 pastaba |Koliforminės bakterijos | Neaptinkama 1 g | XVII priedas | 3 pastaba |Ne pieno riebalai | Neaptinkami trigliceridų analize | XXVI priedas | |Sterolo atsekamosios medžiagos | Neaptinkama | XIV priedas | |Kitos atsekamosios medžiagos: | | | |—vanilinas | Neaptinkama | XII priedas | |—karotino rūgšties etilo esteris | Neaptinkama | XIII priedas | |—enanto rūgšties trigliceridai | Neaptinkama | IUPAC 2.301 5 skyrius | |Juslinis įvertinimas | Ne mažiau kaip 4 balai iš 5 už I, Sk ir Ks | VII priedas | |Vandens dispersija | Ne mažiau kaip 4 balai | IDF Standard 112 A:1989 | |Reglamentas (EB) Nr. 2771/1999 Privatus saugojimas | Nesūdytas sviestas | Pieno riebalai | Ne mažiau kaip 82 % | XI priedas | 6 pastaba |Drėgmė | Ne daugiau kaip 16 % | IX priedas | |Reglamentas (EB) Nr. 2771/1999 Privatus saugojimas | Sūdytas sviestas | Pieno riebalai | Ne mažiau kaip 80 % | XI priedas | 6 pastaba |Drėgmė | Ne daugiau kaip 16 % | IX priedas | |Druska | Ne daugiau kaip 2 % | IDF Standard 12B:1988 | |Reglamentas (EB) Nr. 2571/97 (OL L 350, 1997 12 20, p. 3.) | Nesūdytas sviestas | Pieno riebalai | Ne mažiau kaip 82 % | XI priedas | |Drėgmė | Ne daugiau kaip 16 % | IX priedas | |Atsekamosios medžiagos: | | | |—sterolai | | XIV priedas | |—vanilinas | | XII priedas | |—karotino rūgšties etilo esteris | | XIII priedas | |—enanto rūgšties trigliceridai | | IUPAC 2.301 5 skyrius | |Reglamentas (EB) Nr. 2571/97 | Sūdytas sviestas | Pieno riebalai | Ne mažiau kaip 80 % | XI priedas | |Drėgmė | Ne daugiau kaip 16 % | IX priedas | |Valgomoji druska | Ne daugiau kaip 2 % | IDF Standard 12B:1988 | |Atsekamosios medžiagos: | | | |sterolai | | XIV priedas | |vanilinas | | XII priedas | |karotino rūgšties etilo esteris | | XIII priedas | |enanto rūgšties trigliceridai | | IUPAC 2.301 5 dalis | |Reglamentas (EB) Nr. 2571/97 | Koncentruotas sviestas | Pieno riebalai | Ne mažiau kaip 99,8 % | IDF Standard 24:1964 | |Drėgmė ir SNPM | Ne daugiau kaip 0,2 % | IDF Standard 23A:1988, IDF Standard 24:1964 | |LLR | Ne daugiau kaip 0,35 % (oleino) | IDF Standard 6B:1989 | |PS (maks.) | Ne daugiau kaip 0,5 mekv. deguonies/1000 g riebalų | IDF Standard 74A:1991 (angliškas tekstas) | 1 pastaba |Ne pieno riebalai | Turi nebūti | XXV priedas | |Skonis | Grynas | | |Kvapas | Turi nebūti pašalinio kvapo | | |Kiti | Turi nebūti neutralizuojančių medžiagų, antioksidantų ir konservantų | | |Atsekamosios medžiagos: | | | |—sterolai | | XIV priedas | |—vanilinas | | XII priedas | |—karotino rūgšties etilo esteris | | XIII priedas | |—enanto rūgšties trigliceridai | | IUPAC 2.301 5 skyrius | |Reglamentas (EB) Nr. 2571/97 | Grietinėlė | Riebalai | 35 % | IDF Standard 16C:1987 | |Atsekamosios medžiagos: | | | |—sterolai | | Kompetentingų institucijų patvirtintos metodikos | 2 pastaba |—vanilinas | | XII priedas | |—karotino rūgšties etilo esteris | | Kompetentingų institucijų patvirtintos metodikos | 2 pastaba |—enanto rūgšties trigliceridai | | IUPAC 2.301 5 skyrius | |Reglamentas (EEB) Nr. 429/90 (OL L 45, 1990 2 21, p. 8.) | Koncentruotas sviestas | Pieno riebalai | Ne mažiau kaip 96 % | Kompetentingų institucijų patvirtintos metodikos | 2 pastaba |SNM | Ne daugiau kaip 2 % | Kompetentingų institucijų patvirtintos metodikos | 2 pastaba |Atsekamosios medžiagos: | | | |—stigmasterolis (95 %) | 15 g/100 kg koncentruoto sviesto | XIV priedas | |—stigmasterolis (85 %) | 17 g/100 kg koncentruoto sviesto | XIV priedas | |—enanto rūgšties trigliceridai | 1,1 kg/100 kg sviesto koncentrato | IUPAC 2.301 5 skyrius | |—stigmasterolis ir sviesto rūgšties etilo esteris | Žr. priedo 1 punkto c papunktį | XIV priedas | 2 pastaba |—Lecitinas (E 322) | Ne daugiau kaip 0,5 % | Kompetentingų institucijų patvirtintos metodikos | 2 pastaba |NaCl | Ne daugiau kaip 0,75 % | IDF Standard 12B:1988 | |LRR | Ne daugiau kaip 0,35 % (oleino) | IDF Standard 6B:1989 | |PS (maks.) | Ne daugiau kaip | IDF Standard 74A:1991 (angliškas tekstas), | 1 pastaba |Skonis | Grynas | | |Kvapas | Turi nebūti pašalinio kvapo | | |Kiti | Turi nebūti neutralizavimo medžiagų, antioksidantų ir konservantų | | |Reglamentas (EEB) Nr. 2191/81 (OL L 213, 1981 8 1, p. 20.) | Nesūdytas sviestas | Pieno riebalai | Ne mažiau kaip 82 % | XI priedas | |Drėgmė | Ne daugiau kaip 16 % | IX priedas | |Reglamentas (EEB) Nr. 2191/81 | Sūdytas sviestas | Pieno riebalai | Ne mažiau kaip 80 % | XI priedas | |Drėgmė | Ne daugiau kaip 16 % | IX priedas | |Valgomoji druska | Ne daugiau kaip 2 % | IDF Standard 12B:1988 | |Reglamento (EB) Nr. 1255/1999 9 straipsnis ir II antraštinė dalis | Sūris, pagamintas iš avių ir (arba) ožkų pieno | Karvių pienas | < 1 % | XV priedas | |Reglamentas (EEB) Nr. 2921/90 | I priedas – Rūgštinis kazeinas | Drėgmė | Ne daugiau kaip 12 % | IDF Standard 78C:1991 | |Riebalai | Ne daugiau kaip 1,75 % | IDF Standard 127A:1988 | |Laisvasis rūgštingumas | Ne daugiau kaip 0,30 % (pieno rūgšties) | IDF Standard 91:1979 | |Reglamentas (EEB) Nr. 2921/90 | I priedas – Fermentinis kazeinas | Drėgmė | Ne daugiau kaip 12 % | IDF Standard 78C:1991 | |Riebalai | Ne daugiau kaip 1,00 % | IDF Standard 127A:1988 | |Pelenai | Ne mažiau kaip 7,50 % | IDF Standard 90:1979 | |Reglamentas (EEB) Nr. 2921/90 | I priedas – Kazeinatai | Drėgmė | Ne daugiau kaip 6,0 % | IDF Standard 78C:1991 | |Pieno baltymai | Ne mažiau kaip 88,00 % | IDF Standard 92:1979 | |Riebalai ir pelenai | Ne daugiau kaip 6,0 % | IDF Standard 127A:1988, IDF Standard 89:1979 arba | |Reglamentas (EEB) Nr. 2921/90 | II priedas – Rūgštinis kazeinas | Drėgmė | Ne daugiau kaip 10,0 % | IDF Standard 78C:1991 | |Riebalai | Ne daugiau kaip 1,5 % | IDF Standard 127A:1988 | |Laisvasis rūgštingumas | Ne daugiau kaip 0,20 % (pieno rūgšties) | IDF Standard 91:1979 | |BBS (maks.) | Ne daugiau kaip 30000/1 g. | IDF Standard 100B:1991arba | 3 pastaba |Koliforminės bakterijos | Turi nebūti 0,1 g | XVI priedas | 3 pastaba |Termofilinės bakterijos (maks.) | Ne daugiau kaip 5000/1 g | IDF Standard 100B:1991 | 3 ir 4 pastabos |Reglamentas (EEB) Nr. 2921/90 | II priedas – Fermentinis kazeinas | Drėgmė | Ne daugiau kaip 8,0 % | IDF Standard 78C:1991 | |Riebalai | Ne daugiau kaip 1,0 % | IDF Standard 127A:1988 | |Pelenai | Ne daugiau kaip 7,50 % | IDF Standard 90:1979 | |BBS (maks.) | 30000/1 g | IDF Standard 100B:1991 | 3 pastaba |Koliforminės bakterijos | Turi nebūti 0,1 g | XVI priedas | 3 pastaba |Termofilinės bakterijos | Ne daugiau kaip 5000/1 g | IDF Standard 100B:1991 | 3 ir 4 pastabos |Reglamentas (EEB) Nr. 2921/90 | II priedas – Kazeinatai | Drėgmė | Ne daugiau kaip 6,0 % | IDF Standard 78C:1991 | |Pieno baltymai | Ne mažiau kaip 88,0 % | IDF Standard 92:1979 | |Riebalai ir pelenai | Ne daugiau kaip 6,0 % | IDF Standard 127A:1988, IDF Standard 89:1979 arba | |BBS (maks.) | Ne daugiau kaip 30000/1 g | IDF Standard 100B:1991 | 3 pastaba |Koliforminės bakterijos | Turi nebūti 0,1 g | XVI priedas | 3 pastaba |Termofilinės bakterijos (maks.) | Ne daugiau kaip 5000/1 g | IDF Standard 100B:1991 | 3 ir 4 pastabos |Reglamentas (EEB) Nr. 2921/90 | III priedas – Kazeinatai | Drėgmė | Ne daugiau kaip 60,0 % | IDF Standard 78C:1991 | |Pieno baltymai | Ne mažiau kaip 85,00 % | IDF Standard 92:1979 | |Riebalai | Ne daugiau kaip 1,5 % | IDF Standard 127A:1988 | |Laktozė | Ne daugiau kaip 1,0 % | IDF Standard 106:1982 | |Pelenai | Ne daugiau kaip 6,5 % | IDF Standard 89:1979 arba | |BBS (maks.) | Ne daugiau kaip 30000/1 g. | IDF Standard 100B:1991 | 3 pastaba |Koliforminės bakterijos | Turi nebūti 0,1 g | XVI priedas | 3 pastaba |Termofilinės bakterijos (maks.) | Ne daugiau kaip 5000/1 g. | IDF Standard 100B:1991 | 3 ir 4 pastabos |Reglamentas (EB) Nr. 2799/1999 (OL L 340, 1999 12 31, p. 3.) | Kombinuotieji pašarai ir nugriebto pieno milteliai, (NPM), skirti gyvuliams šerti | Drėgmė (rūgščiųjų pasukų miltelių) | Ne daugiau kaip 5 % | | |Baltymai | Ne mažiau kaip 31,4 % sausųjų neriebalinių medžiagų | IDF Standard 20B:1993 | |Drėgmė (NPM) | Ne daugiau kaip 5 % | IDF Standard 26A:1993 | |Riebalai (NPM) | Ne daugiau kaip 11 % | IDF Standard 9C:1987 | |Fermentinės išrūgos (NPM) | Turi nebūti | XIX priedas | 7 pastaba |Krakmolas (NPM) | Turi nebūti | XXIII priedas | |Drėgmė (mišiniuose) | Ne daugiau kaip 5,0 % sausosios neriebalinės medžiagos | IDF Standard 26A:1993 | |Riebalinės medžiagos (mišiniuose) | — | Komisijos direktyva 84/4/EEB (OL L 15, 1984 1 18, p. 28.) | |Fermentinės išrūgos (mišiniuose) | Turi nebūti | XIX priedas | |NPM kiekis (galutiniame produkte) | Ne mažiau kaip 50 % | XXII priedas | 7 pastaba |Riebalai (galutiniame produkte) | Ne mažiau kaip 2,5 % | Komisijos direktyva 84/4/EEB | 8 pastaba |Krakmolas (galutiniame produkte) | Ne mažiau kaip 2 % | XXIII priedas | 9 pastaba |Varis (galutiniame produkte) | 25 ppm (mg/kg) | Komisijos direktyva 78/633/EEB (OL L 206, 1987 7 26, p. 43.) | |Reglamentas (EB) Nr. 322/96 (OL L 45, 1996 2 23, p. 5.) | Purkštinio džiovinimo NPM | Riebalai | Ne daugiau kaip 1,0 % | IDF Standard 9C:1987 | |Baltymai | Ne mažiau kaip 31,4 % SNM | IDF Standard 20B:1993 | |Drėgmė | Ne daugiau kaip 3,5 % | IDF Standard 26A:1993 | |Rūgštingumas | Ne daugiau kaip 19,5 ml | IDF Standard 86:1981 | |Laktatai | Ne daugiau kaip 150 mg/100 g | IDF Standard 69B:1987 | |Fosfatazė | Neigiama | ISO Standard 3356:1975 | |Tirpumas | Ne daugiau kaip 0,5 ml 24 °C temperatūroje | IDF Standard 129A:1988 | |Suskrudę dalelės | Diskas B (15,0 mg) | ADPI:1990 | |BBS | 40000/1 g | IDF Standard 100B:1991 | 3 pastaba |Koliforminės bakterijos | Neigiama 0,1 g | XVI priedas | 3 pastaba |Pasukos | Neigiama | XX priedas | |Fermentinės išrūgos | Neigiama | XVIII priedas | |Rūgščios išrūgos | Neigiama | Kompetentingų institucijų patvirtintas metodas | 2 pastaba |Antimikrobinės medžiagos | | XXI priedas | |B DALISŠioje dalyje išvardyti metodai taikomi analizuoti produktams, kuriems taikomi 1 stulpelyje nurodyti ES reglamentaiKomisijos reglamentas | Produktas | KN kodas | Parametras | Ribos | Pamatinis metodas | Pastabos |Reglamentas (EEB) Nr. 2658/87 (OL L 256, 1987 9 7, p. 1.) Reglamentas (EB) Nr. 2414/98 (OL L 299, 1998 11 10, p. 7.) Reglamentas (EB) Nr. 1374/98 (OL L 185, 1998 6 30, p. 21.) Reglamentas(EB) Nr. 2508/97 (OL L 345, 1997 12 16, p. 31.) Reglamentas (EB) Nr. 174/1999 (OL L 20, 1999 1 27, p. 8.) | Nekoncentruotas pienas ir grietinėlė, į kuriuos nepridėta cukraus ar kitų saldiklių | 0401 | Riebalai (≤ 6 %) | Kiekvieno produkto ribos nurodytos KN kodas, išsamiau nurodytos, jei taikoma, Komisijos reglamente (EEB) Nr. 3846/87 (OL L 366, 1987 12 24.) Eksporto nomenklatūros 9 dalyje arba Reglamente (EB) Nr. 1374/98 (OL L 185 1998 06 30, p. 21.) | IDF Standard 1D:1996 | |Riebalai (> 6 %) | IDF Standard 16C:1987 | |Pienas ir grietinėlė, koncentruoti arba į kuriuos pridėta cukraus ar kitų saldiklių | 0402 | Riebalai (skysti) | IDF Standard 13C:1987 | |Riebalai (kieti) | IDF Standard 9C:1993 | |Baltymai | IDF Standard 20B:1993 | |Sacharozė (normalus kiekis) | IDF Standard 35A:1992 | |Sacharozė (mažas kiekis) | Kompetentingų institucijų patvirtintos metodikos | 2 pastaba |Sausosios medžiagos (SSP) | IDF Standard 15B:1991 | |Sausosios medžiagos (SPG) | IDF Standard 21B:1987 | |Drėgmė (sausasis pienas ir grietinėlė) | IDF Standard 26A:1993 | |Pasukos, rūgpienis ir grietinė, jogurtas, kefyras ir kitoks fermentuotas arba raugintas pienas ir grietinėlė, koncentruoti arba nekoncentruoti, į kuriuos pridėta arba nepridėta cukraus ar kitų saldiklių arba aromatinių medžiagų | 0403 | Riebalai | IDF Standards 1D:1996, 9C:1987, 16C:1987, 22B:1987, 126A:1988 | |Baltymai | IDF Standard 20B:1993 | |Sacharozė (normalus kiekis) | IDF Standard 35A:1992 | |Sacharozė (mažas kiekis) | Kompetentingų institucijų patvirtintos metodikos | 2 pastaba |Drėgmė (rūgščiųjų pasukų milteliai) | XXIV priedas | |Drėgmė (saldžių pasukų milteliai) | IDF Standard 26A:1993 | |Sausosios medžiagos (kiti produktai) | Kompetentingų institucijų patvirtintos metodikos | |Išrūgos, koncentruotos arba nekoncentruotos, į kurias pridėta arba nepridėta cukraus ar kitų saldiklių; produktai iš natūralių pieno sudedamųjų dalių | 0404 | Riebalai | IDF Standard 9C:1987, 16C:1987, 22B:1987 | |Baltymai | IDF Standard 20B:1993 | |Sacharozė (normalus kiekis) | IDF Standard 35A:1992 | |Sacharozė (mažas kiekis) | Kompetentingų institucijų patvirtintos metodikos | 2 pastaba |040490 | Baltymai | IDF Standard 20B:1993 | |Drėgmė | IDF Standard 26A:1993 | |Sausosios medžiagos | IDF Standard 15B:1991 | |(Koncentruotų produktų) | IDF Standard 21B:1987 | |Sviestas ir kiti pieno riebalai ir aliejai; pieno pastos | 0405 | Riebalai (jeigu jų ≤ 85 %) | XI priedas | |Drėgmė | IX priedas | |Sviestas | SNM | X priedas | |NaCl | IDF Standard 12B:1988 | |Lydytas sviestas | Riebalai (jeigu jų > 99 %) | IDF Standard 24:1964 | |Drėgmė (jeigu riebalų > 99 %) | IDF Standard 23A:1988 | |Sūris ir varškė | 0406 | Riebalai | IDF Standard 5B:1986 | |Sausosios medžiagos | IDF Standard 4A:1982 | |Sausosios medžiagos (sūris Ricotta) | IDF Standard 58:1970 | |NaCl | IDF Standard 88A:1988 | |Laktozė | IDF Standard 79B:1991 | |Reglamentas (EEB) Nr. 2658/87 | Kombinuotieji pašarai | 2309 | Laktozė | | XVII priedas | |--------------------------------------------------II PRIEDAS(3 straipsnis)ĮPRASTINIAIS METODAIS GAUTŲ REZULTATŲ, KURIE YRA ARTIMI RIBOMS NURODYTOMS SUDĖTIES IR KOKYBĖS REIKALAVIMŲ REGLAMENTUOSE, TIKRINIMASJeigu m0 yra riba, nurodyta sudėties ir kokybės reikalavimų reglamente, tai nustatymo (sprendimo) riba L yraL = mojeigu Rįpr/Rpam≤ 1Rįpr : įprastinio metodo atkuriamumo riba;Rpam : pamatinio metodo atkuriamumo riba.Jeigu mo yra viršutinė riba, o Rįpr/Rpam > 1, tai nustatymo riba apskaičiuojama pagal formulę:L = m-R/R· CrD95Jeigu tokiomis pačiomis sąlygomis m0 yra apatinė riba, tai nustatymo riba apskaičiuojama pagal formulę:L = m+R/R· CrD95kai CrD95 pamatinio metodo kritinis skirtumas (žr. IV priedą).Kai m0 yra viršutinė riba, įprastiniu metodu gautas galutinis rezultatas, viršijantis sprendžiamąją ribą, turi būti pakeičiamas pamatiniu metodu gautu galutiniu rezultatu. Šis galutinis rezultatas turi būti grindžiamas ne mažesniu skaičiumi analizių (mėginių) kaip įprastiniu metodu gautas galutinis rezultatas.Kai m0 yra apatinė riba, tokia pati procedūra turi būti taikoma įprastiniu metodu gautam galutiniam rezultatui, esančiam žemiau sprendžiamosios ribos.Pastaba.Aukščiau aprašyta metodika gali būti taikoma, jeigu nėra aptinkamų matricos efektų.Matricos efektai gali būti aptinkami nustatant kiekvieno kalibravimui naudojamo mėginio analizės rezultatų, gautų pamatiniu ir įprastiniu metodu, skirtumą wi.Standartinis nuokrypis, apskaičiuojamas pagal formulęs=∑wi2/2mm : kalibravimui naudojamų mėginių skaičiuspalyginamas su pamatinio ir įprastinio metodų standartinių pakartojamumo nuokrypių aritmetiniu vidurkius=s+ srįpr2/2Matricos efekto atmesti negalima, jeigu+++++ TIFF +++++kai:f = m (f – laisvės laipsnių skaičius);α = paklaidos tikimybė; α = 0,05.Šiuo atveju, kad galėtų būtų galima fiksuoti nustatymo ribą, reikia papildomo tyrimo.--------------------------------------------------III PRIEDAS(4 ir 5 straipsniai)a) Atitikimo su žinoma atkuriamumo riba nustatymo procedūra (cheminė analizė)Kaip paisoma atkuriamumo ribos tikrinama palyginant laboratorijos rezultatus su patyrusios laboratorijos [1] rezultatais, gautais naudojant tapačius mėginius. Abiejose laboratorijose nustatymas atliekamas po du kartus, o rezultatai įvertinami pagal formulę:CrD|yy=r2kai:CrD95 : kritinis skirtumas (P = 0,95),y—1 : dviejų 1-osios laboratorijos gautų rezultatų aritmetinis vidurkis;y—2 : dviejų 2-osios laboratorijos gautų rezultatų aritmetinis vidurkis;R : atkuriamumo riba, nustatoma interpoliavimo būdu,r : pakartojamumo riba, jei preciziškumas reikiamo lygio.Jeigu kritinis skirtumas viršijamas, tai per du mėnesius turi būti atliktas kitas eksperimentas. Jeigu antrojo eksperimento rezultatai neatitinka atkuriamumo ribos, įgaliotos institucijos privalo imtis būtinų priemonių.b) Laikinosios atkuriamumo ribos nustatymo procedūra (cheminė analizė)Laikinoji atkuriamumo riba Rlaik nustatoma pagal lygtį:R=y+r22kai:y—1 : dviejų 1-osios laboratorijos gautų rezultatų vidurkis;y—2 : dviejų 2-osios laboratorijos gautų rezultatų vidurkis (žr. IIIa priedą);r : pakartojamumo riba arba laikinoji pakartojamumo riba.Pastabos:1. Rlaik gali būti naudojama skaičiuojant kritinius skirtumus (žr. VI priedą).2. Rlaik prilyginamas 2r, jeigu apskaičiuotoji Rlaik vertė yra mažesnė kaip 2r.3. RSDR c [2] lygties, tai Rlaik vertė yra nepriimtinai didelė ir jos negalima naudoti kritiniam skirtumui skaičiuoti.4. Rlaik turi būti nustatomas mažiausiai kartą per metus remiantis dviejose laboratorijose gautais rezultatais (žr. IV priedą).5. Kritiniams skirtumams skaičiuoti turi būti naudojamas Rlaik vidurkis. Rlaik vidurkiui taikomos 2ojoje ir 3-ojoje pastabose nurodytos taisyklės.Atkuriamumo riba (R vertė) gaunama iš apskaičiuotos RSDR vertės pagal formulę:R= 0,0283RSDRx— : aritmetinis gautų rezultatų vidurkis.Keletas apskaičiuotų RSDR verčių pavyzdžių:Koncentracija | RSDR, % |1 g/100 g | 4 |0,01 g/100 g | 8 |1 mg/1000 g | 16 |Kai analitės koncentracija yra 1 g/100 g, gaunamaR = 0,0283*1*4 = 0,11 g/100 g.[1] Patyrusioji laboratorija turėtų būti viena iš laboratorijų, sėkmingai dalyvavusių įteisinant tyrimų metodą arba tikrinant laboratorijų patyrimą.[2] koncentracija, išreikšta dešimtaine trupmena (pvz., 10 g/100 g = 0,1).Naudota literatūra:Peeler J.T., Horwitz W., Albert R.Journal of the Association of Official Analytical Chemists.1989, t. 72, Nr.5, p. 784–806.--------------------------------------------------IV PRIEDAS(4 straipsnis)ĮTEISINTAIS METODAIS GAUTŲ ANALIZĖS REZULTATŲ ĮVERTINIMASJeigu analizės rezultatas rodo, kad riba yra viršijama, apskaičiuojamas dviejų ar daugiau gautų rezultatų aritmetinis vidurkis. Tai turi būti daroma taip:1) Kai analizės rezultatas atitinka vienintelio nustatymo rezultatą, turi būti atliekama kita analizė pakartojamumo sąlygomis. Jeigu dvi analizės negali būti atliktos pakartojamumo sąlygomis, atliekamos papildomos dvi analizės pakartojamumo sąlygomis ir šie rezultatai naudojami įvertinti ar paisoma kritinio skirtumo.2) Nustatomas absoliutinis skirtumas tarp pakartojamumo sąlygomis gautų rezultatų aritmetinio vidurkio ir ribos. Jeigu skirtumo absoliutinė vertė viršija kritinį skirtumą, tai reiškia, kad analizuotas mėginys neatitinka reikalavimų.Kritinis skirtumas nustatomas pagal formulę:CrDy- m=2nkai:y— : gautų rezultatų aritmetinis vidurkis;mo : riba;n : analizių (mėginių) skaičius.Jeigu tikslumas reikiamo lygio, tai r ir R gali tekti nustatyti interpoliavimo būdu.Paprastai pateiktas galutinis mėginio analizės rezultatas turi rodyti, kad jis atitinka ribas.Galutiniai rezultatai:- nuo miki m+ CrD, jeigu riba yra maksimali- nuo miki m+ CrD, jeigu riba yra minimali,gali pasitaikyti tik išimtinais atvejais.Galutiniai rezultatai, patenkantys į minėtus ruožus, yra priimtini tik tuo atveju, jeigu pasitaiko ne daugiau kaip kartą iš kiekvienų penkių siuntos mėginių. Jeigu yra analizuojami mažiau kaip penki mėginiai iš siuntos, tai yra priimtinas tik vienas rezultatas, patenkantis į minėtus ruožus. Tačiau jeigu gamintojas pakartotinai tiekia siuntas, turi būti laikomasi taisyklės, kad gali būti priimtinas tik vienas rezultatas, patenkantis į minėtus ruožus per penkis tikrintus mėginius.3) Jeigu galutinis rezultatas x yra apskaičiuojamas pagal formulę x = y1 ± y2 (pvz., skaičiuojant sviesto riebalų kiekį, reikia drėgmės plius sviesto sausosios neriebalinės medžiagos kiekio), o y1 ir y2 yra vieno tipo analizių galutiniai rezultatai, tai x galutinių rezultatų pakartojamumas rx ir atkuriamumas Rx apskaičiuojami taip:r=2r12+ r22R=2R12+ R22kai r1 ir r2 atitinkamaiyra y1 ir y2 pakartojamumo ribos, o R1 ir R2 – atkuriamumo ribos.x palyginamas su m0, vadovaujantis 1 ir 2 punktuose nurodytomis taisyklėmis. Kritinis skirtumas nustatomas pagal formulę:CrDx - m=2nkai x – gautų x1 rezultatų aritmetinis vidurkis.4) Jeigu galutinis rezultatas apskaičiuojamas pagal tokią formulę:x =yy2(pavyzdys – sūrio sausosios medžiagos riebalų kiekis),kai y1 ir y2 yra vieno tipo analizės galutiniai rezultatai, tai absoliučias pakartojamumo rx ir atkuriamumo ribas Rx galima apskaičiuoti taip:r= μx2r*12+ r*22R= μx2R*12+ R*22μ= μ|μ2μ1 : riba arba norima vertė, atitinkanti y1 (pvz., riebalai);μ2 : riba arba norima vertė, atitinkanti y2 (pavyzdžiui, sausoji medžiaga).r=rμ≤ 0,15r=rμ≤ 0,15kai:r1 : pakartojamumo riba, y1;r2 : pakartojamumo riba, y2.R=Rμ≤ 0,15R=Rμ≤ 0,15kai:R1 : atkuriamumo riba, y1;R2 : atkuriamumo riba, y2.rx ir Rx apskaičiavimo procedūros tinka tik tuo atveju, kai santykinės pakartojamumo ir atkuriamumo ribos (,,,) yra ne didesnės kaip 0,15.x yra lyginamas su riba μx vadovaujantis 1 ir 2 punktuose nurodytomis taisyklėmis. Kritinis skirtumas nustatomas pagal formulę:CrDx- μ=2nkaixchronologine tvarka [1] gautų x rezultatų aritmetinis vidurkis.[1] Pastaba.Pavyzdžiui, jeigu yra gauti y11, y12,y21 ir y22 rezultatai, turi būti apskaičiuojami y11/y21 ir y12/y22 aritmetiniai vidurkiai.--------------------------------------------------V PRIEDAS(5 straipsnis)VIDAUS KONTROLĖa) Vidaus kokybės kontrolės (VKK; angl. IQC) procedūra (cheminė analizė)Kontrolinės medžiagos apibūdinimasVKK tikslams naudojama medžiaga, kuri tiriama visai pagal tokią pat arba iš dalies tokią pat procedūrą kaip ir tiriamosios medžiagos.Kontroline medžiaga gali būti:- sertifikuota etaloninė medžiaga,- savoji etaloninė medžiaga,- tarplaboratoriniais testais patvirtinta medžiaga,- medžiaga su pridėtu ieškomu komponentu.VKK diegimo procedūraLaboratorija turėtų diegti VKK pagal IUPAC dokumente Harmonized Guidelines for Internal Quality Control in analytical laboratories [1]. (Vieningos taisyklės vidaus kokybės kontrolei analizinėse laboratorijose diegti) aprašytą procedūrą.VKK atliekama įterpiant kontrolines medžiagas į analizių seką arba kartojant tiriamojo mėginio tyrimą. Kontrolinių medžiagų cheminė sudėtis turi būti panaši kaip tiriamųjų mėginių, jos turi būti pakankamai stabilios reikiamą laiką. Turi būti akivaizdu, kad jos gali būti tinkamai padalytos į identiškas dalis su reikiamas ribas atitinkančia analitės koncentracija.Kontrolinės medžiagos turi būti įterpiamos ne mažiau kaip vieną kartą į kiekvieną analizių seriją, o gautos vertės turi būti atidedamos kontrolės diagramoje, kad būtų galima įvertinti ilgalaikes paklaidas. Be to, laboratorija turi periodiškai parodyti, kad analizių serijoje išlaikomos pakartojamumo sąlygos. Tai gali būti padaroma kartojant kontrolinės medžiagos ir (arba) tiriamosios medžiagos analizes. Šių analizių rezultatai turėtų būti palyginami su paskelbtais pakartojamumo duomenimis ir turimais pačios laboratorijos tikslumo duomenimis.Kai naudojamos kontrolinės medžiagos, tai gautos kontrolinių medžiagų tarpserijinių analizių parametrų vertės turi būti atidedamos Shewhart'o diagramoje (ISO 8258 (1991) su reikiamomis kontrolinėmis ribomis. Kontrolinės ribos turi būti nurodomos tiesx ± 3s,kai st bendrasis standartinis nuokrypiso įspėjamosios ribos – tiesx ± 2stBendrasis standartinis nuokrypis:s=2sb2+ sw2/nkai:sb : tarpserijinis standartinis nuokrypis;sw : serijos standartinis nuokrypis;n : analizių skaičius.Tuo atveju, kai kontrolinės medžiagos nenaudojamos (pvz., dėl stabilumo stokos), kiekvienoje analizių serijoje mažiausiai vienos iš tiriamųjų medžiagų analizė turi būti kartojama.Serijos dubliuojamų analizių (žr. III priedą) rezultatų absoliutusis skirtumas turi būti atidedamas diagramoje. Centrinė linija yra 1,128 sw, žemutinė riba 0, viršutinė riba (reagavimo riba) 3,686 sw. kai sw yra serijos standartinis nuokrypis.Kai koncentracijos ribos plačios, kontrolės metodika turi numatyti mažos ir didelės koncentracijos medžiagas.Jeigu tiriamosios medžiagos apima platų analitės koncentracijų ruožą, laboratorija turi nustatyti ryšį tarp tikslumo ir koncentracijos lygio. Jeigu tikslumas yra proporcingas koncentracijai, tolesnė kontrolė turi būti grindžiama santykiniu tikslumu (t.y. absoliutiniu skirtumu, išreikštu vidurkio procentais).Analizių sistemos būsena nekontroliuojama, jeigu yra bet kuri iš šių sąlygų:A. Diagramoje užrašoma vertė patenka už reagavimo ribų.B. Užrašoma vertė ir ankstesnioji vertė patenka už perspėjamųjų ribų, bet lieka tarp reagavimo ribų.C. Kai naudojamos kontrolinės medžiagos, – devynios iš eilės vertės patenka į tą pačią pusę nuo vidurkio linijos.Į nekontroliuojamą būseną laboratorija turi reaguotiA. sustabdydama analizes iki bus padaryti diagnostiniai tyrimai ir imtasi korekcinių veiksmų, arbaB. atmesdama rezultatų seriją ir pakartodama tiriamosios medžiagos analizę.b) Savų kontrolinių medžiagų parinkimo ir pačios laboratorijos tikslumo ribų nustatymo procedūra (cheminė analizė)Pačioje laboratorijoje preciziškumas gali būti pasiektas kartotine kontrolinių medžiagų ir (arba) tiriamųjų mėginių analize.Laboratorijos, nustatydamos analizių serijų rezultatų kitimo ir tarpserijinio kitimo preciziškumo parametrus, vėliau naudojamus sudarant kontrolės diagramas, turi vadovautis toliau aprašoma procedūra. Laboratorijos gali pritaikyti ir kitokias procedūras su sąlyga, jeigu jas taikant gaunami duomenys yra patikimo preciziškumo.1. Kontrolinių medžiagų parinkimasKai laboratorija naudoja kontrolines medžiagas, pirmiausia turi būti sukaupiami duomenys, kad būtų galima nustatyti ribas. Kai įmanoma, turi būti naudojamos sertifikuotos etaloninės medžiagos (SEM). Galimos kontrolinės medžiagos turi būti analizuojamos pakartojamumo sąlygomis analizių serijoje, į seriją atsitiktine tvarka įterpiant tinkamas SEM, su pakartojimu. Kai šis būdas yra neįmanomas, laboratorijos turi stengtis dalyvauti patyrimo nustatymo testuose ir sutarimu nustatyti sutartinius vidurkius (priskirtines vertes), kurie gali būti laikomi sutartiniu tikruoju vidurkiu, kuriam būdinga tam tikra neapibrėžtis. Kitos procedūros numato tikrųjų verčių nustatymą skaičiuojant arba specialiai užkrėstų (angl. spiked) kontrolinių medžiagų naudojimą.Be to, kai laboratorija reguliariai atlieka tokias analizes ir jau yra įdiegusi statistinę kontrolę, kokios nors naujos kontrolinės medžiagos (pvz., reikalingos todėl, kad pasibaigė atsargos) turi būti parenkamos atsižvelgiant į analizes, kurios yra kontroliuojamos naudojant esamas medžiagas.2. Ribų nustatymasTurėdama parinktą kontrolinę medžiagą, laboratorija turi naudoti ją, nustatydama serijos ir tarpserijinio tikslumo parametrus.Reikalaujama, kad nustatant tikslumą serijoje dviguba kontrolinės medžiagos analizė būtų atliekama mažiausiai 12 kartų. Dubliuojamos analizės turi būti daromos pakartojamumo sąlygomis, t.y. to paties analitiko, su tais pačiais reagentais ir t.t. Dubliuojamos kontrolinės medžiagos analizės turi būti įterptos į analizių seriją atsitiktine tvarka. Kiekviena dubliuojamoji analizė turi būti daroma atskirą dieną per laiko tarpą, kad teisingai atspindėtų kitimą tarp serijų, įvertinant normalius kitimus, pavyzdžiui, reagentų, matuoklių pakartotino kalibravimo ir, jeigu reikia, skirtingų analitikų.Pastaba.Duomenų, kurie netiksliai reprezentuoja tarpserijinį kitimą, naudojimas gali lemti nereikalingą analizių kartojimą dėl nustatytų pernelyg griežtų ribų. Priešingai, laboratorija, pateikianti pernelyg netikslius tikslumo duomenis, gali negebėti atitikti pamatiniuose metoduose nustatytų ribų, gali tikėtis pasirodyti kaip prastesnė lyginant su panašaus lygio laboratorijomis ir gali negauti numatytam tikslui tinkamų duomenų.2.1. Preciziškumo serijoje nustatymas2.1.1. Preciziškumas serijoje, kai naudojama kontrolinė medžiagaDubliuojami duomenys (mažiausiai 12 porų) pirmiausia turi būti tikrinami pagal Cochran'o didžiausiosios dispersijos kriterijų. Tai atitinka didžiausio dubliuojamų duomenų poros skirtumo kvadrato ir duomenų porų skirtumų kvadratų sumos santykį:c =dmax∑di2kai:di = dubliuojamų duomenų poros skirtumas.Cochran'o kriterijaus c vertė lyginama su lentelėse pateiktomis vertėmis (ISO 5725:1994). Kai vertė gali būti priskirta išsimėčiusioms arba atmestinoms, toks rezultatas turi būti ištirtas, kad būtų nustatyta, ar tai yra, pavyzdžiui, techninė klaida, skaičiavimo klaida, apsirikimas atliekant analizę, blogo mėginio analizė. Jeigu išaiškinta techninės klaidos esmė yra tokia, kad ji rodo, jog abejotino rezultato negalima pakeisti, jis turi būti atmestas kaip tikrai netinkamas. Jeigu lieka išsimėčiusių arba atmestinų rezultatų, kurių neįmanoma paaiškinti, išsimėtę rezultatai yra laikomi tinkamais, o statistiškai atmestini atmetami. Laboratorija turi stengtis gauti papildomų rezultatų verčių.Kai laboratorija jau yra įsitikinusi, kad nebėra atmestinų duomenų, serijos standartinis nuokrypis sw gaunamas taip, kaip toliau aprašyta.Kiekvienos iš p dubliuojamų duomenų poros xi1, xi2 sumas= x+ xi2ir dubliuojamų duomenų skirtumasd= x- xi1apskaičiuojami ir susumuojami taip:A = ∑siB = ∑di2C = ∑si2Serijos standartinio nuokrypis yra:s=2B2pLeidžiamoji savojo tikslumo riba yra 2,8 sw.Jeigu naudojamas pamatinis metodas, leidžiamoji savojo tikslumo riba turi būti palyginama su paskelbtu ribiniu leidžiamuoju pakartojamumu. Laboratorija turi vykdyti pamatinio metodo reikalavimus. Turi būti ištirtos šio reikalavimo neatitikimo priežastys.Apibrėžtos ribos turi būti laikomos laikinomis ir peržiūrimomis.2.1.2. Preciziškumas serijoje, kai nėra kontrolinės medžiagosLaboratorija gali nuspręsti nustatyti preciziškumą serijoje dubliuojamomis reprezentatyviųjų mėginių analizėmis (mažiausiai 12 dubliuojamų analizių). Tais atvejais, kai neįmanoma naudoti kontrolines medžiagas, pavyzdžiui, dėl nestabilumo, dubliuojami duomenys turi būti renkami pagal šį metodą.Pastaba.Laikoma, kad šios analizės apima palyginti siaurą verčių ruožą, todėl visiems mėginiams gali būti priskirta viena vertė. Tais atvejais, kai rezultatų ruožas yra platesnis, pavyzdžiui, viršija didumo eilę, o tikslumas priklauso nuo koncentracijos lygio, laboratorijos turi ištirti galimybę naudoti santykinius standartinius nuokrypius.Duomenys turi būti tikrinami pagal Cochran'o kriterijų kaip nurodoma 2.1.1. Kai laboratorija jau yra tikra, kad duomenys yra be atmestinųjų, serijos standartinis nuokrypis ir savoji leidžiamoji tikslumo riba gaunama taip, kaip aprašyta.Serijos standartinis nuokrypis sw gali būti naudojamas kontrolės diagramoms sudaryti (žr. II priedą). Apibrėžtos ribos turi būti laikomos laikinomis ir peržiūrimomis.2.2. Preciziškumo serijoje nustatymasApskaičiuojamas kiekvienos poros vidurkis si/2 ir jie tikrinami pagal Grubbs'o kriterijų (ISO 5725:1994). Atmestinųjų ar išsimėčiusiųjų duomenų atmetimo ir priėmimo kriterijus yra toks, koks aprašytas 2.1.1 punkte. Laboratorija turi stengtis gauti pakaitinių verčių bet kuriam atmestam rezultatui pakeisti. Kai laboratorija jau yra įsitikinusi, kad duomenys yra be atmestinųjų, apskaičiuojamas tarpserijinis standartinis nuokrypis sb.s=1C -B -A2parba yra lygus nuliui, jeigu pošaknio reiškinio ženklas yra neigiamas.Bendrasis standartinis nuokrypis sb naudojamas n analizių vidurkio kontrolės diagramoms sudaryti (žr. II priedą). Apibrėžtos ribos turi būti laikomos laikinomis ir peržiūrimomis.3. Pradinių ribų peržiūraKontrolinės ribos, apibrėžtos taip, kaip aprašyta anksčiau, turi būti laikomos pradiniais įverčiais.Kad būtų galima atnaujinti ribas, nustatytas remiantis priimtinu preciziškumu serijoje (žr. 2.1.2), turi būti surinkta naujų dubliuojamų duomenų naudojant tiriamuosius mėginius. Laikotarpis iki peržiūros priklausys nuo analizių dažnio. Galima vadovautis nuostata, kad duomenys turi būti peržiūrimi, kai tik gaunami kiti 10 dubliuojamų duomenų. Tada visi tie duomenys turi būti tikrinami Cochran'o kriterijumi, o ribos iš naujo apibrėžiamos, jas grindžiant nauja standartinio nuokrypio verte. Kiti sprendimai dėl kontrolinių ribų galiojimo turi būti daromi pagal tolimesnius duomenis.Pradinių tarpserijinio tikslumo duomenų peržiūra taip pat priklauso nuo analizių dažnio. Galima vadovautis nuostata, kad pradinės prielaidos dėl standartinio nuokrypio ir vidurkio turi būti peržiūrimos, iš kontrolinės medžiagos analizių gavus kitus 10 duomenų taškų, kai dažnis yra viena analizė serijoje.Visi šie duomenys turi būti tikrinami Grubbs'o kriterijumi ieškant atmestinųjų. Vidurkis ir standartinis nuokrypis turi būti perskaičiuojami iš naujų duomenų.Be to, šiame tarpsnyje laboratorija turi taikyti Cusum'o diagramą (BS 5700:1984 ir keitimas 5480:1987), kad ištirtų bet kurias problemas, kurios gali būti susijusios, pavyzdžiui, su reagentų senėjimu. Bet kuris atskiras rezultatas, patenkantis už Cusum'o "V-mask" ribų, privalo būti ištirtas.Naujos ribos (vidurkio ir standartinio nuokrypio) turi būti reguliariai kontroliuojamos Cusum'o metodu. Turi būti atidžiai ištiriami bet kurie požymiai, jeigu kontrolinės medžiagos galiojimas kelia abejonių.4. Ataskaita apie tikslumo duomenisLaboratorijos privalo siųsti kompetentingai nacionalinei institucijai informaciją, kurioje būtų tokie duomenys:- taikytas metodas,- serijos standartinis nuokrypis sw ir savoji tikslumo riba,- tarpserijinis standartinis nuokrypis sb,- bendrasis standartinis nuokrypis st,- analizių skaičius, panaudotas gaunant preciziškumo duomenis.[1] M. Thompson and R. Wood. Pure and Applied Chemistry. 1995, t. 67, Nr. 4, p. 649.--------------------------------------------------VI PRIEDAS(6 straipsnis)JUSLINĖS ANALIZĖS VERTINTOJŲ IR JUSLINĖS ANALIZĖS REZULTATŲ PATIKIMUMO VERTINIMASŠios procedūros taikomos, kuomet yra naudojami vertinimo balais metodai (IDF Standard 99C/1997).a) Pakartojamumo rodiklio nustatymasJuslinės analizės vertintojas 12 mėnesių laikotarpyje turi išanalizuoti mažiausiai 10 mėginių, pateiktų kaip akli dublikatai. Tai paprastai atliekama per keletą kartų. Kiekvienos produkto charakteristikos rezultatai yra įvertinami pagal šią formulę:w=∑nkai:w1 : pakartojamumo rodiklis;xi1 : x1 mėginio pirmo įvertinimo rezultatas;xi2 : x1 mėginio antro įvertinimo rezultatas;n : mėginių skaičius.Vertinimui atrinkti mėginiai turėtų atitikti plačią juslinio kokybės vertinimo skalę. w1 turi būti ne daugiau kaip 1,5 (5 balų skalėje).b) Nuokrypio rodiklio nustatymasŠis rodiklis turėtų būti naudojamas patikrinti ar juslinės analizės vertintojas naudoja tą pačią kokybės vertinimo skalę kaip ir patyrusių vertintojų grupė. Juslinės analizės vertintojo gauti rezultatai yra lyginami su juslinės analizės vertintojų grupės nustatytu rezultatų vidurkiu.Rezultatams įvertinti yra naudojama ši formulė:D= 1 +∑x- xx- x—i222nkai:x11, x12 : žr. a skirsnį;x—i2 : vidutinis juslinės analizės vertintojų grupės rezultatas, gautas atliekant pirmą ir antrą mėginio x1 vertinimą;n : mėginių skaičius (mažiausiai 10 per 12 mėnesių).Vertinimui atrinkti mėginiai turėtų atitikti plačią juslinio kokybės vertinimo skalę. D1 neturi viršyti 1,5 (5 balų skalėje).Valstybės narės privalo pranešti apie sunkumus, kylančius taikant šią procedūrą.c) Skirtinguose valstybės narės regionuose ir skirtingose valstybėse narėse gautų rezultatų palyginimasJeigu įmanoma, ne rečiau kaip kartą per metus turi būti palyginami skirtingų regionų vertintojų gauti rezultatai. Jeigu pastebimi dideli skirtumai, būtina imtis priemonių gaunamų skirtumų priežastims nustatyti ir gauti palyginamus (artimus) rezultatus.Valstybės narės gali organizuoti jų ir kaimyninių valstybių narių gaunamų rezultatų palyginimo testus. Dideli skirtumai reikalauja gilesnių tyrimų siekiant gauti palyginamus (artimus) rezultatus.Valstybės narės turi pranešti Komisijai palyginamųjų tyrimų rezultatus.--------------------------------------------------VII PRIEDAS(6 straipsnis)SVIESTO JUSLINIS VERTINIMAS1. Taikymo sritisŠios sviesto juslinio vertinimo procedūros tikslas - nustatyti vienodą metodą, taikomą visose valstybės narėse.2. ApibrėžimaiJuslinis vertinimas (analizė) – produktui būdingų savybių tikrinimas jutimo organais.Vertinimo komisija – grupė atrinktų vertintojų, kurie vertinimo metu nebendrauja ir nedaro įtakos vienas kitam.Vertinimas balais – tai juslinis vertinimas, kurį atlieka vertinimo komisija, naudodama skaitmeninę skalę ir defektų nomenklatūrą.Rūšiavimas – vertinimu balais paremta kokybės klasifikacija.Kontrolės dokumentai – dokumentai, kuriuose registruojami atskirų produkto savybių įvertinimo balai ir galutinė išvada dėl produkto rūšies. (Šie dokumentai taip pat gali būti naudojami produkto cheminės sudėties rodikliams įrašyti).3. Laboratorija3.1. Būtina imtis priemonių, kad vertintojų darbui laboratorijoje neturėtų įtakos išorės veiksniai.3.2. Laboratorijoje turi nebūti pašalinių kvapų. Patalpa turi būti lengvai valoma, o jos sienos šviesios spalvos.3.3. Laboratorija ir jos apšvietimas turi būti tokie, kad neturėtų įtakos produkto vertinimui. Joje turi būti palaikoma reikiama temperatūra.4. Vertintojų atrankaVertintojai turi nusimanyti apie sviesto produktus ir gebėti rūšiuoti sviestą jutimo organais (jusle). Jų kompetenciją turi reguliariai (ne rečiau kaip kartą per metus) tikrinti kompetentinga institucija.5. Reikalavimai komisijaiVertintojų skaičius komisijoje turi būti nelyginis, bet ne mažesnis kaip trys. Dauguma jų turi būti kompetentingos institucijos darbuotojai arba įgalioti asmenys, nedirbantys pieno pramonėje.Kad vertintojų atliekamas vertinimas būtų optimalus, būtina atsižvelgti į keletą veiksnių:- vertintojai turi nesirgti ligomis, kurios galėtų turėti įtakos vertinimui. Tokiu atveju sergantis komisijos vertintojas turi būti pakeistas kitu,- vertintojai turi laiku pradėti vertinimą ir turėti pakankamai laiko vertinimui atlikti,- vertintojai turi nenaudoti stipriai kvepiančių medžiagų (kvepalų, losjonų po skutimosi, dezodorantų ir kt.), nevalgyti aštraus maisto ir kt.,- vertintojai turi nerūkyti, nevalgyti ir negerti nieko, išskyrus vandenį, likus pusvalandžiui iki vertinimo pradžios.6. Kiekvienos charakteringos savybės vertinimas6.1. Juslinis vertinimas turi būti atliekamas pagal šias tris savybes: išvaizdą, konsistenciją ir skonį.Išvaizdai priskiriami šie kriterijai: spalva, vizualiai matomas švarumas, pelėsių augimas ir vandens dispersija. Vandens dispersija tikrinama pagal IDF Standard 112A:1989.Konsistencijai priskiriami šie kriterijai: kietumas ir tepumas.Sviesto konsistencijai įvertinti gali būti taikomi fizikiniai metodai. Komisija numato ateityje šiuos metodus suvienodinti.Skoninėms savybėms priskiriama: skonis ir kvapas.Dideli nuokrypiai nuo rekomenduojamos temperatūros trukdo patikimai įvertinti konsistenciją, skonį ir kvapą. Temperatūra yra pirmaeilės svarbos sąlyga.6.2. Kiekviena charakteringa savybė turi būti vertinama atskirai. Balai skiriami pagal 1-ąją lentelę.6.3. Vertintojai, norėdami pasiekti vertinimo vienodumo, prieš pradėdami tikrinamų mėginių vertinimą, kartu gali įvertinti vieno ar kelių etaloninių mėginių išvaizdą, konsistenciją, skonį ir kvapą.6.4. Priėmimui būtinas vertinimas balais:| Maksimalus | Būtinas |Išvaizda | 5 | 4 |Konsistencija | 5 | 4 |Skonis ir kvapas | 5 | 4 |Kai nesurenkamas būtinas balų skaičius, pateikiamas defekto apibūdinimas. Į kontrolės dokumentą įrašomi kiekvieno vertintojo už kiekvieną charakteristiką duoti balai. Produktas yra priimamas arba atmetamas remiantis daugumos sprendimu. Atvejai, kai atskirų vertintojų kiekvienos produkto savybės vertinimas balais skiriasi daugiau kaip kitų, neturėtų būti dažni (ne dažniau kaip kartą per 20 mėginių). Priešingu atveju, komisijos pirmininkas turi tikrinti komisijos kompetenciją.7. PriežiūraKomisijos pirmininkas, kuris turi būti oficialus kompetentingos institucijos darbuotojas, atsako už visą procedūrą. Jis privalo užpildyti kontrolinius dokumentus pagal atskirus vertinimus ir patvirtinti, ar produktas priimtas, ar atmestas.8. Mėginių ėmimas ir mėginių paruošimas8.1. - Pageidautina, kad mėginių identifikavimas vertinimo metu būtų užslaptintas taip, kad nebūtų jokio šališkumo.- Tai turi padaryti komisijos pirmininkas prieš vertinimą, nedalyvaujant kitiems komisijos nariams.8.2. Kai juslinis vertinimas atliekamas šaldymo saugykloje, mėginiai imami sviesto grąžtu. Jeigu juslinis vertinimas atliekamas kitoje vietoje, imamas ne mažesnis kaip 500 g mėginys.8.3. Vertinimo metu sviesto temperatūra turi būti nuo 10 °C iki 12 °C. Didesnių temperatūros svyravimų turi būti vengiama visomis priemonėmis.9. NomenklatūraNurodyta 2 lentelėje.1 lentelė. Sviesto juslinis vertinimasIšvaizda | Konsistencija | Skonis ir kvapas |Balai | Nr. [1] | Charakteristika | Balai (kokybės klasė) | Nr. [1] | Charakteristika | Balai (kokybės klasė) | Nr. [1] | Charakteristika |5 | | Labai gera Ideali Aukščiausios kokybės (vienodai sausa) | 5 | | Labai gera ideali aukščiausios kokybės (gerai tepasi) | 5 | | Labai geras idealus aukščiausios kokybės (absoliučiai grynas, puikus aromatas) |4 | | Gera [2] | 4 | | Gera [2] | 4 | | Geras [2] || nėra akivaizdžių defektų | 17 | Kieta | | nėra akivaizdžių defektų || | 18 | minkšta | | |3 | | Patenkinama (nedideli defektai) | 3 | | Patenkinama (nedideli defektai) | 3 | | Patenkinamas (nedideli defektai) |1 | Išsiskyrusi (laisva) drėgmė | 14 | Trapi, biri, puri | 21 | Negrynas |2 | Nevienoda (dviejų spalvų | 15 | Kaip tešla, tąsi, gliti | 22 | Pašalinis skonis ir kvapas |3 | Matosi sluoksniai, dryžiai | 16 | Lipni | 25 | Rūgštus |4 | Marga, marmurinė | 17 | Kieta | 27 | Virinimo, svilėsių prieskonis ir kvapas |5 | Dėmėta | 18 | Minkšta | 33 | Pašarų prieskonis |6 | Išsiskyrę skysti riebalai | | | 34 | Apkartęs, kartus |7 | Per sodri spalva | | | 35 | Persūdytas |8 | Silpnos struktūros | | | | |2 | | Prasta (akivaizdūs defektai) | 2 | | Prasta (akivaizdūs defektai) | 2 | | Prastas (akivaizdūs defektai) |1 | Išsiskyrusi (laisva) drėgmė | 14 | Trapi, biri, puri | 21 | Negrynas |3 | Matosi sluoksniai, dryžiai | 15 | Kaip tešla, tąsi, gliti | 22 | Pašalinis skonis ir kvapas |4 | Marga, marmurinė | 16 | Tąsi, lipni | 23 | Senstelėjęs |5 | Dėmėta | 17 | Kieta | 25 | Rūgštus |6 | Išsiskyrę skysti riebalai | 18 | Minkšta | 32 | Oksidacijos, metalo prieskonis |10 | Pašalinės medžiagos | | | 33 | Pašarų prieskonis |11 | Matosi pelėsių | | | 34 | Apkartęs, kartus |12 | Matosi neištirpusi druska | | | 35 | Persūdytas || | | | 36 | Padusęs, puvėsių prieskonis || | | | 38 | Chemikalų prieskonis |1 | | Labai bloga (akivaizdūs defektai) | 1 | | Labai bloga (akivaizdūs defektai) | 1 | | Labai blogas (akivaizdūs defektai) |1 | Išsiskyrusi (laisva) drėgmė | 14 | Trapi, biri, puri | 22 | Pašalinis skonis ir kvapas |3 | Matosi sluoksniai, dryžiai | 15 | Kaip tešla, tąsi, gliti | 24 | Sūrio, varškės prieskonis |4 | Marga, marmurinė | 16 | lipni | 25 | Rūgštus |5 | Dėmėta | 17 | Kieta | 26 | Mielių prieskonis |6 | Išsiskyrę skysti riebalai | 18 | Minkšta | 28 | Pelėsių prieskonis |7 | Per sodri spalva | | | 29 | Aitrus, apkartęs |9 | Grūdėta | | | 30 | Aliejaus, žuvies prieskonis |10 | Pašalinės medžiagos | | | 31 | Lajaus prieskonis |11 | Matosi pelėsių | | | 32 | Oksidacijos, metalo prieskonis |12 | Matosi neištirpusi druska | | | 34 | Apkartęs, kartus || | | | 36 | Padusęs, puvėsių prieskonis || | | | 37 | Salyklo prieskonis || | | | 38 | Chemikalų prieskonis |2 lentelė. Sviesto defektų nomenklatūraI. Išvaizda1. išsiskyrusi (laisva) drėgmė2. nevienoda (dviejų spalvų)3. matosi sluoksniai, dryžiai4. marga, marmurinė5. dėmėta6. išsiskyrę skysti riebalai7. per sodri spalva8. silpna (atvira) struktūra9. grūdėta10. pašalinės medžiagos11. matosi pelėsių12. matosi neištirpusi druskaII. Konsistencija14. trapi, biri, puri15. kaip tešla, tąsi, gliti16. lipni17. kieta18. minkštaIII. Skonis ir kvapas20. be skonio21. negrynas [3]22. pašalinis skonis23. senstelėjęs24. sūrio, varškės prieskonis25. rūgštus26. mielių prieskonis27. a) virinimo prieskonisb) svilėsių prieskonis28. pelėsių prieskonis29. aitrus, apkartęs30. aliejaus, žuvies prieskonis31. lajaus prieskonis32. a) oksidacijos prieskonisb) metalo prieskonis33. pašarų prieskonis34. kartus35. persūdytas36. padusęs, puvėsių prieskonis37. salyklo prieskonis38. chemikalų prieskonis[1] 2 lentelė.[2] Defektai, paminėti prie charakteristikos "gera" yra labai nedideli nukrypimai nuo idealios.[3] Šis apibūdinimas turėtų būti vartojamas kaip galima rečiau, ir tiktai tada, kai defekto negalima apibūdinti tiksliau.--------------------------------------------------VIII PRIEDAS(7 straipsnis)PROCEDŪRA, TAIKYTINA GINČYTINŲ ANALIZĖS REZULTATŲ ATVEJU (cheminė analizė)1. Kai pranešami pirmosios analizės rezultatai, per septynias darbo dienas, veiklos vykdytojui paprašius, gali būti atliekama papildoma analizė, su sąlyga, jeigu turima užplombuotų dubliuojamų produkto mėginių ir jeigu jie buvo laikomi pagal kompetentingosios institucijos reikalavimus.2. Kompetentingoji institucija siunčia tuos mėginius į kitą laboratoriją, veiklos vykdytojui paprašius ir jo paties sąskaita. Ta laboratorija privalo būti įgaliota atlikti oficialiąsias analizes ir turi būti įrodžiusi būtent tokių analizių kompetenciją. Ši kompetencija turi būti patvirtinta dokumentais, liudijančiais sėkmingai dalyvavus profesionalumo testuose arba palyginamuosiuose tarplaboratoriniuose bandymuose. Kita laboratorija turi taikyti pamatinį metodą. Abiejose laboratorijose gauti rezultatai turi būti įvertinami taip:a) Kai abi laboratorijos atitinka pakartojamumo ir atkuriamumo reikalavimusAbiejų laboratorijų gautų rezultatų aritmetinis vidurkis pateikiamas kaip galutinis rezultatas. Galutinis rezultatas įvertinamas apskaičiuojant kritinį skirtumą pagal tokią formulę:CrDy- m=21 -2n-2n2kai:y— : visų rezultatų, gautų abiejose laboratorijose, aritmetinis vidurkis;mo : leidžiamoji riba;R : atkuriamumas;r : pakartojamumas;n1 : 1-osios laboratorijos gautų rezultatų skaičius;n2 : 2-osios laboratorijos gautų rezultatų skaičius.Pastaba.Jeigu galutinis rezultatas skaičiuojamas pagal formulę:x = y± yarbax = y/y(žr. atitinkamai IV priedo 3 ir 4 punktus), tada formulėje vietoj R2 ir r2 įrašoma R2x ir r2x.b) Kai abi laboratorijos atitinka pakartojamumo reikalavimus, bet neatitinka atkuriamumo reikalavimųJeigu antroji analizė patvirtina pirmąją, analizės rezultatas, turi būti atmestas kaip netinkamas. Priešingu atveju turi būti priimtas.c) Kai tik viena laboratorija atitinka pakartojamumo reikalavimusSprendžiant, ar galima priimti analizuojamus kiekius, naudojamus vienos laboratorijos, atitinkančios pakartojamumo reikalavimus, galutinis rezultatas.d) Kai nė viena laboratorija neatitinka pakartojamumo reikalavimų, bet atitinka atkuriamumo reikalavimusTaikomas a punktas.e) Kai nė viena laboratorija neatitinka pakartojamumo reikalavimų arba atkuriamumo reikalavimųAnalizės rezultatai turi būti priimti, jeigu vienos laboratorijos gauti rezultatai leidžia daryti tokią išvadą.f) Kai rezultatai buvo gauti naudojant neįteisintus metodusAnalizės rezultatai turi būti priimti, jeigu vienos laboratorijos gauti rezultatai leidžia daryti tokią išvadą.3. Gautus antrosios analizės rezultatus kompetentingoji institucija turi nedelsdama pranešti veiklos vykdytojui. Jeigu analizės rezultatai atmetami, antrosios analizės išlaidas padengia veiklos vykdytojas.4. Jeigu per penkias darbo dienas nuo mėginių paėmimo veiklos vykdytojas gali įrodyti, kad mėginių ėmimas buvo netinkamas, mėginių ėmimas turi būti pakartotas, jeigu tai įmanoma. Jeigu mėginių ėmimas negali būti pakartotas, analizės rezultatai turi būti priimti.--------------------------------------------------IX PRIEDAS(8 straipsnis)SVIESTO DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS1. Taikymo sritisŠis metodas taikomas sviesto drėgmės kiekiui nustatyti.2. NuorodosIDF Standard 50 C:1995. Pienas ir pieno produktai. Mėginių ėmimo metodai.3. ApibrėžimasSviesto drėgmės kiekis – masės nuostolis, gautas užbaigus šioje metodikoje apibūdintą kaitinimo procesą, išreiškiamas gramais 100 gramų produkto.4. Metodo esmėDrėgmės išgarinimas iš su pemza sumaišyto sviesto mėginio 102° C temperatūroje džiovinimo krosnelėje.5. Įranga ir medžiagosNaudojama įprastinė ir toliau nurodyta laboratorinė įranga:5.1. 1 mg tikslumo analizinės svarstyklės.5.2. Eksikatorius, kuriame yra tinkama drėgmę sugerianti medžiaga, pavyzdžiui, tik ką išdžiovintas silikagelis su drėgmės indikatoriumi.5.3. Džiovinimo krosnelė, ventiliuojama, termostatiškai palaikanti 102° C ± 2° C visoje darbo erdvėje.5.4. Stikliniai, porcelianiniai arba metaliniai (nerūdijantys) indeliai, kurių aukštis vidutiniškai 20 mm, skersmuo nuo 60 mm iki 80 mm.5.5. Pemzos granulės, išplautos, 0,8–10 mm skersmens.6. Mėginių ėmimasŽr. IDF 50 C:1995.7. Metodika7.1. Mėginio paruošimasUždaroje stiklinėje arba plastikinėje taroje esantis mėginys, užimantis nuo pusės iki dviejų trečdalių jos tūrio, šildomas iki temperatūros, kurioje jis būtų pakankamai minkštas ir nesunkiai sumaišomas (mechaniniu maišikliu arba rankomis) iki vienalytės masės. Temperatūra neturėtų viršyti 35° C. Mėginys atvėsinamas iki aplinkos temperatūros. Atvėsinus atidaroma mėginio tara ir, prieš sveriant mėginį, kiek galima greičiau (ne ilgiau kaip per 10 s) mėginys išmaišomas tinkama priemone, pvz., šaukštu arba mentele.7.2. Drėgmės kiekio nustatymas7.2.1. Į indelį (5.4) įpilama apie 10 g pemzos.7.2.2. Indelis su pemza džiovinamas krosnelėje (5.3) 102° C ± 2° C temperatūroje ne mažiau kaip 1 valandą.Pastaba.7.2.2, 7.2.5 ir 7.2.7 punktuose minimas džiovinimo procesas prasideda, kai krosnelės temperatūra pasiekia 102° C ± 2° C.7.2.3. Indelis atvėsinamas eksikatoriuje iki kambario, kuriame sveriama, temperatūros ir pasveriamas 1 mg tikslumu.7.2.4. Į indelį 1 mg tikslumu pasveriamas maždaug 5 g mėginys.7.2.5. Indelis dedamas į 102° C ± 2° C temperatūros krosnelę ir paliekamas 3 val.7.2.6. Indelis atvėsinamas eksikatoriuje iki kambario, kuriame sveriama, temperatūros ir pasveriamas 1 mg tikslumu.7.2.7. džiovinimo procesas atvėsinant ir sveriant indelį, kaip nurodyta 7.2.6 p. kartojamas kas valandą, kol mėginio masė nebekinta (masės skirtumas neturi viršyti 1 mg).Masei pradėjus didėti, skaičiuojant imama mažiausia jos vertė.8. Rezultatų išraiška8.1. Apskaičiavimo metodas ir formulėdrėgmės kiekis W masės procentais apskaičiuojamas pagal šią formulę:W=m- mm- mx 100kai:m0  indelio su pemza masė gramais (7.2.3);m1  indelio su pemza ir mėginio prieš džiovinimą masė gramais (7.2.4);m2  indelio su pemza ir mėginio po džiovinimo masė gramais (7.2.7).Rezultatai užrašomi vieno skaitmens po kablelio tikslumu.8.2. PakartojamumasSkirtumas dviejų atskirų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje ir naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 0,2 %.8.3. AtkuriamumasSkirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 0,3 %.9. Bandymų protokolasBandymų protokole nurodomas taikomas metodas ir gauti rezultatai. Taip pat paminimos visos (ir neprivalomos) metodikos, šioje metodikoje nenurodytos sąlygos bei visos aplinkybės, kurios galėjo daryti poveikį gautam rezultatui. Protokole išdėstoma visa informacija, reikalinga mėginiui identifikuoti.--------------------------------------------------X PRIEDAS(8 straipsnis)SVIESTO SAUSOSIOS NERIEBALINĖS MEDŽIAGOS KIEKIO NUSTATYMAS1. Taikymo sritisŠis metodas taikomas sviesto sausosios neriebalinės medžiagos kiekiui nustatyti.2. NuorodosIDF Standard 50 C:1995 – Pienas ir pieno produktai – Mėginių ėmimo metodai.3. ApibrėžimasSviesto sausosios neriebalinės medžiagos kiekis – procentinė masės dalis, nustatoma apibūdintu metodu. Ji išreiškiama gramais 100 gramų produkto.4. Metodo esmėDrėgmės išgarinimas iš tam tikro kiekio sviesto masės, riebalų ekstrahavimas petroleteriu ir likusios masės svėrimas.5. ReagentasPetroleteris, kurio virimo temperatūra tarp 30 °C ir 60 °C. Išgarinus 100 ml šio reagento, neturi likti daugiau kaip 1 mg nuosėdų.6. Įranga ir medžiagos6.1. 1 mg tikslumo analizinės svarstyklės.6.2. Eksikatorius, kuriame yra tinkama drėgmei sugerti medžiaga, pavyzdžiui, tik ką išdžiovintas silikagelis su drėgmės indikatoriumi.6.3. Džiovinimo krosnelė, ventiliuojama, termostatiškai palaikanti 102 °C ± 2 °C visoje darbo erdvėje.6.4. Stikliniai, porcelianiniai arba metaliniai (nerūdijantys) indeliai, kurių aukštis vidutiniškai 20 mm, skersmuo nuo 60 mm iki 80 mm, su įdėtomis stiklinėmis lazdelėmis.6.5. Filtravimo tigliai su stikliniais filtrais, kurių porų skersmuo nuo 16 μm iki 40 μm, su siurbiamąja kolba.7. Mėginių ėmimasŽr. IDF 50 C:19958. Metodika8.1. Mėginio paruošimasUždaroje stiklinėje arba plastikinėje taroje esantis mėginys, užimantis nuo pusės iki dviejų trečdalių jos tūrio, šildomas iki temperatūros, kurioje jis būtų pakankamai minkštas ir nesunkiai sumaišomas (mechaniniu maišikliu arba rankomis) iki vienalytės masės. Temperatūra neturėtų viršyti 35 °C. Mėginys atvėsinamas iki aplinkos temperatūros. Atvėsinus atidaroma mėginio tara ir, prieš sveriant mėginį, kiek galima greičiau (ne ilgiau kaip per 10 s) mėginys išmaišomas tinkama priemone, pavyzdžiui, šaukštu arba mentele.8.2. Nustatymas8.2.1. indelis su lazdele (6.4) ir tiglis (6.5) džiovinamas krosnelėje (6.3) 1 valandą. Indelis, lazdelė ir tiglis atvėsinami eksikatoriuje iki kambario, kuriame sveriama, temperatūros ir pasveriami 1 mg tikslumu (mo).Pastabos:- paprastai atvėsinimui užtenka 45 minučių,- jeigu analizuojama daugiau negu vienas tos pačios partijos sviesto mėginys, svarbu, kad kiekvieno iš jų analizei būtų naudojamas analogiškas indelio, lazdelės ir tiglio derinys.8.2.2. Tiglis nuimamas, indelis su lazdele pasveriami 1 mg tikslumu (m1).8.2.3. Į indelį 1 mg tikslumu pasveriama apie 5 g mėginio (8.1) (m2).8.2.4. Indelis (su lazdele ir sviesto mėginiu) dedamas į 102 °C ± 2 °C temperatūros krosnelę ir paliekamas per naktį.8.2.5. Indelis (8.2.3) atvėsinamas iki kambario temperatūros.8.2.6. Į indelį įpilama 15 ml šilto (maždaug 25 °C) petroleterio ir stikline lazdele atskiriama kiek galima daugiau nuosėdų, prilipusių prie indelio. Tirpalas perpilamas į tiglį ir leidžiama jam filtruotis į nusiurbimo kolbą.8.2.7. Procedūra (pagal 8.2.6 punktą) kartojama dar keturis kartus. Jeigu ant indelio sienelių nelieka riebalų likučių, ketvirtojo plovimo metu į tiglį perpilamos (be masės nuostolių) nuosėdos. Priešingu atveju procedūra kartojama (pagal 8.2.6 punktą.) iki riebalų likučių nelieka.8.2.8. Nuosėdos tiglyje perplaunamos 25 ml šilto petroleterio.8.2.9. Indelis, lazdelė ir tiglis (kartu) džiovinami 102 °C ± 2 °C temperatūros krosnelėje 30 minučių.8.2.10. Indelis, lazdelė ir tiglis atvėsinami eksikatoriuje iki kambario, kuriame sveriama, temperatūros ir pasveriami 1 mg tikslumu.8.2.11. Procedūros (8.2.9 ir 8.2.10) kartojamos, kol indelio, lazdelės ir tiglio masė (m3) nebekinta (masės skirtumai neturi viršyti 1 mg).9. Rezultatų išraiška9.1. Sausosios neriebalinės medžiagos kiekio apskaičiavimasSausosios neriebalinės medžiagos kiekis SNM masės procentais apskaičiuojamas pagal formulę:SNM =m- mm- m× 100kai:mo  tuščio indelio su lazdele ir tiglio masė gramais (8.2.1);m1  tuščio indelio su lazdele masė gramais (8.2.2);m2  indelio su lazdele ir mėginiu masė gramais (8.2.3);m3  galutinė indelio su lazdele ir filtravimo tiglio su nuosėdomis masė gramais (8.2.11).Rezultatai apskaičiuojami vieno skaitmens po kablelio tikslumu.9.2. PakartojamumasAbsoliutus skirtumas dviejų atskirų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje ir naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 0,1 %.9.3. AtkuriamumasAbsoliutus skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 0,2 %.10. Bandymų protokolasBandymų protokole turi būti nurodomas taikomas metodas ir gauti rezultatai, taip pat visos (ir neprivalomos) metodikos, šioje metodikoje nenurodytos sąlygos, bei aplinkybės, kurios galėjo daryti poveikį gautam rezultatui. Protokole išdėstoma visa informacija, reikalinga mėginiui identifikuoti.Pastaba.Jeigu analizuojamas sūdytas sviestas, tai druska nustatoma kaip sausoji neriebalinė medžiaga. Norint nustatyti sausosios neriebalinės pieno medžiagos kiekį, pridėtos druskos kiekis turi būti atimtas iš sausosios neriebalinės medžiagos kiekio. Apskaičiuoto sausosios neriebalinės medžiagos kiekio rezultatų tikslumas:pakartojamumas: | r = 0,104 %, |atkuriamumas: | R = 0,206 %. |Rezultatų tikslumas, gautas nustatant sausąją neriebalinę medžiagą, galioja tik nustatant sausąją neriebalinę pieno medžiagą.--------------------------------------------------XI PRIEDAS(8 straipsnis)SVIESTO RIEBALŲ KIEKIO NUSTATYMASRiebalų kiekis nustatomas ne tiesiogiai, o atitinkamai nustatant drėgmės kiekį pagal IX priedą ir sausosios neriebalinės medžiagos kiekį pagal X priedą. Riebalų kiekis masės procentais bus lygus100 -W + SNMkai:W : drėgmės kiekis mesės procentais;SNM : sausosios neriebalinės medžiagos kiekis masės procentais.Rezultatų tikslumas nustatant riebalus yra:pakartojamumas | r = 0,22 %, |atkuriamumas | R = 0,36 %. |--------------------------------------------------XII PRIEDAS(9 straipsnis)VANILINO KIEKIO NUSTATYMAS KONCENTRUOTAME SVIESTE, SVIESTE ARBA GRIETINĖLĖJE EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU1. Taikymo sritisMetodas taikomas vanilino kiekiui koncentruotame svieste, svieste arba grietinėlėje nustatyti.2. Metodo esmėŽinomas mėginio kiekis ekstrahuojamas izopropanolio (etanolio,acetonitrilo) mišiniu (1:1:2). Riebalai atšaldomi minus 15 °C – minus 20 °C temperatūroje, po to centrifuguojami.Ekstraktą atskiedus vandeniu, vanilino kiekis nustatomas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu (ESCh, angl. trumpinys – HPLC).3. ĮrangaĮprastinė ir toliau nurodyta laboratorinė įranga:3.1. šaldiklis, kuriame palaikoma minus 15 °C – 20 °C temperatūra;3.2. vienkartiniai 2 ml talpos švirkštai;3.3. membraniniai mikrofiltrai, kurių poros 0,45 μm dydžio, atsparūs tirpalui, kuriame yra 5 % ekstrakcijos tirpalo (4.4);3.4. skysčių chromatografijos sistema, kurią sudaro: siurblys (srautas – 1,0 ml/min), inžektorius (20 μl įšvirkštimas automatiniu arba rankiniu būdu), UV detektorius (veikiantis esant 306 nm bangai, mažiausia skalės padalos vertė 0,01), savirašis ir kolonėlės termostatas, nustatytas 25 °C;3.5. analizinė kolonėlė (250 mm × 4,6 mm dk), užpildyta LiChrospher RP 18 (Merck, vidutinis dalelių skersmuo 5 μm) arba jai lygiavertė;3.6. prieškolonė (apsauginė kolonėlė) (20 mm × 3 mm dk), užpildyta Perisorb RP 18 (vidutinis dalelių skersmuo 30 μm – 40 μm) arba jai lygiavertė.4. ReagentaiVisi naudojami reagentai turi būti analiziškai gryni.4.1. Izopropanolis4.2. 96 % (tūrio) etanolis4.3. Acetonitrilas4.4. Ekstrakcijos tirpalasIzopropanolis (4.1) sumaišomas su etanoliu (4.2) ir acetonitrilu (4.3) santykiu 1:1:2 (tūrio)4.5. Vanilinas (4-hidroksi-3-metoksibenzaldehidas)4.5.1. Pagrindinis vanilino tirpalas (500 μg/ml)Į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 50 mg vanilino (4.5), įpilama 25 ml ekstrakcijos tirpalo (4.4) ir skiedžiama vandeniu iki žymės.4.5.2. Etaloninis vanilino tirpalas (10 μg/ml).Pipete įpilama 5 ml pagrindinio vanilino tirpalo (4.5.1) į 250 ml matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki žymės.4.6. Metanolis, skirtas ESCh analizei4.7. ledinė acto rūgštis4.8. vanduo, skirtas ESCh analizei4.9. ESCh judamoji fazė:1000 ml matavimo kolboje sumaišoma 300 ml metanolio (4.6), apie 500 ml vandens (4.8) ir 20 ml acto rūgšties (4.7) ir skiedžiama vandeniu (4.8) iki žymės. Mišinys filtruojamas per filtrą (3.3), kurio poros 0,45 μm.5. Metodika5.1. Mėginio paruošimas5.1.1. sviestasMėginys šildomas kol pradeda lydytis. Vengiama perkaitinti per 40 °C. Kai mėginys tampa pakankamai plastiškas, jis homogenizuojamas purtant. Prieš paimant mėginį, sviestas maišomas 15 s. Į 100 ml talpos matavimo kolbą 1 mg tikslumu pasveriama apie 5 g (SM g) sviesto.5.1.2. koncentruotas sviestasPrieš imant mėginį indas su koncentruotu sviestu įstatomas į krosnelę, įkaitintą nuo 40 °C iki 50 °C, kol visiškai išsilydo. Mėginys maišomas sukant arba maišant, kad nesusidarytų oro burbuliukų. Į 100 ml matavimo kolbą 1 mg tikslumu pasveriama apie 4 g (SM g) koncentruoto sviesto.5.1.3. grietinėlėMėginys šildomas 35 °C – 40 °C temperatūros vandens vonioje arba termostate. Riebalai paskirstomi vienodai sukant arba, jei reikia, pamaišant. Mėginys greitai atšaldomas iki 20 °C ± 2 °C. Mėginys turi būti homogeniškas, priešingu atveju procedūrą reikia pakartoti. Į 100 ml matavimo kolbą 1 mg tikslumu pasveriama apie 10 g (SM g) grietinėlės.5.2. Tiriamojo tirpalo paruošimasĮ mėginius (5.1.1, 5.1.2 arba 5.1.3) įpilama maždaug 75 ml ekstrakcijos tirpalo (4.4), maišoma arba smarkiai purtoma apie 15 min. ir skiedžiama ekstrakcijos tirpalu (4.4) iki žymės. Apie 10 ml šio ekstrakto pilama į užkemšamą mėgintuvėlį. Mėgintuvėlis dedamas į šaldiklį (3.1) ir laikomas jame apie 30 min. Atšaldytas ekstraktas centrifuguojamas 5 min. maždaug 2000 aps./min. greičiu ir tuoj pat dekantuojamas. Dekantuotam tirpalui leidžiama atvėsti iki kambario temperatūros. 5 ml dekantuoto tirpalo pipete įpilama į 100 ml matavimo kolbutę ir skiedžiama vandeniu iki žymės. Tirpalas filtruojamas per membraninį mikrofiltrą (3.3). Toks filtratas yra paruoštas ESCh analizei.5.3. KalibravimasĮ 100 ml matavimo kolbą pipete įpilama 5 ml etaloninio vanilino tirpalo (4.5.2). Dar įpilama 5 ml ekstrakcijos tirpalo (4.4) ir skiedžiama vandeniu iki žymės. Tirpale yra 0,5 μg/ml vanilino.5.4. Nustatymas ESCh būduChromatografinei sistemai leidžiama stabilizuotis apie 30 min. Įšvirkščiama etaloninio tirpalo (5.3). Tai kartojama tol, kol dviejų, vienas po kito atliekamų įšvirkštimų smailės ploto arba smailės aukščio skirtumas yra mažesnis kaip 2 %. Šiomis sąlygomis vanilino sulaikymo trukmė yra maždaug 9 minutės. Etaloninis tirpalas (5.3) analizuojamas du kartus, kaskart įšvirkščiama po 20 μl tiriamųjų tirpalų (5.2). Nustatomas gautos vanilino smailės plotas arba aukštis. Po 10-ties tiriamųjų tirpalų (5.2) įšvirkštimų vėl du kartus analizuojamas etaloninis tirpalas (5.3).6. Rezultatų apskaičiavimasApskaičiuojamas vidutinis vanilino smailės plotas arba aukštis (AC), iš smailių, gautų atliekant po du kiekvieno tiriamojo tirpalo išvirkštimus (iš viso keturi plotai).Apskaičiuojamas perskaičiavimo koeficientas (angl-response factor) (R)R=AC/CMkai CM – vanilino masė miligramais tirpale (4.5.1).Vanilino (C) kiekis (mg/kg) tiriamajame mėginyje yra apskaičiuojamas pagal formulęC =AS × 20 × 0,96SM × Rkai:AS = tiriamojo mėginio vanilino smailės plotas;SM = mėginio (5.1.1, 5.1.2 arba 5.1.3) masė gramais;kai vanilino kiekis nustatomas grietinėlėje, jis išreiškiamas mg/kg pieno riebalų. Dėl to C dauginamas iš 100/f, kur f –grietinėlės riebumas masės procentais;20 = etaloninio ir tiriamojo mėginio atskiedimo faktorius;0,96 = pataisos koeficientas dėl riebalų kiekio pirmajame tiriamojo mėginio skiedime.Pastaba.Vietoje smailės ploto galima naudoti smailės aukštį (žr. 8.3).7. Metodo tikslumas7.1. Pakartojamumas (r)Skirtumas dviejų atskirų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 16 mg/kg.7.2. Atkuriamumas (R)Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingų laboratorijų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 27 mg/kg.8. Leistinas nuokrypis8.1. Turi būti imami 3 tiriamojo produkto (su žinomu atsekamosios medžiagos priedu) mėginiai, siekiant jo vienodumui patikrinti.8.2. Kaip atsekamoji medžiaganaudojama vanilė arba sintetinis vanilinas.8.2.1. 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehido pridėjimo norma yra 250 g/t koncentruoto sviesto arba sviesto, grietinėlei šios medžiagos pridėjimo norma – 250 g/t pieno riebalų.8.2.2. Trijų produkto mėginių analizės rezultatai, gauti tikrinant atsekamosios medžiagos (vanilino) pridėjimo normą ir pasiskirstymo vienodumą, (priimant kritinį verčių skirtumą su 95 % tikimybe (CrD95)) yra lyginami tarp šių ribų:- 221,0 mg/kg (95 % minimalios normos),- 159,0 mg/kg (70 % minimalios normos).Mažiausia atsekamosios medžiagos koncentracija yra naudojama interpoliuojant vertes tarp 221,0 mg/kg ir 159,0 mg/kg.8.3. Kaip atsekamoji medžiaga naudojama vanilė, gaunama tik iš vanilės pupelių arba jos ekstraktų.8.3.1. 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehido pridėjimo norma yra 100 g/t koncentruoto sviesto arba sviesto, grietinėlei šios medžiagos pridėjimo norma – 100 g/t pieno riebalų.8.3.2. Trijų produkto mėginių analizės rezultatai, gauti tikrinant atsekamosios medžiagos (vanilino) pridėjimo normą ir pasiskirstymo vienodumą, (priimant kritinį verčių skirtumą su 95 % tikimybe (CrD95)) yra lyginami tarp šių ribų:- 79,0 mg/kg (95 % minimalios normos),- 54,0 mg/kg (70 % minimalios normos).Mažiausia atsekamosios medžiagos koncentracija mėginyje yra naudojama interpoliuojant vertes tarp 79,0 mg/kg ir 54,0 mg/kg.9. Pastabos9.1. Pakartojamumas r yra vertė, žemiau kurios absoliutus skirtumas tarp dviejų atskirų analizių rezultatų, gautų naudojant tą patį metodą ir identiškas medžiagas tomis pačiomis sąlygomis (ta pati įranga, ta pati laboratorija ir trumpas laiko tarpas) gali būti tikėtinas su tiksliai apibrėžta tikimybe; nesant kitų požymių, tikimybė yra 95 %.9.2. Atkuriamumas R yra vertė, žemiau kurios skirtumas tarp atskirų analizių rezultatų, gautų naudojant tą patį metodą ir identiškas medžiagas skirtingomis sąlygomis (skirtingi operatoriai, įranga, laboratorijos ir (arba) skirtingas laikas) gali būti tikėtinas su tiksliai apibrėžta tikimybe; nesant kitų požymių, tikimybė yra 95 %.9.3. Nustatymas pridėto vanilino (250 mg/kg sviesto riebalų) svyruoja nuo 97,0 % iki 103,8 %. Nustatymo vidurkis buvo 99,9 % su standartiniu nuokrypiu 2,7 %.9.4. Etaloniniame tirpale yra 5 % ekstrakcijos tirpalo, kompensuojančio smailės plėtimąsi, kurio priežastis – 5 % ekstrakcijos tirpalo, esančio tiriamuosiuose mėginiuose. Tai įgalina kiekio apskaičiavimą pagal smailės aukštį.9.5. Šios analizės pagrindas – tiesinė kalibravimo linija, prasidedanti nuo koordinačių pradžios.Ši priklausomybė turėtų būti tikrinama, naudojant tinkamus etaloninio tirpalo (4.5.2) skiedinius analizės pradžioje, o toliau tai daroma vienodais laiko tarpais ir pakeitus arba sutaisius ESCh įrangą.--------------------------------------------------XIII PRIEDAS(9 straipsnis)BETA-APO-8’-KAROTINO RŪGŠTIES ETILO ESTERIŲ NUSTATYMAS SVIESTE IR KONCENTRUOTAME SVIESTE SPEKTROMETRINIU METODU1. Taikymo sritisŠis metodas taikomas beta-apo-8’-karotino rūgšties etilo esterių (apo karotino esterių) kiekiui svieste ir koncentruotame svieste nustatyti. Apo-karotino esteriai – tai visuma cheminių medžiagų, esančių pagal šią metodiką gautame mėginio ekstrakte ir absorbuojančių šviesą esant 440 nm bangos ilgiui.2. Metodo esmėMatuojama petroleteryje ištirpintų pieno riebalų absorbcija esant 440 nm bangos ilgiui. Apo-karotino esterių kiekis nustatomas remiantis kalibracine kreive.3. Įranga3.1. Graduotos 0,25, 0,50, 0,75 ir 1,0 ml pipetės.3.2. Spektrofotometras, tinkamas naudoti esant 440 nm (ir 447 nm – 449 nm), naudojant 1 cm optinio kelio ilgio kiuvetes.3.3. 20 ml ir 100 ml matavimo kolbos.3.4. Analizinės svarstyklės, kurių svėrimo paklaida ne didesnė kaip 0,1 mg.4. ReagentaiVisi naudojami reagentai turi būti analiziškai gryni.4.1. Apo-karotino esterių suspensija (apie 20 %).4.1.1. Suspensijos grynumas nustatomas tokiu būdu:400 mg suspensijos pasveriama į 100 ml matavimo kolbą ir ištirpinama 20 ml chloroformo (4.4), ir kolba pripildoma iki žymės cikloheksanu (4.5). 5 ml šio tirpalo cikloheksanu praskiedžiama iki 100 ml (tirpalas A). 5 ml tirpalo A cikloheksanu praskiedžiama iki 100 ml. Gauto tirpalo absorbcija matuojama lyginant su cikloheksanu esant 447 nm – 449 nm bangos ilgiui.Apo-karotino esterių koncentracija apskaičiuojama=Amax · 40000A · 2550Amax = maksimali tiriamojo tirpalo absorbcija;A = mėginio masė gramais;2550 = konstanta, nurodanti 1 % suspensijos absorbciją 1 cm kiuvetėje;P suspensijos grynumas %.Pastaba.Apo-karotino esterių suspensija yra jautri šviesos, karščio ir oro poveikiui. Neatidarytoje originalioje pakuotėje (uždarytoje azoto atmosferoje) suspensija šaltoje vietoje gali būti laikoma apie 12 mėn. Atidarius pakuotę, suspensiją reikia sunaudoti per trumpą laiką.4.1.2. Apo-karotino esterių etaloninis tirpalas, apie 0,2 mg/ml0,1 mg tikslumu pasveriama 0,100 g apo-karotino esterių suspensijos (4.1.1) (Wg), ištirpinama petroleteryje (4.2), be nuostolių perpilama į 100 ml matavimo kolbą ir petroleteriu praskiedžiama iki žymės.Šio tirpalo apo-karotino esterių koncentracija yra (W×P)/10 mg/ml.Pastaba.Tirpalas laikomas šaltoje tamsioje vietoje ne daugiau kaip mėnesį.4.2. Petroleteris (40 °C – 60 °C).4.3. Bevandenis granuliuotas natrio sulfatas, kuris prieš naudojimą 2 h džiovinamas 102 °C temperatūroje.4.4. Chloroformas.4.5. Cikloheksanas.5. Metodika5.1. Mėginio paruošimas5.1.1. koncentruoto sviestoMėginys išlydomas krosnelėje apie 45 °C temperatūroje.5.1.2. sviestoMėginys išlydomas krosnelėje apie 45 °C temperatūroje, ir per filtrą, kuriame yra 10 g bevandenio natrio sulfato (4.3), filtruojamas į apsaugotą nuo šviesos indą, palaikant apie 45 °C temperatūrą. Surenkamas pakankamas pieno riebalų kiekis.5.2. Nustatymas1 mg tikslumu pasveriama 1 g koncentruoto sviesto (arba išekstrahuotų pieno riebalų (5.1.2)) (Mg). Be nuostolių perpilama į 20 ml (Vml) matavimo kolbą, praskiedžiama petroleteriu (4.2) iki žymės, gerai išmaišoma.Gauto tirpalo absorbcija perpilama į 1 cm celę, matuojama lyginant su petroleteriu ir esant 440 nm bangos ilgiui. Pagal kalibracinę kreivę nustatoma apo-karotino esterių koncentracija (Cμg/ml).5.3. Kalibracinė kreivėĮpilama 0 ml, 0,25 ml, 0,5 ml, 0,75 ml ir 1,0 ml apo-karotino esterio etaloninio tirpalo (4.1.2) į penkias 100 ml matavimo kolbas. Praskiedžiama petroleteriu (4.2) iki žymės, gerai išmaišoma.Apytikslė šių tirpalų koncentracija yra nuo 0 μg/ml iki 2 μg/ml. Tiksli tirpalų koncentracija apskaičiuojama lyginant su etaloninio tirpalo koncentracija (4.1.2) (W×P)/10 mg/ml. Gautų tirpalų absorbcija matuojama lyginant su petroleteriu (4.2) ir esant 440 nm bangos ilgiui.Ant y ašies atidedamos absorbcijos vertės, o apo-karotino esterių koncentracijos vertės – ant x ašies.6. Rezultatų apskaičiavimas6.1. Apo-karotino esterio kiekis, išreikštas mg/kg, apskaičiuojamas taip:koncentruotas sviestas: (C.V)/Msviestas: 0,82 (C.V)/Mkai:C = apo-karotino esterio kiekis μg/ml, pagal kalibracinę kreivę (5.3);V = tiriamo tirpalo (5.2) tūris mililitrais;M = mėginio masė (5.2) gramais;0,82 = pataisos koeficientas, įvertinantis pieno riebalų kiekį svieste.7. Metodo tikslumas7.1. Pakartojamumas7.1.1. sviesto analizė.Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas turi neviršyti 1,4 mg/kg.7.1.2. koncentruoto sviesto analizė.Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas turi neviršyti 1,6 mg/kg.7.2. Atkuriamumas7.2.1. sviesto analizė.Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingų laboratorijų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 4,7 mg/kg.7.2.2. koncentruoto sviesto analizė.Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingų laboratorijų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 5,3 mg/kg.7.3. Preciziškumo duomenų šaltinisTyrimų preciziškumas nustatytas 1995 metais vykusių tarplaboratorinių bandymų metu, dalyvaujant 11 laboratorijų, kurių kiekviena ištyrė 12 sviesto mėginių ir 12 koncentruoto sviesto mėginių.8. Leistinas nuokrypis8.1. Apo-karotino esterio suspensijos pasiskirstymo vienodumui patikrinti turi būti imami trys produkto mėginiai.8.2. Sviestas8.2.1. Pridėjimo norma sviestui (įskaitant foninę absorbciją) yra 22 mg/kg.8.2.2. Trijų mėginių rezultatai, gauti tikrinant pridėto kiekio ir pasiskirstymo vienodumą, ir mažiausia gauta rezultato vertė yra lyginama su šiais reikalavimais (priimant kritinį verčių skirtumą su 95 % tikimybe (DCr95)):- 18,0 mg/kg (95 % minimalios pridėjimo normos),- 13,0 mg/kg (70 % minimalios pridėjimo normos).Mažiausia gauta apo-karotino koncentracijos vertė mėginyje turi būti naudojama interpoliuojant vertes tarp 18,0 mg/kg ir 13,0 mg/kg.8.3. Koncentruotas sviestas8.3.1. Pridėjimo norma koncentruotam sviestui (įskaitant foninę absorbciją) yra 24 mg/kg.8.3.2. Trijų mėginių rezultatai, gauti tikrinant pridėto kiekio ir pasiskirstymo vienodumą, ir mažiausia gauta rezultato vertė yra lyginama su šiais reikalavimais (priimant kritinį verčių skirtumą su 95 % tikimybe (DCr95)):- 20,0 mg/kg (95 % minimalios pridėjimo normos),- 14,0 mg/kg (70 % minimalios pridėjimo normos).Mažiausia gauta apo-karotino koncentracijos vertė mėginyje turi būti naudojama interpoliuojant vertes tarp 20,0 mg/kg ir 14,0 mg/kg.--------------------------------------------------XIV PRIEDAS(9 straipsnis)SITOSTEROLIO ARBA STIGMASTEROLIO NUSTATYMAS SVIESTE ARBA KONCENTRUOTAME SVIESTE DUJINĖS KAPILIARINIŲ STULPELIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU1. TAIKYMO SRITISŠis metodas skirtas sitosterolio arba stigmasterolio kiekiui nustatyti svieste ir koncentruotame svieste. Sitosteroliu priimta laikyti β-sitosterolio ir 22 dihidro-β-sitosterolio sumą. Kiti steroliai laikomi nesvarbiais.2. METODO ESMĖSitosteroliams ir stigmasteroliams nustatyti sviestas arba koncentruotas sviestas yra muilinami kalio hidroksidu etanolio tirpale, o nemuilinta dalis ekstrahuojama dietileteriu.Steroliai yra transformuojami į trimetilsililo eterius ir analizuojami dujinės kapiliarinių stulpelių chromatografijos metodu, vidiniu etalonu naudojant betuliną.3. ĮRANGA3.1. 150 ml tūrio muilinimo kolba, sujungta su grįžtamuoju šaldytuvu.3.2. 500 ml dalomieji piltuvai.3.3. 250 ml kolbos.3.4. Slėgio išlyginimo piltuvai (apie 250 ml tūrio), dietileterio likučiams surinkti.3.5. Stiklinė kolonėlė, 350 mm x 20 mm, su gludinto stiklo kamščiu.3.6. Vandens vonia arba izogaubtas.3.7. 2 ml buteliukai.3.8. Dujinis chromatografas, naudojamas su kapiliarine kolonėle ir srauto paskirstymo sistema, susidedantis iš:3.8.1. kolonėlių termostatavimo kameros, palaikančios norimą temperatūrą 1 C tikslumu;3.8.2. išgarinimo mazgo su reguliuojama temperatūra;3.8.3. liepsna jonizuojamo detektoriaus ir konverterio – stiprintuvo;3.8.4. integratoriaus – registratoriaus, tinkamo naudoti su konverteriu – stiprintuvu (3.8.3.).3.9. Kvarcinio stiklo kapiliarinė kolonėlė, visiškai padengta su BP1 (100 % dimetilpolisiloksanas) arba ekvivalentiška jai vienodo storio (0,25 m) nejudančiąja faze. Kolonėlė turi būti tinkama lanosterolio ir sitosterolio trimetilsililo dariniams atskirti. Jos ilgis 12 m, vidinis skersmuo 0,2 mm.3.10. 1 l chromatografinis mikrošvirkštas su adatėle.4. REAGENTAIVisi naudojami reagentai turi būti analiziškai gryni. Naudojamas distiliuotas ar ekvivalentiško grynumo vanduo.4.1. Etanolis turi būti ne mažesnio kaip 95 % grynumo.4.2. Kalio hidroksidas: 60 % vandeninis tirpalas: 600 g kalio hidroksido (ne mažiau kaip 85 % grynumo) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.4.3. Betulinas, mažiausiai 99 % grynumo.4.3.1. Betulino tirpalai dietileteryje (4.4).4.3.1.1. Sitosteroliui nustatyti naudojamo betulino tirpalo koncentracija turi būti 1,0 mg/ml.4.3.1.2. Stigmasteroliui nustatyti naudojamo betulino tirpalo koncentracija turi būti 0,4 mg/ml.4.4. Dietileteris, chemiškai grynas (neturintis peroksidų ir kitų priemaišų).4.5. Natrio sulfatas, bevandenis, granuliuotas, prieš tai 2 valandas džiovintas 102 °C temperatūroje.4.6. Sililinimo reagentas – pavyzdžiui TRI-SIL (Pierce Chemical Co, Cat No 49001), arba ekvivalentiškas jam. (Svarbu žinoti, kad TRI-SIL yra degus, toksiškas, korozinis (gali turėti kancerogeninių savybių). Laboratorijos personalas turi žinoti darbo su TRI - SIL saugumo techniką4.7. Lanosterolis4.8. Sitosterolis, ne mažesnio kaip 90 % grynumo.1 pastaba.Kalibravimui naudojamų etaloninių medžiagų grynumas turi būti nustatytas normalizavimo būdu. Tarkime, kad mėginyje esantys visi sitosteroliai yra pavaizduoti chromatogramoje: visų jų smailių plotas sudaro 100 % ir kad visų šių darinių detekcijos signalai yra vienodi. Sistemos linijiškumas turi būti patikrintas tiriamų koncentracijų ribose.4.8.1. Sitosterolio etaloninis tirpalas. Ruošiamas apie 0,5 mg/ml koncentracijos (W1) sitosterolio (4.8) tirpalas dietileteryje (4.4) 0,001 mg/ml tikslumu.4.9. Stigmasterolis. Žinomo, ne mažesnio kaip 90 % grynumo.4.9.1. Stigmasterolio etaloninis tirpalas. Ruošiamas 0,2 mg/ml koncentracijos stigmasterolio (4.9) tirpalas dietileteryje (4.4) 0,001 mg/ml tikslumu.4.10. Kontrolinio mišinio ruošimas. Ruošiamas mišinys, turintis 0,05 mg/ml lanosterolio (4.7) ir 0,5 mg/ml sitosterolio (4.8) dietileteryje (4.4).5. METODAS5.1. Etaloninio tirpalo ruošimas chromatografuoti. Vidinio etalono tirpalas (4.3.1) pilamas į atitinkamą sterolio etaloninį tirpalą tokiu pat būdu, kaip jis pilamas į muilintą mėginį (žr. 5.2.2).5.1.1. Sitosterolio etaloninio chromatografinio tirpalo ruošimas: pilama 1 ml sitosterolio etaloninio tirpalo (4.8.1) į kiekvieną iš dviejų mėgintuvėlių (3.7) ir azoto srautu pašalinamas dietileteris. Pilama 1 ml vidinio etalono tirpalo (4.3.1.1) ir azoto srautu pašalinamas dietileteris.5.1.2. Stigmasterolio etaloninio chromatografinio tirpalo ruošimas: pilama 1 ml etaloninio stigmasterolio tirpalo (4.9.1) į kiekvieną iš dviejų mėgintuvėlių (3.7) ir azoto srautu pašalinamas dietileteris. Pilama 1 ml vidinio etalono tirpalo (4.3.1.2) ir azoto srautu pašalinamas dietileteris.5.2. Muilinimas5.2.1. Sviesto mėginiai išlydomi ne aukštesnėje kaip 35 C temperatūroje ir gerai išmaišomi.Į 150 ml kolbą (3.1) 1 mg tikslumu pasveriama maždaug 1 g sviesto (W2) arba koncentruoto sviesto (W2). Įpilama 50 ml etanolio (4.1) ir 10 ml kalio hidroksido tirpalo (4.2). Prijungiamas grįžtamasis šaldytuvas ir kaitinama 30 min. apie 75 °C temperatūroje. Gautas kondensatas kolboje aušinamas iki kambario (apie 20 °C) temperatūros.5.2.2. Į kolbą įpilama 1 ml vidinio etalono tirpalo (4.3.1.1), jeigu nustatinėjamas sitosterolis, arba 1 ml vidinio etalono tirpalo (4.3.1.2), jeigu nustatinėjamas stigmasterolis. Atidžiai maišoma. Kolbos turinys kiekybiškai perpilamas į 500 ml dalomąjį piltuvą (3.2). Kolba išplaunama įpilant 50 ml vandens ir 250 ml dietileterio (4.4). Dalomasis piltuvas intensyviai purtomas apie 2 minutes ir leidžiama fazėms atsiskirti. Išleidžiamas apatinis vandens sluoksnis ir eterio sluoksnis keturiskart po 100 ml vandens purtant praplaunamas.2 pastaba.Vengti emulsijos susidarymo. Labai svarbu, kad du pirmieji plovimai vandeniu būtų atlikti labai atsargiai (10 apvertimų). Trečiojo plovimo metu intensyviai purtoma apie 30 s. Jeigu susidaro emulsija, ją galima suardyti įpilant 5–10 ml etanolio. Jeigu įpilama etanolio, kiti du plovimai vandeniu atliekami itin intensyviai.5.2.3. Švarus, be muilo eterio sluoksnis perleidžiamas per stiklinę kolonėlę (3.5), užpildytą 30 g bevandenio natrio sulfato (4.5). Eteris surenkamas į 250 ml kolbą (3.3). Įdedama viena virimą reguliuojanti granulė ir distiliuojama beveik iki sausumo vandens vonioje arba izogaubte, kruopščiai surenkant tirpiklio likučius.3 pastaba.Jeigu mėginių ekstraktai yra visiškai išdžiovinami per aukštoje temperatūroje, gali būti sterolio nuostolių.5.3. Trimetilsililo eterio paruošimas5.3.1. Kolboje esantys eterio tirpalo likučiai perpilami į 2 ml mėgintuvėlį (3.7) su 2 ml dietileterio ir eteris pašalinamas naudojant azoto srautą. Kolba du kartus išplaunama po 2 ml dietileteriu, perpilant tirpalą į mėgintuvėlį ir kiekvieną kartą pašalinant eterį azotu.5.3.2. Mėginys sililinamas įpilant 1 ml TRI-SIL (4.6). Užkemšama kolba ir, intensyviai purtant, ištirpinama. Jeigu per 5 min ištirpinti nepavyksta, pašildoma iki 65 °C–70 °C temperatūros. Prieš įpurškiant į dujinį chromatografą, paliekama pastovėti dar 5 min. Etaloniniai tirpalai sililinami tuo pačiu būdu kaip ir mėginiai. Kontrolinis sterolio mišinys (4.10) sililinamas taip pat kaip ir mėginiai.4 pastaba.Sililinimas turi būti vykdomas bevandenėje aplinkoje. Ne visišką betulino sililinimą parodo antroji smailė, artima betulino smailei.Etanolio priemaišos trukdo sililinimui. Taip atsitinka dėl nepakankamo plovimo ekstrahavimo stadijoje. Jeigu ši problema lieka, reikia atlikti penktą plovimą, 30 sek. intensyviai purtant dalijamąjį piltuvą.5.4. Dujų chromatografinė analizė5.4.1. Nustatomos sąlygos analizei atliktiDujinis chromatografas pajungiamas pagal gamintojo instrukciją.Rekomenduojamos šios chromatografijos sąlygos:- kolonėlės temperatūra – 265 °C,- įpurškimo temperatūra – 265 °C,- detektoriaus temperatūra - 300 °C,- dujų srovės greitis –0,6 ml/min.,- vandenilio slėgis – 84 kPa,- oro slėgis –155 kPa,- jautrumas nuo 10:1 iki 50:1. Jautrumas turi būti optimizuotas pagal gamintojo instrukcijos reikalavimus. Detektoriaus signalo linijiškumas turi būti patikrintas analizuojamų koncentracijų intervale.5 pastaba.Ypač svarbu, kad reguliariai būtų valoma inžektoriaus gilzė.- įpurškiamas kiekis yra 1 l trimetilsililo eterio (5.3) tirpalo.Prieš pradedant chromatografinę analizę, leidžiama sistemai stabilizuotis.Rekomenduojamos chromatografijos sąlygos gali būti keičiamos, kad gaunamos chromatogramos atitiktų tokius reikalavimus:- sitosterolio smailė turi būti visiškai atskirta nuo linosterolio. 1 pav. parodyta tipiška chromatograma, kuri turėtų būti gauta iš sililinto kontrolinio mišinio (4.10),- sterolių santykinis sulaikymo laikas apytikriai turi būti:cholesterolio 1,0stigmasterolio 1,3sitosterolio 1,5betulino 2,5.- betulinui sulaikymo laikas – apytikriai 24 minutės.5.4.2. AnalizėĮpurškiama 1 l sililinto etaloninio tirpalo (stigmasterolio ar sitosterolio) ir sureguliuojami integratoriaus parametrai.Dar įpurškiama 1 l sililinto etaloninio tirpalo, perskaičiavimo koeficientams pagal betuliną nustatyti.Įpurškiama 1 l sililinto mėginio tirpalo ir matuojamas smailės plotas. Kiekvienas chromatografinis plovimas turi būti vienodai vertinamas (sulyginamas) pagal įpurkštus etalonus.Kiekvienam gretimam plovimui patartina daryti šešis mėginio ipurškimus.6 pastaba.Stigmasterolio smailės plotų suma (integracija) parodyta 1, 2, ir 3 matavimo taškuose 2b paveiksle.Įvertinant bendrą sitosterolio kiekį, sitosterolio smailės plotas sumuojasi su 22 dihidro-β-sitosterolio (stigmastanolio) smailės, išeinančios tuoj po β -sitosterolio, plotu (3b pav.).6. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS6.1. Nustatomi sterolio ir betulino smailių plotai abiejuose etaloniniuose tirpaluose, įvertinančiuose vieno konkretaus mėginio partiją ir apskaičiuojamas R1:R=Sterolio smailės ploto vidurkis etaloniniame tirpaleBetulino smailės ploto vidurkis etaloniniame tirpaleNustatoma sterolio smailių plotų suma (sitosterolio plius stigmasterolio smailių plotas) ir betulino smailės plotas mėginyje, ir skaičiuojamas R2:R=Sterolio smailės plotas mėginyjeBetulino smailės plotas mėginyjeW1 = sterolio kiekis (mg), esantis 1 ml etaloninio tirpalo (4.8.1 arba 4.9.1);W2 = mėginio kiekis (g) (5.2.1);P = sterolio grynumas (4.8 arba 4.9).Sterolio kiekis mėginyje=RR×WW× P × 107. METODO TIKSLUMAS7.1 Sviestas7.1.1. Pakartojamumas7.1.1.1. StigmasterolisSkirtumas tarp dviejų atskirų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas turi neviršyti 19,3 mg/kg.7.1.1.2. Sitosterolis.Skirtumas tarp dviejų atskirų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas turi, neviršyti 23,0 mg/kg.7.1.2. Atkuriamumas7.1.2.1. Stigmasterolis.Skirtumas tarp dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 31,9 mg/kg.7.1.2.2. Sitosterolis.Skirtumas tarp dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 8,7 % nustatyto vidurkio.7.1.3. Duomenų preciziškumo šaltinisDuomenų preciziškumas buvo nustatytas vadovaujantis 1992 m. aštuonių laboratorijų atliktu eksperimentu, kiekvienai iš jų pateikiant po 6 mėginius (po 3 dvigubus slaptus) sitosteroliui ir po 6 mėginius (po 3 dvigubus slaptus) stigmasteroliui.7.2. Koncentruotas sviestas7.2.1. Pakartojamumas7.2.1.1. StigmasterolisSkirtumas tarp dviejų atskirų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas turi neviršyti 10,2 mg/kg.7.2.1.2. SitosterolisSkirtumas tarp dviejų atskirų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas turi neviršyti 3,6 % nustatyto vidurkio.7.2.2. Atkuriamumas7.2.2.1. StigmasterolisSkirtumas tarp dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 25,3 mg/kg.7.2.2.2. SitosterolisSkirtumas tarp dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 8,9 % santykinai nustatyto vidurkio.7.2.3. Preciziškumo duomenų šaltinisDuomenų tikslumas buvo nustatytas vadovaujantis 1991 m. devynių laboratorijų atliktu eksperimentu, kiekvienai iš jų pateikiant po 6 mėginius (po 3 dvigubus slaptus) stigmasteroliui ir po 6 mėginius (po 3 dvigubus slaptus) sitosteroliui.8. LEISTINAS NUOKRYPIS8.1. Tiriamųjų etaloninių sterolių pasiskirstymo produkte vienodumui nustatyti iš vieno mėginio turi būti paimti trys mėginiai.8.2. Sviestas8.2.1. Stigmasterolis8.2.1.1. Įdedant 150 g 95 % grynumo stigmasterolio į 1 t sviesto jo koncentracija bus 142,5 mg/kg, arba įdedant 170 g 85,0 % grynumo stigmasterolio į 1 t sviesto jo koncentracija bus 144,5 mg/kg.8.2.1.2. Produkto trijų mėginių tyrimo rezultatai, gauti tikrinant įdėto stigmasterolio pasiskirstymo vienodumą ir mažiausia gauto rezultato vertė yra lyginama su šiais reikalavimais (atsižvelgiant į absoliutųjį verčių skirtumą su 95 % tikimybe (Cr D95):- 116,0 mg/kg (ne mažiau kaip 95 % pridėto kiekio, esant stigmasterolio grynumui 95 %),- 118,0 mg/kg (ne mažiau kaip 95 % pridėto kiekio, esant stigmasterolio grynumui 85 %),- 81,0 mg/kg (ne mažiau kaip 70 % pridėto kiekio, esant stigmasterolio grynumui 95 %),- 82,0 mg/kg (ne mažiau kaip 70 % pridėto kiekio, esant stigmasterolio grynumui 85 %).Mažiausia stigmasterolio koncentracijos vertė etaloniniame mėginyje apskaičiuojama interpoliuojant intervale atitinkamai tarp 116,0 mg/kg ir 81,0 mg/kg arba tarp 118,0 mg/kg ir 82,0 mg/kg.8.2.2. Sitosterolis8.2.2.1. Įdedant 600 g 90 % grynumo sitosterolio į 1 t sviesto, jo koncentracija bus 540 mg/kg.8.2.2.2. Produkto trijų mėginių tyrimo rezultatai, gauti tikrinant įdėto sitosterolio pasiskirstymo vienodumą ir mažiausia gauto rezultato vertė yra lyginama su šiais reikalavimais (atsižvelgiant į absoliutųjį verčių skirtumą su 95 % tikimybe (DCr95):- 486,0 mg/kg (ne mažiau kaip 95 % pridėto kiekio, esant sitosterolio grynumui 90 %),- 358,0 mg/kg (ne mažiau kaip 70 % pridėto kiekio, esant sitosterolio grynumui 90 %).Mažiausia sitosterolio koncentracijos vertė etaloniniame mėginyje apskaičiuojama interpoliuojant intervale atitinkamai tarp 486,0 mg/kg ir 358,0 mg/kg.8.3. Koncentruotas sviestas8.3.1. Stigmasterolis8.3.1.1. Įdedant 150 g 95 % grynumo stigmasterolio į 1 t koncentruoto sviesto jo koncentracija bus 142,5 mg/kg, arba įdedant 170 g 85,0 % grynumo stigmasterolio į 1 t koncentruoto sviesto jo koncentracija bus 144,5 mg/kg.8.3.1.2. Produkto trijų mėginių tyrimo rezultatai, gauti tikrinant įdėto stigmasterolio pasiskirstymo vienodumą ir mažiausia gauto rezultato vertė yra lyginama su šiais reikalavimais (atsižvelgiant į absoliutųjį verčių skirtumą su 95 % tikimybe (Cr D95):- 120,0 mg/kg (ne mažiau kaip 95 % pridėto kiekio, esant stigmasterolio grynumui 95 %),- 122,0 mg/kg (ne mažiau kaip 95 % pridėto kiekio, esant stigmasterolio grynumui 85 %),- 84,0 mg/kg (ne mažiau kaip 70 % pridėto kiekio, esant stigmasterolio grynumui 95 %),- 86,0 mg/kg (ne mažiau kaip 70 % pridėto kiekio, esant stigmasterolio grynumui 85 %).Mažiausia stigmasterolio koncentracijos vertė etaloniniame mėginyje apskaičiuojama interpoliuojant intervale atitinkamai tarp 120,0 mg/kg ir 84,0 mg/kg arba 122,0 mg/kg ir 86,0 mg/kg.8.3.2 Sitosterolis8.3.2.1. Įdedant 600 g 90 % grynumo sitosterolio į 1 t koncentruoto sviesto, jo koncentracija bus 540 mg/kg.8.3.2.2. Produkto trijų mėginių tyrimo rezultatai, gauti tikrinant įdėto sitosterolio pasiskirstymo vienodumą ir mažiausia gauto rezultato vertė yra lyginama su šiais reikalavimais (atsižvelgiant į absoliutųjį verčių skirtumą su 95 % tikimybe (Cr D95):- 486,0 mg/kg (ne mažiau kaip 95 % pridėto kiekio, esant sitosterolio grynumui 90 %),- 358,0 mg/kg (ne mažiau kaip 70 % pridėto kiekio, esant sitosterolio grynumui 90 %).Mažiausia sitosterolio koncentracijos vertė etaloniniame mėginyje apskaičiuojama interpoliuojant intervale atitinkamai tarp 486,0 mg/kg ir 358,0 mg/kg.+++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++--------------------------------------------------XV PRIEDAS(10 straipsnis)KARVIŲ PIENO IR JO KAZEINŲ NUSTATYMO SŪRIUOSE IŠ AVIŲ PIENO, OŽKŲ PIENO, BUIVOLIŲ PIENO IR AVIŲ, OŽKŲ IR BUIVOLIŲ PIENO MIŠINIŲ, PAMATINIS METODAS1. ĮvadasKarvių pieno ir jo kazeinų nustatymas sūriuose iš avių pieno, ožkų pieno ir buivolių pieno ir avių, ožkų ir buivolių pieno mišinių, naudojant γ-kazeinų izoelektrinį fokusavimą, prieš tai išskirtus kazeinus suskaldžius plazminu.2. Taikymo sritisŠiuo metodu tiksliai nustatomas natūralus ir termiškai apdorotas karvių pienas ir jo kazeinai šviežiuose ir brandintuose sūriuose, pagamintuose iš avių pieno, ožkų pieno, buivolių pieno ir avių, ožkų ir buivolių pieno mišinių. Jis netinka nustatyti ar į pieną ir sūrį primaišyta termiškai apdoroto karvių pieno išrūgų baltymų koncentrato.3. Metodo esmė3.1. Kazeinų išskyrimas iš sūrio ir etaloninių mėginių.3.2. Išskirtų kazeinų ištirpinimas ir skaldymas plazminu (EC.3.4.21.7).3.3. Plazminu suskaldytų kazeinų izoelektrinis fokusavimas dalyvaujant karbamidui ir baltymų dažymas.3.4. Nudažytų γ3 ir γ2-kazeinų frakcijų elektroforegramų įvertinimas (karvių pieno buvimo mėginyje įrodymas), lyginant tame pačiame gelyje gautas tiriamojo mėginio ir etaloninių mėginių, kuriuose buvo 0 % ir 1 % karvių pieno, elektroforegramas.4. ReagentaiNaudojami analizinio grynumo reagentai, jeigu nenurodyta kitaip. Vanduo turi būti du kartus distiliuotas arba ekvivalentiško grynumo.Pastaba:Toliau išvardyti reikalavimai taikomi laboratorijoje pagamintiems poliakrilamido geliams su karbamidu, kurių matmenys 265 × 125 × 0,25 mm. Jeigu naudojami kitų tipų ir dydžių geliai, kazeino frakcijų išskyrimo sąlygos gali būti patikslintos.Izoelektrinis fokusavimas4.1. Reagentai, skirti poliakrilamido geliams su karbamidu gaminti4.1.1. Pradinis gelio tirpalasVandenyje ištirpinama:4,85 g akrilamido0,15 g N, N’ –metilen-bis-akrilamido (BIS)48,05 g karbamido15,00 g glicerolio (87 % pagal masę)atskiedžiama iki 100 ml ir laikoma tamsaus stiklo butelyje šaldytuve.Pastaba:Vietoje paminėtų neurotoksinių akrilamidų galima naudoti iš anksto sumaišytą akrilamido(BIS) tirpalą, kuriuo yra prekiaujama. Nurodytus akrilamidų kiekius galima pakeisti 16,2 ml šio tirpalo, jeigu jame yra 30 % (pagal masę tūryje) akrilamido ir 0,8 % (pagal masę tūryje) BIS. Pradinio tirpalo galiojimo trukmė – ne daugiau kaip10 dienų; jeigu jo laidumas daugiau kaip 5 μS, tirpalą reikia naujai jonizuoti, 30 min. maišant su 2 g Amberlite MB-3, po to filtruojant per 0,45 μm membraną.4.1.2. Gelio tirpalasGelio tirpalas gaminamas pagrindinį gelio tirpalą (4.1.1) sumaišant su priedais ir amfolitais tokiais kiekiais:9,0 ml pagrindinio tirpalo24 mg β-alanino500 μl amfolito pH 3,5–9,5 [1]250 μl amfolito pH 5–7 [2]250 μl amfolito pH 6–8 [3]Gelio tirpalas sumaišomas ir dvi tris minutes degazuojamas ultragarso vonioje arba vakuume.Pastaba:Gelio tirpalas ruošiamas prieš pat jo naudojimą (6.2).4.1.3. Katalizatorių tirpalai4.1.3.1. N, N, N’ N’– tetrametiletilendiaminas (TEMED).4.1.3.2. 40 % (pagal masę tūryje) amonio peroksosulfatas (PER):800 mg PER ištirpinama vandenyje ir atskiedžiama iki 2 ml.Pastaba.Visada naudojamas ką tik pagamintas PER tirpalas.4.2. Kontaktinis skystisŽibalas arba skystas parafinas.4.3. Anodo tirpalas5,77 g fosforo rūgšties (85 % pagal tūrį) ištirpinama vandenyje ir atskiedžiama iki 100 ml.4.4. Katodo tirpalas2,00 g natrio hidroksido ištirpinama vandenyje ir atskiedžiama vandeniu iki 100 ml.Mėginio paruošimas4.5. Reagentai baltymams išskirti4.5.1. Praskiesta acto rūgštis (25,0 ml ledinės acto rūgšties atskiedžiama vandeniu iki 100 ml).4.5.2. Dichlormetanas4.5.3. Acetonas4.6. Buferinis tirpalas baltymams tirpintiVandenyje ištirpinama5,75 g glicerolio (87 % pagal tūrį)24,03 g karbamido250 mg ditiotreitolioir atskiedžiama iki 50 ml.Pastaba.Laikomas šaldytuve, maksimali laikymo trukmė – 1 savaitė.4.7. Reagentai kazeinui skaldyti plazminu4.7.1. Amonio karbonato buferinis tirpalas0,2 mol/l amonio-vandenilio karbonato tirpalas (1,58 g/100 ml vandens), kuriame yra 0,05 mol/l etilendiamintetraacto rūgšties (EDTA, 1,46 g/100 ml) titruojamas iki pH 8 0,2 mol/l amonio karbonato tirpalu (1,92 g/100 ml vandens), kuriame yra 0,05 mol/l EDTA.4.7.2. Galvijų plazminas (E.C.3.4.21.7), kurio aktyvumas ne mažiau kaip 5 vnt./ml.4.7.3. ε-Aminokaprono rūgštis fermentui slopinti.2,624 g ε-aminokaprono rūgšties (6-amino-n-heksano rūgšties) ištirpinama 100 ml 40 % (pagal tūrį) etanolio.4.8. Etaloniniai tirpalai4.8.1. Sertifikuotus etaloninius traukinto avių ir ožkų lieso pieno mišinius, kuriuose yra 0 % ir 1 % karvių pieno galima nusipirkti Etaloninių medžiagų ir matavimų institute (Commission’s Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440, Geel, Belgija).4.8.2. Laboratorinio etaloninio traukinto buivolių pieno tirpalo, kuriame yra 0 % ir 1 % karvių pieno, paruošimas.Liesas pienas gaunamas centrifuguojant žalią buivolių arba karvių pieną 37 °C temperatūroje 20 min. 2500 × g greičiu. Greitai atšaldžius mėgintuvėlį su jo turiniu iki 6 °C – 8 °C temperatūros, visiškai nuimamas viršutinis riebalų sluoksnis. 1 % etaloninis tirpalas gaminamas 1 l talpos stiklinėje, į 495 ml lieso buivolių pieno įpilant 5,00 ml lieso karvių pieno ir skiesta pieno rūgštimi (10 % pagal masę tūryje) koreguojant mišinio pH iki 6,4. Mišinys pašildomas iki 35 °C temperatūros, įpilama 100 μl šliužo fermento (fermento aktyvumas 1:10000, konc. 3000 vnt/ml), maišoma 1 min ir aliuminine folija uždengta stiklinė paliekama stovėti 35 °C temperatūroje vieną valandą, kad susidarytų sutrauka. Susidarius sutraukai visas traukintas pienas džiovinamas sublimaciniu būdu prieš tai jo nesumaišius ir nenupylus išrūgų. Po sublimacinio džiovinimo gaunami vienalyčiai milteliai. Gaminant 0 % etaloninį tirpalą, ta pati procedūra atliekama su nefalsifikuotu liesu buivolių pienu. Etaloniniai tirpalai turi būti laikomi (– 20)° C temperatūroje.Pastaba.Prieš gaminant etaloninius tirpalus patartina patikrinti buivolių pieno grynumą, izoelektriškai fokusuojant plazminu suskaldytus kazeinus.Reagentai baltymams dažyti4.9. Fiksatyvas150 g trichloracto rūgšties ištirpinama vandenyje ir atskiedžiama iki 1000 ml.4.10. Dažų blukinimo tirpalas500 ml metanolio ir 200 ml ledinės acto rūgšties atskiedžiama distiliuotu vandeniu iki 2000 ml.Pastaba.Kiekvieną dieną gaminamas šviežias blukinimo tirpalas; jį galima gaminti lygiomis dalimis sumaišant pradinius 50 % (pagal tūrį) metanolio ir 20 % (pagal tūrį) ledinės acto rūgšties tirpalus.4.11. Dažymo tirpalai4.11.1. Dažymo tirpalas (1-asis pradinis tirpalas)3,0 g Coomassie briliantinio žaliojo G-250 (C.I. 42655) ištirpinama 1000 ml 90 % (pagal tūrį) metanolio, naudojant magnetinę maišyklę (apie 45 min) ir nufiltruojama per du vidutinio tankumo lankstytuosius filtrus.4.11.2. Dažymo tirpalas (2-asis pradinis tirpalas)5,0 g vario sulfato pentahidrato ištirpinama 1000 ml 20 % (pagal tūrį) acto rūgšties.4.11.3. Dažymo tirpalas (darbinis tirpalas)Prieš pat dažymą abu pagrindiniai tirpalai (4.11.1, 4.11.2) sumaišomi po 125 ml.Pastaba.Dažymo tirpalą būtina paruošti tą pačią dieną, kai jis bus vartojamas.5. Įranga5.1. Stiklinės plokštelės (265 × 125 × 4 mm); guminis volelis (15 cm pločio); lyginamasis stalas.5.2. Gelio lapas, t.y. lapas, ant kurio dedamas gelis (265×125 mm).5.3. Dengiantysis lapas (280 × 125 mm). Ant kiekvieno išilginio lapo krašto priklijuojama lipnios plėvelės juosta (280 × 6 × 0,25 mm) (1 pav.).5.4. Elektrofokusavimo kamera su šaldančia lėkštele (pvz. 265 × 125 mm) ir tinkamas elektros šaltinis (≥ 2,5 kV) arba automatinis elektroforezės įrenginys.5.5. Cirkuliacinis kriostatas, kuriame termostatiškai nustatoma 12 ± 0,5 °C temperatūra.5.6. Centrifuga, kuria pasiekiama 3000 × g.5.7. Elektrodų juostelės (≥ 265 mm ilgio).5.8. Plastmasiniai lašintuvai anodo ir katodo tirpalams.5.9. Mėginio aplikatorius (10 × 5 mm, viskozė arba filtro popierius, mažai adsorbuojantis baltymus).5.10. Nerūdijančio plieno žirklės, skalpeliai ir pincetai.5.11. Nerūdijančio plieno arba stikliniai dažymo ir blukinimo indai (pvz., 280 × 50 mm instrumentinės lėkštelės).5.12. Reguliuojamas lazdelinis homogenizatorius (10 mm spindulio diametras), kurio apsisukimų greitis (8000 – 20000) aps./min.5.13. Magnetinė maišyklė.5.14. Ultragarso vonia.5.15. Įrenginys plėvelės sulydymui.5.16. 25 μl talpos mikropipetės.5.17. Vakuuminis koncentratorius arba sublimatorius.5.18. Termostatiškai reguliuojama vandens vonia, kurios temperatūra nustatoma 35 °C ir (40 ± 1) °C su maišykle.5.19. Optinio tankio matavimo, esant bangos ilgiui λ = 634 nm, įrenginys.6. Metodika6.1. Mėginio paruošimas6.1.1. Kazeinų išskyrimasĮ 100 ml talpos centrifugavimo kiuvetę pasveriama 5,0 g sausosios sūrio masės arba ekvivalentiškas etaloninio tirpalo kiekis, pripilama 60 ml distiliuoto vandens ir gautas tirpalas homogenizuojamas lazdeliniu homogenizatoriumi (8000–10000 aps./min. greičiu). Praskiesta acto rūgštimi (4.5.1) nustatomas tirpalo pH 4,6 ir jis centrifuguojamas (5 min., 3000 × g greičiu). Gauti riebalų ir išrūgų sluoksniai nupilami. Nuosėdos ištirpinamos 40 ml distiliuoto vandens. Praskiesta acto rūgštimi (4.5.1) nustatomas gauto tirpalo pH 4,5. Tirpalas dar kartą homogenizuojamas 20000 aps./min. greičiu. Įpilama 20 ml dichlormetano (4.5.2), vėl homogenizuojama ir centrifuguojama (5 min., 3000 × g greičiu). Kazeino sluoksnis, esantis tarp vandens ir organinio tirpiklio fazių, (2 pav.) nuimamas mentele, o likusios fazės išpilamos. Kazeinas sumaišomas su 40 ml distiliuoto vandens (žr. aukščiau) ir 20 ml dichlormetano (4.5.2) ir gautas tirpalas centrifuguojamas dar kartą. Ši procedūra kartojama tol, kol abi ekstrakcijos fazės tampa bespalvės (2–3 kartus). Gautos baltymų nuosėdos homogenizatoriumi sumaišomos su 50 ml acetono (4.5.3) paskui filtruojamos per vidutinio greitumo lankstytąjį filtrą. Nuosėdos nuo filtro popieriaus nuplaunamos dviem porcijomis acetono po 25 ml, joms leidžiama nudžiūti ore arba azoto srovėje, po to nuosėdos supilamos į grūstuvę.Pastaba:Sausi kazeino izoliatai turi būti laikomi – 20 °C temperatūroje.6.1.2. β-kazeinų skaldymas plazminu, siekiant suintensyvinti γ-kazeinus.25 mg išskirtų kazeinų (6.1.1) ištirpinami 0,5 ml amonio karbonato buferio (4.7.1) ir homogenizuojami 20 min., pvz., ultragarsu. Gautas tirpalas pašildomas iki 40° C temperatūros ir į jį pridedama 10 μl plazmino (4.7.2), sumaišoma ir laikoma 1 valandą 40° C temperatūroje nuolat maišant. Fermento veikimas sustabdomas pridedant 20 μl ε-aminokaprono rūgšties tirpalo (4.7.3), po to 200 mg kieto karbamido ir 2 mg ditiotreitolio.Pastaba.Norint gauti simetriškesnes fokusuoto kazeino juosteles, patartina, pridėjus εaminokaprono rūgšties, tirpalą sublimuoti ir gautus baltymų likučius ištirpinti 0,5 ml baltymus tirpinančiame buferyje (4.6).6.2. Poliakrilamido gelių su karbamidu paruošimasLapas, ant kurio bus dedamas gelis, (5.2) patiesiamas ant stiklinės plokštelės (5.1), užlašinant kelis vandens lašus, kurių perteklius kruopščiai nušluostomas popieriniu rankšluosčiu arba servetėle. Ant kitos stiklinės plokštelės tokiu pačiu būdu patiesiamas dengiantysis lapas (5.3) su 0,25 mm užleidimais. Plokštelė padedama horizontaliai ant lyginančiojo stalo.Paruoštas ir degazuotas gelio tirpalas (4.1.2) sumaišomas su 10 μl TEMED (4.1.3.1.), po to jį įpilama 10 μl PER – tirpalo (4.1.3.2), gerai išmaišoma ir tuoj pat išpilama ant dengiančiojo lapo vidurio. Plokštelė su gelio lapu vienu kraštu padedama (lapu į apačią) ant plokštelės su dengiančiuoju lapu ir lėtai nuleidžiama, taip kad tarp lapų susidarytų vienodai pasiskirsčiusi gelio plėvelė be oro burbuliukų (3 pav.). Naudojant ploną mentelę, plokštelė su gelio lapu visiškai nuleidžiama ir paslegiama trimis ant jos viršaus uždėtomis stiklinėmis plokštelėmis. Pasibaigus polimerizacijai (po 60 min.) ant gelio lapo susipolimerizavęs gelis nuimamas kartu su dengiančiu lapu, paverčiant stiklines plokšteles. Gelio lapo išorinė pusė gerai nuvaloma, pašalinant gelio ir karbamido likučius. Daugiasluoksnis gelio lapas sulydomas į plėvelės tubelę ir laikomas šaldytuve (ne ilgiau kaip šešias savaites).Pastaba.Dengiantysis lapas gali būti panaudojamas dar kartą. Poliakrilamido gelį galima sukarpyti į mažesnius gabaliukus. Taip daryti rekomenduojama, jei analizuojami keli mėginiai arba jei naudojamas automatinis elektroforezės įrenginys (du geliai, kurių dydžiai 4,5 × 5 cm).6.3. Izoelektrinis fokusavimasŠaldymo termostate nustatoma 12 °C temperatūra. Išorinė gelio lapo pusė nušluostoma žibalu (4.2), kurio keli lašai vėliau užlašinami ant šaldymo bloko centro. Ant jo patiesiamas daugiasluoksnis gelio lapas gelio puse žemyn, vengiant oro burbuliukų susidarymo. Žibalo perteklius nušluostomas ir dengiantysis lapas nuimamas. Elektrodo juostelės suvilgomos elektrodo tirpalais (4.3, 4.4), sukarpomos gelio ilgio juostelėmis ir padedamos kaip nurodyta (atstumas tarp elektrodų 9,5 cm).Izoelektrinio fokusavimo sąlygos6.3.1. Gelio matmenys 265 × 125 × 0,25Žingsnis | Laikas (min.) | Įtampa (V) | Srovė (mA) | Galia (W) | Voltvalandės (Vh) |1. Parengtinis fokusavimas | 30 | Ne daugiau kaip 2500 | Ne daugiau kaip 15 | pastovi 4 | pastovi 300 |2. Mėginio fokusavimas [4] | 60 | Ne daugiau kaip 2500 | Ne daugiau kaip 15 | pastovi 4 | pastovi 1000 |3. Galutinis fokusavimas | 60 | Ne daugiau kaip 2500 | Ne daugiau kaip 5 | Ne daugiau kaip 20 | pastovi 3000 |40 | Ne daugiau kaip 2500 | Ne daugiau kaip 6 | Ne daugiau kaip 20 | pastovi 3000 |30 | Ne daugiau kaip 2500 | Ne daugiau kaip 7 | Ne daugiau kaip 25 | pastovi 3000 |Pastaba.Jeigu gelių storis arba plotis pakeisti, srovės ir galios reikšmes reikia patikslinti (pvz., jeigu naudojamas 265 × 125 × 0,5 mm matmenų gelis, elektros srovės ir galios reikšmės padvigubinamos).6.3.2. Įtampos programos pavyzdys automatinės elektroforezės įrangai (2 geliai, kurių matmenys 5,0 × 4,5 cm), kai elektrodai dedami tiesiai ant gelio be juostelių.Žingsnis | Įtampa | Srovė | Galia | Temperatūra | Voltvalandės |1. Parengtinis fokusavimas | 1000 V | 10,0 mA | 3,5 W | 8° C | 85 Vh |2. Mėginio fokusavimas | 250 V | 5,0 mA | 2,5 W | 8° C | 30 Vh |3. Fokusavimas | 100 V | 10,0 mA | 3,5 W | 8° C | 80 Vh |4. Fokusavimas | 100 V | 5,0 mA | 7,0 W | 8° C | 570 Vh |Mėginio aplikatorius uždedamas antrajame žingsnyje, esant 0 Vh.Mėginio aplikatorius nuimamas antrajame žingsnyje, esant 30 Vh.6.4. Baltymų dažymas6.4.1. Baltymų fiksavimasIšjungus elektros srovę, tuoj pat nuimamos elektrodo juostelės ir gelis greitai įdedamas į dažų blukinimo indą, kuriame įpilta 200 ml fiksatyvo (4.9); laikomas jame 15 min, nuolat pajudinant.6.4.2. Gelio plokštelės plovimas ir dažymas.Fiksatyvas gerai nusausinamas ir gelio plokštelė plaunama du kartus kiekvieną kartą po 30 sekundžių su 100 ml dažų blukinimo tirpalo (4.10). Dažų blukinimo tirpalas išpilamas ir į indą pripilama 250 ml dažymo tirpalo (4.11.3); dažymas tęsiasi 45 min., švelniai pakratant.6.4.3. Gelio plokštelės blukinimasDažymo tirpalas išpilamas, gelio plokštelė plaunama du kartus, kiekvieną kartą sunaudojant po 100 ml dažų blukinimo tirpalo (4.10), paskui gelio plokštelė 15 min. purtoma su 200 ml dažų blukinimo tirpalo, kartojant šią procedūrą mažiausiai du tris kartus, kol pagrindas tampa švarus ir bespalvis. Po to plokštelė nuplaunama distiliuotu vandeniu (du kartus po 2 min.) ir džiovinama ore (2–3valandas) arba plaukų džiovintuvu (10–15 min).1 Pastaba:Fiksuojama, plaunama, dažoma ir blukinama 20 °C temperatūroje. Aukštesnės temperatūros nenaudojamos.2 Pastaba:Jeigu naudojamas jautresnis dažymo tirpalas (pvz., Siver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No.17-1150-01), plazminu apdoroti kazeino mėginiai turi būti atskiesti iki 5 mg/ml.7. Rezultatų įvertinimasRezultatai įvertinami, palyginant nežinomo mėginio ir etaloninio tirpalo baltymų frakcijų išsidėstymo juosteles ant to paties gelio. Karvių pienas nustatomas sūriuose iš avių, buivolių ir ožkų pieno ir šių rūšių pieno mišinių pagal γ3 ir γ2-kazeinus, kurių izoelektrinis taškas yra tarp pH 6,5 ir pH 7,5 (4a,b ir 5 pav.). Nustatymo jautrumas yra ne mažesnis kaip 0,5 %.7.1. Vizualinis įvertinimasVizualiai įvertinant karvių pieno kiekį rekomenduojama pasirinkti tokias mėginių ir etaloninių tirpalų koncentracijas, kad avių, ožkų arba buivolių γ3 ir γ2-kazeinų frakcijų išsidėstymo juostelės būtų vienodo intensyvumo lygio ("γ2 E,G,B" ir "γ3 E,G,B" 4a,b ir 5 pav.). Tada karvių pieno kiekį (mažiau, lygu arba daugiau kaip 1 %) nežinomame mėginyje galima nustatyti iš karto, palyginant karvių pieno γ3 ir γ2-kazeinų juostelių intensyvumą ("γ3 C" ir "γ2 C" 4a,b ir 5 pav.) su tų pačių kazeinų intensyvumu etaloniniuose tirpaluose (avių, ožkų pieno) arba laboratoriniuose tirpaluose (buivolių pieno), kuriose yra 0 % ir 1 % karvių pieno.7.2. Įvertinimas pagal optinį tankįKarvių pieno γ3 ir γ2-kazeinų smailės ploto santykį su ožkų, avių arba buivolių pieno γ3 ir γ2-kazeinų smailių plotais galima nustatyti naudojant optinio tankio matavimo įrenginį (5. pav.). Nustatytas dydis palyginamas su 1 % etaloniniu tirpalu (ožkų ir avių pieno) arba laboratoriniu tirpalu (buivolių pieno), analizuotų ant to pačio gelio, γ3 ir γ2-kazeinų smailių ploto santykiu.Pastaba:Šis metodas yra tikslus, jeigu karvių pieno γ3 ir γ2-kazeinų signalas yra aiškiai teigiamas 1 % etaloniniame tirpale, bet ne 0 % etaloniniame tirpale. Jeigu taip nėra, procedūrą reikia patikslinti, atidžiai laikantis metodo atlikimo detalių.Mėginys įvertinamas kaip teigiamas (mėginyje yra karvių pieno), jeigu abiejų karvių pieno γ3 ir γ2-kazeinų frakcijų juostelių intensyvumas arba atitinkami smailių plotų santykiai yra lygūs arba didesni kaip 1 % etaloninio tirpalo.8. Literatūra1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of a plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708–711 (1990).2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83–85 (1995).3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte – and carrier ampholyte/immobilised pH gradient – isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. In.: Electrophoresis-Forum’89 (B.J. Radola, ed.) pp 389–393, Bode-Verlag, Munchen (1989).4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. –kse durch isoelektische Fokussierung in harnstoffhaligen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Uters. Forsch. 174, 195–199 (1982).5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43–56 (1980).+++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++[1] Buferiniai tirpalai Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) ir Resolyte® pH 5-7 (BDH, Merck) ypatingai tinkami reikalingiems γ-kazeinams ištirti.[2] Buferiniai tirpalai Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) ir Resolyte® pH 5-7 (BDH, Merck) ypatingai tinkami reikalingiems γ-kazeinams ištirti.[3] Buferiniai tirpalai Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) ir Resolyte® pH 5-7 (BDH, Merck) ypatingai tinkami reikalingiems γ-kazeinams ištirti.[4] Mėginio uždėjimas: Po parengtinio fokusavimo (1 žingsnis), ant mėginio aplikatorių (10 × 5 mm) pipete užpilama po 18 μl mėginio ir etaloninių tirpalų. Aplikatoriai ant gelio išdėstomi taip, kad vienas nuo kito būtų 1 mm intervalu, o išilgai nuo anodo – 5 mm atstumu ir švelniai prispaudžiami. Fokusuojama naudojant aukščiau nurodytas sąlygas. Praėjus 60 min. po mėginio fokusavimo, mėginio aplikatorius atsargiai nuimamas.--------------------------------------------------XVI PRIEDAS(11 straipsnis)KOLIFORMINIŲ BAKTERIJŲ NUSTATYMAS SVIESTE, NUGRIEBTO PIENO MILTELIUOSE, KAZEINE IR KAZEINATUOSE1 g sviesto mėginiai sėjami į mitybinę terpę, jeigu koliforminės bakterijos nustatomos svieste.0,1 g mėginiai sėjami į mitybinę terpę, jeigu koliforminės bakterijos nustatomos nugriebto pieno milteliuose arba kazeine ir kazeinatuose.Analizė atliekama pagal IDF Standard 73A:1985 taikant šias modifikacijas1) Mėginiai ruošiami pagal IDF Standard 122B:1992. Rūgštinio kazeino mėginiams ruošti taip pat gali būti taikoma IDF Standard 73A:1985 aprašyta mėginių paruošimo procedūra.2) Inkubuojami ir vertinami tiktai mėgintuvėliai į kuriuos pasėta 1 g sviesto ir 0,1 g sausojo nugriebto pieno, kazeino ar kazeinatų mėginiai. Dešimtkarčiai skiediniai nedaromi.Rezultatų vertinimasTrys neigiami rezultatai: | Atitinka reikalavimus. |Du arba trys teigiami rezultatai: | Neatitinka reikalavimų. |Du neigiami rezultatai: | Ištiriami dar du mėginiai atitinkamai po 1 g (sviesto) arba 0,1 g (nugriebto pieno miltelių, kazeino ar kazeinatų). Atitinka reikalavimus, jeigu paskutiniai du rezultatai neigiami. Kitu atveju reikalavimų neatitinka. |PastabosKoliforminių bakterijų kiekis vidutiniškai: 1/10 g sviesto;1/g nugriebto pieno miltelių arba kazeino ir kazeinatų – tai reikalavimų atitikimą rodantys rezultatai, gauti su 93 % tikimybe.Koliforminių bakterijų kiekis vidutiniškai: 1/g sviesto;1/0,1 g nugriebto pieno miltelių arba kazeino ir kazeinatų – tai reikalavimų neatitikimą rodantys rezultatai, gauti su 91 % tikimybe.(Daroma prielaida, kad galioja Puasono (Poisson) skirstinys).--------------------------------------------------XVII PRIEDAS(12 straipsnis)LAKTOZĖS KIEKIO NUSTATYMO METODAS PRODUKTUOSE, KURIŲ KN KODAS 2309 [1]I DALIS1. Taikymo sritisMetodas taikomas tais atvejais, kai laktozės kiekis didesnis nei 0,5 %.2. Metodo esmėMielėms (Saccharomyces cerevisiae) veikiant vandenyje ištirpintus sacharidus laktozė lieka nesuskaidyta. Tirpalą nuskaidrinus ir nufiltravus laktozės kiekis nustatomas Luff-Schoorl metodu.3. ReagentaiDinatrio tiosulfatas 0,1 N.Indikatorius: krakmolo tirpalas. Jis paruošiamas 5 g tirpiojo krakmolo sumaišant su 30 ml vandens (galima dėti 10 mg gyvsidabrio dijodido kaip konservanto). Gautas mišinys supilamas į 1 l verdančio vandens, maišant virinamas 3 minutes ir paliekamas atvėsti.Kalio jodido apie 30 % (30 g/100 ml) tirpalas.Sulfato rūgšties 3 mol/l tirpalas.Luff-Schoorl reagentas.a) Vario (II) sulfato tirpalas. 25 g vario sulfato pentahidrato (CuSO4·5H2O) (neturinčio geležies) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 100 ml.b) Citrinų rūgšties tirpalas. 50 g citrinų rūgšties monohidrato (C6H8O7·H2O) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 50 ml.c) Dinatrio karbonato tirpalas. 143,8 g bevandenio dinatrio karbonato (Na2CO2) ištirpinama 300 ml karšto vandens, atvėsinama.Atsargiai maišant b tirpalas pilamas į c tirpalą, tada įpilamas a tirpalas. Praskiedžiama iki 1 l, leidžiama stovėti per naktį ir tada filtruojama. Patikrinama tokiu būdu gauto reagento molingumas (Cu 0,1 N, Na2CO3 2 N). pH turėtų būti maždaug 9,4.Carrez tirpalas I: 23,8 g cinko acetato dihidrato Zn (C2H3O2)2 ·2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties (CH3COOH) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 100 ml.Carrez tirpalas II: 10,6 g kalio heksacianoferato (II) trihidrato K4F2(CN)6 ·3H2O ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki100 ml.Pemzos granulės, virintos druskos rūgšties tirpale, išplautos vandeniu taip, kad visiškai neliktų rūgšties, ir išdžiovintos. Saccharomyces cerevisiae suspensija: 25 g šviežių mielių ištirpinama 100 ml vandens (šaldytuve laikoma ne ilgiau kaip savaitę).4. Metodika1 g tiriamojo mėginio pasveriama 1 mg tikslumu ir supilama į 100 ml matavimo kolbą. Įpilama nuo 25 ml iki 30 ml vandens. Kolba trisdešimt minučių laikoma verdančio vandens vonioje, po to atvėsinama iki maždaug 35 °C temperatūros.Į kolbą su mėginiu įpilama 5 ml mielių suspensijos [2] ir sukratoma. Matavimo kolba su mišiniu dvi valandas paliekama 38 °C – 40 °C temperatūros vandens vonioje.Po fermentacijos kolba su mišiniu atvėsinama iki maždaug 20 °C temperatūros. Įpilama 2,5 ml Carrez tirpalo I, maišoma pavartant trisdešimt sekundžių, po to įpilama 2,5 ml Carrez tirpalo II ir vėl maišoma pavartant trisdešimt sekundžių. Po to praskiedžiama vandeniu iki 100 ml, sumaišoma ir filtruojama. Pipete paimamas ne didesnis kaip 25 ml filtrato kiekis, apytikriai turintis nuo 40 mg iki 80 mg laktozės; jeigu reikia, vandens papildoma iki 25 ml ir Luff-Schoorl metodu nustatomas bevandenės laktozės kiekis.Atliekamas visas tuščias bandymas tik su mielėmis.II DALIS1. Laktozės kiekio nustatymas Luff-Schoorl metoduĮ 300 ml Erlenmejerio kolbą pipetėmis įpilama 25 ml Luff-Schoorl reagento ir tiksliai išmatuoto 25 ml skaidraus tiriamojo tirpalo.Įdėjus dvi pemzos granules ranka purtant kaitinama virš atviros vidutinio aukščio liepsnos. Tirpalas turi užvirti per dvi minutes. Nedelsiant Erlenmejerio kolba dedama ant asbestuotojo vielinio tinklo, po kuriuo liepsna buvo uždegta anksčiau. Patikrinama, kad būtų kaitinamas tiktai Erlenmejerio kolbos dugnas, tada ant kolbos uždedamas grįžtamasis šaldytuvas. Nuo užvirimo momento virinama lygiai dešimt minučių. Nedelsiant atšaldoma šaltame vandenyje ir maždaug po penkių minučių tiriama taip.Į tirpalą įpilama 10 ml kalio jodido, po to nedelsiant, bet atsargiai (kadangi gali labai putoti) įpilama 25 ml 6N sulfato rūgšties.Titruojama su dinatrio tiosulfatu, kol atsiranda geltona matinė spalva; titravimo pabaigoje dedamas krakmolo indikatorius.Tas pats titravimas atliekamas su tiksliai 25 ml Luff-Schoorl reagento ir 25 ml vandens (vietoj tiriamojo tirpalo) mišiniu, įpylus 10 ml kalio jodido ir 25 ml sulfato rūgšties, šį kartą nevirinant.Naudojantis šia lentele nustatomas laktozės kiekis mg, atitinkantis dviejų tyrimų rezultatų skirtumus (išreikštus 0,05 mol/l dinatrio tiosulfato mililitrais).LENTELĖ25 ml Luff-Schoorl reagento lentelė(sąlygas žr. tekste)1. Dinatrio tiosulfato 0,1 N2. Laktozė C12H22O111 | 2 |ml | mg | skirtumas |1 | 3,6 | || | 3,7 |2 | 7,3 | || | 3,7 |3 | 11,0 | || | 3,7 |4 | 14,7 | || | 3,7 |5 | 18,4 | || | 3,7 |6 | 22,1 | || | 3,7 |7 | 25,8 | || | 3,7 |8 | 29,5 | || | 3,7 |9 | 33,2 | || | 3,8 |10 | 37,0 | || | 3,8 |11 | 40,8 | || | 3,8 |12 | 44,6 | || | 3,8 |13 | 48,4 | || | 3,8 |14 | 52,2 | || | 3,8 |15 | 56,0 | || | 3,9 |16 | 59,9 | || | 3,9 |17 | 63,8 | || | 3,9 |18 | 67,7 | || | 4,0 |19 | 71,7 | || | 4,0 |20 | 75,7 | || | 4,1 |21 | 79,8 | || | 4,1 |22 | 83,9 | || | 4,1 |23 | 88,0 | |[1] Reglamentas (EEB) Nr. 222/88.[2] Produktams, turintiems daugiau nei 40 % fermentuojamo cukraus, suspensijos kiekis padidinamas.--------------------------------------------------XVIII PRIEDAS(13 straipsnis)FERMENTINIŲ IŠRŪGŲ APTIKIMAS VIEŠAJAM SAUGOJIMUI SKIRTUOSE NUGRIEBTO PIENO MILTELIUOSE: GLIKOMAKROPEPTIDŲ NUSTATYMAS EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS (ESCh) METODU1. Taikymo sritisŠiuo metodu, nustatant glikomakropeptidus, galima aptikti fermentines išrūgas viešajam saugojimui skirtuose nugriebto pieno milteliuose.2. NuorodosTarptautinis standartas ISO 707 – Pienas ir pieno produktai – Mėginių ėmimo metodai – I priedo 2 dalies c punkto rekomendacijų taikymas.3. ApibrėžimasGlikomakropeptidų kiekis nugriebto pieno milteliuose: glikomakropeptidų kiekis, išreikštas masės procentais, nustatytas toliau aprašytu metodu.4. Metodo esmė- Nugriebto pieno milteliai regeneruojami, paveikus trichloracto rūgštimi atskiriami baltymai ir riebalai, kurie nusodinami centrifuguojant,- Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESCh) metodu nustatomas glikomakropeptidų (GMP) kiekis,- Gautas rezultatas sulyginamas su etaloninių miltelių, kuriuose nėra fermentinių išrūgų arba yra žinomas jų kiekis, tyrimo rezultatu.5. ReagentaiVisi reagentai turi būti analiziškai gryni, vanduo – distiliuotas arba tokio pat grynumo.5.1. Trichloracto rūgšties tirpalas240 g trichloracto rūgšties (CCl3COOH) ištirpinama nedideliame vandens kiekyje ir praskiedžiama iki 1000 ml.5.2. Eliuentas, pH 6,01,74 g dikalio hidrofosfato (K2HPO4), 12,37 g kalio dihidrofosfato (KH2PO4) ir 21,41 g natrio sulfato (Na2SO4) ištirpinama maždaug 700 ml vandens. Eliuento pH reguliuojamas fosforo rūgšties arba kalio hidroksido tirpalu. pH turi būti 6,0 vnt.Praskiedžiama vandeniu iki 1000 ml ir homogenizuojama.Prieš vartojimą eliuento tirpalas filtruojamas per membraninį filtrą, kurio akučių skersmuo 0,45 μm.5.3. Plovimo tirpalasIš vienos dalies acetonitrilo (CH3CN) ir devynių dalių vandens paruošiamas tirpalas. Prieš vartojimą tirpalas filtruojamas per membraninį filtrą, kurio akučių skersmuo 0,45 μm.Pastaba.Gali būti naudojamas ir kitas antiseptinis tirpalas, jei jis neblogina kolonėlės skiriamosios gebos.5.4. Etaloniniai mėginiai5.4.1. Nugriebto pieno milteliai, atitinkantys nustatytus reikalavimus (0).5.4.2. Tie patys nugriebto pieno milteliai, į kuriuos įmaišyta 5 % (pagal masę) fermentinių išrūgų miltelių, (pvz. (5)).6. Įranga:6.1. Analitinės svarstyklės.6.2. Centrifuga, galinti išvystyti 2200 g išcentrinę jėgą, su maždaug 25 ml talpos užkemšamomis centrifugavimo kiuvetėmis.6.3. Mechaninė purtyklė.6.4. Magnetinė maišyklė.6.5. Apie 7 cm skersmens stikliniai piltuvai.6.6. Vidutinės filtravimo gebos, maždaug 12,5 cm skersmens popieriniai filtrai.6.7. Filtravimo per stiklinį filtrą įranga su 0,45 μm akučių skersmens membraniniu filtru.6.8. 10 ml graduotos pipetės (ISO 648, A klasė arba ISO/R 835).6.9. Vandens vonia, kurioje palaikoma pastovi 25 °C ± 0,5 °C temperatūra.6.10. Efektyviosios skysčių chromatografijos įranga:6.10.1. Siurblys.6.10.2. Rankinis arba automatinis švirkštas, kurio talpa nuo 15 μl iki 30 μl.6.10.3. Dvi nuosekliai sujungtos TSK 2000-SW (arba ekvivalentiškos) kolonėlės (ilgis – 30 cm, vidinis skersmuo 0,75 cm) su prieškolone (3 cm x 0,3 cm), užpildyta I 125 arba ekvivalentiško efektyvumo medžiaga.6.10.4. Termostatas kolonėlėms, kuriame palaikoma 35 °C ± 1 °C temperatūra.6.10.5. Keičiamo bangos ilgio ultravioletinių spindulių (UV) detektorius, kuriuo galima matuoti esant 205 nm bangos ilgiui, esant 0,008 A jautrumui.6.10.6. Integratorius, galintis integruoti tarp dveijų žemiausių taškų.Pastaba.Kolonėles galima laikyti kambario temperatūroje, tačiau jų skiriamoji galia bus šiek tiek mažesnė. Šiuo atveju temperatūra bet kuriame analizės etape neturi skirtis daugiau kaip ± 5 °C.7. Mėginių ėmimas7.1. Tarptautinis standartas ISO 707 – Pienas ir pieno produktai – Mėginių ėmimo metodai – I priedo 2 dalies c punkto paskutinės pastraipos rekomendacijų taikymas.7.2. Mėginiai laikomi tokiomis sąlygomis, kad nebūtų sugadinti ar kitaip pakitę.8. Metodika8.1. Mėginio ruošimas tyrimuiMilteliai suberiami į dvigubai didesnį nei jų kiekis indą su sandariu dangčiu, kuris tuoj pat uždaromas. Indo tūris turi būti maždaug dvigubai didesnis už miltelių tūrį. Vartant uždarytą indą, milteliai gerai sumaišomi.8.2. Tiriamoji mėginio dalisĮ centrifugos kiuvetę (6.2) atsveriama 2,000 g + 0,001 g tiriamojo mėginio (6.2.).8.3. Riebalų ir baltymų pašalinimas:8.3.1. Į kiuvetę su tiriamuoju mėginiu įpilama 20 g šilto (50 °C) vandens. Milteliai ištirpinami purtant juos 5 minutes mechanine purtykle (6.3). Atvėsinama iki 25 °C.8.3.2. Maišant magnetine maišykle (6.4), per 2 minutes, įpilama 10,0 ml trichloracto rūgšties tirpalo (5.1). Kiuvetė įdedama į vandens vonią (6.9) ir laikoma joje 60 minučių.8.3.3. Centrifugoje (6.2), esant 2200 g išcentrinei jėgai, sukama 10 minučių arba filtruojama per filtravimo popierių (6.6). Pirmieji 5 ml filtrato išpilami.8.4. Tyrimas chromatografu8.4.1. Į ESCh (6.10) įšvirkščiama nuo 15 μl iki 30 μl tiksliai pamatuoto nucentrifuguoto arba nufiltruoto tirpalo (8.3.3). Nustatomas 1,0 ml per minutę eliuento (5.2) greitis.Pastabos:1. Eliuento tirpalo (5.2) temperatūra analizės metu turi būti 85 °C, siekiant išlaikyti jį degazuotą ir išvengti bakterijų dauginimosi. Galima naudoti bet kurias kitas, panašiai veikiančias, priemones.2. Darant pertrauką, kolonėles reikia išplauti vandeniu. Jokiu būdu negalima palikti jose eliuento (5.2).Darant ilgesnę nei 24 valandų pertrauką, kolonėles reikia išplauti vandeniu, po to mažiausiai tris valandas plauti plovimo tirpalu (5.3), nustačius 0,2 ml per minutę srauto greitį.8.4.2. Mėginio (E) tyrimo rezultatai užrašomi chromatograma, kurios smailės identifikuojamos pagal sulaikymo trukmę RT taip:II smailė: | antroji chromatogramos smailė, kurios RT yra apie 12,5 minučių. |III smailė: | trečioji chromatogramos smailė, atitinkanti GMP, kurios RT yra 15,5 ± 1,0 minučių. |IV smailė: | ketvirtoji chromatogramos smailė, kurios RT yra apie 17,5 minučių. |Kolonėlių kokybė gali turėti įtakos atskirų smailių sulaikymo trukmei.Integratorius (6.10.6) automatiškai skaičiuoja smailių plotus A:AII: | II smailės plotas; |AIII: | III smailės plotas; |AIV: | IV smailės plotas. |Prieš kiekybinę duomenų interpretaciją labai svarbu išnagrinėti kiekvieną chromatogramą ir atmesti visus labai išsiskiriančius rezultatus, galėjusius atsirasti arba dėl įrengimo bei kolonėlių darbo sutrikimų, arba dėl nagrinėjamo tiriamojo mėginio rodiklių.Jei yra abejonių, tyrimas kartojamas.8.5. Kalibravimas:8.5.1. Nuo 8.2 iki 8.4.2 nurodyti veiksmai tiksliai pakartojami, tiriamąjį mėginį pakeičiant etaloniniais mėginiais (5.4).Tam naudojami tik ką paruošti tirpalai, nes 8 % acto rūgštyje GMP skyla. Esant 30 °C temperatūrai, skilimo greitis yra 0,2 % per valandą.8.5.2. Prieš mėginių analizę kolonėlės kondicionuojamos, etaloninį mėginį (5.4.2) kelis kartus įšvirkščiant į tirpalą (8.5.1), kol GMP atitinkančios smailės plotas ir sulaikymo trukmė tampa pastovūs.8.5.3. Perskaičiavimo koeficientai R nustatomi įšvirkščiant tokius pat filtratų (8.5.1) kiekius, kaip ir tiriant mėginį.9. Rezultatų apdorojimas9.1. Skaičiavimo metodas ir formulės9.1.1. Smailių perskaičiavimo koeficientų skaičiavimas:II smailės: | RII=100AII0 |IV smailės: | RIV=100AIV0 |kai:RII ir RIV = II ir IV smailių perskaičiavimo koeficientai;AII[0] ir AIV = etaloninio mėginio [0] atitinkami II ir IV smailių plotai, nustatyti 8.5.3III smailės: | RIII=WAIII5AIII0 |kai:RIII = III smailės perskaičiavimo koeficientas;AIII[0] ir AIII[5] = etaloninių mėginių [0] ir [5] III smailių plotai;W = išrūgų kiekis etaloniniame mėginyje [5] t. y. 5.9.1.2. Mėginio [E] smailių santykinių plotų skaičiavimas:S= R× AIIES= R× AIIIES= R× AIVEkai:SII[E], SIII[E], SIV = mėginio [E] II, III ir IV smailių santykiniai plotai;AII[E], AIII[E] ir AIV = mėginio [E] II, III ir IV smailių plotai, gauti 8.4.2;RII, RIII, RIV = apskaičiuoti perskaičiavimo koeficientai.9.1.3. Mėginio [E] III smailės santykinės sulaikymo trukmės apskaičiavimas:RRT=RTRTIII5kai:RRTIII[E] = mėginio [E] III smailės santykinė sulaikymo trukmė;RTIII[E] = mėginio [E] III smailės, gautos 8.4.2, sulaikymo trukmė;RTIII[5] = mėginio [5] III smailės, gautos pagal 8.5.3, sulaikymo trukmė.9.1.4. Eksperimentais nustatyta, kad III smailės santykinei sulaikymo trukmei galioja tiesinė priklausomybė, t.y. tarp RRTIII [E] ir fermentinių išrūgų miltelių kiekio procentais, kai jų dedama iki 10 % yra tiesinė priklausomybė.- RRTIII[E] yra <1,000, kai išrūgų kiekis yra >5 %,- RRTIII[E] yra ≥1,000, kai išrūgų kiekis yra ≤5 %,RRTIII vertėms leistina neapibrėžtis yra ±0,002.Normali RRTIII [0] vertė yra artima 1,034. Atsižvelgiant į kolonėlių būklę, ši vertė gali priartėti prie 1,000, tačiau ji visuomet turi būti didesnė už 1.9.2. Fermentinių išrūgų miltelių kiekis mėginyje procentais apskaičiuojamas pagal formulę:W = S-S- 0,9kai:W = fermentinių išrūgų kiekis masės procentais tiriamame mėginyje [E];SIII [E] = santykinis mėginio [E] III smailės plotas, apskaičiuotas 9.1.2;1,3 = vidutinis santykinis II smailės plotas, išreikštas fermentinių išrūgų gramais 100 gramų miltelių, nustatytas įvairios kilmės nefalsifikuotuose nugriebto pieno milteliuose. Šis skaičius gautas eksperimentiniu būdu.SIII[0] = santykinis III smailės plotas, kuris yra lygus RIII × AIII [0]. Šios vertės gautos 9.1.1 ir 8.5.3 atitinkamai;(SIII[0]– 0,9) = pataisa vidutiniam santzkiniam plotui 1,3, jei SIII [0] nėra lygus 0,9. Bandymais nustatyta, kad vidutinis santykinis etaloninio mėginio [0] III smailės plotas lygus 0,9.9.3. Metodo tikslumas9.3.1. PakartojamumasSkirtumas tarp dviejų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas, neturi būti didesnis kaip 0,2 % masės dalimis;9.3.2. AtkuriamumasSkirtumas tarp dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas, neturi būti didesnis kaip 0,4 % masės dalimis.9.4. Interpretacija9.4.1. Konstatuojama, kad fermentinių išrūgų mėginyje nėra, jei santykinis III smailės plotas SIII [E], išreikštas fermentinių išrūgų gramais 100 gramų produkto, yra ≤2,0+Kai:2.0 = didžiausias galimas santykinis III smailės plotas, atsižvelgiant į santykinį III smailės plotą, t.y. 1,3 ir neapibrėžtį dėl nugriebto pieno miltelių sudėties kitimo bei metodo atkuriamumą (9.3.2);SIII[0]– 0,9 = pataisa, kai plotas SIII [0] nėra lygus 0,9 (žr. 9.2 punktą.).9.4.2. Jei III smailės santykinis plotasSyra > 2,0+ir II smailės santykinis plotas SII[E] ≤ 160, fermentinių išrūgų kiekis nustatomas kaip nurodyta 9.2 punkte.9.4.3. Jei III smailės santykinis plotasSyra > 2,0 +ir II smailės santykinis plotas SII[E] ≤ 160, nustatomas bendras baltymų kiekis (P %) ir analizuojami 1 ir 2 paveikslai.9.4.3.1. Duomenys, gauti analizuojant nefalsifikuotus didelį baltymų kiekį turinčius nugriebto pieno miltelius, pateikti 1 ir 2 paveiksluose.Ištisine linija pavaizduota tiesinė regresija, kurios koeficientai apskaičiuoti mažiausių kvadratų metodu.Punktyrinė linija nustato viršutinę III smailės santykinio ploto ribą, su 90 % tikimybe, kad ji nebus peržengta.1 ir 2 paveiksluose punktyrinėmis linijomis pavaizduotų grafikų lygtys:SIII= 0,376 % - 10,7 | (1 paveikslas) |SIII= 0,0123 SIIE+ 0,93 | (2 paveikslas) |kai:SIII  III smailės santykinis plotas, apskaičiuotas pagal bendrą baltymų kiekį arba pagal santykinį smailės SII [E] plotą;P %  bendras baltymų kiekis masės procentais;SII[E]  mėginio smailės santykinis plotas, apskaičiuotas pagal 9.1.2.Šios lygtys atitinka 9.2 aptartą skaičių 1,3.Skirtumai tarp nustatyto santykinio ploto SIII[E] ir santykinio ploto SIII (T1 ir T2) reiškiami lygtimis:T= S-S- 0,9T= S-0,0123 S+ 0,93S- 0,99.4.3.2. T1  yra lygūs arba mažesni už nulį, fermentinių išrūgų aptikti negalima.T2  yra didesni už nulį, fermentinių išrūgų yra.Fermentinių išrūgų kiekis apskaičiuojamas pagal formulę:W = T+ 0,91kai:0,91 – atstumas vertikalioje ašyje tarp ištisinės ir punktyrinės linijų.+++++ TIFF +++++--------------------------------------------------XIX PRIEDAS(13 straipsnis)FERMENTINIŲ IŠRŪGŲ KIEKIO NUSTATYMAS NUGRIEBTO PIENO MILTELIUOSE IR MIŠINIUOSE, KURIE PAMINĖTI REGLAMENTE (EB) Nr. 2799/19991. Tikslas: nustatyti fermentinių išrūgų pridėjimą į:a) nugriebto pieno miltelius, nurodytus Reglamento (EEB) 2799/1999 2 straipsnyje irb) mišinius, nurodytus Reglamento 1799/1999 1 straipsnio 4 dalyje.2. Nuorodos: tarptautinis standartas ISO 7073. ApibrėžimasFermentinių išrūgų kiekis – tai pagal toliau aprašytą metodiką nustatytas medžiagų kiekis masės procentais.4. Metodo esmėGlikomakropeptido (GMP) A kiekis nustatomas pagal šio reglamento XVIII priedą. Teigiamus rezultatus rodantys mėginiai analizuojami dėl makropeptido A efektyviosios skysčių chromatografijos (ESCh) atvirkštinių fazių metodu. Rezultatai vertinami lyginant su etaloniniais mėginiais, sudarytais vien tik iš pieno miltelių ir pieno miltelių su žinomu išrūgų miltelių priedu. Jeigu analizės rezultatas didesnis kaip 1 % (masės), reiškia produkte yra išrūgų sausųjų medžiagų.5. ReagentaiVisi reagentai turi būti analiziškai gryni. Analizei naudojamas vanduo turi būti distiliuotas arba ekvivalentiško grynumo. Acetonitrilas turi būti spektroskopijai ar ESCh tinkamos kokybės.Reagentai, reikalingi šio reglamento XVIII priede aprašytai metodikai.Reagentai, reikalingi ESCh atvirkstiniu faziu metodikai5.1. Trichloracto rūgšties tirpalasIštirpinti vandenyje 240 g trichloracto rūgšties (CCl3CCOOH) ir skiesti iki 1000 ml.5.2. Eliuentai A ir BEliuentas A: 150 ml acetonitrilo (CH3CN), 20 ml izopropanolio (CH3CHOH CH3) ir 1 ml trifloracto rūgšties (TFA, CF3COOH) supilama į 1000 ml matavimo kolbą. Skiedžiama vandeniu iki žymės. Eliuentas B: 550 ml acetonitrilo, 20 ml izopropanolio ir 1 ml TFA supilama į 1000 ml matavimo kolbą. Skiedžiama vandeniu iki žymės. Prieš naudojimą eliuento tirpalas filtruojamas per membraninį filtrą, kurio porų diametras 0,45 μm.5.3. Kolonėlės konservavimasBaigus analizę, kolonėlė perplaunama eliuentu B (per gradientą) ir po to plaunama acetonitrilu (gradientas per 30 minučių). Kolonėlė laikoma acetonitrile.5.4. Etaloniniai mėginiai5.4.1. Nugriebto pieno milteliai (t.y.(0)), atitinkantys viešojo saugojimo reikalavimus.5.4.2. Tokie patys nugriebto pieno milteliai, į kuriuos primaišyta 5 % (masės) etaloninės sudėties fermentinių išrūgų miltelių (5).5.4.3. Tokie patys nugriebto pieno milteliai, į kuriuos primaišyta 50 % (masės) etaloninės sudėties fermentinių išrūgų miltelių (50) [1].6. ĮrangaĮranga, reikalinga šio reglamento XVIII priede aprašytai metodikai.6.1. Analizinės svarstyklės.6.2. Centrifuga, galinti pasiekti centrifugavimo jėgą 2200g, kurioje yra maždaug 50 ml talpos kamščiais užkemšami centrifugavimo mėgintuvėliai.6.3. Mechaninė purtyklė, galinti purtyti esant 50 °C.6.4. Magnetinė maišyklė.6.5. Stikliniai piltuvėliai, apie 7 cm skersmens.6.6. Popieriniai filtrai, vidutinio tankio, apie 12,5 cm skersmens.6.7. Stiklinis filtravimo įrenginys su membraniniais filtrais, kurių poros 0,45 μm skersmens.6.8. Graduotos pipetės, kuriomis galima atmatuoti 10 ml (ISO 648, A klasė arba ISO/R 835) arba sistema, galinti matuoti (skirstyti) 10 ml per 2 minutes.6.9. Termostatinė vandens vonia, nustatyta 25 °C ± 0,5 °C.6.10. ESCh įranga, kurią sudaro:6.10.1. Binario (dvigubo) gradiento įsiurbimo sistema.6.10.2. Rankinis arba automatinis 100 ml talpos inžektorius(švirkštas).6.10.3. Kolonėlė Dupont Protein Plus (20 mm × 4,6 mm dk.) arba ekvivalentiška stambiaporiu kvarcu užpildyta atvirkštinių fazių kolonėlė;6.10.4. Kolonėlės termostatas, nustatytas 35 °C ± 1 °C.6.10.5. Kintamo bangos ilgio UV detektorius, kuriuo galima matuoti 0,02 tikslumu esant 210 nm (jeigu reikia gali būti naudojamas iki 220 nm) bangos ilgiui.6.10.6. Integratorius smailės plotui matuoti.Pastaba.Kolonėlė gali veikti kambario temperatūroje, jeigu ji nesvyruoja daugiau kaip 1° C, priešingu atveju gaunami per dideli GMP sulaikymo trukmės svyravimai.7. Mėginių ėmimas7.1. Mėginiai imami pagal IDF Standard 50C:1995 reikalavimus.7.2. Mėginiai laikomi tokiomis sąlygomis, kurios užkirstų kelią bet kokiam gedimui ar sudėties pasikeitimui.8. Metodika8.1. Tiriamojo mėginio paruošimasMilteliai supilami į sandariai uždaromą tarą, kurios tūris turi būti maždaug dvigubai didesnis negu miltelių. Indas tuojau uždaromas. Pieno milteliai gerai sumaišomi keletą kartų apverčiant indą.8.2. MėginysSveriama 2,00 g ± 0,001 g mėginio į centrifugavimo mėgintuvėlį (6.2) arba tinkamas 50 ml talpos kolbutes, užkemšamas kamščiais;8.3. Riebalų ir baltymų pašalinimas8.3.1. Įpilama 20,0 g šilto (50 °C) vandens. Milteliai ištirpinami purtant 5 minutes (pasukos 30 minučių) mechanine purtykle (6.3). Mėgintuvėlis dedamas į vandens vonią (6.9) ir paliekamas, kad jo turinys sušiltų iki 25 °C.8.3.2. Vienodu tempu per 2 minutes supilama 10,0 ml 25 °C trichloracto rūgšties tirpalo (5.1) smarkiai maišant magnetine maišykle (6.4). Mėgintuvėlis dedamas į vandens vonią (6.9) ir paliekamas 60 minučių.8.3.3. Centrifuguojama (6.2) 10 minučių esant 2200 × g arba filtruojama per filtrą (6.6); pirmieji 5 ml filtrato išpilami.8.4. Chromatografinė analizė8.4.1. Atliekama ESCh analizė kaip aprašyta šio techninio reglamento XIV priede. Jeigu gaunami neigiami rezultatai, tai tiriamajame mėginyje nėra tokio fermentinių išrūgų kiekio, kurį būtų galima aptikti. Jeigu rezultatai teigiami, turi būti taikoma toliau aprašyta atvirkštinių fazių ESCh metodika. Rūgščiųjų pasukų milteliai gali rodyti klaidingai teigiamus rezultatus. Atvirkštinių fazių ESCh metodas atmeta tokią galimybę.8.4.2. Prieš atliekant atvirkštinių fazių ESCh analizę turi būti nustatomos optimalios gradiento sąlygos. GMP sulaikymo trukmė – 26 min ± 2 min yra optimali gradientų sistemai su 6 ml nuliniu sulaikymo tūriu (nuo momento, kai tirpalai kartu ateina į įsiurbimo kilpą, imtinai). Gradientų sistemose su mažesniu nuliniu tūriu (pvz., 2 ml) optimali sulaikymo trukmė turėtų būti 22 minutės.Imami etaloninių mėginių (5.4) be išrūgų ir su 50 % išrūgų tirpalai.Įsiurbiama 100 μl supernatanto arba filtrato (8.3.3) į ESCh aparatą, veikiantį 1 lentelėje nurodytomis sąlygomis.1 LentelėGradiento parinkimo sąlygos chromatografijai optimizuotiLaikas (min.) | Greitis (ml/min.) | % A | % B | Kreivė |Pradžia | 1,0 | 90 | 10 | * |27 | 1,0 | 60 | 40 | lin |32 | 1,0 | 10 | 90 | lin |37 | 1,0 | 10 | 90 | lin |42 | 1,0 | 90 | 10 | lin |Dviejų chromatogramų palyginimas turi parodyti GMPA smailės vietą.Naudojant toliau pateiktą formulę galima apskaičiuoti pradinę tirpalo sudėtį, naudojamą normaliam gradientui (žr. 8.4.3).% B = 10 - 2,5 +/6*30/27% B = 7,5 +/6*1,11kai:RtgmpA : GMPA išlaikymo trukmė paieškos gradiente;10 : pradinis % B paieškos gradiente;2,5 : % B viduriniame taške minus % B pradiniame taške normaliame gradiente;13,5 : paieškos gradiento viduriniojo taško trukmė;26 : pageidaujama GMPA išlaikymo trukmė;6 : apskaičiuoto ir normalaus gradiento nuolydžių santykis;30 : % B pradinis minus % B 27-ą gradiento parinkimo minutę;27 : gradiento parinkimo laikas.8.4.3. Mėginių tirpalaiTiksliai matuojant įsiurbiama 100 μl supernatanto arba filtrato (8.3.3) į ESCh aparatą, veikiantį taip, kad tėkmės greitis būtų 1,0 ml eliuento tirpalo (5.2) per minutę.Eliuento sudėtis analizės pradžioje nustatoma pagal 8.4.2. Normaliai ji artima A:B = 6:24 (5.2). Iškart po įsiurbimo nustatomas linijinis gradientas, kuris duoda 5 % aukštesnį procentą B po 27 minučių. Vėliau paleidžiamas linijinis gradientas, kuris nustato eliuento sudėtį iki 90 % B per 5 minutes. Ši sudėtis palaikoma 5 minutes, po to sudėtis keičiama iki pradinės sudėties gradiento per 5 minutes greičiu. Priklausomai nuo įsiurbimo sistemos vidinio tūrio kitas įsiurbimas gali būti atliekamas 15 minučių po to, kai pasiekiamos pradinės sąlygos.Pastabos:1. Glikomakropeptido sulaikymo trukmė turėtų būti 26 min ± 2 min. Tai gali būti pasiekiama keičiant pradines ir galutines pirmojo gradiento sąlygas. % B skirtumas pradinėmis ir galutinėmis pirmojo gradiento sąlygoms turi išlikti 5 % B.2. Eliuentai turėtų būti pakankamai degazuoti ir tokie išlikti. Tai svarbu, kad galėtų tinkamai veikti gradiento siurbimo sistema. GMP smailės išlaikymo trukmės standartinis nuokrypis turėtų būti mažiau kaip 0,10 minutės (n = 10).3. Kas penkis mėginius įpurškiamas etaloninis mėginys (5), naudojamas apskaičiuojant naują perskaičiavimo koeficientą R (9.1.1).8.4.4. Mėginio (E) chromatografinės analizės rezultatai gaunami chromatogramos forma, kurioje GMP smailė identifikuojama pagal maždaug 26 minučių sulaikymo trukmę.Integratorius (6.40.6) automatiškai skaičiuoja GMP smailės aukštį H. Kiekvienoje chromatogramoje turi būti patikrinta pagrindo linijos vieta. Analizė arba integracija turi būti kartojama, jeigu neteisingai nustatyta pagrindo linijos vieta.Prieš atliekant kiekybinę interpretaciją, svarbu patikrinti kiekvienos chromatogramos išvaizdą, siekiant nustatyti bet kokį nukrypimą, galimą arba dėl aparato ar kolonėlės veikimo sutrikimo arba dėl analizuojamo mėginio kilmės ar prigimties. Esant abejonių, analizė kartojama.8.5. Kalibravimas8.5.1. Etaloniniams mėginiams (5.4.1–5.4.2) taikoma metodika, aprašyta punktuose 8.2–8.4.4. Naudojami šviežiai pagaminti tirpalai, kadangi GMP skyla 8 % trichloracto rūgšties aplinkoje kambario temperatūroje. 4 °C temperatūroje tirpalas išlieka stabilus 24 valandas. Ilgos analizių serijos atveju automatiniame inžektoriuje pageidaujama naudoti šaldomą mėginių padėklą.Pastaba.8.4.2. punktas gali būti praleidžiamas, jeigu % B pradinėmis sąlygomis yra žinomas iš ankstesnės analizės.Etaloninio mėginio (5) chromatograma turi būti analogiška kaip 1 paveiksle: prieš GMPA smailę yra dvi mažos smailės. Svarbu gauti panašius at(si)skyrimus.8.5.2. Prieš atliekant mėginių chromatografiją, įsiurbiama 100 μl etaloninio mėginio be fermentinių išrūgų(0) (5.4.1).Chromatograma neturi rodyti smailės per GMPA smailės sulaikymo trukmę.8.5.3. Nustatomas perskaičiavimo koeficientas R įsiurbiant tą patį filtrato (8.5.1) tūrį, koks buvo įsiurbiamas mėginio.9. Rezultatų išraiška9.1. Apskaičiavimo metodas ir formulė9.1.1. Perskaičiavimo koeficiento R apskaičiavimas:GMP smailės: R = W/Hkai:R = GMP smailės perskaičiavimo koeficientas;H = GMP smailės aukštis;W = išrūgų kiekis etaloniniame mėginyje (5).9.2. Fermentinių išrūgų kiekio mėginyje apskaičiavimas:W(E) = R × H(E)kai:W(E) = fermentinių išrūgų kiekis mėginyje (E) masės procentais;R = GMP smailės perskaičiavimo koeficientas (9.1.1);H(E) = mėginio (E) GMP smailės aukštis.Jeigu W(E) yra didesnis kaip 1 % ir skirtumas tarp sulaikymo trukmės mėginio ir etaloninio mėginio (5) mažesnis kaip 0,2 minutės, tai mėginyje yra fermentinių išrūgų sausųjų medžiagų.9.3. Tikslumas:9.3.1. PakartojamumasSkirtumas dviejų to paties mėginio analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje ir naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 0,2 masės procento.9.3.2. AtkuriamumasDar nenustatytas.9.3.3. Tiesinė priklausomybėEsant nuo 0 iki 16 procentų fermentinių išrūgų, turėtų būti gaunama tiesinė priklausomybė su didesniu kaip 0,99 koreliacijos koeficientu.9.4. Interpretacija9.4.1. Laikoma, kad išrūgų turi būti, jeigu pagal 9.2 punktą gautas rezultatas didesnis kaip 1 % (masės) ir GMP smailės sulaikymo trukmė daugiau kaip 0,2 minutės skiriasi nuo etaloninio mėginio (5) sulaikymo trukmės. 1 % riba nustatyta pagal Reglamento 625/78 (EEB) V priedo 9.2 ir 9.4.1 punktų nuostatas.+++++ TIFF +++++[1] Etaloninės sudėties fermentinių išrūgų miltelių ir išrūgomis falsifikuotų pieno miltelių galima gauti iš NIZO. (Nyderlandų pienininkystės institutas). Kernsemheweg 2, PO Box 20-NL-6710BA Ede. Tačiau taip pat gali būti vartojami ir kiti ekvivalentiškos sudėties pieno milteliai.--------------------------------------------------XX PRIEDAS(14 straipsnis)NUGRIEBTO PIENO MILTELIAI: FOSFATIDILSERINO IR FOSFATIDILETANOLAMINO KIEKIO NUSTATYMASMetodas: atvirkščių fazių ESCh1. Tikslas ir taikymo sritisŠiame metode aprašytas fosfatidilserino (FS) ir fosfatidiletanolamino (FE) kiekio nugriebto pieno milteliuose (NPM) tyrimas, pagal kurį nustatomos juose esančios pasukų kietosios medžiagos.2. ApibrėžimasFS+FE kiekis: medžiagos masės dalis, kuri nustatoma atliekant toliau nurodytus veiksmus. Rezultatas išreiškiamas fosfatidiletanolamino dipalmitoilo (FEDP) miligramais 100 gramų miltelių.3. Metodo esmėIš regeneruotų nugriebto pieno miltelių metanoliu ekstrahuojami aminofosfolipidai. FS ir FE, kaip o-ftalio dialdehidų (OFA) dariniai, nustatomi efektyviosios skysčių chromatografijos (ESCh) atvirkščių fazių metodu, naudojant fluorescensinį detektorių. FS ir FE kiekiai tiriamajame mėginyje nustatomi lyginant rezultatus su etaloniniu mėginiu, kuriame FEDP kiekis yra žinomas.4. ReagentaiVisi reagentai turi būti analiziškai gryni, vanduo– distiliuotas arba tokio pat grynumo.4.1. Etaloninė medžiaga: FEDP, mažiausiai 99 % grynumoPastaba.Etaloninė medžiaga turi būti laikoma minus 18° C temperatūroje4.2. Reagentai etaloniniam ir tiriamajam mėginiams paruošti:4.2.1. Metanolis, skirtas ESCh analizei4.2.2. Chloroformas, skirtas ESCh analizei4.2.3. Triptamino monohidrochloridas4.3. Reagentai o-ftalio dialdehido dariniams gauti:4.3.1. Natrio hidroksidas, 12 mol/l vandeninis tirpalas4.3.2. Boro rūgštis. 0,4 mol/l vandeninis tirpalas, natrio hidroksidu (4.3.1) sunormintas iki pH 10,04.3.3. 2-merkaptoetanolis4.3.4. o-oftalio dialdehidas (OFA)4.4. ESCh eliuavimo tirpalai:Eliuavimo tirpalai ruošiami iš reagentų, skirtų ESCh analizei:4.4.1. Vanduo, skirtas ESCh analizei4.4.2. Fluorescensiškai patikrinto grynumo metanolis4.4.3. Tetrahidrofuranas.4.4.4. Natrio dihidrofosfatas4.4.5. Natrio acetatas4.4.6. Acto rūgštis5. Įranga5.1. Analitinės svarstyklės5.2. 25 ml ir 100 ml laboratorinės stiklinės5.3. 1 ml ir 10 ml pipetės5.4. Magnetinė maišyklė5.5. 0,2 ml, 0,5 ml ir 5 ml graduotos pipetės5.6. 10 ml, 50 ml ir 100 ml matavimo kolbos5.7. 20 μl ir 100 μl švirkštai5.8. Ultragarsinė vonia5.9. Centrifuga, galinti išvystyti 27000 x g išcentrinę jėgą5.10. Apie 5 ml stikliniai buteliukai5.11. 25 ml graduotas cilindras5.12. pH metras5.13. ESCh įranga5.13.1. Judančiosios fazės gradiento formavimo sistema, kurios našumas 1,0 ml/min, esant 200 barų slėgiui5.13.2. Automatinis mėginių ėmiklis, kuriame galima sintetinti darinius5.13.3. 30° C temperatūrą palaikantis kolonėlės šildytuvas5.13.4. Fluorescencinis detektorius, nustatytas 330 nm sužadinimo bangos ilgiui ir 440 nm emisijos bangos ilgiui5.13.5. Integratorius arba duomenis apdorojanti programinė įranga, kuria galima nustatyti smailės plotą5.13.6. Kolonėlė "Lichrosphere–100" (250 x 4,6 mm) arba jai lygiavertė, užpildyta oktadecilsilanu (C18), dalelių dydis 5 μm6. Mėginių ėmimasMėginiai imami pagal IDF Standard 50C:1985.7. Metodika:7.1. Vidinio etaloninio tirpalo paruošimasĮ 100 ml matavimo kolbą (5.6) pasveriama 30,0 g ± 0,1 g triptamino monohidrochlorido (4.2.3) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. 1 ml šio tirpalo pipete (5.3) įpilama į 10 ml matavimo kolbą (5.6) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. Gaunamas 0,15 mmol/l koncentracijos triptamino tirpalas.7.2. Tiriamojo mėginio tirpalo ruošimasĮ 25 ml laboratorinę stiklinę (5.2) pasveriama 1,000 g ± 0,001 g tiriamojo mėginio. Pipete (5.3) įpilama 10 ml iki 40 °C pašildyto distiliuoto vandens ir 30 min maišoma magnetine maišykle (5.4), kad neliktų jokių neištirpusių gumuliukų. 0,2 ml regeneruoto pieno pipete (5.5) įlašinami į 10 ml matavimo kolbą (5.6), švirkštu (5.7) įšvirkščiama 100 μl 0,15 mmol/l triptamino tirpalo (7.1) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. Kruopščiai sumaišoma, vartant kolbą, ir 15 min. apdorojama ultragarsu (5.8). 10 min. sukama centrifugoje (5.9), esant 27.000 x g išcentrinei jėgai, gautas skystis supilamas į stiklinį buteliuką (5.10).Pastaba.Mėginio tirpalas iki ESCh analizės turi būti laikomas 4° C temperatūroje.7.3. Išorinio etaloninio tirpalo ruošimasĮ 50 ml matavimo kolbą (5.6) pasveriama 55,4 mg FEDP (4.1) ir naudojant graduotą cilindrą (5.11) įpilama apie 25 ml chloroformo (4.2.2). Kolba užkemšama kamščiu ir, atsargiai maišant, šildoma iki 50 °C, kol ištirpsta FEDP. Kolba atvėsinama iki 20 °C, praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės ir, vartant kolbą, sumaišoma. 1 ml šio tirpalo pipete (5.3) įpilamas į 100 ml matavimo kolbą (5.6) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. 1 ml šio tirpalo pipete (5.3) įpilamas į 10 ml matavimo kolbą (5.6), švirkštu (5.7) įšvirkščiama 100 μl 0,15 mmol/l triptamino tirpalo (7.1) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. Vartant kolbą, tirpalas sumaišomas.Pastaba.Etaloninis tirpalas iki chromatografinės analizės turi būti laikomas 4 °C temperatūroje.7.4. Sintezuojančio reagento ruošimasĮ 10 ml matavimo kolbą (5.6) pasveriama 25,0 ± 0,1 mg OFA (4.3.4), pipete (5.5) įlašinami 0,5 ml metanolio (4.2.1) ir atsargiai maišoma, kol OFA ištirpsta. Praskiedžiama boro rūgšties tirpalu (4.3.2) iki žymės ir švirkštu (5.7) įšvirkščiama 20 μl 2-merkaptoetanolio (4.3.3).Pastaba.Sintezuojantis tirpalas iki chromatografinės analizės turi būti laikomas 4 °C temperatūroje ir yra tinkamas vieną savaitę.7.5. Nustatymas su ESCh:7.5.1. Eliuavimo tirpalai (4.4)Eliuentas A:0,3 mmol/l natrio dihidrofosfato ir 3 mmol/l natrio acetato tirpalas (acto rūgštimi normalizuotas iki pH6,5): metanolis: tetrahidrofuranas = 558: 440: 2 (tūrio dalimis).Eliuentas B:metanolis7.5.2. Siūlomas eliuento gradientas:Laikas, (min.) | Eliuentas A, (%) | Eliuentas B, (%) | Tekėjimo greitis, (ml/min.) |Pradžia | 40 | 60 | 0 |0,1 | 40 | 60 | 0,1 |5,0 | 40 | 60 | 0,1 |6,0 | 40 | 60 | 1,0 |6,5 | 40 | 60 | 1,0 |9,0 | 36 | 64 | 1,0 |10,0 | 20 | 80 | 1,0 |11,5 | 16 | 84 | 1,0 |12,0 | 16 | 84 | 1,0 |16,0 | 10 | 90 | 1,0 |19,0 | 0 | 100 | 1,0 |20,0 | 0 | 100 | 1,0 |21,0 | 40 | 60 | 1,0 |29,0 | 40 | 60 | 1,0 |30,0 | 40 | 60 | 0 |Pastaba.Norint atkartoti paveiksle pavaizduotą atskyrimą, eliuento gradientą gali tekti šiek tiek pakeisti.Kolonėlės temperatūra: 30 °C.7.5.3. Įšvirkščiamas tūris: 50 μl sintezuojančio reagento ir 50 μl mėginio tirpalo.7.5.4. Kolonėlės pusiausvyros nustatymas:Kiekvieną kartą, paleidžiant sistemą, kolonėlė 15 min. plaunama grynu tirpikliu B, po to nustatomas tirpiklių santykis A: B = 40: 60 ir, nustačius 1 ml/min. greitį, 15 min. laukiama, kol nusistovės pusiausvyra. Atliekamas tuščiasis bandymas, įšvirkščiant metanolį (4.2.1).Pastaba.Paliekant kolonėlę nenaudojamą ilgesniam laikui, ji 30 min. plaunama metanolio chloroformo mišiniu = 80: 20 (tūrio dalimis).7.5.5. FS + FE kiekio nustatymas tiriamajame mėginyje.7.5.6. Atliekamos kelios chromatografinės analizės iš eilės vienodais laiko tarpais, siekiant gauti vienodą sulaikymo trukmę. Atlikus 5–10 mėginių tyrimus, įšvirkščiamas išorinis etaloninis tirpalas (7.3) ir pasitikslinama ar nepakito skyrimas.Pastaba.Po 20–25 analizių kolonėlė mažiausiai 30 min. turi būti plaunama grynu tirpikliu B (7.5.1).7.6. Integravimas:7.6.1. FEDP smailėFEDP atskiriama viena smaile. Smailės plotas nustatomas integruojant tarp minimumų.7.6.2. Triptamino smailėTriptaminas išplaunamas viena smaile (1 pav.). Smailės plotas nustatomas integruojant tarp minimumų.7.6.3. FS ir FE smailių grupėsAprašytomis sąlygomis (1 pav.) FS išplaunamas dviem iš dalies neatsiskyrusiomis smailėmis, prieš kurias yra mažesnė smailė. FE išplaunamas trimis iš dalies neatsiskyrusiomis smailėmis. Visas kiekvienos smailių grupės plotas nustatomas, nubrėžus pagrindo liniją, kaip parodyta 1 paveiksle.8. Rezultatų skaičiavimasFS ir FE kiekis tiriamajame mėginyje apskaičiuojamas pagal formulę:C= 55,36 ××T1T2kai:C = FS arba FE kiekis (mg/100 g miltelių) tiriamajame mėginyje;A1 = FEDP smailės plotas etaloninio mėginio (7.3) chromatogramoje;A2 = FS arba FE smailės plotas tiriamojo mėginio (7.2) chromatogramoje;T1 = triptamino smailės plotas etaloninio mėginio (7.3) chromatogramoje;T2 = triptamino smailės plotas tiriamojo mėginio (7.3) chromatogramoje.9. TikslumasPastaba.Pakartojamumo vertės apskaičiuotos pagal IDF standartą [1]. Apytikslė atkuriamumo riba apskaičiuota pagal III priedo b dalį.9.1. PakartojamumasSantykinio standartinio pakartojamumo skirtumas tarp dviejų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 2 %. Jei šiomis sąlygomis atliekamos dvi analizės, santykinis skirtumas tarp dviejų rezultatų turi neviršyti 6 % šių rezultatų aritmetinio vidurkio.9.2. AtkuriamumasSantykinis skirtumas tarp dviejų atskirų ir nepriklausomų rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose, naudojant skirtingą aparatūrą ir identiškas tyrimo medžiagas, turi neviršyti 11 % jų aritmetinio vidurkio.10. Literatūra10.1. Resmini P., Pellegrino I., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M. Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids. Sci. Tech. Latt.-Cas. 39, 395 (1988).+++++ TIFF +++++[1] IDF 135B/1991. Pienas ir pieno produktai. Analizės metodų tikslumo charakteristikos. Bendrų tyrimų metodikos apžvalga.--------------------------------------------------XXI PRIEDAS(15 straipsnis)ANTIBIOTIKŲ IR SULFAMIDO/DAPSONO LIEKANŲ APTIKIMAS NUGRIEBTO PIENO MILTELIUOSEInhibitorinės medžiagos nustatomos mikrobiologiniu metodu. Kaip testo kultūra naudojama Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953, kuri yra pakankamai jautri, kad būtų galima aptikti piene 4 μg benzilpenicilino ir 100 μg sulfadimidino. Komercinius testų rinkinius taip pat galima naudoti, jei jie yra pakankamai jautrūs benzilpenicilinui ir sulfadimidinui aptikti [1].Tyrimui naudojamas iš nugriebto pieno miltelių regeneruotas pienas (1 g miltelių + 9 ml distiliuoto vandens). Tyrimas atliekamas taip, kaip aprašyta IDF Bulletin No 258/1991 arba pagal analizės rinkinio gamintojo instrukciją.Gavus teigiamą rezultatą, elgiamasi taip:1) Bandymas pakartojamas, į terpę dedant penicilinazę:Jei gaunamas teigiamas rezultatas: šiuo metodu inhibitoriaus identifikuoti negalima.Jei gaunamas neigiamas rezultatas: inhibitorinė medžiaga yra β-laktamininis antibiotikas.2) Bandymas pakartojamas, į terpę dedant p-amino benzoinę rūgštį:Jei gaunamas teigiamas rezultatas: šiuo metodu inhibitoriaus aptikti negalima.Jei gaunamas neigiamas rezultatas: inhibitorinė medžiaga yra sulfamidas (dapsonas).3) Bandymas pakartojamas, į terpę dedant penicilinazės + p-amino benzoinės rūgšties:Jei gaunamas teigiamas rezultatas: šiuo metodu inhibitoriaus identifikuoti negalima.Jei gaunamas neigiamas rezultatas:inhibitorinė medžiaga yra β-laktamininis antibiotikas ir sulfamidas (dapsonas).[1] Svarbi pastaba:Analizuojant pieno miltelius, gali būti gauti klaidingi teigiami rezultatai. Todėl labai svarbu tikrinti, kad, taikant naudojamą bandymo sistemą, nebūtų gaunami klaidingi teigiami rezultatai.--------------------------------------------------XXII PRIEDAS16 straipsnisPIENO MILTELŲ KIEKIO KOMBINUOTUOSIUOSE PAŠARUOSE NUSTATYMAS FERMENTINĖS PARAKAZEINO KOAGULIACIJOS BŪDU1. TikslasPieno miltelių kiekio kombinuotuose pašaruose nustatymas fermentinės parakazeino koaguliacijos būdu.2. Taikymo sritisŠis metodas taikomas kombinuotiesiems pašarams, kurių sudėtyje yra ne mažiau kaip 10 % sausojo pieno miltelių. Dideli kiekiai pasukų ir(arba) ne pieno baltymų gali trukdyti nustatymui.3. Metodo esmė3.1. Kombinuotuosiuose pašaruose esančio kazeino ištirpinimas ekstrahuojant natrio citrato tirpalu.3.2. Kalcio jonų koncentracijos reguliavimas iki reikiamo nusodinti parakazeinui lygio; kazeino pavertimas parakazeinu šliužo fermento pagalba.3.3. Azoto kiekis parakazeino nuosėdose nustatomas Kjeldalio metodu, kaip aprašyta IDF Standard 20A:1986; pieno miltelių kiekis paskaičiuojamas priimant, kad minimalus kazeino kiekis juose yra 27,5 % (žr. 9.1).4. ReagentaiTrinatrio citrato dihidrato 1 % (1 g/100 ml) vandeninis tirpalas.4.1. Kalcio chloridas (2 mol/l tirpalas): sveriama 20,018 g CaCO3 į tinkamo dydžio (150 ml-200 ml) porcelianinį indą arba stiklinę. Užpilama distiliuotu vandeniu (kad apsemtų) ir indas su gaminamu tirpalu statomas į verdančio vandens vonelę. Lėtai supilama nuo 50 ml iki 60 ml druskos rūgšties tirpalo (HCl:vanduo = 1:1), kad visiškai ištirptų karbonatas ir tirpalas nuskaidrėtų. Pagamintas tirpalas laikomas virš vandens garų vonelės, kad būtų pašalinta nesureagavusi HCl ir gaunamas sausas CaCl2. Gauta druska su distiliuotu vandeniu perpilama į 100 ml matavimo kolbutę ir skiedžiama iki žymės. Pamatuojamas pH, kuris turi būti ne mažesnis kaip 4,0. Tirpalas laikomas šaldytuve.4.2. 0,1 mol/l natrio hidroksidas;4.3. 0,1 mol/l druskos rūgštis;4.4. Skystas šliužo fermentas (standartinio aktyvumo 1:10000), laikomas šaldytuve 4 °C - 6 °C temperatūroje.4.5. Reagentai, reikalingi kiekybiniam azoto nustatymui Kjeldalio metodu pagal IDF Standard 20A:1986.4.6. Visi naudojami reagentai turi būti analizinio grynumo. Naudojamas tik distiliuotas arba ekvivalentiško grynumo vanduo. Išskyrus šliužo fermentą (4.5), visuose reagentuose turi nebūti azotinių medžiagų.5. ĮrangaNaudojama įprastinė ir toliau išvardyta laboratorinė įranga:5.1. Piestelė arba homogenizatorius.5.2. Analizinės svarstyklės.5.3. Centrifuga 2000 aps./min. – 3000 aps./min. su 50 ml talpos mėgintuvėliais.5.4. Magnetinė maišyklė su įdedamais 10 mm – 15 mm ilgio strypeliais.5.5. 150 ml - 200 ml talpos stiklinės.5.6. 250 ml ir 500 ml talpos stiklinės.5.7. 60 mm – 80 mm skersmens piltuvėliai.5.8. 150 mm skersmens reti (greitai filtruojantys) bepeleniai filtrai (S.S. 5892, S.S. 595 1/2).5.9. Įvairaus nominalaus tūrio pipetės.5.10. Termostatiškai reguliuojama 37 °C vandens vonia.5.11. pH metras.5.12. Kjeldalio aparatai deginimui ir distiliacijai bei pagalbiniai įrenginiai prie jų.5.13. 25 ml graduotos biuretės.5.14. Plastikinė plovyklė distiliuotam vandeniui.5.15. Nerūdijančio plieno mentelės.5.16. Termometrai.5.17. Termostatiškai reguliuojama džiovinimo krosnelė.6. Metodika6.1. Mėginio paruošimas:Sugrūdama piestelėje arba sumalama malūnėliu iki vienodos konsistencijos nuo 10 g iki 20 g mėginio.6.2. Pieno miltelių tirpinimas ir netirpių liekanų atskyrimas.6.2.1. Pasveriama 1,000 g ± 0,002 g gerai susmulkintų kombinuotųjų pašarų (6.1) tiesiai į 50 ml centrifugavimo mėgintuvėlį. Įpilama 30 ml prieš tai pašildyto iki 45 °C natrio citrato tirpalo (4.1). Maišoma magnetine maišykle ne mažiau kaip 5 minutes.6.2.2. Centrifuguojama 10 minučių, esant 500 × g (2000 aps/min - 3000 aps/min), ir skaidrus supernatantas dekantuojamas į 150 ml–200 ml stiklinėles saugant, kad nuo mėgintuvėlio dugno nepakiltų purios nuosėdos.6.2.3. Likučiai mėgintuvėliuose ekstrahuojami dar du kartus pagal tą pačią metodiką, o ekstraktas supilamas prie pirmojo.6.2.4. Jeigu paviršiuje susidaro skystų riebalų sluoksnis, ekstraktas palaikomas šaldytuve, o sukietėję riebalai nuimami mentele.6.3. Kazeino sutraukdinimas šliužo fermentu6.3.1. Į gautą vandeninį ekstraktą (apie 100 ml) nuolat maišant įlašinama 3,4 ml sotaus kalcio chlorido (4.2). Nustatomas pH 6,4-6,5 su NaOH (4.3) ar HCl (4.4) tirpalu. Dedama į nustatytą 37 °C vandens vonią 15–20 minučių, kad pasiektume druskų pusiausvyrą. Tai parodo lengvas tirpalo drumstimasis.6.3.2. Skystis supilamas į vieną arba du centrifugavimo mėgintuvėlius ir centrifuguojamas 10 minučių, esant 2000 g, kad būtų pašalintos nuosėdos. Supernatantas, neplaunant nuosėdų, supilamas į vieną (arba dvi) centrifugavimo mėgintuvėlį.6.3.3. Supernatantas vėl pašildomas iki 37 °C. Nuolat maišant ekstraktą įlašinama 0,5 ml skysto šliužo fermento (4.5). Sutrauka susidaro per vieną – dvi minutes.6.3.4. Mėginys dedamas atgal į vandens vonią ir paliekamas 15 minučių 37 °C temperatūroje. Išėmus mėginį iš vandens vonios, maišant suardoma jo sutrauka. Centrifuguojama 10 minučių, esant 2000 g. Supernatantas filtruojamas per retą bepelenį filtrą [1] (Whatman Nr. 541 arba ekvivalentišką), filtras išsaugomas. Nuosėdos centrifugos mėgintuvėlyje, maišant perplaunamos 50 ml maždaug 35 °C temperatūros vandens.Vėl centrifuguojama 10 minučių, esant 2000 g. Supernatantas filtruojamas per anksčiau išsaugotą filtrą.6.4. Kazeino azoto nustatymas.6.4.1. Perplautos nuosėdos, naudojant distiliuotą vandenį, be nuostolių perpilamos ant filtro, išsaugoto iš 6.3.4 punkto. Filtras įdedamas į Kjeldalio kolbą. Nustatomas azotas Kjeldalio metodu pagal LST IDF 20B.7. Tuščiasis bandymas:7.1. Tuščiasis bandymas turi būti atliekamas reguliariai, naudojant bepelenį filtrą (5.8), sudrėkintą mišiniu, gautu iš 90 ml natrio citrato (4.1), 1 ml sotaus kalcio chlorido (4.2) ir 0,5 ml skysto šliužo fermento (4.5), ir perplaunant 3 × 15 ml distiliuotu vandeniu prieš mineralizuojant Kjeldalio metodu pagal LST IDF 20B.7.2. Tuščiajam bandymui sunaudotas rūgšties (4.4) kiekis turi būti atimamas iš mėginio titravimui sunaudoto rūgšties kiekio.8. Kontrolinis bandymas8.1. Nurodytai metodikai ir reagentams patikrinti atliekamas kontrolinis nustatymas etaloninių kombinuotųjų pašarų su žinomu nugriebto pieno miltelių kiekiu, nustatytu atliekant bendrus tyrimus. Dviejų lygiagrečių analizių rezultatų vidurkis neturi skirtis daugiau kaip 1 % nuo rezultatų, gautų atliekant bendrus tyrimus.9. Rezultatų išraiška9.1. Sausojo pieno miltelių kiekis kombinuotuosiuose pašaruose procentais apskaičiuojamas pagal formulę:% MMP =27,5- 2,810,908kai N – parakazeino azoto kiekis procentais; 27,5 – koeficientas perskaičiuoti nustatyto kazeino kiekį į nugriebto pieno miltelių kiekį procentais; 2,81 ir 0,908 –regresinės analizės būdu gauti pataisos koeficientai.10. Metodo tikslumas10.1. PakartojamumasNe mažiau kaip 95 % atvejų skirtumas dviejų to paties mėginio analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje ir naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 2,3 g nugriebto pieno miltelių 100 g kombinuotųjų pašarų.10.2. AtkuriamumasNe mažiau kaip 95 % atvejų skirtumas dviejų atskirų to paties mėginio analizių rezultatų, gautų skirtingų laboratorijų analitikų, naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 6,5 g nugriebto pieno miltelių 100 g kombinuotųjų pašarų.11. Leistinas nuokrypisKritinio skirtumo (CrD95) vertė (95 % tikimybės atveju) apskaičiuojama pagal formulę:CrD=nkur: R – atkuriamumas; r – pakartojamumas.Dvikartinio nustatymo CrD95 = 4,5 g.Jeigu cheminės analizės (dvikartinio nustatymo) rezultatai skiriasi nuo deklaruojamo nugriebto sausojo pieno kiekio ne daugiau kaip 4,5 g, laikoma, kad siunta atitinka šio reglamento reikalavimus.12. Pastabos12.1. Didelis kiekis kai kurių ne pieno kilmės baltymų, o ypač sojos baltymų, jeigu jie kaitinami kartu su nugriebtu sausuoju pienu, gali duoti per didelius rezultatus dėl jų nusėdimo kartu su pieno parakazeinu.12.2. Pasukos gali turėti įtakos rezultatų sumažėjimui, nes nustatoma tik jų neriebalinė dalis. Rūgščiosios pasukos gali duoti palyginti mažus rezultatus dėl nepilno jų ištirpimo citrato tirpale.12.3. Lecitinas (0,5 % ir daugiau) taip pat gali sumažinti rezultatus.12.4. Aukšta temperatūra apdoroto nugriebto sausojo pieno milteliai gali padidinti rezultatus dėl kai kurių išrūgų baltymų nusėdimo su parakazeinu.[1] Greitam filtravimui naudojamas bepelenis filtras.--------------------------------------------------XXIII PRIEDAS(17 straipsnis)KOKYBINIS KRAKMOLO NUSTATYMAS NUGRIEBTO PIENO MILTELIUOSE, DENATŪRUOTUOSE PIENO MILTELIUOSE IR KOMBINUOTUOSE PAŠARUOSE1. Taikymo sritisŠis metodas skirtas aptikti krakmolą, kuris naudojamas kaip denatūruotų pieno miltelių atsekamoji medžiaga.Aptikimo riba šiuo metodu yra maždaug 0,05 g krakmolo 100 g mėginio.2. Metodo esmėMetodas remiasi šiomis jodometrijoje naudojamomis reakcijomis:- laisvo jodo fiksavimu koloidais vandeniniuose tirpaluose,- krakmolo micelių absorbcija ir spalvos susidarymu.3. Reagentai3.1. Jodo tirpalas- jodas: 1 g,- kalio jodidas: 2 g,- distiliuotas vanduo: 100 ml.4. Įranga4.1. Analizinės svarstyklės.4.2. Vandens vonelė.4.3. Mėgintuvėliai, 25 mm × 200 mm.5. Analizė:Pasveriamas 1 g mėginio ir perpilamas į mėgintuvėlį (4.3).Įpilama 20 ml distiliuoto vandens ir supurtoma, kad ištirptų.Dedama į verdančio vandens vonią (4.2) ir palaikoma 5 minutes.Išimama iš vonios ir atvėsinama iki kambario temperatūros.Įpilama 0,5 ml jodo tirpalo (3.1) ir stebima susidaranti spalva.6. Rezultatų išraiškaNusidažymas mėlyna spalva rodo, kad mėginyje yra natyvaus krakmolo.Kai mėginyje yra modifikuoto krakmolo spalva gali būti ne mėlyna.7. PastabosSpalva, jos intensyvumas ir mikroskopinis krakmolo vaizdas keisis priklausomai nuo mėginyje esančio natyvaus krakmolo kilmės (pvz., kukurūzų ar bulvių) ir modifikuoto krakmolo tipo.Esant modifikuotų krakmolų susidaro violetinė, raudona arba ruda spalva, priklausomai nuo natyvaus krakmolo kristalinės struktūros ir modifikacijos laipsnio.--------------------------------------------------XXIV PRIEDAS(18 straipsnis)RŪGŠČIŲJŲ PASUKŲ MILTELIŲ DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS1. Taikymo sritisNustatyti drėgmės kiekį gyvulių pašarams skirtuose rūgščiųjų pasukų milteliuose.2. Metodo esmėMėginys džiovinamas vakuume. Masės nuostoliai nustatomi sveriant.3. Įranga3.1. Analizinės svarstyklės.3.2. Nerūdijantys metaliniai arba stikliniai indeliai, uždengiami oro nepraleidžiančiais dangteliais. Indeliai turi būti tokios talpos, kad juose būtų galima paskleisti apie 0,3 g/cm2 mėginio.3.3. Elektra kaitinama vakuuminė krosnelė, kurioje įtaisytas alyvos siurblys ir koks nors mechanizmas paduoti karštam orui arba džiovinimo agentui (pvz., kalcio oksidui).3.4. Eksikatorius su efektyviu džiovinimo agentu.3.5. Ventiliuojama džiovinimo krosnelė, termostatiškai nustatyta 102 °C ± 2 °C.4. MetodikaIndelis (3.2) ir jo dangtelis kaitinami krosnelėje (3.5) ne mažiau kaip 1 val. Po to, uždengus dangteliu indelis perkeliamas į eksikatorių (3.4), leidžiama atvėsti iki kambario temperatūros, pasveriama 0,5 mg tikslumu.Indelis (3.2) kartu su dangteliu pasveriamas 0,5 mg tikslumu. Į pasvertą indelį 1 mg tikslumu pasveriama apie 5 g mėginio ir vienodai paskleidžiama. Indelis nudengiamas ir dedamas į vakuuminę krosnelę (3.3), pašildytą iki 83 °C. Indelis įdedamas kaip galima greičiau, kad pernelyg nenukristų krosnelės temperatūra.Slėgis sumažinamas iki 100 torų (13,3 kPa) ir esant šiam slėgiui džiovinama keturias valandas karšto sauso oro srove arba naudojant džiovinimo agentą (apie 300 g 20-čiai mėginių). Pasiekus reikiamą slėgį vakuuminis siurblys atjungiamas. Džiovinimo laikas skaičiuojamas nuo to momento, kai temperatūra krosnelėje pasiekia 83 °C. Po to, slėgis krosnelėje iš lėto pakeliamas iki atmosferinio. Krosnelė atidaroma, indelis tuoj pat uždengiamas ir išimamas iš krosnelės, paliekamas nuo 30 iki 45 minučių eksikatoriuje (3.4), kad atvėstų ir pasveriamas 1 mg tikslumu. Dar kartą džiovinamas vakuuminėje (3.3) 83 °C temperatūros krosnelėje 30 minučių ir vėl sveriamas. Dviejų svėrimų skirtumas turi būti ne didesnis kaip 0,1 % drėgmės.5. Apskaičiavimas·100Ekai:E = pradinė mėginio masė gramais;m = išdžiovinto mėginio masė gramais.6. Tikslumas6.1. PakartojamumasSkirtumas dviejų atskirų analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje ir naudojant identiškas medžiagas, turi nebūti didesnis kaip 0,4 g drėgmės 100 g rūgščiųjų pasukų miltelių.6.2. AtkuriamumasSkirtumas tarp dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingų laboratorijų analitikų naudojant identiškas medžiagas, neturi būti didesnis kaip 0,6 g drėgmės 100 g rūgščiųjų pasukų miltelių.6.3. Tikslumo duomenų šaltinisTikslumo tarp duomenys buvo nustatyti remiantis 1995 metais vykdyto eksperimento rezultatais. Eksperimente dalyvavo aštuonios laboratorijos ir buvo tirta 12 mėginių (6 akli dublikatai).--------------------------------------------------XXV PRIEDAS(19 straipsnis)PAMATINIS PAŠALINIŲ RIEBALŲ NUSTATYMO PIENO RIEBALUOSE METODAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJA TIRIANT TRIGLICERIDUS – 1 REDAKCIJA1. Taikymo sritisŠis metodas taikomas pašalinių augalinės ir gyvūninės kilmės riebalų (pvz., jautinių ir kiaulinių taukų) pieno ir pieno produktų riebaluose nustatyti, taikant trigliceridų dujų chromatografijos analizę.Augaliniai ir gyvūniniai riebalai grynuose pieno riebaluose yra nustatomi kokybiniu ir kiekybiniu metodais taikant trigliceridų formules, neatsižvelgiant į šėrimo ir laktacijos sąlygas.1 pastaba:Remiantis vien tik pieno riebaluose esančia sviesto rūgštimi (C4) galima nustatyti nežymų pieno riebalų kiekį aliejuje, tačiau kiekybinė ir kokybinė informacija gali būti patikima tik pridėjus mažiausiai 20 masės % pašalinių riebalų, kadangi C4 kiekis pieno riebaluose svyruoja tarp 3,5–4,5 masės %.2 pastaba:kiekybinius rezultatus galima gauti tik taikant trigliceridų analizę, kadangi sterolio kiekis aliejuje svyruoja priklausomai nuo aliejaus žaliavos ir apdorojimo sąlygų.2. ApibrėžimasPašaliniai riebalai pieno riebaluose: visi augalinės ir gyvūninės kilmės riebalai, išskyrus pieno riebalus.3. Metodo esmėIšekstrahavus pieno riebalus, paruošiamas pagrindinis tirpalas. Naudojant dujų chromatografą su užpildyta kolonėle, šiame tirpale nustatomi trigliceridai (bendras anglies atomų skaičius). Į trigliceridų formulę įrašius skirtingos molekulinės masės trigliceridų (C24–C54 tik lyginio C atomų skaičiaus) svorio procentus, pašaliniai riebalai nustatomi kokybiniu arba kiekybiniu metodais.Pastaba:Galima taikyti kapiliarinę dujų chromatografiją, jei užtikrinamas rezultatų pakartojamumas. [1]4. ReagentaiNaudojami tik analiziškai gryni reagentai:4.1. Nešančiosios dujos: azotas, grynumas ≥ 99,996 %.4.2. Sotieji etaloniniai trigliceridai [2], taip pat cholesterolis pieno riebalams standartizuoti pagal 6.5.4 punktą.4.3. Metanolis bevandenis.4.4. n-heksanas.4.5. n-heptanas.4.6. Toluolas.4.7. Dimetilchlorsilano tirpalas: 50 ml dimetilchlorsilano ištirpinama 283 ml toluolo.4.8. Degiosios dujos: vandenilis ir oras.4.9. Nejudančioji fazė: 125/150 μm stambumo (100/120 meš) Gas ChromQ, padengto 3 % OV-1 [3].4.10. 10 % kakavos sviesto tirpalas.5. ĮrangaNaudojama įprastinė laboratorinė įranga bei:5.1. Dujų chromatografas, tinkamas naudoti esant 400° C – 450° C temperatūrai, su liepsnos jonizuojamu detektoriumi (LJD) ir nešančiųjų dujų masės pastovumo kontrole: degiosios dujos (H2) – 30 ml/min., oras – 270 ml/min.Esant dideliam nešančiųjų dujų srautui, liepsna turi būti ypatingai didelė.Pastaba.Dėl aukštos temperatūros trigliceridų analizės metu detektoriaus ir įpurškimo sistemos stikliniai įdėklai turi būti dažnai valomi.Dujų chromatografo tarpinės turi būti atsparios aukštai temperatūrai ir mažo pralaidumo.Pastaba.Tinka naudoti Chromblue (tm) tarpinę (Chrompack).Tarpines reikia reguliariai keisti, pvz., apytikriai po 100 analizių arba pablogėjus atskyrimui (žr. 4 pav.).5.2. Chromatografinė kolonėlėTai U raidės formos kolonėlė (vidinis skersmuo 2 mm, ilgis 500 mm), kurios stiklinis paviršius pirmiausia inaktyvuojamas pagal 6.1 punkte aprašytą metodiką silanizuojant dimetilchlorsilanu.Pastaba.Galima naudoti ir ilgesnes (80–200 mm) užpildytas kolonėles, tada pasiekiamas truputį geresnis rezultatų pakartojamumas. Tačiau darbo metu nejudančioje fazėje atsiranda įtrūkimų, kurių pasekmė – blogesni kiekybiniai rezultatai. Be to, LJD liepsna lengvai užgęsta dėl didelio nešančiųjų dujų greičio nuo 75 iki 85 ml/min.5.3. Kolonėlės užpildymo įrenginys (žr. 1 pav.)+++++ TIFF +++++5.3.1. Plastikinė kolonėlė su užsukamais kamščiais bei žyma, iki kurios kolonėlė turi būti užpildyta nejudančiąja faze.5.3.2. Tankus sietas (tinklo akučių dydis apie 100 μm) su užsukamu kamščiu, tinkamu užsandarinti stiklinę kolonėlę (1 pav.).5.3.3. Silanizuota stiklo vata.5.3.4. Vibratorius, skirtas tolygiam nejudančiosios fazės paskirstymui pripildymo metu.5.4. Nuo1 iki 3 ml Extrelut kolonėlė su silikageliu [4]. Ši kolonėlė naudojama alternatyviojoje pieno riebalų ekstrakcijoje.5.5. 6,4 mm (1/4 colio) grafitinė tarpinė su 6 mm anga.5.6. Įrenginiai kolonėlės silanizavimui pagal 6.1 punktą.5.6.1. Vulfo kolba.5.6.2. Vandens siurblys.5.7. Vandens vonia, palaikanti (50 ± 2) °C temperatūrą.5.8. Džiovinimo spinta, palaikanti (50 ± 2) °C ir (100 ± 2) °C temperatūrą.5.9. Mikropipetė.5.10. Graduota 5 ml pipetė, skirta dozuoti 1,5 ml metanolio.5.11. 50 ml apvaliadugnė kolba.5.12. 50 ml Erlenmejerio kolba.5.13. Piltuvas.5.14. Filtras smulkiomis poromis.5.15. Rotacinis garintuvas.5.16. 1 ml buteliukai, užsandarinti aliumininiu kamščiu su tarpine.5.17. Įpurškimo švirkštas: švirkšto stūmoklis neturi liesti adatos galo.Pastaba.Naudojant švirkštus yra geresnis rezultatų pakartojamumas.Adatos smaigalį reikia nuolatos tikrinti (pvz. stereomikroskopu), kad nepažeistų tarpinės.6. Metodika6.1. Kolonėlės paruošimas (silanizacija)Vulfo kolba prijungiama (pagal 2 pav.) prie vandens siurblio, žarnelė (2) panardinama į tirpalą (4.7). Uždarius čiaupą, kolonėlė pildoma tirpalu (4.7). Po to abi žarnelės nuimamos.+++++ TIFF +++++Kolonėlė pritvirtinama prie stovo ir pipete pilnai pripildoma dimetilchlorsilano tirpalu.Po 20-30 min Vulfo kolba pakeičiama vakuumine kolba, ir kolonėlės turinys išsiurbiamas (3 pav.).6.2. Kolonėlės pripildymasKolonėlės pripildymas atliekamas po kolonėlės plovimo su 75 ml toluolo, 50 ml metanolio ir apytikriai 30 min džiovinimo spintoje, esant apie 100 °C temperatūrai.+++++ TIFF +++++Kolonėlė pripildoma pagal 1 pav. pateiktą schemą. Plastikinė kolonėlė iki žymės užpildoma nejudančiąja faze (4.9). apatinis stiklinės kolonėlės galas užkemšamas apie 1 cm ilgio iš anksto silanizuotos stiklo vatos gabaliuku, kuris įspaudžiamas plieniniu strypeliu. Po to kolonėlės galas užsandarinamas sietu su kamščiu (5.3.2).Kolonėlė nejudančiąja faze pildoma esant 3 barų slėgiui N2 atmosferoje. Proceso metu vibratorius turi judėti aukštyn-žemyn, kad nejudančioji fazė stiklinėje kolonėlėje pasiskirstytų vienodai.Pripildžius nejudančiąja faze, kitas kolonėlės galas užkemšamas tvirtai suspaustos silanizuotos stiklo vatos gabaliuku, išlindęs pluoštas nupjaunamas ir kamštelis mentele įstumiamas keletą milimetrų į kolonėlę;6.3. Mėginių paruošimasMėginių paruošimui naudojamas vienas iš trijų pateiktų metodų:6.3.1. Pieno riebalų išskyrimas iš sviesto5 g – 10 g sviesto išlydoma inde, įstatytame į 50 °C temperatūros vandens vonią (5.7).50 ml Erlenmejerio kolba ir piltuvas su filtru (5.14) pašildomi džiovinimo spintoje iki 50 °C temperatūros. Išlydyto sviesto riebalinis sluoksnis nufiltruojamas per pašildytą įrangą.Šiuose pieno riebaluose beveik nėra fosfolipidų.6.3.2. Riebalų ekstrakcija Röse – Gotllieb metoduEkstrakcija atliekama pagal IDF Standard 1 C:1987, 16C:1987, 116A:1987 arba 22B:1987.Taip paruoštuose pieno riebaluose esantys fosfolipidai cholesterolio smailę padidina 0,1 %.Jeigu chromatogramoje trigliceridų ir cholesterolio smailių plotas bus laikomas 100, tai šis cholesterolio smailės padidėjimas neturės žymesnės įtakos trigliceridų analizės rezultatams.6.3.3. Ekstrakcija naudojant silikagelio kolonėles0,7 ml 20 °C temperatūros pieno mėginio mikropipete supilama į Extrelut kolonėlę (5.4) ir paliekama maždaug 5 minutėms, kad tolygiai pasiskirstytų ant silikagelio.Baltymų-lipidų komplekso denatūravimui pipete įlašinama 1,5 ml metanolio. Po to mėginys ekstrahuojamas su 20 ml n-heksano. n-heksanas pilamas mažais kiekiais, o ištekantis tirpalas surenkamas į iki pastovaus svorio iškaitintą 50 ml apvaliadugnę kolbą.Po ekstrakcijos visas tirpalas išleidžiamas iš kolonėlės.Tirpiklis iš apvaliadugnės kolbos išdistiliuojamas rotaciniu garintuvu esant vandens vonios temperatūrai nuo 40 iki 50 °C.Kolba išdžiovinama, o joje esančių riebalų kiekis nustatomas svėrimo būdu.Pastaba.Pieno riebalų ekstrakcijos pagal Gerber, Weibull-Berntrop, Schmid-Bondzynski-Ratzlaff ar detergentiniu (BDI) metodais trigliceridų analizei taikyti negalima. Taikant šiuos metodus, į riebalų fazę pereina didesnė ar mažesnė dalis nevisiškai esterifikuotų gliceridų ar fosfolipidų.6.4. Mėginio tirpalo paruošimasDujų chromatografijoje naudojamas riebalų (6.3) 5 % tirpalas n-heptane. Ruošiant šį mėginio tirpalą, pasveriami atitinkami mėginių (6.3.1 ir 6.3.2) kiekiai ir ištirpinami atitinkamame kiekyje n-heptano.Ruošiant mėginio (6.3.3) tirpalą, pirmiausia apskaičiuojamas išskirtų riebalų kiekis, po to – reikalingo jų ištirpinimui n-heptano kiekis.Apytiksliai 1 ml mėginio tirpalo perpilama į buteliuką (5.16).6.5. Chromatografinis trigliceridų nustatymasAukštoje, 350° C temperatūroje eliujuojant ilgų grandinių C52-C56 trigliceridus, šiek tiek pakyla nulinė linija, ypač tais atvejais, jei kolonėlės nebuvo tinkamai apdorotos. Šio bazinės linijos pakilimo galima išvengti naudojant dvi kolonėles arba kitaip koreguojant nulinę liniją.Pasirinkus nulinės linijos koregavimo kompensacinį būdą ar dirbant su viena kolonėle, įpurškimo sistemos ir detektoriaus stiklo įdėklams reikia naudoti grafitines tarpines (5.5):6.5.1. Nulinės linijos korekcijaSiekiant išvengti nulinės linijos pakilimo, reikia taikyti vieną iš šių keturių metodų:6.5.1.1. Kolonėlių derinimasTaikant kompensacinį metodą naudojamos dvi kolonėlės.6.5.1.2. Nulinės linijos koregavimas dujų chromatografuAtliekant bandymą be riebalų tirpalo, dujų chromatografu nustatoma ir koreguojama nulinė linija, išvengiant jos pakilimo.6.5.1.3. Nulinės linijos koregavimas kompiuterine programaAtliekant bandymą be riebalų tirpalo, kompiuterine programa nustatoma ir koreguojama nulinė linija, išvengiant jos pakilimo.6.5.1.4. Nulinės linijos koregavimas atliekant tinkamą išankstinį kolonėlės kondicionavimąTinkamai kondicionavus kolonėlę ir maždaug 20 kartų atlikus pieno riebalų tirpalo dujų chromatografiją, nulinės linijos pakilimas aukštoje temperatūroje dažniausiai yra toks nežymus, kad galima atsisakyti jos koregavimo.6.5.2. Įpurškimo technikaSiekiant geresnių kiekybinių rezultatų ir užtikrinti, kad aukštoje temperatūroje verdantys trigliceridai būtų atskirti, taikoma "karšto įpurškimo technika". Riebalų tirpalas įtraukiamas į švirkštą, šalta adata apytikriai 3 sek. šildoma įpurškimo sistemoje Po to švirkšto turinys greitai įpurkščiamas.Pastaba.Taikant šią įpurškimo techniką, išvengiama riebalų sustingimo švirkšte ir įpurškimo sistemoje. Neatliekamas tiesioginis įpurškimas viršutinėje, labiau šildomoje kolonėlės dalyje, nes čia gali kauptis tarpinės fragmentai ir teršalai, kuriuos galima lengvai pašalinti, reguliariai keičiant įpurškimo sistemos įdėklus, neišardant kolonėlės.Reikia vengti adatos smaigalio lietimosi su indo, kuriame yra mėginys, dugnu, kad sulinkusi adata (net jeigu vizualiai tai nepastebima) nepažeistų tarpinės.+++++ TIFF +++++6.5.3. Pripildytos kolonėlės kondicionavimasAtliekant a–c operacijas, kolonėlė su detektoriumi nesujungiama, siekiant išvengti jo užteršimo.Pagal 6.2 punktą pripildyta kolonėlė apdorojama taip:a) 15 min. leidžiamas N2 40 ml/min. esant 50 °C temperatūrai;b) kaitinama iki 355 °C, temperatūros kilimo greitis 1° C/min., N2 srauto greitis 10 ml/min.;c) 12–15 val. laikoma esant 355 °C temperatūrai;d) esant nustatytai temperatūrai, 2 kartus atliekama kakavos sviesto analizė, įšvirkščiant po 1 μl tirpalo (4.10);e) 20 kartų per 2–3 dienas atliekama pieno riebalų analizė, įšvirkščiant po 0,5 μl tirpalo (6.4).Pastaba.Kakavos sviestas sudarytas beveik vien iš aukštose temperatūrose verdančių C50–C56 trigliceridų. Naudojant kakavos sviestą, kolonėlė specialiai paruošiama ilgų grandinių trigliceridų analizei. Aukštose temperatūrose verdančių trigliceridų C50–C54 analizės duomenų pataisos koeficientas yra iki 1,20. Pakartotinai atliekant pieno riebalų tirpalo analizę, pradinis aukštas analizės duomenų pataisos koeficientas, gautas tiriant trigliceridų, kurių anglies atomų skaičius nuo C50 iki C54, sumažėja. Trigliceridų, kurių riebalų rūgščių anglies atomų skaičius yra mažas, šis koeficientas yra apie 1. Paprastai paruošiamos trys poros pripildytų kolonėlių (6.2). Kondicionuotų kolonėlių poros tikrinamos atliekant įprastinę pieno riebalų analizę.Tolesnei analizei naudojama ta kolonėlių pora, su kuria gauti geriausi kiekybiniai rezultatai (analizės duomenų pataisos koeficientas yra artimiausias 1). Kolonėlės, kurių pataisos koeficientas >1,20, nenaudojamos.6.5.4. KalibravimasTrigliceridų ir cholesterolio analizės duomenų pataisos koeficientų nustatymui naudojami etaloniniai trigliceridai (bent jau sotieji C24, C30, C36, C42, C48 ir C54 trigliceridai, bei cholesterolis; dar geriau, jei bus papildomai panaudoti C50 ir C52 etaloniniai trigliceridai). Tarpinių trigliceridų analizės duomenų pataisos koeficientai nustatomi matematinės interpoliacijos būdu.Naudojant etaloninius riebalus, kalibravimą reikia atlikti 2–3 kartus per dieną. Jei gaunami identiški rezultatai, tai atliekant mėginių trigliceridų analizę, pasiekiamas geras kiekybinių rezultatų pakartojamumas.Etaloniniai pieno riebalai, laikant ne aukštesnėje nei minus18 °C temperatūroje, tinkami naudojimui keletą mėnesių.Pastaba.Kiekvienos iš sudedamųjų dalių pataisos koeficientas gali būti nustatomas naudojant etaloninius pieno riebalus su sertifikuota trigliceridų sudėtimi, pavyzdžiui CRM 519 (bevandeniai pieno riebalai), kuriuos galima įsigyti Belgijoje (Institute for Reference Materials and Measurements, Geel, Belgium).6.5.5. Temperatūros režimas, nešančiosios dujos ir kitos trigliceridų analizės sąlygosTemperatūros režimas: 210 °C pradinė kolonėlės temperatūra išlaikoma 1 min., tada keliama 6 °C/min. iki 350 °C ir laikoma šioje temperatūroje 5 minutes.Detektoriaus ir įpurškimo sistemos temperatūra 370 °C.Pastaba.Detektoriaus, įpurškimo sistemos ir kameros pradinė temperatūra palaikoma pastovi (taip pat naktį, savaitgalį, atostogų metu).Nešančiosios dujos: azotas, srauto greitis 40 ml/min.Pastaba.Naudojant 80 cm ilgio kolonėles, N2 srauto greitis turi būti ne mažesnis kaip 75 ml/min ir palaikomas pastovus (taip pat naktį, savaitgalį, atostogų metu). Tikslus dujų srauto greitis turi būti sureguliuotas taip, kad C54 būtų eliuliuojamas 341 °C temperatūroje, nepriklausomai nuo kolonėlės ilgio.Analizės trukmė: 29,3 minutės.Įpurškimo tūris: 0,5 μl.Pastaba:Po kiekvieno įpurškimo švirkštą reikia keletą kartų perplauti heptanu.Liepsnos jonizuojamo detektoriaus režimas: turi atitikti 5.1 punktą.Pastaba:Jis įkaitinamas kiekvienos darbo dienos pradžioje.7. Rezultatų įvertinimas ir matavimo sąlygų kontrolėNelyginio acyl-c skaičiaus (2n+1) trigliceridų smailių plotai sujungiami su atitinkamų žemesnių, turinčių lyginį acyl-c skaičių (2n) trigliceridų smailių plotais. Mažiau pakartojamos mažos C56 smailės nepriskaičiuojamos. Likusiųjų trigliceridų smailių plotas chromatogramoje, įskaitant cholesterolio smailę (greta C24 smailės), yra dauginamas iš etaloninių riebalų (paskutinis kalibravimas) atitinkamų analizės duomenų pataisos koeficiento, ir visų smailių plotų suma prilyginama 100. Apskaičiuojamas C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52, C54 trigliceridų ir laisvojo cholesterolio smailių plotų santykis su 100. Rezultatai išreiškiami masės procentais (g/100 g).Chromatogramos smailės ploto įvertinimui naudojamas integratorius, kuris nubrėžia nulinę liniją. Taip pat galima nulinės linijos reintegracija su optimizuotais integraciniais parametrais.5 ir 6 pav. pateikti du trigliceridų chromatogramų pavyzdžiai. 5 pav. pavaizduota taisyklinga chromatograma, o 6 pav. vaizduojama atsitiktinė klaida tarp C50 ir C54 smailių, nes nulinė linija, palyginti su 5 pav., yra netaisyklinga. Tik naudojant integratorių, kuris nubrėžia nulinę liniją, yra didelė tikimybė pastebėti tokias klaidas ir jų išvengti.+++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++Matavimo sąlygoms kontroliuoti gali būti naudojami santykiniai standartiniai nuokrypiai RSD: (variacijos koeficientas x 100), gauti atlikus tų pačių riebalų 19 analizių, kurių vertės skirtingiems trigliceridams pateiktos 1 lentelėje.1 lentelėTrigliceridų kiekio santykinis standartinis nuokrypis (RSD), n=19Trigliceridas | RSD (%) |C24 | 10,00 |C26 | 2,69 |C28 | 3,03 |C30 | 1,76 |C32 | 1,03 |C34 | 0,79 |C36 | 0,25 |C38 | 0,42 |C40 | 0,20 |C42 | 0,26 |C44 | 0,34 |C46 | 0,37 |C48 | 0,53 |C50 | 0,38 |C52 | 0,54 |C54 | 0,60 |Esant didesniems santykiniams standartiniams nuokrypiams (RSD) nei nurodyta 1 lentelėje, chromatografijos atlikimo sąlygos nėra tinkamos ir reikia patikrinti tarpinę ar nešančiųjų dujų srautą. Smulkios tarpinės dalelės gali nusėsti ant stiklo vatos kolonėlės pradžioje arba kolonėlė yra nebetinkama naudoti dėl nusidėvėjimo, temperatūros poveikio ir t. t. (žr. 3 pav.).Pastaba.1 lentelėje pateiktos vertės nėra privalomos, bet suteikia informaciją apie kokybę. Tačiau jei yra priimamos didesnės RSD vertės, pakartojamumo ir atkuriamumo ribos, nurodytos 11 punkte, vis dėlto turi būti laikomasi.8. Kokybinis pašalinių riebalų nustatymasPašalinių riebalų trigliceridams nustatyti buvo sudarytos formulės (2 lentelė) ir grynųjų pieno riebalų S ribos (3 lentelė), kuriuose gali kisti grynųjų pieno riebalų S vertės. Jei šios ribos viršijamos, tai daroma prielaida, kad yra pašalinių riebalų.Tiksliausia formulė, padedanti nustatyti kiaulinių taukų priemaišą, yra, pvz., tokia:6,5125 [times] C26 + 1,2052 [times] C32 + 1,7336 [times] C34 + 1,7557 [times] C36 + 2,2325 [times] C42 + 2,8006 [times] C46 + 2,5432 [times] C52 + 0,9892 [times] C54 = S (1)Pastaba.755-iems pieno riebalų mėginiams nustatytas S pasikliovimo intervalas 97,96–102,04, esant visų grynųjų pieno riebalų pavyzdžių S verčių standartiniam nuokrypiui SD 0,39897, esant 99 % tikimybei.Jei reikia ištirti nežinomos sudėties riebalų mėginį, tai ši formulė suteikia galimybę paprastomis priemonėmis, nenaudojant kompiuterio, įsitikinti, ar trigliceridų kiekio suma, čia pateikta su atitinkamais pataisos koeficientais, išeina už 97,96–102,04 intervalo ribų, ir jeigu taip, tai yra didelė pašalinių riebalų priemaišų tikimybė.2 lentelėje pateiktos atitinkamos trigliceridų formulės pašalinių sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejaus, hidrogenizuotų žuvų taukų, kokoso ir palmių riešutų aliejaus, taip pat palmių aliejaus ir galvijų lajaus priemaišoms kokybiškai nustatyti.Pašalinių riebalų trigliceridų sudėtis kinta, todėl atliekama iki keturių skirtingų to paties tipo trigliceridų matavimų. (Naudojant tuos pačius pašalinių riebalų tipus, įskaitoma "nepalankiausia" nustatymo riba (žr. 4 lentelę)).Geri visų pašalinių riebalų nustatymo rezultatai gaunami pagal šią bendrąją formulę:2,7575 × C26 + 6,4077 × C28 + 5,5437 × C30 - 15,3247 × C32 + 6,2600 × C34 + 8,0108 × C40 - 5,0336 ×C42 + 0,6356 × C44 + 6,0171 × C46 = S (2)Skaičiavimai bet kokių pašalinių riebalų deriniui nustatyti pieno riebaluose parodė, kad, pvz., taikant 2 lentelėje nurodytą kiaulinių taukų formulę, kiaulinių taukų nustatymo riba yra nuo 2,7 %, bet taikant šią formulę kitiems riebalams, pvz., kokoso, palmių, palmių riešutų aliejui nustatyti, nustatymo riba yra atitinkamai nuo 26,8 %, 12,5 % ar 19,3 %, t. y. šių aliejų priemaiša gali būti nustatyta pagal kiaulinių taukų formulę tik tada, jeigu jų į pieno riebalus pridedami labai dideli kiekiai. Tai pasakytina ir apie kitas 2 lentelėje pateiktas formules.2 lentelėTrigliceridų formulės pašalinių riebalų priemaišoms nustatyti pieno riebaluose S vertes ir jo standartiniai nuokrypiai SDPašalinių sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejaus ir žuvų taukų nustatymo formulė:2,0983 × C30 + 0,7288 × C34 + 0,6927 × C36 + 0,6353 × C38 + 3,7452 ×.C40 - 1,2929 × C42 + 1,3544 × C44 + 1,7013 × C46 + 2,5283 × C50 = S; SD = 0,38157Pašalinių kokoso ir palmių riešutų aliejaus nustatymo formulė:3,7453 × C32 + 1,1134 × C36 + 1,3648 × C38 + 2,1544 × C42 + 0,4273 × C44 + 0,5809 × C46 + 1,1226 × C48 + 1,0306 × C50 + 0,9953 × C52 + 1,2396 × C54 = S; SD = 0,11323Pašalinių palmių aliejaus ir galvijų lajaus arba taukų nustatymo formulė:3,6644 × C28 + 5,2297 × C30 - 12,5073 × C32 + 4,4285 × C34 -0,2010 ×.C36 + 1,2791 × C38 + 6,7433 × C40 - 4,2714 × C42 + 6,3739 × C46 = S; SD = 0,81094Pašalinių kiaulinių taukų nustatymo formulė:6,5125 × C26 + 1,2052 × C32 - 1,7336 × C34 + 1,7557 × C36 + 2,2325 × C42 + 2,8006 × C46 + 2,5432 × C52 - 0,9892 × C54 = S; SD = 0,39897Tiriant nežinomų riebalų mėginį (jei mėginyje yra pieno riebalų ir vienas iš (arba visų)14 pašalinių riebalų mišinys), taikomos visos 2 lentelėje pateiktos formulės ir bendroji formulė (2). Jei nors pagal vieną iš penkių formulių apskaičiuotos S vertės yra už 3 lentelėje pateiktų verčių ribų, tai daroma prielaida, kad mėginyje yra modifikuotų pieno riebalų. Pašalinių riebalų nustatymas piene, remiantis viena iš keturių formulių pagal 2 lentelę, neleidžia daryti išvados, kokių pašalinių riebalų pridėta.3 lentelėPieno riebalų S-ribosFormulė pašaliniams riebalams nustatyti: | S - ribos |Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, linų sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų | 98,05 – 101,95 |Kokoso ir palmių riešutų aliejų | 99,42 – 100,58 |Palmių aliejaus ir galvijų lajaus | 95,90 – 104,10 |Kiaulinių taukų | 97,96 – 102,04 |Bendroji formulė | 95,68 – 104,32 |4 lentelėje nurodytos įvairių pašalinių riebalų nustatymo ribos, kai tikimybė – 99 %. Pirmoje skiltyje pateiktos minimalios nustatymo ribos, taikant 2 lentelės formules, antroje skiltyje – bendrąją formulę. Vien pastarosios formulės pakanka nustatyti nežymius pašalinių riebalų kiekius. Taikant visas formules, nustatomi įvairių pašalinių riebalų deriniai. Pašalinių riebalų trigliceridų sudėties fliuktuacija neturi žymesnės įtakos nustatymo ribai.4 lentelėPašalinių riebalų nustatymo ribos (%), esant tikimybei 99 %| Individuali formulė | Bendroji formulė |Sojų aliejus | 2,1 | 4,4 |Saulėgrąžų aliejus | 2,3 | 4,8 |Alyvų aliejus | 2,4 | 4,7 |Kokoso aliejus | 3,5 | 4,3 |Palmių aliejus | 4,4 | 4,7 |Palmių riešutų aliejus | 4,6 | 5,9 |Rapsų sėklų aliejus | 2,0 | 4,4 |Sėmenų aliejus | 2,0 | 4,0 |Kviečių gemalų aliejus | 2,7 | 6,4 |Kukurūzų gemalų aliejus | 2,2 | 4,5 |Medvilnės sėklų aliejus | 3,3 | 4,4 |Kiauliniai taukai | 2,7 | 4,7 |Jautiniai taukai | 5,2 | 5,4 |Hidrogenizuoti žuvų taukai | 5,4 | 6,1 |Pastaba.Tokiu būdu S ribos yra apskaičiuojamos tuomet, kai daroma prielaida, kad yra pašalinių riebalų priemaiša arba nustatymo pagal individualias formules ribų viršijimas (žr. 4 lentelę).9. Kiekybinis pašalinių riebalų nustatymasPašalinių riebalų kiekiui X ( %) apskaičiuoti pieno riebaluose yra taikoma ši formulė:X= 100·100-S,Šioje formulėje X reiškia nežinomų pašalinių riebalų arba pašalinių riebalų mišinio kiekį nežinomuose pieno riebaluose. S apskaičiuojamas į bendrąją formulę įrašius pašalinių riebalų ar pašalinių riebalų ir pieno riebalų mišinio trigliceridų analizės rezultatus. Jei pašaliniai riebalai nežinomi, tai nustatomos grynųjų pašalinių riebalų S vertės, į bendrąją formulę įrašius grynųjų pašalinių riebalų trigliceridų analizės rezultatus, ir apskaičiuojamas S vidurkis (SF = 7,46). Geri kiekybiniai pašalinių riebalų nustatymo rezultatai gaunami pagal palmių aliejaus ir galvijų lajus formulę (2 lentelė) ir SF = 10,57.Jei pašaliniai riebalai žinomi, tai į formulę (3) įrašomos SF vertės, paimtos iš 5 lentelės, ir parenkama atitinkama pašalinių riebalų formulė apskaičiuoti S iš 2 lentelės.5 lentelė.Įvairių pašalinių riebalų SF vertėsPašaliniai riebalai | SF |Sojų aliejus | 8,18 |Saulėgrąžų aliejus | 9,43 |Alyvų aliejus | 12,75 |Kokoso aliejus | 118,13 |Palmių aliejus | 7,55 |Palmių riešutų aliejus | 112,32 |Rapsų aliejus | 3,30 |Sėmenų aliejus | 4,44 |Kviečių gemalų aliejus | 27,45 |Kukurūzų gemalų aliejus | 9,29 |Medvilnės aliejus | 41,18 |Kiauliniai taukai | 177,55 |Jautiniai taukai | 17,56 |Žuvų taukai | 64,12 |10. Metodo taikymo ribosAprašytasis metodas taikomas pieno partijai ir yra paremtas peino riebalų mėginų reprezentatyvumu.Galimas specialus reprezentatyviojo mėginio tyrimas, jei mėginys sudarytas skirtingose šalyse pagal aukščiau nurodytas formules.Galimybės nustatymui galėtų būti labai geros, jeigu skirtingų šalių formulėse, kurios aprašytos šiame dokumente, būtų nustatytas reprezentatyvus pieno riebalų mėginių kiekis. Ypač geros nustatymo sąlygos būtų sudarytos tada, jei skirtingose šalyse tokios formulės, kaip čia aprašyta, būtų sudarytos iš reprezentatyvaus pieno rieblarų skaičiaus. Tokiu atveju, nereikia sudėtingų kompiuterinių programų, jei yra taikomi 2 lentelėje pateikti trigliceridų deriniai, o pataisos koeficientai yra nustatomi iš naujo, taikant mažiausių kvadratų metodą..Taikant 3 lentelėje pateiktas S ribas, formules galima taikyti bendrai, esant ypatingoms šėrimo sąlygoms, pav., jei šeriama nepakankamai arba pašarinėmis mielėmis, kalcio muilu. Tik esant ekstremalioms šėrimo sąlygoms (pvz., sušertas didelis kiekis aliejingų pašarų, kalcio muilų kartu su pašarų riebalais ir t.t.), pritaikius formules randama pieno riebalų modifikacija.Pastaba.Viršijus ribinius dydžius ir darant prielaidą, kad gali būti modifikacija, frakcionuoti pieno riebalai iš esmės atpažįstami kaip nemodifikuoti riebalai. Pieno riebalų frakcijos su neįprasta pieno riebalų sudėtimi (pvz., kietoji frakcija, gaunama fizikiniais metodais esant aukštai (apie 30 °C) temperatūrai ir mažai išeigai arba naudojant ypatingas sąlygas CO2 atmosferoje) identifikuojamos kaip modifikuoti riebalai.Pieno riebalų frakcionavimą galima nustatyti taikant ir kitus metodus, pvz., diferencinę skanavimo kalorimetriją.11. Metodo tikslumasMetodo tikslumas nustatytas pagal pieno riebalus, taikant 2 lentelėje pateiktas formules ir 3 lentelėje – S ribų vertes.11.1. PakartojamumasSkirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų S verčių, gautų tuo pat metų arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas6 lentelėPakartojamumo (r) ribos, taikant skirtingas trigliceridų formulesFormulė pašaliniams riebalams nustatyti | r |Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų | 0,67 |Kokosų ir palmių riešutų aliejų | 0,12 |Palmių aliejaus ir jautinių taukų | 1,20 |Kiaulinių taukų | 0,58 |Bendroji | 1,49 |11.2. AtkuriamumasSkirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų S verčių, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas.7 lentelėAtkuriamumo ribos (R), taikant skirtingas trigliceridų formulesFormulė pašaliniams riebalams nustatyti | R |Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų | 1,08 |Kokosų ir palmių riešutų aliejų | 0,40 |Palmių aliejaus ir jautinių taukų | 1,81 |Kiaulinių taukų | 0,60 |Bendroji | 2,07 |11.3. Leistinas nuokrypisRemiantis pakartojamumo (r) ir atkuriamumo (R) vertėmis, galima apskaičiuoti visų 3 lentelėje pateiktų S verčių leistinajį nuokrypį (du analizės pakartojimai). Atitinkamos vertės pateiktos 8 lentelėje.8 lentelėVisų triglicerdidų formulių leistini nuokrypiaiFormulė pašaliniams riebalams nustatyti: | Ribos |Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų | 97,43–102,57 |Kokosų ir palmių riešutų aliejų | 99,14–100,86 |Palmių aliejaus ir jautinių taukų | 94,91–105,09 |Kiaulinių taukų | 97,65–102,35 |Bendroji | 94,58–105,42 |11.4. Rezultatų priimtinumasVisi apskaičiuoti ir suapvalinti šimtųjų tikslumu C24, C26, C28 iki C54 trigliceridų kiekiai turi būti pakoreguoti taip, kad jų suma atitiktų 100.Dviejų analizės pakartojimų rezultatai taikomi pakartojamumui patikrinti. Pakartojamumas laikomas priimtinu, jei absoliutus S verčių, apskaičiuotų pagal visas 5 trigliceridų formules, skirtumas tarp dviejų analizių neviršija pakartojamumo (r) ribų pagal 6 lentelę.Kad būtų užtikrintos optimalios dujų chromatografijos sąlygos, ypač kolonėlės kokybė, 10 kartų pakartotų analizių metu apskaičiuotos pagal penkias trigliceridų formules maksimalios ir minimalios S vertės turi neviršyti X × r ribos, čia X = 1,58 (žr.: 10 analizės pakartojimų – žr. Literatūrą (16), ir r pakartojamumo ribas 6 lentelėje).12. Cituojami standartaiDIN 10336:1994 | Nachweis and Bestimmung von Fremdfetten in Milchfett anhand einergaschromatographischen Triglyceridanalyse |IDF Standard 1C:1987 | Milk. Determination of Fat Content – Röse Gottlieb Gravimetric Method |IDF Standard 16C:1987 | Cream. Determination of Fat Content – Röse Gottlieb Gravimetric Method |IDF Standard 1I6A:1987 | Milk-Based Edible Ices and Ice Mixes. Determination of Fat Content – Röse Gottlieb Gravimetric Method |IDF Standard 22B:1987 | Skimmed Milk, Whey & Buttermilk. Determination of Fat Content – Röse Gottlieb Gravimetric Method. |13. Literatūra1. Commission of the European Communities: Detection of foreign fats in milk fat by means of gas chromatographic trig!yceride analysis, dok. Nr. Vl/5202/90-EN, Vl/2645/91.2. Commission of the European Communities: Control of butter fat purity of 100 different samples of different feeding periods from 11 EEC countries, dok. Nr. Vl/4577/93.3. Commission of the European Communities: Consideration of results from the first, second, third, fourth, fifth and sixth EEC collaborative trial: Determination of triglycerides in milk fat, dok. Nr. Vl/2644/91, Vl/8.11.91, Vl/l919/92, Vl/3842/92, Vl/5317/92, Vl/4604/93.4. Timms, R. E.: Detection and quantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47295–303 (1980).5. Precht, D., Heine. K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen, 41 406–410 (1986).6. Luf, W., Stock, A., Brandl, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett über die Triglyceridanalyse. österr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 29-35 (1987).7. Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 143–157 (1989).8. Precht, D.: Schnelle Extraktion von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 119–128 (1990).9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 139–154 (1990).10. Precht, D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 43 (3) 219–242 (1991).11. Precht, D.: Detection of adulterated milkfat by fatty acid and triglyceride analysis. Fat Sci. Technol. 93 538–544 (1991).12. Precht, D.: Detection for foreign fat in milk fat. Qualitative detection by triacylglycerol formulae. II. Quantitative.evaluation of foreign fat mixtures. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 194 1–8, 107–114 (1992).13. Precht, D.: Gas chromatography of triacylglycerols and other lipids on packed columns. in CRC Handbook of Chromatography: Analysis of lipids, p. 123–138, Ed. K.D. Mukherjee, N. Weber, J. Sherma, CRC Press, Boca Raton (1993),14. Precht, D., Molkentin, J.: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4 16–17 (1993).15. Molkentin, J., Precht, D.: Comparison of packed and capillary columns for quantitative gas chromatography of triglycerides in milk fat.Chromatographia 39 (5/6) 265–270 (1994).16. Stange, K,: Angewandte Statistik, Erster Teil, Eindimensionale Probleme, Springer-Verlag, Berlin, p. 378 (1970).[1] Tinkamą metodą aprašė D.PrEBht and J.Molkentin: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News[2] Tinkamu produktu yra prekiaujama.[3] Tinkamas naudoti produktas, kurio prekinis pavadinimas Extrelut, Gas ChromQ, Chrompack, ir kuriuo prekiaujama specializuotose parduotuvėse. Ši informacija palengvina standarto naudojimą, tačiau neprivaloma. Nurodyta dalelių dydžio dimensija gali būti paversta į SI sistemos vienetus pagal BS 410:1988 "British Standard Specification for test sieves".[4] Žr. 3–ią išnašą.--------------------------------------------------XXVI PRIEDASPIRMOJOJE PREAMBULĖJE PAMNĖTŲ REGLAMENTŲ SĄRAŠAS- 1968 m. rugpjūčio 9 d. Komisijos reglamentas (EEB) Nr. 1216/68, nustatantis laktozės kiekio iš trečiųjų šakių įvežamuose pašaruose nustatymo metodą [1], su pakeitimais, padartytais 1987 m. gruodžio 22 d. Komisijos reglamentu (EEB) Nr. 222/88, iš dalies pakeičiančiu tam tikras bendro rinkos organizavimo pieno ir pieno produktų sektoriuje priemones, įvedus Kombinuotąją nomenklatūrą [2];- 1992 m. gruodžio 22 d. Komisijos reglamentas (EEB) Nr. 3942/92, nustatantis pamatinį metodą sitosteroliui ir stigmasteroliui lydytame svieste nustatyti [3], su paskutiniais pakeitimais, padarytais Komisijos reglamentu (EB) Nr. 175/1999, iš dalies pakeičiančiu Reglamentus (EEB) Nr. 3942/42, (EB) Nr. 86/94, (EB) Nr. 1082/96 ir (EB) Nr. 1459/98, nustatančius pamatinius metodus tam tikroms atsekamosioms medžiagoms svieste, lydytame svieste ir grietinėlėje nustatyti [4];- 1994 m. sausio 19 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 86/94, nustatantis pamatinį metodą sitosteroliui ir stigmasteroliui svieste nustatyti [5], su pakeitimais, padarytais Reglamentu (EB) Nr. 175/1999;- 1995 m. lapkričio 24 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 2721/95, nustatantis pieno ir pieno produktų analizės ir kokybės vertinimo pamatinių ir įprastinių metodų taikymo taisykles organizojant bendrąją rinką [6];- 1996 m. birželio 14 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 1080/96, nustatantis pamatinį metodąkoliforminėms bakterijoms svieste, nugriebto pieno milteliuose ir kezeine (kazeinatuose) nustatyti [7];- 1996 m. birželio 14 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 1081/96, nustatantis pamatinį metodą karvės pienui ir kezeinatui sūriuose, pagamintuose iš avių, ožkų ar buivolių pieno arba iš avių, ožkų ar buivolių pieni mišinių nustatyti, ir panaikinatis Reglamentą (EEB) Nr. 690/92 [8];- 1996 m. birželio 14 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 1082/96, nustatantis pamatinį metodą karotino rūgšties etilo esteriui koncentruotame svieste ir svieste nustatyti [9], su pakeitimais, padartytais, padarytais Reglamentu (EB) Nr. 175/1999;- 1996 m. rugsėjo 26 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 1854/96, nustatantis sąrašą pamatinių metodų, kurie turi būti taikomi analizuojant pieną ir peino produktus bei vertinant jų kokybę pagal benrą rinkos organizavimą [10], su pakeitimais, padarytais Reglamentu (EB) Nr. 881/1999 [11];- 1998 m. balandžio 24 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 880/98, nustatatntis pamatinius metodus vandeniui, sausosioms neriebalinėms medžiagoms ir riebalų kiekiui svieste nustatyti [12];- 1998 m. liepos 8 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 1459/98, nustatantis pamatinius metodus vanilinui koncentruotame svieste, svieste ar grietinėlėje nustatyti [13] su pakeitimais, padarytais Reglamentu (EB) Nr. 175/1999.[1] OL L 198, 1968 8 10, p. 13.[2] OL L 28, 1988 2 1, p. 1.[3] OL L 399, 1992 12 31, p. 29.[4] OL L 20, 1999 1 27, p. 22.[5] OL L 17, 1994 1 20, p. 7.[6] OL L 283, 1995 11 25, p. 7.[7] OL L 142, 1996 6 15, p. 13.[8] OL L 142, 1996 6 15, p. 15.[9] OL L 142, 1996 6 15, p. 26.[10] OL L 246, 1996 9 27, p. 5.[11] OL L 111, 1999 9 24, p. 24.[12] OL L 124, 1998 4 25, p. 16.[13] OL L 193, 1998 7 9, p. 16.--------------------------------------------------