CELEX: 31992L0069
Language: es
Date: 1992-07-31 00:00:00
Title: Directiva 92/69/CEE de la Comisión, de 31 de julio de 1992, por la que se adapta al progreso técnico, por decimoséptima vez, la Directiva 67/548/CEE del Consejo, relativa a la aproximación de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas en materia de clasificación, embalaje y etiquetado de las sustancias peligrosas

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31992L0069

Directiva 92/69/CEE de la Comisión, de 31 de julio de 1992, por la que se adapta al progreso técnico, por decimoséptima vez, la Directiva 67/548/CEE del Consejo, relativa a la aproximación de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas en materia de clasificación, embalaje y etiquetado de las sustancias peligrosas  

Diario Oficial n° L 383 de 29/12/1992 p. 0113 - 0115 Edición especial en finés : Capítulo 6 Tomo 6 p. 0003  Edición especial sueca: Capítulo 6 Tomo 6 p. 0003  L 383A 29/12/1992 P. 0001 - 0235

DIRECTIVA 92/69/CEE DE LA COMISIÓN de 31 de julio de 1992  por la que se adapta al progreso técnico, por decimoséptima vez, la Directiva 67/548/CEE del Consejo, relativa a la aproximación de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas en materia de clasificación, embalaje y etiquetado de las sustancias peligrosasLA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS,Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea,Vista la Directiva 67/548/CEE del Consejo, de 27 de junio de 1967, relativa a la aproximación de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas en materia de clasificación, embalaje y etiquetado de las sustancias peligrosas (1), modificada en último lugar por la Directiva 92/32/CEE (2), y, en particular, sus artículos 28 y 29,(1) DO n  196 de 16. 8. 1967, p. 1.(2) DO n  L 154 de 5. 6. 1992, p. 1.Considerando que el apartado 1 del artículo 3 de la Directiva 67/548/CEE y el artículo 3 de la Directiva 88/379/CEE del Consejo, de 7 de junio de 1988, sobre la aproximación de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas de los Estados miembros relativas a la clasificación, envasado y etiquetado de preparados peligrosos (3), modificado en último lugar por la Directiva 90/492/CEE de la Comisión (4), establecen que las propiedades físico-químicas, toxicidad y ecotoxicidad de las sustancias y preparados se determinarán según los métodos previstos en el Anexo V de la Directiva 67/548/CEE;(3) DO n  L 187 de 16. 7. 1988, p. 14.(4) DO n  L 275 de 5. 10. 1990, p. 35.Considerando que el texto del Anexo V de la Directiva 67/548/CEE está actualmente publicado en dos partes, el Anexo de la Directiva 84/449/CEE de la Comisión (5) y el Anexo de la Directiva 88/302/CEE (6) de la Comisión, respectivamente;(5) DO n  L 251 de 19. 9. 1984, p. 1.(6) DO n  L 133 de 30. 5. 1988, p. 1 y DO n  L 136 de 2. 6. 1988, p. 20.Considerando que, para tener en cuenta los adelantos técnicos, es necesario revisar los métodos de ensayo que se incluyen en el Anexo de la Directiva 84/449/CEE de la Comisión;Considerando que, para tener en cuenta los adelantos técnicos, es asimismo necesario revisar el método de ensayo de inhibición del crecimiento de algas incluido actualmente en el Anexo de la Directiva 88/302/CEE de la Comisión y transferir con este motivo dicho método de ensayo al Anexo de la Directiva 84/449/CEE;Considerando que es conveniente reducir al mínimo el número de animales utilizados con fines experimentales, de conformidad con la Directiva 86/609/CEE del Consejo, de 24 de noviembre de 1986, relativa a la aproximación de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas de los Estados miembros respecto a la protección de los animales utilizados con fines experimentales (7);(7) DO n  L 358 de 18. 12. 1986, p. 1. Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva se ajustan al dictamen del Comité para la adaptación al progreso técnico de las Directivas relativas a la eliminación de obstáculos técnicos al comercio de sustancias y preparados peligrosos,HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA: Artículo 1El Anexo de la Directiva 84/449/CEE se sustituirá por el Anexo de la presente Directiva.Artículo 2Queda suprimido el método de ensayo de inhibición del crecimiento de algas descrito en el Anexo de la Directiva 88/302/CEE.Artículo 3Los Estados miembros pondrán en vigor las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas necesarias para dar cumplimiento a lo dispuesto en la presente Directiva antes del 30 de octubre de 1993. Informarán inmediatamente de ello a la Comisión.Cuando los Estados miembros adopten dichas disposiciones, éstas harán referencia a la presente Directiva o irán acompañadas de dicha referencia en su publicación oficial. Los Estados miembros establecerán las modalidades de la mencionada referencia.Artículo 4Los destinatarios de la presente Directiva son los Estados miembros.Hecho en Bruselas, el 31 de julio de 1992.Por la ComisiónKarel VAN MIERTMiembro de la ComisiónAnexo de la Directiva 92/69/CEE de la Comisión, de 31 de julio de 1992, por la que se adapta al progreso técnico, por decimoséptima vez, la Directiva 67/548/CEE del Consejo, relativa a la aproximación de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas en materia de clasificación, embalaje y etiquetado de las sustancias peligrosas(1) ÍNDICEINTRODUCCIÓNPARTE A: MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS //5A.1. Punto de fusión/congelación //5A.2. Punto de ebullición //15A.3. Densidad relativa //21A.4. Presión de vapor //26A.5. Tensión superficial //47A.6. Hidrosolubilidad //54A.8. Coeficiente de reparto //63A.9. Punto de inflamación //74A.10. Inflamabilidad (sólidos) //76A.11. Inflamabilidad (gases) //79A.12. Inflamabilidad (en contacto con el agua) //81A.13. Propiedades pirofóricas de sólidos y líquidos //85A.14. Propiedades explosivas //87A.15. Temperatura de autoinflamación (líquidos y gases) //98A.16. Temperatura de autoinflamación de sólidos //99A.17. Propiedades comburantes (sólidos) //102PARTE B: MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD //107Introducción general //107B.1. Toxicidad aguda por vía oral //110B.1 bis Toxicidad aguda (oral) método de dosis fija //113B.2. Toxicidad aguda por inhalación //117B.3. Toxicidad aguda por vía cutánea //121B.4. Toxicidad aguda - irritación de la piel //124B.5. Toxicidad aguda - irritación ocular //127B.6. Sensibilización de la piel //131B.7. Toxicidad por administración continuada (28 días) por vía oral //136B.8. Toxicidad por administración continuada (28 días) por inhalación //140B.9. Toxicidad por administración continuada (28 días) por vía cutánea //144B.10. Mutagénesis (ensayo citogenético in vitro en mamíferos //148B.11. Mutagénesis (ensayo citogenético in vivo en médula ósea de mamíferos, análisis cromosómico) //151B.12. Mutagénicidad (ensayo de micronúcleos) //154B.13. Mutagénesis (ensayo de mutación revertida en Escherichia coli) //157B.14. Mutagénesis (ensayo de mutación revertida en Salmonella typhimurium) //160PARTE C: MÉTODOS PARA LA DETRMINACIÓN DE LA ECOTOXICIDAD //163C.1. Toxicidad aguda en peces //163C.2. Toxicidad aguda en Daphnia //172C.3. Ensayo de inhibición de algas //179C.4. Biodegradación: determinación de la biodegradabilidad «fácil» //187C.4-A: Pérdida de carbono orgánico disuelto (COD) //194C.4-B: Prueba de detección de la OCDE modificada //197C.4-C: Desprendimiento del dióxido de carbono (CO2) //202C.4-D: Respirometría manométrica //207C.4-E: Frasco cerrado //211C.4-F: MITI (Ministerio de Industria y Comercio Internacional de Japón) //216Anexos //221C.5. Degradación: demanda bioquímica de oxígeno //226C.6. Degradación: demanda química de oxígeno //227C.7. Degradación: degradación abiótica: hidrólisis en función del pH. //229INTRODUCCIÓNEl presente Anexo describe los métodos de ensayo para la determinación de las propiedades fisicoquímicas, toxicológicas y ecotoxicológicas enumeradas en los Anexos VII y VIII de la Directiva 79/831/CEE. Dichos métodos se basan en los métodos reconocidos y recomendados por organismos internacionales competentes (en particular la OCDE).Cuando no se ha podido disponer de tales métodos, se han adoptado normas nacionales o métodos ampliamente reconocidos por los medios científicos. En general, los ensayos deberán hacerse con la sustancia tal y como se define en la Directiva. No debe subestimarse la posible incidencia de la impurezas en los resultados de los ensayos.Cuando los métodos del presente Anexo no sean adecuados al análisis de una propiedad determinada, el notificante deberá justificar el método que haya empleado en su lugar.Los ensayos y los estudios con animales deberán atenerse a las normas nacionales y respetar los principios humanitarios, así como los progresos internacionales en el campo de la protección de animales.Entre diversos métodos de ensayo equivalentes, se elige aquel que precisa el menor número de animales.PARTE A: MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES FISICOQUÍMICASA.1. PUNTO DE FUSIÓN/CONGELACIÓN1. MÉTODOLa mayoría de los métodos descritos se basan en las líneas directrices de la OCDE (1). Los principios fundamentales se dan en las referencias (2) y (3).1.1. INTRODUCCIÓNLos métodos y los aparatos descritos a continuación se utilizan para determinar el punto de fusión de los productos químicos, cualquiera que sea su grado de pureza.La selección del método dependerá de la naturaleza de la sustancia problema. En consecuencia, el factor limitante dependerá de que la sustancia sea fácil, difícilmente o no pulverizable.En determinadas sustancias será preferible determinar el punto de congelación o de solidificación; las normas para proceder a dichas determinaciones también se recogen en el presente método.Cuando, debido a propiedades especiales de la sustancia, no pueda medirse convenientemente ninguno de los parámetros mencionados, puede ser adecuado medir el punto de fluidez.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESEl punto de fusión se define como la temperatura a la que se produce la transición de fase del estado sólido al líquido a presión atmosférica normal; esta temperatura corresponde idealmente a la temperatura de congelación.Dado que la transición de fase de numerosas sustancias se extiende en una amplia gama de temperaturas, ésta se designa muchas veces con el nombre de intervalo de fusión.Conversión de las unidades (K a  C).t = T   273,15t = temperatura Celsius, grado Celsius ( C)T = temperatura termodinámica, kelvin (K)1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANo es necesario emplear sustancias de referencia cada vez que se estudie una nueva sustancia. Deberán servir, esencialmente, para comprobar el funcionamiento del método de vez en cuando y para comparar con los resultados obtenidos mediante otros métodos.En la referencia (4) se enumeran determinadas sustancias de calibración.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYOSe determina la temperatura (o intervalo de temperatura) de transición de fase del estado sólido al líquido o viceversa. En la práctica, las temperaturas del inicio y del final del proceso de fusión/congelación se determinan al calentar/enfriar una muestra de la sustancia problema a presión atmosférica. Se describen cinco tipos de métodos: el método de tubo capilar, el método de superficie caliente, determinación de la temperatura de congelación, métodos de análisis térmico y determinación del punto de fluidez (como el método elaborado para derivados del petróleo).En algunos casos puede ser conveniente medir la temperatura de congelación en lugar de la temperatura de fusión.1.4.1. Método de tubo capilar1.4.1.1. Dispositivos de temperatura de fusión con baño líquidoIntroducir en un tubo capilar una pequeña cantidad de sustancia finamente pulverizada y comprimirla firmemente. Calentar dicho tubo al mismo tiempo que un termómetro y ajustar el aumento de temperatura a poco menos de 1 K por minuto, durante la fusión real. Tomar nota de las temperaturas correspondientes al comienzo y al final de la fusión.1.4.1.2. Dispositivos de temperatura de fusión con bloque metálicoEl fundamento es el mismo que el descrito en el apartado 1.4.1.1, con la diferencia de que el tubo capilar y el termómetro están colocados en un bloque de metal calentado y se observan a través de aberturas practicadas en éste último.1.4.1.3. Detección fotoeléctricaCalentar automáticamente en un cilindro metálico la muestra contenida en el tubo capilar. Por una abertura practicada en el cilindro, enviar un rayo de luz a través de la sustancia hacia una célula fotoeléctrica cuidadosamente calibrada. En el momento de la fusión, las propiedades ópticas de la mayor parte de las sustancias se modifican en el sentido de que la opacidad da paso a la transparencia. En consecuencia, la intensidad de la luz que llega a la célula fotoeléctrica aumenta y envía una señal de parada al indicador digital que registra la temperatura del termómetro de resistencia de platino colocado en la cámara de calentamiento. Este método no es aplicable a determinadas sustancias muy coloreadas.1.4.2. Método de superficie caliente1.4.2.1. Método de la placa caliente de KoflerLa placa caliente de Kofler se compone de dos piezas de metal de conductividad térmica diferente, que se calientan eléctricamente. Está hecha de manera que el gradiente de temperatura sea casi lineal en toda su longitud. La temperatura de dicha placa puede variar de 283 a 573 K gracias a un dispositivo especial de lectura de la temperatura que tiene un cursor con un índice y una regleta graduada, especialmente concebido para dicha placa. Para determinar un punto de fusión se deposita una fina capa de sustancia directamente sobre la placa caliente. En unos segundos, se forma una fina línea de división entre la fase fluida y la fase sólida. Leer la temperatura a la altura de dicha línea, colocando el índice frente a esta última.1.4.2.2. Microscopio de fusiónSe utilizan diferentes microscopios de platina caliente para determinar puntos de fusión con cantidades de sustancia muy pequeñas. La temperatura se suele medir con un termopar sensible, pero a veces se usa un termómetro de mercurio. El dispositivo tipo tiene una carcasa de calor que contiene una platina de metal en la que se coloca una lámina de vidrio sobre la que se deposita la muestra. El centro de la platina metálica se atraviesa con un agujero que permite el paso de la luz procedente del espejo de iluminación del microscopio. Al utilizarlo, la carcasa se cierra con una placa de vidrio para impedir la entrada de aire a la zona de la muestra.El calentamiento de la muestra se regula con un reostato. Para realizar mediciones muy precisas se puede utilizar luz polarizada en el análisis de las sustancias ópticamente anisótropas.1.4.2.3. Método de meniscoEste método se aplica específicamente a las poliamidas.Se determina la temperatura a la cual se observa, a simple vista, el desplazamiento de un menisco de aceite de silicona, atrapado entre una superficie caliente y un cubreobjetos colocado encima de la muestra de poliamida.1.4.3. Método de determinación del punto de congelaciónIntroducir la muestra en un tubo de ensayo especial y colocarlo en un aparato que permita la determinación del punto de congelación. Agitar suavemente la muestra sin interrupción durante el enfriamiento, observando al mismo tiempo la temperatura y registrándola a intervalos adecuados. Cuando varias lecturas indiquen una temperatura constante (previa corrección termométrica), se considera el valor de esta temperatura como el punto de congelación.Debe evitarse el sobreenfriamiento manteniendo el equilibrio entre las fases sólida y líquida.1.4.4. Análisis térmico1.4.4.1. Análisis térmico diferencial (ATD)Esta técnica registra la diferencia de temperaturas entre la sustancia y un material de referencia en función de la temperatura, cuando la sustancia y el material de referencia se someten al mismo programa de temperatura controlada. Cuando la muestra sufre una transición que suponga un cambio de entalpía, ese cambio se indicará por una desviación endotérmica (fusión) o exotérmica (congelación) de la línea de base del registro de temperatura.1.4.4.2. Calorimetría diferencial de barrido (CDB)Esta técnica registra la diferencia de aporte energético a una sustancia y a un material de referencia en función de la temperatura, cuando la sustancia y el material de referencia se someten al mismo programa de temperatura controlada. Esta energía es la energía necesaria para establecer una diferencia de temperatura nula entre la sustancia y el material de referencia. Cuando la muestra sufre una transición que suponga un cambio de entalpía, ese cambio se indicará por una desviación endotérmica (fusión) o exotérmica (congelación) de la línea de base del registro del flujo de calor.1.4.5. Punto de fluidezEste método, desarrollado para los derivados del petróleo, es adecuado para utilizarse con sustancias oleosas de baja temperatura de fusión.Tras un calentamiento previo, se va enfriando la muestra a una velocidad específica y se examinan sus características reológicas a intervalos de 3 K. Se registra como punto de fluidez la temperatura mínima a la que se aprecia movimiento de la sustancia.1.5. CRITERIOS DE CALIDADEn el cuadro siguiente se indican las condiciones de aplicación y la precisión de los diferentes métodos de determinación del punto de fusión/intervalo de fusión.CUADRO: APLICABILIDAD DE LOS MÉTODOS>SITIO PARA UN CUADRO>>SITIO PARA UN CUADRO>>SITIO PARA UN CUADRO>>SITIO PARA UN CUADRO>1.6. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOSLos procedimientos de casi todos los métodos de ensayo están descritos en normas internacionales y nacionales (ver apéndice 1).1.6.1. Métodos de tubo capilarCuando la elevación de temperatura es lenta, las sustancias finamente pulverizadas pasarán, normalmente, por las fases de fusión representadas en la figura 1:Figura 1>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Fase A (Comienzo de la fusión): se adhieren uniformemente gotas finas a la pared interior del tubo capilar.Fase B Aparece un espacio libre entre la muestra y la pared interior, en razón de la retracción del producto en fusión.Fase C La muestra, retraída, comienza a hundirse y a licuarse.Fase D Se forma un menisco completo en la superficie, pero queda todavía una cantidad apreciable de partículas sólidas.Fase E (Final de la fusión): no hay ya ninguna partícula sólida.Durante la determinación del punto de fusión, conviene anotar la temperatura al comienzo y al final de la fusión.1.6.1.1. Dispositivos con baño líquidoLa figura 2 representa un tipo de aparato estandarizado de vidrio (JIS K 0064). Todas las dimensiones están expresadas en milímetros.Figura 2>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>A: Matraz de medida B: Tapón C: Tubo de ventilación D: Termómetro E: Termómetro auxiliar F: Baño líquido G: Tubo capilar de vidrio (80 a 100 mm de longitud; 1,0 mm ± 0,2 mm de diámetro interior y 0,2 a 0,3 mm de espesor de la pared) H: Tubo lateralBaño líquido El líquido deberá elegirse en función del punto de fusión que deba determinarse; por ejemplo, se utilizará parafina líquida para los puntos de fusión que no pasen de 473 K, aceite de silicona para los puntos de fusión que no pasen de 573 K.Podrá utilizarse una mezcla de tres partes de ácido sulfúrico y dos partes de sulfato de potasio (en peso) para los puntos de fusión superiores a 523 K. Deben adoptarse precauciones adecuadas cuando se utilice este tipo de mezcla.Termómetro Sólo podrán utilizarse termómetros que cumplan las exigencias de las normas siguientes o de sus equivalentes:ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.Procedimiento Pulverizar finamente la sustancia seca en un mortero e introducirla en un tubo capilar cerrado en un extremo. La altura del contenido será de unos 3 milímetros después de haberlo comprimido bien. Para obtener una muestra uniformemente comprimida, hay que dejar caer el tubo capilar desde una altura de unos 700 milímetros por el interior de un tubo de vidrio colocado verticalmente sobre un vidrio de reloj.Colocar el tubo capilar, así llenado, en el baño de tal manera que la parte central del bulbo de mercurio del termómetro esté en contacto con la parte del capilar que contiene la muestra. En general, el tubo capilar se introduce en el aparato en el momento en que el baño está a unos 10 K por debajo del punto de fusión.Regular el calentamiento del baño de manera que el aumento de la temperatura sea de unos 3 K/min uto. Agitar el líquido. Al llegar a unos 10 K por debajo de la temperatura de fusión esperada, regular el aumento de temperatura a un máximo de 1 K/minuto.Cálculo El cálculo del punto de fusión se efectúa mediante la fórmula siguiente:T = TD + 0,00016(TD   TE) ndondeT = temperatura de fusión corregida, expresada en KTD = temperatura leída en el termómetro D, expresada en KTE = temperatura leída en el termómetro E, expresada en Kn = número de graduaciones de la columna de mercurio del termómetro D en el vástago emergente.1.6.1.2. Dispositivo con bloque metálicoAparato:El aparato consta de:- un bloque metálico cilíndrico cuya parte superior está vacía y forma un recinto de calentamiento (ver figura 3).- un tapón metálico atravesado por dos o más agujeros que permitan la introducción de los tubos en el bloque,- un sistema de calentamiento del bloque metálico; por ejemplo, una resistencia eléctrica incorporada al bloque,- un reostato para regular la potencia, si se utiliza calentamiento eléctrico,- cuatro ventanas de vidrio resistente al calor, diametralmente opuestas, en ángulo recto, en las paredes laterales del recinto. Frente a una de dichas ventanas se instalará un visor para observar el tubo capilar. Las otras tres ventanas permitirán iluminar el interior del recinto mediante bombillas,- un tubo capilar, de vidrio resistente al calor, cerrado en un extremo (ver punto 1.6.1.1).Termómetro:Ver las normas citadas en el punto 1.6.1.1. También podrán utilizarse elementos termoeléctricos de una precisión equivalente.Figura 3>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>1.6.1.3. Detección fotoeléctricaAparato y procedimiento:El aparato consiste en un recinto metálico dotado de un sistema de calentamiento automático. Se llenan tres tubos capilares siguiendo las instrucciones del punto 1.6.1.1 y se colocan en el horno.Se pueden hacer varios aumentos lineales de temperatura para calibrar el aparato. El aumento de temperatura apropiado se regula eléctricamente con una velocidad constante y lineal preseleccionada. Los aparatos registradores indican la temperatura real del horno y la temperatura de la sustancia en los tubos capilares.1.6.2. Métodos de superficie caliente1.6.2.1. Placa caliente KoflerVer apéndice.1.6.2.2. Microscopio de fusiónVer apéndice.1.6.2.3. Método de menisco (poliamidas)Ver apéndice.El aumento de temperatura en la zona del punto de fusión deberá ser inferior a 1 K/min .1.6.3. Métodos de determinación del punto de congelaciónVer apéndice.1.6.4. Análisis térmico1.6.4.1. Análisis térmico diferencialVer apéndice.1.6.4.2. Calorimetría diferencial de barridoVer apéndice.1.6.5. Determinación del punto de fluidezVer apéndice.2. RESULTADOSEn determinados casos es necesaria la corrección del termómetro.3. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- método utilizado,- especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas) y, en su caso, fase de purificación previa,- estimación de la precisión.El punto de fusión indicado en el informe será la media entre dos mediciones, como mínimo, situadas en la zona de la precisión estimada (ver cuadro).Si la diferencia entre las temperaturas al comienzo y al final de la fusión se encuentra dentro de los límites de precisión del método, la temperatura leída en la fase final de la fusión se considerará el punto de fusión; de lo contrario, se indicarán las dos temperaturas.Si la sustancia se descompone o se sublima antes de alcanzar el punto de fusión, se indicará la temperatura a la que se observa el efecto.Deben indicarse todas las informaciones y observaciones que se consideren útiles para la interpretación de los resultados, en particular lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia.4. BIBLIOGRAFÍA(1) OCDE, París, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C (81) 30 Final.(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics., Butterworths, Londres, 1975, vol. II, 803-834.(3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd. ed., Interscience Publ., Nueva York, 1959, Vol I, Part I, Chapter  VII.(4) IUPAC, Physicochemical Measurements: Catalogue of Reference Materials from National Laboratories, Pure and Applied Chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.ApéndicePara más detalles técnicos, se pueden consultar, por ejemplo, las normas siguientes:1. Métodos de tubo capilar1.1. Dispositivos con baño líquidoASTM E 324-69 Standard Test Method for Relative Initial and Final Melting Points and the Melting Range of Organic ChemicalsBS 4634 Method for the Determination of Melting Point and/or Melting RangeDIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach KapillarverfahrenJIS K 00-64 Testing Methods for Melting Point of Chemical Products1.2. Dispositivos con bloque metálicoDIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen KunststoffenISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of «melting point»2. Métodos de superficie caliente2.1. Placa caliente de KoflerANSI/ASTM D 3451-76 Standard Recommended Practices for Testing Polymeric Powder Coatings2.2. Microscopio de fusiónDIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen2.3. Método de menisco (poliamidas)ISO 1218 (E) Plastics-Polyamides-Determination of «Melting- Point»ANSI/ASTM D 2133-66 Standard Specification for Acetal Resin Injection Moulding and Extrusion MaterialsNF T 51 050 Résines de polyamides. Détermination du «point de fusion». Méthode du ménisque 3. Métodos de determinación del punto de congelaciónBS 4633 Method for the Determination of Crystallizing PointBS 4695 Method for Determination of Melting Point of Petroleum Wax (Cooling Curve)DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und MotorenbenzolenISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeageDIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von FettsäurenNF T 60-114 Point de fusion des paraffinesNF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristalisation (point de congélation)ISO 1392 Method for the determination of the freezing point4. Análisis térmico4.1. Análisis térmico diferencialASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysisASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysisASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical dataDIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe4.2. Calorimetría diferencial de barridoASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysisASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysisASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical dataDIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe5. Determinación del punto de fusiónNBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: Point de trouble et point d'écoulement limite - Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipuntASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oilsISO 3016 Petroleum oils -Determination of pour point.A.2. PUNTO DE EBULLICIÓN1. MÉTODOLa mayoría de los métodos descritos se basan en las líneas directrices de la OCDE (1). Los principios fundamentales se dan en las referencias (2) y (3).1.1. INTRODUCCIÓNLos métodos y dispositivos aquí descritos pueden aplicarse a las sustancias líquidas y de bajo punto de fusión que no sufran reacción química por debajo del punto de ebullición (por ejemplo, autooxidación, redistribución, degradación, etc.). Los métodos son aplicables a las sustancias líquidas puras e impuras.La importancia dada a la descripción de los métodos basados en la detección fotoeléctrica y en el análisis térmico se debe al hecho de que estos métodos permiten determinar no sólo el punto de fusión sino también el punto de ebullición. Además, las medidas pueden efectuarse de manera automática.El «método dinámico» tiene la ventaja de poder utilizarse igualmente para la determinación de la presión de vapor y hacer innecesaria la corrección de la temperatura de ebullición para llevarla a las condiciones normales de presión (101,325 kPa), ya que durante la medición se puede ajustar la presión normal mediante un manostato.ObservacionesLa influencia de las impurezas en la determinación del punto de ebullición depende mucho de la naturaleza de la impureza. Si en la muestra hay impurezas volátiles, que pudieran afectar a los resultados, puede procederse a purificar la sustancia.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESLa temperatura de ebullición normal se define como la temperatura en que la presión de vapor de un líquido es 101,325 kPa.Si la temperatura de ebullición no se mide a la presión atmosférica normal, la dependencia de la presión de vapor respecto a la temperatura puede calcularse cuantitativamente por la ecuación de Clausius-Clapeyron:log p = 2,3 RTD Hv + constantedondep = presión de vapor de la sustancia en pascalesÄ Hv = su calor de vaporización en J mol 1R = constante universal de los gases= 8,314 J mol 1 K 1T = temperatura termodinámica, expresada en K.La temperatura de ebullición se establece con relación a la presión ambiente en el momento de la medición.ConversionesPresión (unidad: kPa)100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa(todavía se permite la unidad «bar» pero no es recomendable).133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr(no se permite la unidad «Torr» ni «mm Hg»).1 atm = atmósfera normal = 101 325 Pa(no se permite la unidad «atm»).Temperatura (unidad: K)t = T   273,15t: temperatura Celsius, grado Celsius ( C)T: temperatura termodinámica, Kelvin (K)1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANo es necesario utilizar sustancias de referencia cada vez que se estudie una nueva sustancia. Dichas sustancias de referencia sirven esencialmente para comprobar la validez del método de vez en cuando y para poder comparar con los resultados según otros métodos.En los métodos enumerados en el Apéndice figuran algunas sustancias de calibración.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYOCinco métodos de determinación del punto de ebullición (o del intervalo de ebullición) se basan en la medición de la temperatura de ebullición; otros dos se basan en el análisis térmico.1.4.1. Método del ebullómetroAunque en un principio los ebullómetros se pensaron para determinar el peso molecular por elevación del punto de ebullición, se prestan también para realizar mediciones exactas del punto de ebullición. En la norma ASTM D 1120-72 (veáse el Apéndice), se describe un aparato muy sencillo. En dicho aparato, el líquido se calienta en condiciones de equilibrio a la presión atmósferica hasta ebullición.1.4.2. Método dinámicoEste método se basa en la medición de la temperatura de recondensación del vapor mediante un termómetro adecuado que se coloca en el reflujo durante la ebullición. En este método puede modificarse la presión.1.4.3. Método de destilación para el punto de ebulliciónEste método se basa en la destilación del líquido, la medida de la temperatura de recondensación del vapor y la determinación de la cantidad de destilado.1.4.4. Método de SiwoloboffSe calienta una muestra en un tubo de ensayo, que se sumerge en un baño caliente. Se introduce en el tubo de ensayo un capilar cerrado, con una burbuja de aire en su parte inferior.1.4.5. Detección fotoeléctricaDe acuerdo con el principio de Siwoloboff, la ascensión de las burbujas permite una medición fotoeléctrica automática.1.4.6. Análisis térmico diferencialEsta técnica registra la diferencia de temperatura entre la sustancia y un material de referencia en función de la temperatura, cuando la sustancia y el material de referencia se someten al mismo programa de temperatura controlada. Cuando la muestra sufre una transición que implique un cambio de entalpía, ese cambio se indica con una desviación endotérmica (ebullición) respecto a la línea base del registro de temperatura.1.4.7. Calorimetría diferencial de barridoEsta técnica registra la diferencia de aporte energético a una sustancia y a un material de referencia en función de la temperatura, cuando la sustancia y el material de referencia se someten al mismo programa de temperatura controlada. Esta energía es la energía necesaria para establecer una diferencia de temperatura nula entre la sustancia y el material de referencia. Cuando la muestra sufre una transición que implique un cambio de entalpía, ese cambio se indica con una desviación endotérmica (ebullición) respecto a la línea base del registro de flujo de calor.1.5. CRITERIOS DE CALIDADLa aplicación y la precisión de los diferentes métodos utilizados para determinar el punto de ebullición/intervalo de ebullición se indican en el cuadro 1.>SITIO PARA UN CUADRO>1.6. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOSEn las normas internacionales y nacionales (veáse el Apéndice) se describen los procedimientos de algunos métodos de ensayo.1.6.1. EbullómetroVeáse el Apéndice.1.6.2. Método dinámicoVeáse el método de ensayo A.4 para la determinación de la presión de vapor.Se considera como temperatura de ebullición la registrada a una presión de 101,325 kPa.1.6.3. Método de destilación (intervalo de ebullición)Veáse el Apéndice.1.6.4. Método de SiwoloboffSe introduce la muestra en un tubo de muestra de unos 5 milímetros de diámetro y se calienta en un aparato apropiado para determinar el punto de fusión (veáse la figura 1).En la figura 1 hay un ejemplo de aparato normalizado apropiado para determinar el punto de fusión y el punto de ebullición (JIS K 0064). Las dimensiones están expresadas en milímetros. El aparato es de vidrio.Figura 1>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>A: Matraz de medidaB: TapónC: Tubo de ventilaciónD: TermómetroE: Termómetro auxiliarF: Baño líquidoG: Tubo de muestra (5 mm de diámetro exterior como máximo) con un tubo capilar de unos 100 mm de longitud, alrededor de 1 mm de diámetro interior, y alrededor de 0,2 o 0,3 mm de espesor de la paredH: Tubo lateralEn el tubo de muestra que contiene la sustancia se introduce un tubo capilar (capilar de ebullición), cerrado a aproximadamente 1 centímetro de su extremo inferior. El nivel hasta el que se añade la sustancia problema es tal que la parte cerrada del capilar quede situada por debajo de la superficie del líquido. El tubo de muestra con el capilar de ebullición debe estar unido al termómetro mediante una cinta elástica o un soporte lateral (veáse la figura 2).Figura 2>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Método de SiwoloboffFigura 3>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Método modificadoEl líquido del baño se elige en función de la temperatura de ebullición. Se puede utilizar aceite de silicona para temperaturas de hasta 573 K. La parafina líquida sólo puede usarse para temperaturas inferiores a 473 K. Al principio, el calentamiento del baño debe graduarse de manera que se obtenga un aumento de temperatura de 3 K por minuto. Hay que agitar el líquido del baño. A unos 10 K por debajo del punto de ebullición supuesto, se reduce el calentamiento de tal manera que el aumento de la temperatura no llegue a 1 K/minuto. Al acercarse a la temperatura de ebullición, comienzan a salir rápidamente burbujas del capilar de ebullición.El punto de ebullición se define como la temperatura a la cual, en un enfriamiento momentáneo, se interrumpe el rosario de burbujas y el líquido comienza a elevarse súbitamente por el capilar. La temperatura leída en el termómetro en ese preciso momento corresponde a la temperatura de ebullición de la sustancia de ensayo.En el método modificado (veáse la figura 3), el punto de ebullición se determina en un capilar de punto de fusión. Este último se alarga en una punta fina de unos 2 centímetros de longitud (a) y se aspira hacia el interior una pequeña cantidad de sustancia. El extremo abierto del fino capilar se cierra por fusión, de forma que quede una pequeña burbuja de aire en el extremo. Al calentarla en el aparato de punto de fusión (b), la burbuja de aire se va dilatando. El punto de ebullición corresponde a la temperatura a la que el tapón de muestra llega al nivel de la superficie del baño de líquido (c).1.6.5. Detección fotoeléctricaSe calienta una muestra de la sustancia en un tubo capilar colocado dentro de un bloque metálico de calentamiento.Por las aberturas practicadas en el bloque, se envía un haz de luz a través de la sustancia hacia una célula fotoeléctrica calibrada en forma precisa.Durante el aumento de la temperatura de la muestra, van escapando del capilar de ebullición algunas burbujas aisladas de aire. Cuando se alcanza la temperatura de ebullición, el número de burbujas aumenta mucho. La consiguiente modificación de la intensidad luminosa es registrada por la célula, que envía una señal de interrupción al indicador que da la temperatura de un termómetro de resistencia de platino colocado en el bloque.Este método es especialmente útil, pues permite efectuar determinaciones por debajo de la temperatura ambiente hasta 253,15 K ( 20  C) sin ninguna modificación del aparato. Basta con colocar éste en un baño refrigerante.1.6.6. Análisis térmico1.6.6.1. Análisis térmico diferencialVeáse el Apéndice.1.6.6.2. Calorimetría diferencial de barridoVer Apéndice.2. RESULTADOSCuando haya diferencias pequeñas respecto a la presión normal (máxima de ± 5 kPa), las temperaturas del punto de ebullición podrán normalizarse a Tn mediante la ecuación de valor numérico de Sidney Young:Tn = T + (fT × D p)dondeÄ p = (101,325   p) [atención al signo]p = medida de la presión, en kPafT = tasa de variación del punto de ebullición con la presión, en K/kPaT = valor medido de la temperatura de ebullición, en KTn = valor de la temperatura de ebullición corregido a presión normal, en K.Los factores de corrección de la temperatura (fT) y las ecuaciones para su aproximación figuran en las normas internacionales citadas en el texto para numerosas sustancias.Por ejemplo, el método DIN 53171 presenta las siguientes correcciones aproximadas para disolventes contenidos en las pinturas:>SITIO PARA UN CUADRO>3. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- método utilizado;- especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas) y, en su caso, fase de purificación previa;- estimación de la precisión.El punto de ebullición registrado será la media entre dos mediciones, como mínimo, situadas en la zona de precisión estimada (véase el cuadro 1).Deberán indicarse los valores medidos de los puntos de ebullición así como su media, y la presión o presiones a que se hayan efectuado las mediciones deberán registrarse en kPa. La presión debe, preferentemente, ser próxima a la presión atmosférica normal.Deben suministrarse todas las informaciones y observaciones que se consideren útiles para la interpretación de los resultados, en particular lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia.4. BIBLIOGRAFIA(1) OCDE, París, 1981, Test Guideline 103 - Decision of the Council C (81) 30 final.(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, Londres 1975, vol. II.(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., Nueva York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.ApéndicePara más detalles técnicos, se pueden consultar las normas siguientes:1. EbullómetroASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes2. Método de destilación (intervalo de ebullición)ISO/R 918 Test method for distillation (distillation yield and distillation range)BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum productsBS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristicsDIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe. Bestimmung des SiedeverlaufesNF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation3. Análisis térmico diferencial y calorimetría diferencial de barridoASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysisASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysisASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical dataDIN 51005 Thermische Analyse: BegriffeA.3. DENSIDAD RELATIVA1. MÉTODOLos métodos descritos se basan en las líneas directrices de la OCDE (1). Los principios fundamentales se dan en la referencia (2).1.1. INTRODUCCIÓNLos métodos descritos de determinación de la densidad relativa son aplicables a las sustancias sólidas y líquidas, cualquiera que sea su grado de pureza. En el cuadro 1 se indican los diversos métodos utilizables.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESLa densidad relativa, D420, de los sólidos o líquidos es la relación entre la masa de un volumen de sustancia problema, determinada a 20  C, y la masa del mismo volumen de agua, determinada a 4  C. La densidad relativa es un número adimensional.La densidad, ñ, de una sustancia es el cociente de su masa m por su volumen v.En unidades SI, la densidad, ñ, se expresa en kilogramos por metro cúbico.1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA (1) (3)No es necesario emplear sustancias de referencia cada vez que se estudie una nueva sustancia. Deben utilizarse, esencialmente, para comprobar la validez del método de vez en cuando y para poder comparar con los resultados obtenidos según otros métodos.1.4. PRINCIPIO DE LOS MÉTODOSSe aplican cuatro clases de métodos.1.4.1. Métodos de flotabilidad1.4.1.1. Areómetro (para líquidos)Se pueden obtener determinaciones de densidad suficientemente precisas y rápidas con areómetros flotantes, que permiten deducir la densidad de un líquido a partir de la profundidad de inmersión leída en una escala graduada.1.4.1.2. Balanza hidrostática (para sustancias líquidas y sólidas)La diferencia entre el peso de una muestra medido en el aire y en un líquido adecuado (como el agua) puede servir para determinar su densidad.En el caso de los sólidos, la densidad medida sólo es representativa de la muestra utilizada en concreto. Para determinar la densidad de un líquido, se pesa un cuerpo, con un volumen v conocido, primero en el aire y luego en el líquido.1.4.1.3. Método del cuerpo sumergido (para las sustancias líquidas) (4)En este método, la densidad de un líquido se determina a partir de la diferencia entre los resultados de la pesada del líquido, antes y después de sumergir un cuerpo de volumen conocido en dicho líquido problema.1.4.2. Métodos picnométricosPara sólidos o líquidos, se pueden utilizar picnómetros de diversas formas cuyos volúmenes sean conocidos. La densidad se calculará a partir de la diferencia de peso entre el picnómetro lleno y el picnómetro vacío, por una parte, y de su volumen conocido, por la otra.1.4.3. Picnómetro de comparación de aire (para sólidos)La densidad de un sólido, cualquiera que sea su forma, se puede medir a la temperatura ambiente mediante un picnómetro de comparación de gases. El volumen de una sustancia en el aire o en un gas inerte se mide en una probeta calibrada de volumen variable. Para el cálculo de la densidad, se efectúa una medida de la masa después de la medida del volumen.1.4.4. Densímetro oscilante (5) (6) (7)La densidad de un líquido se puede medir con un densímetro oscilante. Un oscilador mecánico con forma de tubo en U se hace vibrar a la frecuencia de resonancia del oscilador, que depende de su masa. La introducción de una muestra modifica la frecuencia de resonancia del oscilador, el cual debe calibrarse con ayuda de dos sustancias líquidas de densidades conocidas. Las sustancias deben elegirse de tal manera que sus densidades cubran el intervalo de medición.1.5. CRITERIOS DE CALIDADEn el cuadro se indica la aplicabilidad de los diferentes métodos que se utilizan para determinar la densidad relativa.1.6. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOSLas referencias de las normas citadas como ejemplo, las cuales pueden consultarse para obtener detalles técnicos suplementarios, figuran en el apéndice.Los ensayos deberán realizarse a la temperatura de 20  C y deben hacerse, al menos, dos medidas.2. RESULTADOSVer normas.3. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- método utilizado;- especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas) y, en su caso, fase de purificación previa.También se indicarán tanto la densidad relativa, D420, según lo definido en el punto 1.2, como el estado físico de la sustancia examinada.Deben suministrarse todas las informaciones y observaciones que sean útiles para la interpretación de los resultados, en particular lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia.>SITIO PARA UN CUADRO>4. BIBLIOGRAFÍA(1) OCDE, París, 1981, Test Guideline 109 - Decision of the Council C (81) 30 Final.(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry. Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ. Nueva York, 1959, Vol. I, Part 1.(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties. - Pure and Applied Chemistry, 1976, Vol. 48, 508.(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, Vol 11, 427-430.(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, Vol. 19, 297-302.(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen - Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, Vol. 37, 717-726.(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, Vol. 9, 253-255.ApéndicePara más detalles técnicos, se pueden consultar las normas siguientes:1. MÉTODOS DE FLOTABILIDAD1.1. AreómetroDIN 12790, ISO 387 Hydrometer: general instructionsDIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use Part II: Density hydrometers; standardised sizes, designation Part III: Use and testISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purposeNF T 20-050 Chemical products for industrial use - Determination of density of liquids - Areometric methodDIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers1.2. Balanza hidrostáticaPara sustancias sólidasISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plasticsNF T 20-049 Chemical products for industrial use - Determination of the density of solids other than powders and cellular products - Hydrostatic balance methodASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacementDIN 53479 Testing of plastics and elastomers; determination of densityPara sustancias líquidasISO 901 ISO 758DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density.ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 y ASTM D 1481-62ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer methodBS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method1.3. Métodos del cuerpo sumergidoDIN 53 217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method2. MÉTODOS PICNOMÉTRICOS2.1. Para sustancias líquidasISO 3507 PycnometersISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20  CDIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous)DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10 6 m2 s 1 at 15  C)DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798)DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10 6 m2 s 1 at 20  C, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90  C)DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have a too high vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen)DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801)DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol-water mixture)DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous)DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometerDIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of densityASTM D 297 Section 15: Rubber products - chemical analysisASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compoundsBS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer methodNF T 20-053 Chemical products for industrial use- Determination of density of solids in powder and liquids - Pyknometric method2.2. Para sustancias sólidasISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics.NF T 20-053 Chemical products for industrial use - Determination of density of solids in powder and liquids - Pyknometric methodDIN 19683 Determination of the density of soils3. PICNÓMETRO DE COMPARACIÓN DE AIREDIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der DichteDIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; PrüfungA.4. PRESIÓN DE VAPOR1. MÉTODOLa mayoría de los métodos descritos se basan en las líneas directrices de la OCDE (1). Los principios fundamentales se dan en las referencias (2) y (3).1.1. INTRODUCCIÓNEs conveniente disponer de datos previos sobre la estructura, el punto de fusión y el punto de ebullición de la sustancia antes de proceder al ensayo.No hay ningún método de medida que sea aplicable a toda la gama de presiones de vapor. Por eso se recomiendan varios métodos para medir las presiones de vapor que van de SITIO PARA UN CUADRO>(1) Según el grado de pureza.(2) Estos métodos pueden utilizarse también en el intervalo de 1 a 10 Pa siempre que se tenga cuidado.1.6. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS1.6.1. Medida dinámica1.6.1.1. AparatoEl equipo de medida típico consta de un recipiente de ebullición con refrigerante de vidrio o de metal (ver figura 1), un dispositivo de medida de la temperatura y un dispositivo de regulación y de medida de la presión. El equipo de medida representado en el esquema es de vidrio termorresistente y consta de cinco partes principales:El tubo ancho con un tramo de doble pared tiene junta esmerilada, refrigerante, recipiente de enfriamiento y orificio de entrada.El cilindro de vidrio unido a una bomba Cottrell está montado en la sección del tubo donde se efectúa la ebullición y tiene una superficie rugosa de vidrio triturado para evitar las sacudidas durante el proceso de ebullición.Para medir la temperatura se puede utilizar un termosensor adecuado (por ejemplo, un termopar de camisa o un termómetro de resistencia) introducido en el aparato hasta el punto de medida (n  5, figura 1) a través de una entrada adecuada (por ejemplo, junta esmerilada macho).Se hacen las conexiones necesarias con el dispositivo de regulación y de medida de la presión.El bulbo, que actúa como volumen-tampón, está conectado al aparato de medida a través de un tubo capilar.Un elemento calefactor (por ejemplo, un calentador de cartucho) introducido en la parte inferior del aparato de vidrio, calienta el recipiente de ebullición. La corriente necesaria se establece y se regula por medio de un termopar.La bomba de vacío produce el vacío necesario, entre 102 y aproximadamente 105 Pa.Una válvula adecuada se utiliza para medir aire o nitrógeno con el fin de regular la presión (zona aproximada de medición: de 102 a 105 Pa) y de ventilar el aparato.La presión se mide con un manómetro.1.6.1.2. Procedimiento de medidaLa presión de vapor se mide determinando el punto de ebullición de la muestra a diversas presiones específicas comprendidas entre 103 Pa y 105 Pa, aproximadamente. El punto de ebullición se alcanza cuando la temperatura se mantiene estable a presión constante. Este procedimiento de medida no es aplicable a las sustancias que formen espuma.Se introduce la sustancia en el recipiente limpio y seco. Los sólidos no pulverulentos pueden presentar problemas, que a veces se resuelven calentando la camisa de refrigeración. Una vez lleno el recipiente, se cierra el aparato con la pestaña y se extrae el gas de la sustancia. Se regula a la presión más baja prevista y se acciona el sistema de calentamiento, conectando, simultáneamente, el termosensor a un registrador.Cuando éste indique una temperatura de ebullición fija, a presión constante, se habrá alcanzado el equilibrio. Hay que evitar las sacudidas durante la ebullición. Además, debe obtenerse condensación completa en el refrigerante. Cuando se determina la presión de vapor de sólidos de bajo punto de fusión, hay que evitar que se bloquee el condensador.Una vez registrado el punto de equilibrio, se regulará a una presión más elevada y se irá repitiendo de nuevo el mismo proceso hasta que se alcance una presión de 105 Pa (en total, de 5 a 10 medidas). Los puntos de equilibrio deben repetirse a presiones decrecientes para comprobar los resultados.1.6.2. Medida estática1.6.2.1. AparatoEl aparato se compone de un recipiente para la muestra, de un sistema de calentamiento y enfriamiento para llevar la muestra a la temperatura deseada, así como de un dispositivo para medir la temperatura. El aparato también incluye instrumentos para fijar y medir la presión. Las figuras 2a y 2b ilustran los principios básicos del aparato.El compartimento que contiene la muestra (figura 2a) está unido, por una parte, a una llave de alto vacío y, por la otra, a un tubo en forma de U lleno de un líquido manométrico apropiado. Un extremo del tubo en U se ramifica para unirse a la bomba de vacío, a la bombona de nitrógeno o a la válvula de ventilación y a un manómetro.En lugar de un tubo en U puede utilizarse un manómetro con indicador de presión (figura 2b).Para poner la muestra a la temperatura deseada, se sumergen en un baño a temperatura constante ± 0,2 K, el compartimento de la muestra con la llave y el tubo en U o el manómetro. La temperatura se mide en la pared exterior del compartimento de la muestra o en el propio compartimento.Para evacuar los gases del aparato se utilizará una bomba de vacío con purgador previo de enfriamiento.En el método 2a, la presión de vapor de una sustancia se mide indirectamente con un indicador de cero. Esto tiene en cuenta el hecho de que la densidad del líquido en el tubo en U se altera si la temperatura cambia de forma importante.Los siguientes líquidos pueden utilizarse como indicadores de cero para el tubo en U, según el intervalo de presiones y el comportamiento químico de la sustancia problema: aceites de silicona y ftalatos. La sustancia problema no debe disolverse de forma apreciable o reaccionar con el líquido del tubo U.En el manómetro, el mercurio puede utilizarse en la zona desde la presión atmosférica hasta 102 Pa, los aceites de silicona y los ftalatos de 102 Pa a 10 Pa; en cuanto al manómetro de membrana calentable, puede utilizarse hasta a presiones inferiores a 10 1 Pa. También pueden utilizarse por debajo de 102 Pa otros tipos de manómetros.1.6.2.2. Métodos de medidaAntes de medir, se limpian y se secan completamente todas las partes del aparato cuyo esquema aparece en la figura 2.Para el método 2a, se llena el tubo en U con el líquido previsto, al que antes de realizar las lecturas se le ha extraído el gas a temperatura elevada.Después de introducir la sustancia, se cierra el aparato y se enfría suficientemente para desgasificar. La temperatura debe ser suficientemente baja como para garantizar que se ha extraído el aire aunque, en el caso de sistemas multicomponenciales, no debe alterarse la composición del material. En caso necesario, el equilibrio puede alcanzarse más rápidamente por agitación.La muestra puede subenfriarse, por ejemplo, con nitrógeno líquido (precaución: condensación de aire, líquido de la bomba) o una mezcla de etanol y hielo seco. Para las medidas a baja temperatura, úsese un baño termostatizado conectado a un ultracriomat.Se abre la llave que hay sobre el recipiente de la muestra y se aplica una succión durante varios minutos para extraer el aire. Se cierra luego la llave y se reduce la temperatura de la muestra hasta el nivel más bajo que se desee. En caso necesario, la operación de desgasificado puede repetirse varias veces.Al calentar la muestra aumenta la presión de vapor, lo que hace cambiar el equilibrio del líquido del tubo en U. Para compensar este fenómeno, hay que permitir la entrada de nitrógeno o aire en el aparato a través de una llave hasta que el líquido del manómetro esté otra vez a cero. La presión necesaria para conseguir este efecto puede leerse en un manómetro de precisión a temperatura ambiente y corresponde a la presión de vapor de la sustancia a esa temperatura concreta de medida.El método 2b es similar pero la presión de vapor puede leerse directamente.La relación de la presión de vapor con la temperatura se determina a pequeños intervalos adecuados (aproximadamente, entre 5 y 10 puntos de medida en total) hasta llegar al máximo previsto. Las lecturas a baja temperatura deben repetirse como comprobación.Si los valores obtenidos en las lecturas repetidas no coinciden con la curva obtenida al ir aumentando las temperaturas, puede deberse a las causas siguientes:1. La muestra sigue conteniendo aire (por ejemplo, materiales de elevada viscosidad) o sustancias de bajo punto de ebullición, que se liberan durante el calentamiento y pueden eliminarse mediante succión tras un mayor subenfriamiento.2. La temperatura de enfriamiento no es bastante baja. En este caso se utiliza nitrógeno líquido como agente de enfriamiento.Si se trata de las causas 1 o 2, hay que repetir las medidas.3. La sustancia sufre una reacción química en el intervalo de temperaturas investigado (por ejemplo, descomposición, polimerización).1.6.3. IsoteniscopioPara una descripción completa de este método, consultar la referencia 7. Los principios del aparato de medida están descritos en la figura 3. Como el método estático descrito en el punto 1.6.2., el isoteniscopio es aplicable a sólidos y a líquidos.En el caso de los líquidos, la sustancia misma sirve de líquido de llenado para el manómetro auxiliar. Se pone en el isoteniscopio una cantidad de líquido suficiente para llenar el bulbo y el brazo corto de la sección manométrica. El isoteniscopio se une entonces al sistema de vacío; después de hacer el vacío en su interior, el isoteniscopio se llena de nitrógeno. La evacuación y la purga del sistema se repiten dos veces para eliminar el oxígeno residual. El isoteniscopio lleno se coloca en posición horizontal para que la muestra se extienda formando una fina capa en el bulbo de la muestra y en la sección manométrica (parte en U). La presión del sistema se reduce a 133 Pa y se calienta suavemente la muestra hasta que inicie la ebullición (eliminación de gases fijos disueltos). El isoteniscopio se cambia entonces de posición para que la muestra vuelva al bulbo y al brazo corto del manómetro, de forma que ambos queden totalmente llenos de líquido. La presión se mantiene al mismo nivel que para desgasificar; el extremo alargado del bulbo de la muestra se calienta con una pequeña llama hasta que el vapor originado por la muestra se expande suficientemente para desplazar parte de la muestra desde la porción superior del bulbo y del brazo del manómetro hacia la sección manométrica del isoteniscopio, creando así un espacio libre de nitrógeno y lleno de vapor.El isoteniscopio se coloca entonces en un baño termostático y se ajusta la presión del nitrógeno hasta igualar a la presión de la muestra. El equilibrio de presiones viene indicado por la sección manométrica del isoteniscopio. En equilibrio, la presión de vapor del nitrógeno iguala a la presión de vapor de la sustancia.En el caso de los sólidos, se utilizarán los líquidos manométricos citados en 1.6.2.1, según el intervalo de temperatura y presión. El líquido manométrico desgasificado se introduce en un engrosamiento del brazo largo del isoteniscopio. A continuación se introduce en el bulbo el sólido problema y se desgasifica a temperatura elevada. Después se inclina el isoteniscopio de forma que el líquido manométrico se introduzca en el tubo de U. La medida de la presión de vapor en función de la temperatura se realiza con arreglo al punto 1.6.2.1.6.4. Método de efusión: Balanza de presión de vapor1.6.4.1. AparatoEn la referencia 1 se encontrará la descripción de varios modelos de aparatos. El aparato representado en la figura 4 ilustra los principios generales del presente método. Esta figura muestra los principales componentes del aparato, que está formado por un recipiente de vidrio o de acero inoxidable resistente al vacío elevado, un equipo para producir y medir el vacío y componentes incorporados para medir la presión de vapor en una balanza. En el aparato se incluyen los siguientes componentes incorporados:- un horno de evaporación con reborde y alimentador giratorio. Es un recipiente cilíndrico, hecho, por ejemplo, de cobre o de una aleación resistente químicamente con buena conductividad térmica. También puede utilizarse un recipiente de vidrio con pared de cobre. El horno tiene un diámetro aproximado de 3 a 5 cm y una altura de 2 a 5 cm. Está provisto de 1 a 3 aberturas de diferentes tamaños para la corriente de vapor. El calentamiento se efectúa o bien mediante una placa calefactora por debajo del horno o bien por una espiral calefactora alrededor del exterior del horno. Para evitar que se disipe calor a la placa de la base, el elemento calefactor se une a la placa de la base mediante un metal de baja conductividad térmica (níquel-plata o acero al cromo-níquel), por ejemplo, un tubo de níquel-plata unido a un alimentador giratorio si se utiliza un horno con varias aberturas. Esta disposición tiene la ventaja de permitir la introducción de una barra de cobre, lo que hace posible enfriar desde el exterior por medio de un baño refrigerante.- Si la tapa del horno de cobre tiene tres aberturas de diferentes diámetros, situados a 90  uno de otro, pueden cubrirse varios intervalos de presión de vapor dentro del intervalo global de medida (aberturas con diámetros entre 0,30 y 4,50 mm, aproximadamente). Las aberturas grandes se utilizan para las presiones de vapor pequeñas y viceversa. Girando el horno puede ponerse la abertura deseada o una postura intermedia en la corriente de vapor (abertura del horno-escudo-platillo de balanza) y la corriente de moléculas se libera o se desvía a través de la abertura del horno hacia el platillo de la balanza. Para medir la temperatura de la sustancia se coloca en un lugar adecuado un termopar o un termómetro de resistencia.- Por encima del escudo hay un platillo que forma parte de una microbalanza muy sensible (véase más abajo). El platillo de balanza tiene unos 30 mm de diámetro y puede estar hecho de aluminio dorado.- El platillo de balanza está rodeado por un recinto cilíndrico de refrigeración de bronce o cobre. Según el tipo de balanza, este recinto tiene aberturas para el ástil de la balanza y una abertura con escudo para la corriente de moléculas, y debe garantizar la condensación completa del vapor en el platillo de balanza. La disipación de calor al exterior se realiza, por ejemplo, mediante una barra de cobre conectada al recinto de refrigeración. La barra pasa a través de la placa de la base y se aisla térmicamente de ésta, por ejemplo con un tubo de acero al cromo-níquel. La barra se introduce en un frasco Dewar con nitrógeno líquido bajo la placa de la base o se hace circular nitrógeno líquido a través de la barra. De esta manera, la temperatura de la barra se mantiene a 120  C aproximadamente. El platillo de la balanza se enfría exclusivamente por radiación, lo que es válido para el intervalo de presiones estudiadas (el enfriamiento debe iniciarse alrededor de 1 hora antes de que empiece la medición).- La balanza se coloca por encima del recinto de refrigeración. Como ejemplos de balanzas adecuadas pueden citarse una microbalanza electrónica muy sensible de 2 brazos (8) o un instrumento de bobina móvil (véase la Test Guideline 104 de la OCDE, edición de 12.05.81).- La placa de base también lleva conexiones eléctricas para los termopares (o termómetros de resistencia) y resistencias calefactoras.- El vacío en el recipiente se produce por medio de una bomba de vacío parcial o una bomba de alto vacío (el vacío necesario es, aproximadamente, de 1 a 2 . 10 3 Pa, después de 2 h de bombeo). La presión se regula con un manómetro adecuado de ionización.1.6.4.2. Método de medidaEl receptáculo se llena con la sustancia problema y se cierra la tapa. El escudo y el recinto de refrigeración se deslizan encima del horno. Se cierra el aparato y se conectan las bombas de vacío. La presión final antes de empezar a tomar medidas debe ser aproximadamente 10 4 Pa. El enfriamiento del recinto de refrigeración se iniciará a 10 2 Pa.Una vez obtenido el vacío necesario, se inicia la serie de calibración a la temperatura mínima exigida. Se pone la abertura correspondiente de la tapa, la corriente de vapor pasa a través del escudo directamente a la parte superior y choca con el platillo enfriado de la balanza. Este platillo debe ser bastante grande para garantizar que choca contra él todo el chorro de vapor llegado a través del escudo. El momento de la corriente de vapor actúa como una fuerza contra el platillo de la balanza y las moléculas se condensan en su superficie enfriada.El momento y la condensación simultánea producen una señal en el registrador. La evaluación de las señales proporciona dos datos:1. En el aparato aquí descrito, la presión de vapor se determina directamente a partir del momento sobre el platillo de la balanza [para esto no es necesario conocer el peso molecular (2)]. Para evaluar las lecturas hay que tener en cuenta factores geométricos, como la abertura del horno y el ángulo de la corriente de moléculas.2. La masa del condensado puede medirse a la vez y, a partir de este dato, puede calcularse la velocidad de evaporación. La presión de vapor puede calcularse también a partir de la velocidad de evaporación y del peso molecular mediante la ecuación de Hertz (2): p = G 2 p RT × 103MdondeG  = velocidad de evaporación (kg s 1 m 2)M  = masa molecular (g mol 1)T  = temperatura (K)R  = constante universal molar de los gases (J mol 1K 1)p  = presión de vapor (Pa)Cuando se consigue el vacío necesario, se inicia la serie de medidas a la temperatura más baja prevista.En las medidas siguientes, se aumenta la temperatura a pequeños intervalos hasta el momento en que se consiga la temperatura más alta prevista. Entonces se enfría la muestra una vez más y puede registrarse una segunda curva de presión de vapor. Si esta segunda serie no confirma los resultados de la primera, es posible que la sustancia se descomponga en el intervalo de temperatura que se utiliza en la determinación.1.6.5. Método de efusión: Pérdida de peso1.6.5.1. AparatoEl aparato de efusión consta de las siguientes partes básicas:- un recinto que puede termostatizarse y someterse a vacío, donde se sitúan las células de efusión;- una bomba de alto vacío (por ejemplo, bomba de difusión o bomba turbomolecular), con un manómetro de vacío;- un sifón, con nitrógeno líquido o hielo seco.Como ejemplo, se presenta en la figura 5 un recinto de aluminio, calentado eléctricamente y que puede someterse a vacío, con 4 células de efusión de acero inoxidable. La hoja de acero inoxidable de unos 0,3 mm de grosor tiene un orificio de efusión de 0,2 a 1,0 mm de diámetro y está unida a la célula de efusión por una tapa de rosca.1.6.5.2. Método de medidaLas sustancias problema y de referencia se ponen en cada célula de efusión, el diafragma metálico con el orificio se sujeta con la tapa de rosca y se pesa cada célula con precisión de 0,1 mg. Se coloca la célula en el aparato termostatizado, que se somete a vacío hasta alcanzar una presión por debajo de un décimo de la presión prevista. A intervalos determinados entre 5 y 30 horas se deja entrar aire en el aparato, y la pérdida de masa de la célula de efusión se determina repitiendo la pesada.Con el fin de garantizar que los resultados no se alteran por la presencia de impurezas volátiles, se vuelve a pesar la célula a intervalos determinados para confirmar que la velocidad de evaporación es constante al menos durante dos intervalos de tiempo.La presión de vapor p en la célula de efusión viene dada por:p =mKAtE2pRTMdondep  =  presión de vapor (Pa)m  =  masa de sustancia que sale de la célula durante el tiempo t (kg)t  =  tiempo (s)A  =  área del orificio (m2)K  =  factor de correcciónR  =  constante universal de los gases (J mol 1K 1)T  =  temperatura (K)M  =  masa molecular (kg mol 1)El factor de corrección K depende de la relación entre la longitud y el radio del orificio cilíndrico:relación:0,10,20,61,02,0K:0,9520,9090,7710,6720,514La ecuación anterior puede escribirse:p = EmtTMdondeE= 1KA2pR es la constante de la célula de efusión.Esta constante de la célula de efusión E puede determinarse con sustancias de referencia (2,9) según la siguiente ecuación:E =p(r) tmM(r)Tdondep(r) = presión de vapor de la sustancia de referencia (Pa)M(r) = masa molecular de la sustancia de referencia (kg.mol 1)1.6.6. Método de saturación de gases1.6.6.1. AparatoEl aparato utilizado en el presente método se compone típicamente de cierto número de elementos que se representan en la figura 6a y se describen a continuación (1).Gas inerte:El gas de arrastre no debe reaccionar químicamente con la sustancia problema. El nitrógeno sirve en la mayoría de los casos pero, a veces, pueden ser necesarios otros gases (10). El gas elegido debe estar seco (véase el número 4 de la figura 6a: sonda de humedad relativa).Control de flujo gaseoso:Un sistema adecuado de control de gases es indispensable para lograr un flujo constante y determinado a través de la columna de saturación.Colectores de vapor:Su elección depende de las características de la muestra, así como del método de análisis utilizado. El vapor debe recogerse cuantitativamente y de manera que permita el análisis posterior. Con determinadas sustancias, se utilizarán colectores con líquidos como el hexano o el etilenglicol. Con otras, se podrán utilizar absorbentes sólidos.Como alternativa a la recogida de vapor y su análisis posterior, pueden utilizarse técnicas analíticas incorporadas en serie, como la cromatografía, para determinar la cantidad de material arrastrado por una cantidad conocida de gas de arrastre. Además, puede medirse la pérdida de masa de la muestra.Intercambiador de calor:Para determinaciones a diferentes temperaturas, quizá sea necesario incluir en el aparato un intercambiador de calor.Columna de saturaciónLa sustancia problema se deposita a partir de una solución sobre un soporte inerte, que se introduce una vez recubierto en la columna de saturación. Las dimensiones de ésta y la velocidad de salida deben elegirse de forma que garanticen la saturación completa del gas de arrastre. La columna debe estar termostatizada. En las determinaciones efectuadas a temperaturas superiores a la del ambiente, se debe calentar el espacio entre la columna y los colectores para impedir la condensación de la sustancia.Con el fin de disminuir el arrastre de masa debido a la difusión, puede colocarse un capilar tras la columna de saturación (figura 6b).1.6.6.2. Método de medidaPreparación de la columna de saturación:Una vez disuelta en un disolvente muy volátil, parte de la sustancia se añade a un volumen adecuado de material de soporte. La cantidad de sustancia añadida debe ser suficiente para mantener la saturación durante todo el ensayo. El disolvente se evapora por completo al aire o en un rotavapor y se introduce el material bien homogeneizado en la columna. Una vez termostatizada la muestra, se hace pasar a través del aparato una corriente de nitrógeno seco.Medida:Se conectan los colectores o el detector incorporado en serie al tubo de salida de la columna y se registra el tiempo. Se comprueban la velocidad de flujo al comienzo de la experiencia y a intervalos regulares durante la misma, mediante un medidor de flujo de burbuja (o también, de forma continua, con uno de masa).Debe medirse la presión a la salida de la columna de saturación:a) intercalando un indicador de presión entre el saturador y los colectores (esto puede no ser adecuado por el aumento del espacio muerto y de la superficie de adsorción); o bienb) determinando los descensos de presión a través del sistema de recogida utilizado, en función de la velocidad de flujo en una prueba aparte (este método puede resultar poco satisfactorio en los colectores de líquido).El tiempo que se precise para recoger la cantidad de sustancia necesaria para los distintos métodos de análisis se determina durante ensayos preliminares o por estimación. Como alternativa a la recogida de sustancia problema para su análisis posterior, puede utilizarse alguna técnica análitica cuantitativa incorporada (por ejemplo, la cromatografía). Antes de calcular la presión de vapor a una temperatura dada, conviene efectuar pruebas preliminares para determinar la velocidad de flujo máxima a la que el gas de arrastre se satura completamente con vapor de la sustancia. Esto queda garantizado si el gas de arrastre pasa a través del saturador con la suficiente lentitud para que una velocidad más reducida no determine una presión de vapor calculada mayor.La elección del método de análisis estará en función de la naturaleza de la sustancia que se vaya a ensayar (por ejemplo, cromatografía en fase gaseosa o gravimetría).Se determina la cantidad de sustancia transportada por un volumen conocido de gas de arrastre.1.6.6.3. Cálculo de la presión de vaporLa presión de vapor se calcula a partir de la densidad del vapor (W/V), por medio de la ecuación siguiente:p =WV×RTMdondep  =  presión de vapor (Pa)W  =  masa de sustancia problema evaporada (g)V  =  volumen de gas saturado (m3)R  =  constante universal molar de los gases (J mol 1 K 1)T  =  temperatura (K)M  =  masa molar de la sustancia problema (g mol 1)Los volúmenes medidos deben corregirse para tener en cuenta las diferencias de presión y temperatura entre el medidor de flujo y el saturador termostatizado. Si el medidor de flujo está situado después del colector de vapor, pueden ser necesarias ciertas correcciones para tener en cuenta la evaporación de productos contenidos en los colectores (1).1.6.7. Rotor (8, 11, 13)1.6.7.1. AparatoLa técnica de rotor puede aplicarse utilizando un viscosímetro de rotor como el que se muestra en la figura 8. En la figura 7 aparece un esquema de montaje experimental.El aparato de medida consiste típicamente en una cabeza de medida de rotor, incluida en un recinto termostatizado (regulado con una precisión de 0,1  C). El recipiente con la muestra se coloca en un recinto termostatizado (regulado con una precisión de 0,01  C) y todas las demás partes del montaje se mantienen a una temperatura superior con el fin de evitar la condensación. Una bomba de alto vacío se conecta al sistema por medio de llaves de alto vacío.La cabeza de medida de rotor consiste en una bola de acero (de 4 a 5 mm de diámetro) dentro de un tubo. La bola se suspende y estabiliza en un campo magnético, generalmente mediante la combinación de imanes permanentes y de bobinas de control.Se hace girar la bola por campos giratorios producidos por las bobinas. Unas bobinas de recepción, que miden la magnetización continua, baja y lateral de la bola hacen que se pueda medir la velocidad de giro.1.6.7.2. Método de medidaCuando la bola alcanza una velocidad angular dada v(o) (generalmente, unas 400 revoluciones por segundo), se interrumpe la activación y se produce el frenado debido a la fricción con el gas.El descenso de la velocidad angular se mide en función del tiempo. Como la fricción causada por la suspensión magnética es despreciable en comparación con la fricción por el gas, la presión p del gas viene dada por la siguiente fórmula:p =pcrrs 10 t× lnv (t)v (o)dondec   =  velocidad media de las moléculas del gasr  =  radio de la bolañ  =  densidad másica de la bolaó  =  coeficiente de transferencia del momento tangencial (ó = 1 para superficie esférica ideal de la bola)t  =  tiempov(t)  =  velocidad angular al cabo del tiempo tv(o)  =  velocidad angular inicialEsta ecuación puede escribirse también:p =p c r r10 s×tn tn-1tn × tn-1donde tn y tn 1 son los tiempos necesarios para que se dé un número N determinado de revoluciones. Estos intervalos de tiempo, tn y tn 1, son sucesivos y tn > tn 1.La velocidad media Ec de las moléculas de gas es:c  =(8 RTp M)12dondeT  = temperaturaR  = constante universal molar de los gasesM  = masa molar2. RESULTADOSCualquiera que sea el método elegido, la presión de vapor debe determinarse, al menos, a dos niveles de temperatura. Son preferibles tres niveles, o más, entre 0  C y 50  C, para comprobar la linealidad de la curva de la presión de vapor.3. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- método utilizado,- especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas) y, en su caso, fase de purificación previa,- dos valores al menos de presión de vapor y temperatura, preferentemente entre 0 y 50  C,- todos los datos originales,- una gráfica de log p frente a 1/T,- una estimación de la presión de vapor a 20 o 25  C.En caso de transición (cambio de estado, descomposición), hay que incluir:- descripción del cambio,- temperatura a la que se produce la presión atmosférica,- presión de vapor a 10 y a 20  C por debajo de la temperatura de transición, así como a 10 y 20  C por encima de dicha temperatura (excepto en el caso de transición del estado sólido al estado gaseoso).Deben señalarse todas las informaciones y observaciones útiles para la interpretación de los resultados, en particular lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia.4. BIBLIOGRAFÍA(1) OCDE, París, 1981 Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.(2) Ambrose, B. Le Neindre, B.; B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, Londres, 1975, vol. II.(3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., Nueva York, 1959, Vol. I, Part I.(4) Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; vol. 34, 593.(5) NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10 1 to 105 Pa - Static method.(6) NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10 3 to 1 Pa - Vapor pressure balance method.(7) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure- temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.(8) G. Messer, P. Röhl, G. Grosse y W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, vol. 5, (4), 2440.(9) Ambrose, D.; Lawrenson, I..; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173.(10) B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435.(11) G. Comsa, J.K. Fremerey y B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), 642.(12) G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148(13) J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3), 1715.Apéndice 1Método de estimaciónINTRODUCCIÓNLos valores calculados de presión de vapor pueden utilizarse:- para decidir cuál de los métodos experimentales es el adecuado,- para dar un valor estimado o un valor límite en casos en que el método experimental no pueda aplicarse por causas técnicas (incluida la extrema debilidad de la presión de vapor),- para contribuir a señalar aquellos casos en que la omisión de la medida experimental se justifica por la probabilidad de que la presión de vapor sea PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Aparato para determinar la curva de presión de vapor, según el método dinámico1 = Termopar2 = Volumen tampón3 = Indicador de presión4 = Vacío5 = Punto de medida6 = Elemento de calor de unos 150 WFigura 2a>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Aparato para determinar la curva de presión de vapor según el método estático (con manómetro de tubo en U)1. Muestra problema6. Baño a temperatura constante2. Fase de vapor7. Termómetro3. Llave de alto vacío8. A la bomba de vacío4. Tubo en U (manómetro auxiliar)9. Ventilación5. ManómetroFigura 2b>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Aparato para determinar la curva de presión de vapor según el método estático (con indicador de presión)1. Sustancia problema5. Indicador de presión2. Fase de vapor6. Baño a temperatura constante3. Llave de alto vacío7. Termómetro4. ManómetroFigura 3>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Isoteniscopio (véase la referencia 2)1. Al sistema de control y medida de la presión2. Tubo de 8 mm de diámetro exterior3. Nitrógeno seco en el sistema de presión4. Vapor de la muestra5. Brazo corto6. Muestra líquidaFigura 4>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Aparato para determinar la curva de presión de vapor, según el método de la balanza de presión de vapor1. Sustancia problema2. Fase de vapor con corriente de vapor3. Horno de evaporación con alimentación giratoria3a. Tapa del horno con abertura4. Calefacción (refrigeración) del horno5. Medida de la temperatura de la muestra6. Recinto de refrigeración7. Escudo8. Barra de refrigeración para el recinto de refrigeración9. Platillo de balanza10. Microbalanza11. Al registrador12. A la bomba de alto vacioFigura 5>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Ejemplo de aparato de evaporación a baja presión por el método de efusión, con una célula de efusión de 8 cm3 de volumen1 Conexión al vacío2 Espacios para el termómetro de resistencia de platino o medida y control de la temperatura (2)3 Tapa del recinto de vacío4 Toro5 Recinto de aluminio para hacer el vacío6 Dispositivo para instalar y quitar las células de efusión7 Tapa de rosca8 Tuercas de mariposa (6)9 Pernos (6)10 Células de efusión de acero inoxidable11 Cartuchos calefactores (6)Figura 6a>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Modelo de aparato que permite determinar la presión de vapor, por el método de saturación de gases1 = Regulador de flujo2 = Intercambiador de calor3 = Válvulas de aguja4 = Sonda de humedad relativa5 = Columnas de saturación6 = Juntas PFTE7 = Medidor de flujo8 = Colector (absorbente)9 = Colector (aceite)10 = Medidor de flujo de burbujaFigura 6b>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Modelo de aparato para la determinación de la presión de vapor por el método de saturación de gases, con un capilar tras la cámara de saturación1. Medidor térmico de flujo de masa2. Manómetro3. Cámara termostatizada4. Bobina termostatizadora para el gas de arrastre5. Termómetro (Pt 100)6. Cámara de saturación de gases7. Capilar8. Recipientes de absorción9. Contador de gas10. Colector en fríoFigura 7>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Ejemplo de montaje experimental para el método del rotorAparato de presión de vaporA. Cabeza de medida de rotor;B. Recipiente de la muestra;C. Termostato;D. Al vacío (turbobomba);E. Termostato de aireFigura 8>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Ejemplo de cabeza de medida de rotor1. Bola;2. Extensión tubular al vacío de 63. Imanes permanentes (2);4. Bobinas (2) para la estabilización vertical;5. Bobinas motrices (4);6. Plato de conexión.A.5. TENSIÓN SUPERFICIAL1. MÉTODOLos métodos descritos se basan en las líneas directrices de la OCDE (1). Los principios fundamentales se dan en la referencia (2).1.1. INTRODUCCIÓNLos métodos descritos se aplican a la medida de la tensión superficial de las soluciones acuosas.Antes de efectuar el ensayo, es conveniente disponer de información preliminar sobre la solubilidad en el agua, la estructura, las propiedades de hidrólisis y la concentración crítica para la formación de micelas de la sustancia.Los siguientes métodos son aplicables a la mayor parte de las sustancias químicas, cualquiera que sea su grado de pureza.Las medidas de la tensión superficial por el método del tensiómetro de anillo se limita a las soluciones acuosas con una viscosidad dinámica inferior a 200 mPa s, aproximadamente.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESLa entalpía de superficie libre por unidad de superficie constituye la tensión superficial.Esta última se expresa en:N/m (en unidades SI) omN/m (en subunidades SI) 1 N/m  = 103 dinas/cm1 mN/m = 1 dina/cm en el sistema CGS (en desuso).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANo es necesario emplear sustancias de referencia cada vez que se estudie una sustancia nueva. Se deben utilizar esencialmente para comprobar la validez del método de vez en cuando y para poder comparar con los resultados obtenidos según otros métodos.En las referencias (1) y (3) se señalan sustancias de referencia que cubren una amplia gama de tensiones superficiales.1.4. PRINCIPIOS DE LOS MÉTODOSLos métodos se basan en la medida de la fuerza máxima que es preciso ejercer verticalmente sobre una brida o anillo en contacto con la superficie del líquido estudiado, colocado en un recipiente adecuado, a fin de separarlo de dicha superficie, o sobre una placa, uno de cuyos bordes esté en contacto con la superficie, a fin de elevar la película formada.Las sustancias que sean hidrosolubles al menos a la concentración de 1 mg/l se someterán al ensayo en solución acuosa a una sola concentración.1.5. CRITERIOS DE CALIDADLa precisión de los métodos descritos es mayor de la que normalmente se requiere en la evaluación del riesgo para el medio ambiente.1.6. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOSSe prepara una solución de la sustancia en agua destilada. La concentración de esta solución debe ser el 90 % de la concentración de saturación de la sustancia en agua; si esta con centración es superior a 1 g/l, se utilizará para el ensayo la concentración de 1 g/l. Las sustancias cuya solubilidad en agua es inferior a 1 mg/l no tienen que someterse al ensayo.1.6.1. Método de la placaVéase ISO 304 y NF T 73-060 (Tensioactivos: determinación de la tensión superficial por elevación de películas líquidas).1.6.2. Método de la bridaVéase ISO 304 y NF T 73-060 (Tensioactivos: determinación de la tensión superficial por elevación de películas líquidas).1.6.3. Método del anilloVéase ISO 304 y NF T 73-060 (Tensioactivos: determinación de la tensión superficial por elevación de películas líquidas).1.6.4. Método del anillo armonizado por la OCDE1.6.4.1. AparatoPara efectuar esta medida pueden emplearse tensiómetros comerciales. Constan de los elementos siguientes:- un portamuestras móvil,- un dinamómetro,- un cuerpo de medida (anillo),- un recipiente de medida.1.6.4.1.1. Portamuestras móvilEl portamuestras móvil sirve de soporte al recipiente de medida termostatizado, que contiene el líquido problema. Va montado en la misma peana que el dinamómetro.1.6.4.1.2. DinamómetroEl dinamómetro (véase la figura) va colocado por encima del portamuestras. El error en la medida de la fuerza no debe pasar de ± 10 6 N, lo que equivale a un límite de error de ± 0,1 mg en una medida de masa. En la mayoría de los casos, la escala de medidas de los tensiómetros vendidos en el mercado está calibrada en mN/m, de manera que se puede leer directamente la tensión superficial en mN/m con una precisión de 0,1 mN/m.1.6.4.1.3. Cuerpo de medida (anillo)El anillo suele estar formado por un hilo de platino-iridio de 0,4 mm de grosor, aproximadamente, y una circunferencia media de 60 mm. Dicho anillo está suspendido horizontalmente de una armadura que va unida por una varilla metálica al dinamómetro (véase la figura).Figura>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Cuerpo de medida (todas las dimensiones se expresan en milímetros)1.6.4.1.4. Recipiente de medidaEl recipiente de medida que contiene la solución problema debe ser un recipiente de vidrio termostatizado. Debe estar diseñado de manera que, durante la determinación, la temperatura del líquido y de la fase gaseosa por encima de su superficie se mantenga constante y no haya evaporación. Los recipientes cilíndricos de vidrio de un diámetro interior de, al menos, 45 mm cumplen estos requisitos.1.6.4.2. Preparación del aparato1.6.4.2.1. LimpiezaLos recipientes de vidrio deben limpiarse con cuidado. Si es necesario se lavarán con mezcla sulfocrómica caliente y, a continuación, con ácido fosfórico viscoso (83 a 98 % en peso de H3PO4); se enjuagarán abundantemente con agua corriente y luego con agua bidestilada hasta el momento en que se obtenga reacción neutra; finalmente, se secarán o bien se enjuagarán con parte del líquido que se va a medir.El anillo se limpiará con abundante agua para eliminar todos los restos de sustancias solubles en agua, se sumergerá unos segundos en mezcla sulfocrómica, se enjuagará con agua bidestilada hasta que se obtenga reacción neutra y, finalmente, se secará rápidamente sobre una llama de metanol.Nota:Los restos de sustancias que no se disuelvan ni se destruyan con la mezcla sulfocrómica ni con el ácido fosfórico, como las siliconas, deberán ser eliminadas con un disolvente orgánico apropiado.1.6.4.2.2. Calibrado del aparatoLa validación del aparato consiste en comprobar el punto cero y en ajustarlo de tal manera que la indicación dada por el aparato permita una determinación fiable en mN/m.Montaje:Se nivelará el aparato, por ejemplo con un nivel de burbuja colocado sobre la peana y con tornillos de nivelación.Ajuste del punto cero:Después de montar el anillo en el aparato y antes de sumergirlo en el líquido, debe ajustarse a cero el indicador del tensiómetro y comprobarse el paralelismo del anillo con la superficie del líquido. A tal fin, puede utilizarse la superficie del líquido como espejo.Calibrado:El calibrado en sí del aparato puede hacerse con uno de los dos métodos siguientes:a) con una masa: este procedimiento consiste en utilizar contrapesos de masa conocida (entre 0,1 g y 1,0 g), que se colocan sobre el anillo. El factor de calibrado èa, por el que habrá que multiplicar todas las lecturas del instrumento, se determina mediante la ecuación (1):fa =  srsa(1)dondesr = mg2b (mN/m)m  =  masa del contrapeso (g)g  =  aceleración de la gravedad (981 cm.s 2 a nivel del mar)b  =  circunferencia media del anillo (cm)åa  =  lectura del tensiómetro tras colocación del contrapeso sobre el anillo (mN/m);b) con agua: este procedimiento utiliza agua pura cuya tensión superficial, por ejemplo a 23  C, es igual a 72,3 mN/m. Es más rápido que el sistema anterior, pero siempre existe el riesgo de que la tensión superficial del agua se vea modificada por restos de tensioactivos.El factor de calibrado Öb, por el que habrá que multiplicar todas las lecturas del aparato, se determina mediante la ecuación siguiente (2);fb =  sosg(2)dondeóo  =  valor dado en la bibliografía para la tensión superficial del agua (mN/m) a la temperatura elegida para el ensayoóg  =  valor medido de la tensión superficial del agua (mN/m) a esa misma temperatura.1.6.4.3. Preparación de la muestraLas soluciones acuosas de la sustancia se prepararán teniendo en cuenta las concentraciones exigidas. Es imprescindible que la disolución de la sustancia sea completa.La solución así preparada debe mantenerse a una temperatura constante (± 0,5  C). Dado que la tensión superficial de una solución colocada en el recipiente de medida se modifica después de cierto tiempo, deben efectuarse varias medidas en momentos diferentes y hay que trazar una curva de la tensión superficial en función del tiempo. Cuando ya no haya modificaciones, se habrá alcanzado un estado de equilibrio.El polvo o los vapores de otras sustancias falsean la medida. La operación debe realizarse bajo una campana de protección.1.6.5. Condiciones del ensayoLas medidas deben efectuarse a una temperatura de unos 20  C, sin variaciones de temperatura superiores a ± 0,5  C.1.6.6. Desarrollo del ensayoSe vierte en el recipiente de medida, cuidadosamente limpio, la solución que se desea medir, procurando evitar la formación de burbujas y, a continuación, se coloca el recipiente de medida en el portamuestras, elevándolo hasta que el anillo quede sumergido bajo la superficie de la solución. Entonces se vuelve a bajar gradual y uniformemente (a una velocidad de unos 0,5 cm/min) el portamuestras para separar el anillo de la superficie hasta llegar a la fuerza máxima. La capa de líquido adherida al anillo no debe desprenderse de éste. Una vez acabada la medida, se sumerge de nuevo el anillo y se repiten las medidas hasta que se obtenga un valor de tensión superficial constante. En cada determinación se anotará el tiempo que haya transcurrido desde la transferencia de la solución al recipiente de medida. Las lecturas deben registrarse en el valor máximo de la fuerza necesaria para retirar el anillo de la superficie del líquido.2. RESULTADOSPara calcular la tensión superficial se multiplicará primero el valor leído en el aparato en mN/m por el factor de calibrado Öa o Öb (según el procedimiento de calibrado utilizado). Se obtendrá entonces un valor sólo aproximado que, a continuación, deberá corregirse.Harkins y Jordan (4) han establecido de manera empírica factores de corrección para los valores de tensión superficial obtenidos por el método del anillo, que dependen de las dimensiones del anillo, de la densidad del líquido y de su tensión superficial.Dada la laboriosidad del proceso de determinación del factor de corrección para cada medida a partir de las tablas de Harkins y Jordan, en las soluciones acuosas se admite la utilización de un procedimiento simplificado de lectura de la tensión superficial tomando directamente los valores corregidos de la tabla siguiente, (se recurrirá a la interpolación en las lecturas que se sitúen entre dos valores de la tabla).>SITIO PARA UN CUADRO>Esta tabla se ha elaborado a partir de la corrección de Harkins Jordan, y es similar a la de la norma DIN (DIN 53914) para agua y soluciones acuosas (densidad ñ = 1 g/cm3); se utiliza con un anillo existente en el mercado cuyas dimensiones son R = 9,55 mm (radio medio del anillo) y r = 0,185 mm (radio del hilo que constituye el anillo). La tabla da los valores corregidos de las medidas de tensión superficial efectuadas tras un calibrado con contrapesos o con agua.Otra posibilidad, sin calibrado previo, consiste en calcular la tensión superficial por medio de la fórmula siguiente:s = 4 p Rf × FdondeF  =  fuerza medida en el dinamómetro en el punto de ruptura de la películaR  =  radio del anillof  =  factor de corrección (1).3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- método utilizado;- tipo de agua o de solución utilizada,- especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas),- resultados de las medidas: tensión superficial (leída) incluyendo a la vez las diferentes lecturas y su medida aritmética, así como el valor medio corregido (teniendo en cuenta el factor específico del equipo y la tabla de corrección),- concentración de la solución,- temperatura del ensayo,- tiempo de la solución empleada; en particular, el tiempo transcurrido entre la preparación de la solución y su medida,- evolución de la tensión superficial de la solución con el tiempo a partir del momento en que se haya transferido al recipiente de medida,- deben señalarse todas las informaciones y observaciones que sean útiles para la interpretación de los resultados, especialmente lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia.3.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOSDado que el agua destilada tiene una tensión superficial de 72,75 mN/m a 20  C, se considerarán sustancias tensioactivas aquellas que presenten una tensión superficial inferior a 60 mN/m en las condiciones de este método.4. BIBLIOGRAFÍA(1) OCDE, París, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Chapter XIV, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Interscience Publ., Nueva York, 1959, vol. I, Part I.(3) Pure Appl. Chem., 1976, Vol. 48, 511(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, Vol. 52, 1751.A.6. HIDROSOLUBILIDAD1. MÉTODOLos métodos descritos se basan en las líneas directrices de la OCDE (1).1.1. INTRODUCCIÓNAntes de proceder al ensayo, es conveniente disponer de información sobre la fórmula desarrollada, la presión de vapor, la constante de disociación y la hidrólisis (como función del pH) de la sustancia.No existe un solo método que cubra toda la gama de solubilidades en el agua.Los dos métodos de ensayo descritos a continuación abarcan la gama completa de solubilidades pero no son aplicables a sustancias volátiles:- el primero, denominado en lo sucesivo«método de elución en columna», se aplica a las sustancias esencialmente puras con escasa solubilidad ( 10 2 g/l) y estables en el agua.La hidrosolubilidad de la sustancia puede verse considerablemente afectada por la presencia de impurezas.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESLa hidrosolubilidad de una sustancia es la concentración de saturación de masa de la sustancia en el agua a una temperatura determinada. Se expresa en unidades de masa por volumen de solución. La unidad SI es el kg/m3 (se puede utilizar tambien g/l).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANo es necesario emplear sustancias de referencia cada vez que se analice una sustancia nueva. Deben servir esencialmente para controlar de vez en cuando la validez del método y permitir la comparación con los resultados obtenidos según otros métodos.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYOLa cantidad aproximada de muestra y el tiempo necesario para conseguir la concentración de saturación de masa, deben determinarse mediante un ensayo preliminar sencillo.1.4.1. Método de elución en columnaEste método se basa en la elución con agua de la sustancia problema en una microcolumna cargada con un material soporte inerte como, por ejemplo, bolas de cristal o arena, cubierto con un exceso de sustancia problema. La hidrosolubilidad se determina cuando la concentración en masa del eluato es constante, lo que se indica con una meseta de la gráfica en función del tiempo.1.4.2. Método de frascoEn este método, la sustancia (los sólidos deben estar pulverizados) se disuelve en agua a una temperatura algo superior a la temperatura de ensayo. Cuando se alcanza la saturación, se enfría la mezcla, se mantiene a la temperatura de ensayo y se agita hasta alcanzar el equilibrio. Otra posibilidad es realizar la medida directamente a la temperatura de ensayo si, mediante un muestreo adecuado, se garantiza que se ha alcanzado el equilibrio de saturación. Luego, se determina con un método analítico apropiado la concentración en masa de la sustancia en la solución acuosa, que no debe contener ninguna partícula sin disolver.1.5. CRITERIOS DE CALIDAD1.5.1. RepetibilidadEn lo que respecta al método de elución en columna, se puede conseguir  3% por  C), se utilizarán también otras dos temperaturas, una superior y otra inferior al menos en 10  C a la temperatura inicial elegida. En este caso, la temperatura debe ajustarse a ± 0,1  C. La temperatura elegida se mantendrá constante en todas las partes importantes del equipo.1.6.2. Ensayo preliminarEn una probeta de 10 ml con tapón de vidrio, que contenga alrededor de 0,1 g de muestra (las sustancias sólidas deben estar reducidas a polvo), añadir volúmenes crecientes de agua destilada a temperatura ambiente, siguiendo la progresión indicada en el cuadro siguiente:>SITIO PARA UN CUADRO>Después de la adición de cada una de las cantidades de agua indicadas, agitar vigorosamente la mezcla durante diez minutos y luego comprobar visualmente si contiene partículas de muestra no disueltas. Si después de añadir 10 mm de agua, la muestra o determinadas partes de ésta no se han disuelto, hay que repetir el experimento en una probeta de 100 ml con mayores volúmenes de agua. Si la solubilidad es escasa, el tiempo necesario para disolver la sustancia puede ser considerablemente más largo (hay que dejar al menos 24 horas). La solubilidad aproximada se indica, en el cuadro, bajo el volumen de agua añadida en que se efectúa la disolución completa de la muestra. Si la sustancia se mantiene aparentemente insoluble, hay que dejar más de 24 horas (96 horas como máximo) o bien proceder a una nueva dilución a fin de determinar si hay que utilizar el método de elución en columna o el método de solubilidad en frasco.1.6.3. Método de elución en columna1.6.3.1. Material soporte, disolvente y eluyenteEn el método de elución en columna, el material soporte debe ser inerte. Se pueden emplear bolas de cristal y arena. Para aplicar la sustancia problema al soporte, se utilizará un disolvente volátil adecuado de pureza de reactivo para análisis. Debe emplearse como eluyente agua bidestilada procedente de un aparato de vidrio o de cuarzo.Nota:No debe utilizarse agua procedente directamente de un intercambiador de iones orgánico.1.6.3.2. Carga del soportePesar unos 600 mg de material soporte y pasarlos a un matraz de fondo redondo de 50 ml.Disolver una cantidad idónea y pesada de la sustancia problema en el disolvente elegido. Añadir al soporte una cantidad adecuada de esta solución. El disolvente debe evaporarse por completo, por ejemplo en un rotavapor; de lo contrario, no se daría la saturación en agua del soporte debido al efecto de partición en la superficie del soporte.La carga del soporte puede plantear dificultades (resultados erróneos) si la sustancia problema se deposita en forma de aceite o en una fase cristalina diferente. La dificultad debe examinarse experimentalmente y recoger los datos correspondientes.Dejar que se empape el soporte cargado de esta forma durante unas 2 horas en 5 ml de agua, aproximadamente, y luego pasar la suspensión a la microcolumna. También se podrá verter en esta última el soporte cargado seco, después de haber llenado previamente la microcolumna de agua y se equilibra después durante unas 2 horas.Procedimiento:La elución de la sustancia a partir del soporte puede efectuarse mediante dos sistemas diferentes:- bomba de recirculación (véase la figura 1),- recipiente de nivelación (véase la figura 4).1.6.3.3. Método de elución en columna con bomba de recirculaciónAparatoEn la figura 1 se muestra el esquema de un sistema que se utiliza normalmente. La figura 2 representa una microcolumna idónea, pero cualquier otra de dimensiones diferentes es aceptable, siempre que se mantengan los criterios de reproducibilidad y de sensibilidad. La columna debe tener un espacio de cabeza correspondiente al menos a 5 volúmenes de lecho de agua y una capacidad mínima de cinco muestras. No obstante, se puede reducir la dimensión si los cinco volúmenes de lecho iniciales, eliminados con las impurezas, se sustituyen por disolvente de relleno.La columna debe estar unida a una bomba de recirculación que garantice un caudal aproximado de 25 ml/hora. Las conexiones de la bomba son de politetrafluoretileno (PTFE) o vidrio. La columna y la bomba, cuando estén unidas, deben permitir la toma de muestras del efluente y el equilibrado a presión atmosférica del espacio de cabeza. El material de la columna se retiene con un pequeño tapón de lana de vidrio (5 mm) que servirá también para separar las partículas por filtración. Como bomba de recirculación se podrá utilizar, por ejemplo, una bomba peristáltica o una bomba de membrana (hay que procurar que el material del tubo no sea causa de contaminación ni adsorción).Procedimiento de medidaSe inicia la circulación a través de la columna. El caudal recomendado es de 25 ml/hora, aproximadamente (unos 10 volúmenes de lecho por hora para la columna arriba descrita). Los cinco primeros volúmenes de lecho (mínimo) se descartan a fin de eliminar las impurezas solubles en el agua. Luego se conecta la bomba de recirculación, haciendo funcionar el aparato hasta llegar al estado de equilibrio, definido por cinco muestras sucesivas cuyas concentraciones no difieran de forma aleatoria en más de ± 30 %. Dichas muestras deben estar separadas entre sí por un intervalo de tiempo correspondiente al paso de al menos 10 volúmenes de lecho del eluyente.1.6.3.4. Método de elución en columna con recipiente de nivelaciónAparato (véanse las figuras 3 y 4)Recipiente de nivelación: la conexión con este recipiente se hace mediante una junta de vidrio esmerilado, unida por tubos de politetrafluoretileno. El caudal recomendado es de unos 25 ml/hora. Se recogerán las sucesivas fracciones de eluato y se analizarán según el método elegido.Procedimiento de medida:Para determinar la hidrosolubilidad se utilizarán las fracciones procedentes del intervalo medio de elución cuyas concentraciones sean constantes (± 30 %) al menos en cinco fracciones consecutivas.En ambos casos (con bomba de recirculación o con recipiente de nivelación) se repetirá la operación, reduciendo el caudal a la mitad. Si los resultados de las dos operaciones concuerdan, la prueba es satisfactoria; si se observa una solubilidad aparente más elevada con el caudal inferior, se continuará con la reducción del caudal a la mitad hasta que se obtenga la misma solubilidad en dos operaciones sucesivas.En los dos casos (bomba de recirculación o recipiente de nivelación), se debe controlar la posible presencia de materia coloidal en las fracciones estudiando la aparición del efecto Tyndall (dispersión de la luz). La presencia de tales partículas falsea los resultados y el ensayo deberá repetirse mejorando la eficacia de la filtración de la columna.Anotar el pH de cada muestra. Efectuar una segunda operación a la misma temperatura.1.6.4. Método de frasco1.6.4.1. AparatosPara este método se requiere el material siguiente:- material de vidrio e instrumentos de laboratorio normales,- dispositivo adecuado para agitar las disoluciones a temperaturas constantes controladas,- centrífuga preferiblemente termostatizada y, si fuere necesario, con emulsiones,- equipo para la determinación analítica.1.6.4.2. Procedimiento de medidaEvaluar, a partir del ensayo preliminar, la cantidad de producto necesario para saturar el volumen de agua elegido. El volumen de agua necesario dependerá del método analítico y del intervalo de solubilidad. Poner una cantidad de material aproximadamente cinco veces superior a la cantidad determinada antes, en cada uno de tres recipientes de vidrio con tapón, también de vidrio (por ejemplo, tubos de centrífuga, matraces). Añadir a cada recipiente el volumen de agua elegido y taparlo herméticamente. Agitar los recipientes, debidamente cerrados, a 30  C (utilizar un dispositivo agitador o mezclador que pueda actuar a temperatura constante como, por ejemplo, un agitador magnético en baño de agua controlado por termostato). Un día después, retirar uno de los recipientes y volver a equilibrar durante 24 horas a la temperatura del ensayo, agitando de vez en cuando. El contenido del recipiente se centrifuga luego a la temperatura del ensayo y se determina la concentración de la sustancia problema en la fase acuosa clara utilizando un método analítico adecuado. Los otros dos matraces se tratan de la misma manera, después de un primer equilibrado a 30  C durante dos y tres días, respectivamente. Si al menos las concentraciones de los dos últimos recipientes concuerdan con la reproducibilidad requerida, el ensayo es satisfactorio. Si los resultados de los recipientes 1, 2 y 3 acusan una tendencia a la progresión, repetir de nuevo todo el ensayo utilizando tiempos de equilibrado más largos.El procedimiento de medida puede realizarse también sin la preincubación a 30  C. Para evaluar la velocidad de adquisición del equilibrio de saturación se irán tomando muestras hasta que el tiempo de agitación deje de influir en la concentración de la solución problema.Debe anotarse el pH de cada muestra.1.6.5. AnálisisPara efectuar estas determinaciones es preferible utilizar un método de análisis que sea específico de la sustancia, pues pequeñas cantidades de impurezas solubles pueden originar errores sensibles en la solubilidad medida. Pueden citarse como ejemplos los siguientes métodos: cromatografía en fase gaseosa o líquida, métodos volumétricos, métodos fotométricos, métodos voltamétricos.2. RESULTADOS2.1. MÉTODO DE ELUCIÓN EN COLUMNAEn cada operación debe calcularse el valor medio de al menos cinco muestras consecutivas tomadas durante el equilibrio de saturación, así como la desviación típica. Los resultados deben expresarse en unidades de masa por volumen de solución.Las medias calculadas en dos pruebas con diferentes caudales se compararán para comprobar que su repetibilidad es inferior al 30 %.2.2. MÉTODO DE FRASCODeben indicarse los resultados individuales de cada uno de los tres frascos; se hará la media de los resultados considerados constantes (repetibilidad inferior al 15 %) y se expresarán en unidades de masa por volumen de solución. Dicha operación podrá requerir la conversión de las unidades de masa en unidades de volumen, utilizando la densidad cuando la solubilidad sea muy elevada (> 100 g/l).3. INFORME3.1. MÉTODO DE ELUCIÓN EN COLUMNAEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- resultados del ensayo preliminar,- especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas),- concentraciones individuales, caudales y pH de cada muestra,- desviación típica y media de al menos cinco muestras tomadas durante el equilibrio de saturación de cada operación,- media de dos operaciones consecutivas aceptables,- temperatura del agua durante el proceso de saturación,- método de análisis utilizado,- naturaleza del material de soporte,- carga del material de soporte,- disolvente utilizado,- cualquier indicación de inestabilidad química de la sustancia durante el ensayo y método utilizado,- todas las observaciones útiles para la interpretación de los resultados, especialmente lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia.3.2. MÉTODO DE FRASCOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- resultados del ensayo preliminar,- especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas),- resultados analíticos individuales y su media cuando se determine más de un valor para un mismo recipiente,- pH de cada muestra,- media de los valores de los diferentes recipientes cuando concuerden,- temperatura del ensayo,- método analítico utilizado,- cualquier indicación de inestabilidad química de la sustancia durante el ensayo y método utilizado,- todas las observaciones útiles para la interpretación de los resultados, especialmente lo referente a las impurezas y al estado físico de la sustancia.4. BIBLIOGRAFÍA(1) OCDE, París, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.(2) NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Column elution method(3) NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility - Flask methodApéndiceFigura 1>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Método de elución en columna con bomba de recirculaciónFigura 2>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO> Microcolumna tipo(dimensiones en milímetros)Figura 3>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Microcolumna tipo(dimensiones en milímetros)Figura 4>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Método de elución en columna con recipiente de nivelación1 = Recipiente de nivelación (por ejemplo, frasco de 2,5 l de capacidad)2 = Columna (véase la figura 3)3 = Colector de fracciones4 = Termostato5 = Tubo de teflón6 = Tapón de vidrio esmerilado7 = Tubo para la circulación de agua entre el termostato y la columna, con un diámetro interior de aproximadamente 8 mmA.8 COEFICIENTE DE REPARTO1. MÉTODOEl método de frasco de agitación se basa en las líneas directrices de la OCDE (1).1.1. INTRODUCCIÓNEs conveniente disponer de información preliminar sobre la fórmula desarrollada, la constante de disociación, la hidrosolubilidad, la hidrólisis, la solubilidad en n-octanol y la tensión superficial de la sustancia antes de proceder al ensayo.Las medidas relativas a sustancias ionizables deben hacerse sólo con la forma no ionizada (ácido libre o base libre) obtenida mediante el uso de una solución amortiguadora con un pH que esté al menos una unidad de pH por debajo (ácido libre) o por encima (base libre) del pK.Este método de ensayo incluye dos procedimientos distintos: el método de frasco de agitación y la cromatografía líquida de alta resolución (CLAR). El primero puede aplicarse cuando el valor de log Pow (véanse más abajo las definiciones) está en el intervalo de  2 a 4, y el segundo cuando está en el intervalo de 0 a 6. Antes de llevar a cabo ninguno de los procedimientos experimentales es necesario obtener una estimación previa del coeficiente de reparto.El método de frasco de agitación es aplicable sólo a sustancias esencialmente puras solubles en agua y n-octanol, y no es aplicable a productos tensoactivos (para los que debe darse su valor calculado o una estimación basada en las solubilidades en n-octanol y agua por separado).El método de CLAR no puede aplicarse a ácidos o bases fuertes, complejos metálicos, materiales tensoactivos ni sustancias que reaccionen con el eluyente. Para estos materiales debe darse un valor calculado o una estimación basada en las solubilidades en n-octanol y agua por separado.El método de CLAR es menos sensible a la presencia de impurezas en el compuesto problema que el método de frasco de agitación. Sin embargo, las impurezas pueden hacer en algunos casos que la interpretación de los resultados sea difícil porque la atribución de los picos resulte dudosa. En el caso de mezclas que den una banda sin resolución, hay que establecer los límites superior e inferior de log P.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESEl coeficiente de reparto (P) se define como la relación de las concentraciones en equilibrio (ci) de una sustancia disuelta en un sistema bifásico consistente en dos disolventes considerablemente inmiscibles. En el caso del n-octanol y del agua:Pow = cn-octanolcaguaEl coeficiente de reparto (P) es, pues, el cociente de dos concentraciones; se indica generalmente en forma de su logaritmo decimal (log P).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIAMétodo de frasco de agitaciónNo es necesario utilizar sustancias de referencia cada vez que se investiga una nueva sustancia. Deben servir esencialmente para comprobar de vez en cuando la eficacia del método y para comparar con los resultados obtenidos según otros métodos.Método de CLARCon el fin de relacionar los datos medidos según la CLAR de un compuesto con su P, hay que trazar una gráfica de calibración (log P - datos cromatográficos) con al menos 6 puntos de referencia. La selección de las sustancias de referencia adecuadas depende del criterio del analista. Siempre que sea posible, al menos una sustancia de referencia debe tener un Pow superior al de la sustancia problema, y otra un Pow inferior al de la sustancia problema. En el caso de valores de log P inferiores a 4, la calibración puede basarse en datos obtenidos por el método de frasco de agitación. En el caso de valores de log P superiores a 4, la calibración puede basarse en valores validados aparecidos en la bibliografía, siempre que estos valores estén de acuerdo con los valores calculados. Para mayor precisión, es preferible elegir compuestos de referencia que estén relacionados estructuralmente con la sustancia problema.Se dispone de amplias listas de valores de log Pow de muchos grupos de productos químicos (2) (3). Si no se tienen datos sobre los coeficientes de reparto de compuestos relacionados estructuralmente, puede utilizarse entonces una calibración más general, establecida con otros compuestos de referencia.En el apéndice 2 se recoge una relación de sustancias de referencia recomendadas con sus valores de Pow.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO1.4.1. Método de frasco de agitaciónPara determinar un coeficiente de reparto, es necesario conseguir un equilibrio entre los elementos constitutivos del sistema que se influencien mutuamente y determinar las concentraciones de las sustancias disueltas en las dos fases. Examinando la bibliografía existente sobre este tema, se encuentra que pueden utilizarse varias técnicas diferentes para resolver este problema, es decir, la mezcla completa de las dos fases, seguida de su separación, que permita determinar la concentración en equilibrio de la sustancia de ensayo.1.4.2. Método de CLARLa CLAR se realiza en columnas analíticas rellenas de una fase sólida comercializada con cadenas hidrocarbonadas largas (C8, C18, por ejemplo) unidas por enlaces químicos a la sílice. Los productos químicos inyectados en esta columna la recorrerán a diferente velocidad debido a los diferentes grados de reparto entre la fase móvil y la fase estacionaria hidrocarbonada. Las mezclas de productos químicos se eluyen por orden de hidrofobicidad, saliendo antes los productos hidrosolubles y después los liposolubles, según su coeficiente de reparato hidrocarburo-agua. Esto permite establecer una relación entre el tiempo de retención en una columna de este tipo (de fase inversa) y el coeficiente de reparto n-octanol/agua. El coeficiente de reparto se deduce del factor de capacidad k, dado por la expresiónk = tR   totodonde tR = tiempo de retención de la sustancia problema y to = tiempo medio que necesita una molécula de disolvente para recorrer la columna (tiempo muerto).No es necesario utilizar métodos analíticos cuantitativos, sino sólo determinar los tiempos de elución.1.5. CRITERIOS DE CALIDAD1.5.1. RepetibilidadMétodo de frasco de agitaciónPara obtener un coeficiente de reparto preciso, se harán determinaciones por duplicado en tres series de condiciones de ensayo diferentes, pudiendo variar tanto la cantidad de sustancia especificada como la relación de volumen de los disolventes. Los logaritmos de los valores determinados del coeficiente de reparto deberán situarse en un intervalo de ± 0,3 unidades logarítmicas.Método de CLARPara aumentar la confianza de la medida, deben hacerse las determinaciones por duplicado. Los valores de log P procedentes de las distintas medidas deben estar dentro de un intervalo de ± 0,1 unidades logarítmicas.1.5.2. SensibilidadMétodo de frasco de agitaciónEl intervalo de medida del método está determinado por el límite de detección del procedimiento analítico. Esto debe ser suficiente para evaluar los valores de log Pow en el intervalo de  2 a 4 (a veces, bajo ciertas condiciones, este intervalo puede ampliarse hasta un log Pow de 5), cuando la concentración del soluto en cada fase no sobrepase los 0,01 moles por litro.Método de CLAREl método de CLAR permite la evaluación de coeficientes de reparto en el intervalo de log Pow entre 0 y 6.En principio, el coeficiente de reparto de un compuesto puede estimarse en el margen de ± 1 unidad logarítmica del valor obtenido con el frasco de agitación. En la bibliografía se encuentran correlaciones típicas (4)(5)(6)(7)(8). Normalmente puede obtenerse mayor precisión cuando los gráficos de correlación se basan en compuestos de referencia relacionados estructuralmente (9).1.5.3. EspecificidadMétodo de frasco de agitaciónLa ley de reparto de Nernst sólo se aplica a temperatura, presión y pH constantes para las soluciones diluidas. Estrictamente se aplica a una sustancia pura dispersada entre dos disolventes puros. Los resultados pueden ser modificados por la aparición simultánea, en una o ambas fases, de varios solutos diferentes.La disociación o la asociación de las moléculas disueltas se traduce en desviaciones respecto a la ley de reparto citada. Estas desviaciones se observan porque el coeficiente de reparto pasa a depender entonces de la concentración de la solución.Debido a los multiples equilibrios implicados, este método de ensayo no debe aplicarse sin corregir a los compuestos ionizables. Para estos compuestos debe considerarse la utilización de soluciones amortiguadoras en lugar de agua; el pH de la solución amortiguadora debe diferir del pKa de la sustancia al menos en una unidad de pH y hay que tener en cuenta la importancia de este pH para el medio ambiente.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. Estimación preliminar del coeficiente de repartoEl valor del coeficiente de reparto puede estimarse preferentemente mediante un método de cálculo (véase el apéndice 1), o bien, cuando sea adecuado, utilizando la relación de las solubilidades de la sustancia de ensayo en los disolventes puros (10).1.6.2. Método de frasco de agitación1.6.2.1. Preparaciónn-Octanol: la determinación del coeficiente de reparto debe hacerse recurriendo a un reactivo de calidad analítica.Agua: utilizar agua destilada o bidestilada procedente de un aparato de cristal o de cuarzo. En el caso de compuestos ionizables, puede ser necesario utilizar soluciones amortiguadoras en lugar de agua.Nota:Evitar el agua extraída directamente de un intercambiador de iones.1.6.2.1.1. Presaturación de los disolventesAntes de determinar un coeficiente de reparto, se saturan recíprocamente las fases del sistema de disolventes agitándolas a la temperatura de ensayo. Para realizar esto, es preciso agitar durante 24 horas, en un agitador mecánico, dos grandes frascos que contengan n-octanol puro de calidad analítica o agua, con una cantidad suficiente del otro disolvente y dejarlos reposar hasta que se separen las fases y se alcance el estado de saturación.1.6.2.1.2. Preparación para el ensayoEl volumen del sistema bifásico debe llenar casi completamente el recipiente de ensayo para evitar cualquier pérdida de materia debida a la volatilización. La relación de volumen y las cantidades de sustancia que deben utilizarse se determinan de la siguiente manera:- estimación preliminar del coeficiente de reparto (véase más arriba),- cantidad mínima de sustancia de ensayo requerida para el procedimiento analítico utilizado,- límite de concentración máxima en cada fase de 0,01 moles por litro.Se efectúan tres ensayos. En el primero se utiliza la relación calculada de volúmenes de n-octanol y agua, en el segundo se divide por dos esta relación, y en el tercero se multiplica por dos esta relación (p. ej., 1:1, 1:2, 2:1).1.6.2.1.3. Sustancia de ensayoSe prepara una solución de reserva en n-octanol presaturado con agua. La concentración de esta solución de reserva debe determinarse con precisión antes de utilizarla para determinar el coeficiente de reparto. Esta solución deberá guardarse en condiciones que garanticen su estabilidad.1.6.2.2. Condiciones de ensayoLa temperatura de ensayo debe mantenerse constante (± 1  C) y situarse en el intervalo de 20  C a 25  C.1.6.2.3. Procedimiento de medida1.6.2.3.1. Establecimiento del equilibrio de repartoPara cada serie de condiciones de ensayo, preparar recipientes de ensayo por duplicado con las cantidades requeridas, cuidadosamente medidas, de los dos disolventes, así como la cantidad necesaria de solución de reserva.Medir los volúmenes de las fases de n-octanol. Colocar en un agitador apropiado o agitar a mano los recipientes de ensayo. En caso de usar un tubo para centrifugar, un método que se recomienda consiste en hacer girar rápidamente 180 grados alrededor de su eje transversal el tubo, de forma que el aire que pudiera haber quedado retenido atraviese las dos fases. La experiencia muestra que 50 giros de este tipo suelen ser suficientes para establecer el equilibrio de reparto. Para mayor seguridad, se recomienda hacer 100 giros en cinco minutos.1.6.2.3.2. Separación de las fasesCuando sea necesario para separar las fases, centrifugar la mezcla. Efectuar esta operación con una centrifuga de laboratorio mantenida a temperatura ambiente o, si se utiliza una centrifuga sin control de temperatura, equilibrar los tubos de centrífuga a la temperatura de ensayo durante por lo menos una hora antes del análisis.1.6.2.4. AnálisisPara determinar el coeficiente de reparto, es necesario analizar las concentraciones de la sustancia de ensayo en las dos fases. Para ello, se puede extraer una alícuota de cada una de las dos fases de cada tubo, para cada serie de condiciones de ensayo, y analizarlas según el procedimiento elegido. Debe calcularse la cantidad total de sustancia presente en las dos fases y compararla con la cantidad introducida inicialmente.La muestra de la fase acuosa debe tomarse por un procedimiento que reduzca al mínimo el riesgo de incorporar trazas de n- octanol: para ello se puede utilizar una jeringuilla de cristal con aguja intercambiable; en primer lugar hay que llenar parcialmente de aire la jeringuilla y a continuación expulsarlo lentamente mientras que se va introduciendo al mismo tiempo la aguja a través de la capa de n-octanol. Extraer un volumen adecuado de fase acuosa. Retirar rápidamente la jeringuilla de la solución y quitar la aguja. El contenido de la jeringuilla se podrá utilizar entonces como muestra acuosa. La concentración en las dos fases diferentes deberá determinarse, preferentemente, mediante un procedimiento específico de la sustancia. Algunos ejemplos de métodos analíticos que pueden ser adecuados son:- métodos fotométricos,- cromatografía en fase gaseosa,- cromatografía líquida de alta resolución.1.6.3. Método de CLAR1.6.3.1. PreparaciónAparatosSe necesita un cromatógrafo de líquidos, dotado de una bomba de caudal constante y un instrumento de detección adecuado. Es recomendable el uso de una válvula de inyección con circuito de inyección. La presencia de grupos polares en la fase estacionaria puede afectar gravemente al funcionamiento de la columna de CLAR; por tanto, las fases estacionarias deben presentar la mínima proporción posible de grupos polares (11). Pueden utilizarse rellenos de fase inversa con micropartículas o columnas ya rellenas, disponibles comercialmente. Puede ponerse una columna de seguridad entre el sistema de inyección y la columna de análisis.Fase móvilPara preparar el disolvente de elución, del que se eliminarán los gases disueltos antes de utilizarlo, se empleará metanol para CLAR y agua para CLAR. Se empleará la elución isocrática. Se utilizarán mezclas de metanol/agua en que el contenido mínimo de agua será del 25%. La mezcla típica de metanol-agua en la proporción de 3:1 (v/v) es satisfactoria para eluir compuestos de log P 6 en el plazo de una hora con un caudal de 1 ml/min. En el caso de compuestos de mayor log P puede ser necesario abreviar el tiempo de elución (y el de los compuestos de referencia) disminuyendo la polaridad de la fase móvil o la longitud de la columna.Las sustancias muy poco solubles en n-octanol tienden a dar valores de log Pow anormalmente bajos con el método de CLAR; los picos de estos compuestos acompañan a veces al frente de disolvente. Esto se debe probablemente al hecho de que el proceso de reparto es demasiado lento como para alcanzar el equilibrio en el tiempo necesario normalmente en una separación por CLAR. Si se disminuye el caudal y/o se baja la proporción metanol/agua es posible obtener un valor fiable.Las sustancias de ensayo y de referencia deben ser solubles en la fase móvil en concentraciones suficientes para permitir su detección. Sólo podrán añadirse aditivos a la mezcla metanol-agua en casos excepcionales, ya que los aditivos cambian las propiedades de la columna. Si se trata de cromatogramas con aditivos, es obligatorio utilizar una columna independiente del mismo tipo. Si la mezcla metanol-agua no es adecuada, pueden utilizarse otras mezclas de disolventes orgánicos con agua, como etanol-agua o acetonitrilo-agua.El pH del eluyente es fundamental para los compuestos ionizables. Debe situarse en el intervalo de pH de funcionamiento de la columna, que suele estar entre 2 y 8. Se recomienda el uso de soluciones amortiguadoras. Hay que evitar la precipitación de sales y el deterioro de la columna que se producen con algunas mezclas de fase orgánica con soluciones amortiguadoras. Las medidas de CLAR con fases estacionarias a base de sílice con el pH superior a 8 no son recomendables porque el uso de una fase móvil alcalina puede provocar una rápida alteración de las características de la columna.SolutosLos compuestos de referencia deben tener la mayor pureza posible. Si es posible, los compuestos que se vayan a utilizar en el ensayo o en la calibración se disolverán en la fase móvil.Condiciones de ensayoLa temperatura durante las medidas no debe variar más de ± 2 K.1.6.3.2. MedidaCálculo del tiempo muerto toEl tiempo muerto to puede determinarse utilizando una serie homóloga (por ejemplo, n-alquil-metil-cetonas) o bien compuestos orgánicos no retenidos (por ejemplo, tiourea o formamida). Para calcular el tiempo muerto to utilizando una serie homóloga, se inyectarán al menos 7 miembros de una serie homóloga y se determinarán sus respectivos tiempos de retención. Los tiempos de retención, medidos directamente, tr(nc + 1), se representan gráficamente en función de tr(nc) y se determinan la ordenada en el origen a y la pendiente b de la ecuación de regresión:tr(nc + 1) = a + b tr(nc)siendo nc = número de átomos de carbono. El tiempo muerto to viene dado por:t0 = a / (1   b)Gráfico de calibraciónEl paso siguiente es construir una gráfica de correlación de log k frente a log P para los compuestos de referencia adecuados. En la práctica, se inyecta simultáneamente una serie de 5 a 10 compuestos patrón de referencia cuyo log P esté alrededor del intervalo supuesto, y se determinan los tiempos de retención, preferiblemente con un integrador-registrador unido al sistema de detección. Se calculan los respectivos logaritmos de los factores de capacidad, log K, y se representan en función del log P determinado según el método de frasco de agitación. La calibración se realiza a intervalos regulares, al menos una vez al día, de forma que puedan tenerse en cuenta los posibles cambios en las características de la columna.Determinación del factor de capacidad de la sustancia de ensayoSe inyecta la cantidad más pequeña posible de sustancia de ensayo en fase móvil. Se determina (por duplicado) el tiempo de retención para calcular el factor de capacidad k. A partir de la gráfica de correlación de los compuestos de referencia puede interpolarse el coeficiente de reparto de la sustancia de ensayo. Cuando los coeficientes de reparto son muy altos o muy bajos es necesario hacer una extrapolación y en estos casos hay que tener muy en cuenta los límites de confianza de la línea de regresión.2. RESULTADOSMétodo de frasco de agitaciónLa fiabilidad de los valores determinados de P puede verificarse procediendo a una comparación de las medias de las determinaciones efectuadas por duplicado frente a la media general.3. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas),- cuando no puedan aplicarse los métodos (p. ej., con productos tensoactivos), habrá que dar un valor calculado o una estimación a partir de las solubilidades en n-octanol y agua por separado,- toda la información y las observaciones que sean útiles para la interpretación de los resultados, especialmente en lo relativo a las impurezas y al estado físico de la sustancia.Para el método de frasco de agitación:- resultado de la estimación previa, en su caso,- temperatura de la determinación,- datos sobre los procedimientos analíticos utilizados para determinar las concentraciones,- tiempo y velocidad de la centrifugación, en su caso,- concentraciones medidas en ambas fases en cada determinación (es decir, hay que indicar un total de 12 concentraciones),- peso de la sustancia de ensayo, volumen de cada fase empleado en cada recipiente de ensayo y cantidad calculada total de sustancia de ensayo presente en cada fase tras el equilibrado,- valores calculados del coeficiente de reparto (P) y media de cada conjunto de condiciones de ensayo, así como la media de todas las determinaciones. Si hay alguna indicación de que el coeficiente de reparto puede variar con la concentración, habrá que señalarlo en el informe,- desviación típica de los distintos valores de P respecto a su media,- media del valor P de todas las determinaciones, expresada también en logaritmo decimal,- valor teórico calculado de Pow cuando este valor se haya determinado o cuando el valor medido sea superior a 104,- pH del agua utilizada y fase acuosa durante la prueba,- si se utilizan soluciones amortiguadoras, hay que justificar su uso en lugar del agua e indicar su composición, concentración y pH, así como el pH de la fase acuosa antes y después del ensayo.Para el método de CLAR:- resultado de la estimación previa, en su caso,- sustancias de ensayo y de referencia, con sus purezas,- intervalo de temperatura de las determinaciones,- pH al que se hacen las determinaciones,- características de las columnas de análisis y de seguridad, fase móvil y sistema de detección,- datos de la retención y valores de log P de la bibliografía correspondiente a las sustancias de referencia utilizadas en la calibración,- datos de la recta de regresión ajustada (log K frente a log P),- datos de retención media y valor interpolado de log P del compuesto problema,- descripción del equipo y condiciones de funcionamiento,- perfiles de elución,- cantidades de sustancias problema y de referencia introducidas en la columna,- tiempo muerto y método para medirlo.4. BIBLIOGRAFÍA(1) OCDE, París, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.(2) C. Hansch y A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, Nueva York, 1979.(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) - Available from Pomona College Medical Chemistry Project, 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.(4) L. Renberg, G. Sundström y K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1981, vol. 80, 683.(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt y R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219.(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.(8) J.E. Haky y A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675.(9) S. Fujisawa y E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787.(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (editado por E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.(11) R.F. Rekker y H.M. de Kort, Euro. J Med. Chem., 1979, vol. 14, 479.(12) A. Leo, C. Hansch y D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, Vol. 71, 525.(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use - Determination of partition coefficient - Flask shaking method.(15) C.V. Eadsforth y P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.(16) A. Leo, C. Hansch y D. Elkins, Chem. Rev, 1971, vol. 71, 525.(17) C. Hansch, A Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani y E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.(18) W.B. Neely, D.R. Branson y G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113.(19) D.S. Brown y E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382.(20) J.K. Seydel y K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, Nueva York, 1979.(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984.(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, Nueva York, Basilea, 1978.(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.Apéndice 1Métodos de cálculo y estimaciónINTRODUCCIÓNEn Handbook of Chemical Property Estimation Methods (a) se ofrece una introducción general de los métodos de cálculo, junto con datos y ejemplos.Los valores calculados de Pow pueden utilizarse:- para decidir cuál de los métodos experimentales es adecuado (intervalo del método de frasco de agitación: log Pow entre  2 y 4; intervalo del método de CLAR: log Pow entre 0 y 6),- para seleccionar las condiciones de ensayo adecuadas (p. ej., sustancias de referencia para procedimientos de CLAR, relación de volúmenes n-octanol/agua para el método de frasco de agitación),- como control interno del laboratorio para detectar posibles errores experimentales,- para dar una estimación de Pow en casos en que los métodos experimentales no puedan aplicarse por causas técnicas.MÉTODO DE ESTIMACIÓNEstimación previa del coeficiente de repartoEl valor del coeficiente de reparto puede estimarse a partir de las solubilidades de la sustancia problema en los disolventes puros:Pestimado = cn-octanol de saturación cagua de saturaciónMÉTODOS DE CÁLCULOPrincipio de los métodos de cálculoTodos los métodos de cálculo se basan en la fragmentación formal de la molécula en subestructuras adecuadas de las que se conocen incrementos fiables de log Pow. El log Pow de toda la molécula se calcula entonces como la suma de los valores de los fragmentos correspondientes más unos términos de corrección por las interacciones intramoleculares.Existen listas de constantes de fragmentos y términos de corrección (b) (c) (d) (e). Algunas se actualizan periódicamente (b).Criterios cualitativosEn general, la fiabilidad del método de cálculo va disminuyendo al aumentar la complejidad del compuesto estudiado. En el caso de moléculas simples de bajo peso molecular y uno o dos grupos funcionales, puede esperarse una desviación de 0,1 a 0,3 unidades logarítmicas de Pow entre los resultados de los diferentes métodos de fragmentación y el valor medido. Si se trata de moléculas más complejas, el margen de error puede ser mayor, dependiendo de la fiabilidad y disponibilidad de constantes de fragmentos, así como de la capacidad de detectar interacciones intramoleculares (p. ej., enlaces de hidrógeno) y del uso adecuado de los términos de corrección (problema menos arduo con los programas de ordenador CLOGP-3) (b). En el caso de compuestos ionizados, es importante considerar correctamente la carga o el grado de ionización.Procedimientos de cálculoMétodo de ð de HanschLa constante del sustituyente hidrofóbico original, ð, introducida por Fujita et al. (f) se define como:px = log Pow (PhX)   log Pow (PhH)donde Pow (PhX) es el coeficiente de reparto de un derivado aromático y Pow (PhH) el del compuesto original.(P. ej. pCl= log Pow (C6H5Cl)   log Pow (C6H6)= 2,84   2,13 = 0,71).Según esta definición, el método de ð es aplicable principalmente a la sustitución aromática. Se han tabulado los valores de ð de gran número de sustituyentes (b) (c) (d) y se utilizan para calcular el log Pow de moléculas o subestructuras aromáticas.Método de RekkerSegún Rekker (g), el valor de log Pow se calcula de la manera siguiente:log Pow = Siai fi + Sj (términos de interacción)donde fi representa las constantes de los diferentes fragmentos moleculares y ai la frecuencia de su aparición en la molécula estudiada. Los términos de corrección pueden expresarse como integral múltiple de una sola constante Cm (llamada «constante mágica»). Las constantes de fragmentos fi y Cm se han obtenido a partir de una lista de 1 054 valores experimentales de Pow (825 compuestos) mediante análisis de regresión múltiple (c) (h). La determinación de los términos de interacción se lleva a cabo según normas establecidas recogidas en la bibliografía (e) (h) (i).Método de Hansch-LeoSegún Hansch y Leo (c), el valor de log Pow se calcula de la forma siguiente:log Pow = Siai fi + Sj bj Fjdonde fi representa las constantes de los diferentes fragmentos moleculares; Fj, los términos de corrección, y ai y bj las frecuencias correspondientes de presencia. A partir de valores experimentales de Pow, se establecieron por el método de tanteo una lista de valores de fragmentos atómicos y de grupos y una lista de términos de corrección Fj (llamados «factores»). Los términos de corrección se han ordenado en varias clases diferentes (a) (c). Es bastante complicado y exige mucho tiempo el tener en cuenta todas las normas y los términos de corrección. Se han ideado programas informáticos (b).Método combinadoEl cálculo de log Pow de moléculas complejas puede mejorarse considerablemente si se divide la molécula en grandes subestructuras de las que se conozcan valores fiables de log Pow a partir de listas (b) (c) o por mediciones propias. Estos fragmentos (p.ej., heterociclos, antraquinona, azobenceno) pueden combinarse con los valores ð de Hansch o con las constantes de fragmentos de Rekker o Leo.Observacionesi) Los métodos de cálculo sólo pueden aplicarse a compuestos parcial o completamente ionizados, si es posible tener en cuenta los necesarios factores de corrección.ii) Si puede suponerse la presencia de enlaces de hidrógeno intramoleculares, hay que añadir los correspondientes términos de corrección (aproximadamente, de + 0,6 a + 1,0 unidades logarítmicas de Pow) (a). La presencia de tales enlaces puede suponerse a partir de modelos estéricos o datos espectroscópicos de la molécula.iii) Si son posibles varias formas tautoméricas, debe usarse como base para el cálculo la forma más probable.iv) Hay que seguir cuidadosamente las revisiones de las listas de constantes de fragmentos.InformeCuando se utilicen métodos de cálculo/estimación, el informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- descripción de la sustancia (mezcla, impurezas, etc.),- indicación de cualquier posible enlace de hidrógeno intramolecular, disociación, carga o cualquier otro efecto poco común (p. ej., tautomería),- descripción del método de cálculo,- indicación o suministro de la base de datos,- peculiaridades de la selección de los fragmentos,- documentación exhaustiva de los cálculos.BIBLIOGRAFÍA(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl y D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, Nueva York, 1983.(b) Pomona College, Medical Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, Nueva York, 1979.(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. - Chim. Ther., 1979, vol. 14, 479.(f) T. Fujita, J. Iwasa y C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, vol. 1 Elsevier, Nueva York, 1977.(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.(i) R.A. Scherrer, ACS - American Chemical Society, Washington D. C., 1984, Symposium Series 255, p.225.Apéndice 2>SITIO PARA UN CUADRO>A.9. PUNTO DE INFLAMACIÓN1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNEs conveniente disponer de datos preliminares sobre la inflamabilidad de la sustancia antes de proceder al ensayo. Este procedimiento es aplicable a las sustancias líquidas cuyos vapores pueden ser inflamados por fuentes de ignición. Los métodos de ensayo descritos en el presente documento sólo son válidos para los intervalos de punto de inflamación especificados en cada uno de los distintos métodos.A la hora de seleccionar el método hay que tener en cuenta las posibles reacciones químicas entre la sustancia y el soporte de la muestra.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESEl punto de inflamación es la temperatura mínima, corregida a una presión de 101,325 kPa, a la cual un líquido desprende vapores, en las condiciones definidas en el método de ensayo, en una cantidad tal que se produzca una mezcla vapor/aire inflamable en el recipiente del ensayo.Unidad:  Ct =  T   273,15(t en  C y T en K)1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANo es necesario utilizar sustancias de referencia cada vez que se examina una nueva sustancia. Su principal función es la de servir para comprobar las características del método de vez en cuando y comparar con los resultados obtenidos según otros métodos.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOSe coloca la sustancia en un recipiente de ensayo y se calienta o se enfría hasta la temperatura de ensayo según el procedimiento descrito en cada método concreto. Se hacen pruebas de ignición para observar si la muestra se inflama o no a la temperatura de ensayo.1.5. CRITERIOS DE CALIDAD1.5.1. RepetibilidadLa repetibilidad depende del intervalo del punto de inflamación y del método de ensayo utilizado; máximo 2  C.1.5.2. SensibilidadLa sensibilidad depende del método de ensayo utilizado.1.5.3. EspecificidadLa especificidad de ciertos métodos de ensayo se limita a algunos intervalos de punto de inflamación y depende de las características de la sustancia (por ejemplo, alta viscosidad).1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. PreparaciónSe coloca una muestra de la sustancia problema en un aparato de ensayo, de conformidad con los puntos 1.6.3.1. y/o 1.6.3.2.Por seguridad, se recomienda para sustancias energéticas o tóxicas seguir un método que exija una muestra pequeña, alrededor de 2 cm3.1.6.2. Condiciones del ensayoSe debe instalar el aparato lejos de corrientes de aire, siempre que esto no suponga ningún problema de seguridad.1.6.3. Desarrollo del ensayo1.6.3.1. Método de equilibrioVéanse las normas ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523 e ISO 3679.1.6.3.2. Métodos de no equilibrioAparato Abel:Véanse las normas BS 2000, parte 170, NF M07-011 y NF T66-009.Aparato Abel-Pensky:Véanse las normas EN 57, DIN 51755 primera parte (para temperaturas de 5  a 65  C), DIN 51755 segunda parte (para temperaturas inferiores a 5  C) y NF M07-036.Aparato Tag:Véase la norma ASTM D-56.Aparato Pensky-Martens:Véanse las normas ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34 y NF M07-019.Observaciones:Cuando el punto de inflamación determinado por un método de no equilibrio del punto 1.6.3.2. tiene los siguientes valores: 0 ± 2  C, 21 ± 2  C o 55 ± 2  C, es conveniente confirmarlo mediante un método de equilibrio utilizando el mismo aparato.Únicamente se pueden utilizar para la notificación los métodos que puedan dar la temperatura del punto de inflamación.Para determinar el punto de inflamación de líquidos viscosos (pinturas, gomas, etc.) que contengan disolventes, sólo se pueden utilizar los aparatos y métodos de ensayo que permitan determinar el punto de inflamación de los líquidos viscosos.Véanse las normas ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523 y DIN 53213 primera parte.2. RESULTADOS3. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especificación precisa de la sustancia (identificación e impurezas),- descripción del método utilizado, así como cualquier desviación,- los resultados y cualquier otra información u observación que pueda ser útil para la interpretación de los resultados.4. BIBLIOGRAFÍANinguna.A.10. INFLAMABILIDAD (SÓLIDOS)1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNEs conveniente disponer de datos preliminares sobre las posibles propiedades explosivas de la sustancia antes de proceder al ensayo.El presente método sólo es aplicable a las sustancias en polvo, granulosas o pastosas.Para no englobar todas las sustancias que pueden inflamarse, sino únicamente aquellas que se queman muy rápidamente o cuya forma de combustión es, de una forma u otra, particularmente peligrosa, sólo se considerarán como fácilmente inflamables las sustancias cuya velocidad de combustión sobrepase un cierto límite.Puede ser especialmente peligroso que la incandescencia se propague a través de un polvo metálico debido a las dificultades para apagar un fuego. Los polvos metálicos se considerarán fácilmente inflamables si permiten la difusión de la incandescencia en toda su masa en un tiempo especificado.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESTiempo de combustión expresado en segundos.1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANo se especifican.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOLa sustancia se dispone formando una mecha o cinta continua de unos 250 mm de longitud y se hace un ensayo exploratorio previo para determinar si, al aplicar una llama de gas, se produce la propagación de la combustión con llama o sin ella. Si se produce la propagación a lo largo de 200 mm de la mecha dentro de un tiempo dado, hay que realizar un ensayo completo para determinar la velocidad de combustión.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNo se indican.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. Ensayo exploratorio previoSe pone la sustancia formando una mezcla o cinta continua de unos 250 mm de longitud, 20 mm de anchura y 10 mm de altura, sobre una placa incombustible, no porosa y de baja conductividad térmica. Una llama fuerte procedente de un mechero de gas (diámetro mínimo: 5 mm) se aplica a un extremo de la mecha hasta que el polvo empieza a arder o durante un máximo de 2 minutos (5 minutos si se trata de polvos de metales o de aleaciones metálicas). Hay que observar si la combustión se propaga a lo largo de 200 mm de la mecha durante un período de prueba de 4 minutos (o 40 minutos si se trata de polvos metálicos). Si la sustancia no se enciende ni propaga la combustión ardiendo con llama o sin ella a lo largo de 200 mm de la mecha en el plazo de 4 minutos (o 40 minutos), entonces la sustancia no debe considerarse fácilmente inflamable y no es necesario seguir con las pruebas. Si la sustancia propaga la combustión a lo largo de 200 mm de longitud de la mecha en menos de 4 minutos (o menos de 40 minutos si se trata de polvos metálicos), hay que aplicar el procedimiento descrito a continuación (puntos 1.6.2. y siguientes).1.6.2. Ensayo de la velocidad de combustión1.6.2.1. PreparaciónEn el caso de sustancias en polvo o granulosas se vierte la sustancia sin comprimir dentro de un molde de 250 mm de longitud con una sección transversal triangular de 10 mm de altura interior y 20 mm de anchura. A ambos lados del molde, en sentido longitudinal, se colocan dos placas metálicas a modo de soportes laterales, que deben sobrepasar en 2 mm el borde superior de la sección triangular transversal del molde (véase la figura). A continuación se deja caer tres veces el molde desde una altura de 2 cm, sobre una superficie dura. Si es necesario, se completa el molde de nuevo. A continuación, se retiran las placas laterales y se enrasa. Se coloca sobre el molde una placa no combustible, no porosa y de baja conductividad térmica, se le da la vuelta y se desmolda.Las sustancias pastosas se extienden sobre una superficie no combustible, no porosa y de baja conductividad térmica, formando un cordón de 250 mm de longitud y alrededor de 1 cm2 de sección.1.6.2.2. Condiciones del ensayoEn el caso de sustancias sensibles a la humedad, hay que efectuar el ensayo lo más rápidamente posible después de retirar la sustancia del recipiente.1.6.2.3. Desarrollo del ensayoColocar el dispositivo en el tiro de una campana de gases.La velocidad del aire debe ser suficiente para evitar que los humos pasen al laboratorio y no debe variar mientras dure el ensayo. Alrededor del dispositivo se pondrá una pantalla.Se utiliza una llama fuerte procedente de un mechero de gas (diámetro mínimo: 5 mm) para encender un extremo de la sustancia. Cuando la mecha ha ardido a lo largo de 80 mm, se procede a medir la velocidad de combustión a lo largo de los siguientes 100 mm. El ensayo se repite seis veces, usando cada vez una placa fría y limpia, salvo que se obtenga antes un resultado positivo.2. RESULTADOSPara proceder a la evaluación es preciso conocer el tiempo de combustión del ensayo exploratorio previo (1.6.1) y el menor tiempo de combustión de un máximo de seis ensayos (1.6.2.3)3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especificación precisa de la sustancia (identificación e impurezas),- descripción de la sustancia de ensayo y su estado físico, incluida la tasa de humedad,- resultados del ensayo exploratorio previo y del ensayo de velocidad de combustión en su caso,- cualquier observación complementaria que pueda ser útil para la interpretación de los resultados.3.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOSLas sustancias pulverulentas, granulosas o pastosas se deberán considerar fácilmente inflamables cuando el tiempo de combustión de cualquier ensayo efectuado según el procedimiento descrito en 1.6.2. sea inferior a 45 segundos. Deberá considerarse que los polvos metálicos o de aleaciones metálicas son fácilmente inflamables cuando puedan encenderse y la llama o la zona de reacción se extienda a toda la muestra en 10 minutos o menos.4. BIBLIOGRAFIA(1) NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.ApéndiceFigura>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Molde y accesorios necesarios para la formación de las mechas todas las dimensiones expresadas en milímetros)A.11. INFLAMABILIDAD (GASES)1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNEl presente método permite determinar si los gases mezclados con el aire a temperatura (alrededor de 20  C) y presión ambiente son inflamables y, en caso positivo, en qué intervalo de concentraciones. Se exponen a una chispa eléctrica mezclas que contengan concentraciones crecientes de gas problema y se observa si se produce la inflamación.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESEl intervalo de inflamabilidad es el intervalo de concentración entre los límites de explosión superior e inferior. Los límites de explosión superior e inferior son los límites de concentración del gas inflamable en mezcla con el aire a los que el fuego no se propaga.1.3. SUSTANCIA DE REFERENCIANo se especifica.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOSe aumenta gradualmente la concentración del gas en el aire y, en cada etapa, se expone la mezcla a una chispa eléctrica.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNo se indican.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. EquipoEl recipiente de ensayo es un cilindro de cristal de un diámetro interior de al menos 50 mm y una altura mínima de 300 mm, que se pone verticalmente. Los electrodos de ignición distan de 3 a 5 mm uno del otro y están situados a 60 mm del fondo del cilindro. El cilindro está equipado con una válvula para reducir la presión. El aparato debe estar protegido por un blindaje para limitar los daños de una posible explosión.La fuente de ignición es una chispa inductiva constante de 0,5 segundos de duración, producida por un transformador de alta tensión con una tensión de salida de 10 a 15 kV (la potencia máxima es de 300 W). En la referencia (2) se describe un ejemplo de equipo adecuado.1.6.2. Condiciones del ensayoEl ensayo debe efectuarse a temperatura ambiente (alrededor de 20  C).1.6.3. Desarrollo del ensayoMediante bombas dosificadoras se llena el cilindro de cristal con una mezcla de aire y gas de concentración conocida. Se hace saltar una chispa en esta mezcla y se observa si se desprende una llama de la fuente de ignición y se propaga independientemente. Se irá aumentando la concentración de gas en un 1 % de volumen cada vez, hasta que se produzca la inflamación descrita anteriormente.Si la estructura química del gas indica que debe ser ininflamable y puede calcularse la composición de la mezcla estequiométrica con el aire, sólo será necesario someter a ensayo, en etapas del 1 %, mezclas que estén en el intervalo entre el 10 % por debajo y el 10 % por arriba de la composición estequiométrica.2. RESULTADOSLa propagación de la llama constituye el único dato válido para la determinación de esta propiedad.3. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especificación precisa de la sustancia (identificación e impurezas),- descripción del aparato utilizado, mencionando las dimensiones,- temperatura en el momento del ensayo,- concentraciones de ensayo, así como los resultados obtenidos,- resultado del ensayo: gas no inflamable o fácilmente inflamable,- si se ha llegado a la conclusión de que el gas no es inflamable, se debe indicar el intervalo de concentraciones que se ha sometido a ensayo en etapas del 1 %,- cualquier información u observación que pueda ser útil para la interpretación de los resultados.4. BIBLIOGRAFÍA(1) NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. Redeker y H. Schacke. «Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen». Chem.-Ing.-Tech., 1984, vol. 56, 126-127.A.12. INFLAMABILIDAD (EN CONTACTO CON EL AGUA)1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNEste método de ensayo puede utilizarse para determinar si la reacción de una sustancia con el agua o el aire húmedo ocasiona el desprendimiento de una cantidad peligrosa de un gas o de varios gases, que puedan ser fácilmente inflamables.Puede aplicarse tanto a sustancias sólidas como líquidas, pero no a las sustancias que se inflaman espontáneamente en conctacto con el aire.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESSustancias fácilmente inflamables: preparados que, en contacto con el agua o el aire húmedo, desprenden una cantidad peligrosa de gases fácilmente inflamables, a una velocidad mínima de 1 l/kg por hora.1.3. PRINCIPIO DEL MÉTODOEl ensayo incluye varias fases sucesivas que se describen a continuación; si la inflamación se produce en cualquiera de estas fases no es necesario proseguir el ensayo. Si se sabe que la sustancia no reacciona violentamente con el agua, se pasa directamente a la fase 4 (1.3.4).1.3.1. Fase 1Se coloca la sustancia problema en una cubeta que contenga agua destilada a 20  C y se observa si el gas desprendido se inflama o no.1.3.2. Fase 2Se coloca la sustancia de ensayo en un papel de filtro que flote sobre un recipiente lleno de agua destilada a 20  C y se observa si el gas que se desprende se inflama o no. El papel de filtro sólo sirve para mantener la sustancia en un lugar, lo cual aumenta las probabilidades de inflamación.1.3.3. Fase 3Se forma con la sustancia de ensayo una pila de 2 cm de altura y 3 cm de diámetro, aproximadamente. Se añaden algunas gotas de agua a la pila y se observa si el gas que se desprende se inflama o no.1.3.4. Fase 4Se mezcla la sustancia de ensayo con agua destilada a 20  C y se mide la velocidad de producción de gas durante 7 horas, a intervalos de una hora. Si al cabo de 7 horas la velocidad de producción es variable o va aumentando, debe prolongarse el tiempo de medida hasta un máximo de 5 días. Si, en un momento dado, la velocidad de producción supera 1 l/kg por hora, el ensayo puede darse por acabado.1.4. SUSTANCIA DE REFERENCIANo se especifica.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNo se indican.1.6. DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS1.6.1. Fase 11.6.1.1. Condiciones del ensayoEl ensayo se realiza a temperatura ambiente (alrededor de 20  C).1.6.1.2. Desarrollo del ensayoSe coloca una pequeña cantidad (aproximadamente unos 2 mm de diámetro) de la sustancia problema en una cubeta con agua destilada. Observar: i) si hay desprendimiento de gas y ii) si el gas se inflama. Si se inflama, se considerará que la sustancia es peligrosa y se dará por finalizado el ensayo.1.6.2. Fase 21.6.2.1. EquipoPapel de filtro flotando sobre una superficie de agua destilada en un recipiente adecuado, como, por ejemplo, una cubeta de evaporación de 100 mm de diámetro.1.6.2.2. Condiciones del ensayoEl ensayo se realiza a temperatura ambiente (alrededor de 20  C).1.6.2.3. Desarrollo del ensayoSe coloca una pequeña cantidad de la sustancia problema (aproximadamente 2 mm de diámetro) sobre el centro del papel de filtro. Observar: i) si hay desprendimiento de gas y ii) si el gas se inflama. Si se inflama, se considerará que la sustancia es peligrosa y se dará por finalizado el ensayo.1.6.3. Fase 31.6.3.1. Condiciones del ensayoEl ensayo se realiza a temperatura ambiente (alrededor de 20  C).1.6.3.2. Desarrollo del ensayoSe forma con la sustancia de ensayo una pila de 2 cm de altura y 3 cm de diámetro, aproximadamente, con un pequeño cráter en la cumbre. Se añaden algunas gotas de agua en el hueco y se observa: i) si hay desprendimiento de gas, ii) si el gas se inflama. Si se inflama, se considerará que la sustancia es peligrosa y se dará por finalizado el ensayo.1.6.4. Fase 41.6.4.1. EquipoEl equipo se monta según se muestra en la figura.1.6.4.2. Condiciones del ensayoHay que asegurarse de que el recipiente que contiene la sustancia problema está libre de partículas pulverulentas (tamaño de partícula PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>EquipoA.13. PROPIEDADES PIROFÓRICAS DE SÓLIDOS Y LÍQUIDOS1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNEl procedimiento del ensayo es aplicable a las sustancias sólidas y líquidas que pueden inflamarse espontáneamente poco tiempo después de haber entrado en contacto con el aire a temperatura ambiente (alrededor de 20  C).Este método de ensayo no puede aplicarse a las sustancias que tienen que exponerse al aire durante varias horas o días a temperatura ambiente o a temperaturas elevadas antes de inflamarse.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESSe considera que una sustancia tiene propiedades pirofóricas si, en las condiciones descritas en 1.6, se inflama o se carboniza.También puede ser necesario estudiar la autoinflamabilidad de líquidos según el método A.15 Temperatura de autoinflamación (líquidos y gases).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANo se especifican.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOSe añade la sustancia, sea sólida o líquida, a un soporte inerte y se pone en contacto con el aire a temperatura ambiente durante un período de cinco minutos. Si las sustancias líquidas no se inflaman, entonces se absorben en papel de filtro y se exponen al aire a temperatura ambiente (alrededor de 20  C) durante cinco minutos. Si un sólido o líquido se inflama, o un líquido inflama o carboniza a un papel de filtro, entonces se considera que la sustancia es pirofórica.1.5. CRITERIOS DE CALIDADRepetibilidad: debido a la importancia en relación con la seguridad, un solo resultado positivo será suficiente para considerar que la sustancia es pirofórica.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO1.6.1. EquipoLlenar una cubeta de porcelana de unos 10 cm de diámetro con una capa de tierra de infusorios, de unos 5 mm de espesor, a temperatura ambiente (alrededor de 20  C).Observaciones:La tierra de infusorios, o cualquier otra sustancia inerte equivalente que se obtenga fácilmente, se tomará como representativa de suelo sobre el que pudiera esparcirse la sustancia en caso de accidente.El papel de filtro seco es necesario para el ensayo de los líquidos que no se inflaman en contacto con el aire cuando están unidos a un soporte inerte.1.6.2. Realización del ensayoa) Sólidos pulverulentosSe vierte 1 o 2 cm3 de la sustancia problema, desde una altura de alrededor de 1 m, sobre una superficie no combustible y se observa si la sustancia se inflama durante la caída o durante los primeros cinco minutos después de depositarse.El ensayo se realiza seis veces, salvo que se produzca ignición.b) LíquidosSe vierten 5 cm3 del líquido problema en la cubeta de porcelana preparada y se observa si la sustancia se inflama en un tiempo de cinco minutos.Si no se observa inflamación durante estos seis ensayos, hay que realizar los siguientes ensayos:Con una jeringuilla se ponen 0,5 ml de la sustancia en un papel de filtro dentado y se observa si se produce inflamación o carbonización del papel de filtro en el plazo de cinco minutos desde la adición del líquido. El ensayo se realiza tres veces, salvo que se produzca inflamación o carbonización.2. RESULTADOS2.1. TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOSEl ensayo puede interrumpirse tan pronto como se obtenga un resultado positivo en cualquiera de las pruebas.2.2. EVALUACIÓNUna sustancia se considera pirofórica si se inflama en el plazo de cinco minutos cuando se añade a un soporte inerte y se expone al aire, o bien cuando la sustancia líquida carboniza o inflama un papel de filtro en el plazo de cinco minutos desde que se pone en contacto con éste y se expone al aire.3. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especificación precisa de la sustancia (identificación e impurezas),- resultado del ensayo,- cualquier observación complementaria que sea útil para la interpretación de los resultados.4. BIBLIOGRAFÍA(1) NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, Naciones Unidas, Nueva York.A.14. PROPIEDADES EXPLOSIVAS1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNSe trata de un método de ensayo que permite determinar si una sustancia sólida o pastosa presenta o no peligro de explosión cuando se expone al efecto de una llama (sensibilidad térmica) o a un choque o fricción (sensibilidad a estímulos mecánicos), y si una sustancia líquida presenta peligro de explosión cuando se expone al efecto de una llama o un choque.El método comprende tres partes:a) un ensayo de sensibilidad térmica (1);b) un ensayo de sensibilidad mecánica respecto al choque (1);c) un ensayo de sensibilidad mecánica respecto a la fricción (1).El método proporciona datos que permiten evaluar la probabilidad de inicio de una explosión por medio de algunos estímulos corrientes. No tiene por objeto determinar si una sustancia puede o no hacer explosión en cualesquiera condiciones.El método sirve para determinar si una sustancia presenta peligro de explosión (sensibilidad térmica y mecánica) en las condiciones específicas definidas por la Directiva. En el ensayo se utiliza un cierto número de equipos ampliamente utilizados internacionalmente (1) y que, por regla general, dan resultados convincentes. Hay que reconocer que el método no es definitivo. Pueden utilizarse equipos distintos a los especificados siempre que estén reconocidos internacionalmente y se pueda establecer una buena correlación entre los resultados obtenidos con el equipo alternativo y los del equipo especificado.No es necesario realizar los ensayos si los datos termodinámicos disponibles (calor de formación, calor de descomposición, etc.) o la ausencia de ciertos grupos reactivos (2) en la fórmula desarrollada permiten establecer de forma razonablemente inequívoca que la sustancia no puede descomponerse rápidamente con formación de gases o liberación de calor (dicho de otro modo, si la materia no presenta ningún riesgo de explosión). No es necesario realizar un ensayo de sensibilidad a la fricción con las sustancias líquidas.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESExplosivos:Sustancias que puedan hacer explosión bajo el efecto de una llama, o que sean sensibles al choque o a la fricción en el equipo especificado (o que sean más sensibles mecánicamente que el 1,3-dinitrobenceno en un equipo alternativo).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA1,3-dinitrobenceno, producto cristalino técnico pasado por tamiz de 0,5 mm, para los métodos de fricción y choque.Perhidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX, hexogen, ciclonita - CAS 121-82-4), recristalizado a partir de ciclohexanona acuosa, tamizado por vía húmeda a través de un tamiz de 250 ìm y retenido en un tamiz de 150 ìm y secado a 103 ± 2  C durante 4 horas para la segunda serie de ensayos de fricción y choque.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOSe debe realizar un ensayo preliminar para determinar las condiciones de seguridad que deben presidir la ejecución de los tres ensayos de sensibilidad.1.4.1. Pruebas de seguridad en la manipulación (3)Por razones de seguridad, antes de pasar a los ensayos principales, se someten muestras muy reducidas (unos 10 mg) de sustancia a un calentamiento sin confinamiento con llama de gas, a choque con cualquier tipo de instrumento adecuado y a fricción utilizando un mazo y un yunque, o cualquier otro tipo de instrumento que sirva para producir fricción. El objetivo es determinar si la sustancia es tan sensible y explosiva que, los ensayos de sensibilidad prescritos, especialmente el de sensibilidad térmica, deban realizarse con precauciones especiales a fin de evitar cualquier daño corporal al operario.1.4.2. Sensibilidad térmicaEste método consiste en calentar la sustancia en un tubo de acero cerrado por placas horadadas con agujeros de diferentes diámetros, para determinar si la sustancia puede hacer explosión en condiciones de calor intenso y un confinamiento determinado.1.4.3. Sensibilidad mecánica (choque)El método consiste en someter la sustancia al choque producido por una masa especificada que se deja caer desde una altura también especificada.1.4.4. Sensibilidad mecánica (fricción)Este método consiste en someter la sustancia sólida o pastosa a una fricción entre superficies tipo, en condiciones específicas de carga y de movimiento relativo.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNo se indican.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. Sensibilidad térmica (efecto de la llama)1.6.1.1. EquipoEl equipo consiste en un tubo de acero no reutilizable con un sistema de cierre reutilizable (figura 1), instalado en un instrumento de calefacción y protección. Cada tubo se obtiene por embutido de una lámina de acero (véase el apéndice) y tiene 24 mm de diámetro interior, 75 mm de longitud y 0,5 mm de espesor de pared. Los tubos tienen un reborde en el extremo abierto para que se puedan cerrar con el dispositivo de la placa horadada. Este dispositivo consiste en una placa horadada resistente a la presión, con un orificio central, unido firmemente al tubo mediante una junta aterrajada en dos partes (tuerca y abrazadera de rosca); esta junta está hecha de acero al cromo-manganeso (véase el apéndice) exento de chispas hasta 800  C. Las placas horadadas tienen 6 mm de espesor, están hechas de acero resistente al calor (véase el apéndice) y pueden escogerse con varios diámetros de abertura.1.6.1.2. Condiciones del ensayoNormalmente se somete a ensayo la sustancia tal como llega al laboratorio, aunque en algunos casos (por ejemplo, si está prensada, fundida o condensada de alguna otra forma) puede ser necesario estudiar la sustancia después de triturarla.Si se trata de un sólido, la masa de material que debe utilizarse en cada ensayo se determina mediante un proceso seco de dos fases. Se llena un tubo tarado con 9 cm3 de sustancia y ésta se apisona aplicando una fuerza de 80 N a toda la sección transversal del tubo. La forma de llenar el tubo puede ser distinta por razones de seguridad o en caso de que la forma física de la muestra pueda cambiar por la compresión; por ejemplo, si la sustancia es muy sensible a la fricción, no puede apisonarse. Si el material es compresible, se añade más cantidad y se vuelve a apisonar hasta que la altura del relleno queda a 55 mm de la boca. Se determina la masa total utilizada para llenar el tubo hasta el nivel de 55 mm y se hacen dos adiciones más, cada una apisonada con una fuerza de 80 N. Entonces, según sea necesario, se añade más material y se apisona o bien se extrae para dejar la altura del relleno a 15 mm de la boca. Se lleva a cabo un segundo proceso seco, empezando con una cantidad igual a un tercio de la masa total utilizada en el primer proceso seco, y se apisona esta cantidad. Se añaden otros dos incrementos de esta cantidad con apisonamiento de 80 N y se ajusta el nivel de la sustancia en el tubo a 15 mm de la boca por adición o extracción de material, según sea necesario. La cantidad de sólido determinada en el segundo proceso seco es la que se utilizará en cada ensayo; el llenado se hace en tres cantidades iguales, comprimida cada una a 9 cm3 mediante la fuerza que sea necesaria. (Puede ser más fácil utilizar anillos separadores.)Los líquidos y geles se cargan en el tubo hasta una altura de 60 mm teniendo especial cuidado con los geles para evitar la formación de vacíos. La abrazadera de rosca se desliza sobre el tubo desde el fondo, se inserta la placa horadada correspondiente y se aprieta la tuerca después de poner un lubricante a base de disulfuro de molibdeno. Es muy importante comprobar que no queda nada de sustancia aprisionada entre el reborde y la placa o en las roscas.La fuente de calor es propano procedente de una botella industrial, provisto de un regulador de presión (60 a 70 mbar), que pasa a través de un contador y mediante un distribuidor se reparte en cuatro mecheros de forma equilibrada (lo que se comprueba por observación visual de las llamas de los mecheros). Los mecheros se colocan alrededor del recinto de ensayo según se indica en la figura 1. Los cuatro mecheros suponen un consumo total de unos 3,2 litros de propano por minuto. Pueden utilizarse otros mecheros y gases combustibles pero la velocidad de calentamiento debe ser la especificada en la figura 3. Independientemente del equipo utilizado, es necesario comprobar periódicamente la velocidad de calentamiento mediante tubos llenos de ftalato de dibutilo, según se indica en la figura 3.1.6.1.3. Desarrollo de los ensayosCada ensayo se realiza hasta que el tubo esté fragmentado o el tubo se haya calentado durante cinco minutos. Si el ensayo produce la fragmentación del tubo en tres o más piezas, que en algunos casos pueden estar unidas entre sí por bandas estrechas de metal, según ilustra la figura 2, entonces se considera que el ensayo produce explosión. Un ensayo en que se produzcan menos fragmentos o no haya fragmentación se considera que no produce explosión.Se hace primero una serie de tres ensayos con una placa de 6,0 mm de diámetro de orificio y, si no se obtienen explosiones, se hace una segunda serie de tres ensayos con una placa de 2,0 mm de diámetro de orificio. Desde el momento en que se produzca una explosión en cualquiera de las dos series de ensayos no es necesario seguir realizando ensayos.1.6.1.4. EvaluaciónEl resultado del ensayo se considera positivo si se produce una explosión en cualquiera de las dos series de ensayos.1.6.2. Sensibilidad mecánica (choque)1.6.2.1. Equipo (figura 4)Las partes fundamentales de un equipo clásico de martinete son un bloque de acero fundido con base, yunque, columna, guías, pesos que caen, mecanismo de liberación y un soporte para las muestras. El yunque de acero (100 mm de diámetro por 70 mm de altura) se atornilla a la parte superior de un bloque de acero (230 mm de longitud por 250 mm de anchura por 200 mm de altura) con una base de fundición (450 mm de longitud por 450 mm de anchura por 60 mm de altura). En un soporte atornillado a la parte posterior del bloque de acero se fija la columna, hecha de tubo de acero estirado sin costuras. El aparato se fija con cuatro tornos a un bloque macizo de hormigón (de 60 × 60 × 60 cm) de forma que los raíles de guía sean absolutamente verticales y el peso caiga en caída libre. Pueden utilizarse pesos de 5 y 10 kg, de acero macizo. La cabeza de choque de cada peso está hecha de acero templado HRC 60 a 63 y tiene un diámetro mínimo de 25 mm.La muestra problema se pone en un dispositivo de choque, formado por dos cilindros coaxiales de acero macizo, uno encima del otro, en un anillo de guía de acero en forma de cilindro hueco. Los cilindros de acero macizo deben tener 10 ( 0,003,  0,005) mm de diámetro y 10 mm de altura, sus superficies deben estar pulidas, los bordes redondeados (0,5 mm de radio de curvatura) y su dureza debe ser de HRC 58 a 65. El cilindro hueco debe tener 16 mm de diámetro exterior, un orificio pulido de 10 (+ 0,005, + 0,010) mm y 13 mm de altura. El dispositivo de choque se monta sobre un yunque intermedio (26 mm de diámetro y 26 mm de altura) hecho de acero y centrado por un anillo con perforaciones que dejen escapar los humos.1.6.2.2. Condiciones de ensayoEl volumen de muestra debe ser de 40 mm3, o bien un volumen adecuado para otro tipo de aparato alternativo. Las sustancias sólidas deben someterse a ensayo en estado seco y prepararse de la forma siguiente:a) las sustancias en polvo se pasan por tamiz de 0,5 mm; para las pruebas se usa la fracción que haya atravesado el tamiz;b) las sustancias prensadas, fundidas o condensadas de alguna otra forma se trituran en fragmentos pequeños y se tamizan; la fracción de diámetro comprendido entre 0,5 y 1 mm es la que se utiliza para los ensayos y debe ser representativa de la sustancia original.Las sustancias normalmente suministradas como pastas se someterán a ensayos en el estado más seco posible o en algún caso, suprimiendo al máxima posible la cantidad de diluyente. Las sustancias líquidas se estudiarán dejando una separación de 1 mm entre el cilindro de acero superior y el inferior.1.6.2.3. Desarrollo de los ensayosSe ejecuta una serie de seis ensayos dejando caer la masa de 10 kg desde la altura de 0,40 m (40 J). Si se obtiene alguna explosión en esta serie de 40 J, hay que realizar otra serie de 6 ensayos, dejando caer la masa de 5 kg desde la altura de 0,15 m (7,5 J). En otros equipos, se compara la muestra con la sustancia de referencia elegida según un procedimiento establecido (por ejemplo, técnica de subida y bajada, etc).1.6.2.4. EvaluaciónEl resultado del ensayo se considera positivo si se produce una explosión (una inflamación y/o una detonación es equivalente a una explosión) al menos una vez en cualquiera de los ensayos con el equipo de choque especificado o si la muestra es más sensible que el 1,3-dinitrobenceno o el RDX en un ensayo de choque alternativo.1.6.3. Sensibilidad mecánica (fricción)1.6.3.1. Equipo (figura 5)El equipo para el ensayo de fricción consiste en una base de acero fundido sobre la que se monta el dispositivo de fricción. Este consiste en una espiga fija de porcelana y un plato de porcelana móvil. El plato de porcelana se fija a una corredera que se desplaza sobre dos rieles. La corredera se conecta a un motor eléctrico por medio de una barra de conexión, una leva y un engranaje de transmisión adecuado, de forma que el plato de porcelana se desplace una sola vez hacia atrás y hacia adelante por debajo de la espiga de porcelana a lo largo de 10 mm. La espiga de porcelana puede cargarse, por ejemplo, con 120 o 360 N.Los platos planos de porcelana están hechos de porcelana técnica blanca (rugosidad entre 9 y 32 ìm) y sus dimensiones son 25 mm de longitud, 25 mm de anchura y 5 mm de altura. La espiga cilíndrica de porcelana también es de porcelana técnica blanca, mide 15 mm de longitud y 10 mm de diámetro y sus superficies extremas son esféricas y rugosas, con un radio de curvatura de 10 mm.1.6.3.2. Condiciones de los ensayosEl volumen de la muestra debe ser de 10 mm3, o bien un volumen adecuado para otro tipo de aparato alternativo.Las sustancias sólidas se someten a ensayo en estado seco y se preparan de la forma siguiente:a) las sustancias en polvo se pasan por tamiz de 0,5 mm; para las pruebas se utiliza toda la fracción que haya atravesado el tamiz;b) las sustancias prensadas, fundidas o condensadas de alguna otra forma se trituran en fragmentos pequeños y se tamizan; para los ensayos se utiliza la fracción de diámetro inferior a 0,5 mm.Las sustancias normalmente suministradas como pastas se someterán a ensayos en el estado más seco posible. Si la sustancia no puede ser preparada en estado seco, la pasta (suprimiendo al máximo posible la cantidad de diluyente) es sometida a ensayo en forma de pélicula de 0,5 mm de espesor, 2 mm de anchura y 10 mm de longitud, preparada con una plantilla.1.6.3.3. Desarrollo de los ensayosSe pone sobre la muestra la espiga de porcelana y se aplica la carga. Al realizar el ensayo, las marcas esponjosas del plato de porcelana deben ser transversales a la dirección del movimiento. Hay que vigilar para que la espiga se apoye en la muestra, que haya bastante sustancia problema bajo la espiga y que el plato se mueva correctamente bajo la espiga. En el caso de sustancias pastosas, para aplicar la sustancia al plato se utiliza un dosificador de 0,5 mm de espesor con una ranura de 2 × 10 mm. El plato de porcelana tiene que desplazarse 10 mm hacia adelante y hacia atrás bajo la espiga en el plazo de 0,44 segundos. Cada parte de la superficie del plato y de la espiga debe utilizarse sólo una vez; los dos extremos de cada espiga sirven para dos ensayos y cada una de las dos superficies de un plato sirve para tres ensayos.Se ejecuta una serie de seis pruebas con una carga de 360 N. Si se obtiene algún resultado positivo durante estas seis pruebas, hay que realizar otra serie de seis pruebas con una carga de 120 N. En otros equipos, se compara la muestra con la sustancia de referencia elegida mediante un procedimiento establecido (por ejemplo, técnica de subida y bajada, etc.)1.6.3.4. EvaluaciónEl resultado del ensayo se considera positivo si se produce una explosión (una crepitación y/o una detonación o una inflamación equivale a una explosión) al menos una vez en cualquiera de las pruebas con el equipo especificado de fricción o si se satisfacen los criterios equivalentes de otro ensayo alternativo de fricción.2. RESULTADOSEn principio, se considera que una sustancia presenta peligro de explosión en el sentido de la Directiva si se obtiene un resultado positivo en el ensayo de sensibilidad térmica, al choque o a la fricción.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- identidad, composición, pureza, grado higrométrico, etc., de la sustancia que se somete a ensayo,- forma física de la muestra y si se ha triturado, fragmentado o tamizado,- observaciones durante los ensayos de sensibilidad térmica (por ejemlo, masa de la muestra, número de fragmentos, etc.),- observaciones durante los ensayos de sensibilidad mecánica (por ejemplo, formación de cantidades considerables de humo o descomposición completa sin detonación, llamas, chispas, crepitación, etc.),- resultado de cada tipo de ensayo,- si se ha utilizado otro aparato alternativo, hay que indicar la justificación científica de dicha utilización, así como las pruebas de correlación entre los resultados obtenidos con el aparato especificado y los obtenidos con aparatos equivalentes,- cualquier observación que se considere útil, por ejemplo, referencia a ensayos realizados con productos similares, que puedan ser importantes para la interpretación correcta de los resultados,- cualquier otra observación importante para la interpretación de los resultados.3.2. INTERPRETACIÓN Y EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOSEl informe debe indicar los resultados que se consideren erróneos, anormales o no representativos. Cuando se rechace un resultado, se facilitará una explicación y se indicarán los resultados del ensayo sustitutivo o complementario. Si un resultado anormal no pudiera explicarse, se deberá aceptar el valor obtenido y se utilizará para clasificar la sustancia en consecuencia.4. BIBLIOGRAFÍA(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, Naciones Unidas, Nueva York.(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, Londres, ISBN 0-750-60103-5, 1990.(3) Koenen, H., Ide, K.H. y Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 y 30-42.(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of explosion risk.ApéndiceEjemplo de especificación de material para el ensayo de sensibilidad térmica (véase DIN 1623)(1) Tubo: especificación de material n  1.0336.505 g(2) Placa horadada: especificación de material n  1.4873(3) Tuerca y abrazadera de rosca: especificación de material n  1.3817Figura 1>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Figura 2>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Ensayo de sensibilidad térmicaEjemplos de fragmentaciónFigura 3>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Calibración de la velocidad de calentamiento en el ensayo de sensibilidad térmicaCurva temperatura/tiempo obtenida al calentar ftalato de dibutilo (27 cm3) en un tubo cerrado (placa con orificio de 1,5 mm) utilizando un caudal de propano de 3,2 l/min. La temperatura se mide con un termopar de 1 mm de diámetro de alumel/cromel revestido de acero inoxidable, situado en el centro a 43 mm por debajo del borde del tubo. La velocidad de calentamiento entre 135  C y 285  C debe estar entre 185 y 215 K/min.Figura 4>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Equipo del ensayo de choque (dimensiones en milímetros)Fig. 4a Martinete, vista generalFig.4b Martinete, parte frontal y lateralinferior>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Figura 4>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>ContinuaciónFig. 4c Dispositivo de choque paraFig. 4d Dispositivo de choque para sustancias líquidas sustancias en polvo o pastosas>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>(1) espiga de suspensión(2) marcador de altura(3) ranura de colocación(4) cabeza cilíndrica de choque(5) pestillo contra el reboteFigura 5>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Equipo de sensibilidad a la fricciónFig. 5a Equipo de fricción:Fig. 5b Posición inicial de la vista de frente y plantaespiga sobre la muestra>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>A.15. TEMPERATURA DE AUTOINFLAMACIÓN (LÍQUIDOS Y GASES)1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNNo deben someterse a este ensayo las sustancias explosivas ni las que empiecen a arder espontáneamente en contacto con el aire a temperatura ambiente. El procedimiento de ensayo es aplicable a gases, líquidos y vapores que, en presencia de aire, puedan inflamarse por el contacto con una superficie caliente.La temperatura de autoinflamación puede reducirse considerablemente por la presencia de impurezas catalíticas, por el material de la superficie o por un mayor volumen del recipiente de ensayo.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESEl grado de autoinflamabilidad se expresa en términos de temperatura de autoinflamación. La temperatura de autoinflamación es la temperatura más baja a la que se inflama la sustancia problema, en presencia del aire y en las condiciones definidas por el método de ensayo.1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIALas sustancias de referencia se citan en las normas (véase el punto 1.6.3.). Sirven fundamentalmente para comprobar las características del método de vez en cuando y para poder comparar con los resultados obtenidos según otros métodos.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOEl método determina la temperatura mínima de la superficie interna de un recinto que provoca la inflamación de un gas, vapor o líquido inyectado en el recinto.1.5. CRITERIOS DE CALIDADLa repetibilidad varía según el intervalo de temperatura de autoinflamación y el método de ensayo utilizado.La sensibilidad y la especificidad dependen del método de ensayo utilizado.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. EquipoEl equipo se describe en el método que se indica en el punto 1.6.3.1.6.2. Condiciones del ensayoSe somete a ensayo una muestra de la sustancia problema según el método indicado en el punto 1.6.3. Desarrollo del ensayoVéanse las normas CEI-79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056 y NF T 20-037.2. RESULTADOSRegistrar la temperatura de ensayo, la presión atmosférica, la cantidad de muestra utilizada y el intervalo de tiempo que transcurre hasta que se produce la inflamación.3. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especificación precisa de la sustancia (identificación e impurezas),- cantidad de muestra utilizada, presión atmosférica,- equipo utilizado,- resultados de las medidas (temperaturas de ensayo, resultados relativos a la inflamación, intervalos de tiempo correspondientes),- cualquier observación complementaria que pueda ser útil para la interpretación de los resultados.4. BIBLIOGRAFÍANinguna.A.16. TEMPERATURA RELATIVA DE AUTOINFLAMACIÓN DE SÓLIDOS1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNLas sustancias explosivas y las sustancias que se inflaman espontáneamente en contacto con el aire a temperatura ambiente no deben someterse a este ensayo.El objetivo del ensayo es proporcionar datos preliminares sobre la autoinflamabilidad de las sustancias sólidas a altas temperaturas.Si el calor producido, bien por reacción de la sustancia con el oxígeno o bien por descomposición exotérmica, no se disipa con la suficiente rapidez en el ambiente, el autocalentamiento ocasiona la autoinflamación. La autoinflamación se produce, en consecuencia, cuando la velocidad de producción de calor sobrepasa la velocidad de disipación.El procedimiento es útil como ensayo de selección preliminar para las sustancias sólidas. Teniendo en cuenta la naturaleza compleja de la inflamación y de la combustión de los sólidos, la temperatura de autoinflamación determinada según este método sólo debe servir para hacer comparaciones.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESLa temperatura de autoinflamación, tal como se determina por este método, es la temperatura ambiente mínima, expresada en grados centígrados ( C), a la que se inflama cierto volumen de una sustancia en condiciones definidas.1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOSe coloca un volumen definido de la sustancia problema en un horno a temperatura ambiente; se registra la curva de temperatura en el centro de la muestra frente al tiempo, elevando la temperatura del horno hasta 400  C o hasta el punto de fusión, si éste es menor, a razón de 0,5  C por minuto. La temperatura del horno a la que la temperatura de la muestra alcanza los 400  C por autocalentamiento es la que, a fines del presente ensayo, se denomina temperatura de autoinflamación.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. Equipo1.6.1.1. HornoHorno de laboratorio con temperatura programable (volumen: unos 2 litros) equipado con circulación natural de aire y una válvula de explosión. Se debe evitar que los gases de descomposición entren en contacto con las resistencias eléctricas para evitar cualquier peligro de explosión.1.6.1.2. Cubo de tela de alambreSiguiendo el modelo de la figura 1, se corta un pedazo de tela metálica de acero inoxidable con abertura de 0,045 mm. Se dobla la tela metálica y se sujeta con alambre para formar un cubo abierto por la parte superior.1.6.1.3. TermoparesTermopares apropiados.1.6.1.4. RegistroCualquier registro de dos canales, calibrado en el intervalo de 0 a 600  C o a una tensión correspondiente.1.6.2. Condiciones del ensayoEl ensayo se efectúa con las sustancias tal y como se reciben.1.6.3. Desarrollo del ensayoSe llena el cubo con la sustancia problema, se comprime con cuidado y se añade más sustancia hasta llenar por completo el cubo. Se suspende éste en el centro del horno a temperatura ambiente. Se coloca un termopar en el centro del cubo y otro entre el cubo y la pared del horno para registrar la temperatura de este último.Las temperaturas del horno y de la muestra se registran continuamente elevando la temperatura del horno hasta los 400  C o hasta el punto de fusión del sólido, si este valor es menor, a razón de 0,5  C por minuto.Cuando la sustancia se inflame, el termopar colocado en la muestra indicará una subida muy fuerte de la temperatura por encima de la temperatura del horno.2. RESULTADOSLa temperatura del horno a la que la temperatura de la muestra alcanza los 400  C por autocalentamiento es significativa para la evaluación (véase la figura 2).3. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- descripción de la sustancia problema,- resultados de las medidas, incluida la curva de temperatura-tiempo,- todas las observaciones complementarias que sean útiles para la interpretación de los resultados.4. BIBLIOGRAFÍA(1) NF T 20-036 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperatura of the spontaneous flammability of solids.Figura 1>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Modelo de cubo de ensayo de 20 mmFigura 2>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Curva tipo temperatura/tiempoA.17. PROPIEDADES COMBURANTES (SÓLIDOS)1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNEs conveniente disponer de información previa sobre las posibles propiedades explosivas de la sustancia antes de proceder al ensayo.Este ensayo no es aplicable a líquidos, gases, sustancias explosivas o fácilmente inflamables ni a los peróxidos orgánicos.Este ensayo es innecesario cuando el examen de la estructura química ponga de manifiesto que la sustancia no puede dar reacción exotérmica con un combustible.Para saber si en este ensayo hay que tomar precauciones especiales, debe efectuarse una prueba preliminar.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESTiempo de combustión: tiempo de reacción, expresado en segundos, necesario para que la zona de reacción se propague a través de la pila, según el procedimiento descrito en el punto 1.6.Velocidad de combustión: expresada en milímetros por segundo.Velocidad máxima de combustión: el valor más elevado entre las velocidades de combustión obtenidas con mezclas que contengan desde un 10 a un 90 % en peso de oxidante.1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIAComo sustancia de referencia se utiliza nitrato de bario (de grado analítico) tanto para el ensayo como para el ensayo preliminar.La mezcla de referencia es la mezcla compuesta por nitrato de bario y celulosa en polvo, preparada según lo indicado en el punto 1.6, que tiene la velocidad máxima de combustión (se trata, generalmente, de una muestra con un 60 % en peso de nitrato de bario).1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOPor razones de seguridad se procede a un ensayo preliminar. Este ensayo será, por sí solo, suficiente si durante el mismo se observa claramente que la sustancia problema tiene propiedades comburantes. En caso contrario, la sustancia deberá someterse al ensayo completo.Para efectuar este ensayo completo se mezclan en proporciones variables la sustancia problema y un combustible definido. Con cada una de las mezclas se forma una pila y ésta se enciende por un extremo. La velocidad máxima de combustión observada se compara con la velocidad máxima de combustión de la mezcla de referencia.1.5. CRITERIOS DE CALIDADCualquier método de trituración y de mezcla que deba emplearse será válido siempre que la diferencia entre la velocidad máxima de combustión en los seis ensayos y la media aritmética no sobrepase el 10 %.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. Preparación1.6.1.1. Sustancia problemaCon el fin de obtener una granulometría inferior a 0,125 mm, se somete la muestra al siguiente procedimiento: se tamiza, se tritura la parte que quede y se tamiza de nuevo, repitiendo la operación hasta que toda la muestra haya pasado por el tamiz.Para triturar y tamizar puede utilizarse cualquier método, siempre que se cumplan los criterios de calidad requeridos.Antes de hacer la mezcla se desecará la muestra a 105  C hasta obtener peso constante. Si la temperatura de descomposición de la sustancia es inferior a 105  C, se secará a una temperatura inferior adecuada.1.6.1.2. CombustibleEl combustible es celulosa en polvo, del tipo utilizado en cromatografía en capa fina y en columna. Se considera adecuada una celulosa en la que la longitud de más del 85 % de las fibras esté comprendida entre 0,020 y 0,075 mm. El polvo de celulosa se tamiza con una malla de 0,125 mm. Hay que usar el mismo lote de celulosa en todo el ensayo.Antes de preparar la mezcla, hay que secar la celulosa a 105  C hasta obtener el peso constante.Si en el ensayo preliminar se utiliza serrín, se elegirá un serrín de madera blanda, que se pasará por un tamiz de 1,6 mm de malla, se mezclará bien y se secará a 105  C durante cuatro horas en capas de no más de 25 mm de espesor. Una vez enfriado, se debe guardar en un envase hermético, llenándolo lo más posible. Es preferible utilizar el serrín dentro de las 24 horas siguientes al secado.1.6.1.3. Fuente de igniciónDebe utilizarse la llama fuerte de un mechero de gas (diámetro mínimo: 5 mm). Si se utiliza otra fuente de ignición (p. ej., si se hace el ensayo en atmósfera inerte) hay que dar su descripción y justificación.1.6.2. Desarrollo del ensayoNota:Las mezclas de comburante con celulosa o serrín deben considerarse potencialmente explosivas y tratarse con las debidas precauciones.1.6.2.1. Ensayo preliminarLa sustancia secada se mezcla bien con celulosa o serrín seco, en una proporción en peso de 2 partes de sustancia problema por 1 parte de celulosa o serrín. Con la mezcla se forma una pila cónica de 3,5 cm de diámetro de base y 2,5 cm de altura, llenando sin comprimir un molde cónico (por ejemplo, un embudo de laboratorio de cristal con el vástago tapado).La pila se coloca sobre una superficie fría, incombustible, no porosa y de baja conductividad térmica. El ensayo debe realizarse bajo una campana extractora (véase el punto 1.6.2.2.).La fuente de ignición se pone en contacto con el cono. Se observan y se anotan la intensidad y la duración de la reacción resultante.Si la reacción es intensa, se considerará que la sustancia es comburante.Cuando existan dudas respecto al resultado, será necesario efectuar el ensayo completo que se describe a continuación.1.6.2.2. Ensayo completoSe preparan mezclas de comburante y de celulosa que contengan de un 10 a un 90 % en peso de comburante, en incrementos del 10 %. Para los casos límite, hay que utilizar mezclas intermedias de comburante y celulosa para determinar la velocidad máxima de combustión con más precisión.Se forma la pila con ayuda de un molde metálico de sección triangular de 250 mm de longitud, 10 mm de altura interior y 20 mm de anchura interior. A ambos lados de este molde se colocan en sentido longitudinal dos placas metálicas puestas como topes laterales que sobrepasen en 2 mm el borde superior de la sección triangular (figura). Este montaje se llena, sin apretar, con un ligero exceso de mezcla. Después de haber dejado caer una vez el molde desde una altura de 2 cm sobre una superficie dura, se elimina la materia sobrante por medio de una lámina sostenida oblicuamente. Se quitan entonces los topes laterales y se aplana la superficie del polvo con ayuda de un rodillo. Se pone entonces sobre el molde una placa incombustible, no porosa y de baja conductividad térmica, se da la vuelta al conjunto y se quita el molde.Se pone la pila en el tiro de una campana de gases.Durante el ensayo, la velocidad de aspiración debe ser constante y suficiente para evitar que los humos se expandan por el laboratorio. Alrededor del aparato se coloca un cortaviento.Dadas las propiedades higroscópicas de la celulosa y de algunas sustancias problema, el ensayo debe efectuarse lo más rápidamente posible.Se enciende un extremo de la pila aplicándole la llama.Se mide el tiempo de reacción sobre 200 mm después de que la zona de reacción haya recorrido una distancia inicial de 30 mm.El ensayo se realiza con la sustancia de referencia y, por lo menos una vez, con cada una de las mezclas de sustancia problema con celulosa.Si se observa una velocidad máxima de combustión significativamente mayor que la de la mezcla de referencia, puede detenerse el ensayo; si no es así, se repetirá de nuevo cinco veces con cada una de las tres mezclas que hayan dado las velocidades de combustión más elevadas.Si se sospecha que el resultado es un falso positivo, hay que repetir el ensayo con una sustancia inerte que presente un tamaño de partícula similar, como el kieselguhr, en lugar de la celulosa. Otra posibilidad es someter a ensayo en atmósfera inerte (PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Molde y accesorios necesarios para formar las pilas(todas las dimensiones expresadas en milímetros)PARTE B: MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD INTRODUCCIÓN GENERAL: PARTE BA. INTRODUCCIÓNVéase la introducción general.B. DEFINICIONES(i) La toxicidad aguda incluye los efectos desfavorables que se manifiestan durante un período dado (habitualmente 14 días) después de la administración de una dosis única de una sustancia.(ii) La DL50 (dosis letal media) es la dosis única que, estadísticamente, es la causa de la muerte del 50% de los animales a los que se les ha administrado la sustancia. El valor de la DL50 se expresa en peso de sustancia de ensayo por unidad de peso de los animales sometidos al experimento (miligramos por kilo).(iii) La CL50 (concentración letal media) es la concentración de una sustancia que, estadísticamente, es la causa -durante una exposición o, después de ésta, en un plazo definido - de la muerte del 50% de los animales expuestos a la misma durante un período determinado. El valor de la CL50 se expresa en peso de sustancia de ensayo por unidad de volumen de aire (miligramos por litro).(iv) El nivel sin efectos tóxicos es la dosis o el nivel de exposición máximos utilizados en un ensayo que no produce signos detectables de toxicidad.(v) La toxicidad subaguda/subcrónica incluye los efectos desfavorables que aparecen en los animales de laboratorio cuando reciben dosis diarias de una sustancia o cuando están expuestos diariamente a la misma durante un período de tiempo breve, en comparación con sus expectativas de vida.(vi) La dosis máxima tolerada (DMT) es el nivel más alto de dosis que produce signos de toxicidad en animales sin alterar de forma importante la supervivencia en relación con la prueba en la que se usa.(vii) La irritación cutánea es la producción de modificaciones cutáneas reversibles de naturaleza inflamatoria que aparecen después de la aplicación de una sustancia.(viii) La irritación ocular es la producción de modificaciones oculares reversibles que aparecen después de la aplicación de la sustancia sobre la superficie anterior del ojo.(ix) La sensibilización de la piel (dermatitis alérgica de contacto) es una reacción cutánea, de origen inmunológico, a una sustancia.Definiciones específicas de la toxicidad por inhalación- un aerosol se define como partículas (sólidas o líquidas) dispersas de forma homogénea en el aire- el diámetro aerodinámico es el diámetro de una esfera de densidad uno (1 g cm 3) que tenga la misma velocidad de sedimentación que la partícula en cuestión- el diámetro aerodinámico de la mediana de la masa (DAMM) es el diámetro aerodinámico calculado que divide por dos la distribución en tamaño del aerosol al medirlo en masa- la desviación geométrica típica (DGT) es el cociente entre el percentil 84 estimado y el percentil 50 estimado e indica la pendiente de la curva acumulativa de distribución del tamaño de las partículas, suponiendo que la distribución en tamaño es logarítmica normal.Definiciones específicas para el procedimiento de la dosis fija en la determinación de toxicidad oral aguda- La toxicidad manifiesta se refiere a los efectos tóxicos observados tras la administración de la sustancia que se estudie, que tienen una intensidad tal que el nivel de dosis inmediatamente superior podría provocar la muerte.- La dosis discriminante es el nivel de dosis más elevado de los cuatro establecidos que se puede administrar sin que se produzca la muerte (incluyendo el sacrificio por motivos humanitarios).C. MUTAGENICIDAD (incluidos los ensayos preexploratorios de carcinogenicidad)Para la evaluación preliminar del potencial mutagénico de una sustancia es preciso disponer de información suficiente sobre dos efectos finales, a saber, la mutación génica y las aberraciones cromosómicas.Estos dos tipos de efectos finales se evalúan por medio de los siguientes ensayos:(i) ensayos basados en la aparición de mutaciones génicas (puntuales) en células procariotas tales como Salmonella typhimurium; se puede utilizar también Escherichia coli. La elección entre estos dos organismos puede venir determinada por la sustancia de ensayo;(ii) ensayos basados en la producción de aberraciones cromosómicas en células de mamíferos cultivadas in vitro; también se puede operar in vivo (ensayo de micronúcleos o análisis de las células de la médula ósea en el estadio de la metafase). Sin embargo, en ausencia de alguna contraindicación los ensayos in vitro son mayormente preferidos.D. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓNExisten límites para la extrapolación directa al hombre de los resultados obtenidos mediante la experimentación animal e in vitro; hay que tenerlo en cuenta al evaluar e interpretar los ensayos de toxicidad.Si se dispone de ello, la evidencia de efectos adversos en los seres humanos pueden ser importantes a la hora de determinar los efectos potenciales de las sustancias químicas en la población humana.E. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICASLa toxicología es una ciencia experimental en pleno progreso y existe bibliografía abundante sobre cada tema. En las líneas directrices de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE) se puede encontrar información.Observaciones complementariasCuidado de los animalesAl proceder a experimentaciones toxicológicas, es esencial controlar rigurosamente las condiciones ambientales y utilizar técnicas de cuidados apropiadas para los animales.(i) condiciones de alojamientoLas condiciones ambientales de los locales o recintos donde se lleva a cabo la experimentación deben ser adecuadas para la especie que se utilice. Para ratas, ratones y cobayas, la temperatura del local debe ser de 22 ± 3  C y la humedad relativa de 30 a 70%; para los conejos, la temperatura debe ser de 20 ± 3  C y la humedad relativa de 30 a 70%.Algunas técnicas experimentales son particularmente sensibles a los efectos de la temperatura; en tales casos, en la descripción del método se incluyen indicaciones detalladas sobre las condiciones idóneas. En todas las investigaciones sobre efectos tóxicos deben vigilarse y registrarse la temperatura y la humedad y consignar las medidas en el informe final del estudio.Cuando se utilice alumbrado artificial, habrá que alternar, normalmente, 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los datos relativos al programa de alumbrado deberán registrarse y consignarse en el informe final del estudio.En los informes sobre las experiencias con animales es importante indicar el tipo de jaula utilizada así como el número de animales alojados en cada una, tanto durante la exposición a las sustancias químicas como durante el período de observación posterior.(ii) AlimentaciónEl alimento debe responder a todas las exigencias nutricionales de la especie sometida a experimentación. Cuando se incorporan sustancias de ensayo al alimento de los animales, puede reducirse el valor nutritivo del alimento si se da una interacción entre la sustancia y los componentes de la comida.Al interpretar los resultados del ensayo debe considerarse la posibilidad de una interacción de este tipo.Las impurezas contenidas en la dieta alimenticia cuya influencia en la toxicidad esté probada, no deberán estar presentes en concentraciones que puedan interferir en el ensayo.Bienestar de los animalesSe prestará la debida consideración al bienestar de los animales cuando se elaboren los métodos de ensayo. A continuación se dan algunos ejemplos brevemente, sin que la lista sea exhaustiva. Los términos exactos o las condiciones precisas se encontrarán en el texto de los métodos:- Se introduce un método alternativo para la determinación de la toxicidad oral aguda, el «Procedimiento de Dosis Fija». En él no se utiliza la muerte como punto final específico. Se utilizan menos animales y se produce menos dolor y sufrimiento que en el caso de la determinación clásica de la toxicidad oral aguda.- Se reduce el número de animales utilizados al mínimo cientifícamente aceptable: solamente se someten a ensayo 5 animales del mismo sexo por nivel de dosis en los métodos B.1 y B.3. Se utilizan solamente 10 animales (y solamente 5 para el grupo de control negativo) para la determinación de la sensibilización de la piel en el ensayo de maximización del conejillo de indias (método B.6). Se reduce también el número de animales que se necesitan para el control positivo cuando se estudia la mutagenicidad in vivo (métodos B.11 y B.12).- Se reducen al mínimo el dolor y el sufrimiento de los animales durante los ensayos: puede ser preciso sacrificar a los animales que muestren signos intensos y continuados de dolor y sufrimiento; no será preciso realizar la dosificación de sustancias de manera que provoque intenso dolor y sufrimiento debido a las propiedades corrosivas o irritantes (métodos B.1, B.2 y B.3.).- Se evita la realización de ensayos con dosis innecesariamente altas mediante la introducción de ensayos límite, no solamente en los ensayos de toxicidad aguda (métodos B.1, B.2 y B.3) sino también en los ensayos in vivo sobre mutagenesis (métodos B.11 y B.12).- Una estrategia para examinar la irritación permite ahora no realizar un ensayo, o reducirlo a un estudio sobre un solo animal si se pueden proporcionar las suficientes evidencias cientifícas.Dicha evidencia científica se puede basar en las propiedades físico-químicas de la sustancia, en los resultados de otros ensayos ya realizados o en los resultados de ensayos in vitro bien convalidados. Por ejemplo, si se ha llevado a cabo un estudio de toxicidad aguda con la sustancia por vía dérmica (método B. 3) a la dosis de ensayo límite sin que se haya observado irritación de la piel, pueden ser innecesarios ensayos ulteriores de irritación dérmica (método B.4); sustancias que hayan mostrado capacidad de corrosión evidente o grave irritación de la piel en un estudio de irritación dérmica (método B.4) no deben probarse posteriormente en cuanto a su capacidad de irritación ocular (método B.5).B.1. TOXICIDAD AGUDA POR VÍA ORAL 1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIONESVéase la introducción general de la parte B (punto B).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOSe administran oralmente, mediante alimentación forzada, dosis crecientes de la sustancia de ensayo a varios lotes de animales de laboratorio, utilizándose una sola dosis por lote. Las dosis deben seleccionarse a partir de los resultados de una prueba de determinación del intervalo. Se observan a continuación los efectos y la mortalidad debidos a la sustancia. Se realiza la autopsia a los animales que mueren durante la prueba así como a los que sobreviven al final del experimento. Este método está esencialmente destinado a los estudios con roedores.Los animales que muestren signos de dolor y angustia graves y duraderos deberá sacrificarse de forma humanitaria. No se administrarán sustancias de forma que produzcan dolor y angustia graves debido a sus propiedades corrosivas o irritantes.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO1.6.1. PreparacionesSe mantiene a los animales en las condiciones de alojamiento y alimentación adecuadas para el experimento por lo menos durante los 5 días anteriores al mismo. Antes de comenzar el ensayo, se eligen al azar animales adultos jóvenes y sanos y se reparten entre los diferentes lotes del experimento. Si es necesario, la sustancia de ensayo se disuelve o se pone en suspensión en un vehículo adecuado. Se recomienda utilizar una solución acuosa siempre que sea posible; si no, se puede utilizar una solución en aceite vegetal y, eventualmente, una solución en otros vehículos o una suspensión. En lo que se refiere a los vehículos no acuosos, debe conocerse o determinarse su toxicidad antes o durante el ensayo. Normalmente, en lo que se refiere a los roedores, el volumen no debe sobrepasar los 10 ml/kg de peso corporal, salvo que sean soluciones acuosas, de las que se pueden utilizar hasta 20 ml/kg. La variabilidad del volumen de ensayo debe minimizarse ajustando la concentración, de forma que se garantice un volumen constante para todas las dosis estudiadas.1.6.2. Condiciones experimentales1.6.2.1. Animales de laboratorioLa especie preferida es la rata, salvo indicación contraria.Es preciso utilizar cepas de laboratorio corrientes. Para cada sexo, al comienzo del ensayo, la diferencia de peso entre los animales utilizados no debe exceder de ± 20% del valor medio apropiado.1.6.2.2. Número y sexoPara cada dosis se utilizarán al menos 5 roedores. Todos serán del mismo sexo. Si se utilizan hembras, deberán ser nulíparas y no grávidas. Cuando se disponga de información que demuestre que uno de los sexos es mucho más sensible, se usarán animales de ese sexo para el ensayo.Nota: Se tomará en consideración utilizar un número menor de animales en los ensayos de toxicidad aguda, si se trata de animales de un orden superior al de los roedores.Se seleccionarán cuidadosamente las dosis y se hará todo lo posible para no sobrepasar dosis moderadamente tóxicas. Se evitará en estos ensayos la administración de dosis letales de la sustancia.1.6.2.3. DosisLas dosis deben ser en número suficiente, al menos tres, y espaciadas adecuadamente para producir lotes que presenten variedad de efectos tóxicos y de tasas de mortalidad. Los resultados deben ser suficientes para que se pueda trazar una curva dosis/respuesta y, si fuera posible, permitir una determinación válida de la DL50.1.6.2.4. Pruebas límiteCuando se usen roedores, se realizará una prueba límite, con dosificación única de al menos 2 000 mg/kg de peso corporal, en un grupo de 5 machos y 5 hembras, utilizando los procedimientos descritos anteriormente. Si hay mortalidad debida a la sustancia, habrá que considerar la realización de un estudio completo.1.6.2.5. Período de observaciónEl período de observación debe ser por lo menos de 14 días. No obstante, su extensión no debe fijarse de forma rígida, sino que debe determinarse en función de las reacciones de toxicidad, de su velocidad de aparición y de la duración del período de recuperación; por lo tanto, en caso de necesidad puede prolongarse. Es importante el momento en el que aparecen y en el que desaparecen los síntomas de toxicidad, así como el momento de la muerte, sobre todo si en la sustancia se observa una tendencia a causar una muerte retardada.1.6.3. ProcedimientoLos animales deben estar en ayunas antes de que se les administre la sustancia. En el caso de la rata, se le debe retirar el alimento desde la víspera de la administración de la sustancia; para los animales que tienen un metabolismo más rápido es conveniente acortar el período de ayuno; el agua no será racionada. Al día siguiente, se deben pesar los animales antes de la administración de la sustancia de ensayo mediante ingestión forzada de una dosis única. Si no es posible administrar la sustancia en una dosis única, se administrará en fracciones más pequeñas durante un período no superior a 24 horas. Después de administrarles la sustancia, se puede todavía dejar sin alimento a los animales durante 3 o 4 horas. Si la dosis se administra en fracciones repartidas a lo largo de cierto lapso de tiempo, puede resultar necesario dar alimento y agua a los animales en función de la duración del tratamiento.Una vez se haya administrado la sustancia, las observaciones se efectuarán y registrarán de forma sistemática, abriendo una ficha individual para cada animal. El primer día, las observaciones deben efectuarse con frecuencia.Deberá hacerse un examen clínico cuidadoso al menos una vez cada día laborable. Diariamente se harán otras observaciones, actuando de forma que se reduzca la pérdida de animales en el estudio, por ejemplo, mediante autopsia o refrigeración de los animales muertos, así como aislamiento o sacrificio de los animales débiles o moribundos. La observación diaria debe concentrarse en las modificaciones de la piel y del pelo, de los ojos, de las mucosas, del aparato respiratorio, del sistema circulatorio, de los sistemas nerviosos autónomo y central, de la actividad somato-motriz y del comportamiento. Deben observarse con especial atención los temblores, las convulsiones, la salivación, las diarreas, el letargo, el sueño y el coma. El momento de la muerte debe registrarse con la mayor precisión posible.Se hará la autopsia a los animales que mueran durante el experimento y, al final del mismo, a los que hayan sobrevivido. Deben registrarse todas las modificaciones patológicas macroscópicas. Si es necesario se extraerán tejidos para su examen histopatológico.Valoración de la toxicidad en el otro sexoTras completar el estudio en uno de los sexos, se hará un estudio mediante administración de la sustancia, al menos, en un grupo de 5 animales del sexo contrario, de forma que quede establecido que los animales de este sexo no son mucho más sensibles a la sustancia de ensayo. En circunstancias particulares podrá justificarse el uso de menor número de animales. Cuando se disponga de información adecuada que demuestre que los animales del sexo sometido a ensayo son mucho más sensibles, podrá prescindirse del ensayo en animales del otro sexo.2. RESULTADOSLos datos deberán inventariarse en un cuadro que indique, para cada lote del ensayo, el número de animales al principio del ensayo, el momento de la muerte de cada animal, el número de animales que presentan otros síntomas de toxicidad, la descripción de los efectos tóxicos y los resultados de la autopsia. El peso de cada animal debe determinarse y registrarse poco tiempo antes de la administración de la sustancia y, después, una vez por semana y en el momento de la muerte. Las variaciones de peso deben calcularse y registrarse cuando la supervivencia del animal supere un día. Los animales sacrificados de forma humanitaria por angustia y dolor debidos a la sustancia se registrarán como muertos debidos a la sustancia. La DL50 puede determinarse mediante un método reconocido. La evaluación de los resultados debe incluir la posible relación que exista entre la exposición de los animales a la sustancia de ensayo y la incidencia y gravedad de todas las anomalías, incluidas las anomalías clínicas y de comportamiento, las lesiones macróscopicas, los cambios de peso corporal, la mortalidad y demás efectos tóxicos.3. INFORME3.1. Informe del ensayoEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especie, cepa, origen, condiciones ambientales, régimen alimentario, etc.- condiciones del ensayo,- dosis (indicando las concentraciones y, en su caso, el vehículo),- sexo de los animales utilizados,- cuadro de los datos de respuestas por sexo y por dosis (número de animales muertos o sacrificados durante el ensayo, número de animales con síntomas de toxicidad, número de animales expuestos),- momento de la muerte después de la administración de la dosis, razones y criterios usados para el sacrificio humanitario de los animales,- todo tipo de observaciones,- valor de la DL50 para el sexo sometido al ensayo completo, determinada el decimocuarto día (indicando con precisión el método de cálculo),- intervalo de confianza estadística del 95 % para la DL50 (cuando pueda conseguirse),- curva dosis/mortalidad y pendiente de esta curva (cuando el método de cálculo lo permita),- observaciones de la autopsia,- toda observación histopatológica,- resultado de todas las pruebas en el sexo contrario,- discusión de los resultados (debe prestarse especial atención al efecto que puede tener sobre el valor calculado de la DL50 el sacrificio de animales durante el ensayo),- interpretación de los resultados.3.2. Evaluación e interpretaciónVéase introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).B.1 bis. TOXICIDAD AGUDA (ORAL) - MÉTODO DE DOSIS FIJA1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNVéase introducción general, Parte B (A).1.2. DEFINICIONESVéase introducción general, Parte B (B).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIOS DEL MÉTODOEl ensayo de toxicidad oral aguda proporciona información sobre los efectos adversos que pueden acaecer, en un breve período de tiempo, como consecuencia de la ingestión de una única dosis de la sustancia que se estudia.El método de dosis fija se lleva a cabo en dos fases.En un estudio preliminar, se investigan de manera secuencial los efectos de varias dosis administradas por vía oral a animales individuales de un solo sexo. El estudio preliminar proporciona información acerca de la relación entre dosis y toxicidad, así como una estimación de la dosis letal mínima. No se suelen utilizar más de 5 animales en esta primera fase.En el estudio principal, se administra la sustancia por vía oral a grupos de 5 machos y 5 hembras, a uno de los niveles de dosis preestablecidos (5, 50, 500 o 2 000 mg/kg). Se utiliza una dosis determinada mediante el estudio preliminar; será la dosis proclive a producir una «toxicidad manifiesta» (véase 1.2 Definiciones), pero ninguna muerte.Una vez administrada la sustancia, se realizan observaciones sobre sus efectos.En caso de que la dosis inicial elegida produzca una toxicidad manifiesta pero no la muerte, no será preciso realizar otras pruebas.En caso de que el nivel de dosis elegido no produzca toxicidad manifiesta, se deberá volver a administrar la sustancia al nivel de dosis inmediatamente superior. Si los animales mueren, o si es preciso sacrificarlos debido a una fuerte reacción tóxica en los mismos, se deberá volver a administrar la sustancia al nivel de dosis inmediatamente inferior.Este procedimiento permite la identificación de la «dosis discriminante» (véase 1.2 Definiciones), que es la mayor de las dosis preestablecidas que se puede administrar sin que provoque la muerte (incluyendo el sacrificio de los animales).Es posible que se deban sacrificar los animales que muestren signos intensos y constantes de sufrimiento y dolor. No se deberían llevar a cabo pruebas en las que se utilicen dosis de la sustancia que se sabe que provocan sufrimiento y dolor intensos debido a las propiedades corrosivas o irritantes de dicha sustancia.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ESTUDIO1.6.1. Preparación1.6.1.1. Animales de experimentaciónA no ser que existan contraindicaciones, la especie preferida será la rata.Se deberán emplear tipos de ratas habitualmente utilizados en laboratorio. Al principio de la prueba, la amplitud de la variación del peso para cada sexo de los animales utilizados no debería sobrepasar ± 20 % del valor medio pertinente.Se mantiene a los animales bajo condiciones experimentales de vida y de alimentación durante un período mínimo de cinco días antes de la realización del ensayo. Se eligen al azar animales jóvenes y sanos antes del ensayo y son asignados a los grupos de tratamiento del estudio preliminar y del estudio principal. En la práctica, sin embargo, se puede utilizar un solo grupo de cada sexo en el estudio principal.1.6.1.2. Preparación y administración de la dosisSi es necesario, se disuelve o se suspende la sustancia en cuestión en un vehículo apropiado. Se recomienda que, si es posible, se considere en primer lugar la utilización de una solución acuosa, a continuación una solución de aceite vegetal, después una posible solución en otros vehículos, o la suspensión. En el caso de los vehículos no acuosos, se deberían conocer las características tóxicas propias del vehículo, o se deberían determinar antes o durante la realización del ensayo. En los roedores, el volumen no debería sobrepasar 10 ml/kg del peso corporal, excepto en el caso de las soluciones acuosas, en las que se pueden usar 20 ml/kg. Se debería reducir a un mínimo la variación en el volumen de las sustancias mediante el ajuste de la concentración, con el fin de asegurar que se utiliza un volumen constante en todos los niveles de dosis.Se suprimirá la alimentación de los animales antes de la administración de la sustancia. En el caso de la rata, se deberá suprimir la alimentación la noche anterior; sin embargo, no se le suprimirá el agua. Se pesará a los animales al día siguiente y se les administrará en ese momento la sustancia mediante alimentación forzada en una única dosis. Si no es posible administrar una única dosis, se podrá dividir la dosis en pequeñas partes en un período que no sobrepase las 24 horas. Una vez se ha administrado la sustancia, se podrá suprimir la alimentación durante tres o cuatro horas más. Si se administra la dosis en pequeñas partes a lo largo de un cierto período podrá ser necesario dar comida y bebida a los animales, en función de la duración de dicho período.1.6.2. Procedimiento1.6.2.1. Estudio preliminarSe estudia los efectos de varias dosis sobre animales individuales. En ausencia de indicaciones sobre una mayor sensibilidad de los machos, se utilizarán hembras. La dosificación es secuencial, con un mínimo de 24 horas antes de administrar la dosis a otro animal. Se observará cuidadosamente cada animal para detectar signos de toxicidad, durante un período de por lo menos 7 días; en caso que persistan signos de toxicidad moderada después de 7 días, se deberá prolongar la observación por otro período de 7 días. Se pueden considerar los niveles de dosis inicial siguientes: 5, 50, 500 y 2 000 mg/kg. Si la dosis inicial escogida no produce toxicidad grave, será necesario investigar uno o varios niveles de dosis intermedias. De esta manera, debe ser posible conseguir información sobre el nivel (los niveles) de dosis que produce(n) algunos signos de toxicidad y el nivel de dosis mínimo que produce mortalidad.Se debería intentar seleccionar la dosis inicial usando evidencia procedente de sustancias relacionadas. En ausencia de dicha información, se sugiere utilizar en primer lugar la dosis de 500 mg/kg. En caso de no manifestarse ningun signo de toxicidad con la dosis inicial, se investigará la dosis inmediatamente superior. Si no se produce ninguna mortalidad a la dosis de 2 000 mg/kg, el estudio preliminar se da por terminado y se efectúa el estudio principal a esa misma dosis. Si se manifiestan efectos graves, requiriendo el sacrificio de los animales, a la dosis inicial (por ejemplo 500 mg/kg), se administrará la dosis inmediatamente inferior a otro animal. Si este animal sobrevive, se podrán administrar los niveles de dosis intermedios entre las dosis fijas a otros animales. Normalmente, no se debería usar más de 5 animales en este procedimiento.1.6.2.2. Estudio principalSe deberían utilizar un mínimo de 10 animales (5 hembras y 5 machos) para cada nivel de dosis que se investiga. Las hembras deberán ser nulíparas y no deberán estar preñadas.Un principio del método de dosis fija es que sólo se utilizan dosis moderadamente tóxicas. Se debería evitar la administración de dosis letales de la sustancia.El nivel de dosis que se utilizará en la prueba se debería seleccionar a partir de uno de los cuatro niveles de dosis fija, es decir, 5, 50, 500 o 2 000 mg/kg del peso corporal. El nivel de dosis inicialmente elegido deberá ser aquel que produzca toxicidad manifiesta pero no la muerte (incluyendo el sacrificio de los animales; las muertes accidentales no están incluidas pero se deberían registrar). No se deberán realizar más ensayos cuando el nivel de dosis en cuestión produzca toxicidad manifiesta pero no la muerte.En los casos en los que la administración del nivel de dosis elegido no provoque toxicidad manifiesta, se deberá volver a realizar un ensayo con la sustancia al nivel de dosis inmediatamente superior. Sin embargo, se deberá continuar la observación de los animales hasta que finalice el período de observación. En caso en que una fuerte reacción tóxica haga preciso el sacrificio de los animales, o si los animales mueren a consecuencia del compuesto, se deberá realizar un nuevo ensayo con la sustancia al nivel de dosis inmediatamente inferior. Una vez más, los animales que no se deban sacrificar se mantendrán bajo observación durante todo el período de observación.Una vez administrada la sustancia, se realizarán observaciones y se registrarán sistemáticamente. Se deberán realizar registros individuales para cada animal.El período de observación será de un mínimo de 14 días. Sin embargo, no se debería fijar rígidamente la duración de la observación. Se determinará mediante las reacciones tóxicas, la velocidad de su aparición y la duración del período de recuperación. Así pues, se podrá ampliar cuando se considere necesario. Es importante conocer el momento en el que aparecen y desaparecen los signos de toxicidad, así como el momento de la muerte, especialmente si existe una tendencia al retraso en la aparición de signos de toxicidad.Se deberá realizar un minucioso examen clínico un mínimo de dos veces al día de la dosificación y un mínimo de una vez al día los días siguientes. Se deberán sacrificar los animales que manifiesten dolor o intensos signos de sufrimiento. Será preciso realizar observaciones adicionales durante los primeros días tras la dosificación si los animales continúan mostrando signos de toxicidad. Se podrá dar por concluido el ensayo si se comprueba que el nivel de dosis inicialmente elegido era demasiado elevado.Las observaciones deberían incluir los cambios en la piel , ojos y membranas mucosas, y también los sistemas respiratorio, circulatorio, nervioso central y autónomo, así como la actividad somatomotriz y las pautas de comportamiento. Se deberá prestar especial atención a los temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargia, sueño y coma.Se deberá determinar el peso de cada animal inmediatamente antes de que se administre la sustancia, de forma diaria los tres días siguientes y de forma semanal con posterioridad. Se pesarán y se realizarán necropsias a los animales que mueran durante la realización del ensayo y a los que sobrevivan a la finalización del mismo. Se deberán registrar todos los grandes cambios patológicos. Si así se indica, se deberán extraer tejidos para realizar exámenes histopatológicos.Podrá ser necesario realizar una investigación de un segundo o, en casos excepcionales, de un tercer nivel de dosis, lo que estará en función de los resultados del nivel de dosis anterior.En caso de que una sustancia produzca la muerte con una dosis de 5 mg/kg del peso corporal (o cuando un estudio de determinación de la gama de valores indique que ese nivel de dosis provocará la muerte) podrá ser necesario seguir investigando la toxicidad aguda de la sustancia.2. RESULTADOSSe deberán resumir los resultados (tanto los del estudio preliminar como los del estudio principal) en forma de tabla en la que se muestre el número de animales existentes al iniciar el ensayo para cada nivel de dosis, el número de animales que muestren signos de toxicidad, el número de animales que hayan muerto durante el ensayo o hayan sido sacrificados, una descripción de los efectos tóxicos y, para el estudio principal, si se observó la existencia de toxicidad manifiesta relacionada con el compuesto, la evolución en el tiempo de los efectos tóxicos y la información que proporcionen las necropsias. Se deberán calcular y registrar los cambios de peso cuando los animales sobrevivan más de un día.Los animales que se sacrifiquen debido al dolor y sufrimiento relacionado con el compuesto se registrarán como muertes provocadas por el compuesto.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información, considerando tanto el estudio preliminar como el estudio principal:- especie, tipo, origen, condiciones medioambientales, dieta, etc.- condiciones en que se realiza el ensayo- niveles de dosis (con el vehículo, si se utilizó, y la concentración)- resultados completos de todos los niveles de dosis investigados- tabulación de la información sobre la respuesta por sexo y nivel de dosis (por ejemplo, número de animales utilizado; cambios en el peso corporal; número de animales que murieron o fueron sacrificados durante el ensayo, si se da el caso; número de animales que mostraron signos de toxicidad; naturaleza, intensidad y duración de los efectos)- evolución en el tiempo de la aparición de signos de toxicidad y si éstos eran reversibles- en el caso de que los animales murieran o fueran sacrificados, lapso de tiempo entre la muerte y la dosificación, razones y criterios utilizados para el sacrificio por razones humanitarias de los animales- resultados de las necropsias- resultados de los exámenes histopatológicos- discusión de los resultados- interpretación de los resultados, incluidos los signos de toxicidad manifiesta y el nivel de la dosis discriminante identificada en el ensayo.3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN>SITIO PARA UN CUADRO>Véase introducción general, Parte B (D).4. REFERENCIASVéase introducción general, Parte B (E).B.2. TOXICIDAD AGUDA POR INHALACIÓN1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNEs útil disponer de información preliminar sobre la distribución del tamaño de partícula, la presión de vapor, el punto de fusión, el punto de ebullición, el punto de inflamación y la detonabilidad (si procede) de la sustancia.Véase también la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIONESVéase la introducción general de la parte B (punto B).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOSe exponen varios lotes de animales de laboratorio a la sustancia de ensayo a concentraciones diferentes durante un período determinado, utilizándose una sola concentración por lote. Se observan a continuación los efectos y la mortalidad debidos a la sustancia. Se realiza la autopsia a los animales que mueran durante el experimento así como, al final del mismo, a los que hayan sobrevivido.Los animales que muestren signos de angustia y dolor graves y duraderos deberán sacrificarse de forma humanitaria. No se administrarán sustancias que produzcan dolor y angustia graves debido a sus propiedades corrosivas o irritantes.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. PreparaciónSe mantiene a los animales en las condiciones de alojamiento y alimentación adecuadas para el experimento por lo menos durante los cinco días anteriores al mismo. Antes de comenzar el ensayo, se eligen al azar animales jóvenes sanos y se reparten entre los diferentes lotes del experimento. No es necesario someterlos a una exposición simulada, a menos que lo exija el dispositivo de exposición utilizado.Puede ser necesario micronizar las sustancias sólidas para conseguir partículas del tamaño adecuado.Si es preciso, se puede añadir la sustancia a un vehículo adecuado para obtener una concentración apropiada de aquélla en la atmósfera, en cuyo caso se utilizará un grupo testigo para dicho vehículo. Si para facilitar la dosificación se utiliza un vehículo u otros aditivos, no deberán producir efectos tóxicos. Pueden utilizarse resultados disponibles ya comprobados, siempre que sean apropiados.1.6.2. Condiciones del ensayo1.6.2.1. Animales de laboratorioSalvo indicación contraria, la rata es la especie idónea. Es preciso utilizar cepas de laboratorio corrientes. Para cada sexo, la diferencia de peso al comienzo de la prueba entre los animales utilizados en el ensayo no debe exceder de ± 20 % del valor medio apropiado.1.6.2.2. Número y sexoPara cada nivel de concentración se utilizarán al menos diez roedores (5 hembras y 5 machos). Las hembras deberán ser nulíparas y no grávidas.Nota: Se considerará la posibilidad de utilizar un número menor de animales cuando se realicen ensayos de toxicidad aguda con animales de un orden superior al de los roedores. Las dosis se seleccionarán cuidadosamente y se hará todo lo posible por no sobrepasar dosis moderadamente tóxicas. Se evitará en esos ensayos la administración de dosis letales de la sustancia de ensayo.1.6.2.3. Concentraciones de exposiciónLas concentraciones deben ser en número suficiente, al menos tres, y espaciadas adecuadamente para producir lotes que presenten variedad de efectos tóxicos y de tasas de mortalidad. Los resultados deben ser suficientes para que se pueda trazar una curva concentración/mortalidad y, si fuera posible, permitir una determinación válida de la CL50.1.6.2.4. Prueba límiteSi la exposición durante 4 horas de 5 machos y 5 hembras a la concentración de 5 miligramos por litro de un gas o de un aerosol de sustancias líquidas o sólidas o - si ello no fuera posible debido a las propiedades químicas o físicas, incluso explosivas, de la sustancia - a la concentración máxima posible no causa la muerte de ningún animal dentro de los 14 días siguientes, no será necesario continuar el experimento.1.6.2.5. Duración de la exposiciónLa duración de la exposición debe ser de 4 horas.1.6.2.6. Equipo experimentalLos animales deben exponerse a la sustancia por medio de un dispositivo de inhalación que produzca un flujo dinámico de, por lo menos, 12 renovaciones de aire por hora, para garantizar un contenido de oxígeno suficiente y la distribución uniforme del producto de ensayo en la atmósfera. Si se utiliza una cámara, debe estar concebida de forma que se evite, en lo posible, el amontonamiento de los animales y que su exposición máxima por inhalación de la sustancia quede asegurada. Por regla general, para garantizar la estabilidad de la atmósfera, el «volumen» total de animales de laboratorio no debe sobrepasar el 5 % del volumen de la cámara de ensayo. También se puede recurrir a un sistema de exposición oro-nasal, únicamente de cabeza o de cuerpo entero, en una cámara individual; con los dos primeros tipos de exposición se evita la absorción de la sustancia por otras vías.1.6.2.7. Período de observaciónEl período de observación debe ser por lo menos de 14 días. No obstante, su extensión no debe fijarse de forma rígida, sino que debe determinarse en función de las reacciones de toxicidad, de su velocidad de aparición y de la duración del período de recuperación; por lo tanto, en caso de necesidad puede prolongarse. Son importantes el momento en que aparecen y desaparecen los síntomas de toxicidad, así como el momento de la muerte, sobre todo si en la sustancia se observa una tendencia a causar una muerte retardada.1.6.3. ProcedimientoPoco tiempo antes de la exposición, se pesan los animales y, a continuación, se exponen a la concentración de ensayo en el equipo descrito, durante 4 horas, una vez que se haya estabilizado la concentración en la cámara. La estabilización debe ser rápida. La temperatura durante el ensayo debe mantenerse a 22 ± 3  C. Lo ideal sería mantener la humedad relativa entre el 30 y el 70 % pero en ciertos casos (por ejemplo, en la prueba de algunos aerosoles) esto puede resultar imposible. El mantener una ligera presión negativa dentro de la cámara ( & le; 5 mm de agua) evitará la dispersión de la sustancia de ensayo en la zona circundante. Se privará de alimento y de agua a los animales durante la exposición. Se utilizarán sistemas apropiados para crear y controlar la atmósfera de ensayo. El sistema debe permitir crear condiciones de exposición estables lo más rápidamente posible. La cámara se diseñará y funcionará de forma que se mantenga en su interior una distribución homogénea de la atmósfera del ensayo.Es conveniente medir o vigilar:(a) el caudal de aire (permanentemente);(b) la concentración real de la sustancia de ensayo en la zona de respiración, al menos tres veces durante la exposición (algunas atmósferas, p. ej., aerosoles a altas concentraciones, necesitarán una vigilancia más frecuente). Durante el período de exposición, la concentración no debe variar en más de ± 15 % respecto al valor medio. Sin embargo, en el caso de ciertos aerosoles puede ser difícil conseguir este control, en cuyo caso se puede aceptar una diferencia mayor. En los aerosoles, debe analizarse el tamaño de las partículas tan a menudo como sea necesario (al menos una vez por grupo de ensayo);(c) temperatura y humedad, si es posible continuamente;Las observaciones tienen lugar durante y después de la exposición y se registran sistemáticamente; debe abrirse una ficha individual para cada animal. El primer día deben efectuarse con frecuencia las observaciones. Deberá hacerse un examen clínico cuidadoso al menos cada día laborable. Diariamente se harán otras observaciones complementarias actuando de manera que se reduzca la pérdida de animales para el estudio, por ejemplo, mediante autopsia o refrigeración de los animales muertos, así como aislamiento o sacrificio de los animales débiles o moribundos.La observación incluirá las modificaciones de la piel y del pelo, los ojos, las mucosas, el aparato respiratorio, el sistema circulatorio, los sistemas nerviosos autónomo y central, la actividad somato-motriz y el comportamiento. Deben observarse con especial atención la respiración, los temblores, las convulsiones, la salivación, las diarreas, el letargo, el sueño y el coma. El momento de la muerte debe registrarse con la mayor precisión posible. El peso de cada animal deberá determinarse semanalmente después de la exposición, así como en el momento de la muerte. Se hará la autopsia a los animales que mueran durante el experimento y, al final del mismo, a los que hayan sobrevivido. Deben registrarse, especialmente, las modificaciones de las vías respiratorias superiores e inferiores, anotando todos los cambios patológicos importantes. Si es necesario, se extraerán tejidos para un examen histopatológico.2. RESULTADOSLos resultados deberán inventariarse en un cuadro que indique, para cada grupo de ensayo, el número de animales al principio del mismo, el momento de la muerte de cada animal, el número de animales que presenten otros síntomas de toxicidad, la descripción de los efectos tóxicos y los resultado de la autopsia. Las variaciones de peso deben calcularse y registrarse cuando la supervivencia del animal supere un día. Los animales sacrificados por razones humanitarias debido a angustia o dolor producidos por la sustancia se registrarán como muertes debidas a la sustancia. La CL50 debe determinarse mediante un método reconocido. La evaluación de los resultados debe incluir la posible relación que existe entre la exposición de los animales a la sustancia y la incidencia y gravedad de todas las anomalías, incluidas las anomalías clínicas y de comportamiento, las lesiones macroscópicas, los cambios de peso corporal, la mortalidad y demás efectos tóxicos.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especie, cepa, origen, condiciones ambientales, régimen alimentario, etc.;- condiciones del ensayo: Descripción del dispositivo de exposición, incluidos su concepción, tipo, dimensiones, fuente de aire, sistema generador de aerosoles, método de acondicionamiento del aire y, en su caso, método de alojamiento de los animales en la cámara de ensayo. Debe describirse el equipo utilizado para medir la temperatura y la humedad, así como la concentración de los aerosoles y la granulometría de las partículas.Datos relativos a la exposiciónDeben presentarse en forma de tabla, indicando los valores medios así como una medida de la variabilidad (por ejemplo desviación típica); a ser posible, deben incluir;(a) el caudal de aire a través del dispositivo de inhalación,(b) temperatura y humedad del aire,(c) concentraciones nominales (cantidad total de sustancia de ensayo introducida en el dispositivo de inhalación, dividida por el volumen de aire),(d) en su caso, naturaleza del vehículo,(e) concentraciones reales en la zona de respiración,(f) el diámetro aerodinámico de la mediana de la masa (DAMM) y la desviación geométrica típica (DGT),(g) duración de la estabilización,(h) duración de la exposición,- tabla de reacciones, por sexo y por nivel de exposición (número de animales que mueren o se sacrifican durante el ensayo, número de animales que presentan síntomas de toxicidad, número de animales expuestos),- momento de la muerte, durante o después de la exposición, motivos y criterios para el sacrificio humanitario de los animales,- observaciones de cualquier tipo,- valor de la CL50 para cada sexo, determinado al final del período de observación (indicando con precisión el método de cálculo utilizado),- intervalo de confianza estadística del 95 % para la CL50 (si es posible determinarlo),- curva concentración/mortalidad y pendiente de la curva (si el método de cálculo lo permite),- resultados de las autopsias,- toda observación histopatológica,- discusión de los resultados (prestando especial atención al efecto que pueda tener sobre el valor calculado de CL50 el sacrificio humanitario de animales durante el ensayo,- interpretación de los resultados.3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).B.3. TOXICIDAD AGUDA POR VÍA CUTÁNEA1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIONESVéase la introducción general de la parte B (punto B).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOSe administran dosis diferentes de la sustancia de ensayo por aplicación cutánea a varios lotes de animales de laboratorio, utilizándose una sola dosis por lote. Se observan a continuación los efectos y la mortalidad causados por la sustancia. Se realiza la autopsia a los animales que mueran durante el ensayo así como al final de ésta, a los que hayan sobrevivido.Los animales que muestren signos de dolor y angustia graves y duraderos deberán sacrificarse de forma humanitaria. No se administrarán sustancias que produzcan dolor y angustia graves debido a sus propiedades corrosivas o irritantes.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. PreparaciónSe mantiene a los animales en las jaulas para el experimento en las condiciones de alojamiento y alimentación adecuadas para el ensayo por lo menos durante los 5 días anteriores. Antes de comenzar el ensayo se eligen al azar animales adultos jóvenes y sanos y se reparten entre los diferentes lotes del ensayo. Unas veinticuatro horas antes del ensayo se esquila o se rasura el pelo de la región dorsal del tronco de los animales, evitando cualquier lesión de la piel que pueda modificar su permeabilidad. La superficie que hay que preparar para la aplicación de la sustancia no debe ser inferior al 10 % de la superficie corporal. Cuando se sometan a ensayo sólidos, que puedan pulverizarse eventualmente, la sustancia deberá humedecerse con agua o, si es preciso, con un vehículo adecuado, para asegurar un buen contacto con la piel. Si se utiliza un vehículo, se habrá de tener en cuenta su incidencia sobre la penetración de la sustancia en la piel. Las sustancias líquidas, generalmente, se aplican sin diluir.1.6.2. Condiciones del ensayo1.6.2.1. Animales de laboratorioSe pueden utilizar ratas o conejos adultos. Se pueden utilizar igualmente otras especies pero, en tal caso, hay que justificar su utilización. Es preciso utilizar cepas de laboratorio corrientes. Para cada sexo, la diferencia de peso al comienzo del ensayo entre los animales utilizados no debe exceder de ± 20 % del valor medio apropiado.1.6.2.2. Número y sexoPara cada dosis se utilizarán al menos 5 animales del mismo sexo. Si se utilizan hembras, deberán ser nulíparas y no grávidas. Cuando se disponga de información que demuestre que un sexo es mucho más sensible, se utilizarán para la prueba animales de ese sexo.Nota: Se considerará la posibilidad de utilizar un número menor de animales cuando se realicen ensayos de toxicidad aguda con animales de un orden superior al de los roedores. Las dosis se seleccionarán cuidadosamente y se hará todo lo posible por no sobrepasar dosis moderadamente tóxicas. Se evitará en esos ensayos la administración de dosis letales de la sustancia de estudio.1.6.2.3. DosisLas dosis deben ser en número suficiente, al menos tres, y espaciadas adecuadamente para producir lotes que presenten variedad de efectos tóxicos y de mortalidad. Al elegir las dosis debe tomarse en consideración cualquier efecto irritante o corrosivo. Los resultados deben ser sufcientes para que se pueda trazar una curva dosis/respuesta y, si fuera posible, permitir una determinación válida de la DL50.1.6.2.4. Prueba límitePuede realizarse un ensayo límite, con dosificación única de al menos 2 000 mg/kg de peso corporal, en un grupo de 5 machos y 5 hembras, utilizando los procedimientos descritos anteriormente. Si hay mortalidad debida a la sustancia, habrá que considerar la realización de un estudio completo.1.6.2.5. Período de observaciónEl período de observación debe ser de, al menos, 14 días. Sin embargo, su extensión no debe fijarse de forma rígida, sino que debe determinarse en función de las reacciones de toxicidad, su velocidad de aparición y la duración del período de curación; por lo tanto, puede prolongarse en caso de necesidad. Es importante el momento en el que aparecen y en el que desaparecen los síntomas de toxicidad, así como el momento de la muerte, sobre todo si se observa en la sustancia una tendencia a causar una muerte retardada.1.6.3. ProcedimientoLos animales deben estar alojados en jaulas individuales. La sustancia debe aplicarse sobre una superficie equivalente al 10 % de la superficie total del cuerpo. En el caso de sustancias altamente tóxicas la superficie puede ser menor, pero procurando que en toda la superficie la sustancia forme una pélicula lo más fina y uniforme posible.Las sustancias de ensayo deben mantenerse en contacto con la piel por medio de un apósito de gasa porosa y un esparadrapo no irritante durante 24 horas. Además, la parte tratada debe estar convenientemente cubierta para mantener en su lugar el apósito de gasa y la sustancia e impedir que los animales puedan ingerir esta última. Se pueden utilizar aparatos de contención para impedir que los animales ingieran la sustancia, pero no se recomienda una inmovilización completa.Al término del período de aplicación de la sustancia de ensayo, ésta deberá eliminarse, a ser posible, con agua o con otro procedimiento adecuado de limpieza de la piel.Las observaciones se registrarán sistemáticamente a medida que se efectúen, abriendo una ficha individual para cada animal. El primer día las observaciones deben efectuarse con frecuencia. Deberá hacerse un examen clínico atento al menos cada día laborable. Diariamente deberán hacerse otras observaciones actuando de manera que se reduzca el número de animales perdidos para el estudio, por ejemplo mediante autopsia o refrigeración de los animales muertos, así como aislamiento o sacrificio de los animales débiles o moribundos.Las observaciones deben incluir las modificaciones del pelo, la piel tratada, los ojos y las mucosas, el aparato respiratorio, el sistema circulatorio, los sistemas nerviosos autónomo y central, la actividad somato-motriz y el comportamiento. Deben observarse con especial atención los temblores, las convulsiones, la salivación, las diarreas, el letargo, el sueño y el coma. El momento de la muerte debe anotarse con la mayor precisión posible. Se hará la autopsia a los animales que mueran durante el experimento y, al final del mismo, a los que hayan sobrevivido. Deben registrare todas las modificaciones patológicas macroscópicas. Si es necesario se extraerán tejidos para un examen histopatológico posterior.Valoración de la toxicidad en el otro sexoTras completar el estudio en uno de los sexos, se hará un estudio con al menos un grupo de 5 animales del sexo contrario, de forma que quede establecido que los animales de este sexo no son mucho más sensibles a la sustancia de ensayo. En circunstancias particulares podrá justificarse el uso de menor número de animales. Cuando se disponga de información adecuada que demuestre que los animales del sexo sometido a prueba son mucho más sensibles, podrá prescindirse del ensayo en animales del otro sexo.2. RESULTADOSLos resultados deberán inventariarse en un cuadro que indique, para cada lote, el número de animales al principo del ensayo, el momento de la muerte de cada animal, el número de animales que presenten otros síntomas de toxicidad, la descripción de los efectos tóxicos y los resultados de la autopsia. El peso de cada animal debe determinarse y anotarse poco antes de la aplicación de la sustancia y, después de la misma, una vez por semana y en el momento de su muerte; deben calcularse y registrarse las variaciones de peso cuando la supervivencia del animal supere un día. Los animales que se sacrifiquen de forma humanitaria debido a angustia o dolor causados por la sustancia se registrarán como muertes debidas a la sustancia. La DL50 debe determinarse mediante un método reconocido.La evaluación de los resultados debe incluir la eventual relación que exista entre la exposición de los animales a la sustancia y la incidencia y gravedad de todas las anomalías, incluidas las anomalías clínicas y del comportamiento, las lesiones macroscópicas, los cambios de peso corporal, la mortalidad y cualquier otro efecto tóxico.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especie, cepa, origen, condiciones ambientales, régimen alimentario, etc.;- condiciones de ensayo (incluido el procedimiento de limpieza de la piel y el tipo de apósito: oclusivo o no oclusivo),- dosis (indicando las concentraciones y, en su caso, el vehículo),- sexo de los animales utilizados,- tabla de respuestas por sexo y por dosis (número de animales que mueren o son sacrificados durante el ensayo, número de animales con síntomas de toxicidad, número de animales expuestos),- momento de la muerte después de administrar la dosis, motivos y criterios para el sacrificio humanitario de los animales,- todas las observaciones,- valor de la DL50 para el sexo sometido a un estudio completo, determinado el decimocuarto día, indicando con precisión el método de cálculo,- intervalo de confianza estadística del 95 % para la DL50 (si es posible determinarlo),- curva dosis/mortalidad y pendiente de la curva si el método de cálculo lo permite,- resultados de la autopsia,- observaciones histopatológicas,- resultado de cualquier ensayo en el sexo contrario,- discusión de los resultados (prestando especial atención al efecto que puede tener sobre la DL50 calculada el sacrificio humanitario de animales durante el ensayo),- interpretación de los resultados.3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).B.4. TOXICIDAD AGUDA (IRRITACIÓN DE LA PIEL)1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto B).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOConsideraciones inicialesSe procurará tener en cuenta escrupulosamente toda información disponible sobre una sustancia para reducir al mínimo los ensayos de sustancias en condiciones que, probablemente, vayan a producir reacciones graves. La siguiente información puede ser útil cuando se sopese si es adecuado realizar un ensayo completo, un estudio en un animal único o no realizar más ensayos:i) Propiedades fisicoquímicas y reactividad química. Las sustancias que sean ácidos o bases fuertes (pH demostrado igual o inferior a 2 o igual o superior a 11,5, por ejemplo) no necesitarán pruebas de irritación dérmica primaria si son de esperar propiedades corrosivas. Debe tenerse también en cuenta la reserva ácida o básica.ii) Si se dispone de evidencia convincente de efectos graves en pruebas in vitro validadas, no será necesario hacer una prueba completa.iii) Resultados de estudios de toxicidad aguda. Si se ha realizado una prueba de toxicidad aguda por vía cutánea a la dosis de sustancia de la prueba límite (2 000 mg/kg de peso corporal) y no se ha observado irritación de la piel, será innecesario realizar más pruebas de irritación dérmica. Además, es innecesario someter a prueba materiales que hayan mostrado toxicidad elevada por vía cutánea.Se aplica la sustancia de ensayo, en una dosis única, sobre la piel de varios animales de laboratorio, siendo cada uno de ellos su propio testigo. Se observa la importancia de la reacción de irritación y se valora después de un lapso de tiempo determinado; se hará una descripción detallada con el fin de permitir una evaluación completa de los efectos. El período de observación debe ser suficientemente largo para poder evaluar completamente el carácter reversible de los efectos observados.Los animales que muestren signos graves y duraderos de angustia o dolor deberán ser sacrificados de forma humanitaria.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. PreparaciónUnas veinticuatro horas antes del ensayo se esquila o se rasura el pelo de la región dorsal del tronco del animal.Al hacer esta operación hay que tener cuidado de no arañar la piel. Sólo deben utilizarse animales que tengan una piel sana e intacta.Algunas cepas de conejo tienen islotes de pelo denso que son más prominentes en ciertas épocas del año. No se aplicarán las sustancias de ensayo en esas zonas de crecimiento denso.Si se someten a ensayo sustancias sólidas (que, si es necesario, se pueden pulverizar) deben humedecerse suficientemente con agua o, si es preciso, con un vehículo adecuado, para garantizar un buen contacto con la piel. En este último caso, hay que tener en cuenta la incidencia del vehículo en la irritación cutánea provocada por la sustancia de ensayo. Las sustancias líquidas se aplican generalmente sin diluir.1.6.2. Condiciones del ensayo1.6.2.1. Animales de laboratorioAunque pueden utilizarse varias especies de mamíferos, la especie idónea es el conejo albino.1.6.2.2. Número de animalesSi se sospecha, por resultados preliminares in vitro u otras razones, que la sustancia podría producir necrosis (ej. corrosiva) debe pensarse en un ensayo con animal único. Si los resultados de este ensayo no indican corrosividad, se completará el mismo usando al menos dos animales más.Para el ensayo completo, se utilizarán por lo menos tres animales sanos adultos. No es necesario utilizar animales separados para disponer de un grupo de control no tratado. Puede resultar necesaria la utilización de un número mayor para precisar las respuestas dudosas.1.6.2.3. DosisSalvo indicación contraria, se aplicará en el lugar elegido un volumen de 0,5 ml de líquido o 0,5 g de sustancia sólida o semisólida. En cada animal, las zonas de piel adyacente no tratada sirven de testigo.1.6.2.4. Período de observaciónLa duración del período de observación no debe fijarse de forma rígida y debe ser suficiente para poder evaluar por completo el carácter reversible o irreversible de los efectos observados, aunque normalmente no debe superar los 14 días a partir de la administración.1.6.3. ProcedimientoLos animales deben estar alojados en jaulas individuales. La sustancia debe aplicarse sobre una pequeña superficie de piel (unos 6 cm2) y cubrirse con un apósito de gasa, mantenido en su lugar con un esparadrapo no irritante. En el caso de líquidos o de algunas pastas puede resultar necesario extender en primer lugar la sustancia sobre una gasa y después aplicar ésta sobre la piel; la gasa debe mantenerse en contacto con la piel, sin apretar, por medio de un apósito oclusivo o semioclusivo apropiado durante todo el período de exposición. Hay que impedir que el animal alcance la gasa y que ingiera o inhale la sustancia.Al final del período de exposición debe eliminarse la sustancia, a ser posible, con agua o con un disolvente apropiado, teniendo cuidado de no modificar ni la respuesta producida ni la integridad de la epidermis.La duración de la exposición suele ser de 4 horas.Si se sospecha que la sustancia puede producir necrosis (ej. corrosiva) deberá reducirse la duración de la exposición (por ejemplo, 1 hora o 3 minutos). Este ensayo puede hacerse también utilizando en primera instancia un único animal y, si no queda excluido por la toxicidad dérmica aguda de la sustancia de ensayo, pueden aplicarse simultáneamente a ese animal tres apósitos. El primero se retira a los tres minutos. Si no hay reacción cutánea grave, se retira el segundo al cabo de una hora. Si las observaciones en este punto aconsejan una exposición de cuatro horas y ésta puede hacerse humanitariamente, se retira el tercer apósito a las cuatro horas, graduando las respuestas obtenidas. En este caso (es decir, si ha sido posible una exposición de cuatro horas), se completará el ensayo utilizando al menos otros dos animales, salvo que no se considere humanitario hacerlo (por ejemplo, si se observa necrosis tras la exposición de cuatro horas).Si se observa une reacción grave de la piel (p. ej. necrosis) al cabo de tres minutos o de una hora, se terminará inmediatamente el ensayo.En ciertas condiciones pueden indicarse exposiciones más largas, por ejemplo, según los modos de utilización y de exposición previstos en el hombre.1.6.3.1. Observación y graduaciónDebe observarse la aparición de manifestaciones eritematosas y edematosas y graduar la respuesta a los 60 minutos y a las 24, 48 y 72 horas de haber levantado el apósito. Las reacciones de irritación se registran y gradúan según la tabla 1. Pueden resultar también necesarias otras observaciones si no se ha demostrado claramente la reversibilidad de las lesiones en las primeras 72 h. Además de estas observaciones sobre la irritación, deberá describirse completamente cualquier lesión grave, como la corrosión (destrucción irreversible del tejido de la piel) o cualquier otro efecto tóxico.Pueden utilizarse técnicas como el estudio histopatológico o la medida del espesor del pliegue cutáneo para aclarar reacciones o respuestas dudosas enmascaradas por la tinción de la piel por la sustancia de ensayo.2. RESULTADOSLos resultados deberán inventariarse en un cuadro que indique, para cada animal, la graduación del eritema y del edema durante todo el período de observación. También deberá registrarse cualquier lesión grave, una descripción de la intensidad y naturaleza de la irritación, reversibilidad o corrosión y cualquier otro efecto tóxico que se observe.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especie, cepa, origen, condiciones ambientales, régimen alimentario, etc.,- condiciones de ensayo (incluidas las propiedades fisicoquímicas de la sustancia que sean oportunas, la técnica de preparación y limpieza de la piel y el tipo de apósito: oclusivo o semioclusivo),- tabla de resultados de la reacción de irritación en cada animal y en cada momento de observación (por ejemplo, 1, 24, 48 y 72 horas, etc., después de levantar el apósito),- descripción de cualquier lesión grave observada, incluida la corrosión,- descripción de la intensidad y naturaleza de la irritación observada y cualquier observación histopatológica,- descripción de cualquier efecto tóxico distinto a la irritación cutánea,- discusión de los resultados,- interpretación de los resultados.3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).Apéndice>SITIO PARA UN CUADRO>B.5. TOXICIDAD AGUDA (IRRITACIÓN OCULAR)1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto B).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOConsideraciones inicialesSe procurará tener en cuenta escrupulosamente toda información disponible sobre una sustancia para reducir al mínimo las pruebas de sustancias en condiciones que, probablemente, vayan a producir reacciones graves. Puede ser útil a este respecto disponer de la siguiente información:i) Propiedades fisicoquímicas y reactividad química. Las sustancias que sean ácidos o bases fuertes (pH en el ojo demostrado igual o inferior a 2 o igual o superior a 11,5, por ejemplo) no necesitarán someterse a prueba si son de esperar lesiones graves. Debe tenerse también en cuenta la reserva ácida o básica.ii) Resultados de estudios alternativos validados. Las sustancias que hayan mostrado propiedades potencialmente corrosivas o gravemente irritantes no tienen que someterse a la prueba de irritación ocular, ya que se supone que estas sustancias producirían efectos graves en los ojos si se siguiera este método.iii) Resultados de estudios de irritación de la piel. Las sustancias que hayan mostrado claras propiedades corrosivas o hayan producido irritación grave de la piel en un estudio de irritación de la misma no tienen que someterse al ensayo de irritación ocular, ya que se supone que estas sustancias pueden producir efectos graves en los ojos.Se aplica la sustancia de ensayo, en una dosis única, a un ojo de cada uno de varios animales de laboratorio; el ojo no tratado se utiliza como testigo. Se observa la importancia de la reacción de irritación y se valora a intervalos determinados; se hará una descripción detallada con el fin de permitir una evaluación completa de los efectos. El período de observación debe ser suficientemente largo para poder evaluar completamente el carácter reversible o irreversible de los efectos observados.Los animales que muestren signos graves y duraderos de angustia o dolor deberán ser sacrificados de forma humanitaria.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. PreparaciónDeben examinarse los dos ojos de cada animal seleccionado provisionalmente para el ensayo durante las 24 horas que preceden al mismo. No se utilizarán aquellos animales en los que se observe irritación ocular, defectos oculares o una lesión de cornea ya existente.1.6.2. Condiciones del ensayo1.6.2.1. Animales de laboratorioAunque se hayan utilizado otros animales diferentes, se recomienda efectuar el ensayo en conejos albinos adultos y sanos.1.6.2.2. Número de animalesSe considerará la posibilidad de hacer un ensayo en un único animal, si se prevén efectos graves. Si el resultado de este ensayo en un conejo sugiere que la sustancia es gravemente irritante (efecto reversible) o corrosiva (efecto irreversible) para el ojo utilizando el procedimiento descrito, puede no ser necesario realizar ensayos adicionales de irritación ocular en otros animales. En ocasiones, puede ser adecuado hacer ensayos en animales adicionales para investigar aspectos específicos.Cuando no se utilice un único animal, se utilizarán por lo menos tres animales. Puede resultar necesario utilizar un mayor número de animales para precisar las respuestas dudosas.1.6.2.3. DosisSi la sustancia de ensayo es un líquido, se utiliza un volumen de 0,1 ml. En cuanto a las sustancias sólidas, pastosas y en forma de partículas, la cantidad que se utilice debe tener un volumen de 0,1 ml o pesar alrededor de 0,1 g (siempre debe anotarse el peso). Si la sustancia de ensayo es sólida o granulosa debe ser triturada en polvo fino. La medida del volumen de las sustancias en forma de partículas debe ir precedida de una compresión ligera, por ejemplo, dando golpecitos al recipiente de medida.Para las sustancias contenidas en pulverizadores o en recipientes de aerosoles a presión, debe expelerse el líquido y recoger y depositar 0,1 ml en el ojo, como se describe en el caso de los líquidos.1.6.2.4. Período de observaciónLa duración del período de observación no debe fijarse de forma rígida y debe ser suficiente para poder evaluar el carácter reversible o irreversible de los efectos observados, aunque normalmente no debe superar los 21 días, a contar desde la instilación.1.6.3. ProcedimientoLos animales deben estar alojados en jaulas individuales. La sustancia de ensayo debe instilarse en el saco conjuntival de uno de los ojos de cada animal, después de haber separado delicadamente el párpado inferior del globo ocular, y a continuación se juntan los párpados con cuidado durante un segundo más o menos para evitar que la sustancia salga. El otro ojo que no se trata sirve de testigo.Si se piensa que la sustancia puede producir un dolor desproporcionado, se usará un anestésico local antes de la instilación de la sustancia de ensayo. El tipo, concentración y tiempo de aplicación del anestésico local deben seleccionarse cuidadosamente para garantizar que su uso no produzca diferencias significativas en la reacción a la sustancia de prueba. Debe anestesiarse de forma similar el ojo testigo.No deben lavarse los ojos de los animales durante las 24 horas siguientes a la instilación de la sustancia de ensayo. Si es necesario, puede hacerse un lavado al final de dicho período.Puede estar indicado realizar ensayos adicionales con conejos a los que se les hace un lavado de ojos poco tiempo después de la instilación de la sustancia, en el caso de aquellas sustancias que hayan demostrado su carácter irritante en el ensayo citado anteriormente. En estos casos, se recomienda utilizar 3 conejos. Medio minuto después de la instilación, los ojos de los conejos se lavan durante medio minuto, utilizando un volumen y una velocidad de salida del líquido que no produzca lesiones.1.6.3.1. Observación y graduaciónLos ojos deben examinarse después de 1, 24, 48 y 72 horas. Si no hay evidencia de lesiones oculares al cabo de 72 horas, se puede poner fin al ensayo.Puede resultar necesario una observación prolongada en caso de daños persistentes en la córnea o de cualquier otra irritación ocular con el fin de determinar la evolución de las lesiones y su carácter reversible o irreversible. Además de las observaciones relativas a la córnea, al iris y a la conjuntiva, es conveniente registrar y describir todas las lesiones que se observen. La valoración de la reacción ocular (véase la tabla) debe registrarse en cada examen. (La valoración de las reacciones oculares puede dar lugar a diversas interpretaciones; como ayuda, los laboratorios de investigación y las personas encargadas de efectuar o de interpretar las observaciones, pueden recurrir a una guía ilustrada que trate de las irritaciones oculares.)Para facilitar el examen de las reacciones, se puede utilizar una lupa binocular, una lámpara manual de hendidura, un biomicroscopio u otro instrumento adecuado. Después de registrar las observaciones efectuadas al cabo de 24 horas, puede proseguirse el examen de los ojos de algunos conejos o de todos ellos por medio de fluoresceína.2. RESULTADOSLos resultados deben inventariarse en un cuadro que recoja, para cada animal, los índices de irritación en el momento de cada observación. Hay que indicar una descripción del grado y naturaleza de la irritación, la presencia de lesiones graves y cualquier otro efecto no ocular que se observe.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- datos sobre los animales (especie, cepa, origen, condiciones ambientales, régimen alimentario, etc.,- condiciones del ensayo (incluidas las propiedades fisicoquímicas de la sustancia que sean oportunas),- tabla de resultados de la reacción de irritación o corrosión en cada animal y en cada momento de observación (por ejemplo, 1, 24, 48 y 72 horas),- descripción de cualquier lesión grave observada,- descripción narrativa del grado y naturaleza de la irritación o la corrosión observadas, incluidas la zona de córnea afectada y su reversibilidad,- descripción del método utilizado para graduar la irritación después de 1, 24, 48 y 72 horas (por ejemplo, lámpara manual de hendidura, biomicroscopio, fluoresceína),- descripción de cualquier efecto local no ocular que se observe,- discusión de los resultados.- interpretación de los resultados,3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).Apéndice>SITIO PARA UN CUADRO>B.6. SENSIBILIZACIÓN DE LA PIEL1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNObservaciones:La sensibilidad y capacidad de los ensayos para detectar sustancias potencialmente sensibilizantes de la piel humana se consideran importantes en un sistema de clasificación de la toxicidad aplicable a la salud pública.No hay un método único que detecte todas las sustancias con potencial de sensibilización de la piel humana y que sea adecuado para todas las sustancias.Para seleccionar un ensayo deben tenerse en cuenta factores como las características físicas de una sustancia, incluyendo en ellas la capacidad de penetración de la piel.Los ensayos que utilizan cobayas pueden subdividirse en ensayos con adyuvante, en las que se potencia un estado alérgico disolviendo o suspendiendo la sustancia de ensayo en adyuvante completo de Freunds (FCA), y en ensayos sin adyuvante.Es posible que los ensayos con adyuvantes sean más exactas, a la hora de predecir el efecto sensibilizante que una sustancia puede tener en la piel humana, que los métodos que no utilizan FCA; son, pues, los métodos preferidos.El ensayo de maxilización en cobayas (GPMT) es un ensayo con adyuvante ampliamente utilizado. Aunque se pueden utilizar algunos otros métodos para detectar el potencial sensibilizante de una sustancia, se considera a la GPMT como la técnica con adyuvante de preferencia.Los ensayos sin adyuvantes (suele utilizarse sobre todo el ensayo de Buehler) se consideran menos sensibles con muchas clases de químicos.En ciertos casos, puede haber buenas razones para escoger el ensayo de Buehler, que implica una aplicación tópica, antes que la inyección intradérmica utilizada en la GPMT. Cuando se use el ensayo de Buehler habrá que justificarlo desde el punto de vista científico.Se describen en este método el ensayo de maximización en cobayas (GPMT) y el ensayo de Buehler. Se pueden utilizar otros métodos siempre que estén bien validados y que se dé su justificación científica.Independientemente del método que se utilice, debe controlarse a intervalos regulares (seis meses) la sensibilidad de la cepa de cobayas utilizada para probar la sensibilización de la piel; para ello se usarán un sensibilizante conocido, suave y moderado, y deberá obtenerse un número satisfactorio de respuestas positivas.Véase también la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIÓNVéase la introducción general de la, parte B (punto B).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIASe recomiendan las sustancias siguientes, diluidas como sea necesario, así como cualquier otra sustancia activa sensibilizadora, conocida en la bibliografía, ó que pertenezca al grupo de la sustancia que se estudia.- p-fenilendiaminan  CAS 106-50-3- 2,4-dinitroclorobencenon  CAS 97-00-7- dicromato potásicon  CAS 7778-50-9- sulfato de neomicinan  CAS 1405-10-3- sulfato de níqueln  CAS 7786-81-41.4. PRINCIPIO DEL MÉTODODespués de una exposición inicial a la sustancia de ensayo (período de inducción) se somete a los animales, aproximadamente dos semanas después de la última exposición de inducción, a una exposición de provocación a la sustancia con el fin de establecer si se ha inducido un estado de hipersensibilidad. La sensibilización se determina examinando la respuesta cutánea a la exposición de provocación.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. Prueba de maximización en cobayas (GPMT)1.6.1.1. PreparaciónSe eligen al azar cobayas albinos jóvenes y sanos y se reparten en lotes tratados y lotes testigo. Antes de administrar la sustancia, se esquila o se rasura el pelo de la región dorsal superior procurando no dañar la piel.1.6.1.2. Condiciones del ensayo1.6.1.2.1. Animales de laboratorioSe utilizan cepas corrientes de laboratorio de cobaya albino, con peso individual inferior a 500 g.1.6.1.2.2. Número y sexoSe pueden utilizar animales de ambos sexos. Si se utilizan hembras deben ser nulíparas y no grávidas. Se utilizan por lo menos 10 animales para el lote tratado y 5, por lo menos, para el lote testigo. Si se utiliza un número menor de animales, se debe explicar la razón. Si se obtienen resultados dudosos, se decidirá si se repite el ensayo con otro lote de animales, según el examen histopatológico. Cuando no sea posible concluir definitivamente si la sustancia es o no es sensibilizante, se recomienda utilizar animales adicionales, hasta llegar, al menos, a un total de 20 animales con la sustancia de ensayo y 10 animales control.1.6.1.2.3. DosisLa concentración de la sustancia se ajusta a un nivel que produzca cierta evidencia de irritación de la piel pero que los animales puedan tolerar bien en cada fase de inducción.La concentración de provocación será la máxima que no induzca irritación cutánea alguna en los animales no sensibilizados.Estas concentraciones pueden determinarse mediante un estudio preliminar reducido (2 ó 3 animales).1.6.1.2.4. Período de observaciónDurante el período de inducción, se observa la piel para controlar los posibles efectos irritantes. Después de la exposición de provocación, se registran las reacciones cutáneas, 24 y 48 horas después de quitar el apósito.1.6.1.3. ProcedimientoSe pesan los animales antes de empezar y al terminar el ensayo. Se rasura el pelo de la región dorsal superior. El procedimiento consta de dos fases:1.6.1.3.1. InducciónDía 0 - grupo tratadoLas inyecciones intradérmicas, cada una de 0,1 ml, que a continuación se indican se ponen por pares en el dorso superior, de forma que una de las inyecciones del par se sitúe a un lado de la línea media y la otra en el opuesto:Inyección 1: 0,1 ml de adyuvante completo de Freunds (FCA) mezclado con agua o suero fisiológico 1:1,Inyección 2:0,1 ml de sustancia de ensayo, en un vehículo adecuado, si fuera necesario:Inyección 3:0,1 ml de sustancia de ensayo en FCA.En la inyección 3, las sustancias hidrosolubles se disuelven en 0,05 ml de agua y 0,05 ml de FCA no diluido. Si se ensayan sustancias liposolubles o insolubles, se mezclan con FCA no diluido.En la inyección 3, la concentración final de la sustancia de ensayo será igual que la de la inyección 2.Las inyecciones 1 y 2 se hacen próximas una de la otra y lo más cerca posible de la cabeza, mientras que la inyección 3 se sitúa hacia la parte caudal de la superficie de ensayo.Día 0 - lote testigoLas inyecciones intradérmicas siguientes se ponen por pares en los mismos lugares citados:Inyección 1:0,1 ml de FCA mezclado con agua o suero fisiológico 1:1Inyección 2:0,1 ml de vehículo solo;Inyección 3:0,1 ml de vehículo en FCA.Sexto día - lotes tratados y testigoSi la sustancia no es irritante para la piel, se pincela la zona de ensayo, tras esquilarla y/o rasurarla, con 0,5 ml de laurilsulfato sódico al 10 % en vaselina, para crear irritación local.Séptimo día - lote tratadoSe elimina de nuevo el pelo de la zona de ensayo. Por medio de un vehículo adecuado se vierte la sustancia (debe justificarse la elección del vehículo; los sólidos, pulverizados finamente, se incorporan a un vehículo adecuado; los líquidos se pueden aplicar directamente) sobre un papel de filtro (2 × 4 cm) que se aplica sobre la superficie de ensayo y se mantiene en contacto con la zona de ensayo mediante un apósito oclusivo durante 48 horas.Séptimo día - lote testigoSe elimina de nuevo el pelo de la zona de ensayo. Se aplica sólo el vehículo, sobre la zona de ensayo, según el mismo método, y se mantiene en contacto con la piel mediante un vendaje oclusivo durante 48 horas.1.6.1.3.2. ProvocaciónVigésimo primer díaSe elimina el pelo de los costados de los animales tratados y de los testigos. Se aplica un apósito o una cámara con sustancia de ensayo sobre un costado de los animales tratados, mientras que en el otro costado se les aplica un apósito o una cámara únicamente con vehículo.Los apósitos se mantienen en contacto con la piel mediante un vendaje oclusivo durante 24 horas.Se somete el grupo testigo a la misma manipulación.Vigésimo tercer y vigésimo cuarto días- 21 horas después de haber levantado el apósito se limpia de pelo si fuera necesario la superficie sometida a ensayo,- 3 horas más tarde (48 horas después de comenzar la aplicación de provocación) se observa y registra la reacción cutánea,- 24 horas después de esta observación, se procede a una segunda observación (72 horas) que se registra.Para precisar los resultados obtenidos en esta primera fase de provocación, se puede programar una segunda, si fuera necesario con un nuevo grupo testigo para el vehículo, más o menos una semana después de la primera fase.Todas las reacciones cutáneas y todas las observaciones no habituales que se deriven de las fases de inducción y de provocación deben registrarse y consignarse en el informe.Pueden utilizarse técnicas como el estudio histopatológico o la medida del espesor del pliegue cutáneo para aclarar reacciones o respuestas dudosas, enmascaradas por la tinción de la piel por la sustancia de ensayo.1.6.2. Ensayo de Buehler1.6.2.1. PreparativosSe eligen al azar cobayas albinos jóvenes y sanos y se reparten en lotes tratados y lotes testigo. Antes de administrar la sustancia, se esquila y/o se rasura el pelo de un costado, procurando no dañar la piel.1.6.2.2. Condiciones del ensayo1.6.2.2.1. Animales de laboratorioSe utilizan cepas de cobayas albinos usadas corrientemente en laboratorios, con peso individual menor de 500 g.1.6.2.2.2. Número y sexoPueden usarse animales de ambos sexos. Si se utilizan hembras, deberán ser nulíparas y no grávidas. Se usarán al menos 20 animales en el lote tratado y al menos 10 en el lote testigo. Si se utiliza un número menor de animales, deberá explicarse la razón. Si se obtienen resultados dudosos, se decidirá si se repite el ensayo, con otro lote de animales, según el examen histopatológico.1.6.2.2.3. DosisLa concentración de la sustancia de ensayo, en cada fase de inducción se ajusta al nivel máximo que tenga buena tolerancia sistémica y que, en cuanto a las sustancias irritantes, produzca irritación moderada o leve en la mayoría de los animales de ensayo. La concentración de provocación será la máxima que no produzca señales de irritación cutánea en animales no sensibilizados. Estas concentraciones pueden determinarse mediante un estudio preliminar reducido (2 ó 3 animales).1.6.2.2.4. Período de observaciónDurante el período de inducción, se observa la piel para controlar los efectos irritantes. Después de la exposición de provocación, se registran las reacciones cutáneas 24 y 48 horas después de quitar el apósito, es decir, 30 y 54 horas después del comienzo de la aplicación.1.6.2.3. ProcedimientoSe pesan los animales antes de empezar y al terminar el ensayo.El procedimiento consta de dos fases:1.6.2.3.1. InducciónDía 0 - lote tratadoSe elimina el pelo de un costado. Por medio de un vehículo adecuado (debe justificarse la elección del vehículo, los líquidos pueden, si procede, aplicarse directamente) se distribuyen 0,5 ml de la sustancia en un algodón, que se aplica a la zona de ensayo y se mantiene en contacto con la piel por medio de un apósito oclusivo o una cámara y una sujeción adecuada durante 6 horas.Día 0 - lote testigoSe elimina el pelo de un costado. Se aplica sólo el vehículo a la zona de ensayo, según el mismo método, y se mantiene en contacto con la piel por medio de un apósito oclusivo o una cámara y una sujeción adecuada durante 6 horas.Séptimo y decimocuarto díasSe hace la misma aplicación que el día 0 en la misma zona de ensayo (eliminar el pelo si es necesario), los días séptimo y decimocuarto.1.6.2.3.2. ProvocaciónVigésimo octavo díaSe elimina el pelo del otro costado de los animales tratados y testigo. Se aplica un apósito oclusivo o una cámara que contenga 0,5 ml de la sustancia de ensayo, a la máxima concentración no irritante, a la parte posterior del costado de los animales tratados. Se aplica también a la parte anterior del costado un apósito oclusivo o una cámara con vehículo solo.Los apósitos oclusivos se mantienen en contacto mediante una sujeción adecuada durante 6 horas.El lote testigo se somete a la misma manipulación.Vigésimo noveno y trigésimo días- la zona de provocación se limpia y se limpia de pelo, si es necesario, 21 horas después de quitar el apósito- tres horas más tarde (30 horas desde el comienzo del ensayo de provocación) se observa y registra la reacción cutánea,- se hace una segunda observación 24 horas después de la anterior (54 horas) y se registra.1.6.2.3.3. Observación y graduaciónDeben registrarse y consignarse en el informe todas las reacciones cutáneas y todas las observaciones no habituales que se deriven de los procedimientos de inducción y provocación.Pueden utilizarse técnicas como el estudio histopatológico o la medida del espesor del pliegue cutáneo para aclarar reacciones o respuestas dudosas, enmascaradas por la tinción de la piel por la sustancia de ensayo.2. RESULTADOS (ensayo de maximización en cobayas y ensayo de Buehler)Los resultados deben inventariarse en un cuadro que indique, para cada animal, las reacciones cutáneas anotadas en cada observación.3. INFORME (ensayo de maximización en cobayas y ensayo de Buehler)3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- cepa de cobaya utilizada,- condiciones del ensayo, vehículo y concentraciones de la sustancia utilizadas para la inducción y la provocación,- número, edad y sexo de los animales,- peso de cada animal al comienzo y al final del ensayo,- cada observación individual realizada en cada animal, incluido el sistema de graduación si se hubiera utilizado,- discusión de los resultados,- interpretación de los resultados.3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN (ensayo de maximización en cobayas y ensayo de Buehler)Véase la introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).B.7. TOXICIDAD POR ADMINISTRACIÓN CONTINUADA (28 DÍAS) VÍA ORAL1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto B).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOSe administra diariamente la sustancia de ensayo, por vía oral y en dosis diversas a varios lotes de animales, a razón de una dosis por lote durante un período de 28 días. Durante el período de administración, se observa a los animales todos los días con el fin de descubrir los efectos tóxicos. Se practica la autopsia a los animales que mueren durante el ensayo y, al final del mismo, a los que hayan sobrevivido.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. PreparaciónSe mantiene a los animales en las condiciones de alojamiento y alimentación adecuadas para el experimento, por lo menos los cinco días anteriores al mismo. Antes de comenzar el ensayo, se eligen al azar animales jóvenes y sanos y se reparten en lotes. Las sustancias de ensayo pueden ser administradas con el alimento, por alimentación forzada, en cápsulas o con el agua. Las dosis deben administrarse de la misma manera durante todo el experimento. Si para facilitar la administración se utiliza un vehículo u otros aditivos, éstos no deben ser tóxicos. Pueden utilizarse los datos ya publicados.1.6.2. Condiciones del ensayo1.6.2.1. Animales de laboratorioSalvo indicación contraria, la rata es la especie idónea. Hay que utilizar animales jóvenes y sanos de una cepa de laboratorio corriente; en condiciones ideales, la sustancia debe empezar a administrarse antes de que las ratas alcancen las seis semanas de edad; en ningún caso pueden tener más de ocho semanas.Al principio del experimento, la diferencia de peso entre los animales utilizados no debe exceder del ± 20 % del valor medio apropiado.1.6.2.2. Número y sexoDeben utilizarse por lo menos 10 animales (5 hembras y 5 machos) para cada dosis. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. Si se van a sacrificar algunos animales durante el experimento habrá que añadir al número de animales la cantidad que se haya previsto sacrificar. Además, puede tratarse un lote satélite de 10 animales (5 de cada sexo) con la dosis más elevada durante 28 días para observar la reversibilidad, la persistencia o la aparición tardía de efectos tóxicos durante los 14 días siguientes al tratamiento. Se utiliza también un lote satélite de 10 animales testigo (5 de cada sexo).1.6.2.3. DosisSe utilizan al menos 3 dosis y un testigo. A excepción de la administración de la sustancia de ensayo, los animales del lote testigo deben ser tratados de la misma forma que los de los lotes de ensayo. Si para facilitar la administración se utiliza un vehículo, éste se administrará también a los testigos, procediendo de la misma forma que con los lotes tratados; el volumen será el mismo que se administre al lote tratado con la dosis más elevada. La dosis más elevada debe producir efectos tóxicos que no originen la muerte de ningún animal (o sólo de algunos). La dosis más baja no debe producir ningún efecto tóxico detectable. Si se dispone de una estimación aceptable sobre la exposición del hombre, la dosis más baja administrada debe ser superior a este valor. En condiciones óptimas, la dosis media debe producir unos efectos tóxicos observables mínimos. Si se utilizan varias dosis intermedias, la diferencia entre ellas debe ser suficiente para producir una gradación de los efectos tóxicos. En los lotes correspondientes a las dosis bajas o intermedias, así como en el lote testigo, la mortalidad debe ser baja para que la evaluación de los resultados sea significativa.Cuando la sustancia de ensayo se administre con el alimento, se puede utilizar una concentración alimentaria constante (ppm o mg/kg de comida) o bien una dosis constante por unidad de peso corporal de los animales; debe precisarse el método escogido. En el caso de una sustancia administrada por alimentación forzada, las dosis deben administrarse todos los días a la misma hora y su cantidad debe adaptarse (semanal o bisemanalmente) a fin de conservar un nivel de dosis constante por unidad de peso del animal.1.6.2.4. Prueba límiteSi durante un experimento de 28 días efectuado según el método descrito a continuación, con una dosis de 1 000 mg/kg por de peso corporal y por día o con una dosis más elevada, en función de una posible exposición humana (si se conoce), no se descubre ningún efecto tóxico, puede ser innecesario continuar el experimento. Cuando se trata de sustancias de baja toxicidad, administradas con el alimento, es preciso asegurarse de que su cantidad o sus propiedades no interfieren con las exigencias nutricionales normales.1.6.2.5. Período de observaciónSe deben observar todos los animales diariamente y registrar los síntomas de toxicidad así como el momento de su aparición, su intensidad y su duración. Asímismo deben registrarse el momento de la muerte y el momento en que aparecen y desaparecen los síntomas de toxicidad.1.6.3. ProcedimientoLas dosis de sustancia se administran a los animales, en condiciones óptimas, todos y cada uno de los días, durante un período de 28 días. Los animales de los lotes satélite previstos para las observaciones complementarias deben mantenerse en observación durante 14 días más, sin tratamiento, con el fin de descubrir la recuperación o la persistencia de los efectos tóxicos.La observación debe incluir las modificaciones del pelo, la piel, los ojos y las mucosas, el aparato respiratorio, el sistema circulatorio, los sistemas nerviosos autónomo y central, la actividad somatomotriz y el comportamiento. El consumo alimentario (y el consumo de agua cuando la sustancia de ensayo se administre con el agua de bebida) y el peso de los animales deben determinarse cada semana. Es necesario observar regularmente a los animales para tratar, en la medida de lo posible, no se pierdan por razones como el canibalismo, autolisis de los tejidos o error de emplazamiento. Al final del período de estudio, se hará la autopsia en todos los animales supervivientes de los lotes tratados no satélites. Los animales moribundos y los que presenten angustia o dolor graves se retirarán inmediatamente, se sacrificarán de forma humanitaria y se les hará la autopsia.Al terminar el período de ensayo se efectuarán los siguientes exámenes sobre todos los animales, incluidos los testigos:1. examen hematológico que incluya al menos el hematocrito, la concentración de hemoglobina, el recuento de los hematíes y leucocitos, la fórmula leucocitaria y un estudio de la coagulación;2. determinaciones bioquímicas clínicas de la sangre que incluyan al menos un parámetro sobre las funciones hepática y renal: alanina-aminotransferasa (conocida antiguamente con el nombre de glutamato-piruvato-transaminasa) y aspartato aminotransferasa (conocida antiguamente con el nombre de glutamato-oxalacetato-transaminasa) del suero, nitrógeno ureico, albúmina, creatinina plásmatica, bilirrubina total y proteínas séricas totales.Otras determinaciones que pueden ser necesarias para una evaluación toxicológica adecuada incluyen el calcio, el fósforo, los cloruros, el sodio, el potasio, la glucosa en ayunas, los lípidos, las hormonas, el equilibrio ácido básico, la metahemoglobina y la actividad colinesterásica.Si es necesario, pueden efectuarse otros análisis bioquímicos clínicos para profundizar el estudio de los efectos tóxicos observados.1.6.3.1. Autopsia generalSe debe practicar una autopsia general completa a todos los animales del ensayo. Al menos el hígado, los riñones, las glándulas suprarrenales y los testículos se deben pesar húmedos, lo más rápidamente posible después de la disección, para evitar que se sequen. Los órganos y tejidos (hígado, riñones, bazo, testículos, glándulas suprarrenales y corazón, así como cualquier otro órgano que presente lesiones macroscópicas o modificaciones volumétricas) deberán conservarse en un medio apropiado para que puedan realizarse exámenes histopatológicos posteriores.1.6.3.2. Examen histopatológicoHay que practicar un examen histopatológico de los órganos y tejidos conservados del lote expuesto a la dosis más elevada y del lote testigo. Los órganos y los tejidos que presenten lesiones atribuibles a la sustancia de ensayo en el nivel de dosis más elevado deberán examinarse en todos los lotes que hayan estado expuestos a dosis más bajas. Deberá hacerse un examen histológico a todos los animales de los lotes satélites, centrado especialmente en los órganos y tejidos en los que se hayan comprobado lesiones en los otros lotes tratados.2. RESULTADOSLos resultados deberán inventariarse en una tabla que indique, para cada lote del experimento, el número de animales al principio del ensayo y el número de animales en los que se haya observado cada tipo de lesión.Todos los resultados observados deben evaluarse por medio de un método estadístico adecuado. Podrá utilizarse cualquier método estadístico reconocido.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especie, cepa, origen, condiciones ambientales, régimen alimentario etc.,- condiciones de ensayo,- dosis (incluido, en su caso, el vehículo) y concentraciones,- respuesta tóxica por sexo y por dosis,- nivel que no produce ningún efecto (si es posible),- momento de la muerte durante el experimento o indicación de que los animales han sobrevivido al mismo,- efectos tóxicos u otros,- momento de observación de cualquier síntoma anormal y su evolución,- cantidades de alimento y peso corporal,- análisis hematológicos practicados y resultados completos,- análisis bioquímicos clínicos practicados y resultados completos,- resultados de la autopsia,- descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas,- tratamiento estadístico de los resultados, cuando proceda,- discusión de los resultados,- interpretación de los resultados.3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).B.8. TOXICIDAD POR ADMINISTRACIÓN CONTINUADA (28 DÍAS) POR INHALACIÓN1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNEs útil disponer de información preliminar sobre la distribución de las partículas por tamaño, la presión de vapor, el punto de fusión, el punto de ebullición, el punto de inflamación y la capacidad explosiva (si procede) de la sustancia.Véase también la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto B).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOSe exponen varios grupos de animales, diariamente, durante un tiempo determinado, a la sustancia de ensayo en concentraciones distintas, utilizándose una sola concentración para cada lote, durante un período de 28 días. Cuando se utilice un vehículo para obtener una concentración adecuada de la sustancia en la atmósfera, se utilizará un lote testigo para el vehículo. Durante el período de administración se observa diariamente a los animales a fin de descubrir los síntomas de toxicidad. Se practica la autopsia a los animales que mueren durante el experimento y, al final del mismo, a los que hayan sobrevivido.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. PreparaciónSe mantiene a los animales en las condiciones de alojamiento y alimentación adecuadas para el experimento, por lo menos durante los cinco días anteriores al mismo. Antes de comenzar el ensayo, se eligen al azar animales jóvenes y sanos y se reparten en lotes. Si es necesario, se puede añadir un vehículo apropiado a la sustancia de ensayo para obtener una concentración apropiada de ésta en la atmósfera. Si se utiliza un vehículo u otros aditivos para facilitar las dosis, éstos no deberán ser tóxicos. Pueden utilizarse datos ya publicados.1.6.2. Condiciones de ensayo1.6.2.1. Animales de laboratorioSalvo indicación contraria, la rata es la especie idónea. Hay que utilizar animales jóvenes y sanos de una cepa de laboratorio corriente.Al principio del experimento, la diferencia de peso entre los animales no debe exceder del ± 20 % del valor medio apropiado.1.6.2.2. Número y sexoDeben utilizarse diez animales (5 hembras y 5 machos) para cada lote experimental. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. Si se van a sacrificar algunos animales durante el experimento, habrá que añadir la cantidad de animales que se haya previsto sacrificar. Además, puede tratarse un lote satélite de 10 animales (5 de cada sexo) con la dosis más elevada durante 28 días para observar la reversibilidad, la persistencia o la aparición tardía de efectos tóxicos durante los 14 días siguientes al tratamiento. Se utiliza también un lote satélite de 10 animales testigo (5 de cada sexo).1.6.2.3. Concentración de exposiciónSon necesarias al menos tres concentraciones, así como un lote testigo y, en su caso, un lote testigo para el vehículo (la concentración del vehículo debe ser la del nivel de exposición más elevado). A excepción de la inhalación de la sustancia, los animales del grupo testigo deben ser tratados de la misma forma que los de los grupos experimentales. La dosis más elevada debe producir efectos tóxicos que no originen la muerte de ningún animal (o sólo de algunos). La dosis más baja no debe producir ningún efecto tóxico detectable. Si se dispone una estimación aceptable sobre la exposición del hombre, la concentración más baja administrada debe ser superior a este valor. En condiciones ideales, la concentración intermedia debe producir unos efectos tóxicos observables mínimos. Si se utilizan varias concentraciones intermedias, la diferencia entre ellas debe ser suficiente para producir una gradación de los efectos tóxicos. En los lotes correspondientes a las concentraciones bajas e intermedias, así como en los lotes testigo, la mortalidad debe ser baja para que la evaluación de los resultados sea significativa.1.6.2.4. Período de exposiciónLa exposición diaria debe ser de 6 horas, pero pueden resultar necesarios otros períodos de exposición para responder a algunas exigencias específicas.1.6.2.5. EquipoLos animales deben estar expuestos a la sustancia por medio de un dispositivo de inhalación que asegure un flujo continuo de aire de al menos 12 renovaciones por hora, garantizando un contenido en oxígeno apropiado y un reparto uniforme del producto de ensayo en el aire. Si se utiliza una cámara, debe estar concebida para impedir el amontonamiento de los animales y asegurar su exposición máxima, por inhalación de la sustancia de ensayo. Por regla general, para garantizar la estabilidad de la atmósfera de una cámara se debe procurar que el «volumen» total de animales de laboratorio no sobrepase el 5 % del volumen de la cámara de ensayo. También se puede recurrir a un sistema de exposición oro-nasal, únicamente de la cabeza o de cuerpo entero, en una cámara individual; con los dos primeros tipos de exposición se evita la absorción de la sustancia por otras vías.1.6.2.6. Período de observaciónDeberá observarse diariamente a los animales para descubrir los síntomas de toxicidad durante todo el período de tratamiento y de recuperación. Deberán registrarse el momento de la muerte y el momento en que aparecen y desaparecen los síntomas de toxicidad.1.6.3. ProcedimientoLos animales están expuestos a la sustancia de ensayo diariamente entre 5 y 7 días por semana, durante un período de 28 días. Los animales de los grupos satélite destinados a observaciones complementarias deberán mantenerse en observación durante 14 días más, sin tratamiento, con el fin de descubrir la desaparición o la persistencia de los efectos tóxicos. La temperatura a la que se efectúa el ensayo debe ser de 22  C ± 3  C.En condiciones ideales, la humedad relativa debe mantenerse entre el 30 y el 70 %, pero, en algunos casos, esto puede resultar imposible (por ejemplo, ensayos con aerosoles). Se puede evitar la pérdida de sustancia por dispersión a la zona circundante manteniendo una ligera presión negativa (&le; 5 mm de agua) dentro de la cámara. Durante la exposición los animales no deben recibir alimento ni agua.Es conveniente utilizar un sistema de inhalación que funcione en condiciones dinámicas provisto de un dispositivo adecuado para el control analítico de la concentración. Para determinar las concentraciones de exposición adecuadas, se recomienda proceder a un ensayo preliminar. El caudal deberá ajustarse de manera que las concentraciones sean homogéneas en toda la cámara. El sistema debe permitir obtener lo más rápidamente posible unas condiciones de exposición estables.Se debe medir o controlar:(a) el caudal de aire (permanentemente);(b) la concentración real de la sustancia de ensayo, medida en la zona de respiración. Durante el período de exposición diaria la concentración no debe variar en más de ± 15 % respecto del valor medio. Sin embargo, en el caso de algunos aerosoles, es difícil alcanzar este grado de control, aceptándose en dichos casos una diferencia mayor. Durante todo el ensayo hay que mantener las concentraciones diarias lo más constantes posible. En el caso de los aerosoles, se hará al menos un análisis semanal del tamaño de las partículas en cada lote de ensayo;(c) temperatura y humedad, permanentemente si es posible.Las observaciones tienen lugar durante y después de la exposición y se registran sistemáticamente; deben conservarse individualmente los datos de cada animal. Deben observarse diariamente todos los animales y registrar los síntomas de toxicidad, así como el momento de su aparición, su intensidad y su duración. La observación incluirá las modificaciones del pelo y la piel, los ojos y las mucosas, el aparato respiratorio, el sistema circulatorio, los sistemas nerviosos autónomo y central, la actividad somato-motriz y el comportamiento. El peso de los animales debe determinarse cada semana. Se recomienda igualmente medir el consumo alimentario cada semana. Es necesario observar regularmente a los animales para procurar que no se pierdan en el ensayo por razones como el canibalismo, autolisis de los tejidos o error de emplazamiento. Al final del ensayo se practicará la autopsia a todos los animales supervivientes de los lotes tratados no satélites. Los animales moribundos y los que muestren angustia o dolor graves deberán ser retirados inmediatamente, se sacrificarán de forma humanitaria y se les practicará la autopsia.Los exámenes que figuran a continuación se efectuarán en todos los animales (incluidos los testigos) al terminar el ensayo:(i) análisis hematológico que incluya al menos el hematocrito, la concentración de hemoglobina, el recuento de hematíes y leucocitos, la fórmula leucocitaria, así como un estudio de la coagulación;(ii) determinaciones bioquímicas clínicas de la sangre incluyendo al menos un parámetro sobre las funciones hepática y renal: alanina aminotransferasa (antiguamente conocida con el nombre de glutamano-piruvato-transaminasa) y aspartato aminotransferasa (antiguamente conocida con el nombre de glutamato-oxalacetato-transaminasa) del suero, nitrógeno ureico, albúmina, creatinina plasmática, bilirrubina total y proteínas séricas totales.Otras determinaciones que pueden ser necesarias para una evaluación toxicológica adecuada incluyen el calcio, el fósforo, los cloruros, el sodio, el potasio, la glucosa en ayunas, los lípidos, las hormonas, el equilibrio ácido-básico, la metahemoglobina y la actividad colinesterásica.Si es necesario pueden realizarse otros análisis bioquímicos para profundizar el estudio de los efectos tóxicos observados.1.6.3.1. Autopsia generalSe deberá practicar una autopsia general completa a todos los animales del ensayo. Al menos el hígado, los riñones, las glándulas suprarrenales, los pulmones y los testículos se deben pesar húmedos, lo más rápidamente posible después de la disección para evitar que se sequen. Los órganos y tejidos deben conservarse en un medio apropiado para que puedan realizarse exámenes histopatológicos posteriores: las vías respiratorias, el hígado, los riñones, el bazo, los testículos, las glándulas suprarrenales y el corazón, así como todos los órganos que presenten lesiones macroscópicas o modificaciones volumétricas. Los pulmones deben extraerse enteros, pesarse y tratarse con un fijador adecuado para conservar la estructura pulmonar.1.6.3.2. Examen histopatológicoHay que practicar un examen histopatológico de los órganos y tejidos conservados del lote expuesto a la concentración más alta y del lote o lotes testigo. Los órganos y los tejidos que presenten lesiones atribuibles a la sustancia de ensayo en la concentración más elevada deben ser examinados en todos los grupos que hayan estado expuestos a concentraciones más bajas. Deberá someterse a un examen histopatológico a los animales de todos los grupos satélite, centrado especialmente en los órganos y tejidos en los que se hayan comprobado lesiones en los otros lotes tratados.2. RESULTADOSLos resultados deben inventariarse en una tabla que indique, para cada lote de ensayo, el número de animales al comienzo del ensayo y el número de animales en los que se haya observado cada tipo de lesión.Todos los resultados observados deben evaluarse por medio de un método estadístico adecuado. Puede utilizarse cualquier método estadístico reconocido.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especie, cepa, origen, condiciones ambientales, régimen alimentario, etc.,- condiciones de ensayo:Hay que describir el aparato de exposición, incluidos diseño, tipo, dimensiones, fuente de aire, sistema generador de aerosoles, método de acondicionamiento del aire, tratamiento del aire de salida y, en su caso, método de alojamiento de los animales en la cámara de ensayo. Debe describirse el equipo utilizado para medir la temperatura, la humedad y, en su caso, la estabilidad de las concentraciones de aerosoles o la granulometría.Datos relativos a la exposición:Deben presentarse en forma de tabla, indicando los valores medios y una medida de la variabilidad (por ejemplo, desviación típica); deben incluir, en la medida de lo posible:a) caudales de aire a través del dispositivo de inhalación,b) temperatura y humedad del aire,c) concentraciones nominales (cantidad total de sustancia de ensayo introducida en el dispositivo de inhalación, dividida por el volumen del aire),d) en su caso, naturaleza del vehículo,e) concentraciones reales en la zona de respiración,f) diámetro aerodinámico de la mediana de la masa (DAMM) y desviación geométrica típica (DGT),- respuesta tóxica por sexo y concentración,- momento de la muerte durante el ensayo o indicación de que los animales han sobrevivido a la misma,- descripción de los efectos tóxicos o de otro tipo; nivel que no causa ningún efecto,- momento de observación de cualquier síntoma anormal y evolución del mismo,- cantidades de alimento y peso corporal,- análisis hematológicos practicados y resultados de éstos,- pruebas bioquímicas clínicas practicadas y resultados de éstas,- resultados de la autopsia,- descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas,- tratamiento estadístico de los resultados, si es posible,- discusión de los resultados,- interpretación de los resultados.3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).B.9. TOXICIDAD POR ADMINISTRACIÓN CONTINUADA (28 DÍAS) VÍA CUTÁNEA1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto B).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOLa sustancia de ensayo se aplica diariamente por vía cutánea en dosis distintas a varios lotes de animales de laboratorio, utilizándose una sola dosis para cada lote, durante un período de 28 días. Durante el período de aplicación se observa diariamente a los animales a fin de descubrir los síntomas de toxicidad. Se practica la autopsia a los animales que mueren durante el ensayo así como a los que sobreviven al final del mismo.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. PreparaciónSe mantiene a los animales en las condiciones de alojamiento y alimentación adecuadas para el experimento, por lo menos, durante los cinco días anteriores al mismo. Antes de comenzar el ensayo, se eligen al azar animales jóvenes y sanos y se reparten en lotes tratados y lotes testigo. Poco tiempo antes del ensayo se esquila la piel de la región dorsal de los animales. Se puede recurrir al rasurado, pero, en este caso, debe efectuarse unas 24 horas antes del ensayo. Suele ser necesario repetir el esquileo o el rasurado aproximadamente cada semana. Durante el esquileo o el rasurado hay que procurar no causar lesiones en la piel. La superficie que hay que despejar para aplicar la sustancia de ensayo no debe ser inferior al 10 % de la superficie corporal. Debe tenerse en cuenta el peso del animal para decidir la zona que hay que despejar y las dimensiones de la superficie que se va a tratar. Cuando la sustancia sea sólida (que, si es preciso, puede pulverizarse), deberá humedecerse con agua o, en su caso, con un vehículo apropiado, de forma que se asegure un buen contacto con la piel. Las sustancias líquidas se utilizan generalmente sin diluir. Se procede a una aplicación diaria, entre 5 y 7 días por semana.1.6.2. Condiciones de ensayo1.6.2.1. Animales de laboratorioPueden utilizarse ratas, conejos o cobayas adultos. Se pueden utilizar también otras especies pero, en este caso, se habrá de justificar su utilización.Al principio del ensayo la diferencia de peso entre los animales no debe exceder del ± 20 % del valor medio adecuado.1.6.2.2. Número y sexoDeben utilizarse al menos diez animales (5 hembras y 5 machos) de piel sana, para cada dosis. Las hembras deben ser nulíparas y no grávidas. Si se van a sacrificar algunos animales durante el ensayo habrá que añadir la cantidad de animales que se haya previsto sacrificar. Además, puede tratarse un lote satélite de 10 animales (5 de cada sexo) con el nivel de dosis más elevado durante 28 días para observar la reversibilidad, la persistencia o la aparición tardía de efectos tóxicos durante los 14 días siguientes al tratamiento. Se utiliza también un lote satélite de 10 animales testigo (5 de cada sexo).1.6.2.3. DosisSe utilizan al menos tres dosis, así como un lote testigo y, en su caso, un lote testigo para el vehículo. El período mínimo de exposición será de 6 horas diarias.La sustancia de ensayo debe aplicarse todos los días a la misma hora y las dosis deben adaptarse semanalmente o bisemanalmente con objeto de conservar un nivel de dosis constante respecto al peso corporal de los animales. A excepción de la administración de las sustancias de ensayo, debe tratarse a los animales del lote testigo de la misma forma que a los de los lotes experimentales. Cuando para facilitar la administración se utilice un vehículo, éste se administrará también al lote testigo, del vehículo en las mismas condiciones que a los lotes tratados; la dosis será la misma que se administre al grupo tratado con la dosis más elevada. La dosis más elevada debe producir efectos tóxicos que no originen la muerte de ningún animal (o sólo de algunos). La dosis más baja no debe producir ningún efecto tóxico detectable. Si se dispone de una estimación aceptable sobre la exposición del hombre, la dosis más baja administrada debe superar este valor. En condiciones óptimas la dosis intermedia debe producir unos efectos tóxicos observables mínimos. Si se utilizan varias dosis intermedias, la diferencia entre ellas debe ser suficiente para producir una graduación de los efectos tóxicos. En los lotes correspondientes a dosis bajas o intermedias, así como en los lotes testigo, la mortalidad debe ser baja para que la evaluación de los resultados sea significativa.Si la aplicación de la sustancia de ensayo provoca una irritación cutánea grave, deben reducirse las concentraciones; esto puede producir una disminución, incluso una desaparición, de otros efectos tóxicos en las dosis más elevadas. Si las lesiones cutáneas son muy graves, puede resultar necesario detener el experimento y comenzar de nuevo con concentraciones más bajas.1.6.2.4. Prueba límiteSi en un experimento preliminar realizado con una dosis de 1 000 mg/kg, o con una dosis más elevada en función de una posible exposición humana (si se conoce), no se ha observado ningún efecto tóxico, puede ser innecesario continuar el experimento.1.6.2.5. Período de observaciónSe deben observar todos los animales diariamente con el fin de descubrir los síntomas de toxicidad. Debe registrarse el momento de la muerte, así como el momento en que aparecen y desaparecen los síntomas de toxicidad.1.6.3. ProcedimientoLos animales deben estar alojados en jaulas individuales. En condiciones óptimas, la sustancia se administra a los animales todos los días, durante un período de 28 días. Los animales de todos los grupos satélites destinados a observaciones complementarias deben mantenerse en observación 14 días más, sin tratamiento, para comprobar la curación o la persistencia de los efectos tóxicos. La duración mínima de la exposición debe ser de 6 horas diarias. La sustancia debe aplicarse uniformemente sobre una superficie equivalente más o menos al 10 % de la superficie total corporal. Cuando se trata de sustancias altamente tóxicas, la superficie cubierta puede ser menor, pero procurando que al aplicar la sustancia se forme en toda la superficie una capa lo más fina y uniforme posible.Durante la exposición, la sustancia se mantiene en contacto con la piel mediante un apósito de gasa porosa y un esparadrapo no irritante. Además, la superficie tratada debe estar convenientemente cubierta para mantener en su sitio el apósito de gasa y la sustancia e impedir que los animales puedan ingerir esta última. Pueden utilizarse aparatos de contención para impedir la ingestión de la sustancia, pero no se recomienda una inmovilización completa. Puede usarse un dispositivo protector en forma de collar como método alternativo.Al término del período de exposición, hay que eliminar cualquier residuo de sustancia, a ser posible, con agua, o con cualquier otro procedimiento adecuado de limpieza de la piel.Deben observarse todos los animales diariamente y registrar los síntomas de toxicidad, así como el momento de su aparición, su intensidad y su duración. La observación incluirá las modificaciones del pelo y la piel, los ojos y las mucosas, el aparato respiratorio, el sistema circulatorio, los sistemas nerviosos autónomo y central, la actividad somato-motriz y el comportamiento. Semanalmente deben determinarse los pesos de los animales y se recomienda igualmente medir el consumo alimentario cada semana. Es necesario observar regularmente a los animales para procurar que no se pierdan en el experimento por razones como el canibalismo, autolisis de los tejidos o error de emplazamiento. Al término de la experiencia se practica la autopsia a todos los animales supervivientes de los lotes tratados no satélites. Los animales moribundos y los que presenten angustia o dolor graves se retirarán inmediatamente, se sacrificarán de forma humanitaria y se les practicará la autopsia.Al terminar el ensayo se efectuarán los siguientes análisis en todos los animales (incluidos los del lote testigo):1. análisis hematológico que incluya al menos el hematocrito, la concentración de hemoglobina, el recuento de hematíes y leucocitos, la fórmula leucocitaria, así como un estudio de la coagulación;2. determinaciones bioquímicas clínicas de la sangre incluyendo al menos un parámetro sobre las funciones hepáticas y renal: alanina-aminotransferasa (antiguamente conocida con el nombre de glutamato-piruvato-transaminasa) y aspartato aminotransferasa (antiguamente conocido con el nombre de glutamato-oxalacetato-transaminasa) del suero, nitrógeno ureico, albúmina, creatinina plasmática, bilirrubina total y proteínas séricas totales.Otras determinaciones que pueden ser necesarias para una evaluación toxicológica adecuada incluyen el calcio, fósforo, cloruros, sodio, potasio, glucosa en ayunas, lípidos, hormonas, el equilibrio ácido-básico, metahemoglobina y la actividad colinesterásica.Si es necesario, pueden realizarse otros análisis bioquímicos para profundizar el estudio de los efectos tóxicos observados.1.6.4. Autopsia generalSe practicará una autopsia general completa a todos los animales sometidos al ensayo. Al menos el hígado, los riñones, las glándulas suprarrenales y los testículos se deben pesar húmedos, lo más rápidamente posible después de la disección, para evitar que se sequen. Los órganos y tejidos, es decir, la piel normal y tratada, el hígado, los riñones, el bazo, los testículos, las glándulas suprarrenales, el corazón y los órganos diana (es decir los que presentan lesiones importantes o modificaciones volumétricas) deben conservarse en un medio apropiado para que puedan realizarse exámenes histopatológicos posteriores.1.6.5. Examen histopatológicoHay que practicar un examen histopatológico de los órganos y tejidos que se conserven del lote expuesto a la dosis más elevada y del lote testigo. Los órganos y los tejidos que presenten lesiones inducidas por la sustancia de ensayo en el nivel de dosis más elevado, deben examinarse en todos los lotes que hayan estado expuestos a dosis más bajas. Los animales del lote satélite deberán someterse a un examen histológico, centrado especialmente en los órganos y tejidos en los que se hayan comprobado lesiones en los demás lotes tratados.2. RESULTADOSLos resultados deberán inventariarse en un cuadro que indique, para cada lote de ensayo, el número de animales al comienzo del ensayo y el número de animales en los que se haya observado cada tipo de lesión.Todos los resultados observados deben evaluarse por medio de un método estadístico adecuado. Puede utilizarse cualquier método estadístico reconocido.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- datos relativos a los animales (especie, cepa, origen, condiciones ambientales, régimen alimentario, etc.),- condiciones de ensayo, (incluido el tipo de apósito: oclusivo o no oclusivo),- dosis (en su caso, también el vehículo) y concentraciones,- nivel que no produce ningún efecto, si es posible,- respuesta tóxica por sexo y dosis,- momento de la muerte durante el ensayo o indicación de que los animales han sobrevivido,- efectos tóxicos u otros,- momento de observación de cualquier síntoma anormal y su evolución,- cantidades de alimento y peso corporal,- análisis hematológicos practicados y resultados,- pruebas bioquímicas clínicas practicadas y resultados,- resultados de la autopsia,- descripción detallada de todas las observaciones histopatológicas,- tratamiento estadístico de los resultados, si es posible,- discusión de los resultados,- interpretación de los resultados.3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).B.10. ENSAYO CITOGENÉTICO «IN VITRO» EN MAMÍFEROS1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto C).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOEl ensayo citogenético in vitro es un ensayo de mutagenicidad a corto plazo destinado a descubrir aberraciones cromosómicas estructurales en células de mamíferos en cultivo. Pueden utilizarse cultivos de líneas celulares establecidas, así como cultivos de células primarias. Después de la exposición a las sustancias de ensayo en presencia y en ausencia de un sistema adecuado de activación metabólica, se tratan los cultivos celulares con un inhibidor mitótico, como la colchicina, con el fin de acumular las células en un estadio de la mitosis similar a la metafase (c-metafase). Las células se recolectan en el momento oportuno y se hacen preparaciones cromosómicas. Se tiñen estas preparaciones y se analizan las células en metafase para descubrir las aberraciones cromosómicas.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. Preparación1.6.1.1. CélulasSe utilizan líneas celulares establecidas o cultivos de células primarias, por ejemplo, células de hámster chino y linfocitos humanos. Las sustancias de ensayo se preparan en medio de cultivo o se disuelven en vehículos apropiados antes del tratamiento de las células.1.6.1.2. Sistema de activación metabólicaLas células deben exponerse a la sustancia de ensayo tanto en presencia de un sistema adecuado de activación metabólica como sin este sistema. El sistema más comúnmente utilizado es una fracción postmitocondrial suplementada con cofactor, preparada a partir de hígado de roedores tratados con agentes inductores de enzimas.1.6.2. Condiciones de ensayosNúmero de cultivosSe utilizan al menos dos cultivos para cada ensayo.Utilización de testigos positivos y negativosSe utilizan como testigos negativos el disolvente (cuando no sea el medio de cultivo o el agua), la mezcla de activación de enzimas hepáticas, la mezcla de activación de enzimas hepáticas con el disolvente y los testigos no tratados.Se incluye un testigo positivo en cada experimento; cuando se utilice la mezcla de activación de enzimas hepáticas para activar la sustancia de ensayo, el testigo positivo deberá ser una sustancia que necesite una activación metabólica.DosisComo mínimo se utilizan tres dosis de la sustancia de ensayo en un intervalo de al menos una unidad logarítmica; la dosis más elevada reducirá la actividad mitótica alrededor de un 50 % o mostrará alguna indicación de citotoxicidad. Si no es tóxica, la sustancia de ensayo se probará hasta su límite de solubilidad o hasta una concentración máxima de 5 mg/ml.Condiciones de cultivoSe utiliza un medio de cultivo y condiciones de incubación apropiados (por ejemplo, temperatura, recipientes de cultivo, concentraciones de CO2 y humedad).1.6.3. Procedimiento1.6.3.1. Preparación de los cultivosLíneas celulares establecidas: las células se obtienen a partir de cultivos madre (por ejemplo, por tripsinización o por agitación vigorosa), se siembran en recipientes de cultivo a la densidad adecuada y se incuban a 37  C.Linfocitos humanos: se añade sangre completa heparinizada a un medio de cultivo que contenga fitohemaglutinina, suero de feto de ternera y antibióticos, y se incuba a 37  C.1.6.3.2. Tratamiento de los cultivos con la sustancia de ensayoi) Tratamiento sin mezcla de activación de enzimas hepáticasTodos los tratamientos deben cubrir, a ser posible, al menos el período de un ciclo celular completo y los sistemas de fijación deben garantizar el análisis de las primeras mitosis posteriores al tratamiento de las células tratadas en los distintos estadios del ciclo.Cuando el tratamiento no cubre un ciclo celular completo, se escogen tiempos de fijación múltiples para extraer muestras de células que se encuentren en estadios diferentes del ciclo celular durante el tratamiento, es decir G1, S y G2.La sustancia de ensayo se añade a los cultivos de líneas celulares establecidas cuando estas estén en su fase de crecimiento exponencial. Los cultivos de linfocitos humanos se tratan cuando aún están en estado semisincrónico.ii) Tratamiento con mezcla de activación de enzimas hepáticasPara el tratamiento, la sustancia de ensayo en combinación con la mezcla de activación de enzimas hepáticas debe estar presente el mayor tiempo posible, aunque sin llegar a producir un efecto tóxico en las células. Si, por razones de toxicidad, el tratamiento no puede cubrir el período de un ciclo celular completo, se deben escoger tiempos de fijación múltiples para extraer muestra de células que se encuentren en diferentes estadios del ciclo celular en el momento del tratamiento, es decir G1, S y G2.Recolección de las célulasLos cultivos celulares se tratan con un inhibidor del huso mitótico antes de su recolección durante un período adecuado. Para la preparación de los cromosomas, cada cultivo se recolecta y trata por separado.Se necesitan al menos dos momentos de recolección de células. Se recomienda que uno se haga aproximadamente al final de un ciclo celular y otro más tarde; ello permite abarcar con seguridad todos los estadios del ciclo celular y prevé los retrasos de éste.1.6.3.3. Preparación de los cromosomasLa preparación de los cromosomas comprende un tratamiento hipotónico de las células, la fijación, la distribución en portaobjetos y la tinción.AnálisisPara descubrir las aberraciones cromosómicas, de cada cultivo se analizan al menos 100 metafases bien distribuidas. Los portaobjetos se codifican antes del análisis. En los linfocitos humanos sólo se analizan las metafases que contengan 46 centrómeros.En las líneas celulares establecidas, sólo se analizan las metafases con ± 2 centrómetros del número modal.Además debe valorarse durante el ensayo, para cada dosis, el índice mitótico o cualquier otra indicación de citotoxicidad, cuando proceda.2. RESULTADOSLos resultados se presentarán en forma de tabla. Se registrarán por separado las aberraciones de tipo cromatídico (lagunas, fracturas, intercambios), las aberraciones de tipo cromosómico (p. ej, lagunas, fracturas, cromosomas enanos, anillos, dicéntricos, policéntricos) y el número de metafases anormales (lagunas incluidas y excluidas), tanto de todos los cultivos tratados como de los cultivos testigo.Los resultados se evaluarán con métodos estadísticos apropiados.Los resultados se compararán con testigos negativos concomitantes.Se realizarán al menos dos ensayos independientes. Sin embargo, si hay justificación científica, puede bastar un ensayo único. No es necesario realizar el segundo de forma idéntica al ensayo inicial. De hecho, puede ser preferible alterar algunas condiciones del ensayo para obtener datos más útiles.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- células utilizadas,- condiciones del ensayo: composición del medio, concentración de CO2, temperatura de incubación, duración de la incubación, dosis, momento del tratamiento, duración del tratamiento con el inhibidor de huso mitótico y concentración de éste, tipo de mezcla de activación de enzimas hepáticas utilizada, testigos positivos y negativos,- número de cultivos celulares,- número de metafases analizadas (por separado para cada cultivo),- índice mitótico u otras indicaciones de citotoxicidad,- tipo y número de aberraciones por separado para cada cultivo tratado y testigo, número modal de cromosomas en las líneas celulares establecidas utilizadas,- evaluación estadística,- discusión de los resultados,- interpretación de los resultados.3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).B.11. ENSAYO CITOGENÉTICO IN VIVO EN MÉDULA ÓSEA DE MAMÍFEROS, ANÁLISIS CROMOSÓMICO1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto C).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOEl ensayo citogenético in vivo es un ensayo de mutagenicidad a corto plazo destinado a descubrir aberraciones cromosómicas estructurales que, generalmente, se evalúan durante la primera mitosis consecutiva al tratamiento. Con los mutágenos químicos, la mayor parte de las aberraciones inducidas son de tipo cromatídico.En este método, se utilizan células de médula ósea de mamíferos expuestos, por vías apropiadas, a las sustancias de ensayo y sacrificados a intervalos sucesivos. Antes de sacrificarlos, se trata a los animales por medio de sustancias tales como la colchicina, que actúan como inhibidores del huso, con el fin de acumular las células en una fase de mitosis del tipo metafásico (c-metafase). A partir de las células se efectúan preparaciones de cromosomas secadas al aire y, después, teñidas; a continuación se analizan las metafases en el microscopio para observar las aberraciones cromosómicas.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. PreparaciónSe disuelven las sustancias de ensayo en suero fisiológico. Si se trata de sustancias insolubles, se disuelven o se ponen en suspensión en vehículos apropiados.Se utilizan soluciones de la sustancia de ensayo recién preparadas. Si para facilitar la administración se utiliza un vehículo, éste no debe interferir con la sustancia de ensayo ni producir efectos tóxicos.1.6.2. Condiciones de prueba1.6.2.1. Animales de laboratorioSe utilizan roedores tales como la rata, el ratón o el hámster chino. Se eligen al azar animales adultos jóvenes y sanos, y se reparten en lotes tratados y lotes testigo.1.6.2.2. Número y sexoSe utilizan por lo menos 5 hembras y 5 machos en cada lote de ensayo y en cada lote testigo. Por lo tanto, se sacrificarán 10 animales por período y por lote si el programa del ensayo establece varios momentos de observación después del tratamiento. En el caso del lote testigo positivo, basta un solo tiempo de muestreo.1.6.2.3. Vía de administraciónEn general, las sustancias de ensayo sólo deben administrarse una vez. En función de la información toxicológica de que se disponga, podrá aplicarse un programa de administración repetida. No obstante, éste sólo se podrá aplicar si la sustancia de ensayo no produce un efecto citotóxico sobre la médula ósea. La administración se hace generalmente por vía oral o por inyección intraperitoneal. Tambien pueden ser apropiadas otras vías de administración.1.6.2.4. Utilización de testigos positivos y negativosComo testigo positivo se utiliza una sustancia que produzca aberraciones cromosómicas in vivo, incluyendo igualmente en el plan de cada ensayo un lote testigo negativo (disolvente).1.6.2.5. DosisPara el ensayo de base se utiliza una dosis de la sustancia de ensayo que debe ser la dosis máxima tolerada o la que haga aparecer algunos signos de citotoxicidad como, por ejemplo, una inhibición parcial de la mitosis.Para los compuestos «no tóxicos», la dosis máxima (límite) que debe investigarse tras una administración única es de 2 000 mg/kg de peso corporal.Si se utiliza un protocolo de dosis repetidas, la dosis límite es de 1 000 mg/kg de peso corporal.Pueden utilizarse otras dosis suplementarias cuando razones de orden científico así lo exijan.Si el ensayo sirve de método de verificación, es conveniente utilizar al menos dos dosis suplementarias.1.6.3. ProcedimientoEl ensayo puede realizarse de dos maneras:(i) se administra a los animales, en una sola vez, la sustancia de ensayo a la dosis máxima tolerada. De entrada, se toman muestras a las 24 horas después del tratamiento. Si los resultados son claramente positivos en este estadio, no será necesario tomar más muestras. No obstante, si los resultados son negativos o dudosos, dado que la cinética del ciclo celular puede verse influida por la sustancia de ensayo, se realizará una toma anterior y una toma posterior a intervalos apropiados entre las 6 y 48 horas siguientes a la administración de la sustancia.Cuando se utilicen dosis suplementarias, habrá que extraer las muestras en el período de sensibilidad máxima, o si no se conoce, 24 horas después del tratamiento;(ii) si la información farmacocinética y metabólica aconseja un programa de tratamiento repetido, se puede aplicar una administración repetida, tomando las muestras 6 y 24 horas después del último tratamiento.Preparación de la médula óseaAntes de sacrificar los animales, se les inyecta, por vía intraperitoneal, una dosis adecuada de inhibidor de huso mitótico para obtener un número apropiado de células en c-metafase. Se extrae la médula ósea de los dos fémures de cada uno de los animales recién sacrificados, mediante enjuague con una solución isotónica. Después de un tratamiento hipotónico idóneo, se fijan las células y luego se distribuyen en portaobjetos. Una vez se hayan secado al aire, los portaobjetos se tiñen.AnálisisLos portaobjetos se codifican antes de analizarlos en el microscopio. Se analizan, por cada animal, al menos 50 metafases bien distribuidas que incluyan el número completo de centrómeros, para descubrir las aberraciones cromosómicas estructurales. Además, pueden establecerse los índices mitóticos para cada animal.2. RESULTADOSLos resultados se presentarán en forma de tabla. Se registrarán por separado y para todos los animales tratados y testigos las aberraciones de tipo cromatídico e isocromatídico (lagunas, gaps, fracturas, intercambios) y el número de metafases anormales (lagunas incluídas y excluídas) así como los índices mitóticos (cuando se establezcan). Igualmente se registrarán las medias y las desviaciones típicas obtenidas para cada lote tratado y para cada lote testigo. Los resultados se evaluarán mediante los métodos estadísticos adecuados.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especie, cepa y edad de los animales utilizados,- número de animales de cada sexo de los lotes de ensayo y de los testigos,- condiciones de ensayo: descripción detallada del programa de tratamiento y de extracción de muestras, dosis, duración del tratamiento con el inhibidor de huso mitótico usado y su concentración,- número de metafases analizadas por animal,- índices mitóticos (si se han establecido),- tipo y número de aberraciones por separado para cada animal tratado y testigo,- signos de toxicidad durante el estudio,- evaluación estadística,- discusión de los resultados,- interpretación de los resultados.3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).B.12. MUTAGENICIDAD (ENSAYO DE MICRONÚCLEOS)1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto C).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOLa prueba de micronúcleos es un ensayo in vivo a corto plazo destinado a descubrir las lesiones cromosómicas o del aparato mitótico inducidas por sustancias químicas. Este ensayo se basa en un aumento del número de micronúcleos en los eritrocitos policromáticos de los animales tratados respecto de los animales testigo.Los micronúcleos están formados por fragmentos de cromosomas o por cromosomas enteros retrasados en la mitosis. Cuando los eritroblastos se transforman en eritrocitos, el núcleo principal es expulsado, mientras que el micronúcleo puede ser conservado en el citoplasma. Para este ensayo se utilizan eritrocitos policromáticos jóvenes procedentes de la médula ósea de mamíferos de laboratorio que hayan estado expuestos, por las vías apropiadas, a la sustancia de ensayo. Después de extraer la médula ósea, se preparan y tiñen frotis. Se cuenta en el microscopio el número de micronúcleos presentes en los eritrocitos policromáticos y se establece la relación entre eritrocitos policromáticos y normocromáticos.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. PreparaciónLas sustancias de ensayo se disuelven en solución isotónica. Si se trata de sustancias insolubles, se disuelven o se ponen en suspensión en vehículos adecuados. Si se utiliza un vehículo, no debe interferir con la sustancia de ensayo ni producir efectos tóxicos. Normalmente, se utilizan soluciones de la sustancia de ensayo recién preparadas.1.6.2. Condiciones de prueba1.6.2.1. Animales de laboratorioSe recomienda utilizar ratones, pero también pueden utilizarse otros mamíferos. Se eligen al azar animales adultos jóvenes y sanos, y se reparten en lotes tratados y lotes testigo.1.6.2.2. Número y sexoSe utilizan por lo menos 5 hembras y 5 machos en cada lote experimental y en cada lote testigo. Por lo tanto, se sacrificarán 10 animales por período y por lote si el programa establece varios momentos de observación después del tratamiento. En el caso del lote testigo positivo, basta una sola toma de muestras.1.6.2.3. Vía de administraciónEn general, las sustancias de ensayo sólo deben administrarse una vez. En función de la información toxicológica de que se disponga, podrá aplicarse un programa de administración repetida. No obstante, éste sólo se podrá aplicar si la sustancia de ensayo no produce un efecto citotóxico sobre la médula ósea. La administración se hace generalmente por vía oral o por inyección intraperitoneal. Tambien pueden ser apropiadas otras vías de administración.1.6.2.4. Utilización de testigos positivos y negativosSe utilizarán testigos positivos y negativos (disolvente) en cada prueba.1.6.2.5. DosisPara el ensayo de base se utiliza una sola dosis de la sustancia de ensayo, que debe ser la dosis máxima tolerada o la que haga aparecer algunos signos de citotoxicidad como, por ejemplo, una modificación parcial de la relación eritrocitos policromáticos/eritrocitos normocromáticos.La dosis máxima (límite) de compuestos «no tóxicos» que debe investigarse tras la administración de una dosis única es de 2 000 mg/kg de peso corporal.Si se emplea un programa de administración repetida, la dosis límite será de 1 000 mg/kg de peso corporal y día.Pueden utilizarse otras dosis suplementarias cuando razones de orden científico así lo exijan.Si el ensayo sirve de método de verificación es conveniente utilizar al menos dos dosis suplementarias.1.6.3. ProcedimientoEl ensayo puede realizarse de dos maneras:(i) se administra a los animales, en una sola vez, la sustancia de ensayo. Las tomas de muestras deben efectuarse en el momento correspondiente a la sensibilidad máxima del ensayo, el cual varía según la sustancia de ensayo. Por eso, se extraen muestras de médula ósea al menos en dos ocasiones, no antes de 12 horas tras el tratamiento y sin sobrepasar las 48 horas.Cuando se utilicen dosis suplementarias, es conveniente tomar muestras en el período de máxima sensibilidad o, si no se conoce, 24 horas después del tratamiento;(ii) si la información farmacocinética y metabólica aconseja un programa de tratamiento repetido, se puede aplicar una administración repetida, tomando las muestras en una ocasión, no antes de 12 horas después del último tratamiento.Preparación de la médula óseaLa médula ósea se extrae de los dos fémures de cada uno de los animales recién sacrificados mediante enjuague con suero de ternera fetal. Las células se sedimentan por centrifugación y se descarta el sobrenadante. Se depositan gotas de la suspensión celular homogénea sobre portaobjetos y se extienden en frotis. Una vez se hayan secado al aire, los portaobjetos se tiñen.AnálisisLos portaobjetos se codifican antes de analizarlos en el microscopio. Se busca la presencia de micronúcleos en, al menos, 1 000 eritrocitos policromáticos por animal.Para cada animal, se determina la relación entre eritrocitos normocromáticos y policromáticos en un recuento de 1 000 eritrocitos.2. RESULTADOSLos resultados se presentarán en forma de tabla. Se registrarán por separado, para cada animal tratado y testigo, el número de eritrocitos policromáticos evaluados y el número de eritrocitos policromáticos con micronúcleos, así como el porcentaje de células micronucleadas y la relación entre eritrocitos normocromáticos y policromáticos. Se registrarán igualmente las medias y las desviaciones típicas para cada lote tratado y para cada lote testigo. Los resultados se evaluarán mediante los métodos estadísticos adecuados.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- especie, cepa y edad de los animales utilizados,- número de animales de cada sexo de los lotes tratados y de los testigos,- condiciones de prueba: descripción detallada de los programas de tratamiento y de extracción de muestras, dosis, datos relativos a la toxicidad, testigos negativos y positivos,- criterios de recuento de los micronúcleos,- relación dosis-efecto, si es posible,- signos de toxicidad durante el estudio,- evaluación estadística,- discusión de los resultados,- interpretación de los resultados.3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).B.13. MUTAGENICIDAD (ENSAYO DE MUTACIÓN REVERTIDA EN ESCHERICHIA COLI1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto C).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOEl sistema de reversión del triptófano de E. coli (trp) es un ensayo microbiano que permite medir la reversión trp   . trp+ debida a sustancias químicas que causan sustituciones de bases en el genoma del organismo.Las bacterias se exponen a las sustancias de ensayo con y sin activación metabólica. Después de un período de incubación adecuado en un medio mínimo, se cuentan las colonias revertidas y se compara el número obtenido con el de las revertidas espontáneamente, observado en un cultivo testigo, no tratado y/o en presencia de disolvente.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODOEl ensayo puede realizarse por los siguientes métodos: i) método de preincubación; y ii) método de incorporación directa, en el que las bacterias y la sustancia de ensayo se mezclan con agar de recubrimiento y se vierten en la superficie de una placa de agar selectivo.1.6.1. Preparación1.6.1.1. BacteriasLas bacterias se cultivan a 37  C hasta el final de la fase exponencial o hasta el principio de la fase estacionaria de crecimiento. La densidad celular aproximada debe ser de 108-109 células por mililitro.1.6.1.2. Activación metabólicaLas bacterias deben exponerse a la sustancia de ensayo en presencia y en ausencia de un sistema de activación metabólica adecuado. El sistema más frecuentemente utilizado es una fracción postmitocondrial suplementada con cofactores, preparada a partir de hígados de roedores tratados con agentes inductores enzimáticos.1.6.2. Condiciones de prueba1.6.2.1. Cepas de pruebaDeben utilizarse tres cepas: WP2, WP2 uvr A y WP2 uvr A pKM 101. Para la preparación y conservación de los cultivos es conveniente utilizar métodos ampliamente reconocidos. Deben verificarse las exigencias de crecimiento, la identidad genética de las cepas y su sensibilidad a los rayos UV o a la mitomicina C, así como la resistencia a la ampicilina de la cepa WP2 uvr A pKM 101. Asimismo, las cepas deben producir mutaciones revertidas espontáneas en las gamas de frecuencia esperadas.1.6.2.2. MediosSe utiliza un medio apropiado para la expresión y selección de los mutantes, así como un agar de recubrimiento adecuado.1.6.2.3. Utilización de testigos positivos y negativosSe deben realizar paralelamente ensayos con testigos no tratados y testigos con el disolvente. También deben realizarse pruebas con testigos positivos con dos fines:i) confirmar la sensibilidad de las cepas bacterianas.Pueden utilizarse el metilmetanosulfonato, el óxido de 4-nitroquinolina o la etilnitrosourea como testigos positivos para los ensayos sin activación metabólica;ii) garantizar la actividad del sistema metabolizante adecuado.El 2-aminoantraceno constituye un testigo positivo de la actividad de un sistema metabolizante para todas las cepas. Si es posible, es conveniente usar un testigo positivo de la misma clase química que la sustancia de ensayo.1.6.2.4. Concentración de sustancia de ensayo por placaPor lo menos, deben probarse 5 concentraciones distintas de sustancia de ensayo con diferencias de media unidad semilogarítmica entre placas. Las sustancias se someten a ensayo hasta que se alcancen los límites de solubilidad o de toxicidad. La toxicidad se manifiesta por una reducción del número de mutaciones revertidas espontáneas, por una aclaración de la capa de fondo o por la tasa de supervivencia de los cultivos tratados. Las sustancias químicas no tóxicas deben probarse hasta los 5 mg por placa antes de que se pueda considerar negativa la sustancia de ensayo.1.6.2.5. Condiciones de incubaciónSe incuban las placas entre 48 y 72 horas a 37  C.1.6.3. ProcedimientoEn el método de incorporación directa sobre placa sin activación enzimática, se añaden la sustancia de ensayo y 0,1 ml de cultivo bacteriano fresco a 2,0 ml de agar de recubrimiento. En los ensayos con activación metabólica se añaden al agar de recubrimiento 0,5 ml de una mezcla de activación de enzimas hepáticas que contenga una cantidad adecuada de fracción postmitocondrial, después de haber incorporado la sustancia de ensayo y las bacterias. Se mezcla el contenido de cada tubo y se vierte sobre la superficie de una placa de agar selectivo. El agar de recubrimiento se deja solidificar y las placas se incuban a 37  C entre 48 y 72 horas. Al término del período de incubación se cuentan las colonias revertidas en cada placa.En el método de preincubación, se preincuba una mezcla compuesta por la sustancia de ensayo, 0,1 ml de cultivo bacteriano fresco y una cantidad adecuada de mezcla de activación de enzimas hepáticas, o la misma cantidad de solución amortiguadora, y luego se le añaden 2,0 ml de agar de recubrimiento. El resto del procedimiento es idéntico al del método de incorporación directa sobre placa.En los dos métodos las placas se preparan al menos por triplicado.2. RESULTADOSSe indicará el número de colonias revertidas por placa en todas las series testigo y en las series tratadas. Deben indicarse el recuento por placa, el número medio de colonias revertidas por placa y las desviaciones típicas, tanto para la sustancia de ensayo como para los testigos.Los resultados deben evaluarse mediante los métodos estadísticos adecuados.Se realizarán al menos dos pruebas independientes. No es necesario que la segunda se haga de la misma manera que la primera. De hecho, puede ser preferible alterar determinadas condiciones de prueba a fin de obtener datos más útiles.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguente información:- bacteria y cepa utilizada,- condiciones de prueba: dosis, toxicidad, composición del medio, métodos de tratamiento (preincubación, incubación), sistema de activación metabólica, sustancias de referencia, testigos negativos,- recuento por placa, número medio de colonias revertidas por placa, desviación típica, relación dosis/efecto (si es posible),- discusión de los resultados,- interpretación de los resultados.3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).B.14. MUTAGENICIDAD (ENSAYO DE MUTACIÓN REVERTIDA EN SALMONELLA TYPHIMURIUM)1.MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto A).1.2. DEFINICIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto C).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANinguna.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOEl sistema de reversión de la histidina (his) de Salmonella typhimurium es un ensayo microbiano que permite medir la reversión his   . his+ inducida por sustancias químicas causantes de sustituciones de bases o de mutaciones de desplazamiento de la lectura en el genoma del organismo.Las bacterias se exponen a las sustancias de ensayo con y sin activación metabólica y se cultivan en medio mínimo. Después de un período de incubación adecuado se cuenta el número de colonias revertidas y se compara con el de las revertidas espontáneamente observado en un cultivo testigo no tratado y/o en presencia de disolvente.1.5. CRITERIOS DE CALIDADNinguno.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. Preparación1.6.1.1. BacteriasSe cultivan las bacterias a 37  C hasta el final de la fase exponencial o hasta el principio de la fase estacionaria de crecimiento. La densidad celular aproximada debe ser de 108 a 109 células por mililitro.1.6.1.2. Activación metabólicaLas bacterias deben exponerse a la sustancia de ensayo en presencia y en ausencia de un sistema adecuado de activación metabólica. El sistema más frecuentemente usado es una fracción postmitocondrial suplementada con cofactores, preparada a partir de hígados de roedores tratados con agentes inductores enzimáticos.1.6.2. Condiciones de ensayo1.6.2.1. Cepas de ensayoDeberán utilizarse por lo menos cuatro cepas, TA 1535, TA 1537, ó TA 97, TA 98 y TA 100; pueden utilizarse otras cepas suplementarias, por ejemplo, TA 1538 y TA 102. Para la preparación y conservación de los cultivos es conveniente utilizar métodos ampliamente reconocidos. Deben verificarse las exigencias de crecimiento y la identidad genética de las cepas, su sensibilidad a los rayos UV y al cristal violeta, así como su resistencia a la ampicilina. Asimismo, las cepas deben producir mutaciones revertidas espontáneas en las gamas de frecuencia esperadas.1.6.2.2. MediosSe utiliza un medio selectivo apropiado, así como un agar de recubrimiento adecuado.1.6.2.3. Utilización de testigos positivos y negativosSe deben realizar paralelamente ensayos con testigos no tratados y testigos con el disolvente. También deben realizarse ensayos con testigos positivos con dos fines:i) confirmar la sensibilidad de las cepas bacterianas.Para los ensayos sin activación metabólica pueden utilizarse los compuestos siguientes:CepasSustanciaTA 1535, TA 100 Azida de sodioTA 1538, TA 98, TA 97 2-nitrofluorenoTA 1537 9-aminoacridinaTA 102 hidroperóxido de cumenoii) garantizar la actividad del sistema metabolizante adecuado.El 2-aminoantraceno es un testigo positivo de la actividad de un sistema metabolizante para todas las cepas. Si es posible, es conveniente utilizar un testigo positivo que pertenezca a la misma clase química que la sustancia de ensayo.1.6.2.4. Cantidad de sustancia de ensayo por placaPor lo menos, deben probarse 5 concentraciones distintas de sustancia de ensayo con diferencias de media unidad logarítmica entre ellas. Las sustancias se someten a ensayo hasta que se alcancen los límites de solubilidad o de toxicidad. La toxicidad se manifiesta por una reducción del número de mutaciones revertidas espontáneas, por una aclaración de la capa de fondo o por la tasa de supervivencia de los cultivos tratados. Las sustancias químicas no tóxicas deben probarse hasta los 5 mg por placa antes de que se pueda considerar negativa la sustancia de ensayo.1.6.2.5. Condiciones de incubaciónSe incuban las placas entre 48 y 72 horas a 37  C.1.6.3. ProcedimientoEn el método de incorporación directa sobre placa sin activación enzimática, se añaden la sustancia de ensayo y 0,1 ml de cultivo bacteriano fresco a 2,0 ml de agar de recubrimiento. En los ensayos con activación metabólica se añaden al agar de recubrimiento, 0,5 ml de una mezcla de activación de enzimas hepáticas que contenga una cantidad adecuada de fracción postmitocondrial, después de haber incorporado la sustancia de ensayo y las bacterias. Se mezcla el contenido de cada tubo y se vierte sobre la superficie de una placa de agar selectivo. El agar de recubrimiento se deja solidificar y las placas se incuban a 37  C entre 48 y 72 horas. Al término del período de incubación se cuentan las colonias revertidas en cada placa. En el método de preincubación, se preincuba una mezcla compuesta por la sustancia de ensayo, 0,1 ml de cultivo bacteriano fresco y una cantidad adecuada de mezcla de activación de enzimas hepáticas, o la misma cantidad de solución amortiguadora, y luego se le añaden 2,0 ml de agar de recubrimiento. El resto del procedimiento es idéntico al del método de incorporación directa sobre placa.En los dos métodos las placas se preparan, al menos, por triplicado.2. RESULTADOSSe indicará el número de colonias revertidas por placa en todas las series testigo y en las series tratadas. Deben indicarse el recuento por placa, el número medio de colonias revertidas por placa y la desviación típica, tanto para la sustancia de ensayo como para los testigos.Los resultados deben evaluarse mediante los métodos estadísticos adecuados.Se realizarán al menos dos ensayos independientes. No es necesario que el segundo se haga de la misma manera que el primero. De hecho, puede ser preferible alterar determinadas condiciones de ensayo a fin de obtener datos más útiles.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluíra, a ser posible, la siguiente información:- bacteria y cepa utilizada,- condiciones experimentales: dosis, toxicidad, composición del medio, métodos de tratamiento (preincubación, incubación), sistema de activación metabólica, sustancias de referencia, testigos negativos,- recuento por placa, número medio de colonias revertidas por placa, desviación típica, relación dosis/efecto, (si es posible),- discusión de los resultados,- interpretación de los resultados.3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓNVéase la introducción general de la parte B (punto D).4. BIBLIOGRAFÍAVéase la introducción general de la parte B (punto E).PARTE C: MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ECOTOXICIDAD C.1. TOXICIDAD AGUDA EN PECES1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNEl objeto de este ensayo es determinar la toxicidad letal aguda de una sustancia en peces de agua dulce. Es conveniente disponer, en la medida de lo posible, de una amplia información sobre la hidrosolubilidad, la presión de vapor, la estabilidad química, las constantes de disociación y la biodegradabilidad de la sustancia de ensayo, con el fin de seleccionar el método de ensayo más apropiado (estático, semiestático, dinámico), que permita garantizar concentraciones constantes de la sustancia de ensayo durante todo el período de ensayo.Tanto en la planificación del ensayo como en la interpretación de los resultados deberá tenerse en cuenta otro tipo de información suplementaria (por ejemplo, la fórmula estructural, el grado de pureza, la naturaleza y porcentaje de impurezas significativas, la presencia y cantidad de aditivos, así como el coeficiente de reparto n-octanol/agua)1.2. DEFINICIÓN Y UNIDADESLa toxicidad aguda es el efecto adverso, discernible, inducido en un organismo como consecuencia de la exposición a una sustancia dada durante un corto período de tiempo (días).En el presente ensayo, la toxicidad aguda viene expresada como la concentración letal media (CL50), es decir, la concentración que, en el agua, causa la muerte del 50 % de los peces de un lote sometido a ensayo durante un período de exposición continuo que debe indicarse.Todas las concentraciones de la sustancia de ensayo se expresan en peso por volumen (mg/l). Pueden expresarse también en peso por peso (mg/kg 1).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIASe podrá efectuar un ensayo con una sustancia de referencia a fin de demostrar que, en las condiciones experimentales de laboratorio, la respuesta de la especie sometida al ensayo no ha variado significativamente.Para este ensayo no se especifica ninguna sustancia de referencia.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYOPuede realizarse una prueba límite a 100 mg/l, para demostrar que la CL50 es mayor que esta concentración.Se exponen los peces a la sustancia o sustañcias de ensayo añadidas al agua, durante un período de 96 horas y en un intervalo de concentraciones determinado. Se registra la mortalidad, como mínimo, cada 24 horas y se calculan, si es posible, las concentraciones causantes de la muerte del 50 % de los peces (CL50) en cada período de observación.1.5. CRITERIOS DE CALIDADLos criterios de calidad se aplicarán tanto al ensayo límite como al método de ensayo definitivo.La mortalidad de los testigos, no debe sobrepasar el 10 % al final del ensayo (o un pez si se utilizan menos de 10).La concentración de oxígeno disuelto debe ser superior al 60 % del valor de saturación, a la largo de todo el ensayo.La concentración de la sustancia de ensayo debe ser superior al 80 % de la concentración inicial durante todo el ensayo.Para las sustancias que se disuelven fácilmente en el medio de ensayo, produciendo soluciones estables, es decir, que no se volatilizan, degradan, hidrolizan ni adsorben en cantidad significativa, la concentración inicial puede considerarse equivalente a la concentración nominal. Se demostrará que se han mantenido las concentraciones a lo largo del ensayo y de que se han satisfecho los criterios de calidad.En cuanto a las sustancias(i) poco solubles en el medio de ensayo, o(ii) capaces de formar emulsiones o dispersiones estables, o(iii) no estables en soluciones acuosas,se tomará como concentración inicial la concentración medida en la solución (o, si no es técnicamente posible, medida en la columna de agua) al comienzo del ensayo. La concentración se determinará tras un período de equilibrio pero antes de introducir los peces de ensayo.En cualquiera de estos casos se harán mediciones complementarias, durante el ensayo, con el fin de confirmar la concentración de exposición real o que se han mantenido los criterios de calidad.El pH no variará más de 1 unidad.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYOPueden utilizarse tres tipos de procedimientos.Ensayo estáticoEnsayo de toxicidad durante el cual no hay renovación de la solución de ensayo (las soluciones no se renuevan durante todo el ensayo).Ensayo semiestáticoEnsayo sin renovación continua de la solución de ensayo, pero con renovación periódica, de las soluciones de ensayo después de períodos prolongados (por ejemplo, cada 24 horas).Ensayo dinámicoEnsayo de toxicidad durante el cual se va renovando constantemente el agua de los recipientes de ensayo. El producto químico sometido a ensayo se transporta con el agua utilizada para renovar el medio de ensayo.1.6.1. Reactivos1.6.1.1. Soluciones de las sustancias de ensayoLas soluciones madre a las concentraciones requeridas se preparan disolviendo la sustancia en agua desionizada o en agua según el punto 1.6.1.2.Las concentraciones elegidas para el ensayo se preparan mediante dilución de la solución madre. Si se procede a un ensayo a concentraciones elevadas, la sustancia puede disolverse directamente en el agua de dilución.En general, las sustancias se ensayarán sólo hasta su límite de solubilidad. En el caso de algunas sustancias (p. ej., aquéllas que son poco hidrosolubles, que tienen un elevado Pow o que forman en el agua dispersiones estables más que verdaderas soluciones), se puede aceptar una concentración de ensayo por encima del límite de solubilidad de la sustancia a fin de garantizar que se obtiene la máxima concentración soluble/estable. Es importante, sin embargo, que esta concentración no altere por otra parte el sistema de ensayo (por ejemplo, formación en la superficie del agua de una película de la sustancia que impida la oxigenación del agua, etc.)Puede utilizarse dispersión ultrasónica, solventes orgánicos, emulgentes o dispersantes para favorecer la preparación de las soluciones madre de las sustancias poco hidrosolubles o para que dichas sustancias se dispersen mejor en el medio de ensayo. Cuando se utilicen estas sustancias auxiliares, todas las concentraciones de ensayo deberán contener la misma cantidad de sustancia auxiliar y se expondrá un lote de peces como testigo suplementario a la misma concentración de la sustancia auxiliar que la utilizada en las series del ensayo. La concentración de esas sustancias auxiliares debe reducirse al mínimo, y en ningún caso será superior a 100 mg por litro en el medio de ensayo.El ensayo debe realizarse sin ajustar el pH. Si se produjera un cambio significativo del pH, debe repetirse el ensayo ajustando el pH y registrar los resultados. En ese caso, el valor del pH de la solución madre debe ajustarse al valor del pH del agua de dilución, excepto que existan razones concretas que lo impidan. Para ajustar el pH se utilizará, preferentemente, HCl o NaOH. Este ajuste del pH debe efectuarse de forma que no se modifique significativamente la concentración de la sustancia de ensayo en la solución madre. Si el ajuste ocasiona una reacción química o una precipitación física de la sustancia de ensayo, deberá mencionarse en el informe.1.6.1.2. Agua de mantenimiento y de diluciónSe podrá utilizar agua potable (no contaminada por concentraciones potencialmente peligrosas de cloro, metales pesados u otras sustancias), agua natural de buena calidad o agua reconstituida (véase el Apéndice 1). Se preferirán las aguas cuya dureza total esté comprendida entre 10 y 250 mg por litro (como CaCO3), y un pH comprendido entre 6,0 y 8,5.1.6.2. EquipoEl equipo debe ser de material químicamente inerte:- sistema de dilución automático (para el ensayo dinámico),- aparato para medir el oxígeno,- aparato para determinar la dureza del agua,- equipo apropiado para el control de la temperatura,- pHmetro.1.6.3. Peces del ensayoLos peces deben gozar de buena salud y estar exentos de malformaciones visibles.Se recomienda que la especie utilizada se elija en función de criterios prácticos como disponibilidad inmediata durante todo el año, fácil mantenimiento, comodidad para el ensayo, sensibilidad relativa a las sustancias químicas, y todos los demás factores significativos económicos, biológicos o ecológicos. Debe tenerse tambien en cuenta, al seleccionar la especie de peces, la necesidad de que los datos sean comparables y la existencia de una armonización internacional en vigor (referencia 1).Las especies que se recomiendan para la realización de este ensayo figuran en el Apéndice 2; las especies preferidas son el pez cebra y la trucha.1.6.3.1. MantenimientoLos peces que se someten al ensayo deberán provenir preferentemente de un solo lote, siendo todos los individuos de longitud y edad similares. Deben mantenerse, al menos durante 12 días, en las siguientes condiciones.carga:apropiada al sistema (recirculación o ensayo dinámico) y a la especie de peces,agua:véase 1.6.1.2,luz:fotoperíodo de 12 a 16 horas por día,concentración de oxígeno disuelto:al menos 80 % del valor de saturación,alimentación:diariamente o 3 veces por semana; la alimentación debe ser interrumpida 24 horas antes de comenzar el ensayo.1.6.3.2. MortalidadSe registrará la mortalidad después de un período inicial de 48 horas. Se juzgará la calidad del lote según los siguientes criterios:- mortalidad superior al 10 % de la población en 7 dias:se rechaza todo el lote,- mortalidad al cabo de 7 días comprendida entre el 5 y el 10 % de la población:se prolongará el período de observación 7 días más. Si no aparecen nuevas mortalidades, se admite el lote, en caso contrario debe rechazarse,- mortalidad inferior al 5 % de la población:se admite el lote.1.6.4. AdaptaciónLos peces deben mantenerse en las condiciones de ensayo (calidad y temperatura del agua), durante al menos 7 días antes de su utilización.1.6.5. Procedimiento del ensayoAntes del ensayo definitivo se puede proceder a un ensayo para determinar el intervalo de concentraciones eficaces, el cual proporcionará información sobre el intervalo de concentraciones que deberán utilizarse en el ensayo definitivo.Se efectuará un control (o testigo), sin sustancia de ensayo y, si se considera importante, un control (o testigo) con la sustancia auxiliar, además de las concentraciones de ensayo propiamente dichas.Se elegirá un método estático, semiestático o dinámico, en función de las propiedades físicas y químicas de la sustancia de ensayo, para cumplir los criterios de calidad.Los peces estarán expuestos a la sustancia de ensayo en las siguientes condiciones:- duración: 96 horas,- número de animales: al menos 7 por concentración,- recipientes: de una capacidad apropiada, en función de la carga recomendada,- carga: se recomienda una carga máxima de 1,0 g por litro para los ensayos estáticos y semiestáticos; para los ensayos dinámicos se puede aceptar una carga más elevada,- concentraciónes de ensayo: al menos cinco concentraciones de ensayo que difieran en un factor constante no mayor de 2,2 y abarcando si es posible el intervalo de 0 % a 100 % de mortalidad,- agua: véase el punto 1.6.1.2.,- luz: fotoperíodo de 12 a 16 horas por día,- temperatura: apropiada para la especie elegida (Apéndice 2), pero en los límites de ± 1  C, en cualquier ensayo concreto,- concentración en oxígeno disuelto: al menos el 60 % del valor de la saturación a la temperatura elegida,- alimento: ninguno.Los peces se observarán después de las 2 a 4 primeras horas y, al menos, a intervalos de 24 horas. Los peces son considerados muertos si el toque del pedúnculo caudal no produce reacción alguna y no se percibe ningún movimiento respiratorio. Los peces muertos se retirarán en el momento de cada observación y se registrará la mortalidad.Se registrarán las anomalías visibles (por ejemplo, pérdida de equilibrio, cambios en el comportamiento natatorio, función respiratoria, pigmentación, etc.).Diariamente se medirá el pH, el oxígeno disuelto y la temperatura.Ensayo límitePuede realizarse un ensayo límite a 100 mg por litro, utilizando los procedimientos descritos en este método de ensayo, con el fin de demostrar que la CL50 es mayor que dicha concentración.Si la naturaleza de la sustancia no permite alcanzar una concentración de 100 mg por litro en el agua de ensayo, el ensayo límite debe ser realizado a una concentración igual a la solubilidad de la sustancia (o a la máxima concentración que forme una dispersión estable) en el medio utilizado (véase también el punto 1.6.1.1).El ensayo límite se realizará utilizando de 7 a 10 peces, y el mismo número en los controles (o testigos). (La teoría binomial indica que cuando se utilizan 10 peces y la mortalidad es cero, hay un limite de confianza del 99,9 % de que la CL50 es mayor que la concentración usada en el ensayo límite. Si se utilizan 7, 8 o 9 peces, la ausencia de mortalidad proporciona un límite de confianza del 99 % de que la CL50 es mayor que la concentración usada.)Si aparece mortalidad, debe ser realizado un estudio completo. Si se observan efectos subletales, deben registrarse.2. RESULTADOS Y EVALUACIÓNSe trazará sobre papel log-probit el porcentaje de mortalidad en función de la concentración, para cada período en que se registren observaciones (24, 48, 72 y 96 horas).Cuando sea posible y para cada tiempo de observación, se calculará la CL50 con sus límites de confianza (p = 0,05) utilizando procedimientos estandardizados; estos valores se redondearán a una o, como mucho, dos cifras significativas (ejemplos de redondeo a dos cifras: 170 en lugar de 173,5; 0,13 en lugar de 0,127; 1,2 en lugar de 1,21).Si la pendiente de la curva de concentración/porcentaje de respuesta es demasiado acentuada como para permitir calcular la CL50, bastará con una estimación gráfica de este valor.Si dos concentraciones consecutivas, con una razón de 2,2, dan sólo 0 y 100 % de mortalidad, estos dos valores serán suficientes para indicar el rango en el que se encuentra la CL50.Si se observa que la estabilidad o la homogeneidad de la sustancia de ensayo no puede mantenerse, se mencionará en el informe y se tendrá en cuenta al interpretar los resultados.3. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- información acerca del pez de ensayo (nombre científico, cepa, proveedor, tratamiento previo eventual, tamaño y número utilizado en cada concentración de ensayo),- orígen del agua de dilución y sus principales características químicas (pH, dureza, temperatura),- en el caso de una sustancia poco hidrosoluble, método de preparación de la solución madre y de las soluciones de ensayo,- concentraciones de las eventuales sustancias auxiliares,- relación de las concentraciones utilizadas y cualquier información disponible sobre la estabilidad, a dichas concentraciones, de la sustancia en la solución de ensayo,- si se realizan análisis químicos, los métodos utilizados y los resultados obtenidos,- resultados del ensayo límite, si se ha realizado,- motivos de la elección y los detalles del procedimiento de ensayo utilizado (por ejemplo: sistema estático, semiestático, dinámico, velocidad de administración, tasa de renovación, aireación o no, carga de peces, etc.),- descripción del equipo de ensayo,- régimen de iluminación,- concentraciones del oxígeno disuelto, valores de pH y temperaturas de las soluciones de ensayo cada 24 horas,- pruebas de que se han respetado los criterios de calidad,- tabla que muestre la mortalidad acumulada para cada concentración y para el testigo (y, en su caso, el testigo con producto auxiliar) para cada uno de los tiempos de observación recomendados,- representación gráfica de los porcentajes de mortalidad en función de las concentraciones al final del ensayo,- si es posible, valores de la CL50 en cada uno de los tiempos de observación recomendados (límite de confianza del 95 %),- métodos estadísticos utilizados para determinar los valores de la CL50,- si se utiliza una sustancia de referencia, resultados obtenidos,- concentración máxima utilizada que no haya causado mortalidad durante el período de ensayo,- concentración mínima utilizada que haya causado un 100 % de mortalidad durante el período de ensayo.4. BIBLIOGRAFÍA(1) OCDE, París 1981, Test Guideline 203, Decisión del Consejo C(81) 30 final, y actualizaciones.(2) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio - Static and Flow Through methods - NFT 90-303 June 1985.(3) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri - Static and Flow Through methods - NFT 90-305 June 1985.(4) ISO 7346/1, /2 and /3 - Water Quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan - Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.(5) Eidgenössisches Department des Innern, Suiza, Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden - Part II 1974.(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15).(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.(8) NEN 6506 - Water - Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979.(12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.(13) Comisión de las Comunidades Europeas, Inter-Laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die Ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.(15) Litchfield, J.T. y Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm. Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.(16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K, 1978.(17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793- 821.(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3-32.(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink), American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.(20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. y Andrews, R.W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.Apéndice 1Agua reconstituidaEjemplo de agua de dilución adecuadaLos productos químicos deben ser de calidad analítica.El agua debe ser agua destilada de buena calidad, o agua desionizada de una conductividad inferior a 5 ìScm 1.El aparato para la destilación del agua no contendrá ningún componente de cobre.Soluciones madresCaCl2 . 2H2O (cloruro de calcio dihidratado): 11,76 g disolver y enrasar a un litro con agua.MgSO4 . 7H2O (sulfato de magnesio heptahidratado): 4,93 g disolver y enrasar a un litro con agua.NaHCO3 (carbonato ácido de sodio): 2,59 g disolver y enrasar a un litro con agua.KCl (cloruro de potasio): 0,23 g disolver y enrasar a un litro con agua.Agua de dilución reconstituidaMezclar 25 ml de cada una de las cuatro soluciones madre y completar hasta un litro con agua.Airear hasta que la concentración de oxígeno disuelto sea igual al valor de saturación del aire.El pH debe ser 7,8 ± 0,2.Si es necesario, ajustarlo con NaOH (hidróxido de sodio) o HCl (ácido clorhídrico).El agua de dilución así preparada se deja reposar durante unas 12 horas y no debe ser aireada posteriormente.La suma de iones Ca/Mg en esta solución es igual a 2,5 mmol/l. La relación de los iones Ca:Mg es de 4:1, la de los iones Na:K de 10:1. La alcalinidad total de esta solución es igual a 0,8 mmol/l.Cualquier desviación en la preparación del agua de dilución no debe modificar su composición ni sus propiedades.Apéndice 2>SITIO PARA UN CUADRO>AprovisionamientoLos peces que se mencionan arriba son fáciles de criar y se puede disponer fácilmente de ellos durante todo el año. Pueden reproducirse y desarrollarse en explotaciones piscícolas o en el laboratorio, en condiciones sanitarias controladas, de forma que el animal que se someta al ensayo esté sano y su origen sea conocido. Estos peces están disponibles en casi todo el mundo.Apéndice 3Ejemplo de curva de procentaje de mortalidad/concentración>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Ejemplo de determinación de la CL50 en un papel log-probitC.2. TOXICIDAD AGUDA EN DAPHNIA1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNLa finalidad de esta prueba es determinar la concentración efectiva media de una sustancia (CE50) para la inmovilización de Dafnia en agua dulce. Es conveniente disponer, en la medida de lo posible, de una amplia información sobre la hidrosolubilidad, la presión de vapor, la estabilidad química, las constantes de disociación y la biodegradabilidad de la sustancia de ensayo, antes de proceder al ensayo.Al proyectar el ensayo y al interpretar los resultados deberá tenerse en cuenta otro tipo de información suplementaria (p. ej., la fórmula desarrollada, el grado de pureza, la naturaleza y porcentaje de impurezas significativas, la presencia y cantidad de aditivos, así como el coeficiente de reparto n-octanol/agua)1.2. DEFINICIÓN Y UNIDADESLa exigencia de la Directiva relativa a la CL50 sobre la Dafnia se cumple mediante la determinación de la CE50 tal como se describe en este método de ensayo.En este ensayo, la toxicidad aguda viene expresada por la concentración efectiva media (CE50) de inmovilización, es decir, la concentración (en valor inicial) que inmoviliza al 50 % de las Dafnia en una serie de ensayo durante un período de exposición continua que debe establecerse.Inmovilización:Se consideran inmovilizados los organismos incapaces de desplazarse durante los 15 segundos siguientes a una ligera agitación del recipiente de ensayo.Todas las concentraciones de la sustancia de ensayo se expresan en peso por volumen (mg/l miligramos por litro). Pueden expresarse también en peso por peso (mg.kg 1).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIAPuede someterse a ensayo una sustancia de referencia para demostrar que, en las condiciones experimentales en laboratorio, la sensibilidad de la especie utilizada no se ha modificado de forma significativa.En el Anexo 2 se da el resumen de los resultados de una prueba interlaboratorios de la CEE, utilizando cuatro sustancias diferentes.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYOPuede hacerse una prueba límite a 100 mg/l para confirmar que la CE50 es mayor que esa concentración.Se exponen las Dafnia a un abanico de concentraciones de la sustancia a ensayar añadida al agua durante 48 horas; si se usa un ensayo más corto habrá que justificarlo en el informe.En condiciones de ensayo idénticas, y un rango adecuado de concentración de la sustancia de ensayo, diferentes concentraciones de una sustancia de ensayo ejercen efectos diferentes sobre la capacidad de movilidad de la Dafnia. En consecuencia, al final del ensayo, a cada concentración, corresponderá un porcentaje diferente de inmovilizazión de las Dafnia. Las concentraciones que causan una inmovilización de 0 o 100 % se determinan directamente de las observaciones del ensayo, mientras que la CE50 en 48 horas se determina, a ser posible, por cálculo.Para este método se utiliza un sistema estático, asi pues las soluciones de ensayo no se renuevan durante el período de exposición.1.5. CRITERIOS DE CALIDADLos criterios de calidad se aplicarán tanto en el ensayo límite como en todo el método de ensayo.La inmovilización de los testigos, al final del ensayo, no debe exceder del 10 %.Las Dafnia de los grupos testigo no deben ser arrastradas hacia la superficie del agua.Es deseable que la concentración de oxígeno disuelto en los recipientes de ensayo se mantenga por encima de 3 mg l 1 durante todo el ensayo. No obstante, en ningún caso debe ser inferior a 2 mg l 1.La concentración de la sustancia de ensayo debe mantenerse en un 80 % de la concentración inicial, a lo largo de todo el ensayo.Para sustancias que se disuelven fácilmente en el medio de ensayo, produciendo soluciones estables, es decir, que no se volatilizan, degradan, hidrolizan ni adsorben en cantidad significativa, la concentración inicial puede considerarse como equivalente de la concentración nominal. Se presentarán evidencias de que se han mantenido las concentraciones a lo largo del ensayo y de que se han satisfecho los criterios de calidad.En cuanto a las sustancias(i) poco solubles en el medio de ensayo, o(ii) capaces de formar emulsiones o dispersiones estables, o(iii) no estables en soluciones acuosas,se tomará como concentración inicial la concentración medida en la solución (o, si no es técnicamente posible, medida en la columna de agua) al comienzo de la prueba. La concentración se determinará tras un período de equilibrio, pero antes de introducir los organismos de ensayo.En cualquiera de estos casos se harán mediciones complementarias, durante el ensayo, con el fin de confirmar la concentración de exposición real o que se han mantenido los criterios de calidad.El pH no variará más de 1 unidad.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO1.6.1. Reactivos1.6.1.1. Soluciones de las sustancias de ensayoLas soluciones madre con las concentraciones requeridas se preparan disolviendo la sustancia en agua desionizada o en agua según el punto 1.6.1.2.Las concentraciones elegidas para el ensayo se preparan mediante dilución de la solución madre. Si se procede a un ensayo con concentraciones elevadas, la sustancia puede disolverse directamente en el agua de dilución.En general, las sustancias se probarán sólo hasta el límite de solubilidad. En el caso de algunas sustancias (p. ej., aquéllas que son poco hidrosolubles, que tienen un elevado Pow o que forman en el agua dispersiones estables más que verdaderas soluciones), se puede aceptar una concentración de ensayo por encima del límite de solubilidad de la sustancia a fin de garantizar que se obtiene la máxima concentración soluble/estable. Es importante, sin embargo, que esta concentración no interfiera de cualquier otra forma en el sistema de ensayo (p. ej., formación en la superficie del agua de una película de la sustancia que impida la oxigenación del agua, etc.).Puede utilizarse dispersión ultrasónica, disolventes orgánicos, emulgentes o dispersantes para favorecer la preparación de las soluciones madre de las sustancias poco hidrosolubles o para que dichas sustancias se dispersen mejor en el medio de ensayo. Cuando se usen estas sustancias auxiliares, todas las concentraciones de ensayo deberán contener la misma cantidad de sustancias auxiliares y se expondrá un lote de Dafnia como control adicional a la misma concentración de sustancia auxiliar que la utilizada en las series del ensayo. La concentración de esas sustancias auxiliares debe reducirse al mínimo, pero en ningún caso será superior a 100 mg por litro en el medio de ensayo.El ensayo debe realizarse sin ajustar el pH. En caso de modificaciones significativas del pH, es conveniente repetir el ensayo ajustando el pH e informar de los resultados. En tal caso, el valor del pH de la solución madre debe adaptarse al valor del pH del agua de disolución, salvo que haya razones concretas que lo impidan. Para ajustar el pH se usa, preferentemente, HCl o NaOH. Este ajuste debe efectuarse de tal forma que no modifique significativamente la concentración de la sustancia de ensayo en la solución madre. Si el ajuste provoca una reacción química o una precipitación física de la sustancia de ensayo, deberá mencionarse en el informe.1.6.1.2. Agua para el ensayoEn este ensayo se utiliza agua reconstituida (véase el Anexo 1 y la referencia (2): ISO 6341). Para evitar la aclimatación antes del ensayo, se recomienda que el agua utilizada para la cría sea de calidad (pH, dureza) similar al agua que se utilizará en el ensayo.1.6.2. EquipoSe utilizará material corriente de laboratorio. El material que entre en contacto con las soluciones de ensayo deberá ser, preferentemente, de cristal:- aparato para medir el oxígeno (con microelectrodo o cualquier otro equipo que sea conveniente para medir el oxígeno disuelto en muestras de pequeño volumen),- aparato adecuado para el control de la temperatura,- pHmetro,- aparato para determinar la dureza del agua.1.6.3. Organismos de ensayoLa especie preferida para el ensayo es Daphnia magna aunque también se permite Daphnia pulex. Los animales de ensayo tendrán menos de 24 horas al comienzo del ensayo, criados en el laboratorio, carecerán de enfermedades aparentes y serán de origen conocido (cría, tratamientos previos, etc.).1.6.4. ProcedimientoAntes de proceder al ensayo definitivo puede realizarse un ensayo preliminar, para obtener información sobre el rango de concentraciones que debe usarse en el ensayo definitivo.Además de las series de ensayo debe realizarse un ensayo control sin la sustancia a ensayar y, si en su caso, un ensayo control conteniendo la sustancia auxiliar.Las Dafnia se exponen a la sustancia de ensayo en las siguientes condiciones:- duración: preferentemente 48 h,- número de animales:al menos 20 animales por concentración de ensayo, repartidos preferentemente en cuatro lotes de 5 o en dos lotes de 10,- carga: un mínimo de 2 ml de solución de ensayo para cada animal,- concentración de ensayo: la solución de ensayo debe prepararse inmediatamente antes de introducir las Dafnia, preferiblemente sin utilizar más disolventes que el agua. Las concentraciones se calculan en serie geométrica, con una relación no superior a 2,2. Al mismo tiempo que los grupos controles, deben ensayarse concentraciones que den 0 y 100 % de inmovilización después de 48 h y una serie de resultados intermedios de inmovilización que permitan el cálculo de la CE50 a 48 h.- agua: ver 1.6.1.2.,- luz: es facultativo un fotoperíodo, luz-oscuridad- temperatura: la temperatura de ensayo debe situarse entre 18 y 22  C, pero debe mantenerse constante para cada ensayo entre ± 1  C,- aireación: no airear por borboteo las soluciones de ensayo,- alimentación: ninguna.Al final del ensayo deberá medirse el pH y la concentración de oxígeno de los controles y de todas las concentraciones de ensayo; el pH de las soluciones de ensayo no debe modificarse.Las sustancias volátiles deben someterse a ensayo en recipientes llenos y herméticamente cerrados, suficientemente grandes como para evitar la falta de oxígeno.Se observan las Dafnia al menos después de 24 horas de exposición y de nuevo al cabo de 48 horas.Ensayo límitePuede realizarse una prueba límite a 100 mg por litro, utilizando los procedimientos descritos en este método de ensayo, a fin de demostrar que la CE50 es mayor que dicha concentración.Si la sustancia es de tal naturaleza que no se puede alcanzar la concentración de 100 mg por litro en el agua de ensayo, se hará el ensayo límite a una concentración igual a la solubilidad de la sustancia (o a la máxima concentración que forme una dispersión estable) en el medio utilizado (ver también el punto 1.6.1.1.).El ensayo límite se hará utilizando 20 Dafnia, divididas en dos o cuatro lotes, con igual número en el (los) control(es). Si hay inmovilización, debe realizarse un estudio completo.2. RESULTADOS Y EVALUACIÓN Hay que representar en papel log-probit el porcentaje de inmovilización en función de las concentraciones, para cada período en que se recojan datos de las observaciones (24 y 48 horas).Si los resultados lo permiten, y en cada período de observación, debe estimarse la CE50 y sus límites de confianza (p=0,05) utilizando un método estandardizado; estos valores se redondearán a una o como máximo dos cifras significativas (ejemplos de redondeo a dos cifras: 170 en lugar de 173,5; 0,13 en lugar de 0,127; 1,2 en lugar de 1,21).Si la pendiente de la curva concentración/porcentaje de respuesta es demasiado inclinada como para permitir calcular la CE50, bastará con dar una estimación gráfica de este valor.Cuando dos concentraciones inmediatamente consecutivas, en una relación 2,2, sólo den 0 y 100 % de inmovilización, bastarán estos dos valores para indicar el intervalo en que se sitúa la CE50.Si se comprueba que la estabilidad o la homogeneidad de la sustancia de ensayo no puede mantenerse, se interpretarán los resultados con prudencia y se indicará en el informe.3. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- información acerca del organismo sometido a ensayo (nombre científico, estirpe, proveedor u origen, tratamiento previo eventual, método de cría, incluyendo el origen y la clase, cantidad y frecuencia de la alimentación),- origen del agua de dilución y sus principales características químicas (es decir, pH, temperatura, dureza),- en caso de sustancias de baja hidrosolubilidad, método de preparación de las soluciones madre y de las soluciones de ensayo,- concentración de cualquier sustancias auxiliares utilizadas,- concentraciones utilizadas y cualquier información disponible sobre la estabilidad, a dichas concentraciones, de las sustancias ensayadas en la solución de ensayo,- si se han realizado análisis químicos, los métodos utilizados y los resultados obtenidos,- resultados del ensayo límite, si lo hay,- descripción del equipo de ensayo,- información acerca de la iluminación,- concentraciones del oxígeno disuelto, valores del pH y temperatura de las soluciones de ensayo,- evidencia de que se han cumplido los criterios de calidad,- tabla mostrando la inmovilización acumulada en el ensayo control (y en el control con sustancia auxiliar si se ha utilizado) y en cada concentración de ensayo, para los períodos de observación recomendados (24 y 48 horas),- representación gráfica de los porcentajes de respuesta en relación con las concentraciones al final del ensayo,- si es posible, valores de la CE50 para cada período de observación recomendado (con un límite de confianza del 95 %),- métodos estadísticos utilizados para determinar el valor de la CE50,- si se utiliza una sustancia de referencia, resultados obtenidos,- concentración más alta ensayada que no haya originado ninguna inmovilización durante el período de ensayo,- concentración más baja ensayada que haya provocado un 100 % de inmovilización durante el período de ensayo.4. BIBLIOGRAFIA(1) OCDE, París 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30, final and updates.(2) International Standard ISO, Water Quality - Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989(3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera - crustacea) NFT 90 301 (January 1983).(4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P. y Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.(5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11).(6) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K.(7) Litchfield, J. T. y Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments, J. Pharmacol. and Exper. Ther., 1949, vol. 96, 99-113.(8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res. 1969, vol. 3, 793-821.(9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res., 1970, vol. 4, 3-32.(10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM, 1977, STP 634, 65-84.(11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. y Andrews, R.W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.Anexo 1Agua reconstituidaEjemplo de agua de dilución idónea (según norma ISO 6341)Todos los productos químicos deben ser de calidad analítica.El agua debe ser un agua destilada de buena calidad, o agua desionizada de una conductividad inferior a 5 ìScm 1.El aparato de destilación del agua no tendrá ningún componente de cobre.Soluciones madreCaCl2 . 2 H2O (cloruro de calcio dihidratado): 11,76 g disolver en agua y completar hasta un litro.NaHCO3 carbonato ácido de sodio): 2,59 g disolver en agua y completar hasta un litro.MgSO4.7 H2O (sulfato de magnesio heptahidratado): 4,93 g disolver en agua y completar hasta un litro.KCl (cloruro de potasio): 0,23 g disolver en agua y completar hasta un litro.Agua de dilución reconstituidaMezclar 25 ml de cada una de las cuatro soluciones madre y completar hasta un litro con agua.Airear hasta que la concentración de oxígeno disuelto sea igual al valor de saturación del aire.El pH debe ser 7,8 ± 0,2.Si es necesario, ajustarlo con NaOH (hidróxido de sodio) o HCl (ácido clorhídrico).El agua de dilución así preparada se deja reposar durante unas 12 horas y no necesita ser aireada posteriormente.La suma de iones Ca/Mg en esta solución es igual a 2,5 mmol/l. La relación de los iones Ca:Mg es de 4:1, la de los iones Na:K de 10:1. La alcalinidad total de esta solución es igual a 0,8 mmol/l.Cualquier modificación en la preparación del agua de dilución no debe cambiar su composición ni sus propiedades.Anexo 2PRUEBA INTERLABORATORIO DE LA CEEResumen de los resultados de una prueba interlaboratorios de la CEE realizada en 1978 (citada también en la referencia 2)Observación: el objeto de esta prueba interlaboratorios fue la determinación de la CE50 a 24 horasSustancias utilizadas:1) Dicromato potásico2) Acido tetrapropilbencenosulfónico3) Sal sódica del ácido tetrapropilbencenosulfónico4) Sal potásica del ácido tricloro-2,4,5-fenoxiacético>SITIO PARA UN CUADRO>Anexo 3Ejemplo de curva de concentración: porcentaje de inmovilización>PRINCIPIO DE GRÁFICO>>FIN DE GRÁFICO>Ejemplo de determinación de la CE50 utilizando papel log-probitInmovilización en %C.3. ENSAYO DE INHIBICIÓN DE ALGAS1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNEl objeto de este ensayo es determinar los efectos de una sustancia sobre el crecimiento de una especie de alga verde unicelular. Ensayos relativamente breves (72 horas) pueden valorar los efectos sobre varias generaciones. Este método puede adaptarse para ser utilizado con diferentes especies de algas unicelulares, en cuyo caso se proporcionará, junto con el informe del ensayo, una descripción del método utilizado.Este método se aplica más fácilmente a sustancias hidrosolubles las cuales, en las condiciones del ensayo, van a permanecer probablemente en el agua.El método puede ser utilizado para sustancias que no interfieren directamente con la medición del crecimiento de las algas.Es conveniente disponer, si es posible, de información sobre la hidrosolubilidad, presión de vapor, estabilidad química, constantes de disociación y biodegradabilidad de las sustancias antes de comenzar el ensayo.Debe tenerse en cuenta, tanto en la planificación de la prueba como en la interpretación de sus resultados, otro tipo de información adicional (por ejemplo, fórmula estructural, el grado de pureza, la naturaleza y el porcentaje de impurezas significativas, la presencia y cantidad de aditivos y el coeficiente de reparto n-octanol/agua).1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESDensidad celular: número de células por mililitro.Crecimiento: incremento de la densidad celular durante el período de ensayo.Tasa de crecimiento: incremento de densidad celular por unidad de tiempo.CE50: en este ensayo, es la concentración de la sustancia de ensayo que da lugar a una reducción del 50 %, bien en el crecimiento (C50Eb) bien en la tasa de crecimiento (C50Er) con respecto al testigo.NOEC (concentración sin efecto observado): en este método, es la mayor concentración ensayada en la que no se observa una inhibición significativa del crecimiento respecto al testigo.Todas las concentraciones de las sustancia de ensayo se expresan en peso por volumen (miligramos por litro). Pueden expresarse también en peso por peso (mg.kg 1).1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIAPuede someterse a ensayo una sustancia de referencia para demostrar que, en las condiciones de ensayo en laboratorio, la sensiblidad de la especie utilizada no se ha modificado de forma significativa.Si se utiliza una sustancia de referencia, deben darse los resultados en el informe del ensayo. Puede utilizarse dicromato potásico como sustancia de referencia, pero su color puede afectar a la calidad e intensidad de la luz disponibles para las células, así como a las determinaciones espectrofotométricas, si se utilizan. Se ha usado el dicromato potásico en un ensayo internacional inter-laboratorios (véanse la referencia 3 y el Apéndice 2).1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYOPuede realizarse un ensayo límite a 100 mg/l a fin de demostrar que la CE50 es mayor que esa concentración.Se exponen cultivos de algas verdes seleccionadas en fase exponencial de crecimiento a diversas concentraciones de la sustancia de ensayo durante varias generaciones bajo condiciones definidas.Las soluciones de ensayo se incuban durante un período de 72 horas, durante el cual se mide la densidad celular en cada una de ellas al menos cada 24 horas. Se determina la inhibición del crecimiento en relación a un cultivo testigo.1.5. CRITERIOS DE CALIDADLos criterios de calidad se aplicarán tanto en el ensayo límite como en todo el método de ensayo.La densidad celular en los cultivos testigo debe aumentar en un factor de al menos 16 en 3 días.La concentración de la sustancia de ensayo debe mantenerse dentro del 80 % de la concentración inicial durante toda la duración del ensayo.En el caso de sustancias que se disuelven fácilmente en el medio de ensayo, produciendo soluciones estables, es decir, que no se volatilizan, degradan, hidrolizan ni adsorben en cantidad significativa, la concentración inicial puede considerarse como equivalente a la concentración nominal. Debe evidenciarse que se han mantenido las concentraciones a lo largo del ensayo y de que se han satisfecho los criterios de calidad.En cuanto a las sustancias(i) poco solubles en el medio de ensayo, o(ii) capaces de formar emulsiones o dispersiones estables, o(iii) no estables en solución acuosa, se tomará como concentración inicial la concentración medida en la solución al comienzo del ensayo. La concentración se determinará tras un período de equilibrio.En cualquiera de estos casos se harán mediciones complementarias, durante el ensayo, con el fin de confirmar la concentración de exposición real o que se han mantenido los criterios de calidad.Se admite que durante el período del ensayo se incorporan a la biomasa algal, cantidades significativas de la sustancia de ensayo. Por ello, a fin de demostrar conformidad con los criterios de calidad anteriormente mencionados, se tendrá en cuenta tanto la cantidad de sustancia incorporada a la biomasa algal como la sustancia en solución (o, si no es posible técnicamente, medida en la columna de agua). No obstante, como la determinación de la concentración de la sustancia en la biomasa algal puede plantear problemas técnicos importantes, puede demostrarse que se han cumplido los criterios de calidad con un recipiente de ensayo que contenga la sustancia a la concentración más elevada pero sin algas y midiendo las concentraciones en la solución (o, si no es posible técnicamente, en la columna de agua) al comienzo y al final del período de ensayo.1.6. DESCRIPCION DEL MÉTODO DE ENSAYO1.6.1. Reactivos1.6.1.1. Soluciones de las sustancias de ensayoLas soluciones madre a las concentraciones requeridas se preparan disolviendo la sustancia en agua desionizada o en agua que responda a las condiciones establecidas en el punto 1.6.1.2.Las concentraciones de ensayo elegidas se preparan añadiendo partes alícuotas adecuadas a precultivos de algas (véase el Apéndice 1). En general, las sustancias se ensayarán sólo hasta el límite de su solubilidad. En el caso de algunas sustancias (p. ej., aquéllas que son poco hidrosolubles, que tienen un elevado Pow o que forman en el agua dispersiones estables más que verdaderas soluciones), se puede aceptar una concentración de ensayo por encima del límite de solubilidad de la sustancia a fin de garantizar que se obtiene la máxima concentración soluble/estable. Es importante, sin embargo, que esta concentración no altere por otra parte el sistema de ensayo (p ej., formación en la superficie del agua de una película de la sustancia que impida la oxigenación del agua, etc.).Puede utilizarse dispersión ultrasónica, solventes orgánicos, emulgentes o dispersantes para favorecer la preparación de las soluciones madre de las sustancias poco hidrosolubles o para que dichas sustancias se dispersen mejor en el medio de ensayo. Cuando se usen estas sustancias auxiliares, todas las concentraciones de ensayo deberán contener la misma cantidad de producto auxiliar y se expondrán testigos adicionales a la misma concentración del producto auxiliar que la utilizada en las series del ensayo. La concentración de estas sustancias auxiliares debe reducirse al mínimo, y en ningún caso será superior a 100 mg por litro en el medio de ensayo.El ensayo debe realizarse sin ajustar el pH. Si se produjera un cambio significativo del pH, debe repetirse el ensayo ajustando el pH y registrar los resultados. En ese caso, el valor del pH de la solución madre debe ajustarse al valor del pH del agua de dilución, excepto que existan razones concretas que lo impidan. Para ajustar el pH se utilizará, preferentemente, HCl o NaOH. Este ajuste del pH debe efectuarse de tal forma que no se modifique significativamente la concentración de la sustancia de ensayo en la solución madre. Si el ajuste ocasiona una reacción química o una precipitación física de la sustancia de ensayo, deberá mencionarse en el informe.1.6.1.2. Medio de ensayoEl agua debe ser agua destilada de buena calidad, o agua desionizada de una conductividad inferior a 5 ìS.cm 1. El aparato para la destilación del agua no contendrá ningún componente de cobre.Se recomienda el medio siguiente.Se preparan cuatro soluciones madre, de acuerdo con la tabla siguiente. Las soluciones madre se esterilizan por filtración en membrana o por autoclave, y se conservan en la oscuridad a 4  C. La solución madre n  4 se esterilizará sólo por filtración en membrana. Estas soluciones madre se diluirán para conseguir las concentraciones finales de nutrientes en las soluciones de ensayo.>SITIO PARA UN CUADRO>1.6.2. Equipo- Equipo normal de laboratorio.- Matraces de ensayo de volumen adecuado (por ejemplo, serán adecuados matraces cónicos de 250 ml cuando el volumen de la solución de ensayo sea de 100 ml). Todos los matraces de ensayo serán idénticos en cuanto a material y dimensiones.- Equipo de cultivo: cámara en la que pueda mantenerse una temperatura de 21 a 25  C con una oscilación de ± 2  C, y con una iluminación uniforme continua, que proporcione un rango espectral de 400 a 700 nm. Si las algas en los cultivos testigo alcanzan las tasas de crecimiento recomendadas, puede suponerse que las condiciones para el crecimiento, incluida la intensidad luminosa, han sido adecuadas.Se recomienda utilizar, en el nivel medio de las soluciones de ensayo, una intensidad luminosa en el rango de 60 a 120 ìE.m 2.s 1 (35 a 70 × 1018 fotones.m 2.s 1) medida en el rango de 400 a 700 nm utilizando un receptor adecuado. Cuando se utilizan instrumentos de medición de luminosidad calibrados en lux, se puede aceptar un rango equivalente de 6 000 a 10 000 lux.Puede obtenerse la intensidad luminosa utilizando de 4 a 7 lámparas fluorescentes de 30 W del tipo blanco universal (temperatura de color de aproximadamente 4 000 K), a una distancia de 0,35 m del cultivo de algas.- Las mediciones de densidad celular se harán utilizando un método directo de recuento de células vivas, por ejemplo, un microscopio con cámaras de recuento. No obstante, pueden utilizarse otros procedimientos (fotometría, turbidimetría, ...) si son suficientemente sensibles y si muestran una correlación suficientemente buena con la densidad celular.1.6.3. Organismos de ensayoSe sugiere que las especies de algas verdes utilizadas sean especies de crecimiento rápido adecuadas para cultivo y ensayo. Se prefieren las especies siguientes:- Selenastrum capricornutum, por ejemplo, ATCC 22662 or CCAP 278/4,- Scenedesmus subspicatus, por ejemplo, 86.81 SAG,Nota:ATCC = American Type Culture Collection (EEUU)CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (G.B.)SAG = Colección de cultivos de algas (Gotinga, RFA)Si se utilizan otras especies, deben mencionarse las cepas en el informe.1.6.4. Procedimiento del ensayoBasándose en los resultados de las pruebas de tanteo se determinará el intervalo de concentraciones en el que se espera que ocurran los efectos.Las dos medidas de crecimiento (biomasa y tasa de crecimiento) pueden dar lugar a medidas muy divergentes de inhibición de crecimiento; deben utilizarse ambas en la prueba de tanteo de rango para garantizar que la progresión geométrica de las concentraciones permitirá el cálculo de la C50Eb y C50Er.Densidad celular inicialSe recomienda que la densidad celular inicial en los cultivos de ensayo sea de aproximadamente 104 células/ml para Selenastrum capricornutum y Scenedesmus subspicatus. Cuando se utilicen otras especies, la biomasa será comparable.Concentraciones de la sustancia de ensayoPara este ensayo se utilizarán al menos cinco concentraciones en progresión geométrica con un factor que no exceda de 2,2. La concentración mínima ensayada no tendrá efectos observables sobre el crecimiento de las algas. La concentración máxima ensayada inhibirá el crecimiento al menos un 50 % en relación con el testigo y, preferentemente, detendrá completamente el crecimiento.Réplicas y controlesCada concentración de ensayo incluirá tres réplicas. Se harán tres controles sin sustancia de ensayo y, si procede, tres controles que contengan la sustancia auxiliar. La prueba podrá modificarse, si se justifica, para aumentar el número de concentraciones y reducir el número de réplicas por concentración.Realización del ensayoLos cultivos de ensayo que contienen las concentraciones deseadas de la sustancia de ensayo y la cantidad deseada de inóculo de algas se preparan añadiendo partes alícuotas de soluciones madre de la sustancia de ensayo a cantidades adecuadas de precultivosde algas (véase el Apéndice 1).Se agitan los matraces de ensayo y se colocan en el aparato de cultivo. Se mantienen las algas en suspensión mediante agitación, removiendo o con burbujeo de aire, para facilitar el intercambio de gases y reducir la variación del pH en las soluciones de ensayo. Los cultivos deberán mantenerse a una temperatura entre los 21 y los 25  C, con variaciones máximas de ± 2  C.La densidad celular en cada matraz se determinará al menos a las 24, 48 y 72 horas después del comienzo del ensayo. Se utilizará el medio de cultivo de algas filtrado conteniendo la concentración adecuada del producto de ensayo para determinar el fondo, cuando se utilicen mediciones de densidad celular distintas de los métodos de recuento directo.El pH se medirá al comienzo del ensayo y a las 72 horas.El pH de los controles no debe desviarse, en general, más de 1,5 unidades durante el ensayo.Ensayo de sustancias volátilesActualmente, no existe una forma generalmente aceptada para ensayar sustancias volátiles. Cuando se conozca que una sustancia tiende a volatilizarse, se podrán utilizar matraces cerrados con aumento del espacio superior (de cabeza). Hay que tener en cuenta la posibilidad de que falte CO2 cuando se calcule el espacio superior (de cabeza) de los matraces cerrados. Se han propuesto variaciones a este método (véase la referencia (4)).Se debe intentar determinar la cantidad de sustancia que permanence en solución, y se aconseja gran precaución cuando se interpreten las ensayos de las pruebas con sustancias químicas si se usan sistemas cerrados.Ensayo límiteUtilizando los procedimientos descritos en este método, puede realizarse un ensayo límite a 100 mg por litro a fin de demostrar que la CE50 es mayor que esa concentración.Si la naturaleza de la sustancia no permite alcanzar una concentración de 100 mg por litro en el agua de ensayo, el ensayo límite debe ser realizado a una concentración igual a la solubilidad de la sustancia (o a la concentración máxima que forme una dispersión estable) en el medio usado (véase también el punto 1.6.1.1.).El ensayo límite debe ser realizado al menos por triplicado, con el mismo número de testigos. Deben usarse para el ensayo límite las dos medidas de crecimiento (biomasa y tasa de crecimiento).Si se encuentra en un ensayo límite una disminución media igual o superior al 25 % en la biomasa o en la tasa de crecimiento, en relación con el testigo, debe llevarse a cabo un ensayo completo.2. RESULTADOS Y EVALUACIÓNSe tabularán las medidas de densidad celular en los cultivos de ensayo y en los controles, junto con las concentraciones de la sustancia de ensayo y los tiempos a los que se realizan las determinaciones. Se hará una gráfica del valor medio de la densidad celular para cada concentración de sustancia de ensayo, así como para los testigos, en función del tiempo (0-72 horas), a fin de conseguir curvas de crecimiento.Para determinar la relación concentración/efecto, pueden utilizarse los dos enfoques siguientes. Algunas sustancias pueden estimular el crecimiento a bajas concentraciones. Sólo se tendrán en cuenta los datos que indiquen una inhibición entre 0 y 100 %.2.1. COMPARACIÓN DE LAS ÁREAS BAJO LAS CURVAS DE CRECIMIENTOEl área entre las curvas de crecimiento y la línea horizontal N = N0 puede calcularse de acuerdo con la fórmula:A =N1N02 × t1 +N1 + N22N02 × (t2t1) + +Nn 1 + Nn 2N02× (tn tn 1)en la que:A = área,N0 = número de células/ml en el momento t0 (comienzo del ensayo,N1 = número medido de células/ml a t1,Nn = número medido de células/ml a tn,t1 = tiempo en que se realiza la primera medida tras el comienzo del ensayo,tn = tiempo en que se realiza la medida n tras el comienzo del ensayo,n = n = número de medidas hechas tras el comienzo del ensayo.El porcentaje de inhibición del crecimiento celular para cada concentración de sustancia de ensayo (IA) se calculará de acuerdo con la fórmula:IA = Ac   AtAc × 100donde:Ac = área entre la curva de crecimiento del testigo y la línea horizontal N = N0.At = área entre la curva de crecimiento a la concentración t y la línea horizontal N = N0.Los valores IA se representarán en una gráfica en papelsemilogarítmico o en papel probit semilogarítmico en función de las concentraciones correspondientes. Si la gráfica se hace en papel probit, se unirán los puntos con una línea recta, bien de forma aproximada o mediante una regresión por ordenador.La CE50 se calcula a partir de la línea de regresión leyendo la concentración equivalente a la inhibición del 50 % (IA = 50 %). Para expresar este valor de forma inequívoca en relación a este método de cálculo, se propone utilizar el símbolo C50Eb. Es esencial que C50Eb vaya acompañada del período adecuado de exposición, por ejemplo, C50Eb (0-72 horas).2.2. COMPARACION DE LAS TASAS DE CRECIMIENTOLa tasa media de crecimiento específico (ì) de los cultivos con crecimiento exponencial puede calcularse comom = ln Nn ln N0tn t0donde t0 es el momento del comienzo del ensayo.Por otra parte, la tasa media de crecimiento específico puede derivarse de la pendiente de la línea de regresión en una gráfica de ln N en función del tiempo.El porcentaje de inhibición de la tasa de crecimiento específico para cada concentración de la sustancia de ensayo (Iìt) se calcula de acuerdo con la fórmula:Imt = mc   mtmc × 100dondeìc = tasa media de crecimiento específico de los testigosìt = tasa media de crecimiento específico a la concentración de ensayo  tEl porcentaje de inhibición de la tasa media de crecimiento específico para cada concentración de sustancia de ensayo en relación con el valor de los testigos se representará en una gráfica en función de logaritmo de la concentración. La CE50 puede leerse en la gráfica resultante. Para expresar de forma inequívoca la CE50 obtenida por este método se propone utilizar el símbolo C50Er. Deben indicarse los momentos de medición, por ejemplo, si el valor de refiere a los momentos 0 y 72 horas, el símbolo será C50Er (0-72 horas).Nota: La tasa de crecimiento específico es un término logarítmico, y pequeños cambios en la tasa de crecimiento pueden dar lugar a grandes cambios en la biomasa. Por ello, CEb y CEr son valores que no pueden compararse numéricamente.2.3. CÁLCULO DE LA NOECLa concentración sin efecto observado se determina mediante un procedimiento estadístico adecuado por comparación de muestras múltiples (p. ej., análisis de la varianza y prueba de Dunnett), utilizando los valores de las áreas bajo las curvas de crecimiento A (véase el punto 2.1) o las tasas de crecimiento específico ì (véase el punto 2.2) correspondientes a cada réplica individual.3. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- sustancia de ensayo: datos de identificación química,- organismos de ensayo: origen, cultivo de laboratorio, número de cepa, método de cultivo,- condiciones del ensayo:- fecha del comienzo y del final del ensayo y su duración,- temperatura,- composición del medio,- equipo de cultivo,- pH de las soluciones al comienzo y al final del ensayo (si se observa una diferencia de pH superior a 1,5 unidades, deberá adjuntarse explicación),- vehículos y métodos utilizados para disolver la sustancia de ensayo y concentración del vehículo en las soluciones de ensayo,- calidad e intensidad de la luz,- concentraciones ensayadas (medidas o nominales),- resultados:- densidad celular para cada matraz a cada tiempo de medición y método para medir la densidad celular,- valores medios de densidad celular,- curvas de crecimiento,- representación gráfica de la relación concentración/efecto,- valores de CE y método de cálculo,- NOEC,- otros efectos observados.4. BIBLIOGRAFÍA(1) OCDE, París, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81)30 Final.(2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag «Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus», in: Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.(3) ISO 8692 - Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.(4) S. Galassi y M. Vighi - Chemosphere, 1981, vol. 10, 1123-1126.Apéndice 1Ejemplo de procedimiento para el cultivo de algasObservaciones generalesEl objetivo del cultivo mediante el siguiente procedimiento es el de obtener cultivos de algas para ensayos de toxicidad.Deberán utilizarse métodos apropiados que garanticen que los cultivos de algas no están contaminados por bacterias (ISO 4833). Puede ser conveniente utilizar cultivos axénicos, pero serán esenciales los cultivos de una sola especie de alga.Todas las operaciones deberán llevarse a cabo en condiciones estériles, con el fin de evitar la contaminación por bacterias u otras especies de algas. Se eliminarán los cultivos contaminados.Procedimiento para la obtención de algasPreparación de soluciones nutritivas (medios)El medio se puede preparar por dilución de las soluciones madre concentradas de nutrientes. Para un medio sólido, se añadirá un 0,8 % de agar. El medio utilizado será estéril. La esterilización por autoclave puede dar pérdida de NH3.Cultivos de inóculoLos cultivos de inóculo son pequeños cultivos de algas que se trasfieren periódicamente a un medio de cultivo fresco para que actúen como elemento inicial del ensayo. Si los cultivos no se utilizan regularmente, se mantienen en tubos de agar inclinado y se transfieren a un medio fresco al menos cada dos meses.Los cultivos de inóculo se cultivan en matraces cónicos que contengan el medio apropiado (un volumen alrededor de 100 ml). Cuando las algas se incuban a 20  C con iluminación continua, será necesario hacer una transferencia semanal.Durante la transferencia se llevará, con pipetas estériles, una cantidad de cultivo «viejo» a matraces con medio fresco, de manera que, con las especies de crecimiento rápido, la concentración inicial sea unas 100 veces menor que en el cultivo viejo.La tasa de crecimiento de una especie puede determinarse a partir de la curva de crecimiento. Si se conoce, será posible calcular la densidad a la cual deberá transferirse el cultivo al nuevo medio. Esto deberá realizarse antes de que el cultivo alcance su fase letal.PrecultivoEl precultivo está concebido para obtener una cantidad apropiada de algas para la inoculación de los cultivos de ensayo. Dicho precultivo deberá incubarse en las condiciones del ensayo y se utilizará cuando esté aún en fase de crecimiento exponencial, normalmente después de un período de incubación de 3 días. Si los cultivos de algas contienen células deformadas o anormales, deberán eliminarse.Apéndice 2La norma ISO 8692: Calidad del agua; prueba de inhibición del crecimiento de algas en agua dulce utilizando Scenedesmus subspicatus y Selenastrum capricornutum da los siguientes resultados en una prueba multicéntrica llevada a cabo por 16 laboratorios, utilizando como sustancia de prueba el dicromato potásico.>SITIO PARA UN CUADRO>C.4. DETERMINACIÓN DE LA BIODEGRADABILIDAD «FACIL» PARTE I. CONSIDERACIONES GENERALESI.1. INTRODUCCIÓNSe describen seis métodos de ensayo que permiten detectar la biodegradabilidad fácil de los productos químicos en medio acuoso aerobio:(a) Pérdida de carbono orgánico disuelto (COD) (Método C.4-A)(b) Prueba de detección de la OCDE modificada - Pérdida de COD (Método C.4-B)(c) Desprendimiento de dióxido de carbono (CO2) (prueba de Sturm modificada) (Método C.4-C)(d) Respirometría manométrica (Método C.4-D)(e) Frasco cerrado (Método C.4-E)(f) MITI (Ministerio de Industria y Comercio Internacional de Japón) (Método C.4-F).En la Parte I del presente método se recogen consideraciones generales y consideraciones comunes a los seis ensayos. Los aspectos específicos de los distintos métodos se tratan en las Partes II a VII. Los Anexos contienen definiciones, fórmulas y material complementario.Un estudio comparativo interlaboratorios, realizado por la OCDE en 1988, demostró la homogeneidad de los resultados obtenidos con estos métodos. Sin embargo, las características físicas de la sustancia problema pueden hacer que se prefiera un método a los otros.I.2. SELECCIÓN DEL MÉTODO ADECUADOPara seleccionar el método más adecuado es fundamental poseer información sobre la solubilidad, presión de vapor y características de absorción del producto químico. Debería conocerse la estructura química o la fórmula para calcular los valores teóricos o comprobar los valores obtenidos en las mediciones de parámetros, como DTO, CO2T, COD, COT o DQO (véanse los Anexos I y II).Las sustancias problema con una hidrosolubilidad no inferior a 100 mg/l pueden estudiarse con cualquier método, siempre que no sean volátiles ni sufran absorción. En el cuadro 1 se indican los métodos adecuados para los productos químicos poco hidrosolubles, volátiles o que sufran absorción. En el Anexo III se describe cómo pueden tratarse las sustancias poco hidrosolubles y las volátiles. Las sustancias moderadamente volátiles pueden estudiarse con el método de pérdida de COD si hay bastante espacio para el gas en los recipientes utilizados (que debieran estar convenientemente cerrados). En este caso, es necesario utilizar un control abiótico para tener en cuenta las posibles pérdidas físicas.>SITIO PARA UN CUADRO>Es necesario disponer de información sobre la pureza o las proporciones relativas de los principales componentes del producto problema para interpretar los resultados obtenidos, especialmente cuando éstos son bajos o dudosos.El disponer de datos sobre la toxicidad de la sustancia problema para bacterias (Anexo IV) puede ser muy útil para seleccionar las concentraciones adecuadas para el ensayo y puede ser fundamental para interpretar correctamente los valores bajos de la biodegradación.I.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIAPara comprobar el procedimiento se someten a ensayo sustancias de referencia que cumplan los criterios de biodegradabilidad fácil; para ello se introduce, en paralelo con el ensayo a realizar, una muestra con la sustancia de referencia adecuada.La anilina (recién destilada), el acetato sódico y el benzoato sódico son sustancias adecuadas. Todas estas sustancias de referencia se degradan con estos métodos aunque no se añada inóculo deliberadamente.Se pensó en buscar una sustancia de referencia que fuera fácilmente biodegradable pero que necesitara para su biodegradación la adición de inóculo. Se ha propuesto el uso del ftalato ácido de potasio pero es necesario disponer de más información sobre esta sustancia antes de que pueda ser aceptada como sustancia de referencia.En el ensayo respirométrico, los compuestos que contengan nitrógeno pueden afectar a la captación de oxígeno debido a la nitrificación (véanse los Anexos II y V).I.4. PRINCIPIO DE LOS MÉTODOS DE ENSAYOSe inocula una solución o suspensión de la sustancia problema en un medio mineral y se incuba en condiciones aerobias en la oscuridad o bajo luz difusa. La cantidad de COD en la solución problema debida al inóculo debería mantenerse lo más baja posible respecto a la cantidad de COD debida a la sustancia problema.Para tener en cuenta la actividad endógena del inóculo, se realizan ensayos paralelos en blanco, que contienen inóculo pero sin sustancia problema, si bien la actividad endógena de las células en presencia de la sustancia no corresponderá exactamente con la del control endógeno. Se trabajará en paralelo con una sustancia de referencia para controlar el funcionamiento de los procedimientos.En general, la degradación se sigue mediante la determinación de parámetros, como el COD, la producción de CO2 y el consumo de oxígeno, tomando medidas con la frecuencia suficiente para permitir la identificación del comienzo y de la finalización de la biodegradación. Con los repirómetros automáticos, la medición es continua. El COD se mide a veces junto con otro parámetro, pero esto suele hacerse sólo al principio y al final del ensayo. También puede utilizarse el análisis químico específico para evaluar la degradación primaria de la sustancia problema y determinar la concentración de las sustancias intermedias formadas eventualmente (esto es obligatorio en la prueba del MITI).El ensayo dura normalmente 28 días. Sin embargo, es posible terminar los ensayos antes del día 28, por ejemplo en el caso de que la curva de biodegradación haya alcanzado un nivel constante en, al menos, 3 determinaciones. También es posible prolongar los ensayos mas de 28 días cuando la curva indique que la biodegradación se ha iniciado pero sin que se haya alcanzado el nivel constante el día 28.I.5. CRITERIOS DE CALIDADI.5.1. ReproducibilidadDebido a la naturaleza de la biodegradación y de las poblaciones bacterianas mixtas utilizadas como inóculos, las determinaciones deben realizarse al menos por duplicado.La experiencia indica que la variación entre duplicados será menor cuanto mayor sea la concentración de microorganismos añadida inicialmente al medio de ensayo. También se ha visto en estudios interlaboratorios que pueden darse grandes variaciones entre los resultados obtenidos por diferentes laboratorios; no obstante, con los compuestos químicos que son fácilmente biodegradables se obtienen normalmente resultados concordantes.I.5.2. Validez del ensayoUn ensayo se considera válido si la máxima diferencia entre los duplicados respecto a los valores de la eliminación de la sustancia problema en la parte de la gráfica en forma de meseta, al final del test o al final del período de diez días, es inferior al 20 % y si la degradación porcentual de la sustancia de referencia alcanza el nivel de biodegradabilidad fácil antes de los 14 días. Si no se cumple alguna de estas condiciones, es necesario repetir el ensayo. Debido al rigor de los métodos, la obtención de bajos porcentajes de biodegradación no significa necesariamente que la sustancia problema no sea biodegradable en condiciones ambientales, sino que indica que será necesario realizar más estudios para establecer la biodegradabilidad.Si en un ensayo de toxicidad, realizado con la sustancia problema junto con una sustancia de referencia, se obtiene en 14 días menos del 35 % de degradación (según el COD) o menos del 25 % (según la DTO o el CO2T), se supone que la sustancia de ensayo es inhibidora (véase también el Anexo IV). La serie de ensayo debe repetirse, a ser posible, utilizando una concentración inferior de sustancia problema o una concentración superior de inóculo, que no exceda de 30 mg de sólidos/litro.I.6. PREPARATIVOS Y PROCEDIMIENTOS GENERALESEn el cuadro 2 se resumen las condiciones generales aplicables a los ensayos. El material y las demás condiciones experimentales relativas específicamente a un ensayo concreto se describen después bajo el título de cada ensayo.>SITIO PARA UN CUADRO>I.6.1. Agua de diluciónSe usará agua desionizada o destilada, exenta de sustancias tóxicas (por ejemplo, iones Cu++) a concentraciones inhibidoras. No debe contener más del 10 % del contenido en carbono orgánico introducido por la sustancia problema. Esta elevada pureza del agua es necesaria para no obtener valores elevados en la prueba en blanco. La contaminación puede proceder de impurezas inherentes, y también, de las resinas cambiadoras de iones y de residuos materiales procedentes de bacterias y algas. Para cada serie de ensayos debe utilizarse un solo lote de agua, comprobado previamente mediante análisis de COD. Esta comprobación no es necesaria para el ensayo del frasco cerrado, pero el consumo de oxígeno del agua debe ser bajo.I.6.2. Soluciones madre de elementos mineralesLas soluciones de ensayo se prepararán a partir de soluciones madre de elementos minerales en concentración adecuada. Las siguientes soluciones madre pueden utilizarse (con diferentes factores de dilución) en los métodos de pérdida de COD, detección de la OCDE modificada, desprendimiento de CO2, respirometría manométrica y frasco cerrado.Los factores de dilución y, en el caso de la prueba MITI, la preparación específica del medio mineral se recogen bajo el encabezamiento de cada prueba específica.Soluciones madre:Hay que preparar las siguientes soluciones madre, utilizando reactivos de grado analítico.(a) Ortofosfato diácido de potasio, KH2PO48,50 gOrtofosfato ácido de potasio, K2HPO421,75 gOrtofosfato ácido de sodio dihidratado Na2HPO4 . 2 H2O33,40 gCloruro amónico, NH4CL0,50 gDisolver en agua y enrasar a 1 litro. El pH de la solución debe ser 7,4.(b) Cloruro cálcico, anhidro, CaCl227,50 go Cloruro cálcico dihidratado, CaCl2 . 2 H2O36,40 gDisolver en agua y enrasar a 1 litro.(c) Sulfato magnésico heptahidratado, MgSO4 . 7 H2O22,50 gDisolver en agua y enrasar a 1 litro.(d) Cloruro de hierro (III) hexahidratado, FeCl3. 6 H2O0,25 gDisolver en agua y enrasar a 1 litro.Nota: con el fin de no tener que preparar esta solución inmediatamente antes de su uso, añádase una gota de HCl concentrado o 0,4 g de EDTA (sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético) por litro.I.6.3. Soluciones madre de productos químicosPor ejemplo, disolver de 1 a 10 g, según se considere adecuado, de sustancia problema o de referencia en agua desionizada y enrasar a 1 litro cuando la solubilidad sea superior a 1 g/l. En caso contrario, preparar soluciones madre en el medio mineral o añadir los productos químicos directamente en el medio mineral. Para el tratamiento de productos químicos menos solubles, véase el Anexo III, pero teniendo en cuenta que en la prueba del MITI (Método C.4-F) no pueden utilizarse ni disolventes ni emulgentes.I.6.4. InóculosEl inóculo puede proceder de diversas fuentes: lodo activado, aguas residuales efluentes (no cloradas), aguas superficiales, suelos o una mezcla de todo ello. En el caso de los ensayos de pérdida de COD, desprendimiento del CO2 y respirometría manométrica, si se utiliza lodo activado, éste debe proceder de una planta depuradora o de una instalación de laboratorio que reciba predominantemente aguas residuales domésticas. Se ha visto que los inóculos procedentes de otras fuentes dan resultados más dispersos. En el caso de la prueba de detección de la OCDE modificada y de la prueba de frasco cerrado, es necesario un inóculo más diluido sin flóculos de lodo y la fuente preferida es un efluente secundario procedente de una depuradora de aguas residuales domésticas o de una instalación de laboratorio. En el caso del método MITI, el inóculo se obtiene mezclando material procedente de distintas fuentes y se describe bajo el encabezamiento específico de esta prueba.I.6.4.1. Inóculo procedente de lodos activadosSe recoge una muestra de lodo activado recién obtenido del depósito de aireación de una planta depuradora de aguas residuales o de una instalación de laboratorio que trate predominantemente aguas residuales domésticas. En caso necesario, se retiran las partículas gruesas, por filtración a través de un tamiz fino y a continuación se mantiene el lodo en condiciones aerobias.Otra posibilidad es dejar sedimentar o centrifugar (por ejemplo, a 1 100 g durante 10 minutos) después de eliminar las posibles partículas gruesas. Se desecha el sobrenadante. El lodo puede ser lavado en el medio mineral. Se suspende el lodo concentrado en medio mineral para obtener una concentración de 3 a 5 g de sólidos suspendidos/l y se somete a aireación hasta que se utilice.El lodo debería obtenerse de una planta convencional que trabaje adecuadamente. Si tiene que obtenerse el lodo de una planta depuradora de elevado rendimiento o cuando se piense que contiene inhibidores, debería lavarse el lodo. El lodo resuspendido se mezcla bien y se deja sedimentar o se centrifuga, se desecha el sobrenadante del lodo lavado y se vuelve a resuspender en otro volumen de medio mineral. Este procedimiento se repite hasta que se considere que el lodo queda exento de un exceso de sustrato o de inhibidores.Después de conseguir la resuspensión completa, o con el lodo sin tratar, se toma una muestra justo antes de su utilización para determinar el peso seco de los sólidos en suspensión.Otra posibilidad diferente es homogeneizar el lodo activado (de 3 a 5 g de sólidos suspendidos/l). Se trata el lodo en un agitador mecánico durante 2 minutos a velocidad media. El lodo agitado se deja sedimentar durante 30 minutos, o más en caso necesario, y se decanta el líquido para utilizarlo como inóculo en la proporción de 10 ml/l de medio mineral.I.6.4.2. Otras fuentes de inóculosEste inóculo puede obtenerse a partir del efluente secundario de una planta depuradora o de una instalación de laboratorio que reciba predominantemente aguas residuales domésticas. Se toma una muestra reciente y se mantiene en condiciones aerobias durante el transporte. Se deja sedimentar durante 1 hora o se filtra a través de papel de filtro grueso y el efluente decantado o el filtrado se mantiene en condiciones aerobias hasta su utilización. Pueden utilizarse hasta 100 ml de este tipo de inóculo por cada litro de medio.Otra fuente adicional de inóculo es el agua superficial. En este caso, se recoge una muestra de un agua superficial adecuada como, por ejemplo, ríos o lagos, y se mantiene en condiciones aerobias hasta su utilización. En caso necesario, se concentra el inóculo por filtración o centrifugación.I.6.5. Acondicionamiento previo de los inóculosLos inóculos pueden estar preacondicionados a las condiciones experimentales, pero no preadaptados a la sustancia problema. El acondicionamiento previo consiste en la aireación del lodo activado en medio mineral o bien del efluente secundario durante 5 o 7 días a la temperatura del ensayo. El acondicionamiento previo mejora a veces la precisión de los métodos de ensayo reduciendo los valores del blanco. El acondicionamiento previo se considera innecesario para el inóculo del MITI.I.6.6. Controles abióticosCuando sea necesario, se estudiará la posible degradación abiótica de la sustancia problema determinando la eliminación de COD, el consumo de oxígeno o el desprendimiento de dióxido de carbono en controles estériles que no contengan inóculo. La esterilización se consigue mediante filtración a través de membrana (0,2-0,45 micrómetros) o mediante la adición de una sustancia tóxica adecuada a la concentración conveniente. Si se utiliza una membrana de filtración, coger las muestras de forma aséptica para mantener la esterilidad. A no ser que la absorción de la sustancia problema haya sido excluida de antemano, las pruebas en las que se mide la biodegradación como la eliminación de COD, especialmente con lodo activado como inóculo, debieran incluir un control abiótico inoculado y envenenado.I.6.7. Número de frascosEl número de frascos en un ensayo normal se describe bajo el encabezamiento de cada ensayo.Pueden utilizarse los siguientes tipos de frasco:Suspensión de ensayo:conteniendo la sustancia problema y el inóculo.Inóculo aislado:conteniendo únicamente inóculo.Control del procedimiento:conteniendo sustancia problema e inóculo.Control estéril abiótico:estéril, conteniendo la sustancia problema (véase punto I.6.6.).Control de absorción:conteniendo la sustancia problema, inóculo y agente esterilizante.Control de toxicidad:conteniendo la sustancia problema, la sustancia de referencia e inóculo.La determinación en la suspensión de ensayo y en el inóculo aislado deberían realizarse obligatoriamente en paralelo. Es aconsejable realizar las determinaciones en los otros frascos también en paralelo.Sin embargo, esto puede no ser siempre posible. Hay que asegurarse de que se toman bastantes muestras o lecturas para tener la certeza de que se alcanza el porcentaje de eliminación adecuado durante el período de tiempo de 10 días.I.7 DATOS Y EVALUACIÓNPara el cálculo de Dt, degradación porcentual, se utilizan los valores medios de las medidas de los parámetros, realizadas por duplicado en los dos recipientes del ensayo y en el blanco. Las fórmulas vienen dadas en las secciones específicas correspondientes a cada ensayo. El curso de la degradación se representa gráficamente y se indica el período de observación de 10 días. Se calcula y se registra la pérdida porcentual al final del período de observación de 10 días y el valor en la fase estacionaria o al final del ensayo, según se considere adecuado.En los ensayos respirométricos, los compuestos nitrogenados pueden afectar al consumo de oxígeno debido a la nitrificación (véanse los Anexos II y V).I.7.1. Medida de la degradación basada en la determinación del CODEl porcentaje de degradación (Dt) en cada momento en que se tome una muestra debiera calcularse separadamente para los frascos conteniendo la sustancia problema, utilizando los valores medios de las medidas por duplicado del COD con el fin de valorar la validez de la prueba (véase punto I.5.2). Se calcula utilizando la siguiente ecuación:Dt = (1CtCbtCoCbo) × 100donde:Dt = degradación porcentual en el tiempo t.Co = concentración media inicial de COD en el medio de cultivo inoculado con la sustancia problema (mg COD/l),Ct = concentración media de COD en el medio de cultivo inoculado con sustancia problema en el tiempo t (mg COD/l),Cbo = concentración media inicial de COD en el medio mineral en blanco inoculado (mg COD/l),Cbt = concentración media de COD en el medio mineral en blanco inoculado, en el tiempo t (mg COD/l).Todas las concentraciones son las obtenidas experimentalmente.I.7.2. Degradación medida por análisis específicosCuando se tienen datos analíticos específicos, la biodegradación primaria se calcula con la fórmula siguiente:Dt = Sb SaSb × 100donde:Dt = degradación porcentual en el tiempo t, normalmente 28 días,Sa = cantidad residual de sustancia problema en el medio inoculado al final de la prueba (mg),Sb = cantidad residual de sustancia problema en la prueba en blanco con agua o medio a los que sólo se ha aÄDnadido la sustancia problema (mg).I.7.3. Degradación abióticaCuando se utilice un control abiótico estéril, calcular el porcentaje de degradación abiótica utilizando:% de degradación abiótica = Cs(o)   Cs(t)Cs(o) × 100dondeCs(o) = concentración COD en el control estéril el día 0,Cs(t) = concentración COD en el control estéril el día t.I.8. INFORMEEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- sustancias problema y de referencia así como su pureza;- condiciones del ensayo;- inóculo: naturaleza y lugar o lugares de recogida, concentración y posible tratamiento de acondicionamiento previo;- proporción y naturaleza de los residuos industriales presentes en las aguas residuales, si se conocen;- tiempo de duración del ensayo y temperatura a la que se ha realizado;- en caso de sustancias problema poco solubles, tratamiento realizado;- método de ensayo utilizado; motivos científicos y explicación en caso de que se haya realizado algún cambio en el procedimiento;- ficha de recogida de datos;- cualquier fenómeno de inhibición que se haya observado;- cualquier degradación abiótica que se haya observado;- datos químicos analíticos específicos, si se tienen;- datos analíticos sobre los intermediarios, si se tienen;- gráfica de la degradación porcentual frente al tiempo para las sustancias problema y de referencia; hay que indicar claramente la fase de latencia, la fase de degradación, el período de observación de 10 días y la pendiente (Anexo I). Si la prueba ha cumplido con los criterios de validez, podrá utilizarse para la gráfica la media de los porcentajes de degradación de los frascos que contengan la sustancia problema;- porcentaje de eliminación obtenido después del período de observación de 10 días, en la fase estacionaria y al final de la prueba.PARTE II. ENSAYO BASADO EN LA PÉRDIDA DE COD (Método C.4-A)II.1. PRINCIPIO DEL MÉTODOUn volumen medido de medio mineral inoculado con una concentración conocida de la sustancia problema (10-40 mg COD/l) como única fuente nominal de carbono orgánico se somete a aireación en la oscuridad o bajo luz difusa a 22 ± 2  C.La degradación se va siguiendo mediante el análisis del COD a intervalos frecuentes durante un período de 28 días. El grado de biodegradación se calcula expresando la concentración de COD eliminada (corregida con los valores obtenidos en el blanco con inóculo) como porcentaje de la concentración presente inicialmente. El grado de biodegradación primaria también puede calcularse mediante análisis químico complementario realizado al principio y al final de la incubación.II.2. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODOII.2.1. Equipo(a) Matraces cónicos, por ejemplo de 250 ml hasta 2 l, según el volumen necesario para los análisis de COD;(b) Agitador para matraces cónicos, bien con control automático de la temperatura o bien situado en una sala a temperatura constante. La agitación debe ser suficiente como para mantener condiciones aerobias en todos los matraces;(c) Equipo de filtración con membranas adecuadas;(d) Analizador de COD;(e) Equipo para determinar el oxígeno disuelto;(f) Centrífuga.II.2.2. Preparación del medio mineralPara la preparación de la solución madre, véase I.6.2.Se mezclan 10 ml de solución (a) con 800 ml de agua de dilución, se añade 1 ml de las soluciones (b) a (d) y se enrasa a 1 l con agua de dilución.II.2.3. Preparación y acondicionamiento previo del inóculoEl inóculo puede obtenerse de diversas fuentes: lodo activado, aguas residuales efluentes, aguas superficiales, suelos, o de una combinación de ellos.Véanse los puntos I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. y I.6.5.II.2.4. Preparación de los matracesComo ejemplo, se introducen alícuotas de 800 ml de medio mineral en matraces cónicos de 2 litros y se añaden volúmenes suficientes de las soluciones madre de las sustancias problema y de referencia a los distintos matraces para obtener una concentración de sustancia equivalente a 10-40 mg COD/l. Controlar los valores del pH y ajustar a 7,4 si es necesario. Se inoculan los matraces con lodo activado u otra fuente de inóculo (véase el punto I.6.4.), para obtener una concentración final que no exceda de 30 mg de sólidos en suspensión/l. También hay que preparar controles del inóculo en el medio mineral pero sin sustancia problema ni de referencia.En caso necesario, puede utilizarse un recipiente para comprobar el posible efecto inhibidor de la sustancia problema inoculando una solución que contenga, en el medio mineral, concentraciones comparables tanto de la sustancia problema como de la sustancia de referencia.También, en caso necesario, puede prepararse otro matraz estéril para observar si la sustancia problema se degrada abióticamente. Para ello, se utiliza una solución de la sustancia problema sin inóculo (véase el punto I.6.6.).Además, si se sospecha que la sustancia problema puede adsorberse de forma significativa en las paredes o fondo del recipiente utilizado para la realización del ensayo, en los lodos, etc., hay que hacer una evaluación previa para determinar la importancia de la adsorción y, en consecuencia, la idoneidad de la prueba para esa sustancia (véase el cuadro 1). Preparar un matraz conteniendo la sustancia problema, el inóculo y el agente esterilizante.Todos los matraces se enrasan a 1 l con medio mineral y, tras mezclar, se toma una muestra de cada matraz para determinar la concentración inicial de COD (véase el Anexo II.4). Por ejemplo, se tapa la boca de los matraces con papel de aluminio, de forma que se permita la libre circulación de aire entre el matraz y la atmósfera ambiente. A continuación se ponen los recipientes en el agitador para iniciar el ensayo.II.2.5. Número de matraces en un ensayo normal Matraces 1 y 2: suspensión de ensayo matraces 3 y 4: con inóculo solo (blanco con inóculo) matraz 5: control de procedimiento preferentemente y cuando sea necesario: matraz 6: control estéril abiótico matraz 7: control de adsorción matraz 8: control de toxicidad.Véase también el punto I.6.7.II.2.6. Realización del ensayoA lo largo de todo el ensayo, hay que determinar la concentración de COD en cada matraz por duplicado a intervalos de tiempo conocidos con la suficiente frecuencia para poder determinar el principio del período de observación de 10 días y la pérdida porcentual al final de dicho período de 10 días. Debe limitarse al mínimo el volumen de suspensión problema tomado para cada determinación.Antes de tomar las muestras, hay que compensar las pérdidas por evaporación de los matraces añadiendo agua de dilución (I.6.1) en la cantidad necesaria. Antes de tomar las muestras hay que homogeneizar bien el medio de cultivo y asegurarse de que el material que se adhiere a las paredes de los recipientes se disuelve o resuspende. Inmediatamente después de tomar la muestra, ésta se filtra por membrana o se centrifuga (véase el Anexo II.4). La muestra filtrada o centrifugada se analiza el mismo día; en caso contrario, se conserva a 2-4  C durante un máximo de 48 horas, o por debajo de  18  C durante un período mayor.II.3. DATOS E INFORMEII.3.1. Tratamiento de los resultadosCalcular la degradación porcentual al tiempo t según se indica en el punto I.7.1. (determinación de COD) y, de forma optativa, en el punto I.7.2. (análisis específico).Todos los resultados deben registrarse en las fichas de recogida de datos presentadas.II.3.2. Validez de los resultados.Véase el punto I.5.2.II.3.3. InformeVéase el punto I.8.II.4. FICHA DE RECOGIDA DE DATOSA continuación se da un ejemplo de la ficha de recogida de datos.ENSAYO DE PÉRDIDA DE COD1. LABORATORIO2. FECHA DE COMIENZO DE LA PRUEBA3. SUSTANCIA A EXAMINARNombre:...Concentración de la solución madre: ... mg/l en sustancia químicaConcentración inicial en el medio, to: ... mg/l en sustancia química4. INÓCULOFuente:...Tratamiento realizado:...Acondicionamiento previo en su caso:...Concentración de sólidos en suspensión en la mezcla de ensayo: ... mg/l5. DETERMINACIONES DE CARBONOAnalizador de carbono:>SITIO PARA UN CUADRO>6. EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS>SITIO PARA UN CUADRO>7. CONTROL ABIÓTICO (optativo)>SITIO PARA UN CUADRO>% de degradación abiótica = Cs(o)   Cs(t)Cs(o) × 1008. ANÁLISIS QUÍMICO ESPECÍFICO (optativo)>SITIO PARA UN CUADRO>PARTE III. ENSAYO DE DETECCIÓN DE LA OCDE MODIFICADO (Método C.4-B)III.1. PRINCIPIO DEL MÉTODOUn volumen medido de medio mineral con una concentración conocida de la sustancia problema (10-40 mg COD/l) como única fuente nominal de carbono orgánico se inocula con 0,5 ml de efluente por litro de medio. La mezcla se airea en la oscuridad o bajo luz difusa a 22 ± 2  C.La degradación se va siguiendo mediante análisis del COD a intervalos frecuentes a lo largo de un período de 28 días. El grado de biodegradación se calcula expresando la concentración de COD eliminado (corregida con los valores obtenidos en el blanco con inóculo) como porcentaje de la concentración presente inicialmente. El grado de biodegradación primaria también puede calcularse a partir de análisis químicos suplementarios realizados al principio y al final de la incubación.III.2. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODOIII.2.1. Equipo(a) Matraces cónicos, por ejemplo de 250 ml a 2 l, según el volumen necesario para el análisis de COD;(b) Agitador para matraces cónicos, bien con control automático de temperatura o bien situado en una sala de temperatura constante. La agitación debe ser suficiente como para mantener condiciones aerobias en todos los matraces;(c) Equipo de filtración con membranas adecuadas;(d) Analizador de COD;(e) Equipo para determinar el oxígeno disuelto;(f) Centrífuga.III.2.2. Preparación del medio mineralPara la preparación de la solución madre, véase el punto I.6.2.Se mezclan 10 ml de la solución (a) con 800 ml de agua de dilución, se añade 1 ml de las soluciones (b) a (d) y se enrasa a 1 l con agua de dilución.Este método utiliza tan sólo 0,5 ml de efluente/l como inóculo y, por tanto, puede ser necesario enriquecer el medio con oligoelementos y factores de crecimiento. Esto se consigue añadiendo 1 ml de cada una de las siguientes soluciones por litro de medio final:Solución de oligoelementos:Sulfato de manganeso tetrahidratado, MnSO4. 4H2 39,9 mgAcido bórico, H3BO3 57,2 mgSulfato de zinc heptahidratado, ZnSO4. 7H2 42,8 mgHeptamolibdato de amonio (NH4)6 Mo7O24 34,7 mgQuelato de hierro (FeCl3 ácido etilendiaminotetraacético) 100,0 mgDisolver en agua de dilución y llevar a 1 000 ml.Solución de vitaminas:Extracto de levadura 15,0 mgDisolver el extracto de levadura en 100 ml de agua. Esterilizar mediante filtración por membrana de 0,2 micrómetros o bien preparar extemporáneamente.III.2.3. Preparación y acondicionamiento previo del inóculoEl inóculo está derivado de un efluente secundario de una planta depuradora o de una instalación de laboratorio que reciba de manera primordial aguas residuales domésticas. Véanse los puntos I.6.4.2. y I.6.5.Se usan 0,5 ml por litro de medio mineral.III.2.4. Preparación de los matracesSe introducen porciones de, por ejemplo, 800 ml de medio mineral en matraces cónicos de 2 litros y se añaden volúmenes suficientes de las soluciones madre de las sustancias problema y de referencia a los distintos matraces para obtener una concentración de sustancia equivalente a 10-40 mg COD/l. Revise el valor pH y ajústelo si es necesario, a 7,4. Se inoculan los matraces con efluente de aguas residuales en la proporción de 0,5 ml/l (véase I.6.4.2.). También deben prepararse controles del inóculo con el medio mineral pero sin sustancia problema ni de referencia.En caso necesario, puede utilizarse un matraz para comprobar el posible efecto inhibidor de la sustancia problema inoculando una solución que contenga, en medio mineral, concentraciones comparables tanto de la sustancia problema como de una sustancia de referencia.También, en caso necesario, puede prepararse otro matraz estéril para comprobar si la sustancia problema se degrada abióticamente utilizando una solución de esta sustancia sin inóculo (véase I.6.6.).Además, si se sospecha que la sustancia problema puede adsorberse de forma significativa en el recipiente utilizado para el ensayo, en los lodos, etc., debe hacerse una prueba previa para determinar el alcance probable de la absorción y, en consecuencia, la adecuación de la prueba para esa sustancia concreta (véase el cuadro 1). Prepárese un matraz conteniendo la sustancia problema, el inóculo y un agente esterilizante.Todos los matraces se enrasan a 1 l con medio mineral y, después de agitar, se toma una muestra de cada matraz para determinar la concentración inicial de COD (véase el Anexo II.4). Se tapan las bocas de los matraces con papel de aluminio, por ejemplo, de forma que se permita la libre circulación de aire entre el matraz y la atmósfera circundante. A continuación se ponen los recipientes en el agitador para iniciar el ensayo.III.2.5. Número de matraces en un ensayo normalMatraces 1 y 2: suspensión de ensayomatraces 3 y 4: con inóculo solo (blanco con inóculo)matraz 5: control de procedimiento preferentemente y cuando sea necesario:matraz 6: control estéril abióticomatraz 7: control de adsorciónmatraz 8: control de toxicidad.Véase también el punto I.6.7.III.2.6. Realización del ensayoA lo largo del ensayo hay que determinar las concentraciones de COD en cada matraz por duplicado a intervalos de tiempo conocidos, con la suficiente frecuencia como para poder determinar el inicio del período de observación de 10 días y el porcentaje de eliminación al final de dicho período de 10 días. Para cada determinación debe tomarse sólo el volumen mínimo necesario de suspensión problema.Antes de tomar las muestras, hay que compensar las pérdidas que se han producido por evaporación del medio de ensayo en los matraces, añadiendo la cantidad necesaria de agua de dilución (I.6.1). Antes de tomar las muestras hay que agitar bien el medio de cultivo y asegurarse de que el material que se hubiera adherido a las paredes de los recipientes se disuelve o se resuspende. Se filtra por membrana o se centrifuga (véase el Anexo II.4) inmediatamente después de haber tomado la muestra. Las muestras filtradas o centrifugadas se analizan el mismo día; en caso contrario, se conservan a 2-4  C durante 48 horas como máximo o por debajo de  18  C durante un período más prolongado.III.3. DATOS E INFORMEIII.3.1. Tratamiento de los resultadosSe calcula el porcentaje de degradación en el tiempo t según se indica en I.7.1. (determinación de COD) y, de forma optativa, en I.7.2. (análisis específico).Todos los resultados deben registrarse en las fichas de recogida de datos indicadas.III.3.2. Validez de los resultadosVéase el punto I.5.2.III.3.3. InformeVéase el punto I.8.III.4. FICHA DE RECOGIDA DE DATOSA continuación se ofrece un ejemplo de ficha de recogida de datos.ENSAYO DE DETECCIÓN DE LA OECD MODIFICADO1. LABORATORIO2. FECHA DE COMIENZO DE LA PRUEBA3. SUSTANCIA A EXAMINARNombre:Concentración de la solución madre: mg/l en sustancia químicaConcentración inicial en el medio, to: mg/l ensustancia química4. INÓCULOFuente:Tratamiento realizado:Acondicionamiento previo en su caso:Concentración de sólidos en suspensión en la mezcla de reacción: mg/l5. DETERMINACIONES DE CARBONOAnalizador de carbono:>SITIO PARA UN CUADRO>6. EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS>SITIO PARA UN CUADRO>7. CONTROL ABIOTICO (optativo)>SITIO PARA UN CUADRO>% de degradación abiótica = Cs(o)   Cs(t)Cs(o) × 1008. ANALISIS QUIMICO ESPECIFICO (optativo)>SITIO PARA UN CUADRO>PARTE IV. ENSAYO DE DESPRENDIMIENTO DE CO2 (Método C.4-C)IV.1. PRINCIPIO DEL METODOSe hace pasar una corriente de aire exento de dióxido de carbono a velocidad controlada, en la oscuridad o bajo luz diffusa, a través de un volumen medido de medio mineral inoculado que contiene una concentración conocida de la sustancia problema (10-20 mg COD o COT/l) como única fuente nominal de carbono orgánico. La degradación se observa a lo largo de 28 días determinando el dióxido de carbono producido, que se recoge en hidróxido de sodio o de bario y se mide por valoración del hidróxido residual o como carbono inorgánico. La cantidad de dióxido de carbono producido a partir de la sustancia problema (con las correcciones necesarias según el resultado del blanco con inóculo) se expresa como porcentaje de CO2T. El grado de biodegradación también puede calcularse mediante un análisis complementario de COD realizado al principio y al final de la incubación.IV.2. DESCRIPCION DEL METODOIV.2.1. Equipo(a) Matraces, 2-5 litros, provisto cada uno de un tubo de aireación, que llegue practicamente al fondo del recipiente, y de una salida;(b) Agitadores magnéticos, cuando se trate de sustancias poco solubles;(c) Frascos de absorción de gases;(d) Aparato para controlar y medir el flujo de aire;(e) Aparato para eliminar el dióxido de carbono en la preparación de aire exento de dióxido de carbono; otra posibilidad es utilizar una mezcla de oxígeno exento de CO2 y de nitrógeno exento de CO2, provenientes de sendas botellas, en las proporciones correctas (20 % O2:80 % N2);(f) Equipo para determinar el dióxido de carbono, bien volumétricamente o bien con un analizador de carbono inorgánico;(g) Equipo de filtración por membrana (opcional);(h) Analizador de COD (opcional).IV.2.2. Preparación del medio mineralPara la preparación de las soluciones madre, véase I.6.2.Se mezclan 10 ml de solución (a) con 800 ml de agua de dilución; se añade 1 ml de las soluciones (b) a (d) y se enrasa a 1 l con agua de dilución.IV.2.3. Preparación y acondicionamiento previo del inóculoEl inóculo puede obtenerse de diversas fuentes: lodo activado, aguas residuales efluentes, aguas superficiales, suelos, o de una combinación de ellos.Véanse los puntos I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. y I.6.5.IV.2.4. Preparación de los matracesLos siguientes volúmenes y pesos, dados meramente como ejemplo, indican los valores apropiados para matraces de 5 litros que contengan 3 l de suspensión. Si se utilizan volúmenes más pequeños hay que modificar los valores en consecuencia, pero hay que asegurarse de que el dióxido de carbono formado puede medirse con precisión.A cada matraz de 5 litros se añaden 2 400 ml de medio mineral. Se añade a continuación un volumen adecuado del lodo activado ya preparado (véanse los puntos I.6.4.1 y I.6.5.) para tener una concentración de sólidos en suspensión que no exceda de 30 mg/l en el volumen final de 3 l de mezcla inoculada. Otra posibilidad es diluir en primer lugar el lodo preparado para obtener una suspensión de 500-1 000 mg/l en el medio mineral antes de añadir una alícuota al contenido del matraz de 5 litros para obtener una concentración final de 30 mg/l; de esta forma se consigue mayor precisión. También pueden utilizarse otras fuentes de inóculos (véase el punto I.6.4.2.). añadir una alícuota al contenido del matraz de 5 litros para obtener una concentración final de 30 mg/l; de esta forma se consigue mayor precisión. También pueden utilizarse otras fuentes de inóculos (véase el punto I.6.4.2.).Estas mezclas inoculadas se someten a un flujo de aire exento de CO2 durante una noche para purgar el dióxido de carbono del sistema.Se añade a los matraces, por separado y por duplicado, la sustancia problema y la sustancia de referencia procedentes de sendas soluciones madre, en volúmenes conocidos, como para obtener concentraciones de 10 a 20 mg de COD o COT/l, procedente de las sustancias añadidas; algunos matraces se dejan como controles del inóculo sin añadirles ninguna sustancia. Las sustancias problema poco solubles se añaden directamente a los matraces teniendo en cuenta una relación de peso o de volumen, o bien se opera según se describe en el Anexo III.En caso necesario, puede utilizarse un matraz para comprobar el posible efecto inhibidor de la sustancia problema añadiendo tanto sustancia problema como sustancia de referencia en las mismas concentraciones que se dan en los otros matraces.También, en caso necesario, puede utilizarse un matraz estéril para comprobar si la sustancia problema se degrada abióticamente utilizando una solución de la sustancia sin inóculo (véase I.6.6.). Esterilízese mediante la adición de una sustancia tóxica en la concentración apropiada.Se llevan los volúmenes de las suspensiones de todos los matraces a 3 l mediante adición de medio mineral previamente aireado con aire exento de CO2. Otra posibilidad es tomar muestras para el análisis del COD (véase el Anexo II.4.) o análisis específicos. Se conectan los frascos de absorción a las salidas de aire de los matraces.Si se utiliza hidróxido de bario, hay que conectar a cada matraz de 5 litros tres frascos de absorción puestos en serie, cada uno con 100 ml de solución de hidróxido de bario 0,0125 M. La solución debe estar exenta de sulfatos y carbonatos precipitados y su concentración debe determinarse justo antes de ser utilizada. Si se utiliza hidróxido de sodio, se conectan dos frascos, de los que el segundo actúa como control para comprobar que todo el dióxido de carbono ha quedado absorbido en el primero. Son adecuados los frascos de absorción provistos de cierres de botellas de suero. A cada frasco se añaden 200 ml de solución de hidróxido de sodio 0,05 M, cantidad suficiente para absorber todo el dióxido de carbono producido si la sustancia química se degrada por completo. La solución de hidróxido de sodio, incluso cuando se prepara extemporáneamente, contiene trazas de carbonatos; esto se corrige deduciendo la cantidad de carbonatos presentes en el blanco.IV.2.5. Número de matraces en un ensayo normalMatraces 1 y 2: suspensión de ensayomatraces 3 y 4: con inóculo solo (blanco con inóculo)matraz 5: control de procedimientopreferentemente y cuando sea necesario:matraz 6: control estéril abióticomatraz 7: control de toxicidad.Véase también el punto I.6.7.IV.2.6. Realización del ensayoEl ensayo se inicia haciendo borbotear aire exento de CO2 a través de las suspensiones a la velocidad de 30-100 ml/min. Periódicamente se toman muestras del absorbente de dióxido de carbono para analizar el contenido de CO2. Durante los primeros 10 días se recomienda que los análisis se hagan cada dos o tres días y, después, cada cinco días hasta llegar al día 28, de forma que pueda determinarse el período de observación de 10 días.El día 28 se toman muestras (opcionalmente) para el análisis de COD o análisis específicos, se mide el pH de las suspensiones y se añade 1 ml de ácido clorhídrico concentrado a cada matraz; se airean los frascos durante una noche para arrastrar el dióxido de carbono presente en las suspensiones problema. El día 29 se hace el último análisis del dióxido de carbono producido.Los días en que se haga la medición del CO2, se desconecta el absorbente de hidróxido de bario más próximo al matraz y se valora la solución de hidróxido con HCl 0,05 M utilizando fenolftaleína como indicador. Los restantes absorbentes se unen al matraz y se coloca en el extremo libre de la serie un nuevo absorbente con 100 ml de hidróxido de bario 0,0125 M recién preparado. Hay que hacer valoraciones según sea necesario, por ejemplo, cuando se observe la aparición de un precipitado importante en el primer frasco y antes de que aparezca en el segundo, o al menos una vez por semana. Cuando se utiliza NaOH como absorbente, se toma con jeringa una muestra pequeña (según las características del analizador de carbono utilizado) de la solución de hidróxido de sodio del absorbente más próximo al matraz. Se inyecta la muestra en la parte CI del analizador de carbono para analizar directamente el dióxido de carbono producido.El contenido del segundo frasco sólo se analiza al final de la prueba para introducir las correcciones necesarias en caso de que se haya producido arrastre de dióxido de carbono.IV.3. DATOS E INFORMEIV.3.1. Tratamiento de los resultadosLa cantidad de CO2 retenida en un absorbente viene dada por:mg CO2 = (100 × CB  0,5 × V × CA) × 44donde:V  = volumen de HCl utilizado para valorar los 100 ml del absorbente (ml),CB = concentración de la solución de hidróxido de bario (M),CA = concentración de la solución de ácido clorhídrico (M),Si CB es 0,0125 M y CA es 0,05 M, el resultado de la valoración de 100 ml de hidróxido de bario es 50 ml y el peso de CO2 viene dado por:0,052 × 44 × ml HCl valorado = 1,1 × ml HClAsí pues, para pasar el volumen de HCl valorado a mg de CO2 producido, el factor en este caso es 1,1.Se calculan los pesos de CO2 producido del inóculo solo y del inóculo más la sustancia problema utilizando los respectivos resultados de valoración y la diferencia es el peso de CO2 producido a partir de la sustancia problema sola.Por ejemplo, si el inóculo solo da una valoración de 48 ml y el inóculo con la sustancia problema da 45 ml,CO2 del inóculo = 1,1 × (50-48) = 2,2 mgCO2 del inóculo con la sustancia problema= 1,1 × (50-45) = 5,5 mgy, por tanto, el peso de CO2 producido a partir de la sustancia problema es 3,3 mg.El porcentaje de biodegradación se calcula con la fórmula siguiente:% degradación = CO2T × mg de sustancia problema añadidamg CO2 producido × 100o bien% degradación = mg COT añadido en la prueba × 3,67mg CO2 producido × 1003,67 es el factor de conversión (44/12) para pasar de carbono a dióxido de carbono.El porcentaje de degradación tras un intervalo cualquiera de tiempo se obtiene sumando los valores porcentuales de CO2T calculados para cada uno de los días hasta el momento en que se haya medido.En el caso de absorbentes de hidróxido de sodio, la cantidad de dióxido de carbono producido, expresado como CI (mg) se calcula multiplicando la concentración de CI en el absorbente por el volumen de éste.El porcentaje de degradación se calcula con la fórmula siguiente:% CO2T = mg CI del matraz problema   mg CI del blancomg COT añadidos como sustancia problema × 100La pérdida de COD se calcula opcionalmente según se describe en 1.7. Se registran estos resultados y todos los demás en las fichas de datos mencionadas.IV.3.2. Validez de los resultadosEl contenido en CI de la suspensión de sustancia problema en el medio mineral al inicio de la prueba debe ser inferior al 5 % del CT, y el desprendimiento total de CO2 en el blanco con inóculo al final de la prueba no debe exceder normalmente de 40 mg/l por término medio. Si se obtienen valores superiores a 70 mg CO2/l, es necesario revisar críticamente los datos y la técnica experimental.Véase también el punto I.5.2.IV.3.3. InformeVéase el punto I.8.IV.4. FICHA DE RECOGIDA DE DATOSA continuación se presenta un ejemplo de ficha de recogida de datos.ENSAYO DE DESPRENDIMIENTO DE DIOXIDO DE CARBONO1. LABORATORIO2. FECHA DE COMIENZO DE LA PRUEBA3. SUSTANCIA A EXAMINARNombre:...Concentración de la solución madre: ... mg/l en sustancia químicaConcentración inicial en el medio: ... mg/l en sustancia químicaCarbono total añadido al matraz: ... mg CCO2T: ... mg CO2 4. INOCULOFuente: ...Tratamiento realizado: ...Acondicionamiento previo en su caso: ...Concentración de sólidos en suspensión en la mezcla de reacción: ... mg/l5. PRODUCCION DE DIOXIDO DE CARBONO Y DEGRADABILIDAD:Método: Ba(OH)2/NaOH/otro>SITIO PARA UN CUADRO>6. ANALISIS DE CARBONO (opcional)Analizador de carbono:>SITIO PARA UN CUADRO>% COD eliminado = 1    Ct    Cb(t) Co   Cb(o) × 1007. DEGRADACIÓN ABIÓTICA (opcional)% degrad. abiót. = formac. de CO2 en el matraz estéril tras 28 días (mg)CO2T (mg) × 100PARTE V. RESPIROMETRÍA MANOMÉTRICA (Método C.4-D)V.1. PRINCIPIO DEL MÉTODOSe somete a agitación en un frasco cerrado a temperatura constante (± 1  C o más exacto), durante 28 días, un volumen medido de medio mineral inoculado que contenga una concentración conocida de la sustancia química de ensayo (100 mg/l de la sustancia de ensayo, para dar al menos 50-100 mg DTO/l) como única fuente nominal de carbono orgánico. Se determina el consumo de oxígeno midiendo la cantidad de oxígeno (producido por electrólisis) requerido para mantener un volumen constante de gas en el frasco del respirómetro, o a partir de los cambios de volumen o presión (o una combinación de ambas cosas) en el aparato. El dióxido de carbono producido se absorbe en una solución de hidróxido potásico u otro absorbente adecuado. La cantidad de oxígeno consumido por la sustancia problema (corregida según el consumo del blanco con inóculo, realizada en paralelo) se expresa como porcentaje de DTO o DQO. Opcionalmente, se puede calcular también la biodegradación primaria mediante un análisis adicional específico realizado al comienzo y al final de la incubación, y la biodegradación última mediante un análisis de COD.V.2. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODOV.2.1. Equipo(a) respirómetro adecuado;(b) control de temperatura, manteniéndolo con un margen de ± 1  C o más exacto;(c) conjunto de membrana y filtros (opcional);(d) analizador de carbono (opcional);V.2.2. Preparación del medio mineralPara la preparación de las soluciones madre, véase I.6.2.Mezclar 10 ml de la solución (a) con 800 ml de agua de dilución, añadir 1 ml de las soluciones (b) a (d) y enrasar hasta 1 l con agua de dilución.V.2.3. Preparación y acondicionamiento previo del inóculoEl inóculo puede obtenerse de diversas fuentes: lodo activado, aguas residuales efluentes, aguas superficiales, suelos, o de una combinación de ellos.Véanse los puntos I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. y I.6.5.V.2.4. Preparación de los frascosPreparar soluciones de las sustancias problema y de referencia, en lotes separados, en un medio mineral equivalente a una concentración, normalmente, de 100 mg de sustancia /l (que dé al menos 50-100 mg DTO/l) utilizando soluciones madre.Calcular la DTO sobre la base de la formación de sales de amonio salvo que se prevea nitrificación; en este caso, el cálculo debe basarse en la formación de nitratos (véase el Anexo II.2.).Determinar los valores de pH y, si es necesario, ajustarlos a 7,4 ± 0,2.Las sustancias débilmente solubles deben añadirse en un estadio posterior (véase más abajo).Si hay que determinar la toxicidad de la sustancia problema, preparar posteriormente otra solución en medio mineral que contenga tanto la sustancia problema como la de referencia a las mismas concentraciones que las utilizadas para el ensayo.Si se necesita una medida del consumo fisicoquímico de oxígeno, preparar una solución de la sustancia problema, generalmente, a una concentración de 100 mg DTO/l. Esterilizar dicha solución mediante la adición de una sustancia tóxica adecuada (véase I.6,6.).Introducir en frascos, al menos por duplicado, el volumen necesario de soluciones de sustancias problema y de referencia. Añadir a los siguientes frascos solamente medio mineral (para controles de inóculos) y, si es necesario, la solución con mezcla de sustancia problema y de referencia y la solución estéril.Si la sustancia problema es poco soluble, se añadirá directamente en este estadio basándose en el volumen o en el peso o actuando como se describe en el Anexo III. Añadir hidróxido de potasio con cal sodada u otro absorbente a los compartimentos de absorción de CO2.V.2.5. Número de frascos en un ensayo normalMatraces 1 y 2: suspensión de ensayomatraces 3 y 4: con inóculo solo (blanco con inóculo)matraz 5: control de procedimientopreferentemente y cuando sea necesario:matraz 6: control estérilmatraz 7: control de toxicidad.Véase también el punto I.6.7.V.2.6. Realización del ensayoSe deja que los recipientes alcancen la temperatura deseada y se inoculan los recipientes adecuados con lodo activado preparado u otra fuente de inóculo para obtener una concentración de sólidos suspendidos no superior a 30 mg/l. Se monta el equipo, se pone en marcha el agitador y se controla la impermeabilidad al aire, comenzando en este momento la medición del consumo de oxígeno. Generalmente no hay que hacer más que tomar las lecturas necesarias y los controles diarios para asegurarse de que se mantienen la temperatura correcta y la agitación adecuada.Calcular el consumo de oxígeno según las lecturas tomadas a intervalos frecuentes y regulares, utilizando los métodos proporcionados por el fabricante del equipo. Al final de la incubación, normalmente 28 días, medir el pH del contenido de los frascos, especialmente si el consumo de oxígeno es inferior o superior a la DTONH4 (en aquellos compuestos que contengan nitrógeno).Si es necesario, se tomarán muestras de los frascos del respirómetro, al comienzo y al final, para analizar el COD o realizar un análisis químico específico (véase Anexo II.4). Cuando se haga la primera toma de muestras, hay que asegurarse de que se conoce el volumen de suspensión problema que queda en el frasco. Cuando la sustancia problema nitrogenada consuma oxígeno, determinar el aumento de la concentración de nitrito y nitrato en 28 días y calcular la corrección teniendo en cuenta el oxígeno consumido por nitrificación (Anexo V).V.3. DATOS E INFORMEV.3.1. Tratamiento de los resultadosDividir el consumo de oxígeno (mg) de la sustancia problema después de un tiempo dado (corregido según el blanco con inóculo después del mismo tiempo) entre el peso de la sustancia problema utilizada. Esto dará la DBO expresada en mg de oxígeno/mg de sustancia problema, es decirDBO = mg O2 consumido por la sust. problema   mg O2 consumido por el blancomg de sustancia problema en el frasco= mg de O2 por mg de sustancia problemacalcular el porcentaje de biodegradación, bien a partir de:% de biodegradación = % DTO =  DBO (mg O2/mg sustancia)DTO (mg O2/mg sustancia) × 100,o bien de:% DQO =  DBO (mg O2/mg sustancia) DQO (mg O2/mg sustancia) × 100Debe señalarse que estos dos métodos no dan necesariamente el mismo valor. Es preferible usar el primero.En el caso de sustancias a examinar que contengan nitrógeno, se utiliza la DTO (NH4 o NO3) adecuada según se espere o se sepa que va haber nitrificación o no (Anexo II.2). Si hay nitrificación pero no es completa, se calcula una corrección según el oxígeno consumido por nitrificación basándose en los cambios de la concentración de nitrito y nitrato (Anexo V).Cuando se hagan determinaciones opcionales de carbono orgánico o análisis químicos específicos, calcular la degradación porcentual, tal como se describe en I.7.Registrar todos los resultados en las fichas de datos adjuntas.V.3.2. Validez de los resultadosEl consumo de oxígeno del blanco con inóculo es normalmente de 20-30 mg O2/l y no debe ser superior a 60 mg/l en 28 días. Los valores superiores a 60 mg/l exigirán un examen crítico de los datos y de las técnicas experimentales. Si el valor del pH está fuera del rango 6-8,5 y el consumo de oxígeno por la sustancia problema es inferior al 60 %, debe repetirse el ensayo con menor concentración de la sustancia problema.Véase también I.5.2.V.3.3. InformeVéase el punto I.8.V.4. FICHA DE RECOGIDA DE DATOSA continuación se da un ejemplo de una ficha de recogida de datos.RESPIROMETRÍA MANOMÉTRICA1. LABORATORIO2. FECHA DE COMIENZO DE LA PRUEBA3. SUSTANCIA A EXAMINARNombre: ...Concentración de la solución madre: ... mg/lConcentración inicial en el medio, Co: ... mg/lVolumen en el matraz de prueba (V): ... mlDTO de sustancia/DQO de sustancia: ... mg O2/mg de sustancia a examinar (NH4, NO3)4. INOCULOFuente: ...Tratamiento realizado: ...Acondicionamiento previo en su caso: ...Concentración de sólidos en suspensión en la mezcla de reacción: ... mg/l5. CONSUMO DE OXÍGENO: BIODEGRADABILIDAD>SITIO PARA UN CUADRO>6. CORRECCIÓN POR NITRIFICACIÓN (véase Anexo V)>SITIO PARA UN CUADRO>7. ANÁLISIS DE CARBONO (opcional)Analizador de carbono:>SITIO PARA UN CUADRO>% COD eliminado = 1    Ct   Cblt Co   Cblo × 1008. ANÁLISIS QUÍMICO ESPECÍFICO (opcional)Sb = concentración en el control fisicoquímico (estéril) a los 28 días.Sa = concentración en el frasco inoculado a los 28 días.% biodegradación = Sb   SaSb × 1009. DEGRADACIÓN ABIÓTICA (opcional)a = consumo de oxígeno en frascos estériles después de 28 días, mg.consumo de oxígeno por mg de sustancia problema = CoVa(véanse las secciones 1 y 3)% degradación abiótica = CoV × DTOa × 100PARTE VI. ENSAYO DEL FRASCO CERRADO (Método C.4-E)VI.1. PRINCIPIO DEL MÉTODOSe prepara una solución de la sustancia problema en medio mineral, generalmente con una concentración de 2-5 mg/l. Esta solución se inocula con un número relativamente pequeño de microorganismos de una población mixta y se mantiene en frascos cerrados completamente llenos, en la oscuridad y a temperatura constante. La degradación se sigue mediante el análisis del oxígeno disuelto durante un período de 28 días. La cantidad de oxígeno consumido por la sustancia problema, corregido según el consumo de oxígeno por parte del blanco con inóculo realizado en paralelo, se expresa como porcentaje de DTO o DQO.VI.2. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODOVI.2.1. Equipoa) Frascos de DBO, con tapones de cristal de, por ejemplo, 250-300 ml.b) Baño maría o incubadora, para mantener los frascos a temperatura constante (± 1  C o más exacto) en la oscuridad.c) Frascos de cristal grandes (2-5 l) para la preparación de medios y para rellenar los frascos de DBO.d) Electrodo de oxígeno y oxímetro o equipamiento y reactivos para la valoración según Winkler.VI.2.2. Preparación del medio mineralPara la preparación de la solución madre, véase I.6.2.Mezclar 1 ml de las soluciones (a) a (d) y rellenar hasta 1 l con agua de dilución.VI.2.3. Preparación del inóculoEl inóculo se deriva normalmente de un efluente secundario de una planta depuradora o de una instalación de laboratorio que reciba predominantemente aguas residuales domésticas. Otra fuente posible de inóculo es el agua superficial. Utilizar normalmente desde una gota (0,05 ml) hasta 5 ml de filtrado por litro de medio; se pueden necesitar varias pruebas para descubrir el volumen óptimo para un efluente dado. (Véanse los puntos I.6.4.2. y I.6.5.)VI.2.4. Preparación de los frascosSe airea intensamente el medio mineral durante 20 minutos por lo menos. Realizar cada serie de ensayos con el mismo medio mineral. Generalmente, el medio está listo para su uso después de dejarlo reposar 20 horas, a la temperatura del ensayo. Determinar la concentración de oxígeno disuelto como control; debe dar un valor de unos 9 mg/l a 20  C. Todas las operaciones de transferencia y llenado de medio saturado de aire y sin burbujas, se harán, por ejemplo, mediante sifones.Se preparan grupos paralelos de frascos de DBO para la determinación de sustancias problema y de referencia en series experimentales simultáneas. Reunir un número suficiente de frascos de DBO, incluyendo blancos con inóculo, para permitir hacer, al menos por duplicado, mediciones de consumo de oxígeno a los intervalos deseados, por ejemplo, a los 0, 7, 14, 21 y 28 días. Pueden ser necesarios más frascos si se quiere determinar el período de observación de 10 días.Se añade medio mineral bien aireado a frascos grandes de manera que estén llenos aproximadamente hasta un tercio de su capacidad. A continuación se añade suficiente cantidad de las soluciones madre de las sustancias problema y de las sustancias de referencia a frascos grandes por separado de forma que la concentración final de las sustancias químicas no exceda normalmente de 10 mg/l. No se añadirá ninguna sustancia al blanco de control contenido en otro frasco grande.La concentración de oxígeno disuelto no debe bajar por debajo de 0,5 mg/l en los frascos de DBO, para poder garantizar la no limitación de la actividad del inóculo. Esto limita la concentración de la sustancia problema a unos 2 mg/l. Sin embargo, en caso de compuestos poco degradables y de aquéllos que tienen baja DTO, puede usarse una concentración de 5-10 mg/l. En algunos casos, es aconsejable realizar series paralelas de sustancias problema a dos concentraciones diferentes, por ejemplo, 2 y 5 mg/l. Normalmente, se calculará la DTO basándose en la formación de sales de amonio pero, si se espera o se sabe que va a haber nitrificación, se calculará basándose en la formación de nitrato (DTONO3: véase Anexo II.2). No obstante, si hay nitrificación pero no es completa, se corregirá de acuerdo con los cambios en la concentración de nitrito y nitrato, determinada por análisis (véase Anexo V).Si se va a investigar la toxicidad de la sustancia problema (en el caso, por ejemplo, de que se haya encontrado previamente un valor de biodegradabilidad bajo), será necesaria otra serie de frascos.Se prepara otro frasco grande que contenga medio mineral aireado (alrededor de un tercio de su volumen) más la sustancia problema y la de referencia a concentraciones finales normalmente iguales a las de los otros frascos grandes.Se inoculan las soluciones en los frascos grandes con efluente secundario (desde una gota, alrededor de 0,05 ml, hasta 5 ml/l) o con otra fuente como agua de río (véase I.6.4.2.). Finalmente se llevan las soluciones al volumen deseado con medio mineral aireado utilizando un tubo que llegue hasta el fondo del frasco para conseguir una mezcla adecuada.VI.2.5. Número de frascos en una serie típicaEn una serie típica se usan los siguientes frascos:al menos 10 que contengan la sustancia problema y el inóculo (suspensión de ensayo),al menos 10 que sólo contengan el inóculo (blanco con inóculo),al menos 10 que contengan la sustancia de referencia y el inóculo (control de procedimiento),y, cuando sea necesario, 6 frascos que contengan la sustancia problema, la sustancia de referencia y el inóculo (control de toxicidad). Sin embargo, puede necesitarse al menos el doble de frascos si se desea garantizar la posibilidad de determinar el período de observación de 10 días.VI.2.6. Realización del ensayoSe introduce inmediatamente cada solución preparada en el respectivo grupo de frascos de DBO mediante un tubo desde el cuarto inferior (no el fondo) del frasco grande apropiado, de forma que se rellenen completamente todos los frascos de DBO. Se golpea ligeramente para eliminar toda burbuja de aire. Se analizan inmediatamente los frascos para determinar el oxígeno disuelto a tiempo cero, mediante los métodos de Winkler o de electrodo. Pueden preservarse los contenidos de los frascos, para su análisis ulterior, mediante el método de Winkler añadiendo sulfato de manganeso (II) e hidróxido sódico (el primer reactivo del método Winkler); estos frascos, que contienen el oxígeno fijado como óxido hidratado de manganeso (III) (precipitado marrón), se pueden almacenar en la oscuridad y a 10-20  C durante no más de 24 horas antes de continuar con el análisis según el método de Winkler. Se tapan los restantes frascos replicados asegurándose de que no quedan burbujas dentro de ellos y se incuban a 20  C en la oscuridad. Cada serie debe acompañarse de una serie paralela completa para la determinación en el blanco inoculado. Retirar al menos frascos duplicados de todas las series para el análisis del oxígeno disuelto a intervalos de tiempo (al menos semanalmente) durante los 28 días de incubación.Las muestras semanales permitirán la valoración del porcentaje de eliminación en un período de observación de 14 días, mientras que las muestras tomadas cada 3 o 4 días permitirán determinar el período de observación de 10 días, lo que requerirá aproximadamente el doble de frascos.En el caso de las sustancias que contengan nitrógeno, deberán hacerse correcciones del consumo de oxígeno si tiene lugar cualquier tipo de nitrificación. Con este fin, se usará el método del electrodo de O2 a fin de determinar la concentración de oxígeno disuelto y sacar una muestra del frasco de DBO para análisis de nitrito y nitrato. El oxígeno utilizado se calculará a partir del aumento de concentración de nitrito y nitrato (véase Anexo V).VI.3. DATOS E INFORMEVI.3.1. Tratamiento de los resultadosSe calcula en primer lugar la DBO obtenida tras cada período de tiempo sustrayendo la depleción de oxígeno (mg O2/l) del blanco con inóculo de la que presenta la sustancia problema. Se divide esta depleción corregida entre la concentración (mg/l) de la sustancia problema a fin de obtener la DBO específica en mg de oxígeno por mg de sustancia problema. Se calcula la biodegradabilidad porcentual dividiendo la DBO específica entre la DTO específica (calculada de acuerdo con el Anexo II.2) o la DQO (determinada por análisis, véase Anexo II.3); así pues:DBO = mg de consumo de O2 sustancia problema   mg de O2 consumo blancomg sustancia problema en el frasco= mg de O2 por mg de sustancia problema% de degradación =  DBO (mg O2/mg sustancia problema) DTO (mg O2/mg sustancia problema) × 100o% de degradación =  DBO (mg O2/mg sutancia problema) DQO (mg O2/mg sustancia problema) × 100En el caso de sustancias que contengan nitrógeno, se utiliza la DTO (NH4 o NO3) adecuada según se espere o se sepa que va haber nitrificación o no (Anexo II.2). Si hay nitrificación pero no es completa, se calcula una corrección según el oxígeno consumido por nitrificación basándose en los cambios de la concentración de nitrito y nitrato (Anexo V).VI.3.2. Validez de los resultadosLa depleción de oxígeno en el blanco con inóculo no debe sobrepasar 1,5 mg de oxígeno disuelto/l después de 28 días. Si hay valores superiores a este, deberá hacerse una revisión de las técnicas experimentales. La concentración residual de oxígeno en los frascos del ensayo no deberá bajar por debajo de 0,5 mg/l en ningún momento. Estos valores tan bajos de oxígeno sólo son válidos si el método de determinación del oxígeno disuelto es capaz de medir dichos niveles con exactitud.Véase también I.5.2VI.3.3. InformeVéase el punto I.8.VI.4. FICHA DE RECOGIDA DE DATOSA continuación se da un ejemplo de ficha de recogida de datos.ENSAYO DEL FRASCO CERRADO1. LABORATORIO2. FECHA DE COMIENZO DE LA PRUEBA3. SUSTANCIA A EXAMINARNombre:Concentración de la solución madre: mg/lConcentración inicial en el frasco: mg/lDTO/DQO: mg O2/mg de sustancia a examinar4. INÓCULOFuente:Tratamiento realizado:Acondicionamiento previo en su caso:Concentración de sólidos en suspensión en la mezcla de reacción: mg/l5. DETERMINACIÓN DEL ODMétodo: Winkler/electrodo>SITIO PARA UN CUADRO>6. CORRECCIÓN POR NITRIFICACIÓN (véase Anexo V)>SITIO PARA UN CUADRO>7. DEPLECIÓN DE OD: % DE DEGRADACIÓN>SITIO PARA UN CUADRO>mto = valor a tiempo 0 en el frasco de la pruebamtx = valor a tiempo t en el frasco de la pruebambo = valor medio del blanco a tiempo 0mbx = valor medio del blanco a tiempo xSe aplicará también una corrección según la nitrificación basándose en iii+vi de la sección 6.8. DEPLECIÓN DE OD EN EL BLANCOConsumo de oxígeno por el blanco: (mbo   mb28) mg/l. Este consumo es importante para la validez del ensayo. Debe ser menor de 1,5 mg/l.PARTE VII. ENSAYO DEL M.I.T.I. (Método C.4-F)VII.1. PRINCIPIO DEL MÉTODOSe mide automáticamente durante un período de 28 días, en un respirómetro cerrado, a 25 ± 1  C y en la oscuridad, el consumo de oxígeno en una solución o suspensión agitada, de la sustancia problema en un medio mineral, inoculado con un inóculo especial de microorganismos no adaptados. El dióxido de carbono producido es absorbido por cal sodada. La biodegradabilidad se expresa como porcentaje de consumo de oxígeno (corregido según el consumo del blanco) sobre el consumo teórico (DTO). El porcentaje de biodegradabilidad primaria se calcula también basándose en los análisis químicos específicos adicionales hechos al comienzo y al final de la incubación y, opcionalmente, por análisis de COD.VII.2. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODOVII.2.1. Equipoa) Medidor electrolítico automático de DBO o respirómetro normalmente equipado con seis frascos, de 300 ml cada uno y que llevan cápsulas para el absorbente de CO2.b) Temperatura ambiente constante o baño maría a 25  C ± 1  C o más exacta;c) Conjunto de membrana y filtros (opcional)d) Analizador de carbono (opcional).VII.2.2. Preparación del medio mineralSe prepararán las siguientes soluciones madre, utilizando reactivos de calidad analítica y agua (I.6.1.):(a) Ortofosfato diácido de potasio, KH2PO4 8,50 gOrtofosfato monoácido de potasio, K2HPO4 21,75 gOrtofosfato monoácido de sodio dodecahidratado Na2HPO4 12 H2O 44,60 gCloruro amónico, NH4Cl 1,70 gDisolver en agua y enrasar hasta 1 litroEl pH de la solución debe ser de 7,2(b) Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO4 7 H2O 22,50 gDisolver en agua y enrasar a 1 litro(c) Cloruro cálcido anhidro, CaCl2 27,50 gDisolver en agua y enrasar a 1 litro(d) Cloruro de hierro (III) hexahidratado, FeCl3 6 H2O 0,25 gDisolver en agua y enrasar a 1 litroSe toman 3 ml de cada solución (a), (b), (c) y (d) y se enrasa a 1 litro.VII.2.3. Preparación del inóculoSe recogen muestras frescas de no menos de 10 puntos, sobre todo en zonas donde se utilicen y viertan diversos productos químicos. En los sitios como las instalaciones de tratamiento de aguas residuales, tratamiento industrial de aguas residuales, ríos, lagos, mares, se recogerá muestras de 1 litro de lodo, suelo superficial, agua, etc. y se mezclarán cuidadosamente. Después de eliminar la materia flotante y de dejar sedimentar, el sobrenadante se ajustará a pH 7 ± 1 con hidróxido sódico o ácido fosfórico.Se utiliza un volumen adecuado del sobrenadante filtrado para rellenar un recipiente de decantación de lodo activado y se airea el líquido durante 23 h 30 min. Treinta minutos después de detener la aireación, se elimina alrededor de un tercio del volumen total de sobrenadante y se añade al material sedimentado un volumen igual de una solución (pH 7) que contenga 0,1 % respectivamente de glucosa, peptona y ortofosfato monopotásico, volviendo a comenzar la aireación. Este procedimiento se repite una vez al día. La unidad de lodo funcionará de acuerdo con las prácticas correctas: los efluentes deben estar limpios, la temperatura debe permanecer a 25 ± 2  C, el pH debe ser 7 ± 1, el lodo debe estar bien sedimentado, debe haber aireación suficiente para mantener la mezcla en aerobiosis en todo momento, los protozoos deben estar presentes; al menos cada tres meses se hará un ensayo de la actividad del lodo frente a una sustancia de referencia. No se debe utilizar lodo como inóculo hasta al menos un mes después de la operación, pero no más de cuatro meses después. Posteriormente, tomar muestras de al menos 10 sitios a intervalos regulares, una vez cada tres meses.A fin de mantener la misma actividad en el lodo reciente y en el antiguo, se mezcla el sobrenadante filtrado de un lodo activado en uso con un volumen igual de sobrenadante filtrado de una mezcla reciente recogida de diez fuentes y se cultiva el líquido combinado tal como se ha dicho anteriormente. Se toma el lodo para usarlo como inóculo de 18 a 24 horas después de haber alimentado la unidad.VII.2.4. Preparación de los frascosSe preparan los seis frascos siguientes:No. 1: sustancia problema en agua de dilución en concentración de 100 mg/lNo. 2, 3 y 4: sustancia problema en medio mineral en concentración de 100 mg/lNo. 5: sustancia de referencia (por ejemplo, anilina) en medio mineral en concentración de 100 mg/lNo. 6: medio mineral soloLas sustancias problema poco solubles se añaden directamente calculadas en peso o en volumen o se actúa como se describe en el Anexo III, excepto que no se utilizan ni disolventes ni agentes emulsificantes. Se añade el absorbente de CO2 a todos los frascos en las cápsulas especiales. Se ajusta el pH a 7,0 en los frascos No. 2, 3 y 4.VII.2.5. Realización del ensayoSe inoculan los frascos No. 2, 3 y 4 (suspensiones problema), No. 5 (control de actividad) y No. 6 (blanco con inóculo) con un pequeño volumen del inóculo de manera que dé una concentración de 30 mg/l de sólidos suspendidos. No se añade inóculo al frasco No. 1 que sirve como control abiótico. Se monta el equipo, se controla la impermeabilidad al aire, se ponen en marcha los agitadores y se comienza la medición del consumo de oxígeno en condiciones de oscuridad. Se controla diariamente la temperatura, el agitador y el registrador culombimétrico de consumo de oxígeno, tomando nota de cualquier cambio de color del contenido de los frascos. El consumo de oxígeno se leerá directamente de los seis frascos por un método apropiado, por ejemplo a partir del registrador gráfico de seis puntos, dando lugar a una curva de DBO. Al final de la incubación, normalmente 28 días, se mide el pH del contenido de los frascos y se determina la concentración de la sustancia problema y/o residual y cualquier intermediario y, en el caso de una sustancia soluble en el agua, la concentración de COD (Anexo II.4). Se tendrá un cuidado especial en el caso de sustancias volátiles. Si se supone que va a haber nitrificación, se determina la concentración de nitrato y de nitrito en la medida de lo posible.VII.3. DATOS E INFORMEVII.3.1. Tratamiento de los resultadosSe divide el consumo de oxígeno (mg) de la sustancia problema después de un tiempo dado, corregido según el consumo del blanco con inóculo después del mismo tiempo, entre el peso de la sustancia problema utilizada. Con ello obtenemos la DBO expresada en mg de oxígeno/mg de sustancia problema, es decir:DBO = mg de consumo de O2 sustancia problema   mg de O2 consumo blancomg sustancia problema en el frasco= mg O2/mg sustancia problemaLa biodegradación porcentual se obtiene de la siguiente manera:% biodegradación = % DTO =   DBO (mg O2/mg sustancia)  DTO (mg O2/mg sustancia) × 100En las mezclas, se calcula la DTO basándose en el análisis elemental, como si fuera una sustancia simple. Se utilizará la DTO adecuada (DTONH4 o DTONO3) según haya nitrificación nula o completa (Anexo II.2). No obstante, si hay nitrificación pero es incompleta, se corregirá según el oxígeno consumido por la nitrificación, calculado según los cambios en las concentraciones de nitrito y nitrato (Anexo V).Se calcula el porcentaje de biodegración primaria a partir de la pérdida de sustancia química originaria específica (véase I.7,2).Dt = Sb   SaSb × 100 %Si ha habido en el frasco No. 1 una pérdida de sustancia problema que dé la medida de la eliminación fisicoquímica, se informará de ello y se utilizará la concentración de la sustancia problema (Sb) después de 28 días en este frasco para calcular el porcentaje de biodegradación.Cuando se hagan determinaciones de COD (opcional), el porcentaje de biodegradación última se calculará con la siguiente fórmula:Dt = 1    Ct    Cbt Co   Cbo × 100como se describe en el punto I.7.1. Si ha habido en el frasco No. 1 una pérdida de COD, que mide la eliminación fisicoquímica, se utilizará la concentración de COD en este frasco para calcular el porcentaje de biodegradación.Se registrarán todos los resultados en la ficha de datos adjunta.VII.3.2. Validez de los resultadosEl consumo de oxígeno del blanco con inóculo es normalmente de 20 a 30 mg O2/l y no debe ser mayor de 60 mg/l en 28 días. Los valores superiores a 60 mg/l exigirán una revisión crítica de los datos y de las técnicas experimentales. Si el pH cae fuera del rango 6-8,5 y el consumo de oxígeno con la sustancia problema es menor del 60 %, debe repetirse el ensayo con una concentración inferior de la sustancia problema.Véase también I.5.2.Si el porcentaje de degradación de anilina calculado a partir del consumo de oxígeno no excede del 40 % después de 7 días y del 65 % después de 14 días, el ensayo se considerará no válido.VII.3.3. InformeVéase el punto I.8.VII.4. FICHA DE RECOGIDA DE DATOSA continuación se da un ejemplo de una ficha de recogida de datos.PRUEBA DEL MITI (I)1. LABORATORIO2. FECHA DE COMIENZO DE LA PRUEBA3. SUSTANCIA A EXAMINARNombre: ...Concentración de la solución madre: ... mg/l, en sustanciaConcentración inicial en el medio, Co: ... mg/l, en sustanciaVolumen de la mezcla de reacción, V: ... mlDTO de la sustancia: ... mg O2/l4. INÓCULOPuntos de muestreo del lodo:1) ...2) ...3) ...4) ...5) ...6) ...7) ...8) ...9) ...10) ...Concentración de sólidos en suspensión en el lodo activado tras aclimatación con vertidos sintéticos =  ... mg/lVolumen de lodo activado por litro de medio final = ... mlConcentración de lodo en el medio final = ... mg/l5. CONSUMO DE OXÍGENO: BIODEGRADABILIDADTipo de respirómetro usado:>SITIO PARA UN CUADRO>6. ANÁLISIS DE CARBONO (opcional)Analizador de carbono:>SITIO PARA UN CUADRO>% COD eliminado: a   (b   c)a × 1007. DATOS DEL ANÁLISIS QUÍMICO ESPECÍFICO>SITIO PARA UN CUADRO>% degradación = Sb   SaSb × 100Calcular % de degradación de los frascos a1, a2 y a3 respectivamente.8. COMENTARIOSSe adjuntará una curva de DBO en función del tiempo, si se dispone de ella.ANEXO IABREVIATURAS Y DEFINICIONESOD: Oxígeno disuelto (mg/l); es la concentración de oxígeno disuelto en una muestra acuosa.DBO: Demanda bioquímica de oxígeno (g); es la cantidad de oxígeno consumido por los microorganismos que metabolizan una sustancia problema; se expresa también como gramos de oxígeno consumido por gramo de sustancia problema. (Véase método C.5.).DQO: Demanda química de oxígeno (g); es la cantidad de oxígeno consumido durante la oxidación de una sustancia problema con dicromato en medio ácido caliente. Proporciona una medida de la cantidad de sustancia oxidable presente; se expresa también como gramos de oxígeno consumido por gramo de sustancia problema. (Véase método C.6.)COD: Carbono orgánico disuelto; es el carbono orgánico presente en solución o el que pasa a través de un filtro de 0,45 micrómetros o permanece en el sobrenadante tras centrifugación a 40 000 m.s 2 (± 4 000 g) durante 15 minutos.DTO: Demanda teórica de oxígeno (mg); es la cantidad total de oxígeno necesario para oxidar completamente una sustancia; se calcula basándose en la fórmula molecular (véase Anexo II.2) y se expresa también como mg de oxígeno requeridos por mg de sustancia problema.CO2T: Dióxido de carbono teórico (mg); es la cantidad de dióxido de carbono que se calcula que va a producirse a partir del contenido en carbono, conocido o medido, de la sustancia problema cuando se mineraliza completamente; se expresa también como mg de dióxido de carbono producido por mg de sustancia de ensayo.COT: Carbono orgánico total; es la suma total del carbono orgánico en solución y en suspensión en una muestra.CI: Carbono inorgánico,CT: Carbono total; es el total del carbono orgánico e inorgánico presente en una muestra.Biodegradación primaria:Es la alteración de la estructura química de una sustancia, producida por acción biológica y que da lugar a la pérdida de las propiedades específicas de esa sustancia.Biodegradación última (aerobia):Es el nivel de degradación al que llega la sustancia de ensayo cuando es totalmente utilizada por microorganismos dando lugar a la producción de dióxido de carbono, agua, sales minerales y nuevos constituyentes celulares microbianos (biomasa).Fácilmente biodegradable:Categoría arbitraria de sustancias químicas que han pasado determinados ensayos específicos de clasificación en cuanto a la biodegradabilidad última; estos ensayos son tan estrictos que es asumido que, según ellos, estos compuestos deben degradarse rápida y completamente en medio ambiente acuático en condiciones de aerobiosis.Intrínsecamente biodegradable:Categoría de sustancias químicas en las que hay evidencia inequívoca de biodegradación (primaria o última) en un ensayo de biodegradabilidad reconocido.Tratabilidad:Es la capacidad de las sustancias de ser eliminadas durante el tratamiento biológico de los residuos acuosos sin afectar negativamente al funcionamiento normal de los procesos de tratamiento. Generalmente, los compuestos fácilmente biodegradables son tratables, pero no todos los compuestos intrínsecamente biodegradables son tratables. Pueden darse también procesos abióticos.Tiempo de latenciaEn una prueba de pérdida, es el tiempo transcurrrido desde la inoculación hasta que el porcentaje de degradación aumenta hasta al menos el 10 %. El tiempo de latencia suele ser muy variable y poco reproducible.Tiempo de degradaciónEs el tiempo transcurrido desde el final del tiempo de latencia hasta el momento en que se alcanza el 90 % del nivel máximo de degradación.Período de observación de 10 díasSon los 10 días que siguen inmediatamente al momento en que se alcanza el 10 % de degradación.ANEXO IICÁLCULO Y DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS INDICATIVOS ADECUADOSDependiendo del método elegido, se necesitarán determinados parámetros indicativos. La sección siguiente describe el cálculo de esos valores. El uso de estos parámetros se describe en cada uno de los métodos.1. Contenido en carbonoEl contenido en carbono se calcula basándose en la composición elemental conocida o determinada por análisis elemental de la sustancia problema.2. Demanda teórica de oxígeno (DTO)La demanda teórica de oxígeno (DTO) puede calcularse si se conoce la composición elemental o se determina mediante análisis elemental. Para un compuesto:CcHhClclNnNanaOoPpSssin nitrificación,DTONH4 = 16 (2 c + 1/2 (h   cl   3 n) + 3 s + 5/2 p + 1/2 na   o)Pm mg/mgo con nitrificaciónDTONO3 = 16 (2 c + 1/2 (h   cl) + 5/2 n + 3 s + 5/2 p + 1/2 na   o)Pm mg/mg3. Demanda química de oxígeno (DQO)La demanda química de oxígeno (DQO) se determina de acuerdo con el método C.6.4. Carbono orgánico disuelto (COD)El carbono orgánico disuelto (COD) es, por definición, el carbono orgánico de cualquier sustancia o mezcla de sustancias en agua que pasa a través de un filtro de 0,45 micrómetros.Se toman muestras de los recipientes de ensayo y se filtran inmediatamente en el equipo de filtración utilizando un filtro de membrana adecuado. Se desprecian los primeros 20 ml de filtrado (puede disminuirse la cantidad si se utilizan filtros más pequeños). Si se inyectan volúmenes de 10 a 20 ml o menores (el volumen depende de la cantidad necesaria para el analizador de carbono), se guardan para el análisis de carbono. La concentración de COD se determina mediante un analizador de carbono orgánico capaz de medir exactamente una concentración de carbono equivalente o inferior al 10 % de la concentración de COD inicial utilizada en el ensayo.Las muestras filtradas que no puedan analizarse en el mismo día de trabajo pueden conservarse almacenadas en un refrigerador a 2 4  C durante 48 horas, o por debajo de  18  C durante períodos más prolongados.Comentarios:Los filtros de membrana vienen a menudo impregnados con agentes tensoactivos para hacerlos hidrófilos. Así pues, el filtro puede contener varios mg de carbono orgánico soluble que puede interferir en las determinaciones de biodegradabilidad. Los agentes tensoactivos y otros compuestos orgánicos solubles se eliminan de los filtros hirviendo éstos en agua desionizada durante tres períodos de 1 hora cada uno. Los filtros pueden almacenarse a continuación en agua durante una semana. Si se utilizan cartuchos de filtro de un solo uso, cada lote debe controlarse para confirmar que no libera carbono orgánico soluble.Dependiendo del tipo de filtro de membrana, la sustancia puede ser retenida por absorción. Por ello, es aconsejable asegurarse de que la sustancia problema no queda retenida en el filtro.Puede usarse centrifugación, en lugar de filtración, a 40 000 m.sec 2 (4 000 g) durante 15 minutos para diferenciar el COT del COD. El método no es fiable con una concentración inicial embargo, se pierde el criterio específico del ensayo de biodegradabilidad fácil.BIBLIOGRAFÍAReynolds, L. et al. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol. 16, 2259.ANEXO VCORRECCIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO POR INTERFERENCIA DE LA NITRIFICACIÓNSi la sustancia problema no contiene nitrógeno, los errores debidos a no tener en cuenta la nitrificación, en el cálculo del consumo de oxígeno, son despreciables (no superiores al 5 %), incluso si la oxidación del N amónico en el medio se da irregularmente en los distintos recipientes de ensayo y blanco. No obstante, en el caso de sustancias que contienen N, pueden darse errores graves.Si ha habido nitrificación pero no es completa, el consumo de oxígeno que se ha observado en la mezcla de reacción puede corregirse según la cantidad de oxígeno utilizado para oxidar el amonio a nitrito y nitrato, si se determinan los cambios en la concentración del nitrito y del nitrato durante la incubación mediante las ecuaciones siguientes:2 NH4Cl + 3 O2 = 2 HNO2 + 2 HCl + 2 H2O (1)2 HNO2 + O2 = 2 HNO3 (2)Globalmente:2 NH4Cl + 4 O2 = 2 HNO3 + 2 HCl + 2 H2O (3)En la ecuación (1) el consumo de oxígeno por 28 g de nitrógeno contenidos en cloruro amónico (NH4Cl) al ser oxidado a nitrito es de 96 g, es decir, un factor de 3,43 (96/28). Del mismo modo, en la ecuación (3) el consumo de oxígeno por 28 g de nitrógeno al ser oxidado a nitrato es de 128 g, es decir, un factor de 4,57 (128/28).Como las reacciones son secuenciales, desencadenadas por especies bacterianas diferentes bien determinadas, es posible que la concentración de nitrito aumente o disminuya; en este último caso, se formará una concentración equivalente de nitrato. Así pues, el oxígeno consumido en la formación de nitrato es 4,57 multiplicado por el aumento de la concentración de nitrato, mientras que el oxígeno relacionado con la formación de nitrito es 3,43 multiplicado por el aumento en la concentración de nitrito o bien con la disminución de su concentración, la pérdida de oxígeno es 3,43 multiplicado por la disminución de la concentración.Es decir:O2 consumido en la formación de nitrato-N = 4,57 × aumento en la concentración de nitrato (4)yO2 consumido en la formación de nitrito-N = 3,43 × aumento en la concentración de nitrito (5)yO2 perdido en la desaparición de nitrito-N =  3,43 × disminución en la concentración de nitrito (6)de forma queconsumo de O2 debido a la nitrificación = ± 3,43 × cambio en concentración de nitrito-N + 4,57 × aumento en concentración de nitrato (7)y, por consiguiente,consumo de O2 debido a oxidación del C = consumo total observado menos consumo debido a nitrificación (8)Si sólo se determina el N oxidado total, puede considerarse que el consumo de oxígeno debido a la nitrificación es, como primera aproximación, 4,57 × aumento del N oxidado.El valor corregido del consumo de oxígeno debido a la oxidacion del C se compara entonces con la DTO NH4 tal como se calcula en el Anexo II.C.5. DEGRADACIÓN: DEMANDA BIOQUÍMICA DE OXÍGENO1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNEl objetivo del ensayo es medir la demanda bioquímica de oxígeno (DBO) de las sustancias orgánicas, sólidas o líquidas.Los resultados que se obtienen con este método de ensayo son representativos, sobre todo, cuando se aplica a los compuestos hidrosolubles; no obstante, al menos en principio, el método puede hacerse extensible a los compuestos volátiles y los compuestos de baja hidrosolubilidad.El método sólo es aplicable a las sustancias orgánicas que no produzcan efectos inhibidores sobre las bacterias a la concentración de ensayo. Si la sustancia de ensayo no es soluble a la concentración de ensayo, se puede recurrir a procedimientos especiales, tales como la dispersión por ultrasonidos, a fin de lograr una dispersión satisfactoria de la sustancia de ensayo.Es conveniente disponer de información sobre la toxicidad de la sustancia para poder interpretar los resultados bajos y para elegir la concentración de ensayo adecuada.1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESLa DBO se define como la masa de oxígeno disuelto necesario para asegurar, en condiciones determinadas, la oxidación bioquímica de un volumen dado de una solución de la sustancia sometida a ensayo.Los resultados se expresan en gramos de DBO por gramo de sustancia de prueba.1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIAEs conveniente la utilización de una sustancia de referencia apropiada para verificar la actividad del inóculo.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYOSe siembra con microorganismos y se incuba en la obscuridad a una temperatura ambiente constante dada, una cantidad determinada de sustancia, disuelta o dispersa en un medio apropiado y aireado.La DBO se determina por la diferencia entre el contenido en oxígeno disuelto al principio y al final del ensayo. La duración mínima del ensayo es de cinco días y la máxima, de 28.Debe efectuarse un ensayo paralelo en blanco, sin sustancia de ensayo.1.5. CRITERIOS DE CALIDADLa determinación de la DBO no puede considerarse como una determinación válida de la biodegradabilidad de la sustancia. Esta prueba sólo puede considerarse como prueba exploratoria.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYOSe prepara una solución o una dispersión preliminar de la sustancia, con el fin de obtener una concentración de DBO compatible con el método utilizado. La DBO se determina entonces aplicando un método nacional o internacional normalizado que sea apropiado.2. RESULTADOS Y EVALUACIÓNLa DBO contenida en la solución preliminar se calcula según el método normalizado elegido y se expresa en gramos de DBO por gramo de sustancia de ensayo.3. INFORMEDebe indicarse el método utilizado.La demanda bioquímica de oxígeno debe ser la media de al menos tres mediciones válidas.Para facilitar la interpretación de los resultados deben incluirse todos los datos y observaciones que sean pertinentes, especialmente en lo referente a impurezas, estado físico, efectos tóxicos y propiedades específicas de la sustancia que puedan afectar a los resultados.Debe mencionarse si se ha utilizado un aditivo inhibidor de la nitrificación biológica.4. BIBLIOGRAFÍALista de métodos normalizados, por ejemplo:NF T 90-103: Determination of the Biochemical Oxygen DemandNBN 407: Biochemical Oxygen DemandNBN 3235 5.4: Bepaling van het biochemisch zuurstofverbruik (BZV)The Determination of Biochemical Oxygen Demand, Methods for the Examination of Water and Associates Materials, HMSO, Londres.ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.C.6. DEGRADACIÓN: DEMANDA QUÍMICA DE OXÍGENO1. MÉTODO1.1. INTRODUCCIÓNEl objetivo del ensayo es medir la demanda química de oxígeno (DQO) de las sustancias orgánicas, sólidas o líquidas, mediante la aplicación de cualquier procedimiento normalizado, en condiciones de laboratorio determinadas.Es conveniente disponer de información sobre la fórmula de la sustancia para facilitar la realización del ensayo y la interpretación de los resultados obtenidos (por ejemplo, sales halógenas, sales ferrosas de compuestos orgánicos, compuestos organoclorados).1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESLa demanda química de oxígeno es la medida de la oxidabilidad de una sustancia, definida como la cantidad equivalente en oxígeno de un reactivo oxidante consumida por la sustancia en condiciones de laboratorio determinadas.El resultado se expresa en gramos de DQO por gramo de sustancia de ensayo.1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANo es preciso emplear sustancias de referencia cada vez que se analiza una nueva sustancia. Dichas sustancias de referencia sirven, principalmente, para calibrar periódicamente el método y permitir la comparación de resultados cuando se apliquen métodos distintos.1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYOUna cantidad determinada de sustancia, disuelta o dispersa en agua, se oxida con dicromato de potasio en presencia de ácido sulfúrico concentrado, con catalizador de sulfato de plata, en caliente y con reflujo durante dos horas. El dicromato residual se valora con ayuda de sulfato ferroso amónico titulado.En el caso de las sustancias con cloro, se debe añadir sulfato mercúrico (las soluciones que contienen sales de mercurio deben ser tratadas, después de su utilización, pra evitar que pase mercurio al medio ambiente) para atenuar la interferencia de los cloruros.1.5. CRITERIOS DE CALIDADDada la arbitrariedad del método de determinación de la DQO, ésta debe considerarse como un «indicador de oxidabilidad» y se utiliza en calidad de tal como método práctico de evaluación de la materia orgánica.Los cloruros pueden interferir en este ensayo; las sustancias inorgánicas reductoras u oxidantes pueden interferir igualmente con la determinación de la DQO.Algunos compuestos cíclicos y muchas sustancias volátiles (p.ej., ácidos grasos de cadena corta) no se oxidan totalmente durante el ensayo.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYOSe prepara una solución o una dispersión preliminar de la sustancia, para conseguir una DQO de 250 a 600 mg por litro.Notas:Cuando se trata de sustancias poco solubles y que no se dispersan, se puede pesar una cantidad de sustancia finamente pulverizada, o en estado líquido, correspondiente a unos 5 mg de DQO, e introducirla en el aparato experimental añadiendo agua.La demanda química de oxígeno (DQO) se determina a menudo mejor, sobre todo en el caso de sustancias poco solubles, con una variante del método, es decir, en un sistema cerrado con ecualizador de presión (H. Kelkenberg, 1975). Con esta modificación puede conseguirse cuantificar sustancias que se determinan con mucha dificultad cuando se usa el método convencional (p. ej., ácido acético). Sin embargo, el método falla igualmente en el caso de la piridina. Si se alcanza una concentración de dicromato potásico de 0,25 N (0,0416 M), como se prescribe en la referencia (1), se facilita la adición directa de 5-10 mg de sustancia, lo que resulta esencial para la determinación de la DQO de las sustancias poco hidrosolubles (ref. (2)).Por lo demás, la DQO se determina a continuación aplicando cualquier método nacional o internacional normalizado que sea adecuado.2. RESULTADOS Y EVALUACIÓNSe calcula la DQO contenida en el frasco experimental según el método normalizado elegido y se expresa en gramos de DQO por gramo de sustancia de ensayo.3. INFORMEDebe indicarse el método utilizado.La demanda química de oxígeno debe ser la media de al menos tres mediciones. Se incluirán todos los datos y observaciones que puedan facilitar la interpretación de los resultados, especialmente los referentes a impurezas, estado físico y propiedades específicas de la sustancia (si se conocen) que puedan afectar a los resultados.Debe mencionarse si se ha usado sulfato mercúrico para reducir la interferencia de los cloruros.4. BIBLIOGRAFÍA(1) Kelkenberg, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, vol. 8, 146.(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.Lista de métodos normalizados, por ejemplo:NBN T 91-201 Determination of the Chemical Oxygen DemandISBN 0 11 7512494 Chemical Oxygen Demand (dichromate value) of polluted and waste watersNF T 90-101 Determination of the Chemical DemandDS 217 - Water Determination of the Chemical Oxygen DemandAnalysisDIN 38409-H-41 Determination of the Chemical Oxygen Demand (COD) within the range above 15 mg/lNEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruikISO 6060 Water Quality: Chemical Oxygen Demand Dichromate MethodsC.7. DEGRADACIÓN ABIÓTICA HIDRÓLISIS EN FUNCIÓN DEL pH1. MÉTODOEste método se basa en el descrito en las líneas directrices de la OCDE (1)1.1. INTRODUCCIÓNLa hidrólisis es una reacción importante que controla la degradación abiótica. Esta reacción es particularmente importante en las sustancias poco biodegradables, y puede influir en la persistencia de una sustancia en el medio ambiente.La mayor parte de las reacciones de hidrólisis son de seudo primer orden y, por lo tanto, los tiempos de semireacción son independientes de la concentración. Esto permite, normalmente, extrapolar los resultados obtenidos en concentraciones de laboratorio a las condiciones ambientales.Además, existen varios ejemplos (2), que muestran una concordancia satisfactoria entre los resultados obtenidos en agua pura y en agua natural con varios tipos de productos químicos.Para realizar este ensayo es conveniente disponer de informaciones preliminares sobre la presión de vapor de la sustancia.Este método sólo es aplicable a las sustancias hidrosolubles. Las impurezas pueden influir en los resultados.El comportamiento hidrolítico de las sustancias químicas debería estudiarse con los valores de pH más normales en el medio ambiente (pH de 4 a 9).1.2. DEFINICIONES Y UNIDADESLa hidrólisis se define como la reacción de un producto químico RX con el agua. Esta reacción puede estar representada por un cambio neto del radical X por OH:RX + HOH  . ROH + HX [1]La velocidad a la cual disminuye la concentración de RX viene dada por la relación:velocidad = k . [H2O] . [RX] [2]Dado que la cantidad de agua presente excede en mucho a la sustancia química, este tipo de reacción se describe normalmente como una reacción de seudo primer orden, en la que la constante de velocidad observada viene dada por la relación:kobs = k . [H2O] [3]Esta constante puede ser determinada para un valor de pH y una temperatura T, utilizando la expresiónkobs = 2,303t  7 log  C0Ct[4]donde:t = tiempoC0 = concentración de la sustancia al tiempo 0Ct = concentración de la sustancia al tiempo t2,303= factor de conversión entre los logaritmos neperianos y los decimales.Las concentraciones se expresan en g/l o mol/l.La dimensión de la constante kobs es (tiempo) 1.El tiempo de semivida t1-2 se define como el tiempo necesario para reducir en un 50 % la concentración de la sustancia química de ensayo, es decir:Ct = 1-2  c0[5]De las expresiones [4] y [5] se puede deducir quet1-2 = 0,693/kobs[6]1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIANo es necesario utilizar sustancias de referencia cada vez que se estudia una nueva sustancia. Deben servir esencialmente para controlar de vez en cuando la eficacia del método y permitir la comparación con los resultados obtenidos con otro método.Se han utilizado como sustancias de referencia las sustancias siguientes (1):Acido acetilsalicílico (Aspirina)0,0-dietil 0-(6-metil-2-(1-metiletil)4-pirimidinil)-éster del ácido fósforotioico (Dimpilato, Diazinon)1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODOLa sustancia se disuelve en el agua a una concentración baja, controlándose el pH y la temperatura.La disminución de la concentración de la sustancia en el transcurso del tiempo se sigue mediante cualquier procedimiento analítico que sea apropiado.Los logaritmos de las concentraciones de la sustancia se llevan a una gráfica frente al tiempo y, si se obtiene una recta, puede obtenerse la constante de velocidad de primer orden por la pendiente de la misma (véase el punto 2).Cuando no se puede determinar inmediatamente una constante de velocidad para una temperatura determinada, el valor de esta constante se estima normalmente mediante la relación de Arrhenius, que da la dependencia de la constante de velocidad en función de la temperatura. De la gráfica lineal del logaritmo de la constante de velocidad, tal como se ha determinado a la temperatura apropiada en función de la inversa de la temperatura absoluta (K), se puede extrapolar el valor de la constante de velocidad que no se había podido obtener directamente.1.5. CRITERIOS DE CALIDADLa referencia (2) cita que las medidas de constante de velocidad de hidrólisis para 13 clases de estructuras orgánicas pueden ser de gran precisión.La repetibilidad depende, en particular, del control del valor del pH y de la temperatura y podría verse afectada por la presencia de microorganismos y en algún caso especial por la concentración de oxígeno disuelto.1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO1.6.1. Reactivos1.6.1.1. Soluciones tampón de pHEl ensayo se efectúa con tres valores de pH: 4,0, 7,0 y 9,0.Para ello deberán prepararse soluciones tampón utilizando productos químicos de grado de reactivo y agua destilada o desionizada estéril. En el Apéndice se presentan algunos ejemplos de soluciones tampón.La solución amortiguadora de pH utilizada puede influir sobre la velocidad de la hidrólisis; en ese caso debe utilizarse otra solución tampón. En la referencia (2) se recomienda la utilización de tampones de borato o acetato en lugar de fosfato.Si se desconoce el valor del pH de las soluciones tampón a la temperatura de ensayo, deberá determinarse con ayuda de un pHmetro calibrado a la temperatura elegida con una precisión de ± 0,1 unidades de pH.1.6.1.2. Soluciones de ensayoLa sustancia de ensayo debe disolverse en la solución tampón elegida a una concentración que no sobrepase 0,01 M o bien la mitad de la concentración de saturación, si este valor es inferior.La utilización de disolventes orgánicos miscibles con el agua sólo se recomienda para las sustancias poco hidrosolubles.La cantidad de disolvente deberá ser inferior al 1 % y no deberá interferir con el proceso hidrolítico.1.6.2. EquipoDeberán emplearse matraces cerrados de cristal, pero hay que evitar la utilización de grasa en los esmerilados.Si la sustancia o la solución tampón que se utilizan son volátiles, o si el ensayo se realiza a temperaturas elevadas, es preferible utilizar tubos sellados o cerrados, llenándolos completamente.1.6.3. Método analítico El método para determinar la sustancia de ensayo a las concentraciones de la solución de ensayo debe ser específico y puede consistir en una combinación de varios métodos analíticos apropiados.El método analítico se elegirá en función de la naturaleza de la sustancia de ensayo y será suficientemente preciso y sensible para detectar una disminución del 10 % de la concentración inicial.1.6.4. Condiciones de ensayoLos ensayos se realizarán utilizando un recinto termostático controlado o un baño a temperatura constante a ± 0,5  C de la temperatura elegida. Se mantendrá la temperatura y se medirá dentro del límite de ± 0,1  C. Las interferencias fotolíticas deberán evitarse por medios adecuados.Será necesario eliminar el oxígeno disuelto en el caso de las sustancias fácilmente oxidables (por ejemplo, borboteando nitrógeno o argón durante 5 minutos antes de preparar la solución).1.6.5. Procedimiento del ensayo1.6.5.1. Ensayo preliminarDeberá hacerse un ensayo preliminar para todas las sustancias a 50  C ± 0,5  C con tres valores de pH: 4,0, 7,0 y 9,0.Se tomará un número de medidas suficientes, de forma que se pueda estimar si, para cada valor de pH y a una temperatura de 50  C, el tiempo de semivida (t1-2) es inferior a 2,4 horas, o si al cabo de 5 días se observa menos del 10 % de la hidrólisis. (Se puede considerar que estos valores corresponden, respectivamente, a tiempos de semivida inferiores a un día o superiores a un año en condiciones más representativas de las del medio ambiente (25  C)).Si el ensayo preliminar indica que, para cada uno de los valores de pH, (4, 7 y 9), el 50 %, o más de la sustancia de ensayo ha sido hidrolizado en 2,4 horas a 50  C o que menos del 10 % ha sido hidrolizado al cabo de 5 días, no se necesita proseguir los ensayos.En otros casos y para aquellos valores de pH con los que no se hayan cumplido estas condiciones, se efectuará el ensayo n  1.1.6.5.2. Ensayo n  1El ensayo n  1 se realiza a una temperatura dada, preferentemente a 50  C ± 0,5  C y, si fuera posible, en condiciones estériles, con los valores de pH que en los ensayos preliminares hayan mostrado la necesidad de efectuar ensayos suplementarios.Para determinar el comportamiento de seudo primer orden a los valores de pH especificados, debe escogerse un número suficiente de muestras (no menos de 4) con el fin de cubrir un intervalo del 20 al 70 % de hidrólisis. Para cada valor de pH se determina el orden de la reacción.Estimación de la constante de velocidad a 25  C.La elección del procedimiento experimental depende del resultado del ensayo n  1, es decir, si la reacción es o no de seudo primer orden.Si los resultados del ensayo n  1 no permiten determinar con certeza que la reacción es de seudo primer orden, deben proseguirse los experimentos, tal como se describen en el ensayo n  2.Si del resultado del ensayo n  1 se puede concluir, sin lugar a dudas, que la reacción es de seudo primer orden, deberán proseguirse los experimentos según lo descrito en el ensayo n  3. (En algunas circunstancias también se puede calcular la constante de velocidad a 25  C sobre la base de las constantes determinadas a 50  C, utilizando los resultados del ensayo n  1 (véase el punto 3.2).1.6.5.3. Ensayo n  2Este ensayo se efectuará para cada pH en el que el ensayo n  1 haya indicado la necesidad de continuar así los experimentos:- bien a una temperatura inferior a 40  C,- o a dos temperaturas, por encima de los 50  C, con una diferencia de 10  C, por lo menos, entre ambas.Para cada valor de pH y para cada temperatura a que se efectúe el ensayo n  2, se medirán por lo menos seis puntos, espaciados convenientemente, de manera que los porcentajes de hidrólisis abarquen un intervalo del 20 al 70 %.Para un mismo valor de pH y una misma temperatura se efectuará una determinación por duplicado. Cuando el ensayo n  2 se efectúe a dos temperaturas por encima de 50  C, la determinación por duplicado se realizará, preferentemente, a la más baja de ellas.Para cada valor de pH y para cada temperatura a que se efectúe el ensayo n  2, se dará, si fuere posible, una estimación gráfica del tiempo de semivida (t1-2).1.6.5.4. Ensayo n 3Este ensayo se realizará para cada valor de pH cuyos resultados en el ensayo n  1 así lo hayan indicado:- bien a una temperatura inferior a 40  C,- o a dos temperaturas por encima de los 50  C, con una diferencia de 10  C, por lo menos, entre ambas.Para cada valor de pH y para cada temperatura a que se efectúe el ensayo n  3, se elegirán tres puntos de determinación, el primero en tiempo 0 y el segundo y tercero cuando los porcentajes de hidrólisis sean superiores al 30 %; deberán calcularse la constante kobs y el t1-2.2. RESULTADOSEn el caso de un comportamiento de seudo primer orden pueden obtenerse los valores de kobs para cada valor de pH y cada temperatura de ensayo a partir del gráfico de los logaritmos de las concentraciones en función del tiempo, utilizando la expresión:kobs =   pendiente × 2,303 [7]Además, t1-2 puede calcularse según la ecuación [6].Hay que estimar k25  C aplicando la ecuación de Arrhenius cuando sea apropiado.En el caso de que el comportamiento no sea de pseudo primer orden, véase el punto 3.1.3. INFORME3.1. INFORME DEL ENSAYOEl informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información:- las especificaciones de la sustancia,- cualquier resultado que se obtenga con sustancias de referencia,- el principio y los detalles del método analítico usado,- para cada ensayo: la temperatura, el valor del pH, la composición de la solución tampón y la tabla de todos los puntos experimentales concentración-tiempo,- en el caso de reacciones de seudo primer orden, los valores de t1-2 y kobs, así como el método de cálculo,- en el caso de las reacciones que no sean de seudo primer orden, establecer el gráfico de los logaritmos de las concentraciones en función del tiempo,- cualquier información y observación que sea necesaria para la interpretación de los resultados.3.2. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOSA veces es posible calcular valores aceptables de la constante de velocidad (a 25  C) de las sustancias de ensayo, siempre que ya existan valores experimentales de la energía de activación para homólogos de la sustancia química y siempre que pueda aceptarse razonablemente que la energía de activación de la sustancia de ensayo es de igual magnitud.4. BIBLIOGRAFÍA(1) OCDE, París, 1981, Test guideline 111. Decision of the Council, C(81) 30 Final.(2) W. Mabey y T. Mill, «Critical Review of Hydrolysis of Organic Compounds in Water Under Environmental Conditions,» J. Phys. Chem. Ref. Data, 197, vol. 7 (2), 383-415.ApendiceSoluciones tampónA. CLARK Y LUBSLos valores de pH que se indican han sido calculados a partir de medidas de potencial utilizando las ecuaciones estándar de Sörensen (1909). Los valores reales de pH son 0,04 unidades más elevados que los valores de la tabla.Composición pHftalato ácido de potasio 0,1 M + HCl 0,1 N a 20  C2,63 ml HCl 0,1 N + 50 ml de ftalato, completar hasta 100 ml 3,8ftalato ácido de potasio 0,1 M + NaOH 0,1 N a 20  C0,40 ml NaOH 0,1 N + 50 ml de ftalato, completar hasta 100 ml 4,03,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml de ftalato, completar hasta 100 ml 4,2fosfato monopotásico 0,1 M + NaOH 0,1 N a 20  C23,45 ml de NaOH 0,1 N + 50 ml de fosfato, completar hasta 100 ml 6,829,63 ml de NaOH 0,1 N + 50 ml de fosfato, completar hasta 100 ml 7,035,00 ml de NaOH 0,1 N + 50 ml de fosfato, completar hasta 100 ml 7,2H3BO3 0,1 M en KCl 0,1 M + NaOH 0,1 N a 20  C16,30 ml de NaOH 0,1 N + 50 ml de ácido bórico, completar hasta 100 ml 8,821,30 ml de NaOH 0,1 N + 50 ml de ácido bórico, completar hasta 100 ml 9,026,70 ml de NaOH 0,1 N + 50 ml de ácido bórico, completar hasta 100 ml 9,2B. KOLTHOFF Y VLEESCHOUWERComposición pHCitrato monopotásico 0,1 M y NaOH 0,1 N a 18  C (añadir un fino cristal de timol para evitar la formación de mohos).2,0 ml de NaOH 0,1 N + 50 ml de citrato, completar hasta 100 ml 3,809,0 ml de NaOH 0,1 N + 50 ml de citrato, completar hasta 100 ml 4,016,3 ml de NaOH 0,1 N + 50 ml de citrato, completar hasta 100 ml 4,2C. SÖRENSENbórax 0,05 M + HCl 0,1 N>SITIO PARA UN CUADRO>bórax 0,05 M + NaOH 0,1 N>SITIO PARA UN CUADRO>