CELEX: 31972L0199
Language: da
Date: 1972-04-27 00:00:00
Title: Kommissionens tredje direktiv 72/199/EØF af 27. april 1972 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer

Avis juridique important

|

31972L0199

Kommissionens tredje direktiv 72/199/EØF af 27. april 1972 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer  

EF-Tidende nr. L 123 af 29/05/1972 s. 0006 - 0034 den finske specialudgave: kapitel 3 bind 4 s. 0184  den danske specialudgave: serie III kapitel 1966-1972 s. 0071  den svenske specialudgave: kapitel 3 bind 4 s. 0184  den engelske specialudgave: serie III kapitel 1966-1972 s. 0074  den græske specialudgave: Kapitel 03 bind 8 s. 0007  den spanske specialudgave: Kapitel 03 bind 6 s. 0008  den portugisiske specialudgave: Kapitel 03 bind 6 s. 0008 

++++  KOMMISSIONENS TREDJE DIREKTIV  af 27 . april 1972  om fastsaettelse af faellesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer   ( 72/199/EOEF )  KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -  under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab ,  under henvisning til Raadets direktiv af 20 . juli 1970 om indfoerelse af faellesskabsregler for proeveudtagning og faelleskabsanalysemetoder til den officielle kontrol af foderstoffer ( 1 ) , saerlig artikel 2 , og  ud fra foelgende betragtninger :  Ovennaevnte direktiv bestemmer , at officielle kontrolforanstaltninger vedroerende foderstoffer med henblik paa at konstatere , om de i henhold til administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser foreskrevne betingelser med hensyn til foderstoffers beskaffenhed og sammensaetning er opfyldt , foretages under anvendelse af faellesskabsregler for proeveudtagning og faellesskabsanalysemetoder ;  ved Kommissionens direktiver nr . 71/250/EOEF af 15 . juni 1971 ( 2 ) og nr . 71/393/EOEF af 18 . november 1971 ( 3 ) er allerede en raekke analysemetoder fastlagt ; det arbejde , der i mellemtiden er udfoert , er nu saa vidt fremskredet , at en 3 . serie analysemetoder boer fastlaegges ;  de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den staaende Komité for foderstoffer -  Artikel 1  Medlemsstaterne foreskriver , at analyser i forbindelse med officiel kontrol af foderstoffer med hensyn til disses indhold af stivelse , raaprotein , pepsin - og saltsyreoploeseligt raaprotein og fri og total gossypol samt med hensyn til pepsinaktiviteten udfoeres efter de i bilag I til dette direktiv beskrevne metoder . De almindelige bestemmelser i foerste del ( indledning ) af bilaget til Kommissionens foerste direktiv nr . 71/250/EOEF af 15 . juni 1971 om fastsaettelse af faellesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer finder anvendelse paa de i bilag I til dette direktiv beskrevne metoder .  Artikel 2  Medlemsstaterne foreskriver , at analyser i forbindelse med officiel kontrol af foderstoffer med henblik paa paavisning og identifikation af antibiotika inden for tetracyklingruppen samt med hensyn til foderstoffernes indhold af klortetracyklin , oxytetracyklin , tetracyklin , oleandomycin , tytosin og virginiamycin udfoeres efter de i bilag II til dette direktiv beskrevne metoder .  De almindelige bestemmelser i foerste del ( indledning ) af bilaget til Kommissionens foerste direktiv nr . 71/250/EOEF af 15 . juni 1971 med undtagelse af den del , der vedroerer forberedelse af analyseproeven , finder anvendelse paa de i bilag II til dette direktiv beskrevne metoder .  Artikel 3  Senest 1 . juli 1973 bringer medlemsstaterne de noedvendige administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser i anvendelse for at efterkomme dette direktivs bestemmelser . De underretter straks Kommissionen herom .  Artikel 4  Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne .  Udfaerdiget i Bruxelles , den 27 . april 1972 .  Paa Kommissionens vegne  S . L . MANSHOLT  Formand  ( 1 ) EFT nr . L 170 af 3 . 8 . 1970 , s . 2 .  ( 2 ) EFT nr . L 155 af 12 . 7 . 1971 , s . 13 .  ( 3 ) EFT nr . L 279 af 20 . 12 . 1971 , s . 7 .  BILAG I  1 . BESTEMMELSE AF STIVELSE   - polarimetrisk metode -  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af indholdet af stivelse og nedbrydningsprodukter heraf med hoej molekylvaegt i foderstoffer med undtagelse af saadanne , som indeholder snitter og diffusionssnitter af roer , toerrede roeblade og -toppe , kartoffelpulp , toergaer , inulinholdige produkter ( f . eks . jordskoksnitter og -mel ) eller fedtegrever .  2 . Princip  Metoden er baseret paa en dobbelt bestemmelse . Ved den foerste bestemmelse behandles proeven i varm tilstand med fortyndet saltsyre . Efter klaring og filtrering maales oploesningens optiske drejning polarimetrisk .  Ved den anden bestemmelse ekstraheres proeven med ethanol 40 % . Efter behandling af filtratet med saltsyre klares og filtreres og den optiske drejning maales under samme betingelser som ved den foerste bestemmelse .  Forskellen mellem de to maalinger , multipliceret med en kendt faktor , giver proevens stivelsesindhold .  3 . Reagenser  3.1 Saltsyre 25 % , mf . 1,126 ( w/w ) .  3.2 Saltsyre 1,128 % ( w/v ) .  Koncentrationen skal kontrolles ved titrering med 0,1 N natriumhydroxydoploesning under tilstedevaerelse af metylroedt 0,1 % ( w/v ) i ethanol 94 % ( v/v ) . 10 ml = 30,94 ml 0,1 N NaOH .  3.3 Carrez-oploesning I : 21,9 g zinkacetat Zn ( CH3COO)2 * 2 H2O og 3 g iseddike oploeses i vand , og der fyldes op med vand til 100 ml .  3.4 Carrez-oploesning II : 10,6 g kaliumhexacyanoferrat , K4 ( Pe(ON)6 ) * 3 H2O oploeses i vand , og der fyldes op med vand til 100 ml .  3.5 Ethanol 40 % ( v/v ) , mf . 0,948 ved 20 * C .  4 . Apparatur  4.1 250 ml Erlenmeyerkolbe med tilsleben prop og tilbageloebskoeler .  4.2 Polarimeter eller saccharimeter .  5 . Udfoerelse  5.1 Tilberedning af proeven  Proeven skal formales saa fint , at den passerer en sigte med runde huller fuldstaendigt  ( huldiameter 0,5 mm ) .  5.2 Bestemmelse af den totale optiske drejning  ( P eller S ) ( se bemaerkning 7.1 )  2,5 g af proeven afvejes med 1 mg noejagtighed i en 100 ml maalekolbe , og der tilsaettes 25 ml saltsyre ( 3.2 ) . Kolben rystes , indtil substansen er godt fordelt ; derefter tilsaettes yderligere 25 ml saltsyre ( 3.2 ) . Til slut anbringes kolben i et kogende vandbad . I de foerste 3 minutter rystes kolben kraftigt og med regelmaessige mellemrum for at forhindre klumpdannelse . Vandmaengden i vandbadet skal vaere tilstraekkelig til fortsat at holde vandet i kog , naar kolben saenkes ned . Under omrystningen maa kolben ikke tages op af vandet . Efter noejagtig 15 minutter tages kolben op af vandbadet , hvorefter der tilsaettes 30 ml koldt vand og straks afkoeles til 20 * C .  Der tilsaettes 5 ml Carrez-oploesning I  ( 3.3 ) og rystes 1 minut ; umiddelbart derefter tilsaettes 5 ml Carrez-oploesning II ( 3.4 ) , og der rystes atter 1 minut . Derpaa fyldes op med vand til maerket , omrystes og filtreres . Saafremt filtratet ikke er fuldstaendig klart , hvilket sjaeldent forekommer , skal bestemmelsen gentages med stoerre maengder af Carrez-oploesningerne I og II , f . eks . 10 ml .  Umiddelbart derefter maales oploesningens optiske drejning i et 200 mm roer med et polarimeter eller et saccharimeter .  5.3 Bestemmelse af den optiske drejning  ( P' eller S' ) for de i ethanol 40 % oploeselige substanser .  5 g af proeven afvejes med 1 mg noejagtighed i en 100 ml maalekolbe og der tilsaettes ca . 80 ml ethanol ( 3.5 ) ( se bemaerkning 7.2 ) . Derpaa henstilles kolben 1 time ved rumtemperatur . Under henstanden rystes kolben kraftigt seks gange , saaledes at substansen blandes godt med ethanolen . Der fyldes op med ethanol ( 3.5 ) til maerket , omrystes og filtreres .  50 ml af filtratet ( = 2,5 g af proeven ) afpipetteres i en 250 ml Erlenmeyerkolbe og der tilsaettes 2,1 ml saltsyre ( 3.1 ) ; kolben rystes kraftigt , sluttes til en tilbagekoebskoeler og saettes i et bad med kogende vand . Efter noejagtig 15 minutter tages Erlenmeyerkolben op af vandbadet og indholdet skylles over i en 100 ml maalekolbe med en lille maengde koldt vand ; umiddelbart herefter afkoeles til en temperatur paa 20 * C .  Derpaa klares med Carrez-oploesningerne I ( 3.3 ) og II ( 3.4 ) , fyldes op med vand til maerket , omrystes og filtreres , og den optiske drejning maales som beskrevet under 5.2 andet og tredje afsnit .  6 . Beregning af resultaterne  Indholdet af stivelse i procent af proeven beregnes som foelger :  6.1 Polarimetriske maalinger  Stivelses-procent = ( 2000 * ( P - P' ) ) / ( a ) ( 20 * , D )  P = total optisk drejning i cirkelgrader .  P' = optisk drejning i cirkelgrader af de i ethanol 40 % oploeselige substanser .   ( a ) ( 20 * /D ) = den rene stivelses specifikke drejningsevne .  Til denne faktor anvendes ifoelge aftale nedenstaaende vaerdier :   + 185,9 * : risstivelse ,   + 195,4 * : kartoffelstivelse ,   + 184,6 * : majsstivelse ,   + 182,7 * : hvedestivelse ,   + 181,5 * : bygstivelse ,   + 181,3 * : havrestivelse ,   + 184,0 * : andre stivelsesarter samt stivelsesblandinger i foderblandinger .  6.2 Saccharimetriske maalinger  Stivelses-procent = ( 2000 / ( a ) ( 20 * D ) ) *  ( ( 2 N * 0,665 ) ( S - S' ) ) /100 =  ( 26,6 N ( S - S' ) ) / ( a ) ( 20 * D )  S = total optisk drejning i saccharimeter-grader .  S' = optisk drejning i saccharimeter-grader af de i ethanol 40 % oploeselige substanser .  N = vaegt af saccharose i g , som i 100 ml vand ved en lagtykkelse paa 200 mm giver en optisk drejning paa 100 saccharimeter-grader . Denne vaegt varierer alt efter saccharimetertype :  16,29 g ved franske saccharimetre ,  26,00 g ved tyske saccharimetre ,  20,00 g ved blandede saccharimetre .   ( a ) ( 20 * , D ) = den rene stivelses specifikke drejningsevne ( se 6.1 ) .  6.3 Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve ved indhold paa mindre end 40 % stivelse ikke vaere mere end 0,4 % absolut , ved indhold paa 40 % og mere ikke over 1 % relativt .  7 . Bemaerkninger  7.1 Indeholder proeven mere end 6 % karbonater , beregnet som kalciumkarbonat , skal disse foer bestemmelsen af den totale optiske drejning destrueres med den hertil noedvendige maengde af fortyndet svovlsyre .  7.2 Ved produkter med hoejt laktoseindhold , f . eks . vallepulver eller skummetmaelkspulver , anvendes efter tilsaetning af 80 ml ethanol ( 3.5 ) foelgende fremgangsmaade :  Maalekolben forsynes med en tilbageloebskoeler og nedsaenkes i 30 minutter i et vandbad paa 50 * C . Efter afkoeling fortsaettes som beskrevet under 5.3 .  2 . BESTEMMELSE AF RAAPROTEIN  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader konventionel udregning af indholdet af raaprotein i foderstoffer paa basis af kvaelstofindholdet ( Kjeldahl ) .  2 . Princip  Proeven destrueres i vaad tilstand . Den sure nedbrydningsrest goeres alkalisk med en natriumhydroxydoploesning . Den frigjorte ammoniak fraskilles ved destillation og opsamles i en bestemt maengde svovlsyre , hvis overskud titreres med en natriumhydroxydoploesning .  3 . Reagenser  3.1 Kaliumsulfat p . a .  3.2 Katalysator : Kobber(II)-oxyd CuO p.a . eller krystalliseret kobbersulfat CuSO4 * 5 H2O p.a . eller kviksoelv eller kviksoelvoxyd HgO p.a .  3.3 Zink p.a . , granuleret  3.4 Svovlsyre p.a . , mf . 1,84  3.5 0,1 N svovlsyre  3.6 0,5 N svovlsyre  3.7 Metylroedt-indikator : 300 mg metylroedt oploeses i 100 ml ethanol 95-96 % ( v/v )  3.8 Natriumhydroxydoploesning 40 % ( w/v )  3.9 0,1 N natriumhydroxydoploesning  3.10 0,25 N natriumhydroxydoploesning  3.11 Maettet natriumsulfidoploesning p.a .  3.12 Natriumtiosulfatoploesning 8 % ( w/v ) ; Na2S2O3 * 5 H2O p.a .  3.13 Granuleret pimpsten , vasket med saltsyre og gloedet .  4 . Apparatur  Destruktionsapparat og destillationsapparat ifoelge Kjeldahl ( se bemaerkning 7.1 ) .  5 . Udfoerelse  5.1 Destruktion  1 g af proeven afvejes med 1 mg noejagtighed og kommes i destruktionskolben . Hertil saettes 10 g kaliumsulfat ( 3.1 ) , en passende maengde af katalysatoren ( 3.2 ) ( 0,3 til 0,4 g kobberoxyd eller 0,9 til 1,2 g kobbersulfat eller en draabe kivksoelv eller 0,6 til 0,7 g kviksoelvoxyd ) , 25 ml svovlsyre ( 3.4 ) og et par stykker granuleret pimpsten ( 3.13 ) og kolbeindholdet blandes Kolben opvarmes i begyndelsen moderat , derefter - under jaevnlig omrystning - til substansen forkuller og skumdannelsen ophoerer og mod slutningen intensivt til vaesken koger jaevnt . Overophedning af kolben og vedhaeng af organiske dele paa kolbevaeggen skal undgaas . Saasnart oploesningen er klar og farveloes ( resp . lysegroen , saafremt der er anvendt en kobberholdig katalysator ) fortsaettes kogningen i endnu 1 time , hvorefter der afkoeles .  5.2 Destillation  Under kontinuerlig svingning tilsaettes der forsigtigt 250 til 350 ml vand , hvorved sulfaterne skal oploeses fuldstaendigt . Der afkoeles ; derpaa tilsaettes nogle stykker granuleret zink ( 3.3 ) .  I destillationsapparatets forlagskolbe kommes der alt efter det forventede kvaelstofindhold noejagtig 25 ml 0,1 N ( 3.5 ) eller 0,5 N ( 3.6 ) svovlsyre  ( se bemaerkning 7.2 ) , hvortil der saettes nogle draaber metylroedt-I ( 3.7 ) .  Kolben forbindes med destillationsapparatets koeler og dennes yderste ende saenkes mindst 1 cm ned i vaesken i forlagskolben ( se bemaerkning 7.3 ) . Gennem en tragt med hane fyldes 100 ml natriumhydroxydoploesning 40 % ( 3.8 ) langsomt ned i destillationskolben . Ved anvendelse af en kviksoelvkatalysator tilsaettes der i destillationskolben yderligere 10 ml natriumsulfidoploesning ( 3.11 ) eller 25 ml natriumtiosulfatoploesning ( 3.12 ) .  Kolben opvarmes saaledes , at der i loebet af 30 minutter afdestilleres ca . 150 ml af vaesken . Efter disse 30 minutters forloeb kontrolleres den neutrale reaktion i destillatet med lakmuspapir . Er reaktionen alkalisk , fortsaettes destilleringen . Den bringes til ophoer , naar destillatet paa lakmuspapiret viser sig at vaere neutralt . Under destilleringsprocessen svinges forlagskolbens indhold med jaevne mellemrum , og dets farvning iagttages . Saafremt farvningen gaar over i det gullige , tilsaettes omgaaende en noeje afmaalt maengde 0,1 N  ( 3.5 ) eller 0,5 N ( 3.6 ) svovlsyre .  5.3 Titrering  I forlagskolben titreres overskuddet af svovlsyre med 0,1 N ( 3.9 ) eller 0,25 N ( 3.10 ) natriumhydroxydoploesning , alt efter den anvendte svovlsyres normalitet , til omslag til klar gul farve .  5.4 Kontrol af metoden  For at kontrollere , om reagenserne er kvaelstoffri , udfoeres et blindforsoeg ( destillation og titrering ) uden analyseproeven . Til kontrol af metodens noejagtighed skal analysen ( destruktion , destillation og titrering ) udfoeres med 1,5 til 2,0 g acetanilid p.a . ( smp . 114 * C ; % N : 10,36 ) ved tilstedevaerelse af 1 g kvaelstoffri saccharose . 1 g acetanilid forbruger 14,80 ml 0,5 N svovlsyre .  6 . Beregning af resultaterne  Maengden af den forbrugte svovlsyre beregnes . 1 ml 0,1 N svovlsyre svarer til 1,4 mg kvaelstof . Kvaelstofmaengden multipliceres med faktoren 6,25 . Resultatet udtrykkes i procent af proeven .  Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved en og samme proeve ved indhold paa mindre end 20 % raaprotein ikke vaere over 0,2 % absolut , ved indhold paa fra 20 % til 40 % raaprotein ikke over 1,0 % relativt , ved indhold paa over 40 % raaprotein ikke over 0,4 % absolut .  7 . Bemaerkninger  7.1 Apparatur , ved hvilket omhaeldning mellem destruktion og destillation er noedvendig , kan anvendes . Der maa ikke spildes under omhaeldningen .  7.2 Ved kvaelstoffattige foderstoffer kan maengden af 0,1 N svvovlsyre , som skal fyldes i opsamlingskolben , eventuelt reduceres til 10 eller 15 ml , hvorefter der fyldes op med vand til 25 ml .  7.3 Findes der ikke nogen tragt med hane paa destillationsapparatet , sker tilsaetningen af natriumhydroxydoploesningen umiddelbart foer kolben forbindes med koeleren ; vaesken skal i saa fald loebe langsomt ned langs kolbevaeggen for at undgaa , at den opblandes med den sure oploesning .  3 . BESTEMMELSE AF DET MED PEPSIN OG SALTSYRE OPLOESELIGE RAAPROTEIN  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af det med pepsin og saltsyre oploeselige raaprotein under definerede betingelser . Metoden gaelder for alle foderstoffer .  2 . Princip  Proeven behandles 48 timer ved 40 * C med en pepsin-saltsyre-oploesning . Suspensionen filtreres , og kvaelstofindholdet i filtratet bestemmes efter den til bestemmelse af raaprotein beskrevne metode .  3 . Reagenser  3.1 Saltsyre , mf . 1,125 .  3.2 0,075 N saltsyre .  3.3 Pepsin 2.0 E/mg . Aktiviteten er defineret i 4 . del af forskrifterne i dette bilag og kontrolleres i overensstemmelse dermed .  3.4 Pepsinoploesning ca . 0,02 % ( w/v ) i saltsyre  ( 3.2 ) , frisk tilberedt . Aktivitet 400 E/l .  3.5 Antiskumemulsion ( f . eks . silikone ) .  3.6 Samtlige under punkt 3 i metoden til bestemmelse af raaproteiner anfoerte reagenser .  4 . Apparatur  4.1 I termostatstyret vandbad eller varmeskab , indstillet paa 40 * C mere eller mindre 1 * C .  4.2 Apparatur til destruktion og destillation ifoelge Kjeldahl .  5 . Udfoerelse  5.1 Oploesning af raaproteinet ( se bemaerkning 7.2 )  2 g af proeven afvejes med 1 mg noejagtighed og kommes i en 500 ml maalekolbe . Hertil saettes 450 ml pepsinoploesning ( 3.4 ) , som foerst er opvarmet til 40 * C , hvorefter der rystes for at forhindre klumpdannelse . Suspensionens pH-vaerdi skal ligge under 1,7 . Kolben henstilles i vandbad eller varmeskab ( 4.1 ) i 48 timer . Der rystes efter 8 , 24 og 32 timer . Efter 48 timer tilsaettes 15 ml saltsyre ( 3.1 ) , afkoeles til 20 * C , fyldes op med vand til maerket og filtreres .  5.2 Destruktion  250 ml af filtratet kommes i destruktionsapparaturets kolbe ( 4.2 ) . Derpaa tilsaettes de til destruktionen noedvendige reagenser , som anfoert i beskrivelsen af metoden til bestemmelse af raaprotein under punkt 5.1 , 2 . punktum . Der blandes og opvarmes til kogetemperatur . Saafremt der dannes kraftigt skum , tilsaettes nogle draaber antiskumemulsion ( 3.5 ) . Vaesken holdes i kraftigt kog , til vandet er naesten fuldstaendig fordampet . De sidste spor af vand elimineres forsigtigt ved lavere varmetilfoersel . Naar oploesningen er klar og farveloes ( resp . lysegroen ved anvendelse af en kobberholdig katalysator ) , fortsaettes kogningen i endnu 1 time ; derpaa afkoeles der .  5.3 Destillation og titrering  Fremgangsmaade som beskrevet i metoden til bestemmelse af raaproteiner under 5.2 og 5.3 .  5.4 Blindforsog  Et blindforsoeg udfoeres under anvendelse af samme fremgangsmaade uden analyseproeve .  6 . Beregning af resultaterne  Rumfanget af den i blindforsoeget forbrugte svovlsyre traekkes fra analyseproevens forbrug . 1 ml 0,1 N svovlsyre svarer til 1,4 mg kvaelstof .  Den fundne kvaelstofmaengde multipliceres med faktoren 6.25 . Resultatet udtrykkes i procent af proeven .  Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve   - ved indhold paa mindre end 20 % oploeseligt raaprotein , ikke vaere over 0,4 % absolut ,   - ved indhold paa 20 til 40 % oploeseligt raaprotein , ikke over 2 % relativt ,   - ved indhold paa mere end 40 % oploeseligt raaprotein , ikke over 0,8 % absolut .  7 . Bemaerkninger  7.1 De beregnede vaerdier staar ikke i direkte forhold til fordoejeligheden in vivo .  7.2 Foderstoffer , hvis raafedtindhold er mere end 10 % , skal affedtes ved ekstraktion med petroleumsaeter ( kp . 40-60 * C ) .  4 . BESTEMMELSE AF PEPSINAKTIVITET  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tjener til kontrol af aktiviteten i den pepsin , der anvendes til bestemmelse af det med pepsin og saltsyre oploeselige raaprotein .  2 . Princip  Haemoglobin behandles under definerede betingelser med pepsin og fortyndet saltsyre . Den ikke hydrolyserede andel af proteinerne udfaeldes med trikloreddikesyre . Til filtratet saettes natriumhydroxydoploesning og reagens ifoelge Folin-Ciocalteu . Ekstinktionen af denne oploesning maales ved 750 m og den til denne ekstinktion svarende maengde tyrosin aflaeses af en standardkurve .  Definition : Pepsin-enheden ( E ) defineres som den enzymmaengde , der under metodens betingelser pr . minut frigiver saa mange hydroxyaryl-grupper , at disses farvning med Folin-Ciocalteureagens giver en ekstinktion , som svarer til ekstinktionen af 1 m mol tyrosin under de samme betingelser .  3 . Reagenser  3.1 0,2 N saltsyre  3.2 0,06 N saltsyre  3.3 0,025 N saltsyre  3.4 trikloreddikesyreoploesning 5 % ( w/v )  3.5 0,5 N natriumhydroxydoploesning  3.6 Reagens ifoelge Folin-Ciocalteu : 100 g natriumwolframat ( Na2WO4 * 2 H2O ) , 25 g natriummolybdat ( Na2MoO4 * 2 H2O ) og 700 ml vand kommes i en 2 liters rundbundet kolbe med tilsleben prop . - Der tilsaettes 50 ml fosforsyre  ( mf . 1,71 ) og 100 ml koncentreret saltsyre  ( mf . 1,19 ) , hvorpaa kolben forbindes med en tilbageloebskoeler . Der opvarmes til kogetemperatur og oploesningen holdes svagt i kog 10 timer . Efter afkoeling fjerner man tilbageloebskoeleren , tilsaetter 175 g litiumsulfat ( Li2SO4 * 2 H2O ) , 50 ml , vand og 1 ml brom . Umiddelbart herefter koger man 15 minutter for at fjerne den overskydende brom .  Efter afkoeling fyldes oploesningen over i en 1 liter maalekolbe , der fyldes op med vand , rystes og filtreres . Det faerdige reagens maa ikke antage groenlig farve . Foer brugen fortyndes 1 volumendel reagens med 2 volumendele vand .  3.7 Haemoglobinoploesning : En til 354 mg kvaelstof ( 1 ) svarende haemoglobinmaengde ( ca . 2 g ) , proteasesubstrat ifoelge Anson , afvejes og kommes i en 200 ml kolbe med tilsleben prop . Man tilsaetter nogle ml 0,06 N saltsyre ( 3.2 ) , forbinder kolben med vakuumpumpen og ryster , indtil haemoglobinet er fuldstaendig oploest . Derefter fjerner man vakuum og tilsaetter under omrystning den endnu indtil 100 ml manglende maengde saltsyre ( 3.2 ) . Friskfremstilles foer brugen .  3.8 Tyrosin-standardoploesning : 181,2 mg tyrosin oploeses i saltsyre ( 3.1 ) og der fyldes op med samme syre til 1 liter ( stamoploesning ) . Der udtages 20,0 ml af denne oploesning , som fortyndes med saltsyre ( 3.1 ) til 100 ml . 1 ml af denne oploesning indeholder 0,2 m mol tyrosin .  4 . Apparatur  4.1 Ultratermostat , indstillet paa 25 * C mere eller mindre 0,1 * C .  4.2 Spektrofotometer .  4.3 Kronometer , noejagtighed : 1 sek .  4.4 pH-meter .  5 . Udfoerelse  5.1 Fremstilling af oploesningen ( se bemaerkning 7.1 )  150 mg pepsin oploeses i 100 ml saltsyre ( 3.2 ) . Af denne oploesning afpipetteres 2 ml i en 50 ml maalekolbe , og der fyldes op med saltsyre  ( 3.3 ) til maerket . Den med pH-meteret kontrollerede pH-vaerdi boer ligge paa 1,6 mere eller mindre 0,1 . Kolben saettes ind i ultratermostaten ( 4.1 ) .  5.2 Hydrolyse  5,0 ml haemoglobinoploesning ( 3.7 ) pipetteres over i et reagensglas og der opvarmes i ultratermostaten  ( 4.1 ) til 25 * C . Derpaa tilsaetter man 1,0 ml af den ifoelge 5,1 fremstillede pepsinoploesning , blander ved hjaelp af en i spidsen fortykket glasstang , som bevaeges ca . 10 gange op og ned , og lader reagensglasset henstaa i noejagtig 10 minutter  ( regnet fra pepsinoploesningens tilsaetning ) i vandbad ved 25 * C ( tid og temperatur skal overholdes noeje ) . Efter forloebet af de 10 minutter tilsaettes 10,0 ml af den i forvejen til 25 * C opvarmede trikloreddikeoploesning ( 3.4 ) , der rystes og filtreres gennem et toert filter .  5.3 Udvikling af farvningen og maaling af ekstinktionen  5,0 ml af filtratet afpipetteres i en 50 ml Erlenmeyerkolbe , hvortil der saettes 10,0 ml natriumhydroxydoploesning ( 3.5 ) . Derpaa tilsaettes der under konstant omrystning 3,0 ml af det fortyndede reagens ifoelge Folin-Ciocalteu  ( 3.6 ) . Efter 5 til 10 minutter bestemmes ekstinktionen af oploesningen fotometrisk i 1 cm kuvetter ved 750 m over for vand .  5.4 Til hver bestemmelse udfoeres et blindforsog som foelger :  5,0 ml haemoglobinoploesning ( 3.7 ) afpipetteres i et reagensglas og opvarmes i ultratermostaten  ( 4.1 ) til 25 * C . Derpaa tilsaetter man 10,0 ml af den i forvejen til 25 * C opvarmede trikloreddikesyreoploesning ( 3.4 ) , blander og tilsaetter umiddelbart derefter 1,0 ml af den ifoelge 5.1 fremstillede pepsinoploesning . Man blander ved hjaelp af en glasstang og lader reagensglasset henstaa i noejagtig 10 minutter ved 25 * C i et vandbad ( 4.1 ) . Der omrystes og filtreres . Herefter fortsaetter man som beskrevet under 5.3 .  5.5 Standardkurve  I 50 ml Erlenmeyerkolben kommes 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 og 5,0 ml tyrosinstandardoploesning ( 3.8 )  ( svarende til tyrosinmaengderne paa 0,2 , 0,4 , 0,6 , 0,8 og 1,0 m mol ) . Raekken kompletteres med en tyrosinfri sammenligningsproeve . De enkelte afmaalinger suppleres med saltsyre ( 3.1 ) til 5,0 ml . Endvidere tilsaettes der 10,0 ml . natriumhydroxydoploesning ( 3.5 ) og under konstant omrystning 3,0 ml af det fortyndede reagens ifoelge Folin-Ciocalteu ( 3.6 ) . Ekstinktionen maales som under 5.3 , sidste punktum . Standardkurven tegnes ved at saette de tilsatte maengder tyrosin mod ekstinktionen .  6 . Beregning af resultaterne  Af standardkurven aflaeses den maengde tyrosin i m mol , som svarer til den med blindvaerdien korrigerede ekstinktion af de farvede oploesninger .  Pepsinens aktivitet i m mol tyrosin pr . mg og pr . minut ved 25 * C beregnes efter foelgende formel :  Enheder pr . mg ( E/mg ) = 0,32 a/p  idet  a = den af standardkurven aflaeste tyrosinmaengde i m mol ,  p = vaegten i mg af den ifoelge 5.2 tilsatte pepsinmaengde .  7 . Bemaerkninger  7.1 Den maengde pepsin , som skal oploeses , vaelges saaledes , at der ved den fotometriske slutmaaling opnaas en ekstinktion paa 0,35 mere eller mindre 0,035 .  7.2 2 E/mg , bestemt efter denne metode , svarer til  3.64 m-Anson E/mg ( m mol tyrosin/mg * min . ved 35,5 * C ) eller  36 400 gaengse E/g ( m mol tyrosin/g * 10 min . ved 35,5 * C ) .  5 . BESTEMMELSE AF FRI OG TOTALGOSSYPOL  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af fri gossypol , totalgossypol og kemisk naert beslaegtede substanser i froe , mel og kager af bomuldsfroe , samt i foderblandinger , som indeholder produkter af bomuldsfroe . Den laveste graense for bestemmeligheden er 20 ppm .  2 . Princip  Gossypol ekstraheres under tilstedevaerelse af 3-amino-1-propanol enten med en isopropanol-hexan-blanding til bestemmelse af fri gossypol eller med dimetylformamid til bestemmelse af totalgossypol og omsaettes med anilin til gossypol-dianiline , hvis ekstinktion maales ved 440 mm .  3 . Reagenser  3.1 Isopropanol-hexan-blanding : 60 volumendele isopropanol p.a . blandes med 40 volumendele n-hexan .  3.2 Oploesningsmiddel A : I en 1 liter maalekolbe fyldes der ca . 500 ml isopropanol-hexan-blanding  ( 3.1 ) , 2 ml 3-amino-1-propanol , 8 ml iseddike og 50 ml vand , og der fyldes op med isopropanol-hexan-blanding ( 3.1 ) til maerket . Dette reagens er holdbart 1 uge .  3.3 Oploesningsmiddel B : I en 100 ml maalekolbe afpipetteres 2ml 3-amino-1-propanol og 10 ml iseddike , hvorefter der afkoeles til rumtemperatur og fyldes op med N,N-dimetylformamid til maerket . Dette reagens er holdbart 1 uge .  3.4 Anilin p . a . : Saafremt ekstinktionen i blindforsoeget er stoerre end 0,022 , destilleres anilinen over zinkstoev , idet man bortkaster de foerste og sidste 10 % af destillatet . I koeleskab er dette reagens ved opbevaring i vel tillukket , brunt glas holdbart i et par maaneder .  3.5 Gossypol-standardoploesning A : I en 250 ml maalekolbe oploeses 27,9 mg gossypol-acetat med oploesningsmiddel A ( 3.2 ) og der fyldes op til maerket med dette . 50 ml af denne oploesning afpipetteres i en 250 ml maalekolbe og der fyldes op med oploesningsmiddel A ( 3.2 ) til maerket . Denne oploesnings gossypolkoncentration er 0,02 mg/ml . Foer brugen henstaar denne oploesning 1 time ved rumtemperatur .  3.6 Gossypol-standardoploesning B : I en 50 ml maalekolbe oploeses 27,9 mg gossypol-acetat i oploesningsmiddel B ( 3.3 ) og der fyldes op til maerket . Gossypolkoncentrationen i denne oploesning er 0,5 mg/ml .  Standard-gossypol-oploesningerne er holdbare i 24 timer , saafremt de er beskyttet mod lyset .  4 . Apparatur  4.1 Mekanisk rysteapparat : ca . 35 omdr./min .  4.2 Spektrofotometer .  5 . Udfoerelse  5.1 Afvejning  Stoerrelsen af den afvejede stofmaengde retter sig efter det formodede indhold af gossypol i proeven . Det er fordelagtigt at arbejde med en lille afvejning og med en relativt stor aliquot del af filtratet for at faa en tilstraekkelig maengde gossypol til en noejagtig fotometrisk maaling . Til bestemmelsen af fri gossypol i froe , mel og kager af bomuldsfroe boer afvejningen ikke vaere paa mere end 1 g , medens den ved foderblandinger kan vaere paa 5 g . En aliquot del af filtratet paa 10 ml er i de fleste tilfaelde anvendelig ; den skal indeholde 50 til 100 mg gossypol . Til bestemmelsen af totalgossypol boer afvejningen ligge paa fra 0,5 til 5 g , saaledes at der i den aliquot del af filtratet paa 2 ml er et indhold paa 40 til 200 mg gossypol .  Analyser udfoeres ved en rumtemperatur paa ca . 20 * C .  5.2 Bestemmelse af fri gossypol  Den afvejede stofmaengde bringes i en 250 ml kolbe med tilsleben prop , hvis bund er daekket med glassplinter , 50 ml af oploesningsmidlet A ( 3.2 ) tilsaettes med pipette , kolben lukkes og rystes én time i rysteapparat . Derpaa filtreres gennem et toert filter og giltratet opsamles i en lille kolbe med tilsleben prop . Under filtreringen tildaekkes tragten med et urglas . Lige store aliquote dele af filtratet , indeholdende 50 til 100 mg gossypol afpipetteres i to 25 ml maalekolber ( A og B ) , eventuelt fortyndes med oploesningsmiddel A ( 3.2 ) til 10 ml . Derpaa suppleres kolbens indhold ( A ) med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket . Denne oploesning anvendes som sammenligningsoploesning ved maalingen af proeveoploesningen . Derefter afpipetteres 10 ml oploesningsmiddel A ( 3.2 ) i to andre 25 ml maalekolber . Indholdet i kolben ( C ) suppleres med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket . Denne oploesning anvendes som sammenligningsoploesning ved maalingen af blindproeveoploesningen .  Til hver af maalekolberne ( D ) og ( B ) saettes 2 ml anilin ( 3.4 ) . Der opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand til udvikling af farvningen , afkoeles til stuetemperatur , fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket , omrystes , hvorefter det hele henstaar 1 time .  Herefter maales i spektrofotometeret ved 440 mm og i glaskuvetter paa 1 cm tykkelse blindproevens ( B ) ekstinktion i forhold til sammenligningsoploesningen  ( C ) og proeveoploesningens ( B ) ekstinktion i forhold til sammenligningsoploesningen ( A ) . Ekstinktionen af blindproeveoploesningen traekkes fra ekstinktionen af proeveoploesningen ( = korrigeret ekstinktion ) . Paa basis af den fundne vaerdi beregnes indholdet af fri gossypol som beskrevet under 6 .  5.3 Bestemmelse af totalgossypol  En afvejet stofmaengde indeholdende 1 til 5 mg gossypol kommes i en 50 ml maalekolbe ; derpaa tilsaettes 10 ml af oploesningsmidlet B ( 3.3 ) . Samtidig tilberedes et blindforsoeg med 10 ml af oploesningsmidlet B ( 3.3 ) i en anden 50 ml maalekolbe . Begge maalekolber opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand , afkoeles til stuetemperatur og fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket . Der omrystes , henstills 10 til 15 minutter , derpaa filtreres , og filtratet opsamles i kolber med tilsleben prop .  2 ml af proevefiltratet afpipetteres i hver af to 25 ml maalekolber og 2 ml af filtratet fra blindforsoeget i hver af to andre 25 ml maalekolber . En kolbe i hver serie fyldes op med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til 25 ml . Disse oploesninger anvendes som sammenligningsoploesninger .  Til hver af de to andre maalekolber saettes 2 ml anilin ( 3.4 ) . Derpaa opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand til udvikling af farvningen , afkoeles til stuetemperatur , fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til 25 ml , omrystes , hvorefter det hele henstaar 1 time .  Ekstinktionen maales som beskrevet under 5.2 for fri gossypol . Paa basis af den fundne vaerdi beregnes indholdet af totalgossypol som beskrevet under 6 .  6 . Beregning af resultaterne  Beregningen af resultaterne kan foretages paa basis af den specifikke ekstinktion ( 6.1 ) eller ved benyttelse af en standardkurve ( 6.2 ) .  6.1 Paa basis af den specifikke ekstinktion  Den specifikke ekstinktion andrager under de angivne betingelser for fri gossypol  E 1 % /1 cm = 625  totalgossypol E 1 % /1 cm = 600  Indholdet af fri eller totalgossypol i proeven andrager :  ( E * 1250 ) /E ( 1 % /1 cm ) * p * a = % gossypol  idet :  E = korrigeret ekstinktion , som bestemt under 5.2 ,  p = afvejet stofmaengde i g  a = aliquot del af filtratet i ml .  6.2 Ved hjaelp af en standardkurve  6.2.1 Fri gossypol  Der forberedes 2 raekker med hver fem 25 ml maalekolber . I begge raekker afpipetteres 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 og 10,0 af gossypol-standardoploesningen A ( 3.5 ) og rumfanget suppleres til 10 ml med oploesningsmidlet A ( 3.2 ) . I hver raekke stilles en 25 ml maalekolbe , som kun indeholder 10 ml af oploesningsmidlet A ( 3.2 )  ( blindforsoeg ) .  Kolberne i den foerste raekke inclusive blindforsoeget fyldes op med isopropanol-hexan-blandingen  ( 3.1 ) til 25 ml ( sammenligningsraekke ) .Til hver af kolberne i den anden raekke , inclusive blindforsoeget , saettes 2 ml anilin  ( 3.4 ) . Derpaa opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand til udvikling af farvningen , afkoeles til rumtemperatur , fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket , rystes , hvorefter det hele henstaar 1 time  ( standardraekke ) .  Under de i 5.2 beskrevne betingelser maales ekstinktionen af standardraekkeoploesningerne ved sammenligning med de tilsvarende oploesninger i sammenligningsraekken . Standardkurven fremstilles grafisk , idet ekstinktionsvaerdierne og gossypolmaengderne ( i mg ) indtegnes over for hinanden .  6.2.2 Totalgossypol  Der tilberedes seks 50 ml maalekolber . I den foerste afpipetteres 10 ml af oploesningsmidlet B ( 3.3 ) og i hver af de oevrige 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 og 10,0 ml af gossypolstandardoploesningen B ( 3.6 ) . Indholdet i hver af kolberne suppleres med oploesningsmidlet B ( 3.3 ) til 10 ml , opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand , afkoeles til rumtemperatur , fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket og rystes .  I to raekker med seks 25 ml maalekolber afpipetteres i hver 2,0 ml af denne oploesning . Kolberne i den foerste raekke fyldes op med isopropanol-hexan-blandingen  ( 3.1 ) til 25 ml ( sammenligningsraekke ) .  I kolberne i den anden raekke kommes i hver 2 ml anilin ( 3.4 ) . Derpaa opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand , afkoeles til rumtemperatur , fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket , rystes , hvorefter det hele henstaar 1 time ( standardraekke ) .  Under de i 5.2 beskrevne betingelser maales ekstinktionen af standardraekkeoploesningerne ved sammenligning med de tilsvarende oploesninger i sammenligningsraekken . Standardkurven fremstilles grafisk , idet ekstinktionsvaerdierne og gossypolmaengderne ( i mg ) indtegnes over for hinanden .  6.3 Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve ved indhold paa   - mindre end 500 ppm gossypol ikke vaere over 15 % relativt ,   - 500 til 750 ppm gossypol ikke over 75 ppm absolut ,   - 750 ppm og mere gossypol ikke over 10 % relativt .  ( 1 ) Kvaelstofindholdet bestemmes efter Kjeldahls semimikrometode ( teoretisk indhold : 17,7 % nitrogren ) .  BILAG II  1 . PAAVISNING OG IDENTIFIKATION AF ANTIBIOTIKA INDEN FOR TETRACYKLINGRUPPEN  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tjener til paavisning og identifikation af antibiotika inden for tetracyklingruppen i foderstoffer , som indeholder mindst 0,1 ppm antibiotikum , i koncentrater og i forblandinger .  2 . Princip  Proeven ekstraheres med en blanding af metanol og saltsyre . Ekstrakten papirkromatograferes til sammenligning med standardoploesninger efter opstigende metodik . Antibiotikaerne paavises og identificeres ved sammenligning af deres Rf-vaerdier med standardstoffernes enten ved fluorescens i UV-lys ( hoejt indhold af antibiotika ) eller ved bioautografi paa et med B . cereus podet agarnaeringssubstrat .  3 . Reagenser og naeringssubstrat  3.1 Stoedpudeoploesning , pH 3,5  Citronsyre-monohydrat p.a . * 10,256 g *  Dinatriumfosfat Na2HPO4 * 2 H2O p.a . * 7,45 g *  Acetone p.a . * 300 ml *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  3.2 Fosfatstoedpudeoploesning , pH 5,5  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 130,86 g *  Dinatriumfosfat Na2HPO4 * 2 H2O p.a . * 6,947 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  3.3 Udviklingsvaeske I : Blanding af nitrometan , ren/kloroform , ren/a-diklorhydrin : 20/10/1,5 i vol . Tilberedes umiddelbart foer brugen .  3.4 Udviklingsvaeske II : Blanding af nitrometan , ren/kloroform , ren/a-pikolin : 20/10/3 i vol . Tilberedes umiddelbart foer brugen .  3.5 Blanding af metanol , ren/saltsyre ( mf . 1,19 ) : 98/2 i vol  3.6 0,1 N slatsyre  3.7 Ammoniakoploesning , mf . 0,91  3.8 Standardpraeparater : Klortetracyklin , oxytetracyklin , tetracyklin , hvis aktivitet angives som hydroklorid .  3.9 Testorganisme : B . cereus ATCC 11.778  Opbevaring af stamkulturen , fremstilling af sporesuspensionen og udpodning paa naeringssubstratet : Fremgangsmaade som i den under punkterne 3.1 og 3.2 i 2 . del af dette bilag beskrevne bestemmelsesmetode for klortetracyklin , oxytetracyklin og tetracyklin ved diffusion i agarnaeringssubstrat .  3.10 Naeringssubstrat ( 1 )  Glukose * 1 g *  Pepton , tryptisk fordoejet * 10 g *  Koedekstrakt * 1,5 g *  Gaerekstrakt * 3 g *  Agar * 20 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  Foer brugen indstilles til pH 5,8 .  3.11 Oploesning af 0,1 % ( w/v ) 2,3,5-trifonyltetrazoliumklorid og 5 % ( w/v ) glukose .  4 . Apparatur  4.1 Papirkromatografisk apparatur indrettet til opstigende metodik ( 25 cm papirhoejde ) . Schleicher - og Schuell-papir 2040 b eller 2043 b , eller tilsvarende .  4.2 Centrifuge .  4.3 Inkubator , indstillet paa 30 * C .  4.4 UV-lampe til fluorescenspaavisning .  4.5 Glasplader ca . 20 gange 30 cm , til fremstilling af en flad skaal til bioautografien .  5 . Standardoploesninger  5.1 Stamoploesninger  Med saltsyre ( 3.6 ) fremstilles oploesninger af standardpraeparaterne ( 3.8 ) , hvis koncentration svarer til 500 mg klortetracyklin-HCl , oxytetracyklin-HCl og tetracyklin-HCl pr . ml .  5.2 Sammenligningsoploesninger til paavisning i UV-lys  Oploesningerne ( 5.1 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 3.2 ) , for at opnaa oploesninger , hvis koncentration svarer til 100 mg klortetracyklin-HCl , oxytetracyklin-HCl og tetracyklin-HCl pr . ml .  5.3 Sammenligningsoploesninger til paavisning ved bioautografi  Oploesningerne ( 5.1 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 3.2 ) for at opnaa oploesninger , hvis koncentration svarer til 5 mg klortetracyklin : HCl , oxytetracyklin-HCl og tetracyklin-HCl pr . ml .  6 . Ekstraktion  Ved et forventet indhold af antibiotikum paa under 10 ppm kan man enten anvende den homogeniserede proeve eller den udsigtede finfraktion , da antibiotikaerne fortrinsvis befinder sig i de fineste fraktioner .  Proeven opslaemmes med blandingen ( 3.5 ) og centrifugeres . Det ovenstaaende vaeskelag paasaettes direkte eller , om noedvendigt , fortyndes der med blandingen ( 3.5 ) , for at opnaa koncentrationer af antibiotikum paa ca . 100 mg pr . ml ( 6.1 ) og ca . 5 mg pr . ml ( 6.2 ) .  7 . Paavisning og identifikation  7.1 Kromatografering  Papiret dyppes i stoedpudeoploesningen pH 3,5  ( 3.1 ) og udpresses mellem toert filtrerpapir for at fjerne den overskydende vaeske . Derpaa afsaettes der pletter à 0,01 ml af sammenligningsoploesningerne ( 5.2 og 5.3 ) og ekstraktoploesningerne ( 6.1 og 6.2 ) paa papiret . Afgoerende for en god adskillelse er den rigtige fugtighed i papiret ; det er eventuelt noedvendigt at toerre papiret lidt mere .  Der udvikles ved opstigende kromatografering med udviklingsvaeske I ( 3.3 ) til paavisning ved bioautografi , med udviklingsvaeske II ( 3.4 ) til paavisning i UV-lys . Naar vaeskefronten har bevaeget sig ca . 15 til 20 cm opad ( ca . 1 1/2 time ) , afbrydes kromatograferingen og papiret toerres .  7.2 Paavisning i UV-lys  Ved et antibiotikumindhold paa over 1 mg/cm2 kan pletterne efter behandling med ammoniakdampe ( 3.7 ) som foelge af deres guldgule fluorescens goeres synlige i UV-lys ( 4.4 ) .  7.3 Paavisning ved bioautografi  Det med B . cereus ( 3.9 ) podede naeringssubstrat  ( 3.10 ) haeldes paa glasplader ( 4.5 ) og papiret laegges paa substratet . Efter 5 minutters kontakt traekkes det af og laegges et andet sted paa substratet , hvor det bliver under inkubationstiden . Inkubationen sker natten over ved 30 * C i inkubatoren . Ved tilstedevaerelsen af et antibiotikum inden for tetracyklingruppen forekommer der i det ellers uklare naeringssubstrat klare haemningszoner .  Kromatogrammet fikseres efter inkubationen ved besproejtning af papiret med oploesningen ( 3.11 ) .  7.4 Identifikation  Nedenfor angives de relative Rf-vaerdier for de til tetracyklingruppen hoerende antibiotika . Disse vaerdier kan variere en ubetydelighed alt efter papirets kvalitet og fugtighedsindhold .  Klortetracyklin ( CTC ) * 0,60 *  Tetracyklin ( TC ) * 0,40 *  Oxytetracyklin ( OTC ) * 0,20 *  4-Epi-CTC * 0,15 *  4-Epi-TC * 0,13 *  4-Epi-OTC * 0,10 *  Epi-forbindelser har en mindre antibiotisk aktivitet end de normale forbindelser .  2 . BESTEMMELSE AF KLORTETRACYKLIN , OXYTETRACYKLIN OG TETRACYKLIN  A . VED DIFFUSION I AGARNAERINGSSUBSTRAT  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af klortetracyklin  ( CTC ) , oxytetracyklin ( OTC ) og tetracyklin  ( TC ) i foderstoffer , koncentrater og forblandinger . Den laveste graense for bestemmeligheden andrager 5 ppm . Indhold under 5 ppm kan bedoemmes ved grafisk interpolation .  2 . Princip  Ved indhold lige med eller under 50 ppm ekstraheres proeven med formamid . Ved indhold over 50 ppm ekstraheres proeven til bestemmelse af CTC med en blanding af acetone , vand og saltsyre , og til bestemmelse af CTC og TC med en blanding af metanol og saltsyre .  Derpaa fortyndes ekstrakterne , og deres antibiotiske aktivitet bestemmes ved maaling af diffusionen af CTC , OTC eller TC i et med B . cereus-podet agarnaeringssubstrat . Diffusionen paavises ved hjaelp af de opstaaende haemningszoner mod testorganismen . Diameteren af disse haemningszoner er direkte proportional med logaritmen til koncentrationen af det paagaeldende antibiotikum .  3 . Testorganisme : B . cereus ATCC 11.778  3.1 Opbevaring af stamkulturen  Et agarskraaglas af naeringssubstratet ( 4.1 ) , uden borsyre og metylenblaat , podes med B . cereus og inkuberes ved ca . 30 * C patten over . Derefter opbevares kulturen i koeleskab og podes hver 14 . dag over i agarskraaglas .  3.2 Fremstilling af sporesuspensionen  Et agarskraaglas ( 3.1 ) opslaemmes med 2 til 3 ml fysiologisk kogsaltoploesning ( 4.5 ) . Med denne suspension podes en Rouxkolbe , som indeholder 300 ml af naeringssubstratet ( 4.1 ) , uden borsyre og metylenblaat , med en agarkoncentration paa 3 til 4 % . Efter en inkubationstid paa 3 til 5 dage ved 28 til 30 * C opslaemmes kimene efter endt sporolering , som kontrolleres mikroskopisk , med 15 ml ethanol ( 4.6 ) og homogeniseres . Denne suspension kan opbevares i mindst 5 maaneder i koeleskab .  Ved hjaelp af forsoegsplader med testsubstratet  ( 4.1 ) findes den podningsmaengde , som giver de stoerst mulige , men endnu skarpe haemningszoner med de forskellige anvendte koncentrationer af antibiotika . Den ligger normalt paa 0,2 til 0,3 ml/1000 ml . Podningen af substratet skal ske ved 50 til 60 * C .  4 . Naeringssubstrat og reagenser  4.1 Testsubstrat ( 1 )  Glukose * 1 g *  Pepton , tryptisk fordoejet * 10 g *  Koedekstrakt * 1,5 g *  Gaerekstrakt * 3 g *  Agar , alt efter kvalitet * 10-20 g *  Tween 80 * 1 ml *  Fosfatstoedpudeoploesning , pH 5,5 ( 4.2 ) * 10 ml *  Borsyreoploesning 5 % ( w/v ) * 15 ml *  Ethanolisk metylenblaatoploesning 0,5 % * 4 ml *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  Indstilles foer brugen paa pH 5,8 .  4.2 Fosfatstoedpudeoploesning pH 5,5  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 130,86 g *  Dinatriumfosfat Na2HPO4 * 2H2O p.a . * 6,947 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  4.3 Fosfatstoedpudeoploesning ph 5,5 fortyndet til 1/10 .  4.4 Fosfatstoedpudeoploesning pH 8  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 1,407 g *  Dinatriumfosfat Na2HPO4 * 2 H2O p.a . * 57,539 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  4.5 Fysiologisk kogsaltoploesning , steril  4.6 Ethanol 20 % ( v/v )  4.7 0,1 N saltsyre  4.8 Formamid 70 % ( v/v ) : Friskfremstillet foer brug og indstillet til pH 4,5 med ca . 2 N svovlsyre .  4.9 Blanding acetone , ren/vand/saltsyre ( mf . 1,19 ) : 65/33/2 i vol .  4.10 Blanding af metanol , ren/saltsyre ( mf . 1,19 ) : 98/2 i vol .  4.11 Standardpraeparater : CTC , OTC , TC , hvis aktivitet angives som hydroklorid .  5 . Standardoploesninger  5.1 Klortetracyklin  Med 0,1 N saltsyre ( 4.7 ) fremstilles der af standardpraeparatet ( 4.11 ) en stamoploesning , hvis koncentration svarer til 500 mg klortetracyklin-HCl pr . ml . Denne oploesning er holdbar 1 uge ved opbevaring i koeleskab .  Af denne stamoploesning fremstilles en arbejdsstandardoploesning S8 , hvis koncentration svarer til 0,2 mg klortetracyklin-HCl pr . ml . Fortyndingen sker med fosfatstoedpudeoploesning pH 5,5 , som er fortyndet til 1/10 ( 4.3 ) og indeholder en tilsaetning paa 0,01 % amidosort ( 2 ) .  Derpaa fremstilles nedennaevnte koncentrationer med fosfatstoedpudcoploesningen ( 4.3 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) :  S4 * 0,1 mg/ml *  S2 * 0,05 mg/ml *  S1 * 0,025 mg/ml *  5.2 Oxytetracyklin  Paa samme maade som anfoert under 5.1 fremstilles der af en stamoploesning , hvis koncentration svarer til 400 mg oxytetracyklin-HCl pr . ml , en arbejdsstandardoploesning S8 med 1,6 mg tetracyklin-HCl pr . ml , og derefter foelgende koncentrationer :  S4 * 0,8 mg/ml *  S2 * 0,4 mg/ml *  S1 * 0,2 mg/ml *  5.3 Tetracyklin  Paa samme maade som anfoert under 5.1 fremstilles der af en stamoploesning , hvis koncentration svarer til 500 mg tetracyklin-HCl pr . ml , en arbejdsstandardoploesning S8 med 1,0 mg tetracyklin-HCl pr . ml , og derefter foelgende koncentrationer :  S4 * 0,5 mg/ml *  S2 * 0,25 mg/ml *  S1 * 0,125 mg/ml *  6 . Ekstraktion  6.1 Indhold , lig med eller under 50 ppm  Efter de nedenfor beskrevne angivelser tilsaettes der formamid ( 4.8 ) til en afvejet maengde stof , og der rystes i 30 minutter paa et rystebord . Derpaa fortyndes straks med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.3 ) som beskrevet nedenfor for at opnaa U8-koncentrationen . Formamidkoncentrationen i denne oploesning maa ikke andrage mere end 40 % . Herefter centrifugeres eller dekanteres ekstrakten for at faa en klar oploesning . Umiddelbart derefter fremstilles koncentrationerne U4 , U2 og U1 med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.3 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) .  Antibiotika * CTC * OTC * TC *  Formodet indhold i ppm * 10 * 50 * 10 * 50 * 10 * 50 *  Afvejning i g * 10 * 10 * 24 * 9,6 * 20 * 10 *  ml formamid ( 4.8 ) * 100 * 100 * 80 * 100 * 80 * 100 *  ml fosfatstoedpudeoploesning ( 4.3 ) * fort . 1 : 5 ( a ) * fort . 1 : 25 ( b ) * 70 * 200 * 120 * fort . 1 : 5 ( a ) *  U8 koncentration i mg/ml * 0,2 * 0,2 * 1,6 * 1,6 * 1,0 * 1,0 *  ( a ) 20 ml ekstrakt udtages og fortyndes til 100 ml med fostfatstoedpudeoploesning i en maalekolbe .  ( b ) 4 ml ekstrakt udtrages og fortyndes til 100 ml med fostfatstoedpudeoploesning i en maalekolbe .  6.2 Indhold over 50 ppm  6.2.1 Klortetracyklin  Baseret paa det formodede indhold af antibiotika i proeven eller paa fremstillingsgarantien blandes en afvejet stofmaengde paa mellem 2 og 10 g med den 20-dobbelte volumen af blandingen ( 4.9 ) og der rystes 30 minutter paa et rystebord . Under ekstraktionen skal pH-vaerdien ligge under 3 ; om noedvendigt justeres ned til 3 ( ved mineralblandinger indstilles pH-vaerdien med 10 % eddikesyre ) .  Derefter bringes en aliquot del af ekstrakten til at ligge paa pH 5,5 ved hjaelp af fosfatstoedpudeoploesningen pH 8 ( 4.4 ) under tilsaetning af bromkresol-groent  ( omslag fra gult til blaat ) . Derefter fortyndes der med den til 1/10 fortyndede fosfatstoedpudeoploesning pH 5,5 ( 4.3 ) for at faa U8-koncentrationen ( se 6.1 ) .  Umiddelbart herefter fremstilles koncentrationerne U4 , U2 og U1 med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.3 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) .  6.2.2 Oxytetracyklin og tetracyklin  Der fortsaettes paa samme maade som beskrevet under 6.2.1 , idet man erstatter blandingen ( 4.9 ) med blandingen ( 4.10 ) .  7 . Testmetode  7.1 Podning af naeringssubstratet  Sporesuspensionen ( 3.2 ) podes ud paa testsubstratet  ( 4.1 ) ved 50 til 60 * C .  7.2 Fremstilling af pladerne  Testen saettes an som diffusionstest paa plader med hver 4 koncentrationstrin paa standardoploesningen  ( S8 , S4 , S2 , S1 ) og ekstraktet ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Hver plade skal ubetinget indeholde alle 4 koncentrationer af standard og proeve .  Derfor skal pladerne have en saadan stoerrelse , at der kan udstanses mindst 8 huller i substratlaget ; huldiameteren skal vaere 10 til 13 mm . Den podede substratmaengde ( 7.1 ) skal vaere beregnet saaledes , at man faar et ensartet lag paa ca . 2 mm tykkelse . Testen boer fortrinsvis udfoeres paa plader , som er fremstillet af en glasplade , hvorpaa der laegges en plandrejet aluminiums - eller kunststofring med 20 mm hoejde og 200 mm diameter .  I hullerne afpipetteres noeje afmaalte maengder af antibiotika-oploesningen paa mellem 0,10 og 0,15 ml , alt efter hullernes diameter .  For hver proeve gentages paafyldningen af hver koncentration mindst 4 gange , saaledes at der pr . paasaetning for hver proeve kan bedoemmes 32 haemningszoner .  7.3 Inkubation  Der inkuberes i 18 timer ved ca . 28 til 30 * C .  8 . Bedoemmelse  Haemningszonernes diameter maales fortrinsvis ved projektion . Maalingerne indtegnes paa semilogaritmepapir , idet logaritmen til koncentrationerne indfoeres over for haemningszonernes diameter . Baade for standarden og for ekstrakten traekkes lige linjer . Ved en test med ukompliceret forloeb skal de to lige linjer vaere parallelle .  Logaritmen til den relative aktivitet udregnes efter foelgende formel :   ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) * 0,602 / U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2  Faktisk aktivitet = formodet aktivitet gange relativ aktivitet .  9 . Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve ikke vaere mere end 10 % relativt .  B . VED TURBIDIMETRI  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af klortetracyklin  ( CTC ) , oxytetracyklin ( OTC ) og tetracyklin ( TC ) ved indhold paa over 1 g/kg , saafremt ingen forstyrrende ledsagesubstanser foerer til uklare ekstrakter . Denne metode er hurtigere end metoden ved diffusion i agarnaeringssubstrat .  2 . Princip  Proeven ekstraheres til bestemmelse af CTC med en blanding af acetone , vand og saltsyre og til bestemmelse af OTC og TC med en blanding af metanol og saltsyre .  Ekstrakterne fortyndes og deres antibiotiske virkning bestemmes ved maaling af transmissionen i et med Staphylococcus aureus podet naeringssubstrat , til hvilket der er sat antibiotikum . Transmissionen er en funktion af antibiotikumets koncentration .  3 . Testorganisme : Staphylococcus aureus K 141 ( 3 )  3.1 Opbevaring af stamkulturen  Et agarskraaglas af naeringssubstratet ( 4.1 ) med tilsaetning af 1,5 til 3 % agar ( alt efter kvalitet ) podes med S . aureus og inkuberes ved ca . 37 * C natten over . Derefter opbevares kulturen i koeleskab og podes hver 4 . uge over i agarskraaglas . Samtidig anlaegges subkulturer til brug i laboratoriet .  3.2 Fremstilling af podningskulturen  24 timer foer testen podes et agarskraaglas med en subkultur og inkuberes natten over ved 37 * C . Hele kulturen i et skraaglas suspenderes i ca . 2 ml af testsubstratet ( 4.1 ) og skylles derefter over i ca . 100 ml af testsubstratet ( 4.1 ) under sterile betingelser . Denne suspension inkuberes i vandbad ved 37 * C indtil stammevaeksten indtraeder i sin logaritmiske fase ( 1 1/2 til 2 timer ) .  4 . Naeringssubstrat og reagenser  4.1 Testsubstrat ( 1 )  Pepton * 5 g *  Gaerekstrakt * 1,5 g *  Koedekstrakt * 1,5 g *  Natriumklorid * 3,5 g *  Glukose * 1,0 g *  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 1,32 g *  Dikaliumfosfat K2HPO4 p.a . * 3,68 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  Efter sterilisation pH 6,8 til 7,0  4.2 Fosfatstoedpudeoploesning , pH 4,5  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 13,6 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  4.3 0,1 N saltsyre  4.4 Blanding af acetone , ren/vand/saltsyre  ( mf . 1,19 ) : 65/33/2 i vol .  4.5 Blanding af metanol , ren/saltsyre ( mf . 1,19 ) : 98/2 i vol .  4.6 Formaldehydoploesning ca . 10 % ( w/v )  4.7 Standardpraeparater : CTC , OTC , TC , hvis aktivitet angives som hydroklorid .  5 . Standardoploesning  Med saltsyre ( 4.3 ) fremstilles der af standardpraeparatet  ( 4.7 ) en stamoploesning , hvis koncentration svarer til 400 til 500 mg CTC-HCl , OTC-HCl eller TC-HCl pr . ml . Denne oploesning er holdbar 1 uge i koeleskab .  6 . Ekstraktion  6.1 Klortetracyklin  En proeve paa 1 til 2 g bringes sammen med ca . 100 ml af blandingen ( 4.4 ) i en 200 eller 250 ml maalekolbe og rystes 30 minutter paa et rystebord . Derpaa fortyndes der til maerket med fosfatstoedpudeoploesning pH 4,5 ( 4.2 ) , blandes og hensaettes til bundfaeldning .  6.2 Oxytetracyklin og tetracyklin  En proeve paa 1 til 2 g bringes sammen med ca . 100 ml af blandingen ( 4.5 ) i en 200 eller 250 ml maalekolbe og rystes 30 minutter paa et rystebord . Derpaa fortyndes der til maerket med fosfatstoedpudeoploesning pH 4,5 ( 4.2 ) , blandes og hensaettes til bundfaeldning .  7 . Testmetode  7.1 Fremstilling af standard - og ekstraktserier  Standardoploesningen ( 5 ) og ekstraktoploesningen ( 6 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesning pH 4,5  ( 4.2 ) saaledes , at man faar en serie af fortyndinger . For hver bestemmelse opstilles der paa basis af den paagaeldende fortynding en standardkurve , som mindst tillader interpolationen af 2 maalevaerdier for ekstraktoploesningen . Fortyndingerne vaelges efter stammens vaekstbetingelser . Disse betingelser kan vaere forskellige i de enkelte laboratorier . Normalt anvendes foelgende fremgangsmaade :  7.1.1 Klortetracyklin  Standardoploesningen ( 5 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.2 ) for at faa en arbejdsstandardoploesning , hvis koncentration svarer til 0,2 mg CTC-HCl pr . ml . Derpaa tilberedes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.2 ) 6 fortyndinger i testglas med en gentagelse for hver fortynding som foelger :  ml arbejds-standardoploesning * ml fosfatstoedpudeoploesning ( 4.2 ) * CTC-HCl koncentration  ( mg/ml ) *  0,7 * 0,3 * 0,14 *  0,6 * 0,4 * 0,12 *  0,55 * 0,45 * 0,11 *  0,45 * 0,55 * 0,09 *  0,4 * 0,6 * 0,08 *  0,3 * 0,7 * 0,06 *  Ekstrakten ( 6.1 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.2 ) til en formodet koncentration af CTC-HCl paa 0,12 mg/ml . Dermed paafyldes 2 glas med hver 1 ml og 2 andre glas med hver 0,75 ml ( = 0,09 mg ) , og volumenet i de 2 sidste glas suppleres til 1 ml med fosfatstoedpudeoploesningen  ( 4.2 ) .  7.1.2 Oxytetracyklin og tetracyklin  Standardoploesningen ( 5 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.2 ) for at faa en arbejdsstandardoploesning , hvis koncentration svarer til 0,6 mg OTC-HCl eller TC-HCl pr . ml . Derpaa tilberedes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.2 ) 7 fortyndinger i testglas med en gentagelse for hver fortynding som foelger :  ml arbejdsstandardoploesning * ml fosfatstoedpudeoploesning ( 4.2 ) * OTC-HCl eller TC-HCl ( mg/ml ) *  0,9 * 0,1 * 0,54 *  0,8 * 0,2 * 0,48 *  0,7 * 0,3 * 0,42 *  0,6 * 0,4 * 0,36 *  0,4 * 0,6 * 0,24 *  0,3 * 0,7 * 0,18 *  0,2 * 0,8 * 0,12 *  Ekstrakten ( 6.2 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.2 ) til en formodet koncentration af OTC-HCl eller TC-HCl paa 0,48 mg/ml . Dermed paafyldes 2 glas med hver 1 ml og 2 andre glas med hver 0,5 ml ( = 0,24 mg ) og rumfanget i de 2 sidste glas suppleres til 1 ml med fosfatstoedpudeoploesningen  ( 4.2 ) .  7.2 Podning af naeringssubstratet  Testsubstratet ( 4.1 ) podes med kulturen ( 3.2 ) saaledes , at der ved 590 mm og med en 5-cm-kuvette opnaas en transmission paa 85 % og med en 2-cm-kuvette en transmission paa 92 % , idet fotometeret indstilles til 100 % transmission med det upodede testsubstrat ( 4.1 ) .  7.3 Podning  I hvert testglas ( 7.1.1 eller 7.1.2 ) fyldes der 9 ml podet substrat ( 7.2 ) . Paafyldningen skal ske saa vidt muligt uden forureninger , men ikke noedvendigvis under sterile forhold .  7.4 Inkubation  Inkubationen sker obligatorisk i et vandbad , som ved konstant bevaegelse holdes paa en temperatur paa 37 * C mere eller mindre 0,1 * C . Inkubationstiden vaelges saaledes , at den tillader fremstilling af transmissionskurver med en for noejagtige maalinger egnet stigning ( normalt 2 1/2 til 3 timer ) . Derefter sproejtes hvert af glassene med 1 ml formaldehydoploesning  ( 4.6 ) for at stoppe vaeksten .  7.5 Maaling af vaeksten  Transmissionen maales ved 590 mm , idet fotometeret indstilles paa 100 % transmission med den klareste standardoploesning ( svarende til den hoejeste koncentration af antibiotika ) . Paa grund af de ringe turbiditetsdifferencer for de enkelte glas anbefales det at benytte mindst 2-cm-kuvetter , eller bedre endnu - 5-cm-kuvetter .  8 . Beregning af resultaterne  Standardkurven fremstilles grafisk paa millimeterpapir , idet fotometriske transmissioner og koncentrationer af antibiotikum indfoeres over for hinanden . Ekstraktens transmissionsvaerdier interpoleres paa standardkurver og proevens indhold af antibiotikum beregnes .  9 . Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved en og samme proeve ikke vaere mere end 10 % ,  3 . BESTEMMELSE AF OLEANDOMYCIN   - VED DIFFUSION I AGARNAERINGSSUBSTRAT -  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af oleandomycin i foderstoffer , koncentrater og forblandinger , ogsaa ved tilstedevaerelse af tetracykliner . Den laveste graense for bestemmeligheden andrager 0,5 ppm .2 . Princip  Proeven ekstraheres med en fortyndet metanolisk tris-(hydroxymetyl ) aminometan-oploesning . Efter centrifugering fortyndes ekstraten og dens antibiotiske aktivitet bestemmes ved maaling af oleandomycinets diffusin i et med B . cereus podet agarnaeringssubstrat . Diffusionen paavises ved hjaelp af de opstaaende haemningszoner med testorganismen . Diameteren af disse haemningszoner er direkte proportional med logaritmen til koncentrationen af antibiotikumet .  3 . Testorganisme : B . cereus K 250 TR ( 4 )  ( tetracyklinresistent )  3.1 Opbevaring af stamkulturen  Et agarskraaglas af naeringssubstratet ( 4.1 ) , som indeholder 100 mg oxytetracyklin , podes med B . cereus og inkuberes ved ca . 30 * C natten over .  Derefter opbevares kulturen i koeleskab og podes hver 4 . uge over i agarskraaglas .  3.2 Fremstilling af sporesuspensionen  Et agarskraaglas ( 3.1 ) opslaemmes med ca . 3 ml fysiologisk kogsaltoploesning ( 4.3 ) . Med denne suspension podes en Roux-kolbe , som indeholder 300 ml af naeringssubstratet ( 4.1 ) , men med en agarkoncentration paa 3-4 % . Efter en inkubationstid paa 3 til 5 dage ved 28 til 30 * C opslaemmes kimene efter endt sporolering , som kontrolleres mikroskopisk , med 15 ml ethanol og homogeniseres . Denne suspension er holdbar mindst 5 maaneder ved opbevaring i koeleskab .  Ved hjaelp af forsoegsplader med testsubstratet  ( 4.2 ) findes den podningsmaengde , som giver de stoerst mulige , men stadig skarpe haemningszoner med de forskellige anvendte koncentrationer af oleandomycin . Den andrager normalt 0,1 til 0,2 ml/1000 ml . Podningen af naeringssubstratet skal ske ved 60 * C .  4 . Naeringssubstrater og reagenser  4.1 Kultursubstrat ( 1 )  Glukose * 1 g *  Pepton , tryptisk fordoejet * 10 g *  Koedekstrakt * 1,5 g *  Gaerekstrakt * 3 g *  Agar , alt efter kvalitet * 10-20 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  Indstilles foer brugen til pH 6,5 .  4.2 Testsubstrat ( 1 )  Substrat ( 4.1 ) indstillet til pH 8,8 .  4.3 Fysiologisk kogsaltoploesning , steril .  4.4 Ethanol 20 % ( v/v ) .  4.5 Metanol , ren .  4.6 Tris ( hydroxymetyl)-aminometan-oploesning p.a . 0,5 % ( w/v ) .  4.7 Ekstraktionsoploesning  Metanol , ren * 50 ml *  Destilleret vand * 50 ml *  Tris ( hydroxymetyl)-aminometan p.a . * 0,5 g *  4.8 Standardpraeparat : Oleandomycin med kendt aktivitet .  5 . Standardoploesninger  En maengde af standardpraeparatet ( 4.8 ) oploeses i 5 ml metanol ( 4.5 ) og fortyndes med oploesningen  ( 4.6 ) for at faa en koncentration af oleandomycin paa 100 mg/ml .  Af denne stamoploesning fremstilles der ved fortynding med oploesningen ( 4.6 ) en arbejdsstandardoploesning S8 , som indeholder 0,1 mg/ml oleandomycin . Derefter fremstilles nedenstaaende koncentrationer med oploesningen ( 4.6 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) :  S4 * 0,05 mg/ml *  S2 * 0,025 mg/ml *  S1 * 0,0125 mg/ml *  6 . Ekstraktion  Baseret paa det formodede indhold af oleandomycin i proeven blandes en afvejet stofmaengde paa 2 til 10 g med 100 ml af oploesningen ( 4.7 ) , og der rystes 30 minutter paa et rystebord .  Efter centrifugering udtages en aliquot del af ekstrakten og fortyndes med oploesningen ( 4.6 ) for at opnaa en formodet koncentration af oleandomycin paa 0,1 mg/lm  ( = U8 ) . Umiddelbart herefter fremstilles koncentrationerne U4 , U2 og U1 med oploesningen  ( 4.6 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger  ( 1 + 1 ) .  7 . Testmetode  7.1 Podning af naeringssubstratet  Sporesuspensionen ( 3.2 ) podes ud paa testsubstratet  ( 4.2 ) ved 60 * C .  7.2 Fremstilling af pladerne  Testen saettes an som diffusionstest paa plader med hver 4 koncentrationstrin af standardoploesningen  ( S8 , S4 , S2 , S1 ) og ekstraktet ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Hver plade skal ubetinget indeholde alle koncentrationer af standard og proeve .  Derfor skal pladerne have en saadan stoerrelse , at der kan udstanses mindst 8 huller i substratlaget . Huldiameteren skal vaere 10 til 13 mm . Den podede substratmaengde ( 7.1 ) skal vaere beregnet saaledes , at man faar et ensartet lag paa ca . 2 mm tykkelse . Testen boer fortrinsvis udfoeres paa plader , som er fremstillet ved hjaelp af en glasplade , hvorpaa der laegges en plandrejet aluminiums - eller kunststofring med 20 mm hoejde og 20 mm diameter .  I hullerne afpipetteres noeje afmaalte maengder af antibiotikaoploesningen , mellem 0,10 og 0,15 ml alt efter hullernes diameter .  For hver proeve gentages paafyldningen af hver koncentration mindst 4 gange , saaledes at der pr . paasaetning for hver proeve kan bedoemmes 32 haemningszoner .  7.3 Inkubation  Der inkuberes i ca . 18 timer ved 28 til 30 * C .  8 . Bedoemmelse  Haemningszonernes diameter maales fortrinsvis ved projektion . Maalingerne indtegnes paa semilogaritmepapir , idet logaritmen til koncentrationerne indfoeres over for haemningszonernes diameter . Baade for standarden og for ekstrakten traekkes lige linjer . Ved en test med ukompliceret forloeb skal de to lige linjer vaere parallelle .  Logaritmen til den relative aktivitet udregnes efter foelgende formel :   ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) * 0,602 / U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2  Faktisk aktivitet = formodet aktivitet gange relativ aktivitet .  9 . Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve ikke vaere mere end 10 % .  4 . BESTEMMELSE AF TYLOSIN   - VED DIFFUSION I AGARNAERINGSSUBSTRAT -  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af tylosin i foderstoffer , koncentrater og forblandinger . Den laveste graense for bestemmeligheden andrager 2 ppm .  2 . Princip  Proeven behandles med en til 80 * C opvarmet fosfatstoedpudeoploesning pH 8 og ekstraheres derefter med metanol . Efter centrifugering fortyndes ekstrakten , og dens antibiotiske aktivitet bestemmes ved maaling af tylosinets diffusion i et med Sarcina lutea podet agarnaeringssubstrat . Diffusionen paavises ved hjaelp af de opstaaende haemningszoner med testorganismen . Diameteren af disse haemningszoner er direkte proportional med logaritmen til koncentrationen .  3 . Testorganisme : Sarcina lutea ATCC 9341  3.1 Opbevaring af stamkulturen  Et agarskraaglas af naeringssubstratet ( 4.1 ) indstilles til pH 7,0 , podes med Sarcina lutea og inkuberes ved ca . 35 * C natten over . Derefter opbevares kulturen i koeleskab og podes 1 gang om maaneden over i agarskraaglas .  3.2 Fremstilling af kimsuspensionen  Et agarskraaglas ( 3.1 ) opslaemmes med 2 til 3 ml steril , friskfremstillet kogsaltoploesning ( 4.4 ) . Med denne suspension podes en Roux-kolbe , som indeholder 250 ml af substratet ( 4.1 ) pH 7,0 . Efter en inkubationstid paa 24 timer ved 35 * C opslaemmes kimene med 25 ml fysiologisk kogsaltoploesning  ( 4.4 ) og homogeniseres . Denne suspension fortyndes for at opnaa en transmission ved 650 mm paa ca . 75 % . Denne suspension er holdbar 1 uge ved opbevaring i koeleskab .  Ved hjaelp af forsoegsplader med testsubstratet ( 4.1 ) findes den podningsmaengde , som giver de stoerst mulige men endnu skarpe haemningszoner med de forskellige anvendte koncentrationer af tylosin . Udpodningen paa substratet skal ske ved en temperatur paa mellem 48 og 50 * C .  4 . Naeringssubstrat og reagenser  4.1 Testsubstrat ( 1 )  Glukose * 1 g *  Pepton , tryptisk fordoejet * 10 g *  Koedekstrakt * 1,5 g *  Gaerekstrakt * 3 g *  Agar , alt efter kvalitet * 10-20 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  Til opbevaring af stamkulturen og fremstilling af kimsuspensionen indstillede til pH 7,0 til bestemmelsen justeres til pH 8,0 .  4.2 Fosfatstoedpudeoploesning , pH 8  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 0,523 g *  Dikaliumfosfat K2HPO4 p.a . * 16,730 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  4.3 Fosfatstoedpudeoploesning , pH 7  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 5,5 g *  Dikaliumfosfat K2HPO4 p.a . * 13,6 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  4.4 Fysiologisk kogsaltoploesning , steril  4.5 Metanol , ren  4.6 Metanol 40 % ( v/v )  4.7 Blanding af fosfatstoedpudeoploesning ( 4.2 ) og metanol , ren : 60/40 i vol .  4.8 Standardpraeparat : Tylosin med kendt aktivitet .  5 . Standardoploesninger  Standardpraeparatet ( 4.8 ) toerres 3 timer ved 60 * C i vakuumtoerreskabet ved 5 mm Hg . En afvejet stofmaengde paa 10 til 50 mg oploeses med 5 ml metanol  ( 4.5 ) i en maalekolbe og fortyndes derpaa med fostfatstoedpudeoploesningen pH 7 ( 4.3 ) for at opnaa en koncentration af tylosin base paa 1000 mg/ml .  Af denne stamoploesning fremstilles der ved fortynding med blandingen ( 4.7 ) en arbejdsstandardoploesning S8 , som indeholder 2 mg tylosin base/ml . Herefter fremstilles nedenstaaende koncentrationer med blandingen ( 4.7 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) :  S4 * 1 mg/ml *  S2 * 0,5 mg/ml *  S1 * 0,25 mg/ml *  6 . Ekstraktion  Der afvejes ved koencentrater 10 g ved forblandinger og foderblandinger 20 g . Den afvejede stofmaengde opslaemmes med 60 ml fosfatstoedpudeoploesning pH 8 ( 4.2 ) opvarmet til 80 * C og homogeniseres 2 minutter ( koekkenmaskine , Ultra-Turrax etc . ) .  Efter henstand i 10 minutter tilsaettes 40 ml metanol ( 4.5 ) og der homogeniseres paa ny i 5 minutter . Ekstrakten centrifugeres og en aliquot del fortyndes med blandingen ( 4.7 ) for at opnaa en formodet koncentration af tylosin paa 2 mg/ml ( = U8 ) . Umiddelbart herefter fremstilles koncentrationerne U4 , U2 og U1 med blandingen ( 4.7 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) .  Ved indhold paa under 10 ppm inddampes ekstrakten ved 35 * C til toerhed i en rotationsfordamper og opslaemmes med metanol 40 % ( 4.6 ) .  7 . Testmetode  7.1 Podning af naeringssubstratet  Kim-suspensionen ( 3.2 ) udpodes paa det til pH 8,0 justerede testsubstrat ( 4.1 ) ved 48 til 50 * C .  7.2 Fremstilling af pladerne  Testen saettes an som diffusionstest paa plader med hver 4 koncentrationstrin af standardoploesningen  ( S8 , S4 , S2 , S1 ) og ekstraktet ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Hver plade skal ubetinget indeholde alle 4 koncentrationer af standard og proeve .  Derfor skal pladerne have en saadan stoerrelse , at der kan udstanses mindst 8 huller i substratlaget . Huldiameteren skal vaere 10 til 13 mm . Den podede substratmaengde ( 7.1 ) skal vaere beregnet saaledes , at man faar et ensartet lag paa ca . 2 mm tykkelse . Testen boer fortrinsvis udfoeres paa plader , som er fremstillet ved hjaelp af en glasplade , hvorpaa der laegges en plandrejet aluminiums - eller kunststofring med 20 mm hoejde og 200 mm diameter .  I hullerne afpipetteres noeje afmaalte maengder af antibiotikaoploesningen , mellem 0,10 og 0,15 ml alt efter hullernes diameter .  For hver proeve gentages paafyldningen af hver koncentration mindst 4 gange , saaledes at der pr . paasaetning for hver proeve kan bedoemmes 32 haemningszoner .  7.3 Inkubation  Der inkuberes natten over ved 35 til 37 * C .  8 . Bedoemmelse  Haemningszonernes diameter maales fortrinsvis ved projektion . Maalingerne indtegnes paa semilogaritmepapir , idet logaritmen til koncentrationen indfoeres over for diameteren af haemningszonerne . Baade for standarden og for ekstrakten traekkes lige linjer . Ved en test med ukompliceret forloeb skal de to lige linjer vaere parallelle . - Logaritmen til den relative aktivitet udregnes efter foelgende formel :   ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) * 0,602 / U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2  Faktisk aktivitet = formodet aktivitet gange relativ aktivitet .  9 . Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve ikke vaere mere end 10 % .  5 . BESTEMMELSE AF VIRGINIAMYCIN   - VED DIFFUSION I AGARNAERINGSSUBSTRAT -  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af virginiamycin i foderstoffer , koncentrater og forblandinger . Den laveste graense for bestemmeligheden andrager 2 ppm .  2 . Princip  Proeven ekstraheres med en metanolisk Tween-80 oploesning . Efter centrifugering eller filtrering fortyndes ekstrakten og dens antibiotiske aktivitet bestemmes ved maaling af virginiamycinets diffusion i et med Sarcina * tea podet agarnaeringssubstrat . Diffusionen paavises ved hjaelp af de opstaaende haemningszoner med testorganismen . Diameteren af disse haemningszoner er direkte proportional med logaritmen til koncentrationen .  3 . Testorganisme : Sarcina lutea ATCC 9341  3.1 Opbevaring af stamkulturen  Et agarskraaglas af testsubstratet ( 4.1 ) podes med S . lutea og inkuberes ved ca . 35 * C natten over . Derefter opbevares kulturen i koeleskab og podes hver 14 . dag over i agarskraaglas .  3.2 Fremstilling af kim-suspensionen  Et agarskraaglas ( 3.1 ) opslaemmes med 2 til 3 ml steril , friskfremstillet kogsaltoploesning ( 4.3 ) . Med denne suspension podes en Roux-kolbe , som indeholder 250 ml af substratet ( 4.1 ) . Efter en inkubationstid paa 24 timer ved 35 * C opslaemmes kimene med 25 ml fysiologisk kogsaltoploesning ( 4.3 ) og homogeniseres . Denne suspension fortyndes for at opnaa en transmission ved 650 mm paa ca . 75 % . Denne suspension er holdbar 1 uge ved opbevaring i koeleskab .  Ved hjaelp af forsoegsplader med testsubstratet ( 4.1 ) findes den podningsmaengde , som giver de stoerst mulige , men stadig skarpe haemningszoner med de forskellige anvendte koncentrationer af virginiamycin . Podningen af naeringssubstratet skal ske ved en temperatur paa mellem 48 og 50 * C .  4 . Naeringssubstrat og reagenser  4.1 Testsubstrat ( 1 )  Glukose * 1 g *  Pepton , tryptisk fordoejet * 10 g *  Koedekstrakt * 1,5 g *  Gaerekstrakt * 3 g *  Agar , alt efter kvalitet * 10-20 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  Foer brugen justeres til pH 6,5 .  4.2 Fosfatstoedpudeoploesning , pH 6  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 8,0 g *  Dikaliumfosfat K2HPO4 p.a . * 2,0 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  4.3 Fysiologisk kogsaltoploesning , steril .  4.4 Metanol , ren .  4.5 Blanding af fosfatstoedpudeoploesning ( 4.2 ) og metanol , ren : 80/20 i vol .  4.6 Metanolisk Tween-80-oploesning 0,5 % ( w/v ) .  4.7 Standardpraeparat : Virginiamycin med kendt aktivitet .  5 . Standardoploesninger  Der fremstilles en metanolisk oploesning af standardpraeparatet ( 4.7 ) , som indeholder 800 mg virginiamycin/ml . Af denne stamoploesning fremstilles der ved fortynding med blandingen ( 4.5 ) en arbejdsstandardoploesning S8 , som indeholder 1 mg virginiamycin/ml . Derefter fremstilles nedenstaaende koncentrationer med blandingen ( 4.5 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) :  S4 * 0,5 mg/ml *  S2 * 0,25 mg/ml *  S1 * 0,125 mg/ml *  6 . Ekstraktion  6.1 Ved indhold af virginiamycin , lige med eller under 50 ppm  Der afvejes 10 til 20 g af proeven , tilsaettes 100 ml af oploesningen ( 4.6 ) og rysses 30 minutter paa et rystebord . Derefter centrifugeres eller filtreres 20 ml af den klare oploesning udtages og inddampes i en rotationsfordamper til toerhed . Inddampningsresten opslaemmes i 20 ml eller mere af blandingen ( 4.5 ) for at opnaa en formodet koncentration af virginiamycin paa 1 mg/ml ( = U8 ) . Umiddelbart herefter fremstilles koncentrationerne U4 , U2 og U1 med blandingen ( 4.5 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) .  6.2 Ved indhold af virginiamycin over 50 ppm  Der afvejes 1 til 10 g af proeven , tilsaettes 100 ml af oploesningen ( 4.6 ) og rystes 30 minutter paa et rystebord . Derefter centrifugeres eller filtreres og fortyndes med blandingen ( 4.5 ) for at opnaa en formodet koncentration af virginiamycin paa 1 mg/ml ( = U8 ) . Umiddelbart herefter fremstilles koncentrationerne U4 , U2 og U1 som beskrevet under 6.1 .  7 . Testmetode  7.1 Podning af naeringssubstratet  Kim-suspensionen ( 3.2 ) podes ud paa testsubstratet  ( 4.1 ) ved 48 til 50 * C .  7.2 Fremstilling af pladerne  Testen saettes an som diffusionstest paa plader med hver 4 koncentrationstrin af standardoploesningen  ( S8 , S4 , S2 , S1 ) og ekstraktet ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Hver plade skal ubetinget indeholde alle 4 koncentrationer af standard og proeve .  Derfor skal pladerne have en saadan stoerrelse , at der kan udstanses mindst 8 huller i substratlaget ; huldiameteren skal vaere 10 til 13 mm . Den podede substratmaengde ( 7.1 ) skal vaere beregnet saaledes , at man faar et ensartet lag paa ca . 2 mm tykkelse . Testen boer fortrinsvis udfoeres paa plader , som er fremstillet ved hjaelp af en glasplade , hvorpaa der laegges en plandrejet aluminiums - eller kunststofring med 20 mm hoejde og 200 mm diameter . I hullerne afpipetteres noeje afmaalte maengder af antibiotikaoploesningen paa mellem 0,10 og 0,15 ml , alt efter hullernes diameter .  For hver proeve gentages paafyldningen af hver koncentration mindst 4 gange , saaledes at der pr . paasaetning for hver proeve kan bedoemmes 32 haemningszoner .  7.3 Inkubation  Der inkuberes i 18 time ved 28 til 30 * C .  8 . Bedoemmelse  Haemningszonernes diameter maales fortrinsvis ved projektion . Maalingerne indtegnes paa semilogaritmepapir , idet logaritmen til koncentrationerne indfoeres over for haemningszonernes diameter . Baade for standarden og for ekstrakten traekkes lige linjer . Ved en test med ukompliceret forloeb skal de to lige linjer vaere parallelle .  Logaritmen til den relative aktivitet udregnes ved hjaelp af foelgende formel :   ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) * 0,602 / U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2  Faktisk aktivitet = formodet aktivitet gange relativ aktivitet .  9 . Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve ikke vaere mere end 10 % relativt .  ( 1 ) Ethvert naeringssubstrat , som er normal handelsvare og har tilsvarende sammensaetning , og som giver samme resultater , kan anvendes .  ( 2 ) Amldesort tjener til fremhaevelse af standardoploesningernes haemningszoner ( blaa ringe ) .  ( 3 ) Denne af LUPA , Klel , isolerede stamme har en intensivere vaekst end S . aureus ATCC 6538 P .  ( 4 ) Stamme isoleret af LUFA , Kiel .