CELEX: 32012R0640
Language: hr
Date: 2012-07-06 00:00:00
Title: Uredba Komisije (EU) br. 640/2012 od 6. srpnja 2012. o izmjeni Uredbe (EZ) br. 440/2008 o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) radi prilagodbe tehničkom napretku  Tekst značajan za EGP

15/Sv. 24
            
            
               HR
            
            
               Službeni list Europske unije
            
            
               104
            
         32012R0640
   
               L 193/1
            
            
               SLUŽBENI LIST EUROPSKE UNIJE
            
         UREDBA KOMISIJE (EU) br. 640/2012
   od 6. srpnja 2012.
   o izmjeni Uredbe (EZ) br. 440/2008 o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) radi prilagodbe tehničkom napretku
   (Tekst značajan za EGP)
   EUROPSKA KOMISIJA,
   uzimajući u obzir Ugovor o funkcioniranju Europske unije,
   uzimajući u obzir Uredbu (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća od 18. prosinca 2006. o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) i osnivanju Europske agencije za kemikalije te o izmjeni Direktive 1999/45/EZ i stavljanju izvan snage Uredbe Vijeća (EEZ) br. 793/93 i Uredbe Komisije (EZ) br. 1488/94 kao i Direktive Vijeća 76/769/EEZ te direktiva Komisije 91/155/EEZ, 93/67/EEZ, 93/105/EZ i 2000/21/EZ (1), a posebno njezin članak 13. stavak 3.,
   budući da:
   
               (1)
            
            
               Uredba Komisije (EZ) br. 440/2008 (2) sadrži ispitne metode za određivanje fizikalno-kemijskih svojstava, toksičnosti i ekotoksičnosti tvari koje se primjenjuju za potrebe Uredbe (EZ) br. 1907/2006.
            
         
               (2)
            
            
               Potrebno je ažurirati Uredbu (EZ) br. 440/2008 da bi se u nju prioritetno uključile nove i ažurirane alternativne ispitne metode koje je nedavno donio OECD u interesu smanjenja broja životinja koje se koriste u pokusima, u skladu s Direktivom 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (3) i Direktivom Vijeća 86/609/EEZ od 24. studenoga 1986. o usklađivanju zakona i drugih propisa država članica s obzirom na zaštitu životinja koje se koriste u pokusne i druge znanstvene svrhe (4). Zainteresirane strane već su konzultirane o tom nacrtu.
            
         
               (3)
            
            
               Uredbu (EZ) br. 440/2008 treba stoga na odgovarajući način izmijeniti.
            
         
               (4)
            
            
               Mjere predviđene ovom Uredbom u skladu su s mišljenjem Odbora osnovanog na temelju članka 133. Uredbe (EZ) br. 1907/2006,
            
         DONIJELA JE OVU UREDBU:
   Članak 1.
   Prilog Uredbi (EZ) br. 440/2008 mijenja se u skladu s Prilogom ovoj Uredbi.
   Članak 2.
   Ova Uredba stupa na snagu trećeg dana od dana objave u Službenom listu Europske unije.
   
      Ova je Uredba cijelosti obvezujuća i izravno se primjenjuje u svim državama članicama.
      Sastavljeno u Bruxellesu 6. srpnja 2012.
      
         
            Za Komisiju
         
         
            Predsjednik
         
         José MANUEL BARROSO
      
   
   
      (1)  SL L 396, 30.12.2006., str. 1.
   
      (2)  SL L 142, 31.5.2008., str. 1.
   
      (3)  SL L 276, 20.10.2010., str. 33.
   
      (4)  SL L 358, 18.12.1986., str. 1.
   PRILOG
   Prilog Uredbi (EZ) br. 440/2008 mijenja se kako slijedi:
   
               1.
            
            
               Poglavlje B.42. zamjenjuje se sljedećim:
               „B.42.   PREOSJETLJIVOST KOŽE: ANALIZA LOKALNIH LIMFNIH ČVOROVA
               
               UVOD
               
                           1.
                        
                        
                           Smjernice OECD-a za ispitivanje kemijskih tvari i ispitne metode EU-a koje se na njima temelje, periodički se preispituju u svjetlu znanstvenog napretka, promjene regulatornih potreba i razmatranja o dobrobiti životinja. Originalna ispitna metoda (TM) za utvrđivanje preosjetljivosti kože kod miševa, analiza lokalnih limfnih čvorova (LLNA; Smjernica za ispitivanje OECD-a 429; Poglavlje B.42 ovog Priloga) je prethodno donesena (1). Objavljeni su detalji validacije metode LLNA i pregled povezanog djelovanja (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Ažurirana metoda LLNA se temelji na ocjeni iskustva i znanstvenih podataka (12). To je druga ispitna metoda za procjenu potencijala kemikalija da senzibiliziraju kožu kod životinja (tvari i smjese). U drugoj metodi (Smjernica za ispitivanje OECD-a 406; Poglavlje B.6. ovog Priloga) primjenjuju se testovi na zamorcima, konkretnije maksimizacijski test sa zamorcima i Buehlerov test (13). Metoda LLNA ima određene prednosti u odnosu na B.6 i Smjernicu za ispitivanje OECD-a 406 (13) s obzirom na dobrobit životinja. Ova ažurirana ispitna metoda LLNA obuhvaća niz referentnih normi (Dodatak 1.) koje se mogu koristiti za ocjenjivanje statusa validacije novih i/ili izmijenjenih ispitnih metoda koje su u funkcionalnom i mehanicističkom smislu slične metodi LLNA u skladu s načelima iz Smjernice OECD-a br. 34 (14).
                        
                     
                           2.
                        
                        
                           Metodom LLNA proučava se indukcijska faza senzibilizacije kože i dobivaju kvantitativni podaci pogodni za procjenjivanje reakcije na dozu. Treba napomenuti da su blagi/umjereni senzibilizatori, koji se preporučuju kao prikladne pozitivne kontrolne tvari za test sa zamorcima (B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (13), prikladni i za uporabu kod metode LLNA (6)(8)(15). Kao opcija ove ispitne metode također je opisan smanjeni pristup LLNA (rLLNA) pri kojem bi se moglo koristiti do 40 % manje životinja. Metoda rLLNA se može koristiti kada postoji regulatorna potreba za potvrđivanjem negativnog predviđanja potencijala preosjetljivosti kože pod uvjetom da su ispunjene sve ostale specifikacije protokola LLNA, kako je opisano u ovoj metodi. Predviđanje negativnog rezultata treba se temeljiti na svim dostupnim informacijama opisanim u stavku 4. Prije primjene pristupa rLLNA potrebno je dostaviti jasna obrazloženja i znanstvenu utemeljenost njegove uporabe. Ako se unatoč očekivanjima dobiju pozitivan ili dvosmislen rezultat rLLNA, mogu biti potrebna dodatna ispitivanja radi tumačenja ili razjašnjenja nalaza. Metoda rLLNA se ne smije koristiti za utvrđivanje opasnosti ispitivanih tvari koje uzrokuju preosjetljivost kože ako su potrebni podaci o reakciji na dozu, kao što je potkategorizacija za Uredbu (EZ) br. 1272/2008 o razvrstavanju, označivanju i pakiranju tvari i smjesa i Globalno usklađeni sustav razvrstavanja i označivanja kemikalija Ujedinjenih naroda (UN).
                        
                     DEFINICIJE
               
                           3.
                        
                        
                           Korištene definicije navedene su u Dodatku 2.
                        
                     POČETNA RAZMATRANJA I OGRANIČENJA
               
                           4.
                        
                        
                           Metoda LLNA alternativna je metoda za utvrđivanje kemikalija koje imaju potencijal za uzrokovanje senzibilizacije kože. To nužno ne znači da u svim slučajevima metodu LLNA treba primijeniti umjesto testa sa zamorcima (B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (13), već da je pokus jednakovrijedan i da se može koristiti kao alternativa kod koje za pozitivne i negativne rezultate obično nije potrebna daljnja potvrda. Ispitni laboratoriji trebaju uzeti u obzir sve dostupne podatke o ispitivanoj tvari prije provođenja studije. Spomenuti podaci uključuju identitet i kemijsku strukturu ispitivane tvari, njezina fizikalno-kemijska svojstva, rezultate svih in vitro ili in vivo ispitivanja toksičnosti i toksikološke podatke o strukturno povezanim kemikalijama. Ti se podaci uzimaju u obzir radi utvrđivanja prikladnosti metode LLNA za odnosnu tvar (s obzirom na nekompatibilnost određenih vrsta kemikalija s metodom LLNA - vidjeti stavak 5.) i pomoći kod odabira doze.
                        
                     
                           5.
                        
                        
                           Metoda LLNA je metoda in vivo, pa kao takva ne isključuje uporabu životinja u procjeni kontaktne senzibilizacijske aktivnosti. Međutim, ona ima potencijala smanjiti broj životinja koje su potrebne za tu svrhu. Nadalje, metoda LLNA nudi znatno finiji način uporabe životinja (manje boli i patnje) u ispitivanju kontaktne senzibilizacije. Metoda LLNA temelji se na analizi imunoloških događanja koja stimuliraju kemikalije za vrijeme indukcijske faze senzibilizacije. Za razliku od testa sa zamorcima (B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (13), kod metode LLNA nije potrebno izazivati provokacijski inducirane hipersenzibilizirane dermalne reakcije. Nadalje, za metodu LLNA nije potrebno koristiti adjuvans, kao što je to slučaj s maksimizacijskim testom sa zamorcima (13). Metoda LLNA stoga smanjuje bol i patnju životinja. Unatoč prednostima metode LLNA u odnosu na B.6 i Smjernicu za ispitivanje OECD-a 406, treba priznati da postoje neka ograničenja zbog kojih može biti potrebno primijeniti B.6 ili Smjernicu za ispitivanje OECD-a 406 (13) (npr. lažni negativni nalazi metode LLNA kod određenih metala, lažni pozitivni nalazi kod nekih sredstava s nadražujućim djelovanjem na kožu (kao što su neke površinski aktivne tvari) (19) (20) ili topivost ispitivane tvari). Povrh toga, ispitivanja na zamorcima mogu biti potrebna za kemijske razrede ili tvari koje sadrže funkcionalne skupine za koje je dokazano da djeluju kao potencijalni zbunjujući faktori (21) (npr. B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (13). Nadalje, s obzirom na ograničenu bazu podataka za validaciju koja se prije svega sastoji od formulacija pesticida, pozitivni rezultat za ove vrste ispitivanih tvari se može vjerojatnije postići metodom LLNA nego ispitivanjem na zamorcima (22). Međutim, kod ispitivanja formulacija mogu se uzeti u obzir slične tvari s poznatim rezultatima kao referentne vrijednosti za dokazivanje ispravnog djelovanja metode LLNA (vidjeti stavak 16.). Pored takvih utvrđenih ograničenja LLNA se može primjenjivati za ispitivanje bilo koje tvari, osim ako ne postoji mogućnost da bi njezina svojstva mogla utjecati na točnost metode LLNA.
                        
                     NAČELO ISPITIVANJA
               
                           6.
                        
                        
                           Metoda LLNA počiva na temeljnom načelu prema kojem senzibilizatori induciraju primarnu proliferaciju limfocita u limfnom čvoru čime dolazi do drenaže mjesta kemijske primjene. Ta je proliferacija proporcionalna primijenjenoj dozi i potencijalu primijenjenog alergena te predstavlja jednostavan način za dobivanje kvantitativno izmjerene senzibilizacije. Proliferacija se mjeri usporedbom prosječne proliferacije svake ispitivane skupine s prosječnom proliferacijom u kontrolama tretiranim nosačem. Određuje se omjer prosječne proliferacije u svakoj tretiranoj skupini i proliferacije u kontrolama s nosačem, nazvan indeks stimulacije, koji mora biti najmanje tri da bi se ispitivana tvar mogla dalje vrednovati kao potencijalni senzibilizator kože. Ovdje opisane metode temelje se na uporabi in vivo radioaktivnih oznaka za mjerenje povećanog broja stanica koje proliferiraju u aurikularnim limfnim čvorovima koji uzrokuju drenažu. Međutim, za procjenu broja proliferirajućih stanica mogu se koristiti drugi parametri ako su u potpunosti ispunjeni zahtjevi izvedbe (Dodatak 1.).
                        
                     OPIS ANALIZE
               
                  Odabir životinjskih vrsta
               
               
                           7.
                        
                        
                           Za ovaj su test odabrana vrsta miševi. Koriste se mlade odrasle ženke soja CBA/Ca ili CBA/J koje još nisu imale potomstvo i nisu skotne. Na početku studije životinje trebaju biti stare između osam do 12 tjedana, a odstupanje mase životinja treba biti minimalno i ne smije prelaziti 20 % srednje mase. Drugi sojevi i mužjaci mogu se koristiti ako postoji dovoljno podataka da u reakciji prema metodi LLNA nema razlika specifičnih za soj i/ili spol.
                        
                     
                  Uvjeti smještaja i prehrane
               
               
                           8.
                        
                        
                           Miševi trebaju biti smješteni u skupinama (23), osim ako se ne dokaže prikladna znanstvena utemeljenost za pojedinačni smještaj. Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 °C (± 3 °C). Iako bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a poželjno je da ne prijeđe 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50–60 %. Svjetlost treba biti umjetna, s tim da je redoslijed 12 sati svjetla, 12 sati tame. Za hranjenje se može koristiti konvencionalna laboratorijska hrana s neograničenom količinom vode za piće.
                        
                     
                  Priprema životinja
               
               
                           9.
                        
                        
                           Životinje se nasumice biraju, jednoznačno identificiraju (ali ne bilo kojim oblikom označavanja ušiju) i drže u kavezima najmanje pet dana prije početka doziranja kako bi se aklimatizirale na laboratorijske uvjete. Prije početka tretiranja sve životinje treba pregledati kako bi se potvrdilo da nemaju zapaženih lezija kože.
                        
                     
                  Priprema ispitnih otopina
               
               
                           10.
                        
                        
                           Tvrde kemikalije se prije primjene na uho miša trebaju rastopiti ili suspendirati u otapalima/nosačima i prema potrebi razrijediti. Tekuće kemikalije se mogu nanijeti čiste ili razrijeđene prije doziranja. Netopive kemikalije, koje se obično koriste u medicinskim uređajima, trebaju se podvrgnuti postupku pretjerane ekstrakcije u odgovarajućem otapalu kako bi se prije primjene na uho miša otkrili svi ekstraktibilni sastojci za ispitivanje. Ispitivane tvari se pripremaju svakodnevno osim ako podaci o stabilnosti ne dokažu prihvatljivost njihova skladištenja.
                        
                     
                  Provjera pouzdanosti
               
               
                           11.
                        
                        
                           Kemikalije pozitivne kontrole koriste se kako bi se dokazalo da se pokus provodi na odgovarajući način tako što reagiraju prikladnom i ponovljivom preosjetljivošću kao ispitivana tvar koja uzrokuje preosjetljivost, čiji je stupanj reakcije točno utvrđen. Preporučuje se uvođenje paralelne pozitivne kontrole radi dokazivanja sposobnosti laboratorija da uspješno izvede svaku analizu i kako bi se omogućilo ocjenjivanje ponovljivosti i usporedivosti unutar jednog ili između više laboratorija. Određena regulatorna tijela zahtijevaju pozitivnu kontrolu za svaku studiju te se stoga korisnici pozivaju da prije izvođenja metode LLNA kontaktiraju relevantna tijela. Sukladno tomu, potiče se rutinska uporaba paralelne pozitivne kontrole kako bi se izbjeglo dodatno ispitivanje na životinjama radi ispunjavanja zahtjeva koji se mogu javiti zbog periodičke uporabe paralelne kontrole (vidjeti stavak 12.). Pozitivna kontrola treba proizvesti pozitivnu reakciju na metodu LLNA kod razine izlaganja za koju se očekuje da će dati porast indeksa stimulacije (SI) > 3 u odnosu na negativnu kontrolnu skupinu. Dozu pozitivne kontrole treba odabrati tako da ne uzrokuje prekomjerno nadraživanje kože ili sustavnu toksičnost i da je indukcija ponovljiva, ali ne prekomjerna (tj. SI > 20 se smatra pretjeranim). Poželjne pozitivne kontrole su 25 %-tni heksilcinamaldehid (CAS br. 101-86-0) u acetonu: maslinovo ulje (4:1; v/v) i 5 %-tni merkaptobenzotiazol (CAS br. 149-30-4) i N,N-N-dimetilformamid (vidjeti Dodatak 1., Tablicu 1.). Moguće su okolnosti u kojima se, uz odgovarajuće obrazloženje, mogu koristiti druge pozitivne kontrole koje ispunjavaju gore navedene kriterije.
                        
                     
                           12.
                        
                        
                           Iako se preporučuje uvođenje paralelne skupine pozitivne kontrole, u određenim situacijama periodičko ispitivanje (tj. u intervalima ≤ 6 mjeseci) pozitivne kontrole može biti prikladno za laboratorije koji redovito izvode metode LLNA (tj. najmanje jednom mjesečno) i imaju povijesnu bazu podataka pozitivne kontrole koja dokazuje sposobnost laboratorija da dobiva ponovljive i točne rezultate pozitivnih kontrola. Odgovarajuća osposobljenost za metodu LLNA može se uspješno dokazati dobivanjem dosljednih pozitivnih rezultata pozitivne kontrole u najmanje 10 neovisnih ispitivanja provedenih u razumnom vremenskom razdoblju (manje od jedne godine).
                        
                     
                           13.
                        
                        
                           Paralelnu skupinu pozitivne kontrole potrebno je uvesti svaki put kada dođe do proceduralne promjene metode LLNA (zamjena stručnog osoblja, promjena materijala i/ili reagensa ispitne metode, promjena opreme, promjena izvora ispitivanih životinja) i te se promjene moraju navesti u laboratorijskim izvješćima. Potrebno je uzeti u obzir učinak tih promjena na primjerenost prethodno uspostavljene baze podataka prilikom utvrđivanja potrebe za uspostavom nove baze povijesnih podataka radi dokazivanja dosljednosti rezultata pozitivne kontrole.
                        
                     
                           14.
                        
                        
                           Istraživači trebaju biti svjesni da odluka o provođenju periodičke umjesto paralelne studije pozitivne kontrole utječe na prikladnost i prihvatljivost negativnih rezultata dobivenih bez paralelne pozitivne kontrole u razdoblju između svake periodičke pozitivne kontrole. Na primjer, ako se periodičkom pozitivnom kontrolom dobije lažni negativni rezultat, mogu se dovesti u pitanje negativni rezultati ispitivane tvari dobiveni u razdoblju između posljednje prihvatljive periodičke pozitivne kontrolne studije i neprihvatljive periodičke pozitivne kontrolne studije. Kod odlučivanja o uvođenju paralelne pozitivne kontrole ili provođenju samo periodičkih pozitivnih kontrola potrebno je pažljivo uzeti u obzir posljedice tih rezultata. Također je potrebno razmotriti mogućnost uporabe manjeg broja životinja u skupini paralelne pozitivne kontrole ako je to opravdano sa znanstvenog stajališta i ako laboratorij na temelju svojih posebnih povijesnih podataka dokaže da se može koristiti manje miševa (12).
                        
                     
                           15.
                        
                        
                           Iako pozitivnu kontrolnu tvar treba ispitati u nosaču za koji je poznato da izaziva dosljednu reakciju (npr. aceton; maslinovo ulje; 4:1, v/v), u nekim regulatornim situacijama bit će potrebno i ispitivanje u nestandardnom nosaču (klinički/kemijski relevantnoj formulaciji) (24). Ako se paralelna pozitivna kontrola ispituje u drugačijem nosaču od ispitivane tvari, potrebno je uključiti posebnu kontrolu s nosačem za paralelnu pozitivnu kontrolu.
                        
                     
                           16.
                        
                        
                           U slučajevima kada se ocjenjuju tvari iz posebnog kemijskog razreda ili raspona reakcija, referentne tvari mogu također biti korisne za dokazivanje ispravnosti ispitne metode za otkrivanje potencijala preosjetljivosti kože tih vrsta ispitivanih tvari. Prikladne referentne tvari moraju imati sljedeće značajke:
                           
                                       —
                                    
                                    
                                       strukturnu i funkcionalnu sličnost s razredom ispitivane tvari,
                                    
                                 
                                       —
                                    
                                    
                                       poznata fizikalna/kemijska svojstva,
                                    
                                 
                                       —
                                    
                                    
                                       popratne podatke iz LLNA,
                                    
                                 
                                       —
                                    
                                    
                                       popratne podatke od drugih životinjskih modela i/ili ljudi.
                                    
                                 
                     ISPITNI POSTUPAK
               
                  Broj životinja i visine doze
               
               
                           17.
                        
                        
                           Po jednoj dozirnoj skupini koriste se najmanje četiri životinje, s najmanje tri koncentracije ispitivane tvari, plus paralelna negativna kontrolna skupina tretirana samo nosačem za ispitivanu tvar i jedna pozitivna kontrola (paralelna ili nedavno provedena, na temelju laboratorijske politike uzimajući u obzir stavke 11.-15.). Potrebno je razmotriti ispitivanje višestrukih doza pozitivne kontrole, posebno ako se ispitivanje pozitivne kontrole izvodi s prekidima. Osim tretiranja ispitivanom tvari, sa životinjama u kontrolnim skupinama treba postupati i tretirati ih jednako kao i životinje u tretiranim skupinama.
                        
                     
                           18.
                        
                        
                           Odabir doze i nosača treba se temeljiti na preporukama navedenim u referencama (3) i (5). Uzastopne doze se obično odabiru iz odgovarajućih serija koncentracija kao što su 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Odabir uporabljene serije koncentracija mora biti popraćena odgovarajućim znanstvenim obrazloženjem. Kod odabira tri uzastopne koncentracije treba uzeti u obzir sve postojeće toksikološke podatke (o akutnoj toksičnosti i nadraživanju kože) te strukturne i fizikalno-kemijske podatke, ako dostupne, kako bi se najvišom koncentracijom maksimaliziralo izlaganje, ali istodobno izbjegla sustavna toksičnost i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože (3)(25). U nedostatku tih podataka može biti potrebno provesti početno predprobiranje (vidjeti stavke 21.-24.).
                        
                     
                           19.
                        
                        
                           Nosač ne smije ometati niti utjecati na rezultate ispitivanja i treba se odabrati na temelju povećanja topljivosti s ciljem postizanja što viših koncentracija, a da se istodobno proizvede otopina/suspenzija pogodna za primjenu ispitivane tvari. Kao nosači preporučuju se aceton: maslinovo ulje (4:1 v/v), N,N-dimetilformamid, metil etil keton, propilen glikol i dimetil sulfoksid (19), ali mogu se koristiti i drugi ako se to dostatno znanstveno obrazloži. U nekim situacijama može biti potrebno primijeniti klinički relevantno otapalo ili komercijalnu formulaciju u kojoj se ispitivana tvar prodaje, kao dodatnu kontrolu. Posebno treba paziti da u sustav nosača budu ugrađene hidrofilne ispitivane tvari koje vlaže kožu i ne isušuju se odmah, uključivanjem odgovarajućih sredstava za otapanje (npr. 1 %-tnim Pluronic® L92). Znači, nosače koji su u potpunosti vodeni treba izbjegavati.
                        
                     
                           20.
                        
                        
                           Obrada limfnih čvorova pojedinačnih miševa omogućuje ocjenjivanje promjenljivosti među životinjama i statističku usporedbu razlika između mjerenja ispitivanom tvari i kontrolnom skupinom s nosačem (vidjeti stavak 35.). Pored toga, ocjenjivanje mogućnosti smanjenja broja miševa u skupini pozitivne kontrole je izvedivo nakon što se prikupe pojedinačni podaci o životinjama (12). Određena regulatorna tijela zahtijevaju da se prikupe pojedinačni podaci o životinjama. Međutim, neka regulatorna tijela mogu prihvatiti skupne podatke o životinjama i u tim slučajevima korisnici mogu sami odabrati hoće li prikupljati pojedinačne ili skupne podatke o životinjama.
                        
                     
                  Predprobiranje
               
               
                           21.
                        
                        
                           Ako nisu dostupne informacije za određivanje najviše doze za ispitivanje (vidjeti stavak 18.), potrebno je obaviti predprobiranje kako bi se odredila odgovarajuća visina doze za ispitivanje u LLNA. Svrha predprobiranja je pružiti smjernice za odabir najviše doze za uporabu u glavnoj studiji LLNA ako nisu dostupne informacije o koncentraciji koja uzrokuje sustavnu toksičnost (vidjeti stavak 24.) i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože (vidjeti stavak 23.). Najveća ispitana visina doze je 100 %-tna ispitivana tvar za tekućine ili najveća moguća koncentracija za krute tvari ili suspenzije.
                        
                     
                           22.
                        
                        
                           Predprobiranje se izvodi u uvjetima koji su identični glavnoj studiji LLNA, s razlikom da se ne ocjenjuje proliferacija limfnih čvorova i može se koristiti manje životinja po dozirnoj skupini. Preporučuje se uporaba jedne ili dvije životinje po dozirnoj skupini. Svi miševi se svakodnevno prate s ciljem otkrivanja kliničkih znakova sustavne toksičnosti ili lokalnog nadraživanja na mjestu primjene. Tjelesna masa se bilježi prije ispitivanja i prije završetka (6. dan). Oba uha svakog miša se pregledavaju radi otkrivanja eritema i boduju se prema tablici 1. (25). Debljina uha se mjeri posebnim mjernim instrumentom (pr. digitalnim mikrometrom ili mjeračem debljine Peacock Dial) prvi dan (prije doze), treći dan (otprilike 48 sati nakon prve doze) i šesti dan. Pored toga, šesti dan se debljina uha može odrediti mjerenjem mase uzorka uha dobivenog probijanjem, što se izvodi nakon humanog usmrćenja. Prekomjerno lokalno nadraživanje kože se označuje bodovima za eriteme ≥ 3 i/ili povećanjem debljine uha za ≥ 25 % na bilo koji dan mjerenja (26) (27). Najviša odabrana doza za glavnu studiju LLNA je sljedeća niža doza iz serije koncentracija u predprobiranju (vidjeti stavak 18.) koja ne uzrokuje sustavnu toksičnost i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože.
                           
                              Tablica 1.
                           
                           
                              Bodovanje eritema
                           
                           
                                       Zapažanja
                                    
                                    
                                       Bodovi
                                    
                                 
                                       Bez eritema
                                    
                                    
                                       0
                                    
                                 
                                       Vrlo slabi eritem (jedva zamjetan)
                                    
                                    
                                       1
                                    
                                 
                                       Dobro vidljiv eritem
                                    
                                    
                                       2
                                    
                                 
                                       Umjeren do jak eritem
                                    
                                    
                                       3
                                    
                                 
                                       Jak eritem (crvenilo cikle) do nekroze kože što onemogućuje stupnjevanje eritema
                                    
                                    
                                       4
                                    
                                 
                     
                           23.
                        
                        
                           Pored 25 %-tnog povećanja debljine uha (26) (27), statistički značajno povećanje debljine uha kod tretiranih miševa u odnosu na kontrolne miševe se također koristi za određivanje nadražujućih tvari u LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Međutim, iako se statistički značajna povećanja debljine uha mogu javiti, kada su ona manja od 25 % ne povezuju se posebno s prekomjernim nadraživanjem (30) (32) (33) (34).
                        
                     
                           24.
                        
                        
                           Kada se koriste u okviru cjelokupne ocjene, sljedeća klinička opažanja mogu ukazivati na sustavnu toksičnost (35) (36) te stoga mogu naznačiti najvišu dozu za uporabu u glavnoj LLNA: promjene u djelovanju živčanog sustava (npr. piloerekcija, ataksija, tremori i grčevi); promjene u ponašanju (npr. agresivnost, promjene u njezi, značajna promjena u stupnju aktivnosti); promjene u disanju (npr. promjene učestalosti i intenziteta disanja kao što su dispneja, zadihanost i hroptanje) i promjene u konzumaciji hrane i vode. Prilikom ocjenjivanja treba uzeti u obzir znakove letargije i/ili nereagiranja, sve kliničke znakove boli i patnje koji nisu blagi ili trenutačni, ili gubitak težine > 5 % od prvog do šestog dana i smrtnost. Životinje koje su pred uginućem ili koje očito trpe bol ili pokazuju znakove teške i trajne patnje trebaju se humano usmrtiti (37).
                        
                     
                  Plan pokusa glavne studije
               
               
                           25.
                        
                        
                           Plan pokusa je sljedeći:
                           —   Prvi dan: Pojedinačno identificirati životinje i zabilježiti masu svake životinje i sva klinička opažanja. Primijeniti 25 μl odgovarajuće otopine ispitivane tvari, samog nosača ili pozitivne kontrole (paralelna ili nedavno provedena, na temelju laboratorijske politike uzimajući u obzir stavke 11.-15.) na stražnji dio uha.
                           —   Drugi i treći dan: Ponoviti postupak primjene proveden prvog dana.
                           —   Četvrti i peti dan: Bez tretiranja.
                           —   Šesti dan: Zabilježiti masu svake životinje. Svim miševima u ispitnoj i kontrolnoj skupini u venu na repu ubrizgati 250 μl sterilnog fosfatnog pufera (PBS) sa sadržajem 20 μCi (7,4e + 105 Bq)3H-metil timidina. Alternativno svim miševima u venu na repu ubrizgati 250 μl sterilnog fosfatnog pufera (PBS) sa sadržajem 2 μCi (7,4e + 104 Bq)125I-jododeoksiuridina i 10–5 M fluorodeoksiuridina. Nakon pet sati životinje humano usmrtiti. Izrezati drenažne aurikularne limfne čvorove iz svakog uha i staviti zajedno u pufer PBS za svaku životinju (pojedinačni pristup); alternativno uzeti limfne čvorove iz svakog uha i staviti u pufer PBS za svaku tretiranu skupinu (skupni pristup). Pojedinosti i sheme za identifikaciju i disekciju limfnih čvorova mogu se naći u referenci (12). Za daljnje praćenje lokalne reakcije kože u glavnoj studiji mogu se u protokol studije uključiti dodatni parametri kao što su ocjenjivanje eritema ušiju ili mjerenja debljine uha (dobiveni uređajem za mjerenje debljine ili određivanjem mase uzorka uha pri obdukciji).
                        
                     
                  Priprema suspenzije stanica
               
               
                           26.
                        
                        
                           Suspenzija pojedinačnih stanica limfnih čvorova (LNC), odstranjenih bilateralno iz pojedinačnih životinja ili iz tretiranih skupina, priprema se nježnom mehaničkom dezagregacijom kroz mrežicu od 200 μm od nehrđajućeg čelika ili drugom prihvatljivom metodom za dobivanje suspenzije pojedinačnih stanica. Stanice limfnog čvora dva se puta peru preostalim puferom PBS i DNA se ostave 18 sati taložiti s 5 % trikloroctenom kiselinom (TCA) pri 4 °C (3). Peleti se ponovno suspendiraju u 1 ml TCA i prenose u scintilacijske bočice koje sadrže 10 ml scintilacijske tekućine za brojanje3H, ili se prenose izravno u kušalice za brojanje joda125I pomoću gama zraka.
                        
                     
                  Određivanje proliferacije stanica (ugrađena radioaktivnost)
               
               
                           27.
                        
                        
                           Ugradnja3H-metil timidina mjeri se β-scintilacijskim brojačem kao raspadanje u minuti (DPM). Ugradnja125I-jododeoksiuridina mjeri se brojanjem joda125I i također se izražava kao DPM. Ovisno o pristupu, ugradnja će se izražavati kao DPM/miš (individualni pristup) ili DPM/tretirana skupina (skupni pristup).
                        
                     
                  Smanjena LLNA
               
               
                           28.
                        
                        
                           U određenim slučajevima kada postoji regulatorna potreba za potvrđivanjem negativnog predviđanja potencijala preosjetljivosti kože, može se koristiti neobavezni protokol rLLNA (16) (17) (18) s manjim brojem životinja, pod uvjetom da su ispunjene sve ostale specifikacije protokola LLNA iz ove ispitne metode. Prije primjene pristupa rLLNA potrebno je dostaviti jasna obrazloženja i znanstvenu utemeljenost njegove uporabe. Ako se dobije pozitivan ili dvosmislen rezultat, mogu biti potrebna dodatna ispitivanja radi tumačenja ili razjašnjenja nalaza.
                        
                     
                           29.
                        
                        
                           Jedina razlika između protokola ispitnih metoda LLNA i rLLNA je manji broj dozirnih skupina zbog čega rLLNA ne daje podatke o odnosu doza-učinak. Metoda rLLNA se stoga ne treba koristiti kada su potrebni podaci o odnosu doza-učinak. Kao i kod LLNA s više doza, koncentracija ispitivane tvari koja se ocjenjuje u rLLNA mora biti najveća koncentracija koja ne uzrokuje očitu sustavnu toksičnost i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože kod miševa (vidjeti stavak 18.).
                        
                     OPAŽANJA
               
                  Klinička opažanja
               
               
                           30.
                        
                        
                           Sve miševe treba pomno opažati najmanje jednom dnevno s obzirom na sve kliničke znakove lokalnog nadraživanja na mjestu primjene ili sustavne toksičnosti. Sva opažanja sustavno se bilježe te se za svaku životinju bilješke vode pojedinačno. Programi praćenja uključuju kriterije za pravodobno identificiranje miševa koji pokazuju znakove sustavne toksičnosti, prekomjernog lokalnog nadraživanja kože ili korozije kože za eutanaziju (37).
                        
                     
                  Tjelesne mase
               
               
                           31.
                        
                        
                           Kao što je navedeno u stavku 25., pojedinačne tjelesne mase treba mjeriti na početku testa i u vrijeme planiranog usmrćivanja životinja.
                        
                     IZRAČUN REZULTATA
               
                           32.
                        
                        
                           Rezultati za svaku tretiranu skupinu izraženi su kao indeks stimulacije (SI). Ako se primjenjuje individualni pristup, SI se dobiva dijeljenjem prosječnog raspadanja u minuti (DPM) po životinji unutar svake skupine tretirane ispitivanom tvari i pozitivne kontrolne skupine s prosječnim DPM po životinji za kontrolnu skupinu s otopinom/nosačem. Prosječan SI za kontrolne skupine tretirane nosačem tada iznosi 1. Ako se primjenjuje skupni pristup, SI se dobiva tako da se za svaku tretiranu skupinu skupno ugrađena radioaktivnost podijeli sa skupnom ugradnjom kontrolne skupine za otapalo; tako se dobiva prosječni indeks SI.
                        
                     
                           33.
                        
                        
                           U postupku odlučivanja rezultat se smatra pozitivnim kada je SI ≥ 3. Međutim, kod odlučivanja da se neki granični rezultat proglasi pozitivnim može se, također, koristiti snaga učinka na dozu, statistički značaj i dosljednost reakcija u otapalu/nosaču i pozitivnoj kontroli (4) (5) (6).
                        
                     
                           34.
                        
                        
                           Ako je potrebno razjasniti dobivene rezultate, valja uzeti u obzir razna svojstva ispitivane tvari, uključujući i to ima li strukturne veze s poznatim senzibilizatorima kože, uzrokuje li pretjerano nadraživanje kože kod miševa i prirodu odnosa opažene reakcije na dozu. Ova i druga pitanja detaljno su razmotrena drugdje (7).
                        
                     
                           35.
                        
                        
                           Prikupljanje podataka o radioaktivnosti na razini pojedinačnog miša omogućit će statističku analizu prisutnosti i stupnja odnosa između doze i učinka. Svaka statistička procjena može uključiti ocjenu odnosa između doze i učinka te odgovarajući prilagođene usporedbe ispitnih skupina (npr. skupina s doziranjem u parovima u odnosu na paralelne kontrolne skupine s nosačem). Statističke analize mogu uključiti linearnu regresiju ili Williamsov test za ocjenu trendova odnosa doza-učinak i Dunnettov test za usporedbe u parovima. Prilikom odabira prikladne metode statističke analize istraživač treba biti svjestan eventualnih razlika između varijanata kao i drugih problema s tim u vezi, zbog kojih može biti neophodna transformacija podataka ili neparametarska statistička analiza. U svakom slučaju istraživač će možda morati izvršiti izračune SI i statističke analize sa sigurnim točkama podataka (koji se ponekad nazivaju ‚netipične vrijednosti’) i bez njih.
                        
                     PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
               
                  Podaci
               
               
                           36.
                        
                        
                           Podatke treba sažeti u tabličnom obliku. Kad se koristi pristup pojedinačne životinje, navode se vrijednosti DPM za pojedinačnu životinju, srednje vrijednosti DPM za skupinu/životinja, s tim povezana razlika između stvarne i predviđene pogreške (npr. SD, SEM) i srednja vrijednost SI za svaku dozirnu skupinu u odnosu na paralelnu kontrolnu skupinu s nosačem. Kad se koristi skupni pristup za tretiranu skupinu, navode se srednje/prosječne vrijednosti DPM i srednja vrijednost SI za svaku dozirnu skupinu u odnosu na paralelnu kontrolnu skupinu s nosačem.
                        
                     
                  Izvješće o ispitivanju
               
               
                           37.
                        
                        
                           Izvješće o ispitivanju treba sadržavati sljedeće informacije:
                           
                                        
                                    
                                    
                                       Ispitivane i kontrolne tvari:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   identifikacijski podaci (npr. brojevi CAS i EZ, ako su poznati, podrijetlo, čistoća, poznate nečistoće, broj šarže),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   fizikalna priroda i fizikalno-kemijska svojstva (npr. hlapljivost, stabilnost, topljivost),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   ako je mješavina, sastav i relativni postoci sastojaka.
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Otapalo/nosač:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   identifikacijski podaci (čistoća, koncentracija (prema potrebi); upotrijebljeni volumen),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   dokaz opravdanosti izbora nosača.
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Ispitne životinje:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   podrijetlo miševa CBA,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   mikrobiološki status životinja, ako je poznat,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   broj i starost životinja,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   podrijetlo životinja, uvjeti smještaja, prehrana itd.
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Uvjeti ispitivanja:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinosti o pripravljanju i primjeni ispitivane tvari,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   dokaz opravdanosti odabira doze (uključujući rezultate predprobiranja, ako je provedeno),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   koncentracije nosača i ispitivane tvari koji su upotrijebljeni i ukupna količina tvari koja je primijenjena,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uključujući vrstu/podrijetlo hrane, izvor vode),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinosti o programima tretiranja i uzorkovanja,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   metode mjerenja toksičnosti,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   kriteriji za određivanje studija pozitivnima ili negativnima,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinosti o bilo kojim odstupanjima od protokola i objašnjenje učinaka tog odstupanja na izradu i rezultate studije,
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Provjera pouzdanosti:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   sažetak rezultata najsvježije provjere pouzdanosti uključujući informacije o upotrijebljenoj ispitanoj tvari, koncentraciji i nosaču,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   podaci o paralelnim i/ili povijesnim pozitivnim kontrolama i paralelnim negativnim kontrolama za ispitni laboratorij,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   ako nije uključena paralelna pozitivna kontrola, datum i laboratorijsko izvješće za posljednju periodičku pozitivnu kontrolu i izvješće u kojem se navode povijesni pozitivni kontrolni podaci za laboratorij, kojima se opravdava neprovođenje paralelne pozitivne kontrole,
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Rezultati:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinačne mase miševa na početku doziranja i u vrijeme planiranog usmrćenja, srednja i s tim povezana razlika između stvarne i predviđene pogreške (npr. SD, SEM) za svaku tretiranu skupinu,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   vrijeme prve pojave i znakova toksičnosti, uključujući eventualno nadraživanje kože na mjestu primjene, za svaku životinju
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   tablica DPM vrijednosti za pojedinačne miševe (individualni pristup) ili srednjih/prosječnih (skupni pristup za tretiranu skupinu) DPM vrijednosti i indeksi stimulacije za svaku tretiranu skupinu,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   srednja i povezana razlika između stvarne i predviđene pogreške (npr. SD, SEM) za DPM/miš za svaku tretiranu skupinu i rezultati analize netipičnih vrijednosti za svaku tretiranu skupinu ako se koristi pojedinačni pristup,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   izračunani SI i prikladno mjerilo promjenljivosti koje uzima u obzir promjenljivost između životinja u ispitivanoj tvari i kontrolnim skupinama kada se koristi pojedinačni pristup,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   odnos doza – reakcija,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   statistička analiza, ako je primjereno,
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Rasprava o rezultatima:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   kratki komentar o rezultatima, analiza doza-reakcije i, prema potrebi, statističke analize, sa zaključkom o tome treba li ispitivanu tvar smatrati senzibilizatorom kože.
                                                
                                             
                                 
                     REFERENCE
               
                           1.
                        
                        
                           OECD (2002.), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           2.
                        
                        
                           Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992.), The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary, Food Chem. Toxicol., 30, str. 165-169.
                        
                     
                           3.
                        
                        
                           Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994.), The local lymph node assay: developments and applications, Toxicol., 93, str. 13-31.
                        
                     
                           4.
                        
                        
                           Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998.), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise, J. Toxicol. Environ. Health, 53, str. 563-79.
                        
                     
                           5.
                        
                        
                           Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996.), The local lymph node assay: status of validation, Food Chem. Toxicol., 34, str. 999-1002.
                        
                     
                           6.
                        
                        
                           Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996.), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 34, str. 985-997.
                        
                     
                           7.
                        
                        
                           Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998.), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 36, str. 327-33.
                        
                     
                           8.
                        
                        
                           Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000.), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins, Toxicol., 146, str. 49-59.
                        
                     
                           9.
                        
                        
                           Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: str. 258-273.
                        
                     
                           10.
                        
                        
                           Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34, str. 274-286.
                        
                     
                           11.
                        
                        
                           Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: str. 249-257.
                        
                     
                           12.
                        
                        
                           ICCVAM (2009.), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]
                        
                     
                           13.
                        
                        
                           OECD (1992.), Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 406, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           14.
                        
                        
                           OECD (2005.), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           15.
                        
                        
                           Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998.), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde, J. Appl. Toxicol., 18, str. 281-284.
                        
                     
                           16.
                        
                        
                           Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006.), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis, 54, str. 181-185.
                        
                     
                           17.
                        
                        
                           ESAC (2007.), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA), European Commission Directorate-General, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alternative Methods, April 2007. Dostupno na: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]
                        
                     
                           18.
                        
                        
                           ICCVAM (2009.), The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
                        
                     
                           19.
                        
                        
                           ICCVAM (1999.), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
                        
                     
                           20.
                        
                        
                           Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008.), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, str. 1896-1904.
                        
                     
                           21.
                        
                        
                           Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009.), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, str. 90-96.
                        
                     
                           22.
                        
                        
                           ICCVAM (2009.), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
                        
                     
                           23.
                        
                        
                           ILAR (1996.), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
                        
                     
                           24.
                        
                        
                           McGarry, H.F. (2007.), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH, Toxicol., 238, str. 71-89.
                        
                     
                           25.
                        
                        
                           OECD (2002.), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 404, Pariz, France. Dostupno na: [http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]
                        
                     
                           26.
                        
                        
                           Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007.), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, str. 235.
                        
                     
                           27.
                        
                        
                           ICCVAM (2009.), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]
                        
                     
                           28.
                        
                        
                           Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998.), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, str. 195-206.
                        
                     
                           29.
                        
                        
                           Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998.), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions, Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, str. 83-94.
                        
                     
                           30.
                        
                        
                           Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998.), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals, Toxicol. Meth., 8, str. 245-256.
                        
                     
                           31.
                        
                        
                           Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999.), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods, Drug. Chem. Toxicol., 22, str. 491-506.
                        
                     
                           32.
                        
                        
                           Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005.), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, str. 60-68.
                        
                     
                           33.
                        
                        
                           Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005.), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, str. 721-728.
                        
                     
                           34.
                        
                        
                           Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007.), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract, Environ. Health Perspect., 115, str. 1023-1028.
                        
                     
                           35.
                        
                        
                           OECD (1987.), Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of Chemicals No 402, Pariz, France. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           36.
                        
                        
                           ICCVAM (2009.), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]
                        
                     
                           37.
                        
                        
                           OECD (2000.), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                  Dodatak 1.
                  
                     Zahtjevi izvedbe za ocjenjivanje predloženih sličnih ili izmijenjenih ispitnih metoda llna za preosjetljivost kože
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Cilj zahtjeva izvedbe je pružiti temelj na kojem se za nove ispitne metode, zaštićene (autorskim pravima, žigom, registrirane) i nezaštićene, može odrediti njihova dostatna točnost i pouzdanost za posebne svrhe ispitivanja. Ti zahtjevi izvedbe koji se temelje na validiranim i prihvaćenim ispitnim metodama, mogu se koristiti za ocjenjivanje pouzdanosti i točnosti drugih sličnih metoda (kolokvijalno nazvanih ‚i ja također’ testovi) koje se temelje na sličnim znanstvenim načelima i mjere ili predviđaju isti biološki ili toksični učinak (14).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Prije donošenja izmijenjenih metoda (tj. predloženih mogućih poboljšanja odobrene ispitne metode) potrebno je ocijeniti učinak predloženih izmjena na rezultat ispitivanja i mjeru u kojoj će te izmjene utjecati na dostupne podatke o ostalim sastavnicama validacijskog postupka. Ovisno o broju i vrsti predloženih izmjena, dobivenim podacima i pripadajućoj dokumentaciji o tim izmjenama, one trebaju proći isti validacijski postupak kako je opisan za novo ispitivanje ili, ako je prikladno, trebaju biti predmet ograničenog ocjenjivanja pouzdanosti i važnosti na temelju utvrđenih zahtjeva izvedbe (14).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Za slične ili izmijenjene metode, koje su predložene za uporabu u okviru ove ispitne metode, treba se odrediti njihova pouzdanost i točnost koristeći kemikalije koje predstavljaju puni raspon bodova LLNA. Kako bi se izbjegla neopravdana uporaba životinja, čvrsto se preporučuje da prije započinjanja validacijskih studija u skladu sa zahtjevima izvedbe i smjernicama iz ove ispitne metode kreatori modela konzultiraju odgovarajuća tijela.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Ti se zahtjevi izvedbe temelje na usklađenim zahtjevima izvedbe US-ICCVAM, EC-ECVAM i japanskim JaCVAM (12) za ocjenjivanje valjanosti sličnih ili izmijenjenih verzija LLNA. Zahtjevi izvedbe sadrže ključne elemente ispitne metode, preporučene referentne kemikalije i standarde za točnost i pouzdanost koje predložena metoda mora ispuniti ili premašiti.
                           
                        I.   Ključni elementi ispitne metode
                  
                  
                              5.
                           
                           
                              Kako bi se osiguralo da je slična ili izmijenjena metoda LLNA funkcionalno i mehanicistički analogna LLNA i da mjeri isti biološki učinak, u protokol ispitne metode moraju se uključiti sljedeći elementi:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          ispitivana tvar se primjenjuje lokalno na oba uha miša,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          proliferacija limfocita se mjeri u limfnim čvorovima koji dreniraju područje primjene ispitivane tvari,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          proliferacija limfocita se mjeri tijekom indukcijske faze senzibilizacije kože,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          najviša odabrana doza za ispitivane tvari je najveća koncentracija koja ne uzrokuje sustavnu toksičnost i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože kod miša. Za pozitivne referentne kemikalije najviša doza treba biti visoka barem kao vrijednosti LLNA EC3 za odgovarajuće referentne kemikalije (vidjeti tablicu 1.) i ne smije uzrokovati sustavnu toksičnost i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože kod miša,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          u svaku studiju treba uključiti paralelnu kontrolu s nosačem i prema potrebi se također koristi paralelna pozitivna kontrola,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          koriste se najmanje četiri životinje po dozirnoj skupini,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          mogu se prikupljati pojedinačni ili skupni podaci o životinjama.
                                       
                                    Ako neki od ovih kriterija nije ispunjen, tada se ovi zahtjevi izvedbe ne mogu koristiti za validaciju slične ili izmijenjene metode.
                           
                        II.   Minimalni popis referentnih kemikalija
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Usklađeni zahtjevi izvedbe US-ICCVAM, EC-ECVAM i japanski –JaCVAM (12) odredili su 18 minimalnih referentnih kemikalija koje se mogu koristiti i četiri neobavezne referentne kemikalije (tj. tvari koje su proizvele lažne pozitivne ili lažne negativne rezultate u LLNA u usporedbi s rezultatima na ljudima i zamorcima (B.6, ili Smjernica OECD-a 406) (13), te stoga omogućuju dokazivanje jednake ili bolje izvedbe u odnosu na LLNA) koje su uključene u zahtjeve izvedbe LLNA. Kriteriji odabira za određivanje tih kemikalija su bili sljedeći:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          popis referentnih kemikalija sadržava one vrste tvari koje se obično testiraju radi njihova potencijala za senzibilizaciju kože i opseg reakcija koje je LLNA u mogućnosti izmjeriti ili predvidjeti,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          tvari imaju jasno definiranu kemijsku strukturu,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          za svaku tvar su dostupni podaci o LLNA iz pokusa na zamorcima (tj. B.6; Smjernica OECD-a 406) (13) i, ako je moguće, podaci iz pokusa na ljudima, i
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          tvari su lako dostupne na tržištu.
                                       
                                    Preporučene referentne kemikalije su navedene u tablici 1. Studije koje koriste predložene referentne kemikalije ocjenjuju se u nosaču uz koji su navedene u tablici 1. U slučajevima kada navedena tvar nije dostupna, mogu se koristiti druge tvari koje ispunjavaju spomenute kriterije odabira uz odgovarajuće obrazloženje.
                              
                                 Tablica 1.
                              
                              
                                 Preporučene referentne kemikalije za zahtjeve izvedbe LLNA
                              
                              
                                          Broj
                                       
                                       
                                          Kemikalije (3)
                                          
                                       
                                       
                                          broj CAS
                                       
                                       
                                          Stanje
                                       
                                       
                                          Nosač (4)
                                          
                                       
                                       
                                          CE3 % (5)
                                          
                                       
                                       
                                          N (6)
                                          
                                       
                                       
                                          0,5x – 2,0x CE3
                                       
                                       
                                          Stvarni raspon EC3
                                       
                                       
                                          LLNA u usporedbi sa zamorcima
                                       
                                       
                                          LLNA u usporedbi s ljudima
                                       
                                    
                                          1
                                       
                                       
                                          5-kloro-2-metil-4-izotiazolin-3-on (CMI)/2-metil-4-izotiazolin-3-on (MI) (7)
                                          
                                       
                                       
                                          26172-55-4/2682-20-4
                                       
                                       
                                          tekuće
                                       
                                       
                                          DMF
                                       
                                       
                                          0,009
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          0,0045-0,018
                                       
                                       
                                          NC
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          2
                                       
                                       
                                          DNCB
                                       
                                       
                                          97-00-7
                                       
                                       
                                          kruto
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          0,049
                                       
                                       
                                          15
                                       
                                       
                                          0,025-0,099
                                       
                                       
                                          0,02-0,094
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          3
                                       
                                       
                                          4- fenilenediamin
                                       
                                       
                                          106-50-3
                                       
                                       
                                          kruto
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          0,11
                                       
                                       
                                          6
                                       
                                       
                                          0,055-0,22
                                       
                                       
                                          0,07-0,16
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          4
                                       
                                       
                                          kobaltov klorid
                                       
                                       
                                          7646-79-9
                                       
                                       
                                          kruto
                                       
                                       
                                          DMSO
                                       
                                       
                                          0,6
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                       
                                          0,3-1,2
                                       
                                       
                                          0,4-0,8
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          5
                                       
                                       
                                          izoeugenol
                                       
                                       
                                          97-54-1
                                       
                                       
                                          tekuće
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          1,5
                                       
                                       
                                          47
                                       
                                       
                                          0,77-3,1
                                       
                                       
                                          0,5-3,3
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          6
                                       
                                       
                                          2- merkaptobenzotiazol
                                       
                                       
                                          149-30-4
                                       
                                       
                                          kruto
                                       
                                       
                                          DMF
                                       
                                       
                                          1,7
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          0,85-3,4
                                       
                                       
                                          NC
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          7
                                       
                                       
                                          citral
                                       
                                       
                                          5392-40-5
                                       
                                       
                                          tekuće
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          9,2
                                       
                                       
                                          6
                                       
                                       
                                          4,6-18,3
                                       
                                       
                                          5,1-13
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          8
                                       
                                       
                                          HCA
                                       
                                       
                                          101-86-0
                                       
                                       
                                          tekuće
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          9,7
                                       
                                       
                                          21
                                       
                                       
                                          4,8-19,5
                                       
                                       
                                          4,4-14,7
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          9
                                       
                                       
                                          eugenol
                                       
                                       
                                          97-53-0
                                       
                                       
                                          tekuće
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          10,1
                                       
                                       
                                          11
                                       
                                       
                                          5,05-20,2
                                       
                                       
                                          4,9-15
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          10
                                       
                                       
                                          fenil benzoat
                                       
                                       
                                          93-99-2
                                       
                                       
                                          kruto
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          13,6
                                       
                                       
                                          3
                                       
                                       
                                          6,8-27,2
                                       
                                       
                                          1,2-20
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          11
                                       
                                       
                                          cimetov alkohol
                                       
                                       
                                          104-54-1
                                       
                                       
                                          kruto
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          21
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          10,5-42
                                       
                                       
                                          NC
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          12
                                       
                                       
                                          Imidazolidinil uree
                                       
                                       
                                          39236-46-9
                                       
                                       
                                          kruto
                                       
                                       
                                          DMF
                                       
                                       
                                          24
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          12-48
                                       
                                       
                                          NC
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          13
                                       
                                       
                                          metil metakrilat
                                       
                                       
                                          80-62-6
                                       
                                       
                                          tekuće
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          90
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          45-100
                                       
                                       
                                          NC
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          14
                                       
                                       
                                          klorobenzen
                                       
                                       
                                          108-90-7
                                       
                                       
                                          tekuće
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          25
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          NA
                                       
                                       
                                          NA
                                       
                                       
                                          –/–
                                       
                                       
                                          –/ (1)
                                          
                                       
                                    
                                          15
                                       
                                       
                                          izopropanol
                                       
                                       
                                          67-63-0
                                       
                                       
                                          tekuće
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          50
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          NA
                                       
                                       
                                          NA
                                       
                                       
                                          –/–
                                       
                                       
                                          –/+
                                       
                                    
                                          16
                                       
                                       
                                          mliječna kiselina
                                       
                                       
                                          50-21-5
                                       
                                       
                                          tekuće
                                       
                                       
                                          DMSO
                                       
                                       
                                          25
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          NA
                                       
                                       
                                          NA
                                       
                                       
                                          –/–
                                       
                                       
                                          –/ (1)
                                          
                                       
                                    
                                          17
                                       
                                       
                                          metil salicilat
                                       
                                       
                                          119-36-8
                                       
                                       
                                          tekuće
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          20
                                       
                                       
                                          9
                                       
                                       
                                          NA
                                       
                                       
                                          NA
                                       
                                       
                                          –/–
                                       
                                       
                                          –/–
                                       
                                    
                                          18
                                       
                                       
                                          salicilna kiselina
                                       
                                       
                                          69-72-7
                                       
                                       
                                          kruto
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          25
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          NA
                                       
                                       
                                          NA
                                       
                                       
                                          –/–
                                       
                                       
                                          –/–
                                       
                                    
                                          Neobavezne tvari za dokazivanje poboljšane izvedbe u odnosu na LLNA
                                       
                                    
                                          19
                                       
                                       
                                          natrijev laurilsulfat
                                       
                                       
                                          151-21-3
                                       
                                       
                                          kruto
                                       
                                       
                                          DMF
                                       
                                       
                                          8,1
                                       
                                       
                                          5
                                       
                                       
                                          4,05-16,2
                                       
                                       
                                          1,5-17,1
                                       
                                       
                                          +/–
                                       
                                       
                                          +/–
                                       
                                    
                                          20
                                       
                                       
                                          etilen glikol dimetakrilat
                                       
                                       
                                          97-90-5
                                       
                                       
                                          tekuće
                                       
                                       
                                          MEK
                                       
                                       
                                          28
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          14-56
                                       
                                       
                                          NC
                                       
                                       
                                          +/–
                                       
                                       
                                          +/+
                                       
                                    
                                          21
                                       
                                       
                                          ksilen
                                       
                                       
                                          1330-20-7
                                       
                                       
                                          tekuće
                                       
                                       
                                          AOO
                                       
                                       
                                          95,8
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          47,9-100
                                       
                                       
                                          NC
                                       
                                       
                                          +/ (2)
                                          
                                       
                                       
                                          +/–
                                       
                                    
                                          22
                                       
                                       
                                          niklov klorid
                                       
                                       
                                          7718-54-9
                                       
                                       
                                          kruto
                                       
                                       
                                          DMSO
                                       
                                       
                                          5
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                       
                                          NA
                                       
                                       
                                          NA
                                       
                                       
                                          –/+
                                       
                                       
                                          –/+
                                       
                                    
                                          Skraćenice: AOO = aceton: maslinovo ulje (4:1, v/v); CAS br. = Broj iz međunarodnog popisa kemijskih tvari; DMF = N,N-dimetilformamid; DMSO = dimetil sulfoksid; DNCB = 2,4-dinitroklorobenzen; EC3 = potrebna procijenjena koncentracija za proizvodnju indeksa stimulacije 3; GP = rezultati testova na zamorcima (tj. B.6 ili Smjernica OECD-a 406) (13); HCA = heksil cimetov aldehid; Liq = tekuće; LLNA = rezultat lokalne analize limfnih čvorova kod miševa tj. B.42 ili Smjernica OECD-a 429) (1); MEK = metil etil keton; NA = nije primjenjivo budući da je indeks stimulacije < 3; NC = nije izračunano budući da su podaci dobiveni iz jedne studije; Sol = kruto; Veh = nosač.
                                       
                                    
                        III.   Utvrđeni standardi pouzdanosti i točnosti
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Točnost slične ili izmijenjene metode LLNA treba ispuniti ili premašiti zahtjeve izvedbe LLNA kada se ocjenjuje uporabom 18 minimalnih referentnih kemikalija koje su obavezne. Nova ili izmijenjena metoda mora se pravilno razvrstati na temelju odluke ‚da/ne’. Međutim, nova ili izmijenjena metoda možda neće pravilno razvrstati sve minimalne referentne kemikalije koje se trebaju koristiti. Ako je, na primjer, neki blagi senzibilizator pogrešno razvrstan, za dokazivanje jednake učinkovitosti može se uzeti u obzir obrazloženje takve pogreške i prikladni dodatni podaci (rezultati ispitivanja koji pokazuju pravilno razvrstavanje za ostale tvari s fizikalnim, kemijskim i senzibilizacijskim svojstvima sličnim onima pogrešno razvrstane referentne kemikalije). U tim okolnostima validacijski status nove ili izmijenjene ispitne metode LLNA se ocjenjuje pojedinačno za svaki slučaj.
                           
                        
                     Ponovljivost u laboratoriju
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Za utvrđivanje ponovljivosti u laboratoriju nova ili izmijenjena metoda LLNA se ocjenjuje uporabom jasno definirane tvari koja uzrokuje preosjetljivost. Zahtjevi izvedbe LLNA temelje se na promjenljivosti rezultata iz ponovljenih testova s heksil cimetovim aldehidom (HCA). Za ocjenjivanje pouzdanosti u laboratoriju potrebno je u četiri zasebne prilike s razmakom od najmanje tjedan dana između testova dobiti granične vrijednosti ocijenjene koncentracije (ECt) za HCA. Za prihvatljivu ponovljivost u laboratoriju svaki laboratorij mora dobiti vrijednosti ECt od 5 % do 20 % za HCA i od 0,025 % do 0,1 % za DNCB, što predstavlja raspon od 0,5 do 2,0-puta prosječne koncentracije EC3, određene za HCA (10 %) u LLNA (vidjeti tablicu 1.).
                           
                        
                     Ponovljivost između laboratorija
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Međulaboratorijska ponovljivost nove ili izmijenjene metode LLNA ocjenjuje se uporabom dviju jasno definiranih tvari koje uzrokuju preosjetljivost. Zahtjevi izvedbe LLNA temelje se na promjenljivosti rezultata iz testova s HCA i 2,4-dinitroklorobenzenom (DNCB) u različitim laboratorijima. ECt vrijednosti se dobivaju neovisno i u samo jednoj studiji koja se provodi u najmanje tri zasebna laboratorija. Za dokazivanje prihvatljive ponovljivosti između laboratorija svaki laboratorij mora dobiti vrijednosti ECt od 5 % do 20 % za HCA i od 0,025 % do 0,1 % za DNCB, što predstavlja raspon od 0,5 do 2,0-puta prosječne koncentracije EC3, određene za HCA (10 %) i DNCB (0,05 %), u LLNA (vidjeti tablicu 1.).
                           
                        
               
                  Dodatak 2.
                  
                     Definicije
                  
                  Točnost: stupanj podudarnosti između rezultata ispitne metode i prihvaćenih referentnih vrijednosti. To je mjerilo učinkovitosti ispitne metode i jedan od aspekata relevantnosti. Ovaj se termin često koristi umjesto ‚podudarnosti’ kako bi se označio udio točnih rezultata ispitne metode (14).
                  Referentna tvar: tvar koja uzrokuje ili ne uzrokuje preosjetljivost i koja se koristi kao standard za usporedbu s ispitivanom tvari. Referentna tvar treba imati sljedeća svojstva: i. dosljedni i pouzdani izvor(i); ii. strukturna i funkcionalna sličnost s razredom tvari koje se ispituju; iii. poznate fizikalno-kemijske značajke; iv. popratni podaci o poznatim učincima; i v. poznata učinkovitost u okviru željene reakcije.
                  Ocijenjeni prag koncentracije (ECt): ocijenjena koncentracija ispitivane tvari potrebna da se proizvede indeks stimulacije koji ukazuje na pozitivnu reakciju.
                  Ocijenjena koncentracija tri (EC3): ocijenjena koncentracija ispitivane tvari potrebna da se proizvede indeks stimulacije tri.
                  Lažno negativna tvar: ispitivana tvar koja je ispitnom metodom netočno određena kao negativna ili neaktivna kada je u stvari pozitivna ili aktivna.
                  Lažno pozitivna tvar: ispitivana tvar koja je ispitivanjem netočno određena kao pozitivna ili aktivna kada je u stvari negativna ili neaktivna.
                  Opasnost: potencijal štetnog učinka na zdravlje ili okoliš. Štetni učinak se javlja samo ako je stupanj izloženosti dovoljno visok.
                  Ponovljivost između laboratorija: mjera u kojoj različiti kvalificirani laboratoriji koji koriste isti protokol i ispituju istu tvar, mogu proizvesti kvalitativno i kvantitativno slične rezultate. Ponovljivost između laboratorija se određuje prije i tijekom validacijskog postupka i pokazuje u kojoj se mjeri neko ispitivanje može uspješno prenijeti iz jednog laboratorija u drugi, također navedena kao međulaboratorijska ponovljivost (14).
                  Ponovljivost u laboratoriju: određivanje u kojoj mjeri stručno osoblje u okviru istog laboratorija može uspješno ponoviti rezultate koristeći određeni protokol u različitim trenucima. Također se navodi kao unutarlaboratorijska ponovljivost (14).
                  I ja također test: kolokvijalni izraz za ispitnu metodu koja je strukturno i funkcionalno slična validiranoj i prihvaćenoj referentnoj ispitnoj metodi. Takva ispitna metoda je kandidat za catch-up validaciju. Izraz se često koristi umjesto slične ispitne metode (14).
                  Netipična vrijednost: netipična vrijednost je zapažanje koje značajno odstupa od ostalih vrijednosti u nasumičnom uzorku populacije.
                  Zahtjevi izvedbe: zahtjevi koji se temelje na validiranoj ispitnoj metodi i pružaju temelj za ocjenjivanje usporedivosti predložene, funkcionalno i mehanicistički slične, ispitne metode. Oni uključuju: i. ključne elemente ispitne metode; ii. minimalni popis referentnih kemikalija odabranih između kemikalija koje se koriste za dokazivanje prihvatljive učinkovitosti validirane ispitne metode, i iii. slične razine točnosti i pouzdanosti, utemeljene na rezultatima dobivenim za validiranu ispitnu metodu, koje se prilikom ocjenjivanja trebaju dokazati predloženom ispitnom metodom koristeći minimalni popis referentnih kemikalija (14).
                  Zaštićena ispitna metoda: ispitna metoda čija je proizvodnja ili distribucija ograničena patentima, autorskim pravima, žigom itd.
                  Osiguranje kvalitete: postupak upravljanja pri kojem pojedinci, neovisni od osoba koje provode ispitivanje, ocjenjuju ispunjavanje standarda laboratorijskog ispitivanja, zahtjeve i postupke vođenja evidencije te točnost prijenosa podataka.
                  Referentne kemikalije: kemikalije odabrane za uporabu u validacijskom postupku, za koje su reakcije u referentnom sustavu ispitivanja in vitro i in vivo ili željenim vrstama već poznate. Te kemikalije trebaju biti reprezentativne za razrede kemikalija za koje se očekuje da će ispitna metoda biti uporabljena i trebaju predstavljati puni raspon reakcija koje se mogu očekivati od kemikalija za koje se može koristiti, u rasponu od jake do slabe i negativne reakcije. Za različite faze validacijskog postupka te različite ispitne metode i uporabe mogu biti potrebne različite skupine referentnih kemikalija (14).
                  Relevantnost: opis odnosa ispitivanja i željenog učinka te njegova značajnost i korisnost za posebnu namjenu. Radi se o mjeri u kojoj ispitivanje točno mjeri ili predviđa željeni biološki učinak. Relevantnost uključuje i razmatranje o točnosti (sukladnosti) ispitne metode (14).
                  Pouzdanost: mjera u kojoj se ispitna metoda može ponoviti unutar i između laboratorija tijekom vremena uporabom istog protokola. Ocjenjuje se izračunavanjem unutarlaboratorijske i međulaboratorijske ponovljivosti (14).
                  Preosjetljivost kože: imunološki proces koji se javlja kada je osjetljivi pojedinac lokalno izložen kemijskom alergenu koji uzrokuje imunosnu reakciju kože koja može dovesti do kontaktne preosjetljivosti.
                  Indeks stimulacije (SI): izračunana vrijednost za ocjenjivanje potencijala preosjetljivosti kože koju može uzrokovati ispitivana tvar, koja je omjer proliferacije u tretiranim skupinama i paralelnoj kontrolnoj skupini s nosačem.
                  Ispitivana tvar (navodi se također i kao ispitivana kemikalija): svaka tvar ili smjesa koja je ispitana ovom metodom.
                  Validirana ispitna metoda: ispitna metoda za koju su dovršene validacijske studije radi određivanja relevantnosti (uključujući točnost) i pouzdanosti za posebnu namjenu. Važno je primijetiti da validirana ispitna metoda možda neće biti dovoljno učinkovita u smislu prihvatljive točnosti i pouzdanosti za predloženu namjenu (14).
               
               ”
            
         
               2.
            
            
               Poglavlje B.46. zamjenjuje se sljedećim:
               „B.46.   TEST NADRAŽIVANJA KOŽE IN VITRO NA MODELU REKONSTRUIRANE LJUDSKE EPIDERME
               
               UVOD
               
                           1.
                        
                        
                           Nadraživanje kože je izazivanje reverzibilnog oštećenja kože nakon primjene ispitivane kemikalije u trajanju do najviše 4 sata (prema definiciji u Globalno usklađenom sustavu razvrstavanja i označivanja kemikalija (GHS) Ujedinjenih naroda (UN) i Uredbi (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vijeća od 16. prosinca 2008. o razvrstavanju, označivanju i pakiranju tvari i smjesa (1) (3)). Ova ispitna metoda predviđa in vitro postupak koji se može koristiti za određivanje opasnosti nadražujućih kemikalija (tvari i smjesa) u skladu s kategorijom 2. UN GHS i EU CLP (1) (2) (3). U EU-u i drugim regijama koje nisu donijele neobaveznu kategoriju 3. UN GHS (blago nadražujuće tvari), ova se ispitna metoda može također koristiti za određivanje nerazvrstanih kemikalija, tj. ‚Bez kategorije’ prema UN GHS i U CLP (1) (3). Ova se ispitna metoda može koristiti za određivanje nadražujućeg djelovanja kemikalija na kožu kao samostalni zamjenski test za ispitivanje nadraživanja kože in vivo u okviru strategije stupnjevitog ispitivanja (4. i poglavlje B.4. iz ovog Priloga).
                        
                     
                           2.
                        
                        
                           Ocjenjivanje nadraživanja kože do sada je uglavnom zahtijevalo korištenje laboratorijskih životinja (Smjernica OECD-a 404; poglavlje B.4. iz ovog Priloga) (4). Vodeći računa o dobrobiti životinja, metoda B.4 je revidirana 2004. tako da se dopustilo da se za određivanje nagrizanja/nadraživanja kože primijeni strategija stupnjevitog ispitivanja i koriste validirane in vitro ili ex vivo metode, kako bi se izbjegla bol i patnja životinja. Za ocjenjivanje nagrizajućeg djelovanja u okviru strategije stupnjevitog ispitivanja iz metode B.4 ili Smjernice OECD-a 404 (4) donijete su tri validirane in vitro ispitne metode kao Smjernice OECD-a 430, 431 i 435 (5) (6) (7) i dvije od njih kao poglavlja B.40 i B.40a ovog Priloga.
                        
                     
                           3.
                        
                        
                           Ova se ispitna metoda bavi konačnim učinkom nadraživanja kože na zdravlje ljudi. Ona se temelji na rekonstruiranoj ljudskoj epidermi (RhE) koja u cjelokupnoj svojoj izvedbi (korištenje netransformiranih keratinocita iz ljudske epiderme kao izvora stanica i korištenje reprezentativnog tkiva i citoarhitekture) vjerno oponašaju biokemijska i fiziološka svojstva gornjih dijelova ljudske kože tj. epiderme. Ova ispitna metoda, također, obuhvaća i niz zahtjeva izvedbe (Dodatak 2.) za ocjenjivanje sličnih i izmijenjenih ispitnih metoda na temelju rekonstruirane ljudske epiderme, koje razvije EC-ECVAM (8), u skladu s načelima iz Smjernice OECD-a br. 34 (9).
                        
                     
                           4.
                        
                        
                           Postoje tri validirane metode koje su sukladne ovoj ispitnoj metodi. Predvalidacijske, optimizacijske i validacijske studije su dovršene za in vitro metodu (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) u kojoj se koristi model rekonstruirane ljudske epiderme i koja je dostupna na tržištu kao EpiSkinTM (validirana referentna metoda - VRM). Još su dvije in vitro metode za ispitivanje nadraživanja kože na temelju rekonstruirane ljudske epiderme, dostupne na tržištu i validirane u skladu sa zahtjevima izvedbe (21), pokazale slične rezultate kao validirana referentna metoda i one su EpiDermTM SIT (EPI-200) i SkinEthicTM RHE metode (22).
                        
                     
                           5.
                        
                        
                           Da bi se predložena, slična ili izmijenjena, in vitro metoda na temelju rekonstruirane ljudske epiderme, osim validirane referentne metode i metoda EpiDermTM SIT (EPI-200) ili SkinEthicTM RHE, mogla koristiti u regulatorne svrhe, potrebno je odrediti njezinu pouzdanost, relevantnost (točnost) i ograničenja s obzirom na predloženu uporabu kako bi se osiguralo da se može smatrati sličnom validiranoj referentnoj metodi, u skladu sa zahtjevima izvedbe utvrđenim u ovoj ispitnoj metodi (Dodatak 2.). Pored toga, preporučuje se da se prije razvoja i validacije slične ili izmijenjene in vitro metode rekonstruirane ljudske epiderme te prije njezina podnošenja na zakonsko usvajanje konzultira referentni dokument OECD-a za pojašnjenje ispitivanja nadraživanja kože in vitro (23).
                        
                     DEFINICIJE
               
                           6.
                        
                        
                           Korištene definicije navedene su u Dodatku 1.
                        
                     POČETNA RAZMATRANJA I OGRANIČENJA
               
                           7.
                        
                        
                           Ograničenje ispitne metode, kako je dokazala validacijska studija (16), je da ne omogućuje razvrstavanje kemikalija u neobaveznu kategoriju 3. UN GHS (blago nadražujuće tvari). Kada se koristi kao djelomični zamjenski test, može se zatražiti provođenje daljnjeg in vivo ispitivanja kako bi se u potpunosti utvrdio potencijal nadraživanja kože (4. i poglavlje B.4 ovog Priloga). Priznaje se da je uporaba ljudske kože podložna nacionalnim i međunarodnim etičkim načelima i uvjetima.
                        
                     
                           8.
                        
                        
                           Ova se ispitna metoda odnosi na in vitro komponentu nadraživanja kože u okviru strategije stupanjskog ispitivanja B.4. (Smjernica OECD-a 404) nagrizanja/nadraživanja kože (4). Iako ova ispitna metoda ne pruža odgovarajuće informacije o nagrizanju kože, treba primijetiti da se B.40a (Smjernica OECD-a 431) o nagrizanju kože temelji na istom sustavu ispitivanja RhE, ali koristi drugi protokol (poglavlje B.40a). Ova se metoda temelji na modelima rekonstruirane ljudske epiderme koristeći ljudske keratinocite koji stoga predstavljaju in vitro ciljni organ vrste koja se proučava. Pored toga neposredno uključuje početnu fazu upalne kaskade/mehanizma djelovanja (oštećenje stanica i tkiva koje dovodi do lokalizirane ozljede) koja se javlja tijekom nadraživanja in vivo. U postupku validacije na kojem se temelji ova ispitna metoda ispitan je široki raspon kemikalija i empirijska baza podataka validacijske studije sadržavala je ukupno 58 kemikalija (16) (18) (23). To se odnosi na krute tvari, tekućine, polukrute tvari i voskove. Tekućine mogu biti vodene ili bezvodne, a krute tvari mogu biti topljive ili netopljive u vodi. Kada god je to moguće, krute se tvari trebaju samljeti u fini prah prije primjene. Ne zahtijeva se nikakva drugačija obrada uzorka prije tretiranja. U validacijskoj studiji još nisu ocijenjeni plinovi i aerosoli (24). Iako se može zamisliti da se plinovi i aerosoli mogu ispitati tehnologijom rekonstruirane ljudske epiderme, trenutačna ispitna metoda ne dopušta njihovo testiranje. Potrebno je također primijetiti da vrlo obojene kemikalije mogu utjecati na mjerenja održivosti stanica te da je za korekcije potrebno upotrijebiti prilagođene kontrole (vidjeti stavke 24.-26.).
                        
                     
                           9.
                        
                        
                           Jedan ciklus testiranja koji se sastoji od tri ponavljanja tkiva trebao bi biti dovoljan za ispitivanu kemikaliju, ako je razvrstavanje nedvosmisleno. Međutim, u slučaju graničnih rezultata, kao što su neskladna ponavljana mjerenja i/ili prosječni postotak održivosti jednak 50 ± 5 %, potrebno je razmotriti mogućnost provođenja drugog ciklusa, a potom i trećeg ako rezultati prvih dvaju ciklusa nisu usklađeni.
                        
                     NAČELO ISPITIVANJA
               
                           10.
                        
                        
                           Ispitivana se kemikalija nanosi lokalno na trodimenzionalni model rekonstruirane ljudske epiderme, koji čine netransformirani ljudski epidermalni keratinociti uzgojeni u svrhu dobivanja visoko izdiferenciranog modela ljudske epiderme. Sastoji se od organiziranih bazalnih, trnastih i zrnatih slojeva te višeslojnog rožnatog sloja (stratum corneum) koji između stanica sadrži lamelarne masne slojeve, koji predstavljaju glavne razrede lipida, analogno onima koji se nalaze in vivo.
                        
                     
                           11.
                        
                        
                           Kemijski izazvano nadraživanje kože koje se očituje u pojavi eritema i edema je rezultat kaskade događaja koja započinje prodiranjem u rožnati sloj i oštećenjem nižih slojeva keratinocita. Umirući keratinociti otpuštaju posrednike koji započinju upalnu kaskadu koja djeluje na stanice dermisa, a posebno stromalne i endotelne stanice. Zamijećeni eritemi i edemi (24) posljedica su dilatacije i povećane propusnosti endotelnih stanica. Metode na temelju rekonstruirane ljudske epiderme mjere početne događaje u kaskadi.
                        
                     
                           12.
                        
                        
                           Vijabilnost stanica u modelima rekonstruirane ljudske epiderme mjeri se enzimskom pretvorbom vitalne boje MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, tiazolil plava); CAS broj 298-93-1 u plavu sol formazana, koja se kvantitativno mjeri nakon ekstrakcije iz tkiva (25). Nadražujuće kemikalije prepoznaju se po tome što spuštaju vijabilnost stanica ispod definiranih pragova (tj. ≤ 50 % za 2. kategoriju UN GHS/EU CLP). Ovisno o regulatornom okviru u kojem se koriste rezultati ove ispitne metode, kemikalije kod kojih je vijabilnost stanica iznad definiranog praga se mogu smatrati tvarima koje ne nadražuju (tj. > 50 %, izvan kategorije).
                        
                     DOKAZIVANJE OSPOSOBLJENOSTI
               
                           13.
                        
                        
                           Prije rutinske primjene bilo koje od tri validirane metode koje ispunjavaju zahtjeve ove ispitne metode, laboratoriji moraju dokazati tehničku osposobljenost na deset referentnih kemikalija koje su navedene u tablici 1. Za slične metode, razvijene u okviru ove ispitne metode, ili izmjene neke od triju validiranih metoda, prije početka uporabe metode za regulatorno ispitivanje potrebno je ispuniti zahtjeve izvedbe opisane u Dodatku 2. ove ispitne metode.
                        
                     
                           14.
                        
                        
                           U okviru dokazivanja osposobljenosti preporučuje se da korisnik po primitku provjeri svojstva pregrade tkiva u skladu sa specifikacijama proizvođača modela rekonstruirane ljudske epiderme. To je posebno važno ako se tkiva pošiljaju na velike udaljenosti/duga vremenska razdoblja. Nakon što metoda bude uspješno uspostavljena i osposobljenost u pogledu njene uporabe dokazana, takav rutinski pregled neće biti potreban. Međutim, kod rutinske uporabe metode preporučuje se daljnje ocjenjivanje svojstava pregrade u pravilnim vremenskim razmacima.
                           
                              Tablica 1.
                           
                           
                              Referentne kemikalije
                               (8)
                           
                           
                                       Kemikalija
                                    
                                    
                                       CAS broj
                                    
                                    
                                       Rezultat in vivo
                                           (9)
                                       
                                    
                                    
                                       Agregatno stanje
                                    
                                    
                                       Kategorija UN GHS/EU CLP
                                    
                                 
                                       naftalenoctena kiselina
                                    
                                    
                                       86-87-3
                                    
                                    
                                       0
                                    
                                    
                                       K
                                    
                                    
                                       bez kat.
                                    
                                 
                                       Izopropanol
                                    
                                    
                                       67-63-0
                                    
                                    
                                       0,3
                                    
                                    
                                       T
                                    
                                    
                                       bez kat.
                                    
                                 
                                       metil-stearat
                                    
                                    
                                       112-61-8
                                    
                                    
                                       1
                                    
                                    
                                       K
                                    
                                    
                                       bez kat.
                                    
                                 
                                       heptil-butirat
                                    
                                    
                                       5870-93-9
                                    
                                    
                                       1,7
                                    
                                    
                                       T
                                    
                                    
                                       bez kat.
                                       
                                          fakultativna 3. kat
                                           (10)
                                           (11)
                                       
                                    
                                 
                                       heksil-salicilat
                                    
                                    
                                       6259-76-3
                                    
                                    
                                       2
                                    
                                    
                                       T
                                    
                                    
                                       bez kat.
                                       
                                          fakultativna 3. kat
                                           (10)
                                           (11)
                                       
                                    
                                 
                                       ciklamen-aldehid
                                    
                                    
                                       103-95-7
                                    
                                    
                                       2,3
                                    
                                    
                                       T
                                    
                                    
                                       2.kat.
                                    
                                 
                                       1-bromheksan
                                    
                                    
                                       111-25-1
                                    
                                    
                                       2,7
                                    
                                    
                                       T
                                    
                                    
                                       2.kat.
                                    
                                 
                                       Kalijev hidroksid (5 % aq.)
                                    
                                    
                                       1310-58-3
                                    
                                    
                                       3
                                    
                                    
                                       T
                                    
                                    
                                       2.kat.
                                    
                                 
                                       1-metil-3-fenil-1-piperazin
                                    
                                    
                                       5271-27-2
                                    
                                    
                                       3,3
                                    
                                    
                                       K
                                    
                                    
                                       2.kat.
                                    
                                 
                                       Heptanal
                                    
                                    
                                       111-71-7
                                    
                                    
                                       4
                                    
                                    
                                       T
                                    
                                    
                                       2. kat.
                                    
                                 
                     POSTUPAK
               
                           15.
                        
                        
                           U nastavku se nalazi opis elemenata i postupaka u vezi s metodom na temelju rekonstruirane ljudske epiderme za potrebe ocjenjivanja nadraživanja kože. Model rekonstruirane ljudske epiderme treba se rekonstruirati i može se preparirati interno ili nabaviti na tržištu. Dostupni su standardni operativni postupci za EpiSkinTM, EpiDermTM SIT (EPI-200) i SkinEthic RHE (26) (27) (28). Ispitivanje se provodi na sljedeći način:
                        
                     
                  Elementi ispitne metode rekonstruirane ljudske epiderme
               
               
                  Opći uvjeti
               
               
                           16.
                        
                        
                           Za obnovu epitela koriste se netransformirani ljudski keratinociti. Ispod funkcionalnog rožnatog sloja (stratum corneum) nalaze se višestruki slojevi vitalnih epitelnih stanica (bazalni sloj, trnasti sloj, zrnati sloj). I sam rožnati sloj je višeslojan te sadrži esencijalni profil lipida kao čvrstu funkcionalnu barijeru koja je sposobna zaustaviti brzi prodor citotoksičnih markerskih tvari, npr. natrijev dodecil-sulfat (SDS) ili Triton X-100. Funkcija barijere treba se dokazati i može se ocijeniti određivanjem koncentracije markerske kemikalije koja smanjuje vijabilnost tkiva za 50 % (IC50) nakon fiksnog vremena izlaganja ili određivanjem vremena izlaganja koje je potrebno da se vijabilnost tkiva smanji za 50 % (ET50) nakon primjene markerske kemikalije u unaprijed određenoj fiksnoj koncentraciji. Model rekonstruirane ljudske epiderme mora biti dovoljno nepropustan da spriječi prolazak materijala oko rožnatog sloja do vitalnog tkiva jer bi to značilo loše modeliranje izlaganja kože. Model rekonstruirane ljudske epiderme ne smije biti onečišćen bakterijama, virusima, mikroplazmama i gljivicama.
                        
                     
                  Funkcionalni uvjeti
               
               Vijabilnost
               
                           17.
                        
                        
                           Test za određivanje stupnja vijabilnosti je MTT test (25). Korisnici modela rekonstruirane ljudske epiderme trebaju osigurati da svaka šarža uporabljenog modela ispunjava utvrđene kriterije za negativnu kontrolu (NC). Optička gustoća (OD) samog ekstrakcijskog otapala treba biti dovoljno mala tj. OD< 0,1. Raspon prihvatljivosti (gornja i donja granica) negativnih kontrolnih vrijednosti optičke gustoće (u uvjetima ispitne metode nadraživanja kože) određuje kreator/dobavljač modela RhE, a rasponi prihvatljivosti za tri validirane metode su navedeni u Tablici 2. Potrebno je dokumentirati da je tkivo, obrađeno negativnom kontrolom, stabilno u kulturi (tj. daje slična mjerenja vijabilnosti) za vrijeme trajanja ispitnog izlaganja.
                           
                              Tablica 2.
                           
                           
                              Rasponi prihvatljivosti za negativne kontrolne vrijednosti optičke gustoće
                           
                           
                                        
                                    
                                    
                                       Donja granica prihvatljivosti
                                    
                                    
                                       Gornja granica prihvatljivosti
                                    
                                 
                                       EpiSkinTM(SM)
                                    
                                    
                                       ≥ 0,6
                                    
                                    
                                       ≤ 1,5
                                    
                                 
                                       EpiDermTM SIT (EPI-200)
                                    
                                    
                                       ≥ 1,0
                                    
                                    
                                       ≤ 2,5
                                    
                                 
                                       SkinEthicTM RHE
                                    
                                    
                                       ≥ 1,2
                                    
                                    
                                       ≤ 2,5
                                    
                                 
                     Funkcija barijere
               
                           18.
                        
                        
                           Rožnati sloj i njegov sastav lipida mora biti sposoban zaustaviti brzi prodor citotoksičnih markerskih kemikalija, npr. SDS ili Triton X-100, procijenjeno na temelju IC50 ili ET50 (tablica 3.).
                        
                     Morfologija
               
                           19.
                        
                        
                           U izvedbi histološkog pregleda modela rekonstruirane ljudske epiderme mora se dokazati da je struktura slična strukturi ljudske epiderme (uključujući višeslojni rožnati sloj).
                        
                     Obnovljivost
               
                           20.
                        
                        
                           Rezultati pozitivne i negativne kontrole ispitne metode moraju dokazati obnovljivost tijekom vremena.
                        
                     Kontrole kakvoće (KK)
               
                           21.
                        
                        
                           Kreator/dobavljač modela rekonstruirane ljudske epiderme treba osigurati i dokazati da svaka šarža uporabljenog modela epiderme ispunjava definirane kriterije za odobrenje proizvoda, među kojima su najvažniji vijabilnost (stavak 17.), funkcija barijere (stavak 18.) i morfologija (stavak 19.). Ti se podaci trebaju dostaviti korisnicima metode tako da ih mogu uključiti u izvješća o ispitivanju. Područje prihvatljivosti (gornja i donja granica prihvatljivosti) za IC50 i ET50 određuje kreator/dobavljač modela rekonstruirane ljudske epiderme (ili ispitivač ako koristi vlastiti model). Za pouzdano predviđanje razvrstavanja nadraživanja prihvatljivi su isključivo rezultati dobiveni s tkivima koja ispunjavaju zadane kriterije. U tablici 3. su kao primjer navedena područja prihvatljivosti za tri validirane metode.
                           
                              Tablica 3.
                           
                           
                              Primjeri kriterija za kontrolu kakvoće šarže
                           
                           
                                        
                                    
                                    
                                       Donja granica prihvatljivosti
                                    
                                    
                                       Gornja granica prihvatljivosti
                                    
                                 
                                       EpiSkinTM(SM)
                                       (18-satna obrada SDS-om) (26)
                                    
                                    
                                       IC50 = 1,0 mg/ml
                                    
                                    
                                       IC50 = 3,0 mg/ml
                                    
                                 
                                       EpiDermTM SIT (EPI-200)
                                       (1 % Triton X-100) (27)
                                    
                                    
                                       ET50 = 4,8 sati
                                    
                                    
                                       ET50 = 8,7 sati
                                    
                                 
                                       SkinEthicTM RHE
                                       (1 % Triton X-100) (28)
                                    
                                    
                                       ET50 = 4,0 sati
                                    
                                    
                                       ET50 = 9,0 sati
                                    
                                 
                     
                  Primjena ispitivanih i kontrolnih tvari
               
               
                           22.
                        
                        
                           Za svaku ispitivanu kemikaliju i kontrole u svakom ciklusu treba upotrijebiti najmanje tri ponavljanja. Bilo da se radi o tekućinama ili krutim tvarima, treba nanijeti dovoljnu količinu ispitivane kemikalije tako da površina kože bude ravnomjerno prekrivena, ali pazeći da se izbjegne beskonačna doza, tj. najmanje 25 μl/cm2 ili 25 mg/cm2. U slučaju krutih tvari površinu epiderme treba prije nanošenja navlažiti deioniziranom ili destiliranom vodom kako bi se poboljšao kontakt između ispitivane kemikalije i površine kože. Kad god je to moguće, krute tvari treba ispitivati u obliku sitnog praha. Na kraju razdoblja izlaganja ispitivanu kemikaliju treba pažljivo isprati s površine kože vodenom puferskom otopinom ili 0,9 %-tnom NaCl. Ovisno o tome koja je od triju validiranih metoda rekonstruirane ljudske epiderme primijenjena, razdoblje izlaganja može biti između 15 i 60 minuta, a temperatura inkubacije između 20 i 37 °C. Ta se razdoblja izlaganja i temperature optimiziraju za svaku metodu rekonstruirane ljudske epiderme i predstavljaju različita intrinzična svojstva metoda. Za podrobnije informacije vidjeti standardne operativne postupke (Standard Operating Procedures) za metode (26) (27) (28).
                        
                     
                           23.
                        
                        
                           U svakom ciklusu ispitivanja treba paralelno koristiti negativne kontrole (NK) i pozitivne kontrole (PK) kako bi se dokazalo da se vijabilnost (NK), funkcija barijere i posljedična osjetljivost (PK) tkiva kreću u okvirima propisanog područja prihvatljivosti. Predlaže se da se kao PK koristi 5 %-tna vodena otopina SDS. Predložene NK kemikalije su voda ili otopina soli puferirana fosfatom (PBS).
                        
                     
                  Mjerenja vijabilnosti stanica
               
               
                           24.
                        
                        
                           Najvažniji element ispitnog postupka je da se mjerenja vijabilnosti ne provode neposredno nakon izlaganja ispitivanoj kemikaliji, već nakon dovoljno dugog razdoblja inkubacije po obradi, tijekom koje se oprana tkiva drže u svježem mediju. Ova faza ostavlja dovoljno vremena da se tkivo oporavi od slabih citotoksičnih učinaka, ali i da se pojave jasni znakovi citotoksičnih učinaka. U fazi optimizacije testa (11) (12) (13) (14) (15) pokazalo se da optimalno razdoblje inkubacije nakon obrade iznosi 42 sata.
                        
                     
                           25.
                        
                        
                           Analiza MTT je validirana kvantitativna validirana metoda koja se treba koristiti za mjerenje vijabilnosti stanica prema ovoj ispitnoj metodi. Ta je analiza prikladna za trodimenzionalni model tkiva. Uzorak tkiva se stavi u otopinu MTT odgovarajuće koncentracije (npr. 0,3 – 1 mg/ml) i ostavi u njoj tri sata. Nataloženi plavi formazan se zatim ekstrahira iz tkiva pomoću otapala (npr. izopropanol, kiseli izopropanol) i koncentracija formazana izmjeri određivanjem vrijednosti OD na 570 nm uz pojas propuštanja do najviše ± 30 nm.
                        
                     
                           26.
                        
                        
                           Optička svojstva ispitivane kemikalije odnosno njezino kemijsko djelovanje na MTT mogu ometati analizu i dovesti do pogrešne procjene vijabilnosti (budući da ispitivana kemikalija može spriječiti ili obrnuti proces nastajanja boje, ali ga i izazvati). To se može dogoditi kad se određena ispitivana kemikalija ne ispere u potpunosti s kože ili prodre u epidermu. Ako ispitivana kemikalija izravno djeluje na MTT (smanjenjem MTT), prirodno je obojena ili se oboji tijekom obrade tkiva, treba upotrijebiti dodatne kontrole kako bi se utvrdio i ispravio utjecaj ispitivane kemikalije na mjernu tehniku koja se koristi za mjerenje vijabilnosti. Podroban opis načina na koji se ispravlja izravna redukcija MTT i interferencije bojila može se pronaći u standardnim operativnim postupcima za tri validirane metode (26) (27) (28).
                        
                     
                  Kriteriji prihvatljivosti
               
               
                           27.
                        
                        
                           Za svaku metodu koja koristi valjane šarže modela rekonstruirane ljudske epiderme (vidjeti stavak 21.), OD vrijednost tkiva obrađenih negativnom kontrolom ukazuje na kakvoću tkiva nakon što su dovršeni koraci dopreme i preuzimanja te čitav postupak u skladu s protokolom. OD vrijednosti kontrola ne smiju biti ispod propisanih donjih granica. Isto tako, tkiva obrađena pozitivnom kontrolom tj. 5 %-tnom vodenom otopinom SDS trebaju pokazivati sposobnost da reagiraju na nadražujuću kemikaliju u uvjetima ispitne metode (26) (27) (28). Potrebno je definirati odgovarajuće mjere varijabilnosti između tkiva u ponavljanjima (npr. ako se koriste standardne devijacije, one trebaju biti u okviru jednostranog 95 %-tnog intervala tolerancije, izračunanog na temelju povijesnih podataka; pri validiranoj referentnoj metodi SD < 18 %).
                        
                     
                  Tumačenje rezultata i model predviđanja
               
               
                           28.
                        
                        
                           Na temelju OD vrijednosti dobivenih za pojedinačne ispitane kemikalije može se izračunati postotak vijabilnosti u odnosu na negativnu kontrolu, koja je određena kao 100 %. Potrebno je jasno utvrditi i dokumentirati prijelomnu vrijednost postotka vijabilnosti stanica koja se koristi za razlikovanje nadražujućih kemikalija od nerazvrstanih ispitivanih kemikalija i statistički postupak ili postupke koji su korišteni za vrednovanje rezultata i identifikaciju nadražujućih kemikalija te dokazati njihovu prikladnost. Prijelomne vrijednosti za predviđanje nadraživanja navedene su u nastavku:
                           
                                       —
                                    
                                    
                                       smatra se da je ispitivana kemikalija nadražujuća za kožu u smislu 2. kategorije UN GHS/EU CLP ako je vijabilnost tkiva nakon izlaganja i inkubacije nakon obrade manja ili jednaka (≤) 50 %,
                                    
                                 
                                       —
                                    
                                    
                                       ovisno o regulatornom okviru u kojem se koriste rezultati ispitne metode, može se smatrati da ispitivana kemikalija nije nadražujuća za kožu u smislu oznake ‚bez kategorije’ UN GHS/EU CLP ako je vijabilnost tkiva nakon izlaganja i inkubacije nakon obrade viša od (>) 50 %.
                                    
                                 
                     PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
               
                  Podaci
               
               
                           29.
                        
                        
                           Podaci iz pojedinačnih ponavljanja tkiva u svakom ciklusu (npr. vrijednosti OD i izračunati postoci vijabilnosti stanica za svaku ispitivanu kemikaliju zajedno s razvrstavanjem) trebaju se prikazati u tabličnom obliku, uključujući eventualne podatke iz ponovljenih pokusa. Osim toga, za svaki ciklus treba navesti srednje vrijednosti ± standardnu devijaciju. Za svaku ispitanu kemikaliju treba navesti zapažene interakcije s MTT reagensom i obojenim ispitnim kemikalijama.
                        
                     
                  Izvješće o ispitivanju
               
               
                           30.
                        
                        
                           Izvješće o ispitivanju sadrži sljedeće informacije:
                           
                                        
                                    
                                    
                                       Ispitivane i kontrolne kemikalije:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   kemijski naziv(i), npr. CAS naziv i CAS broj, EZ naziv i broj, ako poznati,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   čistoća i sastav kemikalija (u masenom postotku/cima),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   fizikalno-kemijska svojstva bitna za provedbu istraživanja (npr. fizikalno stanje, stabilnost i hlapljivost, pH, topljivost u vodi, ako poznati),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   obrada ispitivanih/kontrolnih kemikalija prije ispitivanja, prema potrebi (npr. zagrijavanje, usitnjavanje),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   uvjeti skladištenja.
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Obrazloženje modela rekonstruirane ljudske epiderme i protokola koji je primijenjen.
                                    
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Ispitni uvjeti:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   sustav stanica koji je upotrijebljen,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   potpune popratne informacije o konkretnom modelu rekonstruirane ljudske epiderme koji je korišten, uključujući njegove radne značajke; to među ostalim uključuje sljedeće podatke:
                                                   
                                                               i.
                                                            
                                                            
                                                               vijabilnost;
                                                            
                                                         
                                                               ii.
                                                            
                                                            
                                                               funkcija barijere;
                                                            
                                                         
                                                               iii.
                                                            
                                                            
                                                               morfologija;
                                                            
                                                         
                                                               iv.
                                                            
                                                            
                                                               ponovljivost i prediktivnost;
                                                            
                                                         
                                                               v.
                                                            
                                                            
                                                               kontrole kakvoće (KK) modela;
                                                            
                                                         
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   detalji ispitnog postupka,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   ispitne doze, trajanje izlaganja i razdoblje inkubacije nakon obrade,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   opis mogućih izmjena ispitne metode,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   uputa na postojeće podatke o modelu; to među ostalim uključuje:
                                                   
                                                               i.
                                                            
                                                            
                                                               prihvatljivost podataka o kontroli kakvoće s uputom na postojeće podatke o šarži;
                                                            
                                                         
                                                               ii.
                                                            
                                                            
                                                               prihvatljivost vrijednosti pozitivnih i negativnih kontrola s uputom na srednje vrijednosti i raspone za pozitivne i negativne kontrole,
                                                            
                                                         
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   opis primijenjenih kriterija vrednovanja, uključujući obrazloženje odabrane/ih prijelomne/ih vrijednosti modela predviđanja,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   uputa na postojeće kontrolne podatke;
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Rezultati:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   tablični prikaz podataka za pojedinačne ispitne kemikalije za svaki ciklus i svako mjerenje ponavljanja,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   oznake kontrola koje se koriste za tvari koje neposredno smanjuju MTT i/ili ispitivanih kemikalija za bojenje,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   opis drugih zapaženih učinaka.
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Rasprava rezultata.
                                    
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Zaključci.
                                    
                                 
                     REFERENCE
               
                           1.
                        
                        
                           UN (2009.), United Nations Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and Geneva. Dostupno na: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]
                        
                     
                           2.
                        
                        
                           EC-ECVAM (2009.), Statement on the ‚Performance under UN GHS of three in vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards’, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                        
                     
                           3.
                        
                        
                           Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006. OJ L 353, 31.12.2008., str. 1.
                        
                     
                           4.
                        
                        
                           OECD (2004.), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 404, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           5.
                        
                        
                           OECD (2004.), In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 430, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           6.
                        
                        
                           OECD (2004.), In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 431, OECD, Pariz. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           7.
                        
                        
                           OECD (2006.), In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 435, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           8.
                        
                        
                           EC-ECVAM (2009.), Performance Standards for in vitro skin irritation test methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                        
                     
                           9
                        
                        
                           OECD (2005.), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No 34, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           10.
                        
                        
                           Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001.), A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, Results and evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, str. 57-93.
                        
                     
                           11.
                        
                        
                           Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002.), Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 16, str. 765-770.
                        
                     
                           12.
                        
                        
                           Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. and Spielmann, H. (2004.), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests, ALTEX 21, str. 107-114.
                        
                     
                           13.
                        
                        
                           Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. and Spielmann, H. (2005.), The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests — An assessment of the performance of the optimised test, ATLA 33, str. 351-367.
                        
                     
                           14.
                        
                        
                           Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. (2005.), The in vitro acute skin irritation of chemicals: optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, str. 329-349.
                        
                     
                           15.
                        
                        
                           Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002.), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, str. 109-129.
                        
                     
                           16.
                        
                        
                           Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007.), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, str. 559-601.
                        
                     
                           17.
                        
                        
                           Hoffmann, S. (2006.), ECVAM skin irritation validation study phase II: Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1-α. Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                        
                     
                           18.
                        
                        
                           Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007.), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, str. 603-619.
                        
                     
                           19.
                        
                        
                           Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007.), In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy — Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, str. 351-358.
                        
                     
                           20.
                        
                        
                           EC-ECVAM (2007.), Statement on the validity of in vitro tests for skin irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                        
                     
                           21.
                        
                        
                           EC-ECVAM (2007.), Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation testing. Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                        
                     
                           22.
                        
                        
                           EC-ECVAM (2008.), Statement on the scientific validity of in vitro tests for skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC29), 5 November 2008. Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                        
                     
                           23.
                        
                        
                           OECD (2010.), Explanatory background document to the OECD draft Test Guideline on in vitro skin irritation testing. OECD Series on Testing and Assessment, No 137, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html]
                        
                     
                           24.
                        
                        
                           Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004.), In vitro skin irritation: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, Toxicol. in Vitro 18, str. 231-243.
                        
                     
                           25.
                        
                        
                           Mosmann, T. (1983.), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 65, str. 55-63.
                        
                     
                           26.
                        
                        
                           EpiSkinTM SOP, Version 1.8 (February 2009.), ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkinTM test method 15 min-42 hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                        
                     
                           27.
                        
                        
                           EpiDermTM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009.), Protocol for: In vitro EpiDermTM skin irritation test (EPI-200-SIT., For use with MatTek Corporation’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                        
                     
                           28.
                        
                        
                           SkinEthicTM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009.), SkinEthic skin irritation test-42a test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Dostupno na: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
                        
                     
                           29.
                        
                        
                           Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995.), Irritant contact dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, str. 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York.
                        
                     
                           30.
                        
                        
                           Commission Directive 2001/59/EC of 6 August 2001 adapting to technical progress for the 28th time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances, OJ L 225, 21.8.2001., str. 1.
                        
                     
                           31.
                        
                        
                           Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004.), Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, str. 1-4.
                        
                     
                           32.
                        
                        
                           Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular in vitro assays and animal in vivo data, ALTEX, 14, str. 359-365.
                        
                     
                           33.
                        
                        
                           Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, M. and Kandárová, H. (2010.), Comparison of human skin irritation patch test data with in vitro skin irritation assays and animal data, Contact Dermatitis, 62, str. 109-116.
                        
                     
                  Dodatak 1.
                  
                     Definicije
                  
                  Točnost: Stupanj podudarnosti između rezultata ispitne metode i prihvaćenih referentnih vrijednosti. Ona je mjerilo učinkovitosti ispitne metode i jedan od aspekata relevantnosti. Izraz se često koristi u istom značenju kao ‚podudarnost’ kako bi se označio udio točnih rezultata ispitne metode (9).
                  Vijabilnost stanica: Parametar za mjerenje ukupne aktivnosti populacije stanica, npr. sposobnost staničnih mitohondrijskih dehidrogenaza da reduciraju vitalnu boju MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, tiazolil plavo;), koji ovisno o krajnjoj točki koja se mjeri i planu ispitivanja korelira s ukupnim brojem i/ili vitalnošću živih stanica.
                  Podudarnost: Mjerilo učinkovitosti ispitnih metoda koje daju kategorijske rezultate i jedan od aspekata relevantnosti. Izraz se koristi u istom značenju kao ‚točnost’ i određen je kao udio svih ispitanih kemikalija koje su pravilno razvrstane kao pozitivne ili negativne. (9).
                  ET50: Može se izračunati određivanjem vremena izlaganja koje je potrebno da se vijabilnost stanica smanji za 50 % nakon primjene markerske kemikalije u unaprijed određenoj fiksnoj koncentraciji, vidjeti također IC50.
                  EU CLP (Uredba (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vijeća od 16. prosinca 2008. o razvrstavanju, označivanju i pakiranju tvari i smjesa): provodi u Europskoj uniji (EU) sustav GHS Ujedinjenih naroda za razvrstavanje i označivanje kemikalija (tvari i smjesa) (3).
                  GHS (Globalno usklađeni sustav razvrstavanja i označivanja kemikalija Ujedinjenih naroda (UN)): Sustav za razvrstavanje kemikalija (tvari i smjesa) prema standardiziranim vrstama i stupnjevima fizikalnih opasnosti i opasnosti za zdravlje i okoliš, koji obuhvaća odgovarajuća komunikacijska sredstva kao što su piktogrami, signalne riječi, obavijesti o opasnosti, obavijesti o mjerama opreza i sigurnosno-tehnički listovi, kojima se prenose informacije o njihovim štetnim učincima s ciljem zaštite ljudi (uključujući poslodavce, radnike, prijevoznike, potrošače i pružatelje pomoći) i okoliša (1.).
                  IC50: Može se izračunati određivanjem koncentracije pri kojoj markerska kemikalija smanjuje vijabilnost tkiva za 50 % (IC50) nakon fiksnog vremena izlaganja, vidjeti također ET50.
                  Beskonačna doza: Količina ispitivane kemikalije nanesena na epidermu koja prelazi količinu koja je potrebna da se potpuno i jednoliko prekrije površina epiderme.
                  I ja također test: Kolokvijalni izraz za ispitnu metodu koja je strukturno i funkcionalno slična validiranoj i prihvaćenoj referentnoj ispitnoj metodi. Takva ispitna metoda je kandidat za catch-up validaciju. Izraz se često koristi u istom značenju kao slična ispitna metoda (9).
                  Zahtjevi izvedbe: Zahtjevi na temelju validirane ispitne metode koji čine osnovu za ocjenjivanje usporedivosti predložene metode koja je mehanicistički i funkcionalno slična ispitnoj metodi. Oni uključuju: i. ključne elemente ispitne metode; ii. minimalni popis referentnih kemikalija odabranih između kemikalija koje se koriste za dokazivanje prihvatljive učinkovitosti validirane ispitne metode, i iii. usporedive razine točnosti i pouzdanosti, utemeljene na rezultatima dobivenim za validiranu ispitnu metodu, koje se prilikom ocjenjivanja trebaju dokazati predloženom ispitnom metodom koristeći minimalni popis referentnih kemikalija (9).
                  Referentne kemikalije: Kemikalije odabrane za uporabu u validacijskom postupku, za koje su reakcije u referentnom sustavu ispitivanja in vitro i in vivo ili željenim vrstama već poznate. Te kemikalije trebaju biti reprezentativne za razrede kemikalija za koje se očekuje da će ispitna metoda biti uporabljena i trebaju predstavljati puni raspon reakcija koje se mogu očekivati od kemikalija za koje se može koristiti, u rasponu od jake do slabe i negativne reakcije. Za različite faze validacijskog postupka te različite ispitne metode i uporabe mogu biti potrebne različite skupine referentnih kemikalija (9).
                  Relevantnost: Opis odnosa ispitivanja i željenog učinka te njegova značajnost i korisnost za posebnu namjenu. Radi se o mjeri u kojoj ispitivanje točno mjeri ili predviđa željeni biološki učinak. Relevantnost uključuje i razmatranje o točnosti (podudarnosti) ispitne metode (9).
                  Pouzdanost: Pokazuje u kojoj se mjeri ispitna metoda može ponoviti unutar jednog laboratorija i između više laboratorija tijekom vremena uz primjenu istog protokola. Ocjenjuje se izračunavanjem unutarlaboratorijske i međulaboratorijske ponovljivosti (9).
                  Zamjenski test: Test koji zamjenjuje rutinsko ispitivanje za određivanje opasnosti i/ili procjenu rizika, za koji je utvrđeno da osigurava istovjetnu ili bolju zaštitu zdravlja ljudi, zdravlja životinja ili okoliša u odnosu na prihvaćeno ispitivanje u svim mogućim okolnostima ispitivanja i za sve kemikalije (9).
                  Osjetljivost: Udio svih pozitivnih/aktivnih ispitivanih kemikalija koje su pravilno razvrstane primjenom testa. Ona je mjera točnosti ispitne metode koja daje kategorijske rezultate i važan čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode (9).
                  Nadraživanje kože: Izazivanje reverzibilnog oštećenja kože nakon primjene ispitivane kemikalije u trajanju do najviše 4 sata. Nadraživanje kože je lokalna neimunogena reakcija koja se javlja ubrzo nakon podražaja (29). Njezina glavna značajka je reverzibilan proces koji uključuje upalne reakcije i većinu karakterističnih kliničkih znakova nadraživanja (eritem, edem, svrbež i bol) koji se povezuju s upalnim procesom.
                  Specifičnost: Udio svih negativnih/neaktivnih ispitnih kemikalija koje su pravilno razvrstane primjenom testa. Ona je mjera točnosti ispitne metode koja daje kategorijske rezultate i važan čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode (9).
                  Strategija stupanjskog ispitivanja: Ispitivanje koje koristi metode prema načelu sekvencijalnosti; odabrane metode na svakoj sljedećoj razini određuju se na temelju rezultata ispitivanja na prethodnoj razini (9).
                  Ispitivana kemikalija (navedena i kao ispitivana tvar): Svaka tvar ili smjesa koja se ispituje ovom metodom.
               
               
                  Dodatak 2.
                  
                     Zahtjevi izvedbe za ocjenjivanje predloženih sličnih ili izmijenjenih metoda in vitro rekonstruirane ljudske epiderme za ispitivanje nadraživanja kože
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Cilj zahtjeva izvedbe je pružiti temelj na kojem se za nove ispitne metode, zaštićene (autorskim pravima, žigom, registrirane) i nezaštićene, može odrediti njihova dostatna točnost i pouzdanost u posebne svrhe ispitivanja. Ti zahtjevi izvedbe koji se temelje na validiranim i prihvaćenim metodama, mogu se koristiti za ocjenjivanje pouzdanosti i točnosti drugih sličnih metoda (kolokvijalno nazvanih ‚i ja također’ testovi) koje se temelje na sličnim znanstvenim načelima i mjere ili predviđaju isti biološki ili toksični učinak (9).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Prije donošenja izmijenjenih metoda tj. predloženih mogućih poboljšanja odobrene metode, potrebno je ocijeniti učinak predloženih izmjena na rezultate ispitivanja i mjeru u kojoj će te izmjene utjecati na dostupne podatke o ostalim sastavnicama validacijskog postupka. Ovisno o broju i vrsti predloženih izmjena, dobivenim podacima i popratnoj dokumentaciji o tim izmjenama, one trebaju proći isti validacijski postupak, kako je opisan za novo ispitivanje, ili ako je prikladno, trebaju biti predmet ograničenog ocjenjivanja pouzdanosti i relevantnosti na temelju utvrđenih zahtjeva izvedbe (9).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Za slične (‚i ja također’) ili izmijenjene metode bilo koje od tri validirane metode (EpiSkin™ (validirana referentna metoda – VRM), EpiDerm™ SIT (EPI-200) i SkinEthic™ RHE) koje su predložene za uporabu u okviru ove ispitne metode, treba se odrediti njihova pouzdanost i točnost koristeći kemikalije koje predstavljaju čitavo područje vrijednosti nadraživanja prema Draizeu. Kod ocjenjivanja primjenom 20 preporučenih referentnih kemikalija iz zahtjeva izvedbe (tablica 1.), treba dobiti vrijednosti pouzdanosti i točnosti za predložene slične ili izmijenjene metode usporedive ili bolje od onih dobivenim validiranom referentnom metodom (tablica 2.) (2) (16). Vrijednosti pouzdanosti i točnosti koje se moraju postići navedene su u stavcima 8. do 12. u ovome dodatku. Obuhvaćene su nerazvrstane kemikalije (bez kategorije prema UN GHS/EU CLP) i razvrstane kategorije (kategorija 2. prema UN GHS/EU CLP) (1) koje predstavljaju različite kemijske razrede, tako da se pouzdanost i točnost (osjetljivost, specifičnost i opća točnost) predložene metode mogu usporediti s odgovarajućim vrijednostima validirane referentne metode. Prije nego što se ispitna metoda primijeni za ispitivanje novih kemikalija treba odrediti njezinu pouzdanost kao i sposobnost da pravilno odredi nadražujuće kemikalije 2. kategorije prema UN GHS/EU CLP te, ovisno o regulatornom okviru za koji se dostavljaju podaci, njezina sposobnost da pravilno odredi kemikalije bez kategorije prema UN GHS/EU.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Ovi se zahtjevi izvedbe temelje na zahtjevima izvedbe EC-ECVAM PS (8), ažuriranim u skladu s UN GHS i EU CLP sustavima za razvrstavanje i označivanje (1) (3). Izvorni zahtjevi izvedbe utvrđeni su nakon dovršenja validacijske studije (21) i temelje se na sustavu razvrstavanja EU-a, kako je određeno u Direktivi Komisije 2001/59/EZ od 6. kolovoza 2001. o dvadesetosmoj prilagodbi tehničkom napretku Direktive Vijeća 67/548/EEZ o usklađivanju zakona i drugih propisa u odnosu na razvrstavanje, pakiranje i označivanje opasnih tvari (12). Budući da je u razdoblju između dovršenja validacijske studije i uspostave ove ispitne metode prema GHS UN donesen sustav za razvrstavanje i označivanje u EU-u (CLP EU) (3), zahtjevi izvedbe su ažurirani (8). To se ažuriranje uglavnom odnosilo na izmjene i. skupine referentnih kemikalija zahtjeva izvedbe i ii. određenih vrijednosti pouzdanosti i točnosti (2) (23).
                           
                        ZAHTJEVI IZVEDBE ZA ISPITNE METODE REKONSTRUIRANE LJUDSKE EPIDERME IN VITRO ZA NADRAŽIVANJE KOŽE
                  
                              5.
                           
                           
                              Zahtjevi izvedbe obuhvaćaju sljedeća tri elementa:
                              
                                          I.
                                       
                                       
                                          ključne elemente ispitne metode;
                                       
                                    
                                          II.
                                       
                                       
                                          minimalni popis referentnih kemikalija;
                                       
                                    
                                          III.
                                       
                                       
                                          definirane vrijednosti točnosti i pouzdanosti.
                                       
                                    
                        I.   Ključni elementi ispitne metode
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Sastoje se od ključnih strukturnih, funkcionalnih i proceduralnih elemenata validirane metode koji se trebaju uključiti u protokol predložene metode koja je mehanicistički i funkcionalno slična ispitnoj metodi ili je njezina inačica. Ti elementi uključuju jedinstvena svojstva metode, kritične proceduralne pojedinosti i mjere kontrole kakvoće. Sukladnost s ključnim elementima ispitne metode pomaže osigurati da se slična ili izmijenjena predložena metoda temelji na istim načelima kao i odgovarajuća validirana referentna metoda (9). Ključni elementi ispitne metode detaljno su opisani u stavcima 16. do 21. ispitne metode, a ispitivanje se izvodi u skladu sa sljedećim:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          opći uvjeti (stavak 16.),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          funkcionalni uvjeti koji uključuju:
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vijabilnost (stavak 17.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      funkciju barijere (stavak 18.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      morfologiju (stavak 19.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obnovljivost (stavak 20.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kontrolu kakvoće (stavak 21.).
                                                   
                                                
                                    
                        II.   Minimalni popis referentnih kemikalija
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Referentne kemikalije se koriste da bi se utvrdilo jesu li pouzdanost i točnost predložene slične ili izmijenjene metode, za koju je dokazano da je strukturno i funkcionalno dovoljno slična validiranim referentnim metodama, ili koja predstavlja neznatno izmijenjenu varijantu jedne od triju validiranih metoda, usporedive ili bolje od pouzdanosti i točnosti validirane referentne metode (2) (8) (16) (23). Dvadeset preporučenih referentnih kemikalija popisanih u tablici 1. uključuju kemikalije iz različitih kemijskih razreda (tj. kategorije kemikalija na temelju funkcionalnih skupina) koje predstavljaju čitavo područje vrijednosti nadraživanja prema Draizeu (od nenadražujućih do jako nadražujućih). Kemikalije na ovome popisu sadrže 10 kemikalija iz 2. kategorije UN GHS/EU CLP i 10 kemikalija bez kategorije, od kojih su tri neobavezne kemikalije iz 3. kategorije UN GHS. U okviru ove ispitne metode neobavezna 3. kategorija se smatra kao ‚bez kategorije’. Kemikalije iz tablice 1. su odabrane između kemikalija koje se koriste u fazi optimizacije nakon faze predvalidacije i u validacijskoj studiji validirane referentne metode s obzirom na kemijsku funkcionalnost i agregatno stanje (14) (18). Te referentne kemikalije predstavljaju minimalni broj kemikalija koje se trebaju koristiti za ocjenjivanje točnosti i pouzdanosti predložene slične ili izmijenjene metode, ali se ne smiju koristiti za razvoj novih metoda. Ako neka od popisanih kemikalija nije dostupna, mogu se koristiti druge kemikalije za koje postoje odgovarajući referentni podaci in vivo, odabrane prvenstveno između kemikalija koje se koriste u fazi optimizacije nakon faze predvalidacije ili u validacijskoj studiji validirane referentne metode. Dodatne kemikalije koje predstavljaju druge razrede kemikalija i za koje postoje odgovarajući referentni podaci in vivo, mogu se po želji uvrstiti u minimalni popis referentnih kemikalija radi daljnjeg ocjenjivanja točnosti predložene metode.
                              
                                 Tablica 1.
                              
                              
                                 Minimalni popis referentnih kemikalija za određivanje točnosti i pouzdanosti sličnih ili izmijenjenih metoda rekonstruirane ljudske epiderme koje se koriste u ispitivanju nadraživanja kože
                                  (13)
                              
                              
                                          Kemikalija
                                       
                                       
                                          CAS br.
                                       
                                       
                                          Agregatno stanje
                                       
                                       
                                          Rezultat ocjenjivanja in vivo
                                          
                                       
                                       
                                          Kat. VRM in vitro
                                          
                                       
                                       
                                          Kat. GHS/EU CLP in vivo
                                          
                                       
                                    
                                          1-brom-4-klorbutan
                                       
                                       
                                          6940-78-9
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          0
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                    
                                          dietil-ftalat
                                       
                                       
                                          84-66-2
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          0
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                    
                                          naftalenoctena kiselina
                                       
                                       
                                          86-87-3
                                       
                                       
                                          K
                                       
                                       
                                          0
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                    
                                          alil-fenoksiacetat
                                       
                                       
                                          7493-74-5
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          0,3
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                    
                                          izopropanol
                                       
                                       
                                          67-63-0
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          0,3
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                    
                                          4-metil-tio-benzaldehid
                                       
                                       
                                          3446-89-7
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                    
                                          metil-stearat
                                       
                                       
                                          112-61-8
                                       
                                       
                                          K
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                    
                                          heptil-butirat
                                       
                                       
                                          5870-93-9
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          1,7
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                    
                                          heksil-salicilat
                                       
                                       
                                          6259-76-3
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                       
                                          izvan kat.
                                       
                                    
                                          cinamaldehid
                                       
                                       
                                          104-55-2
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                       
                                          Izvan kat.
                                          (fakultativna 3. kat) (15)
                                          
                                       
                                    
                                          
                                             1-dekanol
                                              (14)
                                          
                                       
                                       
                                          
                                             112-30-1
                                          
                                       
                                       
                                          
                                             T
                                          
                                       
                                       
                                          
                                             2,3
                                          
                                       
                                       
                                          
                                             2. kat.
                                          
                                       
                                       
                                          
                                             2. kat.
                                          
                                       
                                    
                                          ciklamen-aldehid
                                       
                                       
                                          103-95-7
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          2,3
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                    
                                          1-bromheksan
                                       
                                       
                                          111-25-1
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          2,7
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                    
                                          2-klormetil-3,5-dimetil-4-metoksipiridin-hidroklorid
                                       
                                       
                                          86604-75-3
                                       
                                       
                                          K
                                       
                                       
                                          2,7
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                    
                                          
                                             di-n-propil disulfid
                                              (14)
                                          
                                       
                                       
                                          
                                             629-19-6
                                          
                                       
                                       
                                          
                                             T
                                          
                                       
                                       
                                          
                                             3
                                          
                                       
                                       
                                          
                                             izvan kat.
                                          
                                       
                                       
                                          
                                             2 kat.
                                          
                                       
                                    
                                          kalijev hidroksid (5 % vode)
                                       
                                       
                                          1310-58-3
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          3
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                    
                                          benzenetiol, 5-(1,1-dimetiletil)-2-metil
                                       
                                       
                                          7340-90-1
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          3,3
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                    
                                          1-metil-3-fenil-1-piperazin
                                       
                                       
                                          5271-27-2
                                       
                                       
                                          K
                                       
                                       
                                          3,3
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                    
                                          heptanal
                                       
                                       
                                          111-71-7
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          3,4
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                    
                                          tetrakloroetilen
                                       
                                       
                                          127-18-4
                                       
                                       
                                          T
                                       
                                       
                                          4
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                       
                                          2. kat.
                                       
                                    
                        III.   Definirane vrijednosti točnosti i pouzdanosti
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Za utvrđivanje pouzdanosti i relevantnosti predloženih sličnih ili izmijenjenih metoda koje se trebaju prenositi između laboratorija, potrebno je ispitati svih 20 referentnih kemikalija iz tablice 1. u najmanje tri laboratorija. Međutim, ako će se predložena metoda koristiti isključivo u jednom laboratoriju, za validaciju nije potrebno provesti ispitivanje u više laboratorija. Ipak je ključno da spomenute validacijske studije neovisno ocjenjuju međunarodno priznata validacijska tijela u skladu s međunarodnim smjernicama (9). U svakom laboratoriju moraju se ispitati svih 20 referentnih kemikalija u tri neovisna ciklusa s različitim šaržama tkiva i u dovoljno udaljenim vremenskim intervalima. Svaki ciklus se sastoji od najmanje tri, paralelno ispitana, ponavljanja tkiva za svaku uključenu ispitanu kemikaliju, negativnu i pozitivnu kontrolu.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Vrijednosti pouzdanosti i točnosti predložene metode se izračunavaju uzimajući u obzir sva četiri dolje navedena kriterija i osiguravajući da se vrijednosti pouzdanosti i relevantnosti izračunavaju na unaprijed određeni i dosljedni način:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          Za izračun promjenljivosti i prediktivne sposobnosti (točnosti) metode unutar jednog laboratorija i između više laboratorija mogu se koristiti isključivo podaci dobiveni iz u cijelosti izvedenih sekvenci ciklusa.
                                       
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          Svaki uključeni laboratorij konačno razvrstava svaku referentnu kemikaliju na temelju prosječne vrijednosti vijabilnosti u različitim ciklusima kompletne sekvence.
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          Za izračun promjenljivosti metode između laboratorija mogu se koristiti isključivo podaci dobiveni za kemikalije za koje su u svim uključenim laboratorijima u cijelosti dovršene sekvence ciklusa.
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          Izračun vrijednosti točnosti treba se temeljiti na pojedinačnim laboratorijskim predviđanjima koja su različiti uključeni laboratoriji ostvarili za 20 referentnih kemikalija.
                                       
                                    U tom kontekstu, sekvenca ciklusa sastoji se od tri neovisna ciklusa koje izvodi jedan laboratorij za jednu ispitivanu kemikaliju. Kompletna sekvenca je sekvenca ciklusa koju izvede jedan laboratorij za jednu ispitivanu kemikaliju, pri čemu su sva tri ciklusa valjana. To znači da bilo koji nevaljani pojedinačni ciklus poništava cjelokupnu sekvencu od tri ciklusa.
                           
                        
                     Obnovljivost unutar laboratorija
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Kod ocjenjivanja varijabilnosti unutar laboratorija podudarnost između razvrstavanja (2. kategorija/izvan kategorije UN GHS/EU CLP) dobivenih u različitim nezavisnim ispitivanjima 20 referentnih kemikalija u istom laboratoriju mora biti ≥ 90 %.
                           
                        
                     Obnovljivost između laboratorija
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Ocjenjivanje obnovljivosti između laboratorija nije nužno ako će se predložena ispitna metoda koristiti samo u jednom laboratoriju. Ako će se metoda koristiti u više laboratorija, podudarnost između razvrstavanja (2. kategorija/izvan kategorije UN GHS/EU CLP) dobivenih u različitim nezavisnim ispitivanjima 20 referentnih kemikalija, po mogućnosti u najmanje tri laboratorija, mora iznositi ≥ 80 %.
                           
                        
                     Prediktivna sposobnost (točnost)
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Točnost (osjetljivost, specifičnost i ukupna točnost) predložene slične ili izmijenjene metode mora biti usporediva ili bolja od odgovarajućih vrijednosti validirane referentne metode uzimajući u obzir dodatne podatke o relevantnosti željenih vrsta (tablica 2.). Osjetljivost treba biti jednaka ili viša (≥) od 80 % (2) (8) (23). Međutim, dodatno posebno ograničenje primjenjuje se na osjetljivost predložene metode in vitro s obzirom da više od jednog uključenog laboratorija mogu pogrešno razvrstati samo dvije kemikalije in vivo iz 2. kategorije, 1-dekanol i di-n-propil disulfid, kao bez kategorije. Specifičnost treba biti jednaka ili viša (≥) 70 % (2) (8) (23). Ne postoje dodatna ograničenja s obzirom na specifičnost predložene metode in vitro, tj. bilo koji uključeni laboratorij može pogrešno razvrstati bilo koju kemikaliju in vivo bez kategorije, sve dok je konačna specifičnost ispitne metode unutar prihvatljivog okvira. Ukupna točnost treba biti jednaka ili viša (≥) od 75 % (2) (8) (23). Iako je osjetljivost validirane referentne metode, izračunana za 20 referentnih kemikalija iz tablice 1., jednaka 90 %, da bi se bilo koja slična ili izmijenjena metoda smatrala valjanom, definirana minimalna vrijednost osjetljivosti iznosi 80 %, budući da je poznato da 1-dekanol (granična kemikalija) i di-n-propil disulfid (lažna negativna validirane referentne metode) nisu nadražujući za ljude (31) (32) (33), iako je ispitivanjima utvrđeno da su nadražujući za kuniće. Budući da se modeli rekonstruirane ljudske epiderme temelje na stanicama ljudskog podrijetla, oni mogu predvidjeti da te kemikalije nisu nadražujuće (UN GHS/EU CLP bez kategorije).
                              
                                 Tablica 2.
                              
                              
                                 Zahtijevane prediktivne vrijednosti osjetljivosti, specifičnosti i ukupne točnosti za bilo koju sličnu ili izmijenjenu metodu da bi se smatrale valjanima
                              
                              
                                          Osjetljivost
                                       
                                       
                                          Specifičnost
                                       
                                       
                                          Ukupna točnost
                                       
                                    
                                          ≥ 80 %
                                       
                                       
                                          ≥ 70 %
                                       
                                       
                                          ≥ 75 %
                                       
                                    
                        
                     Kriteriji prihvatljivosti studije
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Moguće je da jedno ili više ispitivanja koja se odnose na jednu ili više ispitivanih kemikalija ne ispunjavaju kriterije prihvatljivosti ispitivanja za ispitivane i kontrolne kemikalije ili nisu prihvatljiva iz drugih razloga. Kako bi se dopunili podaci koji nedostaju, za svaku ispitivanu kemikaliju moguće je provesti najviše dva dodatna ispitivanja (‚ponovno ispitivanje’). Točnije, budući da se kod ponovnog ispitivanja trebaju paralelno ispitati i pozitivna i negativna kontrola, za svaku ispitivanu kemikaliju moguće je provesti najviše dva dodatna ciklusa.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Postoji vjerojatnost da čak i nakon ponovnog ispitivanja svaki uključeni laboratorij za svaku referentnu kemikaliju ne postigne minimum od tri valjana ciklusa koji su potrebni za svaku ispitivanu kemikaliju, zbog čega je matrica podataka nepotpuna. U tim je slučajevima potrebno ispuniti sljedeća tri kriterija kako bi se podaci smatrali prihvatljivima:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          Svih 20 referentnih kemikalija imaju barem jednu kompletnu sekvencu ciklusa.
                                       
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          U svakome od najmanje tri uključena laboratorija potrebno je dovršiti najmanje 85 % sekvenci ciklusa (za 20 kemikalija; tj. u pojedinačnom laboratoriju dopuštene su tri nevaljane sekvence ciklusa).
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          Mora biti dovršeno najmanje 90 % svih mogućih sekvenci ciklusa iz najmanje tri laboratorija (za 20 kemikalija ispitanih u 3 laboratorija; tj. ukupno je dopušteno šest nevaljanih sekvenci ciklusa).
                                       
                                    
                        
               ”
            
         
               3.
            
            
               Dodaju se sljedeća poglavlja:
               „B.49.   
                     IN VITRO MIKRONUKLEUS TEST STANICE SISAVCA
               
               UVOD
               
                           1.
                        
                        
                           Mikronukleus test in vitro je test genotoksičnosti za otkrivanje mikronukleusa (MN) u citoplazmi interfaznih stanica. Mikronukleusi mogu nastati iz acentričnih kromosomskih fragmenata (tj. nedostatka centromera) ili cijelih kromosoma koji tijekom anafaze razdiobe stanice nisu sposobni putovati na polove. Testom se otkriva aktivnost klastogenih i aneugenih kemikalija (tvari i smjesa) (1) (2) u stanicama u kojima je tijekom ili nakon izloženosti ispitivanoj tvari došlo do razdiobe. Ova ispitna metoda dopušta uporabu protokola s citohalazinom B (citoB), inhibitorom polimerizacije aktina, ili bez njega. Dodavanje citohalazina B prije ciljane mitoze omogućuje identifikaciju i selektivnu analizu učestalosti mikronukleusa u stanicama koje su dovršile jednu mitozu, budući da takve stanice imaju dvije jezgre (3) (4). Ova ispitna metoda također omogućuje uporabu protokola bez blokirane citokineze pod uvjetom da postoje dokazi da je u analiziranoj staničnoj populaciji mitoza već dovršena.
                        
                     
                           2.
                        
                        
                           Pored analize mikronukleusa in vitro za određivanje kemikalija (tvari i smjesa) koje uzrokuju nastajanje mikronukleusa, uporabom blokirane citokineze, imunokemijskog označivanja kinetohora ili hibridizacije centromernim/telomernim sondama (fluorescentna in situ hibridizacija (FISH)) mogu se također dobiti podaci o mehanizmima oštećenja kromosoma i nastajanja mikronukleusa (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Postupci označivanja i hibridizacije mogu se koristiti u slučaju povećanog nastajanja mikronukleusa kada istraživač želi utvrditi je li povećanje posljedica klastogenih i/ili aneugenih djelovanja.
                        
                     
                           3.
                        
                        
                           Mikronukleusi predstavljaju oštećenje koje je preneseno na stanice kćeri, dok se kromosomske aberacije u metafaznim stanicama ne moraju nužno prenijeti. Budući da se mikronukleusi u interfaznim stanicama mogu ocijeniti relativno objektivno, laboratorijsko osoblje treba utvrditi samo je li došlo do razdiobe stanica i koliko stanica sadrži mikronukleus. Pripravci se stoga mogu vrednovati relativno brzo i analiza može biti automatizirana, zbog čega je postalo praktično pri svakom tretiranju vrednovati na tisuće umjesto na stotine stanica povećavajući moć analize. Budući da mikronukleusi mogu nastati iz zaostalih kromosoma, postoji mogućnost otkrivanja tvari koje uzrokuju aneuploidiju i koje se teško proučavaju u klasičnim ispitivanjima kromosomskih aberacija, npr. Smjernica OECD-a 473 (poglavlje B.10 ovog Priloga) (17). Međutim, analiza mikronukleusa in vitro ne omogućuje razlikovanje kemikalija koje uzrokuju poliploidiju od onih koje uzrokuju klastogenost bez posebnih tehnika kao što je fluorescentna in situ hibridizacija (FISH), opisana u stavku 2.
                        
                     
                           4.
                        
                        
                           Analiza mikronukleusa in vitro je metoda in vitro koja obično koristi uzgojene ljudske stanice ili stanice glodavaca. Pruža sveobuhvatnu osnovu za istraživanje potencijala kromosomskog oštećenja in vitro budući da se mogu otkriti aneugeni i klastogeni agensi.
                        
                     
                           5.
                        
                        
                           Analiza mikronukleusa in vitro je pouzdana i učinkovita za različite vrste stanica u prisutnosti ili odsutnosti citohalazina B. Postoje opširni podaci koji podupiru valjanost analize mikronukleusa in vitro kod različitih staničnih linija glodavaca (CHO, V79, CHL/IU, and L5178Y) i ljudskih limfocita (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Oni posebno uključuju međunarodne validacijske studije kojima koordinira Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) i izvješća International Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). Dostupni podaci su, također, bili ponovno ocijenjeni u retrospektivnoj validacijskoj studiji s obzirom na težinu dokaza, koju je proveo Europski centar za validaciju alternativnih metoda (ECVAM) Europske komisije, dok je Znanstveni savjetodavni odbor ECVAM-a (ESAC) ispitnu metodu potvrdio kao znanstveno valjanu (32) (33) (34). Opisana je uporaba ljudske limfoblastične stanične linije TK6 (35), stanica HepG2 (36) (37) i primarnih embrionalnih stanica sirijskog hrčka (38), iako one nisu bile korištene u validacijskim studijama.
                        
                     DEFINICIJE
               
                           6.
                        
                        
                           Korištene definicije navedene su u Dodatku 1.
                        
                     POČETNA RAZMATRANJA
               
                           7.
                        
                        
                           Za izvođenje testova in vitro obično se koristi egzogeni izvor metaboličke aktivacije, osim ako stanice imaju metaboličko djelovanje u odnosu na tvari koje se ispituju. Egzogeni sustav metaboličke aktivacije ne oponaša u cijelosti uvjete in vivo. Potrebno je paziti da se izbjegnu uvjeti koji bi mogli dovesti do neprirodnih pozitivnih rezultata koji ne ukazuju na intrinzičnu mutagenost, a mogu nastati zbog značajnih promjena pH ili osmolalnosti ili zbog visoke razine citotoksičnosti (39) (40) (41). Ako dodavanjem ispitivane kemikalije dođe do promjene pH medija, potrebno je prilagoditi pH, po mogućnosti dodavanjem pufera u koncentriranu otopinu tako da svi obujmi za sve ispitane koncentracije i za sve kontrole ostanu isti.
                        
                     
                           8.
                        
                        
                           Za analizu nastanka mikronukleusa ključno je da je došlo do mitoze u tretiranim i netretiranim kulturama. Najviše podataka za vrednovanje mikronukleusa dobije se u stanicama koje su dovršile jednu mitozu tijekom ili nakon tretiranja ispitivanom tvari.
                        
                     NAČELO ISPITIVANJA
               
                           9.
                        
                        
                           Stanične kulture ljudskog podrijetla ili stanične kulture sisavaca izlažu se ispitivanoj tvari s egzogenim izvorom metaboličke aktivacije i bez njega, osim ako se koriste stanice s odgovarajućim metaboličkim djelovanjem. U sve testove uključuju se paralelne kemikalije s otapalom/nosačem (VC) i pozitivne kontrolne kemikalije.
                        
                     
                           10.
                        
                        
                           Tijekom ili nakon izlaganja ispitivanoj tvari stanice se uzgajaju dovoljno dugo da zbog oštećenja kromosoma ili vretena dođe do nastajanja mikronukleusa u interfaznim stanicama. Za nastanak aneuploidije ispitivana tvar obično mora biti prisutna tijekom mitoze. Dobivene i obojane interfazne stanice analiziraju se s obzirom na prisutnost mikronukleusa. Idealno bi se mikronukleusi trebali vrednovati isključivo u stanicama koje su dovršile mitozu tijekom izloženosti ispitivanoj tvari ili u razdoblju nakon izloženosti, ako se koristi. U kulturama koje su tretirane blokatorom citokineze to se postiže vrednovanjem isključivo stanica s dvije jezgre. U nedostatku blokatora citokineze važno je dokazati da je u analiziranim stanicama vjerojatno došlo do razdiobe stanica tijekom ili nakon izlaganja ispitivanoj tvari. Za sve protokole važno je dokazati da je došlo do proliferacije stanica i u kontrolnim i u tretiranim kulturama, dok je u kulturama (ili paralelnim kulturama) u kojima se vrednuju mikronukleusi potrebno ocijeniti opseg citotoksičnosti ili citostaze uzrokovanih ispitivanom tvari.
                        
                     OPIS ANALIZE
               
                  Pripravci
               
               
                           11.
                        
                        
                           Mogu se koristiti uzgojeni primarni ljudski limfociti periferne krvi (5) (19) (42) (43) i određeni broj staničnih linija glodavaca kao što su CHO, V79, CHL/IU i L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Uporaba drugih staničnih linija i vrsta mora se opravdati na temelju njihove dokazane učinkovitosti u analizi, kako je opisano u odjeljku Kriteriji prihvatljivosti. Budući da učestalost mikronukleusa u pozadini utječe na osjetljivost analize, preporučuje se uporaba staničnih vrsta s niskom i stabilnom učestalosti nastajanja mikronukleusa u pozadini.
                        
                     
                           12.
                        
                        
                           Ljudski limfociti periferne krvi dobivaju se od mladih (približno 18-35 godina starosti), zdravih pojedinaca nepušača koji nisu nedavno bili izloženi genotoksičnim kemikalijama ili zračenju. Ako se za uporabu ujedinjuju stanice više donora, potrebno je odrediti broj donora. Učestalost mikronukleusa raste s dobi, i taj je trend izraženiji kod žena nego kod muškaraca (44), što treba uzeti u obzir kod odabira donorskih stanica.
                        
                     Mediji i uvjeti uzgajanja
               
                           13.
                        
                        
                           Za održavanje kultura koriste se odgovarajući mediji i uvjeti inkubacije (posude za kulture, koncentracija CO2, temperatura i vlažnost). Kontinuirane stanične linije i sojevi se redovito provjeravaju s obzirom na stabilnost modalnog kromosomskog broja i odsutnost kontaminacije mikoplazme i ne smiju se koristiti ako su kontaminirane ili ako dođe do promjene u modalnom broju kromosoma. Uobičajeno trajanje staničnog ciklusa za uvjete uzgajanja koji se koriste u ispitnom laboratoriju treba biti poznato. Ako se koristi metoda blokiranja citokineze, koncentracija citokinetskog inhibitora mora biti optimizirana za određenu vrstu stanica i mora biti dokazana njegova sposobnost da proizvede dobar broj stanica s dvije jezgre za vrednovanje.
                        
                     Priprema kultura
               
                           14.
                        
                        
                           Kontinuirane stanične linije i sojevi: stanice se razmnažaju iz primarnih kultura, nacijepe na medij takvom gustoćom da se izbjegne konfluencija kultura u jednom sloju i da kulture suspenzije ne dosegnu preveliku gustoću prije ubiranja, i inkubiraju se pri 37 °C.
                        
                     
                           15.
                        
                        
                           Limfociti: cjelokupna krv, tretirana antikoagulansom (npr. heparinom), ili izdvojeni limfociti, kultiviraju se u prisutnosti mitogena, npr. fitohemaglutinina (PHA) prije izlaganja ispitivanoj tvari i citohalazinu B.
                        
                     Metabolička aktivacija
               
                           16.
                        
                        
                           Kod uporabe stanica s neodgovarajućom endogenom sposobnošću metabolizma potrebno je koristiti egzogene sustave metaboliziranja. Najčešće korišteni sustav je postmitohondrijska frakcija s dodanim kofaktorom (S9), pripravljena iz jetre glodavaca, koja je bila tretirana sredstvima za enzimsku indukciju, kao što je Aroclor 1254 (45) (46), ili smjesom fenobarbitona i β-naftoflavona (46) (47) (48) (49). Posljednja kombinacija nije u suprotnosti sa Stockholmskom konvencijom o postojanim organskim onečišćujućim tvarima (50) i Uredbom (EZ) br. 850/2004 o postojanim organskim onečišćujućim tvarima (66), i dokazano je da je za nastanak oksidaza s miješanom funkcijom jednako učinkovita kao Aroclor 1254 (46) (47) (48) (49). Frakcija S9 se obično uporablja u koncentracijama 1–10 % (v/v) u konačnom ispitivanom mediju. Uvjeti sustava za aktivaciju metabolizma mogu ovisiti o razredu ispitivane kemikalije i u nekim slučajevima može biti primjereno uporabiti više od jedne koncentracije S9.
                        
                     
                           17.
                        
                        
                           Stanične linije modificirane genetskim inženjeringom, koje izražavaju specifične aktivirajuće enzime ljudi ili glodavaca, mogu ukloniti potrebu za egzogenim sustavom aktivacije metabolizma i mogu se koristiti kao ispitivane stanice. U takvim slučajevima odabir uporabljenih staničnih linija mora biti znanstveno utemeljen, npr. zbog važnosti oksidaze s miješanom funkcijom za metabolizam ispitivane tvari (51) i njihove reaktivnosti na poznate aneugene i klastogene tvari (vidjeti zasebni odjeljak o kriterijima prihvatljivosti). Treba priznati da postoji mogućnost da izražene oksidaze s miješanom funkcijom ne metaboliziraju ispitivanu tvar; u tom slučaju negativni rezultati ne znače da ispitivana tvar ne može uzrokovati nastanak mikronukleusa.
                        
                     Priprema ispitivane tvari
               
                           18.
                        
                        
                           Prije tretiranja stanica krute kemikalije se otapaju u odgovarajućim otapalima ili nosačima i prema potrebi razrjeđuju. Tekuće se kemikalije mogu dodati neposredno u ispitivane sustave i/ili razrijediti prije tretiranja. Plinovite ili hlapive kemikalije ispituju se nakon što se prikladno izmijene standardni protokoli, kao što je tretiranje u hermetički zatvorenim posudama (52) (53). Koriste se svježi pripravci ispitivane tvari, osim ako podaci o stabilnosti dokažu da je pohranjivanje prihvatljivo.
                        
                     
                  Uvjeti testiranja
               
               Otapala/nosači
               
                           19.
                        
                        
                           Otapalo/nosač ne smije reagirati u dodiru s ispitivanom tvari i mora biti kompatibilan s preživljavanjem stanica ili održavanjem djelovanja S9 pri uporabljenoj koncentraciji. Ako se koriste manje poznata otapala/nosači (npr. voda, medij za kultiviranje stanica, dimetil sulfoksid), njihovu uporabu trebaju podupirati podaci koji ukazuju na njihovu kompatibilnost s ispitivanom tvari i nepostojanje genotoksičnosti. Preporučuje se da se, kada god je to moguće, prvo uzme u obzir uporaba vodenog otapala/nosača.
                        
                     Uporaba citohalazina B kao blokatora citokineze
               
                           20.
                        
                        
                           Za učinkovitost analize mikronukleusa in vitro vrlo je važno osigurati da u stanicama koje se vrednuju mitoza bude dovršena tijekom tretiranja ili u razdoblju inkubacije nakon tretiranja, ako se koristi. Citohalazin B je agens koji se najčešće koristi za blokadu citokineze budući da sprječava sastavljanje aktina i time onemogućava odvajanje stanica kćeri nakon mitoze, zbog čega nastaju stanice s dvije jezgre (5) (54) (55). Vrednovanje mikronukleusa stoga se može ograničiti na stanice u kojima je došlo do mitoze tijekom tretiranja ili nakon njega. Učinak ispitivane tvari na kinetiku proliferacija stanica može se mjeriti istodobno. Citohalazin B koristi se kao blokator citokineze kada se koriste ljudski limfociti, budući da se trajanje staničnih ciklusa razlikuje od kulture do kulture i između donora, te budući da svi limfociti ne reagiraju na fitohemaglutinin (PHA). Kod ispitivanja staničnih linija koriste se i druge metode za određivanje jesu li se stanice koje se vrednuju podijelile; te su metode opisane u nastavku (vidjeti stavak 26.).
                        
                     
                           21.
                        
                        
                           Za svaku vrstu stanica laboratorij određuje prikladnu koncentraciju citohalazina B kako bi se postigla optimalna učestalost stanica s dvije jezgre u kontrolnim kulturama s otapalom/nosačem. Prikladna koncentracija citohalazina B je obično između 3 i 6 μg/ml.
                        
                     Mjerenje proliferacija stanica i citotoksičnosti te odabir koncentracija izloženosti
               
                           22.
                        
                        
                           Kod određivanja najviše koncentracije tvari koja se ispituje, treba izbjegavati koncentracije koje imaju sposobnost izazivanja nepravilnih pozitivnih reakcija, kao što su koncentracije koje izazivaju pretjeranu citotoksičnost, oborine u mediju kultiviranja i značajne promjene pH ili osmolalnosti (39) (40) (41).
                        
                     
                           23.
                        
                        
                           Proliferacija stanica se mjeri kako bi se osiguralo da je u tretiranim stanicama tijekom analize došlo do mitoze i da se stanice tretiraju na odgovarajućim razinama citotoksičnosti (vidjeti stavak 29.). Citotoksičnost se određuje sa i bez aktivacije metabolizma u stanicama koje zahtijevaju aktivaciju metabolizma uporabom relativnog povećanja broja stanica (relative increase in cell counts, RICC) ili relativnog udvostručenja populacije (relative population doubling, RPD) (vidjeti Dodatak 2. za formule), osim ako se koristi citohalazin B. Ako se koristi citohalazin B, citotoksičnost se može odrediti indeksom ponavljanja (RI) (vidjeti Dodatak 2. za formulu).
                        
                     
                           24.
                        
                        
                           Tretiranje kultura citohalazinom B i mjerenje relativne učestalosti stanica s jednom, dvije ili više jezgri u kulturi predstavlja preciznu metodu za kvantificiranje učinka na proliferaciju stanica i citotoksično ili citostatično djelovanje tretiranja (5) i osigurava da se vrednuju samo one stanice u kojima je došlo do razdiobe tijekom ili nakon tretiranja.
                        
                     
                           25.
                        
                        
                           U studijama s citohalazinom B citostaza/citotoksičnost mogu se kvantificirati pomoću indeksa proliferacije s blokiranom citokinezom (cytokinesis-block proliferation index, CBPI) (5) (26) (56) ili se mogu dobiti pomoću indeksa ponavljanja iz najmanje 500 stanica po kulturi (vidjeti Dodatak 2. za formule). Kada se za ocjenu proliferacija stanica koristi citohalazin B, CBPI ili RI se trebaju odrediti na temelju najmanje 500 stanica po kulturi. Ta se mjerenja, među ostalim, mogu koristiti za ocjenu citotoksičnosti usporedbom vrijednosti u tretiranim i kontrolnim kulturama. Ocjenjivanje drugih markera citotoksičnosti (npr. konfluentnost, broj stanica, apoptoza, nekroza, broj metafazi) može pružiti korisne informacije.
                        
                     
                           26.
                        
                        
                           U studijama bez citohalazina B potrebno je dokazati da je tijekom ili nakon tretiranja ispitivanom tvari došlo do razdiobe stanica koje se vrednuju u kulturi, jer se u suprotnome mogu dobiti lažni negativni rezultati. Metode koje su bile uporabljene kako bi se osiguralo da se vrednuju podijeljene stanice uključuju ugradnju i naknadno otkrivanje bromdeoksiuridina (BrdU) za određivanje stanica koje se udvostručile (57), stvaranje klonova kada su stanice iz stalnih staničnih linija tretirane i vrednovane in situ na mikroskopskom stakalcu (indeks proliferacije (PI)) (25) (26) (27) (28), ili mjerenje relativnog udvostručenja populacije (RPD) ili relativnog povećanja broja stanica (RICC) ili druge provjerene metode (16) (56) (58) (59) (vidjeti Dodatak 2. za formule). Ocjenjivanje drugih markera citotoksičnosti ili citostaze (npr. konfluentnost, broj stanica, apoptoza, nekroza, broj metafazi) može pružiti korisne informacije.
                        
                     
                           27.
                        
                        
                           Potrebno je ocijeniti najmanje tri koncentracije koje se mogu analizirati. Da bi se to postiglo, može biti potrebno izvesti pokus koristeći veći broj koncentracija u bliskom slijedu i analizirati nastajanje mikronukleusa u tim koncentracijama koje osiguravaju odgovarajući opseg citotoksičnosti. Druga strategija je izvođenje preliminarnog testa citotoksičnosti kako bi se suzio raspon za konačni test.
                        
                     
                           28.
                        
                        
                           Najviša koncentracija trebala bi proizvesti 55 ± 5 % citotoksičnosti. Više bi razine mogle uzrokovati oštećenja kromosoma kao sekundarni učinak citotoksičnosti (60). Ako se pojavi citotoksičnost, odabrane ispitivane koncentracije trebale bi pokriti raspon od one koja proizvede 55 ± 5 % citotoksičnosti do one koja proizvede malu citotoksičnost ili je uopće ne proizvodi.
                        
                     
                           29.
                        
                        
                           Ako se ne uoči toksičnost niti oborina, najviša ispitivana koncentracija trebala bi iznositi 0,01 M, 5 mg/ml ili 5 μl/ml, koja god je niža. Razmak između koncentracija koje su odabrane za analizu obično ne bi trebao biti veći od 10. Za ispitivane tvari koje pokažu strmu krivulju reakcije na koncentraciju, može biti potrebno smanjiti razmak između koncentracija tako da se vrednuju i kulture u umjerenom i niskom rasponu toksičnosti.
                        
                     
                           30.
                        
                        
                           Kada je topljivost ograničujući faktor, najviša koncentracija, ako nije ograničena citotoksičnošću, treba biti najniža koncentracija pri kojoj je u kulturama vidljiva minimalna oborina, pod uvjetom da nema nikakvih ometanja pri vrednovanju. Oborina se ocjenjuje metodama kao što je svjetlosno mikroskopiranje, kojim se opaža oborina koja je postojana ili se pojavi tijekom kultiviranja (do kraja tretiranja).
                        
                     Kontrole
               
                           31.
                        
                        
                           U svaki pokus se uvode paralelne pozitivne kontrole i kontrole s otapalom/nosačem s aktivacijom metabolizma ili bez nje..
                        
                     
                           32.
                        
                        
                           Pozitivne kontrole su potrebne za dokazivanje sposobnosti uporabljenih stanica, i protokola ispitivanja, za određivanje klastogenih i aneugenih tvari te za potvrđivanje metaboličke sposobnosti pripravka S9. Pozitivne kontrole trebaju koristiti poznate pokretače tvorbe mikronukleusa pri koncentracijama za koje se očekuje malo, ali ponovljivo povećanje s obzirom na pozadinu, i pokazuju osjetljivost sustava ispitivanja. Koncentracije pozitivne kontrole odabiru se tako da su učinci jasni, ali prilikom čitanja ne otkrivaju odmah identitet kodiranih slajdova.
                        
                     
                           33.
                        
                        
                           Za dokazivanje metaboličke kompetencije i sposobnosti sustava da otkriva klastogene potrebno je koristiti klastogen koji zahtijeva aktivaciju metabolizma (npr. ciklofosfamid; benzo[a]piren). Mogu se koristiti i druge pozitivne kontrole, ako je to utemeljeno. Budući da u određenim uvjetima tretiranja ili određenim staničnim linijama neke pozitivne kontrole, kojima je potrebna aktivacija metabolizma, mogu biti aktivne bez egzogene aktivacije metabolizma, potrebno je ispitati potrebu za aktivacijom metabolizma i djelovanje pripravka S9 na odabranoj staničnoj liniji i uz odabrane koncentracije.
                        
                     
                           34.
                        
                        
                           Trenutačno nisu poznati aneugeni koji za svoje genotoksično djelovanje zahtijevaju aktivaciju metabolizma (16). Pozitivne kontrole koje su trenutačno prihvaćene za aneugeno djelovanje su, na primjer, kolhicin i vinblastin. Mogu se koristiti i druge kemikalije ako utječu na nastanak mikronukleusa isključivo ili prvenstveno kroz aneugeno djelovanje. Da bi se izbjegla potreba za dvjema pozitivnim kontrolama (za klastogenost i aneugenost) bez aktivacije metabolizma, kontrola aneugenosti može poslužiti kao pozitivna kontrola bez S9, dok se kontrola klastogenosti može upotrijebiti za ispitivanje prikladnosti uporabljenog sustava za aktivaciju metabolizma. Pozitivna kontrola za klastogenost i aneugenost treba se koristiti u stanicama koje ne zahtijevaju S9. Preporučene pozitivne kontrole su navedene u Dodatku 3.
                        
                     
                           35.
                        
                        
                           Ako su dostupne prikladne kemikalije, može se razmotriti mogućnost uporabe pozitivnih kontrola povezanih s razredom kemikalija. Sve uporabljene pozitivne kontrole trebaju biti prikladne za vrstu stanica i uvjete aktivacije.
                        
                     
                           36.
                        
                        
                           Za svaku fazu prikupljanja potrebno je uključiti kontrole s otapalom/nosačem. Pored toga, koriste se također i netretirane kontrole, osim ako objavljeni ili laboratorijski povijesni kontrolni podaci dokazuju da odabrano otapalo pri uporabljenim koncentracijama ne izaziva nikakve genotoksične niti druge štetne učinke.
                        
                     ISPITNI POSTUPAK
               
                  Program tretiranja
               
               
                           37.
                        
                        
                           Kako bi vjerojatnost otkrivanja aneugenih ili klastogenih tvari koje djeluju u određenoj fazi staničnog ciklusa bila što veća, važno je da u svim fazama njihovih staničnih ciklusa dovoljan broj stanica bude tretiran ispitivanom tvari. Program tretiranja staničnih linija i primarnih staničnih kultura može se, stoga, nešto razlikovati od onoga za limfocite koji zahtijevaju mitogensku stimulaciju za započinjanje staničnog ciklusa, kako se razmatra u stavcima 41.–43. (16).
                        
                     
                           38.
                        
                        
                           Teoretska razmatranja zajedno s objavljenim podacima (18) ukazuju da će većina aneugenih i klastogenih tvari biti otkrivene kratkotrajnim tretiranjem u trajanju od 3 do 6 sati s dodanim pripravkom S9 ili bez njega, nakon čega slijedi odstranjivanje ispitivane tvari i razdoblje rasta 1,5–2,0 staničnih ciklusa (6). Stanice se uzorkuju u vremenu koje je ekvivalentno približno 1,5–2,0 puta uobičajenog (tj. netretiranog) staničnog ciklusa nakon početka ili na kraju tretiranja (vidjeti tablicu 1.). Vrijeme uzorkovanja ili obnavljanja se može produljiti ako je poznato ili se sumnja da ispitivana tvar utječe na duljinu staničnog ciklusa (npr. pri ispitivanju analognih nukleozida).
                        
                     
                           39.
                        
                        
                           Zbog moguće citotoksičnosti pripravaka S9 za kultivirane stanice sisavca, produljena izloženost u trajanju od 1,5–2,0 puta uobičajenih staničnih ciklusa se uporablja isključivo ako nije prisutan S9. Kod produljenog tretiranja nudi se mogućnost tretiranja stanica s ispitivanom kemikalijom u odsutnosti ili prisutnosti citohalazina B. Ta se mogućnosti odnosi na situacije gdje se može javiti zabrinutost zbog mogućih interakcija između ispitivane tvari i citohalazina B.
                        
                     
                           40.
                        
                        
                           U tablici 1. su predstavljeni preporučeni programi tretiranja stanica. Ti se opći programi tretiranja mogu izmijeniti ovisno o stabilnosti ili reaktivnosti ispitivane tvari ili posebnim značajkama rasta uporabljenih stanica. Sva tretiranja moraju početi i završiti tijekom eksponencijalnog rasta stanica. Ti programi su detaljnije predstavljeni u stavcima 41.-47. u nastavku.
                           
                              Tablica 1.
                           
                           
                              Razdoblja tretiranja i prikupljanja stanica za analizu mikronukleusa in vitro
                              
                           
                           
                                       Limfociti, primarne stanice i stanične linije tretirane citohalazinom B
                                    
                                    
                                       + S9
                                    
                                    
                                       Tretirati 3-6 sati u prisutnosti S9;
                                       odstraniti S9 i hranjivu podlogu;
                                       dodati svježu podlogu i citohalazin B;
                                       prikupiti stanice nakon 1,5-2,0 uobičajenih staničnih ciklusa.
                                    
                                 
                                       – S9
                                       Kratkotrajna izloženost
                                    
                                    
                                       Tretirati 3-6 sati;
                                       odstraniti hranjivu podlogu;
                                       dodati svježu podlogu i citohalazin B;
                                       prikupiti stanice nakon 1,5-2,0 uobičajenih staničnih ciklusa.
                                    
                                 
                                       – S9
                                       Dugotrajna izloženost
                                    
                                    
                                       
                                          Opcija A: Tretirati u trajanju od 1,5-2,0 uobičajenih staničnih ciklusa u prisutnosti citohalazina B;
                                       prikupiti na kraju razdoblja izloženosti.
                                       
                                          Opcija B: Tretirati u trajanju od 1,5-2,0 uobičajenih staničnih ciklusa;
                                       odstraniti ispitivanu tvar;
                                       dodati svježu podlogu i citohalazin B;
                                       prikupiti stanice nakon 1,5-2,0 uobičajenih staničnih ciklusa.
                                    
                                 
                                       Stanične linije tretirane bez citohalazina B
                                       (Identično gore navedenim programima tretiranja, ali bez dodavanja citohalazina B)
                                    
                                 
                     
                  Limfociti, primarne stanice i stanične linije s citohalazinom B
               
               
                           41.
                        
                        
                           Najučinkovitiji pristup za limfocite je započeti s izlaganjem ispitivanoj tvari 44-48 sati nakon stimulacije PHA, kada više nema sinkronizacije ciklusa (5). U početnoj analizi stanice se tretiraju 3 do 6 sati ispitivanom tvari u prisutnosti ili odsutnosti S9. Hranjiva podloga se odstranjuje i zamjenjuje svježom podlogom koja sadrži citohalazin B i stanice se prikupljaju nakon 1,5–2,0 uobičajenih staničnih ciklusa.
                        
                     
                           42.
                        
                        
                           Ako su oba početna testa kratkoročnog tretiranja (3–6 sati) negativna ili dvojbena, izvodi se naknadno tretiranje s duljom izloženosti bez S9. Postoje dvije opcije tretiranja koje su jednako prihvatljive. Međutim, ako se eksponencijalni rast nakon 96 sati od stimulacije smanjuje, za stimulirane limfocite može biti primjerenija opcija A. U opciji B, također, stanične kulture ne smiju konfluirati prije konačnog uzorkovanja.
                           
                                       —
                                    
                                    
                                       Opcija A: Stanice se tretiraju ispitivanom tvari u trajanju od 1,5-2,0 uobičajenih staničnih ciklusa i prikupljaju na kraju tretiranja.
                                    
                                 
                                       —
                                    
                                    
                                       Opcija B: Stanice se tretiraju ispitivanom tvari u trajanju od 1,5-2,0 uobičajenih staničnih ciklusa. Hranjiva podloga se odstranjuje i zamjenjuje svježom podlogom i stanice se prikupljaju nakon dodatnih 1,5–2,0 uobičajenih staničnih ciklusa.
                                    
                                 
                     
                           43.
                        
                        
                           Primarne stanice i stanične linije tretiraju se na sličan način kao i limfociti, osim što ih nije potrebno stimulirati s PHA 44-48 sati. Stanice koje nisu limfociti, izlažu se tako da na kraju studije budu još uvijek u fazi logaritamskog rasta.
                        
                     
                  Stanične linije bez citohalazina B
               
               
                           44.
                        
                        
                           Stanice se tretiraju 3-6 sati u prisutnosti ili odsutnosti S9. Hranjiva podloga se odstranjuje i zamjenjuje svježom podlogom i stanice se prikupljaju nakon 1,5–2,0 uobičajenih staničnih ciklusa
                        
                     
                           45.
                        
                        
                           Ako su oba početna testa kratkotrajnog tretiranja (3–6 sati) negativna ili dvojbena, izvodi se naknadno tretiranje s duljom izloženosti (bez S9). Postoje dvije opcije tretiranja koje su jednako prihvatljive.
                           
                                       —
                                    
                                    
                                       Opcija A: Stanice se tretiraju ispitivanom tvari u trajanju od 1,5-2,0 uobičajenih staničnih ciklusa i prikupljaju na kraju tretiranja.
                                    
                                 
                                       —
                                    
                                    
                                       Opcija B: Stanice se tretiraju ispitivanom tvari u trajanju od 1,5-2,0 uobičajenih staničnih ciklusa. Hranjiva podloga se odstranjuje i zamjenjuje svježom podlogom i stanice se prikupljaju nakon dodatnih 1,5–2,0 uobičajenih staničnih ciklusa.
                                    
                                 
                     
                           46.
                        
                        
                           Na kraju tretiranja u trajanju od 3 do 6 sati u monoslojevima mogu biti prisutne mitotičke stanice (prepoznatljive kao okrugle i odvajaju se od površine). Budući da se te mitotičke stanice lako odvajaju, mogu se izgubiti prilikom odstranjivanja podloge s ispitivanom tvari. Te se stanice pažljivo prikupljaju prilikom ispiranja kultura i potom pažljivo vraćaju u kulture, kako se u trenutku prikupljanja ne bi izgubile stanice koje se nalaze u fazi mitoze i koje su rizične za nastajanje mikronukleusa.
                        
                     
                  Broj kultura
               
               
                           47.
                        
                        
                           Za svaku koncentraciju ispitivane tvari i kulture s nosačem/otapalom i kulture negativne kontrole koriste se dvojne kulture. Ako se na temelju povijesnih laboratorijskih podataka može dokazati da su razlike između dvojih kultura minimalne, prihvatljiva je uporaba jedne kulture. Ako se koristi jedna kultura, preporučuje se analiza većeg broja koncentracija.
                        
                     
                  Prikupljanje stanica i priprema stakalca
               
               
                           48.
                        
                        
                           Svaka kultura se prikuplja i obrađuje zasebno. Priprema stanica može uključiti hipotonično tretiranje, iako taj korak nije potreban ako se na drugi način može ostvariti primjereno širenje stanica. U pripremi stakalca mogu se koristiti različite tehnike, pod uvjetom da se za vrednovanje dobiju pripravci sa stanicama visoke kakvoće. Potrebno je zadržati citoplazmu stanica kako bi se omogućilo otkrivanje mikronukleusa i (u metodi blokirane citokineze) pouzdana identifikacija binuklearnih stanica.
                        
                     
                           49.
                        
                        
                           Stakalca se mogu obojiti različitim metodama, kao što su Giemsa ili DNA-specifična fluorescentna bojila (59). Uporaba DNA-specifičnog bojila (npr. akridin oranž (61) ili Hoechst 33258 plus pyronin-Y (62)) može ukloniti neke artefakte povezane s uporabom bojila koja nisu specifična za DNA. Za određivanje sadržaja (kromosom/kromosomski fragment) mikronukleusa, ako se žele dobiti mehanicističke informacije o njihovom nastajanju, mogu se koristiti antikinetohorna antitijela, fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) pancentromernim sondama DNA ili primarno označivanje in situ početnicama specifičnim za centromere zajedno s odgovarajućim bojanjem DNA (15) (16). Za razlikovanje između klastogenih i aneugenih tvari mogu se koristiti i druge metode, ako su dokazano učinkovite.
                        
                     
                  Analiza
               
               
                           50.
                        
                        
                           Sva stakalca, uključujući one s otapalom/nosačem i kontrolna, neovisno se kodiraju prije mikroskopske analize. Umjesto toga, kodirani uzorci mogu se analizirati validiranim, automatiziranim sustavom analize protočnom citometrijom ili slikovnom analizom.
                        
                     
                           51.
                        
                        
                           U kulturama tretiranim s citohalazinom B potrebno je analizirati učestalost mikronukleusa u najmanje 2 000 binuklearnih stanica po koncentraciji (najmanje 1 000 binuklearnih stanica po kulturi; dvije kulture po koncentraciji). Ako se koristi jedna kultura, potrebno je vrednovati najmanje 2 000 binuklearnih stanica po koncentraciji iz te kulture. Ako je za vrednovanje pri svakoj koncentraciji dostupno znatno manje od 1 000 binuklearnih stanica po kulturi ili 2 000 binuklearnih stanica ako se koristi jedna kultura te ako nije utvrđeno značajno povećanje mikronukleusa, potrebno je ponoviti ispitivanje koristeći više stanica ili pri manje toksičnim koncentracijama, koje god je primjerenije. Treba paziti da se ne vrednuju binuklearne stanice nepravilnog oblika ili ako postoji velika razlika u veličini jezgre; isto tako binuklearne stanice se ne smiju zamijeniti sa slabo raširenim multinuklearnim stanicama. Stanice koje imaju više od dvije glavne jezgre ne analiziraju se u vezi s mikronukleusima, budući da osnovna učestalost mikronukleusa u tim stanicama može biti veća (63) (64). Vrednovanje mononuklearnih stanica je prihvatljivo, ako je dokazano da ispitivana tvar utječe na djelovanje citohalazina B.
                        
                     
                           52.
                        
                        
                           U staničnim linijama, analiziranim bez tretiranja citohalazinom B, mikronukleusi se vrednuju u najmanje 2 000 stanica po koncentraciji (najmanje 1 000 stanica po kulturi; dvije kulture po koncentraciji). Ako se koristi samo jedna kultura po koncentraciji, potrebno je vrednovati najmanje 2 000 stanica iz te kulture.
                        
                     
                           53.
                        
                        
                           Ako se koristi citohalazin B, za ocjenu proliferacije stanica potrebno je odrediti CBPI ili RI (vidjeti Dodatak 2.) koristeći najmanje 500 stanica po kulturi. Ako se tretiranje izvodi bez dodanog citohalazina B, ključno je dostaviti dokaz da je došlo do proliferacije stanica koje se vrednuju, kako je raspravljeno u stavcima 24.–27.
                        
                     
                  Kriteriji prihvatljivosti
               
               
                           54.
                        
                        
                           Laboratorij koji predlaže uporabu analize mikronukleusa in vitro, opisane u ovoj ispitnoj metodi, uporabom referentnih kemikalija iz Dodatka 3. mora dokazati svoju sposobnost da pouzdano i precizno otkriva kemikalije s poznatim aneugenim i klastogenim djelovanjem, s metaboličkom aktivacijom ili bez nje, kao i poznate negativne kemikalije. Kao dokaz svoje sposobnosti da pravilno izvodi ovu ispitnu metodu laboratorij dostavlja dokaz da su stanice koje su predmet vrednovanja s obzirom na nastanak mikronukleusa dovršile jednu diobu jezgre ako se ispitivanje izvodi bez uporabe citohalazina B.
                        
                     
                           55.
                        
                        
                           Preporučuje se uporaba kemikalija iz Dodatka 3. kao referentnih kemikalija. Mogu se uključiti zamjenske ili dodatne kemikalije, ako je njihovo djelovanje poznato, ako induciraju mikronukleuse istim mehanizmima djelovanja i ako se pokaže da su relevantne za kemikalije koje će se ispitivati postupkom analize mikronukleusa in vitro. Obrazloženje može uključiti validacijsku studiju u kojoj su uporabljene različite tvari ili studiju usmjerenu na uži spektar koji se temelji na kemijskom razredu ispitivane tvari ili mehanizmu oštećivanja koji se proučava.
                        
                     
                           56.
                        
                        
                           Kontrolne kulture s otapalom/nosačem i netretirane kulture moraju ponovljivo dati nisku i dosljednu učestalost mikronukleusa (obično 5–25 mikronukleusa/1 000 stanica za vrste stanica iz stavka 11.). Druge vrste stanica mogu imati različne raspone reakcija koje se trebaju odrediti prilikom njihove validacije za uporabu u analizi mikronukleusa in vitro. Podaci dobiveni negativnom kontrolom, kontrolom s otapalom i pozitivnom kontrolom koriste se za utvrđivanje povijesnih kontrolnih raspona. Te se vrijednosti koriste kod odlučivanja o prikladnosti paralelne negativne/pozitivne kontrole za ispitivanje.
                        
                     
                           57.
                        
                        
                           Ako se za analizu predlažu manje izmjene protokola (npr. uporaba automatizirane umjesto ručne tehnike brojanja; uporaba nove vrste stanica), učinkovitost izmjene se mora dokazati prije nego što se izmijenjeni protokol može smatrati prihvatljivim za uporabu. Dokazivanje učinkovitosti uključuje dokaz da se mogu otkriti glavni mehanizmi loma kromosoma i dodavanje ili gubitak, i da se za razred pojedinačne tvari ili širi opseg tvari koje će se ispitivati, mogu dobiti odgovarajući pozitivni i negativni rezultati.
                        
                     PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
               
                  Obrada rezultata
               
               
                           58.
                        
                        
                           Ako se koristi tehnika blokirane citokineze, za ocjenjivanje indukcije mikronukleusa koristi se isključivo učestalost binuklearnih stanica s mikronukleusima (bez obzira na broj mikronukleusa po stanici). Brojanje stanica s jednim, dvama ili više mikronukleusa može pružiti korisne informacije, ali nije obvezno.
                        
                     
                           59.
                        
                        
                           Potrebno je odrediti paralelna mjerenja citotoksičnosti i/ili citostaze za sve tretirane kulture i kontrolne kulture s otapalom/nosačem (58). Za sve tretirane i kontrolne kulture potrebno je izračunati CBPI ili RI kao mjerenja kašnjenja staničnog ciklusa, ako se koristi metoda blokirane citokineze. U odsutnosti citohalazina B koristi se RPD, RICC ili PI (vidjeti Dodatak 2.).
                        
                     
                           60.
                        
                        
                           Potrebno je dostaviti podatke o pojedinačnoj kulturi. Pored toga, svi se podaci sažimaju u obliku tablice.
                        
                     
                           61.
                        
                        
                           U analizi mikronukleusa in vitro kemikalije mogu inducirati mikronukleuse zato što uzrokuju lom kromosoma, gubitak kromosoma ili njihovu kombinaciju. Za određivanje je li mehanizam indukcije mikronukleusa posljedica klastogenog i/ili aneugenog djelovanja, može se koristiti daljnja analiza uporabom antikinetohornih antitijela, in situ sonda specifičnih za centromere ili drugih metoda.
                        
                     
                  Ocjenjivanje i tumačenje rezultata
               
               
                           62.
                        
                        
                           Jasnu pozitivnu ili negativnu reakciju nije potrebno provjeravati dodatnim ispitivanjem. Dvosmisleni rezultati se mogu pojasniti analizom dodatnih 1 000 stanica iz svih kultura kako se ne bi izgubili slijepi uzorci. Ako takav pristup ne riješi pitanje dvosmislenosti rezultata, potrebno je provesti dodatno ispitivanje. U daljnjim pokusima potrebno je razmotriti mogućnost izmjene parametara studije u proširenom ili suženom rasponu uvjeta, kako je primjereno. Mogu se izmijeniti sljedeći parametri: razmak između ispitnih koncentracija, raspored tretiranja i prikupljanja stanica i/ili uvjeti metaboličke aktivacije.
                        
                     
                           63.
                        
                        
                           Postoji nekoliko kriterija za određivanje pozitivnog rezultata, kao što je na primjer povećanje povezano s koncentracijom ili statistički značajno povećanje broja stanica s mikronukleusima. Najprije se treba razmotriti biološka relevantnost rezultata. Ovisno o tome smatraju li se opažene vrijednosti unutar ili izvan povijesnog raspona kontrola, pružaju se smjernice kod ocjenjivanja biološke važnosti reakcije. Kod ocjenjivanja rezultata ispitivanja mogu se kao pomoć koristiti odgovarajuće statističke metode (65). Međutim, rezultati statističkog ispitivanja trebaju se ocijeniti s obzirom na odnos između doze i reakcije. Potrebno je, također, uzeti u obzir ponovljivost i povijesne podatke.
                        
                     
                           64.
                        
                        
                           Iako većina pokusa daje jasne pozitivne ili negativne rezultate, u nekim slučajevima dobiveni podaci onemogućavaju donošenje konačne ocjene o djelovanju ispitivane tvari. Te dvosmislene ili upitne reakcije se mogu javiti bez obzira na broj ponavljanja pokusa.
                        
                     
                           65.
                        
                        
                           Pozitivni rezultati analize mikronukleusa in vitro ukazuju da u kultiviranim stanicama sisavca ispitivana tvar uzrokuje lom ili gubitak kromosoma. Negativni rezultati ukazuju da u primijenjenim uvjetima ispitivana tvar ne uzrokuje lom i/ili gubitak ili udvostručenje kromosoma u kultiviranim stanicama sisavca.
                        
                     
                  Izvješće o ispitivanju
               
               
                           66.
                        
                        
                           Izvješće o ispitivanju uključuje najmanje sljedeće informacije, ako su relevantne za provođenje studije:
                           
                                        
                                    
                                    
                                       
                                          Ispitivana kemikalija:
                                       
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   identifikacijski podaci i brojevi CAS i EZ,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   fizikalna priroda i čistoća,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   fizikalno-kemijska svojstva relevantna za izvođenje studije,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   reakcija ispitivane kemikalije s otapalom/nosačem ili hranjivom podlogom.
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       
                                          Otapalo/nosač:
                                       
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   dokaz opravdanosti izbora otapala/nosača,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   topivost i stabilnost ispitivane tvari u otapalu/nosaču,
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       
                                          Stanice:
                                       
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   vrsta i podrijetlo uporabljenih stanica,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   prikladnost uporabljene stanične vrste,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   odsutnost mikoplazme, ako se primjenjuje,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   podaci o duljini staničnog ciklusa, vremenu udvostručenja ili indeksu proliferacije,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   ako se koriste limfociti, spol, dob i broj donora krvi, ako se primjenjuje,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   ako se koriste limfociti, je li izložena puna krv ili odvojeni limfociti,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   broj pasaža, ako se primjenjuje,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   metode održavanja staničnih kultura, ako se primjenjuje,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   modalni broj kromosoma,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   uobičajeno (negativna kontrola) trajanje staničnog ciklusa,
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       
                                          Uvjeti ispitivanja:
                                       
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   identitet tvari koja blokira citokinezu (npr. citohalazin B), ako se koristi, njezina koncentracija i trajanje izloženosti stanice,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   dokaz opravdanosti odabira koncentracija i broj kultura uključujući podatke o citotoksičnosti i ograničenja topivosti, ako postoje,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   sastav podloge, koncentracija CO2, ako se primjenjuje,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   koncentracija ispitivane tvari,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   koncentracija (i/ili obujam) nosača i dodane ispitivane tvari,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   temperatura i vrijeme inkubacije,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   trajanje tretiranja,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   vrijeme prikupljanja nakon tretiranja,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   gustoća stanica kod nasađivanja, ako se primjenjuje,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   vrsta i sastav sustava metaboličke aktivacije uključujući kriterije prihvatljivosti,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pozitivne kontrolne kemikalije i negativne kontrole,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   metode pripreme stakalca i uporabljene tehnike bojenja,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   kriteriji za identifikaciju mikronukleusa,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   broj analiziranih stanica,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   metode mjerenja citotoksičnosti,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   sve dodatne informacije o citotoksičnosti,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   kriteriji za određivanje studija pozitivnima, negativnima ili dvosmislenima,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   uporabljena(e) metoda(e) statističke analize,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   metode, kao što je uporaba kinetohornih antitijela, za određivanje sadrže li mikronukleusi cijele ili fragmentirane kromosome, ako se primjenjuje,
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       
                                          Rezultati:
                                       
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   uporabljena metoda mjerenja citotoksičnosti, npr. CBPI ili RI u slučaju metode blokirane citokineze; RICC, RPD ili PI kada se ne koriste metode blokirane citokineze; druga zapažanja ako je primjereno, npr. konfluencija stanica, aptoza, nekroza, brojanje u metafazi, učestalost binuklearnih stanica,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   znakovi oborina,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   podaci o pH i osmolalnosti hranjive podloge, ako određeni,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   definicija prihvatljivih stanica za analizu,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   raspodjela mononuklearnih, binuklearnih i višenuklearnih stanica ako se koristi metoda blokirane citokineze,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   broj stanica s mikronukleusima, koji se navodi zasebno za svaku tretiranu i kontrolnu kulturu, i određivanje jesu li iz binuklearnih ili mononuklearnih stanica, ako je primjereno,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   odnos koncentracija – reakcija, ako je moguće,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   kemijski podaci o paralelnim negativnim (otapalo/nosač) i pozitivnim kontrolama (koncentracije i otapala),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   kemijski podaci o povijesnim negativnim (otapalo/nosač) i pozitivnim kontrolama, zajedno s rasponima, prosjecima i standardnom devijacijom i intervalom pouzdanosti (npr. 95 %),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   statistička analiza, vrijednosti p, ako postoje,
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       
                                          Rasprava o rezultatima
                                       
                                    
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       
                                          Zaključci
                                       
                                    
                                 
                     REFERENCE
               
                           1.
                        
                        
                           Kirsch-Volders, M. (1997.), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, str. 1-4.
                        
                     
                           2.
                        
                        
                           Parry, J.M. and Sors, A. (1993.), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, str. 3-15.
                        
                     
                           3.
                        
                        
                           Fenech, M. and Morley, A.A. (1985.), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, str. 233-246.
                        
                     
                           4.
                        
                        
                           Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000.), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, str. 167-172.
                        
                     
                           5.
                        
                        
                           Fenech, M. (2007.), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), str. 1084-1104.
                        
                     
                           6.
                        
                        
                           Fenech, M. and Morley, A.A. (1986.), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, str. 193-198.
                        
                     
                           7.
                        
                        
                           Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989.), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, str. 34-43.
                        
                     
                           8.
                        
                        
                           Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990.), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, str. 9-20.
                        
                     
                           9.
                        
                        
                           Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991.), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, str. 297-302.
                        
                     
                           10.
                        
                        
                           Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993.), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, str. 329-334.
                        
                     
                           11.
                        
                        
                           Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993.), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, str. 205-213.
                        
                     
                           12.
                        
                        
                           Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993.), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, str. 519-525.
                        
                     
                           13.
                        
                        
                           Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994.), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, str. 9-20.
                        
                     
                           14.
                        
                        
                           Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996.), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, str. 233-245.
                        
                     
                           15.
                        
                        
                           Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996.), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, str. 211-219.
                        
                     
                           16.
                        
                        
                           Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003.), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, str. 153-163.
                        
                     
                           17.
                        
                        
                           OECD (1997.), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Pariz. Dostupno na: [www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           18.
                        
                        
                           Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006.), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, str. 13-36.
                        
                     
                           19.
                        
                        
                           Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006.), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, str. 37-60.
                        
                     
                           20.
                        
                        
                           Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006.), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, str. 61-87.
                        
                     
                           21.
                        
                        
                           Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006.), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, str. 88-124.
                        
                     
                           22.
                        
                        
                           Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006.), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, str. 125-152.
                        
                     
                           23.
                        
                        
                           Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997.), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, str. 187-208.
                        
                     
                           24.
                        
                        
                           Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997.), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, str. 45-59.
                        
                     
                           25.
                        
                        
                           Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998.), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, str. 81-116.
                        
                     
                           26.
                        
                        
                           Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999.), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells — comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, str. 183-190.
                        
                     
                           27.
                        
                        
                           Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999.), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, str. 55-71.
                        
                     
                           28.
                        
                        
                           von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000.), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells — results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, str. 137-163.
                        
                     
                           29.
                        
                        
                           Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002.), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, str. 123-134.
                        
                     
                           30.
                        
                        
                           Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999.), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, str. 569-580.
                        
                     
                           31.
                        
                        
                           Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006.), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, str. 1-152.
                        
                     
                           32.
                        
                        
                           ECVAM (2006.), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16- 17 November, 2006, Dostupno na: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]
                        
                     
                           33.
                        
                        
                           ESAC (2006.), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Dostupno na: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]
                        
                     
                           34.
                        
                        
                           Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008.), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, str. 271-283.
                        
                     
                           35.
                        
                        
                           Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995.), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, str. 105-115.
                        
                     
                           36.
                        
                        
                           Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002.), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, str. 257-260.
                        
                     
                           37.
                        
                        
                           Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004.), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, str. 315-328.
                        
                     
                           38.
                        
                        
                           Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997.), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, str. 61-70.
                        
                     
                           39.
                        
                        
                           Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991.), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, str. 147-205.
                        
                     
                           40.
                        
                        
                           Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992.), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, str. 297-305.
                        
                     
                           41.
                        
                        
                           Brusick, D. (1986.), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, str. 789-886.
                        
                     
                           42.
                        
                        
                           Fenech, M. and Morley, A.A. (1985.), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, str. 29-36.
                        
                     
                           43.
                        
                        
                           Fenech, M. (1997.), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, str. 11-18.
                        
                     
                           44.
                        
                        
                           Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001.), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen. 37, str. 31-45.
                        
                     
                           45.
                        
                        
                           Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983.), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, str. 173-215.
                        
                     
                           46.
                        
                        
                           Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980.), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, str. 55-65.
                        
                     
                           47.
                        
                        
                           Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992.), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, str. 175-177.
                        
                     
                           48.
                        
                        
                           Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976.), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, str. 85-88.
                        
                     
                           49.
                        
                        
                           Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996.), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, str. 51-59.
                        
                     
                           50.
                        
                        
                           UNEP (2001.), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Dostupno na: [http://www.pops.int/]
                        
                     
                           51.
                        
                        
                           Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996.), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, str. 247-274.
                        
                     
                           52.
                        
                        
                           Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982.), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, str. 91-103.
                        
                     
                           53.
                        
                        
                           Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983.), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, str. 795-801.
                        
                     
                           54.
                        
                        
                           Fenech, M. (1993.), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, str. 35-44.
                        
                     
                           55.
                        
                        
                           Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002.), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, str. 103-112.
                        
                     
                           56.
                        
                        
                           Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004.), Corrigendum to ‚Report from the in vitro micronucleus assay working group’, Mutation Res., 564, str. 97-100.
                        
                     
                           57.
                        
                        
                           Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984.), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, str. 61-65.
                        
                     
                           58.
                        
                        
                           Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008.), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, str. 1-3.
                        
                     
                           59.
                        
                        
                           Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995.), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, str. 169-184.
                        
                     
                           60.
                        
                        
                           Galloway, S. (2000.), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, str. 191-201.
                        
                     
                           61.
                        
                        
                           Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983.), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, str. 241-247.
                        
                     
                           62.
                        
                        
                           MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983.), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, str. 269-275.
                        
                     
                           63.
                        
                        
                           Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983.), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, str. 241-247.
                        
                     
                           64.
                        
                        
                           Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003.), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, str. 65-75.
                        
                     
                           65.
                        
                        
                           Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003.), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, str. 463-467.
                        
                     
                           66.
                        
                        
                           Regulation (EC) No 850/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004 on persistent organic pollutants and amending Directive 79/117/EEZ, SL L 229, 30.4.2004., str. 5.
                        
                     
                  Dodatak 1.
                  
                     Definicije
                  
                  Aneugen: svaka tvar ili postupak koji u interakciji s elementima mitotičkog i meiotičkog ciklusa diobe stanice uzrokuje aneuploidiju u stanicama ili organizmima.
                  Aneuploidija: odstupanje od normalnog diploidnog (ili haploidnog) broja kromosoma u jednom kromosomu ili više od jednog kromosoma, ali ne u cijeloj skupini ili skupinama kromosoma (poliploidija).
                  Apoptoza: programirana smrt stanice koju obilježava niz koraka što vode do razgradnje stanica u čestice vezane na membranu, koje se potom odstranjuju fagocitozom ili rasipanjem.
                  Proliferacija stanica: povećanje broja stanica kao posljedica mitotičke diobe stanice.
                  Centromer: DNK sekvenca kromosoma gdje su spojena oba kromatida i na kojoj su na obje strane pričvršćena oba kinetohora.
                  Klastogen: svaka tvar ili postupak koji uzrokuje strukturne kromosomske aberacije u populacijama stanica ili organizama.
                  Citokineza: postupak diobe stanice koji slijedi odmah nakon mitoze i kojim nastaju dvije stanice kćeri od kojih svaka sadrži jednu jezgru.
                  Indeks proliferacije s blokiranom citokinezom (CBPI): udio stanica u fazi druge diobe u tretiranoj populaciji u odnosu na netretiranu kontrolu (vidjeti Dodatak 2. za formulu).
                  Citostaza: sprečavanje rasta stanica (vidjeti Dodatak 2. za formulu).
                  Citotoksičnost: štetni učinci na staničnu strukturu ili funkciju koji na kraju uzrokuju smrt stanice.
                  Genotoksičnost: opći izraz koji obuhvaća sve vrste oštećenja DNA ili kromosoma uključujući lomove, preuređivanje adukata, mutacije, aberacije kromosoma i aneuploidiju. Sve vrste genotoksičnih učinaka ne dovode do mutacija ili trajnog oštećenja kromosoma.
                  Interfazne stanice: stanice koje nisu u fazi mitoze.
                  Kinetohor: proteinska struktura koja nastaje na centromeru kromosoma na koju se tijekom diobe stanice prihvaćaju niti vretena, čime se omogućuje pravilno kretanje kromosoma kćeri prema polovima stanica kćeri.
                  Mikronukleusi: male jezgre, dodatne i odvojene od glavne stanične jezgre, koje nastanu tijekom telofaze mitoze ili mejoze iz zaostalih fragmenata kromosoma ili cijelih kromosoma.
                  Mitoza: dioba stanične jezgre koja je obično podijeljena na profazu, prometafazu, metafazu, anafazu i telofazu.
                  Mitotički indeks: omjer između stanica u metafazi i ukupnog broja stanica opaženih u populaciji stanica; pokazatelj stupnja proliferacije stanice te populacije.
                  Mutagen: uzrokuje nasljednu promjenu sekvence osnovnih parova DNA u genima ili strukture kromosoma (kromosomske aberacije).
                  Nerazdvajanje: nesposobnost para kromatida da se razdvoji i pravilno odvoji u razvijajuće stanice kćeri, zbog čega nastaju stanice kćeri s nenormalnim brojem kromosoma.
                  Poliploidija: brojčane kromosomske aberacije u stanicama ili organizmima koje utječu na cijeli set kromosoma, za razliku od pojedinačnih kromosoma ili više kromosoma kod aneuploidije.
                  Indeks proliferacije (PI): metoda mjerenja citotoksičnosti kada se ne koristi citohalazin B (vidjeti Dodatak 2. za formulu).
                  Relativno povećanje broja stanica (RICC): metoda mjerenja citotoksičnosti kada se ne koristi citohalazin B (vidjeti Dodatak 2. za formulu).
                  Relativno udvostručenje populacije (RPD): metoda mjerenja citotoksičnosti kada se ne koristi citohalazin B (vidjeti Dodatak 2. za formulu).
                  Indeks ponavljanja (RI): udio dovršenih ciklusa stanične diobe u tretiranoj kulturi u odnosu na netretiranu kulturu, tijekom razdoblja izloženosti i obnavljanja (vidjeti Dodatak 2. za formulu).
                  Ispitivana kemikalija (navodi se i kao ispitivana tvar): svaka tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom metodom.
               
               
                  Dodatak 2.
                  
                     Formule za ocjenjivanje citotoksičnosti
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              
                                 Kod uporabe citohalazina B ocjena citotoksičnosti se temelji na indeksu proliferacije s blokiranom citokinezom (CBPI) ili indeksu ponavljanja (RI) (16) (58). CBPI pokazuje prosječni broj staničnih ciklusa po stanici tijekom razdoblja izloženosti citohalazinu B i može se koristiti za izračun proliferacije stanica. RI pokazuje relativni broj jezgri u tretiranim kulturama u usporedbi s kontrolnim kulturama i može se koristiti za izračun % citostaze:
                              % citostaze = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}
                              i:
                              
                                          T
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          kultura tretirana ispitivanom kemikalijom
                                       
                                    
                                          C
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          kontrolna kultura s nosačem
                                       
                                    pri čemu:
                              
                                 
                              Stoga, CBPI koji je jednak 1 (sve stanice su mononuklearne) odgovara 100 % citostaze.
                              Citostaza = 100 – RI
                              
                                 
                              
                                          T
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          tretirane kulture
                                       
                                    
                                          C
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          kontrolne kulture
                                       
                                    
                        
                              2.
                           
                           
                              Stoga, RI od 53 % znači da u usporedbi s brojem stanica koje su se podijelile u binuklearne i multinuklearne stanice u kontrolnoj kulturi, samo 53 % od tog broja stanica podijelilo se u tretiranoj kulturi, tj. 47 % citostaze.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              
                                 Kada se ne koristi citohalazin B, preporučuje se ocjena citotoksičnosti na temelju relativnog povećanja broja stanica (RICC) ili relativnog udvostručenja populacije (RPD) (58), budući da obje metode uzimaju u obzir omjer stanične populacije koja se podijelila.
                              
                                 
                              
                                 
                              pri čemu:
                              udvostručenje populacije = (log (broj stanica nakon tretiranja ÷ početni broj stanica)) ÷ log 2
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Stoga, RICC ili RPD od 53 % pokazuje 47 % citotoksičnosti/citostaze.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Uporabom indeksa proliferacije (PI) citotoksičnost se može ocijeniti brojanjem klonova koji se sastoje od 1 stanice (cl1), 2 stanice (cl2), 3 do 4 stanice (cl4) i 5 do 8 stanica (cl8)
                              
                                 
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Indeks proliferacije se koristi kao značajan i pouzdan parametar citotoksičnosti također i za stanične linije kultivirane in situ bez citohalazina B (25) (26) (27) (28).
                           
                        
               
                  Dodatak 3.
                  
                     Referentne kemikalije preporučene za ocjenjivanje učinkovitosti
                      (16)
                  
                  
                              Kategorija
                           
                           
                              Kemikalija
                           
                           
                              Br. CAS
                           
                           
                              Br. EZ
                           
                        1.   Klastogeni, aktivni bez metaboličke aktivacije
                           
                        
                               
                           
                           
                              Citozin arabinozid
                           
                           
                              147-94-4
                           
                           
                              205-705-9
                           
                        
                               
                           
                           
                              Mitomicin C
                           
                           
                              50-07-7
                           
                           
                              200-008-6
                           
                        2.   Klastogeni koji zahtijevaju metaboličku aktivaciju
                           
                        
                               
                           
                           
                              Benzo(a)piren
                           
                           
                              50-32-8
                           
                           
                              200-028-5
                           
                        
                               
                           
                           
                              Ciklofosfamid
                           
                           
                              50-18-0
                           
                           
                              200-015-4
                           
                        3.   Aneugeni
                           
                        
                               
                           
                           
                              Kolhicin
                           
                           
                              64-86-8
                           
                           
                              200-598-5
                           
                        
                               
                           
                           
                              Vinblastin
                           
                           
                              143-67-9
                           
                           
                              205-606-0
                           
                        4.   Negativne tvari
                           
                        
                               
                           
                           
                              Di(2-etilhexil)ftalat
                           
                           
                              117-81-7
                           
                           
                              204-211-0
                           
                        
                               
                           
                           
                              Nalidiksinska kiselina
                           
                           
                              389-08-2
                           
                           
                              206-864-7
                           
                        
                               
                           
                           
                              Piren
                           
                           
                              129-00-0
                           
                           
                              204-927-3
                           
                        
                               
                           
                           
                              Natrijev klorid
                           
                           
                              7647-14-5
                           
                           
                              231-598-3
                           
                        
               
                  B.50.   PREOSJETLJIVOST KOŽE: ANALIZA LOKALNIH LIMFNIH ČVOROVA: DA
               
               UVOD
               
                           1.
                        
                        
                           Smjernice OECD-a za ispitivanje kemijskih tvari i ispitne metode EU-a periodički se preispituju u svjetlu znanstvenog napretka, promjene regulatornih potreba i razmatranja o dobrobiti životinja. Prva ispitna metoda (TM) (B.42) za utvrđivanje preosjetljivosti kože kod miševa, analiza lokalnih limfnih čvorova (LLNA; Smjernica za ispitivanje OECD-a 429) je revidirana (1). Objavljeni su detalji validacije metode LLNA i pregled povezanog djelovanja (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Kod LLNA se za mjerenje proliferacije limfocita uporablja radioizotopni timidin ili jod te je, stoga, uporaba ove analize ograničena ako je nabava, uporaba ili odlaganje radioaktivnosti problematična. LLNA: DA (razvio ju je Daicel Chemical Industries, Ltd) je neradioaktivna inačica LLNA, koja količinski određuje sadržaj adenozin-trifosfata (ATP) pomoću bioluminiscencije kao pokazatelja proliferacije limfocita. Ispitnu metodu LNNA: DA je validirao i pregledao međunarodni odbor za stručnu reviziju koji ju je preporučio kao korisnu za utvrđivanje kemikalija koje izazivaju preosjetljivost i kemikalija koje ne izazivaju preosjetljivost, uz određena ograničenja (10) (11) (12) (13). Svrha ove ispitne metode je procjena potencijala kemikalija da senzibiliziraju kožu kod životinja (tvari i smjese). Poglavlje B.6. ovog Priloga i Smjernica za ispitivanje OECD-a 406 koriste testove na zamorcima, konkretnije maksimizacijski test sa zamorcima i Buehlerov test (13). Metoda LLNA ima određene prednosti u odnosu na B.6 i Smjernicu za ispitivanje OECD-a 406 (14). Metoda LLNA (poglavlje B.42 ovog Priloga; Smjernica za ispitivanje OECD-a 429) i dvije neradioaktivne inačice, analiza LLNA: DA (poglavlje B.50 ovog Priloga; Smjernica za ispitivanje OECD-a 442 A) i LLNA: BrdU-ELISA (poglavlje B.51 ovog Priloga; Smjernica za ispitivanje OECD-a 442 B), sve imaju prednosti u odnosu na testove na zamorcima iz metode B.6. i Smjernice za ispitivanje OECD-a 406 (14) u smislu manje i usavršene uporabe životinja.
                        
                     
                           2.
                        
                        
                           Slično kao i metodom LLNA, LLNA: DA proučava indukcijsku fazu senzibilizacije kože i pruža kvantitativne podatke pogodne za procjenjivanje reakcije na dozu. Pored toga, sposobnost otkrivanja senzibilizatora kože bez uporabe radioaktivne oznake za DNA isključuje mogućnost profesionalne izloženosti radioaktivnosti i pitanja odlaganja otpada. To zauzvrat može omogućiti povećanu uporabu miševa za otkrivanje senzibilizatora kože, čime se može dodatno smanjiti uporaba zamoraca za ispitivanje potencijala preosjetljivosti kože (tj. B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (14).
                        
                     DEFINICIJE
               
                           3.
                        
                        
                           Korištene definicije navedene su u Dodatku 1.
                        
                     POČETNA RAZMATRANJA I OGRANIČENJA
               
                           4.
                        
                        
                           Metoda LLNA: DA je inačica metode LLNA za utvrđivanje kemikalija koje imaju potencijal za uzrokovanje senzibilizacije kože uz posebna ograničenja. To nužno ne znači da u svim slučajevima metodu LLNA: DA treba primijeniti umjesto metode LLNA ili testa sa zamorcima (tj. B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (14), već da je pokus jednakovrijedan i da se može koristiti kao alternativa kod koje za pozitivne i negativne rezultate obično nije potrebna daljnja potvrda (10) (11). Ispitni laboratoriji trebaju uzeti u obzir sve dostupne podatke o ispitivanoj tvari prije provođenja studije. Spomenuti podaci uključuju identitet i kemijsku strukturu ispitivane tvari, njezina fizikalno-kemijska svojstva, rezultate svih in vitro ili in vivo ispitivanja toksičnosti i toksikološke podatke o strukturno povezanim kemikalijama. Ti se podaci uzimaju u obzir radi utvrđivanja prikladnosti metode LLNA: DA za odnosnu tvar (s obzirom na nekompatibilnost određenih vrsta kemikalija s metodom LLNA: DA - vidjeti stavak 5.) i pomoći kod odabira doze.
                        
                     
                           5.
                        
                        
                           Metoda LLNA: DA je metoda in vivo, pa kao takva ne isključuje upotrebu životinja u procjeni kontaktne senzibilizacijske aktivnosti. Međutim, ona ima potencijala smanjiti uporabu životinja u tu svrhu u usporedbi s testovima na zamorcima (B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (14). Nadalje, metoda LLNA: DA nudi znatno finiji način upotrebe životinja (manje boli i patnje) u ispitivanju kontaktne senzibilizacije, budući da za razliku od B.6 i Smjernice OECD-a 406 nije potrebno izazivati provokacijski inducirane hipersenzibilizirane dermalne reakcije. Unatoč prednostima metode LLNA: DA u odnosu na B.6 i Smjernicu OECD-a 406, postoje neka ograničenja zbog kojih može biti potrebno primijeniti B.6 ili Smjernicu OECD-a 406 (13) (npr. ispitivanje određenih metala, lažni pozitivni nalazi kod nekih sredstava s nadražujućim djelovanjem na kožu (kao što su neke površinski aktivne tvari) (6) (1. i Poglavlje B.42 iz ovog Priloga), topivost ispitivane tvari). Povrh toga, ispitivanja na zamorcima mogu biti potrebna za kemijske razrede ili tvari koje sadrže funkcionalne skupine za koje je dokazano da djeluju kao potencijalni zbunjujući faktori (16) (tj. B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406 (14)). Preporučuje se da se ograničenja koja su utvrđena za metodu LLNA (1. i Poglavlje B.42 iz ovog Priloga) primjenjuju i na metodu LLNA: DA (10). Pored toga, uporaba metode LLNA: DA možda nije primjerena za ispitivanje tvari koje utječu na razine adenozin-trifosfata (ATP) (tj. tvari koje djeluju kao inhibitori ATP-a) ili tvari koje utječu na precizno mjerenje ATP-a u stanicama (npr. prisutnost enzima koji razgrađuju ATP, prisutnost izvanstaničnog ATP-a u limfnom čvoru). Pored takvih utvrđenih ograničenja metoda LLNA: DA se može primjenjivati za ispitivanje bilo koje tvari, osim ako ne postoji mogućnost da bi njezina svojstva mogla utjecati na točnost metode LLNA: DA. Pored toga, potrebno je uzeti u obzir mogućnost graničnih pozitivnih rezultata kada se dobiju vrijednosti stimulacijskog indeksa (SI) između 1,8 i 2,5 (vidjeti stavke 31–32.). To se temelji na bazi podataka za validaciju s 44 tvari s indeksom stimulacije ≥ 1,8 (vidjeti stavak 6.), za koje su metodom LLNA: DA pravilno određena sva 32 senzibilizatora pri LLNA, ali su nepravilno određene tri od 12 tvari koje pri LLNA ne izazivaju preosjetljivost s vrijednostima stimulacijskog indeksa između 1,8 i 2,5 (tj. granično pozitivna vrijednost) (10). Međutim, budući da je za određivanje vrijednosti stimulacijskog indeksa i izračun predvidljivih svojstava ispitivanja uporabljen isti set podataka, navedeni rezultati mogu precijeniti stvarna predvidljiva svojstva.
                        
                     NAČELO ISPITIVANJA
               
                           6.
                        
                        
                           Metoda LLNA: DA počiva na temeljnom načelu prema kojem senzibilizatori induciraju proliferaciju limfocita u limfnom čvoru čime dolazi do drenaže mjesta kemijske primjene. Ta je proliferacija proporcionalna primijenjenoj dozi i potencijalu primijenjenog alergena te predstavlja jednostavan način za dobivanje kvantitativno izmjerene senzibilizacije. Proliferacija se mjeri usporedbom prosječne proliferacije svake ispitivane skupine s prosječnom proliferacijom u kontrolama tretiranim nosačem. Određuje se omjer prosječne proliferacije u svakoj tretiranoj skupini i proliferacije u kontrolama s nosačem, nazvan indeks stimulacije, koji mora biti ≥ 1,8 da bi se ispitivana tvar mogla dalje vrednovati kao potencijalni senzibilizator kože. Ovdje opisane metode temelje se na mjerenju sadržaja ATP-a bioluminiscencijom (za koju je poznato da je povezana s brojem živućih stanica) (17), kako bi se pokazao povećani broj stanica koje proliferiraju u aurikularnim limfnim čvorovima koji uzrokuju drenažu (18) (19). Metoda bioluminiscencije koristi enzim luciferaze za kataliziranje nastanka svjetlosti iz ATP-a i luciferin u skladu sa sljedećom reakcijom:
                           
                              ATP + luciferină + O
                              2
                              oxiluciferină + AMP + PPi
                               + CO
                              2 + svjetlost
                           
                           Emitirani intenzitet svjetlosti je linearno povezan s koncentracijom ATP-a i mjeri se luminometrom. Analiza reakcije između luciferina i luciferaze je osjetljiva metoda za određivanje ATP-a koji se koristi u širokom opsegu primjena (20).
                        
                     OPIS ANALIZE
               
                  Odabir životinjskih vrsta
               
               
                           7.
                        
                        
                           Za ovaj test odabrana vrsta su miševi. Validacijske studije za LLNA: DA provedene su isključivo sa sojem CBA/J, koji se stoga smatra preporučenim sojem (12) (13). Koriste se mlade odrasle ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu skotne. Na početku studije životinje trebaju biti stare između osam do 12 tjedana, a odstupanje mase životinja treba biti minimalno i ne smije prelaziti 20 % srednje mase. Drugi sojevi i mužjaci mogu se koristiti ako postoji dovoljno podataka da u reakciji prema metodi LLNA: DA nema značajnih razlika specifičnih za soj i/ili spol.
                        
                     
                  Uvjeti smještaja i prehrane
               
               
                           8.
                        
                        
                           Miševi trebaju biti smješteni u skupinama (21), osim ako se ne dokaže prikladna znanstvena utemeljenost za pojedinačni smještaj. Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 °C (± 3 °C). Iako bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a poželjno je da ne prijeđe 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50–60 %. Svjetlost treba biti umjetna, s tim da je redoslijed 12 sati svjetla, 12 sati tame. Za hranjenje se može koristiti konvencionalna laboratorijska hrana s neograničenom količinom vode za piće.
                        
                     
                  Priprema životinja
               
               
                           9.
                        
                        
                           Životinje se nasumice biraju, jednoznačno identificiraju (ali ne bilo kojim oblikom označavanja ušiju) i drže u kavezima najmanje pet dana prije početka doziranja kako bi se aklimatizirale na laboratorijske uvjete. Prije početka tretiranja sve životinje treba pregledati kako bi se potvrdilo da nemaju zapaženih lezija kože.
                        
                     
                  Priprema ispitnih otopina
               
               
                           10.
                        
                        
                           Tvrde kemikalije se prije primjene na uho miša trebaju rastopiti ili suspendirati u otapalima/nosačima i prema potrebi razrijediti. Tekuće kemikalije se mogu nanijeti čiste ili razrijeđene prije doziranja. Netopive kemikalije, koje se obično koriste u medicinskim uređajima, trebaju se podvrgnuti postupku pretjerane ekstrakcije u odgovarajućem otapalu kako bi se prije primjene na uho miša otkrili svi ekstraktibilni sastojci za ispitivanje. Ispitivane tvari se pripremaju svakodnevno osim ako podaci o stabilnosti ne dokažu prihvatljivost njihova skladištenja.
                        
                     
                  Provjera pouzdanosti
               
               
                           11.
                        
                        
                           Kemikalije pozitivne kontrole koriste se kako bi se dokazalo da se pokus provodi na odgovarajući način tako što reagiraju prikladnom i ponovljivom preosjetljivošću na ispitivanu tvar koja uzrokuje preosjetljivost, čiji je stupanj reakcije točno utvrđen. Preporučuje se uvođenje paralelne pozitivne kontrole radi dokazivanja sposobnosti laboratorija da uspješno izvede svaku analizu i da se omogući ocjenjivanje ponovljivosti i usporedivosti unutar jednog ili između više laboratorija. Određena regulatorna tijela zahtijevaju pozitivnu kontrolu za svaku studiju te se, stoga, korisnici pozivaju da prije izvođenja metode LLNA: DA kontaktiraju relevantna tijela. Sukladno tomu, potiče se rutinska uporaba paralelne pozitivne kontrole kako bi se izbjeglo dodatno ispitivanje na životinjama radi ispunjavanja zahtjeva koji se mogu javiti zbog periodičke uporabe paralelne kontrole (vidjeti stavak 12.). Pozitivna kontrola treba proizvesti pozitivnu reakciju na metodu LLNA: DA kod razine izlaganja za koju se očekuje da će dati porast indeksa stimulacije (SI) ≥ 1,8 u odnosu na negativnu kontrolnu skupinu. Dozu pozitivne kontrole treba odabrati tako da ne uzrokuje prekomjernu nadraženost kože ili sustavnu toksičnost i da je indukcija ponovljiva, ali ne prekomjerna (tj. SI > 10 se smatra pretjeranim). Poželjne pozitivne kontrole su 25 %-tni heksilcinamaldehid (CAS br. 101-86-0) i 25 %-tni eugenol (CAS br. 97-53-0) u acetonu: maslinovo ulje (4:1; v/v). Moguće su okolnosti u kojima se, uz odgovarajuće obrazloženje, mogu koristiti druge pozitivne kontrole koje ispunjavaju gore navedene kriterije.
                        
                     
                           12.
                        
                        
                           Iako se preporučuje uvođenje paralelne skupine pozitivne kontrole, u određenim situacijama periodičko ispitivanje (tj. u intervalima ≤ 6 mjeseci) pozitivne kontrole može biti prikladno za laboratorije koji redovito izvode metodu LLNA: DA (tj. najmanje jednom mjesečno) i imaju povijesnu bazu podataka pozitivne kontrole koja dokazuje sposobnost laboratorija da dobiva ponovljive i točne rezultate pozitivnih kontrola. Odgovarajuća osposobljenost za metodu LLNA: DA može se uspješno dokazati dobivanjem dosljednih pozitivnih rezultata pozitivne kontrole u najmanje deset neovisnih ispitivanja provedenih u razumnom vremenskom razdoblju (manje od jedne godine).
                        
                     
                           13.
                        
                        
                           Paralelnu skupinu pozitivne kontrole potrebno je uvesti svaki put kada dođe do proceduralne promjene metode LLNA: DA (zamjena stručnog osoblja, promjena materijala i/ili reagensa ispitne metode, promjena opreme, promjena izvora ispitivanih životinja) i te se promjene moraju navesti u laboratorijskim izvješćima. Potrebno je uzeti u obzir učinak tih promjena na primjerenost prethodno uspostavljene baze podataka prilikom utvrđivanja potrebe za uspostavom nove baze povijesnih podataka radi dokazivanja dosljednosti rezultata pozitivne kontrole.
                        
                     
                           14.
                        
                        
                           Istraživači trebaju biti svjesni da odluka o provođenju periodičke umjesto paralelne studije pozitivne kontrole utječe na prikladnost i prihvatljivost negativnih rezultata dobivenih bez paralelne pozitivne kontrole u razdoblju između svake periodičke pozitivne kontrole. Na primjer, ako se periodičkom pozitivnom kontrolom dobije lažni negativni rezultat, mogu se dovesti u pitanje negativni rezultati ispitivane tvari dobiveni u razdoblju između posljednje prihvatljive periodičke pozitivne kontrolne studije i neprihvatljive periodičke pozitivne kontrolne studije. Kod odlučivanja o uvođenju paralelne pozitivne kontrole ili provođenju samo periodičkih pozitivnih kontrola potrebno je pažljivo uzeti u obzir posljedice tih rezultata. Također je potrebno razmotriti mogućnost uporabe manjeg broja životinja u skupini paralelne pozitivne kontrole ako je to opravdano sa znanstvenog stajališta i ako laboratorij na temelju svojih posebnih povijesnih podataka dokaže da se može koristiti manje miševa (22).
                        
                     
                           15.
                        
                        
                           Iako pozitivnu kontrolnu tvar treba ispitati u nosaču za koji je poznato da izaziva dosljednu reakciju (npr. aceton; maslinovo ulje; 4:1, v/v), u nekim regulatornim situacijama bit će potrebno i ispitivanje u nestandardnom nosaču (klinički/kemijski relevantnoj formulaciji) (23). Ako se paralelna pozitivna kontrola ispituje u drugačijem nosaču od ispitivane tvari, potrebno je uključiti posebnu kontrolu s nosačem za paralelnu pozitivnu kontrolu.
                        
                     
                           16.
                        
                        
                           U slučajevima kada se ocjenjuju tvari iz posebnog kemijskog razreda ili raspona reakcija, referentne tvari mogu također biti korisne za dokazivanje ispravnosti ispitne metode za otkrivanje potencijala preosjetljivosti kože tih vrsta ispitivanih tvari. Prikladne referentne tvari moraju imati sljedeće značajke:
                           
                                       —
                                    
                                    
                                       strukturnu i funkcionalnu sličnost s razredom ispitivane tvari,
                                    
                                 
                                       —
                                    
                                    
                                       poznata fizikalna/kemijska svojstva,
                                    
                                 
                                       —
                                    
                                    
                                       popratne podatke iz LLNA: DA,
                                    
                                 
                                       —
                                    
                                    
                                       popratne podatke od drugih životinjskih modela i/ili ljudi.
                                    
                                 
                     ISPITNI POSTUPAK
               
                  Broj životinja i visine doze
               
               
                           17.
                        
                        
                           Po jednoj dozirnoj skupini koriste se najmanje četiri životinje, s najmanje tri koncentracije ispitivane tvari, plus paralelna negativna kontrolna skupina tretirana samo nosačem za ispitivanu tvar i jedna pozitivna kontrola (paralelna ili nedavno provedena, na temelju laboratorijske politike uzimajući u obzir stavke 11.-15.). Potrebno je razmotriti ispitivanje višestrukih doza pozitivne kontrole, posebno ako se ispitivanje pozitivne kontrole izvodi s prekidima. Osim tretiranja ispitivanom tvari, sa životinjama u kontrolnim skupinama treba postupati i tretirati ih jednako kao i životinje u tretiranim skupinama.
                        
                     
                           18.
                        
                        
                           Odabir doze i nosača treba se temeljiti na preporukama navedenim u referencama (2) i (24). Uzastopne doze se obično odabiru iz odgovarajućih serija koncentracija kao što su 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Odabir uporabljene serije koncentracija mora biti popraćen odgovarajućim znanstvenim obrazloženjem. Kod odabira tri uzastopne koncentracije treba uzeti u obzir sve postojeće toksikološke podatke (o akutnoj toksičnosti i nadraživanju kože) te strukturne i fizikalno-kemijske podatke o odnosnoj ispitivanoj tvari (i/ili strukturno povezanim tvarima), ako su dostupne, kako bi se najvišom koncentracijom maksimaliziralo izlaganje, ali istodobno izbjegla sustavna toksičnost i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože (24)(25). U nedostatku tih podataka može biti potrebno provesti početno predprobiranje (vidjeti stavke 21.-24.).
                        
                     
                           19.
                        
                        
                           Nosač ne smije ometati niti utjecati na rezultate ispitivanja i treba se odabrati na temelju povećanja topljivosti s ciljem postizanja što viših koncentracija, a da se istodobno proizvede otopina/suspenzija pogodna za primjenu ispitivane tvari. Kao nosači preporučuju se aceton: maslinovo ulje (4:1 v/v), N,N-dimetilformamid, metil etil keton, propilen glikol i dimetil sulfoksid (6), ali mogu se koristiti i drugi ako se to dostatno znanstveno obrazloži. U nekim situacijama može biti potrebno primijeniti klinički relevantno otapalo ili komercijalnu formulaciju u kojoj se ispitivana tvar prodaje, kao dodatnu kontrolu. Posebno treba paziti da u sustav nosača budu ugrađene hidrofilne ispitivane tvari koje vlaže kožu i ne isušuju se odmah, uključivanjem odgovarajućih sredstava za otapanje (npr. 1 %-tnim Pluronic® L92). Znači, nosače koji su u potpunosti vodeni treba izbjegavati.
                        
                     
                           20.
                        
                        
                           Obrada limfnih čvorova pojedinačnih miševa omogućuje ocjenjivanje promjenljivosti među životinjama i statističku usporedbu razlika između mjerenja ispitivanom tvari i kontrolnom skupinom s nosačem (vidjeti stavak 33.). Pored toga, ocjenjivanje mogućnosti smanjenja broja miševa u skupini pozitivne kontrole je izvedivo nakon što se prikupe pojedinačni podaci o životinjama (22). Određena regulatorna tijela nadalje zahtijevaju da se prikupe pojedinačni podaci o životinjama. Redovito prikupljanje pojedinačnih podataka o životinjama osigurava prednosti za dobrobit životinja, tako što se izbjegava dvostruko ispitivanje koje bi bilo potrebno, ako bi regulatorna tijela kasnije razmatrala rezultate izvorno prikupljene na jedan način (npr. preko grupnih podataka o životinjama), zajedno s drugim zahtjevima (npr. pojedinačni podaci o životinjama).
                        
                     
                  Predprobiranje
               
               
                           21.
                        
                        
                           Ako nisu dostupne informacije za određivanje najviše doze za ispitivanje (vidjeti stavak 18.) potrebno je obaviti predprobiranje kako bi se odredila odgovarajuća visina doze za ispitivanje u LLNA: DA. Svrha predprobiranja je pružiti smjernice za odabir najviše doze za uporabu u glavnoj studiji LLNA: DA, ako nisu dostupne informacije o koncentraciji koja uzrokuje sustavnu toksičnost (vidjeti stavak 24.) i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože (vidjeti stavak 23.). Najveća ispitana visina doze je 100 %-tna ispitivana tvar za tekućine ili najveća moguća koncentracija za krute tvari ili suspenzije.
                        
                     
                           22.
                        
                        
                           Predprobiranje se izvodi u uvjetima koji su identični glavnoj studiji LLNA: DA, s razlikom da se ne ocjenjuje proliferacija limfnih čvorova i može se koristiti manje životinja po dozirnoj skupini. Preporučuje se uporaba jedne ili dvije životinja po dozirnoj skupini. Svi miševi se svakodnevno prate s ciljem otkrivanja kliničkih znakova sustavne toksičnosti ili lokalnog nadraživanja na mjestu primjene. Tjelesna masa se bilježi prije ispitivanja i prije završetka (8. dan). Oba uha svakog miša se pregledavaju radi otkrivanja eritema i boduju prema tablici 1. (25). Debljina uha se mjeri posebnim mjernim instrumentom (pr. digitalnim mikrometrom ili mjeračem debljine Peacock Dial) prvi dan (prije doze), treći dan (otprilike 48 sati nakon prve doze), sedmi dan (24 sata prije završetka) i osmi dan. Pored toga, osmi dan se debljina uha može odrediti mjerenjem mase uzorka uha dobivenog probijanjem, što se izvodi nakon humanog usmrćenja. Prekomjerno lokalno nadraživanje kože se označuje bodovima za eriteme ≥ 3 i/ili povećanjem debljine uha za ≥ 25 % na bilo koji dan mjerenja (26) (27). Najviša odabrana doza za glavnu studiju LLNA: DA je sljedeća niža doza iz serije koncentracija u predprobiranju (vidjeti stavak 18.) koja ne uzrokuje sustavnu toksičnost i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože.
                           
                              Tablica 1.
                           
                           
                              Bodovanje eritema
                           
                           
                                       Zapažanja
                                    
                                    
                                       Bodovi
                                    
                                 
                                       Bez eritema
                                    
                                    
                                       0
                                    
                                 
                                       Vrlo slabi eritem (jedva zamjetan)
                                    
                                    
                                       1
                                    
                                 
                                       Dobro vidljiv eritem
                                    
                                    
                                       2
                                    
                                 
                                       Umjeren do jak eritem
                                    
                                    
                                       3
                                    
                                 
                                       Jak eritem (crvenilo cikle) do nekroze kože što onemogućuje stupnjevanje eritema
                                    
                                    
                                       4
                                    
                                 
                     
                           23.
                        
                        
                           Pored 25 %-tnog povećanja debljine uha (26)(27), statistički značajno povećanje debljine uha kod tretiranih miševa u odnosu na kontrolne miševe se, također, koristi za određivanje nadražujućih tvari u LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Međutim, iako se statistički značajna povećanja debljine uha mogu javiti, ona se posebno ne povezuju s prekomjernim nadraživanjem kada su manja od 25 % (30) (32) (33) (34).
                        
                     
                           24.
                        
                        
                           Sljedeća klinička opažanja mogu ukazivati na sustavnu toksičnost (35) kada se koriste u okviru cjelokupne ocjene te, stoga, mogu naznačiti najvišu dozu za uporabu u glavnoj LLNA: DA: promjene u djelovanju živčanog sustava (npr. piloerekcija, ataksija, tremori i grčevi); promjene u ponašanju (npr. agresivnost, promjene u njezi, značajna promjena u stupnju aktivnosti); promjene u disanju (npr. promjene učestalosti i intenziteta disanja kao što su dispneja, zadihanost i hroptanje) i promjene u konzumaciji hrane i vode. Prilikom ocjenjivanja treba uzeti u obzir znakove letargije i/ili nereagiranja, sve kliničke znakove boli i patnje koji nisu blagi ili trenutačni, ili gubitak težine > 5 % od prvog do osmog dana i smrtnost. Životinje koje su pred uginućem ili pokazuju znakove teške boli i patnje trebaju se humano usmrtiti (36).
                        
                     
                  Plan pokusa glavne studije
               
               
                           25.
                        
                        
                           Plan pokusa je sljedeći:
                           —   Prvi dan: Pojedinačno identificirati životinje i zabilježiti masu svake životinje i sva klinička opažanja. Primijeniti 1 %-tnu vodenu otopinu natrijevog laurel sulfata (SLS) na stražnju stranu svakog uha koristeći četkicu umočenu u otopinu SLS za premaz stražnje strane svakog uha u četiri do pet poteza. Sat vremena nakon tretiranja SLS-om primijeniti 25 μl odgovarajuće otopine ispitivane tvari, samog nosača ili pozitivne kontrole (paralelna ili nedavno provedena, ovisno o laboratorijskoj politici uzimajući u obzir stavke 11.-15.) na stražnji dio svakog uha.
                           —   Drugi, treći i sedmi dan: Ponoviti predtretman 1 %-tnom vodenom otopinomu SLS-a i postupak primjene proveden prvog dana.
                           —   Četvrti, peti i šesti dan: Bez tretiranja.
                           —   Osmi dan: Zabilježiti masu svake životinje i sva klinička opažanja. Otprilike 24 do 30 sati nakon početka primjene sedmog dana životinje humano usmrtiti. Izrezati drenažne aurikularne limfne čvorove iz svakog uha i staviti odvojeno u pufer PBS za svaku životinju. Pojedinosti i sheme za identifikaciju i disekciju limfnih čvorova mogu se naći u referenci (22). Za daljnje praćenje lokalne reakcije kože u glavnoj studiji mogu se u protokol studije uključiti dodatni parametri kao što su ocjenjivanje eritema ušiju ili mjerenja debljine uha (dobiveni uređajem za mjerenje debljine ili određivanjem mase uzorka uha pri obdukciji).
                        
                     
                  Priprema suspenzije stanica
               
               
                           26.
                        
                        
                           Suspenzija pojedinačnih stanica limfnih čvorova (LNC) svakog miša, odstranjenih bilateralno, priprema se tako da se limfni čvorovi stave između dva predmetna stakalca koja se lagano pritisnu kako bi se zdrobili čvorovi. Nakon provjere da se tkivo raširilo u tanki sloj, stakalca se odvajaju. Tkivo na oba stakalca se suspendira u PBS-u tako da se svako stakalce drži pod kutom nad Petrijevom zdjelicom i ispere PBS-om istodobno strugajući tkivo sa stakalca odgovarajućim priborom. Limfni čvorovi životinja u negativnoj kontroli su mali te je stoga važno njima pažljivo rukovati da ne dođe do umjetnog učinka na vrijednosti SI. Za ispiranje oba stakalca koristi se ukupno 1 ml PBS. Suspenzija iz stanica limfnih čvorova u Petrijevoj zdjelici se lagano homogenizira strugalom za stanice. Potom se mikropipetom prikupi 20 μL alikvota suspenzije LNC-a pazeći da se ne pobere membrana koja je vidljiva okom, i naknadno se pomiješa s 1,98 ml PBS kako bi se dobilo 2 ml uzorka. Istim postupkom se pripremi drugi uzorak od 2 ml, tako da za svaku životinju budu pripravljena dva uzorka.
                        
                     
                  Određivanje proliferacije stanica (mjerenje sadržaja ATP-a u limfocitima)
               
               
                           27.
                        
                        
                           Povećanje sadržaja ATP-a u limfnim čvorovima mjeri se metodom luciferin/luciferaza koristeći komplet za mjerenje ATP-a, koji mjeri bioluminiscenciju u relativnim luminiscentnim jedinicama (RLU). Trajanje analize od trenutka usmrćenja životinja do mjerenja sadržaja ATP-a za svaku pojedinačnu životinju mora biti jednako, otprilike 30 minuta, budući da se smatra da sadržaj ATP-a postupno opada po usmrćenju životinja (12). Stoga se serija postupaka od izrezivanja aurikularnih limfnih čvorova do mjerenja ATP-a mora dovršiti u 20 minuta prema unaprijed određenom rasporedu koji je jednak za svaku životinju. Luminiscencija ATP-a se mjeri u svakom uzorku od 2 ml tako da se za svaku životinju prikupe dva mjerenja ATP-a. Potom se određuje prosječna luminiscencija ATP-a koja se koristi u daljnjim izračunima (vidjeti stavak 30.).
                        
                     OPAŽANJA
               
                  Klinička opažanja
               
               
                           28.
                        
                        
                           Sve miševe treba pomno opažati najmanje jednom dnevno s obzirom na sve kliničke znakove lokalnog nadraživanja na mjestu primjene ili sustavne toksičnosti. Sva opažanja sustavno se bilježe za svaku životinju. Programi praćenja uključuju kriterije za pravodobno identificiranje miševa koji pokazuju znakove sustavne toksičnosti, prekomjernog lokalnog nadraživanja kože ili korozije kože za eutanaziju (36).
                        
                     
                  Tjelesne mase
               
               
                           29.
                        
                        
                           Kao što je navedeno u stavku 25., pojedinačne tjelesne mase treba mjeriti na početku testa i u vrijeme planiranog usmrćivanja životinja.
                        
                     IZRAČUN REZULTATA
               
                           30.
                        
                        
                           Rezultati za svaku tretiranu skupinu su izraženi kao prosječni indeks stimulacije (SI). SI se dobiva dijeljenjem prosječne RLU po životinji unutar svake skupine tretirane ispitivanom tvari i pozitivne kontrolne skupine s prosječnim RLU po životinji za kontrolnu skupinu otopine/nosača. Prosječan SI za kontrolne skupine tretirane nosačem tada iznosi 1.
                        
                     
                           31.
                        
                        
                           U postupku odlučivanja rezultat se smatra pozitivnim kada je SI ≥ 1,8 (10). Međutim, kod odlučivanja da se neki granični rezultat (tj. vrijednost SI između 1,8 i 2,5) proglasi pozitivnim može se, također, koristiti snaga učinka na dozu, statistički značaj i dosljednost reakcija u otapalu/nosaču i pozitivnoj kontroli (2) (3) (37).
                        
                     
                           32.
                        
                        
                           U slučaju graničnog pozitivnog rezultata s vrijednošću SI između 1,8 i 2,5, za potvrđivanje pozitivnog rezultata korisnici mogu, pored vrijednosti SI, uzeti u obzir i dodatne podatke kao što je odnos između doze i reakcije, dokaz sustavne toksičnosti ili prekomjerne nadraženosti i, prema potrebi, statistički značaj (10). Također je potrebno uzeti u obzir razna svojstva ispitivane tvari, uključujući i to ima li strukturne veze s poznatim senzibilizatorima kože, uzrokuje li pretjerano nadraživanje kože kod miševa i prirodu odnosa reakcije na dozu koja je opažena. Ova i druga pitanja detaljno su razmotrena drugdje (4).
                        
                     
                           33.
                        
                        
                           Prikupljanje podataka na razini pojedinačnog miša omogućit će statističku analizu prisutnosti i stupnja odnosa između doze i učinka. Svaka statistička procjena može uključiti ocjenu odnosa između doze i učinka te odgovarajući prilagođene usporedbe ispitnih skupina (npr. skupina s doziranjem u parovima u odnosu na paralelne kontrolne skupine s otapalom/nosačem). Statističke analize mogu uključiti linearnu regresiju ili Williamsov test za ocjenu trendova odnosa doza-učinak i Dunnettov test za usporedbe u parovima. Prilikom odabira prikladne metode statističke analize istraživač treba biti svjestan eventualnih razlika između varijanata kao i drugih problema s tim u vezi, zbog kojih može biti neophodna transformacija podataka ili neparametarska statistička analiza. U svakom slučaju istraživač će možda morati izvršiti izračune SI i statističke analize sa sigurnim točkama podataka (koji se ponekad nazivaju ‚netipične vrijednosti’) i bez njih.
                        
                     PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
               
                  Podaci
               
               
                           34.
                        
                        
                           Podatke treba sažeti u tabličnom obliku koji pokazuje vrijednosti relativne luminiscentne jedinice za pojedinačnu životinju, prosječnu relativnu luminiscentnu jedinicu po životinji za skupinu, s tim povezane pogreške (npr. SD, SEM) i prosječni SI za svaku dozirnu skupinu u odnosu na paralelnu kontrolnu skupinu s otapalom/nosačem.
                        
                     
                  Izvješće o ispitivanju
               
               
                           35.
                        
                        
                           Izvješće o ispitivanju treba sadržavati sljedeće informacije:
                           
                                        
                                    
                                    
                                       Ispitivane i kontrolne tvari:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   identifikacijski podaci (npr. brojevi CAS i EZ, ako poznati, podrijetlo, čistoća, poznate nečistoće, broj šarže),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   fizikalna priroda i fizikalno-kemijska svojstva (npr. hlapljivost, stabilnost, topljivost),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   ako je mješavina, sastav i relativni postoci sastojaka.
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Otapalo/nosač:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   identifikacijski podaci (čistoća, koncentracija (prema potrebi); upotrijebljeni volumen),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   dokaz opravdanosti izbora nosača.
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Ispitne životinje:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   podrijetlo miševa CBA,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   mikrobiološki status životinja, ako je poznat,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   broj i starost životinja,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   podrijetlo životinja, uvjeti smještaja, prehrana itd.
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Uvjeti ispitivanja:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   podrijetlo, broj šarže i podaci proizvođača o osiguranju kakvoće/kontroli kakvoće za komplet ATP,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinosti o pripravljanju i primjeni ispitivane tvari,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   dokaz opravdanosti odabira doze (uključujući rezultate predprobiranja, ako je provedeno),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   koncentracije nosača i ispitivane tvari koji su upotrijebljeni i ukupna količina ispitivane tvari koja je primijenjena,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uključujući vrstu/podrijetlo hrane, izvor vode),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinosti o programima tretiranja i uzorkovanja,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   metode mjerenja toksičnosti,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   kriteriji za određivanje studija pozitivnima ili negativnima,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinosti o bilo kojim odstupanjima od protokola i objašnjenje učinaka tog odstupanja na izradu i rezultate studije,
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Provjera pouzdanosti:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   sažetak rezultata najsvježije provjere pouzdanosti uključujući informacije o upotrijebljenoj ispitanoj tvari, koncentraciji i nosaču,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   podaci o paralelnim i/ili povijesnim pozitivnim kontrolama i paralelnim negativnim kontrolama (s otapalom/nosačem) za ispitni laboratorij,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   ako nije uključena paralelna pozitivna kontrola, datum i laboratorijsko izvješće za posljednju periodičku pozitivnu kontrolu i izvješće u kojem se navode povijesni pozitivni kontrolni podaci za laboratorij, kojima se opravdava neprovođenje paralelne pozitivne kontrole,
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Rezultati:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinačne mase miševa na početku doziranja i u vrijeme planiranog usmrćenja, srednja i povezana razlika između stvarne i predviđene pogreške (npr. SD, SEM) za svaku tretiranu skupinu,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   vrijeme prve pojave i znakova toksičnosti, uključujući eventualno nadraživanje kože na mjestu primjene, za svaku životinju,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   vrijeme usmrćenja životinje i mjerenja ATP-a za svaku životinju,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   tablica vrijednosti RLU za pojedinačne miševe i vrijednosti SI za svaku dozirnu tretiranu skupinu,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   srednja i povezana razlika između stvarne i predviđene pogreške (npr. SD, SEM) za RLU/miš za svaku tretiranu skupinu i rezultati analize netipičnih vrijednosti za svaku tretiranu skupinu,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   izračunani SI i prikladno mjerilo promjenljivosti koje uzima u obzir promjenljivost između životinja u ispitivanoj tvari i kontrolnim skupinama,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   odnos doza – reakcija,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   statistička analiza, ako je primjereno,
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Rasprava o rezultatima:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   kratki komentar o rezultatima, analiza doza-reakcije, i prema potrebi, statističke analize, sa zaključkom o tome treba li ispitivanu tvar smatrati senzibilizatorom kože.
                                                
                                             
                                 
                     REFERENCE
               
                           1.
                        
                        
                           OECD (2010.), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           2.
                        
                        
                           Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996.), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem, Toxicol., 34, str. 999-1002.
                        
                     
                           3.
                        
                        
                           Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996.), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem, Toxicol., 34, str. 985-997.
                        
                     
                           4.
                        
                        
                           Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998.), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, str. 327-333.
                        
                     
                           5.
                        
                        
                           Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000.), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, str. 49-59.
                        
                     
                           6.
                        
                        
                           ICCVAM (1999.), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
                        
                     
                           7.
                        
                        
                           Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, str. 258-273.
                        
                     
                           8.
                        
                        
                           Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, str. 274-286.
                        
                     
                           9.
                        
                        
                           Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, str. 249-257.
                        
                     
                           10.
                        
                        
                           ICCVAM (2010.), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd, based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]
                        
                     
                           11.
                        
                        
                           ICCVAM (2009.), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].
                        
                     
                           12.
                        
                        
                           Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008.), Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, str. 1-10.
                        
                     
                           13.
                        
                        
                           Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008.), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, str. 11-26.
                        
                     
                           14.
                        
                        
                           OECD (1992.), Skin Sensitisation, Test Guideline No 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           15.
                        
                        
                           Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008.), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, str. 1896-1904.
                        
                     
                           16.
                        
                        
                           Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009.), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, str. 90-96.
                        
                     
                           17.
                        
                        
                           Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993.), The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Meth., 160, 81-88.
                        
                     
                           18.
                        
                        
                           Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984.), Evaluation of the proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP. J. Immunol. Meth., 72, str. 127-132.
                        
                     
                           19.
                        
                        
                           Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003.), Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population. Biomat., 24, str. 27-34.
                        
                     
                           20.
                        
                        
                           Lundin A. (2000.), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Meth. Enzymol., 305, str. 346-370.
                        
                     
                           21.
                        
                        
                           ILAR (1996.), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
                        
                     
                           22.
                        
                        
                           ICCVAM (2009.), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]
                        
                     
                           23.
                        
                        
                           McGarry, H.F. (2007.), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, str. 71-89.
                        
                     
                           24.
                        
                        
                           Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994.), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, str. 13-31.
                        
                     
                           25.
                        
                        
                           OECD (2002.), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           26.
                        
                        
                           Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007.), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, str. 235.
                        
                     
                           27.
                        
                        
                           ICCVAM (2009.), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
                        
                     
                           28.
                        
                        
                           Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998.), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol., 21, str. 195-206.
                        
                     
                           29.
                        
                        
                           Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998.), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, str. 83-94.
                        
                     
                           30.
                        
                        
                           Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998.), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, str. 245-256.
                        
                     
                           31.
                        
                        
                           Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999.), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug Chem. Toxicol., 22, str. 491-506.
                        
                     
                           32.
                        
                        
                           Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005.), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, str. 60-68.
                        
                     
                           33.
                        
                        
                           Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005.), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, str. 721-728.
                        
                     
                           34.
                        
                        
                           Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007.), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, str. 1023-1028.
                        
                     
                           35.
                        
                        
                           ICCVAM (2009.), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]
                        
                     
                           36.
                        
                        
                           OECD (2000.), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           37.
                        
                        
                           Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998.), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health, 53 str. 563-79.
                        
                     
                           38.
                        
                        
                           OECD (2005.), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 34, ENV/JM/MONO (2005)14, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                  Dodatak 1.
                  DEFINICIJE
                  Točnost: stupanj podudarnosti između rezultata ispitne metode i prihvaćenih referentnih vrijednosti. To je mjerilo učinkovitosti ispitne metode i jedan od aspekata relevantnosti. Ovaj se termin često koristi umjesto ‚podudarnosti’ kako bi se označio udio točnih rezultata ispitne metode (38).
                  Referentna tvar: tvar koja uzrokuje ili ne uzrokuje preosjetljivost i koja se koristi kao standard za usporedbu s ispitivanom tvari. Referentna tvar treba imati sljedeće svojstva: i. dosljedni i pouzdani izvor(i); ii. strukturna i funkcionalna sličnost s razredom tvari koje se ispituju; iii. poznate fizikalno-kemijske značajke; iv. popratni podaci o poznatim učincima; i v. poznata učinkovitost u okviru željene reakcije.
                  Lažno negativna tvar: tvar koja je ispitnom metodom netočno određena kao negativna ili neaktivna kada je u stvari pozitivna ili aktivna.
                  Lažno pozitivna tvar: tvar koja je ispitivanjem netočno određena kao pozitivna ili aktivna kada je u stvari negativna ili neaktivna.
                  Opasnost: potencijal štetnog učinka na zdravlje ili okoliš. Štetni učinak se javlja samo ako je stupanj izloženosti dovoljno visok.
                  Ponovljivost između laboratorija: mjera u kojoj različiti kvalificirani laboratoriji koji koriste isti protokol i ispituju istu tvar, mogu proizvesti kvalitativno i kvantitativno slične rezultate. Ponovljivost između laboratorija se određuje prije i tijekom validacijskog postupka i pokazuje u kojoj se mjeri neko ispitivanje može uspješno prenijeti iz jednog laboratorija u drugi, također navedena kao međulaboratorijska ponovljivost (38).
                  Ponovljivost u laboratoriju: određivanje u kojoj mjeri stručno osoblje u okviru istog laboratorija može uspješno ponoviti rezultate koristeći određeni protokol u različitim trenucima. Također se navodi kao unutarlaboratorijska ponovljivost (38).
                  Netipična vrijednost: netipična vrijednost je zapažanje koje značajno odstupa od ostalih vrijednosti u nasumičnom uzorku populacije.
                  Osiguranje kvalitete: postupak upravljanja pri kojem pojedinci neovisni od osoba koje provode ispitivanje, ocjenjuju ispunjavanje standarda laboratorijskog ispitivanja, zahtjeve i postupke vođenja evidencije te točnost prijenosa podataka.
                  Pouzdanost: mjera u kojoj se ispitna metoda može ponoviti unutar i između laboratorija tijekom vremena uporabom istog protokola. Ocjenjuje se izračunavanjem unutarlaboratorijske i međulaboratorijske ponovljivosti (38).
                  Preosjetljivost kože: imunološki proces koji se javlja kada je osjetljivi pojedinac lokalno izložen kemijskom alergenu koji uzrokuje imunosnu reakciju kože koja može dovesti do kontaktne preosjetljivosti.
                  Indeks stimulacije (SI): izračunana vrijednost za ocjenjivanje potencijala preosjetljivosti kože koju može uzrokovati ispitivana tvar, koja je omjer proliferacije u tretiranim skupinama i paralelnoj kontrolnoj skupini s nosačem.
                  Ispitivana tvar (navodi se također kao i ispitivana kemikalija): svaka tvar ili smjesa koja je ispitana ovom metodom.
               
               
                  B.51.   PREOSJETLJIVOST KOŽE: ANALIZA LOKALNIH LIMFNIH ČVOROVA: BrdU-ELISA
               
               UVOD
               
                           1.
                        
                        
                           Smjernice OECD-a za ispitivanje kemijskih tvari i ispitnih metoda EU-a se periodički preispituju u svjetlu znanstvenog napretka, promjene regulatornih potreba i razmatranja o dobrobiti životinja. Prva ispitna metoda (TM) (B.42) za utvrđivanje preosjetljivosti kože kod miševa, analiza lokalnih limfnih čvorova (LLNA; Smjernica za ispitivanje OECD-a 429) je revidirana (1. i poglavlje B.42. u ovome Prilogu). Objavljeni su detalji validacije metode LLNA i pregled povezanog djelovanja (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Kod LLNA se za mjerenje proliferacije limfocita uporablja radioizotopni timidin ili jod te je stoga uporaba ove analize ograničena ako je nabava, uporaba ili odlaganje radioaktivnosti problematična. LLNA: BrdU-ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) je neradioaktivna inačica metode LLNA, u kojoj se koristi radioaktivno neoznačeni 5-bromo 2-deoksiuridin (BrdU) (CAS br. 59-14-3) u sustavu ispitivanja koji se temelji na ELISA za mjerenje proliferacije limfocita. Ispitnu metodu LNNA: BrdU-ELISA je validirao i pregledao međunarodni nezavisni odbor za stručnu reviziju koji ju je preporučio kao korisnu za utvrđivanje kemikalija koje izazivaju preosjetljivost i kemikalija koje ne izazivaju preosjetljivost, uz određena ograničenja (10) (11) (12). Svrha ove ispitne metode je procjena potencijala kemikalija da senzibiliziraju kožu kod životinja (tvari i smjese). Poglavlje B.6. ovog Priloga i Smjernica za ispitivanje OECD-a 406 koriste testove na zamorcima, konkretnije maksimizacijski test sa zamorcima i Buehlerov test (13). Metoda LLNA (poglavlje B.42 ovog Priloga; Smjernica za ispitivanje OECD-a 429) i dvije neradioaktivne inačice, analiza LLNA: BrdU-ELISA (poglavlje B.51 ovog Priloga; Smjernica za ispitivanje OECD-a 442 B) i LLNA: DA (poglavlje B.50 ovog Priloga; Smjernica za ispitivanje OECD-a 442 A), sve imaju prednosti u odnosu na testove na zamorcima iz metode B.6. i Smjernica za ispitivanje OECD-a 406 (13) u smislu manje i usavršene uporabe životinja.
                        
                     
                           2.
                        
                        
                           Slično kao i metodom LLNA, LLNA: BrdU-ELISA proučava indukcijsku fazu senzibilizacije kože i pruža kvantitativne podatke pogodne za procjenjivanje reakcije na dozu. Pored toga, sposobnost otkrivanja senzibilizatora kože bez uporabe radioaktivne oznake za DNA isključuje mogućnost profesionalne izloženosti radioaktivnosti i pitanja odlaganja otpada. To zauzvrat može omogućiti povećanu uporabu miševa za otkrivanje senzibilizatora kože, čime se može dodatno smanjiti uporaba zamoraca za ispitivanje potencijala preosjetljivosti kože (tj. B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (13).
                        
                     DEFINICIJE
               
                           3.
                        
                        
                           Korištene definicije navedene su u Dodatku 1.
                        
                     POČETNA RAZMATRANJA I OGRANIČENJA
               
                           4.
                        
                        
                           Metoda LLNA: BrdU-ELISA je inačica metode LLNA za utvrđivanje kemikalija koje imaju potencijal za uzrokovanje senzibilizacije kože uz posebna ograničenja. To nužno ne znači da u svim slučajevima metodu LLNA: BrdU-ELISA treba primijeniti umjesto metode LLNA ili testa sa zamorcima (tj. B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (13), već da je pokus jednakovrijedan i da se može koristiti kao alternativa kod koje za pozitivne i negativne rezultate obično nije potrebna daljnja potvrda (10) (11). Ispitni laboratoriji trebaju uzeti u obzir sve dostupne podatke o ispitivanoj tvari prije provođenja studije. Spomenuti podaci uključuju identitet i kemijsku strukturu ispitivane tvari, njezina fizikalno-kemijska svojstva, rezultate svih in vitro ili in vivo ispitivanja toksičnosti i toksikološke podatke o strukturno povezanim kemikalijama. Ti se podaci uzimaju u obzir radi utvrđivanja prikladnosti metode LLNA: BrdU-ELISA za odnosnu tvar (s obzirom na nekompatibilnost određenih vrsta kemikalija s metodom LLNA: BrdU-ELISA - vidjeti stavak 5.) i pomoći kod odabira doze.
                        
                     
                           5.
                        
                        
                           Metoda LLNA: BrdU-ELISA je metoda in vivo, pa kao takva ne isključuje uporabu životinja u procjeni kontaktne senzibilizacijske aktivnosti. Ona, međutim, ima potencijala smanjiti uporabu životinja u tu svrhu u usporedbi s testovima na zamorcima (B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406) (13). Nadalje, metoda LLNA: BrdU-ELISA nudi znatno finiji način uporabe životinja u ispitivanju kontaktne senzibilizacije, budući da za razliku od B.6 i Smjernice OECD-a 406 nije potrebno izazivati provokacijski inducirane hipersenzibilizirane dermalne reakcije. Nadalje, za metodu LLNA: BrdU-ELISA nije potrebno koristiti adjuvans, kao što je to slučaj s maksimizacijskim testom sa zamorcima (poglavlje B.6 ovog Priloga, 13). Metoda LLNA: BrdU-ELISA smanjuje patnju životinja. Unatoč prednostima metode LLNA: BrdU-ELISA u odnosu na B.6 i Smjernicu OECD-a 406 (13), postoje neka ograničenja zbog kojih može biti potrebno primijeniti B.6 ili Smjernicu OECD-a 406 (npr. ispitivanje određenih metala, lažni pozitivni nalazi kod nekih sredstava s nadražujućim djelovanjem na kožu (kao što su neke površinski aktivne tvari) (6) (1. i poglavlje B.42 iz ovog Priloga), topivost ispitivane tvari). Povrh toga, ispitivanja na zamorcima mogu biti potrebna za kemijske razrede ili tvari koje sadrže funkcionalne skupine za koje je dokazano da djeluju kao potencijalni zbunjujući faktori (15) (tj. B.6; Smjernica za ispitivanje OECD-a 406 (13). Preporučuje se da se ograničenja koja su utvrđena za metodu LLNA) (1. i poglavlje B.42 iz ovog Priloga) primjenjuju i na metodu LLNA: BrdU-ELISA (10). Pored takvih utvrđenih ograničenja metoda LLNA: BrdU-ELISA se može primjenjivati za ispitivanje bilo koje kemikalije, osim ako ne postoji mogućnost da bi njezina svojstva mogla utjecati na točnost metode LLNA: BrdU-ELISA. Pored toga, potrebno je uzeti u obzir mogućnost graničnih pozitivnih rezultata kada se dobiju vrijednosti stimulacijskog indeksa (SI) između 1,6 i 1,9 (vidjeti stavke 31–32.). To se temelji na bazi podataka za validaciju s 43 tvari s indeksom stimulacije ≥ 1,6 (vidjeti stavak 6.), za koje su metodom LLNA: BrdU-ELISA pravilno određena sva 32 senzibilizatora pri LLNA, ali su nepravilno određene dvije od 11 tvari koje pri LLNA ne izazivaju preosjetljivost s vrijednostima stimulacijskog indeksa između 1,6 i 1,9 (tj. granično pozitivna vrijednost) (10). Međutim, budući da je za određivanje vrijednosti stimulacijskog indeksa i izračun predvidljivih svojstava ispitivanja uporabljen isti set podataka, navedeni rezultati mogu precijeniti stvarna predvidljiva svojstva.
                        
                     NAČELO ISPITIVANJA
               
                           6.
                        
                        
                           Metoda LLNA: BrdU-ELISA počiva na temeljnom načelu prema kojem senzibilizatori induciraju proliferaciju limfocita u limfnom čvoru čime dolazi do drenaže mjesta kemijske primjene. Ta je proliferacija proporcionalna primijenjenoj dozi i potencijalu primijenjenog alergena te predstavlja jednostavan način za dobivanje kvantitativno izmjerene senzibilizacije. Proliferacija se mjeri usporedbom prosječne proliferacije svake ispitivane skupine s prosječnom proliferacijom u kontrolnoj skupini tretiranoj nosačem. Određuje se omjer prosječne proliferacije u svakoj tretiranoj skupini i proliferacije u paralelnoj kontrolnoj skupini s nosačem, nazvan indeks stimulacije, koji mora biti ≥ 1,6 da bi se ispitivana tvar mogla dalje vrednovati kao potencijalni senzibilizator kože. Ovdje opisane metode temelje se na mjerenju sadržaja BrdU kako bi se pokazao povećani broj stanica koje proliferiraju u aurikularnin limfnim čvorovima koji uzrokuju drenažu. BrdU je analogan timidinu i slično se uključuje u proliferirajuće stanice DNA. Uključivanje BrdU se mjeri testom ELISA koji koristi specifično protutijelo za BrdU, koje je također označeno peroksidazom. Ako se doda supstrat, peroksidaza reagira sa supstratom i nastane obojani produkt koji se količinski određuje pri određenoj apsorbanci koristeći čitač mikrotitarskih pločica.
                        
                     OPIS ANALIZE
               
                  Odabir životinjskih vrsta
               
               
                           7.
                        
                        
                           Za ovaj test odabrana vrsta su miševi. Validacijske studije za LLNA: BrdU-ELISA provedene su isključivo sa sojem CBA/JN, koji se stoga smatra preporučenim sojem (10) (12). Koriste se mlade odrasle ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu skotne. Na početku studije životinje trebaju biti stare između osam do 12 tjedana, a odstupanje mase životinja treba biti minimalno i ne smije prelaziti 20 % srednje mase. Drugi sojevi i mužjaci mogu se koristiti ako postoji dovoljno podataka da u reakciji prema metodi LLNA: BrdU-ELISA nema značajnih razlika specifičnih za soj i/ili spol.
                        
                     
                  Uvjeti smještaja i prehrane
               
               
                           8.
                        
                        
                           Miševi trebaju biti smješteni u skupinama (16), osim ako se ne dokaže prikladna znanstvena utemeljenost za pojedinačni smještaj. Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 °C (± 3 °C). Iako bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a poželjno je da ne prijeđe 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50–60 %. Svjetlost treba biti umjetna, s tim da je redoslijed 12 sati svjetla, 12 sati tame. Za hranjenje se može koristiti konvencionalna laboratorijska hrana s neograničenom količinom vode za piće.
                        
                     
                  Priprema životinja
               
               
                           9.
                        
                        
                           Životinje se nasumice biraju, jednoznačno identificiraju (ali ne bilo kojim oblikom označavanja ušiju) i drže u kavezima najmanje pet dana prije početka doziranja kako bi se aklimatizirale na laboratorijske uvjete. Prije početka tretiranja sve životinje treba pregledati kako bi se potvrdilo da nemaju zapaženih lezija kože.
                        
                     
                  Priprema ispitnih otopina
               
               
                           10.
                        
                        
                           Tvrde kemikalije se prije primjene na uho miša trebaju rastopiti ili suspendirati u otapalima/nosačima i prema potrebi razrijediti. Tekuće kemikalije se mogu nanijeti čiste ili razrijeđene prije doziranja. Netopive kemikalije, koje se obično koriste u medicinskim uređajima, trebaju se podvrgnuti postupku pretjerane ekstrakcije u odgovarajućem otapalu kako bi se prije primjene na uho miša otkrili svi ekstraktibilni sastojci za ispitivanje. Ispitivane tvari se pripremaju svakodnevno osim ako podaci o stabilnosti ne dokažu prihvatljivost njihova skladištenja.
                        
                     
                  Provjera pouzdanosti
               
               
                           11.
                        
                        
                           Kemikalije pozitivne kontrole koriste se kako bi se dokazalo da se pokus provodi na odgovarajući način tako što reagiraju prikladnom i ponovljivom preosjetljivošću kao ispitivana tvar koja uzrokuje preosjetljivost, čiji je stupanj reakcije točno utvrđen. Preporučuje se uvođenje paralelne pozitivne kontrole radi dokazivanja sposobnosti laboratorija da uspješno izvede svaku analizu i da se omogući ocjenjivanje ponovljivosti i usporedivosti unutar jednog ili između više laboratorija. Određena regulatorna tijela zahtijevaju pozitivnu kontrolu za svaku studiju te se, stoga, korisnici pozivaju da prije izvođenja metode LLNA: BrdU-ELISA kontaktiraju relevantna tijela. Sukladno tomu, potiče se rutinska uporaba paralelne pozitivne kontrole kako bi se izbjeglo dodatno ispitivanje na životinjama radi ispunjavanja zahtjeva koji se mogu javiti zbog periodičke uporabe paralelne kontrole (vidjeti stavak 12.). Pozitivna kontrola treba proizvesti pozitivnu reakciju na metodu LLNA: BrdU-ELISA kod razine izlaganja za koju se očekuje da će dati porast indeksa stimulacije (SI) ≥ 1,6 u odnosu na negativnu kontrolnu skupinu. Dozu pozitivne kontrole treba odabrati tako da ne uzrokuje prekomjerno nadraživanje kože ili sustavnu toksičnost i da je indukcija ponovljiva, ali ne prekomjerna (tj. SI > 14 se smatra pretjeranim). Poželjne pozitivne kontrole su 25 %-tni heksilcinamaldehid (CAS br. 101-86-0) i 25 %-tni eugenol (CAS br. 97-53-0) u acetonu: maslinovo ulje (4:1; v/v). Moguće su okolnosti u kojima se, uz odgovarajuće obrazloženje, mogu koristiti druge pozitivne kontrole koje ispunjavaju gore navedene kriterije.
                        
                     
                           12.
                        
                        
                           Iako se preporučuje uvođenje paralelne skupine pozitivne kontrole, u određenim situacijama periodičko ispitivanje (tj. u intervalima ≤ 6 mjeseci) pozitivne kontrole može biti prikladno za laboratorije koji redovito izvode metodu LLNA: BrdU-ELISA (tj. najmanje jednom mjesečno) i imaju povijesnu bazu podataka pozitivne kontrole koja dokazuje sposobnost laboratorija da dobiva ponovljive i točne rezultate pozitivnih kontrola. Odgovarajuća osposobljenost za metodu LLNA: BrdU-ELISA može se uspješno dokazati dobivanjem dosljednih pozitivnih rezultata pozitivne kontrole u najmanje deset neovisnih ispitivanja provedenih u razumnom vremenskom razdoblju (manje od jedne godine).
                        
                     
                           13.
                        
                        
                           Paralelnu skupinu pozitivne kontrole potrebno je uvesti svaki put kada dođe do proceduralne promjene metode LLNA: BrdU-ELISA (npr. zamjena stručnog osoblja, promjena materijala i/ili reagensa ispitne metode, promjena opreme, promjena izvora ispitivanih životinja) i te se promjene moraju navesti u laboratorijskim izvješćima. Potrebno je uzeti u obzir učinak tih promjena na primjerenost prethodno uspostavljene povijesne baze podataka prilikom utvrđivanja potrebe za uspostavom nove baze povijesnih podataka radi dokazivanja dosljednosti rezultata pozitivne kontrole.
                        
                     
                           14.
                        
                        
                           Istraživači trebaju biti svjesni da odluka o provođenju periodičke umjesto paralelne studije pozitivne kontrole utječe na prikladnost i prihvatljivost negativnih rezultata dobivenih bez paralelne pozitivne kontrole u razdoblju između svake periodičke pozitivne kontrole. Na primjer, ako se periodičkom pozitivnom kontrolom dobije lažni negativni rezultat, mogu se dovesti u pitanje negativni rezultati ispitivane tvari dobiveni u razdoblju između posljednje prihvatljive periodičke pozitivne kontrolne studije i neprihvatljive periodičke pozitivne kontrolne studije. Kod odlučivanja o uvođenju paralelne pozitivne kontrole ili provođenju samo periodičkih pozitivnih kontrola potrebno je pažljivo uzeti u obzir posljedice tih rezultata. Također je potrebno razmotriti mogućnost uporabe manjeg broja životinja u skupini paralelne pozitivne kontrole ako je to opravdano sa znanstvenog stajališta i ako laboratorij na temelju svojih posebnih povijesnih podataka dokaže da se može koristiti manje miševa (17).
                        
                     
                           15.
                        
                        
                           Iako pozitivnu kontrolnu tvar treba ispitati u nosaču za koji je poznato da izaziva dosljednu reakciju (npr. aceton; maslinovo ulje; 4:1, v/v), u nekim regulatornim situacijama bit će potrebno i ispitivanje u nestandardnom nosaču (klinički/kemijski relevantnoj formulaciji) (18). Ako se paralelna pozitivna kontrola ispituje u drugačijem nosaču od ispitivane tvari, potrebno je uključiti posebnu kontrolu s nosačem za paralelnu pozitivnu kontrolu.
                        
                     
                           16.
                        
                        
                           U slučajevima kada se ocjenjuju tvari iz posebnog kemijskog razreda ili raspona reakcija, referentne tvari mogu također biti korisne za dokazivanje ispravnosti ispitne metode za otkrivanje potencijala preosjetljivosti kože tih vrsta ispitivanih tvari. Prikladne referentne tvari moraju imati sljedeće značajke:
                           
                                       —
                                    
                                    
                                       strukturnu i funkcionalnu sličnost s razredom ispitivane tvari,
                                    
                                 
                                       —
                                    
                                    
                                       poznata fizikalna/kemijska svojstva,
                                    
                                 
                                       —
                                    
                                    
                                       popratne podatke iz LLNA: BrdU-ELISA,
                                    
                                 
                                       —
                                    
                                    
                                       popratne podatke od drugih životinjskih modela i/ili ljudi.
                                    
                                 
                     ISPITNI POSTUPAK
               
                  Broj životinja i visine doze
               
               
                           17.
                        
                        
                           Po jednoj dozirnoj skupini koriste se najmanje četiri životinje s najmanje tri koncentracije ispitivane tvari, plus paralelna negativna kontrolna skupina tretirana samo nosačem za ispitivanu tvar i jedna pozitivna kontrola (paralelna ili nedavno provedena, na temelju laboratorijske politike uzimajući u obzir stavke 11.-15.). Potrebno je razmotriti ispitivanje višestrukih doza pozitivne kontrole, posebno ako se ispitivanje pozitivne kontrole izvodi s prekidima. Osim tretiranja ispitivanom tvari, sa životinjama u kontrolnim skupinama treba postupati i tretirati ih jednako kao i životinje u tretiranim skupinama.
                        
                     
                           18.
                        
                        
                           Odabir doze i nosača treba se temeljiti na preporukama navedenim u referencama (2) i (19). Uzastopne doze se obično odabiru iz odgovarajućih serija koncentracija kao što su 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Odabir uporabljene serije koncentracija mora biti popraćen odgovarajućim znanstvenim obrazloženjem. Kod odabira tri uzastopne koncentracije treba uzeti u obzir sve postojeće toksikološke podatke (o akutnoj toksičnosti i nadraživanju kože) te strukturne i fizikalno-kemijske podatke o odnosnoj ispitivanoj tvari (i/ili strukturno povezanim tvarima), ako dostupne, kako bi se najvišom koncentracijom maksimaliziralo izlaganje, ali istodobno izbjegla sustavna toksičnost i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože (19) (20 i poglavlje B.4 iz ovog Priloga). U nedostatku tih podataka može biti potrebno provesti početno predprobiranje (vidjeti stavke 21.-24.).
                        
                     
                           19.
                        
                        
                           Nosač ne smije ometati niti utjecati na rezultate ispitivanja i treba se odabrati na temelju povećanja topljivosti s ciljem postizanja što viših koncentracija, a da se istodobno proizvede otopina/suspenzija pogodna za primjenu ispitivane tvari. Kao nosači preporučuju se aceton: maslinovo ulje (4:1 v/v), N,N-dimetilformamid, metil etil keton, propilen glikol i dimetil sulfoksid (6), ali mogu se koristiti i drugi ako se to dostatno znanstveno obrazloži. U nekim situacijama može biti potrebno primijeniti klinički relevantno otapalo ili komercijalnu formulaciju u kojoj se ispitivana tvar prodaje, kao dodatnu kontrolu. Posebno treba paziti da u sustav nosača budu ugrađene hidrofilne ispitivane tvari koje vlaže kožu i ne isušuju se odmah, uključivanjem odgovarajućih sredstava za otapanje (npr. 1 %-tnim Pluronic® L92). Znači, nosače koji su u potpunosti vodeni treba izbjegavati.
                        
                     
                           20.
                        
                        
                           Obrada limfnih čvorova pojedinačnih miševa omogućuje ocjenjivanje promjenljivosti među životinjama i statističku usporedbu razlika između mjerenja ispitivanom tvari i kontrolnom skupinom s nosačem (vidjeti stavak 33.). Pored toga, ocjenjivanje mogućnosti smanjenja broja miševa u skupini pozitivne kontrole je izvedivo nakon što se prikupe pojedinačni podaci o životinjama (17). Određena regulatorna tijela zahtijevaju da se prikupe pojedinačni podaci o životinjama. Redovito prikupljanje pojedinačnih podataka o životinjama osigurava prednosti za dobrobit životinja, tako što se izbjegava dvostruko ispitivanje koje bi bilo potrebno, ako bi regulatorna tijela kasnije razmatrala rezultate, izvorno prikupljene na jedan način (npr. preko grupnih podataka o životinjama), zajedno s drugim zahtjevima (npr. pojedinačni podaci o životinjama).
                        
                     
                  Predprobiranje
               
               
                           21.
                        
                        
                           Ako nisu dostupne informacije za određivanje najviše doze za ispitivanje (vidjeti stavak 18.) potrebno je obaviti predprobiranje kako bi se odredila odgovarajuća visina doze za ispitivanje u LLNA: BrdU-ELISA. Svrha predprobiranja je pružiti smjernice za odabir najviše doze za uporabu u glavnoj studiji LLNA: BrdU-ELISA, ako nisu dostupne informacije o koncentraciji koja uzrokuje sustavnu toksičnost (vidjeti stavak 24.) i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože (vidjeti stavak 23.). Najveća ispitana visina doze je 100 %-tna koncentracija ispitivane tvari za tekućine ili najveća moguća koncentracija za krute tvari ili suspenzije.
                        
                     
                           22.
                        
                        
                           Predprobiranje se izvodi u uvjetima koji su identični glavnoj studiji LLNA: BrdU-ELISA, s razlikom da se ne ocjenjuje proliferacija limfnih čvorova i može se koristiti manje životinja po dozirnoj skupini. Preporučuje se uporaba jedne ili dvije životinje po dozirnoj skupini. Svi miševi se svakodnevno prate s ciljem otkrivanja kliničkih znakova sustavne toksičnosti ili lokalnog nadraživanja na mjestu primjene. Tjelesna masa se bilježi prije ispitivanja i prije završetka (6. dan). Oba uha svakog miša se pregledavaju radi otkrivanja eritema i boduju prema tablici 1. (20 i poglavlje B.4 iz ovog Priloga). Debljina uha se mjeri posebnim mjernim instrumentom (npr. digitalnim mikrometrom ili mjeračem debljine Peacock Dial) prvi dan (prije doze), treći dan (otprilike 48 sati nakon prve doze) i šesti dan. Pored toga, šesti dan se debljina uha može odrediti mjerenjem mase uzorka uha dobivenog probijanjem, što se izvodi nakon humanog usmrćenja. Prekomjerno lokalno nadraživanje kože se označuje bodovima za eriteme ≥ 3 i/ili povećanjem debljine uha za ≥ 25 % na bilo koji dan mjerenja (21) (22). Najviša odabrana doza za glavnu studiju LLNA: BrdU-ELISA je sljedeća niža doza iz serije koncentracija u predprobiranju (vidjeti stavak 18.) koja ne uzrokuje sustavnu toksičnost i/ili prekomjerno lokalno nadraživanje kože.
                           
                              Tablica 1.
                           
                           
                              Bodovanje eritema
                           
                           
                                       Zapažanja
                                    
                                    
                                       Bodovi
                                    
                                 
                                       Bez eritema
                                    
                                    
                                       0
                                    
                                 
                                       Vrlo slabi eritem (jedva zamjetan)
                                    
                                    
                                       1
                                    
                                 
                                       Dobro vidljiv eritem
                                    
                                    
                                       2
                                    
                                 
                                       Umjeren do jak eritem
                                    
                                    
                                       3
                                    
                                 
                                       Jak eritem (crvenilo cikle) do nekroze kože što onemogućuje stupnjevanje eritema
                                    
                                    
                                       4
                                    
                                 
                     
                           23.
                        
                        
                           Pored 25 %-tnog povećanja debljine uha (21)(22), statistički značajno povećanje debljine uha kod tretiranih miševa u odnosu na kontrolne miševe se, također, koristi za određivanje nadražujućih tvari u LLNA (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Međutim, iako se statistički značajna povećanja debljine uha mogu javiti, ona se posebno ne povezuju s prekomjernim nadraživanjem kada su manja od 25 % (25) (26) (27) (28) (29).
                        
                     
                           24.
                        
                        
                           Sljedeća klinička opažanja mogu ukazivati na sustavnu toksičnost (30) kada se koriste u okviru cjelokupne ocjene te stoga mogu naznačiti najvišu dozu za uporabu u glavnoj LLNA: BrdU-ELISA: promjene u djelovanju živčanog sustava (npr. piloerekcija, ataksija, tremori i grčevi); promjene u ponašanju (npr. agresivnost, promjene u njezi, značajna promjena u stupnju aktivnosti); promjene u disanju (npr. promjene učestalosti i intenziteta disanja kao što su dispneja, zadihanost i hroptanje) i promjene u konzumaciji hrane i vode. Prilikom ocjenjivanja treba uzeti u obzir znakove letargije i/ili nereagiranja, sve kliničke znakove boli i patnje koji nisu blagi ili trenutačni, ili gubitak težine > 5 % od prvog do šestog dana i smrtnost. Životinje koje su pred uginućem ili pokazuju znakove teške boli i patnje trebaju se humano usmrtiti (31).
                        
                     
                  Plan pokusa glavne studije
               
               
                           25.
                        
                        
                           Plan pokusa je sljedeći:
                           —   Prvi dan: Pojedinačno identificirati životinje i zabilježiti masu svake životinje i sva klinička opažanja. Primijeniti 25 μl odgovarajuće otopine ispitivane tvari, samog nosača ili pozitivne kontrole (paralelna ili nedavno provedena, ovisno o laboratorijskoj politici uzimajući u obzir stavke 11.-15.) na stražnji dio svakog uha.
                           —   Drugi i treći dan: Ponoviti postupak primjene proveden prvog dana.
                           —   Četvrti dan: Bez tretiranja.
                           —   Peti dan: Intraperitonealno ubrizgavanje 0,5 ml (5 mg/miš) otopine BrdU (10 mg/ml).
                           —   Šesti dan: Zabilježiti masu svake životinje i sva klinička opažanja. Otprilike 24 sata (24 h) nakon ubrizgavanja BrdU životinje humano usmrtiti. Izrezati drenažne aurikularne limfne čvorove iz svakog uha i staviti odvojeno u pufer PBS za svaku životinju. Pojedinosti i sheme za identifikaciju i disekciju limfnih čvorova mogu se naći u referenci (17). Za daljnje praćenje lokalne reakcije kože u glavnoj studiji mogu se u protokol studije uključiti dodatni parametri kao što su ocjenjivanje eritema ušiju ili mjerenja debljine uha (dobiveni uređajem za mjerenje debljine ili određivanjem mase uzorka uha pri obdukciji).
                        
                     
                  Priprema suspenzije stanica
               
               
                           26.
                        
                        
                           Suspenzija pojedinačnih stanica limfnih čvorova (LNC) svakog miša, odstranjenih bilateralno, priprema se blagom mehaničkom dezagregacijom kroz žičanu mrežu od nehrđajućeg čelika s otvorima od 200 mikrona ili drugom prihvatljivom tehnikom za dobivanje suspenzije pojedinačne stanice (npr. uporabom plastičnog tučka za jednokratnu uporabu za drobljenje limfnih čvorova, nakon čega slijedi filtriranje kroz najlonsku mrežu s otvorima od 70 mikrona). Postupak pripreme suspenzije LNC je kritičan za ovu analizu te, stoga, svaki izvođač mora prethodno steći tu vještinu. Limfni čvorovi životinja u negativnoj kontroli su mali te je, stoga, s njima važno pažljivo rukovati da ne dođe do umjetnog učinka na vrijednosti SI. U svakom slučaju ciljani obujam suspenzije LNC treba se prilagoditi utvrđenom optimiziranom obujmu (približno 15 ml). Optimizirani obujam temelji se na postizanju prosječne apsorbance negativne kontrolne skupine u rasponu 0,1–0,2.
                        
                     
                  Određivanje proliferacije stanica (mjerenje sadržaja BrdU u DNA limfocita)
               
               
                           27.
                        
                        
                           BrdU se mjeri testom ELISA koristeći trgovački komplet (npr. Roche Applied Science, Mannheim, Njemačka, br. u katalogu 11 647 229 001). Ukratko u jažice mikroploča s ravnim dnom doda se 100 μL suspenzije LNC u tri primjerka. Nakon fiksacije i denaturacije LNC u svaku se jažicu dodaje anti-BrdU protutijelo i omogući reakcija. Potom se anti-BrdU protutijelo ukloni ispiranjem, doda se otopina supstrata i omogući nastanak kromogena. Potom se izmjeri apsorbanca pri 370 nm s referentnom valnom duljinom 492 nm. U svakom slučaju ispitni uvjeti analize moraju biti optimizirani (vidjeti stavak 26.).
                        
                     OPAŽANJA
               
                  Klinička opažanja
               
               
                           28.
                        
                        
                           Sve miševe treba pomno opažati najmanje jednom dnevno s obzirom na sve kliničke znakove bilo lokalnog nadraživanja na mjestu primjene ili sustavne toksičnosti. Sva opažanja sustavno se bilježe za svaku životinju. Programi praćenja uključuju kriterije za pravodobno identificiranje miševa koji pokazuju znakove sustavne toksičnosti, prekomjernog lokalnog nadraživanja kože ili korozije kože za eutanaziju (31).
                        
                     
                  Tjelesne mase
               
               
                           29.
                        
                        
                           Kao što je navedeno u stavku 25., pojedinačne tjelesne mase treba mjeriti na početku testa i u vrijeme planiranog usmrćivanja životinja.
                        
                     IZRAČUN REZULTATA
               
                           30.
                        
                        
                           Rezultati za svaku tretiranu skupinu su izraženi kao prosječni indeks stimulacije (SI). SI se dobiva dijeljenjem prosječnog indeksa označivanja BrdU po životinji unutar svake skupine tretirane ispitivanom tvari i pozitivne kontrolne skupine s prosječnim indeksom označivanja BrdU za kontrolnu skupinu otopine/nosača. Prosječan SI za kontrolne skupine tretirane nosačem tada iznosi 1.
                           Indeks označivanja BrdU se određuje kako slijedi:
                           indeks označivanja BrdU = (ABSem – ABS blankem) – (ABSref – ABS blankref)
                           pri čemu: em = valna duljina emisije; i ref = referentna valna duljina.
                        
                     
                           31.
                        
                        
                           U postupku odlučivanja rezultat se smatra pozitivnim kada je SI ≥ 1,6 (10). Međutim, kod odlučivanja da se neki granični rezultat (tj. vrijednost SI između 1,6 i 1,9) proglasi pozitivnim može se također koristiti snaga učinka na dozu, statistički značaj i dosljednost reakcija u otapalu/nosaču i pozitivnoj kontroli (3 (6) (32).
                        
                     
                           32.
                        
                        
                           U slučaju graničnog pozitivnog rezultata s vrijednošću SI između 1,6 i 1,9, za potvrđivanje pozitivnog rezultata korisnici mogu, pored vrijednosti SI, uzeti u obzir i dodatne podatke kao što je odnos između doze i reakcije, dokaz sustavne toksičnosti ili prekomjerne nadraženosti i, prema potrebi, statistički značaj (10). Potrebno je također uzeti u obzir razna svojstva ispitivane tvari, uključujući i to ima li strukturne veze s poznatim senzibilizatorima kože, uzrokuje li pretjerano nadraživanje kože kod miševa i prirodu odnosa opažene reakcije na dozu. Ova i druga pitanja detaljno su razmotrena drugdje (4).
                        
                     
                           33.
                        
                        
                           Prikupljanje podataka na razini pojedinačnog miša omogućit će statističku analizu prisutnosti i stupnja odnosa između doze i učinka. Svaka statistička procjena može uključiti ocjenu odnosa između doze i učinka te odgovarajući prilagođene usporedbe ispitnih skupina (npr. skupina s doziranjem u parovima u odnosu na paralelne kontrolne skupine s otapalom/nosačem). Statističke analize mogu uključiti linearnu regresiju ili Williamsov test za ocjenu trendova odnosa doza-učinak i Dunnettov test za usporedbe u parovima. Prilikom odabira prikladne metode statističke analize istraživač treba biti svjestan eventualnih razlika između varijanata kao i drugih problema s tim u vezi, zbog kojih može biti neophodna transformacija podataka ili neparametarska statistička analiza. U svakom slučaju istraživač će možda morati izvršiti izračune SI i statističke analize sa i bez sigurnih točaka podataka (koji se ponekad nazivaju ‚netipične vrijednosti’).
                        
                     PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
               
                  Podaci
               
               
                           34.
                        
                        
                           Podatke treba sažeti u tabličnom obliku koji pokazuje vrijednosti indeksa označivanja BrdU za pojedinačnu životinju, prosječni indeks označivanja BrdU po životinji za skupinu, s tim povezane pogreške (npr. SD, SEM) i prosječni SI za svaku dozirnu skupinu u odnosu na paralelnu kontrolnu skupinu s otapalom/nosačem.
                        
                     
                  Izvješće o ispitivanju
               
               
                           35.
                        
                        
                           Izvješće o ispitivanju treba sadržavati sljedeće informacije:
                           
                                        
                                    
                                    
                                       Ispitivane i kontrolne tvari:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   identifikacijski podaci (npr. brojevi CAS i EZ, ako poznati, podrijetlo, čistoća, poznate nečistoće, broj šarže),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   fizikalna priroda i fizikalno-kemijska svojstva (npr. hlapljivost, stabilnost, topljivost),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   ako je mješavina, sastav i relativni postoci sastojaka.
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Otapalo/nosač:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   identifikacijski podaci (čistoća, koncentracija (prema potrebi); upotrijebljeni volumen),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   dokaz opravdanosti izbora nosača.
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Ispitne životinje:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   podrijetlo miševa CBA,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   mikrobiološki status životinja, ako je poznat,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   broj i starost životinja,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   podrijetlo životinja, uvjeti smještaja, prehrana itd.
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Uvjeti ispitivanja:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   podrijetlo, broj šarže i podaci proizvođača o osiguranju kakvoće/kontroli kakvoće za komplet ELISA (osjetljivost na protutijela i specifičnost te granica opažanja),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinosti o pripravljanju i primjeni ispitivane tvari,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   dokaz opravdanosti odabira doze (uključujući rezultate predprobiranja, ako je provedeno),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   koncentracije nosača i ispitivane tvari koji su upotrijebljeni i ukupna količina ispitivane tvari koja je primijenjena,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uključujući vrstu/podrijetlo hrane, izvor vode),
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinosti o programima tretiranja i uzorkovanja,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   metode mjerenja toksičnosti,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   kriteriji za određivanje studija pozitivnima ili negativnima,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinosti o bilo kojim odstupanjima od protokola i objašnjenje učinaka tog odstupanja na izradu i rezultate studije,
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Provjera pouzdanosti:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   sažetak rezultata najsvježije provjere pouzdanosti uključujući informacije o upotrijebljenoj ispitanoj tvari, koncentraciji i nosaču,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   podaci o paralelnim i/ili povijesnim pozitivnim kontrolama i paralelnim negativnim kontrolama (s otapalom/nosačem) za ispitni laboratorij,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   ako nije uključena paralelna pozitivna kontrola, datum i laboratorijsko izvješće za posljednju periodičku pozitivnu kontrolu i izvješće u kojem se navode povijesni pozitivni kontrolni podaci za laboratorij, kojima se opravdava neprovođenje paralelne pozitivne kontrole,
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Rezultati:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   pojedinačne mase miševa na početku doziranja i u vrijeme planiranog usmrćenja, srednja i povezana razlika između stvarne i predviđene pogreške (npr. SD, SEM) za svaku tretiranu skupinu,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   vrijeme prve pojave i znakova toksičnosti, uključujući eventualno nadraživanje kože na mjestu primjene, za svaku životinju,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   tablica indeksa označivanja BrdU za pojedinačne miševe i vrijednosti SI za svaku tretiranu skupinu,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   srednja i povezana razlika između stvarne i predviđene pogreške (npr. SD, SEM) za indeks označivanja BrdU/miš za svaku tretiranu skupinu i rezultati analize netipičnih vrijednosti za svaku tretiranu skupinu,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   izračunani SI i prikladno mjerilo promjenljivosti koje uzima u obzir promjenljivost između životinja u ispitivanoj tvari i kontrolnim skupinama,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   odnos doza – reakcija,
                                                
                                             
                                                   —
                                                
                                                
                                                   statistička analiza, ako je primjereno,
                                                
                                             
                                 
                                        
                                    
                                    
                                       Rasprava o rezultatima:
                                       
                                                   —
                                                
                                                
                                                   kratki komentar o rezultatima, analiza doza-reakcije, i prema potrebi, statističke analize, sa zaključkom o tome treba li ispitivanu tvar smatrati senzibilizatorom kože.
                                                
                                             
                                 
                     REFERENCE
               
                           1.
                        
                        
                           OECD (2010.), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           2.
                        
                        
                           Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996.), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, str. 999-1002.
                        
                     
                           3.
                        
                        
                           Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996.), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, str. 985-997.
                        
                     
                           4.
                        
                        
                           Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998.), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, str. 327-33.
                        
                     
                           5.
                        
                        
                           Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000.), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, str. 49-59.
                        
                     
                           6.
                        
                        
                           ICCVAM (1999.), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
                        
                     
                           7.
                        
                        
                           Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), str. 258-273.
                        
                     
                           8.
                        
                        
                           Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), str. 274-286.
                        
                     
                           9.
                        
                        
                           Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001.), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), str. 249-257.
                        
                     
                           10.
                        
                        
                           ICCVAM (2010.), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No 10-7552A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm]
                        
                     
                           11.
                        
                        
                           ICCVAM (2009.), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]
                        
                     
                           12.
                        
                        
                           Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005.), Novel approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, str. 129-134.
                        
                     
                           13.
                        
                        
                           OECD (1992.), Skin Sensitisation, Test Guideline No 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           14.
                        
                        
                           Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008.), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, str. 1896-1904.
                        
                     
                           15.
                        
                        
                           Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009.), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, str. 90-96.
                        
                     
                           16.
                        
                        
                           ILAR (1996.), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
                        
                     
                           17.
                        
                        
                           ICCVAM (2009.), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]
                        
                     
                           18.
                        
                        
                           McGarry, H.F. (2007.), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, str. 71-89.
                        
                     
                           19.
                        
                        
                           Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994.), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, str. 13-31.
                        
                     
                           20.
                        
                        
                           OECD (2002.), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           21.
                        
                        
                           Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007.), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, str. 235.
                        
                     
                           22.
                        
                        
                           ICCVAM (2009.), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
                        
                     
                           23.
                        
                        
                           Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998.), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, str. 195-206.
                        
                     
                           24.
                        
                        
                           Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998.), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, str. 83-94.
                        
                     
                           25.
                        
                        
                           Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998.), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, str. 245-256.
                        
                     
                           26.
                        
                        
                           Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999.), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, str. 491-506.
                        
                     
                           27.
                        
                        
                           Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005.), A European inter- laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, str. 60-68.
                        
                     
                           28.
                        
                        
                           Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005.), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, str. 721-728.
                        
                     
                           29.
                        
                        
                           Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007.), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, str. 1023-1028.
                        
                     
                           30.
                        
                        
                           ICCVAM (2009.), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupno na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm].
                        
                     
                           31.
                        
                        
                           OECD (2000.), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                           32.
                        
                        
                           Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998.), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, str. 563-79.
                        
                     
                           33.
                        
                        
                           OECD (2005.), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                        
                     
                  Dodatak 1.
                  DEFINICIJE
                  Točnost: stupanj podudarnosti između rezultata ispitne metode i prihvaćenih referentnih vrijednosti. To je mjerilo učinkovitosti ispitne metode i jedan od aspekata relevantnosti. Ovaj se termin često koristi umjesto ‚podudarnosti’ kako bi se označio udio točnih rezultata ispitne metode (33).
                  Referentna tvar: tvar koja uzrokuje ili ne uzrokuje preosjetljivost i koja se koristi kao standard za usporedbu s ispitivanom tvari. Referentna tvar treba imati sljedeće svojstva: i. dosljedni i pouzdani izvor(i); ii. strukturna i funkcionalna sličnost s razredom tvari koje se ispituju; iii. poznate fizikalno-kemijske značajke; iv. popratni podaci o poznatim učincima; i v. poznata učinkovitost u okviru željene reakcije.
                  Lažno negativna tvar: tvar koja je ispitnom metodom netočno određena kao negativna ili neaktivna kada je u stvari pozitivna ili aktivna (33).
                  Lažno pozitivna tvar: tvar koja je ispitivanjem netočno određena kao pozitivna ili aktivna kada je u stvari negativna ili neaktivna (33).
                  Opasnost: potencijal štetnog učinka na zdravlje ili okoliš. Štetni učinak se javlja samo ako je stupanj izloženosti dovoljno visok.
                  Ponovljivost između laboratorija: mjera u kojoj različiti kvalificirani laboratoriji koji koriste isti protokol i ispituju istu tvar, mogu proizvesti kvalitativno i kvantitativno slične rezultate. Ponovljivost između laboratorija određuje se prije i tijekom validacijskog postupka i pokazuje u kojoj se mjeri neko ispitivanje može uspješno prenijeti iz jednog laboratorija u drugi, također navedena kao međulaboratorijska ponovljivost (33).
                  Ponovljivost u laboratoriju: određivanje u kojoj mjeri stručno osoblje u okviru istog laboratorija može uspješno ponoviti rezultate koristeći određeni protokol u različitim trenucima. Također se navodi kao unutarlaboratorijska ponovljivost (33).
                  Netipična vrijednost: netipična vrijednost je zapažanje koje značajno odstupa od ostalih vrijednosti u nasumičnom uzorku populacije.
                  Osiguranje kvalitete: postupak upravljanja pri kojem pojedinci neovisni od osoba koje provode ispitivanje, ocjenjuju ispunjavanje standarda laboratorijskog ispitivanja, zahtjeve i postupke vođenja evidencije te točnost prijenosa podataka.
                  Pouzdanost: mjera u kojoj se ispitna metoda može ponoviti unutar i između laboratorija tijekom vremena uporabom istog protokola. Ocjenjuje se izračunavanjem unutarlaboratorijske i međulaboratorijske ponovljivosti (33).
                  Preosjetljivost kože: imunološki proces koji se javlja kada je osjetljivi pojedinac lokalno izložen kemijskom alergenu koji uzrokuje imunosnu reakciju kože koja može dovesti do kontaktne preosjetljivosti.
                  Indeks stimulacije (SI): izračunana vrijednost za ocjenjivanje potencijala preosjetljivosti kože koju može uzrokovati ispitivana tvar, koja je omjer proliferacije u tretiranim skupinama i paralelnoj kontrolnoj skupini s nosačem.
                  Ispitivana tvar (navodi se također kao i ispitivana kemikalija): svaka tvar ili smjesa koja je ispitana ovom metodom.”
               
               ”
            
         
      (1)  Pretpostavlja se da nije senzibilizator kod ljudi budući da nisu nađeni nikakvi rezultati kliničkih epikutalnih testova, nije uključen u komplet za epikutalno testiranje kao alergen i nisu pronađena nikakva izvješća o slučajevima senzibilizacije kod ljudi.
   
      (2)  Podaci o zamorcima nisu dostupni.
   
      (3)  Kemikalije treba pripravljati svakodnevno, osim ako podaci o stabilnosti dokažu da je skladištenje prihvatljivo.
   
      (4)  Zbog mogućeg učinka različitih nosača na učinkovitost LLNA, za svaku referentnu kemikaliju treba koristiti preporučeni nosač (24) (32).
   
      (5)  Prosječna vrijednost ako je dostupno više od jedne vrijednosti EC3. Za negativne tvari (tj. sa stimulacijskim indeksom < 3) navodi se najviša ispitana koncentracija.
   
      (6)  Broj studija LLNA iz kojih su dobiveni podaci.
   
      (7)  Na tržištu je dostupan pod nazivom Kathon CG (br. CAS 55965-84-9), koji je smjesa CMI i MI u odnosu 3:1. Relativne koncentracije svakog sastojka su od 1,1 % do 1,25 % (CMI) i od 0,3 % do 0,45 % (MI). Neaktivni sastojci su magnezijeve soli (21,5 % do 24 %) i bakrov nitrat (0,15 % do 0,17 %), s preostalom formulacijom 74 % do 77 % vode. Kathon CG je lako dostupan preko Sigma-Aldrich i Rohm and Haas (sada Dow Chemical Corporation).
   
      (8)  Ove referentne kemikalije su podskup referentnih kemikalija koje su uporabljene u validacijskoj studiji.
   
      (9)  Broj bodova in vivo u skladu s B.4. i Smjernicom OECD-a 404 (4).
   
      (10)  U ovoj ispitnoj metodi neobavezna kategorija 3. UN GHS (blago nadražujuće tvari) (1) smatra se kao Bez kategorije.
   
      (11)  Neobavezna kategorija 3. UN GHS se ne primjenjuje prema EU CLP.
   
      (12)  SL L 225, 21.8.2001., str. 1.
   
      (13)  Odabir kemikalija se temelji na sljedećim kriterijima: i. kemikalije su dostupne na tržištu, ii. reprezentativne su za čitavo područje vrijednosti nadraživanja prema Draizeu (od nenadražujućih do jako nadražujućih), iii. imaju jasno definiranu kemijsku strukturu, iv. reprezentativne su za kemijsku funkcionalnost koja je korištena u validacijskom postupku, i v. nemaju ekstremni toksični profil (npr. kancerogeno ili reproduktivno toksično djelovanje) i nisu povezane s neprimjereno visokim troškovima zbrinjavanja.
   
      (14)  Sukladno UN GHS, nije u EU CLP.
   
      (15)  Kemikalije koje su nadražujuće za kuniće, ali za koje postoje pouzdani dokazi da nisu nadražujuće za ljude (31) (32) (33).
   
      (16)  Referentne kemikalije su preporučene kemikalije za uporabu. Zamjenske ili dodatne kemikalije se mogu dodati na popis referentnih kemikalija, ako je njihovo djelovanje poznato, ako induciraju mikronukleuse istim mehanizmima djelovanja i ako se pokaže da su relevantne za kemikalije koje se ispituju postupkom analize mikronukleusa in vitro. Ovisno o namjeni, obrazloženje može uključiti validacijsku studiju u kojoj je uporabljen široki niz tvari ili studiju usmjerenu na uži spektar koji se temelji na kemijskom razredu ispitivane tvari ili mehanizmu oštećenja koji se proučava.