CELEX: 31981L0715
Language: el
Date: 1981-07-31 00:00:00
Title: Ένατη οδηγία 81/715/EOK της Επιτροπής της 31ης Ιουλίου 1981 περί καθορισμού των μεθόδων κοινοτικής ανάλυσης για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών

Avis juridique important

|

31981L0715

Ένατη οδηγία 81/715/EOK της Επιτροπής της 31ης Ιουλίου 1981 περί καθορισμού των μεθόδων κοινοτικής ανάλυσης για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών  

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 257 της 10/09/1981 σ. 0038 - 0046 Φινλανδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 13 σ. 0233  Ισπανική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 03 τόμος 23 σ. 0070  Σουηδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 13 σ. 0233  Πορτογαλική ειδική έκδοση : Κεφάλαιο 03 τόμος 23 σ. 0070 

ΕΝΑΤΗ ΟΔΗΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 31ης Ιουλίου 1981 περί καθορισμού των μεθόδων κοινοτικής αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφώνΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,  Έχοντας υπόψη:  τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητος,  την οδηγία 70/373/ΕΟΚ του Συμβουλίου της 20ής Ιουλίου 1970 περί εισαγωγής τρόπων λήψεως δειγμάτων και μεθόδων κοινοτικής αναλύσεως για τον επίσημο έλεγχο των ζωοτροφών(1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την πράξη προσχωρήσεως της Ελλάδος, και ιδίως το  άρθρο 2,  Εκτιμώντας:  ότι η οδηγία που αναφέρεται ανωτέρω προβλέπει ότι οι επίσημοι έλεγχοι των ζωοτροφών που αποβλέπουν στη διαπίστωση ότι τηρούνται οι όροι που επιβάλλονται δυνάμει των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων, σχετικά με την ποιότητα και τη  σύνθεση των ζωοτροφών, πραγματοποιούνται σύμφωνα με τους τρόπους λήψεως δειγμάτων και τις μεθόδους κοινοτικής αναλύσεως- ότι οι οι οδηγίες της Επιτροπής 71/250/ΕΟΚ(2), 71/393/ΕΟΚ(3), 72/199/ΕΟΚ(4), 73/46/ΕΟΚ(5),74/203/ΕΟΚ(6), 75/84/ΕΟΚ(7), 76/372/ΕΟΚ(8) και 78/633/ΕΟΚ(9), όπως τροποποιήθηκαν τελευταία από την οδηγία της 30ής Ιουλίου 1981, έχουν ήδη καθορίσει έναν ορισμένο  αριθμό μεθόδων κοινοτικής αναλύσεως- ότι λαμβάνοντας υπόψη την κατάσταση προόδου των εργασιών που πραγματοποιούνται έκτοτε πρέπει να θεσπιστεί ενάτη σειρά μεθόδων- ότι τα μέτρα που προβλέπονται στην παρούσα οδηγία είναι σύμφωνα με τη γνώμη της Μόνιμης Επιτροπής Ζωοτροφών,  ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ:   Άρθρο 1  Τα Κράτη μέλη επιβάλλουν ώστε οι αναλύσεις για τους επισήμους ελέγχους των ζωοτροφών, όσον αφορά την περιεκτικότητά τους σε avoparcine και σε monensin sodium, να παγματοποιούνται σύμωνα με τις μεθόδους που περιγράφονται στο παράρτημα.   Άρθρο 2  Τα Κράτη μέλη θέτουν σε ισχύ τις νομοθετικές, κανονιστικές και διοικητικές διατάξεις που είναι αναγκαίες για να συμμορφωθούν προς τις διατάξεις της παρούσας οδηγίας την 1η Δεκεμβρίου 1981 και ενημερώνουν περί αυτού την Επιτροπή.   Άρθρο 3  Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα Κράτη μέλη.  Έγινε στις Βρυξέλλες, στις 31 Ιουλίου 1981.  Για την Επιτροπή Ο Πρόεδρος Gaston THORN  (1) ΕΕ αριθ. L 170 της 3. 8. 1970, σ. 2.  (2) ΕΕ αριθ. L 155 της 12. 7. 1971, σ. 13 (3) ΕΕ αριθ. L 279 της 20. 12. 1971, σ. 7.  (4) ΕΕ αριθ. L 123 της 29. 5. 1972, σ. 6.  (5) ΕΕ αριθ. L 83 της 30. 3. 1973, σ. 21.  (6) ΕΕ αριθ. L 108 της 22. 4. 1974, σ. 7.  (7) ΕΕ αριθ. L 32 της 5. 2. 1975, σ. 26.  (8) ΕΕ αριθ. L 102 της 15. 4. 1976, σ. 8.  (9) ΕΕ αριθ. L 206 της 29. 7. 1978, σ. 43.      ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ   1. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ AVOPARCINE ΔΙΑ ΔΙΑΧΥΣΕΩΣ ΠΑΝΩ ΣΕ GELOSE  1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό της avoparcine στις τροφές και προ-μείγματα. Το κατώτερο όριο του προσδιορισμού είναι 2 mg/kg (2 ppm). Η παρουσία πολυαιθερικών αντιβιοτικών να παρεμβληθεί στον προσδιορισμό.  2. ΑΡΧΗ Το δείγμα υποβάλλεται σε εκχύλιση δια μείγματος - ακετόνη/νερό/υδροχλωρικό οξύ. Η αντιβιοτική ενεργότης του εκχυλίσματος προσδιορίζεται δια μετρήσεως της διαχύσεως της avoparcine εντός μέσου με βάση την gelose, στο οποίο έχει προηγηθεί διασπορά του  Bacillus subtillis. Η διάχυση διαπιστούται από το σχηματισμό ζωνών ανενεργοποιήσεως του μικροοργανισμού. Η διάμετρος των ζωνών αυτών θεωρείται ότι είναι ευθέως ανάλογη προς τον λογάριθμο της συγκεντρώσεως σε αντιβιοτικό για την περιοχή των συγκεντρώσεων  που χρησιμοποιούνται.  3. ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΣ: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054) 3.1. Επεξεργασία του υποστρώματος Στον μέσον καλλιέργειας (4.1), εντός κεκλιμένων σωλήνων, διασπείρεται Bacillus subtilis. Επωάζεται επί μια νύχτα στους 30 oC, διατηρείται σε ψυγείο στους 4 oC περίπου και ανανεούται η διασπορά κάθε μήνα.  3.2. Προετοιμασία του αιωρήματος σπορίων(1)Συλλέγονται τα σπόρια από ένα σωλήνα με gelose (3.1), πρόσφατης παρασκευής, με τη βοήθεια 2 έως 3 ml αποστειρωμένου ύδατος. Το αιώρημα αυτό διασπείρεται σε 300 ml μέσου καλλιέργειας (4.1) εντός φιάλης Roux και  επωάζεται επί 3 έως 5 ημέρες στους 30 oC. Αφού ελεγχθεί η ανάπτυξη των σπορίων στο μικροσκόπιο, συλλέγονται τα σπόρια εντός 15 ml αιθανόλης (4.2) και ομογενοποιούνται. Αυτό το αιώρημα μπορεί να διατηρείται επί 5 μήνες τουλάχιστον στους 4 oC περίπου.  4. ΜΕΣΟΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 4.1. Μέσον επεξεργασίας του υποστρώματος(2) "" ID="1">Πεπτόνη> ID="2">6,0 g"> ID="1">Τρυπτόνη> ID="2">4,0 g"> ID="1">Εκχύλισμα μαγιάς> ID="2">3,0 g"> ID="1">Εκχύλισμα κρέατος> ID="2">1,5 g"> ID="1">Γλυκόζη> ID="2">1,0 g"> ID="1">Gelose> ID="2">15,0 g"> ID="1">Νερό> ID="2">1 000ml">  ID="1">pH 6,5 (έπειτα από αποστείρωση)."> 4.2. Αιθανόλη 20 % (v/v): διαλύονται 200 ml αιθανόλης με 800 ml ύδατος.  4.3. Υδροχλωρικό οξύ, d: 1,18 έως 1,19.  4.4. Διάλυμα 2 Μ υδροξειδίου του νατρίου.  4.5. Φωσφορικό ρυθμιστικό 0,1 Μ:  Δισόξινο φωσφορικό κάλι, KH2PO4: 13,6 g.  Νερό 1 000 ml.  Διορθούται το pH στο 4,5.  4.6. Μείγμα ακετόνης/νερού/υδροχλωρικού οξέος (4.3): 65/32,5/2,5 (v/v/v).  4.7. Πρότυπος ουσία: θειική avoparcine γνωστής ενεργότητας.  5. ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Διαλύεται ποσότητα 10 mg περίπου προτύπου ουσίας (4.7), επακριβώς ζυγισμένη, εντός φωσφορικού ρυθμιστικού (4.5) και αραιούται με το ίδιο ρυθμιστικό για να ληφθεί ένα μητρικό διάλυμα avoparcine των 100 μg/ml. Διατηρούμενο σε κλειόμενες φιάλες στους 4 oC,  το διάλυμα αυτό είναι σταθερό επί 7 ημέρες.  5.1. Για τα προ μείγματα Ετοιμάζονται με βάση το παραπάνω διάλυμα και δια διαδοχικών αραιώσεων με τη βοήθεια του φωσφρορικού ρυθμιστικού (4.5) τα ακόλουθα διαλύματα:  S8 4,0 μg/ml S4 2,0 μg/ml S2 1,0 μg/ml S1 0,5 μg/ml.  5.2 Για τις τροφές Ετοιμάζονται με βάση το μητρικό διάλυμα και δια διαδοχικών αραιώσεων με τη βοήθεια του φωσφορικού ρυθμιστικού (4.5) τα ακόλουθα διαλύματα:  S8 2,0 μg/ml S4 1,0 μg/ml S2 0,5 μg/ml S1 0,25 μg/ml.  6. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ 6.1. Προμείγματα Ζυγίζεται, με ακρίβεια 10 mg, μια ποσότητα δείγματος που περιέχει 10 έως 100 mg avoparcine, μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml, προστίθενται 60 ml του μείγματος (4.6) και ανακινείται επί 15 min επί μηχανικού αναδευτήρα. Εξετάζεται το pH και  διορθούται στο 2, εάν χρειάζεται, με υδροχλωρικό οξύ (4.3). Συμπληρούται μέχρι της χαραγής με το μείγμα (4.6) και ομογενοποιείται. Διηθείται μια ποσότητα από κατάλληλο χάρτινο ηθμό (π.χ. Whatman no 1) και απορρίπτονται τα 5 πρώτα ml του διηθήματος.  Παραλαμβάνεται ένα μέρος και διορθούται το pH στα 4,5 με τη βοήθεια του διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (4.4). Αραιούται αυτό το διάλυμα με φωσφορικό ρυθμιστικό (4.5) για να ληφθεί μια συγκέντρωση σε avoparcine εκτιμούμενη ως 4 μg/ml (= U8).  Ξεκινώντας από αυτό το διάλυμα και δια διαδοχικών αραιώσεων (1 + 1) με τη βοήθεια του φωσφορικού ρυθμιστικού (4.5) ετοιμάζονται τα διαλύματα U4 (εκτιμούμενη συγκέντρωση: 2 μg/ml), U2 (εκτιμούμενη συγκέντρωση:1 μg/ml) και U1 (εκτιμούμενη συγκέντρωση: 0,5  μg/ml).  6.2. Τροφές Ζυγίζεται ποσότητα δείγματος από 50,0 g, προστίθενται 100 ml μείγματος (4.6) και ανακινείται επί 30 min επί μηχανικού ανακινητού. Διαυγάζεται το εκχύλισμα δια φυγοκεντρήσεως (εντός κεκλεισμένων σωλήνων), παραλαμβάνεται ένα μέρο του διαυγούς διηθήματος  (σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα) και διορθούται το pH στα 4,5 με τη βοήθεια του διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου (4.4). Αυτό το διάλυμα αραιούται με το φωσφορικό ρυθμιστικό (4.5) για να ληφθεί το διάλυμα U8 (σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα).  Από αυτό το διάλυμα ετοιμάζονται δια διαδοχικών αραιώσεων (1 + 1) με τη βοήθεια του φωσφορικού ρυθμιστικού (4.5) τα διαλύματα U4 (εκτιμούμενη συγκέντρωση: 1,0  μg/ml), U2 (εκτιμούμενη συγκέντρωση: 0,5 μg/ml) και U1 (εκτιμούμενη συγκέντρωση: 0,25 μg/ml).    "" ID="1">Εκτιμούμενη συγκέντρωση σε avoparcine (mg/kg)> ID="2">5> ID="3">7,5> ID="4">10> ID="5">15> ID="6">20> ID="7">40"> ID="1">Βάρος του δείγματος σε g (+- 0,1 g)> ID="2">50> ID="3">50> ID="4">50> ID="5">50> ID="6">50> ID="7">50">  ID="1">Όγκος του μείγματος (4,6) (ml)> ID="2">100> ID="3">100> ID="4">100> ID="5">100> ID="6">100> ID="7">100"> ID="1">Όγκος του διαυγούς εκχυλίσματος (ml)> ID="2">20> ID="3">15> ID="4">20> ID="5">15> ID="6">20> ID="7">10"> ID="1">Τελικός όγκος (ml):  U8> ID="2">25> ID="3">25> ID="4">50> ID="5">50> ID="6">100> ID="7">100"> ID="1">Εκτιμούμενη συγκέντρωση U8 σε μg/ml> ID="2">2> ID="3">περίπου 2> ID="4">2> ID="5">περίπου 2> ID="6">2> ID="7">2"> 7. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΤΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ 7.1. Εμβολιασμός του μέσου καλιέργειας Στο μέσον που αποτελεί τη βάση του προσδιορισμού (4.1) διασπείρεται, στους 50 - 60 oC, το αιώρημα των σπορίων (3.2). Από προκαταρκτικές δοκιμές με το μέσον (4.1) επί πλακών προσδιορίζεται η ποσότητα εμβολίου που επιτρέπει να ληφθούν για τις διάφορες  συγκεντρώσεις σε avoparcine ζώνες ανενεργοποιήσεως όσο το δυνατόν εκτεταμένες αλλά πάντοτε σαφείς.  7.2. Προετοιμασία των τριβλίων Η διάχυση πάνω σε gelose πραγματοποιείται εντός τριβλίων με τις τέσσερις συγκεντρώσεις του προτύπου διαλύματος (S8, S4, S2, S1) και τις τέσσερις συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος (U8, U4, U2, U1). Κάθε τριβλίο πρέπει απαραίτητα να δεχθεί τις τέσσερις  συγκεντρώσεις του προτύπου και του εκχυλίσματος. Για το σκοπό αυτό το μέγεθος των τριβλίων εκλέγεται έτσι ώστε να είναι δυνατό να σχηματισθούν στον μέσον με βάση τη gelose οκτώ τουλάχιστον κοιλότητες διαμέτρου 10 έως 13 mm, των οποίων τα κέντρα δεν  απέχουν περισσότερο από 30 mm. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν τριβλία επίπεδες υάλινες πλάκες, στις οποίες θα έχει εφαρμοστεί στεφάνη από αλουμίνιο ή πλαστική ύλη διαμέτρου 200 mm και ύψους 20 mm.  Εισάγεται εντός των τριβλίων μια ποσότητα μέσου (4.1), που έχει υποστεί διασπορά όπως υποδεικνύεται στο 7,1, τέτοια ώστε να ληφθεί στιβάδα πάχους περίπου 2 mm (60 ml για τριβλίο διαμέτρου 200 mm). Αφήνεται προς στερεοποίηση, χαράσσονται οι κοιλότητες  και αποτίθενται σε αυτές επακριβώς μετρημένοι όγκοι των διαλυμάτων του προτύπου και του εκχυλίσματος (0,10 έως 0,15 ml ανά κοιλότητα, ανάλογα με τη διάμετρο). Γίνονται τέσσερις τουλάχιστον επαναλήψεις από κάθε συγκέντρωση έτσι ώστε κάθε προσδιορισμός να  αποτελεί αντικείμενο εκτιμήσεως 32 ζωνών ανεργοποιήσεως.  7.3. Επώαση Τα τριβλία επωάζονται επί 16 έως 18 ώρες στους 30 oC.  8. ΕΚΤΙΜΗΣΗ Μετράται η διάμετρος των ζωνών ανενεργοποιήσεως με ακρίβεια 0,1 mm. Για κάθε συγκέντρωση καταγράφονται οι μέσες μετρήσεις επί ημιλογαριθμικού χάρτου, τοποθετώντας τον λογάριθμο των συγκεντρώσεων έναντι των διαμέτρων των ζωνών ανενεργοποιήσεως.  Χαράσσονται οι ευθείες, οι πλέον αντιπροσωπευτικές, για το πρότυπο διάλυμα και για το εκχύλισμα, ενεργώντας, επί παραδείγματι, ως κατωτέρω:  Προσδιορίζεται το πλέον ενδεδειγμένο σημείο του χαμηλότερου επιπέδου του προτύπου διαλύματος (SL) με τη βοήθεια του τύπου:  (a) SL =  Προσδιορίζεται το πλέον ενδεδειγμένο σημείο του υψηλότερου επιπέδου του προτύπου διαλύματος (SH) με τη βοήθεια του τύπου:  (b) SH =  Προσδιορίζονται κατά τον ίδιο τρόπο τα πλέον ενδεδειγμένα σημεία του εκχυλίσματος για το χαμηλότερο (UL) και το υψηλότερο επίπεδο (UH), αντικαθιστώντας στους παραπάνω τύπους τα S1, S2, S4 και S8 με τα U1, U2, U4 και U8.  Καταγράφονται οι τιμές SL και SH στο ίδιο διάγραμμα. Δια συνδέσεως των δύο σημείων λαμβάνεται η ευθεία η πιο αντιπροσωπευτική για το πρότυπο διάλυμα. Ενεργώντας με τον ίδιο τρόπο για τα UL και UH λαμβάνεται η ευθεία η πιο αντιπροσωπευτική για το  εκχύλισμα.  Σε απουσία κάθε παρεμβαλλόμενης ουσίας, οι ευθείες θα έπρεπε να είναι παράλληλες. Στην πράξη θεωρούνται ως παράλληλες όταν τα (SH-SL) και (UH-UL) δεν διαφέρουν περισσότερο από 10 % του μέσου όρου των.  Αν οι ευθείες δεν είναι παράλληλες μπορεί να παραληφθεί είτε το U1 και S1 είτε το U8 και S8. Οι τιμές SL, SH, UL και UH που επιτρέπουν να ληφθούν οι ευθείες οι πλέον αντιπροσωπευτικές υπολογίζονται τότε με τη βοήθεια των κατωτέρω τύπων:  (a) SL =  ή  (b) SH =  ή  και αναλόγων τύπων για τα UL και UH. Η χρησιμοποίηση αυτής της εναλλακτικής λύσεως πρέπει επίσης να γίνει αντικείμενο επαληθεύσεως ως προς το παράλληλο των ευθειών, όπως υποδεικνύεται ανωτέρω. Η λήψη αποτελέσματος προερχόμενου από τρία επίπεδα πρέπει να  μνημονεύεται στο δελτίο αναλύσεως.  Όταν οι ευθείες θεωρούνται παράλληλες, υπολογίζεται ο λογάριθμος της σχετικής ενεργότητας (log. A) με έναν από τους κατωτέρω τύπους:  Για 4 επίπεδα (c) log. A =  γιά 3 επίπεδα (d) log. A =  ή (d) log. A =  Πραγματική ενεργότητα = εκτιμηθείσα ενεργότητα x σχετική ενεργότητα.  Αν η σχετική ενεργότητα ευρίσκεται έξω από τη σειρά των τιμών που περιλαμβάνονται μεταξύ 0,5 και 2,0, επαναλαμβάνεται ο προσδιορισμός με διενέργεια καταλλήλων ρυθμίσεων των συγκεντρώσεων του εκχυλίσματος ή, ενδεχομένως, των προτύπων διαλυμάτων. Όταν  αυτή η ενεργότητα δεν μπορεί να αχθεί μέσα στα όρια των απαιτουμένων τιμών, το αποτέλεσμα πρέπει να θεωρείται ως κατά προσέγγιση και η μνεία αυτή πρέπει να σημειούται στο δελτίο αναλύσεως.  Όταν οι ευθείες θεωρούνται μη παράλληλες, επαναλαμβάνεται ο προσδιορισμός. Εάν και πάλι ο παραλληλισμός δεν επιτευχθεί, ο προσδιορισμός πρέπει να θεωρείται ως μη ικανοποιητικός.  9. ΕΠΑΝΑΛΗΨΙΜΟΤΗΤΑ Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που πραγματοποιήθηκαν επί του ιδίου δείγματος από τον ίδιο αναλυτή δεν πρέπει να υπερβαίνει:  - 2 mg/kg, σε απόλυτη τιμή, για τις περιεκτικότητες σε avoparcine από 2 έως 10 mg/kg- - 20 % του πλέον υψηλού αποτελέσματος για τις περιεκτικότητες από 10 έως 25 mg/kg- - 5 mg/kg, σε απόλυτη τιμή, για τις περιεκτικότητες από 25 έως 50 mg/kg- - 10 % του πλέον υψηλού αποτελέσματος για τις περιεκτικότητες τις ανώτερες από 50 mg/kg.   2. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΜΕΤΑ ΝΑΤΡΙΟΥ MONENSIN ΔΙΑ ΔΙΑΧΥΣΕΩΣ ΠΑΝΩ ΣΕ GELOSE  1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΙ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ Η μέθοδος επιτρέπει τον προσδιορισμό τής μετά νατρίου monensin στις τροφές και τα προμείγματα. Το κατώτερο όριο του προσδιορισμού είναι 10 mg/kg (10 ppm)(3).  2. ΑΡΧΗ Το δείγμα υποβάλλεται σε εκχύλιση με μεθανόλη 90 %. Το εκχύλισμα υποβάλλεται σε κατάλληλες επεξεργασίες ανάλογα με την περιεκτικότητα σε μετά νατρίου monensin του δείγματος. Η αντιβιοτική του ενεργότητα προσδιορίζεται δια μετρήσεως τής διαχύσεως της  μετά νατρίου monensin εντός μέσου με βάση την gelose στο οποίο έχει προηγηθεί διασπορά του Bacillus subtilis. Η διάχυση διαπιστούται από το σχηματισμό ζωνών ανενεργοποιήσεως του μικροοργανισμού. Η διάμετρος των ζωνών αυτών θεωρείται ότι είναι ευθέως  ανάλογη προς τον λογάριθμο της συγκεντρώσεως σε αντιβιοτικό για την περιοχή των συγκεντρώσεων που χρησιμοποιούνται. Η ευαισθησία της μεθόδου μειούται επί παρουσίας ιόντων νατρίου.  3. ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΣ: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054) 3.1. Επεξεργασία του υποστρώματος Στο μέσον καλλιέργειας (4.1), εντός κεκλιμένων σωλήνων, διασπείρεται Bacillus subtilis. Επωάζεται επί μια νύκτα στους 30 oC, διατηρείται σε ψυγείο στους 4 oC και ανανεούται η διασπορά κάθε μήνα.  3.2. Προετοιμασία του αιωρήματος σπορίων(4)Συλλέγονται τα σπόρια από ένα σωλήνα με gelose (3.1), πρόσφατης παρασκευής, με τη βοήθεια 2 έως 3 ml αποστειρωμένου ύδατος. Το αιώρημα αυτό διασπείρεται σε 300 ml μέσου καλλιέργειας (4.1) εντός φιάλης Roux και  επωάζεται επί 3 έως 5 ημέρες στους 30 oC. Αφού ελεγχθεί η ανάπτυξη των σπορίων στο μικροσκόπιο, συλλέγονται τα σπόρια εντός 15 ml αιθανόλης (4.3) και ομογενοποιούνται. Αυτό το αιώρημα μπορεί να διατηρείται επί 5 μήνες τουλάχιστον στους 4 oC περίπου.  4. ΜΕΣΟΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 4.1. Μέσον επεξεργασίας του υποστρώματος(5) "" ID="1">Τρυπτόνη> ID="2">10,0 g"> ID="1">Εκχύλισμα μαγιάς> ID="2">3,0 g"> ID="1">Εκχύλισμα κρέατος> ID="2">1,5 g"> ID="1">Γλυκόζη> ID="2">1,0 g"> ID="1">Gelose (ανάλογα με την ποιότητα)> ID="2">10,0 έως 20,0 g"> ID="1">Νερό> ID="2">1 000  ml"> ID="1">pH 6,5 (έπειτα από αποστείρωση)."> 4.2. Μέσον ως βάση του προσδιορισμού  "" ID="1">Γλυκόζη> ID="2">10,0 g"> ID="1">Εκχύλισμα μαγιάς> ID="2">2,5 g"> ID="1">Όξινο φωσφορικό κάλι, K2HPO4> ID="2">0,69 g"> ID="1">Δισόξινο φωσφορικό κάλι,KH2PO4> ID="2">0,45 g"> ID="1">Gelose (ανάλογα με την ποιότητα)> ID="2">10,0 έως  20,0 g"> ID="1">Νερό> ID="2">1 000 ml"> ID="1">pH 6 (έπειτα από αποστείρωση)."> 4.3. Αιθανόλη 20 % (v/v): διαλύονται 200 ml αιθανόλης με 800 ml ύδατος.  4.4. Μεθανόλη, άνυδρος.  4.5. Μεθανόλη 90 % (v/v): διαλύονται 900 ml μεθανόλης (4.4) με 100 ml ύδατος.  4.6. Μεθανόλη 50 % (v/v): διαλύονται 500 ml μεθανόλης (4.4) με 500 ml ύδατος.  4.7. Οξείδιο του αργιλίου σε μείγματα (Alcoa F, 20 mesh, ενεργοποιημένη Alumina UGI: F. Lancaster and Co., ή ισοδύναμη).  4.8. Πρότυπος ουσία: μετά νατρίου monensin γνωστής ενεργότητας (ειδικά διαθέσιμη στο International Laboratory for Biological Standards, Central Veterinary Laboratory, Weybridge, UK-Surrey KT 15 3NB).  5. ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ 5.1. Περιστροφικός συμπυκνωτής υπό κενό, με φιάλη σφαιρικού πυθμένα των 250 ml.  5.2. Υάλινη στήλη χρωματογραφίας, εσωτερικής διαμέτρου 25 mm, μήκους 400 mm, με στενεύον άνοιγμα διαμέτρου 2 mm στο ένα άκρο.  5.3. Υάλινη στήλη χρωματογραφίας εσωτερικής διαμέτρου 11 mm, μήκους 300 mm περίπου, με στενεύον άνοιγμα διαμέτρου 2 mm στο ένα άκρο.  6. ΠΡΟΤΥΠΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Διαλύεται μια ποσότητα επακριβώς εζυγισμένη προτύπου ουσίας (4.8) εντός μεθανόλης (4.4) και αραιούται για να ληφθεί ένα μητρικό διάλυμμα μετά νατρίου monensin 800 μg/ml. Διατηρούμενο σε κλειόμενες φιάλες στους 4 oC το διάλυμα αυτό είναι σταθερό επί δύο  εβδομάδες.  Ετοιμάζονται με βάση αυτό το διάλυμα και δια διαδοχικών αραιώσεων με τη βοήθεια μεθανόλης 50 % (4.6) τα ακόλουθα διαλύματα:  S8 8 μg/ml S4 4 μg/ml S2 2 μg/ml S1 1 μg/ml 7. ΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ 7.1. Εκχύλιση 7.1.1. Προμείγματα Ζυγίζεται ποσότητα δείγματος από 2,0 g, προστίθενται 100 ml μεθανόλης 90 % (4.5), ομογενοποιείται και έπειτα φυγοκεντρούνται επί μερικά λεπτά της ώρας. Αραιούται το υπερκείμενο διάλυμα με μεθανόλη 50 % (4.6) για να ληφθεί μια συγκέντρωση μετά νατρίου  monensin εκτιμούμενη σε 8 μg/ml (= U8).  7.1.2. Τροφές των οποίων η περιεκτικότητα σε μετά νατρίου monensin δεν είναι κατώτερη από 50 ppm Ζυγίζεται μια ποσότητα δείγματος από 10 έως 20 g, προστίθενται 100 ml μεθανόλης 90 % (4.5), ομογενοποιούνται επί 15 min και αφήνονται εν ηρεμία.  Εισάγεται βύσμα βάμβακος στο στενεύον άνοιγμα της υάλινης στήλης (5.2), προστίθεται οξείδιο του αργιλίου (4.7), με ταυτόχρονες ελαφρές κρούσεις της στήλης, μέχρις ότου η σχηματιζόμενη στήλη φτάσει σε ύψος τα 75 έως 80 mm.  Αποχύνεται το εκχύλισμα επί της στήλης οξειδίου του αργιλίου και συλλέγεται το διήθημα. Αραιούνται 30 ml του διηθήματος στα 50 ml με νερό. Αραιούται έπειτα με μεθανόλη 50 % (4.6) για να ληφθεί μια συγκέντρωση σε μετά νατρίου monensin εκτιμούμενη σε 8  μg/ml (= U8).  7.1.3. Τροφές των οποίων η περικτικότητα σε μετά νατρίου monensin είναι κατώτερη από 50 ppm (μέχρι του ορίου των 10 ppm) Ζυγίζεται μια ποσότητα δείγματος από 10 έως 20 g, προστίθενται 100 ml μεθανόλης 90% (4.5), και ομογενοποιούνται επί 15 λεπτά της ώρας. Φυγοκεντρούνται για να ληφθεί διαυγές διήθημα.  Παραλαμβάνονται 40 ml από το υγρό που επιπλέει για δείγμα του οποίου η περιεκτικότητα σε μετά νατρίου monensin είναι 20 ppm- 80 ml για δείγμα του οποίου η περιεκτικότητα είναι 10 ppm. Εξατμίζεται μέχρι ξηρού υπό κενό στην περιστροφική συσκευή (5.1) σε  θερμοκρασία μη υπερβαίνουσα τους 40 oC. Διαλύεται το υπόλειμμα σε 10 ml μεθανόλης 90 % (4.5).  Εισάγεται βύσμα βάμβακος στο στευνεύον άνοιγμα του υάλινου σωλήνα (5.3), προστίθεται οξείδιο του αργιλίου (4.7), με ταυτόχρονες ελαφρές κρούσεις του σωλήνα, μέχρις ότου η σχηματιζόμενη στήλη φθάσει τα 75 έως 80 mm ύψος.  Αποχύνεται το μεθανολικό διάλυμα του υπολείματος επί της στήλης του οξειδίου του αργιλίου και συλλέγεται το διήθημα. Πλύνεται η στήλη με 10 ml μεθανόλης 90 % (4.5) και προστίθενται τα εκπλύματα στο διήθημα.  Εξατμίζεται το διάλυμα μέχρι ξηρού υπό κενό στην περιστροφική συσκευή (5.1) σε θερμοκρασία κατώτερη από 40 oC. Διαλύεται το ίζημα σε 10 ml μεθανόλης άνυδρης (4.4) και συμπληρούται στα 20 ml με ύδωρ. Φυγοκεντρούται στις 4 000 στροφές ανά λεπτό της ώρας  τουλάχιστον επί 5 λεπτά. Αραιούται έπειτα με μεθανόλη 50 % (4.6) για να ληφθεί μετά συγκέντρωση σε μετά νατρίου monensin εκτιμούμενη σε 8 μg/ml (= U8).  7.2. Διαλύματα του εκχυλίσματος Προετοιμάζονται με βάση το διάλυμα U8 και με διαδοχικές αραιώσεις (1 + 1) με τη βοήθεια μεθανόλης 50 % (4.6) τα διαλύματα U4 (συγκέντρωση εκτιμούμενη σε: 4 μg/ml), U2 (συγκέντρωση εκτιμούμενη σε: 2 μg/ml) και U1 (συγκέντρωση εκτιμούμενη σε: 1 μg/ml).  8. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ 8.1. Εμβολιασμός του μέσου καλλιέργειας Στο μέσον, που αποτελεί τη βάση του προσδιορισμού (4.2), διασπείρεται στους 50 - 60 oC το αιώρημα των σπορίων (3.2). Από προκαταρκτικές δοκιμές με το μέσον (4.2) επί πλακών προσδιορίζεται η ποσότητα του εμβολίου που επιτρέπει να ληφθούν, για τις  διάφορες συγκεντρώσεις σε μετά νατρίου monensin, ζώνες ενεργοποιήσεως όσο το δυνατόν εκτεταμένες αλλά πάντοτε σαφείς.  8.2. Προετοιμασία των τριβλίων Η διάχυση πάνω σε gelose πραγματοποιείται εντός τριβλίων με τις τέσσερις συγκεντρώσεις του προτύπου διαλύματος (S8, S4, S2, S1) και τις τέσσερις συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος (U8, U4, U2, U1). Κάθε τριβλίο πρέπει απαραίτητα να δεχθεί τις τέσσερις  συγκεντρώσεις του προτύπου και του εκχυλίσματος. Για το σκοπό αυτό το μέγεθος των τριβλίων εκλέγεται έτσι ώστε να είναι δυνατό να σχηματισθούν στο μέσον με βάση την gelose οκτώ τουλάχιστον κοιλότητες διαμέτρου 10 έως 13 mm, των οποίων τα κέντρα δεν  απέχουν περισσότερο από 30 mm. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν τριβλία επίπεδες υάλινες πλάκες, στις οποίες θα έχει εφαρμοστεί στεφάνη από αλουμίνιο ή πλαστική ύλη διαμέτρου 200 mm και ύψους 20 mm.  Εισάγεται εντός των τριβλίων μια ποσότητα μέσου (4.2), που έχει υποστεί διασπορά όπως υποδεικνύεται στο 8.1, τέτοια ώστε να ληφθεί στιβάδα πάχους περίπου 2 mm (60 ml για τριβλίο διαμέτρου 200 mm). Αφήνεται προς στερεοποίηση, χαράσσονται οι κοιλότητες  και αποτίθενται σε αυτές επακριβώς μετρημένοι όγκοι των διαλυμάτων του προτύπου και του εκχυλίσματος (0,10 έως 0,15 ml ανά κοιλότητα, ανάλογα με την διάμετρο). Γίνονται 4 τουλάχιστον επαναλήψεις από κάθε συγκέντρωση, έτσι ώστε κάθε προσδιορισμός να  αποτελεί αντικείμενο εκτιμήσεως 32 ζωνών ανενεργοποιήσεως.  8.3. Επώαση Τα τριβλία επωάζονται επί 18 ώρες στους 35 - 37 oC περίπου.  9. ΕΚΤΙΜΗΣΗ Μετράται η διάμετρος των ζωνών ανενεργοποιήσεως με ακρίβεια 0,1 mm. Για κάθε συγκέντρωση καταγράφονται οι μέσες μετρήσεις επί ημιλογαριθμικού χάρτου, τοποθετώντας τον λογάριθμο των συγκεντρώσεων έναντι των διαμέτρων των ζωνών ανενεργοποιήσεως.  Χαράσσονται οι ευθείες, οι πλέον αντιπροσωπευτικές, για το πρότυπο διάλυμα και για το εκχύλισμα, ενεργώντας, επί παραδείγματι, ως κατωτέρω:  Προσδιορίζεται το πλέον ενδεδειγμένο σημείο του χαμηλότερου επιπέδου του προτύπου διαλύματος (SL) με τη βοήθεια του τύπου:  (a) SL =  Προσδιορίζεται το πλέον ενδεδειγμένο σημείο του υψηλότερου επιπέδου του προτύπου διαλύματος (SH) με τη βοήθεια του τύπου:  (b) SH =  Προσδιορίζονται κατά τον ίδιο τρόπο τα πλέον ενδεδειγμένα σημεία του εκχυλίσματος για το χαμηλότερο (UL) και το υψηλότερο επίπεδο (UH) αντικαθιστώντας στους παραπάνω τύπους τα S1, S2, S4 και S8 με τα U1, U2, U4 και U8.  Καταγράφονται οι τιμές SL και SH στο ίδιο διάγραμμα. Δια συνδέσεως των δύο σημείων λαμβάνεται η ευθεία η πιο αντιπροσωπευτική για το πρότυπο διάλυμα. Ενεργώντας με τον ίδιο τρόπο για τα UL και UH λαμβάνεται η ευθεία η πιο αντιπροσωπευτική για το  εκχύλισμα.  Σε απουσία κάθε παρεμβαλλόμενης ουσίας, οι ευθείες θα έπρεπε να είναι παράλληλες. Στην πράξη θεωρούνται ως παράλληλες όταν τα (SH-SL) και (UH-UL) δεν διαφέρουν περισσότερο από 10% του μέσου όρου των.  Αν οι ευθείες δεν είναι παράλληλες μπορεί να παραληφθεί είτε το U1 και S1S 1 είτε το U8 και S8. Οι τιμές SL, SH, UL και UH που επιτρέπουν να ληφθούν οι ευθείες οι πλέον αντιπροσωπευτικές υπολογίζονται τότε με τη βοήθεια των κατωτέρω τύπων:  (a) SL =  ή  (b) SH =  ή  και αναλόγων τύπων για τα UL και UH. Η χρησιμοποίηση αυτής της εναλλακτικής λύσεως πρέπει επίσης να γίνει αντικείμενο επαληθεύσεως ως προς το παράλληλο των ευθειών, όπως υποδεικνύεται ανωτέρω. Η λήψη αποτελέσματος προερχόμενου από τρία επίπεδα πρέπει να  μνημονεύεται στο δελτίο αναλύσεως.  Όταν οι ευθείες θεωρούνται παράλληλες, υπολογίζεται ο λογάριθμος της σχετικής ενεργότητας (log. A) με έναν από τους κατωτέρω τύπους:  Για 4 επίπεδα (c) log. A =  (d) log. A =  ή (d) log. A =  Πραγματική ενεργότητα = εκτιμηθείσα ενεργότητα x σχετική ενεργότητα.  Αν η σχετική ενεργότητα ευρίσκεται έξω από τη σειρά των τιμών που περιλαμβάνονται μεταξύ 0,5 και 2,0, επαναλαμβάνεται ο προσδιορισμός με διενέργεια καταλλήλων ρυθμίσεων των συκγεντρώσεων του εκχυλίσματος ή, ενδεχομένως, των προτύπων διαλυμάτων. Όταν  αυτή η ενεργότητα δεν μπορεί να αχθεί μέσα στα όρια των απαιτουμένων τιμών, το αποτέλεσμα πρέπει να θεωρείται ως κατά προσέγγιση και η μνεία αυτή πρέπει να σημειούται στο δελτίο αναλύσεων.  Όταν οι ευθείες θεωρούνται μη παράλληλες, επαναλαμβάνεται ο προσδιορισμός. Εάν και πάλι ο παραλληλισμός δεν επιτευχθεί, ο προσδιορισμός πρέπει να θεωρείται ως μη ικανοποιητικός.  10. ΕΠΑΝΑΛΗΨΙΜΟΤΗΤΑ Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο προσδιορισμών που πραγματοποιήθηκαν επί του ιδίου δείγματος από τον ίδιο αναλυτή δεν πρέπει να υπερβαίνει:  - 20 % του πλέον υψηλού αποτελέσματος για τις περιεκτικότητες σε μετά νατρίου monensin από 10 έως 25 mg/kg- - 5 mg/kg, σε απόλυτη τιμή, για τις περιεκτικότητες από 25 έως 50 mg/kg- - 10 % του πλέον υψηλού αποτελέσματος για τις περιεκτικότητες τις ανώτερες από 50 mg/kg.    (1) Άλλες μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν στο μέτρο που έχει αποδειχθεί ότι παρέχουν ανάλογα αιωρήματα σπορίων.  (2) Κάθε εμπορικό μέσον καλλιέργειας με ανάλογη σύσταση και που δίδει τα ίδια αποτελέσματα μπορεί να χρησιμοποιείται.  (3) 1 mg τής μετά νατρίου monensin ισοδυναμεί με 1 000 μονάδες "UK".  (4) Άλλες μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν στο μέτρο που έχει αποδειχθεί ότι παρέχουν ανάλογα αιωρήματα σπορίων.  (5) Κάθε εμπορικό μέσον καλλιέργειας με ανάλογη σύσταση και που δίδει τα ίδια αποτελέσματα μπορεί να χρησιμοποιείται.