CELEX: 32014R0260
Language: hr
Date: 2014-01-24 00:00:00
Title: Uredba Komisije (EU) br. 260/2014 оd 24. siječnja 2014. o izmjeni Uredbe (EZ) br. 440/2008 o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) radi prilagodbe tehničkom napretku  Tekst značajan za EGP

19.3.2014   
            
            
               HR
            
            
               Službeni list Europske unije
            
            
               L 81/1
            
         
      UREDBA KOMISIJE (EU) br. 260/2014
   оd 24. siječnja 2014.
   o izmjeni Uredbe (EZ) br. 440/2008 o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) radi prilagodbe tehničkom napretku
   (Tekst značajan za EGP)
   EUROPSKA KOMISIJA,
   uzimajući u obzir Ugovor o funkcioniranju Europske unije,
   uzimajući u obzir Uredbu (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća od 18. prosinca 2006. o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) i osnivanju Europske agencije za kemikalije te o izmjeni Direktive 1999/45/EZ i stavljanju izvan snage Uredbe Vijeća (EEZ) br. 793/93 i Uredbe Komisije (EZ) br. 1488/94, kao i Direktive Vijeća 76/769/EEZ i direktiva Komisije 91/155/EEZ, 93/67/EEZ, 93/105/EZ i 2000/21/EZ (1), a posebno njezin članak 13. stavak 3.,
   budući da:
   
               (1)
            
            
               Uredba Komisije (EZ) br. 440/2008 (2) sadrži ispitne metode za određivanje fizikalno-kemijskih svojstava, toksičnosti i ekotoksičnosti tvari koje se primjenjuju u smislu Uredbe (EZ) br. 1907/2006.
            
         
               (2)
            
            
               Uredbu (EZ) br. 440/2008 potrebno je ažurirati kako bi se u nju prioritetno uključile nove i ažurirane alternativne ispitne metode koje je nedavno donio OECD radi smanjenja broja životinja koje se koriste u pokusima u skladu s Direktivom 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (3) i Direktivom Vijeća 86/609/EEZ od 24. studenog 1986. o usklađivanju odredaba utvrđenih zakonom i drugim propisima država članica o zaštiti životinja koje se koriste za pokusne i druge znanstvene svrhe (4).
            
         
               (3)
            
            
               Prilagodbom su obuhvaćene dvije metode za utvrđivanje fizikalno-kemijskih svojstava, uključujući ažuriranu verziju ispitne metode za određivanje topljivost u vodi i novu ispitnu metodu za određivanje koeficijenta razdiobe bitnog za ocjenu postojanosti, bioakumulativnosti i otrovnosti (PBT); četiri nove i jedna ažurirana metoda za određivanje ekotoksičnosti tvari te njezina ostanka i ponašanja u okolišu; devet metoda za određivanje toksičnosti i drugih učinaka na zdravlje, uključujući četiri ispitne metode za određivanje inhalacijske toksičnosti, koje obuhvaćaju ažurirane verzije triju metoda i jednu novu metodu za smanjenje broja životinja koje se koriste u pokusima i poboljšanu ocjenu učinaka, ažuriranu verziju ispitne metode za utvrđivanje oralne toksičnosti kod ponovljenog doziranja u trajanju 28 dana radi uključivanja parametara za ocjenu endokrinog djelovanja, ažuriranu verziju ispitne metode za određivanje toksikokinetičnosti bitne za osmišljavanje i razumijevanje toksikoloških studija te ažurirane verzije ispitnih metoda za određivanje kronične toksičnosti i kancerogenosti i kombinirane kronične toksičnosti i kancerogenosti.
            
         
               (4)
            
            
               Uredbu (EZ) br. 440/2008 bi stoga trebalo na odgovarajući način izmijeniti.
            
         
               (5)
            
            
               Mjere predviđene ovom Uredbom u skladu su s mišljenjem Odbora osnovanog na temelju članka 133. Uredbe (EZ) br. 1907/2006,
            
         DONIJELA JE OVU UREDBU:
   Članak 1.
   Prilog Uredbi (EZ) br. 440/2008 mijenja se u skladu s Prilogom ovoj Uredbi.
   Članak 2.
   Ova Uredba stupa na snagu trećeg dana od dana objave u Službenom listu Europske unije.
   
      Ova je Uredba u cijelosti obvezujuća i izravno se primjenjuje u svim državama članicama.
      Sastavljeno u Bruxellesu 24. siječnja 2014.
      
         
            Za Komisiju
         
         
            Predsjednik
         
         José Manuel BARROSO
         
      
   
   
      (1)  SL L 396, 30.12.2006., str. 1.
   
      (2)  SL L 142, 31.5.2008., str. 1.
   
      (3)  SL L 276, 20.10.2010., str. 33.
   
      (4)  SL L 358, 18.12.1986., str. 1.
   
      PRILOG
      Prilog Uredbi (EZ) br. 440/2008 mijenja se i glasi:
      
                  1.
               
               
                  Poglavlje A.6 mijenja se i glasi:
                  „A.6.   TOPLJIVOST U VODI
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 105 (1995.). Ova je ispitna metoda revidirana verzija originalne smjernice TG 105 donesene 1981. Nema razlike u sadržaju između aktualne verzije i verzije iz 1981. Promijenjen je uglavnom format. Revizija se temelji na ispitnoj metodi EU-a ‚Topljivost u vodi’ (1).
                           
                        UVODNA RAZMATRANJA
                  
                              2.
                           
                           
                              Prisutnost nečistoća može znatno utjecati na topljivost tvari u vodi. Ova se ispitna metoda bavi određivanjem topljivosti u vodi tvari koje su načelno čiste, stabilne u vodi i nehlapljive. Prije određivanja topljivosti u vodi korisno je imati neke preliminarne podatke o ispitivanoj tvari, kao što su strukturna formula, tlak pare, konstanta disocijacije i hidroliza kao funkcija pH.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              U ovoj ispitnoj metodi opisane su dvije metode, metoda eluiranja kolone i metoda tikvice, koje obuhvaćaju odgovarajuću topljivost ispod i iznad 10 –2 g/l. Također je opisan i jednostavni preliminarni test. Taj test omogućuje određivanje približno prikladnog broja uzoraka koji će se rabiti u završnom ispitivanju te vrijeme potrebno za postizanje zasićenja.
                           
                        DEFINICIJE I JEDINICE
                  
                              4.
                           
                           
                              Topljivost tvari u vodi jest koncentracija mase zasićenosti tvari u vodi na zadanoj temperaturi.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Topljivost u vodi izražava se masom otopljene tvari po volumenu otopine. Jedinica prema sustavu SI je kg/m3, ali se može rabiti i g/l.
                           
                        REFERENTNE KEMIKALIJE
                  
                              6.
                           
                           
                              Pri istraživanju ispitivane tvari ne moraju se primjenjivati referentne kemikalije.
                           
                        OPIS METODA
                  
                     Uvjeti ispitivanja
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Ispitivanje valja provoditi na 20 ± 0,5 °C. Odabranu temperaturu valja održavati konstantnom u svim relevantnim dijelovima opreme.
                           
                        
                     Preliminarno ispitivanje
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Sve veći volumeni vode na sobnoj temperaturi postupno se dodaju u otprilike 0,1 g uzorka (krute ispitivane tvari moraju se fino usitniti) u cilindar od 10 ml sa staklenim čepom. Nakon svakog dodavanja određene količine vode mješavinu treba protresati 10 minuta i zatim vizualno provjeriti ima li u uzorku još neotopljenih dijelova. Ako nakon dodavanja 10 ml vode uzorak ili dijelovi uzorka ostanu neotopljeni, pokus treba ponoviti u cilindru od 100 ml. Približna topljivost navedena je u tablici 1. pod onim volumenom vode u kojem dolazi do potpunog otapanja uzorka. Ako je topljivost niska, može biti potrebno dugo vrijeme za otapanje ispitivane tvari za što treba omogućiti najmanje 24 sata. Ako se nakon 24 sata ispitivana tvar još uvijek ne otopi, treba produljiti vrijeme otapanja (do 96 sati) ili je pokušati dodatno razrijediti kako bi se utvrdilo treba li primijeniti metodu eluiranja kolone ili metodu tikvice.
                              
                                 Tablica 1.
                              
                              
                                          ml vode na 0,1 g otopljene tvari
                                       
                                       
                                          0,1
                                       
                                       
                                          0,5
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                       
                                          100
                                       
                                       
                                          > 100
                                       
                                    
                                          približna topljivost u g/l
                                       
                                       
                                          > 1 000
                                       
                                       
                                          1 000 do 200
                                       
                                       
                                          200 do 100
                                       
                                       
                                          100 do 50
                                       
                                       
                                          50 do 10
                                       
                                       
                                          10 do 1
                                       
                                       
                                          < 1
                                       
                                    
                        
                     Metoda eluiranja kolone
                  
                  
                     Načelo
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Ova se metoda zasniva na eluiranju vodom ispitivane tvari iz mikro-kolone koja je napunjena inertnim nosivim materijalom, prethodno obloženim prekomjernom količinom ispitivane tvari (2). Topljivost u vodi određuje se kada koncentracija mase eluata dosegne plato kao funkciju vremena.
                           
                        
                     Aparatura
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Aparatura obuhvaća mikro-kolonu (slika 1.) koja se održava na konstantnoj temperaturi. Mikro-kolona je povezana s recirkulacijskom crpkom (slika 2.) ili nivelacijskom posudom (slika 3.). Mikro-kolona sadrži inertni nosač koji na mjestu drži mali čep od staklene vune koji također služi i za filtriranje čestica. Materijali koji se mogu upotrijebiti kao nosač jesu staklene kuglice, dijatomejska zemlja ili drugi inertni materijali.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Mikro-kolona prikazana na slici 1. prikladna je za povezivanje s recirkulacijskom crpkom. U koloni iznad uzorka mora biti mjesta za pet volumena vode (koji se odbacuju na početku pokusa) i volumen pet uzoraka (koji se uzimaju za analizu tijekom pokusa). Druga je mogućnost smanjiti veličinu ako se sustavu tijekom pokusa može dodavati voda kako bi se zamijenilo početnih pet volumena vode koji su uklonjeni s nečistoćama. Kolona je preko cijevi od inertnog materijala povezana s recirkulacijskom crpkom koja može dobaviti približno 25 ml/h. Recirkulacijska crpka može biti, primjerice, peristaltička ili membranska crpka. Treba voditi računa da ne dođe do kontaminacije materijalom same cijevi i/ili adsorpcije na materijal cijevi.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Shematski raspored s nivelacijskom posudom prikazan je na slici 3. U tom je rasporedu mikro-kolona opremljena jednosmjernom slavinom. Spoj s nivelacijskom posudom sastoji se od ubrušenog staklenog spoja i cjevovoda od inertnog materijala. Brzina protoka iz nivelacijske posude trebala bi iznositi otprilike 25 ml/h.
                              
                                 Slika 1.
                              
                              
                                 
                              Dimenzije u mm
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Priključak za ubrušeni stakleni spoj
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Prostor u koloni
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Unutrašnji 5
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Vanjski 19
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Čep od staklene vune
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Slavina
                                       
                                    
                                 Slika 2.
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Atmosfersko uravnoteženje
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Mjerač protoka
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Mikro-kolona
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Termostatski kontrolirana crpka za cirkulaciju
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Recirkulacijska crpka
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Dvosmjerni ventil za uzorkovanje
                                       
                                    
                                 Slika 3.
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Nivelacijska posuda (npr. 2,5-litarska tikvica)
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Kolona
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Skupljač frakcije
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Termostat
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Teflonski cjevovod
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Ubrušeni stakleni spoj
                                       
                                    
                                          G.
                                       
                                       
                                          Cjevovod (između termostata i kolone, unutarnjeg promjera približno 8 mm)
                                       
                                    
                        
                              13.
                           
                           
                              Oko 600 mg nosivog materijala prebacuje se u tikvicu zaobljenog dna od 50 ml. Odgovarajuća količina ispitivane tvari otapa se u hlapljivom otapalu kvalitete analitičkog reagensa, a odgovarajuća količina te otopine dodaje se nosivom materijalu. Otapalo posve isparava, npr. primjenom okretnog isparivača, jer se u protivnom neće postići zasićenost nosača vodom tijekom faze eluacije zbog razdjeljivanja na površini. Napunjeni nosivi materijal namače se dva sata u oko 5 ml vode, a zatim se ta otopina ulijeva u mikro-kolonu. Kao druga mogućnost, suhi napunjeni nosivi materijal može se usuti u mikro-kolonu ispunjenu vodom i ostaviti dva sata da se uravnoteži.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Dodavanje nosivog materijala može izazvati probleme koji dovode do pogrešnih rezultata, npr. kad se ispitivana tvar taloži kao ulje. Takve probleme valja ispitati i izvijestiti o pojedinostima.
                           
                        
                     Postupak s recirkulacijskom crpkom
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Započinje protok kroz kolonu. Preporuča se primjena brzine protoka od približno 25 ml/h, što kod opisane kolone odgovara veličini od 10 volumena punjenja na sat. Najmanje prvih pet volumena vode potroše se na uklanjanje nečistoća topljivih u vodi. Nakon toga, crpka se ostavi u radu dok se ne postigne ravnoteža, nasumice utvrđena s pet uzastopnih uzoraka čije se koncentracije ne razlikuju za više od ± 30 %. Te uzorke treba međusobno razdvojiti vremenskim intervalima koji odgovaraju prolasku najmanje deset volumena punjenja. Ovisno o primijenjenoj analitičkoj metodi, prednost se može dati izradi krivulje koncentracije u ovisnosti o vremenu kako bi se pokazalo da je postignuta ravnoteža.
                           
                        
                     Postupak s nivelacijskom posudom
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Susljedne frakcije eluata treba prikupiti i analizirati odabranom metodom. Za određivanje topljivosti koriste se frakcije iz srednjeg područja eluata u kojem su koncentracije stalne unutar ± 30 % u najmanje pet uzastopnih frakcija.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Najprikladniji je eluat dvostruko destilirana voda. Također se može upotrebljavati i deionizirana voda s otpornošću većom od 10 megaohm/cm i ukupnim sadržajem organskog ugljika ispod 0,01 %.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              U oba slučaja drugi krug pokusa treba provesti s pola brzine protoka prvog kruga. Ako se rezultati oba kruga slažu, ispitivanje se smatra zadovoljavajućim. Ako je izmjerena topljivost veća s nižom brzinom protoka, tada se prepolavljanje brzine protoka mora nastaviti sve dok dva uzastopna kruga ne daju istu topljivost.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              U oba slučaja kod frakcija treba provjeriti prisutnost koloidne tvari na način da se provjeri javlja li se Tyndallov efekt. Prisutnost takvih čestica ispitivanje čini nevaljanim te ispitivanje valja ponoviti nakon poboljšanja filtriranja kolone.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Valja izmjeriti pH vrijednost svakog uzorka, po mogućnosti posebnim indikatorskim trakama.
                           
                        
                     Metoda tikvice
                  
                  
                     Načelo
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Ispitivana tvar (krutine treba fino usitniti) otapa se u vodi na temperaturi malo višoj od ispitne temperature. Kada se postigne zasićenje, smjesa se hladi i održava na ispitnoj temperaturi. Ako je odgovarajućim uzorkovanjem potvrđeno da se postiglo uravnoteženje zasićenosti, mjerenje se alternativno može obaviti izravno na ispitnoj temperaturi. Zatim se koncentracija mase ispitivane tvari u vodenoj otopini, koja ne smije sadržavati neotopljene čestice, određuje prikladnom analitičkom metodom (3).
                           
                        
                     Aparatura
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Potreban je sljedeći materijal:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          obične laboratorijske staklene posude i instrumenti,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          uređaj za miješanje otopina na kontroliranoj konstantnoj temperaturi,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          centrifuga (poželjno termostatski regulirana), po potrebi s emulzijama, i
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analitička oprema.
                                       
                                    
                        
                     Postupak
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Količina ispitivane tvari koja je potrebna za zasićenje željenog volumena vode procjenjuje se iz preliminarnog ispitivanja. U svaku od tri staklene posude opremljene staklenim zatvaračima (npr. cijevi centrifuge, tikvice) odmjerava se peterostruka gore određena količina tvari. U svaku posudu dodaje se volumen vode odabran ovisno o analitičkoj metodi i području topljivosti. Posude se čvrsto začepe i protresaju na 30 °C. Treba koristiti uređaj za protresanje ili miješanje koji može raditi na stalnoj temperaturi, npr. magnetsku miješalicu u termostatiranoj vodenoj kupki. Nakon jednog dana jedna od posuda uravnotežuje se 24 sata na temperaturi ispitivanja uz povremeno protresanje. Sadržaj posude zatim se centrifugira na temperaturi ispitivanja, a koncentracija ispitivane tvari u jasnoj vodenoj fazi određuje se odgovarajućom analitičkom metodom. S druge dvije tikvice postupa se na sličan način nakon početnog uravnoteženja na 30 °C tijekom dva odnosno tri dana. Ako se koncentracije izmjerene u najmanje dvije posljednje posude ne razlikuje za više od 15 %, ispitivanje se smatra uspješnim. Ako rezultati iz posuda 1., 2. i 3. imaju tendenciju sve većih vrijednosti, ispitivanje treba u potpunosti ponoviti s duljim vremenom uravnoteženja.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Ispitivanje se također može provoditi i bez prethodne inkubacije na 30 °C. Kako bi se procijenila brzina postizanja uravnoteženja zasićenja, uzorci se uzimaju sve do trenutka kada vrijeme miješanja više nema utjecaja na izmjerene koncentracije.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Valja izmjeriti pH vrijednost svakog uzorka, po mogućnosti posebnim indikatorskim trakama.
                           
                        
                     Analitička određivanja
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Za ova ispitivanja poželjno je analitičku metodu odrediti točno prema ispitivanoj tvari jer male količine topljivih nečistoća mogu uzrokovati velike pogreške u izmjerenoj topljivosti. Te metode mogu biti primjerice plinska ili tekućinska kromatografija, titracija, fotometrija te voltametrija.
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Podaci
                  
                  
                     Metoda eluiranja kolone
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Za svaki krug treba izračunati srednju vrijednost i standardnu devijaciju najmanje pet uzastopnih uzoraka izmjerenih kod platoa zasićenja. Srednje vrijednosti dobivene iz prvih dvaju ispitivanja s različitim protocima ne smiju se razlikovati za više od 30 %.
                           
                        
                     Metoda tikvice
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Za svaku od tri tikvice treba izračunati prosjek pojedinačnih rezultata koji se ne bi smjeli razlikovati za više od 15 %.
                           
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                     Metoda eluiranja kolone
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              U izvješću o ispitivanju moraju se navesti sljedeće informacije:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          rezultati preliminarnog testa,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kemijski identitet i nečistoće (preliminarni korak pročišćavanja ako postoji),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          koncentracije, brzine protoka i pH vrijednost svakog uzorka,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          srednje vrijednosti i standardna odstupanja od najmanje pet uzoraka na platou zasićenja svakog kruga,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          prosječna vrijednost najmanje dva uzastopna kruga,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          temperatura vode tijekom postupka zasićenja,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          metoda analize,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          narav nosivog materijala,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          punjenje nosivog materijala,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          primijenjeno otapalo,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          dokaz o eventualnoj kemijskoj nestabilnosti tvari tijekom ispitivanja,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          sve podatke i napomene relevantne za tumačenje rezultata, posebno s obzirom na nečistoće i fizikalno stanje ispitivane tvari.
                                       
                                    
                        
                     Metoda tikvice
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              U izvješću o ispitivanju moraju se navesti sljedeće informacije:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          rezultati preliminarnog testa,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kemijski identitet i nečistoće (preliminarni korak pročišćavanja ako postoji),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pojedinačna analitička određivanja i prosjek ako je za svaku tikvicu određeno više od jedne vrijednosti,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pH vrijednost svakog uzorka,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          prosječne vrijednosti za različite tikvice koje su međusobno usklađene,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          temperatura ispitivanja,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analitička metoda,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          dokaz o eventualnoj kemijskoj nestabilnosti tvari tijekom ispitivanja,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          sve podatke i napomene relevantne za tumačenje rezultata, posebno s obzirom na nečistoće i fizikalno stanje ispitivane tvari.
                                       
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Direktiva Komisije 92/69/EEZ od 31. srpnja 1992. o sedamnaestoj prilagodbi tehničkom napretku Direktive Vijeća 67/548/EEZ o usklađivanju zakona i ostalih propisa o razvrstavanju, pakiranju i označivanju opasnih tvari, SL L 383, 29.12.1992., str. 54.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.”.
                           
                        
            
                  2.
               
               
                  Dodaje se Poglavlje A.23:
                  „A.23   KOEFICIJENT RAZDJELJENJA (1-OKTANOL/VODA): METODA SPOROG MIJEŠANJA
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 123 (2006.). Vrijednosti koeficijenta razdjeljenja 1-oktanol/voda (POW) do log POW od 8,2 pažljivo se određuju metodom sporog miješanja (1). Stoga je to prikladan pokusni pristup za izravno određivanje vrijednosti POW jako hidrofobnih tvari.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Ostale metode za određivanje koeficijenta razdjeljenja 1-oktanol/voda (POW) jesu metoda ‚protresanjem u tikvici’ (2) i određivanje POW iz obrnute faze ponašanja pri retenciji kod visokoučinkovite tekućinske kromatografije (HPLC) (3). Metoda ‚protresanjem u tikvici’ sklona je stvaranju artefakata zbog transfera mikro-kapljica oktanola u vodenoj fazi. S porastom vrijednosti POW prisutnost tih kapljica u vodenoj fazi dovodi do povećanja previsokih procjena koncentracije ispitivane tvari u vodi. Stoga je njezina primjena ograničena na tvari kod kojih je log POW < 4. Druga metoda počiva na pouzdanim podacima o izravno određenoj vrijednosti POW kako bi se odredio odnos između ponašanja pri zadržavanju kod HPLC-a i izmjerenih vrijednosti POW. Prijedlog smjernice OECD-a bio je dostupan za određivanje koeficijenta razdjeljenja 1-oktanol/voda ionizirajućih tvari (4), ali se više neće koristiti.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda razvijena je u Nizozemskoj. Preciznost ovdje opisanih metoda potvrđena je i optimizirana u validacijskoj studiji o prstenastim testovima u kojoj je sudjelovalo 15 laboratorija (5).
                           
                        UVODNA RAZMATRANJA
                  
                     Značenje i primjena
                  
                  
                              4.
                           
                           
                              Za inertne organske tvari utvrđeni su veoma značajni odnosi između koeficijenta razdjeljenja 1-oktanol/voda (POW) i njihove bioakumulacije u ribama. Štoviše, pokazalo se da je POW u korelaciji s toksičnošću za ribe kao i sa sorpcijom kemikalija u krute tvari, poput tala i sedimenata. Opsežan pregled tih odnosa naveden je u referenci (6).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Utvrđene su razne vrste odnosa između koeficijenta razdjeljenja 1-oktanol/voda i drugih svojstava tvari relevantnih za toksičnost u okolišu i kemiju. Kao posljedica toga, koeficijent razdjeljenja 1-oktanol/voda razvio se u ključni parametar u procjeni opasnosti kemikalija po okoliš, kao i u predviđanju sudbine kemikalija u okolišu.
                           
                        
                     Područje primjene
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Pokus sa sporim miješanjem zamišljen je kako bi se smanjilo stvaranje mikro-kapljica iz kapljica 1-oktanola u vodenoj fazi. Kao posljedica toga, nema previsoke procjene koncentracije u vodenoj otopini zbog molekula ispitivane tvari povezanih s tim kapljicama. Stoga je metoda sporog miješanja posebno prikladna za određivanje POW za tvari očekivanih log POW vrijednosti od 5 i većih, za koje se metodom protresanja tikvice (2) često dobivaju pogrešni rezultati.
                           
                        DEFINICIJA I JEDINICE
                  
                              7.
                           
                           
                              Koeficijent razdjeljenja tvari između vode i lipofilnog otapala (1-oktanola) karakterizira uravnoteženu raspodjelu kemikalije između dviju faza. Koeficijent razdjeljenja između vode i 1-oktanola (POW) definira se kao omjer uravnoteženih koncentracija ispitivane tvari u 1-oktanolu zasićenom vodom (CO) i vodi zasićenoj 1-oktanolom (CW).
                              
                                 
                              Budući da je riječ o omjeru koncentracija, koeficijent razdjeljenja nema dimenzija. Najčešće se navodi kao logaritam s bazom 10 (log POW). POW ovisi o temperaturi, a podaci iz izvješća trebaju uključivati temperaturu mjerenja.
                           
                        NAČELO METODE
                  
                              8.
                           
                           
                              Kako bi se odredio koeficijent razdjeljenja, voda, 1-oktanol i ispitivana tvar uravnotežuju se jedni s drugima na konstantnoj temperaturi. Zatim se određuju koncentracije ispitivane tvari u dvjema fazama.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Poteškoće u pokusu povezane s nastankom mikro-kapljica tijekom pokusa s protresanjem u tikvici mogu se smanjiti u (ovdje) predloženom pokusu sa sporim miješanjem. U pokusu sa sporim miješanjem voda, 1-oktanol i ispitivana tvar uravnotežuju se u termostatiranom reaktoru za miješanje. Izmjena faza ubrzava se miješanjem. Miješanje uvodi ograničenu turbulenciju koja pospješuje razmjenu između 1-oktanola i vode bez stvaranja mikro-kapljica (1).
                           
                        PRIMJENJIVOST TESTA
                  
                              10.
                           
                           
                              Budući da bi prisutnost drugih tvari osim ispitivane tvari mogla utjecati na koeficijent aktivnosti ispitivane tvari, ispitivanu tvar treba ispitivati kao čistu tvar. Za pokus s razdjeljivanjem 1-oktanol/vode treba upotrijebiti najviši stupanj čistoće koji se može nabaviti.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Ova se metoda primjenjuje na čiste tvari koje se ne disociraju ili asociraju i koje ne pokazuju značajnu interfacijalnu aktivnost. Može se primijeniti za određivanje omjera razdjeljenja 1-oktanol/vode takvih tvari i smjesa. Ako se metoda primjenjuje za smjese, određeni omjeri razdjeljenja 1-oktanol/vode uvjetovani su i ovise o kemijskom sastavu ispitivane smjese te o sastavu elektrolita upotrijebljenih kao vodena faza. Ako se poduzmu dodatni koraci, metoda se također može primijeniti za disocijativne ili asocijativne spojeve (stavak 12).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Zbog višestrukog uravnoteženja vode i 1-oktanola u razdjeljenju 1-oktanol/vode disocijativnih tvari, kao što su organske kiseline i fenoli, organske lužine i organometalne tvari, omjer razdjeljenja 1-oktanol/vode uvjetovana je konstanta koja snažno ovisi o sastavu elektrolita (7)(8). Stoga je za određivanje omjera razdjeljenja 1-oktanol/vode nužno da se tijekom pokusa kontrolira pH vrijednost i sastav elektrolita te da se unesu u izvješće. Za ocjenu tih omjera razdjeljenja valja pribaviti stručno mišljenje. Uz primjenu vrijednosti konstante/i disocijacije treba odabrati prikladne pH vrijednosti, takve da se za svako stanje ionizacije odredi omjer razdjeljenja. Kada se ispituju organometalni spojevi (8), trebaju se upotrebljavati nekompleksirajući puferi. Uzimajući u obzir postojeće znanje o kemiji voda (konstante kompleksacije, konstante disocijacije), uvjeti pokusa trebaju se odabrati tako da se može procijeniti specijacija ispitivane tvari u vodenoj fazi. Ionska jakost morala bi biti jednaka u svim pokusima zbog primjene pozadinskog elektrolita.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Poteškoće u ispitivanju mogu se pojaviti u provođenju ispitivanja tvari niske topljivosti u vodi ili visokog POW zbog činjenice da su koncentracije u vodi postale toliko niske da ih je teško precizno odrediti. Ova ispitna metoda pruža upute o rješavanju tog problema.
                           
                        INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI
                  
                              14.
                           
                           
                              Kemijski reagensi trebali bi biti čistoće analitičkog stupnja ili veće. Preporuča se primjena neoznačenih ispitivanih tvari poznatog kemijskog sastava i po mogućnosti čistoće od najmanje 99 % ili radioaktivno označenih ispitivanih tvari poznatog kemijskog sastava i radio-kemijske čistoće. U slučaju obilježivača s kratkim vremenom poluraspada valja primijeniti korekcije za raspadanje. U slučaju radioaktivno označenih ispitivanih tvari valja primijeniti analitičku metodu specifičnu za tu kemikaliju kako bi se osiguralo da je izmjerena radioaktivnost izravno povezana s ispitivanom tvari.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Procijenjeni log POW može se dobiti primjenom komercijalno dostupnog softvera za procjenu log POW ili primjenom omjera topljivosti u oba otapala.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Prije provođenja pokusa sa sporim miješanjem za određivanje POW dostupne trebaju biti sljedeće informacije o ispitivanoj tvari:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          strukturna formula;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          prikladne analitičke metode određivanja koncentracije tvari u vodi i 1-oktanolu;
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          konstanta/e disocijacije ionizirajućih tvari (Smjernica OECD-a 112 (9));
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          topljivost u vodenoj otopini (10);
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          abiotička hidroliza (11);
                                       
                                    
                                          (f)
                                       
                                       
                                          laka biorazgradivost (12);
                                       
                                    
                                          (g)
                                       
                                       
                                          tlak pare (13).
                                       
                                    
                        OPIS METODE
                  
                     Oprema i aparatura
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Potrebna je standardna laboratorijska oprema, a posebno sljedeći pribor:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          za miješanje vodene faze koriste se magnetne miješalice i magnetni štapići za miješanje premazani teflonom,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          analitički instrumenti prikladni za određivanje koncentracije ispitivane tvari u slučaju očekivanih koncentracija,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          posuda za miješanje sa slavinom na dnu. Ovisno o procijenjenom log POW i granici detekcije (LOD) ispitivanog spoja u obzir valja uzeti primjenu reakcijske posude jednake geometrije, veće od jedne litre kako bi se dobio dovoljan volumen vode za kemijsku ekstrakciju i analizu. To će rezultirati višim koncentracijama u vodenom ekstraktu te tako pouzdanijim analitičkim određivanjem. Tablica s procjenama minimalnog potrebnog volumena, LOD-a spoja, njegova procijenjenog log POW i njegove topljivosti u vodi nalazi se u Dodatku 1. Tablica se temelji na odnosu log POW i omjera topljivosti u oktanolu i vodi, kao što su pokazali Pinsuwan i sur. (14):
                                          
                                             
                                          gdje je
                                          
                                              (u molaritetu),
                                          te odnos koji navodi Lyman (15) za predviđanje topljivosti u vodi. Vrijednosti topljivosti u vodi izračunate jednadžbom iz Dodatka 1. trebaju se smatrati prvom procjenom. Valja primijetiti da korisnik može izraditi procjenu topljivosti u vodi pomoću svih odnosa za koje smatra da bolje predstavljaju odnos između hidrofobnosti i topljivosti. Za krute spojeve preporučuje se, primjerice, uključivanje tališta u predviđanje topljivosti. U slučaju primjene izmijenjene jednadžbe valja osigurati da je jednadžba za izračun topljivosti u oktanolu još uvijek valjana. Shematski prikaz posude za miješanje obložene staklom volumena od oko jedne litre nalazi se u Dodatku 2. Proporcije posude prikazane u Dodatku 2. pokazale su se povoljnima i valja ih se pridržavati u slučaju primjene aparature drukčije veličine;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          ključno je sredstvo za održavanje temperature konstantnom tijekom pokusa sa sporim miješanjem.
                                       
                                    
                        
                              18.
                           
                           
                              Posude moraju biti izrađene od takvog inertnog materijala da adsorpcija na površinu posude bude zanemariva.
                           
                        
                     Priprema ispitnih otopina
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Određivanje POW valja provesti s 1-oktanolom najviše čistoće koja se komercijalno može nabaviti (najmanje + 99 %). Preporučuje se pročišćavanje 1-oktanola ekstrakcijom kiselinom, lužinom i vodom te sušenjem nakon toga. Uz to se 1-oktanol može pročistiti i destilacijom. Pročišćeni 1-oktanol treba upotrijebiti za pripremu standardnih otopina ispitivanih tvari. Voda za uporabu pri određivanju POW treba biti destilirana u aparaturi od stakla ili kvarca ili dobivena sustavom pročišćavanja, a može se upotrijebiti i voda stupnja čistoće HPLC. Za destiliranu vodu potrebna je filtracija kroz filtar od 0,22 μm, a treba uključiti i slijepe probe kako bi se provjerilo da u koncentriranim ekstraktima koji mogu utjecati na ispitivanu tvar nema nečistoća. U slučaju primjene filtra od staklenih vlakana, filtar treba čistiti pečenjem najmanje tri sata na 400 °C.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Oba se otapala prije pokusa uzajamno zasićuju uravnoteženjem u posudi dovoljne veličine. To se obavlja tijekom dva dana pomoću dvofaznog sustava za sporo miješanje.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Odabire se prikladna koncentracija ispitivane tvari i otapa se u 1-oktanolu (zasićenom vodom). Koeficijent razdjeljenja 1-oktanol/vode valja odrediti u razrijeđenim otopinama 1-oktanola i vode. Stoga koncentracija ispitivane tvari ne bi smjela premašiti 70 % njezine topljivosti s maksimalnom koncentracijom od 0,1 M u bilo kojoj fazi (1). Otopine 1-oktanola upotrijebljene u pokusu ne smiju sadržavati otopljene krutine ispitivane tvari.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Prikladna količina ispitivane tvari otapa se u 1-oktanolu (zasićenom vodom). Ako procijenjeni log POW premaši pet, treba se pobrinuti da otopine 1-oktanola upotrijebljene za pokus ne sadržavaju otopljene krutine ispitivane tvari. S tim ciljem primjenjuje se sljedeći postupak za kemikalije čija je procijenjena vrijednost log POW > 5:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          ispitivana tvar otapa se u 1-oktanolu (zasićenom vodom),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          otopini se ostavi dovoljno vremena da se otopljena kruta tvar istaloži. Tijekom razdoblja taloženja nadzire se koncentracija ispitivane tvari,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          kada izmjerene koncentracije otopine 1-oktanola postignu stabilne vrijednosti, radna otopina razrjeđuje se odgovarajućim volumenom 1-oktanola,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          mjeri se koncentracija razrijeđene radne otopine. Ako se izmjerena koncentracija podudara s razrjeđenjem, razrijeđena radna otopina može se upotrijebiti u pokusu sa sporim miješanjem.
                                       
                                    
                        
                     Uzimanje i analiza uzoraka
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Za analizu ispitivane tvari treba upotrijebiti provjerenu analitičku metodu. Istraživači moraju pružiti dokaz da su koncentracije u 1-oktanolu zasićenom vodom kao i u vodenoj fazi zasićenoj 1-oktanolom tijekom pokusa veće od granice kvantifikacije korištenih analitičkih postupaka u toj metodi. U slučajevima u kojima su potrebne metode ekstrakcije prije pokusa potrebno je uspostaviti analitičke rekuperacije ispitivane tvari iz vodene faze i faze 1-oktanola. Analitičke signale treba korigirati slijepim probama i treba se pobrinuti da se ne dogodi prenošenje analizirane tvari iz jednog uzorka u drugi.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Vjerojatno će prije analize biti potrebna ekstrakcija u vodenoj fazi organskim otapalom i prethodnom koncentracijom ekstrakta zbog relativno niskih koncentracija hidrofobnih ispitivanih tvari u vodenoj fazi. Iz istog razloga potrebno je smanjiti eventualne koncentracije u slijepim probama. Stoga je nužno upotrebljavati otapala visoke čistoće, po mogućnosti otapala za analizu ostataka. Štoviše, rad sa staklenom opremom koja je prethodno pažljivo očišćena(npr. pranjem otapalom ili pečenjem na povišenoj temperaturi) može pomoći pri izbjegavanju unakrsne kontaminacije.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Procijenjeni log POW može se dobiti pomoću programa za procjenu ili stručnom procjenom. Ako je vrijednost veća od šest, treba pobliže nadzirati korekcije slijepih proba i prenošenje analizirane tvari. Slično tomu, ako procijenjeni log POW premašuje šest, obvezna je primjena surogatnog standarda za korekciju rekuperacije kako bi se mogli postići visoki faktori prethodne koncentracije. Komercijalno su dostupni brojni softverski programi za procjenu log POW
                                  (1), npr. Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) i ACD log P (19). Opis pristupa procjeni može se pronaći u referencama (20. - 22.).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Granice kvantifkacije (LOQ) za određivanje ispitivane tvari u 1-oktanolu i vodi određuju se primjenom prihvaćenih metoda. Kao zlatno pravilo, granica kvantifikacije ove metode može se odrediti kao koncentracija u vodi ili 1-oktanolu koja proizvodi omjer signala i šuma jednak deset. Valja odabrati prikladnu metodu ekstrakcije i prethodne koncentracije, a također treba navesti i analitičke rekuperacije. Odabire se prikladan faktor prethodne koncentracije kako bi se dobio signal željene veličine nakon analitičkog određivanja.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Na temelju parametara analitičke metode i očekivanih koncentracija određuje se približna veličina uzorka potrebna za precizno određivanje koncentracije spoja. Treba izbjegavati primjenu uzoraka vode koji su premali za dobivanje dovoljnog analitičkog signala. Također valja izbjegavati primjenu prekomjerno velikih uzoraka vode jer bi u protivnom moglo preostati premalo vode za minimalni broj traženih analiza (n = 5). U Dodatku 1. minimalni volumen uzorka izražen je kao funkcija volumena posude, LOD-a ispitivane tvari i topljivosti ispitivane tvari.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Kvantifikacija ispitivanih tvari odvija se usporedbom s kalibracijskim krivuljama odgovarajućeg spoja. Koncentracije u analiziranim uzorcima moraju se točno odrediti pomoću koncentracija standarda.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Za ispitivane tvari s procijenjenom vrijednošću log POW višom od šest surogatni standard valja ubaciti u uzorak vode prije ekstrakcije kako bi se utvrdili gubici tijekom ekstrakcije i prethodne koncentracije uzoraka vode. Za preciznu korekciju rekuperacije surogati moraju imati svojstva vrlo slična ili identična svojstvima ispitivane tvari. Po mogućnosti se u tu svrhu upotrebljavaju (stabilne) izotopično označene analogne tvari od interesa (primjerice perdeuterirane ili označene s 13C). Ako nije moguće upotrijebiti označene stabilne izotope, npr. 13C ili 2H, iz pouzdanih podataka iz literature treba dokazati da su fizikalno-kemijska svojstva surogata vrlo slična svojstvima ispitivane tvari. Tijekom ekstrakcije tekućina-tekućina vodene faze mogu nastati emulzije. Emulzije se mogu smanjiti dodavanjem soli i puštanjem emulzije da se preko noći istaloži. Treba izvijestiti o metodama koje su se koristile za ekstrakciju i prethodnu koncentraciju uzoraka.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Ako je potrebno, uzorci uzeti iz faze 1-oktanola mogu se prije analize razrijediti prikladnim otapalom. Štoviše, primjena surogatnih standarda za korekciju rekuperacije preporučuje se za tvari za koje su pokusi rekuperacije pokazali visok stupanj varijacije u pokusima rekuperacije (relativna standardna devijacija > 10 %).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Treba izvijestiti o pojedinostima analitičke metode. To obuhvaća metodu ekstrakcije, prethodne koncentracije i faktore razrjeđivanja, parametre instrumenata, rutinu kalibriranja, raspon kalibriranja, analitičku rekuperaciju ispitivane tvari iz vode, dodavanje surogatnih standarda radi korekcije rekuperacije, vrijednosti slijepih proba, granice detekcije i granice kvantifikacije.
                           
                        
                     Provođenje ispitivanja
                  
                  
                     Optimalni omjeri volumena 1-oktanola i vode
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Pri odabiru volumena vode i 1-oktanola u obzir valja uzeti LOQ u 1-oktanolu i vodi, faktore prethodne koncentracije primijenjene na uzorke vode, količine uzorkovane u 1-oktanolu i vodi te očekivane koncentracije. Zbog razloga vezanih uz pokus količinu 1-oktanola u sustavu za sporo miješanje treba odabrati tako da je sloj 1-oktanola dovoljne debljine (> 0,5 cm) kako bi se omogućilo uzorkovanje faze 1-oktanola bez njegova miješanja.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Tipični omjeri faza koji se koriste za određivanje spojeva s log POW od 4,5 i višim iznose 20 do 50 ml 1-oktanola i 950 do 980 ml vode u posudi od jedne litre.
                           
                        
                     Uvjeti ispitivanja
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Tijekom ispitivanja reakcijska posuda temperira se kako bi se variranje temperature smanjilo na ispod 1 °C. Analizu treba provesti na 25 °C.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Sustav pokusa treba zaštititi od danjeg svjetla bilo provođenjem pokusa u mračnoj prostoriji bilo pokrivanjem reakcijske posude aluminijskom folijom.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Pokus treba provesti u okolišu bez prašine (koliko je to moguće).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Sustav 1-oktanola i vode miješa se dok se ne postigne ravnoteža. U pilotskom pokusu trajanje razdoblja uravnoteženja određuje se provođenjem pokusa sa sporim miješanjem i periodičnim uzorkovanjem vode i 1-oktanola. Trenutke uzorkovanja treba rasporediti tijekom minimalnog razdoblja od pet sati.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Svako određivanje POW treba obaviti primjenom najmanje triju neovisnih pokusa sa sporim miješanjem.
                           
                        
                     Određivanje trajanja uravnoteženja
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Pretpostavlja se da se ravnoteža postigla kad regresija omjera koncentracije 1-oktanola i vode u ovisnosti o vremenu tijekom vremenskog razdoblja od četiri vremenske točke rezultira nagibom koji se znatno ne razlikuje od nule na p-razini od 0,05. Minimalno trajanje uravnoteženja iznosi jedan dan prije početka uzorkovanja. Kao zlatno pravilo, uzorkovanje tvari čiji je procijenjeni log POW manji od pet može se obaviti tijekom drugog i trećeg dana. Uravnoteženje će se možda produljiti za više hidrofobnih spojeva. Za spoj čiji je log POW 8,23 (dekaklorobifenil) za uravnoteženje su bila dovoljna 144 sata. Uravnoteženje se ocjenjuje ponovljenim uzorkovanjem iz jedne posude.
                           
                        
                     Početak pokusa
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Na početku pokusa reakcijska posuda puni se vodom zasićenom 1-oktanolom. Treba omogućiti dovoljno vremena za postizanje temperature određene termostatom.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Željena količina ispitivane tvari (otopljene u potrebnom volumenu 1-oktanola zasićenog vodom) pažljivo se dodaje u reakcijsku posudu. Ovo je ključni korak u pokusu jer treba izbjeći turbulentno miješanje dviju faza. Stoga se faza 1-oktanola može polako pipetirati uza stjenku pokusne posude, blizu površine vode. Kasnije će teći niza staklenu stjenku i stvoriti film iznad vodene faze. Uvijek treba izbjegavati dekantiranje 1-oktanola izravno u tikvicu. Kapljice 1-oktanola ne smiju pasti izravno u vodu.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Kad se započne s miješanjem, treba ga postupno ubrzavati. Ako se motori za miješanje ne mogu prikladno ugoditi, treba razmisliti o primjeni pretvarača. Brzinu miješanja treba ugoditi tako da se na kontaktu vode i 1-oktanola stvori vrtlog dubine od 0,5 do maksimalno 2,5 cm. Brzinu miješanja treba smanjiti ako je dubina vrtloga veća od 2,5 cm. U protivnom bi se mogle stvoriti mikro-kapljice iz kapljica 1-oktanola u vodenoj fazi, što bi dovelo do previsoke procjene koncentracije ispitivane tvari u vodi. Maksimalna brzina miješanja od 2,5 cm preporučuje se na temelju spoznaja validacijske studije s prstenastim testovima (5). Riječ je o kompromisu između postizanja velike brzine uravnoteženja, ujedno uz ograničavanje formiranja mikro-kapljica 1-oktanola.
                           
                        
                     Uzorkovanje i obrada uzoraka
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Prije uzorkovanja treba isključiti miješalicu i pustiti da se tekućine prestanu gibati. Po završetku uzorkovanja miješalica se ponovno polako pokreće, kao što je gore opisano, a brzina miješanja postupno se povećava.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Vodena faza uzorkuje se iz zapornog ventila na dnu reakcijske posude. Uvijek bacite volumen vode koji se nalazi u čepovima (otprilike 5 ml u posudi prikazanoj u Dodatku 2.). Voda u čepovima ne miješa se te stoga nije uravnotežena s ostatkom. Zabilježite volumen uzoraka vode i osigurajte da se pri izračunu bilance mase u obzir uzme i količina ispitivane tvari u bačenoj vodi. Gubici radi isparavanja moraju se svesti na minimum na način da se pusti da voda mirno teče u lijevak za odvajanje tako da se ne uznemiruje sloj vode/1-oktanola.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Uzorci 1-oktanola dobivaju se uzimanjem malog alikvota (oko 100 μl) iz sloja 1-oktanola pomoću štrcaljke od stakla i metala od 100 mikrolitara. Treba biti pažljiv kako se ne bi uznemirila granica. Treba zabilježiti volumen uzorkovane tekućine. Dovoljan je mali alikvot jer će se uzorak 1-oktanola razrijediti.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Treba izbjegavati nepotrebne korake prijenosa uzoraka. Stoga volumen uzorka treba odrediti gravimetrijski. U slučaju uzoraka vode to se može postići skupljanjem uzorka vode u lijevak za odvajanje koji već sadržava potreban volumen otapala.
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                              47.
                           
                           
                              Prema ovoj ispitnoj metodi POW se određuje provođenjem triju pokusa sa sporim miješanjem (triju pokusnih jedinica) predmetnog spoja uz primjenu identičnih uvjeta. Regresija primijenjena za pokazivanje stečenog uravnoteženja treba se temeljiti na rezultatima najmanje četiri određivanja CO/CW u uzastopnim vremenskim točkama. To omogućuje izračun varijance kao mjere nesigurnosti prosječne vrijednosti dobivene u svakoj pokusnoj jedinici.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              POW se može okarakterizirati varijancom podataka dobivenih za svaku pokusnu jedinicu. Taj se podatak upotrebljava za izračun POW kao ponderiranog prosjeka rezultata individualnih pokusnih jedinica. Za to se kao faktor ponderiranja upotrebljava obrnuta varijanca rezultata pokusnih jedinica. Kao rezultat toga, podaci s velikim odstupanjem (izraženim kao varijanca) te time i s manjom pouzdanošću manje utječu na rezultat od podataka s niskom varijancom.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Analogno tome izračunava se ponderirana standardna devijacija. Ona karakterizira ponavljanje mjerenja POW. Niska vrijednost ponderirane standardne devijacije ukazuje na to da je određivanje POW često ponavljano u jednom laboratoriju. U nastavku slijedi pregled formalne statističke obrade podataka.
                           
                        
                     Obrada podataka
                  
                  
                     Prikaz stečenog stanja ravnoteže
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Logaritam omjera koncentracije ispitivane tvari u 1-oktanolu i vodi (log (CO/Cw)) izračunava se za svako vrijeme uzorkovanja. Postizanje kemijske ravnoteže prikazuje se grafičkim prikazom tog omjera u ovisnosti o vremenu. Plato u tom grafikonu temelji se na najmanje četiri uzastopne vremenske točke pokazuje da je postignuta ravnoteža i da je spoj doista otopljen u 1-oktanolu. Ako tomu nije tako, ispitivanje treba nastaviti provoditi sve dok četiri uzastopne vremenske točke ne dadnu nagib koji se ne razlikuje značajno od 0 na p-razini od 0,05, pokazujući da log Co/Cw ne ovisi o vremenu.
                           
                        
                     Izračun log POW-
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Vrijednost log POW pokusne jedinice izračunava se kao ponderirana prosječna vrijednost log Co/Cw za dio krivulje log Co/Cw u ovisnosti o vremenu za koji se pokazuje ravnoteža. Ponderirani prosjek izračunava se ponderiranjem podataka s obrnutom vrijednošću varijance tako da utjecaj podataka na konačni rezultat bude obrnuto proporcionalan nesigurnosti podataka.
                           
                        
                     Prosječni log POW
                     
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Prosječna vrijednost log POW iz različitih pokusnih jedinica izračunava se kao prosjek rezultata pojedinačnih pokusnih jedinica ponderiran njihovim odgovarajućim varijancama.
                              To se izračunava na sljedeći način:
                              
                                 
                              gdje je
                              
                                          log POW,i
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          vrijednost log POW pojedinačne pokusne jedinice i;
                                       
                                    
                                          log POW,Av
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          ponderirana prosječna vrijednost određivanja pojedinačnog POW
                                          
                                       
                                    
                                          wi
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          statistički ponder dodijeljen vrijednosti log POW pokusne jedinice i.
                                       
                                    Recipročna vrijednost varijance log POW,i upotrebljava se kao wi
                                 
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Pogreška u prosjeku vrijednosti log POW procjenjuje se kao ponovljivost log Co/Cw određena tijekom faze ravnoteže u pojedinačnim pokusnim jedinicama. Izražena je kao ponderirana standardna devijacija vrijednosti log POW,Av (σlog
                                 Pow,Av) koja je pak mjera pogreške povezane s log POW,Av. Ponderirana standardna devijacija može se izračunati iz ponderirane varijance varlog Pow,Av na sljedeći način:
                              
                                 
                              
                                 
                              Simbol n predstavlja broj pokusnih jedinica.
                           
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              U izvješću o ispitivanju treba navesti sljedeće informacije:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana tvar:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trivijalni naziv, kemijski naziv, CAS broj, strukturna formula (koja navodi položaj oznake ako se upotrebljava radioaktivno označena tvar) te relevantna fizikalno-kemijska svojstva (vidjeti stavak 17.),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čistoća (nečistoće) ispitivane tvari,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čistoća oznake označenih kemikalija i molarna aktivnost (po potrebi),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      preliminarna procjena vrijednosti log Pow kao i metoda korištena za dobivanje te vrijednosti.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      datumi provođenja ispitivanja,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      temperatura tijekom pokusa,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      volumeni 1-oktanola i vode na početku ispitivanja,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      volumeni uzorkovanog 1-oktanola i vode,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      volumeni 1-oktanola i vode preostali u ispitnim posudama,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis ispitnih posuda i uvjeta miješanja (geometrija štapića za miješanje i ispitne posude, visina vrtloga u mm te, ako je dostupna, brzina miješanja),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analitičke metode primijenjene za određivanje ispitivane tvari i granica kvantifikacije metode,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vremena uzorkovanja,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pH vodene faze i korišteni puferi ako je pH prilagođen za ionizirajuće molekule,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj određivanja.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ponovljivost i osjetljivost korištenih analitičkih metoda,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      određene koncentracije ispitivane tvari u 1-oktanolu i vodi kao funkcija vremena,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prikaz bilance mase,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      temperatura i standardna devijacija ili raspon temperature tijekom pokusa,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      regresija omjera koncentracije u ovisnosti o vremenu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prosječna vrijednost log Pow,Av i njezina standardna pogreška,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rasprava i tumačenje rezultata,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      primjeri neobrađenih podataka, brojke reprezentativne analize (svi neobrađeni podaci moraju se spremati u skladu s GLP standardima), uključujući rekuperaciju surogata te broj razina upotrijebljenih pri kalibriranju (zajedno s kriterijima za koeficijent korelacije kalibracijske krivulje) te rezultati osiguranja kvalitete/kontrole kvalitete (QA/QC),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ako je dostupno: izvješće o potvrđivanju postupka analize (treba navesti među referencama).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ‚slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Poglavlje A.8 ovog Dodatka, Koeficijent razdjeljenja.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Poglavlje A.8 ovog Dodatka, Koeficijent razdjeljenja.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              OECD (2000.). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Pariz.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Pariz.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Poglavlje A.6 ovog Dodatka, Topljivost u vodi.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Poglavlje C.7 ovog Dodatka, Razgradnja – abiotička razgradnja: hidroliza kao funkcija pH.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Poglavlje C.4 - Dio II –VII (Metoda A do F) ovog Dodatka, Određivanje ‚lake’ biorazgradivosti.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Poglavlje A.4 ovog Dodatka, Tlak pare.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390.
                           
                        
                     Dodatak 1.
                     
                        Tablica za izračun minimalnih volumena vode potrebnih za detekciju ispitivanih tvari raličitih vrijednosti log POW u vodenoj fazi
                     
                     Pretpostavke:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Maksimalni volumen pojedinačnih alikvota = 10 % ukupnog volumena; 5 alikvota = 50 % ukupnog volumena.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 
                                    . U slučaju nižih koncentracija bit će potrebni veći volumeni.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Volumen upotrijebljen za određivanje LOD-a = 100 ml.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 log Pow u ovisnosti o log Sw i log Pow u ovisnosti o SR (Soct/Sw) predstavljaju razumne odnose za ispitivane tvari.
                              
                           
                        Procjena Sw
                        
                     
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 jednadžba
                              
                              
                                 log Sw
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,496
                              
                              
                                 3,133E+00
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,035
                              
                              
                                 1,084E+00
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,426
                              
                              
                                 3,750E-01
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,887
                              
                              
                                 1,297E-01
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,348
                              
                              
                                 4,487E-02
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,809
                              
                              
                                 1,552E-02
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,270
                              
                              
                                 5,370E-03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,731
                              
                              
                                 1,858E-03
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –3,192
                              
                              
                                 6,427E-04
                              
                           
                        Procjena Soct
                        
                     
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 jednadžba
                              
                              
                                 Soct (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 3,763E+04
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 4,816E+04
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 6,165E+04
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 7,890E+04
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,010E+05
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,293E+05
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,654E+05
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,117E+05
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,710E+05
                              
                           
                        
                     
                                 Ukupna masa ispitivane tvari
                                 (mg)
                              
                              
                                 masaoct/masawater
                                 
                              
                              
                                 masaH2O
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 koncH2O
                                 
                                 (mg/l)
                              
                              
                                 masaoct
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 koncoct
                                 
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 1 319
                              
                              
                                 526
                              
                              
                                 2,5017
                              
                              
                                 2,6333
                              
                              
                                 1 317
                              
                              
                                 26 333
                              
                           
                                 1 686
                              
                              
                                 1 664
                              
                              
                                 1,0127
                              
                              
                                 1,0660
                              
                              
                                 1 685
                              
                              
                                 33 709
                              
                           
                                 2 158
                              
                              
                                 5 263
                              
                              
                                 0,4099
                              
                              
                                 0,4315
                              
                              
                                 2 157
                              
                              
                                 43 149
                              
                           
                                 2 762
                              
                              
                                 16 644
                              
                              
                                 0,1659
                              
                              
                                 0,1747
                              
                              
                                 2 762
                              
                              
                                 55 230
                              
                           
                                 3 535
                              
                              
                                 52 632
                              
                              
                                 0,0672
                              
                              
                                 0,0707
                              
                              
                                 3 535
                              
                              
                                 70 691
                              
                           
                                 4 524
                              
                              
                                 1664 36
                              
                              
                                 0,0272
                              
                              
                                 0,0286
                              
                              
                                 4 524
                              
                              
                                 90 480
                              
                           
                                 5 790
                              
                              
                                 5263 16
                              
                              
                                 0,0110
                              
                              
                                 0,0116
                              
                              
                                 5 790
                              
                              
                                 115 807
                              
                           
                                 7 411
                              
                              
                                 1 664 357
                              
                              
                                 0,0045
                              
                              
                                 0,0047
                              
                              
                                 7 411
                              
                              
                                 148 223
                              
                           
                                 9 486
                              
                              
                                 5 263 158
                              
                              
                                 0,0018
                              
                              
                                 0,0019
                              
                              
                                 9 486
                              
                              
                                 189 713
                              
                           
                        Izračun volumena
                     
                     
                        Minimalni volumen potreban za fazu H2O za svaku koncentraciju LOD
                     
                     
                                 log Kow
                                 
                              
                              
                                 LOD (mikrogram/l)→
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,38
                              
                              
                                 3,80
                              
                              
                                 38
                              
                              
                                 380
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,94
                              
                              
                                 9,38
                              
                              
                                 94
                              
                              
                                 938
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 232
                              
                              
                                 2 318
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,57
                              
                              
                                 5,73
                              
                              
                                 57,26
                              
                              
                                 573
                              
                              
                                 5 726
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,41
                              
                              
                                 14,15
                              
                              
                                 141
                              
                              
                                 1 415
                              
                              
                                 14 146
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 3,50
                              
                              
                                 34,95
                              
                              
                                 350
                              
                              
                                 3 495
                              
                              
                                 34 950
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 8,64
                              
                              
                                 86,35
                              
                              
                                 864
                              
                              
                                 8 635
                              
                              
                                 86 351
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 21,33
                              
                              
                                 213
                              
                              
                                 2 133
                              
                              
                                 21 335
                              
                              
                                 213 346
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 52,71
                              
                              
                                 527
                              
                              
                                 5 271
                              
                              
                                 52 711
                              
                              
                                 527 111
                              
                           
                                 Volumen upotrijebljen za LOD (l)
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                        Legenda uz izračun
                     
                     Predstavlja < 10 % ukupnog volumena vodene faze, posuda za uravnoteženje od 1 litre.
                     Predstavlja < 10 % ukupnog volumena vodene faze, posuda za uravnoteženje od 2 litre.
                     Predstavlja < 10 % ukupnog volumena vodene faze, posuda za uravnoteženje od 5 litre.
                     Predstavlja < 10 % ukupnog volumena vodene faze, posuda za uravnoteženje od 10 litre.
                     Premašuje 10 % čak i posude za izjednačenje od 10 litri.
                     
                        Potrebni pregled volumena, kao funkcija topljivosti u vodi i log Pow
                        
                     
                     Minimalni volumen potreban za fazu H2O za svaku koncentraciju LOD (ml)
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                              
                                 LOD (mikrogram/l)→
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,24
                              
                              
                                 2,38
                              
                              
                                 23,80
                              
                              
                                 237,97
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 3
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,40
                              
                              
                                 3,97
                              
                              
                                 39,66
                              
                              
                                 396,62
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                              
                                 1 189,86
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                 0,51
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,84
                              
                              
                                 508,42
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,02
                              
                              
                                 10,17
                              
                              
                                 101,68
                              
                              
                                 1 016,83
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                              
                                 2 033,67
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,87
                              
                              
                                 8,69
                              
                              
                                 86,90
                              
                              
                                 869,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,17
                              
                              
                                 1,74
                              
                              
                                 17,38
                              
                              
                                 173,80
                              
                              
                                 1 738,02
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,375
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 231,75
                              
                              
                                 2 317,53
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,43
                              
                              
                                 4,35
                              
                              
                                 43,45
                              
                              
                                 434,51
                              
                              
                                 4 345,05
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 0,4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,19
                              
                              
                                 1,86
                              
                              
                                 18,57
                              
                              
                                 185,68
                              
                              
                                 1 856,79
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,37
                              
                              
                                 3,71
                              
                              
                                 37,14
                              
                              
                                 371,36
                              
                              
                                 3 713,59
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,74
                              
                              
                                 7,43
                              
                              
                                 74,27
                              
                              
                                 742,72
                              
                              
                                 7 427,17
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,49
                              
                              
                                 14,85
                              
                              
                                 148,54
                              
                              
                                 1 485,43
                              
                              
                                 14 854,35
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,63
                              
                              
                                 6,35
                              
                              
                                 63,48
                              
                              
                                 634,80
                              
                              
                                 6 347,95
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,27
                              
                              
                                 12,70
                              
                              
                                 126,96
                              
                              
                                 1 269,59
                              
                              
                                 12 695,91
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,54
                              
                              
                                 25,39
                              
                              
                                 253,92
                              
                              
                                 2 539,18
                              
                              
                                 25 391,82
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,78
                              
                              
                                 507,84
                              
                              
                                 5 078,36
                              
                              
                                 50 783,64
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,17
                              
                              
                                 21,70
                              
                              
                                 217,02
                              
                              
                                 2 170,25
                              
                              
                                 21 702,46
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 4,34
                              
                              
                                 43,40
                              
                              
                                 434,05
                              
                              
                                 4 340,49
                              
                              
                                 43 404,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 9,04
                              
                              
                                 90,43
                              
                              
                                 904,27
                              
                              
                                 9 042,69
                              
                              
                                 90 426,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 18,09
                              
                              
                                 180,85
                              
                              
                                 1 808,54
                              
                              
                                 18 085,39
                              
                              
                                 180 853,86
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 7,73
                              
                              
                                 77,29
                              
                              
                                 772,89
                              
                              
                                 7 728,85
                              
                              
                                 77 288,50
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 15,46
                              
                              
                                 154,58
                              
                              
                                 1 545,77
                              
                              
                                 15 457,70
                              
                              
                                 154 577,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0015
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 23,19
                              
                              
                                 231,87
                              
                              
                                 2 318,66
                              
                              
                                 23 186,55
                              
                              
                                 231 865,51
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 46,37
                              
                              
                                 463,73
                              
                              
                                 4 637,31
                              
                              
                                 46 373,10
                              
                              
                                 463 731,03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 0,002
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 19,82
                              
                              
                                 198,18
                              
                              
                                 1 981,77
                              
                              
                                 19 817,73
                              
                              
                                 198 177,33
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 39,64
                              
                              
                                 396,35
                              
                              
                                 3 963,55
                              
                              
                                 39 635,47
                              
                              
                                 396 354,66
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 79,27
                              
                              
                                 792,71
                              
                              
                                 7 927,09
                              
                              
                                 79 270,93
                              
                              
                                 792 709,32
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 158,54
                              
                              
                                 1 585,42
                              
                              
                                 15 854,19
                              
                              
                                 158 541,86
                              
                              
                                 1 585 418,63
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 33,88
                              
                              
                                 338,77
                              
                              
                                 3 387,68
                              
                              
                                 33 876,77
                              
                              
                                 338 767,72
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 67,75
                              
                              
                                 677,54
                              
                              
                                 6 775,35
                              
                              
                                 67 753,54
                              
                              
                                 677 535,44
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 135,51
                              
                              
                                 1 355,07
                              
                              
                                 13 550,71
                              
                              
                                 135 507,09
                              
                              
                                 1 355 070,89
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,000125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 271,01
                              
                              
                                 2 710,14
                              
                              
                                 27 101,42
                              
                              
                                 271 014,18
                              
                              
                                 2 710 141,77
                              
                           
                                 Volumen upotrijebljen za LOD (l)
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                  
                     Dodatak 2.
                     
                        Primjer ispitne posude obložene staklom za pokus sa sporim miješanjem radi određivanja POW
                        
                     
                     
                        
                  ”
            
                  3.
               
               
                  Ovime se Poglavlje B.2 mijenja i glasi:
                  „B.2.   AKUTNA INHALACIJSKA TOKSIČNOST
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a 403 (2009.) (1). Originalna Smjernica za ispitivanje 403 (TG 403) o akutnoj inhalaciji usvojena je 1981. Ova revidirana ispitna metoda B.2 (kao ekvivalent revidiranom TG 403) osmišljena je da bude fleksibilnija, da smanji uporabu životinja te da ispuni regulatorne potrebe. Revidiranu ispitnu metodu karakteriziraju dva tipa ispitivanja: tradicionalni protokol LC50 i protokol koncentracija × vrijeme (C × t). Primarne karakteristike ove ispitne metode jesu mogućnost određivanja odnosa koncentracije i reakcije koji mogu imati posljedice od nesmrtonosnih do smrtonosnih kako bi se odredila srednja smrtonosna koncentracija (LC50), prag nesmrtonosne koncentracije (npr. LC01) i nagib te kako bi se utvrdila moguća osjetljivost u odnosu na spol. Protokol C × t treba primijeniti u slučaju specifične regulatorne ili znanstvene potrebe koja zahtijeva testiranje životinja na dulje vrijeme, npr. u svrhu planiranja reakcije u slučaju nužde (npr. određivanje vrijednosti Acute Exposure Guideline Levels (AEGL), Emergency Response Planning Guidelines (ERPG) ili Acute Exposure Threshold Levels (AETL)) ili planiranja iskorištenja površina.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Smjernice za provođenje i tumačenje studija ove ispitne metode mogu se pronaći u Smjernici za ispitivanje akutne inhalacijske toksičnosti (GD 39) (2).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se na kraju ovog Poglavlja i u GD 39 (2).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda omogućuje karakterizaciju ispitivane kemikalije i kvantitativnu procjenu rizika te omogućuje rangiranje i razvrstavanje ispitivanih kemikalija u skladu s Uredbom (EZ) br. 1272/2008 (3). GD 39 (2) donosi smjernice za odabir prikladne ispitne metode za ispitivanje akutnosti. Kada se traži samo informacija o razvrstavanju i označavanju, općenito se preporučuje poglavlje B.52 ovog Priloga (4) [vidjeti GD 39 (2)]. Ispitna metoda B.2 nije specifično namijenjena za ispitivanje specijaliziranih materijala, poput slabo topljivih izometrijskih ili vlaknastih materijala ili proizvedenih nanomaterijala.
                           
                        UVODNA RAZMATRANJA
                  
                              5.
                           
                           
                              Kako bi se na minimum svela uporaba životinja, prije razmatranja ispitivanja u skladu s ovom ispitnom metodom ispitni laboratorij u obzir treba uzeti sve dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji, uključujući postojeće studije (npr. poglavlje B.52 ovog Priloga (4)) čiji bi podaci opravdali neprovođenje dodatnih ispitivanja. Informacije koje mogu pomoći u odabiru najprikladnijih vrsta, sojeva, spola, načina izlaganja i prikladnih ispitnih koncentracija obuhvaćaju identitet, kemijsku strukturu te fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije; rezultate bilo kakvih ispitivanja toksičnosti in vitro ili in vivo; očekivanu uporabu i potencijal za izlaganje ljudi; dostupne podatke (Q)SAR i toksikološke podatke o tvarima srodne strukture [vidjeti GD 39 (2)].
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Ispitivanje korozivnih i/ili nadražujućih ispitivanih kemikalija u koncentracijama za koje se očekuje da će izazvati ozbiljne bolove i/ili patnje treba izbjegavati koliko je god moguće. Potencijal izazivanja korozije/nadraženosti treba ocijeniti stručnom procjenom uz primjenu dokaza iz ljudskog i životinjskog iskustva (npr. iz ispitivanja uz primjenu ponavljanih doza provedenih u koncentracijama koje ne izazivaju koroziju/nadraženost), postojećih podataka in vitro (npr. iz poglavlja B.40, (5), B.40 bis (6) ovog Priloga ili OECD TG 425 (7)), vrijednosti pH, informacija o sličnim tvarima ili drugih podataka koji se odnose na to radi određivanja može li se odustati od daljnjeg ispitivanja. Za specifične regulatorne potrebe (npr. u svrhu planiranja za slučaj nužde) ova se ispitna metoda može upotrijebiti za izlaganje životinja tim materijalima jer voditelju istraživanja ili glavnom istraživaču pruža mogućnost kontrole odabira ciljanih koncentracija. Međutim, ciljane koncentracije ne smiju izazvati ozbiljne učinke korozije/nadraženosti nego učinke dovoljne za produljenje krivulje koncentracije i reakcije na razine koje postižu regulatorni i znanstveni cilj ispitivanja. Te koncentracije treba odabrati zasebno u svakom pojedinačnom slučaju i treba pružiti obrazloženje za odabir koncentracije [vidjeti GD 39 (2)].
                           
                        NAČELO ISPITIVANJA
                  
                              7.
                           
                           
                              Ova revidirana ispitna metoda B.2 osmišljena je da postigne dovoljno informacija o akutnoj toksičnosti ispitivane kemikalije kako bi se omogućilo njezino razvrstavanje te kako bi se pružili podaci o smrtonosnom djelovanju (npr. LC50, LC01 i nagib) za jedan od oba spola, kao što je potrebno za kvantitativnu procjenu rizika. Ova ispitna metoda nudi dvije metode. Prva je metoda tradicionalni protokol u kojem se skupine životinja izlažu graničnoj koncentraciji (granični test) ili seriji koncentracija u postupku korak po korak u prethodno određenom trajanju od obično 4 sata. Ostala trajanja izlaganja mogu se primijeniti u specifične regulatorne svrhe. Druga je metoda protokol (C × t) u kojem se skupine životinja izlažu jednoj (granična koncentracija) ili nizu višestrukih koncentracija tijekom više vremenskih razdoblja.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Životinje koje ugibaju ili pokazuju izrazite znakove stresa i boli treba humano usmrtiti i u tumačenju rezultata ispitivanja tretirati jednako kao i životinje uginule pri ispitivanju. Kriteriji za donošenje odluke o usmrćivanju životinja u stanju ugibanja ili koje teško pate te upute o prepoznavanju predvidive ili prijeteće smrti predmet su Smjernice za humano usmrćivanje br. 19 OECD-a (8).
                           
                        OPIS METODE
                  
                     Odabir životinjske vrste
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Treba upotrijebiti zdrave, mlade odrasle životinje sojeva koji se obično koriste u laboratorijima. Preferirana vrsta je štakor, a u slučaju uporabe drugih vrsta treba dati obrazloženje.
                           
                        
                     Priprema životinja
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Treba upotrebljavati ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne. Na dan izlaganja životinje moraju biti mlade odrasle jedinke između 8 i 12 tjedana starosti, srednje vrijednosti tjelesne mase od ± 20 % za svaki spol bilo koje prethodno izložene životinje iste dobi. Životinje se odabiru nasumice i označavaju radi pojedinačne identifikacije. Životinje se drže u kavezima najmanje 5 dana prije početka ispitivanja kako bi im se omogućila aklimatizacija na laboratorijske uvjete. Životinje također treba aklimatizirati na ispitnu aparaturu kratko vrijeme prije ispitivanja jer će se tako smanjiti stres izazvan uvođenjem u novu okolinu.
                           
                        
                     Uzgoj životinja
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Temperatura prostorije u kojoj se drže pokusne životinje trebala bi iznositi 22 ± 3 °C. Relativna vlažnost zraka idealno bi se morala održavati u rasponu od 30 do 70 % iako to možda neće biti moguće kad se kao nosač primjenjuje voda. Prije i nakon izlaganja životinje općenito treba smjestiti u kaveze u skupinama po spolu i koncentraciji, ali broj životinja po kavezu ne smije ometati jasna opažanja svake životinje i tako se trebaju na minimum svesti gubici zbog kanibalizma i borbe. Ako izlaže samo nos životinja, može biti potrebno aklimatizirati životinje na cijevi koje ih sputavaju. Cijevi koje sputavaju životinje ne smiju im nametnuti pretjeran fizički, toplinski ili imobilizacijski stres. Sputavanje može utjecati na fiziološke krajnje učinke, poput tjelesne temperature (hipertermija) i/ili respiratornog minutnog volumena. Ako su dostupni generički podaci koji pokazuju da se takve promjene ne događaju u znatnom opsegu, nije potrebna prethodna prilagodba cijevima koje sputavaju. Životinje, koje su cijelim tijelom izložene aerosolu, tijekom izlaganja treba smjestiti pojedinačno kako bi se spriječilo da se ispitivani aerosol filtrira kroz krzno drugih životinja u istom kavezu. Može se upotrijebiti konvencionalna i certificirana laboratorijska prehrana, osim tijekom izlaganja, u kombinaciji s neograničenom zalihom javne pitke vode. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati tame.
                           
                        
                     Komore za inhalaciju
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Pri odabiru komore za inhalaciju u obzir valja uzeti narav ispitivane kemikalije i cilj ispitivanja. Prednost se daje izlaganju samo nosom (koje uključuje samo glavu, samo nos ili samo njušku). Izlaganju samo nosom općenito se daje prednost za ispitivanja tekućih ili krutih aerosola te para koje se mogu kondenzirati iz aerosola. Posebni ciljevi ispitivanja mogu se bolje postići uporabom izlaganja čitavog tijela, ali to treba opravdati u izvješću o ispitivanju. Kako bi se osigurala stabilnost atmosfere u slučaju primjene komore za čitavo tijelo, ukupni volumen pokusnih životinja ne smije premašiti 5 % volumena komore. Načela tehnika izlaganja samo nosom i čitavim tijelom te njihove specifične prednosti i nedostaci opisani su u GD 39 (2).
                           
                        UVJETI IZLAGANJA
                  
                     Primjena koncentracija
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Izlaganje samo nosom kod štakora može trajati do 6 sati. Ako se miševi izlažu samo nosom, izlaganje općenito ne smije biti dulje od 4 sata. Ako su potrebna istraživanja duljeg trajanja, treba dati obrazloženje [vidjeti GD 39 (2)]. Životinje izložene aerosolu u komorama za izlaganje čitavim tijelom treba smjestiti pojedinačno kako bi se spriječilo gutanje ispitivane kemikalije zbog njegovanja životinja u istom kavezu. Tijekom izlaganja treba obustaviti hranjenje. Voda se može davati tijekom cijelog izlaganja čitavim tijelom.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Životinje se izlažu ispitivanoj kemikaliji u vidu plina, pare, aerosola ili njihovih smjesa. Fizikalno stanje koje će se ispitivati ovisi o fizikalno-kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, odabranoj koncentraciji i/ili fizikalnom obliku koji je obično prisutan tijekom manipulacije ispitivanom kemikalijom i njezine uporabe. Higroskopske i kemijski reaktivne ispitivane kemikalije treba ispitivati u uvjetima suhog zraka. Treba paziti kako bi se izbjeglo stvaranje eksplozivnih koncentracija.
                           
                        
                     Distribucija veličine čestica
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Određivanje veličine čestica treba provesti za sve aerosole i pare koje se mogu kondenzirati iz aerosola. Kako bi se omogućilo izlaganje svih relevantnih područja respiratornog trakta, preporučuje se aerosol srednjeg aerodinamičkog promjera čestica (MMAD) u rasponu od 1 do 4 μm s geometrijskom standardnom devijacijom (σg) u rasponu od 1,5 do 3,0 (2) (9) (10). Iako treba uložiti razuman napor za postizanje tih standarda, ako se isti ne mogu postići, treba dati stručno mišljenje. Primjerice, isparine metala mogu biti manje od tog standarda, a čestice, vlakna i higroskopni materijali pod nabojem (čija se veličina povećava u vlažnom okolišu respiratornog trakta) mogu premašiti taj standard.
                           
                        
                     Priprema ispitivane kemikalije u nosaču
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Za stvaranje odgovarajuće koncentracije i veličine čestica ispitivane kemikalije u atmosferi može se upotrijebiti nosač. U pravilu se prednost daje vodi. Materijali u česticama mogu se podvrgnuti mehaničkim procesima kako bi se postigla potrebna distribucija veličine čestica, no treba paziti da se ispitivana kemikalija ne rastavi niti promijeni. U slučajevima u kojima se smatra da mehanički procesi mijenjaju ispitivanu kemikaliju (npr. ekstremne temperature uslijed prekomjernog mljevenja zbog trenja) treba analitički provjeriti sastav ispitivane kemikalije. Treba primijeniti dovoljnu razinu opreza da se ne bi kontaminirala ispitivana kemikalija. Nije nužno ispitivati nedrobive granulirane materijale koji su namjerno oblikovani tako da se ne mogu inhalirati. Treba primijeniti test atricijom kako bi se dokazalo da se tijekom rukovanja granuliranim materijalom ne stvaraju čestice koje se mogu udahnuti. Ako se tijekom testa atricijom stvore tvari koje se mogu udahnuti, treba provesti test inhalacijske toksičnosti.
                           
                        
                     Kontrolne životinje
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Nije potrebna paralelna negativna skupina (zrak). U slučaju primjene drugog nosača osim vode pri stvaranju ispitne atmosfere kontrolna skupina nosača treba se primijeniti samo ako nisu dostupni podaci o povijesnoj inhalacijskoj toksičnosti. Ako ispitivanje toksičnosti ispitivane kemikalije formulirane u nosaču ne pokaže nikakvu toksičnost, znači da nosač nije toksičan u ispitnoj koncentraciji te stoga nema potrebe za kontrolnim nosačem.
                           
                        PRAĆENJE UVJETA IZLAGANJA
                  
                     Protok zraka u komori
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Protok zraka u komori treba pažljivo kontrolirati, neprestano pratiti te bilježiti najmanje jedanput svakog sata tijekom svakog izlaganja. Praćenje ispitne koncentracije (ili stabilnosti) u atmosferi sastavno je mjerenje svih dinamičkih parametara i pruža neizravno sredstvo za kontrolu svih relevantnih parametara za stvaranje dinamičke atmosfere. Treba posebno obratiti pozornost na izbjegavanje ponovnog udisanja u komorama za izlaganje samo nosom u slučajevima gdje je protok zraka kroz sustav za izlaganje neadekvatan za pružanje dinamičkog protoka atmosfere ispitivane kemikalije. Postoje propisane metodologije koje se mogu primijeniti kako bi se pokazalo da u odabranim uvjetima rada ne dolazi do ponovnog udisanja (2) (11). Koncentracija kisika mora iznositi najmanje 19 %, a koncentracija ugljikova dioksida ne smije premašivati 1 %. Ako postoji opravdana sumnja da se takvi standardi ne mogu postići, treba mjeriti koncentraciju kisika i ugljikova dioksida.
                           
                        
                     Temperatura i relativna vlažnost zraka u komori
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Temperaturu u komori treba održavati na 22 ± 3 °C. Relativnu vlažnost zraka u zoni gdje životinje dišu, za izlaganja samo nosom i čitavim tijekom, treba pratiti i bilježiti najmanje tri puta tijekom izlaganja do 4 sata te jedanput svakoga sata tijekom kraćih izlaganja. Relativnu vlažnost zraka trebalo bi idealno održavati u rasponu od 30 do 70 %, no to može biti nemoguće (npr. u slučaju ispitivanja smjesa na bazi vode) ili nemjerljivo zbog utjecanja na ispitivanu kemikaliju pomoću ispitne metode.
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija: Nazivna koncentracija
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Kad god je to moguće, treba izračunati i zabilježiti nazivnu koncentraciju u komori za izlaganje. Nazivna koncentracija jest masa proizvedene ispitivane kemikalije podijeljena s ukupnim volumenom zraka koji je prošao kroz sustav komore. Nazivna se koncentracija ne koristi za karakterizaciju izlaganja životinja nego usporedba nazivne koncentracije i stvarne koncentracije daje uvid u učinkovitost proizvodnje sustava ispitivanja te se stoga može upotrijebiti za otkrivanje problema pri proizvodnji.
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija: Stvarna koncentracija
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Stvarna koncentracija jest koncentracija ispitivane kemikalije u zoni udisanja životinja u komori za inhalaciju. Stvarna koncentracija može se dobiti specifičnim metodama (npr. izravnim uzorkovanjem, adsorpcijskim ili kemijskim reaktivnim metodama te analitičkom karakterizacijom nakon toga) ili nespecifičnim metodama, poput filtriranja u gravimetrijskoj analizi. Primjena gravimetrijske analize prihvatljiva je samo za aerosole sa samo jednom komponentom u prahu ili aerosole tekućina niskog stupnja hlapljivosti i treba je podržati odgovarajućom preliminarnom karakterizacijom specifičnom za ispitivanu kemikaliju. Gravimetrijskom analizom može se odrediti i koncentracija aerosola s višekomponentnim prahom. No, za to su potrebni analitički podaci koji pokazuju da je sastav materijala koji se prenosi zrakom sličan početnom materijalu. Ako ta informacija nije dostupna, potrebna je ponovna analiza ispitivane kemikalije (idealno u stanju kada se prenosi zrakom) u pravilnim intervalima tijekom ispitivanja. Za agense, pod utjecajem aerosola, koji mogu ispariti ili sublimirati treba pokazati da su odabranom metodom skupljene sve faze. U izvješću o ispitivanju treba navesti ciljanu, nazivnu i stvarnu koncentraciju, ali samo se stvarne koncentracije koriste u statističkim analizama za izračun vrijednosti smrtonosne koncentracije.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Ako je moguće, treba upotrijebiti jednu šaržu ispitivane kemikalije, a ispitivani uzorak treba skladištiti u uvjetima u kojima će biti očuvana njegova čistoća, homogenost i stabilnost. Prije početka ispitivanja treba odrediti svojstva ispitivane kemikalije, uključujući njezinu čistoću i, ako je tehnički izvedivo, identitet te količine identificiranih kontaminirajućih tvari i nečistoća. To se može pokazati sljedećim podacima, ali nije ograničeno na njih: vrijeme zadržavanja i relativno vršno područje, molekulska masa iz spektroskopskog mjerenja ili kromatografske analize plina ili sličnih procjena. Iako određivanje identiteta ispitivanog uzorka nije odgovornost ispitnog laboratorija, za laboratorij može biti mudro, barem u ograničenim okvirima, da potvrdi naručiteljevu karakterizaciju (npr. boju, fizikalnu prirodu itd.).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Atmosferu izlaganja treba održavati konstantnom koliko je to moguće i pratiti neprestano i/ili na mahove, ovisno o metodi analize. Ako se primjenjuje uzorkovanje na mahove, uzorke atmosfere u komori treba uzimati najmanje dvaput tijekom ispitivanja od četiri sata. Ako to nije izvedivo zbog ograničenog protoka zraka ili niskih koncentracija, tijekom čitavog razdoblja izlaganja može se uzeti jedan uzorak. Ako se pojave označene fluktuacije uzorak po uzorak, sljedeće ispitne koncentracije moraju upotrijebiti četiri uzorka po izlaganju. Pojedinačni uzorci koncentracije u komori ne smiju od srednje koncentracije odstupati za više od ± 10 % za plinove i pare ili ± 20 % za tekućine ili krute aerosole. Treba izračunati i zabilježiti vrijeme za postizanje ravnoteže u komori (t95). Trajanje izlaganja proteže se kroz vrijeme proizvodnje ispitivane kemikalije, a to uzima u obzir vrijeme potrebno za postizanje t95. Smjernica za procjenu t95 može se pronaći u GD 39 (2).
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Za vrlo složene smjese koje se sastoje od plinova/para i aerosole (npr. zapaljive atmosfere i ispitivane kemikalije izbačene iz namjenskih proizvoda/uređaja za krajnju uporabu) svaka se faza može ponašati drukčije u komori za inhalaciju tako da treba odabrati najmanje jedan indikator (analiziranu tvar), obično glavnu aktivnu tvar u smjesi, svake faze (plin/para i aerosol). Kada je ispitivana kemikalija smjesa, treba izvijestiti o analitičkoj koncentraciji smjese, a ne samo za aktivnu tvar ili komponentu (analiziranu tvar). Dodatne informacije o stvarnim koncentracijama mogu se pronaći u GD 39 (2).
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija: Distribucija veličine čestica
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Distribuciju veličine čestica u aerosolu treba odrediti najmanje dvaput tijekom svakog izlaganja od 4 sata uporabom kaskadnog impaktora ili alternativnog instrumenta, poput uređaja za aerodinamičku analizu veličine čestica. Ako se može dokazati da su rezultati dobiveni kaskadnim impaktorom ili alternativnim instrumentom ekvivalentni, u cijelom se istraživanju može upotrebljavati alternativni instrument. Drugi uređaj, poput gravimetrijskog filtra ili uređaja za sudaranje/uređaja za mjerenje mjehurića plina, treba upotrijebiti paralelno s primarnim instrumentom kako bi se potvrdila učinkovitost skupljanja primarnog instrumenta. Koncentracija mase dobivena analizom veličine čestica trebala bi biti u razumnim granicama koncentracije mase dobivene analizom filtracijom [vidjeti GD 39 (2)]. Ako se ekvivalentnost može dokazati u ranoj fazi istraživanja, mogu se izostaviti daljnja mjerenja radi potvrde. Radi dobrobiti životinja treba provoditi mjerenja kako bi se na minimum sveli nepotpuni podaci koji mogu dovesti do potrebe za ponovnim izlaganjem. Određivanje veličine čestica treba provesti za pare ako postoji ikakva mogućnost da bi kondenzacijom pare mogao nastati aerosol ili ako čestice detektirane u atmosferi pare imaju potencijal za miješane faze (vidjeti stavak 15.).
                           
                        POSTUPAK
                  
                              26.
                           
                           
                              U nastavku su opisane dvije vrste istraživanja: tradicionalni protokol i protokol C × t. Oba protokola mogu uključivati preliminarno istraživanje, glavno istraživanje i/ili granični test (tradicionalni protokol) ili ispitivanje na graničnoj koncentraciji (C × t). Ako se za jedan od spolova zna da je osjetljiviji, voditelj istraživanja može odabrati da se ta istraživanja provedu samo na osjetljivom spolu. Ako izlaganju samo nosom nisu izloženi štakori nego drugi glodavci, maksimalno trajanja izlaganja treba prilagoditi kako bi se na minimum sveo stres specifičan za tu vrstu. Prije početka u obzir treba uzeti sve dostupne podatke kako bi se na minimum svela primjena životinja. Primjerice, podaci dobiveni primjenom Poglavlja B.52 ovog Priloga (4) mogu eliminirati potrebu za preliminarnim istraživanjem te također mogu pokazati je li jedan od spolova osjetljiviji [vidjeti GD 39 (2)].
                           
                        TRADICIONALNI PROTOKOL
                  
                     Općenita razmatranja: Tradicionalni protokol
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              U tradicionalnom istraživanju skupine životinja izlažu se ispitivanoj kemikaliji na određeno vremensko razdoblje (općenito 4 sata) u komori za izlaganje samo nosom ili čitavim tijelom. Životinje se izlažu graničnoj koncentraciji (granični test) ili najmanje trima koncentracijama u postupku korak po korak (glavno istraživanje). Preliminarno istraživanje može prethoditi glavnom istraživanju, osim ako već ne postoje neke informacije o ispitivanoj kemikaliji, poput prethodno provedenog istraživanja B.52 [vidjeti GD 39 (2)].
                           
                        
                     Preliminarno istraživanje: Tradicionalni protokol
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Preliminarno istraživanje primjenjuje se kako bi se procijenila snaga ispitivane kemikalije, identificirale razlike među spolovima po pitanju osjetljivosti te kako bi se pomoglo pri odabiru razina koncentracije pri izlaganju za glavno istraživanje ili granični test. Pri odabiru razina koncentracije za preliminarno istraživanje treba upotrijebiti sve dostupne informacije, uključujući dostupne podatke o (Q)SAR i podatke za slične kemikalije. Na svakoj koncentraciji treba izložiti najviše tri mužjaka i tri ženke (potrebne su tri životinje svakog spola kako bi se odredila razlika među spolovima). Preliminarno istraživanje može obuhvaćati samo jednu koncentraciju, ali, ako je potrebno, može se ispitivati više koncentracija. Preliminarno istraživanje ne smije obuhvaćati ispitivanje tolikog broja životinja i koncentracija da nalikuje glavnom istraživanju. Umjesto preliminarnog istraživanja može se upotrijebiti prethodno provedeno istraživanje B.52 (4) [vidjeti GD 39 (2)].
                           
                        
                     Granični test: Tradicionalni protokol
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Granični test primjenjuje se kada se za ispitivanu kemikaliju zna ili očekuje da je zapravo netoksična, tj. izaziva toksične reakcije samo iznad regulatorne granične koncentracije. U graničnom testu jedna skupina od tri mužjaka i tri ženke izlaže se ispitivanoj kemikaliji na graničnoj koncentraciji. Informacije o toksičnosti ispitivane kemikalije mogu se dobiti iz znanja o sličnim ispitivanim kemikalijama, uzimajući u obzir identitet i postotak komponenata za koje se zna da su od toksikološke važnosti. U takvim situacijama, u kojima postoji malo informacija o njezinoj toksičnosti ili ih uopće nema ili se za ispitivanu kemikaliju očekuje da je toksična, treba provesti glavno istraživanje.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Odabir graničnih koncentracija obično ovisi o regulatornim zahtjevima. Ako se primjenjuje Uredba (EZ) br. 1272/2008, granične koncentracije za plinove, pare i aerosole iznose redom 20 000 ppm, 20 mg/l i 5 mg/l (ili maksimalna koncentracija koja se može postići) (3). Tehnički može biti zahtjevno proizvesti granične koncentracije nekih ispitivanih kemikalija, posebno para i aerosola. Kada se ispituje aerosol, primarni cilj treba biti postizanje veličine čestica koja se može udahnuti (MMAD 1 - 4 μm). To je s većinom ispitivanih kemikalija moguće na koncentraciji od 2 mg/l. Ispitivanje aerosola na koncentraciji većoj od 2 mg/l treba pokušati samo ako se može postići veličina čestica koja se može udisati [vidjeti GD 39 (2)]. Uredba (EZ) br. 1272/2008 destimulira ispitivanja previše iznad granične koncentracije radi dobrobiti životinja (3). Graničnu koncentraciju treba uzeti u obzir samo ako postoji velika vjerojatnost da će rezultati takvog ispitivanja biti izravno relevantni za zaštitu ljudskog zdravlja (3) te ako je u izvješću o istraživanju navedeno obrazloženje. U slučaju potencijalno eksplozivnih ispitivanih kemikalija treba voditi brigu o tome da se izbjegnu uvjeti povoljni za eksploziju. Kako bi se izbjegla nepotrebna primjena životinja, prije graničnog testa treba provesti ispitivanje bez životinja kako bi se osiguralo da se u komori mogu postići uvjeti za granični test.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Ako se na graničnoj koncentraciji opazi ugibanje ili krajnja iscrpljenost, rezultati graničnog testa mogu poslužiti kao preliminarno istraživanje za daljnje istraživanje na drugim koncentracijama (vidjeti glavno istraživanje). Ako fizikalna ili kemijska svojstva ispitivane kemikalije onemogućuju postizanje granične koncentracije, treba ispitati maksimalnu koncentraciju koja se može postići. Ako se na maksimalnoj koncentraciji koja se može postići dogodi smrtonosno djelovanje manje od 50 %, nije potrebno daljnje ispitivanje. Ako se granična koncentracija ne može postići, izvješće o istraživanju mora pružiti objašnjenje i podatke koji to potkrjepljuju. Ako maksimalna koncentracija pare koja se može postići ne izazove toksičnost, može biti potrebno proizvesti ispitivanu kemikaliju kao tekući aerosol.
                           
                        
                     Glavno istraživanje: Tradicionalni protokol
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Glavno istraživanje obično se provodi uz primjenu pet mužjaka i pet ženki (ili 5 životinja osjetljivijeg spola ako je poznat) po razini koncentracije, s najmanje tri razine koncentracije. Za postizanje snažne statističke analize treba upotrijebiti dovoljan broj razina koncentracije. Vremensko razdoblje između izloženih skupina određuje se nastupom, trajanjem i ozbiljnošću znakova toksičnosti. Izlaganje životinja sljedećoj razini koncentracije treba odgoditi sve dok postoji opravdana mogućnost preživljavanja prethodno ispitivanih životinja. To voditelju istraživanja omogućuje prilagodbu ciljane koncentracije sljedećoj skupini koja će biti izložena. Zbog ovisnosti o sofisticiranoj tehnologiji to nije uvijek primjenjivo u inhalacijskim studijama pa se izlaganje životinja na sljedećoj razini koncentracije treba temeljiti na prethodnom iskustvu i znanstvenoj procjeni. U slučaju ispitivanja smjesa treba se konzultirati s GD 39 (2).
                           
                        PROTOKOL KONCENTRACIJA × VRIJEME (C × T)
                  
                     Općenita razmatranja: Protokol C × t
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Istraživanje C × t korak po korak može se smatrati alternativom tradicionalnom protokolu pri određivanju inhalacijske toksičnosti (12) (13) (14). Taj pristup životinjama omogućuje izlaganje ispitivanoj kemikaliji na više razina koncentracije i na više vremenskih razdoblja. Čitavo ispitivanje provodi se u komori za izlaganje samo nosom (komore za izlaganje čitavim tijelom nisu primjenjive za ovaj protokol). Dijagram toka u Dodatku 1. ilustrira ovaj protokol. Simulacijska analiza pokazala je da su i tradicionalni protokol i protokol C × t u stanju prikazati snažne vrijednosti LC50, ali je protokol C × t općenito bolji u prikazivanju snažnih vrijednosti LC01 i LC10 (15).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Simulacijska analiza dokazala je da uporaba dviju životinja po intervalu C × t (po jedne od svakog spola ili po dvije osjetljivijeg spola) načelno može biti prikladna pri ispitivanju 4 koncentracije i 5 trajanja izlaganja u glavnom istraživanju. U određenim okolnostima voditelj istraživanja može odabrati uporabu dvaju štakora svakog spola za interval C × t (15). Uporabom 2 životinja svakog spola za koncentraciju i vremensku točku može se smanjiti pristranost i varijabilnost procjena, povećati stopa uspješnosti procjene te poboljšati obuhvaćenost intervalom pouzdanosti. Međutim, u slučaju nedovoljnog približavanja podacima za procjenu (u slučaju primjene jedne životinje svakog spola ili više životinja osjetljivijeg spola) može biti dovoljna i 5. koncentracija izlaganja. Daljnje upute u svezi s brojem životinja i koncentracijama koje treba primijeniti u istraživanju C × t nalaze se u GD 39 (2).
                           
                        
                     Preliminarno istraživanje: Protokol C × t
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Preliminarno istraživanje primjenjuje se za procjenu djelovanja ispitivane kemikalije te za pomoć pri odabiru razina koncentracije izlaganja u glavnom istraživanju. Preliminarno istraživanje uz primjenu do triju životinja po spolu i koncentraciji [za detalje vidjeti Dodatak III. GD 39 (2)] može biti potrebno za odabir prikladne početne koncentracije za glavno istraživanje te za svođenje broja upotrijebljenih životinja na minimum. Može biti potrebno upotrijebiti tri životinje svakog spola kako bi se odredila razlika među spolovima. Te se životinje trebaju izložiti jedanput, načelno 240 minuta. Izvedivost stvaranja prikladne atmosfere za ispitivanje treba ocijeniti tijekom tehničkih predispitivanja bez životinja. Preliminarno istraživanje načelno nije potrebno provoditi ako su podaci o smrtnosti dostupni iz istraživanja B.52 (4). Pri odabiru početne ciljane koncentracije u istraživanju B.2 voditelj istraživanja u obzir treba uzeti opažene uzorke smrtnosti u svim dostupnim istraživanjima B.52 (4) za oba spola i za sve ispitne koncentracije [vidjeti GD 39 (2)].
                           
                        
                     Početna koncentracija: Protokol C × t
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Početna koncentracija (sesija izlaganja I.) (Dodatak 1.) bit će granična koncentracija ili koncentracija koju je odabrao voditelj istraživanja na temelju preliminarnog istraživanja. Skupine od 1 životinje po spolu izlažu se toj koncentraciji u više intervala (npr. 15, 30, 60, 120 ili 240 minuta) tako da se postigne ukupni broj od 10 životinja (takozvana sesija izlaganja I.) (Dodatak 1.).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Odabir graničnih koncentracija obično ovisi o regulatornim zahtjevima. Ako se primjenjuje Uredba (EZ) br. 1272/2008, granične koncentracije za plinove, pare i aerosole iznose redom 20 000 ppm, 20 mg/l i 5 mg/l (ili maksimalna koncentracija koja se može postići) (3). Tehnički može biti zahtjevno proizvesti granične koncentracije nekih ispitivanih kemikalija, posebno para i aerosola. U slučaju ispitivanja aerosola cilj treba biti postizanje veličine čestica koja se može udisati (npr. MMAD 1 - 4 μm) na graničnoj koncentraciji od 2 mg/l. To je moguće s većinom ispitivanih kemikalija. Ispitivanje aerosola na koncentraciji većoj od 2 mg/l treba pokušati samo ako se može postići veličina čestica koja se može udisati [vidjeti GD 39 (2)]. Uredba (EZ) br. 1272/2008 destimulira ispitivanja previše iznad granične koncentracije radi dobrobiti životinja (3). Ispitivanje previše iznad granične koncentracije treba uzeti u obzir samo ako postoji velika vjerojatnost da će rezultati takvog ispitivanja biti izravno relevantni za zaštitu ljudskog zdravlja (3), a u izvješću o ispitivanju treba navesti obrazloženje. U slučaju potencijalno eksplozivnih ispitivanih kemikalija treba voditi brigu o tome da se izbjegnu uvjeti povoljni za eksploziju. Kako bi se izbjegla nepotrebna primjena životinja, prije ispitivanja na početnoj koncentraciji treba provesti ispitivanje bez životinja kako bi se osiguralo da se u komori mogu postići uvjeti za tu koncentraciju.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Ako se na početnoj koncentraciji opazi ugibanje ili krajnja iscrpljenost, rezultati na toj koncentraciji mogu poslužiti kao početak za daljnje ispitivanje na drugim koncentracijama (vidjeti glavno istraživanje). Ako fizikalna ili kemijska svojstva onemogućuju postizanje granične koncentracije, treba ispitati maksimalnu koncentraciju koja se može postići. Ako se na maksimalnoj koncentraciji koja se može postići dogodi smrtonosno djelovanje manje od 50 %, nije potrebno daljnje ispitivanje. Ako se granična koncentracija ne može postići, izvješće o istraživanju mora pružiti objašnjenje i podatke koji to potkrjepljuju. Ako maksimalna koncentracija pare koja se može postići ne izazove toksičnost, može biti potrebno proizvesti ispitivanu kemikaliju kao tekući aerosol.
                           
                        
                     Glavno istraživanje: Protokol C × t
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Početna koncentracija (sesija izlaganja I.) (Dodatak 1.) ispitana u glavnom istraživanju bit će granična koncentracija ili koncentraciju koju je odabrao voditelj istraživanja na temelju preliminarnog istraživanja. Ako se tijekom sesije izlaganja I. ili nakon nje opazi smrtnost, minimalno izlaganje (C × t) koje izaziva smrtnost uzet će se kao smjernica za određivanje koncentracije i razdoblja izlaganja za sesiju izlaganja II. Svaka sljedeća sesija izlaganja ovisit će o prethodnoj sesiji (vidjeti Dodatak 1.).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Za mnoge ispitivane kemikalije rezultati dobiveni na početnoj koncentraciji zajedno s tri dodatne sesije izlaganja s manjim vremenskim rasterom (npr. geometrijski razmaci razdoblja izlaganja kao što je navedeno faktorom između uzastopnih razdoblja, načelno √2) bit će dovoljni za određivanje odnosa smrtnosti C × t (15), ali može biti korisno primijeniti 5. koncentraciju izlaganja [vidjeti Dodatak 1. i GD 39 (2)]. Za matematičku obradu rezultata za protokol C × t vidjeti Dodatak 1.
                           
                        OPAŽANJA
                  
                              41.
                           
                           
                              Životinje treba često klinički promatrati tijekom razdoblja izlaganja. Nakon izlaganje klinička promatranja treba obavljati najmanje dvaput na dan izlaganja ili češće ako to zahtijeva reakcija životinja na tretman te najmanje jedanput dnevno u sljedećih 14 dana. Duljina razdoblja promatranja nije fiksno određena, ali treba je odrediti u skladu s prirodom i vremenom nastupanja kliničkih znakova i duljinom razdoblja oporavka. Važni su trenuci u kojima se pojavljuju i nestaju znakovi toksičnosti, posebno ako postoji tendencija ka kašnjenju znakova toksičnosti. Sva se opažanja sustavno bilježe u pojedinačnoj evidenciji za svaku životinju. Životinje u stanju ugibanja te životinje koje pokazuju znakove jake patnje i/ili trajne znakove ozbiljnog stresa treba humano usmrtiti radi njihove dobrobiti. Pri provođenju ispitivanja radi otkrivanja kliničkih znakova toksičnosti treba paziti na to da se početno slabo pojavljivanje i prolazne promjene u disanju, koje su rezultat postupka izlaganja, ne zamijene s toksičnošću povezanom s ispitivanom kemikalijom, što bi izazvalo prijevremeno usmrćivanje životinja. U obzir treba uzeti načela i kriterije sažete u Smjernici o humanom usmrćivanju (GD 19) (7). Ako se životinje usmrte zbog humanih razloga ili ih se pronađe uginule, vrijeme ugibanja treba zabilježiti što je moguće preciznije.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Promatranja u kavezu moraju obuhvaćati promjene na koži i krznu, očima i sluznicama te dišnom, cirkulacijskom, autonomnom i središnjem živčanom sustavu te somatomotoričkoj aktivnosti i uzorcima ponašanja. Ako je moguće, treba zamijetiti razliku između lokalnih i sistemskih učinaka. Treba obratiti pozornost na opažanje tremora, konvulzija, salivacije, dijareje, letargije, spavanja i kome. Mjerenje rektalne temperature može pružiti dodatne dokaze o refleksnoj bradipneji ili hipo/hipertermiji povezanima s tretmanom ili držanjem u zatvorenom.
                           
                        
                     Tjelesna masa
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Pojedinačnu tjelesnu masu životinja treba zabilježiti jedanput tijekom razdoblja aklimatizacije, na dan izlaganja prije samog izlaganja (0. dana), barem 1., 3. i 7. dana (i jedanput tjedno nakon toga) te u trenutku ugibanja ili usmrćenja ako nastupe iza 1. dana. Tjelesna masa prepoznaje se kao kritični pokazatelj toksičnosti pa treba pobliže pratiti životinje kod kojih je primijećen neprekidan pad od ≥ 20 % u usporedbi s vrijednostima prije istraživanja. Životinje koje prežive važu se i humano usmrćuju na kraju razdoblja nakon izlaganja.
                           
                        
                     Patologija
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Sve pokusne životinje, uključujući i one koje su tijekom ispitivanja uginule ili usmrćene i uklonjene iz istraživanja radi svoje dobrobiti, treba podvrgnuti makroskopskoj obdukciji. Ako se obdukcija ne može provesti neposredno nakon otkrića uginule životinje, životinju treba ohladiti (ne zamrznuti) na dovoljno niskim temperaturama kako bi se razgradnja svela na minimum. Obdukciju treba provesti što je moguće prije, obično u roku od jednog ili dva dana. Za svaku životinju treba zabilježiti sve makroskopske patološke promjene uz poseban naglasak na promjenama u respiratornom traktu.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Dodatne pretrage, a priori obuhvaćene planom ispitivanja, mogu se uzeti u obzir radi proširenja interpretacijske vrijednosti istraživanja, poput mjerenja mase pluća preživjelih štakora i/ili pružanja dokaza o iritaciji pomoću mikroskopske pretrage respiratornog trakta. Ispitani organi također mogu obuhvaćati organe koji pružaju dokaze o makroskopskoj patologiji kod životinja koje su preživjele 24 sata ili dulje te organa za koje se zna ili očekuje da su pogođeni. Mikroskopska pretraga cijelog respiratornog trakta može pružiti korisne informacije za ispitivane kemikalije koje reagiraju s vodom, poput kiselina i higroskopskih ispitivanih kemikalija.
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Podaci
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Treba pribaviti pojedinačne podatke o tjelesnoj masi i nalazima obdukcije za svaku životinju. Podatke prikupljene kliničkim promatranjem treba sažeti u obliku tablice, koja za svaku ispitnu skupinu pokazuje broj upotrijebljenih životinja, broj životinja koje pokazuju specifične znakove toksičnosti, broj životinja koje su tijekom ispitivanja pronađene uginule ili su usmrćene iz humanih razloga, vrijeme uginuća svake životinje, opis i vremenski tijek te reverzibilnost toksičnih učinaka i nalaze obdukcije.
                           
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Izvješće o ispitivanju treba, ako je primjereno, sadržavati sljedeće informacije:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusne životinje i njihov uzgoj
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Opis uvjeta u kavezu, uključujući: broj (ili promjenu broja) životinja u svakom kavezu, materijal podloge, temperaturu i relativnu vlažnost zraka u kavezu, razdoblje svjetla i tame, identifikaciju prehrane,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korištenu vrstu/soj i obrazloženje za uporabu druge vrste osim štakora,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj, dob i spol životinja,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metodu nasumičnog odabira,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalje o kvaliteti hrane i vode (uključujući i vrstu/podrijetlo prehrane, izvor vode),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis kondicioniranja prije ispitivanja, uključujući i prehranu, karantenu i liječenje bolesti,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana kemikalija
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Fizikalna narav, čistoća te, ako je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva (uključujući i izomerizaciju),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Identifikacijski podaci i broj registracije Chemical Abstract Services (CAS), ako je poznat,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosač
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Obrazloženje za uporabu nosača i obrazloženje za odabir nosača (ako nije voda),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Povijesni ili odgovarajući podaci koji pokazuju da nosač ne ometa rezultate istraživanja,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Komora za inhalaciju
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Opis komore za inhalaciju, uključujući i dimenzije i volumen,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Podrijetlo i opis opreme korištene za izlaganje životinja te stvaranje atmosfere,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Oprema za mjerenje temperature, vlažnosti, veličine čestica te stvarne koncentracije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Izvor zraka i obrada dovoda/odvoda zraka i sustav korišten za kondicioniranje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Metode korištene za kalibriranje opreme radi osiguravanja homogene atmosfere za ispitivanje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Razlika u tlaku (pozitivna ili negativna),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Otvori za izlaganje po komori (samo nos), lokacija životinja u sustavu (čitavo tijelo),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Privremena homogenost/stabilnost atmosfere za ispitivanje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Lokacija senzora temperature i vlažnosti te uzorkovanje ispitne atmosfere u komori,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Brzine protoka zraka, otvor za brzinu protoka zraka po izlaganju (samo nos) ili dovod životinja po komori (čitavo tijelo),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Informacije o opremi upotrijebljenoj za mjerenje kisika i ugljikova dioksida, ako je primjenjivo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Vrijeme potrebno za postizanje uravnoteženja u komori za inhalaciju (t95)
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Broj promjena u volumenu po satu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uređaji za mjerenje (ako je primjenjivo),
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podaci o izlaganju
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Argumentacija za odabir ciljane koncentracije u glavnom istraživanju,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nazivne koncentracije (ukupna masa ispitivane kemikalije proizvedena u komori za inhalaciju podijeljena s volumenom zraka koji je prošao kroz komoru),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Stvarne koncentracije ispitivane kemikalije iz zone udisanja životinja; za smjese koje stvaraju heterogene fizikalne oblike (plinove, pare, aerosol) svaka se može analizirati odvojeno,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Sve koncentracije zraka moraju se prikazati u jedinicama mase (npr. mg/l, mg/m3 itd.); i jedinice volumena (npr. ppm, ppb itd.) također se mogu usput prikazati,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Distribucija veličine čestica, srednji aerodinamički promjer čestica (MMAD) te geometrijska standardna devijacija (σg), uključujući i metode za njihov izračun. Treba prijaviti pojedinačne analize veličine čestica,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Detalji o pripremi ispitivane kemikalije, uključujući i detalje o svim postupcima korištenima za smanjenje veličine čestica krutih tvari ili za pripremu otopina ispitivane kemikalije. U slučajevima u kojima su mehanički postupci mogli izmijeniti sastav ispitivane kemikalije uključiti rezultat analiza za utvrđivanje sastava ispitivane tvari,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Opis (po mogućnosti uz dijagram) opreme korištene za stvaranje atmosfere za ispitivanje te izlaganje životinja atmosferi za ispitivanje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Detalji korištene kemijske analitičke metode i potvrda metode (uključujući učinkovitost rekuperacije ispitivane kemikalije iz medija za uzorkovanje),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Argumentacija za odabir ispitnih koncentracija,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz temperature, vlažnosti zraka i protoka zraka u komori,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz podataka o nazivnoj i stvarnoj koncentraciji u komori,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz podataka o veličini čestica, uključujući i podatke o skupljenim analitičkim uzorcima, distribuciju veličina čestica te izračune MMAD i σg,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz podataka o reakciji i razini koncentracije za svaku životinju (npr. životinje koje pokazuju znakove toksičnosti, uključujući smrtnost, prirodu, ozbiljnost, vrijeme nastupanja i trajanja učinaka),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Individualne tjelesne mase životinja prikupljene tijekom istraživanja; datum i vrijeme uginuća ako je nastupilo prije planiranog usmrćenja, vremenski tijek nastupanja znakova toksičnosti te jesu li bili reverzibilni za svaku životinju,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nalazi obdukcije i histopatološki nalazi za svaku životinju ako su dostupni,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Procjena smrtonosnog djelovanja (npr. LC50, LD01), uključujući i granice pouzdanosti od 95 % te nagib (ako je dobiven metodom vrednovanja),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Statistički odnos, uključujući i procjenu eksponenta n (protokol C × t). Treba navesti naziv korištenog statističkog softvera,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rasprava i tumačenje rezultata
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Poseban naglasak treba staviti na opis metoda korištenih za ispunjavanje kriterija ove ispitne metode, npr. graničnu koncentraciju ili veličinu čestica,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Treba se pozabaviti sposobnošću udisanja čestica u svjetlu općih nalaza, posebno ako se nisu mogli ispuniti kriteriji za veličinu čestica,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      U slučaju humanog usmrćenja životinja koje su patile ili pokazivale znakove teškog ili trajnog stresa treba dati objašnjenje na temelju kriterija Smjernice za humano usmrćivanje OECD-a (8),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Ako je ispitivanje s poglavljem B.52 ovog Priloga (4) prekinuto u korist ove ispitne metode B.2, treba pružiti obrazloženje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      U opću ocjenu istraživanja treba uključiti dosljednost metoda korištenih za određivanje nazivnih i stvarnih koncentracija te odnos stvarne koncentracije prema nazivnoj,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Treba se pozabaviti uzrokom smrti i prevladavajućim načinom djelovanja (sistemski u odnosu na lokalni).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (2009.). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Uredba (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vijeća od 16. prosinca 2008. o razvrstavanju, označavanju i pakiranju tvari i smjesa, kojom se izmjenjuju i dopunju te ukidaju Direktiva 67/548/EEZ i 1999/45/EZ te izmjenjuje i dopunjuje Uredba (EZ) br. 1907/2006, SL L 353, 31.12.2008., str. 1.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Poglavlje B.52 ovog Priloga, Akutna inhalacijska toksičnost - Metoda ATC (Acute Toxic Class).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Poglavlje B.40 ovog Priloga, Nagrizanje kože in vitro: test transkutanog električnog otpora (TER).
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Poglavlje B.40 bis ovog Priloga, Nagrizanje kože in vitro: test na modelu ljudske kože.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2000.). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              OECD (2009.). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.
                           
                        DEFINICIJA
                  Ispitivana kemikalija: Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne metode.
                  
                     Dodatak 1.
                     
                        Protokol C x t
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Istraživanje koncentracija × vrijeme (C × t) korak po korak može se smatrati alternativom tradicionalnom protokolu za određivanje inhalacijske toksičnosti (12) (13) (14). Treba mu dati prednost ako postoji specifična regulatorna ili znanstvena potreba za ispitivanjem životinja kroz više razdoblja, kao i za planiranje reakcije u slučaju nužde ili planiranje iskorištenja površina. Taj pristup obično počinje s ispitivanjem na graničnoj koncentraciji (sesija izlaganja I.), u kojem se životinje izlažu ispitivanoj kemikaliji pet puta (npr. 15, 30, 60, 120 i 240 minuta) tako da se tijekom jedne sesije izlaganja postigne više izlaganja (vidjeti sliku 1.). Ako se primjenjuje Uredba (EZ) br. 1272/2008, granične koncentracije za plinove, pare i aerosol iznose redom 20 000 ppm, 20 mg/l i 5 mg/l. Te razine smiju se prekoračiti samo u slučaju regulatorne ili znanstvene potrebe za ispitivanjem na tim razinama (vidjeti stavak 37. u glavnom tekstu B.2).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 U situacijama u kojima ima malo informacija o toksičnosti ispitivane kemikalije ili ih uopće nema treba provesti preliminarno istraživanje u kojemu se skupine od najviše 3 životinje svakog spola izlažu ciljanim koncentracijama koje odabire voditelj istraživanja, općenito na 240 minuta.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Ako se tijekom sesije izlaganja I. ispituje granična koncentracija i ako se uoči smrtnost manja od 50 %, nije potrebno dodatno ispitivanje. Ako postoji regulatorna ili znanstvena potreba za određivanjem odnosa koncentracije, vremena, reakcije na višim razinama nego što pokazuje granična koncentracija, sljedeće izlaganje treba provesti na višoj razini jednakoj dvostrukoj graničnoj koncentraciji (npr. 2L na slici 1.).
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Ako se na graničnoj koncentraciji uoči toksičnost, potrebno je dodatno ispitivanje (glavno istraživanje). Ta dodatna izlaganja mogu se provesti na nižim koncentracijama (na slici 1.: sesije izlaganja II., III. ili IV.’) ili na višim koncentracijama uz kraće trajanje (na slici 1.: sesija izlaganja IV.) uz prilagođena i ne toliko razmaknuta trajanja.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Ispitivanje (početna koncentracija i dodatne koncentracije) provodi se uporabom jedne životinje svakog spola po koncentraciji i vremenskoj točki ili s dvije životinje osjetljivijeg spola po koncentraciji i vremenskoj točki. U određenim okolnostima voditelj istraživanja može odabrati primjenu dva štakora svakog spola po koncentraciji i vremenskoj točki (ili četiri životinje osjetljivijeg spola po koncentraciji i vremenskoj točki) (15). Uporabom dviju životinja po spolu po koncentraciji i vremenskoj točki može se općenito smanjiti pristranost i varijabilnost procjena, povećati stopa uspješnosti procjene te poboljšati obuhvaćenost intervalom pouzdanosti u odnosu na ovdje opisani protokol. Ostali detalji nalaze se u GD 39 (2).
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 U idealnom slučaju svaka sesija izlaganja provodi se jedan dan. Time se pruža mogućnost odgode sljedećeg izlaganja do opravdane mogućnosti preživljavanja, a voditelju istraživanja omogućuje se prilagođavanje ciljane koncentracije i trajanja sljedećoj sesiji izlaganja. Preporučuje se da se svaka sesija izlaganja započne sa skupinom koja će se najdulje izlagati, npr. skupinom koja će biti izložena 240 minuta, a zatim skupinom koja će biti izložena 120 minuta i tako dalje. Ako, primjerice, životinje u skupini izloženoj 240 minuta ugibaju nakon 90 minuta ili pokazuju jake znakove toksičnosti (npr. ekstremne promjene u uzorcima disanja poput otežana disanja), nema smisla izlagati skupinu do 120 minuta jer će smrtnost vjerojatno iznositi 100 %. Stoga voditelj istraživanja treba odabrati kraća izlaganja za tu koncentraciju (npr. 90, 65, 45, 33 i 25 minuta).
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Koncentraciju u komori treba često mjeriti kako bi se odredio prosjek koncentracije u ovisnosti o vremenu za svako trajanje izlaganja. Kad god je to moguće, u statističkoj analizi treba upotrijebiti vrijeme ugibanja svake životinje (radije nego trajanje izlaganja).
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Treba ispitati rezultate prvih četiriju sesija izlaganja kako bi se identificirale praznine u podacima u krivulji koncentracija-vrijeme (vidjeti sliku 1.). U slučaju nedovoljne prikladnosti može se provesti dodatno izlaganje (5. koncentracija). Koncentraciju i trajanje izlaganja za 5. izlaganje treba odabrati kako bi se pokrila ta praznina.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Sve sesije izlaganja (uključujući prvu sesiju izlaganja) upotrijebit će se za izračun odnosa koncentracije, vremena i reakcije primjenom statističke analize (16). Ako je moguće, za svaki interval C × t treba upotrijebiti prosječnu koncentraciju ponderiranu vremenom i trajanje izlaganja do uginuća (ako isto nastupi tijekom izlaganja).
                                 
                                    Slika 1.
                                 
                                 
                                    Hipotetska ilustracija odnosa koncentracija-vrijeme-smrtnost kod štakora
                                 
                                 
                                    
                                 Otvoreni simboli = preživjeli; zatvoreni simboli = uginule životinje
                                 Trokuti = ženke; krugovi = mužjaci
                                 Puna linija = vrijednosti LC50 (interval 7,5 - 240 min) za mužjake s n = 1
                                 Isprekidana linija = vrijednosti LC50 (interval 7,5 - 240 min) za ženke s n = 1
                                 Istočkana linija = hipotetske vrijednosti LC50 za mužjake i ženke ako je n jednak 2 (12).
                                 Pojmovnik
                                 Koncentracija:
                                 Vrijeme izlaganja:
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 U nastavku slijedi primjer postupka korak po korak:
                                 
                                    Sesija izlaganja I. –   ispitivanje na graničnoj koncentraciji (vidjeti sliku 1.)
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jedna životinja po spolu po koncentraciji u vremenskoj točki; ukupno deset životinja (2)
                                             
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Ciljana koncentracija (3) = granična koncentracija.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Izlaganje pet skupina životinja na toj ciljanoj koncentraciji na vrijeme od redom 15, 30, 60, 120 i 240 minuta.
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Sesija izlaganja II.
                                     (4)
                                    –   glavno istraživanje
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jedna životinja po spolu po koncentraciji u vremenskoj točki; ukupno deset životinja.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Izlaganje pet skupina životinja na nižoj koncentraciji (5) (1/2L) uz nešto dulje trajanje izlaganja (faktor razmaka √2; vidjeti sliku 1.).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Sesija izlaganja III. –   glavno istraživanje
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jedna životinja po spolu po koncentraciji u vremenskoj točki; ukupno deset životinja.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Izlaganje pet skupina životinja na nižoj koncentraciji (5) (1/4L) uz nešto dulje trajanje izlaganja (faktor razmaka √2; vidjeti sliku 1.).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Sesija izlaganja IV.′ –   glavno istraživanje
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jedna životinja po spolu po koncentraciji u vremenskoj točki; ukupno deset životinja.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Izlaganje pet skupina životinja na nižoj koncentraciji (5) (1/8L) uz nešto dulje trajanje izlaganja (faktor razmaka √2; vidjeti sliku 1.).
                                          
                                       
                                    ↓ ili
                                 
                                 
                                    Sesija izlaganja IV. –   glavno istraživanje
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jedna životinja po spolu po koncentraciji u vremenskoj točki; ukupno deset životinja.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Izlaganje pet skupina životinja na višoj koncentraciji (6) (2L) uz nešto kraće trajanje izlaganja (faktor razmaka √2; vidjeti sliku 1.).
                                          
                                       
                           
                        Matematička obrada rezultata za protokol C × t
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Postupak C × t s 4 ili 5 koncentracija izlaganja i pet trajanja prikazat će 20 odnosno 25 podatkovnih točaka. S podatkovnim točkama može se izračunati odnos C × t uz primjenu statističke analize (16):
                                 
                                    Jednadžba 1
                                 
                                 
                                    
                                 gdje je C = koncentracija; t = trajanje izlaganja ili
                                 
                                    Jednadžba 2
                                 
                                 
                                    
                                 gdje je 
                                 Primjenom jednadžbe 1 može se izračunati vrijednost LC50 za zadano razdoblje (npr. 4 sata, 1 sat, 30 minuta ili bilo koje razdoblje unutar ispitivanih razdoblja) uz primjenu P = 5 (reakcija 50 %). Obratite pozornost da se Haberovo pravilo može primijeniti samo ako je n = 1. LC01 može se izračunati primjenom P = 2.67.
                              
                           ”
            
                  4.
               
               
                  Ovime se Poglavlja B.7 i B.8 mijenjaju i glase:
                  „B.7.   28-DNEVNO ISPITIVANJE ORALNE TOKSIČNOSTI NA GLODAVACIMA UZ PRIMJENU PONAVLJANIH DOZA
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a 407 (2008.). Originalna Smjernica za ispitivanje 407 usvojena je 1981. 1995. usvojena je revidirana verzija kako bi se od životinja upotrijebljenih u ispitivanju dobile dodatne informacije, posebno o neurotoksičnosti i imunotoksičnosti.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              1998. godine OECD je započeo djelovanje visokog prioriteta radi revizije postojećih Smjernica za ispitivanje te radi razvoja novih Smjernica za preventivno ispitivanje i ispitivanje potencijalnih endokrinih ometača (8). Jedan od elemenata aktivnosti bilo je ažuriranje postojeće smjernice OECD za ‚28-dnevno ispitivanje oralne toksičnosti na glodavacima uz primjenu ponavljanih doza’ (TG 407) parametrima prikladnim za otkrivanje endokrine aktivnosti ispitivanih kemikalija. Taj je postupak bio podvrgnut opsežnom međunarodnom programu za ispitivanje relevantnosti i provedivosti dodatnih parametara, održavanja tih parametara za kemikalije s (anti)estrogenom, (anti)androgenom i (anti)tiroidnom aktivnošću, intra- i interlaboratorijske mjerne obnovljivosti te utjecanja novih parametara na parametre koje zahtijeva prethodna smjernica TG 407. Velika količina podataka dobivenih na taj način prikupljena je i detaljno ocijenjena u opsežnom izvješću OECD-a (9). Ova ažurirana ispitna metoda B.7 (kao ekvivalent TG 407) rezultat je iskustva i rezultata dobivenih tijekom međunarodnog programa ispitivanja. Ova ispitna metoda omogućuje stavljanje određenih neizravnih endokrinih učinaka u kontekst s drugim toksikološkim učincima.
                           
                        POČETNA RAZMATRANJA I OGRANIČENJA
                  
                              3.
                           
                           
                              Pri određivanju i ocjenjivanju toksičnih svojstava kemikalije određivanje oralne toksičnosti uz primjenu ponavljanih doza može se provesti nakon dobivanja početnih informacija o toksičnosti iz ispitivanja akutne toksičnosti. Ova ispitna metoda namijenjena je istraživanju učinaka na vrlo širok spektar potencijalnih meta toksičnosti. Pruža informacije o mogućnim rizicima po zdravlje za koje je vjerojatno da će nastati iz ponovljenog izlaganja tijekom relativno ograničenog vremenskog razdoblja, uključujući i učinke na živčani, imunološki i endokrini sustav. Što se tiče tih konkretnih konačnih učinaka, treba identificirati kemikalije s neurotoksičnim potencijalom koji može opravdati daljnja dublja istraživanja tog aspekta i kemikalija koje ometaju fiziologiju štitnjače. Također može pružiti podatke o kemikalijama koje pogađaju muške i/ili ženske reproduktivne organe u mladih odraslih životinja te može pružiti upozorenje na imunološke učinke.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Rezultate ove ispitne metode B.7 treba upotrijebiti za identifikaciju opasnosti i procjenu rizika. Rezultate dobivene parametrima povezanima s endokrinim sustavom treba promatrati u kontekstu ‚OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals’ (11). Ta metoda obuhvaća osnovno istraživanje toksičnosti s ponavljanim dozama koje se može upotrijebiti za kemikalije za koje nije opravdano 90-dnevno ispitivanje (npr. ako proizvedena količina ne prelazi određene granice) ili kao preliminarno ispitivanje za neko dugotrajno ispitivanje. Izlaganje mora trajati 28 dana.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Provedeni međunarodni program za potvrdu parametara prikladnih za potencijalno otkrivanje endokrine aktivnosti ispitivane kemikalije pokazao je da će kvaliteta podataka dobivenih ovom ispitnom metodom B.7 uvelike ovisiti o iskustvu ispitnog laboratorija. To se posebno dovodi u vezu s histopatološkim određivanjem cikličkih promjena u ženskim reproduktivnim organima te s određivanjem mase malih organa koji ovise o hormonima koji se teško seciraju. Razvijena je smjernica za histopatologiju (19). Ona je dostupna na OECD-ovoj javnoj stranici o Smjernicama za ispitivanje. Namijenjena je kao pomoć patolozima u njihovim pregledima i kao pomoć pri povećanju osjetljivosti analize. Pokazalo se da je čitav niz parametara indikativan za toksičnost povezanu s endokrinim sustavom te su oni uključeni u ovu ispitnu metodu. Parametri za koje nije bilo dovoljno dostupnih podataka koji bi dokazali korisnost ili koji su pružili samo slabe dokaze u programu potvrde njihove sposobnosti u pomaganju pri određivanju endokrinih ometača predloženi su kao opcijski konačni učinci (vidjeti Dodatak 2.).
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Na temelju podataka dobivenih postupkom potvrde treba naglasiti da osjetljivost ove analize nije dovoljna za identifikaciju svih tvari s (anti)androgenim ili (anti)estrogenim načinima djelovanja (9). Ova ispitna metoda ne provodi se u životnom razdoblju koje je najosjetljivije na endokrine poremećaje. Unatoč tomu ova je ispitna metoda tijekom postupka potvrde identificirala tvari koje slabo i snažno utječu na funkciju štitnjače te tvari snažne i umjerene endokrinološke aktivnosti, koje djeluju kroz estrogenske ili androgenske receptore, ali u većini slučajeva nije uspjela identificirati endokrinološki aktivne tvari koje slabo utječu na estrogenske ili androgenske receptore. Stoga se ne može opisati kao preventivna analiza za endokrinološku aktivnost.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Dakle, nedostatak učinaka povezanih s tim načinima djelovanja ne može se uzeti kao dokaz za nedostatak učinaka na endokrini sustav. Što se tiče neizravnih endokrinih učinaka, karakterizacija tvari se stoga ne treba temeljiti samo na rezultatima ove ispitne metode, nego je treba upotrijebiti u pristupu težine dokaza uz primjenu svih postojećih podataka o kemikaliji radi karakterizacije potencijalne endokrinološke aktivnosti. Stoga, regulatorna odluka o endokrinološkoj aktivnosti (karakterizacija tvari) mora biti utemeljena na širokom pristupu, a ne samo na rezultatima primjene ove ispitne metode.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Potvrđeno je da će svi postupci utemeljeni na životinjama potvrditi lokalne standarde brige o životinjama; opisi brige i tretmana navedeni u nastavku jesu minimalni standardi postupanja i zamijenit će ih lokalna regulativa u slučajevima gdje je stroža. Ostale smjernice za humano tretiranje životinja dao je OECD (14).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Korištene definicije nalaze se u Dodatku 1.
                           
                        NAČELO ISPITIVANJA
                  
                              10.
                           
                           
                              Ispitivana se kemikalija 28 dana svakodnevno oralno primjenjuje u stupnjevanim dozama za nekoliko skupina pokusnih životinja, po jedna visina doze na svaku skupinu. Tijekom razdoblja primjene životinje se svakodnevno pažljivo promatraju radi uočavanja simptoma toksičnosti. Na životinjama koje uginu ili budu usmrćene tijekom ispitivanja obavlja se obdukcija, s tim da se po završetku ispitivanja preživjele životinje usmrćuju i također obduciraju. 28-dnevno ispitivanje pruža informacije o učincima ponovljenog oralnog izlaganja i može ukazati na potrebu za daljnjim dugotrajnim ispitivanjima. Također, može pružiti informacije o odabiru koncentracija za dugotrajna ispitivanja. Podaci dobiveni primjenom ove ispitne metode moraju omogućiti karakterizaciju toksičnosti ispitivane kemikalije, ukazivanje na odnos doze i reakcije te određivanje vrijednosti visine doze bez vidljivih štetnih učinaka (NOAEL, No Observed Adverse Effect Level).
                           
                        OPIS METODE
                  
                     Odabir životinjske vrste
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Najčešće korištena životinjska vrsta je štakor iako se mogu koristiti i neke druge vrste glodavaca. Ako se parametri navedeni u ovoj ispitnoj metodi B.7 istražuju na drugoj vrsti glodavaca, treba pružiti detaljno obrazloženje. Iako je biološki logično da druge vrste moraju na sličan način kao i štakor reagirati na toksične tvari, primjena manjih vrsta može rezultirati povećanom raznolikošću zbog tehničkih izazova pri seciranju manjih organa. U programu međunarodne potvrde za određivanje endokrinih ometača primjenjivali su se samo štakori. Treba upotrijebiti mlade zdrave odrasle životinje sojeva koji su uobičajeni u laboratorijskoj praksi. Odabiru se ženke koje prethodno nisu imale leglo i koje nisu gravidne. S doziranjem treba početi što je prije moguće nakon odbijanja mladunaca od sise, a u svakom slučaju prije nego što životinje navrše devet tjedana. Na početku ispitivanja razlike u tjelesnoj masi korištenih životinja smiju biti minimalne i ne premašivati ± 20 % prosječne tjelesne mase svakog spola. Kada se ponovljena oralna doza upotrebljava kao preliminarna u odnosu na dugotrajno istraživanje, prednost se daje primjeni životinja istog soja i istog podrijetla u oba istraživanja.
                           
                        
                     Smještaj i hranjenje
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Svi postupci trebaju biti usklađeni s lokalnim standardima brige o životinjama u laboratoriju. Temperatura u prostoriji s pokusnim životinjama trebala bi iznositi 22 °C (± 3 °C). Premda bi relativna vlažnost zraka trebala iznositi najmanje 30 % te po mogućnosti ne premašivati 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50 - 60 %. Rasvjeta treba biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može primjenjivati konvencionalna laboratorijska prehrana uz neograničene količine pitke vode. Na odabir prehrane može utjecati potreba za osiguranjem prikladne primjese ispitivane kemikalije ako se ista primjenjuje tom metodom. Životinje trebaju biti smještene u malim skupinama istoga spola; životinje se mogu smjestiti i pojedinačno ako je to znanstveno opravdano. U slučaju skupnog smještaja, u jednom kavezu ne smije biti smješteno više od pet životinja.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Hranu treba redovito analizirati radi kontaminirajućih tvari. Uzorak prehrane treba zadržati do kraja izrade izvješća.
                           
                        
                     Priprema životinja
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Zdrave, mlade odrasle životinje nasumično se raspoređuju u kontrolne skupine i skupine koje će se tretirati. Kaveze treba rasporediti na način da se učinci do kojih bi moglo doći zbog položaja kaveza svedu na minimum. Životinje se identificiraju na jedinstven način i drže u kavezima najmanje pet dana prije početka istraživanja kako bi im se omogućila aklimatizacija na laboratorijske uvjete.
                           
                        
                     Priprema doza
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Ispitivana se kemikalija primjenjuje oralnom intubacijom pomoću želučane sonde, odnosno preko hrane ili vode za piće. Metoda oralne primjene ovisi o svrsi studije i fizikalnim/kemijskim/toksikokinetičkim svojstvima ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Prema potrebi, ispitivana se kemikalija otapa ili suspendira u odgovarajućem nosaču. Kad god je moguće, preporuča se najprije razmotriti mogućnost primjene vodene otopine/suspenzije, zatim mogućnost primjene otopine/suspenzije u ulju (npr. kukuruzno ulje), i tek na kaju mogućnost otapanja u ostalim nosačima. Za sve nosače, osim vode, moraju biti poznata toksična svojstva nosača. Treba odrediti stabilnost ispitivane kemikalije u nosaču.
                           
                        POSTUPAK
                  
                     Broj i spol životinja
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Najmanje deset životinja (pet ženki i pet mužjaka) treba upotrijebiti za ispitivanje svake visine doze. Ako se planira usmrćivanje životinja u međuvremenu, prije završetka studije navedeni broj treba povećati za broj životinja predviđen za takvo usmrćivanje. Treba razmotriti i mogućnost uključivanja i dodatne satelitske skupine od deset životinja (pet od svakoga spola) u kontrolnu skupinu i skupinu koja će primiti najvišu dozu radi opažanja reverzibilnosti, postojanosti ili zakašnjelog nastupa toksičnih učinaka najmanje 14 dana nakon tretiranja.
                           
                        
                     Doziranje
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Općenito gledano, treba upotrijebiti najmanje tri ispitne skupine i kontrolnu skupinu, ali ako se iz procjene drugih podataka ne očekuju učinci kod doze od 1 000 mg/kg tjelesne mase po danu, može se provesti granični test. Ako nisu dostupni prikladni podaci, može se provesti preliminarno ispitivanje za određivanje raspona (životinje istog soja i podrijetla) kako bi se pomoglo pri određivanju visina doze koje će se primjenjivati. Osim tretiranja ispitivanom kemikalijom, sa životinjama u kontrolnoj skupini treba postupati na jednak način kao i sa životinjama u ispitnoj skupini. Ako se pri primjeni ispitivane kemikalije koristi nosač, volumen nosača koji primi kontrolna skupina treba biti jednak najvećem upotrijebljenom volumenu.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Visine doza treba odabrati uzimajući u obzir sve postojeće podatke o toksičnosti i (toksiko)kinetici koji su dostupni za ispitivanu kemikaliju ili srodne kemikalije. Najvišu dozu treba odabrati s ciljem da se izazovu toksični učinci, ali ne i smrt ili velika patnja životinja. Nakon toga treba odabrati niz sve nižih doza koje će se primjenjivati za utvrđivanje svih reakcija vezanih uz doziranje, kao i dozu kod koje nema vidljivih štetnih učinaka (NOAEL) kao najnižu dozu. Za određivanje sve nižih doza često su najpogodniji dvostruki do četverostruki intervali, i često je bolje dodati četvrtu pokusnu skupinu nego da između doziranja budu jako veliki intervali (npr. iznad faktora 10).
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              U slučaju prisutnosti opažene opće toksičnosti (npr. smanjene tjelesne mase, učinaka na jetri, srcu, plućima ili bubrezima itd.) ili drugih promjena koje ne moraju biti reakcija na toksičnost (npr. smanjeno uzimanje hrane, povećanje jetre), opažene učinke na imunološkim, neurološkim ili endokrinim krajnjim učincima treba tumačiti s oprezom.
                           
                        
                     Granični test
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Ako test s jednom visinom doze, koja iznosi najmanje 1 000 mg/kg tjelesne mase na dan, ili je zbog davanja hrane ili pitke vode jednaka postotku u hrani ili pitkoj vodi (na temelju određivanja tjelesne mase), uz primjenu postupaka opisanih za ovu studiju, ne izazove vidljive štetne učinke i ako se toksičnost ne očekuje na temelju podataka o strukturno srodnim tvarima, potpuna studija uz primjenu tri visine doza neće se smatrati neophodnom. Granični test ne vrijedi samo u slučajevima kad izloženost ljudi ukazuje na potrebu za primjenom više doze.
                           
                        
                     Primjena doza
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Životinjama se ispitivana kemikalija dozira svakodnevno 7 dana u tjednu u razdoblju od 28 dana. U slučaju primjene oralnom intubacijom ispitivanu kemikaliju treba dati u jednoj dozi pomoću želučane sonde ili prikladne intubacijske kanile. Maksimalni volumen tekućine koji se može primijeniti odjednom ovisi o veličini pokusne životinje. Taj volumen ne smije biti veći od 1 ml/100 g tjelesne mase, osim u slučaju vodenih otopina gdje je dopušteno upotrijebiti 2 ml/100 g tjelesne mase. Osim u slučaju nadražujućih ili nagrizajućih kemikalija kod kojih se štetni učinci obično javljaju pri višim koncentracijama, varijabilnost ispitnog volumena treba prilagođavanjem koncentracije svesti na najmanju moguću mjeru kako bi se zajamčio stalni volumen pri svim visinama doza.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Kod kemikalija koje se primjenjuju putem hrane ili vode za piće važno je osigurati da količine ispitivane kemikalije ne utječu na uravnoteženi unos hrane ili vode. Kad se ispitivana kemikalija daje u hrani, može se koristiti ili stalna koncentracija u odnosu na količinu hrane (ppm) ili stalna visina doze u odnosu na tjelesnu masu životinje; alternativa koja se koristi u pokusu mora se specificirati. U slučajevima kad se kemikalija daje oralnom intubacijom, dozu treba davati svaki dan otprilike u isto vrijeme te je po potrebi prilagođavati kako bi se održala stalna visina doze u odnosu na tjelesnu masu životinje. Kad se prije dugotrajnog ispitivanja radi preliminarna studija s ponovljenim dozama, u obje studije prehrana životinja treba biti slična.
                           
                        
                     Opažanja
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Opažanje bi trebalo trajati 28 dana. Životinje u satelitskoj skupini za koje se planira naknadno opažanje treba najmanje 14 dana držati bez tretiranja kako bi se utvrdilo jesu li toksični učinci zakašnjeli ili postojani i jesu li se životinje od njih oporavile.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Opća bi klinička opažanja trebalo obavljati barem jednom dnevno, najbolje u isto vrijeme svakog dana, uzimajući u obzir vršno razdoblje očekivanih učinaka nakon doziranja. Zdravstveno stanje životinja treba zabilježiti. Barem dvaput dnevno sve životinje treba pregledati radi otkrivanja mogućih simptoma morbiditeta i mortaliteta.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Jednom prije prvog izlaganja, te barem jednom tjedno nakon toga, treba obaviti detaljno kliničko opažanje stanja svih životinja (ovo će omogućiti utvrđivanje promjena u stanju istih subjekata). Ta opažanja treba obaviti izvan kaveza u kojem životinja inače boravi, najbolje u standardnom ograđenom prostoru i svaki put otprilike u isto vrijeme. Rezultate opažanja treba pažljivo bilježiti, pri čemu je najbolje koristiti sustav vrednovanja jasno definiran od strane laboratorija koji obavlja ispitivanje. Treba poduzeti sve što je potrebno kako bi se osiguralo da odstupanja u uvjetima ispitivanja budu minimalna te da opažanja po mogućnosti provode promatrači koji ne znaju za tretiranje. Opaženi simptomi trebaju obuhvaćati, ali ne biti ograničeni na, promjene na koži, dlaci, očima, sluznicama, pojavu sekreta i ekskreta te aktivnost autonomnog živčanog sustava (npr. lakrimacija (suzenje), piloerekcija (naježenost dlake), veličina zjenica, nepravilnosti u disanju). Treba zabilježiti i promjene u hodu, držanju i reakcijama na rukovanje, kao i prisutnost kloničkih ili toničkih pokreta, stereotipa (npr. pretjerano njegovanje krzna, ponavljano kretanje u krug) ili neobičnog ponašanja (npr. samoozljeđivanje, hodanje unatrag) (2).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              U četvrtom tjednu izlaganja treba obaviti ocjenu senzorne reaktivnosti na različite podražaje (2) (npr. zvučne, vizualne i proprioceptivne) (3)(4)(5), ocjenu jakosti stiska (6) te ocjenu motoričke aktivnosti (7). Daljnje pojedinosti o postupcima koji se mogu primjenjivati navedene su u odgovarajućoj referentnoj literaturi. Međutim, osim referentnih mogu se primjenjivati i alternativni postupci.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Funkcionalna opažanja koja se obavljaju u četvrtom tjednu izlaganja mogu se izostaviti ako se studija provodi kao preliminarno ispitvanje za naknadnu (90-dnevnu) studiju subkroničnosti. U tom slučaju funkcionalna opažanja treba uključiti u tu sljedeću studiju. S druge strane, kad postoje podaci o funkcionalnim opažanjima iz studije uz primjenu ponavljanih doza, može se povećati mogućnost odabira visina doza za naknadnu studiju subkroničnosti.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              U iznimnim slučajevima funkcionalna opažanja mogu izostati i kod skupina koje na drugi način pokazuju simptome toksičnosti do mjere koja bi znatno ometala obavljanje funkcionalnog ispitivanja.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Pri obdukciji treba uzimanjem vaginalnih razmaza (opcijski) odrediti cikluse estrusa svih ženki. Ta će opažanja pružiti informacije o stadiju ciklusa estrusa u vrijeme usmrćivanja te pomoći pri histološkoj ocjeni tkiva osjetljivih na estrogen [vidjeti smjernicu o histopatologiji (19)].
                           
                        
                     Tjelesna masa i unos hrane/vode
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Sve životinje treba vagati barem jednom tjedno. Unos hrane treba mjeriti najmanje na tjednoj osnovi. Ako se ispitivana kemikalija daje s vodom za piće, unos vode treba isto tako mjeriti najmanje na tjednoj osnovi.
                           
                        
                     Hematologija
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Na kraju razdoblja ispitivanja treba obaviti sljedeće hematološke pretrage: hematokrit, koncentracija hemoglobina, broj eritrocita, retikulocite, ukupni i diferencijalni broj leukocita, broj trombocita i mjerenje vremena/potencijala zgrušavanja krvi. Ostala određivanja koja treba provesti ako ispitivana kemikalija ili njezini navodni metaboliti imaju ili se sumnja da imaju oksidacijska svojstva obuhvaćaju koncentraciju metaemoglobina i Heinzova tjelešca.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Uzorke krvi je potrebno uzeti na specificiranom mjestu i pohraniti u odgovarajućim uvjetima neposredno prije ili u tijeku usmrćivanja životinja. Životinje trebaju postiti tijekom noći prije usmrćivanja (7).
                           
                        
                     Klinička biokemija
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Kliničke biokemijske pretrage za utvrđivanje jakog toksičnog djelovanja na tkiva i posebno na bubrege i jetru, treba obaviti na uzorcima krvi uzetim od svake životinje neposredno prije usmrćivanja ili u okviru postupka usmrćivanja životinja (osim u uvjetima za koje je utvrđeno da su na umoru i/ili su neplanirano usmrćene prije završetka studije). Pretrage koje se rade na plazmi ili serumu trebaju obuhvatiti mjerenje natrija, kalija, glukoze, ukupne količine kolesterola, ureje, kreatinina, ukupne količine proteina i albumina te više od dva enzima indikativna za hepatocelularna oštećenja (kao što su alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, alkalna fosfataza, gama glutamil transpeptidaza i glutamat dehidrogenaza) te žučne kiseline. Mjerenja dodatnih enzima (jetrenog ili drugog podrijetla) i bilirubina mogu u određenim okolnostima pružiti korisne informacije.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              U zadnjem tjednu studije neobvezno se mogu obaviti analize urina dobivenog sabiranjem u određenim vremenskim razmacima: izgled, količina, osmolalnost ili specifična težina, pH, protein, glukoza i krv/krvne stanice.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Osim toga, treba razmisliti i o ispitivanju plazmatskih ili serumskih markera koji označavaju oštećenja tkiva. Ako poznata svojstva ispitivane kemikalije mogu, ili se očekuje da će, utjecati na određene metaboličke profile, treba obaviti i druge pretrage koje uključuju kalcij, fosfor, trigliceride, specifične hormone i kolinesterazu. Te vrijednosti treba izmjeriti kod izloženosti kemikalijama određenih klasa opasnosti ili od slučaja do slučaja.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Iako u međunarodnoj procjeni krajnjih učinaka povezanih s endokrinim sustavom nije dokazana jasna prednost za određivanje hormona štitnjače (T3, T4) i TSH, može biti korisno zadržati uzorke plazme ili seruma radi mjerenja T3, T4 i TSH (opcijski) ako postoji indikacija za djelovanje na osovinu hipofiza-štitna žlijezda. Ti se uzorci mogu zamrznuti na -20° radi skladištenja. Sljedeći čimbenici mogu utjecati na varijabilnost i apsolutne koncentracije za određivanje hormona:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          vrijeme usmrćivanja zbog varijacije koncentracije hormona kroz dan
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          metoda usmrćivanja radi izbjegavanja pretjeranog stresa za životinje koji može utjecati na koncentraciju hormona
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pribor za određivanje hormona koji se može razlikovati od njihovih standardnih krivulja.
                                       
                                    Konačna identifikacija kemikalija koje djeluju na štitnjaču pouzdanija je pomoću histopatološke analize nego pomoću razine hormona.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Uzorke plazme koji su posebno namijenjeni određivanju hormona treba uzeti u usporedivo doba dana. Preporuča se da se obrati pozornost na određivanje T3, T4 i TSH potaknuto na temelju promjena u histopatologiji štitnjače. Brojčane vrijednosti dobivene analizom koncentracija hormona razlikuju se ovisno o različitom, komercijalno dostupnom priboru. Stoga se može dogoditi da nije moguće pružiti kriterije o djelovanju na temelju ujednačenih povijesnih podataka. Druga je mogućnost da laboratoriji nastoje održavati koeficijente varijacije ispod 25 za T3 i T4 te ispod 35 za TSH. Sve koncentracije treba zabilježiti u mg/ml.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Ako su povijesni polazni podaci neprikladni, u obzir valja uzeti određivanje hematoloških i kliničkih biokemijskih varijabli prije početka doziranja ili po mogućnosti na skupini životinja koje nisu uključene u pokusne skupine.
                           
                        PATOLOGIJA
                  
                     Makroskopska analiza
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Sve životinje korištene u studiji moraju se podvrgnuti kompletnoj, detaljnoj makroskopskoj analizi koja obuhvaća pažljivi pregled vanjske površine tijela, svih otvora te lubanjske, prsne i trbušne šupljine i njihovog sadržaja. S jetre, bubrega, nadbubrežnih žlijezda, testisa, epididimisa, prostate + sjemenskih mjehurića s koagulacijskim žlijezdama kao cjeline, timusa, slezene, mozga i srca svih životinja (osim onih za koje je utvrđeno da su na umoru i/ili se neplanirano usmrte prije završetka studije) treba obrezati sve okolno tkivo, prema potrebi, te ih još mokre izvagati što prije nakon sekcije kako bi se izbjeglo sušenje organa. Treba biti pažljiv pri obrezivanju kompleksa prostate da se izbjegne punkcija sjemenskih mjehurića ispunjenih tekućinom. Druga je mogućnost da se sjemenski mjehurići i prostata obrežu i izvažu nakon fiksacije.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Osim toga, još dva tkiva mogu se opcijski izvagati što prije nakon sekcije kako bi se izbjeglo njihovo sušenje: jajnici u paru (mokra težina) i maternica, uključujući i grlić maternice (upute za uklanjanje i pripremu materničnih tkiva radi vaganja dane su u OECD TG 440 (18)).
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Masa štitnjače (opcijski) može se odrediti nakon fiksacije. Obrezivanje također treba obaviti vrlo pažljivo te samo nakon fiksacije kako bi se izbjeglo oštećivanje tkiva. Oštećena tkiva mogu kompromitirati histopatološku analizu.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Sljedeća tkiva treba čuvati u sredstvu za fiksiranje koje je najprimjerenije i za tu vrstu tkiva i za planirani kasniji histopatološki pregled (vidjeti stavak 47): sve velike lezije, mozak (reprezentativne regije uključujući veliki mozak, mali mozak i medulu/most), leđnu moždinu, oko, želudac, tanko i debelo crijevo (uključujući Peyerove ploče), jetru, bubrege, nadbubdrežne žlijezde, slezenu, srce, timus, štitnjaču, dušnik i pluća (preparirane upuhivanjem fiksativa i zatim uranjanjem), spolne žlijezde (testise i jajnike), pomoćne spolne organe (maternicu i cerviks, epididimise, prostatu + sjemenske mjehuriće s koagulacijskim žlijezdama), vaginu, mokraćni mjehur, limfne čvorove [osim najbližeg drenažnog čvora treba uzeti još jedan limfni čvor na temelju laboratorijskog iskustva (15)], periferni živac (bedreni ili tibijalni) po mogućnosti smješten uz mišić, skeletni mišić i kost, s leđnom moždinom (sekcija ili alternativno svježi aspirat koštane srži). Preporuča se da se testisi fiksiraju uranjanjem u Bouinov ili izmijenjeni Davidsonov fiksativ (16) (17). Vezivnu ovojnicu treba nježno i plitko punktirati na oba pola organa iglom koja omogućuje brzu penetraciju fiksativa. Klinički i drugi nalazi mogu sugerirati potrebu za pregledom dodatnih tkiva. Treba sačuvati i sve one organe za koje se na temelju saznanja o svojstvima ispitivane kemikalije smatra da bi mogli biti ciljni.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Sljedeća tkiva mogu dati dragocjenu indikaciju za učinke na endokrini sustav: Spolne žlijezde (jajnici i testisi), pomoćni spolni organi (maternica s cerviksom, epididimisi, sjemenski mjehurići s koagulacijskim žlijezdama, dorzolateralna i ventralna prostata), vagina, hipofiza, muška mliječna žlijezda, štitnjača i nadbubrežna žlijezda. Promjene u muškim mliječnim žlijezdama nisu dovoljno dokumentirane, ali taj parametar može biti vrlo osjetljiv na tvari s estrogenskim djelovanjem. Opažanja organa/tkiva koja nisu nisu popisana u stavku 43. su opcijska (vidjeti Dodatak 2.).
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Smjernica o histopatologiji (19) pruža dodatne detaljne informacije o sekciji, fiksaciji, seciranju i histopatologiji endokrinih tkiva.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              U međunarodnom programu ispitivanja dobiveni su neki dokazi da se suptilni učinci na endokrini sustav uzrokovani kemikalijama male snage utjecaja na homeostazu spolnih hormona mogu identificirati pomoću smetnje u sinkronizaciji ciklusa estrusa u različitim tkivima, a ne toliko očitim histopatološkim promjenama na ženskim spolnim organima. Iako nije dobiven konačan dokaz za takve učinke, preporuča se da se pri tumačenju histopatologije jajnika (folikularnih, tekalnih i granuloznih stanica), maternice, cerviksa i vagine u obzir uzmu dokazi moguće asinkronije ciklusa estrusa. Ako se tako procijeni, u tu usporedbu može se također uključiti i stadij ciklusa određen vaginalnim razmazima.
                           
                        
                     Histopatologija
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Na sačuvanim organima i tkivima svih životinja u kontrolnoj skupini i skupini s visokom dozom treba provesti potpunu histopatologiju. Ta ispitivanja treba proširiti na životinje svih drugih skupina doziranja ako su u skupini s visokom dozom opažene promjene povezane s tretiranjem.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Treba pregledati sve veće lezije.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Ako se koristi satelitska skupina, treba napraviti histopatološki pregled onih tkiva i organa na kojima su kod tretiranih skupina primijećene promjene.
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Podaci
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Podatke treba prikazati pojedinačno za svaku životinju. Osim toga, najbolje ih je rezimirati u obliku tablice iz koje se za svaku testiranu skupinu vidjeti broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja koje uginule ili su iz humanih razloga usmrćene tijekom ispitivanja, vrijeme smrti ili humanog usmrćivanja, broj životinja kod kojih su opaženi znakovi toksičnosti, opis opaženih znakova toksičnosti, uključujući i vrijeme pojavljivanja, trajanje i stupanj svih toksičkih učinaka, broj životinja kod kojih su se javile lezije, vrsta lezija i postotak životinja koje pokazuju određene vrste lezija.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Tamo gdje je to moguće, brojčane rezultate treba analizirati uz primjenu odgovarajuće opće prihvatljive statističke metode. Usporedbe učinaka po rasponu visina doza trebala bi spriječiti uporabu višestrukih t-ispitivanja. Statističke metode treba odabrati još u fazi planiranja studije.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Radi kontrole kvalitete predlaže se da se skupljaju povijesni kontrolni podaci te da se izračunaju koeficijenti varijacije za brojčane podatke, posebno za parametre povezane s otkrivanjem endokrinih ometača. Ti se podaci mogu upotrijebiti za uspoređivanje kada se ocjenjuju stvarne studije.
                           
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Izvješću o ispitivanju mora sadržavati sljedeće informacije:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana kemikalija:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizikalna narav, čistoća i fizikalno-kemijska svojstva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikacijski podaci.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosač (po potrebi):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dokaz opravdanosti odabira nosača, ako se ne radi o vodi.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusne životinje:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korištena vrsta/soj,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj, starost i spol životinja,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinačne tjelesne mase životinja na početku ispitivanja.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obrazloženje odabira vrste, ako se ne radi o štakorima.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obrazloženje za odabir visina doza,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinosti o formulaciji ispitivane kemikalije/pripremanju hrane, postignuta koncentracija, stabilnost i homogenost pripravaka,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci o primjeni ispitivane kemikalije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      preračunavanje koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za piće (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne težine/dan), prema potrebi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinosti o kvaliteti hrane i vode.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Opcijski istraživani krajnji učinci
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      popis istraživanih opcijskih krajnjih učinaka.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tjelesna masa/promjene u tjelesnoj masi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      unos hrane i unos vode, po potrebi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci o toksičkim reakcijama po spolu i visini doza, uključujući znakove toksičnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vrsta, stupanj i trajanje opaženih kliničkih promjena (jesu li reverzibilne ili nisu),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      senzorska aktivnost, ocjena jakosti stiska i motorne aktivnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematološka ispitivanja s relevantnim normalnim vrijednostima,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinička biokemijska ispitivanja s relevantnim normalnim vrijednostima,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci o tjelesnoj masi nakon smrti i podaci o masi organa,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nalazi obdukcije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detaljni opis svih histopatoloških nalaza,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci o apsorpciji, ako postoje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      statistička obrada rezultata, prema potrebi.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Diskusija o rezultatima.
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zaključci.
                                          
                                       
                                    
                        
                     Dodatak 1.
                     DEFINICIJE
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Androgeni učinak je sposobnost kemikalije da djeluje kao prirodni androgeni hormon (npr. testosteron) u organizmu sisavaca.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antiandrogeni učinak je sposobnost kemikalije da potiskuje djelovanje prirodnog androgenog hormona (npr. testosterona) u organizmu sisavaca.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antiestrogeni učinak je sposobnost kemikalije da potiskuje djelovanje prirodnog estrogenog hormona (npr. estradiol 17ß) u organizmu sisavaca.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antitiroidna aktivnost jest sposobnost kemikalije da potiskuje djelovanje prirodnog hormona štitnjače (npr. T3) u organizmu sisavaca.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Doziranje je opći pojam koji obuhvaća dozu, njenu učestalost i trajanje doziranja.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Doza je količina ispitivane kemikalije koja se primjenjuje. Doza se izražava kao masa ispitivane kemikalije po jedinici tjelesne mase pokusne životinje po danu (npr. mg/kg tjelesne mase po danu) ili kao stalna koncentracija u hrani.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Evidentna toksičnost je opći naziv koji opisuje jasne znakove toksičnosti nakon primjene ispitivane kemikalije. Ti bi znakovi trebali biti dovoljni za utvrđivanje opasnosti i trebaju biti takvi da se za primjenu povišene doze može očekivati da će rezultirati razvojem ozbiljnih znakova toksičnosti i mogućom smrću.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    NOAEL je kratica za veličinu doze bez vidljivih štetnih učinaka. To je najviša doza pri kojoj se ne opažaju nikakvi štetni učinci vezani uz tretiranje.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Estrogeni učinak je sposobnost kemikalije da djeluje kao prirodni estrogeni hormon (npr. estradiol 17ß) u organizmu sisavaca.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ispitivana kemikalija: Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne metode.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tiroidna aktivnost je sposobnost kemikalije da djeluje kao prirodni hormon štitnjače (npr. T3) u organizmu sisavaca.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Validacija je znanstveni postupak s ciljem karakterizacije operativnih zahtjeva i ograničenja ispitne metode, za pokazivanje njezine pouzdanosti i relevantnosti za dotičnu svrhu.
                              
                           
                  
                     Dodatak 2.
                     
                        Krajnji učinci preporučeni za detekciju endokrinih ometača (ED-ova) u ovoj ispitnoj metodi B.7
                     
                     
                                 Obvezni krajnji učinci
                              
                              
                                 Opcijski krajnji učinci
                              
                           
                                 Masa
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             testisi
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             epididimisi
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nadbubrežne žlijezde
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             prostata + sjemenski mjehurići s koagulacijskim žlijezdama
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             jajnici
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             maternica s cerviksom
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             štitnjača
                                          
                                       
                           
                                 Histopatologija
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             spolne žlijezde:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         testisi i
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         jajnici
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pomoćni spolni organi:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         epididimisi
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         prostata + sjemenski mjehurići s koagulacijskim žlijezdama
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         maternica s cerviksom
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nadbubrežna žlijezda
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             štitnjača
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vagina
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             vaginalni razmazi
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             muške mliječne žlijezde
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             hipofiza
                                          
                                       
                           
                                 Mjerenje hormona
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             razine cirkulirajućih hormona T3, T4
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             razine cirkulirajućeg hormona TSH
                                          
                                       
                           
                  
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (Pariz, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (1998.). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              OECD (2002.). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              OECD (2006.). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              OECD (2000.). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              OECD (2007.). OECD Guideline for Testing of Chemicals N°440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              OECD (2009.). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.
                           
                        B.8.   SUBAKUTNA INHALACIJSKA TOKSIČNOST: 28-DNEVNA STUDIJA
                  
                  SAŽETAK
                  Ova revidirana ispitna metoda B.8 osmišljena je za potpunu karakterizaciju toksičnosti ispitivane kemikalije inhalacijom pomoću ponovljenog izlaganja u ograničenom vremenskom razdoblju (28 dana) te za pružanje podataka za procjenu kvantitativnog rizika od inhalacije. Skupine od najmanje pet mužjaka i pet ženki glodavaca izlažu se šest sati dnevno 28 dana a) ispitivanoj kemikaliji na tri ili više razina koncentracije, b) filtriranom zraku (negativna kontrola) i/ili c) nosaču (kontrola nosača). Životinje se općenito izlažu pet dana tjedno, ali također je dopušteno i izlaganje sedam dana tjedno. Uvijek se ispituju mužjaci i ženke, ali se oni mogu izlagati različitim razinama koncentracije ako je poznato da je jedan od spolova osjetljiviji na ispitivanu kemikaliju koja se primjenjuje. Ova metoda voditelju istraživanja omogućuje fleksibilnost uključivanja satelitskih (reverzibilnih) skupina, bronhoalveolarnog ispiranja (BAL), neuroloških ispitivanja te dodatnih kliničko-patoloških i histopatoloških procjena s ciljem bolje karakterizacije toksičnosti ispitivane kemikalije.
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a 412 (2009.). Originalna Smjernica za ispitivanje 412 (TG 412) o subakutnoj inhalaciji usvojena je 1981. (1). Ova ispitna metoda B.8 (kao ekvivalent revidiranoj TG 412) ažurirana je kako bi odrazila stanje znanosti te kako bi ispunila aktualne i buduće regulatorne potrebe.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Ova metoda omogućuje karakterizaciju štetnih učinaka nakon ponovljenog svakodnevnog inhalacijskog izlaganja ispitivanoj kemikaliji 28 dana. Podaci dobiveni 28-dnevnom studijom subakutne inhalacijske toksičnosti mogu se upotrijebiti za procjene kvantitativnog rizika [ako ne slijedi 90-dnevna studija subkronične inhalacijske toksičnosti (Poglavlje B.29 ovog Priloga)]. Podaci također mogu pružiti informacije o odabiru koncentracija za dugotrajne studije, kao što je 90-dnevna studija subkronične inhalacijske toksičnosti. Ova ispitna metoda nije specijalno namijenjena testiranju nanomaterijala. Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se na kraju ovog Poglavlja i u Smjernici 39. (2).
                           
                        UVODNA RAZMATRANJA
                  
                              3.
                           
                           
                              Laboratorij koji provodi ispitivanje mora prije provođenja studije u obzir uzeti sve raspoložive informacije o ispitivanoj kemikaliji kako bi povećao kvalitetu studije i na minimum sveo primjenu životinja. Informacije koje će pomoći u odabiru najprikladnijih ispitnih koncentracija mogu obuhvaćati identitet, kemijsku strukturu te fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije, rezultate bilo kakvih ispitivanja toksičnosti in vitro ili in vivo, očekivanu(-e) uporabu(-e) i potencijal za izlaganje ljudi, dostupne podatke o (Q)SAR i toksikološke podatke o kemikalijama srodne strukture te podatke dobivene ispitivanjem akutne inhalacijske toksičnosti. Ako se tijekom studije očekuje ili uoči neurotoksičnost, voditelj istraživanja može odlučiti da obuhvati prikladne procjene kao što su serije funkcionalnih opažanja (FOB) te mjerenje motoričke aktivnosti. Iako određivanje vremena izlaganja u svezi sa specifičnim ispitivanjima može biti ključno, obavljanje tih dodatnih aktivnosti ne bi trebalo utjecati na osnovni plan studije.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Razrijeđene nagrizajuće ili nadražujuće ispitivane kemikalije mogu se ispitivati na koncentracijama koje će proizvesti željeni stupanj toksičnosti [vidjeti GD 39 (2)]. Kada se životinje izlažu tim materijalima, ciljane koncentracije moraju biti dovoljno niske da ne bi izazvale značajnu patnju ili stres, ali biti dovoljno visoke za proširenje krivulje koncentracije i reakcije na razine koje ispunjavaju regulatorni i znanstveni cilj ispitivanja. Te koncentracije treba odabirati u svakom pojedinom slučaju, najbolje na temelju odgovarajuće isplanirane studije za utvrđivanje raspona koja pruža informacije o kritičnim krajnjim učincima, pragu nadraženosti te vremenu pojavljivanja (vidjeti stavke 11. - 13.). Treba pružiti obrazloženje za odabir koncentracija.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Životinje u stanju ugibanja ili životinje koje očito trpe bol ili pokazuju znakove ozbiljnog stresa treba humano usmrtiti. Životinje u stanju ugibanja uzimaju se u obzir jednako kao i životinje koje uginu pri ispitivanju. Kriteriji za odlučivanje o usmrćivanju životinja u stanju ugibanja ili koje teško pate te upute o prepoznavanju predvidive ili prijeteće smrti predmet su Smjernice za humano usmrćivanje br. 19 OECD-a (3).
                           
                        OPIS METODE
                  
                     Odabir životinjske vrste
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Treba upotrijebiti zdrave, mlade odrasle glodavce sojeva koji se obično koriste u laboratorijima. Prednost se daje vrsti štakora. U slučaju primjene drugih vrsta treba priložiti obrazloženje.
                           
                        
                     Priprema životinja
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Treba upotrebljavati ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne. Na dan nasumičnog odabira životinje moraju biti mlade odrasle jedinke u dobi između 7 i 9 tjedana. Tjelesna masa mora biti u rasponu ± 20 % prosječne mase svakog spola. Životinje se nasumično odabiru, označavaju radi pojedinačne identifikacije te drže u kavezima najmanje pet dana prije početka ispitivanja kako bi im se omogućila aklimatizacija na laboratorijske uvjete.
                           
                        
                     Uzgoj životinja
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Životinje treba pojedinačno identificirati, po mogućnosti potkožnim transponderima, kako bi se olakšalo opažanje i izbjegla zamjena. Temperatura prostorije u kojoj se drže pokusne životinje trebala bi iznositi 22 ± 3 °C. Relativna vlažnost zraka idealno bi se morala održavati u rasponu od 30 do 70 % iako to možda neće biti moguće kad se kao nosač primjenjuje voda. Prije i nakon izlaganja životinje općenito treba smjestiti u kaveze u skupinama po spolu i koncentraciji, ali broj životinja po kavezu ne smije ometati jasna opažanja svake životinje i tako se trebaju na minimum svesti gubici zbog kanibalizma i borbe. Ako izlaže samo nos životinja, može biti potrebno aklimatizirati životinje na cijevi koje ih sputavaju. Cijevi koje sputavaju životinje ne smiju im nametnuti pretjeran fizički, toplinski ili imobilizacijski stres. Sputavanje može utjecati na fiziološke krajnje učinke, poput tjelesne temperature (hipertermija) i/ili respiratornog minutnog volumena. Ako su dostupni generički podaci koji pokazuju da se takve promjene ne događaju u znatnom opsegu, nije potrebna prethodna prilagodba cijevima koje sputavaju. Životinje, koje su cijelim tijelom izložene aerosolu, tijekom izlaganja treba smjestiti pojedinačno kako bi se spriječilo da se ispitivani aerosol filtrira kroz krzno drugih životinja u istom kavezu. Može se upotrijebiti konvencionalna i certificirana laboratorijska prehrana, osim tijekom izlaganja, u kombinaciji s neograničenom zalihom javne pitke vode. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka.
                           
                        
                     Komore za inhalaciju
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Pri odabiru komore za inhalaciju u obzir valja uzeti narav ispitivane kemikalije i predmet ispitivanja. Prednost se daje metodi izlaganja samo nosom (koja uključuje samo glavu, samo nos ili samo njušku). Izlaganju samo nosom općenito se daje prednost za ispitivanja tekućih ili krutih aerosola te para koje se mogu kondenzirati iz aerosola. Posebni ciljevi ispitivanja mogu se bolje postići uporabom izlaganja čitavog tijela, ali to treba opravdati u izvješću o ispitivanju. Kako bi se osigurala stabilnost atmosfere u slučaju primjene komore za čitavo tijelo, ukupni volumen pokusnih životinja ne smije premašiti 5 % volumena komore. Načela tehnika izlaganja samo nosom i čitavim tijelom te njihove specifične prednosti i nedostaci opisani su u GD 39 (2).
                           
                        STUDIJE TOKSIČNOSTI
                  
                     Granične koncentracije
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Za razliku od akutnih studija, u 28-dnevnoj studiji subakutne inhalacijske toksičnosti nema određenih graničnih koncentracija. Maksimalna ispitna koncentracija treba uzeti u obzir: 1) maksimalnu koncentraciju koja se može postići, 2) razinu za izlaganje ljudi s ‚najgorim scenarijem ’, 3) potrebu za održavanjem odgovarajuće opskrbe kisikom i/ili 4) pretpostavke za dobrobit životinja. U nedostatku ograničenja na temelju podataka mogu se upotrijebiti akutne granice iz Uredbe (EZ) br. 1272/2008 (13) (tj. do maksimalne koncentracije od 5 mg/l za aerosole, 20 mg/l za pare i 20 000 ppm za plinove); vidjeti GD 39 (2). Ako je pri ispitivanju plinova ili vrlo hlapljivih ispitivanih kemikalija (npr. rashladnih sredstava) potrebno premašiti te granice, treba priložiti obrazloženje. Granična koncentracija trebala bi izazvati nedvojbenu toksičnost, a da pritom ne izazove pretjerani stres za životinje ili utječe na njihovu dugovječnost (3).
                           
                        
                     Studija za utvrđivanje raspona
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Prije početka glavne studije može biti potrebno provesti studiju za utvrđivanje raspona. Studija za utvrđivanje raspona opsežnija je od preliminarne studije jer nije ograničena na odabir koncentracije. Znanje prikupljeno u studiji za utvrđivanje raspona može dovesti do uspješne glavne studije. Studija za utvrđivanje raspona može, primjerice, pružiti tehničke informacije u svezi s analitičkim metodama, određivanjem veličine čestica, otkrivanjem toksičnih mehanizama, kliničko-patološkim i histopatološkim podacima i procjenama mogućih NOAEL i MTC koncentracija u glavnoj studiji. Voditelj istraživanja može odlučiti primijeniti studiju za utvrđivanje raspona radi identifikacije praga nadraženosti respiratornog trakta (npr. s histopatologijom respiratornog trakta, ispitivanjem plućnih funkcija ili bronhoalveolarnim ispiranjem), gornje koncentracije koja se tolerira bez prekomjernog stresa za životinje i parametara koji će najbolje okarakterizirati toksičnost ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Studija za utvrđivanje raspona može obuhvaćati jednu ili više razina koncentracije. Svakoj razini koncentraciji ne smije se izlagati više od tri mužjaka i tri ženke. Studija za utvrđivanje raspona treba trajati najmanje pet dana i općenito ne dulje od 14 dana. U izvješću o studiji treba pružiti argumentaciju za odabir koncentracije za glavnu studiju. Cilj glavne studije jest pokazati odnos koncentracije i reakcije temeljen na očekivanjima za najosjetljiviji krajnji učinak. Niska koncentracija idealno bi trebala biti koncentracija s neopaženim štetnim učincima dok visoka koncentracija treba izazvati nedvojbenu toksičnost bez izazivanja pretjeranog stresa za životinje ili bez utjecaja na njihovu dugovječnost (3).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Pri odabiru razina koncentracije za studiju za utvrđivanje raspona u obzir treba uzeti sve raspoložive informacije uključujući odnose strukture i aktivnosti te podatke za slične kemikalije (vidjeti stavak 3.). Studija za utvrđivanje raspona može potvrditi/opovrgnuti mehanistički utemeljene krajnje učinke koje se smatra najosjetljivijima, npr. inhibiciju kolinesteraze organofosfatima, formaciju methemoglobina eritrocitotoksičnim agensima, hormone štitnjače (T3, T4) za tirotoksikante, proteine, LDH ili neutrofile u bronhoalveolarnom ispiranju za neškodljive, slabo topljive čestice ili aerosole koji nadražuju pluća.
                           
                        
                     Glavna studija
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Glavna studija subakutne toksičnosti općenito obuhvaća tri razine koncentracije kao i paralelnu negativnu kontrolu (zrak) i/ili kontrolu nosača po potrebi (vidjeti stavak 17.). Sve raspoložive podatke treba upotrijebiti kao pomoć pri odabiru odgovarajućih razina izlaganja, uključujući rezultate sustavnih studija toksičnosti, metabolizma i kinetike (poseban naglasak treba staviti na izbjegavanje visokih razina koncentracije koje zasićuju kinetičke procese). Svaka ispitna skupina sadrži najmanje deset glodavaca (pet mužjaka i pet ženki) koji se izlažu ispitivanoj kemikaliji šest sati dnevno pet dana u tjednu u razdoblju od četiri tjedna (ukupno trajanje studije 28 dana). Životinje se mogu također izlagati i sedam dana tjedno (npr. kada se ispituju inhalirani lijekovi). Ako je za jedan od spolova poznato da je osjetljiviji na ispitivanu kemikaliju koja se primjenjuje, spolovi se mogu izlagati različitim razinama koncentracije kako bi se optimizirao odnos koncentracije i reakcije, kao što je opisano u stavku 15. Ako izlaganju samo nosom nisu izloženi štakori nego drugi glodavci, maksimalno trajanje izlaganja treba prilagoditi kako bi se na minimum sveo stres specifičan za tu vrstu. Ako se primjenjuje izlaganje kraće od šest sati dnevno ili ako je potrebno provesti dugotrajno izlaganje (npr. 22 sata dnevno) u sklopu studije izlaganja čitavim tijelom [vidjeti GD 39 (2)], treba pružiti argumente. Tijekom izlaganja treba obustaviti davanje hrane osim ako izlaganje nije dulje od šest sati. Voda se može davati tijekom cijelog izlaganja čitavim tijelom.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Odabrane ciljane koncentracije moraju identificirati ciljni(-e) organ(-e) i pokazati jasan odnos koncentracije i reakcije:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Visoka razina koncentracije trebala bi rezultirati toksičnim učincima, ali ne izazvati znakove dugotrajnosti ili smrtnosti koji bi spriječili suvislu ocjenu.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Srednju(-e) razinu(-e) koncentracije trebalo bi prorijediti kako bi se proizvelo stupnjevanje toksičnih učinaka između visoke i niske koncentracije.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Niska koncentracija treba pružiti malo ili nimalo dokaza o toksičnosti.
                                       
                                    
                        
                     Satelitska (reverzibilna) studija
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Satelitska (reverzibilna) studija može se primijeniti kako bi se promatrala reverzibilnost, postojanost ili zakašnjelo pojavljivanje toksičnosti u razdoblju nakon tretiranja, odgovarajućeg trajanja, ali ne kraćeg od 14 dana. Satelitske (reverzibilne) skupine sastoje se od pet mužjaka i pet ženki koji se izlažu istodobno s pokusnim životinjama u glavnoj studiji. Skupine za satelitsku (reverzibilnu) studiju treba izlagati ispitivanoj kemikaliji na najvišoj razini koncentracije i moraju se provoditi paralelne kontrole zraka i/ili nosača (vidjeti stavak 17.).
                           
                        
                     Kontrolne životinje
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Sa životinjama iz paralelnih negativnih kontrola (zrak) treba postupati na jednak način kao i sa životinjama iz ispitne skupine osim što ih se izlaže filtriranom zraku, a ne ispitivanoj kemikaliji. Ako se voda ili druga tvar primjenjuje kao pomoć u stvaranju ispitne atmosfere, u studiju treba uključiti kontrolni nosač umjesto negativne (zrak) kontrolne skupine. Kada god je to moguće, kao nosač treba upotrebljavati vodu. Kada se kao nosač koristi voda, životinje iz kontrolne skupine treba izlagati zraku jednake relativne vlažnosti kao i izložene skupine. Odabir prikladnog nosača treba se temeljiti na prikladno provedenoj predstudiji ili povijesnim podacima. Ako nije poznata toksičnost medija, voditelj istraživanja može odlučiti da upotrijebi negativnu (zrak) kontrolu i kontrolu nosača, ali to se izričito destimulira. Ako povijesni podaci pokažu da nosač nije toksičan, nema potrebe za negativnom (zrak) kontrolnom skupinom i treba rabiti samo kontrolu nosača. Ako predstudija ispitivane kemikalije formulirane u nosaču ne pokaže nikakvu toksičnost, znači da nosač nije toksičan u ispitnoj koncentraciji te stoga ne treba provoditi kontrolu nosača.
                           
                        UVJETI IZLAGANJA
                  
                     Primjena koncentracija
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Životinje se izlažu ispitivanoj kemikaliji u vidu plina, pare, aerosola ili njihovih smjesa. Fizikalno stanje koje će se ispitivati ovisi o fizikalno-kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, odabranoj koncentraciji i/ili fizikalnom obliku koji je obično prisutan tijekom manipulacije ispitivanom kemikalijom i njezine uporabe. Higroskopske i kemijski reaktivne ispitivane kemikalije treba ispitivati u uvjetima suhog zraka. Treba paziti kako bi se izbjeglo stvaranje eksplozivnih koncentracija. Materijal u česticama može se podvrgnuti mehaničkim procesima za smanjenje veličine čestica. Ostale upute nalaze se u GD 39 (2).
                           
                        
                     Distribucija veličine čestica
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Određivanje veličine čestica treba provesti za sve aerosole i pare koje se mogu kondenzirati iz aerosola. Kako bi se omogućilo izlaganje svih relevantnih područja respiratornog trakta, preporuča se aerosol sa srednjim aerodinamičkim promjerom čestica (MMAD) u rasponu od 1 do 3 μm s geometrijskom standardnom devijacijom (σg) u rasponu od 1,5 do 3,0 (4). Iako treba učiniti razuman napor za postizanje tih standarda, ako se ne mogu postići, treba podnijeti stručno mišljenje. Primjerice, metalne čestice u isparini mogu biti manje od tog standarda, a napunjene čestice i vlakna mogu biti veći.
                           
                        
                     Priprema ispitivane kemikalije u nosaču
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Idealno bi bilo da se ispitivana kemikalija ispituje bez nosača. Ako je potrebno primijeniti nosač za stvaranje odgovarajuće koncentracije ispitivane tvari i veličine čestica, prednost treba dati vodi. Kad god se ispitivana kemikalija otapa u nosaču, treba dokazati njegovu stabilnost.
                           
                        PRAĆENJE UVJETA IZLAGANJA
                  
                     Protok zraka u komori
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Protok zraka u komori za izlaganje treba pažljivo kontrolirati, neprestano nadzirati te bilježiti najmanje jedanput u sat vremena tijekom svakog izlaganja. Nadziranje koncentracije (ili privremene stabilnosti) u ispitnoj atmosferi, provedeno u stvarnom vremenu, sastavna je mjera svih dinamičkih parametara i pruža neizravno sredstvo za kontrolu svih relevantnih parametara dinamičke inhalacije. Ako se koncentracija nadzire u stvarnom vremenu, učestalost mjerenja protoka zraka može se smanjiti na jedno mjerenje po izlaganju dnevno. Posebnu pažnju treba obratiti na izbjegavanje ponovnog udisanja u komorama za izlaganje samo nosom. Koncentracija kisika mora iznositi najmanje 19 %, a koncentracija ugljikova dioksida ne smije premašivati 1 %. Ako postoji opravdana sumnja da se takav standard ne može postići, treba mjeriti koncentraciju kisika i ugljikova dioksida. Ako mjerenja prvog dana izlaganja pokažu da su plinovi na pravilnoj razini, nisu potrebna daljnja mjerenja.
                           
                        
                     Temperatura i relativna vlažnost zraka u komori
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Temperaturu u komori treba održavati na 22 ± 3 °C. Relativnu vlažnost zraka u području udisanja životinja za izlaganje samo nosom i čitavim tijelom treba neprestano nadzirati i bilježiti svakoga sata tijekom svakog izlaganja kad je to moguće. Relativnu vlažnost zraka trebalo bi po mogućnosti održavati u rasponu od 30 do 70 %, no to može biti nemoguće (npr. u slučaju ispitivanja smjesa na bazi vode) ili nemjerljivo zbog utjecanja na ispitivanu kemikaliju pomoću ispitne metode.
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija: Nazivna koncentracija
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Kad god je to moguće, treba izračunati i zabilježiti nazivnu koncentraciju u komori za izlaganje. Nazivna koncentracija jest masa proizvedene ispitivane kemikalije podijeljena ukupnim volumenom zraka koji je prošao kroz sustav komore. Nazivna se koncentracija ne koristi za karakterizaciju izlaganja životinja nego usporedba nazivne koncentracije i stvarne koncentracije daje uvid u učinkovitost proizvodnje sustava ispitivanja te se stoga može upotrijebiti za otkrivanje problema pri proizvodnji.
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija: Stvarna koncentracija
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Stvarna koncentracija jest koncentracija ispitivane kemikalije uzorkovana u zoni udisanja životinja u komori za inhalaciju. Stvarna koncentracija može se dobiti specifičnim metodama (npr. izravnim uzorkovanjem, adsorpcijskim ili kemijskim reaktivnim metodama te analitičkom karakterizacijom nakon toga) ili nespecifičnim metodama poput gravimetrijske analize filtra. Primjena gravimetrijske analize prihvatljiva je samo za aerosole sa samo jednom komponentom u prahu ili aerosole tekućina niskog stupnja hlapljivosti i treba je podržati odgovarajućom preliminarnom karakterizacijom specifičnom za ispitivanu kemikaliju. Gravimetrijskom analizom može se odrediti i koncentracija aerosola s višekomponentnim prahom. No, za to su potrebni analitički podaci koji pokazuju da je sastav materijala koji se prenosi zrakom sličan početnom materijalu. Ako ta informacija nije dostupna, potrebna je ponovna analiza ispitivane kemikalije (idealno u stanju kada se prenosi zrakom) u pravilnim intervalima tijekom ispitivanja. Za agense, pod utjecajem aerosola, koji mogu ispariti ili sublimirati treba pokazati da su odabranom metodom skupljene sve faze.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Ako je moguće, tijekom trajanja studije treba upotrijebiti jednu partiju ispitivane kemikalije, a ispitivani uzorak treba skladištiti u uvjetima u kojima će biti očuvana njegova čistoća, homogenost i stabilnost. Prije početka studije treba karakterizirati ispitivanu kemikaliju uključujući njezinu čistoću, ako je tehnički izvedivo, identitet te količine identificiranih kontaminirajućih tvari i nečistoća. To se može dokazati sljedećim podacima, ali nije ograničeno na njih: vrijeme retencije i relativno vršno područje, molekulska masa iz spektroskopskog mjerenja ili kromatografske analize plina ili sličnih procjena. Iako identitet ispitivanog uzorka nije odgovornost ispitnog laboratorija, za laboratorij može biti mudro barem u ograničenim okvirima potvrditi naručiteljevu karakterizaciju (npr. boju, fizikalno stanje itd.).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Atmosferu izlaganja treba održavati konstantnom koliko je god moguće. Uređaj za nadzor u stvarnom vremenu, kao što je fotometar za aerosol ili uređaj za analizu ukupnih ugljikovodika za paru, može se upotrijebiti za dokazivanje stabilnosti uvjeta izlaganja. Stvarnu koncentraciju u komori treba mjeriti najmanje 3 puta tijekom svakog dana izlaganja za svaku razinu izlaganja. Ako to nije izvedivo zbog ograničenog protoka zraka ili niskih koncentracija, prihvatljiv je jedan uzorak po razdoblju izlaganja. Uzorak se u idealnom slučaju uzima tijekom cijelog razdoblja izlaganja. Pojedinačni uzorci koncentracije u komori ne smiju od srednje koncentracije u komori odstupati za više od ± 10 % za plinove i pare i ne za više od ± 20 % za tekućine ili kruti aerosol. Treba izračunati i zabilježiti vrijeme za postizanje ravnoteže u komori (t95). Trajanje izlaganja zahvaća vrijeme proizvodnje ispitivane kemikalije. Pritom se vodi računa o vremenu potrebnom za postizanje ravnoteže u komori (t95) i vremenu raspada. Smjernica za procjenu t95 može se pronaći u GD 39 (2).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Za vrlo složene smjese sastavljene od plinova/para i aerosola (npr. zapaljive atmosfere i i ispitivane kemikalije izbačene iz namjenskih proizvoda/uređaja za krajnju uporabu) svaka se faza može ponašati drukčije u komori za inhalaciju. Stoga treba odabrati najmanje jedan indikator (analiziranu tvar), obično glavnu aktivnu tvar u smjesi, svake faze (plin/para i aerosol). Kada je ispitivana kemikalija smjesa, treba izvijestiti o analitičkoj koncentraciji ukupne smjese, a ne samo za aktivni sastojak ili indikator (analiziranu tvar). Dodatne informacije o stvarnim koncentracijama mogu se pronaći u GD 39 (2).
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija: Distribucija veličine čestica
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Distribuciju veličine čestica u aerosolu treba odrediti najmanje jedanput tjedno za svaku razinu koncentracije uporabom kaskadnog impaktora ili alternativnog instrumenta poput uređaja za aerodinamičku analizu veličine čestica (APS). Ako se može dokazati da su rezultati dobiveni kaskadnim impaktorom i alternativnim instrumentom ekvivalentni, u studiji se može upotrebljavati alternativni instrument.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Drugi uređaj, poput gravimetrijskog filtra ili uređaja za sudaranje/uređaja za mjerenje mjehurića plina, treba upotrijebiti paralelno s primarnim instrumentom kako bi se potvrdila učinkovitost skupljanja primarnog instrumenta. Koncentracija mase dobivena analizom veličine čestica trebala bi biti u razumnim granicama koncentracije mase dobivene analizom filtracijom [vidjeti GD 39 (2)]. Ako se ekvivalentnost može dokazati na svim koncentracijama ispitanima u ranoj fazi istraživanja, mogu se izostaviti daljnja mjerenja radi potvrde. Radi dobrobiti životinja treba provoditi mjerenja kako bi se minimalizirali nedefinitivni podaci koji mogu izazvati potrebu za ponavljanjem studije.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Određivanje veličine čestica treba provesti za pare ako postoji ikakva mogućnost da bi kondenzacijom pare mogao nastati aerosol ili ako su u čestice otkrivene u atmosferi pare s potencijalom za miješane faze.
                           
                        OPAŽANJA
                  
                              31.
                           
                           
                              Životinje treba klinički promatrati prije, tijekom i nakon razdoblja izlaganja. Češća opažanja mogu biti potrebna ovisno o reakciji životinja tijekom izlaganja. Ako primjena cijevi koje sputavaju, slabo osvijetljenih komora za čitavo tijelo ili neprozirna atmosfera ometaju opažanje na životinjama, opažanje treba pažljivo obaviti nakon izlaganja. Opažanja prije izlaganja sljedećeg dana mogu ocijeniti reverzibilnost ili pogoršanje toksičnih učinaka.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Sva se opažanja bilježe u pojedinačnim evidencijama za svaku životinju. Ako se životinje usmrte zbog humanih razloga ili ih se pronađe uginule, vrijeme ugibanja treba zabilježiti što je moguće preciznije.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Opažanja u kavezu moraju uključivati promjene na koži i krznu, očima i sluznicama te promjene u dišnom i cirkulacijskom sustavu, promjene u živčanom sustavu te promjene u somatomotoričkoj aktivnosti i uzorcima ponašanja. Treba obratiti pozornost na opažanje tremora, konvulzija, salivacije, dijareje, letargije, spavanja i kome. Mjerenje rektalne temperature može pružiti dodatne dokaze o refleksnoj bradipneji ili hipo/hipertermiji povezanoj s tretiranjem ili držanjem u zatvorenom. U protokol studije mogu se uključiti i dodatna određivanja, kao što su kinetika, biološki monitoring, funkcija pluća, retencija slabo topljivih materijala koji se nakupljaju u plućnom tkivu te promjene u ponašanju.
                           
                        TJELESNA MASA
                  
                              34.
                           
                           
                              Pojedinačnu masu životinja treba zabilježiti neposredno prije prvog izlaganja (0. dan), dvaput tjedno nakon toga (primjerice, petkom i ponedjeljkom kako bi se dokazao oporavak preko vikenda bez izlaganja ili u vremenskom razdoblju koje omogućuje utvrđivanje sistemske toksičnosti) te u vrijeme uginuća ili usmrćenja. Ako u prva dva tjedna nema učinaka, tijekom ostatka studije tjelesna se masa može mjeriti jedanput tjedno. Satelitske (reverzibilne) životinje (ako se koriste) treba nastaviti vagati jedanput tjedno tijekom čitavog razdoblja oporavka. Na kraju istraživanja sve životinje treba izvagati kratko prije usmrćenja kako bi se omogućilo nepristrano određivanje odnosa mase organa i tjelesne mase.
                           
                        UNOS HRANE I VODE
                  
                              35.
                           
                           
                              Unos hrane treba mjeriti jedanput tjedno. Također se može mjeriti i unos vode.
                           
                        KLINIČKA PATOLOGIJA
                  
                              36.
                           
                           
                              Kliničko-patološke pretrage treba obaviti za sve životinje uključujući kontrolnu i satelitsku (reverzibilnu) skupinu u trenutku usmrćivanja. Treba zabilježiti vremensko razdoblje između kraja izlaganja i prikupljanja krvi, posebno ako je rekonstrukcija ciljanog krajnjeg učinka brza. Uzorkovanje nakon završetka izlaganja indicirano je za parametre s kratkim poluvremenom plazme (npr. COHb, CHE, i MetHb).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              U tablici 1. navedeni su kliničko-patološki parametri koji se općenito traže za sva toksikološka ispitivanja. Analiza urina ne traži se rutinski, ali se može provesti ako se smatra korisnom na temelju očekivane ili opažene toksičnosti. Voditelj istraživanja može odlučiti da odredi i dodatne parametre radi bolje karakterizacije toksičnosti ispitivane kemikalije (npr. kolinesteraza, lipidi, hormoni, ravnoteža kiselina i lužina, methemoglobin ili Heinzova tjelešca, kreatin kinaza, omjer mijeloida i eritroida, troponin, plinovi u arterijskoj krvi, laktat dehidrogenaza, sorbitol dehidrogenaza, glutamat dehidrogenaza i gama glutamil transpeptidaza).
                              
                                 Tablica 1.
                              
                              
                                 Standardni kliničko-patološki parametri
                              
                              
                                          Hematologija
                                       
                                    
                                          Broj eritrocita
                                          Hematokrit
                                          Koncentracija hemoglobina
                                          Prosječna masa hemoglobina
                                          Prosječni volumen eritrocita
                                          Prosječna koncentracija hemoglobina u eritrocitima
                                          Retikulociti
                                       
                                       
                                          Ukupni broj leukocita
                                          Diferencijalni broj leukocita
                                          Broj trombocita
                                          Vrijeme zgrušavanja (odabrati jedno):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Protrombinsko vrijeme
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Vrijeme zgrušavanja
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Parcijalno tromboplastinsko vrijeme
                                                   
                                                
                                    
                                          Klinička kemija
                                       
                                    
                                          Glukoza (8)
                                          
                                          Ukupni kolesterol
                                          Trigliceridi
                                          Dušična urea u krvi
                                          Ukupni bilirubin
                                          Kreatinin
                                          Ukupni proteini
                                          Albumini
                                          Globulini
                                       
                                       
                                          Alanin aminotransferaza
                                          Aspartat aminotransferaza
                                          Alkalna fosfataza
                                          Kalij
                                          Natrij
                                          Kalcij
                                          Fosfor
                                          Kloridi
                                       
                                    
                                          Analiza urina (opcija)
                                       
                                    
                                          Izgled (boja i zamućenost)
                                          Volumen
                                          Specifična težina ili osmolalnost
                                          pH
                                       
                                       
                                          Ukupni proteini
                                          Glukoza
                                          Krv/krvne stanice
                                       
                                    
                        
                              38.
                           
                           
                              Ako postoji dokaz da je donji respiratorni trakt (tj. alveole) primarno mjesto taloženja i retencije, bronhoalveolarno ispiranje (BAL) može biti tehnika izbora za kvantitativnu analizu hipotetski utemeljenih parametara učinka doze fokusiranih na alveolitis, upalu pluća i fosfolipidozu. To omogućuje prikladno i temeljito istraživanje promjena u ozljedama na alveolama povezanih s reakcijama na dozu i protok vremena. Tekućina za BAL mora se analizirati radi ukupnog i diferencijalnog broja leukocita, ukupnog broja proteina i laktat dehidrogenaze. Drugi parametri koji se mogu uzeti u obzir jesu parametri indikativni za lizosomalne bolesti, fosfolipidozu te iritacijske ili alergijske upale koje mogu uključivati određivanje proupalnih citokineza/kemokineza. Mjerenja BAL obično upotpunjuju rezultate histopatoloških pretraga, ali ih ne mogu zamijeniti. Upute za provođenje ispiranja pluća nalaze se u GD 39 (2).
                           
                        MAKROSKOPSKA PATOLOGIJA I MASA ORGANA
                  
                              39.
                           
                           
                              Sve pokusne životinje, uključujući i one koje su tijekom ispitivanja uginule ili su uklonjene iz studije radi svoje dobrobiti, treba podvrgnuti kompletnim pretragama (ako je izvedivo) i makroskopskoj analizi. Treba zabilježiti vrijeme između kraja posljednjeg izlaganja svake životinje i njezina usmrćivanja. Ako se obdukcija ne može provesti neposredno nakon otkrića uginule životinje, životinju treba ohladiti (ne zamrznuti) na dovoljno niskim temperaturama kako bi se razgradnja svela na minimum. Obdukciju treba provesti što je moguće prije, obično u roku od jednog ili dva dana. Za svaku životinju treba zabilježiti sve makroskopske patološke promjene uz poseban naglasak na promjenama u respiratornom traktu.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              U tablici 2. nalazi se popis organa i tkiva koje tijekom makroskopske analize treba sačuvati u odgovarajućem mediju radi histopatoloških pretraga. Čuvanje [točno određenih] organa i tkiva te drugih organa i tkiva prepušteno je voditelju istraživanja. Masno otisnute organe treba obrezati i izvagati što je moguće prije nakon sekcije kako bi se izbjeglo njihovo sušenje. Štitnjaču i epididimise treba izvagati samo ako je potrebno jer obrezivanje artefakata može spriječiti histopatološku procjenu. Tkiva i organe treba fiksirati u puferiranom 10 % formalinu ili drugom prikladnom fiksativu odmah nakon provedene obdukcije, i to, dakle, ne kraće od 24 - 48 sati prije obrezivanja ovisno o primijenjenom fiksativu.
                              
                                 Tablica 2.
                              
                              
                                 Organi i tkiva sačuvani tijekom makroskopske analize
                              
                              
                                 Nadbubrežne žlijezde
                              
                              Koštana srž (i/ili svježi aspirat)
                              
                                 Mozak (uključujući sekcije velikog i malog mozga te medule/mosta)
                              [Oči (mrežnica, očni živac) i očni kapci]
                              
                                 Srce
                              
                              
                                 Bubrezi
                              
                              Grkljan (3 razine, 1 razina za uključivanje u bazu epiglotisa)
                              
                                 Jetra
                              
                              
                                 Pluća (svi režnjevi na jednoj razini, uključujući glavni bronh)
                              Limfni čvorovi iz hilusne regije pluće, posebno za slabo topljive ispitivane kemikalije u česticama, za dublje pretrage i/ili studije s imunološkim fokusom u obzir se mogu uzeti dodatni limfni čvorovi, npr. limfni čvorovi iz medijastinalne, cervikalne/submandibularne i/ili aurikularne regije.
                              Nazofaringealna tkiva (najmanje 4 razine: 1 razina za uključivanje nazofaringealnog kanala i nazalno limfatičko tkivo (NALT))
                              Jednjak
                              [Olfaktorni bulbus]
                              Jajnici
                              Sjemenski mjehurići
                              Kralježnica (vratna, srednja prsna i slabinska)
                              
                                 Slezena
                              
                              Želudac
                              
                                 Testisi
                              
                              
                                 Timus
                              
                              Štitnjača
                              Dušnik (najmanje 2 razine uključujući 1 longitudinalnu sekciju kroz greben i 1 transverzalnu sekciju)
                              [Mokraćni mjehur]
                              Maternica
                              Sve makroskopske lezije
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Pluća treba ukloniti netaknuta, izvagati te polako nalijevati prikladnim fiksativom pod tlakom od 20 - 30 cm vode kako bi se osiguralo održanje strukture pluća (5). Sekcije treba prikupiti za sve režnjeve jedne razine, uključujući glavni bronh, ali ako je provedeno ispiranje pluća, neisprani režanj treba secirati na tri razine (ne serijske sekcije).
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Treba ispitati najmanje 4 razine nazofaringealnih tkiva, a jedna od njih mora uključivati nazofaringealni kanal (5, 6, 7, 8, 9) kako bi se omogućilo potpuno ispitivanje ljuskavog, tranzicijskog (necilijarnog respiratornog), respiratornog (cilijarnog respiratornog) i olfaktornog epitela te drenažno limfatično tkivo (NALT; 10, 11). Treba ispitati tri razine grkljana, a jedna od njih mora obuhvaćati bazu epiglotisa (12). Treba ispitati najmanje dvije razine dušnika uključujući jednu longitudinalnu sekciju kroz greben mjesta razdvajanja ekstrapulmonalnog bronha te jednu transverzalnu sekciju.
                           
                        HISTOPATOLOGIJA
                  
                              43.
                           
                           
                              Treba provesti histopatološku procjenu svih organa i tkiva navedenih u tablici 2. za kontrolnu skupinu i skupinu izloženu visokoj koncentraciji te za sve životinje koje uginu ili su usmrćene tijekom studije. Posebnu pozornost treba posvetiti respiratornom traktu, organima metama te makroskopskim lezijama. Organe i tkiva s lezijama u skupini izloženoj visokoj koncentraciji treba ispitati u svim skupinama. Voditelj istraživanja može odlučiti provesti histopatološke pretrage za dodatne skupine kako bi dokazao jasnu reakciju na koncentraciju. Ako se upotrebljava satelitska (reverzibilna) skupina, histopatološku procjenu treba provesti na svim tkivima i organima za koje je u tretiranim skupinama utvrđeno da pokazuju učinke. U slučaju pojavljivanja prekomjernog broja uginulih životinja ili drugih problema u skupini izloženoj visokoj koncentraciji, koje kompromitiraju značenje podataka, histopatološku analizu treba provesti na sljedećoj nižoj koncentraciji. Treba pokušati povezati makroskopska opažanja s mikroskopskim nalazima.
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Podaci
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Treba navesti individualne podatke o tjelesnoj masi, potrošnji hrane, kliničkoj patologiji, makroskopskoj patologiji, masi organa te histopatologiji. Podatke prikupljene kliničkim promatranjem treba skupiti u obliku tablice, prikazujući za svaku ispitnu skupinu broj upotrijebljenih životinja, broj životinja koje pokazuju specifične znakove toksičnosti, broj životinja koje su tijekom ispitivanja pronađene uginule ili su usmrćene iz humanih razloga, vrijeme uginuća pojedinih životinja, opis i vremenski tijek te reverzibilnost toksičnih učinaka i nalaze obdukcije. Sve rezultate, kvantitativne i popratne, treba ocijeniti odgovarajućom statističkom metodom. Može se upotrijebiti bilo koja opće prihvaćena statistička metoda, a statističke metode treba odabrati tijekom planiranja studije.
                           
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              Izvješće o ispitivanju treba, ako je primjereno, sadržavati sljedeće informacije:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusne životinje i njihov uzgoj
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Opis uvjeta držanja u kavezu, uključujući: broj (ili promjenu broja) životinja u svakom kavezu, materijal podloge, temperaturu i relativnu vlažnost zraka u kavezu, razdoblje svjetla i tame, identifikaciju prehrane.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Korištena vrsta/soj i obrazloženje za uporabu druge vrste osim štakora. Mogu se navesti podrijetlo i povijesni podaci ako potječu od životinja izloženih u sličnim uvjetima izlaganja, smještaja i posta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Broj, dob i spol životinja.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Metoda nasumičnog odabira.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Opis svih kondicioniranja prije ispitivanja, uključujući prehranu, karantenu i liječenje bolesti.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana kemikalija
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Fizikalna narav, čistoća te, ako je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva (uključujući izomerizaciju).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Identifikacijski podaci i broj registracije Chemical Abstract Services (CAS) ako je poznat.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosač
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Obrazloženje za uporabu nosača i obrazloženje za odabir nosača (ako nije voda).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Povijesni ili odgovarajući podaci koji pokazuju da nosač ne ometa rezultate studije.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Komora za inhalaciju
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Detaljan opis komore za inhalaciju, uključujući volumen i dijagram.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Podrijetlo i opis opreme korištene za izlaganje životinja te stvaranje atmosfere.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Oprema za mjerenje temperature, vlažnosti, veličine čestica te stvarne koncentracije.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Izvor zraka i sustav za klimatizaciju.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Metode korištene za kalibriranje opreme radi osiguravanja homogene atmosfere za ispitivanje.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Razlika u tlaku (pozitivna ili negativna).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Otvori za izlaganje po komori (samo nos); lokacija životinja u sustavu (čitavo tijelo).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Stabilnost ispitne atmosfere.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Lokacija senzora temperature i vlažnosti te uzorkovanje ispitne atmosfere u komori.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tretiranje dovodnog/ekstrahiranog zraka.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Količina protoka zraka, otvor za količinu protoka zraka po izlaganju (samo nos) ili dovod životinja po komori (čitavo tijelo).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Vrijeme za postizanje ravnoteže u komori za inhalaciju (t95).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Broj promjena u volumenu po satu.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uređaji za mjerenje (ako je primjenjivo).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podaci o izlaganju
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Argumentacija za odabir ciljane koncentracije u glavnoj studiji.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nazivne koncentracije (ukupna masa ispitivane kemikalije proizvedena u komori za inhalaciju podijeljena volumenom zraka koji je prošao kroz komoru).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Stvarne koncentracije ispitivane kemikalije iz zone udisanja životinja; za smjese koje stvaraju heterogene fizikalne oblike (plinove, pare, aerosol) svaka se može analizirati odvojeno.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Sve koncentracije zraka treba navesti u jedinicama mase (mg/l mg/m3 itd.), a ne u jedinicama volumena (ppm, ppb itd.).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Distribucija veličine čestica, srednji aerodinamički promjer čestica (MMAD) te geometrijska standardna devijacija (σg) uključujući metode za njihov izračun. Treba prikazati pojedinačne analize veličine čestica.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Pojedinosti o pripremi ispitivane kemikalije, uključujući pojedinosti o svim postupcima korištenim za smanjenje veličine čestica krutina ili za pripremu otopina ispitivane kemikalije.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Opis (po mogućnosti uz dijagram) opreme korištene za stvaranje ispitne atmosfere te izlaganje životinja ispitnoj atmosferi.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Pojedinosti o opremi korištenoj za nadziranje temperature, vlažnosti i protoku zraka u komori (tj. razvoj kalibracijske krivulje).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Pojedinosti o opremi korištenoj za skupljanje uzoraka za određivanje koncentracije u komori i distribuciju veličine čestica.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Pojedinosti o korištenoj kemijskoj analitičkoj metodi i potvrdi metode (uključujući učinkovitost rekuperacije ispitivane kemikalije iz medija za uzorkovanje).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Metoda nasumičnog odabira za svrstavanje životinja u ispitnu i kontrolnu skupinu.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uključujući tip/izvor hrane, izvor vode).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Argumentacija za odabir ispitnih koncentracija.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz temperature, vlažnosti zraka i protoka zraka u komori.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz podataka o nazivnoj i stvarnoj koncentraciji u komori.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz podataka u veličini čestica, uključujući podatke o skupljenim analitičkim uzorcima, distribuciju veličina čestica te izračune MMAD i σg.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz podataka o reakciji i razini koncentracije za svaku životinju (npr. životinje koje pokazuju znakove toksičnosti uključujući smrtnost, narav, stupanj, vrijeme nastupanja i trajanja učinaka).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz pojedinačne mase životinja.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz unosa hrane.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz kliničko-patoloških podataka.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nalazi obdukcije i histopatološki nalazi za svaku životinju ako su dostupni.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz svih ostalih izmjerenih parametara.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rasprava i tumačenje rezultata
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Poseban naglasak treba staviti na opis metoda korištenih za ispunjavanje kriterija ove ispitne metode, npr. graničnu koncentraciju ili veličinu čestica.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Treba raspravljati o sposobnosti udisanja čestica u svjetlu općih nalaza, posebno ako se nisu mogli ispuniti kriteriji za veličinu čestica.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      U opću ocjenu studije treba uključiti dosljednost metoda korištenih za određivanje nazivnih i stvarnih koncentracija te odnos stvarne koncentracije prema nazivnoj.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Treba se pozabaviti uzrokom smrti i prevladavajućim načinom djelovanja (sistemski u odnosu na lokalni).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      U slučaju humanog usmrćivanja životinja koje su patile ili pokazivale znakove velikog i trajnog stresa treba pružiti objašnjenje na temelju kriterija iz Smjernice za humano usmrćivanje OECD-a (3).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Treba identificirati organ/e metu/e.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Treba odrediti NOAEL i LOAEL.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1981.). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Pariz.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              OECD (2000.). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, str. 229-258.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Uredba (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vijeća od 16. prosinca 2008. o razvrstavanju, označavanju i pakiranju tvari i smjesa, kojom se izmjenjuju i dopunjuju i ukidaju Direktiva 67/548/EEZ i 1999/45/EZ te izmjenjuje i dopunjuje Uredba (EZ) br. 1907/2006, SL L 353, 31.12.2008., str. 1.
                           
                        
                     Dodatak 1.
                     DEFINICIJA
                     Ispitivana kemikalija: Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne metode.
                  ”
            
                  5.
               
               
                  Poglavlja B.29 i B.30 mijenjaju se i glase:
                  „B.29.   SUBKRONIČNA INHALACIJSKA TOKSIČNOST: 90-DNEVNA STUDIJA
                  
                  SAŽETAK
                  Ova revidirana ispitna metoda B.29 osmišljena je za potpunu karakterizaciju toksičnosti ispitivane kemikalije inhalacijom u subkroničnom trajanju (90 dana) te za pružanje podataka za procjenu kvantitativnog rizika od inhalacije. Skupine od deset mužjaka i deset ženki glodavaca izlažu se šest sati dnevno 90 dana (13 tjedana) a) ispitivanoj kemikaliji na tri ili više razina koncentracije, b) filtriranom zraku (negativna kontrola) i/ili c) nosaču (kontrola nosača). Životinje se općenito izlažu pet dana tjedno, ali također je dopušteno i izlaganje sedam dana tjedno. Uvijek se ispituju mužjaci i ženke, ali se oni mogu izlagati različitim razinama koncentracije ako je poznato da je jedan od spolova osjetljiviji na ispitivanu kemikaliju koja se primjenjuje. Ova metoda voditelju istraživanja omogućuje fleksibilnost uključivanja satelitskih (reverzibilnih) skupina, usmrćivanja u međuvremenu, bronhoalveolarnog ispiranja (BAL), neuroloških ispitivanja te dodatnih kliničko-patoloških i histopatoloških procjena s ciljem bolje karakterizacije toksičnosti ispitivane kemikalije.
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a 413 (2009.). Originalna Smjernica za ispitivanje 413 (TG 413) usvojena je 1981 (1). Ova ispitna metoda B.29 (kao ekvivalent revidirane TG 413 (2009)) ažurirana je kako bi odrazila stanje znanosti te kako bi ispunila aktualne i buduće regulatorne potrebe.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Studije subkronične inhalacijske toksičnosti primarno se primjenjuju radi određivanja regulatornih koncentracija za određivanje rizika po radnike u radnim uvjetima. Također se primjenjuju za određivanje rezidencijalnih rizika po ljude, transport te okoliš. Ova metoda omogućuje karakterizaciju štetnih učinaka nakon ponovljenog svakodnevnog inhalacijskog izlaganja ispitivanoj kemikaliji tijekom 90 dana (otprilike 10 % životnog vijeka štakora). Podaci dobiveni iz studija subkronične inhalacijske toksičnosti mogu se upotrijebiti za procjenu kvantitativnog rizika te za odabir koncentracija za kronične studije. Ova ispitna metoda nije specijalno namijenjena testiranju nanomaterijala. Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se na kraju ovog poglavlja i u Smjernici (GD) 39 (2).
                           
                        UVODNA RAZMATRANJA
                  
                              3.
                           
                           
                              Ispitni laboratorij mora u obzir uzeti sve raspoložive informacije o ispitivanoj kemikaliji prije provođenja studije kako bi povećao kvalitetu istraživanja i na minimum sveo primjenu životinja. Informacije koje će pomoći u odabiru najprikladnijih ispitnih koncentracija mogu obuhvaćati identitet, kemijsku strukturu te fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije; rezultate bilo kakvih ispitivanja toksičnosti in vitro ili in vivo; očekivanu uporabu i potencijal za izlaganje ljudi; dostupne podatke (Q)SAR i toksikološke podatke o tvarima srodne strukture te podatke dobivene ostalim istraživanjima s ponovljenim izlaganjem. Ako se tijekom studije očekuje ili uoči neurotoksičnost, voditelj istraživanja može odlučiti da obuhvati prikladne procjene kao što su serije funkcionalnih opažanja (FOB) te mjerenje motoričke aktivnosti. Iako određivanje vremena izlaganja u svezi sa specifičnim ispitivanjima može biti ključno, obavljanje tih dodatnih aktivnosti ne bi trebalo utjecati na osnovni plan studije.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Razrijeđene nagrizajuće ili nadražujuće ispitivane kemikalije mogu se ispitivati na koncentracijama koje će proizvesti željeni stupanj toksičnosti. Za više informacija pogledajte GD 39 (2). Kada se životinje izlažu tim materijalima, ciljane koncentracije moraju biti dovoljno niske da ne bi izazvale značajnu patnju ili stres, ali biti dovoljno visoke za proširenje krivulje koncentracije i reakcije na razine koje ispunjavaju regulatorni i znanstveni cilj ispitivanja. Te koncentracije treba odabirati u svakom pojedinom slučaju, najbolje na temelju odgovarajuće isplanirane studije za utvrđivanje raspona koja pruža informacije o kritičnim krajnjim učincima, pragu nadraženosti te vremenu pojavljivanja (vidjeti stavke 11. - 13.). Treba pružiti obrazloženje za odabir koncentracija.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Životinje u stanju ugibanja ili životinje koje očito trpe bol ili pokazuju znakove ozbiljnog stresa treba humano usmrtiti. Životinje u stanju ugibanja uzimaju se u obzir jednako kao i životinje koje uginu pri ispitivanju. Kriteriji za odlučivanje o usmrćivanju životinja u stanju ugibanja ili koje teško pate te upute o prepoznavanju predvidive ili prijeteće smrti predmet su Smjernice za humano usmrćivanje br. 19 OECD-a (3).
                           
                        OPIS METODE
                  
                     Odabir životinjske vrste
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Treba upotrijebiti zdrave, mlade odrasle glodavce sojeva koji se obično koriste u laboratorijima. Prednost se daje vrsti štakora. U slučaju primjene drugih vrsta treba priložiti obrazloženje.
                           
                        
                     Priprema životinja
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Treba upotrebljavati ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne. Na dan nasumičnog odabira životinje moraju biti mlade odrasle jedinke u dobi između sedam i devet tjedana. Tjelesna masa mora biti u rasponu ± 20 % prosječne mase svakog spola. Životinje se nasumično odabiru, označavaju radi pojedinačne identifikacije te drže u kavezima najmanje pet dana prije početka ispitivanja kako bi im se omogućila aklimatizacija na laboratorijske uvjete.
                           
                        
                     Uzgoj životinja
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Životinje treba pojedinačno identificirati, po mogućnosti potkožnim transponderima, kako bi se olakšalo opažanje i izbjegla zamjena. Temperatura prostorije u kojoj se drže pokusne životinje trebala bi iznositi 22 ± 3 °C. Relativna vlažnost zraka idealno bi se morala održavati u rasponu od 30 do 70 % iako to možda neće biti moguće kad se kao nosač primjenjuje voda. Prije i nakon izlaganja životinje općenito treba smjestiti u kaveze u skupinama po spolu i koncentraciji, ali broj životinja po kavezu ne smije ometati jasna opažanja svake životinje i tako se trebaju na minimum svesti gubici zbog kanibalizma i borbe. Ako izlaže samo nos životinja, može biti potrebno aklimatizirati životinje na cijevi koje ih sputavaju. Cijevi koje sputavaju životinje ne smiju im nametnuti pretjeran fizički, toplinski ili imobilizacijski stres. Sputavanje može utjecati na fiziološke krajnje učinke, poput tjelesne temperature (hipertermija) i/ili respiratornog minutnog volumena. Ako su dostupni generički podaci koji pokazuju da se takve promjene ne događaju u znatnom opsegu, nije potrebna prethodna prilagodba cijevima koje sputavaju. Životinje, koje su cijelim tijelom izložene aerosolu, tijekom izlaganja treba smjestiti pojedinačno kako bi se spriječilo da se ispitivani aerosol filtrira kroz krzno drugih životinja u istom kavezu. Može se upotrijebiti konvencionalna i certificirana laboratorijska prehrana, osim tijekom izlaganja, u kombinaciji s neograničenom zalihom javne pitke vode. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka.
                           
                        
                     Komore za inhalaciju
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Pri odabiru komore za inhalaciju u obzir valja uzeti narav ispitivane kemikalije i predmet ispitivanja. Prednost se daje metodi izlaganja samo nosom (koja uključuje samo glavu, samo nos ili samo njušku). Izlaganju samo nosom općenito se daje prednost za ispitivanja tekućih ili krutih aerosola te para koje se mogu kondenzirati iz aerosola. Posebni ciljevi ispitivanja mogu se bolje postići uporabom izlaganja čitavog tijela, ali to treba opravdati u izvješću o ispitivanju. Kako bi se osigurala stabilnost atmosfere u slučaju primjene komore za čitavo tijelo, ukupni volumen pokusnih životinja ne smije premašiti 5 % volumena komore. Načela tehnika izlaganja samo nosom i čitavim tijelom te njihove specifične prednosti i nedostaci navedeni su u GD 39 (2).
                           
                        STUDIJE TOKSIČNOSTI
                  
                     Granične koncentracije
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Za razliku od akutnih studija, u studijama subkronične inhalacijske toksičnosti nema određenih graničnih koncentracija. Maksimalna ispitna koncentracija treba uzeti u obzir: 1) maksimalnu koncentraciju koja se može postići, 2) razinu za izlaganje ljudi s ‚najgorim scenarijem ’, 3) potrebu za održavanjem odgovarajuće opskrbe kisikom i/ili 4) pretpostavke za dobrobit životinja. U nedostatku ograničenja na temelju podataka mogu se upotrijebiti akutne granice iz Uredbe (EZ) br. 1272/2008 (13) (tj. do maksimalne koncentracije od 5 mg/l za aerosole, 20 mg/l za pare i 20 000 ppm za plinove); vidjeti GD 39 (2). Ako je potrebno premašiti te granice pri ispitivanju plinova ili vrlo hlapljivih ispitivanih kemikalija (npr. rashladnih sredstava), treba priložiti obrazloženje. Granična koncentracija trebala bi izazvati nedvojbenu toksičnost, a da pritom ne izazove pretjerani stres za životinje ili utječe na njihovu dugovječnost (3).
                           
                        
                     Studija za utvrđivanje raspona
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Prije početka glavne studije općenito je potrebno provesti studiju za utvrđivanje raspona. Studija za utvrđivanje raspona opsežnija je od preliminarne studije jer nije ograničena na odabir koncentracije. Znanje prikupljeno u studiji za utvrđivanje raspona može dovesti do uspješne glavne studije. Studija za utvrđivanje raspona može, primjerice, pružiti tehničke informacije u svezi s analitičkim metodama, određivanjem veličine čestica, otkrivanjem toksičnih mehanizama, kliničko-patološkim i histopatološkim podacima i procjenama mogućih NOAEL i MTC koncentracija u glavnoj studiji. Voditelj istraživanja može odlučiti primijeniti studiju za utvrđivanje raspona radi identifikacije praga nadraženosti respiratornog trakta (npr. s histopatologijom respiratornog trakta, ispitivanjem plućnih funkcija ili bronhoalveolarnim ispiranjem), gornje koncentracije koja se tolerira bez prekomjernog stresa za životinje i parametara koji će najbolje okarakterizirati toksičnost ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Studija za utvrđivanje raspona može obuhvaćati jednu ili više razina koncentracije. Ovisno o odabranim krajnjim učincima, tri do šest mužjaka i tri do šest ženki treba izložiti svakoj razini koncentracije. Studija za utvrđivanje raspona treba trajati najmanje pet dana i općenito ne dulje od 28 dana. U izvješću o studiji treba pružiti argumentaciju za odabir koncentracije za glavnu studiju. Cilj glavne studije jest pokazati odnos koncentracije i reakcije temeljen na očekivanjima za najosjetljiviji krajnji učinak. Niska koncentracija idealno bi trebala biti koncentracija s neopaženim štetnim učincima dok visoka koncentracija treba izazvati nedvojbenu toksičnost bez izazivanja pretjeranog stresa za životinje ili bez utjecaja na njihovu dugovječnost (3).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Pri odabiru razina koncentracije za studiju za utvrđivanje raspona u obzir treba uzeti sve raspoložive informacije uključujući odnose strukture i aktivnosti te podatke za slične kemikalije (vidjeti stavak 3.). Studija za utvrđivanje raspona može potvrditi/opovrgnuti mehanistički utemeljene krajnje učinke koje se smatra najosjetljivijima, npr. inhibiciju kolinesteraze organofosfatima, formaciju methemoglobina eritrocitotoksičnim agensima, hormone štitnjače (T3, T4) za tirotoksikante, proteine, LDH ili neutrofile u bronhoalveolarnom ispiranju za neškodljive, slabo topljive čestice ili aerosole koji nadražuju pluća.
                           
                        
                     Glavna studija
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Glavna studija subkronične toksičnosti općenito obuhvaća tri razine koncentracije, kao i, po potrebi, paralelnu negativnu kontrolu (zrak) i/ili kontrolu nosača (vidjeti stavak 18.). Sve raspoložive podatke treba upotrijebiti kao pomoć pri odabiru odgovarajućih razina izlaganja, uključujući rezultate sustavnih studija toksičnosti, metabolizma i kinetike (poseban naglasak treba staviti na izbjegavanje visokih razina koncentracije koje zasićuju kinetičke procese). Svaka ispitna skupina sadrži deset mužjaka i deset ženki glodavaca koji se izlažu ispitivanoj kemikaliji šest sati dnevno pet dana tjedno u razdoblju od 13 tjedana (ukupno trajanje studije najmanje 90 dana). Životinje se mogu također izlagati i sedam dana tjedno (npr. kada se ispituju inhalirani lijekovi). Ako je za jedan od spolova poznato da je osjetljiviji na ispitivanu kemikaliju koja se primjenjuje, spolovi se mogu izlagati različitim razinama koncentracije kako bi se optimizirao odnos koncentracije i reakcije, kao što je opisano u stavku 15. Ako izlaganju samo nosom nisu izloženi štakori nego drugi glodavci, maksimalno trajanje izlaganja treba prilagoditi kako bi se na minimum sveo stres specifičan za tu vrstu. Ako se primjenjuje izlaganje kraće od šest sati dnevno ili ako je potrebno provesti dugotrajno izlaganje (npr. 22 sata dnevno) u sklopu studije izlaganja čitavim tijelom (vidjeti GD 39 (2)), treba pružiti argumente. Tijekom izlaganja treba obustaviti davanje hrane osim ako izlaganje nije dulje od šest sati. Voda se može davati tijekom cijelog izlaganja čitavim tijelom.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Odabrane ciljane koncentracije moraju identificirati ciljni(-e) organ(-e) i pokazati jasan odnos koncentracije i reakcije:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Visoka razina koncentracije trebala bi rezultirati toksičnim učincima, ali ne izazvati znakove dugotrajnosti ili smrtnosti koji bi spriječili suvislu ocjenu.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Srednju(-e) razinu(-e) koncentracije trebalo bi prorijediti kako bi se proizvelo stupnjevanje toksičnih učinaka između visoke i niske koncentracije.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Niska koncentracija treba pružiti malo ili nimalo dokaza o toksičnosti.
                                       
                                    
                        
                     Usmrćivanje u međuvremenu
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Ako se planiraju usmrćivanja u međuvremenu, broj životinja na svakoj razini izlaganja treba povećati za broj životinja usmrćenih prije završetka studije. Treba navesti argumentaciju za primjenu usmrćivanja u međuvremenu i valja ga prikladno razjasniti statističkim analizama.
                           
                        
                     Satelitska (reverzibilna) studija
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Satelitska (reverzibilna) studija može se primijeniti kako bi se promatrala reverzibilnost, postojanost ili zakašnjelo pojavljivanje toksičnosti u razdoblju nakon tretiranja, odgovarajućeg trajanja, ali ne kraćeg od 14 dana. Satelitske (reverzibilne) skupine sastoje se od deset mužjaka i deset ženki koji se izlažu istodobno s pokusnim životinjama u glavnoj studiji. Skupine za satelitsku (reverzibilnu) studiju treba izlagati ispitivanoj kemikaliji na najvišoj razini koncentracije i moraju se provoditi paralelne kontrole zraka i/ili nosača (vidjeti stavak 18.).
                           
                        
                     Kontrolne životinje
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Sa životinjama iz paralelnih negativnih kontrola (zrak) treba postupati na jednak način kao i sa životinjama iz ispitne skupine osim što ih se izlaže filtriranom zraku, a ne ispitivanoj kemikaliji. Ako se voda ili druga tvar primjenjuje kao pomoć u stvaranju ispitne atmosfere, u studiju treba uključiti kontrolni nosač umjesto negativne (zrak) kontrolne skupine. Kada god je to moguće, kao nosač treba upotrebljavati vodu. Kada se kao nosač koristi voda, životinje iz kontrolne skupine treba izlagati zraku jednake relativne vlažnosti kao i izložene skupine. Odabir prikladnog nosača treba se temeljiti na prikladno provedenoj predstudiji ili povijesnim podacima. Ako nije poznata toksičnost medija, voditelj istraživanja može odlučiti da upotrijebi negativnu (zrak) kontrolu i kontrolu nosača, ali to se izričito destimulira. Ako povijesni podaci pokažu da nosač nije toksičan, nema potrebe za negativnom (zrak) kontrolnom skupinom i treba rabiti samo kontrolu nosača. Ako predstudija ispitivane kemikalije formulirane u nosaču ne pokaže nikakvu toksičnost, znači da nosač nije toksičan u ispitnoj koncentraciji te stoga ne treba provoditi kontrolu nosača.
                           
                        UVJETI IZLAGANJA
                  
                     Primjena koncentracija
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Životinje se izlažu ispitivanoj kemikaliji u vidu plina, pare, aerosola ili njihovih smjesa. Fizikalno stanje koje će se ispitivati ovisi o fizikalno-kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, odabranim koncentracijama i/ili fizikalnom stanju koje je obično prisutno tijekom manipulacije ispitivanom kemikalijom i njezine uporabe. Higroskopske i kemijski reaktivne ispitivane kemikalije treba ispitivati u uvjetima suhog zraka. Treba paziti kako bi se izbjeglo stvaranje eksplozivnih koncentracija. Materijali u česticama mogu se podvrgnuti mehaničkim procesima radi smanjenja veličine čestica. Ostale upute nalaze se u GD 39 (2).
                           
                        
                     Distribucija veličine čestica
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Određivanje veličine čestica treba provesti za sve aerosole i pare koje se mogu kondenzirati iz aerosola. Kako bi se omogućilo izlaganje svih relevantnih područja respiratornog trakta, preporuča se aerosol sa srednjim aerodinamičkim promjerom čestica (MMAD) u rasponu od 1 do 3 μm s geometrijskom standardnom devijacijom (σg) u rasponu od 1,5 do 3,0 (4). Iako treba učiniti razuman napor za postizanje tih standarda, ako se ne mogu postići, treba podnijeti stručno mišljenje. Primjerice, metalne čestice u isparini mogu biti manje od tog standarda, a napunjene čestice i vlakna mogu biti veći.
                           
                        
                     Priprema ispitivane kemikalije u nosaču
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Idealno bi bilo da se ispitivana kemikalija ispituje bez nosača. Ako je potrebno primijeniti nosač za stvaranje odgovarajuće koncentracije ispitivane tvari i veličine čestica, prednost treba dati vodi. Kad god se ispitivana kemikalija otapa u nosaču, treba dokazati njegovu stabilnost.
                           
                        PRAĆENJE UVJETA IZLAGANJA
                  
                     Protok zraka u komori
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Protok zraka u komori za izlaganje treba pažljivo kontrolirati, neprestano nadzirati te bilježiti najmanje jedanput u sat vremena tijekom svakog izlaganja. Nadziranje koncentracije (ili privremene stabilnosti) u ispitnoj atmosferi, provedeno u stvarnom vremenu, sastavna je mjera svih dinamičkih parametara i pruža neizravno sredstvo za kontrolu svih relevantnih parametara dinamičke inhalacije. Ako se koncentracija nadzire u stvarnom vremenu, učestalost mjerenja protoka zraka može se smanjiti na jedno mjerenje po izlaganju dnevno. Posebnu pozornost treba obratiti na izbjegavanje ponovnog udisanja u komorama za izlaganje samo nosom. Koncentracija kisika mora iznositi najmanje 19 %, a koncentracija ugljikova dioksida ne smije premašivati 1 %. Ako postoji opravdana sumnja da se takav standard ne može postići, treba mjeriti koncentraciju kisika i ugljikova dioksida. Ako mjerenja prvog dana izlaganja pokažu da su plinovi na pravilnoj razini, nisu potrebna daljnja mjerenja.
                           
                        
                     Temperatura i relativna vlažnost zraka u komori
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Temperaturu u komori treba održavati na 22 ± 3 °C. Relativnu vlažnost zraka u području udisanja životinja za izlaganje samo nosom i čitavim tijelom treba neprestano nadzirati i bilježiti svakoga sata tijekom svakog izlaganja kad je to moguće. Relativnu vlažnost zraka trebalo bi po mogućnosti održavati u rasponu od 30 do 70 %, no to može biti nemoguće (npr. u slučaju ispitivanja smjesa na bazi vode) ili nemjerljivo zbog utjecanja na ispitivanu kemikaliju pomoću ispitne metode.
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija: Nazivna koncentracija
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Kad god je to moguće, treba izračunati i zabilježiti nazivnu koncentraciju u komori za izlaganje. Nazivna koncentracija jest masa proizvedene ispitivane kemikalije podijeljena ukupnim volumenom zraka koji je prošao kroz sustav komore. Nazivna se koncentracija ne koristi za karakterizaciju izlaganja životinja nego usporedba nazivne koncentracije i stvarne koncentracije daje uvid u učinkovitost proizvodnje sustava ispitivanja te se stoga može upotrijebiti za otkrivanje problema pri proizvodnji.
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija: Stvarna koncentracija
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Stvarna koncentracija jest koncentracija ispitivane kemikalije uzorkovana u zoni udisanja životinja u komori za inhalaciju. Stvarne koncentracije mogu se dobiti specifičnim metodama (npr. izravnim uzorkovanjem, adsorpcijskim ili kemijskim reaktivnim metodama te analitičkom karakterizacijom nakon toga)ili nespecifičnim metodama poput gravimetrijske analize filtra. Primjena gravimetrijske analize prihvatljiva je samo za aerosole sa samo jednom komponentom u prahu ili aerosole tekućina niskog stupnja hlapljivosti i treba je podržati odgovarajućom preliminarnom karakterizacijom specifičnom za ispitivanu kemikaliju. Gravimetrijskom analizom može se odrediti i koncentracija aerosola s višekomponentnim prahom. No, za to su potrebni analitički podaci koji pokazuju da je sastav materijala koji se prenosi zrakom sličan početnom materijalu. Ako ta informacija nije dostupna, potrebna je ponovna analiza ispitivane kemikalije (idealno u stanju kada se prenosi zrakom) u pravilnim intervalima tijekom ispitivanja. Za agense, pod utjecajem aerosola, koji mogu ispariti ili sublimirati treba pokazati da su odabranom metodom skupljene sve faze.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Ako je moguće, tijekom trajanja studije treba upotrijebiti jednu partiju ispitivane kemikalije, a ispitivani uzorak treba skladištiti u uvjetima u kojima će biti očuvana njegova čistoća, homogenost i stabilnost. Prije početka studije treba odrediti svojstva ispitivane kemikalije, uključujući njezinu čistoću i, ako je tehnički izvedivo, identitet te količine identificiranih kontaminirajućih tvari i nečistoća. To se može pokazati sljedećim podacima, ali nije ograničeno na njih: vrijeme zadržavanja i relativno vršno područje, molekulska masa iz spektroskopskog mjerenja ili kromatografske analize plina ili sličnih procjena. Iako identitet ispitivanog uzorka nije odgovornost ispitnog laboratorija, za laboratorij može biti mudro barem u ograničenim okvirima potvrditi naručiteljevu karakterizaciju (npr. boju, fizikalno stanje itd.).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Atmosferu izlaganja treba održavati konstantnom koliko je god moguće. Uređaj za nadzor u stvarnom vremenu, kao što je fotometar za aerosol ili uređaj za analizu ukupnih ugljikovodika za paru može se upotrijebiti za dokazivanje stabilnosti uvjeta izlaganja. Stvarnu koncentraciju u komori treba mjeriti najmanje tri puta tijekom svakog dana izlaganja za svaku razinu izlaganja. Ako to nije izvedivo zbog ograničenog protoka zraka ili niskih koncentracija, prihvatljiv je jedan uzorak po razdoblju izlaganja. Uzorak se u idealnom slučaju uzima tijekom cijelog razdoblja izlaganja. Pojedinačni uzorci koncentracije u komori ne smiju od srednje koncentracije u komori odstupati za više od ± 10 % za plinove i pare i ne za više od ± 20 % za tekućine ili kruti aerosol. Treba izračunati i zabilježiti vrijeme za postizanje ravnoteže u komori (t95). Trajanje izlaganja zahvaća vrijeme proizvodnje ispitivane kemikalije. Pritom se vodi računa o vremenu potrebnom za postizanje ravnoteže u komori (t95) i vremenu raspada. Smjernica za procjenu t95 može se pronaći u GD 39 (2).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Za vrlo složene smjese sastavljene od plinova/para i aerosola (npr. zapaljive atmosfere i i ispitivane kemikalije izbačene iz namjenskih proizvoda/uređaja za krajnju uporabu) svaka se faza može ponašati drukčije u komori za inhalaciju. Stoga treba odabrati najmanje jedan indikator (analiziranu tvar), obično glavni aktivni sastojak smjese, svake faze (plin/para i aerosol). Kada je ispitivana kemikalija smjesa, treba izvijestiti o analitičkoj koncentraciji ukupne smjese, a ne samo za aktivni sastojak ili indikator (analiziranu tvar). Dodatne informacije o stvarnim koncentracijama mogu se pronaći u GD 39 (2).
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija: Distribucija veličine čestica
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Distribuciju veličine čestica u aerosolu treba odrediti najmanje jedanput tjedno za svaku razinu koncentracije uporabom kaskadnog impaktora ili alternativnog instrumenta poput uređaja za aerodinamičku analizu veličine čestica (APS). Ako se može dokazati da su rezultati dobiveni kaskadnim impaktorom i alternativnim instrumentom ekvivalentni, u studiji se može upotrebljavati alternativni instrument.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Drugi uređaj, poput gravimetrijskog filtra ili uređaja za sudaranje/uređaja za mjerenje mjehurića plina, treba upotrijebiti paralelno s primarnim instrumentom kako bi se potvrdila učinkovitost skupljanja primarnog instrumenta. Koncentracija mase dobivena analizom veličine čestica trebala bi biti u razumnim granicama koncentracije mase dobivene analizom filtracijom [vidjeti GD 39 (2)]. Ako se ekvivalentnost može dokazati na svim koncentracijama ispitanima u ranoj fazi istraživanja, mogu se izostaviti daljnja mjerenja radi potvrde. Radi dobrobiti životinja treba provoditi mjerenja kako bi se minimalizirali nedefinitivni podaci koji mogu izazvati potrebu za ponavljanjem studije.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Određivanje veličine čestica treba provesti za pare ako postoji ikakva mogućnost da bi kondenzacijom pare mogao nastati aerosol ili ako su u čestice otkrivene u atmosferi pare s potencijalom za miješane faze.
                           
                        OPAŽANJA
                  
                              32.
                           
                           
                              Životinje treba klinički promatrati prije, tijekom i nakon razdoblja izlaganja. Češća opažanja mogu biti potrebna ovisno o reakciji životinja tijekom izlaganja. Ako primjena cijevi koje sputavaju, slabo osvijetljenih komora za čitavo tijelo ili neprozirna atmosfera ometaju opažanje na životinjama, opažanje treba pažljivo obaviti nakon izlaganja. Opažanja prije izlaganja sljedećeg dana mogu ocijeniti reverzibilnost ili pogoršanje toksičnih učinaka.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Sva se opažanja bilježe u pojedinačnim evidencijama za svaku životinju. Ako se životinje usmrte zbog humanih razloga ili ih se pronađe uginule, vrijeme ugibanja treba zabilježiti što je moguće preciznije.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Opažanja u kavezu moraju uključivati promjene na koži i krznu, očima i sluznicama te promjene u dišnom i cirkulacijskom sustavu, promjene u živčanom sustavu te promjene u somatomotoričkoj aktivnosti i uzorcima ponašanja. Treba obratiti pozornost na opažanje tremora, konvulzija, salivacije, dijareje, letargije, spavanja i kome. Mjerenje rektalne temperature može pružiti dodatne dokaze o refleksnoj bradipneji ili hipo/hipertermiji povezanoj s tretiranjem ili držanjem u zatvorenom. U protokol studije mogu se uključiti i dodatna određivanja, kao što su kinetika, biološki monitoring, funkcija pluća, retencija slabo topljivih materijala koji se nakupljaju u plućnom tkivu te promjene u ponašanju.
                           
                        TJELESNA MASA
                  
                              35.
                           
                           
                              Pojedinačnu masu životinja treba zabilježiti kratko prije prvog izlaganja (0. dan) te zatim dvaput tjedno (na primjer: petkom i ponedjeljkom kako bi se dokazao oporavak preko vikenda bez izlaganja ili u vremenskim intervalima kako bi se omogućilo utvrđivanje sistemske toksičnosti) te u vrijeme ugibanja ili usmrćivanja. Ako u prva četiri tjedna nema učinaka, tijekom ostatka studije tjelesna se masa može mjeriti jedanput tjedno. Satelitske (reverzibilne) životinje (ako se koriste) treba nastaviti vagati jedanput tjedno tijekom čitavog razdoblja oporavka. Na kraju istraživanja sve životinje treba izvagati kratko prije usmrćenja kako bi se omogućilo nepristrano određivanje odnosa mase organa i tjelesne mase.
                           
                        UNOS HRANE I VODE
                  
                              36.
                           
                           
                              Unos hrane treba mjeriti jedanput tjedno. Također se može mjeriti i unos vode.
                           
                        KLINIČKA PATOLOGIJA
                  
                              37.
                           
                           
                              Kliničko-patološke pretrage treba obaviti za sve životinje uključujući kontrolnu i satelitsku (reverzibilnu) skupinu u trenutku usmrćivanja. Treba zabilježiti vremensko razdoblje između kraja izlaganja i prikupljanja krvi, posebno ako je rekonstrukcija ciljanog krajnjeg učinka brza. Uzorkovanje nakon završetka izlaganja indicirano je za parametre s kratkim poluvremenom plazme (npr. COHb, CHE, i MetHb).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              U tablici 1. navedeni su kliničko-patološki parametri koji se općenito traže za sva toksikološka ispitivanja. Analiza urina ne traži se rutinski, ali se može provesti ako se smatra korisnom na temelju očekivane ili opažene toksičnosti. Voditelj istraživanja može odlučiti da odredi i dodatne parametre radi bolje karakterizacije toksičnosti ispitivane kemikalije (npr. kolinesterazu, lipide, hormone, ravnotežu kiselina i lužina, methemoglobin ili Heinzova tjelešca, kreatin kinazu, omjer mijeloida i eritroida, troponin, plinove u arterijskoj krvi, laktat dehidrogenazu, sorbitol dehidrogenazu, glutamat dehidrogenazu i gama glutamil transpeptidazu).
                              
                                 Tablica 1.
                              
                              
                                 Standardni kliničko-patološki parametri
                              
                              
                                          Hematologija
                                       
                                    
                                          Broj eritrocita
                                          Hematokrit
                                          Koncentracija hemoglobina
                                          Prosječna masa hemoglobina
                                          Prosječni volumen eritrocita
                                          Prosječna koncentracija hemoglobina u eritrocitima
                                          Retikulociti
                                       
                                       
                                          Ukupni broj leukocita
                                          Diferencijalni broj leukocita
                                          Broj trombocita
                                          Vrijeme zgrušavanja (odabrati jedno):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Protrombinsko vrijeme
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Vrijeme zgrušavanja
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Parcijalno tromboplastinsko vrijeme
                                                   
                                                
                                    
                                          Klinička kemija
                                       
                                    
                                          Glukoza (9)
                                          
                                          Ukupni kolesterol
                                          Trigliceridi
                                          Dušična urea u krvi
                                          Ukupni bilirubin
                                          Kreatinin
                                          Ukupni proteini
                                          Albumini
                                          Globulini
                                       
                                       
                                          Alanin aminotransferaza
                                          Aspartat aminotransferaza
                                          Alkalna fosfataza
                                          Kalij
                                          Natrij
                                          Kalcij
                                          Fosfor
                                          Kloridi
                                       
                                    
                                          Analiza urina (opcija)
                                       
                                    
                                          Izgled (boja i zamućenost)
                                          Volumen
                                          Specifična težina ili osmolalnost
                                          pH
                                       
                                       
                                          Ukupni proteini
                                          Glukoza
                                          Krv/krvne stanice
                                       
                                    
                        
                              39.
                           
                           
                              Ako postoji dokaz da je donji respiratorni trakt (tj. alveole) primarno mjesto taloženja i retencije, bronhoalveolarno ispiranje (BAL) može biti tehnika izbora za kvantitativnu analizu hipotetski utemeljenih parametara učinka doze fokusiranih na alveolitis, upalu pluća i fosfolipidozu. To omogućuje prikladno i temeljito istraživanje promjena u ozljedama na alveolama povezanih s reakcijama na dozu i protok vremena. Tekućina za BAL mora se analizirati radi ukupnog i diferencijalnog broja leukocita, ukupnog broja proteina i laktat dehidrogenaze. Drugi parametri koji se mogu uzeti u obzir jesu parametri indikativni za lizosomalne bolesti, fosfolipidozu te iritacijske ili alergijske upale koje mogu uključivati određivanje proupalnih citokineza/kemokineza. Mjerenja BAL obično upotpunjuju rezultate histopatoloških pretraga, ali ih ne mogu zamijeniti. Upute za provođenje ispiranja pluća nalaze se u GD 39 (2).
                           
                        OFTALMOLOŠKI PREGLED
                  
                              40.
                           
                           
                              Primjenom oftalmoskopa ili ekvivalentnog uređaja treba obaviti pregled fundusa, refrakcijskih medija, šarenice i konjunktive za sve životinje prije primjene ispitivane kemikalije te za sve na skupine izložene visokoj koncentraciji i kontrolne skupine na kraju. Ako se otkriju promjene u očima, treba pregledati sve životinje u ostalim skupinama uključujući satelitsku (reverzibilnu) skupinu.
                           
                        MAKROSKOPSKA PATOLOGIJA I MASA ORGANA
                  
                              41.
                           
                           
                              Sve pokusne životinje, uključujući i one koje su tijekom ispitivanja uginule ili su uklonjene iz studije radi svoje dobrobiti, treba podvrgnuti kompletnim pretragama (ako je izvedivo) i makroskopskoj analizi. Treba zabilježiti vrijeme između kraja posljednjeg izlaganja svake životinje i njezina usmrćivanja. Ako se obdukcija ne može provesti neposredno nakon otkrića uginule životinje, životinju treba ohladiti (ne zamrznuti) na dovoljno niskim temperaturama kako bi se razgradnja svela na minimum. Obdukciju treba provesti što je moguće prije, obično u roku od jednog ili dva dana. Za svaku životinju treba zabilježiti sve makroskopske patološke promjene uz poseban naglasak na promjenama u respiratornom traktu.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              U tablici 2. nalazi se popis organa i tkiva koje tijekom makroskopske analize treba sačuvati u odgovarajućem mediju radi histopatoloških pretraga. Čuvanje [točno određenih] organa i tkiva te drugih organa i tkiva prepušteno je voditelju istraživanja. Masno otisnute organe treba obrezati i izvagati što je moguće prije nakon sekcije kako bi se izbjeglo njihovo sušenje. Štitnjaču i epididimise treba izvagati samo ako je potrebno jer obrezivanje artefakata može spriječiti histopatološku procjenu. Tkiva i organe treba fiksirati u puferiranom 10 % formalinu ili drugom prikladnom fiksativu odmah nakon provedene obdukcije, i to, dakle, ne kraće od 24 - 48 sati prije obrezivanja ovisno o primijenjenom fiksativu.
                              
                                 Tablica 2.
                              
                              
                                 Organi i tkiva sačuvani tijekom makroskopske analize
                              
                              
                                 Nadbubrežne žlijezde
                              
                              Aorta
                              Koštana srž (i/ili svježi aspirat)
                              
                                 Mozak (uključujući sekcije velikog i malog mozga te medule/mosta)
                              Cekum
                              Debelo crijevo
                              Dvanaesnik
                              [Epididimisi]
                              [Oči (mrežnica, očni živac) i očni kapci]
                              Bedrena kost i zglob koljena
                              Žučni mjehur (ako postoji)
                              [Harderove žlijezde]
                              
                                 Srce
                              
                              Ileum
                              Jejunum
                              
                                 Bubrezi
                              
                              [Suzne žlijezde (ekstraorbitalne)]
                              Grkljan (3 razine uključujući bazu epiglotisa)
                              
                                 Jetra
                              
                              
                                 Pluća (svi režnjevi na jednoj razini, uključujući glavni bronh)
                              Limfni čvorovi iz hilarne regije pluća, posebno za slabo topljive ispitivane kemikalije u česticama. Za dublje pretrage i/ili istraživanja s imunološkim fokusom u obzir se mogu uzeti dodatni limfni čvorovi, npr. iz medijastinalne, cervikalne/submandibularne i/ili aurikularne regije.
                              Limfni čvorovi (udaljeni od ulaza)
                              Mliječne žlijezde (ženske)
                              Mišić (bedro)
                              Nazofaringealna tkiva (najmanje 4 razine: 1 razina za uključivanje nazofaringealnog kanala i nazalno limfatičko tkivo (NALT))
                              Jednjak
                              [Olfaktorni bulbus]
                              
                                 Jajnici
                              
                              Gušterača
                              Paraštitna žlijezda
                              Periferni živac (bedreni ili tibijalni, po mogućnosti blizu mišića)
                              Hipofiza
                              Prostata
                              Rektum
                              Žlijezde slinovnice
                              Sjemenski mjehurići
                              Koža
                              Kralježnica (vratna, srednja prsna i slabinska)
                              
                                 Slezena
                              
                              Prsna kost
                              Želudac
                              Zubi
                              
                                 Testisi
                              
                              
                                 Timus
                              
                              
                                 Štitne žlijezde
                              
                              [Jezik]
                              Dušnik (najmanje 2 razine uključujući 1 longitudinalnu sekciju kroz greben i 1 transverzalnu sekciju)
                              [Mokraćovod]
                              [Mokraćna cijev]
                              Mokraćni mjehur
                              
                                 Maternica
                              
                              Organi mete
                              Sve makroskopske lezije i mase
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Pluća treba ukloniti netaknuta, izvagati te polako nalijevati prikladnim fiksativom pod tlakom od 20 - 30 cm vode kako bi se osiguralo održanje strukture pluća (5). Sekcije treba prikupiti za sve režnjeve jedne razine, uključujući glavni bronh, ali ako je provedeno ispiranje pluća, neisprani režanj treba secirati na tri razine (ne serijske sekcije).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Treba ispitati najmanje četiri razine nazofaringealnih tkiva, a jedna od njih mora uključivati nazofaringealni kanal (5) (6) (7) (8) (9) kako bi se omogućilo potpuno ispitivanje ljuskavog, tranzicijskog (necilijarnog respiratornog), respiratornog (cilijarnog respiratornog) i olfaktornog epitela te drenažno limfatično tkivo (NALT; 10, 11). Treba ispitati tri razine grkljana, a jedna od njih mora obuhvaćati bazu epiglotisa (12). Treba ispitati najmanje dvije razine dušnika uključujući jednu longitudinalnu sekciju kroz greben mjesta razdvajanja ekstrapulmonalnog bronha te jednu transverzalnu sekciju.
                           
                        HISTOPATOLOGIJA
                  
                              45.
                           
                           
                              Treba provesti histopatološku procjenu svih organa i tkiva navedenih u tablici 2. za kontrolnu skupinu i skupinu izloženu visokoj koncentraciji te za sve životinje koje uginu ili su usmrćene tijekom studije. Posebnu pozornost treba posvetiti respiratornom traktu, organima metama te makroskopskim lezijama. Organe i tkiva s lezijama u skupini izloženoj visokoj koncentraciji treba ispitati u svim skupinama. Voditelj istraživanja može odlučiti provesti histopatološke pretrage za dodatne skupine kako bi dokazao jasnu reakciju na koncentraciju. Ako se upotrebljava satelitska (reverzibilna) skupina, histopatološku procjenu treba provesti na svim tkivima i organima za koje je u tretiranim skupinama utvrđeno da pokazuju učinke. U slučaju pojavljivanja prekomjernog broja uginulih životinja ili drugih problema u skupini izloženoj visokoj koncentraciji, koje kompromitiraju značenje podataka, histopatološku analizu treba provesti na sljedećoj nižoj koncentraciji. Treba pokušati povezati makroskopska opažanja s mikroskopskim nalazima.
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Podaci
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Treba navesti individualne podatke o tjelesnoj masi, potrošnji hrane, kliničkoj patologiji, makroskopskoj patologiji, masi organa te histopatologiji. Podatke prikupljene kliničkim promatranjem treba skupiti u obliku tablice, prikazujući za svaku ispitnu skupinu broj upotrijebljenih životinja, broj životinja koje pokazuju specifične znakove toksičnosti, broj životinja koje su tijekom ispitivanja pronađene uginule ili su usmrćene iz humanih razloga, vrijeme uginuća pojedinih životinja, opis i vremenski tijek te reverzibilnost toksičnih učinaka i nalaze obdukcije. Sve rezultate, kvantitativne i popratne, treba ocijeniti odgovarajućom statističkom metodom. Može se upotrijebiti bilo koja opće prihvaćena statistička metoda, a statističke metode treba odabrati tijekom planiranja studije.
                           
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Izvješće o ispitivanju treba, ako je primjereno, sadržavati sljedeće informacije:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusne životinje i njihov uzgoj
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Opis uvjeta u kavezu, uključujući: broj (ili promjenu broja) životinja u svakom kavezu, materijal podloge, temperaturu i relativnu vlažnost zraka u kavezu, razdoblje svjetla i tame, identifikaciju prehrane.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Korištena vrsta/soj i obrazloženje za uporabu druge vrste osim štakora. Mogu se navesti podrijetlo i povijesni podaci ako potječu od životinja izloženih u sličnim uvjetima izlaganja, smještaja i posta.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Broj, dob i spol životinja.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Metoda nasumičnog odabira.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Opis svih kondicioniranja prije ispitivanja, uključujući prehranu, karantenu i liječenje bolesti.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana kemikalija
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Fizikalna narav, čistoća te, ako je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva (uključujući izomerizaciju).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Identifikacijski podaci i broj registracije Chemical Abstract Services (CAS) ako je poznat.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosač
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Obrazloženje za uporabu nosača i obrazloženje za odabir nosača (ako nije voda).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Povijesni ili odgovarajući podaci koji pokazuju da nosač ne ometa rezultate studije.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Komora za inhalaciju
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Detaljan opis komore za inhalaciju, uključujući volumen i dijagram.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Podrijetlo i opis opreme korištene za izlaganje životinja te stvaranje atmosfere.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Oprema za mjerenje temperature, vlažnosti, veličine čestica te stvarne koncentracije.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Izvor zraka i sustav za klimatizaciju.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Metode korištene za kalibriranje opreme radi osiguravanja homogene atmosfere za ispitivanje.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Razlika u tlaku (pozitivna ili negativna).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Otvori za izlaganje po komori (samo nos); lokacija životinja u sustavu (čitavo tijelo).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Stabilnost ispitne atmosfere.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Lokacija senzora temperature i vlažnosti te uzorkovanje ispitne atmosfere u komori.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tretiranje dovodnog/ekstrahiranog zraka.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Količina protoka zraka, otvor za količinu protoka zraka po izlaganju (samo nos) ili dovod životinja po komori (čitavo tijelo).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Vrijeme za postizanje ravnoteže u komori za inhalaciju (t95).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Broj promjena u volumenu po satu.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uređaji za mjerenje (ako je primjenjivo).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podaci o izlaganju
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Argumentacija za odabir ciljane koncentracije u glavnoj studiji.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nazivne koncentracije (ukupna masa ispitivane kemikalije proizvedena u komori za inhalaciju podijeljena volumenom zraka koji je prošao kroz komoru).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Stvarne koncentracije ispitivane kemikalije iz zone udisanja životinja; za smjese koje stvaraju heterogene fizikalne oblike (plinove, pare, aerosol) svaka se može analizirati odvojeno.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Sve koncentracije zraka treba navesti u jedinicama mase (mg/l, mg/m3 itd.), a ne u jedinicama volumena (ppm, ppb itd.).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Distribucija veličine čestica, srednji aerodinamički promjer čestica (MMAD) te geometrijska standardna devijacija (σg) uključujući metode za njihov izračun. Treba prikazati pojedinačne analize veličine čestica.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Detalji o pripremi ispitivane kemikalije, uključujući i detalje o svim postupcima korištenima za smanjenje veličine čestica krutih tvari ili za pripremu otopina ispitivane kemikalije.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Opis (po mogućnosti uz dijagram) opreme korištene za stvaranje ispitne atmosfere te izlaganje životinja ispitnoj atmosferi.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Pojedinosti o opremi korištenoj za nadziranje temperature, vlažnosti i protoku zraka u komori (tj. razvoj kalibracijske krivulje).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Pojedinosti o opremi korištenoj za skupljanje uzoraka za određivanje koncentracije u komori i distribuciju veličine čestica.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Pojedinosti o korištenoj kemijskoj analitičkoj metodi i potvrdi metode (uključujući učinkovitost rekuperacije ispitivane kemikalije iz medija za uzorkovanje).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Metoda nasumičnog odabira za svrstavanje životinja u ispitnu i kontrolnu skupinu.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uključujući tip/izvor hrane, izvor vode).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Argumentacija za odabir ispitnih koncentracija.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz temperature, vlažnosti zraka i protoka zraka u komori.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz podataka o nazivnoj i stvarnoj koncentraciji u komori.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz podataka u veličini čestica, uključujući podatke o skupljenim analitičkim uzorcima, distribuciju veličina čestica te izračune MMAD i σg.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz podataka o reakciji i razini koncentracije za svaku životinju (npr. životinje koje pokazuju znakove toksičnosti uključujući smrtnost, narav, stupanj, vrijeme nastupanja i trajanja učinaka).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz pojedinačne mase životinja.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz unosa hrane.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz kliničko-patoloških podataka.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nalazi obdukcije i histopatološki nalazi za svaku životinju ako su dostupni.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rasprava i tumačenje rezultata
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Poseban naglasak treba staviti na opis metoda korištenih za ispunjavanje kriterija ove ispitne metode, npr. graničnu koncentraciju ili veličinu čestica.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Treba raspravljati o sposobnosti udisanja čestica u svjetlu općih nalaza, posebno ako se nisu mogli ispuniti kriteriji za veličinu čestica.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      U opću ocjenu studije treba uključiti dosljednost metoda korištenih za određivanje nazivnih i stvarnih koncentracija te odnos stvarne koncentracije prema nazivnoj.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Treba se pozabaviti uzrokom smrti i prevladavajućim načinom djelovanja (sistemski u odnosu na lokalni).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      U slučaju humanog usmrćivanja životinja koje su patile ili pokazivale znakove velikog i trajnog stresa treba pružiti objašnjenje na temelju kriterija iz Smjernice za humano usmrćivanje OECD-a (3).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Treba identificirati organ/e metu/e.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Treba odrediti NOAEL i LOAEL.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1981.). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Pariz.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              OECD (2000.). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Whalan.E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Uredba (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vijeća od 16. prosinca 2008. o razvrstavanju, označavanju i pakiranju tvari i smjesa, kojom se izmjenjuju i dopunjuju i ukidaju Direktiva 67/548/EEZ i 1999/45/EZ te izmjenjuje i dopunjuje Uredba (EZ) br. 1907/2006, SL L 353, 31.12.2008., str. 1.
                           
                        
                     Dodatak 1.
                     DEFINICIJA
                     Ispitivana kemikalija: Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne metode.
                  
                  B.30.   STUDIJE KRONIČNE TOKSIČNOSTI
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 452 (2009.). Originalna Smjernica za ispitivanje 452 usvojena je 1981. Smatralo se da je nužno razviti ovu revidiranu ispitnu metodu B.30 kako bi se odrazio skorašnji razvoj u području dobrobiti životinja i regulatornih zahtjeva (1) (2) (3) (4). Ažuriranje ove ispitne metode B.30 provedeno je paralelno s revizijom Poglavlja B.32 ovog Priloga, Test karcinogenosti te Poglavlja B.33 ovog Priloga, Kombinirani test kronične toksičnosti/karcinogenosti, s ciljem dobivanja dodatnih informacija od korištenih životinja i skupljanja daljnjih pojedinosti o odabiru doza. Ova ispitna metoda namijenjena je primjeni u ispitivanju širokog spektra kemikalija, uključujući pesticide i industrijske kemikalije.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Većina studija kronične toksičnosti provodi se na vrstama glodavaca, stoga i ovu ispitnu metodu treba primjenjivati prvenstveno u studijama koje se provode na tim vrstama. Ako se takve studije traže na vrstama ne-glodavaca, također se mogu primijeniti načela i postupci izloženi u ovoj ispitnoj metodi, zajedno s onima izloženima u Poglavlju B.27 ovog Priloga, 90-dnevno ispitivanje oralne toksičnosti na ne-glodavcima uz primjenu ponavljanih doza (5), uz odgovarajuće izmjene, kao što je izneseno u Smjernici za OECD-a br. 116 u vezi s planiranjem i provođenjem studija kronične toksičnosti i karcinogenosti (6).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Tri glavna načina primjene upotrijebljena u studijama toksičnosti jesu oralni, dermalni i inhalacijski. Odabir načina primjene ovisi o fizikalnim i kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije te o pretežnom načinu izlaganja ljudi. Dodatne informacije o odabiru načina izlaganja navedene su u Smjernici OECD-a br. 116 (6).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda usmjerena je na izlaganje oralnim putem, što je najčešće korišteni način u studijama kronične toksičnosti. Dok dugotrajne studije kronične toksičnosti, koje uključuju izlaganje preko kože ili inhalacijom, mogu također biti potrebne i/ili se mogu tražiti pod određenim regulatornim režimima radi određivanja rizika za ljude, oba načina izlaganja uključuju znatnu tehničku složenost. Takve studije treba isplanirati za svaki slučaj posebno iako ovdje izložena ispitna metoda za utvrđivanje i procjenu kronične toksičnosti oralnom primjenom može činiti temelj protokola za studije primjene inhalacijom i/ili dermalnim putem, s obzirom na preporuke za razdoblja tretiranja, kliničke i patološke parametre itd. Dostupna je Smjernica OECD-a za primjenu ispitivanih kemikalija inhalacijom (6) (7) i dermalnim putem (6). Poglavlje B.8 ovog Priloga (8) i Poglavlje B.29 ovog Priloga (9), zajedno sa Smjernicom OECD-a za ispitivanje akutne inhalacije (7), trebaju se pomno proučiti pri planiranju dugotrajnijih studija koje uključuju izlaganje inhalacijom. Poglavlje B.9 ovog Priloga (10) treba uzeti kao pomoć pri ispitivanju provedenom dermalnim putem.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Studija kronične toksičnosti pruža informacije o mogućim rizicima za zdravlje koji će se vjerojatno pojaviti zbog ponovljenog izlaganja kroz dulje životno razdoblje korištenih vrsta. Ta će studija pružiti informacije o toksičnim učincima ispitivane kemikalije, ukazati na organe mete te mogućnost akumulacije. Također može pružiti procjenu neopaženih štetnih učinaka koja se može upotrijebiti za određivanje sigurnosnih kriterija za izlaganje ljudi. Također je naglašena potreba za pažljivim kliničkim opažanjima životinja radi dobivanja što je moguće više informacija.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Ciljevi studije obuhvaćeni ovom ispitnom metodom uključuju:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikaciju kronične toksičnosti ispitivane kemikalije,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikaciju organa meta,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          karakterizaciju odnosa doze i reakcije,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identifikaciju razine neopaženih štetnih učinaka (NOAEL) ili polazne točke za određivanje referentne doze za usporedbu (benchmark dose, BMD),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          predviđanje učinaka kronične toksičnosti na razinama ljudskog izlaganja,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pružanje podataka za ispitivanje pretpostavki u svezi s načinom djelovanja (6).
                                       
                                    
                        UVODNA RAZMATRANJA
                  
                              7.
                           
                           
                              U određivanju i procjeni toksikoloških svojstava ispitivane kemikalije ispitni laboratorij prije provođenja studije mora u obzir uzeti sve dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji kako bi se planiranje studije usmjerilo na učinkovitije ispitivanje potencijala kronične toksičnosti te kako bi se na minimum svela primjena životinja. Informacije koje će pomoći u planiranju studije obuhvaćaju identitet, kemijsku strukturu i fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije, sve informacije o načinu djelovanja, rezultate svih ispitivanja toksičnosti in vitro ili in vivo, očekivanu/e primjenu/e i potencijal za ljudsko izlaganje, dostupne podatke (Q)SAR i toksikološke podatke o kemikalijama srodne strukture, dostupne toksikokinetičke podatke (kinetika jedne doze i ponovljene doze ako je dostupno) te podatke dobivene u drugim studijama s ponovljenim izlaganjem. Određivanje kronične toksičnosti treba provesti nakon dobivanja početnih informacija o toksičnosti iz 28-dnevnog i/ili 90-dnevnog ispitivanja toksičnosti uz primjenu ponavljanih doza. Pristup s fazama u ispitivanju kronične toksičnosti treba smatrati dijelom ukupnog utvrđivanja potencijalno štetnih učinaka dotične ispitivane kemikalije po zdravlje (11) (12) (13) (14).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Prije početka studije treba odrediti najprikladnije statističke metode za analizu rezultata s obzirom na plan i ciljeve pokusa. Pitanja koja valja uzeti u obzir jesu treba li statistika uključivati prilagodbu za preživljavanje i analizu u slučaju prijevremenog kraja jedne ili više skupina. Smjernice o odgovarajućim statističkim analizama i ključnim referencama na međunarodno prihvaćene statističke metode nalaze se u Smjernici br. 116. (6) te također u Smjernici br. 35. za analizu i ocjenu studija kronične toksičnosti i karcinogenosti (15).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Pri provođenju studije kronične toksičnosti uvijek treba slijediti načela i razloge izložene u OECD-ovoj Smjernici br. 19. o prepoznavanju, utvrđivanju i primjeni kliničkih znakova kao humanih krajnjih učinaka za pokusne životinje korištene u procjeni sigurnosti (16), posebno u njezinom stavku 62. U tom stavku stoji da ‚u studijama uz primjenu ponovljenog doziranja, kada životinje pokazuju progresivne kliničke znakove koji izazivaju daljnje pogoršanje stanja, treba donijeti upućenu odluku o tome treba li humano usmrtiti životinje ili ne. Odluka treba uključivati razloge s obzirom na vrijednost informacija dobivenih iz trajnog održavanja te životinje u studiji s obzirom na njezino opće stanje. Ako se odluči zadržati životinju u ispitivanju, učestalost opažanja treba povećati u skladu s potrebama. Također se može privremeno prekinuti s doziranjem ako će to olakšati patnju ili stres ili smanjiti ispitnu dozu bez štetnih utjecaja na svrhu ispitivanja.’
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Detaljne upute za načela odabira doza za studije kronične toksičnosti i karcinogenosti te rasprava o njima mogu se pronaći u Smjernici br. 116. (6), kao i u dvije publikacije instituta International Life Sciences Institute (17) (18). Osnovna strategija odabira doza ovisi o primarnom cilju ili primarnim ciljevima studije (stavak 6.). Pri odabiru odgovarajućih razina doza treba postići ravnotežu između procjene opasnosti s jedne strane i karakterizacije reakcija na nisku dozu te njihovo značenje s druge strane. To je posebno relevantno u situaciji u kojoj treba provesti kombiniranu studiju kronične toksičnosti i karcinogenosti (Poglavlje B.33 ovog Priloga) (stavak 11.).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Treba navesti razloge za provođenje kombinirane studije kronične toksičnosti i karcinogenosti (Poglavlje B.33 ovog Priloga), a ne odvojeno provođenje studije kronične toksičnosti (ova ispitna metoda B.30) i karcinogenosti (Poglavlje B.32 ovog Priloga). Kombinirano ispitivanje pruža veću učinkovitost što se tiče vremena i troškova u usporedbi s provođenjem dviju zasebnih studija, bez kompromitiranja kvalitete podataka u kroničnoj fazi niti u kancerogenoj fazi. Pri provođenju kombinirane studije kronične toksičnosti i karcinogenosti (Poglavlje B.33 ovog Priloga) treba pažljivo razmisliti o načelima odabira doza (stavci 9. i 20. - 25.) te se također priznaje da pod određenim regulatornim okvirima mogu biti nužne odvojene studije.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se na kraju ovog poglavlja i u Smjernici br. 116. (6).
                           
                        NAČELO ISPITIVANJA
                  
                              13.
                           
                           
                              Ispitivana kemikalija daje se svakodnevno u postupnim dozama raznim skupinama pokusnih životinja, obično u razdoblju od 12 mjeseci iako se mogu odabrati dulja ili kraća trajanja ovisno o regulatornim zahtjevima (vidjeti stavak 33.). Odabire se dovoljno dugo vrijeme koje bi omogućilo manifestaciju učinaka kumulativne toksičnosti bez miješanja s učincima gerijatrijskih promjena. Treba obrazložiti odstupanja od trajanja izlaganja od 12 mjeseci, posebno u slučajevima kraćeg trajanja. Ispitivana kemikalija obično se primjenjuje oralnim putem iako se može primijeniti i ispitivanje inhalacijom ili dermalnim putem. Planiranje studije također može uključivati jedno ili više usmrćivanja u međuvremenu, npr. s tri i šest mjeseci, i mogu se uključiti dodatne skupine životinja kako bi se to kompenziralo (vidjeti stavak 19.). Tijekom razdoblja primjene životinje se pomno promatraju radi otkrivanja znakova toksičnosti. Životinje koje ugibaju ili su usmrćene tijekom ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a na kraju ispitivanja preživjele se životinje usmrćuju i podvrgavaju obdukciji.
                           
                        OPIS METODE
                  
                     Odabir životinjske vrste
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda prvenstveno obuhvaća određivanje i ocjenu kronične toksičnosti u glodavaca (vidjeti stavak 2.) iako se priznaje da pod određenim regulatornim režimima mogu biti potrebne slične studije na ne-glodavcima. Treba obrazložiti odabir vrsta. Planiranje i provođenje studija kronične toksičnosti na vrstama ne-glodavaca, ako je potrebno, treba temeljiti na načelima izloženima u ovoj ispitnoj metodi zajedno s načelima iz Poglavlja B.27 ovog Priloga, 90-dnevna studija oralne toksičnosti uz primjenu ponavljanih doza na ne-glodavcima (5). Dodatne informacije o odabiru vrste i soja navedene su u Smjernici br. 116. (6).
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Prednost se u ovoj ispitnoj metodi daje štakorima kao vrsti glodavaca iako se mogu upotrijebiti i druge vrste glodavaca, npr. miševi. Štakori i miševi preferirani su pokusni modeli zbog relativno kratkog životnog vijeka, raširene primjene u farmakološkim i toksikološkim studijama, osjetljivosti na izazivanje tumora te dostupnosti dovoljno karakteriziranih sojeva. Kao posljedica tih svojstava, dostupno je mnogo informacija o njihovoj fiziologiji i patologiji. Treba upotrijebiti mlade zdrave odrasle životinje sojeva koji su uobičajeni u laboratorijskoj praksi. Studiju kronične toksičnosti treba provesti na životinjama istog soja i podrijetla kao i životinje korištene u preliminarnoj/im studiji/-ama toksičnosti kraćeg trajanja. Treba upotrebljavati ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne.
                           
                        
                     Uvjeti smještaja i hranjenja
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Životinje moraju biti smještene pojedinačno ili u kavezima u malim skupinama istog spola; pojedinačni smještaj treba uzeti u obzir samo ako je znanstveno opravdan (19) (20) (21). Kaveze treba rasporediti na način da se učinci do kojih bi moglo doći zbog položaja kaveza svedu na minimum. Temperatura u prostoriji s pokusnim životinjama morala bi iznositi 22 °C (± 3 °C). Premda bi relativna vlažnost zraka trebala iznositi najmanje 30 % te po mogućnosti ne premašivati 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50 - 60 %. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može primjenjivati konvencionalna laboratorijska prehrana uz neograničene količine pitke vode. Prehrana mora ispunjavati sve nutritivne potrebe ispitivanih vrsta, a udio tvari koje kontaminiraju hranu - uključujući ostatke pesticida, postojane organske zagađivače, fitoestrogene, teške metale i mikotoksine, ali ne ograničeno na njih - koje mogu utjecati na rezultat ispitivanja treba biti što je moguće manji. Analitičke informacije o razinama tvari koje kontaminiraju hranjive tvari i prehranu treba izrađivati periodično, barem na početku studije te u slučaju promjene u primijenjenoj seriji, i treba ih uključiti u završno izvješće. Također treba pružiti analitičke informacije o vodi za piće korištenoj u istraživanju. Na odabir prehrane može utjecati potreba za osiguranjem prikladnih dodataka ispitivane kemikalije i ispunjavanjem nutritivnih potreba životinja ako se ispitivana kemikalija primjenjuje kroz hranu.
                           
                        
                     Priprema životinja
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Treba upotrijebiti zdrave životinje koje su se aklimatizirale na laboratorijske uvjete najmanje sedam dana i koje nisu izlagane prethodnim pokusnim postupcima. U slučaju glodavaca doziranje životinja treba početi što je moguće prije nakon prestanka odbijanja od sise i aklimatizacije te po mogućnosti prije nego što životinje navrše osam tjedana. Ispitne životinje treba karakterizirati što se tiče vrste, soja, podrijetla, spola, mase i starosti. Na početku studije odstupanje u masi za svaki spol korištenih životinja mora biti minimalno i ne smije biti veće od ± 20 % prosječne mase svih životinja u studiji, posebno za svaki spol. Životinje treba nasumično odrediti za kontrolne i ispitne skupine. Nakon nasumičnog odabira ne smije biti značajne razlike u prosječnoj tjelesnoj masi između skupina svakog spola. U slučaju statistički značajnih razlika treba ponoviti fazu nasumičnog odabiranja ako je moguće. Svakoj životinji treba dodijeliti jedinstveni identifikacijski broj i treba je trajno označiti tim brojem tetovažom, ugradnjom mikročipa ili drugom odgovarajućom metodom.
                           
                        POSTUPAK
                  
                     Broj i spol životinja
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Treba upotrijebiti oba spola. Treba upotrijebiti dovoljan broj životinja kako bi na kraju studije u svakoj skupini bilo dovoljno životinja za temeljitu biološku i statističku ocjenu. Za glodavce obično treba upotrijebiti najmanje 20 životinja svakog spola po skupini za svaku visinu doze dok se za ne-glodavce preporučuje minimalno četiri životinje svakog spola po skupini. U studijama koje uključuju miševe u svakoj skupini za doziranje mogu biti potrebne dodatne životinje kako bi se provele sve tražene hematološke pretrage.
                           
                        
                     Opskrba za usmrćivanje u međuvremenu, satelitske skupine i indikatorske životinje
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Studija može uključivati opskrbu za usmrćivanje u međuvremenu (najmanje deset životinja po spolu i skupini), npr. s tri i šest mjeseci, kako bi se pribavile informacije o napredovanju toksikoloških promjena i mehanističke informacije ako je to znanstveno opravdano. Ako su takve informacije već dostupne iz prethodnih studija toksičnosti ispitivane kemikalije uz primjenu ponavljanih doza, usmrćivanje u međuvremenu nije znanstveno opravdano. Također se mogu uključiti i satelitske skupine radi nadzora reverzibilnosti svih toksikoloških promjena izazvanih ispitivanom kemikalijom koja se ispituje; one su obično ograničene na najvišu visinu doze u studiji plus kontrola. Ako je potrebno, tijekom studije također se može uključiti i dodatna skupina indikatorskih životinja (tipično pet životinja po spolu) radi praćenja stanja bolesti (22). Ako se planiraju usmrćivanja u međuvremenu ili satelitske ili indikatorske skupine, broj životinja uključenih u planiranje studije treba povećati za broj životinja određenih za usmrćivanje prije završetka studije. Te životinje moraju normalno proći sva opažanja uključujući tjelesnu masu, unos hrane/vode, hematološka i biokemijska mjerenja te patološke pretrage kao i životinje u fazi kronične toksičnosti glavne studije iako se također može osigurati (u skupinama za usmrćivanje u međuvremenu) da se mjerenja ograniče na specifična, ključna mjerenja poput neurotoksičnosti ili imunotoksičnosti.
                           
                        
                     Skupine za doziranje i doziranje
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Smjernice u vezi sa svim aspektima odabira doza i razmak među visinama doza nalaze se u Smjernici br. 116. (6). Treba upotrijebiti najmanje tri visine doza i paralelnu kontrolu, osim ako je proveden granični test (vidjeti stavak 27.). Visine doza općenito se temelje na rezultatima kraćih studija uz primjenu ponavljanih doza ili studija za određivanje raspona i u obzir moraju uzeti sve toksikološke i toksikokinetičke podatke dostupne o ispitivanoj kemikaliji ili srodnim kemikalijama.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Osim ako nije ograničeno fizikalno-kemijskom naravi ili biološkim učincima ispitivane kemikalije, obično treba odabrati najvišu visinu doze kako bi se identificirali organi mete i toksični učinci uz izbjegavanje patnje, ozbiljne toksičnosti, boležljivosti ili smrti. Uzimajući u obzir čimbenike izložene u stavku 22. u nastavku, treba odabrati najvišu visinu doze kako bi se izveli dokazi o toksičnosti, kao što je, primjerice, dokazano padom povećanja tjelesne mase (otprilike 10 %).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              No, ovisno o ciljevima studije (vidjeti stavak 6.), može se odabrati najviša visina doze manja od doze koja pruža dokaze o toksičnosti npr. ako doza izaziva štetan, zabrinjavajuć učinak koji unatoč tomu utječe na životni vijek ili tjelesnu masu. Najviša doza ne smije biti veća od 1 000 mg/kg tjelesne mase dnevno (granična doza, vidjeti stavak 27.).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Visine doza i razmaci između visina doza mogu se odabrati kako bi se odredio ishod doza-reakcija i NOAEL ili drugi namjeravani ishod studije, npr. BMD (vidjeti stavak 25.) na najnižoj visini doze. Čimbenici koje treba uzeti u obzir pri dodjeljivanju nižih doza uključuju očekivani nagib krivulje doze i reakcije, doze na kojima se mogu dogoditi važne promjene u metabolizmu ili načinu toksičnog djelovanja, gdje se očekuje prag ili gdje se očekuje polazna točka za ekstrapolaciju za niske doze.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Odabrani razmak između visina doza ovisit će o svojstvima ispitivane kemikalije i ova ispitna metoda ne može ga propisati, ali dva do četiri intervala smanjenja često pružaju dobru uspješnost ispitivanja kada se koriste za određivanje silaznih visina doza, a često se daje prednost dodavanju četvrte ispitne skupine nego primjeni vrlo velikih intervala (npr. više od faktora između 6 - 10) među dozama. Općenito treba izbjegavati primjenu faktora većih od deset i treba ih opravdati ako se primjenjuju.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Kao što je izloženo u nastavku Smjernice br. 116. (6), točke koje treba uzeti u obzir pri odabiru doze uključuju:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Poznate nelinearnosti ili točke savijanja u odnosu doze i reakcije ili one na koje se sumnja,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Toksikokinetiku i raspone doza u kojima se događaju ili ne događaju metabolička indukcija, zasićenje ili nelinearnost između vanjskih i unutarnjih doza,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Prethodne lezije, markeri učinka ili indikatori operacije ključnih temeljnih bioloških procesa,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Ključni aspekti ili načini djelovanja (ili oni na koje se sumnja), poput doza na kojima počinje rasti citotoksičnost, razina hormona se poremeti, homeostatski mehanizmi uništavaju itd.,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Regije krivulje doze i reakcije gdje je potrebna posebno jaka procjena, npr. u rasponu očekivanog BMD-a ili praga na koji se sumnja,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Uzimanje u obzir očekivanih razina ljudskog izlaganja.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Kontrolna skupina mora biti netretirana skupina ili skupina za kontrolu nosača ako se u primjeni ispitivane kemikalije primjenjuje nosač. Osim radi tretiranja ispitivanom kemikalijom, životinje u kontrolnoj skupini treba tretirati na jednak način kao i životinje u ispitnim skupinama. Ako se primjenjuje nosač, kontrolna skupina mora primiti nosač u najvećoj količini primijenjenoj u skupinama koje primaju doze. Ako se ispitivana kemikalija daje kroz hranu i ako izaziva značajno smanjeno unosa hrane zbog smanjene tečnosti hrane, može biti korisna dodatna kontrolna skupina koja se hrani u paru kako bi poslužila za primjereniju kontrolu.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Ako se na temelju informacija iz preliminarnih studija može očekivati da ispitivanje na jednoj visini doze, ekvivalentnoj najmanje 1 000 mg/kg tjelesne mase po danu, uz primjenu postupaka opisanih za ovu studiju, ne može izazvati štetne učinke te ako se na temelju podataka od kemikalija srodne strukture ne očekuje toksičnost, ne mora biti nužna potpuna studija uz primjenu tri visine doza. Granica od 1 000 mg/kg tjelesne mase po danu vrijedi osim ako izlaganje ljudi ne pokaže potrebu za primjenom više visine doze.
                           
                        
                     Priprema doza i primjena ispitivane kemikalije
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Ispitivana kemikalija obično se daje oralno, kroz hranu ili vodu za piće ili pak sondom. Dodatne informacije o načinima i metodama davanja navedene su u Smjernici br. 116. (6). Način i metoda primjene ovisi o svrsi studije, fizikalnim/kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, njezinoj bioraspoloživosti te pretežnom načinu i metodi izlaganja ljudi. Treba predočiti argumentaciju za odabrani način i metodu primjene. Radi dobrobiti životinja sondu valja upotrijebiti samo za sredstva za koje taj način i metoda primjene opravdano predstavljaju potencijalno izlaganje ljudi (npr. lijekovi). Kemikalije iz hrane ili okoliša, uključujući pesticide, obično se primjenjuju kroz hranu ili vodu za piće. No, u nekim je situacijama, npr. pri radnom izlaganju, prikladnije izlaganje na druge načine.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Po potrebi, ispitivana se kemikalija otapa ili suspendira u odgovarajućem nosaču. U obzir treba uzeti sljedeća svojstva nosača i drugih aditiva po potrebi: učinke na apsorpciju, distribuciju, metabolizam ili retenciju ispitivane kemikalije; učinke na kemijska svojstva ispitivane kemikalije koja se mogu promijeniti u toksična svojstva te učinke na unos hrane ili vode ili nutritivnog statusa životinja. Preporučuje se da se, kada je god moguće, u obzir najprije uzme vodena otopina/suspenzija pa zatim otopina/suspenzija u ulju (npr. kukuruzno ulje) te zatim moguća otopina u drugim nosačima. Za nosače različite od vode moraju biti poznata toksična svojstva nosača. Moraju biti dostupne informacije o stabilnosti ispitivane kemikalije i homogenosti otopina za doziranje ili prehranu (odgovarajući) pod uvjetima primjene (npr. prehrana).
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Kod kemikalija koje se primjenjuju putem hrane ili vode za piće važno je osigurati da količine ispitivane kemikalije ne utječu na uravnoteženi unos hrane ili vode. U dugotrajnim studijama toksičnosti uz primjenu davanja kroz hranu koncentracija ispitivane kemikalije u hrani obično ne smije premašiti gornju granicu od 5 % ukupne hrane kako bi se izbjegla nutritivna neravnoteža. Ako se ispitivana kemikalija daje kroz hranu, može se upotrijebiti konstantna koncentracija u hrani (hrana mg/kg ili ppm) ili konstantna visina doze u odnosu na tjelesnu masu životinje (mg/kg tjelesne mase) izračunata na tjednoj bazi. Treba specificirati korištenu alternativu.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              U slučaju oralne primjene životinjama se svakodnevno daje ispitivana kemikalija (sedam dana svakog tjedna), obično u razdoblju od 12 mjeseci (vidjeti i stavak 33.) iako, ovisno o regulatornim zahtjevima, može biti potrebno i dulje trajanje. Svaki drukčiji režim primjene, npr. pet dana tjedno, treba obrazložiti. U slučaju dermalne primjene životinje se ispitivanom kemikalijom obično tretiraju najmanje šest sati dnevno, sedam dana tjedno, kao što je navedeno u Poglavlju B.9 ovog Priloga (10), u razdoblju od 12 mjeseci. Izlaganje inhalacijom provodi se šest sati dnevno, sedam dana tjedno, ali može se primijeniti i izlaganje pet dana ako je opravdano. Razdoblje izlaganja obično traje 12 mjeseci. Ako izlaganju samo nosom nisu izloženi štakori nego drugi glodavci, maksimalno trajanje izlaganja treba prilagoditi kako bi se na minimum sveo stres specifičan za tu vrstu. Treba pružiti argumentaciju za primjenu izlaganja kraćeg od šest sati dnevno. Vidjeti također i Poglavlje B.8 ovog Priloga (8).
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Ako se ispitivana kemikalija životinjama daje sondom, to treba provesti želučanom sondom ili prikladnom intubacijskom kanilom u slično vrijeme svakog dana. Obično se jedanput dnevno daje jedna doza, primjerice u slučajevima kada je kemikalija lokalni iritans, no moguće je zadržati dnevnu količinu doze na način da je se podijeli (dvaput dnevno). Maksimalni volumen tekućine koji se može primijeniti odjednom ovisi o veličini pokusne životinje. Količinu treba održavati toliko niskom da bude praktična, a obično ne bi trebala biti veća od 1 ml/100 g tjelesne mase za glodavce (22). Varijabilnost u ispitnoj količini treba svesti na minimum prilagodbom koncentracije kako bi se osigurala konstantna količina na svim visinama doze. Iznimku predstavljaju potencijalno nagrizajuće ili nadražujuće kemikalije te ih treba razrijediti kako bi se izbjegli ozbiljni lokalni učinci. Treba izbjegavati ispitivanje na koncentracijama koje su vjerojatno nagrizajuće ili nadražujuće za gastrointestinalni trakt.
                           
                        
                     Trajanje studije
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Dok je ova ispitna metoda primarno planirana kao studija kronične toksičnosti u trajanju od 12 mjeseci, planiranje studije omogućuje i kraća (npr. 6 ili 9 mjeseci) ili dulja (npr. 18 ili 24 mjeseci) trajanja, ovisno o zahtjevima posebnih regulatornih režima ili radi specifičnih mehanističkih svrha. Treba obrazložiti odstupanja od trajanja izlaganja od 12 mjeseci, posebno u slučajevima kraćeg trajanja. Satelitske skupine uključene radi nadzora reverzibilnosti bilo kakvih toksikoloških promjena izazvanih ispitivanom kemikalijom tijekom studije treba održavati bez doziranja u razdoblju ne kraćem od četiri tjedna te ne dulje od trećine ukupnog trajanja studije nakon prestanka izlaganja. Ostale smjernice, uključujući razmatranja o preživljavanju u istraživanju, nalaze se u Smjernici br. 116. (6).
                           
                        OPAŽANJA
                  
                              34.
                           
                           
                              Sve životinje treba pregledati radi boležljivosti ili ugibanja, obično na početku i kraju svakog dana, uključujući vikend i praznike. Opća klinička opažanja valja provoditi najmanje jedanput dnevno, po mogućnosti u isto vrijeme/ista vremena svakog dana te uzimajući u obzir vršno razdoblje očekivanih učinaka nakon doziranja u slučaju primjene sondom.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Detaljna klinička opažanja valja provoditi na svim životinjama najmanje jedanput prije prvog izlaganja (kako bi se omogućila usporedba za svaku jedinku), na kraju prvog tjedna studije te zatim mjesečno. Protokol za opažanja treba organizirati tako da se na minimum svedu varijacije između pojedinih promatrača i ovisno o ispitnoj skupini. Ta opažanja treba obaviti izvan domicilnog kaveza, po mogućnosti u standardnoj areni te svaki put u slično vrijeme. Rezultate opažanja treba pažljivo bilježiti, pri čemu je najbolje koristiti sustav vrednovanja jasno definiran od strane laboratorija koji obavlja ispitivanje. Treba se potruditi osigurati da su varijacije u uvjetima opažanja minimalne. Zabilježeni znakovi moraju obuhvaćati promjene na koži, krznu, očima, sluznicama, pojavu iscjedaka i izlučevina te autonomne aktivnosti (npr. lakrimaciju, piloerekciju, veličinu zjenica te nepravilnosti u disanju), ali ne biti ograničeni na njih. Također treba zabilježiti promjene u hodu, držanju i reakcijama na rukovanje, kao i prisutnost kloničkih ili toničkih pokreta, stereotipa (npr. pretjerano njegovanje krzna, ponavljano kretanje u krug) ili neobičnog ponašanja (npr. samoozljeđivanje, hodanje unatrag) (24).
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Oftalmološke preglede uz primjenu oftalmoskopa ili druge odgovarajuće opreme treba obaviti na svim životinjama prije prve primjene ispitivane kemikalije. Na kraju studije te preglede treba po mogućnosti obaviti na svim životinjama, ali barem u skupini s visokom dozom i kontrolnoj skupini. Ako se na očima opaze promjene povezane s tretiranjem, treba pregledati sve životinje. Ako strukturna analiza ili druge informacije upućuju na okularnu toksičnost, treba povećati učestalost oftalmoloških pregleda.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Za kemikalije za koje prethodne 28-dnevne i/ili 90-dnevne studije toksičnosti uz primjenu ponavljanih doza ukazuju na potencijalno uzrokovanje neurotoksičnih učinaka, senzoričke reaktivnosti na stimulanse različitih tipova (24) (npr. zvučne, vizualne i proprioceptivne stimulanse) (25), (26), (27), prije početka studije te u razdobljima od 3 mjeseca nakon početka studije pa do 12 mjeseci, uključujući i 12. mjesec, te na kraju studije (ako ne traje dulje od 12 mjeseci) mogu se opcijski provesti i određivanje jakosti stiska (28) i određivanje motoričke aktivnosti (29). Daljnje pojedinosti o postupcima koji se mogu primjenjivati navedene su u odgovarajućoj referentnoj literaturi. Međutim, osim referentnih mogu se primjenjivati i drugi postupci.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Za kemikalije, za koje su prethodne 28-dnevne i/ili 90-dnevne studije toksičnosti uz primjenu ponavljanih doza ukazala na potencijalno izazivanje imunotoksičnih učinaka, na kraju se opcijski mogu provesti daljnja istraživanja tog krajnjeg učinka.
                           
                        
                     Tjelesna masa, unos hrane/vode i učinkovitost hrane
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Sve životinje treba izvagati na početku tretiranja, najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjesečno. Mjerenja unosa i učinkovitosti hrane treba provoditi najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjesečno. Unos vode treba mjeriti najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjesečno ako se kemikalija primjenjuje preko vode za piće. Mjerenje unosa vode treba također uzeti u obzir i za studije u kojima se mijenja aktivnost pijenja.
                           
                        
                     Hematologija i klinička biokemija
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              U studijama koje uključuju glodavce hematološke pretrage treba obaviti najmanje na deset mužjaka i deset ženki po skupini, nakon 3, 6 i 12 mjeseci te na kraju studije (ako ne traje dulje od 12 mjeseci) uz primjenu istih životinja svaki put. Kod miševa mogu biti potrebne satelitske životinje kako bi se provele sve potrebne hematološke pretrage (vidjeti stavak 18.). Kod studija na neglodavcima uzorci se uzimaju od manjeg broja životinja (npr. četiri životinje po spolu i skupini kod studija na psima), u vrijeme uzorkovanja u međuvremenu te na kraju, kao što je opisano za glodavce. Mjerenja nakon tri mjeseca, bilo u glodavaca ili neglodavaca, ne moraju se provoditi ako na hematološkim parametrima u prethodnoj 90-dnevnoj studiji provedenoj na usporedivim visinama doze nisu uočeni učinci. Uzorke krvi treba uzimati iz određenog mjesta, primjerice punkcijom srca ili iz retroorbitalnog sinusa, pod anestezijom.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Treba ispitati sljedeći popis parametara (30): Ukupni i diferencijalni broj leukocita, broj eritrocita, broj trombocita, koncentracija hemoglobina, hematokrit (volumen eritrocita), prosječni volumen eritrocita (MCV), prosječna masa hemoglobina u eritrocitima (MCH), prosječna koncentracija hemoglobina u eritrocitima (MCHC), protrombinsko vrijeme te aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme. Ostali hematološki parametri poput Heinzovih tjelešaca ili druge atipične morfologije eritrocita ili methemoglobin mogu se mjeriti po potrebi, ovisno o toksičnosti ispitivane kemikalije. Općenito gledano, treba primijeniti fleksibilan pristup ovisno o opaženim i/ili očekivanim učincima davane ispitivane kemikalije. Ako ispitivana kemikalija ne utječe na hematopoetski sustav, može biti indiciran i broj retikulocita i citologija koštane srži iako se te pretrage ne moraju provoditi rutinski.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Kliničko-biokemijske pretrage za ispitivanje toksičnih učinaka u tkivima i posebno učinaka na bubrege i jetru treba obaviti na uzorcima krvi dobivenima od najmanje deset mužjaka i deset ženki po skupini u jednakim vremenskim intervalima kao što je navedeno u hematološkim pretragama uz primjenu istih životinja. Kod miševa mogu biti potrebne satelitske životinje kako bi se provele sve potrebne kliničko-biokemijske pretrage. Kod studija na neglodavcima uzorci se uzimaju od manjeg broja životinja (npr. četiri životinje po spolu i skupini kod studija na psima), u vrijeme uzorkovanja u međuvremenu te na kraju, kao što je opisano za glodavce. Mjerenja nakon 3 mjeseca, bilo u glodavaca ili neglodavaca, ne moraju se provoditi ako na kliničko-biokemijskim parametrima u prethodnoj 90-dnevnoj studiji provedenoj na usporedivoj visini doze nisu opaženi učinci. Preporučuje se post životinja preko noći (izuzev miševa) prije uzimanja uzoraka krvi. Treba ispitati sljedeći popis parametara (30): glukoza, urea (dušična urea), kreatinin, ukupni proteini, albumini, kalcij, natrij, kalij, ukupani kolesterol, najmanje dvije prikladne pretrage za hepatocelularnu ocjenu (alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, glutamat dehidrogenaza, ukupne žučne kiseline) (31) te najmanje dvije prikladne pretrage za hepatobilijarnu ocjenu (alkalna fosfataza, gama glutamil transferaza, 5′-nukleotidaza, ukupni bilirubin, ukupne žučne kiseline) (31). Ostali kliničko-kemijski parametri poput triglicerida tijekom posta, specifičnih hormona i kolinesteraze mogu se mjeriti ako je potrebno, ovisno o toksičnosti ispitivane kemikalije. Općenito gledano, treba primijeniti fleksibilan pristup ovisno o opaženim i/ili očekivanim učincima davane ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Pretrage analize urina treba provesti na najmanje deset mužjaka i deset ženki po skupini na uzorcima skupljenim u jednakim intervalima kao i za hematologiju i kliničku kemiju. Mjerenja nakon 3 mjeseca ne moraju se provoditi ako na analizi urina u prethodnoj 90-dnevnoj studiji provedenoj na usporedivoj visini doze nisu opaženi učinci. Sljedeći popis parametara bio je uključen u stručne preporuke za kliničko-patološke studije (30): izgled, volumen, osmolalnost ili specifična težina, pH, ukupni proteini i glukoza. Ostale pretrage uključuju ketone, urobilinogen, bilirubin i okultnu krv. Ako je potrebno, mogu se upotrijebiti i drugi parametri radi proširenog istraživanja opaženog učinka/opaženih učinaka.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Općenito se smatra da su osnovne hematološke i kliničko-biokemijske varijable potrebne prije tretiranja za studije na psima, ali ih se ne mora odrediti u studijama na glodavcima (30). No, ako su povijesni osnovni podaci (vidjeti stavak 50.) neprikladni, treba se pobrinuti da se ti podaci izrade.
                           
                        
                     Patologija
                  
                  
                     Makroskopska analiza
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              Sve životinje korištene u studiji obično se moraju podvrgnuti kompletnoj, detaljnoj makroskopskoj analizi koja obuhvaća pažljivi pregled vanjske površine tijela, svih otvora te lubanjske, prsne i trbušne šupljine i njihovog sadržaja. No, može se odlučiti (kod skupina za usmrćivanje u međuvremenu ili satelitskih skupina) da se mjerenja ograniče na specifične, ključne mjere, poput neurotoksičnosti ili imunotoksičnosti (vidjeti stavak 19.). Te životinje ne treba podvrgnuti obdukciji i sljedećim postupcima opisanima u stavcima u nastavku. Indikatorske životinje mogu zahtijevati obdukciju u pojedinačnim slučajevima, a odluka je prepuštena voditelju istraživanja.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Treba prikupiti masu organa svih životinja, osim onih isključenih zadnjim dijelom stavka 45. Nadbubrežne žlijezde, mozak, epididimise, srce, bubrege, jetru, jajnike, slezenu, štitnjaču (izvaganu poslije fiksacije, s paraštitnim žlijezdama) i maternicu svih životinja (osim onih pronađenih u stanju ugibanja i/ili usmrćenih u međuvremenu) treba obrezivanjem osloboditi od svih prianjajućih tkiva po potrebi te ih treba izvagati u mokrom stanju što prije nakon seciranja kako bi se spriječilo njihovo sušenje. U studijama na miševima nadbubrežne žlijezde važu se opcijski.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Sljedeća tkiva treba čuvati u najprikladnijem fiksacijskom mediju za oba tipa tkiva i namjeravane histopatološke pretrage koja slijedi (32) (tkiva u uglatim zagradama opcijska su):
                              
                                          sve makroskopske lezije
                                       
                                       
                                          srce
                                       
                                       
                                          gušterača
                                       
                                       
                                          želudac (predželudac, žljezdani želudac)
                                       
                                    
                                          nadbubrežna žlijezda
                                       
                                       
                                          ileum
                                       
                                       
                                          paraštitna žlijezda
                                       
                                       
                                          [zubi]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          jejunum
                                       
                                       
                                          periferni živac
                                       
                                       
                                          testis
                                       
                                    
                                          mozak (uključujući sekcije velikog i malog mozga te medule/mosta)
                                       
                                       
                                          bubreg
                                       
                                       
                                          hipofiza
                                       
                                       
                                          timus
                                       
                                    
                                          cekum
                                       
                                       
                                          suzna žlijezda (eksorbitalna)
                                       
                                       
                                          prostata
                                       
                                       
                                          štitnjača
                                       
                                    
                                          cerviks
                                       
                                       
                                          jetra
                                       
                                       
                                          rektum
                                       
                                       
                                          [jezik]
                                       
                                    
                                          koagulacijska žiljezda
                                       
                                       
                                          pluća
                                       
                                       
                                          žlijezda slinovnica
                                       
                                       
                                          dušnik
                                       
                                    
                                          debelo crijevo
                                       
                                       
                                          limfni čvorovi (površinski i dubinski)
                                       
                                       
                                          sjemenski mjehurić
                                       
                                       
                                          mokraćni mjehur
                                       
                                    
                                          dvanaesnik
                                       
                                       
                                          mliječna žlijezda (obvezno za ženke i ako se mogu secirati, od mužjaka)
                                       
                                       
                                          skeletni mišić
                                       
                                       
                                          maternica (uključujući cerviks)
                                       
                                    
                                          epididimis
                                       
                                       
                                          [gornji respiratorni trakt uključujući nos, turbinate i paranazalne sinuse]
                                       
                                       
                                          koža
                                       
                                       
                                          [mokraćovod]
                                       
                                    
                                          oko (uključujući mrežnicu)
                                       
                                       
                                          jednjak
                                       
                                       
                                          kralježnica (na tri razine: vratna, srednja prsna i slabinska)
                                       
                                       
                                          [mokraćna cijev]
                                       
                                    
                                          [femur sa zglobom]
                                       
                                       
                                          [olfaktorni bulbus]
                                       
                                       
                                          slezena
                                       
                                       
                                          vagina
                                       
                                    
                                          žučni mjehur (za vrste drukčije od štakora)
                                       
                                       
                                          jajnik
                                       
                                       
                                          [prsna kost],
                                       
                                       
                                          sekcija koštane srži i/ili aspirat svježe koštane srži
                                       
                                    
                                          Harderova žlijezda
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    U slučaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba sačuvati oba organa. Klinički i drugi nalazi mogu sugerirati potrebu za pregledom dodatnih tkiva. Treba sačuvati i sve one organe za koje se na temelju saznanja o svojstvima ispitivane kemikalije smatra da bi mogli biti ciljni. U studijama koje uključuju dermalni način primjene treba sačuvati popis organa sastavljen za oralni način primjene, s tim da je vrlo važno specifično uzorkovanje i čuvanje kože s mjesta primjene. U studijama inhalacijom popis sačuvanih i ispitanih tkiva iz respiratornog trakta treba slijediti preporuke Poglavlja B.8 ovog Priloga (8) i Poglavlja B.29 ovog Priloga (9). Za ostale organe/tkiva (te uz posebno sačuvana tkiva iz respiratornog trakta) treba ispitati popis organa zadan za oralni način primjene.
                           
                        
                     Histopatologija
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              Dostupna je smjernica za najbolju praksu u provođenju istraživanja toksikološke patologije (32). Minimalne histopatološke pretrage moraju uključivati:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          sva tkiva iz skupine izložene visokoj dozi i kontrolne skupine,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          sva tkiva životinja uginulih ili usmrćenih tijekom studije,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          sva tkiva s makroskopskim anomalijama,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          tkiva mete ili tkiva koja pokazuju promjene povezane s tretiranjem u skupini izloženoj visokoj dozi, od svih životinja u svih drugim skupinama doza,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          u slučaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba ispitati oba organa.
                                       
                                    
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Podaci
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Treba pružiti pojedinačne podatke o životinjama za sve ocijenjene parametre. Uz to sve podatke treba skupiti u obliku tablice, prikazujući za svaku ispitnu skupinu broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja koje su tijekom ispitivanja pronađene uginule ili su usmrćene iz humanih razloga te vrijeme smrti ili usmrćivanja, broj uočenih znakova toksičnosti, opis uočenih znakova toksičnosti, uključujući vrijeme nastupanja, trajanje i ozbiljnost svakog toksičnog učinka, broj životinja s lezijama, tip lezija te postotak životinja sa svakim tipom lezije. Tablice sa sažetkom podataka trebaju pružiti prosječne i standardne devijacije (za podatke trajnih ispitivanja) za životinje koje pokazuju toksične učinke ili lezije uz stupnjevanje lezija.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              U tumačenju rezultata studije, npr. u slučaju kada postoje indikacije da su podaci dobiveni u paralelnim kontrolama bitno izvan granica u usporedbi sa skorašnjim podacima od kontrolnih životinja iz istog ispitnog smještaja/kolonije, mogu biti dragocjeni povijesni kontrolni podaci. Povijesne kontrolne podatke, ako se ocjenjuju, treba uzeti iz istog laboratorija i povezati sa životinjama iste dobi i vrste proizvedenih tijekom pet godina prije dotične studije.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Ako je moguće, brojčane rezultate treba ocijeniti prikladnom i opće prihvaćenom statističkom metodom. Statističke metode i podatke koji će se analizirati treba odabrati tijekom planiranja studije (stavak 8.). Ako je potrebno, odabir treba osigurati prilagodbu radi preživljavanja.
                           
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              U izvješću o ispitivanju treba navesti sljedeće informacije:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana kemikalija:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizikalna narav, čistoća i fizikalno-kemijska svojstva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikacijski podaci,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrijetlo kemikalije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj serije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      potvrda kemijske analize.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosač (po potrebi):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obrazloženje odabira nosača (ako nije voda).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusne životinje:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korištene vrste/sojevi te obrazloženje odabira,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj, dob i spol životinja na početku ispitivanja,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinačne tjelesne mase životinja na početku ispitivanja.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      argumentacija za način primjene i odabir doze,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ako je primjenjivo, statistička metoda korištena za analizu podataka,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinosti o pripremi ispitivane kemikalije/hrane,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analitički podaci o postignutoj koncentraciji, stabilnosti i homogenosti preparata,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      način primjene i pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      za studije inhalacijom, bilo samo nosom ili čitavim tijelom,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stvarne doze (mg/kg tjelesne mase po danu) i faktor pretvorbe iz koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za piće (mg/kg ili ppm) sa stvarnom dozom ako je primjenjivo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinosti o kvaliteti hrane i vode.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati (treba prikazati tablično sažete podatke i pojedinačne podatke za životinje):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci o preživljavanju,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tjelesna masa/promjene u tjelesnoj masi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      unos hrane, izračun učinkovitosti hrane ako je napravljen te unos vode ako je primjenjivo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci o toksičkim reakcijama po spolu i visini doza, uključujući znakove toksičnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      narav, učestalost (te ako je zabilježeno, ozbiljnost) i trajanje kliničkih opažanja (prolaznih ili trajnih),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmološki pregledi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematološke pretrage,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kliničko-biokemijske pretrage,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analiza urina,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ishod svih istraživanja neurotoksičnosti ili imunotoksičnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tjelesna masa na kraju,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mase organa (i njihovi omjeri ako je primjenjivo),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nalazi obdukcije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detaljan opis svih histopatoloških nalaza povezanih s tretiranjem,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci o apsorpciji, ako postoje.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Statistička obrada rezultata po potrebi
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rasprava o rezultatima uključujući:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Odnose doza i reakcija,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Razmatranja o svim načinima djelovanja informacija,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Rasprava o svim modelima pristupa,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Određivanje BMD, NOAEL ili LOAEL,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Povijesni kontrolni podaci,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Relevantnost za ljude.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zaključci
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1995.). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Poglavlje B.27 ovog Priloga, Test subkronične oralne toksičnosti - 90-dnevna studija oralne toksičnosti na neglodavcima uz primjenu ponavljanih doza.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              OECD (2012.). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Poglavlje B.8 ovog Priloga, Subakutna inhalacijska toksičnost: 28-dnevna studija.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Poglavlje B.29 ovog Priloga, Subkronična inhalacijska toksičnost: 90-dnevna studija.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Poglavlje B.9 ovog Priloga, Toksičnost (dermalna) pri ponavljanoj dozi (28 dana).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              OECD (2002.). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Pariz.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              OECD (2000.). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 - 837.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se upotrebljavaju u znanstvene svrhe, SL L 276, 20.10.2010., str. 33.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              EMEA (draft) document ‚Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity’ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK i sur. (2004). Smjernica za najbolju praksu: Toksikološka histopatologija, Toksikološka patologija 32: 126-131.
                           
                        
                     Dodatak 1.
                     DEFINICIJA
                     Ispitivana kemikalija: Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne metode.
                  ”
            
                  6.
               
               
                  Poglavlja B.32 i B.33 mijenjaju se i glase:
                  „B.32.   STUDIJE KARCINOGENOSTI
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 451 (2009.). Originalna Smjernica za ispitivanje 451 o studijama karcinogenosti usvojena je 1981. Smatralo se da je nužno razviti ovu revidiranu ispitnu metodu B.32 kako bi se odrazio skorašnji razvoj u području dobrobiti životinja i regulatornih zahtjeva (2) (3) (4) (5) (6). Ova ispitna metoda B.32 ažurirana je paralelno s revizijama Poglavlja B.30 ovog Priloga, Studije kronične toksičnosti te Poglavlja B.33 ovog Priloga, Kombinirane studije kronične toksičnosti/karcinogenosti te s ciljem pribavljanja dodatnih informacija od životinja korištenih u studiji te prikupljanja daljnjih pojedinosti o odabiru doze. Ova ispitna metoda B.32 namijenjena je primjeni u ispitivanju širokog spektra kemikalija, uključujući pesticide i industrijske kemikalije. No, treba imati na umu da neke pojedinosti i zahtjevi mogu biti različiti za ljude (vidjeti Smjernicu S1B o Ispitivanju kancerogenosti lijekova Međunarodne konferencije o usklađivanju (International conference on Harmonisation (ICH)).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Većina studija karcinogenosti provodi se na vrstama glodavaca, stoga i ovu ispitnu metodu treba primjenjivati prvenstveno u studijama koje se provode na tim vrstama. Ako se traži da se studije provode na neglodavcima, treba primijeniti načela i postupke izložene u ovoj ispitnoj metodi uz odgovarajuće modifikacije zajedno s načelima i postupcima izloženima u Poglavlju B.27 ovog Priloga, Studija subkronične oralne toksičnosti-90-dnevna studija oralne toksičnosti na neglodavcima uz primjenu ponavljanih doza (6)-. Ostale upute dostupne su u Smjernici br. 116. o planiranju i provođenju studija kronične toksičnosti i kancerogenosti (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Tri glavna načina primjene korištena u studijama kancerogenosti jesu oralni, dermalni i inhalacijski. Odabir načina primjene ovisi o fizikalnim i kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije te o pretežnom načinu izlaganja ljudi. Dodatne informacije o odabiru načina izlaganja navedene su u Smjernici br. 116. (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda usmjerena je na izlaganje oralnim putem, što je najčešće korišteni način u studijama karcinogenosti. Dok dugotrajne studije karcinogenosti, koje uključuju izlaganje preko kože ili inhalacijom, mogu također biti potrebne i/ili se mogu tražiti pod određenim regulatornim režimima radi određivanja rizika za ljude, oba načina izlaganja uključuju znatnu tehničku složenost. Takve studije treba planirati za svaki slučaj posebno iako ovdje izložena ispitna metoda za određivanje i ocjenu karcinogenosti putem oralne primjene može poslužiti kao temelj za protokol za studije inhalacijom i/ili dermalnim putem, uzimajući u obzir razdoblja tretiranja, kliničke i patološke parametre itd. Dostupna je OECD-ova Smjernica za primjenu ispitivane kemikalije dermalnim (7) i inhalacijskim putem (7) (8). Poglavlje B.8 ovog Priloga (9) i Poglavlje B.29 ovog Priloga (10), zajedno sa Smjernicom OECD-a za ispitivanje akutne inhalacije (8), treba poslužiti kao detaljna konzultacija pri planiranju dugotrajnijih studija koje uključuju izlaganje inhalacijom. Poglavlje B.9 ovog Priloga (11) treba uzeti kao pomoć pri ispitivanju provedenom dermalnim putem.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Studija karcinogenosti pruža informacije o mogućim rizicima za zdravlje koji će se vjerojatno pojaviti zbog ponovljenog izlaganja kroz gotovo čitavo ili čitavo životno razdoblje korištenih vrsta. Ta će studija pružiti informacije o toksičnim učincima ispitivane kemikalije, uključujući i potencijalnu karcinogenost te može ukazati na organe mete i mogućnost akumulacije. Može pružiti procjenu razine neopaženih štetnih učinaka te u slučaju negenotoksičnih karcinogena za tumorske reakcije koje se mogu upotrijebiti za određivanje sigurnosnih kriterija za izlaganje ljudi.– Također je naglašena potreba za pažljivim kliničkim opažanjima životinja radi dobivanja što je moguće više informacija.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Ciljevi studija karcinogenosti obuhvaćenih ovom ispitnom metodom uključuju:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Identifikaciju karcinogenih svojstava ispitivane kemikalije koja rezultiraju povećanjem učestalosti pojavljivanja neoplazmi, povećanim omjerom malignih neoplazmi ili smanjenjem u vrijeme pojavljivanja neoplazmi u usporedbi s konkurentnim kontrolnim skupinama,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Identifikaciju organa meta karcinogenosti,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Identifikaciju vremena pojavljivanja neoplazmi,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Karakterizaciju odnosa doze i reakcije za tumor,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Identifikaciju razine neopaženih štetnih učinaka (NOAEL) ili polazne točke za određivanje referente doze za usporedbu (benchmark dose, BMD),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Ekstrapolaciju karcinogenih učinaka na niskim razinama izlaganja ljudi,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Pružanje podataka za ispitivanje pretpostavki u svezi s načinom djelovanja (2) (7) (12) (13) (14) (15).
                                       
                                    
                        UVODNA RAZMATRANJA
                  
                              7.
                           
                           
                              U određivanju i procjeni potencijalne karcinogenosti ispitivane kemikalije laboratorij koji provodi ispitivanje prije provođenja studije mora u obzir uzeti sve dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji kako bi se plan studije usmjerio na učinkovitije ispitivanje potencijala karcinogenosti te kako bi se na minimum svela primjena životinja. Informacije i razmatranja o svim načinima djelovanja karcinogena na koji se sumnja (2) (7) (12) (13) (14) (15) posebno su važne jer se optimalan plan može razlikovati ovisno o tome zna li se ili sumnja za ispitivanu kemikaliju da je genotoksični karcinogen. Ostale upute o razmatranju načina djelovanja mogu se pronaći u Smjernici br. 116 (9).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Informacije koje će pomoći u planiranju istraživanja obuhvaćaju identitet, kemijsku strukturu i fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije, rezultate svih ispitivanja toksičnosti in vitro ili in vivo uključujući ispitivanja genotoksičnosti; očekivanu/e primjenu/e i potencijal za ljudsko izlaganje, dostupne podatke (Q)SAR, mutagenost/genotoksičnost, karcinogenost i druge toksikološke podatke o kemikalijama srodne strukture, dostupne toksikokinetičke podatke (kinetika jedne doze i ponovljene doze ako je dostupno) te podatke dobivene drugim istraživanjima s ponovljenim izlaganjem. Određivanje karcinogenosti treba provesti nakon dobivanja početnih informacija o toksičnosti iz 28-dnevnog i/ili 90-dnevnog ispitivanja toksičnosti uz primjenu ponavljanih doza. Kratkoročno ispitivanje početnog razvoja raka također može pružiti korisne informacije. Pristup s fazama u ispitivanju karcinogenosti treba smatrati dijelom ukupnog utvrđivanja potencijalno nepovoljnih učinaka dotične ispitivane kemikalije po zdravlje (16) (17) (18) (19).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Prije početka studije treba odrediti najprikladnije statističke metode za analizu rezultata s obzirom na plan i ciljeve pokusa. Problemi koja treba razmatrati uključuju treba li statistika uključivati prilagodbu preživjelih, analizu ukupnog rizika od tumora u odnosu na trajanje preživljavanja, analizu vremena za stvaranje tumora te analizu u slučaju prijevremenog svršetka jedne ili više skupina. Smjernice o odgovarajućim statističkim analizama i ključnim referencama na međunarodno prihvaćene statističke metode nalaze se u Smjernici br. 116. (7) te također u Smjernici br. 35. za analizu i ocjenu studija kronične toksičnosti i karcinogenosti (20).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Pri provođenju istraživanja karcinogenosti uvijek treba slijediti načela i razloge izložene u OECD-ovoj Smjernici br. 19. o prepoznavanju, određivanju i primjeni kliničkih znakova kao humanih krajnjih ishoda za pokusne životinje korištene u procjeni sigurnosti (21) posebno u stavku 62. U tom stavku stoji da ‚u studijama uz primjenu ponovljenog doziranja, kada životinje pokazuju progresivne kliničke znakove koji izazivaju daljnje pogoršanje stanja, treba donijeti upućenu odluku o tome treba li humano usmrtiti životinje ili ne. Odluka treba uključivati razloge s obzirom na vrijednost informacija dobivenih iz trajnog održavanja te životinje u studiji s obzirom na njezino opće stanje. Ako se odluči zadržati životinju u ispitivanju, učestalost opažanja treba povećati u skladu s potrebama. Također se može privremeno prekinuti s doziranjem ako će to olakšati patnju ili stres ili smanjiti ispitnu dozu bez štetnih utjecaja na svrhu ispitivanja.’
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Detaljne upute za načela odabira doza za studije kronične toksičnosti i karcinogenosti te rasprava o njima mogu se pronaći u Smjernici br. 116. (7), kao i u dvije publikacije instituta International Life Sciences Institute (22) (23). Osnovna strategija odabira doza ovisi o primarnom cilju ili primarnim ciljevima studije (stavak 6.). Pri odabiru odgovarajućih razina doza treba postići ravnotežu između procjene opasnosti s jedne strane i karakterizacije reakcija na nisku dozu te njihovo značenje s druge strane. To je posebno relevantno u situaciji u kojoj treba provesti kombiniranu studiju kronične toksičnosti i karcinogenosti (Poglavlje B.33 ovog Priloga) (stavak 12.).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Treba navesti razloge za provođenje kombinirane studije kronične toksičnosti i karcinogenosti (Poglavlje B.33 ovog Priloga), a ne odvojeno provođenje studije kronične toksičnosti (Poglavlje B.30 ovog Priloga) i studije karcinogenosti (ova ispitna metoda B.32). Kombinirano ispitivanje pruža veću učinkovitost što se tiče vremena i troškova u usporedbi s provođenjem dviju zasebnih studija, bez kompromitiranja kvalitete podataka u kroničnoj fazi niti u kancerogenoj fazi. Pri provođenju kombinirane studije kronične toksičnosti i karcinogenosti (Poglavlje B.33 ovog Priloga) treba pažljivo razmisliti o načelima odabira doza (stavci 11. i 22. - 25.) te se također priznaje da pod određenim regulatornim okvirima mogu biti nužne odvojene studije.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se na kraju ovog poglavlja i u Smjernici br. 116. (7).
                           
                        NAČELO ISPITIVANJA
                  
                              14.
                           
                           
                              Ispitivana kemikalija primjenjuje se svakodnevno u stupnjevanim dozama raznim skupinama pokusnih životinja tijekom najvećeg dijela njihova životnog vijeka, obično oralnim putem. Može biti prikladno i ispitivanje inhalacijom ili dermalnim putem. Životinje se pomno promatraju radi znakova toksičnosti i razvoja neoplazmičkih lezija. Životinje koje ugibaju ili su usmrćene tijekom ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a na kraju ispitivanja preživjele se životinje usmrćuju i podvrgavaju obdukciji.
                           
                        OPIS METODE
                  
                     Odabir životinjske vrste
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda prvenstveno obuhvaća određivanje i ocjenu karcinogenosti u glodavaca (stavak 2.). U obzir se može uzeti primjena vrsta neglodavaca ako dostupni podaci sugeriraju da su oni relevantniji za predviđanje zdravstvenih učinaka po ljude. Treba obrazložiti odabir vrsta. Preferirana vrsta glodavaca jesu štakori iako se mogu upotrijebiti i druge vrste glodavaca, npr. miš. Iako uporaba miševa u ispitivanju karcinogenosti može biti ograničeno korisna (24) (25) (26), u nekim aktualnim regulatornim programima još se uvijek traži ispitivanje karcinogenosti u miševa osim ako je utvrđeno da nema znanstvene potrebe za takvom studijom. Štakori i miševi preferirani su pokusni modeli zbog relativno kratkog životnog vijeka, raširene primjene u farmakološkim i toksikološkim studijama, osjetljivosti na izazivanje tumora te dostupnosti dovoljno karakteriziranih sojeva. Kao posljedica tih svojstava, dostupno je mnogo informacija o njihovoj fiziologiji i patologiji. Dodatne informacije o odabiru vrsta i sojeva navedene su u Smjernici br. 116. (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Treba upotrijebiti mlade zdrave odrasle životinje sojeva koji su uobičajeni u laboratorijskoj praksi. Studiju karcinogenosti treba po mogućnosti obaviti na životinjama istog soja i podrijetla kao i životinje korištene u preliminarnoj/im studiji/-ama toksičnosti kraćeg trajanja ako se za životinje tog soja i podrijetla zna da imaju problema u postizanju uobičajeno prihvaćenih kriterija za preživljavanje u dugotrajnim istraživanjima [vidjeti Smjernicu br. 116. (9)], treba razmotriti primjenu životinjskog soja s prihvatljivom stopom preživljavanja za dugotrajnu studiju. Treba upotrebljavati ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne.
                           
                        
                     Smještaj i hranjenje
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Životinje moraju biti smještene pojedinačno ili u kavezima u malim skupinama istog spola; pojedinačni smještaj treba uzeti u obzir samo ako je znanstveno opravdan (27) (28) (29). Kaveze treba rasporediti na način da se učinci do kojih bi moglo doći zbog položaja kaveza svedu na minimum. Temperatura u prostoriji s pokusnim životinjama trebala bi iznositi 22 °C (± 3 °C). Premda bi relativna vlažnost zraka trebala iznositi najmanje 30 % te po mogućnosti ne premašivati 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50 - 60 %. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može primjenjivati konvencionalna laboratorijska prehrana uz neograničene količine pitke vode. Prehrana mora ispunjavati sve nutritivne potrebe ispitivanih vrsta, a udio tvari koje kontaminiraju hranu - uključujući ostatke pesticida, postojane organske zagađivače, fitoestrogene, teške metale i mikotoksine, ali ne ograničeno na njih - koje mogu utjecati na rezultat ispitivanja treba biti što je moguće manji. Analitičke informacije o razinama tvari koje kontaminiraju hranjive tvari i prehranu treba izrađivati periodično, barem na početku studije te u slučaju promjene u primijenjenoj seriji, i treba ih uključiti u završno izvješće. Također treba pružiti analitičke informacije o vodi za piće korištenoj u istraživanju. Na odabir prehrane može utjecati potreba za osiguranjem prikladnih dodataka ispitivane kemikalije i ispunjavanjem nutritivnih potreba životinja ako se ispitivana kemikalija primjenjuje kroz hranu.
                           
                        
                     Priprema životinja
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Treba upotrijebiti zdrave životinje koje su se aklimatizirale na laboratorijske uvjete najmanje sedam dana i koje nisu izlagane prethodnim pokusnim postupcima. U slučaju glodavaca doziranje životinja treba početi što je moguće prije nakon prestanka odbijanja od sise i aklimatizacije te po mogućnosti prije nego što životinje navrše osam tjedana. Ispitne životinje treba karakterizirati što se tiče vrste, soja, podrijetla, spola, mase i starosti. Na početku studije odstupanje u masi za svaki spol korištenih životinja mora biti minimalno i ne smije biti veće od ± 20 % prosječne mase svih životinja u studiji, posebno za svaki spol. Životinje treba nasumično odrediti za kontrolne i ispitne skupine. Nakon nasumičnog odabira ne smije biti značajne razlike u prosječnoj tjelesnoj masi između skupina svakog spola. U slučaju statistički značajnih razlika treba ponoviti fazu nasumičnog odabiranja ako je moguće. Svakoj životinji treba dodijeliti jedinstveni identifikacijski broj i treba je trajno označiti tim brojem tetovažom, ugradnjom mikročipa ili drugom odgovarajućom metodom.
                           
                        POSTUPAK
                  
                     Broj i spol životinja
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Treba upotrijebiti oba spola. Treba upotrijebiti dovoljan broj životinja tako da se omogući temeljita biološka i statistička ocjena. Stoga svaka skupina koja prima dozu i paralelna kontrolna skupina moraju sadržavati najmanje 50 životinja svakog spola. Ovisno o namjeni studije, može biti moguće povećati statističku snagu ključnih procjena drukčijom raspodjelom životinja tako da bude drukčija u raznim skupinama koje primaju dozu s više od 50 životinja u skupinama s niskom dozom, npr. radi procjene karcinogenog potencijala na niskim dozama. No, treba priznati da umjereno povećanje skupine daje relativno malo povećanje statističke snage studije. Daljnje informacije o statističkom planiranju studije i odabiru visina doza radi povećanja statističke snage na maksimum nalaze se u Smjernici br. 116. (7).
                           
                        
                     Odabir za usmrćivanje u međuvremenu i satelitske (indikatorske) skupine
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Studija može omogućivati usmrćivanje u međuvremenu, npr. s 12 mjeseci, kako bi se pribavile informacije o napredovanju neoplazmičkih promjena i mehanističke informacije ako je to znanstveno opravdano. Ako su takve informacije već dostupne iz prethodnih studija toksičnosti ispitivane kemikalije uz primjenu ponavljanih doza, usmrćivanje u međuvremenu nije znanstveno opravdano. Ako su usmrćivanja u međuvremenu uključena u plan studije, broj životinja u svakoj skupini koja prima dozu određen za usmrćivanje u međuvremenu obično će biti deset životinja svakog spola, a ukupni broj životinja uključenih u plan studije treba povećati za broj životinja određenih za usmrćivanje prije završetka studije. Ako je potrebno, tijekom studije može se uključiti i dodatna skupina indikatorskih životinja (tipično pet životinja po spolu) radi nadzora stanja bolesti (30). Ostale upute nalaze se u Smjernici br. 116. (7).
                           
                        
                     Skupine za doziranje i doziranje
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Smjernice u vezi sa svim aspektima odabira doza i razmak među visinama doza nalaze se u Smjernici br. 116. (7). Treba upotrijebiti najmanje tri visine doza i paralelnu kontrolu. Visine doza općenito se temelje na rezultatima kraćih studija uz primjenu ponavljanih doza ili studija za određivanje raspona i u obzir moraju uzeti sve toksikološke i toksikokinetičke podatke dostupne o ispitivanoj kemikaliji ili srodnim kemikalijama.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Osim ako nije ograničeno fizikalno-kemijskom prirodom ili biološkim učincima ispitivane kemikalije, obično treba odabrati najvišu visinu doze kako bi se identificirali organi mete i toksični učinci uz izbjegavanje patnje, ozbiljne toksičnosti, boležljivosti ili smrti. Uzimajući u obzir čimbenike izložene u stavku 23. u nastavku, obično treba odabrati najvišu visinu doze kako bi se izveli dokazi o toksičnosti kao što je, primjerice, dokazano padom povećanja tjelesne mase (otprilike 10 %). No, ovisno o ciljevima studije (vidjeti stavak 6.), može se odabrati najviša visina doze manja od doze koja pruža dokaze o toksičnosti npr. ako doza izaziva štetan, zabrinjavajuć učinak koji unatoč tomu utječe na životni vijek ili tjelesnu masu.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Visine doza i razmaci između visina doza mogu se odabrati kako bi se odredio ishod doza-reakcija i, ovisno o načinu djelovanja ispitivane kemikalije, NOAEL ili drugi namjeravani ishod studije, npr. BMD (vidjeti stavak 25.) na najnižoj visini doze. Čimbenici koje treba uzeti u obzir pri dodjeljivanju nižih doza uključuju očekivani nagib krivulje doze i reakcije, doze na kojima se mogu dogoditi važne promjene u metabolizmu ili načinu toksičnog djelovanja, gdje se očekuje prag ili gdje se očekuje polazna točka za ekstrapolaciju za niske doze.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Odabrani razmak između visina doza ovisit će o svojstvima ispitivane kemikalije i ova ispitna metoda ne može ga propisati, ali dva do četiri intervala smanjenja često pružaju dobro uspješnost ispitivanja za određivanje silaznih visina doza, a često se daje prednost dodavanju četvrte ispitne skupine nego primjeni vrlo velikih intervala (npr. više nego čimbenik između 6 - 10) među dozama. Općenito treba izbjegavati primjenu faktora većih od deset i treba ih opravdati ako se primjenjuju.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Kao što je izloženo u nastavku Smjernice br. 116. (7), točke koje treba uzeti u obzir pri odabiru doze uključuju:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Poznate nelinearnosti ili točke savijanja u odnosu doze i reakcije ili one na koje se sumnja,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Toksikokinetiku i raspone doza u kojima se događaju ili ne događaju metabolička indukcija, zasićenje ili nelinearnost između vanjskih i unutarnjih doza,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Prethodne lezije, markeri učinka ili indikatori operacije ključnih temeljnih bioloških procesa,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Ključni aspekti ili načini djelovanja (ili oni na koje se sumnja), poput doza na kojima počinje rasti citotoksičnost, razina hormona se poremeti, homeostatski mehanizmi uništavaju itd.,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Regije krivulje doze i reakcije gdje je potrebna posebno jaka procjena, npr. u rasponu očekivanog BMD-a ili praga na koji se sumnja,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Uzimanje u obzir očekivanih razina ljudskog izlaganja.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Kontrolna skupina mora biti netretirana skupina ili skupina za kontrolu nosača ako se u primjeni ispitivane kemikalije primjenjuje nosač. Osim radi tretiranja ispitivanom kemikalijom, životinje u kontrolnoj skupini treba tretirati na jednak način kao i životinje u ispitnim skupinama. Ako se primjenjuje nosač, kontrolna skupina mora primiti nosač u najvećoj količini primijenjenoj u skupinama koje primaju doze. Ako se ispitivana kemikalija daje kroz hranu i ako izaziva značajno smanjeno unosa hrane zbog smanjene tečnosti hrane, može biti korisna dodatna kontrolna skupina koja se hrani u paru kako bi poslužila za primjereniju kontrolu.
                           
                        
                     Priprema doza i primjena ispitivane kemikalije
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Ispitivana kemikalija obično se daje oralno, kroz hranu ili vodu za piće ili pak sondom. Dodatne informacije o načinima i metodama davanja navedene su u Smjernici br. 116. (7). Način i metoda primjene ovise o svrsi studije, fizikalno-kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, njezinoj bioraspoloživosti te pretežnom načinu i metodi izlaganja ljudi. Treba predočiti argumentaciju za odabrani način i metodu primjene. Radi dobrobiti životinja oralnu sondu valja upotrijebiti samo za sredstva za koja taj način i metoda primjene opravdano predstavljaju potencijalno izlaganje ljudi (npr. lijekovi). Kemikalije iz hrane ili okoliša, uključujući pesticide, obično se primjenjuju kroz hranu ili vodu za piće. No, u nekim je situacijama, npr. pri radnom izlaganju, prikladnije izlaganje na druge načine.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Po potrebi, ispitivana se kemikalija otapa ili suspendira u odgovarajućem nosaču. U obzir treba uzeti sljedeća svojstva nosača i drugih aditiva po potrebi: učinke na apsorpciju, distribuciju, metabolizam ili retenciju ispitivane kemikalije; učinke na kemijska svojstva ispitivane kemikalije koja se mogu promijeniti u toksična svojstva te učinke na unos hrane ili vode ili nutritivnog statusa životinja. Preporučuje se da se, kada je god moguće, u obzir najprije uzme vodena otopina/suspenzija pa zatim otopina/suspenzija u ulju (npr. kukuruzno ulje) te zatim moguća otopina u drugim nosačima. Za nosače različite od vode moraju biti poznata toksična svojstva nosača. Moraju biti dostupne informacije o stabilnosti ispitivane kemikalije i homogenosti otopina za doziranje ili prehranu (ono što je odgovarajuće) pod uvjetima primjene (npr. prehrana).
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Kod kemikalija koje se primjenjuju putem hrane ili vode za piće važno je osigurati da količine ispitivane kemikalije ne utječu na uravnoteženi unos hrane ili vode. U dugotrajnim studijama toksičnosti uz primjenu davanja kroz hranu koncentracija ispitivane kemikalije u hrani obično ne smije premašiti gornju granicu od 5 % ukupne hrane kako bi se izbjegla nutritivna neravnoteža. Ako se ispitivana kemikalija daje kroz hranu, može se upotrijebiti konstantna koncentracija u hrani (hrana mg/kg ili ppm) ili konstantna visina doze u odnosu na tjelesnu masu životinje (mg/kg tjelesne mase) izračunata na tjednoj bazi. Treba specificirati korištenu alternativu.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              U slučaju oralne primjene životinjama se svakodnevno daje ispitivana kemikalija (sedam dana tjedno) obično u razdoblju od 24 mjeseca za glodavce (vidjeti i stavak 32.). Svaki drukčiji režim primjene, npr. pet dana tjedno, treba obrazložiti. U slučaju dermalne primjene životinje se ispitivanom kemikalijom obično tretiraju najmanje šest sati dnevno, sedam dana tjedno, kao što je navedeno u Poglavlju B.9 ovog Priloga (11), u razdoblju od 24 mjeseci. Izlaganje inhalacijom provodi se šest sati dnevno, sedam dana tjedno, ali može se primijeniti i izlaganje pet dana ako je opravdano. Razdoblje izlaganja obično traje 24 mjeseci. Ako izlaganju samo nosom nisu izloženi štakori nego drugi glodavci, maksimalno trajanje izlaganja treba prilagoditi kako bi se na minimum sveo stres specifičan za tu vrstu. Treba pružiti argumentaciju za primjenu izlaganja kraćeg od šest sati dnevno. Vidjeti također i Poglavlje B.8 ovog Priloga (9).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Ako se ispitivana kemikalija životinjama daje sondom, to treba provesti želučanom sondom ili prikladnom intubacijskom kanilom u slično vrijeme svakog dana. Obično se jedanput dnevno daje jedna doza, primjerice u slučajevima kada je kemikalija lokalni iritans, no moguće je zadržati dnevnu količinu doze na način da je se podijeli (dvaput dnevno). Maksimalni volumen tekućine koji se može primijeniti odjednom ovisi o veličini pokusne životinje. Količinu treba održavati toliko niskom da bude praktična, a obično ne bi trebala biti veća od 1 ml/100 g tjelesne mase za glodavce (31). Varijabilnost u ispitnoj količini treba svesti na minimum prilagodbom koncentracije kako bi se osigurala konstantna količina na svim visinama doze. Iznimku predstavljaju potencijalno nagrizajuće ili nadražujuće kemikalije te ih treba razrijediti kako bi se izbjegli ozbiljni lokalni učinci. Treba izbjegavati ispitivanje na koncentracijama koje su vjerojatno nagrizajuće ili nadražujuće za gastrointestinalni trakt.
                           
                        
                     Trajanje studije
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Studija obično traje 24 mjeseci za glodavce, što predstavlja najveći dio uobičajenog životnog vijeka korištenih životinja. Mogu se primijeniti kraće ili dulje studije, ovisno o životnom vijeku vrste životinja korištenih u studiji, ali to treba obrazložiti. Za specifične sojeve miševa, npr. AKR/J, C3H/J ili C57BL/6J, može biti prikladnije trajanje od 18 mjeseci. U nastavku se nalaze neke upute u vezi s trajanjem, završetkom studije i preživljavanjem; ostale upute uključujući razmatranja o prihvatljivosti negativne karcinogenosti povezane s preživljavanjem u studiji nalaze se u OECD-ovoj Smjernici br. 116. o planiranju i provođenju studija kronične toksičnosti i karcinogenosti (7).
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Završetak studije treba uzeti u obzir kada broj preživjelih u skupinama s nižim dozama ili kontrolnoj skupini padne na manje od 25 %.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Ako samo skupina s visokom dozom prijevremeno ugine zbog toksičnosti, to ne smije izazvati završetak studije.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Treba posebno bilježiti preživljavanje svakog spola.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Studija ne treba trajati dulje od točke u kojoj podaci dostupni iz studije više nisu dovoljni za omogućivanje statistički valjane ocjene.
                                       
                                    
                        OPAŽANJA
                  
                              33.
                           
                           
                              Sve životinje treba pregledati radi boležljivosti ili ugibanja, obično na početku i kraju svakog dana uključujući vikend i praznike. Životinje treba dodatno jedanput dnevno prekontrolirati radi specifičnih znakova od toksikološke važnosti uzimajući u obzir vršno razdoblje očekivanih učinaka nakon doziranja u slučaju davanja sondom. Posebnu pažnju valja obratiti na razvoj tumora, te treba zabilježiti vrijeme nastanka tumora, lokaciju, dimenzije, izgled i napredovanje svakog makroskopski vidljivog ili palpabilnog tumora.
                           
                        
                     Tjelesna masa, unos hrane/vode i učinkovitost hrane
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Sve životinje treba izvagati na početka tretiranja, najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjesečno. Mjerenja unosa i učinkovitosti hrane treba provoditi najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjesečno. Unos vode treba mjeriti najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjesečno ako se kemikalija primjenjuje preko vode za piće. Mjerenje unosa vode treba također uzeti u obzir i za studije u kojima se mijenja aktivnost pijenja.
                           
                        
                     Hematologija, klinička biokemija i druga mjerenja
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Kako bi se na maksimum povećala količina informacija dobivenih iz studije, posebno za način djelovanja, mogu se uzeti uzorci krvi za hematologiju i kliničku biokemiju, o čemu odlučuje voditelj istraživanja. Također može biti prikladna i analiza urina. Ostale upute o vrijednosti uzimanja tih uzoraka kao dio studije karcinogenosti nalaze se u Smjernici br. 116. (7). Ako se smatra prikladnim, uzorkovanje krvi za hematološke i kliničko-kemijske pretrage te analiza urina mogu se provesti kao dio usmrćivanja u međuvremenu (stavak 20.) te na kraju studije na najmanje dest životinja svakog spola u svakoj skupini. Uzorke krvi treba uzimati iz određenog mjesta, primjerice punkcijom srca ili iz retroorbitalnog sinusa, pod anestezijom te pohraniti pod odgovarajućim uvjetima ako je potrebno. Razmazi krvi također se mogu pripremiti za pretrage, posebno ako se čini da je organ meta koštana srž, iako se propituje vrijednosti takvih pretraga za određivanje karcinogenog/onkogenog potencijala (32).
                           
                        PATOLOGIJA
                  
                     Makroskopska analiza
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Sve životinje u studiji, osim indikatorskih životinja (vidjeti stavak 20.) i drugih satelitskih životinja, moraju se podvrgnuti potpunoj, detaljnoj makroskopskoj obdukciji koja obuhvaća pažljiv pregled vanjske površine tijela, svih otvora te lubanjske, prsne i trbušnje šupljine i njihovog sadržaja. Indikatorske životinje mogu zahtijevati obdukciju u pojedinačnim slučajevima, a odluka je prepuštena voditelju istraživanja. Mase organa nisu uobičajeni dio studije karcinogeneze budući da gerijatrijske promjene te, u kasnijim fazama, razvoj tumora remete korisnost podataka o masi organa. No mogu biti ključne pri provođenju ocjene težine dokaza te posebno za razmatranje o načinu djelovanja. Ako su dio satelitske studije, treba ih skupiti ne kasnije od godine dana nakon početka studije.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Sljedeća tkiva treba čuvati u najprikladnijem fiksacijskom mediju za oba tipa tkiva i namjeravane histopatološke pretrage koja slijedi (33) (tkiva u uglatim zagradama opcijska su):
                              
                                          sve makroskopske lezije
                                       
                                       
                                          srce
                                       
                                       
                                          gušterača
                                       
                                       
                                          želudac (predželudac, žljezdani želudac)
                                       
                                    
                                          nadbubrežna žlijezda
                                       
                                       
                                          ileum
                                       
                                       
                                          paraštitna žlijezda
                                       
                                       
                                          [zubi]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          jejunum
                                       
                                       
                                          periferni živac
                                       
                                       
                                          testis
                                       
                                    
                                          mozak (uključujući sekcije velikog i malog mozga te medule/mosta)
                                       
                                       
                                          bubreg
                                       
                                       
                                          hipofiza
                                       
                                       
                                          timus
                                       
                                    
                                          cekum
                                       
                                       
                                          suzna žlijezda (eksorbitalna)
                                       
                                       
                                          prostata
                                       
                                       
                                          štitnjača
                                       
                                    
                                          cerviks
                                       
                                       
                                          jetra
                                       
                                       
                                          rektum
                                       
                                       
                                          [jezik]
                                       
                                    
                                          koagulacijska žiljezda
                                       
                                       
                                          pluća
                                       
                                       
                                          žlijezda slinovnica
                                       
                                       
                                          dušnik
                                       
                                    
                                          debelo crijevo
                                       
                                       
                                          limfni čvorovi (površinski i dubinski)
                                       
                                       
                                          sjemenski mjehurić
                                       
                                       
                                          mokraćni mjehur
                                       
                                    
                                          dvanaesnik
                                       
                                       
                                          mliječna žlijezda (obvezno za ženke i ako se mogu secirati, od mužjaka)
                                       
                                       
                                          skeletni mišić
                                       
                                       
                                          maternica (uključujući cerviks)
                                       
                                    
                                          epididimis
                                       
                                       
                                          [gornji respiratorni trakt uključujući nos, turbinate i paranazalne sinuse]
                                       
                                       
                                          koža
                                       
                                       
                                          [mokraćovod]
                                       
                                    
                                          oko (uključujući mrežnicu)
                                       
                                       
                                          jednjak
                                       
                                       
                                          kralježnica (na tri razine: vratna, srednja prsna i slabinska)
                                       
                                       
                                          [mokraćna cijev]
                                       
                                    
                                          [femur sa zglobom]
                                       
                                       
                                          [olfaktorni bulbus]
                                       
                                       
                                          slezena
                                       
                                       
                                          vagina
                                       
                                    
                                          žučni mjehur (za vrste drukčije od štakora)
                                       
                                       
                                          jajnik
                                       
                                       
                                          [prsna kost],
                                       
                                       
                                          sekcija koštane srži i/ili aspirat svježe koštane srži
                                       
                                    
                                          Harderova žlijezda
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    U slučaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba sačuvati oba organa. Klinički i drugi nalazi mogu sugerirati potrebu za pregledom dodatnih tkiva. Treba također sačuvati sve organe za koje se smatra da bi mogli biti meta na temelju poznatih svojstava ispitivane kemikalije. U studijama koje uključuju dermalni način primjene treba sačuvati popis organa sastavljen za oralni način primjene, s tim da je vrlo važno specifično uzorkovanje i čuvanje kože s mjesta primjene. U studijama inhalacijom popis sačuvanih i ispitanih tkiva iz respiratornog trakta treba slijediti preporuke Poglavlja B.8 i B.29 ovog Priloga. Za ostale organe/tkiva (te uz posebno sačuvana tkiva iz respiratornog trakta) treba ispitati popis organa zadan za oralni način primjene.
                           
                        
                     Histopatologija
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Dostupna je smjernica za najbolju praksu u provođenju istraživanja toksikološke patologije (33). Minimum tkiva na kojima su obavljene pretrage mora uključivati:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Sva tkiva iz skupina izloženih visokoj dozi i kontrolnih skupina,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Sva tkiva životinja uginulih ili usmrćenih tijekom studije,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Sva tkiva s makroskopskim anomalijama uključujući tumore,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Ako se u skupini izloženoj visokoj dozi opaze histopatološke promjene povezane s tretmanom, ta tkiva treba analizirati na svim životinjama u svim skupinama izloženima drugim dozama,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          U slučaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba ispitati oba organa.
                                       
                                    
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Podaci
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Treba pružiti pojedinačne podatke o životinjama za sve ocijenjene parametre. Uz to sve podatke treba skupiti u obliku tablice, prikazujući za svaku ispitnu skupinu broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja koje su tijekom ispitivanja pronađene uginule ili su usmrćene iz humanih razloga te vrijeme smrti ili usmrćivanja, broj uočenih znakova toksičnosti, opis uočenih znakova toksičnosti, uključujući vrijeme nastupanja, trajanje i ozbiljnost svakog toksičnog učinka, broj životinja s lezijama, tip lezija te postotak životinja sa svakim tipom lezije. Tablice sa sažetkom podataka trebaju pružiti prosječne i standardne devijacije (za podatke trajnih ispitivanja) za životinje koje pokazuju toksične učinke ili lezije uz stupnjevanje lezija.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              U tumačenju rezultata studije, npr. u slučaju kada postoje indikacije da su podaci dobiveni u paralelnim kontrolama bitno izvan granica u usporedbi sa skorašnjim podacima od kontrolnih životinja iz istog ispitnog smještaja/kolonije, mogu biti dragocjeni povijesni kontrolni podaci. Povijesne kontrolne podatke, ako se ocjenjuju, treba uzeti iz istog laboratorija i povezati sa životinjama iste dobi i vrste proizvedenih tijekom pet godina prije dotične studije.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Ako je moguće, brojčane rezultate treba ocijeniti prikladnom i opće prihvaćenom statističkom metodom. Statističke metode i podatke koji će se analizirati treba odabrati tijekom planiranja studije (stavak 9.). Ako je potrebno, odabir treba osigurati prilagodbu radi preživljavanja.
                           
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              U izvješću o ispitivanju treba navesti sljedeće informacije:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana kemikalija:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizikalna narav, čistoća i fizikalno-kemijska svojstva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikacijski podaci,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrijetlo kemikalije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj serije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      potvrda kemijske analize,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosač (po potrebi):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obrazloženje odabira nosača (ako nije voda),
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusne životinje:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korištene vrste/sojevi te obrazloženje odabira,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj, dob i spol životinja na početku ispitivanja,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinačna masa životinja na početku ispitivanja,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      argumentacija za način primjene i odabir doze,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ako je primjenjivo, statistička metoda korištena za analizu podataka,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinosti o pripremi ispitivane kemikalije/hrane,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analitički podaci o postignutoj koncentraciji, stabilnosti i homogenosti preparata,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      način primjene i pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      za studije inhalacijom, bilo samo nosom ili čitavim tijelom,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stvarne doze (mg/kg tjelesne mase po danu) i faktor pretvorbe iz koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za piće (mg/kg ili ppm) sa stvarnom dozom ako je primjenjivo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinosti o kvaliteti hrane i vode,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati (treba prikazati tablično sažete podatke i pojedinačne podatke za životinje):
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Općenito
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci o preživljavanju,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tjelesna masa/promjene u tjelesnoj masi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      unos hrane, izračun učinkovitosti hrane ako je napravljen te unos vode,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ako je primjenjivo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toksikokinetički podaci ako su raspoloživi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmoloskopija (ako je raspoloživa),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      hematologija (ako je raspoloživa),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      klinička kemija (ako je raspoloživa),
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Klinički nalazi
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Znakovi toksičnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Učestalost (te, ako je zabilježena, ozbiljnost) svih anomalija,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Narav, ozbiljnost i trajanje kliničkih opažanja (prolaznih ili trajnih),
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Obdukcijski podaci
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tjelesna masa na kraju,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Mase organa i njihovi omjeri ako je primjenjivo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nalazi obdukcije, Učestalost i ozbiljnost anomalija,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Histopatologija
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Neneoplastični histopatološki nalazi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Neoplastični histopatološki nalazi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Međusobni odnos između makroskopskih i mikroskopskih nalaza,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Detaljan opis svih histopatoloških nalaza povezanih s tretiranjem, uključujući stupnjeve ozbiljnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Izvješće svih pregleda objektnih stakalaca mikroskopa provedenih od kolega,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Statistička obrada rezultata po potrebi
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Diskusija o rezultatima uključujući
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Diskusiju o svim modelima pristupa,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Odnos doze i reakcije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Povijesne kontrolne podatke,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Razmatranja o svim načinima djelovanja informacija,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Određivanje BMD, NOAEL ili LOAEL,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Relevantnost za ljude,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zaključci
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1995.). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Poglavlje B.27 ovog Priloga, Test subkronične oralne toksičnosti - 90-dnevna studija oralne toksičnosti na neglodavcima uz primjenu ponavljanih doza.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2012.). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Poglavlje B.8 ovog Priloga, Subakutna inhalacijska toksičnost: 28-dnevna studija.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Poglavlje B.29 ovog Priloga, Subkronična ihnalacijska toksičnost: 90-dnevna studija.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Poglavlje B.9 ovog Priloga, Toksičnost (dermalna) pri ponavljanoj dozi (28 dana).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              OECD (2002.). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Pariz.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              OECD (2000.). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se upotrebljavaju u znanstvene svrhe, SL L 276, 20.10.2010., str. 33.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, D.C., US Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Weingand K, et al. (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P, et al. (2004). Smjernica za najbolju praksu: Toksikološka histopatologija, Toksikološka patologija 32: 126-131.
                           
                        
                     Dodatak 1.
                     DEFINICIJA
                     Ispitivana kemikalija: Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne metode.
                  
                  B. 33.   KOMBINIRANE STUDIJE KRONIČNE TOKSIČNOSTI/KARCINOGENOSTI
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 453 (2009.). Originalna Smjernica za ispitivanje 453 usvojena je 1981. Smatralo se da je nužno razviti ovu ažuriranu ispitnu metodu B.33 kako bi se odrazio recentni razvoj u području dobrobiti životinja i regulatornih zahtjeva (1) (2) (3) (4) (5). Ova ispitna metoda B.33 ažurirana je paralelno s revizijama Poglavlja B.32 ovog Priloga, Studije karcinogenosti te Poglavlja B.30 ovog Priloga, Studije kronične toksičnosti s ciljem pribavljanja dodatnih informacija od životinja korištenih u studiji te prikupljanja daljnjih detalja o odabiru doze. Ova ispitna metoda namijenjena je primjeni u ispitivanju širokog spektra kemikalija, uključujući pesticide i industrijske kemikalije. No, treba imati na umu da neke pojedinosti i zahtjevi mogu biti različiti za ljude [vidjeti Smjernicu S1B o Ispitivanju kancerogenosti lijekova Međunarodne konferencije o usklađivanju (International conference on Harmonisation (ICH)].
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Većina studija kronične toksičnosti i karcinogenosti provode se na vrstama glodavaca, stoga i ovu ispitnu metodu treba primjenjivati prvenstveno u studijama koje se provode na tim vrstama. Ako se traži da se takve studije provode na neglodavcima, također se mogu primijeniti izložena načela i postupci uz odgovarajuće modifikacije, zajedno s načelima i postupcima izloženima u Poglavlju B.27 ovog Priloga, Studija subkronične oralne toksičnosti 90-dnevno ispitivanje oralne toksičnosti na ne-glodavcima uz primjenu ponavljanih doza (6), kao što je izloženo u OECD-ovoj Smjernici br. 116. o planiranju i provođenju studija kronične toksičnosti i karcinogenosti (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Tri glavna načina primjene upotrijebljena u studijama kronične toksičnosti/karcinogenosti jesu oralni, dermalni i inhalacijski. Odabir načina primjene ovisi o fizikalnim i kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije te o pretežnom načinu izlaganja ljudi. Dodatne informacije o odabiru načina izlaganja navedene su u Smjernici br. 116. (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda usmjerena je na izlaganje oralnim putem, što je najčešće korišteni način u studijama kronične toksičnosti i karcinogenosti. Dok dugotrajne studije, koje uključuju izlaganje preko kože ili inhalacijom, mogu također biti potrebne i/ili se mogu tražiti pod određenim regulatornim režimima radi određivanja rizika za ljude, oba načina izlaganja uključuju znatnu tehničku složenost. Takve studije treba planirati za svaki slučaj posebno iako ovdje izložena ispitna metoda za određivanje i ocjenu kronične toksičnosti i karcinogenosti putem oralne primjene može poslužiti kao temelj za protokol za studije inhalacijom i/ili dermalnim putem, uzimajući u obzir preporuke za razdoblja tretiranja, kliničke i patološke parametre itd. Dostupna je OECD-ova Smjernica za primjenu ispitivane kemikalije inhalacijom (7) (8) i dermalnim putem (7). Poglavlje B.8 ovog Priloga (9) i Poglavlje B.29 ovog Priloga (10), zajedno sa Smjernicom OECD-a za ispitivanje akutne inhalacije (8), trebaju poslužiti kao detaljna konzultacija pri planiranju dugotrajnijih studija koje uključuju izlaganje inhalacijom. Poglavlje B.9 ovog Priloga (11) treba uzeti kao pomoć pri ispitivanju provedenom dermalnim putem.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kombinirana studija kronične toksičnosti/karcinogenosti pruža informacije o mogućim rizicima za zdravlje koji će se vjerojatno pojaviti zbog ponovljenog izlaganja kroz gotovo čitavo ili čitavo životno razdoblje korištenih vrsta. Ta će studija pružiti informacije o toksičnim učincima ispitivane kemikalije, uključujući i potencijalnu karcinogenost, te može ukazati na organe mete i mogućnost akumulacije. Može pružiti procjenu razine neopaženih štetnih učinaka te, u slučaju negenotoksičnih karcinogena, za tumorske reakcije koje se mogu upotrijebiti za određivanje sigurnosnih kriterija za izlaganje ljudi. Također je naglašena potreba za pažljivim kliničkim opažanjima životinja radi dobivanja što je moguće više informacija.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Ciljevi studija kronične toksičnosti/karcinogenosti obuhvaćeni ovom ispitnom metodom uključuju:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Identifikaciju karcinogenih svojstava ispitivane kemikalije koja rezultiraju povećanjem učestalosti pojavljivanja neoplazmi, povećanim omjerom malignih neoplazmi ili smanjenjem u vrijeme pojavljivanja neoplazmi u usporedbi s paralelnim kontrolnim skupinama,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Identifikaciju vremena pojavljivanja neoplazmi,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Identifikaciju kronične toksičnosti ispitivane kemikalije,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Identifikaciju organa meta kronične toksičnosti i karcinogenosti,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Karakterizaciju odnosa doze i reakcije,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Identifikaciju razine neopaženih štetnih učinaka (NOAEL) ili polaznu točku za utvrđivanje referentne doze za usporedbu (benchmark dose, BMD),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Ekstrapolaciju karcinogenih učinaka na niskim razinama izlaganja ljudi,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Predviđanje učinaka kronične toksičnosti na razinama ljudskog izlaganja.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Pružanje podataka za ispitivanje pretpostavki u svezi s načinom djelovanja (2) (7) (12) (13) (14) (15).
                                       
                                    
                        UVODNA RAZMATRANJA
                  
                              7.
                           
                           
                              U određivanju i procjeni potencijalne karcinogenosti i kronične toksičnosti ispitivane kemikalije laboratorij koji provodi ispitivanje prije provođenja studije mora u obzir uzeti sve dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji kako bi se plan studije usmjerio na učinkovitije ispitivanje toksikoloških svojstava te kako bi se na minimum svela primjena životinja. Informacije i razmatranja o svim načinima djelovanja karcinogena na koji se sumnja (2) (7) (12) (13) (14) (15) posebno su važne jer se optimalan plan može razlikovati, ovisno o tome zna li se ili sumnja za ispitivanu kemikaliju da je genotoksični karcinogen. Ostale upute o razmatranju načina djelovanja mogu se pronaći u Smjernici br. 116. (7).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Informacije koje će pomoći u planiranju studije obuhvaćaju identitet, kemijsku strukturu i fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije, sve informacije o načinu djelovanja, rezultate svih ispitivanja toksičnosti in vitro ili in vivo uključujući ispitivanja genotoksičnosti, očekivanu/e primjenu/e i potencijal za ljudsko izlaganje, dostupne podatke (Q)SAR, mutagenost/genotoksičnost, karcinogenost i druge toksikološke podatke o kemikalijama srodne strukture, dostupne toksikokinetičke podatke (kinetika jedne doze i ponovljene doze ako je dostupno) te podatke dobivene u drugim studijama s ponovljenim izlaganjem. Određivanje kronične toksičnosti/karcinogenosti treba provesti nakon dobivanja početnih informacija o toksičnosti iz 28-dnevnog i/ili 90-dnevnog ispitivanja toksičnosti uz primjenu ponovljenih doza. Kratkoročno ispitivanje početnog razvoja raka također može pružiti korisne informacije. Pristup s fazama u ispitivanju karcinogenosti treba smatrati dijelom ukupnog utvrđivanja potencijalno štetnih učinaka dotične ispitivane kemikalije po zdravlje (16) (17) (18) (19).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Prije početka studije treba odrediti najprikladnije statističke metode za analizu rezultata s obzirom na plan i ciljeve pokusa. Problemi koja treba razmatrati uključuju treba li statistika uključivati prilagodbu preživjelih, analizu ukupnog rizika od tumora u odnosu na trajanje preživljavanja, analizu vremena za stvaranje tumora te analizu u slučaju prijevremenog svršetka jedne ili više skupina. Smjernice o odgovarajućim statističkim analizama i ključnim referencama na međunarodno prihvaćene statističke metode nalaze se u Smjernici br. 116. (7) te također u Smjernici br. 35. za analizu i ocjenu studija kronične toksičnosti i karcinogenosti (20).
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Pri provođenju studije karcinogenosti uvijek treba slijediti načela i razloge izložene u OECD-ovoj Smjernici o prepoznavanju, određivanju i primjeni kliničkih znakova kao humanih krajnjih učinaka za pokusne životinje korištene u procjeni sigurnosti (21), a posebno u njezinom stavku 62. U tom stavku stoji da ‚u studijama uz primjenu ponovljenog doziranja, kada životinje pokazuju progresivne kliničke znakove koji izazivaju daljnje pogoršanje stanja, treba donijeti upućenu odluku o tome treba li humano usmrtiti životinje ili ne. Odluka treba uključivati razloge s obzirom na vrijednost informacija dobivenih iz trajnog održavanja te životinje u studiji s obzirom na njezino opće stanje. Ako se odluči zadržati životinju u ispitivanju, učestalost opažanja treba povećati u skladu s potrebama. Također se može privremeno prekinuti s doziranjem ako će to olakšati patnju ili stres ili smanjiti ispitnu dozu bez štetnih utjecaja na svrhu ispitivanja.’
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Detaljne upute za načela odabira doza za studije kronične toksičnosti i karcinogenosti te rasprava o njima mogu se pronaći u Smjernici br. 116. (7), kao i u dvije publikacije instituta International Life Sciences Institute (22) (23). Osnovna strategija odabira doza ovisi o primarnom cilju ili primarnim ciljevima studije (stavak 6.). Pri odabiru odgovarajućih razina doza treba postići ravnotežu između procjene opasnosti s jedne strane i karakterizacije reakcija na nisku dozu te njihovo značenje s druge strane. To je posebno relevantno u slučaju ove kombinirane studije kronične toksičnosti i karcinogenosti.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Treba navesti razloge za provođenje ove kombinirane studije kronične toksičnosti i karcinogenosti, a ne odvojeno provođenje studije kronične toksičnosti (Poglavlje B.30 ovog Priloga) i studije karcinogenosti (Poglavlje B.32 ovog Priloga). Kombinirano ispitivanje pruža veću učinkovitost što se tiče vremena i troškova u usporedbi s provođenjem dviju odvojenih studija, bez kompromitiranja kvalitete podataka u kroničnoj fazi niti u karcinogenoj fazi. Pri provođenju kombinirane studije kronične toksičnosti i karcinogenosti treba pažljivo razmisliti o načelima odabira doza (stavci 11. i 22. - 26.) te se također priznaje da u određenim regulatornim okvirima mogu biti nužne odvojene studije. Daljnje upute za planiranje kombinirane studije kronične toksičnosti i karcinogenosti s ciljem postizanja maksimalne učinkovitosti studije u smislu mogućnosti smanjenja broja korištenih životinja, kao i modernizacije raznih pokusnih postupaka, nalaze se u Smjernici br. 116. (7).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se na kraju ovog poglavlja i u Smjernici br. 116. (7).
                           
                        NAČELO ISPITIVANJA
                  
                              14.
                           
                           
                              Planiranje studije obuhvaća dvije paralelne faze, kroničnu fazu i fazu karcinogenosti (za trajanje vidjeti redom stavke 34. i 35.). Ispitivana kemikalija obično se primjenjuje oralnim putem iako se može primijeniti i ispitivanje inhalacijom ili dermalnim putem. Za kroničnu fazu ispitivana kemikalija primjenjuje se svakodnevno u postupnim dozama raznim skupinama pokusnih životinja, jedna visina doze po skupini, obično u razdoblju od 12 mjeseci iako se mogu odabrati dulja ili kraća trajanja ovisno o regulatornim zahtjevima (vidjeti stavak 34.). Odabire se dovoljno dugo vrijeme koje bi omogućilo manifestaciju učinaka kumulativne toksičnosti bez miješanja s učincima gerijatrijskih promjena. Planiranje studije također može uključivati jedno ili više usmrćivanja u međuvremenu, npr. s tri i šest mjeseci, i mogu se uključiti dodatne skupine životinja kako bi se to kompenziralo (vidjeti stavak 20.). Za fazu karcinogenosti ispitivana kemikalija primjenjuje se svakodnevno raznim skupinama pokusnih životinja tijekom najvećeg dijela njihova života. Životinje se u objema fazama pomno promatraju radi znakova toksičnosti i razvoja neoplazmičkih lezija. Životinje koje ugibaju ili su usmrćene tijekom ispitivanja podvrgavaju se obdukciji, a na kraju ispitivanja preživjele se životinje usmrćuju i podvrgavaju obdukciji.
                           
                        OPIS METODE
                  
                     Odabir životinjske vrste
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda prvenstveno obuhvaća određivanje i ocjenu kronične toksičnosti i karcinogenosti u glodavaca (stavak 2.). U obzir se može uzeti primjena vrsta neglodavaca ako dostupni podaci sugeriraju da su oni relevantniji za predviđanje zdravstvenih učinaka po ljude. Treba obrazložiti odabir vrsta. Preferirana vrsta glodavaca jesu štakori iako se mogu upotrijebiti i druge vrste glodavaca, npr. miš. Iako uporaba miševa u ispitivanju karcinogenosti može biti ograničeno korisna (24) (25) (26), u nekim aktualnim regulatornim programima još se uvijek traži ispitivanje karcinogenosti u miševa osim ako je utvrđeno da nema znanstvene potrebe za takvom studijom. Štakori i miševi preferirani su pokusni modeli zbog relativno kratkog životnog vijeka, raširene primjene u farmakološkim i toksikološkim studijama, osjetljivosti na izazivanje tumora te dostupnosti dovoljno karakteriziranih sojeva. Kao posljedica tih svojstava, dostupno je mnogo informacija o njihovoj fiziologiji i patologiji. Plan i provođenje studija kronične toksičnosti/karcinogenosti na vrstama neglodavaca, ako je potrebno, treba temeljiti na načelima izloženima u ovoj ispitnoj metodi zajedno s načelima iz Poglavlja B.27 ovog Priloga, Studija subkronične oralne toksičnosti - 90-dnevna studija oralne toksičnosti na neglodavcima uz primjenu ponavljanih doza (6). Dodatne informacije o odabiru vrste i soja navedene su u Smjernici br. 116. (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Treba upotrijebiti mlade zdrave odrasle životinje sojeva koji su uobičajeni u laboratorijskoj praksi. Kombiniranu studiju kronične toksičnosti/karcinogenosti treba obaviti na životinjama istog soja i podrijetla kao i životinje korištene u preliminarnoj/im studiji/-ama toksičnosti kraćeg trajanja iako, ako se za životinje tog soja i podrijetla zna da imaju problema u postizanju uobičajeno prihvaćenih kriterija za preživljavanje u dugotrajnim studijama [vidjeti Smjernicu br. 116. (7)], treba razmotriti primjenu životinjskog soja s prihvatljivom stopom preživljavanja za dugotrajnu studiju. Treba upotrebljavati ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne.
                           
                        
                     Uvjeti smještaja i hranjenja
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Životinje moraju biti smještene pojedinačno ili u kavezima u malim skupinama istog spola; pojedinačni smještaj treba uzeti u obzir samo ako je znanstveno opravdan (27) (28) (29). Kaveze treba rasporediti na način da se učinci do kojih bi moglo doći zbog položaja kaveza svedu na minimum. Temperatura u prostoriji s pokusnim životinjama morala bi iznositi 22 °C (± 3 °C). Premda bi relativna vlažnost zraka trebala iznositi najmanje 30 % te po mogućnosti ne premašivati 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50 - 60 %. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može primjenjivati konvencionalna laboratorijska prehrana uz neograničene količine pitke vode. Prehrana mora ispunjavati sve nutritivne potrebe ispitivanih vrsta, a udio tvari koje kontaminiraju hranu - uključujući ostatke pesticida, postojane organske zagađivače, fitoestrogene, teške metale i mikotoksine, ali ne ograničeno na njih - koje mogu utjecati na rezultat ispitivanja treba biti što je moguće manji. Analitičke informacije o razinama tvari koje kontaminiraju hranjive tvari i prehranu treba izrađivati periodično, barem na početku studije te u slučaju promjene u primijenjenoj seriji, i treba ih uključiti u završno izvješće. Također treba pružiti analitičke informacije o vodi za piće korištenoj u istraživanju. Na odabir prehrane može utjecati potreba za osiguranjem prikladnih dodataka ispitivane kemikalije i ispunjavanjem nutritivnih potreba životinja ako se ispitivana kemikalija primjenjuje kroz hranu.
                           
                        
                     Priprema životinja
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Treba upotrijebiti zdrave životinje koje su se aklimatizirale na laboratorijske uvjete najmanje sedam dana i koje nisu izlagane prethodnim pokusnim postupcima. U slučaju glodavaca doziranje životinja treba početi što je moguće prije nakon prestanka odbijanja od sise i aklimatizacije te po mogućnosti prije nego što životinje navrše osam tjedana. Ispitne životinje treba karakterizirati što se tiče vrste, soja, podrijetla, spola, mase i starosti. Na početku studije odstupanje u masi za svaki spol korištenih životinja mora biti minimalno i ne smije biti veće od ± 20 % prosječne mase svih životinja u studiji, posebno za svaki spol. Životinje treba nasumično odrediti za kontrolne i ispitne skupine. Nakon nasumičnog odabira ne smije biti značajne razlike u prosječnoj tjelesnoj masi između skupina svakog spola. U slučaju statistički značajnih razlika treba ponoviti fazu nasumičnog odabiranja ako je moguće. Svakoj životinji treba dodijeliti jedinstveni identifikacijski broj i treba je trajno označiti tim brojem tetovažom, ugradnjom mikročipa ili drugom odgovarajućom metodom.
                           
                        POSTUPAK
                  
                     Broj i spol životinja
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Treba upotrijebiti oba spola. Treba upotrijebiti dovoljan broj životinja tako da se omogući temeljita biološka i statistička ocjena. Stoga za glodavce, svaka skupina koja prima dozu (kao što je izloženo u stavku 22.) i paralelna kontrolna skupina namijenjena za fazu karcinogenosti studije stoga mora sadržavati najmanje 50 životinja svakog spola. Ovisno o cilju studije, može biti moguće povećati statističku snagu ključnih procjena drukčijom raspodjelom životinja tako da bude drukčija u raznim skupinama koje primaju dozu s više od 50 životinja u skupinama s niskom dozom, npr. radi procjene karcinogenog potencijala na niskim dozama. No, treba priznati da umjereno povećanje skupine daje relativno malo povećanje statističke snage studije. Svaka skupina koja prima dozu (kao što je izloženo u stavku 22.) i paralelna kontrolna skupina namijenjena za fazu kronične toksičnosti studije mora sadržavati najmanje deset životinja svakog spola u slučaju glodavaca. Treba imati na umu da je taj broj manji od broja u studiji kronične toksičnosti (Poglavlje B.30 ovog Priloga). Tumačenje podataka dobivenih od smanjenog broja životinja po skupini u fazi kronične toksičnosti ove kombinirane studije bit će poduprto podacima dobivenima od većeg broja životinja u fazi karcinogenosti studije. U studijama koje uključuju miševe u svakoj skupini za doziranje u fazi kronične toksičnosti mogu biti potrebne dodatne životinje kako bi se provele sve tražene hematološke pretrage. Daljnje informacije o statističkom planiranju studije i odabiru visina doza radi povećanja statističke snage na maksimum nalaze se u Smjernici br. 116. (7).
                           
                        
                     Omogućivanje usmrćivanja u međuvremenu, satelitske skupine i indikatorske životinje
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Studija može omogućiti usmrćivanje u međuvremenu, npr. sa šest mjeseci za fazu kronične toksičnosti, kako bi se pribavile informacije o napredovanju neoplazmičkih promjena i mehanističke informacije ako je to znanstveno opravdano. Ako su takve informacije već dostupne iz prethodnih studija toksičnosti ispitivane kemikalije uz primjenu ponavljanih doza, usmrćivanje u međuvremenu nije znanstveno opravdano. Životinje upotrijebljene u fazi kronične toksičnosti studije, obično u trajanju od 12 mjeseci (stavak 34.) pružaju podatke o usmrćivanju u međuvremenu za fazu karcinogenosti studije uz postizanje smanjenja ukupnog broja upotrijebljenih životinja. U fazu kronične toksičnosti studije mogu se također uključiti i satelitske skupine radi nadzora reverzibilnosti bilo kakvih toksikoloških promjena izazvanih ispitivanom kemikalijom. To se može ograničiti na najvišu visinu doze u studiji plus kontrola. Ako je potrebno, tijekom studije može se uključiti i dodatna skupina indikatorskih životinja (tipično 5 životinja po spolu) radi praćenja stanja bolesti (30). Daljnje upute za planiranje studije uključuju usmrćivanja u međuvremenu, satelitske i indikatorske životinje uz svođenje na minimum ukupnog broja upotrijebljenih životinja nalaze se u Smjernici br. 116. (7).
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Ako su u plan studije uključene satelitske životinje i/ili usmrćivanja u međuvremenu, broj životinja u svakoj skupini koja prima dozu određen za tu svrhu obično će biti deset životinja svakog spola, a ukupni broj životinja uključenih u plan studije treba povećati za broj životinja određenih za usmrćivanje prije završetka studije. Životinje za usmrćivanje u međuvremenu i satelitske životinje moraju normalno proći sva opažanja uključujući tjelesnu masu, unos hrane/vode, hematološka i kliničko-biokemijska mjerenja te patološke pretrage kao i životinje u fazi kronične toksičnosti glavne studije iako se također može osigurati (u skupinama za usmrćivanje u međuvremenu) da se mjerenja ograniče na specifična, ključna mjerenja poput neurotoksičnosti ili imunotoksičnosti.
                           
                        
                     Skupine za doziranje i doziranje
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Smjernice u vezi sa svim aspektima odabira doza i razmak među visinama doza nalaze se u Smjernici br. 116. (7). U obje faze, kroničnoj i karcinogenoj, treba primijeniti najmanje tri visine doza i paralelnu kontrolu. Visine doza općenito se temelje na rezultatima kraćih studija uz primjenu ponavljanih doza ili studija za određivanje raspona i u obzir moraju uzeti sve toksikološke i toksikokinetičke podatke dostupne o ispitivanoj kemikaliji ili srodnim kemikalijama.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Za fazu kronične toksičnosti studije možda neće biti potrebna potpuna studija uz primjenu tri visine doza ako se može pretpostaviti da ispitivanje na jednoj visini doze, jednakoj najmanje 1 000 mg/kg tjelesne mase po danu, neće izazvati štetne učinke. To mora biti utemeljeno na informacijama iz preliminarnih studija te uzevši u obzir da se ne očekuje toksičnost na temelju podataka o kemikalijama srodne strukture. Granica od 1 000 mg/kg tjelesne mase po danu vrijedi osim ako izlaganje ljudi ne pokaže potrebu za primjenom više visine doze.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Osim ako nije ograničeno fizikalno-kemijskom prirodom ili biološkim učincima ispitivane kemikalije, obično treba odabrati najvišu visinu doze kako bi se identificirali organi mete i toksični učinci uz izbjegavanje patnje, ozbiljne toksičnosti, boležljivosti ili smrti. Obično treba odabrati najvišu visinu doze kako bi se izveli dokazi o toksičnosti kao što je, primjerice, dokazano padom povećanja tjelesne mase (otprilike 10 %). No, ovisno o ciljevima studije (vidjeti stavak 6.) može se odabrati najviša visina doze manja od doze koja pruža dokaze o toksičnosti npr. ako doza izaziva štetan, zabrinjavajući učinak koji unatoč tomu utječe na životni vijek ili tjelesnu masu.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Visine doza i razmaci između visina doza mogu se odabrati kako bi se odredio ishod doza-reakcija i, ovisno o načinu djelovanja ispitivane kemikalije, NOAEL ili drugi namjeravani ishod studije, npr. BMD (vidjeti stavak 27.). Čimbenici koje treba uzeti u obzir pri dodjeljivanju nižih doza uključuju očekivani nagib krivulje doze i reakcije, doze na kojima se mogu dogoditi važne promjene u metabolizmu ili načinu toksičnog djelovanja, gdje se očekuje prag ili gdje se očekuje polazna točka za ekstrapolaciju za niske doze. U provođenju kombinirane studije karcinogenosti/kronične toksičnosti primarni će cilj biti dobivanje informacija u svrhe određivanja rizika od karcinogenosti, a informacije o kroničnoj toksičnosti obično će biti dopunski cilj. To treba imati u vidu pri odabiru visina doze i razmaka između visina doza za studiju.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Odabrani razmak između visina doza ovisit će o ciljevima studije i svojstvima ispitivane kemikalije i ova ispitna metoda ne može ga detaljno propisati, ali dva do četiri intervala smanjenja često pružaju dobru uspješnost ispitivanja kada se koriste za određivanje silaznih visina doza, a često se prednost dodavanju četvrte ispitne skupine nego primjeni vrlo velikih intervala (npr. više od faktora između 6 - 10) među dozama. Općenito treba izbjegavati primjenu faktora većih od 10 i treba ih opravdati ako se primjenjuju.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Kao što je izloženo u nastavku Smjernice br. 116. (7), točke koje treba uzeti u obzir pri odabiru doze uključuju:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Poznate nelinearnosti ili točke savijanja u odnosu doze i reakcije ili one na koje se sumnja,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Toksikokinetiku i raspone doza u kojima se događaju ili ne događaju metabolička indukcija, zasićenje ili nelinearnost između vanjskih i unutarnjih doza,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Prethodne lezije, markeri učinka ili indikatori operacije ključnih temeljnih bioloških procesa,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Ključni aspekti ili načini djelovanja (ili oni na koje se sumnja), poput doza na kojima počinje rasti citotoksičnost, razina hormona se poremeti, homeostatski mehanizmi uništavaju itd.,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Regije krivulje doze i reakcije gdje je potrebna posebno jaka procjena, npr. u rasponu očekivanog BMD-a ili praga na koji se sumnja,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Uzimanje u obzir očekivanih razina ljudskog izlaganja, posebno pri odabiru srednjih i niskih doza.
                                       
                                    
                        
                              28.
                           
                           
                              Kontrolna skupina mora biti netretirana skupina ili skupina za kontrolu nosača ako se u primjeni ispitivane kemikalije primjenjuje nosač. Osim radi tretiranja ispitivanom kemikalijom, životinje u kontrolnoj skupini treba tretirati na jednak način kao i životinje u ispitnim skupinama. Ako se primjenjuje nosač, kontrolna skupina mora primiti nosač u najvećoj količini primijenjenoj u skupinama koje primaju doze. Ako se ispitivana kemikalija daje kroz hranu i ako izaziva značajno smanjeno unosa hrane zbog smanjene tečnosti hrane, može biti korisna dodatna kontrolna skupina koja se hrani u paru kako bi poslužila za primjereniju kontrolu.
                           
                        
                     Priprema doza i primjena ispitivane kemikalije
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Ispitivana kemikalija obično se daje oralno, kroz hranu ili vodu za piće ili pak sondom. Dodatne informacije o načinima i metodama davanja navedene su u Smjernici br. 116. (7). Način i metoda primjene ovisi o svrsi studije, fizikalnim/kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, njezinoj bioraspoloživosti te pretežnom načinu i metodi izlaganja ljudi. Treba predočiti argumentaciju za odabrani način i metodu primjene. Radi dobrobiti životinja sondu valja upotrijebiti samo za sredstva za koje taj način i metoda primjene opravdano predstavljaju potencijalno izlaganje ljudi (npr. lijekovi). Kemikalije iz hrane ili okoliša, uključujući pesticide, obično se primjenjuju kroz hranu ili vodu za piće. No, u nekim je situacijama, npr. pri radnom izlaganju, prikladnije izlaganje na druge načine.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Po potrebi, ispitivana se kemikalija otapa ili suspendira u odgovarajućem nosaču. U obzir treba uzeti sljedeća svojstva nosača i drugih aditiva po potrebi: učinke na apsorpciju, distribuciju, metabolizam ili retenciju ispitivane kemikalije; učinke na kemijska svojstva ispitivane kemikalije koja se mogu promijeniti u toksična svojstva te učinke na unos hrane ili vode ili nutritivnog statusa životinja. Preporučuje se da se, kada je god moguće, u obzir najprije uzme vodena otopina/suspenzija pa zatim otopina/suspenzija u ulju (npr. kukuruzno ulje) te zatim moguća otopina u drugim nosačima. Za nosače različite od vode moraju biti poznata toksična svojstva nosača. Moraju biti dostupne informacije o stabilnosti ispitivane kemikalije i homogenosti otopina za doziranje ili prehranu (odgovarajući) pod uvjetima primjene (npr. prehrana).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Kod kemikalija koje se primjenjuju putem hrane ili vode za piće važno je osigurati da količine ispitivane kemikalije ne utječu na uravnoteženi unos hrane ili vode. U dugotrajnim studijama toksičnosti uz primjenu davanja kroz hranu koncentracija ispitivane kemikalije u hrani obično ne smije premašiti gornju granicu od 5 % ukupne hrane kako bi se izbjegla nutritivna neravnoteža. Ako se ispitivana kemikalija daje kroz hranu, može se upotrijebiti konstantna koncentracija u hrani (hrana mg/kg ili ppm) ili konstantna visina doze u odnosu na tjelesnu masu životinje (mg/kg tjelesne mase) izračunata na tjednoj bazi. Treba specificirati korištenu alternativu.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              U slučaju oralne primjene životinjama se svakodnevno daje ispitivana kemikalija (sedam dana tjedno) obično u razdoblju od 12 mjeseci (kronična faza) ili 24 mjeseca (faza karcinogenosti), vidjeti stavke 33. i 34. Svaki drukčiji režim primjene, npr. pet dana tjedno, treba obrazložiti. U slučaju dermalne primjene životinje se ispitivanom kemikalijom obično tretiraju najmanje šest sati dnevno, sedam dana tjedno, kao što je navedeno u Poglavlju B.9 ovog Priloga (11), u razdoblju od 12 mjeseci (kronična faza) ili 24 mjeseca (faza karcinogenosti). Izlaganje inhalacijom provodi se šest sati dnevno, sedam dana tjedno, ali može se primijeniti i izlaganje pet dana ako je opravdano. Razdoblje izlaganja obično će trajati 12 mjeseci (kronična faza) ili 24 mjeseca (faza karcinogenosti). Ako izlaganju samo nosom nisu izloženi štakori nego drugi glodavci, maksimalno trajanje izlaganja treba prilagoditi kako bi se na minimum sveo stres specifičan za tu vrstu. Treba pružiti argumentaciju za primjenu izlaganja kraćeg od šest sati dnevno. Vidjeti također i Poglavlje B.8 ovog Priloga (9).
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Ako se ispitivana kemikalija životinjama daje sondom, to treba provesti želučanom sondom ili prikladnom intubacijskom kanilom u slično vrijeme svakog dana. Obično se jedanput dnevno daje jedna doza, primjerice u slučajevima kada je kemikalija lokalni iritans, no moguće je zadržati dnevnu količinu doze na način da je se podijeli (dvaput dnevno). Maksimalni volumen tekućine koji se može primijeniti odjednom ovisi o veličini pokusne životinje. Količinu treba održavati toliko niskom da bude praktična, a obično ne bi trebala biti veća od 1 ml/100 g tjelesne mase za glodavce (31). Varijabilnost u ispitnoj količini treba svesti na minimum prilagodbom koncentracije kako bi se osigurala konstantna količina na svim visinama doze. Iznimku predstavljaju potencijalno nagrizajuće ili nadražujuće kemikalije te ih treba razrijediti kako bi se izbjegli ozbiljni lokalni učinci. Treba izbjegavati ispitivanje na koncentracijama koje su vjerojatno nagrizajuće ili nadražujuće za gastrointestinalni trakt.
                           
                        
                     Trajanje studije
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Razdoblje doziranja i trajanje kronične faze ove studije obično je 12 mjeseci iako plan studije također dopušta i primjenu kraćeg (npr. 6 ili 9 mjeseci) ili duljeg (npr. 18 ili 24 mjeseca) trajanja studije, ovisno o zahtjevima posebnih regulatornih režima ili radi specifičnih mehanističkih svrha. Treba obrazložiti odstupanja od trajanja izlaganja od 12 mjeseci, posebno u slučajevima kraćeg trajanja. Sve skupine koje primaju dozu dodijeljene toj fazi bit će završene u određeno vrijeme radi ocjene kronične toksičnosti i neoplastične patologije. Satelitske skupine uključene radi nadzora reverzibilnosti bilo kakvih toksikoloških promjena izazvanih ispitivanom kemikalijom tijekom studije treba održavati bez doziranja u razdoblju ne kraćem od četiri tjedna te ne dulje od trećine ukupnog trajanja studije nakon prestanka izlaganja.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Faza karcinogenosti studije obično traje 24 mjeseca za glodavce, što predstavlja najveći dio uobičajenog životnog vijeka korištenih životinja. Mogu se primijeniti kraće ili dulje studije, ovisno o životnom vijeku soja životinja korištenih u studiji, ali to treba obrazložiti. Za specifične sojeve miševa, npr. AKR/J, C3H/J ili C57BL/6J, može biti prikladnije trajanje od 18 mjeseci. U nastavku se nalaze neke upute u vezi s trajanjem, završetkom studije i preživljavanjem; ostale upute uključujući razmatranja o prihvatljivosti studije negativne karcinogenosti povezane s preživljavanjem u studiji nalaze se u OECD-ovoj Smjernici br. 116. (7):
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Završetak studije treba uzeti u obzir kada broj preživjelih u skupinama s nižim dozama ili kontrolnoj skupini padne na manje od 25 %.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Ako samo skupina s visokom dozom prijevremeno ugine zbog toksičnosti, to ne smije izazvati završetak studije.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Treba posebno bilježiti preživljavanje svakog spola.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Studija ne treba trajati dulje od točke u kojoj podaci dostupni iz studije više nisu dovoljni za omogućivanje statistički valjane ocjene.
                                       
                                    
                        OPAŽANJA (FAZA KRONIČNE TOKSIČNOSTI)
                  
                              36.
                           
                           
                              Sve životinje treba pregledati radi boležljivosti ili ugibanja, obično na početku i kraju svakog dana, uključujući vikend i praznike. Opća klinička opažanja valja provoditi najmanje jedanput dnevno, po mogućnosti u isto vrijeme/ista vremena svakog dana te uzimajući u obzir vršno razdoblje očekivanih učinaka nakon doziranja u slučaju primjene sondom.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Detaljna klinička opažanja valja provoditi na svim životinjama najmanje jedanput prije prvog izlaganja (kako bi se omogućila usporedba za svaku jedinku), na kraju prvog tjedna studije te zatim mjesečno. Protokol za opažanja treba organizirati tako da se na minimum svedu varijacije između pojedinih promatrača i ovisno o ispitnoj skupini. Ta opažanja treba obaviti izvan domicilnog kaveza, po mogućnosti u standardnoj areni te svaki put u slično vrijeme. Rezultate opažanja treba pažljivo bilježiti, pri čemu je najbolje koristiti sustav vrednovanja jasno definiran od strane laboratorija koji obavlja ispitivanje. Treba se potruditi osigurati da su varijacije u uvjetima opažanja minimalne. Opaženi simptomi moraju obuhvaćati, ali ne biti ograničeni na, promjene na koži, dlaci, očima, sluznicama, pojavu sekreta i ekskreta te aktivnost autonomnog živčanog sustava (npr. lakrimacija (suzenje), piloerekcija (naježenost dlake), veličina zjenica, nepravilnosti u disanju). Također treba zabilježiti promjene u hodu, držanju i reakcijama na rukovanje, kao i prisutnost kloničkih ili toničkih pokreta, stereotipa (npr. pretjerano njegovanje krzna, ponavljano kretanje u krug) ili neobičnog ponašanja (npr. samoozljeđivanje, hodanje unatrag) (32).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Oftalmološke preglede uz primjenu oftalmoskopa ili druge odgovarajuće opreme treba obaviti na svim životinjama prije prve primjene ispitivane kemikalije. Na kraju studije te preglede treba po mogućnosti obaviti na svim životinjama, ali barem u skupini s visokom dozom i kontrolnoj skupini. Ako se na očima opaze promjene povezane s tretiranjem, treba pregledati sve životinje. Ako strukturna analiza ili druge informacije upućuju na okularnu toksičnost, treba povećati učestalost oftalmoloških pregleda.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Za kemikalije za koje prethodne 28-dnevne i/ili 90-dnevne studije toksičnosti uz primjenu ponavljanih doza ukazuju na potencijalno uzrokovanje neurotoksičnih učinaka, senzoričke reaktivnosti na stimulanse različitih tipova (32) (npr. zvučne, vizualne i proprioceptivne stimulanse) (33) (34) (35), prije početka studije te u razdobljima od 3 mjeseca nakon početka studije pa do 12 mjeseci, uključujući i 12. mjesec, te na kraju studije (ako ne traje dulje od 12 mjeseci) mogu se opcijski provesti i određivanje jakosti stiska (36) i određivanje motoričke aktivnosti (37). Daljnje pojedinosti o postupcima koji se mogu primjenjivati navedene su u odgovarajućoj referentnoj literaturi. Međutim, osim referentnih mogu se primjenjivati i drugi postupci.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Za kemikalije, za koje su prethodne 28-dnevne i/ili 90-dnevne studije toksičnosti uz primjenu ponavljanih doza ukazala na potencijalno izazivanje imunotoksičnih učinaka, na kraju se opcijski mogu provesti daljnja istraživanja tog krajnjeg učinka.
                           
                        
                     Tjelesna masa, unos hrane/vode i učinkovitost hrane
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Sve životinje treba izvagati na početka tretiranja, najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjesečno. Mjerenja unosa i učinkovitosti hrane treba provoditi najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjesečno. Unos vode treba mjeriti najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjesečno ako se kemikalija primjenjuje preko vode za piće. Mjerenje unosa vode treba također uzeti u obzir i za studije u kojima se mijenja aktivnost pijenja.
                           
                        
                     Hematologija i klinička biokemija
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              U studijama koje uključuju glodavce hematološke pretrage treba obaviti na svim pokusnim životinjama (deset mužjaka i deset ženki iz svake skupine) nakon 3, 6 i 12 mjeseci te na kraju studije (ako ne traje dulje od 12 mjeseci). Kod miševa mogu biti potrebne satelitske životinje kako bi se provele sve potrebne hematološke pretrage (vidjeti stavak 19.). Kod studija na neglodavcima uzorci se uzimaju od manjeg broja životinja (npr. četiri životinje po spolu i skupini kod studija na psima), u vrijeme uzorkovanja u međuvremenu te na kraju, kao što je opisano za glodavce. Mjerenja nakon tri mjeseca, bilo u glodavaca ili neglodavaca, ne moraju se provoditi ako na hematološkim parametrima u prethodnoj 90-dnevnoj studiji provedenoj na usporedivim visinama doze nisu uočeni učinci. Uzorke krvi treba uzimati iz određenog mjesta, primjerice punkcijom srca ili iz retroorbitalnog sinusa, pod anestezijom.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Treba ispitati sljedeći popis parametara (38): ukupni i diferencijalni broj leukocita, broj eritrocita, broj trombocita, koncentraciju hemoglobina, hematokrit (volumen eritrocita), prosječni volumen eritrocita (MCV), prosječnu masu hemoglobina u eritrocitima (MCH), prosječnu koncentraciju hemoglobina u eritrocitima (MCHC), protrombinsko vrijeme te aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme. Ostali hematološki parametri poput Heinzovih tjelešaca ili druge atipične morfologije eritrocita ili methemoglobin mogu se mjeriti po potrebi, ovisno o toksičnosti ispitivane kemikalije. Općenito gledano, treba primijeniti fleksibilan pristup ovisno o opaženim i/ili očekivanim učincima davane ispitivane kemikalije. Ako ispitivana kemikalija ne utječe na hematopoetski sustav, može biti indiciran i broj retikulocita i citologija koštane srži iako se te pretrage ne moraju provoditi rutinski.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Kliničko-biokemijske pretrage za istraživanje glavnih toksičnih učinaka u tkivima i posebno učinaka na bubrege i jetru treba obaviti na uzorcima krvi dobivenima od svih pokusnih životinja (deset mužjaka i deset ženki po skupini) u jednakim vremenskim intervalima, kao što je navedeno u hematološkim pretragama. Kod miševa mogu biti potrebne satelitske životinje kako bi se provele sve potrebne kliničko-biokemijske pretrage. Kod studija na neglodavcima uzorci se uzimaju od manjeg broja životinja (npr. četiri životinje po spolu i skupini kod studija na psima), u vrijeme uzorkovanja u međuvremenu te na kraju, kao što je opisano za glodavce. Mjerenja nakon tri mjeseca, bilo u glodavaca ili neglodavaca, ne moraju se provoditi ako na kliničko-biokemijskim parametrima u prethodnoj 90-dnevnoj studiji provedenoj na usporedivoj visini doze nisu opaženi učinci. Preporučuje se post životinja preko noći (izuzev miševa) prije prikupljanja uzoraka krvi (10). Treba ispitati sljedeći popis parametara (38): glukoza, urea (dušična urea), kreatinin, ukupni proteini, albumini, kalcij, natrij, kalij, ukupni kolesterol, najmanje dvije prikladne pretrage za hepatocelularnu ocjenu (alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, glutamat dehidrogenaza, ukupne žučne kiseline) (39) te najmanje dvije prikladne pretrage za hepatobilijarnu ocjenu (alkalna fosfataza, gama glutamil transferaza, 5′-nukleotidaza, ukupni bilirubin, ukupne žučne kiseline) (39). Ostali kliničko-kemijski parametri poput triglicerida tijekom posta, specifičnih hormona i kolinesteraze mogu se mjeriti ako je potrebno, ovisno o toksičnosti ispitivane kemikalije. Općenito gledano, treba primijeniti fleksibilan pristup ovisno o opaženim i/ili očekivanim učincima davane ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Pretrage analize urina treba provesti na svim pokusnim životinjama (deset mužjaka i deset ženki po skupini) na uzorcima skupljenim u jednakim intervalima kao i za hematologiju i kliničku kemiju. Mjerenja nakon tri mjeseca ne moraju se provoditi ako na analizi urina u prethodnoj 90-dnevnoj studiji provedenoj na usporedivoj visini doze nisu opaženi učinci. Sljedeći popis parametara bio je uključen u stručnu preporuku za studije kliničke patologije (38): izgled, količina, osmolalnost ili specifična težina, pH, ukupan broj proteina i glukoza. Ostale pretrage uključuju ketone, urobilinogen, bilirubin i okultnu krv. Ako je potrebno, mogu se upotrijebiti i drugi parametri radi proširenog istraživanja opaženog učinka/opaženih učinaka.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Općenito se smatra da osnovne hematološke i kliničko-biokemijske varijable treba odrediti prije tretiranja za studije na psima, ali ih se ne mora odrediti u studijama na glodavcima (38). No, ako su povijesni osnovni podaci (vidjeti stavak 58.) neprikladni, treba se pobrinuti da se ti podaci izrade.
                           
                        PATOLOGIJA
                  
                     Makroskopska analiza
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Sve životinje u studiji moraju se podvrgnuti potpunoj, detaljnoj, makroskopskoj obdukciji koja obuhvaća pažljiv pregled vanjske površine tijela, svih otvora te lubanjske, prsne i trbušne šupljine i njihovog sadržaja. No, može se odlučiti (kod skupina za usmrćivanje u međuvremenu ili satelitskih skupina) da se mjerenja ograniče na specifične, ključne mjere, poput neurotoksičnosti ili imunotoksičnosti (vidjeti stavak 21.). Te životinje ne treba podvrgnuti obdukciji i sljedećim postupcima opisanima u stavcima u nastavku. Indikatorske životinje mogu zahtijevati obdukciju u pojedinačnim slučajevima, a odluka je prepuštena voditelju istraživanja.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Treba prikupiti masu organa svih životinja, osim onih isključenih zadnjim dijelom stavka 47. Nadbubrežne žlijezde, mozak, epididimise, srce, bubrege, jetru, jajnike, slezenu, štitnjaču (izvaganu poslije fiksacije, s paraštitnim žlijezdama) i maternicu svih životinja (osim onih pronađenih u stanju ugibanja i/ili usmrćenih u međuvremenu) treba obrezivanjem osloboditi od svih prianjajućih tkiva po potrebi te ih treba izvagati u mokrom stanju što prije nakon seciranja kako bi se spriječilo njihovo sušenje.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Sljedeća tkiva treba čuvati u najprikladnijem fiksacijskom mediju za oba tipa tkiva i namjeravane histopatološke pretrage koja slijedi (40) (tkiva u uglatim zagradama opcijska su):
                              
                                          sve makroskopske lezije
                                       
                                       
                                          srce
                                       
                                       
                                          gušterača
                                       
                                       
                                          želudac (predželudac, žljezdani želudac)
                                       
                                    
                                          nadbubrežna žlijezda
                                       
                                       
                                          ileum
                                       
                                       
                                          paraštitna žlijezda
                                       
                                       
                                          [zubi]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          jejunum
                                       
                                       
                                          periferni živac
                                       
                                       
                                          testis
                                       
                                    
                                          mozak (uključujući sekcije velikog i malog mozga te medule/mosta)
                                       
                                       
                                          bubreg
                                       
                                       
                                          hipofiza
                                       
                                       
                                          timus
                                       
                                    
                                          cekum
                                       
                                       
                                          suzna žlijezda (eksorbitalna)
                                       
                                       
                                          prostata
                                       
                                       
                                          štitnjača
                                       
                                    
                                          cerviks
                                       
                                       
                                          jetra
                                       
                                       
                                          rektum
                                       
                                       
                                          [jezik]
                                       
                                    
                                          koagulacijska žiljezda
                                       
                                       
                                          pluća
                                       
                                       
                                          žlijezda slinovnica
                                       
                                       
                                          dušnik
                                       
                                    
                                          debelo crijevo
                                       
                                       
                                          limfni čvorovi (površinski i dubinski)
                                       
                                       
                                          sjemenski mjehurić
                                       
                                       
                                          mokraćni mjehur
                                       
                                    
                                          dvanaesnik
                                       
                                       
                                          mliječna žlijezda (obvezno za ženke i ako se mogu secirati, od mužjaka)
                                       
                                       
                                          skeletni mišić
                                       
                                       
                                          maternica (uključujući cerviks)
                                       
                                    
                                          epididimis
                                       
                                       
                                          [gornji respiratorni trakt uključujući nos, turbinate i paranazalne sinuse]
                                       
                                       
                                          koža
                                       
                                       
                                          [mokraćovod]
                                       
                                    
                                          oko (uključujući mrežnicu)
                                       
                                       
                                          jednjak
                                       
                                       
                                          kralježnica (na tri razine: vratna, srednja prsna i slabinska)
                                       
                                       
                                          [mokraćna cijev]
                                       
                                    
                                          [femur sa zglobom]
                                       
                                       
                                          [olfaktorni bulbus]
                                       
                                       
                                          slezena
                                       
                                       
                                          vagina
                                       
                                    
                                          žučni mjehur (za vrste drukčije od štakora)
                                       
                                       
                                          jajnik
                                       
                                       
                                          [prsna kost],
                                       
                                       
                                          sekcija koštane srži i/ili aspirat svježe koštane srži
                                       
                                    
                                          Harderova žlijezda
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    U slučaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba sačuvati oba organa. Klinički i drugi nalazi mogu sugerirati potrebu za pregledom dodatnih tkiva. Treba sačuvati i sve one organe za koje se na temelju saznanja o svojstvima ispitivane kemikalije smatra da bi mogli biti ciljni. U studijama koje uključuju dermalni način primjene treba ispitati popis organa sastavljen za oralni način primjene, s tim da je nužno specifično uzorkovanje i čuvanje kože s mjesta primjene. U studijama inhalacijom popis sačuvanih i ispitanih tkiva iz respiratornog trakta treba slijediti preporuke Poglavlja B.8 ovog Priloga (9) i Poglavlja B.29 ovog Priloga (10). Za ostale organe/tkiva (te uz posebno sačuvana tkiva iz respiratornog trakta) treba ispitati popis organa zadan za oralni način primjene.
                           
                        
                     Histopatologija
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Dostupna je smjernica za najbolju praksu u provođenju istraživanja toksikološke patologije (40). Minimalne histopatološke pretrage moraju uključivati:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          sva tkiva iz skupine izložene visokoj dozi i kontrolne skupine,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          sva tkiva životinja uginulih ili usmrćenih tijekom studije,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          sva tkiva s makroskopskim anomalijama,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          tkiva mete ili tkiva koja pokazuju promjene povezane s tretiranjem u skupini izloženoj visokoj dozi, od svih životinja u svih drugim skupinama doza,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          u slučaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba ispitati oba organa.
                                       
                                    
                        OPAŽANJA (FAZA KARCINOGENOSTI)
                  
                              51.
                           
                           
                              Sve životinje treba pregledati radi boležljivosti ili ugibanja, obično na početku i kraju svakog dana uključujući vikend i praznike. Životinje treba dodatno provjeravati jedanput dnevno radi specifičnih znakova od toksikološke važnosti. U slučaju studije uz primjenu sonde životinje treba provjeravati u razdoblju odmah nakon doziranja. Posebnu pažnju valja obratiti na razvoj tumora, te treba zabilježiti vrijeme nastanka tumora, lokaciju, dimenzije, izgled i napredovanje svakog makroskopski vidljivog ili palpabilnog tumora.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Sve životinje treba izvagati na početka tretiranja, najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjesečno. Mjerenja unosa i učinkovitosti hrane treba provoditi najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjesečno. Unos vode treba mjeriti najmanje jedanput tjedno u prvih 13 tjedana te zatim barem jedanput mjesečno ako se kemikalija primjenjuje preko vode za piće. Mjerenje unosa vode treba također uzeti u obzir i za studije u kojima se mijenja aktivnost pijenja.
                           
                        
                     Hematologija, klinička biokemija i druga mjerenja
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Kako bi se na maksimum povećala količina informacija dobivenih iz studija, posebno za način djelovanja, mogu se uzeti uzorci krvi za hematologiju i kliničku biokemiju, o čemu odlučuje voditelj istraživanja. Također može biti prikladna i analiza urina. Podaci o životinjama upotrijebljenima u fazi kronične toksičnosti studije, obično u trajanju od 12 mjeseci (stavak 34.) pružit će informacije o tim parametrima. Ostale upute o vrijednosti uzimanja tih uzoraka kao dio studije karcinogenosti nalaze se u Smjernici br. 116. (7). Ako se uzimaju uzorci krvi, treba ih prikupiti na kraju razdoblja ispitivanja, neposredno prije ili kao dio postupka usmrćivanja životinja. Treba ih uzimati iz određenog mjesta, primjerice punkcijom srca ili iz retroorbitalnog sinusa, pod anestezijom. Razmazi krvi također se mogu pripremiti za pretrage, posebno ako se čini da je organ meta koštana srž, iako se propituje vrijednosti takvih pretraga razmaza krvi u fazi karcinogenosti za određivanje karcinogenog/onkogenog potencijala (38).
                           
                        PATOLOGIJA
                  
                     Makroskopska analiza
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Sve životinje u studiji, osim indikatorskih životinja ili drugih satelitskih životinja (vidjeti stavak 20.), moraju se podvrgnuti potpunoj, detaljnoj makroskopskoj obdukciji koja obuhvaća pažljiv pregled vanjske površine tijela, svih otvora te lubanjske, prsne i trbušne šupljine i njihovog sadržaja. Indikatorske životinje mogu zahtijevati obdukciju u pojedinačnim slučajevima, a odluka je prepuštena voditelju istraživanja. Mase organa nisu uobičajeni dio studije karcinogeneze budući da gerijatrijske promjene te, u kasnijim fazama, razvoj tumora remete korisnost podataka o masi organa. No mogu biti ključne pri provođenju ocjene težine dokaza te posebno za razmatranje o načinu djelovanja. Ako su dio satelitske studije, treba ih skupiti ne kasnije od godine dana nakon početka studije.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Sljedeća tkiva treba čuvati u najprikladnijem fiksacijskom mediju za oba tipa tkiva i namjeravane histopatološke pretrage koja slijedi (40) (tkiva u uglatim zagradama opcijska su):
                              
                                          sve makroskopske lezije
                                       
                                       
                                          srce
                                       
                                       
                                          gušterača
                                       
                                       
                                          želudac (predželudac, žljezdani želudac)
                                       
                                    
                                          nadbubrežna žlijezda
                                       
                                       
                                          ileum
                                       
                                       
                                          paraštitna žlijezda
                                       
                                       
                                          [zubi]
                                       
                                    
                                          aorta
                                       
                                       
                                          jejunum
                                       
                                       
                                          periferni živac
                                       
                                       
                                          testis
                                       
                                    
                                          mozak (uključujući sekcije velikog i malog mozga te medule/mosta)
                                       
                                       
                                          bubreg
                                       
                                       
                                          hipofiza
                                       
                                       
                                          timus
                                       
                                    
                                          cekum
                                       
                                       
                                          suzna žlijezda (eksorbitalna)
                                       
                                       
                                          prostata
                                       
                                       
                                          štitnjača
                                       
                                    
                                          cerviks
                                       
                                       
                                          jetra
                                       
                                       
                                          rektum
                                       
                                       
                                          [jezik]
                                       
                                    
                                          koagulacijska žiljezda
                                       
                                       
                                          pluća
                                       
                                       
                                          žlijezda slinovnica
                                       
                                       
                                          dušnik
                                       
                                    
                                          debelo crijevo
                                       
                                       
                                          limfni čvorovi (površinski i dubinski)
                                       
                                       
                                          sjemenski mjehurić
                                       
                                       
                                          mokraćni mjehur
                                       
                                    
                                          dvanaesnik
                                       
                                       
                                          mliječna žlijezda (obvezno za ženke i ako se mogu secirati, od mužjaka)
                                       
                                       
                                          skeletni mišić
                                       
                                       
                                          maternica (uključujući cerviks)
                                       
                                    
                                          epididimis
                                       
                                       
                                          [gornji respiratorni trakt uključujući nos, turbinate i paranazalne sinuse]
                                       
                                       
                                          koža
                                       
                                       
                                          [mokraćovod]
                                       
                                    
                                          oko (uključujući mrežnicu)
                                       
                                       
                                          jednjak
                                       
                                       
                                          kralježnica (na tri razine: vratna, srednja prsna i slabinska)
                                       
                                       
                                          [mokraćna cijev]
                                       
                                    
                                          [femur sa zglobom]
                                       
                                       
                                          [olfaktorni bulbus]
                                       
                                       
                                          slezena
                                       
                                       
                                          vagina
                                       
                                    
                                          žučni mjehur (za vrste drukčije od štakora)
                                       
                                       
                                          jajnik
                                       
                                       
                                          [prsna kost],
                                       
                                       
                                          sekcija koštane srži i/ili aspirat svježe koštane srži
                                       
                                    
                                          Harderova žlijezda
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    U slučaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba sačuvati oba organa. Klinički i drugi nalazi mogu sugerirati potrebu za pregledom dodatnih tkiva. Treba također sačuvati sve organe za koje se smatra da bi mogli biti meta na temelju poznatih svojstava ispitivane kemikalije. U studijama koje uključuju dermalni način primjene treba ispitati popis organa sastavljen za oralni način primjene, s tim da je nužno specifično uzorkovanje i čuvanje kože s mjesta primjene. U studijama inhalacijom popis sačuvanih i ispitanih tkiva iz respiratornog trakta treba slijediti preporuke Poglavlja B.8 ovog Priloga (8) i Poglavlja B.29 ovog Priloga (9). Za ostale organe/tkiva (te uz posebno sačuvana tkiva iz respiratornog trakta) treba ispitati popis organa zadan za oralni način primjene.
                           
                        
                     Histopatologija
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Dostupna je smjernica za najbolju praksu u provođenju istraživanja toksikološke patologije (40). Minimum tkiva na kojima su obavljene pretrage mora uključivati:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Sva tkiva iz skupina izloženih visokoj dozi i kontrolnih skupina,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Sva tkiva životinja uginulih ili usmrćenih tijekom studije,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Sva tkiva s makroskopskim anomalijama uključujući tumore,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Ako se u skupini izloženoj visokoj dozi opaze histopatološke promjene povezane s tretmanom, ta tkiva treba analizirati na svim životinjama u svim skupinama izloženima drugim dozama,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          U slučaju organa u paru, npr. bubrega, nadbubrežnih žlijezda, treba ispitati oba organa.
                                       
                                    
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE (KARCINOGENOST I KRONIČNA TOKSIČNOST)
                  
                     Podaci
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Treba pružiti pojedinačne podatke o životinjama za sve ocijenjene parametre. Uz to sve podatke treba skupiti u obliku tablice, prikazujući za svaku ispitnu skupinu broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja koje su tijekom ispitivanja pronađene uginule ili su usmrćene iz humanih razloga te vrijeme smrti ili usmrćivanja, broj uočenih znakova toksičnosti, opis uočenih znakova toksičnosti, uključujući vrijeme nastupanja, trajanje i ozbiljnost svakog toksičnog učinka, broj životinja s lezijama, tip lezija te postotak životinja sa svakim tipom lezije. Tablice sa sažetkom podataka trebaju pružiti prosječne i standardne devijacije (za podatke trajnih ispitivanja) za životinje koje pokazuju toksične učinke ili lezije uz stupnjevanje lezija.
                           
                        
                              58.
                           
                           
                              U tumačenju rezultata studije, npr. u slučaju kada postoje indikacije da su podaci dobiveni u paralelnim kontrolama bitno izvan granica u usporedbi sa skorašnjim podacima dobivenim od kontrolnih životinja iz istog ispitnog smještaja/kolonije, mogu biti dragocjeni povijesni kontrolni podaci. Povijesne kontrolne podatke, ako se ocjenjuju, treba uzeti iz istog laboratorija i povezati sa životinjama iste dobi i soja proizvedenih tijekom pet godina prije dotične studije.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Ako je moguće, brojčane rezultate treba ocijeniti prikladnom i opće prihvaćenom statističkom metodom. Statističke metode i podatke koji će se analizirati treba odabrati tijekom planiranja studije (stavak 9.). Ako je potrebno, odabir treba osigurati prilagodbu radi preživljavanja.
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              U izvješću o ispitivanju treba navesti sljedeće informacije:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana kemikalija:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizikalna narav, čistoća i fizikalno-kemijska svojstva,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      identifikacijski podaci,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrijetlo kemikalije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj serije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      potvrda kemijske analize.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosač (po potrebi):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obrazloženje odabira nosača (ako nije voda).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusne životinje:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korištene vrste/sojevi te obrazloženje odabira,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj, dob i spol životinja na početku ispitivanja,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podrijetlo, uvjeti držanja, prehrana itd.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinačne tjelesne mase životinja na početku ispitivanja.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      argumentacija za način primjene i odabir doze,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ako je primjenjivo, statistička metoda korištena za analizu podataka,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinosti o pripremi ispitivane kemikalije/hrane,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analitički podaci o postignutoj koncentraciji, stabilnosti i homogenosti preparata,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      način primjene i pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      za studije inhalacijom, bilo samo nosom ili čitavim tijelom,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stvarne doze (mg/kg tjelesne mase po danu) i faktor pretvorbe iz koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za piće (mg/kg ili ppm) sa stvarnom dozom ako je primjenjivo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinosti o kvaliteti hrane i vode.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati (treba prikazati tablično sažete podatke i pojedinačne podatke za životinje):
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Općenito
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Podaci o preživljavanju,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tjelesna masa/promjene u tjelesnoj masi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Unos hrane, izračun učinkovitosti hrane ako je napravljen te unos vode ako je primjenjivo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Toksikokinetički podaci ako su raspoloživi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Oftalmoloskopija (ako je raspoloživa)
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Hematologija (ako je raspoloživa)
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Klinička kemija (ako je raspoloživa)
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Klinički nalazi
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Znakovi toksičnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Učestalost (te, ako je zabilježena, ozbiljnost) svih anomalija,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Narav, ozbiljnost i trajanje kliničkih opažanja (prolaznih ili trajnih),
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Obdukcijski podaci
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tjelesna masa na kraju,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Mase organa i njihovi omjeri ako je primjenjivo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nalazi obdukcije, Učestalost i ozbiljnost anomalija.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Histopatologija
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Neneoplastični histopatološki nalazi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Neoplastični histopatološki nalazi,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Međusobni odnos između makroskopskih i mikroskopskih nalaza
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Detaljan opis svih histopatoloških nalaza povezanih s tretiranjem, uključujući stupnjeve ozbiljnosti,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Izvješće svih pregleda objektnih stakalaca mikroskopa provedenih od kolega
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Statistička obrada rezultata po potrebi
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rasprava o rezultatima uključujući:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Rasprava o svim modelima pristupa
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Odnosi doza i reakcija
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Povijesni kontrolni podaci
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Razmatranja o svim načinima djelovanja informacija
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Određivanje BMD, NOAEL ili LOAEL
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Relevantnost za ljude
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Zaključci
                                          
                                       
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (1995.). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Poglavlje B.27 ovog Priloga, Studija subkronične oralne toksičnosti - 90-dnevna studija oralne toksičnosti na neglodavcima uz primjenu ponavljanih doza.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2012.). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Poglavlje B.8 ovog Priloga. Subakutna inhalacijska toksičnost: 28-dnevna studija.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Poglavlje B.29 ovog Priloga, Subkronična inhalacijska toksičnost: 90-dnevna studija.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Poglavlje B.9 ovog Priloga, Toksičnost (dermalna) pri ponavljanoj dozi (28 dana).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69-98.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              OECD (2002.). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Pariz.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              OECD (2000.). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196-1203.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se upotrebljavaju u znanstvene svrhe, SL L 276, 20.10.2010., str. 33.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-06-9.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15-23.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              EMEA (draft) document ‚Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity’ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK i sur. (2004). Smjernica za najbolju praksu: Toksikološka histopatologija, Toksikološka patologija 32: 126-131.
                           
                        
                     Dodatak 1.
                     DEFINICIJA
                     Ispitivana kemikalija: Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne metode.
                  ”
            
                  7.
               
               
                  Poglavlje B.36 mijenja se i glasi:
                  „B.36.   TOKSIKOKINETIKA
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 417 (2010.). Studije kojima se istražuje toksikokinetika (TK) ispitivane kemikalije provode se radi prikupljanja odgovarajućih informacija o njezinoj apsorpciji, distribuciji, biotransformaciji (tj. metabolizmu) i izlučivanju te radi pomoći u povezivanju koncentracije ili doze s opaženom toksičnošću te radi pomoći pri razumijevanju mehanizma njezine toksičnosti. TK može pomoći pri razumijevanju studija toksičnosti na način da se pokaže da se pokusne životinje sustavno izlažu ispitivanoj kemikaliji te otkrivanjem cirkulirajućih dijelova (početna kemikalija/metaboliti). Osnovni parametri TK određeni tim studijama također će pružiti informacije o potencijalu za akumulaciju ispitivane kemikalije u tkivima i/ili organima te potencijal induciranja biotransformacije kao rezultat izlaganja ispitivanoj kemikaliji.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Podaci o TK mogu pridonijeti određivanju prikladnosti i relevantnosti podataka o toksičnosti za životinje radi ekstrapolacije rizika po ljude i/ili procjenu rizika. Osim toga, studije toksičnosti mogu pružiti korisne informacije za određivanje visina doze za studije toksičnosti (linearna i nelinearna kinetika), učinaka načina primjene, bioraspoloživosti te probleme povezane s planiranjem studija. Određeni tipovi TK podataka mogu se upotrijebiti u razvoja modela fiziološki utemeljene toksikokinetike (PBTK).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Postoje važne primjene za podatke o metabolitu/TK poput sugeriranja mogućih toksičnosti i načina djelovanja te njihova odnosa s visinom doze i načinom izlaganja. Povrh toga, podaci o metabolizmu mogu pružiti korisne informacije za određivanje toksikološkog značaja izlaganja za egzogeno proizvedene metabolite ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Odgovarajući toksikokinetički podaci pomoći će u podršci daljnje prihvatljivosti i primjenjivosti kvantitativnih odnosa strukture i aktivnosti, pristupima analognog predviđanja (read-across) i grupiranja u procjeni sigurnosti kemikalija. Podaci o kinetici također se mogu upotrijebiti za vrednovanje toksikološke relevantnosti drugih studija (npr. in vivo/in vitro).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Osim ako nije spomenut drugi način primjene (vidjeti posebno stavke 74. - 78.), ova ispitna metoda može se primijeniti na oralnu primjenu ispitivane kemikalije.
                           
                        UVODNA RAZMATRANJA
                  
                              6.
                           
                           
                              Regulatorni sustavi imaju drukčije zahtjeve i potrebe u svezi s mjerenjem konačnih učinaka i parametara povezanih s toksikokinetikom za različite razrede kemikalija (npr. pesticida, biocida, industrijskih kemikalija). Za razliku od većine ispitnih metoda, ove ispitna metoda opisuje ispitivanje toksikokinetike koje uključuje višestruka mjerenja i konačne učinke. U budućnosti će se možda razviti nekoliko novih ispitnih metoda i/ili smjernica za poseban i detaljniji opis svakog konačnog učinka. U slučaju ove ispitne metode zahtjevi i/ili potrebe svakog regulatornog sustava određuju koja će se ispitivanja ili određivanja provoditi.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Postoje brojne studije koje se mogu provesti za vrednovanje TK ponašanja ispitivane kemikalije u regulatorne svrhe. Međutim, ovisno o specifičnim regulatornim potrebama ili situacijama, za vrednovanje ispitivane kemikalije nisu potrebne sve od tih mogućih studija. U planiranju studija toksikokinetičnosti potrebna je fleksibilnost, uzimajući u obzir svojstva ispitivane kemikalije. U nekim je slučajevima moguće istraživati samo određeni komplet pitanja kako bi se odredila opasnost povezana s ispitivanom kemikalijom i udjelom rizika. U nekim se slučajevima TK podaci mogu prikupljati kao dio vrednovanja u drugim toksikološkim studijama. Za druge pak situacije mogu biti potrebna dodatne i/ili opsežnije studije TK-a, ovisno o regulatornim potrebama i/ili u slučaju pojavljivanja novih pitanja kao dijela vrednovanja ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Laboratorij koji provodi ispitivanje u obzir mora uzeti sve raspoložive informacije o ispitivanoj kemikaliji i relevantnim metabolitima i analognim tvarima prije provođenja studije kako bi povećao kvalitetu studije i na minimum sveo primjenu životinja. To može obuhvaćati podatke iz drugih relevantnih ispitnih metoda (studije in vivo, studije in vitro i/ili vrednovanja in silico). Fizikalno-kemijska svojstva, kao što su koeficijent razdjeljenja oktanol-voda (izražen kao log POW), pKa, topljivost u vodi, tlak pare i molekularna masa kemikalije mogu biti korisna za planiranje studije i tumačenje rezultata. Ona se mogu odrediti primjenom odgovarajućih metoda, kao što je opisano u relevantnoj ispitnoj metodi.
                           
                        OGRANIČENJA
                  
                              9.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda nije osmišljena kao odgovor na posebne okolnosti, kao što su gravidne životinje ili životinje tijekom laktacije i mladunčad, ni za vrednovanje potencijalnih ostataka u izloženih životinja koje proizvode hranu. Međutim, podaci dobiveni iz studije B.36 mogu pružiti pozadinske informacije za vođenje pri planiranju specifičnih studija za takva istraživanja. Ova ispitna metoda nije namijenjena testiranju nanomaterijala. Izvješće o preliminarnoj reviziji OECD-ovih smjernica za ispitivanje za njihovu primjenjivost na nanomaterijale pokazuje da se TG 417 (ekvivalentna ovoj ispitnoj metodi B.36) ne može primijeniti na nanomaterijale (1).
                           
                        DEFINICIJE
                  
                              10.
                           
                           
                              Definicije upotrijebljene u svrhu ove ispitne metode navedene su u Dodatku.
                           
                        RAZMATRANJA O DOBROBITI ŽIVOTINJA
                  
                              11.
                           
                           
                              Upute o humanom postupanju sa životinjama dostupne su u OECD-ovoj Smjernici (GD) 19 (2). Preporučuje se konzultiranje s OECD-ovom Smjernicom 19. za sve studije in vivo i in vitro opisane u ovoj ispitnoj metodi.
                           
                        OPIS METODA
                  
                     Pilotske studije
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Primjena pilotskih studija preporučuje se i potiče za odabir pokusnih parametara za studije toksikokinetike (npr. metabolizam, bilanca mase, analitički postupci, pronalaženje doza, izdisanje CO2 itd.). Za karakterizaciju nekih od tih parametara nije potrebna primjena radioaktivno označenih kemikalija.
                           
                        
                     Odabir životinja
                  
                  
                     Vrste
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Vrste (i sojevi) životinja upotrijebljenih za ispitivanje TK po mogućnosti trebaju biti jednaki kao i životinja upotrijebljenih u drugim toksikološkim studijama provedenima s predmetnom ispitivanom kemikalijom. Obično se treba primijeniti štakor, kao što je raširen običaj u toksikološkim studijama. Primjena drugih ili dodatnih vrsta može biti opravdana ako studije kritične toksičnosti dadnu dokaze o značajnoj toksičnosti u tih vrsta ili ako se pokaže da je njihova toksičnost/toksikokinetika relevantnija za ljude. Treba pružiti obrazloženje za odabir vrsta i sojeva životinja.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Osim ako nije drukčije navedeno, ova ispitna metoda odnosi se na štakore kao pokusnu vrstu. Određeni aspekti ove metode mogu se promijeniti za primjenu drugih pokusnih vrsta.
                           
                        
                     Starost i soj
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Treba upotrebljavati mlade, zdrave, odrasle jedinke (obično u dobi od 6 - 12 tjedana u vrijeme doziranja) (vidjeti još i stavke 13. i 14.). Treba pružiti obrazloženje za primjenu životinja koje nisu mlade odrasle jedinke. Sve životinje moraju biti slične dobi na početku studije. Varijacije u masi pojedinih životinja ne smiju biti veće od ± 20 % prosječne mase ispitne skupine. U idealnom slučaju treba upotrijebiti isti soj koji se upotrijebio i za dobivanje toksikološke baze podataka za ispitivanu kemikaliju.
                           
                        
                     Broj i spol životinja
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Za svaku ispitnu dozu treba upotrijebiti najmanje četiri životinje istog spola. Treba pružiti obrazloženje za spol upotrijebljenih životinja. Primjenu obaju spolova (četiri mužjaka i četiri ženke) treba uzeti u obzir ako postoji dokaz o značajnim razlikama u toksičnosti povezanima sa spolom.
                           
                        
                     Uvjeti smještaja i hranjenja
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Tijekom razdoblja ispitivanja životinje načelno treba smjestiti pojedinačno. Skupni smještaj može biti opravdan u posebnim uvjetima. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati tame. Temperatura prostorije za ispitivanje životinje mora iznositi 22 °C (± 3 °C), a relativna vlažnost zraka 30 - 70 %. Za hranjenje se može primjenjivati konvencionalna laboratorijska prehrana uz neograničene količine pitke vode.
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Ispitivana kemikalija koja je radioaktivno obilježena pomoću 14C treba se primijeniti za sve aspekte studije u svezi s bilancom mase i identifikacijom metabolita, međutim može se pokazati:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          da se bilanca mase i identifikacija metabolita može prikladno vrednovati primjenom neobilježene ispitivane kemikalije,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          da je analitička specifičnost i osjetljivost metode upotrijebljene s neradioaktivnom ispitivanom kemikalijom jednaka ili veća od one koja se može postići s radioaktivno obilježenom ispitivanom kemikalijom,
                                       
                                    da se tada ne mora upotrijebiti radioaktivno obilježena ispitivana kemikalija. Nadalje, mogu se upotrijebiti i drugi radioaktivni i stabilni izotopi, posebno ako je element odgovoran za toksični segment ispitivane kemikalije ili je dio tog toksičnog segmenta. Ako je moguće, radioaktivnu oznaku treba locirati u središnjem dijelu molekule koja je metabolički stabilna (ne može se zamijeniti, ne uklanja se metabolički kao CO2 i ne postaje dio monokarbonske zalihe organizma). Označavanje više mjesta ili specifičnih regija molekule može biti potrebno radi praćenja metaboličke sudbine ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Radioaktivno obilježene i radioaktivno neobilježene ispitivane kemikalije treba analizirati primjenom odgovarajućih metoda radi utvrđivanja čistoće i identiteta. Radioaktivna čistoća radioaktivne ispitivane kemikalije mora biti najveća koja se može postići za određenu ispitivanu kemikaliju (u idealnom slučaju mora biti veća od 95 %) i treba uložiti razuman napor za identifikaciju nečistoća prisutnih na 2 % ili više. Treba podnijeti izvješće o čistoći, identitetu i udjelu identificiranih nečistoća. Individualni regulatorni programi mogu odabrati pružanje dodatnih uputa za podršku pri definiranju i specifikacijama ispitivanih kemikalija složenih od smjesa i metoda za određivanje čistoće.
                           
                        
                     Odabir doza
                  
                  
                     Pilotska studija
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Za pilotsku je studiju obično dovoljna jedna oralna doza. Doza mora biti netoksična, ali dovoljno visoka kako bi omogućila identifikaciju metabolita u izlučevinama (i plazmi ako je potrebno) te kako bi ispunila određeni cilj pilotske studije, kao što je navedeno u stavku 12. ove ispitne metode.
                           
                        
                     Glavne studije
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Za glavne studije prednost se daje najmanje dvjema dozama jer informacije prikupljene od najmanje dviju skupina koje primaju dozu mogu pomoći pri određivanju doza u drugim studijama toksičnosti te pomoći pri određivanju reakcije na dozu u već dostupnim ispitivanjima toksičnosti.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Ako se daju dvije doze, obje moraju biti dovoljno visoke kako bi omogućile identifikaciju metabolita u izlučevinama (i plazmi ako je potrebno). Za odabir doza u obzir treba uzeti informacije iz dostupnih podataka o toksičnosti. Ako te informacije nisu dostupne (npr. iz studija akutne oralne toksičnosti koje bilježe kliničke znakove toksičnosti ili iz studija toksičnosti uz primjenu ponovljenih doza), u obzir se mogu uzeti vrijednost za višu dozu koja je manja od procijenjenog LD50 (oralni i dermalni način primjene) ili LC50 (primjena inhalacijom) ili manja od niže vrijednosti procijenjenog raspona akutne toksičnosti. Niža doza mora biti razlomak više doze.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Ako se ispituje samo jedna visina doze, u idealnom slučaju doza mora biti dovoljno visoka kako bi omogućila identifikaciju metabolita u izlučevinama (i plazmi ako je potrebno), a da ne izaziva očitu toksičnost. Treba pružiti argumente za neuključivanje druge visine doze.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Ako treba ustanoviti učinak doze na kinetičke procese, dvije doze neće biti dovoljne, a barem jedna doza mora biti dovoljno visoka kako bi došlo do zasićenja tih procesa. Ako područje ispod krivulje koncentracije plazme u ovisnosti o vremenu (AUC) nije linearno između dviju visina doza korištenih u glavnoj studiji, to snažno upućuje na to da se zasićenje jednog ili više kinetičkih procesa odvija negdje između dviju visina doza.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Za ispitivane kemikalije niske toksičnosti treba upotrijebiti maksimalnu dozu od 1 000 mg/kg tjelesne mase (oralna i dermalna primjena) (ako se daje inhalacijom, upute potražite u Poglavlju B.2 ovog Priloga, ta doza obično ne prelazi 2 mg/l). Za razmatranja o specifičnostima kemikalije nije potrebna viša doza, ovisno o regulatornim potrebama. Uvijek treba obrazložiti odabir doze.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Podaci o toksikokinetici jedne doze i podaci o distribuciji u tkivu mogu biti prikladni za određivanje potencijala za akumulaciju i/ili postojanost. No, u nekim je slučajevima potrebna primjena ponovljene doze i) kako bi se cjelovitije pristupilo potencijalu akumulacije i/ili postojanosti promjena u TK (npr. indukcija i inhibicija enzima) ili ii) kao što zahtijeva primjenjivi regulatorni sustav. U studijama koje uključuju ponovljenu primjenu doza, dok je obično dovoljna ponovljena primjena niske doze, u određenim uvjetima može također biti potrebna ponovljena primjena visoke doze (vidjeti još i stavak 57.).
                           
                        
                     Primjena ispitivane kemikalije
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Ispitivanu kemikaliju treba otopiti ili homogeno suspendirati u istom nosaču koji se koristio i za druge studije provedene primjenom oralnom sondom s istom ispitivanom kemikalijom ako su dostupne informacije o tom nosaču. Treba navesti argumentaciju za odabir nosača. Pri planiranju studije treba razmotriti odabir nosača i količinu doziranja. Uobičajena metoda primjene jest primjena sondom, no, u specifičnim situacijama može biti korisna primjena preko želatinozne kapsule ili kao primjesa hrani (u oba slučaja treba pružiti obrazloženje). Treba pružiti dokaz o stvarnoj dozi primijenjenoj na svakoj životinji.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Maksimalna količina tekućine koja se primjenjuje oralnom sondom odjedanput ovisi o veličini pokusne životinje, tipu nosača za doziranje te o tome je li hranjenje obustavljeno prije primjene ispitivane kemikalije ili nije. Treba navesti argumentaciju za davanje ili uskraćivanje hrane prije doziranja. Količinu obično treba održavati što je moguće manjom za nosače s vodenom otopinom ili nosače bez vodene otopine. Količina doze obično ne bi smjela biti veća od 10 ml/kg tjelesne mase za glodavce. Količine nosača korištenih za više lipofilnih ispitivanih kemikalija mogu početi od 4 ml/kg tjelesne mase. Za ponovljenu primjenu doza, u slučaju da je kontraindiciran svakodnevni post, u obzir treba uzeti manje količine doza (npr. 2 - 4 ml/kg tjelesne mase). Ako je moguće, u obzir treba uzeti primjenu količine doze usklađene s dozom primijenjenoj u drugim studijama primjene ispitivane kemikalije pomoću oralne sonde.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Za određivanje bioraspoloživosti ili relativne oralne apsorpcije može se upotrijebiti intravenozna (IV) primjena ispitivane kemikalije i mjerenje ispitivane kemikalije u krvi i/ili izlučevinama. Za IV studije jedna doza (obično ekvivalentna nižoj oralnoj dozi, ali da nije veća od nje - vidjeti odabir doza) ispitivane kemikalije daje se uz primjenu odgovarajućeg nosača. Taj materijal treba primjenjivati u prikladnoj količini (npr. 1 ml/kg tjelesne mase) na odabrano mjesto primjene najmanje četirima životinjama odgovarajućeg spola (ako je opravdano, mogu se upotrebljavati oba spola, vidjeti stavak 16.). Za IV primjenu ispitivane kemikalije potreban je posve rastopljen ili otopljen pripravak doze. Nosač za IV primjenu ne smije negativno utjecati na integritet krvi ili protok krvi. Ako se ispitivana kemikalija primjenjuje preko infuzije, brzinu infuzije treba zabilježiti i standardizirati među životinjama te se pobrinuti da se upotrebljava infuzijska pumpa. Ako se kanila uvodi u jugularnu venu (radi primjene ispitivane kemikalije i/ili prikupljanje krvi) ili ako se za primjenu koristi femoralna arterija, treba primijeniti anesteziju. Dovoljnu pozornost treba obratiti na tip anestezije jer isti može utjecati na toksikokinetiku. Životinjama se prije primjene ispitivane kemikalije s nosačem mora omogućiti odgovarajući oporavak.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Drugi načini primjene, kao što je dermalni način i inhalacija (vidjeti stavke 74. - 78.), mogu se primjenjivati za određene ispitivane kemikalije uzimajući u obzir njihova fizikalno-kemijska svojstva i očekivanu ljudsku uporabu ili izlaganje.
                           
                        
                     Mjerenja
                  
                  
                     Bilanca mase
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Bilanca mase određena je zbrojem postotka primijenjene (radioaktivne) doze izlučene u urinu, izmetu i izdahnutom zraku i postotka prisutnog u tkivima, ostacima trupla te ispirku kaveza (vidjeti stavak 46.). Općenito se ukupan oporavak od primijenjene ispitivane kemikalije (radioaktivnost) smatra prikladnim ako je > 90 %.
                           
                        
                     Apsorpcija
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Početna procjena apsorpcije može se postići isključivanjem postotka doze u gastrointestinalnom (GI) traktu i/ili izmetu iz određivanja bilance mase. Za izračun postotka apsorpcije vidjeti stavak 33. Za ispitivanje izlučevina vidjeti stavke 44. - 49. Ako se točna mjera apsorpcije uz primjenu oralnog doziranja ne može odrediti iz studija bilance mase (npr. ako je u izmetu prisutno više od 20 % primijenjene doze), mogu biti potrebna daljnja istraživanja. Te studije mogu kompromitirati 1) oralnu primjenu ispitivane kemikalije i mjerenje ispitivane kemikalije u žuči ili 2) oralnu i IV primjenu ispitivane kemikalije i mjerenje neto ispitivane kemikalije prisutne u mokraći plus truplu za svaki od dvaju načina primjene. U oba plana studije mjerenje radioaktivnosti provodi se kao surogatna metoda za specifičnu kemijsku analizu ispitivane kemikalije i metabolita.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Ako se provodi studija žučnih izlučevina, obično se koristi oralni način primjene. U tom slučaju u žučne kanale najmanje četiriju životinja odgovarajućeg spola (ili obaju spolova ako je opravdano) treba uvesti kanilu i primijeniti jednu dozu ispitivane kemikalije. Sljedeća primjena ispitivane kemikalije, izlučivanja radioaktivnosti/ispitivane kemikalije u žuči treba nadzirati dokle god je potrebno kako bi se procijenio postotak primijenjene doze koja se izlučuje tim putem, što se može upotrijebiti za izravan izračun opsega oralne apsorpcije na sljedeći način:
                              
                                 
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              S nekim razredima ispitivane kemikalije može se dogoditi izravna sekrecija apsorbirane doze preko crijevnih membrana. U tim se slučajevima mjerenje postotka doze u izmetu nakon oralne primjene u glodavaca s kanilom u žučnom kanalu ne smatra reprezentativnim za neapsorbiranu dozu. Preporučuje se da se u slučaju sumnje na crijevnu sekreciju postotak apsorbirane doze temelji na apsorpciji izračunatoj iz usporedbe izlučevina nakon oralne i IV primjene (netretirani štakori ili štakori s kanilom u žučnom kanalu) (vidjeti stavak 35.). Također se preporučuje da se u slučaju da se kvantifikacija crijevne sekrecije smatra potrebnom, izlučivanje kod štakora s kanilom u žučnom kanalu izmjeri nakon IV primjene doze.
                           
                        
                     Bioraspoloživost
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Bioraspoloživost se može odrediti iz kinetike plazme/krvi oralnih i IV skupina kao što je opisano u stavcima 50. - 52., specifičnom kemijskom analizom ispitivane kemikalije i/ili relevantnog/ih metabolita tako da nije potrebna radioaktivno obilježena ispitivana kemikalija. Bioraspoloživost (F) ispitivane kemikalije ili relevantnog/ih metabolita može se izračunati na sljedeći način:
                              
                                 
                           
                        gdje je AUC područje ispod krivulje koncentracije plazme u ovisnosti o vremenu, a exp je pokusni način primjene (oralni, dermalni ili inhalacijom).
                  
                              36.
                           
                           
                              Za primjenu i određivanje rizika od sistemskih učinaka, bioraspoloživosti toksične komponente općenito se daje prednost nad postotkom apsorpcije pri usporedbi sistemskih koncentracija iz studija na životinjama s analognim podacima dobivenima biološkim nadzorom iz studija o izlaganju radnika. Situacija može postati složenija ako su doze u nelinearnom omjeru tako da je važno da se u preventivnom ispitivanju toksikokinetike odrede doze u linearnom rasponu.
                           
                        
                     Distribucija u tkivu
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Poznavanje distribucije ispitivane kemikalije i/ili njezinih metabolita u tkivu važno je za identifikaciju tkiva meta, razumijevanje temeljnih mehanizama toksičnosti te dobivanje informacija o potencijalu akumulacije i postojanosti ispitivane kemikalije i metabolita. Postotak ukupne (radioaktivne) doze u tkivima i ostacima trupla treba minimalno mjeriti na kraju pokusa s izlučevinama (npr. tipično do 7 dana nakon primjene doze ili manje, ovisno o specifičnom ponašanju ispitivane kemikalije). Ako se na završetku studije u tkivima ne otkrije ispitivana kemikalija (npr. zato što je ispitivana kemikalija uklonjena prije završetka studije zbog kratkog vremena poluraspada), treba se pobrinuti da se podaci ne protumače pogrešno. U takvoj situaciji treba ispitati distribuciju u tkivu u vrijeme vršne koncentracije ispitivane tvari (i/ili metabolita) u plazmi/krvi (Tmax) ili vršnu stopu mokraćnih izlučevina ako je potrebno (vidjeti stavak 8.). Nadalje, može biti potrebno skupljati tkivo u dodatnim vremenskim točkama kako bi se odredila distribucija ispitivane kemikalije i/ili njezinih metabolita u tkivu, kako bi se ocijenila ovisnost o vremenu (ako je potrebno), kako bi se pomoglo u utvrđivanju bilance mase i/ili ako to zahtijeva nadležno tijelo. Tkiva koja treba prikupiti uključuju jetru, mast, GI trakt, bubreg, slezenu, cijelu krv, ostatke trupla, tkiva organa meta i sva druga tkiva (npr. štitnjaču, eritrocite, reproduktivne organe, kožu, oko (posebno u pigmentiranih životinja) od potencijalnog značenja u toksikološkoj ocjeni ispitivane kemikalije. Treba razmotriti analizu dodatnih tkiva u isto vrijeme kako bi se na maksimum povećala primjena životinja te u slučaju da je u studijama subkronične ili kronične toksičnosti opažena toksičnost organa meta. Treba također podnijeti izvješće o (radioaktivnoj) preostaloj koncentraciji i omjerima tkiva i plazme (krv).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Nadležno tijelo također može trebati ili tražiti vrednovanje distribucije u tkivima u dodatnim vremenskim točkama poput vremena vršne koncentracije plazme/krvi (npr. Tmax) ili vršne stope mokraćnih izlučevina dobivenu iz odgovarajućih pokusa kinetike plazme/krvi ili izlučevina. Ta informacija može biti korisna za razumijevanje toksičnosti i potencijala ispitivane kemikalije i akumuliranja i postojanosti metabolita. Treba pružiti obrazloženje za odabir uzoraka, uzorci za analizu općenito moraju biti jednaki kao i oni gore (vidjeti stavak 37.).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Kvantifikacija radioaktivnosti za studije distribucije u tkivu može se provesti uz primjenu seciranja organa, homogenizacije, izgaranja i/ili solubilizacije uz zatim tekućinsko scintilacijsko brojanje (LSC) uhvaćenih ostataka. Određene tehnike, trenutačno u raznim stadijima razvoja, npr. kvantitativna autoradiografija cijelog tijela i mikroskopska autoradiografija receptora, mogu se pokazati korisnima pri određivanju distribucije ispitivane kemikalije u organima i/ili tkivima (3) (4).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Za drukčije načine primjene osim oralnog treba prikupiti i analizirati specifična tkiva kao što su pluća u studijama pomoću inhalacije te koža u dermalnim studijama. Vidjeti stavke 74. - 78.
                           
                        
                     Metabolizam
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Izlučevine (i plazmu ako je potrebno) treba skupiti radi identifikacije i kvantifikacije nepromijenjene ispitivane kemikalije i metabolita, kao što je opisano u stavcima 44. - 49. Prihvatljivo je udruživanje izlučevina radi olakšanja identifikacije metabolita unutar zadane skupine koja prima dozu. Preporučuje se profiliranje metabolita iz svakog vremenskog razdoblja. No, ako nedostatak uzoraka i/ili radioaktivnosti to ne dopusti, udruživanje urina i izmeta iz nekoliko vremenskih točaka je prihvatljivo, ali nije prihvatljivo udruživanje iz različitih spolova ili doza. Za analizu urina, izmeta, istekle radioaktivnosti tretiranih životinja te žuči, ako je potrebno, treba primijeniti odgovarajuće kvalitativne i kvantitativne metode.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Treba se razumno potruditi oko identifikacije metabolita prisutnih u 5 % ili više primijenjene doze te oko izrade metaboličke sheme za ispitivanu kemikaliju. Treba identificirati ispitivane kemikalije koje su karakterizirane u izlučevinama koje obuhvaćaju 5 % ili više primijenjene doze. Identifikacija se odnosi na točno određenje strukture komponenti. Tipično se identifikacija obavlja ko-kromatografijom metabolita s poznatim standardima uz primjenu dvaju disimilarnih sustava ili tehnikama koje omogućuju pozitivnu identifikaciju strukture, kao što je spektrometrija masa, nuklearna magnetska rezonanca (NMR) itd. U slučaju ko-kromatografije kromatografske tehnike uz primjenu iste stacionarne faze s dvama različitim sustavima otapala ne smatraju se prikladnom dvometodnom provjerom identiteta metabolita jer te da metode nisu neovisne. Identifikaciju ko-kromatografijom treba provesti uz primjenu dvaju disimilarnih, analitički neovisnih sustava kao što su reverzna i normalna faza tankoslojne kromatografije (TLC) i tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti (HPLC). Ako se pokaže da je kromatografska separacija odgovarajuće kvalitete, nije potrebna dodatna potvrda spektroskopskim srednjim vrijednostima. Alternativno se jednoznačna identifikacija može postići primjenom metoda koje pružaju informacije o strukturi kao što su: tekućinska kromatografija/spektrometrija masa (LC-MS) ili tekućinska kromatografija/tandemska spektrometrija masa (LC-MS/MS), plinska kromatografija/spektrometrija masa (GC-MS) i spektrometrija NMR.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Ako na 5 % ili više primijenjene doze nije moguće identificirati metabolite, u završnom izvješću treba pružiti obrazloženje. Može biti prikladno identificirati metabolite u manje od 5 % primijenjene doze kako bi se postiglo bolje razumijevanje metaboličkog tijeka procjene opasnosti i/ili rizika od ispitivane kemikalije. Kad god je moguće, treba pružiti potvrdu strukture. To može uključivati profiliranje u plazmi ili krvi ili drugim tkivima.
                           
                        
                     Ekskrecija
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Brzinu i opseg ekskrecije primijenjene doze treba odrediti mjerenjem postotka rekuperirane (radioaktivne) doze iz urina, izmeta i izdahnutog zraka. Ti će podaci pomoći i u određivanju bilance mase. Količine ispitivane kemikalije (radioaktivnost) elimirane putem urina, izmeta i izdahnutog zraka treba odrediti u odgovarajućim vremenskim intervalima (vidjeti stavke 47. - 49.). Pokusi s primjenom ponavljanih doza moraju se pravilno isplanirati kako bi se omogućilo prikupljanje podataka o ekskreciji radi ispunjenja ciljeva opisanih u stavku 26. To će omogućiti usporedbu s pokusima s primjenom jedne doze.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Ako pilot studija pokaže da se u izdahnutom zraku ne eliminira značajna količina ispitivane kemikalije (radioaktivnost) (u skladu sa stavkom 49.), u konačnoj studiji ne treba skupljati izdahnuti zrak.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Svaku životinju treba smjestiti u odvojenu metaboličku jedinicu za skupljanje izlučevina (urina, izmeta i izdahnutog zraka). Na kraju svakog razdoblja skupljanja (vidjeti stavke 47. - 49.), metaboličke jedinice treba isprati prikladnim otapalom (to je poznato kao ‚ispiranje kaveza’) kako bi se osigurala maksimalna rekuperacija ispitivane kemikalije (radioaktivnost). Skupljanje izlučevina treba završiti nakon 7 dana ili nakon rekuperacije najmanje 90 % primijenjene doze, ovisno o tome što nastupi prvo.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Ukupne količine ispitivane kemikalije (radioaktivnost) u mokraći treba odrediti u najmanje dvije vremenske točke 1. dana skupljanja, od kojih jedna mora biti na 24 h nakon primjene doze, a zatim svakodnevno do završetka studije. Savjetuje se odabir više od dva trenutka uzorkovanja prvog dana (npr. na 6, 12 i 24 h). Rezultate pilot studija treba analizirati radi informacije o drugim ili dodatnim vremenskim točkama za skupljanje. Treba pružiti argumentaciju za raspored skupljanja.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Ukupne količine ispitivane kemikalije (radioaktivnost) u izmetu treba određivati svakodnevno počevši s 24 h nakon primjene doze pa do završetka studije, osim ako pilot studije ne sugeriraju druge ili dodatne vremenske točke za skupljanje. Treba pružiti argumentaciju za drukčiji raspored skupljanja.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Skupljanje izdahnutog CO2 i drugih hlapljivih materijala može se prekinuti u pokusu predmetne studije ako je u izdahnutom zraku tijekom razdoblja skupljanja od 24 h pronađeno manje od 1 % primijenjene doze.
                           
                        
                     Studije s vremenskim tijekom
                  
                  
                     Kinetika plazme/krvi
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Svrha je ovih studija dobiti procjenu osnovnih parametara TK [npr. Cmax, Tmax poluvrijeme (t1/2), AUC] za ispitivanu kemikaliju. Te se studije mogu provoditi sa samo jednom dozom ili bolje s još dvjema dozama. Namještanje doza treba odrediti na temelju naravi pokusa i/ili ciljanog problema. Za rješavanje problema kao što su bioraspoloživost ispitivane kemikalije i/ili za pojašnjenje učinka doze na klirens (npr. za pojašnjenje je li klirens zasićen u obliku koji ovisi o dozi) mogu biti potrebni kinetički podaci.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Za te studije treba primijeniti najmanje četiri životinje jednog spola po skupini koja prima dozu. Treba pružiti obrazloženje za spol upotrijebljenih životinja. Primjenu obaju spolova (četiri mužjaka i četiri ženke) treba uzeti u obzir ako postoji dokaz o značajnim razlikama u toksičnosti povezanima sa spolom.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Nakon primjene ispitivane kemikalije (radioaktivno obilježene) u odgovarajućim vremenskim točkama od svake životinje treba uzeti uzorke krvi uz primjenu prikladne metode uzorkovanja. Količina i broj uzoraka krvi koji se mogu dobiti po životinji može biti ograničena potencijalnim učincima ponovljenog uzorkovanja ili zdravlja/fiziologije životinje i/ili osjetljivosti analitičke metode. Treba analizirati uzorke za svaku pojedinačnu životinju. U nekim okolnostima (npr. karakterizacija metabolita) također može biti potrebno udruživanje uzoraka više od jedne životinje. Udružene uzorke treba jasno identificirati te pružiti objašnjenje za udruživanje. Ako se primjenjuje radioaktivno obilježena ispitivana kemikalija, može biti prikladna analiza ukupne radioaktivnosti. Ako je tako, treba analizirati ukupnu radioaktivnost u cijelom tijelu i plazmi ili plazmi i crvenim krvnim tjelešcima kako bi se omogućio izračun omjera krvi i plazme. U drugim okolnostima mogu biti potrebne specifičnije pretrage koje zahtijevaju identifikaciju početnog spoja i/ili metabolita ili određivanje proteinskih veza.
                           
                        
                     Kinetika drugih tkiva
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Svrha ovih studija jest dobivanje informacija o vremenskom tijeku kako bi se pristupilo pitanjima u svezi s problemima, kao što su toksični način djelovanja, bioakumulacija i biopostojanost putem određivanja razina ispitivane kemikalije u raznim tkivima. Odabir tkiva i broj vrednovanih vremenskih točaka ovisit će o problemu kojemu se pristupa i toksikološkoj bazi podataka za ispitivanu kemikaliju. Plan tih studija kinetike dodatnih tkiva treba uzeti u obzir informacije skupljene kao što je opisano u stavcima 37. - 40. Te studije mogu uključivati jednu dozu ili ponovljene doze. Treba podnijeti detaljnu argumentaciju za pristup.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Razlozi za obavljanje studija kinetike drugih tkiva mogu uključivati:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          dokaz o produženom poluvijeku krvi, koji sugerira moguću akumulaciju ispitivane kemikalije u raznim tkivima ili
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          zanimanje u ispitivanju je li postignuta razina stabilnog stanja u specifičnim tkivima (npr. u studijama uz primjenu ponovljene doze iako nije postignuta očita razina stabilnog stanja ispitivane kemikalije, može postojati zanimanje za utvrđivanje je li razina stabilnog stanja postignuta i u dobivenim tkivima meti).
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              Za ove tipove studija vremenskog tijeka odgovarajuću oralnu dozu ispitivane kemikalije treba primijeniti na najmanje četirima životinjama po dozi po vremenskoj točki te tijekom vremena distribucije koje se nadzire u odabranim tkivima. Može se upotrijebiti samo jedan spol osim ako se ne uoči specifična toksičnost u nekom spolu. Hoće li se analizirati ukupna radioaktivnost ili početni spoj i/ili metaboliti također ovisi o problemu kojemu se pristupa. Distribucija u tkivu treba se odrediti primjenom odgovarajućih tehnika.
                           
                        
                     Indukcija/inhibicija enzima
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Studije usmjerena na moguće učinke indukcije/inhibicije enzima ili biotransformaciju ispitivane kemikalije na kojoj se vrši studija mogu biti potrebne u jednom ili više od sljedećih slučajeva:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          Raspoloživ dokaz koji ukazuje na odnos između biotransformacije ispitivane kemikalije i povećane toksičnosti,
                                       
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          Raspoloživi podaci o toksičnosti koji ukazuju na nelinearan odnos između doze i metabolizma,
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          Rezultati studija identifikacije metabolita pokazuju identifikaciju potencijalnog toksičnog metabolita koji je možda proizveden enzimskim tijekom koji je inducirala ispitivana kemikalija,
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          Pri objašnjavanju učinaka za koje se pretpostavlja da su povezani s fenomenom indukcije enzima,
                                       
                                    
                                          5.
                                       
                                       
                                          Ako se u metaboličkom profilu ispitivane kemikalije opaze toksikološki značajne promjene bilo u pokusima in vitro ili in vivo s različitim vrstama ili uvjetima, može biti potrebna karakterizacija uključenog(ih) enzima (npr. enzimi faze I enzimi kao što su izoenzimi sustava monooksigenaze koji ovise o Citokromu P450, enzimi faze II kao što su izoenzimi sulfotransferaze ili uridin difosfat glukuronozil transferaza ili bilo koji drugi relevantni enzimi). Ta se informacija može upotrijebiti za vrednovanje odnosa vrsta s ekstrapolacijom vrsta.
                                       
                                    
                        
                              57.
                           
                           
                              Treba primijeniti odgovarajuće, prikladno ocijenjene i obrazložene protokole studija za vrednovanje promjena u TK povezanih s ispitivanom kemikalijom. Planovi studija kao primjer sastoje se od primjene ponavljanih doza s neoznačenom ispitivanom kemikalijom, nakon čega slijedi jedna radioaktivno obilježena doza 14. dana ili primjena ponavljanih doza s radioaktivno obilježenom ispitivanom kemikalijom te uzorkovanja 1., 7. i 14. dana radi određivanja profila metabolita. Primjena ponavljanih doza s radioaktivno obilježenom ispitivanom kemikalijom također može pružiti informacije o bioakumulaciji (vidjeti stavak 26.).
                           
                        DODATNI PRISTUPI
                  
                              58.
                           
                           
                              Dodatni pristupi, osim pokusa in vivo opisanih u ovoj ispitnoj metodi, mogu pružiti korisne informacije o apsorpciji, distribuciji, metabolizmu ili eliminaciji ispitivane kemikalije u određenih vrsta.
                           
                        
                     Primjena informacija in vitro
                     
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              U studijama in vitro uz primjenu odgovarajućih sustava ispitivanja može se pristupiti nekolicini pitanja u svezi s metabolizmom ispitivane kemikalije. Svježe izolirani ili uzgojeni hepatociti i substanične frakcije (npr. mikrosomi i citosol ili frakcija S9) iz jetre mogu se upotrijebiti u studiji mogućih metabolita. Lokalni metabolizam u organu meti, npr. plućima, može biti koristan za procjenu rizika. U te svrhe mogu biti korisne mikrosomalne frakcije tkiva meta. Studije s mikrosomima mogu biti korisne za pristup potencijalnim razlikama i spolu i životnom stadiju te karakterizirati parametre enzima (Km i Vmax) koji mogu pomoći u određivanju ovisnosti doze o metabolizmu u odnosu na razine izlaganja. Mikrosomi uz to mogu biti korisni za identifikaciju specifičnih mikrosomalnih enzima uključenih u metabolizam ispitivane kemikalije, što može biti relevantno u ekstrapolaciji vrsta (vidjeti još i stavak 56.). Potencijal indukcije biotransformacije također se može ispitati uz primjenu jetrenih substaničnih frakcija (npr. mikrosoma i citosola) životinja koje su prethodno tretirane ispitivanom kemikalijom, in vitro pomoću studija o indukciji hepatocita ili iz specifičnih staničnih linija koje pokazuju relevantne enzime. U određenim okolnostima i u odgovarajućim uvjetima substanične frakcije iz ljudskih tkiva također se mogu uzeti u obzir za određivanje potencijalnih razlika u biotransformaciji među vrstama. Rezultati istraživanja in vitro također mogu biti korisni u razvoju modela PBTK (5).
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Studije o dermalnoj apsorpciji in vitro mogu pružiti dodatne informacije za karakterizaciju apsorpcije (6).
                           
                        
                              61.
                           
                           
                              Za pristup sličnim pitanjima mogu se upotrijebiti primarne stanične kulture stanica jetre i svježi presjeci tkiva te mikrosomi iz jetre. U određenim slučajevima na specifična se pitanja može odgovoriti uporabom staničnih linija s definiranom ekspresijom relevantnog enzima ili proizvedenih staničnih linija. U određenim slučajevima može biti korisno istražiti inhibiciju i indukciju izoenzima specifičnog citokroma P450 (npr. CYP1A1, 2E1, 1A2 i drugih) i/ili enzima faze II pomoću početnog spoja uz primjene studija in vitro. Dobivene informacije mogu biti korisne za spojeve slične strukture.
                           
                        
                     Uporaba podataka o toksikokinetici iz studija o toksičnosti kao dodatnih informacija
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Analiza uzoraka krvi, tkiva i/ili izlučevina dobivenih tijekom provođenja drugih studija toksičnosti mogu pružiti podatke o bioraspoloživosti, promjenama u koncentraciji plazme tijekom vremena (AUC, Cmax), potencijalu bioakumulacije, klirensu te promjenama u metabolizmu i kinetici ovisno o spolu ili životnom stadiju.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Razmatranja o planiranju studije mogu se primijeniti za odgovor na pitanja u vezi sa: zasićenjem apsorpcije, tijekom biotransformacije ili ekskrecije na visokim razinama doze; djelovanjem novih metaboličkih tijekova na višim dozama i ograničenjem toksičnih metabolita na više doze.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Ostala razmatranja o određivanju opasnosti mogu obuhvaćati probleme kao što su:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Osjetljivost povezana s dobi zbog razlika u statusu barijere krv-mozak, kapaciteta bubrega i/ili detoksikacije,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Subpopulacijska osjetljivost zbog razlika u kapacitetu biotransformacije ili drugim TK razlikama,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Opseg izlaganja fetusa transplacentarnim transferima ili kemikalijama ili novog mladunčeta laktacijom.
                                       
                                    
                        
                     Primjena toksikokinetičkog modeliranja
                  
                  
                              65.
                           
                           
                              Toksikokinetički modeli mogu biti korisni za razne aspekte procjene opasnosti i rizika, kao primjerice u predviđanju sistemskog izlaganja i interne doze u tkivu. Osim toga, može se pristupiti specifičnim pitanjima o načinu djelovanja, a ti modeli mogu pružiti temelj za ekstrapolaciju vrsta, načina izlaganja, uzoraka doziranja i procjene rizika za ljude. Podaci korisni za razvoj modela PBTK za ispitivanu kemikaliju u svim danim vrstama obuhvaćaju 1) koeficijente razdjeljenja, 2) biokemijske konstante i fiziološke parametre, 3) parametre specifične za način izlaganja te 4) in vivo kinetičke podatke za ocjenu modela [npr. parametre klirensa za relevantne (> 10 %) tijekove ekskrecije, Km i Vmax za metabolizam]. Pokusne podatke upotrijebljene u razvoju modela treba proizvesti znanstveno opravdanim metodama i treba ocijeniti rezultate modela. Parametri specifični za ispitivanu kemikaliju i vrstu, kao što su brzina apsorpcije, parcioniranje krvi u tkivu i konstanta brzine metabolizma, često se određuju kako bi se olakšao razvoj modela za neodjeljke ili modela utemeljenog na fiziologiji (7).
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                              66.
                           
                           
                              Preporučuje se da se izvješće o studiji obuhvaća i sadržaj.
                           
                        
                     Tijelo izvješća
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              U tijelu izvješća moraju se nalaziti informacije pokrivene ovom ispitnom metodom, organizirane u odjeljke i odlomke na sljedeći način:
                           
                        
                     Sažetak
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              Ovaj odjeljak izvješća o studiji treba obuhvaćati sažetak plana studije te opis korištenih metoda. Također, mora istaknuti ključne nalaze što se tiče bilance mase, naravi i magnitude metabolita, ostataka u tkivu, klirensa, potencijala bioakumulacije, razlika među spolovima itd. Sažetak treba predstaviti s dovoljno detalja kako bi se omogućilo vrednovanje nalaza.
                           
                        
                     Uvod
                  
                  
                              69.
                           
                           
                              Ovaj odjeljak izvješća treba obuhvaćati ciljeve studije, razloge i plan te odgovarajuće reference i pozadinsku povijest.
                           
                        
                     Materijali i metode
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              Ovaj odjeljak izvješća treba obuhvaćati detaljan opis svih primjerenih informacija kao što su:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          Ispitivana kemikalija
                                          Ovaj pododjeljak treba obuhvaćati identifikaciju ispitivane kemikalije: kemijski naziv, molekularnu strukturu, kvalitativno i kvantitativno određenje njezina kemijskog spoja, kemijsku čistoću te, ako je moguće, tip i količinu nečistoća. Također treba obuhvaćati informacije o fizikalno-kemijskim svojstvima, uključujući fizikalno stanje, boju, makroskopsku topljivost i/ili koeficijent razdjeljenja, stabilnost te po potrebi korozivnost. Ako je primjenjivo, treba pružiti informacije o izomerima. Ako je ispitivana kemikalija radioaktivno obilježena, u ovaj pododjeljak treba uključiti sljedeće informacije: tip radioaktivnih nuklida, položaj oznake, specifičnu aktivnost te radiokemijsku čistoću.
                                          Treba navesti tip opisa svih nosača, diluensa, sredstava za suspenziju i emulgatora ili drugih materijala korištenih u primjeni ispitivane kemikalije.
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          Pokusne životinje
                                          Ovaj pododjeljak treba obuhvaćati informacije o pokusnim životinjama, uključujući odabir i obrazloženje za vrstu, soj i starost na početku studije, spol i tjelesnu masu, zdravstveni status te uzgoj životinja.
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          Metode
                                          Ovaj pododjeljak treba obuhvaćati detalje o planu studije i korištenoj metodologiji. Treba uključivati opis:
                                          
                                                      1.
                                                   
                                                   
                                                      Obrazloženje za sve modifikacije načina izlaganja i uvjeta izlaganja, ako je primjenjivo,
                                                   
                                                
                                                      2.
                                                   
                                                   
                                                      Obrazloženje za odabir visina doze,
                                                   
                                                
                                                      3.
                                                   
                                                   
                                                      Opis pilot studija korištenih u planiranju pokusa sljedećih studija, ako je primjenjivo. Treba navesti podatke iz pilot studija koji služe kao podrška,
                                                   
                                                
                                                      4.
                                                   
                                                   
                                                      Kako je pripremana otopina doze te tip korištenog otapala ili nosača, ako je neki korišten,
                                                   
                                                
                                                      5.
                                                   
                                                   
                                                      Broj tretiranih skupina i broj životinja po skupini,
                                                   
                                                
                                                      6.
                                                   
                                                   
                                                      Visine i količine doza (te specifičnu aktivnost doze ako je korištena radioaktivnost),
                                                   
                                                
                                                      7.
                                                   
                                                   
                                                      Način(i) i metode primjene,
                                                   
                                                
                                                      8.
                                                   
                                                   
                                                      Učestalost doziranja,
                                                   
                                                
                                                      9.
                                                   
                                                   
                                                      Razdoblje posta (ako je primijenjeno),
                                                   
                                                
                                                      10.
                                                   
                                                   
                                                      Ukupna radioaktivnost po životinji,
                                                   
                                                
                                                      11.
                                                   
                                                   
                                                      Postupanje sa životinjama,
                                                   
                                                
                                                      12.
                                                   
                                                   
                                                      Skupljanje uzoraka i manipulacija uzorcima,
                                                   
                                                
                                                      13.
                                                   
                                                   
                                                      Analitičke metode korištene za odvajanje, kvantitaciju i identifikaciju metabolita,
                                                   
                                                
                                                      14.
                                                   
                                                   
                                                      Granica detekcije korištenih metoda,
                                                   
                                                
                                                      15.
                                                   
                                                   
                                                      Druga korištena pokusna mjerenja i postupci (uključujući i ocjenu metoda za analizu metabolita).
                                                   
                                                
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          Statistička analiza
                                          Ako se za analizu nalaza studije koristi statistička analiza, treba obuhvatiti dovoljno informacija o metodi analize i korištenom računalnom programu tako da neovisni revizor/statističar može ponovno vrednovati i rekonstruirati analizu.
                                          U slučaju studije za modeliranje sustava, kao što je PBTK, predstavljanje modela treba obuhvaćati potpun opis modela kako bi se omogućila neovisna rekonstrukcija i ocjena modela (vidjeti stavak 65. i Dodatak: Definicije).
                                       
                                    
                        
                     Rezultati
                  
                  
                              71.
                           
                           
                              Sve podatke treba sažeti i tablično prikazati s odgovarajućim statističkim vrednovanjem te opisati u tekstu ovog odjeljka. Podatke o radioaktivnosti treba sažeti i prikazati ako je potrebno za studiju, obično kao mikrogramske ili miligramske ekvivalente po jedinici uzorka iako se mogu upotrijebiti i druge jedinice. Ovaj odjeljak treba obuhvaćati grafičke ilustracije nalaza, reprodukciju reprezentativnih kromatografskih i spektrometrijskih podataka, identifikaciju/kvantifikaciju metabolita i predložene metaboličke tijekove uključujući molekularnu strukturu metabolita. Treba obuhvatiti i sljedeće informacije, ako je primjenjivo:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          Količinu i postotak rekuperacije radioaktivnosti u urinu, izmetu, izdahnutom zraku te ispiranje kaveza od urina i izmeta.
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Za dermalne studije također obuhvatite i podatke o rekuperaciji ispitivane kemikalije iz tretirane kože, ispiraka kože te ostataka radioaktivnosti u aparatu koji pokriva kožu i metaboličkoj jedinici, kao i rezultate studije dermalnog ispiranja. Za ostale rasprave vidjeti stavke 74. - 77.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Za inhalacijske studije također obuhvatite i podatke o rekuperaciji ispitivane kemikalije iz plućnog i nazalnog tkiva (8). Za ostale rasprave vidjeti stavak 78.
                                                   
                                                
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          Distribucija u tkivu navedena kao postotak primijenjene doze i koncentracije (mikrogramski ekvivalent po gramu tkiva) i omjer tkiva i krvi ili tkiva i plazme,
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          Bilanca materijala razvijena iz svake studije koja obuhvaća analizu tjelesnih tkiva i izlučevina,
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          Koncentracije plazme i toksikokinetički parametri (bioraspoloživost, AUC, Cmax, Tmax, klirens, polutijek) nakon primjene relevantnim načinom/načinima izlaganja,
                                       
                                    
                                          5.
                                       
                                       
                                          Brzina i opseg apsorpcije ispitivane kemikalije nakon primjene relevantnih načinom/načinima izlaganja,
                                       
                                    
                                          6.
                                       
                                       
                                          Količine ispitivane kemikalije i metabolita (navedenih kao postotak primijenjene doze) skupljenih u izlučevinama,
                                       
                                    
                                          7.
                                       
                                       
                                          Reference na podatke iz dodatka koji sadrže pojedinačne podatke o životinjama za sva mjerenja konačnih učinaka (npr. primjena doze, postotak rekuperacije, koncentracije, TK parametre itd.),
                                       
                                    
                                          8.
                                       
                                       
                                          Slika s predloženim metaboličkim tijekovima i molekularnim strukturama metabolita.
                                       
                                    
                        
                     Rasprava i zaključci
                  
                  
                              72.
                           
                           
                              Autor u ovom odjeljku treba:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          Pružiti predloženi metabolički tijek utemeljen na rezultatima metabolizma i dispozicije ispitivane kemikalije,
                                       
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          Raspravljati o svim potencijalnim razlikama između vrsta i spolova po pitanju dispozicije i/ili biotransformacije ispitivane kemikalije,
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          Tablično prikazati i raspravljati o identifikaciji i magnitudi metabolita, klirensu, potencijalu bioakumulacije te razini ostataka početnog spoja i/ili metabolita u tkivu, kao i o mogućim promjenama u TK parametrima koje ovise o dozi, ako je potrebno,
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          U ovaj odjeljak treba integrirati sve relevantne TK podatke dobivene tijekom provođenja studije toksičnosti,
                                       
                                    
                                          5.
                                       
                                       
                                          Pružiti sažet zaključak koji se može poduprijeti nalazima studije,
                                       
                                    
                                          6.
                                       
                                       
                                          Dodati odjeljke (ako je potrebno ili prikladno).
                                       
                                    
                        
                              73.
                           
                           
                              Dodatni odjeljci trebaju se upotrijebiti kako bi se uključile dodatne bibliografske informacije, tablice, slike, dodaci itd.
                           
                        ALTERNATIVNI NAČINI IZLAGANJA
                  
                     Dermalni
                  
                  
                     Dermalni tretman
                  
                  
                              74.
                           
                           
                              U ovom odjeljku nalaze se specifične informacije o istraživanju toksikokinetike ispitivane kemikalije dermalnim putem. Za dermalnu apsorpciju treba proučiti poglavlje B.44 ovog Priloga [Apsorpcija putem kože: metoda in vivo (9)]. Za ostale konačne učinke, kao što su distribucija i metabolizam, može se primijeniti ispitna metoda B.36. Pri dermalnom tretmanu treba se upotrijebiti jedna ili više visina doza za ispitivanu kemikaliju. Ispitivana kemikalija (npr. čisti, razrijeđeni ili formulirani materijal koji sadrži ispitivanu kemikaliju koja se primjenjuje na kožu) mora biti jednaka (ili realističan surogat) kemikaliji kojoj mogu biti izloženi ljudi ili druge potencijalne vrste meta. Visinu/e doza treba odabrati u skladu sa stavcima 20. - 26. ove ispitne metode. Čimbenici koji se mogu uzeti u obzir pri odabiru dermalne doze uključuju očekivano ljudsko izlaganje i/ili doze na kojima je u drugim studijama dermalne toksičnosti opažena toksičnost. Dermalnu dozu/dermalne doze treba razrijediti, po potrebi, u prikladnom nosaču te primijeniti u količini prikladnoj za davanje doze. Krzno kratko prije ispitivanja treba štipaljkama učvrstiti tako da se ukloni s dorzalnog područja trupa pokusnih životinja. Može se obaviti brijanje, ali to se mora obaviti otprilike 24 h prije ispitivanja. Pri učvršćivanju krzna štipaljkama ili brijanju treba paziti da se ne ošteti koža jer bi to moglo promijeniti njezinu propusnost. Otprilike 10 % površine tijela treba očistiti radi primjene ispitivane kemikalije. U slučaju kemikalija visoke toksičnosti površina može biti manja od 10 %, ali što više površine treba biti pokriveno tankim i ravnomjernim slojem. Za sve ispitivane skupine treba primijeniti jednak tretman površine. Dozirna područja treba zaštititi prikladnom zaštitom osiguranom protiv micanja. Životinje treba smjestiti odvojeno.
                           
                        
                              75.
                           
                           
                              Studiju s primjenom dermalnog ispiranja treba provesti kako bi se odredila količina primijenjene doze ispitivane kemikalije koja se može ukloniti s kože ispiranjem tretiranog područja blagim sapunom i vodom. Ta studija također može pomoći pri utvrđivanju bilance mase ako se ispitivana kemikalija primjenjuje dermalnim putem. Za tu studiju s primjenom dermalnog ispiranja jednu dozu ispitivane kemikalije treba dati dvjema životinjama. Odabir visine doze u skladu je sa stavkom 23. ove ispitne metode (vidjeti još i stavak 76. za raspravu o vremenu kontakta s kožom). Treba odrediti količine rekuperirane ispitivane kemikalije u ispircima kako bi se odredila učinkovitost uklanjanja ispitivane kemikalije pranjem.
                           
                        
                              76.
                           
                           
                              Osim ako to korozivnost ne dopusti, ispitivanu kemikaliju treba primijeniti i zadržati na koži najmanje 6 sati. U trenutku uklanjanja zaštite tretirano područje treba isprati pridržavajući se postupka izloženog u studiji uz primjenu dermalnog ispiranja (vidjeti stavak 75.). I zaštitu i ispirke treba analizirati na ostatke ispitivane kemikalije. Na završetku studije sve životinje treba humano usmrtiti u skladu s (2) te ukloniti tretiranu kožu. Odgovarajuću sekciju tretirane kože treba analizirati kako bi se odredili ostaci ispitivane kemikalije (radioaktivnost).
                           
                        
                              77.
                           
                           
                              Za toksikokinetičko određivanje lijekova mogu biti potrebni različiti postupci u skladu s odgovarajućim regulatornim sustavom.
                           
                        
                     Inhalacija
                  
                  
                              78.
                           
                           
                              Treba primijeniti jednu koncentraciju (ili više ako je potrebno) ispitivane kemikalije. Koncentraciju/e treba odabrati u skladu sa stavcima 20. - 26. ove ispitne metode. Inhalacijske tretmane treba provoditi uz primjenu aparature ‚glava rakete’ ili ‚samo glava’ kako bi se spriječila apsorpcija drugim načinima izlaganja (8). Ako se primjenjuju drukčiji uvjeti za inhalaciju, treba dokumentirati obrazloženje za modifikaciju. Treba definirati trajanje izlaganja inhalacijom. Tipično izlaganje traje 4 - 6 sati.
                           
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              OECD (2009.). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Pariz.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              OECD (2000.). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Pariz.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Poglavlje B.45 ovog Priloga, Apsorpcija putem kože: metoda in vitro.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Poglavlje B.44 ovog Priloga, Apsorpcija putem kože: metoda in vivo.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Barton HA, et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York.
                           
                        
                     Dodatak
                     DEFINICIJE
                     
                        Apsorpcija: proces(i) preuzimanja kemikalije u tkiva ili kroz tkiva. Apsorpcija se odnosi na početni spoj i sve njegove metabolite. Ne treba je pomiješati s ‚bioraspoloživošću’.
                     
                        Akumulacija (bioakumulacija): povećanje količine ispitivane kemikalije tijekom vremena u tkivima (obično u masnim tkivima nakon ponovljenog izlaganja). Ako je unos ispitivane kemikalije u tijelo veći od stope eliminacije, organizam akumulira ispitivanu kemikaliju i mogu se postići toksične koncentracije ispitivane kemikalije.
                     
                        ADME: kratica za apsorpciju, distribuciju, metabolizam i ekskreciju (‚Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion’).
                     
                        AUC: (područje ispod krivulje koncentracije plazme i vremena): područje ispod krivulje u dijagramu koncentracije ispitivane kemikalije u plazmi tijekom vremena. Predstavlja ukupnu količinu ispitivane kemikalije koju tijelo apsorbira tijekom unaprijed određenog vremenskog razdoblja. Pod linearnim uvjetima AUC (od početka vremena do beskonačnosti) je proporcionalan ukupnoj količini ispitivane kemikalije koju je tijelo apsorbiralo, bez obzira na stopu apsorpcije.
                     
                        Autoradiografija: (autoradiografija cijelog tijela): primjenjuje se za kvalitativno i/ili kvantitativno određivanje mjesta radioaktivne ispitivane kemikalije. Ova se tehnika koristi filmom s X-zrakama ili novije digitalnim radiološkim prikazom uz pomoć fosfora kako bi vizualizirala radioaktivno obilježene molekule ili fragmente molekula bilježenjem zračenja koje emitiraju u predmetu koji se istražuje. Kvantitativna autoradiografija cijelog tijela u usporedbi sa seciranjem organa može imati neke prednosti za ocjenu distribucije ispitivane kemikalije i utvrđivanje ukupne rekuperacije i razlučivanja radioaktivnog materijala u tkivima. Značajna je prednost, primjerice, što se može primijeniti na modelu pigmentiranih životinja radi utvrđivanja mogućih asocijacija ispitivane kemikalije s melaninom koji može vezati određene molekule. No, iako može pružiti pogodne preglede veznih mjesta niskog afiniteta i visokog kapaciteta u cijelom tijelu, ova tehnika može biti ograničena u prepoznavanju specifičnih mjesta meta kao što su vezna mjesta receptora, gdje je za određivanje potrebna relativno visoka rezolucija i velika osjetljivost. Kada se primjenjuje autoradiografija, pokusi s ciljem određivanja bilance mase primijenjenog spoja moraju se provoditi kao odvojena skupina ili u studiji odvojenoj od pokusa distribucije u tkivu, gdje su sve izlučevine (koje mogu obuhvaćati i izdahnuti zrak) i cijela trupla homogenizirana i određena tekućinskim scintilacijskim brojanjem.
                     
                        Žučno izlučivanje: izlučivanje putem žučnih kanala.
                     
                        Bioakumulacija: vidjeti ‚akumulacija’.
                     
                        Bioraspoloživost: dio primijenjene doze koja postiže sistemsku cirkulaciju ili je dostupna na mjestu fiziološke aktivnosti. Bioraspoloživost ispitivane kemikalije obično se odnosi na početni spoj, ali se može odnositi i na njegov metabolit. U obzir se uzima samo na jedan kemijski oblik. Nota bene: bioraspoloživost i apsorpcija nisu isto. Razlika između npr. oralne apsorpcije (tj. prisutnosti u stijenci crijeva i portalnoj cirkulaciji) i bioraspoloživosti (tj. prisutnosti u sistemskoj krvi i tkivima) može nastati kemijskim raspadanjem zahvaljujući metabolizmu stijenke crijeva ili transportu odljevom natrag u šupljinu crijeva ili presistemski metabolizam u jetri između ostalih čimbenika (10). Bioraspoloživost toksične komponente (početni spoj ili metabolit) ključni je parametar u procjeni rizika za ljude (ekstrapolacija visoke do niske doze, ekstrapolacija između načina primjene) za izvođenje interne vrijednosti iz ekstremnih NOAEL ili BMD (primijenjena doza). Za učinke na jetru nakon oralne primjene dovoljna je oralna apsorpcija. No za svaki učinak, osim onog na ulazu, bioraspoloživost je općenito pouzdaniji parametar za daljnju uporabu u procjeni rizika od apsorpcije.
                     
                        Biopostojanost: vidjeti ‚postojanost’.
                     
                        Biotransformacija: (obično enzimska) kemijska konverzija ispitivane kemikalije u drugu kemikaliju unutar tijela. Sinonim za ‚metabolizam’.
                     
                        Cmax
                        : maksimalna (vršna) koncentracija u krvi (plazmi/serumu) nakon primjene ili maksimalna (vršna) ekskrecija (u urinu ili izmetu) nakon primjene.
                     
                        Klirens: kvantitativno mjerenje brzine kojom se ispitivana kemikalija uklanja iz krvi, plazme ili određenog tkiva u jedinici vremena.
                     
                        Odjeljak: strukturalni ili biokemijski dio (ili jedinica) tijela, tkiva ili stanice, koji je odvojen od ostatka.
                     
                        Tijek detoksikacije: niz koraka koji dovode do eliminacije toksičnih kemikalija iz tijela, bilo metaboličkom izmjenom ili izlučivanjem.
                     
                        Distribucija: raspršenje ispitivane kemikalije i njezinih derivata kroz organizam.
                     
                        Enzimi/izozimi: proteini koji kataliziraju kemijske reakcije. Izozimi i enzimi koji kataliziraju slične kemijske reakcije, ali se razlikuju po svojem aminokiselinskom slijedu.
                     
                        Enzimski parametri: Km: Michaelisova konstanta i Vmax: maksimalna brzina.
                     
                        Ekskrecija: proces(i) kojim(a) se primijenjena ispitivana kemikalija i/ili njezini metaboliti uklanjanju iz tijela.
                     
                        Egzogeno: uvedeno izvana ili proizvedeno izvan organizma ili sustava.
                     
                        Ekstrapolacija: utjecaj jedne ili više nepoznatih vrijednosti na temelj onoga što je poznato ili što se promatra.
                     
                        Poluvrijeme (t1/2): vrijeme potrebno za koncentraciju ispitivane kemikalije da se u odjeljku smanji za pola. Obično se odnosi na koncentraciju plazme ili količinu ispitivane kemikalije u cijelom tijelu.
                     
                        Indukcija/indukcija enzima: sinteza enzima kao odgovor na stimulans iz okoliša ili induktorsku molekulu.
                     
                        Linearnost/linearna kinetika: proces je linearan po pitanju kinetike ako su sve brzine transfera između odjeljaka proporcionalne količini prisutnih koncentracija, tj. prvom redu. Posljedično su konstantni klirens i količine distribucije te poluvijeka. Postignute su koncentracije proporcionalne brzini doziranja (izlaganja) te se lakše predviđa akumulacija. Linearnost/nelinearnost se može utvrditi usporedbom relevantnih parametara, npr. AUC nakon izlaganja različitim dozama ili nakon jednog i ponovljenog izlaganja. Nedostatak ovisnosti može biti indikativan za zasićenje enzima uključenih u metabolizam spoja, povećanje AUC nakon ponovljenog izlaganja u usporedbi s jednim izlaganjem može biti indikacija za inhibiciju metabolizma, a smanjenje u AUC može biti indikacija za indukciju metabolizma [vidjeti i (11)].
                     
                        Bilanca mase: izračun ulaza ispitivane kemikalije u sustav i njezina izlaza iz sustava.
                     
                        Bilanca materijala: vidjeti ‚bilanca mase’.
                     
                        Mehanizam (način) toksičnosti/mehanizam (način) djelovanja: mehanizam djelovanja odnosi se na specifične biokemijske interakcije kroz koje ispitivana kemikalija proizvodi svoj učinak. Način djelovanja odnosi se na općenitije tijekove koji izazivaju toksičnost ispitivane kemikalije.
                     
                        Metabolizam: sinonim za ‚biotransformaciju’.
                     
                        Metaboliti: proizvodi metabolizma ili metaboličkih procesa.
                     
                        Oralna apsorpcija: postotak doze ispitivane kemikalije apsorbirane na mjestu davanja (npr. GI trakt). Ovaj ključni parametar može se upotrijebiti za razumijevanje frakcije primijenjene ispitivane kemikalije koja dolazi do portalne vene te zatim jetre.
                     
                        Koeficijent razdjeljenja: poznat i kao koeficijent distribucije, predstavlja mjeru diferencijalne topljivosti kemikalije u dvama otapalima.
                     
                        Vršne razine krvi (plazma/serum): maksimalna (vršna) koncentracija krvi (plazma/serum) nakon davanja (vidjeti i ‚Cmax’).
                     
                        Postojanost (biopostojanost): dugoročna prisutnost kemikalije (u biološkom sustavu) zbog otpornosti na degradaciju/eliminaciju.
                     
                        Analogno predviđanje (read-across): informacija o konačnom učinku za jednu ili više kemikalija upotrebljava se za predviđanje konačnog učinka za ciljanu kemikaliju.
                     
                        Mikroskopska autoradiografija receptora (ili mikroautoradiografija receptora): ova se tehnika može primjenjivati za temeljito ispitivanje ksenobiotičke interakcije sa specifičnim tkivima ili populacijama stanica kao što su na primjer u studijama receptorskih veza ili specifičnog načina djelovanja koja mogu zahtijevati visoku rezoluciju i visoku osjetljivost koja se ne može postići drugim tehnikama, kao što je autoradiografija cijelog tijela.
                     
                        Način primjene (oralno, IV, dermalno, inhalacija itd.): odnosi se na način kojim se kemikalije daju u tijelo (npr. oralno sondom, oralno prehranom, dermalno, inhalacijom, intravenozno itd.).
                     
                        Zasićenje: stanje u kojem je jedan ili više kinetičkih procesa (npr. apsorpcija, metabolizam ili klirens) na maksimumu (čitaj ‚zasićen’).
                     
                        Osjetljivost: sposobnost metode ili instrumenta da razlikuje između reakcija na mjerenja uz predočenje različitih razina varijable koju se ispituje.
                     
                        Razine krvi (plazma) u stabilnom stanju: stanje neravnoteže otvorenog sustava u kojem su sve sile, koje djeluju na sustav, točno uravnotežene suprotnim silama tako da su sve njegove komponente stacionarne u koncentraciji iako tvar prolazi sustavom.
                     
                        Modeliranje sustava (toksikokinetika na bazi psihologije, na bazi farmakokinetike, farmakokinetika na bazi fiziologije, na bazi biologije itd.): Apstraktni model koji se za opis ponašanja sustava koristi matematičkim jezikom.
                     
                        Tkivo meta: tkivo u kojem se manifestira glavni nepovoljni učinak ili toksikant.
                     
                        Ispitivana kemikalija: bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne metode.
                     
                        Distribucija u tkivu: reverzibilno kretanje ispitivane kemikalije s jedne lokacije u tijelu do druge. Distribucija u tkivu može se istraživati seciranjem organa, homogenizacijom, izgaranjem i tekućinskim scintilacijskim brojanjem ili kvalitativnom i/ili kvantitativnom autoradiografijom cijelog tijela. Prvospomenuto je korisno za postizanje koncentracije i postotka rekuperacije iz tkiva i ostataka trupla istih životinja, ali može pokazati nedostatak za sva tkiva i može imati manje od idealne ukupne rekuperacije (< 90 %). Definiciju posljednjeg vidjeti gore.
                     
                        Tmax
                        : vrijeme za postizanje Cmax.
                     
                        Toksikokinetika (farmakokinetika): istraživanje apsorpcije, distribucije, metabolizma i ekskrecije kemikalija tijekom vremena.
                     
                        Ocjena modela: postupak procjene prikladnosti modela za dosljedno opisivanje raspoloživih toksikokinetičkih podataka. Modeli se mogu vrednovati statističkom i vizualnom usporedbom predviđanja modela s pokusnim vrijednostima u odnosu na opću neovisnu varijablu (npr. vrijeme). Treba obrazložiti opseg vrednovanja u odnosu na namjeravanu primjenu modela.
                  ”
            
                  8.
               
               
                  Ovime se dodaje Poglavlje B.52:
                  „B.52.   AKUTNA INHALACIJSKA TOKSIČNOST - METODA AKUTNOG TOKSIČNOG RAZREDA
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova je ispitna metoda ekvivalentna Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 436 (2009.). Prva smjernica o akutnoj inhalaciji TG 403 usvojena je 1981. i otada je revidirana (vidjeti Poglavlje B.2 ovog Priloga (1)). Za razvoj metode inhalacijskog akutnog toksičnog razreda (ATC) (2) (3) (4) smatralo se prikladnim slijediti usvajanje revidirane oralne metode ATC (Poglavlje B.1 tris ovog Priloga) (5). Utvrđivanje restropektivnog djelovanja ispitne metode ATC za akutnu inhalacijsku toksičnost pokazalo je da je metoda prikladna za primjenu u svrhu razvrstavanja i označivanja (6). Ispitna metoda inhalacije ATC omogućit će primjenu serijskih koraka koncentracija ciljane mete za određivanje ranga toksičnosti ispitivane kemikalije. Smrtnost se upotrebljava kao konačni učinak, ali životinje u teškoj patnji ili stresu koje ugibaju ili kojima prijeti ugibanje treba humano usmrtiti kako bi se smanjila patnja. Smjernica o humanom usmrćivanju dostupna je u OECD-ovoj Smjernici br. 19. (7).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Upute za provođenje i tumačenje ove ispitne metode mogu se pronaći u Smjernici br. 39. za ispitivanje akutne inhalacijske toksičnosti (GD 39) (8).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Definicije upotrijebljene u kontekstu ove ispitne metode nalaze se u Dodatku 1. i Smjernici 39. (8).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Ispitna metoda pruža informacije o opasnim svojstvima i omogućuje rangiranje i razvrstavanje ispitivane kemikalije u skladu s Uredbom (EZ) br. 1272/2008 za razvrstavanje kemikalija koje uzrokuju akutnu toksičnost (9). U slučaju da su potrebne početne procjene vrijednosti LC50 ili analize reakcije na koncentraciju treba upotrijebiti Pglavlje B.2 ovog Priloga (1) kao odgovarajuću ispitnu metodu. Ostale upute za odabir ispitne metode mogu se pronaći u GD 39 (8). Ova ispitna metoda nije specifično namijenjena za ispitivanje specijaliziranih materijala, poput slabo topljivih izometrijskih ili vlaknastih materijala ili proizvedenih nanomaterijala.
                           
                        UVODNA RAZMATRANJA
                  
                              5.
                           
                           
                              Kako bi se na minimum svela uporaba životinja, prije razmatranja ispitivanja u skladu s ovom ispitnom metodom laboratorij koji provodi ispitivanje u obzir treba uzeti sve dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji, uključujući postojeće studije čiji bi podaci opravdali neprovođenje dodatnih ispitivanja. Informacije koje mogu pomoći u odabiru najprikladnijih vrsta, sojeva, spola, načina izlaganja i prikladnih ispitnih koncentracije obuhvaćaju identitet, kemijsku strukturu te fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije; rezultate bilo kakvih ispitivanja toksičnosti in vitro ili in vivo; očekivanu(e) uporabu(e) i potencijal za izlaganje ljudi; dostupne podatke (Q)SAR i toksikološke podatke o tvarima srodne strukture. Koncentracije za koje se očekuje da izazivaju tešku patnju i stres zbog nagrizajućeg (11) ili ozbiljno nadražujućeg djelovanja ne treba ispitivati ovom ispitnom metodom [vidjeti GD 39 (8)].
                           
                        NAČELO ISPITIVANJA
                  
                              6.
                           
                           
                              Načelo je ispitivanja da se na temelju postupka korak po korak prikuplja dovoljna količina informacija o akutnoj inhalacijskoj toksičnosti ispitivane kemikalije tijekom razdoblja izlaganja od 4 sata kako bi se omogućilo njezino razvrstavanje. Ostala trajanja izlaganja mogu se primijeniti u specifične regulatorne svrhe. U svakom od definiranih koraka koncentracije ispituju se po tri životinje svakog spola. Ovisno o boležljivosti i/ili stupnju ugibanja životinja mogu biti dovoljna dva koraka za omogućenje prosudbe o akutnoj toksičnosti ispitivane kemikalije. Ako postoji dokaz da je jedan spol osjetljiviji od drugog, ispitivanje se može nastaviti samo s osjetljivijim spolom. Ishod prethodnog koraka odredit će sljedeći korak da bude kako slijedi:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          Nije potrebno daljnje ispitivanje,
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          Ispitivanje triju životinja svakog spola ili
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          Ispitivanje sa šest životinja osjetljivijeg spola, tj. procjena najniže granice razreda toksičnosti treba se temeljiti na šest životinja po ispitnoj skupini i ispitnoj koncentracije neovisno o spolu.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Životinje koje ugibaju ili životinje koje očito pate ili pokazuju znakove ozbiljnog i trajnog stresa treba humano usmrtiti i u tumačenju rezultata ispitivanja tretirati jednako kao i životinje uginule pri ispitivanju. Kriteriji za odlučivanje o usmrćivanju životinja u stanju ugibanja ili koje teško pate te upute o prepoznavanju predvidive ili prijeteće smrti predmet su Smjernice za humano usmrćivanje br. 19. OECD-a (7).
                           
                        OPIS METODE
                  
                     Odabir životinjske vrste
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Treba upotrijebiti zdrave, mlade odrasle životinje sojeva koji se obično koriste u laboratorijima. Preferirane vrsta je štakor, a u slučaju uporabe drugih vrsta treba dati obrazloženje.
                           
                        
                     Priprema životinja
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Treba upotrebljavati ženke koje još nisu imale potomstvo i nisu gravidne. Na dan izlaganja životinje moraju biti mlade odrasle jedinke između 8 i 12 tjedana starosti, srednje vrijednosti tjelesne mase u granicama od ± 20 % za svaki spol bilo koje prethodno izložene životinje jednake dobi. Životinje se odabiru nasumice i označavaju radi pojedinačne identifikacije. Životinje se drže u kavezima najmanje pet dana prije početka ispitivanja kako bi im se omogućila aklimatizacija na laboratorijske uvjete. Životinje također treba aklimatizirati na ispitnu aparaturu kratko vrijeme prije ispitivanja jer će se tako smanjiti stres izazvan uvođenjem u novu okolinu.
                           
                        
                     Uzgoj životinja
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Temperatura prostorije u kojoj se drže pokusne životinje trebala bi iznositi 22 ± 3 °C. Relativna vlažnost zraka idealno bi se morala održavati u intervalu od 30 do 70 % iako to možda neće biti moguće ako se kao nosač primjenjuje voda. Prije i nakon izlaganja životinje općenito treba smjestiti u kaveze u skupinama po spolu i koncentraciji, ali broj životinja po kavezu ne smije ometati jasna opažanja svake životinje i tako se trebaju na minimum svesti gubici zbog kanibalizma i borbe. Ako izlaže samo nos životinja, može biti potrebno aklimatizirati životinje na cijevi koje ih sputavaju. Cijevi koje sputavaju životinje ne smiju im nametnuti pretjeran fizički, toplinski ili imobilizacijski stres. Sputavanje može utjecati na fiziološke krajnje učinke, poput tjelesne temperature (hipertermija) i/ili respiratornog minutnog volumena. Ako su dostupni generički podaci koji pokazuju da se takve promjene ne događaju u znatnom opsegu, nije potrebna prethodna prilagodba cijevima koje sputavaju. Životinje, koje su cijelim tijelom izložene aerosolu, tijekom izlaganja treba smjestiti pojedinačno kako bi se spriječilo da se ispitivani aerosol filtrira kroz krzno drugih životinja u istom kavezu. Može se upotrijebiti konvencionalna i certificirana laboratorijska prehrana, osim tijekom izlaganja, u kombinaciji s neograničenom zalihom javne pitke vode. Rasvjeta mora biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati tame.
                           
                        
                     Komore za inhalaciju
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Pri odabiru komore za inhalaciju u obzir valja uzeti narav ispitivane kemikalije i cilj ispitivanja. Prednost se daje izlaganju samo nosom (koje uključuje samo glavu, samo nos ili samo njušku). Izlaganju samo nosom općenito se daje prednost za ispitivanja tekućih ili krutih aerosola te para koje se mogu kondenzirati iz aerosola. Posebni ciljevi ispitivanja mogu se bolje postići uporabom izlaganja čitavog tijela, ali to treba opravdati u izvješću o ispitivanju. Kako bi se osigurala stabilnost atmosfere u slučaju primjene komore za čitavo tijelo, ukupni volumen pokusnih životinja ne smije premašiti 5 % volumena komore. Načela tehnika izlaganja samo nosom i čitavim tijelom te njihove specifične prednosti i nedostaci opisani su u GD 39 (8).
                           
                        UVJETI IZLAGANJA
                  
                     Primjene koncentracija
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Preporučuje se fiksno trajanje izlaganja od četiri sata koje ne uključuje vrijeme uravnoteženja. Druga trajanja mogu biti potrebna radi ispunjavanja određenih zahtjeva, međutim, u izvješću o studiji treba pružiti obrazloženje [vidjeti GD 39. (8)]. Životinje izložene u komorama za izlaganje čitavim tijelom treba smjestiti pojedinačno kako bi se spriječila apsorpcija ispitivane kemikalije zbog njegovanja životinja u istom kavezu. Tijekom izlaganja treba obustaviti hranjenje. Voda se može davati tijekom cijelog izlaganja čitavim tijelom.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Životinje se izlažu ispitivanoj kemikaliji u vidu plina, pare, aerosola ili njihovih smjesa. Fizikalno stanje koje će se ispitivati ovisi o fizikalno-kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije, odabranoj koncentraciji i/ili fizikalnom obliku koji je obično prisutan tijekom manipulacije ispitivanom kemikalijom i njezine uporabe. Higroskopske i kemijski reaktivne ispitivane kemikalije treba ispitivati u uvjetima suhog zraka. Treba paziti kako bi se izbjeglo stvaranje eksplozivnih koncentracija.
                           
                        
                     Distribucija veličine čestica
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Određivanje veličine čestica treba provesti za sve aerosole i pare koje se mogu kondenzirati iz aerosola. Kako bi se omogućilo izlaganje svih relevantnih područja respiratornog trakta, preporučuje se aerosol srednjeg aerodinamičkog promjera čestica (MMAD) u rasponu od 1 do 4 μm s geometrijskom standardnom devijacijom (σg) u rasponu od 1,5 do 3,0 (8) (13) (14). Iako treba uložiti razuman napor za postizanje tih standarda, ako se isti ne mogu postići, treba dati stručno mišljenje. Primjerice, isparine metala mogu biti manje od tog standarda, a čestice, vlakna i higroskopni materijali pod nabojeme (čija se veličina povećava u vlažnom okolišu respiratornog trakta) mogu premašiti taj standard.
                           
                        
                     Priprema ispitivane kemikalije u nosaču
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Za stvaranje odgovarajuće koncentracije i veličine čestica ispitivane kemikalije u atmosferi može se upotrijebiti nosač. U pravilu se prednost daje vodi. Materijali u česticama mogu se podvrgnuti mehaničkim procesima kako bi se postigla potrebna distribucija veličine čestica, no treba paziti da se ispitivana kemikalija ne rastavi niti promijeni. U slučajevima u kojima se smatra da su mehanički procesi promijenili ispitivanu kemikaliju (npr. ekstremne temperature uslijed prekomjernog mljevenja zbog trenja) treba analitički provjeriti sastav ispitivane kemikalije. Treba primijeniti dovoljnu razinu opreza da se ne bi kontaminirala ispitivana kemikalija. Nije nužno ispitivati nedrobive granulirane materijale koji su namjerno oblikovani tako da se ne mogu inhalirati. Treba primijeniti test atricijom kako bi se dokazalo da se tijekom rukovanja granuliranim materijalom ne stvaraju čestice koje se mogu udahnuti. Ako se tijekom testa atricijom stvore tvari koje se mogu udahnuti, treba provesti test inhalacijske toksičnosti.
                           
                        
                     Kontrolne životinje
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Nije potrebna paralelna negativna skupina (zrak). U slučaju primjene drugog nosača osim vode pri stvaranju ispitne atmosfere kontrolna skupina nosača treba se primijeniti samo ako nisu dostupni podaci o povijesnoj inhalacijskoj toksičnosti. Ako ispitivanje toksičnosti ispitivane kemikalije formulirane u nosaču ne pokaže nikakvu toksičnost, znači da nosač nije toksičan u ispitnoj koncentraciji te stoga nema potrebe za kontrolnim nosačem.
                           
                        PRAĆENJE UVJETA IZLAGANJA
                  
                     Protok zraka u komori
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Protok zraka u komori treba pažljivo kontrolirati, neprestano pratiti te bilježiti najmanje jedanput svakog sata tijekom svakog izlaganja. Praćenje ispitne koncentracije (ili stabilnosti) u atmosferi sastavno je mjerenje svih dinamičkih parametara i pruža neizravno sredstvo za kontrolu svih relevantnih parametara za stvaranje dinamičke atmosfere. Treba posebno obratiti pozornost na izbjegavanje ponovnog udisanja u komorama za izlaganje samo nosom u slučajevima gdje je protok zraka kroz sustav za izlaganje neadekvatan za pružanje dinamičkog protoka atmosfere ispitivane kemikalije. Postoje propisane metodologije koje se mogu primijeniti kako bi se pokazalo da u odabranim uvjetima rada ne dolazi do ponovnog udisanja (8) (15). Koncentracija kisika mora iznositi najmanje 19 %, a koncentracija ugljikova dioksida ne smije premašivati 1 %. Ako postoji opravdana sumnja da se takvi standardi ne mogu postići, treba mjeriti koncentraciju kisika i ugljikova dioksida.
                           
                        
                     Temperatura i relativna vlažnost zraka u komori
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Temperaturu u komori treba održavati na 22 ± 3 °C. Relativnu vlažnost zraka u zoni gdje životinje dišu, za izlaganja samo nosom i čitavim tijekom, treba pratiti i bilježiti najmanje tri puta tijekom izlaganja do četiri sata te jedanput svakog sata tijekom kraćih izlaganja. Relativnu vlažnost zraka trebalo bi idealno održavati u rasponu od 30 do 70 %, no to može biti nemoguće (npr. u slučaju ispitivanja smjesa na bazi vode) ili nemjerljivo zbog utjecanja na ispitivanu kemikaliju pomoću ispitne metode.
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija: nazivna koncentracija
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Kad god je to moguće, treba izračunati i zabilježiti nazivnu koncentraciju u komori za izlaganje. Nazivna koncentracija jest masa proizvedene ispitivane kemikalije podijeljena s ukupnim volumenom zraka koji je prošao kroz sustav komore. Nazivna se koncentracija ne koristi za karakterizaciju izlaganja životinja nego usporedba nazivne koncentracije i stvarne koncentracije daje uvid u učinkovitost proizvodnje sustava ispitivanja te se stoga može upotrijebiti za otkrivanje problema pri proizvodnji.
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija: stvarna koncentracija
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Stvarna koncentracija jest koncentracija ispitivane kemikalije u zoni udisanja životinja u komori za inhalaciju. Stvarna koncentracija može se dobiti specifičnim metodama (npr. izravnim uzorkovanjem, apsorpcijskim ili kemijskim reaktivnim metodama te analitičkom karakterizacijom nakon toga) ili nespecifičnim metodama poput gravimetrijske analize filtra. Primjena gravimetrijske analize prihvatljiva je samo za aerosole sa samo jednom komponentom u prahu ili aerosole tekućina niskog stupnja hlapljivosti i treba je podržati odgovarajućom preliminarnom karakterizacijom specifičnom za ispitivanu kemikaliju. Gravimetrijskom analizom može se odrediti i koncentracija aerosola s višekomponentnim prahom. No, za to su potrebni analitički podaci koji pokazuju da je sastav materijala koji se prenosi zrakom sličan početnom materijalu. Ako ta informacija nije dostupna, potrebna je ponovna analiza ispitivane kemikalije (idealno u stanju kada se prenosi zrakom) u pravilnim intervalima tijekom ispitivanja. Za agense, pod utjecajem aerosola, koji mogu ispariti ili sublimirati treba pokazati da su odabranom metodom skupljene sve faze. U izvješću o ispitivanju treba navesti ciljanu, nazivnu i stvarnu koncentraciju, ali samo se stvarne koncentracije koriste u statističkim analizama za izračun vrijednosti smrtonosne koncentracije.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Ako je moguće, treba upotrijebiti jednu šaržu ispitivane kemikalije, a ispitivani uzorak treba skladištiti u uvjetima u kojima će biti očuvana njegova čistoća, homogenost i stabilnost. Prije početka studije treba odrediti svojstva ispitivane kemikalije, uključujući njezinu čistoću i, ako je tehnički izvedivo, identitet te količine identificiranih kontaminirajućih tvari i nečistoća. To se može pokazati sljedećim podacima, ali nije ograničeno na njih: vrijeme zadržavanja i relativno vršno područje, molekulska masa iz spektroskopskog mjerenja ili kromatografske analize plina ili sličnih procjena. Iako identitet ispitivanog uzorka nije odgovornost ispitnog laboratorija, za laboratorij može biti mudro barem u ograničenim okvirima potvrditi naručiteljevu karakterizaciju (npr. boju, fizikalnu narav itd.).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Atmosferu izlaganja treba održavati konstantnom koliko je to moguće i pratiti neprestano i/ili na mahove, ovisno o metodi analize. Ako se primjenjuje uzorkovanje na mahove, uzorke atmosfere u komori treba uzimati najmanje dvaput tijekom ispitivanja od četiri sata. Ako to nije izvedivo zbog ograničenog protoka zraka ili niskih koncentracija, tijekom čitavog razdoblja izlaganja može se uzeti jedan uzorak. Ako se pojave označene fluktuacije uzorak po uzorak, sljedeće ispitne koncentracije moraju upotrijebiti četiri uzorka po izlaganju. Pojedinačni uzorci koncentracije u komori ne smiju od srednje koncentracije u komori odstupati za više od ± 10 % za plinove i pare i ne za više od ± 20 % za tekućine ili kruti aerosol. Treba izračunati i zabilježiti vrijeme za postizanje ravnoteže u komori (t95). Trajanje izlaganja proteže se kroz vrijeme proizvodnje ispitivane kemikalije, a to uzima u obzir vrijeme potrebno za postizanje t95. Smjernica za procjenu t95 može se pronaći u GD 39. (8).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Za vrlo složene smjese koje se sastoje od plinova/para i aerosole (npr. zapaljive atmosfere i ispitivane kemikalije izbačene iz namjenskih proizvoda/uređaja za krajnju uporabu) svaka se faza može ponašati drukčije u komori za inhalaciju tako da treba odabrati najmanje jedan indikator (analiziranu tvar), obično glavnu aktivnu tvar u smjesi, svake faze (plin/para i aerosol). Kada je ispitivana kemikalija smjesa, treba izvijestiti o analitičkoj koncentraciji ukupne smjese, a ne samo za aktivni sastojak ili indikator (analiziranu tvar). Dodatne informacije o stvarnim koncentracijama mogu se pronaći u GD 39 (8).
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija: distribucija veličine čestica
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Distribuciju veličine čestica u aerosolu treba odrediti najmanje dvaput tijekom svakog izlaganja od četiri sata uporabom kaskadnog impaktora ili alternativnog instrumenta, poput uređaja za aerodinamičku analizu veličine čestica. Ako se može dokazati da su rezultati dobiveni kaskadnim impaktorom ili alternativnim instrumentom ekvivalentni, u cijelom se istraživanju može upotrebljavati alternativni instrument. Drugi uređaj, poput gravimetrijskog filtra ili uređaja za sudaranje/uređaja za mjerenje mjehurića plina, treba upotrijebiti paralelno s primarnim instrumentom kako bi se potvrdila učinkovitost skupljanja primarnog instrumenta. Koncentracija mase dobivena analizom veličine čestica trebala bi biti u razumnim granicama koncentracije mase dobivene analizom filtracijom [vidjeti GD 39 (8)]. Ako se ekvivalentnost može dokazati u ranoj fazi istraživanja, mogu se izostaviti daljnja mjerenja radi potvrde. Radi dobrobiti životinja treba provoditi mjerenja kako bi se na minimum sveli nepotpuni podaci koji mogu dovesti do potrebe za ponovnim izlaganjem. Određivanje veličine čestica treba provesti za pare ako postoji ikakva mogućnost da bi kondenzacijom pare mogao nastati aerosol ili ako čestice detektirane u atmosferi pare imaju potencijal za miješane faze (vidjeti stavak 14.).
                           
                        POSTUPAK
                  
                     Glavno ispitivanje
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Za svaki se korak upotrebljavaju tri životinje svakog spola ili šest životinja osjetljivijeg spola. Ako izlaganju samo nosom nisu izloženi štakori nego druge vrste glodavaca, maksimalna trajanja izlaganja treba prilagoditi kako bi se na minimum sveo stres specifičan za vrstu. Visina koncentracije koju treba primijeniti kao početnu dozu odabrana je među četiri određene visine, a visina početne koncentracije treba biti ona za koju je najvjerojatnije da će izazvati toksičnost u nekima od doziranih životinja. Sheme ispitivanja za plinove, pare i aerosole (obuhvaćene dodacima 2. - 4.) predstavljaju ispitivanje s obustavljenim vrijednostima kategorija CLP 1 - 4 (9) za plinove (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) (Dodatak 2.), za pare (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 h) (Dodatak 3.) te za aerosole (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 h) (Dodatak 4.). Kategorija 5, koja nije implementirana u Uredbu (EZ) br. 1272/2008 (9) odnosi se na koncentracije više od odgovarajućih graničnih koncentracija. Za svaku početnu koncentraciju primjenjuje se odgovarajuća shema ispitivanja. Ovisno o broju humano usmrćenih ili uginulih životinja, postupak ispitivanja slijedi naznačene strelice sve dok se ne omogući kategorizacija.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Vremensko razdoblje između izloženih skupina određuje se nastupom, trajanjem i ozbiljnošću znakova toksičnosti. Izlaganje životinja sljedećoj visini koncentracije treba odgoditi sve dok postoji opravdana mogućnost preživljavanja prethodno ispitivanih životinja. Preporučuje se razdoblje od tri ili četiri dana između izlaganja na svakoj visini koncentracije kako bi se omogućilo opažanje odgođene toksičnosti. Vremenski interval može se prilagoditi po potrebi, npr. u slučaju nepotpunih zaključaka.
                           
                        
                     Granični test
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Granični test primjenjuje se kada se za ispitivanu kemikaliju zna ili očekuje da je zapravo netoksična, npr. izvođenjem toksične reakcije samo iznad regulirajuće granične koncentracije. Informacije o toksičnosti ispitivane kemikalije mogu se dobiti iz znanja o sličnim ispitivanim kemikalijama ili sličnim smjesama, uzimajući u obzir identitet i postotak poznatih komponenti za koje se zna da su od toksikološke važnosti. U takvim situacijama, u kojima postoji malo informacija o njezinoj toksičnosti ili ih uopće nema ili se za ispitivanu kemikaliju očekuje da bude toksična, treba provesti glavno ispitivanje [ostale upute nalaze se u GD 39. (8)].
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Uz primjenu uobičajenog postupka tri životinje svakog spola ili šest životinja osjetljivijeg spola izložene su koncentracijama od 20 000 ppm za plinove, 20 mg/l za pare i 5 mg/l za prašinu/maglu redom (ako se može postići), što služi kao granični test za ovu ispitnu metodu. Kada se ispituje aerosol, primarni cilj treba biti postizanje veličine čestica koja se može udahnuti (MMAD 1 - 4 μm). To je s većinom ispitivanih kemikalija moguće na koncentraciji od 2 mg/l. Ispitivanje aerosola na koncentraciji višoj od 2 mg/l treba pokušati samo ako se može postići veličina čestica koja se može udisati [vidjeti GD 39. (8)]. Dodatno ispitivanje granične koncentracije destimulira se radi dobrobiti životinja u skladu s GHS (16). Ispitivanje u kategoriji 5 GHS (16), koje nije implementirano u Uredbi (EZ) br. 1272/2008 (9), treba uzeti u obzir samo ako postoji velika vjerojatno da će rezultati takvog ispitivanja biti izravno relevantni za zaštitu ljudskog zdravlja te u izvješću o studiji treba pružiti obrazloženje. U slučaju potencijalno eksplozivnih ispitivanih kemikalija treba voditi brigu o tome da se izbjegnu uvjeti povoljni za eksploziju. Kako bi se izbjegla nepotrebna primjena životinja, prije graničnog testa treba provesti ispitivanje bez životinja kako bi se osiguralo da se u komori mogu postići uvjeti za granični test.
                           
                        OPAŽANJA
                  
                              29.
                           
                           
                              Životinje treba često klinički promatrati tijekom razdoblja izlaganja. Nakon izlaganje klinička promatranja treba obavljati najmanje dvaput na dan izlaganja ili češće ako to zahtijeva reakcija životinja na tretman te najmanje jedanput dnevno u sljedećih 14 dana. Duljina razdoblja promatranja nije fiksno određena, ali treba je odrediti u skladu s prirodom i vremenom nastupanja kliničkih znakova i duljinom razdoblja oporavka. Važni su trenuci u kojima se pojavljuju i nestaju znakovi toksičnosti, posebno ako postoji tendencija ka kašnjenju znakova toksičnosti. Sva se opažanja sustavno bilježe u pojedinačnoj evidenciji za svaku životinju. Životinje u stanju ugibanja te životinje koje pokazuju znakove jake patnje i/ili trajne znakove ozbiljnog stresa treba humano usmrtiti radi njihove dobrobiti. Pri provođenju ispitivanja radi otkrivanja kliničkih znakova toksičnosti treba paziti na to da se početno slabo pojavljivanje i prolazne promjene u disanju koje su rezultat postupka izlaganja ne zamijene učincima povezanim s tretmanom. U obzir treba uzeti načela i kriterije rezimirane u Smjernici o humanom usmrćivanju (GD 19.) (7). Ako se životinje usmrte zbog humanih razloga ili ih se pronađe uginule, vrijeme ugibanja treba zabilježiti što je moguće preciznije.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Promatranja u kavezu moraju uključivati promjene na koži i krznu, očima i sluznicama te dišnom, cirkulacijskom, autonomnom i središnjem živčanom sustavu te somatomotoričkoj aktivnosti i uzorcima ponašanja. Ako je moguće, treba zamijetiti razliku između lokalnih i sistemskih učinaka. Treba obratiti pozornost na opažanje tremora, konvulzija, salivacije, dijareje, letargije, spavanja i kome. Mjerenje rektalne temperature može pružiti dodatne dokaze o refleksnoj bradipneji ili hipo/hipertermiji povezanoj s tretiranjem ili držanjem u zatvorenom.
                           
                        
                     Tjelesna masa
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Pojedinačnu masu životinja treba zabilježiti jedanput tijekom razdoblja aklimatizacije, na dan izlaganja prije samog izlaganja (0. dan), barem 1., 3. i 7. dana (i jedanput tjedno nakon toga) te u trenutku ugibanja ili usmrćenja ako nastupe iza 1. dana. Tjelesna masa prepoznaje se kao kritični pokazatelj toksičnosti pa treba pobliže pratiti životinje u kojih je primijećen neprekidan pad od ≥ 20 % u usporedbi s vrijednostima prije istraživanja. Životinje koje prežive važu se i humano usmrćuju na kraju razdoblja nakon izlaganja.
                           
                        
                     Patologija
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Sve pokusne životinje, uključujući i one koje su tijekom ispitivanja uginule ili usmrćene i uklonjene iz istraživanja radi svoje dobrobiti, treba podvrgnuti makroskopskoj obdukciji. Ako se obdukcija ne može provesti neposredno nakon otkrića uginule životinje, životinju treba ohladiti (ne zamrznuti) na dovoljno niskim temperaturama kako bi se na minimum svela razgradnja. Obdukciju treba provesti što je moguće prije, obično u roku od jednog ili dva dana. Za svaku životinju treba zabilježiti sve makroskopske patološke promjene uz poseban naglasak na promjenama u respiratornom traktu.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Dodatne pretrage, a priori obuhvaćene planom ispitivanja, mogu se razmotriti radi proširenja interpretacijske vrijednosti istraživanja poput mjerenja mase pluća preživjelih štakora i/ili pružanja dokaza iritacije pomoću mikroskopske pretrage respiratornog trakta. Ispitani organi također mogu obuhvaćati organe koji pružaju dokaze o makroskopskoj patologiji u životinja koje su preživjele 24 sata ili dulje te organa za koje se zna ili očekuje da su pogođeni. Mikroskopska pretraga cijelog respiratornog trakta može pružiti korisne informacije za ispitivane kemikalije koje reagiraju s vodom, poput kiselina i higroskopskih ispitivanih kemikalija.
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Podaci
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Treba pribaviti pojedinačne podatke o tjelesnoj masi i nalazima obdukcije za svaku životinju. Podatke prikupljene kliničkim promatranjem treba sažeti u obliku tablice, koja za svaku ispitnu skupinu pokazuje broj upotrijebljenih životinja, broj životinja koje pokazuju specifične znakove toksičnosti, broj životinja koje su tijekom ispitivanja pronađene uginule ili su usmrćene iz humanih razloga, vrijeme uginuća svake životinje, opis i vremenski tijek te reverzibilnost toksičnih učinaka i nalaze obdukcije.
                           
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Izvješće o ispitivanju treba, ako je primjereno, sadržavati sljedeće informacije:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Pokusne životinje i njihov uzgoj
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Opis uvjeta u kavezu, uključujući: broj (ili promjenu broja) životinja u svakom kavezu, materijal podloge, temperaturu i relativnu vlažnost zraka u kavezu, razdoblje svjetla i tame, identifikaciju prehrane,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korištenu vrstu/soj i obrazloženje za uporabu druge vrste osim štakora,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj, dob i spol životinja,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metodu nasumičnog odabira,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalje o kvaliteti hrane i vode (uključujući i vrstu/podrijetlo prehrane, izvor vode),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis kondicioniranja prije ispitivanja, uključujući i prehranu, karantenu i liječenje bolesti,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana kemikalija
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Fizikalna narav, čistoća te, ako je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva (uključujući izomerizaciju),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Identifikacijski podaci i broj registracije Chemical Abstract Services (CAS), ako je poznat,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Nosač
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Obrazloženje za uporabu nosača i obrazloženje za odabir nosača (ako nije voda),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Povijesni ili odgovarajući podaci koji pokazuju da nosač ne ometa rezultate istraživanja,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Komora za inhalaciju
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Opis komore za inhalaciju, uključujući i dimenzije i volumen,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Podrijetlo i opis opreme korištene za izlaganje životinja te stvaranje atmosfere,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Oprema za mjerenje temperature, vlažnosti, veličine čestica te stvarne koncentracije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Izvor zraka i obrada dovoda/odvoda zraka i sustav korišten za kondicioniranje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Metode korištene za kalibriranje opreme radi osiguravanja homogene atmosfere za ispitivanje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Razlika u tlaku (pozitivna ili negativna),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Otvori za izlaganje po komori (samo nos), lokacija životinja u sustavu (čitavo tijelo),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Privremena homogenost/stabilnost atmosfere za ispitivanje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Lokacija senzora temperature i vlažnosti te uzorkovanje ispitne atmosfere u komori,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Brzine protoka zraka, otvor za brzinu protoka zraka po izlaganju (samo nos) ili dovod životinja po komori (čitavo tijelo),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Informacije o opremi upotrijebljenoj za mjerenje kisika i ugljikova dioksida, ako je primjenjivo,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Vrijeme potrebno za postizanje uravnoteženja u komori za inhalaciju (t95),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Broj promjena u volumenu po satu,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Uređaji za mjerenje (ako je primjenjivo),
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Podaci o izlaganju
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Argumentacija za odabir ciljane koncentracije u glavnom istraživanju,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nazivne koncentracije (ukupna masa ispitivane kemikalije proizvedena u komori za inhalaciju podijeljena s volumenom zraka koji je prošao kroz komoru),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Stvarne koncentracije ispitivane kemikalije iz zone udisanja životinja; za ispitne smjese koje stvaraju heterogene fizikalne oblike (plinove, pare, aerosol) svaka se može analizirati odvojeno,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Sve koncentracije zraka moraju se prikazati u jedinicama za masu (npr. mg/l, mg/m3 itd.); jedinice za volumen (npr. ppm, ppb itd.) također se mogu prikazati usput,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Distribucija veličine čestica, srednji aerodinamički promjer čestica (MMAD) te geometrijska standardna devijacija (σg) uključujući metode za njihov izračun. Treba prijaviti pojedinačne analize veličine čestica,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Detalji o pripremi ispitivane kemikalije, uključujući i detalje o svim postupcima korištenima za smanjenje veličine čestica krutih materijala ili za pripremu otopina ispitivane kemikalije. U slučajevima u kojima su mehanički postupci mogli izmijeniti sastav ispitivane kemikalije uključiti rezultat analiza za utvrđivanje sastava ispitivane tvari,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Opis (po mogućnosti uz dijagram) opreme korištene za stvaranje atmosfere za ispitivanje te izlaganje životinja atmosferi za ispitivanje,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Detalji korištene kemijske analitičke metode i potvrda metode (uključujući učinkovitost rekuperacije ispitivane kemikalije iz medija za uzorkovanje),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Argumentacija za odabir ispitnih koncentracija,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz temperature, vlažnosti zraka i protoka zraka u komori,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz podataka o nazivnoj i stvarnoj koncentraciji u komori,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz podataka o veličini čestica, uključujući i podatke o skupljenim analitičkim uzorcima, distribuciju veličina čestica te izračune MMAD i σg,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Tablični prikaz podataka o reakciji i razini koncentracije za svaku životinju (npr. životinje koje pokazuju znakove toksičnosti uključujući smrtnost, prirodu, ozbiljnost i trajanje učinaka),
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Individualne tjelesne mase životinja prikupljene tijekom istraživanja; datum i vrijeme uginuća ako je nastupilo prije programiranog usmrćenja; vremenski tijek nastupanja znakova toksičnosti te jesu li bili reverzibilni za svaku životinju,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Nalazi obdukcije i histopatološki nalazi za svaku životinju ako su dostupni,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Razvrstavanje u kategorije CLP i obustavljena vrijednost LC50,
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rasprava i tumačenje rezultata
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Poseban naglasak treba staviti na opis metoda korištenih za ispunjavanje kriterija ove ispitne metode, npr. graničnu koncentraciju ili veličinu čestica,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Treba se pozabaviti sposobnošću udisanja čestica u svjetlu općih nalaza, posebno ako se nisu mogli ispuniti kriteriji za veličinu čestica,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      U opću ocjenu istraživanja treba uključiti dosljednost metoda korištenih za određivanje nazivnih i stvarnih koncentracija te odnos stvarne koncentracije prema nazivnoj,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Treba se pozabaviti vjerojatnim uzrokom smrti i prevladavajućim načinom djelovanja (sistemski u odnosu na lokalni).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      U slučaju humanog usmrćivanja životinja koje su patile ili pokazivale znakove velikog i trajnog stresa treba pružiti objašnjenje na temelju kriterija iz Smjernice za humano usmrćivanje OECD-a (7).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Poglavlje B.2 ovog Priloga, Akutna toksičnost (inhalacijska).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243-254.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537-549.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Diener W, Kayser D and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129-134.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Poglavlje B.1 tris ovog Priloga, Akutna oralna toksičnost - metoda utvrđivanja akutnog toksičnog razreda.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              OECD (2009.). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              OECD (2000.). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              OECD (2009.). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Uredba (EZ) br. 1272/2008 Europskog parlamenta i Vijeća od 16. prosinca 2008. za razvrstavanju, označivanju i pakiranju tvari i smjesa, kojom se izmjenjuju i dopunjuju i ukidaju direktive 67/548/EEZ i 1999/45/EZ te izmjenjuje i dopunjuje Uredba (EZ) br. 1907/2006, SL L 353, 31.12.2008., str. 1.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Poglavlje B.40 ovog Priloga, Nagrizanje kože in vitro: test transkutanog električnog otpora (TER).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Poglavlje B.40 bis ovog Priloga, Nagrizanje kože in vitro: test na modelu ljudske kože.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              OECD (2005.). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Dostupno: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html]
                           
                        
                     Dodatak 1.
                     DEFINICIJA
                     Ispitivana kemikalija: Bilo koja tvar ili smjesa ispitivana primjenom ove ispitne metode.
                  
                  
                     Dodatak 2.
                     
                        Postupak koji treba slijediti za svaku početnu koncentraciju za plinove (ppm/4 h)
                     
                     Opće napomene (12)
                     
                     Za svaku početnu koncentraciju odgovarajuće sheme ispitivanja, kao što je obuhvaćeno ovim Dodatkom, izlažu postupak koji treba slijediti.
                     Dodatak 2.a: Početna koncentracija iznosi 100 ppm
                     Dodatak 2.b: Početna koncentracija iznosi 500 ppm
                     Dodatak 2.c: Početna koncentracija iznosi 2 500 ppm
                     Dodatak 2.d: Početna koncentracija iznosi 20 000 ppm
                     Ovisno o broju humano usmrćenih ili uginulih životinja postupak ispitivanja slijedi naznačene strelice.
                  
                  
                     Dodatak 2.a
                     
                        Akutna inhalacijska toksičnost
                     
                     
                        Postupak ispitivanja s početnom koncentracijom od 100 ppm/4 h za plinove
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 2.b
                     
                        Akutna inhalacijska toksičnost
                     
                     
                        Postupak ispitivanja s početnom koncentracijom od 500 ppm/4 h za plinove
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 2.c
                     
                        Akutna inhalacijska toksičnost
                     
                     
                        Postupak ispitivanja s početnom koncentracijom od 2 500 ppm/4 h za plinove
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 2.d
                     
                        Akutna inhalacijska toksičnost
                     
                     
                        Postupak ispitivanja s početnom koncentracijom od 20 000 ppm/4 h za plinove
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 3.
                     
                        Postupak koji treba slijediti za svaku početnu koncentraciju za pare (mg/l/4 h)
                     
                     Opće napomene (13)
                     
                     Za svaku početnu koncentraciju odgovarajuće sheme ispitivanja, kao što je obuhvaćeno ovim Dodatkom, izlažu postupak koji treba slijediti.
                     Dodatak 3.a: Početna koncentracija iznosi 0,5 mg/l
                     Dodatak 3.b: Početna koncentracija iznosi 2,0 mg/l
                     Dodatak 3.c: Početna koncentracija iznosi 10 mg/l
                     Dodatak 3.d: Početna koncentracija iznosi 20 mg/l
                     Ovisno o broju humano usmrćenih ili uginulih životinja, postupak ispitivanja slijedi naznačene strelice.
                  
                  
                     Dodatak 3.a
                     
                        Akutna inhalacijska toksičnost
                     
                     
                        Postupak ispitivanja s početnom koncentracijom od 0,5 mg/L/4h za pare
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 3.b
                     
                        Akutna inhalacijska toksičnost
                     
                     
                        Postupak ispitivanja s početnom koncentracijom od 2 mg/L/4 h za pare
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 3.c
                     
                        Akutna inhalacijska toksičnost
                     
                     
                        Postupak ispitivanja s početnom koncentracijom od 10 mg/L/4 h za pare
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 3.d
                     
                        Akutna inhalacijska toksičnost
                     
                     
                        Postupak ispitivanja s početnom koncentracijom od 20 mg/L/4 h za pare
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 4.
                     
                        Postupak koji treba slijediti za svaku početnu koncentraciju za aerosole (mg/l/4 h)
                     
                     Opće napomene (14)
                     
                     Za svaku početnu koncentraciju odgovarajuće sheme ispitivanja, kao što je obuhvaćeno ovim Dodatkom, izlažu postupak koji treba slijediti.
                     Dodatak 4.a: Početna koncentracija iznosi 0,05 mg/l
                     Dodatak 4.b: Početna koncentracija iznosi 0,5 mg/l
                     Dodatak 4.c: Početna koncentracija iznosi 1 mg/l
                     Dodatak 4.d: Početna koncentracija iznosi 5 mg/l
                     Ovisno o broju humano usmrćenih ili uginulih životinja, postupak ispitivanja slijedi naznačene strelice.
                  
                  
                     Dodatak 4.a
                     
                        Akutna inhalacijska toksičnost
                     
                     
                        Postupak ispitivanja s početnom koncentracijom od 0,05 mg/L/4 h za pare
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 4.b
                     
                        Akutna inhalacijska toksičnost
                     
                     
                        Postupak ispitivanja s početnom koncentracijom od 0,5 mg/L/4 h za aerosole
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 4.c
                     
                        Akutna inhalacijska toksičnost
                     
                     
                        Postupak ispitivanja s početnom koncentracijom od 1 mg/L/4 h za aerosole
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 4.d
                     
                        Akutna inhalacijska toksičnost
                     
                     
                        Postupak ispitivanja s početnom koncentracijom od 5 mg/L/4 h za aerosole.
                     
                        
                  ”
            
                  9.
               
               
                  Poglavlje C.10 zamjenjuje se sljedećim:
                  „C.10.   SIMULACIJSKI TEST AEROBNOG PROČIŠĆAVANJA OTPADNIH VODA C.10-A: JEDINICE S AKTIVNIM MULJEM - C.10-B: BIOFILMOVI
                  
                  
                     C.10-A:   Jedinice s aktivnim muljem
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 303 (2001.). Pedesetih godina prošlog stoljeća došlo je do spoznaje da nanovo uvedeni surfaktanti izazivaju prekomjerno pjenjenje u postrojenjima za pročišćavanje otpadnih voda i u rijekama. Oni se tada nisu u cijelosti uklanjali tijekom aerobnog pročišćavanja, a u nekim su slučajevima i ograničavali opadanje ostalih organskih tvari. To je potaklo brojna istraživanja o načinu na koji bi se surfaktanti mogli ukloniti iz otpadnih voda i jesu li nove kemikalije koje se proizvode u industriji prikladne za pročišćavanje otpadnih voda. Da bi se to ostvarilo, koristili su se modeli uređaja koji su predstavljali dvije osnovne vrste aerobnog biološkog pročišćavanja otpadnih voda (aktivni mulj i perkolacijska ili kapajuća filtracija). Bilo bi nepraktično vrlo skupo distribuirati svaku novu kemikaliju i nadzirati postrojenja za pročišćavanje velikih razmjera, čak i na lokalnoj razini.
                           
                        POČETNA RAZMATRANJA
                  
                     Jedinice s aktivnim muljem
                  
                  
                              2.
                           
                           
                              Opisani su modeli jedinica s aktivnim muljem veličine (u rasponu) od 300 ml do oko 2 000 ml. Neki su modeli izvrsno oponašali postrojenja velikih razmjera s taložnicama iz kojih se istaloženi mulj crpi natrag u aeracijski bazen, a drugi su bili opremljeni taložnicama, npr. Swisher (1). Veličina aparature podliježe kompromisu: s jedne strane, ona mora biti dovoljno velika za uspješan mehanički rad i za osiguravanje dovoljne količine uzoraka, a da pritom to ne utječe na rad, a s druge strane, ne bi smjela biti toliko velika da zahtijeva prekomjerni prostor i materijale.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Dvije vrste aparature koje su se dosad naširoko i na zadovoljavajući način primjenjivale su Husmannove jedinice (2) i jedinice s propusnom posudom (3)(4), koje su se prve koristile u studiji surfaktanata i opisuju se u ovoj ispitnoj metodi. Uspješno se primjenjuju i druge jedinice također uspješno primjenjuju, npr. Eckenfelder (5). Zbog relativno visokih troškova i velikih napora pri primjeni ovog simulacijskog testa istodobno su se istraživali jednostavniji i jeftiniji testovi probira, koji su sada sadržani u poglavlju C.4 AF ovog Priloga (6). Iskustvo s brojnim surfaktantima i drugim kemikalijama pokazalo je da su se upravo one kemikalije koje su prošle na testovima probira (lako biorazgradive) razgrađivale i u ovom simulacijskom testu. Neke od kemikalija koje nisu prošle na testovima probira prošle su na testovima inherentne biorazgradivosti (poglavlja C.12 (7) i C.19 (8) ovog Priloga), ali su se samo neke od kemikalija iz potonje skupine razgradile u simulacijskom testu, dok se one kemikalije koje nisu prošle na testovima kojima inherentne biorazgradivosti nisu razgradile u simulacijskim testovima (9)(10)(11).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Za neke su svrhe dostatni simulacijski testovi provedeni u jedinstvenom skupu radnih uvjeta; njihovi se rezultati izražavaju kao postotak opadanja ispitivane kemikalije ili otopljenog organskog ugljika (DOC). U ovoj ispitnoj metodi naveden je i opis takvog testa. Međutim, za razliku od prethodne verzije ovog poglavlja, u kojoj je opisan samo jedan tip aparature kojom se pročišćavaju sintetičke otpadne vode načinom rada ‚s povezanim jedinicama’ relativno grubim metodama izdvajanja mulja, u ovom tekstu nudi se cijeli niz varijacija. Opisuju se alternativne vrste aparature, način rada te uklanjanje iz otpadnih voda i izdvajanje mulja. Ovaj tekst počiva na tekstu norme ISO 11733 (12), koji je temeljito ispitan tijekom svoje pripreme iako sama metoda nije bila podvrgnuta prstenastom testu.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Za druge je svrhe potrebno preciznije odrediti koncentraciju ispitivane kemikalije u otpadnoj vodi pa je za to potrebna opsežnija metoda. Tako se, primjerice, svakog dana i tijekom trajanja testa brzina izdvajanja mulja mora preciznije kontrolirati, a jedinice se moraju ispitati na cijelom nizu brzina izdvajanja. Za potpuno sveobuhvatnu ispitnu metodu testove bi također trebalo provoditi na dvije ili tri različite temperature. Tu je metodu opisao Birch (13)(14), a u sažetom obliku navedena je u Dodatku 6. Međutim, sadašnje znanje nije dovoljno da se donese odluka o tomu koji se kinetički modeli mogu primijeniti na biorazgradnju kemikalija u pročišćavanju otpadnih voda i u vodenom okolišu općenito. Primjena Monodove kinetike, koja je kao primjer navedena u Dodatku 6., ograničena je na kemikalije prisutne u koncentraciji od 1 mg/l i višoj, ali je po mišljenju nekih i to tek potrebno dokazati. Testovi na koncentracijama koje bolje odražavaju one utvrđene u otpadnim vodama navedeni su u Dodatku 7., ali su takvi testovi, kao i oni iz Dodatka 6., uvršteni u dodatke umjesto da se objave kao zasebne ispitne metode.
                           
                        
                     Filtri
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Mnogo je manje pažnje posvećeno modelima perkolacijskih filtara, i to možda zbog toga što su oni složeniji i manje kompaktni od modela postrojenja s aktivnim muljem. Gerike i sur. razvili su jedinice s kapajućim filtrima i radili su s njima u načinu rada ‚s povezanim jedinicama’ (15). Ti su filtri bili relativno veliki (visine 2 m; volumena 60 l) i za svaki je bilo potrebno i do 2 l/h otpadnih voda. Baumann i sur. (16) simulirali su kapajuće filtre umetanjem traka od poliesterskog ‚flisa’ u cjevčice od 1 m (unutarnjeg promjera 14 mm) nakon što bi trake namakali 30 minuta u koncentriranom aktivnom mulju. Ispitivana kemikalija, kao jedini izvor ugljika u otopini mineralnih soli, ulila bi se u okomitu cjevčicu te je procjenjivana njezina biorazgradnja iz mjerenja DOC-a u otpadnoj vodi i CO2 u otpadnom plinu.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Biofiltri se simuliraju na drukčiji način (15); u unutarnju površinu rotirajućh cjevčica, nagnutih pod malim kutom u odnosu na horizontalu, ulijevaju se otpadne vode (oko 250 ml/h) s ispitivanom kemikalijom ili bez nje pa se u skupljenoj izlaznoj vodi analizira količina DOC-a i/ili specifična ispitivana kemikalija.
                           
                        NAČELO ISPITIVANJA
                  
                              8.
                           
                           
                              Ova je metoda namijenjena za određivanje eliminacije primarne i/ili potpune biorazgradnje organskih kemikalija topljivih u vodi pomoću aerobnih mikroorganizama u ispitnom sustavu koji neprekidno radi, simulirajući tako proces koji se odvija u aktivnom mulju. Lako biorazgradivi organski medij i organska ispitivana kemikalija predstavljaju izvore ugljika i energije za te mikroorganizme.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Dvije ispitne jedinice koje neprekidno rade (postrojenja s aktivnim muljem ili propusne posude) pogone se paralelno i u istim uvjetima koji se biraju tako da odgovaraju svrsi testa. Srednje vrijeme hidrauličkog zadržavanja obično iznosi 6 h, a srednja starost mulja (vrijeme zadržavanja mulja) iznosi 6 do 10 dana. Mulj se izdvaja jednom od dviju metoda, ispitivana kemikalija obično se dodaje u koncentraciji otopljenog organskog ugljika (DOC) između 10 mg/l i 20 mg/l ulaznoj vodi (organskom mediju) samo jedne jedinice. Druga se jedinica koristi kao kontrolna jedinica kako bi se odredila biorazgradnja organskog medija.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Iz često uzimanih uzoraka izlazne vode određuju se, po mogućnosti, DOC ili kemijska potrošnja kisika (KPK), zajedno s koncentracijom ispitivane kemikalije (ako je potrebno), i to specifičnom analizom izlazne vode iz jedinice u koju se dodaje ispitivana kemikalija. Pretpostavlja se da je razlika između koncentracije DOC-a i KPK-a u izlaznoj vodi u ispitnoj i kontrolnoj jedinici rezultat ispitivane kemikalije ili njezinih organskih metabolita. Ta se razlika uspoređuje s koncentracijom DOC-a ili KPK-a u ulaznoj vodi koja je rezultat ispitivane kemikalije dodane kako bi se odredila eliminacija ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Biorazgradnja se obično može razlikovati od bioadsorpcije pomnim ispitivanjem krivulje vremena eliminacije i obično se može potvrditi primjenom testa biorazgradnje pomoću aklimatiziranog inokuluma iz jedinice u koju se dodaje ispitivana kemikalija.
                           
                        INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI
                  
                              12.
                           
                           
                              Trebali bi biti poznati čistoća, topljivost u vodi, hlapljivost i adsorpcijska svojstva ispitivane kemikalije kako bi se omogućilo ispravno tumačenje rezultata. Normalno hlapljive i netopljive kemikalije mogu se ispitivati samo ako se poduzmu posebne mjere opreza (vidjeti Dodatak 5.). Također bi trebala biti poznata i kemijska struktura ili barem empirijska formula kako bi se izračunale teorijske vrijednosti i/ili provjerile izmjerene vrijednosti parametara, na primjer teoretska potrošnja kisika (TPK), otopljeni organski ugljik (DOC) i kemijska potrošnja kisika (KPK).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Informacije o toksičnosti ispitivane kemikalije za mikroorganizme (vidjeti Dodatak 4.) mogu biti korisne za odabir odgovarajućih ispitnih koncentracija te mogu biti ključne za ispravno tumačenje niskih vrijednosti biorazgradnje.
                           
                        RAZINE PROLAZNOSTI
                  
                              14.
                           
                           
                              U prvoj primjeni ovog simulacijskog (potvrdnog) testa na primarnu biorazgradnju surfaktanata potrebno je opadanje specifične kemikalije veće od 80 % prije nego što se surfaktant smije staviti na tržište. Ako se ne postigne vrijednost od 80 %, može se primijeniti simulacijski (potvrdni) test, a surfaktant se smije staviti na tržište tek ako specifična kemikalija opadne za više od 90 %. Kod kemikalija općenito nije riječ o pozitivnom ili negativnom rezultatu testa, a dobivena vrijednost postotka opadanja može se upotrijebiti u približnim izračunima vjerojatne koncentracije u okolišu koja će se koristiti u procjeni opasnosti koju te kemikalije predstavljaju. Rezultati obično odgovaraju pravilu ‚sve ili ništa’. U nizu studija o čistim kemikalijama dobiveni su rezultati s postotkom opadanja DOC-a > 90 % za više od tri četvrtine kemikalija te > 80 % za više od 90 % kemikalija koje su pokazale znatniji stupanj biorazgradivosti.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Relativno malen broj kemikalija (npr. surfaktanti) prisutan je u otpadnim vodama u koncentracijama (oko 10 mg C/l) koje se koriste u ovom testu. Neke kemikalije u tim koncentracijama mogu imati inhibitorni učinak, dok se kinetika opadanja nekih drugih kemikalija može razlikovati u niskim koncentracijama. Do preciznije procjene razgradnje može se doći primjenom modificiranih metoda kod kojih se upotrebljavaju realistično niske koncentracije ispitivane kemikalije, a prikupljeni bi se podaci mogli koristiti za izračun kinetičkih konstanti. Međutim, još uvijek nisu potvrđene neophodne pokusne tehnike niti su uspostavljeni kinetički modeli koji opisuju reakcije biorazgradnje (vidjeti Dodatak 7.).
                           
                        REFERENTNE KEMIKALIJE
                  
                              16.
                           
                           
                              Kako bi se osiguralo ispravno provođenje pokusnog postupka, korisno je povremeno, istodobno s istraživanjem ispitivanih kemikalija, ispitati kemikalije za koje je poznato kako se ponašaju. Takve kemikalije obuhvaćaju adipinsku kiselinu, 2-fenil fenol, 1-naftol, difensku kiselinu, 1-naftolnu kiselinu itd. (9)(10)(11).
                           
                        MJERNA OBNOVLJIVOST REZULTATA ISPITIVANJA
                  
                              17.
                           
                           
                              Znatno je manji broj izvješća o studijama simulacijskih testova nego testova lake biorazgradivosti. Mjerna obnovljivost u (istodobnim) višestrukim određivanjima je dobra (unutar 10 - 15 %) za ispitivane kemikalije koje se razgrađuju za 80 % ili više, ali za slabije razgradive kemikalije veća je varijabilnost. Isto tako, kod nekih graničnih kemikalija zabilježeni su znatno različiti rezultati (npr. 10 %, 90 %) u različitim prilikama tijekom 9 tjedana testa.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Male su razlike pronađene u rezultatima dobivenima s dvije vrste aparature, ali su se neke kemikalije razgrađivale bolje i dosljednije u prisustvu komunalnih otpadnih voda nego sintetičkih otpadnih voda prema smjernici OECD-a.
                           
                        OPIS ISPITNE METODE
                  
                     Aparatura
                  
                  
                     Sustav ispitivanja
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Sustav ispitivanja za jednu ispitivanu kemikaliju sastoji se od ispitne jedinice i kontrolne jedinice, ali kada se provode samo specifične analize (primarna biorazgradnja), potrebna je samo ispitna jedinica. Ista se kontrolna jedinica može koristiti za nekoliko ispitnih jedinica u koje se dodaju iste ili različite ispitivane kemikalije. U slučaju načina rada ‚s povezanim jedinicama’ (Dodatak 3.) svaka ispitna jedinica mora imati svoju kontrolnu jedinicu. Sustav ispitivanja može biti model postrojenja s aktivnim muljem, Husmannova jedinica (Dodatak 1., slika 1.) ili propusna posuda (Dodatak 1., slika 2.). U oba su slučaja potrebne posude, dovoljno velike i za ulaznu i za izlaznu vodu, kao i dozirne crpke za ulaznu vodu, pomiješanu s otopinom ispitivane kemikalije ili odvojeno.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Svaka jedinica postrojenja s aktivnim muljem sastoji se od dozračne posude poznatog kapaciteta od 3 oko litre aktivnog mulja i separatora (sekundarni pročišćavač) zapremine od oko 1,5 litre; volumeni se u izvjesnoj mjeri mogu i mijenjati prilagodbom visine separatora. Dopuštena je primjena posuda različite veličine ako one rade pod usporedivim hidrauličkim opterećenjima. Ako nije moguće održavati temperaturu u ispitnoj prostoriji u željenom rasponu, preporučuje se primjena posuda s vodenim omotačem s vodom kontrolirane temperature. ‚Air-lift’ crpka ili dozirna crpka koriste se za recirkulaciju aktivnog mulja iz separatora u dozračnu posudu, neprekidno ili s prekidima u redovnim razmacima.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Sustav s propusnom posudom sastoji se od unutarnjeg, propusnog cilindra sa stožastim dnom koji se nalazi u malo većoj posudi istog oblika, ali sačinjenoj od nepropusnog plastičnog materijala. Prikladan materijal za propusnu posudu je propusni polietilen maksimalne veličine pora 90 μm i debljine 2 mm. Razdvajanje mulja od pročišćavanog organskog medija odvija se diferencijalnim prolaskom kroz propusnu stjenku. Izlazna se voda skuplja u prstenastom prostoru iz kojih se prelijeva u sabirnu posudu. Nema taloženja te stoga nema ni vraćanja mulja. Cijeli se sustav može montirati u vodenoj kupelji kontrolirane temperature. Propusne se posude začepljuju i mogu se prelijevati u početnim etapama. U tom slučaju potrebno je zamijeniti propusno punjenje čistim punjenjem, pri čemu se mulj iz posude kroz sifon propusti u čistu kantu, a začepljeno punjenje izvadi. Nakon što se obriše nepropusni vanjski cilindar, umetne se čisto punjenje i mulj se vrati u posudu. Sav mulj koji se zalijepi na stjenke začepljenog punjenja također se pažljivo sastruže i prenese. Začepljene posude čiste se prvo blagim mlazom vode kako bi se uklonio preostali mulj, potom namakanjem u otopini razrijeđenog natrijeva hipoklorita, potom u vodi i na kraju se temeljito isperu vodom.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Za dozračivanje mulja u dozračnim posudama obiju sustava potrebne su prikladne tehnike, primjerice sinterirani kamen (zračni kamen) i komprimirani zrak. Zrak se pročišćava, po potrebi, propuštanjem kroz odgovarajući filtar i pranjem. Kroz sustav mora proći dostatna količina zraka da bi se zadržali aerobni uvjeti i da se pahulje mulja zadrže u suspenziji cijelo vrijeme trajanja testa.
                           
                        
                     Aparatura za filtraciju ili centrifuga
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Uređaj za filtraciju uzoraka pomoću membranskih filtara prikladne propusnosti (nazivni promjer otvora 0,45 μm) koji adsorbira topljive organske kemikalije i ispušta organski ugljik u minimalnoj količini. Ako se koriste filtri koji ispuštaju organski ugljik, filtri se pažljivo operu vrućom vodom kako bi se uklonio organski ugljik koji curi. Druga je mogućnost primjena centrifuge koja može proizvesti 40 000 m/s2.
                           
                        
                     Analitička oprema
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Aparatura potrebna za određivanje:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          DOC-a (otopljenog organskog ugljika) i TOC-a (ukupnog organskog ugljika) ili KPK-a (kemijske potrošnje kisika),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          specifične kemikalije, ako je potrebno,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          suspendiranih krutih tvari, pH-a, koncentracije kisika u vodi,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          temperature, kiselosti i lužnatosti,
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          amonijaka, nitrita i nitrata ako se test provodi u uvjetima nitrifikacije.
                                       
                                    
                        
                     Voda
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Voda iz slavine koja sadrži manje od 3 mg/l DOC-a. Odredite lužnatost ako već nije poznata.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Deionizirana voda koja sadržava manje od 2 mg/l DOC-a.
                           
                        
                     Organski medij
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Kao organski medij dopuštene su sintetičke otpadne vode, komunalne otpadne vode ili njihova kombinacija. Pokazalo se (11) (14) da uporaba samo komunalnih otpadnih voda često dovodi do povećanog postotka opadanja DOC-a pa čak i da omogućuje opadanje i biorazgradnju nekih kemikalija koje se biološki ne razgrađuju kada se upotrebljavaju sintetičke otpadne vode prema smjernici OECD-a. Isto tako, neprekidno dodavanje ili dodavanje s prekidima komunalnih otpadnih voda često stabilizira aktivni mulj, uključujući i njegovu ključnu sposobnost dobrog taloženja. Dakle, preporučuje se uporaba komunalnih otpadnih voda. Izmjerite koncentraciju DOC-a ili KPK-a u svakoj novoj šarži organskog medija. Trebala bi biti poznate kiselost ili lužnatost organskog medija. Moguće je da će zbog organskog medija biti potrebno dodavanje odgovarajućeg pufera (natrijev hidrogenkarbonat ili kalijev dihidrogen fosfat) ako je niske kiselosti ili lužnatosti kako bi se tijekom testa pH u dozračnoj posudi održao na oko 7,5 ± 0,5. O količini pufera koju treba dodati te o trenutku dodavanja odlučuje se u svakom pojedinom slučaju. Kada se smjese dodaju neprekidno ili s prekidima, DOC (ili KPK) smjese mora se održavati na približno konstantnoj vrijednosti, npr. razrjeđivanjem vodom.
                           
                        
                     Sintetičke otpadne vode
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Po litri vode iz slavine otopi se: pepton, 160 mg; mesni ekstrakt, 110 mg; urea, 30 mg; anhidridni dikalijev hidrogen fosfat (K2HPO4), 28 mg; natrijev klorid (NaCl), 7 mg; kalcijev klorid dihidrat (CaCl2.2H2O), 4 mg; magnezijev sulfat heptahidrat (Mg2SO4.7H20), 2 mg. Te sintetičke otpadne vode OECD-a služe samo kao primjer i daju srednju koncentraciju DOC-a u ulaznoj vodi od oko 100 mg/l. Druga je mogućnost primjena drugih smjesa koje imaju otprilike jednaku koncentraciju DOC-a, a koje su sličnije pravim otpadnim vodama. Ako je potrebna ulazna voda slabije koncentracije, sintetičke otpadne vode se razrijede, primjerice u omjeru 1:1, vodom iz slavine kako bi se dobila koncentracija od oko 50 mg/l. Takva ulazna voda slabije koncentracije omogućit će bolji rast nitrifikacijskih organizama, a ta modifikacija trebala bi se primjenjivati ako se ispituje simulacija postrojenja za nitrifikaciju otpadnih voda. Te se sintetičke otpadne vode mogu napraviti u destiliranoj vodi u koncentriranom obliku i mogu se čuvati na oko 1 °C do tjedan dana. Po potrebi se razrijede vodom iz slavine. (Ovaj medij nije zadovoljavajući, npr. vrlo je visoka koncentracija dušika, relativno je nizak sadržaj ugljika, ali nije predloženo ništa bolje, osim da se doda više fosfata kao pufera i dodatnog peptona).
                           
                        
                     Komunalne otpadne vode
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Koristite svježe istaložene otpadne vode koje se skupljaju svakodnevno iz postrojenja za pročišćavanje u koje se pretežno dovode komunalne otpadne vode. Njih treba prikupiti prije primarnog taloženja iz preljevnog kanala primarnog taložnika ili iz ulijeva postrojenja s aktivnim muljem te u njima uglavnom ne bi smjelo biti grubih čestica. Te se otpadne vode mogu koristiti nekoliko dana nakon skladištenja (općenito ne dulje od sedam dana) na oko 4 °C ako se dokaže da nije došlo do znatnijeg opadanja DOC-a (ili KPK-a) (npr. za manje od 20 %) tijekom skladištenja. Kako bi se ograničile smetnje u sustavu, trebalo bi prije uporabe prilagoditi DOC (ili KPK) svake nove šarže na odgovarajuću konstantnu vrijednost, npr. razrjeđivanjem vodom iz slavine.
                           
                        
                     Aktivni mulj
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Prikupite aktivni mulj za inokulaciju iz aeracijskog bazena ispravnog postrojenja za pročišćavanje otpadnih voda ili iz laboratorijske jedinice s aktivnim muljem, u kojoj se pretežno pročišćavaju komunalne otpadne vode.
                           
                        
                     Radne otopine ispitivane kemikalije
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Za kemikalije odgovarajuće topljivosti pripremite radne otopine prikladnih koncentracija (npr. 1 do 5 g/l) u deioniziranoj vodi ili u mineralnom dijelu sintetičkih otpadnih voda (za netopljive i hlapljive kemikalije vidjeti Dodatak 5.). Odredite DOC i ukupni organski ugljik (TOC) radne otopine pa ponovite mjerenja za svaku novu šaržu. Ako je razlika između DOC-a i TOC-a veća od 20 %, provjerite topljivost u vodi ispitivane kemikalije. Usporedite DOC ili koncentraciju ispitivane kemikalije izmjerene specifičnom analizom radne otopine s nazivnom vrijednošću kako biste utvrdili je li oporavak dovoljno dobar (obično se može očekivati > 90 %). Utvrdite, posebno za disperzije, može li se ili ne DOC koristiti kao analitički parametar ili se može koristiti samo jedna analitička tehnika specifična za ispitivanu kemikaliju. Za disperziju je potrebna centrifuga uzoraka. Za svaku novu šaržu, specifičnom analizom izmjerite DOC, KPK ili ispitivanu kemikaliju.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Odredite pH radne otopine. Ekstremne vrijednosti upućuju na to da dodavanje kemikalije možda utječe na pH aktivnog mulja u sustavu ispitivanja. U tom slučaju malim količinama anorganske kiseline ili lužine neutralizirajte radnu otopinu kako biste dobili pH od 7 ± 0,5, ali izbjegavajte taloženje ispitivane kemikalije.
                           
                        POSTUPAK
                  
                              33.
                           
                           
                              Opisan je postupak za jedinice postrojenja s aktivnim muljem koji treba malo prilagoditi za sustav s propusnom posudom.
                           
                        
                     Priprema inokuluma
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Na početku testa inokulirajte sustav ispitivanja bilo aktivnim muljem bilo inokulumom koji sadrži nisku koncentraciju mikroorganizama. Inokulum do uporabe treba odzračivati na sobnoj temperaturi i upotrijebite ga u roku od 24 h. U prvom slučaju uzmite uzorak aktivnog mulja iz aeracijskog bazena ispravnog postrojenja za pročišćavanje bioloških otpadnih voda ili laboratorijskog postrojenja za pročišćavanje u koje se pretežno dovode komunalne otpadne vode. Ako treba simulirati uvjete nitrifikacije, uzmite mulj iz postrojenja za pročišćavanje nitrificiranih otpadnih voda. Odredite koncentraciju suspendiranih krutih tvari te, ako je to potrebno, koncentrirajte mulj taloženjem tako da se ispitnom sustavu dodaje minimalna količina. Pobrinite se da početna koncentracija suhe tvari iznosi oko 2,5 g/l.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              U drugom slučaju kao inokulum upotrijebite 2 ml/l do 10 ml/l izlazne vode iz postrojenja za pročišćavanje komunalnih bioloških otpadnih voda. Da biste dobili što je moguće veći broj različitih vrsta bakterija, može biti korisno dodati inokulum iz raznih drugih izvora, primjerice iz površinskih voda. U tom će se slučaju aktivni mulj razviti i rasti u sustavu ispitivanja.
                           
                        
                     Doziranje organskog medija
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Pobrinite se da na početku i tijekom testa temeljito očistite spremnike ulazne i izlazne vode te cjevovode iz posude ulazne i posude izlazne vode kako biste uklonili nakupine mikroba. Sastavite sustav ispitivanja u prostoriji u kojoj se kontrolira temperatura (obično u rasponu od 20 – 25 °C) ili koristite ispitne jedinice s vodenim omotačem. Pripremite dovoljnu količinu potrebnog organskog medija (stavci 27. – 29.). Na početku napunite dozračnu posudu organskim medijem pa dodajte inokulum (stavci 34., 35.). Započnite dozračivanje tako da se mulj drži u suspenziji i u aerobnom stanju pa započnite doziranje ulazne vode i recirkulaciju istaloženog mulja. Organski medij dozirajte iz spremnika u dozračne posude (stavci 20., 21.) ispitne i kontrolne jedinice pa u slične spremnike skupite odgovarajuću izlaznu vodu. Kako bi se dobilo normalno vrijeme hidrauličkog zadržavanja od 6 h, organski se medij crpi brzinom od 0,5 l/h. Kako biste potvrdili tu brzinu, izmjerite dnevnu količinu doziranog organskog medija bilježenjem smanjenja volumena medija u spremnicima. Za određivanje učinaka ispuštanja s prekidima i ‚udarnog’ dodavanja kemikalija bit će potrebni drugi načini doziranja.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Ako se organski medij priprema za uporabu tijekom razdoblja duljeg od 1 dana, potrebno je hlađenje na otprilike 4 °C ili neke druge prikladne metode konzerviranja kako bi se spriječio nastanak mikrobnih nakupina i biološka razgradnja izvan ispitnih jedinica (stavak 29.). Ako se koriste sintetičke otpadne vode, moguće je pripremiti i uskladištiti na otprilike 4 °C koncentriranu radnu otopinu (npr. koncentracije deset puta veće od normalne, stavak 28.). Ta se radna otopina prije uporabe može dobro miješati s odgovarajućom količinom vode iz slavine; druga je mogućnost izravno crpiti radnu otopinu dok se odgovarajuća količina vode iz slavine crpi zasebno.
                           
                        
                     Doziranje ispitivane kemikalije
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Dodajte odgovarajuću količinu radne otopine ispitivane kemikalije (stavak 31.) u spremnik ulazne vode ili je dozirajte izravno zasebnom crpkom u dozračnu posudu. Uobičajena srednja ispitna koncentracija ulazne vode trebala bi iznositi između 10 mg/l i 20 mg/l DOC-a, a krajnja gornja koncentracija ne iznosi više od 50 mg/l. Ako je niska topljivost u vodi ispitivane kemikalije ili ako postoji vjerojatnost pojave toksičnih učinaka, snizite koncentraciju DOC-a na 5 mg/l ili čak i manje, ali samo ako je raspoloživa i ako se primjenjuje odgovarajuća specifična analitička metoda (dispergirane ispitivane kemikalije koje se slabo tope u vodi mogu se dodavati posebnim tehnikama doziranja, vidjeti Dodatak 5.).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Započnite s dodavanjem ispitivane kemikalije po isteku razdoblja tijekom kojega se sustav stabilizirao i kada učinkovito uklanja DOC organskog medija (oko 80 %). Vrlo je važno prije dodavanja ispitivane kemikalije provjeriti rade li sve jedinice podjednako učinkovito; ako to nije slučaj, obično pomaže miješanje pojedinih muljeva i dodavanje jednake količine u pojedine jedinice. Kada se koristi inokulum od (otprilike) 2,5 g/l (suhe mase) aktivnog mulja, ispitivana kemikalija može se dodavati od samog početka testa jer je prednost izravnog dodavanja sve većih količina od početka ta da se aktivni mulj može bolje prilagoditi ispitivanoj kemikaliji. Bez obzira na način dodavanja ispitivane kemikalije, preporučuje se da se u redovnim razmacima mjere relevantna brzina protoka i/ili količine u spremniku/spremnicima.
                           
                        
                     Rukovanje aktivnim muljem
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Koncentracija krutih tvari u aktivnom mulju obično se tijekom testa stabilizira unutar granica, neovisno o vrsti upotrijebljenog inokuluma, u rasponu od 1 do 3 g/l (suha masa), ovisno o kakvoći i koncentraciji organskog medija, radnim uvjetima, naravi prisutnih mikroorganizama i utjecaju ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Odredite suspendirane krute tvari u dozračnim posudama najmanje jedanput tjedno i izdvojite višak mulja kako biste koncentraciju održali na 1 g/l do 3 g/l (suhe mase) ili održavajte srednju starost mulja na konstantnoj vrijednosti, obično u rasponu od 6 do 10 dana. Ako se odabere, primjerice, vrijeme zadržavanja mulja od osam dana, svakodnevno uklonite 1/8 količine aktivnog mulja iz dozračne posude i to bacite. Provodite to svakodnevno ili, po mogućnosti, pomoću automatske crpke koja radi s prekidima. Održavanjem koncentracije suspendiranih krutih tvari konstantnom ili unutar uskih granica ne održavate konstantnim vrijeme zadržavanja mulja (SRT), što je radna varijabla koja određuje vrijednost koncentracije ispitivane kemikalije u izlaznoj vodi.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Tijekom cijelog testa najmanje jedanput dnevno uklonite sav mulj koji se prilijepi na stjenke dozračne posude i separatora tako da se ponovno suspendira. Redovito pregledavajte i čistite sve cijevi i cjevovode kako biste spriječili razvoj biofilma. Reciklirajte istaloženi mulj iz separatora u dozračnu posudu, po mogućnosti crpljenjem s prekidima. U sustavu s propusnom posudom nema recikliranja, ali se pobrinite da su čiste unutarnje posude umetnute prije nego što količina u posudi znatno naraste (stavak 21.).
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              U Husmannovim jedinicama postrojenja može doći do slabog taloženja i gubitka mulja. To se može popraviti provođenjem jedne ili većeg broja dolje navedenih mjera, istodobno i u ispitnoj i u kontrolnoj jedinici:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          svježi mulj ili flokulant (primjerice 2 ml/posudi od 50 g/l FeCl3) mogu se dodavati u redovitim razmacima, npr. svakog tjedna, ali osigurajte da ne dođe do reakcije ili precipitacije ispitivane kemikalije i FeCl3;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          ‚air-lift’ crpka može se zamijeniti peristaltičkom crpkom, omogućujući tako protok mulja pri recirkulaciji približno jednak protoku ulazne vode koji se treba koristiti te omogućujući razvoj anaerobne zone u istaloženom mulju (geometrijom ‚air-lift’ crpke minimalna brzina protoka vraćenog mulja ograničena je na otprilike dvanaestorostruku brzinu protoka ulazne vode);
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mulj se može crpiti s prekidima iz separatora u dozračnu posudu (npr. 5 min. svakih 2,5 h za recirkulaciju 1 l/h do 1,5 l/h;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      može se koristiti netoksično sredstvo protiv pjenjenja u minimalnoj koncentraciji kako bi se spriječio gubitak pjenjenjem (npr. silikonsko ulje);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kroz mulj u separatoru može se puštati zrak u kratkim, udarnim mlazovima (npr. 10 s svakih sat vremena);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      organski se medij može dozirati u razmacima u dozračnu posudu (npr. 3 min. do 10 min. svakih sat vremena).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     Uzorkovanje i analiza
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              U redovnim razmacima izmjerite koncentraciju otopljenog kisika, temperaturu i pH aktivnog mulja u dozračnim posudama. Pobrinite se da uvijek ima dovoljno kisika (> 2 mg/l) i da se temperatura održava u traženom rasponu (obično 20 °C do 25 °C). Održavajte pH na 7,5 ± 0,5 doziranjem malih količina anorganske lužine ili kiseline u dozračnu posudu ili u ulaznu vodu ili povećanjem puferskog kapaciteta organskog medija (vidjeti stavak 27.). Kada dođe do nitrifikacije, nastaje kiselina, a oksidacija 1 mg N proizvodi otprilike 7 mg CO3
                                 –-. Učestalost mjerenja ovisi o parametrima koje treba izmjeriti i o stabilnosti sustava, a dnevna i tjedna mjerenja mogu se razlikovati.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Izmjerite DOC ili KPK u ulaznoj vodi koja se ulijeva u kontrolnu i ispitnu posudu. Koncentraciju ispitivane kemikalije u ispitnoj ulaznoj vodi izmjerite specifičnom analizom ili je procijenite na temelju koncentracije u radnoj otopini (stavak 31.), upotrijebljenog volumena i količine otpadnih voda koja se dozira u ispitnu jedinicu. Preporučuje se izračunati koncentraciju ispitivane kemikalije da bi se smanjila varijabilnost podataka o koncentraciji.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Uzmite odgovarajuće uzorke iz skupljene izlazne vode (npr. smjese koje stoje 24 h) i filtrirajte ih kroz membranu veličine pora 0,45 μm ili ih centrifugirajte na oko 40 000 m/s2 otprilike 15 min. Centrifugiranje se koristi ako je teško provesti filtraciju. Odredite DOC ili KPK najmanje dvaput za svaki uzorak kako biste izmjerili potpunu biorazgradnju te, ako je to potrebno, za primarnu biorazgradnju analizom specifičnom za ispitivanu kemikaliju.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Uporaba KPK-a može izazvati analitičke probleme na niskim koncentracijama, stoga se ona preporučuje jedino ako se koristi dovoljno visoka ispitna koncentracija (oko 30 mg/l). Za kemikalije koje dobro adsorbiraju preporučuje se i mjerenje količine adsorbirane kemikalije u mulju pomoću analitičke tehnike specifične za ispitivanu kemikaliju.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Učestalost uzorkovanja ovisi o očekivanom trajanju testa. Preporučuje se učestalost tri puta tjedno. Kada jedinice počnu učinkovito raditi, pričekajte od jednog tjedna do maksimalno šest tjedana nakon dodavanja ispitivane kemikalije za njezinu prilagodbu i postizanje stabilnog stanja. Po mogućnosti odredite najmanje 15 valjanih vrijednosti u stacionarnoj fazi (stavak 59.) koja obično traje tri tjedna, za evaluaciju rezultata ispitivanja. Test se može završiti ako se postigne zadovoljavajući stupanj eliminacije (npr. > 90 %) i ako je dostupno tih 15 vrijednosti koje predstavljaju analize provedene svakog radnog dana tijekom tri tjedna. Obično test ne treba trajati duže od 12 tjedana nakon dodavanja ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Ako se mulj nitrificira i ako treba proučiti utjecaje ispitivane kemikalije na nitrifikaciju, analizirajte prisutnost amonijaka i/ili nitrita plus nitrata u uzorcima izlazne vode iz ispitne i kontrolne jedinice najmanje jedanput tjedno.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Sve analize treba provoditi što je prije moguće, posebno određivanja dušika. Ako se analize moraju odgoditi, uskladištite uzorke na oko 4 °C na tamnom mjestu u do vrha napunjenim i čvrsto zatvorenim bocama. Ako se uzorci moraju skladištiti dulje od 48 h, konzervirajte ih dubokim smrzavanjem, acidifikacijom (npr. 10 ml/l otopine sumporne kiseline od 400 g/l) ili dodavanjem odgovarajuće toksične tvari (npr. 20 ml/l otopine merkurijeva (II) klorida od 10 g/l). Pobrinite se da tehnika konzerviranja ne utječe na rezultate analize.
                           
                        
                     Povezivanje ispitnih jedinica
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Ako treba primijeniti rad s povezanim jedinicama (Dodatak 3.), svakodnevno zamijenite istu količinu aktivnog mulja (150 ml do 1 500 ml za dozračne posude koje sadržavaju tri litre suspenzije) iz dozračnih posuda ispitne jedinice i njezine kontrolne jedinice. Ako se ispitivana kemikalija jako adsorbira na mulj, promijenite samo supernatant u separatoru. U oba slučaja koristite se faktorom korekcije za izračun rezultata ispitivanja (stavak 55.).
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Obrada rezultata
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Izračunajte postotak eliminacije DOC-a ili KPK-a ispitivane kemikalije za svaku vremenski određenu procjenu pomoću sljedeće jednadžbe:
                              
                                 
                              gdje je
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % eliminacija DOC-a ili KPK-a u vremenu t
                                       
                                    
                                          Cs
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          DOC ili KPK u ulaznoj vodi nastao zbog ispitivane kemikalije, procijenjen po mogućnosti iz radne otopine (mg/l)
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          izmjerena vrijednost DOC-a ili KPK-a u ispitnoj izlaznoj vodi u vremenu t (mg/l)
                                       
                                    
                                          Eo
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          izmjerena vrijednost DOC-a ili KPK-a u kontrolnoj izlaznoj vodi u vremenu t (mg/l)
                                       
                                    
                        
                              53.
                           
                           
                              Stupanj eliminacije DOC-a ili KPK-a organskog medija u kontrolnoj jedinici korisna je informacija pri procjeni aktivnosti biorazgradnje aktivnog mulja tijekom testa. Postotak eliminacije izračunajte pomoću jednadžbe:
                              
                                 
                              gdje je
                              
                                          DB
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % eliminacije DOC-a ili KPK-a organskog medija u kontrolnoj jedinici u vremenu t
                                       
                                    
                                          CM
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          DOC ili KPK organskog medija u kontrolnoj ulaznoj vodi (mg/l)
                                       
                                    Prema potrebi izračunajte postotak eliminacije DOC-a ili KPK-a nastale zbog organskog medija plus ispitivane kemikalije u ispitnoj jedinici pomoću jednadžbe:
                              
                                 
                              gdje je
                              
                                          DT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % eliminacije DOC-a ili KPK-a u ukupnoj ispitnoj ulaznoj vodi
                                       
                                    
                                          CT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          DOC ili KPK ukupne ispitne ulazne vode ili izračunato iz radnih otopina (mg/l)
                                       
                                    
                        
                              54.
                           
                           
                              Izračunajte opadanje ispitivane kemikalije ako se to mjerilo specifičnom analitičkom metodom u svakom vremenski određenom određivanju iz jednadžbe:
                              
                                 
                              gdje je
                              
                                          DST
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % primarne eliminacije ispitivane kemikalije u vremenu t
                                       
                                    
                                          Si
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          izmjerena ili procijenjena koncentracija ispitivane kemikalije u ispitnoj ulaznoj vodi (mg/l)
                                       
                                    
                                          Se
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          izmjerena koncentracija ispitivane kemikalije u isptnoj izlaznoj vodi u vremenu t (mg/l)
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              Ako se koristio način rada ‚s povezanim jedinicama’, kompenzirajte otapanje ispitivane kemikalije u dozračnoj posudi zamjenom mulja putem faktora korekcije (vidjeti Dodatak 3.). Ako se koristi srednje vrijeme hidrauličkog zadržavanja od 6 h i zamjena polovine volumena aktivnog mulja u dozračnoj posudi, određene dnevne vrijednosti eliminacije (Dt, stavak 52.) moraju se korigirati kako bi se dobio pravi stupanj eliminacije, Dtc, ispitne kemikalije iz jednadžbe:
                              
                                 
                           
                        
                     Izražavanje rezultata ispitivanja
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Grafički prikažite postotak eliminacije Dt (ili Dtc) i Dst, ako imate te vrijednosti, u ovisnosti o vremenu (vidjeti Dodatak 2.). Iz oblika krivulje eliminacije ispitivane kemikalije (per se ili kao DOC) mogu se izvući određeni zaključci o procesu opadanja.
                           
                        
                     Adsorpcija
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Ako se od početka testa zamijeti velika eliminacija DOC-a ispitivane kemikalije, ispitivana kemikalija se najvjerojatnije eliminira adsorpcijom na krute tvari u aktivnom mulju. To je moguće i dokazati određivanjem adsorbirane ispitivane kemikalije specifičnom analizom. Nije uobičajeno da eliminacija DOC-a kemikalija koje se mogu adsorbirati ostane visoka tijekom cijelog testa; obično je u početku visok stupanj opadanja, ali isti postupno pada do neke uravnotežene vrijednosti. Međutim, ako je ispitivana kemikalija koja se može adsorbirati mogla izazvati aklimatizaciju mikrobne populacije na ovaj ili onaj način, eliminacija DOC-a ispitivane kemikalije naknadno bi porasla i postigla visoku vrijednost platoa (stabilno stanje).
                           
                        
                     Faza prilagodbe
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Kao i u statičkim testovima probira, za brojne je ispitivane kemikalije potrebna faza prilagodbe prije nego što dođe do potpune biorazgradnje. U fazi prilagodbe odvija se aklimatizacija ili prilagodba bakterija koje se razgrađuju, pri čemu ispitivana kemikalija gotovo uopće ne opada, a potom dolazi do početnog rasta tih bakterija. Ta faza završava, a smatra se da faza razgradnje započinje nakon što opadne otprilike 10 % početne količine ispitivane kemikalije (nakon što se odvoji dovoljno vremena za adsorpciju, ako se ona događa). Faza prilagodbe često je krajnje varijabilna i slabo se može mjerno obnoviti.
                           
                        
                     Stacionarna faza
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              Stacionarna faza krivulje eliminacije u neprekidnom testu definira se kao faza u kojoj dolazi do maksimalne razgradnje. Stacionarna faza trebala bi trajati najmanje tri tjedna i imati oko 15 izmjerenih valjanih vrijednosti.
                           
                        
                     Srednji stupanj eliminacije ispitivane kemikalije
                  
                  
                              60.
                           
                           
                              Izračunajte srednju vrijednost iz vrijednosti eliminacije (Dt) ispitivane kemikalije u stacionarnoj fazi. Zaokružite na najbliži cijeli broj (1 %) i dobit ćete stupanj eliminacije ispitivane kemikalije. Također se preporučuje da se izračuna i 95 % intervala pouzdanosti srednje vrijednosti.
                           
                        
                     Eliminacija organskog medija
                  
                  
                              61.
                           
                           
                              Grafički prikažite postotak eliminacije DOC-a ili KPK-a organskog medija u kontrolnoj jedinici (DB) u ovisnosti o vremenu. Označite srednji stupanj eliminacije na isti način kao i za ispitivanu kemikaliju (stavak 60.).
                           
                        
                     Navođenje biorazgradnje
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Ako se ispitivana kemikalija ne adsorbira znatno na aktivni mulj i ako krivulja eliminacije ima tipičan oblik krivulje biorazgradnje s fazama prilagodbe, razgradnje i stacionarnom fazom (stavci 58., 59.), izmjerena eliminacija može se sa sigurnošću pripisati biorazgradnji. Ako dođe do velikog početnog opadanja, simulacijskim testom ne mogu se razlikovati procesi biološke i abiotičke eliminacije. U takvom slučaju, ali i u svim drugim slučajevima u kojima postoji bilo kakva dvojba o biorazgradnji (npr. ako dođe do ljuštenja), analizirajte adsorbiranu ispitivanu kemikaliju ili provedite dodatne testove statičke biorazgradnje na temelju parametara koji jasno označuju biološke procese. Takvi su testovi metode utroška kisika (poglavlje C.4 D, E i F ovog Priloga (6)) ili test mjerenja proizvodnje ugljikova dioksida (poglavlje C.4 C ovog Priloga (6)) ili ISO-ova Headspace metoda (plinski prostor) (18), u kojima se koristi prethodno izloženi inokulum iz simulacijskog testa. Ako se izmjere i opadanje DOC-a i opadanje specifične kemikalije, znatne razlike (pri čemu je prva vrijednost niža od druge) među postocima opadanja naznačuju prisutnost u izlaznoj vodi intermedijarnih organskih proizvoda koji se možda teže razgrađuju od polazne kemikalije.
                           
                        
                     Valjanost rezultata ispitivanja
                  
                  
                              63.
                           
                           
                              Podaci o ponašanju inokuluma pri normalnoj biorazgradnji dobivaju se ako se odredi stupanj eliminacije organskog medija (stavak 53.) u kontrolnoj jedinici. Test se može smatrati valjanim ako je stupanj eliminacije DOC-a ili KPK-a u kontrolnoj jedinici/jedinicama > 80 % nakon dva tjedna i nema neuobičajenih primjedbi.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Ako se upotrebljavala lako biorazgradiva (referentna) kemikalija, stupanj biorazgradnje (Dt, stavak 52.) trebao bi biti > 90 %.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Ako se test provodi u uvjetima nitrifikacije, srednja koncentracija u izlaznoj vodi trebala bi biti < 1 mg/l amonija-N i < 2 mg/l nitrita-N.
                           
                        
                              66.
                           
                           
                              Ako nisu ispunjeni ti kriteriji (stavci 63. – 65.), ponovite test korištenjem inokuluma iz nekog drugog izvora, ispitajte referentnu kemikaliju i revidirajte sve pokusne postupke.
                           
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              Izvješće o ispitivanju mora obuhvaćati sljedeće:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana kemikalija:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci za identifikaciju;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizikalno stanje i, prema potrebi, fizikalno-kemijska svojstva.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vrsta sustava za ispitivanje; sve modifikacije za ispitivanje netopljivih i hlapljivih kemikalija,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vrsta organskog medija,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      udio i narav industrijskih otpadnih voda u otpadnim vodama, ako je poznato,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inokulum, stanje i mjesto/mjesta uzorkovanja, koncentracija i svaka prethodna obrada,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      radna otopina ispitivane kemikalije: sadržaj DOC-a i TOC-a; kako je pripremljena, ako je riječ o suspenziji; upotrijebljena ispitna koncentracija; obrazloženje ako je vanjski raspon 10-20 mg/l DOC-a; metoda dodavanja; datum prvog dodavanja, sve promjene,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      srednja starost mulja i srednje vrijeme hidrauličkog zadržavanja; metoda izdvajanja mulja; metode savladavanja bubrenja, gubitka mulja itd.,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      primijenjene analitičke tehnike,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ispitna temperatura;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kakvoća bubrenja mulja, indeks volumena mulja (SVI), suspendirane tvari iz miješane suspenzije (MLSS);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sve devijacije od standardnih postupaka i sve okolnosti koje su možda utjecale na rezultate.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati ispitivanja:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      svi izmjereni podaci (DOC, KPK, specifične analize, pH, temperatura, koncentracija kisika, suspendirane krute tvari, dušikovi spojevi, ako je relevantno,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sve izračunate vrijednosti Dt (ili Dtc), DB, DSt dobivene u tabličnom obliku i krivuljama eliminacije.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci o fazi prilagodbe i stacionarnoj fazi, trajanju testa, stupnju eliminacije ispitivane kemikalije i organskog medija u kontrolnoj jedinici, zajedno sa statističkim podacima i izjavama o biorazgradivosti i valjanosti testa;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rasprava o rezultatima.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Swisher RD (1987). „Surfactant Biodegradation”, 2nd Edn. Marcel Dekker Inc. New York, str. 1085.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698-706.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing biodegradability. Technical Report No. 70, Water Research Centre, Medmenham, UK.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909-915.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Eckenfelder, W.W (19) US EPA.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Poglavlje C.4 ovog Priloga, Određivanje ‚lake’ biorazgradivosti.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Poglavlje C.12 ovog Priloga, Biorazgradivost - izmijenjeni test SCAS.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Poglavlje C.19 ovog Priloga, Procjena koeficijenta adsorpcije (K
                                    OC
                                 ) na tlu i na mulju iz otpadnih voda pomoću visoko djelotvorne tekućinske kromatografije (HPLC).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157-173.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. str. 113-138, In: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              ISO 11733 (1995; revidirano 2004). Evaluation of the elimination and biodegradability of organic substances in an aqueous medium - activated sludge simulation test.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33-48.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340-343.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753-758.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials. str. 91-98 ISBN 011 751661 9.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              ISO 14593 (1998). Water Quality - Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels.
                           
                        
                     Dodatak 1.
                     
                        Slika 1.
                     
                     
                        Oprema koja se koristi za procjenu biorazgradivosti
                     
                     Husmannova jedinica
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 Spremnik
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 Dozirna crpka
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 Dozračna komora (zapremine 3 l)
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 Taložnik
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 ‚Air-lift’ crpka
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 Sabirna posuda
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 Dozračnik
                              
                           
                                 H.
                              
                              
                                 Mjerač protoka zraka
                              
                           
                        Slika 2.
                     
                     
                        Oprema koja se koristi za procjenu biorazgradivosti
                     
                     Propusna posuda
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 Spremnik
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 Dozirna crpka
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 Propusna dozračna posuda
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 Vanjska nepropusna posuda
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 Sabirna posuda
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 Difuzor
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 Mjerač protoka zraka
                              
                           
                        Slika 3.
                     
                     
                        Podaci o dozračnoj posudi propusne posude od 3 litre
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 2.
                     
                        Primjer krivulje eliminacije
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 3.
                     [INFORMATIVNO]
                     POVEZIVANJE ISPITNIH JEDINICA
                     Da bi se pokušalo ujednačiti mikrobnu populaciju u muljevima u ispitnoj jedinici, u koju se dodaju otpadne vode plus ispitivana kemikalija, te u kontrolnoj jedinici u koju se dodaju samo otpadne vode, uvedena je svakodnevna izmjena mulja (1). Taj se postupak naziva povezivanje, a metoda je poznata kao ‚povezane jedinice’. Povezivanje se na početku provodilo pomoću Husmannovih jedinica s aktivnim muljem, ali se provodilo i s jedinicama s propusnom posudom (2)(3). Između nepovezanih i povezanih jedinica, bilo Husmannovih jedinica bilo propusnih posuda, nisu pronađene nikakve značajnije razlike tako da utrošak vremena i energije potreban pri povezivanju jedinica ovdje nema nikakvu prednost.
                     Može se činiti da se izmjenom mulja postiže znatno opadanje jer se sve više izjednačuju neke od ispitivanih kemikalija u transferiranju i koncentracijama ispitivane kemikalije u ispitnoj i kontrolnoj izlaznoj vodi. Dakle, moraju se primijeniti faktori korekcije, koji ovise o izmijenjenom dijelu i srednjem vremenu hidrauličkog zadržavanja. O tom je izračunu objavljeno više pojedinosti (1).
                     Izračunajte korigirani stupanj eliminacije DOC-a ili KPK-a pomoću opće formule:
                     
                        
                     gdje je
                     
                                 Dtc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 korigirani % eliminacije DOC-a ili KPK-a
                              
                           
                                 Dt
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 određeni % eliminacije DOC-a ili KPK-a
                              
                           
                                 a
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 dio zamijenjenog volumena jedinica s aktivnim muljem
                              
                           
                                 r
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 srednje vrijeme hidrauličkog zadržavanja (h)
                              
                           Ako se, primjerice, zamijeni pola volumena aeracijskog bazena (a = 0,5), a srednje vrijeme hidrauličkog zadržavanja 6h, korekcijska formula glasi:
                     
                        
                     
                        LITERATURA
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test. str. 113-138. In: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
                              
                           
                  
                     Dodatak 4.
                     VREDNOVANJE INHIBICIJE AKTIVNOG MULJA
                     
                        Proces pomoću ispitivanih kemikalija
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Kemikalija (ili otpadne vode) ne mogu se razgraditi ni opasti u simulacijskom testu, a mogu imati čak i inhibitorni učinak na mikroorganizme u aktivnom mulju. Ostale se kemikalije biorazgrađuju na niskim koncentracijama, ali u višim koncentracijama (hormeza) imaju inhibitorni učinak. Inhibitorni se učinci mogu otkriti i u ranijoj fazi ili se mogu odrediti testom toksičnosti pomoću inokuluma sličnog onomu koji se koristio u simulacijskom testu (1). Te su metode inhibicija potrošnje kisika (poglavlje C.11 ovog Priloga (2) i ISO 8192(3)) ili inhibicija rasta organizama u aktivnom mulju (ISO 15522 (4)).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 U simulacijskom će se testu sve inhibicije očitovati u različitom sadržaju otopljenog organskog ugljika (DOC) ili kemijske potrošnje kisika (KPK) u izlaznoj vodi iz ispitne posude i izlaznoj vodi iz kontrolne posude, koji je veći od DOC-a dodanog u vidu ispitivane kemikalije. Drugim riječima, postotak opadanja DOC-a (i biokemijske potrošnje kisika BPK, kemijske potrošnje kisika KPK, i/ili NH+
                                    4) organskog medija bit će smanjen tijekom pročišćavanja prisustvom ispitivane kemikalije. Ako se to dogodi, test treba ponoviti sa smanjenom koncentracijom ispitivane kemikalije sve dok se ne postigne razina na kojoj ne dolazi do inhibicije te možda i daljnjim smanjivanjem koncentracije sve dok se ispitivana kemikalija ne razgradi. Međutim, ako ispitivana kemikalija (ili otpadna voda) imaju štetan učinak na proces bez obzira na sve ispitne koncentracije, to je znak da je tu kemikaliju teško, ako ne i nemoguće, biološki pročistiti, već možda ima više smisla ponoviti test aktivnim muljem iz nekog drugog izvora i/ili podvrgnuti mulj postupnijoj aklimatizaciji.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 I obratno: ako se ispitivana kemikalija eliminira biološkim pročišćavanjem u prvom simulacijskom testu, trebalo bi povisivati njezinu koncentraciju ako se mora saznati ima li ta kemikalija inhibitorni učinak.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 U nastojanjima određivanja stupnjeva inhibicije treba imati na umu da se populacija u aktivnom mulju može promijeniti tako da s vremenom mikroorganizmi mogu razviti toleranciju na inhibitornu kemikaliju.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Izračun stupnja inhibicije:
                                 Ukupni postotak opadanja Ro BPK-a, DOC-a, KPK-a itd. za ispitnu i kontrolnu jedinicu može se izračunati iz:
                                 
                                    
                                 gdje je:
                                 
                                             I
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentracija u ulaznoj vodi BPK-a, DOC-a, KPK-a itd. za ispitnu ili kontrolnu posudu (mg/l)
                                          
                                       
                                             E
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             odgovarajuće koncentracije u izlaznoj vodi (mg/l).
                                          
                                       I i E moraju se korigirati po pitanju DOC-a nastalog zbog ispitivane kemikalije u ispitnim jedinicama, u protivnom će izračuni postotka inhibicije biti netočni.
                                 Stupanj inhibicije koji izaziva prisustvo ispitivane kemikalije može se izračunati iz:
                                 
                                    
                                 gdje je:
                                 
                                             Rc
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             postotak opadanja u kontrolnim posudama
                                          
                                       
                                             Rt
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             postotak opadanja u ispitnim posudama
                                          
                                       
                           
                        LITERATURA
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Reynolds L et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Poglavlje C.12 ovog Priloga, Biorazgradivost - test inhibicije disanja aktivnog mulja.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 ISO 8192 (2007) Water quality - Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 ISO 15522 (1999) Water Quality - Determination of the inhibitory effect of water constituents on activated sludge microorganisms.
                              
                           
                  
                     Dodatak 5.
                     
                        Ispitivane kemikalije slabo topljive u vodi - hlapljive kemikalije
                     
                     
                        Kemikalije slabo topljive u vodi
                     
                     Objavljeno je vrlo malo izvješća o podvrgavanju kemikalija slabo topljivih u vodi i netopljivih kemikalija testovima koji simuliraju pročišćavanje otpadnih voda (1)(2)(3).
                     Nema jedinstvene metode dispergiranja ispitivane kemikalije koja bi se mogla primijeniti na sve netopljive kemikalije. Čini se da bi dvije od četiri metode opisane u normi ISO 10634 (4) bile prikladne za pokušaj dispergiranja ispitivanih kemikalija za simulacijske testove, a to su uporaba emulgatora i/ili ultrazvučne energije. Treba utvrditi stabilnost tako nastale disperzije u razdoblju od najmanje 24 h. Prikladno stabilizirane disperzije, sadržane u spremniku u kojemu se neprekidno miješaju (stavak 38.), potom se doziraju u aeracijski bazen, a zasebno se dodaju komunalne (ili sintetičke) otpadne vode.
                     Ako su disperzije stabilne, ispitajte na koji se način može odrediti ispitivana kemikalija u raspršenom obliku. DOC vjerojatno neće biti prikladan pa bi trebalo pronaći specifičnu analitičku metodu za ispitivanu kemikaliju koja bi se mogla primijeniti na otpadne vode, krute tvari iz otpadnih voda i aktivni mulj. Potom se određuje sudbina ispitivane kemikalije u simulaciji procesa aktivnog mulja, i to u tekućem i krutom stanju. Potom se utvrđuje ‚bilanca mase’ kako bi se odlučilo je li došlo do biorazgradnje ispitivane kemikalije. Međutim, time bi se navela samo primarna biorazgradnja. Trebalo bi pokušati pokazati i potpunu biorazgradnju primjenom respirometrijskog testa lake biorazgradivosti (poglavlje C.4 ovog Priloga (5) C, F ili D) koristeći kao inokulum mulj izložen ispitivanoj kemikaliji u simulacijskom testu.
                     
                        Hlapljive kemikalije
                     
                     Primjena simulacija pročišćavanja otpadnih voda na hlapljive kemikalije podložna je raspravi i problematična. Kao i sa kemikalijama slabo topljivima u vodi, objavljeno je vrlo malo izvješća u kojima se opisuju simulacijski testovi u kojima se koriste hlapljive kemikalije. Konvencionalni tip aparature za potpuno miješanje prilagođava se zatvaranjem aeracijskog bazena i taložnika, mjerenjem i kontroliranjem protoka zraka pomoću mjerača protoka i propuštanjem izlaznog plina kroz odvajače kako bi se skupila hlapljiva organska tvar. U nekim se slučajevima koristi i vakuumska crpka za crpljenje izlaznog plina kroz ‚hladni’ odvajač ili odvajač ispiranjem koji sadržava Tenax i silikonski gel za analize plinskom kromatografijom. Ispitivana kemikalija prisutna u odvajaču može se analitički odrediti.
                     Test se provodi u dva dijela. Jedinice se prvo pogone bez mulja, ali se sintetičke otpadne vode plus ispitivana kemikalija crpe u aeracijski bazen. Nekoliko se dana skupljaju ulazna i izlazna voda i izlazni plin i analiziraju se na ispitivanu kemikaliju. Iz prikupljenih podataka može se izračunati postotak (Rvs) kemikalije oguljene iz sustava.
                     Potom se provodi uobičajeni biološki test (s muljem) čiji su radni uvjeti identični onima u studiji ljuštenjem. Mjere se i DOC i KPK da bi se provjerilo rade li jedinice ispravno. U prvom se dijelu testa provode i povremene analize da bi se odredila ispitivana kemikalija u ulaznoj vodi, izlaznoj vodi i izlaznom plinu, a nakon aklimatizacije provode se češće analize. I opet se iz podataka u stabilnom stanju može izračunati postotak opadanja ispitivane kemikalije iz tekućeg stanja svim procesima (RT) (fizikalnim i biološkim), kao i udio (RV) oguljen iz sustava.
                     Izračun:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 U nebiološkom testu može se izračunati postotak ((RVP) ispitivane tvari oguljene iz sustava iz:
                                 gdje je
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             opadanje ispitivane kemikalije hlapljenjem (%),
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             ispitivana kemikalija skupljena u odvajaču izražena kao ekvivalentna koncentracija u tekućem stanju (mg/l),
                                          
                                       
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentracija ispitivane kemikalije u ulaznoj vodi (mg/l).
                                          
                                       
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 U biološkom testu može se izračunati postotak (RV) ispitivane tvari oguljene iz sustava iz:
                                 gdje je
                                 
                                             RV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             opadanje ispitivane kemikalije hlapljenjem u biološkom testu (%),
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             ispitivana kemikalija skupljena u odvajaču u biološkom testu izražena kao ekvivalentna koncentracija u tekućoj ulaznoj vodi (mg/l),
                                          
                                       
                                             SI
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentracija ispitivane kemikalije u ulaznoj vodi (mg/l).
                                          
                                       
                           
                                 (c)
                              
                              
                                 U biološkom testu dan je postotak (RT) ispitivane kemikalije koja opada u svim procesima:
                                 gdje je
                                 SE= koncentracija ispitivane kemikalije u (tekućoj) izlaznoj vodi (mg/l).
                              
                           
                                 (d)
                              
                              
                                 Tako se postotak (RBA) koji je opao u biorazgradnji plus adsorpciji može izračunati iz:
                                 Trebalo bi provesti zasebne testove da se odredi adsorbira li se ispitivana kemikalija; ako je to slučaj, može se provesti daljnja korekcija.
                              
                           
                                 (e)
                              
                              
                                 Usporedba omjera ispitivane kemikalije oljuštene u sustavima biološkog (Rv) i nebiološkog testa (Rvp) navodi opći učinak koji je biološko pročišćavanje imalo na emisiju ispitivane kemikalije u atmosferu.
                                 
                                             
                                                Primjer:
                                             
                                          
                                          
                                             Benzen
                                          
                                       Vrijeme zadržavanja mulja = 4 dana
                                 Sintetičke otpadne vode; vrijeme zadržavanja = 8 h
                                 
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             SI = 150 mg/l
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             150 mg/l (SEP = 0)
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             22,5 mg/l
                                          
                                       
                                             SE
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             50 μg/l
                                          
                                       Tako je
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 %, RV = 15 %
                                          
                                       
                                             RT
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 % i RBA = 85 %.
                                          
                                       Pretpostavlja se da se benzen ne adsorbira na mulj.
                              
                           
                        LITERATURA
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 ISO 10634 (1995) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Poglavlje C.4 ovog Priloga, Određivanje ‚Lake’ Biorazgradivosti.
                              
                           
                  
                     Dodatak 6.
                     
                        Učinci vremena zadržavanja mulja (SRT) na pročistivost kemikalija
                     
                     UVOD
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Metoda opisana u glavnom dijelu teksta namijenjena je da se odredi može li se ispitivana kemikalija (obično ona kojoj je svojstvena biorazgradivost, ali koja se ne biorazgrađuje lako) biorazgraditi unutar ograničenja nametnutih u postrojenjima za pročišćavanje otpadnih voda. Rezultati se izražavaju u kategorijama postotka opadanja i postotka biorazgradnje. Uvjeti rada jedinica s aktivnim muljem i odabir ulazne vode omogućuju prilično velike varijacije u koncentraciji ispitivane kemikalije u izlaznoj vodi. Testovi se provode samo na jednoj nazivnoj koncentraciji krutih tvari u mulju ili jednom nazivnom vremenu zadržavanja mulja (SRT), a opisani režimi izdvajanja mulja mogu izazvati velike varijacije vrijednosti SRT-a tijekom testa, kako u različitim danima tako i tijekom istog dana.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 U ovoj se varijanti (1)(2) SRT kontrolira unutar znatno užih ograničenja tijekom razdoblja od 24h (baš kao i u postrojenju velikih razmjera), što rezultira konstantnijom koncentracijom u izlaznoj vodi. Preporučuju se komunalne otpadne vode jer one pokazuju dosljedniji i viši postotak opadanja. Isto tako, ispituju se učinci cijelog niza vrijednosti SRT-a, a u još detaljnijoj studiji mogu se odrediti i učinci raspona temperatura na koncentraciju u izlaznoj vodi.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Međutim, još uvijek nije postignut opći dogovor o tome koji kinetički modeli funkcioniraju kada se kemikalije biorazgrađuju u uvjetima postrojenja za pročišćavanje otpadnih voda. Odabrali smo na prikupljene podatke primijeniti Monodov model rasta bakterija i primjene supstrata (1)(2) jer se namjeravalo tu metodu primijeniti samo na kemikalije koje se proizvode u velikim količinama, što rezultira koncentracijama u otpadnim vodama iznad 1 mg/l. Valjanost ovog pojednostavljenog modela i pretpostavke od kojih se krenulo uveli su se pomoću niza alkoholnih etoksilata s različitim stupnjevima primarne biorazgradivosti (2)(3).
                                 
                                             
                                                Napomena.
                                             
                                          
                                          
                                             Ova varijanta metode počiva dobrano na tekstu ispitne metode C.10-A, a u nastavku teksta navedeno je samo ono u čemu se te metode razlikuju.
                                          
                                       
                           NAČELO ISPITIVANJA
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Jedinice s propusnom posudom za aktivni mulj, namijenjene za olakšavanje (gotovo) neprekidnog izdvajanja miješane suspenzije što omogućuje vrlo preciznu kontrolu vremena zadržavanja mulja (SRT ili θs), pogone se u načinu rada ‚s nepovezanim jedinicama’ tijekom nekoliko SRT-a te, proizvoljno, još i na nizu različitih temperatura. Vrijeme zadržavanja obično iznosi 2 do 10 dana, a temperatura između 5 i 20 °C. Otpadne vode, po mogućnosti komunalne, i otopina ispitivane kemikalije doziraju se zasebno u jedinice onom brzinom koja daje potrebno vrijeme zadržavanja otpadnih voda (3 do 6 sati) i potrebnu koncentraciju ispitivane kemikalije u ulaznoj vodi. Kontrolne jedinice u koje se ne dodaje ispitivana kemikalija pogone se paralelno u poredbene svrhe.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Mogu se koristiti i druge vrste aparature, ali treba se vladati s krajnjom pažnjom kako bi se osiguralo postizanje dobre kontrole SRT-a. Primjerice, kada se koristi postrojenjima, koja sadrže i taložnik, možda će biti potrebno predvidjeti gubitak krutih tvari putem izlazne vode iz postrojenja. Nadalje, moraju se također poduzeti i posebne mjere opreza kako bi se izbjegle greške zbog varijacije količine mulja u taložniku.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Jedinice se pogone u svakom odabranom nizu uvjeta, a kada se postigne ravnoteža, tijekom razdoblja od otprilike tri tjedna dobivaju se prosječne koncentracije ispitivane kemikalije i, po odabiru, DOC-a u stabilnom stanju u izlaznoj vodi. Osim što se određuje postotak opadanja ispitivane kemikalije i, fakultativno, DOC-a, u grafičkom se obliku izražava i odnos između uvjeta rada postrojenja i koncentracije u izlaznoj vodi. Iz tih provizornih podataka mogu se izračunati kinetičke konstante, a mogu se predvidjeti i uvjeti u kojima se ispitivana kemikalija može obrađivati.
                              
                           INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 12. i 13.
                              
                           RAZINE PROLAZNOSTI
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 14. i 15.
                              
                           REFERENTNA ISPITIVANA KEMIKALIJA
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 16.
                              
                           MJERNA OBNOVLJIVOST REZULTATA ISPITIVANJA
                     
                                 10.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 17. i 18.
                              
                           OPIS METODE
                     
                        Aparatura
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Prikladna jedinica je modificirani sustav s propusnom posudom (Dodatak 6.1.). Sastoji se od unutarnje posude (ili punjenja) sačinjene od propusnog polietilena debljine 3,2 mm i veličine pora od približno 90 μm, s tupo zavarenim zglobom. (Zbog toga je ova jedinica čvršća od one opisane u stavku 21. ovog poglavlja, C.10 A). Punjenje se umetne u vanjsku posudu od nepropusnog polietilena, koja se sastoji od dvaju dijelova: kružnog dna u kojem se probuše provrti za dva zračna voda i jedan vod za izdvajanje mulja i gornjeg cilindra koji se vijcima pričvrsti za dno i čiji je ispust postavljen tako da daje poznati volumen (3 l) u posudu s propusnom posudom. Jedan zračni vod opremljen je difuzor-kamenom, a drugi je vod sa slobodnim krajem postavljen pod pravim kutom u odnosu na kamen u posudi. Taj sustav stvara turbulenciju potrebnu da se osigura potpuno miješanje sadržaja u posudi, te daje koncentracije otopljenog kisika veće od 2 mg/l.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Odgovarajući broj jedinica održava se na kontroliranim temperaturama u rasponu od 5 do 20 °C (± 1 °C), bilo u vodenoj kupelji bilo u prostorijama s konstantnom temperaturom. Potrebne su i crpke za doziranje u dozračne posude otopine ispitivane kemikalije i istaloženh otpadnih voda traženom brzinom (0-1,0 ml/min i 0-25 ml/min) te treća crpka za odvod otpadnog mulja iz dozračnih posuda. Potrebna, vrlo niska brzina protoka otpadnog mulja postiže se primjenom crpke podešene na veću brzinu i radom s prekidima primjenom brojčanika, npr. rad od 10 sekundi u minuti, brzina crpljenja od 3 ml/min, čime se postiže brzina izdvajanja od 0,5 ml/min.
                              
                           
                        Aparatura za filtraciju ili centrifuga
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 23.
                              
                           
                        Analitička oprema
                     
                     
                                 14.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 24.
                              
                           
                        Voda
                     
                     
                                 15.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 25. i 26.
                              
                           
                        Organski medij
                     
                     
                                 16.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 27.
                              
                           
                        Sintetičke otpadne vode
                     
                     
                                 17.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 28.
                              
                           
                        Komunalne otpadne vode
                     
                     
                                 18.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 29.
                              
                           
                        Aktivni mulj
                     
                     
                                 19.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavak 30.
                              
                           
                        Radne otopine ispitivane kemikalije
                     
                     
                                 20.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 31. i 32.
                              
                           POSTUPAK
                     
                        Priprema inokuluma
                     
                     
                                 21.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, samo stavak 34. - koristite aktivni mulj (oko 2,5 g/l).
                              
                           
                        Broj ispitnih jedinica
                     
                     
                                 22.
                              
                              
                                 Za jednostavan test, tj. za mjerenje postotka opadanja, potreban je samo jedan SRT, ali za dobivanje podataka neophodnih za izračun provizornih kinetičkih konstanti potrebno je 4-5 vrijednosti SRT-a. Obično se biraju vrijednosti između dva i deset dana. Praktično je zgodno provoditi test istodobno na 4 ili 5 SRT-a i pri istoj temperaturi; u proširenim se studijama koriste iste vrijednosti SRT-a, ili možda različit raspon vrijednosti, pri drugim temperaturama unutar raspona od 5 do 20 °C. Za primarnu biorazgradnju (osnovna uporaba) obično je potrebna samo jedna jedinica za svaki skup uvjeta. Međutim, za potpunu biorazgradivost potrebna je i kontrolna jedinica za svaki skup uvjeta, u koju se dodaju otpadne vode, ali ne i ispitivana kemikalija. Ako se sumnja da je u otpadnim vodama prisutna ispitivana kemikalija, bit će potrebno primijeniti i kontrolnu jedinicu prilikom procjene primarne biorazgradnje te poduzeti sve neophodne korekcije u izračunima.
                              
                           
                        Doza organskog medija i ispitivane kemikalije
                     
                     
                                 23.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 36. do 39., ali imajte na umu da se otopina ispitivane kemikalije dozira zasebno i da se koriste različite brzine izdvajanja mulja. Isto tako, često pratite i, po potrebi, prilagodite unutar ± 10 % brzine protoka ulazne vode, izlazne vode i izdvajanja mulja, npr. dvaput dnevno. Ako se u analitičkim metodama kada se koriste komunalne otpadne vode suočite s poteškoćama, provedite test sa sintetičkim otpadnim vodama, ali potrebno je osigurati da različiti mediji daju usporedive kinetičke podatke.
                              
                           
                        Rukovanje jedinicama s aktivnim muljem
                     
                     
                                 24.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 40. do 43., ali SRT kontrolirajte samo ‚konstantnim’ izdvajanjem mulja.
                              
                           
                        Uzorkovanje i analiza
                     
                     
                                 25.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 44. do 50., osim što se treba odrediti koncentracija ispitivane kemikalije, a fakultativno se može odrediti i DOC; ne smije se upotrebljavati KPK.
                              
                           PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                     
                        Obrada rezultata
                     
                     
                                 26.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 52. do 54.
                              
                           
                        Izražavanje rezultata ispitivanja
                     
                     
                                 27.
                              
                              
                                 Primjenjuje se poglavlje C.10 A, stavci 56. do 62.
                              
                           
                        Izračun kinetičkih konstanti
                     
                     
                                 28.
                              
                              
                                 Realističnije je navesti srednju koncentraciju ispitivane kemikalije u stabilnom stanju u izlaznoj vodi i opisati na koji način ona varira s radnim uvjetima postrojenja nego navesti postotak primarne biorazradnje. To se može postići razmatranjem jednadžbe (6) u Dodatku 6.2., koja može dati vrijednosti za KS, μm i θSC, kritično vrijeme zadržavanja mulja.
                                 (Kao druga mogućnost, mogu se dobiti približne vrijednosti KS i μm pomoću jednostavnog računalnog programa kojim bi teoretska krivulja izračunata iz jednadžbe 2 (Dodatak 6.2.) odgovarala dobivenim pokusnim vrijednostima. Premda nijedna otopina nije jedinstvena, može se dobiti razumna približna vrijednost KS i μm.)
                              
                           
                        Varijabilnost rezultata
                     
                     
                                 29.
                              
                              
                                 Opće je iskustvo da se za pojedine kemikalije dobivaju varijabilne vrijednosti kinetičkih parametara. Smatra se da uvjeti u kojima je mulj rastao, kao i uvjeti koji pretežu u korištenom testu (kao što je u stavku 5. i u drugim testovima), značajno utječu na rezultirajuće vrijednosti. O jednom aspektu te varijabilnosti raspravljali su Grady i sur. (4), koji su predložili da se nazivi ‚postojeći’ i ‚intrinzičan’ primijene na dva skupa ekstremnih uvjeta koji predstavljaju granice fiziološkog stanja koje neka kultura može postići u kinetičkom pokusu. Ako nije dopušteno da se tijekom testa promijeni to stanje, vrijednosti kinetičkih parametara odražavaju uvjete u okolini iz koje su uzeti mikroorganizmi; te se vrijednosti nazivaju ‚postojeće’. Na drugom ekstremnom kraju, ako su uvjeti u testu takvi da dopuštaju potpuno razvijanje sustava sinteze bjelančevina, što omogućuje maksimalnu moguću brzinu rasta, za dobivene kinetičke parametre kaže se da su ‚intrinzični’ te da ovise samo o naravi supstrata i vrstama bakterija u toj kulturi. Rukovoditi se treba time da se postojeće vrijednosti dobivaju održavanjem niskim omjera koncentracije i supstrata prema kompetentnim mikroorganizmima (So/Xo), npr. 0,025, a intrinzične vrijednosti pojavljuju se kad je taj omjer visok, npr. najmanje 20. U oba bi slučaja So trebalo biti jednako ili veće od relevantne vrijednosti Ks, konstante poluzasićenosti.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 O varijabilnost i ostalim aspektima kinetike biorazgradnje raspravljalo se na nedavnoj radionici SETAC-a (5). Iz takvih studija, o kojima postoje izvješća i o kojima su se provodili projekti, trebao bi proizići jasniji pogled na kinetiku u postrojenjima za pročišćavanje otpadnih voda kako bi se omogućilo bolje tumačenje postojećih podataka, kao i da bi se predložili relevantniji planovi za buduće ispitne metode.
                              
                           
                        LITERATURA:
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33-48.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340-343.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742-748.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
                              
                           
                  
                     Dodatak 6.1.
                     
                        Propusna posuda s kontrolom SRT-a
                     
                     
                        
                  
                  
                     Dodatak 6.2.
                     
                        Izračun kinetičkih konstanti
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Pod pretpostavkom da se primjenjuje Monodova kinetika te uzimajući u obzir bilancu mase aktivnih krutih tvari i supstrata u cijelom sustavu s aktivnim muljem (1), mogu se dobiti sljedeći izrazi:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [1]
                                          
                                       ili
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [2]
                                          
                                       gdje je
                                 
                                             S1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentracija supstrata u izlaznoj vodi, (mg/l)
                                          
                                       
                                             KS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             konstanta poluzasićenosti, koncentracija na kojoj je μ = μm/2 (mg/l)
                                          
                                       
                                             μ
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             specifična brzina rasta (d–1)
                                          
                                       
                                             μm
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             maksimalna vrijednost μm(d–1)
                                          
                                       
                                             Kd
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             specifična brzina raspadanja aktivnih krutih tvari (d–1)
                                          
                                       
                                             θS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             srednje vrijeme zadržavanja mulja, SRT (d)
                                          
                                       Ispitivanjem ove jednadžbe dolazi se do sljedećih zaključaka:
                                 
                                             i.
                                          
                                          
                                             Koncentracija u izlaznoj vodi ne ovisi o koncentraciji u ulaznoj vodi (S0); dakle, postotak biorazgradnje varira ovisno o koncentraciji u ulaznoj vodi, S0.
                                          
                                       
                                             ii.
                                          
                                          
                                             Jedini kontrolni parametar u postrojenju koji ima utjecaja na S1 jest vrijeme zadržavanja mulja, θS.
                                          
                                       
                                             iii.
                                          
                                          
                                             Za danu koncentraciju u ulaznoj vodi, S0, postojat će kritično vrijeme zadržavanja mulja, takvo da je:
                                             
                                                         
                                                            
                                                      
                                                      
                                                         [3]
                                                      
                                                   gdje je
                                             θSC= kritično vrijeme zadržavanja mulja, ispod kojega će se kompetentni mikroorganizmi isprati iz postrojenja.
                                          
                                       
                                             iv.
                                          
                                          
                                             Budući da su ostali parametri u jednadžbi (2) povezani s kinetikom rasta, temperatura će vjerojatno imati utjecaja na razinu supstrata u izlaznoj vodi i na kritičnu starost mulja, tj. vrijeme zadržavanja mulja potrebno za dobivanje određenog stupnja pročišćavanja rast će s padom temperature.
                                          
                                       
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Iz bilance mase krutih tvari u sustavu s propusnom posudom, a i pod pretpostavkom da je koncentracija krutih tvari u izlaznoj vodi u postrojenju, X2, niska u usporedbi s koncentracijom u dozračnoj posudi, X1, vrijeme zadržavanja mulja
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [4]
                                          
                                       i
                                 
                                    
                                 gdje je
                                 
                                             V
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             volumen dozračne posude (l)
                                          
                                       
                                             X1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentracija krutih tvari u dozračnoj posudi (mg/l)
                                          
                                       
                                             X2
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentracija krutih tvari u izlaznoj vodi (mg/l)
                                          
                                       
                                             Q0
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             brzina protoka ulazne vode (l/d)
                                          
                                       
                                             Q1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             brzina protoka otpadnog mulja (l/d)
                                          
                                       Dakle, moguće je kontrolirati vrijeme zadržavanja mulja na bilo kojoj prethodno odabranoj vrijednosti kontroliranjem brzine protoka otpadnog mulja, Q1.
                                 Zaključci
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Glavni cilj ovog testa je, dakle, omogućiti prognozu koncentracije u izlaznoj vodi, a time i razina ispitivane kemikalije u ulaznoj vodi.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Grafičkim prikazom S1 u ovisnosti o θS, kritično vrijeme zadržavanja mulja, θSC, ponekad se može smjesta procijeniti, npr. krivulja 3 na slici 1. Kad to nije moguće, θSC se može izračunati, zajedno s približnim vrijednostima μm i KS, grafičkim prikazom S1 u ovisnosti o S1•θS.
                                 Prebacivanjem veličina u jednadžbi (1) dobivamo
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [5]
                                          
                                       Ako je Kd malen, tada 1 + θs · Kd ~ 1 i [5] postaje:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [6]
                                          
                                       Dakle, na grafičkom prikazu dobit ćemo ravnu crtu (vidjeti sliku 2.) nagiba 1/μm a sjecište KS/μm; a i θS ~1/μm.
                                 
                                    Slika 1.
                                 
                                 
                                    Tri temperature; pet SRT-a
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    Slika 2.
                                 
                                 
                                    Regresijska linija SRT · S1 naspram S1 na T = 5o C
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    Pojmovnik:
                                 
                                 koncentracija u izlaznoj vodi
                                 Krivulja
                              
                           
                  
                     Dodatak 7.
                     TEST U RASPONU NISKIH (μg/l) KONCENTRACIJA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Mnoge su kemikalije obično prisutne u vodenom okolišu, čak i u otpadnim vodama, u vrlo niskim koncentracijama (μg/l). U takvim koncentracijama one vjerojatno ne služe kao primarni supstrati koji rezultiraju rastom, nego je vjerojatnije da će se razgraditi kao sekundarni supstrati koji ne rastu, zajedno s nizom kemikalija koje sadržavaju ugljik, a koje se javljaju u prirodi. Stoga, ni razgradnja takvih kemikalija neće se uklapati u model opisan u Dodatku 6. Mogu se primijeniti brojni drugi modeli, a u uvjetima koji prevladavaju u sustavima za pročišćavanje otpadnih voda moglo bi se istodobno primijeniti više od jednog modela. Za rasvjetljavanje te problematike bit će potrebna brojna istraživanja.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 U međuvremenu, može se slijediti postupak iz glavnog dijela teksta (poglavlje C.10 A), ali samo za primarnu biorazgradivost, gdje se koriste prikladno niske koncentracije (< 100 μg/l) i potvrđeni analitički postupak. Može se izračunati postotak biorazgradnje (vidjeti stavak 54. Ispitne metode) pod uvjetom da se u obzir uzmu abiotički procesi (adsorpcija, hlapljivost itd.). Kao primjer može poslužiti studija autora Nyholma i njegovih suradnika (1)(2) u kojoj se koristi ciklus od 4 h u sustavu punjenja i pražnjenja. Oni su izvijestili o pseudo konstantama prvog reda za 5 kemikalija koje su se dodale sintetičkim otpadnim vodama u koncentraciji od 5 do 100 μg/l. (Za potpunu biorazgradivost mogu se koristiti 14C obilježene ispitivane kemikalije. Opisivanje tog ciklusa seže onkraj područja primjene ove Ispitne metode jer dosad ne postoje dogovoreni postupci iako predložena metoda za ISO 14592 (3) sadržava smjernice o uporabi 14C obilježenih kemikalija.
                              
                           
                        Test SCAS
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Kasnije je predložen dvofazni test (4)(5)(6); iza metode aktivnog mulja s polukontinuiranim režimom (SCAS) slijedi kratkotrajni kinetički test na uzorcima uzetima iz jedinica SCAS. Sustav SCAS radi s poznatim brzinama izdvajanja mulja (za razliku od izvorne ispitne metode iz C.12), a u njega se ulijevaju izmijenjene sintetičke otpadne vode OECD-a ili komunalne otpadne vode. Sintetičke otpadne vode izmijenjene su (zbog promjene pH vrijednosti i slabog sposobnosti taloženja mulja) dodavanjem fosfata kao pufera, ekstrakta kvasca, željezova (III) klorida i soli elemenata u tragovima, a njihov KPK povišen je na oko 750 mg/l povećanjem koncentracije peptona i mesnog ekstrakta. Jedinice su pogonjene u ciklusu od 24 h: dozračivanje je trajalo 23 h, izdvajanje mulja, taloženje, izvlačenje supernatanta (iz izlazne vode) te su se nakon toga dodale sintetičke otpadne vode plus ispitivana kemikalija, do 100 μg/l, (tj. u otprilike istoj koncentraciji kao i u kratkotrajnom testu). Jedanput tjedno 10 % ukupnog mulja zamijenilo se svježim muljem kako bi se održala uravnotežena mikrobna populacija.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Mjerile su se koncentracije ispitivane kemikalije na početku i na kraju dozračivanja, a test se nastavio sve dok se nije postiglo konstantno opadanje ispitivane kemikalije; to traje od jednog tjedna do nekoliko mjeseci.
                              
                           
                        Kratkotrajni test
                     
                     
                                 5.
                              
                              
                                 Primjenjuje se kratkotrajni test (npr. 8 sati) kako bi se odredila (pseudo) konstanta kinetičke brzine prvog reda iz raspadanja ispitivane kemikalije u aktivnom mulju poznatog, ali različitog podrijetla i povijesti. Posebice treba napomenuti da su uzorci mulja uzimani iz reaktora SCAS-a - na kraju razdoblja dozračivanja kad je niska koncentracija organskog supstrata - tijekom pokusa aklimatizacije (stavci 3., 4.). Mulj se može uzimati i iz paralelne jedinice SCAS koja nije izložena dodavanju ispitivane kemikalije, za potrebe usporedbe. Dozračuju se smjese mulja i ispitivane kemikalije koja se dodaje u dvjema ili većem broju koncentracija u rasponu od 1-50 μg/l, bez dodavanja sintetičkih otpadnih voda ili drugog organskog supstrata. Ispitivana kemikalija preostala u otopini određuje se u redovitim razmacima, npr. svakog sata, ovisno o razgradivosti kemikalije, tijekom razdoblja ne duljeg od 24h. Prije prikladne analize uzorci se centrifugiraju.
                              
                           
                        Izračuni
                     
                     
                                 6.
                              
                              
                                 Podaci iz jedinica SCAS koriste se za izračun postotka opadanja ispitivane kemikalije (stavak 54.). Isto tako, i konstanta prosječne brzine, K1, (normalizirana za koncentraciju suspendiranih krutih tvari) može se izračunati iz:
                                 
                                    
                                 gdje je
                                 
                                             t
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             vrijeme dozračivanja (23h)
                                          
                                       
                                             Ce
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentracija na kraju razdoblja dozračivanja (μg/l)
                                          
                                       
                                             Ci
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentracija na početku razdoblja dozračivanja (μg/l)
                                          
                                       
                                             SS
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             koncentracija krutih tvari u aktivnom mulju (g/l)
                                          
                                       
                           
                                 7.
                              
                              
                                 U kratkotrajnom testu grafički se prikazuje logaritamski % preostale koncentracije u ovisnosti o vremenu, a nagib početnog dijela (10-50 % razgradnje) grafičkog prikaza jednak je K1, (pseudo) konstanti prvog reda. Ta se konstanta normalizira u pogledu koncentracije krutih tvari u mulju dijeljenjem nagiba s koncentracijom krutih tvari u mulju. Podaci iz izvješća moraju obuhvaćati i pojedinosti o početnim koncentracijama ispitivane kemikalije i suspendiranih krutih tvari, vrijeme zadržavanja mulja, punjenje i izvor mulja te pojedinosti o prethodnoj izloženosti (ako ona uopće postoji) ispitivanoj kemikaliji.
                              
                           
                        Varijabilnost rezultata
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 O varijabilnost i ostalim aspektima kinetike biorazgradnje raspravljalo se na nedavnoj radionici SETAC-a (7). Iz takvih studija, o kojima postoje izvješća i o kojima su se provodili projekti, trebao bi proizići jasniji pogled na kinetiku u postrojenjima za pročišćavanje otpadnih voda kako bi se omogućilo bolje tumačenje postojećih podataka, kao i da bi se predložili relevantniji planovi za buduće ispitne metode.
                              
                           
                        LITERATURA
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339-353.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505-1510.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality - Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations in water.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851-864.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711-735.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
                              
                           
                  
                     C.10-B:   Biofilmovi
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Simulacijski testovi obično se provode s kemikalijama koje nisu prošle test pretraživanja na laku biorazgradivost (poglavlje C.4 A do F ovog Priloga (9)), ali su prošle test na biorazgradivost koja im je svojstvena. Iznimno se simulacijski testovi provode i sa svim kemikalijama o kojima se traži više informacija, posebice kemikalija u velikim količinama, a obično se primjenjuje test aktivnim muljem (C.10 A). Međutim, u nekim okolnostima traže se specifični podaci o ponašanju kemikalija prema metodama pročišćavanja otpadnih voda koje obuhvaćaju biofilmove, a posebno perkolacijske ili kapajuće filtre, rotirajuće biološke kontaktore, fluidizirane slojeve. Za zadovoljavanje te potrebe razvijeni su brojni uređaji.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Gerike et al. (1) koristili su velike, kapajuće pilot filtre, i to u povezanom načinu rada. Ti su filtri zauzimali mnogo prostora i za njih su bili potrebni relativno veliki volumeni otpadnih voda ili sintetičkih otpadnih voda. Truesdale et al. (2) opisali su manje filtre (promjera 6 ft × 6 in) kroz koje su puštane prirodne otpadne vode bez surfaktanta, ali su im i dalje trebali veliki volumeni. Čak je 14 tjedana bilo potrebno za razvijanje ‚zrelih’ biofilmova, a još 4-8 tjedana nakon što je uveden ispitivani surfaktant po prvi puta da bi se počela odvijati aklimatizacija.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Baumann et al. (3) razvili su znatno manje filtre koji su koristili ‚flis’ od poliestera koji je prije toga bio umočen u aktivni mulj kao inertni medij koji podržava biofilm. Ispitivana kemikalija koristila se kao jedini izvor ugljika, a biorazgradivost se procjenjivala iz mjerenja otopljenog organskog ugljika (DOC) u ulaznoj vodi i u izlaznoj vodi, a iz količine CO2 procjenjivao se izlazni plin.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Posve drukčiji pristup zauzeli su Gloyna et al. (4) koji su izumili rotirajući cijevni reaktor. Na unutarnjoj površini rotirajuće cijevi uzgajan je biofilm na poznatoj površini prolaskom ulazne vode koja se dodavala na gornjem vrhu cijevi, nagnute pod malim kutom u odnosu na horizntalu. Reaktor se koristio za proučavanje biorazgradivosti surfaktanata (5), kao i za ispitivanje optimalne debljine biofilma i raspršenja kroz taj film (6). Nadalje, potonji su autori razvili reaktor, ali su ga i izmijenili kako bi mogli odrediti CO2 u izlaznom plinu.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Stalni odbor analitičara (Standing Committee of Analysts (UK)) usvojio je rotirajući cijevni reaktor kao standardnu metodu za procjenu kako biorazgradivosti kemikalija (7) tako i pročistivosti i toksičnosti otpadih voda (8). Prednosti ovdje opisane metode jesu jednostavnost, kompaktnost, mjerna obnovljivost i potreba za relativno malim volumenima organskog medija.
                           
                        NAČELO ISPITIVANJA
                  
                              6.
                           
                           
                              Sintetičke ili komunalne otpadne vode, i ispitivana kemikalija, u smjesama ili samostalno, nanose se na unutarnju površinu nagnute cijevi koja se sporo okreće. Na toj se unutarnjoj površini stvara sloj mikroorganizama, sličan sloju na biofiltru. Odabiru se uvjeti rada reaktora kako bi se postigla adekvatna eliminacija organske tvari i, po potrebi, oksidacija amonijaka.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Skupi se izlazna voda iz cijevi i ona se ili taloži i/ili filtrira prije analize na otopljeni organski ugljik (DOC) i/ili na ispitivanu kemikaliju specifičnom metodom. Kontrolne jedinice u koje se ne dodaje ispitivana kemikalija pogone se paralelno u istim uvjetima u poredbene svrhe. Pretpostavlja se da je razlika između koncentracije DOC-a u izlaznoj vodi u ispitnoj i kontrolnoj jedinici rezultat ispitivane kemikalije i njezinih organskih metabolita. Ta se razlika uspoređuje s koncentracijom dodane ispitivane kemikalije (kao DOC-a) kako bi se izračunala eliminacija ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Biorazgradnja se obično može razlikovati od bioadsorpcije pomnim proučavanjem krivulje eliminacije. Potvrda se obično može dobiti primjenom testa na laku biorazgradnju (apsorpcija kisika ili proizvodnja ugljikova dioksida) pomoću aklimatiziranog inokuluma koji se uzima na kraju testa iz reaktora u koje se dodala ispitivana kemikalija.
                           
                        INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI
                  
                              9.
                           
                           
                              Trebali bi biti poznati čistoća, topljivost u vodi, hlapljivost i adsorpcijska svojstva ispitivane kemikalije kako bi se omogućilo ispravno tumačenje nastalih rezultata.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Obično se hlapljive i slabo topljive kemikalije ne mogu ispitivati ako se ne poduzmu posebne mjere opreza (vidjeti Dodatak 5. poglavlju C.10 A). Također bi trebala biti poznata i kemijska struktura ili barem empirijska formula kako bi se izračunale teoretske vrijednosti i/ili provjerile izmjerene vrijednosti parametara, npr. teoretska potrošnja kisika (TPK), DOC.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Informacije o toksičnosti ispitivane kemikalije po mikroorganizme (vidjeti Dodatak 4. poglavlju C.10 A) mogu biti korisne za odabir odgovarajućih ispitnih koncentracija te mogu biti ključne za ispravno tumačenje niskih vrijednosti biorazgradnje.
                           
                        RAZINE PROLAZNOSTI
                  
                              12.
                           
                           
                              Izvorno je bilo potrebno da primarna biorazgradnja surfaktanata dosegne 80 % ili više prije nego što bi se kemikalija mogla staviti na tržište. Ako se ne postigne vrijednost od 80 %, može se primijeniti simulacijski (potvrdni) test, a surfaktant se smije staviti na tržište tek ako specifična kemikalija opadne za više od 90 %. Kod kemikalija općenito nije upitna razina (ne)prolaznosti, a vrijednost postotka opadanja može se upotrijebiti u približnim izračunima vjerojatne koncentracije u okolišu koja će se koristiti u procjeni opasnosti koju predstavljaju te kemikalije. U nizu studija o čistim kemikalijama došlo je do rezultata da je postotak opadanja DOC-a > 90 % u više od tri četvrtine te > 80 % u više od 90 % kemikalija koje su pokazale značajniji stupanj biorazgradivosti.
                           
                        REFERENTNE KEMIKALIJE
                  
                              13.
                           
                           
                              Kako bi se osiguralo ispravno provođenje pokusnog postupka, korisno je povremeno ispitati referentne kemikalije za koje je poznato kako se ponašaju. Takve kemikalije obuhvaćaju adipinsku kiselinu, 2fenil fenol, 1-naftol, difensku kiselinu i 1-naftolnu kiselinu.
                           
                        MJERNA OBNOVLJIVOST REZULTATA ISPITIVANJA
                  
                              14.
                           
                           
                              Laboratorij u Ujedinjenoj Kraljevini utvrdio je da relativno standardno odstupanje u testovima iznosi 3,5 %, a među testovima 5 % (7).
                           
                        OPIS METODE
                  
                     Aparatura
                  
                  
                     Rotirajući cijevni reaktori
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Aparatura (vidjeti slike 1. i 2. u Dodatku 8.) sastoji se od svežnja akrilnih cijevi duljine 30,5 cm i unutarnjeg promjera 5 cm, koje stoje na kotačima s gumenim obručem u metalnom potpornom okviru. Svaka cijev ima vanjsku brtvu, dubine približno 0,5 cm, da bi se zadržala na kotačima, unutarnja površina sastruže se grubom žičanom vunom, a na gornjem vrhu (ulijevu) nalazi se unutarnja brtva dubine 0,5 cm koja zadržava tekućinu. Cijevi su nagnute pod kutom od otprilike jednog stupnja u odnosu na horizontalu kako bi se postiglo potrebno vrijeme kontakta kada se medij ulije u čistu cijev. Kotače s gumama okreće spori motor varijabilne brzine. Temperaturu u cijevima kontrolira instalacija u prostoriji s konstantnom temperaturom.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Stavljanjem svakog cijevnog reaktora unutar malo veće, začepljene cijevi i osiguravanjem da su spojevi plinonepropusni, izlazni plin CO2 može se skupljati u alkalnu otopinu za naknadno mjerenje (6).
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              24-satno punjenje, za svaku cijev, organskog medija u koji je, po potrebi, dodana ispitivana kemikalija nalazi se u spremniku od 20 l (A)(vidjeti sliku 2.). Ako je to potrebno, otopina ispitivane kemikalije može se zasebno dozirati. Blizu dna svakog spremnika postoji ispust spojen odgovarajućim cjevovodom, npr. silikonskom gumom, putem peristaltičke crpke (B) sa staklenom ili akrilnom dovodnom cijevi koja 24 cm ulazi u gornji kraj (ulijev) nagnute cijevi (C). S donjeg kraja nagnute cijevi omogućeno je kapanje izlazne vode koja se skuplja u drugi spremnik (D). Prije analize izlazna se voda taloži ili filtrira.
                           
                        
                     Aparatura za filtriranje-centrifugiranje
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Uređaj za filtraciju uzoraka pomoću membranskih filtara prikladne propusnosti (nazivni promjer otvora 0,45 μm) koji adsorbira organske kemikalije ili ispušta organski ugljik u minimalnoj količini. Ako se koriste filtri koji ispuštaju organski ugljik, pažljivo se operu vrućom vodom kako bi se uklonio organski ugljik koji curi. Druga je mogućnost primjena centrifuge koja može postići 40 000 m/s2.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Analitička oprema za određivanje:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          DOC-a/ukupnog organskog ugljika (TOC-a), ili kemijske potrošnje kisika (KPK-a);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          specifične kemikalije (HPLC (visokodjelotvorna tekućinska kromatografija), GC (plinska kromatografija) itd.) ako je potrebno;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pH-a, temperature, kiselosti, lužnatosti;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          amonijaka, nitrita i nitrata ako se testovi provode u uvjetima nitrifikacije.
                                       
                                    
                        
                     Voda
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Voda iz slavine koja sadržava manje od 3 mg/l DOC-a.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Destilirana ili deionizirana voda koja sadržava manje od 2 mg/l DOC-a.
                           
                        
                     Organski medij
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Kao organski medij mogu se koristiti sintetičke otpadne vode, komunalne otpadne vode ili njihova kombinacija. Pokazalo se da uporaba samo komunalnih otpadnih voda često dovodi do povećanog postotka opadanja DOC-a (u jedinicama s aktivnim muljem), pa čak i da omogućuje biorazgradnju nekih kemikalija koje se biološki ne razgrađuju kada se upotrebljavaju sintetičke otpadne vode OECD-a. Dakle, preporučuje se uporaba komunalnih otpadnih voda. Izmjerite koncentraciju DOC-a (ili KPK-a) u svakoj novoj šarži organskog medija. Trebale bi biti poznate kiselost ili lužnatost organskog medija. Moguće je da će zbog medija biti potrebno dodavanje odgovarajućeg pufera (natrijev hidrogenkarbonat ili kalijev dihidrogen fosfat) ako je niske kiselosti ili lužnatosti kako bi se pH tijekom testa održao na oko 7,5 ± 0,5 u reaktoru. O količini pufera te o trenutku dodavanja odlučuje se u svakom pojedinom slučaju.
                           
                        
                     Sintetičke otpadne vode
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Po 1 litri vode iz slavine otopi se: pepton, 160 mg; mesni ekstrakt, 110 mg; urea, 30 mg; anhidridni dikalijev hidrogen fosfat (K2HPO4), 28 mg; natrijev klorid (NaCl), 7 mg; kalcijev klorid dihidrat (CaCl2.2H2O), 4 mg; magnezijev sulfat heptahidrat (MgSO4.7H2O), 2 mg. Te sintetičke otpadne vode OECD-a služe samo kao primjer i daju srednju koncentraciju DOC-a u ulaznoj vodi od oko 100 mg/l. Druga je mogućnost primjena drugih smjesa koje imaju otprilike iste koncentracije DOC-a, a koje su sličnije pravim otpadnim vodama. Te se sintetičke otpadne vode mogu napraviti u destiliranoj vodi u koncentriranom obliku i mogu se čuvati na oko 1 °C do tjedan dana. Po potrebi se razrijede vodom iz slavine. (Ovaj medij nije zadovoljavajući, npr. vrlo je visoka koncentracija dušika, relativno je nizak sadržaj ugljika, ali nije predloženo ništa bolje, osim da se doda više fosfata kao pufera i dodatnog peptona).
                           
                        
                     Komunalne otpadne vode
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Koristite svježe istaložene otpadne vode koje se skupljaju svakodnevno iz postrojenja za pročišćavanje u koje se pretežno dodaju komunalne otpadne vode. Njih bi trebalo skupiti iz preljevnog kanala primarnog taložnika ili iz ulijeva postrojenja s aktivnim muljem te u njima uglavnom ne bi smjelo biti grubih čestica. Te se otpadne vode mogu koristiti nekoliko dana nakon skladištenja na oko 4 °C ako se dokaže da nije došlo do znatnijeg opadanja DOC-a (ili KPK-a) (npr. za manje od 20 %) tijekom skladištenja. Da bi se ograničile smetnje u sustavu, trebalo bi prije uporabe prilagoditi DOC (ili KPK) svake nove šarže na odgovarajuću konstantnu vrijednost, npr. razrjeđivanjem vodom iz slavine.
                           
                        
                     Sredstvo za podmazivanje
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Za podmazivanje valjaka peristaltičke crpke mogu se upotrijebiti glicerol ili maslinovo ulje: oboje je prikladno za uporabu na cjevovodu od silikonske gume.
                           
                        
                     Radne otopine ispitivane kemikalije
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Za kemikalije odgovarajuće topljivosti pripremite radne otopine prikladnih koncentracija (npr. 1 do 5 g/l) u deioniziranoj vodi ili u mineralnom dijelu sintetičkih otpadnih voda. Za netopljive kemikalije vidjeti Dodatak 5. u poglavlju C.10-A. Ta metoda nije prikladna za hlapljive kemikalije ako se ne izmijene cijevni reaktori (stavak 16.). Odredite DOC i TOC radne otopine pa ponovite mjerenja za svaku novu šaržu. Ako je razlika između DOC-a i TOC-a veća od 20 %, provjerite topljivost u vodi ispitivane kemikalije. Usporedite DOC ili koncentraciju ispitivane kemikalije izmjerene specifičnom analizom radne otopine s nazivnom vrijednošću kako biste utvrdili je li obnavljanje dovoljno dobro (obično se može očekivati > 90 %). Utvrdite, posebno za disperzije, može li se ili ne može DOC koristiti kao analitički parametar ili se može koristiti samo jedna analitička tehnika specifična za ispitivanu kemikaliju. Za disperziju je potrebna centrifuga uzoraka. Za svaku novu šaržu izmjerite DOC, KPK ili ispitivanu kemikaliju pomoću specifične analize.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Odredite pH radne otopine. Ekstremne vrijednosti znak su toga da dodavanje kemikalije možda utječe na pH aktivnog mulja u sustavu ispitivanja. U tom slučaju neutralizirajte radnu otopinu kako biste dobili pH od 7 ± 0,5 s malim količinama anorganske kiseline ili lužine, ali izbjegavajte precipitaciju (taloženje) ispitivane kemikalije.
                           
                        POSTUPAK
                  
                     Priprema organskog medija za doziranje
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Pobrinite se da na početku i tijekom testa temeljito očistite spremnike ulazne i izlazne vode te cjevovode iz posude ulazne i posude izlazne vode kako biste uklonili nakupine mikroba.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Pripremite sintetičke otpadne vode (stavak 23.) nanovo svakog dana bilo od krutih tvari bilo od koncentrirane radne otopine što se razrijeđuju vodom iz slavine. Izmjerite potrebnu količinu u cilindru pa je dodajte u čistu posudu za ulaznu vodu. Isto tako, kad je to neophodno, u sintetičke otpadne vode prije razrjeđivanja dodajte potrebnu količinu radne otopine ili referentne kemikalije. Ako je zgodnije ili neophodno za izbjegavanje gubitka ispitivane kemikalije, pripremite zasebnu razrijeđenu otopinu ispitivane kemikalije u zasebnom spremniku pa je drugom dozirnom crpkom ulijte u nagnute cijevi.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Druga (i preferirana) mogućnost jest korištenje istaložene komunalne otpadne vode (stavak 24.) koje, ako je to moguće, se nanovo skupljaju svakoga dana.
                           
                        
                     Rad rotirajućih cijevnih reaktora
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Za procjenu jedne ispitivane kemikalije potrebna su dva identična cijevna reaktora i oni se sastavljaju u prostoriji s konstantnom temperaturom, obično na 22 ± 2 °C.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Podesite peristaltičku crpku kako bi crpila 250 ± 25 ml/h organskog medija (bez ispitivane kemikalije) u nagnute cijevi, koje se rotiraju brzinom od 18 ± 2 opm. Nanesite sredstvo za podmazivanje (stavak 25.) na cijevi crpke, i to na početku testa i povremeno tijekom testa kako bi se osigurao njihov ispravan rad i produljio životni vijek cijevi.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Podesite kut nagnutosti cijevi u odnosu na horizontalu kako bi se dobilo vrijeme djelovanja od 125 ± 12,5 s za ulijevanje u čistu cijev. Procijenite vrijeme zadržavanja dodavanjem nebiološkog markera (npr. NaCl, inertno bojilo) u ulijev: smatra se da vrijeme potrebno za postizanje vršne koncentracije u izlaznoj vodi predstavlja srednje vrijeme zadržavanja (kad postoji maksimalni film, vrijeme zadržavanja može se povećati do 30 min.).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Pokazalo se da te stope, brzine i vremena rezultiraju adekvatnim opadanjem (> 80 %) DOC-a (ili KPK-a) te da stvaraju nitrificiranu izlaznu vodu. Stopu protoka treba izmijeniti ako opadanje nije dostatno ili ako treba simulirati radnu uspješnost točno određenog postrojenja za pročišćavanje. U potonjem slučaju podešavajte brzinu doziranja organskog medija sve dok radna uspješnost reaktora ne bude jednaka radnoj uspješnosti postrojenja za pročišćavanje.
                           
                        
                     Inokulacija
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Možda će inokulacija zrakom biti dovoljna za početak rasta mikroorganizama kada se koriste sintetičke otpadne vode, ali u protivnom dodajte 1 ml/l istaloženih otpadih voda u ulijev za 3 dana.
                           
                        
                     Mjerenja
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              U redovitim razmacima provjeravajte jesu li dozirane količine i brzine okretanja unutar traženih granica. Isto tako, izmjerite i pH izlazne vode, posebno ako se očekuje nitrifikacija.
                           
                        
                     Uzorkovanje i analiza
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Metoda, obrazac i učestalost uzorkovanja biraju se tako da odgovaraju svrsi testa. Primjerice, uzmite brze uzorke ulazne i izlazne vode ili skupljajte uzorke tijekom duljeg razdoblja, npr. 36 h. U prvom razdoblju, bez ispitivane kemikalije, uzimajte uzorke dvaput tjedno. Profiltrirajte uzorke kroz membrane ili ih centrifugirajte na oko 40 000 m/s2 otprilike 15 min (stavak 18.). Možda će biti potrebno pustiti uzorke da se istalože i/ili ih filtrirati kroz grubi filtar prije filtracije kroz membranu. Provedite određivanja DOC-a (ili KPK-a) najmanje dva puta te, ako je potrebno, i BPK-a, amonijaka i nitrita/nitrata.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Sve analize treba provesti što je moguće prije nakon skupljanja i pripreme uzoraka. Ako se analize moraju odgoditi, uskladištite uzorke na oko 4 °C na tamnom mjestu u do vrha napunjenim i čvrsto zatvorenim bocama. Ako se uzorci moraju skladištiti dulje od 48 h, konzervirajte ih dubokim smrzavanjem, acidifikacijom ili dodavanjem odgovarajuće toksične kemikalije (npr. 20 ml/l otopine merkurijeva (II) klorida od 10 g/l). Pobrinite se da tehnika konzerviranja ne utječe na rezultate analize.
                           
                        
                     Faza ustaljenja
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              U ovoj fazi površinski biofilm naraste do optimalne debljine, što obično traje oko dva tjedna, a ne bi trebalo premašiti šest tjedana. Opadanje (stavak 44.) DOC-a (ili KPK-a) se povećava i doseže vrijednost platoa. Kad se plato dosegne na sličnoj vrijednosti u obje cijevi, jedna se odabire da bude kontrolna u ostatku testa, tijekom kojega bi njihova radna uspješnost trebala ostati dosljedna.
                           
                        
                     Uvođenje ispitivane kemikalije
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              U ovoj fazi dodajte ispitivanu kemikaliju u drugi reaktor u traženoj koncentraciji, obično 1020 mg C/l. U kontrolnu se cijev i dalje dodaje samo organski medij.
                           
                        
                     Faza aklimatizacije
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Nastavite s analizama DOC-a (ili KPK-a) dvaput tjedno te, ako treba procijeniti i primarnu biorazgradivost, izmjerite i koncentraciju ispitivane kemikalije specifičnom analizom. Ostavite jedan do šest tjedana (ili dulje u posebnim uvjetima) za aklimatizaciju nakon što je ispitivana kemikalija uvedena po prvi put. Kada postotak opadanja (stavci 43.-45.) dosegne maksimalnu vrijednost, dobivajte 1215 valjanih vrijednosti u fazi platoa tijekom otprilike tri tjedna radi procjene srednjeg postotka opadanja. Smatra se da je test završen kad se postigne dovoljno visok stupanj eliminacije. Neka trajanje testa ne bude duže od 12 tjedana nakon prvog dodavanja ispitivane kemikalije.
                           
                        
                     Ljuštenje filma
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Naglo vađenje većih količina viška filma iz cijevi, ili ljuštenje, odvija se u relativno redovitim razmacima. Kako bi se osiguralo da to nema utjecaja na poredbenost rezultata, dajte da testovi obuhvate najmanje dva puna ciklusa rasta i ljuštenja.
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Obrada rezultata
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Izračunajte postotak eliminacije DOC-a (ili KPK-a) ispitivane kemikalije za svaku vremenski određenu procjenu pomoću sljedeće jednadžbe:
                              
                                 
                              gdje je
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          postotak eliminacije DOC-a (ili KPK-a) u vremenu t;
                                       
                                    
                                          Cs
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          koncentracija DOC-a (ili KPK-a) u ulaznoj vodi nastala zbog ispitivane kemikalije, po mogućnosti procijenjene iz koncentracije, i volumena dodanog u radnu otopinu (mg/l);
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          izmjereni DOC (ili KPK) u ispitnoj izlaznoj vodi u vremenu t (mg/l);
                                       
                                    
                                          Eo
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          izmjereni DOC (ili KPK) u kontrolnoj izlaznoj vodi u vremenu t (mg/l).
                                       
                                    Ponovite izračun i za referentnu kemikaliju, ako se ista ispituje.
                           
                        
                     Radna uspješnost kontrolnog reaktora
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Stupanj eliminacije DOC-a (ili KPK-a) (DB) organskog medija u kontrolnom reaktoru korisna je informacija pri procjeni aktivnosti biorazgradnje biofilma tijekom testa. Postotak eliminacije izračunajte pomoću jednadžbe:
                              
                                 
                              gdje je
                              Cm= DOC (ili KPK) organskog medija u kontrolnoj ulaznoj vodi (mg/l).
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Izračunajte opadanje (DST) ispitivane kemikalije, ako se ono mjerilo, specifičnom analitičkom metodom u svakom vremenski određenom određivanju iz jednadžbe:
                              
                                 
                              gdje je
                              
                                          Si
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          izmjerena ili, po mogućnosti, procijenjena koncentracija ispitivane kemikalije u ispitnoj ulaznoj vodi (mg/l)
                                       
                                    
                                          Se
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          izmjerena koncentracija ispitivane kemikalije u ispitnoj izlaznoj vodi u vremenu t (mg/l)
                                       
                                    Ako analitička metoda rezultira pozitivnom vrijednošću u neizmijenjenim otpadnim vodama koja je jednaka S
                                    c
                                  mg/l, izračunajte postotak opadanja (DSC) iz:
                              
                                 
                           
                        
                     Izražavanje rezultata ispitivanja
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Grafički prikažite postotak eliminacije D
                                    t
                                  i DST (ili DSC), ako je raspoloživ, u ovisnosti o vremenu (vidjeti Dodatak 2. u poglavlju C.10- A). Uzmite srednju vrijednost (zaokruženu na najbliži cijeli broj) i standardno odstupanje 12-15 vrijednosti za DT (i za DST, ako je raspoloživ) dobivene u fazi platoa kao postotak opadanja ispitivane kemikalije. Iz oblika krivulje eliminacije mogu se izvući izvjesni zaključci o procesima opadanja.
                           
                        
                     Adsorpcija
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Ako se na početku testa zamijeti velika eliminacija DOC-a ispitivane kemikalije, ispitivana kemikalija vjerojatno se eliminira adsorpcijom na biofilm. To je moguće dokazati određivanjem adsorbirane ispitivane kemikalije na krutim tvarima oljuštenima iz filma. Nije uobičajeno da eliminacija DOC-a kemikalija koje se mogu adsorbirati ostane visoka tijekom cijelog testa; obično je u početku visok stupanj opadanja koji postupno pada do neke uravnotežene vrijednosti. Međutim, ako je adsorbirana ispitivana kemikalija mogla izazvati aklimatizaciju mikrobne populacije, eliminacija DOC-a ispitivane kemikalije naknadno bi porasla i postigla visoku vrijednost platoa.
                           
                        
                     Faza prilagodbe (‚lag’ faza)
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              Kao i u statičkim testovima probira, za brojne je ispitivane kemikalije potrebna faza prilagodbe (‚lag’ faza) prije nego što dođe do potpune biorazgradnje. U fazi prilagodbe odvija se aklimatizacija (ili prilagodba) kompetentnih bakterija, pri čemu ispitivana kemikalija gotovo uopće ne opada, a potom dolazi do početnog rasta tih bakterija. Ta faza završava, a proizvoljno se smatra da faza razgradnje započinje nakon što opadne otprilike 10 % početne količine ispitivane kemikalije (nakon što se odvoji dovoljno vremena za adsorpciju, ako se ona događa). Faza prilagodbe često je krajnje varijabilna i slabo se može mjerno obnoviti.
                           
                        
                     Stacionarna faza (faza platoa)
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Stacionarna faza (faza platoa) krivulje eliminacije u neprekidnom testu definira se kao faza u kojoj dolazi do maksimalne razgradnje. Ta faza trebala bi trajati najmanje tri tjedna i imati oko 1215 izmjerenih valjanih vrijednosti.
                           
                        
                     Srednji stupanj eliminacije ispitivane kemikalije
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Izračunajte srednju vrijednost iz vrijednosti eliminacije Dt (i Dst, ako je raspoloživ) ispitivane kemikalije u stacionarnoj fazi. Zaokružite na najbliži cijeli broj (1 %) i dobit ćete stupanj eliminacije ispitivane kemikalije. Također se preporučuje da se izračuna i 95 % intervala pouzdanosti srednje vrijednosti. Na sličan način izračunajte i srednji stupanj (DB) eliminacije organskog medija u kontrolnoj posudi.
                           
                        
                     Navođenje biorazgradnje
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Ako se ispitivana kemikalija ne adsorbira značajno na biofilm i ako krivulja eliminacije ima tipičan oblik krivulje biorazgradnje s fazama prilagodbe, razgradnje i stacionarnom fazom (stavci 48., 49.), izmjerena eliminacija može se sa sigurnošću pripisati biorazgradnji. Ako dođe do velikog početnog opadanja, simulacijskim testom ne mogu se razlikovati procesi biološke i abiotičke eliminacije. U takvom slučaju, ali i u svim drugim slučajevima u kojima postoji bilo kakva dvojba o biorazgradnji (npr. ako dođe do ljuštenja), analizirajte adsorbiranu ispitivanu kemikaliju na uzorcima filma ili provedite dodatne statične testove (testove pretraživanja na) biorazgradnju na temelju parametara koji jasno označuju biološke procese. Takvi su testovi metode apsorpcije kisika (poglavlje C.4 ovog Priloga D, E i F) (9) ili test kojim se mjeri proizvodnja CO2 (poglavlje C.4-C ovog Priloga ili metoda Headspace) (10); kao inokulum upotrijebite prethodno izloženi biofilm iz odgovarajućeg reaktora.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Ako se izmjere i opadanje DOC-a i opadanje specifične kemikalije, znatne razlike (prethodna vrijednost niža od potonje) među postocima opadanja naznačuju prisutnost u izlaznoj vodi intermedijarnih organskih proizvoda koji se možda teže razgrađuju; njih bi trebalo ispitati.
                           
                        
                     Valjanost rezultata ispitivanja
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Test možete smatrati valjanim ako je stupanj eliminacije DOC-a (ili KPK-a) u kontrolnim jedinicama > 80 % nakon 2 tjedna rada i ako niste primijetili ništa neobično.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Ako je ispitivana (referentna) kemikalija koja se lako biorazgrađuje, stupanj biorazgradnje treba biti > 90 %, a razlika među vrijednostima dvostrukog određivanja ne smije biti veća od 5 %. Ako nisu ispunjena ta dva uvjeta, revidirajte pokusni postupak i/ili dobijte komunalne otpadne vode iz nekog drugog izvora.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Slično tomu, vrijednosti biorazgradnje iz dvostrukih jedinica (ako se koriste) u kojima se pročišćava ispitivana kemikalija ne bi se smjele razlikovati za više od 5 %. Ako nije ispunjen taj kriterij, ali je opadanje veliko, nastavite provoditi analizu još tri tjedna. Ako je opadanje nisko, istražite inhibitorni učinak ispitivane kemikalije, ako on već nije poznat, pa ponovite test na nižoj koncentraciji ispitivane kemikalije, ako je to izvedivo.
                           
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Izvješće o ispitivanju mora obuhvaćati sljedeće:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana kemikalija:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci za identifikaciju;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizikalno stanje i, prema potrebi, fizikalno-kemijska svojstva.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sve izmjene sustava ispitivanja, posebno ako se ispituju netopljive ili hlapljive tvari;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vrsta organskog medija;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      udio i narav industrijskih otpadnih voda u otpadnim vodama, ako se koriste i ako je poznato;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda inokulacije;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sadržaj DOC-a (otopljenog organskog ugljika) i TOC-a (ukupnog organskog ugljika) radne otopine ispitivane kemikalije; način njezine pripreme, ako je riječ o suspenziji; korištena ispitna koncentracija/koncentracije, obrazloženje ako je vanjski raspon DOC-a 1020 mg/l; metoda dodvanja; datum prvog dodavanja; sve promjene koncentracije;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      srednje vrijeme hidrauličkog zadržavanja (bez rasta); brzina okretanja cijevi; približni kut nagnutosti, ako je moguće;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinosti o ljuštenju; vrijeme i intenzitet;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ispitna temperatura i raspon;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      primijenjene analitičke tehnike.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati ispitivanja:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      svi izmjereni podaci DOC, KPK, specifične analize, pH, temperatura, N kemikalije, ako je relevantno,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      svi izračunati podaci Dt (ili Dtc), DB, Ds dobivene u tabličnom obliku i krivuljama eliminacije,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci o fazi prilagodbe (‚lag’ fazi) i stacionarnoj fazi (fazi platoa), trajanju testa, stupnju eliminacije ispitivane kemikalije, referentne kemikalije (ako je ispitivana) i organskog medija (u kontrolnoj jedinici), zajedno sa statističkim podacima i izjavama o biorazgradivosti i valjanosti testa,
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rasprava o rezultatima.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753-758.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92-94.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Poglavlje C.4 ovog Priloga, Određivanje ‚lake’ biorazgradivosti A-F.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of released inorganic carbon in sealed vessels.
                           
                        
                     Dodatak 8.
                     
                        Slika 1.
                     
                     
                        Rotirajuće cijevi
                     
                     
                        
                     
                        Pojmovnik:
                     
                     Pogled sprijeda
                     Pogled A
                     Pogled B
                     Pogonjeni kotači
                     Kotači s praznim hodom
                     Pogonski motor
                     Mjenjač brzina
                     Unutarnja prirubnica
                     Mehanizam naginjanja
                     Pogonski stožasti zupčanik
                     
                        Slika 2.
                     
                     
                        Dijagram toka
                     
                     
                        
                     A: Spremnik za ulijevanje
                     B: Peristaltička crpka
                     C: Rotirajuća cijev
                     D: Posuda za skupljanje izlazne vode
                     
                        DEFINICIJE:
                     
                     a. Ispitivana kemikalija: Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom Ispitnom metodom.
                     b. Kemikalije: ‚Treba napomenuti da se pojam „kemikalija” koristi u širokom smislu riječi u smislu sporazuma UNCED-a (Konferencije Ujedinjenih naroda o okolišu i razvoju) i naknadnih dokumenata te obuhvaća tvari, proizvode, smjese, pripravke ili sve druge pojmove koji se možda koriste u postojećim sustavima za označavanje područja valjanosti’.
                  ”
            
                  10.
               
               
                  Dodaju se poglavlja C.27, C.28, C.29 i C.30:
                  „C.27   TEST TOKSIČNOSTI TRZALACA (CHIRONOMIDAE) U VODI IZ SEDIMENTA SA SEDIMENTOM OBRAĐENIM SPIKINGOM
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 218 (2004). Ova ispitna metoda namijenjena je procjeni učinaka produljenog izlaganja kemikalija ličinkama iz sedimenta vrste slatkovodnih dvokrilaca (diptera) Chironomus sp. Temelji se na postupcima postojećih testova toksičnosti za Chironomus riparius i Chironomus tentans koji su razvijeni u Europi (1)(2)(3) i Sjevernoj Americi (4)(5)(6)(7)(8) i ispitani u prstenastom testu (1)(6)(9). Mogu se koristiti i druge vrste trzalaca o kojima postoji dobra dokumentacija, npr. Chironomus yoshimatsui (10)(11).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Scenarij izlaganja koji se koristi u ovoj ispitnoj metodi jest obogaćivanje sedimenta ispitnom tvari spikingom. Odabir prikladnog scenarija izlaganja ovisi o cilju provođenja testa. Cilj scenarija obogaćivanja sedimenta spikingom jest simulirati akumulirane razine kemikalija koje postoje u sedimentu. Ovaj sustav izlaganja obuhvaća spiking sedimenta iz ispitnog sustava sediment/voda.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Tvari koje treba ispitati na organizme koji žive u sedimentu obično u njemu opstaju tijekom duljih razdoblja. Organizmi iz sedimenta mogu se izlagati na razne načine. Relativna važnost svakog načina izlaganja i vrijeme potrebno da bi svaki od tih načina pridonio općim učincima toksičnosti ovise o fizikalno-kemijskim svojstvima predmetne kemikalije. Za jako adsorptivne tvari (npr. s log Kow > 5) ili za tvari koje se vežu sa sedimentom kovalentnim vezama, značajan način izlaganja može biti gutanje kontaminirane hrane. Kako se ne bi podcijenila toksičnost jako lipofilnih tvari, može se u obzir uzeti uporaba hrane koja se dodaje sedimentu prije primjene ispitivane tvari. Da bi se u obzir uzeli svi potencijalni načini izlaganja, ova se ispitna metoda usredotočuje na dugotrajno izlaganje. Test traje u rasponu od 20 - 28 dana za C. riparius i C. yoshimatsui, te 28 - 65 dana za C. tentans. Ako su za neku specifičnu svrhu potrebni kratkotrajni podaci, primjerice radi istraživanja učinaka neke nestabilne kemikalije, višestruka određivanja mogu se ukinuti nakon deset dana.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Izmjereni konačni učinci jesu ukupni broj odraslih životinja preobraženih u vrijeme preobrazbe. Preporučuje se da se preživljavanje i rast ličinki mjere tek nakon deset dana ako su potrebni dodatni kratkotrajni podaci, i to pomoću dodatnih višestrukih određivanja, ako je to prikladno.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Preporučuje se uporaba formuliranog sedimenta. Formulirani sediment ima nekoliko prednosti nad prirodnim sedimentima:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          pokusna varijabilnost je smanjena jer stvara mjerno obnovljivu ‚standardiziranu matricu’ te se eliminira potreba za pronalaženjem nekontaminiranih i čistih izvora sedimenta;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          testovi se mogu provoditi u bilo koje doba, a da se pritom ne suočava sa sezonskom varijabilnošću u ispitnom sedimentu, a nema ni potrebe za prethodnom obradom sedimenta radi uklanjanja urođene faune; uporaba formuliranog sedimenta također snižava troškove povezane s terenskim prikupljanjem dovoljnih količina sedimenta za rutinsko testiranje;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          uporaba formuliranog sedimenta omogućuje usporedbe toksičnosti i razvrstavanje tvari sukladno tome.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Korištene definicije navedene su u Dodatku 1.
                           
                        NAČELO ISPITIVANJA
                  
                              7.
                           
                           
                              Ličinke trzalaca u prvom stadiju razvoja izlažu se rasponu koncentracija ispitne kemikalije u sustavima sediment/voda. Ispitna tvar dodaje se u sediment, a nakon toga se ličinke u prvom stadiju razvoja uvode u ispitne laboratorijske čaše, u kojima su već stabilizirane koncentracije sedimenta i vode. Na kraju testa mjeri se brzina preobrazbe i razvoja trzalaca. Također se mogu mjeriti i preživljavanje i masa ličinki nakon deset dana, ako je to potrebno (pomoću dodatnih višestrukih određivanja, ako je primjereno). Ti se podaci analiziraju bilo modelom regresijske analize s ciljem određivanja koncentracije koja bi izazvala × % smanjenje u preobrazbi ili preživaljavanju i rastu ličinki (npr. EC15, EC50 itd.) bilo statističkim hipotetskim testiranjem s ciljem određivanja NOEC-a/LOEC-a. Za potonje je potrebna usporedba vrijednosti učinka s kontrolnim vrijednostima pomoću statističkih testova.
                           
                        INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI
                  
                              8.
                           
                           
                              Trebali bi biti poznati topljivost ispitivane tvari u vodi, njezin tlak pare, izmjerena ili izračunata razdioba u sedimentu i stabilnost u vodi i sedimentu. Treba biti dostupna pouzdana analitička metoda kvantifikacije ispitivane tvari u vodi iznad sedimenta, pornoj vodi i sedimentu, zajedno s poznatom i prijavljenom preciznošću i granicama detekcije. Korisne informacije obuhvaćaju strukturnu formulu i čistoću ispitivane tvari. Korisna informacija je još i kemijska sudbina ispitivane tvari (npr. rasipanje, abiotička i biotička razgradnja itd.). Daljnje smjernice za testiranje tvari čija su fizikalno-kemijska svojstva takva da je zbog njih teško provoditi testove nalaze se u (12).
                           
                        REFERENTNE KEMIKALIJE
                  
                              9.
                           
                           
                              Referentne kemikalije mogu se ispitivati periodično kako bi se osigurala pouzdanost protokola i uvjeta ispitivanja. Primjeri referentnih toksičnih tvari koji se uspješno koriste u prstenastim testovima i validacijskim studijama jesu: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid i kalijev klorid (1)(2)(5)(6)(13).
                           
                        VALJANOST ISPITIVANJA
                  
                              10.
                           
                           
                              Da bi test bio valjan, primjenjuju se sljedeći uvjeti:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          postotak preobrazbe u kontrolnim posudama mora na kraju testa iznositi najmanje 70 %. (1)(6);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          preobrazba vrsti C. riparius i C. yoshimatsui u odrasle životinje u kontrolnim posudama treba se odviti između 12. i 23. dana nakon njihova umetanja u posude; za vrstu C. tentans potrebno je razdoblje od 20 do 65 dana.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          na kraju testa treba u svakoj posudi izmjeriti pH i koncentraciju otopljenog kisika. Koncentracija kisika treba iznositi najmanje 60 posto vrijednosti zasićenosti kisikom (ASV) na određenoj temperaturi, a pH vode iznad sedimenta treba biti u rasponu od 6-9 u svim ispitnim posudama;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          temperatura vode ne bi se smjela razlikovati za više od ± 1,0 °C. Temperatura vode može se kontrolirati izotermičkom sobom i u tom slučaju temperatura u prostoriji treba se potvrđivati u odgovarajućim vremenskim razmacima.
                                       
                                    
                        OPIS METODE
                  
                     Ispitne posude
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Studija se provodi u staklenim laboratorijskim čašama od 600 ml promjera 8 cm. Prikladne su i druge posude, ali se mora zajamčiti da je i u njima prikladna dubina sedimenta i vode iznad sedimenta. Površina sedimenta mora biti dovoljno velika da po svakoj ličinki bude 2 do 3 cm2 površine. Omjer dubine sloja sedimenta i dubine vode iznad sedimenta treba biti 1:4. Ispitne posude i druga aparatura koja dolazi u doticaj sa sustavom ispitivanja treba biti načinjena u cijelosti od stakla ili nekog drugog kemijski inertnog materijala (npr. teflona).
                           
                        
                     Odabir vrste
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Vrsta koju treba koristiti u ovom testu po mogućnosti je Chironomus riparius. I vrsta Chironomus tentans također je prikladna, ali je njome teže rukovati te je za nju potrebno dulje vrijeme ispitivanja. Može se koristiti i vrsta Chironomus yohimatsui. Pojedinosti o metodi uzgoja kulture nalaze se u Dodatku 2. za vrstu Chironomus riparius. Podaci o uvjetima uzgoja kulture dostupni su također i za druge vrste, tj. Chironomus tentans (4) i Chironomus yoshimatsui (11). Mora se potvrditi identifikacija vrste prije ispitivanja, ali to nije potrebno prije svakog ispitivanja ako organizmi potječu iz kulture uzgojene u laboratoriju.
                           
                        
                     Sediment
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Po mogućnosti bi se trebao koristiti formulirani sediment (zvan još i obrađeni, umjetni ili sintetički sediment). Međutim, ako se koristi prirodni sediment, on se treba karakterizirati (barem pH, sadržaj otopljenog ugljika, a preporučuje se i određivanje drugih parametara kao što su omjer C/N i granulometrija) te ne smije biti kontaminiran i u njemu ne smije biti nikakvih organizama koji bi se mogli natjecati sa ili jesti trzalce. Također se preporučuje da se prirodni sediment, prije uporabe u testu toksičnosti trzalaca, prethodno priprema sedam dana u istim uvjetima koji prevladavaju i u narednom ispitivanju. Za uporabu u ovom ispitivanju preporučuje se sljedeći formulirani sediment, na temelju umjetnog tla iz ispitne metode C.8 (14), (1)(15)(16):
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          4-5 % (suhe mase) treseta: što je moguće bliže pH od 5,5 do 6,0; važno je da se koristi treset u obliku praha, fino usitnjen (veličine čestica ≤ 1 mm) i isključivo sušen na zraku.
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          20 % (suhe mase) kaolinitske gline (sadržaj kaolinita po mogućnosti iznad 30 %).
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          75-76 % (suhe mase) kremenog pijeska (fini bi pijesak trebao prevladavati s više od 50 posto čestica između 50 i 200 μm).
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          Dodaje se deionizirana voda kako bi se dobio sadržaj vlage konačne smjese u rasponu od 30 - 50 %.
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          Dodaje se kalcijev karbonat kemijski čiste kakvoće (CaCO3) kako bi se pH konačne smjese sedimenta podesila na 7,0 ± 0,5. Sadržaj organskog ugljika konačne smjese trebao bi iznositi 2 % (± 0,5 %) i treba se prilagoditi dodavanjem odgovarajućih količina treseta i pijeska prema (a) i (c).
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              Treba biti poznat izvor treseta, kaolinitske gline i pijeska. Treba provjeriti nisu li komponente sedimenta kemijski kontaminirane (npr. teški metali, organoklorni spojevi, organofosforni spojevi itd.). Primjer pripreme formuliranog sedimenta opisan je u Dodatku 3. I miješanje suhih sastojaka također je prihvatljivo ako se pokaže da nakon dodavanja vode iznad sedimenta ne dolazi do razdvajanja sastojaka sedimenta (npr. lebdenje čestica treseta) i da su treset ili sediment dovoljno prethodno pripremljeni.
                           
                        
                     Voda
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Kao ispitna voda prikladna je svaka voda koja ima kemijska svojstva prihvatljive vode za razrjeđivanje koja su navedena u dodacima 2. i 4. Kao voda za uzgoj kultura i ispitna voda prikladna je svaka prikladna voda, prirodna voda (površinske ili podzemne vode), obrađena voda (vidjeti Dodatak 2.) ili deklorirana voda iz slavine ako će trzalci u njoj preživjeti tijekom uzgoja kulture i ispitivanja, a da ne pokažu nikakve znakove stresa. Na početku testa pH ispitne vode treba biti između 6 i 9, a ukupna tvrdoća ne viša od 400 mg/l kao CaCO3. Međutim, ako se sumnja u postojanje interakcije između iona tvrdoće i ispitivane tvari, trebalo bi koristiti vodu manje tvrdoće (samim time, u toj se situaciji ne smije koristiti medij Elendt M4). Tijekom cijele studije trebalo bi koristiti istu vrstu vode. Najmanje dvaput godišnje ili kada se sumnja da su se svojstva kakvoće vode navedena u Dodatku 4. značajno promijenila, treba izmjeriti ta svojstva.
                           
                        
                     Radne otopine - sedimenti obrađeni spikingom
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Sedimenti obrađeni spikingom odabrane koncentracije obično se pripremaju dodavanjem otopine ispitivane tvari izravno u sediment. Radna otopina ispitivane tvari otopljena u deioniziranoj vodi miješa se s formuliranim sedimentom valjkastim mlinom, miješalicom hrane ili ručnim miješanjem. Ako je ispitivana tvar slabo topljiva u vodi, može se otopiti u što je moguće manjem volumenu prikladnog organskog otapala (npr. heksan, aceton ili klorofor). Ta se otopina potom miješa s 10 g finog kremenog pijeska za jednu ispitnu posudu. Otapalo se pusti da ispari i mora se u cijelosti ukloniti iz pijeska; potom se pijesak miješa s prikladnom količinom sedimenta po ispitnoj laboratorijskoj čaši. Samo lako hlapljiva sredstva mogu se koristiti za otapanje, dispergiranje ili emulgiranje ispitivane tvari. Treba imati na umu da se pijesak koji nastane miješanjem ispitivane tvari i pijeska mora uzeti u obzir prilikom pripreme sedimenta (tj. sediment stoga treba pripremiti s manje pijeska). Treba se pobrinuti da se ispitivana tvar koja se dodaje u sediment temeljito i ravnomjerno rasprši u sedimentu. Ako je potrebno, mogu se analizirati i poduzorci kako bi se odredio stupanj homogenosti.
                           
                        PLAN ISPITIVANJA
                  
                              17.
                           
                           
                              Plan ispitivanja odnosi se na odabir broja i raspored ispitnih koncentracija, na broj posuda za svaku koncentraciju i na broj ličinki po posudi. Opisani su planovi za procjenu točke koncentracije s učinkom (EC), za procjenu najviše koncentracije bez vidljivog učinka (NOEC) i za provođenje graničnog ispitivanja.
                           
                        
                     Plan za regresijsku analizu
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Koncentracija s učinkom (npr. EC15, EC50) i raspon koncentracije, iznad kojega je učinak ispitivane tvari od interesa, trebaju obuhvaćati koncentracije uključene u ispitivanje. Općenito, preciznost, a posebno valjanost, s kojom se mogu procijeniti koncentracije s učinkom (ECx), poboljšavaju se kad se koncentracija s učinkom nalazi unutar raspona ispitnih koncentracija. Treba izbjegavati ekstrapolaciju ispod najniže pozitivne koncentracije ili iznad najviše koncentracije. Preliminarno ispitivanje za određivanje raspona korisno je za odabir raspona koncentracija koji će se koristiti (vidjeti stavak 27.).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Ako treba procijeniti ECx, treba ispitati najmanje pet koncentracija i tri višestruka određivanja. U svakom se slučaju savjetuje korištenje dovoljnog broja ispitnih koncentracija kako bi se dobila dobra procjena modela. Faktor između koncentracija ne bi smio biti veći od dva (iznimka se može učiniti u slučajevima kada krivulja odgovora na dozu ima plitak nagib). Broj višestrukih određivanja u svakom tretmanu može se sniziti ako se poveća broj ispitnih koncentracija različitog odgovora. Povećanjem broja višestrukih određivanja ili smanjivanje trajanja intervala ispitnih koncentracija obično dovodi do užih intervala pouzdanosti. Dodatna višestruka određivanja potrebna su ako treba procijeniti 10 - dnevno preživljavanje i rast ličinki.
                           
                        
                     Plan za procjenu NOEC-a/LOEC-a
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Ako treba procijeniti LOEC (najnižu koncentraciju s vidljivim učinkom) i NOEC (najvišu koncentraciju bez vidljivog učinka), treba koristiti pet ispitnih koncentracija u najmanje četiri višestruka određivanja, a faktor između koncentracija ne bi smio biti veći od dva. Broj višestrukih određivanja trebao bi biti dovoljan da osigura adekvatnu statističku snagu kojom će otkriti 20 % razlike od kontrolne posude pri razini značajnosti od 5 % (p = 0,05). Kod brzine razvoja obično je prikladna analiza varijance (ANOVA), kao što su Dunnettov test i Williamsov test (17)(18)(19)(20). Kod omjera preobrazbe mogu se koristiti Cochran-Armitageov test, Fisherov test (s Bonferronijevom korekcijom) ili Mantel-Haenszelov test.
                           
                        
                     Granično ispitivanje
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Može se provesti granično ispitivanje (jedna ispitna koncentracija i kontrolna posuda) ako se u preliminarnom testu za određivanje raspona ne vide nikakvi učinci. Svrha graničnog ispitivanja jest provesti ispitivanje na koncentracijama dovoljno visokim da omogući donositeljima odluke da isključe moguće toksične učinke ispitivane tvari, a granica se postavlja na koncentraciju za koju se ne očekuje da će se pojaviti u bilo kojoj situaciji. Preporučuje se 1 000 mg/kg (suha masa). Obično je potrebno najmanje šest višestrukih određivanja i za ispitnu i za kontrolnu posudu. Treba pokazati adekvatnu statističku snagu kojom će se otkriti 20 % razlike od kontrolne posude pri razini značajnosti od 5 % (p = 0,05). Kod metričkog odgovora (brzina razvoja i masa) t-test je prikladna statistička metoda ako podaci zadovoljavaju zahtjeve tog testa (normalnost, homogene varijance). Ako ti zahtjevi nisu ispunjeni, mogu se koristiti t-test nejednake varijance ili neparametarski test, kao što je Wilcoxon-Mann-Whitheyev test. Kod omjera preobrazbe prikladan je Fisherov test.
                           
                        POSTUPAK
                  
                     Uvjeti izlaganja
                  
                  
                     Priprema sustava sediment/voda spikingom
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Postupak spikinga opisan u ispitnoj metodi C.8: Toksičnost za gujavice preporučuje se za primjenu ispitivane tvari (14). Sedimenti obrađeni spikingom stavljaju se u posude pa se dodaje voda iznad sedimenta, i to u omjeru sedimenta i vode 1:4 (vidjeti stavke 11. i 15.). Dubina sloja sedimenta trebala bi se kretati u rasponu od 1,5 - 3 cm. Da bi se izbjeglo razdvajanje sastojaka sedimenta i resuspendiranje finog materijala tijekom dodavanja ispitne vode u vodeni stupac, sediment se može prekriti plastičnim diskom dok se na njega lijeva voda, a disk se miče odmah nakon toga. Mogu biti prikladni i drugi predmeti.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Ispitne posude bi trebale biti pokrivene (npr. staklenim pločama). Ako je potrebno, tijekom studije se u izvorni volumen vode nadolijeva još vode kako bi se nadomjestilo isparavanje vode. To bi se trebalo činiti pomoću destilirane ili deionizirane vode kako bi se spriječilo stvaranje soli.
                           
                        
                     Stabilizacija
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Kad se pripremi sediment postupkom spikinga s vodom iznad sedimenta, poželjno je dopustiti razdiobu ispitivane tvari iz tekućeg stanja u sediment (3)(4)(6)(13). To bi se po mogućnosti trebalo učiniti u uvjetima temperature i dozračivanja koji se koriste u ispitivanju. Prikladno vrijeme uravnoteženja specifično je za svaki sediment i kemikaliju, a može se kretati od nekoliko sati pa sve do nekoliko dana, pa čak u rijetkim slučajevima i do nekoliko tjedana (4-5 tjedana). Budući da je time ostavljeno dovoljno vremena za razgradnju brojnih kemikalija, ne čeka se uravnoteženje, ali se preporučuje vrijeme uravnoteženja od 48 sati. Na kraju tog dodatnog vremena uravnoteženja treba izmjeriti koncentraciju ispitivane tvari u vodi iznad sedimenta, pornoj vodi i u sedimentu, barem u najvišoj koncentraciji i u jednoj nižoj (vidjeti stavak 38.). Ta analitička određivanja ispitivane tvari omogućuju izračun bilance mase i izražavanje rezultata na temelju izmjerenih koncentracija.
                           
                        
                     Dodavanje ispitnih organizama
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Četiri do pet dana prije dodavanja ispitnih organizama u ispitne posude, mase jajašaca bi se trebale izvaditi iz kultura i staviti u male posude u hranjivu podlogu za uzgoj kulture. Mogu se koristiti stara hranjiva podloga iz matične kulture ili svježe pripremljena hranjiva podloga za uzgoj kulture. Ako se koristi potonja, hranjivoj podlozi za uzgoj kulture treba dodati manju količinu hrane, npr. zelenih algi i/ili nekoliko kapljica suspenzije fino usitnjenih pahuljica riblje hrane (vidjeti Dodatak 2.). Treba koristiti samo svježe položene mase jajašaca. Valjenje ličinki obično počinje nekoliko dana nakon polaganja jajašaca (2 do 3 dana za Chironomus riparius na 20 °C i 1 do 4 dana za Chironomus tentans na 23 °C i za Chironomus yoshimatui na 25 °C), a ličinke se razvijaju u četiri stadija razvoja, od kojih svaki traje 4-8 dana. U ispitivanju treba koristiti ličinke iz prvog stadija razvoja (2-3 ili 1-4 dana poslije valjenja). Stadij mušica moguće je provjeriti pomoću širine kapsule glave (6).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Dvadeset ličinki iz prvog stadija razvoja stavljaju se nasumice u svaku ispitnu posudu koja sadržava vodu i sediment obrađen spikingom, i to pomoću tupe pipete. Treba zaustaviti dozračivanje vode tijekom dodavanja ličinki u ispitne posude i tako treba ostati još 24 sata nakon dodavanja ličinki (vidjeti stavke 25. i 32.). Prema upotrijebljenom planu ispitivanja (vidjeti stavke 19. i 20.) broj ličinki po koncentraciji iznosi najmanje 60 za procjenu točke EC-a i 80 za određivanje NOEC-a.
                           
                        
                     Ispitne koncentracije
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Ispitivanje za određivanje raspona može biti korisno za određivanje raspona koncentracija za konačno ispitivanje. U tu se svrhu koristi niz široko razmaknutih koncentracija ispitivane tvari. Da bi se dobila ista gustoća površine po trzalcu, koja će se koristiti i u konačnom ispitivanju, trzalci se izlažu svakoj koncentraciji ispitivane tvari tijekom vremena koje omogućuje procjenu odgovarajućih ispitnih koncentracija, a nisu potrebna višestruka određivanja.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              O ispitnim koncentracijama za konačno ispitivanje odlučuje se na temelju rezultata ispitivanja za određivanje raspona. Trebalo bi koristiti i odabrati najmanje pet koncentracija, kao što je to opisano u stavcima 18. do 20.
                           
                        
                     Kontrolne posude
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              U ispitivanje bi, s odgovarajućim brojem višestrukih određivanja, trebalo uključiti kontrolne posude bez ispitivane tvari, ali sa sedimentom (vidjeti stavke 19.-20.). Ako se za primjenu ispitivane tvari koristilo otapalo (vidjeti stavak 16.), treba dodati i kontrolnu posudu s otapalom sedimenta.
                           
                        
                     Sustav ispitivanja
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Koriste se statički sustavi. Polustatični ili protočni sustavi sa stalnim ili isprekidanim obnavljanjem vode iznad sedimenta mogu se koristiti u iznimnim slučajevima, na primjer ako specifikacije kakvoće vode postanu neprikladne za ispitni organizam ili ako utječu na uravnoteženje kemikalije (npr. ako razine otopljenog kisika previše padnu, ako se previše povisi koncentracija proizvoda izlučivanja ili ako iz sedimenta cure minerali koji utječu na pH i/ili tvrdoću vode). Međutim, obično su dostatne i daje se prednost drugim metodama poboljšanja kakvoće vode iznad sedimenta, kao što je dozračivanje.
                           
                        
                     Hrana
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Potrebno je hraniti ličinke, po mogućnosti svakodnevno ili najmanje triput tjedno. Čini se da je riblja hrana (suspenzija u vodi fino usitnjene hrane, npr. Tetra-Min ili Tetra-Phyll; pojedinosti vidjeti u Dodatku 2.) u količini od 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg za C. yoshimatui) dnevno po ličinki prikladna za mlade ličinke prvih 10 dana. Za starije će ličinke biti potrebno malo više hrane: 0,5 - 1 mg dnevno po ličinki trebalo bi biti dostatno za ostatak ispitivanja. Porcije hrane treba smanjiti u svim tretmanima te kontrolirati rastu li gljivice i primijeti li se smrtnost u kontrolnim posudama. Ako se ne može zaustaviti rast gljivica, ispitivanje treba ponoviti. Kada se ispituju jako adsorptive tvari (npr. čiji je log Kow > 5) ili tvari koje stvaraju kovalentne veze sa sedimentom, formuliranom se sedimentu prije faze stabilizacije može dodati količina hrane neophodna za osiguranje preživljavanja i prirodnog rasta organizama. U tu se svrhu, umjesto riblje hrane, mora koristiti biljni materijal, npr. može se dodati 0,5 % (suha masa) fino usitnjenog lišća npr. velike koprive (Urtica dioica), duda (Morus alba), bijele djeteline (Trifolium repens), špinata (Spinacia oleracea) ili nekog drugog biljnog materijala (Cerophyl ili alfa-celuloze).
                           
                        
                     Uvjeti za inkubaciju
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Blago dozračivanje vode iznad sedimenta u ispitnim posudama osigurava se po mogućnosti 24 sata poslije dodavanja ličinki i traje tako tijekom cijelog ispitivanja (treba se pobrinuti da koncentracija otopljenog kisika ne padne ispod 60 posto ASV-a). Dozračivanje se vrši putem staklene pasterove pipete pričvršćene 2-3 cm iznad sloja sedimenta (tj. jedan ili par mjehurića/s). Pri ispitivanju hlapljivih kemikalija može se pobrinuti da se ne dozračuje sustav sediment/voda.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Ispitivanje se provodi na konstantnoj temperaturi od 20 °C (± 2 °C). Za C. tentans i C. yoshimatui preporučene temperature su 23 °C odnosno 25 °C (± 2 °C). Koristi se fotoperiod od 16 sati, a jačina svjetlosti treba biti 500 do 1 000 luksa.
                           
                        
                     Trajanje izlaganja
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Izlaganje počinje dodavanjem ličinki u posude sa sedimentom obrađenim spikingom i kontrolne posude. Maksimalno trajanje izlaganja je 28 dana za C. riparius i C. yoshimatsui, a 65 dana za C. tentans. Ako se ličinke prije preobraze u mušice, ispitivanje se može prekinuti nakon minimalno pet dana nakon što se i zadnja ličinka u kontrolnoj posudi preobrazi u odraslu životinju.
                           
                        
                     Promatranja
                  
                  
                     Preobrazba
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Određuju se vrijeme razvoja i ukupni broj muških i ženskih mušica koje su se u cijelosti preobrazile. Mužjaci se lako razaznaju po svojim dlakavim ticalima.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Ispitne posude treba promatrati najmanje triput tjedno da bi se vizualno procijenilo svako nenormalno ponašanje (npr. napuštanje sedimenta, neuobičajeno plivanje) u usporedbi s kontrolnim posudama. Tijekom razdoblja očekivane preobrazbe potrebno je svakodnevno brojati preobražene mušice. Svakodnevno se vodi evidencija i o spolu i broju preobraženih mušica. Nakon identifikacije mušice se vade iz posuda. Treba zabilježiti sve mase jajašaca položene prije prekida ispitivanja te iste treba izvaditi kako bi se spriječilo ponovno uvođenje ličinki u sediment. Također se bilježi i broj vidljivih kukuljica koje se nisu uspjele preobraziti. Smjernice o mjerenju preobrazbe navedene su u Dodatku 5.
                           
                        
                     Rast i preživljavanje
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Ako treba dobiti podatke o 10-dnevnom preživljavanju i rastu ličinki, na samom početku treba dodatne ispitne posude kako bi ih se moglo naknadno koristiti. Sediment iz tih dodatnih posuda prosijava se kroz sito od 250 μm kako bi se zadržale ličinke. Kriteriji za smrt jesu nepomičnost ili izostanak reakcije na mehaničke podražaje. I neoporavljene ličinke treba prebrojati kao mrtve (možda su mikrobi već razgradili ličinke koje su uginule na početku ispitivanja). Određuje se suha masa (bez pepela) preživjelih ličinki po svakoj ispitnoj posudi pa se izračunava srednja pojedinačna suha masa po posudi. Korisno je odrediti kojem stadiju razvoja pripadaju preživjele ličinke; za to se može upotrijebiti mjerenje širine kapsule glave svake ličinke.
                           
                        
                     Analitička mjerenja
                  
                  
                     Koncentracija ispitivane tvari
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Prije početka ispitivanja (tj. dodavanja ličinki) vade se uzorci cjelovitog sedimenta iz najmanje jedne posude po tretmanu radi analitičkog određivanja koncentracije ispitivane tvari u sedimentu. Preporučuje se da se na početku (vidjeti stavak 24.) i na kraju ispitivanja analiziraju, kao minimum, uzorci vode iznad sedimenta, porne vode i sedimenta, i to u najvišoj koncentraciji i u nekoj nižoj. Ta određivanja koncentracije ispitivane tvari daju informacije o ponašanju/razdiobi ispitivane tvari u sustavu voda/sediment.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Kada se provode posredna mjerenja (npr. 7. dana) te ako su za analizu potrebni veliki uzorci koji se ne mogu uzeti iz ispitnih posuda, a da to pritom ne utječe na sustav ispitivanja, analitička određivanja treba provoditi na uzorcima iz dodatnih ispitnih posuda koje se tretiraju na isti način (uključujući i prisustvo ispitnih organizama), ali koje se ne koriste za biološka promatranja.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Preporučeni postupak za izoliranje međuprostorne vode jest centrifugiranje na npr. 10 000 g i 4 °C tijekom 30 min. Međutim, ako se pokaže da se ispitivana tvar ne adsorbira na filtre, prihvatljiva bi mogla biti i filtracija. U nekim slučajevima možda neće biti moguće analizirati koncentracije u pornoj vodi jer je uzorak premalen.
                           
                        
                     Fizikalno-kemijski parametri
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Na odgovarajući način treba izmjeriti pH i temperaturu u ispitnim posudama (vidjeti stavak 10.). Tvrdoću i amonijak treba mjeriti u kontrolnim posudama i u jednoj ispitnoj posudi u najvišoj koncentraciji na početku i na kraju ispitivanja.
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Obrada rezultata
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Cilj ovog ispitivanja jest odrediti učinak ispitivane tvari na brzinu razvoja i ukupni broj potpuno preobraženih muških i ženskih mušica ili, u slučaju 10-dnevnog ispitivanja, učinke na preživljavanje i masu ličinki. Ako ne postoje naznake statistički različite osjetljivosti spolova, rezultati mužjaka i ženki mogu se ujediniti radi statističke analize. Razlike u osjetljivosti spolova mogu se statistički prosuditi, npr. tabličnim testom χ2-r × 2. Preživljavanje ličinki i njihova srednja pojedinačna suha masa po posudi moraju se odrediti nakon deset dana kada je to potrebno.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Koncentracije s učinkom izražene i utemeljene na suhoj masi izračunavaju se po mogućnosti na temelju koncentracija u sedimentu izmjerenih na početku ispitivanja (vidjeti stavak 38.).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Za izračun procjene točke EC50 ili bilo koje druge ECx kao dodatna ponovna određivanja mogu se koristiti statistički podaci dobiveni za svaku posudu. U izračunu intervala pouzdanosti za bilo koji ECx u obzir treba uzeti varijabilnost između posuda ili se treba pokazati da je ta varijabilnost toliko neznatna da se može ignorirati. Kad se model prilagođava metodi najmanjih kvadrata, na statističke podatke za svaku posudu treba primijeniti transformaciju kako bi se poboljšala homogenst varijance. Međutim, vrijednosti ECx trebale bi se izračunati tek nakon što se odgovor transformira natrag u izvornu vrijednost.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Kada je cilj statističke analize određivanje NOEC-a/LOEC-a testiranjem hipoteze, u obzir se mora uzeti varijabilnost među posudama, npr. ugniježđenom ANOVA-om. Kao druga mogućnost, u situacijama kada se pobiju pretpostavke uobičajene ANOVA-e, mogu biti prikladna i robusnija ispitivanja (21).
                           
                        
                     Omjer preobrazbe
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Omjeri preobrazbe su kvantalni podaci i mogu se analizirati Cochran-Armitageovim testom koji se primjenjuje snižavanjem korak po korak kada se očekuje odgovor na monotoničnu dozu i kad se ti podaci slažu s tim očekivanjem. Ako to nije slučaj, mogu se koristiti Fisherov test ili Mantel-Haenszelov test s Bonferroni-Holmovim prilagođenim p-vrijednostima. Ako ima dokaza za još veću varijabilnost između višestrukih određivanja u istoj koncentraciji nego što bi to naznačila binomijalna raspodjela (često zvana i ‚ekstra-binomijalna’ varijacija), treba primijeniti robusni Cochran-Armitageov ili Fisherov test kakvi su predloženi u (21).
                              Određuje se broj mušica preobraženih po posudi, ne, koji se onda dijeli brojem uvedenih ličinki, na:
                              
                                 
                              gdje je:
                              
                                          
                                             ER
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          omjer preobrazbe
                                       
                                    
                                          
                                             ne
                                             
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          broj preobraženih mušica po posudi
                                       
                                    
                                          
                                             na
                                             
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          broj uvedenih ličinki po posudi
                                       
                                    
                        
                              47.
                           
                           
                              Najprikladnija alternativa za velike uzorke, kada postoji ekstra-binomijalna varijanca, jest tretirati omjer preobrazbe kao kontinuirani odgovor te primijeniti postupke poput Williamovog testa kada se očekuje odgovor na monotoničnu dozu i kad je isti u skladu s tim ER podacima. Dunnettov bi test bio prikladan gdje nema monotoničnosti. Veliki uzorak se ovdje definira kao broj preobraženih mušica i broj nepreobraženih mušica veći od pet, i to na osnovi ponovljenog određivanja (posude).
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Za primjenu vrijednosti ANOVA vrijednosti ER-a moraju se prvo transformirati arkus sinus drugi korijen transformacijom ili Freeman-Tukeyovom transformacijom kako bi se dobila približna normalna raspodjela i ujednačile varijance. Kad se koriste apsolutne frekvencije, mogu se primijeniti Cochran-Armitageov, Fisherov (Bonferronijev) ili Mantel-Haenszelov test. Arkus sinus drugi korijen transformacija primjenjuje se tako što se uzme inverzni sinus (sin–1) drugog korijena ER-a.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Za omjere preobrazbe vrijednosti ECx računaju se regresijskom analizom (ili npr. probit (22), logit, Weibull, prikladan komercijalni softver itd.). Ako regresijka analiza ne uspije (npr. kad imamo manje od dva djelomična odgovora), koriste se druge neparametarske metode, kao što su pomični prosjek ili jednostavna interpolacija.
                           
                        
                     Brzina razvoja
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Srednje vrijeme razvoja predstavlja srednji raspon vremena između uvođenja ličinki (0. dan ispitivanja) i njihove preobrazbe u pokusnu skupinu mušica. (Za izračun stvarnog vremena razvoja u obzir treba uzeti starost ličinki u trenutku uvođenja). Brzina razvoja recipročna je vremenu razvoja (jedinica: 1/dan) i predstavlja dio razvoja ličinki koji se odvija tijekom jednog dana. Brzina razvoja preferira se za evaluaciju ovih studija o toksičnosti sedimenta jer je njezina varijanca niža, a homogenija je i bliža normalnoj raspodjeli u usporedbi s vremenom razvoja. Stoga se mogu koristiti moćni postupci parametarskih testova s brzinom razvoja radije nego s vremenom razvoja. Za brzinu razvoja kao kontinuirani odgovor mogu se procijeniti vrijednosti ECx regresijskom analizom (npr. (23), (24)).
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Za sljedeće statističke testove pretpostavlja se da se broj mušica zamijećen na dan pregleda x preobrazio u srednjem vremenskom intervalu između dana x i dana x - l (l = trajanje intervala pregleda, obično 1 dan). Srednja brzina razvoja po posudi (‾x) računa se prema:
                              
                                 
                              gdje je:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          srednja brzina razvoja po posudi
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          indeks intervala pregleda
                                       
                                    
                                          
                                             m
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          maksimalni broj intervala pregleda
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          broj mušica preobraženih u intervalu pregleda i
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          ukupni broj mušica preobraženih na kraju pokusa (= )
                                       
                                    
                                          xi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          brzina razvoja mušica preobraženih u intervalu i
                                       
                                    
                                 
                              gdje je:
                              
                                          dayi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          dan pregleda (dani od primjene)
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          trajanje intervala pregleda i (dani, obično 1 dan)
                                       
                                    
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Izvješće o ispitivanju mora sadržavati barem sljedeće podatke:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana tvar:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizikalno stanje i, gdje je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva (topljivost u vodi, tlak pare, podjelni koeficijent u tlu (ili u sedimentu ako postoji), stabilnost u vodi itd.);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci za identifikaciju kemikalije (opći naziv, kemijski naziv, CAS broj itd.), uključujući i čistoću i analitičku metodu kvantifikacije ispitivane tvari.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitne vrste:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korištene ispitne životinje: vrsta, znanstveni naziv, izvor organizama i uvjeti uzgoja;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci o rukovanju masama jajašaca i ličinkama;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      starost ispitnih životinja u trenutku umetanja u ispitne posude.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korišteni sediment, tj. prirodni ili formulirani sediment;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      za prirodni sediment lokacija i opis mjesta uzorkovanja sedimenta, uključujući, po mogućnosti, povijest onečišćenja, svojstva: pH, sadržaj organskog ugljika, omjer C/N i granulometrija (ako je prikladno);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      priprema formuliranog sedimenta: sastojci i svojstva (sadržaj organskog ugljika, pH, vlaga itd. na početku ispitivanja);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      priprema ispitne vode (ako se koristi obrađena voda) i svojstva (koncentracija kisika, pH, provodljivost, tvrdoća itd. na početku ispitivanja);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dubina sedimenta i vode iznad sedimenta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      volumen vode iznad sedimenta i porne vode, masa mokrog sedimenta sa i bez porne vode;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ispitne posude (materijal i veličina);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda obrađivanja sedimenta spikingom: korištene ispitne koncentracije, broj višestrukih određivanja i uporaba otapala, ako je isti korišten;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      faza stabilizacijskog uravnoteženja sustava sediment/voda obrađenog spikingom: trajanje i uvjeti;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uvjeti inkubacije: temperatura, ciklus i jačina svjetlosti, dozračivanje (učestalost i intenzitet);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detaljni podaci o hranjenju, uključujući i vrstu hrane, pripremu, količinu i režim hranjenja.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nazivne ispitne koncentracije, izmjerene ispitne koncentracije i rezultati svih analiza za određivanje koncentracije ispitivane tvari u ispitnoj posudi;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kakvoća vode u ispitnim posudama, tj. pH, temperatura, otopljeni kisik, tvrdoća i amonijak;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nadolijevanje isparene ispitne vode, ako je bilo;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj preobraženih muških i ženskih mušica po posudi i po danu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj ličinki koje se nisu preobrazile u mušice po posudi;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      srednja pojedinačna suha masa ličinki po posudi i po stadiju razvoja, ako je to primjereno;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      postotak preobrazbe po određivanju i ispitnoj koncentraciji (muške i ženske mušice zajedno);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      srednja brzina razvoja potpuno preobraženih mušica po određivanju i brzina tretmana (muške i ženske mušice zajedno);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      procjena toksičnih konačnih učinaka, npr. ECx (i s time povezani intervali pouzdanosti), NOEC i/ili LOEC, te statističke metode korištene za njihovo određivanje;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rasprava o rezultatima, uključujući i svaki utjecaj na rezultate ispitivanja nastao uslijed odstupanja od ove ispitne metode.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Ispitna metoda C.8 ovog Priloga, Toksičnost za gujavice.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312.
                           
                        
                     Dodatak 1.
                     DEFINICIJE
                     Za potrebe ove ispitne metode koriste se sljedeće definicije:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Formulirani sediment ili obrađeni, umjetni ili sintetički sediment je smjesa tvari koja se koristi za oponašanje fizikalnih sastojaka prirodnog sedimenta.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Voda iznad sedimenta je voda koja se ispitnoj posudi nalazi iznad sedimenta.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Međuprostorna voda ili porna voda je voda u prostoru između sedimenta i čestica tla.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sediment obrađen spikingom je sediment u koji je dodana ispitivana tvar.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ispitivana kemikalija: Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom ispitnom metodom.
                              
                           
                  
                     Dodatak 2.
                     
                        Preporuke za uzgoj kulture Chironomus riparius
                        
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Ličinke vrste Chironomus mogu se uzgajati u posudama za kristalizaciju ili velikim spremnicima. Fini kremeni pijesak nanese se u tankom sloju dubine oko 5 do 10 mm po dnu spremnika. Također se pokazalo da je dijatomejska zemlja (npr. Merck, Art 8117) prikladan supstrat (dostatan je tanji sloj od svega par mm). Potom se dodaje prikladna voda u dubini od nekoliko cm. Trebalo bi nadolijevati vodu po potrebi kako bi se zamijenila voda izgubljena isparavanjem i spriječilo isušivanje. Voda se po potrebi može nadolijevati. Treba osigurati blago dozračivanje. Posude za uzgoj ličinki trebale bi se držati u prikladnom kavezu koji će spriječiti bijeg preobraženih odraslih životinja. Kavez treba biti dovoljno velik da se preobražene odrasle životinje mogu rojiti, u protivnom možda neće doći do kopulacije (minimalno oko 30 × 30 × 30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Kaveze treba držati na sobnoj temperaturi ili u prostoriji s konstantnim okolišem na 20 ± 2 °C s fotoperiodom od 16 sati svjetlosti (jačine oko 1 000 luksa), 8 sati mraka. Iz raznih izvješća saznajemo da vlažnost zraka ispod 60 % RV može spriječiti razmnožavanje.
                              
                           
                        Voda za razrjeđivanje
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Može se koristiti bilo koja prikladna prirodna ili sintetička voda. Obično se koriste izvorska voda, deklorirana voda iz slavine i umjetni mediji (npr. mediji Elendt ‚M4’ ili ‚M7’, vidjeti u nastavu teksta). Voda se prije uporabe mora dozračiti. Ako je to potrebno, voda za uzgoj kulture može se obnoviti pažljivim izlijevanjem korištene vode iz posuda za uzgoj kulture, izravno ili putem sifona, da se pritom ne unište cjevčice s ličinkama.
                              
                           
                        Hranjenje ličinki
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Ličinke vrste Chironomus treba hraniti pahuljicama riblje hrane (Tetra Min®, Tetra Phyll® ili neka druga slična robna marka riblje hrane), i to otprilike 250 mg dnevno po posudi. Hrana se može dati i kao suhi usitnjeni prah ili kao suspenzija u vodi: 1,0 g pahuljaste hrane doda se u 20 ml vode za razrjeđivanje i izmiješa u homogenu smjesu. Taj se pripravak može dodavati brzinom od oko 5 ml dnevno po posudi (protresti prije uporabe). Starije ličinke mogu dobiti više hrane.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Hranjenje se prilagođava kakvoći vode. Ako hranjiva podloga za uzgoj kultura postane ‚mutna’, treba smanjiti hranjenje. Dodavanje hrane mora se pažljivo nadzirati. Premalo hrane dovest će do prebacivanja ličinki prema vodenom stupcu, a previše hrane dovest će do povećane aktivnosti mikroba i sniženih koncentracija kisika. Oba ta uvjeta mogu dovesti do sniženih brzina rasta.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Također se mogu dodati i stanice nekih zelenih algi (npr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) kada se postavljaju nove posude za uzgoj kultura.
                              
                           
                        Hranjenje preobraženih odraslih životinja
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Neki izvođači pokusa sugerirali su da bi vuneni podložak namočen u zasićenoj šećernoj otopini mogao poslužiti kao hrana za preobražene odrasle životinje.
                              
                           
                        Preobrazba
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Na 20 ± 2 °C ličinke se počinju preobražavati u odrasle životinje iz posuda za uzgoj ličinki nakon otprilike 13 - 15 dana. Mužjaci se lako razaznaju po svojim dlakavim ticalima.
                              
                           
                        Mase jajašaca
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Kad se u kavezu za uzgoj pojave odrasle životinje, u svim posudama za uzgoj ličinki triput tjedno treba provjeravati ima li položenih želatinoznih masa jajašaca. Ako ima masa jajašaca, njih treba pažljivo ukloniti. Treba ih prenijeti u malu posudu u kojoj se nalazi uzorak vode za uzgoj. Te se mase jajašaca koriste za postavljanje nove posude za uzgoj kulture (npr. 2 - 4 mase jajašaca/posudi) ili se koriste za testove toksičnosti.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Valjenje ličinki u prvom stadiju razvoja trebalo bi se zbiti nakon 2 - 3 dana.
                              
                           
                        Postavljanje novih posuda za uzgoj kulture
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Kad se kulture razviju, trebalo bi biti moguće postaviti novu posudu za uzgoj kulture jedanput tjedno ili rjeđe, ovisno o potrebama ispitivanja, i ukloniti starije posude nakon što se ličinke preobraze u odrasle mušice. Na taj će se način uz minimalno upravljanje stvarati redovita zaliha odraslih životinja.
                              
                           
                        Priprema ispitnih otopina ‚M4’ i ‚M7’
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendt (1990.) je opisao medij ‚M4’. Medij ‚M7’ priprema se kao medij ‚M4’, osim za tvari iz tablice 1., za koje su koncentracije četiri puta niže u ‚M7’ od onih u ‚M4’. Publikacija o mediju ‚M7’ trenutačno se priprema (Elendt, osobna prepiska). Ispitnu otopinu ne treba pripremati prema Elendtu i Biasu (1990.) jer koncentracije NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 i K2HPO4 navedene za pripremu radnih otopina nisu adekvatne.
                              
                           
                        Priprema medija ‚M7’
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Svaka se radna otopina (I) priprema zasebno, a kombinirana radna otopina (II) priprema se iz tih radnih otopina (I) (vidjeti tablicu 1.). Za pripremu medija ‚M7’ miješa se pedeset ml kombinirane radne otopine (II) i količine svake radne otopine makronutrijenata navedene u tablici 2. do ukupno 1 litre deionizirane vode. Vitaminska radna otopina priprema se dodavanjem triju vitamina u deioniziranu vodu, kao što je naznačeno u tablici 3., a 0,1 ml kombinirane vitaminske radne otopine dodaje se konačnom mediju ‚M7’ tik prije uporabe. (Vitaminska radna otopina čuva se zamrznuta u malim alikvotima). Medij se dozrači i stabilizira.
                              
                           
                        LITERATURA
                     
                     BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
                     
                        Tablica 1.
                     
                     
                        Radne otopine elemenata u tragovima za medij M4 i M7
                     
                     
                                 Radne otopine (I)
                              
                              
                                 Količina (mg) od koje se umiješa do 1 litre deionizirane vode
                              
                              
                                 Za pripremu kombinirane radne otopine (II): pomiješajte sljedeće količine (mg) radnih otopina (I) u do 1 litre deionizirane vode
                              
                              
                                 Konačne koncentracije u ispitnim otopinama (mg/l)
                              
                           
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                              
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                           
                                 H3BO3
                                     (15)
                                 
                              
                              
                                 57 190
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 2,86
                              
                              
                                 0,715
                              
                           
                                 MnCl2 · 4 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 7 210
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,361
                              
                              
                                 0,090
                              
                           
                                 LiCl (15)
                                 
                              
                              
                                 6 120
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,306
                              
                              
                                 0,077
                              
                           
                                 RbCl (15)
                                 
                              
                              
                                 1 420
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,071
                              
                              
                                 0,018
                              
                           
                                 SrCl2 · 6 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 3 040
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,152
                              
                              
                                 0,038
                              
                           
                                 NaBr (15)
                                 
                              
                              
                                 320
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,016
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 Na2MoO4 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 1 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,063
                              
                              
                                 0,016
                              
                           
                                 CuCl2 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 335
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,017
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 ZnCl2
                                 
                              
                              
                                 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,013
                              
                              
                                 0,013
                              
                           
                                 CaCl2 · 6 H2O
                              
                              
                                 200
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,010
                              
                              
                                 0,010
                              
                           
                                 KI
                              
                              
                                 65
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0033
                              
                              
                                 0,0033
                              
                           
                                 Na2SeO3
                                 
                              
                              
                                 43,8
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0022
                              
                              
                                 0,0022
                              
                           
                                 NH4VO3
                                 
                              
                              
                                 11,5
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,00058
                              
                              
                                 0,00058
                              
                           
                                 Na2EDTA · 2 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 5 000
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 2,5
                              
                              
                                 0,625
                              
                           
                                 FeSO4 · 7 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 1 991
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,249
                              
                           
                        
                     
                        Tablica 2.
                     
                     
                        Radne otopine makronutrijenata za medij M4 i M7
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Količina od koje se umiješa do 1 litre deionizirane vode
                                 (mg)
                              
                              
                                 Količina radnih otopina makronutrijenata koja se dodaje za pripremu medija M4 i M7
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Konačne koncentracije u ispitnim otopinama M4 i M7
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 CaCl2 · 2 H2O
                              
                              
                                 293 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 293,8
                              
                           
                                 MgSO4 · 7 H2O
                              
                              
                                 246 600
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                 123,3
                              
                           
                                 KC1
                              
                              
                                 58 000
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 5,8
                              
                           
                                 NaHCO3
                                 
                              
                              
                                 64 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 64,8
                              
                           
                                 NaSiO3 · 9 H2O
                              
                              
                                 50 000
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                 10,0
                              
                           
                                 NaNO3
                                 
                              
                              
                                 2 740
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,274
                              
                           
                                 KH2PO4
                                 
                              
                              
                                 1 430
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,143
                              
                           
                                 K2HPO4
                                 
                              
                              
                                 1 840
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,184
                              
                           
                        
                     
                        Tablica 3.
                     
                     
                        Vitaminska radna otopina za medij M4 i M7. Sve tri vitaminske otopine kombiniraju se u jednu vitaminsku radnu otopinu.
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Količina od koje se umiješa do 1 litre deionizirane vode
                                 (mg)
                              
                              
                                 Količina vitaminske radne otopine koja se dodaje za pripremu medija M4 i M7
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Konačne koncentracije u ispitnim otopinama M4 i M7
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 Tiamin-hidroklorid
                              
                              
                                 750
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,075
                              
                           
                                 Cijanokobalamin (B12)
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,0010
                              
                           
                                 Biotin
                              
                              
                                 7,5
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,00075
                              
                           
                        LITERATURA
                     
                     Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33.
                     Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167.
                  
                  
                     Dodatak 3.
                     PRIPREMA FORMULIRANOG SEDIMENTA
                     
                        Sastav sedimenta
                     
                     Formulirani sediment trebao bi imati sljedeći sastav:
                     
                                 Sastojak
                              
                              
                                 Svojstva
                              
                              
                                 % sedimenta
                                 suha masa
                              
                           
                                 Treset
                              
                              
                                 Sphagnum moss treset, što bliže pH području od 5,5-6,0, bez vidljivih ostataka biljaka, fino usitnjen (veličina čestica ≤ 1 mm) i sušen na zraku
                              
                              
                                 4 - 5
                              
                           
                                 Kremeni pijesak
                              
                              
                                 Veličina zrna: > 50 % čestica trebalo bi biti u rasponu od 50-200 μm
                              
                              
                                 75 - 76
                              
                           
                                 Kaolinitska glina
                              
                              
                                 Sadržaj kaolinita ≥ 30 %
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Organski ugljik
                              
                              
                                 Prilagođava se dodavanjem treseta i pijeska
                              
                              
                                 2 (± 0,5)
                              
                           
                                 Kalcijev karbonat
                              
                              
                                 CaCO3, u prahu, kemijski čist
                              
                              
                                 0,05 (- 0,1)
                              
                           
                                 Voda
                              
                              
                                 Provodljivost ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30 (- 50)
                              
                           
                        Priprema
                     
                     Treset se suši na zraku i usitnjava u fini prah. Priprema se suspenzija potrebne količine treseta u prahu u deioniziranoj vodi pomoću uređaja za homogenizaciju visoke djelotvornosti. pH te suspenzije podešava se u području od 5,5 ± 0,5 pomoću CaCO3. Suspenzija se priprema najmanje dva dana blagim miješanjem na 20 ± 2 °C kako bi se stabilizirala pH i uspostavila stabilna mikrobna komponenta. pH se ponovno mjeri i trebala bi iznositi 6,0 ± 0,5. Potom se suspenzija treseta miješa s ostalim sastojcima (pijeskom i kaolinitskm glinom) i deioniziranom vodom da bi se dobio homogeni sediment sa sadržajem vode u području od 30 - 50 posto suhe mase sedimenta. Još jednom se mjeri pH konačne smjese i podešava na 6,5 do 7,5 pomoću CaCO3 ako je potrebno. Uzimaju se uzorci sedimenta kako bi se odredili suha masa i sadržaj organskog ugljika. Potom se preporučuje da se formulirani sediment, prije uporabe u testu toksičnosti trzalaca, priprema sedam dana u istim uvjetima koji prevladavaju i u naknadnom ispitivanju.
                     
                        Skladištenje
                     
                     Suhi sastojci za pripremu umjetnog sedimenta mogu se skladištiti na suhom i hladnom mjestu na sobnoj temperaturi. Formulirani (mokri) sediment ne bi trebalo skladištiti prije uporabe u ispitivanju. Njega bi trebalo iskoristiti nakon razdoblja pripremanja od sedam dana koje završava pripremu.
                     
                        LITERATURA
                     
                     Poglavlje C.8 ovog Priloga. Toksičnost za gujavice.
                     Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20.
                  
                  
                     Dodatak 4.
                     
                        Kemijska svojstva prihvatljive vode za razrjeđivanje
                     
                     
                                 Tvar
                              
                              
                                 Koncentracije
                              
                           
                                 Lebdeće čestice
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Ukupni organski ugljik
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Neionizirani amonijak
                              
                              
                                 < 1 μg/l
                              
                           
                                 Tvrdoća kao CaCO3
                                 
                              
                              
                                 < 400 mg/l (17)
                                 
                              
                           
                                 Rezidualni klor
                              
                              
                                 < 10 μg/l
                              
                           
                                 Ukupni organofosforni pesticidi
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Ukupni organofosforni pesticidi plus poliklorirani bifenili
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Ukupni organski klor
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     Dodatak 5.
                     
                        Smjernice za praćenje preobrazbe ličinki trzalaca
                     
                     U ispitne laboratorijske čaše postave se zamke za preobražene životinje. Te su zamke potrebne od 20. dana do kraja ispitivanja. Slijedi crtež primjera korištenih zamki:
                     
                        
                     A: najlonski zaslon
                     B: obrnute plastične čaše
                     C: laboratorijska čaša za izlaganje bez usnika
                     D: priključci na zaslonu za promjenu vode
                     E: voda
                     F: sediment
                  
                  C.28.   TEST TOKSIČNOSTI TRZALACA (CHIRONOMIDAE) U VODI IZ SEDIMENTA S VODOM OBRAĐENOM SPIKINGOM
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda odgovara OECD TG 219 (2004.). Ova je ispitna metoda namijenjena procjeni učinaka produljenog izlaganja kemikalija ličinkama slatkovodnih dvokrilaca trzalaza (Chironomus sp) koje borave u sedimentu. Uglavnom se temelji na smjernici BBA u kojoj se koristi sustav ispitivanja sediment/voda s umjetnim tlom i scenarij izlaganja u vodenom stupcu (1). Ona također uzima u obzir i postojeće protokole testova toksičnosti za Chironomus riparius i Chironomus tentans koji su razvijeni u Europi i Sjevernoj Americi (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) i ispitani u prstenastom testu (1)(6)(9). Mogu se koristiti i druge vrste trzalaca o kojima postoji dobra dokumentacija, npr. Chironomus yoshimatsui (10)(11).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Scenarij izlaganja koji se koristi u ovoj ispitnoj metodi jest obrađivanje vode spikingom. Odabir prikladnog scenarija izlaganja ovisi o cilju provođenja testa. Cilj scenarija izlaganja u vodi, uključujući i obrade vodenog stupca spikingom, jest simulirati rasap pesticida, a obuhvaća i početne vršne koncentracije u pornoj vodi. Koristan je i za druge vrste izlaganja (uključujući i izlijevanja kemikalija), osim procesa akumulacije koji traju dulje od razdoblja ispitivanja.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Tvari koje treba ispitati na organizme koji žive u sedimentu obično u njemu opstaju tijekom duljih razdoblja. Organizmi iz sedimenta mogu se izlagati na razne načine. Relativna važnost svakog načina izlaganja i vrijeme potrebno da bi svaki od tih načina pridonio općim učincima toksičnosti ovise o fizikalno-kemijskim svojstvima predmetne kemikalije. Za jako adsorptivne tvari (npr. s log Kow > 5) ili za tvari koje se vežu sa sedimentom kovalentnim vezama značajan način izlaganja može biti gutanje kontaminirane hrane. Kako se ne bi podcijenila toksičnost jako lipofilnih tvari, može se u obzir uzeti uporaba hrane koja se dodaje sedimentu prije primjene ispitivane tvari. Da bi se u obzir uzeli svi potencijalni načini izlaganja, ova se ispitna metoda usredotočuje na dugotrajno izlaganje. Test traje u rasponu od 20 - 28 dana za C. riparius i C. yoshimatsui, a 28 - 65 dana za C. tentans. Ako su za neku specifičnu svrhu potrebni kratkotrajni podaci, primjerice radi istraživanja učinaka nestabilnih kemikalija, višestruka određivanja mogu se ukinuti nakon deset dana.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Izmjereni konačni učinci jesu ukupni broj odraslih životinja preobraženih u vrijeme preobrazbe. Preporučuje se da se preživljavanje i rast ličinki mjere tek nakon deset dana ako su potrebni dodatni kratkotrajni podaci, i to pomoću dodatnih višestrukih određivanja, ako je to prikladno.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Preporučuje se uporaba formuliranog sedimenta. Formulirani sediment ima nekoliko prednosti nad prirodnim sedimentima:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          pokusna varijabilnost je smanjena jer stvara mjerno obnovljivu ‚standardiziranu matricu’ te se eliminira potreba za pronalaženjem nekontaminiranih i čistih izvora sedimenta;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          testovi se mogu provoditi u bilo koje doba, a da se pritom ne suočava sa sezonskom varijabilnošću u ispitnom sedimentu, a nema ni potrebe za prethodnom obradom sedimenta radi uklanjanja urođene faune; uporaba formuliranog sedimenta također snižava troškove povezane s terenskim prikupljanjem dovoljnih količina sedimenta za rutinsko testiranje;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          uporaba formuliranog sedimenta omogućuje usporedbu toksičnosti i razvrstavanje tvari u skladu s tim: podaci o toksičnosti iz testova s prirodnim i umjetnim sedimentom mogli su se usporediti za nekoliko kemikalija (2).
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Korištene definicije navedene su u Dodatku 1.
                           
                        NAČELO ISPITIVANJA
                  
                              7.
                           
                           
                              Ličinke trzalaca u prvom stadiju razvoja izlažu se rasponu koncentracija ispitivane tvari u sustavima sediment/voda. Ispitivanje počinje stavljanjem ličinki u prvom stadiju razvoja u ispitne laboratorijske čaše u kojima se nalazi sustav sediment/voda i naknadnom obradom ispitivane tvari u vodi spikingom. Na kraju testa mjeri se brzina preobrazbe i razvoja trzalaca. Također se mogu mjeriti i preživljavanje i masa ličinki nakon deset dana, ako je to potrebno (pomoću dodatnih višestrukih određivanja, ako je to primjereno). Ti se podaci analiziraju bilo modelom regresijske analize s ciljem određivanja koncentracije koja bi izazvala × % smanjenje u preobrazbi, preživljavanju ili rastu ličinki (npr. EC15, EC50 itd.) bilo statističkim hipotetskim testiranjem s ciljem određivanja NOEC-a/LOEC-a. Za potonje je potrebna usporedba vrijednosti učinka s kontrolnim vrijednostima pomoću statističkih testova.
                           
                        INFORMACIJE O ISPITIVANOJ TVARI
                  
                              8.
                           
                           
                              Trebali bi biti poznati topljivost ispitivane tvari u vodi, njezin tlak pare, izmjerena ili izračunata razdioba u sedimentu i stabilnost u vodi i sedimentu. Treba biti dostupna pouzdana analitička metoda kvantifikacije ispitivane tvari u vodi iznad sedimenta, pornoj vodi i sedimentu, zajedno s poznatom i prijavljenom preciznošću i granicama detekcije. Korisne informacije obuhvaćaju strukturnu formulu i čistoću ispitivane tvari. Korisna informacija je još i kemijska sudbina ispitivane tvari (npr. rasipanje, abiotička i biotička razgradnja itd.). Daljnje smjernice za testiranje tvari čija su fizikalno-kemijska svojstva takva da je zbog njih teško provoditi testove nalaze se u (12).
                           
                        REFERENTNE KEMIKALIJE
                  
                              9.
                           
                           
                              Referentne kemikalije mogu se ispitivati periodično kako bi se osigurala pouzdanost protokola i uvjeta ispitivanja. Primjeri referentnih toksičnih tvari koji se uspješno koriste u prstenastim testovima i validacijskim studijama jesu: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid i kalijev klorid. (1)(2)(5)(6)(13).
                           
                        VALJANOST ISPITIVANJA
                  
                              10.
                           
                           
                              Da bi test bio valjan, primjenjuju se sljedeći uvjeti:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          postotak preobrazbe u kontrolnim posudama mora na kraju testa iznositi najmanje 70 %. (1)(6);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          preobrazba vrsti C. riparius i C. yoshimatsui u odrasle životinje u kontrolnim posudama treba se odviti između 12. i 23. dana nakon njihova umetanja u posude; za vrstu C. tentans potrebno je razdoblje od 20 do 65 dana.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          na kraju testa treba u svakoj posudi izmjeriti pH i koncentraciju otopljenog kisika. Koncentracija kisika treba iznositi najmanje 60 % vrijednosti zasićenosti kisikom (ASV) na određenoj temperaturi, a pH vode iznad sedimenta treba biti u rasponu od 6-9 u svim ispitnim posudama;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          temperatura vode ne bi se smjela razlikovati za više od ± 1,0 °C. Temperatura vode može se kontrolirati izotermičkom sobom i u tom slučaju temperatura u prostoriji treba se potvrđivati u odgovarajućim vremenskim razmacima.
                                       
                                    
                        OPIS METODE
                  
                     Ispitne posude
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Studija se provodi u staklenim laboratorijskim čašama od 600 ml promjera 8 cm. Prikladne su i druge posude, ali se mora zajamčiti da je i u njima prikladna dubina sedimenta i vode iznad sedimenta. Površina sedimenta mora biti dovoljno velika da po svakoj ličinki bude 2 do 3 cm2 površine. Omjer dubine sloja sedimenta i dubine vode iznad sedimenta treba biti 1:4. Ispitne posude i druga aparatura koja dolazi u doticaj sa sustavom ispitivanja treba biti načinjena u cijelosti od stakla ili nekog drugog kemijski inertnog materijala (npr. teflona).
                           
                        
                     Odabir vrste
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Vrsta koju treba koristiti u ovom testu po mogućnosti je Chironomus riparius. I vrsta Chironomus tentans također je prikladna, ali je njome teže rukovati te je za nju potrebno dulje vrijeme ispitivanja. Može se koristiti i vrsta Chironomus yohimatsui. Pojedinosti o metodi uzgoja kulture nalaze se u Dodatku 2. za vrstu Chironomus riparius. Podaci o uvjetima uzgoja kulture dostupni su također i za druge vrste, tj. Chironomus tentans (4) i Chironomus yoshimatsui (11). Mora se potvrditi identifikacija vrste prije ispitivanja, ali to nije potrebno prije svakog ispitivanja ako organizmi potječu iz kulture uzgojene u laboratoriju.
                           
                        
                     Sediment
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Po mogućnosti bi se trebao koristiti formulirani sediment (zvan još i obrađeni, umjetni ili sintetički sediment). Međutim, ako se koristi prirodni sediment, isti se treba karakterizirati (barem pH, sadržaj otopljenog ugljika, a preporučuje se i određivanje drugih parametara kao što su omjer C/N i granulometrija) te ne smije biti kontaminiran i u njemu ne smije biti nikakvih organizama koji bi se mogli natjecati sa ili jesti trzalce. Također se preporučuje da se prirodni sediment, prije uporabe u testu toksičnosti trzalaca, prethodno priprema sedam dana u istim uvjetima koji prevladavaju i u narednom ispitivanju. Za uporabu u ovom ispitivanju preporučuje se sljedeći formulirani sediment, na temelju umjetnog tla iz ispitne metode C.8 (14), (1)(15)(16):
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          4-5 % (suhe mase) treseta: što je moguće bliže pH od 5,5 do 6,0; važno je da se koristi treset u obliku praha, fino usitnjen (veličine čestica ≤ 1 mm) i isključivo sušen na zraku.
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          20 % (suhe mase) kaolinitske gline (sadržaj kaolinita po mogućnosti iznad 30 %).
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          75-76 % (suhe mase) kremenog pijeska (fini bi pijesak trebao prevladavati s više od 50 % čestica između 50 i 200 μm).
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          Dodaje se deionizirana voda kako bi se dobila vlaga konačne smjese u rasponu od 30 - 50 %.
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          Dodaje se kalcijev karbonat kemijski čiste kakvoće (CaCO3) kako bi se pH konačne smjese sedimenta podesila na 7,0 ± 0,5.
                                       
                                    
                                          (f)
                                       
                                       
                                          Sadržaj organskog ugljika konačne smjese trebao bi iznositi 2 % (± 0,5 %) i treba se prilagoditi dodavanjem odgovarajućih količina treseta i pijeska prema (a) i (c).
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              Treba biti poznat izvor treseta, kaolinitske gline i pijeska. Treba provjeriti nisu li komponente sedimenta kemijski kontaminirane (npr. teški metali, organoklorni spojevi, organofosforni spojevi itd.). Primjer pripreme formuliranog sedimenta opisan je u Dodatku 3. I miješanje suhih sastojaka također je prihvatljivo ako se pokaže da nakon dodavanja vode iznad sedimenta ne dolazi do razdvajanja sastojaka sedimenta (npr. lebdenje čestica treseta) i da su treset ili sediment dovoljno prethodno pripremljeni.
                           
                        
                     Voda
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Kao ispitna voda prikladna je svaka voda koja ima kemijska svojstva prihvatljive vode za razrjeđivanje koja su navedena u dodacima 2. i 4. Kao voda za uzgoj kultura i ispitna voda prikladna je svaka prikladna voda, prirodna voda (površinske ili podzemne vode), obrađena voda (vidjeti Dodatak 2.) ili deklorirana voda iz slavine ako će trzalci u njoj preživjeti tijekom uzgoja kulture i ispitivanja, a da ne pokažu nikakve znakove stresa. Na početku testa pH ispitne vode treba biti između 6 i 9, a ukupna tvrdoća ne viša od 400 mg/l kao CaCO3. Međutim, ako se sumnja u postojanje interakcije između iona tvrdoće i ispitivane tvari, trebalo bi koristiti vodu manje tvrdoće (u toj se situaciji stoga ne smije koristiti medij Elendt M4). Tijekom cijele studije trebalo bi koristiti istu vrstu vode. Najmanje dvaput godišnje ili kada se sumnja da su se svojstva kakvoće vode navedena u Dodatku 4. značajno promijenila, treba izmjeriti ta svojstva.
                           
                        
                     Radne otopine - voda obrađena spikingom
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Ispitne koncentracije izračunavaju se na temelju koncentracija u vodenom stupcu, tj. u vodi iznad sedimenta. Ispitne otopine u odabranoj koncentraciji pripremaju se razrjeđivanjem radne otopine. Radne otopine trebalo bi, po mogućnosti, pripremiti otapanjem ispitivane tvari u ispitnom mediju. Možda će u nekim slučajevima biti potrebno upotrijebiti otapala ili dispergente kako bi se dobila prikladno koncentrirana radna otopina. Primjeri prikladnih otapala jesu: aceton, etanol, metanol, etilen glikol monoetil eter, etilen glikol dimetil eter, dimetilformamid i trietilen glikol. Dispergenti koji se mogu koristiti jesu Cremophor RH40, Tween 80, metil-celuloza 0,01 % i HCO-40. Koncentracija otapajućeg sredstva u konačnom ispitnom mediju trebala bi biti minimalna (tj. ≤ 0,1 ml/l) i trebala bi biti ista u svim tretmanima. Kada se koristi otapajuće sredstvo, ono ne smije imati nikakve značajne učinke na preživljavanje ili nikakav vidljiv negativan učinak na ličinke trzalaca, što se otkriva kontrolom samo s otapalom. Međutim, treba uložiti sve napore da se izbjegne uporaba takvih tvari.
                           
                        PLAN ISPITIVANJA
                  
                              17.
                           
                           
                              Plan ispitivanja odnosi se na odabir broja i raspored ispitnih koncentracija, na broj posuda za svaku koncentraciju i na broj ličinki po posudi. Opisani su planovi za procjenu točke koncentracije s učinkom (EC), za procjenu najviše koncentracije bez vidljivog učinka (NOEC) i za provođenje graničnog ispitivanja. Regresijskoj se analizi daje prednost nad pristupom testiranja hipoteze.
                           
                        
                     Plan za regresijsku analizu
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Koncentracija s učinkom (npr. EC15, EC50) i raspon koncentracije, iznad kojega je učinak ispitivane tvari od interesa, trebaju obuhvaćati koncentracije uključene u ispitivanje. Općenito, preciznost, a posebno valjanost, s kojom se mogu procijeniti koncentracije s učinkom (ECx), poboljšavaju se kad se koncentracija s učinkom nalazi unutar raspona ispitnih koncentracija. Treba izbjegavati ekstrapolaciju ispod najniže pozitivne koncentracije ili iznad najviše koncentracije. Preliminarno ispitivanje za određivanje raspona korisno je za odabir raspona koncentracija koji će se koristiti (vidjeti stavak 27.).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Ako treba procijeniti ECx, treba ispitati najmanje pet koncentracija i tri višestruka određivanja. U svakom se slučaju savjetuje korištenje dovoljnog broja ispitnih koncentracija kako bi se dobila dobra procjena modela. Faktor između koncentracija ne bi smio biti veći od dva (iznimka se može učiniti u slučajevima kada krivulja odgovora na dozu ima plitak nagib). Broj višestrukih određivanja u svakom tretmanu može se sniziti ako se poveća broj ispitnih koncentracija različitog odgovora. Povećanjem broja višestrukih određivanja ili smanjivanje trajanja intervala ispitnih koncentracija obično dovodi do užih intervala pouzdanosti. Dodatna višestruka određivanja potrebna su ako treba procijeniti 10 - dnevno preživljavanje i rast ličinki.
                           
                        
                     Plan za procjenu NOEC-a/LOEC-a
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Ako treba procijeniti LOEC/NOEC (najnižu koncentraciju s vidljivim učinkom/najvišu koncentraciju bez vidljivog učinka), treba koristiti pet ispitnih koncentracija u najmanje četiri višestruka određivanja, a faktor između koncentracija ne bi smio biti veći od dva. Broj višestrukih određivanja trebao bi biti dovoljan da osigura adekvatnu statističku snagu kojom će se otkriti 20 % razlike od kontrolne posude pri razini značajnosti od 5 % (p = 0,05). Kod brzine razvoja obično je prikladna analiza varijance (ANOVA), kao što su Dunnettov test i Williamsov test (17)(18)(19)(20). Kod omjera preobrazbe mogu se koristiti Cochran-Armitageov test, Fisherov test (s Bonferronijevom korekcijom) ili Mantel-Haenszelov test.
                           
                        
                     Granično ispitivanje
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Može se provesti granično ispitivanje (jedna ispitna koncentracija i kontrolna posuda) ako se u preliminarnom testu za određivanje raspona ne vide nikakvi učinci. Cilj graničnog ispitivanja jest naznačiti da je vrijednost toksičnosti ispitivane tvari veća od ispitivane granične koncentracije. U ovoj se ispitnoj metodi ne mogu dati nikakvi prijedlozi preporučene koncentracije; to se prepušta prosudbi zakonodavca. Obično je potrebno najmanje šest višestrukih određivanja i za ispitnu i za kontrolnu posudu. Treba pokazati adekvatnu statističku snagu kojom će se otkriti 20 % razlike od kontrolne posude pri razini značajnosti od 5 % (p = 0,05). Kod metričkog odgovora (brzina razvoja i masa) t-test je prikladna statistička metoda ako podaci zadovoljavaju zahtjeve tog testa (normalnost, homogene varijance). Ako ti zahtjevi nisu ispunjeni, mogu se koristiti t-test nejednake varijance ili neparametarski test, kao što je Wilcoxon-Mann-Whitheyev test. Kod omjera preobrazbe prikladan je Fisherov test.
                           
                        POSTUPAK
                  
                     Uvjeti izlaganja
                  
                  
                     Priprema sustava voda/sediment obrađenog spikingom
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Odgovarajuće količine formuliranog sedimenta (vidjeti stavke 13.-14. i Dodatak 3.) dodaju se u ispitne posude gdje tvore sloj debljine najmanje 1,5 cm. Voda se nadolijeva do 6 cm (vidjeti stavak 15.). Omjer debljine sloja sa sedimentom i dubine vode ne bi smio premašivati 1:4, a sloj sa sedimentom ne bi trebao biti deblji od 3 cm. Sustav sediment/voda treba blago dozračivati sedam dana prije dodavanja ispitnih organizama (vidjeti stavak 14. i Dodatak 3.). Da bi se izbjeglo razdvajanje sastojaka sedimenta i resuspendiranje finog materijala tijekom dodavanja ispitne vode u vodeni stupac, sediment se može prekriti plastičnim diskom dok se na njega lijeva voda, a disk se miče odmah nakon toga. Mogu biti prikladni i drugi predmeti.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Ispitne posude bi trebale biti pokrivene (npr. staklenim pločama). Ako je potrebno, tijekom studije se u izvorni volumen vode nadolijeva još vode kako bi se nadomjestilo isparavanje vode. To bi se trebalo činiti pomoću destilirane ili deionizirane vode kako bi se spriječilo stvaranje soli.
                           
                        
                     Dodavanje ispitnih organizama
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Četiri do pet dana prije dodavanja ispitnih organizama u ispitne posude, mase jajašaca bi se trebale izvaditi iz kultura i staviti u male posude u hranjivu podlogu za uzgoj kulture. Mogu se koristiti stara hranjiva podloga iz matične kulture ili svježe pripremljena hranjiva podloga za uzgoj kulture. Ako se koristi potonja, hranjivoj podlozi za uzgoj kulture treba dodati manju količinu hrane, npr. zelenih algi i/ili nekoliko kapljica suspenzije fino mljevenih pahuljica riblje hrane (vidjeti Dodatak 2.). Treba koristiti samo svježe položene mase jajašaca. Valjenje ličinki obično počinje nekoliko dana nakon polaganja jajašaca (2 do 3 dana za Chironomus riparius na 20 °C i 1 do 4 dana za Chironomus tentans na 23 °C i za Chironomus yoshimatui na 25 °C), a ličinke se razvijaju u četiri stadija razvoja, od kojih svaki traje 4-8 dana. U ispitivanju treba koristiti ličinke iz prvog stadija razvoja (2-3 ili 1-4 dana poslije valjenja). Stadij mušica moguće je provjeriti pomoću širine kapsule glave (6).
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Dvadeset ličinki iz prvog stadija razvoja stavljaju se nasumice u svaku ispitnu posudu koja sadržava vodu i sediment obrađen spikingom, i to pomoću tupe pipete. Treba zaustaviti dozračivanje vode tijekom dodavanja ličinki u ispitne posude i tako treba ostati još 24 sata nakon dodavanja ličinki (vidjeti stavke 24. i 32.). Prema upotrijebljenom planu ispitivanja (vidjeti stavke 19. i 20.) broj ličinki po koncentraciji iznosi najmanje 60 za procjenu točke EC-a i 80 za određivanje NOEC-a.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Dvadeset i četiri sata nakon dodavanja ličinki ispitivana tvar dodaje se spikingom u vodeni stupac iznad sedimenta i ponovno se osigura blago dozračivanje. Male količine otopina ispitivane tvari stavljaju se ispod površine vode pipetom. Voda iznad sedimenta trebala bi se potom pažljivo promiješati kako se sediment ne bi umiješao.
                           
                        
                     Ispitne koncentracije
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Ispitivanje za određivanje raspona može biti korisno za određivanje raspona koncentracija za konačno ispitivanje. U tu se svrhu koristi niz široko razmaknutih koncentracija ispitivane tvari. Da bi se dobila ista gustoća površine po trzalcu, koja će se koristiti i u konačnom ispitivanju, trzalci se izlažu svakoj koncentraciji ispitivane tvari tijekom vremena koje omogućuje procjenu odgovarajućih ispitnih koncentracija, a nisu potrebna višestruka određivanja.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              O ispitnim koncentracijama za konačno ispitivanje odlučuje se na temelju rezultata ispitivanja za određivanje raspona. Trebalo bi koristiti i odabrati najmanje pet koncentracija, kao što je to opisano u stavcima 18. do 20.
                           
                        
                     Kontrolne posude
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              U ispitivanje bi, s odgovarajućim brojem višestrukih određivanja, trebalo uključiti kontrolne posude bez ispitivane tvari, ali sa sedimentom (vidjeti stavke 19.-20.). Ako se za primjenu ispitivane tvari koristilo otapalo (vidjeti stavak 16.), treba dodati i kontrolnu posudu s otapalom sedimenta.
                           
                        
                     Sustav ispitivanja
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Koriste se statički sustavi. Polustatični ili protočni sustavi sa stalnim ili isprekidanim obnavljanjem vode iznad sedimenta mogu se koristiti u iznimnim slučajevima, na primjer ako specifikacije kakvoće vode postanu neprikladne za ispitni organizam ili ako utječu na uravnoteženje kemikalije (npr. ako razine otopljenog kisika previše padnu, ako se previše povisi koncentracija proizvoda izlučivanja ili ako iz sedimenta cure minerali koji utječu na pH i/ili tvrdoću vode). Međutim, obično su dostatne i daje se prednost drugim metodama poboljšanja kakvoće vode iznad sedimenta, kao što je dozračivanje.
                           
                        
                     Hrana
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Potrebno je hraniti ličinke, po mogućnosti svakodnevno ili najmanje triput tjedno. Čini se da je riblja hrana (suspenzija u vodi fino mljevene hrane, npr. Tetra-Min ili Tetra-Phyll; pojedinosti vidjeti u Dodatku 2.) u količini od 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg za C. yoshimatui) dnevno po ličinki prikladna za mlade ličinke prvih 10 dana. Za starije će ličinke biti potrebno malo više hrane: 0,5 - 1 mg dnevno po ličinki trebalo bi biti dostatno za ostatak ispitivanja. Porcije hrane treba smanjiti u svim tretmanima te kontrolirati rastu li gljivice i primijeti li se smrtnost u kontrolnim posudama. Ako se ne može zaustaviti rast gljivica, ispitivanje treba ponoviti. Kada se ispituju jako adsorptive tvari (npr. čiji je log Kow > 5) ili tvari koje stvaraju kovalentne veze sa sedimentom, formuliranom se sedimentu prije faze stabilizacije može dodati količina hrane neophodna za osiguranje preživljavanja i prirodnog rasta organizama. U tu se svrhu, umjesto riblje hrane, mora koristiti biljni materijal, npr. može se dodati 0,5 % (suha masa) fino usitnjenog lišća npr. velike koprive (Urtica dioica), duda (Morus alba), bijele djeteline (Trifolium repens), špinata (Spinacia oleracea) ili nekog drugog biljnog materijala (Cerophyl ili alfa-celuloze).
                           
                        
                     Uvjeti za inkubaciju
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Blago dozračivanje vode iznad sedimenta u ispitnim posudama osigurava se po mogućnosti 24 sata poslije dodavanja ličinki i traje tako tijekom cijelog ispitivanja (treba se pobrinuti da koncentracija otopljenog kisika ne padne ispod 60 % ASV-a). Dozračivanje se vrši putem staklene pasterove pipete pričvršćene 2-3 cm iznad sloja sedimenta (tj. jedan ili par mjehurića/s). Pri ispitivanju hlapljivih kemikalija može se pobrinuti da se ne dozračuje sustav sediment/voda.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Ispitivanje se provodi na konstantnoj temperaturi od 20 °C (± 2 °C). Za C. tentans i C. yoshimatui preporučene temperature su 23 °C odnosno 25 °C (± 2 °C). Koristi se fotoperiod od 16 sati, a jačina svjetlosti treba biti 500 do 1 000 luksa.
                           
                        
                     Trajanje izlaganja
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Izlaganje počinje dodavanjem ličinki u posude sa sedimentom obrađenim spikingom i kontrolne posude. Maksimalno trajanje izlaganja je 28 dana za C. riparius i C. yoshimatsui, a 65 dana za C. tentans. Ako se ličinke prije preobraze u mušice, ispitivanje se može prekinuti nakon minimalno pet dana nakon što se i zadnja ličinka u kontrolnoj posudi preobrazi u odraslu životinju.
                           
                        PROMATRANJA
                  
                     Preobrazba
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Određuju se vrijeme razvoja i ukupni broj muških i ženskih mušica koje su se u cijelosti preobrazile. Mužjaci se lako razaznaju po svojim dlakavim ticalima.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Ispitne posude treba promatrati najmanje triput tjedno da bi se vizualno procijenilo svako nenormalno ponašanje (npr. napuštanje sedimenta, neuobičajeno plivanje) u usporedbi s kontrolnim posudama. Tijekom razdoblja očekivane preobrazbe potrebno je svakodnevno brojati preobražene mušice. Svakodnevno se vodi evidencija i o spolu i broju preobraženih mušica. Nakon identifikacije mušice se vade iz posuda. Treba zabilježiti sve mase jajašaca položene prije prekida ispitivanja te ih treba izvaditi kako bi se spriječilo ponovno uvođenje ličinki u sediment. Također se bilježi i broj vidljivih kukuljica koje se nisu uspjele preobraziti. Smjernice o mjerenju preobrazbe navedene su u Dodatku 5.
                           
                        
                     Rast i preživljavanje
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Ako treba dobiti podatke o 10-dnevnom preživljavanju i rastu ličinki, na samom početku treba dodatne ispitne posude kako bi ih se moglo naknadno koristiti. Sediment iz tih dodatnih posuda prosijava se kroz sito od 250 μm kako bi se zadržale ličinke. Kriteriji za smrt jesu nepomičnost ili izostanak reakcije na mehaničke podražaje. I neoporavljene ličinke treba prebrojati kao mrtve (možda su mikrobi već razgradili ličinke koje su uginule na početku ispitivanja). Određuje se suha masa (bez pepela) preživjelih ličinki po svakoj ispitnoj posudi pa se izračunava srednja pojedinačna suha masa po posudi. Korisno je odrediti kojem stadiju razvoja pripadaju preživjele ličinke; za to se može upotrijebiti mjerenje širine kapsule glave svake ličinke.
                           
                        
                     Analitička mjerenja
                  
                  
                     Koncentracija ispitivane tvari
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Kao minimum, na početku (po mogućnosti sat vremena poslije dodavanja ispitivane tvari) i na kraju ispitivanja moraju se analizirati uzorci vode iznad sedimenta, porne vode i sedimenta, i to u najvišoj koncentraciji i u nekoj nižoj. Ta određivanja koncentracije ispitivane tvari daju informacije o ponašanju/razdiobi ispitivane tvari u sustavu voda/sediment. Uzorkovanje sedimenta na početku ispitivanja može utjecati na sustav ispitivanja (npr. uklanjanje ispitnih ličinki) pa bi stoga trebalo koristiti dodatne ispitne posude za provođenje analitičkih određivanja na početku i tijekom ispitivanja, po potrebi (vidjeti stavak 39.). Možda neće biti potrebno provoditi mjerenja u sedimentu ako je razdioba ispitivane tvari i između vode i sedimenta jasno određena u studiji vode/sedimenta u poredbenim uvjetima (npr. omjer sedimenta i vode, vrsta primjene, sadržaj organskog ugljika u sedimentu).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Kada se provode posredna mjerenja (npr. 7. dana) te ako su za analizu potrebni veliki uzorci koji se ne mogu uzeti iz ispitnih posuda, a da to pritom ne utječe na sustav ispitivanja, analitička određivanja treba provoditi na uzorcima iz dodatnih ispiinih posuda koje se tretiraju na isti način (uključujući i prisustvo ispitnih organizama), ali koje se ne koriste za biološka promatranja.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Preporučeni postupak za izoliranje međuprostorne vode jest centrifugiranje na npr. 10 000 g i 4 °C tijekom 30 min. Međutim, ako se pokaže da se ispitivana tvar ne adsorbira na filtre, prihvatljiva bi mogla biti i filtracija. U nekim slučajevima možda neće biti moguće analizirati koncentracije u pornoj vodi jer je uzorak premalen.
                           
                        
                     Fizikalno-kemijski parametri
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Na odgovarajući način treba izmjeriti pH, otopljeni kisik u ispitnoj vodi i temperaturu u ispitnim posudama (vidjeti stavak 10.). Tvrdoću i amonijak treba mjeriti u kontrolnim posudama i u jednoj ispitnoj posudi u najvišoj koncentraciji na početku i na kraju ispitivanja.
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Obrada rezultata
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Cilj ovog ispitivanja jest odrediti učinak ispitivane tvari na brzinu razvoja i ukupni broj potpuno preobraženih muških i ženskih mušica ili, u slučaju 10-dnevnog ispitivanja, učinke na preživljavanje i masu ličinki. Ako ne postoje naznake statistički različite osjetljivosti spolova, rezultati mužjaka i ženki mogu se ujediniti radi statističke analize. Razlike u osjetljivosti spolova mogu se statistički prosuditi, npr. tabličnim testom χ2-r × 2. Preživljavanje ličinki i njihova srednja pojedinačna suha masa po posudi moraju se odrediti nakon 10 dana kada je to potrebno.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Koncentracije s učinkom izražene kao koncentracije u vodi iznad sedimenta izračunavaju se po mogućnosti na temelju koncentracija izmjerenih na početku ispitivanja (vidjeti stavak 38.).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Za izračun procjene točke EC50 ili bilo koje druge ECx kao dodatna ponovna određivanja mogu se koristiti statistički podaci dobiveni za svaku posudu. U izračunu intervala pouzdanosti za bilo koji ECx u obzir treba uzeti varijabilnost između posuda ili se treba pokazati da je ta varijabilnost toliko neznatna da se može ignorirati. Kada se model prilagođava metodi najmanjih kvadrata, na statističke podatke za svaku posudu treba primijeniti transformaciju kako bi se poboljšala homogenst varijance. Međutim, vrijednosti ECx trebale bi se izračunati tek nakon što se odgovor transformira natrag u izvornu vrijednost.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Kada je cilj statističke analize određivanje NOEC-a/LOEC-a testiranjem hipoteze, u obzir se mora uzeti varijabilnost među posudama, npr. ugniježđenom ANOVA-om. Kao druga mogućnost, u situacijama kada se pobiju pretpostavke uobičajene ANOVA-e, mogu biti prikladna i robusnija ispitivanja (21).
                           
                        
                     Omjer preobrazbe
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Omjeri preobrazbe su kvantalni podaci i mogu se analizirati Cochran-Armitageovim testom koji se primjenjuje snižavanjem korak po korak kada se očekuje odgovor na monotoničnu dozu i kad se ti podaci slažu s tim očekivanjem. Ako to nije slučaj, mogu se koristiti Fisherov test ili Mantel-Haenszelov test s Bonferroni-Holmovim prilagođenim p-vrijednostima. Ako ima dokaza za još veću varijabilnost između višestrukih određivanja u istoj koncentraciji nego što bi to naznačila binomijalna raspodjela (često zvana i ‚ekstra-binomijalna’ varijacija), treba primijeniti robusni Cochran-Armitageov ili Fisherov test kakvi su predloženi u (21).
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Određuje se broj mušica preobraženih po posudi, ne, koji se onda dijeli brojem uvedenih ličinki, na:
                              
                                 
                              gdje je:
                              
                                          
                                             ER
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          omjer preobrazbe
                                       
                                    
                                          
                                             ne
                                             
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          broj preobraženih mušica po posudi
                                       
                                    
                                          
                                             na
                                             
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          broj uvedenih ličinki po posudi
                                       
                                    
                        
                              48.
                           
                           
                              Najprikladnija alternativa za velike uzorke, kada postoji ekstra-binomijalna varijanca, jest tretirati omjer preobrazbe kao kontinuirani odgovor te primijeniti postupke poput Williamovog testa kada se očekuje odgovor na monotoničnu dozu i kad je isti u skladu s tim ER podacima. Dunnettov bi test bio prikladan gdje nema monotoničnosti. Veliki uzorak se ovdje definira kao broj preobraženih mušica i broj nepreobraženih mušica veći od pet, i to na osnovi ponovljenog određivanja (posude).
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Za primjenu vrijednosti metode ANOVA vrijednosti ER-a moraju se prvo transformirati arkus sinus drugi korijen transformacijom ili Freeman-Tukeyovom transformacijom kako bi se dobila približna normalna raspodjela i ujednačile varijance. Kad se koriste apsolutne frekvencije, mogu se primijeniti Cochran-Armitageov, Fisherov (Bonferronijev) ili Mantel-Haenszelov test. Arkus sinus drugi korijen transformacija primjenjuje se tako što se uzme inverzni sinus (sin–1) drugog korijena ER-a.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Za omjere preobrazbe vrijednosti ECx računaju se regresijskom analizom (ili npr. probit (22), logit, Weibull, prikladan komercijalni softver itd.). Ako regresijka analiza ne uspije (npr. kad imamo manje od dva djelomična odgovora), koriste se druge neparametarske metode, kao što su pomični prosjek ili jednostavna interpolacija.
                           
                        
                     Brzina razvoja
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Srednje vrijeme razvoja predstavlja srednji raspon vremena između uvođenja ličinki (0. dan ispitivanja) i njihove preobrazbe u pokusnu skupinu mušica. (Za izračun stvarnog vremena razvoja u obzir treba uzeti starost ličinki u trenutku uvođenja). Brzina razvoja recipročna je vremenu razvoja (jedinica: 1/dan) i predstavlja dio razvoja ličinki koji se odvija tijekom jednog dana. Brzina razvoja preferira se za evaluaciju ovih studija o toksičnosti sedimenta jer je njezina varijanca niža, a homogenija je i bliža normalnoj raspodjeli u usporedbi s vremenom razvoja. Stoga se mogu koristiti moćni postupci parametarskih testova s brzinom razvoja radije nego s vremenom razvoja. Za brzinu razvoja kao kontinuirani odgovor mogu se procijeniti vrijednosti ECx regresijskom analizom (npr. (23), (24)).
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Za sljedeće statističke testove pretpostavlja se da se broj mušica zamijećen na dan pregleda x preobrazio u srednjem vremenskom intervalu između dana x i dana x - l (l = trajanje intervala pregleda, obično 1 dan). Srednja brzina razvoja po posudi x računa se prema:
                              
                                 
                              gdje je:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          srednja brzina razvoja po posudi
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          indeks intervala pregleda
                                       
                                    
                                          m
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          maksimalni broj intervala pregleda
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          broj mušica preobraženih u intervalu pregleda i
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          ukupni broj mušica preobraženih na kraju pokusa (= )
                                       
                                    
                                          xi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          brzina razvoja mušica preobraženih u intervalu i
                                       
                                    
                                 
                              gdje je:
                              
                                          dayi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          dan pregleda (dani od primjene)
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          trajanje intervala pregleda i (dani, obično 1 dan)
                                       
                                    
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Izvješće o ispitivanju mora sadržavati barem sljedeće podatke:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana tvar:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      fizikalno stanje i, gdje je relevantno, fizikalno-kemijska svojstva (topljivost u vodi, tlak pare, podjelni koeficijent u tlu (ili u sedimentu ako postoji), stabilnost u vodi itd.);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci za identifikaciju kemikalije (opći naziv, kemijski naziv, CAS broj itd.), uključujući i čistoću i analitičku metodu kvantifikacije ispitivane tvari.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitne vrste:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korištene ispitne životinje: vrsta, znanstveni naziv, izvor organizama i uvjeti uzgoja;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci o rukovanju masama jajašaca i ličinkama;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      starost ispitnih životinja u trenutku umetanja u ispitne posude.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      korišteni sediment, tj. prirodni ili formulirani sediment;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      za prirodni sediment lokacija i opis mjesta uzorkovanja sedimenta, uključujući, po mogućnosti, povijest onečišćenja, svojstva: pH, sadržaj organskog ugljika, omjer C/N i granulometrija (ako je prikladno).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      priprema formuliranog sedimenta: sastojci i svojstva (sadržaj organskog ugljika, pH, vlaga itd. na početku ispitivanja);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      priprema ispitne vode (ako se koristi obrađena voda) i svojstva (koncentracija kisika, pH, provodljivost, tvrdoća itd. na početku ispitivanja);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dubina sedimenta i vode iznad sedimenta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      volumen vode iznad sedimenta i porne vode, masa mokrog sedimenta sa i bez porne vode;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ispitne posude (materijal i veličina);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda pripreme radnih otopina i ispitnih koncentracija;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uporaba ispitivane tvari: korištene ispitne koncentracije, broj višestrukih određivanja i uporaba otapala, ako je isti korišten;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uvjeti inkubacije: temperatura, ciklus i jačina svjetlosti, dozračivanje (učestalost i intenzitet);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detaljni podaci o hranjenju, uključujući i vrstu hrane, pripremu, količinu i režim hranjenja.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nazivne ispitne koncentracije, izmjerene ispitne koncentracije i rezultati svih analiza za određivanje koncentracije ispitivane tvari u ispitnoj posudi;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      kakvoća vode u ispitnim posudama, tj. pH, temperatura, otopljeni kisik, tvrdoća i amonijak;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nadolijevanje isparene ispitne vode, ako je bilo;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj preobraženih muških i ženskih mušica po posudi i po danu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj ličinki koje se nisu preobrazile u mušice po posudi;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      srednja pojedinačna suha masa ličinki po posudi i po stadiju razvoja, ako je to primjereno;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      postotak preobrazbe po određivanju i ispitnoj koncentraciji (muške i ženske mušice zajedno);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      srednja brzina razvoja potpuno preobraženih mušica po određivanju i brzina tretmana (muške i ženske mušice zajedno);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      procjena toksičnih konačnih učinaka, npr. ECx (i s time povezani intervali pouzdanosti), NOEC i/ili LOEC, te statističke metode korištene za njihovo određivanje;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rasprava o rezultatima, uključujući i svaki utjecaj na rezultate ispitivanja nastao uslijed odstupanja od ove ispitne metode.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Poglavlje C.8 ovog Priloga, Toksičnost za gujavice,
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577-585.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312.
                           
                        
                     Dodatak 1.
                     DEFINICIJE
                     Za potrebe ove metode koriste se sljedeće definicije:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Formulirani sediment ili obrađeni, umjetni ili sintetički sediment je smjesa tvari koja se koristi za oponašanje fizikalnih sastojaka prirodnog sedimenta.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Voda iznad sedimenta je voda koja se u ispitnoj posudi nalazi iznad sedimenta.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Međuprostorna voda ili porna voda je voda u prostoru između sedimenta i čestica tla.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Voda obrađena spikingom je voda u koju je dodana ispitivana tvar.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ispitivana kemikalija: Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom ispitnom metodom.
                              
                           
                  
                     Dodatak 2.
                     
                        Preporuke za uzgoj kulture Chironomus riparius
                        
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Ličinke vrste Chironomus mogu se uzgajati u posudama za kristalizaciju ili velikim spremnicima. Fini kremeni pijesak nanese se u tankom sloju dubine oko 5 do 10 mm po dnu spremnika. Također se pokazalo da je dijatomejska zemlja (npr. Merck, Art 8117) prikladan supstrat (dostatan je tanji sloj od svega par mm). Potom se dodaje prikladna voda u dubini od nekoliko cm. Trebalo bi nadolijevati vodu po potrebi kako bi se zamijenila voda izgubljena isparavanjem i spriječilo isušivanje. Voda se po potrebi može nadolijevati. Treba osigurati blago dozračivanje. Posude za uzgoj ličinki trebale bi se držati u prikladnom kavezu koji će spriječiti bijeg preobraženih odraslih životinja. Kavez treba biti dovoljno velik da se preobražene odrasle životinje mogu rojiti, u protivnom možda neće doći do kopulacije (minimalno oko 30 x 30 x 30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Kaveze treba držati na sobnoj temperaturi ili u prostoriji s konstantnim okolišem na 20 ± 2 °C s fotoperiodom od 16 sati svjetlosti (jačine oko 1 000 luksa), 8 sati mraka. Iz raznih izvješća saznajemo da vlažnost zraka ispod 60 % RV može spriječiti razmnožavanje.
                              
                           
                        Voda za razrjeđivanje
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Može se koristiti bilo koja prikladna prirodna ili sintetička voda. Obično se koriste izvorska voda, deklorirana voda iz slavine i umjetni mediji (npr. mediji Elendt ‚M4’ ili ‚M7’, vidjeti u nastavu teksta). Voda se prije uporabe mora dozračiti. Ako je to potrebno, voda za uzgoj kulture može se obnoviti pažljivim izlijevanjem korištene vode iz posuda za uzgoj kulture, izravno ili putem sifona, da se pritom ne unište cjevčice s ličinkama.
                              
                           
                        Hranjenje ličinki
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Ličinke vrste Chironomus treba hraniti pahuljicama riblje hrane (Tetra Min®, Tetra Phyll® ili neka druga slična robna marka riblje hrane), i to otprilike 250 mg dnevno po posudi. Hrana se može dati i kao suhi usitnjeni prah ili kao suspenzija u vodi: 1,0 g pahuljaste hrane doda se u 20 ml vode za razrjeđivanje i izmiješa u homogenu smjesu. Taj se pripravak može dodavati brzinom od oko 5 ml dnevno po posudi (protresti prije uporabe). Starije ličinke mogu dobiti više hrane.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Hranjenje se prilagođava kakvoći vode. Ako hranjiva podloga za uzgoj kultura postane ‚mutna’, treba smanjiti hranjenje. Dodavanje hrane mora se pažljivo nadzirati. Premalo hrane dovest će do prebacivanja ličinki prema vodenom stupcu, a previše hrane dovest će do povećane aktivnosti mikroba i sniženih koncentracija kisika. Oba ta uvjeta mogu dovesti do sniženih brzina rasta.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Također se mogu dodati i stanice nekih zelenih algi (npr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) kada se postavljaju nove posude za uzgoj kultura.
                              
                           
                        Hranjenje preobraženih odraslih životinja
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Neki izvođači pokusa sugerirali su da bi vuneni podložak namočen u zasićenoj šećernoj otopini mogao poslužiti kao hrana za preobražene odrasle životinje.
                              
                           
                        Preobrazba
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Na 20 ± 2 °C ličinke se počinju preobražavati u odrasle životinje iz posuda za uzgoj ličinki nakon otprilike 13 - 15 dana. Mužjaci se lako razaznaju po svojim dlakavim ticalima.
                              
                           
                        Mase jajašaca
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Kad se u kavezu za uzgoj pojave odrasle životinje, u svim posudama za uzgoj ličinki triput tjedno treba provjeravati ima li položenih želatinoznih masa jajašaca. Ako ima masa jajašaca, njih treba pažljivo ukloniti. Treba ih prenijeti u malu posudu u kojoj se nalazi uzorak vode za uzgoj. Te se mase jajašaca koriste za postavljanje nove posude za uzgoj kulture (npr. 2 - 4 mase jajašaca/posudi) ili se koriste za testove toksičnosti.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Valjenje ličinki u prvom stadiju razvoja trebalo bi se zbiti nakon 2 - 3 dana.
                              
                           
                        Postavljanje novih posuda za uzgoj kulture
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 Kad se kulture razviju, trebalo bi biti moguće postaviti novu posudu za uzgoj kulture jedanput tjedno ili rjeđe, ovisno o potrebama ispitivanja, i ukloniti starije posude nakon što se ličinke preobraze u odrasle mušice. Na taj će se način uz minimalno upravljanje stvarati redovita zaliha odraslih životinja.
                              
                           
                        Priprema ispitnih otopina ‚M4’ i ‚M7’
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendt (1990.) je opisao medij ‚M4’. Medij ‚M7’ priprema se kao medij ‚M4’, osim za tvari iz tablice 1., za koje su koncentracije četiri puta niže u ‚M7’ od onih u ‚M4’. Publikacija o mediju ‚M7’ trenutačno se priprema (Elendt, osobna prepiska). Ispitnu otopinu ne treba pripremati prema Elendtu i Biasu (1990.) jer koncentracije NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 i K2HPO4 navedene za pripremu radnih otopina nisu adekvatne.
                              
                           
                        Priprema medija ‚M7’
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Svaka se radna otopina (I) priprema zasebno, a kombinirana radna otopina (II) priprema se iz tih radnih otopina (I) (vidjeti tablicu 1.). Za pripremu medija ‚M7’ miješa se 50 ml kombinirane radne otopine (II) i količine svake radne otopine makronutrijenata navedene u tablici 2. do ukupno 1 l deionizirane vode. Vitaminska radna otopina priprema se dodavanjem triju vitamina u deioniziranu vodu, kao što je naznačeno u tablici 3., a 0,1 ml kombinirane vitaminske radne otopine dodaje se konačnom mediju ‚M7’ tik prije uporabe. (Vitaminska radna otopina čuva se zamrznuta u malim alikvotima). Medij se dozrači i stabilizira.
                                 
                                    Tablica 1.
                                 
                                 
                                    Radne otopine elemenata u tragovima za medij M4 i M7
                                 
                                 
                                             Radne otopine (I)
                                          
                                          
                                             Količina (mg) od koje se umiješa do 1 litre deionizirane vode
                                          
                                          
                                             Za pripremu kombinirane radne otopine (II): pomiješajte sljedeće količine (mg) radnih otopina (I) u do 1 litre deionizirane vode
                                          
                                          
                                             Konačne koncentracije
                                             u ispitnim otopinama (mg/l)
                                          
                                       
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                          
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                       
                                             H3BO3
                                                 (18)
                                             
                                          
                                          
                                             57 190
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             2,86
                                          
                                          
                                             0,715
                                          
                                       
                                             MnCl2 · 4 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             7 210
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,361
                                          
                                          
                                             0,090
                                          
                                       
                                             LiCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             6 120
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,306
                                          
                                          
                                             0,077
                                          
                                       
                                             RbCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 420
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,071
                                          
                                          
                                             0,018
                                          
                                       
                                             SrCl2 · 6 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             3 040
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,152
                                          
                                          
                                             0,038
                                          
                                       
                                             NaBr (18)
                                             
                                          
                                          
                                             320
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             Na2MoO4 · 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,063
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                       
                                             CuCl2 · 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             335
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,017
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             ZnCl2
                                             
                                          
                                          
                                             260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                       
                                             CaCl2 · 6 H2O
                                          
                                          
                                             200
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                       
                                             KI
                                          
                                          
                                             65
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                       
                                             Na2SeO3
                                             
                                          
                                          
                                             43,8
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                       
                                             NH4VO3
                                             
                                          
                                          
                                             11,5
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                       
                                             Na2EDTA · 2 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             5 000
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             2,5
                                          
                                          
                                             0,625
                                          
                                       
                                             FeSO4 · 7 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             1 991
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,249
                                          
                                       
                                    Tablica 2.
                                 
                                 
                                    Radne otopine makronutrijenata za medij M4 i M7
                                 
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Količina od koje se umiješa do 1 litre deionizirane vode
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Količina radnih otopina makronutrijenata koja se dodaje za pripremu medija M4 i M7
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Konačne koncentracije u ispitnim otopinama M4 i M7
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             CaCl2 · 2 H2O
                                          
                                          
                                             293 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             293,8
                                          
                                       
                                             MgSO4 · 7 H2O
                                          
                                          
                                             246 600
                                          
                                          
                                             0,5
                                          
                                          
                                             123,3
                                          
                                       
                                             KC1
                                          
                                          
                                             58 000
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             5,8
                                          
                                       
                                             NaHCO3
                                             
                                          
                                          
                                             64 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             64,8
                                          
                                       
                                             NaSiO3 · 9 H2O
                                          
                                          
                                             50 000
                                          
                                          
                                             0,2
                                          
                                          
                                             10,0
                                          
                                       
                                             NaNO3
                                             
                                          
                                          
                                             2 740
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,274
                                          
                                       
                                             KH2PO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 430
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,143
                                          
                                       
                                             K2HPO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 840
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,184
                                          
                                       
                                    Tablica 3.
                                 
                                 
                                    Vitaminska radna otopina za medij M4 i M7
                                 
                                 Sve tri vitaminske otopine kombiniraju se u jednu vitaminsku radnu otopinu.
                                 
                                    
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Količina od koje se umiješa do 1 litre deionizirane vode
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Količina vitaminske radne otopine koja se dodaje za pripremu medija M4 i M7
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Konačne koncentracije u ispitnim otopinama M4 i M7
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             Tiamin-hidroklorid
                                          
                                          
                                             750
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,075
                                          
                                       
                                             Cijanokobalamin (B12)
                                          
                                          
                                             10
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,0010
                                          
                                       
                                             Biotin
                                          
                                          
                                             7,5
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,00075
                                          
                                       
                           
                        LITERATURA
                     
                     BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
                     Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33.
                     Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167.
                  
                  
                     Dodatak 3.
                     PRIPREMA FORMULIRANOG SEDIMENTA
                     
                        Sastav sedimenta
                     
                     Formulirani sediment trebao bi imati sljedeći sastav:
                     
                                 Sastojak
                              
                              
                                 Svojstva
                              
                              
                                 % sedimenta
                                 suha masa
                              
                           
                                 Treset
                              
                              
                                 Sphagnum moss treset, što bliže pH području od 5,5-6,0, bez vidljivih ostataka biljaka, fino usitnjen (veličina čestica ≤ 1 mm) i sušen na zraku
                              
                              
                                 4-5
                              
                           
                                 Kremeni pijesak
                              
                              
                                 Veličina zrna: > 50 % čestica trebalo bi biti u rasponu od 50-200 μm
                              
                              
                                 75-76
                              
                           
                                 Kaolinitska glina
                              
                              
                                 Sadržaj kaolinita ≥ 30 %
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Organski ugljik
                              
                              
                                 Prilagođava se dodavanjem treseta i pijeska
                              
                              
                                 2 (± 0,5)
                              
                           
                                 Kalcijev karbonat
                              
                              
                                 CaCO3, u prahu, kemijski čist
                              
                              
                                 0,05 (- 0,1)
                              
                           
                                 Voda
                              
                              
                                 Provodljivost ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30 (- 50)
                              
                           
                        Priprema
                     
                     Treset se suši na zraku i usitnjava u fini prah. Priprema se suspenzija potrebne količine treseta u prahu u deioniziranoj vodi pomoću uređaja za homogenizaciju visoke djelotvornosti. pH te suspenzije podešava se u području od 5,5 ± 0,5 pomoću CaCO3. Suspenzija se priprema najmanje dva dana blagim miješanjem na 20 ± 2 °C kako bi se stabilizirala pH i uspostavila stabilna mikrobna komponenta. pH se ponovno mjeri i trebala bi iznositi 6,0 ± 0,5. Potom se suspenzija treseta miješa s ostalim sastojcima (pijeskom i kaolinitskm glinom) i deioniziranom vodom da bi se dobio homogeni sediment sa sadržajem vode u području od 30 - 50 posto suhe mase sedimenta. Još jednom se mjeri pH konačne smjese i podešava na 6,5 do 7,5 pomoću CaCO3 ako je potrebno. Uzimaju se uzorci sedimenta kako bi se odredili suha masa i sadržaj organskog ugljika. Potom se preporučuje da se formulirani sediment, prije uporabe u testu toksičnosti trzalaca, priprema sedam dana u istim uvjetima koji prevladavaju i u naknadnom ispitivanju.
                     
                        Skladištenje
                     
                     Suhi sastojci za pripremu umjetnog sedimenta mogu se skladištiti na suhom i hladnom mjestu na sobnoj temperaturi. Formulirani (mokri) sediment ne bi trebalo skladištiti prije uporabe u ispitivanju. Njega bi trebalo iskoristiti nakon razdoblja pripremanja od sedam dana koje završava pripremu.
                     
                        LITERATURA:
                     
                     Poglavlje C.8 ovog Priloga. Toksičnost za gujavice.
                     Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20.
                  
                  
                     Dodatak 4.
                     
                        Kemijska svojstva prihvatljive vode za razrjeđivanje
                     
                     
                                 Tvar
                              
                              
                                 Koncentracije
                              
                           
                                 Lebdeće čestice
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Ukupni organski ugljik
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Neionizirani amonijak
                              
                              
                                 < 1 μg/l
                              
                           
                                 Tvrdoća kao CaCO3
                                 
                              
                              
                                 < 400 mg/l (20)
                                 
                              
                           
                                 Rezidualni klor
                              
                              
                                 < 10 μg/l
                              
                           
                                 Ukupni organofosforni pesticidi
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Ukupni organofosforni pesticidi plus poliklorirani bifenili
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Ukupni organski klor
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     Dodatak 5.
                     
                        Smjernice za praćenje preobrazbe ličinki trzalaca
                     
                     U ispitne laboratorijske čaše postave se zamke za preobražene životinje. Te su zamke potrebne od 20. dana do kraja ispitivanja. Slijedi crtež primjera korištenih zamki:
                     
                        
                     
                                 A
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 najlonski zaslon
                              
                           
                                 B
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 obrnute plastične čaše
                              
                           
                                 C
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 laboratorijska čaša za izlaganje bez usnika
                              
                           
                                 D
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 priključci na zaslonu za promjenu vode
                              
                           
                                 E
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 voda
                              
                           
                                 F
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 sediment
                              
                           
                  C.29.   LAKA BIORAZGRADIVOST - CO2 U ZAČEPLJENIM POSUDAMA (TEST PLINSKOG PROSTORA (HEADSPACE))
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 310 (2006.). Ova ispitna metoda je metoda probira za evaluaciju lake biorazgradivosti kemikalija, a informacije sadržane u njoj slične su informacijama o šest metoda opisanih u poglavlju C.4 Priloga A do F. Dakle, kemikalija koja pokazuje pozitivne rezultate u ovoj ispitnoj metodi može se smatrati lako biorazgradivom te, slijedom toga, i brzo razgradivom u okolišu.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Poznata metoda za određivanje ugljikovog dioksida (CO2) (1), utemeljena na Sturmovom izvornom testu (2) za procjenu biorazgradivosti organskih kemikalija, obično je, zbog mjerenja ugljikova dioksida koji nastaje djelovanjem mikroba, prvi izbor za ispitivanje slabo topljivih kemikalija i jako adsorptivnih kemikalija. Također se odabire i za topljive (ali nehlapljive) kemikalije jer mnogi smatraju da je nastajanje ugljikova dioksida jedini nedvosmisleni dokaz djelovanja mikroba. Na opadanje otopljenog organskog ugljika mogu utjecati fizikalno-kemijski procesi - adsorpcija, hlapljenje, precipitacija (taloženje), hidroliza - kao i djelovanje mikroba, a i u mnogim nebiološkim reakcijama troši se kisik; rijetko kad CO2 nastaje od organskih kemikalija abiotički. U izvornom i izmijenjenom Sturmovom testu (1)(2) do opadanja CO2 dolazi u tekućem stanju u apsorpcijske posude propuhivanjem (tj. tretiranjem mjehurića zraka da uklanjaju CO2 iz tekućeg medija), dok se u Larsonovoj verziji (3)(4) CO2 transferira iz reakcijske posude do apsorbera propuštanjem zraka bez CO2 kroz plinski prostor te naknadnim neprestanim protresanjem ispitne posude. Samo se u Larsonovoj izmijenjenoj verziji protresa reakcijska posuda; miješanje se nalaže samo za netopljive tvari u ISO 9439 (5) i u izvornoj verziji iz SAD-a (6), a u objema se nalaže prije propuhivanje negoli zamjena količine u plinskom prostoru. U drugoj službenoj američkoj EPA metodi (7), koja se temelji na Gledhillovoj metodi (8), protresena reakcijska posuda zatvara se, a nastali CO2 skuplja se u unutarnji alkalni odvajač izravno iz plinovitog stanja, kao i u klasičnim Warburg/Barcroftovim respirometrijskim tikvicama.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Međutim, pokazalo se da se anorganski ugljik (IC) akumulira u mediju tijekom primjene standardnog, izmijenjenog Sturmova testa na čitav niz kemikalija (9). Pronađena je koncentracija IC-a od čak 8 mg/l tijekom razgradnje 20 mg C/l anilina. Dakle, skupljanje CO2 u alkalnim odvajačima nije dobro odrazilo pravu količinu CO2 koja nastaje djelovanjem mikroba u različitim trenucima tijekom razgradnje. Kao rezultat toga, specifikacija da se > 60 % teoretskog maksimuma CO2 (ThCO2) mora skupiti u ‚roku od 10 dana’ (10 dana neposredno nakon postizanja 10 % biorazgradnje) da bi se ispitivana kemikalija razvrstala kao lako biorazgradiva neće biti ispunjena za neke kemikalije koje bi se tako razvrstale opadanjem otopljenog organskog ugljika (DOC).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Kada je postotak razgradnje niža vrijednost od očekivane, moguće je da se IC akumulira u ispitnoj otopini. Tada se razgradivost može procijeniti nekim drugim testovima biorazgradivosti.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Ostali nedostaci Sturmove metodologije (nespretna, vremenski zahtjevna, podložnija pokusnoj greški i neprimjenjiva na hlapljive kemikalije) davno su potaknuli potragu za tehnikom začepljenih posuda drukčijom od Gledhillove, radije nego protoku plina (10)(11). Boatman i sur. (12) revidirali su ranije metode i usvojili sustav zatvorenog plinskog prostora u kojemu se CO2 ispušta u plinski prostor na kraju inkubacije acidifikacijom medija. CO2 se mjerio analizom plinskom kromatografijom (GC)/IC u automatski uzimanim uzorcima plinskog prostora, ali se u obzir nije uzimao otopljeni anorganski ugljik (DIC) u tekućem stanju. Isto tako, i korištene su posude bile vrlo male (20 ml), a sadržavale su svega 10 ml medija, što je izazvalo poteškoće, npr. pri dodavanju vrlo malih količina netopljivih ispitivanih kemikalija, i/ili možda mikroorganizmi nisu u dovoljnoj mjeri ili uopće prisutni u inokuliranom mediju da bi mogli razgraditi ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Te su poteškoće nadvladane u neovisnim studijama autora Strujisa i Stoltenkampa (13) te Bircha i Fletchera (14), od kojih su potonji bili nadahnuti svojim iskustvom s aparaturom korištenom u testu anaerobne biorazgradnje (15). U prethodnoj se metodi (13) CO2 mjeri u plinskom prostoru nakon acidifikacije i uravnoteženja, dok se u potonjoj metodi (14) mjeri DIC i u plinovitom i u tekućem stanju, bez tretmana; u tekućem je stanju bilo prisutno više od 90 % nastalog IC-a. Prednost obiju metoda nad Sturmovim testom jest u tome da je sustav ispitivanja kompaktniji i lakši za upravljanje, mogu se ispitivati i nehlapljive kemikalije, a izbjegava se i vjerojatnost odgode u mjerenju nastalog CO2.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Oba ta pristupa kombinirana su u normi ISO Headspace CO2 (16), koja je ispitana u prstenastom testu (17), a upravo se na toj normi i temelji ova ispitna metoda. Slično tomu, ta su dva pristupa korištena i u američkoj EPA metodi (18). Preporučuju se dvije metode mjerenja CO2, naime, CO2 u plinskom prostoru nakon acidifikacije (13) i IC u tekućem stanju nakon dodavanja viška lužina. Potonju je metodu uveo Peterson tijekom CONCAWE prstenastog testa (19) ove metode mjerenja u plinskom prostoru koja je izmijenjena kako bi se mjerila svojstvena biorazgradivost. Izmjene načinjene u reviziji ove metode iz 1992. godine (20) iz poglavlja C.4 ovog Priloga za laku biorazgradivost obuhvaćene su ovom ispitnom metodom pa su uvjeti (medij, trajanje itd.) i inače jednaki onima iz revidiranog Sturmova testa (20). Birch i Fletcher (14) pokazali su da se ovim testom plinskog prostora dobivaju rezultati vrlo slični onima koji se dobiju prstenastim testom OECD-a istih kemikalija (21) revidiranih ispitnih metoda.
                           
                        NAČELO ISPITIVANJA
                  
                              8.
                           
                           
                              Ispitivana kemikalija, obično u koncentraciji od 20 mg C/l, kao jedini izvor ugljika i energije, inkubira se u puferskom mediju s mineralnim solima koji je inokuliran miješanom populacijom mikroorganizama. Test se provodi u začepljenim bocama u kojima se u plinskom prostoru nalazi zrak, koji predstavlja zalihu kisika za aerobnu biorazgradnju. Razvijanje CO2 koje nastaje kao rezultat konačne aerobne biorazgradnje ispitivane kemikalije određuje se mjerenjem viška IC-a nastalog u ispitnim bocama u usporedbi s onim nastalim u posudama sa slijepim probama koje sadržavaju samo inokulirani medij. Stupanj biorazgradnje izražava se kao postotak teoretskog maksimuma proizvodnje IC-a (ThIC), i to na temelju količine ispitivane kemikalije (kao organskog ugljika) koja se dodala na početku.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Također se mogu mjeriti i opadanje DOC-a i/ili stupanj primarne biorazgradnje ispitivane kemikalije (20).
                           
                        INFORMACIJE O ISPITIVANOJ KEMIKALIJI
                  
                              10.
                           
                           
                              Sadržaj organskog ugljika (% w/w) ispitivane kemikalije mora biti poznat bilo iz njezine kemijske strukture bilo mjerenjem kako bi se mogao izračunati postotak razgradnje. Za hlapljive ispitivane kemikalije izmjerena ili izračunata konstanta Henryjevog zakona pomaže u određivanju odgovarajućeg omjera volumena plinskog prostora i tekućine. Podaci o toksičnosti ispitivane kemikalije na mikroorganizme pomažu u odabiru odgovarajuće ispitne koncentracije i tumačenju rezultata koji pokazuju slabu biorazgradivost: preporučuje se da se ubaci i kontrola inhibicije, osim ako već nije poznato da ispitivana kemikalija nema inhibitorni učinak na djelovanje mikroba (vidjeti stavak 24.).
                           
                        PRIMJENJIVOST METODE
                  
                              11.
                           
                           
                              Ovaj se test može primijeniti na ispitivane kemikalije topljive u vodi i netopljive premda treba osigurati dobro dispergiranje ispitivane kemikalije. Pomoću preporučenog omjera volumena plinskog prostora i tekućine od 1:2 mogu se ispitivati hlapljive kemikalije s konstantom Henryjeva zakona do 50 Pa.m3.mol–1 pošto udio ispitivane kemikalije u plinskom prostoru neće biti veći od 1 % (13). Manji volumen plinskog prostora može se koristiti pri ispitivanju kemikalija koje su hlapljivije, ali je moguće da je ograničavajuća njihova biodostupnost, posebno ako su one slabo topljive u vodi. Međutim, korisnici moraju osigurati da omjer volumena plinskog prostora i tekućine, kao i koncentracija ispitivane kemikalije, budu takvi da je dostupno dovoljno kisika za potpunu aerobnu biorazgradnju (npr. izbjegavati uporabu visoke koncentracije supstrata i malog volumena plinskog prostora). Smjernice o tome nalaze se u (13)(23).
                           
                        REFERENTNE KEMIKALIJE
                  
                              12.
                           
                           
                              Kako bi se provjerio postupak ispitivanja, paralelno treba ispitivati referentnu kemikaliju čija je biorazgradivost već poznata. U tu se svrhu mogu koristiti anilin, natrijev benzoat ili etilen-glikol za ispitivanje ispitivanih kemikalija topljivih u vodi te 1-oktanol za slabo topljive ispitivane kemikalije (13). Biorazgradnja tih kemikalija mora u roku od 14 dana doseći > 60 % ThIC-a.
                           
                        MJERNA OBNOVLJIVOST
                  
                              13.
                           
                           
                              U ISO prstenastom testu ove metode (17) dobiveni su sljedeći rezultati u preporučenim uvjetima, uključujući i 20 mg C ispitivane kemikalije/l.
                              
                                          Ispitivana kemikalija
                                       
                                       
                                          Srednja vrijednost postotka biorazgradnje
                                          (28d)
                                       
                                       
                                          Koeficijent varijacije
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Broj laboratorija
                                       
                                    
                                          Anilin
                                       
                                       
                                          90
                                       
                                       
                                          16
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                    
                                          1-oktanol
                                       
                                       
                                          85
                                       
                                       
                                          12
                                       
                                       
                                          14
                                       
                                    Varijabilnost unutar testa (mjerna obnovljivost) je, pomoću anilina, bila niska, a koeficijent varijabilnosti nije bio veći od 5 % u gotovo svim ispitnim nizovima. U dva slučaja u kojima je mjerna obnovljivost bila lošija, veća varijabilnost je vjerojatno bila rezultat velike proizvodnje IC-a u slijepim probama. Mjerna obnovljivost je bila gora s 1-oktanolom, ali je još uvijek bila manja od 10 % za 79 % ispitnih nizova. Ta je veća varijabilnost unutar testa vjerojatno bila rezultat grešaka u doziranju jer se mala količina (3 do 4 μl) 1-oktanola morala ubrizgati u začepljene ispitne boce. Veći bi koeficijenti varijacije rezultirali nižim koncentracijama ispitivane kemikalije od onih korištenih, posebno na koncentracijama ispod 10 mg C/l. To bi se moglo djelomice nadvladati snižavanjem koncentracije ukupnog anorganskog ugljika (TIC) u inokulumu.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              U prstenastom testu EU-a (24), u kojemu je ispitivano pet surfaktanata dodanih u koncentraciji od 10 mg C/l, dobiveni su sljedeći rezultati:
                              
                                          Ispitivana kemikalija
                                       
                                       
                                          Srednja vrijednost postotka biorazgradnje
                                          (28d)
                                       
                                       
                                          Koeficijent varijacije
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Broj laboratorija
                                       
                                    
                                          Tetrapropilen
                                          Benzen sulfonat
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                       
                                          45
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Di-izo-oktilsulfo-sukcinat
                                          (anionski)
                                       
                                       
                                          72
                                       
                                       
                                          22
                                       
                                       
                                          9
                                       
                                    
                                          Heksadecil-trimetil (21)
                                          
                                          Amonijak klorid
                                          (kationski)
                                       
                                       
                                          75
                                       
                                       
                                          13
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Izo-nonilfenol-(etoksilat)9
                                          
                                          (neionski)
                                       
                                       
                                          41
                                       
                                       
                                          32
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Koko-amid-propil
                                          Dimetilhidroksi
                                          Sulfobetain
                                          (amfoterni)
                                       
                                       
                                          60
                                       
                                       
                                          23
                                       
                                       
                                          11
                                       
                                    Rezultati pokazuju da je, općenito, varijabilnost bila veća za slabije razgrađene surfaktante. Varijabilnost unutar testa bila je manja od 15 % za više od 90 % slučajeva, a najviša je bila od 30-40 %.
                              
                                          NAPOMENA:
                                       
                                       
                                          Većina surfaktanata ne sadrže samo jednu molekulu, nego su mješavina izomera, homologa itd., koji se razgrađuju po isteku različitih karakterističnih razdoblja odgode i različitim kinetičkim brzinama, što rezultira ‚zamućenim’, izlomljenim krivuljama, tako da je moguće da se prolazna vrijednost od 60 % neće doseći u ‚roku od 10 dana’ premda bi svaka pojedinačna molekularna vrsta dosegla > 60 % u roku od 10 dana da je sama ispitivana. To se primjećuje i kod drugih kompleksnih smjesa.
                                       
                                    
                        OPIS METODE
                  
                     Aparatura
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Uobičajena laboratorijska aparatura i:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          Staklene serum boce, začepljene čepovima od butilnog kaučuka i aluminijskim brtvama na navrtanje. Preporučena veličina je ‚125 ml’ s ukupnim volumenom od oko 160 ml (u tom bi slučaju volumen svake boce trebao biti poznat i iznositi 160 ± 1 ml). Manja veličina posuda može se koristiti ako rezultati ispunjavaju uvjete opisane u stavcima 66. i 67.;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          Analizator ugljika ili neki drugi instrument (npr. plinski kromatograf) za mjerenje anorganskog ugljika;
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          Šprice velike preciznosti za uzorke plina i tekućine;
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          Orbitalna miješalica u okruženju s kontroliranom temperaturom;
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          Dovod zraka bez CO2 - to se može pripremiti propuštanjem zraka kroz granule natronskog vapna ili korištenjem smjese plina u omjeru 80 % N2/20 % 02 (opcijski) (vidjeti stavak 28.);
                                       
                                    
                                          (f)
                                       
                                       
                                          Uređaj za membransku filtraciju propusnosti od 0,20 - 0,45 μm (fakultativno),
                                       
                                    
                                          (g)
                                       
                                       
                                          Analizator organskog ugljika (fakultativno).
                                       
                                    
                        
                     Reagensi
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Tijekom cijelog testa koristite reagense analitičke čistoće.
                           
                        
                     Voda
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Treba koristiti destiliranu ili deioniziranu vodu koja sadržava ≤ 1 mg/l ukupnog organskog ugljika. To predstavlja ≤ 5 % početnog sadržaja organskog ugljika koji je uveden na preporučenu dozu ispitivane kemikalije.
                           
                        
                     Radne otopine za medij s mineralnim solima
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Radne otopine i medij s mineralnim solima slični su testovima iz norme ISO 14593 (16) i poglavlja C.4 ‚Laka biorazgradivost’ (20). Uporaba više koncentracije amonijakova klorida (2,0 g/l umjesto 0,5 g/l) potrebna je samo u vrlo iznimnim slučajevima, npr. kad je koncentracija ispitivane kemikalije > 40 mg C/l. Radne otopine treba čuvati u hladnjaku i baciti ih nakon šest mjeseci ili ranije ako ima dokaza precipitacije ili rasta mikroba. Pripremiti sljedeće radne otopine:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          Kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4) 8,50 g
                                          Dikalijev hidrogen fosfat (K2HPO4) 21,75 g
                                          Dinatrijev hidrogen fosfat dihidrat (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g
                                          Amonijakov klorid (NH4Cl) 0,50 g
                                          Otopiti u vodi i načiniti 1 litru. pH te otopine treba iznositi 7,4 (± 0,2). Ako to nije slučaj, pripremiti novu otopinu.
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          Kalcijev klorid dihidrat (CaCl2.2H2O) 36,40 g
                                          Otopiti u vodi i načiniti 1 litru.
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          Magnezijev sulfat heptahidrat (MgSO4.7H2O) 22,50 g
                                          Otopiti u vodi i načiniti 1 litru.
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          Željezov (III) klorid heksahidrat (FeCl3.6H20) 0,25g
                                          Otopiti u vodi i načiniti 1 litru pa dodati kapljicu koncentrata.
                                       
                                    
                        
                     Priprema mineralnog medija
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Pomiješati 10 ml otopine (a) s približno 800 ml vode (stavak 17.), potom dodati 1 ml otopina (b), (c) i (d) te načiniti 1 litru pomoću vode (stavak 17.).
                           
                        
                     Ostali reagensi
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Koncentrirana orto-fosforna kiselina (H3PO4) (> 85 % mase po volumenu).
                           
                        
                     Otopina s natrijevim hidroksidom 7M
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Otopiti 280 g natrijeva hidroksida (NaOH) u 1 litri vode (stavak 17.). Odrediti koncentraciju DIC-a te otopine i u obzir uzeti tu vrijednost pri izračunu rezultata testa (vidjeti stavke 55. i 61.), posebno u svjetlu validacijskog kriterija iz stavka 66. točke (b). Pripremiti svježu otopinu ako je previsoka koncentracija DIC-a.
                           
                        
                     Ispitivana kemikalija
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Pripremiti u vodi radnu otopinu ispitivane kemikalije koja je dovoljno topljiva u vodi (stavak 17.) ili u ispitnom mediju (stavak 19.) na koncentraciji po mogućnosti 100-struko većoj od konačne koncentracije koja će se koristiti u testu; možda će biti neophodno podesiti pH radne otopine. Radnu otopinu treba dodati mineralnom mediju da se postigne konačna koncentracija organskog ugljika od 2 do 4 mg C/l, po mogućnosti 20 mg C/l. Ako se koriste niže koncentracije, možda će biti narušena dobivena preciznost. U posude se mogu dodavati i topljive i netopljive tekuće kemikalije, i to izravno pomoću šprica velike preciznosti. Možda će slabo topljive i netopljive ispitivane kemikalije trebati posebno tretirati (25). Na izboru stoje:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          izravno dodavanje poznatih vaganih količina;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          ultrazvučno dispergiranje prije dodavanja;
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          dispergiranje pomoću emulgatora potrebnih da bi se utvrdilo imaju li ikakav inhibitorni ili stimulacijski učinak na djelovanje mikroba prije dodavanja;
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          adsorpcija tekućih ispitivanih kemikalija ili otopina u prikladno hlapljivom otapalu na neki inertni medij ili nosač (npr. filtar od staklenih vlakana), a potom i isparavanje otapala i izravno dodavanje poznatih količina;
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          dodavanje poznatog volumena otopine ispitivane kemikalije u lako hlapljivom otapalu u praznu ispitnu posudu, a potom i isparavanje otapala.
                                       
                                    Sredstva ili otapala korišteni u točkama (c), (d) i (e) moraju biti ispitana na stimulacijski ili inhibitorni učinak na djelovanje mikroba (vidjeti stavak 42. točku (b)).
                           
                        
                     Referentna kemikalija
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Pripremiti radnu otopinu (topljive) referentne kemikalije u vodi (stavak 17.) u koncentraciji po mogućnosti 100 puta većoj od konačne koncentracije koja će se koristiti (20 mg C/l) u testu.
                           
                        
                     Provjera inhibicije
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Ispitivane kemikalije obično ne pokazuju značajnije znakove razgradnje u uvjetima korištenima u procjena lake biorazgradivosti. Jedan od mogućih uzroka jest taj da ispitivana kemikalija ima inhibitorni učinak na inokulum na koncentraciji korištenoj u testu. U plan ispitivanja može se stoga uključiti i provjera inhibicije kako bi se olakšala identifikacija (retrospektivno) inhibicije kao mogućeg uzroka ili čimbenika koji pridnosi tom učinku. Kao druga mogućnost, provjerom inhibicije mogu se isključiti takve interferencije i može se pokazati da se nulta ili slaba razgradnja mogu pripisati isključivo nepodložnosti na napad mikroba u uvjetima testa. Da bi se dobili podaci o toksičnosti ispitivane kemikalije na (aerobne) mikroorganizme, pripremiti otopinu u ispitnom mediju koji sadržava ispitivanu kemikaliju i referentnu kemikaliju (stavak 19.), od kojih je svaka u istoj koncentraciji kao i pri dodavanju (vidjeti stavke 22. i 23.).
                           
                        
                     Inokulum
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Inokulum se može izvesti iz niza izvora: aktivnog mulja, izlaznih otpadnih voda (bez klora), površinskih voda i tala ili iz kombinacije tih izvora (20). Biorazgradivo djelovanje izvora treba provjeriti pomoću referentne kemikalije. Bez obzira na to koji je izvor, ne bi trebalo koristiti mikroorganizme koji su prethodno izlagani ispitivanoj kemikaliji ako se postupkom želi ispitati laka biorazgradivost.
                              
                                          
                                             Upozorenje:
                                          
                                       
                                       
                                          Aktivni mulj, otpadne vode i izlazna voda nakon pročišćavanja otpadnih voda sadržavaju patogene organizme i s njima se mora rukovati oprezno.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Iskustvo pokazuje da je optimalni volumen za inokulum onaj koji:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          je dostatan za poticanje odgovarajućeg biorazgradivog djelovanja;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          razgrađuje referentnu kemikaliju u propisanom postotku (vidjeti stavak 66.),
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          proizvodi 102 do 105 jedinica koje tvore kolonije po mililitru u konačnoj smjesi;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          obično proizvodi koncentraciju od 4 mg/l suspendiranih krutih tvari u konačnoj smjesi kada se koristi aktivni mulj, mogu se koristiti koncentracije do 30 mg/l, ali one mogu značajno povećati proizvodnju CO2 u slijepim probama (26);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pridonosi s manje od 10 % početne koncentracije organskog ugljika koji je uvela ispitivana kemikalija;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          općenito predstavlja 1-10 ml inokuluma na 1 litru ispitne otopine.
                                       
                                    
                        
                     Aktivni mulj
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Aktivni se mulj nanovo skuplja iz aeracijskog bazena postrojenja za pročišćavanje otpadnih voda ili iz dozračne posude laboratorijske jedinice u kojima se pročišćavaju pretežno komunalne otpadne vode. Ako je to potrebno, treba ukloniti grube čestice prosijavanjem (npr. primjenom sita veličine mrežice od 1 mm2), a mulj treba održavati u aerobnom stanju do uporabe.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Kao druga mogućnost, nakon uklanjanja svih grubih čestica treba pustiti da se mulj istaloži ili ga centrifugirati (npr. 1 100 × g na 10 minuta). Baciti tekući supernatant. Mulj se može prati u mineralnoj otopini. Suspendirati koncentrirani mulj u mineralnom mediju kako bi se dobila koncentracija od 3-5 g suspendirane krute tvari/l. Potom dozračivati do uporabe.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Mulj treba uzeti iz ispravnog konvencionalnog postrojenja za pročišćavanje. Ako se mulj treba uzeti iz postrojenja za pročišćavanje velikih brzina ili ako se smatra da mulj sadržava inhibitore, treba ga oprati. Pustiti da se resuspendirani mulj istaloži ili ga centrifugirati nakon temeljitog miješanja, baciti tekući supernatant pa ponovno suspendirati oprani mulj u još jednoj količini mineralnog medija. Ponavljati taj postupak sve dok se ne bude smatralo da u mulju više nema viška supstrata ili inhibitora.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Nakon potpunog resuspendiranja ili kod neobrađenog mulja uzeti uzorak neposredno prije uporabe za određivanje suhe mase suspendiranih krutih tvari.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Još jedna mogućnost jest homogenizirati aktivni mulj (3-5 g suspendirane krute tvari/l). Tretirati mulj u Waring miješalici dvije minute na srednjoj brzini. Pustiti 30 minuta da se izmiješani mulj istaloži, ili dulje ako je potrebno, pa izliti tekućinu za uporabu u vidu inokuluma brzinom od oko 10 mg/l mineralnog medija.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Daljnje smanjenje proizvodnje CO2 u slijepim probama može se postići dozračivanjem mulja preko noći zrakom bez CO2. Upotrijebiti 4 mg/l krute tvari aktivnog mulja kao koncentraciju inokuluma u ovom testu (13).
                           
                        
                     Sekundarne otpadne vode
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Druga mogućnost je da se inokulum dobije iz sekundarnih otpadnih voda iz postrojenja za pročišćavanje ili laboratorijske jedinice u koje se pretežno dodaju komunalne otpadne vode. Održavati uzorak u aerobnim uvjetima i upotrijebiti ga na dan skupljanja ili ga, po potrebi, prethodno kondicionirati. Otpadne vode treba filtrirati kroz grubi filtar kako bi se uklonile grube lebdeće čestice, a potom se mjeri pH vrijednost.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Za smanjenje sadržaja IC-a filtrat se 1 h propuhuje zrakom bez CO2 (stavak 15. točka (e)) dok se pH održava na 6,5 pomoću ortofosforne kiseline (stavak 20.). pH vrijednost vraća se na početnu vrijednost pomoću natrijeva hidroksida (stavak 21.), a nakon taloženja od oko 1 h za inokulaciju se uzima prikladna količina supernatanta. Tim se postupkom propuhivanja smanjuje sadržaj IC-a u inokulumu. Primjerice, ako se kao inokulum koristila maksimalna preporučena količina filtriranih propuhanih otpadnih voda (100 ml) po litri, količina IC-a prisutna u posudama s kontrolnom slijepom probom kretala se u rasponu od 0,4 do 1,3 mg/l (14), što predstavlja 2-6,5 % ispitivane kemikalije C na 20 mg C/l i 4-13 % na 10 mg C/l.
                           
                        
                     Površinske vode
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Treba uzeti uzorak prikladnih površinskih voda. Njega treba čuvati u aerobnim uvjetima i upotrijebiti ga na dan uzimanja. Uzorak treba biti koncentriran, ako je to potrebno, filtriranjem ili centrifugiranjem. Količina inokuluma koja će se upotrijebiti u svakoj ispitnoj posudi treba ispunjavati kriterije iz stavka 26.
                           
                        
                     Tla
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Treba uzeti uzorak prikladnog tla, koji se uzima na dubini do 20 cm ispod površine tla. Iz uzorka tla treba odstraniti kamenčiće, ostatke biljaka i beskralježnjake prije nego što se on prosije kroz mrežicu veličine 2 mm (ako je uzorak premokar da bi ga se smjesta moglo prosijati, djelomice ga osušiti na zraku kako bi se olakšalo prosijavanje). Treba ga držati u aerobnim uvjetima i upotrijebiti na dan uzimanja (ako se uzorak prenosi u labavo vezanoj vrećici od crnog polietilena, može se držati na 2 do 4 °C u toj vrećici do mjesec dana).
                           
                        
                     Prethodno kondicioniranje inokuluma
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Inokulum se može prethodno kondicionirati na uvjete pokusa, ali se ne smije prethodno prilagoditi ispitivanoj kemikaliji. Prethodno kondicioniranje može smanjiti stvaranje CO2 u slijepim probama. Prethodno se kondicioniranje sastoji od dozračivanja aktivnog mulja nakon razrjeđivanja u ispitnom mediju do 30 mg/l vlažnim zrakom bez CO2 od 5-7 dana na ispitnoj temperaturi.
                           
                        POSTUPAK ISPITIVANJA
                  
                     Broj boca
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Broj boca (stavak 15. točka (a)) potrebnih za ispitivanje ovisit će o učestalosti analiza i trajanju ispitivanja.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Preporučuje se da se analiziraju tri boce nakon dovoljnog broja vremenskih razmaka takvih da se može identificirati rok od 10 dana. Isto tako, na kraju ispitivanja analizira se najmanje pet boca (stavak 15. točka (a)) iz setova (a), (b) i (c) (vidjeti stavak 42.) kako bi se omogućilo da se izračuna 95 % intervala pouzdanosti za srednju vrijednost postotka biorazgradnje.
                           
                        
                     Inokulirani medij
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Inokulum se koristi na koncentraciji od 4 mg/l suhe tvari aktivnog mulja. Neposredno prije uporabe pripremiti dovoljnu količinu inokuliranog medija dodavanjem, primjerice, 2 ml prikladno tretiranog aktivnog mulja (stavci 27. do 32.) na 2 000 mg/l u 1 litru medija s mineralnim solima (stavak 19.). Ako se trebaju koristiti sekundarne otpadne vode, dodaje se do 100 ml otpadnih voda (stavak 33.) u 900 ml medija s mineralnim solima (stavak 19.) i razrijedi se medijem u 1 litru.
                           
                        
                     Priprema boca
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Alikvoti inokuliranog medija stavljaju se u boce za višestruka određivanja kako bi se dobio omjer plinskog prostora i tekućine od 1:2 (npr. dodati 107 ml u boce zapremine od 160 ml). Mogu se koristiti i drugi omjeri, ali vidjeti upozorenja u stavku 11. Kada se koristi neka druga vrsta inokuluma, mora se pobrinuti da se inokulirani medij propisno promiješa kako bi se osiguralo da je ravnomjerno raspoređen u ispitnim bocama.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Pripremaju se setovi boca (stavak 15. točka (a)) koje sadržavaju:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          Ispitne boce (obilježene s FT) koje sadržavaju ispitivanu kemikaliju;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          Kontrole sa slijepim probama (obilježene s FB) koje sadržavaju samo ispitni medij plus inokulum; također se moraju dodati i sve kemikalije, otapala, sredstva ili filtri od staklenih vlakana koji su se koristili za uvođenje ispitivane kemikalije u ispitne posude;
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          Posude (obilježene s FC) za provjeru postupka koje sadržavaju referentnu kemikaliju;
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          Ako je to potrebno, posude (obilježene s FI) za provjeru mogućeg inhibitornog učinka ispitivane kemikalije koje sadržavaju i ispitivanu kemikaliju i referentnu kemikaliju u istim koncentracijama (stavak 24.) kao i u bocama FT i FC;
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          Posude (obilježene s FS) za provjeru moguće abiotičke razgradnje kao (a) plus 50 mg/l HgCl2 ili sterilizirane na neki drugi način (npr. u autoklavu).
                                       
                                    
                        
                              43.
                           
                           
                              Ispitivane i referentne kemikalije topljive u vodi dodaju se kao vodene radne otopine (stavci 22., 23. i 24.) kako bi se dobila koncentracija od 10 do 20 mg C/l.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Netopljive ispitivane kemikalije i netopljive referentne kemikalije dodaju se u boce na niz načina (vidjeti stavak 22. točke (a) do (e)) ovisno o naravi ispitivane kemikalije, bilo prije bilo poslije dodavanja inokuliranog medija, ovisno o metodi obrade ispitivane kemikalije. Ako se koristi jedan od postupaka iz stavka 22. točaka (a) do (e), boce sa slijepim probama FB (stavak 42. točka (b)) treba tretirati na sličan način, ali bez ispitivane kemikalije ili referentne kemikalije.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Hlapljive ispitivane kemikalije treba ubrizgati u začepljene bode (stavak 47.) pomoću mikrošprice. Doza se izračunava iz ubrizgane količine i gustoće ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              U posude treba dodati vodu, ako je to potrebno, kako bi u svakoj posudi bio isti volumen tekućine. Mora se osigurati da omjer plinskog prostora i tekućine (obično 1:2) i koncentracija ispitivane kemikalije budu takvi da u plinskom prostoru ima dovoljno kisika za potpunu biorazgradnju.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Potom se sve boce začepljuju, primjerice čepovima od butilnog kaučuka i aluminija. U ovoj fazi treba dodati hlapljive ispitivane kemikalije (stavak 45.). Ako treba pratiti pad koncentracije DOC-a u ispitnoj otopini kao i za provedbu analize u nultom vremenu za početnu koncentraciju IC-a (sterilne kontrole, stavak 42. točka (e)) ili druge determinante, iz ispitne posude uzima se odgovarajući uzorak. Potom se ispitna posuda i njezin sadržaj bacaju.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Začepljene bode stavljaju se na kružnu mućkalicu (stavak 15. točka (d)), a brzina mućkanja mora biti dovoljna da sadržaj boce bude dobro promiješan i u suspenziji (npr. 150 do 200 opm), te se inkubiraju u mraku na 20 °C, a temperatura se mora održavati na ± 1 °C.
                           
                        
                     Uzorkovanje
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Režim uzorkovanja ovisit će o fazi prilagodbe i kinetičkoj brzini biorazgradnje ispitivane kemikalije. Boce se žrtvuju za analizu na dan uzorkovanja, što bi se trebalo događati najmanje jedanput tjedno ili češće (npr. dvaput tjedno) ako je potrebna krivulja potpune razgradnje. Potrebni broj boca za višestruko određivanje uzima se iz mućkalice i predstavljaju FT, FB i FC te, ako se koriste, i FI i FS (vidjeti stavak 42.). Test se obično provodi 28 dana. Ako krivulja biorazgradnje naznačuje da je plato postignut prije 28 dana, test se može završiti i ranije. Za analizu uzeti uzorke iz pet boca rezerviranih za 28. dan testa te rezultate iskoristiti za izračun granica pouzdanosti ili koeficijenta varijacije postotka biorazgradnje. Boce koje predstavljaju provjere inhibicije i abiotičke razgradnje ne trebaju se uzorkovati toliko često kao druge boce; dovoljno ih je uzorkovati 1. i 28. dana.
                           
                        
                     Analiza anorganskog ugljika (IC)
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Proizvodnja CO2 u bocama određuje se mjerenjem porasta koncentracije anorganskog ugljika (IC) tijekom inkubacije. Na raspolaganju su dvije preporučene metode za mjerenje količine IC-a proizvedene u testu, a slijedi njihov opis. Budući da te metode mogu dati malo različite rezultate, u ispitnom nizu treba koristiti samo jednu.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Metoda (a) preporučuje se ako je vjerojatno da medij sadržava ostatke, primjerice, papira filtra od staklenih vlakana i/ili netopljive ispitivane kemikalije. Ta se analiza može provoditi plinskim kromatografom ako nije dostupan analizator ugljika. Važno je da boce budu na ili blizu ispitne temperature kad se analizira plin u plinskom prostoru. Metoda (b) može biti lakša za laboratorije koji se koriste analizatorom ugljika za mjerenje IC-a. Važno je da se otopina natrijeva hidroksida (stavak 21.) upotrijebljena za pretvaranje CO2 u karbonat ili svježe pripremi ili da bude poznat njezin sadržaj IC-a kako bi se to moglo uzeti u obzir pri izračunu rezultata testa (vidjeti stavak 66. točku (b)).
                           
                        
                     Metoda (a):   acidifikacija na pH < 3
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Prije svake serije analiza kalibrira se analizator IC-a primjenom odgovarajućeg standarda IC-a (npr. 1 % w/w CO2 u N2). Koncentrirana ortofosforna kiselina (stavak 20.) ubrizgava se kroz septum svake uzorkovane boce radi snižavanja pH-a medija na < 3 (npr. dodati 1 ml u 107 ml ispitnog medija). Boce se ponovno vraćaju na mućkalicu. Nakon mućkanja od sat vremena na ispitnoj temperaturi boce se skidaju s mućkalice, iz plinskog prostora svake boce uzimaju se alikvoti (npr. 1 ml) plina i isti se ubrizgavaju u analizator IC-a. Izmjerene koncentracije IC-a bilježe se kao mg C/l.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Načelo ove metode jest da, nakon acidifikacije na pH < 3 i uravnoteženja na 20 °C, konstanta uravnoteženja za raspodjelu CO2 između tekućeg i plinovitog stanja u ispitnim bocama iznosi 1,0 kada se mjeri kao koncentracija (13). To bi se trebalo pokazati za sustav ispitivanja najmanje jedanput na sljedeći način:
                              Postaviti boce koje sadržavaju 5 i 10 mg/l kao IC uporabom otopine anhidridnog natrijeva karbonata (Na2 CO3) u vodi bez CO2 koja se priprema acidifikacijom vode na pH 6,5 koncentriranom ortofosfornom kiselinom (stavak 20.), propuhivanjem preko noći zrakom bez CO2 te podizanjem pH lužinama do neutralnosti. Osigurati da omjer volumena plinskog prostora i volumena tekućine bude isti kao i u testu (npr. 1:2). Acidificirati i uravnotežiti na način opisan u stavku 52., potom izmjeriti koncentracije IC-a i plinovitog (plinski prostor) i tekućeg stanja. Provjeriti jesu li te dvije koncentracije jednake unutar pokusne greške. Ako to nije slučaj, operater treba revidirati postupke. Ta provjera raspodjele IC-a između tekućeg i plinovitog stanja ne treba se provoditi svaki put kad se provodi test; ista se vjerojatno može provesti pri kalibraciji.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Ako treba izmjeriti opadanje DOC-a (samo ispitivane kemikalije topljive u vodi), treba uzeti uzorke u tekućem stanju iz zasebnih (neacidificiraniih) boca, filtrirati ih kroz membranu i ubrizgati ih u analizator DOC-a. Te se boce mogu, po potrebi, koristiti i za druge analize kako bi se izmjerila primarna biorazgradnja.
                           
                        
                     Metoda (b):   pretvaranje CO2 u karbonat
                  
                  
                              55.
                           
                           
                              Prije svake serije analiza kalibrira se analizator IC-a primjenom odgovarajućeg standarda, primjerice, otopine natrijeva bikarbonata (NaHCO3) u vodi bez CO2 (vidjeti stavak 53.) u rasponu od 0 do 20 mg/l kao IC. Otopina natrijeva hidroksida (7M, stavak 21.) (npr. 1 ml u 107 ml medija) ubrizgava se kroz septum svake uzorkovane boce, a boce se mućkaju 1 h na ispitnoj temperaturi. Koristiti istu otopinu NaOH na svim bocama žrtvovanima određenog dana, ali ne nužno u svim prilikama za uzorkovanje tijekom testa. Ako su u svim prilikama za uzorkovanje potrebne apsolutne vrijednosti IC-a u slijepim probama, trebat će odrediti IC otopine NaOH svaki put kad se ista koristi. Boce se skidaju s mućkalice i puštaju se da se istalože. Špricom se izvlače prikladne količine (npr. 50 do 1 000 μl) u tekućem stanju iz svake posude. Uzorci se ubrizgavaju u analizator IC-a i bilježe se koncentracije IC-a. Treba osigurati da je korišteni analizator propisno opremljen kako bi mogao analizirati lužnate uzorke koji nastaju u ovoj metodi.
                           
                        
                              56.
                           
                           
                              Načelo ove metode jest da je, nakon dodavanja lužina i mućkanja, zanemariva koncentracija IC-a u plinskom prostoru. To treba provjeriti za sustav ispitivanja najmanje jedanput korištenjem standarda IC-a, dodavanjem lužina i uravnoteživanjem te mjerenjem koncentracije IC-a i u plinskom prostoru i u tekućem stanju (vidjeti stavak 53.). Koncentracija u plinskom prostoru treba biti blizu nule. Ta provjera virtualno potpune apsorpcije CO2 ne mora se provoditi svaki put kad se provodi test.
                           
                        
                              57.
                           
                           
                              Ako treba izmjeriti opadanje DOC-a (samo ispitivane kemikalije topljive u vodi), treba uzeti uzorke u tekućem stanju iz zasebnih boca (koje ne sadržavaju dodane lužine), filtrirati ih kroz membranu i ubrizgati ih u analizator DOC-a. Te se boce mogu, po potrebi, koristiti i za druge analize kako bi se izmjerila primarna biorazgradivost.
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Izračun rezultata
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Pod pretpostavkom 100 %-tne mineralizacije ispitivane kemikalije u CO2, višak ThIC-a proizvedenog u kontrolnim slijepim probama jednak je TOC-u koji se na početku testa dodaje u svaku ispitnu bocu, to jest:
                              
                                 
                              Ukupna masa (mg) anorganskog ugljika (TIC) u svakoj boci jest:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          Jednadžba [1]
                                       
                                    gdje je:
                              
                                          VL
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          volumen tekućine u boci (litra),
                                       
                                    
                                          CL
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          koncentracija IC-a u tekućini (mg/l kao ugljika),
                                       
                                    
                                          VH
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          volumen plinskog prostora (litra),
                                       
                                    
                                          CH
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          koncentracija IC-a u plinskom prostoru (mg/l kao ugljika).
                                       
                                    Izračuni TIC-a za ove dvije analitičke metode koje se koriste za mjerenje IC-a u ovom testu opisane su u nastavku teksta u stavcima 60. i 61. Postotak biorazgradnje (% D) u svakom slučaju dobiva se ovako:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          Jednadžba [2]
                                       
                                    gdje je:
                              
                                          TICt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          mg TIC-a u ispitnoj boci u vrijeme t,
                                       
                                    
                                          TICb
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          srednja vrijednost mg TIC-a u bocama sa slijepim probama u vrijeme t,
                                       
                                    
                                          TOC
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          mg TOC-a dodanih na početnu u ispitnu posudu.
                                       
                                    Izračunava se postotak biorazgradnje % D za ispitnu bocu (FT), referentnu bocu (FC) i, ako je i to obuhvaćeno, za kontrolne boce za praćenje inhibicije (FI) iz odgovarajućih količina TIC-a proizvedenih do svakog trenutka uzorkovanja.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Ako je došlo do značajnog porasta sadržaja TIC-a u sterilnim kontrolama (FS) tijekom trajanja testa, može se zaključiti da je došlo do abiotičke razgradnje ispitivane kemikalije i to se mora uzeti u obzir u izračunu D u jednadžbi [2].
                           
                        
                     Acidifikacija na pH < 3
                  
                  
                              60.
                           
                           Budući da acidifikacija na pH < 3 i uravnoteženje rezultiraju ujednačenjem koncentracije TIC-a u tekućem i plinovitom stanju, treba mjeriti samo koncentraciju IC-a u plinovitom stanju. Dakle, iz jednadžbe [1] 
                                 , gdje je VB = volumen serum boce.
                        
                     Pretvaranje CO2 u karbonat
                  
                  
                              61.
                           
                           U ovoj se metodi izračuni provode kao u jednadžbi [1], ali se ignorira zanemariva količina IC-a u plinovitom stanju, to jest 
                                 , i 
                                 .
                        
                     Izražavanje rezultata
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Krivulja biorazgradnje dobiva se grafičkim prikazom postotka biorazgradnje D u ovisnosti o vremenu inkubacije i, ako je to moguće, naznačuju se faza prilagodbe, faza biorazgradnje, rok od 10 dana i faza platoa, to jest faza u kojoj je postignuta maksimalna razgradnja i u kojoj se izravnala krivulja biorazgradnje. Ako se za paralelne ispitne posude dobiju poredbeni rezultati FT (< 20 % razlike), grafički se prikazuje srednja vrijednost krivulje (vidjeti Dodatak 2., slika 1.); a ako ne, krivulje se grafički prikazuju za svaku posudu. Određuje se srednja vrijednost postotka biorazgradnje u fazi platoa ili se procjenjuje najviša vrijednost (npr. kad krivulja opada u fazi platoa), ali je vrlo važno ocijeniti da u potonjem slučaju ta vrijednost ne bude netipična. Naznačiti maksimalnu razinu biorazgradnje kao ‚stupanj biorazgradnje ispitivane kemikalije’ u izvješću o ispitivanju. Ako broj ispitnih posuda nije bio dovoljan za naznaku faze platoa, za izračun srednje vrijednosti koriste se podaci izmjereni posljednjeg dana testa. Ta posljednja vrijednost, srednja vrijednost pet višestrukih određivanja, služi kao naznaka preciznosti kojom je određen postotak biorazgradnje. Isto tako, treba izvijestiti i o vrijednosti dobivenoj po isteku roka od 10 dana.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Na isti se taj način grafički prikazuje krivulja za referentnu kemikaliju, FC, te, ako je i to obuhvaćeno, i za provjeru abiotičke eliminacije, FS, i za kontrolu inhibicije, FI.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Bilježe se količine TIC-a u kontrolama sa slijepim probama (FB), kao i one u tikvicama FS (abiotička provjera) ako su te posude bile obuhvaćene testom.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Izračunati D za posude FI, i to na temelju prinosa teoretskog IC-a očekivanog samo iz referentne komponente te smjese. Ako je, 28. dana [(DFC
                                  (22) – DFI
                                  (23))/DFC] × 100 > 25 %, može se pretpostaviti da je ispitivana kemikalija inhibirala djelovanje inokuluma, a to može biti zaslužno za niske vrijednosti DFT dobivene u uvjetima testa. U tom se slučaju test može ponoviti s nižom ispitnom koncentracijom te, po mogućnosti, smanjenjem DIC-a u inokulumu i TIC-a nastalog u kontrolama sa slijepim probama jer će niže koncentracije u protivnom smanjiti preciznost ove metode. Druga je mogućnost uporaba drugog inokuluma. Ako se u tikvici FS (abiotička) zamijeti značajan porast (> 10 %) količine TIC-a, možda je došlo do procesa abiotičke razgradnje.
                           
                        
                     Valjanost rezultata
                  
                  
                              66.
                           
                           
                              Test se smatra valjanim ako:
                              
                                          a)
                                       
                                       
                                          je srednja vrijednost postotka razgradnje u posudama FC koje sadržavaju referentnu kemikaliju > 60 % do 14. dana inkubacije i ako
                                       
                                    
                                          b)
                                       
                                       
                                          je srednja vrijednost količine TIC-a prisutna u kontrolama sa slijepim probama FB na kraju testa > 3 mg C/l.
                                       
                                    Ako nisu ispunjena ta ograničenja, test treba ponoviti s inokulumom iz drugog izvora i/ili treba revidirati korištene postupke. Primjerice, ako je problem u visokoj proizvodnji IC-a u slijepim probama, treba slijediti postupak iz stavaka 27. do 32.
                           
                        
                              67.
                           
                           
                              Ako ispitivana kemikalija ne dosegne 60 % ThIC-a te ako se pokaže da ona nema inhibitorni učinak (stavak 65.), test se može ponoviti s povišenom koncentracijom inokuluma (do 30 mg/l aktivnog mulja i 100 ml otpadnih voda/l) ili s inokulumima iz drugih izvora, poglavito ako se razgradnja kretala u rasponu od 20 do 60 %.
                           
                        
                     Tumačenje rezultata
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              Biorazgradnja > 60 % ThIC-a u roku od 10 dana u ovom testu pokazuje da je ispitivana kemikalija lako biorazgradiva u aerobnim uvjetima.
                           
                        
                              69.
                           
                           
                              Ako se ne postigne prolazna vrijednost od 60 %, odrediti pH vrijednost medija u bocama koji nije učinjen ni kiselim niti lužnatim; vrijednost niža od 6,5 mogla bi biti znak nitrifikacije. U takvom slučaju ponoviti test s puferskom otopinom više koncentracije.
                           
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              Sastaviti tablicu % D za svaku ispitnu bocu (FT), referentnu bocu (FC) i, ako je obuhvaćena, kontrolnu bocu za provjeru inhibicije (FI) za svaki dan uzorkovanja. Ako se za boce za višestruko određivanje dobiju poredbeni rezultati, grafički prikazati krivulju srednje vrijednosti % D u ovisnosti o vremenu. Zabilježiti količinu TIC-a u kontrolama sa slijepim probama (FB) i u sterilnim kontrolama (FS), DOC-a i/ili drugih determinanti te postotak njihova opadanja.
                           
                        
                              71.
                           
                           
                              Odrediti srednju vrijednost % D u fazi platoa ili koristiti najvišu vrijednost ako krivulja biorazgradnje opadne u fazi platoa, a to prijaviti kao ‚stupanj biorazgradnje ispitivane kemikalije’. Važno je osigurati da u potonjem slučaju najviša vrijednost ne bude netipična.
                           
                        
                              72.
                           
                           
                              Izvješće o ispitivanju mora obuhvaćati sljedeće podatke:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana kemikalija:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      uobičajeni naziv, kemijski naziv, CAS broj, strukturna formula i relevantna fizikalno-kemijska svojstva;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čistoća (nečistoće) ispitivane kemikalije.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      upućivanje na ovu ispitnu metodu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      opis korištenog sustava ispitivanja (npr. zapremina posude, omjer plinskog prostora i tekućine, metoda miješanja itd.);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      primjena ispitivane kemikalije i referentne kemikalije na sustav ispitivanja: korištena ispitna koncentracija i količina ugljika dozirana u svaku ispitnu bocu, uporaba otapala;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pojedinosti o korištenom inokulumu, sve prethodne obrade i prethodno kondicioniranje;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      temperatura inkubacije;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      validacija načela analize IC-a;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      osnovna svojstva korištenog analizatora IC-a (i sve ostale korištene analitičke metode);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      broj određivanja.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sirovi podaci i izračunate vrijednosti biorazgradivosti u obliku tablice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      grafikon postotka razgradnje u ovisnosti o vremenu za ispitivane i referentnim kemikalijama, fazi prilagodbe, fazi razgradnje, roku od 10 dana i nagibu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      postotak opadanja na platou na kraju testa i po isteku roka od 10 dana;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obrazloženje odbijanja rezultata ispitivanja;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sve ostale činjenice relevantne za postupak koji se slijedio;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rasprava o rezultatima.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Poglavlje C.4 ovog Priloga Određivanje ‚lake’ biorazgradivosti - test razvijanja CO2 (metoda C.4-C).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159-167.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              ISO 9439 (1990; revidirano 1999). Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium - Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507-524.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527-1550.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              ISO 14593, (1999) Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis of inorganic carbon in sealed vessels (C02 headspace test).
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Battersby NS (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813-1822.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR and Starkey M (1999). An „inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219-3235.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Poglavlje C.4 ovog Priloga, Određivanje ‚lake’ biorazgradivosti.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Pariz.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Poglavlje C.11 ovog Priloga, Test inhibicije disanja aktivnog mulja.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              ISO 10634 (1996) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
                           
                        
                     Dodatak 1.
                     KRATICE I DEFINICIJE
                     IC: Anorganski ugljik
                     ThCO2: Teoretski ugljikov dioksid (mg) je izračunata količina ugljikova dioksida koja će nastati iz poznatog i izmjerenog sadržaja ugljika ispitivane kemikalije nakon njezine potpune mineralizacije; također se izražava i kao mg ugljikova dioksida koji nastane po mg ispitivane kemikalije.
                     DOC: Otopljeni organski ugljik je organski ugljik prisutan u otopini ili onaj koji prolazi kroz filtar veličine 0,45 mikrometara ili ostaci u supernatantu nakon centrifugiranja na približno 4 000 g (oko 40 000 m sec-2) tijekom 15 min.
                     DIC: Otopljeni anorganski ugljik
                     ThIC: Teoretski anorganski ugljik
                     TIC: Ukupni anorganski ugljik
                     Lako biorazgradivo: Proizvoljno razvrstavanje kemikalija koje su prošle određene specificirane testove pretraživanja na konačnu biorazgradivost; ti su testovi toliko strogi da se pretpostavlja da će se takve kemikalije brzo i potpuno biorazgraditi u vodenom okolišu u aerobnim uvjetima.
                     Rok od 10 dana: 10 dana neposredno poslije postizanja 10 % biorazgradnje.
                     Svojstvena biorazgradivost: Razvrstavanje kemikalija za koje postoje nedvosmisleni dokazi biorazgradnje (primarne ili konačne) u bilo kojem ispitivanju biorazgradivosti.
                     Konačna aerobna biorazgradnja: Razina biorazgradnje koja se postigne kad mikroorganizmi u cijelosti prožmu ispitivanu kemikaliju, što rezultira proizvodnjom ugljikova dioksida, vode, mineralnih soli i novim mikrobnim staničnim sastojcima (biomasom).
                     Mineralizacija: Mineralizacija je potpuna biorazgradnja neke organske kemikalije u CO2 i H2O u aerobnim uvjetima te u CH4, CO2 i H2O u anaerobnim uvjetima.
                     Faza prilagodbe (‚lag’ faza): Vrijeme od početka testa do postizanja aklimatizacije i/ili prilagodbe razgrađujućih mikroorganizama i do porasta stupnja biorazgradnje ispitivane kemikalije ili organske tvari do zamjetne razine (npr. 10 % maksimalne teoretske biorazgradnje ili niže, ovisno o preciznosti tehnike mjerenja).
                     Faza razgradnje: Vrijeme od završetka faze prilagodbe do trenutka kad se postigne 90 % maksimalne razine razgradnje.
                     Stacionarna faza (faza platoa): Faza platoa je faza u kojoj je postignuta maksimalna razgradnja i u kojoj se izravnala krivulja biorazgradnje.
                     Ispitivana kemikalija: Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom ispitnom metodom.
                  
                  
                     Dodatak 2.
                     
                        Primjer krivulje biorazgradnje
                     
                     
                        Slika 1.
                     
                     
                        Biorazgradnja 1-oktanola u ispitivanju CO2 u plinskom prostoru
                     
                     
                        
                     Pojmovnik
                     Biorazgradnja
                     Faza razgradnje
                     Maksimalna razina biorazgradnje
                     Stacionarna faza (faza platoa)
                     Rok od 10 dana
                     Trajanje ispitivanja (dana)
                  
                  C.30.   BIOAKUMULACIJA U KOPNENIM OLIGOHETIMA
                  
                  UVOD
                  
                              1.
                           
                           
                              Ova ispitna metoda odgovara Smjernici za ispitivanje OECD-a (TG) 317 (2010). Od ispitnih metoda koje se odnose na sudbinu u okolišu, Biokoncentracija: Test s ribama u protočnom postupku (poglavlje C.13 ovog Priloga (49)) objavljena je 1996., a Bioakumulacija u bentičkim oligohetima iz sedimenta (53) objavljena je 2008. Ekstrapolacija podataka o vodenoj bioakumulaciji kod kopnenih organizama, poput gujavica, je teška, ako ne i nemoguća. Modeli izračuna utemeljenih na lipofilnosti ispitivane kemikalije, npr. (14) (37), trenutačno se koriste za procjenu bioakumulacije kemikalija u tlu, kao npr. u dokumentu EU-a o tehničkim smjernicama (19). Već je obrađena potreba za ispitnom metodom specifičnom za ovo područje, npr. (55). Takva je metoda poglavito važna za procjenu sekundarnog otrovanja u kopnenim prehrambenim lancima (4). Nekoliko se nacionalnih ispitinih metoda bavilo pitanjem bioakumulacije u drugim organizmima osim riba, npr. (2) i (72). Metodu mjerenja bioakumulacije iz onečišćenih tala u gujavicama (Eisenia fetida, Savigny) i crvima razvilo je Američko društvo za testiranje i materijale (American Society for Testing and Materials) (3). Međunarodno prihvaćena metoda za određivanje bioakumulacije u tlu obrađenom spikingom poboljšat će procjenu rizika kemikalija u kopnenim ekosustavima, npr. (25) (29).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Beskralježnjaci koji konzumiraju tlo izloženi su kemikalijama vezanim za tlo. Među tim životinjama kopneni oligoheti igraju važnu ulogu u strukturi i funkciji tala (15) (20). Kopneni oligoheti žive u tlu, a djelomice i na površini tla (poglavito u sloju legla); oni često predstavljaju vrstu koja najviše obiluje biomasom (54). Bioturbacijom tla te služenjem kao plijen, ove životinje mogu snažno utjecati na bioraspoloživost kemikalija drugim organizmima, poput beskralježnjaka (npr. grabežljivih grinja i kornjaša; npr. (64) ili kralježnjaka grabežljivaca (npr. lisica i galebova) (18) (62). Neke vrste kopnenih oligoheta koje se trenutačno koriste u ispitivanjima ekotoksičnosti opisane su u Dodatku 5.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Standardni vodič za provođenje laboratorijskog ispitivanja toksičnosti ili bioakumulacije tla Američkog društva za testiranje i materijale (ASTM Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bioaccumulation Tests) s gujavicom Eisenia fetida i bijelim crvom Enchytraeus albidus (3) donosi brojne ključne i korisne pojedinosti za provedbu ove ispitne metode bioakumulacije u tlu. Daljnji dokumenti na koje se upućuje u ovoj ispitnoj metodi jesu poglavlje C.13 ovog Priloga, Biokoncentracija: Test s ribama u protočnom postupku (49) i OECD TG 315: Bioakumulacija u bentičkim oligohetima iz sedimenta (53). Praktična iskustva sa studijama o bioakumulaciji u tlu i publikacijama iz literature, npr. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79), također su glavni izvori informacija za ovu ispitnu metodu.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Ova se ispitna metoda uglavnom može primijeniti na stabilne, neutralne organske kemikalije, koje naginju adsorpciji na tla. Ovom ispitnom metodom moguće je testiranje na bioakumulaciju stabilnih metaloorganskih spojeva koji se vežu za tlo. Također se može primijeniti i na metale i druge elemente u tragovima.
                           
                        PREDUVJETI
                  
                              5.
                           
                           
                              Testovi za mjerenje bioakumulacije kemikalije u kopnenim oligohetima provođeni su s teškim metalima (vidjeti npr. (63)) i s postojanim, organskim kemikalijama niskih log Kow vrijednosti između 3,0 i 6,0, npr. (40). Takvi se testovi primjenjuju i na:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Kemikalije s vrijednostima log Kow većima od 6,0 (superhidrofobne kemikalije);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Kemikalije koje pripadaju razredu organskih kemikalija za koje je poznato da imaju bioakumulacijski potencijal u živim organizmima, npr. površinski aktivne ili jako adsorptivne kemikalije;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Kemikalije koje naznačuju bioakumulacijski potencijal zbog strukturnih svojstava, npr. analogoni kemikalija s poznatim bioakumulacijskim potencijalom; i
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Metale.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Podaci o ispitivanoj kemikaliji, kao što su uobičajeni naziv, kemijski naziv (po mogućnosti IUPAC naziv), strukturna formula, CAS registarski broj, čistoća, mjere opreza, ispravni uvjeti skladištenja i analitičke metode trebaju se dobiti prije početka studije. Osim toga, trebaju biti poznati i sljedeći podaci:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          topljivost u vodi;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          podjelni koeficijent oktanol/voda, Kow;
                                          
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          podjelni koeficijent tlo/voda, izražen kao Koc,
                                          
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          tlak pare;
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          razgradivost (npr. u tlu, vodi);
                                       
                                    
                                          (f)
                                       
                                       
                                          poznati metaboliti.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Mogu se koristiti radioaktivno obilježene i radioaktivno neobilježene ispitivane kemikalije. Međutim, radi olakšavanja analize preporučuje se korištenje radioaktivno obilježenih ispitivanih kemikalija. Odluka o tomu donosi se na temelju otkrivanja ograničenja ili traženja mjerenja polazne ispitivane kemikalije i metabolita. Ako se koristi radioaktivno obilježena ispitivana kemikalija i mjere ukupni radioaktivni ostaci, važno je karakterizirati radioaktivno obilježene ostatke i u tlu i u ispitnim organizmima, i to po pitanju postotka polazne ispitivane kemikalije i radioaktivno obilježene nepolazne kemikalije, npr. u uzorcima uzetima u stabilnom stanju ili na kraju faze apsorpcije kako bi se omogućio izračun faktora bioakumulacije (BAF) za polaznu ispitivanu kemikaliju i predmetne metabolite tla (vidjeti stavak 50.). Možda će se ovdje opisana metoda morati izmijeniti kako bi se npr. omogućilo dovoljno biomase za mjerenje radioaktivno neobilježene organske ispitivane kemikalije ili metala. Kada se mjere ukupni radioaktivni ostaci (tekućinskim scintilacijskim brojenjem nakon ekstrakcije, izgaranja ili otapanja tkiva), faktor bioakumulacije temelji se na polaznoj ispitivanoj kemikaliji i metabolitima. Izračun BAF-a trebao bi se, po mogućnosti, temeljiti na koncentraciji polazne ispitivane kemikalije u organizmima i ukupnim radioaktivnim ostacima. Nakon toga iz BAF-a treba izračunati faktor akumulacije u biota tlu (BSAF), normaliziran na sadržaj lipida u crvu i sadržaj organskog ugljika (OC), radi usporedbe rezultata različitih ispitivanja bioakumulacije.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Trebala bi biti poznata toksičnost ispitivane kemikalije na vrste korištene u testu, npr. koncentracija s učinkom (ECx) ili smrtonosna koncentracija (LCx) za vrijeme trajanja faze apsorpcije (npr. (19)). Odabrana koncentracija ispitivane kemikalije trebala bi, po mogućnosti, iznositi oko 1 % njezina akutnog asimptotskog LC50 te biti najmanje desetostruko veća od svojih granica detekcije u tlu korištenom analitičkom metodom. Ako su dostupne, prednost treba dati vrijednostima toksičnosti dobivenima iz dugotrajnih studija o subletalnim konačnim učincima (51) (52). Ako takvi podaci nisu dostupni, test akutne toksičnosti dat će korisne informacije (vidjeti npr. (23)).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Treba biti dostupna prikladna analitička metoda poznate točnosti, preciznosti i osjetljivosti na kvantifikaciju kemikalije u ispitnim otopinama, u tlu i u biološkom materijalu, zajedno s pojedinostima o pripremi i skladištenju uzoraka, kao i sigurnosno-tehničkim listovima za materijale. Također trebaju biti poznate i analitičke granice detekcije ispitivane tvari u tlu i u tkivu crva. Ako se koristi 14C obilježena ispitivana kemikalija, trebaju biti poznati specifična radioakitvnost (tj. Bq mol-1) i postotak radioaktivnosti povezan s nečistoćama. Specifična radioaktivnost ispitivane kemikalije treba biti dovoljno velika da olakša analizu, a upotrijebljene ispitne koncentracije ne smiju izazivati toksične učinke.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Ispitivanje se može provoditi s umjetnim tlom ili s prirodnim tlima. Prije početka ispitivanja trebaju biti poznati podaci o svojstvima korištenog prirodnog tla, npr. podrijetlo tla ili njegovih sastojaka, pH, sadržaj organskog ugljika, raspodjela veličine čestica (postotak pijeska, praha i gline) te vodni kapacitet (WHC) (3) (48).
                           
                        NAČELO ISPITIVANJA
                  
                              11.
                           
                           
                              Parametri koji karakteriziraju bioakumulaciju ispitivane kemikalije obuhvaćaju i faktor bioakumulacije (BAF), konstantu brzine apsorpcije (ks) i konstantu brzine eliminacije (ke). Definicije su navedene u Dodatku 1.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Ispitivanje se sastoji od dviju faza: faze apsorpcije (faze izlaganja) i faze eliminacije (faze nakon izlaganja). Tijekom faze apsorpcije skupine crva u višestrukim određivanjima izlažu se tlu, koje je spikingom obrađeno ispitivanom kemikalijom. Osim ispitnih životinja, kontrolne skupine crva drže se u istim uvjetima, samo bez ispitivane kemikalije. Mjere se suha masa i sadržaj lipida ispitnih organizama. To se može učiniti i s crvima iz kontrolne skupine. Analitičke pozadinske vrijednosti (slijepe probe) mogu se dobiti analizom uzoraka kontrolnih crva i tla. Za fazu eliminacije crvi se prenose u tlo u kojemu nema ispitivane kemikalije. Faza eliminacije uvijek je potrebna, osim ako je apsorpcija ispitivane kemikalije bila neznatna tijekom faze izlaganja. Faza eliminacije donosi podatke o brzini kojom ispitni organizmi izlučuju ispitivanu kemikaliju (npr. (27)). Ako se tijekom faze apsorpcije ne postigne stabilno stanje, određivanje kinetičkih parametara - faktora kinetičke bioakumulacije BAFk, konstante brzine apsorpcije i eliminacije - u pravilu bi se trebalo temeljiti na istodobnom usklađivanju rezultata faze apsorpcije i faze eliminacije. Koncentracija ispitivane kemikalije u/na crvima prati se tijekom obje faze ispitivanja.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Tijekom faze apsorpcije mjerenja se vrše u vremenima uzorkovanja od 14 dana (enhitreji) ili od 21 dana (gujavice) sve dok se ne postigne stabilno stanje (11) (12) (67). Stabilno je stanje postignuto kad je grafički prikaz koncentracije u crvima u ovisnosti o vremenu paralelan s vremenskom osi te kada tri uzastopne analize koncentracije u uzorcima uzetima u vremenskim razmacima od najmanje dva dana ne variraju više od ± 20 % jedna od druge na temelju statističkih usporedbi (npr. analiza varijance, regresijska analiza).
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Faza eliminacije sastoji se od prijenosa ispitnih organizama u posude koje sadržavaju isti supstrat, samo bez ispitivane kemikalije. Tijekom faze eliminacije mjerenja se vrše u vremenima uzorkovanja tijekom 14 dana (enhitreji) ili 21 dana (gujavice), osim ako prethodno analitičko određivanje nije pokazalo 90 % smanjenja ostataka ispitivane kemikalije u crvima. Koncentracija ispitivane kemikalije u crvima na kraju faze eliminacije prijavljuje se kao neeliminirani ostaci. Faktor bioakumulacije stabilnog stanja (BAFss) računa se, po mogućnosti, i kao omjer koncentracije u crvima (Ca) i u tlu (Cs) u očito stabilnom stanju i kao faktor kinetičke bioakumulacije, BAFK, kao omjer konstante brzine apsorpcije iz tla (ks) i konstante brzine eliminacije (ke) (za definicije vidjeti Dodatak 1.), pod pretpostavkom kinetike prvog reda (za izračune vidjeti Dodatak 2.). Ako je očito da se ne može primijeniti kinetika prvog reda, treba se koristiti drugim modelima.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Konstanta brzine apsorpcije, konstanta (ili konstante kada su obuhvaćeni i drugi modeli) brzine eliminacije, faktor kinetičke bioakumulacije (BAFK) te, kad je moguće, granice pouzdanosti svih tih parametara izračunavaju se iz jednadžbi kompjutoriziranog modela (za smjernice vidjeti Dodatak 2.). Ispravnost usklađenosti bilo kojeg modela može se odrediti, npr. iz koeficijenta korelacije ili koeficijenta određivanja (koeficijenti blizu jedinice znak su dobre usklađenosti) ili hi-kvadratom. Isto tako, i veličina standardne pogreške ili granica pouzdanosti blizu procijenjenih parametara mogu biti znak ispravne usklađenosti modela.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Da bi se smanjila varijabilnost rezultata ispitivanja za ispitivane kemikalije visoke lipofilnosti, faktori bioakumulacije trebali bi se izražavati u odnosu na sadržaj lipida i sadržaj organskog ugljika (kg organskog ugljika u tlu (OC) kg-1 sadržaja lipida u crvima). Taj se pristup temelji na činjenici da za neke razrede kemikalija postoji jasna veza između bioakumulacijskog potencijala i lipofilnosti; to je dobro utvrđeno za ribe (47). Postoji veza između sadržaja lipida u ribama i bioakumulacije takvih kemikalija. Slične su korelacije pronađene i za bentičke organizme, npr. (30) (44). Slično tomu, ta je korelacija pokazana i za kopnene oligohete, npr. (5) (6) (7) (14). Ako je na raspolaganju dovoljno tkiva crva, sadržaj lipida ispitnih životinja može se odrediti na istom biološkom materijalu koji se koristio za određivanje koncentracije ispitivane kemikalije. Druga je mogućnost uporaba kontrolnih životinja za mjerenje sadržaja lipida.
                           
                        VALJANOST ISPITIVANJA
                  
                              17.
                           
                           
                              Da bi ispitivanje bilo valjano, moraju biti ispunjeni sljedeći kriteriji i za kontrolne i za ispitne posude:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Na kraju ispitivanja ukupna smrtnost tijekom faze apsorpcije i faze eliminacije ne bi trebala biti veća od 10 % (gujavice) ili 20 % (enhitreji) od ukupnog broja uvedenih crva.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Za Eisenia fetida i Eisenia andrei srednja vrijednost gubitka mase izmjerena na kraju faze apsorpcije i na kraju faze eliminacije ne bi trebala premašivati 20 % u usporedbi s početnom svježom masom (f.w.) na početku svake faze.
                                       
                                    
                        OPIS METODE
                  
                     Ispitne vrste
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Za ispitivanje bioakumulacije preporučuje se nekoliko vrsta kopnenih oligoheta. Najčešće korištene vrste Eisenia fetida ili Eisenia andrei (Lumbricidae), ili Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus, ili Enchytraeus luxuriosus (Enchytraeidae) opisane su u Dodatku 5.
                           
                        
                     Aparatura
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Treba se pobrinuti da se izbjegava uporaba materijala, za sve dijelove opreme, koji se mogu otapati, adsorbirati ispitivanu kemikaliju ili propuštati druge kemikalije te onih koji imaju negativan učinak na ispitne životinje. Standardne pravokutne ili cilindrične posude, načinjene od kemijski inertnog materijala i prikladne zapremine, mogu se koristiti u skladu s brzinom punjenja, tj. brojem ispitnih crva. Plemeniti čelik, plastika ili staklo mogu se koristiti za svu opremu koja dolazi u doticaj s ispitnim medijem. Ispitne posude treba prikladno zatvoriti kako bi se izbjegao bijeg crva te ujedno omogućio dovoljan dotok zraka. Za kemikalije s visokim koeficijentima adsorpcije, kao što su sintetički piretroidi, možda će biti potrebno silanizirano staklo. U tim će se situacijama oprema morati baciti nakon uporabe (49). Treba spriječiti izlazak radioaktivno obilježenih ispitivanih kemikalija i hlapljivih kemikalija. Treba koristiti zamke (npr. staklene posude za pranje plinova) koje sadržavaju odgovarajuće apsorbente kako bi se zadržali svi ostaci koji isparavaju iz ispitnih posuda.
                           
                        
                     Tlo
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Kakvoća ispitnog tla treba omogućiti preživljavanje i, po mogućnosti, razmnožavanje ispitnih organizama za trajanja aklimatizacije i razdoblja ispitivanja, a da pritom oni ne pokazuju nikakvo neuobičajeno ponašanje ili izgled. Crvi bi trebali rovati u tlu.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Kao supstrat u ispitivanjima, preporučuje se uporaba umjetnog tla opisanog u poglavlju C.8 ovog Priloga (48). Priprema umjetnog tla za uporabu u ispitivanjima bioakumulacije te preporuke za skladištenje umjetnog tla nalaze se u Dodatku 4. Umjetno tlo sušeno na zraku može se skladištiti na sobnoj temperaturi do uporabe.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Međutim, prirodna tla s neonečišćenih mjesta mogu poslužiti kao ispitno tlo i/ili tlo za uzgoj kultura. Za prirodna tla treba biti svojstveno podrijetlo (mjesto skupljanja), pH, sadržaj organskog ugljika, raspodjela veličine čestica (postotak pijeska, praha i gline), maksimalni vodni kapacitet (WHCmax) te postotak sadržaja vode. Analiza tla ili njegovih sastojaka na mikroonečišćivače prije uporabe trebala bi dati korisne informacije. Ako se koristi tlo s poljoprivrednog zemljišta, isto ne smije biti tretirano proizvodima za zaštitu usjeva niti balegom tretiranih životinja kao gnojivom najmanje godinu dana ranije, a organskim gnojivima najmanje šest mjeseci prije uzorkovanja (50). Postupci manipulacije prirodnih tala prije njihove uporabe u ispitivanjima ekotoksičnosti s oligohetima u laboratoriju opisani su u (3). Vrijeme skladištenja prirodnih tala u laboratoriju treba biti što je moguće kraće.
                           
                        
                     Primjena ispitivane kemikalije
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Ispitna se kemikalija inkorporira u tlo. U obzir treba uzeti fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije. Ispitivana kemikalija topljiva u vodi treba se potpuno otopiti u vodi prije miješanja s tlom. Preporučeni postupak spikinga za ispitivane kemikalije slabo topljive u vodi obuhvaća premazivanje jednog ili većeg broja sastojaka (umjetnog) tla ispitivanom kemikalijom. Primjerice, kremeni pijesak ili njegov dio mogu se namočiti u otopini ispitivane kemikalije u prikladnom organskom otapalu, koji onda polako isparava dok ne ostavi suhi pijesak. Premazani dio potom se može umiješati u vlažno tlo. Glavna prednost ovog postupka jest ta da se u tlo ne uvodi otapalo. Kada se koristi prirodno tlo, ispitivana kemikalija može se dodati postupkom spikinga dijela tla sušenog na zraku na gore opisani način za umjetno tlo ili miješanjem ispitivane kemikalije u vlažno tlo, uz naknadnu fazu isparavanja ako se koristi otapajuće sredstvo. Općenito, što je moguće više treba izbjegavati doticaj vlažnog tla s otapalima. U obzir treba uzeti sljedeće (3):
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Ako se koristi neko drugo otapalo osim vode, ono treba biti mješljivo s vodom i/ili treba izići (primjerice, ispariti) i ostaviti samo ispitivanu kemikaliju na tlu.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Ako se koristi kontrola s otapalom, nema potrebe za negativnom kontrolom. Kontrola s otapalom trebala bi sadržavati najvišu koncentraciju otapala koja se dodaju tlu i u njoj se treba koristiti otapalo iz iste šarže koja se koristila za radnu otopinu. Glavni kriteriji za odabir odgovarajućeg otapajućeg sredstva trebali bi biti toksičnost i hlapljivost otapala, topljivost ispitivane kemikalije u odabranom otapalu.
                                       
                                    
                        
                              24.
                           
                           
                              Za kemikalije koje su slabo topljive u vodi i u organskim otapalima 2,0 - 2,5 g fino usitnjenog kremenog pijeska po ispitnoj posudi može se pomiješati s količinom ispitivane kemikalije, npr. uporabom žbuke i tucanog pijeska, za dobivanje željene ispitne koncentracije. Ta se smjesa kremenog pijeska i ispitivane kemikalije dodaje prethodno navlaženom tlu i temeljito se izmiješa s odgovarajućom količinom deionizirane vode da bi se dobio potrebni sadržaj vlage. Konačna se smjesa podijeli na ispitne posude. Taj se postupak ponavlja za svaku ispitnu koncentraciju, a pripremi se također i prikladn akontrola s 2,0 - 2,5 g fino usitnjenog kremenog pijeska po ispitnoj posudi.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Koncentracija ispitivane kemikalije u tlu treba se odrediti nakon postupka spikinga. Homogena raspodjela ispitivane kemikalije u tlu treba se provjeriti prije uvođenja ispitnih organizama. Treba izvijestiti o metodi koja se koristila za spiking te o razlozima za odabir specifičnog postupka spikinga.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Između tla i faze porne vode, u idealnom slučaju, trebala bi se uspostaviti ravnoteža prije dodavanja organizama; preporučuje se vremensko razdoblje od četiri dana na 20 °C. Za mnoge organske kemikalije slabo topljive u vodi vrijeme potrebno za postizanje prave ravnoteže između adsorbiranih i otopljenih dijelova može biti nekoliko dana ili nekoliko mjeseci. Ovisno o cilju studije, primjerice kada treba oponašati uvjete u okolišu, tlo obrađeno postupkom spikinga može se ostaviti dulje vrijeme da ‚stari’, npr. za metale to su tri tjedna na 20 °C (22).
                           
                        
                     Uzgoj kulture ispitnih organizama
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Crve, po mogućnosti, treba držati u trajnoj laboratorijskoj kulturi. Smjernice o metodama uzgoja laboratorijskih kultura za Eisenia fetida i Eisenia andrei te za vrstu Enchytraeidae navedene su u Dodatku 5. (vidjeti još i (48) (51) (52)).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Crvi koji se koriste u ispitivanju ne smiju imati zamjetnih bolesti, abnormalnosti i parazita.
                           
                        PROVEDBA ISPITIVANJA
                  
                              29.
                           
                           
                              Ispitni organizmi izlažu se ispitivanoj kemikaliji tijekom faze apsorpcije. Faza apsorpcije treba trajati 14 dana (enhitreji) ili 21 dan (gujavice), osim ako se ne pokaže da je postignuto stabilno stanje.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Za fazu eliminacije crvi se prenose u tlo u kojemu nema ispitivane kemikalije. Prvi uzorak treba uzeti 4 - 24 h nakon početka faze eliminacije. Primjeri rasporeda uzorkovanja za fazi apsorpcije od 21 dana i fazu eliminacije od 21 dana nalaze se u Dodatku 3.
                           
                        
                     Ispitni organizmi
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Za mnoge vrste kopnenih enhitreja vrlo je mala pojedinačna masa (npr. 5-10 mg mokre mase po jedinci Enchytraeus albidus, a još manje za Enchytraeus crypticus ili Enchytraeus luxuriosus); da bi se provelo mjerenja mase i kemijska analiza, možda će biti neophodno pridružiti i crve iz ispitnih posuda za višestruka određivanja (tj. svi će se crvi iz posuda za višestruka određivanja iskoristiti za dobivanje jednog rezultata analize tkiva). 20 jedinki enhitreja dodaje se u posude za višestruka određivanja, a treba biti najmanje tri posude za višestruka određivanja. Ako je granica analitičke detekcije ispitivane kemikalije visoka, možda će biti potrebno još više crva. Za ispitne vrste veće pojedinačne mase (Eisenia fetida i Eisenia andrei) mogu se koristiti posude za višestruka određivanja koje sadržavaju samo jednu jedinku.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Gujavice koje se koriste u ispitivanju trebale bi biti slične mase (npr. Eisenia fetida i Eisenia andrei trebale bi imati pojedinačnu masu od 250 – 600 mg). Enhitreji (npr. Enchytraeus albidus) trebaju biti dugački otprilike 1 cm. Svi crvi koji se koriste u određenom ispitivanju trebaju dolaziti iz istog izvora i to trebaju biti odrasle životinje s pojasom žljezdanog epitela (klitelum) (vidjeti Dodatak 5.). Budući da masa i starost životinja mogu utjecati na vrijednosti BAF-a (npr. zbog varirajućeg sadržaja lipida i/ili prisustva jajašaca), te parametre treba točno zabilježiti i u obzir uzeti pri tumačenju rezultata. Osim toga, kokoni se mogu polagati i tijekom razdoblja izlaganja, što će također imati utjecaja na vrijednosti BAF-a. Preporučuje se da se poduzorak ispitnih crva izvaže prije ispitivanja kako bi se procijenila srednja vrijednost mokre i suhe mase.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Treba koristiti visoki omjer tla i crva da bi se na minimum sveo pad koncentracije ispitivane kemikalije u tlu tijekom faze apsorpcije. Za vrste Eisenia fetida i Eisenia andrei preporučuje se minimalna količina od 50 g suhe mase (d.w.) tla po crvu, a za enhitreje minimalno 10-20 g d.w. tla po ispitnoj posudi. Posude trebaju sadržavati sloj tla debljine 2-3 cm (enhitreji) ili 4-5 cm (gujavice).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Crvi koji se koriste u ispitivanju vade se iz kulture (npr. enhitreji pomoću draguljarske pincete). Odrasle se životinje prenose u neobrađeno ispitno tlo radi aklimatizacije i hrane se (vidjeti stavak 36.). Ako se uvjeti ispitivanja razlikuju od uvjeta uzgoja kulture, faza aklimatizacije od 24-72 h trebala bi biti dovoljna da se crvi prilagode uvjetima ispitivanja. Nakon aklimatizacije gujavice se ispiru prenošenjem u staklene posude (npr. petri zdjelice) koje sadržavaju čistu vodu te se naknadno važu prije nego što se dodaju ispitnom tlu. Prije vaganja iz crva treba odstraniti višak vode blagim pritiskanjem crva o stijenku posude ili pažljivim tapkanjem crva blago navlaženim papirnatim ručnikom.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Treba promatrati i bilježiti ponašanje ispitnih organizama pri rovanju. U ispitivanjima s gujavicama te životinje (kontrolne i ispitne) obično rovare u tlu u roku od par sati; to treba provjeriti najkasnije 24 h nakon dodavanja crva u ispitne posude. Ako gujavice ne rovu u tlu (npr. više od 10 % tijekom više od polovice trajanja faze apsorpcije), to je znak da ili uvjeti ispitivanja nisu prikladni ili ispitni organizmi nisu zdravi. U takvim bi se slučajevima ispitivanje trebalo prekinuti i ponoviti. Enhitreji uglavnom žive u međuprostornim porama tla pa je moguće da je njihova koža samo djelomice u doticaju sa supstratom koji je okružuje; pretpostavlja se da je jednako izlaganje enhitreja koji rovu i onih koji ne rovu te da izostanak rovanja kod enhitreja ne mora nužno značiti i potrebu za ponavljanjem ispitivanja.
                           
                        
                     Hranjenje
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Hranjenje treba planirati kad se koristi tlo s niskim sadržajem organskog ugljika. Kad se koristi umjetno tlo, za gujavice se preporučuje tjedna brzina hranjenja (tj. crve treba hraniti jedanput tjedno) od 7 mg suhog gnojiva na g suhe mase tla, a za enhitreje preporučuje se tjedna brzina od 2-2,5 mg usitnjenih zobenih pahuljica na g suhe mase tla (11). Prva porcija hrane treba se izmiješati s tlom neposredno prije dodavanja ispitnih organizama. Po mogućnosti treba koristiti istu vrstu hrane kao i u uzgoju kultura (vidjeti Dodatak 5.).
                           
                        
                     Svjetlo i temperatura
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Ispitivanja treba provoditi u kontroliranom ciklusu svjetla i mraka od 16/8 sati, po mogućnosti 400 do 800 luksa u području ispitnih posuda (3). Ispitna temperatura cijelo vrijeme trajanja ispitivanja treba iznositi 20 ± 2 °C.
                           
                        
                     Ispitne koncentracije
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Koristi se samo jedna koncentracija. Treba obrazložiti situacije u kojima je/su potrebna(-e) dodatna(-e) koncentracija(-e). Ako je toksičnost (ECx) ispitivane kemikalije blizu granice analitičke detekcije, preporučuje se uporaba radioaktivno obilježene ispitivane kemikalije visoke specifične radioaktivnosti. Za metale bi koncentracija trebala biti viša od razine u tkivu i tlu.
                           
                        
                     Višestruka određivanja
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Za kinetička mjerenja (fazu apsorpcije i fazu eliminacije) minimalni broj ispitnih posuda višestrukog određivanja treba biti tri po mjestu uzorkovanja. Ukupni broj pripremljenih posuda višestrukog određivanja treba biti dovoljan da obuhvati sva vremena uzorkovanja tijekom faze apsorpcije i faze eliminacije.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Za biološka promatranja i mjerenja (npr. omjer suhe i mokre mase, sadržaj lipida) te za analizu pozadinskih koncentracija u crvima i u tlu treba osigurati najmanje 12 posuda za višestruko određivanje iz negativne kontrole (četiri se uzorkuju na početku, četiri na kraju apsorpcije i četiri na kraju eliminacije) ako se ne koristi nikakvo drugo otapalo osim vode. Ako se za primjenu ispitivane kemikalije koristi otapajuće sredstvo, paralelno s ispitinim posudama za višestruko određivanje treba provoditi i ispitivanje kontrolnih posuda s otapalom (četiri posude za višestruko određivanje uzorkuju se na početku, četiri na kraju faze apsorpcije i četiri na kraju faze eliminacije) koje sadržavaju sve sastojke osim ispitivane kemikalije. U tom slučaju mogu se pripremiti i četiri dodatne posude za višestruko određivanje iz negativne kontrole (bez otapala) za fakultativno uzorkovanje na kraju faze apsorpcije. Te posude za višestruko određivanje mogu se biološki usporediti s kontrolama s otapalom da bi se dobile informacije o mogućem utjecaju otapala na ispitne organizme. Preporučuje se da se pripremi dovoljan broj dodatnih posuda za višestruko određivanje (npr. osam) za ispitne i kontrolnu/kontrolne posude.
                           
                        
                     Učestalost mjerenja kakvoće tla
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              pH tla, sadržaj vlage u tlu i temperatura (neprekidno) u ispitnoj prostoriji trebaju se mjeriti na početku i na kraju faze apsorpcije i faze eliminacije. Jedanput tjedno treba prekontrolirati sadržaj vlage u tlu vaganjem ispitnih posuda i usporedbom stvarnih masa s početnim masama na početku ispitivanja. Gubitke vode treba kompenzirati dodavanjem deionizirane vode.
                           
                        
                     Uzorkovanje i analiza crva i tla
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Primjer rasporeda faze apsorpcije i faze eliminacije u ispitivanjima bioakumulacije kod gujavica i enhitreja naveden je u Dodatku 3.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Tlo se uzorkuje iz ispitnih posuda za određivanje koncentracije ispitivane kemikalije prije umetanja crva te tijekom faze apsorpcije i faze eliminacije. Tijekom ispitivanja određuju se koncentracije ispitivane kemikalije u crvima i u tlu. Općenito, mjere se ukupne koncentracije u tlu. Kao druga mogućnost, mogu se mjeriti koncentracije i u pornoj vodi; u takvom slučaju treba navesti obrazloženje i metode prije započinjanja studije te ih treba obuhvatiti u izvješću.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Crvi i tlo uzorkuju se najmanje u šest prigoda tijekom faze apsorpcije i faze eliminacije. Ako se pokazala stabilnost ispitivane kemikalije, može se smanjiti broj analiza tla. Preporučuje se da se analiziraju najmanje tri posude iz višestrukih određivanja na početku i na kraju faze apsorpcije. Ako koncentracija izmjerena na kraju faze apsorpcije odstupa od početne koncentracije za više od 30 %, treba analizirati i uzorke tla koji su se uzeli drugih dana.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              U svakom trenutku uzorkovanja ukloniti crve iz tla predmetne posude za višestruko određivanje (npr. rasuti tlo iz posude za višestruko određivanje na pliticu i izvaditi crve mekanom draguljarskom pincetom), brzo ih isprati vodom u plitkoj staklenoj ili čeličnoj posudi. Ukloniti višak vode (vidjeti stavak 34.). Pažljivo prenijeti crve u prethodno izvaganu posudu, smjesta ih izvagati, uključujući i sadržaj crijeva.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Gujavice (Eisenia sp.) treba potom pustiti da isprazne crijeva tijekom noći, npr. na vlažnom filtarskom papiru u zatvorenoj petri zdjelici (vidjeti stavak 34.). Nakon pražnjenja crijeva treba odrediti masu crva kako bi se procijenio eventualno pad biomase tijekom ispitivanja (vidjeti validacijske kriterije u stavku 17.). Vaganje i analiza tkiva enhitreja provode se bez pražnjenja crijeva jer je to tehnički teško izvedivo zbog male veličine tih crva. Nakon konačnog određivanja mase crve treba odmah usmrtiti, i to najprikladnijom metodom (npr. pomoću tekućeg dušika ili njihovim zamrzavanjem na temperaturama ispod -18 °C).
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Tijekom faze eliminacije crvi zamjenjuju onečišćeni sadržaj crijeva čistim tlom. To znači da mjerenja crva koji nisu ispraznili crijeva (u ovom kontekstu enhitreja) uzorkovanih neposredno prije faze eliminacije uključuje i onečišćeno tlo iz crijeva. Za vodene oligohete pretpostavlja se da se, nakon početnih 4 – 24 h faze eliminacije, većina onečišćenog sadržaja crijeva zamijeni čistim sedimentom, npr. (46). Do sličnih spoznaja se došlo i za gujavice u studijama akumulacije radioaktivno obilježenih kadmija i cinka (78). U enhitrejima koji nisu ispraznili crijeva koncentracija prvog uzorka faze eliminacije može se uzeti u obzir kao koncentracija u tkivu nakon pražnjenja crijeva. Kako bi se u obzir uzelo i razrjeđivanje koncentracije ispitivane kemikalije u neonečišćenom tlu tijekom faze eliminacije, masa sadržaja crijeva može se procijeniti iz omjera mokre mase crva/mase praha crva ili iz suhe mase crva/mase praha crva.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Uzorke tla i crva treba, po mogućnosti, analizirati neposredno nakon njihova vađenja (tj. u roku od 1-2 dana) kako bi se spriječila razgradnja ili drugi gubici, a preporučuje se i izračun približnih brzina apsorpcije i eliminacije tijekom nastavka ispitivanja. Ako se analiza odgodi, uzorke treba uskladištiti prikladnom metodom, npr. dubokim smrzavanjem (≤ -18 °C).
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Treba provjeriti jesu li za određenu metodu zadovoljavajuće preciznost i mjerna obnovljivost kemijske analize, kao i vraćanje ispitivane kemikalije iz uzoraka tla i crva; treba izvijestiti i o učinkovitosti ekstrakcije, granici detekcije (LOD) i granici kvantifikacije (LOQ). Slično tomu, treba provjeriti može li se ispitivana kemikalija detektirati u kontrolnim posudama u koncentracijama višima od pozadinske. Kad je koncentracija ispitivane kemikalije u pokusnom organizmu Ca > 0 u kontrolnim crvima, to treba uzeti u obzir pri izračunu kinetičkih parametara (vidjeti Dodatak 2.). Sa svim uzorcima treba tijekom ispitivanja postupati tako da se na minimum svedu onečišćenja i gubici (npr. nastali kao rezultat adsorpcije ispitivane kemikalije na uređaj za uzorkovanje).
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Pri radu s radioaktivno obilježeimn ispitnim kemikalijama moguće je analizirati i polazne kemikalije i njihove metabolite. Korisne informacije donosi kvantifikacija polazne ispitivane kemikalije i metabolita u stabilnom stanju ili na kraju faze apsorpcije. Potom bi uzorke trebalo ‚očistiti’ kako bi se polazna ispitivana kemikalija mogla zasebno kvantitativno odrediti. Ako pojedinačni metaboliti premašuju 10 % ukupne radioaktivnosti u analiziranom(-im) uzorku(-cima), preporučuje se identifikacija tih metabolita.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Treba zabilježiti i u izvješće uključiti i ukupni oporavak te oporavak ispitivane kemikalije u crvima, tlu te, ako se koriste, u zamkama koje sadržavaju apsorbente radi zadržavanja isparene ispitivane kemikalije.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Spajanje jedinki uzorkovanih iz određene ispitne posude prihvatljivo je za crve enhitreja koji su manji od gujavica. Ako spajanje obuhvaća smanjenje broja posuda za višestruko određivanje, to ograničava statistički postupak koji se može primijeniti na podatke. Ako se traže specifični statistički postupak i snaga, u ispitivanje treba uključiti odgovarajući broj posuda za višekratno određivanje kako bi se omogućilo željeno spajanje, postupak i snaga.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Preporučuje se da se BAF izražava i kao funkcija ukupne suhe mase i, kad je to potrebno (tj. za jako hidrofobne kemikalije), kao funkcija sadržaja lipida. Treba koristiti prikladne metode za određivanje sadržaja lipida (neke postojeće metode, npr. (31) (58), treba prilagoditi u tu svrhu). U tim se metodama koristi tehnika ekstrakcije klorofora/metanola. Međutim, radi izbjegavanja uporabe kloriranih otapala, treba koristiti izmijenjenu metodu Bligha i Dyera (9) kao što je opisano u (17). Budući da razne metode možda neće dati identične vrijednosti, vrlo je važno navesti pojedinosti korištene metode. Kad je to moguće, tj. ako postoji dovoljno tkiva crva, analizu lipida treba, po mogućnosti, provoditi na istom uzorku ili ekstraktu kao i u analizi ispitivane kemikalije jer se lipidi često moraju ukloniti iz ekstrakta prije nego što se on može kromatografski analizirati (49). Druga je mogućnost da se upotrijebe kontrolne životinje za mjerenje sadržaja lipida, što se potom može iskoristiti za normalizaciju vrijednosti BAF-a. Tim se potonjim pristupom umanjuje onečišćenost opreme ispitivanom kemikalijom.
                           
                        PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
                  
                     Obrada rezultata
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Krivulja apsorpcije ispitivane kemikalije dobiva se grafičkim prikazom koncentracije u/na crvima tijekom faze apsorpcije u ovisnosti o vremenu na aritmetičkoj ljestvici. Kada krivulja dosegne plato ili stabilno stanje (vidjeti definicije u Dodatku 1.), faktor bioakumulacije stabilnog stanja BAFss izračunava se iz:
                              
                                 
                              Ca je koncentracija ispitivane kemikalije u pokusnom organizmu
                              Cs je koncentracija ispitivane kemikalije u tlu
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Ako se ne postigne stabilno stanje, umjesto BAFss treba odrediti BAFK, na temelju konstanti brzine, i to na sljedeći način:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          Odrediti faktor akumulacije (BAFK) kao omjer ks/ke.
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Brzina apsorpcije i brzina eliminacije se, po mogućnosti, izračunavaju istodobno (vidjeti jednadžbu 11. u Dodatku 2.).
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          Konstanta brzine eliminacije (ke) obično se određuje iz krivulje eliminacije (tj. grafičkog prikaza koncentracije ispitivane tvari u crvima tijekom faze eliminacije). Konstanta brzine apsorpcije ks izračunava se potom na temelju vrijednosti ke i Ca koje se dobiju iz krivulje apsorpcije – za opis tih metoda vidjeti Dodatak 2. Za dobivanje BAFK i konstanti brzine, ks, i ke, prednost se daje metodama uporabe procjene nelinearnih parametara na računalu. Ako eliminacija nije očito prvog reda, treba primijeniti kompleksnije modele.
                                       
                                    
                        
                     Izvješće o ispitivanju
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Izvješće o ispitivanju treba obuhvaćati sljedeće podatke:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitivana kemikalija:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      svi dostupni podaci o akutnoj ili dugotrajnoj toksičnosti (npr. ECx, LCx” NOEC) ispitivane kemikalije na oligohete iz tla;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      čistoća, fizikalna narav i fizikalno-kemijska svojstva, npr. log Kow, topljivost u vodi;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      podaci za identifikaciju kemikalije, izvor ispitivane tvari, identitet i koncentracija upotrijebljenog otapala;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ako se koristi radioaktivno obilježena ispitivana kemikalija, precizan položaj obilježenih atoma, specifična radioaktivnost i radioaktivno kemijska čistoća.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Ispitne vrste:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      znanstveni naziv, soj, izvor, sve vrste prethodne obrade, aklimatizacija, starost, red veličina itd.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Uvjeti ispitivanja:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      primijenjeni postupak ispitivanja;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vrsta i svojstva korištene rasvjete i fotoperiod/fotoperiodi;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      plan ispitivanja npr. broj i veličina ispitnih posuda, masa tla i visina sloja tla, broj posuda za višestruko određivanje, broj crva u svakoj posudi za višestruko određivanje, broj ispitnih koncentracija, trajanje faze apsorpcije i faze eliminacije, učestalost uzorkovanja);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      obrazloženje odabira materijala ispitne posude;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda pripreme i primjene ispitivane tvari, kao i obrazloženje odabira specifične metode;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nazivne ispitne koncentracije, srednje vrijednosti izmjerenih vrijednosti i njihove standardne devijacije u ispitnim posudama te metoda kojom su dobivene te vrijednosti;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      izvor sastojaka umjetnog tla ili – ako se koriste prirodni mediji – podrijetlo tla, opis svake prethodne obrade, rezultati iz kontrola (preživljavanje, razvoj biomase, razmnožavanje), svojstva tla (pH, sadržaj ukupnog organskog ugljika, raspodjela veličine čestica (postotak pijeska, praha i gline), WHCmax, postotak sadržaja vode na početku i na kraju ispitivanja i sva ostala provedena mjerenja);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detaljni podaci o obradi uzoraka tla i crva, uključujući i pojedinosti o pripremi, skladištenju, postupcima spikinga, ekstrakciji i analitičkim postupcima (i preciznosti) za ispitivanu tvar u crvima i u tlu, te sadržaj lipida (ako je izmjeren) i oporavak ispitivane tvari.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultati:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      smrtnost crva iz kontrola i crva u svakoj ispitnoj posudi te svako opaženo neuobičajeno ponašanje (npr. izbjegavanje tla, nedostatak razmnožavanja u ispitivanjima bioakumulacije s enhitrejima);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      omjer suhe mase i mokre mase tla i pokusnih organizama (korisno za normalizaciju);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mokra masa crva u svakom trenutku uzorkovanja; za gujavice mokra masa na početku ispitivanja i u svakom trenutku uzorkovanja prije i poslije pražnjenja crijeva;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sadržaj lipida pokusnih organzama (ako je određen);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      krivulje koje pokazuju kinetiku apsorpcije i eliminacije ispitivane kemikalije u crva i vrijeme do stabilnog stanja;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Ca i Cs (sa standardnom devijacijom i rasponom, ako je to primjereno) za sve trenutke uzorkovanja (Ca izraženo u g kg–1 mokre i suhe mase cijelog tijela, Cs izražen u g kg–1 mokre i suhe mase tla). Ako se traži i faktor bioakumulacije biota tla (BSAF) (npr. radi usporedbe rezultata dvaju ili većeg broja ispitivanja provedenih sa životinjama različitog sadržaja lipida), dodatno se može izraziti Ca kao g kg–1 sadržaja lipida u organizmu, a Cs se može izraziti kao g kg–1 organskog ugljika (OC) u tlu;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      BAF (izražen u kg tla·kg–1 crva), konstanta brzine apsorpcije tla ks (izražena u g tla kg–1 crva na dan–1) i konstanta brzine eliminacije ke (izražena u dana–1); BSAF (izražen u kg tla OC kg–1 sadržaja lipida u crvima) može se prijaviti naknadno;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ako su mjereni: postoci polazne kemikalije, metaboliti i vezani ostaci (tj. postotak ispitivane kemikalije koja se ne može ekstrahirati uobičajenim metodama ekstrakcije) detektirani u tlu i pokusnim životinjama;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metode korištene za statističke analize podataka.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Vrednovanje rezultata:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sukladnost rezultata s validacijskim kriterijima navedenima u stavku 17.;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      neočekivani ili neobični rezultati, npr. nepotpuna eliminacija ispitivane kemikalije iz pokusnih životinja.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     LITERATURA
                  
                  
                              1.
                           
                           
                              Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM International, E1676-04: str. 26.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation - New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235-276.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93-99.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154-165.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Bell AW (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1-13.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911-917.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Pariz, str. 671.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185-196.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida. J. Soils Sediments 3: 13-20.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System. Chemosphere 20: 91-100.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2-29.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., The Netherlands, str. 555-576.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bachmann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140-145.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Uredba (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća od 18. prosinca 2006. o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) i osnivanju Europske agencije za kemikalije te o izmjeni Direktive 1999/45/EZ i stavljanju izvan snage Uredbe Vijeća (EEZ) br. 793/93 i Uredbe Komisije (EZ) br. 1488/94 kao i Direktive Vijeća 76/769/EEZ i Direktiva Komisije 91/155/EEZ, 93/67/EEZ, 93/105/EZ i 2000/21/EZ, SL L 396, 30.12.2006., str. 1.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. Third Edition, Chapman & Hall, London, str. 426.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Pariz
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: str. 149. Može se preuzeti s interneta na adresi: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: str. 57.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32: 1897-1905.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29: 1501-1514.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78-84.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225-1231.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099-1105.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15-20.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              ISO 11268-2 (1998) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Jaenike J (1982). ‚Eisenia foetida’ is two biological species. Megadrilogica 4: 6-8.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080-2090.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767-775.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217-232.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University München, str. 137.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244-1249.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Poglavlje C.8 ovog Priloga, Toksičnost za gujavice
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Poglavlje C.13 ovog Priloga, Biokoncentracija: test protočnosti na ribama.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Poglavlje C.21 ovog Priloga, Mikroorganizmi iz tla: test transformacije dušika.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Pariz.
                              
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Oecd (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Pariz.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Pariz.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378-396.
                           
                        
                              56.
                           
                           
                              Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77-81.
                           
                        
                              57.
                           
                           
                              Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida. RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.
                           
                        
                              58.
                           
                           
                              Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: str. 373.
                           
                        
                              61.
                           
                           
                              Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129.
                           
                        
                              62.
                           
                           
                              Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413-433.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Schmelz R and Collado R (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 57: 93-100.
                           
                        
                              66.
                           
                           
                              Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.
                           
                        
                              67.
                           
                           
                              Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557-2563.
                           
                        
                              68.
                           
                           
                              Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320.
                           
                        
                              69.
                           
                           
                              Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67-81.
                           
                        
                              70.
                           
                           
                              Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167-1171.
                           
                        
                              71.
                           
                           
                              UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.
                           
                        
                              72.
                           
                           
                              US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000.
                           
                        
                              73.
                           
                           
                              Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277-285.
                           
                        
                              74.
                           
                           
                              Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
                           
                        
                              75.
                           
                           
                              Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023-1033.
                           
                        
                              76.
                           
                           
                              Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates. Environmental Pollution 136: 409-417.
                           
                        
                              77.
                           
                           
                              Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161-165.
                           
                        
                              78.
                           
                           
                              Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851.
                           
                        
                              79.
                           
                           
                              Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402-406.
                           
                        
                     Dodatak 1.
                     DEFINICIJE
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioakumulacija je porast koncentracije ispitivane kemikalije u ili na organizmu u odnosu na koncentraciju ispitivane kemikalije u mediju koji je okružuje. Bioakumulacija nastaje i iz procesa biokoncentracije i iz procesa biomagnifikacije (vidjeti u nastavku teksta).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biokoncentracija je porast koncentracije ispitivane kemikalije u ili na organizmu, koja nastaje kao rezultat apsorpcije kemikalije isključivo iz medija koji je okružuje (tj. putem tjelesne površine i konzumiranog tla), u odnosu na koncentraciju ispitivane kemikalije u mediju koji je okružuje.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Biomagnifikacija je porast koncentracije ispitivane kemikalije u ili na organizmu, koja nastaje uglavnom kao rezultat apsorpcije iz onečišćene hrane ili plijena, u odnosu na koncentraciju ispitivane kemikalije u hrani ili plijenu. Biomagnifikacija može dovesti do prijenosa akumulacije ispitivane tvari unutar mreža hrane.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Eliminacija ispitivane kemikalije je gubitak te kemikalije iz tkiva pokusnog organizma aktivnim ili pasivnim procesima koji se odvijaju neovisno o prisustvu ili odsustvu ispitivane tvari u mediju koji je okružuje.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Faktor bioakumulacije (BAF) u bilo kojem trenutku tijekom faze apsorpcije ovog ispitivanja bioakumulacije je koncentracija ispitivane kemikalije u/na pokusnom organizmu (Ca u g·kg-1 suhe mase crva) podijeljena s koncentracijom te kemikalije u mediju koji je okružuje (Cs kao g·kg-1 suhe mase tla); jedinica za BAF je kg tla·kg-1 crva.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Faktor bioakumulacije stabilnog stanja (BAFss) je BAF u stabilnom stanju i ne mijenja se značajno tijekom duljeg razdoblja, a koncentracija ispitivane kemikalije u mediju koji je okružuje (Cs kao g.kg-1 suhe mase tla) konstantna je tijekom tog razdoblja.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Faktori bioakumulacije izračunati izravno iz omjera konstante brzine apsorpcije tla i konstante brzine eliminacije tla (ks i ke, vidjeti u nastavku teksta) nazivaju se faktorom kinetičke bioakumulacije (BAFK).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Faktor akumulacije biota tla (BSAF) je koncentracija ispitivane kemikalije u/na pokusnom organizmu, normalizirana lipidima, podijeljena s koncentracijom ispitivane kemikalije u tlu, normaliziranom organskim ugljikom, u stabilnom stanju. Tada se Ca izražava kao g·kg-1 sadržaja lipida organizma, a Cs kao g·kg-1 sadržaja organskog ugljika tla; jedinica za BSAF je kg OC·kg-1 lipida.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Plato ili stabilno stanje definira se kao uravnoteženje između procesa apsorpcije i eliminacije koji se odvijaju istodobno tijekom faze izlaganja. Stabilno se stanje postiže na grafičkom prikazu BAF-a u ovisnosti o vremenu kada krivulja postane paralelna s vremenskom osi i kad se rezultati tri uzastopne analize BAF-a provedene na uzorcima koji se uzimaju u razmacima od najmanje dva dana nalaze unutar 20 % jedni od drugih te kad ne postoje statistički značajne razlike među trima razdobljima uzorkovanja. Za ispitivane kemikalije koje se sporo apsorbiraju prikladniji bi vremenski razmak bio sedam dana (49).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Podjelni koeficijent organski ugljik-voda (Koc) je omjer koncentracije kemikalije u/na dijelu tla s organskim ugljikom i koncentracije kemikalije u vodi u ravnoteži.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Podjelni koeficijent oktanol-voda (Kow) je omjer topljivosti kemikalije u n-oktanolu i vodi u ravnoteži, ponekad se izražava i kao Pow. Logaritam Kow (log Kow) koristi se kao znak bioakumulacijskog potencijala kemikalije kod vodenih organizama.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Faza apsorpcije ili izlaganja je vrijeme tijekom kojega pokusni organizmi bivaju izloženi ispitivanoj kemikaliji.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konstanta brzine apsorpcije tla (ks) je brojčana vrijednost koja definira brzinu porasta koncentracije ispitivane tvari u/na pokusnom organizmu, a koja nastaje kao rezultat apsorpcije iz faze tla. ks se izražava kao g tla kg-1 crva d-1.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Faza eliminacije je vrijeme, nakon prijenosa pokusnih organizama iz onečišćenog medija u medij bez ispitivane tvari, tijekom kojega se proučava eliminacija (ili neto gubitak) kemikalije iz pokusnih organizama.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Konstanta brzine eliminacije (ke) je brojčana vrijednost koja definira brzinu opadanja koncentracije ispitivane tvari u/na pokusnim organizmima, nakon prijenosa pokusnih organizama iz medija koji sadržava ispitivanu tvar u medij bez te kemikalije; ke se izražava u d-1.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ispitivana kemikalija: Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom Ispitnom metodom.
                              
                           
                  
                     Dodatak 2.
                     
                        Izračun parametara apsorpcije i eliminacije
                     
                     Osnovni konačni učinak ispitivanja bioakumulacije je faktor bioakumulacije, BAF. Izmjereni BAF može se izračunati dijeljenjem koncentracije u pokusnom organizmu, Ca, a koncentracijom u tlu, Cs, u stabilnom stanju. Ako se stabilno stanje ne postigne tijekom faze apsorpcije, BAFK se, umjesto BAFss, izračunava iz konstanti brzine. Međutim, ipak treba primijetiti temelji li se BAF na koncentracijama u stabilnom stanju ili ne.
                     Najčešći način dobivanja faktora kinetičke bioakumulacije (BAFK), konstante brzine apsorpcije tla (ks) i konstante brzine eliminacije (ke) jest uporaba metoda procjene nelinearnih parametara na računalu, npr., na temelju modela opisanih u (68). Kad je zadan niz podataka o koncentracijama u sekvencijalnim vremenima i modeli jednadžbi:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [jednadžba 1]
                              
                           ili
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [jednadžba 2]
                              
                           gdje je
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentracija kemikalije u crvima [g kg-1 mokre ili suhe mase]
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 konstanta brzine apsorpcije u tkivu [g tla kg-1 crva d-1]
                              
                           
                                 Cs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentracija kemikalije u tlu [g kg-1 mokre ili suhe mase]
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 konstanta brzine eliminacije [d-1]
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 vrijeme na kraju faze apsorpcije,
                              
                           ti računalni programi izračunavaju vrijednosti BAFK, ks i ke.
                     Kad se pozadinska koncentracija u neizloženim crvima, npr. na dan 0, značajno razlikuje od nule (to može biti slučaj, npr. za metale), pozadinsku koncentraciju (Ca,0) treba obuhvatiti tim jednadžbama pa bi one glasile:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [jednadžba 3]
                              
                           i
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [jednadžba 4]
                              
                           U slučajevima kad se opazi značajan pad koncentracije ispitivane kemikalije u tlu tijekom razdoblja trajanja faze apsorpcije, mogu se primijeniti sljedeći modeli, npr. (67) (79):
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [jednadžba 5]
                              
                           gdje je
                     
                                 Cs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentracija kemikalije u tlu [g kg-1 mokre ili suhe mase]
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 konstanta brzine razgradnje u tlu [d-1]
                              
                           
                                 C0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 početna koncentracija kemikalije u tlu [g kg-1 mokre ili suhe mase]
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [jednadžba 6]
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [jednadžba 7]
                              
                           gdje je
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentracija kemikalije u crvima [g kg-1 mokre ili suhe mase]
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 konstanta brzine apsorpcije u tkivu [g tla kg-1 crva d-1]
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 konstanta brzine razgradnje u tlu [d-1]
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 konstanta brzine eliminacije [d-1]
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 vrijeme na kraju faze apsorpcije.
                              
                           Kad se tijekom faze apsorpcije postigne stabilno stanje (tj. t = ∞), jednadžba 1
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [jednadžba 1]
                              
                           može se skratiti na:
                     
                        
                     ili
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [jednadžba 8]
                              
                           Tada je ks/ke x Cs pristup koncentraciji ispitivane tvari u tkivu crva u stabilnom stanju (Ca,ss).
                     Faktor akumulacije biota tla (BSAF) može se izračunati na sljedeći način:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [jednadžba 9]
                              
                           gdje je foc udio organskog ugljika u tlu, a flip udio lipida u crvu, a obje te vrijednosti, po mogućnosti, se određuju na uzorcima uzetima iz ispitivanja, a temelje se jedna na suhoj masi, a druga na mokroj masi.
                     Može se izraditi model kinetike eliminacije pomoću podataka iz faze eliminacije te primjenom sljedećeg modela jednadžbe i računalno utemeljene metode procjene nelinearnih parametara. Ako podaci na grafičkom prikazu u ovisnosti o vremenu naznačuju konstantni eksponencijalni pad koncentracije ispitivane tvari u životinjama, model s jednim odjelom (jednadžba 9) može se upotrijebiti za opis trajanja eliminacije.
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [jednadžba 10]
                              
                           Ponekad se čini da su procesi eliminacije dvofazni i da u njima dolazi do rapidnog pada Ca tijekom početnih faza, a to se pretvara u sporiji gubitak ispitivanih tvari u kasnijim fazama eliminacije, npr. (27) (68). Te se dvije faze mogu protumačiti pretpstavkom da u organizmu postoje dva odjela iz kojih se gubi ispitivana kemikalija, i to različitom brzinom. U tim bi slučajevima trebalo proučiti specifičnu literaturu, npr. (38) (39) (40) (78).
                     Putem gore navedenog modela jednadžbe mogu se u istom ispitivanju izračunati i kinetički parametri (ks i ke) primjenom kinetičkog modela prvog reda istodobno na sve podatke, kako iz faze apsorpcije tako i iz faze eliminacije. Za opis metode koja bi omogućila takav kombinirani izračun konstanti brzine apsorpcije i eliminacije mogu se konzultirati reference (181), (213) i (210).
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [jednadžba 11]
                              
                           
                                 
                                    Napomena:
                                 
                              
                              
                                 Kad se istodobno procjenjuju parametri apsorpcije i eliminacije iz kombiniranih podataka o apsorpciji i eliminaciji, ‚m’ iz jednadžbe 11 je deskriptor koji računalnom programu omogućuje da dodijeli podpojmove jednadžbe nizovima podataka iz odgovarajuće faze te da se vrednovanje propisno provede (m = 1 za fazu apsorpcije; m = 2 za fazu eliminacije).
                              
                           Unatoč tomu, ove modele jednadžbi treba koristiti s oprezom, poglavito kada tijekom ispitivanja dođe do promjena bioraspoloživosti ili (bio)razgradnje ispitivane kemikalije (vidjeti npr. (79)).
                  
                  
                     Dodatak 3.
                     PRIMJERI PLANOVA ISPITIVANJA BIOAKUMULACIJE TLA
                     
                        Ispitivanje s gujavicama
                     
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 Faza apsorpcije s osam datuma uzorkovanja korištenih za izračun kinetike
                                 
                                             Dan
                                          
                                          
                                             Djelatnost
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             Kondicioniranje pripremljenog tla 48 h;
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             Obrada dijela tla spikingom s otopinom ispitivane kemikalije; isparavanje eventualnih otapala; miješanje sastojaka tla; raspodjela tla u ispitne posude; uravnoteženje u uvjetima ispitivanja četiri dana (tri tjedna za tlo obrađeno spikingom s metalima);
                                          
                                       
                                             – 3 do – 1
                                          
                                          
                                             Vađenje pokusnih organizama iz uzgojene kulture radi aklimatizacije; priprema i vlaženje sastojaka tla;
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             Mjerenje temperature i pH tla; vađenje uzoraka tla iz ispitnih posuda i kontrola s otapalom radi određivanja koncentracije ispitivane kemikalije; dodavanje porcije hrane; vaganje i nasumično raspoređivanje crva u ispitne posude; zadržavanje dovoljnog broja poduzoraka crva za određivanje analitičkih pozadinskih vrijednosti, mokre i suhe mase te sadržaja lipida; vaganje svih ispitnih posuda radi kontrole vlažnosti tla; kontrola dovoda zraka ako se koristi zatvoreni sustav ispitivanja;
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Kontrola dovoda zraka, bilježenje ponašanja crva i temperature; uzimanje uzoraka tla i crva za određivanje koncentracije ispitivane tvari;
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan;
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Kontrola dovoda zraka, ponašanja crva i temperature;
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan;
                                          
                                       
                                             5 - 6
                                          
                                          
                                             Isto kao i 3. dan;
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan; dodavanje porcije hrane; kontrola vlažnosti tla ponovnim vaganjem ispitnih posuda i nadomještanje isparene vode;
                                          
                                       
                                             8 - 9
                                          
                                          
                                             Isto kao i 3. dan;
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan;
                                          
                                       
                                             11 - 13
                                          
                                          
                                             Isto kao i 3. dan;
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan; dodavanje porcije hrane; kontrola vlažnosti tla ponovnim vaganjem ispitnih posuda i nadomještanje isparene vode;
                                          
                                       
                                             15 - 16
                                          
                                          
                                             Isto kao i 3. dan;
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan;
                                          
                                       
                                             18 - 20
                                          
                                          
                                             Isto kao i 3. dan;
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan; mjerenje temperature i pH tla; kontrola vlažnosti tla ponovnim vaganjem ispitnih posuda; kraj faze apsorpcije; prijenos crva iz preostalih izloženih posuda za višestruko određivanje u posude koje sadržavaju čisto tlo za fazu eliminacije (bez pražnjenja crijeva); uzorkovanje tla i crva iz kontrola s otapalima.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Djelatnosti prethodnog izlaganja (fazu uravnoteženja) treba planirati uzimajući u obzir svojstva ispitivane kemikalije.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Djelatnosti opisane za 3. dan treba provoditi svakodnevno (barem za radnih dana).
                                          
                                       
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 Faza eliminacije
                                 
                                             Dan
                                          
                                          
                                             Djelatnost
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             Priprema i vlaženje sastojaka tla; kondicioniranje pripremljenog tla 48 h;
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             Miješanje sastojaka tla; podjela tla na ispitne posude; inkubacija u uvjetima ispitivanja 4 dana;
                                          
                                       
                                             0 (kraj faze apsorpcije)
                                          
                                          
                                             Mjerenje temperature i pH tla; vaganje i nasumična raspodjela crva na ispitne posude; dodavanje porcije hrane; prijenos crva iz preostalih izloženih posuda za višestruko određivanje u posude koje sadržavaju čisto tlo; uzimanje uzoraka tla i crva nakon 4 - 6 dana za određivanje koncentracije ispitivane kemikalije;
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Kontrola dovoda zraka, bilježenje ponašanja crva i temperature; uzimanje uzoraka tla i crva za određivanje koncentracije ispitivane kemikalije;
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan;
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Kontrola dovoda zraka, ponašanja crva i temperature;
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan;
                                          
                                       
                                             5 - 6
                                          
                                          
                                             Isto kao i 3. dan;
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan; dodavanje porcije hrane; kontrola vlažnosti tla ponovnim vaganjem ispitnih posuda i nadomještanje isparene vode;
                                          
                                       
                                             8 - 9
                                          
                                          
                                             Isto kao i 3. dan;
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan;
                                          
                                       
                                             11 - 13
                                          
                                          
                                             Isto kao i 3. dan;
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan; dodavanje porcije hrane; kontrola vlažnosti tla ponovnim vaganjem ispitnih posuda i nadomještanje isparene vode;
                                          
                                       
                                             15 - 16
                                          
                                          
                                             Isto kao i 3. dan;
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan;
                                          
                                       
                                             18 - 20
                                          
                                          
                                             Isto kao i 3. dan;
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan; mjerenje temperature i pH tla; kontrola vlažnosti tla ponovnim vaganjem ispitnih posuda; uzorkovanje tla i crva iz kontrola s otapalima.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Pripremu tla prije početka faze eliminacije treba obaviti na isti način kao i prije faze apsorpcije.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Djelatnosti opisane za 3. dan treba provoditi svakodnevno (barem za radnih dana).
                                          
                                       
                           
                        Ispitivanje s enhitrejima
                     
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 Faza apsorpcije s osam datuma uzorkovanja korištenih za izračun kinetike
                                 
                                             Dan
                                          
                                          
                                             Djelatnost
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             Kondicioniranje pripremljenog tla 48 h;
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             Obrada dijela tla spikingom s otopinom ispitivane kemikalije; isparavanje eventualnih otapala; miješanje sastojaka tla; raspodjela tla u ispitne posude; uravnoteženje u uvjetima ispitivanja četiri dana (tri tjedna za tlo obrađeno spikingom s metalima);
                                          
                                       
                                             – 3 do – 1
                                          
                                          
                                             Vađenje pokusnih organizama iz uzgojene kulture radi aklimatizacije; priprema i vlaženje sastojaka tla;
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             Mjerenje temperature i pH tla; vađenje uzoraka tla iz ispitnih posuda i kontrola s otapalom radi određivanja koncentracije ispitivane kemikalije; dodavanje porcije hrane u tlo; vaganje i nasumično raspoređivanje crva u ispitne posude; zadržavanje dovoljnog broja poduzoraka crva za određivanje analitičkih pozadinskih vrijednosti, mokre i suhe mase te sadržaja lipida; vaganje svih ispitnih posuda radi kontrole vlažnosti tla; kontrola dovoda zraka ako se koristi zatvoreni sustav ispitivanja;
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Kontrola dovoda zraka, bilježenje ponašanja crva i temperature; uzimanje uzoraka tla i crva za određivanje koncentracije ispitivane tvari;
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan;
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Kontrola dovoda zraka, ponašanja crva i temperature;
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan;
                                          
                                       
                                             5 - 6
                                          
                                          
                                             Isto kao i 3. dan;
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan; dodavanje porcije hrane u tlo; kontrola vlažnosti tla ponovnim vaganjem ispitnih posuda i nadomještanje isparene vode;
                                          
                                       
                                             9
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan;
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             Isto kao i 3. dan;
                                          
                                       
                                             11
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan;
                                          
                                       
                                             12 - 13
                                          
                                          
                                             Isto kao i 3. dan;
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             Isto kao i 1. dan; dodavanje porcije hrane u tlo; mjerenje temperature i pH tla; kontrola vlažnosti tla ponovnim vaganjem ispitnih posuda; kraj faze apsorpcije; prijenos crva iz preostalih izloženih posuda za višestruko određivanje u posude koje sadržavaju čisto tlo za fazu eliminacije (bez pražnjenja crijeva); uzorkovanje tla i crva iz kontrola s otapalima.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Djelatnosti prethodnog izlaganja (fazu uravnoteženja) treba planirati uzimajući u obzir svojstva ispitivane kemikalije.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Djelatnosti opisane za 3. dan treba provoditi svakodnevno (barem za radnih dana).
                                          
                                       
                           
                  
                     Dodatak 4.
                     
                        Umjetno tlo – preporuke za pripremu i skladištenje
                     
                     Budući da je moguće da tijekom cijele godine neće biti dostupna prirodna tla iz određenog izvora, a da prirođeni organizmi kao i prisustvo mikroonečišćivača mogu utjecati na ispitivanje, za uporabu u ovom ispitivanju preporučuje se umjetni supstrat, umjetno tlo prema poglavlju C.8 ovog Priloga, Toksičnost za gujavice (48). U tom tlu može preživjeti, narasti i razmnožavati se nekoliko pokusnih vrsta, a omogućeni su i maksimalna standardizacija, kao i intra- i interlaboratorijska poredbenost uvjeta ispitivanja i uzgoja.
                     Sastojci tla
                     
                                 Treset:
                              
                              
                                 10 %
                              
                              
                                 Sphagnum treset, u skladu sa Smjernicom OECD-a 207 (48),
                              
                           
                                 Kremeni pijesak:
                              
                              
                                 70 %
                              
                              
                                 Industrijski kremeni pijesak (sušen na zraku); veličina zrna: više od 50 % čestica treba biti u rasponu od 50-200 μm, ali sve čestice trebaju biti ≤ 2 mm,
                              
                           
                                 Kaolinitska glina:
                              
                              
                                 20 %
                              
                              
                                 Sadržaj kaolinita ≥ 30 %,
                              
                           
                                 Kalcijev karbonat:
                              
                              
                                 ≤ 1 %
                              
                              
                                 CaCO3, u prahu, kemijski čist.
                              
                           Kao druga mogućnost, može se smanjiti sadržaj organskog ugljika u umjetnom tlu, npr. smanjenjem sadržaja treseta na 4-5 % suhog tla i sukladnim povećanjem sadržaja pijeska. Takvim smanjenjem sadržaja organskog ugljika može se smanjiti mogućnost adsorpcije ispitivane kemikalije u tlo (organski ugljik), a može se povećati dostupnost ispitivane kemikalije crvima (74). Pokazalo se da vrste Enchytraeus albidus i Eisenia fetida ispunjavaju validacijske kriterije o razmnožavanju kada se ispituju u tlima nižeg sadržaja organskog ugljika, npr. 2,7 % (33), (201), a iskustvo pokazuje da se to može postići i s umjetnim tlom s 5 % treseta.
                     
                        Priprema
                     
                     Suhi sastojci tla temeljito se izmiješaju (npr. u velikoj laboratorijskoj miješalici). To treba učiniti otprilike tjedan dana prije početka ispitivanja. Izmiješane suhe sastojke tla treba navlažiti deioniziranom vodom najmanje 48 h prije primjene ispitivane tvari kako bi se uravnotežila/stabilizirala kiselost. Za određivanje pH koristi se smjesa tla i otopina 1 M KCl u omjeru 1:5. Ako se pH vrijednost ne kreće unutar raspona (6,0 ± 0,5), tlu se dodaje dovoljna količina CaCO3 ili se pripremi nova šarža tla.
                     Maksimalni vodni kapacitet (WHC) umjetnog tla određuje se prema ISO 11268-2 (35). Najmanje dva dana prije početka ispitivanja vlaži se suho umjetno tlo dodavanjem dovoljno deionizirane ili obrađene vode da bi se dobilo otprilike pola konačnog sadržaja vode. Konačni sadržaj vode treba iznositi 40 % do 60 % maksimalnog WHC-a. Na početku ispitivanja prethodno navlaženo tlo dijeli se u onoliko šarži koliko ima ispitnih koncentracija i kontrola koje se koriste za ispitivanje, a sadržaj vlage se podešava na od 40 - 60 % WHCmax pomoću otopine ispitivane tvari i/ili dodavanjem deionizirane ili obrađene vode. Sadržaj vlage određuje se na početku i na kraju ispitivanja (na 105 °C). On bi trebao biti optimalan za zahtjeve vrsta (sadržaj vlage može se provjeriti i na sljedeći način: kad se tlo blago zgnječi rukom, među prstima bi se trebale pojaviti sitne kapljice).
                     
                        Skladištenje
                     
                     Suhi sastojci umjetnog tla mogu se skladištiti na sobnoj temperaturi do uporabe. Pripremljeno, prethodno navlaženo tlo može se skladištiti na hladnom mjestu do tri dana prije spikinga; treba se pobrinuti da se isparavanje vode svede na minimum. Tlo obrađeno spikingom s ispitivanom tvari treba se iskoristiti odmah, osim ako ne postoje podaci koji naznačuju da bi se to određeno tlo moglo skladištiti, a da to nema utjecaja na toksičnost i bioraspoloživost ispitivane tvari. Onda se uzorci spikingom obrađenog tla mogu skladištiti do analize u uvjetima preporučenima za određenu ispitivanu tvar.
                  
                  
                     Dodatak 5.
                     
                        Vrste kopnenih oligoheta preporučene za ispitivanje bioakumulacije iz tla
                     
                     
                        Gujavice
                     
                     Preporučuje se pokusna vrsta Eisenia fetida (Savigny 1826), koja pripada obitelji Lumbricidae. Od 1972. godine ona se dijeli na dvije podvrste (Eisenia fetida i Eisenia andrei (10)). Po Jaenikeu (36) to su prave, zasebne vrste. Eisenia fetida lako se raspoznaje po svojim svijetlim žutim trakama između članaka, dok je Eisenia andrei jednoobrazne, tamno-crvene boje. Obje vrste podrijetlo vuku najvjerojatnije iz područja Crnog mora, ali su danas raširene po cijelom svijetu, poglavito u antropogenski izmijenjenim staništima, poput gomila komposta. Obje se mogu koristiti i za ispitivanja ekotoksičnosti i za ispitivanja bioakumulacije.
                     
                        Eisenia fetida i Eisenia andrei dostupne su i u trgovinama, npr. kao mamac za ribe. U usporedbi s ostalim gujavicama iz obitelji Lumbricidae te dvije vrste imaju kratak životni ciklus, a zrelost postižu u roku od 2-3 mjeseca (na sobnoj temperaturi). Njihova optimalna temperatura iznosi otprilike 20 – 24 °C. Prednost daju relativno vlažnim supstratima čija je pH gotovo neutralna i koji imaju visok sadržaj organskih tvari. Budući da se te vrste naširoko koriste u standardiziranim ispitivanjima ekotoksičnosti već 25 godina, njihov uzgoj ima dugu tradiciju (48) (77).
                     Obje se vrste mogu uzgajati u širokom rasponu životinjskog otpada. Medij za uzgoj koji preporučuje ISO (35) je mješavina konjskog ili govedskog izmeta i treseta u omjeru 50:50. pH vrijednost tog medija treba biti oko 6 do 7 (regulira se kalcijevim karbonatom), treba imati nisku ionsku provodlljivost (manje od 6 mS/cm ili manje od 0,5 % koncentracije soli) i ne smije biti prekomjerno onečišćen amonijakom ili životinjskim urinom. Isto tako, mogu se koristiti tlo za vrtove iz trgovina koje ne sadržava aditive ili umjetno tlo prema OECD-u (48) ili njihova mješavina u omjeru 50:50. Supstrat bi trebao biti vlažan, ali ne previše mokar. Prikladne su kutije za uzgoj volumena od 10 do 50 litara.
                     Da bi se dobili crvi standardne starosti i mase, najbolje je uzgoj započeti s kokonima. Dakle, odrasli se crvi dodaju u kutiju za uzgoj koja sadržava svježi supstrat kako bi nastali kokoni. Praktično iskustvo pokazuje da gustoća naseljenosti od otprilike 100 odraslih crva na kg supstrata (mokre mase) vodi do dobrih brzina razmnožavanja. Nakon 28 dana odrasli se crvi vade. Gujavice koje se izvale iz kokona koriste se a ispitivanje kad sazriju nakon najmanje dva mjeseca, ali kraće od 12 mjeseci.
                     Može se smatrati da su crvi gore opisanih vrsta zdravi ako se kreću kroz supstrat, ne pokušavaju izići iz supstrata i ako se neprekidno razmnožavaju. Sporo kretanje ili stražnji dio žute boje (u slučaju Eisenia fetida) znak su iscrpljenosti supstrata. U tom se slučaju preporučuju svježi supstrat i/ili manji broj životinja po kutiji.
                     
                        Dodatne odabrane reference
                     
                     Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1-58.
                     Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1-81.
                     Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
                     Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49-55.
                     Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180-201.
                     Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1-171.
                     Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. str. 331-338.
                     
                        Enhitreji
                     
                     Preporučena pokusna vrsta je Enchytraeus albidus Henle 1837 (bijeli crvi). Enchytraeus albidus jedna je od najvećih (do 15 mm) vrsta kolutićavih oligoheta iz obitelji Enchytraeidae i distribuira se diljem svijeta, npr. (8). Enchytraeus albidus može se naći u morskim, limničkim i kopnenim staništima, uglavnom u organskoj tvari u raspadu (morska trava, kompost), a rijetko na livadama (42). Ta velika ekološka tolerancija i neke morfološke varijacije znak su da je moguće da postoji više podvrsta ove vrste.
                     
                        Enchytraeus albidus dostupna je u trgovinama, gdje se prodaje kao hrana za ribe. Treba provjeriti je li kultura onečišćena drugom, obično manjom vrstom (60). Ako dođe do onečišćenja, sve crve treba oprati vodom u petri zdjelici. Potom se veliki primjerci vrste Enchytraeus albidus biraju (stereomikroskopom) za početak nove kulture. Svi se ostali crvi bacaju. Oni imaju kratak životni ciklus kako se zrelost postiže već od 33. dana (na 18 °C) i 74. dana (na 12 °C). Za ispitivanje treba koristiti samo kulture koje su najmanje 5 tjedana (jedan naraštaj) držane u laboratoriju bez problema.
                     Prikladne su i druge vrste iz roda Enchytraeus, poglavito Enchytraeus luxuriosus. Ta je vrsta pravi stanovnik tla, koje smo opisali u (65). Ako se koriste druge vrste Enchytraeus, treba ih jasno identificirati i u izvješću treba navesti obrazloženje za odabir te vrste.
                     
                        Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) je vrsta koja spada u istu skupinu kao i Enchytraeus luxuriosus. Nije dokazano da ona sa sigurnošću nastanjuje polja, samo je opisana za uzgoj kulture crva i gomile komposta (Römbke 2003). Stoga nisu poznati njezini izvorni ekološki zahtjevi. Međutim, skorašnje laboratorijske studije različitih tala iz polja potvrdile su da ova vrsta ima veliku toleranciju na svojstva tla, poput pH i teksture (Jänsch i sur. 2005). U novije se vrijeme upravo ta vrsta često koristila u studijama ekotoksičnosti, i to radi jednostavnosti njezina uzgoja i ispitivanja, npr. Kuperman i sur. 2003). Međutim, ona je malena (3 – 12 mm; u prosjeku 7 mm (Westheide & Müller 1996), a zbog toga je rukovanje njome znatno teže u usporedbi s Enchytraeus albidus. Kad se koristi neka druga vrsta umjesto Enchytraeus albidus, ispitna posuda može, ali i ne mora biti manja. Osim toga, treba uzeti u obzir i to da se ova vrsta rapidno razmnožava, a naraštaji se smjenjuju brže od svakih 20 dana na 20 ± 2 °C (Achazi i sur. 1999), a na višim temperaturama čak i brže.
                     Enhitreji iz vrste Enchytraeus albidus (kao i iz ostalih vrsta Enchytraeus) mogu se uzgajati velikim plastičnim kutijama (npr. 30 × 60 × 10 cm ili 20 × 12 × 8 cm, što je prikladno za uzgoj crva male veličine) napunjenima mješavinom umjetnog tla i neonečišćenog vrtnog tla bez aditiva koje se može kupiti u trgovinama. Treba izbjegavati kompost jer on može sadržavati toksične kemikalije poput teških metala. Prije uporabe iz tla za uzgoj treba odstraniti faunu dubokim smrzavanjem u tri navrata. Može se koristiti i čisto umjetno tlo, ali je moguće da će brzina razmnožavanja biti manja u usporedbi s onom koja se razvija kod miješanih supstrata. pH supstrata treba iznositi 6,0 ± 0,5. Kultura se drži u inkubatoru na temperaturi od 15 ± 2 °C bez svjetla. U svakom slučaju treba izbjegavati temperature iznad 23 °C. Umjetno/prirodno tlo treba biti vlažno, ali ne mokro. Kad se tlo blago stisne rukama, trebaju se pojaviti samo sitne kapljice vode. U svakom slučaju treba izbjegavati anoksične uvjete (npr. ako se koristi poklopac, mora postojati dovoljno otvora na poklopcu za dostatnu razmjenu zraka). Tlo za uzgoj treba dozračivati pažljivim miješanjem jedanput tjedno.
                     Crve treba hraniti najmanje jedanput tjedno ad libitum usitnjenom zobi koja se stavlja u šupljinu na površini tla i prekriva tlom. Ako u spremniku ostane hrana preostala od posljednjeg hranjenja, sukladno tome treba prilagoditi količinu nove hrane. Ako na preostaloj hrani narastu gljivice, hranu treba zamijeniti novom količinom usitnjene zobi. Da bi se pospješilo razmnožavanje, usitnjena se zob može svaka dva tjedna zamijeniti proteinskim prahom modificiranim vitaminima, dostupnim u trgovinama. Nakon tri mjeseca životinje se prenose u svježe pripremljenu kulturu ili supstrat za uzgoj. Usitnjenu zob, koja se mora čuvati u zatvorenim posudama, treba obraditi u autoklavu ili je treba zagrijati prije uporabe kako bi se izbjegle infekcije grinjama iz brašna (npr. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) ili grabežljive grinje (npr. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Nakon dezinfekcije hrana se usitnjava da bi se mogla lakše rasuti po površini tla. Još jedan mogući izvor je pekarski kvasac ili riblja hrana TetraMin®.
                     Općenito gledano, uvjeti uzgoja su povoljni ako crvi ne pokušavaju izići iz supstrata, ako se brzo kreću kroz tlo, imaju sjajnu vanjsku površinu na koju se ne lijepe čestice tla, više-manje su bijele boje i ako se vide crvi različite starosti. Zapravo, može se smatrati da su crvi zdravi ako se neprekidno razmnožavaju.
                     
                        Dodatne odabrane reference
                     
                     Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126.
                     Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51-83.
                     Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656.
                     Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607-616.
                     Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488.
                     Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267.
                  ”
            
         (1)  Ova se informacija navodi samo kao pomoć korisniku. Mogu se rabiti ostali ekvivalentni računalni programi ako se pokaže da pružaju jednake rezultate.
      
         (2)  Ako nije dostupna informacija o osjetljivosti spolova, upotrijebit će se štakori oba spola, tj. 1 životinja svakog spola po koncentraciji. Na temelju postojećih informacija ili ako tijekom ove sesije izlaganja postane očito da je jedan od spolova osjetljiviji, upotrijebit će se deset životinja osjetljivijeg spola (dvije životinje po koncentraciji i vremenskoj točki) na svakoj razini koncentracije tijekom sljedećeg ispitivanja.
      
         (3)  Ako se primjenjuje Uredba (EZ) br. 1272/2008, granične koncentracije za plinove, pare i aerosol iznose redom 20 000 ppm, 20 mg/l i 5 mg/l. U slučaju očekivane toksičnosti ili na temelju rezultata preliminarnih istraživanja treba odabrati niže početne koncentracije. U slučaju regulatornih ili znanstvenih potreba mogu se upotrijebiti više koncentracije.
      
         (4)  U idealnom slučaju izlaganje životinja sljedećoj razini koncentracije treba odgoditi sve dok postoji opravdana mogućnost preživljavanja prethodno ispitivanih životinja. To voditelju istraživanja omogućuje prilagodbu ciljane koncentracije i trajanja za sljedeću sesiju izlaganja.
      
         (5)  Minimalna doza (koncentracija × vrijeme) koja rezultira smrtnošću tijekom ispitivanja na početnoj koncentraciji (prva sesija izlaganja) uzet će se kao smjernica za određivanje sljedeće kombinacije koncentracije i trajanja izlaganja. Koncentracija će se tipično smanjivati upola (1/2L), a životinje će biti izložene kroz novo vremensko razdoblje s finijim razmakom uz primjenu geometrijske podjele razdoblja izlaganja s faktorom 1,4 (√2; vidjeti referencu 11.) oko vremena u skladu s minimalnom razinom smrtonosne doze (vrijeme × koncentracija) uočenoj tijekom prvog izlaganja. Na ovoj je slici (Slika 1.) smrtnost tijekom sesije izlaganja I. uočena tek u 15. minuti; stoga se trajanja sesije II. centriraju oko 30. minute i iznose 15, 21 30, 42 i 60 minuta. Nakon prva dva izlaganja preporučuje se da se podaci unesu u dijagram nalik gornjem dijagramu te da se provjeri je li odnos između koncentracije i vremena pod kutom od 45° (n = 1) ili je li odnos koncentracije, vremena i reakcije manje strm (npr. n = 2) ili strmiji (npr. n = 0,8). U posljednjim se slučajevima preporučuje da se u skladu s tim primjene sljedeće koncentracije i trajanja.
      
         (6)  U određenim slučajevima može biti nužno povećati koncentraciju (2L) kroz novo razdoblje s još finijim razmakom uz primjenu geometrijske podjele razdoblja izlaganja s faktorom 1,4 (√2) u blizini vremena u skladu s minimalnom razinom smrtonosne koncentracije uočenom tijekom prvog izlaganja. Minimalno trajanje izlaganja po mogućnosti treba biti dulje od 5 minuta; maksimalno trajanje izlaganja ne bi smjelo biti dulje od 8 sati.
      
         (7)  Post tijekom noći preporuča se za niz mjerenja u serumu i plazmi, a najviše za glukozu. Najvažniji razlog za tu preporuku jest činjenica da bi povećana varijabilnost, koja bi neizbježno nastala kao rezultat izostanka posta, pokazivala sklonost zamagljivanju suptilnih učinaka i otežala tumačenje rezultata. S druge pak strane post preko noći može utjecati na opći metabolizam životinja, a posebno u studijama o hranjenju moglo bi ometati dnevno izlaganje ispitivanoj kemikaliji. Ako se primjenjuje post preko noći, klinička biokemijska određivanja treba obaviti nakon provođenja funkcionalnih opažanja u 4. tjednu studije.
      
         (8)  Budući da dulji post može izazvati pristranost u mjerenju glukoze za tretirane i kontrolne životinje, voditelj istraživanja treba odrediti trebaju li životinje postiti. Ako se primjenjuje razdoblje posta, ono treba biti primjereno korištenim vrstama; za štakore to može biti 16 h (post preko noći). Određivanje glukoze u razdoblju posta može se provesti nakon prekonoćnog posta u zadnjem tjednu izlaganja ili nakon prekonoćnog posta prije obdukcije (u posljednjem slučaju zajedno sa svim ostalim kliničko-patološkim parametrima).
      
         (9)  Budući da dulji post može izazvati pristranost u mjerenju glukoze za tretirane i kontrolne životinje, voditelj istraživanja treba odrediti trebaju li životinje postiti. Ako se primjenjuje razdoblje posta, ono treba biti primjereno korištenim vrstama; za štakore to može biti 16 h (post preko noći). Određivanje glukoze u razdoblju posta može se provesti nakon prekonoćnog posta u zadnjem tjednu izlaganja ili nakon prekonoćnog posta prije obdukcije (u posljednjem slučaju zajedno sa svim ostalim kliničko-patološkim parametrima).
      
         (10)  Post preko noći preporučuje se za niz mjerenja u serumu i plazmi, a najviše za glukozu. Najvažniji razlog za tu preporuku jest činjenica da bi povećana varijabilnost, koja bi neizbježno nastala kao rezultat izostanka posta, pokazivala sklonost zamagljivanju suptilnih učinaka i otežala tumačenje rezultata. S druge pak strane post preko noći može utjecati na opći metabolizam životinja, a posebno u studijama o hranjenju moglo bi ometati dnevno izlaganje ispitivanoj kemikaliji. Sve životinje treba procjenjivati u istom fiziološkom stanju, a detaljne ili neurološke procjene po mogućnosti treba odrediti za dan kada se ne provodi biokemijsko uzimanje uzoraka.
      
         (11)  Vrednovanje nagrizanja može se temeljiti na stručnoj procjeni uz primjenu dokaza kao što su: ljudsko i životinjsko iskustvo, postojeći podaci (in vitro), npr. Poglavlje B.40 (10), B.40 bis (11) ovog Priloga ili OECD-ove TG 435 (12), pH vrijednosti, informacije dobivene od sličnih kemikalija ili bilo kakvih drugih primjerenih podataka.
      
         (12)  Sljedeće se tablice odnose na GHS (Globalno usklađeni sustav za razvrstavanje i označivanje kemikalija). EU ekvivalent je Uredba (EZ) br. 1272/2008. U slučaju akutne inhalacijske toksičnosti Uredba (EZ) br. 1272/2008 (9) ne implementira kategoriju 5.
      
         (13)  Sljedeće se tablice odnose na GHS (Globalno usklađeni sustav za razvrstavanje i označivanje kemikalija). EU ekvivalent je Uredba (EZ) br. 1272/2008. U slučaju akutne inhalacijske toksičnosti Uredba (EZ) br. 1272/2008 (9) ne implementira kategoriju 5.
      
         (14)  Sljedeće se tablice odnose na GHS (Globalno usklađeni sustav za razvrstavanje i označivanje kemikalija). EU ekvivalent je Uredba (EZ) br. 1272/2008. U slučaju akutne inhalacijske toksičnosti Uredba (EZ) br. 1272/2008 (9) ne implementira kategoriju 5.
      
         (15)  Ove se tvari razlikuju u M4 i M7, kao što je naznačeno gore.
      
         (16)  Ove se otopine pripremaju odvojeno, a potom se sjedine i odmah obrade u autoklavu.
      
         (17)  Međutim, treba imati na umu da, ako se sumnja u postojanje interakcije između iona tvrdoće i ispitivane tvari, trebalo bi koristiti vodu manje tvrdoće (u toj se situaciji stoga ne smije koristiti medij Elendt M4).
      
         (18)  Ove se tvari razlikuju u M4 i M7, kao što je naznačeno gore.
      
         (19)  Ove se otopine pripremaju odvojeno, a potom se sjedine i odmah obrade u autoklavu.
      
         (20)  Međutim, treba imati na umu da, ako se sumnja u postojanje interakcije između iona tvrdoće i ispitivane tvari, trebalo bi koristiti vodu manje tvrdoće (u toj se situaciji stoga ne smije koristiti medij Elendt M4).
      
         (21)  Dodan je SiO2 radi neutralizacije toksičnosti.
      
         (22)  Postotak razgradnje u posudama FC koje sadržavaju referentnu tvar.
      
         (23)  Postotak razgradnje u posudama FI.