CELEX: 32009D0976
Language: da
Date: 2009-12-15 00:00:00
Title: Kommissionens afgørelse af 15. december 2009 om ændring af bilag D til Rådets direktiv 64/432/EØF for så vidt angår diagnostiske test for enzootisk kvægleukose (meddelt under nummer K(2009) 9951) (EØS-relevant tekst)

18.12.2009   
            
            
               DA
            
            
               Den Europæiske Unions Tidende
            
            
               L 336/36
            
         
      KOMMISSIONENS AFGØRELSE
   
   af 15. december 2009
   om ændring af bilag D til Rådets direktiv 64/432/EØF for så vidt angår diagnostiske test for enzootisk kvægleukose
   (meddelt under nummer K(2009) 9951)
   (EØS-relevant tekst)
   (2009/976/EU)
   EUROPA-KOMMISSIONEN HAR —
   under henvisning til traktaten om Den Europæiske Unions funktionsmåde,
   under henvisning til Rådets direktiv 64/432/EØF af 26. juni 1964 om veterinærpolitimæssige problemer ved handel inden for Fællesskabet med kvæg og svin (1), særlig artikel 16, stk. 2, og
   ud fra følgende betragtninger:
   
               (1)
            
            
               Direktiv 64/432/EØF finder anvendelse på handel inden for EU med kvæg, og i direktivets bilag D, kapitel II, foreskrives de test til diagnosticering af enzootisk kvægleukose, der skal anvendes i forbindelse med bekæmpelse og udryddelse af sygdommen og i forbindelse med overvågning samt med henblik på etablering og bevarelse af en besætningsstatus som officielt fri for enzootisk kvægleukose og certifikatudstedelse ved handel inden for EU med kvæg.
            
         
               (2)
            
            
               I henhold til kapitel II i bilag D til direktiv 64/432/EØF skal enzootisk kvægleukose påvises enten ved en agar-gel-immunodiffusionsprøve (AGID-prøve), hvor der anvendes et antigen, der er standardiseret i forhold til det officielle EF-standardserum (E.I. serum), eller ved en ELISA-prøve (enzyme-linked immunosorbent assay), der er standardiseret i forhold til E4-serum. Begge standarder leveres af Veterinærinstituttet, Danmarks Tekniske Universitet.
            
         
               (3)
            
            
               Der er for nylig blevet udviklet et nyt standardserum til enzootisk kvægleukose (E05-serum) af Verdensorganisationen for Dyresundheds (OIE) referencelaboratorium for enzootisk kvægleukose i Tyskland (Friedrich-Loeffler-Institut) i samarbejde med OIE's referencelaboratorier i Det Forenede Kongerige (Veterinary Laboratories Agency) og Polen (National Veterinary Research Institute), efter at det er blevet testet ved en ringtest blandt de pågældende laboratorier. E05-serummet er blevet valideret i forhold til E.I.- og E4-sera ved forskellige AGID- og ELISA-prøver og følgelig blevet optaget som et akkrediteret OIE-standardserum i afsnit B(2) i kapitel 2.4.11 i OIE's Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 6. udgave, 2008. Serummet kan leveres fra OIE's referencelaboratorium for enzootisk kvægleukose i Tyskland.
            
         
               (4)
            
            
               Dertil kommer, at Veterinærinstituttet, Danmarks Tekniske Universitet, har meddelt Kommissionen, at det ikke længere er i stand til at opfyldes sine forpligtelser vedrørende levering af de standardsera, der for øjeblikket er omhandlet i kapitel II i bilag D til direktiv 64/432/EØF.
            
         
               (5)
            
            
               De tyske kompetente myndigheder og Friedrich-Loeffler-Institut har indvilget i at blive leverandør af E05-serummet, som derfor bliver det nye officielle EU-standardserum til påvisning af enzootisk kvægleukose.
            
         
               (6)
            
            
               Direktiv 64/432/EØF bør derfor ændres i overensstemmelse hermed.
            
         
               (7)
            
            
               Foranstaltningerne i denne afgørelse er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Stående Komité for Fødevarekæden og Dyresundhed —
            
         VEDTAGET FØLGENDE AFGØRELSE:
   Artikel 1
   Kapitel II i bilag D til direktiv 64/432/EØF erstattes af teksten i bilaget til denne afgørelse.
   Artikel 2
   Denne afgørelse er rettet til medlemsstaterne.
   
      Udfærdiget i Bruxelles, den 15. december 2009.
      
         
            På Kommissionens vegne
         
         Androulla VASSILIOU
         
         
            Medlem af Kommissionen
         
      
   
   
      (1)  EFT 121 af 29.7.1964, s. 1977/64.
   
      BILAG
      Kapitel II i bilag D til direktiv 64/432/EØF affattes således:
      
         »KAPITEL II
         
            PRØVER TIL PÅVISNING AF ENZOOTISK KVÆGLEUKOSE
         
         Enzootisk kvægleukose påvises ved en agar-gel-immunodiffusionsprøve (AGID-prøve) som beskrevet i del A og B eller ved en ELISA-prøve (enzyme-linked immunosorbent assay) som beskrevet i del C. Agar-gel-immunodiffusionsprøve er forbeholdt enkeltdyrsprøver. Gøres der behørigt begrundet indsigelse mod prøveresultaterne, benyttes en backuptest i form af en agar-gel-immunodiffusionsprøve.
         AGID-prøven og ELISA-prøven standardiseres i forhold til E05-serummet, som er det officielle EU-standardserum, der leveres af:
         
                     Friedrich-Loeffler-Institut
                  
               
                     Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit
                  
               
                     OIE Reference Laboratory for Enzootic Bovine Leukosis (EBL)
                  
               
                     Südufer 10
                  
               
                     17493 Greifswald — Insel Riems
                  
               
                     Tyskland.
                  
               A.   Agar-gel-immunodiffusionsprøven for enzootisk kvægleukose
         
         
                     1.
                  
                  
                     Til prøven anvendes et antigen, der indeholder glycoprotein fra kvægleukosevirus. Antigenet standardiseres i forhold til E05-serum.
                  
               
                     2.
                  
                  
                     Statsinstitutterne, de nationale referencelaboratorier eller de officielle institutter, der i overensstemmelse med artikel 6a er udpeget til at være ansvarlige for at koordinere standarder og diagnosticeringsmetoder for prøver til påvisning af enzootisk kvægleukose, skal være ansvarlige for at standardantigenet til laboratoriebrug kalibreres i forhold til E05-serum.
                  
               
                     3.
                  
                  
                     Standardantigener til laboratoriebrug sendes mindst en gang om året til statsinstitutterne, de nationale referencelaboratorier eller de officielle institutter, der er udpeget i overensstemmelse med artikel 6a, for at blive prøvet over for E05-serum. Ud over en sådan standardisering kan det anvendte antigen kalibreres som angivet i del B.
                  
               
                     4.
                  
                  
                     Reagenserne til prøven omfatter:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 antigen: Antigenet skal indeholde specifikt glycoprotein fra enzootisk kvægleukosevirus, som er standardiseret efter E05-serum
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 det serum, der skal prøves
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 kendt positivt kontrolserum
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 agar-gel
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             0,8 % agar
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             8,5 % NaCl
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             0,05 M Tris-buffer, pH 7,2
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             15 ml af denne agar hældes i en petriskål med en diameter på 85 mm, hvilket giver et 2,6 mm tykt agarlag.
                                          
                                       
                           
               
                     5.
                  
                  
                     I agaren udskæres syv fugtfrie huller helt til skålens bund; hullerne skal danne et mønster med et hul i midten og de øvrige seks huller som en cirkel rundt om.
                     Midterhullets diameter: 4 mm
                     Periferihullernes diameter: 6 mm
                     Afstand mellem midterhul og periferihuller: 3 mm.
                  
               
                     6.
                  
                  
                     Midterhullet fyldes med standardantigenet. Periferihul 1 og 4 (jf. B.3) fyldes med kendt positivt serum, og hul 2, 3, 5 og 6 fyldes med de sera, der skal prøves. Hullerne fyldes, indtil menisken forsvinder.
                  
               
                     7.
                  
                  
                     Dette giver følgende reagensmængder:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Antigen: 32 μl
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Kontrolserum: 73 μl
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Sera, der skal prøves: 73 μl.
                              
                           
               
                     8.
                  
                  
                     Herefter henstår det 72 timer ved stuetemperatur (20-27 °C) i et lukket fugtighedskammer.
                  
               
                     9.
                  
                  
                     Prøven kan aflæses efter 24 og 48 timer, men aflæsning af det endelige resultat må først ske efter 72 timer:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Det serum, der skal prøves, er positivt, hvis det danner en specifik præcipitinlinje med BLV-antigenet og en helt identisk linje med kontrolserummet.
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Det serum, der skal prøves, er negativt, hvis det ikke danner en specifik højde med BLV-antigenet, og hvis det ikke afbøjer kontrolserummets linje.
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 Reaktionen anses for usikker, hvis den:
                                 
                                             i)
                                          
                                          
                                             afbøjer kontrolserummets linje mod hullet med BLV-antigen uden at danne en synlig præcipitinlinje med antigenet, eller
                                          
                                       
                                             ii)
                                          
                                          
                                             hvis den hverken kan aflæses som positiv eller negativ.
                                          
                                       
                           I tilfælde af inkonklusiv reaktion kan prøven gentages med koncentreret serum.
                  
               
                     10.
                  
                  
                     Hullerne kan danne et andet mønster, hvis E05-serum fortyndet i forholdet 1:10 i negativt serum kan påvises som positivt.
                  
               B.   Metode til standardisering af antigener
         
         
                     1.
                  
                  
                     Opløsninger og materialer:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 40 ml 1,6 % agarose i 0,05 M Tris/MCl-buffer, pH 7,2 med 8,5 % NaCl
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 15 ml kvægleukoseserum, der kun indeholder antistoffer mod glycoproteiner af kvægleukosevirus; fortynding: 1:10 i 0,05 M Tris/HCl-buffer, pH 7,2 med 8,5 % NaCl
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 15 ml kvægleukoseserum, der kun indeholder antistoffer mod glycoproteiner af kvægleukosevirus; fortynding: 1:5 i 0,05 M Tris/HCl-buffer, pH 7,2 med 8,5 % NaCl
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 fire petriskåle af plast med en diameter på 85 mm
                              
                           
                                 e)
                              
                              
                                 en dorn med en diameter på 4 til 6 mm
                              
                           
                                 f)
                              
                              
                                 referenceantigen
                              
                           
                                 g)
                              
                              
                                 det antigen, der skal standardiseres
                              
                           
                                 h)
                              
                              
                                 vandbad (56 °C).
                              
                           
               
                     2.
                  
                  
                     Fremgangsmåde:
                     Agarosen (1,6 %) opløses i Tris/HCl-buffer ved forsigtig opvarmning til 100 °C. Den hensættes derefter i vandbad på 56 °C i ca. 1 time. Også kvægleukoseserumfortyndingerne hensættes i vandbad på 56 °C.
                     Nu blandes 15 ml af den 56 °C varme agaroseopløsning med 15 ml kvægleukoseserum (1:10) og omrystes hurtigt; derefter hældes det i to petriskåle, 15 ml i hver. Det samme gøres med kvægleukoseserummet i fortyndingen 1:5.
                     Når agarosen er størknet, laves der huller på følgende måde:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 
                                    
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 
                                    
                              
                           
               
                     3.
                  
                  
                     Tilsætning af antigen:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Petriskål 1 og 3:
                                 
                                             i)
                                          
                                          
                                             hul A — ufortyndet referenceantigen
                                          
                                       
                                             ii)
                                          
                                          
                                             hul B — referenceantigen, fortynding 1:2
                                          
                                       
                                             iii)
                                          
                                          
                                             hul C og E — referenceantigen
                                          
                                       
                                             iv)
                                          
                                          
                                             hul D — ufortyndet antigen, der skal prøves.
                                          
                                       
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Petriskål 2 og 4:
                                 
                                             i)
                                          
                                          
                                             hul A — ufortyndet antigen, der skal prøves
                                          
                                       
                                             ii)
                                          
                                          
                                             hul B — antigen, der skal prøves, fortynding 1:2
                                          
                                       
                                             iii)
                                          
                                          
                                             hul C — antigen, der skal prøves, fortynding 1:4
                                          
                                       
                                             iv)
                                          
                                          
                                             hul D — antigen, der skal prøves, fortynding 1:8.
                                          
                                       
                           
               
                     4.
                  
                  
                     Bemærkninger:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 For at få optimal udfældning bør forsøget foretages med to serumfortyndinger (1:5 og 1:10).
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Hvis udfældningsdiameteren er for lille med begge fortyndinger, fortyndes serummet yderligere.
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 Hvis udfældningsdiameteren med begge fortyndinger er for stor og udviskes, vælges et mindre fortyndet serum.
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 Agarosens endelige koncentration skal være 0,8 %; serumkoncentrationernes henholdsvis 5 % og 10 %.
                              
                           
                                 e)
                              
                              
                                 De målte diametre indsættes i følgende koordinatsystem. Den fortynding af det antigen, der skal prøves, som har samme diameter som referenceantigenet, er den fortynding, der skal anvendes.
                              
                           
                        
                  
               C.   ELISA-prøve (enzyme-linked immunosorbent assay) til påvisning af enzootisk kvægleukose
         
         
                     1.
                  
                  
                     Der anvendes følgende materialer og reagenser:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 mikroplader, skåle eller enhver anden form for fast fase
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 antigenet bindes til den faste fase med eller uden brug af polyklonale eller monoklonale antistoffer. Hvis antigenet påføres den faste fase direkte, må alle testprøver med positiv reaktion gentestes med kontrolantigenet. Kontrolantigenet bør være identisk med antigenet, bortset fra at det ikke indeholder BLV-antigener. Hvis den faste fase påføres capture-antistoffer, må antistofferne ikke reagere med andre antigener end BLV-antigener
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 den biologiske prøve
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 en tilsvarende positiv og negativ kontrol
                              
                           
                                 e)
                              
                              
                                 konjugat
                              
                           
                                 f)
                              
                              
                                 et substrat, der svarer til det anvendte enzym
                              
                           
                                 g)
                              
                              
                                 eventuelt en stopopløsning
                              
                           
                                 h)
                              
                              
                                 opløsninger til fortynding af prøverne, til fremstilling af reagenserne og til vask
                              
                           
                                 i)
                              
                              
                                 et aflæsningssystem, der passer til det anvendte substrat.
                              
                           
               
                     2.
                  
                  
                     Teststandardisering og -følsomhed
                     ELISA-prøven skal være så følsom, at E05-serum reagerer positivt, når det fortyndes ti gange (serumprøver) eller 250 gange (mælkeprøver) mere end den opløsning, der fås ved pooling af prøver. Hvis prøver (serum og mælk) testes separat, skal E05-serum, der fortyndes i forholdet 1:10 (i negativt serum) eller 1:250 (i negativ mælk), reagere positivt, når det testes i samme prøveopløsning som den, der anvendes til enkeltdyrsprøver. De institutter, der er omhandlet i del A, punkt 2, er ansvarlige for kvalitetskontrollen med ELISA-prøven og skal navnlig for hvert parti fastsætte, hvor mange prøver der skal indgå i en pulje på basis af den titer, der er opnået med E05-serum.
                  
               
                     3.
                  
                  
                     Betingelser for anvendelse af ELISA-prøven til påvisning af enzootisk kvægleukose
                     
                                 a)
                              
                              
                                 ELISA-prøver kan anvendes på prøver af serum og mælk.
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Anvendes der ELISA'er med henblik på udstedelse af certifikat i henhold til artikel 6, stk. 2, litra c), eller med henblik på etablering og bevarelse af en besætningsstatus i henhold til bilag D, kapitel I, skal serum- eller mælkeprøverne puljes på en sådan måde, at de udtagne prøver med sikkerhed kan henføres til det individuelle dyr i puljen. Eventuelle verifikationstest skal udføres på prøver fra individuelle dyr.
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 Hvis der anvendes ELISA'er på en prøve af mælk i tank, skal prøven tages fra mælk, der er indsamlet fra en bedrift med mindst 30 % lakterende malkekøer. Eventuelle verifikationstest skal udføres på serum- eller mælkeprøver fra individuelle dyr.«