CELEX: 32008D0984
Language: sk
Date: 2008-12-10 00:00:00
Title: 2008/984/ES: Rozhodnutie Komisie z  10. decembra 2008 , ktorým sa mení a dopĺňa príloha C k nariadeniu Rady 64/432/EHS a rozhodnutie 2004/226/ES, pokiaľ ide o diagnostické testy pre brucelózu hovädzieho dobytka [oznámené pod číslom K(2008) 7642] (Text s významom pre EHP)

31.12.2008   
            
            
               SK
            
            
               Úradný vestník Európskej únie
            
            
               L 352/38
            
         
      ROZHODNUTIE KOMISIE
   
   z 10. decembra 2008,
   ktorým sa mení a dopĺňa príloha C k nariadeniu Rady 64/432/EHS a rozhodnutie 2004/226/ES, pokiaľ ide o diagnostické testy pre brucelózu hovädzieho dobytka
   [oznámené pod číslom K(2008) 7642]
   (Text s významom pre EHP)
   (2008/984/ES)
   KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,
   so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,
   so zreteľom na smernicu Rady 64/432/EHS z 26. júna 1964 o zdravotných problémoch zvierat ovplyvňujúcich obchod s hovädzím dobytkom a ošípanými vnútri Spoločenstva (1), a najmä na jej článok 6 ods. 2 písm. b) a článok 16 ods. 1 druhý pododsek,
   keďže:
   
               (1)
            
            
               Príloha C k smernici 64/432/EHS stanovuje diagnostické metódy na zisťovanie brucelózy hovädzieho dobytka, ktoré sa majú používať na kontrolu a eradikáciu uvedenej choroby a na dohľad a monitorovanie, ako aj na ustanovenie a zachovanie štatútu stáda hovädzieho dobytka bez úradne potvrdeného výskytu brucelózy a na certifikáciu požadovanú pre obchod s hovädzím dobytkom v rámci Spoločenstva.
            
         
               (2)
            
            
               Rozhodnutím Komisie 2004/226/EC zo 4. marca 2004, ktorým sa schvaľujú testy na zisťovanie protilátok proti brucelóze hovädzieho dobytka v rámci smernice Rady 64/432/EHS (2), sa schvaľujú určité testy pre brucelózu hovädzieho dobytka, ktoré sa môžu použiť ako alternatíva k povinnému sérum aglutinačnému testu (SAT) na certifikáciu hovädzieho dobytka v súlade s článkom 6 ods. 2 písm. b) smernice 64/432/EHS.
            
         
               (3)
            
            
               Test fluorescenčnej polarizácie (FPA) je nový diagnostický test, ktorý sa zaradil ako predpísaný test pre medzinárodný obchod do kapitoly 2.4.3. (brucelóza hovädzieho dobytka) Príručky diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá Svetovej organizácie pre zdravie zvierat (OIE), šieste vydanie z roku 2008.
            
         
               (4)
            
            
               Komisia požiadala Európsky úrad pre bezpečnosť potravín (EFSA) o poskytnutie vedeckého stanoviska o vhodnosti zaradenia testu FPA do prílohy C k smernici 64/432/EHS.
            
         
               (5)
            
            
               Okrem toho Komisia požiadala Európsky úrad pre bezpečnosť potravín, aby posúdil vhodnosť testu FPA a testov uvedených v článku 1 rozhodnutia 2004/226/ES na účely certifikácie hovädzieho dobytka pre obchod v rámci Spoločenstva.
            
         
               (6)
            
            
               Pracovná skupina pre zdravotný stav a ochranu dobrých životných podmienok zvierat (Panel on animal health and welfare – AHAW) prijala 11. decembra 2006 vedecké stanovisko k metódam diagnostiky brucelózy hovädzieho dobytka (3), v ktorom dospela k záveru, že s výnimkou testu SAT sú diagnostické testy na zisťovanie brucelózy hovädzieho dobytka zaradené do prílohy C k smernici 64/432/EHS vhodné na to, aby sa naďalej používali ako štandardné testy na účely certifikácie jednotlivých kusov hovädzieho dobytka pre obchod v rámci Spoločenstva.
            
         
               (7)
            
            
               Keďže je však test SAT testom pred opustením stáda priamo predpísaným pre obchodovanie s dobytkom v článku 6 ods. 2 písm. b) smernice 64/432/EHS, musí byť v prílohe C k uvedenej smernici uvedená technická špecifikácia.
            
         
               (8)
            
            
               Okrem toho sa vo vedeckom stanovisku z 11. decembra 2006 dospelo k záveru, že senzitivita a špecifickosť testu FPA sú porovnateľné so senzitivitou a špecifickosťou testov zaradených do prílohy C k smernici 64/432/EHS, a takisto sa zistilo, že test je vhodný na zaradenie do uvedenej prílohy ako štandardný test na diagnostiku brucelózy týchto zvierat pre obchod v rámci Spoločenstva.
            
         
               (9)
            
            
               Nedávno vyvinuté metódy polymerázovej reťazovej reakcie opísané v oddiele 1 písm. d) kapitoly 2.4.3. Príručky diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá Svetovej organizácie pre zdravie zvierat, šieste vydanie z roku 2008, poskytujú dodatočné prostriedky na zisťovanie a identifikáciu Brucella spp., a preto by mali byť zaradené do prílohy C k smernici 64/432/EHS.
            
         
               (10)
            
            
               Príloha C k smernici 64/432/EHS a rozhodnutie 2004/226/ES by sa preto mali zodpovedajúcim spôsobom zmeniť a doplniť.
            
         
               (11)
            
            
               Opatrenia stanovené v tomto rozhodnutí sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat,
            
         PRIJALA TOTO ROZHODNUTIE:
   Článok 1
   Príloha C k smernici 64/432/EHS sa nahrádza textom v prílohe k tomuto rozhodnutiu.
   Článok 2
   Článok 1 rozhodnutia 2004/226/ES sa nahrádza takto:
   
      „Článok 1
      Týmto sa na certifikačné účely schvaľuje komplement fixačný test, test s pufrovaným brucelovým antigénom [test s použitím bengálskej červenej (RBT)], testy ELISA a test fluorescenčnej polarizácie (FPA) vykonané v súlade s prílohou C k smernici 64/432/EHS.“
   
   Článok 3
   Toto rozhodnutie je určené členským štátom.
   
      V Bruseli 10. decembra 2008
      
         
            Za Komisiu
         
         Androulla VASSILIOU
         
         
            členka Komisie
         
      
   
   
      (1)  Ú. v. ES 121, 29.7.1964, s. 1977/64.
   
      (2)  Ú. v. EÚ L 68, 6.3.2004, s. 36.
   
      (3)  http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-1178620753812_1178620772731.htm
   
      PRÍLOHA
      
                  1.
               
               
                  V prílohe C k smernici 64/432/EHS sa body 1, 2 a 3 nahrádzajú takto:
                  
                     „PRÍLOHA C
                     BRUCELÓZA
                     1.   IDENTIFIKÁCIA PÔVODCU
                     Preukázanie organizmov s morfológiou Brucella na základe zmeneného sfarbenia odolného proti kyselinám alebo imunošpecifického sfarbenia v materiáli z abortov, vo vaginálnych výtokoch alebo mlieku poskytuje predbežný dôkaz o brucelóze, najmä ak je podporené serologickými testmi. Metódy polymerázovej reťazovej reakcie poskytujú dodatočné prostriedky zisťovania.
                     Ak je to možné, mali by byť brucely (Brucella spp.) izolované pomocou bežných alebo selektívnych médií kultiváciou z maternicového výtoku, potratených plodov, sekrétov z vemena alebo z vybraných tkanív, ako napríklad lymfatických uzlín a samčích a samičích pohlavných orgánov.
                     Po izolácii sa identifikujú druhy a biovary podľa testov na fágovú lýzu a/alebo testov oxidačného metabolizmu, kultivačných, biochemických a serologických kritérií. Metóda polymerázovej reťazovej reakcie sa môže používať ako doplňujúca metóda, ako aj metóda biotypizácie založená na špecifických sekvenciách genómu.
                     Použité techniky a prostriedky, ich štandardizácia a interpretácia výsledkov musia byť v súlade s údajmi špecifikovanými v Príručke diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá Svetovej organizácie pre zdravie zvierat, šieste vydanie z roku 2008 v kapitole 2.4.3. (brucelóza hovädzieho dobytka), v kapitole 2.7.2. (brucelóza kôz a oviec) a v kapitole 2.8.5. (brucelóza ošípaných).
                     2.   IMUNOLOGICKÉ TESTY
                     2.1.   Štandardy
                     2.1.1.   Biovar Brucella abortus 1 Weybridge kmeň č. 99 alebo USDA kmeň 1119-3 sa musia použiť pri príprave všetkých antigénov použitých pri teste s bengálskou červenou (rose bengal test – RBT), sérum aglutinačnom teste (serum agglutination test – SAT), komplement fixačnom teste (complement fixation test – CFT) a krúžkovej mliečnej skúške (milk ring test – MRT).
                     2.1.2.   Štandardným referenčným sérom pre testy RBT, SAT, CFT a MRT je medzinárodné referenčné štandardné sérum OIE (OIEISS), pôvodne nazývané druhé medzinárodné anti-Brucella abortus sérum WHO (ISAbS).
                     2.1.3.   Štandardnými referenčnými sérami pre enzýmové imunoanalýzy (testy ELISA) sú:
                     
                                 —
                              
                              
                                 OIEISS,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 slabo pozitívne OIE ELISA štandardné sérum (OIEELISAWPSS),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 silne pozitívne OIE ELISA štandardné sérum (OIEELISASPSS),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 negatívne OIE ELISA štandardné sérum (OIEELISANSS).
                              
                           2.1.4.   Štandardnými referenčnými sérami pre testy fluorescenčnej polarizácie (FPA) sú:
                     
                                 —
                              
                              
                                 slabo pozitívne OIE ELISA štandardné sérum (OIEELISAWPSS),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 silne pozitívne OIE ELISA štandardné sérum (OIEELISASPSS),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 negatívne OIE ELISA štandardné sérum (OIEELISANSS).
                              
                           2.1.5.   Štandardné séra uvedené v bodoch 2.1.3 a 2.1.4 sú k dispozícii v referenčnom laboratóriu Spoločenstva pre brucelózu alebo ich možno získať od Veterinary Laboratories Agency (VLA), Weybridge, Spojené kráľovstvo.
                     2.1.6.   Štandardy OIEISS, OIEELISAWPSS, OIEELISASPSS a OIEELISANSS sú medzinárodnými primárnymi štandardmi, z ktorých musia vychádzať sekundárne referenčné národné štandardné séra (ďalej len ‚pracovné štandardy‘) pre každý test uvedený v bode 2.1.1 v každom členskom štáte.
                     2.2.   Enzýmové imunoanalýzy alebo iné aglutinačné analýzy na zisťovanie brucelózy hovädzieho dobytka v sére alebo mlieku
                     2.2.1.   Materiál a reagenty
                     Použitá technika a interpretácia výsledkov sa musia potvrdiť v súlade s princípmi ustanovenými v kapitole 1.1.4 Príručky diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá Svetovej organizácie pre zdravie zvierat, šieste vydanie z roku 2008, a musia zahŕňať aspoň laboratórne a diagnostické štúdie.
                     2.2.2.   Štandardizácia testu
                     2.2.2.1.   Štandardizácia postupu testu pre jednotlivé vzorky séra:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 predriedenie (1) OIEISS v pomere 1/150 alebo predriedenie OIEELISAWPSS v pomere 1/2 alebo predriedenie OIEELISASPSS v pomere 1/16 pripravené v negatívnom sére (alebo v zmesi negatívnych sér) musí viesť k pozitívnej reakcii;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 predriedenie OIEISS v pomere 1/600 alebo predriedenie OIEELISAWPSS v pomere 1/8 alebo predriedenie OIEELISASPSS v pomere 1/64 pripravené v sére (alebo v zmesi negatívnych sér) musí viesť k negatívnej reakcii;
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 OIEELISANSS musí vždy viesť k negatívnej reakcii.
                              
                           2.2.2.2.   Štandardizácia postupu testu pre súhrnné vzorky séra:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 predriedenie OIEISS v pomere 1/150 alebo predriedenie OIEELISAWPSS v pomere 1/2 alebo predriedenie OIEELISASPSS v pomere 1/16 pripravené v negatívnom sére (alebo v zmesi negatívnych sér) a znovu zriedené v negatívnom sére počtom vzoriek, ktoré tvoria zmes, musí viesť k pozitívnej reakcii;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 OIEELISANSS musí vždy viesť k negatívnej reakcii;
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 test musí byť vhodný na zistenie dôkazu o infekcii v jedinom zvierati zo skupiny zvierat, ktorých vzorky boli zmiešané.
                              
                           2.2.2.3.   Štandardizácia postupu testu pre súhrnné vzorky mlieka alebo srvátky:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 predriedenie OIEISS v pomere 1/1 000 alebo predriedenie OIEELISAWPSS v pomere 1/16 alebo predriedenie OIEELISASPSS v pomere 1/125 pripravené v negatívnom sére (alebo v zmesi negatívnych sér) a znovu zriedené v pomere 1/10 v negatívnom mlieku, musí viesť k pozitívnej reakcii;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 OIEELISANSS riedený v pomere 1/10 v negatívnom mlieku musí vždy viesť k negatívnej reakcii;
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 test musí byť vhodný na zistenie dôkazu o infekcii v jedinom zvierati zo skupiny zvierat, ktorých vzorky mlieka alebo srvátky boli zmiešané.
                              
                           2.2.3.   Podmienky aplikácie testov ELISA na diagnostiku brucelózy hovädzieho dobytka:
                     2.2.3.1.   Pri uplatňovaní kalibračných podmienok pre testy ELISA stanovených v bodoch 2.2.2.1 a 2.2.2.2 na vzorkách séra sa diagnostická senzitivita testu ELISA rovná alebo bude vyššia ako senzitivita testu RBT alebo CFT, pričom sa zohľadní epidemiologická situácia, počas ktorej sa test používa.
                     2.2.3.2.   Pri uplatňovaní kalibračných podmienok pre test ELISA stanovených v bode 2.2.2.3 na súhrnných vzorkách mlieka sa diagnostická senzitivita testu ELISA rovná alebo bude vyššia ako senzitivita testu MRT, pričom sa zohľadní epidemiologická situácia, ako aj priemerný a predpokladaný vysoký počet zvierat chovu.
                     2.2.3.3.   Ak sa testy ELISA použijú na certifikačné účely v súlade s článkom 6 ods. 1 alebo na ustanovenie a zachovanie štatútu stáda v súlade s prílohou A časťou II ods. 10, musí sa zber vzoriek séra vykonať tak, aby sa výsledky testov mohli bez pochýb priradiť k jednotlivému zvieraťu zaradenému do súhrnnej vzorky. Každý potvrdzujúci test sa musí vykonať na vzorkách séra odobratých od jednotlivých zvierat.
                     2.2.3.4.   Testy ELISA sa môžu použiť na vzorku mlieka odobratého z mlieka zozbieraného z farmy aspoň od 30 % dojníc v laktácii. Ak sa použije uvedená metóda, musia sa prijať opatrenia, aby sa zabezpečilo, že vzorky odobraté na vyšetrenie sa môžu bez pochýb priradiť k jednotlivým zvieratám, od ktorých sa mlieko odobralo. Každý potvrdzujúci test sa musí vykonať na vzorkách séra odobratých od jednotlivých zvierat.
                     2.3.   Komplement fixačný test (CFT)
                     2.3.1.   Antigén predstavuje bakteriálnu suspenziu vo fenole soľnom [NaCl 0,85 % (m/V) a fenole pri 0,5 % (V/V)] alebo vo veronalovom pufri. Antigény sa môžu doručiť v koncentrovanom stave za predpokladu, že nálepka na fľaši uvádza riediaci faktor, ktorý sa má použiť. Antigén sa musí skladovať pri teplote 4 °C a nesmie zmrznúť.
                     2.3.2.   Séra sa musia inaktivovať takto:
                     
                                 —
                              
                              
                                 sérum hovädzieho dobytka: 56 až 60 °C na 30 až 50 minút,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 sérum ošípaných: 60 °C na 30 až 50 minút.
                              
                           2.3.3.   Aby počas postupu testu nastala autentická reakcia, použije sa vyššia dávka komplementu, ako je minimum potrebné na úplnú hemolýzu.
                     2.3.4.   Pri každom vykonaní komplement fixačného testu sa vykonajú tieto kontroly:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 kontrola antikomplementárneho účinku séra;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 kontrola antigénu;
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 kontrola senzibilizovaných červených krviniek;
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 kontrola komplementu;
                              
                           
                                 e)
                              
                              
                                 kontrola senzitivity na začiatku reakcie pomocou pozitívneho séra;
                              
                           
                                 f)
                              
                              
                                 kontrola špecifickosti reakcie pomocou negatívneho séra.
                              
                           2.3.5.   Výpočet výsledkov
                     OIEISS obsahuje 1 000 medzinárodných jednotiek CFT (ICFTU) na 1 ml. Ak je danou metódou testované OIEISS, výsledok sa vyjadruje ako titer (t. j. TOIEISS, najvyššie priame riedenie OIEISS, ktoré vedie k 50 % hemolýze). Výsledok testu pre testované sérum vyjadrený ako titer (TTESTSERUM) sa musí vyjadriť v ICFTU na 1 ml. Faktor (F) potrebný na prevedenie titru neznámeho testovaného séra (TTESTSERUM) testovaného prostredníctvom uvedenej metódy je na účely vyjadrenia titru v ICFTU možné zistiť zo vzorca:
                     F = 1 000 × 1/TOIEISS
                     
                     a obsah medzinárodných jednotiek CFT na ml testovaného séra (ICFTUTESTSERUM) zo vzorca:
                     ICFTUTESTSERUM = F × TTESTSERUM
                     
                     2.3.6.   Interpretácia výsledkov
                     Sérum obsahujúce 20 alebo viac ICFTU na ml sa považuje za pozitívne.
                     2.4.   Krúžková mliečna skúška (MRT)
                     2.4.1.   Antigén predstavuje bakteriálnu suspenziu vo fenole soľnom [NaCl 0,85 % (m/V) a fenol pri 0,5 % (V/V)] sfarbenom hematoxylínom. Antigén sa musí skladovať pri teplote 4 °C a nesmie zamrznúť.
                     2.4.2.   Senzitivita antigénu sa musí štandardizovať vo vzťahu k OIEISS tak, aby antigén vytvoril pozitívnu reakciu s riedením OIEISS v pomere 1/500 v negatívnom mlieku, pričom riedenie v pomere 1/1 000 musí byť negatívne.
                     2.4.3.   Krúžková skúška sa musí vykonať na vzorkách, ktoré predstavujú obsah každej kanvy mlieka alebo obsah každej zbernej nádrže z farmy.
                     2.4.4.   Vzorky mlieka nesmú zmrznúť, ohriať sa ani byť podrobené prudkému trepaniu.
                     2.4.5.   Reakcia sa musí vykonať použitím jednej z týchto metód:
                     
                                 —
                              
                              
                                 v stĺpci mlieka s minimálnou výškou 25 mm a objemom mlieka 1 ml, do ktorého sa pridalo buď 0,03 ml, alebo 0,05 ml jedného zo štandardizovaných sfarbených antigénov,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 v stĺpci mlieka s minimálnou výškou 25 mm a objemom mlieka 2 ml, do ktorého sa pridalo 0,05 ml jedného zo štandardizovaných sfarbených antigénov,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 v objeme mlieka 8 ml, do ktorého sa pridalo 0,08 ml jedného zo štandardizovaných sfarbených antigénov.
                              
                           2.4.6.   Zmes mlieka a antigénov musí byť inkubovaná pri teplote 37 °C na 60 minút spolu s pozitívnymi a negatívnymi pracovnými štandardmi. Nasledujúca 16- až 24-hodinová inkubácia pri teplote 4 °C zvyšuje senzitivitu testu.
                     2.4.7.   Interpretácia výsledkov:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 negatívna reakcia: sfarbené mlieko, bezfarebná smotana;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 pozitívna reakcia:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             identicky sfarbené mlieko a smotana alebo
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bezfarebné mlieko a sfarbená smotana.
                                          
                                       
                           2.5.   Test na brucelózu s pufrovaným brucelovým antigénom [test s bengálskou červenou (RBT)]
                     2.5.1.   Antigén predstavuje bakteriálnu suspenziu v pufrovanom riedidle antigénu Brucella pri pH 3,65 ± 0,05 sfarbenom použitím bengálskej červenej farby. Antigén sa doručí hotový na použitie a musí sa skladovať pri teplote 4 °C a nesmie zmrznúť.
                     2.5.2.   Antigén sa pripraví bez ohľadu na koncentráciu buniek, jeho senzitivita sa však musí štandardizovať vo vzťahu k OIEISS tak, aby antigén vytvoril pozitívnu reakciu s riedením séra v pomere 1/45 a negatívnu reakciu s riedením v pomere 1/55.
                     2.5.3.   Test RBT sa vykoná týmto spôsobom:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 sérum (20 μl – 30 μl) sa v rovnakom objeme zmieša s antigénom na bielej doštičke alebo smaltovanej doštičke tak, aby vznikla zóna s priemerom približne 2 cm. Zmes sa štyri minúty jemne premieša pri teplote okolitého vzduchu a potom sa pri dobrom osvetlení pozoruje aglutinácia;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 možno použiť automatickú metódu, táto metóda však musí byť aspoň tak senzitívna a presná ako manuálna metóda.
                              
                           2.5.4.   Interpretácia výsledkov
                     Akákoľvek viditeľná reakcia sa považuje za pozitívnu, pokiaľ nenastalo nadmerné osychanie okolo krajov.
                     Pozitívne alebo negatívne pracovné štandardy sa zaradia do každej série testov.
                     2.6.   Sérum aglutinačný test (SAT)
                     2.6.1.   Antigén predstavuje bakteriálnu suspenziu vo fenole soľnom [NaCl 0,85 % (m/V) a fenol pri 0,5 % (V/V)].
                     Nesmie sa použiť formaldehyd.
                     Antigény sa môžu doručiť v koncentrovanom stave za predpokladu, že nálepka na fľaši uvádza riediaci faktor, ktorý sa použije.
                     Na zníženie počtu falošne pozitívnych výsledkov sérum aglutinačného testu možno pridať do antigénovej suspenzie až do 5 mM EDTA na finálne riedenie testu. Následne sa v antigénovej suspenzii musí znovu upraviť hodnota pH 7,2.
                     2.6.2.   OIEISS obsahuje 1 000 medzinárodných jednotiek aglutinácie.
                     2.6.3.   Antigén sa pripraví bez ohľadu na koncentráciu buniek, ale jeho senzitivita sa musí štandardizovať v spojení s OIEISS tak, aby antigén vytvoril buď 50 % aglutinácie s finálnym riedením séra v pomere 1/600 až 1/1 000, alebo 75 % aglutinácie s finálnym riedením séra v pomere1/500 až 1/750.
                     Odporúča sa porovnať reaktivitu nových dávok antigénu a dávok už štandardizovaných použitím skupiny vymedzených sér.
                     2.6.4.   Test sa vykoná buď v skúmavkách, alebo na mikrotitračných doštičkách. Zmes antigénu a riedení sér sa inkubuje 16 až 24 hodín pri teplote 37 °C.
                     Pre každé sérum sa musia pripraviť aspoň tri riedenia. Riedenia podozrivého séra sa musia pripraviť tak, aby sa odčítanie reakcie pri hranici pásma pozitivity uskutočnilo v prostrednej skúmavke (alebo v prostredných jamkách pri odčítaní na mikrotitračných doštičkách).
                     2.6.5.   Interpretácia výsledkov
                     Stupeň aglutinácie Brucella v sére sa musí vyjadriť v IU na ml.
                     Sérum obsahujúce 30 alebo viac IU na ml sa považuje za pozitívne.
                     2.7.   Test fluorescenčnej polarizácie (FPA)
                     2.7.1.   Test fluorescenčnej polarizácie sa môže vykonať v sklenených skúmavkách alebo na mikrotitračných doštičkách s 96 jamkami. Použitý postup, jeho štandardizácia a interpretácia výsledkov musia byť v súlade s údajmi špecifikovanými v kapitole 2.4.3. (brucelóza hovädzieho dobytka) Príručky diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá Svetovej organizácie pre zdravie zvierat, šieste vydanie z roku 2008.
                     2.7.2.   Štandardizácia testu
                     Test FPA sa štandardizuje tak, aby:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 OIEELISASPSS a OIEELISAWPSS konzistentne viedli k pozitívnym výsledkom;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 predriedenie OIEELISAWPSS v pomere 1/8 alebo predriedenie OIEELISASPSS v pomere 1/64 vytvorené v negatívnom sére (alebo v negatívnom súhrnnom sére) vždy viedlo k negatívnej reakcii;
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 OIEELISANSS vždy viedlo k negatívnej reakcii.
                              
                           V každej dávke testov by malo byť zahrnuté toto: silno pozitívne, slabo pozitívne a negatívne pracovné štandardné sérum (kalibrované na základe štandardného séra OIE ELISA).
                     3.   DOPLŇUJÚCE TESTY
                     3.1.   Kožný test na brucelózu (BST)
                     3.1.1.   Podmienky použitia testu BST
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Kožný test na brucelózu sa nepoužije na účely certifikácie pre obchod v rámci Spoločenstva.
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Kožný test na brucelózu je jedným z najšpecifickejších testov na zisťovanie brucelózy v nezaočkovaných zvieratách; avšak diagnóza sa nesmie stanoviť iba na základe pozitívnych intradermálnych reakcií.
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 Hovädzí dobytok, ktorý je testovaný s negatívnym výsledkom pri jednom zo serologických testov vymedzených v tejto prílohe a ktorý reagoval pozitívne na test BST, sa považuje za nakazený alebo podozrivý z nákazy.
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 Hovädzí dobytok, ktorý je testovaný s pozitívnym výsledkom pri jednom zo serologických testov vymedzených v tejto prílohe, môže byť predmetom testu BST na účely podpory interpretácie výsledkov tohto serologického testu; najmä pokiaľ nie je možné pri hovädzom dobytku bez úradne potvrdeného výskytu brucelózy alebo bez výskytu brucelózy vylúčiť skríženú reakciu s protilátkami voči ostatným baktériám.
                              
                           3.1.2.   Test sa musí vykonať použitím štandardizovaného a vymedzeného brucelózneho alergénneho prípravku, ktorý neobsahuje hladký lipopolysacharidový (LPS) antigén, pretože ten môže vyvolať nešpecifické zápalové reakcie alebo môže ovplyvniť nasledujúce serologické testy.
                     Požiadavky na výrobu brucelínu sú v súlade s oddielom C1 kapitoly 2.4.3. Príručky diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá (OIE), šieste vydanie z roku 2008.
                     3.1.3.   Postup testu
                     3.1.3.1.   Objem 0,1 ml alergénu brucelózy sa vpichne vnútrokožne do podchvostovej riasy, kože slabiny alebo na strane krku.
                     3.1.3.2.   Test sa odčíta po 48 až 72 hodinách.
                     3.1.3.3.   Hrúbka kože na mieste vpichu sa odmeria s verniérovými svorkami pred injekciou a pri opätovnom preskúmaní.
                     3.1.3.4.   Interpretácia výsledkov
                     
                                  
                              
                              
                                 Silné reakcie sú ľahko rozpoznateľné lokálnym opuchom a zatvrdnutím.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Hrúbka kože 1,5 mm až 2 mm sa považuje za pozitívnu reakciu na test BST.
                              
                           3.2.   Kompetetívna enzýmová imunoanalýza (cELISA)
                     3.2.1.   Podmienky použitia cELISA
                     Na certifikačné účely sa pri obchode v rámci Spoločenstva test cELISA nepoužije.
                     Hovädzí dobytok, ktorý je testovaný s pozitívnym výsledkom pri jednom z ďalších serologických testov vymedzených v tejto prílohe, môže byť predmetom testu cELISA na účely podpory interpretácie výsledkov tohto ďalšieho serologického testu; najmä pokiaľ nie je možné pri hovädzom dobytku bez úradne potvrdeného výskytu brucelózy alebo bez výskytu brucelózy vylúčiť skríženú reakciu s protilátkami proti iným baktériám, alebo na účely eliminácie reakcií spôsobených reziduálnymi protilátkami vytvorenými v reakcii na očkovanie kmeňom S19.
                     3.2.2.   Postup testu
                     Test sa vykoná v súlade s predpisom uvedeným v oddiele B(2) kapitoly 2.4.3. Príručky diagnostických testov a vakcín pre suchozemské zvieratá (OIE), šieste vydanie z roku 2008.“
                  
               
            
                  2.
               
               
                  V prílohe C k smernici 64/432/EHS sa bod 4.1 nahrádza takto:
                  „4.1.   Úlohy a zodpovednosti
                  Národné referenčné laboratóriá vymenované v súlade s článkom 6a sú zodpovedné za:
                  
                              a)
                           
                           
                              schvaľovanie výsledkov validačných štúdií preukazujúcich spoľahlivosť metódy testu použitej v členskom štáte;
                           
                        
                              b)
                           
                           
                              určovanie maximálneho počtu vzoriek, ktoré sa môžu zmiešať pri použitých ELISA súpravách;
                           
                        
                              c)
                           
                           
                              kalibráciu pracovných štandardov uvedených v bode 2.1.6;
                           
                        
                              d)
                           
                           
                              kontrolu kvality všetkých antigénov a ELISA súprav používaných v členskom štáte;
                           
                        
                              e)
                           
                           
                              spoluprácu s národným referenčným laboratóriom Spoločenstva pre brucelózu a dodržiavanie jeho odporúčaní.“
                           
                        
            
         (1)  Na účely tejto prílohy sa riedenia uvedené na tvorbu tekutých reagentov vyjadrujú tak, že napríklad pomer 1/150 znamená riedenie jedna v 150.