CELEX: 32016D1840
Language: hu
Date: 2016-10-14 00:00:00
Title: A Bizottság (EU) 2016/1840 végrehajtási határozata (2016. október 14.) a 2009/156/EK tanácsi irányelv IV. mellékletének az afrikai lópestis diagnózisának módszerei tekintetében történő módosításáról (az értesítés a C(2016) 6509. számú dokumentummal történt) (EGT-vonatkozású szöveg)

18.10.2016   
            
            
               HU
            
            
               Az Európai Unió Hivatalos Lapja
            
            
               L 280/33
            
         A BIZOTTSÁG (EU) 2016/1840 VÉGREHAJTÁSI HATÁROZATA
   (2016. október 14.)
   a 2009/156/EK tanácsi irányelv IV. mellékletének az afrikai lópestis diagnózisának módszerei tekintetében történő módosításáról
   
      
         (az értesítés a C(2016) 6509. számú dokumentummal történt)
      
   
   (EGT-vonatkozású szöveg)
   AZ EURÓPAI BIZOTTSÁG
   tekintettel az Európai Unió működéséről szóló szerződésre,
   tekintettel a lófélék mozgására és harmadik országból történő behozatalára irányadó állat-egészségügyi feltételekről szóló, 2009. november 30-i 2009/156/EK tanácsi irányelvre (1), és különösen annak 20. cikkére,
   mivel:
   
               (1)
            
            
               A 2009/156/EK irányelv IV. melléklete rendelkezik az afrikai lópestis szükség esetén alkalmazandó diagnosztikai módszeréről a lófélék vizsgálatára vonatkozóan azok Unión belüli mozgása, illetve a nem EU országokból történő importálása előtt.
            
         
               (2)
            
            
               A 2009/156/EK irányelv elfogadása óta fejlődött az afrikai lópestis diagnózisára szolgáló, fejlett, rendkívül érzékeny és hatékony tesztek elvégzésére alkalmas laboratóriumi kapacitás. Ezzel párhuzamosan a Nemzetközi Állatjárványügyi Hivatal (OIE) „A szárazföldi állatoknál alkalmazott diagnosztikai vizsgálatok és vakcinák kézikönyve” (2) afrikai lópestis diagnózisával kapcsolatos fejezetét módosították, hogy tükrözze ezt a fejlődést.
            
         
               (3)
            
            
               A 2014-es munkaprogramja részeként az Európai Unió afrikai lópestissel foglalkozó referencialaboratóriuma (3) jelentést készített a 2009/156/EK irányelv IV. mellékletében leírt diagnosztikai módszerek technikai értékeléséről. A Bizottsághoz 2015 májusában benyújtott értékelés arra a következtetésre jutott, hogy a kompetitív ELISA próba (enzyme-linked immunosorbent assay) a továbbiakban már nem elérhető, az indirekt ELISA próba alkalmazása nem általános, azonban 4-6 hónappal az igénylés után biztosítható, a blokkoló ELISA próba pedig kereskedelmi forgalomban kapható és gyakran alkalmazzák a minták elemzésére az Európai Unió afrikai lópestissel foglalkozó referencialaboratóriuma által szervezett jártassági vizsgálati gyakorlatok során.
            
         
               (4)
            
            
               Ezenfelül a jelentés hangsúlyozza, hogy a reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (RT-PCR) általi nukleinsav felismerő módszerek előnyösebbek a szerológiai diagnosztikai módszereknél, mivel lehetővé teszik a betegség felismerését a fertőzés korai stádiumában. Továbbá az Európai Unió tagállamai nemzeti referencialaboratóriumainak többsége valós idejű RT-PCR módszereket alkalmaz, az afrikai lópestis diagnózisára is, amely módszerek a célnak megfelelőnek bizonyultak a 2009–2014 között végzett éves jártassági vizsgálati gyakorlatokban. A jelentés arra is rámutatott, hogy az Unión kívül számos OIE referencialaboratórium és egyéb, specifikus afrikai lópestis tapasztalattal bíró laboratórium létezik, amelyek legalább egy valós idejű RT-PCR módszert bevezettek az afrikai lópestis genom detektálására.
            
         
               (5)
            
            
               A 2015. november 24–25-én Ascotban, az Egyesült Királyságban az európai uniós referencialaboratóriumok és nemzeti referencialaboratóriumok közös, az afrikai lópestisről és a kéknyelv betegségről tartott szakmai szemináriuma javasolta a valós idejű reverz transzkripciós (RRT) polimeráz láncreakció (PCR) módszerek beillesztését a 2009/156/EK irányelv IV. mellékletébe az afrikai lópestis vírus kimutatására.
            
         
               (6)
            
            
               Bár minden elérhető valós idejű RT-PR módszer kellőképpen érzékeny az afrikai lópestis genom detektálására, az Agüero et al. (2008) (4) által leírt eljárást használják a laboratóriumok a legszéleskörűbben. A Guthrie et al. (2013) (5) által leírt módszert specifikusan annak biztosítására alakították ki, hogy az afrikai lópestis kockázatának kitett területekről származó lovakat biztonságosan lehessen szállítani az OIE szárazföldi állatok egészségügyi kódexe (6) által előírt minimális karantén időszak után.
            
         
               (7)
            
            
               Ezért célszerű a 2009/156/EK irányelv IV. mellékletébe belefoglalni a kórokozó azonosításra és az antitest detektálásra szolgáló módszereket, mint az afrikai lópestis gyors diagnosztizálására szolgáló komplementer módszereket.
            
         
               (8)
            
            
               Ezért a 2009/156/EK irányelv IV. mellékletét módosítani kell a kompetitív ELISA próba törlésével és az indirekt és blokkoló ELISA próbák eljárásainak frissítésével az OIE „A szárazföldi állatoknál alkalmazott diagnosztikai vizsgálatok és vakcinák kézikönyve” 2016. évi, az OIE küldötteinek 2012. májusi világtalálkozóján elfogadott változaton (7) alapuló kiadásának 2.5.1. fejezete alapján. Ezzel egyidőben az Agüero et al. (2008), valamint Guthrie et al. (2013) által leírt valós idejű RT-PCR eljárásokat e mellékletbe kell foglalni, hogy elérhetővé tegyék azokat a kórokozó azonosítására szolgáló vizsgálatokat a mozgás előtti vizsgálat céljából.
            
         
               (9)
            
            
               A 2009/156/EK irányelvet ezért ennek megfelelően módosítani kell.
            
         
               (10)
            
            
               Az e határozatban előírt intézkedések összhangban vannak a Növények, Állatok, Élelmiszerek és Takarmányok Állandó Bizottságának véleményével,
            
         ELFOGADTA EZT A HATÁROZATOT:
   1. cikk
   A 2009/156/EK irányelv IV. melléklete helyébe e határozat mellékletének szövege lép.
   2. cikk
   Ennek a határozatnak a tagállamok a címzettjei.
   
      Kelt Brüsszelben, 2016. október 14-én.
      
         
            a Bizottság részéről
         
         Vytenis ANDRIUKAITIS
         
            a Bizottság tagja
         
      
   
   
      (1)  HL L 192., 2010.7.23., 1. o.
   
   
      (2)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf
   
      (3)  A Tanács 1992. április 29-i 92/35/EGK irányelve az afrikai lópestis elleni küzdelemre irányuló ellenőrzési szabályok és intézkedések meghatározásáról (HL L 157., 1992.6.10., 19. o.).
   
      (4)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. and Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.
   
      (5)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30–35
   
      (6)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf
   
      (7)  Lásd a 2. lábjegyzetet.
   
      MELLÉKLET
      
         
            IV. MELLÉKLET
            
               AFRIKAI LÓPESTIS
            
            
               DIAGNÓZIS
            
            A. RÉSZ
            Szerológiai vizsgálatok
            Az alábbiakban leírt szerológiai módszerek ELISA próbák (enzyme-linked immunosorbent assays), amelyek a 2012 májusában az OIE küldöttek világtalálkozója által elfogadott, „A szárazföldi állatoknál alkalmazott diagnosztikai vizsgálatok és vakcinák kézikönyve” 2016-os kiadása 2.5.1. fejezete B szakaszának 2. pontján alapulnak.
            A VP7 vírusfehérje az afrikai lópestis vírus (ALPV) egyik immundomináns major antigénje, és a kilenc ALPV szerotípuson belül megmarad. A rekombináns ALPV-VP7 fehérjék igazoltan stabilak, ártalmatlanok és alkalmasak az antigénként történő felhasználásra az ELISA próbák során az ALPV-ellenes ellenanyagok meghatározására magas fokú szenzitivitás és specificitás mellett (Laviada et al., 1992b (1); Maree és Paweska, 2005). Az afrikai lópestis (ALP) szerológiai diagnózisára alkalmas ALP-VP7 ELISA próbák közé tartozik az indirekt ELISA és a blokkoló ELISA.
            1.   Az afrikai lópestis vírusával (ALPV) szemben termelt ellenanyagok kimutatására szolgáló indirekt ELISA próba
            
            Az ennél a módszernél alkalmazott konjugátum a torma-peroxidáz anti-ló gamma-globulin, amely lovak, öszvérek és szamarak szérumával reagál. A Maree és Paweska (2005) (2) által leírt módszer G-fehérjét használ konjugátumként, amely zebra szérummal is reagál.
            Az antigént a spanyolországi Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA) biztosítja az igénylést követő 4-6 hónapon belül.
            1.1.   Vizsgálati eljárás
            
            1.1.1.   Szilárd fázis
            
                     
                        1.1.1.1.
                     
                     
                        Az ELISA-lemezeket 9,6 pH-értékű karbonát/bikarbonát pufferoldatban hígított rekombináns ALPV-4 VP7-tel vonjuk be. A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C-on.
                     
                  
                     
                        1.1.1.2.
                     
                     
                        A lemezeket ötször kimossuk 0,01 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó desztillált vízzel (mosóoldat). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.
                     
                  
                     
                        1.1.1.3.
                     
                     
                        Blokkoljuk a lemezeket 7,2 pH-értékű, foszfáttal pufferelt sóoldat (PBS) és 5 % (w/v) sovány tej (Nestlé Dry Skim MilkTM) lyukanként 200 μl-nyi keverékével egy órán át 37 °C-on.
                     
                  
                     
                        1.1.1.4.
                     
                     
                        Távolítsuk el a blokkoló oldatot, és finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz.
                     
                  1.1.2.   Vizsgálandó minták
            
                     
                        1.1.2.1.
                     
                     
                        A vizsgálandó szérummintákat, valamint a pozitív és negatív kontrollszérumokat 1:25 arányban PBS, 5 % (w/v) sovány tej és 0,05 % (v/v) Tween-20 lyukanként 100 μl-nyi keverékében hígítjuk. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.
                        Titráláshoz készítsünk kétszeres hígítási sort 1:25 aránytól kezdve (lyukanként 100 μl), a lemez minden oszlopában egy szérumból, majd ugyanezt a pozitív és negatív kontrollszérumból is. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.
                     
                  
                     
                        1.1.2.2.
                     
                     
                        A lemezeket ötször kimossuk 0,01 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó desztillált vízzel (mosóoldat). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.
                     
                  1.1.3.   Konjugátum
            
                     
                        1.1.3.1.
                     
                     
                        Adagoljunk lyukanként 100 μl-nyi, PBS, 5 % tej és 0,05 % Tween-20 7,2 pH értékű keverékében hígított torma-peroxidázzal (HRP) konjugált anti-ló gamma-globulint. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.
                     
                  
                     
                        1.1.3.2.
                     
                     
                        A lemezeket ötször kimossuk 0,01 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó desztillált vízzel (mosóoldat). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.
                     
                  1.1.4.   Kromogén/szubsztrát
            
                     
                        1.1.4.1.
                     
                     
                        Adjunk mindegyik lyukhoz 200 μl kromogén-/szubsztrátoldatot (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetil-aminobenzaldehid) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzo-tiazolin hidrazon hidroklorid) + 5 μl H2O2).
                        A színképződést kb. 5–10 perccel később 50 μl 3N H2SO4 hozzáadásával állítjuk le (mielőtt a negatív kontrollszérum elszíneződne).
                        Más kromogének is alkalmazhatók, mint pl. az ABTS (2,2′-azino-bisz-[3-etilbenzotiazolin-6-szulfonsav]), TMB (tetra-metil benzidin) vagy az OPD (orto-fenildiamin).
                     
                  
                     
                        1.1.4.2.
                     
                     
                        Olvassuk le a lemezeket 600 (vagy 620) nm-en.
                     
                  1.2.   Az eredmények értékelése
            
            
                     
                        1.2.1.
                     
                     
                        A küszöbértéket úgy számítjuk ki, hogy 0,06-ot hozzáadunk a negatív kontroll értékéhez (0,06 a standard szórás 30 negatív szérumból származtatva).
                     
                  
                     
                        1.2.2.
                     
                     
                        A küszöbértéknél alacsonyabb abszorpciós értéket mutató vizsgált mintákat negatívnak tekintjük.
                     
                  
                     
                        1.2.3.
                     
                     
                        A küszöbérték + 0,15-nél nagyobb abszorpciós értéket mutató vizsgált mintákat pozitívnak tekintjük.
                     
                  
                     
                        1.2.4.
                     
                     
                        A köztes abszorpciós értéket mutató vizsgált minták kétesnek tekintendők, ezért egy második technikát kell alkalmazni az eredmények megerősítéshez.
                     
                  2.   Az afrikai lópestis vírusával (ALPV) szemben termelt ellenanyagok kimutatására szolgáló blokkoló ELISA próba
            
            A kompetitív blokkoló ELISA próba specifikus ALPV-ellenes antitestek detektálására szolgál a lófélék bármely fajából származó szérumban, ideértve a lovakat, szamarakat, zebrát és azok keresztezéseit, megkerülve az indirekt ELISA próbák során alkalmanként tapasztalt specificitási problémát.
            A vizsgálat elve az ELISA-lemezhez kötött rekombináns VP7-fehérje és a konjugált, ALP-VP7-specifikus monoklonális ellenanyag (mea) közötti reakció megszakításán alapul. A vizsgálandó szérumban lévő ellenanyagok gátolják az antigén és a mea közötti reakciót, ami a színintenzitás csökkenését fogja eredményezni. Mivel a mea a VP7 ellen irányul, a próba érzékenysége és specificitása magas fokú.
            A kompetitív blokkoló ELISA próba kereskedelmi forgalomban kapható.
            2.1.   Vizsgálati eljárás
            
            2.1.1.   Szilárd fázis
            
                     
                        2.1.1.1.
                     
                     
                        Az ELISA-lemezeket 9,6 pH-értékű karbonát/bikarbonát pufferoldatban hígított, 50-100 ng mennyiségű rekombináns ALPV-4 VP7-tel vonjuk be. A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C-on.
                     
                  
                     
                        2.1.1.2.
                     
                     
                        A lemezeket háromszor kimossuk 0,135 M NaCl-ot és 0,05 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó, 0,1× foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBST). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.
                     
                  2.1.2.   Vizsgálandó minták és kontrollok
            
                     
                        2.1.2.1.
                     
                     
                        A vizsgálandó szérummintákat, valamint a pozitív és negatív kontrollszérumokat 1:5 arányban 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween-20 és 0,1 % Kathon lyukanként 100 μl-nyi keverékében hígítjuk. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.
                        Titráláshoz készítsünk a vizsgálandó szérumokból kétszeres hígítási sort 1:10 aránytól 1:280 arányig 8 lyukban (lyukanként 100 μl), a lemez minden oszlopában egy szérumból, majd ugyanezt a pozitív és negatív kontrollszérumból is. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.
                     
                  
                     
                        2.1.2.2.
                     
                     
                        A lemezeket ötször kimossuk 0,135 M NaCl-ot és 0,05 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó, 0,1× foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBST). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.
                     
                  2.1.3.   Konjugátum
            
                     
                        2.1.3.1.
                     
                     
                        Adagoljunk lyukanként 100 μl-nyi, torma-peroxidázzal konjugált mea anti-VP7-et. Előzetesen ezt a mea-t 1/5 000–1/15 000 arányban hígították StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics. Referencia: SZ03) és desztillált víz 1/1 arányú oldatában. 30 percig 37 °C-on inkubáljuk.
                     
                  
                     
                        2.1.3.2.
                     
                     
                        A lemezeket ötször kimossuk 0,135 M NaCl-ot és 0,05 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó, 0,1× foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBST). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.
                     
                  2.1.4.   Kromogén/szubsztrát
            Mindegyik lyukhoz hozzáadunk 100 μl kromogén-/szubsztrátoldatot (1 ml ABTS (2,2′-azino-bisz-[3-etilbenzotiazolin-6-szulfonsav]), 5 mg/ml, + 9 ml szubsztrát puffer (0,1 M 4 pH-értékű, 0,03 % H2O2-t tartalmazó foszfát-citrát puffer), és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A színképződést lyukanként 100 μl 2 % (w/v) SDS (nátrium-dodecil-szulfát) hozzáadásával állítjuk le.
            2.1.5.   Leolvasás
            Olvassuk le ELISA-leolvasóban 405 nm-en.
            2.2.   Az eredmények értékelése
            
            
                     
                        2.2.1.
                     
                     
                        Határozzuk meg minden egyes minta blokkoló százalékát (BSz) a következő képlet használatával, amelynél az „Ea” ellenanyagot jelöl:
                        
                           
                     
                  
                     
                        2.2.2.
                     
                     
                        Az 50 %-nál magasabb BSz értéket mutató minták ALPV ellenanyagokra pozitívnak tekintendők.
                     
                  
                     
                        2.2.3.
                     
                     
                        A 45 %-nál alacsonyabb BSz értéket mutató minták ALPV ellenanyagokra negatívnak tekintendők.
                     
                  
                     
                        2.2.4.
                     
                     
                        A 45-50 % közötti BSz értékeket mutató minták kétesnek tekintendők, és újra kell azokat vizsgálni. Amennyiben az eredmény ismételten kétes, a kétes minta vételétől számított legalább két hét elteltével az állatoktól újabb mintát kell venni.
                     
                  B. RÉSZ
            A kórokozó azonosítása
            Valós idejű reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (rRT-PCR)
            A nukleinsav módszereken alapuló kórokozó azonosító vizsgálatoknak az ALPV kilenc szerotípusából származó referencia törzseket kell felismernie.
            A 2.1. pontban leírt módszer „A szárazföldi állatoknál alkalmazott diagnosztikai vizsgálatok és vakcinák kézikönyve”, 2016-os kiadása 2.5.1. fejezete B. szakaszának 1.2. pontján alapul, ahogy azt 2012 májusában elfogadta az OIE delegáltak világtalálkozója.
            A minták – legyen az vér vagy lép – vizsgálatára használt, bármely RT-PCR detektálási módszernek a 2009/156/EK irányelv szerint a 2. pontban leírt módszertanokéval azonos érzékenységet kell teljesítenie vagy meghaladnia azt.
            Az 1–9 szerotípusú referenciatörzsekbe tartozó inaktivált vírusok az Európai Unió referencialaboratóriumától, illetve az OIE afrikai lópestissel foglalkozó referencialaboratóriumától (Algete, Spanyolország) szerezhetők be.
            1.   A vírus RNS extrakciója
            
            A jó reakció biztosítása érdekében magas minőségű ALPV RNS kinyerése szükséges a mintából. A klinikai mintákból a nukleinsavak extrakciója számos házon belüli és kereskedelmi forgalomban kapható módszer segítségével végezhető.
            A kereskedelmi készletek különböző megközelítéseket alkalmaznak az RNS izoláláshoz. Legnagyobb részük az alábbi eljárások valamelyikén alapul:
            
                        —
                     
                     
                        a nukleinsavak fenol-kloroform extrakciója;
                     
                  
                        —
                     
                     
                        a nukleinsavak adszorpciója egy filter rendszerre;
                     
                  
                        —
                     
                     
                        a nukleinsavak adszorpciója egy mágneses gyöngy-rendszerre;
                     
                  A házon belüli RNS extrakció egy példája az alábbiakban található:
            
                        1.1.
                     
                     
                        1 g szövetmintát 1 ml denaturáló oldatban (4 M guanidium-tiocianát, 25 mM nátrium-citrát, 0,1 M 2-merkaptoetanol, 0,5 % sarcosyl) homogenizálunk.
                     
                  
                        1.2.
                     
                     
                        A centrifugálást követően a felülúszóhoz hozzáadjuk 1 μg élesztő RNS, 0,1 ml 2 M-os, 4 pH-értékű nátrium-acetát, 1 ml fenol és 0,2 ml kloroform/izoamil-alkohol keverékét (49/1).
                     
                  
                        1.3.
                     
                     
                        A szuszpenziót erősen felrázzuk, majd 15 percig jégen hűtjük.
                     
                  
                        1.4.
                     
                     
                        A centrifugálást követően a vizes fázisban jelenlévő RNS-t fenollal kivonjuk, etanollal precipitáljuk, majd steril vízben újraszuszpendáljuk.
                     
                  2.   Valós idejű RT-PCR eljárás
            
            2.1.   Csoport-specifikus valós idejű RT-PCR Agüero et al., 2008 szerint
                (3)
            
            Ez a csoportspecifikus valós idejű RT-PCR az ALPV VP7 fehérjéjét célozza meg, és képes detektálni minden ismert, jelenleg cirkuláló ALPV szerotípust és törzset. Nagyon jó eredményekkel alkalmazták ezt a módszert az Európai Unió tagállamainak résztvevő nemzeti referencialaboratóriumai az Európai Unió referencialaboratóriuma által 2009-2015 közötti időszakban évente szervezett jártassági teszteken. Ezenfelül az OIE referencialaboratóriumok hálózata keretében 2015-ben szervezett nemzetközi körvizsgálatban ezt a protokollt nagyon magas helyre sorolták a többi között.
            Az ALPV vírusfajok detektálásához a primer és próba szekvenciák az alábbiak:
            
                        —
                     
                     
                        forward primer
                     
                     
                        5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        reverse primer
                     
                     
                        5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        MGB-TaqMan próba
                     
                     
                        5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
                     
                  
                        2.1.1.
                     
                     
                        A primer törzskoncentrációt 8 μM munkakoncentrációra hígítjuk („8 μM primer munkatörzs”), a próbát pedig 50 μM munkakoncentrációra hígítjuk („50 μM próba munkatörzs”). Alakítsunk ki egy tesztlemez tervet és töltsük be azt a valós idejű PCR készülék szoftverébe. A tervet használva útmutatóként, minden egyes 8 μM-os primer törzsoldatból 2,5 μl-nyit (végső koncentráció 1 μM) hozzáadunk minden egyes lyukhoz, amely RNS mintákat, pozitív és/vagy negatív kontrollokat fog tartalmazni (a primer oldat végső koncentrációja 1 μM 20 μl RT-PCR oldatban). A lemezt jégen tároljuk.
                     
                  
                        2.1.2.
                     
                     
                        Az izolált RNS (tesztminták és pozitív kontroll) 2 μl-jét, illetve negatív reakciós kontrollok esetén 2 μl RNáz-mentes vizet keverünk el a forward és reverse primerekkel. Ezt a keveréket 5 percig 95 °C-ra hevítve denaturáljuk, ezt gyors hűtés követi a jégen legalább 5 percig.
                     
                  
                        2.1.3.
                     
                     
                        A vizsgálandó minták számára megfelelő mennyiségű valós idejű egylépcsős RT-PCR mesterkeveréket készítünk a gyártó utasításait követve. Minden RNA-mintát tartalmazó lyukhoz 0,1 μl 50 μM-os próba törzsoldatot adunk (a próbaoldat koncentrációja 0,25 μM minden RNA-mintát tartalmazó lyuk esetében). A valós idejű egylépcsős RT-PCR mesterkeverékből 13 μl-nyit oszlatunk el minden egyes lyukban a denaturált primereket és RNS-t tartalmazó PCR lemezen.
                     
                  
                        2.1.4.
                     
                     
                        A lemezt egy reverz transzkripcióra és cDNS amplifikációra/fluoreszcencia detektálásra programozott valós idejű thermal cycler-be helyezzük. Az amplifikációs körülmények a következőkből állnak: első reverz transzkripciós lépés 48 °C-on 25 percig, majd 10 percig 95 °C-on („forró start”), ezután egy 95 °C-on 15 másodpercből, 55 °C-on 35 másodpercből és 72 °C-on 30 másodpercből álló ciklus 40-szer ismételve (vagy 40 ciklusnyi 97 °C 2 másodpercig és 55 °C 30 másodpercig, amennyiben gyors reakciókat lehetővé tevő reagenseket és a termocyler-t használnak). A fluoreszcencia adatokat az 55 °C-os lépés végén vesszük fel.
                     
                  
                        2.1.5.
                     
                     
                        A vizsgálat érvénytelennek tekintendő, ha atípusos amplifikációs görbéket kaptunk, és meg kell azt ismételni.
                        A minták pozitívnak tekintendők, ha a Ct érték (azon ciklus száma, amelynél a reakcióban generált fluoreszcencia meghaladja a fluoreszcencia küszöbértéket) kisebb vagy egyenlő a meghatározott Ct küszöbértékkel (35) 40 PCR cikluson belül (Ct ≤ 35).
                        A minták kétesnek tekintendők, ha a Ct érték magasabb mint a meghatározott Ct küszöbérték (35) 40 PCR cikluson belül (Ct > 35).
                        A minták negatívnak tekintendők, ha egy horizontális amplifikációs görbét nyerünk, amely nem keresztezi a küszöbvonalat 40 PCR cikluson belül.
                     
                  2.2.   Csoport-specifikus valós idejű RT-PCR Guthrie et al., 2013 szerint
                (4)
            
            Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) próbákat használó valós idejű RT-PCR az ALPV nukleinsav detektálására.
            A leírt ALPV RT-PCR vizsgálatot úgy tervezték, hogy az ALPV számos, jelenleg cirkuláló vad törzséből származó szekvenciát használjon (Quan et al., 2010 (5)). Védett szintetikus külső kontrolltesztet is magában foglal a vizsgálati elemek megfelelő működésének verifikálása céljából.
            Az egylépcsős valós idejű PCR-hoz való készletek kereskedelmi forgalomban kaphatók. Az alábbiakban néhány alaplépés látható a Guthrie et al. (2013) által leírtaknak megfelelően, amelyek módosíthatók a helyi/esetspecifikus igények, a használt készletek és a rendelkezésre álló készülékek függvényében
            Az ALPV vírusfajok detektálásához a primer és próba szekvenciák az alábbiak:
            
                        —
                     
                     
                        forward primer
                     
                     
                        5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        reverse primer
                     
                     
                        5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        MGB-TaqMan próba
                     
                     
                        5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
                     
                  
                        2.2.1.
                     
                     
                        A primer és próba keverék törzsoldatokat 25x, 5 μΜ-os koncentrációban készítjük el a forward és reverse primerek esetén, 3 μΜ-osan pedig a próba esetében. Alakítsunk ki egy tesztlemez tervet és töltsük be azt a valós idejű PCR készülék szoftverébe. A tervet használva útmutatóként, RNS mintákból 5 μl-t, beleértve a tesztmintákat, valamint pozitív és negatív kontrollokat, hozzáadunk a lemez megfelelő lyukaihoz a tervet követve.
                     
                  
                        2.2.2.
                     
                     
                        Az RNS-t 5 percig 95 °C-ra hevítve denaturáljuk, ezt gyors hűtés követi a jégen legalább 3 percig.
                     
                  
                        2.2.3.
                     
                     
                        A vizsgálandó minták számára megfelelő mennyiségű valós idejű egylépcsős RT-PCR mesterkeveréket készítünk a gyártó utasításait követve. 1 μl 25× primer próba keverék törzsoldatot (a fenti 2.2.1. pontból) adunk a mesterkeverékhez, így minden egyes lyukban 200 nM-os végleges koncentrációt érünk el minden primer és 120 nM-t a próba esetében. A mesterkeverékből 20 μl-nyit oszlatunk el minden egyes lyukban a denaturált primereket tartalmazó PCR lemezen.
                     
                  
                        2.2.4.
                     
                     
                        A lemezt egy reverz transzkripcióra és cDNS amplifikációra/fluoreszcencia detektálásra programozott valós idejű thermal cycler-be helyezzük a gyártó javaslata szerint. Az amplifikációs körülmények például a következőkből állnak: első reverz transzkripciós lépés 48 °C-on 10 percig, majd 95 °C-on 10 percig, ezután 95 °C-on 15 másodpercből és 60 °C-on 45 másodpercből álló ciklus 40-szer ismételve.
                     
                  
                        2.2.5.
                     
                     
                        A minták pozitívnak tekintendők, ha a normalizált fluoreszcencia az AHSV RT-PCR vizsgálatnál meghaladja a 0,1-es küszöböt 36 PCR cikluson belül a minta összes replikátumában.
                        A minták kétesnek tekintendők, ha a normalizált fluoreszcencia az AHSV RT-PCR vizsgálatnál meghaladja a 0,1-es küszöböt 36-40 PCR ciklus között a minta bármely replikátumában.
                        A minták negatívnak tekintendők, ha a normalizált fluoreszcencia az RT-PCR vizsgálatnál nem haladta meg a 0,1-es küszöböt 40 PCR cikluson belül a minta összes replikátumában, és ha a normalizált fluoreszcencia a védett szintetikus külső kontrollteszt esetében meghaladja a 0,1-es küszöböt 33 PCR cikluson belül.
                     
                  
      
      
         (1)  Laviada M.D., Roy P. and Sanchez-Vizcaino J.M (1992b). Adaptation and evaluation of an indirect ELISA and immunoblotting test for African horse sickness antibody detection. In: Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses: Proceedings of the Second International Symposium. Walton T.E. & Osburn B.l., Eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646–650.
      
         (2)  Maree S. and Paweska J.T. (2005). Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera. J. Virol. Methods, 125 (1), 55–65.
      
         (3)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. and Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.
      
         (4)  Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30-5.
      
         (5)  Quan, M., Lourens, C.W., MacLachlan, N.J., Gardner, I.A., Guthrie, A.J., 2010. Development and optimisation of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus. J. Virol. Methods 167, 45–52.