CELEX: 31998L0073
Language: cs
Date: 1998-09-18 00:00:00
Title: Směrnice Komise 98/73/ES ze dne 18. září 1998, kterou se po dvacáté čtvrté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látekText s významem pro EHP.

Důležité právní upozornění

|

31998L0073

Směrnice Komise 98/73/ES ze dne 18. září 1998, kterou se po dvacáté čtvrté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látekText s významem pro EHP.  

Úřední věstník L 305 , 16/11/1998 S. 0001 - 0181 CS.ES Kapitola 13 Svazek 21 S. 139  - 316 ET.ES Kapitola 13 Svazek 21 S. 139  - 316 HU.ES Kapitola 13 Svazek 21 S. 139  - 316 LT.ES Kapitola 13 Svazek 21 S. 139  - 316 LV.ES Kapitola 13 Svazek 21 S. 139  - 316 MT.ES Kapitola 13 Svazek 21 S. 139  - 316 PL.ES Kapitola 13 Svazek 21 S. 139  - 316 SK.ES Kapitola 13 Svazek 21 S. 139  - 316 SL.ES Kapitola 13 Svazek 21 S. 139  - 316

		Směrnice Komise 98/73/ESze dne 18. září 1998,kterou se po dvacáté čtvrté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek(Text s významem pro EHP)KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství,s ohledem na směrnici Rady 67/548/EHS ze dne 27. června 1967 o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek [1], naposledy pozměněnou směrnicí Komise 97/69/ES [2], a zejména na článek 28 uvedené směrnice,vzhledem k tomu, že příloha I směrnice 67/548/EHS obsahuje seznam nebezpečných látek společně s podrobnými údaji o postupech klasifikace a označování jednotlivých látek; že vědecké a technické poznatky ukazují, že by měl být seznam nebezpečných látek ve výše uvedené příloze přizpůsoben a doplněn;vzhledem k tomu, že v příloze V směrnice 67/548/EHS uvedeny metody stanovení fyzikálních a chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity látek a přípravků; že je nezbytné přizpůsobit výše uvedenou přílohu technickému pokroku;vzhledem k tomu, že opatření této směrnice jsou v souladu se stanoviskem Výboru pro přizpůsobení technickému pokroku směrnic pro odstranění technických překážek obchodu na úseku nebezpečných látek a přípravků,PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:Článek 1Směrnice 67/548/EHS se mění takto:1. Příloha I se mění takto:a) odpovídající položky v příloze I směrnice 67/548/EHS se nahrazují položkami v příloze I této směrnice;b) položky v příloze II této směrnice se vkládají do přílohy I směrnice 67/548/EHS.2. Příloha V se mění takto:a) část A přílohy V směrnice 67/548/EHS se doplňuje o texty v příloze III A, III B a III C této směrnice;b) část C přílohy V směrnice 67/548/EHS se doplňuje o texty v příloze III D této směrnice.Článek 2Členské státy uvedou v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději do 31. října 1999. Neprodleně o nich uvědomí Komisi.Tyto předpisy přijaté členskými státy musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebomusí být takový odkaz učiněn při jejichúředním vyhlášení. Způsob odkazu si stanoví členské státy.Článek 3Tato směrnice vstupuje v platnost dvacátým dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství.Článek 4Tato směrnice je určena členským státům.V Bruselu dne 18. září 1998.Za KomisiRitt Bjerregaardčlenka Komise[1] Úř. věst. 196, 16.8.1967, s. 1.[2] Úř. věst. L 343, 13.12.1997, s. 19.--------------------------------------------------ANEXO IBILAG IANHANG IΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IANNEX IANNEXE IALLEGATO IBIJLAGE IANEXO ILIITE IBILAGA I+++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++--------------------------------------------------ANEXO IIBILAG IIANHANG IIΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IIANNEX IIANNEXE IIALLEGATO IIBIJLAGE IIANEXO IILIITE IIBILAGA II+++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF ++++++++++ TIFF +++++--------------------------------------------------PŘÍLOHA III AA.18 POČETNĚ PRŮMĚRNÁ MOLEKULOVÁHMOTNOST A DISTRIBUCE MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI POLYMERŮ1. METODATato gelově permeační chromatografická metodaje replikou metody OECD TG 118 (1996). Základní principy a dalšítechnické informace jsou uvedeny v odkaze (1).1.1 ÚvodVlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že nenímožné popsat jedinou metodu a přesně stanovitpodmínky separace a hodnocení, které by pokrylyvšechny eventuality a specifika vyskytující se přiseparaci polymerů. Zejména pro složité polymernísystémy není gelově permeační chromatografie(GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná,může být molekulová hmotnost stanovena jinýmimetodami (viz příloha). V takových případechby měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodněnípoužité metody.Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1).Podrobné informace o provádění experimentůa o hodnocení údajů lze nalézt v uvedenénormě DIN. V případě, že jsou nezbytnéúpravy experimentálních podmínek, musíbýt změny zdůvodněny. Mohou být použityjiné normy, jsou-li na ně uvedeny úplné odkazy.V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorkypolystyrenu o známé polydisperzitě a metodamůže být upravena tak, aby byla vhodná pro určitépolymery, např. ve vodě rozpustné polymery a polymerys dlouhými větvemi.1.2 Definice a jednotkyPočetně průměrná molekulová hmotnost Mn a hmotnostně průměrnámolekulová hmotnost Mw se stanovípomocí těchto rovnic:+++++ TIFF +++++kdeHi  je výška signálu detektoru nad základní čaroupro retenční objem Vi,Mi  je molekulová hmotnost frakce polymeru s retenčnímobjemem Vi an  je počet údajů.Šířka distribuce molekulové hmotnosti, kteráje mírou polydisperzity systému, je dána poměrem Mw/Mn.1.3 Referenční látkyVzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musíbýt provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvyklepoužívá lineární polystyrenový standards úzkou distribucí se známými průměrnýmimolekulovými hmotnostmi Mn a Mw a se známou distribucí molekulovéhmotnosti. Kalibrační křivka může býtpro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorkupoužita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standardůidentické.Stanovený vztah mezi molekulovou hmotností a elučnímobjemem je platný pouze za specifických podmínek určitéhoexperimentu. Podmínky zahrnují předevšímteplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel),chromatografické podmínky a separační kolonunebo systém kolon.Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobemjsou relativními hodnotami a označují se jako "molekulové hmotnosti ekvivalentní polystyrenu". To znamená, žese molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturnícha chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem odabsolutní hodnoty více či méně lišit.Použijí-li se jiné standardy, např. poly(ethylenglykol),poly(ethylenoxid), poly(methyl-methakrylát), poly(akrylová kyselina),musí být použití zdůvodněno.1.4 Podstata zkušební metodyDistribuce molekulové hmotnosti vzorku i průměrnémolekulové hmotnosti (Mn, Mw) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciálnítyp kapalinové chromatografie, při němž se vzorekdělí podle hydrodynamických objemů jednotlivýchsložek (2).Separace probíhá při průchodu vzorku kolonounaplněnou porézním materiálem, obvykle organickýmgelem. Malé molekuly proniknou do pórů, zatímcovelké molekuly nikoli. Průchod velkých molekul je tedykratší a jsou eluovány nejdříve. Středněvelké molekuly pronikají do některých pórůa jsou eluovány později. Nejmenší molekulyse středním hydrodynamickým poloměrem menšímnež velikost pórů gelu pronikají do všechpórů. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.V ideálním případě závisíseparace pouze na velikosti molekul, ale v praxi je obtížnévyhnout se alespoň některým rušivým adsorpčnímjevům. Nestejnoměrné plnění kolony a mrtvéobjemy mohou situaci zhoršit (2).Detekce se provádí například měřenímindexu lomu nebo UV absorpce a výsledkem je jednoduchádistribuční křivka. Má-li být všakkřivce přiřazena skutečná molekulováhmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu polymery se známou molekulovouhmotností a v ideálním případěv podstatě podobnou strukturou, např. různýmipolystyrenovými standardy. Křivka má zpravidla gaussovskýtvar, někdy deformovaný prodloužením na straněnízké molekulové hmotnosti, přičemžsvislá osa udává hmotnostní zlomek různýchmolekulových hmotností a na vodorovné ose je vynesenlogaritmus molekulové hmotnosti.1.5 Kritéria jakostiOpakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepšínež 0,3 %. Je-li chromatogram hodnocen v závislostina čase a neodpovídá výše uvedenémukritériu (1), musí být požadovaná opakovatelnostzajištěna korekcí vnitřním standardem.Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostechstandardů. V případě polystyrenovýchstandardů jsou typickými hodnotamiMp < 2000 | Mw/Mn < 1,20 |2000 ≤ Mp ≤ 106 | Mw/Mn < 1,05 |Mp > 106 | Mw/Mn< 1,20 |(Mp je molekulová hmotnost standarduodpovídající maximu píku)1.6 Popis zkušební metody1.6.1 Příprava standardníchroztoků polystyrenuPolystyrenové standardy se rozpustí opatrným míchánímve zvoleném eluentu. Při přípravěroztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.Koncentrace zvolených standardů závisí na různýchfaktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitěroztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximálnívstřikovaný objem musí být přizpůsobendélce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typickévstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPCs kolonou o rozměrech 30 cm × 7,8 mm jsouobvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsoumožné, ale neměly by překročit 250 μl.Optimální poměr mezi vstřikovaným objemema koncentrací musí být stanoven před vlastníkalibrací kolony.1.6.2 Příprava roztoku vzorkuStejné požadavky platí v zásaděpro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrnýmtřepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle,např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádnémpřípadě by neměl být rozpuštěnpomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné,přečistí se roztok vzorku filtrací přesmembránový filtr o velikosti pórů 0,2 až2 μm.Přítomnost nerozpuštěných částicmusí být zaznamenána v závěrečnémprotokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokoumolekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostní koncentracenerozpuštěných částic vyjádřenév procentech by měla být použita vhodná metoda.Roztoky by měly být použity do 24 hodin.1.6.3 Přístroje a pomůcky- zásobník rozpouštědla,- odplynovací zařízení (podle potřeby),- dávkovací čerpadlo,- tlumič rázů (podle potřeby),- vstřikovací systém,- chromatografické kolony,- detektor,- průtokoměr (podle potřeby),- zapisovač,- nádoba na odpad.Musí být zajištěno, aby byl systém GPCinertní k použitým rozpouštědlům(např. použitím ocelových kapilár pro THF).1.6.4 Vstřikování a systémdávkování rozpouštědlaUrčený objem roztoku vzorku se vnese na kolonu buďdávkovačem nebo ručně v ostře ohraničenézóně. Příliš rychlý pohyb pístuvzad nebo vpřed (při ručním vnesení) můžezpůsobit změny v pozorované distribuci molekulovéhmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možnoneměl působit rázy a v ideálnímpřípadě by měl být opatřen tlumičemrázů. Průtok je řádově 1 ml/min.1.6.5 KolonaPodle typu vzorku se k charakterizaci polymeru použije jednoduchákolona nebo několik za sebou řazených kolon. Komerčněje dostupná řada porézních materiálůdefinovaných vlastností (např. velikost pórů,vylučovací meze). Výběr separačníhogelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku(hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), takna specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo,teplota a průtok (1, 2, 3).1.6.6 Teoretická patraPoužitá kolona nebo kombinace kolon musí býtcharakterizována počtem teoretických pater. Připoužití THF jako eluentu to zahrnuje vnesení roztokuethylbenzenu nebo jiné vhodné nepolární rozpuštěnélátky na kolonu známé délky. Počet teoretickýchpater je dán touto rovnicí:N = 5,54neboN = 16kdeN  je počet pater v maximu,Ve  je eluční objem píku,W  šířka píku na základní čáře,W½  šířka píku v polovině výšky.1.6.7 Separační účinnostVedle počtu teoretických pater, který je veličinouurčující šířku pásu, hrajeroli také separační účinnost, kteráse stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separačníúčinnost kolony se získá z tohoto vztahu:e,Me,≥ 6,0cm3cm2kdeVe, Mx  je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotnostíMx,Ve, (10Mx)  je eluční objem pro polystyren s 10krátvětší molekulovou hmotností.Rozlišení systému je obecně definovánotímto vztahem:R= 2××M/M1kdeVe1, Ve2  jsou eluční objemy dvou standardů polystyrenuv maximu píku,W1, W2  jsou šířky píků na základní čáře,M1, M2  jsou molekulové hmotnosti odpovídajícímaximu píků (měly by se lišit faktorem 10).Hodnota R pro kolonový systém by měla býtvětší než 1,7 (4).1.6.8 RozpouštědlaVšechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu(v případě THF 95 % čistotu). Zásobníkrozpouštědla (v případě potřebypod inertní atmosférou) musí být dostatečněvelký pro kalibraci kolony a pro několik analýzvzorku. Z rozpouštědla musí být předjeho dopravou čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.1.6.9 Kontrola teplotyTeplota kritických vnitřních součástí(vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a vedení)by měla být konstantní a měla by býtv souladu s volbou rozpouštědla.1.6.10 DetektorDetektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenáváníkoncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojítke zbytečnému rozšíření píků,musí být objem kyvety detektoru co nejmenší. Nemělby být větší než 10 μl, s výjimkoudetektorů k měření rozptylu světlaa viskozity. K detekci se obvykle používá diferenciálníhorefraktometru. Vyžadují-li to však specifickévlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla,lze použít jiné typy detektorů, např. UV/vis,IR detektory a viskozitní detektory atd.2. ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍZPRÁV2.1 ÚdajePokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavkytýkající se registrace a zpracováníúdajů, měla by být použita norma DIN (1).Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávisléexperimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně.Pro každé měření musí býtuvedeny hodnoty Mn, Mw, Mw/Mn a Mp. Je nezbytné výslovně uvést, ženaměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícímimolekulové hmotnosti použitého standardu.Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů(případně korigovaných za použitívnitřního standardu) se proti těmto veličinámvynesou do grafu hodnoty log Mp (přičemž Mp je výška maxima píku kalibračníhostandardu). Pro jeden řád hodnot molekulové hmotnostijsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a procelou křivku, která by měla pokrýt odhadovanoumolekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pětnaměřených bodů. Poslední bod kalibračníkřivky na straně nízkých molekulových hmotnostíse určí hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárnímrozpouštědlem. Početně a hmotnostněprůměrné molekulové hmotnosti se obecněurčí elektronickým zpracováním údajůzaloženým na rovnicích v bodě 1.2. Přimanuálním zpracování údajů do číselnéformy lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).Distribuční křivka musí být znázorněnave formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnostnebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V grafickémznázornění by měl mít jeden řádmolekulové hmotnosti délku 4 cm a výškamaxima píku by měla být asi 8 cm. U integrálníchdistribučních křivek by měla být vzdálenostmezi 0 a 100 % na ose y přibližně10 cm.2.2 Protokol o zkoušceProtokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:2.2.1 Zkoušená látka- dostupné informace o zkoušené látce (identifikace,přísady, nečistoty),- popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti,problémy.2.2.2 Přístrojové vybavení- zásobník eluentu, inertní plyn, odplyněníeluentu, složení eluentu, nečistoty,- dávkovací čerpadlo, tlumič rázů,vstřikovací systém,- separační kolony (výrobce, všechny informaceo charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů,druh separačního materiálu atd., počet, délkaa pořadí použitých kolon),- počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separačníúčinnost (rozlišení systému),- informace o symetrii píků,- teplota kolony, způsob řízení teploty,- detektor (princip měření, typ, objem kyvety),- průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip měření),- systém pro záznam a zpracování údajů(hardware a software).2.2.3 Kalibrace systému- podrobný popis metody použité pro sestrojeníkalibrační křivky,- informace o kritériích jakosti této metody (např.korelační koeficient, součet čtverců chybatd.),- informace o všech extrapolacích, předpokladecha aproximacích provedených během experimentálníhopostupu a při hodnocení a zpracováníúdajů,- všechny naměřené hodnoty použitépři konstrukci kalibrační křivky musí býtdokumentovány v tabulce, která musí pro každýkalibrační bod obsahovat tyto informace:- název vzorku,- výrobce vzorku,- charakteristické hodnoty standardů Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, jak jsou poskytnutyvýrobcem nebo jak jsou zjištěny z následnýchměření, společně s podrobnostmi o metoděstanovení,- vstříknutý objem a vstříknutákoncentrace,- hodnota Mp použitá po kalibraci,- eluční objem nebo korigovaný retenční časměřený v maximu píku,- hodnota Mp vypočtená pro maximumpíku,- chyba vypočtené hodnoty Mp a kalibračníhodnoty Mp vyjádřená v procentech.2.2.4 Hodnocení- hodnocení vlivu času: metody použité pro zajištěnípožadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřnístandard atd.),- informace o tom, zda bylo hodnocení provedeno na základěelučního objemu nebo retenčního času,- informace o mezích hodnocení v případě, žepík nebyl úplně analyzován,- popis metody vyrovnávání křivek, bylo-li použito,- příprava a postupy předúpravy vzorku,- popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic,- vstříknutý objem (μl) a vstříknutákoncentrace (mg/ml),- pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkámod ideálních charakteristik metody GPC,- podrobný popis všech změn zkušebníchpostupů,- podrobnosti o rozsahu chyb,- jakékoli další informace a pozorovánírelevantní pro interpretaci výsledků.3. LITERATURA(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie(GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J.,Bly, D. D. (eds.) (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.(3) ASTMD 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averagesand Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (GelPermeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials,Philadelphia, Pennsylvania.(4) ASTMD 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averagesand Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-ExclusionChromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia,Pennsylvania.--------------------------------------------------PŘÍLOHA III BA.19 OBSAH NÍZKOMOLEKULÁRNÍCH LÁTEK V POLYMERECH1. METODATato gelově permeační chromatografická metoda je replikou metody OECD TG 119 (1996). Základní principy a další technické informace jsou uvedeny v odkazech.1.1 ÚvodVlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že není možné popsat jedinou metodu a přesně stanovit podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro složité polymerní systémy není gelově permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody.Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení údajů lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou-li na ně uvedeny úplné odkazy. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. ve vodě rozpustné polymery a polymery s dlouhými větvemi.1.2 Definice a jednotkyNízká molekulová hmotnost je konvenčně definována jako molekulová hmotnost pod 1000.Početně průměrná molekulová hmotnost Mn a hmotnostně průměrná molekulová hmotnost Mw se stanoví pomocí těchto rovnic:+++++ TIFF +++++kdeHi  je výška signálu detektoru nad základní čarou pro retenční objem Vi,Mi  je molekulová hmotnost frakce polymeru pro retenční objem Vi an  je počet údajů.Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou polydisperzity systému, je dána poměrem Mw/Mn.1.3 Referenční látkyVzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými průměrnými molekulovými hmotnostmi Mn a Mw a se známou distribucí molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a standardů identické.Stanovený vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických podmínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouštědel), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém kolon.Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako "molekulové hmotnosti ekvivalentní polystyrenu". To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. poly(ethylenglykol), poly(ethylenoxid), poly(methyl-methakrylát), poly (akrylová kyselina), musí být použití zdůvodněno.1.4 Podstata zkušební metodyDistribuce molekulové hmotnosti vzorku i průměrné molekulové hmotnosti (Mn, Mw) lze stanovit metodou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž se vzorek dělí podle hydrodynamických objemů jednotlivých složek (2).Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou do pórů, zatímco velké molekuly nikoliv. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají do některých pórů a jsou eluovány později. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu pronikají do všech pórů. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec.V ideálním případě závisí separace pouze na velikosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým adsorpčním jevům. Nestejnoměrné plnění kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2).Detekce se provádí například měřením indexu lomu nebo UV absorpce a výsledkem je jednoduchá distribuční křivka. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu polymery se známou molekulovou hmotností a v ideálním případě v podstatě podobnou strukturou, např. různé polystyrenové standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní zlomek různých molekulových hmotností a na vodorovné ose je vynesen logaritmus molekulové hmotnosti.Obsah molekul o nízké hmotnosti se odečte z této kalibrační křivky. Výpočet může být správný pouze tehdy, je-li odezva nízkomolekulárních látek hmotnostně ekvivalentní polymeru jako celku.1.5 Kritéria jakostiOpakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Je-li chromatogram hodnocen v závislosti na čase a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1), musí být požadovaná opakovatelnost zajištěna korekcí vnitřním standardem. Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami:Mp < 2000 | Mw/Mn < 1,20 |2000 ≤ Mp ≤ 106 | Mw/Mn < 1,05 |Mp > 106 | Mw/Mn < 1,20 |(Mp je molekulová hmotnost standardu odpovídající maximu píku)1.6 Popis zkušební metody1.6.1 Příprava standardních roztoků polystyrenuPolystyrenové standardy se rozpustí opatrným mícháním ve zvoleném eluentu. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce.Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roztoku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30 × 7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalibrací kolony.1.6.2 Příprava roztoku vzorkuStejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným třepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o velikosti pórů 0,2 až 2 μm.Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v závěrečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostní koncentrace nerozpuštěných částic vyjádřené v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 h.1.6.3 Korekce na obsah nečistot a přísadKorekce obsahu frakce s M < 1000 v důsledku příspěvku od přítomných nepolymerních specifických složek (např. nečistot a/nebo přísad) je obvykle nezbytná, není-li naměřený obsah < 1 %. Dosáhne se toho přímou analýzou roztoku polymeru nebo eluátu GPC.V případech, kdy je eluát po průchodu kolonou pro další analýzu příliš zředěný, musí být zkoncentrován. Může být nezbytné odpařit eluát do sucha a opět jej rozpustit. Zkoncentrování eluátu musí být provedeno za podmínek, při nichž je zajištěno, že nedojde ke změnám v eluátu. Zpracování eluátu po GPC závisí na analytické metodě použité ke kvantitativnímu stanovení.1.6.4 Přístroje a pomůckyAparatura pro GPC sestává z těchto částí:- zásobník rozpouštědla,- odplynovací zařízení (podle potřeby),- dávkovací čerpadlo,- tlumič rázů (podle potřeby),- vstřikovací systém,- chromatografické kolony,- detektor,- průtokoměr (podle potřeby),- zapisovač,- nádoba na odpad.Musí být zajištěno, aby byl systém GPC inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF).1.6.5 Vstřikování a systém dávkování rozpouštědlaUrčený objem roztoku vzorku se vnese na kolonu buď dávkovačem nebo ručně v ostře ohraničené zóně. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním vnesení) může způsobit změny v pozorované distribuci molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být opatřen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min.1.6.6 KolonaPodle typu vzorku se k charakterizaci polymeru použije jednoduchá kolona nebo několik za sebou řazených kolon. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, vylučovací meze). Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrodynamický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou rozpouštědlo, teplota a průtok (1, 2, 3).1.6.7 Teoretická patraPoužitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. Při použití THF jako eluentu to zahrnuje vnesení roztoku ethylbenzenu nebo jiné vhodné nepolární rozpuštěné látky na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán touto rovnicí:N = 5,54neboN = 16kdeN  je počet pater,Ve  je eluční objem v maximu píku,W  šířka píku na základní čáře,W½  šířka píku v polovině výšky.1.6.8 Separační účinnostVedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roli také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z tohoto vztahu:V-V10M≥ 6,0cm3cm2kdeVe, Mx  je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností Mx,Ve, (10 Mx)  je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností.Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem:R= 2××M/M1kdeVe1, Ve2  jsou eluční objemy dvou standardů polystyrenu v maximu píku,W1, W2  jsou šířky píků na základní čáře,M1, M2  jsou molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10).Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4).1.6.9 RozpouštědlaVšechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 99,5 % čistotu). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho dopravou čerpadlem na kolonu odstraněny plyny.1.6.10 Kontrola teplotyTeplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a vedení) by měla být konstantní a měla by být v souladu s volbou rozpouštědla.1.6.11 DetektorDetektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detektoru co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používá diferenciálního refraktometru. Vyžadují-li to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/vis, IR detektory a viskozitní detektory atd.2. ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ2.1 ÚdajePokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování údajů, měla by být použita norma DIN (1).Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně. Ve všech případech je důležité stanovit také údaje ze slepých pokusů zpracovaných za stejných podmínek jako vzorek.Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu.Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního standardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log Mp (přičemž Mp je výška maxima píku kalibračního standardu). Pro jeden řád hodnot molekulové hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje alespoň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se určí hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Při stanovení se část křivky odpovídající molekulovým hmotnostem nižším než 1000 podle potřeby koriguje na nečistoty a přísady. Eluční křivky se obvykle hodnotí pomocí elektronického zpracování údajů. Při manuálním zpracování údajů do číselné formy lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3).Jestliže je v koloně zachycen nerozpustný polymer, je jeho molekulová hmotnost pravděpodobně vyšší než molekulová hmotnost rozpuštěné frakce, a pokud by tato skutečnost nebyla zohledněna, došlo by k nadhodnocení obsahu molekul o nízké hmotnosti. Návod na korigování obsahu molekul o nízké hmotnosti na obsah nerozpuštěného polymeru je uveden v příloze.Distribuční křivka musí být znázorněna ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumulativní četnost v procentech proti log M). V grafickém znázornění by měl mít jeden řád molekulové hmotnosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. U integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ose y přibližně 10 cm.2.2 Protokol o zkoušceProtokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:2.2.1 Zkoušená látka- dostupné informace o zkoušené látce (identifikace, přísady, nečistoty),- popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy.2.2.2 Přístrojové vybavení- zásobník eluentu, inertní plyn, odplynění eluentu, složení eluentu, nečistoty,- dávkovací čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém,- separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd., počet, délka a pořadí použitých kolon),- počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému),- informace o symetrii píků,- teplota kolony, způsob řízení teploty,- detektor (princip měření, typ, objem kyvety),- průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip měření),- systém pro záznam a zpracování údajů (hardware a software).2.2.3 Kalibrace systému- podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky,- informace o kritériích jakosti této metody (např. korelační koeficient, součet čtverců chyb atd.),- informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování údajů,- všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat tyto informace:- název vzorku,- výrobce vzorku,- charakteristické hodnoty standardů Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení,- vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace,- hodnota Mp použitá po kalibraci,- eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku,- hodnota Mp vypočtená pro maximum píku,- chyba vypočtené hodnoty Mp a kalibrační hodnoty Mp vyjádřená v procentech.2.2.4 Informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností v polymeru- popis metod použitých v analýze a způsobu, jakým byly experimenty provedeny,- informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností vyjádřeném v hmotnostních procentech celkového vzorku,- informace o nečistotách, přísadách a jiných nepolymerních podílech vyjádřených v hmotnostních procentech celkového vzorku.2.2.5 Hodnocení- hodnocení vlivu času: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd.),- informace o tom, zda bylo hodnocení provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času,- informace o mezích hodnocení v případě, že pík nebyl úplně analyzován,- popis metody vyrovnávání křivek, bylo-li použito,- příprava a postupy předúpravy vzorku,- popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic,- vstříknutý objem (μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml),- pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC,- podrobný popis všech změn zkušebních postupů,- podrobnosti o rozsahu chyb,- jakékoli další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků.3. LITERATURA(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Díl 1.(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. (eds.) (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.--------------------------------------------------PŘÍLOHA III CA.20 CHOVÁNÍ POLYMERŮ PŘI ROZPOUŠTĚNÍ NEBO EXTRAKCI VE VODĚ1. METODAPopsaná metoda je replikou revidované verze metody OECD TG 120 (1997). Další technické informace jsou uvedeny v odkaze (1).1.1 ÚvodU určitých polymerů, např. emulzních polymerů, může být před použitím dále popsané metody nezbytná předúprava. Tato metoda není použitelná pro kapalné polymery a pro polymery, které za zkušebních podmínek reagují s vodou.Není-li metoda použitelná nebo proveditelná, je možné zkoumat chování polymerů při rozpouštění a extrakci jinými metodami. V takových případech by měly být uvedeny všechny podrobnosti použité metody a její zdůvodnění.1.2 Referenční látkyNejsou.1.3 Podstata zkušební metodyChování polymerů při rozpouštění nebo extrakci ve vodném prostředí se zjišťuje baňkovou metodou (viz A.6, rozpustnost ve vodě, baňková metoda) s úpravou uvedenou dále.1.4 Kritéria jakostiNejsou.1.5 Popis zkušební metody1.5.1 Přístroje a pomůckyPro provedení metody je nezbytné toto zařízení:- drticí zařízení, např. mlýnek pro přípravu částic o známé velikosti,- třepačka s možností řízení teploty,- membránový filtrační systém,- vhodné analytické vybavení,- normalizovaná síta.1.5.2 Příprava vzorkuReprezentativní vzorek musí být nejdříve omezen za použití vhodného síta na velikost částic 0,125 až 0,25 mm. Kvůli stálosti vzorku nebo kvůli procesu drcení může být nezbytné chlazení. Kaučukovité materiály mohou být drceny při teplotě kapalného dusíku (1).Pokud není možné dosáhnout požadované velikosti částic, je třeba přijmout taková opatření, aby byla velikost částic zmenšena co nejvíce; výsledky by měly být zaznamenány. Ve zprávě je nezbytné uvést, jak byl rozdrcený vzorek uchován do provedení zkoušky.1.5.3 PostupDo každé ze tří nádob opatřených skleněnými zátkami se naváží po 10 g zkoušené látky a přidá se po 1000 ml vody. Ukáže-li se zpracování 10 g polymeru neschůdným, mělo by být použito nejbližší vyšší množství, které lze zpracovat, a objem vody by měl být podle toho upraven.Nádoby se těsně zazátkují a poté se třepou při 20 °C. Měla by být použita třepačka nebo míchačka schopná pracovat při konstantní teplotě. Po 24 hodinách se obsah každé nádoby odstředí nebo zfiltruje a v čiré vodné fázi se vhodnou analytickou metodou stanoví koncentrace polymeru. Nejsou-li k dispozici vhodné analytické metody pro vodnou fázi, lze celkovou rozpustnost nebo extrahovatelnost zhodnotit z hmotnosti sušiny na filtru nebo odstředěné sraženiny.Obvykle je nezbytné kvantitativně rozlišit nečistoty a přísady na jedné straně, a nízkomolekulární podíly na druhé straně. V případě gravimetrického stanovení je také důležité provést slepý pokus bez použití zkoušené látky s cílem zohlednit zbytky pocházející z experimentálního postupu.Chování při rozpouštění nebo extrakci polymerů ve vodě při 37 °C a pH 2 a 9 může být stanoveno způsobem popsaným v případě provádění experimentu při 20 °C. Hodnot pH lze dosáhnout přidáním buď vhodných pufrů, nebo vhodných kyselin nebo zásad, např. kyseliny chlorovodíkové, kyseliny octové, hydroxidu sodného nebo draselného analytické čistoty nebo NH3.V závislosti na použité metodě by měla být provedena jedna nebo dvě zkoušky. Jsou-li k dispozici dostatečně specifické metody pro přímou analýzu vodné fáze na obsah polymeru, měla by stačit jedna zkouška, jak je uvedena výše. Nejsou-li však takové metody k dispozici a zjištění chování polymeru při rozpouštění nebo extrakci je omezeno na nepřímou analýzu stanovením celkového obsahu organického uhlíku (TOC) ve vodném extraktu, měla by být provedena dodatečná zkouška. Tato dodatečná zkouška by měla být rovněž provedena třikrát, přičemž se použije 10krát menší množství vzorků polymeru a stejné množství vody jako v první zkoušce.1.5.4 Analýza1.5.4.1 Zkouška s jednou velikostí vzorkuMetody pro přímou analýzu složek polymeru ve vodné fázi mohou být k dispozici. V opačném případě lze také zvážit nepřímou analýzu rozpuštěných nebo extrahovaných složek polymeru stanovením celkového obsahu rozpustných složek a provedením korekce na obsah nepolymerních složek.Analýza vodné fáze na obsah celkového polymerního podíluje možná buď dostatečně citlivou metodou, např.- stanovením celkového obsahu organického uhlíku (TOC) rozkladem persíranem nebo dichromanem za vzniku CO2 a následnou IR analýzou nebo chemickou analýzou,- atomovou absorpční spektrometrií (AAS) nebo jejím protějškem spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem (ICP) pro silikonové polymery nebo polymery obsahující kov,- UV absorpcí nebo spektrofluorimetrií pro aromatické polymery,- kapalinovou chromatografií s hmotovým spektrometrem (LC-MS) pro nízkomolekulární vzorky,nebo vakuovým odpařením vodného extraktu do sucha a spektroskopickou (IR nebo UV atd.) nebo AAS/ICP analýzou zbytku.Není-li analýza vodné fáze jako takové možná, měl by být vodný extrakt extrahován organickým rozpouštědlem nemísitelným s vodou, např. chlorovaným uhlovodíkem. Rozpouštědlo se poté odpaří a zbytek se analyzuje způsobem popsaným výše pro obsah polymeru. Jakékoli složky, které jsou identifikovány jako nečistoty nebo přísady, se odečtou, aby byl stanoven stupeň rozpustnosti samotného polymeru.Jsou-li přítomna relativně velká množství takových materiálů, může být nezbytné analyzovat zbytek například HPLC nebo GC, aby se odlišily nečistoty z přítomného monomeru nebo deriváty monomeru a aby tak mohl být stanoven skutečný obsah monomeru nebo jeho derivátů.V některých případech může být postačující pouhé odpaření organického rozpouštědla do sucha a zvážení suchého zbytku.1.5.4.2 Zkouška se dvěma různými velikostmi vzorkuVšechny vodné extrakty se analyzují na celkový obsah organického uhlíku (TOC).Provede se gravimetrické stanovení nerozpuštěného nebo neextrahovaného podílu vzorku. Zůstávají-li po odstředění nebo filtraci obsahu každé nádoby usazeny na stěnách nádoby zbytky polymeru, měla by být nádoba oplachována filtrátem, dokud není vyčištěna od všech viditelných zbytků. Poté se filtrát opět odstředí nebo zfiltruje. Zbytky, které zůstanou na filtru nebo v centrifugační kyvetě, se vysuší ve vakuu při 40 °C a zváží. Sušení se provádí do konstantní hmotnosti.2. ÚDAJE2.1 Zkouška s jednou velikostí vzorkuPro každou ze tří nádob by měly být uvedeny jednotlivé výsledky a průměrné hodnoty vyjádřené v jednotkách hmotnosti vztažené na objem roztoku (obvykle mg/l) nebo v jednotkách hmotnosti vztažené na hmotnost vzorku polymeru (obvykle mg/g). Kromě toho by měla být uvedena ztráta hmotnosti vzorku (vypočtená jako hmotnost rozpuštěné látky dělená hmotností výchozího vzorku). Měly by být vypočteny relativní směrodatné odchylky (RSD). Měly by být uvedeny jednotlivé hodnoty pro celkovou látku (polymer + hlavní přísady atd.) a pro samotný polymer (tj. po odečtení příspěvku od těchto přísad).2.2 Zkouška se dvěma různými velikostmi vzorkuPro každý experiment by měly být uvedeny jednotlivé hodnoty TOC ve vodných extraktech obou trojích experimentů a průměrné hodnoty vyjádřené v jednotkách hmotnosti vztažené na objem roztoku (obvykle mg C/l) a rovněž v jednotkách hmotnosti vztažené na hmotnost výchozího vzorku (obvykle mg C/g).Není-li mezi výsledky pro vysoké a nízké poměry vzorek/voda rozdíl, může to znamenat, že všechny extrahovatelné složky byly skutečně vyextrahovány. V takovém případě obvykle nebývá přímá analýza nezbytná.Měly by být uvedeny jednotlivé hmotnosti zbytků vyjádřené v procentech počátečních hmotností vzorků. Měly by být vypočteny průměrné hodnoty za celý experiment. Rozdíly mezi 100 % a zjištěnými hodnotami v procentech představují množství rozpustného a extrahovatelného materiálu v původním vzorku vyjádřené v procentech.3. ZPRÁVY3.1 Protokol o zkoušceProtokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:3.1.1 Zkoušená látka- dostupné informace o zkoušené látce (identifikace, přísady, nečistoty, obsah podílu o nízké molekulové hmotnosti).3.1.2 Experimentální podmínky- popis použitých postupů a experimentálních podmínek,- popis analytických a detekčních metod.3.1.3 Výsledky- výsledky rozpustnosti nebo extrahovatelnosti v mg/l; jednotlivé a střední hodnoty pro extrakční zkoušky v různých roztocích, rozepsané podle obsahu polymeru, nečistot, přísad atd.,- výsledky rozpustnosti nebo extrahovatelnosti v mg/g polymeru,- hodnoty TOC ve vodných extraktech, hmotnost rozpuštěné látky a vypočtené procentuální hodnoty (pokud byly stanoveny),- hodnota pH každého vzorku,- informace o hodnotách získaných při slepém pokusu,- podle potřeby upozornění na chemickou nestálost zkoušené látky během zkušebních postupů a analytických postupů,- všechny informace, které jsou důležité pro interpretaci výsledků.4. LITERATURA(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.--------------------------------------------------PŘÍLOHA III DC.13 BIOAKUMULACE: PRŮTOKOVÁ ZKOUŠKA NA RYBÁCH1. METODATato bioakumulační metoda je replikou metody OECD TG 305 (1996).1.1 ÚvodV této metodě je popsán postup pro charakterizaci schopnosti látek bioakumulovat se v rybách za průtokových podmínek. Ačkoliv jsou průtokové režimy preferovány, připouštějí se i semistatické režimy, jsou-li splněna kritéria validace.V metodě jsou dostatečně popsány podrobnosti pro provedení zkoušky, přičemž je poskytnuta dostatečná volnost pro přizpůsobení experimentálního uspořádání podmínkám v jednotlivých laboratořích a různým vlastnostem zkoušených látek. Metoda je nejefektivnější pro stabilní organické chemikálie s hodnotou log Po/v od 1,5 do 6,0 (1), ale může být také použita na superlipofilní látky (s hodnotou log Po/v > 6,0). Předběžně odhadnutý bioakumulační faktor (BCF), někdy označovaný jako KB, bude pro takové superlipofilní látky pravděpodobně vyšší než hodnota bioakumulačního faktoru v ustáleném stavu (BCFus), která je očekávána z laboratorních experimentů. Předběžné odhady pro organické látky s hodnotou log Po/v až asi 9,0 lze získat pomocí rovnice Binteina et al (2). Mezi parametry, které charakterizují bioakumulační potenciál, patří rychlostní konstanta příjmu (k1), rychlostní konstanta vylučování (k2) a BCFus.Izotopově značené zkoušené látky mohou usnadnit analýzu vzorků vody a ryb a mohou být použity v případě, že by měla být provedena identifikace a kvantifikace produktů rozkladu. Měří-li se celkový obsah radioaktivního zbytku (například po spálení nebo solubilizaci tkáně), je hodnota BCF založena na výchozí sloučenině, všech zadržených metabolitech a také na asimilovaném uhlíku. Hodnoty BCF založené na celkovém obsahu radioaktivního zbytku tedy nemohou být přímo srovnatelné s hodnotou BCF získanou specifickou chemickou analýzou pouze výchozí sloučeniny.V izotopových studiích mohou být pro stanovení BCF výchozí sloučeniny zařazeny čisticí postupy, a je-li to považováno za nezbytné, mohou být charakterizovány hlavní metabolity. Je možné rovněž kombinovat studii metabolismu ryb se studií bioakumulace analýzou a identifikací zbytků v tkáních.1.2 Definice a jednotkyBiokoncentrace/Bioakumulace je nárůst koncentrace zkoušené látky v organismu (v jeho specifikované tkáni) nebo na něm vzhledem ke koncentraci zkoušené látky v okolním médiu.Bioakumulační faktor (BCF nebo KB) je koncentrace zkoušené látky v rybách nebo na nich nebo v jejich specifikovaných tkáních (Cr v μg/g (ppm)) dělená koncentrací chemikálie v okolním médiu (Cv v μg/ml (ppm)), a to kdykoliv ve fázi příjmu při této zkoušce.Bioakumulační faktor v ustáleném stavu (BCFus nebo KB) se po dlouhou dobu výrazně nemění; koncentrace zkoušené látky v okolním médiu je po tuto dobu konstantní.Plató nebo ustálený stav je stav dosažený tehdy, je-li při grafickém znázornění křivka časové závislosti koncentrace zkoušené látky v rybách (Cr) rovnoběžná s časovou osou a tři po sobě jdoucí analýzy Cr vzorků odebraných v intervalech alespoň dvou dnů se neliší více než o ± 20 % a není-li mezi těmito třemi dobami odběru žádný výrazný rozdíl. Analyzují-li se spojené vzorky, požadují se čtyři po sobě jdoucí analýzy. V případě zkoušených látek, jejichž příjem probíhá pomalu, jsou vhodnější sedmidenní intervaly.Bioakumulační faktory vypočtené přímo z kinetických rychlostních konstant (k1/k2) se nazývají kinetické akumulační faktory (BCFk).Rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (Po/v) je rovnovážný poměr mezi rozpustností chemikálie v oktan-1-olu a ve vodě (metoda A.8) a označuje se také jako Ko/v. Logaritmus hodnoty Po/v se používá jako ukazatel potenciálu chemikálie bioakumulovat se ve vodních organismech.Expozice nebo fáze příjmu je časový úsek, během něhož jsou ryby vystaveny působení zkoušené chemikálie.Rychlostní konstanta příjmu (k1) je číselná hodnota definující rychlost nárůstu koncentrace zkoušené látky v testovacích rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních), jsou-li ryby této chemikálii vystaveny (k1 se vyjadřuje v jednotce den– 1).Poexpoziční nebo vylučovací fáze je časový úsek po přemístění testovacích ryb z média obsahujícího zkoušenou látku do média, které tuto látku neobsahuje, během něhož se studuje vylučování látky z testovacích ryb (nebo její čistý úbytek v nich).Rychlostní konstanta vylučování (k2) je číselná hodnota definující rychlost poklesu koncentrace zkoušené látky v testovacích rybách (nebo v jejich specifikovaných tkáních) po jejich přemístění z média obsahujícího zkoušenou látku do média, které tuto látku neobsahuje (k2 se vyjadřuje v jednotce den– 1).1.3 Podstata zkušební metodyZkouška má dvě fáze: fázi expozice (příjem) a poexpoziční fázi (vylučování). Během fáze příjmu jsou dvě oddělené skupiny ryb stejného druhu vystaveny alespoň dvěma koncentracím zkoušené látky. Poté jsou přemístěny do média, které zkoušenou látku neobsahuje, aby začala fáze vylučování. Fáze vylučování je vždy nezbytná, není-li příjem látky během fáze příjmu nevýznamný (např. je-li BCF menší než 10). Koncentrace zkoušené látky v rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních) se sleduje v průběhu obou fází zkoušky. Vedle těchto dvou zkušebních koncentrací se za stejných podmínek, s výjimkou přítomnosti zkoušené látky, udržuje kontrolní skupina ryb, aby mohly být na odpovídající kontrolní skupině porovnány možné nepříznivé účinky pozorované při bioakumulačních zkouškách a aby byly získány koncentrace zkoušené látky v pozadí.Fáze příjmu trvá 28 dnů, není-li prokázáno, že je rovnováhy dosaženo dříve. Délku fáze příjmu a dobu potřebnou k ustavení rovnovážného stavu lze předpovědět pomocí rovnice v příloze 3. Fáze vylučování poté začne po přemístění ryb do jiné nádrže bez zkoušené látky. Je-li to možné, vypočítají se bioakumulační faktory nejlépe jako poměr (BCFus), tj. poměr koncentrace v rybách (Cr) a ve vodě (Cv) ve zřetelném rovnovážném stavu, a jako kinetický bioakumulační faktor (BCFk), tj. poměr rychlostních konstant příjmu (k1) a vylučování (k2) za předpokladu kinetiky prvního řádu. Neřídí-li se zjevně naměřené hodnoty kinetikou prvního řádu, měl by být použit složitější model (příloha 5).Nedojde-li k ustálenému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve; poté začne fáze vylučování.Rychlostní konstanta příjmu, rychlostní konstanta (nebo konstanty, jsou-li použity složitější modely) vylučování (úbytku), bioakumulační faktor a, je-li to možné, intervaly spolehlivosti každého z těchto parametrů se vypočítají z modelu, který popisuje naměřené koncentrace zkoušené látky v rybách a ve vodě.Faktor BCF se vyjadřuje jako funkce celkové živé hmotnosti ryby. Pro zvláštní účely však mohou být použity specifikované tkáně nebo orgány (např. svalovina, játra), je-li ryba dostatečně velká nebo je-li možné ji rozdělit na jedlý (vykostěný) podíl a nejedlý podíl (vnitřnosti). Vzhledem k tomu, že u mnoha organických látek existuje zřetelný vztah mezi schopností bioakumulace a lipofilností, existuje také odpovídající vztah mezi obsahem tuku v testovacích rybách a pozorovanou bioakumulací takové látky. Aby se tedy snížilo kolísání výsledků pro tyto látky s vysokou lipofilností (tj. s log Po/v > 3), měla by být bioakumulace vztažena vedle celkové hmotnosti těla také k obsahu tuku.Obsah tuku by měl být stanoven pokud možno na stejném biologickém materiálu, jaký je použit ke stanovení koncentrace zkoušené látky.1.4 Informace o zkoušené látcePřed prováděním zkoušek bioakumulace by měly být o zkoušené látce známy tyto informace:a) rozpustnost ve vodě;b) rozdělovací koeficient n-oktanol/voda Po/v (označovaný také jako Ko/v, stanovený metodou HPLC, viz A.8);c) hydrolýza;d) fototransformace ve vodě stanovená ozářením slunečním nebo simulovaným slunečním světlem za podmínek zkoušky bioakumulace (3);e) povrchové napětí (u látek, u nichž nelze stanovit log Po/v);f) tlak par;g) v případě potřeby "snadná" biologická rozložitelnost.Další požadovanou informací je toxicita pro druh ryby, který má být použit, nejlépe asymptotická hodnota LC50 (tj. časově nezávislá). K dispozici musí být vhodná analytická metoda o známé přesnosti a citlivosti pro kvantitativní stanovení zkoušené látky ve zkušebních roztocích a v biologickém materiálu a dále podrobnosti o přípravě a uchovávání vzorků. Měly by být také známy meze stanovitelnosti zkoušené látky jak ve vodě, tak v rybích tkáních. Je-li použita zkoušená látka značená 14C, měla by být známá aktivita nečistot vyjádřená v procentech.1.5 Validita zkouškyAby byla zkouška platná, měly by být splněny tyto podmínky:- kolísání teploty je menší než ±2 °C,- koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60 % nasycení,- koncentrace zkoušené látky v nádrži je udržována v intervalu ±20 % kolem střední hodnoty naměřených hodnot během fáze příjmu,- mortalita nebo jiné nepříznivé účinky a choroby jak u kontrolních, tak u exponovaných ryb je na konci zkoušky menší než 10 %; jestliže je zkouška prodloužena na několik týdnů nebo měsíců, měl by být úhyn nebo jiné nepříznivé účinky v obou skupinách ryb menší než 5 % za měsíc nebo by neměl překročit celkem 30 %.1.6 Referenční sloučeninyPoužití referenčních sloučenin o známém bioakumulačním potenciálu by mohlo být užitečné pro kontrolu experimentálního postupu. Zatím však ještě nelze doporučit žádné specifické látky.1.7 Popis zkušební metody1.7.1 Přístroje a pomůckyU všech částí zařízení je třeba se vyhýbat použití materiálů, které se mohou rozpouštět, sorbovat nebo vyluhovat a mají nepříznivý účinek na ryby. Lze použít standardní pravoúhlé nebo válcové nádrže vyrobené z inertního materiálu a mající vhodný objem s ohledem na náplň. Použití měkkých trubek z plastu by mělo být minimalizováno. Měly by být použity trubky z teflonu (R), z korozivzdorné oceli a/nebo ze skla. Zkušenosti ukázaly, že pro látky s vysokými absorpčními koeficienty, jako jsou syntetické pyrethroidy, je nutné použít silanizované sklo. V těchto případech musí být zařízení po použití zlikvidováno.1.7.2 VodaKe zkoušce se používá přírodní voda, která by měla být získána z nekontaminovaného zdroje stálé kvality. Ředicí voda musí mít kvalitu, která umožní přežití zvoleného druhu ryby po dobu aklimatizace a v průběhu fází zkoušky, aniž by vykazoval abnormální vzhled nebo chování. V ideálním případě by mělo být prokázáno, že testovací druh může v ředicí vodě přežít, růst a rozmnožovat se (např. zkouškou s laboratorní kulturou nebo zkouškou toxicity během životního cyklu). Voda by měla být charakterizována alespoň hodnotou pH, tvrdostí, celkovým obsahem pevných látek, celkovým obsahem organického uhlíku a podle možnosti také obsahem amoniaku a dusičnanů, alkalitou a v případě mořských druhů salinitou. Všechny parametry, které jsou důležité pro optimální prospívání ryb, jsou známy; v příloze I jsou přesto uvedeny doporučené maximální koncentrace pro řadu parametrů sladké a mořské vody.Voda by měla mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH by měla být v rozmezí 6,0 až 8,5, avšak během zkoušky by se pH nemělo lišit o více než ± 0, 5. Pro ujištění, že voda nebude mít přílišný vliv na výsledky zkoušky (například tvorbou komplexů se zkoušenou látkou) nebo nepříznivý vliv na stav obsádky ryb, by měly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Je-li kvalita ředicí vody relativně konstantní, mělo by být stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavních aniontů a kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidů (např. celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno např. každé tři měsíce. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být stanovení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců).Celkový přirozený obsah částic a rovněž obsah organického uhlíku (TOC) v ředicí vodě by měl být co nejnižší, aby nedošlo k absorpci zkoušené látky na organických látkách, což může snížit její biologickou dostupnost (4). Maximální přijatelná hodnota je 5 mg/l pro částice (sušina zachycená filtrem 0,45 μm) a 2 mg/l pro celkový organický uhlík (viz příloha 1). Je-li to nezbytné, měla by být voda před použitím filtrována. Příspěvek k obsahu organického uhlíku od testovacích ryb (exkrety) a ze zbytků potravy by měl být co nejmenší. V průběhu zkoušky by neměla koncentrace organického uhlíku ve zkušební nádrži překročit koncentraci organického uhlíku pocházejícího ze zkoušené látky a ze solubilizačního činidla, je-li použito, o více než 10 mg/l (±20 %).1.7.3 Zkušební roztokyZásobní roztok zkoušené látky se připraví ve vhodné koncentraci. Zásobní roztok by měl být připraven nejlépe jednoduchým smícháním nebo protřepáním zkoušené látky s ředicí vodou. Použití rozpouštědel nebo dispersantů (solubilizačních činidel) se nedoporučuje; v některých případech však může být pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné. Rozpouštědly, která mohou být použita, jsou ethanol, methanol, ethylenglykol-monomethylester, ethylenglykol-dimethylester, dimethylformamid a triethylenglykol. Dispersanty, které mohou být použity, jsou Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky odbouratelná činidla je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Zkoušená látka může být značena radioaktivními izotopy a měla by být nejvyšší čistoty (např. > 98 %).Při průtokových zkouškách je pro zajištění koncentrací zkoušené látky nezbytný systém, který nepřetržitě dávkuje a ředí zásobní roztok zkoušené látky (např. měřicí čerpadlo, proporcionální ředění, saturační systém). Přijatelná je výměna nejlépe pěti objemů v každé zkušební nádrži za den. Upřednostňuje se průtokový režim, není-li to však možné (např. jsou-li testovací organismy nepříznivě ovlivňovány), může být použita semistatická technika za předpokladu, že jsou splněna kritéria validity. Rychlosti průtoku zásobního roztoku a ředicí vody by měly být kontrolovány jak 48 hodin před zkouškou, tak poté alespoň denně během zkoušky. Tato kontrola by měla zahrnovat stanovení rychlosti průtoku v každé testovací nádrži a měla by zajistit, aby se rychlost průtoku neměnila o více než 20 % v rámci jedné nádrže nebo mezi nádržemi.1.7.4 Výběr druhůDůležitými kritérii pro výběr druhu jsou jeho dostupnost, možnost získat jej ve vyhovující velikosti a jeho bezproblémové udržování v laboratoři. Dalšími kritérii pro výběr druhu ryb jsou jeho rekreační, komerční a ekologický význam a rovněž srovnatelná citlivost, úspěšné dřívější použití atd.Doporučené druhy jsou uvedeny v příloze 2. Mohou být použity i jiné druhy, avšak zkušební postup musí být upraven, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. V takovém případě by měly být uvedeny důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky.1.7.5 Chov rybObsádka ryb se nechá aklimatizovat alespoň dva týdny při zkušební teplotě a krmí se odpovídající stravou stejného typu jako v průběhu zkoušky.Po 48 hodinách aklimatizace se zaznamená úhyn a použijí se tato kritéria:- úhyn vyšší než 10 % populace za sedm dnů: vyměnit celou obsádku,- úhyn 5 až 10 % populace za sedm dnů: nechat aklimatizovat dalších sedm dnů,- úhyn nižší než 5 % populace za sedm dnů: násada se přijímá; dojde li během dalších sedmi dnů k úhynu vyššímu než 5 %, celá obsádka se vymění.Zajistí se, aby ryby použité pro zkoušku nevykazovaly pozorovatelné nemoci a abnormality. Všechny nemocné ryby se vymění. Dva týdny před zkouškou nebo v průběhu zkoušky nesmí být léčeny u ryb žádné nemoci.1.8 Provedení zkoušky1.8.1 Předběžná zkouškaMůže být užitečné provést předběžný experiment s cílem optimalizovat zkušební podmínky konečné zkoušky, např. výběr koncentrace (koncentrací) zkoušené látky, délka fáze příjmu a fáze vylučování.1.8.2 Podmínky expozice1.8.2.1 Délka fáze příjmuPředpověď délky fáze příjmu lze získat z praktických zkušeností (např. z dřívější studie nebo podle chemikálie podobné akumulace) nebo z určitých empirických vztahů využívajících znalosti buď rozpustnosti ve vodě nebo rozdělovacího koeficientu n-oktanol/voda pro zkoušenou látku (viz příloha 3).Fáze příjmu trvá 28 dnů, není-li prokázáno, že je rovnováhy dosaženo dříve. Nedosáhne-li se ustáleného stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení, přičemž se provádějí další měření, nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve.1.8.2.2 Délka fáze vylučováníDoba odpovídající polovině délky fáze příjmu je obvykle dostatečná k tomu, aby se přiměřeně snížil (např. o 95 %) obsah látky v organismu (vysvětlení odhadu – viz příloha 3). Jestliže doba nezbytná pro dosažení 95 % úbytku je neprakticky dlouhá, překračuje například dvakrát běžnou délku fáze příjmu (tj. více než 56 dnů), může být použita kratší doba (tj. dokud není koncentrace zkoušené látky menší než 10 % koncentrace v rovnovážném stavu). V případě látek se složitějším charakterem příjmu a vylučování, než jaký představuje model ryby s jedním kompartmentem řídícím se kinetikou prvního řádu, však delší fáze vylučování umožní stanovit rychlostní konstanty úbytku. Délka fáze však může být určena dobou, po kterou zůstává koncentrace zkoušené látky v rybách nad mezí detekce analytické metody.1.8.2.3 Počty testovacích rybPočet ryb na jednu zkušební koncentraci se zvolí tak, aby byly pro každý odběr k dispozici nejméně čtyři ryby na jeden vzorek. Je-li požadována větší statistická váha, budou pro vzorek nezbytná větší množství ryb.Použijí-li se pohlavně dospělé ryby, uvede se, zda byly v experimentu použity samice nebo samci nebo obojí. Jsou-li použita obě pohlaví, mělo by být před započetím expozice prokázáno, že rozdíl v obsahu lipidů mezi oběma pohlavími není významný; oddělení samců a samic může být nezbytné.V každé zkoušce se vyberou ryby podobné hmotnosti, tak aby hmotnost nejmenší z nich nebyla nižší než dvě třetiny hmotnosti největší ryby. Všechny by měly být stejného stáří a měly by pocházet ze stejného zdroje. Vzhledem k tomu, že stáří a hmotnost ryby mají zřejmě často významný vliv na hodnoty BCF (1), musí být tyto podrobnosti přesně zaznamenány. Doporučuje se zvážit před zkouškou dílčí vzorek obsádky ryb s cílem odhadnout střední hmotnost.1.8.2.4 NásadaVolí se vysoký poměr množství vody k množství ryb, aby se minimalizovalo snížení koncentrace Cv způsobené přidáním ryb na začátku zkoušky, a také proto, aby nedošlo k poklesu koncentrace rozpuštěného kyslíku. Je důležité, aby rychlost nasazování byla přiměřená použitému druhu. V každém případě se obvykle doporučuje rychlost nasazování 0,1 až 1,0 g ryb (živá hmotnost) na litr vody za den. Vysoká rychlost nasazování může být zvolena, je-li prokázáno, že požadovaná koncentrace zkoušené látky může být udržována v mezích ±20 % a že koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60 % nasycení.Při volbě režimu nasazování má být přihlédnuto k obvyklému přirozenému prostředí ryb. Například ryby žijící u dna mohou vyžadovat při stejném objemu vody větší plochu dna než pelagické druhy ryb.1.8.2.5 KrmeníBěhem aklimatizace a po dobu zkoušky se ryby krmí vhodnou stravou se známým obsahem tuku a celkových bílkovin podávanou v množství dostatečném pro udržení zdravého stavu a pro udržení tělesné hmotnosti. Ryby se krmí denně v průběhu aklimatizace a po dobu zkoušky množstvím přibližně 1 až 2 % tělesné hmotnosti; tím se udrží v průběhu zkoušky obsah tuku u většiny druhů ryb na relativně konstantní úrovni. Množství krmiva by mělo být například jednou týdně nově přepočítáno, aby byla udržena odpovídající tělesná hmotnost a obsah tuku. Hmotnost ryb v každé nádrži může být pro tento výpočet odhadnuta z hmotnosti ryb naposledy odebraných z dotyčné nádrže. Ryby, které zůstaly v nádrži, se neváží.Nezkrmená potrava a exkrety se odstraňují z nádrží odsátím denně krátce po krmení (30 min. až 1 h). Nádrže se udržují v celém průběhu zkoušky v co nejvyšší čistotě, aby byla koncentrace organických látek co nejnižší, neboť přítomnost organického uhlíku může snižovat biologickou dostupnost zkoušené látky (1).Poněvadž mnoho krmiv pochází z rybí moučky, mělo by být krmivo analyzováno na přítomnost zkoušené látky. Je rovněž žádoucí, aby bylo krmivo analyzováno na přítomnost pesticidů a těžkých kovů.1.8.2.6 Světlo a teplotaFotoperioda je obvykle 12 až 16 hodin a teplota (±2 °C) by měla odpovídat testovacímu druhu (viz příloha 2). Druh a charakteristiky osvětlení by měly být známy. Měla by být věnována pozornost možné fototransformaci zkoušené látky za světelných podmínek studie. Mělo by být použito vhodné osvětlení, aby ryby nebyly vystaveny fotoproduktům nevyskytujícím se v přírodě. V některých případech může být vhodné použít filtr pro odfiltrování UV záření s vlnovou délkou kratší než 290 nm.1.8.2.7 Zkušební koncentraceRyby jsou vystaveny za průtokových podmínek alespoň dvěma koncentracím zkoušené látky ve vodě. Vyšší (nejvyšší) koncentrace zkoušené látky se obvykle volí tak, aby byla na úrovni 1 % její asymptotickéhodnoty akutní LC50 a aby byla desetkrát vyšší než je mez detekce této látky ve vodě při použité analytické metodě.Nejvyšší zkušební koncentraci lze také stanovit dělením akutní 96hodinové LC50 příslušným poměrem akutní/chronická letální dávka (u některých chemikálií může koeficient ležet mezi 3 a 100). Je-li to možné, volí se další koncentrace tak, aby se lišila od výše uvedené faktorem 10. Není-li to možné z důvodu kritéria 1 % z LC50 nebo z důvodu kritéria meze detekce, může být použit nižší faktor než 10 nebo by mělo být zváženo použití zkoušené látky značené 14C. Žádná koncentrace by neměla překročit rozpustnost látky.Je-li použito solubilizační činidlo, neměla by jeho koncentrace být vyšší než 0,1 ml/l a mělo by být stejné ve všech zkušebních nádržích. Jeho příspěvek, společně s příspěvkem zkoušené látky, k celkovému obsahu organického uhlíku ve zkušební vodě by měl být znám. Měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat.1.8.2.8 Kontrolní experimentyVedle zkušební série by měl být proveden kontrolní experiment s ředicí vodou, která popřípadě obsahuje solubilizační činidlo, pokud bylo zjištěno, že toto činidlo nemá na ryby žádné účinky. Není-li tomu tak, měly by být provedeny oba kontrolní experimenty.1.8.3 Četnost měření kvality vodyV průběhu zkoušky by mělo být v každé nádrži měřeno množství rozpuštěného kyslíku, TOC, pH a teplota. Celková tvrdost a popřípadě salinita by měly být měřeny v kontrolních experimentech a v jedné nádrži s vyšší (nejvyšší) koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a popřípadě salinita by měly být měřeny alespoň třikrát – na začátku, přibližně uprostřed a na konci fáze příjmu – a jednou týdně ve fázi vylučování. Hodnota TOC by měla být měřena na začátku zkoušky (24 hodin a 48 hodin před započetím fáze příjmu) před nasazením ryb a alespoň jednou týdně jak v průběhu fáze příjmu, tak v průběhu fáze vylučování. Teplota by měla být měřena denně, pH na začátku a na konci každé fáze a tvrdost vody jednou v průběhu zkoušky. Teplota by měla být měřena nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné nádrži.1.8.4 Odběr vzorků a analýza ryb a vody1.8.4.1 Časový rozvrh odebírání vzorků ryb a vodyVoda ze zkušebních nádrží se pro stanovení koncentrace zkoušené látky odebírá před nasazením ryb a během fáze příjmu i během fáze vylučování. Voda se odebírá alespoň ve stejnou dobu jako ryby a před krmením. Během fáze příjmu se stanovují koncentrace zkoušené látky, aby se ověřilo, že jsou v souladu s kritérii validity.Ryby se odebírají alespoň pětkrát během fáze příjmu a alespoň čtyřikrát během fáze vylučování. Vzhledem k tomu, že v mnoha případech bude obtížné s tímto počtem vzorků vypočítat rozumně přesný odhad hodnoty BCF, zejména jde-li o jinou než jednoduchou kinetiku prvního řádu, může být účelné odebírat vzorky v obou fázích častěji (viz příloha 4). Dodatečné vzorky se uloží a analyzují až poté, co se výsledky prvního kola analýz ukáží jako nedostatečné pro výpočet hodnoty BCF o požadované přesnosti.Příklad přijatelného časového rozvrhu odběru vzorků je uveden v příloze 4. Jiné plány lze snadno odvodit pomocí jiné předpokládané hodnoty Po/v, s níž se vypočítá expoziční doba pro 95 % příjem.V odběru vzorků se pokračuje během fáze příjmu do dosažení ustáleného stavu nebo po dobu 28 dnů, podle toho, co nastane dříve. Není-li ustáleného stavu dosaženo do 28 dnů, v odběru vzorků se pokračuje do ustavení ustáleného stavu nebo do 60 dnů, podle toho, co nastane dříve. Před zahájením fáze vylučování se ryby přemístí do čistých nádrží.1.8.4.2 Odběr vzorků a příprava vzorkůVzorky vody pro analýzy se odebírají například odsáváním potrubím z inertního materiálu ze středu zkušební nádrže. Vzhledem k tomu, že se biologicky nedostupná frakce zkoušené látky nedá často oddělit od biologicky dostupné frakce ani filtrací, ani odstředěním (zejména v případě superlipofilních chemikálií, tj. chemikálií s log Po/v > 5) (1, 5), nemohou být vzorky takto zpracovány.Namísto toho je třeba učinit opatření pro to, aby byly nádrže udržovány co nejčistší, a obsah organického uhlíku by měl být pravidelně monitorován jak během fáze příjmu, tak během fáze vylučování.Při každém odběru se z nádrží odebere vhodný počet ryb (obvykle alespoň čtyři). Odebrané ryby se rychle omyjí pod tekoucí vodu, důkladně se osuší, ihned se usmrtí nejvhodnější humánní metodou a zváží se.Ryby a voda se pokud možno analyzují ihned po odběru s cílem předejít degradaci nebo ztrátám a vypočítat přibližné rychlosti příjmu a vylučování ještě v průběhu zkoušky. Okamžitá analýza rovněž zabrání opožděnému stanovení plató při jeho dosažení.Neprovádí-li se analýza okamžitě, vzorky se vhodným způsobem uchovají. Před zahájením studie je třeba zjistit informace o řádné metodě uchovávání vzorků s ohledem na dotyčnou zkoušenou látku – například hluboké zmrazení, udržování při 4 °C, délka uchovávání, vyluhování atd.1.8.4.3 Kvalita analytické metodyVzhledem k tomu, že celý postup je určen hlavně správností, přesností a citlivostí analytické metody použité pro analýzu zkoušené látky, je třeba experimentálně kontrolovat, že přesnost a reprodukovatelnost chemické analýzy a rovněž výtěžek zkoušené látky jak z vody, tak ze vzorků ryb jsou pro danou analytickou metodu dostatečné. Kontroluje se také, zda se zkoušená látka nevyskytuje v použité ředicí vodě.Hodnoty Cv a Cr se podle potřeby korigují na výtěžky a hodnoty pozadí v kontrolních experimentech. Vzorky ryb a vody se zpracovávají tak, aby se minimalizovala kontaminace a ztráty (např. v důsledku adsorpce odběrným zařízením).1.8.4.4 Analýza vzorků rybJe-li ve zkoušce použit materiál značený radioizotopy, je možné provést analýzu na celkovou aktivitu (tj. pro výchozí látku i s metabolity) nebo lze provést separaci, tak aby mohla být výchozí látka analyzována samostatně. Také hlavní metabolity mohou být charakterizovány v rovnovážném stavu nebo na konci fáze příjmu, podle toho, k čemu dojde dříve. Je-li hodnota BCF vyjádřená celkovou aktivitou reziduí ≥ 1000 %, může být účelné, a pro určité kategorie chemikálií, např. pesticidy, se to důrazně doporučuje, identifikovat a kvantifikovat produkty rozkladu představující ≥ 10 % celkového množství reziduí v tkáních ryb v ustáleném stavu. Jsou-li produkty rozkladu představující ≥ 10 % celkových značených reziduí identifikovány a kvantifikovány, doporučuje se také identifikovat a kvantifikovat produkty rozkladu ve zkušební vodě.Koncentrace zkoušené látky by měla být obvykle stanovena pro každou jednotlivou zváženou rybu. Není-li to možné, mohou být vzorky při každém odběru sdružovány, avšak sdružování omezuje statistické postupy, které lze na údaje aplikovat. Pokud je důležitý určitý statistický postup a statistická váha, měl by být ve zkoušce nasazen přiměřený počet ryb vyhovující požadovanému sdružování a statistické váze (6, 7).Hodnota BCF by měla být vyjádřena jako funkce celkové hmotnosti a v případě lipofilních látek také jako funkce obsahu lipidů. Obsah lipidů v rybách se stanoví pokud možno při každém odběru. Pro stanovení obsahu lipidů by měla být použita vhodná metoda (odkazy 8 a 2 v příloze 3). Jako standardní metoda může být doporučena technika extrakce směsí chloroform a methanol (9). Různé metody neposkytují stejné hodnoty (10), a proto je důležité uvést podrobnosti o použité metodě. Je-li to možné, měla by být analýza lipidů provedena na extraktu připraveném pro analýzu zkoušené látky, neboť lipidy musí být často před chromatografickou analýzou odstraněny. Obsah lipidů v rybách (v mg/kg živé hmotnosti) na konci experimentu by se neměl lišit od jejich obsahu na počátku o více než ±25 %. Měl by být uveden také podíl pevných látek v tkáních, aby bylo možné provést přepočet koncentrace tuků z živé hmotnosti na sušinu.2. ÚDAJE2.1 Zpracování výsledkůKřivka příjmu zkoušené látky se sestrojí vynesením její koncentrace v rybách nebo na nich (nebo ve specifikovaných tkáních) v průběhu fáze příjmu proti času v lineárním měřítku. Dosáhla-li křivka plató, tj. pokud začíná být rovnoběžná s časovou osou, vypočítá se hodnota BCFus v rovnovážném stavu z poměruCv ustáleném stavuCv ustáleném stavustřední hodnotaNení-li dosaženo ustáleného stavu, je možné vypočítat hodnotu BCFus s dostatečnou přesností pro posouzení rizika z ustáleného stavu při 80 % (1,6/k2) nebo 95 % (3,0/k2) rovnováze.Také akumulační faktor BCFk se stanoví jako poměr dvou rychlostních konstant prvního řádu k1/k2. Rychlostní konstanta vylučování se obvykle stanoví z křivky vylučování (tj. grafu poklesu koncentrace zkoušené látky v rybách v čase). Rychlostní konstanta příjmu se poté vypočte pomocí hodnoty k2 a hodnoty Cr odvozené z křivky příjmu (viz také příloha 5). Upřednostňovanou metodou pro získání hodnoty BCFk a rychlostních konstant k1 a k2 je metoda nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače (11). K výpočtu hodnot k1 a k2 lze jinak použít grafické metody. Není-li zjevně křivka vylučování křivkou prvního řádu, měly by být použity složitější modely (viz odkazy v příloze 3) a měl by být konzultován biostatistik.2.2 Interpretace výsledkůVýsledky by měly být interpretovány opatrně v případě, že se naměřené koncentrace zkoušených roztoků pohybují na úrovních blízkých mezi detekce analytické metody.Jasně vymezené křivky příjmu a úbytku jsou ukazatelem dobré kvality údajů o bioakumulaci. Rozdíl konstant příjmu a vylučování pro dvě zkušební koncentrace by měl být nižší než 20 %. Pozorované významné rozdíly v rychlostech příjmu a vylučování mezi dvěma použitými zkušebními koncentracemi by měly být zaznamenány a mělo by být uvedeno jejich možné vysvětlení. Interval spolehlivosti hodnot BCF u dobře navržených studií se obecně blíží ± 20 %.3. ZPRÁVYProtokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:3.1 Zkoušená látka- fyzikální povaha a popřípadě fyzikálně-chemické vlastnosti,- chemické identifikační údaje (včetně obsahu organického uhlíku, je-li to třeba),- v případě značení radioaktivními izotopy jejich přesná poloha a aktivita nečistot, vyjádřená v procentech.3.2 Testovací druh- vědecký název, kmen, zdroj, případné předběžné ošetření, aklimatizace, stáří, rozmezí velikostí atd.3.3 Zkušební podmínky- použitý zkušební postup (např. průtokový nebo semistatický),- typ a charakteristiky použitého osvětlení a fotoperioda (fotoperiody),- uspořádání zkoušky (např. počet a velikost zkušebních nádrží, rychlost výměny objemu vody, počet opakování, počet ryb v jednom opakování, počet zkušebních koncentrací, délka fází příjmu a vylučování, četnost odběru vzorků ryb a vzorků vody),- metoda přípravy zásobních roztoků a častost jejich obnovování (je-li použito solubilizační činidlo, musí být uvedena jeho koncentrace a jeho příspěvek k obsahu organického uhlíku ve vodě),- nominální zkušební koncentrace, střední hodnoty naměřených koncentrací ve zkušebních nádržích, jejich směrodatné odchylky a metody jejich stanovení,- zdroj ředicí vody, popis jakékoli předchozí úpravy, výsledky jakéhokoli prokazování schopnosti zkušebních ryb žít v této vodě a charakteristiky vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je-li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah suspendovaných látek, popřípadě salinita zkušebního média a výsledky jakýchkoli jiných provedených měření,- kvalita vody ve zkušebních nádržích, hodnota pH, tvrdost vody, obsah TOC, teplota a koncentrace rozpuštěného kyslíku,- podrobné informace o krmení (například typ krmiva, zdroj, složení – alespoň pokud možno obsah lipidů a bílkovin, podávané množství a četnost),- informace o zpracování vzorků ryb a vody, včetně podrobností o přípravě, uchovávání, o extrakci a analytických postupech (a přesnosti), pokud jde o zkoušenou látku a obsah tuku (je-li měřen).3.4 Výsledky- výsledky jakýchkoli provedených předběžných studií,- úhyn kontrolních ryb a ryb v každé expoziční nádrži a jakékoli pozorované neobvyklé chování,- obsah lipidů v rybách (je-li stanoven při zkoušce),- křivky (včetně všech naměřených údajů) příjmu a vylučování zkoušené chemikálie rybami, doba dosažení ustáleného stavu,- hodnoty Cr a Cv (popřípadě se směrodatnými odchylkami a rozpětím) pro všechny odběry (hodnota Cr se vyjadřuje v μg/g živé hmotnosti (ppm) celého těla nebo specifikovaných tkání, např. lipidů, a Cv se vyjadřuje v μg/ml (ppm)); hodnoty Cv pro kontrolní experimenty (měly by být uvedeny také hodnoty pozadí),- bioakumulační faktor v ustáleném stavu (BCFus) a/nebo kinetický akumulační faktor (BCFk) a popřípadě 95 % meze spolehlivosti pro rychlostní konstanty příjmu a vylučování (úbytku) (vše vztaženo na celý organismus a na celkový obsah lipidů v rybě, je-li stanoven, nebo na její specifikované tkáně), intervaly spolehlivosti a směrodatné odchylky (jsou-li k dispozici) a metody výpočtu nebo analýzy údajů pro každou použitou koncentraci zkoušené látky,- v případě použití látek značených radioaktivními izotopy a je-li to nutné, musí být uvedena akumulace jakýchkoli detekovaných metabolitů,- všechny zvláštnosti zkoušky, všechny odchylky od těchto postupů a ostatní relevantní informace.Výsledky typu "nedetekováno při uvedené mezi detekce" by se měly minimalizovat předběžným vývojem metod a uspořádáním experimentu, neboť takové výsledky nelze pro výpočet rychlostních konstant použít.4. LITERATURA(1) Connell D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, 117-156.(2) Bintein S., Devillers J., Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, 29-390.(3) OECD, Paris (1996 ). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Dánsko.(5) US EPA 822-R-94–002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. Červen 1994.(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher`s Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.(7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N. C. 27711.(8) Compaan H. (1980) v "The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation", kap. 2.3, část II. Government Publishing Office, Haag, Nizozemsko.(9) Gardner et al, (1995). Limnol. Oceanogr. 30, 1099-1105.(10) Randall R. C., Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L., Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ. Toxicol. Chem. 10, 1431-1436.(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method Ring Test Programme, 1984 to 1985. Závěrečná zpráva březen 1987. Autoři: P. Kristensen, N. Nyholm.(12) ASTM E-1022–84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.--------------------------------------------------