CELEX: 32016D1840
Language: lt
Date: 1476403200000
Title: 2016 m. spalio 14 d. Komisijos įgyvendinimo sprendimas (ES) 2016/1840, kuriuo dėl afrikinės arklių ligos diagnostikos metodų iš dalies keičiamas Tarybos direktyvos 2009/156/EB IV priedas (pranešta dokumentu Nr. C(2016) 6509) (Tekstas svarbus EEE)

18.10.2016   
            
            
               LT
            
            
               Europos Sąjungos oficialusis leidinys
            
            
               L 280/33
            
         KOMISIJOS ĮGYVENDINIMO SPRENDIMAS (ES) 2016/1840
   2016 m. spalio 14 d.
   kuriuo dėl afrikinės arklių ligos diagnostikos metodų iš dalies keičiamas Tarybos direktyvos 2009/156/EB IV priedas
   
      
         (pranešta dokumentu Nr. C(2016) 6509)
      
   
   (Tekstas svarbus EEE)
   EUROPOS KOMISIJA,
   atsižvelgdama į Sutartį dėl Europos Sąjungos veikimo,
   atsižvelgdama į 2009 m. lapkričio 30 d. Tarybos direktyvą 2009/156/EB dėl gyvūnų sveikatos reikalavimų, reglamentuojančių arklinių šeimos gyvūnų importą iš trečiųjų šalių ir jų judėjimą (1), ypač į jos 20 straipsnį,
   kadangi:
   
               (1)
            
            
               Direktyvos 2009/156/EB IV priede nustatyti afrikinės arklių ligos diagnozavimo metodai, kurie, jei būtina, taikytini iki perkeliant arklinių šeimos gyvūnus Sąjungoje arba juos importuojant iš ES nepriklausančių šalių;
            
         
               (2)
            
            
               nuo tada, kai buvo priimta Direktyva 2009/156/EB, buvo išplėtoti laboratorijų pajėgumai pažangiems, labai jautriems ir veiksmingiems afrikinės arklių ligos diagnostiniams tyrimams atlikti. Siekiant atsižvelgti į šią pažangą buvo iš dalies pakeistas su afrikinės arklių ligos diagnostika susijęs Pasaulio gyvūnų sveikatos organizacijos (OIE) Sausumos gyvūnų diagnostinių tyrimų ir vakcinų vadovo skyrius (2);
            
         
               (3)
            
            
               Europos Sąjungos etaloninė afrikinės arklių ligos tyrimo laboratorija (3), įgyvendindama savo 2014 m. darbo programą, parengė Direktyvos 2009/156/EB IV priede aprašytų diagnostikos metodų techninio vertinimo ataskaitą. 2015 m. gegužės mėn. Komisijai pateiktame vertinime padaryta išvada, kad konkurencinė imunofermentinė analizė (konkurencinė IFA) nebetaikoma, netiesioginė imunofermentinė analizė nėra naudojama bendrai, bet galėtų būti atliekama po 4–6 mėnesių nuo prašymo pateikimo, ir kad blokavimo IFA galima įsigyti rinkoje ir ji yra bendrai naudojama mėginiams tirti, atliekant kvalifikacijos tikrinimo pratybas, kurias rengia Europos Sąjungos etaloninės afrikinės arklių ligos laboratorija;
            
         
               (4)
            
            
               ataskaitoje taip pat pabrėžiama, kad, palyginti su serologiniais diagnostikos metodais, nukleorūgščių atpažinimo atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininės reakcijos (ATPGR) metodai yra pranašesni, nes juos taikant ligą galima nustatyti ankstyvojoje užkrėtimo stadijoje. Be to, dauguma Europos Sąjungos valstybių narių nacionalinių etaloninių laboratorijų taiko tikralaikės ATPGR metodus (taip pat afrikinei arklių ligai diagnozuoti), kurie per 2009–2014 m. atliktas kvalifikacijos tikrinimo pratybas pasirodė esantys tinkami. Ataskaitoje taip pat nurodyta, kad už Sąjungos ribų veikia konkrečios patirties afrikinės arklių ligos srityje turinčių OIE etaloninių ir kitų laboratorijų, kurios jau yra taikiusios bent vieną tikralaikės ATPGR metodą afrikinės arklių ligos genomui aptikti;
            
         
               (5)
            
            
               per 2015 m. lapkričio 24 ir 25 d. vykusį bendrą Europos Sąjungos etaloninių afrikinės arklių ligos ir mėlynojo liežuvio ligos laboratorijų ir nacionalinių etaloninių laboratorijų seminarą Jungtinėje Karalystėje Askote rekomenduota įtraukti į Direktyvos 2009/156/EB IV priedą tikralaikės atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininės reakcijos (ATPGR) metodus afrikinės arklių ligos virusui aptikti;
            
         
               (6)
            
            
               nors visi taikomi tikralaikės ATPGR metodai afrikinės arklių ligos genomui aptikti yra pakankamai jautrūs, tačiau laboratorijose dažniausiai taikoma Agüero et al. (2008 m.) (4) aprašyta procedūra. Guthrie et al. (2013 m.) (5) aprašyta procedūra buvo specialiai sukurta siekiant užtikrinti, kad būtų galima saugiai vežti arklius iš teritorijų, kuriose esama pavojaus užsikrėsti afrikine arklių liga, praėjus mažiausiam karantino laikotarpiui, vadovaujantis OIE sausumo gyvūnų sveikatos kodeksu (6);
            
         
               (7)
            
            
               todėl tikslinga įtraukti į Direktyvos 2009/156/EB IV priedą sukėlėjo nustatymo ir antikūnų aptikimo metodus kaip papildomus afrikinės arklių ligos greitos diagnostikos metodus;
            
         
               (8)
            
            
               todėl Direktyvos 2009/156/EB IV priedas turėtų būti atitinkamai iš dalies pakeistas, iš jo turėtų būti išbrauktas konkurencinės IFA tyrimas, o netiesioginės ir blokavimo IFA tyrimų procedūros turėtų būti atnaujintos pagal OIE sausumos gyvūnų diagnostinių tyrimų ir vakcinų vadovo 2016 m. leidimo, pagrįsto 2012 m. gegužės mėn. pasaulinėje OIE delegatų asamblėjoje priimta versija (7), 2.5.1 skyrių. Į tą priedą taip pat reikėtų įtraukti Agüero et al. (2008 m.) ir Guthrie et al. (2013 m.) leidiniuose aprašytas tikralaikės ATPGR procedūras, kad tuos sukėlėjo nustatymo tyrimus būtų galima atlikti prieš perkeliant arklius;
            
         
               (9)
            
            
               todėl Direktyva 2009/156/EB turėtų būti atitinkamai iš dalies pakeista;
            
         
               (10)
            
            
               šiame sprendime nustatytos priemonės atitinka Augalų, gyvūnų, maisto ir pašarų nuolatinio komiteto nuomonę,
            
         PRIĖMĖ ŠĮ SPRENDIMĄ:
   1 straipsnis
   Direktyvos 2009/156/EB IV priedas keičiamas šio sprendimo priedu.
   2 straipsnis
   Šis sprendimas skirtas valstybėms narėms.
   
      Priimta Briuselyje 2016 m. spalio 14 d.
      
         
            Komisijos vardu
         
         Vytenis ANDRIUKAITIS
         
            Komisijos narys
         
      
   
   
      (1)  OL L 192, 2010 7 23, p. 1.
   
      (2)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf.
   
      (3)  1992 m. balandžio 29 d. Tarybos direktyva 92/35/EEB, nustatanti afrikinės arklių ligos kontrolės reikalavimus ir kovos su ja priemones (OL L 157, 1992 6 10, p. 19).
   
      (4)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. ir Jimenez-Clavero A. (2008 m.). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.
   
      (5)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30–35
   
      (6)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf
   
      (7)  Žr. 2 išnašą.
   
      PRIEDAS
      
         
            „IV PRIEDAS
            
               AFRIKINĖ ARKLIŲ LIGA
            
            
               DIAGNOZĖ
            
            A DALIS
            Serologiniai tyrimai
            Toliau aprašomas serologinis metodas – imunofermentinė analizė (IFA) pagal Sausumos gyvūnų diagnostinių tyrimų ir vakcinų vadovo 2016 m. leidimo, priimto 2012 m. gegužės mėn. pasaulinėje OIE delegatų asamblėjoje, 2.5.1 skyriaus B skirsnio 2 punktą.
            VP7 virusinis baltymas yra visų devynių afrikinės arklių ligos viruso (AALV) serotipų imunodominuojantis pagrindinis antigenas. Įrodyta, kad rekombinantiniai AALV VP7 baltymai yra stabilūs ir nekenksmingi antigenai ir tinka naudoti AALV antikūnų, kurių tikslumo ir specifiškumo indeksas yra didelis, nustatymo procedūrose (Laviada et al., 1992b (1), Maree and Paweska, 2005 m.). Netiesioginė IFA ir blokavimo IFA yra du AAL VP7 IFA tyrimai, tinkami afrikinės arklių ligos serologinei diagnozei.
            1.   Netiesioginė IFA afrikinės arklių ligos viruso (AALV) antikūnams nustatyti
            
            Šiam metodui taikomas konjugatas yra krieno peroksidaze konjuguojamas arklio gamaglobulinas, reaguojantis su arklių, mulų ir asilų serumu. Taikant Maree & Paweska (2005 m.) (2) aprašytą metodą kaip konjugatas naudojamas G baltymas, reaguojantis ir su zebrų serumu.
            Antigeną galima gauti Ispanijos tyrimų centre Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA) per 4–6 mėnesius nuo prašymo pateikimo.
            1.1.   Tyrimų procedūra
            
            1.1.1.   Kietoji fazė
            
                     
                        1.1.1.1.
                     
                     
                        IFA plokštelės padengiamos rekombinantiniu AALV-4 VP7, praskiestu karbonato ir (arba) bikarbonato buferiniu tirpalu, kurio pH 9,6. Plokštelės per naktį inkubuojamos 4 °C temperatūroje.
                     
                  
                     
                        1.1.1.2.
                     
                     
                        Plokštelės penkis kartus nuplaunamos distiliuotu vandeniu, kuriame yra 0,01 % tūrio „Tween 20“ (plaunamojo tirpalo). Apverstos plokštelės atsargiai patapšnojamos ant sugeriamosios medžiagos, kad nusikratytų ant jų likęs plaunamasis tirpalas.
                     
                  
                     
                        1.1.1.3.
                     
                     
                        Plokštelės vienai valandai 37 °C temperatūroje blokuojamos fosfato buferiniu druskų tirpalu (PBS) + 5 % (m/V) nugriebto pieno (Nestlé Dry Skim Milk
                           TM) po 200 μl duobutėje.
                     
                  
                     
                        1.1.1.4.
                     
                     
                        Blokuojantis tirpalas pašalinamas ir plokštelės atsargiai patapšnojamos ant sugeriamosios medžiagos.
                     
                  1.1.2.   Tiriamieji mėginiai
            
                     
                        1.1.2.1.
                     
                     
                        Serumo mėginiai, kuriuos reikia ištirti, bei teigiami ir neigiami kontroliniai serumai praskiedžiami santykiu 1:25 PBS + 5 % (m/V) nugriebto pieno + 0,05 % (V/V) „Tween 20“, po 100 μl į duobutę. Vieną valandą inkubuojama 37 °C temperatūroje.
                        Titravimui paruošiamos dvigubo skiedimo eilutės nuo 1:25 (100 μl duobutėje), po vieną serumų mėginį plokštelės stulpeliui, tas pats atliekama su teigiamais ir neigiamais kontroliniais mėginiais. Vieną valandą inkubuojama 37 °C temperatūroje.
                     
                  
                     
                        1.1.2.2.
                     
                     
                        Plokštelės penkis kartus nuplaunamos distiliuotu vandeniu, kuriame yra 0,01 % tūrio „Tween 20“ (plaunamojo tirpalo). Apverstos plokštelės atsargiai patapšnojamos ant sugeriamosios medžiagos, kad nusikratytų ant jų likęs plaunamasis tirpalas.
                     
                  1.1.3.   Konjugatas
            
                     
                        1.1.3.1.
                     
                     
                        Paruošiama po 100 μl duobutėje krienų peroksidaze (HRP) konjuguoto arklio gamaglobulino, praskiesto su PBS + 5 % pieno + 0,05 % „Tween 20“ tirpalo, kurio pH 7,2. Vieną valandą inkubuojama 37 °C temperatūroje.
                     
                  
                     
                        1.1.3.2.
                     
                     
                        Plokštelės penkis kartus nuplaunamos distiliuotu vandeniu, kuriame yra 0,01 % tūrio „Tween 20“ (plaunamojo tirpalo). Apverstos plokštelės atsargiai patapšnojamos ant sugeriamosios medžiagos, kad nusikratytų ant jų likęs plaunamasis tirpalas.
                     
                  1.1.4.   Chromogenas / Substratas
            
                     
                        1.1.4.1.
                     
                     
                        Į duobutes pripilama po 200 μl chromogeno / substrato tirpalo (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetil-aminobenzaldehido) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzo-tiazolinhidrazono hidrochlorido) + 5 μlH2O2).
                        Spalvos kaita sustabdoma maždaug po 5–10 minučių pripylus 50 μl 3N H2SO4 (prieš neigiamam kontroliniam mėginiui pradedant nusidažyti).
                        Galima naudoti ir kitus chromogenus, pvz., ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-etilbenzotiazolin-6-sulfoninę rūgštį]), TMB (tetrametilbenzidiną) arba OPD (orto-fenildiaminą).
                     
                  
                     
                        1.1.4.2.
                     
                     
                        Plokštelės vertinamos esant 600 nm (arba 620 nm).
                     
                  1.2.   Rezultatų vertinimas
            
            
                     
                        1.2.1.
                     
                     
                        Ribinė vertė apskaičiuojama prie neigiamos kontrolės vertės pridedant 0,06 (0,06 yra standartinis 30 neigiamų serumų grupės nuokrypis).
                     
                  
                     
                        1.2.2.
                     
                     
                        Tiriamieji mėginiai, kurių absorbavimo vertės yra mažesnės už ribinę vertę, laikomi neigiamais.
                     
                  
                     
                        1.2.3.
                     
                     
                        Tiriamieji mėginiai, kurių absorbavimo vertės yra didesnės už ribinę vertę + 0,15, laikomi teigiamais.
                     
                  
                     
                        1.2.4.
                     
                     
                        Tiriamieji mėginiai, kurių absorbavimo vertės yra tarp pirmiau nurodytų, yra neįtikinami, ir rezultatams patvirtinti reikia atlikti kitą tyrimą.
                     
                  2.   Blokavimo IFA afrikinės arklių ligos viruso (AALV) antikūnams nustatyti
            
            Konkurencinė blokavimo IFA yra skirta nustatyti specifiniams AALV antikūnams bet kurios arklinių šeimos gyvūnų, pvz., arklių, asilų, zebrų ir jų mišrūnų, serume, ir ją taikant galima išvengti specifiškumo, kartais pasitaikančio taikant netiesioginę IFA.
            Šio tyrimo principas – reakcijos tarp rekombinantinio VP7, baltymo, absorbuoto IFA plokštelės, ir konjuguotojo AAL VP7 vienaląsčio specialiojo monokloninio antikūno (Mab), blokavimas. Tiriamojo serumo antikūnai stabdys reakciją tarp antigeno ir Mab, todėl pasikeis spalva. Kadangi Mab taip pat veikia prieš VP7, tyrimo tikslumas ir specifiškumas yra labai dideli.
            Konkurencinę blokavimo IFA galima įsigyti rinkoje.
            2.1.   Tyrimų procedūra
            
            2.1.1.   Kietoji fazė
            
                     
                        2.1.1.1.
                     
                     
                        IFA plokštelės padengiamos 50–100 ng rekombinantinio AALV-4 VP7, praskiesto karbonato ir (arba) bikarbonato buferiniu tirpalu, kurio pH 9,6. Inkubuojama per naktį 4 °C temperatūroje.
                     
                  
                     
                        2.1.1.2.
                     
                     
                        Plokštelės tris kartus nuplaunamos fosfato buferiniu druskų tirpalu (PBS) 0,1×, kuriame yra 0,135 M NaCl ir 0,05 % (V/V) „Tween 20“ (PBST) tirpalo. Apverstos plokštelės atsargiai patapšnojamos ant sugeriamosios medžiagos, kad nusikratytų ant jų likęs plaunamasis tirpalas.
                     
                  2.1.2.   Tiriamieji ir kontroliniai mėginiai
            
                     
                        2.1.2.1.
                     
                     
                        Serumo mėginiai, kuriuos reikia ištirti, bei teigiami ir neigiami kontroliniai serumai santykiu 1:5 praskiedžiami tirpalu, kuriame yra 0,35 M NaCl, 0,05 % (V/V) „Tween 20“ ir 0,1 % „Kathon“ tirpalo, 100 μl duobutei. Vieną valandą inkubuojama 37 °C temperatūroje.
                        Titravimui paruošiamos tiriamųjų serumų dvigubo skiedimo serijos 8 duobutėse nuo 1:10 iki 1:280 (100 μl duobutėje), po vieną serumų mėginį plokštelės stulpeliui, tas pats atliekama su teigiamais ir neigiamais kontroliniais mėginiais. Vieną valandą inkubuojama 37 °C temperatūroje.
                     
                  
                     
                        2.1.2.2.
                     
                     
                        Plokštelės penkis kartus nuplaunamos fosfato buferiniu druskų tirpalu (PBS) 0,1×, kuriame yra 0,135 M NaCl ir 0,05 % (V/V) „Tween 20“ (PBST) tirpalo. Apverstos plokštelės atsargiai patapšnojamos ant sugeriamosios medžiagos, kad nusikratytų ant jų likęs plaunamasis tirpalas.
                     
                  2.1.3.   Konjugatas
            
                     
                        2.1.3.1.
                     
                     
                        Paruošiama po 100 μl duobutėje krienų peroksidaze konjuguoto VP7 Mab. Šis Mab iš anksto praskiedžiamas 1/5 000–1/15 000 1/1 „StabiliZyme Select® Stabilizer“ (SurModics. Nuoroda: SZ03) tirpalu distiliuotame vandenyje. 30 minučių inkubuojama 37 °C temperatūroje.
                     
                  
                     
                        2.1.3.2.
                     
                     
                        Plokštelės penkis kartus nuplaunamos fosfato buferiniu druskų tirpalu (PBS) 0,1×, kuriame yra 0,135 M NaCl ir 0,05 % (V/V) „Tween 20“ (PBST) tirpalo. Apverstos plokštelės atsargiai patapšnojamos ant sugeriamosios medžiagos, kad nusikratytų ant jų likęs plaunamasis tirpalas.
                     
                  2.1.4.   Chromogenas / Substratas
            Į kiekvieną duobutę pripilama po 100 μl chromogeno substrato tirpalo (1 ml ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-etilbenzotiazolin-6-sulfoninės rūgšties]) 5 mg/ml + 9 ml substrato buferinio (0,1 M fosfato-citrato buferinio tirpalo, kurio pH 4 ir kuriame yra 0,03 % H2O2) ir 10 minučių inkubuojama kambario temperatūroje. Spalvos kaita sustabdoma pripilant į kiekvieną duobutę 100 μl 2 % (m/V) SDS (natrio dodecilo sulfato).
            2.1.5.   Vertinimas
            Vertiname IFA analizatoriumi, nustačius 405 nm.
            2.2.   Rezultatų vertinimas
            
            
                     
                        2.2.1.
                     
                     
                        Nustatoma kiekvieno mėginio blokavimo procentinė dalis (BP), taikant toliau pateiktą formulę; čia „Abs“ – antikūnai:
                        
                           
                     
                  
                     
                        2.2.2.
                     
                     
                        Mėginiai, kurių BP vertė viršija 50 %, turėtų būti laikomi teigiamais AALV antikūnams.
                     
                  
                     
                        2.2.3.
                     
                     
                        Mėginiai, kurių BP vertė yra mažesnė kaip 45 %, turėtų būti laikomi neigiamais AALV antikūnams.
                     
                  
                     
                        2.2.4.
                     
                     
                        Mėginiai, kurių BP vertė yra 45–50 %, turėtų būti laikomi neįtikinamais ir tiriami dar kartą. Jeigu tyrimo rezultatai ir vėl yra neįtikinami, gyvūnai tiriami dar kartą, imant mėginius ne anksčiau kaip praėjus dviem savaitėms nuo neįtikinamu laikyto mėginio paėmimo.
                     
                  B DALIS
            Sukėlėjo nustatymas
            Tikralaikė atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (tlATPGR)
            Nukleorūgšties metodais pagrįstais sukėlėjo nustatymo tyrimais turi būti nustatomos devynių AALV serotipų kontrolinės padermės.
            2.1 punkte aprašytas serologinis metodas yra pagrįstas Sausumos gyvūnų diagnostinių tyrimų ir vakcinų vadovo 2016 m. leidimo, priimto 2012 m. gegužės mėn. pasaulinėje OIE delegatų asamblėjoje, 2.5.1 skyriaus B skirsnio 1.2 punktu.
            Bet koks ATPGR nustatymo metodas, naudojamas tiriant kraujo ar blužnies mėginius, pagal Direktyvą 2009/156/EB turi būti toks pat tikslus kaip 2 punkte aprašytų metodų arba tikslesnis.
            Inaktyvuotų 1–9 serotipų virusų kontrolinių padermių galima gauti iš Europos Sąjungos etaloninės laboratorijos arba OIE etaloninės afrikinės arklių ligos tyrimų laboratorijos Alchetėje, (Ispanija).
            1.   Virusinių RNR išskyrimas
            
            Siekiant užtikrinti tinkamą atsaką, reikia iš mėginio išskirti aukštos kokybės AALV RNR. Nukleorūgštis iš klinikinių mėginių galima išskirti taikant įvairius laboratorijose naudojamus ir rinkoje parduodamus metodus.
            Rinkiniai, kuriais prekiaujama rinkoje, taikomi naudojant skirtingus RNR išskyrimo metodus. Dauguma metodų yra grindžiami viena iš šių procedūrų:
            
                        —
                     
                     
                        nukleorūgščių išskyrimas fenolio-chloroformo metodu,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        nukleorūgščių adsorbcija filtravimo sistema,
                     
                  
                        —
                     
                     
                        nukleorūgščių adsorbcija magnetinių rutuliukų sistema.
                     
                  Toliau pateiktas laboratorijoje taikomo RNR išskyrimo metodo pavyzdys.
            
                        1.1.
                     
                     
                        1 g audinio mėginys homogenizuojamas 1 ml denatūravimo tirpalo (4 M guanidino tiocianato, 25 mM natrio citrato, 0,1 M 2-merkaptoetanolio, 0,5 % sarkozilo).
                     
                  
                        1.2.
                     
                     
                        Po centrifugavimo prie supernatanto pridedama 1 μg mielių RNR, 0,1 ml 2 M natrio acetato, kurio pH 4, 1 ml fenolio ir 0,2 ml chloroformo / izoamilo alkoholio mišinio (49/1).
                     
                  
                        1.3.
                     
                     
                        Suspensija stipriai pakratoma ir 15 minutę aušinama ant ledo.
                     
                  
                        1.4.
                     
                     
                        Po centrifugavimo vandeninėje fazėje esanti RNR ekstrahuojama fenoliu, nusodinama etanoliu ir pakartotinai nusodinama steriliame vandenyje.
                     
                  2.   Tikralaikės ATPGR procedūra
            
            2.1.   Konkrečios grupės tikralaikė ATPGR (Agüero et al., 2008 m.
                (3)
               )
            
            Ši konkrečios grupės tikralaikė ATPGR skirta AALV VP7 ir ją taikant galima nustatyti visus žinomus AALV serotipus ir šiuo metu paplitusias padermes. Ją taikė ir gerų rezultatų gavo Europos Sąjungos valstybių narių nacionalinės etaloninės laboratorijos, dalyvavusios kvalifikacijos tikrinimo pratybose, kurias 2009–2015 m. kasmet rengė Europos Sąjungos etaloninė laboratorija. Be to, 2015 m. OIE etaloninių laboratorijų tinklui atliekant tarptautinį tarplaboratorinį lyginamąjį tyrimą šis protokolas pateko tarp davusiųjų geriausių rezultatų.
            Pradmenų ir zondų sekos AALV rūšių virusams nustatyti:
            
                        —
                     
                     
                        tiesioginis pradmuo
                     
                     
                        5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        atvirkštinis pradmuo
                     
                     
                        5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        MGB „TaqMan“ zondas
                     
                     
                        5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
                     
                  
                        2.1.1.
                     
                     
                        Pradinė pradmens koncentracija skiedžiama iki 8 μM darbinės koncentracijos (toliau – 8 μM pradinė pradmens darbinė koncentracija), o zondas skiedžiamas iki 50 μM darbinės koncentracijos (toliau – 50 μM pradinė zondo darbinė koncentracija). Bandymo plokštelės išdėstymas turėtų būti konfigūruojamas ir įvedamas į tikralaikės PGR įrenginio programinę įrangą. Remiantis išdėstymu, į kiekvieną duobutę, kurioje bus laikomi RNR mėginiai ir teigiami arba neigiami kontroliniai mėginiai, įpilama 2,5 μl kiekvieno 8 μM pradinio darbinio pradmens tirpalo (galutinė pradmens koncentracija bus 1 μM 20 μl ATPGR mišinio). Plokštelė laikoma ant ledo.
                     
                  
                        2.1.2.
                     
                     
                        2 μl izoliuotosios RNR (tiriamieji mėginiai ir teigiami kontroliniai mėginiai) arba 2 μl vandens be ribonukleazių (neigiamos reakcijos kontroliniai mėginiai) sumaišomi su tiesioginiais ir atvirkštiniais pradmenimis. Mišinys denatūruojamas kaitinant 5 min. 95 °C temperatūroje, paskui ne trumpiau kaip 5 min. greitai ataušinamas ant ledo.
                     
                  
                        2.1.3.
                     
                     
                        Laikantis gamintojo instrukcijų paruošiamas atitinkamo tūrio vienetapės tikralaikės ATPGR reakcijų mišinys tam tikram tirtinų mėginių skaičiui. Į kiekvieną duobutę, kurioje bus laikomi RNR mėginiai, įpilama 0,1 μl 50 μM pradmens darbinio tirpalo (galutinė pradmens koncentracija bus 0,25 μM kiekvienoje duobutėje su RNR mėginiais). PGR plokštelėje į kiekvieną duobutę, kurioje yra denatūruotų pradmenų ir RNR, įpilama po 13 μl vienetapės tikralaikės ATPGR reakcijų mišinio.
                     
                  
                        2.1.4.
                     
                     
                        Plokštelė dedama į tikralaikį termociklerį, užprogramuotą atvirkštinei transkripcijai ir kDNR amplifikacijai arba fluorescenciniam aptikimui. Amplifikacijos sąlygos: pirmas atvirkštinės transkripcijos etapas, trunkantis 25 min. esant 48 °C temperatūrai, paskui – 10 min. esant 95 °C temp. (vadinamasis karštas paleidimas), 40 ciklų po 15 sek. esant 95 °C temp., 35 sek. esant 55 °C temp. ir 30 sek. esant 72 °C temp. (arba, jeigu naudojami greitos reakcijos reagentai ir termocikleriai, – 40 ciklų po 2 sek. esant 97 °C temp. ir 30 sek. esant 55 °C temp.). Fluorescencijos duomenys gaunami pasibaigus 55 °C temperatūros etapui.
                     
                  
                        2.1.5.
                     
                     
                        Jeigu gaunamos netipiškos amplifikacijos kreivės, tyrimas laikomas negaliojančiu.
                        Jeigu Ct vertė (ciklų, per kuriuos vykstant reakcijai gautos fluorescencijos intensyvumas viršija fluorescencijos ribas, skaičius) yra mažesnė už nustatytąją Ct ribą (35 per 40 PGR ciklų) arba jai lygi (Ct ≤ 35), mėginiai laikomi teigiamais.
                        Jeigu Ct vertė yra didesnė už nustatytąją Ct ribą (35 per 40 PGR ciklų, Ct ≥ 35), mėginiai laikomi neįtikimais.
                        Jeigu gaunama horizontali amplifikacijos kreivė, kuri nekerta ribinės linijos per 40 PGR ciklų, mėginiai laikomi neigiamais.
                     
                  2.2.   Konkrečios grupės tikralaikė ATPGR (Guthrie et al., 2013 m.
                (4)
               )
            
            Tikralaikė ATPGR naudojant fluorescencijos rezonansinės energijos perdavimo zondus AALV nukleorūgščiai nustatyti.
            Aprašytas AALV ATPGR tyrimas buvo sukurtas naudojant šiuo metu paplitusių labai įvairių AALV lauko padermių sekas (Quan et al., 2010 m. (5)). Tai apima ir patentuotą sintetinį išorinį kontrolinį tyrimą, skirtą patikrinti, ar tyrimo komponentai veikia tinkamai.
            Vienetapės tikralaikės PGR rinkiniais prekiaujama rinkoje. Toliau pateikti kai kurie pagrindiniai etapai, aprašyti Guthrie et al. (2013 m.), kuriuos galima keisti atsižvelgiant į konkrečios vietos arba atvejo reikalavimus, naudojamus rinkinius ir turimą įrangą.
            Pradmenų ir zondų sekos AALV rūšių virusams nustatyti:
            
                        —
                     
                     
                        tiesioginis pradmuo
                     
                     
                        5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        atvirkštinis pradmuo
                     
                     
                        5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        MGB „TaqMan“ zondas
                     
                     
                        5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
                     
                  
                        2.2.1.
                     
                     
                        Pradiniai pradmenų ir zondų mišinių tirpalai yra 25 kartus koncentruoti 5 μΜ (tiesioginiams ir atvirkštiniams pradmenims) ir 3 μΜ (zondams). Bandymo plokštelės išdėstymas turėtų būti konfigūruojamas ir įvedamas į tikralaikės PGR įrenginio programinę įrangą. Remiantis išdėstymu, į atitinkamas plokštelės duobutes dedama po 5 μl RNR mėginių, įskaitant tiriamuosius mėginius bei teigiamus ir neigiamus kontrolinius mėginius.
                     
                  
                        2.2.2.
                     
                     
                        RNR denatūruojama kaitinant 5 min. 95 °C temperatūroje, paskui ne trumpiau kaip 3 min. greitai ataušinama ant ledo.
                     
                  
                        2.2.3.
                     
                     
                        Laikantis gamintojo instrukcijų paruošiamas atitinkamo tūrio vienetapės tikralaikės ATPGR reakcijų mišinys tam tikram tirtinų mėginių skaičiui. Į reakcijos mišinį įpilamas 1 μl 25 kartus koncentruoto pradinio pradmens ir zondo mišinio tirpalas (žr. 2.2.1 punktą), kad kiekvienoje duobutėje būtų gauta 200 nM (kiekvieno pradmens) ir 120 nM (zondo) galutinė koncentracija. PGR plokštelėje į kiekvieną duobutę, kurioje yra denatūruotos RNR, įpilama po 20 μl reakcijų mišinio.
                     
                  
                        2.2.4.
                     
                     
                        Remiantis gamintojo rekomendacijomis, plokštelė dedama į tikralaikį termociklerį, užprogramuotą atvirkštinei transkripicijai ir kDNR amplifikacijai arba fluorescenciniam aptikimui. Amplifikacijos sąlygos, pvz, yra: pirmas atvirkštinės transkripcijos etapas, trunkantis 10 min. esant 48 °C temperatūrai, paskui – 10 min. esant 95 °C temp. ir 40 ciklų po 15 sek. esant 95 °C temp. ir 45 sek. esant 60 °C temp.
                     
                  
                        2.2.5.
                     
                     
                        Jeigu atliekant AALV ATPGR tyrimą įprastinė fluorescencija visuose kartotiniuose mėginiuose per 36 PGR ciklus viršija 0,1 ribą, mėginiai laikomi teigiamais.
                        Jeigu atliekant AALV ATPGR tyrimą įprastinė fluorescencija bent viename kartotiniame mėginyje per 36–40 PGR ciklų viršija 0,1 ribą, mėginiai laikomi neįtikinamais.
                        Jeigu atliekant AALV ATPGR tyrimą įprastinė fluorescencija visuose kartotiniuose mėginiuose per 40 PGR ciklų neviršija 0,1 ribos ir jeigu atliekant patentuotą sintetinį išorinį kontrolinį tyrimą įprastinė fluorescencija per 33 PGR ciklus viršijo 0,1 ribą, mėginiai laikomi neigiamais.“
                     
                  
      
      
         (1)  Laviada M.D., Roy P. and Sanchez-Vizcaiono J.M (1992b). Adaptation and evaluation of an indirect ELISA and immunoblotting test for African horse sickness antibody detection. Skaityti: Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses: Proceedings of the Second International Symposium. Walton T.E. & Osburn B.l., Eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646–650.
      
         (2)  Maree S. and Paweska J.T. (2005 m.) Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera. J. Virol. Methods, 125 (1), 55–65.
      
         (3)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. and Jimenez-Clavero A. (2008 m.). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.
      
         (4)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30–5.
      
         (5)  Quan, M., Lourens, C.W., MacLachlan, N.J., Gardner, I.A., Guthrie, A.J., 2010 m. Development and optimisation of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus. J. Virol. Methods 167, 45–52.