CELEX: 32016D1840
Language: sv
Date: 2016-10-14 00:00:00
Title: Kommissionens genomförandebeslut (EU) 2016/1840 av den 14 oktober 2016 om ändring av bilaga IV till rådets direktiv 2009/156/EG vad gäller metoder för diagnostisering av afrikansk hästpest [delgivet med C(2016) 6509] (Text av betydelse för EES)

18.10.2016   
            
            
               SV
            
            
               Europeiska unionens officiella tidning
            
            
               L 280/33
            
         KOMMISSIONENS GENOMFÖRANDEBESLUT (EU) 2016/1840
   av den 14 oktober 2016
   om ändring av bilaga IV till rådets direktiv 2009/156/EG vad gäller metoder för diagnostisering av afrikansk hästpest
   
      
         [delgivet med C(2016) 6509]
      
   
   (Text av betydelse för EES)
   EUROPEISKA KOMMISSIONEN HAR ANTAGIT DETTA BESLUT
   med beaktande av fördraget om Europeiska unionens funktionssätt,
   med beaktande av rådets direktiv 2009/156/EG av den 30 november 2009 om djurhälsovillkor vid förflyttning och import av hästdjur från tredjeland (1), särskilt artikel 20, och
   av följande skäl:
   
               (1)
            
            
               I bilaga IV till direktiv 2009/156/EG fastställs de diagnostiska metoder för afrikansk hästpest som vid behov ska användas för undersökning av hästdjur före förflyttning inom unionen eller import från tredjeländer.
            
         
               (2)
            
            
               Sedan direktiv 2009/156/EG antogs har laboratoriernas kapacitet att genomföra avancerade, mycket sensitiva och effektiva tester för diagnostisering av afrikansk hästpest utvecklats. Samtidigt har kapitlet om diagnostisering av afrikansk hästpest i Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals
                   (2) från Världsorganisationen för djurhälsa (OIE) ändrats för att återspegla denna utveckling.
            
         
               (3)
            
            
               Som en del av sitt arbetsprogram för 2014 utarbetade Europeiska unionens referenslaboratorium för afrikansk hästpest (3) en rapport om den tekniska bedömningen av de diagnostiska metoder som beskrivs i bilaga IV till direktiv 2009/156/EG. I bedömningen som lades fram för kommissionen i maj 2015 drogs slutsatsen att kompetitiv Elisa inte längre är tillgänglig och att indirekt Elisa inte används i praktiken men att resultat kan fås på begäran inom 4–6 månader, medan blockerande Elisa är kommersiellt tillgänglig och vanligen används för analys av prover vid de provningsjämförelser som anordnas av EU:s referenslaboratorium för afrikansk hästpest.
            
         
               (4)
            
            
               I rapporten konstateras också att PCR-metoder med omvänd transkription (RT-PCR) har fördelar jämfört med serologiska diagnosmetoder när det gäller igenkänning av nukleinsyra, eftersom de gör det möjligt att påvisa sjukdomen i ett tidigt skede av infektionen. De flesta nationella referenslaboratorier i EU:s medlemsstater använder dessutom realtids RT-PCR-metoder, exempelvis för diagnostisering av afrikansk hästpest, och dessa metoder har visat sig vara ändamålsenliga vid de årliga provningsjämförelserna under perioden 2009–2014. Rapporten visar också att flera av OIE:s referenslaboratorier för afrikansk hästpest och andra laboratorier med särskild sakkunskap på området utanför EU använder minst en realtids RT-PCR-metod för påvisande av afrikansk hästpest-genom.
            
         
               (5)
            
            
               Det gemensamma seminariet för afrikansk hästpest och blåtunga med EU:s referenslaboratorier och de nationella referenslaboratorierna som hölls i Ascot (Förenade kungariket) den 24 och 25 november 2015 rekommenderade att realtids RT-PCR-metoder för påvisande av afrikansk hästpest-virus införs i bilaga IV till direktiv 2009/156/EG.
            
         
               (6)
            
            
               Trots att alla tillgängliga realtids RT-PCR-metoder för påvisande av afrikansk hästpest-genom är tillräckligt sensitiva, är den metod som beskrivs av Agüero et al. (2008) (4) den som flest laboratorier använder. Den metod som beskrivs av Guthrie et al. (2013) (5) är specifikt utformad för att säkerställa att hästar från riskområden för afrikansk hästpest kan transporteras på ett säkert sätt efter den kortaste karantänperiod som krävs enligt OIE:s Terrestrial Animal Health Code
                   (6).
            
         
               (7)
            
            
               Det är därför lämpligt att införa metoder för identifiering av agens och för påvisande av antikroppar i bilaga IV till direktiv 2009/156/EG som kompletterande metoder för snabb diagnostisering av afrikansk hästpest.
            
         
               (8)
            
            
               Bilaga IV till direktiv 2009/156/EG bör därför ändras genom att kompetitiv Elisa stryks och metoderna för indirekt Elisa och blockerande Elisa uppdateras i enlighet med kapitel 2.5.1 i OIE:s Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (upplaga 2016) som bygger på den version som antogs av OIE:s World Assembly of Delegates i maj 2012 (7). Samtidigt bör de realtids RT-PCR-metoder som beskrivs av Agüero et al. (2008) och Guthrie et al. (2013) läggas till i den bilagan så att dessa tester för identifiering av agens blir tillgängliga för testning före förflyttning.
            
         
               (9)
            
            
               Direktiv 2009/156/EG bör därför ändras i enlighet med detta.
            
         
               (10)
            
            
               De åtgärder som föreskrivs i detta beslut är förenliga med yttrandet från ständiga kommittén för växter, djur, livsmedel och foder.
            
         HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
   Artikel 1
   Bilaga IV till direktiv 2009/156/EG ska ersättas med texten i bilagan till detta beslut.
   Artikel 2
   Detta beslut riktar sig till medlemsstaterna.
   
      Utfärdat i Bryssel den 14 oktober 2016.
      
         
            På kommissionens vägnar
         
         Vytenis ANDRIUKAITIS
         
            Ledamot av kommissionen
         
      
   
   
      (1)  EUT L 192, 23.7.2010, s. 1.
   
      (2)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf
   
      (3)  Rådets direktiv 92/35/EEG av den 29 april 1992 om kontrollregler och åtgärder för bekämpning av afrikansk hästpest (EGT L 157, 10.6.1992, s. 19).
   
      (4)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. och Jimenez-Clavero A., ”Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus”, J. Vet. Diagn. Invest., 2008, 20, s. 325–328.
   
      (5)  Guthrie A.J., MacLachlan N.J., Joone C., Lourens C.W., Weyer C.T., Quan M., Monyai M.S. och Gardner I.A., ”Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus”, Journal of Virological Methods, 2013, 189(1), s. 30–35.
   
      (6)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf
   
      (7)  http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf
   
      BILAGA
      
         
            ”BILAGA IV
            
               AFRIKANSK HÄSTPEST
            
            
               DIAGNOSTISERING
            
            DEL A
            Serologiska tester
            Den serologiska metoden är ett Elisa-test (enzyme-linked immunosorbent assays) baserat på kapitel 2.5.1 avsnitt B punkt 2 i Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (upplaga 2016) som antogs av OIE:s World Assembly of Delegates i maj 2012.
            Virusproteinet VP7 är ett betydande immunodominant antigen i afrikansk hästpest-virus (AHSV) och är konserverat i de nio AHSV-serotyperna. Rekombinanta AHSV-VP7-proteiner har visat sig vara stabila, ofarliga och lämpliga att använda som antigener i Elisa-metoder för bestämning av AHSV-antikroppar med en hög sensitivitet och specificitet (Laviada et al. (1992b) (1), Maree och Paweska (2005)). Indirekt Elisa och blockerande Elisa är de två AHS-VP7 Elisa-tester som är lämpliga för serologisk diagnostisering av afrikansk hästpest (AHS).
            1.   Indirekt Elisa för påvisande av antikroppar mot afrikansk hästpest-virus (AHSV)
            
            Konjugatet som används i denna metod är ett antihästgammaglobulin konjugerat med pepparrotsperoxidas (HPR) som reagerar med serum från hästar, mulor och åsnor. Den metod som beskrivs av Maree och Paweska (2005) (2) använder protein G som konjugat som också reagerar med zebraserum.
            Antigenet tillhandahålls på begäran av Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA) i Spanien inom 4–6 månader.
            1.1   Testförfarande
            
            1.1.1   Fast fas
            
                     
                        1.1.1.1
                     
                     
                        
                           Coata Elisa-plattorna med rekombinant AHSV-4 VP7 som spätts i en karbonat-bikarbonatbuffert med pH 9,6. Inkubera plattorna över natten vid 4 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.1.2
                     
                     
                        Skölj plattorna fem gånger med destillerat vatten innehållande 0,01 % (v/v) Tween 20 (tvättlösning). Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.
                     
                  
                     
                        1.1.1.3
                     
                     
                        Blockera plattorna med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (pH 7,2) innehållande 5 % (w/v) skummjölk (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/brunn, i en timme vid 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.1.4
                     
                     
                        Avlägsna den blockerande lösningen och slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material.
                     
                  1.1.2   Prover
            
                     
                        1.1.2.1
                     
                     
                        De serumprover som ska testas samt positiva och negativa kontrollserum späds 1:25 i PBS innehållande 5 % (w/v) skummjölk och 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl/brunn. Inkubera i en timme vid 37 °C.
                        Vid titreringen görs en tvåfaldig spädningsserie från 1:25 (100 μl/brunn), ett serum per kolumn på plattan, och detsamma görs med de positiva och negativa kontrollerna. Inkubera i en timme vid 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.2.2
                     
                     
                        Skölj plattorna fem gånger med destillerat vatten innehållande 0,01 % (v/v) Tween 20 (tvättlösning). Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.
                     
                  1.1.3   Konjugat
            
                     
                        1.1.3.1
                     
                     
                        Tillsätt 100 μl/brunn av HRP-konjugerat antihästgammaglobulin som spätts i PBS innehållande 5 % mjölk och 0,05 % Tween 20 (pH 7,2). Inkubera i en timme vid 37 °C.
                     
                  
                     
                        1.1.3.2
                     
                     
                        Skölj plattorna fem gånger med destillerat vatten innehållande 0,01 % (v/v) Tween 20 (tvättlösning). Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.
                     
                  1.1.4   Kromogen/substrat
            
                     
                        1.1.4.1
                     
                     
                        Tillsätt 200 μl/brunn av kromogen-/substratlösning (10 ml 80,6 mM DMAB [dimetylaminobensaldehyd] och 10 ml 1,56 mM MBTH [3-metyl-2-bensotiazolinhydrazonhydroklorid] och 5 μl H2O2).
                        Färgutvecklingen stoppas genom tillsats av 50 μl 3N H2SO4 efter cirka 5–10 minuter (innan det negativa kontrollprovet börjar färgas).
                        Andra kromogener såsom ABTS (2,2′-azino-bis-[3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra]), TMB (tetrametylbensidin) eller OPD (orto-fenyldiamin) kan också användas.
                     
                  
                     
                        1.1.4.2
                     
                     
                        Avläs plattorna vid 600 nm (eller 620 nm).
                     
                  1.2   Tolkning av resultaten
            
            
                     
                        1.2.1
                     
                     
                        Beräkna cut-off-värdet genom att lägga till 0,06 till det negativa kontrollvärdet (0,06 är standardavvikelsen för en grupp med 30 negativa serum).
                     
                  
                     
                        1.2.2
                     
                     
                        Prover som ger absorbansvärden som är lägre än cut-off-värdet ska betraktas som negativa.
                     
                  
                     
                        1.2.3
                     
                     
                        Prover som ger absorbansvärden som är högre än cut-off-värdet (+ 0,15) ska betraktas som positiva.
                     
                  
                     
                        1.2.4
                     
                     
                        Prover som ger absorbansvärden som ligger mellan negativt och positivt ska betraktas som osäkra och en annan metod måste användas för att bekräfta resultatet.
                     
                  2.   Blockerande Elisa för påvisande av antikroppar mot afrikansk hästpest-virus (AHSV)
            
            Det kompetitiva blockerande Elisa-testet är utformat för att påvisa specifika AHSV-antikroppar i serum från alla arter av hästdjur (dvs. hästar, åsnor, zebror och korsningar av dessa), och därmed undviks problemet med specificitet som ibland har uppkommit vid indirekt Elisa.
            Principen för testet är en blockering av reaktionen mellan det rekombinanta VP7-proteinet som är absorberat till Elisa-plattan och en konjugerad AHS-VP7-specifik monoklonal antikropp. Om antikroppar finns i testserumet blockeras reaktionen mellan antigenet och den monoklonala antikroppen, vilket minskar färgutvecklingen. Eftersom den monoklonala antikroppen riktas mot VP7 har testet en hög sensitivitet och specificitet.
            Det kompetitiva blockerande Elisa-testet är kommersiellt tillgängligt.
            2.1   Testförfarande
            
            2.1.1   Fast fas
            
                     
                        2.1.1.1
                     
                     
                        
                           Coata Elisa-plattorna med 50–100 ng rekombinant AHSV-4 VP7 som spätts i en karbonat-bikarbonatbuffert med pH 9,6. Inkubera över natten vid 4 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.1.2
                     
                     
                        Skölj plattorna tre gånger med PBS 0,1× innehållande 0,135 M NaCl och 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.
                     
                  2.1.2   Prover och kontroller
            
                     
                        2.1.2.1
                     
                     
                        De serumprover som ska testas samt positiva och negativa kontrollserum späds 1:5 i ett spädningsmedel innehållande 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 och 0,1 % Kathon, 100 μl/brunn. Inkubera i en timme vid 37 °C.
                        Vid titreringen görs en tvåfaldig spädningsserie av testserumet från 1:10 till 1:280 över åtta brunnar (100 μl/brunn), ett serum per kolumn på plattan, och detsamma görs med de positiva och negativa kontrollerna. Inkubera i en timme vid 37 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.2.2
                     
                     
                        Skölj plattorna fem gånger med PBS 0,1× innehållande 0,135 M NaCl och 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.
                     
                  2.1.3   Konjugat
            
                     
                        2.1.3.1
                     
                     
                        Tillsätt 100 μl/brunn av HPR-konjugerade monoklonala antikroppar mot VP7. Denna monoklonala antikropp har i förväg spätts 1:5 000–1:15 000 i en 1:1 lösning av StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics, referens: SZ03) och destillerat vatten. Inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
                     
                  
                     
                        2.1.3.2
                     
                     
                        Skölj plattorna fem gånger med PBS 0,1× innehållande 0,135 M NaCl och 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.
                     
                  2.1.4   Kromogen/substrat
            Tillsätt 100 μl/brunn av kromogen-/substratlösning, dvs. 1 ml 5 mg/ml ABTS (2,2′-azino-bis-[3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra]) och 9 ml substratbuffert (0,1 M fosfatcitratbuffert med pH 4 innehållande 0,03 % H2O2) och inkubera i tio minuter vid rumstemperatur. Färgutvecklingen stoppas genom tillsats av 100 μl/brunn av 2 % (w/v) SDS (natriumdodecylsulfat).
            2.1.5   Avläsning
            Avläs vid 405 nm i Elisa-läsare.
            2.2   Tolkning av resultaten
            
            
                     
                        2.2.1
                     
                     
                        Fastställ hur många procent av varje prov som blockerats (BP) med hjälp av följande formel, där ”Abs” betecknar antikroppar:
                        
                           
                     
                  
                     
                        2.2.2
                     
                     
                        Prover som visar ett BP-värde som är högre än 50 % bör betraktas som positiva för AHSV-antikroppar.
                     
                  
                     
                        2.2.3
                     
                     
                        Prover som visar ett BP-värde som är lägre än 45 % bör betraktas som negativa för AHSV-antikroppar.
                     
                  
                     
                        2.2.4
                     
                     
                        Prover som visar ett BP-värde på 45–50 % bör betraktas som osäkra och måste testas på nytt. Om resultatet återigen är osäkert bör djuren testas på nytt på prover som tas tidigast två veckor efter det att det prov som betraktades som osäkert togs.
                     
                  DEL B
            Identifiering av agens
            Realtids PCR med omvänd transkription (rRT-PCR)
            Tester för identifiering av agens som baseras på nukleinsyremetoder ska påvisa referensstammar av de nio AHSV-serotyperna.
            Metoden som beskrivs i punkt 2.1 är baserad på kapitel 2.5.1 avsnitt B punkt 1.2 i Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (upplaga 2016) som antogs av OIE:s World Assembly of Delegates i maj 2012.
            De RT-PCR detektionsmetoder som används för testning av prover (antingen blod eller mjälte) inom ramen för direktiv 2009/156/EG måste ha en sensitivitet som motsvarar eller överstiger den hos de metoder som beskrivs i punkt 2.
            Inaktiverade virus av referensstammar av serotyperna 1–9 kan erhållas från EU:s referenslaboratorium eller från OIE:s referenslaboratorium för afrikansk hästpest i Algete, Spanien.
            1.   Extraktion av virus-RNA
            
            Det AHSV-RNA som extraheras från provet måste vara av hög kvalitet för att garantera en bra reaktion. Nukleinsyror kan extraheras från kliniska prover med flera olika egenutvecklade eller kommersiella metoder.
            Kommersiella kit använder olika metoder för att isolera RNA. De flesta är baserade på någon av följande metoder:
            
                        —
                     
                     
                        Fenol-kloroformextraktion av nukleinsyror.
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Adsorption av nukleinsyror med filtersystem.
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Adsorption av nukleinsyror med magnetisk partikelteknik.
                     
                  Följande metod är ett exempel på en egenutvecklad metod för RNA-extraktion:
            
                        1.1
                     
                     
                        1 g vävnadsprov homogeniseras i 1 ml denatureringsmedel (4 M guanidiumtiocyanat, 25 mM natriumcitrat, 0,1 M 2-merkaptoetanol, 0,5 % sarkosyl).
                     
                  
                        1.2
                     
                     
                        Efter centrifugering tillsätts 1 μg jäst-RNA, 0,1 ml 2 M natriumacetat (pH 4), 1 ml fenol och 0,2 ml av en kloroform-isoamylalkoholblandning (49:1) till supernatanten.
                     
                  
                        1.3
                     
                     
                        Suspensionen skakas kraftigt och kyls på is i 15 minuter.
                     
                  
                        1.4
                     
                     
                        Efter centrifugering extraheras det RNA som finns i vattenfasen med fenol, fälls ut med etanol och återsuspenderas i sterilt vatten.
                     
                  2.   Realtids RT-PCR-metod
            
            2.1   Gruppspecifik realtids RT-PCR enligt Agüero et al. (2008)
                (3)
            
            Detta gruppspecifika realtids RT-PCR riktar in sig på VP7 i AHSV och kan påvisa alla kända AHSV-serotyper och AHSV-stammar som för närvarande cirkulerar. Metoden har använts med väldigt goda resultat av de nationella referenslaboratorier i EU:s medlemsstater som deltog i de årliga provningsjämförelser som anordnades av EU:s referenslaboratorium under perioden 2009–2015. I ett internationellt ringtest som anordnades 2015 inom ramen för OIE:s nätverk av referenslaboratorier rankades denna metod mycket högt i jämförelse med andra metoder.
            Primer- och probsekvenser för påvisande av AHSV:
            
                        —
                     
                     
                        Framåtriktad primer:
                     
                     
                        5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Bakåtriktad primer:
                     
                     
                        5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        MGB-TaqMan-prob:
                     
                     
                        5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
                     
                  
                        2.1.1
                     
                     
                        Stamlösningarna för primrarna späds till arbetslösningar på 8 μM, medan proben späds till en arbetslösning på 50 μM. En mall för testplattan bör utformas och läggas in i programvaran för realtids PCR-instrumentet. 2,5 μl av arbetslösningen för varje primer (på 8 μM) tillsätts varje brunn som enligt mallen ska innehålla RNA-prover, positiva och/eller negativa kontroller (primerns slutkoncentration kommer att vara 1 μM i 20 μl RT-PCR-mix). Plattan förvaras på is.
                     
                  
                        2.1.2
                     
                     
                        2 μl isolerat RNA (prover och positiv kontroll) eller 2 μl RNas-fritt vatten (negativ kontroll) blandas med framåtriktade och bakåtriktade primrar. Blandningen denatureras genom upphettning i 5 minuter vid 95 °C, följt av en snabb kylning på is i minst 5 minuter.
                     
                  
                        2.1.3
                     
                     
                        Bered enligt tillverkarens anvisningar den volym av mastermix för ettstegs realtids RT-PCR som är lämplig för det antal prover som ska testas. 0,1 μl av arbetslösningen för proben (på 50 μM) tillsätts varje brunn med RNA-prover (probens slutkoncentration kommer att vara 0,25 μM i varje brunn med RNA-prover). 13 μl mastermix för ettstegs realtids RT-PCR tillsätts varje brunn i PCR-plattan innehållande denaturerade primrar och denaturerat RNA.
                     
                  
                        2.1.4
                     
                     
                        Plattan placeras i en realtids termocykler programmerad för omvänd transkription och cDNA amplifiering/fluorescensdetektion. Amplifieringsförhållandena består av ett första steg med omvänd transkription i 25 minuter vid 48 °C, följt av 10 minuter vid 95 °C (hot start) och 40 cykler på 15 sekunder vid 95 °C, 35 sekunder vid 55 °C och 30 sekunder vid 72 °C (eller 40 cykler på 2 sekunder vid 97 °C och 30 sekunder vid 55 °C om termocykler och reagenser för snabba reaktioner används). Fluorescensdata samlas in vid slutet av steget vid 55 °C.
                     
                  
                        2.1.5
                     
                     
                        Testet betraktas som ogiltigt om atypiska amplifieringskurvor erhålls och ska i så fall upprepas.
                        Prover betraktas som positiva om Ct-värdet (cykelnummer då fluorescensen i en reaktion passerar tröskelvärdet för fluorescens) är lägre än eller lika med det fastställda Ct-värdet (35) inom 40 PCR-cykler (Ct ≤ 35).
                        Prover betraktas som osäkra om Ct-värdet är högre än det fastställda Ct-värdet (35) inom 40 PCR-cykler (Ct ≥ 35).
                        Prover betraktas som negativa om en horisontell amplifieringskurva erhålls som inte passerar tröskelvärdet inom 40 PCR-cykler.
                     
                  2.2   Gruppspecifik realtids RT-PCR enligt Guthrie et al. (2013)
                (4)
            
            Realtids RT-PCR med FRET-prober (Fluorescence Resonance Energy Transfer) för att påvisa AHSV:s nukleinsyror.
            I denna RT-PCR-metod för AHSV används sekvenser från flera olika fältstammar av AHSV som för närvarande cirkulerar (Quan et al. (2010) (5)). I metoden ingår också ett patentskyddat syntetiskt externt kontrolltest för att kontrollera att testet fungerar som det ska.
            Kit för ettstegs realtids PCR är kommersiellt tillgängliga. Nedan följer några grundläggande steg enligt Guthrie et al. (2013) som kan modifieras beroende på lokala/specifika krav, vilka kit som används och vilken utrustning som finns tillgänglig.
            Primer- och probsekvenser för påvisande av AHSV:
            
                        —
                     
                     
                        Framåtriktad primer:
                     
                     
                        5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        Bakåtriktad primer:
                     
                     
                        5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
                     
                  
                        —
                     
                     
                        MGB-TaqMan-prob:
                     
                     
                        5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
                     
                  
                        2.2.1
                     
                     
                        Stamlösningen för primer-probblandningen är koncentrerad 25× och innehåller 5 μΜ framåtriktade och bakåtriktade primrar och 3 μΜ prob. En mall för testplattan bör utformas och läggas in i programvaran för realtids PCR-instrumentet. 5 μl RNA-prover (inklusive testprover samt positiva och negativa kontroller) tillsätts de lämpliga brunnarna enligt mallen.
                     
                  
                        2.2.2
                     
                     
                        RNA:t denatureras genom upphettning i 5 minuter vid 95 °C, följt av en snabb kylning på is i minst 3 minuter.
                     
                  
                        2.2.3
                     
                     
                        Bered enligt tillverkarens anvisningar den volym av mastermix för ettstegs realtids RT-PCR som är lämplig för det antal prover som ska testas. 1 μl av 25× stamlösningen för primer-probblandningen (se punkt 2.2.1) tillsätts mastermixen, vilket ger en slutkoncentration på 200 nM/brunn för varje primer och 120 nM/brunn för proben. 20 μl mastermix tillsätts varje brunn i PCR-plattan innehållande denaturerat RNA.
                     
                  
                        2.2.4
                     
                     
                        Plattan placeras i en realtids termocykler programmerad för omvänd transkription och cDNA amplifiering/fluorescensdetektion enligt tillverkarens anvisningar. Amplifieringsförhållandena består exempelvis av ett första steg med omvänd transkription i 10 minuter vid 48 °C, följt av 10 minuter vid 95 °C och 40 cykler på 15 sekunder vid 95 °C och 45 sekunder vid 60 °C.
                     
                  
                        2.2.5
                     
                     
                        Prover betraktas som positiva om den normaliserade fluorescensen för AHSV RT-PCR-testet överstiger ett tröskelvärde på 0,1 inom 36 PCR-cykler i alla replikat av ett prov.
                        Prover betraktas som osäkra om den normaliserade fluorescensen för AHSV RT-PCR-testet överstiger ett tröskelvärde på 0,1 mellan PCR-cyklarna 36 och 40 i minst ett replikat av ett prov.
                        Prover betraktas som negativa om den normaliserade fluorescensen för AHSV RT-PCR-testet inte överstiger ett tröskelvärde på 0,1 inom 40 PCR-cykler i alla replikat av ett prov och om den normaliserade fluorescensen för det patentskyddade syntetiska externa kontrolltestet överstiger ett tröskelvärde på 0,1 inom 33 PCR-cykler.”
                     
                  
      
      
         (1)  Laviada M.D., Roy P. och Sanchez-Vizcaino J.M., ”Adaptation and evaluation of an indirect ELISA and immunoblotting test for African horse sickness antibody detection”, Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses: Proceedings of the Second International Symposium, Walton T.E. & Osburn B.I. (Eds), CRC Press, Boca Raton, Florida, Förenta staterna, 1992b, s. 646–650.
      
         (2)  Maree S. och Paweska J.T, ”Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera”, J. Virol. Methods, 2005, 125(1), s. 55–65.
      
         (3)  Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. och Jimenez-Clavero A., ”Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus”, J. Vet. Diagn. Invest., 2008, 20, s. 325–328.
      
         (4)  Guthrie A.J., MacLachlan N.J., Joone C., Lourens C.W., Weyer C.T., Quan M., Monyai M.S. och Gardner I.A., ”Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus”, Journal of Virological Methods, 2013, 189(1), s. 30–35.
      
         (5)  Quan, M., Lourens, C.W., MacLachlan, N.J., Gardner, I.A. och Guthrie, A.J., ”Development and optimisation of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus”, J. Virol. Methods, 2010, 167, s. 45–52.